KR101433381B1 - 다발성 골수종의 치료를 위한 ｃｄ38에 대한 항체 - Google Patents

다발성 골수종의 치료를 위한 ｃｄ38에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

인간 CD38에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체, 및 관련된 항체-기재 조성물 및 분자가 개시된다. 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 인간 항체를 사용하기 위한 치료 및 진단 방법이 또한 개시된다.
CD38, CD38 결합 펩티드, 항-CD38 항체, 다발성 골수종

Description

다발성 골수종의 치료를 위한 ＣＤ38에 대한 항체{ANTIBODIES AGAINST CD38 FOR TREATMENT OF MULTIPLE MYELOMA}
본 발명은 특이적 특성이 있고 특히 다발성 골수종을 치료하는데 유용한, CD38에 결합하는 항체에 관한 것이다.
다발성 골수종은 증식 지수가 낮고 수명이 연장된 분비성 형질 세포의 골수 내의 잠복성 축적을 특징으로 하는 B 세포 악성종양이다. 이 질환은 궁극적으로 뼈 및 골수를 공격하여, 결과적으로 골격계 전반에 걸쳐 다발성 종양 및 병변이 초래된다.
모든 암의 약 1％, 및 모든 혈액 악성종양의 10％를 약간 초과하는 정도가 다발성 골수종 (MM)에 기인할 수 있다. MM의 빈도는 노화 집단에서 증가하고, 진단 시점에서의 평균 연령은 약 61세이다.
다발성 골수종에 대한 현재 입수가능한 요법에는 화학요법, 줄기 세포 이식, Thalomid® (탈리도미드), Velcade® (보르테조밉), Aredia® (파미드로네이트), 및 Zometa® (졸레드론산)이 포함된다. 화학요법제 예컨대 빈크리스틴, BCNU, 멜팔란, 시클로포스파미드, 아드리아마이신, 및 프레드니손 또는 덱사메타손과 같은 화학요법제들의 조합을 포함하는 현재의 치료 프로토콜로는 오직 약 5％의 완전 완화 율이 산출되고, 평균 생존은 진단 시점으로부터 약 36-48개월이다. 고용량 화학요법에 이어서 자가 골수 또는 말초혈 단핵 세포 이식을 사용하는 최근의 진전으로 완전 완화율 및 완화 기간이 증가되었다. 그러나, 전체적인 생존만이 약간 연장되었고, 치료에 대한 증거가 수득되지 않았다. 결국, 인터페론-알파 (IFN-α) 단독 또는 스테로이드와 조합된 유지 요법 하에서도 모든 MM 환자는 재발하였다.
MM에 대한 입수가능한 화학요법적 치료 요법의 효능은 낮은 세포 증식 속도 및 다중 약물 내성의 발달로 인해 제한된다. 90％를 초과하는 MM 환자에 대해, 질환이 화학요법저항성이 된다. 그 결과, 형질 세포 상의 표면 항원을 표적으로 하는 입양 면역요법을 목표로 하는 별법적인 치료 요법이 추구된다.
CD38은 이같은 악성 형질 세포 상에서 발현되는 항원의 예이고, 다발성 골수종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, B-세포 급성 림프구성 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 원발성 전신 아밀로이드증, 외투 세포 림프종, 전-림프구성/골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 여포성 림프종, NK-세포 백혈병 및 형질 세포 백혈병이 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 악성 혈액학적 질환에서 발현된다. CD38의 발현은 전립선 내의 샘상피, 췌장 내의 섬세포, 귀밑샘이 포함되는 샘 내의 도관 상피, 기관지 상피 세포, 고환 및 난소 내의 세포 및 직장결장 샘암종 내의 종양 상피를 포함하여 여러 기원의 상피/내피 세포에서 기술되었다. CD38 발현이 수반될 수 있는 질환에는 폐의 기관지-상피 암종, 유방암 (유방의 소엽 및 관 내의 표면 상피의 악성 증식으로부터 발달됨), B-세포로부터 발달되는 췌장 종양 (인슐린종), 장 내의 상피로부터 발달되는 종양 (예를 들어 샘암종 및 편평 세포 암종)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. CNS에서는, 신경모세포종이 CD38을 발현한다. 기타 질환에는 전립선에서의 암종, 고환에서의 고환종, 및 난소암이 포함된다.
정상적으로, CD38은 조혈 세포에 의해, 그리고 고체 조직에서 발현된다. 조혈 세포와 관련하여, 대다수의 수질 흉선세포는 CD38+이고, 휴지기 및 순환 T- 및 B-세포는 CD38-이며, 활성화된 세포는 CD38+이다. CD38은 약 80％의 휴지기 NK 세포 및 단핵세포 상에서, 그리고 림프절 배중심 림프모구, 형질 B 세포 및 일부 여포내 세포 상에서 또한 발현된다. CD38은 수지상 세포에 의해 또한 발현될 수 있다. 상당한 비율의 정상 골수 세포, 특히 전구체 세포가 CD38을 발현한다. 또한, 탯줄 혈액 세포의 50-80％가 CD38+이고, 생애 최초의 2 내지 3년 동안 인간 혈액 내에서 이렇게 유지된다. 림프구 전구체 세포에 더하여, CD38은 적혈구 및 혈소판 상에서 또한 발현된다.
고체 조직과 관련하여, CD38은 장 내의 상피내 세포 및 고유판 림프구에 의해, 뇌 내의 푸르키니에 세포 및 신경섬유 매듭에 의해, 전립선 내의 상피 세포, 췌장 내의 β-세포, 뼈 내의 파골세포, 눈 내의 망막 세포 및 평활근 및 횡문근의 횡문근형질막에 의해 발현된다.
CD38에 기인하는 기능에는 부착 및 신호전달 이벤트에서의 수용체 매개 및 (외부(ecto)-)효소 활성 모두가 포함된다. 외부효소(ectoenzyme)로서, CD38은 NAD+ 를 고리형 ADP-리보스 (cADPR) 및 ADPR의 형성, 뿐만 아니라 니코틴아미드 및 니코틴산-아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NAADP)의 형성을 위한 기질로서 사용한다. cADPR은 소포체로부터의 Ca2 + 동원을 위한 2차 메신저로 작용하는 것으로 나타났다. Ca2 +를 통한 신호전달에 더하여, CD38 신호전달은 T 및 B 세포 상의 항원-수용체 복합체 또는 다른 유형의 수용체 복합체, 예를 들어 MHC 분자와의 혼선을 통해 발생하고, 이러한 방식으로 여러 세포성 응답에서, 뿐만 아니라 IgG1의 스위칭(switching) 및 분비에서 또한 수반된다.
항-CD38 항체가 문헌, 예를 들어, [Lande R, et al., Cell Immunol. 220(1), 30-8 (2002)], [Ausiello CM, et al., Tissue Antigens. 56(6), 539-47 (2000)], 및 [Cotner T, et al., Int J Immunopharmacol. 3(3), 255-68 (1981)]에 기술되어 있다. CD38에는 다수의 기능이 있고, 이러한 기능은 CD38에 결합하는 분자에 의해 활성화될 수 있거나, 활성화되지 않을 수 있다. 예를 들어, 마우스 항-CD38 항체 IB4는 CD38과 관련하여 작동성 성질을 갖는다. IB4는 주르캇(Jurkat) 세포에서의 Ca2+ 동원에 의해 지시되는 바와 같이 T 세포 활성화를 유도하고 ([Zubiaur M, et al., J Immunol. 159(1), 193-205 (1997)], 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 상당한 증식을 유도하며, 상당한 수준의 IL-6 방출을 유도하고, 검출가능한 수준의 IFN-γ 방출을 유도하는 것 ([Lande, Zubiaur Morra, Ansiello, 상기 문헌)으로 나타난다.
발명의 개요
본 발명은
(i) 각각 서열 1 및 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
(ii) 각각 서열 11 및 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
(iii) 각각 서열 21 및 서열 26에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산; 또는
(iv) (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 바와 같은 서열의 보존적 서열 변형물인 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산
에 의해 코딩되는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 10에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 5에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3 및 서열 10에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 경쇄 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 3에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 4에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 5에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 9에 기재 된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 10에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 2에 기재된 바와 같은 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 VL 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 7의 VH CDR1 - VH CDR3 영역에 스패닝(spanning)된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 7에 기재된 바와 같은 서열 또는 서열 7의 VH CDR1 - VH CDR3 스패닝 영역에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 7에 기재된 바와 같은 서열 또는 서열 7의 VH CDR1 - VH CDR3 스패닝 영역과 비교하여 1-5개, 예컨대 1-3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 VL 영역 및 상기 정의된 바와 같은 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 20에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 15에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3 및 서열 20에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 경쇄 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 13에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 14에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 15에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 18에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 19에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 20에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 12에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 12에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 VL 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공 한다.
본 발명은 서열 17에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 17의 VH CDR1 - VH CDR3 영역에 스패닝된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 17에 기재된 바와 같은 서열 또는 서열 17의 VH CDR1 - VH CDR3 스패닝 영역에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 17에 기재된 바와 같은 서열 또는 서열 17의 VH CDR1 - VH CDR3 스패닝 영역과 비교하여 1-5개, 예컨대 1-3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 VL 영역 및 상기 정의된 바와 같은 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 30에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 25에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3 및 서열 30에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 경쇄 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 23에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 24에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 25에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 28에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 29에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 30에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 22에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 22에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 VL 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 27에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 27의 VH CDR1 - VH CDR3 영역에 스패닝된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 27에 따른 서열 또는 서열 27의 VH CDR1 - VH CDR3 스패닝 영역에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 27에 기재된 바와 같은 서열 또는 서열 27의 VH CDR1 - VH CDR3 스패닝 영역과 비교하여 1-5개, 예컨대 1-3개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 VL 영역 및 상기 정의된 바와 같은 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 인간 CD38 (서열 31)에 결합하고, 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는 펩티드를 제공한다.
본 발명은 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만, 예컨대 10％ 미만, 5％ 미만 또는 1％ 미만인, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
본 발명은 인간 CD38 (서열 31)에 결합하고, 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는 펩티드를 제공한다.
본 발명은 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인 간 CD38 (서열 33)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만, 예컨대 10％ 미만, 5％ 미만 또는 1％ 미만인, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
본 발명은 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하는, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
본 발명은 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 75％ - 125％에 상응하는, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
본 발명은
(i) 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하고,
(ii) 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하고,
(iii) 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하는 결합 특성을 갖는, 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 펩티드를 제공한다.
본 발명은
(i) 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않고,
(ii) 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않고,
(iii) 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하는 결합 특성을 갖는, 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 펩티드를 제공한다.
본 발명은 EC50이 본 명세서의 실시예 17에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 결정되는, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
본 발명은 CD38에의 결합에 대해 상기 실시양태 (i)에 따른 항체와 경쟁하는 펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 흡수에 의해 평가시 90％ 이상의 신호로 경쟁이 정의되는 본 명세서의 실시예 8 또는 9에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여, 또는 형광에 의해 평가시 90％ 이상의 신호로 경쟁이 정의되는 명세서의 실시예 7에 기술된 바와 같은 교차-차단 측정법을 사용하여 경쟁이 결정된다.
본 발명은 CD38 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이러한 에피토프는 상기 정의된 바와 같은 항체가 또한 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공한다.
본 발명은 인간 CD38 (서열 31)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG에 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공한다.
본 발명은 인간 CD38에 결합하는 것에 대한 특이적 결합 특성이 상기 정의된 바와 같은 항체와 실질적으로 동일한 펩티드를 제공한다.
본 발명은
(i) CD38의 길항제로 작용함;
(ii) 본 명세서의 실시예 18에 기술된 방법에 의해 결정시 말초혈 단핵 세포의 현저한 증식을 유도하지 않음;
(iii) 본 명세서의 실시예 19에 기술된 방법에 의해 결정시 인간 단핵구 또는 말초혈 단핵 세포에 의한 현저한 IL-6 방출을 유도하지 않음;
(iv) 본 명세서의 실시예 20에 기술된 방법에 의해 결정시 인간 T 세포 또는 말초혈 단핵 세포에 의한 검출가능한 IFN-γ 방출을 유도하지 않음;
(v) 본 명세서의 실시예 12에 기술된 바와 같은 방법에 의해 CD38 발현 세포에 의해 내재화되고; 예컨대 37℃에서 5 내지 15분 이내에 CHO-CD38 세포에 의해 내재화됨;
(vi) 본 명세서의 실시예 5에 기술된 방법에 의해 결정시 ADCC를 유도하고; 예컨대 Daudi-luc 세포에서 15 ng/㎖ 미만, 예컨대 10 ng/㎖ 미만의 EC50 값으로, 그리고 MM 세포에서 75 ng/㎖, 예컨대 50 ng/㎖, 30 ng/㎖ 또는 10 ng/㎖ 미만의 EC50 값으로 유도함;
(vii) 본 명세서의 실시예 6에 기술된 방법에 의해 보체의 존재 하에 CDC를 유도하고; 예컨대 daudi-luc 또는 CD38-CHO 세포에서 5 ㎍/㎖ 미만, 예컨대 1 ㎍/ ㎖ 미만의 EC50 값으로 유도함;
(viii) cGDPR의 합성을 억제함;
(ix) cADPR의 합성을 억제함;
(x) 본 명세서의 실시예 20에 기술된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시, 10-8 M 미만, 예컨대 10-8 M 내지 10-11 M 범위, 예를 들어 7 × 10-9 M 내지 10-10 M 범위의 친화력 (KD)으로 인간 CD38에 결합함
중 1가지 이상의 특성을 갖는, 인간 CD38에 결합하는 펩티드를 제공한다.
본 발명은 본 명세서의 실시예 24에 기술된 분광광도측정 방법에 의해 결정시 3 ㎍/㎖의 농도에서 90분 후 cGDPR의 합성을 25％ 이상, 예컨대 30％ 이상 억제하는, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
본 발명은 문헌 [Munshi et al., J. Biol. Chem. 275, 21566-21571 (2000)]에 기술된 HPLC 방법에 의해 결정시 3 ㎍/㎖의 농도에서 90분 후 cADPR의 합성을 25％ 이상, 예컨대 30％ 이상 억제하는, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 펩티드는 인간 모노클로날 항체이다.
본 발명은 전장 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체, 예컨대 IgG1 항체, 바람직하게는 IgG1,κ 항체 또는 IgM 항체, 바람직하게는 IgM,κ 항체인 것을 특징으로 하는, 상기 정의된 바와 같은 항체를 제공한다.
본 발명은
(i) 인간 Hv1263/3M28 (VHI) 생식계열 서열로부터 유래된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 인간 L15 (VκI) 생식계열 서열로부터 유래된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (이때, 인간 항체는 인간 CD38에 결합함); 또는
(ii) 인간 VH3-DP-47/V3-23 (VHIII) 생식계열 서열로부터 유래된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 인간 L6 (VκI) 생식계열 서열로부터 유래된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (이때, 인간 항체는 인간 CD38에 결합함)
을 포함하는, 단리된 인간 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명은 펩티드가 진핵생물 세포 내에서 글리코실화되는, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
본 발명은 방사성 동위원소를 부착시키기 위한 킬레이터 링커를 추가로 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
본 발명은 실질적으로 단리된 형태인, 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은
(i) 서열 1의 VL 뉴클레오티드 서열;
(ii) 서열 6의 VH 뉴클레오티드 서열;
(iii) 서열 1의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 6의 VH 뉴클레오티드 서열;
(iv) 서열 11의 VL 뉴클레오티드 서열;
(v) 서열 16의 VH 뉴클레오티드 서열;
(vi) 서열 11의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 16의 VH 뉴클레오티드 서열;
(vii) 서열 21의 VL 뉴클레오티드 서열;
(viii) 서열 26의 VH 뉴클레오티드 서열; 또는
(ix) 서열 21의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 26의 VH 뉴클레오티드 서열
을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 인간 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 인간 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 IgG1 항체를 코딩하는, 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은
(i) 각각 서열 1 및 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
(ii) 각각 서열 11 및 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
(iii) 각각 서열 21 및 서열 26에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산; 또는
(iv) (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 서열의 보존적 서열 변형물인 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산
을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 제공한다.
본 발명은
(i) 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열;
(ii) 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열;
(iii) 서열 22에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 27에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열; 또는
(iv) (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 및 인간 중쇄 가 변 아미노산 서열의 보존적 서열 변형물
을 포함하는, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
본 발명은
(i) 각각 서열 1 및 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
(ii) 각각 서열 11 및 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
(iii) 각각 서열 21 및 서열 26에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산; 또는
(iv) (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 서열의 보존적 서열 변형물인 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산
을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마(transfectoma)를 제공한다.
본 발명은
(i) 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열;
(ii) 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열;
(iii) 서열 22에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 27에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열; 또는
(iv) (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 및 인간 중쇄 가변 아미노산 서열의 보존적 서열 변형물
을 포함하는, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바에 따르는 펩티드를 생산하는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 함유하는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 검출가능한 양의 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 생산하는, 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 비-인간 동물 또는 식물을 제공한다.
본 발명은 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 포함하고, 펩티드가 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 단량체성 IgM 항체인 면역접합체를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드, 및 인간 이펙터 세포에 대한 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드, 및 CD3, CD4, CD138, IL-15R, 막 결합형 또는 수용체 결합형 TNF-α, 인간 Fc 수용체, 또는 막 결합형 또는 수용체 결합형 IL-15에 대한 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드 또는 상기 정의된 바와 같은 면역접합체, 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 1가지 이상의 추가적인 치료제를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 CD38을 발현하는 세포의 성장 및/또는 증식이 억제되도록 상기 정의된 바와 같은 펩티드, 상기 정의된 바와 같은 면역접합체, 상기 정의된 바와 같은 제약 조성물, 또는 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하는, CD38을 발현하는 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 상기 정의된 바와 같은 펩티드, 상기 정의된 바와 같은 면역접합체, 상기 정의된 바와 같은 제약 조성물, 또는 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 대상에게 상기 정의된 바와 같은 펩티드, 상기 정의된 바와 같은 면역접합체, 상기 정의된 바와 같은 제약 조성물, 또는 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 질환 또는 장애는 류머티스성 관절염이다.
한 실시양태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종이다.
한 실시양태에서, 방법은 1가지 이상의 추가적인 치료제를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 1가지 이상의 추가적인 치료제는 화학요법제, 항염증제, 또는 면역억제제 및/또는 면역조절제로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 1가지 이상의 추가적인 치료제는 시스플라틴(cisplatin), 제피티닙(gefitinib), 세툭시맵(cetuximab), 리툭시맵(rituximab), 베바시주맵(bevacizumab), 에를로티닙(erlotinib), 보르테조밉(bortezomib), 탈리도미드(thalidomide), 파미드로네이트(pamidronate), 졸레드론산(zoledronic acid), 클로드로네이트(clodronate), 리센드로네이트(risendronate), 이반드로네이트(ibandronate), 에티드로네이트(etidronate), 알렌드로네이트(alendronate), 틸루드로네이트(tiludronate), 삼산화비소, 레날리도미드(lenalidomide), 필그라스팀(filgrastim), 페그필그라스팀(pegfilgrastim), 사르그라모스팀(sargramostim), 수베로일아닐리드 히드록삼산, 및 SCIO-469로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명은
a) 상기 정의된 바와 같은 펩티드와 샘플을 펩티드와 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 접촉시키는 단계; 및
b) 복합체의 형성을 검출하는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위한 시험관내 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 포함하는, 샘플 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은
a) 상기 정의된 바와 같은 펩티드를 펩티드와 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 투여하는 단계; 및
b) 형성된 복합체를 검출하는 단계
를 포함하는, 대상 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포를 검출하기 위한 생체내 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체가 샘플 내의 상기 정의된 바와 같은 항체의 수준을 검출하는데 사용된다.
한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체가 샘플 내의 CD38에 대한 인간 모노클로날 항체의 수준을 검출하는데 사용된다.
도 1A는 유동 세포측정법에 의해 측정된 CD38-형질감염 CHO (CHO-CD38) 세포에 대한 -003, -005 및 이소타입 대조군 항체 HuMab-KLH의 결합을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 4에 기술된다.
도 1B는 유동 세포측정법에 의해 측정된 CD38-형질감염 CHO (CHO-CD38) 세포 에 대한 -024 및 HuMab-KLH의 결합을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 4에 기술된다.
도 2A는 유동 세포측정법에 의해 측정된 Daudi 세포에 대한 -003, -005 및 HuMab-KLH의 결합을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 4에 기술된다.
도 2B는 유동 세포측정법에 의해 측정된 Daudi 세포에 대한 -024 및 HuMab-KLH의 결합을 나타낸다
도 3은 다발성 골수종 세포에 대한 -003, -005, -024 및 HuMab-KLH의 결합을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 4에 기술된다.
도 4A는 리툭시맵 및 HuMab-KLH와 비교하여 ADCC에 의한 Daudi 세포의 용해를 유도하는 -003 및 -005의 능력을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 5에 기술된다.
도 4B는 HuMab-KLH와 비교하여 ADCC에 의한 Daudi 세포의 용해를 유도하는 -024의 능력을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 5에 기술된다.
도 5A는 HuMab-KLH와 비교하여 ADCC에 의한 새로운 다발성 골수종 종양 세포의 용해를 유도하는 -003, -005 및 -024의 능력을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 5에 기술된다.
도 5B는 HuMab-KLH와 비교하여 ADCC에 의한 새로운 형질 세포 백혈병 종양 세포의 용해를 유도하는 -003, -005 및 -024의 능력을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 5에 기술된다.
도 6은 HuMab-KLH와 비교하여 ADCC에 의한 JK6L (다발성 골수종 세포주)의 용해를 유도하는 -003 및 -005의 능력을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 5에 기술 된다.
도 7은 HuMab-KLH와 비교하여 ADCC에 의한 AMO-1 (다발성 골수종 세포주)의 용해를 유도하는 -003 및 -005의 능력을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 5에 기술된다.
도 8은 HuMab-KLH와 비교하여 -003 및 -005에 의해 유도되는 Daudi-luc 세포의 CDC-매개 용해를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 6에 기술된다.
도 9A는 HuMab-KLH와 비교하여 -003 및 -005에 의해 유도되는 CHO-CD38 세포의 CDC-매개 용해를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 6에 기술된다.
도 9B는 HuMab-KLH와 비교하여 -024에 의해 유도되는 CHO-CD38 세포의 CDC-매개 용해를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 6에 기술된다.
도 10A는 -003, -005 및 HuMab-KLH의 존재 하에서의 3％ 불응성 종양 세포의 CDC-매개 용해를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 6에 기술된다.
도 10B는 -003, -005 및 HuMab-KLH의 존재 하에서의 9％ 불응성 종양 세포의 CDC-매개 용해를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 6에 기술된다.
도 10C는 -003, -005 및 HuMab-KLH의 존재 하에서의 30-40％ 종양 세포의 CDC-매개 용해를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 6에 기술된다.
도 10D는 -003, -005 및 HuMab-KLH의 존재 하에서의 70％ 종양 세포의 CDC-매개 용해를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 6에 기술된다.
도 10E는 -024 및 HuMab-KLH의 존재 하에서의 다발성 골수종 세포의 CDC-매개 용해를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 6에 기술된다.
도 11은 -003 및 -005가 CD38에 대한 결합을 교차-차단하지 않는다는 것을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 7에 기술된다.
도 12A는 -003으로의 대식세포, 림프구 및 형질 B 세포의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 12B는 -003으로의 기관지 상피의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 12C는 -003으로의 근육세포의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 12D는 -003으로의 사이노몰구스(cynomolgus) 림프 조직의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 13A는 -005로의 대식세포, 림프구 및 형질 B 세포의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 13B는 -005로의 기관지 상피의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 13C는 -005로의 근육세포의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 13D는 -005로의 사이노몰구스 림프 조직의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 14A는 CD31로의 간 내피의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 14B는 vWF로의 간 내피의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 14C는 항-KLH로의 간 내피의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다,
도 14D는 -003으로의 간 내피의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 14E는 -005로의 간 내피의 면역조직학적 염색을 나타낸다. 실험 설정은 실시예 10에 기술된다.
도 15A는 유동 세포측정법에 의해 측정된, 사이노몰구스 림프구 상에서의 -003 및 -005의 교차반응성을 HuMab-KLH와 비교하여 나타낸다. 실험 설정은 실시예 11에 기술된다.
도 15B는 유동 세포측정법에 의해 측정된, 사이노몰구스 단핵구 상에서의 -003 및 -005의 교차반응성을 HuMab-KLH와 비교하여 나타낸다. 실험 설정은 실시예 11에 기술된다.
도 15C는 유동 세포측정법에 의해 측정된, 붉은털 원숭이(rhesus monkey) PBMC 상에서의 -003 및 -005의 교차반응성을 HuMab-KLH와 비교하여 나타낸다. 실험 설정은 실시예 11에 기술된다.
도 16A는 EtBr-켄칭(quenching)에 의해 측정된 -003의 내재화를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 12에 기술된다.
도 16B는 EtBr-켄칭에 의해 측정된 -005의 내재화를 나타낸다. 실험 설정은 실시예 12에 기술된다.
도 17A은 생체내 SCID 루시페라제 이미지화에 의해 측정된, 예방 환경에서의 종양 세포 성장의 -003 및 -005에 의해 야기된 억제를 항-CD20 모노클로날 항체 (리툭시맵) 및 HuMab-KLH와 비교하여 나타낸다. 실험 설정은 실시예 13에 기술된다.
도 17B는 생체내 SCID 루시페라제 이미지화에 의해 측정된, 치료 환경 I에서의 종양 세포 성장의 -003 및 -005에 의해 야기된 억제를 항-CD20 모노클로날 항체 (리툭시맵) 및 HuMab-KLH와 비교하여 나타낸다. 실험 설정은 실시예 13에 기술된다.
도 17C는 생체내 SCID 루시페라제 이미지화에 의해 측정된, 치료 환경 II에서의 종양 세포 성장의 -003 및 -005에 의해 야기된 억제를 항-CD20 모노클로날 항체 (리툭시맵) 및 HuMab-KLH와 비교하여 나타낸다. 실험 설정은 실시예 13에 기술된다.
도 17D는 생체내 SCID 루시페라제 이미지화에 의해 측정된, 치료 환경 III에서의 -003 및 -024에 의한 종양 세포 성장의 억제를 HuMab-KLH와 비교하여 나타낸다. 실험 설정은 실시예 13에 기술된다.
도 18은 가교의 존재 또는 부재 하의 -003 및 -005에 의한 세포자멸사의 유도를 항-CD20 모노클로날 항체 (리툭시맵) 및 HuMab-KLH와 비교하여 나타낸다. 실험 설정은 실시예 14에 기술된다.
도 19는 항-KLH (HuMab-KLH) 또는 -005로의 처리 후 제14일의 이식된 RA- SCID 마우스 이종이식편 내의 CD38-양성 세포의 조직학적 점수를 나타낸다. 방법은 실시예 15에 기술된다.
도 20은 항-KLH (HuMab-KLH) 또는 -005로의 처리 후 제14일의 이식된 RA-SCID 마우스 이종이식편 내의 CD138-양성 세포의 조직학적 점수를 나타낸다. 방법은 실시예 15에 기술된다.
도 21은 이식 전 (A), 항-KLH로의 처리 후 (B), 또는 -005로의 처리 후 (C)의 이종이식편 내의 B 세포의 CD38 염색을 나타낸다. 방법은 실시예 15에 기술된다.
도 22는 이식 전 (A), 항-KLH로의 처리 후 (B), 또는 -005로의 처리 후 (C)의 이종이식편 내의 B 세포의 CD138 염색을 나타낸다. 방법은 실시예 15에 기술된다.
도 23은 ELISA에 의해 측정된, 야생형 및 돌연변이 인간 CD38에 대한 -003 및 -005의 결합을 나타낸다. 23A: T237A 돌연변이 인간 CD38에 대한 -003 및 -005의 결합. 23B: Q272R 돌연변이 인간 CD38에 대한 -003 및 -005의 결합. 23C: S274F 돌연변이 인간 CD38에 대한 -003 및 -005의 결합. 방법은 실시예 17에 기술된다.
도 24는 HuMab-KLH와 비교하여, 인간 PBMC의 증식 (A), IL-6 생산 (B) 및 IFN-γ 생산 (C)에 대한 -003 및 -005의 효과를 나타낸다. 방법은 각각 실시예 18, 19 및 20에 기술된다.
도 25는 다양한 농도의 -003 (B), -005 (C), -024 (D) 또는 항-KLH (A)의 존재 하에서의 cGDP리보스의 효소에 의한 생산을 나타낸다. 방법은 실시예 23에 기술된다.
도 26은 CHO-CD38 세포의 CDC (26A), Daudi 세포의 CDC (26B), 및 Daudi 세포의 ADCC (26C)에서의 -003, -005 및 형태형성 항체 TH-3079 간의 경쟁을 나타낸다.
본 발명의 서열들이 첨부된 서열 목록에서 제시된다.
서열 1은 항체 -003의 VL 영역의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2는 항체 -003의 VL 영역의 아미노산 서열이다.
서열 3은 서열 2의 aa 24-34를 포함하는 항체 -003의 VL CDR1의 아미노산 서열이다.
서열 4는 서열 2의 aa 50-56을 포함하는 항체 -003의 VL CDR2의 아미노산 서열이다.
서열 5는 서열 2의 aa 89-97을 포함하는 항체 -003의 VL CDR3의 아미노산 서열이다.
서열 6은 항체 -003의 VH 영역의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 7은 항체 -003의 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열 8은 서열 7의 aa 31-35를 포함하는 항체 -003의 VH CDR1의 아미노산 서열이다.
서열 9는 서열 7의 aa 50-66을 포함하는 항체 -003의 VH CDR2의 아미노산 서열이다.
서열 10은 서열 7의 aa 99-109를 포함하는 항체 -003의 VH CDR3의 아미노산 서열이다.
서열 11은 항체 -005의 VL 영역의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 12는 항체 -005의 VL 영역의 아미노산 서열이다.
서열 13은 서열 12의 aa 24-34를 포함하는 항체 -005의 VL CDR1의 아미노산 서열이다.
서열 14는 서열 12의 aa 50-56을 포함하는 항체 -005의 VL CDR2의 아미노산 서열이다.
서열 15는 서열 12의 aa 89-97을 포함하는 항체 -005의 VL CDR3의 아미노산 서열이다.
서열 16은 항체 -005의 VH 영역의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 17은 항체 -005의 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열 18은 서열 17의 aa 31-35를 포함하는 항체 -005의 VH CDR1의 아미노산 서열이다.
서열 19는 서열 17의 aa 50-66을 포함하는 항체 -005의 VH CDR2의 아미노산 서열이다.
서열 20은 서열 17의 aa 99-111을 포함하는 항체 -005의 VH CDR3의 아미노산 서열이다.
서열 21은 항체 -024의 VL 영역의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 22는 항체 -024의 VL 영역의 아미노산 서열이다.
서열 23은 서열 22의 aa 24-34를 포함하는 항체 -024의 VL CDR1의 아미노산 서열이다.
서열 24는 서열 22의 aa 50-56을 포함하는 항체 -024의 VL CDR2의 아미노산 서열이다.
서열 25는 서열 22의 aa 89-97을 포함하는 항체 -024의 VL CDR3의 아미노산 서열이다.
서열 26은 항체 -024의 VH 영역의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 27은 항체 -024의 VH 영역의 아미노산 서열이다.
서열 28은 서열 27의 aa 31-35를 포함하는 항체 -024의 VH CDR1의 아미노산 서열이다.
서열 29는 서열 27의 aa 50-66을 포함하는 항체 -024의 VH CDR2의 아미노산 서열이다.
서열 30은 서열 27의 aa 99-111을 포함하는 항체 -024의 VH CDR3의 아미노산 서열이다.
서열 31은 인간 CD38의 서열이다.
서열 32는 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38의 서열이다.
서열 33은 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38의 서열이다.
서열 34는 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38의 서열이다.
본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 다양한 장애, 예컨대 다발성 골수종의 치료, 진단 및 예방에 유용할 수 있는 CD38 결합 펩티드 ("CD38BP")를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 항체 -003이다. -003은 서열 2의 서열로 구성된 VL 영역 및 서열 7의 서열로 구성된 VH 영역을 갖는 인간 모노클로날 IgG1 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 항체 -005이다. -005는 서열 12의 서열로 구성된 VL 영역 및 서열 17의 서열로 구성된 VH 영역을 갖는 인간 모노클로날 IgG1 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 항체 -024이다. -024는 서열 22의 서열로 구성된 VL 영역 및 서열 27의 서열로 구성된 VH 영역을 갖는 인간 모노클로날 IgG1 항체이다.
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열들보다 각각의 서열들 간에 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크(framework) 서열 상에 그래프트(gratf)된 특이적인 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적인 천연 발생 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, [Riechmann, L. et al., Nature 332, 323-327 (1998)], [Jones, P. et al., Nature 321, 522-525 (1986)] 및 [Queen, C. et al., PNAS USA 86, 10029-10033 (1989)] 참조).
항체 중쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 한다는 것이 당업계에 주지되어 있기 때문에 ([Ditzel HJ, et al., J Immunol. 157(2), 739-49 (1996)], [Barbas SM et al., J. Am. Chem. Soc. 116, 2161-2162 (1994)], 및 [Barbas SM et al., Proc Natl Acad Sci USA 92(7), 2529-33 (1995)]), 본 발명의 CD38BP는 -003 또는 -005 또는 -024의 중쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 본 발명의 CD38BP는 또한 -003 또는 -005 또는 -024의 중쇄 및 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 본 발명의 CD38BP는 각각 -003 및 -005 및 -024의 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 CD38BP는 각각 -003 및 -005 및 -024의 CDR1을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 CD38에의 결합에 대해 -003과 경쟁하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 CD38에의 결합에 대해 -005와 경쟁하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 CD38에의 결합에 대해 -024와 경쟁하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 경쟁은 실시예 섹션에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 결정된다.
한 실시양태에서, 경쟁은 실시예 섹션에 기술된 바와 같은 FACS를 사용하여 결정된다.
본 발명은 CD38 에피토프에 특이적으로 결합하는 CD38BP를 제공하고, 이 에피토프는 -003 또는 -005 또는 -024에 의해 또한 특이적으로 결합된다.
본 발명은 인간 CD38에 결합하는 것에 대해 -003 또는 -005 또는 -024와 실질적으로 동일한 특이적 결합 특성을 갖는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 3으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 4로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 5로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 5로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 3으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 5로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 4로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 5로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 4로 본질적으로 구성되는 VL CDR2 및 서열 3으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 8로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 9로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 10으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 10으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 8로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 10으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 9로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 10으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 9로 본질적으로 구성되는 VH CDR2 및 서열 8로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 13으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 14로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 15로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 15로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 13으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 15로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 14로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 15로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 14로 본질적으로 구성되는 VL CDR2 및 서열 13으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 18로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 19로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 20으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 20으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 18로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 20으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 19로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 20으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 19로 본질적으로 구성되는 VH CDR2 및 서열 18로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 23으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 24로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 25로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 25로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 23으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 25로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 24로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 25로 본질적으로 구성되는 VL CDR3 및 서열 24로 본질적으로 구성되는 VL CDR2 및 서열 23으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 28로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 29로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 30으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 30으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 28로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 30으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 29로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 서열 30으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3 및 서열 29로 본질적으로 구성되는 VH CDR2 및 서열 28로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은
(a) 서로 독립적으로 서열 3, 서열 4, 및 서열 5로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR을 포함하는 제1 VL 영역; 및
(b) 서로 독립적으로 서열 8, 서열 9, 및 서열 10으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR을 포함하는 제1 VH 영역
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은
(a) 서로 독립적으로 서열 13, 서열 14, 및 서열 15로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR을 포함하는 제1 VL 영역; 및
(b) 서로 독립적으로 서열 18, 서열 19, 및 서열 20으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR을 포함하는 제1 VH 영역
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은
(a) 서로 독립적으로 서열 23, 서열 24, 및 서열 25로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR을 포함하는 제1 VL 영역; 및
(b) 서로 독립적으로 서열 28, 서열 29, 및 서열 30으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR을 포함하는 제1 VH 영역
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, VL 영역 및 VH 영역은 펩티드 내의 동일한 사슬 상에 존재한다.
추가적인 실시양태에서, VL 영역 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 분리된다.
한 실시양태에서, VL 영역 및 VH 영역은 펩티드 내의 별도의 사슬 상에 존재한다.
추가적인 실시양태에서, VL 영역 및 VH 영역은 면역글로불린 폴드(fold) 단백질의 환경에서 펩티드 내의 별도의 사슬 상에 존재한다.
한 실시양태에서, 제1 VL 영역 및 제1 VH 영역은 VL 영역 내의 3개의 CDR 및 VH 영역 내의 3개의 CDR이 협동적으로 회합되어 인간 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것에 기여하도록 배향된다.
추가적인 실시양태에서, 펩티드는 제1 VL 영역과 동일한 제2 VL 영역 및 제1 VH 영역과 동일한 제2 VH 영역을 포함하고, 이때 제2 VL 영역 및 제2 VH 영역은 협동적으로 회합되어 인간 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것에 기여한다.
본 발명은 -003 또는 -005 또는 -024의 VL 영역의 기능성 변이체인 VL 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, CD38BP의 VL 영역은 각각 서열 2 또는 서열 12 또는 서열 22에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성된다. 한 실시양태에서, CD38BP는 각각 -003 또는 -005 또는 -024의 에피토프 결합 특성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는다.
본 발명은 -003 또는 -005 또는 -024의 VH 영역의 기능성 변이체인 VH 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 펩티드의 VH 영역은 각각 서열 7 또는 서열 17 또는 서열 27에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성된다. 한 실시양태에서, CD38BP는 각각 -003 또는 -005 또는 -024의 에피토프 결합 특성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는다.
본 발명은 -003 또는 -005 또는 -024의 CDR의 기능성 변이체인 1개 이상의 CDR을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 펩티드의 1개 이상의 CDR은 각각 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 또는 서열 10에 따른 서열, 또는 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 18, 서열 19, 또는 서열 20에 따른 서열, 또는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 28, 서열 29, 또는 서열 30에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성된다. 한 실시양태에서, CD38BP는 각각 -003 또는 -005 또는 -024의 에피토프 결합 특성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는다.
한 실시양태에서, CD38BP는 -003 또는 -005 또는 -024의 친화성, 결합성 또는 특이성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는다.
한 실시양태에서, CD38BP는 CD38에의 결합에 대해 -003 또는 -005 또는 -024와 경쟁한다. 추가적인 실시양태에서, 경쟁은 실시예 섹션에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 결정된다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 경쟁은 실시예 섹션에 기술된 바와 같은 FACS를 사용하여 결정된다.
한 실시양태에서, CD38BP는 CD38 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이러한 에피토프는 -003 또는 -005 또는 -024에 의해 또한 특이적으로 결합된다.
한 실시양태에서, CD38B는 -003 또는 -005 또는 -024보다 더 큰 친화력으로 인간 CD38에 결합한다.
한 실시양태에서, CD38BP는 -003 또는 -005 또는 -024와 실질적으로 동일한 특이적 CD38 결합 특성을 갖는다.
한 실시양태에서, CD38BP에는 다른 CD38 결합 펩티드가 실질적으로 없다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 항체이다. 추가적인 실시양태에서, CD38BP는 인간 항체이다. 또다른 추가적인 실시양태에서, CD38BP는 인간화 항체이다. 또다른 추가적인 실시양태에서, CD38BP는 키메라 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체이다. 추가적인 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 추가적인 실시양태에서, 항체는 IgG1,κ 항체이다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 항체는 IgM 항체이다. 추가적인 실시양태에서, 항체는 IgM,κ 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
한 실시양태에서, CD38BP는 진핵생물 세포 내에서 글리코실화된다.
한 실시양태에서, CD38BP는 방사성 동위원소를 부착시키기 위한 킬레이터 링커를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, CD38BP는 실질적으로 단리된 형태이다.
본 발명은 본 발명의 CD38BP를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 CD38BP를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
한 실시양태에서, 발현 벡터는 서열 1의 VL 뉴클레오티드 서열, 서열 6의 VH 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 1의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 6의 VH 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 발현 벡터는 서열 11의 VL 뉴클레오티드 서열, 서열 16의 VH 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 11의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 16의 VH 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 발현 벡터는 서열 21의 VL 뉴클레오티드 서열, 서열 26의 VH 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 21의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 26의 VH 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 발현 벡터는 인간 항체의 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 인간 항체의 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 IgG1 항체를 코딩한다.
본 발명은 가변 경쇄 영역 내에 서열 1에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을, 가변 중쇄 영역 내에 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄 핵산은 서열 1에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 인간 중쇄 핵산은 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄 가변 영역은 서열 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄 가변 영역은 서열 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 서열 1에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 6에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항-CD38 항체는 서열 1에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산, 및 서열 6에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩된다.
본 발명은 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄는 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄는 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열을 포함한다.
본 발명은 가변 경쇄 영역 내에 서열 11에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을, 가변 중쇄 영역 내에 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄 핵산은 서열 11에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 인간 중쇄 핵산은 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄 가변 영역은 서열 12에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄 가변 영역은 서열 17에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 서열 11에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 16에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항-CD38 항체는 서열 11에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산, 및 서열 16에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩된다.
본 발명은 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄는 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄는 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열을 포함한다.
본 발명은 가변 경쇄 영역 내에 서열 21에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을, 가변 중쇄 영역 내에 서열 26에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄 핵산은 서열 21에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 인간 중쇄 핵산은 서열 26에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 서열 22에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 27에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄 가변 영역은 서열 22에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄 가변 영역은 서열 27에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 서열 21에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 26에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항-CD38 항체는 서열 21에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산, 및 서열 26에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩된다.
본 발명은 서열 22에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 27에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 경쇄는 서열 22에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄는 서열 27에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 CD38BP를 생산하는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 함유하는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 검출가능한 양의 본 발명의 CD38BP를 생산하는, 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 식물을 제공한다.
본 발명은 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 본 발명의 CD38BP를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 단량체성 IgM 항체이다.
본 발명은 본 발명의 CD38BP, 및 인간 이펙터 세포에 대한 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 인간 이펙터 세포에 대한 결합 특이성은 CD3, CD4, CD138, IL-15R, 막 결합형 또는 수용체 결합형 TNF-α, 인간 Fc 수용체, 또는 막 결합형 또는 수용체 결합형 IL-15에 대한 결합 특이성이다.
본 발명은 본 발명의 CD38BP에 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
본 발명은 샘플 내의 CD38에 대한 인간 모노클로날 항체의 수준을 검출하기 위한 본 발명의 항-이디오타입 항체의 용도를 제공한다.
하기 목록은 본 발명의 선택된 실시양태들의 목록이다.
실시양태 1: 각각 서열 1 및 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
실시양태 2: 각각 서열 1 및 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
실시양태 3: 각각 서열 11 및 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
실시양태 4: 각각 서열 11 및 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
실시양태 5: 각각 서열 21 및 서열 26에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
실시양태 6: 각각 서열 21 및 서열 26에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가변 영역 내에 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
실시양태 7: CD38에의 결합에 대해 실시양태 2에 따른 항체와 경쟁하는 펩티드.
실시양태 8: 경쟁이 본 명세서의 실시예 8 또는 9에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 측정되는, 실시양태 7에 따른 펩티드.
실시양태 9: 경쟁이 본 명세서의 실시예 7에 기술된 바와 같은 교차-차단 측정법을 사용하여 측정되는, 실시양태 7에 따른 펩티드.
실시양태 10: CD38 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이러한 에피토프가 또한 실시양태 2에 따른 항체에 의해 특이적으로 결합되는 펩티드.
실시양태 11: 인간 CD38에 결합하는 것에 대한 특이적 결합 특성이 실시양태 2에 따른 항체와 실질적으로 동일한 펩티드.
실시양태 12: 서열 3으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 펩티드.
실시양태 13: 서열 4로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 펩티드.
실시양태 14: 서열 5로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 펩티드.
실시양태 15: 서열 3으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 14에 따른 펩티드.
실시양태 16: 서열 4로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 또한 포함하는, 실시양태 14에 따른 펩티드.
실시양태 17: 서열 3으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 16에 따른 펩티드.
실시양태 18: 서열 8로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 펩티드.
실시양태 19: 서열 9로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 펩티드.
실시양태 20: 서열 10으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 펩티드.
실시양태 21: 서열 8로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 20에 따른 펩티드.
실시양태 22: 서열 9로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 또한 포함하는, 실시양태 20에 따른 펩티드.
실시양태 23: 서열 8로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 22에 따른 펩티드.
실시양태 24:
(a) 서로 독립적으로 서열 3, 서열 4, 및 서열 5로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR을 포함하는 제1 VL 영역; 및
(b) 서로 독립적으로 서열 8, 서열 9, 및 서열 10으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR을 포함하는 제1 VH 영역
을 포함하는 펩티드.
실시양태 25: VL 영역 및 VH 영역이 펩티드 내의 동일한 사슬 상에 존재하는, 실시양태 24에 따른 펩티드.
실시양태 26: VL 영역 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 분리된, 실시양태 25에 따른 펩티드.
실시양태 27: VL 영역 및 VH 영역이 펩티드 내의 별도의 사슬 상에 존재하는, 실시양태 24에 따른 펩티드.
실시양태 28: VL 영역 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 펩티드 내의 별도의 사슬 상에 존재하는, 실시양태 27에 따른 펩티드.
실시양태 29: 제1 VL 영역 및 제1 VH 영역이 VL 영역 내의 3개의 CDR 및 VH 영역 내의 3개의 CDR이 협동적으로 회합되어 인간 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것에 기여하도록 배향되는, 실시양태 24 내지 28 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 30: 제1 VL 영역과 동일한 제2 VL 영역 및 제1 VH 영역과 동일한 제2 VH 영역을 포함하고, 이때 제2 VL 영역 및 제2 VH 영역은 협동적으로 회합되어 인간 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것에 기여하는, 실시양태 29에 따른 펩티드.
실시양태 31: 실시양태 2의 항체의 VL 영역의 기능성 변이체인 VL 영역을 포함하는 펩티드.
실시양태 32: 펩티드의 VL 영역이 서열 2에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 31에 따른 펩티드.
실시양태 33: 실시양태 2의 항체의 VH 영역의 기능성 변이체인 VH 영역을 포함하는 펩티드.
실시양태 34: 펩티드의 VH 영역이 서열 7에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 33에 따른 펩티드.
실시양태 35: 실시양태 2의 항체의 CDR의 기능성 변이체인 1개 이상의 CDR을 포함하는 펩티드.
실시양태 36: 펩티드의 1개 이상의 CDR이 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 8, 서열 9, 또는 서열 10에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 35에 따른 펩티드.
실시양태 37: 실시양태 2의 항체의 에피토프 결합 특성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는, 실시양태 31 내지 36 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 38: 실시양태 2의 항체의 친화성, 결합성 또는 특이성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는, 실시양태 31 내지 36 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 39: 인간 CD38에 특이적으로 결합하는, 실시양태 12 내지 38 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 40: CD38에의 결합에 대해 실시양태 2에 따른 항체와 경쟁하는, 실시양태 12 내지 39 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 41: 경쟁이 본 명세서의 실시예 8 또는 9에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 측정되는, 실시양태 40에 따른 펩티드.
실시양태 42: 경쟁이 본 명세서의 실시예 7에 기술된 바와 같은 교차-차단 측정법을 사용하여 측정되는, 실시양태 7에 따른 펩티드.
실시양태 43: CD38 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이러한 에피토프가 또한 실시양태 2에 따른 항체에 의해 특이적으로 결합되는, 실시양태 39에 따른 펩티드.
실시양태 44: 실시양태 2에 따른 항체보다 더 큰 친화력으로 인간 CD38에 결합하는, 실시양태 39 내지 43 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 45: 실시양태 2에 따른 항체와 실질적으로 동일한 특이적 CD38 결합 특성을 갖는, 실시양태 39 내지 43 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 46: CD38 결합 펩티드에 다른 CD38 결합 펩티드가 실질적으로 없는, 실시양태 39 내지 45 증 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 47: 인간 CD38 (서열 31)에 결합하고, 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는 펩티드.
실시양태 48: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만인, 실시양태 47에 따른 펩티드.
실시양태 49: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 10％ 미만인, 실시양태 48에 따른 펩티드.
실시양태 50: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 5％ 미만인, 실시양태 49에 따른 펩티드.
실시양태 51: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 1％ 미만인, 실시양태 50에 따른 펩티드.
실시양태 52: 인간 CD38 (서열 31)에 결합하고, 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는 펩티드.
실시양태 53: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만인, 실시양태 52에 따른 펩티드.
실시양태 54: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 10％ 미만인, 실시양태 53에 따른 펩티드.
실시양태 55: 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는, 실시양태 47 내지 51 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 56: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만인, 실시양태 55에 따른 펩티드.
실시양태 57: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 10％ 미만인, 실시양태 56에 따른 펩티드.
실시양태 58: 상기 펩티드가 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하는, 실시양태 47 내지 57 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 59: 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 75％를 초과하는, 실시양태 58에 따른 펩티드.
실시양태 60: 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 85％를 초과하는, 실시양태 59에 따른 펩티드.
실시양태 61: 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 90％를 초과하는, 실시양태 60에 따른 펩티드.
실시양태 62: 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 95％를 초과하는, 실시양태 61에 따른 펩티드.
실시양태 63: CD38에의 결합에 대해 실시양태 4에 따른 항체와 경쟁하는 펩티드.
실시양태 64: 경쟁이 본 명세서의 실시예 8 또는 9에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 측정되는, 실시양태 63에 따른 펩티드.
실시양태 65: 경쟁이 본 명세서의 실시예 7에 기술된 바와 같은 교차-차단 측정법을 사용하여 측정되는, 실시양태 63에 따른 펩티드.
실시양태 66: CD38 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이러한 에피토프가 또한 실시양태 4에 따른 항체에 의해 특이적으로 결합되는 펩티드.
실시양태 67: 인간 CD38에 결합하는 것에 대한 특이적 결합 특성이 실시양태 4에 따른 항체와 실질적으로 동일한 펩티드.
실시양태 68: 서열 13으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 펩티드.
실시양태 69: 서열 14로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 펩티드.
실시양태 70: 서열 15로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 펩티드.
실시양태 71: 서열 13으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 70에 따른 펩티드.
실시양태 72: 서열 14로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 또한 포함하는, 실시양태 70에 따른 펩티드.
실시양태 73: 서열 13으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 72에 따른 펩티드.
실시양태 74: 서열 18로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 펩티드.
실시양태 75: 서열 19로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 펩티드.
실시양태 76: 서열 20으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 펩티드.
실시양태 77: 서열 18로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 76에 따른 펩티드.
실시양태 78: 서열 19로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 또한 포함하는, 실시양태 76에 따른 펩티드.
실시양태 79: 서열 18로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 78에 따른 펩티드.
실시양태 80:
(a) 서로 독립적으로 서열 13, 서열 14, 및 서열 15로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR을 포함하는 제1 VL 영역; 및
(b) 서로 독립적으로 서열 18, 서열 19, 및 서열 20으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR을 포함하는 제1 VH 영역
을 포함하는 펩티드.
실시양태 81: VL 영역 및 VH 영역이 펩티드 내의 동일한 사슬 상에 존재하는, 실시양태 80에 따른 펩티드.
실시양태 82: VL 영역 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 분리된, 실시양태 81에 따른 펩티드.
실시양태 83: VL 영역 및 VH 영역이 펩티드 내의 별도의 사슬 상에 존재하는, 실시양태 80에 따른 펩티드.
실시양태 84: VL 영역 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 펩티드 내의 별도의 사슬 상에 존재하는, 실시양태 83에 따른 펩티드.
실시양태 85: 제1 VL 영역 및 제1 VH 영역이 VL 영역 내의 3개의 CDR 및 VH 영역 내의 3개의 CDR이 협동적으로 회합되어 인간 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것에 기여하도록 배향되는, 실시양태 80 내지 84 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 86: 제1 VL 영역과 동일한 제2 VL 영역 및 제1 VH 영역과 동일한 제2 VH 영역을 포함하고, 이때 제2 VL 영역 및 제2 VH 영역은 협동적으로 회합되어 인간 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것에 기여하는, 실시양태 85에 따른 펩티드.
실시양태 87: 실시양태 4의 항체의 VL 영역의 기능성 변이체인 VL 영역을 포함하는 펩티드.
실시양태 88: 펩티드의 VL 영역이 서열 12에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 87에 따른 펩티드.
실시양태 89: 실시양태 4의 항체의 VH 영역의 기능성 변이체인 VH 영역을 포함하는 펩티드.
실시양태 90: 펩티드의 VH 영역이 서열 17에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 89에 따른 펩티드.
실시양태 91: 실시양태 4의 항체의 CDR의 기능성 변이체인 1개 이상의 CDR을 포함하는 펩티드.
실시양태 92: 펩티드의 1개 이상의 CDR이 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 18, 서열 19, 또는 서열 20에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 91에 따른 펩티드.
실시양태 93: 실시양태 4의 항체의 에피토프 결합 특성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는, 실시양태 87 내지 92 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 94: 실시양태 4의 항체의 친화성, 결합성 또는 특이성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는, 실시양태 87 내지 92 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 95: 인간 CD38에 특이적으로 결합하는, 실시양태 68 내지 94 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 96: CD38에의 결합에 대해 실시양태 4에 따른 항체와 경쟁하는, 실시양태 68 내지 95 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 97: 경쟁이 본 명세서의 실시예 8 또는 9에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 측정되는, 실시양태 96에 따른 펩티드.
실시양태 98: 경쟁이 본 명세서의 실시예 7에 기술된 바와 같은 교차-차단 측정법을 사용하여 측정되는, 실시양태 96에 따른 펩티드.
실시양태 99: CD38 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이러한 에피토프가 또한 실시양태 4에 따른 항체에 의해 특이적으로 결합되는, 실시양태 95에 따른 펩티드.
실시양태 100: 실시양태 4에 따른 항체보다 더 큰 친화력으로 인간 CD38에 결합하는, 실시양태 95 내지 99 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 101: 실시양태 4에 따른 항체와 실질적으로 동일한 특이적 CD38 결합 특성을 갖는, 실시양태 95 내지 99 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 102: CD38 결합 펩티드에 다른 CD38 결합 펩티드가 실질적으로 없는, 실시양태 95 내지 101 증 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 103: 인간 CD38 (서열 31)에 결합하고, 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는, 실시양태 63 내지 102 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 104: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만인, 실시양태 103에 따른 펩티드.
실시양태 105: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 10％ 미만인, 실시양태 104에 따른 펩티드.
실시양태 106: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 5％ 미만인, 실시양태 105에 따른 펩티드.
실시양태 107: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 1％ 미만인, 실시양태 106에 따른 펩티드.
실시양태 108: 인간 CD38 (서열 31)에 결합하고, 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는 펩티드.
실시양태 109: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만인, 실시양태 108에 따른 펩티드.
실시양태 110: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 10％ 미만인, 실시양태 109에 따른 펩티드.
실시양태 111: 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는, 실시양태 103 내지 107 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 112: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만인, 실시양태 111에 따른 펩티드.
실시양태 113: 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 10％ 미만인, 실시양태 112에 따른 펩티드.
실시양태 114: 상기 펩티드가 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하는, 실시양태 103 내지 113 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 115: 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 75％를 초과하는, 실시양태 114에 따른 펩티드.
실시양태 116: 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 85％를 초과하는, 실시양태 115에 따른 펩티드.
실시양태 117: 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 90％를 초과하는, 실시양태 116에 따른 펩티드.
실시양태 118: 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50이 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 95％를 초과하는, 실시양태 117에 따른 펩티드.
실시양태 119: CD38에의 결합에 대해 실시양태 6에 따른 항체와 경쟁하는 펩티드.
실시양태 120: 경쟁이 본 명세서의 실시예 8 또는 9에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 측정되는, 실시양태 119에 따른 펩티드.
실시양태 121: 경쟁이 본 명세서의 실시예 7에 기술된 바와 같은 교차-차단 측정법을 사용하여 측정되는, 실시양태 119에 따른 펩티드.
실시양태 122: CD38 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이러한 에피토프가 또한 실시양태 6에 따른 항체에 의해 특이적으로 결합되는 펩티드.
실시양태 123: 인간 CD38에 결합하는 것에 대한 특이적 결합 특성이 실시양태 6에 따른 항체와 실질적으로 동일한 펩티드.
실시양태 124: 서열 23으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 펩티드.
실시양태 125: 서열 24로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 펩티드.
실시양태 126: 서열 25로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 펩티드.
실시양태 127: 서열 23으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 126에 따른 펩티드.
실시양태 128: 서열 24로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 또한 포함하는, 실시양태 126에 따른 펩티드.
실시양태 129: 서열 23으로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 128에 따른 펩티드.
실시양태 130: 서열 28로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 펩티드.
실시양태 131: 서열 29로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 펩티드.
실시양태 132: 서열 30으로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 펩티드.
실시양태 133: 서열 28로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 132에 따른 펩티드.
실시양태 134: 서열 29로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 또한 포함하는, 실시양태 132에 따른 펩티드.
실시양태 135: 서열 28로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 또한 포함하는, 실시양태 134에 따른 펩티드.
실시양태 136:
(a) 서로 독립적으로 서열 23, 서열 24, 및 서열 25로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR을 포함하는 제1 VL 영역; 및
(b) 서로 독립적으로 서열 28, 서열 29, 및 서열 30으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR을 포함하는 제1 VH 영역
을 포함하는 펩티드.
실시양태 137: VL 영역 및 VH 영역이 펩티드 내의 동일한 사슬 상에 존재하는, 실시양태 136에 따른 펩티드.
실시양태 138: VL 영역 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 분리된, 실시양태 137에 따른 펩티드.
실시양태 139: VL 영역 및 VH 영역이 펩티드 내의 별도의 사슬 상에 존재하는, 실시양태 136에 따른 펩티드.
실시양태 140: VL 영역 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 펩티드 내의 별도의 사슬 상에 존재하는, 실시양태 139에 따른 펩티드.
실시양태 141: 제1 VL 영역 및 제1 VH 영역이 VL 영역 내의 3개의 CDR 및 VH 영역 내의 3개의 CDR이 협동적으로 회합되어 인간 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것에 기여하도록 배향되는, 실시양태 136 내지 140 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 142: 제1 VL 영역과 동일한 제2 VL 영역 및 제1 VH 영역과 동일한 제2 VH 영역을 포함하고, 이때 제2 VL 영역 및 제2 VH 영역은 협동적으로 회합되어 인간 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 것에 기여하는, 실시양태 141에 따른 펩티드.
실시양태 143: 실시양태 6의 항체의 VL 영역의 기능성 변이체인 VL 영역을 포함하는 펩티드.
실시양태 144: 펩티드의 VL 영역이 서열 22에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 143에 따른 펩티드.
실시양태 145: 실시양태 6의 항체의 VH 영역의 기능성 변이체인 VH 영역을 포함하는 펩티드.
실시양태 146: 펩티드의 VH 영역이 서열 27에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 145에 따른 펩티드.
실시양태 147: 실시양태 6의 항체의 CDR의 기능성 변이체인 1개 이상의 CDR을 포함하는 펩티드.
실시양태 148: 펩티드의 1개 이상의 CDR이 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 28, 서열 29, 또는 서열 30에 따른 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는, 실시양태 147에 따른 펩티드.
실시양태 149: 실시양태 6의 항체의 에피토프 결합 특성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는, 실시양태 143 내지 148 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 150: 실시양태 6의 항체의 친화성, 결합성 또는 특이성의 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상을 갖는, 실시양태 143 내지 148 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 151: 인간 CD38에 특이적으로 결합하는, 실시양태 124 내지 150 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 152: CD38에의 결합에 대해 실시양태 6에 따른 항체와 경쟁하는, 실시양태 124 내지 151 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 153: 경쟁이 본 명세서의 실시예 8 또는 9에 기술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 측정되는, 실시양태 152에 따른 펩티드.
실시양태 154: 경쟁이 본 명세서의 실시예 7에 기술된 바와 같은 교차-차단 측정법을 사용하여 측정되는, 실시양태 152에 따른 펩티드.
실시양태 155: CD38 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이러한 에피토프가 또한 실시양태 6에 따른 항체에 의해 특이적으로 결합되는, 실시양태 151에 따른 펩티드.
실시양태 156: 실시양태 6에 따른 항체보다 더 큰 친화력으로 인간 CD38에 결합하는, 실시양태 151 내지 155 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 157: 실시양태 6에 따른 항체와 실질적으로 동일한 특이적 CD38 결합 특성을 갖는, 실시양태 151 내지 156 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 158: CD38 결합 펩티드에 다른 CD38 결합 펩티드가 실질적으로 없는, 실시양태 151 내지 157 증 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 159: 펩티드가 CD38의 작동제가 아닌, 실시양태 1 내지 158 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 160: 펩티드가 말초혈 단핵 세포의 현저한 증식을 유도하지 않는, 실시양태 1 내지 159 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 161: 펩티드가 인간 단핵구 또는 말초혈 단핵 세포에 의한 현저한 IL-6의 방출을 유도하지 않는, 실시양태 1 내지 160 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 162: 펩티드가 인간 T 세포 또는 말초혈 단핵 세포에 의한 검출가능한 IFN-γ의 방출을 유도하지 않는, 실시양태 1 내지 161 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 163: 펩티드가 항체인, 실시양태 7 내지 162 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 164: 항체가 인간 항체인, 실시양태 1 내지 6 또는 163 중 어느 하나에 따른 항체.
실시양태 165: 항체가 인간화 항체인, 실시양태 1 내지 6 또는 163 중 어느 하나에 따른 항체.
실시양태 166: 항체가 키메라 항체인, 실시양태 1 내지 6 또는 163 중 어느 하나에 따른 항체.
실시양태 167: 항체가 모노클로날 항체인, 실시양태 1 내지 6 또는 163 내지 166 중 어느 하나에 따른 항체.
실시양태 168: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체인 것을 특징으로 하는, 실시양태 1 내지 6 또는 163 내지 167 중 어느 하나에 따른 항체.
실시양태 169: IgG1 항체인 것을 특징으로 하는, 실시양태 168에 따른 항체.
실시양태 170: 항체가 IgG,κ 항체인, 실시양태 169에 따른 항체.
실시양태 171: IgM 항체인 것을 특징으로 하는, 실시양태 168에 따른 항체.
실시양태 172: 항체가 IgM,κ 항체인, 실시양태 171에 따른 항체.
실시양태 173: 펩티드가 진핵생물 세포 내에서 글리코실화되는, 실시양태 2 내지 172 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 174: 항체 단편 또는 단일쇄 항체인, 실시양태 1 내지 6 또는 163 내지 173 중 어느 하나에 따른 항체.
실시양태 175: 방사성 동위원소를 부착시키기 위한 킬레이터 링커를 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 174 중 어느 하나에 따른 펩티드 또는 항체.
실시양태 176: 실질적으로 단리된 형태인, 실시양태 1 내지 175 중 어느 하나에 따른 펩티드.
실시양태 177: 실시양태 1 내지 175 중 어느 하나에 따른 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
실시양태 178: 실시양태 1 내지 175 중 어느 하나에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
실시양태 179: 서열 1의 VL 뉴클레오티드 서열, 서열 6의 VH 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 1의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 6의 VH 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
실시양태 180: 서열 11의 VL 뉴클레오티드 서열, 서열 16의 VH 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 11의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 16의 VH 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
실시양태 181: 인간 항체의 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 실시양태 179 또는 실시양태 180에 따른 발현 벡터.
실시양태 182: 인간 항체의 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 IgG1 항체를 코딩하는 실시양태 181에 따른 발현 벡터.
실시양태 183: 가변 경쇄 영역 내에 서열 1에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을, 가변 중쇄 영역 내에 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마.
실시양태 184: 인간 경쇄 핵산은 서열 1에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 인간 중쇄 핵산은 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 실시양태 183에 따른 하이브리도마.
실시양태 185: 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마.
실시양태 186: 인간 경쇄 가변 영역은 서열 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄 가변 영역은 서열 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 실시양태 185에 따른 하이브리도마.
실시양태 187: 서열 1에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 6에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마.
실시양태 188: 인간 모노클로날 항-CD38 항체가 서열 1에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산, 및 서열 6에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는, 실시양태 187에 따른 트랜스펙토마.
실시양태 189: 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마.
실시양태 190: 인간 경쇄는 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄는 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열을 포함하는, 실시양태 189에 따른 트랜스펙토마.
실시양태 191: 가변 경쇄 영역 내에 서열 11에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을, 가변 중쇄 영역 내에 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마.
실시양태 192: 인간 경쇄 핵산은 서열 11에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 인간 중쇄 핵산은 서열 16에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 실시양태 191에 따른 하이브리도마.
실시양태 193: 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마.
실시양태 194: 인간 경쇄 가변 영역은 서열 12에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄 가변 영역은 서열 17에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 실시양태 193에 따른 하이브리도마.
실시양태 195: 서열 11에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 16에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산 또는 이의 보존적 서열 변형물에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마.
실시양태 196: 인간 모노클로날 항-CD38 항체가 서열 11에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 핵산, 및 서열 16에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는, 실시양태 195에 따른 트랜스펙토마.
실시양태 197: 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물, 및 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열 또는 이의 보존적 서열 변형물을 포함하는 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마.
실시양태 198: 인간 경쇄는 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하고, 인간 중쇄는 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노 서열을 포함하는, 실시양태 197에 따른 트랜스펙토마.
실시양태 199: 실시양태 1 내지 175 중 어느 하나에 따른 펩티드를 생산하는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포.
실시양태 200: 실시양태 178에 따른 발현 벡터를 함유하는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포.
실시양태 201: 검출가능한 양의 실시양태 1 내지 175 중 어느 하나에 따른 펩티드를 생산하는, 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 식물
실시양태 202: 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 실시양태 1 내지 174 중 어느 하나에 따른 펩티드를 포함하는 면역접합체.
실시양태 203: 실시양태 1 내지 168 또는 실시양태 171 내지 174 중 어느 하나에 따른 펩티드를 포함하고, 펩티드가 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 단량체성 IgM 항체인 면역접합체.
실시양태 204: 실시양태 1 내지 175 중 어느 하나에 따른 펩티드, 및 인간 이펙터 세포에 대한 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자.
실시양태 205: 실시양태 1 내지 175 중 어느 하나에 따른 펩티드, 및 CD3, CD4, IL-15R, 막 결합형 또는 수용체 결합형 TNF-α, 인간 Fc 수용체, 또는 막 결합형 또는 수용체 결합형 IL-15에 대한 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자.
실시양태 206: 실시양태 1 내지 176 중 어느 하나에 따른 펩티드 또는 실시양태 202 내지 205 중 어느 하나에 따른 면역접합체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
실시양태 207: 1가지 이상의 추가적인 치료제를 포함하는, 실시양태 206에 따른 제약 조성물.
실시양태 208: CD38을 발현하는 세포의 성장 및/또는 증식이 억제되도록 실시양태 1 내지 176 중 어느 하나에 따른 펩티드, 실시양태 202 내지 205 중 어느 하나에 따른 면역접합체, 실시양태 206 또는 207에 따른 제약 조성물, 또는 실시양태 178 내지 182 중 어느 하나에 따른 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하는, CD38을 발현하는 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법.
실시양태 209: CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 실시양태 1 내지 176 중 어느 하나에 따른 펩티드, 실시양태 202 내지 205 중 어느 하나에 따른 면역접합체, 실시양태 206 또는 207에 따른 제약 조성물, 또는 실시양태 178 내지 182 중 어느 하나에 따른 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
실시양태 210: CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 대상에게 실시양태 1 내지 176 중 어느 하나에 따른 펩티드, 실시양태 202 내지 205 중 어느 하나에 따른 면역접합체, 실시양태 206 또는 207에 따른 제약 조성물, 또는 실시양태 178 내지 182 중 어느 하나에 따른 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애를 예방하는 방법.
실시양태 211: 질환 또는 장애가 류머티스성 관절염인, 실시양태 209 또는 실시양태 210에 따른 방법.
실시양태 212: 질환 또는 장애가 다발성 골수종인, 실시양태 209 또는 실시양태 210에 따른 방법.
실시양태 213: 1가지 이상의 추가적인 치료제를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 실시양태 209 내지 212 중 어느 하나에 따른 방법.
실시양태 214: 1가지 이상의 추가적인 치료제가 화학요법제, 항염증제, 또는 면역억제제 및/또는 면역조절제로부터 선택되는, 실시양태 213에 따른 방법.
실시양태 215: 1가지 이상의 추가적인 치료제가 시스플라틴, 제피티닙, 세툭시맵, 리툭시맵, 베바시주맵, 에를로티닙, 보르테조밉, 탈리도미드, 파미드로네이트, 졸레드론산, 클로드로네이트, 리센드로네이트, 이반드로네이트, 에티드로네이트, 알렌드로네이트, 틸루드로네이트, 삼산화비소, 레날리도미드, 필그라스팀, 페그필그라스팀, 사르그라모스팀, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 및 SCIO-469로 구성되는 군으로부터 선택되는, 실시양태 213에 따른 방법.
실시양태 216:
a) 실시양태 1 내지 176 중 어느 하나에 따른 펩티드와 샘플을 항체와 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 접촉시키는 단계; 및
b) 복합체의 형성을 검출하는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위한 시험관내 방법.
실시양태 217: 상기 펩티드가 항체인, 실시양태 216에 따른 시험관내 방법.
실시양태 218: 실시양태 1 내지 176 중 어느 하나에 따른 펩티드를 포함하는, 샘플 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위한 키트.
실시양태 219:
a) 실시양태 1 내지 176 중 어느 하나에 따른 펩티드를 항체와 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 투여하는 단계; 및
b) 형성된 복합체를 검출하는 단계
를 포함하는, 대상 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포를 검출하기 위한 생체내 방법.
실시양태 220: 상기 펩티드가 항체인, 실시양태 219에 따른 생체내 방법.
실시양태 221: 실시양태 2, 4, 또는 163 내지 174 중 어느 하나에 따른 펩티드에 결합하는 항-이디오타입 항체.
실시양태 222: 샘플 내의 실시양태 2, 4, 또는 163 내지 174 중 어느 하나에 따른 펩티드의 수준을 검출하기 위한 실시양태 221에 따른 항-이디오타입 항체의 용도.
실시양태 223: 샘플 내의 CD38에 대한 인간 모노클로날 항체의 수준을 검출하기 위한 실시양태 221에 따른 항-이디오타입 항체의 용도.
용어 "CD38" 및 "CD38 항원"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 CD38 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는, 인간 CD38의 모든 변이체, 이소형(isoform) 및 종 상동체를 포함한다. 당업계에서 인지되는 바와 같이, CD38의 동의어에는 ADP 리보실 사이클라제 1, cADPr 가수분해효소 1, Cd38-rs1, 고리형 ADP-리보스 가수분해효소 1, I-19, NIM-R5 항원이 포함된다.
본원에 기술된 CD38-결합 펩티드 및 비-CD38 펩티드 모두와 관련된 용어 펩티드에는 임의의 적절한 펩티드가 포함되고, 달리 언급되거나 문맥적으로 모순되지 않는 한 용어 폴리펩티드 및 단백질과 동의어로 사용될 수 있다; 단, 독자는 각각의 아미노산 중합체-함유 분자의 각 유형이 유의한 차이로 회합될 수 있고, 따라서 본 발명의 개별적인 실시양태를 형성한다는 것을 인지한다 (예를 들어, 다중 폴리펩티드 사슬로 구성된 항체와 같은 펩티드는, 예를 들어, 단일쇄 항체, 펩티드 면역부착소(immunoadhesin), 또는 단일쇄 면역원성 펩티드와 유의하게 상이하다). 따라서, 본원에서의 용어 펩티드는 임의의 적절한 크기 및 조성의 임의의 적절한 펩티드를 지칭하는 것으로 일반적으로 이해되어야 한다 (아미노산의 수 및 단백질 분자 내의 회합된 사슬의 수와 관련하여). 또한, 본원에 기술된 본 발명의 방법 및 조성물의 문맥에서의 펩티드는 달리 언급되거나 문맥적으로 모순되지 않는 한 비-천연 발생 및/또는 비-L 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본원에서 더욱 논의될 바와 같이, 달리 언급되거나 문맥적으로 모순되지 않는 한, 용어 펩티드 (및 용어(들)의 개별적인 실시양태로서 논의되는 경우, 폴리펩티드 및/또는 단백질)는 유도체화 펩티드 분자를 또한 포함한다. 간략하게, 본 발명의 문맥에서, 유도체는 펩티드의 1개 이상의 아미노산 잔기가 화학적으로 변형되거나 (예를 들어 알킬화, 아실화, 에스테르 형성, 또는 아미드 형성에 의해), 또는 1개 이상의 비-아미노산 유기 및/또는 무기 원자 또는 분자 치환체 (예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기, 친지성 치환체 (펩티드의 아미노산 서열에 스페이서(spacer) 잔기 또는 기 예컨대 β-알라닌, γ-아미노부티르산 (GABA), UD-글루탐산, 숙신산 등을 통해 임의로 연결될 수 있다), 형광단, 비오틴, 방사성 핵종 등)와 회합된 펩티드이고, 달리 언급되거나 문맥적으로 모순되지 않는 한, 비-필수, 비-천연 발생 및/또는 비-L 아미노산 잔기를 또한 또는 별법적으로 포함할 수 있다 (그러나, 이같은 유도체가 자체적으로 및 스스로 본 발명의 독립적인 양상으로 간주될 수 있고, 네이키드(naked) 펩티드와 이같은 유도체 간의 어떠한 종류의 등가성을 부여하기보다는 본 발명을 기술하는데 있어서 편의를 위해 이같은 분자가 펩티드의 의미 내에 포함된다는 것을 또다시 인지하여야 한다). 이같은 아미노산 잔기의 비제한적인 예로는 예를 들어 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, β-알라닌, β-아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 히드록시라이신, 알로히드록시라이신, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로이소류신, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, 6-N-메틸라이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 및 스타틴 할로겐화 아미노산이 포함된다.
항원 결합 펩티드는 적절한 기간의 시간 (예를 들어 약 15분 이상, 약 30분 이상, 약 45분 이상, 약 1시간 이상, 약 2시간 이상, 약 4시간 이상, 약 6시간 이상, 약 12시간 이상, 약 1-24시간, 약 1-36시간, 약 1-48시간, 약 1-72시간, 약 1주, 또는 그 이상) 후에 ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot), 또는 본원에 기술되고/되거나 당업계에 공지된 기타 유사하게 적절한 단백질 결합 기술에 의해 검출되도록 및/또는 검출가능하게 항원에 결합되도록 항원과 관렵된 생리학적 효과를 유도하고/하거나, 촉진하고/하거나, 증강시키고/시키거나 조정하기에 충분한 양의 시간 동안 세포성 및/또는 생리학적 환경 하에 소정의 항원의 일부분에 특이적으로 결합하는 임의의 펩티드를 지칭한다.
CD38 결합 펩티드, 또는 CD38BP는 항원 CD38에 특이적으로 결합하는 항원 결합 펩티드이다. 한 실시양태에서, CD38BP가 CD38에 결합하는 것은 실시예 4에 기술된 방법을 사용하여 측정된다.
용어 면역글로불린은 한 쌍의 저분자량 경쇄 (L)와 한 쌍의 중쇄 (H)의 폴리펩티드 사슬 두 쌍으로 구성된 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 지칭하고, 모두 4개의 사슬은 디술피드 결합에 의해 상호연결된다. 면역글로불린의 구조는 잘 규명되어 있다. 예를 들어 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))] 참조. 간략하게, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된 더욱 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 또한 명명되는 초가변성 영역 (또는 서열 및/또는 구조적으로 한정된 루프의 형태가 초가변성일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 나누어질 수 있다.
각각의 VH 및 VL은 전형적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되고, 이들은 아미노 말단에서 카르복실 말단 방향으로 하기와 같은 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 ([Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)]를 또한 참조). 전형적으로, 이러한 영역 내의 아미노산 잔기의 번호매김은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기술된 방법에 의해 수행된다 (본원에서의 캐벗(Kabat)에서와 같은 또는 캐벗에 따른 가변 도메인 잔기 번호매김과 같은 문구는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이러한 번호매김 시스템을 지칭한다). 이러한 번호매김 시스템을 사용하여, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 이러한 영역 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 수의 아미노산 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 VH CDR2의 잔기 52 뒤쪽의 단일 아미노산 삽입물 (캐벗에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤쪽의 삽입된 잔기들 (예를 들어 캐벗에 따른잔기 82a, 82b, 및 82c 등)을 포함할 수 있다. 잔기들의 캐벗 번호매김은 "표준" 캐벗 번호매김 서열과 항체의 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.
본 발명의 문맥에서의 용어 항체 (Ab)는 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 단편, 또는 이들의 유도체를 지칭하고, 이는 전형적인 생리학적 조건 하에 약 30분 이상, 약 45분 이상, 약 1시간 이상, 약 2시간 이상, 약 4시간 이상, 약 8시간 이상, 약 12시간 이상, 약 24시간 이상, 약 48시간 이상, 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 그 이상 등과 같은 충분한 기간의 시간, 또는 임의의 기타 관련된 기능적으로 정의된 기간 (예컨대 항원에 대한 항체 결합과 관련된 생리학적 응답을 유도하고/하거나, 촉진하고/하거나, 증강시키고/시키거나 조정하는데 충분한 시간) 동안 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다.
면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (c1q)이 포함되는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
항-CD38 항체는 이중특이적 항체, 디아바디(diabody), 또는 유사 분자일 수 있다 (디아바디의 설명에 대해서, 예를 들어 [PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993)] 참조). 실제로, 본 발명에 의해 제공되는 이중특이적 항체, 디아바디 등은 CD38의 일부분에 더하여 임의의 적절한 표적에 결합할 수 있다.
상기 지시된 바와 같이, 용어 항체는, 달리 언급되거나 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한, 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 유지된 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편들에 의해서 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 "항체" 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 하기의 것들이 포함된다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편 및 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 한쪽 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 본질적으로 구성된 dAb 단편 ([Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합물. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH이 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨)를 형성한 단일 단백질 사슬로 만들어지도록 할 수 있는 합성 링커로 두 도메인을 연결시킬 수 있다 (예를 들어 [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)] 및 [Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참조). 이같은 단일쇄 항체는 달리 언급되거나 문맥적으로 명백하게 지시되지 않는 한 용어 항체 내에 포함된다. 단일쇄 항체의 또다른 형태, 예컨대 디아바디가 용어 항체 내에 포함된다. 이같은 단편이 항체의 의미 내에 일반적으로 포함되지만, 이는 총괄적으로, 그리고 각각 독립적으로, 상이한 생물학적 성질 및 용도를 나타내는 본 발명의 독특한 양상이다. 본 발명의 문맥 내의 이러한 항체 및 기타 유용한 항체가 본원에서 추가로 논의된다.
용어 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체, 항체에 대한 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 및 임의의 공지된 기술, 예컨대 효소에 의한 절단, 펩티드 합성, 및 재조합 기술에 의해 제공되는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 유지된 항체 단편 (항원-결합 단편)이 또한 일반적으로 포함된다는 것을 이해하여야 한다. 생성된 항체는 임의의 이소타입을 지닐 수 있다.
항-CD38 항체는 항원 CD38에 특이적으로 결합하는, 상기 기술된 바와 같은 항체이다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 군으로 일반적으로 구성되고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특이적 전하 특성을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 손실되지만 후자에 대해서는 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접적으로 수반되는 아미노산 잔기 (에피토프의 면역우성(immunodominant) 성분으로 또한 칭해짐) 및 결합에 직접적으로 수반되지 않는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기 (바꿔 말하면, 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 존재함)를 포함한다.
용어 "이중특이적 분자"는 2가지의 상이한 결합 특이성을 갖는 임의의 작용제, 예컨대 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체에 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있다. 용어 "다중특이적 분자"는 2가지를 초과하는 상이한 결합 특이성을 갖는 임의의 작용제, 예컨대 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체 및 (c) 1개 이상의 다른 성분에 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD38, 및 이펙터 세포 상의 Fc 수용체와 같은 기타 세포 표면 항원 또는 표적에 대해 지시된 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "이중특이적 항체"는 이중특이적 분자인 임의의 항-CD38 항체를 포함하도록 의도된다. 용어 "이중특이적 항체"에는 디아바디가 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에 발현되지만, 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들이 또다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루게 되고 2개의 항원 결합 부위가 생성되는, 2가의 이중특이적 항체이다 (예를 들어, [Holliger, P. et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993)], [Poljak, R.J. et al., Structure 2, 1121-1123 (1994)] 참조).
본원에서 사용된 용어 "이펙터 세포"는, 면역 응답의 인지 및 활성화 단계와 대조적으로, 면역 응답의 이펙터 단계에 수반되는 면역 세포를 지칭한다. 대표적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예컨대, 세포독성 T 세포 (CTL)가 포함되는 B 세포 및 T 세포), 킬러(killer) 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만(mast) 세포 및 호염구가 포함된다. 일부 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하고, 특정 면역 기능을 수행한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있고, 예컨대 호중구가 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현시키는 단핵구, 대식세포는 표적 세포를 특이적으로 사멸시키는 것 및 항원을 면역계의 다른 성분에 제시하는 것, 또는 항원을 제시하는 세포에 결합하는 것에 관여한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 식세포작용할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인과 같은 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 γ (IFN-γ) 및/또는 G-CSF에 의해 상향조절되는 것으로 발견되었다. 이러한 증강된 발현은 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식세포작용하거나 용해시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그래프트된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
본원에 사용된 인간 항체는, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자를 지니는 트랜스제닉 마우스를 면역화시킴으로써 또는 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써, 인간 면역글로불린 서열을 사용하는 시스템으로부터 항체가 수득된다면 특정 생식계열 서열"로부터 유래"되고, 이때 선택된 인간 항체는 생식계열 VH 또는 VL 가변 영역 유전자 절편에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 90％ 이상, 예컨대 95％ 이상, 예를 들어 96％ 이상, 예컨대 97％ 이상, 예를 들어 98％ 이상, 또는 예컨대 99％ 이상 동일하다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 VH 또는 VL 가변 영역 유전자 절편 서열로부터 유래된 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이, 예컨대 5개 이하, 예를 들어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다.
키메라 항체는 1가지 항체로부터의 1개 이상의 영역 및 또다른 종으로부터 유래된 1가지 이상의 항체로부터의 1개 이상의 영역을 함유하는 항체이다. 1가 키메라 항체는 디술피드 다리를 통해 키메라 L 사슬과 회합된 키메라 H 사슬에 의해 형성된 이량체 (HL)이다. 2가 키메라 항체는 1개 이상의 디술피드 다리를 통해 회합된 2개의 HL 이량체에 의해 형성된 사량체 (H2L2)이다. 다가 키메라 항체가, 예를 들어, 올리고머를 형성하는 CH 영역 (예를 들어 IgM H 사슬, 또는 μ 사슬로부터의 영역)을 사용함으로써, 또한 생산될 수 있다. 전형적으로, 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지 부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편을 지칭한다 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 및 [Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는 당업계에 주지된 재조합 프로세스에 의해 생산된다 (예를 들어 [Cabilly et al., PNAS USA 81, 3273-3277 (1984)], [Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984)], [Boulianne et al., Nature 312, 643-646 (1984)], EP125023, [Neuberger et al., Nature 314, 268-270 (1985)], EP171496, EP173494, WO86/01533, EP184187, [Sahagan et al., J. Immunol. 137. 1066-1074 (1986)], WO87/02671, [Liu et al., PNAS USA 84, 3439-3443 (1987)], [Sun et al., PNAS USA 84, 214-218 (1987)], [Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988)] 및 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)] 참조).
인간화 항체는 인간에서의 면역 응답을 피하거나 폐기하도록 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인 및 프레임워크 내의 특정 아미노산이 돌연변이된, 비-인간 종으로부터 유래된 항체이다. 비-인간 (예를 들어, 마우스) 항체의 인간화 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 항원-결합 특성 예컨대 특이성, 및 친화성을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능을 더욱 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한 인간화 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 임의로 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은 [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992)] 참조.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일한 분자 조성의 항체 분자들의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일한 결합 특이성 및 친화성을 보인다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 인간 모노클로날 항체는 무한증식 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀(transchromosomal) 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체는 mAb로 약칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 동물 (예컨대 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마 (본원의 다른 곳에서 추가로 기술함)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 조합형 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱시키는 것을 수반하는 임의의 기타 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이같은 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 특정 실시양태에서, 이같은 재조합 인간 항체에 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용된 경우에는, 생체내 체세포 돌연변이유발)이 이루어질 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리(repertoire) 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용된 "이종 항체"는 이같은 항체를 생산하는 트랜스제닉 비-인간 생물과 관련되어 정의된다. 이러한 용어는 비-인간 동물로 구성되지 않는 생물에서 발견되는 것에 상응하고 일반적으로 트랜스제닉 비-인간 동물 이외의 종으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, CD38에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 CD38 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, 인간 CD38의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 관련 항원, 예를 들어, 다른 종으로부터의 항원 (예컨대 CD38 종 상동체)에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상이한 특이성을 갖는 "단리된" 모노클로날 항체들의 조합물은 잘 규명된 조성으로 조합된다.
본원에서 사용된 "특이적 결합"은 소정의 항원에 대한 항원 결합 펩티드, 예컨대 항체의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항원 결합 펩티드, 예컨대 항체는 재조합 CD38을 리간드로, 항체를 분석물로 사용하여 BIAcore 3000 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정하는 경우 약 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 약 10-11 M 이하의 KD에 상응하는 친화력으로 결합한다. 항원 결합 펩티드는 소정의 항원에 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합 친화력보다 10배 이상 낮은, 예컨대 100배 이상 낮은, 예를 들어 1000배 이상 낮은, 예컨대 10,000배 이상 낮은 KD에 상응하는 친화력으로 결합할 수 있다. 친화력이 더 낮은 양은 항원 결합 펩티드의 KD에 의존적이어서, 항원 결합 펩티드의 KD가 매우 낮으면 (즉, 항원 결합 펩티드가 고도로 특이적이면), 항원에 대한 친화력이 비-특이적 항원에 대한 친화력보다 낮은 양은 10,000배 이상일 수 있다. 문구 "항원을 인식하는 항원 결합 펩티드" 및 "항원에 특이적인 항원 결합 펩티드"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 펩티드"와 상호교환적으로 사용된다. 또한, 문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "kd" (sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 속도 상수를 지칭하도록 의도된다. 상기 값은 koff 값으로 또한 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "ka" (M-1 × sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 평형 속도 상수를 지칭하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "KD" (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "KA" (M-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭하도록 의도되고, ka를 kd로 나누어 수득된다.
본원에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM)를 나타낸다.
본원에 사용된 "이소타입 스위칭(switching)"은 항체의 클래스 또는 이소타입이 1가지 면역글로불린 클래스에서 다른 면역글로불린 클래스들 중 하나로 변하는 현상을 지칭한다.
본원에 사용된 "스위칭되지 않은 이소타입"은 이소타입 스위칭이 일어나지 않은 경우에 생산되는 중쇄의 이소타입 클래스를 지칭한다; 스위칭되지 않은 이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 전형적으로 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 하류의 첫번째 CH 유전자이다. 이소타입 스위칭은 고전적 이소타입 스위칭 또는 비-고전적 이소타입 스위칭으로 분류되었다. 고전적 이소타입 스위칭은 트랜스진 내의 1개 이상의 스위치 서열 영역을 수반하는 재조합 이벤트에 의해 발생한다. 비-고전적 이소타입 스위칭은, 예를 들어, 인간 σμ와 인간 Σμ 간의 상동 재조합 (δ-관련 결실)에 의해 발생할 수 있다. 별법적인 비-고전적 스위칭 메커니즘, 예컨대 특히 트랜스진 간의 재조합 및/또는 염색체 간의 재조합이 발생하여 이소타입 스위칭이 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "스위치 서열"은 스위치 재조합을 담당하는 DNA 서열을 지칭한다. "스위치 공여자" 서열, 전형적으로 μ 스위치 영역은 스위치 재조합 동안 결실되는 구축물 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "스위치 수용자" 영역은 결실될 구축물 영역과 대체 불변 영역 (예컨대 γ, ε 등)의 사이에 있을 것이다. 재조합이 항상 발생하는 특정 부위는 없기 때문에, 최종 유전자 서열이 구축물로부터 전형적으로 예측가능하지 않을 것이다.
본원에 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 더욱 구체적으로는 면역글로불린 (항체) 단백질에 공유결합으로 부착된 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다. 이종 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스진의 CH 유전자가 유래되는 종보다 비-인간 트랜스제닉 동물 종의 글리코실화 패턴과 더 유사한 것으로 것으로 당업자가 인식할 경우, 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비-인간 트랜스제닉 동물 종에 의해 생산되는 항체 상에서 천연적으로 발생하는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할 수 있다.
한 대상에게 적용되는 본원에 사용된 용어 "천연-발생"은 상기 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않고 자연 내의 공급원으로부터 단리될 수 있는 생물 (바이러스를 포함) 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연-발생 서열이다.
본원에 사용된 용어 "재배열된"은 V 절편이 완전한 VH 또는 VL 도메인 각각을 본질적으로 코딩하는 형상으로 D-J 또는 J 절편에 바로 인접하여 위치해 있는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 좌위의 형상을 말한다. 재배열된 면역글로불린 (항체) 유전자 좌위는 생식계열 DNA와 비교하여 확인할 수 있다; 재배열된 좌위에는 1개 이상의 재조합 7량체/9량체 상동성 요소가 있을 것이다.
V 절편과 관련하여 본원에 사용된 용어 "재배열되지 않은" 또는 "생식계열 형상"은 V 절편이 D 또는 J 절편에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 형상을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하도록 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다. 핵산은 전체 세포 내에, 세포 용해물 내에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 젤 전기영동 및 당업계에 주지된 기타 기술이 포함되는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예컨대 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제되었을 때 "단리된" 또는 "실질적으로 순수하게 된" 것이다. [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)] 참조.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 조절 서열의 전사와 관련하여, 작동가능하게 연결된 것은 연결될 DNA 서열들이 인접한다는 것을 의미하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결시키는 것이 필요한 경우, 서열들이 인접하고 리딩 프레임 내에 있다는 것을 의미한다. 스위치 서열의 경우, 작동가능하게 연결된 것은 서열이 스위치 재조합을 실행시킬 수 있다는 것을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "성장 억제" (예를 들어, 세포를 지칭하는 경우)는 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체와 접촉되지 않은 동일한 세포의 성장과 비교하여 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체와 접촉되었을 때 세포 성장에서의 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 적어도 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 99％, 또는 100％의 세포 배양물 성장 억제를 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "결합 억제" 및 "결합 차단" (예를 들어 CD38 결합 파트너가 CD38에 결합하는 것의 억제/차단을 지칭하는 경우)은 상호교환가능하게 사용되고, 부분적 억제/차단 및 완전한 억제/차단 모두를 포함한다. CD38 결합 파트너가 CD38에 결합하는 것의 억제/차단은 CD38 결합 파트너가 억제 또는 차단 없이 CD38에 결합하는 경우 발생하는 세포 신호전달의 정상적인 수준 또는 유형을 감소시키거나 변형시킬 수 있다. 억제 및 차단은 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체와 접촉되지 않은 리간드와 비교하여 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체와의 접촉 시 CD38에 대한 CD38 결합 파트너의 결합 친화력에서의 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 적어도 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 99％, 또는 100％의 CD38에 대한 CD38 결합 파트너의 결합의 차단을 포함하도록 또한 의도될 수 있다.
"표적 세포"는 본 발명의 조성물 (CD38BP, 예컨대 인간 모노클로날 항-CD38 항체, 및/또는 CD38에 대해 지시된 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 예를 들어 포함함)에 의해 표적화될 수 있는 대상 (예를 들어 인간 또는 동물) 내의 임의의 바람직하지 않음 세포를 의미한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 CD38을 발현 또는 과발현하는 세포이다. CD38을 발현하는 세포에는 전형적으로 조혈 세포, 예컨대 수질 흉선세포, 활성화된 T 및 B 세포, 80％의 휴지기 NK 세포 및 단핵구, 림프절 배중심 림프모구, 형질 B 세포 및 일부 여포내 세포, 수지상 세포, 정상 골수 세포, 특정 전구체 세포, 50-80％의 탯줄 혈액 세포, 적혈구 및 혈소판이 포함된다. CD38은 비-조혈 세포, 예컨대 장 내의 상피내 세포 및 고유판 림프구에 의해, 뇌 내의 푸르키니에 세포 및 신경섬유 매듭에 의해, 전립선 내의 상피 세포, 췌장 내의 β-세포, 뼈 내의 파골세포, 눈 내의 망막 세포 및 평활근 및 횡문근의 횡문근형질막에 의해 또한 발현될 수 있다. 악성 세포에서, CD38은 다발성 골수종, 원발성 또는 속발성 형질 세포성 백혈병, B-세포 만성 림프구성 백혈병, B-세포 급성 림프구성 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 원발성 전신 아밀로이드증, 외투 세포 림프종, 전-림프구성/골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 여포성 림프종, 및 NK-세포 백혈병이 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 악성 혈액학적 질환에서 발현된다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 자신이 연결된 또다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭하도록 의도된다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이고, 이는 추가적인 DNA 절편이 내부에 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프이다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 이때 추가적인 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제될 수 있다 (예를 들어 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜형 포유류 벡터). 기타 벡터 (예컨대 비-에피솜형 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 따라서 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이므로 상호교환적으로 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 불능 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 단순히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하도록 의도된다. 이같은 용어는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이같은 세포의 자손을 또한 지칭하도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 후속 세대에서 일부 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이같은 자손이 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포는, 예를 들어, 트랜스펙토마, 예컨대 CHO 세포, NS/0 세포, 및 림프구성 세포를 포함한다.
용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이같은 조절 서열은, 예를 들어, [Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함하여 발현 벡터의 디자인은 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현용 조절 서열의 예로는 포유류 세포에서의 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 별법적으로, 비-바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상"은 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
다양한 형태의 용어 "형질감염"은 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 광범위한 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 리포펙틴(lipofectin) 형질감염 등을 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "트랜스펙토마"는 항체를 발현하는 재조합 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, 식물 세포, 또는 진균류 (효모 세포 포함)를 포함한다.
용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
용어 "트랜스제닉 비-인간 동물"은 1개 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스진 또는 트랜스크로모좀(transchromosome) (동물의 천연 게놈 DNA 내로 통합되거나 통합되지 않음)을 포함하는 게놈을 갖고 완전한 인간 항체를 발현할 수 있는 비-인간 동물을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는, CD38 항원 및/또는 CD38을 발현하는 세포로 면역화되는 경우 마우스가 인간 항-CD38 항체를 생산하도록, 인간 경쇄 트랜스진, 및 인간 중쇄 트랜스진 또는 인간 중쇄 트랜스크로모좀을 가질 수 있다. 인간 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 마우스, 예를 들어 HuMAb 마우스, 예컨대 HCo7 또는 HCo12 마우스의 경우에서와 같이 마우스의 염색체 DNA 내로 삽입될 수 있거나, 또는 인간 중쇄 트랜스진은 WO 02/43478에 기술된 트랜스크로모조멀 KM 마우스의 경우에서와 같이 염색체 외부에 유지될 수 있다. 이같은 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 마우스 (본원에서 총괄적으로 "트랜스제닉 마우스"로 지칭)는 V-D-J 재조합 및 이소타입 스위칭을 거침으로써 소정의 항원에 대한 다양한 이소타입의 인간 모노클로날 항체 (예컨대 IgG, IgA, IgM, IgD 및/또는 IgE)를 생산할 수 있다. 트랜스제닉 비-인간 동물은 특정 항체를 코딩하는 유전자를 도입함으로써, 예를 들어, 이러한 유전자를 동물의 유액에서 발현되는 유전자에 작동가능하게 연결시킴으로써, 특정 항원에 대한 항체를 생산하는데 또한 사용될 수 있다.
본원에서의 용어 특이성은 CD38의 다른 부분 (다른 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체가 결합하는 다른 에피토프 포함)과는 검출가능한 반응성이 거의 없거나 없으면서 CD38 내의 한 에피토프를 인식하는 CD38 결합 펩티드, 예컨대 항-CD38 항체의 능력을 지칭한다. 특이성은 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 분석법에 의해 상대적으로 결정될 수 있다. 더욱 특히, 특이성은 본원에 기술된 임의의 에피토프 확인/특징화 기술 또는 당업계에 공지된 이의 등가물에 의해 결정될 수 있다.
그럼에도 불구하고 특정 항원 결정기에 특이적인 항체는 CD38과 약간 생물학적으로 관련되어 존재할 수 있는 다른 생체분자와 교차-반응할 수 있다. 더욱 전형적으로, CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체는 다른 종으로부터의 CD38 상동체와 교차-반응할 수 있다. 어느 한쪽 또는 양쪽 모두의 문맥에서, 이같은 교차-반응성 항체는 관련된 구조 및/또는 환경 인자에 관하여 인간 CD38에 대해 선택적이다.
본원에서의 용어 선택성은 특정 영역, 표적 또는 펩티드, 전형적으로 1가지 이상의 다른 생물학적 분자, 구조물, 세포, 조직 등과 대조적으로 CD38 내의 영역 또는 에피토프에 대한 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체의 우선적인 결합을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체는 결장암 세포의 환경에서 CD38의 일부분에 선택적이다 (즉, 항-CD38 항체는 결장암 세포의 다른 성분들에 비해 CD38의 일부분에 선택적으로 결합할 것이다).
본 발명의 CD38BP는 실질적으로 단리된 형태로 전형적으로 사용 및 제공된다. 실질적으로 단리된 분자는 분자가 속하는 분자의 클래스에 관해 분자가 발견되는 조성물 내의 우세한 종인 분자이다 (즉, 조성물 내의 분자 유형의 약 50％ 이상을 구성하고, 전형적으로 조성물 내의 분자, 예를 들어, 펩티드 종의 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 그 이상을 구성할 것이다 (예를 들어, 조성물은 모든 존재하는 펩티드 종과 관련하여 CD38BP에 대해 적어도 약 98％, 98％, 또는 99％의 균질성을 나타낼 것이다)).
단리된 분자는 유의한 수준 (예컨대 약 1％ 초과, 약 2％ 초과, 약 3％ 초과, 또는 약 5％ 초과)의, CD38BP이 생산되는 세포 또는 동물 내에 함유된 임의의 외인성 및 바람직하지 않은 생리학적 인자, 예컨대 비-CD38 결합 생체분자 (또는 본 발명의 CD38BP의 결합 및/또는 활성을 간섭할 수 있는 CD38 결합 분자)와 회합되지 않은 분자를 지칭한다. 단리된 분자는 인간의 개입 (자동, 수동, 또는 자동 및 수동)으로 인한 순도 단계를 통과한 임의의 분자를 또한 지칭한다. 본 발명에 의해 제공되는 다수의 다양한 조성물, 예컨대 1가지 이상의 제약상 허용가능한 담체를 함유하는 조성물에서, CD38BP는 조성물 내의 전체 분자 종의 수의 관점에서 비교적 소량으로 존재할 수 있다 (예를 들어 다량의 제약상 허용가능한 담체, 안정화제, 및/또는 방부제를 함유하는 조성물의 경우). 일부 경우에, 추가적인 펩티드, 예컨대 BSA가 미리 정제된 CD38BP와 함께 이같은 조성물에 포함될 수 있다. 그러나, 조성물의 이같은 추가적인 구성성분이 CD38BP의 의도된 용도에 허용가능하다면, 이같은 조성물은 단리된 CD38BP를 포함하는 것으로 여전히 기술될 수 있다.
전형적으로 본 발명의 CD38BP에는 다른 CD38BP, 예컨대 상이한 항원 특이성을 갖는 CD38BP가 실질적으로 없다. 그러나, 본 발명은 상이한 특이성 및 특성을 갖는 다수의 CD38BP들을 포함하는 조성물을 또한 제공한다 (예를 들어 본 발명은 상이한 특이성 및/또는 선택성 특성을 갖는 CD38BP들의 "칵테일"을 제공한다).
"치료"는 증상 또는 질환 상태의 진정, 개선 또는 근절 (치유)를 목적으로 유효량의 본 발명의 치료적으로 활성인 화합물을 투여하는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2의 서열로 본질적으로 구성되는 VL 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 7의 서열로 본질적으로 구성되는 VH 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2의 서열로 본질적으로 구성되는 VL 영역 및 서열 7의 서열로 본질적으로 구성되는 VH 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 3의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 4의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 5의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 8의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 9의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 10의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각 서열 3, 서열 4 및 서열 5로 본질적으로 구성되는 VL CDR (VL CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로 본질적으로 구성되는 VH CDR (VH CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VL CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 3, 서열 4 및 서열 5로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR, 및
(b) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VH CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP의 VL 영역과 VH 영역 사이에 위치한 가요성 링커를 포함하는 CD38BP를 제공한다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 VL 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 별도의 사슬 상에 제시되고, VL CDR1, CDR2, CDR3 및 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3이 협동적으로 회합되어 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는데 기여하도록 배향된 CD38BP를 제공한다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP가 2개의 동일한 항원 결정기 결합 부위를 포함하도록, 2 셋트의 가변 도메인 (회합된 별도의 사슬 상의 회합된 VL 및 VH 도메인의 셋트)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
이러한 단락에 기술된 임의의 이같은 CD38BP는, 적어도 부분적으로, 서열 2의 서열을 포함하는 VL 영역 및 서열 7의 서열을 포함하는 VH 영역을 갖는 항체와 유사한 에피토프 특이성, 선택성 및 기타 특성을 가질 것으로 예상되고, 따라서 다발성 골수종의 치료에서 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 12의 서열로 본질적으로 구성되는 VL 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 17의 서열로 본질적으로 구성되는 VH 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 12의 서열로 본질적으로 구성되는 VL 영역 및 서열 17의 서열로 본질적으로 구성되는 VH 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 13의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 14의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 15의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 18의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 19의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 20의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각 서열 13, 서열 14 및 서열 15로 본질적으로 구성되는 VL CDR (VL CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각 서열 18, 서열 19 및 서열 20으로 본질적으로 구성되는 VH CDR (VH CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VL CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 13, 서열 14 및 서열 15로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR, 및
(b) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VH CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 18, 서열 19 및 서열 20으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP의 VL 영역과 VH 영역 사이에 위치한 가요성 링커를 포함하는 CD38BP를 제공한다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 VL 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 별도의 사슬 상에 제시되고, VL CDR1, CDR2, CDR3 및 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3이 협동적으로 회합되어 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는데 기여하도록 배향된 CD38BP를 제공한다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP가 2개의 동일한 항원 결정기 결합 부위를 포함하도록, 2 셋트의 가변 도메인 (회합된 별도의 사슬 상의 회합된 VL 및 VH 도메인의 셋트)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
이러한 단락에 기술된 임의의 이같은 CD38BP는, 적어도 부분적으로, 서열 12의 서열을 포함하는 VL 영역 및 서열 17의 서열을 포함하는 VH 영역을 갖는 항체와 유사한 에피토프 특이성, 선택성 및 기타 특성을 가질 것으로 예상되고, 따라서 다발성 골수종의 치료에서 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 22의 서열로 본질적으로 구성되는 VL 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 27의 서열로 본질적으로 구성되는 VH 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 22의 서열로 본질적으로 구성되는 VL 영역 및 서열 27의 서열로 본질적으로 구성되는 VH 영역을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 23의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 24의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 25의 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 28의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 29의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 30의 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각 서열 23, 서열 24 및 서열 25로 본질적으로 구성되는 VL CDR (VL CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각 서열 28, 서열 29 및 서열 30으로 본질적으로 구성되는 VH CDR (VH CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VL CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 23, 서열 24 및 서열 25로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR, 및
(b) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VH CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 28, 서열 29 및 서열 30으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP의 VL 영역과 VH 영역 사이에 위치한 가요성 링커를 포함하는 CD38BP를 제공한다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 VL 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 별도의 사슬 상에 제시되고, VL CDR1, CDR2, CDR3 및 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3이 협동적으로 회합되어 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는데 기여하도록 배향된 CD38BP를 제공한다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP가 2개의 동일한 항원 결정기 결합 부위를 포함하도록, 2 셋트의 가변 도메인 (회합된 별도의 사슬 상의 회합된 VL 및 VH 도메인의 셋트)을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
이러한 단락에 기술된 임의의 이같은 CD38BP는, 적어도 부분적으로, 서열 22의 서열을 포함하는 VL 영역 및 서열 27의 서열을 포함하는 VH 영역을 갖는 항체와 유사한 에피토프 특이성, 선택성 및 기타 특성을 가질 것으로 예상되고, 따라서 다발성 골수종의 치료에서 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 N-말단 잔기 및/또는 1개, 2개 또는 3개의 C-말단 아미노산 잔기가 손실된, 서열 3 또는 서열 13 또는 서열 23에 따른 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1개 또는 2개의 N-말단 잔기 및/또는 1개, 2개 또는 3개의 C-말단 잔기가 손실된, 서열 4 또는 서열 14 또는 서열 24에 따른 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 N-말단 잔기 및/또는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 C-말단 잔기가 손실된, 서열 5 또는 서열 15 또는 서열 25에 따른 서열로 본질적으로 구성되는 VL CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 N-말단 잔기 및/또는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 C-말단 잔기가 손실된, 서열 8 또는 서열 18 또는 서열 28에 따른 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR1을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 N-말단 아미노산 및/또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 C-말단 아미노산이 손실된, 서열 9 또는 서열 19 또는 서열 29에 따른 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR2를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1개, 2개 또는 3개의 N-말단 아미노산 잔기 및/또는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 C-말단 아미노산 잔기가 손실된, 서열 10 또는 서열 20 또는 서열 30에 따른 서열로 본질적으로 구성되는 VH CDR3을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
본 발명은 이러한 "말단절단된(truncated)" CDR 서열이 서로 및/또는 본원에 기술된 다른 CDR 서열과 조합된 CD38BP를 또한 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VL CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 3, 서열 4 및 서열 5로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR, 및
(b) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VH CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP의 VL 영역과 VH 영역 사이에 위치한 가요성 링커를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 VL 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 별도의 사슬 상에 제시되고, VL CDR1, CDR2, CDR3 및 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3이 협동적으로 회합되어 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는데 기여하도록 배향된 CD38BP를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP가 2개의 동일한 항원 결정기 결합 부위를 포함하도록, 2 셋트의 가변 도메인 (회합된 별도의 사슬 상의 회합된 VL 및 VH 도메인의 셋트)을 포함하는 CD38BP를 제공한다. 이러한 단락에 기술된 임의의 이같은 CD38BP는, 적어도 부분적으로, 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체와 유사한 에피토프 특이성, 선택성 및 기타 특성을 가질 것으로 예상된다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VL CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 13, 서열 14 및 서열 15로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR, 및
(b) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VH CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 18, 서열 19 및 서열 20으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP의 VL 영역과 VH 영역 사이에 위치한 가요성 링커를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 VL 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 별도의 사슬 상에 제시되고, VL CDR1, CDR2, CDR3 및 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3이 협동적으로 회합되어 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는데 기여하도록 배향된 CD38BP를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP가 2개의 동일한 항원 결정기 결합 부위를 포함하도록, 2 셋트의 가변 도메인 (회합된 별도의 사슬 상의 회합된 VL 및 VH 도메인의 셋트)을 포함하는 CD38BP를 제공한다. 이러한 단락에 기술된 임의의 이같은 CD38BP는, 적어도 부분적으로, 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체와 유사한 에피토프 특이성, 선택성 및 기타 특성을 가질 것으로 예상된다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VL CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 23, 서열 24 및 서열 25로 본질적으로 구성되는 3개의 VL CDR, 및
(b) CD38BP 내에서 서로 매우 근접한 (예를 들어, 야생형 항-CD38 항체에서의 VH CDR들의 간격에 가깝게), 독립적으로 서열 28, 서열 29 및 서열 30으로 본질적으로 구성되는 3개의 VH CDR
을 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP의 VL 영역과 VH 영역 사이에 위치한 가요성 링커를 포함하는 CD38BP를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 VL 및 VH 영역이 면역글로불린 폴드 단백질의 환경에서 별도의 사슬 상에 제시되고, VL CDR1, CDR2, CDR3 및 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3이 협동적으로 회합되어 CD38 상의 항원 결정기에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는데 기여하도록 배향된 CD38BP를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP가 2개의 동일한 항원 결정기 결합 부위를 포함하도록, 2 셋트의 가변 도메인 (회합된 별도의 사슬 상의 회합된 VL 및 VH 도메인의 셋트)을 포함하는 CD38BP를 제공한다. 이러한 단락에 기술된 임의의 이같은 CD38BP는, 적어도 부분적으로, 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체와 유사한 에피토프 특이성, 선택성 및 기타 특성을 가질 것으로 예상된다.
본 발명은 예시된 항체들의 VL 영역, VH 영역, 또는 1개 이상의 CDR의 기능성 변이체를 포함하는 CD38BP를 또한 제공한다. CD38BP의 문맥에서 사용된 VL, VH, 또는 CDR의 기능성 변이체는 모 항체의 친화성/결합성 및/또는 특이성/선택성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)이 여전히 유지되도록 하고, 일부 경우에 이같은 CD38BP는 모 항체보다 더 큰 친화성, 선택성, 및/또는 특이성과 관련될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2 또는 서열 12 또는 서열 22에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 예컨대 60％ 이상, 예를 들어 약 70％ 이상, 예컨대 약 75％ 이상, 예를 들어 약 80％ 이상, 예컨대 약 85％ 이상, 예를 들어 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는 변이체 VL을 포함하고, 각각 서열 2 또는 서열 12 또는 서열 22의 변이체 VL 서열을 갖는 항체, 예컨대 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체, 및 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체, 및 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 각각의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 갖는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 3 또는 서열 13 또는 서열 23 중 어느 하나에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 예컨대 60％ 이상, 예를 들어 약 70％ 이상, 예컨대 약 75％ 이상, 예를 들어 약 80％ 이상, 예컨대 약 85％ 이상, 예를 들어 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는 변이체 VL CDR1을 포함하고, 각각 서열 3 또는 서열 13 또는 서열 23의 변이체 VL CDR1 서열을 갖는 항체, 예컨대 각각 서열 2 또는 서열 12 또는 서열 22의 VL 서열을 갖는 항체, 예컨대 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체, 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체, 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 각각의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 갖는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 4 또는 서열 14 중 어느 하나에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 예컨대 60％ 이상, 예를 들어 약 70％ 이상, 예컨대 약 75％ 이상, 예를 들어 약 80％ 이상, 예컨대 약 85％ 이상, 예를 들어 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는 변이체 VL CDR2를 포함하고, 각각 서열 4 또는 서열 14 또는 서열 24의 변이체 VL CDR2 서열을 갖는 항체, 예컨대 각각 서열 2 또는 서열 12 또는 서열 22의 VL 서열을 갖는 항체, 예컨대 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체, 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체, 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 각각의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 갖는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 5 또는 서열 15 또는 서열 25 중 어느 하나에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 예컨대 60％ 이상, 예를 들어 약 70％ 이상, 예컨대 약 75％ 이상, 예를 들어 약 80％ 이상, 예컨대 약 85％ 이상, 예를 들어 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는 변이체 VL CDR3을 포함하고, 각각 서열 5 또는 서열 15 또는 서열 25의 변이체 VL CDR3 서열을 갖는 항체, 예컨대 각각 서열 2 또는 서열 12 또는 서열 22의 VL 서열을 갖는 항체, 예컨대 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체, 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체, 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 각각의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 갖는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 7 또는 서열 17 또는 서열 27 중 어느 하나에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 예컨대 60％ 이상, 예를 들어 약 70％ 이상, 예컨대 약 75％ 이상, 예를 들어 약 80％ 이상, 예컨대 약 85％ 이상, 예를 들어 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는 변이체 VH를 포함하고, 각각 서열 7 또는 서열 17 또는 서열 27의 변이체 VH 서열을 갖는 항체, 예컨대 서열 7의 VH 서열 및 서열 2의 VL 서열을 갖는 항체, 또는 서열 17의 VH 서열 및 서열 12의 VL 서열을 갖는 항체, 또는 서열 27의 VH 서열 및 서열 22의 VL 서열을 갖는 항체 각각의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 갖는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 8 또는 서열 18 또는 서열 28 중 어느 하나에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 예컨대 60％ 이상, 예를 들어 약 70％ 이상, 예컨대 약 75％ 이상, 예를 들어 약 80％ 이상, 예컨대 약 85％ 이상, 예를 들어 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는 변이체 VH CDR1을 포함하고, 각각 서열 8 또는 서열 18 또는 서열 28의 변이체 VH CDR1 서열을 갖는 항체, 예컨대 각각 서열 7 또는 서열 17 또는 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체, 예컨대 서열 7의 VH 서열 및 서열 2의 VL 서열을 갖는 항체, 또는 서열 17의 VH 서열 및 서열 12의 VL 서열을 갖는 항체, 또는 서열 27의 VH 서열 및 서열 22의 VL 서열을 갖는 항체 각각의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 갖는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 9 또는 서열 19 또는 서열 29 중 어느 하나에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 예컨대 60％ 이상, 예를 들어 약 70％ 이상, 예컨대 약 75％ 이상, 예를 들어 약 80％ 이상, 예컨대 약 85％ 이상, 예를 들어 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는 변이체 VH CDR2를 포함하고, 각각 서열 9 또는 서열 19 또는 서열 29의 변이체 VH CDR2 서열을 갖는 항체, 예컨대 각각 서열 7 또는 서열 17 또는 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체, 예컨대 서열 7의 VH 서열 및 서열 2의 VL 서열을 갖는 항체, 또는 서열 17의 VH 서열 및 서열 12의 VL 서열을 갖는 항체, 또는 서열 27의 VH 서열 및 서열 22의 VL 서열을 갖는 항체 각각의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 갖는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 10 또는 서열 20 또는 서열 30 중 어느 하나에 따른 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 50％ 이상, 예컨대 60％ 이상, 예를 들어 약 70％ 이상, 예컨대 약 75％ 이상, 예를 들어 약 80％ 이상, 예컨대 약 85％ 이상, 예를 들어 약 90％ 이상, 예컨대 약 95％ 이상인 서열로 본질적으로 구성되는 변이체 VH CDR3을 포함하고, 각각 서열 10 또는 서열 20 또는 서열 30의 변이체 VH CDR3 서열을 갖는 항체, 예컨대 각각 서열 7 또는 서열 17 또는 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체, 예컨대 서열 7의 VH 서열 및 서열 2의 VL 서열을 갖는 항체, 또는 서열 17의 VH 서열 및 서열 12의 VL 서열을 갖는 항체, 또는 서열 27의 VH 서열 및 서열 22의 VL 서열을 갖는 항체 각각의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 갖는 CD38BP를 제공한다.
두 서열 간의 동일성 ％는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 수 및 각 갭의 길이를 고려한, 동일한 위치의 수를 서열로 나눈 함수이다 (즉, ％ 상동성 = 동일한 위치의 #/ 위치의 총 # × 100). 서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 ％의 결정은 하기의 비제한적인 실시예에 기술된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 ％는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능함) 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 또한 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 ％를 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함된 [E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4, 11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성 ％를 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능함) 내의 GAP 프로그램에 포함된 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 또한 "질의 서열(query sequence)"로 사용하여, 예를 들어, 관련 서열을 동정하기 위해 공공 데이터베이스를 검색할 수 있다. 이같은 검색은 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-10 (1990)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어길이 = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여, 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여, 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬 을 수득하기 위해, [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-3402 (1997)]에 기술된 바와 같이 Gapped BLAST를 사용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조.
CDR 변이체의 서열은 대부분 보존성인 치환을 통해 모 항체 서열의 CDR의 서열과 상이할 수 있다: 예를 들어, 변이체 내의 치환의 적어도 약 35％, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 (예를 들어, 약 65-99％)은 보존성 아미노산 잔기 대체이다. 본 발명의 문맥에서, 보존성 치환은 하기의 3개의 표 중 1가지 이상에서 반영된 아미노산 클래스 내에서의 치환에 의해 정의될 수 있다:
보존성 치환에 대한 아미노산 잔기 클래스
산성 잔기 Asp 및 Glu
염기성 잔기 Lys, Arg 및 His
전하를 띠지 않는 친수성 잔기 Ser, Thr, Asn 및 Gln
전하를 띠지 않는 지방족 잔기 Gly, Ala, Val Leu 및 Ile
전하를 띠지 않는 비-극성 잔기 Cys, Met 및 Pro
방향족 잔기 Phe, Tyr 및 Trp
별법적인 보존성 아미노산 잔기 치환 클래스
1 Ala (A) Ser (S) Thr (T)
2 Asp (D) Glu (E)
3 Asp (N) Gln (Q)
4 Arg (R) Lys (K)
5 Ile (I) Leu (L) Met (M)
6 Phe (F) Tyr (Y) Trp (W)
아미노산 잔기의 별법적인 물리적 및 기능적 분류
알콜 기-함유 잔기 S 및 T
지방족 잔기 I, L, V 및 M
시클로알케닐-관련 잔기 F, H, W 및 Y
소수성 잔기 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y
음성 전하를 띠는 잔기 D 및 E
극성 잔기 C, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T
양성 전하를 띠는 잔기 H, K 및 R
소형 잔기 A, C, D, G, N, P, S T 및 V
초소형 잔기 A, G 및 S
회전 형성에 수반되는 잔기 A, C, D, E, G, H, K N, Q, R, S, P 및 T
가요성 잔기 Q, T, K, S, G, P, D, E 및 R
더욱 보존성인 치환 군에는 하기의 것들이 포함된다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아르파라긴-글루타민. [Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company]에 예를 들어 기술된 원리를 사용하여 아미노산의 추가적인 군이 또한 공식화될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 소수성/친수성 성질 및 잔기 중량/크기의 관점에서의 보존이 예시된 항체의 CDR과 비교하여 변이체 CDR에서 또한 실질적으로 유지된다 (예를 들어, 서열의 중량, 소수성 점수, 또는 중량 및 소수성 점수가 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 그 이상 (예를 들어, 약 65-99％) 유지된다). 예를 들어, 보존성 잔기 치환은, 또한 또는 별법적으로, 강 또는 약을 기초로 하고 중량을 기초로 하는 보존 군의 대체를 기초로 하고, 이는 당업계에 공지되어 있다.
유사한 잔기의 유지는, 또한 또는 별법적으로, BLAST 프로그램 (예를 들어, NCBI를 통해 입수가능한 BLAST 2.2.8)을 사용하여 결정되는 유사성 점수에 의해 측정할 수 있다. 적절한 변이체는 전형적으로 모 펩티드에 대해 약 45％ 이상, 예컨대 약 55％ 이상, 약 65％ 이상, 약 75％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 그 이상 (예를 들어, 약 70-99％)의 유사성을 나타낸다.
상기의 정의된 군에 제시된 것들보다 덜 보존성인 치환을 선택함으로써 기능에서의 실질적인 변화가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 변화 구역 내의 펩티드의 구조, 예를 들어, 알파-나선형 또는 베타-나선형 구조; 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성; 또는 측쇄의 체적에 더욱 현저하게 영향을 미칠 수 있는 비-보존성 치환이 이루어질 수 있다. 펩티드의 성질에서 가장 큰 변화를 일으킬 것으로 일반적으로 예상되는 치환은 1) 친수성 잔기, 예를 들어, 세릴 또는 트레오닐과 소수성 잔기, 예를 들어, 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴, 또는 알라닐이 서로 치환되거나; 2) 시스테인 또는 프롤린과 임의의 다른 잔기가 서로 치환되거나; 3) 양전성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 라이실, 아르기닐, 또는 히스티딜과 음전성 잔기, 예를 들어, 글루타밀 또는 아스파틸이 서로 치환되거나; 또는 4) 체적이 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌과 측쇄가 없는 잔기, 예를 들어, 글리신이 서로 치환되는 경우의 것들이다. 따라서, 기능/구조에서의 현저한 변화가 요망되는 경우에 이러한 비-보존성 치환 및 기타 비-보존성 치환이 펩티드 내로 도입될 수 있고, 구조/기능의 보존이 요망되는 경우에는 이같은 변화를 피한다.
치환 변이체를 생성시키기 위한 간편한 방식은 당업계에 공지된 방법을 사용하는 파지를 사용하는 친화력 성숙이다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 또한 수행하여, 항원 결합에 현저하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 간의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 이로울 수 있다. 이같은 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 치환에 적절한 후보물질일 것이다.
변이체 항체를 생성시키기 위해 초가변 영역 삽입이 이루어지는 경우, 공지된 항체 내의 당해 초가변 영역의 전형적인 길이 범위를 고려하여야 한다. 예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 제1 초가변 영역에 대해, 실질적으로 유사한, 따라서 예상된 적합한 크기를 유지하면서 모 항체의 VL CDR1 서열 내로 삽입물이 도입될 수 있고, VL CDR1 서열은 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따르면, 예를 들어, 전형적으로 총 약 9-20개 (예를 들어, 약 10-17개)의 잔기를 갖는다. 유사하게, VL CDR2은 전형적으로 잔기 약 5-10개의 총 길이이고; VL CDR3은 전형적으로 잔기 약 7-20개의 길이이고; VH CDR1은 전형적으로 잔기 약 10-15개의 길이이며; VH CDR2는 전형적으로 잔기 약 15-20개의 길이이고; VH CDR3은 전형적으로 잔기 약 6-30개 (예를 들어, 잔기 3-25개)의 길이이다. VH 영역 내에서의 삽입은 VH CDR3 내에서, 그리고 전형적으로 도메인의 C-말단 근처에서, 예컨대 [Kabat et al., 상기 문헌]에 기술된 바와 같은 정렬 및 번호매김을 사용하여 모 VH CDR3의 대략 잔기 97-102에서 이루어진다 (예를 들어 모 VH CDR3 서열의 잔기 번호 100에 인접하여 또는 이에 대해 서열 내의 C-말단에). 초가변 영역 내에 아미노산 잔기(들)이 삽입된 항체 변이체는 무작위로 제조될 수 있고, 특히 표적 항원에 대한 모 항체의 출발 결합 친화력이 무작위로 생산된 항체 변이체가 쉽게 스크리닝될 수 있도록 하는 경우에 그러하다. 예를 들어, 파지 디스플레이가 이같은 무작위 변이체를 스크리닝하는 간편한 방법을 제공한다.
CDR 변이체의 디자인, 구축 및/또는 평가에서, 에피토프에 더 양호하게 결합되도록 하기 위해 CDR 영역이 변형될 수 있다는 사실에 유의할 수 있다. 항체 CDR은 항원의 단백질 표면 내로 내밀어질 수 있는 손가락을 포함할 수 있는 상보성 표면 또는 기타 파라토프 구조를 제공함으로써 전형적으로 작동하고, 이러한 표면 또는 구조 상에 에피토프가 맞게 된다. 에피토프가 단단하게 맞지 않으면, 항체가 최상의 친화력을 제공하지 않을 수 있다. 그러나, 에피토프와 같이, 파라토프 구조에는 이러한 결합의 대부분의 원인이 되는 몇개의 주요 잔기가 있다. 따라서, CDR 서열은 동일한 펩티드에 대한 항체들 간에 길이 및 조성이 현저하게 다를 수 있다. 당업자는 종종 이같은 에피토프 결합에 중요한 기여물인 특정 잔기, 예컨대 타이로신 잔기 (예를 들어, VH CDR3 서열의 상황에서)가 CDR 변이체에서 전형적으로 유지된다는 것을 인지할 것이다.
항원 내에 존재하는 1개 이상의 아미노산 잔기와 항체 내에 존재하는 1개 이상의 아미노산 잔기 간의 접촉 또는 에너지적으로 유리한 상호작용을 증가시키는 1개 이상의 아미노산 잔기를 도입함으로써 (치환 또는 삽입에 의해), CDR 영역의 변이체는 항원과 모 항체 간의 아미노산 접촉과 비교하여 항원과 항체 변이체 간의 아미노산 접촉을 또한 증가시킬 수 있다. 당해 아미노산 상호작용은 수소 결합 상호작용, 반데르발스 상호작용 및 이온성 상호작용으로부터 선택될 수 있다.
당업자는 본 발명의 항체의 CDR 변이체를 포함하는 CD38BP의 디자인 및 선별에 유용한 추가적인 원리를 인지할 것이다.
예시된 항체들의 CDR의 변이체인 CDR 변이체의 문맥에서, 특히 항-CD38 항체 또는 이의 단편에서의 변이체 CDR의 문맥에서, CDR 구조성 루프 구조(들)을 지지하고/하거나 배향시키는데 필요한 잔기들은 전형적으로 유지될 것이고/이거나; CDR 구조성 루프의 약 10옹스트롬 이내에 속하는 잔기 (그러나 임의로, 수 용매 접근가능 면적이 또한 약 5 제곱 옹스트롬 이상인 이러한 면적 내의 잔기만)는 전형적으로 변형되지 않거나 보존성 아미노산 잔기 치환에 의해서만 변형될 수 있고/있거나; CDR 구조성 루프-유사 구조가 변이체 내에서 유지되도록, 아미노산 서열에 오직 제한된 수의 삽입 및/또는 결실 (존재하는 경우)만이 적용될 것이다 (관련된 기술 및 관련된 원리의 해설이 예를 들어 [Schiweck et al., J Mol Biol. 268(5), 934-51 (1997)], [Morea, Biophys Chem. 68(1-3), 9-16 (1997)], [Shirai et al., FEBS Lett. 399(1-2), 1-8 (1996)], [Shirai et al., FEBS Lett. 455(1-2), 188-97 (1999)], [Reckzo et al., Protein Eng. 8(4), 389-95 (1995)] 및 [Eigenbrot et al., J Mol Biol. 229(4), 969-95 (1993)]에 기술되어 있다). 또한 WO 03/048185, WO 03/070747 및 WO 03/027246 참조.
변이체 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 추가적인 기술에는 미국 특허 20040009498, [Marks et al., Methods Mol Biol. 248, 327-43 (2004)], [Azriei-Rosenfeld et al., J Mol Biol. 335(1), 177-92 (2004)], [Park et al., Biochem Biophys Res Commun. 275(2). 553-7 (2000)], [Kang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 88(24), 11120-3 (1991)], [Zahnd et al., J Biol Chem. 279(18), 18870-7 (2004)], [Xu et al., Chem Biol. 9(8), 933-42 (2002)], [Border et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97(20), 10701-5 (2000)], [Crameri et al., Nat Med. 2(1), 100-2 (1996)]에 예를 들어 기술되고, WO 03/048185에 예를 들어 더욱 일반적으로 기술된 방향성 진화(directed evolution) 및 기타 변이체 생성 기술이 포함된다.
생성된 항체 변이체를 임의의 적절한 스크리닝 기술에 적용할 수 있고, 1가지 이상의 관련된 분석법에서의 적절하고 바람직하게 우수한 성질을 갖는 항체를 추가적인 개발용으로 선택할 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 CDR 서열을 포함하는 CD38BP는, 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 및/또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 및/또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체의 친화성/결합성 및/또는 특이성/선택성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 그 이상)을 유지하면서, 그러나 임의로 인간 환자에 대한 면역원성, 에피토프에 대한 친화성, 증가된 반감기 등과 같은 다른 특성에서는 상이하게, 임의의 적절한 수 및 조합의 이같은 VL 및 VH CDR를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이같은 CD38BP는 모 항체보다 더 큰 친화성, 선택성, 및/또는 특이성과 관련될 수 있다. 한 실시양태에서, VL CDR 및/또는 VH CDR의 전체 셋트보다 적은 부분이 본 발명의 CD38BP 내에 존재한다. 한 실시양태에서, 모든 VL CDR 및 VH CDR가 존재한다.
-003 및 -005 및 -024와 비교하여 본 발명의 변이체 CD38BP에서 변형 또는 유지될 수 있는, 항체의 또다른 기능성 성질의 예는 하기와 같다:
(1) CD38에 대한 고친화력 결합;
(2) CD38로부터의 낮은 해리 속도;
(3) CD38 표적에 대한 CD38-결합의 억제 또는 차단;
(4) CD38을 발현하는 T 세포 또는 B 세포의 제거;
(5) CD55/59 음성 또는 CD55/59 양성 세포의 고수준의 CDC의 유도;
(6) CD38에의 결합 시 지질 뗏목(raft) 내로의 전위;
(7) T 세포의 내성화;
(8) CD38을 발현하는 T 또는 B 세포의 증식 억제;
(9) CD38의 내재화;
(10) CD38 효소 활성의 억제 또는 유도;
(11) CD38-유도 신호 전달의 억제 또는 유도;
(12) 사이토카인 생산의 유도 또는 억제;
(13) T 세포 또는 B 세포 분화의 유도 또는 차단;
(14) 세포자멸사의 유도 또는 이로부터의 구출;
(15) NK 세포에 의한 용해 유도의 약화 또는 촉진;
(16) 췌장에서의 β 세포에 의한 인슐린 생산의 유도 또는 억제;
(17) CD38을 발현하는 종양 세포가 있는 대상의 생존 연장; 및/또는
(18) 적절한 이펙터 세포와 혼합되는 경우, CD38 표적의 ADCC의 유도.
본 발명은 CD38에의 결합에 대해 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -003) 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -005) 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -024)와 경쟁 (경쟁적으로 억제) 또는 교차-경쟁 (즉, 비교적 부분적으로 에피토프 결합을 억제)하는 능력을 특징으로 하는 CD38BP를 또한 제공한다.
이같은 CD38BP는, 예를 들어, 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체가 결합하는 에피토프와 동일하거나 이와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체로부터 유래된 Fab 단편일 수 있다. 이같은 Fab 단편은, mAb 분자와 비교하여 비교적 작은 크기로 인해, CD38에의 결합에 대해 상기 항체와 현저하게 경쟁하지 않을 수 있다 (단편이 유래된 항체는 경쟁함). 그럼에도 불구하고, 이같은 CD38BP는 CD38의 인접 영역을 유사하게 표적화하는데 유용할 수 있다 (예를 들어, 면역접합체 CD38BP의 상황에서 세포독소, 방사성 핵종 등을 표적화하는 상황에서). 따라서, 이같은 CD38BP는 본 발명의 방법의 문맥에서 유용할 수 있고, 따라서 또한 본 발명에 의해 제공된다.
2개 이상의 CD38BP에 의한 CD38 또는 CD38의 일부분에의 결합에 대한 경쟁은 임의의 적절한 기술에 의해 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 경쟁은 예를 들어 실시예 7, 8 및 9에 기술된 바와 같이 결정된다.
본 발명의 문맥에서의 경쟁은 결합 파트너에 결합하는 또다른 분자의 존재 하에서 특정 결합 파트너에 결합하는 특정 분자의 경향에서의 임의의 검출가능하게 현저한 감소를 지칭한다. 전형적으로, 경쟁은 충분한 양의 2가지 이상의 경쟁 CD38BP 및 CD38 분자를 사용하여 ELISA 분석법 또는 FACS 분석법 (실시예 섹션에 기술됨)에 의해 예를 들어 결정시, 또다른 CD38BP의 존재로 인한 CD38BP와 하기 물질 간의 결합에서의 약 10％ 이상, 예컨대 약 15％ 이상, 또는 약 20％ 이상의 감소를 의미한다:
(a) CD38 형태물 (예를 들어 "프로세싱형", "성숙형", "비-프로세싱형" "프로세싱되지 않은" 또는 "미성숙형" CD38);
(b) 유리 CD38 형태물 (예를 들어, 생체내 프로세싱에 의해 생산된 CD38 단편);
(c) CD38와 회합된 또다른 펩티드, 예컨대 CD31, 및 CD38로 구성된 이종이량체성 펩티드;
(d) CD38와 1가지 기질, 예컨대 cAMP, NAD+ 및/또는 cADPR의 복합체;
(e) CD38와 가용성 리간드, 예컨대 CD31의 이량체화, 회합형 및/또는 프로세싱형 이량체; 또는
(f) CD38의 일부분.
예를 들어 CD38의 특정 영역의 항체-결합 성질이 이의 단편에서 유지되는 환경에서, 예컨대 다양한 테스트된 단편 내에 위치하는 잘 제시된 선형 에피토프 또는 충분히 큰 CD38 단편뿐만 아니라 CD38에서 제시되는 입체형태 에피토프의 경우에, 이는 또한 경쟁이 1가지를 초과하는 CD38 및/또는 CD38의 일부분과 관련하여 CD38BP들 간에 존재하는 경우일 수 있다.
경쟁을 평가하는 것은 제1량의 제1분자, 제2량의 제2분자 및 제3량의 제3분자 (또는 실제의 동시발생 데이타에 대한 대용물로서 제1분자 및 제2분자와 관련하여 새로운 결합 데이타에 합리적으로 비교될 수 있는 결합 연구에 의해 결정된 기준물)를 사용하는 상대적인 억제 결합의 평가를 전형적으로 수반하고, 이때 제1량, 제2량 및 제3량 모두는 다른 존재하는 분자와 관련하여 당면 분자의 선택성 및/또는 특이성에 관한 정보를 부여하는 비교를 이루기에 충분한다. 제1량, 제2량 및 제3량은 당면한 CD38BP의 성질 및 따라서 잠재적인 표적에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 실시예 섹션에 기술된 것들과 유사한 ELISA 평가를 위해, 약 5-50 ㎍ (예를 들어, 약 10-50 ㎍, 약 20-50 ㎍, 약 5-20 ㎍, 약 10-20 ㎍ 등)의 CD38BP 및/또는 CD38 표적이 경쟁이 존재하는지를 평가하기 위해 필요하다. 조건이 또한 결합에 적절하여야 한다. 전형적으로, 생리학적 조건 또는 생리학적 조건에 근접한 조건 (예를 들어, 약 20-40℃의 온도, 약 7-8의 pH 등)이 CD38BP:CD38 결합에 적절하다.
종종 경쟁은 ELISA 및/또는 FACS 분석에 의해 결정될 때 약 5％를 초과하는 현저하게 더 큰 상대적 억제로 표시된다. 특정 환경에서 무엇이 경쟁의 적절한 수준인지의 기준/결정인자로서 상대적 억제의 더 높은 역치를 설정하는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어, CD38에 결합하는 또다른 펩티드 또는 분자 (예를 들어, CD38의 천연 결합 파트너 예컨대 CD31 (CD31 항원으로 또한 칭해짐), EndoCAM, GPIIA', PECAM-1, 혈소판/내피 세포 부착 분자 또는 천연 발생 항-CD38 항체)의 결합을 차단하는 기능이 의도되어 디자인된 새로운 항체를 선택 또는 스크리닝하기 위해 경쟁 분석이 사용되는 경우). 따라서, 예를 들어, 약 10％ 이상의 상대적 억제가 검출되거나; 약 15％ 이상의 상대적 억제가 검출되거나; 또는 약 20％ 이상의 상대적 억제가 검출되면 항체가 충분히 경쟁적인 것으로 간주되는 경쟁성 기준을 설정하는 것이 가능하다. 경쟁 항체에 속하는 에피토프들이 항원 내에 밀접하게 위치하는 경우, CD38 결합의 약 40％를 초과하는 상대적 억제로 경쟁이 표시될 수 있다 (예를 들어, 약 45％ 이상의 억제, 예컨대 약 50％ 이상의 억제, 예를 들어 약 55％ 이상의 억제, 예컨대 약 60％ 이상의 억제, 예를 들어 약 65％ 이상의 억제, 예컨대 약 70％ 이상의 억제, 예를 들어 약 75％ 이상의 억제, 예컨대 약 80％ 이상의 억제, 예를 들어 약 85％ 이상의 억제, 예컨대 약 90％ 이상의 억제, 예를 들어 약 95％ 이상의 억제, 또는 더 높은 수준의 상대적 억제).
경쟁은 한 분자와 잠재적인 두 경쟁 파트너 간의 교차-반응성의 역(逆)으로 간주될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 CD38 내의 1개 이상의 잔기 또는 영역에 특이적으로 결합하지만, 또한 다른 펩티드, 펩티드 영역 또는 분자와 교차-반응하지 않고, 예를 들어, 본 발명은 CD38와 상동성이 있는 단백질, 예컨대 BST-1 (골수 간질 세포 항원-1) 및 Mo5 (CD157로 또한 칭해짐)와 교차-반응하지 않는 항-CD38 항체; 또는 정상 조직, 예컨대 다발성 골수종에 수반되지 않은 조직의 환경 내의 CD38과 교차-반응하지 않는 항-CD38 항체를 제공한다. 전형적으로, 교차-반응성의 결여는 적절한 분석 조건 하에 충분한 양의 분자를 사용하여 ELISA 및/또는 FACS 분석법에 의해 평가했을 때 분자들 간의 약 5％ 미만의 상대적인 억제를 의미한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38 또는 이의 일부에의 결합에 대해 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체, 예컨대 항체 -003과 경쟁하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38 또는 이의 일부에의 결합에 대해 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체, 예컨대 항체 -005와 경쟁하는 CD38BP를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38 또는 이의 일부에의 결합에 대해 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체, 예컨대 항체 -024와 경쟁하는 CD38BP를 제공한다.
본원의 다른 곳에서 언급되는 바와 같이, 달리 언급되거나 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한, CD38BP이 CD38에 결합하는 것에 대한 언급은 임의의 적절한 환경, 예컨대 CD38의 구조가 존재하는 입체형태적 환경; 또는 선형 에피토프 환경에서의 결합을 지칭하도록 의도된다. 물론, 이같은 환경(들)의 제한된 부분 집합에서의 결합이 본 발명에 의해 제공되는 임의의 CD38BP와 관련하여 중요한 특성일 수 있다.
경쟁 억제에 의해 CD38BP 특이성을 결정하기 위한 추가적인 방법을, 예를 들어, [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988], [Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley InterScience N.Y., (1992, 1993)], 및 [Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983)]에서 확인할 수 있다.
인간 CD38는 다수의 상이한 에피토프를 포함하고, 이는 (1) 인간 CD38 내의 단일 펩티드 사슬 내에 포함된 펩티드 항원 결정기; (2) 특정 사슬 상의 1개 이상의 비-인접 아미노산 및/또는 공간적으로 인접하지만 분리된 펩티드 사슬 (전형적으로, 사슬의 각각의 아미노산 서열이 인간 CD38 폴리펩티드 서열을 따라 해체되어 위치하는 경우) 상에 존재하는 아미노산으로 구성된 입체형태성 항원 결정기; (3) 인간 CD38에 공유결합으로 부착된 분자 구조, 예컨대 탄수화물 기 전체 또는 이의 일부로 구성되는 번역후 항원 결정기; 또는 (4) (1)-(3)의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 문맥에서의 에피토프는 면역글로불린에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 펩티드 또는 펩티드-유도체 결정기를 포함한다. 에피토프는 임의의 적절한 위치 (CD38의 선형 서열 기준) 배향 (폴딩된 CD38, 또는 이의 단편 기준), 아미노산 조성 (및 따라서, 적어도 부분적으로, 전하)의 임의의 적절한 수의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 에피토프는 CD38의 1차 서열에 관하여 1개 이상의 인접 또는 비-인접 위치 내의 약 3-10개의 아미노산, 전형적으로 3-8개의 아미노산으로 구성될 수 있다 (예를 들어 에피토프는 CD38 내의 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 비-인접 위치 내에 분포된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 잔기로 본질적으로 구성될 수 있다). 별법적으로, 예를 들어, 에피토프는 CD38 내의 약 5-40개의 인접 아미노산 잔기 (예를 들어, 약 7-30개의 아미노산 잔기, 약 5-20개의 아미노산 잔기, 또는 약 3-15개의 아미노산 잔기)의 영역에 의해 규정되는 것으로 간주될 수 있다 (단독 또는 가까운 CD38 도메인의 일부와 조합됨). 일부 에피토프에서, 오직 1개의 아미노산 잔기 또는 오직 몇개의 아미노산 잔기만이 CDR 또는 CDR(들) 인식에 결정적인 경우가 있을 수 있다 (그리고, 따라서 CD38BP:CD38 항원 친화성 및 결합성에 가장 중요). 따라서, 에피토프는 1개 이상의 이같은 결정적인 잔기를 기초로 특징화될 수 있고, 이때 다른 잔기가 에피토프에 또한 약간 덜 기여할 수 있는 것으로 인식된다. 아미노산의 영역에 의해 정의되는 에피토프의 경우, 적어도 일부의 CD38BP가 특이적인 에피토프가 "손실"되지 않으면서 잔기가 적합한 다른 잔기로 치환될 수 있도록 영역 내의 1개 이상의 아미노산이 항원 결합에 중요하지 않게, 심지어 무시할 수 있을 정도로 기여할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -003) 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -005) 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -024)가 또한 특이적으로 결합하는 CD38 에피토프에 특이적으로 결합하는 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체를 제공한다. 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체의 CDR 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체의 CDR 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체의 CDR과 상이한 1개 이상의 CDR을 갖는 CD38BP가 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 및 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 및 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 각각과 동일한 에피토프에 대해 여전히 특이적일 수 있다. 일부 이같은 경우에, 당해 CD38BP는 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 및 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 및 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 각각보다 에피토프의 특정 구조 또는 영역에 대해 더욱 특이적/선택적이거나 이를 인식할 수 있다.
서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -003) 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -005) 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -024)에 결합되는 CD38 에피토프는 표준 맵핑(mapping) 및 특징화 기술을 통해 확인될 수 있고, 이의 추가적인 개선은 당업자에게 수많은 예가 입수가능한 임의의 적절한 기술에 의해 확인될 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 CD38BP에 대한 에피토프를 확인 및/또는 특징화하는데 또한 사용될 수 있다. 이같은 맵핑/특징화 방법의 한 예로서, 항-CD38 항체에 대한 에피토프가 CD38 단백질 내의 노출된 아민/카르복실의 화학적 변형을 사용하여 에피토프 "풋-프린팅(foot-printing)"에 의해 결정될 수 있다. 이같은 풋-프린팅 기술의 한 구체적인 예는 수용체 및 리간드 단백질 아미드 양성자의 수소/중수소 교환, 결합 및 역-교환이 발생하는 HXMS (질량 분광법에 의해 결정되는 수소-중수소 교환)를 사용하는 것이고, 이때 단백질 결합에 참여하는 골격 아미드 기는 역-교환으로부터 보호되고, 따라서 계속 중수소화될 것이다. 관련 영역이 이러한 지점에서 펩티드 단백질용해, 급속 마이크로보어(microbore) 고성능 액체 크로마토그래피 분리, 및/또는 전자분무 이온화 질량 분광법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, [Ehring H, Analytical Biochemistry, 267(2) 252-259 (1999)] 및/또는 [Engen, J. R. and Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A] 참조. 적절한 에피토프 확인 기술의 또다른 예는 유리 항원 및 항체와 같은 항원 결합 펩티드와 복합체를 이룬 항원의 2차원 NMR 스펙트럼에서의 신호의 위치가 전형적으로 비교되는 핵 자기 공명 에피토프 맵핑 (NMR)이다. 항원에 상응하는 신호만이 NMR 스펙트럼에서 보이고, 항원 결합 펩티드로부터는 신호가 보이지 않도록 전형적으로 항원이 15N으로 동위원소 표지된다. 항원 결합 펩티드와의 상호작용에 수반되는 아미노산으로부터 유래되는 항원 신호는 전형적으로 유리 항원으로부터의 스펙트럼에 비하여 복합체의 스펙트럼에서 위치 이동될 것고, 결합에 수반되는 아미노산이 이러한 방식으로 확인될 수 있다. 예를 들어 [Ernst Schering Res Found Workshop. (44), 149-67 (2004)], [Huang et al., Journal of Molecular Biology 281(1), 61-67 (1998)] 및 [Saito and Patterson, Methods. 9(3), 516-24 (1996)] 참조.
질량 분광법 방법을 사용하여 에피토프 맵핑/특징화를 또한 수행할 수 있다. 예를 들어 [Downward, J Mass Spectrom. 35(4), 493-503 (2000)] 및 [Kiselar and Downard, Anal Chem. 71.(9), 1792-801 (1999)] 참조.
프로테아제 소화 기술이 에피토프 맵핑 및 확인의 문맥에서 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 트립신을 사용하여 CD38에 대해 약 1:50의 비율로 37℃ 및 pH 7-8에서의 하룻밤 동안 소화시킨 후, 펩티드 확인을 위한 질량 분광법 (MS) 분석을 사용함으로써, 항원 결정기-관련 영역/서열을 프로테아제 소화에 의해 결정할 수 있다. 이어서 CD38BP에 의해 트립신 절단으로부터 보호된 펩티드를 트립신 소화에 적용된 샘플과 CD38BP와 함께 인큐베이션된 후 예를 들어 트립신에 의한 소화 (이에 의해 결합제에 대한 풋프린트가 드러남)에 적용된 샘플의 비교에 의해 확인할 수 있다. 유사한 에피토프 특징화 방법에서 키모트립신, 펩신 등과 같은 다른 효소를 또한 또는 별법적으로 사용할 수 있다. 이러한 측정에서 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -003) 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -005) 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -024)와 실질적으로 동일한 결과를 제공하는 CD38BP는 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -003) 또는 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -005) 또는 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -024) 각각과 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 것으로 생각된다. 유사한 기술에 대한 논의를 위해, 예를 들어 [Manca, Ann 1st Super Sanita. 27(1), 15-9 (1991)] 참조.
관련된 항원 결정기 영역을 확인하기 위한 또다른 방법은 1개가 비오틴화된 2개의 항체를 사용하는 CD38에 대한 경쟁적 분석에 의한 에피토프 맵핑이다.
관련된 항원 결정기 영역을 확인하기 위한 또다른 방법은 PEPSCAN-기재 효소-연결 면역분석법에 의한 CD38의 선형 또는 루프형 펩티드에 대한 항체의 결합이고, 예를 들어 [Slootstra-JW et al. Mol-Divers. 1, 87-96 (1996)]를 참조한다.
관련된 항원 결정기 영역을 확인하기 위한 또다른 방법은 부위 지정 돌연변이유발이고, 예를 들어 [Polyak and Deans, Blood 99, 3956-3962 (2002)]를 참조한다.
다양한 파지 디스플레이 기술이 에피토프를 확인하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어 [Wang and Yu, Curr Drug Targets. 5(1), 1-15 (2004)], [Burton, Immunotechnology. 1(2), 87-94 (1995 Aug)], [Cortese et al., Immunotechnology. 1(2), 87-94 (1995)] 및 [Irving et al., Curr Opin Chem Biol. 5(3), 314-24 (2001)] 참조. 변형된 파지 디스플레이-관련 기술을 통해 컨센서스(consensus) 에피토프를 또한 확인할 수 있다 (http://www.cs.montana.edu/~mumey/papers/jcb03.pdf 참조).
에피토프 맵핑에 잠재적으로 유용한 또다른 방법에는 결정학 기술, X선 회절 기술 (예컨대 Poljak 등에 의해 1970년대-1980년대에 개발된 X선 회절/서열 연구 기술), 및 [Multipin Peptide Synthesis Technology]의 응용이 포함된다. 컴퓨터를 기초로 하는 방법 예컨대 서열 분석 및 3차원 구조 분석 및 도킹(docking)이 항원 결정기를 확인하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 개별적인 모노클로날 항체의 Fab 단편의 구조의 도킹과 함께 CD38의 구조를 사용하는 분자 모델링에 의해 또한 결정될 수 있다. 이러한 맵핑 방법 및 기타 맵핑 방법이 [Epitope Mapping Practical Approach (Westwood and Hay Eds.) 2001 Oxford University Press]에 논의되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2의 VL 서열 및 서열 7의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -003), 서열 12의 VL 서열 및 서열 17의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -005), 및 서열 22의 VL 서열 및 서열 27의 VH 서열을 갖는 항체 (예컨대 항체 -024)로부터 선택된 1개 이상의 mAb와 실질적으로 동일한 특이적 CD38-결합 특성을 갖는 CD38BP를 제공한다.
맵핑 연구는 인간 CD38에 대해 생성된 여러 모노클로날 항체가 CD38의 C-말단 (220-296) 내의 에피토프에 결합한다는 것을 나타냈다 ([Hoshino et al.] 및 [Ferrero et al.]). 이러한 영역 내에서, 3개의 아미노산 차이가 인간과 사이노몰구스 CD38 서열 간에 발견되었다: 인간 서열의 T237, Q272 및 S274가 사이노몰구스의 A238, R273 및 F275에 상응한다. -005는 사이노몰구스 조직에 결합하지 않는다 (실시예 10 및 11에 제시됨). 제한된 숫자의 아미노산 차이가, 예를 들어 단백질에 대한 카르복시말단 부분에, 인간과 원숭이 CD38 서열 간에 존재하고, 예를 들어 하기의 3개의 아미노산 차이가 인간과 사이노몰구스 CD38 서열 간에 존재한다: 인간 CD38 내의 T237, Q272 및 S274가 사이노몰구스 원숭이 CD38 내의 A238, R273 및 F275에 상응한다 (서열 21 및 서열 22 비교). -005는 서열 31의 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 huCD38 단백질 (Q272R), 또는 서열 31의 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 huCD38 단백질 (S274F)에 야생형 인간 CD38에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는다 (실시예 17에 제시됨). -005의 결합은 위치 S274F에서의 아미노산 치환에 의해 특히 폐기된다.
따라서, 본 발명은 인간 CD38 (서열 31)에 결합하고, 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는 펩티드를 제공한다.
또한 본 발명은 인간 CD38 (서열 31)에 결합하고, 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합하지 않는 펩티드를 제공한다.
용어 "동일한 정도"는 돌연변이 인간 CD38에 대한 펩티드의 결합이 야생형 인간 CD38에 대한 펩티드의 결합보다 현저하게 낮도록 해석되어야 한다. CD38 분자 (야생형 및 돌연변이)에 대한 펩티드의 결합은 다수의 방법에서 결정될 수 있고, 돌연변이에 대한 결합이 야생형에 대한 결합보다 "현저하게 낮은"지를 결정하는 것은 당업자의 통상적인 지식 내에 속한다. 또다른 펩티드에 대한 펩티드 결합을 결정하는 다수의 상이한 기술들, 예를 들어 ELISA, 방사선면역분석법, BIAcore 또는 유동 세포측정법이 당업자에게 입수가능하다.
결합을 결정하는 한 방법은 돌연변이 단백질 및 야생형 단백질에 대한 펩티드 결합의 EC50을 결정한 후, 수득된 값들을 비교하는 것에 의한 것이다. 결합을 결정하는 또다른 방법은 포화 농도에서의 결합 크기 (예를 들어 결합 신호의 플래토(plateau))를 측정하거나, 또는 예를 들어 BIAcore에 의해 키네틱 속도 상수 kon 및 koff를 결정하는 것에 의한 것이다.
한 실시양태에서, CD38 단백질 (돌연변이 또는 야생형)에 대한 당해 펩티드의 결합은 실시예 17에 기술된 ELISA에 의한 것이다.
한 실시양태에서, 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만이다. 한 실시양태에서, 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 10％ 미만이다. 한 실시양태에서, 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 5％ 미만이다. 한 실시양태에서, 위치 274의 세린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 34)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 1％ 미만이다.
한 실시양태에서, 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 50％ 미만이다. 한 실시양태에서, 위치 272의 글루타민 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 33)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 10％ 미만이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 인간 CD38 (서열 31)에 결합하는 것과 동일한 정도로 결합한다. 한 실시양태에서, 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 75％를 초과한다. 한 실시양태에서, 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 85％를 초과한다. 한 실시양태에서, 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 90％를 초과한다. 한 실시양태에서, 위치 237의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 인간 CD38 (서열 32)에 대한 펩티드 결합의 EC50은 인간 CD38 (서열 31)에 대한 펩티드 결합의 EC50의 95％를 초과한다.
CD38 내의 더욱 특이적인 가능한 항원 결정기 영역을 확인하기 위해, 다양한 예측 분석 방법이 적용될 수 있다. 첫번째 분석적 접근법에서, (1) 고도로 소수성인 영역 (Kyte-Doolittle 방법 사용); (2) 돌출(Protrusion) 지수 방법에 의해 결정되는 항원성; (3) Parker 방법에 의해 결정되는 항원성; (4) Hopp/Woods 방법에 의해 결정되는 항원성; 및 (5) Goldman, Engleman, 및 Steitz 방법에 의해 결정되는 친수성에 대해 CD38을 분석할 수 있다. 길이가 아미노산 10-40개 범위인 서열을 1가지 이상의 이러한 성질을 나타내는 것을 기초로 선택할 수 있다. 이러한 접근법에 대한 근거는 다수의 이상적인 B 세포 에피토프가 친수성이고, 표면-배향되며, 가요성인, 아미노산 약 8-10개 길이의 서열이라는 일반적인 합의이다.
본 발명은 이같은 방식으로 확인된 CD38의 CD38-영역에 특이적인 CD38BP를 제공한다. 또한, 이러한 서열의 말단을 본원에 기술된 또다른 분석법을 통해 밝혀진 예측된 항원 결정기 영역과 비교하여, 추가적인 가능한 특이적 항원-결정기 함유 영역을 제공할 수 있다. 또다른 유사한 비교가 쉽게 이루어져 추가적인 가능한 항원 결정기 영역을 제공할 수 있고, 이때 이러한 항원 결정기 영역에 결합하는 CD38BP는 본 발명의 또다른 양상으로 간주될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 항체이다. 본 발명에 의해 제공되는 CD38 결합 면역글로불린 분자의 비제한적인 예로는 하기의 것들이 포함된다: (a) (i) 인간 B 세포 표면 항원 특이성이 있는 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 2개의 동일한 키메라 중쇄 및 (ii) 2개의 동일한 인간 (즉 키메라가 아님) 경쇄를 포함하는 완전한 기능성 면역글로불린 분자: (b) (i) 상기 지시된 바와 같은 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 2개의 동일한 키메라 중쇄 및 (ii) 2개의 동일한 비-인간 (즉 키메라가 아님) 경쇄를 포함하는 완전한 기능성 면역글로불린 분자; (c) 1가 항체, 즉, (i) 상기 지시된 바와 같은 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 2개의 동일한 키메라 중쇄 및 (ii) 2개의 상이한 경쇄를 포함하고, 2개의 경쇄 중 하나만이 중쇄의 가변 영역과 동일한 특이성을 갖는 완전한 기능성 면역글로불린 분자. 생성된 항체 분자는 이의 한쪽 끝에만 결합하고, 따라서 2가 결합이 불가능하다. 또다른 예로서, 본 발명에 의해 제공되는 면역글로불린-관련 펩티드는 하기의 것들을 포함하는 것으로 언급될 수 있다: (a) 전체 면역글로불린 분자; (b) scFv; (c) 모노클로날 항체; (d) 인간 항체; (e) 키메라 항체; (f) 인간화 항체; (g) Fab 단편; (h) Fab' 단편; (i) F(ab')2 단편; (j) Fv 분자; 및 (k) 디술피드-연결 Fv 분자.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 폴리클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 모노클로날 항체이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 인간 모노클로날 항체이다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 인간화 항체이다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 키메라 항체이다. 또다른 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 인간이 아닌 포유류 종으로부터 전체적으로 유래된 모노클로날 항체이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 완전하게 마우스 모노클로날 항체이다.
모노클로날 항체는 균일한 구조 및 특이성을 갖는 균질한 항체 집단을 포함하는 조성물을 지칭한다. 전형적으로, 모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체이고, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 각각의 모노클로날 항체는, 여러 에피토프에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 전형적으로 단일 에피토프에 대해 지시된다. 항체가 모노크놀로날이라는 것은 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법으로 생산될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법으로 생산될 수 있다. [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222. 581-597 (1991)]에 예를 들어 기술된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 모노클로날 항체가 또한 단리될 수 있다.
모노클로날 항체는 임의의 적절한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모노클로날 항체를 당해 항원 (예를 들어 표면 상에 항원을 발현하는 세포 또는 당해 항원을 코딩하는 핵산의 형태)으로 면역화된 마우스로부터 수득된 마우스 지라 B 세포로부터 제조된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다. 모노클로날 항체를 면역화된 인간 또는 비-인간 포유동물 예컨대 래트, 개, 영장류 등의 항체-발현 세포로부터 유래된 하이브리도마로부터 또한 수득할 수 있다.
별법적으로, 클로닝된 항체 유전자가 원핵생물, 예컨대 미생물, 예컨대 대장균 (단일쇄 Fv 항체 ,생산용), 조류, 뿐만 아니라 곤충 세포를 포함하는 또다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 비-인간 동물, 예컨대 양 및 토끼로부터의 유액 또는 암탉으로부터의 알, 또는 트랜스제닉 식물에서 항체가 생산될 수 있다. 예를 들어 [Verma, R., et al., J.Immunol.Meth. 216, 165-181 (1998)]; [Pollock, et al., J.Immunol.Meth. 231, 147-157 (1999)]; 및 [Fischer, R., et al., Biol.Chem. 380, 825-839 (1999)] 참조.
한 실시양태에서, 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 지니는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 사용하여 CD38에 대해 지시된 인간 모노클로날 항체가 생성될 수 있다. 이같은 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 마우스에는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 각각 지칭되는 것들이 포함되고, 본원에서 총괄적으로 "트랜스제닉 마우스"로 지칭된다. 이같은 마우스에서 생성된 인간 모노클로날 항체는 HuMab로 약칭될 수 있다.
HuMAb 마우스는 내인성 μ 및 κ 사슬 좌위를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌위(minilocus)를 포함한다 ([Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)]). 따라서, 마우스가 마우스 IgM 또는 κ 발현의 감소를 나타내고, 면역화에 응답하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에는 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이가 일어나 고친화력 인간 IgG,κ 모노클로날 항체가 생성된다 ([Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌]; [Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994)], [Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995)] 및 [Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)]에서 재고됨). HuMAb 마우스의 제조는 [Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992)], [Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993)], [Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994)], [Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994)], [Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 상세하게 기술되어 있다. 또한 미국 특허 5,545,806, 미국 특허 5,569,825, 미국 특허 5,625,126, 미국 특허 5,633,425, 미국 특허 5,789,650, 미국 특허 5,877,397, 미국 특허 5,661,016, 미국 특허 5,814,318, 미국 특허 5,874,299, 미국 특허 5,770,429, 미국 특허 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187 참조.
HCo7 마우스에는 내인성 경쇄 (카파) 유전자에서의 JKD 파괴 ([Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)]에 기술됨), 내인성 중쇄 유전자에서의 CMD 파괴 (WO 01/14424의 실시예 1에 기술됨), KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스진 ([Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기술됨), 및 HCo7 인간 중쇄 트랜스진 (미국 특허 5,770,429에 기술됨)이 있다.
HCo12 마우스에는 내인성 경쇄 (카파) 유전자에서의 JKD 파괴 ([Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)]에 기술됨), 내인성 중쇄 유전자에서의 CMD 파괴 (WO 01/14424의 실시예 1에 기술됨), KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스진 ([Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기술됨), 및 HCo12 인간 중쇄 트랜스진 (WO 01/14424의 실시예 2에 기술됨)이 있다. KM 마우스 균주에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 [Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기술된 바와 같이 동종형으로 파괴되었고, 내인성 마우스 중쇄 유전자는 WO 01/09187의 실시예 1에 기술된 바와 같이 동종형으로 파괴되었다. 이러한 마우스 균주는 [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기술된 바와 같이 인간 카파 경쇄 트랜스진인 KCo5를 지닌다. 또한 이러한 마우스는 WO 02/43478에 기술된 바와 같이 염색체 14 단편 hCF (SC20)으로 구성되는 인간 중쇄 트랜스크로모좀을 지닌다.
KM 마우스는 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 카파 경쇄 트랜스진을 함유한다. 마우스의 면역화가 마우스 면역글로불린보다는 인간 면역글로불린의 생산에 이르도록 내인성 마우스 중쇄 및 경쇄 유전자가 KM 마우스에서 또한 파괴되었다. KM 마우스의 구축 및 인간 면역글로불린을 생성시키기 위한 이의 용도가 WO 02/43478에 상세하게 기술되어 있다.
이러한 트랜스제닉 마우스로부터의 비장세포를 사용하여 주지된 기술에 따라 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 이같은 트랜스제닉 포유동물, CD38BP의 발현을 코딩하는 작동가능한 핵산 서열을 포함하는 포유동물, 1개 이상의 CD38-코딩 핵산 서열로 안정적으로 형질감염된 포유동물 등은 본 발명의 추가적인 양상이다.
본 발명의 인간 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 다른 종으로부터 유래된 본 발명의 항체는 당해 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대한 또다른 트랜스제닉 비-인간 포유동물 또는 식물의 생성 및 이로부터 회수가능한 형태의 항체의 생산을 통해 트랜스제닉하게 또한 생성될 수 있다. 포유동물에서의 트랜스제닉 생산과 함께, 항체는 염소, 소 또는 기타 포유동물의 유액 내에 생산되거나 또는 유액으로부터 회수될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 5,827,690, 미국 특허 5,756,687, 미국 특허 5,750,172 및 미국 특허 5,741,957 참조.
또한, 본 발명의 인간 항체 또는 다른 종으로부터 유래된 본 발명의 항체는 당업계에 주지된 기술을 사용하여 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 기타 기술이 포함되는 디스플레이-유형 기술을 통해 생성될 수 있고, 생성된 분자에 추가적인 성숙, 예컨대 친화력 성숙이 적용될 수 있고, 이같은 기술은 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어 [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227. 381 (1991)] (파지 디스플레이), [Vaughan et al., Nature Biotech 14. 309 (1996)] (파지 디스플레이), [Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997)] (리보솜 디스플레이), [Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988)] (파지 디스플레이), [Scott TIBS 17, 241-245 (1992)], [Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990)], [Russet et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993)], [Hoogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992)], [Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992)], 및 미국 특허 5,733,743 참조). 디스플레이 기술을 사용하여 인간 항체가 아닌 항체를 생산하는 경우, 이같은 항체는, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 인간화될 수 있다.
본 발명의 인간화된 모노클로날 항체는 인간 항체로부터의 불변 도메인을 비-인간 종의 가변 도메인에 융합시킴으로써 생성될 수 있다. 인간화 항체를 만드는 방법은 예를 들어 미국 특허 6,054,297, 미국 특허 5,886,152 및 미국 특허 5,877,293에서 확인할 수 있다. 인간화 항체는 동물-유래 모노클로날 항체보다 인간 면역글로불린에 더 큰 상동성을 갖는다. 전형적으로 "수입" (동물) 가변 도메인으로부터의 비-인간 아미노산 잔기가 인간 "골격" 내로 형질감염된다. 인간화는 설치류 상보성 결정 영역 ("CDR ") 또는 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 CDR 서열을 치환함으로써 Winter 및 공동 연구자의 방법 ([Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)])에 따라 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체에서, 인간 가변 도메인의 CDR 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환되었다. 따라서, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 허용한다 ([Sims et al., J. Immunol.,151, 2296 (1993)], [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)]). 또다른 방법에서는 경쇄 또는 중쇄의 특정 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 다수의 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992)], [Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)]).
인간화 항체가 항원에 대한 높은 친화력 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지하는 것이 또한 전형적으로 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물을 분석하는 프로세스에 의해 인간화 항체를 제조할 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 특정 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 최대화되도록 수용자 및 수입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합시킬 수 있지만, 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는 것은 CDR 잔기이다.
마우스 항체 또는 다른 종으로부터의 항체가 임의의 적절한 기술을 사용하여 인간화 또는 영장류화될 수 있고, 다수의 적절한 기술이 이미 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어 [Winter and Harris Immunol Today 14, 43-46 (1993)] 및 [Wright et al., Crit. Reviews in Immunol. 125-168 (1992)] 참조). 당해 항체가 재조합 DNA 기술에 의해 조작되어, CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인, 및/또는 프레임워크 도메인이 상응하는 인간 서열로 치환될 수 있다 (WO 92/02190 및 미국 특허 5,530,101, 미국 특허 5,585,089, 미국 특허 5,693,761, 미국 특허 5,693,792, 미국 특허 5,714,350, 및 미국 특허 5,777,085 참조).
항체의 인간화는 설치류 CDR 또는 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 CDR 서열을 치환함으로써 Winter 및 공동 연구자의 방법 ([Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)])에 따라 또한 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는, 어떤 면에서, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
또한, 키메라 면역글로불린 유전자의 구축을 위해 Ig cDNA를 사용하는 것이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 [Liu et al., PNAS USA 84, 3439 (1987)] 및 [J.Immunol. 139, 3521 (1987)] 참조). mRNA가 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 기타 세포로부터 단리되어, cDNA를 생산하는데 사용된다: 당해 cDNA는 특정 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭될 수 있다 (미국 특허 4,683,195 및 미국 특허 4,683,202). 별법적으로, 라이브러리를 제조하고 스크리닝하여, 당해 서열을 단리할 수 있다. 그 후, 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열이 인간 불변 영역 서열에 융합된다. 인간 불변 영역 (뿐만 아니라 가변 영역)의 서열은 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N. I. H. publication no. 91-3242]에서 확인할 수 있고, 더욱 최근의 관련 데이타는 http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/GeneralInfo.html에서 입수할 수 있다. 이소타입의 선택은 전형적으로 원하는 이펙터 기능, 예컨대 보체 고정, 또는 항체-의존성 세포형 세포독성에서의 활성에 의해 인도될 것이다. 예시적인 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 영역, 카파 또는 람다 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 그 후, 키메라 인간화 항체가 통상적인 방법에 의해 발현될 수 있다.
본 발명의 CD38BP는 다량체화에 대해 임의의 적절한 형태일 수 있다. 항-CD38 항체 및 항체 단편은 IgM 항체와 관련된 것들과 같은 더 고급의 다량체성 형태가 아닌 경우 적어도 이종삼량체 형태일 수 있다. 또다른 실시양태에서, CD38BP는 이량체 또는 단량체로서 제시될 수 있다. 본 발명의 단량체성 CD38BP는, 예를 들어, 다량체성 펩티드 조성물을 형성하도록 임의의 적절한 기술에 의해 변형될 수 있다.
원한다면, 본 발명의 항-CD38 항체의 클래스가 공지된 방법에 의해 스위칭될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM인 본 발명의 항체가 본 발명의 IgG 항체로 클래스가 스위칭될 수 있다. 또한, 클래스 스위칭 기술을 사용하여 한 IgG 서브클래스로부터 또다른 서브클래스로 전환시킬 수 있고, 예를 들어 IgG1에서 IgG2로 전환될 수 있다. 따라서, 다양한 치료 용도를 위해 본 발명의 항체의 이펙터 기능이 이소타입 스위칭에 의해, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로 변화될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1 항체, 예를 들어 IgG1,κ 또는 IgG1,λ 이소타입이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG3 항체, 예를 들어 IgG3,κ 또는 IgG3,λ 이소타입이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG4 항체, 예를 들어 IgG4,κ 또는 IgG4,λ이소타입. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgA1 또는 IgA2 항체이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgM 항체이다.
항-CD38 항체는 인간 림프구로부터 유래된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA로부터 제조될 수 있는 조합형 재조합 항체 라이브러리, 예컨대 scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터 회수될 수 있다. 이같은 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리의 생성을 위한 다수의 시판되는 키트가 존재한다. 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에 사용될 수 있는 또다른 방법 및 시약이 또한 존재한다 (예를 들어 미국 특허 5,223,409, WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690, [Fuchs et al., Bio/Technology 9, 1370-1372 (1991)], [Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3, 81-85 (1992)], [Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989)], [McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)], [Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734 (1993)], [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992)], [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)], [Gram et al., PNAS USA 89, 3576-3580 (1992)], [Garrad et al., Bio/Technology 9, 1373-1377 (1991)], [Hoogenboom et al., Nuc Acid Res 19, 4133-4137 (1991)] 및 [Barbas et al., PNAS USA 88, 7978-7982 (1991)] 참조). 적절한 VL 및 VH 핵산 서열을 임의의 적합한 방법을 사용하여 선택할 수 있다. 예를 들어, WO 93/06213에 기술된 에피토프 압인(imprinting) 방법을 사용함으로써 VL 및 VH 핵산을 선택할 수 있다. 항체 라이브러리, 예컨대 scFv 라이브러리를 공지되고 적절한 방법, 예컨대 WO92/01047, [McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)] 및 [Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734 (1993)]에 예를 들어 기술된 것들을 사용하여 제조 및 스크리닝할 수 있다 (인간 CD38-함유 펩티드를 항원(들)로 사용). 이같은 항체 라이브러리 및 CD38BP의 기타 조합물 (라이브러리, 풀 등)은, 면역원성 펩티드, 소형 분자, 기타 항-CD38 항체에 대한 스크리닝 방법 (예를 들어, 경쟁 분석에 의해) 등에서의 도구로서; 및/또는 진단 방법 및 조성물 (예를 들어, 다른 항체와 임의로 회합된 이같은 항체의 패널을 포함하는 면역분석 칩이 표준 기술에 의해 제조될 수 있다)에서 더욱 포괄적인 면역 응답을 제공하기 위해 치료적으로 사용될 수 있는 본 발명의 양상이다. 일단 최초의 인간 VL 및 VH 절편이 선택되면, 여러 쌍의 최초로 선택된 VL 및 VH 절편들이 CD38-함유 펩티드 결합에 대해 스크리닝되는 "믹스 앤 매치(mix and match)" 실험을 수행하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택할 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 반응성을 ELISA 또는 기타 적절한 에피토프 분석 방법에 의해 결정할 수 있다 (이같은 기술 및 원리의 논의에 대해서 예를 들어 [Scott, J. K. and Smith, G. P. Science 249, 386-390 (1990)], [Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990)], [Felici et al., J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991)] 및 [Kuwabara et al., Nature Biotechnology 15, 74-78 (1997)] 참조). 항원에 대한 친화력 및/또는 항원으로부터의 해리 키네틱 (오프(off)-속도)에 의해 항체를 선택할 수 있다 (예를 들어 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992)] 참조).
항-CD38 항체의 품질 및/또는 다양성을 더욱 개선시키기 위해, VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 절편이, 예를 들어 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내에서, 천연 면역 응답 동안 항체의 친화력 성숙을 담당하는 생체내 체세포 돌연변이 프로세스와 유사한 프로세스에서 무작위로 돌연변이될 수 있다. 이러한 시험관내 친화력 성숙은 생성된 PCR 생성물이 무작위 돌연변이가 VH 및/또는 VL CDR3 영역 내로 도입된 VH 및 VL 절편을 코딩하도록, VH CDR3 또는 VL CDR3에 각각 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시킴으로써 달성될 수 있고, 전형적으로 이러한 프라이머는 특정 위치에서 4개의 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼합물로 "스파이크(spiked)"된다. 이러한 무작위로 돌연변이된 VH 및 VL 절편을 CD38-함유 펩티드에의 결합에 대해 재-스크리닝할 수 있다.
스크리닝 후, 선택된 항체를 코딩하는 핵산을 디스플레이 패키지로부터 (예를 들어, 파지 게놈으로부터) 회수하고, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 적합한 벡터 내로 서브클로닝할 수 있다. 원한다면, 이같은 항체-코딩 핵산을 추가로 조작하여, 또다른 항체 형태 또는 CD38BP를 생성시킬 수 있다. 조합형 라이브러리의 스크리닝에 의해 회수된 재조합 항체를 발현시키기 위해, 전형적으로 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 재조합 발현 벡터 내로 클로닝하고, 핵산의 발현 및 항체의 생산에 적절한 조건 하에 적합한 숙주 세포 (포유류 세포, 효모 세포 등) 내로 도입한다.
고친화력 항체 펩티드, 예컨대 인간 단일쇄 Fv (scFv) 및 Fab 항체 단편을 또한 이같은 라이브러리로부터 당해 항원이 고체 표면, 예컨대 미량역가 플레이트 또는 비드 상에 고정된 패닝(panning) 기술을 사용하여 단리할 수 있다 (예를 들어 [Barbas and Burton, Trends. Biotechnol. 14, 230-234 (1996)] 및 [Aujame et al., Hum. Antibodies 8, 155-68 (1997)] 참조). 또한 대형 나이브(naive) 파지 디스플레이가 면역화 없이 직접적으로 인간 항체를 단리하는 것을 가능하게 한다 (예를 들어 [de Haard et al., J. Biol. Chem. 274(26), 18218-18230 (1999)] 참조).
한 실시양태에서, 본 발명은 변이체 항-CD38 항체를 제공한다. "변이체" 항-CD38 항체는 CDR 또는 기타 VH 및/또는 VL 서열에서의 1개 이상의 적절한 아미노산 잔기 변형, 즉 치환, 결실, 삽입 또는 말단 서열 부가에 의해 모 항체 (전형적으로 면역화에 의해 생성됨)와 상이한 항체이다 (단, 이같은 변화에 의해, 모 항체의 에피토프 결합 특성의 양은, 개선되지 않는 한, 적어도 실질적으로 유지된다).
항체 변이체에서의 변이는 단일한 변이체 항체 내에서 각각의 프레임워크 영역, 불변 도메인 및/또는 가변 영역 (또는 임의의 1개 이상의 이의 CDR) 내에서 이루어질 수 있다. 별법적으로, 변이는 항체 내의 프레임워크 영역, 가변 영역 (또는 이의 단일 CDR), 또는 불변 도메인 중 오직 하나에서만 이루어질 수 있다. [Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085 (1989)]에 예를 들어 기술된 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기술을 사용하여 변이체 VL, VH, 또는 특정 CDR 서열을 포함하는 CD38BP의 생성에서 치환 또는 결실에 적절한 잔기를 확인할 수 있고, 또다른 적절한 돌연변이유발 기술을 또한 적용할 수 있다. 공지된 돌연변이유발 및 스크리닝 방법, 예컨대 [Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241, 53-57 (1988)] 또는 [Bowie and Sauer, PNAS USA 86, 2152-2156 (1989)]에 개시된 것들을 사용하여다중 아미노산 치환이 또한 이루어질 수 있고 테스트될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 항체 변이체에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 1개 이상의 CDR 내와 같은 모 항체의 1개 이상의 초가변 영역 내에 또는 이에 인접하여 도입 또는 삽입될 수 있다. 항-CD38 항체 변이체는 모 항체의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 양이 유지된다면 임의의 수의 삽입된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 항-CD38 항체 변이체는 약 1-30개의 삽입된 아미노산 잔기, 예를 들어 약 1-10개, 예컨대 예를 들어 약 2-10개, 예를 들어 2-5개 또는 예컨대 약 1-5개의 삽입된 아미노산 잔기를 예를 들어 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD38 항체 변이체는 약 1-30개의 결실된 아미노산 잔기, 예를 들어 약 1-10개, 예컨대 예를 들어 약 2-10개, 예를 들어 2-5개 또는 예컨대 약 1-5개의 결실된 아미노산 잔기를 예를 들어 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD38 항체 변이체는 약 1-30개의 치환된 아미노산 잔기, 예를 들어 약 1-10개, 예컨대 예를 들어 약 2-10개, 예를 들어 2-5개 또는 예컨대 약 1-5개의 치환된 아미노산 잔기를 예를 들어 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD38 항체 변이체는 약 1-30개의 말단 서열 아미노산 잔기 부가물, 예를 들어 약 1-10개, 예컨대 예를 들어 약 2-10개, 예를 들어 2-5개 또는 예컨대 약 1-5개의 말단 서열 아미노산 잔기 부가물을 예를 들어 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 변이체는 2개 이상의 이같은 삽입, 결실, 치환 및 말단 서열 아미노산 잔기 부가의 조합을 또한 포함할 수 있고, 단 변이체는 1개 이상의 CD38 에피토프에 관한 모 항체 친화성, 특이성 및/또는 선택성의 적어도 실질적인 비율을 지닌다.
항체 변이체의 선택에서 고려할 사항들 (예를 들어, 아미노산 잔기 기능 특성의 보존, 소수성 특성을 기초로 하는 아미노산 잔기의 보존, 및/또는 중량/크기를 기초로 하는 아미노산 잔기의 보존)이 본원의 다른 곳에 기술된다. 전형적으로, 아미노산 서열 변형, 예컨대 보존성 치환 변이는 바람직하게는 모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는다 (예를 들어, 대체 아미노산은 모 서열의 기능을 특성화하는 2차 구조를 파괴하는 경향이 없어야 한다). 당업계에 인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예가, 예를 들어, [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))], [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))] 및 [Thornton et al., Nature 354, 105 (1991)]에 기술되어 있다. 펩티드 변이체의 디자인 및 구축에 관련된 추가적인 원리가 예를 들어 [Collinet et al., J Biol Chem 2Z5(23), 17428-33 (2000)]에 기술되어 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 항체-코딩 핵산 내로 도입함으로써 (예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발에 의해) 또는 화학적 펩티드 합성에 의해 수득될 수 있다. 이같은 변이체는, 예를 들어, 본원에 예시된 항체의 아미노산 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입, 및/또는 치환 및/또는 말단 서열 부가를 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 원하는 변이체에 도달하도록 이루어질 수 있고, 단 변이체는 모 항체의 에피토프 결합 특성의 적어도 실질적인 비율을 지닌다. 모 항체에 대한 아미노산 서열 변화는, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킴으로써, 모 항체에 관한 변이체 항체의 번역후 프로세스를 또한 변형시킬 수 있다.
본 발명의 변이체 항체는 초가변 영역, 예컨대 CDR에서의 변형을 포함할 수 있다. 이같은 CDR 변이체를 포함하는 CD38BP의 예가 본원의 다른 곳에 기술되어 있고, 상기 기술된 바와 같이, 이같은 CD38BP는 항체일 수 있다.
본 발명의 변이체 항체는 초가변 영역의 외부인 프레임워크 (FR) 변형을, 예를 들어 Fc 영역 내에서 포함할 수 있고, 이러한 변형은 유리한 성질, 예컨대 항체의 기능성 또는 약동학적 성질의 변화와 관련될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역 또는 불변 도메인 내에서의 치환 또는 기타 변형 (삽입, 결실, 말단 서열 부가 또는 이의 임의 조합)은 모 항체에 비한 변이체 항체의 반감기에서의 증가와 관련될 수 있거나, 또는 모 항체에 비해 변이체 항체의 면역원성을 변화시키기 위해, 또다른 분자에의 공유 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하기 위해, 또는 C1q 결합 및 CDC의 감소 또는 증가 또는 FcγR 결합 및 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)의 감소 또는 증가가 예를 들어 초래되는 보체 고정과 같은 성질을 변형시키기 위해 이루어질 수 있다. 예를 들어 치환은 중쇄 불변 영역의 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 및 322 중 1개 이상에서 이루어질 수 있어서, 변형되지 않은 항체와 비교하여 항원에 대한 결합은 유지하면서 이펙터 기능에서의 변화를 야기할 수 있다 (미국 특허 5,624,821 및 미국 특허 5,648,260 참조). ADCC를 증가시키는 Fc 영역이 변형된 항체가 개시된 WO 00/42072, 및 FcRI에 결합하는 항체의 능력을 변화시킴으로써 C1q에 결합하는 항체의 능력을 감소시키고 이어서 C1q가 보체를 고정하는 항체의 능력을 감소시키는 CH2 도메인의 N-말단 영역에서의 돌연변이가 있는 항체가 개시된 WO 94/29351를 추가로 참조할 수 있다. 또한, [Shields et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604 (2001)]에는 FcγRIII 결합이 개선된 조합 변이체, 예를 들어 T256A/S298A, S298A/E333A, 및 S298A/E333A/K334A가 교시되어 있다.
분자가 무손상 CH2 도메인 또는 무손상 Ig Fc 영역을 포함하지 않도록 Ig 불변 도메인 또는 Ig-유사 불변 도메인의 샐비지(salvage) 수용체 에피토프를 변형시킴으로써 항체의 생체내 반감기가 또한 개선될 수 있다 (미국 특허 6,121,022 및 미국 특허 6,194,551 참조). Fc 영역 내에 돌연변이를 제조함으로써, 예를 들어 위치 252의 류신을 트레오닌으로, 위치 254의 세린을 트레오닌으로, 또는 위치 256의 페닐알라닌을 트레오닌으로 치환함으로써 생체내 반감기가 더욱 증가될 수 있다 (미국 특허 6,277,375 참조).
한 실시양태에서, 본 발명은 항체 내의 잠재적인 T 세포 에피토프가 합리적인 디자인을 통해 감소 또는 제거된 변이체 항-CD38 항체를 제공한다. 따라서, 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 잠재적인 T 세포 에피토프가 제거된 "탈면역화(deimmunized)" 항-CD38 항체를 제공한다. 탈면역화 항-CD38 항체의 디자인 및 구축은 임의의 적절한 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다 (탈면역화 항체의 제조 방법에 대해 예를 들어 WO9852976 참조). 이같은 CD38BP (예를 들어, 항-CD38 변이체 항체)가 본 발명에 따라 투여되는 경우 인간에서의 면역원성이 제거 또는 실질적으로 감소될 것으로 예상된다.
기타 프레임워크 돌연변이는 단백질용해에 대한 감수성을 감소시킬 수 있고/있거나, 산화에 대한 감수성을 감소시킬 수 있고/있거나, 관련된 변이체 항체에 생리화학적 또는 기능적 성질을 부여할 수 있거나 이를 변형시킬 수 있는 서열 변화를 포함할 수 있다.
프레임워크에서의 아미노산 서열 변이로 모 항체에 비해 변이체 항체에서 글리코실화 패턴 변형이 또한 초래될 수 있다. 변형은 모 항체에서 발견되는 1개 이상의 탄화수소 부분의 결실 및/또는 모 항체 내에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소에 의해 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성될 수 있다. O-연결된 글리코실화는 당 예컨대 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신 또한 사용될 수 있다. 항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 항체가 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 편리하게 이루어질 수 있다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변형은 원래의 항체 또는 폴리펩티드의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체는 FcγRIII에 대한 Fc의 친화력을 증강시키기 위해 Fc의 위치 297의 Asn에 부착된 탄수화물에 정상적으로 부착되는 푸코스 단위를 부가하지 않는 트랜스펙토마에서 또한 발현될 수 있고, 결과적으로 NK 세포의 존재 하에서 항체의 ADCC가 증가될 것이다, ([Shield et al., J. Biol. Chem. 277. 26733 (2002)] 참조). 푸코실화에 초점을 맞춘 또다른 글리코실화 변형 방법이 WO 00/61739 (Kyowa)에 기술되어 있다. 또한, CDC를 변형시키기 위해 갈락토실화 변형이 이루어질 수 있다. 변형된 당형태 및 개선된 ADCC 활성의 모노클로날 항체의 발현이 초래되는, GntIII을 발현하도록 조작된 CHO 세포주가 개시된 WO 99/54342 및 [Umana et al., Nat. Biotechnol. 17, 176 (1999)]를 추가로 참조할 수 있다.
신규 항-CD38 항체의 제조를 위한 또다른 잠재적으로 적절한 기술에는 CDR 워킹(walking) 돌연변이유발, 항체 사슬 셔플링(shuffling), "절제(parsimonious) 돌연변이유발" ([Balint and Larrick, Gene 137, 109-118 (1993)]), 및 기타 친화력 성숙 기술 (예를 들어 [Wu et al., PNAS USA 95, 6037-42 (1998)] 참조)이 포함된다. 레퍼토리(Repertoire) 클로닝 절차가 변이체 항체의 생산에 또한 유용할 수 있다 (예를 들어 WO 96/33279 참조).
CDR 변이체의 생성에 대해 공지된 다수의 기술이 존재하고, 임의의 적절한 기술 또는 이의 조합이 예시된 항체의 CDR의 CDR 변이체를 생성시키기 위하여 본 발명의 문맥에서 유용할 수 있다. 이같은 기술의 예로는 [Studnicka et al., Protein Engineering 7, 805-814 (1994)]에 기술된 바와 같은 비-필수 잔기의 제거 ([Soderlind et al., Immunotechnology. 4(3-4), 279-85 (1999)]를 또한 참조), CDR 워킹 돌연변이유발 및 기타 인공 친화력 성숙 기술 (예를 들어 [Yang et al., Journal of Molecular Biology 254(3), 392-403 (1995)] 참조), 전형적으로 합성 올리고뉴클레오티드를 임의로 포함하는 다양한 셋트의 유전자 주형으로부터 CDR이 증폭되고, VL, VH, 및/또는 CDR의 불변 영역이 증폭되며, 다양한 단편들이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 혼합 (단일-가닥 또는 이중-가닥 포맷) 및 조립되어, 마스터(master) 프레임워크 내로 도입된 셔플링된 CDR을 보유하는 유전자 생성물을 코딩하는 항체-단편의 셋트가 생산되고, 전장 생성물의 생산을 확실히 하도록 삽입된 제한 부위 너머의 부위에 어닐링(annealing)된 외부 프라이머를 사용하여 증폭되고, 당해 벡터 내로 삽입되어 변이체 CDR-함유 단백질을 발현하도록 사용되는 CDR 셔플링 기술이 포함된다. 적합한 구조는 변이체/모방체 구조와 모 서열의 구조의 중첩에 의해, 예를 들어, NMR 용액 구조의 비교에 의해 결정될 수 있다. CDR 서열 변이체의 합리적인 디자인을 위한 유용한 방법이 예를 들어 WO 91/09967 및 WO 93/16184에 기술되어 있다. 이같은 방법의 추가적인 예가 본원의 다른 곳에서 제공된다.
본 발명은 CD38에 결합하는 능력이 있는 본 발명의 항체 (변이체 항체 포함)의 단편 (CD38 결합 단편)을 제공한다. 따라서 CD38BP는 천연-발생 항체와 관련된 완전한 사량체성 구조보다 적은 부분을 포함하는 항체-유사 분자를 포함한다. 항체 단편은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하는 임의의 펩티드일 수 있다 (이는, 예를 들어, 본 발명의 항체로부터의 CDR, 이의 변이체, 또는 항원 단편이 CD38 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁하도록 하는 기타 CDR을 포함하는 인간화 항체의 단편을 포함한다). 한 실시양태에서, 항체 단편은 항체 분자의 일부분으로 본질적으로 구성되거나 일부분으로만 구성되는 펩티드를 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 1개 이상의 VH CDR을 함유하는 중쇄 가변 도메인의 적어도 일부분, 및 임의로 본 발명의 항체의 1개 이상의 VL CDR을 함유하는 경쇄-가변 도메인을 포함하고, 중쇄 가변 도메인, 및 임의의 경쇄 가변 도메인이 임의로 추가적인 부분, 예컨대 면역글로불린 불변 도메인에 융합된 항체 단편을 제공한다. 불변 도메인 서열이 중쇄 및/또는 경쇄 서열에 부가되어, 부부적인 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 갖는 종이 형성될 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역이 포함되는, 불변 영역, 또는 이의 일부분, 또는 임의의 항체 이소타입이 이러한 목적에 사용될 수 있다.
CD38-결합 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편이 포함된다. 본 발명의 문맥에서의 항체 단편에는 CDR을 포함하는 펩티드 등이 또한 포함된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 중쇄 CDR을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 임의의 본원에 기술된 경쇄 CDR을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 두 폴리펩티드 사슬이 1개 이상의 사슬간 디술피드 결합에 의해 공유결합으로 연결된 항체 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 항체 단편이 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, 및/또는 F(ab')2 단편으로부터 선택되는 이같은 양상을 갖는 2사슬 항체 단편을 제공한다.
통상적인 기술을 사용하여 항체가 단편화될 수 있고, 전체 항체에 대해 상기 기술된 바와 동일한 방식으로 단편들을 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편을 디술피드 다리가 환원되도록 처리하여, Fab' 단편이 생산될 수 있다. Fab 단편은 IgG 항체를 파파인으로 처리함으로써 수득될 수 있다; Fab' 단편은 IgG 항체의 펩신 소화로 수득될 수 있다. Fab' 단편은 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 통해 Fab'을 결합시킴으로써 또한 생산될 수 있다. Fab' 단편은 F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단함으로써 수득된 항체 단편이다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편을 환원제, 예컨대 디티오트레이톨로 처리함으로써 수득될 수 있다. 항체 단편 펩티드는 이같은 펩티드를 코딩하는 핵산을 재조합 세포에서 발현시킴으로써 또한 생성될 수 있다 (예를 들어 [Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)] 참조). 예를 들어, F(ab')2 단편의 일부분을 코딩하는 키메라 유전자는 H 사슬의 힌지 영역 및 CH1 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있고, 여기에 번역 종결 코돈이 이어져서, 이같은 말단절단 항체 단편 분자가 산출될 수 있다.
CD38BP는 1가 항체 및 단일쇄 항체를 또한 포함한다. 단일쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결된 펩티드이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 단일 펩티드 사슬 내에 본 발명의 항-CD38 항체의 Fv 내의 중쇄 및 경쇄가 가요성 펩티드 링커 (전형적으로 약 10개, 12개, 15개 또는 그 이상의 아미노산 잔기)로 연결된 단일쇄 Fv (scFv)를 제공한다. 이같은 항체의 생산 방법은 예를 들어 미국 특허 4,946,778, [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)], [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)], [Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 및 [McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)]에 기술되어 있다. 단일쇄 항체는 1가 (단일 VH 및 VL만이 사용된 경우), 2가 (2개의 VH 및 VL이 사용된 경우), 또는 다가 (2개를 초과하는 VH 및 VL이 사용된 경우)일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, CD38BP는 다중 결합 부위 또는 표적 에피토프에 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자가 생성되도록 또다른 기능성 분자, 예를 들어 또다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대 Fab' 단편)에 연결되거나 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 1개 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또다른 항체, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들어 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 회합 등에 의해). 한 실시양태에서, CD38BP는 본 발명의 항체이다.
따라서, 본 발명은 CD38에 특이적인 1개 이상의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα 수용체 (CD89), 또는 T 세포 수용체, 예를 들어, CD3이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 FcγR, FcαR 또는 FcεR 발현 이펙터 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN)), 및 CD38을 발현하는 표적 세포 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제공한다. 이러한 이중특이적 및 다중특이적 분자는 CD38 발현 세포를 이펙터 세포에 표적화시키고, Fc 수용체-매개 이펙터 세포 활성, 예컨대 CD38 발현 세포의 포식작용, 항체 의존성 세포형 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출, 또는 과산화물 음이온의 생성을 촉발시킨다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-CD38 결합 특이성에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 결합 특이성은 항-증강 인자 (EF) 부분, 예를 들어, 세포독성 활성에 수반되는 표면 단백질에 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 응답을 증가시키는 분자이다. "항-증강 인자 부분"은 소정의 분자, 예를 들어, 항원 또는 수용체에 결합함으로써 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정기의 효과를 증강시키는 항체, 기능성 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-증강 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 별법적으로, 항-증강 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성이 결합하는 본체와 상이한 본체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증강 인자 부분은 세포독성 T 세포에 결합할 수 있다 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대한 증가된 면역 응답이 초래되는 기타 면역 세포를 통해).
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이성으로서 1개 이상의 추가적인 항체 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv 포함)를 포함한다. 미국 특허 4,946,778 (Ladner et al.)에 기술된 바와 같이 추가적인 항체 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소 단편 예컨대 Fv 또는 단일쇄 구축물일 수 있다. 미국 특허 2003/0118592 및 미국 특허 2003/0133939에 기술된 바와 같이 항체는 또한 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질일 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 모노클로날 항체에 의해 제공되고, 이의 결합은 인간 인간 면역글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "IgG 수용체"는 염색체 1 상에 위치한 8개의 γ-사슬 유전자 중 임의의 것을 지칭한다. 이러한 유전자들은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), 및 FcγRIII (CD16)의 3가지 Fc* 수용체 클래스로 분류되는 총 12개의 막통과 또는 가용성 수용체 이소형을 코딩한다. 한 실시양태에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화력 FcγRI이다. 이러한 모노클로날 항체의 생산 및 특성화가 WO 88/00052 (Fanger et al.) 및 미국 특허 4,954,617에 기술되어 있다. 이러한 항체들은 수용체의 Fcγ 결합 부위와 별개의 부위에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하고, 따라서 이들의 결합은 생리학적 수준의 IgG에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에서 유용한 특이적 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. 또다른 실시양태에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 인간화된 형태의 mAb 22 (H22)이다. H22 항체의 생산 및 특성화가 [Graziano, R.F. et al., J. Immunol. 155(10), 4996-5002 (1995)] 및 WO 94/10332에 기술되어 있다. H22 항체 생산 세포주가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 명칭 HA022CL1 하에 1992년 11월 4일에 기탁되었고, 이의 접속 번호는 CRL 11177이다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예를 들어, Fcα 수용체 (FcαI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되고, 한 실시양태에서 이의 결합은 인간 면역글로불린 (IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 "IgA 수용체"는 염색체 19 상에 위치한 1개의 α-유전자의 생성물 (FcαRI)을 포함하도록 의도된다. 이러한 유전자는 55 내지 110 kDa의 별법적으로 스플라이싱된 여러 막통과 이소형을 코딩하는 것으로 공지되어 있다. FcαRI (CD89)는 단핵구/대식세포, 호산구성 및 호중구성 과립구 상에서 구성적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단에서는 그렇지 않다. FcαRI는 IgAI 및 IgA2 모두에 대해 중간 정도의 친화력을 갖고, 이는 사이토카인 예컨대 G-CSF 또는 GM-CSF에의 노출 시 증가된다 ([Morton, H.C. et al., Critical Reviews in Immunology 16, 423-440 (1996)]). IgA 리간드 결합 도메인 외부에서 FcαRI에 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 4개의 FcαRI-특이적 모노클로날 항체가 기술되었다 ([Monteiro, R.C. et al., J. Immunol. 148, 1764 (1992)]).
FcαRI, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII, 특히 FcγRII 및 FcγRIII는 (1) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포 상에서 주로 발현되고; (2) 고수준으로 발현되며 (예를 들어 세포 당 5,000-100,000개); (3) 세포독성 활성 (예를 들어 ADCC, 포식작용)의 매개물이고; (4) 표적으로 하는 항원 (자가 항원 포함)의 증강된 항원 제시를 매개하기 때문에 본 발명에서 사용하기 위한 촉발 수용체의 예이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 다중특이적 항-CD38 항체 또는 항체-유사 분자이고, 이의 특정 예는 적어도 부분적으로 CD38에 포함된 에피토프에 특이적인 적어도 한쌍의 VH 서열 및 VL 서열 사슬, 및 제2의 에피토프에 특이적인 제2의 적어도 한쌍의 VH 및 VL 서열 사슬을 포함하는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체 내의 VH 및 VL 서열은 항-CD38 VH 및 VL 영역에 상응하는 완전한 VH 및 VL 서열, 변이체 VH 및/또는 VL 서열, 또는 VH 및/또는 VL 영역의 적절한 일부분, 예컨대 CDR 서열 및 당해 에피토프에 대한 결합을 제공하는데 충분한 기타 서열의 적절한 조합을 포함할 수 있다.
예시적인 이중특이적 항체 분자는 (i) CD38에 대한 특이성을 갖는 한 항체와 제2의 표적에 대한 또다른 항체가 함께 접합된 2개의 항체, (ii) CD38에 특이적인 1개의 사슬 및 제2의 분자에 특이적인 제2사슬을 갖는 단일 항체, 및 (iii) CD38 및 제2의 분자에 대한 특이성을 갖는 단일쇄 항체를 포함한다. 전형적으로, 제2의 표적/제2의 분자는 CD38 이외의 분자이다. 한 실시양태에서, 제2의 분자는 암 항원/종양-관련 항원 예컨대 암종배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원 (PSA), RAGE (신장 항원), α-태아단백질, CAMEL (흑색종 상의 CTL-인식 항원), CT 항원 (예컨대 MAGE-B5, -B6, -C2, -C3, 및 D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE, 및 SAGE), 뮤신(mucin) 항원 (예를 들어, MUC1, 뮤신-CA125 등), 강글리오시드 항원, 티로시나제, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, 및 Ep-CAM이다. 한 실시양태에서, 제2의 분자는 제2의 분자는 암-관련 인테그린, 예컨대 α5β3 인테그린이다. 한 실시양태에서, 제2의 분자는 혈관형성 인자 또는 기타 암-관련 성장 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 안지오제닌, 및 이의 수용체, 특히 암 진행과 관련된 수용체 (예를 들어 HER1-HER4 수용체 중 하나)이다. 본원에서 논의된 기타 암 진행-관련 단백질이 또한 적절한 제2의 분자일 수 있다. 한 실시양태에서, 제2의 분자는 CD138과 같이 다발성 골수종 세포의 표면에서 발현되는 분자이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 디아바디이다.
이중특이적 항체는 가교-결합 또는 "이종접합체" 항체를 또한 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해서 제안되었다 (예를 들어 미국 특허 4,676,980호 참조). 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교-결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적절한 펩티드 가교결합제 및 기술이 당업계에 주지되어 있고, 이같은 가교결합제 및 기술의 예가 예를 들어 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
따라서, 본원에서의 논의가 항체에 초점을 맞출 수 있지만, 항체의 실시양태 및 양상은 적합한 경우 항체 단편, 예컨대 Fab 단편, Fab' 단편, 및 scFv 펩티드, 항체-유사 펩티드 (CDR을 포함하는 펩티드), 이중특이적 및 다중특이적 항체 및 기타 CD38BP에 동등하게 적용될 수 있고, 단 본 발명의 CD38BP는 상응하는 완전한 항체의 항원-결합 성질의 적어도 실질적인 비율을 유지하여야 한다는 것을 이해하여야 한다. 일부 예에서, 항체 단편은 더 낮은 항원-결합 친화력과 관련될 수 있지만, 친화력에서의 임의의 이같은 손실을 상쇄할 수 있는 또다른 유리한 양상을 제공할 수 있다.
본 발명의 CD38BP, 특히 항-CD38 항체는 보체 고정 능력을 제공하는지 아닌지의 능력을 기초로 선택될 수 있다. 보체 고정 및 CDC가 가능한 항체의 다수의 이소타입이 있고, 비제한적으로 하기의 것들이 포함된다: 마우스 IgM, 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 마우스 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1, 및 인간 IgG3. 이러한 이소타입에는 비제한적으로 인간 IgG2 및 인간 IgG4가 포함되지 않는다. 이소타입 결정 및 항체의 CDC 기능 특성 및 보체 보정을 변형시키기 위한 기타 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 CD38BP는 면역부착소를 또한 포함하고, 이는 항-CD38 항체의 1개 이상의 CDR이 분자와 공유결합으로 또는 비공유결합으로 회합된 분자이다. 면역부착소에는 더 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 CDR(들)이 혼입될 수 있거나, CDR(들)이 또다른 폴리펩티드 사슬에 공유결합으로 연결될 수 있거나, CDR(들)이 비공유결합으로 혼입될 수 있다. CDR은 면역부착소가 CD38에 특이적으로 결합하도록 한다.
본 발명은 CD38BP 융합 단백질을 또한 제공한다. CD38BP 융합 단백질은 CD38 내에 적어도 부분적으로 포함된 1개 이상의 도메인에 특이적 및/또는 선택적인 임의의 적절한 아미노산 서열 또는 서열들의 조합 (예를 들어, 항-CD38 항체 VH 도메인, VL 도메인, 또는 이의 특정 CDR), 및 CD38-특이적/선택적 서열에 단독으로 귀착될 수 없는 검출가능한 생물학적 기능 및/또는 특성 (예를 들어, 증가된 생체내 반감기, 형광성, 특정 세포 유형에 대한 증가된 표적화 등)을 융합 단백질에 부여하는, 1개 이상의 비-상동성이고, 전형적으로 실질적으로 유사하지 않은 아미노산 서열 (예를 들어, CD38-특이적/선택적 서열에 대해 약 40％ 미만, 약 35％ 미만, 약 30％ 미만, 약 25％ 미만, 약 20％ 미만의 아미노산 서열 동일성)을 포함할 수 있다. 이같은 융합 단백질의 기능성 서열은 가요성 링커(들)에 의해 분리될 수 있다. 2차 서열(들)이 또한 세포독성 또는 세포자멸사성 펩티드로부터 유래될 수 있다. 2차 서열은 또한 진단 성질을 부여할 수 있다. 이같은 서열의 예로는 양고추냉이 과산화효소와 같이 용이하게 가시화되는 효소로부터 유래된 것들이 포함된다.
CD38BP 융합 단백질은 에피토프 택(tag)을 포함하는 것을 또한 특징으로 할 수 있다. 에피토프 택 서열은 항체가 이에 대하여 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, CD38BP의 문맥에서, (에피토프 택이 없는 모 CD38BP와 비교하여) CD38B의 활성 (선택성, 특이성, 친화력, 및/또는 생물학적 활성)을 실질적으로 간섭하지 않도록 충분히 짧은 아미노산 서열이다. 바람직하게는 에피토프 택은 항-에피토프 택 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않도록 충분히 독특하다. 적절한 택 폴리펩티드는 일반적으로 약 6개 이상의 아미노산 잔기를 갖고, 통상적으로 약 8-50개의 아미노산 잔기 (예를 들어, 약 9-30개의 잔기)를 갖는다. 에피토프 택의 예로는 인플루엔자 HA 택 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 ([Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]); c-myc 택 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 ([Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12), 3610-3616 (1985)]) 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 택 및 이의 항체 ([Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)])가 포함된다. 특정 실시양태에서, 에피토프 택은 "샐비지 수용체 결합 에피토프"이다. 본원에서 사용된 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것을 담당하는 IgG 분자 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
본 발명의 CD38BP는 CD38BP 유도체를 또한 포함한다. 유도체는 펩티드의 1개 이상의 아미노산 잔기가 화학적으로 변형되거나 (예를 들어 알킬화, 아실화, 에스테르 형성, 또는 아미드 형성에 의해) 또는 1개 이상의 이종성 치환체 (예를 들어, 친지성 치환체, PEG 부분, 적절한 유기 부분 링커에 의해 연결된 펩티드 측쇄 등)와 공유결합에 의해 회합된 펩티드이다. 또한 펩티드가 치료용 부분, 예컨대 세포독소, 화학요법 약물, 면역억제제, 또는 방사성 동위원소에 접합될 수 있다 (소위 면역접합체). 일반적으로, 본원에 기술된 CD38BP는 임의의 적절한 수의 이같은 변형된 아미노산의 포함 및/또는 이같은 접합된 치환체와의 회합에 의해 변형될 수 있다. 일반적으로 이러한 문맥에서의 적절성은 유도체화되지 않은 모 CD38BP와 관련된 CD38 선택성 및/또는 특이성을 적어도 실질적으로 유지하는 능력에 의해 결정된다. 1개 이상의 변형된 아미노산의 포함은, 예를 들어, (a)폴리펩티드 혈청 반감기를 증가시키거나, (b) 폴리펩티드 항원성을 감소시키거나, 또는 (c) 폴리펩티드 저장 안정성을 증가시키는데 유리할 수 있다. 아미노산(들)은, 예를 들어, 재조합 생산 동안 번역과 동시에 또는 번역 후에 변형될 수 있거나 (예를 들어, 포유류 세포에서의 발현 동안 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결 글리코실화), 합성 수단에 의해 변형될 수 있다. 변형된 아미노산의 비제한적인 예로는 글리코실화 아미노산, 술페이트화 아미노산, 프레닐화 (예를 들어, 파르네실화, 제라닐제라닐화) 아미노산, 아세틸화 아미노산, 아실화 아미노산, PEG화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 카르복실화 아미노산, 인산화 아미노산 등이 포함된다. 아미노산의 변형에서 당업자를 인도하는데 적합한 참조문헌은 문헌에 충분히 공급되어 있다. 예시적인 프로토콜이 [Walker (1998) Protein Protocols On Cd-Rom, Humana Press, Towata, NJ]에서 확인된다. 변형된 아미노산은 글리코실화 아미노산, PEG화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오틴화 아미노산, 지질 부분에 접합된 아미노산, 및 유기 유도체화제에 접합된 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
추가적으로, 항체는 예를 들어 이의 순환 반감기를 증가시키기 위한 중합체에 대한 공유 접합에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 전형적인 중합체, 및 이를 펩티드에 부착시키는 방법이 예를 들어 미국 특허 4,766,106, 미국 특허 4, 179,337, 미국 특허 4,495,285 및 미국 특허 4,609,546에 개시되어 있다. 추가적인 예시적인 중합체에는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 분자량이 약 1,000 내지 약 40,000, 예컨대 약 2000 내지 약 20,000, 예를 들어, 약 3,000-12,000인 PEG)이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 방사성 핵종, 효소, 효소 기질, 보조인자, 형광성 마커, 화학발광 마커, 펩티드 택 또는 자기 입자로부터 선택된 제2분자에 접합된 CD38BP를 제공한다. 한 실시양태에서, CD38BP는 1개 이상의 항체 단편, 핵산 (올리고뉴클레오티드), 뉴클레아제, 호르몬, 면역조정인자, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성 작용제, 염료 등에 접합될 수 있다. 이러한 작용제 및 기타 적절한 작용제는 직접적으로 또는 간접적으로 본 발명의 CD38BP에 커플링될 수 있다. 제2작용제의 간접 커플링의 한 예는 스페이서 부분에 의한 커플링이다. 이어서 이러한 스페이서는 불용성 또는 가용성일 수 있고 (예를 들어 [Diener et al., Science 231. 148 (1986)] 참조), 표적 부위에서 및/또는 특정 조건 하에 CD38BP로부터 약물이 방출될 수 있도록 선택될 수 있다. CD38BP에 커플링될 수 있는 치료제의 추가적인 예로는 렉틴 및 형광성 펩티드가 포함된다.
한 실시양태에서, 1개 이상의 방사선표지된 아미노산을 포함하는 CD38BP 유도체가 제공된다. 방사선표지된 CD38BP는 진단 및 치료 목적 모두를 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 비제한적인 예로는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 131I, 및 186Re가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 방사선표지된 아미노산 및 관련된 펩티드 유도체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 [Junghans et al., Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))] 및 미국 특허 4,681,581, 미국 특허 4,735,210, 미국 특허 5,101,827, 미국 특허 5,102,990 (미국 특허 RE35,500), 미국 특허 5,648,471 및 미국 특허 5,697,902 참조). 예를 들어, 방사성 동위원소가 클로르아민 T 방법에 의해 접합될 수 있다.
진단 환경에서의 유리한 방사성 핵종은 인듐 동위원소이고, 치료 용도의 환경에서 적합한 것은 세포독성인 이트륨 동위원소이다. 일반적으로 광자-방출 방사성 동위원소가 진단 (방사선면역섬광조영술 (RIS)) 방법에서 유리하다. 오거(Auger) 전자는 경로 길이가 매우 짧고 (5-10 nm), 세포독성이기 위해서 내재화될 필요가 있다 (예를 들어 [Adelstein et al., Nucl. Med. Biol. 14, 165-169 (1987)] 참조). 따라서, 이같은 동위원소에 접합된 펩티드는 진단 방법에서 유용할 수 있지만, 내재화되는 펩티드만이 치료 환경에서 오거 전자를 방출하는 방사성 동위원소로 간주되어야 한다. 알파 입자는 치료제로서 효과적이기 위해 세포에 근접할 필요가 있다 (세포 3-4개의 직경 이내) ([Vriesendorp et al., "Radioimmunoglobulin therapy," in High Dose Cancer Therapy Armitage et al., (eds). (Williams & Wilkins, Baltimore, Md. 1992)]). 오거 전자 및 알파 방출체 모두 높은 선택성을 갖는 것으로 간주될 수 있는데, 전형적으로 이들의 짧은 범위의 방출이 이웃의 정상 세포에 방사선을 조사시키지 않을 것이기 때문이다.
방사선금속 111In 및 90Y는 각각 순수한 γ-방출제 및 순수한 β-방출제이다. 가장 통상적으로 사용되는 오거 전자 방출체인 요오드-125는 반감기가 약 60일이고, 종종 생체 내에서 면역접합체에 의해 방출된다 (탈할로겐화에 의해). 임상 용도용으로 가장 통상적으로 고려되는 알파 방출제인 아스타틴-211 및 비스무트-212는 반감기가 비교적 짧고 (각각 7.2시간 및 1.0시간), 첫번째 알파 방출 후 면역접합체에 의해 유지되지 않을 수 있는 방사성 동위원소로 붕괴된다 ([Wilbur, Antibiot. Immunoconjug. Radiopharm. 4, 5-97 (1991)]). 진단 용도를 위해, 인듐-111 또는 테크네튬-99m으로 표지된 CD38BP가 사용될 수 있다. 이러한 동위원소 모두는 이미지화를 위한 적합한 에너지 범위 내의 감마 선을 방출한다 (100-250 keV). 이러한 범위 미만의 에너지는 외부 이미지화 장치에 도달하기에 충분하도록 투과하지 않는다. 더 높은 에너지 수준은 조준하기 어렵고, 해상도가 불량한 진단용 이미지를 제고한다. 99Tc의 짧은 반감기는 이의 용도를 종양 흡수가 신속한 면역접합체로 제한한다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 방사성 동위원소와 접합된 제1 및 제2 CD38BP가 제공된다. 또다른 실시양태에서, 2개의 방사성 동위원소와 접합된 단일 CD38BP가 제공된다. 2개의 별도의 방사성 동위원소, 예를 들어, 이미지화를 위한 1개 및 치료를 위한 1개를 사용하는 것이 장점은 외래 환자 치료를 용이하게 한다는 것이다. 진단용으로 사용된 낮은 양의 방사선활성은 방사선조사 위험을 나타내지 않으면서, 치료용 동위원소, 예컨대 순수한 β-방출제에 의해 방출된 방사선조사는 주로 표적화된 세포 인근에서 전형적으로 흡수될 것이다.
방사성 동위원소는 직접적으로 또는 간접적으로 CD38BP에 부착될 수 있다. 방사성 동위원소 125I, 131I, 99Tc, 186Re, 및 188Re는, 예를 들어, 아미노산 관능기를 통해 단백질 (항체 포함)에 공유결합될 수 있다. 방사성 요오드에 대해, 이는 타이로신 상에서 발견되는 페놀기를 통해 일반적으로 이루어진다. 이를 달성하기 위한 수많은 방법이 존재한다: 클로르아민-T (예를 들어 [Greenwood et al., Biochem J. 89, 114-123 (1963)] 참조) 및 로도젠(lodogen) ([Salacinski et al., Anal. Biochem. HZ, 136-146 (1981)]). Tc 및 Re 동위원소는 시스테인의 술프히드릴 기를 통해 공유 결합될 수 있다 (예를 들어 [Griffiths et al., Cancer Res. 51, 4594-4602 (1991)] 참조). 그러나, 종종 신체가 이러한 공유 결합을 파괴하여, 방사성 동위원소를 순환계로 방출시킬 수 있기 때문에 이같은 조성물은 진단 목적에 비교적 더 잘 적합할 수 있다.
CD38BP는 검출에 유용한 효소, 예컨대 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스프타제, 글루코스 산화효소 등으로 또한 표지될 수 있다. CD38BP는 비오틴으로 또한 표지될 수 있고, 따라서 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접적인 측정을 통해 검출될 수 있다. 또한 CD38BP는 2차 리포터가 인식하는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 택 등)으로 표지될 수 있다. 효소 접합체 후보물질의 추가적인 예로는 말레이트 탈수소효소, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이성화효소, 효모 알콜 탈수소효소, α-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이성화효소, 아스파라기나제, 글루코스 산화효소, 리보뉴클레아제, 요소분해효소, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제가 포함된다.
추가적인 대표적인 표지화 부분에는 일반적으로 스핀-표지 분자 및 진단에 유용한 기타 표지화 부분이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 가교된 CD38BP 유도체를 제공한다. 예를 들어, 이같은 CD38BP 유도체는 2개 이상의 항체를 가교시킴으로써 생산될 수 있고, 이 중 1개 이상은 CD38에 특이적/선택적이다 (동일한 유형 또는 상이한 유형 (예를 들어,이중특이적 항체가 생성되도록)). 적절한 가교제에는 적합한 스페이서에 의해 분리된 2개의 별도의 반응성 기를 갖는 이종2기능성(heterobifunctional)인 것들 (예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 또는 동종2기능성(homobifunctional)인 것들 (예를 들어, 디숙시닐이미딜 수베레이트)이 포함된다. 이같은 링커는 Pierce Chemical Company (Rockford, Ill)로부터 입수가능하다.
CD38BP는 임의의 적절한 유형의 화학기, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기와 접합될 수 있다. 이러한 접합된 기 및 또다른 접합된 기를 사용하여 CD38BP의 생물학적 특성을 개선시킬 수 있고, 예를 들어, 혈청 반감기, 용해도, 및/또는 조직 결합을 증가시킬 수 있다.
CD38BP 유도체는 방사성 동위원소, 단백질, 또는 기타 작용제/부분/화합물을 (a) CD38BP 또는 이의 서브유닛 (예를 들어, 항-CD38 항체 H 사슬, L 사슬, 또는 이의 항-CD38 특이적/선택적 단편)의 N-말단 측면 또는 C-말단 측면, 적합한 치환체 기 또는 측쇄 또는 (b) CD38BP 내의 당 사슬에 화학적으로 접합시킴으로써 생산될 수 있다 (예를 들어, [Antibody Engineering Handbook, Osamu Kanemitsu 편저, Chijin Shokan 출판 (1994)] 참조). 적합한 경우 내부 잔기 또는 당에서의 접합에 의해 유도체가 또한 생성될 수 있다.
CD38BP는 검출제, 예를 들어 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 란탄족 인광체 등이 포함되는 형광 화합물로 또한 유도체화될 수 있다. 적절한 형광 표지의 추가적인 예로는 125Eu 표지, 이소티오시아네이트 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, o-프탈알데히드 표지, 형광아민(fluorescamine) 표지 등이 포함된다. 화학발광 표지의 예로는 루미날(luminal) 표지, 이소루미날(isoluminal) 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시페라제 표지, 에쿼린(aequorin) 표지 등이 포함된다.
한 실시양태에서, CD38BP 유도체는 접합된 핵산 또는 핵산-관련 분자를 포함한다. 본 발명의 한 이같은 양상에서, 접합된 핵산은 세포독성 리보뉴클레아제이다. 한 실시양태에서, 접합된 핵산은 안티센스 핵산이다 (예를 들어, S100A10 표적화 안티센스 분자 (본 발명의 조합 조성물 또는 조합 투여에서 또한 독립적인 성분일 수 있음) - 예를 들어 [Zhang et al., J Biol Chem. 279(3), 2053-62 (2004)] 참조). 한 실시양태에서, 접합된 핵산은 억제성 RNA 분자이다 (예를 들어, siRNA 분자). 한 실시양태에서, 접합된 핵산은 면역자극성 핵산이다 (예를 들어, 면역자극성 CpG 모티프-함유 DNA 분자). 한 실시양태에서, 접합된 핵산은 종양 억제인자 유전자, 항암 백신, 항안 사이토카인, 또는 세포자멸사성 작용제의 발현을 코딩하는 발현 카세트이다. 이같은 유도체는 1가지 이상의 세포독성 단백질, 예컨대 식물 또는 박테리아 독소의 발현을 코딩하는 핵산의 접합을 또한 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, CD38BP는 기능성 핵산 분자에 접합된다. 기능성 핵산에는 안티센스 분자, 간섭 핵산 분자 (예를 들어, siRNA 분자), 앱타머(aptamer), 리보자임, 트리플렉스(triplex) 형성 분자, 및 외부 인도 서열이 포함된다. 기능성 핵산 분자는 표적 분자가 지니는 특정 활성의 어펙터(affector), 억제제, 조정인자 및 자극인자로 작용할 수 있거나, 또는 기능성 핵산 분자는 임의의 다른 분자와 독립적으로 신생(de novo) 활성을 지닐 수 있다. 안티센스 분자의 디자인 및 용도를 보조하는 방법 및 기술의 대표적인 샘플을 하기의 비제한적인 미국 특허 목록에서 확인할 수 있다: 미국 특허 5,135,917, 미국 특허 5,294,533, 미국 특허 5,627,158, 미국 특허 5,641,754, 미국 특허 5,691,317, 미국 특허 5,780,607, 미국 특허 5,786,138, 미국 특허 5,849,903, 미국 특허 5,856,103, 미국 특허 5,919,772, 미국 특허 5,955,590, 미국 특허 5,990,088, 미국 특허 5,994,320, 미국 특허 5,998,602, 미국 특허 6,005,095, 미국 특허 6,007,995, 미국 특허 6,013,522, 미국 특허 6,017,898, 미국 특허 6,018,042, 미국 특허 6,025,198, 미국 특허 6,033,910, 미국 특허 6,040,296, 미국 특허 6,046,004, 미국 특허 6,046,319 및 미국 특허 6,057,437.
한 실시양태에서, CD38BP는 앱타머에 접합된다. 앱타머는 예를 들어 특이적 방식으로 표적 분자와 상호작용하는 분자이다. 전형적으로, 앱타머는 한정된 2차 및 3차 구조, 예컨대 스템-루프(stem-loop) 또는 G-쿼텟(quartet)으로 폴딩되는, 길이가 염기 15-50개 범위인 소형 핵산이다. 앱타머는 소형 분자, 예컨대 ATP (미국 특허 5,631,146) 및 트레오필린 (미국 특허 5,580,737), 뿐만 아니라 대형 분자, 예컨대 역전사효소 (미국 특허 5,786,462) 및 트롬빈 (미국 특허 5,543,293)에 결합할 수 있다. 다수의 상이한 표적 분자에 결합하는 앱타머의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예를 하기의 비제한적인 미국 특허 목록에서 확인할 수 있다: 미국 특허 5,476,766, 미국 특허 5,503,978, 미국 특허 5,631,146, 미국 특허 5,731,424, 미국 특허 5,780,228, 미국 특허 5,792,613, 미국 특허 5,795,721, 미국 특허 5,846,713, 미국 특허 5,858,660, 미국 특허 5,861,254, 미국 특허 5,864,026, 미국 특허 5,869,641, 미국 특허 5,958,691, 미국 특허 6,001,988, 미국 특허 6,011,020, 미국 특허 6,013,443, 미국 특허 6,020,130, 미국 특허 6,028,186, 미국 특허 6,030,776 및 미국 특허 6,051,698.
한 실시양태에서, 본 발명은 리보자임에 접합된 CD38BP를 제공한다. 리보자임은 분자내 또는 분자간 화학 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 따라서 리보자임은 촉매 핵산이다. 천연 시스템에서 발견된 리보자임, 예컨대 (a) 해머헤드(hammerhead) 리보자임, (예를 들어 미국 특허 5,334,711, 미국 특허 5,436,330, 미국 특허 5,616,466, 미국 특허 5,633,133, 미국 특허 5,646,020, 미국 특허 5,652,094, 미국 특허 5,712,384, 미국 특허 5,770,715, 미국 특허 5,856,463, 미국 특허 5,861,288, 미국 특허 5,891,683, 미국 특허 5,891,684, 미국 특허 5,985,621, 미국 특허 5,989,908, 미국 특허 5,998,193, 미국 특허 5,998,203, WO 9858058, WO 9858057 및 WO 9718312에 기술됨), (b) 헤어핀(hairpin) 리보자임 (예를 들어 미국 특허 5,631,115, 미국 특허 5,646,031, 미국 특허 5,683,902, 미국 특허 5,712,384, 미국 특허 5,856,188, 미국 특허 5,866,701, 미국 특허 5,869,339 및 미국 특허 6,022,962에 기술됨), 및 (c) 테트라히메나(tetrahymena) 리보자임 (예를 들어 미국 특허 5,595,873 및 미국 특허 5,652,107에 기술됨)을 기초로 하는, 뉴클레아제 또는 핵산 중합효소 유형 반응을 촉매하는 다수의 상이한 유형의 리보자임이 존재한다. 또한 천연 시스템에서 발견되지 않지만 새롭게 특정 반응을 촉매하도록 조작된 다수의 리보자임이 존재한다 (이의 예는 예를 들어 미국 특허 5,580,967, 미국 특허 5,688,670, 미국 특허 5,807,718 및 미국 특허 5,910,408에 기술되어 있다). 리보자임은 전형적으로 RNA 또는 DNA 기질을 절단하고, 더욱 통상적으로는 RNA 기질을 절단한다. 전형적으로 리보자임은 표적 기질의 인식 및 결합에 이은 절단을 통해 핵산 기질을 절단한다. 종종 이러한 인식은 정규 또는 비-정규 염기쌍 상호작용을 주로 기초로 한다. 이러한 성질은 리보자임이 핵산의 표적 특이적 절단에 특히 양호한 후보물질이도록 하는데, 이는 표적 기질의 인식이 표적 기질 서열을 기초로 하기 때문이다. 다양한 상이한 반응을 촉매하는 리보자임의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예를 하기의 비제한적인 미국 특허 목록에서 확인할 수 있다: 미국 특허 5,646,042, 미국 특허 5,693,535, 미국 특허 5,731,295, 미국 특허 5,811,300, 미국 특허 5,837,855, 미국 특허 5,869,253, 미국 특허 5,877,021, 미국 특허 5,877,022, 미국 특허 5,972,699, 미국 특허 5,972,704, 미국 특허 5,989,906 및 미국 특허 6,017,756.
한 실시양태에서, 본 발명은 트리플렉스 형성 기능 핵산에 접합된 CD38BP를 제공한다. 이같은 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥 핵산과 상호작용할 수 있다. 트리플렉스 분자가 표적 영역과 상호작용할 때, 세 가닥의 DNA가 왓슨-크릭(Watson-Crick) 및 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍형성 모두에 의존적인 복합체를 형성하는, 트리플렉스로 칭해지는 구조가 형성된다. 트리플렉스 분자는 높은 친화성 및 특이성으로 표적 영역에 결합할 수 있다. 여러 상이한 표적 분자에 결합하는 트리플렉스 분자의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예를 하기의 비제한적인 미국 특허 목록에서 확인할 수 있다: 미국 특허 5,176,996, 미국 특허 5,645,985, 미국 특허 5,650,316, 미국 특허 5,683,874, 미국 특허 5,693,773, 미국 특허 5,834,185, 미국 특허 5,869,246, 미국 특허 5,874,566 및 미국 특허 5,962,426.
한 실시양태에서, CD38BP는 외부 가이드 서열에 접합된다. 외부 가이드 서열 (EGS)은 표적 분자를 절단하는 RNA분해효소 P에 의해 인식되는 복합체를 형성하는 표적 핵산 분자에 결합하는 분자이다. EGS는 선택된 RNA 분자를 특이적으로 표적화하도록 디자인될 수 있다. RNA분해효소 P 는 세포 내의 전달 RNA (tRNA)의 프로세싱을 보조한다. 표적 RNA:EGS 복합체가 천연 tRNA 기질을 모방하도록 하는 EGS를 사용함으로써 사실상 모든 RNA 서열을 절단하도록 박테리아 RNA분해효소 P가 고용될 수 있다 (논의를 위해 예를 들어 WO 92/03566 및 [Forster and Altman, Science 238, 407-409 (1990)] 참조). 다양한 상이한 표적 분자의 절단을 촉진하는 EGS 분자의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예가 하기의 비제한적인 미국 특허 목록에서 제공된다: 미국 특허 5,168,053, 미국 특허 5,624,824, 미국 특허 5,683,873, 미국 특허 5,728,521, 미국 특허 5,869,248 및 미국 특허 5,877,162.
한 실시양태에서, CD38BP는 간섭 핵산 분자, 예컨대 siRNA 또는 기타 RNAi 분자 (예를 들어, 뉴클레오티드 약 20-25개의 억제성 이중 가닥 (ds) RNA 분자)에 접합되고, 이는 표적 유전자 발현 생성물, 예컨대 CD38 매개 질환 또는 용태에서 수반되는 유전자 발현 생성물의 작용을 간섭하도록 표적화된다. 간섭 핵산 분자의 제조 및 사용 방법이 예를 들어 [Nishikura, Cell. 107(4). 415-8 (2001)], [Fjose et al., Biotechnol Annu Rev. 7, 31-57 (2001)], [Hanon, Nature 418, 244-51 (2002)], [Brantl, Biochim Biophys Acta. 1575(1-3), 15-25 (2002)], [Tuschl, Chembiochem. 2(4), 239-45 (2001)], [Caplen, Expert Opin Biol Ther. 3(4), 575-86 (2003)], [Lu et al., Curr Opin Mol Ther. 5(3), 225-34 (2003)], [Shuey et al., Drug Discov Today. 7(20), 1040-6 (2002)], [Shi, Trends Genet. 19(1), 9-12 (2003)], [Kovar et al., Semin Cancer Biol. 13(4), 275-81 (2003)], [Lavrey et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 6(4), 561-9 (2003)], [Clewey, Commun Dis Public Health. 6(2), 162-3 (2003)], [Duxbury et al., J Surg Res. 117(2), 339-44 (2004)], [Caplen et al., Ann N Y Acad Sci. 1002, 56-62 (2003)], WO 01/75164, 미국 특허 6,506,559, 미국 특허 20040086884, 미국 특허 20040077574, 미국 특허 20040063654, 미국 특허 20040033602, 미국 특허 20030167490, 미국 특허 20030157030, 미국 특허 20030114409, 미국 특허 20030108923, 미국 특허 20040014113 및 미국 특허 20020132788에서 제공된다.
한 실시양태에서, CD38BP는 종양 표적화 도메인 펩티드 또는 분자에 접합된다. 한 실시양태에서, CD38BP는 종양 표적화 인자 VII 서열에 접합된다.
CD38BP를 접합되는 분자(들)에 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 상기 기술된 것들을 사용할 수 있고, [Hunter et al., Nature 144, 945 (1962)], [David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974)], [Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981)] 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)]에 기술된 것들이 포함된다. 연결/접합은 임의의 적절한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 공유 결합은 디술피드 결합 형태를 취할 수 있고 (필요하고 적절한 경우), CD38BP는 여분의 시스테인 코돈을 함유하도록 조작될 수 있고, 이는 바람직하게는 분자의 CD38 결합 활성을 간섭하지 않는다. 변형된 CD38BP의 시스테인과 반응성인 술프히드릴 기로 유도체화된 독소 분자가 CD38BP 펩티드와 면역접합체를 형성할 수 있다. 별법적으로, 고체 상 폴리펩티드 기술을 사용하여 술프히드릴 기가 CD38BP에 직접 도입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 내로의 술프히드릴 기의 도입이 [Hiskey, Peptides 3, 137 (1981)]에 기술되어 있다. 펩티드 내로의 술프히드릴 기의 도입이 [Maasen et al., Eur. J. Biochem. 134, 32 (1983)]에 기술되어 있다. 일단 정확한 술프히드릴 기가 존재하면, 세포독소 및 CD38BP를 정제하고, 양쪽 모두의 황 기가 환원되고; 세포독소 및 리간드가 혼합되고 (예를 들어 약 1:5 내지 1:20의 비율); 실온에서 디술피드 결합 형성이 완료되도록 진행된다 (일반적으로 약 20 내지 30분). 그 후, 혼합물을 포스페이트 완충 염수에 대해 투석하거나 세파덱스(Sephadex)와 같은 수지에서 크로마토그래피하여 미반응 리간드 및 독소 분자를 제거한다.
수많은 유형의 세포독성 화합물이 세포독성 화합물 상의 반응기를 통해 또는 가교제의 사용을 통해 단백질에 연결될 수 있다. 아민과 생체 내에서 안정적인 공유 결합을 형성할 통상적인 반응성 기는 이소티오시아네이트이다 ([Means et al., Chemical modifications of proteins (Holden-Day, San Francisco 1971) pp. 105-110]). 이러한 기는 라이신의 ε-아민 기와 우선적으로 반응한다. 말레이미드는 시스테인 사의 술프히드릴 기와 안정적인 생체내 공유 결합을 형성하는데 통상적으로 사용되는 반응성 기이다 ([Ji., Methods Enzymol 91., 580-609 (1983)]). 모노클로날 항체는 전형적으로 방사선금속 이온과 공유 결합을 형성할 수 없지만, 이는 항체에 공유 결합된 킬레이트화제의 사용을 통해 간접적으로 항체에 부착될 수 있다. 킬레이트화제는 아미노산 잔기의 아민 ([Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984)]) 및 술프히드랄 기 ([Koyama, Chem. Abstr. 120, 217262t (1994)])를 통해, 그리고 또한 탄수화물 기 ([Rodwell et al., PNAS USA 83, 2632-2636 (1986)], [Quadri et al., Nucl. Med. Biol. 20, 559-570 (1993)])를 통해 부착될 수 있다. 이러한 킬레이트화제들은 금속 이온에 결합하는 1개 및 항체에 킬레이트화되는 또다른 1개의 2가지 유형의 관능기를 함유하기 때문에, 통상적으로 2관능성 킬레이트화제로 지칭된다 ([Sundberg et al., Nature 250, 587-588 (1974)]).
2개의 반응성 관능기를 갖는 가교제는 동종2관능성 또는 이종2관능성으로 분류된다. 동종2관능성 가교제의 예로는 술프히드릴 기와 반응성인 비스말레이미도헥산 (BMH) ([Chen et al., J Biol Chem 266, 18237-18243 (1991)]) 및 아미노 기와 반응성인 에틸렌 글리코비스[숙신이미딜숙시네이트] (EGS) ([Browning et al., J. Immunol. 143, 1859-1867 (1989)])가 포함된다. 이종2관능성 가교제의 예로는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS) ([Myers et al., J. Immunol. Meth. 121, 129-142 (1989)])가 포함된다. 이러한 방법론은 단순하고, 통상적으로 사용된다.
치료 또는 진단제는 또한 또는 별법적으로 디술피드 결합 형성을 통해 환원된 항체 성분의 힌지 영역에 부착될 수 있다. 별법적으로, 이같은 펩티드는 이종2관능성 가교제, 예컨대 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)를 사용하여 항체 성분에 부착될 수 있다. [Yu et al., Int. J. Cancer 56, 244 (1994)]. 이같은 접합을 위한 일반적인 기술은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, [Wong, Chemistry Of Protein Conjugation And Cross-Linking (CRC Press 1991)], [Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", Monoclonal Antibodies: Principles And Applications, Birch et al., (eds.) (Wiley-Liss, Inc. 1995)], [Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", Monoclonal Antibodies: Production, Engineering And Clinical Application, Ritter et al., (eds.) (Cambridge University Press 1995)] 참조.
일부 실시양태에서, 표지 및 기타 접합된 치환체들은 잠재적인 입체장애를 감소시키기 위한 다양한 길이의 스페이서 팔에 의해 CD38BP 아미노산 서열에 부착된다.
표지되지 않은 CD38BP(들)이 CD38BP(들)과 반응성인 다른 표지된 항체들 (제2항체), 예컨대 항-CD38 mAb에 결합하는 인간 면역글로불린 불변 영역에 특이적인 항체와 조합되어 사용될 수 있다. 별법적으로, CD38BP가 직접적으로 표지화될 수 있다. 광범위한 표지가 CD38BP의 직접적 또는 간접적인 표지화, 예컨대 방사성 핵종, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드 (특히 합텐) 등으로의 표지화에 사용될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입물의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 택에 융합된 항체가 포함된다. 항체 분자의 또다른 삽입 변이체로는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 PEG 또는 폴리펩티드 또는 효소가 N- 또는 C-말단에 융합되는 것이 포함된다. 이같은 항-CD38 항체 융합 단백질 및 CD38BP 서열을 포함하는 유사한 융합 단백질은 본 발명의 또다른 양상이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료용 부분, 예컨대 세포독소, 화학요법 약물, 면역억제제, 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명의 CD38BP, 예컨대 인간 항-CD38 항체를 포함하는 분자를 제공한다. 이같은 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 1개 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다.
세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 (예를 들어 세포를 죽이는) 임의의 작용제를 포함한다. 당업계에 주지된 이러한 클래스의 약물, 및 이들의 작용 메커니즘의 설명에 대해서는, [Goodman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8th Ed., Macmillan Publishing Co., 1990] 참조. 항체 면역독소의 제조에 관한 추가적인 기술이 예를 들어 [Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993)] 및 미국 특허 5,194,594에서 제공된다.
본 발명의 면역접합체의 형성에 적절한 치료제로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 악티노마이신 D, 1-데히드로-테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신, 항대사물질 (예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 젬시타빈, 클라드리빈), 알킬화제 (예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 기타 백금 유도체, 예컨대 카르보플라틴), 항생제 (예컨대 닥티노마이신 (기존의 악티노마이신), 블레오마이신, 다우노루비신 (기존의 다우노마이신), 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 칼리키아마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC)), 디프테리아 독소 및 관련 분자 (예컨대 디프테리아 A 사슬 및 이의 활성 단편 및 하이브리드 분자), 리신 독소 (예컨대 리신 A 또는 탈글리코실화 리신 A 사슬 독소), 콜레라 독소, 시가(Shiga)-유사 독소 (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈모모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 젤라닌, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토락카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신 독소가 포함된다. 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 본 발명의 CD38BP와 조합되어 투여될 수 있는 치료제는 또한 본 발명의 CD38BP에 대한 접합에 유용한 치료용 부분일 수 있다. 예를 들어, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 지니는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이같은 단백질은, 예를 들어, 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는, 생물학적 응답 변형인자 예컨대, 예를 들어, 림포카인, 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-6 (IL-6), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 또는 미토콘드리아로부터 단리된 기타 성장 인자 및 세포자멸사 유도 단백질을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 세포독성제는 칼리키아마이신, 90Y, 125I 및 131I이다.
본 발명의 CD38BP에 접합될 수 있는 치료용 세포독소의 또다른 예로는 칼리키아마이신 및 듀오카르마이신이 포함된다. 상기 지적된 바와 같이, 약물 부분은 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석될 필요가 없다. 예를 들어, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이같은 단백질은, 예를 들어, 세포 표면에서 활성인 작용제, 예컨대 포스포리파제 효소, 예를 들어 포스포리파제 C를 포함할 수 있다.
전형적으로 독소의 용해 부분은 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 Fab 단편에 쉽게 연결될 수 있다. 또다른 적절한 접합되는 분자에는 리보뉴클레아제 (RNA분해효소), DNA분해효소 I, 포도상구균 장독소-A, 포크위드(pokeweed) 안티바이러스 단백질, 디프테린 독소, 및 슈도모나스 내독소가 포함된다. 예를 들어, [Pastan et al., Cell 47, 641 (1986)] 및 [Goldenberg, Calif. Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994)] 참조. 본 발명에서 사용하기에 적절한 추가적인 독소는 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 6,077,499 참조).
CD38BP, 예컨대 항체와 이같은 세포독성 부분의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제를 사용하여 제조될 수 있다. 이같은 시약의 예로는 SPDP, IT, 이미도에스테르의 2관능성 유도체 예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl, 활성 에스테르 예컨대 디숙신이미딜 수베레이트, 알데히드 예컨대 글루타르알데히드, 비스-아조 화합물 예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민, 비스-디아조늄 유도체 예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민, 디이소시아네이트 예컨대 톨릴렌 2,6-디이소시아네이트, 및 비스-활성 플루오르 화합물 예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 도세탁셀, 파클리탁셀 및 비노렐빈)이 포함된다.
이같은 치료용 부분을 CD38BP, 예컨대 항체에 접합시키기 위한 기술은 주지되어 있다. 예를 들어 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)], [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)], [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985)], ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62, 119-58 (1982)] 참조.
한 실시양태에서, 본 발명은 혼합 독소에 접합된 CD38BP를 제공한다. 혼합 독소 분자는 2개의 상이한 (전형적으로 폴리펩티드) 독소로부터 유래된 분자이다. 일반적으로, 펩티드 독소는 일반화된 진핵생물 세포 결합을 담당하는 1개 이상의 도메인, 1개 이상의 효소적으로 활성인 도메인, 및 1개 이상의 전위 도메인을 포함한다. 결합 및 전위 도메인은 각각 세포 인식 및 독소 진입에 필요하다. 전위 도메인을 갖는 것으로 공지된 천연-발생 단백질에는 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 A, 및 가능한 기타 펩티드 독소가 포함된다. 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소 A의 전위 도메인은 잘 규명되어 있고 (예를 들어 [Hoch et al., PNAS USA 82, 1692 (1985)], [Colombatti et al., J. Biol. Chem. 261, 3030 (1986)] 및 [Deleers et al., FEBS Lett. 160, 82 (1983)] 참조), 다른 분자 내의 이같은 도메인의 존재 및 위치는 [Hwang et al., Cell 48, 129 (1987)] 및 [Gray et al., PNAS USA 8J.2645 (1984)]에 의해 사용된 것들과 같은 방법에 의해 결정할 수 있다. 이러한 기술의 관점에서, 유용한 혼합 독소 하이브리드 분자가, 예를 들어, 미국 특허 5,906,820에 기술된 바와 같이, 대장균 시가-유사 독소의 효소적으로 활성인 A 서브유닛 ([Calderwood et al., PNAS USA 84, 4364 (1987)])을 디프테리아 독소의 전위 도메인 (아미노산 잔기 202 내지 460), 및 특정 세포 유형을 표적화하는 분자에 융합시킴으로써 형성될 수 있다. 3개의 부분으로 이루어진 하이브리드의 표적화 부분은 표적화된 세포에 분자가 특이적으로 부착될 수 있도록 할 수 있고, 디프테리아 독소 전위 부분은 시가-유사 독소의 효소적으로 활성인 A 서브유닛을 표적화된 세포 내로 삽입하는 작용을 할 수 있다. 시가-유사 독소의 효소적으로 활성인 부분은, 디프테리아 독소와 같이, 세포의 단백질 합성 장치 상에 작용하여 단백질 합성을 방지하고, 따라서 표적화된 세포를 죽인다.
본 발명에 따른 면역접합체는 CD38-관련 장애, 예컨대 다발성 골수종의 치료를 위한 세포독성 방사선약물이 생성되도록 방사성 동위원소, 예를 들어, 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-111을 또한 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP, 예컨대 인간 항체는 링커-킬레이터, 예를 들어, 튜세탄에 부착되고, 이는 항체가 방사성 동위원소에 부착되도록 한다.
추가적으로 유용한 접합체 치환체에는 항암 레티노이드가 포함된다. 탁산 접합체 (예를 들어 [Jaime et al., Anticancer Res. 21(2A), 1119-28 (2001)] 참조), 시스플라틴 접합체, 탑시가린 접합체, 리놀레산 접합체, 칼리키아마이신 접합체 (예를 들어 [Damle et al., Curr Opin Pharmacol. 3(4), 386-90 (2003)] 참조), 독소루비신 접합체, 젤다나마이신 접합체 등이 암의 치료를 촉진하는데 또한 유용할 수 있다 (일반적으로, [Trail et al., Cancer Immunol Immunother. 52(5), 328-37 (2003)] 참조).
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD38 항체에 대해 상승된 2차 및 항-이디오타입 항체를 제공한다. 2차 항체는 항-CD38 항체에 특이적인, 전형적으로 이에 대해 상승된 항체를 지칭한다. 항-이디오타입 (Id) 항체는 항체의 항원-결합 부위와 일반적으로 관련된 독특한 결정기를 인식하는 항체이다. Id 항체는 항-CD38 mAb의 공급원과 동일한 종 및 유전자 유형의 동물을 mAb로 면역화시킴으로써 제조될 수 있고, mAb에 대해 항-Id가 제조된다. 면역화되는 동물은 면역화 항체의 이디오타입 결정기에 대한 항체 (항-Id 항체)를 생산함으로써 면역화 항체의 이디오타입 결정기를 인식하고 이에 응답할 수 있다. 이같은 항체는 예를 들어 미국 특허 4,699,880에 기술되어 있다. 이같은 항체는 본 발명의 추가적인 양상이다.
항-Id 항체가 또다른 동물에서 면역 응답을 유도하는 "면역원"으로서 또한 사용되어, 소위 항-항-Id 항체가 생산될 수 있다. 항-항-Id는 항-Id를 유도한 원래의 mAb와 에피토프가 동일할 수 있다. 따라서, mAb의 이디오타입 결정기에 대한 항체를 사용함으로써, 동일한 특이성의 항체를 발현하는 또다른 클론을 확인할 수 있다. 항-Id 항체는 임의의 적절한 기술, 예컨대 항-CD38 항체 및 기타 본 발명의 CD38BP에 대해 본원의 다른 곳에서 기술된 것들에 의해 변하고/변하거나 (따라서 항-Id 항체 변이체가 생성됨), 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 항-Id mAb가 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)과 같은 캐리어에 커플링되어, BALB/c 마우스를 면역화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 마우스로부터의 혈청은 원래의/모 CD38 항체와 동일하지 않다면 유사한 결합 성질을 갖는 항-항-Id 항체를 전형적으로 함유할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP를 코딩하는 핵산을 제공한다. CD38BP-코딩 핵산은 임의의 적절한 특성을 가질 수 있고, 임의의 적절한 양상 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, CD38BP-코딩 핵산은 DNA, RNA, 또는 이의 하이브리드의 형태일 수 있고, 비-천연발생 염기, 변형 골격 (예를 들어, 핵산의 안정성을 촉진하는 포스포티오에이트 골격), 또는 비-천연발생 염기 및 변형 골격을 포함할 수 있다. 유리하게는 핵산은 표적 숙주 세포(들)에서의 원하는 발현, 복제 및/또는 분비를 촉진하는 특징을 포함한다. 이같은 특징의 예로는 복제 기원 성분, 선별 유전자 성분, 프로모터 성분, 인핸서 요소 성분, 폴리아데닐화 서열 성분, 종결 성분 등이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP-코딩 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 CD38BP-코딩 핵산의 발현, CD38BP 펩티드의 생산, 표적 세포의 형질감염/형질전환, CD38BP-코딩 핵산의 복제를 촉진하거나, 핵산의 안정성을 촉진하거나, 핵산 및/또는 형질전환/형질감염된 세포의 검출을 촉진하거나, 또는 유리한 생물학적 기능을 CD38BP-코딩 핵산에 부여하는 전달 비히클(vehicle)이다. 본 발명의 문맥에서의 벡터는 염색체성, 비-염색체성 및 합성 핵산 벡터 (적절한 셋트의 발현 제어 요소를 포함하는 핵산 서열)를 포함하여 임의의 적절한 벡터일 수 있다. 이같은 벡터의 예로는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합물, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터가 포함된다. 한 실시양태에서, CD38BP-코딩 핵산은 선형 발현 요소를 예를 들어 포함하는 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터 (예를 들어 [Sykes and Johnston, Nat Biotech T7, 355-59 (1997)]에 기술됨), 압축(compacted) 핵산 벡터 (예를 들어 미국 특허 6,077, 835 및/또는 WO 00/70087에 기술됨), 플라스미드 벡터 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "깔따구" 최소-크기 핵산 벡터 (예를 들어 [Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)]에 기술됨) 내에 포함되거나, 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaP04-침전 구축물 (예를 들어 WO 00/46147, [Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986)], [Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)], 및 [Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)]에 기술됨)로서 포함된다. 이같은 핵산 벡터 및 이의 용도는 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 5,589,466 및 미국 특허 5,973,972 참조).
한 실시양태에서, 벡터는 박테리아 세포에서의 CD38BP의 발현에 적절하다. 이같은 벡터의 예로는, 예를 들어, 쉽게 정제될 수 있는 융합 단백질이 고수준으로 발현되도록 하는 벡터 (예를 들어 다관능성 대장균 클로닝 및 발현 벡터 예컨대 BlueScript (Stratagene), pIN 벡터 ([Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)]), pET 벡터 (Novagen, Madison WI) 등)가 포함된다.
또한 또는 별법적으로 발현 벡터는 효모 시스템에서의 발현에 적절한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적절한 임의의 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 사용하기에 적절한 벡터에는, 예를 들어, 구성성 또는 유도성 프로모터 예컨대 알파 인자, 알콜 산화효소 및 PGH를 포함하는 벡터가 포함된다 ([F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)], 및 [Grant et al., Methods in Enzymol 153. 516-544 (1987)]에 개관됨).
핵산 및/또는 벡터는 분비/국소화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 또한 포함할 수 있고, 이는 폴리펩티드, 예컨대 신생 폴리펩티드 사슬을 원하는 세포 구획, 막 또는 기관에 표적화시킬 수 있거나, 또는 폴리펩티드가 원형질막주위 공간으로 또는 세포 배양 배지 내로 분비되도록 한다. 이같은 서열은 당업계에 공지되어 있고, 분비 리더(leader) 또는 신호 펩티드, 기관 표적화 서열 (예를 들어, 핵 국소화 서열, ER 잔류 신호, 미토콘드리아 통과 서열, 엽록체 통과 서열), 막 국소화/앵커(anchor) 서열 (예를 들어, 정지 전달 서열, GPI 앵커 서열) 등이 포함된다.
CD38BP-코딩 핵산은 임의의 적절한 프로모터, 인핸서, 및 기타 발현-촉진 요소를 포함할 수 있다. 이같은 요소의 예로는 강력한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3-3, MMTV, 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리(A) 종결 서열, 대장균에서의 플라스미드 생성물에 대한 복제 기원, 선별 마커로서의 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)가 포함된다. 핵산은 CMV IE와 같은 구성성 프로모터와 반대되는 유도성 프로모터를 또한 포함할 수 있다 (당업자는 이같은 용어가 특정 조건 하에서의 유전자 발현 정도의 기술어라는 것을 인지할 것이다).
한 실시양태에서, 핵산은 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 또는 숙주 동물에 놓이고/놓이거나 전달될 수 있다. 임의의 적절한 바이러스 벡터가 이와 관련하여 사용될 수 있고, 다수가 당업계에 공지되어 있다. 바이러스 벡터는 단독의 또는 원하는 숙주 세포에서의 본 발명의 핵산의 전달, 복제 및/또는 발현을 용이하게 하는 또다른 바이러스 단백질과 조합된 임의의 수의 바이러스 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 전체 바이러스 게놈 또는 일부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 바이러스 단백질/핵산 접합체, 바이러스-유사 입자 (VLP), 미국 특허 5,849,586 및 WO 97/04748에 기술된 것들과 유사한 벡터, 또는 바이러스 핵산 및 본 발명의 핵산을 포함하는 무손상 바이러스 입자일 수 있다. 바이러스 입자 바이러스 벡터는 야생형 바이러스 입자 또는 변형된 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 및/또는 발현을 위한 또다른 벡터 또는 야생형 바이러스, 예컨대 아데노바이러스 벡터 앰플리콘(amplicon)의 존재를 필요로 하는 벡터일 수 있다 (즉, 헬퍼-의존적 바이러스일 수 있다). 전형적으로, 이같은 바이러스 벡터는 야생형 바이러스 입자, 또는 트랜스진 용량을 증가시키거나 또는 형질감염 및/또는 핵산의 발현을 보조하기 위해 단백질 및/또는 핵산 함량이 변형된 바이러스 입자 (이같은 벡터의 예로는 헤르페스 바이러스/AAV 앰플리콘이 포함된다)로 본질적으로 구성된다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 정상적으로 인간을 감염시키는 바이러스와 유사하고/하거나 이로부터 유래된다. 이와 관련하여 적절한 바이러스 벡터 입자에는, 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 입자 (임의의 아데노바이러스과 바이러스 또는 아데노바이러스과 바이러스로부터 유래된 바이러스 포함), 아데노-관련 바이러스 벡터 입자 (AAV 벡터 입자) 또는 기타 파르보바이러스 또는 파르보바이러스 벡터 입자, 유두종바이러스 벡터 입자, 플라비바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 (렌티바이러스벡터 포함)가 포함된다. 이같은 바이러스 및 바이러스 벡터의 예는 예를 들어 [Fields et al., eds., Virology Raven Press, Ltd., New York (3rd ed., 1996 and 4th ed., 2001)], [Encyclopedia of Virology, R. G. Webster et al.,eds., Academic Press (2nd ed., 1999)], [Fundamental Virology, Fields et al., eds., Lippincott- Raven (3rd ed., 1995)], [Levine, "Viruses," Scientific American Library No. 37 (1992)], [Medical Virology, D. O. White et al., eds., Acad. Press (2nd ed. 1994)], 및 [Introduction to Modern Virology, Dimock, N. J. et al., eds., Blackwell Scientific Publications, Ltd. (1994)]에 기술되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터에는 예를 들어 [Carter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992)] 및 [Muzcyzka, Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129 (1992)]에서와 같은 아데노바이러스 및 아데노-관련 벡터가 포함된다. AAV 벡터의 추가적인 유형 및 양상이 예를 들어 [Carter, Contrib. Microbiol. 4, 85-86 (2000)], [Smith-Arica, Curr. Cardiol. Rep. 3(1), 41-49 (2001)], [Taj, J. Biomed. Sci. 7(4), 279-91 (2000)], [Vigna et al., J. Gene Med. 2(5), 308-16 (2000)], [Klimatcheva et al., Front. Biosci. 4, D481-96 (1999)], [Lever et al., Biochem. Soc. Trans. 27(6), 841-47 (1999)], [Snyder, J Gene Med. 1(3), 166-75 (1999)], [Gerich et al., Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 5(2), 118-23 (1998)], 및 [During, Adv. Drug Deliv. Review 27(1), 83-94 (1997)] 및 미국 특허 4,797,368, 미국 특허 5,139,941, 미국 특허 5,173, 414, 미국 특허 5,614,404, 미국 특허 5,658,785, 미국 특허 5,858,775 및 미국 특허 5,994,136)에 기술되어 있다. 미국 특허 4,797,368 및 [Laughlin et al., Gene 23, 65-73 (1983)]에 예를 들어 기재된 방법을 사용하여 아데노-관련 바이러스 벡터를 구축 및/또는 정제할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 방법에서 사용될 수 있는 또다른 유형의 바이러스 벡터는 유두종바이러스 벡터이다. 적절한 유두종바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있고,, 예를 들어, [Hewson, Mol Med Today 5(1), 8 (1999)], [Stephens, Biochem J. 248(1), 1-11 (1987)] 및 미국 특허 5,719, 054에 기술되어 있다. 유두종바이러스 벡터의 예가 예를 들어 WO 99/21979에서 제공된다. 알파바이러스 벡터가 또다른 환경에서의 유전자 전달 벡터일 수 있다. 알파바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 [Carter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992)], [Muzcyzka, Curr Top Microbiol Immunol. 158, 97-129 (1992)], [Schlesinger, Expert Opin Biol Ther. 1(2), 177-91 (2001)], [Polo et al., Dev Biol (Basel). 104, 181-5 (2000)], [Wahlfors et al., Gene Ther. 7(6), 472-80 (2000)], [Colombage et al., Virology. 250(1), 151-63 (1998)] 및 WO 01/81609, WO 00/39318, WO 01/81553, WO 95/07994 및 WO 92/10578에 기술되어 있다.
또다른 군의 바이러스 벡터는 헤르페스 바이러스 벡터이다. 헤르페스 바이러스 벡터의 예가 예를 들어 [Lachmann et al., Curr Opin Mol Ther 1(5), 622-32 (1999)], [Fraefel et al., Adv Virus Res. 55, 425-51 (2000)], [Huard et al., Neuromuscul 7(5), 299-313 (1997)], [Glorioso et al., Annu Rev Microbiol. 49, 675-710 (1995)], [Latchman, Mol Biotechnol. 2(2), 179-95 (1994)], 및 [Frenkel et al., Gene Ther. 1(Suppl 1), S40-6 (1994)], 뿐만 아니라 미국 특허 6,261,552 및 미국 특허 5,599,691에 기술되어 있다.
렌티바이러스 벡터가 포함되는 레트로바이러스 벡터 또한 특정 환경에서 유리한 유전자 전달 비히클일 수 있다. 수많은 레트로바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 레트로바이러스 벡터의 예가 예를 들어 [Miller, Curr Top Microbiol Immunol 158. 1-24 (1992)], [Salmons and Gunzburg, Human Gene Therapy 4, 129-141 (1993)], [Miller et al., Methods in Enzymolosy 217, 581-599 (1994)], [Weber et al., Curr Opin Mol Ther. 3(5), 439-53 (2001)], [Hu et al., Pharmacol Rev. 52(4), 493-511 (2000)], [Kim et al., Adv Virus Res. 55, 545-63 (2000)], [Palu et al., Rev Med Virol. 10(3), 185-202 (2000)] 및 [Takeuchi et al., Adv Exp Med Biol. 465, 23-35 (2000)], 뿐만 아니라 미국 특허 6,326,195, 미국 특허 5,888,502, 미국 특허 5,580,766, 및 미국 특허 5,672, 510에 기술되어 있다.
아데노바이러스 또한 유전자 전달에 적절한 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어 [Graham et al, Mol Biotechnol 33(3), 207-220 (1995)], [Stephenson, Clin Diagn Virol 10(2-3), 187-94 (1998)], [Jacobs, Clin Sci (Lond). 85(2), 117-22 (1993)], 미국 특허 5,922,576, 미국 특허 5,965,358 및 미국 특허 6,168,941 및 WO98/22588, WO98/56937, WO99/15686, WO99/54441, 및 WO00/32754에 기술되어 있다. 본 발명에 유용한 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터가 예를 들어 [Jolly Cancer Gene Therapy 1, 51-64 (1994)], [Latchman Molec Biotechnol 2, 179-195 (1994)] 및 [Johanning et al., Nucl Acids Res 23, 1495-1501 (1995)]에 기술되어 있다.
기타 적절한 바이러스 벡터에는 폭스 바이러스 벡터가 포함된다. 이같은 벡터의 예가 예를 들어 [Berencsi et al., J Infect Dis 183(8), 1171-9 (2001)], [Rosenwirth et al., Vaccine 19(13-14), 1661-70 (2001)], [Kittlesen et al., J Immunol 164(8), 4204-11 (2000)], [Brown et al., Gene Ther 7(19), 1680-9 (2000)], [Kanesa-thasan et al., Vaccine 19(4-5), 483-91 (2000)], [Sten, Drua 60(2), 249-71 (2000)]에 기술되어 있다. 우두 바이러스 벡터가 폭스바이러스 벡터일 수 있다. 이같은 벡터의 예 및 이의 용도가 예를 들어 [Venugopal et al., Res Vet Sci 57(2), 188-193 (1994)], [Moss Dev Biol Stand 82, 55-63 (1994)], [Weisz et al., Mol Cell Biol 43, 137-159 (1994)], [Mahr and Payne, Immunobiology 184(2-3), 126-146 (1992)], [Hruby, Clin Microbiol Rev 3(2), 153-170 (1990)] 및 WO92/07944, WO98/13500, 및 WO89/08716에서 제공된다.
본 발명의 또다른 양상에는 이같은 핵산, 벡터, 또는 이중 하나 또는 양쪽 모두의 조합물을 포함하는 재조합 세포, 예컨대 효모, 박테리아 및 포유류 세포 (예를 들어, 무한증식 포유류 세포)가 포함된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 CD38BP의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 세포 게놈 내로 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 통합되지 않은 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 CD38BP에 특이적인 CD38의 임의의 상기 기술된 항원 결정기, 예컨대 -003 및 -005 및 -024에 특이적인 CD38의 항원 결정기 부분을 포함하는 면역원성 펩티드를 또한 제공한다. 이같은 면역원은 활성 면역치료 요법을 포함하는 방법에서 직접적인 면역 응답을 도출해내는데 사용될 수 있다. 본 발명은 이같은 CD38 면역원, 및 융합 단백질의 반감기를 개선시키거나 (예를 들어, 면역글로불린 도메인 서열의 포함에 의해); 융합 단백질의 검출 및/또는 정제를 용이하게 하거나 (예를 들어, 형광 펩티드 서열, 리포터 효소 서열, 에피토프 택, 헥사-히스티딘 서열 등을 포함함으로써); 융합 단백질의 표적화를 촉진하거나 (예를 들어, 표적 세포 상의 수용체에 특이적인 리간드 또는 리간드의 일부분을 포함함으로써); 별개의 면역 응답의 유도를 촉진하거나 (예를 들어, 암 항원 또는 이의 면역원성 단편에 상응하거나); 세포독성제이거나; 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 열 충격 융합 단백질 파트너는 융합 단백질의 유사하지 않은 이종성 항원 부분에 대해 생성된 면역 응답을 증가시키면서, 또한 융합 단백질의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다)을 달성하는 융합 파트너 서열을 포함하는 융합 단백질을 또한 제공한다. 융합 단백질은 1개 이상의 절단 부위를 특히 도메인들 사이에 또한 포함할 수 있다.
이같은 펩티드의 변이체, 및 이같은 면역원성 펩티드 또는 면역원성 펩티드 변이체의 유도체는 본 발명의 추가적인 양상이다 (예를 들어, 이같은 CD38 면역원성 펩티드 유도체는 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 회합 등에 의해 다른 분자 본체 예컨대 항체, 독소, 방사성 동위원소, 세포독성제, 또는 세포증식억제제에 변형될 수 있다). CD38 에피토프 서열을 포함하는 펩티드 미니토프(mimitope) 또한 백신 후보물질로 유용할 수 있다. 이같은 펩티드는 항-CD38 항체의 정제에 또한 유용할 수 있다. 본원에 기술된 B-세포 에피토프 서열에 더하여, 이같은 펩티드는 1개 이상의 항-CD38 T 세포 에피토프를 포함하도록 또한 또는 별법적으로 조작 또는 선별될 수 있다. 이같은 에피토프는 당업계에 공지된 임의의 적절한 기술에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, T 세포 에피토프 예측 소프트웨어 적용에 의해).
한 실시양태에서, 본 발명은 이같은 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 이같은 핵산은 적절한 벡터, 예컨대 복제-결핍 표적화 벡터 (예를 들어, 표적화 핵산 벡터 또는 복제-결핍 표적화 아데노바이러스 벡터) 내에서 숙주로 전달될 수 있다. 본 발명은 1개 이상의 이같은 면역원성 펩티드 및/또는 면역원성 펩티드-코딩 핵산의 조성물을 또한 제공한다.
본 발명의 CD38BP는 "중화" CD38BP, 예컨대 중화 항체를 포함한다. 용어 "중화" CD38BP" 및 "중화 항체"는 CD38-관련 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 억제 또는 제거할 수 있는 CD38BP 또는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 중화 CD38BP, 예컨대 중화 항-CD38 항체는 CD38의 기능, 예컨대 효소 활성, 신호 전달, 사이토카인 발현 유도, 증식 또는 분화 유도, 또는 용해 유도를 대략 동일한 양의 -003 또는 -005 또는 -024의 투여로 인한 이같은 세포의 억제와 거의 동일하거나 더 큰 정도로 직접적으로 또는 간접적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 CD38BP는 CD38에 적어도 부분적으로 함유된 1개 이상의 에피토프에 대한 임의의 적절한 친화력 및/또는 결합성을 가질 수 있다. 친화력은 CD38BP가 이같은 에피토프에 결합하는 강도를 지칭한다. 전형적으로, 친화력은 [Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]로 정의되는 해리 상수 Kd에 의해 측정되고, 식중 [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체 (또는 CD38BP-항원 복합체)의 몰 농도이고, [Ab]는 결합되지 않은 항체 (또는 CD38BP)의 몰 농도이며, [Ag]는 결합되지 않은 항원의 몰 농도이다. 친화력 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. 경쟁적 억제에 의해 특이성 및 친화력을 결정하는 적절한 방법은 예를 들어 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)], [Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley InterScience N.Y., (1992, 1993)] 및 [Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983)]에서 확인할 수 있다.
본 발명의 CD38BP, 특히 항-CD38 항체는 CD38 내에 적어도 부분적으로 포함된 1개 이상의 에피토프에 대한 친화력이 약 104 내지 약 1010 M-1의 범위일 수 있다. 본원에서의 용어 면역반응은 해리 상수 Kd가 약 10-4 M 미만인 CD38 에피토프에 대한 CD38BP의 결합을 지칭한다.
CD38BP는 CD38에 대해 적어도 -003 및 -005 및 -024만큼 큰 친화력을 가질 수 있고, 일부 실시양태에서는 적어도 거의 -003 및 -005 및 -024만큼 큰 친화력을 가질 수 있다. 친화력은 본원의 다른 곳에서 기술된 임의의 방법 또는 당업계에 공지된 등가물에 의해 결정될 수 있다. 친화력을 결정하는데 사용될 수 있는 한 방법의 예가 [Scatchard analysis of Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980)]에서 제공된다. 결합 친화력은 평형 방법 (예를 들어 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 또는 방사선면역분석법 (RIA)) 또는 키네틱 분석법 (예를 들어 BIACORE™ 분석법)에 의해 또한 결정될 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체에 대한 해리 상수는 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 약 0.1 nM 이하, 약 0.01 nM 이하, 또는 심지어 약 0.001 nM 이하이다.
본 발명의 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체는 -003 및 -005 및 -024와 유사한 기능 특성을 나타낼 수 있고, 예컨대 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개 세포독성 (CDC) 분석법에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 5500362 참조).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 CD38의 작동자가 아니라, CD38의 길항제로서 작용한다. CD38의 작동제는 CD38에 속하는 1가지 이상의 기능을 활성화시키는 분자이다. 이같은 기능은 부착 및 신호전달 이벤트에서의 수용체 매개 및 (외부-) 효소 활성을 포함할 수 있다. 또한, 외부효소로서, CD38는 NAD+를 고리형 ADP-리보스 (cADPR) 및 ADPR, 뿐만 아니라 니코틴아미드 및 니코틴산-아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NAADP)의 형성을 위한 기질로서 사용한다. cADPR은 소포체로부터의 Ca2 + 동원에 대한 2차 전령으로 작용하는 것으로 나타났다. Ca2 +를 통한 신호전달에 더하여, CD38 신호전달은 T 및 B 세포 상의 항원-수용체 복합체 또는 또다른 유형의 수용체 복합체, 예를 들어 MHC 분자와의 혼선을 통해 발생하고, 이러한 방식으로 여러 세포 응답에 수반되고, 또한 IgG1의 스위칭 및 분비에 수반된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 PBMC의 현저한 증식을 유도하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 현저한 수준의 IL-6 방출을 유도하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 검출가능한 수준의 IFN-γ 방출을 유도하지 않는다. 이같은 분석은 [Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000)]에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다.
본 발명의 항-CD38 항체, 뿐만 아니라 본 발명의 기타 CD38BP는 임의의 적절한 유형의 세포 또는 동물에서의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다.
재조합 CD38BP, 예컨대 재조합 항체, 예컨대 재조합 인간 항체는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 CD38BP, 예컨대 항체, 예컨대 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 CD38BP, 예컨대 항체, 예컨대 인간 항체를 포함한다.
재조합 항체, 예컨대 재조합 인간 항체는 조합형 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 동물, 예컨대 트랜스제닉 동물로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린-코딩 핵산 서열이 인간 면역글로불린-코딩 핵산 및 인간 면역글로불린-코딩 유전자에 대해 외인성인 또다른 핵산 서열로 스플라이싱되는 것을 수반하는 임의의 또다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 또한 포함한다. 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 전형적으로 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이같은 재조합 인간 항체에 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용된 경우에는, 생체내 체세포 돌연변이유발)이 이루어질 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열일 수 있다. 인간 항체의 두가지 유형 모두 본 발명에 의해 제공된다.
재조합 단백질 생산에 적절한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 [Sambrook and Russell (eds.), Molecular cloning, third edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA]를 참조한다.
또한, 항체 생산에 적절한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988)], [Harlow and Lane: Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999))], 미국 특허 4,376,110 및 [Ausubel et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley InterScience N.Y., (1987, 1992)]에 기술된 것들이 포함된다. 모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여, 또는 기타 주지된, 후속 개발된 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)] 참조). 본 발명의 항-CD38 항체의 생산에 유용한 하이브리도마가 또한 본 발명에 의해 제공된다. 이같은 하이브리도마는 임의의 적절한 유형의 골수종, 헤테로골수종, 포블라스토이드(phoblastoid) 세포, 형질세포종 또는 기타 이의 등가물 및 임의의 적절한 유형의 항체-발현 세포를 사용하여 화학적 융합, 전기적 융합, 또는 임의의 적절한 기술에 의해 형성될 수 있다. 형질전환된 무한증식 B 세포가 본 발명의 항체를 효율적으로 생산하는데 또한 사용될 수 있고, 본 발명에 의해 또한 제공된다. 이같은 세포는 표준 기술, 예컨대 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 또는 형질전환 유전자로의 형질전환에 의해 생산될 수 있다. (예를 들어, ["Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity," Zurawaki, V. R. et al., Monoclonal Antibodies, Kennett R. H. et al. eds., Plenum Press, N.Y. 1980, pp 19-33] 참조). 따라서, 안정적 및 연속적이고/이거나 무한증식되는 항-CD38 항체 발현 세포 및 세포주는 본 발명의 양상이다. CD38BP-코딩 또는 CD38BP-단편-코딩 핵산을 포함하는 진핵생물 및 원핵생물 세포 (예를 들어, 효모 세포, 연속적이고/이거나 무한증식되는 포유류 세포주 (예를 들어, 림프구 항체-생산 세포 유래 세포주), 식물 세포, 곤충 세포, 및 박테리아 세포 예컨대 대장균 세포 등)가 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명의 인간 항-CD38 항체를 발현하는 트랜스제닉 동물, 예컨대 비-인간 영장류, 설치류 (예를 들어, 햄스터, 기니 피그, 및 래트 (이의 변형 균주 예컨대 중증 복합형 면역결핍 (SCID) 마우스 및 기타 면역손상 동물 균주 포함)), 개 등이 또한 본 발명에 의해 제공된다.
CD38BP를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 재조합 세포가 임의의 적절한 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 인산칼슘-침전 촉진 형질감염, 수용체-매개 표적화 및 형질감염, 생탄도(biolistic) 전달, 전기천공, 덱스트란-매개 형질감염, 리포솜-매개 형질전환, 원형질체 융합, 직접적인 미세주사 등에 의해 세포 내로 전달되는 CD38BP-코딩 서열 (또는 서열들)을 포함하는 네이키드 DNA 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 침습성 박테리아 세포 벡터 또는 기타 전체 세포 벡터 등으로의 형질감염/형질전환). 세포의 형질전환/형질감염 방법은 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2d Edition, 1989 및 3rd Edition, 2001)] 및 [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)] 참조). 이같은 재조합 세포는 본 발명의 양상이다.
재조합 단백질 발현에 숙주로 이용가능한 세포주는 당업계에 주지되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 입수가능한 다수의 무한증식 세포주가 포함된다. 특히, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, 헬라(HeLa) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 및 다수의 기타 세포주가 포함된다. 사용될 수 있는 또다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 세포이다. 단백질, 예컨대 CD38BP (항-CD38 항체 포함)을 코딩하는 핵산 (또는 핵산-함유 벡터)가 포유류 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 단백질, 예컨대 CD38BP가 숙주 세포 내에서 발현되도록 하거나 단백질, 예컨대 CD38BP이 숙주 세포가 배양되는 배양 배지 내로 분비되도록 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 단백질, 예컨대 CD38BP가 생산될 수 있다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 CD38BP를 회수할 수 있다. 분비 신호 없이 직접적으로 발현되는 경우 숙주 세포 용해물로부터 CD38BP를 또한 회수할 수 있다.
CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체를 박테리아 세포 및 진핵생물 단세포 미생물, 예컨대 효모에서 또한 생산할 수 있다. 박테리아 세포에서 생산된 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체에는 전형적으로 정상적인 글리코실화가 결여되고, 따라서 박테리아 세포에서 생산된 항-CD38 항체는 포유류 세포 및/또는 동물에서 생산된 항-CD38 항체와 관련된 ADCC 기능 및 기타 양상의 면역 응답 (예를 들어, NK 세포의 고용)의 관점에서 다소 부족할 수 있다. 효모 세포에서 생산된 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체는 포유류 세포에서 생산된 항체와 상이한 유형의 글리코실화 패턴을 정상적으로 나타낸다. 그러나, 효과적으로 글리코실화된 항체를 효모에서 생산하기 위한 방법이 Glycofi, Inc. (Lebanon, NH, USA)와 같은 회사에 의해 현재 개발 중이다. [Wildt S et al., Nat Rev Microbiol. 3(2), 119-28 (2005)]를 또한 참조.
CD38BP 유전자 (항-CD38 항체 유전자 포함)를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입되는 경우, CD38BP는 CD38BP가 숙주 세포 내에서 발현되도록 하거나 항체가 숙주 세포가 배양되는 배양 배지 내로 분비되도록 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 세포 배양물, 세포 용해물 및 동물 (예를 들어, 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물의 복수액)으로부터 항체 및 기타 CD38BP를 정제하는 것은 면역친화성 컬럼 정제; 술페이트 침전, 크로마토포커싱(chromatofocusing); 정제용 SDS-PAGE 등이 예를 들어 포함되는 당업계에 공지된 임의의 다수의 적절한 기술을 적용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어, [Kohler and Milstein, Nature 256, 495 (1975)]의 표준 체세포 혼성화 기술이 포함되는 다양한 기타 기술에 의해 또한 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 또다른 기술, 예를 들어 인간 항체 유전자의 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 기술을 또한 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD38 항체는 마우스 시스템에서 생성된 하이브리도마를 사용하여 생산된다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 융합용 면역화 비장세포의 단리를 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 마우스 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.
CD38에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생성시키기 위해, 예를 들어, [Lonberg et al., (1994), 상기 문헌], [Fishwild et al., (1996), 상기 문헌], 및 WO 98/24884에 기술된 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자 (예를 들어, HCo12, HCo7 또는 KM 마우스)를 함유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 CD38를 발현하는 세포 및/또는 CD38 항원의 강화 제제로 면역화시킬 수 있다. 별법적으로, 마우스를 인간 CD38을 코딩하는 마우스로 면역화시킬 수 있다. 최초 주입 시 마우스는 6-16주령일 수 있다. 예를 들어, CD38 항원의 강화 제제 (5-50 ㎍)를 사용하여 HuMAb 마우스를 복강내 면역화시킬 수 있다. CD38 항원의 정제 또는 강화 제제를 사용하는 면역화로 항체가 초래되지 않는 경우, CD38를 발현하는 세포, 예를 들어, 세포주로 마우스를 또한 면역화시켜 면역 응답을 촉진할 수 있다.
다양한 항원으로의 축적된 경험은 먼저 완전 프로인트 애쥬번트(adjuvant) 내의 CD38 발현 세포로 복강내 (i.p.) 또는 피하 (s.c.) 면역화된 후, PBS 내의 CD38 발현 세포로 격주로 i.p. 면역화 (총 10회 이하)될 때 HuMAb 트랜스제닉 마우스가 가장 양호하게 응답한다는 것을 나타냈다. 안와후방 출혈에 의해 수득되는 혈장 샘플로 면역화 프로토콜의 진행에 걸쳐 면역 응답을 모니터링할 수 있다. 혈장을 FACS 분석에 의해 스크리닝할 수 있고, 항-CD38 인간 면역글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 희생 및 비장을 제거하기 예를 들어 4일 및 3일 전에 마우스를 CD38 발현 세포로 정맥내로 부스팅(boosting)시킬 수 있다.
인간 CD38에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성시키기 위해, 면역화된 동물로부터의 비장세포 및 림프절 세포를 단리하고, 적합한 무한증식 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 그 후, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50％ PEG (w/v)로 SP2/0 비-분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581)에 융합시킬 수 있다. 세포를 약 1×105개/웰로 편평 바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅한 후, 통상적인 시약 이외에 10％ 태아 클론 혈청, 5-10％ 오리겐 하이브리도마 클로닝 인자 (IGEN) 및 1×HAT (Sigma)를 함유하는 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 약 2주 후, HAT를 HT로 바꾼 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 그 후, 각각의 웰을 ELISA에 의해 인간 카파-경쇄 함유 항체에 대해, 그리고 CD38 특이성에 대해 CD38 발현 세포를 사용하여 FACS 분석에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 발생하면, 일반적으로 10-14일 후 배지를 관찰할 수 있다다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하여 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성이면, 항-CD38 모노클로날 항체를 한계 희석법에 의해 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 후, 안정적인 서브클론을 시험관내에서 배양하여, 특성화를 위해 조직 배양 배지 내의 항체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 당업계에 주지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 예를 들어 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 또한 생산될 수 있다. 예를 들어 [Morrison, S., Science 229, 1202 (1985)] 참조.
예를 들어, 항체, 또는 이의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분적인 경쇄 및 중쇄 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자생물학 기술 (예를 들어 PCR 증폭, 부위 지정 돌연변이유발)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 나타내도록 항체 유전자가 벡터 내로 결찰되는 것을 의미하도록 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 더욱 전형적으로는 양쪽 모두의 유전자가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 이들을 원하는 이소타입의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 VH 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내의 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 삽입함으로써 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 생성시키는데 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 별법적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인프레임(in-frame)으로 연결되도록 항체 사슬 유전자가 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 항체 사슬 유전자가 발현되도록 하고 이를 제어하는 조절 서열을 보유한다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예컨대 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 선별가능 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예를 들어 미국 특허 4,399,216, 미국 특허 4,634,665 및 미국 특허 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별가능 마커 유전자는 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여한다. 선별가능 마커 유전자의 예로는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr-숙주 세포에서 사용) 및 neo 유전자 (G418 선별용)가 포함된다.
경쇄 및 중쇄, 발현 벡터(들)의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)을 표준 절차에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물, 예컨대 포유류, 숙주 세포일 수 있다. 예를 들어 항원 결합 단편이 진핵생물 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 전장 항체가 진핵생물 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 진핵생물 세포, 예컨대 포유류 숙주 세포에서 발현된다. 본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유류 숙주 세포의 예로는 CHO 세포 (예를 들어 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp, Mol. Biol. 159, 601-621 (1982)]에 기술된 바와 같이, DHFR 선별가능 마커와 함께 사용되는, [Urlaub and Chasin, PNAS USA 77, 4216-4220 (1980)]에 기술된 dhfr-CHO 세포 포함), NS/0 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포 및 SP2.0 세포가 포함된다. 특히 NS/O 골수종 세포와 함께 사용하기 위해, 발현 시스템의 또다른 예는 WO87/04462, WO89/01036 및 EP338 841에 기술된 GS (글루타민 합성효소) 유전자 발현 시스템이다.
CD38BP 유전자는 원핵생물 세포, 예컨대 미생물, 예를 들어 scFv 항체 생산용 대장균, 조류, 뿐만 아니라 곤충 세포가 포함되는 또다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, CD38BP는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예컨대 양 및 토끼로부터의 유액 또는 암탉으로부터의 알에서 생산될 수 있다. 예를 들어 [Verma, R. et al., J.Immunol.Meth. 216, 165-181 (1998)], [Pollock et al., J.Immunol.Meth. 231, 147-157 (1999)] 및 [Fischer, R. et al., Biol.Chem. 380, 825-839 (1999)] 참조.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이성 CD38BP는 화학 기술 (예를 들어 [D. M. Kranz et al., PNAS USA 78, 5807 (1981)] 참조), "폴리도마(polydoma)" 기술 (미국 특허 4,474,893 참조) 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 및 Fab' 단편의 연결이 포함되는 다양한 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321 (1990)] 및 [Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)] 참조). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 특징으로 하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (예를 들어 [Milstein and Cuello, Nature 305, 537 (1983)] 참조). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))들은 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산하고, 이중 오직 1개만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
여러 접근법에 따라, 원하는 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 재조합 또는 합성 방법에 의해 면역글로불린 불변 도메인에 융합된다. 전형적으로 가변 도메인 서열은 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인에 융합된다. 또한 전형적으로, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 1개 이상의 융합 펩티드에 또한 존재한다. 이러한 유형의 접근법의 더욱 특정한 예에서, 한쪽 팔에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄를, 또다른쪽 팔에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공)을 포함하는 이중특이적 항체가 생산된다. 이같은 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 바람직한 이중특이적 화합물을 분리하는 것을 용이하게 할 수 있다 (이같은 접근법은 WO 94/04690에 기술되어 있다). 이중특이적 항체 생성의 추가적인 상세한 설명에 대해서는, 예를 들어, [Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986)] 참조.
또다른 접근법에서, 한 쌍의 항체 분자 간의 계면이 이중특이적 항체 분자의 집단을 형성하도록 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로이량체의 백분율을 최대화시키도록 조작될 수 있다. 전형적으로, 이같은 계면은 항체 불변 영역의 CH3 도메인의 적어도 일부분을 포함한다. 일반적으로 이같은 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 더 작은 아미노산 측쇄를 갖는 1개 이상의 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄 잔기를 더 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 큰 측쇄 아미노산 잔기(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 구성요소 결합 특이성, 예를 들어, 항-FcR 및 항-CD38 결합 특이성을 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각각의 결합 특이성이 별도로 생성된 후, 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 가교제가 공유결합 접합에 사용될 수 있다. 가교제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)가 포함된다. 예를 들어 [Karpovsky et al., J. Exp. Med. 160, 1686 (1984)], [Liu, M. A. et al., PNAS USA 82, 8648 (1985)] 참조. 또다른 예에서, [Brennan et al., Science 229, 81 (1985)]에는 무손상 항체가 단백질용해적으로 절단되어 F(ab')2 단편이 생성되는 절차가 기술되어 있다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992)]에는 관련된 기술에 따른 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기술되어 있다. 기타 방법에는 [Paulus (Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132 (1985))] 및 [Glennie et al., J. Immunol. 139, 2367-2375 (1987)]에 기술된 것들이 포함된다. 접합제의 예는 SATA 및 술포-SMCC이고, 모두 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)로부터 입수가능하다.
결합 특이성이 항체인 경우, 이는 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수 개의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개를 함유하도록 변형된다.
별법적으로, 양쪽 결합 특이성 모두 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포 내에서 발현 및 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 mAb×mAb, mAb×Fab, Fab×F(ab')2 또는 리간드×Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어, 이중특이적 분자는 단일쇄 분자, 예컨대 단일쇄 이중특이적 항체, 단일쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 단일쇄 분자일 수 있거나 또는 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자의 제조 방법이 예를 들어 미국 특허 5,260,203, 미국 특허 5,455,030, 미국 특허 4,881,175, 미국 특허 5,132,405, 미국 특허 5,091,513, 미국 특허 5,476,786, 미국 특허 5,013,653, 미국 특허 5,258,498 및 미국 특허 5,482,858에 기술되어 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다 ([Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992)] 참조). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결하고, 생성된 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시키고, 단량체를 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성시킬 수 있다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. [Hollinger et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993))]에 기술된 "디아바디" 기술이 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메카니즘을 또한 제공한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다. 예를 들어 [Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994)] 참조.
또한, 이중특이적 항체는 "디아바디" ([Holliger et al., PNAS USA, 90, 6444-6448 (1993)]) 또는 "야누신(Janusin)" ([Traunecker et al., EMBO J 10, 3655-3659 (1991)] 및 [Traunecker et al., Int J Cancer Suppl 7, 51-52 (1992)])으로서 형성될 수 있다. 이중특이적 항체는, 정의에 따라, 단일 결합 부위를 갖는 단편 (예를 들어, 본 발명에 의해 또한 제공되는 Fab, Fab', 및 Fv 단편)의 형태로 존재하지 않는다.
특정 표적에 대한 이중특이적 및 다중특이적 분자의 결합은 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사선면역분석법 (RIA), FACS 분석법, 생물학적 분석법 (예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이러한 분석법은 당해 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용함으로써 특정한 당해 단백질-항체 복합체의 존재를 일반적으로 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 항체-FcR 복합체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 예를 들어 사용하여 검출할 수 있다. 별법적으로, 임의의 다양한 기타 면역분석법을 사용하여 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사선으로 표지시키고, 방사선면역분석법 (RIA)에서 사용할 수 있다 (예를 들어, [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). γ 카운터 또는 섬광 카운터의 사용과 같은 수단에 의해 또는 오토라디오그래피에 의해 방사성 동위원소를 검출할 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 본 발명은 -003 또는 -005 또는 -024의 CDR 영역과 동일하거나 이로부터 유래된 CDR 영역을 갖는 항체를 제공한다. 이같은 항체는 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그래프트된 -003 또는 -005 또는 -024로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 생성될 수 있다
이같은 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이타베이스로부터 수득할 수 있다. 이러한 생식계열 서열은 B 세포 성숙 동안 V(D)J 연결에 의해 형성되는 완전히 조립된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문에 성숙형 항체 유전자 서열과 다를 것이다. 생식계열 유전자 서열은 가변 유전자 전반에 걸친, 그러나 전형적으로 CDR 내에 군집된 돌연변이를 함유하는 고친화력 2차 레퍼토리 항체의 서열과 또한 상이할 것이다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노 말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에서는 비교적 드물다. 이러한 이유로, 원래의 항체와 유사한 결합 성질을 갖는 무손상 재조합 항체를 재생성시키기 위해서 특정 항체의 전체 DNA 서열을 수득할 필요가 없다 (WO 99/45962 참조). CDR 영역에 스패닝되어 있는 부분적인 중쇄 및 경쇄 서열이 전형적으로 이러한 목적에 충분하다. 부분적인 서열은 어떤 생식계열 가변 및 연결 유전자 절편이 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는지를 결정하는데 사용된다. 그 후, 가변 영역의 결손 부분을 채우는데 생식계열 서열이 사용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안 절단되고, 최종 항체의 성질에 기여하지 않는다. 결손 서열을 부가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열이 결찰 또는 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 조합될 수 있다. 별법적으로, 전체 가변 영역이 짧고 중첩되는 올리고뉴클레오티드들의 셋트로 합성되고 PCR 증폭에 의해 조합되어, 전체적으로 합성형인 가변 영역 클론이 생성될 수 있다. 이러한 방법은 특정 제한 부위의 제거 또는 포함, 또는 특정 코돈의 최적화와 같은 소정의 장점을 갖는다.
중첩되는 합성 올리고뉴클레오티드 셋트를 디자인하여 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩 능력을 갖는 합성 V 서열을 생성시키기 위해 하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사물의 뉴클레오티드 서열이 사용된다. 합성 중쇄 및 카파 사슬 서열은 3가지 방식에서 천연 서열과 상이할 수 있다; 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 하기 위해 반복된 뉴클레오티드 염기의 스트링(string)의 중단되고; 코작의 법칙(Kozak's rules) ([Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991)])에 따라 최적 번역 개시 부위가 혼입되고; 번역 개시 부위의 상류에서 HindIII 부위가 조작된다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 모두에 대해, 최적화된 코딩 가닥 및 상응하는 비-코딩 가닥 서열은 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중앙점에서 30-50개의 뉴클레오티드로 절단된다. 따라서, 각 사슬에 대해, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 150-400개의 절편에 스패닝되는 중첩되는 이중 가닥 셋트로 조립될 수 있다. 그 후, 풀이 주형으로 사용되어, 뉴클레오티드 150-400개의 PCR 증폭 생성물이 생산된다. 전형적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 셋트는 2개의 풀로 절단될 것이고, 이들이 별도로 증폭되어 2개의 중첩 PCR 생성물이 생성된다. 그 후, 이러한 중첩 생성물들이 PCR 증폭에 의해 조합되어, 완전한 가변 영역이 형성된다. 또한, 발현 벡터 구축물 내로 용이하게 클로닝될 수 있는 단편이 생성되도록 PCR 증폭에서 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 (카파 경쇄의 BbsI 부위, 또는 감마 중쇄의 AgeI 부위 포함)의 중첩 단편을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
그 후, 재구축된 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 클로닝된 프로모터 서열, 리더 서열, 번역 개시 서열, 불변 영역 서열, 3' 비번역 서열, 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결 서열과 조합되어 발현 벡터 구축물이 형성된다. 중쇄 및 경쇄 발현 구축물은 단일 벡터 내로 조합되거나, 또는 숙주 세포 내로 공동-형질감염, 연속-형질감염 또는 별도-형질감염될 수 있고, 그 후 융합되어 양쪽 사슬 모두를 발현하는 숙주 세포가 형성된다.
신규 항원-특이성을 기존의 성숙 항체에 그래프트하기 위해 유사한 절차를 따를 수 있다. 전형적으로, CDR-공여체 항체와 동일한 가변 생식계열 유전자로부터 유래된 수용체 항체가 선택되지만, 다른 수용체 항체가 또한 선택될 수 있다. 그 후, 공여체 항체로부터의 1개 이상의 CDR이 상기 기술된 방법을 사용하여 이전된다.
본 발명의 한 실시양태에서, -003 및 -005 및 -024의 구조적 특색이 사용되어, -003 및 -005 및 -024의 1가지 이상의 기능적 성질, 즉 CD38에 대한 결합이 유지된, 구조적으로 관련된 항-CD38 항체, 예를 들어 인간 항-CD38 항체가 생성된다. 더욱 특히, -003 또는 -005 및 -024의 1개 이상의 CDR 영역이 공지된 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합에 의해 조합되어, 본 발명의 추가적인 재조합-조작 인간 항-CD38 항체가 생성될 수 있다.
인간 IgGκ에 대한 발현 벡터의 구축에서 사용하기 위한 대표적인 플라스미드가 하기에 기술된다. 플라스미드는 PCR 증폭된 V 카파 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 완전한 중쇄 및 경쇄 미니유전자를 재구축하는데 사용될 수 있도록 구축되었다. 이러한 플라스미드는 완전한 인간 IgG1,κ 또는 IgG4,κ 항체를 발현시키는데 사용될 수 있다. 유사한 플라스미드가 다른 중쇄 이소타입의 발현을 위해, 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 구축될 수 있다.
다수의 상이한 방식으로 본 발명의 CD38BP, 예컨대 본 발명의 인간 항-CD38잔기 항체를 단리하여 특징을 규명할 수 있다. 예를 들어, 선택된 하이브리도마가 모노클로날 항체 정제를 위해 적절한 플라스크에서 성장될 수 있다. 그 후, 상청액을 여과하고 농축한 후, 단백질 A-세파로스 (IgG1 이소타입 항체용) (Pharmacia, Piscataway, NJ), 또는 IgG3 이소타입 항체의 경우 항-인간 IgG 코팅 세파로스 또는 단백질 G-세파로스를 사용하는 친화 크로마토그래피를 실행할 수 있다. 용출된 IgG를 젤 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 점검하여 순도를 확실하게 할 수 있다. 완충액을 PBS로 교환할 수 있고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체가 분취되어 -80℃에서 저장될 수 있다.
선택된 CD38BP, 예컨대 인간 항-CD38 모노클로날 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 부위 지정 또는 다중 부위 지정 돌연변이유발을 사용할 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 미량역가 플레이트의 웰이 4℃에서 하룻밤 동안 10 ㎍/㎖의 항-인간 Ig로 코팅될 수 있다. 5％ BSA (소 혈청 알부민)로의 차단 후, 플레이트가 10 ㎍/㎖의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 주위 온도에서 2시간 동안 반응된다. 이어서, 웰이 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, IgE, IgAI, IgA2, 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합 프로브와 반응될 수 있다. 세정 후, pNPP 기질 (1 mg/㎖)로 플레이트가 현상되고, 405 nm의 OD에서 분석된다.
면역화된 마우스의 혈청 내의 항-CD38 항체의 존재 또는 CD38을 발현하는 살아 있는 세포에 대한 CD38BP (항-CD38 항체 포함)의 결합을 결정하기 위해, 유동 세포측정법을 사용할 수 있다. 간략하게, CD38을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장됨)를 0.1％ BSA 및 0.02％ 아지드화나트륨을 함유하는 PBS 내의 다양한 농도의 CD38BP와 혼합하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세정 후, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 단일한 살아 있는 세포 상에서 게이팅(gating)하기 위해 광 및 측면 산란 성질을 사용하여 유동 세포측정기 (예를 들어, Becton Dickinson FACS 기기)로 유동 세포측정법에 의해 샘플을 분석할 수 있다. 형광 현미경검사를 사용하는 별법적인 분석법이 유동 세포측정 분석법에 더하여 또는 유동 세포측정 분석법 대신 사용될 수 있다. 세포가 상기 기술된 바와 같이 정확하게 염색되어, 형광 현미경검사에 의해 검사될 수 있다. 이러한 방법은 개별적인 세포들이 가시화되도록 하지만, 항원의 밀도에 따라 감도가 감소될 수 있다.
CD38BP, 예컨대 항-CD38 인간 IgG를 웨스턴 블롯팅에 의해 CD38 항원과의 반응성에 대해 추가로 테스트할 수 있다. 간략하게, CD38을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제공하고, 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원들을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 20％ 탈지유로 차단하고, 테스트할 CD38BP로 프로빙한다. 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 인간 IgG 결합을 검출할 수 있고, BCIP/NBT 기질 정제 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)로 현상할 수 있으며, CD38BP의 또다른 특이적 부분에 대해 지시된 검출제를 또한 사용할 수 있다.
CD38에 대한 결합 특이성에 더하여, CD38BP (인간 항-CD38 항체 포함)를 CD38를 발현하는 세포의 다양한 활성, 예컨대 인슐린 생산, Ca2 + 방출, 사이토카인 생산, 용해 유도, 분화 및 증식 (이에 한정되지 않음)을 억제하는 능력에 대해 테스트할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 마우스가 CD38을 발현하는 세포로 면역화되었을 때 인간 항-CD38 항체를 생산하도록 인간 중쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 제공한다. 인간 중쇄 트랜스진은 본원에 상세하게 기술된 바와 같이, 트랜스제닉 마우스, 예를 들어 HuMAb 마우스의 경우와 같이, 마우스의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 별법적으로, 인간 중쇄 트랜스진은 WO 02/43478에 기술된 바와 같이, 트랜스크로모조멀 (예를 들어, KM) 마우스의 경우와 같이, 염색체외부에 유지될 수 있다. 이같은 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 동물은 V-D-J/V-J 재조합 및 이소타입 스위칭을 겪음으로써, CD38에 대한 여러 이소타입의 인간 모노클로날 항체 (예를 들어 IgG, IgA 및/또는 IgE)를 생산할 수 있다. 이종 항체 레퍼토리로의 외래 항원 자극에 대해 응답하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비-인간 동물의 디자인은 트랜스제닉 동물 내에 함유된 이종 면역글로불린 트랜스진이 B-세포 발달 경로 전반에 걸쳐 정확하게 기능하는 것을 필요로 한다. 이는, 예를 들어, 이종 중쇄 트랜스진의 이소타입 스위칭을 포함한다. 따라서, 트랜스진은 이소타입 전환 및 항체 유전자의 1가지 이상의 하기 특성이 유도될 수 있도록 구축된다: (1) 높은 수준의 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능적 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 대립유전자 배제에 대한 응답, (4) 충분한 1차 레퍼토리의 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과다돌연변이, 및 (7) 면역 응답 동안 트랜스진 항체 좌위의 우세.
상기 기준 모두가 충족될 필요는 없다. 예를 들어, 트랜스제닉 동물의 내인성 면역글로불린 좌위가 기능적으로 파괴된 실시양태에서, 트랜스진은 대립유전자 배제를 활성화할 필요가 없다. 또한, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 유전자를 포함하는 실시양태에서, 적어도 이미 재배열된 트랜스진에 대해서, 기능적 유전자 재배열의 두번째 기준이 불필요하다. 분자 면역학에 대한 배경을 위해서, [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.] 참조.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생성시키는데 사용된 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비-인간 동물은 트랜스제닉 동물의 생식계열 내에 재배열된 이종 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 또는 이들의 조합을 함유한다. 각각의 중쇄 트랜스진은 1개 이상의 CH 유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 기능성 이소타입 스위치 서열을 포함할 수 있고, 이는 트랜스제닉 동물의 B-세포에서 다중 CH 유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 이소타입 스위칭을 지지할 수 있다. 이같은 스위치 서열은 트랜스진 CH 유전자의 공급원 역할을 하는 종으로부터의 생식계열 면역글로불린 좌위에서 천연적으로 발생하는 것들일 수 있거나, 또는 이같은 스위치 서열은 트랜스진 구축물을 수용할 종 (트랜스제닉 동물)에서 발생하는 것들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스 생산에 사용되는 인간 트랜스진 구축물에 마우스 중쇄 좌위에서 천연적으로 발생하는 것과 유사한 스위치 서열이 혼입된 경우, 이러한 구축물에서 더욱 높은 빈도로 이소타입 스위칭 이벤트가 일어날 수 있는데, 이는 아마도 마우스 스위치 서열은 마우스 스위치 재조합효소 시스템과 함께 작동되도록 최적화되어 있는 반면, 인간 스위치 서열의 경우에는 그렇지 않기 때문일 것이다. 스위치 서열은 통상적인 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝될 수 있거나, 또는 면역글로불린 스위치 영역 서열에 대한 공개된 서열 정보를 기초로 디자인된, 중첩되는 합성 올리고뉴클레오티드로부터 신생으로 합성될 수 있다 ([Mills et al., Nucl. Acids Res. 15, 7305-7316 (1991)], [Sideras et al., Intl. Immunol. 1, 631-642 (1989)]). 각각의 상기 트랜스제닉 동물에 대해, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 상당한 분획 (10％ 이상)의 B 세포에서 발견된다.
본 발명의 트랜스제닉 비-인간 동물을 생성시키는데 사용되는 트랜스진은 1개 이상의 가변 유전자 절편, 1개의 다양성(diversity) 유전자 절편, 1개의 연결 유전자 절편 및 1개 이상의 불변 영역 유전자 절편을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 포함한다. 면역글로불린 경쇄 트랜스진은 1개 이상의 가변 유전자 절편, 1개의 연결 유전자 절편 및 1개 이상의 불변 영역 유전자 절편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 유전자 절편을 코딩하는 유전자 절편은, 트랜스제닉 비-인간 동물로 구성되지 않은 종으로부터 수득된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 절편을 코딩하는 DNA로부터 유래하거나 이러한 DNA에 상응한다는 점에서, 트랜스제닉 동물에 대하여 이종성이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 트랜스진은 개별적인 유전자 절편들이 재배열되지 않도록, 즉 기능성 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않게끔 구축된다. 이같은 재배열되지 않은 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 절편의 재조합 (기능적 재배열)을 지지하고, CD38 항원에 노출되는 경우 트랜스제닉 동물에서 생성된 재배열된 면역글로불린 중쇄 내에 D 영역 유전자 절편의 전부 또는 일부분이 혼입되는 것을 지지할 수 있다.
별법적인 실시양태에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니좌위"를 포함한다. 이같은 트랜스진은 C, D 및 J 절편의 실질적인 부분뿐만 아니라 V 유전자 절편의 하위군을 전형적으로 포함한다. 이같은 트랜스진 구축물에서, 다양한 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 클래스 스위치 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스 공여자 및 스플라이스-수용자 서열, 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유래된 상응하는 서열을 포함한다. 이같은 조절 서열은 본 발명에서 사용된 비-인간 동물의 동일하거나 관련된 종으로부터의 트랜스진 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자 절편들이 트랜스제닉 마우스에서 사용하기 위한 설치류 면역글로불린 인핸서 서열을 갖는 트랜스진에서 조합될 수 있다. 별법적으로, 합성 조절 서열이 트랜스진에 혼입될 수 있고, 이때 이같은 합성 조절 서열은 포유류의 게놈에서 천연적으로 발생하는 것으로 공지된 기능적 DNA 서열에 대해 상동성이 아니다. 합성 조절 서열은 컨센서스 규칙, 예를 들어, 스플라이스-수용자 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용되는 서열을 특정화하는 규칙에 따라 디자인된다. 예를 들어, 미니좌위는, 천연 생식계열 Ig 좌위와 비교하여, 비필수 DNA 부분 (예를 들어, 개재(intervening) 서열; 인트론 또는 이의 일부)이 1개 이상 내부 결실 (즉, 말단에서 결실되지 않음)된 게놈 면역글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
바람직한 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 비-인간 동물, 예를 들어 마우스는 현저한 레퍼토리, 이상적으로는 부피 조정 후 인간과 실질적으로 유사한 레퍼토리로 면역글로불린 생산을 나타낼 것이다.
이상적으로는 레퍼토리는, 일반적으로 약 10％ 이상, 예컨대 25 내지 50％ 이상의 다양성과 함께, 부피를 조정했을 때 인간에서 나타나는 것과 비슷할 것이다. 일반적으로, 마우스 게놈 내로 도입되고, V(-D-)J 유전자 절편 재배열 및 연결 영역에서의 무작위 뉴클레오티드 부가에 의해 생성된 부가적인 다양성에 의해 구동되는 상이한 V, J 및 D 영역의 수에 따라, 약 1,000개 이상의 상이한 면역글로불린 (이상적으로는 IgG), 예컨대 104 내지 106개 이상의 상이한 면역글로불린이 생산될 것이다. 전형적으로, 면역글로불린은 소정의 항원에 대하여 약 10-8 M 미만, 예컨대 10-9 M, 10-10 M 또는 10-11 M 미만, 심지어 이보다 낮은 친화력 (KD)을 나타낼 것이다. 상기 기술된 바와 같은 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 비-인간 동물, 예를 들어 마우스가, 예를 들어, CD38을 발현하는 세포로 면역화될 수 있다. 별법적으로, 트랜스제닉 동물이 인간 CD38을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 그러면, 동물은 스위치 재조합 (시스-스위칭)을 통해 클래스-스위칭을 거쳐 CD38에 반응성인 면역글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되는 인간 항체 ("인간 서열 항체"로 또한 지칭됨)일 것이며, 이는 체세포 돌연변이 및 V 영역 재조합 연결에 의해 유도되는 서열, 뿐만 아니라 생식계열-코딩 서열을 포함할 수 있다; 이러한 인간 항체는, 체세포 돌연변이 및 상이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 또다른 비-생식계열 서열이 존재할 수 있을지라도, 인간 VL 및 JL 또는 VH, DH 및 JH 유전자 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 지칭될 수 있다. 각 항체 사슬의 가변 영역은 통상적으로 인간 생식계열 V 및 J 유전자 절편과, 그리고 중쇄의 경우에는 인간 생식계열 V, D 및 J 유전자 절편과 80％ 이상 유사하고; 종종 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식계열 서열과 85％ 이상 유사하며; 흔히 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식계열 서열과 90 또는 95％ 이상 유사하다. 그러나, 비-생식계열 서열은 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 마우스의 생식계열 내의 인간 트랜스진(들) 내에서 발견되는 인간 V, D 또는 J 유전자 절편에 의해 코딩되지 않는 약간의 가변 영역 서열을 종종 가질 것이다. 전형적으로, 이같은 비-생식계열 서열 (또는 개별적인 뉴클레오티드 위치)은 CDR 내 또는 그 근처에, 또는 체세포 돌연변이가 군집되는 것으로 공지된 영역 내에 군집될 것이다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비-인간 동물로부터 유래된 B 세포를 또한 제공한다. B 세포는 인간 CD38에 높은 친화력 (예를 들어 10-8 M 미만의 해리 평형 상수 (KD))으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마를 생성시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 방사선 표지된 모노클로날 항체를 사용하는 CD38 발현 세포의 스캐차드(scatchard) 분석에 의해 또는 FACS 분석을 사용하는 1/2-최대 결합 농도의 결정에 의해, 또는 BIAcore 장치 상에서 측정되는 바와 같이 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 분석에 의해 결정되는 경우 친화력 (KD)이 10-8 M 미만, 예컨대 10-9 M, 10-10 M 또는 10-11 M 미만이거나 또는 심지어 이보다 낮은 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
본 발명은 (1) 인간 VL 유전자 절편 및 인간 JL 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CL 유전자 절편에 의해 코딩되는 경쇄 불변 영역으로 구성되는 인간 서열 경쇄; 및 (1) 인간 VH 유전자 절편, D 영역, 및 인간 JH 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CH 유전자 절편에 의해 코딩되는 불변 영역으로 구성되는 인간 서열 중쇄를 포함하는 항-CD38 항체를 제공한다. 원래의 인간 생식계열 서열이 쉽게 인식되지 않을 수 있도록 재조합 및 체세포 돌연변이 이벤트에 의해 인간 D 유전자가 실질적으로 변형될 수 있다는 것을 주지하여야 한다.
CD38에 대한 고친화력 인간 모노클로날 항체의 개발은 인간 면역글로불린 트랜스진이 통합된 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물에서 인간 가변 영역 유전자 절편의 레퍼토리를 확장시키는 방법에 의해 용이해질 수 있고, 상기 방법은 상기 통합된 인간 면역글로불린 트랜스진에 존재하지 않는 V 영역 유전자 절편을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈 내로 도입하는 것을 포함한다. 종종, V 영역 트랜스진은 인간 게놈에서 천연적으로 발생하는 것과 같은 또는 재조합 방법에 의해 별도로 함께 스플라이싱될 수 있는 인간 VH 또는 VL (VK) 유전자 절편 어레이의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체 (YAC)이고, 이는 고장난 또는 생략된 V 유전자 절편을 포함할 수 있다. 종종 5개 이상의 기능성 V 유전자 절편이 YAC 상에 함유된다. 이러한 변형에서, V 레퍼토리 확장 방법에 의해 생산되는 트랜스제닉 동물을 제조할 수 있고, 여기서 동물은 V 영역 트랜스진 상에 존재하는 V 영역 유전자 절편에 의해 코딩되는 가변 영역 서열, 및 인간 Ig 트랜스진 상에서 코딩되는 C 영역을 포함하는 면역글로불린 사슬을 발현한다. V 레퍼토리 확장 방법에 의해, 5개 이상의 다른 V 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물이 생성될 수 있다; 약 24개 이상의 V 유전자를 함유하는 동물도 생성될 수 있다. 일부 V 유전자 절편은 기능성이 아닐 수 있다 (예를 들어, 위유전자(pseudogene) 등); 이러한 절편은 유지될 수 있거나, 또는 원한다면 당업자에게 입수가능한 재조합 방법에 의해 선택적으로 결실될 수 있다.
J 및 C 유전자 절편을 함유하는 인간 Ig 트랜스진에는 실질적으로 존재하지 않는 확장된 V 절편 레퍼토리를 갖는 기능성 YAC을 함유하도록 마우스 생식계열이 일단 조작되면, 확장된 V 절편 레퍼토리를 갖는 기능성 YAC이 상이한 인간 Ig 트랜스진을 갖는 비-인간 동물 생식계열 내로 교배되는 백그라운드(background)를 포함하는 기타 유전적 백그라운드 내로 소질이 전파 및 교배될 수 있다. 확장된 V 절편 레퍼토리를 갖는 다수의 기능성 YAC은 인간 Ig 트랜스진 (또는 다중 인간 Ig 트랜스진)과 함께 작용하도록 생식계열 내로 교배될 수 있다. 본원에서 YAC 트랜스진으로 지칭되지만, 게놈 내로 통합되는 경우 이같은 트랜스진에는 효모 서열, 예컨대 효모에서의 자가 복제에 필요한 서열이 실질적으로는 결여되어 있을 수 있다; 이같은 서열은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않은 후 (즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 프로자이고트(prozygote) 내로의 도입 전)에 유전자 조작 (예를 들어, 제한 소화 및 펄스-필드(pulsed-field) 젤 전기영동 또는 기타 적절한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 서열 면역글로불린 발현의 소질을 전파시키는 방법은 인간 Ig 트랜스진(들)을 갖고, 또한 확장된 V 절편 레퍼토리를 갖는 기능성 YAC을 임의로 갖는 트랜스제닉 동물을 교배시키는 것을 포함한다. VH 및 VL 유전자 절편 모두가 YAC 상에 존재할 수 있다. 인간 Ig 트랜스진 및/또는 인간의 기타 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진이 포함되는 또다른 인간 트랜스진이 하버링(harboring)된 백그라운드를 포함하여 당업자가 원하는 임의의 백그라운드 내로 트랜스제닉 동물이 교배될 수 있다. 본 발명은 확장된 V 영역 레퍼토리 YAC 트랜스진을 갖는 트랜스제닉 마우스에 의해 생산되는 고친화력 인간 서열 면역글로불린을 또한 제공한다. 본 발명의 트랜스제닉 동물의 특정 실시양태가 상기에 기술되어 있지만, 하기의 3가지 카테고리로 분류되는 기타 실시양태가 구현된다.
I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물,
II. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물; 및
III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 통상적인 기술 예컨대 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA1 1995]에 기술된 것들에 따라 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제, 뿐만 아니라 임의의 또다른 공지된 보조제 및 부형제와 함께 제형될 수 있다.
제약상 허용가능한 담체 또는 희석제, 뿐만 아니라 임의의 또다른 공지된 보조제 및 부형제는 선택된 본 발명의 화합물 및 선택된 투여 방식에 적절하여야 한다. 제약 조성물의 담체 및 기타 성분의 적절성은 본 발명의 선택된 화합물 또는 제약 조성물의 원하는 생물학적 성질에 대해 현저한 음성 영향이 없는 것을 기초로 선택된다 (예를 들어, 항원 결합에 대해 실질적인 것 미만의 영향 (10％ 이하의 상대적인 억제, 5％ 이하의 상대적인 억제)).
본 발명의 제약 조성물은 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제 (예를 들어, 비이온성 세제, 예컨대 트윈(Tween)-80), 안정화제 (예를 들어, 당 또는 단백질이 없는 아미노산), 방부제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 제약 조성물 내에 포함되기에 적절한 기타 물질을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 내의 활성 성분들의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 응답을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 용태, 일반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에 주지된 유사 인자가 포함되는 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다.
제약 조성물은 임의의 적절한 경로 및 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 적절한 생체내 및 시험관내 투여 경로가 당업계에 주지되어 있고, 당업자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 화합물은 임의의 적절한 경로, 예컨대 경구, 비강, 흡입, 국소 (볼, 경피 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화될 수 있는 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 활성 성분은 경질 또는 연질 껍질의 젤라틴 캡슐 내로 넣어지거나, 정제로 압축되거나, 또는 환자의 음식 내로 직접 혼입될 수 있다. 경구 투여에 적절한 본 발명의 제약 조성물에는 적합한 것으로 당업계에 공지된 담체를 함유하는 섭취성 정제, 볼 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등이 포함된다. 본 발명의 화합물을 경구 투여하기 위해, 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 또는 이와 공동 투여하는 것이 필요할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비강에 투여된다. 비강 투여에 적절한 본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지되어 있고, 전형적으로 스프레이, 점비제 및 흡입제가 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 국소 투여된다. 국소 또는 경피 투여에 적절한 본 발명의 제약 조성물에는 적합한 것으로 당업계에 공지된 담체를 함유하는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제가 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 직장에 투여된다. 직장 투여에 적절한 본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지되어 있고, 젤, 페이스트, 스프레이 제형, 좌약이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 질에 투여된다. 질 투여에 적절한 본 발명의 제약 조성물에는 적합한 것으로 당업계에 공지된 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비경구적으로 투여된다.
본원에 사용된 문구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여"는 장내 및 국소 투여 이외의, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 표피, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 건내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 두개내, 흉곽내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 피하 주사에 의해 결정질 형태로 투여된다. [Yang et al., PNAS USA 100(12), 6934-6939 (2003)] 참조.
제약 조성물은 당업계에 공지된 의학 기구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 무침 피하 주사 기구, 예컨대 미국 특허 5,399,163, 미국 특허 5,383,851, 미국 특허 5,312,335, 미국 특허 5,064,413, 미국 특허 4,941,880, 미국 특허 4,790,824, 또는 미국 특허 4,596,556에 개시된 기구로 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 주지된 이식물 및 모듈의 예로는 하기의 것들이 포함된다: 제어 속도로 의약을 투여하기 위한 이식형 미세주입 펌프가 개시된 미국 특허 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 기구가 개시된 미국 특허 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프가 개시된 미국 특허 4,447,233; 연속적인 약물 전달을 위한 유동성 이식형 주입 장치가 개시된 미국 특허 4,447,224; 다중 챔버 구획이 있는 삼투압 약물 전달 시스템이 개시된 미국 특허 4,439,196; 및 삼투압 약물 전달 시스템이 개시된 미국 특허 4,475,196. 다수의 또다른 이같은 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 제약 조성물은 특정 투여 경로, 예컨대 경구, 비강, 국소 (볼, 경피 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여용으로 제형될 수 있다. 제약 조성물은 단위 투여 제형으로 간편하게 제공될 수 있고, 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 일으키는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100％ 중에서, 이러한 양은 약 0.01％ 내지 약 99％의 활성 성분, 예컨대 약 0.1％ 내지 약 70％, 예를 들어 약 1％ 내지 약 30％ 범위일 것이다.
선택된 투여 경로와 상관 없이, 제약상 허용가능한 염의 형태 또는 적절한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 제약 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용가능한 투여 제형으로 제형될 수 있다. "제약상 허용가능한 염"은 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 어떠한 바람직하지 않은 독성학적 효과도 부여하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, [Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. 66, 1-19 (1977)] 참조). 이같은 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염에는 비독성 무기산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유도된 것들, 뿐만 아니라, 비독성 유기산 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 것들이 포함된다. 염기 부가염에는 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 것들, 뿐만 아니라, 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유도된 것들이 포함된다.
제약상 허용가능한 담체에는 본 발명의 화합물과 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 가능한 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균 및 항진균 작용제, 등장화제, 항산화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다.
본 발명의 제약 조성물에서 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비-수성 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로피렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 및 참기름, 카르복시메틸 셀룰로, 트라가칸트 검 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 및/또는 다양한 완충제가 포함된다. 기타 담체가 제약 분야에 주지되어 있다.
제약상 허용가능한 담체에는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 이같은 매질 및 작용제를 제약상 활성인 물질에 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 상용성이 아닌 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 이를 사용하는 것이 구현된다.
예를 들어, 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 적합한 유동성이 유지될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용가능한 항산화제, 예를 들어 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술파이트 및 소듐 술파이트 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 조성물 내에 등장화제, 예컨대 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 염화나트륨을 또한 포함할 수 있다.
제약상 허용가능한 희석제에는 염수 및 수용성 완충제 용액이 포함된다.
본 발명의 제약 조성물은 선택된 투여 경로에 적합한 1가지 이상의 보조제, 예컨대 방부제, 습윤화제, 유화제, 분산제, 방부제 또는 완충제를 또한 함유할 수 있고, 이는 제약 조성물의 저장 기간 또는 유효성을 증강시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 락토스, 수크로스, 분말 (예를 들어, 전분 분말), 알칸산의 셀룰로스 에스테르, 스테아르산, 탈크, 스테아르산마그네슘, 산화 마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 아카시아, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 폴리비닐 알콜과 예를 들어 부가혼합될 수 있다. 보조제의 또다른 예는 QS21, GM-CSF, SRL-172, 히스타민 디히드로클로라이드, 티모카르틴, Tio-TEPA, 모노포스포릴-지질 A/마이코박테리아 조성물, 백반, 불완전 프로인트 애쥬번트, 몬타니드 ISA, 리비(ribi) 애쥬번트 시스템, TiterMax 애쥬번트, 신텍스(syntex) 애쥬번트 제형, 면역-자극 복합체 (ISCOM), 저부(gerbu) 애쥬번트, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 지질다당류, 및 폴리이노신:폴리시티딜산이다.
미생물의 존재를 방지하는 것은 멸균 절차 및 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부타놀, 페놀, 소르브산 등의 포함 모두에 의해 확실해질 수 있다. 또한, 주사용 제형의 장기(長期) 흡수가 흡수를 지연시키는 작용제 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 화합물을 포함하는 본 발명의 제약 조성물은 이의 적절한 염을 또한 포함할 수 있다. 임의의 적절한 형태 (예를 들어, 완충제 염)의 임의의 적절한 염, 예컨대 알칼리 토금속 염이 본 발명의 화합물의 안정화에서 사용될 수 있다. 적절한 염에는 전형적으로 염화나트륨, 숙신산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 및 염화칼슘이 포함된다. 한 실시양태에서, 알루미늄 염이 본 발명의 제약 조성물에서 본 발명의 화합물을 안정화시키는데 사용되고, 이러한 알루미늄 염은 이같은 조성물이 환자에게 투여될 때 보조제로서 또한 기능하 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 다양한 적절한 형태일 수 있다. 이같은 형태에는, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 제형, 예컨대 액체 용액 (예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산액 또는 현탁액, 에멀션, 마이크로에멀션, 젤, 크림, 과립, 분말, 정제, 알약, 분말, 리포솜, 덴드리머(dendrimer) 및 기타 나노입자 (예를 들어 [Baek et al., Methods Enzymol. 362, 240-9 (2003)], [Nigavekar et al., Pharm Res. 21(3), 476-83 (2004)] 참조), 미세입자, 및 좌약이 포함된다.
최적의 형태는 선택된 투여 양식, 조성물의 성질, 및 치료 용도에 좌우된다. 제형에는 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질 (양이온성 또는 음이온성) 함유 소포, DNA 접합체, 무수성 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카르보왁스 (다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 젤, 및 카르보왁스를 함유하는 반고체 혼합물이 포함된다. 임의의 상기의 것들이 본 발명에 따른 치료 및 요법에서 적절할 수 있고, 단 제약 조성물 내의 활성 성분은 제형에 의해 불활성화되지 않고, 제형은 생리학적으로 투여 경로에 대해 생리학적으로 혼화성 및 허용성이다. 제약 화학자에게 주지된 부형제 및 담체에 관한 추가적인 정보를 위해서, 예를 들어 [Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52, 238-311 (1998)] 및 이의 인용문 참조.
본 발명의 화합물은 급속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체, 예컨대 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 함께 제조될 수 있다. 이같은 담체는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성, 생체적합성 중합체 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리앤하이드리드(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산 (단독 또는 왁스와의 혼합물), 또는 당업계에 주지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이같은 제형의 제조 방법은 당업자에게 일반적으로 주지되어 있다. 예를 들어, [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.
본 발명의 조성물을 특정 투여 경로에 의해 투여하기 위해, 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 또는 이와 공동 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물이 적합한 담체, 예를 들어, 리포솜, 또는 희석제 내에서 대상에게 투여될 수 있다. 리포솜에는 수중유중수 CGF 에멀션, 뿐만 아니라 통상적인 리포솜이 포함된다 ([Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)]).
투여 경로에 따라, 활성 화합물이 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 화합물이 적합한 담체, 예를 들어, 리포솜 내에서 투여될 수 있다. 리포솜에는 수중유중수 CGF 에멀션, 뿐만 아니라 통상적인 리포솜이 포함된다 ([Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)]).
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 생체 내에서의 적절한 분포를 확실히 하도록 제형될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다수의 고도로 친수성이 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료용 화합물이 BBB를 통과하는 것을 확실히 하기 위해 (원하는 경우), 이를 예를 들어 리포솜 내에 제형할 수 있다. 리포솜의 제작 방법에 대해서, 예를 들어 미국 특허 4,522,811, 미국 특허 5,374,548 및 미국 특허 5,399,331 참조. 리포솜은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 운반되어, 표적화된 약물 전달을 증강시키는 1가지 이상의 부분을 포함할 수 있다 (예를 들어 [V.V. Ranade J. Clin. Pharmacol. 29, 685 (1989)] 참조). 대표적인 표적화 부분에는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어 미국 특허 5,416,016 참조), 만노시드 ([Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 1038 (1988)]), 항체 ([P.G. Bloeman et al., FEBS Lett. 357, 140 (1995)], [M. Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 180 (1995)]), 계면활성제 단백질 A 수용체 ([Briscoe et al., Am. J. Physiol. 1233. 134 (1995)]) (이의 여러 종은 본 발명의 제약 조성물, 뿐만 아니라 본 발명의 분자 성분을 포함할 수 있음), p120 ([Schreier et al., J. Biol. Chem. 269, 9090 (1994)])이 포함된다. 또한 [K. Keinanen, M.L. Laukkanen, FEBS Lett. 346, 123 (1994)] 및 [J.J. Killion, I.J. Fidler, Immunomethods 4, 273 (1994)] 참조.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 리포솜 내에 제형될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 리포솜은 표적화 부분을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 리포솜 내의 화합물은 볼루스 주사에 의해 원하는 영역에 근접한 부위, 예를 들어, 염증 또는 감염 부위, 또는 종양 부위에 전달된다. 조성물은 용이한 주사성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 조성물은 제작 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하고, 박테리아 또는 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 태반을 가로지르는 운반이 방지 또는 감소되도록 제형될 수 있다. 이는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 화합물의 PEG화 또는 F(ab')2 단편의 사용에 의해 이루어질 수 있다. [Cunningham-Rundles C et al., J Immunol Methods. 152, 177-190 (1992)] 및 [Landor M., Ann Allergy Asthma Immunol 74, 279-283 (1995)]를 또한 참조할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제약상 허용가능한 담체에는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 이같은 매질 및 작용제를 제약상 활성인 물질에 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 상용성이 아닌 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 이를 사용하는 것이 구현된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
주사용 제약 조성물은 전형적으로 제작 및 보관 조건 하에서 멸균되어야 하고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 고농도의 약물에 적절한 기타 규칙적(ordered) 구조물로서 제형될 수 있다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 예를 들어 함유하는 수성 또는 비수성 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성이, 예를 들어, 코팅물 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기(長期) 흡수가 흡수를 지연시키는 작용제 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 포함하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 멸균 주사 용액은, 필요하다면 예를 들어 상기 열거된 바와 같은 성분 중 하나 또는 성분들의 조합물과 함께, 필요한 양의 활성 화합물을 적합한 용매에 혼입시킨 후, 멸균 미세 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 기본적인 분산 매질 및 필요한 기타 성분 (예를 들어 상기 열거된 것들로부터의 성분)을 함유하는 무균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 분산액이 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 진공 건조 및 동결 건조이고, 이에 의해 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말이 산출된다.
멸균 주사 용액은, 필요하다면 예를 들어 상기 열거된 바와 같은 성분 중 하나 또는 성분들의 조합물과 함께, 필요한 양의 활성 화합물을 적합한 용매에 혼입시킨 후, 멸균 미세 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 기본적인 분산 매질 및 필요한 기타 성분 (예를 들어 상기 열거된 것들로부터의 성분)을 함유하는 무균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 분산액이 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 진공 건조 및 동결 건조이고, 이에 의해 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말이 산출된다.
본 발명의 제약 조성물은 1가지의 본 발명의 화합물 또는 조합된 본 발명의 화합물들을 함유할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 상이한 메커니즘으로 작용하는 여러 가지의 (예를 들어 2가지 이상의) 본 발명의 화합물의 조합물, 예를 들어, 한 화합물은 주로 CDC를 유도함으로써 작용하고 또다른 화합물은 주로 세포자멸사를 유도함으로써 작용하는 조합물을 포함한다.
본 발명의 CD38BP (항-CD38 항체, 면역접합체, 이중특이적/다중특이적 분자, 조성물 및 본원에 기술된 기타 유도체 포함)에는 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 진단 및 치료가 수반되는 수많은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도가 있다. 예를 들어, 항체는 다양한 장애를 치료, 예방 및 진단하기 위해 배양 중인 세포에, 예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여될 수 있거나, 또는 인간 대상에게, 예를 들어, 생체내 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "대상"은 CD38BP에 응답하는 인간 및 비-인간 동물을 포함하도록 의도된다. 대상에는, 예를 들어, CD38 기능, 예컨대 효소 활성, 신호 전달, 사이토카인 발현 억제, 증식 또는 분화 유도 및/또는 용해 유도를 억제함으로써, 및/또는 CD38 발현 세포의 수를 제거/감소시킴으로써 정정 또는 경감될 수 있는 장애가 있는 인간 환자가 포함될 수 있다.
예를 들어, CD38BP는 생체내에서 또는 시험관 내에서 1가지 이상의 하기의 생물학적 활성을 도출해내는데 사용될 수 있다: CD38 기능 (예컨대 효소 활성, 신호 전달, 사이토카인 발현 유도, 증식 또는 분화 유도, 및/또는 용해 유도) 억제, CD38 발현 세포 살해, 인간 이펙터 세포의 존재 하에서의 CD38 발현 세포의 포식작용 또는 ADCC 매개, 및 보체의 존재 하에서의 CD38 발현 세포의 CDC 매개, 또는 세포자멸사에 의한 CD38 발현 세포 살해.
보체 결합 부위, 예컨대 보체에 결합하는 IgG1, -2 또는 -3 또는 IgM의 일부분을 갖는 본 발명의 CD38BP를 포함하는 임의의 조성물이 또한 보체의 존재 하에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 본 발명의 CD38BP 및 적합한 이펙터 세포로 생체외 처리하는 것을 보체 또는 보체를 함유하는 혈청의 첨가로 보충할 수 있다. 본 발명의 CD38BP로 코팅된 표적 세포의 포식작용 또는 용해가 보체 단백질의 결합에 의해 개선될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP로 코팅된 표적 세포가 또한 보체에 의해 용해될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 보체를 활성화시키지 않는다.
본 발명의 CD38BP는 또한 보체와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 혈청 또는 보체와 함께 CD38BP를 포함하는 조성물은 본 발명의 범주 내에 속한다. 이러한 조성물에서, 보체는 예를 들어 접합에 의해 CD38BP에 근접하게 위치하거나, 또는 공동 투여에 적절할 수 있다. 별법적으로, CD38BP 및 보체 또는 혈청이 별도로 투여될 수 있다.
본 발명의 CD38BP는 FcyR 또는 CD38를 발현하는 세포의 표적화, 예를 들어 이같은 세포의 표지에 또한 사용될 수 있다. 이같은 용도를 위해, CD38BP는 검출될 수 있는 분자에 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명은 Fc 수용체, 예컨대 FcγR, 또는 CD38를 발현하는 세포를 생체외에서 또는 시험관내에서 국소화시키는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어, 본 발명의 CD38BP에 연결된 이펙터 세포가 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 표적화용 이펙터 세포는 인간 백혈구 예컨대 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 또다른 세포에는 호산구, 천연 킬러 세포 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 원한다면, 이펙터 세포를 치료될 대상으로부터 수득할 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리학적으로 허용가능한 용액 내의 세포의 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 108 내지 109 개일 수 있지만, 치료 목적에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 표적 세포, 예를 들어, CD38 발현 종양 세포에서의 국소화를 수득하고, 세포를, 예를 들어, 포식작용 또는 용해에 의해 죽이는데 충분할 것이다.
표적-특이적 이펙터 세포로의 치료는 표적화된 세포의 제거를 위한 또다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CD38BP 및/또는 이러한 조성물이 장전된 이펙터 세포를 사용하는 항-종양 요법이 화학요법과 함께 사용될 수 있다. 추가적으로, 2개의 별개의 세포독성 이펙터 집단이 종양 세포 거부에 대해 지시되는 조합 면역요법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-FcγRI 또는 항-CD3에 연결된 CD38BP가 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자가, 예컨대 세포 표면 상의 수용체의 캡핑(capping) 및 제거에 의해, 이펙터 세포 상의 FcαR 또는 FcyR 수준을 조정하는데 사용될 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물이 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38에 특이적으로 결합하는 CD38BP 또는 이의 일부분과 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 샘플 및 대조군 샘플을 CD38BP와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내의 CD38 항원의 존재를 검출하거나, CD38 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 그 후, 복합체의 형성이 검출되고, 이 때 샘플과 대조군 샘플 간의 상이한 복합체 형성은 샘플 내의 CD38 항원의 존재를 가리킨다. 면역분석 측정을 위한 방법의 예로는 ELISA, RIA, FACS 분석, 플라즈몬 공명 분석, 크로마토그래피 분석, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 및/또는 면역침전이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 순환 CD38의 수준 또는 막 표면 상에 CD38을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있고, 이어서 이러한 수준이 특정 질환 증상에 연결될 수 있다. 별법적으로, CD38BP는 CD38 발현 세포의 기능을 고갈시키거나 이와 상호작용함으로써, 이러한 세포를 질환의 중요한 매개물로서 연루시키는데 사용될 수 있다. 이는 항-CD38 항체와 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 샘플 및 대조군 샘플을 항-CD38 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체와 CD38 간에 형성된 임의의 복합체가 검출되고, 샘플과 대조군에서 비교된다.
본 발명의 CD38BP를 시험관 내에서의 치료 및 진단 용도와 관련된 결합 활성에 대해 먼저 테스트할 수 있다. 예를 들어, CD38BP를 유동 세포측정 분석법을 사용하여 테스트할 수 있다. 또한, 1가지 이상의 이펙터-매개 이펙터 세포 활성을 촉발시키는 CD38BP의 활성을 분석할 수 있다. 예를 들어, CDC 및/또는 세포자멸사를 촉발시키는 본 발명의 항-CD38 항체의 능력을 분석할 수 있다. CDC, 동형 부착, 분자 군집 또는 세포자멸사를 분석하는 프로토콜은 당업계에 주지되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 CD38-발현 세포의 존재를 검출하거나 이의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (i) 검출가능한 마커에 접합된 본 발명의 CD38BP를 대상에게 투여하는 단계; (ii) 상기 검출가능한 마커를 검출하는 수단에 대상을 노출시켜, CD38-발현 세포를 함유하는 영역을 확인하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체는 본 발명의 면역접합체에서 치료 부분와 같은 표적 화합물을 사용함으로써 화합물 (예를 들어, 치료제, 표지, 세포독소, 면역억제제 등)을 표적화시키는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38을 발현하는 세포를 생체외에서 또는 시험관 내에서 국소화시키는 방법을 또한 제공한다 (예를 들어, 검출가능한 표지, 예컨대 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 사용).
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역독소를 투여함으로써 CD38가 표면에 결합된 세포를 죽이는 방법을 제공한다.
본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP를 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 이같은 CD38BP는 특정 장애와 관련된 CD38 유도 활성을 억제하거나, 또는 CD38을 발현하는 세포의 수를 제거 또는 감소시키는데 사용된다.
이같은 방법은 장애를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로 본 발명의 CD38BP 조성물을 대상에게 투여하는 것을 수반한다. CD38BP 조성물은 단독으로, 또는 CD38BP 조성물과 함께 또는 상승작용적으로 작용하여 CD38 발현 세포가 수반되는 질환을 치료 또는 예방하는 또다른 치료제, 예컨대 본원의 다른 곳에서 기술된 것들과 함께 투여될 수 있다. 별법적으로, 면역접합체가 세포독소 또는 방사선독소를 CD38를 표적화시킴으로써 CD38이 표면 상에 발현된 세포를 죽이는데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애는 B 세포 림프종, 형질 세포 악성종양, T/NK 세포 림프종 및 골수성 악성종양이 예를 들어 포함되는 종양형성성 장애, 예컨대 CD38를 발현하는 종양 세포를 특징으로 하는 장애이다.
이같은 종양형성성 질환의 예로는 전구체 B 세포 림프모구성 백혈병/림프종 및 B 세포 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종이 포함되는 B 세포 림프종/백혈병; 급성 전골수구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 및 성숙 B 세포 신생물, 예컨대 B 세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소림프구성 림프종 (SLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병, B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 외투세포 림프종 (MCL), 여포성 림프종 (FL) (저등급, 중간등급 및 고등급 FL 포함), 피부 여포 중심 림프종, 변연대 B 세포 림프종 (MALT 유형, 결절 및 비장 유형), 모발상 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 형질 세포 백혈병, 이식후 림프세포증식성 장애, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질 세포 백혈병 및 역형성 대세포 림프종 (ALCL)이 포함된다.
한 실시양태에서, CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애는 다발성 골수종이다.
B 세포 비-호지킨 림프종의 예는 림프종모양 육아종증, 원발성 삼출성 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 종격 거대 B 세포 림프종, 중쇄 질환 (γ, μ 및 α 질환 포함), 면역억제제로의 치료에 의해 유도된 림프종, 예컨대 사이클로스로핀-유도 림프종, 및 메토트렉세이트-유도 림프종이다.
본 발명의 한 실시양태에서, CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애는 호지킨(Hodgkin) 림프종이다.
CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 예는 하기를 포함하는 T 및 NK 세포로부터 유래된 악성종양일 수 있다: T 세포 전림프구성 백혈병, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, 성인 T 세포 백혈병/림프종, 결절외 NK/T 세포 림프종, 비강 유형, 장병증-유형 T 세포 림프종, 간비장 T 세포 림프종, 피하 지방층염-유사 T 세포 림프종, 아구성 NK 세포 림프종, 균상 식육종/세자리(Sezary) 증후군, 원발성 피부 CD30 양성 T 세포 림프세포증식성 장애 (원발성 피부 역형성 거대 세포 림프종 C-ALCL, 림프종모양 구진증, 경계선 병변), 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 비특정형 말초 T 세포 림프종, 및 역형성 거대세포 림프종을 포함하는 성숙 T 세포 및 NK 세포 신생물.
골수 세포로부터 유래된 악성 종양의 예로는 급성 골수성 백혈병 (급성 전골수구성 백혈병 포함), 및 만성 골수증식성 질환 (만성 골수성 백혈병 포함)이 포함된다.
본 발명의 한 실시양태에서, CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애는 CD38 발현 B 세포, 형질 세포, 단핵구 및 T 세포가 수반되는 면역 장애일 수 있다.
CD38 발현 B 세포, 형질 세포, 단핵구 및 T 세포가 수반되는 면역 장애의 예로는 자가면역 장애, 예컨대 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신성 경피증 및 경화증, 염증성 장질환 (IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 호흡곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체 신염, 습진, 천식, 죽상경화증, 백혈구 부착 결핍증, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 소아 발병형 당뇨병, 레이터병, 베체트병, 면역 복합체 신염, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 면역-매개 혈소판감소증, 예컨대 급성 특발성 혈소판감소성 자색반 및 만성 특발성 혈소판감소성 자색반, 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 루푸스 신염, 전신성 홍반성 루푸스, 류머티스성 관절염 (RA), 아토피성 피부염, 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, 다발성 경화증, HIV, 및 헤르페스 바이러스 관련 질환이 포함된다. 추가적인 예는 중증 급성 호흡곤란 증후군 및 맥락망막염이다. 또한, 엡스타인-바 바이러스 (EBV)와 같은 바이러스에 의한 B-세포의 감염에 의해 야기되거나 매개되는 것들과 같은 기타 질환 및 장애가 포함된다.
한 실시양태에서, CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애는 류머티스성 관절염이다.
자가항체 및/또는 과도한 B 및 T 림프구 활성이 우세하고, 본 발명에 따라 치료될수 있는 염증성, 면역 및/또는 자가면역 장애의 추가적인 예로 하기의 것들이 포함된다:
혈관염 및 기타 혈관 장애, 예컨대 현미경적 다발성 혈관염, 척-스트라우스 증후군, 및 기타 ANCA-관련 혈관염, 결절성 다발성 동맥염, 본태성 한랭글로불린혈증 혈관염, 피부 백혈구파괴성 혈관염, 카와사키병, 다까야스 동맥염, 거대 세포 관절염, 헤노흐-쉔라인 자색반, 원발성 또는 단리된 대뇌 혈관염, 결절성 홍반, 폐쇄성 혈전혈관염, 혈전성 혈소판감소성 자색반 (용혈성 요독 증후군 포함), 및 피부 백혈구파괴성 혈관염을 포함하는 2차 혈관염 (예를 들어, B형 간염, C형 간염, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, B-세포 신생물, 류머티스성 관절염, 쇼그렌 증후군 또는 전신성 홍반성 루푸스에 대해 2차); 추가적인 예는 결절 홍반, 알레르기성 혈관염, 지방층염, 베버-크리스티안병, 고글로불린혈 자색반, 및 버거병임;
피부 장애, 예컨대 접촉성 피부염, 선형 IgA 피부병, 백반증, 괴저성 농피증, 후천성 수포성 표피박리증, 심상성 천포창 (반흔성 천포창 및 수포성 천포창 포함), 원형 탈모증 (범발성 탈모증 및 전두 탈모증 포함), 포진성 피부염, 다형 홍반, 및 만성 자가면역 두드러기 (혈관 신경성 부종 및 두드러기성 혈관염 포함);
면역-매개 혈구감소증, 예컨대 자가면역 호중구감소증 및 적혈구계 무형성증;
결합 조직 장애, 예컨대 CNS 루푸스, 원판상 홍반성 루푸스, CREST 증후군, 혼합형 결합 조직 질환, 다발성 근염/피부근염, 봉입체 근염, 2차 아밀로이드증, 제I형 및 제II형 한랭글로불린혈증, 섬유근육통, 인지질 항체 증후군, 2차 혈우병, 재발성 다연골염, 사르코이드증, 근육 강직 증후군, 및 류마티스 열; 추가적인 예는 호산구성 근막염임;
관절염, 예컨대 강직성 척추염, 소아형 만성 관절염, 성인 스틸병, 및 SAPHO 증후군; 추가적인 예는 천장골염, 반응성 관절염, 스틸병 및 통풍임;
혈액학적 장애, 예컨대 재생불량성 빈혈, 원발성 용혈성 빈혈 (한랭 응집소 증후군 포함), CLL 또는 전신성 홍반성 루푸스에 2차적인 용혈성 빈혈; POEMS 증후군, 악성 빈혈, 및 발덴스트롬 고글로불린혈증 자색반; 추가적인 예는 과립구결핍증, 자가면역 호중구감소증, 프랭클린병, 셀리그만병, 감마 중쇄 질환, 흉선종 및 림프종에 2차적인 부신생물성 증후군, 및 인자 VIII 억제제 형성임;
내분비병증, 예컨대 다발성 내분비병증, 및 애디슨병; 추가적인 예는 자가면역 저혈당증, 자가면역 갑상선기능저하증, 자가면역 인슐린 증후군, 드 퀘르뱅 갑상선염, 및 인슐린 수용체 항체-매개 인슐린 내성임;
간-위장관 장애, 예컨대 복강 질환, 휘플병, 원발성 담즙성 간경변, 만성 활동성 간염, 및 원발성 경화성 담관염; 추가적인 예는 자가면역 위염임;
신장병증, 예컨대 급속 진행성 사구체신염, 연쇄상구균 감염후 신염, 굳파스튜어 증후군, 막성 사구체신염, 및 한랭글로불린혈증성 신염; 추가적인 예는 미세변화 질환임;
신경계 장애, 예컨대 자가면역 신경병증, 다발성 단신경염, 램버트-이튼 근무력 증후군, 시든햄 무도병, 척수 배면근 위축, 및 귈랭-바레 증후군; 추가적인 예는 척수병증/열대 경직성 대부전마비, 중증 근무력증, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 및 만성 염증성 탈수초성 신경병증임; 다발성 경화증;
심장 및 폐 장애, 예컨대 COPD, 섬유성 폐포염, 폐쇄성 세기관지염, 알레르기성 아스페르길루스증, 낭포성 섬유증, 뢰플러 증후군, 심근염, 및 심막염; 추가적인 예는 과민성 폐렴, 및 폐암에 2차적인 부신생물성 증후군임;
알레르기성 장애, 예컨대 기관지 천식 및 고-IgE 증후군; 추가적인 예는 일과성 흑내장임;
안과 장애, 예컨대 특발성 맥락망막염;
감염성 질환, 예컨대 파르보바이러스 B 감염 (수족(hands and socks) 증후군 포함);
산부인과 장애, 예컨대 재발성 유산, 재발성 태아 상실, 및 자궁내 성장 지체; 추가적인 예는 부인과 신생물에 2차적인 부신생물성 증후군임;
남성 생식기 장애, 예컨대 고환 신생물에 2차적인 부신생물성 증후군; 및
이식-유래 장애, 예컨대 동종이식 및 이종이식 거부반응, 및 이식편-대-숙주 질환.
항체는 암, 예컨대 상기 기술된 바와 같은 종양형성성 장애의 발생 위험을 감소시키고/시키거나, 이같은 암 진행에서의 이벤트의 발병을 지연시키고/시키거나, 이같은 암이 완화되고 있을 때 재발 위험을 감소시키기 위해 또한 예방적으로 투여될 수 있다. 이는 또다른 생물학적 인자로 인해 존재하는 것으로 알려진 종양의 위치를 정하는 것이 어려운 환자에서 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 CD38BP를 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 필요한 용량에서 및 기간 동안 원하는 치료 결과가 달성되기에 충분한 양을 지칭한다. CD38BP의 치료적 유효량은 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 원하는 응답을 도출해 내는 CD38BP의 능력과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다. 또한 치료적 유효량은 치료적으로 이로운 효과가 항체의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방적 유효량"은 필요한 용량에서 및 기간 동안 원하는 예방 효과 (예를 들어, 장애가 발생할 가능성의 감소, 장애의 강도 또는 확산의 감소, 절박한 장애 동안 생존 가능성의 증가, 질환 상태 발병의 지연 등)가 달성되기에 충분한 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
종양 치료에 대한 "치료적 유효량"은 질환의 진행을 안정화시키는 능력으로 또한 측정될 수 있다. 암을 억제하는 화합물의 능력이 인간 종양에서의 효능의 전조가 되는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 별법적으로, 당업자에게 공지된 시험관내 분석에 의해 세포 성장을 억제하거나 세포자멸사를 유도하는 화합물의 능력을 시험함으로써 조성물의 이러한 성질이 평가될 수 있다. 치료적 유효량의 치료 화합물은 종양 크기를 감소시키거나, 아니면 대상에서의 증상을 경감시킬 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자를 기초로 이같은 양을 결정할 수 있을 것이다.
류마티스 관절염에 대한 "치료적 유효량"으로 환자에게서 ACR20 예비적 개선 정의(Preliminary Definition of Improvement), 예컨대 ACR50 예비적 개선 정의, 예를 들어 ARC70 예비적 개선 정의가 야기될 수 있다.
ACR20 예비적 개선 정의는 압통 관절 카운트 (Tender Joint Count, TCJ) 및 부종 관절 카운트 (Swollen Joint Count, SWJ)의 ≥20% 개선; 및 환자 통증 평가 (Patient Pain Assessment, VAS), 환자의 전반적인 평가 (Patient Global assessment, VAS), 의사의 전반적 평가 (Physician Global Assessment, VAS), 환자의 자가-평가 장애 (Patent Self-Assessed Disability, HAQ), 급성기 반응물질 (Acute Phase Reactant, CRP 또는 ESR)의 5가지 평가 항목 중 3가지에서 ≥20% 개선으로 정의된다.
ACR50 및 ACR70은 각각 동일한 방식으로 ≥50% 및 ≥70% 개선으로 정의된다. 추가적인 상세사항에 대해서는 [Felson et al., American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism 38, 727-735 (1995)] 참조.
별법적으로, 류머티스성 관절염에 대한 치료적 유효량은 EULAR에 의해 정의된 바와 같은, DAS28 및/또는 DAS56가 포함되는 DAS (질환 활성 점수)에 의해 측정될 수 있다.
최적의 원하는 응답 (예를 들어, 치료 응답)을 제공하기 위해 투여 요법이 조정된다. 예를 들어, 치료 상황의 요건에 따라 지시되는 바와 같이, 단일 볼루스를 투여할 수 있나, 여러 번으로 나누어 경시적으로 투여할 수 있거나, 또는 용량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 일정하게 하기 위해 비경구 조성물을 단위 투여 제형으로 제형할 수 있다. 본원에서 사용된 단위 투여 제형은 치료될 대상에 대하여 단위 투여량으로서 적절한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여 제형에 대한 상세사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성되는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서의 감수성 치료를 위해 이같은 활성 화합물을 배합하는 분야에서 고유한 제한에 의해 지시되며, 이에 직접적으로 의존한다.
본 발명의 CD38BP의 효과적인 투여량 및 투여 요법은 치료될 질환 또는 용태에 좌우될 것이고, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료적 유효량에 대한 대표적인 비제한적인 범위는 약 0.1-100 mg/kg, 예컨대 약 0.1-50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-20 mg/kg, 예컨대 약 0.1-10 mg/kg, 예를 들어 약 0.5, 예컨대 약 0.3, 약 1, 또는 약 3 mg/kg이다.
통상적인 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에서 사용되는 본 발명의 CD38BP의 용량을 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 양보다 더 낮은 수준에서 시작하여 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적절한 일일 용량은 치료 효과를 일으키는데 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이같은 효과적인 용량은 일반적으로 상기 기술된 인자에 좌우될 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여일 수 있고, 예를 들어 표적 부위 근처에 투여될 수 있다. 원한다면, 치료 조성물의 효과적인 일일 용량은, 임의로 단위 투여 제형으로, 하루 동안 적절한 간격으로 분리되어 투여되는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 화합물을 상기 기술된 바와 같은 제약 조성물로서 투여하는 것이 바람직하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 10 내지 500 mg/㎡, 예컨대 200 내지 400 mg/㎡의 일주일 투여량으로 주입에 의해 투여될 수 있다. 이같은 투여를 예를 들어, 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복할 수 있다. 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸친 연속 주입에 의해 투여가 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 독성 부작용을 감소시키기 위해 장기간, 예컨대 24시간 초과에 걸친 저속 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 250 mg 내지 2000 mg, 예를 들어 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg 또는 2000 mg의 일주일 투여량으로, 8회까지, 예컨대 4 내지 6회 투여될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸친 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 이같은 요법은, 예를 들어, 6개월 또는 12개월 후에 필요하다면 1회 이상 반복될 수 있다. 예를 들어 생물학적 샘플을 취하고 본 발명의 CD38BP의 항원 결합 영역을 표적으로 하는 항-이디오타입 항체를 사용하여, 투여 시 혈액 내의 본 발명의 화합물의 양을 측정함으로써, 투여량이 결정 또는 조정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 유지 요법에 의해, 예를 들어, 6개월 이상의 기간 동안 1주일에 한번씩 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 본 발명의 CD38BP를 1회 주입한 후 방사성 동위원소에 접합된 본 발명의 CD38BP를 주입하는 것을 포함하는 요법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 7 내지 9일 후에 요법을 반복할 수 있다.
비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 치료를 약 0.1-100 mg/kg, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg의 양의 본 발명의 화합물의 일일 투여량으로, 치료 개시 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 또는 40일, 또는 별법적으로 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주 또는 20주, 또는 이의 임의의 조합에, 단일 용량 또는 24시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간, 또는 2시간, 또는 이의 임의의 조합의 간격으로의 분할 용량을 사용하여 제공할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 조합 요법으로 또한 투여될 수 있고, 즉 치료될 질환 또는 용태와 관련된 또다른 치료제와 조합될 수 있다. 이같은 투여는 동시 투여, 별도 투여 또는 연속투여일 수 있다. 동시 투여를 위해서, 작용제들을 적당하게 단일조성물로서 또는 별도의 조성물로서 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 기술되는 바와 같은 1가지 이상의 추가적인 치료제들과 조합된 본 발명의 CD38BP의 투여를 포함하는, 상기 기술된 바와 같은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 위한 1가지 이상의 화학요법제와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 또한 제공한다.
한 실시양태에서, 조합 투여는 본 발명의 조성물을 1가지 이상의 화학요법제, 1가지 이상의 항염증제, 또는 1가지 이상의 면역억제제 및/또는 면역조절제와 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 것을 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 1가지 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 1가지 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종의 치료 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 위해 1가지 이상의 화학요법제와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅포퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 젬시타빈, 클라드리빈 및 유사한 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 기타 백금 유도체, 예컨대 카르보플라틴, 및 유사한 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 항생제, 예컨대 닥티노마이신 (기존의 악티노마이신), 블레오마이신, 다우노루비신 (기존의 다우노마이신), 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC) 및 유사한 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 항유사분열제, 예컨대 탁산, 예를 들어 도데탁셀, 및 파클리탁셀, 및 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 비노렐빈으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 국소이성화효소 억제제, 예컨대 토포테칸으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 성장 인자 억제제, 예컨대 ErbB1 (EGFR)의 억제제 (예컨대 제피티닙 (Iressa®), 세툭시맵 (Erbitux®), 에를로니팁 (Tarceva®), HuMax-EGFr (WO 2002/100348에 개시된 2F8) 및 유사한 작용제), ErbB2 (Her2/neu)의 억제제 (예컨대 트라스투주맵 (Herceptin®) 및 유사한 작용제) 및 유사한 작용제로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 이같은 성장 인자 억제제는 파르네실 트랜스페라제 억제제, 예컨대 SCH-66336 및 R115777일 수 있다. 한 실시양태에서, 이같은 성장 인자 억제제는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제, 예컨대 베바시주맵 (Avastin®)일 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 타이로신 키나제 억제제, 예컨대 이매티닙 (Glivec, Gleevec STI571), 라파티닙, PTK787/ZK222584 및 유사한 작용제일 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 히스톤 데아세틸라제 억제제일 수 있다. 이같은 히스톤 데아세틸라제 억제제에는 히드록삼산계 하이브리드 극성 화합물, 예컨대 SAHA (수베로일아닐리드 히드록삼산)이 포함된다.
한 실시양태에서, 이같은 화학요법제는 P38a MAP 키나제 억제제, 예컨대 SCIO-469일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 1가지 이상의 혈관형성, 혈관신생 및/또는 기타 혈관화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 1가지 이상의 혈관형성, 혈관신생 및/또는 기타 혈관화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종의 치료 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 위해 1가지 이상의 혈관형성, 혈관신생 및/또는 기타 혈관화 억제제와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다
이같은 혈관형성 억제제의 예는 유로키나제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 (예컨대 마리마스탯, 네오바스탯, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 및 유사한 작용제), 내피 세포 이동 및 증식 억제제 (예컨대 TNP-470, 스쿠알라민, 2-메톡시에스트라디올, 콤브레타스타틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 페니실라민, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) 및 유사한 작용제), 혈관형성성 성장 인자의 억제제 (예컨대 ZD6474, SU6668, 혈관형성제 및/또는 이의 수용체 (예컨대 VEGF, bFGF, 및 안지오포이에틴-1)에 대한 항체, 탈리도미드 (Thalomid®), 탈리도미드 유사체 (예컨대 CC-5013 (레날리도미드, Revlimid™) 및 CC4047 (Actimid™), Sugen 5416, SU5402, 항-혈관형성성 리보자임 (예컨대 안지오자임), 인터페론 α (예컨대 인터페론 α2a), 수라민 및 유사한 작용제), VEGF-R 키나제 억제제 및 기타 항-혈관형성성 타이로신 키나제 억제제 (예컨대 SU011248), 내피-특이적 인테그린/생존 신호전달의 억제제 (예컨대 비탁신 및 유사한 작용제), 구리 길항제/킬레이트화제 (예컨대 테트라티오몰리브데이트, 캅토프릴 및 유사한 작용제), 카르복시아미도-트리아졸 (CAI), ABT-627, CM101, 인터류킨-12 (IL-12), IM862, PNU145156E, 뿐만 아니라 혈관형성을 억제하는 뉴클레오티드 분자 (예컨대 안티센스-VEGF-cDNA, 안지오스타틴을 코딩하는 cDNA, p53을 코딩하는 cDNA 및 결핍 VEGF 수용체-2를 코딩하는 cDNA) 및 유사한 작용제이다.
이같은 혈관형성, 혈관신생 및/또는 기타 혈관화 억제제의 또다른 예는 항-혈관형성성 헤파린 유도체 및 관련 분자 (예를 들어, 헤파리나제 III), 테모졸로미드, NK4, 대식세포 이동 억제성 인자 (MIF), 시클로옥시게나제-2 억제제, 저산소증-유도성 인자 1의 억제제, 항-혈관형성성 대두 이소플라본, 올티프라즈, 푸마길린 및 이의 유사체, 소마토스타틴 유사체, 펜토산 폴리술페이트, 테코갈란 소듐, 달테파린, 툼스타틴, 트롬보스포딘, NM-3, 콤브레스타틴, 칸스타틴, 아바스타틴, 기타 관련 표적에 대한 항체 (예컨대 항-알파-v/베타-3 인테그린 및 항-키니노스타틴 mAb) 및 유사한 작용제이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 탈리도미드 (Thalomid?), 탈리도미드 유사체 (예컨대 CC-5013 (레날리도미드, Revlimid™) 및/또는 CC4047 (Actimid™)와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 탈리도미드와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맵 (Rituxan®, Mabthera®), WO 2004/035607에 개시된 바와 같은 인간 모노클로날 항-CD20 항체, 예컨대 11B8, 2F2 또는 7D8와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 프로테아솜(proteasome) 억제제, 예컨대 보르테조밉 (Velcade®)일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 덱사메타손 등일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명의 CD38BP와 조합하여 사용하기 위한 치료제는 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 덱사메타손 등일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 항암 면역원, 예컨대 암 항원/종양-관련 항원 (예를 들어, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM/TACSTDI), 뮤신 1 (MUC1), 암종배아 항원 (CEA), 종양-관련 당단백질 72 (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, 암-관련 바이러스 백신 (예를 들어, 인간 유두종바이러스 백신), 종양-유래 열 충격 단백질, 및 유사한 작용제일 수 있다. 본원의 다른 곳에 기술된 다수의 또다른 적절한 암 항원/종양-관련 항원 및 당업계에 공지된 유사한 분자가 또한 또는 별법적으로 이같은 실시양태에서 사용될 수 있다. 항암 면역원성 펩티드는 항-이디오타입 "백신" 예컨대 BEC2 항-이디오타입 항체, Mitumomab, CeaVac 및 관련된 항-이디오타입 항체, MG7 항체에 대한 항-이디오타입 항체, 및 기타 항암 항-이디오타입 항체를 또한 포함한다 (예를 들어 [Birebent et al., Vaccine. 21.(15), 1601-12 (2003)], [Li et al., Chin Med J (Engl). 114(9), 962-6 (2001)], [Schmitt et al., Hybridoma. 13(5), 389-96 (1994)], [Maloney et al., Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985)], [Raychardhuri et al., J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986)], [Pohl et al., Int J Cancer. 50(6), 958-67 (1992)], [Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996)] 및 [Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002)] 참조). 이같은 항-이디오타입 Ab는 담체에 임의로 접합될 수 있고, 이러한 담체는 합성 (전형적으로 불활성) 분자 담체, 단백질 (예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) (예를 들어 [Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)] 참조), 또는 세포 (예를 들어 적혈구 세포 - 예를 들어 [Wi et al., J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)] 참조)일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 비스포스포네이트일 수 있다. 잠재적으로 적절한 비스포스포네이트의 예는 파미드로네이트 (Aredia®), 졸레드론산 (Zometa®), 클로드로네이트 (Bonefos®), 리센드로네이트 (Actonel®), 이반드로네이트 (Boniva®), 에티드로네이트 (Didronel®), 알렌드로네이트 (Fosamax®), 틸루드로네이트 (Skelid®), 인카드로네이트 (Yamanouchi Pharmaceutical) 및 미노드로네이트 (YM529, Yamanouchi)일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 콜로니 자극 인자일 수 있다. 적절한 콜로니 자극 인자의 예는 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 예컨대 필그라스팀 (Neupogen®) 및 페그필그라스팀 (Neulasta®), 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 예컨대 사르그라모스팀 (Leukine®)이다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 적혈구조혈제일 수 있다. 적절한 적혈구조혈제의 예는 에리트로포이에틴 (EPO), 예컨대 에포에틴 알파 (예를 들어 Procrit®, Epogen®, 및 Eprex®) 및 에포에틴 베타 (예를 들어 NeoRecormon®) 및 적혈구조혈-자극 단백질 (예를 들어 Aranesp®)이다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 항암 사이토카인, 케모카인, 또는 이의 조합물일 수 있다. 적절한 사이토카인 및 성장 인자의 예로는 IFNγ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (예를 들어, INFα2b), IFNβ, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스팀(ancestim), 및 TNFα가 포함된다. 적절한 케모카인에는 Glu-Leu-Arg (ELR)-음성 케모카인 예컨대 IP-10, MCP-3, MIG, 및 인간 CXC 및 C-C 케모카인 족으로부터의 SDF-1α가 포함될 수 있다. 적절한 사이토카인에는 사이토카인 유도체, 사이토카인 변이체, 사이토카인 단편, 및 사이토카인 융합 단백질이 포함된다.
본원에서의 천연-발생 펩티드-코딩 핵산이 수반되는 이러한 방법 또는 용도 및 기타 방법 또는 용도는 별법적으로 또는 추가적으로 "유전자 활성화" 및 상동성 재조합 유전자 상향조절 기술에 의해, 예컨대 미국 특허 5,968,502, 미국 특허 6,063,630 및 미국 특허 6,187,305 및 EP 0505500에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 Fcα 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조정하는, 예를 들어 증강시키거나 억제하는 작용제일 수 있다. 이러한 용도에 적절한 작용제의 예로는 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-6 (IL-6), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 예컨대 필그라스팀 (Neupogen®) 및 페그필그라스팀 (Neulasta®), 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 예컨대 사르그라모스팀 (Leukine®), 인터페론-γ (IFN-γ), 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 포함된다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 세포 주기 제어/세포자멸사 조절인자 (또는 "조절제")일 수 있다. 세포 주기 제어/세포자멸사 조절인자에는 (i) 세포 주기 제어/세포자멸사 조절인자를 표적으로 하고 이를 조정하는 분자, 예컨대 cdc-25 (예컨대 NSC 663284), (ii) 세포 주기를 과잉자극하는 사이클린-의존적 키나제 (예컨대 플라보피리돌 (L868275, HMR1275), 7-히드록시스타우로스포린 (UCN-01, KW-2401), 및 로스코비틴 (R-로스코비틴, CYC202)), 및 (iii) 텔로머라제 조정인자 (예컨대 B1BR1532, SOT-095, GRN163 및 미국 특허 6,440,735 및 미국 특허 6,713,055에 예를 들어 기술된 조성물)가 포함된다. 세포자멸사성 경로를 방해하는 분자의 예로는 TNF-관련 세포자멸사-유도 리간드 (TRAIL)/세포자멸사-2 리간드 (Apo-2L), NF-κB 차단을 유도하여 IL-6 생산 억제에 이르는 작용제, TRAIL 수용체를 활성화시키는 항체, IFN, 안티-센스 Bcl-2, 및 As2O3 (삼산화비소, Trisenox®)가 포함된다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 호르몬 조절제, 예컨대 항-안드로겐 및 항-에스트로겐 요법에 유용한 작용제일 수 있다. 이같은 호르몬 조절제의 예는 타목시펜, 이독시펜, 풀베스트란트, 드롤록시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 디에틸스틸베스트롤, 에티닐 에스트라디올/에스티닐, 항-안드로겐제 (예컨대 플루타미드/에울렉신), 프로게스틴 (예컨대 히드록시-프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론/프로베라, 메게스트롤 아세테이트//메게이스), 아드레노코르티코스테로이드 (예컨대 히드로코르티손, 프레드니손), 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (및 이의 유사체 및 기타 LHRH 작동제 예컨대 부세렐린 및 고세렐린), 아로마타제 억제제 (예컨대 아나스트라졸/아리미덱스, 아미노글루테티미드/시트라덴, 엑세메스탄), 호르몬 억제제 (예컨대 옥트레오티드/산도스타틴) 및 유사한 작용제이다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 항-무력증 작용제 (예를 들어, 종양 및 암 항원에 대한 내성을 차단하는 소형 분자 화합물, 단백질, 당단백질 또는 항체)일 수 있다. 이같은 화합물의 예는 CTLA-4의 활성을 차단하는 분자, 예컨대 MDX-010 ([Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)])이다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 종양 억제제 유전자-함유 핵산 또는 벡터 예컨대 인간 재조합 야생형 p53/SCH58500를 코딩하는 복제-결핍 아데노바이러스 등; 종양유전자, 돌연변이 유전자 또는 조절되지 않는 유전자를 표적으로 하는 안티센스 핵산; 또는 돌연변이되거나 조절되지 않는 유전자를 표적으로 하는 siRNA일 수 있다. 종양 억제제 표적의 예로는, 예를 들어, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1, 및 DCC가 포함된다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 항암 핵산, 예컨대 제나센스 (오그메로센/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (리포솜 캡슐화 c-raf 안티센스 올리고뉴클레오티드/ISIS-5132), MG98, 및 PKCα, 클러스테린, IGFBP, 단백질 키나제 A, 시클린 D1 또는 Bcl-2h를 표적으로 하는 기타 안티센스 핵산일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 억제성 항암 RNA 분자일 수 있다 (예를 들어 [Lin et al., Curr Cancer Drug Targets. 1(3), 241-7 (2001)], [Erratum in: Curr Cancer Drug Targets. 3(3), 237 (2003)], [Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004)], [Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004)], [Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003)], [Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003)] 및 [Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)] 참조).
본 발명의 조성물 및 조합 투여 방법은 이같은 암 항원/종양-관련 항원을 코딩하는 네이키드 DNA 백신과 같은 핵산 백신의 투여를 또한 포함한다 (예를 들어 미국 특허 5,589,466, 미국 특허 5,593,972, 미국 특허 5,703,057, 미국 특허 5,879,687, 미국 특허 6,235,523, 및 미국 특허 6,387,888 참조). 한 실시양태에서, 조합 투여 방법 및/또는 조합 조성물은 자가 백신 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 조합 조성물 및/또는 조합 투여 방법은 전체 세포 백신 또는 사이토카인-발현 세포 (예를 들어 재조합 IL-2 발현 섬유아세포, 재조합 사이토카인-발현 수지상 세포 등)를 포함한다 (예를 들어 [Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003)], [Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002)] 및 [Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002)] 참조). 본 발명의 조합 방법에서 유용할 수 있는 이같은 자가 세포 접근법의 또다른 예는 MyVax® 개인화 면역요법(Personalized Immunotherapy) 방법 (기존에 GTOP-99로 지칭됨) (Genitope Corporation - Redwood City, CA, USA)이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP가 바이러스, 바이러스 단백질 등과 조합되거나 또는 공동-투여되는 조합 조성물 및 조합 투여 방법을 제공한다. 생체 내에서 오직 1회 또는 수 회만 복제될 수 있고 종양 세포에 표적화된 복제-결핍 바이러스가 예를 들어 이같은 조성물 및 방법의 유용한 성분일 수 있다. 이같은 바이러스 작용제는 면역자극제, 예컨대 GM-CSF 및/또는 IL-2를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있거나, 또는 이와 회합될 수 있다. 천연적인 종양용해 바이러스 및 재조합 종양용해 바이러스 (예를 들어 HSV-1 바이러스, 레오바이러스, 복제-결핍 및 복제-민감성 아데노바이러스 등) 모두가 이같은 방법 및 조성물의 유용한 성분일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP가 종양용해 바이러스와 조합되거나 이와 공동-투여되는 조합 조성물 및 조합 투여 방법을 제공한다. 이같은 바이러스의 예로는 종양용해 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스가 포함되고, 이는 변형된 바이러스일 수 있거나, 변형된 바이러스가 아닐 수 있다 (예를 들어 [Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003)], [Stiles et al., Surgery. 134(2), 357-64 (2003)], [Sunarmura et al., Pancreas. 28(3), 326-9 (2004)], [Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004)], [Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002)], [Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999)], [Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004)] 및 [Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001)] 참조).
본 발명의 조합 조성물 및 조합 투여 방법에는 "전체 세포" 및 "입양" 면역요법이 또한 수반될 수 있다. 예를 들어, 이같은 방법은 면역계 세포 (예를 들어 종양-침윤성 림프구 (TIL), 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 (예를 들어 종양-특이적 항원 및/또는 유전적 증강으로 확장된 T 세포), 항체-발현 B 세포 또는 기타 항체 생산/제시 세포, 수지상 세포 (예를 들어, 항-사이토카인 발현 재조합 수지상 세포, DC-확장제 예컨대 GM-CSF 및/또는 Flt3-L과 함께 배양된 수지상 세포, 및/또는 종양-관련 항원-로딩 수지상 세포), 항-종양 NK 세포, 소위 하이브리드 세포, 또는 이의 조합물의 주입 또는 재주입을 포함할 수 있다. 세포 용해물이 이같은 방법 및 조성물에서 또한 유용할 수 있다. 이같은 양상에서 유용할 수 있는 임상 시도 중인 세포형 "백신"에는 Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics), 및 Melacine® 세포 용해물이 포함된다. 백반과 같은 보조제와 임의로 부가혼합된, 암 세포로부터 쉐딩(sheding)된 항원 및 이의 혼합물 (예를 들어 [Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001] 참조)이 또한 이같은 방법 및 조합 조성물에서의 성분일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 내부 백신화 방법의 적용과 함께 환자에게 전달될 수 있다. 내부 백신화는 (i) 전체적인 종양 세포 또는 (ii) (a) 분비된 단백질, 당단백질 또는 기타 생성물, (b) 막-회합 단백질 또는 당단백질 또는 막과 회합되거나 막에 삽입된 기타 성분, 및/또는 (c) 세포내 단백질 또는 기타 세포내 성분을 포함하는 부분적인 종양 세포에 대해 지시된 면역 응답의 도출에 전형적으로 이르는 환자 내에서의 유도된 종양 또는 암 세포 사망, 예컨대 종양 세포의 약물-유도 또는 방사선조사-유도 세포 사망을 지칭한다. 내부 백신화-유도 면역 응답은 체액성 (즉 항체-보체 매개), 또는 세포-매개성 (예를 들어, 내부적으로 죽은 종양 세포 또는 이의 일부를 인식하는 내인성 세포독성 T 림프구의 발생 및/또는 증가)일 수 있다. 방사선요법에 더하여, 상기 종양 세포-사망 및 내부 백신화를 유도하는데 사용될 수 있는 약물 및 작용제의 비제한적인 예는 통상적인 화학요법제, 세포-주기 억제제, 항-혈관형성 약물, 모노클로날 항체, 세포자멸사-유도제, 및 신호 전달 억제제이다.
상기 기술된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 또다른 항암제의 예는 분화 유도체, 레티노산 및 레티노산 유사체 (예컨대 모든 트랜스 레티노산, 13-시스 레티노산 및 유사한 작용제), 비타민 D 유사체 (예컨대 세오칼시톨 및 유사한 작용제), ErbB3, ErbB4, IGF-IR, 인슐린 수용체, PDGFRa, PDGFR베타, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, AIk, LTK, PTK7의 억제제, 및 유사한 작용제이다.
상기 기술된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 또다른 항암제의 예는 카텝신 B, 카텝신 D 탈수소효소 활성의 조정인자, 글루타티온-S-트랜스페라제 (예컨대 글루타실시스테인 합성효소 및 락테이트 탈수소효소), 및 유사한 작용제이다.
상기 기술된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 또다른 항암제의 예는 에스트라무스틴 및 에피루비신이다.
상기 기술된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 또다른 항암제의 예는 HSP90 억제제 예컨대 17-알릴 아미노 겔드-아나마이신, PSA, CA125, KSA 등과 같은 종양 항원에 대해 지시된 항체, 인테그린 예컨대 인테그린 β1, VCAM의 억제제 및 유사한 작용제이다.
상기 기술된 바와 같은 장애를 치료하기 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제로서 관련될 수 있는 또다른 항암제의 예는 칼시네우린-억제제 (예컨대 발스포다르, PSC 833 및 기타 MDR-1 또는 p-당단백질 억제제), TOR-억제제 (예컨대 시롤리무스, 에베롤리무스 및 라파마이신), 및 "림프구 귀향" 메커니즘의 억제제 (예컨대 FTY720), 및 세포 신호전달에 효과가 있는 작용제 예컨대 부착 분자 억제제 (예를 들어 항-LFA 등)이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 방사선요법을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 방사선요법을 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종의 치료 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종을 치료하기 위해 방사선요법과 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다.
방사선요법은 방사선을 포함할 수 있거나, 또는 방사선약물의 조합 투여가 제공된다. 방사선의 공급원은 치료될 환자에 대해 외부 또는 내부일 수 있다 (방사선 치료는, 예를 들어, 외부 광선 방사선 요법 (EBRT), 근접치료 (BT) 또는 골격 표적화 방사선요법의 형태일 수 있다). 이같은 방법의 실행에서 사용될 수 있는 방사성 원소에는, 예를 들어, 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리쿰-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 요오드-123, 요오드-131, 및 인듐-111이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 자가 말초 줄기 세포 또는 골수 이식과 조합하여 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 자가 말초 줄기 세포 또는 골수 이식과 조합하여 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP을 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종의 치료 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 위해 자가 말초 줄기 세포 또는 골수 이식과 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다
한 실시양태에서, 본 발명은 정형외과적 시술과 조합하여 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 위해 자가 말초 줄기 세포 또는 골수 이식과 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다
정형외과적 시술은 통증을 제어하거나 기능 또는 운동성을 유지시키기 위해 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애, 예컨대 다발성 골수종의 치료에서 사용될 수 있다. 이같은 시술은 물리 치료, 골절을 예방 또는 치료하기 위한 뼈의 부목 고정, 또는 골절을 치유하기 위한 수술 절차 (소수술 또는 대수술)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 CD38BP 또는 조합 조성물이 종양의 내부로 접근하는 것을 촉진하는 1가지 이상의 작용제의 전달과 함께 투여될 수 있다. 이같은 방법은, 예를 들어, 종양을 이완시킬 수 있는 릴랙신의 전달과 함께 수행될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 6,719,977 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 세포 투과 펩티드 (CPP)에 결합될 수 있다. 세포 투과 펩티드 및 관련 펩티드 (예컨대 조작된 세포 투과 항체)가 예를 들어 [Zhao et al., J Immunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001)], [Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000)], [Lindgren et al., Biochem J. 377(Pt 1), 69-76 (2004)], [Buerger et al., J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75 (2003)], [Pooga et al., FASEB J. 12(1), 67-77 (1998)] 및 [Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72 (2002)]에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 1가지 이상의 항염증제를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 1가지 이상의 항염증제를 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종의 치료 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 위해 1가지 이상의 항염증제와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다
한 실시양태에서, 이같은 항염증제는 스테로이드성 약물 및 NSAID (비-스테로이드성 항-염증 약물)로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 항염증제는 아스피린 및 기타 살리실레이트, Cox-2 억제제 (예컨대 로페콕십 및 셀레콕십), NSAID (예컨대 이부프로펜, 페노프로펜, 나프록센, 술린닥, 디클로페낙, 피록시캄, 케토프로펜, 디플루니살, 나부메톤, 에토돌락, 옥사프로진, 및 인도메타신), 항-IL6R 항체, 항-IL8 항체, 항-IL15 항체, 항-IL15R 항체, 항-CD4 항체, 항-CD11a 항체 (예를 들어, 에팔리주맵), 항-알파-4/베타-1 인테그린 (VLA4) 항체 (예를 들어, 나탈리주맵), 염증성 질환의 치료를 위한 CTLA4-Ig, 프레드니솔론, 프레드니손, 질환 변형 항류머티스성 약물 (DMARD) 예컨대 메토트렉세이트, 히드록시클로로퀸, 술파사라진, 피리미딘 합성 억제제 (예컨대 레플루노미드), IL-1 수용체 차단제 (예컨대 아나킨라), TNF-α 차단제 (예컨대 에타네르셉트, 인플릭시맵, 및 아달리무맵) 및 유사한 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 1가지 이상의 면역억제제 및/또는 면역조정제를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 1가지 이상의 면역억제제 및/또는 면역조정제를 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종의 치료 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 위해 1가지 이상의 면역억제제 및/또는 면역조정제와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다
한 실시양태에서, 이같은 면역억제제 및/또는 면역조정제는 시클로스포린, 아자티오프린, 미코페놀산, 미코페놀레이트 모페틸, 코르티코스테로이드 예컨대 프레드니손, 메토트렉세이트, 금 염, 술파살라진, 항말라리아제, 브레퀴나르, 레플루노미드, 미조리빈, 15-데옥시스페르구알린, 6-메르캅토퓨린, 시클로포스파미드, 라파마이신, 타크롤리무스 (FK-506), OKT3, 항-흉선세포 글로불린, 티모펜틴, 티모신-α 및 유사한 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 면역억제제 및/또는 면역조정제는 면역억제성 항체, 예컨대 IL-2 수용체의 p75에 결합하는 항체, 또는 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNγ, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-6; IGF, IGFR1, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a 또는 CD58에 결합하는 항체, 또는 이들의 리간드에 결합하는 항체로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 이같은 면역억제제 및/또는 면역조정제는 가용성 IL-15R, IL-10, B7 분자 (B7-1, B7-2, 이의 변이체, 및 이의 단편), ICOS, 및 OX40, 음성 T 세포 조절인자의 억제제 (예컨대 CTLA4에 대한 항체) 및 유사한 작용제로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 2가지 이상의 면역억제제 및/또는 면역조정제와 함께, 예컨대 프레드니손 및 시클로스포린; 프레드니손, 시클로스포린 및 아자티오프린; 또는 프레드니손, 시클로스포린 및 미코페놀레이트 모페틸과 함께 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 항-C3b(i) 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP 및 항-C3b(i) 항체를 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종의 치료 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다발성 골수종의 치료를 위해 항-C3b(i) 항체와 함께 투여되는 제약 조성물의 제조를 위한 본 발명의 CD38BP의 용도를 제공한다
한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위해 본 발명의 CD38BP와 함께 사용하기 위한 치료제는 히스톤 데아세틸라제 억제제 (예를 들어 페닐부티레이트) 및/또는 DNA 복원제 (예를 들어 DNA 복원 효소 및 관련 조성물 예컨대 디메리신)로부터 선택될 수 있다.
치료적 유효량의 본 발명의 CD38BP의 투여를 포함하는 상기 기술된 바와 같은 장애의 치료를 위한 본 발명의 방법은 항암-지시 광역학 요법 (예를 들어 항암 레이저 요법 (임의로 광감작제의 사용과 함께 실행될 수 있음); 예를 들어 [Zhang et al., J Control Release. 93(2), 141-50 (2003)] 참조), 항암 음파 및 충격파 요법 (예를 들어 [Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)] 참조), 및/또는 항암 기능식품 요법 (예를 들어 [Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34(1) 249-69, viii (2004)] 및 [Rafi, Nutrition. 20(1), 78-82 (2004)] 참조)을 또한 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 CD38BP는 항암-지시 광역학 요법 (예를 들어 항암 레이저 요법 (임의로 광감작제의 사용과 함께 실행될 수 있음)), 항암 음파 및 충격파 요법, 및/또는 항암 기능식품 요법과 함께 투여되는 상기 기술된 바와 같은 장애를 치료하기 위한 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물은 조합 요법에서, 즉 치료될 질환 또는 용태와 관련된?1가지 이상의 작용제와 조합되어, 별도의 제약 조성물로서 또는 상기 기술된 바와 같은 1가지 이상의 추가적인 치료제와 공동-제형된 본 발명의 화합물로 투여될 수 있다. 이같은 조합 요법은 본 발명의 화합물 및/또는 공동-투여되는 작용제의 투여량을 저하시킴으로써, 다양한 단독요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피하는데 필요할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 면역조정제, 예컨대 면역조정 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소 (예컨대 TNF 예컨대 TNFα), 또는 조혈 인자와 접합된 CD38BP를 제공한다. 접합체로서 유용할 수 있는 이같은 분자의 예로는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 및 IL-21, 콜로니 자극 인자 (예컨대 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)), 인터페론 (예컨대 IFNα, IFNβ, 및 IFNγ), "S1 인자"로 명명된 줄기 세포 성장 인자, 및 트롬보포이에틴, 이의 활성 단편, 이의 유도체, 이의 변이체, 또는 이의 임의의 조합물이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 CD38BP는 CD38의 수준, 또는 막 표면 상에 CD38을 함유하는 세포의 수준을 검출함으로써 CD38을 발현하는 활성화된 세포가 발병기전에서 중요한 역할을 하는 질환을 진단하기 위해 생체 내에서 또는 시험관 내에서 사용될 수 있다. 이는 항체와 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에, 테스트할 샘플을, 임의로 대조군 샘플과 함께, CD38BP와 접촉시킴으로써 예를 들어 달성될 수 있다. 그 후, 복합체 형성을 검출한다 (예를 들어, ELISA 사용). 테스트 샘플과 함께 대조군 샘플을 사용하는 경우, 복합체가 양쪽 샘플에서 검출되고, 복합체 형성에서의 임의의 통계학적으로 유의한 샘플들 간의 차이는 테스트 샘플 내의 CD38의 존재를 가리킨다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 침습성 세포 및 조직, 및 본 발명의 CD38BP에 의해 표적화되는 기타 세포의 확인 및 진단, 및 치료 처치의 진행, 처치 후 상태, 발암 위험, 암 진행 등의 모니터링을 위한 방법을 제공한다.
이같은 진단 분석법의 한 예에서, 본 발명은 CD38BP와 잠재적인 CD38 함유 조직 간의 면역복합체를 형성시키는 단계 및 면역복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하고, 면역복합체의 형성이 조직 내의 침습성 세포의 존재와 상관되는, 조직 내의 침습성 세포의 수준을 진단하는 방법을 제공한다. 접촉은 표지된 단리된 항체 및 표준 이미지화 기술을 사용하여 생체 내에서 수행될 수 있거나, 또는 조직 샘플 상에서 시험관 내에서 수행될 수 있다.
CD38BP는 임의의 적절한 기술에 의해 임의의 적절한 생물학적 샘플 내의 CD38-함유 펩티드 및 펩티드 단편을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 통상적인 면역분석법의 예로는 ELISA, RIA, FACS 분석, 플라즈몬 공명 분석, 크로마토그래프 분석, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 및/또는 CD38BP를 사용하는 면역침전이 비제한적으로 포함된다. 본 발명의 항-CD38 항체를 사용하여 인간으로부터 CD38 및 CD38-단편을 검출할 수 있다. 이같은 기술에서 사용되는 적절한 CD38BP용 표지 및/또는 2차 항체에는 다양한 효소, 인공 기, 형광 물질, 발광 물질, 및 방사성 물질이 비제한적으로 포함된다. 적절한 효소의 예로 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고; 적절한 인공 기의 예 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되며; 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되고; 적절한 방사선 물질의 예로는 125I, 131I, 35S, 및 3H가 포함된다.
예를 들어, 검출가능한 물질로 표지된 CD38 펩티드 표준물, 및 표지되지 않은 CD38BP, 예컨대 표지되지 않은 항-CD38 항체를 사용하여 경쟁 면역분석법에 의해 생물학적 샘플 내에서 CD38BP를 또한 분석할 수 있다. 이같은 분석법에서, 생물학적 샘플, 표지된 CD38 펩티드 표준물(들) 및 CD38BP를 합치고, 표지되지 않은 CD38BP에 결합된 표지된 CD38의 양을 검출한다. 생물학적 샘플 내의 CD38 펩티드의 양은 CD38BP에 결합된 표지된 CD38의 양에 반비례할 것이다.
CD38BP는 종양의 생체내 이미지화에 특히 유용하다. CD38과 회합된 종양의 생체내 이미지화는 임의의 적절한 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 99Tc-표지화 또는 또다른 감마선 방출 동위원소로의 표지화가 종양 내의 항-CD38 항체 또는 2차 표지된 (예를 들어, FITC 표지된) CD38BP:CD38 복합체를 표지하는데 사용될 수 있고, 전형적으로 저-에너지, 고해상도 콜리메이터 또는 저-에너지 다목적 콜리메이터를 사용하여, 감마 섬광 카메라 (예를 들어, Elscint Apex 409ECT 장치)로 이미지화될 수 있다. 그 후 염색된 조직을 종양 내의 CD38-회합 펩티드의 양의 지표로서 방사성 카운팅에 대해 평가할 수 있다. 이같은 기술을 사용하여 수득된 이미지를, 예를 들어 CD38 또는 CD38-단편을 침습성 암 세포의 존재에 대한 생체마커(biomarker)로 사용하는 환경에서, 환자, 포유동물 또는 조직 내의 CD38의 생분포를 평가하는데 사용할 수 있다. 이러한 기술에 대한 변형은 자기 공명 이미지화 (MRI)를 사용하여 감마 카메라 기술에 비해 이미지화를 개선시키는 것을 포함한다. 유사한 면역섬광조영술 방법 및 원리가, 예를 들어, [Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988)], [Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990)], 및 [Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman & Hall 1993)]에 기술되어 있다. 이같은 이미지는 본원의 다른 곳에 예들이 기술된 항암제 (예를 들어, 세포자멸사성 작용제, 독소, 또는 CHOP 화학요법 조성물)의 표적화된 전달에 또한 사용될 수 있다. 또한, 이같은 이미지는 또한 또는 별법적으로 종양 제거를 위한 수술 기술에 대한 기초로 사용될 수 있다. 또한, 이같은 생체내 이미지화 기술은 환자에게 종양이 있는 것으로 확인되지만 (또다른 생체마커의 존재, 전이 등으로 인해), 전통적인 분석 기술에 의해 종양을 확인할 수 없는 상황에서 종양이 확인되고 위치가 정해지도록 할 수 있다. 모든 이러한 방법은 본 발명의 양상이다.
본 발명에 의해 제공되는 생체내 이미지화 및 기타 진단 방법은 인간 환자 (예를 들어, 이전에 암으로 진단되지 않은 환자 또는 암으로부터 회복/완화 기간 중인 환자)에서의 미세전이의 검출에 특히 유용하다. 모든 암세포의 90％까지를 구성할 수 있는 암종 암세포가, 예를 들어, 항-CD38 항체 접합체 조성물로 매우 잘 염색되는 것으로 나타났다. 본원에 기술된 모노클로날 항-CD38 항체 및 기타 CD38BP로의 검출은 공격성/침습성인 암종의 존재를 가리킬 수 있고, 또한 또는 별법적으로 이같은 미세전이에 대해 관련된 모노클로날 항-CD38 항체, CD38BP, 또는 관련된 조성물 치료를 사용할 가능성의 지표를 제공할 수 있다. 또한, 암 세포와 회합된 모노클로날 항-CD38 항체는 이같은 암-관련 조직과 다른 형태의 CD38가 회합될 수 있는 정상 세포로부터의 세포를 유리하게 구별할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체가 검출-촉진 방사선비투과제에 접합되고, 접합된 항체가 예컨대 혈류 내로의 주사에 의해 숙주에 투여되고, 숙주 내의 표지된 항체의 존재 및 위치가 분석되는 생체내 이미지화 방법을 제공한다. 이러한 기술 및 본원에서 제공되는 임의의 기타 진단 방법을 통해, 본 발명은 인간 환자 및 인간 환자로부터 취해진 생물학적 샘플 내의 질환-관련 세포의 존재를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
진단용 이미지화를 위해, 방사성 동위원소가 직접적으로 또는 매개 관능기에 의해 간접적으로 CD38BP에 결합될 수 있다. 유용한 매개 관능기에는 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산이 포함된다 (예를 들어 미국 특허 5,057,313 참조). 방사성 동위원소-접합 CD38BP가 수반되는 이같은 진단 분석법에서, 전형적으로 환자에게 전달되는 접합된 펩티드의 투여량은 검출 및 정확한 측정을 허용할, 최소 반감기, 최소 신체 잔류 및 최소 동위원소량의 최적의 조합을 위한 동위원소의 선택을 통해 가능한 한 낮은 수준으로 유지된다.
방사성 동위원소 및 방사선비투과제에 더하여, 염료 (예컨대 비오틴-스트렙타비딘 복합체), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 자기 공명 이미지화 (MRI)용 증강제 (예를 들어 상자성 이온)에 접합된 CD38BP를 사용하여 진단 방법이 수행될 수 있다 (예를 들어, MRI 기술 및 MRI 증강제에 접합된 항체의 제조가 기술된 미국 특허 6,331,175 참조). 이같은 진단/검출제는 자기 공명 이미지화에서 사용하기 위한 작용제, 및 형광 화합물로부터 선택될 수 있다. CD38BP, 예컨대 항체에 방사성 금속 또는 상자성 이온이 있는 성분을 로딩하기 위해, 이를 이온 결합을 위한 다수의 킬레이트화 기가 부착된 긴 꼬리가 있는 시약과 반응시키는 것이 필요할 수 있다. 이같은 꼬리는 중합체 예컨대 폴리라이신, 다당류, 또는 포르피린, 폴리아미드, 크라운 에테르, 비스티오세미카르바존, 폴리옥심, 및 이러한 목적에 유용한 것으로 공지된 유사한 기와 같은 킬레이트화 기가 결합될 수 있는 펜던트 기가 있는, 기타 유도체화된 또는 유도체화가능한 사슬일 수 있다. 표준 화학을 사용하여 킬레이트가 CD38BP에 커플링될 수 있다. 일반적으로 킬레이트는 면역반응성을 최소한도로 손실시키고 응집 및/또는 내부 가교를 최소화시키면서 분자에 대한 결합을 형성할 수 있는 기에 의해 CD38BP, 예컨대 항-CD38 mAB에 연결된다. 킬레이트를 항체에 접합시키기 위한 더욱 일반적인 또다른 방법 및 시약이 예를 들어 미국 특허 4,824,659에 개시되어 있다. 가능한 유용한 금속-킬레이트 조합의 예로는 방사선-이미지화를 위한 60 내지 4,000 keV의 일반적인 에너지 범위 내의 진단용 동위원소, 예컨대 125I, 123I, 124I, 62Cu, 64Cu, 18F, 111In, 67Ga, 67Ga, 99Tc, 94Tc, 11C, 13N, 15O, 및 76BR과 함께 사용되는, 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 시클로헥실 유사체가 포함된다. 이러한 킬레이트 및 유사한 킬레이트는, 비-방사성 금속, 예컨대 망간, 철 및 가돌리늄과 착물을 형성한 경우, CD38BP와 함께 MRI 진단 방법에 유용할 수 있다. 거대고리형 킬레이트 예컨대 NOTA, DOTA, 및 TETA는 다양한 금속 및 방사선금속, 가장 특히 각각 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사선 핵종과 함께 사용된다. 이같은 금속-킬레이트 착물은 고리 크기를 당해 금속에 맞춤으로써 매우 안정적으로 만들어질 수 있다. 핵종, 예컨대 RAIT용 223Ra를 안정적으로 결합시키는데 흥미로운 기타 고리-유형 킬레이트 예컨대 거대고리형 폴리에테르가 진단 방법에 또한 적절할 수 있다.
따라서, 본 발명은 CD38BP가 조영제 (예컨대 자기 공명 이미지화, 전산화 단층촬영, 또는 초음파 조영-증강제를 위한 조영제), 또는 예를 들어, 감마-, 베타-, 알파-, 오거 전자-, 또는 양전자-방출 동위원소일 수 있는 방사성 핵종에 접합된 진단용 CD38BP 접합체를 제공한다. 추가적인 유용한 접합 CD38BP가 본원의 다른 곳에서 기술되고, 이는 본 발명에 의해 제공되는 진단 방법 및 조성물 (예를 들어, 진단 키트)에 또한 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체를 포함하는 컨테이너, 및 CD38 펩티드에 대한 CD38BP의 결합을 검출하기 위한 1가지 이상의 시약을 포함하는 암진단용 키트를 제공한다. 시약은, 예를 들어, 형광 택, 효소 택 또는 기타 검출가능한 택을 포함할 수 있다. 또한 시약은 효소 반응을 위한 2차 또는 3차 항체 또는 시약을 포함할 수 있고, 이때 효소 반응으로 가시화될 수 있는 생성물이 생산된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 적절한 컨테이너(들) 내의 표지된 형태 또는 표지되지 않은 형태의 1가지 이상의 본 발명의 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체, 간접 분석용 인큐베이션을 위한 시약, 및 표지의 성질에 좌우되는, 이같은 분석에서의 검출을 위한 기질 또는 유도체화제를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 대조군 시약(들) 및 사용 설명서가 또한 포함될 수 있다.
진단 키트는 세포 활성의 검출 또는 조직 샘플 또는 숙주 내의 CD38 펩티드의 존재의 검출을 위해 접합/표지 항-CD38 항체와 같은 CD38BP와 사용하는데 또한 공급될 수 있다. 이같은 진단 키트, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에서 기술된 치료 용도용 키트에서, 전형적으로 CD38BP는, 단독으로 또는 표적 세포 또는 펩티드에 특이적인 추가적인 항체와 함께, 컨테이너 내의 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 제약상 허용가능한 담체 (예를 들어, 불활성 담체) 및/또는 이의 성분, 예컨대 트리스(Tris), 포스페이트, 또는 카르보네이트 완충제, 안정화제, 방부제, 살생물제, 살생물제, 불활성 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 등 (전형적으로, 혼합을 위한 별도의 컨테이너 내에 포함됨), 및 추가적인 시약 (또한 전형적으로 별도의 컨테이너(들)에 포함됨)이 또한 포함될 수 있다. 특정 키트에서, 항-CD38 항체 또는 기타 CD38BP에 결합할 수 있는 2차 항체가 또한 포함되고, 이는 전형적으로 별도의 컨테이너 내에 존재한다. 2차 항체는 본 발명의 항-CD38 항체 또는 기타 본 발명의 CD38BP와 유사한 방식으로 전형적으로 표지에 접합되고 제형된다.
상기 및 본원의 다른 곳에 기술된 방법을 사용하여, 암/종양 세포의 부분집합을 한정하고 이같은 세포 및 관련 조직/성장의 성장을 특징화하는데 CD38BP를 사용할 수 있다.
한 예에서, CD38BP 또는 항-CD38 항체가 니트로셀룰로스 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정할 수 있는 기타 고체 지지체에 첨가될 수 있다. 이어서 지지체를 적절한 완충제로 세정한 후, 검출가능하게 표지된 CD38 펩티드 또는 항체로 처리한다. 이어서 고체 상 지지체를 완충제로 2차 세정하여, 결합되지 않은 펩티드 또는 항체를 제거한다. 이어서 고체 지지체 상의 결합된 표지의 양을 공지된 방법 단계에 의해 검출할 수 있다.
노출된 기질과 반응하는 연결된 효소를 화학 부분을 생성시키는데 사용할 수 있고, 이러한 부분을, 예를 들어 분광광도분석, 형광측정 또는 가시적 수단에 의해, CD38BP 접합체 및/또는 융합 단백질의 관점에서 검출할 수 있다. CD38BP 및 항-CD38 항체를 검출가능하게 표지시키는데 사용될 수 있는 효소에는 말레이트 탈수소효소, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이성화효소, 효모 알콜 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이성화효소, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 산화효소, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제, 및 아세틸콜린에스테라제가 포함된다. CD38BP를 형광 화합물로 또한 표지시킬 수 있다. 형광 표지된 항체가 적절한 파장의 빛에 노출되는 경우, 형광으로 인해 이의 존재를 검출할 수 있다. 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 형광아민이 가장 통상적으로 사용되는 형광 표지 화합물이다.
형광-방출 금속 예컨대 152Eu, 또는 란탄 계열의 기타 물질을 사용하여 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체가 또한 검출가능하게 표지될 수 있다. 이러한 금속은, 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)와 같은 금속 킬레이트화 기를 사용하여 항-CD38 항체에 부착될 수 있다.
화학발광 화합물에 커플링시킴으로써 CD38BP 및 항-CD38 항체가 또한 검출가능하게 표지될 수 있다. 이어서 화학발광적으로 표지된 CD38-BP의 존재가 화학 반응이 진행되는 동안 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 써로매틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염, 및 옥살레이트 에스테르이다.
마찬가지로, 생물발광 화합물을 사용하여 CD38BP를 표지시킬 수 있다. 생물발광은 촉매적 단백질이 화학발광 반응의 효능을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학발광의 유형이다. 발광의 존재를 검출함으로써 생물발광 단백질의 존재가 결정된다. 표지 목적을 위한 중요한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 애큐오린이다.
표지된 펩티드 또는 항체, 항체 단편 또는 유도체의 검출은 예를 들어 검출가능한 표지가 방사성 감마 방출체인 경우 섬광 카운터에 의해, 또는 예를 들어 표지가 형광 물질인 경우 형광계측기에 의해 달성될 수 있다. 효소 표지의 경우, 효소에 대한 기질을 사용하는 비색법에 의해 검출이 달성될 수 있다. 유사하게 제조된 표준물질과 비교하여 기질의 효소 반응 정도를 시각적으로 비교함으로써 검출이 또한 달성될 수 있다.
이러한 진단 기술 및 기타 진단 기술을 사용하여 CD38 펩티드 또는 CD38-단편에 대한 임의의 적절한 물질을 스크리닝할 수 있다. 스크리닝될 수 있는 물질의 예로는 혈액, 혈청, 림프, 소변, 염증성 삼출물, 뇌척수액, 양수, 조직 추출물 또는 균질화물이 예를 들어 포함된다. 그러나, 본 발명은 이러한 샘플들만을 사용하는 분석에 한정되지 않고, 당업자는 또다른 샘플이 사용되도록 하는 적절한 조건을 결정할 수 있다.
조직학적 검사물을 환자로부터 제거하고, 본 발명의 표지된 CD38BP, 예컨대 항-CD38 항체를 이같은 검사물에 제공함으로써 원위치(in situ) 검출이 달성될 수 있다. 본 발명의 표지된 CD38BP, 예컨대 표지된 항-CD38 항체 (또는 단편)를 생물학적 샘플에 가하거나 덮어씌움으로써 본 발명의 CD38BP, 항-CD38-항체 (또는 단편)가 제공될 수 있다. 이같은 절차를 사용함으로써, CD38 또는 CD38-단편의 존재뿐만 아니라, 시험된 조직 내의 이같은 펩티드의 분포를 또한 결정할 수 있다 (예를 들어, 암 세포의 확산을 평가하는 환경에서). 본 발명을 사용하여, 당업자는 이같은 원위치 검출을 달성하기 위해 임의의 광범위한 조직학적 방법 (예컨대 염색 절차)이 변형될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
본 발명은 잠재적으로 중요한 임의의 개인 또는 실체 (예컨대 제약 체인, 처방 관리자, 보험 회사, HMO, 병원 및 병원 체인, 기타 건강 관리 회사, 약국 이윤 관리자, 잠재적인 환자, 암 환자, 기존의 암 환자, 완화 중인 환자, 1차 진료의, 간호사, 약사, 및/또는 주요 여론 주도층)에게 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 임의의 용태 또는 용태들의 조합의 예방 또는 치료에서 화합물을 사용하는 것에 관한 정보를 배포하는 것 (예컨대 핸드-아웃, 우편 등으로 제공되는 인쇄물에 의해, 광고 신호에 의해, 텔레비젼 프로그램 및 광고에 의해, 라디오 프로그램 및 광고에 의해, 인터넷 사이트 포스팅에 의해, 이메일에 의해, 통신판매에 의해, 호별 또는 직접 대면 마케팅에 의해, 컨퍼런스, 패널, 포럼 등을 자금지원 및/또는 주최함으로써, 판매원 및/또는 의학/과학 교섭자의 서비스를 고용 및/또는 계약함으로써, 이같은 용도와 관련된 과학 연구 및 간행물을 자금지원 및/또는 주최함으로써 등)을 포함하는, 본 발명의 CD38BP의 판매 및/또는 사용을 촉진하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 본 발명의 화합물의 제약 조성물 및 사용설명서를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 키트는 1가지 이상의 추가적인 작용제, 예컨대 상기 기술된 바와 같은 면역억제제, 화학요법제, 항염증제 또는 방사선독성제, 또는 1가지 이상의 추가적인 본 발명의 CD38BP (예컨대 보체 활성을 갖는 CD38BP)를 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 진단제 및/또는 기타 치료제를 또한 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 키트는 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 장애의 상태 또는 존재를 진단하기 위한 진단 방법에서 사용될 수 있는 본 발명의 CD38BP 및 진단제를 포함한다. 한 실시양태에서, 키트는 주사용 조성물을 형성하도록 고도로 안정적인 조성물과 혼합될 수 있는 제약상 허용가능한 담체(들)과 조합된 고도로 안정적인 형태 (예컨대 동결건조 형태)의 본 발명의 CD38BP를 포함한다.
본원에서 인용된, 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참조문헌은 각각의 참조문헌이 본원에 전체적으로 거명에 의해 포함되고 기재되는 것으로 개별적으로, 그리고 명확하게 지시되는 것과 동일한 정도로 거명에 의해 본원에 포함된다.
모든 제목 및 소제목은 편의를 위해서만 본원에서 사용되고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
상기 기술된 요소들의 모든 가능한 변형에서의 임의의 조합은 본원에서 달리 지시되거나 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
본 발명을 기술하는데 있어서 정관사 및 부정관사 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에서 달리 지시되거나 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서의 값들의 범위의 상술은, 달리 지시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 것의 약기(略記) 방법으로 작용하는 것으로 단지 의도되고, 각각의 별도의 값은 본원에서 개별적으로 상술되는 것처럼 명세서 내로 포함된다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 제공된 모든 정확한 값은 상응하는 근사값을 표시한다 (예를 들어, 특정 인자 또는 측정에 관해 제공되는 모든 정확한 예시적인 값은 적합한 경우 "약"으로 수식되는 상응하는 근사 측정을 또한 제공하는 것으로 간주될 수 있다).
본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되거나 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다.
본원에서 제공된 임의의, 그리고 모든 예, 또는 예시적 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더욱 양호하게 조명하기 위해 의도되고, 달리 지시되지 않는 한 본 발명의 범주에 제한을 두지않는다. 명세서 내의 언어는 임의의 요소가 본 발명의 실행에 필수적인 것을 가리키는 것으로, 명확하게 이처럼 언급되지 않는 한, 해석되지 않아야 한다
본원에서의 특허 문서의 인용 및 포함은 편의를 위해서만 이루어지고, 이러한 특허 문서의 어떠한 관점의 타당성, 특허가능성, 및/또는 시행가능성도 반영하지 않는다.
요소(들)에 관하여 "포함하는", "갖는", "포함되는" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용하는 본 발명의 임의의 실시양태의 본원에서의 기술은, 달리 언급되거나 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한, 이러한 특정 요소(들)로 "구성되는", "본질적으로 구성되는" 또는 "실질적으로 이루어지는" 본 발명의 유사한 실시양태에 대한 원조를 제공하기 위해 의도된다 (예를 들어, 특정 요소를 포함하는 것으로 본원에 기술된 조성물은, 달리 언급되거나 문맥적으로 명백하게 모순되지 않는 한, 이러한 요소로 구성되는 조성물을 또한 기술하는 것으로 이해되어야 한다).
본 발명은 적용가능한 법이 허용하는 최대 범위로 본원에서 제시된 실시양태에 상술된 내용의 모든 변형 및 등가물을 포함한다.
본원에서 인용된 모든 특허, 계류 중인 특허 출원 및 기타 간행물은 거명에 의해 본원에 전체적으로 포함된다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이는 추가적인 제한으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
루시페라제 -형질감염 ( Daudi - luc ) 세포의 제작
Daudi 세포 (버킷 림프종으로부터 유래됨)의 배양물을 10％ FCS (Optimum C241, Wisent Inc., St. Bruno, QC, Canada), 2 mM L-글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨 (모두 Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Scotland)이 보충된 RPMI 1640 배양 배지에서 배양하였다. 배지를 일주일에 2회씩 새롭게 하였다. 형질감염 전에, 세포를 나누고, 1 ㎖ 당 1-1.5×106 개의 세포로 파종하여, 생존력 및 최적의 성장을 확실하게 하였다.
루시페라제 형질감염
8.2×106개의 CD38+ Daudi 세포를 350 ㎕ RPMI (10％ dFCS (Gibco BRL)가 보충됨)에 용해시키고, 전기천공 큐벳 (Biorad, Hemel Hempstead, Herts, UK)으로 옮겼다. 그 후, GTS (Aidevron, Fargo, ND, USA)로부터의 gWIZ 루시페라제 40 ㎍ 및 푸로마이신 내성을 부여하는 pPur 벡터 (BD Biosciences, Alphen a/d Rijn, The Netherlands) 10 ㎍을 첨가하였다. 세포를 얼음 상에서 10분 동안 휴지시킨 후, 세포를 전기천공시켰다 (250 V, 950 μF; Gene Pulser II, Biorad Laboratories GmbH, Muenchen, Germany). 다시 세포를 얼음 상에서 휴지시키고, 40 ㎖ RPMI (10 ％ FCS가 보충됨)에 용해시켰다. 그 후, 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트 (웰 당 100 ㎕)에 플레이팅하였다. 48시간 후에, 푸로마이신 (최종 농도: 1 ㎍/㎖; Sigma-Aldrich Chemie BV, Zwijndrecht, The Netherlands)을 첨가하였다. 푸로마이신-내성 클론을 24-웰 조직 배양 플레이트에서 추가로 배양하였다.
루시페라제 활성의 결정
세포의 루시페라제 활성을 루시페라제 분석 시스템 (#E4030, Promega, Madison, Wl, USA)을 사용하여 결정하였다. 1×105개의 세포를 에펜도르프 원심분리기에서 원심분리하고 (13,500 rpm, 1분), 펠렛을 100 ㎕ PBS으로 용해시켰다. 원심분리 (13,500 rpm, 1분) 후, 펠렛을 20 ㎕ 리포터 용해 완충제(Reporter Lysis Buffer) (Promega)로 용해시키고, 동결 및 해동시켰다. 원심분리 (13,500 rpm, 1분) 후, 20 ㎕ 상청액을 따라내고, 100 ㎕ 루시페라제 분석 시약을 첨가하였다 (특수 발광측정기 튜브 (Promega) 내에서). 발광측정기 (LB9507, Berthold, Vilvoorde, Belgium)에서 발광을 측정하였다 (10초).
실시예 2
마우스의 면역화 및 하이브리도마의 생성
-003에 대한 면역화 프로토콜
HCo12 마우스를 2주에 한번씩 20 ㎍의 정제된 HA-CD38로 면역화시켰다. 100 ㎕ 완전 프로인트 애쥬번트 (CFA)와 혼합된 100 ㎕ PBS의 존재 하에 복강 내로 1차 면역화가 수행되었다. 이러한 1차 면역화 후, 정제된 HA-CD38로의 후속 부스트 (13×)를 100 ㎕ 불완전 프로인트 애쥬번트 (IFA)와 혼합된 100 ㎕ PBS의 존재 하에 피하 주사 및 복강내 주사를 번갈아서 수행하였다. 역가 발생 후, 마우스를 PBS 내의 HA-CD38 20 ㎍으로 정맥 내로 부스팅하였다.
-005 및 -024에 대한 면역화 프로토콜
HCo12 마우스를 2주에 한번씩 20 ㎍의 정제된 HA-CD38 및 NIH-3T3-CD38 형질감염 세포로 번갈아 면역화시켰다. 100 ㎕ CFA와 혼합된 100 ㎕ PBS 내의 5×106개의 세포로 복강 내로 1차 면역화가 수행되었고, 100 ㎕ IFA와 혼합된 100 ㎕ PBS의 존재 하에 HA-CD38로 피하 주사로 2차 및 후속 면역화가 수행되었다. 형질감염된 세포로의 후속 면역화가 200 ㎕ PBS의 존재 하에 수행되었다. 역가 발생 후, 마우스를 PBS 내의 20 ㎍ HA-CD38로 정맥 내로 부스팅하였다.
CD38 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
HCo12 마우스로부터 마우스 비장세포를 단리하고, 표준 프로토콜을 기초로 PEG와 함께 마우스 골수종 세포주에 융합시켰다. 생성된 하이브리도마를 ELISA에 의해 인간 항체 생산에 대해, 그리고 FACS 분석에 의해 인간 CD38-형질감염 NS/0 세포를 사용하여 CD38 특이성에 대해, 그리고 ELISA에 의해 재조합 HA-CD38 단백질 결합에 대해 스크리닝하였다. 인간 모노클로날 항-CD38 항체인 -003, -005 및 -024를 각각 발현하는 3가지 하이브리도마 세포주를 선별하였다.
실시예 3
CD38 로의 NIH 세포의 형질감염
NIH-3T3-CD38 세포 생산용 벡터 (pclpuroCD38)를 M. Glennie 교수 (Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, UK)로부터 수득하였다. NIH-3T3 세포 (DSMZ, ACC 59; 웰 당 150,000개의 세포; 0.5 ㎖; 96-웰 편평바닥 플레이트, Greiner)를 DMEM (글루코스 [4.5 g/ℓ], 10％ FCS, L-글루타민, Na-피루베이트가 보충됨; BioWhittaker) 내에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서, DNA (0.8 ㎍) 및 리포펙타민 (Invitrogen, Breda, The Netherlands)을 DMEM에서 희석하고, 혼합하였다 (20분, 실온). 그 후, 혼합물 (100 ㎕)을 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션하였다 (하룻밤 동안, 37℃).
CD38 발현에 대한 스크리닝
NIH-3T3-CD38 세포를 세정하고 (1 ㎖ PBS), 트립신 (200 ㎕, 트립신-EDTA, BioWhittaker)으로 처리하였다. 이어서, 1 ㎖의 DMEM을 첨가하고, 혼합물을 FACS 튜브 내로 피펫팅하였다. 원심분리 (1200 rpm, 5분) 후, 세포를 FACS 완충제 (FB; PBS, 0.05％ BSA, 0.02％ NaN3)에서 세정하고, 1 ㎖ FB에 재현탁시켰다. 원심분리 (1200 rpm, 5분) 후, 상청액을 제거하고, 마우스 항-인간 CD38-PE를 첨가하였다 (1/50 희석, Sanquin, Amsterdam, The Netherlands). 세포를 FB에서 세정한 후, 세포를 유동 세포측정법에 의한 획득을 위해 FB에 재현탁시켰다.
확장 및 선별
트립신 처리 후, 세포를 T25 플라스크 (Greiner) 내의 DMEM (글루코스 4.5 g/ℓ, 2 mM L-글루타민, 및 푸로마이신 (2 ㎍/㎖)이 보충됨; BioWhittaker)로 옮겼 다. 푸로마이신-함유 배지에서의 2주 후, 유동 세포측정법에 의해 푸로마이신-내성 세포를 안정적인 CD38 발현에 대해 테스트하였다. 선택된 NIH-3T3-CD38 세포를 한계 희석에 의해 서브클로닝하였다. 이러한 세포들을 확장시킨 후, 모두 15개의 NIH-3T3-CD38 클론을 CD38 발현에 대해 테스트하였다. 사용할 때까지 고-CD38 NIH-3T3-CD38 세포를 액체 질소 (-80℃)에서 동결시켰다.
NIH -3 T3 - CD38 세포의 배양
세포를 DMEM (글루코스 (4.5 g/ℓ), 10％ FCS, 2 mM L-글루타민, Na-피루베이트, 페니실린, 스트렙토마이신이 보충됨)에서 배양하였다. 트립신/EDTA을 사용하여 세포를 2주에 한번씩 계대시키고, T75 플라스크에 플라스크 당 1×106개의 세포로 파종하였다. 사용할 때까지 고-CD38 NIH-3T3-CD38 세포를 액체 질소 (-80℃)에서 동결시켰다.
HA - CD38 항원의 정제
세파로스 4B (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)를 항-CD38 항체 (Serotec, Oxford, UK)와 커플링시켰다. 컬럼 (컬럼 튜브 HR5/20이 12 cm 층 높이로 충전됨; 컬럼 부피 2.4 ㎖; 최대 유속 0.5 ㎖/분)을 5배 이상의 컬럼 부피 (CV)의 PBS로 평형화시켰다. 샘플을 여과하고, 컬럼에 로딩하였다. 신호가 기준선으로 돌아올 때까지 컬럼을 PBS로 세정하였다 (약 3 CV). pH 2의 0.1 M 글리신으로 용출시켰다. 용출된 분획을 1％ (v/v) 2 M 트리스-HCl, pH 9로 중화시켰다.
항- CD38 항체의 정제
인간 항-CD38 항체를 조직 배양 상청액으로부터 정제하였다. 먼저, 상청액을 0.20 μM 데드-엔드(dead-end) 필터로 여과하였다. 이어서, 상청액을 5 ㎖ 단백질 A 컬럼 (rProtein FF, Amersham Bioscience) 상에 로딩하고, 0.1 M 시트르산-NaOH, pH 3로 용출시켰다. 용출액을 즉각적으로 2M 트리스-HCl, pH 9로 중화시키고, 하룻밤 동안 12.6 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.4 (B. Braun, Oss, The Netherlands)에 대해 투석하였다. 투석 후, 샘플을 0.20 μM 데드-엔드 필터로 멸균 여과하였다.
His - CD38 뱃치의 정제
CD38의 세포외 도메인에 대한 서열을 함유하는 DNA 구축물로, 단백질이 His-CD38-발현 세포의 세포 배양 상청액 내에 존재하였다. 추가적인 폴리-His-택 서열이 구축물 내에 포함되어, 단백질의 N-말단에 존재하였다. 이러한 택은 고정된 금속 친화 크로마토그래피로의 정제를 가능하게 하였다. 이러한 공정에서, 크로마토그래프 수지 상에 고정된 킬레이터가 Co2 + 양이온으로 충전되었다. 특히 6개의 히스티딘 아미노산을 포함하는 아미노산이 Co2 +에 강하게 결합한다. 따라서, His 택이 부착된 CD38 단백질이 이같은 컬럼에 강하게 결합하였고, 배양 상청액 내에 존재하는 다른 단백질들은 컬럼을 통과하거나, 세정에 의해 제거되었다. 이어서, 강하게 결합된, His-택이 부착된 CD38 단백질이 Co2 +에 대한 His의 결합과 경쟁하는 이미다졸을 함유하는 완충제로 용출되었다. 충분한 His-CD38이 정제되면, 탈염 컬럼 상에서의 완충제 교환에 의해 단백질로부터 용출제를 제거하였다.
실시예 4
CD38 -형질감염 CHO ( CHO - CD38 ) 세포, Daudi - luc 세포 및 신선한 다발성 골수종 (MM) 종양 세포에 대한 -003, -005, 및 -024의 결합
수확 및 카운팅 후, Daudi-luc 세포, CD38로 형질감염된 CHO 세포 및 대조군 CHO 세포를 PBS (1㎖ 당 1×106개의 세포)에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 96-웰 V-바닥 플레이트에 넣고 (100 ㎕/웰), PBS-BSA (0.1％ BSA 및 0.02％ Na-아지드가 보충된 PBS)에서 2회 세정하였다. 그 후, PBS-BSA 내의 항체 용액 50 ㎕를 세포에 첨가하였다 (4℃, 30분). PBS-BSA에서 3회 세정 후, PBS-BSA 내의 토끼 항-인간 IgG-FITC 50 ㎕ (1:400 희석물)을 첨가하였다 (4℃, 암실, 30분). 세포를 3회 세정하고, CHO-CD38 및 Daudi-luc 세포에 대한 CD38-항체의 특이적 결합을 유동 세포측정법에 의해 검출하였다. HuMab-KLH (본원의 다른 곳에서 기술된 면역화 프로토콜을 사용하여 Genmab B. V. (Utrecht, The Netherlands)에 의해 생성된 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)에 대한 인간 모노클로날 항체)가 대조군으로 사용되었다. 도 1 및 2는 -003, -005, 및 -024가 비록 EC50 (표 1)은 상이하지만 CHO-CD38 세포 및 Daudi-luc 세포에 결합한다는 것을 나타낸다. 대조군 CHO 세포에 대한 결합은 관찰되지 않았다 (데이타는 제시되지 않음).
신선한 MM 종양 세포를 Lokhorst 박사 (University Medical Center Utrecht, Utrecht, The Netherlands)로부터 수득하였다. Ficoll (Bio Whittaker; 림프구 분리 배지, cat 17-829E) 구배 원심분리에 의해 다발성 골수종 환자의 골수로부터 종 양 세포를 단리하였다. 수확 및 카운팅 후, MM 세포 (웰 당 100,000개의 세포)를 25 ㎕의 FITC-표지 CD38-특이적 항체 및 25 ㎕의 CD138과 재현탁시켰다. 인큐베이션 (4℃, 30분) 후, 세포를 PBS-BSA에서 세정하고, PE-표지 염소-항-마우스 IgG (1:200; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Soham, UK)를 첨가하였다. 인큐베이션 (4℃, 30분) 및 PBS-BSA에서의 세포 세정 후, 유동 세포측정법에 의해 형광을 측정하였다.
도 3은 -003, -005 및 -024가 MM 세포에 결합한다는 것을 나타낸다.
Figure 112007075237487-pct00001
실시예 5
항체-의존성 세포-매개 세포독성
Daudi-luc 세포, 신선한 다발성 골수종 종양 세포, 신선한 형질세포 백혈병 종양 세포 및 JK6L 및 AMO-1 다발성 골수종 세포를 RPMI++ (10％ 포괄적 송아지 혈청 (HyClone, Logan, UT, USA)이 보충된 RPMI 1640 배양 배지) 내에서 수집하고 (5×106개의 세포), 여기에 100 μCi 51Cr (크롬-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, The Netherlands)를 첨가하고, 혼합물을 37℃ 수조에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 세정 (PBS에서 2회, 1500 rpm, 5분) 후, 세포를 RPMI++에 재현탁시키고, 트립판 블루 배제에 의해 카운팅하였다. 세포를 1㎖ 당 세포 1×105개의 농도가 되게 하였다.
이펙터 세포의 제조
신선한 말초혈 단핵 세포 (건강한 지원자, UMC Utrecht, Utreht, The Netherlands)를 제조업자의 지시에 따라 Ficoll (Bio Whittaker; 림프구 분리 배지, cat 17-829E)에 의해 40 ㎖의 헤파린 혈액으로부터 단리하였다. RPMI++ 내에 세포를 재현탁시킨 후, 세포를 트립판 블루 배제에 의해 카운팅하고, 세포를 1㎖ 당 세포 1×107개의 농도가 되게 하였다.
ADCC 설정
50 ㎕의 51Cr-표지 표적 세포를 96-웰 플레이트에 피펫팅하고, 50 ㎕의 항체를 첨가하고, RPMI++에서 희석하였다 (최종 농도 10, 1, 0.1, 0.01 ㎍/㎖). 세포를 인큐베이션하고 (실온, 15분), 50 ㎕의 이펙터 세포를 첨가하여, 이펙터 대 표적 비율이 100:1이 되도록 하였다 (최대 용해의 결정을 위해서는, 100 ㎕의 5％ 트리톤-X100을 이펙터 세포 대신 첨가하였고; 자발적인 용해의 결정을 위해서는, 50 ㎕의 표적 세포 및 100 ㎕의 RPMI++를 사용하였다). 세포를 회전 침전시키고 (500 rpm, 5분), 인큐베이션하였다 (37℃, 5％ CO2, 4시간). 세포를 회전 침전 (1500 rpm, 5분)시킨 후, 100 ㎕의 상청액을 마이크론 튜브 내로 수확하고, 감마 카운터에서 카운팅하였다. 특이적 용해 백분율을 하기와 같이 계산하였다:
(샘플의 cpm - 표적 세포만의 cpm) / (최대 용해의 cpm - 표적 세포 만의 cpm)
[식중, cpm은 분당 카운트이다].
Daudi-luc 세포 (도 4 및 표 2)에서, -003, -005, 및 -024는 ADCC에 의한 용해를 유도하였고, -003, 및 -005은 리툭시맵 (항-CD20 mAb)보다 약간 양호하게 기능을 수행하였다. 흥미롭게도, 신선한 다발성 골수종 종양 세포 (H. Lokhorst 박사 (UMCU, The Netherlands)로부터 수득함)가 표적 세포로 사용된 경우에도, ADCC가 -003, -005 및 -024에 의해 유도되었다 (도 5A 및 표 2).
Figure 112007075237487-pct00002
인간 말초혈 단핵 세포 Erlangen 의 강화
인간 지원자로부터의 인간 혈액 (university Erlangen, Erlangen, Germany)을 RPMI 1640에서 2회 희석하고, 혈액 세포를 Ficoll (림프구 분리 배지 1077 g/㎖, 710 g, 실온, 20분; BioWhittaker, Cambrex Bio Science Verviers, Verviers, Belgium, cat. 17-829E, 로트# 0148 32) 상에 층을 이루게 하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (MNC)를 간기(間期)로부터 수집하고, 세정하고, 10％ FCS, 2 mM L-글루타민, 5 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (모두 BioWhittaker)이 보충된 RPMI 1640 배양 배지에 재현탁시키고, 여기에 25 mM HEPES (BioWhittaker)를 첨가하였다.
ADCC 설정 II
표적 B-세포 (신선한 형질 세포 백혈병 종양 세포, JK6L 및 AMO-1 B-세포주, T. Valerius 박사 (University of Erlangen (Erlangen, Germany)로부터 수득함)를 20 μCi 51Cr (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)로 2시간 동안 표지시켰다. RPMI-10에서의 광범위한 세정 후, 세포를 1㎖ 당 1×105개로 조정하였다. MNC (50㎕), 감작 항체 (50 ㎕), 및 RPMI-10 (50 ㎕)를 둥근 바닥 미량역가 플레이트 (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany)에 첨가하였다. 200 ㎕의 최종 부피가 되도록 신선한 형질 세포 백혈병 종양 세포 JK6L 또는 AMO-1 세포 (50 ㎕)를 첨가함으로써 분석이 시작되었다. 40:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비율이 사용되었다. 인큐베이션 (3시간, 37℃) 후, 원심분리에 의해 분석을 정지시키고, 삼중물로부터의 51Cr 방출을 섬광 카운터에서 분당 카운트 (cpm)로 측정하였다. 세포형 세포독성의 백분율을 하기 식을 사용하여 계산하였고:
％ 특이적 용해 = (실험 cpm - 기저 cpm) / (최대 cpm - 기저 cpm)×100
이때 최대 51Cr 방출은 퍼콜산 (3％ 최종 농도)를 표적 세포에 첨가함으로써 결정하였고, 기저 방출은 감작 항체 및 이펙터 세포의 부재 하에 측정하였다.
양쪽 모두의 다발성 골수종 세포주 (즉 JK6L 및 AMO-1)에서, CD38 발현이 낮은 경우 (AMO-1 세포주)에서도, -003 및 -005 모두로 용해가 유도되었다 (도 6 및 7).
-003, -005 및 -024가 형질 세포 백혈병 1차 종양 세포의 ADCC를 유도하였다 (도 5B).
실시예 6
보체 -의존적 세포독성
Daudi-luc 세포의 수확 및 카운팅 후, 세포의 생존력은 ≥ 90％일 것이다. 세정 (PBS) 후, 세포를 RPMI-B (1％ BSA가 보충된 RPMI) 내에 1㎖ 당 2.0×108개의 세포로 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트 내에 웰 당 1×105개의 세포로 놓았다 (50 ㎕/웰). 이어서, 50 ㎕ 항체를 웰에 첨가하였다 (최종 농도 범위 0-100 ㎍/㎖ (RPMI-B 내에서 3배 희석)). 인큐베이션 (실온, 15분) 후, 11 ㎕의 풀링된 인간 혈청 (18명의 건강한 제공자의 풀)을 각 웰에 첨가하였다 (37℃, 45분). 웰을 1회 재현탁시키고, 120 ㎕를 FACS 튜브 (Greiner)로 옮겼다. 이어서, 10 ㎕의 요오드화 프로피듐 (PI; Sigma-Aldrich Chemie B.V.)를 이러한 현탁액에 첨가하였다 (용액 1㎖ 당 10 ㎍). 죽은 세포 (PI-양성 세포에 상응)의 백분율 측정에 의해 유동 세포측정법 (FACScalibur™, Becton Dickinson, San Diego, CA, USA)에 의해 용해를 검출하였다.
도 8 및 표 2는 Daudi-luc 세포의 용해가 -005 (~60％ 최대 용해)에 의해 유도되고, -003에 의한 이러한 용해는 매우 높은 항체 농도에서만 나타난다는 것을 나타낸다. -024는 Daudi 세포에서 CDC를 유도하지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). CHO-CD38 세포에서, -003, -005, 및 -024 모두에 의해 용해가 유도되었다 (도 9 및 표 3). -003에 의한 용해는 더 높은 농도에서 유도되었다. 여러 MM 환자에서 수득된 종양 세포 (A: 3％ 불응성 종양 세포, B: 9％ 불응성 종양 세포, C: 30-40％ 종양 세포, 및 D: 70％ 종양 세포) (모두 Lokhorst 박사 및 Bloem 박사 (University Medical Center Utrecht, The Netherlands)로부터 수득됨)에서, CDC-매개 용해가 -005의 존재 하에 관찰되었지만, -003의 존재 하에서는 관찰되지 않았다 (도 10). -024 또한 MM 종양 세포의 용해를 유도하였다 (도 10E).
Figure 112007075237487-pct00003
실시예 7
FACS 를 사용한 교차-차단 연구
CHO-CD38 세포를 과량의 표지되지 않은 CD38-특이적 항체의 존재 하에 인큐베이션하였다 (4℃, 15분). 이어서, 세포를 FITC-표지된 CD38-특이적 항체와 함께 인큐베이션하였다 (농도가 EC90에 근접함, 40C, 45분). 세포를 PBS-BSA로 2회 세정한 후, 유동 세포측정법에 의해 형광을 측정하였다. 도 11은 표지되지 않은 -003이 FITC-표지된 -003의 결합을 차단한 반면, FITC-표지된 -005의 결합은 차단되지 않았음을 나타낸다. 또한, 표지되지 않은 -005는 FITC-표지된 -005의 결합을 차단하였지만, FITC-표지된 -003의 결합은 차단하지 않았다. -003 및 -005는 결합에 대해 경쟁하지 않았기 때문에, 상이한 에피토프에 결합하였다.
실시예 8
ELISA 를 사용한 교차 차단 연구
가용성 인간 CD38을 ELISA 플레이트의 표면 상에 코팅하였다. 코팅된 CD38을 과량의 표지되지 않은 CD38 특이적 항체와 함께 약 15분 동안 인큐베이션하고, 이어서 비오틴화 CD38-특이적 항체를 첨가하였다 (농도가 EC90에 근접함, 실온, 1시간). PBS/트윈으로 3회 세정 후, 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합 스트렙타비딘을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. ABTS-용액의 첨가에 의해 복합체를 검출할 수 있고, HRP 매개 기질 전환을 ELISA 판독기를 사용하여 OD 405 nm에서 측정하였다.
실시예 9
샌드위치- ELISA 를 사용한 교차-차단 연구
CD38 특이적 항체를 ELISA 플레이트의 표면 상에 코팅하였다. 플레이트에 결합된 항체를 유체 상 내의 과량의 CD38 특이적 항체의 존재 하에 가용성 비오틴화 CD38과 함께 인큐베이션하였다. PBS/트윈으로의 세정 후, 결합된 비오틴화 CD38을 1시간 동안 실온에서 HRP-접합 스트렙타비딘으로 검출하였다. 이러한 복합체를 ABTS-용액의 첨가에 의해 검출할 수 있고 (PBS/트윈으로의 세정 후), HRP 매개 기질 전환을 ELISA 판독기를 사용하여 OD 405 nm에서 측정하였다.
실시예 10
면역조직 화학에 의한 인간 조직의 패널과의 반응성 및 사이노몰구스 조직과의 교차반응성
동결된 인간 조직 (H. Niessen 박사 (Free University Medical Center, Amsterdam, The Netherlands)으로부터 수득) 또는 원숭이 조직 (Inveresk Research, Glasgow, Scotland)으로부터의 절편을 6㎛로 절단하고, 하룻밤 동안 공기-건조시켰다. 이러한 저온유지 절편을 아세톤에 고정하고 (실온, 10분), 공기-건조시켰다 (약 5분). 그 후, 절편을 0.1％ H2O2를 함유하는 1×시트르산/포스페이트 완충제 (pH 5.8; Sigma)와 함께 인큐베이션하여, 내인성 과산화효소를 차단하였다. 실온에서의 20분 후, 절편을 PBS 및 0.05％ 트윈-20 (PBST, 실온, 5분; Riedel de-Haen, Germany)으로 2회 세정하였다. 이어서, 절편을 아비딘과 함께 인큐베이션하고 (실온, 15분; DAKO, Glostrup, Denmark), PBST로 2회 세정하고, 비오틴과 함께 인큐베이션하여 (실온, 15분; DAKO), 내인성 비오틴을 차단하였다. 절편을 PBST로 2회 세정한 후, 절편을 PBST++ (10％ 정상 인간 혈청 (NHS, CLB, Amsterdam, Netherlands) 및 10％ 정상 염소 혈청 (NGS; DAKO)이 보충된 PBST)와 함께 예비-인큐베이션하였다 (실온, 20분). 예비-인큐베이션 혈청을 블롯팅한 후, 절편을 지시된 농도의 2％ PBST++에 희석된 FITC-표지된 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다 (실온, 60분). 그 후, 절편을 2％ PBST++ 내의 토끼-항-FITC (1:1000; DAKO)와 함께 인큐베이션하였다 (실온, 30분). PBST로 절편을 세정한 후, 절편을 2％ PBST++ 내의 염소-항-토끼-비오틴 (1:400; DAKO)와 함께 인큐베이션하였다 (실온, 30분). 이어서, 절편을 세정하고, 2％ PBST++ 내의 SABC-HRP (1:100; DAKO)와 함께 인큐베이션하였다 (실온, 30분). 절편을 PBST에서 2회 세정한 후, 아미노-에틸-카르바졸 (AEC)-발색 용액 (50 mM 아세테이트 완충제, pH4.9, 0.01％ H2O2; Riedel-de-Haen)과 함께 인큐베이션하였다 (실온, 10분). 마지막으로, 절편을 밀리포어(millipore) H2O에서 세정하고 (5분), 헤마톡실린 (DAKO)으로 대조염색시켰다. 글리세르젤(glycergel) (37℃)을 사용하여, 절편을 커버 슬립으로 고정하고, 광현미경 (Axiovision-2; Zeiss, Thomwood, NY, USA)으로 연구하였다.
-003 및 -005로 기관지 상피 (도 12B 및 13B), 뿐만 아니라 횡문근 (근육세포, 도 12C 및 13C), 대식세포, 림프구 및 형질 B 세포 (도 12A 및 13A)가 염색되었다. -024에서도 횡문근 및 기관지 상피가 유사하게 염색되었지만, 염색이 덜 강했다. -003 (도 14D), -005 (14E) 또는 -024 (데이타는 제시되지 않음)로는 내피 세포의 염색이 관찰되지 않았지만, 내피 세포 마커 CD31 (도 14A) 및 vWF (14B)에 대한 양성 대조군 항체로는 명확한 염색이 관찰되었다. 항-KLH가 음성 대조군 항체로 사용되었다 (도 14C). -003 (도 12D) 및 -024 (데이타는 제시되지 않음)는 사이노몰구스 원숭이 림프 조직과 교차-반응하였지만, -005 (도 13D)는 교차-반응하지 않았다.
실시예 11
유동 세포측정법에 의한 사이노몰구스 또는 붉은털 원숭이 말초혈 단핵 세포 (PBMC)와의 교차반응성
4.5 ㎖의 충격 완충제 (1.7 mM NH4Cl, 1 mM EDTA), 40 ㎖ H2O 및 450 ㎕ 10％ KHCO3를 첨가함으로써 5 ㎖의 사이노몰구스 원숭이 말초 혈액 (Inveresk Research)을 용해시켰다. 용혈 후, 세포를 원심분리하고 (1200 rpm, 10분), PBS에서 3회 세정하였다. 트립판 블루로 세포를 카운팅한 후, 세포를 PBS-BSA에 재현탁시켰다 (1㎖ 당 1×106개의 세포).
17.5 ㎖의 붉은털 원숭이 말초 혈액 (BPRC, Rijswijk, The Netherlands)을 RPMI 1640로 1:1로 희석하고, Ficoll (1.077 g/㎖; BioWhittaker, cat. 17- 829E, 로트# 0148 32) 상에 층을 이루게 하였다. 원심분리 (710 g, 실온, 20분) 후, 간기를 수집하고, RPMI에서 2회 세정하였다. 마지막 세정 후, 세포를 RPMI 1640에서 50㎕ 당 세포 1×105개의 농도로 재현탁시켰다.
세포를 96-웰 플레이트로 옮기고 (웰 당 100,000개의 PBMC), FACS 완충액 (PBS, 0.05％ BSA, 0.02％ NaN3)에서 세정하고, 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다 (4℃, 30분). PBS-BSA에서 세정한 후, 50 ㎕의 FITC-표지된 토끼-항-hIgG (DAKO, Glostrup, Denmark)를 첨가하였다 (4℃, 30분). 최종적으로, 세포를 FACS 튜브에 150 ㎕의 총 부피로 수집하였다. FACScalibur™ (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA)을 사용하여 샘플을 측정 및 분석하였다.
유동 세포측정법으로, 사이노몰구스 림프구 (도 15A) 및 단핵구 (도 15B)에 대한 -003의 교차-반응성이 나타났고, -005에서는 나타나지 않았다. 또한 붉은털 원숭이에서, 단핵 세포에 대한 -003의 교차 반응성이 관찰되었지만, -005에서는 관찰되지 않았다 (도 15C).
실시예 12
내재화 실험
CHO-CD38 세포를 포화 농도의 FITC-표지된 CD38-특이적 항체로 염색하였다 (얼음 상에서, 30분). 세포 세정 (10％ FCS가 보충된 RPMI1640) 후, 1개의 세포 풀을 37℃로 가온시켜 내재화가 일어나도록 하였고, 다른 풀은 얼음 상에서 방치하였다. 여러 시간 간격 (0-120분)으로, 세포 분취량을 취하여 빙냉 PBS-BSA로 옮겨서, 내재화를 정지시켰다. 샘플을 PBS-BSA로 2회 세정한 후, EtBr (PBS-BSA 내에 희석됨, 최종 농도 2 mg/㎖)을 샘플에 첨가하여, 막-결합된 FITC를 켄칭(quenching)하였다. 유동 세포측정법에 의해 형광을 측정하였다.
도 16A 및 16B는 -003 및 -005가 37℃에서 5분 이내에 CHO-CD38 세포에 의해 내재화되는 것을 나타낸다.
실시예 13
생체내 SCID - 루시페라제 실험
이러한 모델에서, 종양 세포가 개똥벌레 루시페라제로 형질감염되었다. 루시페린 (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)을 마우스에게 투여했을 때, 표지된 세포가 고도로 민감한 CCD 카메라를 사용하는 생체발광 이미지화에 의해 생체내에서 검출될 수 있다. [Wetterwald et al., American Journal of Pathology 160(3), 1143-1153 (2002)] 참조.
Daudi 세포를 Gene Therapy Systems (San Diego, CA)으로부터의 gWIZ 루시페라제로 형질감염시키고, 10％ FCS, Pen/Strep, 피루브산나트륨 및 1 ㎍/㎖ 푸로마이신 (Sigma)이 있는 RPMI에서 배양하였다. 세포를 루시페라제 발현 (1×105개의 세포 당 RLU로 표현됨)에 대해 발광측정기에서, CD38 발현에 대해 FACS에 의해 분석하였다. 마우스 1마리당 2.5×106 개의 루시페라제-형질감염 Daudi 세포를 SCID 마우스 내로 정맥내 주사하였다. 마우스를 -003, -005, 이소타입 대조군 항체 (HuMab-KLH) 또는 리툭시맵 (항-CD20 항체)로 처리하였다. 항체를 복강내 주사하였다. 4가지 처리 환경이 사용되었다 (표 4 참조). 예방 환경에서는, 항체 (100 ㎍/마우스) 및 세포를 동시에 투여하였다. 치료 환경 I에서는, 항체 (300 ㎍/마우스)를 세포 투여 7일 후에 투여하였다. 치료 환경 II에서는, 항체 (10 ㎍/마우스)를 세포 투여 14일 후에 투여하였다. 치료 환경 III에서는, 항체 (100 ㎍/마우스)를 세포 투여 7일 후에 투여하였다. 이미지화를 위해, 케타민/자일라진/아트로핀의 혼합물의 복강내 주사에 의해 마우스를 마취시켰다. 합성 D-루시페린 (나트륨 염, Molecular Probes)을 25 mg/㎖의 용량으로 복강 내에 제공하였다. 이어서, 마우스를 가벼운 단단한 상자 내에 넣고, 3분 후에, VersArray 1300B 액체 질소 냉각 CCD 검출기 (Roper Scientific)를 사용하여 이미지화를 시작하였다. 루시페라제로부터 방출되는 광자를 5분의 노출 기간에 걸쳐 카운팅하였다. 조명 하에, 흑백 이미지가 참조용으로 만들어졌다. MetaVue 소프트웨어 (Universal Imaging Corp)를 데이타 수집 및 이미지 분석에 사용하였다. GraphPad PRISM 버젼 3.02 (Graphpad Software Inc)를 사용하는 일원 분산 분석 및 뉴먼-케울스(Newman-Keuls) 포스트 테스트를 사용하여 군들 간의 차이의 통계적 유의성이 설정되었다.
Figure 112007075237487-pct00004
도 17A 및 17B는 -003 및 -005가, 항-CD20 항체에 대해 관찰된 억제와 유사하게, 예방 환경 및 치료 환경 I에서 종양 세포의 성장을 억제하였음을 나타낸다. 두 항체 모두에서 이소타입 대조군 항체보다 현저하게 양호하게 수행되었다. 또한 치료 환경 II에서, CD38-항체는 Daudi-luc 종양 세포의 성장을 느리게 하였다 (도 17C). 치료 환경 III에서, -003 및 -024는 Daudi-luc 종양 세포 성장의 명백한 억제를 나타냈다 (도 17D).
실시예 14
세포자멸사
세포자멸사 분석을 제조업자의 지시에 따라 수행하였다 (아넥신-V 세포자멸사 키트, BD Biosciences, Alphen a.d. Rijn, Netherlands). 간략하게, CD38 mAb를, 단독으로 또는 교차-차단 rb-항-hIgG (50 ㎍/㎖)의 존재 하에, 5 ㎍/㎕의 -003 또는 -005 또는 항-CD20 항체의 농도로, 2.5×105개의 세포 (루시페라제-형질감염 Daudi 세포, 24-웰 플레이트 내의 0.5 ㎖ RPMI++ 내)에 첨가하였다.
인큐베이션 (37℃, 5％ CO2, 20시간) 후, 세포를 조심스럽게 수확하고, 결합 완충제로 세정하였다 (-1200 rpm, 4℃, 5분, BD Biosciences). 펠렛을 100 ㎕의 결합 완충제에 재현탁시켰다. 이어서, 5 ㎕의 아넥신-V-FITC (BD Biosciences) 및 10 ㎕의 PI (BD Biosciences)를 현탁액에 첨가하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 400 ㎕의 결합 완충제를 첨가하고, 샘플을 측정하였다 (FL2에서의 PI 판독). 세포자멸사성 세포의 분석을 위해, FACScalibur 유동 세포측정기를 CellQuest 프로 소프트웨어 (BD Biosciences)와 함께 사용하여 유동 세포측정법에 의해 모든 아넥신-V-양성 세포를 카운팅하였다. 10,000개 이상의 이벤트를 분석용으로 수집하였다. 이러한 집단은 PI-양성 세포뿐만 아니라 PI-음성 세포 모두를 포함하였다.
도 18은 -003 및 -005가 세포자멸사를 유도하지 않았음을 나타낸다. 그러나, 가교 후, 표적 세포의 세포자멸사가 관찰되었다. -003은 가교 후 항-CD20 항체 (리툭시맵)에 의해 유도된 세포자멸사와 유사한 세포자멸사를 유도하였다. -005는 가교 후 세포자멸사를 덜 유도할 수 있었다. 표적 세포로서의 RAMOS 세포로 유사한 결과가 수득되었다 (데이타는 제시되지 않음).
실시예 15
RA - SCID 마우스 모델에서의 조직 이식 B 세포에 대한 -005의 효과
윤활 조직의 이식
Charles River Laboratories Nederland (Maastricht, Netherlands)로부터 구입한 SCID-마우스 (균주 C.B.-17/lcrCrl-SCID-bg, 수컷/암컷, 4-12주령)를 IVC 우리에서 표준 조건의 온도 및 빛 하에 유지시켰고, 실험용 사료 및 물을 자유롭게 먹게 하였다. 이식 전에, 1:1 비율의 케타민 (NIMATEK, EuroVet) 및 자일라진 (Rompun, Bayer)의 복강내 주사에 의해 마우스 (각각의 실험군 당 3마리의 마우스, 0일)를 마취시켰다. 수술 가위를 사용하여 피부를 조금 절개하였다. 관절 교체 수술을 받는 류머티스성 관절염 환자로부터의 염증이 있는 윤활 조직을 6개의 소형 단편의 군집물 (총 2-3㎣)로서 각각의 마우스의 옆구리 상에 피하 이식하였다. Permacol 시아노아크릴레이트 풀을 사용하여 상처를 닫았다. 실험 1일째에, 염증이 있는 윤활 이식물 내의 B 세포를 체크하기 위해 나머지 윤활 조직을 분석하였다. -005 (12 mg/kg) 또는 대조군 항체 (항-KLH, 30 mg/kg)를 실험 8일째에 200 ㎕의 부피로 주사하였다 (정맥내). 실험 말기 (14일째)에, CO2 흡입에 의해 마우스를 희생시키고, 윤활 이식편을 외식(外植)하였다. 이식편들 중 하나를 추후의 면역조직화학적 분석용으로 OCT 화합물 (TissueTek, Sacura Finetek Europe) 내에 스냅(snap)-동결시키고, 또다른 하나를 추가적인 RNA 분석용으로 액체 질소 내의 함침에 의해 동결시켰다.
면역조직화학
SuperFrost (Menzel GmbH, Braunschweig) 슬라이드 상의 5 μM 냉동절편을 LEICA CM1900 저온조를 사용하여 제조하고, -80℃에서 보관하였다. 해동된 절편을 아세톤에서 10분 동안 고정시키고, 실온에서 건조시키고, PBS에서 3×5분 동안 세정하였다. 모든 단계를 실온에서 수행하였다. 0.3％ 과산화수소 및 0.1％ 아지드화나트륨이 보충된 PBS와 함께 20분 동안 인큐베이션함으로써 내인성 과산화효소 활성을 차단하였다. 슬라이드를 PBS에서 3×5분 동안 세정하고, PBS / 1％ BSA 내의 10％ 정상 인간 혈청 (NHS) / 10％ 정상 토끼 혈청 (NRbS)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 1 ％ BSA / 10％ NHS / 10％ NRbS가 보충된 PBS에 희석된 1차 항체 (마우스 mAb)를 60분 동안 인큐베이션하였다. 3×2분 동안의 세정 후, PBS (1％ BSA / 10％ NHS / 10％ NRbS가 보충됨) 내의 1:50으로 희석된 HRP-접합체 (염소 항-마우스 Ig-HRP; DAKO P0447)를 30분 동안 첨가하였다. TSA™ 비오틴 시스템 (Perkin Elmer Life Sciences, NEL700)을 사용하여 과산화효소 신호를 증강시켰다. 슬라이드를 3×2분 동안 PBS에서 세정하고, 증폭 완충제 내의 1:1600으로 희석된 비오티닐 티라미드와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 3×2분 동안 PBS에서 세정한 후, PBS (1％ BSA가 보충됨) 내의 1:400으로 희석된 스트렙타비딘-HRP를 30분 동안 첨가하였다. 슬라이드를 3×2분 동안 PBS에서 세정하고, DAB 용액 (DAKO Cytomation K3465)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 증류수로 발색 반응을 정지시켰다. 최종적으로, 슬라이드를 헤마톡실린 (MERCK)으로 대조염색시키고, 흐르는 물로 세정하고, 카이저(Kaiser) 글리세린 및 커버슬립으로 덮었다.
염색강도의 점수화
염색된 윤활 조직 이종이식물을 2명의 숙련가에 의해 맹검 방식으로 점수화하였다. 먼저, 일련의 절편으로부터 가장 강한 절편을 선별하고, 이러한 기준 절편에게 최고 점수 8을 매겼다. 이어서 다른 절편에서의 염색 강도를 기준 절편과 비교하여 0 내지 8의 규모로 점수화하였다.
통계적 분석
염색 강도의 점수화를 Graph Pad Prism 버젼 4.01 (Graph Pad software, Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 일원 ANOVA에 이어서 던(Dunn) 다중 비교에 테스트에 의해 분석하였다
도 19 및 도 21은 항-CD38-양성 형질 세포의 수가 -005로의 처리 후 감소되었음을 나타낸다. 항-CD138로의 형질 세포의 염색으로 -005가 감소된 수의 형질 세포를 초래한다는 것이 확인되었다 (도 20 및 22).
실시예 16
CD38 에 대한 인간 항체의 코딩 서열의 시퀀싱
RNA 제조
모노클로날 항체 -003, -005 및 -024를 각각 발현하는 하이브리도마 세포주의 5×106개의 세포로부터 제조업자의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트 (Qiagen, Westburg, Leusden, Netherlands)로 전체 RNA를 제조하였다.
-003, -005 및 -024의 cDNA 제조
제조업자의 프로토콜에 따라 SMART RACE cDNA 증폭 키트 (Clontech)를 사용하여 RNA의 5'-RACE-상보적 DNA (cDNA)를 100 ng의 전체 RNA로부터 제조하였다.
Isogen Bioscience (Maarssen, The Netherlands)에 의해 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하고 정량하였다. 프라이머를 H2O에 100 pmol/㎕로 용해시키고, -20℃에서 보관하였다. 모든 PCR 및 시퀀싱 프라이머의 요약을 표로 작성하였다 (표 5). PCR을 위해, PfuTurbo® Hotstart DNA 중합효소 (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands; 제품# 600322)를 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 각각의 반응 믹스는 총부피 30 ㎕의 PCR 반응 완충제 (중합효소와 함께 공급됨) 내에 200 μM 혼합 dNTP (Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands; 제품# 1814362), 12 pmol의 역 프라이머 (VH3003-005용 RACEG1A1, VH3003-003용 RACEVHApaI 및 VL3003-003 및 005용 RACEVLBsiWI), 7.2 pmol의 UPM-Mix (UPM-Mix: 2μM ShortUPMH3 및 0.4 μM LongUPMH3), 0.6 ㎕의 5'RACE cDNA 주형, 및 1.5 유닛의 PfuTurbo® Hotstart DNA 중합효소를 함유하였다. PCR 반응을 TGradient Thermocycler 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Germany; 제품# 050-801)으로 35-사이클 프로그램 (95℃에서 2분 동안의 변성; 35사이클의 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1.5분; 72℃에서 10분 동안의 최종 신장)을 사용하여 수행하였다. 적합한 경우, 추가적으로 분석 또는 프로세싱할 때까지 PCR 믹스를 4℃에서 보관하였다.
Figure 112007075237487-pct00005
pGEMT -벡터 시스템 II 내에서의 -003-2F5 V H 및 V L 및 -005 V L 및 -024 V H 및 V L 의 클로닝
반응 생성물을 1％ TAE 아가로스 젤 상에서의 전기영동에 의해 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 정확한 크기의 밴드를 젤로부터 잘라내고, Qiaexll 젤 추출 키트 (Qiagen, 카탈로그# 20021)를 사용하여 DNA를 아가로스로부터 단리하였다.
PCR 단편으로부터 단리된 젤을 200 μM dATP 및 2.5 유닛의 Amplitaq (Perkin Elmer)와 함께 72℃에서 10분 동안 인큐베이션하여, A 꼬리를 붙이고, 미니용출 컬럼 (Qiagen)을 사용하여 정제하였다. A 꼬리가 달린 PCR 단편을 pGEMT 이지(easy) 벡터 시스템 II 키트 및 프로토콜 (LJ270, 3/4면)을 사용하여 pGEMTeasy 벡터 (Promega) 내로 클로닝하였다. 2 ㎕의 결찰 혼합물을 OneShot DH5αT1R 수용성 대장균 (Invitrogen) 내로 형질전환시키고, LB/Amp/IPTG/Xgal 플레이트 상에 플레이팅하였다.
시퀀싱
각각 20개 (VH-003), 16개 (VL-003), 15개 (VL-005) 및 6개 (VH 및 VL-024)의 백색 콜로니를 골라내고, 플라스미드를 단리하고, M13 역 프라이머로 시퀀싱한 후, -003 및 -024의 V-영역 및 -005의 VL 영역을 AGOWA (Berlin, Germany)로 시퀀싱하였다. -005 VH 영역을 프라이머 HCseq5를 사용하여 PCR 생성물 상에서 직접 시퀀싱하였다. 벡터 NTI 어드밴스드 수트 (Invitrogen)를 사용하여 서열을 분석하였다.
항체 -003, -005, -024 및 형태형성 항체 3079용 발현 벡터의 생성
pConG1f0.4 (Lonza Biologies, Slough, UK) 내로의 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 (HindIII 및 ApaI) 및 이상적인 코작(Kozak) 서열 (GCCGCCACC)을 도입하는 프라이머 VH3003-003for 및 RACEVHApaI을 사용하여 -003의 VH 영역을 함유하는 pGemT 플라스미드 클론으로부터 PCR에 의해 -003의 VH 코딩 영역을 증폭시켰다. pConG1f0.4 벡터는 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역을 함유한다. HindIII 및 ApaI을 사용하여 VH PCR 단편을 pConG1f0.4 벡터 내로 인-프레임으로 삽입하였다. 구축물을 서열 분석에 의해 점검하였다.
pConG1f0.4 내로의 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 (HindIII 및 ApaI) 및 이상적인 코작 서열을 도입하는 프라이머 VH3003-5for 및 RACEVHApaI을 사용하여 -005의 VH 영역을 함유하는 pGemT 플라스미드 클론으로부터 PCR에 의해 -005의 VH 코딩 영역을 증폭시켰다. pConG1f0.4 벡터는 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역을 함유한다. HindIII 및 ApaI을 사용하여 VH PCR 단편을 pConG1f0.4 벡터 내로 인-프레임으로 삽입하였다. 구축물을 서열 분석에 의해 점검하였다.
pConG1f0.4 내로의 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 (HindIII 및 ApaI) 및 이상적인 코작 서열을 도입하는 프라이머 VH300324exfor 및 RACEVHApaI을 사용하여 -024의 VH 영역을 함유하는 pGemT 플라스미드 클론으로부터 PCR에 의해 -024의 VH 코딩 영역을 증폭시켰다. pConG1f0.4 벡터는 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역을 함유한다. HindIII 및 ApaI을 사용하여 VH PCR 단편을 pConG1f0.4 벡터 내로 인-프레임으로 삽입하였다. 구축물을 서열 분석에 의해 점검하였다.
특허 WO 2005/103083 A2에 공개된 데이타를 기초로 하여, 형태형성 항체 3079의 VH 코딩 영역을 GeneArt (Regensburg, Germany)에 의해 합성하였다. 코딩 영역은 발현 수준의 증강을 위해 HEK 세포에서의 발현에 대해 최적화된 코돈이었고, pConG1f0.4 내로의 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 (HindIII 및 ApaI) 및 이상적인 코작 서열이 삽입되었다. 합성 VH 영역을 함유하는 플라스미드를 ApaI 및 HindIII로 소화시키고, VH 단편을 pConG1f0.4 벡터 내로 인-프레임으로 삽입하였다.
pConKappa0.4 (Lonza Biologies) 내로의 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 (HindIII 및 Pfl23II) 및 이상적인 코작 서열을 도입하는 프라이머 VL3003-5exfor 및 RACEVLBsiWI을 사용하여 -005의 VL 영역을 함유하는 pGemT 플라스미드 클론으로부터 PCR에 의해 -005의 VL 코딩 영역을 증폭시켰다. pConKappa0.4 벡터는 카파 경쇄 불변 영역을 함유한다. HindIII 및 Pfl23II를 사용하여 VL PCR 단편을 pConKappa0.4 벡터 내로 인-프레임으로 삽입하였다. 구축물을 서열 분석에 의해 점검하였다.
pConKappa0.4 내로의 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 (HindIII 및 Pfl23II) 및 이상적인 코작 서열을 도입하는 프라이머 VL3003-003for 및 RACEVLBsiWI을 사용하여 -003의 VL 영역을 함유하는 pGemT 플라스미드 클론으로부터 PCR에 의해 -003의 VL 코딩 영역을 증폭시켰다. HindIII 및 Pfl23II를 사용하여 VL PCR 단편을 pConKappa0.4 벡터 내로 인-프레임으로 삽입하였다. 구축물을 서열 분석에 의해 점검하였다.
pConKappa0.4 내로의 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 (HindIII 및 Pfl23II) 및 이상적인 코작 서열을 도입하는 프라이머 VL3003-24-5exfor 및 RACEVLBsiWI을 사용하여 -024의 VL 영역을 함유하는 pGemT 플라스미드 클론으로부터 PCR에 의해 -024의 VL 코딩 영역을 증폭시켰다. HindIII 및 Pfl23II를 사용하여 VL PCR 단편을 pConKappa0.4 벡터 내로 인-프레임으로 삽입하였다. 구축물을 서열 분석에 의해 점검하였다.
특허 WO 2005/103083에 공개된 데이타를 기초로 하여, 형태형성 항체 3079의 VL 코딩 영역을 GeneArt에 의해 합성하였다. 코딩 영역은 발현 수준의 증강을 위해 HEK 세포에서의 발현에 대해 최적화된 코돈이었고, pConKappa0.4 내로의 클로닝을 위한 적절한 제한 부위 (HindIII 및 Pfl23II) 및 이상적인 코작 서열이 삽입되었다. 합성 VL 영역을 함유하는 플라스미드를 Pfl23II 및 HindIII로 소화시키고, VH 단편을 pConKappa0.4 벡터 내로 인-프레임으로 삽입하였다.
실시예 17에 기술된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 벡터를 공동-형질감염시킴으로써 항체들을 HEK-293F 세포에서 일시적으로 발현시켰다.
CHO - K1SV 세포 내에서의 안정적인 세포주의 생성
안정적인 세포주의 생성을 위해, -003 또는 -005의 중쇄 및 경쇄 벡터를 표준 클로닝 기술에 의해 단일 이중 유전자 벡터로 합쳤다.
-003 또는 -005의 이중 유전자 벡터를 선형화시키고, 본질적으로 제조업자에 의해 기술된 바와 같이, CHO-K1SV (Lonza Biologies) 세포 내로 형질감염시켰다. Lonza Biologies에 의해 기술 바와 같이 25 μM L-메티오닌 술폭시민 (MSX)으로의 선별에 의해 적절한 세포주를 선별하였다. 생산이 가장 높은 클론들을 선별하여, CD-CHO (Invitrogen) 배지에서 증식시키고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 세포 배양 상청액으로부터 항체를 정제하였다.
실시예 17
부위 지정 돌연변이유발을 사용한 에피토프 맵핑
Isogen Bioscience (Maarssen, The Netherlands)에 의해 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하고 정량하였다. 프라이머를 H2O에 100 pmol/㎕로 용해시키고, -20℃에서 보관하였다. 모든 PCR 및 시퀀싱 프라이머의 요약이 표 6에 제시된다. PCR을 위해, PfuTurbo® Hotstart DNA 중합효소 (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands)를 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 각각의 반응 믹스는 총부피 20 ㎕의 PCR 반응 완충제 (중합효소와 함께 공급됨) 내에 200 μM 혼합 dNTP (Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands), 10 pmol의 전방향 및 역방향 프라이머, 100 ng의 게놈 DNA 또는 1 ng의 플라스미드 DNA, 및 1 유닛의 PfuTurbo® Hotstart DNA 중합효소를 함유하였다. PCR 반응을 TGradient Thermocycler 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Germany; 제품# 050-801)으로 32-사이클 프로그램 (95℃에서 2분 동안의 변성; 30사이클의 95℃에서 30초, 60-70℃ 구배 (또는 또다른 특정 어닐링 온도)에서 30초, 및 72℃에서 3분; 72℃에서 10분 동안의 최종 신장)을 사용하여 수행하였다. 적합한 경우, 추가적으로 분석 또는 프로세싱할 때까지 PCR 믹스를 4℃에서 보관하였다.
아가로스 젤 전기영동을 1×트리스 아세테이트 EDTA 완충제 내의 50 ㎖의 젤을 사용하여 Sambrook ([Sambrook, Russell et al. 2000])에 따라 수행하였다. 젤 내에 에티듐 브로마이드가 포함되고, UV광 하에 관찰함으로써 DNA가 가시화되었다. 젤 이미지를 CCD 카메라 및 이미지 분석 시스템 (GeneGnome; Syngene, via Westburg B.V., Leusden, The Netherlands)에 의해 기록하였다.
원하는 PCR 단편의 정제를 MinElute PCR 정제 키트 (Qiagen, via Westburg, Leusden, The Netherlands; 제품# 28006)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 단리된 DNA를 UV 분광법 (하기 참조)에 의해 정량하고, 아가로스 젤 전기영동에 의해 품질을 평가하였다.
별법적으로, PCR 또는 소화 생성물을 1％ 트리스 아세테이트 EDTA 아가로스 젤을 사용하여 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리하였다 (예를 들어 다중 단편이 존재하는 경우). 원하는 단편을 젤로부터 절단하고, QIAEX II 젤 추출 키트 (Qiagen; 제품# 20051)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 회수하였다.
핵산의 광학 밀도를 NanoDrop ND-1000 분광광도계 (Isogen Life Science, Maarssen, The Netherlands)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 결정하였다. 260 nm에서의 광학 밀도 (OD)의 분석에 의해 DNA 농도를 측정하였다 (1 OD260nm 유닛 = 50 ㎍/㎖). 모든 샘플에 대해, 핵산이 용해된 완충제를 기준물로 사용하였다.
제한 효소 및 보충물들은 New England Biolabs (Beverly, MA, USA) 또는 Fermetas (Vilnius, Lithuania)로부터 수득하였고, 제조업자의 지시에 따라 사용되었다. DNA (100 ng)를 최종 부피 10 ㎕의 적합한 완충제 내의 5 유닛의 효소(들)로 소화시켰다 (적합한 경우 반응 부피가 증진됨). 소화물들을 권장 온도에서 최소 60분 동안 인큐베이션하였다. 양립할 수 없는 완충제 또는 온도 조건이 수반되는 제한효소들로의 이중 소화를 필요로 하는 단편에 대해서는, 순차적으로 소화시켰다. 필요하다면, 소화 생성물을 아가로스 젤 전기영동 및 젤 추출에 의해 정제하였다.
Quick 결찰 키트 (New England Biolabs)로 제조업자의 지시에 따라 DNA 단편을 결찰시켰다. 각각의 결찰에 대해, 벡터 DNA를 적합하게는 3배 몰 과량의 삽입 DNA와 혼합하였다.
플라스미드 DNA (1-5 ㎕의 DNA 용액, 전형적으로는 2 ㎕의 DNA 결찰 믹스)를 제조업자의 설명서에 따라 열-충격 방법을 사용하여 One Shot DH5α-T1R 대장균 (Invitrogen, Breda, The Netherlands; 제품# 12297-016) 내로 형질전환시켰다. 이어서, 세포를 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 Luria-Bertani (LB) 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 박테리아 콜로니가 명백해질 때까지 플레이트를 16-18시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
ThermoStart PCR Master Mix (Abgene, via Wetsburg, Leusden, The Netherlands; 제품# AB-938-DC15/b) 및 프라이머 pConG1seq1 및 pEE13.4seqrev2 (표 6)를 사용하여 콜로니 PCR을 통해 원하는 서열을 함유하는 벡터의 존재에 대해 박테리아 콜로니를 스크리닝하였다. 선별된 콜로니들을 20 ㎕ 피펫 팁으로 가볍게 건드리고, 소규모 배양을 위해 2 ㎖ LB에서 짧게 건드린 후, PCR 믹스에 재현탁시켰다. TGradient Thermocycler 96으로 35-사이클 프로그램 (95℃에서 15분 동안의 변성; 35사이클의 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 2분; 이어서 72℃에서 10분 동안의 최종 신장 단계)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 적합한 경우, 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석할 때까지 PCR 혼합물을 4℃에서 보관하였다.
제조업자의 설명서에 따라 Qiagen (via Westburg, Leusden, The Netherlands)으로부터의 하기의 키트를 사용하여 대장균 배양물로부터 플라스미드 DNA를 단리하였다. 대규모 플라스미드 제조 (50-150 ㎖ 배양물)를 위해, HiSpeed 플라스미드 맥시 키트 (제품# 12663) 또는 HiSpeed 플라스미드 미디 키트 (제품# 12643)를 사용하였다. 소규모 플라스미드 제조 (±2 ㎖ 배양물)를 위해서는, Qiaprep 스핀 미니프렙 키트 (제품# 27106)가 사용되었고, DNA가 50 ㎕ 용출 완충제 (키트와 함께 제공됨) 내에 용출되었다.
HA - CD38 발현 벡터 pEE13 .4 HACD38 의 구축
프라이머 cd38forha 및 cd38exrev를 사용하여 플라스미드 pClpuroCD38 (Tenovus Research Laboratory (Southampton General Hospital, Southampton, UK)의 M. Glennie 교수로부터 수득됨)로부터 인간 CD38의 세포외 도메인을 증폭시켰다. 이러한 PCR 반응에 의해, HA-택이 도입되었다. 이러한 PCR 생성물을 프라이머 SPHMM38ex 및 cd38exrev와 함께 2차 PCR 반응에 대한 주형으로 사용하였다. 이러한 PCR 반응에 의해, 신호 펩티드 SPHMM, 제한 부위 및 최적의 발현을 위한 이상적인 코작 서열 (GCCGCCACC)이 도입되었다. 정제 후, 이러한 PCR 단편을 발현 벡터 pEE13.4 (Lonza Biologies) 내로 클로닝하고, 완전한 코딩 서열을 프라이머 pConKseq1, pEE13.4seqrev, cd38seq1for 및 cd38seq2rev (표 6)로의 시퀀싱에 의해 확인하였다. 이러한 구축물을 pEE13.4HACD38로 명명하였다.
부위-지정 돌연변이유발
위치 237에서 T가 A로 돌연변이되거나 (T237A, 서열 32), 위치 272에서 Q가 R로 돌연변이되거나 (Q272R, 서열 33), 또는 위치 274에서 S가 F로 돌연변이된 (S274F, 서열 34), huCD38의 3가지 단일 돌연변이 단백질을 구축하였다. 부위-지정 돌연변이유발을 QuickChange II XL 부위-지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 이러한 방법은 성공적인 돌연변이유발을 스크리닝하기 위한 여분의 침묵 제한 부위의 도입 또는 제한 부위의 손실을 포함하였다 (T237A 돌연변이체에 대해 여분의 Xba1 부위, Q272R 돌연변이체에 대해 여분의 Bcg1 부위, 및 S274F 돌연변이체에 대해 Ssp1 부위의 손실). 간략하게, 5 ㎕의 10× 반응 완충제, 1 ㎕ 올리고뉴클레오티드 HACD38T237Afor2, HACD38Q272Rfor 또는 HACD38S274Ffor (100 pmol/㎕), 1 ㎕의 올리고뉴클레오티드 HACD38T237Arev2, HACD38Q272Rrev 또는 HACD38S274Frev (100 pmol/㎕), 1 ㎕의 dNTP 믹스, 3 ㎕의 퀵솔루션(Quicksolution), 1 ㎕의 플라스미드 pEE13.4HACD38 (50 ng/㎕) 및 1 ㎕ PfuUltra HF DNA 중합효소를 50 ㎕의 총 부피로 혼합하고, TGradient Thermocycler 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Germany; 제품# 050-801)로 18-사이클 프로그램 (95℃에서 1분 동안 변성; 18사이클의 95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 및 68℃에서 10분)을 사용하여 증폭시켰다. 추가적으로 프로세싱할 때까지 PCR 혼합물을 4℃에서 보관하였다. 이어서, PCR 혼합물을 1 ㎕ DpnI과 함께 60분 동안 37℃에서 인큐베이션하여, pEE13.4HACD38 WT 벡터를 소화시키고, 추가적으로 프로세싱할 때까지 4℃에서 보관하였다. 반응 혼합물을 5 ㎕의 3M NaAc 및 125 ㎕ 에탄올로 침전시키고, 20분 동안 -20℃에서 인큐베이션하고, 20분 동안 4℃에서 14000×g에서 회전-침전시켰다. DNA 펠렛을 70％ 에탄올로 세정하고, 건조시키고, 4 ㎕ 물에 용해시켰다. 총 4 ㎕의 반응 혼합물로 One Shot Top 10DH5α T1R 수용성 대장균 세포 (Invitrogen, Breda, The Netherlands)를 제조업자의 지시에 따라 형질전환시켰다. 이어서, 세포를 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 Luria-Bertani (LB) 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 박테리아 콜로니가 명백해질 때까지 플레이트를 16-18시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 프라이머 pConG1seq1 및 pEE13.4seqrev2 (표 5)를 사용하여 콜로니 PCR에 의해 콜로니를 스크리닝하고, 관련된 제한 효소로 소화시켜, 돌연변이유발성 올리고뉴클레오티드의 혼입에 대해 스크리닝하였다. 각각의 돌연변이체에 대해 2개의 양성 콜로니를 성장시키고, 플라스미드 DNA를 단리하였다. 프라이머 cd38seq1for, pConG1seq1 및 pEE13.4seqrev2를 사용하여 완전한 HACD38 코딩 서열을 결정하여, 돌연변이의 존재 및 추가적인 원치않는 돌연변이의 부재를 확인하였다.
DNA 시퀀싱
플라스미드 DNA 샘플을 서열 분석을 위해 AGOWA (Berlin, Germany)로 보냈다. 벡터 NTI 어드밴스드 소프트웨어 (Informax, Oxford, UK)를 사용하여 서열이 분석되었다.
HEK -293F 세포 상에서의 일시적인 발현
Freestyle™ 293-F (현탁액 성장 및 화학적으로 규명되는 Freestyle 배지에 대해 개조된 HEK-293 서브클론 (HEK-293F)) 세포를 Invitrogen으로부터 수득하고, 293펙틴 (Invitrogen)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 pEE13.4HACD38 및 돌연변이 T237A, Q272R 및 S274F가 있는 3가지의 구축물로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포의 배양 상청액을 항-CD38 결합 연구를 위해 ELISA에서 사용하였다.
항- CD38 항체 결합
ELISA 플레이트 (Greiner, # 655092)를 하룻밤 동안 4℃에서 1 ㎍의 항-HA 항체 (Sigma, #H-9658)로 코팅하고, 이어서 2％ 닭 혈청으로 차단하였다. 형질감염된 HEK293F 세포의 배양 상청액을 희석하고, ELISA 플레이트에 가하여, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세정 후, HuMab -003 및 -005의 단계 희석물을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 HRP-접합 염소-항-인간 IgG 항체로 검출하였다. 분석물을 ABTS (Roche, # 1112597)로 발색시키고, 분광광도계를 사용하여 흡광도를 405 nm에서 측정하였다.
도 23A-23C에서 볼 수 있는 바와 같이, -003 및 -005 모두 wt 인간 CD38에 결합하였다. -003의 결합은 돌연변이 T237A (도 23A), Q272R (도 23B) 또는 S274F (도 23C)의 도입에 의해 영향을 받지 않았다. -005는 돌연변이 T237A가 있는 CD38에 결합할 수 있었다 (도 23A). 돌연변이 Q272R이 있는 CD38에 대한 -005의 결합은 EC50 및 최대 결합 용량 모두에 대해 심하게 영향을 받았다 (도 23B). -005는 위치 274의 세린이 페닐알라닌으로 대체된 돌연변이 CD38에 결합할 수 없었다 (도 23C).
이러한 데이타는 -003 및 -005가 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 연구로 CD38에 대한 -005의 결합이 위치 272 및 274에서의 돌연변이에 민감성이라는 것이 밝혀졌다. 특히, S274가 CD38에 대한 -005 결합에 필수적이다.
Figure 112007075237487-pct00006
실시예 18
PBMC 의 증식 유도
-003, -005 및 -024를 본질적으로 [Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000)]에 기술된 바와 같은 분석법으로 테스트하였다. 간략하게, 건강한 제공자로부터의 PBMC를 200 ㎕ RPMI++ 내의 항체 (최종 농도: 1.1 - 3.3 - 10 - 30 ㎍/㎖)의 존재 하에 편평 바닥 96-웰 플레이트에서 웰 당 1×105개의 세포로 배양하였다. 세포를 IL-15 (333 ng/㎖; Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, USA)로 자극하는 것을 양성 대조군으로 사용하였다. 37℃에서 4일 동안 인큐베이션한 후, 30 ㎕의 3H-티미딘 (16.7 μCi/㎖)을 첨가하고, 하룻밤 동안 계속 배양하였다. 3H-티미딘 혼입을 Packard Cobra 감마 카운터 (Packard Instruments, Meriden, DT, USA)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 평가하였다. 데이타는 10명의 제공자로부터 수득된 PBMC의 평균 cpm (± SEM)으로 제시된다. 결과는 -003 및 -005가 PBMC의 현저한 증식을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다 (도 24A). -024 또한 PBMC의 현저한 증식을 유도하지 않았다 (데이타는 제시되지 않음).
실시예 19
IL -6 유도
-003, -005 및 -024를 [Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000)]에 기술된 바와 같은 분석법으로 테스트하였다. 간략하게, PBMC를 500 ㎕ RPMI++ 내의 20 ㎍/㎖의 항체 및 10 ng/㎖의 LPS (Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, The Netherlands)의 존재 하에 48-웰 플레이트에서 웰 당 1×106개의 세포로 배양하였다. 37℃에서 하룻밤 동안의 인큐베이션 후, 상청액을 수확하고, -20℃에서 보관하였다. IL-6 농도를 ELISA (IL-6 ELISA 키트, U-CyTech Biosciences, Utrecht, The Netherlands)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 평가하였다. 데이타는 7명의 제공자로부터의 pg/㎖ 단위의 평균 농도 (± SEM)로 제시된다. 결과는 -003 및 -005가 현저한 수준의 IL-6 방출을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다 (도 24B). -024 또한 현저한 수준의 IL-6 방출을 유도하지 않았다 (데이타는 제시되지 않음).
실시예 20
IFN -v 방출 유도
-003, -005 및 -024를 [Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000)]에 기술된 바와 같은 방법으로 분석하였다. 간략하게, PBMC를 500 ㎕ RPMI++ 내의 20 ㎍/㎖의 항체 및 1 ㎍/㎖의 OKT-3 (Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)의 존재 하에 48-웰 플레이트에서 웰 당 1×106개의 세포로 배양하였다. 37℃에서 하룻밤 동안의 인큐베이션 후, 상청액을 수확하고, -20℃에서 보관하였다. IFN-γ 농도를 ELISA (IFN-γ ELISA 키트, U-CyTech Biosciences, Utrecht, The Netherlands)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 평가하였다. 데이타는 9명의 제공자로부터의 pg/㎖ 단위의 평균 농도 (± SEM)로 제시된다. 결과는 -003 및 -005가 현저한 수준의 IFN-γ 방출을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다 (도 24C). -024 또한 현저한 수준의 IFN-γ 방출을 유도하지 않았다 (데이타는 제시되지 않음).
실시예 21
재조합 CD38 에 대한 -003 및 -005의 결합 친화력
CD38에 대한 -003 및 -005의 결합을 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 테스트하였다. 간략하게, 정제된 항체를 아민 커플링을 통해 CM-5 센서 칩 (Biacore, Uppsala, Sweden) 상에 고정시켰다. HA-택이 부착된 CD38 (실시예 3 참조)을 흘려 보내고, mAb에 대한 항원의 결합을 Biacore 3000 (Biacore)을 사용하여 칩의 표면에서의 굴절률에서의 변화에 의해 검출하였다. -003 (표 7) 및 -005 (표 8)에 대한 해리 및 속도 상수가 하기에 요약되고 (3회 실험의 평균 ± SD), 이는 -003 및 -005 모두 CD38에 대해 높은 친화력을 갖는다는 것을 나타낸다.
Figure 112007075237487-pct00007
Figure 112007075237487-pct00008
실시예 22
에피토프 맵핑
PEPSCAN 방법을 사용한 에피토프 맵핑
공지된 절차 ([Geysen et al. 1984. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to resolution of a single amino acid. Proc Natl Acad Sci USA 81:3998]; [Slootstra et al. 1996. Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libriries. Mol Divers 1:87]; [Puijk et al. 2001. Segment synthesis, PCT, The Netherlands, p.1.])를 사용하여, 인간 CD38의 C-말단의 아미노산 138개에 걸쳐 선형 20량체 및 루프형 15량체 펩티드를 합성하였다. 또한, C-말단에서의 서열을 기초로, 영역 KNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI, 영역 CVHNLQPEKVQTLEAWVIHGG, 및 영역 CLESIISKRNIQFSAKNIYRC에 걸쳐서 상이한 크기의 단일-루프 펩티드를 제조하였다. 또한, 여분의 셋트를 디자인하여 SKRNIQFSCKNIYR 및 EKVQTLEAWVIHGG로 구성되는 이중-루프 영역을 재구축시켰다. 천연 시스테인을 알라닌으로 대체시켰다. 신용 카드 포맷의 미니-PEPSCAN 카드를 사용하여 ELISA에서 펩티드를 스크리닝하였다.
펩티드 합성
표준 Fmoc-화학을 사용하여 펩티드를 합성하고, 스캐빈저와 함께 TFA를 사용하여 탈보호시켰다. 이어서, 탈보호된 펩티드를 마이크로어레이 상에서 아세토니트릴 (1:1 [부피/부피])이 보충된 중탄산암모늄 (20 mM, pH 7.9) 내의 2,6-비스(브로모메틸)피리딘 또는 2,4,6-트리스(브로모메틸)메시틸렌의 0.5 mM 용액과 반응시켰다. 용액 내에 완전하게 덮이게 하면서 마이크로어레이를 용액 내에서 30-60분 동안 부드럽게 진탕시켰다. 마지막으로, 마이크로어레이를 과량의 밀리포어 H2O로 광범위하게 세정하고, PBS (pH 7.2) 내의 1％ 소듐 도데실술페이트, 0.1％ β-메르캅토에탄올을 함유하는 파괴-완충제 내에서 70℃에서 30분 동안 초음파처리한 후, 밀리포어 H2O 내에서 또다시 45분 동안 초음파처리하였다.
PEPSCAN ELISA -분석
공유결합으로 연결된 펩티드를 함유하는 455-웰 신용카드 포맷 폴리에틸렌 카드를 혈청과 함께 인큐베이션하였다 (예를 들어, 5％ 말 혈청 [부피/부피] 및 5％ 오브알부민 [중량/부피]를 함유하는 차단 용액에서 1:1000로 희석됨) (4℃, 하룻밤). 세정 후, 펩티드를 토끼-항-인간 Ig 과산화효소와 함께 인큐베이션하고 (1:1000 희석, 25℃, 1시간), 세정 후, 과산화효소 기질 (2,2'-아지노-디-3-에틸 벤즈티아졸린 술포네이트 및 2 ㎕/㎖ 3％ H2O2)를 첨가하였다. 1시간 후, 발색을 CCD-카메라 및 이미지 프로세싱 시스템으로 측정하였다. 장비는 55 mm 렌즈 CCD 카메라 (Sony CCD 비디오 카메라 XC-77RR, Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8 렌즈), 카메라 어댑터 (Sony Camera 어댑터 DC-77RR) 및 이미지 프로세싱 소프트웨어 패키지 Optimas, 버젼 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.; Optimas는 펜티엄II 컴퓨터 시스템에서 실행됨)로 구성되었다.
에피토프 표시 방법
개별적인 아미노산들을 인간 CD38 아미노산 서열에서 가장 작은 독특한 단위를 나타내는 디펩티드 모티프에 의해 확인하였다. 테스트된 1164개의 펩티드 각각에 존재하는 모든 디펩티드 모티프들에게 각각의 전체 펩티드에 대해 수득된 ELISA 값이 수여되었다. 강한 결합에서 불량한 결합까지 디펩티드 모티프들의 순위를 매기기 위해, 각각의 개별적인 모티프로부터 수득된 ELISA 값을 모든 1164개의 테스트된 선형 및 루프형 펩티드로부터의 평균 ELISA 값으로 나누어서 상대적인 신호를 계산하였고, 감소되는 값으로 정렬하였다. 이러한 방식으로, 입체형태 에피토프에 대한 아미노산 기여가 고려되었다. 각각의 테스트된 mAb에 대해, 점수가 2.5를 초과하는 모든 디펩티드 모티프 (즉, 이러한 모티프를 함유하는 펩티드의 ELISA 값이 모든 1164개의 펩티드로 수득된 것들의 ELISA 값의 2.5배 이상임)를 선별하였다. 점수매김 시스템에 의해 선형 CD38 서열 상에서 나타나는 단일 아미노산 기여로 데이타를 디컨볼루션(deconvolution)하였다. 선형 CD38 서열을 따라 진행함으로써, 그리고 독특한 디펩티드 단위를 기준점으로 사용함으로써, 점수가 높은 펩티드의 이러한 셋트 내에 CD38 아미노산이 존재하는 각 경우에 1점이 수여되었다.
-003, 005 및 -024 모두가 인간 CD38의 영역 SKRNIQFSCKNIYR 및 EKVQTLEAWVIHGG에 결합하는 것으로 발견되었다. -003는 특히 모티프 RNIQF 및 WVIH를 인식하였고, -005는 특히 모티프 KRN 및 VQTL을 인식하였다.
실시예 23
효소 활성
인간 CD38의 효소 활성을 본질적으로 [Graeff et al., J. Biol. Chem. 269, 30260-30267 (1994)]에 기술된 바와 같은 분석법으로 측정하였다. 간략하게, 기질 NGD+ (80 μM)를 20 mM 트리스-HCl, pH 7.0을 함유하는 완충제 내의 CD38 (0.6 ㎍/㎖의 인간 CD38의 His-택이 부착된 세포외 도메인; His-CD38의 정제에 관하여 실시예 3 참조)과 함께 인큐베이션하였다. cGDPR 생산을 410 nm의 방출 파장 (300 nm에서 여기)에서 분광광도측정에 의해 모니터링할 수 있다. 본 실시예에서는, 340 ± 60 nm의 여기 필터 및 430 ± 8 nm의 방출 필터가 사용되었다.
CD38의 효소 활성에 대한 -003, -005 및 -024의 효과를 테스트하기 위해, 재조합 His-CD38 단백질을 15분 동안 실온에서 다양한 농도 (30, 3, 0.3 및 0.03 ㎍/㎖)의 여러 항체와 함께 예비-인큐베이션한 후, 기질 NGD+를 첨가하였다. 고리형 GDP-리보스 (cGDPR)의 생산을 항체를 첨가한 후의 여러 시점에 기록하였다 (3분, 6분, 9분, 12분, 30분, 45분, 60분, 75분 및 90분).
도 25B는 -005가 cGDPR 생산에 대해 두드러진 억제 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 90분 후, 30 및 3 ㎍/㎖의 -005의 첨가로 cGDPR 생산이 32％ 및 34％ 감소하였다 (표 9). -005의 상이한 뱃치를 사용하는 독립적인 실험에서 유사한 결과가 관찰되었다.
-003 (도 25B, 표 9), -024 (도 25D, 표 9) 또는 항-KLH (도 25A, 표 9)의 첨가 후에는 cGPDR 생산에 대한 억제 효과가 관찰되지 않았다.
이러한 발견을 기초로, -005는 NAD+로부터의 고리형 ADP-리보스 (cADPR)의 합성을 억제할 것으로 또한 예상된다. cADPR 합성의 억제는 [Munshi et al., J. Biol. Chem. 275. 21566-21571 (2000)]에 기술된 HPLC 방법에 따라 결정할 수 있다.
Figure 112007075237487-pct00009
실시예 24
-003 및 -005와 형태형성 항체 3079의 비교.
항체 -003 및 -005를 형태형성 항체 3079 (TH-3079)와 기능적으로 비교하였다. 형태형성 항체 TH-3079의 클로닝 및 발현 방법은 실시예 16에 기술되어 있다. CDC 방법은 실시예 6에 기술되어 있다. ADCC 방법은 실시예 5에 기술되어 있다. 도 26A는 -005 및 -003 및 TH-3079가 CD38-형질감염 CHO 세포의 CDC-매개 용해를 유도한다는 것을 나타내고, 최대 용해가 유사하였다. EC50 값을 비교했을 때, -005 항체가 CHO-CD38 세포의 용해를 유도하는데 있어서 TH3079보다 양호하였고, EC50이 2배 더 낮았다 (표 10 참조).
도 26B는 -005가 Daudi-루시페라제 세포의 CDC-매개 용해를 유도하는데 있어서 TH-3079보다 우수하다는 것을 나타내고, -005에 의한 최대 용해가 TH3079에 의한 것보다 2-3배 더 높았다. EC50 값을 비교했을 때, -005 항체는 Daudi-루시페라제 세포의 용해를 유도하는데 있어서 TH-3079와 유사하였다 (표 10 참조). -003은 Daudi-루시페라제 세포의 현저한 CDC-매개 용해를 유도하지 않는다.
도 26C는 이러한 실험에서 -005, -003 및 TH-3079가 ADCC를 통한 Daudi 표적 세포의 용해를 매개한다는 것을 나타낸다. (log) EC50 및 최대 용해에서 차이가 발견되지 않았다 (표 11, n=5).
Figure 112007075237487-pct00010
Figure 112007075237487-pct00011
<110> Genmab A/S <120> Human Monoclonal Antibodies against CD38 <130> P/18.WO <160> 34 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcttccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 6 <211> 366 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 6 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgctt tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gatgggaagg gtcatccctt tccttggtat agcaaactcc 180 gcacagaaat tccagggcag agtcacaatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggacctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagatgat 300 atagcagcac ttggtccttt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 gcctcc 366 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser 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<212> PRT <213> homo sapiens <400> 15 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 16 <211> 372 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 16 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr 85 90 95 Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Thr Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Cys Ala Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr 225 230 235 240 Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Gly Gly Cys Cys Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys 290 295 300 Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys 305 310 315 320 Cys Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly 325 330 335 Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly 340 345 350 Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys 355 360 365 Cys Thr Cys Cys 370 <210> 17 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 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homo sapiens <400> 24 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 25 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 366 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 26 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagcttttcc aactactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctc atgactctga tgccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccttc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacatgta 300 gggtggggat cgcggtactg gtacttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcactgtc 360 tcctca 366 <210> 27 <211> 122 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro His Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Val Gly Trp Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 28 Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 29 Ile Ile Tyr Pro His Asp Ser Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 30 His Val Gly Trp Gly Ser Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 31 <211> 300 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 31 Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys 1 5 10 15 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val 20 25 30 Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln 35 40 45 Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu 50 55 60 Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val 65 70 75 80 Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys 85 90 95 His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile 115 120 125 Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr 130 135 140 Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys 145 150 155 160 Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp 165 170 175 Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val 180 185 190 Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu 195 200 205 Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser 210 215 220 Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala 225 230 235 240 Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp 245 250 255 Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln 260 265 270 Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val 275 280 285 Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 290 295 300 <210> 32 <211> 300 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 32 Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys 1 5 10 15 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val 20 25 30 Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln 35 40 45 Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu 50 55 60 Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val 65 70 75 80 Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys 85 90 95 His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile 115 120 125 Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr 130 135 140 Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys 145 150 155 160 Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp 165 170 175 Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val 180 185 190 Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu 195 200 205 Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser 210 215 220 Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Ala Leu Glu Ala 225 230 235 240 Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp 245 250 255 Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln 260 265 270 Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val 275 280 285 Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 290 295 300 <210> 33 <211> 300 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 33 Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys 1 5 10 15 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val 20 25 30 Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln 35 40 45 Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu 50 55 60 Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val 65 70 75 80 Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys 85 90 95 His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile 115 120 125 Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr 130 135 140 Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys 145 150 155 160 Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp 165 170 175 Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val 180 185 190 Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu 195 200 205 Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser 210 215 220 Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala 225 230 235 240 Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp 245 250 255 Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Arg 260 265 270 Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val 275 280 285 Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 290 295 300 <210> 34 <211> 300 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 34 Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys 1 5 10 15 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val 20 25 30 Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln 35 40 45 Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu 50 55 60 Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val 65 70 75 80 Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys 85 90 95 His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile 115 120 125 Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr 130 135 140 Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys 145 150 155 160 Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp 165 170 175 Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val 180 185 190 Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu 195 200 205 Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser 210 215 220 Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala 225 230 235 240 Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp 245 250 255 Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln 260 265 270 Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val 275 280 285 Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 290 295 300

Claims (97)

  1. 인간 경쇄 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 3에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 4에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 5에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 8에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 9에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 10에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 서열 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 서열 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 서열 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역 및 서열 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    (i) 각각 서열 1 및 서열 6에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산, 또는
    (ii) (i)에 기재된 서열의 보존적 서열 변형물인 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산
    으로 코딩되는 항체.
  6. 인간 경쇄 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 13에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 14에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 15에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 18에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 19에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 20에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
  7. 제6항에 있어서, 서열 12에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 항체.
  8. 제6항에 있어서, 서열 17에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 항체.
  9. 제6항에 있어서, 서열 17의 VH CDR1 내지 VH CDR3 영역에 스패닝된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는 항체.
  10. 제6항에 있어서, 서열 12에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역 및 서열 17에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 항체.
  11. 제6항에 있어서,
    (i) 각각 서열 11 및 서열 16에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산, 또는
    (ii) (i)에 기재된 서열의 보존적 서열 변형물인 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산
    으로 코딩되는 항체.
  12. 인간 경쇄 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 23에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열 24에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2 및 서열 25에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 28에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열 29에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2 및 서열 30에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
  13. 제12항에 있어서, 서열 22에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 항체.
  14. 제12항에 있어서, 서열 27에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 항체.
  15. 제12항에 있어서, 서열 27의 VH CDR1 내지 VH CDR3 영역에 스패닝된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는 항체.
  16. 제12항에 있어서, 서열 22에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 영역 및 서열 27에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체.
  17. 제12항에 있어서,
    (i) 각각 서열 21 및 서열 26에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산, 또는
    (ii) (i)에 기재된 서열의 보존적 서열 변형물인 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산
    으로 코딩되는 항체.
  18. CD38에의 결합에 대해 제5항, 제11항, 또는 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체와 경쟁하는 항체.
  19. 제18항에 있어서, 흡광(absorption)에 의해 평가시 90％ 이상의 신호로 경쟁이 정의되고 ELISA를 사용하여 경쟁이 결정되는 것인 항체.
  20. 제18항에 있어서, 형광에 의해 평가시 90％ 이상의 신호로 경쟁이 정의되고 교차-차단 측정법을 사용하여 경쟁이 결정되는 것인 항체.
  21. 인간 CD38 (서열 31)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG에 특이적으로 결합하는 항체.
  22. 제21항에 있어서, 모티프 RNIQF 및 WVIH를 인식하는 항체.
  23. 제21항에 있어서, 모티프 KRN 및 VQTL을 인식하는 항체.
  24. 제1항 내지 제17항 및 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) CD38의 길항제로 작용함;
    (ii) 말초혈 단핵 세포의 현저한 증식을 유도하지 않음;
    (iii) 인간 단핵구 또는 말초혈 단핵 세포에 의한 현저한 IL-6 방출을 유도하지 않음;
    (iv) 인간 T 세포 또는 말초혈 단핵 세포에 의한 검출가능한 IFN-γ 방출을 유도하지 않음;
    (v) CD38 발현 세포에 의해 내재화됨;
    (vi) ADCC를 유도함;
    (vii) 보체의 존재 하에 CDC를 유도함;
    (viii) cGDPR의 합성을 억제함;
    (ix) cADPR의 합성을 억제함;
    (x) 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시, 10-8 M 미만의 친화력 (KD)으로 인간 CD38에 결합함
    중 1가지 이상의 특성을 갖는 것인 항체.
  25. 제24항에 있어서, 분광광도측정 방법에 의해 결정시 3 ㎍/㎖의 농도에서 90분 후 cGDPR의 합성을 25％ 이상 억제하는 항체.
  26. 제24항에 있어서, HPLC 방법에 의해 결정시 3 ㎍/㎖의 농도에서 90분 후 cADPR의 합성을 25％ 이상 억제하는 항체.
  27. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 모노클로날 항체인 항체.
  28. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  29. 제28항에 있어서, IgG1 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  30. 제29항에 있어서, IgG1,κ인 것을 특징으로 하는 항체.
  31. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵생물 세포 내에서 글리코실화되는 항체.
  32. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편 또는 단일쇄 항체인 항체.
  33. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 동위원소를 부착시키기 위한 킬레이터 링커를 추가로 포함하는 항체.
  34. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 형태인 항체.
  35. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  36. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  37. (i) 서열 1의 VL 뉴클레오티드 서열;
    (ii) 서열 6의 VH 뉴클레오티드 서열;
    (iii) 서열 1의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 6의 VH 뉴클레오티드 서열;
    (iv) 서열 11의 VL 뉴클레오티드 서열;
    (v) 서열 16의 VH 뉴클레오티드 서열;
    (vi) 서열 11의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 16의 VH 뉴클레오티드 서열;
    (vii) 서열 21의 VL 뉴클레오티드 서열;
    (viii) 서열 26의 VH 뉴클레오티드 서열; 또는
    (ix) 서열 21의 VL 뉴클레오티드 서열 및 서열 26의 VH 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 발현 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 인간 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 인간 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 IgG1 항체를 코딩하는 것인 발현 벡터.
  40. (i) 각각 서열 1 및 서열 6에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
    (ii) 각각 서열 11 및 서열 16에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산; 또는
    (iii) 각각 서열 21 및 서열 26에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
    을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마.
  41. (i) 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노산 서열;
    (ii) 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열 22에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 27에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노산 서열;
    을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 하이브리도마.
  42. (i) 각각 서열 1 및 서열 6에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
    (ii) 각각 서열 11 및 서열 16에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산; 또는
    (iii) 각각 서열 21 및 서열 26에 기재된 바와 같은 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산;
    을 포함하는 인간 경쇄 및 인간 중쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마(transfectoma).
  43. (i) 서열 2에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 7에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노산 서열;
    (ii) 서열 12에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 17에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열 22에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 가변 아미노산 서열, 및 서열 27에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 아미노산 서열;
    을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 모노클로날 항-CD38 항체를 생산하는 트랜스펙토마.
  44. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포.
  45. 제37항에 따른 발현 벡터를 함유하는 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포.
  46. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 검출가능한 양으로 생산하는, 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 비-인간 동물 또는 식물.
  47. 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 면역접합체.
  48. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하고, 상기 항체가 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 단량체성 IgM 항체인 면역접합체.
  49. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및 인간 이펙터 세포에 대한 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자.
  50. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및 CD3, CD4, CD138, IL-15R, 막 결합형 또는 수용체 결합형 TNF-α, 인간 Fc 수용체, 또는 막 결합형 또는 수용체 결합형 IL-15에 대한 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자.
  51. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체; 세포독성제, 방사성 동위원소 또는 약물에 연결된 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 면역접합체; 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는,
    B 세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소림프구성 림프종 (SLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병, B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 외투세포 림프종 (MCL), 여포성 림프종 (FL) (저등급, 중간등급 및 고등급 FL 포함), 피부 여포 중심 림프종, 변연대 B 세포 림프종 (MALT 유형, 결절 및 비장 유형), 모발상 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 형질 세포 백혈병, 이식후 림프세포증식성 장애, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질 세포 백혈병, 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 림프종모양 육아종증, 원발성 삼출성 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 종격 거대 B 세포 림프종, 중쇄 질환 (γ, μ 및 α 질환 포함), 사이클로스로핀-유도 림프종, 메토트렉세이트-유도 림프종, 호지킨(Hodgkin) 림프종, T 세포 전림프구성 백혈병, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, 성인 T 세포 백혈병/림프종, 결절외 NK/T 세포 림프종, 비강 유형, 장병증-유형 T 세포 림프종, 간비장 T 세포 림프종, 피하 지방층염-유사 T 세포 림프종, 아구성 NK 세포 림프종, 균상 식육종/세자리(Sezary) 증후군, 원발성 피부 CD30 양성 T 세포 림프세포증식성 장애 (원발성 피부 역형성 거대 세포 림프종 C-ALCL, 림프종모양 구진증, 경계선 병변), 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 비특정형 말초 T 세포 림프종, 역형성 거대세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 (급성 전골수구성 백혈병 포함), 및 만성 골수증식성 질환 (만성 골수성 백혈병 포함)
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제를 포함하는 제약 조성물
  53. 제52항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 화학요법제, 항염증제, 또는 면역억제제 및/또는 면역조절제로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 시스플라틴(cisplatin), 제피티닙(gefitinib), 세툭시맵(cetuximab), 리툭시맵(rituximab), 베바시주맵(bevacizumab), 에를로티닙(erlotinib), 보르테조밉(bortezomib), 탈리도미드(thalidomide), 파미드로네이트(pamidronate), 졸레드론산(zoledronic acid), 클로드로네이트(clodronate), 리센드로네이트(risendronate), 이반드로네이트(ibandronate), 에티드로네이트(etidronate), 알렌드로네이트(alendronate), 틸루드로네이트(tiludronate), 삼산화비소, 레날리도미드(lenalidomide), 필그라스팀(filgrastim), 페그필그라스팀(pegfilgrastim), 사르그라모스팀(sargramostim), 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SCIO-469로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  55. a) 샘플과 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 상기 항체와 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 접촉시키는 단계; 및
    b) 복합체의 형성을 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위한 시험관내 방법.
  56. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 샘플 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위한 키트.
  57. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 상기 항체와 CD38 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 투여하는 단계; 및
    b) 형성된 복합체를 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플 내의 CD38 항원, 또는 CD38을 발현하는 세포를 검출하기 위한 생체외 방법.
  58. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체.
  59. 샘플 내의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체의 수준을 검출하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체에 결합하는 항-이디오타입 항체.
  60. 제58항에 있어서, 샘플 내의 CD38에 대한 인간 모노클로날 항체의 수준을 검출하기 위한 항-이디오타입 항체.
  61. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    B 세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소림프구성 림프종 (SLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병, B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 외투세포 림프종 (MCL), 여포성 림프종 (FL) (저등급, 중간등급 및 고등급 FL 포함), 피부 여포 중심 림프종, 변연대 B 세포 림프종 (MALT 유형, 결절 및 비장 유형), 모발상 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 형질 세포 백혈병, 이식후 림프세포증식성 장애, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질 세포 백혈병, 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 림프종모양 육아종증, 원발성 삼출성 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 종격 거대 B 세포 림프종, 중쇄 질환 (γ, μ 및 α 질환 포함), 사이클로스로핀-유도 림프종, 메토트렉세이트-유도 림프종, 호지킨(Hodgkin) 림프종, T 세포 전림프구성 백혈병, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, 성인 T 세포 백혈병/림프종, 결절외 NK/T 세포 림프종, 비강 유형, 장병증-유형 T 세포 림프종, 간비장 T 세포 림프종, 피하 지방층염-유사 T 세포 림프종, 아구성 NK 세포 림프종, 균상 식육종/세자리(Sezary) 증후군, 원발성 피부 CD30 양성 T 세포 림프세포증식성 장애 (원발성 피부 역형성 거대 세포 림프종 C-ALCL, 림프종모양 구진증, 경계선 병변), 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 비특정형 말초 T 세포 림프종, 역형성 거대세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 (급성 전골수구성 백혈병 포함), 및 만성 골수증식성 질환 (만성 골수성 백혈병 포함)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 대상에서 CD38을 발현하는 세포가 수반되는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 항체.
  62. 제61항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제와 조합하여 투여되는 항체.
  63. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 멜팔란을 포함하는 것인 항체.
  64. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 덱사메타손을 포함하는 것인 항체.
  65. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 시클로포스파미드를 포함하는 것인 항체.
  66. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 빈크리스틴을 포함하는 것인 항체.
  67. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 독소루비신을 포함하는 것인 항체.
  68. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 혈관 내피 성장 인자 억제제를 포함하는 것인 항체.
  69. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 CD40에 결합하는 면역억제 항체를 포함하는 것인 항체.
  70. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 것인 항체.
  71. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 TOR 억제제를 포함하는 것인 항체.
  72. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 IL-6에 결합하는 면역억제 항체를 포함하는 것인 항체.
  73. 제62항에 있어서, 1가지 이상의 추가적인 치료제가 IGF-IR 억제제를 포함하는 것인 항체.
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