JP4279768B2 - ジスルフィド架橋結合した糖タンパク質ホルモン類似体類およびそれらの調製および使用 - Google Patents
ジスルフィド架橋結合した糖タンパク質ホルモン類似体類およびそれらの調製および使用 Download PDFInfo
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発明の分野
本発明は、糖タンパク質ホルモン類の類似体類、ならびにそれらの調製および用途に関する。より具体的には、本発明は、糖タンパク質ホルモン類をジスルフィド結合架橋した類似体類ならびにそれらの調製および用途に関する。
糖タンパク質ホルモン類には、コリオゴナドトロピンとしても知られている絨毛性ゴナドトロピン(chorionic gonadotropin)(CG)、ルトロピンとしても知られている黄体形成ホルモン(luteinizing hormone) (LH)、ホリトロピンとして知られている卵胞刺激ホルモン(follicle stimulating hormone)(FSH)、およびチロトロピンとしても知られている甲状腺刺激ホルモン(thyroid stimulatinghormone)(TSH)が含まれる。ヒトからのそれらは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、ヒト黄体形成ホルモン(hLH)、ヒト卵胞刺激ホルモン(hFSH)、および、ヒト甲状腺刺激ホルモン(hTSH)として知られている。これらのホルモンは、生殖腺および甲状腺の機能に重要な役割を果たしている(Pierceら、1981:Moyleら、1995)。CGおよびLHはLHレセプター類と結合してそれらを刺激し、FSHはFSHレセプター類と結合してそれらを刺激し、また、TSHはTSHレセプター類と結合しそれらを刺激する。CGは、主に、霊長類を含む数少ない哺乳動物の胎盤によって大量に生成されるホルモンである。霊長類からのCGのβ−サブユニットのアミノ酸配列は、通常、LHのそれらとは異なる。ウマもまたCGを生成するが、ウマのCHは、ウマのLHと同一のアミノ酸配列を持つ(Murphyら、1991)。
従って、本発明の目的は、上で論議したようなこの技術分野での欠陥を打ち消すことにある。本発明の糖タンパク質ホルモン類似体は、相当する糖タンパク質の生物活性を少なくとも一部分保持しつつも、改善された安定性を提供している。好ましくは、本発明の類似体は、該当するホルモンのその天然のレセプターに対するアフィニティーを少なくとも25%、保持している。本発明のこのような類似体は、適正に設計された位置に据えられたサブユニット内ジスルフィド結合が、α−またはβ−サブユニットの片方または両方の残基を修飾することによって作り出され、ホルモン構造上へのサブユニット内架橋による影響の可能性を最小にするので、従来技術の糖タンパク質ホルモン類似体以上の改善を提供する。
本発明による糖タンパク質ホルモンの類似体は、CA2188508およびHanら(1996)に記載された一般の教示以上の改良を示す。サブユニット内ジスルフィド結合は、糖タンパク質ホルモンヘテロダイマーのα−サブユニットおよびβ−サブユニットを安定化する。改良された類似体は、ホルモンの三次元構造の混乱を具体的に減少させるように設計され、それによって、ダイマーがインビボで形成され、形成されたダイマーが天然のレセプターと親和性を持ち、そして、それへのアゴニスト活性を持つ可能性がより大きくなるであろう。
タンパク質の修飾を、以下のように分類することができる;
有望−−−これらの修飾は、特定の用途へのタンパク質の有用性を強化する。
中立−−−これらの修飾は、特定の用途へのタンパク質の有用性を強化も減少もさせない。
非有望−−これらの修飾は、特定の用途へのタンパク質の有用性を減少させるが、必ずしも除外しない。
不活性化−これらの修飾は、特定の用途へのタンパク質の有用性を除外する。
寛容−−−これらの修飾は、有望、中立または非有望であるが、不活性化はしない。
・放射能標識、酵素標識、および蛍光標識した誘導体の例のように、分子をより検出しやすくする;
・熱、光、酸化剤、還元剤および酵素のような、特定の物理的、化学的、生物学的作因に関して、分子をより安定にする;
・例えば、その投与を容易にするために、分子を興味ある溶媒により溶けやすくする、または、例えば、その沈殿を容易にするために、またはその他の分子の捕獲へのその利用を可能にするために、溶けにくくする;
・例えば、アミノ酸側鎖上に保護基を置いて、分子が関与することのできる反応の形態を制限する、または、逆に、例えば、実質的なカップリング反応を促進するために分子上に反応基を置いて、可能な反応を拡大する;
・分子の免疫原を少なく(または多く)する;
・患者に投与した場合、分子が特定の器官または組織に残留する時間を増加(あるいは減少)させる、または特定の器官または組織内へのその到着を早める(または遅らせる);
・一つ以上のその生物学的または免疫学的活性を強化(あるいは減少)する、例えば、レセプターへのその親和性を増加あるいは減少させる、またはその特異性を変える;または
・前の活性を補う新しい活性を授ける(例えば、抗癌抗体に毒素をくっつける);または
・分子の望ましくない副作用を阻害する。
(a) 挿入または欠損よりむしろ置換であり、;
(b) 内部より末端、または、内部であればループあるいはドメイン間リンカーの、挿入または欠損であり、;
(c) 内部残基よりむしろ表面残基に影響を与え;
(d) 結合部位から遠い分子の部分に影響を与え;
(e) 一つのアミノ酸を、大きさ、チャージ、および/または疎水性の類似したもう一つのアミノ酸に置換し;そして
(f) 興味あるタンパク質が属する同族タンパク質のファミリー中で実質上変化に晒されている部位にある。機能性変異体を設計するために、このような要件を用いることができる。
アミノ酸−特異的化学親和性標識を用いて、実際に露出しいる残基を探し出すことができる。それらは表面上に出現していると考えられるため、最も有用な標識は、チャージした残基と反応するそれらであると考えられる。サンプル標識には、以下の物が含まれる;
アミノ酸 アフィニティ−ラベル
Asp、Glu ジアゾ化合物(非イオン化AA)
またはエポキシド(イオン化AA)
Lys 2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸、酢酸、
スクシン酸、マレイン酸およびシトラコン酸の無水物
Arg シクロヘキサンジオン、ヒドラジン
結合部位の部分であるかを決定するために、用いることもできる。遊離のタンパク質が標識された場合にえられる標識の配置を、複合タンパク質が標識された場合に得られる標識の配置と比較する。複合体では、結合相手が結合タンパク質の結合部位残基をふさぐので、結合部位残基は、遊離タンパク質内では標識され、複合タンパク質内では標識されないはずである。
Ala→Val、Glu→Gln、Phe→Leu、Ile→Leu、Ile→Val、
Lys→Arg、Leu→Ile、Leu→Val、Met→Leu、Met→Val、
Asn→Asp、Asn→Ser、Arg→Lys、Arg→Gln、Ser→Ala、
Thr→Ser、Val→Ile、Val→Leu、Tyr→Phe、Cys(-SH)→Ala、
さらなるこれらの置換は、5−10%の範囲の可能性を持つ。
Phe→Val、Phe→Tyr、His→Val、Leu→Phe、Met→Ala、
Met→Ile、Gln→Glu、Gln→His、Gln→Met、Ser→Gly、
Ser→Thr、Thr→Val、Val→Ala、Trp→Phe、Tyr→Leu、
Cys(-SH)→Ser、
Overingtonら(1992)、表5を参照のこと。
本発明の糖タンパク質ホルモン類似体を含む医薬組成物には、それら類似体が、その予定された目的を達成する有効な量で含有されている組成物全てが含まれる。更に、それら医薬組成物は、薬学的に用いることができる製剤中に、活性化合物の処理を容易にする賦形剤および添加剤を含む適当な薬学的に許容しうる担体を含有してよい。適当な薬学的に許容しうるビヒクルは、当該技術分野において周知であり、例えば、この分野で標準的な参考書である、Alfonso Gennaro 監修,Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.(イーストン,PA,1990年)で記載されている。薬学的に許容しうるビヒクルは、糖タンパク質ホルモン類似体の投与方式、溶解度および安定性によって常套法で選択することができる。例えば、静脈内投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有しうる滅菌水性液剤が含まれうる。
ジスルフィド結合によるサブユニット内架橋の判定基準によれば、表1Bのデータは、フリーのシステインがα−サブユニット残基31に生じるならば、そしてβ−サブユニットTyr37がシステインで置き換えられるならば、システインノット間のサブユニット内ジスルフィド結合によって安定化したhCGの類似体を製造することは可能であろうということを示唆した。これは、Tyr37がシステインで置き換えられたhCG β−サブユニットの類似体、およびCys7がSerで置き換えられたヒトα−サブユニットの類似体を製造することによって行なわれた。この後者の変化は、アミノ酸Cys7とCys31との間のα−サブユニットで通常見出されるジスルフィドを破壊して、残基37に導入されたβ−サブユニットシステインとのジスルフィド結合を形成するのに利用可能な残基31にフリーのα−サブユニットシステインを残した。これらサブユニット構築物それぞれが、培養された哺乳動物細胞中で発現された場合、残基31のα−サブユニットおよび残基37のβ−サブユニットのシステインは、サブユニット内ジスルフィド結合を形成した。
シートベルト(seat-belt)は、hCGのレセプター結合活性に影響を与えることが周知である(Campbell ら,1991年;Moyle ら,1994年;Han ら,1996年)。hCG β−サブユニットアミノ酸残基101−109の、それらのhFSH対向部分(counterparts)(すなわち、hFSH β−サブユニット残基95−103)での置換は、類似体のLH活性を与えることなくFSH活性の劇的な増加をもたらした(Moyle ら,1994年;Han ら,1996年)。実際に、この置換は、hTSHで特異的に見出されるいずれの残基も導入しなかったとしても、hCGのTSH活性も増加させた(Campbell ら,1997年)。関連の多機能類似体の活性へのサブユニット内ジスルフィドの影響を研究することにより、特定のジスルフィドが、ルトロピン、ホリトロピンおよびチロトロピンの活性にどのように影響するかが示された。この実施例は、システインノット間のサブユニット内ジスルフィドが、hCGの類似体(CFC101−114)のLHおよびFSH活性にどのように影響したかを詳しく説明し、ここにおいて、hCG β−サブユニット残基101−114は、それらのhFSH対向部分(すなわち、hFSH β−サブユニット残基95−108)で置き換えられていた。
hCGのα−およびβ−サブユニット中の残基のCαとCβ炭素原子の間の距離は(表1B)、それらサブユニットが1個またはそれ以上のジスルフィド結合によって拘束された多数の他の追加のダイマーを製造することが可能であろうということを示唆している。α−サブユニット残基31とβ−サブユニット残基37との間のhCGおよびCFC101−114の架橋は、得られた類似体の安定性を有意に増大させ、それらの生物学的活性に最小限の影響を与えた。レセプター結合に影響を与えることが前もって示された分子の一部分へのジスルフィド架橋の導入が、その安定性および活性を変化させるかどうか突きとめるために、ジスルフィド結合をhCGおよびCFC101−114中のα−サブユニットループ2とシートベルトとの間に遺伝子操作した。これら実験は、糖タンパク質ホルモンのこの領域中へのジスルフィドの導入が、それらの安定性を増加させたことを示した。しかしながら、ジスルフィドを生じるのに必要とされた置換は、レセプターと相互作用し且つシグナル伝達を引起こすそれらの能力に影響を与えた。これは、レセプター相互作用またはレセプター特異性に関与しないホルモンの部分へのジスルフィド結合の導入が、高内分泌活性を維持するのに好ましいことを示した。どちらの種類のジスルフィド架橋類似体も、それらの免疫学的活性を保持していたので、そのジスルフィドの位置は、免疫原を設計する場合にあまり重要でないかもしれない。このジスルフィドのシグナル伝達への影響は、ホルモンアンタゴニストまたは免疫原を開発するのに有用でありうる。
3つ全ての主要な糖タンパク質ホルモンレセプターに相互作用する能力を有する糖タンパク質ホルモン類似体であるCFC101−114のシートベルトとα−サブユニットの間に、ジスルフィド結合を創製した。これは、LHとFSHのレセプターとの相互作用に対する該タンパク質のこの領域の相対的な影響の特性決定を可能にした。
糖タンパク質への複数のジスルフィドの導入がそれらの生物活性に如何に影響するかを調べるため、実施例1および3に示したジスルフィドを含むhCG類似体を作成した。これらの類似体は、実施例1および3に記載された発現ベクターの一部を交換することにより製造した。pCI−α(C7S,K51C)は、pSVL−αC7SとpSVL−αK51CのBsmI消化により製造し、各消化において生成される小さい断片と大きい断片をアガロース電気泳動により分離して、pSVL−αC7Sからの大きな断片をpSVL−αK51Cからの小さな断片に連結した。その結果の構築物をXhoIとBamHIにより消化して、修飾されたリンカーであって実施例1に記載されたpCI中に連結した。pCI−hCGβ’(Y31C,D99C)は、pSVL−hCGβ’D99CとpCI−hCGβ’Y37CのAocI(Bsu36Iのイソシゾマー)とBamHIによる消化により製造し、小さい断片と大きい断片をアガロース電気泳動により分離して、pSVL−hCGβ’D99C由来の小さな断片をpCI−hCGβ’Y37C由来の大きな断片に連結した。これらのベクターによりコードされる類似体の配列を図31に記載する。
hCGとCFC101−114がそれらのLAおよび/またはFSH活性を破壊することなくそれらのシステインノット間のサブユニット内ジスルフィドにより安定化されたとの発見は、この領域がホルモン活性に必要ないことを強く示唆する。即ち、FSHへの同様なジスルフィドの工作は増大した安定性と強力なFSH活性を有するFSH類似体をもたらすはずであると期待される。この類似体はhCGおよびhFSHα−サブユニットを認識する抗体例えばA113を結合することも期待される。該変異部位から離れたhFSHβ−サブユニットループ1および/または3の領域を認識する抗体、例えばB602を結合することも期待される。
実施例1−4は、糖タンパク質ホルモンおよびそれらの類似体のサブユニット間の単一のサブユニット内ジスルフィド結合がそれらの安定性を増大させうることを教示する。これらの実施例は、レセプター結合、レセプター結合特異性に重要であるかまたはタンパク質を不適切なコンフォメーションに歪める残基を含まないならば、該分子のレセプター結合およびシグナル形質導入活性に対するジスルフィド結合の作用は小さくなることも示す。α−およびβ−サブユニットの両者のN末端部分は、実質上ホルモン活性を破壊することなく変更されうることから、該タンパク質のこの部分は鍵となるレセプター接触には関与しないことを示唆する。よって、表1Bにおいて有望であることが示された部位における糖タンパク質ホルモンのN末端のジスルフィド結合の導入は、それらの生物活性を憂慮すべき程破壊することなくそれらを安定化することになると期待される。
この類似体を発現するのに有用なベクターを製造するのに必要なアミノ酸配列を図34Aと図34Bに示す。
前記のとおり、実施例1−4は、糖タンパク質とそれらの類似体のサブユニット間のサブユニット内部ジスルフィド結合がそれらの安定性を高めうることを教示する。これらの実施例は、レセプター結合またはレセプター結合特異性に重要な残基を含まないならば、ジスルフィド結合とシグナル形質導入へのジスルフィド結合の作用も示す。よって、本発明によれば、hFSHのN末端のジスルフィド結合の導入がそれを安定化させて有用な治療用の特性を有することになる類似体を導く。
もっとも密接に関連したヒトルトロピンはhCGとhLHである。即ち、活性なジスルフィド架橋hCG類似体を製造するのに必要な変異は活性なジスルフィド架橋hLH類似体の製造にも有用なはずであることが期待されるはずである。hLHは安定性の低いゴナドトロピンであり、そしてサブユニット内部ジスルフィドが顕著にhLHの安定性を増大させることも予測される。システイン内部ノットジスルフィド架橋hLHおよびそのN末端近傍において架橋されたhLHを製造するのに必要なβ−サブユニットのアミノ酸配列を、それぞれ図36と図37に示す。
前記のとおり、実施例1−4は、糖タンパク質ホルモンとそれらの類似体のサブユニットの間のサブユニット内部ジスルフィド結合がそれらの安定性を高めうることを教示する。これらの実施例は、レセプター結合またはレセプター結合特異性に重要な残基を含まないならば、ジスルフィド結合とシグナル形質導入へのジスルフィド結合の作用も示す。よって、hTSHのα−およびβ−サブユニットのシステインノット内あるいはhTSHのα−およびβ−サブユニットのN末端内の残基間のジスルフィド結合の導入がヘテロダイマーを安定化して、放射線切除治療前に甲状腺を刺激する等の有用な治療特性を有することになる類似体を導く。
これらの類似体を発現するのに有用なベクターを製造するのに必要なアミノ酸配列は図38および39に示される。
糖タンパク質ホルモンの脱グリコシル化が生物学上のシグナルを引き出すそれらの能力を低下させることはよく知られている(Moyle et al,1975;Matzuk et al,1989)。しかしながら、それらの不安定性のために、脱グリコシル化されたホルモンは治療上有用でない。遺伝上脱グリコシル化されたホルモンへのジスルフィド架橋の導入はホルモンアンタゴニストとしてのそれらの利用性を高めることになると期待される。LHまたはhCGのアンタゴニストは、前生殖能力(profertility)および抗生殖能力(antifertility)の用途の両方を有するはずである。即ち、不適切に高いLHレベルを有するために不妊の女性に投与した場合、LHアンタゴニストは受胎能を増強するはずである。妊娠初期の段階であった女性に投与した場合、hCGアンタゴニストは妊娠を停止させるはずである。二機能性LH/FSH分子のアンタゴニスト例えばCFC101−114あるいはCFC101−109(Moyle et al,1994)も有用なはずである。そのようなアンタゴニストの一時的な使用は不適切な卵巣機能を停止させるために使用することができ、それにより、月経周期のリセットを導く。これは、有力な前生殖効果を有するはずである。初期妊娠におけるそのようなアンタゴニストの使用は、プロゲステロンおよびエストラジオール両者の生産を抑圧して妊娠を停止させることが期待されるはずである。
親のホルモンよりも安定なことが期待されるゴナドトロピンの別のジスルフィド架橋類似体を表9−15に示す。これらは、実施例1−5に示されたとおりに、α−サブユニットおよびβ−サブユニットを発現できるベクターによる細胞の同時トランスフェクトにより製造されるはずである。
このジスルフィドを創製する残基は高い親和性のレセプター接触に関与しないと提案されているhCGの領域中にある(Moyle et al,1995)。hCGの第2のβ−サブユニットループも第3のβ−サブユニットループもルトロピン活性に必要なく、そして両者が欠損したhCGの活性類似体を作成することができる(Moyle et al,1998)。さらに、β−サブユニットループ2がそのhFSH同等物で置換された、完全に活性のhCGの類似体を製造した(Campbell et al,1991)。即ち、該タンパク質のこれらの部分の間のサブユニット内ジスルフィドの追加がその生物活性を破壊するとは本発明者らにより予測されなかった。この類似体はhCGのα−およびβ−サブユニットをコードするベクターを修飾してそれらを哺乳類細胞中で同時発現することにより製造されるはずである。α−サブユニット構築物は、表9に示すαV76Cと呼ぶアミノ酸配列を有するタンパク質をコードした。この構築物は、オリゴヌクレオチド1131と1132をプライマーとして(表5)そしてpMB589を鋳型として用いることによりPCR変異導入により製造された。プラスミドpMB589は、Asn52のコドンがアスパラギン酸に変化し、並びにArg42とSer43のコドンがサイレントなBglII部位を創製するように修飾された、ヒトα−サブユニットの類似体をコードする、pCI’中の構築物である。
hCGとhFSHのβ−サブユニットのアミノ酸配列の類似性、特にシステイン(表4)に基づき、両方のタンパク質は同様の構造を有すると予測される。hCGのβ−サブユニットループ2中のVal44とα−サブユニットループ3中のVal76の相対的な位置は、これらの残基のシステインへの変化がβ−サブユニットループ2とα−サブユニットループ3の間にサブユニット内ジスルフィドを創製するはずであることを示唆した。Val38は、hCGのβ−サブユニットのVal44のように、hFSHのβ−サブユニット中で同様な位置を占める。よって、hFSHβVal38のシステインへの変化およびその結果の構築物の間にV76Cを伴う発現は、ジスルフィド架橋ヘテロダイマーをもたらすと考えられた。hFSHのβ−サブユニット中のVal38をシステインに変化させるために、本発明者は、XhoIとBamHI制限部位間に非翻訳3’および5’末端を持たないhFSHβcDNAコーディング配列を含む構築物であるpMB603を用いて開始した。pMB603のBstXIとPpuMI部位の間の小さなDNA断片を、オリゴヌクレオチド1154と1155(表5)をアニールすることにより製造されたオリゴヌクレオチドカセットで置き換えた。
サブユニット内部ジスルフィドに関与することができる遊離チオールを創製するように各々のサブユニットを修飾することにより、前のジスルフィド架橋ヘテロダイマーを製造した。ここでは、hCGのβ−サブユニットのみを修飾することによりジスルフィド架橋hCG類似体を製造できることを示す。hCGの結晶構造は、α−サブユニットCys31がβ−サブユニットTyr37の近傍に位置して、両方の鎖の側鎖が互いの方に向かっていることを示した。この観察は、以前に、hCGのα−サブユニット残基31とβ−サブユニット残基37の間にサブユニット内ジスルフィド結合を挿入するのに用いられた。hCGの結晶構造は、α−サブユニット残基Cys7がhCGのβ−サブユニット残基Arg6の近傍に位置していることも示す。事実、α−サブユニット残基Arg6と37は、Arg6とTyr37を変換するように、αCys7−αCys31とβCys6−βCys−37のサブユニット内ジスルフィドを含むヘテロダイマー、αCys7−βCys6とαCys31−βCys37のサブユニット内ジスルフィドを含むヘテロダイマー、あるいはαCys7−βCys37とαCys31−βCys6サブユニット内ジスルフィドを含むヘテロダイマーの形成を促進するかもしれない。コンピューターシミュレーションは、これらのジスルフィド結合の各々が不都合な株を用いずにタンパク質上に形成できたことを示した。複数のジスルフィドの形成は、異なる半減期を有する異性体またはアイソフォームの群を創製するのに有用であるべきである。これらは、特に生物反応が「ジャンプスタート」することを要求される場合に、新規な治療用用途を有するかもしれない。これらを用いる際は、ホルモン応答を開始するために類似体の大きな巨丸剤を投与するはずである。架橋されなかったヘテロダイマーの画分は、架橋したヘテロダイマーの画分よりも早くクリアされることが期待される。結果として、多量の初期注射は応答を開始するのに十分であるが、その活性は応答を維持するために長期間保持される低レベルに散在する。この類似体は、PEG化類似体の製造のための中間体として機能することも期待される。システイン残基は唯一の反応性を有し、そしてタンパク質表面上に遊離システインを負荷することがしばしば望まれる。しかしながら、システインの反応性のために、この種のタンパク質は創製するのが難しくなりうる。α−サブユニットCys7−Cys31ジスルフィドが遊離システインを創製する状態に容易に低下されることは知られている。β−サブユニットにおける残基6と37の間へのシステインの導入は、同様な種類のジスルフィドを創製することが予測される。これらのジスルフィド中のシステインは該タンパク質中の他のシステインよりも活性であることが予測され、特に、それらがジスルフィド交換を促進する位置にあるからである。即ち、本発明者は、残基Cys37において存在するα−サブユニットシステインとβ−サブユニット残基Cys6において付加されたシステインに、該タンパク質を修飾するはずの試薬を反応させることが可能であると予測する。これらは、該タンパク質をPEG化できて、その生物半減期を安定化させることができるものを含むことができた。このプロセスにおいて「自由にされた(freed)」システインは、該タンパク質を安定化するはずのサブユニット内ジスルフィドを形成するはずである。この類似体の製造は、hCGβ’Y37Cとして知られる類似体に第2システインを付加することを必要とした。
hCGβ’R6C,Y37C:
前に述べたとおり、複数のジスルフィドの形成は異なる半減期を有するタンパク質の群を創製するのに有用かもしれない。同様な類似体は、濾胞の発生を刺激するための改良されたアプローチを申し出る。サブユニット内ジスルフィドを含まないでかつ架橋されなかったヘテロダイマーの画分は、サブユニット内架橋を含むヘテロダイマーの画分よりも早くクリアされるべきである。結果として、多量の初期注射は応答を開始するのに十分であるが、その活性は長期間保持される低レベルに散在する。これは、濾胞期の間に観察されるFSH刺激の種類をより密接に模倣するはずであり、そして過剰刺激のチャンスを減じるかもしれない。hFSHのβ−サブユニットのN末端へのシステインの付加あるいはhFSHのβ−サブユニットのN末端へのhCGのβ−サブユニットアミノ末端の付加はヘテロダイマーおよびサブユニット内架橋の形成を促進するはずであると予測される。実施例15中の類似体のそれに類似のヘテロダイマーを形成することが期待されるhFSHのβ−サブユニットは如何に示すアミノ酸配列を有すはずである:
hFSH’βR−2C,Y31C:
β−サブユニットアミノ酸94−110がそれらのhFSH同等物で置換されたhCG類似体は高いFSH活性を有する。hCGのβ−サブユニット残基101−109に代えてhFSHのβ−サブユニット残基95−103を含み、そしてβ−サブユニット6と37においてシステインを含むhCGとhFSHのキメラは、実施例15におけるものと同様なジスルフィド配置を形成すると予測される。これらは、高いFSH活性を有することも期待される。そのような類似体の一つのβ−サブユニットのアミノ酸配列は以下である:
CFC94−117βR6C,Y37C:
Claims (5)
- α−サブユニットおよびβ−サブユニットを有する、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、およびヒト黄体形成ホルモン(hLH)からなる群から選択される糖タンパク質ホルモンであって、上記糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Tyr37をシステインで置換し、そしてα−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Cys7をセリンで置換することにより、α−サブユニットの天然Cys31残基と修飾されてシステイン残基になるβ−サブユニットの残基37の間にサブユニット間ジスルフィド結合を形成する上記糖タンパク質ホルモンを有効量、および薬学上受容可能な賦形剤を含む、薬学組成物。
- α−サブユニットおよびβ−サブユニットを有するヒト卵胞刺激ホルモン(hFSH)由来の糖タンパク質ホルモンであって、hFSHのβ−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Tyr31をシステインで置換し、そしてα−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Cys7をセリンで置換することにより、α−サブユニットの天然Cys31残基と修飾されてシステイン残基になるhFSHのβ−サブユニットの残基31の間にサブユニット間ジスルフィド結合を形成する上記糖タンパク質ホルモンを有効量、および薬学上受容可能な賦形剤を含む、薬学組成物。
- α−サブユニットおよびβ−サブユニットを有するヒト甲状腺刺激ホルモン(hTSH)由来の糖タンパク質ホルモンであって、hTSHのβ−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Tyr30をシステインで置換し、そしてα−サブユニットのアミノ酸配列が修飾されて、残基Cys7をセリンで置換することにより、α−サブユニットの天然Cys31残基と修飾されてシステイン残基になるhTSHのβ−サブユニットの残基30の間にサブユニット間ジスルフィド結合を形成する上記糖タンパク質ホルモンを有効量、および薬学上受容可能な賦形剤を含む、薬学組成物。
- 流体である、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の薬学組成物。
- 安定である、請求項4記載の薬学組成物。
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