KR20020026456A - 사상균에서 발현된 ｄｎａ 라이브러리의 고산출량 스크리닝 - Google Patents

사상균에서 발현된 ｄｎａ 라이브러리의 고산출량 스크리닝 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사상균에서 외인성 DNA 라이브러리를 발현하는 방법을 제공한다. 진균은 인트론-함유 진핵생물 유전자를 포함할 수 있고, 또한 글리코실화 및 단백질 폴딩과 같은 번역 후 프로세싱 단계를 수행할 수 있다. 본 발명은 고산출량 스크리닝 및 발현된 단백질의 특정 분자의 진화를 허용하는 변형된 형태를 가지는 진균의 사용을 제공한다. 같은 형질전환된 진균은 분리, 특성화, 및 이용분야 검정을 위하여 단백질의 더 많은 양을 생산하는 데 사용될 수 있고, 또한 단백질의 상업적 생산에 적합할 수 있다.

Description

사상균에서 발현된 ＤＮＡ 라이브러리의 고산출량 스크리닝{HIGH-THROUGHPUT SCREENING OF EXPRESSED DNA LIBRARIES IN FILAMENTOUS FUNGI}
자연-발생 미생물의 개체군은 광범위한 배열의 생화학 및 대사 다양성을 나타낸다. 많은 미생물을 분리하고 배양하는 부분적인 어려움때문에, 개체군내에 존재하는 많은 잠재적으로 가치있는 단백질 및 폴리펩티드가 동정되지 못했다. 게다가, 세상의 미생물의 1% 이하가 현재까지 배양되었다고 추정되었다. 현재까지 비배양, 비동정 미생물, 및 또한 공지된 미생물의 단백질, 폴리펩티드 및 대사물질의 특징에 대한 새로운 접근법에 대한 긴급한 요구가 있다(본원에 사용된 용어 "단백질"은 펩티드 및 폴리펩티드를 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다). 또한, 단백질의 변형 및/또는 생산을 할 수 있도록 이러한 단백질을 코딩하는 유전자의 동정 및 분리에 대한 새로운 접근법에 대한 요구가 있다.
본 문제의 한 접근법은 Short 의 U.S. 특허 5,968,672; 6,001,574, 6,030,779, 및 6,057,103 에 개시되었다(그 내용은 본원에 참고로 수록된다). 접근법에서, 게놈 DNA 라이브러리는 현존함에 틀림없는 어떤 미생물을 분리 또는 배양하려는 시도의 존재 또는 부재로 환경 샘플(예를 들어, 토양 샘플)로부터 직접적으로 제조된다.E.Coli에서 발현된 DNA 라이브러리, 및 발현된 단백질이 관심있는 성질 또는 활성에 대해 스크리닝된다. Short 는 본 방법의 진균 숙주 세포의 사용을 언급하지만, 개시 또는 사용가능케 하지는 않는다.
개시된 접근법은 몇몇의 심각한 단점을 가지고 있고, 그중 하나는E.coli는 인트론을 가지는 유전자를 효과적으로 발현하지 않는다는 것이다. 토양의 대략 90% 종의 미생물은 진핵생물(원칙적으로 진균)이고, 이것은 일반적으로 그들의 게놈 DNA 에 인트론을 가진다. 약 100,000 종의 진균문 진균이 공지된 것을 고려하면, 약 1,000,000 이 지금까지 발견된 것으로 추측되고(B.Kendrick, The Fifth Kingdom, Mycologue Publications 1999), 단백질 및 대사물질 다양성의 가능성은 진균 게놈에서 훨씬 높지만, 인트론의 존재는 대부분의 진균 단백질 및 대사 레파토리를 박테리아 발현 시스템의 범위밖에 있게 한다. 진균에 독특한 많은 유형의 효소가(예를 들어, 분비 진균 리기닌 과산화효소 및 만가네세-의존 과산화효소)있을 뿐만 아니라E.coli에서 발현된다면 글리코실화될 수 없는 글리코실화된 효소(예를 들어, 리기닌 과산화효소,A.niger전화효소)를 포함하는 많은 진균 단백질이 존재한다. 진균 게놈의 훨씬 많은 수 및 더 큰 크기 및 복잡성, 많은 진균 단백질의 유일성, 및 많은 진균 단백질의 글리코실화는 모두 게놈 DNA 의 박테리아 발현에 의해 실질적으로 검출될 수 있는 허용된 환경 샘플에서 미생물 단백질 및 대사물질 다양성의 분별은 10% 미만 상당이라는 것을 나타낸다.
부분적으로 AIDS 의 확산 및 증가하는 기관 이식 수용자 군에 기인하여, 증가하는 면역-이감염성 또는 면역-억제 개체군이 있고, 진균 감염의 수 및 다양성은 신속히 진행되었다(Infect.Med.16:380-382, 385-386(1999)). 항-진균 약제의 새로운 표적에 대한 진행중인 연구에서 병인성 진균으로부터의 단백질을 동정하고 특성화하려는 요구가 존재하고, 이것은 진균 게놈으로부터 유래된 DNA 라이브러리를 스크리닝 능력을 요구한다. 또한, 진균 게놈에의 인트론의 존재는 통상 이용가능한 박테리아 숙주에서 게놈 DNA 라이브러리의 발현을 어렵게 만든다. 또한 항생제 활성을 가지는 새로운 진균 대사산물의 고산출량 스크리닝을 요구하는 항생제-내성 박테리아 감염 우세성의 증가가 있었다.
고등생물의 진핵생물 게놈은 또한 박테리아에서 DNA 라이브러리의 포괄적인 발현을 하기에는 너무 복잡하다. 모든 진핵생물 종을 고려하는 경우에, 박테리아는 모든 공지된 종의 단지 약 0.3% 를 나타내므로(E.O.Wilson, "The Current State of Biological Diversity", in Biodiversity, National Academy Press, Washington DC, 1988, Chapter1); 박테리아 발현 시스템으로 접근가능한 세상의 유전 다양성의 분별은 극히 제한된다.
인트론을 가지는 문제점을 피하는 것은, cDNA 라이브러리를 제조하고 박테리아에서 그것을 발현하는 것으로 가능하다. 그러나, 본 접근법은 RNA 전사체의 존재에 의존하고, 활발하게 전사되지 않는 어떤 유전자는 라이브러리에서 발현되지 않을 것이다. 많은 바람직한 단백질은 특정 조건하에서만 발현되고(예를 들어, 병인 성 진균에서 독성) 이러한 조건은 mRNA 가 회수되는 시기에만 존재하지 않을 수 있다. 더욱이, cDNA 라이브러리를 제조에 충분한 RNA 를 얻기 위해서는, 상당한 양의 유기물을 배양할 필요가 있다. 배양에서 잘 자라지 않은 환경 샘플의 유기물, 또는 적당한 배양 조건이 공지되지 않은 신규한 미생물의 경우에, 충분한 RNA 를 쉽게, 신뢰할 정도로 얻을 수 없을 것이다. 대조적으로, 충분한 게놈 DNA 를 무작위 프라이머 또는 어떤 유형의 유전자를 선호하도록 설계된 프라이머를 사용하여, PCR 증폭으로 많은 소량의 개개의 세포로부터 얻을 수 있다. 최종적으로, 유기물에서 많이 발현된 유전자는 mRNA 에서 과발현되는 경향이 있을 것이므로, cDNA 라이브러리에서 최소한 발현된 유전자의 희생으로 과발현된다. 현존하는 mRNA 종 범위의 높은 수준을 가지기 위해서, cDNA 라이브러리가 게놈 라이브러리 대신에 사용되는 경우에는 훨씬 많은 클론이 스크리닝되어야만 하는데, 이는 후자의 경우 현존하는 다양한 유전자와 거의 동일한 발현을 할 것이기 때문이다. 명백하게, 모든 것이 가능하다면, 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이 더욱 바람직하다.
또한,E.coli는 많은 단백질을 분비할 수 없으므로, 스크리닝이 유전자 산물의 분비에 의존하는 스크리닝용 숙주 세포로서 바람직하지 않다.E.coli, 및 박테리아 숙주의 추가적인 단점은 원핵생물은 일반적으로 많은 진핵생물 단백질의 활성에 요구되는 많은 번역후 변형의 제공할 수 없다는 것이다. 글리코실화에 추가하여, 서브유닛 절단, 이황화 결합 형성, 및 단백질의 적당한 폴딩은 활성 단백질을 생산하기 위해서 종종 요구되는 번역-후 프로세싱의 예이다.
이러한 프로세싱을 보장하기 위해서, 때때로 포유동물 세포를 사용할 수 있지만, 포유동물 세포는 유지하는 것이 어렵고, 비싼 배지를 요구하고, 일반적으로 고효율로 형질전환되지 않는다. 그러므로, 이러한 형질전환 시스템은 cDNA 라이브러리 스크리닝용 숙주 세포로서 포유동물에서 사용하고자 하는 노력이 있었지만, 단백질의 고산출량 스크리닝에 용이하지 않다(Schouten et al., WO 99/64582). 라이브러리 스크리닝 전에 포유동물 세포와 형질전환된 원형질체의 융합을 포함하는접근법이 개시되었지만(U.S. 특허 5,989,814), 단백질 라이브러리의 발현은 세포 융합 전에 박테리아 또는 효모에서 일어난다. 숙주 세포에서 발현 후에 효소적으로 글리코실화 패턴을 변형시키려는 노력이 있었지만(Meynial-Salles and Combes, J.Biotechnol., 46:1-14(1996)), 이러한 방법은 특정 산물에 대해 맞추어져야만 하고, DNA 라이브러리의 단백질 발현에 적합하지 않다. 더욱 최근에, Maras et al., Eur.J.Biochem, 249:701-707(1997)(또한, US 특허 5,834,251 참조)는 사람의 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 을 발현하도록 유전적으로 설계된Trichoderma reesei균주를 개시했다. 효소는 더욱 밀접하게 대체로 천연 포유동물 산물에 가까운 제 1 단계로, 다른 발현 외인성 단백질상의 만노스에 N-아세틸글루코사민을 전달한다.
숙주 세포로서 효모의 사용은 어느 정도 상기 문제를 해결하지만, 다른 문제를 도입한다. 효모는 외인성 단백질을 과-글리코실화하는 경향이 있어서(Bretthauer and Castellino, 1999, Biotechnol. Appl.. Biochem. 30:193-200), 변형된 글리코실화 패턴은 발현된 포유동물 단백질을 매우 항원성으로 되게 한다(C.Ballou, in Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, J.Stathern et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1982, 335-360). 효모는 제한된 수의 인트론을 대처할 수 있지만, 일반적으로 척추동물과 같은 고등 종의 복잡한 유전자를 다룰 수 없다. 사상균의 유전자 조차도 통상 효모가 효율적으로 전사시키기기에 너무 복잡하고, 이러한 문제는 효모 및 사상균간의 발현 차이 및 스플라이싱 서열으로 더욱 심해진다(예를 들어, M.Innis et al., Science 1985 228:21-26). 이러한 난점에도 불구하고, 효모용, 일반적으로 cDNA 라이브러리로의 사용을 위한 형질전환 및 발현 시스템이 광범위하게 개발되었다. 포유동물 기원의 천연 분비 및 멤브레인 단백질(Klein, et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 1996 93:7108-7113;Treco, U.S. 특허 5,783,385), 및 이종 진균 단백질(Dalboge and Heldt-Hansen, Mol.Gen. Genet. 243:153-260(1994)), 및 포유동물 단백질(Tekamp-Olson and Meryweather, U.S. 특허 6,017,731)을 스크리닝하는 데 사용된 효모 발현 시스템이 개발되었다.
본원의 효모 발현 시스템에 사용된 용어 "효모"는 일반적으로S.cerevisiae및Pichia pastoris와 같은Saccharomycetales목의 유기물을 말한다. 개시 목적으로, 용어 "진균" 은Saccharmycetales목이 아닌Euascomycetes강의Basidiomycetes, Zygomycetes, Oomycetes, 및Chythridiomycetes,및Ascomycetes를 말하는 것으로 이해되어야만 한다. 사상균은 생장 성장동안 균사 연장, 및 필수적인 호기성 탄소 이화작용으로 효모와 구별될 수 있다(효모에서 생장 성장은 단일세포 엽상체로부터의 발아에 의하여 이루어지고, 효모는 발효 이화작용을 사용할 수 있다).
진균 유전자 산물의 적당한 인트론 스플라이싱, 및 글리코실화, 폴딩, 및 다른 번역 후 변형은 토양 샘플의 게놈 DNA 를 스크리닝하는 사상균 이상의 숙주를 만드는 진균 숙주 종에 의해서 가장 효과적으로 다루어질 수 있을 것이다. 또한 프로테아제, 셀룰라아제, 및 아밀라제와 같은 상업적 관심있는진균 효소의 생산을 위한 우수한 숙주로 만들 수 있다. 또한 사상균은 포유동물 유전자를 포함하는 다른 진핵생물 유전자의 산물을 전사, 번역, 프로세싱, 및 분비할 수 있다. 후자의 성질은 사상균을 생의학 관심있는 단백질 생산을 위한 매력적인 숙주로 만든다. 사상균에 도입된 글리코실화 패턴은 효모에 의해 도입된 패턴보다 포유동물 단백질의 그것에 가장 유사하게 닮았다. 이러한 이유로, 이종 단백질의 발현을 위한 진균 숙주 시스템의 개발에 많은 노력을 기울여왔고, 많은 진균 발현 시스템이 개발되었다. 본 영역의 성과를 개관하기 위해서, Maras et al., Glycoconjugate J., 16:99-107(1999); Peberdy, Acta Microbiol.Immunol.Hung.46:165-174(1999); Kruszewsa, Acta Biochim.Pol.46:181-195(1999); Acher et al., Crit. Rev. Biotechnol. 17:273-306(1997); 및 Jeenes et al., Biotech. Genet. Eng. Rev. 9:327-367(1991)참조.
진균 게놈으로부터 유래된 DNA 라이브러리의 고산출 발현 및 분석은 또한 일반적으로 많은 포유동물 유전자에 대하여 기능을 분류하는 데 사용될 것이다. 예를들어, 일단 관심있는활성 특징을 가지는 진균 단백질이 확인되면, 코딩 유전자의 서열은 동종 유전자를 찾기 위해 사람 게놈 서열에 비교될 수 있다.
Yelton et al., U.S 특허번호 4,816,405 는 이종 단백질을 생산 및 분비하는 사상Ascomycetes의 변형을 개시한다. Buxton et al.,의 U.S 특허번호 4,885,249, 및 Buxton 및 Radford, Mol. Gen. Genet. 196:339-344(1984)는 숙주 세포에 통합될 수 있는 선택 마커를 포함하는 DNA 벡터에 의한Aspergillus niger의 형질전환을 개시한다. McKnight et al., U.S. 특허 4,935,349, 및 Boel,U.S. 특허 5,536,661 은Aspergillus및 다른 사상균에서 이종 유전자 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 포함하는Aspergillus에서 진핵생물 유전자를 발현하는 방법을 개시한다. Royer et al., U.S. 특허 5,837,847, 및 Berka et al., WO 00/56900 은 천연 및 돌연변이체Fusarium spp.프로모터를 사용하는Fusarium venenatum에서 사용된 발현 시스템을 개시한다. Conneely et al., U.S 특허 5,955,316 은Aspergillus에서 락토페린의 발현 및 생산에 적합한 플라스미드 구조체를 개시한다.Cladosporium글루코스 옥시다제는Aspergillus에서 발현되었다(U.S.특허 5,879,921).
Neurospora.Lambowitz, U.S. 특허 4,486,533 에 사용된 유사한 기법은 사상균에서 자율적으로 복제하는 DNA 벡터 및Neurospora에서 이종 유전자의 도입 및 발현을 위한 그것의 사용을 개시한다. Stuart et al. 은 포유동물 유전자 및 U.S. 특허 5,695,965 의 내인성 전사 조절 요소, 및 U.S. 특허 5,776,730 의 감소된 수준의 세포외 프로테아제를 가지는 개선된 균주Neurospora로Neurospora crassa스페로플라스트의 동시-형질전환을 개시한다.Neurospora의 형질전환용 벡터는U.S. 특허 5,834,191 에 개시된다. Takagi et al. 은 U.S. 특허 5,436,158 에서Rhizopus용 형질전환 시스템을 개시한다. Sisniega-Barroso et al. 은Aspergillus awamori의 글루타메이트 디히드로게나제 유전자의 프로모터를 사용하는 WO 99/51756 의 사상균을 위한 형질전환 시스템을 개시한다. Dantas-Barbosa et al., FEMS Microbiol. Lett. 1998 169:185-190 은 리튬 아세테이트 방법 또는 일렉트로포레이션을 사용하여 히그로마이신 B 내성에 대한 Humicola grisea var.thermoidea 의 형질전환을 개시한다.
더욱 성공적인 진균 발현 시스템중에는Aspergillus및Trichoderma의 것으로 Berka et al., U.S. 특허 5,578,463 에 개시된다; 또한 Devchand 및 Gwynne, J.Biotechnol.17:3-9(1991) 및 Gouka et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.47:1-11(1997)참조. 형질전환된 균주Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Theilavia terrestris 및 Sporotirchum cellulophilus의 예는 WO 96/02563 및 U.S. 특허 5,602,004, 5,604,129 및 5,695,985 에 제시되고, 이것은Aspergillus및Trichoderma시스템의 어떤 단점을 개시하고, 다른 진균이 대규모 단백질 생산에 더욱 적합할 수 있다는 것을 제안한다.
Ascomycetes를 제외한 문의 형질전환을 위한 방법이 당업계에 공지된다; 예를 들어, Munoz-Rivas et al., Mol.Gen.Genet.1986 205:103-106(Schizophylum commune); van de Rhee et al., Mol. Gen. Genet. 1996 250:252-258(Agaricus bisporus); Arnau et al., Mol. Gen. Genet. 1991 225:193-198(Mucor circinelloides);Liou et al., Biosci Biotechmol. Biochem 1992 56:1503-1504(Rhizopus niveus); Judelson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 1991 4:602-607(Phytophtora infestans); 및 de Groot et al., Nature Biothechnol. 1998 16:839-842(Agaricus bisporus) 참조.
예를 들어, 원형질체 융합과 같은 사상균의 일반적인 형질전환 방법에 추가하여, Chakraborty 및 Kapoor, Nucleic Acids Res. 18:6737(1990)은 일렉트로포레이션에 의한 사상균의 형질전환을 개시한다. De Groot et al., Nature Biotechnol 16:839-842(1998)은 몇몇 사상균의Agrobacterium tumefaciens-매개 형질전환을 개시한다; 진균에서의 DNA 바이오리스틱 도입이 수행되었다; 예를 들어, Christiansen et al., Curr. Genet. 29 :100-102(1995); Durand et al., Curr. Genet. 31:158-161(1997); 및 Barcellos et al., Can. J. Micorbiol. 44:1137-1141(1998) 참조. 세포의 "마크네토-바이오리스틱" 트랜스펙션을 위한 자기 입자의 사용은 U.S. 특허 5,516,670 및 5,753,477 에 개시되고, 사상균에 이용가능한 것으로 기대된다.
숙주로서 진균을 사용하는 발현 시스템을 개발시키려는 많은 연구가 있었다는 것은 자명하다. 그러나, 일반적인 진균 숙주는 모두 사상균이고, 이것을 비-교반 배양물에서 얽힌 매트의 균사 및, 교반 탱크 생물학적 반응기에서 매우 점성의 현탁(액침) 배양물을 형성하는 경향이 있다. 사상균의 이러한 성질은 또한 진균 숙주 세포에서 효소의 산업적 생산에 어떤 문제점을 유발한다. 예를 들어, 고점성 및/또는 균사체의 조밀한 집합체의 형성은 교반, 통기, 및 영양소 분산의 어려움을 초래한다. 일반적으로, 사상균은 배양물의 점성때문에 마이크로타이터 플레이트에현탁 배양물의 미세피펫으로 옮기는 것에 적합하지 않다. 더욱이, 얽힌 균사때문에, DNA 라이브러리를 발현하는 전형적인 사상균의 배양물은 대규모의 별개 클론으로 쉽게 분리되지 않고, 이것은 고산출량 분석 시스템에 요구될 때 개개의 유전자형의 평가를 방해한다.
일정한 교반의 부재에서 전형적인 사상균은 호기성 포자를 생산하는 액체 배지의 표면에서 매트를 형성하면서 자라는 경향이 있다. 액침 배양물의 경우에는 일반적으로 포자를 형성하지 않는다. 양 성질은 마이크로타이터 플레이트에서 사상균 클론의 배양, 및 효율적인 조작 및 고산출량 스크리닝을 위한 이러한 배양의 사용에 대해 실질적인 장애로 존재한다. 현탁 포자 또는 다른 생식 컴피턴트 요소는 각각의 마이크로타이터 웰로의 분리 및 분배에 적합한 반면에, 호기성 포자의 생산은 표면 매트가 형성되도록 허용되는 경우에 마이크로타이터 웰의 상호-오염을 유발할 것이다. 마이크로타이터 웰에서 매트 형성을 방해하는데 요구되는 정도로의 배지 교반이 용이하는 않은, 호기성 포자를 조절하는 어려움에 추가적으로, 표면 매트는 많은 분석(특히, 분광광도 흡광 분석법)을 어렵거나 불가능하게 하면서, 광 전달을 방해한다. 표면 매트는 또한 산화, 시약 및 영양소 첨가, 및 피펫팅과 같은 과정을 방해한다.
배양물의 물리적 성질에 대한 진균 형태의 영향이 인식되어왔고, 더욱 유리한 형태를 가지는 자연-발생 균주가 U.S. 특허번호 5,695,985 로 Jesen 및 Boominathan 의 실시예에 개시된대로 동정되었다. 공언된 분지를 가지는 헐거운 균사체의 동종 분배는 특히 바람직한 형태로 개시되었다. 국제 특허출원 WO 97/26330및 US 특허 6,184,026 으로 Schuster 및 Royer 는 이종 단백질의 산업상 생산을 위한 더욱 적당한 형태를 가지는 진균 세포를 동정하는 유사한 방법을 제공한다. 본 방법은 특이적으로 변형된 형태를 찾기 위해서 야생형 균주보다 모 진균 세포 라인의 돌연변이체를 스크리닝하는 단계, 돌연변이체를 형질전환하는 단계, 및 형질전환된 돌연변이체의 배양물이 모 세포 라인보다 더욱 이종 단백질을 생산하는지를 평가하는 단계를 포함한다. 적어도 10% 이상의 균사 분지를 가지는 돌연변이체가 특히 요구된다. 본 방법은Trichoderma, Fusarium및Aspergillus균주에 대해 예시하고, 많은 다른 속에의 이용가능성을 제시한다.
Aspergillus orzae돌연변이체의 배양물 점성에 대한 분지 빈도의 효과를 Bocking et al., Biotechnol.Bioeng.65:638-648(1999) 에 의해 실험되었고; 훨씬 더 분지 균주는 본 연구에서 더 낮은 점성을 나타냈다. PCT 출원 WO 00/00613 의 Van Wezel et al.,은 분지 감소 및/또는 사상 미생물의 분절화를 증가시켜서 배양물의 점성이 감소되는 방법을 개시한다. 본 방법은Streptomyces griseus의 SsgA 유전자를 가지는 미생물을 형질전환시키는 것을 포함한다. 본 방법은Actinomycetales목 사상 박테리아에서 증명되지만, 사상균에도 이용가능하다는 것이 언급된다. WO 00/56893 의 Dunn-Coleman et al.,은 42 ℃ 이상에서 배양된 경우에 고분지 표현형을 나타내고, 균사 분지의 정도 및 배양물 점성간의 1차 관계를 나타낸 HbrA2 돌연변이체A.nidulans를 개시한다.
사상균 발현 시스템의 가장 최근의 노력은 효소의 산업적 생산에 적합한 균주의 동정에 관한 것이었음로 관심은 배양물 점성, 형질전환의 안정성, 단위 부피당 이종 단백질의 산출량, 및 생체량의 비율로서의 산출량에 집중되었다. DNA 라이브러리는 진균에서 발현되었다; 예를 들어,Aspergillus nidulans라이브러리가A nidulans에서 발현된 Gems 및 Clutterbuck, Curr. Genet. 1993 24:520-524 및,Penicillium에서 기원한 게놈 라이브러리가Aspergillus에서 발현된 Gems et al., Mol. Gen. Genet. 1994 242:467-471 참조. 이러한 논문은 발현된 단백질 스크리닝에 관하여 개시 또는 제시하지는 않았다; DNA 라이브러리로부터의 유전자의 발현이 증명되었다는 것은 숙주에서 돌연변이체 대립유전자의 상보성을 의미한다. 상보성 방법은 검출하고자 하는 각 외인성 단백질 활성에 대한 특정 돌연변이체 숙주를 필요로 하고, 일반적인 라이브러리 스크리닝에 대한 수단을 제공하지 않는다.
Trichoderma reesei에서의 발현에 의한Aspergillus niger전화효소 유전자의 클로닝은 Berges et al., Curr. Genet. 1993 24:53-59 에 개시되었다. 선택 마커를 함유하는 코스미드 벡터에서 제조된A.niger게놈 라이브러리, 및 숙주T.reesei(수크로스를 이용할 수 없다)를 사용하여,A.niger전화효소 유전자를 관련있는 선택 과정으로 클로닝했다. 이것은 다시, 숙주의 매우 특이적 성질이 단일 발현된 외인성 단백질의 존재를 검출하는데 요구되었고, 게놈 라이브러리의 스크리닝은 개시되거나 가능하지 않았다.
DNA 라이브러리의 발현에 적합한 진균 숙주 세포의 특징은 산업상 단백질 제조에 적합한 숙주의 특징과 많은 측면에서 다르다. 일반적인 관점에서, 고산출량 스크리닝에 적합합 진균 숙주는 많은 기준을 만족해야만 하고; 그중에서도 하기의 것이다:
- 숙주는 고효율로 형질전환되어야만 한다.
- 숙주는 인트론-함유 유전자를 포함해야만 하고 어떤 필요한 스플라이싱을 수행해야만 한다.
- 숙주는 발현된 단백질이 활성 형태로 생산되도록하는 번역 후 프로세싱을 해야만 한다.
- 라이브러리가 단백질에 대해 분석되는 경우에, 숙주는 분석법에 의한 검출을 위해 충분히 높은 산출량으로 단백질을 생산해야만 한다.
- 숙주는 이용의 용이성 및 다능성을 위해 다양한 발현 조절 요소를 수용해야만 한다.
- 숙주는 쉽게-선택가능한 마커의 사용을 허용해야만 한다.
- 숙주 세포 배양물은 저 점성이어야만 한다.
- 숙주는 프로테아제가 부족하고 및/또는 프로테아제 발현의 억제에 용이해야만 한다.
- 숙주는 다양한 외인성 단백질 활성 또는 성질을 위한 스크린을 허용해야만 한다.
- 숙주 진균 배양물의 균사는 단일 클론의 분리를 방해할 만큼 너무 얽히지 말하야 하며, 소형화 고산출량 스크리닝 포맷(예를 들어, 미세피펫팅)에서 효율적인 전달 및 복제를 방지하는 지점까지 점성이 올라갈만큼 얽히지 않아야만 한다.
- 숙주는 표면 매트를 형성하지 않아야만 하나, 바람직하게 액침 배양물로서 배양된다.
- 숙주는 고산출량 스크린으로 제공된 배양 조건하에서 액침 포자 또는 다른 번식체의 효율적인 생산을 허용해야만 한다.
대사물질이 스크리닝되는 경우에, 숙주 세포가 대사물질을 쉽게 검출될 수 있고/또는 분석될 수 있는 배지로 분비한 경우라면, 유리할 것이다. 이상적으로, 숙주는 단지 외인성 단백질을 분비하여야만 한다.
단백질을 평가하는 경우에, 숙주가 또한 단백질의 분리 및 정제를 가능케 하는 충분한 이종 단백질을 발현하는 경우라면, 특히 유리할 것이다. 이러한 특징을 가지는 숙주 세포는 유전자를 다른 유기물에 전달하는데 필요한 시간 소모적인 분자 생물학적 조작없이 단지 숙주 세포를 배양함으로써 관심있는 이종 단백질을 더 특성화하는 것을 가능하게 할 것이다. 바람직하게는, 숙주는 단백질을 분비할 수 있어야만 하고, 이것은 더욱 신뢰성 있고 더욱 다양한 분석을 허용할 것이다.
숙주 세포가 이종 DNA 의 분리에 용이한 경우에 유리할 것이므로 유전자의 더이상의 연구 및 변형이 수행될 수 있다.
숙주의 성질에 추가하여, 형질전환 시스템은 또한 어떤 특징을 나타내야만한다. 형질전환 빈도는 의미있는 스크린에 요구된 형질전환체의 수를 유발하도록 충분히 높아야만 한다.이상적으로, 외인성 단백질의 발현은 단일 프로모터에 작용하는 단일 경로에 의해서 단일 유도효소로 유도될 것이다.
현재까지, 이러한 기준의 모든것, 또는 가장 근사하게 만족시키는 숙주 세포 및 형질전환 시스템의 어떤 조합도 개발되지 않았다. 그러므로, DNA 라이브러리, 특히 게놈 및/또는 진핵생물 게놈 DNA 라이브러리의 유전자 산물을 효율적으로 발현할 수 있는 진균 숙주 세포 및 형질전환 시스템에 대한 요구가 현존한다.
(발명의 개요)
본 발명은 액침 배양물에서 배양된 경우에 "전달가능한 생식 요소"를 생산하는 사상균을 사용한다. "전달가능한 생식 요소"는 포자, 번식자, 균사 단편, 원형질체, 미세펠렛, 또는 (1) 배양물 배지에서 다른 이러한 요소로부터 쉽게 분리되고, (2) 단일클론 배양물에서 그자체를 생식할 수 있는 다른 진균 요소를 의미한다. 진균은 또한 바람직하게 덜 공언된 사상 표현형 및/또는 밀집한 성장 형태를 나타내고, 고산출량 DNA 라이브러리 스크리닝에 포함된 물리적 조작에 적합한 저점성 배양물을 생산한다. 특히 바람직한 것은 교반의 부재에서조차 표면 매트보다 액침 배양물일때 배양되는 경향이 있는 사상균이다.
본 발명은 국제 특허출원 PCT/NL99/00618 및 PCT/EP99/202516 에 개시된 형질전환 시스템 성질을 이용한다. 이러한 출원은Chrysosporium lucknowense및Aspergillus sojae와 같은 사상균 숙주에 대한 효율적인 형질전환 시스템을 개시한다. 본 출원은 또한 야생형 숙주 세포의 모든 잇점을 보유하지만, 그들의 사상 표현형을 부분적으로 상실하여 저점성 배양물을 제공하는 돌연변이체 균주가 쉽게 제조된다는 것을 개시한다.
본 발명에 사용하기 위한 진균은 이미 공지된 사상균 숙주에 비하여 높은 단백질/생체량 비율을 나타내는 많은 양의 외인성 단백질을 발현하고 분비한다. 본 발명은 고산출량의 형질전환체를 나타내는 형질전환 시스템을 제공한다. 본 발명은 또한 이종 cDNA 삽입체, 및 특히 게놈 DNA 삽입체의 단백질 산물을 효과적으로 발현하는 형질전환체 진균의 라이브러리를 제공한다. 발명의 다른 양태에서, 형질전환된 진균의 라이브러리는 이종 단백질의 활성 또는 성질에 대한 스크리닝, 또는 외인성 단백질 활성의 결과로서 형질전환된 진균에 의해 생산된 대사물질에 대한 스크리닝, 또는 그것으로부터 유래된 이종 DNA 또는 RNA 전사체에 대한 스크리닝에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기에 개시된 표현형 성질을 가지는 형질전환되지 않은 균주의 대사물질에 대한 고산출량 스크리닝을 가능케한다.
본원에 사용될 때 용어 "돌연변이체 사상균"은 단지 천연에서 발견되지 않은 진균을 말한다. 밀집한 성장 형태, 저점성, 감소된 프로테아제 수준, 액침 성장등과 같은 바람직한 표현형 성질을 유발하는 "돌연변이"는 UV 조사 및 화학적 돌연변이유발과 같은 전통적인 수단, 또는 카세트 돌연변이유발과 같은 분자 생물 방법에 의해서 무작위로 도입될 수 있거나, 유전적 설계 방법에 의해서 의도적으로 도입될 수 있다. 자연 발생 진균은 필수 성질을 포함하는 것으로 발견되므로, 물론 본 발명의 방법에 이용할 수 있을 것이다.
또 다른 발명의 양태에서, 형질전환된 진균의 라이브러리는 예를 들어, 특정 의 발현된 단백질 또는 대사물질의 높은 수준의 생산과 같은 진균 그자체의 유용한 성질에 대해 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 양태는 단백질 생산, 단백질 프로세싱, 및 단백질 분비의 가장 유리한 조합을 가지는 특정 형질전환체가 검출될 수 있는 발현된 관심있는 단백질을 정량 분석에 의해 예시된다.
본 발명의 다른 양태에서, 형질전환된 진균의 라이브러리는 관심있는 핵산 프로브에 혼성화할 수 있는 DNA 서열의 존재를 스크리닝할 수 있다.
본 발명은 사상균 숙주에서 DNA 라이브러리, 특히 합성, 게놈, 및 cDNA 라이브러리의 발현 및 연이은 스크리닝 방법을 제공한다. 시스템은 액침 배양에서 예를 들어, 효율적인 포자형성에 의해서 전달가능한 생식 요소를 생산하는 형질전환 또는 트랜스펙션된 사상균 균주를 사용한다. 균주는 바람직하게는 얽힌 균사의 형성을 최소화 또는 제거하는 형태를 나타낸다. 특히 바람직한 균주는 또한 평가를 위한 외인성 단백질의 분리가능한 양을 발현할 수 있다. 본 발명의 돌연변이체 균주는 특히 전달가능한 생식 요소의 생산, 고 수준의 발현, 및 매우 낮은 배양 점성때문에 고산출량 스크리닝 기법에 특히 적합하다.
도 1 은 실시예에 개시된 웨스턴 블럿이다.
도 2 는 pUT720 맵이다.
도 3 은 pUT970 맵이다.
도 4 는 pUT1064 맵이다.
도 5 는 pUT1065 맵이다.
도 6 는 pF6g 맵이다.
도 7 은 pUT1150 맵이다.
도 8 은 pUT1152 맵이다.
도 9 는 pUT1155 맵이다.
도 10 은 pUT1160 맵이다.
도 11 은 pUT1162 맵이다.
도 12 는 pclA 단백질의 도식적인 구조이다.
도 13A 는 야생형Aspergillus niger의 현미경사진이다.
도 13B 는Aspergillus nigerpclA 돌연변이체의 현미경사진이다.
도 14A 는 야생형Aspergillus sojae의 현미경사진이다.
도 14B 는Aspergillus sojaepclA 돌연변이체의 현미경사진이다.
도 15A-E 는 pyrE 유전자의 서열 결과를 제시한다. 밑줄은 아미노산 서열을 나타내고; 어떤 서열 불확실성때문에 연속적이지 않다. 지시된 아미노산 서열이 가장 가능성 있다. 굵은 형태는 추정상/확실한 인트론을 나타낸다.
광범위한 양태에서, 본 발명은 현탁액에서 전달가능한 생식 요소를 생산하는 형질전환된 사상균, 및 발현된 외인성 단백질 또는 대사물질, 즉, 외인성 및/또는 외인성 효소에 의해 생산된 작은 분자 산물과 관련된 생화학적 또는 생물학적 활성과 같은 관심있는 생물학적 성질에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 저점성 사상균의 라이브러리는 핵산 서열을 함유하는 진균을 포함하고, 각 핵산 서열은 이종 단백질을 코딩하고, 각 핵산 서열은 발현 조절 영역 및 선택적으로 분비 신호를 코딩하는 서열 및/또는 담체 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 형질전환된 균주는 이종 단백질을 분비할 수있다.
본 발명의 발현 및 스크리닝 방법, 및 그에 사용된 진균은 다양한 이용분야에서 유용성을 가지는 진균, 단백질, 대사물질, 및 DNA 분자 생산에 유용하다. 본 발명의 방법은 또한 핵산 및 단백질 서열 정보를 생산하는데 유용하고, 정보는 그 자체로 청구된 방법의 가치있는 산물로 여겨진다.
본 발명의 바람직한 사상균은 저점성의 배양물 배지를 특징으로 한다. 전형적인 산업상-등급 사상균은 200 센티푸아즈 일반적으로 1,000 cP 이상, 및 10,000 cP 에 이를 수 있는 점성 웰로 배양물을 생산하는 반면에, 본 발명의 진균은 최적 또는 거의 최적의 성장 조건에서 적당한 영양소의 존재에서 48 시간 이사을 배양한 후에 200 cP 미만, 바람직하게는 100 cP 미만, 더욱 바람직하게는 60 cP 미만, 및 가장 바람직하게는 10 cP 미만을 나타낸다. 본 발명의 사상균은 일반적으로, 짧은,분명한, 얽히지 않은 균사, 또는 미세펠렛을 특징으로한다. 미세펠렛은 훨씬 더 크고 다수의 얽힌 클론으로부터 유래된 펠렛과 다른 것으로 약간 또는 얽히지 않은 균사의 집합물이다. 예를 들어, 돌연변이체 UV 18-25Chrysosporium lucknowense균주(점성 ＜10 cP) 및 형태학적으로 유사한 돌연변이체Trichoderma longibrachiatumX-252 균주(점성 ＜60 cP)는 길이 100 및 200 마이크론내의 짧은, 얽히지 않은 균사의 존재를 특징으로 하고, 저점성으로 설계된 돌연변이체Aspergillus sojaepclA 는 상당한 분지 및 짧은 균사를 가지는 조밀한 형태를 특징으로 한다(도 14 참조). WO 97/26330 에 개시된 저점성 진균이 "더욱 긴 균사 분지"를 가진것으로 개시된 반면에, 본 발명의 어떤 진균은 비돌연변이체 진균에 비교되는 경우에 등가 또는 훨씬 작게 감소된 균사 분지를 가진다. 균사 길이는 배양물의 점성을 조절하는데 우세한 역할을 하는 것으로 보인다.
특히 바람직한 진균 균주는 높은 외인성 분비 단백질/생체량 비율을 가지는 것을 특징으로 한다. 비율은 바람직하게는 1:1 이상이고, 더욱 바람직하게는 2:1 이상이고, 가장 바람직하게는 6:1 또는 그 이상이다. 가장 바람직하게, 비율은 8:1 내지 그 이상이다. 이러한 높은 비율은 더욱 감도 및/또는 더욱 빠른 스크리닝 분석을 허용하면서 외인성 단백질의 더 높은 농도를 초래하기 때문에, 고산출량 스크리닝 환경에서 유리하다. 이것은 예를 들어, 96 웰 플레이트 내지 384 웰 플레이트, 및 1536 웰 플레이트에 이르도록 분석 용액의 부피가 감소될 때 특히 유리하다. 본 발명의 방법은 마이크로타이터 플레이트 포맷, 및 액체 샘플을 사용하는 대부분의 다른 HTS 포맷의 어느 것에 적합하다.
어느 사상균은 본원에 개시된 돌연변이 과정에 의해서 본 발명에의 사용에 적합한 돌연변이체 균주로 전환될 수 있다는 것이 예상된다. 사상균의 바람직한 속 중에는 Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Cryplococcus, Acremonium, Tolypocladiu, Scytalidim, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola,및Trichoderma, 및 그것의 아나모르프 및 텔레오모르프이다. 더욱 바람직한 것은Chrysosporium, Trichoderma, Aspergillus, 및 Fusarium 이다. 가장 바람직한 것은Chrysosporium이다. 진균의 속 및 종은 Barnett 및 Hunter, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3rd Edition, 1972, Burgess Publishing Company 에 개시된 것과 일치하는 형태로 한정될 수 있다.Chrysosporium속의 진균 분류에 관한 상세한 설명을 제공하는 원은 Van Oorschot, C.a.n.(1980)"A revision of Chrysosporium and allied genera" in Studies in Mycology No.20, Centraal Bureau voor Schimmelcultures(CBS), Baarn, The Netherlands, pp. 1-36 이다. 본 교시에 따라서,Chrysosporium속은Hyphomycetales목에 속하는Moniliaceae과에 속한다.
진균 명명법에서 정보를 제공하는 다른 용이한 원은 부다페스트 조약 기탁이고, 특히 온라인 데이터베이스를 제공하는 것이다(하기의 인터넷 주소는 http 프로토콜을 사용한다). ATCC(US)는 www.atcc.org.에서, CBS(NE)는 www.cbs.knaw.nl 에서, VKM(RU)는 www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/general 에서 정보를 제공한다. 모든 이러한 기관은 진균 종의 구별되는 특징에 대한 교시를 제공할 수 있다.Ascomycota 의 택일적인 분류법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Undef&id=4890 에서 발견될 수 있다. 택일적인 분류법에 따라서, 속Chrysosporium은Onygenaceae과,Onygenales목,Ascomycota강에 속한다.
Chrysosporium의 정의는 하기의 균주를 제한없이 포함한다:C.botryoides, C.carmidhaelii, C.crassitunicatum, C.europae, C.evolceannui, C.farinicola, C.fastidium, C.filiforme, C.georgiae, C.globiferum, C.globiferum var. articulatum, C.globiferum var.niveum, C.hirundo, C. hispanicum, C.holmii, C.indicum, C.inops, C.keratinophilum, C.kreiselii, C.kuzurovianum, C.lignorum, C.lobatum, C.lucknowense, C.lucknowenseGarg 27K,C.medium, C.medium var. spissescens, C.mephiticum, C.merdarium, C.merdarium var. roseum, C.minor, C.pannicola, C.parvum, C.parvum var. crescens, C.pilosum, C.pseudomerdarium, C.pyriformis, C.queenslandicum, C.sigleri, C.sulfureum, C.synchronum, C.tropicum, C.undulatum, C.vallenarense, C.vespertilium, C.zonatum.
C.lucknowense는 셀룰라제 단백질의 높은 천연 생산자를 제공했기 때문에 특히 관심있는Chrysosporium의 종이다(국제특허출원 WO 98/15633, PCT/NL99/00618, 및 U.S. 특허 5,811,381 및 6,015,707). 국제 기탁 접수 번호 ATCC 44006, CBS 251.72, CBS 143.77, CBS 272,77, 및 VKM F-3500D 를 가지는 균주는Chrysosporium lucknowense균주의 예이다.Chrysosporium의 정의내에는 천연또는 유발 돌연변이유발로 돌연변이된 것을 포함하는Chrysosporium계승자로부터 유래된 균주가 또한 포함된다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 현탁액에서 전달가능한 생식 요소를 생산하는 경향이 있고, 짧은, 구별되는, 얽히지 않은 균주("조밀한 성장")를 특징으로 하는 형태를 나타내고, 현탁액에서 배양되는 경우에 발효 배지의 액침 성장 및 감소된 점성을 특징으로 하는 표현형을 나타내는, 조사 및 화학-유발 돌연변이유발의 조합으로 얻어진Chrysosporium의 돌연변이체를 사용한다. 다른 구체예에서, 본 발명은Trichoderma의 형태적으로 유사한 돌연변이체를 사용한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은Aspergillus sojae또는Aspergillus niger의 표현형적으로 유사한 돌연변이체를 사용한다.
예를 들어, VKM F-3500 (균주 "C1")은 균주 UV 13-6 을 생산하도록 자외선에 그것을 놓음으로써 돌연변이되었다. 균주는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 더욱 돌연변이되어서 균주 NG7-19 를 생성한다. 나중의 균주는 교대로 자외선에 의한 돌연변이에 놓여서 균주 UV18-25 를 초래한다(VKM F-3631D). 돌연변이 과정동안, 형태 특징은 액체 배양물 또는 플레이트상에서 뿐만 아니라 현미경하에서 다소 다양화되었다. 각 일련의 돌연변이유발로, 배양물은 평평하고 매트한 콜로니 출현에 이를때까지, 플레이트상에서Chrysosporium의 특징으로 개시된 솜털 모양 및 펠트 출현을 덜 보였다. 어떤 배지에서 야생형 균주로 관찰된 브라운 염료는 돌연변이체 균주에서 덜 우세했다. 액체 배양물에서, 돌연변이체 UV18-25 는 야생형 균주 C1 및 돌연변이체 UV13-6 및 NG7C-19 보다 눈에 띄게 덜 점성이었다. 모든 균주가Chrysosporium의 총 미시적 특징을 유지한 반면에, 균사는 각 일련의 돌연변이 및 UV18-25 로 더욱 가늘어졌고, 균사체의 분명한 분열이 관찰될 수 있었다. 균사 분열은 UV18-25 의 배양물과 결합된 저점성의 원인인것 같다. 대기 포자형성에 대한 균주 능력은 각 돌연변이 단계와 함께 감소되었다. 이것은 균주가 종래의 분류(형태)정의로부터 편향을 나타내는 동안Chrysosporium속에 유전적으로 속할 수 있다는 것을 증명한다.
특히Chrysosporium의 아나모르프 형태는 본 발명에 따른 스크리닝 이용에 적합한 것으로 밝혀졌다. 아나모르프의 대사물질은 그것을 높은 발현 정도에 특히 적합하게 한다. 텔레오모르프는 아나모르프 및 텔레오모르프의 유전적 구성이 일치하는 때에 적합해야만 한다. 아나모르프 및 텔레오모르프간의 차이는 하나는 무성 상태이고 다른 것은 성 상태이고; 2 상태는 어떤 조건에서 서로 다른 형태를 나타내는 것이다.
다른 예는Aspergillus sojae의 유전적으로 설계된 돌연변이체 균주를 포함한다. 이러한 돌연변이체에서 특정 엔도프로테아제 코딩 유전자가 파괴되었다. 이것은 향상된 분지 및 짧은 균사를 나타내는 조밀한 성장 표형형, 및 액침 배양에서 미세펠렛의 형성을 초래하였다. 더욱이, 본원에 언급된Aspergillus sojae는 고산출량 스크리닝 시스템에의 사용에 특히 적합하게 하는 특정 액침 배양 조건하에서 효율적인 포자형성을 나타내도록 유도될 수 있다. 이 경우에, 전달가능한 생식 요소의 형성에 기여하는 조건은 단지 0.6 g/ml EDTA 를 함유하는 합성 배지로 구성되었다. 기여 조건은 숙주마다 다양할 것이나, 숙주가 적합한 것으로 발견된 경우라면 이미 공지될 것이다.
당업계에 알려진 비독성 및 비병인 진균 균주를 사용하는 것이 실험자에게 위험을 감소시키고 전체적인 스크리닝 과정을 단순화하기 때문에 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 진균은 외인성 단백질의 분해를 최소화하고/또는 프로테아제 생산의 억제를 용이하게 하기 위해서 프로테아제를 결실시킬 것이다. 발현 숙주로서 프로테아제 결실 균주의 사용은 돌연변이체의 스크리닝으로 사용될 수 있거나, 프로테아제 유전자는 US 특허 6,025,185 에서 Christensen 및 Hynes의 실시예에 개시된 대로, "녹 아웃"될 수 있거나 그렇지 않으며 당업계에 공지된 방법으로 불활성화될 수 있다(비기능 areA 유전자를 가지는Aspergillus oryzae).
Chrysosporium돌연변이체는 프로테아제의 발현을 감소시켜서 특히 단백질성 산물이 프로테아제 활성에 감도가 있는 경우에 그들을 단백질성 산물의 생산에 특히 적합하게 만든다. 그러므로, 본 발명은 예를 들어,C.lucknowense균주 C1(VKM F-3500 D)와 같은 비돌연변이체Chrysosporium균주보다 덜 프로테아제를 생산하는 돌연변이체Chrysosporium균주를 사용할 수 있다. 특히 이러한 균주의 프로테아제 활성(분비 융합 단백질을 절단할 의도의 어느 선택 프로테아제를 제외)은 C1 균주에 의해 생산된 양의 절반 미만, 더욱 바람직하게는 30 % 미만, 및 가장 바람직하게는 약 10 % 미만이다. 감소된 프로테아제 활성은 엷은 층 밀크 플레이트상에 형성된 할로를 측정하거나 소 혈청 알부민(BSA) 분해와 같은 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
숙주에 의한 분석에서 방해를 최소화하기 위해서, 셀룰라제 및 다른 많이 분비된 단백질을 코딩하는 것과 같은 숙주 사상균에서 다른 유전자를 불활성화하는것이 바람직할 수 있다. 분비된 단백질을 코딩하는 유전자는 결실 또는 돌연변이될 수 있거나, 택일적으로 유발 시스템 또는 원하지 않는 단백질의 발현에 관련된 다른 경로를 조절하는 유전자가 변형되어서 이러한 발현을 감소시킬 수 있다. 내인성 프로모터가 본 발명의 벡터에 사용되는 경우에, 같은 유발자의 조절하에 다른 단백질에 대한 유전자를 불활성화하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 프로테아제 분비의 억제에 적합한 진균은 프로테아제 발현이 프로테아제 생산을 최소화할 수 있도록 조작될 수 있는(예를 들어, 아미노산 농도) 환경 조건에 반응하는 조절 요소의 억제하에 있는 것이다.
바람직하게, 선택 숙주에서 고발현을 가능케하는 상동 발현-조절 영역은 벡터를 형질전환시키는데 사용된다.Trichoderma또는Aspergillus와 같은 이종 숙주로부터 유래된 고 발현 조절 영역은 당업계에 주지되고 사용될 수 있다. 실시예에 의해서, 대규모 양으로 발현되어 본 발명에 사용되기 위한 적당한 발현 조절 서열을 제공하는 공지된 단백질의 제한되지 않은 예는 히드로포빈, 프로테아제, 아밀라제, 크실라나제, 펙티나제, 에스테르아제, β-갈락토시다제, 셀룰라제(예를 들어, 엔도-글루카나제, 셀로비오히드롤라제) 및 폴리갈락투로나제이다.
발현 조절 영역은 발현될 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포한한다. 프로모터는 연결되어서 발현될 서열의 개시 코돈의 발현을 허용하도록 위치시킬 수 있다. 프로모터 서열은 구성적일 수 있으나, 바람직하게는 유발가능하다. 유발 프로모터 및 적당한 유발 배지의 사용은 프로모터에 조절가능하게 연결된 유전자의 발현을 선호한다. 상동 종, 또는 단백질의 발현을허용할 수 있는 이종 균주으로부터 어느 발현 조절 서열이 조사된다. 발현 조절 서열은 예를 들어,ascomycete조절 영역과 같은 진균 발현 조절 연역에 적합하다. 적당하게, 자낭균 발현 조절 영역은 하기의 속의 어느것으로부터 기원한 조절영역이다:Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Humicola, Neurospora, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Talaromyces, 또는Emericela및Hypocrea와 같은 그것의 택일적 성 형태.Trichoderma로부터의 셀로비오히드롤라제; 알코올 디히드로게나제 A, 알코올 디히드로게나제 R, 글루타메이트 디히드로게나제, TAKA 아밀라제, 글루코아밀라제, 및Aspergillus로부터의 글리세르알데히드 포스페이트 디히드로게나제 프로모터;Neurospora의 포스포글리세르에이트 및 교차-경로 조절 포로모터;Rhizomucor miehei의 리파제 및 아스파르트산 프로테인아제 프로모터;Penicillium canescens의 β-갈락토시다제 프로모터; 및 셀로비오히드롤라제, 엔도글루카나제, 크실라나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 A, 및Chrysosporium의 프로테아제 프로모터는 대표적인 예이다. 같은 속의 발현 조절 서열은 그것이 숙주에 특히 적합할 것 같기 때문에 바람직하다.
최대량으로 단백질을 발현하는Chrysosporium의 균주로부터의 자연 발현-조절 서열이 특히 바람직하다. 이러한 균주의 예는 모스코바의 All Russian Collection(VKM)기탁 기관의 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다. 야생형 C1 균주는 수탁번호 VKM F-3500 D, 기탁일 29-08-1996, C1 UV13-6 돌연변이체는 수탁번호 VKM F3632 D, 및 기탁일 02-09-1998, C1 NG7C-19 돌연변이체는 수탁번호 VKM F-3633 D 및 기탁일 02-09-1998, 및 C1 UV18-25 돌연변이체는 수탁번호 VKM F-3631 D및 기탁일 02-09-1998 을 가진다. 균주는 저점성 돌연변이체의 발생을 위한 원으로 바람직하고; 게다가 VKM F-3631 D 균주는 이미 필요한 저점성 표현형을 나타낸다. X-252 로 지정된, 저점성 돌연변이체Trichoderma균주를 교대로T.longibrachiatum의 QM 9414 균주(ATCC 26921)의 돌연변이에 의해 유래된Trichoderma longibrachiatum18.2 KK 의 2 순환의 조사후에 얻었다. 다른 구체예에서, 본 발명은Aspergillus sojae및Aspergillus niger의 표현형적으로 유사한 돌연변이체를 사용한다.
바람직하게, 숙주가Chrysosporium인 경우에,Chrysosporium프로모터 서열은 숙주에 의한 그것의 양호한 인식을 확실히 하기 위해서 사용된다. 어떤 이종 발현 조절 서열 역시 천연Chrysosporium서열과 같은 효율성으로Chrysosporium에서 작용한다. 이것은Chrysosporium의 형질전환에 사용될 주지된 구조체 및 벡터를 허용하고, 숙주에서 양호한 형질전환 및 발현 비율을 가능케하는 벡터를 제조할 많은 다른 가능성을 제공한다. 예를 들어, 표준Aspergillus형질전환 기법은 예를 들어, Christiansen et al. Bil/Technology 1988 6:1419-1422 에 개시된 대로 사용될 수 있다. US 특허 4,816,405, 5,198, 345, 5,503,991, 5, 364,770, 5,705,358, 5,728,547, 및 5,578,463, EP-B-215.594 (Trichoderma 용)과 같은Aspergillus형질전환 벡터의 상세한 설명을 제공하는 다른 문헌 및 그들의 목록은 참고문헌으로 수록된다. 셀룰라제의 최고 발현율이Chrysosporium균주에서 발견된 경우에, 셀룰라제 유전자의 발현 조절 영역이 특히 바람직하다.
본 발명의 벡터는 효소를 코딩하는 유전자, 바람직하게는 분비 효소로부터유래될 수 있다. 프로모터 서열을 얻은 적당한 효소의 예는 카르보히드레이트-분해 효소(예를 들어, 셀룰라제, 크실라나제, 만나나제, 만노시다제, 펙티나제, 글루코아밀라제, α-아밀라제와 같은 아밀라제, α-및 β-갈락토시다제, α-및 β-글루코시다제, β-글루카나제, 키티나제, 키타나제), 다른 히드롤라제(라파제, 에스테르아제, 피타제), 옥시도리덕타제(카탈라제, 글루코스-옥시다제) 및 트랜스퍼라제(트랜스글리코실라제, 트랜스글루타아미나제, 이소머라제 및 인버타제)이다.Chrysosporium lucknowense에서 기원한 몇몇의 예는 표 A 에 제시된다.
핵산 구조체는 발현될 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 바람직하게는Chrysosporium, 더욱 바람직하게는Chrysosporium lucknowense또는 그것의 유도체에서 기원한 핵산 발현 조절 영역을 포함한다. 특히 바람직한 핵산 구조체는 셀룰라제 또는 크실라나제 발현, 바람직하게는 셀로비오히드롤라제 발현, 가장 바람직하게는 표 A 에 개시된 55 kDa 셀로비오히드롤라제(CBH1) 의 발현과 관련된Chrysosporium에서 기원한 발현 조절 영역을 포함할 것이다. 추가적인 예로서, 히드로포빈, 프로테아제, 아밀라제, 크실라나제, 에스테르아제, 펙티나제, β-갈락토시다제, 셀룰라제(예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로비오히드롤라제) 및 폴리갈락투로나제의Chrysosporium프로모터 서열 역시 본 발명의 범위내로 여겨진다.
예를 들어, 표 A 에 개시된 발현 효소의 어느 프로모터 또는 조절 영역이 적당하게 사용될 수 있다. 이러한 프로모터 및 조절 영역의 핵산 서열은Chrysosporium균주로부터 쉽게 얻을 수 있다. 프로모터 서열이 결정될 수 있는 방법은 다양하고 당업계에 공지된다. 일반적으로 프로모터 서열은 관련 유전자의 개시에서 ATG 개시 코돈에 바로 앞에 선행하는 것으로 발견된다. 예를 들어, 프로모터 서열은 재조합 DNA 기법을 사용하고, 유전자 발현에서 이러한 결실의 효과를 검사함으로써 관련 유전자의 업스트림의 서열을 결실시킴으로써 확인될 수 있다. 또한 예를 들어, 프로모터 서열은 종종 컨센서스 프로모터 서열과 관련 유전자의 업스트림 영역의 서열을 비교함으로써 추론될 수 있다.
예를 들어, C1 엔도글루카나제의 프로모터 서열은 상응하는 유전자를 클로닝함으로써 본 방법(PCT/NL99/00618)에서 확인되었다. 본 발명에 따른 바람직한 프로모터는 55kDa 셀로비오히드롤라제(CBH), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 A, 및Chrysosporium의 33 kDa 크실라나제(XylF) 프로모터이고, 이 효소는 그들 자신의 프로모터로 높은 수준으로 발현되기 때문이다. 특히Chrysosporium lucknowense, 특히C.lucknowenseGARG27K 의 카르보히드레이트-분해 효소는 다른 진균 숙주 유기물에서 단백질의 발현 라이브러리에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 서열의 특정 구체예는Chrysosporium, Aspergillus및Trichoderma에 대해 공지된다.Chrysosporium용 프로모터가 PCT/NL99/00618 에 개시된다. 예를 들어, U.S. 특허 4,935,349; 5,198,349; 5,252,726; 5,705,358; 및 5,965,384 및 PCT 출원 WO 93/07277 과 같은 종래 기술은Aspergillus에 사용된 많은 발현 조절 영역을 제공한다.Trichoderma에서의 발현은 U.S. 특허 6,022,725 DP 개시된다. 이러한 특허의 목록은 본원에 참고문헌으로 일체로 수록된다.
히드로포빈 유전자는 발현율이 높은 진균 유전자이다. 그러므로, 바람직하게는Chrysosporium으로부터 유도된 히드로포빈 유전자는 본 발명의 적당한 구체예에서 발현 조절 서열로서 적당하게 적용될 수 있다. 히드로포빈에 대한Trichoderma reesei및Trichoderma harzianum유전자 서열은 예를 들어 종래기술에 개시될 뿐만 아니라Aspergillus fumigatus및Aspergillus nidulans에 대한 유전자 서열 및 관련 서열 정보는 참고문헌으로 본원에 수록된다(Nakari-Setala et al., Eur. J. Biochem. 1996, 235:248-255; Parta et al., Infect. Immun. 1994 62:4389-4395; Munoz et al., Curr. Genet. 1997,32:225-230; 및 Stringer et al., Mol.Microbiol. 1995 16:33-44). 서열정보를 사용하여 당업자는 상기에 제시된 것과 같은 표준 기법을 사용하여 적당한 실험으로Chrysosporium히드로포빈 유전자의 발현 조절 서열을 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 재조합Chrysosporium균주는 이종 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 히드로포빈-조절 영역을 포함할 수 있다.
발현 조절 서열 역시 추가적으로 인핸서 또는 사일렌서를 포함한다. 이것은 종래 기술에 공지되고 일반적으로 프로모터로부터 어느 정도 먼 거리에 위치한다. 발현 조절 서열 역시 액티베이터 결합 부위 및 리프레서 결합 부위를 가지는 프로모터를 포함할 수 있다. 어떤 경우에 이러한 부위 역시 이러한 형태의 조절을 제거하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, creA 부위가 존재하는 사상균 프로모터가 개시되었다. creA 부위는 creA 의 존재로부터 일반적으로 초래되는 글루코스 억제가 제거된다는 것을 확실히 하도록 돌연변이 될 수 있다. 이러한 프로모터의 사용은 글루코스의 존재에서 프로모터에 의해 조절된 핵산 서열로 코딩된 단백질 라이브러리의 생산을 가능케한다. 방법은 WO 94/13820 및 WO 97/09438 에 예증된다. 이러한 프로모터는 그들의 creA 부위의 존재 또는 부재로 사용될 수 있다. creA 부위가 돌연변이된 돌연변이체는 본 발명에 따른 재조합 균주에서 발현 조절 서열로서 사용될 수 있고, 그것이 조절하는 핵산 서열의 라이브러리는 글루코스의 존재하에서 발현될 수 있다. 이러한Chrysosporium프로모터는 WO 97/09438 에 예시된 것에 유사한 방식으로 탈억제를 확실히 한다. creA 부위의 확인은 종래 기술로 공지된다. 택일적으로, 예를 들어, creA 유전자 그자체에서 리프레션 시스템의 어디에서도 돌연변이를 가지는 숙주 균주에서 돌연변이되지 않았던 creA 결합 부위를 가지는 프로모터에 적용하는 것이 가능하여, 균주는 creA 결합 부위의 존재에도 불구하고 글루코스의 존재에서 단백질 라이브러리를 생산할 수 있다.
종결자 서열 역시 발현 조절 서열이고 이것은 발현될 서열의 3'말단에 작동가능하게 연결된다. 다양한 공지된 진균 종결자는 본 발명의 숙주 균주에서 기능하는 것 같다. 예는A.nidulanstrpC 종결자,A.nigerα-글리코시다제 종결자,A.niger글루코아밀라제 종결자, Mucor miehei 카르복실 프로테아제 종결자(US 5,578,463 참조), 및Trichoderma reesei셀로비오히드롤라제 종결자이다.Chrysosporium종결자 서열, 예컨대 EG6 종결자는Chrysosporium에서 역시 기능할 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 적당한 형질전환 벡터는 선택적으로 신호 서열을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 발현될 외인성 핵산 서열을 가질 것이다. 발현될 단백질의 아미노산 서열에 작동가능하게 연결될 경우에, 신호 서열은 숙주 생물로부터 단백질의 분비를 가능케 하는 아미노산 서열이다. 이러한 신호 서열은 이종 단백질과 관련될 것이거나 숙주에 천연적인 것일 수 있다. 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열은 신호 서열 및 이종 단백질의 번역을 허용하도록 프레임내에위치해야만 한다. 본 발명이 사용되는 경우에 신호 서열은 특히 특정 분자 진화와 결합하고, 단일, 분비 외인성 단백질로 진화되는 것이 바람직할 것이다.
라이브러리를 발현하도록 사용될 벡터에서 신호 서열을 포함하는 것은 이것이 관심있는 단백질의 발현 가능성을 감소시킬 것이므로 덜 유리할 것이라는 것이 이해될 것이다. 무작위 절단 DNA 로 제조되고 벡터에 클로닝된 게놈 라이브러리에서, 신호 서열에 대한 라이브러리에서 프레임으로 유전자의 융합을 얻을 가능성은 낮다. 또한, 프레임으로 융합이 얻어진 경우에도, 선택된 신호 서열은 모든 유전자와 함께 작동가능할 수 없다. 이러한 이유 때문에, 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 경우에 신호 서열을 사용하지 않고, 세포내 외인성 단백질의 활성 또는 존재를 스크리닝하는 것이 바람직할 수있다. 세포내 단백질의 활성 또는 존재의 분석은 진균 세포를 원형질체로 전환하고, 용균하는 효소로 형질전환체 라이브러리를 선처리함으로써 이룰수 있다. 과정은 van Zeyl et al., J.Biotechnol.59:221-224(1997) 에 개시되었다. 과정을 마이크로타이터 플레이트에서 배양된Chrysosporium형질전환체로부터 콜로니 PCR을 허용하는Chrysosporium에 적용되었다.
Chrysosporium균주로부터 단백질의 분비를 허용할 수 있는 어는 신호 서열이 조사된다. 이러한 신호 서열은 바람직하게는 진균 신호 서열, 더욱 바람직하게는Ascomycete신호 서열이다. 적당한 신호 서열은 일반적으로 진핵생물, 바람직하게는 효모 또는 하기의 진균 속으로부터 유도될 수 있다:Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula,Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces또는Emericella및Hypocrea와 같은 그것의 택일적인 자웅 형태. 특히 유용한 신호 서열은 셀로비오히드롤라제, 엔도글루카나제, β-갈락토시다제, 크실라나제, 펙티나제, 에스테르아제, 히드로포빈, 프로테아제 또는 아밀라제와 천연적으로 연결된 것이다. 예는Aspergillus또는Humicola의 아밀라제 또는 글루코아밀라제,Aspergillus oryzae의 TAKA 아밀라제,Aspergillus niger의 α-아밀라제, Mucor의 카르복실 펩티다제(US 5,578,463),Rhizomucor miehei의 리파제 또는 프로테인아제,Trichoderma의 셀로비오히드롤라제,Chrysosporium의Penicillium canescensCBH 의 β-갈락토시다제, 및Saccharomyces의 α메이팅 인자이다.
택일적으로 신호 서열은Bacillus균주의 아밀라제 또는 서브틸리신 유전자로부터 유래할 수 있다. 숙주 균주로서 같은 속의 신호 서열은 그것이 특정 숙주에 특히 가장 적합할 것 같기 때문에 가장 적당하므로;Chrysosporium lucknowense가 숙주인 경우에, 신호 서열은 바람직하게는Chrysosporium이다.Chrysosporium균주 C1, UV 13-6, NG7C-19 및 UV18-25 는 최대 많은 양의 단백질을 분비하고, 이러한 균주로부터의 신호 서열은 특히 관심있는 것이다. 사상균 및 효모의 신호 서열뿐만 아니라 비진균 원의 신호 서열이 사용될 수 있다.
본 발명의 어느 구체예에 따른 형질전환된 재조합 숙주 진균은 선택 마커를 더 포함할 수 있다. 이러한 선택 마커는 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포의 선택을 허용한다. 선택 마커는 종종 비형질전환된 균주에 외인성 특정 형태의 내성을 제공하는 유전자 산물을 코딩한다. 이것은 일반적으로 중금속, 항생제 또는 살충제에 내성일 수 있다. 영양요구성 마커는 숙주 세포에서 영양소 결핍을 유발하고, 이러한 결핍을 수정하는 유전자가 선택에 사용될 수 있다. 통상 사용되는 내성 및 영양소요구성 마커의 에는 amdS (아세타미다제), hph(히그로마이신 포스포트랜스퍼라제), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실라제), 및 pyrE(오르테이트 P-리보실 트랜스퍼라제, trpC(안트라닐레이트 합성효소), argB(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제), sC(술페이트 아데닐트랜스퍼라제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제), niaD(니트레이트 환원효소), Sh-ble(브레오마이신-프레오마이신 내성), 돌연변이체 아세토락테이트 합성효소(술포닐우레아 내성), 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(아미노글리코사이드 내성)이다. Chrysosporium 의 바람직한 선택 마커는 오로테이트 P-리보실 트랜스퍼라제이다. 선택 마커가 별개의 벡터에 있거나 선택 마커가 이종 단백질에 대한 단백질-코딩 서열로서 같은 핵산 단편에 있는 경우에 동시형질전환으로 선택할 수 있다.
형질전환 빈도의 더 이상의 향상은 예를 들어,Aspergillus niger에 사용되는 AMA1 복제 서열을 사용하여 얻을 수 있다(Verdoes et al., Gene 146:159-165(1994)). 서열은 많은 다른 사상균에서 10 내지 100 배의 형질전환 빈도의 증가를 초래한다. 더욱이, 도입된 DNA 는 진균 게놈에의 통합없이 다수 카피 형태로 진균 세포에서 자율적으로 보유된다. 이것은 본 발명의 고산출량 스크리닝 방법에 유리할 것으로 기대되는데, 비통합 상태는 서로다른 형질전환체간의 유전자 발현 수준의 다양성을 감소시키기 때문이다. 더욱이, 도입된 DNA 가 숙주 DNA 에 재결합되지 않기 때문에, 원하지 않는 돌연변이가 숙주에서 발생하지 않을 것이다. 외인성유전자 발현의 단일형태 수준은 AMA1 과 같은 자가 복제 벡터를 사용하여 얻을 수 있거나, 택일적으로 진균에서 자가 복제는 말단 서열로 촉진될 수 있다(A.Aleksenko 및 L.Ivanova, Mol. Gen. Genet 1998 260:159-164 참조).
본원에 사용될 때, 용어 "이종 단백질"은 본 발명에 따른 발현에 사용된 숙주 균주에 의해 일반적으로 발현 또는 분비되지 않는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 이종 단백질은 원핵생물 기원일 수 있거나, 또는 진균, 식물, 곤충, 또는 포유동물과 같은 고등 동물로부터 유래될 수 있다. 제약학적 스크리닝 목적을 위해서 사람 단백질에 대한 빈번한 선호도가 있을 것이어서, 바람직한 구체예는 사람기원의 DNA 라이브러리인 숙주일 것이다. 그러므로, 이러한 구체예는 또한 본 발명의 적당한 실시예로 여겨진다.
게놈 사람 DNA 라이브러리로부터 유래된 본 발명의 사상균에서 사람 유전자 라이브러리의 발현은 몇 가지 이유에서 효율적으로 기대된다. 현재 사람 유전자의 평균 크기는 3,000-5,000 bp 이고, 사람 인트론 평균은 약 75 bp 내지 150 bp(총 범위 40-＞50,000)로 공지된다. 사상균은 40-75bp 의 인트론을 가지지만, 길이 500 bp 의 인트론을 다룰 수 없다. 평균적으로, 사람 유전자는 유전자당 3-5 인트론을 운반한다(M.Deutsch, M.Long, Nucl.Acids Res. 1999 27:3219-3228; 표 B). 사람 신호 서열은 또한 사상균에서 기능하는 것으로 공지된다. 이러한 이유로, 많은 사람 유전자가 본 발명의 방법으로 발현 및 스크리닝될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 방법은 원핵생물 및 진핵생물 게놈으로부터 유래된 DNA 라이브러리의 발현에 유용하다는 것이 기대된다. 상기에 개시된 대로, 방법은 최대 많은 유전자 및 단백질에의 용이한 접근을 허용하면서 분비 및 세포내 단백질의 발현 및 발견이 가능할 수 있다.
본 발명의 더 이상의 양태는 진균 돌연변이체 라이브러리의 제조 및 스크리닝을 포함하고, 진균 돌연변이체 라이브러리는 본원에 개시된 방법으로 제조되었다. 라이브러리는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 통합 또는 비통합 형질전환으로 본 발명에 따른 진균 숙주의 형질전환에 의해서 얻을 수 있다. 바람직한 숙주 균주상에 기초한 진균 라이브러리는 최소화 및/또는 고산출량 포맷 스크리닝에서 외인성 단백질의 바람직한 성질 또는 활성에 대하여 조작되고 스크리닝될 수 있다. 관심있는 성질 또는 활성은 물리적, 물리화학적, 화학적, 생물학적, 또는 촉매 성질, 또는 라이브러리 요소의 외인성 단백질로 관련된 이러한 성질의 어느 개선, 증가 또는 감소를 의미한다. 라이브러리는 또한 외인성 및/또는 내인성 단백질의 결과로서 생산된 대사물질, 또는 대사물질과 관련된 성질 또는 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 라이브러리는 또한 이러한 단백질 또는 대사물질의 증가 또는 감소된 양을 생산하는 군류에 대하여 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 형질전환된 진균의 라이브러리는 바람직한 성질을 가지는 진균 대사물질의 존재에 대하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 대상물질의 예는 폴리케티드, 알카로이드, 및 테르펜노이드 천연 산물을 포함한다. 다수의 유전자 또는 유전자 더미(오페론)은 본 발명의 숙주 세포에 트랜스팩션될 수 있고, 그 다음, 코딩된 효소의 작용으로 생산된 비단백질 산물은 숙주 세포에서 생산될 것이라는 것이 기대된다. 예를 들어, 로바스타틴의 생산에 필요한 단백질을 코딩하는 DNA 는Aspergillus oryzae에 트랜스팩션될 수 있다는 것이 보여졌다(U.S. 특허 5,362,638; 또한 U.S. 특허 5,849,541 참조).
본 발명의 다른 구체예에서, 형질전환된 진균의 라이브러리는 관심있는 핵산 프로브에 혼성화할 수 있는 DNA 존재에 대하여 스크리닝될 수 있다. 구체예에서, 외인성 단백질의 발현 및/또는 분비는 그것이 여전히 바람직할 것이지만 필수적이지는 않다. 단백질 발현이 요구되지 않는 경우에, 조절 서열은 벡터에 필요하지 안은 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 형질전환된 진균의 라이브러리는 예를 들어, 물리적 또는 화학적 극한에 대한 내성, 또는 관심있는 물질을 생산, 변형, 분해 또는 대사할 수 있는 능력과 같은 진균 그자체의 바람직한 성질에 대하여 스크리닝될 수있다. 이러한 바람직한 성질은 단일 외인성 단백질의 존재에 기인할 수 있거나그렇지 않을 수 있다. 관련 진화 과정의 일부로서 사용된 경우에 구체예가 특히 유용할 것이다.
이종 DNA 는 당업계에 공지된 방법으로 생물 표본으로부터 제조된 게놈 DNA, 또는 cDNA 일 수 있다. 생물 표본은 환경 샘플(예를 들어, 토양, 퇴적물, 산림 한계, 해수 또는 담수), 또는 추출된, 여과된, 또는 원심분리 또는 그렇지 않으면 그로부터 농축된 샘플일 수 있다. 환경 샘플로부터 유래된 혼합된 미생물 배양물 역시 사용될 수 있다. 생물 샘플은 또는 배양된 미생물, 또는 식물, 곤충, 또는 포유동물과 같은 다른 동물과 같은 생물의 단일 표본으로부터 유도될 수 있다. 게다가, 이종 DNA 는 합성 또는 반합성, 예를 들어, 무작위 DAN 서열 또는 서플링, 돌연변이, 또는 달리 변형된 자연-발생 절편을 포함하는 DNA 일 수 있다. 반합성 핵산 라이브러리의 예는 Wagner et al., WO 00.0632 에서 발견된다. 환경 샘플로부터의(또는 그로부터 유래된 혼합 배양물) DNA 는 (1) 적당한 벡터가 더욱 합리적으로 선택될 수 있고, (2) 실행자는 관심있는 단백질이 확인된다면 더이상의 스크리닝을 위해 관련 또는 유사한 종에 특정할 것이다라는 점에서 잇점이 있을 것이다.
종래의 진균 숙주에 비하여, 형질전환, 발현 및 분비 비율은 조밀한 균사체 형태의 균주 UV18-25 를 나타내는Chrysosporium균주를 사용하는 경우에 더욱 높다. 그러므로, 본 발명에 따른 재조합 균주는 바람직하게는 이러한 형태를 나타낼 것이다. 그러나, 본 발명은 또는 비재조합 균주 또는 이러한 성질을 나타내는 진균의 유전자 설계된 균주를 포함할 것이다. 본 발명의 흥미로운 구체예는 균주 NG7C-19의 점성이하, 바람직하게는 상응 또는 동일 배양 조건에서 UV18-25 의 점성 이하의 점성을 나타내는 재조합Chrysosporium균주를 사용할 것이다. UV18-25 의 배양물의 점성이 발효의 중반 내지 말기 단계동안 최적의 배양 조건에서 이미 공지된Trichoderma reesei의 범위 200-600 cP 와 대조되고, 종래의Aspergillus niger의 범위 1500-2000 cP 의 점성을 가지는 10 cP 미만이라는 것을 결정했다. 따라서, 본 발명은ChrysosporiumUV18-25(VKM F-3631D)균주,TrichodermaX 252 균주, 또는A.sojaepclA(ATCC11906 으로부터 유래) 또는A.nigerpclA 와 같은 저점성 특징을 나타내는 어는 유전적으로 설계되거나 돌연변이체 사상균을 사용할 수 있다.
사상균 배양물의 유동성은 거의 고체 내지 자유-유동 액체로 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 점성은 Brookfield 와동 점성계, 운동 점성 튜브의 사용, 떨어지는 볼 점성계 또는 컵 형태의 점성계에 의해 쉽게 정량화될 수 있다. 발효 육즙은 비-Newtonian 유동이고, 명백한 점성은 어느 정도 절단율에 의존할 것이다(Goudar et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.1999 51:310-315). 그러나, 효과는 본 발명에 사용된 저점성 배양물에 대하여 훨씬 덜 분명할 것이다.
본 발명의 방법에 따른 발현 라이브러리의 스크리닝에서 이러한 저점성 배양물의 사용은 훨씬 유리하다. 사상균에서 발현된 DNA 라이브러리의 스크리능은 상대적으로 느리고 수고스러운 방법에 제한되었다. 일반적으로, 일단 진균이 형질전환되었다면(그리고 형질전환체가 선택적으로 선택되었다면), 형질전환된 진균의 라이브러리를 개개의 생물 또는 생식 요소에 분산시키기 위해서 포자 또는 분생자를 준비하거나 기계적으로 균사체를 파괴하는 것이 필요했다. 분산이 요구되므로 각각의 생물은 클론 콜리니 또는 배양물로 배양될 수 있다. 그 다음, 포자, 분생자, 또는균사체 단편은 표준 배양 디쉬에서 희석되고 "플레이팅 아웃"되고, 개개의 콜로니는 색상, 물질에 대한 변경, 또는 찾아진 단백질 활성 또는 성질의 존재의 검출가능한 지표에 대하여 조사된다. 다른 접근법에서, 분비된 단백질은 멤브레인상의 콜로니로부터 블럿팅되고, 멤브레인은 관심있는 단백질 활성 또는 성질의 존재의 지표에 대하여 프로브되거나 검사된다. 멤브레인의 사용은 외인성 단백질의 단백질가수분해가 문제되는 경우에 유용성을 증명했다(Asgeirsdottir et al., Appl.Environ.Microbiol. 1999, 65:2250-2252). 이러한 과정은 노동-집중적이고, 자동화가 가능하지 않은 것으로 증명되었고, 결과적으로 진균-발현 단백질의 고산출량 스크리닝은 종래의 사상균으로 이루어지지 않았다. 이러한 개시의 목적을 위해서, 고산출량 스크리능은 일일당 1000 이상의 형질전환체에 의해 발현된 단백질을 평가할 수 있고, 특히 일일당 5,000 이상의 형질전환체를 평가할 수 있는 방법, 및 가장 구체적으로는 일일당 10,000 이상의 형질전환체를 평가할 수 있는 어느 부분적 또는 전-자동화 스크리닝 방법을 말한다.
따라서, 본 발명에 따른 형질전환된 진균 라이브러리의 자동화 고산출량 스크리능은 많은 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 박테리아 또는 효모에 이용가능한 것으로 공지된 방법은 일반적으로 본 발명의 저점도 진균에 적용될 수 있다. 이것은 사용된 돌연변이체 진균의 균사의 상대적으로 얽히지 않은 형태의 결과로서 저점성 표현형과 조합하여 전달가능한 생식 요소의 존재로 가능해진다. 본질적으로, 돌연변이체 진균 및/또는 그들의 전달가능한 생식 요소는 자동화 고산출량 스크리닝에 관련된 기계적 조작동안 개개의 박테리아 또는 효모와 아주 유사하게 행동한다. 이것은 야생형 진균, 및 서로의 개개의 생물의 용이한 분리를 허용하지 않는 매우 얽힌 균사를 생산하는 산업상 가장 적합한 진균에도 대조된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 형질전환된 진균이 희석 현탁액은 기계적 미세피펫으로 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 앨리쿼트될 수 있다. 384- 또는 1536-웰 마이크로플레이트에 피펫팅할 수 있는 액체 -조작 장치 역시 마이크로플레이트에 생물의 자동화 분산에 적용될 수 있다는 것이 기대된다. 현탁 생물의 농도는 웰당 생물의 평균 수 (또는 다른 전달가능한 생식 요소)를 조절하기에 바람직하게 조절될 수 있다. 다수의 개개의 생물이 웰에 앨리쿼트되는 경우에 바람직한 단백질 활성 또는 성질의 확인은 웰의 내용물의 희석 및 존재하는 생물을 개개의 클론 콜로니 또는 배양물로 배양하는 것에 의할 것이다는 것이 이해될 것이다. 이러한 방식으로, 시스템의 산출량은 "최고"에 존재하는 각 웰의 내용물의 연속적인 용해에 대한 요구를 댓가로 증가될 수 있다.
택일적인 구체예에서, 세포 분류기는 생물 또는 검출자 세포에서 다른 전달가능한 생식 요소의 검출에 기초하여 마이크로플레이트의 웰에 배양물의 유동을 지시할 수 있는 유동 경로에 개재될 수 있다. 구체예는 웰당 1 생물의 합리적으로 정확한 분배를 허용한다. 형질전환체를 확인하기 위한 그린 형광 단백질과 같은 선택적으로 검출가능한 마커의 사용은 본 구체예에 특히 유용하고, 이것은 형광-활성 세포 분류기에 의한 형질전환체의 자동화 선택을 허용하기 때문이다.
또 다른 구체예에서, 고체 배지에서 자라는 콜로니는 로봇식 콜로니 집게로 집을 수 있고, 생물은 로봇으로 마이크로타이터 플레이트의 웰에 전달될 수 있다.웰-분리 콜리니는 각 웰에서 단일 클론을 유발할 것이다.
그 다음, 분산된 생물은 마이크로플레이트 웰에서 클론 배양물로 배양되도록 허용된다. 유발자, 영양제등은 자동화 유체 분산 시스템에 의해서 원하는 대로 첨가될 수 있다. 시스템은 또한 관심있는 단백질 활성 또는 성질의 검출을 가능하게 하도록 요구된 어떤 시약을 첨가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 색상 또는 형광생성 물질은 효소 활성의 분광 또는 형광 검출을 허용하도록 첨가될 수 있다. 마이크로플레이트의 웰에서 배양물의 저점성 및 액침 성장 습성은 배양물로의 이러한 시약의 빠른 분산을 허용하여, 분석의 감도 및 신뢰성을 크게 증가시킨다. 산소 및 영양제의 분산 역시 크게 증가하여 외인성 펩티드의 빠른 성장 및 최대 발현 및 분비를 촉진한다. 신틸레이션 근접 분석과 같은 어떤 분석은 가용성 성분의 분산에 의존하여 평형 상태에 도달하고; 본 발명의 진균 배양물의 저점성 역시 이러한 고산출량 분석을 가능케 한다. 최종적으로, 고자동화 시스템에서, 마이크로타이터 플레이트에서 웰로부터 관심있는 클론 배양물을 자동적으로 집고, 흡출하거나, 피펫팅하는 것이 바라직할 것이고, 배양물의 저점성 및 액침 성장 습성이 이것을 가능케 할 것이다. 상기 모든 작동은 종래의 사상균 배양물, 특히 마이크로타이터 플레이트 웰의 비교반, 무절단 상태에서 표면 매트일때 자라는 배양물의 점성라면 어렵거나 불가능할 것이다.
다른 구체예에서, 단일 세포는 미세유동 장치를 통과할 것이고, 관심있는 성질 또는 활성은 시각적으로 검출된다(Wada et al., WO 99.67639). 저점성은 미세유동 장치의 작동에 필수적이고, 본 발명의 저점성 돌연변이체 진균의 배양은 미세유동 조작에 용이할 것이 기대된다. Short et al., US 특허 6,174,673 은 이러한 활성을 발현하는 세포가 형광 활성 세포 분류기로 분리될 수 있는 방식을 개시했다. 본 발명의 방법은 발현된 단백질의 확인 방법과 양립가능하다.
형질전환체가 형광 단백질을 마커로서 운반하는 구체예에서, 형광은 정량화될 수 있고, 유전자 발현 및/또는 허용된 배양물에서 발현된 단백질 양을 측정할 때 사용될 수 있다. 구체예에서, Blyna et al., WO 00/78997 에 개시된대로 관심있는 외인성 단백질을 검출하는 것뿐만 아니라 단백질의 특정 활성을 평가하는 것이 가능하다. 구체예는 특히 본 발명의 스크리닝 방법이 검출 진화 과정의 일부로서 사용된 경우에 바람직하다.
더 높은 점성이 허용되는 경우에, US 특허 6,046,021 의 Bochner 에 개시된 대로, 겔 형성 매트릭스는 마이크로플레이트 포맷에서 진균를 배양하고, 생화학 분석을 수행하는 경우에 어떤 잇점을 제공한다.
또다른 부류의 고산출량 스크리닝은 고체 기질상에서 자라는 많은 개개의 콜로니의 디지털 영상화 분광계로 측광 분석하는 것이다. 예를 들어, Youvan et al., 1994, Meth. Enzymol 246:732-748 참조. 본 방법에서, 특정화된 시약의 전체적인 흡수 또는 발산의 변화는 관심있는 이종 단백질 활성 또는 성질 존재의 지표이다.저점성 돌연변이체의 사용에 참여한 개개 생물의 용이한 분산은 본 방법에서 사상균의 사용을 가능케 한다. 고체 배지에서 측면 성장을 덜 나타내고, 반반하고, 조밀하고, 윤곽이 꽤 뚜렷한 콜로니를 나타내는 본 발명의 돌연변이체 진균의 콜리니 경향성은 또한 이러한 스크리닝 시스템에 유리하다. 더욱이, 박테리아에 비하여 진균의 우수한 발현 및 분비 특징은 스펙트럼 분석을 위한 단백질의 더 많은 양을 제공한다.
자동화 미생물 조작 수단은 일본 특허출원번호 11-304666 에 개시된다. 장치는 개개의 세포를 함유하는 미세액적의 전달을 가능케하고, 형태적 관점에서 본 발명의 진균 균주는 본 장치로 개개의 클론의 미세조작을 용이하게 할 것이라는 것이 기대된다.
자동화 미생물 고산출량 스크리닝 시스템은 Beydon et al., J.Biomol. Screening 5:13-21(2000) 에 개시된다. 로봇 시스템은 한천 플레이트에 400 nl 의 부피로 액적을 전달할 수 있고, 시간당 10,000 스크리닝 포인트를 프로세싱할 수 있고, 효모 2-하이브리드 스크리닝에 사용되었다. 본 발명의 진균 숙주가 이러한 형태의 시스템을 가지고 효모를 고산출량 스크리닝을 할때 적용될 수 있다는 것이 이해된다.
마이크로타이터 플레이트에 택일적으로, 형질전환체는 미세콜로니 형태로 플레이트상에서 배양될 수 있고, WO 00.78997 에 개시된 대로 시각적으로 분석될 수 있다.
고산출량 스크리닝의 진화는 일반적으로 Jayawickreme 및 Kost, Curr. Opin. Biotechnol. 8:629-634(1997)에 개시된다. 좀처럼 전사되지 않고 서로 다르게 발현된 유전자의 고산출량 스크린은 von Stein et al., Nucleic Acids Res. 35:2598-2603(1997) 에 개시된다.
Chrysosporium균주 UV18-25 및Trichoderma균주 x 252 는 본 발명의 다양한 양태를 아주 잘 예시한다. 그러나, 본 발명은 현탁액에서 전달가능한 생식 요소를 생산하고 배양물에서 저점성을 나타내는 사상균의 다른 돌연변이체 또는 달리 유전적으로 설계된 균주를 사용할 수 있다. 진균의 특정 형태가 중요하지 않을 수 있고; 본 발명은 유사하고 긴 균사 분지와 같은 다른 형태가 감소된 점성을 유발할 수 있다는 것을 제외하고는 2 균주에서 짧은, 얽히지 않은 균사체를 관찰할 수 있었다. 본 발명에 따른 진균 균주는 그들이 중성 pH 및 온도 25-43℃ 의 조건에서 최적의 성장을 나타낸다면 바람직하다. 이러한 스크리닝 조건은 특히 산성 pH 에서 분해 또는 불활성에 놓인 외인성 단백질의 활성을 유지하는데 유리하다. 대부분의 포유동물 단백질, 및 특히 사람의 단백질은 생리 pH 및 온도에서 기능하도록 진화되었고, 사람 효소의 정상 활성에 대한 스크리닝은 이러한 조건에서 가장 잘 수행된다. 치료적 사용을 위한 단백질은 이러한 조건에서 기능할 것이고, 이것은 또한 바람직한 스크리닝 조건을 만든다.Chrysospoirum균주는 정확하게 이러한 성질을 나타내고, 중성 pH 및 35-40℃에서 잘 배양되는 반면에, 다른 일반적으로 사용된 진균 숙주 종(예를 들어,Aspergillus및Trichoderma)는 산성 pH 에서 잘 자라고, 본 이유에 덜 적합할 수 있다.
본 발명의 방법의 다른 이용분야는 "특정 진화"의 과정이고, 신규한 단백질-코딩 DNA 서열이 생산되고, 코딩된 단백질은 숙주 세포에서 발현되고, 원하는 특징을 나타내는 단백질을 코딩하는 그러한 서열이 선택, 돌연변이, 및 재발현된다. 과정은 많은 순환동안 반복되어서 원하는 특징을 가지는 단백질이 얻어진다. 유전자 셔플링, 단백질 엔지니어링, 에러-프로운 PCR, 부위 특이적 돌연변이유발, 및 조합및 무작위 돌연변이유발은 외인성 단백질을 코딩하는 신규한 DNA 서열이 생성될 수 있는 과정의 예이다. U.S. 특허 5,223,409, 5,780,279 및 5,770,356 은 진화 방향의 교시를 제공한다. Kuchner 및 Arnold, Trends in Biotechonlogy, 15:523-530(1997); Schmidt-Dannert 및 Aarnold, Trends in Biotech., 17:135-136(1999); Arnold 및 Volkov, Curr.Opin.Chem. Biol., 3:54-59(1999); Zhao et al., Manual of Industrial Microbiology and Biotechnololy, 2ndEd., (Demain and Davies, eds.) pp 597-604, ASM Press, Washington DC, 1999;Arnold and Wintrode, Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, 및 Bioseparation, (Flickinger and Drew, eds.)pp.971-987, John Wiley & Sons, New York, 1999; 및 Minshull 및 Stemmer, Curr. Opin. Chem. Bion. 3:284-290 참조.
조합 돌연변이유발의 이용은 Hu et al., Biochemistry 1998 37:10006-10015 에 개시된다. US 5,763,192는 합성 서열을 확률적으로 발생시키고, 숙주 세포에 그것들을 도입하고, 원하는 특징을 갖는 숙주 세포를 선택함에 의한, 신규한 단백질-코딩 DNA 서열을 얻기 위한 과정을 설명한다. 인공 유전자 재조합(DNA 셔플링)을 행하는 방법은 무작위 프라이밍 재조합(Z. Shao, et al., Nucleic Acids Res., 26:681-683 (1998)), 엇갈린 확장 방법(H. Zhao et al., Nature Biotech., 16:258-262 (1998)), 및 이종 재조합(A. Volkov et al., Nucleic Acids Res., 27:218 (1999))을 포함한다. 에러 경향이 있는 PCR이 또 다른 접근법이다(Song and Rhee, Appl. Environ. Microbiol. 66:890-894 (2000)).
특정 진화 과정에서 선택 단계를 수행하는 두가지의 광범위하게 실행되는 방법이 있다. 한 방법은, 관심있는 단백질 활성이 숙주 세포의 생존에 다소 본질적이다. 예를 들어, 원하는 활성이 pH 8에서의 셀룰라제 활성이라면, 셀룰라제 유전자는 돌연변이되어 숙주 세포안에 도입될 수 있다. 형질전환체는 유일한 탄소 공급원으로서 셀룰라제를 사용하여 성장하고, 극히 소수의 생존체가 남을 때까지 pH가 점진적으로 증가된다. 아마 상대적으로 높은 pH에서 셀룰라제 활성을 코딩하는 생존체로부터의 돌연변이 셀룰라제 유전자는 또 다른 라운드의 돌연변이가 행해지고, 이 과정이 pH 8의 셀룰로스에서도 잘 성장할 수 있는 형질전환체가 얻어질 때까지 반복된다. 효소의 열안정성 변이체가 유전자 돌연변이 및 숙주 세포의 고온 배양의 사이클에 의해 마찬가지로 진화될 수 있다(Liao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986 83:576-580; Giver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 95:12809-12813). 이런 사용을 위하여, 외인성 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 돌연변이가 특정 진화를 위해 사용된 몇가지 방법 중 어느 것에 의해, 예를 들어 유전자 셔플링, 생체내 재조합, 또는 카세트 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다.
이런 방법의 주요 이점은 "가장 알맞은 것의 생존" 선택 단계의 대량 병행 성질이다. 백만 또는 십억의 실패한 돌연변이가 그것들을 개별적으로 평가할 필요 없이 고찰로부터 동시에 제거된다. 그러나, 숙주의 생존에 관심있는 효소 활성을 연결하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 예를 들어, 원하는 단백질 특성이 관심있는 표적에 대한 선택적 결합인 경우, 생존에 본질적인 결합 특성을 만드는 것은 어려운 것 같다. 또한, 고온 또는 극단의 pH와 같은 강요된 조건하의 생존은 복합적인 인자에 좌우되는 것 같으며, 숙주 세포가 돌연변이 단백질의 특성과 관련되지 않은 이유때문에 생존할 수 없다면, 바람직한 돌연변이는 선택되지 않고 손실될 것이다.
대량 병행 "가장 알맞은 것의 생존" 접근법의 대안은 연속 스크리닝이다. 이 접근법에서, 개개의 형질전환체는 인디케이터 배지상에서 성장한 콜로니 주변의 깨끗하거나 또는 착색된 구역의 관찰, 비색계 또는 형광계 효소 분석, 면역분석, 결합 분석 등과 같은 전통적 방법에 의해 스크리닝된다. 예를 들어, Joo et al., Nature 399:670-673 (1999), 이 경우 공통인자로서 NADH를 필요로 하지 않는 시토크롬 P450 모노옥시게나제가 돌연변이 및 스크리닝의 사이클에 의해 진화되었다; May et al., Nature Biotech. 18:317-320 (2000), 이 경우 역입체선택성의 히단토이나제가 유사한 방식으로 진화되었다; Miyazaki et al., J. Mol. Biol. 297:1015-1026 (2000), 이 경우 열안정성 서브틸리신이 진화되었다.
스크리닝 접근법은, 특히 이것이 대량 병행 "생존 스크린" 기법의 처리량에 근접한 고산출량 방식으로 수행될 수 있다면, 단순한 "생존 스크린"을 능가하는 분명한 이점을 가진다. 예를 들어, 병행진화도가 형질전화된 유기체에 대한 디지탈 영상화(Joo et al., Chemistry & Biology, 6:699-706 (1999)) 또는 콜로니에 대한 디지탈 분광기에 의한 평가(Youvan et al., 1994, Meth. Enzymol. 246:732-748) 같은 측정법을 사용함에 의해 도입된다. 일련의 분석이 세포 소팅의 사용에 의해 자동화될 수 있다(Fu et al., Nature Biotech., 17:1109-1111 (1999)). 고산출량 스크리닝에 대한 잘 성립된 접근법은 상업적으로 입수가능한 플레이트 리더를 사용하는, 마이크로타이터 플레이트에서의 자동화된 발현 단백질 평가를 포함하며, 본 발명의 방법은 특정 진화에 이런 모드의 고산출량 스크리닝의 사용에 아주 적합하다.
본 발명의 이 구체예에서, 관심있는 단백질을 코딩하는 유전자는 다수의 돌연변이를 발생시키는 어떤 공지된 방법에 의해 돌연변이되고, 돌연변이 단백질-코딩 DNA는 본 발명에 따르는 저점성 사상균 숙주안에 적합한 발현 벡터에 의해 도입되고, 형질전환체가 선택적으로 선택되어 배양된다. 다음에, 숙주 세포는 개별 단일클론 배양물을 제공하기 위해서, 마이크로타이터 플레이트의 웰안에 이미 설명된 바와 같이 분배되거나, 또는 달리 용해성 위치안에서 공간적으로 분리된다. 각각의 분배된 배양물은 관심있는 단백질 활성에 대해 스크리닝되고, 원하는 특성을 가장 강하게 나타내는 것들이 선택된다. 선택된 배양물에 있는 관심있는 단백질을 코딩하는 유전자는 다시 돌연변이되고, 돌연변이 DNA가 저점성 진균 숙주안에 다시 도입되고, 형질전환체가 재-스크리닝된다. 돌연변이 및 재-스크리닝 과정이 관심있는 특정값이 바람직한 수준에 도달할 때까지 반복된다.
다른 구체예에서, 특정 진화는 돌연변이 및 대장균과 같은 다른 유기체에서 관심있는 유전자의 재생성에 의해 수행되고, 이어서 돌연변이 유전자가 스크리닝을 위해 본 발명에 따라서 사상균으로 전달된다.
스크리닝 분석법을 토대로 관심있게 된 단백질이 상업적 이용에 필요한 모든 다른 특성을 필수적으로 가지지 않을 것이라는 것이 당업자에 의해 쉽게 인정될 것이다. 예를 들어, 효소 활성의 소유가, 그것이 높은 특이적 활성이라 해도, 돌연변이 효소가 필수의 열 또는 pH 안정성, 세제 또는 프로테아제 내성, 또는 비면역원성, 또는 상업적으로 생육가능한 제품에서 바람직하거나 또는 필수적인 다른 특성을 가진다는 것을 나타내지는 않을 것이다. 확인된 단백질이 상업적으로 유용한 특성을 가지는지의 여부를 쉽게 측정하는 방법에 대한 필요가 있다.
스크리닝에 대한 선행 기술의 접근법은 이런 필요에 용액을 제공하지는 않으며, 이것은 숙주 유기물(박테리아 및 이스트)이 분리가능한 양의 단백질을 생성하도록 조정되지 않았기 때문이다. 지금까지는, DNA 라이브러리 제조, 유전자 발현, 스크리닝, 연구 양의 유전자 생성물의 발현, 및 산업적으로 적합한 생성 균주에서의 과발현을 통해 진행되는 바와 같은, 잠재적으로 유용한 유전자를 한 유기체에서 다른 유기체로 전달하는 것이 필수적이었다. 한편, 본 발명의 돌연변이 사상균은, 특히 본원에 설명된 벡터와 함께 사용될 때, 외인성 단백질에 대한 우수한 과잉생산자 및 분비자이다. 충분한 단백질이 특성화의 목적을 위해서 뿐만 아니라, 시험 사용에서의 평가를 위해서 분리될 수 있다. 실제로, 본 발명의 스크리닝 방법에 사용된 균주는, 그것들이 저점성, 고 발현 속도, 및 매우 높은 단백질/생체물질 비율과 같은 바람직한 생성 특성을 가지므로, 산업적 생성에도 적합하다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 방법은 외인성 라이브러리 단백질(또는 그것의 선구물질)의 발현 및 분비를 허락하는 조건하에서, 본 발명에 따라 확인된 클론성 콜로니 또는 배양물을 배양하는 단계, 및 이어서 관심있는 단백질을 얻기 위해 생성된 단백질 회수하는 단계를 더 포함한다. 라이브러리 단백질의 발현 및 분비는 클론된 유전자와 발현 조절 서열에 모두 작동가능하게 연결된 상응하는 신호 서열 또는 세번째 단백질로부터의 신호 서열을 갖는 이종성 단백질(또는 그것의 단편)에 대한 유전자의 프레임내 융합을 만드는 것에 의해 용이하게 될 수 있다. 이런 접근법에 의하여, 라이브러리 단백질의 어떤 이종성 아미노산 서열 상류인 융합 단백질이 만들어진다. 이어서, 이 융합 선구물질 단백질이 당업계에 공지된 정제 기법을 사용하여 분리되고 회수될 수 있다. 그 방법은 분비된 융합 단백질 선구물질에 분열 단계를 행하여 관심있는 라이브러리 단백질을 발생시키는 것을 선택적으로 포함할 수 있다. 분열 단계는 Kex-2, Kex-2 유사 프로테아제, 또는 다른 선택성 프로테아제를 사용하여 수행될 수 있으며, 이 때 벡터가 조작되고 이로써 프로테아제 분열 부위가 잘 분비된 단백질 담체와 관심있는 단백질을 연결한다.
숙주 생물 스크리닝으로부터 직접 유래된 돌연변이체 단백질의 용이한 이용가능성은 숙주를 스크리닝하는 종래기술과 아직 양립가능하지 않았다. 그러므로, 본 발명은 고산출량 스크리닝에 기초하여 관심있는 돌연변이체 단백질로 여겨지는 것은 더이상의 특징을 위한 충분한 양(mg) 및 이용 시도를 위한 더 많은 양(g 내지 kg)으로까지 분리될 수 있다는 점에서 잇점을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 특정 구체예는 단지 고산출량 스크리닝에서 검출된 한 성질만이 아닌 어느 많은 바람직한 성질에 기초하여, 진화의 다음 순환을 위한 돌연변이체 단백질을 선택하기 위한 참여자를 허용한다. 본 발명에 의해 만들어진 더욱 긴축 선택 기준은 더욱 효율적이고 비용-효과적인 특정된 진화 과정을 유발하여야만 한다.
본 발명에 따른 돌연변이체 사상균 균주의 생산 방법은 발현 조절 영역에 작동가능하게 연결된 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA 서열의 라이브러리를 본 발명에 따른 저점성 돌연변이체 사상균에 도입하는 것을 포함한다.
DNA 서열의 도입은 사상균을 형질전환하는 그 자체로 공지된 어느 방식으로 수행될 수 있다. 당업자는 진균 원형질체에 의하여 CaCl2-폴리에틸렌 글리콜 자극 DNA 흡수와 같은 몇몇의 잘 확립된 방법이 있다는 것을 이해할 것이다(Johnstone et al., EMBO J., 1985,4:1307-1311). 원형질체 형질전환 방법은 공지되고 다른 사상균에 대하여 종래기술에 언급된 대로 사용될 수 있다. 이종 DNA 의 진균 게놈에 다수카피 통합에 적합한 벡터가 잘 알려진다; 예를 들어, Giuseppin et al., WO 91.00920 참조. 자가 복제하는 플라스미드의 사용은 오랫동안 진균에 효율적인 형질전환 수단으로 알려졌다(Gems et al., Gene 1991 98:61-67; Verdoes et al., Gene 1994 146:159-165; Aleksenko 및 Clutterbuck, Fungal Genetics Biol. 1997 21:373-387; Aleksenko et al., Mol. Gen. Genet. 1996 253:242-246). 이러한 방법의 상세한 설명은 상기 언급된 참고문헌에서 발견될 수 있어서 본 원에 참고문헌으로 수록된다.
이종 DNA 를 운반하는 벡터의 도입을 위하여 개시물질로서Chrysosporium또는A.sojae의 저점성 돌연변이체 균주를 사용하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 실시예 방법은 하기에 제시된다.
A. 조밀한 성장 형태 돌연변이체의 개발
다양한 특허출원은 형태 돌연변이체가 다양한 방식의 스크리닝으로 분리될 수 있다는 것을 교시한다. WO 96/02653 및 WO 97/26330 은 조밀한 형태를 나타내는비-한정 돌연변이체를 개시한다.A.sojae의 프로단백질 프로세싱 돌연변이체는 기대되지 않은 이상 성장 표현형(초-분지)를 가진 반면에, 단백질 생산에 대한 불리한 효과는 관찰되지 않았다는 것이 발견되었다. 이 균주를 가지는 배양물 실험은 미세펠렛을 가지는 매우 조밀한 성장 표현형을 나타냈다. 관찰된 특징은A.sojae에 존재할뿐만 아니라 예를 들어,A. niger과 같은 다른 돌연변이된 진균에도 존재하였다.
(1) A.niger 프로단백질 프로세싱 돌연변이체의 제조
A.niger로부터의 유전자를 코딩하는 프로단백질 전환효소를 클론하기 위해서, PCR 을 사용했다. 다양한 효모 종 및 고등 진핵생물의 다양한 프로단백질 전환효소 유전자의 비교에 기초하여, 각각, 4,2,2,512,1152,4608,2048 및 49152 배 축퇴성의 상이한 PCR 프라이머를 유전적으로 설계했다. 프라이머 PE4 및 PE6 를 사용한 증폭으로부터 코딩된 단백질 서열로부터 얻은 2 개의 각각의 클론은S.cerevisiaeKEX2 서열과 의미있는 상동성을 보이지 않았다. 클론을 더이상의 연구에 사용했다.
클론된 PCR 단편의 다른 프로단백질 전환효소 유전자에 대해 관찰된 상동성에 기초하여, 상응하는A.niger유전자를 pclA 로 표시했다(프로단백질 전환효소-유사).A.niger의 게놈 분해의 서던 분석은 pclA 유전자가 이종 혼성화 조건(50 ℃, 6xSSC 에서 세척)에서 추가적인 혼성화 신호가 분명하지 않은 경우조차도A.niger게놈에서 밀접하게 관련된 유전자를 가지는 않는 단일 카피 유전자라는 것을 나타냈다.A.nigerN401(van Hartingsveldt et al., Mol.Gen.Genet.1987206:71-75)의 EBML3 게놈 라이브러리의 제1의 스크리닝은 약 10-20 게놈 등가물이 스크리닝되지만 어느 양성 혼성화 플라크를 초래하지 않는다. pclA 유전자의 총 길이 게놈 카피의 제2의 스크리닝은 EMBL4 에서A.nigerN400 게놈 라이브러리부터 분리되었다(Goosen et al., Curr.Genet. 11:499-503(1987)).
5-10 게놈 등가물을 스크리닝한 후에 얻은 8 개의 혼성화 플라크중에서, 6 개는 제1의 스크리닝후에 여전히 양성이었다. 모든 6 개의 클론은 모든 클론에서(게놈 DNA 로부터 관찰되는 경우) 2 개의 혼성화 EcoRV 단편 3 및 4 kb 가 존재하는 PCR 단편(EcoRV 제한 부위에 포함된 PCR 단편)을 가지는 경우에 pclA 유전자의 전 카피를 거의 운반했다. 다른 프로단백질 전환효소의 크기와의 비교에 기초하여, 모든 이러한 단편은 5' 및 3' 양쪽에 인접한 서열을 가지는 완전한 pclA 유전자를 포함할 것이다. 2 개의 EcoRV 단편 및 오버랩핑 5kb EcoR1 단편을 더이상의 특성화를 위해 아클론했다.
제한 맵에 기초하여, pclA 유전자의 완전한 DNA 서열을 EcoRI 및 EcoRV 아클론으로부터 결정했다. 얻어진 서열의 분석은S. cerevisiaeKEX2 유전자 및 다른 프로단백질 전환효소의 그것에 상당히 유사한 오픈 리딩 프레임을 나타냈다. 더이상의 비교에 기초하여 2 개의 추정적인 인트론 서열은 코딩 영역에서 확인되었다.A.nigercDNA 라이브러리에 기초한 pEMBLyex 에서 추정적인 인트론의 양쪽에 인접한 프라이머로 연속적인 PCR 분석은 이러한 2 개의 서열의 가장 5' 가 실제 인트론이라는 것을 나타냈다. 코딩된 PclA 단백질의 일반적인 구조는 다른 프로단백질 전환효소의 그것과 거의 유사했다. 다른 프로단백질 전환효소와 PclA 단백질의 전체적인 유사성은 약 50% 였다.
클론된 pclA 유전자가 기능적인 단백질을 코딩하는 기능적인 유전자라는 것을 증명하기 위해서, pclA 유전자가 없는 균주의 제조를 시도했다. 그러므로, 대부분의 pclA 코딩 영역이A.oryzaepyrG 선택 마커로 대체된 pPCL1A, pclA 결여 벡터가 생성되었다. 연속적으로, 벡터로부터 5kb EcoRI 삽입 단편을 다양한 A.niger 균주의 형질전환에 사용했다.
(pyrG 선택에 기초)형질전환체로부터 다양한 형질전환체를 얻었다. 흥미롭게도, 형질전환체 부분(1-50%로 다양)은 매우 분명한 이상 표현형을 보였다(도 13). 몇몇의 야생형 및 이상 형질전환체의 서던 분석은 몇몇의 제한(조밀) 성장 표현형을 보인 이상 형질전환체는 pclA 유전자를 결실했다는 것을 보였다. 야생형 성장을 나타내는 모든 균주는 야생형 pclA 유전자에 인접하여 또는 이종 위치에서 통합된 대체 단편의 카피를 운반하는 것을 보였다.
(2) A.sojae 프로단백질 프로세싱 돌연변이체의 제조
A.sojae에서 상응하는 돌연변이체를 제조하기 위해서,A.niger의 저점성 돌연변이체의 기능적인 상보성을A.sojaeATCC 11906 코스미드 라이브러리로A.nigerpclA 돌연변이체의 형질전환에 의해서 수행했다. 결과적인 상보성A.niger형질전환체로부터, 게놈 코스미드 클론을 분리했고, 이것은A.sojae단백질 프로세싱 프로테아제 pclA 를 포함했다. 분리된 서열의 부분적인 서열 분석은A.sojaepclA 유전자의 클로닝을 확실히했다. 클론된A.sojaepclA 서열에 기초하여 유전자 대체 벡터를 WO 01/09352 에 개시된 재사용가능한 pyrG 선택 마커를 사용하여 실시예의 어떤 것에 개시된 것과 유사한 방법에 따라서 제조했다.
추가적으로, pyrG 선택 마커 및A.sojaepclA 유전자의 5' 및 3' 절단된 단편을 운반하도록 유전자 방해 벡터를 제조했다. 유전자 대체 및 유전자 방해 벡터 모두 ATCC 11906 및 ATCC11906 유도체에서 pclA 돌연변이체를 생산하도록 사용했다. 결과적인 형질전환체의 어떤 것으로의 배양물 실험은 개선된 형태 특징, 특히 조밀한 성장 형태 및 미세펠렛을 나타냈다(도 14A 및 도 14B).
(3) 대체 A.sojae 조밀한 성장 돌연변이체의 분리
A.sojaeATCC 11906 및 유도체의 형질전환은 진균 선택 마커를 운반하는 선형 DNA 단편으로 수행될 수 있다. 특정 복제 서열이 제공되지 않는다면, 숙주 균주의 게놈에 통합된 도입된 DNA 를 운반하는 과정을 사용하여 형질전환체를 얻는다. 도입된 선택 마커는 이종 기원의 것으로서(A.niger) 게놈의 다양한 위치에서 마커 DNA 를 운반하는 형질전환체의 수거를 유도하면서 이종 재조합만이 발생할 것이다. 통합은 내인성A.sojae서열의 파괴를 초래하는 경향이 있어서,A.sojae돌연변이체 균주의 수거를 초래한다. 이것은A.nigerpyrG 선택 마커를 가지는 DNA 단편을 사용하여A.sojaeATCC 11906alpApyrG 로부터 얻은 형질전환체의 대규모 수거의 분석으로 예증된다. 총 수천개의 형질전환체를 분석했고, 5-10 은 형태 이상 표현형을 보였다. 이중에서, 몇 개는, pclA 돌연변이체에 비교할 만한 표현형을 가졌다.A.sojaepclA 유전자의 클로닝에 대한 개시와 유사하게, 돌연변이에 해당하는 유전자는 형태 표현형의 상보성에 의해서A.sojae유전자 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 클론된 유전자에 기초하여, 해당하는 유전자 파괴/결실 돌연변이체가 생성될수 있다.
(4) Chrysosporium 조밀한 성장 돌연변이체의 분리
A.nigerpclA 유전자에 대하여 개시된 것과 유사한 PCR 기초 클로닝 접근법을 사용하여, pcl1 으로 명명된Chrysosporium프로단백질 프로세싱 유전자의 단편을ChrysosporiumBLUESTAR(TM) 유전자 라이브러리로부터 클론했다. 완전한 게놈 유전자 카피를 운반하는 유전자 단편을 pBLUESTAR 클로으로부터 아클론했다. 얻어진 아클론에 기초하여 유전자 파괴 벡터를A.sojae에 대하여 개시된 대로 생산했다. pyrG 마커 대신에,Chrysosporium의 경우에,A.nigerpyr E 유전자의 반복적으로 양쪽에 인접한 버전을 사용했다.Chrysosporium의 유전자 파괴-형질전환은 조밀한 성장 표현형을 가지는 균주를 초래했다.
B. 점성 결정
하기의 작동가능한 변수 데이터 범위는 5 개의 서로 다른 진균 유기물을 사용하여 진균 발현로 결정되었다. 비교된 5 개의 진균 유기물은Aspergillus niger, Trichoderma longibrachiatum18.2 KK(공식적으로T.reesei),Trichoderma longibrachiatumX252,Chrysosporium lucknowense균주 UV18-25, 및Aspergillus sojaepclA 의 균주였다. 진균 배양물의 점성은 발효 과정동안 다양하고, 영양소농도에 따라서 다양하다. 본원에 보고된 측정의 경우에, 20 및 100 g/l 의 카르보히드레이트 탄소 원(예를 들어, 셀룰로스, 락토스, 수크로스, 크실로스, 글루코스등)을 포함하는 배지가 진균으로 접종되고, 배양물은 탄소원이 소모되는 동안"성장기"를 거치도록 허용된다. 1 리터의 발효 용기가 교반 날개로 500-1000 rpm 에서 교반되는 동안, 진탕 플라스크 배양물을 200 rpm 으로 진탕한다. 전형적으로 최대 점성은 성장기의 말기 또는 그에 근접하여 발생한다. 이 시기에, 배양물을 유가배양법 모드로 전환시키고, 여기에서 탄소원이 탄소원의 농도가 약 0.5g/l 이상으로 증가하지 않는 비율에서 배양물에 공급된다. 1 및 3g/l/hr 사이의 공급 비율이 전형적이다.
점성을 30 ℃ 에서 작동된, 작은 샘플 적용기 및 스핀들 수 31 을 사용하여, BrookfieldLVF 점성계상에서 결정했다. 발효 육즙의 신선한 샘플(10ml)을 작은 샘플 스핀들에 놓았다. 스핀들 속도를 범위 10-80 으로 해독되도록 조정했다. 4 분 후에, 점성계 눈금을 해독했다. 해독을 센티푸아즈(cP)로 점성을 얻기 위해서 하기에 주어진 인자에 의해 다양화되었다.
스핀들 속도 다양화 인자
650
1225
3010
60 5
최종 점성은 발효 말기에 측정했다.
C. CHRYSOSPORIUM, TRICHODERMA 및 TOLYPOCLADIUM 의 형질전환
형질전환 배지는 하기와 같다.
선택 및 배양용 배지:
50 ㎍/ml 프레오마이신 또는 100-150 ㎍/ml 히그로마이신으로 보충된 재생성 배지를 사용하여 형질전환체를 선택한다. 5 ㎍/ml 프레오마이신으로 보충된 GS 배지를 사용하여 항생제 내성을 확실히 한다.
PDA 는 빠른 성장 및 양호한 포자형성을 위한 완전 배지이다. 액체 배지를 1/20th 의 포자 현탁액으로 접종한다(5ml 0.1% 트윈에서 1 90mm PDA 플레이트로부터의 모든 포자). 이러한 배양물을 진탕 플라스크에서 27 ℃ 에서 배양한다(200 rpm).
2 개의 형질전환되지 않은ChrysosporiumC1 균주 및 1 개의Trichoderma reesei기준 균주를 2 개의 배지(GS pH 6.8, 및 Pridham 한천, PA, pH 6.8)에서 시험했다. 항생제 내성 수준을 시험하기 위해서, 포자를 7 일된 PDA 플라이트로부터 수거했다. 선택 플레이트를 32 ℃ 에서 인큐베이션했고, 2, 4 및 5 일에서 계수했다. C-1 균주 NG7C-19 및 UV 18-25 는 기준T.reesei실험 균주의 것에 비하여 프레오마이신 및 히드로마이신의 모두에 대하여 낮은 기초 내성 수준을 가졌다. 이것은 이러한 표준 진균 선택 마커는Chrysosporium균주에 사용될 수 있다는 분명한지시이다. 다른 표준 진균 선택 마커의 문제점은 기대되지 않는다.
Sh-ble(프레오마이신-내성) 형질전환된Chrysosporium균주를 50 ㎍/ml 에서 성공적으로 선택했다. 서로 다른 선택은Chrysosporium에서 얻을 수 있다는 것을 보여주는T.reesei에 사용된 선택 수준이었다. 같은 언급은 150 ㎍/ml 의 수준에서 히그로마이신 내성에 대하여 형질전환된 균주에 대하여 유효하다.
원형질체 형질전환 기법을 가장 일반적으로 적용된 진균 형질전환 기법에 기초한Chrysosporium에 사용했다. 하나의 90 mm PDA 플레이트로부터 모든 포자를 8 ml ICI 에서 회수했고, 15 시간동안 35 ℃ 에서 200 rpm 으로 인큐베이션하기 위해서 50 ml ICI 배지의 진탕 플라스크에 옮겼다. 배양물을 원심분리한 후에, 펠렛을 MnP 에서 세척했고, 10 ml MnP 및 10mg/ml Caylase C3로 용액에 다시 가져왔고, 교반하면서 35 ℃ 에서 30 분동안 인큐베이션했다(150 rpm).
용액을 여과했고, 여과물을 3500 rpm 에서 10 분동안 원심분리에 놓았다. 펠렛을 10 ml MnP Ca2+로 세척했다. 이것을 25 ℃에서 10 분동안 원심분리했다. 그 다음, 냉각 MPC 의 50 ㎕ 를 첨가했다. 혼합물을 30 분동안 아이스상에서 유지했고, 그 위에 2.5 ml PMC 를 첨가했다. 실내온도에서 15 분후에, 500 ㎕ 의 처리된 원형질체를 3 ml 의 MnP Soft 에 혼합했고, 선택제로서 프레오마이신 또는 히그로마이신을 포함하는 MnP 플레이트상에서 즉시 플레이팅했다. 30 ℃ 에서, 5 일동안 인큐베이션한 후에, 형질전환체를 분석했다(클론은 48 시간후에 가시화되었다). 형질전환 효율을 10 ㎍ 의 기준 플라스미드 pAN8-1 을 사용하여 결정했다. 결과는 하기의 표 C 에 제시된다.
결과는Chrysosporium형질전환체 생존력이Trichoderma보다 더 우수하다는 것을 보여준다. 실험에서 얻은 균주의 형질전환력 및 그에 의한 형질전환체의 수는T.reesei보다Chrysosporium의 경우 4 배 더 높다. 그러므로,Chrysosporium형질전환 시스템은 흔히 사용된T.reesei시스템에 같을뿐만 아리라 그것을 능가하기조차 한다. 개선은 pAN8-1 보다 덜 효율적인 형질전환을 하는 벡터에 특히 유용하다는 것이 증명할 수 있다.
많은 다른 형질전환 및 발현 플라스미드는 서열을 코딩하는 동종의Chrysosporium단백질 및 또한Chrysosporium으로 형질전환 실험에 사용된 서열을 코딩하는 이종 단백질로 제조되었다. 벡터 맵은 도 6-11 에 제공된다.
발현이 기대되는 이종 단백질을Chrysosporium에 의해 생산되고, 과 6 에 속하는 엔도클루카나제 6 (MW 43 kDa) 로 구성되고, 이종 단백질은Penicillium의 과 12 에 속하는 엔도클루카나제 3 인(MW 25 kDa) 셀룰라제 군으로부터 선택했다.
pF6g 는 엔도글루카나제 6 오픈 리딩 프레임에 이어서 엔도글루카나제 6 종결 서열을 가진 프레임에서 엔도글루카나제 6 신호 서열에 연결된Chrysosporium엔도글루카나제 6 프로모터 단편을 포함한다. 형질전환체 선택을 선택 벡터를 가지는 동시형질전환을 사용하여 수행한다.
pUT1150 은 엔도글루카나제 6 오픈 리딩 프레임에 이어서T.reesei셀로비오히드롤라제 종결자 서열을 가지는 프레임에서 엔도글루카네제 6 신호 서열에 연결된Trichoderma reesei셀로비오히드롤라제 프로모터를 포함한다. 게다가, 벡터는 선택 마커 즉, 프레오마이신 내성 유전자(Sh-ble 유전자)를 가지는 제2의 발현 카세트를 운반한다.
pUT1152 는 엔도글루카나제 6 오픈 리딩 프레임에 이어서A.nidulans안트라닐레이트 합성효소(trpC) 종결자 서열을 가지는 프레임에서 엔도글루카나제 6 신호 서열에 연결된Aspergillus nidulans글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 A 프로모터를 포함한다. 게다가, 벡터는 선택 마커 즉, 프레오마이신 내성 유전자(Sh-ble 유전자)를 가지는 제2의 발현 카세트를 운반한다.
pUT1155 는 담체 단백질 Sh-ble 가 교대로 엔도글루카나제 6 오픈 리딩 프레임에 이어서A.nidulanstrpC 종결자 서열에 연결된 프레임에서Trichoderma reesei셀로비오히드롤라제 신호 서열에 연결된A.nidulans글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 A 프로모터를 포함한다. 벡터는 분비를 훨씬 더 향상시키는 것으로 공지된 관심있는 단백질에 융합된 담체 단백질을 융합시키는 기법을 사용한다.
pUT1160 은 담체 단백질 Sh-ble 가 교대로 페니실리움의 엔도글루카네제 3오픈 리딩 프레임에 이어서A.nidulanstrpC 종결자 서열에 연결된 프레임에서Trichoderma reeser셀로비오히드롤라제 서열에 연결된Aspergillus nidulans글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 A 프로모터를 포함한다.
pUT1162 는Penicillium의 엔도글루카나제 3 오픈 리딩 프레임에 이어서T.reesei셀로비오히드롤라제 종결자 서열을 가지는 프레임에서 엔도글루카네제 3 신호 서열에 연결된Trichoderma reesei셀로비오히드롤라제 프로모터를 포함한다. 게다가, 이 벡터는 선택 마커로서 프레오마이신 내성 유전자(Sh-ble 유전자)를 가지는 제2의 카세트를 운반한다.
당업자에게는 게놈 또는 cDNA 의 샘플이 단백질-코딩 단편으로 쉽게 절단 또는 분해될 수 있고, 발현 벡터의 라이브러리를 생산하기 위해서 단편을 본원에 예시된 것과 같은 벡터에 연결할 수 있다는 것이 자명할 것이다. 동시-트랜스펙션을 사용하는 더이상의 분명한 방법이 이용가능하고, 자율적으로 복제하는 벡터 또는 통합 벡터가 이러한 벡터의 라이브러리로 사상균을 트랜스펙션하기위해 사용될 수 있다.
표 D 는ChrysosporiumUV18-25 및Tolycladium geodes의 형질전환의 결과를 도시한다. 이종 형질전환체에 대하여 사용된 형질전환 프로토콜은 하기의 단락에 개시된다.
D. CHRUSOSPORIUM 형질전환체에서 이종 및 동종 발현
C1 균주(NG7C-19 및/또는 UV18-25)를 다양한 이종 단백질을 분비하는 그들의 능력에 대해 시험했다: 박테리아 단백질(Streptoalloteichus hindustanus프레오마이신-내성 단백질, Sh-ble), 진균 단백질(Trichoderma reesei크실라나제 II, XYN2) 및 사람의 단백질(사람 리소자임, HLZ). 과정은 하기와 같다:
(1) Streptoalloteichus hindustanus 프레오마이신-내성 단백질의 C1 분비Sh-ble).
C1 균주 NG7C-19 및 UV19-25 는 플라스미드 pUT720(기준 1)에 의해 형질전환되었다. 벡터는 하기의 진균 발현 카세트를 제시한다.
-Aspergillus nidulans글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 (gpdA) 프로모터(기준 2).
- 합성Trichoderma reesei셀로비오히드로라제 I(cbh1) 신호 서열(기준 1,3)
-Streptoalloteichus hindustanus프레오마이신-내성 유전자 Sh-ble(기준 4).
-Aspergillus nidulans트립토판-합성(trpC) 종결자(기준 5).
벡터는 또한 플라스미드 pUC18(기준 6)로부터 β-락타마제 유전자(bla) 및E.coli복제 기점을 운반한다. 플라스미드 맵의 상세한 설명은 도 2 에 제시된다.
C1 원형질체를 C1 에 채택된 Durand et al.(기준 7)에 따라서 형질전환시켰다: 형질전환된 C1 균주의 하나의 90 mm PDA 플레이트로부터 모든 포자를 8 ml ICI 에서 회수했고 35 ℃, 150 rpm 에서 15 시간동안 인큐베이션을 위해 50 ml ICI 배지를 가진 진탕 플라스크에 옮겼다. 그 위에, 배양물을 진탕했고, 펠렛을 MnP 에서 세척했고, 10 ml MnP + 10 mg/ml Caylase C3에서 용해했고, 진탕하면서 35 ℃ 에서 30 분동안 인큐베이션했다. 용액을 여과했고 여과물은 3500 rpm 에서 10 분동안 인큐베이션했다. 펠렛을 10 ml MnPCa2+로 세척했다. 이것을 3500 rpm 에서 10 분동안 진탕했고, 펠렛을 1 ml MnPCa2+에서 꺼냈다. 10 ㎍ 의 pUT720 DNA 를 200 ㎕의 원형질체 용액에 첨가했고, 실내온도에서 10 분동안 인큐베이션했다(ca. 20℃). 그 다음, 50 ㎕ 의 냉각 MPC 를 첨가했다. 혼합물을 2.5 ml PMC 가 첨가된 아이스상에서 30 분동안 유지시켰다. 실내온도에서 15 분후에, 500 ㎕ 의 처리된 원형질체를 3 ml 의 MnR Soft 로 혼합했고, 선택제로서 프레오마이신(pH 6.5 에서 50㎍/ml)을 함유하는 MnR 플레이트상에 즉시 플레이팅했다. 30 ℃ 에서 5 일 인큐베이션 한 후에, 형질전환체를 분석했다(클론은 48 시간후에 가시화되기 시작한다).
C1 형질전환체의 Sh-ble 산물(프레오마이신-내성 클론)을 하기와 같이 분석했다: 제1차 형질전환체를 GS+프레오마이신(5㎍/ml)플레이트에 집어내었고, 내성 확증을 위해서 32 ℃에서 5 일동안 배양했다. 각 증명된 내성 클론은 GS 플레이트에 아클론했다. 형질전환체당 2 개의 아클론을 PDA 플레이트에의 접종에 사용하여액체 배양물 개시용 포자를 얻었다. IC1 에서 액체 배양물을 27 ℃ 에서 5 일동안 배양했다(진탕 200 rpm). 그 다음, 배양물을 원심분리했고(5000g, 10 분), 500 ㎕의 상청액을 수거했다. 이러한 샘플로부터 단백질을 TCA 로 침전했고, Western 샘플 완충액에서 재현탁하여 4 mg/ml 의 총단백질로 하였다(Lowry method, 기준 8). 10 ㎕(약 40 ㎍의 총 단백질)를 12% 아크릴아마이드/SDS 겔에 로딩했고, 전개했다(Mini Trans-BlotTMSystem, BioRad Laboratories). 웨스턴 블럿팅을 1차 항체로서 래빗 항-Sh-ble 항혈청(Societe Cayla, Tolouse FR, Catalog #ANTI-0010)을 사용하여 BioRad 지시에 따라서 수행했다(Schleicher & Schull 0.2 ㎛ 멤브레인).결과는 도 1 및 표 E 에 보여진다.
데이터는:
1) pUT720 의 이종 전사/번역 신호는Chrysosporium에서 기능한다.
2) pUT720 의 이종 신호 서열은Chrysosporium에서 기능한다.
3)Chrysosporium은 이종 박테리아 단백질 분비용 숙주에 사용될 수 있다. 는 것을 도시한다.
(2) 사람의 리소자임(HLZ)의 C1 분비
C1 균주 NG7C-19 및 UV18-25 를 플라스미드 pUT970G(기준 9)로 형질전환하였다. 벡터는 하기의 진균 발현 카세트를 제시한다.
-Aspergillus nidulans글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 (gpdA) 프로모터(기준 2)
-합성Trichoderma reesei셀로비오히드롤라제 I(cbh1) 신호 서열(기준 1, 3).
- 담체 단백질로서 사용된Streptoalloteichus hindustanus프레오마이신-내성 유전자 Sh-ble 4(기준 10).
- 플라스미드 pAN56-2 로부터 클론된Aspergillus niger글루코아밀라제 (glaA2) 힌지 도메인(기준 11, 12).
- KEX2-유사 프로테아제 절단 부위를 특징으로 하는 링커 펩티드(LGERK)(기준 1).
- 사람의 합성 리소자임 유전자(hlz)(기준 10)
-Aspergillus nidulans트립토판-합성효소(trpC) 종결자(기준 5)
벡터는 또한 베타-락타마제 유전자(bla) 및 플라스미드 pUC186 의 E.coli 복제 기원을 운반한다. 상세한 플라스미드 맵은 도 3 에 제공된다.
C1 원형질체를 실시예 1 에 이미 개시된 것과 같은 과정을 사용하여 플라스미드 pUT970G 로 형질전환했다. 융합 단백질(Sh-ble::GAM 힌지::HLZ)은 프레오마이신-내성에 관하여 기능하여서 C1 형질전환체의 용이한 선택을 허용한다. 더욱이, 프레오마이신 내성의 수준은 hlz 발현의 수준과 대체로 상관관계가 있다.
C1 형질전환체(프레오마이신-내성 클론)의 HLZ 산물을 하기와 같은 리소자임-활성 분석법으로 분석했다: 제1차 형질전환체를 GS+프레오마이신(5㎍/ml) 플레이트(내성 확증) 및 또는 LYSO 플레이트(투명대 가시화에 의해서 HLZ 활성 검출)에서 골라냈다(기준 1,10). 플레이트를 32℃에서 5 일동안 배양했다. 각 증명된 클론을 LYSO 플레이트에 아클론했다. 형질전환체당 2 개의 아클론을 PDA 플레이트를 접종에 사용하여 액체 배양물 개시용 포자를 얻었다. ICI 에서 액체 배양물을 27℃ 에서 5 일동안 배양했다(진탕 180 rpm). 그 다음, 배양물을원심분리했다(5000 g, 10 분). 샘플로부터, 리소자임 활성을 Morsky et al. 에 따라서 측정했다(기준 13).
데이터는:
1) 실시예 1 의 포인트 1 & 2 는 확실하다.
2) Sh-ble 는 내성 마커로서Chrysosporium에서 기능한다.
3) Sh-ble 는 담체 단백질로서Chrysosporium에서 기능한다.
4) KEX2-유사 프로테아제 절단 부위는Chrysosporium에서 기능한다(그렇지 않으면 HLZ 는 활동하지 않을 것이다).
5)Chrysosporium은 이종 포유동물 단백질의 분비를 위한 숙주로서 사용될 수 있다는 것을 도시한다.
(3) Trichoderma reesei 크실라제 II(XYN2)의 C1 분비
C1 균주 UV18-25 는 플라스미드 pUT1064 및 pUT1065 에 의해서 형질전환되었다. pUT1064 는 2 개의 하기의 진균 발현 카세트를 제시한다.
제1의 카세트는 프레오마이신-내성 형질전환체의 선택을 허용한다.
-Neurospora crassa교차 경로 조절 유전자 1(cpc-1) 프로모터(기준 14)
-Streptoalloteichus hindustanus프레오마이신-내성 유전자 Sh-ble(기준 4)
-Aspergillus nidulans트립토판-합성효소(trpC) 종결자(기준 5)
제2의 카세트는 크실라나제 생산 카세트이다:
-T.reesei균주 TR2 cbh1 프로모터(기준 15)
-T.reesei균주 TR2 xyn2 유전자(그것의 신호 서열을 포함)(기준 16)
-T.reesei균주 TR2 cbh1 종결자(기준 15)
벡터는 또한 플라스미드 pUC19(기준 6)의 E.coli 복제 기점을 운반한다. 플라스미드가 개시된 맵은 도 4 에 제공된다.
pUT1065 는 하기의 진균 발현 카세트를 제시한다:
-A.nidulans글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(gpdA) 프로모터(기준 2)
- 합성T.reesei셀로비오히드롤라제 I(cbh1) 신호 서열(기준 1,3)
- 담체 단백질로 사용된S.hindustanus프레오마이신-내성 유전자 Sh-ble4(기준 10)
- KEX2-유사 프로테아제 절단 부위를 특징으로 하는 링커 펩티드(SGERK)(기준 1)
-T.reesei균주 TR2xyn2 유전자(신호 서열 없슴)(기준 16)
-A.nidulans트립토판-합성효소(trp C) 종결자(기준 5)
벡터는 또한 플라스미드 pUC18(기준 6)의 β-락타마제 유전자(bla) 및E.coli복제 기점을 운반한다. 플라스미드가 개시된 맵이 도 5 에 제공된다.
C1 원형질체는 실시예 1에 이미 개시된 같은 과정에 따라서 플라스미드 pUT1064 또는 pUT1065 로 형질전환된다. 플라스미드 pUT1065 의 융합 단백질(Sh-ble::XYN2)은 C1 형질전환체의 용이한 선택을 허용하면서 프레오마이신-내성에 관하여 기능적이다. 더욱이, 프레오마이신 내성의 수준은 xyn2 발현의 수준과 대체로 상관관계가 있다. pUT1064 에서, xyn2 는 그 자신의 신호 서열로 클론되었다.
C1 형질전환체의 크실라나제 생산(프레오마이신-내성 클론)을 하기와 같이 크실라나제-활성 분석으로 분석되었다: 제1의 형질전환체를 GS+프레오마이신 (5㎍/ml) 플레이트로(내성 확증) 및, 또한 XYLAN 플레이트(기준 17)에 골라냈고, 크실라나제 활성이 투명대의 관찰로 검출된다. 플레이트를 32℃에서 5 일동안 배양했다. 각 증명된 클론을 XYLAN 플레이트에 아클론했다. 형질전환체 당 2 개의 아클론을 PDA 플레이트에의 접종에 사용하여 액체 배양 접종용 포자를 얻었다. IC1 + 5g/l K+프탈레이트에서 액체 배양물을 27 ℃에서 5 일동안 배양했다(180 rpm 에서 진탕). 그다음, 배양물을 원심분리했다(5000 g, 10 분). 이러한 샘플로부터, 크실라나제 활성을 Miller et al 에 따른 DNS 기법으로 측정했다(기준 18).
이러한 데이터는
1) 실시예 2의 포인트 1 내지 4 가 확인된다.
2) C1 은 이종 진균 단백질의 분비를 위한 숙주로서 사용될 수 있다.
(4) 요약
표 H 는 UV18-25 의 형질전환이 수행된 플라스미드에 대한 결과를 도시한다. 표는 이종 발현 조절 서열 및 신호 서열 및 또는 이종 발현 조절 서열 및 신호 서열을 사용하여 엔도글루카나제 및 셀로비오히드롤라제에 대한 발현 수준을 도시한다. 다양한 플라스미드의 상세한 설명은 발명의 상세한 설명 및 도의 어디에서부터라도 유도될 수 있다. 생산은 35℃의 알칼리 pH 에서 발생한다.
E. ASPERGILLUS SOJAE 유전자 라이브러리의 제조
(1) 벡터 라이브러리
A.sojae의 게놈 DNA 를 이미 개시된 프로토콜을 사용하여 ATCC 11906 으로부터 얻은 원형질체에서 분리했다(Punt, van den Hondel, Methods Enzymol. 1992 216:447-457). 분리후에, DNA 를 Kolar et al., Gene 1988 62:127-34 에 개시된 프로토콜을 사용하여 원형질체로부터 추출했다. 연이어서, DNA 를 부분적으로 MboI 로 분해하여 평균 크기 30-50 kb 의 DNA 단편을 초래했다.
유전자 라이브러리의 제조에 사용된 벡터 pAOpyrGcosarp1 은 Acc656I-BamHI 분해 pHELP1(Gems et al., Gene 1991 98:61-67)에서 pANsCos1 의 3 kb BamHI-HindII 단편(Osiewacz, Curr Genet. 1994 26:87-90) 및 pAO4.2 의 3.2 kb Acc65I-HindIII 단편(De Ruiter-Jacobs et al., Curr. Genet. 1989 16:159-63)의 연결로 제조되었다. 코스미드 벡터는 A.orzye pyrG 선택 마커를 운반하고 사상균에서 자가 복제한다.
MboI 분해 게놈 DNA 를 BamHI-분해 pAOpyrGcosarp1 에 연결했고, 연결 혼합물을 Straragene Supercos1 벡터 키트(Stratagene Inc., La Jolla CA)를 사용하여 파지 입자에 넣었다. 이것은A.sojae게놈의 약 30 배 발현을 나타내면서 총 ca. 30,000 개개의 클론을 초래했다. 결과적인 클론 풀의 스톡(15% 글리세롤로)을 나중의 사용을 위해서 -80℃에서 저장했다.
(2)고빈도 형질전환
A.sojaeATCC 11906 pyrG 돌연변이체를 WO 01/09352 에 개시된대로 ATCC 11906의 플루오로로틱 산-내성 유도체로서 선택했다. 균주,A.sojaeATCC 11906pyrG 를A.nigerpyrG 유전자를 운반하는 2 개의 벡터로 형질전환했다. 벡터 pAB4-1(van Hartingsveldt et al., Mol.Gen.Genet.206:71-75(1987))는 pyrG 유전자만을 운반하는 반면에, pAB4-arp1(Verdoes et al., Gene 146:159-165(1994))는 pyrG 유전자 및A.nidulansAMA1 서열을 운반한다. ATCC 11906pyrG 의 형질전환은 pAB4-1 의 ㎍DNA 당 5-10 형질전환체를 초래하는 반면에 pAB4-arp1 빈도로의 형질전환은 적어도 10-100 배 더 높았다. 형질전환체의 표현형 분석은 pAB4-arp1 형질전환체의 pyrG 표현형은 연속적인 선택하에서만 유지되는 반면에, pAB4-1 형질전환체는 pyrG 표현형에 대한 선택의 존재 및 부존재에도 안정하다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 pAB4-arp1 형질전환체에 도입된 플라스미드 DNA 의 자가복제를 확실히 한다. 유사한 결과는 AMA1 서열 또는 그것의 유도체 예를 들어, pAOpryGcosarp1 을 운반하는 택일적인 진균 형질전환 벡터로 얻었다.
(3) 진균 형질전환체 라이브러리의 제조
A.sojaeATCC11906pyrG 또는 관련 돌연변이체, 특히 그것의 조밀한 형태 돌연변이체를 형질전환 벡터 pAOpryGcosarp1 에 기초한A.sojae유전자 라이브러리로 형질전환했다. 벡터는 자유로이 복제하는 벡터 카피를 가지는 고빈도의 형질전환체를 초래한다. 진균 원형질체를A.sojae또는Chrysosporium의 게놈 진균 DNA 클론을 운반하는 코스미드 라이브러리의 DNA 로 Punt 및 Van den Hondel, Methods Enzymol. 1992 216:447-457 에 개시된 대로 처리했고, 형질전환된 원형질체의 일련의 희석은 선택 한천 플레이트에 플레이팅하여 얻어진 형질전환 빈도를 결정했다. 남은 원형질체를 몇 시간동안 선택 배지에서 재생성했고, 4℃에서 저장했다. 형질전환 빈도에 대하여 얻은 결과에 기초하여(실험에 의존하여 코스미드 라이브러리 DNA 의 ㎍당 수천 이하의 형질전환체의 값에 이른다), 재생성 원형질체의 제한적인 희석물을 96,248 의 마이크로타이터 플레이트, 또는 택일적인 웰 포맷에 플레이팅하여 웰당 하나의 형질전환된 원형질체를 초래했다. 플레이트를 35℃ 에서 인큐베이션하여 진균 생체량을 형성했다. 결과적인 형질전환체 라이브러리를 더이상의 실험을 위해 사용한다.
유사한 전략을ChrysosporiumCBH1 의 돌연변이체 대립형질을 운반하는 진균 형질전환체의 수거의 제조를 위해 사용했다. 전략은 또한 돌연변이형성, 유전자 셔플링 또는 유전자-개발 접근법으로 생성되었는지에 관계없이 관심있는 어떤 다른 유전자로부터 유도된 돌연변이체의 라이브러리로 사용될 수 있다.
F. 액침 발효에서 포자형성의 유발
Aspergillus sojae와 같은 많은 진균은 액침 발효에서 포자형성을 보이지 않는다. 본원에서 우리는 이러한 조건하에서 포자형성을 얻는 아직은 미공지의 접근법을 개시한다.A.sojaeATCC 11906 및 특히 그것의 조밀한 성장 형태 돌연변이체를 효모 추출물로 보충된 합성 성장 배지에서 배양했다. 이러한 조건하에서 생체량의 빠른 축적은 정적 및 교반 배양물 모두에서 발생한다. 그러나, 배양 유체에서 무포자형성이 일어난다. 0.6 g/kg EDTA 의 첨가를 가지는 유사한 성장 배지는 35℃ 에서 2-4 일의 인큐베이션후에 ml 배양물 유체당 109포자에 이르는 상당한 양의 포자 산출량을 초래한다.
G. CHRYSOSPORIUM 및 ASPERGILLUS 를 위한 형질전환 시스템
(1) A.niger 오로테이트 p-리보실 트랜스퍼라제 유전자 pyrE 의 클로닝
사상균을 위한 많은 가전성 형질전환 시스템은 유리딘-요구 돌연변이체 균주의 사용에 기초한다. 이러한 돌연변이체 균주는 오로티딘 5 포스페이트 데카르복실라제(OMPD) 또는 오로테이트 p-리보실 트랜스퍼라제(OPRT)가 결여된다(T.Goosen et al., Curr Genet. 1987, 11:499-503; J.Begueret et al., Gene. 1984 32:487-92). 이미 우리는A.nigerOMPD 유전자 pyrG 를 분리했다(W.van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 1987 206:71-5).A.nigerOPRT 유전자(pyrE)의 클로닝은A.nigerFOA-내성 우리딘-요구 비pyrG 돌연변이체의 상보성으로 수행했다. 상보성을 위해서 벡터 pAOpyrGcosarp1에서A.niger코스미드 라이브러리를 사용했다. 상보적인 형질전환체로부터, 현재는 pyrE 로 명명된 상보적인A.niger유전자를 운반하는 게놈 코스미드 클론을 분리했다. pyrE 유전자를 운반하는 5.5 kb SstII 단편을 pBLUESCRIPT(TM)(Stratagene)에 클론하여 벡터 pBLUEpyrE 를 초래했다. pyrE 코딩 영역에 분포하는 벡터의 1.6 kb 단편을 OPRT 유전자의 위치를 확실히하기 위해서 서열결정했다(도 15 참조).
(2) Chrysosporium lucknowense 용 영양요구성 형질전환 시스템
유리딘-요구Chrysosporium lucknowense균주를 PCT 공개 WO 01/09352 에 개시된 방법에 의해서 C1 및 UV18-25 로부터 플루오로로틱 산 내성 유도체로서 선택했다. 플루오로-오로틱 산 내성 유도체의 선택은 2 가지 형태의 유리딘-요구 돌연변이체, 즉 오로티딘 5 포스페이트 데카르복실라제(OMPD) 돌연변이체 또는 오르테이트 p-리보실 트랜스퍼라제(OPRT)돌연변이체의 분리를 초래할 수 있다(T.Goosen et al., Curr Genet. 1987, 11:499-503). 얻은Chrysosporium돌연변이체의 성질을 결정하기 위해서, 형질전환 실험을 이용가능한A.niger유전자 pyrG(OMPD; 벡터 pAB4-1, W.van Hatringsveldt et al., Mol.Gen. Genet. 1987 206:71-5) 및 pyrE(pBLUE-pyrE;OPRT) 로 수행했다. 표 I 에 도시된 대로, pyrE 유전자로 돌연변이체 균주의 형질전환은 영양요구성 형질전환을 초래하여Chrysosporium균주는 OPRT 돌연변이체임을 암시한다. 출원인이 채택한Chrysosporium유전자 명명법에 따라서, 돌연변이체를 pyr5 로 지정했다.
(3) 자율 복제 진균 형질전환 벡터의 제조 및 사용
벡터 pBLUEpyrE 에 기초하여 사상균에 도입된 경우에 벡터에 자율 복제하는 특징을 제공하는 서열을 운반하느 2 개의 유도체를 생성했다.Aspergillus nidulansAMA1 서열을 운반하는 5.5 kb HindIII 단편(J.Verdoes et al., Gene 1994 146:159-65)을 pBLUEpyrE-AMA 를 초래하는 pBLUEpyrE 의 독특한 HindIII 부위에 도입했다. 사람의 말단 서열을 운반하는 2.1 kb(부분) HindIII 단편(A.Aleksenko, L. Ivanova, Mol.Gen.Genet. 1998 260:159-64)을 pBLUEpyrE-TEL 을 초래하는 pBLUEpyrE 의 독특한 HindIII 부위에 도입했다. 벡터를Aspergillus및Chrysosporium0PRT 돌연변이체 균주에 도입하여 영양요구성 형질전환체를 초래한다. 몇몇의 얻어진 형질전환체는 자유로이 복제하는 플라스미드를 운반하는 형질전환체의 래그 표현형 특징을 보였다(J.Verdoes et al., Gene 1994 146:159-65).
(4) Chrysosporium lucknowense 의 형질전환
프로토콜은 본래Aspergillus형질전환에 사용된 과정에 기초한다(P. Punt, C. van den Hondel, Methods in Enzymology 1992 216:447-457). 풍부한 배지(250 ml)를 1L 의 Erlenmeyer 플라스크에서 106포자/ml 의 pyr5Chrysosporium돌연변이체(상기참조)로 접종했다. 배양물을 대기 인큐베이터(300 rpm)의 35 ℃에서 24-28 시간동안 배양했다. 균사체를 무균 Miracloth(TM)여과기(Calbiochem)를 통해 여과했고, ca. 100 ml 1700 모스몰 NaCl/CaCl2(0.27M CaCl2/0.6 M NaCl)로 세척했다. 균사체를 중량을 잰다음, 아이스상에 유지했다. Caylase(TM)(Cayla)를 첨가했고(g 균사체당 20 mg) 1700 모스몰 NaCl/CaCl2(3.3ml/g 균사체) 및 현탁액을 33℃ 대기 인큐베이터(100 rpm)에서 인큐베이션했다. 원형질체를 현미경에 놓았다. 인큐베이션 1-3 시간 후에, 대부분의 균사체는 제조의 미시적 관점에서 대부분의 원형질체를 남겨두고 분해되었다. 원형질체를 무균 Myracloth 여과기를 통해 여과했고 여과물을 1 부피의 냉각 STC 1700(1.2 M 솔비톨/10 mM Tris.HCl pH 7,5/50mM CaCl2/35mM NaCl)으로 세척했다. 원형질체를 4℃ 에서 10 분동안 2500 rpm 으로 와동했다. 펠렛을 STC1700 에서 재현탁했고 재원심분리했다. 재현탁후에, STC 1700 의 펠렛, 원형질체를 계수했다. STC 1700 을 ml 당 최종 농도 2 × 108원형질체에 첨가했다.
벡터 DNA(pAB4-1 또는 pBLUE-pyrE, 1-10㎍)를 무균 튜브의 바닥에 피펫팅하였고, 1㎕ 1M ATA(아우린트리카르본산) 및 100 ㎕ 원형질체(ca. 2×107)를 DNA 에 첨가했다. 마이너스 DNA 음성 대조군을 실험에 포함시켰다. 혼합후에, 원형질체를실내온도에서 25 분동안 인큐베이션했다. PEG6000(60% PEG/50mM CaCl2/10mM Tris pH 7.5)을 하기와 같이 첨가했다: 250㎕, 혼합, 250㎕, 혼합, 850㎕ 및 혼합. 용액을 20 분동안 실내온도에서 유지했다. 그다음, 튜브를 8 ml STC 1700 으로 채웠고, 혼합했고, 4℃ 에서 10 분동안 2500 rpm 으로 원심분리했고, 펠렛을 250 ㎕ STC 1700 에서 현탁했다. 샘플의 앨리쿼트를 선택 배지상에서 플레이팅하는데 사용했다. pyr+선택의 경우에, 1.5% Daishin 한천, 1.2M 솔비톨, 니트레이트를 가지는 1×AspA, 2mM MgSO47H2O, 1×미량원소, 0.1% 카사미노산 및 1% 글루코스를 함유하는 플레이트를 제조했다. amdS(및 pyr+)에 대해 선택된다면, 플레이트는 1.5% Oxoid 한천, 1.2M 솔비톨, 2mM MgSO4.7H2O, 1×미량원소, 1% 글루코스, 니트레이트가 없는 1×AspA, 15mM CsCl 및 10 mM 아세타마이드 또는 아크릴아마이드를 포함했다. 플레이트를 30 또는 35 ℃ 에서 인큐베이션했다.
PEG6000 처리의 전, 후에 포자 및 생존가능한 원형질체를 니트레이트를 가지고, 솔비톨이 있거나 없는 최소 배지 플레이트에서 STC1700 에서의 희석을 플레이팅하여 계수했다. 100 ㎕의 10-1, 10-2및 10-3희석을 솔비톨이 없는 플레이트상에 플레이팅하여 포자를 계수했고, 100 ㎕ 의 10-2, 10-3, 10-4및 10-5희석을 솔비톨을 가지는 플레이트상에 플레이팅하여 생존가능한 원형질체를 계수했다.
형질전환의 결과는 표 I 에 도시된다.
H. 단백질/생체량 비율
셀룰로스 또는 아밀라제를 생산하는Chrysosporium, Trichoderma, 및Aspergillus균주의 경우에, 총 건조 고체를 60 ℃에서 하룻밤동안 및 100 ℃에서 1 시간동안 예비중량된 여과기를 통하여 전육즙의 측정된 앨리쿼트를 통과시키고, 탈이온수로 세척하고, 케이크 및 여과기를 건조시킴으로써 결정했다. 건조기에서 냉각시킨후에, 건조 여과기 및 여과기 케이크의 중량에서 여과기의 무게를 빼고 제거된 육즙의 양으로 나눔으로써 생체량을 결정했다.
Trichoderma및Aspergillus균주의 경우에, 생체량은 측정시에 생체량을 제외한 불용성 물질이 거의 없는 총 건조 고체에 동등하게 측정되었다. 셀룰라제를 생산하는Chrysosporium균주의 경우에, 배지에 셀룰로스의 의미있는 양이 있어서, 생체량을 총 건조 고체 및 셀룰로스간의 차이로 결정했다. 셀룰로스를 하기와 같이 측정했다.
전육즙의 측정된 앨리쿼트를 원심분리하여 고체를 제거했고 상청액을 폐기했다. 펠렛을 본래의 육즙 부피에 동일한 0.1 N NaOH 의 부피로 재현탁했고, 0.5 N NaOH 의 1/10 을 첨가했다. 혼합물을 65℃ 에서 4 시간동안 인큐베이션했다. 이 처리는 셀룰로스를 제외한 모든것을 용해했다. 알칼리 혼합물을 냉각 및 원심분리했고, 상청액을 폐기했다. 결과적인 펠렛을 탈이온수에서 재현탁 및 원심분리에 의해서 2 번 세척했다. 세척된 펠렛을 탈이온수에서 재현탁했고, 예비중량된 팬에 옮겼고, 상기에 개시된 대로 건조했다. 셀룰로스 농도를 건조 중량을 분석된 앨리쿼트의 부피로 나눔으로써 결정했다.
단백질을 면역글로블린 표준을 사용하여 Bradford 건조-결합 과정으로 결정했다(M. Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248). 다양한 사상균에서 선택 발현된 단백질에 대한 단백질/생체량 비율은 표 J 에 제시된다.
I. A.SOJAE 및 C.LUCKNOWENSE 에서 그린 형광 단백질의 발현 및 선택
가전성 및 쉽게 스크리닝할 수 있는 리포터 단백질의 예로서, 해파리Aequoria victoria로부터의 그린 형광 단백질(GFP)은A.sojae및C.lucknowense에서 발현되었다. GFP (A.Santerre Henriksen et al., Microbiology. 1999, 145:729-734) 및 글루코아밀라제-GFP 융합 유전자(pGPDGFP, C.Gordon et al., Micorbiology. 2000 146:415-26)를 운반하는 벡터를 구성적으로 발현되는A.nidulansgpdA 프로모터로 glaA 프로모터를 대체함으로써 변형시켰다. 벡터를 pyrG 또는 amdS 선택 마커를 사용하는 동시형질전환에 의해A.sojae에 도입했다. 벡터 pGPDGFP 및 그것의 유도체를 pyeE 또는 amdS 선택마커를 사용하여Chrysosporium에 도입했다. 발현은 양 벡터에 의한 GFP 의 발현을 확실하게 하는 밝은 형광A.sojae및Chrysosporium형질전환체를 초래했다. 글루코아밀라제-GFP 융합 단백질을 발현하는 형질전환체로부터 배양 상청액의 형광은 형광적으로 활성 융합 단백질의 분비를 나타냈다. 형광 단백질의 발현은 또한 형광 단백질의 비분비 세포질 버전을 발현하는 다양한 형질전환체로부터 얻은 포자(또는 포자-유사 번식자)에서 관찰되었다.
J. 진균 성장 유니트의 전달
96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 다수-채널 피펫으로 수동으로 또는 자동 플레이트-핸들링 시스템의 수단으로 적당한 배지로 로딩한다. 큰 부피가 상호-감염을 증가시키기 때문에, 증발의 문제를 피하기 위해서 부피는 너무 작지 않아야만 한다. COSTAR(TM)3799 둥근-바닥 플레이트를 사용한다면, 예를 들어, 150 ㎕는 작업하기에 적당한 부피이다. 플레이트를 전달을 위한 족집게(toothpick)를 사용하여 플레이트-성장 콜로니의 포자로 접종한다. 택일적으로, 플레이트는 포자, 원형질체 또는 균사 요소 현탁액의 소 앨리쿼트를 피펫팅하여 접종할 수 있다. 현탁액은 분리된 포자/원형질체 용액 또는 마이크로플레이트 배양 포자형성 배양물로부터 유도될 수 있다. 접종은 또한 핀 또는 96 핀 수단으로 마이크로타이터 플레이트로부터 수행될 수 있다.
연속적으로 플레이트를 35℃에서 접종한다. 증발을 최소화하기 위해서, 뚜껑이 있는 플레이트를 사용할 수 있거나 플레이트를 O2, H2O 및 CO2의 교환을 허용하고 플레이트의 표면에 부착하는 멤브레인으로 봉인할 수 있다. 증발을 더욱 제한하기 위해서, 조정된 대기 인큐베이터를 사용할 수 있다.
인큐베이션 3 내지 4 일 후에, 생체량의 양은 신선한 배지를 함유하는 새로운 마이크로타이터 플레이트에 효과적으로 전달하기에 적당하다. 레프리카 플레이트를 제조하기 위해서, 96-핀 수단을 사용한다. 배양물의 서로다른 배열을 가지는 소산 플레이트를 수동 또는 로봇식 피펫팅 또는 핀 전달에 의해 준비할 수 있다. 전달 핀으로 전달가능한 생식 요소의 존재를 확실히 하기 위해서, 핀 수단은 마이크로타이터 플레이트 배양물에 액침하고 20 초동안 진탕한다. 그 다음, 핀 수단을 개시 플레이트로부터 조심스럽게 제거하고, 새로운 마이크로타이터 플레이트에 프린트를 한다. 유사한 효율적인 전달 과정 역시 다수-채널 피펫을 사용하고, 약 1㎕의 모 마이크로타이터 플레이트 배양물을 전달함으로써 얻을 수 있다. 모든 경우에 효율적인 전달은 포자, 포자-유사 번식자, 원형질체, 또는 균사 또는 균사체 단편과 같은 전달가능한 생식 요소의 존재로 얻는다. 원형질체는 세포 벽 분해 효소에 의한 처리로 마이크로플레이트 웰에서 생산될 수 있고, 그 다음 이러한 원형질체을 전달할 수 있다. 미세플레이트에서 원형질체의 형성은 C.van Zeijl et al., J. Biotechnol. 1997 59:221-224 에 개시되었다.
더 이상의 전달의 향상은 35℃에서 마이크로타이터 플레이트 진탕기상에서 마이크로타이터 플레이트 배양물을 접종함으로써 얻는다. 이것은 배양물에서 전달가능한 생식 요소의 수를 증가시킨다. 마이크로타이터 플레이트 배양물을 저장하기 위해서, 글리세롤은 15% 최종 농도에 첨가되고, 플레이트를 -80℃에서 저장한다.연속적인 전달 실험에서, 플레이트를 탈동결건조하고 전달은 이미 개시된대로 수행한다.A.niger및A.sojae의 야생형 또는 상업적 균주로의 효율적인 전달은 본원에 사용된 조건하에서 실행가능하지 않았는데, 이 균주는 1 일후에 활발한 표면 성장 및 대기 포자형성을 보였기 때문이다. 대기 포자형성은 전달동안 거대한 교차-오염을 야기하고, 웰을 커버하는 표면 성장은 연속적으로 대부분의 공지된 분석 방법을 차단한다.
K. 유전자 발견용 진균 발현 라이브러리의 제조
진균 발현 벡터 pAN52-1NOT(EMBL 수탁번호 Z32524)또는 그것의 유도체의 하나에 기초하여, 독특한 BamHI 클로닝 부위가A.nidulansgpdA 유전자용으로 구성적으로 발현된 폭넓은 진균 숙주 범위 프로모터의 바로 다운스트림에 존재하는 벡터를 제조했다(P.Punt et al., J.Biotechnol.1991 17:19-33). 벡터는 번역 개시 코돈(ATG)을 운반하는 게놈 DNA 단편이 발현될 수 있는 방식으로 제조되었다. 벡터용 선택 마커를 제공하기 위해서, pBLUEpyrE 의 NotI-BamHI 단편을 pAN52-BamHI 으로 명명된 NotI-BglII 분해 발현 벡터에 클론하여 벡터 pAN52-pyrE 를 생산했다. 3-6 kb 크기 범위의Chrysosporium게놈 DNA 단편을 부분적인 Sau3A 분해로 얻었다. 단편을 BamHI-분해 발현 벡터 pAN52-pyrE 에 연결한 후에, 총Chrysosporium게놈을 커버하기에 충분한 많은 재조합 클론을 얻었다. 많은 클론을 적어도 5-10 진균 게놈 등가물을 커버하기 위해 수거했다. 이러한 수거물의 플라스미드 DNA를 제조했고,Chrysosporiumpyr5 또는AspergilluspyrE 돌연변이체의 형질전환을 위해 사용했다. 형질전환체 수거물을 상기에 개시된 대로 마이크로플레이트 포맷에서생산했고, 더 이상의 기능/활성 스크리닝을 위해 사용했다. 택일적으로, 발현 라이브러리는 PCT/NL99/00618 에 개시된 대로 특이적으로 조절된Chrysosporium프로모터를 사용하여 제조될 수 있다.
실시예에 언급된 참고문헌
(하기의 목록 및 본원 상기에 언급된 모든 특허 및 참고문헌은 본원에 참고문헌으로 수록된다):

Claims (48)

  1. DNA 벡터의 라이브러리에 의해서 코딩된 다수의 단백질을 발현하는 방법으로서, 벡터의 라이브러리는 다수의 다른 벡터를 포함하고, 각각의 다른 백터는 다른 단백질-코딩 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 발현-조절 영역 및 선택적으로 분비 신호 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며,
    (a) 현탁액에서의 성장 및 전달가능한 생식 요소의 생산을 특징으로 하는 표현형을 가지는 사상균을 제공하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 이종 단백질-코딩 핵산 서열을 다수의 개개의 진균의 각각에 도입하기 위하여 상기 DNA 벡터의 라이브러리로 상기 사상균을 안정하게 형질전환시키는 단계;
    (c) 현탁액에서 전달가능한 생식 요소의 형성에 기여하는 조건하에서 형질전환된 돌연변이체 사상균을 배양하는 단계;
    (d) 다수의 전달가능한 생식 요소를 서로 분리하는 단계; 및
    (e) 이종 단백질-코딩 핵산 서열로 코딩된 이종 단백질의 발현에 기여하는 조건하에서 단일클론 배양물 또는 단일클론 콜로니를 각 전달가능한 생식 요소로 배양하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 발현 방법.
  2. (a) 제 1 항의 방법에 의해서 단일클론 사상균 배양물 또는 단일클론 사상균 콜로니에서 다수의 단백질을 발현하는 단계; 및
    (b) 관심있는 활성 또는 성질에 대해 개개의 클론 배양물 또는 클론 콜로니를 스크리닝하는 단계를 포함하는 관심있는 활성 또는 성질에 대하여 DNA 벡터의 라이브러리로 코딩된 다수의 단백질을 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. (a) 제 1 항의 방법에 의해서, 단일클론 사상균 배양물 또는 단일클론 사상균 콜로니에서 다수의 단백질을 발현하는 단계;
    (b) 관심있는 활성 또는 성질에 대한 개개의 클론 배양물 또는 클론 콜로니를 스크리닝하는 단계;
    (c) 관심있는 활성 또는 성질을 나타내는 클론 배양물 또는 클론 콜로니로부터 DNA 를 분리하는 단계를 포함하는 관심있는 활성 또는 성질을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. (a) 제 3 항의 방법에 의해서, 관심있는 활성 또는 성질을 나타내는 클론 배양물 또는 클론 콜로니로부터 DNA 를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 DNA 를 서열결정하는 단계를 포함하는 관심있는 활성 또는 성질을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. (a) 제 4 항의 방법에 의해서, 관심있는 활성 또는 성질을 가지는 단백질의 DNA 서열을 생산하는 단계; 및
    (b) DNA 서열을 아미노산 서열로 전환시키는 단계를 포함하는 관심있는 활성 또는 성질을 가지는 단백질의 아미노산 서열을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. (a) 제 1 항의 방법에 의해서, 단일클론 사상균 배양물 또는 단일클론 사상균 콜로니로 다수의 단백질을 발현하는 단계; 및
    (b) 관심있는 활성 또는 성질에 대한 각각 개개의 클론 배양물 또는 클론 콜로니를 스크리닝하는 단계를 포함하는 관심있는 활성 또는 성질을 가지는 대사물질에 대한 다수의 단일클론 사상균 배양물 또는 단일클론 사상균 콜로니를 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. (a) 단백질의 돌연변이체 형태를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터의 라이브러리를 제공하는 단계;
    (b) 현탁액에서 성장 및 전달가능한 생식 요소의 생산을 특징으로 하는 표현형을 가지는 사상균을 제공하는 단계;
    (c) 적어도 하나의 이종 단백질-코딩 핵산 서열을 다수의 개개의 진균의 각각에 도입하기 위하여 상기 DNA 벡터의 라이브러리로 상기 사상균을 안정하게 형질전환시키는 단계;
    (d) 전달가능한 생식 요소 형성에 기여하는 조건하에서 형질전환된 사상균을 배양하는 단계;
    (e) 다수의 전달가능한 생식 요소를 서로 분리하는 단계;
    (f) 이종 단백질-코딩 핵산 서열로 코딩된 이종 단백질의 발현에 기여하는 조건으로 개개의 전달가능한 생식 요소를 클론 배양물 또는 클론 콜로니로 배양하는 단계;
    (g) 관심있는 활성 또는 성질을 가지는 발현된 단백질에 대한 개개의 유기물, 클론 배양물, 또는 클론 콜로니 각각을 스크리닝하는 단계;
    (h) 관심있는 활성 또는 성질을 나타내는 단백질을 발현하는 하나 이상의 개개의 유기물, 클론 배양물, 또는 클론 콜로니를 분리하는 단계;
    (i) 관심있는 활성 또는 성질을 나타내는 단백질을 코딩하는 분리된 개개의 유기물, 클론 배양물, 또는 클론 콜로니의 DNA 를 돌연변이시키는 단계;
    (j) 단계(i) 에서 얻어진 돌연변이된 DNA 서열을 포함하는 벡터의 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (k) 관심있는 성질 또는 활성이 바람직한 수준에 이르거나 더이상 개선이 이루어지지 않을 때까지 단계 (b) 내지 (g)를 반복하는 단계를 포함하는 관심있는 활성 또는 성질을 최적화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 단계 (h) 및 (i) 사이에 단계 (h)에서 분리된 하나 이상의 개개의 유기물, 클론 배양물, 또는 클론 콜로니를 배양하는 단계; 관심있는 활성 또는 성질을 나타내는 발현된 단백질을 분리하는 단계; 및 관심있는 성질에 대한 분리된 단백질을 평가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 2 항에 있어서, 스크리닝 단계는 고산출량 스크리닝으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 3 항에 있어서, 스크리닝 단계는 고산출량 스크리닝으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 4 항에 있어서, 스크리닝 단계는 고산출량 스크리닝으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 5 항에 있어서, 스크리닝 단계는 고산출량 스크리닝으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 6 항에 있어서, 스크리닝 단계는 고산출량 스크리닝으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 7 항에 있어서, 스크리닝 단계는 고산출량 스크리닝으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 8 항에 있어서, 스크리닝 단계는 고산출량 스크리닝으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균은 현탁액에서 배양했을 때 최적 또는 거의 최적의 조건에서 적당한 영양소를 가지고 배양되는 경우 발효 말기에서 200 cP 미만의 배양물 점성을 특징으로 하는 표현형을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균은 현탁액에서 배양했을 때 최적 또는 거의 최적의 조건에서 적당한 영양소를 가지고 배양되는 경우 발효 말기에서 100 cP 미만의 배양물 점성을 특징으로 하는 표현형을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균은 현탁액에서 배양했을 때 최적 또는 거의 최적의 조건에서 적당한 영양소를 가지고 배양되는 경우 발효 말기에서 60 cP 미만의 배양물 점성을 특징으로 하는 표현형을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균은 현탁액에서 배양했을 때 최적 또는 거의 최적의 조건에서 적당한 영양소를 가지고 배양되는 경우 발효 말기에서 10 cP 미만의 배양물 점성을 특징으로 하는 표현형을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 진균 신호 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 진균 신호 서열은 셀룰라제, β-갈락토시다제, 크실라나제, 펙티나제, 에스테르아제, 프로테아제, 아밀라제, 폴리갈락투로나제 및 히드로포빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 진균 유전자의 신호 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 선택 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 단백질-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 발현 조절 서열은 유도 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균은Euascomycetes강 인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 진균은Onygenales목인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 진균은Eurotiales목인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균은Saccharomycetales목이 아닌 것을 조건으로Ascomycota문인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균은Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Talaromyces, Emericella및Hypocrea로 구성되는 군으로부터 선택되는 속인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 진균은Aspergillus, Fusarium, Chrysosporium,및Trichoderma로 구성되는 군으로부터 선택된 속인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 진균은 수탁번호 VKM F-3631 D 를 가지는Chrysosporium균주 UV18-25 인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30 항에 있어서, 진균은Trichoderma longibrachiatum균주 X-252 인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 30 항에 있어서, 진균은Aspergillus sojae균주 pclA 인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 30 항에 있어서, 진균은Aspergillus niger균주 pclA 인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 단백질 대 생체량 비율은 적어도 1:1 인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 발현된 단백질 대 생체량 비율은 적어도 2:1 인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 발현된 단백질 대 생체량 비율은 적어도 6:1 인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 발현된 단백질 대 생체량 비율은 적어도 8:1 인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 전달가능한 생식 요소는 각각의 진균 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 전달가능한 생식 요소는 포자인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 전달가능한 생식 요소는 균사 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 전달가능한 생식 요소는 미세펠렛인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 전달가능한 생식 요소는 원형질체인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. (a) 제 2 항의 방법에 의해서, 관심있는 활성 또는 성질에 대한 DNA 벡터의 라이브러리로 코딩된 다수의 단백질을 스크리닝하는 단계;
    (b) 적당한 규모로 이종 단백질 코딩 핵산 서열로 코딩된 이종 단백질의 발현에 기여하는 조건하에서 관심있는 활성 또는 성질을 발현하는 단일클론 배양물 또는 단일클론 콜로니를 배양하는 단계; 및
    (c) 발현된 단백질을 분리하는 단계로 구성되는 관심있는 활성 또는 성질을 가지는 단백질을 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 7 항 또는 제 8 항의 방법에 의해서 관심있는 활성 또는 성질을 최적화하는 단계, 적당한 규모로 최종 단계 (h) 에서 분리된 개개의 생물, 클론 배양물, 또는 클론 콜로니를 배양하는 단계, 및 배양물로부터 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 관심있는 활성 또는 성질을 가지는 단백질을 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. (a) 현탁액에서의 배양을 특징으로하고, 전달가능한 생식 요소의 생산을 특징으로 하는 표현형을 가지는 사상균을 제공하는 단계; 및
    (b) 적어도 하나의 이종 단백질-코딩 핵산 서열을 다수의 개개의 진균에 도입하기 위해서 DNA 벡터의 라이브러리로 상기 사상균을 안정하게 형질전환시키는 단계를 포함하며, DNA 벡터의 라이브러리는 다수의 다른 벡터를 포함하고, 각 다른 벡터는 다른 단백질-코딩 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 발현-조절 영역 및 선택적으로 분비 신호 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 사상균 라이브러리의 제조 방법.
  47. 제 43 항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 형질전환된 사상균의 라이브러리.
  48. (a) 제 2 의 방법에 의해서, 관심있는 활성 또는 성질에 대한 DNA 벡터의 라이브러리에 의해서 코딩된 다수의 단백질을 스크리닝하는 단계; 및
    (b) 관심있는 활성 또는 성질을 발현하는 단일클론 배양물 또는 단일클론 콜로니를 분리하는 단계로 구성되는 관심있는활성 또는 성질을 가지는 단백질을 발현하는 형질전환된 사상균 숙주를 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
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