CN114222815A

CN114222815A - Suv39h1缺陷的免疫细胞

Info

Publication number: CN114222815A
Application number: CN202080053040.6A
Authority: CN
Inventors: S·阿米格瑞纳; M·赛塔基斯; S·洛佩兹-科博; J·R·富恩塔尔巴
Original assignee: Memory Therapy Co; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie
Current assignee: Memory Therapy Co; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2022-03-22
Also published as: US20220251572A1; MX2022000922A; EP4003407A1; IL290020A; JP2022542102A; BR112022001148A2; KR20220042161A; WO2021013950A1; AU2020318781A1; CA3146895A1

Abstract

本发明涉及表达抗原特异性受体(诸如CAR或TCR)的改进的免疫细胞，其中SUV39H1失活，任选地，结合TRAC基因座的破坏和/或一个或多个ITAM的缺失。本发明还提供了包含这种细胞的组合物，产生这种细胞的方法，以及这种细胞在过继性细胞疗法，例如在癌症或炎性疾病中的用途。

Description

SUV39H1缺陷的免疫细胞

技术领域

本发明涉及过继性细胞疗法领域。本发明提供具有增强的特性的SUV39H1缺陷的免疫细胞。

背景技术

使用具有重组T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)技术的T细胞的过继性T细胞疗法(ATCT)作为有力的癌症疗法替代方案出现(Lim WA&June CH.2018.Cell 168(4):724-740)。治疗性T细胞的有效移植、长期持久性和减少的耗竭与积极的治疗结果相关。另外，过继性转移细胞的增加的持久性似乎取决于中央记忆T细胞(TCM)群体的获得(Powell DJ等,Blood.2005；105(1):241–50；Huang J,Khong HT等J Immunother.2005；28:258–267)。

活化后，T细胞以不可逆的线性方式向效应物(TE)表型发展(Mahnke YD等,Eur JImmunol.2013；43:2797–2809；Farber DL.Semin Immunol.2009；21:84-91)。因此，逆转录病毒或慢病毒转导的促有丝分裂活化驱动T细胞从初始细胞向TE表型分化。与将转导的T细胞数目扩增至临床应用所需的数目(约10⁹-10¹¹个)的离体培养方案组合，T细胞被驱动朝向更分化的表型，这对于系统持久性而言是次优的。成功的实体瘤的基于细胞疗法的主要障碍是活化的T细胞的耗竭，其降低了它们的增殖和破坏靶细胞的能力。PD-1阻断可在早期恢复T细胞功能，但拯救可能是不完全的或暂时的(Sen DR,等2016.Science 354(6316):1165-1169；Pauken KE,等2016.Science 354(6316):1160-1165)。此外，肿瘤中的免疫抑制性微环境介导T细胞耗竭(Joyce JA,Fearon DT.2015.Science 348(6230):74-80)。

本领域仍然需要用于过继性细胞疗法的具有改善的特性的修饰的或工程化的T细胞。

发明简述

其中SUV39H1已失活或抑制的免疫细胞，特别是T细胞，在过继转移后表现出增强的中央记忆表型，增强的存活和持久性，以及减少的耗竭。特别地，这种细胞以增加的效率累积和重编程至长寿命的中央记忆T细胞。这种细胞在诱导肿瘤细胞排斥方面更有效且显示出增强的治疗癌症的功效。

在一个方面，本公开提供了修饰的免疫细胞，其中SUV39H1基因失活或被抑制，所述细胞包含通过插入编码特异性结合抗原的抗原特异性受体的核酸序列而失活的T细胞受体(TCR)α恒定区基因。核酸序列的插入可降低内源TCR表达至少约75％、80％、85％、90％或95％。例如，编码抗原特异性受体的核酸对于免疫细胞可以是异源的，且操作地连接至T细胞受体的内源启动子，使得其表达在内源启动子的控制下。抗原特异性受体可以是嵌合抗原受体(CAR)或异源TCR。在一些实施方案中，编码CAR的核酸操作地连接至内源TRAC启动子。抗原特异性受体结合的抗原的实例，优选结合亲和力KD为10^-7M或10^-8M或更小，包括孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、p95HER2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2,3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、BCMA、Lewis Y、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gplOO、胚胎癌抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSMA)、雌激素受体、孕激素受体、ephrinB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7或Wilms Tumor 1(WT-1)。

在另一方面，本公开提供修饰的免疫细胞，其中SUV39H1基因失活或被抑制，其中所述细胞表达特异性结合抗原的抗原特异性受体。抗原特异性受体可以是嵌合抗原受体(CAR)，其包含：a)细胞外抗原结合结构域，b)跨膜结构域，c)任选地一个或多个共刺激结构域，和d)细胞内信号传导结构域，其包含具有单一活性ITAM结构域的细胞内信号传导结构域，例如其中ITAM2和ITAM3已失活的修饰的CD3ζ结构域。这可通过本领域已知的任何方法实现，例如，ITAM2和ITAM3已失活，或ITAM1和ITAM2已失活。例如，修饰的CD3ζ多肽仅保留ITAM1，并且剩余的CD3ζ结构域缺失(残基90-164)。作为另一个实例，ITAM1被ITAM3的氨基酸序列取代，并且剩余的CD3ζ结构域缺失(残基90-164)。抗原特异性受体可以是包含具有所述单一活性ITAM结构域的细胞内信号传导结构域的TCR。这种CAR或TCR结合的抗原的实例，优选结合亲和力KD为10^-7M或10^-8M或更小，包括孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、p95HER2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2,3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、BCMA、Lewis Y、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gplOO、胚胎癌抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSMA)、雌激素受体、孕激素受体、ephrinB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7或Wilms Tumor 1(WT-1)。

在本文所述的任何方面，修饰的免疫细胞可以是T细胞、T细胞祖细胞、造血干细胞、iPSC、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+和CD8+T细胞、或NK细胞、或TN细胞、TSCM、TCM或TEM细胞。修饰的免疫细胞可以是T调节细胞。在本文所述的任何方面，SUV39H1活性基因可通过免疫细胞的SUV39H1基因的失活或破坏来抑制，或其可通过SUV39H1抑制剂的表达或递送来抑制。在一些实施方案中，免疫细胞保留其野生型基因，但被修饰以包含编码SUV39H1抑制剂的核酸，任选地显性阴性的SUV39H1基因。

在本文所述的任何方面，抗原特异性受体是CAR，其包含：(a)细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域，(c)任选地一个或多个共刺激结构域，和(d)细胞内信号传导结构域。细胞外抗原结合结构域可以是scFv，任选地特异性结合本文公开的癌抗原的scFv。跨膜结构域可以来自CD28、CD8或CD3-ζ。一个或多个共刺激结构域可以是4-1BB、CD28、ICOS、OX40和/或DAP10。细胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ多肽或其片段，任选地CD3-ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中基于免疫受体酪氨酸的活化基序2(ITAM2)和基于免疫受体酪氨酸的活化基序3(ITAM3)失活。

在任何这些实施方案中，抗原特异性受体可以是双特异性抗原特异性受体，其结合(a)第一抗原(例如癌抗原)和(b)T细胞活化抗原，例如CD3ε或TCR的恒定链(α或β)。

在任何这些实施方案中，免疫细胞还可包含特异性地结合第二抗原的第二抗原特异性受体，任选地TCR或CAR。例如，免疫细胞可包含两个CAR，结合第一抗原的第一CAR和结合第二抗原的第二CAR。

在任何这些实施方案中，SUV39H1的失活使SUV39H1表达降低至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在任何这些实施方案中，免疫细胞可以是自体的或同种异体的。在任何这些实施方案中，免疫细胞被修饰以使HLA-A基因座失活。在一些实施方案中，HLA的I类表达减少至少约75％、80％、85％、90％或95％。

在另一个方面，本公开还提供了包含任何前述修饰的免疫细胞的无菌药物组合物。本公开还提供了包含任何前述修饰的免疫细胞和递送装置或容器的试剂盒。

本公开还提供了使用前述修饰的免疫细胞或药物组合物或试剂盒以治疗患者的方法，所述患者患有与抗原相关的疾病，或处于与抗原相关的疾病的风险中，所述疾病任选地为癌症，所述方法通过向所述患者施用治疗有效量的所述免疫细胞或药物组合物。在一些实施方案中，免疫细胞是CAR T-细胞，且向患者施用小于约5×10⁷个细胞，任选地约10⁵至约10⁷个细胞的剂量。该方法还可包含向患者施用第二治疗剂，任选地一种或多种癌症化疗剂、细胞毒性剂、激素、抗血管生成素、放射性标记化合物、免疫疗法、外科手术、冷冻疗法和/或放射疗法。第二治疗剂可以是免疫检查点调节剂。免疫检查点调节剂的实例包括特异性地结合PD1、PDL1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体或A2AR的抗体或其抑制剂。

附图说明

图1通过RT-qPCR显示在已经敲除SUV39H1的CD8+T细胞中的SUV39H1表达水平。

图2A-2C通过流式细胞仪显示与Mock相比几何平均荧光强度(MFI)的倍数变化，表明在SUV39H1敲除细胞中，中央记忆T细胞表面标志物CCR7、CD27和CD62L的表达水平增加。

图3A显示通过流式细胞仪在SUV39H1敲除细胞中指示中央记忆T细胞表面标志物CCR7、CD45RO、CD27和CD62L的表达水平的代表性FACS图。图3B显示CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+细胞的中央记忆细胞亚群的倍数变化频率。

图4A显示了(a)TIM-3阳性、PD-1阴性，(b)TIM-3阳性、PD-1阳性，(c)TIM-3阴性、PD-1阳性，(d)TIM-3阴性、PD-1阴性的细胞亚群的频率的倍数变化。图4B显示TIM-3的表达水平(平均荧光强度的倍数变化)。

图5A显示T-bet的表达水平(平均荧光强度的倍数变化)。图5B显示了表明EOMES和T-bet表达水平的代表性FACS图。图5C显示通过流式细胞仪的(a)EOMES阳性、Tbet阴性，(b)EOMES阳性、Tbet阳性，(c)EOMES阴性、Tbet阳性和(d)EOMES阴性、Tbet阴性的细胞亚群的频率的倍数变化。图5D显示了表明TCF-1和T-bet表达水平的代表性FACS图。图5E显示通过流式细胞仪的(a)TCF1阳性、Tbet阴性，(b)TCF1阳性、Tbet阳性，(c)TCF1阴性、Tbet阳性和(d)TCF1阴性、Tbet阴性的细胞亚群的频率的倍数变化。T细胞主转录因子、T-bet、EOMES和TCF-1的这些表达模式表明SUV39H1敲除细胞的效应物样表型降低。

图6显示连续刺激后每周CD8+T细胞数量的倍数变化，表明SUV39H1敲除细胞的增殖增加。

图7A显示了第二代抗CD19 CAR慢病毒转导后表达CAR的T细胞的百分比。图7B显示了抗CD19 CAR T细胞对CD19阳性Raji细胞的特异性杀伤，其通过xCelligence装置测量为细胞阻抗(细胞指数)的变化。图7C显示抗CD19 CAR-T细胞在注射有表达荧光素酶的CD19阳性NALM-6细胞的NSG小鼠中的特异性体内抗肿瘤活性，其测量为生物荧光的变化。

图8A和8B显示用含有靶向SUV39的gRNA的Cas9 RNP通过电穿孔敲除SUV39H1后表达抗CD19 CAR的T细胞的百分比，并显示通过RT-qPCR在这种细胞中SUV39H1的表达水平降低。图8C显示CAR在总CD3+Mock和SUV39H1KO T细胞中以及在CD4+和CD8+亚群中的表达。在图8D中，通过流式细胞仪定量组蛋白3(H3K9me3)的三甲基化赖氨酸9的量。这证实了SUV39H1的失活对其底物H3K9me3的水平具有直接影响。

图9A通过流式细胞仪显示了表现中央记忆细胞亚群CCR7+ CD45RO+ CD27+ CD62L+的标志物的SUV39H1敲除的抗CD19 CAR-T细胞的百分比。图9B显示中央记忆细胞亚群频率的倍数变化。

图10A显示TIM-3的表达水平(平均荧光强度的倍数变化)，并且图10B显示与Mock相比，敲除SUV39H1的抗CD19 CAR-T细胞中T-bet的表达水平(平均荧光强度的倍数变化)。图10C显示了通过流式细胞仪分析的SUV39H1KO CAR T细胞亚群的频率倍数变化，所述细胞为(a)EOMES阳性、Tbet阴性，(b)EOMES阳性、Tbet阳性，(c)EOMES阴性、Tbet阳性，和(d)EOMES阴性、Tbet阴性。

图11显示了两个代表性供体在连续刺激后每周SUV39H1KO CD8+ CAR T细胞数目的倍数变化，表明SUV39H1 KO CAR T细胞的增殖增加。

图12显示了SUV39H1KO CD3+ CAR T细胞数目的倍数变化。与Mock相比，SUV39H1的失活导致增殖增加。

图13显示了CD8+CAR T细胞(Mock)和SUV39H1KO CAR T细胞的细胞因子信号传导和干性/记忆基因的表达水平。

图14A和14B分别显示了一周的刺激后CD8+CAR T细胞(Mock)和SUV39H1KO CAR T细胞中糖酵解和效应物细胞因子基因的表达水平。具有SUV39H1敲除的抗CD19 CAR-T细胞显示降低的效应物分化。图14C显示了与记忆/干性相关的基因的表达水平。SUV39H1KO CART细胞显示记忆/干性基因的表达水平增加。

图15A显示了其他的干性/记忆性基因的表达水平。图15B显示了与末端效应物分化(效应物细胞因子和自然杀伤(NK)细胞受体)相关的基因的表达水平。图15C显示耗竭相关基因的表达水平。SUV39H1KO CAR T细胞表现出干性/记忆基因的表达增加和末端效应物和耗竭基因的表达减少，这与SUV39H1失活在抑制末端分化中的作用一致。

图16显示了抗CD19 CAR T细胞(Mock或SUV39H1KO)对CD19阳性NALM-6细胞的特异性体外杀伤，通过以2:1的效应物:靶标比例的生物荧光测量。

图17A显示CAR T细胞(Mock或SUV39H1 KO)的有氧糖酵解，通过细胞外通量分析仪Seahorse(Agilent)测量为细胞外酸化速率(ECAR)的变化。图17B显示CAR T细胞(Mock或SUV39H1KO)的糖酵解储备。SUV39H1的失活少量地增加CAR T细胞的糖酵解储备。

图18A显示CAR T细胞(Mock或SUV39H1KO)的线粒体呼吸，通过细胞外通量分析仪Seahorse(Agilent)测量为氧消耗速率(OCR)的变化。图18B显示CAR T细胞(Mock或SUV39H1KO)的ATP产生。SUV39H1的失活增加了不存在葡萄糖和丙酮酸时的线粒体呼吸和总ATP的产生。

图19A显示了用于急性淋巴细胞白血病的异种肿瘤模型的实验步骤。简言之，将表达荧光素酶的2.5×10⁵个NALM-6细胞静脉内注射到NSG小鼠的尾部，且通过生物荧光(IVIS,Perkin Elmer)纵向跟踪它们的体内生长。在肿瘤注射后第3天，我们输注了10⁶个CAR T细胞(Mock或SUV39H1KO)。图19B显示用Mock或SUV39H1KO CAR T细胞处理的NSG小鼠的NALM-6细胞生长和Kaplan-Meyer存活图。SUV39H1KO CAR T细胞表现出更强的抗肿瘤反应和增加的NSG小鼠的存活。

图20A显示用2×10⁶个CAR T细胞(Mock或SUV39H1KO)处理的NSG小鼠中NALM-6细胞的生长。图20B显示用2×10⁶个CAR T细胞(Mock或SUV39H1 KO)处理的NSG小鼠的Kaplan-Meyer存活图。SUV39H1 CAR T细胞表现出更强的抗肿瘤反应和增加的NSG小鼠的存活(10只中有9只)。

图21A显示了组合用于将CAR插入至TRAC基因座中的框内敲入/敲除和平行的SUV39H1敲除的实验步骤。图21B显示CD4+和CD8+亚群中表达CAR的细胞的百分比和CAR+细胞的平均荧光强度(定量细胞表面上CAR分子的数目)。图21C显示了在仅用TRAC或TRAC和SUV39H1的gRNA(在图中显示为“SUV”)处理的CAR T细胞中SUV39H1的表达水平。

发明详述

定义

在本文中术语“抗体”以最广义使用，且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段、重组IgG(rlgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))和单结构域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖基因工程化和/或其他修饰的免疫球蛋白形式，诸如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和杂缀合物抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体、串联二scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整的或全长的抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括IgG及其亚类、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA和IgD。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区。

“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、VHH抗体、单链抗体分子(诸如scFv)和单结构域VH单抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在具体实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，诸如scFv。

“单结构域抗体”是包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。

基因的“失活”或“破坏”是指基因组DNA序列的改变，其导致基因的表达降低或消除，或导致非功能性基因产物表达。示例性方法包括基因沉默、敲减、敲除和/或基因破坏技术，诸如通过基因编辑(例如诱导断裂和/或同源重组)。这种基因破坏的示例是插入、移码和错义突变，基因或基因部分的缺失、敲入和敲除，包括整个基因的缺失。这种破坏可发生在编码区中，例如在一个或多个外显子中，导致不能产生全长产物、功能性产物或任何产物，诸如通过插入终止密码子。这种破坏也可通过启动子或增强子或其他影响转录激活的区域中的破坏而发生，从而阻止基因的转录。基因破坏包括基因靶向，包括通过同源重组的靶向基因失活。

基因产物的“抑制”是指与未被抑制或阻遏的野生型的活性或表达水平相比，其活性和/或基因表达降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。

“非功能性”是指与野生型蛋白相比，活性降低的或缺乏可检测活性的蛋白。

“显性阴性”基因产物是指在同一细胞内干扰或不利地影响野生型产物功能的突变的非功能性基因产物。典型地，突变基因产物与野生型产物相同元件相互作用的能力仍然存在，但某些功能性方面被阻断。

本发明的细胞

免疫细胞

典型地，根据本发明的细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。

更特别地，本发明的细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官(特别是胸腺)，且是免疫系统的细胞(即免疫细胞)，诸如先天或适应性免疫的细胞。例如，髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，典型地是T细胞和/或NK细胞。优选地，根据本发明，细胞特别是淋巴细胞，包括T细胞、B细胞和NK细胞。

根据本发明的细胞也可以是免疫细胞祖细胞，诸如淋巴祖细胞，更优选地是T细胞祖细胞。T细胞祖细胞的实例包括诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)、多能祖细胞(MPP)；淋巴样多能祖细胞(LMPP)；共同淋巴祖细胞(CLP)；淋巴祖细胞(LP)；胸腺沉积物祖细胞(TSP)；早期胸腺祖细胞(ETP)。造血干细胞和祖细胞可从例如脐带血或外周血中获得，例如源自用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员处理后的外周血的CD34+细胞。

典型地，T细胞祖细胞表达一组共有标志物，包括CD44、CD117、CD135和Sca-1，也可参见Petrie HT,Kincade PW.Many roads,one destination for T cellprogenitors.The Journal of Experimental Medicine.2005；202(1):11-13。

典型地，细胞是原代细胞，诸如直接从受试者中分离和/或从受试者中分离并冷冻的细胞。

针对待治疗的受试者，本发明的细胞可以是同种异体的和/或自体的。

在自体免疫细胞疗法中，从患者收集免疫细胞，如本文所述进行修饰，并返回到患者。在同种异体免疫细胞疗法中，从健康供体而非患者收集免疫细胞，如本文所述，进行修饰，并施用于患者。典型地，这些是HLA匹配的，以降低宿主排斥的可能性。免疫细胞还可包含修饰，诸如HLA的I类分子的破坏或去除。例如Torikai等,Blood.2013；122:1341-1349使用ZFN敲除HLA-A基因座，而Ren等,Clin.Cancer Res.2017；23:2255-2266敲除HLA的I类表达所需的β-2微球蛋白(B2M)。

此外，通用‘现成’产品免疫细胞必须包含经设计以减少移植物抗宿主疾病的修饰，诸如TCRαβ受体的失活(例如破坏或缺失)；所得细胞表现出内源TCR的表达显著降低或几乎消除。参见Graham等,Cells.2018Oct；7(10):155的综述。因为单个基因编码α链(TRAC)而两个基因编码β链，TRAC基因座是用于去除或破坏TCRαβ受体表达的典型靶标，尽管TCRβ基因座可以替代地被破坏。或者，可表达TCRαβ信号传导的抑制剂，例如CD3ζ的截短形式可充当TCR抑制分子。Ren等同时敲除TCRαβ、B2M和免疫检查点PD1。

在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，诸如完整T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，诸如由功能、激活状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或存留能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度定义的那些。

T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群是初始T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，诸如干细胞记忆T(TSCM)、中央记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关性不变T(MAIT)细胞、天然存在的和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助性T细胞(诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞)、卵泡辅助性T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。优选地，根据本发明的细胞是由于抑制了SUV39H1而具有干/记忆特性和更高的重构能力的TEFF细胞，以及TN细胞、TSCM、TCM、TEM细胞及它们的组合。

在一些实施方案中，使一个或多个T细胞群富集或耗竭对一种或多种特定标志物(例如表面标志物)呈阳性或表达高水平的细胞，或对一种或多种标志物呈阴性或表达相对较低水平的细胞。在一些情况下，这些标志物是在某些T细胞群(诸如非记忆细胞)上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其他T细胞群(诸如记忆细胞)上存在或以相对较高的水平表达的那些。在一个实施方案中，使细胞(诸如，CD8⁺细胞或T细胞，例如，CD3⁺细胞)富集(即阳性选择)对CD117、CD135、CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L阳性或表达高表面水平的CD117、CD135、CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞和/或耗竭(例如，阴性选择)对CD45RA阳性或表达高表面水平的CD45RA的细胞。在一些实施方案中，使细胞富集或耗竭对CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)阳性或表达高表面水平的CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)的细胞。在一些实例中，使CD8+T细胞富集对CD45RO阳性(或对CD45RA阴性)和对CD62L阳性的细胞。CCR7+、CD45RO+、CD27+、CD62L+细胞的细胞亚群构成中央记忆细胞亚群。

例如，根据本发明，细胞可以包括CD4+T细胞群和/或CD8+T细胞亚群，例如富集中央记忆(T_CM)细胞的亚群。或者，该细胞可以是其他类型的淋巴细胞，包括自然杀伤(NK)细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、先天淋巴样细胞(ILC)和B细胞。

根据本发明用于工程化的细胞和含有细胞的组合物分离自样品，特别是生物样品，例如获自受试者或衍生自受试者。典型地，受试者需要细胞疗法(过继性细胞疗法)和/或是将要接受细胞疗法的受试者。受试者优选是哺乳动物，特别是人。在本发明的一个实施方案中，所述受试者患有癌症。

样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个处理步骤(诸如分离、离心、基因工程(例如病毒载体转导))、洗涤和/或孵化的样品。生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经加工的样品。生物样品包括但不限于体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液；组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。优选地，从其衍生或分离细胞的样品是血液或血液来源的样品，或衍生自单采血液分离术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(典型地为过继性细胞疗法)下，样品包括自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方案中，细胞衍生自细胞系，例如T细胞系。这些细胞也可以获自异种来源，诸如小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。优选地，该细胞是人细胞。

SUV39H1人SUV39H1甲基转移酶在UNIPROT中标为O43463，并且由位于染色体X上的基因SUV39H1编码(NCBI中的基因ID：6839)。示例性的人基因序列是SEQ ID NO:1，并且示例性的人蛋白质序列是SEQ ID NO:2，但应当理解，具有不同序列的多态性或变体存在于不同受试者的基因组中。因此，根据本发明的术语SUV39H1涵盖SUV39H1的所有哺乳动物变体，以及编码与SEQ ID NO:2至少75％、80％，或典型地85％、90％或95％相同的蛋白质的基因，所述蛋白质具有SUV39H1活性(即组蛋白H3的Lys-9被H3K9-组蛋白甲基转移酶甲基化)。

本发明的“SUV39H1表达降低”是指与正常水平相比，SUV39H1表达降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。

“非功能性”SUV39H1蛋白在本文中是指，如上所述的，活性降低的或缺乏可检测活性的蛋白。

如本文所用，两个核酸序列之间的表述“同一性百分比”是指在待比较的两个序列之间，以所述序列的最佳比对获得的相同碱基或氨基酸的百分比，该百分比纯粹是统计的，且这两个序列之间的差异随机分布在两个序列上。如本文所用，“最佳比对”或“优化比对”是指所确定的同一性百分比(见下文)最高的比对。通常通过比较根据最佳比对事先已经比对的这些序列来实现两个核酸序列之间的序列比较；该比较是在比较段上实现的，以便识别和比较相似的局部区域。除了手动操作外，还可以通过使用由SMITH和WATERMAN开发的全局同源性算法(Ad.App.Math.,vol.2,p:482,1981)、通过使用由NEDDLEMAN和WUNSCH开发的局部同源性算法(J.Mol.Biol,vol.48,p:443,1970)、通过使用由PEARSON和LIPMAN开发的相似性方法(Proc.Natl.Acd.Sci.USA,vol.85,p:2444,1988)、通过使用采用这些算法的计算机软件(Wisconsin Genetics software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI USA中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA、TFASTA)、通过使用MUSCLE多重比对算法(Edgar,Robert C,Nucleic Acids Research,vol.32,p:1792,2004)来实现最佳序列比对。为了获得最佳的局部比对，最好使用BLAST软件。通过比较优化比对的这两个序列来测定两个序列之间的同一性百分比，所述序列能够相对于参考序列包含添加或缺失以获得这两个序列之间的优化比对。通过以下计算同一性百分比：测定这两个序列之间相同位置的数目，然后将该数目除以比较位置的总数目，然后将所得结果乘以100以获得这两个序列之间的同一性百分比。

抗原特异性受体

在一些实施方案中，免疫细胞在表面表达抗原特异性受体。因此，所述细胞可包含编码一种或多种抗原特异性受体的一种或多种核酸，任选可操作地连接至异源调控序列。典型地，这样的抗原特异性受体以Kd结合亲和力10^-6M或更小、10^-7M或更小、10^-8M或更小、10^-9M或更小、10^-10M或更小、或10^-11M或更小结合靶抗原(较低的数字表示较大的结合亲和力)。

典型地，所述核酸是异源的(即，例如其通常不存在于被工程化的细胞和/或在这种细胞来源的生物体中)。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的，包括编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合。典型地，所述核酸及其调控序列是异源的。例如，编码抗原特异性受体的核酸对于免疫细胞可以是异源的，且操作性地连接至T细胞受体的内源启动子，使其表达在内源启动子的控制下。在一些实施方案中，编码CAR的核酸操作性地连接至内源TRAC启动子。

本发明的抗原特异性受体包括重组T细胞受体(TCR)及其组分，以及功能性非TCR抗原特异性受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)。

可以设计免疫细胞，特别地如果是同种异体的，以减少移植物抗宿主疾病，使得细胞包含失活的(例如破坏的或缺失的)TCRαβ受体。因为单个基因编码α链(TRAC)而两个基因编码β链，TRAC基因座是降低TCRαβ受体表达的典型靶标。因此，编码抗原特异性受体(例如CAR或TCR)的核酸可整合至TRAC基因座中的一个位置，优选地在第一外显子(SEQ ID NO:3)的5’区域中，该位置显著降低功能性TCRα链的表达。参见，例如，Jantz等，WO2017/062451；Sadelain等，WO2017/180989；Torikai et al,.Blood,119(2):5697-705(2012)；Eyquem等,Nature.2017Mar 2；543(7643):113-117。内源TCRα的表达可减少至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在这些实施方案中，编码抗原特异性受体的核酸的表达任选地在内源TCR-α启动子的控制下。

嵌合抗原受体(CAR)

在一些实施方案中，工程化抗原受体包含嵌合抗原受体(CAR)，包括激活或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR,参见Fedorov等,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))。

嵌合抗原受体(CAR)(也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体、人工T细胞受体)是工程化受体，其可将任意特异性移植到免疫效应细胞(T细胞)上。典型地，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上，通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。

在一些方面，CAR通常通过接头和/或跨膜结构域包含与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这种分子典型地模拟或近似于通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体组合的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。

所述CAR可包括

(a)细胞外抗原结合结构域，

(b)跨膜结构域，

(c)任选地，共刺激结构域，和

(d)细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，构建CAR以对特定抗原(或标志物或配体)具有特异性，诸如在待通过过继细胞疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原，诸如癌症标志物。CAR典型地在其细胞外部分中包含一个或多个抗原结合分子，诸如一个或多个抗原结合片段、结构域或抗体部分，典型地，一个或多个抗体可变结构域。例如，细胞外抗原结合结构域可包含轻链可变结构域和重链可变结构域，典型地为scFv。

用来结合抗原的部分通常分为三类：衍生自抗体的单链抗体片段(scFv)、选自文库的Fab或与其同源受体结合的天然配体(对于第一代CAR)。Sadelain M,Brentjens R,Riviere I中特别报道了这些类别中的每一个的成功实例。嵌合抗原受体(CAR)设计的基本原理参见Cancer discovery.2013；3(4):388-398(特别参见表1)且包括在本申请中。

抗体包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，且可以如上所述进一步亲和力成熟和选择。通常使用源自啮齿动物免疫球蛋白(例如小鼠、大鼠)的嵌合或人源化scFv，因为其容易来源于充分表征的单克隆抗体。人源化抗体含有啮齿动物序列衍生的CDR区；典型地，啮齿动物CDR被移植到人框架中，且一些人框架残基可被回复突变成原始啮齿动物框架残基以保持亲和力，和/或一个或几个CDR残基可被突变以增加亲和力。完全人抗体不具有鼠序列，且典型地通过人抗体文库的噬菌体展示技术，或免疫天然免疫球蛋白基因座已被人免疫球蛋白基因座的片段替代的转基因小鼠来产生。可产生在天然氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的抗体变体，其中抗体保留或基本上保留其特异性结合功能。氨基酸的保守取代是众所周知的且如上所述。还可产生对抗原具有改善的亲和力的其他变体。

典型地，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，诸如衍生自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。

在一些实施方案中，CAR包含特异性结合抗原的抗体重链可变结构域，诸如待靶向的细胞或疾病(诸如肿瘤细胞或癌细胞)的癌症标志物或细胞表面抗原，诸如本文所述或本领域已知的任何靶抗原。

在一些实施方案中，CAR含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原(诸如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如scFv)。

在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，诸如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别以MHC-肽复合物呈递于细胞表面的细胞内抗原，诸如肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(诸如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原特异性受体包括功能性非TCR抗原特异性受体，诸如嵌合抗原特异性受体(CAR)。通常，含有表现出针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。

在一些方面，抗原特异性结合或识别组分与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，CAR包括与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。

在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自天然或合成来源。如果来源是天然的，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区域包括源自(即至少包含其跨膜区域)T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154、ICOS或GITR的α、β或ζ链的那些。跨膜结构域也可以是合成的。在一些实施方案中，跨膜结构域源自CD28、CD8或CD3-ζ。

在一些实施方案中，存在短的寡或多肽接头，例如长度为2至10个氨基酸的接头，并在CAR的跨膜结构域和细胞质信号结构域之间形成连接。

CAR通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。典型地，第一代CAR具有CD3ζ链的胞内结构域，它是来自内源TCR的主要信号传递者。典型地，第二代CAR还包含从各种共刺激蛋白受体(例如CD28、41BB(CD28)、ICOS)到CAR胞质尾的细胞内信号传导结构域，以向T细胞提供其他信号。共刺激结构域包括源自人CD28、4-1BB(CD137)、ICOS-1、CD27、OX40(CD137)、DAP10和GITR(AITR)的结构域。考虑了两种共刺激结构域，例如CD28和4-1BB，或CD28和OX40的组合。第三代CAR结合多个信号传导结构域(诸如CD3z-CD28-4-1BB或CD3z-CD28-OX40)以增强效力。

细胞内信号传导结构域可来自TCR复合物的细胞内组分，诸如介导T细胞活化和细胞毒性的TCR CD3+链，例如CD3ζ链。替代的细胞内信号传导结构域包括FcεRIγ。细胞内信号传导结构域可包含修饰的CD3ζ多肽，所述多肽缺乏其三个免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)中的一个或两个，其中ITAM是ITAM1、ITAM2和ITAM3(从N-端到C-端编号)。CD3-ζ的细胞内信号传导区是SEQ ID NO:4的残基22-164。ITAM1位于氨基酸残基61-89附近，ITAM2位于氨基酸残基100-128附近，并且ITAM3位于残基131-159附近。因此，修饰的CD3ζ多肽可使ITAM1、ITAM2或ITAM3中的任一种失活。或者，修饰的CD3ζ多肽可使任意两种ITAM失活，例如ITAM2和ITAM3，或ITAM1和ITAM2。优选地，ITAM3失活，例如缺失。更优选地，ITAM2和ITAM3失活，例如缺失，留下ITAM1。例如，一种修饰的CD3ζ多肽仅保留ITAM1，并且剩余的CD3ζ结构域缺失(残基90-164)。作为另一个实例，ITAM1被ITAM3的氨基酸序列取代，并且剩余的CD3ζ结构域缺失(残基90-164)。参见，例如Bridgeman等,Clin.Exp.Immunol.175(2):258-67(2014)；Zhao等,J.Immunol.183(9):5563-74(2009)；Maus等,WO 2018/132506；Sadelain等,WO/2019/133969,Feucht等,Nat Med.25(1):82-88(2019)。

因此，在一些方面，抗原结合分子与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。CAR还可进一步包括一种或多种其他分子(诸如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。

在一些实施方案中，一旦连接CAR，CAR的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活正常效应物功能或相应的非工程化免疫细胞(典型地为T细胞)的应答的至少一种。例如，CAR可诱导T细胞的功能，诸如溶细胞活性或T辅助活性、细胞因子或其他因子的分泌。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，且在一些方面还包括在天然情况下与此类受体配合作用以在抗原特异性受体结合后启动信号传导的共受体、和/或此类分子的任何衍生物或变体和/或具有相同功能能力的任何合成序列的那些。

在某些方面，T细胞活化被描述为由两类细胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的细胞(初级细胞质信号传导序列)；以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级细胞质信号传导序列)的细胞。在一些方面，CAR包括这种信号传导组分的一个或两个。

在一些方面，CAR包括初级细胞质信号传导序列，其以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的主要细胞质信号传导序列可含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的序列。在一些实施方案中，CAR中的细胞质信号传导分子含有细胞质信号传导结构域、其部分或衍生自CD3ζ的序列。

CAR还可包括共刺激受体的信号传导结构域和/或跨膜部分，诸如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS。在某些方面，相同的CAR包括激活组分和共刺激组分两者。或者，活化结构域由一个CAR提供，而共刺激由识别另一种抗原的另一种CAR提供。

CAR或其他抗原特异性受体也可以是抑制性CAR(例如iCAR)，且包括削弱或抑制应答(诸如免疫应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的实例是在免疫检查点分子上发现的那些，包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR)。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，其包括这种抑制性分子的信号传导结构域或源自这种抑制性分子的信号传导结构域，从而其起到削弱细胞应答的作用。当由激活受体(例如CAR)识别的抗原也表达或也可以表达在正常细胞表面上时，这种CAR例如用于减少脱靶效应的可能性。

TCR

在一些实施方案中，抗原特异性受体包括重组T细胞受体(TCR)和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。编码TCR的核酸可从多种来源获得，诸如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增天然存在的TCR DNA序列，随后表达抗体可变区，随后选择与抗原的特异性结合。在一些实施方式中，TCR获自分离自患者的T细胞，或获自培养的T细胞杂交瘤。在一些实施方案中，靶抗原的TCR克隆已在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等(2005)J Immunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，噬菌体展示被用于分离针对靶抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349-354。

“T细胞受体”或“TCR”是指含有可变α和β链(分别称为TCRa和TCRp)或可变γ和δ链(分别称为TCRy和TCR5)的分子，且其能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽。在一些实施方案中，TCR为αβ形式。典型地，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但是表达它们的T细胞可能具有不同的解剖位置或功能。TCR可以在细胞表面上或以可溶形式被发现。通常，TCR在通常负责识别结合主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原的T细胞(或T淋巴细胞)表面上被发现。在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾(例如参见Janeway等,Immunobiology:The Immune System in Health andDisease,3rd Ed.,Current Biology Publications,p.4:33,1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区域和在C末端的短细胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号传导的CD3复合物的不变蛋白相关。除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长的TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。

因此，出于本文的目的，提及的TCR包括任何TCR或功能性片段，诸如与结合在MHC分子中的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。可以互换使用的TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指含有TCR的一部分结构域，但结合完整TCR所结合的抗原(例如MHC-肽复合物)的分子。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，诸如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成结合特异性MHC-肽复合物的结合位点，诸如通常每条链包含三个互补决定区的结合位点。

在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成类似于免疫球蛋白的环或互补决定区(CDR)，其赋予抗原识别并通过形成TCR分子的结合位点来确定肽特异性。典型地，如免疫球蛋白一样，CDR被框架区(FR)隔开(例如参见Jores等,Pwc.Nat'lAcad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等,EMBO J.7:3745,1988；也见Lefranc等,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，尽管已显示α链的CDR1与抗原肽的N末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用，但是CDR3是负责识别经加工抗原的主要CDR。CDR2被认为可以识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区可含有其他高变(HV4)区。

在一些实施方案中，TCR链含有恒定结构域。例如，如免疫球蛋白一样，TCR链的细胞外部分(例如，α-链、β-链)可在N末端含有两个免疫球蛋白结构域、一个可变结构域(例如，Va或Vp；典型地基于Kabat编号的氨基酸1-116，Kabat等,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,US Dept.Health and Human Services,Public HealthService National Institutes of Health,1991,5th ed.)以及与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如α-链恒定结构域或Ca，典型地基于Kabat的氨基酸117-259、β-链恒定结构域或Cp，典型地基于Kabat的氨基酸117-295)。例如，在某些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个含有CDR的膜远端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR可在α和β链的每一个中具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。

在一些实施方案中，TCR链可含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电。在某些情况下，TCR链含有细胞质尾巴。在某些情况下，该结构允许TCR与其他分子(如CD3)缔合。例如，含有带有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。

通常，CD3是在哺乳动物和ζ链中可具有三个不同的链(γ、δ和ε)的多蛋白复合物。例如，在哺乳动物中，复合物可含有CD3γ链、CD3δ链、两个CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区域带负电，这是允许这些链与带正电的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的胞内尾各自含有单个保守的基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM，而每个CD3ζ链均具有三个。通常，ITAM参与TCR复合物的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区域，并在将信号从TCR传播到细胞中发挥作用。CD3γ-、δ-和ζ-链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。

在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有两个分开的链(诸如通过一个或多个二硫键连接)的异二聚体(α和β链或γ和δ链)。

示例性抗原特异性受体，包括CAR和重组TCR，以及将所述受体工程化并引入细胞的方法，包括例如在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061；美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337；美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118以及欧洲专利申请号EP2537416中描述的那些，和/或Sadelain等,Cancer Discov.2013April；3(4):388-398；Davila等(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等,Curr.Opin.Immunol.,2012October；24(5):633-39；Wu等,Cancer,2012March 18(2):160-75描述的那些。在一些方面，基因抗原特异性受体包括如美国专利号：7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号：WO/2014055668A1中描述的那些。

抗原

在抗原特异性受体靶向的抗原中，存在通过过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。这些疾病和病症包括增生性、赘生性和恶性疾病和病症，更特别是癌症。还预期感染性疾病和自身免疫性、炎性或变应性疾病。

癌症可以是实体癌或“液体肿瘤”，诸如影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症，也称为造血系统和淋巴组织的肿瘤，其特别包括白血病和淋巴瘤。例如，液体肿瘤包括急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(包括各种淋巴瘤，诸如套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、腺瘤、鳞状细胞癌、喉癌、胆囊癌和胆管癌、视网膜癌(诸如成视网膜细胞瘤))。

实体癌尤其包括影响选自下组的器官之一的癌症：结肠、直肠、皮肤、子宫内膜、肺(包括非小细胞肺癌)、子宫、骨骼(诸如骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、釉质瘤和脊索瘤)、肝、肾、食道、胃、膀胱、胰腺、子宫颈、脑(诸如脑膜瘤、胶质母细胞瘤、低级星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、垂体瘤、神经鞘瘤和转移性脑癌)、卵巢、乳房、头颈部、睾丸、前列腺和甲状腺。

优选地，根据本发明的癌症是如上所述的影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤或与多发性骨髓瘤相关。

根据本发明的疾病还涵盖感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、HIV免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。

根据本发明的疾病还包括自身免疫性或炎性疾病或病症，诸如关节炎，例如类风湿性关节炎(RA)、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化、哮喘，和/或与移植相关的疾病或病症。在这些情况下，T-调节细胞可以是其中SUV39H1被敲除的细胞。

在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如肿瘤或致病性细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。在一些这样的实施方案中，本文提供的多靶点和/或基因破坏方法用于改进特异性和/或功效。

在一些实施方案中，抗原是通用肿瘤抗原。术语“通用肿瘤抗原”是指免疫原性分子，诸如蛋白质，其通常在肿瘤细胞中比在非肿瘤细胞中以更高的水平表达，且还在不同来源的肿瘤中表达。在一些实施方案中，通用肿瘤抗原在人癌症中的表达超过30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的。在一些实施方案中，通用肿瘤抗原在至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或更多种不同类型的肿瘤中表达。在某些情况下，通用肿瘤抗原可以在非肿瘤细胞(诸如正常细胞中)表达，但是其表达水平低于在肿瘤细胞中的表达水平。在某些情况下，通用肿瘤抗原在非肿瘤细胞中根本不表达，诸如在正常细胞中不表达。例如，示例性通用肿瘤抗原包括人端粒酶逆转录酶(hTERT)、survivin、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、p95HER2、Wilms肿瘤基因1(WT1)、livin、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(D1)。包括通用肿瘤抗原的肿瘤抗原的肽表位是本领域已知的，且在某些方面，可用于产生MHC限制性抗原特异性受体，诸如TCR或TCR样CAR(例如，参见公开的PCT申请号WO2011009173或WO2012135854和公开的美国申请号US20140065708)。

在一些方面，抗原在多发性骨髓瘤上表达，诸如CD38、CD138和/或CS-1。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123和/或CD44。针对这种抗原的抗体或抗原结合片段是已知的，例如包括美国专利号8,153,765；8,603477；8,008,450；美国公开申请号US20120189622和公开的国际PCT申请号WO2006099875、WO2009080829或WO201209261中描述的那些。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段(例如scFv)可用于产生CAR。

在一些实施方案中，抗原可以是在癌细胞或肿瘤细胞上表达或上调的抗原，但也可以在免疫细胞(诸如静止或活化的T细胞)中表达。例如，在某些情况下，据报道hTERT、survivin和其他通用肿瘤抗原的表达存在于淋巴细胞中，包括活化的T淋巴细胞(例如，参见Weng等(1996)J Exp.Med.,183:2471-2479；Hathcock等(1998)J Immunol,160:5702-5706；Liu等(1999)Proc.Natl Acad Sci.,96:5147-5152；Turksma等(2013)Journal ofTranslational Medicine,11:152)。同样，在某些情况下，CD38和其他肿瘤抗原也可以在免疫细胞(诸如T细胞)中表达，诸如在活化的T细胞中上调。例如，在一些方面，CD38是已知的T细胞活化标志物。

在一些实施方案中，所述癌症是HER2或p95HER2的过表达或与HER2或p95HER2的过表达相关。p95HER2是HER2的组成型活性C-端片段，其通过编码全长HER2受体的转录物在甲硫氨酸611处的替代的翻译起始而产生。p95HER2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且细胞外结构域的氨基酸序列是MPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDKDDKGCPAEQRASPLT(SEQ ID NO:6)。

已报道HER2或p95HER2在乳腺癌以及胃癌、胃食管癌、食管癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌和头颈癌中过表达。与主要表达HER2的完整形式的那些患者相比，表达p95HER2片段的癌症患者具有更大的发生转移的可能性和更差的预后。Saez等,Clinical Cancer Research,12:424-431(2006)。

与HER2(即，结合p95HER2但不显著结合全长HER2受体)相比，可特异性结合p95HER2的抗原结合结构域公开于Sperinde等,Clin.Cancer Res.16,4226-4235(2010)和美国专利公开号2013/0316380中，其全部内容通过引用并入本文。与HER2相比，产生具有可特异性结合p95HER2的抗原结合结构域的单克隆抗体的杂交瘤公开于国际专利公开号WO/2010/000565和Parra-Palau等,Cancer Res.70,8537-8546(2010)中。实例CAR结合p95HER2的表位PIWKFPD，其结合亲和力KD为10^-7M或更小、10^-8M或更小、10^-9M或更小或10^-10M或更小。特异性结合p95HER2及其CDR的抗原结合结构域的实例公开于美国专利公开号2018/0118849的SEQ ID NO:14-19(本文的SEQ ID NO:7-12)中，且优选对p95HER2的结合亲和力KD为10^-7M或更小、10^-8M或更小、10^-9M或更小或10^-10M或更小。Rius Ruiz等,Sci.Transl.Med.10,eaat1445(2018)和美国专利公开号2018/0118849，其全文以引用方式并入本文，其描述了特异性结合p95HER2的表位PIWKFPD和TCR的CD3ε链的T-细胞双特异性抗体。命名为p95HER2-TCB的抗体由与CD3ε单价结合而与p95HER2二价结合的不对称双臂免疫球蛋白G1(IgG1)组成。双特异性抗体对CD3ε具有约70-100nM的单价低亲和力，这降低了非特异性活化的机会，且对p95HER2具有约9nM的较高二价亲和力。

在本文提供的一些实施方案中，可将免疫细胞(诸如T细胞)工程化以抑制或破坏免疫细胞中编码抗原的基因，从而使所表达的抗原特异性受体在免疫细胞自身上表达的情况下不会特异性结合抗原。因此，在一些方面，这可以避免脱靶效应，诸如工程化的免疫细胞与其自身的结合，这可能降低例如与过继细胞疗法有关的工程化的免疫细胞的功效。

在一些实施方案中，诸如在抑制性CAR的情况下，靶标是脱靶标志物，诸如不在患病细胞或待靶向的细胞上表达但在正常或未患病细胞上表达的抗原，在相同工程化细胞中，所述正常或未患病细胞还表达被激活或刺激受体靶向的疾病特异性靶标。这种抗原的示例是MHC分子，诸如I类MHC分子，例如，其与治疗其中这些分子被下调但在非靶向细胞中保持表达的疾病或病症有关。

在一些实施方案中，工程化的免疫细胞可含有靶向一种或多种其他抗原的抗原特异性受体。在一些实施方案中，一种或多种其他抗原是肿瘤抗原或癌症标志物。在一些实施方案中，通过提供的免疫细胞上的抗原特异性受体靶向的其他抗原可包括孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、p95HER2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙肝表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gplOO、胚胎癌抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、p95HER2、雌激素受体、孕激素受体、ephrinB2、CD 123、CS-1、c-Met、GD-2和MAGE A3、CE7、Wilms Tumor 1(WT-1)、细胞周期蛋白(诸如细胞周期蛋白A1(CCNA1))，和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。

在一些实施方案中，CAR结合病原体特异性抗原。在一些实施方案中，CAR对病毒抗原(诸如HIV、HCV、HBV等)、细菌抗原和/或寄生虫抗原具有特异性。

在一些实施方案中，将本发明细胞基因工程化以在细胞上表达两个或更多个抗原特异性受体，每个受体识别不同的抗原，且典型地，每个受体包括不同的细胞内信号传导组分。例如，在国际专利申请公开号WO 2014055668 A1中描述了这种多靶点策略(描述了活化和共刺激CAR的组合，例如，靶向单独存在于靶标(例如正常细胞)之外，但仅一起存在于待治疗的疾病或病症的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)(描述了表达活化和抑制性CAR的细胞，诸如其中活化CAR结合在正常或未患病细胞和待治疗的疾病或病症细胞上均表达的一种抗原，而抑制性CAR结合仅在正常细胞或不需要治疗的细胞上表达的另一种抗原的那些)。

抗原结合受体的实例包括双特异性抗体，其为不仅结合所需抗原以及活化T细胞抗原(诸如CD3ε)的T细胞活化抗体。

在某些情况下，刺激因子(例如淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对受试者有毒。因此，在某些情况下(诸如在过继细胞疗法中施用时)，工程化细胞包括使细胞易于在体内进行负选择的基因片段。例如，在一些方面，将细胞工程化，使得可以由于施用其的患者体内状况的改变而将其消除。负选择表型可以由插入赋予对所施用试剂(例如化合物)的敏感性的基因所致。负选择基因包括赋予更昔洛韦敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-1TK)基因(Wigler等,Cell II:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因；细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。

在本发明的其他实施方案中，细胞(例如T细胞)未进行工程化以表达重组抗原特异性受体，而是包括对所需抗原具有特异性的天然存在的抗原特异性受体，诸如在孵育步骤中体外或离体培养的肿瘤浸润淋巴细胞和/或T细胞，以促进具有特定抗原特异性的细胞的扩增。例如，在一些实施方案中，通过分离肿瘤特异性T细胞(例如自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))来产生用于过继细胞疗法的细胞。在某些情况下，使用自体肿瘤浸润淋巴细胞直接靶向人肿瘤可以介导肿瘤消退(参见Rosenberg SA,等(1988)N Engl J Med.319:1676-1680)。在一些实施方案中，从切除的肿瘤中提取淋巴细胞。在一些实施方案中，此类淋巴细胞在体外扩增。在一些实施方案中，将此类淋巴细胞与淋巴因子(例如，IL-2)一起培养。在一些实施方案中，此类淋巴细胞介导自体肿瘤细胞的特异性裂解，但不介导同种异体肿瘤或自体正常细胞的特异性裂解。

在另外的核酸中，例如用于引入的基因是那些诸如通过促进转移的细胞的活力和/或功能来改进治疗功效的基因；提供基因标志物以选择和/或评估细胞，诸如评估体内存活或定位的基因；例如，如Lupton S.D.等,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所述，通过使细胞易于在体内进行负选择来改进安全性的基因；还可参见Lupton等的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，其描述了衍生自将显性阳性选择性标志物与阴性选择性标志物融合的双功能选择性融合基因的用途。例如参见Riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏。

获得根据本发明的细胞的方法

本文所用的“SUV39H1活性的抑制”是指与未被抑制的SUV39H1蛋白的活性或水平相比，SUV39H1活性降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。优选地，SUV39H1活性的抑制导致细胞中不存在实质上可检测的SUV39H1活性。SUV39H1活性的抑制可通过抑制SUV39H1基因表达，或通过细胞的SUV39H1基因的失活，或通过外源抑制剂的表达来实现。例如，相对于通过不存在抑制的方法产生的相同细胞，抑制可将细胞中SUV39H1的表达降低至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。基因破坏也可导致SUV39H1蛋白的表达降低或导致非功能性SUV39H1蛋白的表达。根据本发明的免疫细胞中SUV39H1的抑制可以是永久的和不可逆的或瞬时的或可逆的。优选地，SUV39H1抑制是永久的和不可逆的。如下所述，细胞中SUV39H1的抑制可在将细胞注射到目标患者之前或之后实现。

在一些实施方案中，本文公开的工程化免疫细胞中SUV39H1活性的抑制通过递送或表达至少一种抑制或阻断SUV39H1的表达和/或活性的试剂(即“SUV39H1抑制剂”)来实现。合适的SUV39H1抑制剂包括，例如，与SUV39H1基因或其调节元件杂交或结合的试剂，诸如阻断或抑制SUV39H1表达或活性的适体；阻断转录或翻译的核酸分子，诸如与SUV39H1互补的反义分子；RNA干扰剂(诸如小干扰RNA(siRNA)，小发夹RNA(shRNA)，microRNA(miRNA)或piwiRNA(piRNA)；核酶及其组合。

合适的SUV39H1抑制剂还可包括外源核酸，其包含a)与SUV39H1基因组核酸序列杂交的工程化的、非天然存在的成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)向导RNA，和/或b)编码CRISPR蛋白(典型地，II型Cas9蛋白)的核苷酸序列，任选其中所述细胞是用于表达Cas9蛋白的转基因。所述试剂还可以是锌指蛋白(ZFN)或TAL蛋白。Cas9蛋白、TAL蛋白和/或ZNF蛋白直接或间接与阻遏蛋白和/或抑制剂连接。

合适的SUV39H1抑制剂还可包括非功能性SUV39H1。在一些实施方案中，野生型SUV39H1基因未失活，而是在细胞中表达SUV39H1抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是显性阴性的SUV39H1基因，其以抑制野生型SUV39H1活性的水平表达非功能性基因产物。这可能包含显性阴性SUV39H1基因的过表达。

免疫细胞中SUV39H1的失活和特异性结合靶抗原的抗原特异性受体的引入可同时或以任何顺序依次进行。

根据本发明的细胞中SUV39H1的失活也可通过抑制或破坏SUV39H1基因来实现，诸如通过缺失，例如整个基因、外显子或区域的缺失，和/或用外源序列替换，和/或通过突变，例如基因内，典型地在基因的外显子内的移码或错义突变。在一些实施方案中，所述破坏导致过早终止密码子掺入基因中，使得SUV39H1蛋白不表达或是非功能性的。通常在DNA水平进行破坏。破坏通常是永久的、不可逆的，或非瞬时的。

在一些实施方案中，使用基因编辑剂实现基因失活，诸如DNA靶向分子，诸如DNA结合蛋白或DNA结合核酸，或含有其的复合物、化合物或组合物，其特异性结合基因或与基因杂交。在一些实施方案中，DNA靶向分子包含DNA结合结构域，例如锌指蛋白(ZFP)DNA结合结构域、转录激活物样蛋白(TAL)或TAL效应物(TALE)DNA结合结构域、成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)DNA结合结构域，或来自大范围核酸酶的DNA结合结构域。

锌指、TALE和CRISPR系统结合结构域可被“工程化”以结合预定的核苷酸序列。

在一些实施方案中，DNA靶向分子、复合物或组合含有DNA结合分子和一个或多个其他的结构域，诸如效应物结构域以促进基因的抑制或破坏。例如，在一些实施方案中，通过包含DNA结合蛋白和异源调节结构域或其功能片段的融合蛋白进行基因破坏。

典型地，其他结构域是核酸酶结构域。因此，在一些实施方案中，使用工程化蛋白，诸如核酸酶和含核酸酶的复合物或融合蛋白，通过基因或基因组编辑促进基因破坏，所述工程蛋白由与非特异性DNA切割分子(诸如核酸酶)融合或复合的序列特异性DNA结合结构域组成。

这些靶向嵌合核酸酶或含核酸酶的复合物通过诱导靶向双链断裂或单链断裂、刺激细胞DNA修复机制(包括易错非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR))进行精确的基因修饰。在一些实施方案中，核酸酶是内切核酸酶，诸如锌指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶(TALEN)、RNA引导的内切核酸酶(RGEN)，诸如CRISPR相关(Cas)蛋白，或大范围核酸酶。这些系统在本领域中是熟知的(参见例如，美国专利号8,697,359；Sander和Joung(2014)Nat.Biotech.32:347-355；Hale等(2009)Cell 139:945-956；Karginov和Hannon(2010)Mol.Cell 37:7；美国专利公开2014/0087426和2012/0178169；Boch等(2011)Nat.Biotech.29:135-136；Boch等(2009)Science 326:1509-1512；Moscou和Bogdanove(2009)Science 326:1501；Weber等(2011)PLoS One 6:el9722；Li等(2011)Nucl.AcidsRes.39:6315-6325；Zhang等(2011)Nat.Biotech.29:149-153；Miller等(2011)Nat.Biotech.29:143-148；Lin等(2014)Nucl.Acids Res.42:e47)。这些基因策略可根据本领域熟知的方法使用组成型表达系统或诱导型表达系统。

ZFP和ZFN；TAL、TALE和TALEN

在一些实施方案中，靶向DNA的分子包括与效应蛋白(诸如核酸内切酶)融合的DNA结合蛋白，诸如一种或多种锌指蛋白(ZFP)或转录激活物样蛋白(TAL)。实例包括ZFN、TALE和TALEN。参见Lloyd等,Frontiers in Immunology,4(221),1-7(2013)。

在一些实施方案中，靶向DNA的分子包含一种或多种以序列特异性方式结合DNA的锌指蛋白(ZFP)或其结构域。ZFP或其结构域是蛋白质或较大蛋白质内的结构域，其通过结合结构域内氨基酸序列的一个或多个锌指区域以序列特异性方式结合DNA，所述结构域的结构通过锌离子配位而稳定。通常，可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)上进行氨基酸取代来改变ZFP的序列特异性。因此，在一些实施方案中，ZFP或含ZFP的分子是非天然存在的，例如，经工程化以结合选择的靶位点。例如，参见Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。

在一些实施方案中，靶向DNA的分子是或包含与DNA切割结构域融合以形成锌指核酸酶(ZFN)的锌指DNA结合结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域(或切割半结构域)和一个或多个可以工程化或可以不工程化的锌指结合结构域。在一些实施方案中，切割结构域来自IIS型限制性核酸内切酶FokI。例如，参见美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。

在一些方面，例如在靶基因(即SUV39H1)的编码区中的预定位点上，ZFN有效地产生双链断裂(DSB)。典型的靶向基因区域包括外显子、编码N末端区域的区域、第一外显子、第二外显子以及启动子或增强子区域。在一些实施方案中，ZFN的瞬时表达促进工程化细胞中靶基因的高效和永久破坏。特别地，在一些实施方案中，ZFN的递送导致基因的永久破坏，效率超过50％。许多基因特异性工程化锌指可商购获得。例如，Sangamo Biosciences(Richmond,CA,USA)与Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)合作开发了锌指构造平台(CompoZr)，其允许研究人员完全绕开锌指的构造和验证，并提供数千种蛋白质的特异性靶向的锌指。Gaj等,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405。在一些实施例中，使用可商购的锌指或定制设计可商购的锌指(例如，参见Sigma-Aldrich catalog numbersCSTZFND,CSTZFN,CTI1-1KT,和PZD0020)。

在一些实施方案中，靶向DNA的分子包含天然存在或工程化的(非天然存在的)转录激活物样蛋白(TAL)DNA结合结构域，诸如在转录激活物样蛋白效应(TALE)蛋白中。例如，参见美国专利公开号20110301073。在一些实施方案中，分子是DNA结合核酸内切酶，诸如TALE核酸酶(TALEN)。在一些方面，TALEN是包含源自TALE的DNA结合结构域和核酸酶催化结构域以切割核酸靶序列的融合蛋白。在一些实施方案中，将TALE DNA结合结构域工程化以结合编码靶抗原和/或免疫抑制分子的基因内的靶序列。例如，在一些方面，TALE DNA结合结构域可靶向CD38和/或腺苷受体，诸如A2AR。

在一些实施方案中，TALEN识别并切割基因中的靶序列。在某些方面，DNA的切割导致双链断裂。在一些方面，断裂刺激同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的速率。通常，NHEJ是不完善的修复过程，通常会导致切割位点的DNA序列发生变化。在某些方面，修复机制涉及通过直接重新连接(Critchlow和Jackson,Trends Biochem Sci.1998Oct；23(10):394-8)或通过所谓的微同源性介导的末端连接重新结合两个DNA末端的残基。在一些实施方案中，经由NHEJ的修复导致小的插入或缺失，并可用于破坏并由此抑制基因。在一些实施方案中，修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。在一些方面，可通过本领域中众所周知的方法来鉴定和/或选择其中发生裂解诱导的诱变事件(即与NHEJ事件连续的诱变事件)的细胞。

可组装TALE重复序列以特异性靶向SUV39H1基因(Gaj等,Trends inBiotechnology,2013,31(7),397-405)。已建立针对18,740种人蛋白质编码基因的TALEN文库(Kim等,Nature Biotechnology.31,251-258(2013))。定制设计的TALE阵列可通过Cellectis Bioresearch(Paris,France)、Transposagen Biopharmaceuticals(Lexington,KY,USA)和Life Technologies(Grand Island,NY,USA)商购。具体地，靶向CD38的TALEN是可商购的(参见Gencopoeia,目录号HTN222870-1、HTN222870-2和HTN222870-3，可在万维网上获得，网址为www.genecopoeia.com/product/search/detail.php？prt＝26&cid＝&key＝HTN222870)。描述了示例性分子，例如在美国专利公开号US 2014/0120622和2013/0315884中。

在一些实施方案中，TALEN作为由一种或多种质粒载体编码的转基因引入。在一些方面，质粒载体可以含有选择标志物，其提供用于鉴定和/或选择接受所述载体的细胞。

RGEN(CRISPR/Cas系统)

可使用一种或多种DNA结合核酸来进行基因抑制，诸如通过RNA引导的核酸内切酶(RGEN)的破坏，或通过另一种RNA引导的效应分子进行的其他形式的抑制。例如，在一些实施方案中，可使用成簇规则间隔的短回文重复(CRISPR)和CRISPR相关蛋白进行基因抑制。参见Sander和Joung,Nature Biotechnology,32(4):347-355。

一般而言，“CRISPR系统”泛指与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或引导其活性有关的转录本和其他元件，包括编码Cas基因、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(在内源CRISPR系统中涵盖“直接重复”和tracrRNA加工的部分直接重复)、向导序列(在内源CRISPR系统中也称为“间隔子”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录本。

典型地，CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统包括序列特异性结合DNA的非编码RNA分子(向导)RNA和具有核酸酶功能的CRISPR蛋白(例如两个核酸酶结构域)。CRISPR系统的一个或多个元件可源自I型、II型或III型CRISPR系统，诸如Cas核酸酶。优选地，CRISPR蛋白是cas酶，诸如Cas9。Cas酶在本领域中是众所周知的；例如，化脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到。在一些实施方案中，将Cas核酸酶和gRNA引入细胞中。在一些实施方案中，CRISPR系统在靶位点诱导DSB，随后如本文所述进行破坏。在其他实施方案中，被认为是“切割酶”的Cas9变体可用于在靶位点切割单链。例如，成对的切割酶也可以用于提高特异性，每个酶由一对不同的gRNA靶向序列引导。还在其他实施方案中，可将无催化活性的Cas9融合至异源效应物结构域，诸如转录抑制剂，以影响基因表达。

通常，CRISPR系统的特征在于促进靶序列位点处的CRISPR复合物形成的元件。典型地，在形成CRISPR复合物的情况下，“靶序列”通常是指设计为其具有互补性的向导序列的序列，其中靶序列和向导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成，则不一定需要完全互补。靶序列可以包含任何多核苷酸，诸如DNA或RNA多核苷酸。通常，可用于重组为包含靶序列的靶基因座的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源模板多核苷酸可称为编辑模板。在一些方面，重组是同源重组。

在一些实施方案中，将驱动CRISPR系统的一种或多种元件的表达的一种或多种载体引入细胞，以使得CRISPR系统的元件的表达引导CRISPR复合物在一个或多个靶位点处的形成。例如，Cas酶、连接至tracr-配对序列的向导序列和可各自可操作地连接至单独载体上的单独调控元件的tracr序列。或者，可以将由相同或不同调控元件表达的两个或多个元件组合在单个载体中，其中一个或多个其他载体提供不包含在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。在一些实施方案中，可以在任何合适的方向上排列在单个载体中组合的CRISPR系统元件。在一些实施方案中，CRISPR酶、向导序列、tracr伴侣序列和tracr序列可操作地连接至同一启动子并由同一启动子表达。在一些实施方案中，载体包含与编码CRISPR酶的酶编码序列(诸如Cas蛋白)可操作地连接的调控元件。

在一些实施方案中，将与导向序列结合(和任选地与导向序列复合)的CRISPR酶递送至细胞。典型地，CRISPR/Cas9技术可用于敲低工程化细胞中SUV39H1的基因表达。例如，可将Cas9核酸酶和SUV39H1基因特异性的向导RNA引入细胞，例如，使用慢病毒递送载体或多种用于转移到细胞的已知递送方法或媒介的任何一种，诸如多种用于递送Cas9分子和向导RNA的多种已知方法或媒介的任何一种(另参见下文)。编码基因破坏分子和复合物的核酸的递送

在一些实施方案中，将编码DNA靶向分子、复合物或组合的核酸施用或引入细胞。典型地，基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码CRISPR、ZFP、ZFN、TALE和/或TALEN系统的组分的核酸引入培养的细胞。

在一些实施方案中，由于将编码多肽的多核苷酸引入细胞，因此多肽在细胞中原位合成。在一些方面，多肽可在细胞外产生，然后被引入细胞内。

将多核苷酸构建体引入动物细胞的方法是已知的，且作为非限制性实例，包括将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中的稳定转化方法、没有将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中的瞬时转化方法、以及病毒介导的方法。

在一些实施方案中，可通过例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将多核苷酸引入细胞。瞬时转化方法包括显微注射、电穿孔或粒子轰击。所述核酸以表达载体的形式施用。优选地，表达载体是逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、DNA质粒表达载体或AAV表达载体。

核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质、核酸缀合物、裸露的DNA、人工病毒体和试剂增强的DNA吸收。脂质转染在例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,355中描述，和商售的脂质转染试剂(例如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括Feigner的WO 91/17424；WO 91/16024的那些。可以递送到细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。

基于RNA或DNA病毒的系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和用于基因转移的单纯疱疹病毒载体。

有关基因治疗程序的综述，参见Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel&Feigner,TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani&Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon.TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology andNeuroscience 8:35-36(1995)；Kremer&Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada等,in Current Topics in Microbiology and ImmunologyDoerfler and Bohm(eds)(1995)；and Yu等,Gene Therapy 1:13-26(1994)。

可将包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白的报道基因引入细胞中，以编码作为标志物的基因产物，所述标志物用于测量基因产物的表达的改变或修饰。

细胞制备

细胞分离包括根据本领域熟知技术的一个或多个基于制备和/或非亲和力的细胞分离步骤。例如，在一些实施例中，在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育细胞，以去除不需要的组分，富集所需组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实施例中，基于一种或多种性质，诸如密度、粘附性质、尺寸、敏感性和/或对特定组分的抗性，来分离细胞。

在一些实施方案中，细胞制备包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如冷冻保存)细胞的步骤。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。

孵育步骤可以包括培养、孵育、刺激、激活、扩增和/或增殖。

在一些实施方案中，组合物或细胞在刺激条件或刺激剂存在下孵育。这些条件包括设计用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程，诸如用于引入抗原特异性受体。

孵育条件可包括一种或多种特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如营养素、氨基酸、抗生素、离子)和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体)和设计以激活细胞的任何其他试剂。

在一些实施方案中，刺激条件或试剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种试剂，例如配体。在一些方面，所述试剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。这样的试剂可包括抗体，诸如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如与固体载体(诸如珠)结合的抗CD3，抗CD28，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括将抗CD3和/或抗CD28抗体添加到培养基中的步骤(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)。在一些实施方案中，刺激剂包括1L-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL。

在某些方面，根据诸如Riddell等的美国专利号6,040,177，Klebanoff等,JImmunother.2012；35(9):651-660,Terakura等,Blood.2012；1:72-82,和/或Wang等JImmunother.2012,35(9):689-701中描述的技术进行孵育。

在一些实施方案中，通过将饲养细胞(诸如非分裂外周血单核细胞(PBMC))添加至培养起始组合物来扩增T细胞(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体均含有至少约5、10、20或40或更多个PBMC饲养细胞)；并孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数目的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ-辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000-3600rads的γ射线辐照PBMC以阻止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加至培养基。

在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，且通常至少约37摄氏度。任选地，孵育还可以包括添加非分裂的EBV转化的淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000-10,000rads的γ射线照射LCL。在一些方面，以任何合适的量提供LCL饲养细胞，诸如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1。

在实施方案中，通过用抗原刺激初始或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性T细胞，诸如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同抗原在体外刺激细胞来产生巨细胞病毒抗原的抗原特异性T细胞系或克隆。

在一些方面，该方法包括评估一种或多种标志物在经工程化细胞或待工程化细胞的表面上的表达。在一个实施方案中，该方法包括评估寻求通过过继细胞疗法靶向的一种或多种靶抗原(例如，基因工程化抗原特异性受体识别的抗原)的表面表达，例如通过基于亲和力的检测方法，诸如通过流式细胞仪。

细胞基因工程的载体和方法

在一些方面，基因工程涉及将编码基因工程化成分或其他用于引入的成分(诸如编码基因破坏蛋白或核酸的成分)的核酸引入细胞。

通常，将CAR工程化为免疫细胞(例如，T细胞)需要培养细胞以允许转导和扩增。转导可以利用多种方法，但是需要稳定的基因转移以在克隆扩增和持久工程化细胞中实现持续的CAR表达。

在一些实施方案中，通过首先刺激细胞生长，例如T细胞生长、增殖和/或活化，然后转导活化的细胞，并在培养中扩增至足以用于临床应用的数目来实现基因转移。

引入基因工程化成分(例如抗原特异性受体，例如CAR)的各种方法是众所周知的，且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。

在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(诸如衍生自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(诸如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(例如，参见Koste等(2014)Gene Therapy 2014Apr 3.；Carlens等(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等,TrendsBiotechnol.2011November；29(11):550-557)。

在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾聚焦形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。典型地，逆转录病毒是两亲性的，这意味着它们能够感染包括人的若干物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因取代了逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述了许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller and Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)HumanGene Therapy 1:5-14；Scarpa等(1991)Virology 180:849-852；Burns等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；和Boris-Lawrie and Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。

慢病毒转导的方法也是已知的。例如，示例性方法描述于Wang等(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等(2003)Blood.102(2):497-505。

在一些实施方案中，重组核酸通过电穿孔转移到T细胞中(例如，参见Chicaybam等,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，重组核酸通过转位转移到T细胞中(例如，参见Manuri等(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.所描述的)；原生质体融合；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。

用于转移编码基因工程化产物的基因工程化核酸的其他方法和载体在例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述。

本发明的组合物

本发明还包括含有本文所述和/或通过提供的方法产生的细胞的组合物。典型地，所述组合物是用于施用(诸如用于过继细胞疗法)的药物组合物和制剂，优选无菌组合物和制剂。本发明的药物组合物通常包含至少一种本发明的工程化免疫细胞和药学上可接受的无菌载体。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可以将补充活性化合物进一步掺入组合物中。在一些方面，药物组合物中载体的选择部分地由特定的工程化CAR或TCR、表达CAR或TCR的载体或细胞、以及通过用于施用表达CAR的所述载体或宿主细胞的特定方法来确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。例如，合适的防腐剂可包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。典型地，防腐剂或其混合物以占组合物总重量的约0.0001-约2％的量存在。

将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。

治疗方法

本发明还涉及如前定义的细胞，其用于过继性细胞疗法(特别是过继性T细胞疗法)，典型地，用于治疗有需要的受试者中的癌症，而且还用于治疗感染性疾病和自身免疫性、炎性或变应性疾病。考虑治疗上述“抗原”部分所列任何疾病的治疗。

如本文所用，“治疗(treatment/treating)”定义为向有此需要的患者应用或施用本发明的细胞或包含细胞的组合物，目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病(诸如癌症)或疾病(例如癌症)的任何症状。特别地，术语“治疗”是指降低或减轻至少一种与疾病(诸如癌症)相关的不良临床症状，例如疼痛、肿胀、低血细胞计数等。

关于癌症治疗，术语“治疗”也指减缓或逆转肿瘤性不受控制的细胞增殖的进展，即缩小现有肿瘤和/或中止肿瘤生长。术语“治疗”还指在受试者的癌症或肿瘤细胞中诱导凋亡。

其中SUV39H1已失活的免疫细胞，特别地T细胞，在过继转移后表现出增强的中央记忆表型、增强的存活和持久性，以及减少的耗竭。相对于不具有本文所述改善的T细胞，它们增加的效率和功效可使得它们以较低水平给药。因此，可以一定剂量施用其中SUV39H1已失活的T细胞，其任选地具有本文所述的任何其他特征(例如表达CAR，和/或其中T细胞受体(TCR)α恒定区基因通过插入编码CAR或TCR的核酸序列而失活，和/或其中CAR包含a)细胞外抗原结合结构域，b)跨膜结构域，c)任选地一个或多个共刺激结构域，和d)细胞内信号传导结构域，其包含其中ITAM2和ITAM3已失活或缺失和/或其中HLA-A基因已失活或缺失的修饰的CD3ζ细胞内信号传导结构域)。例如，其中SUV39H1已失活的免疫细胞(例如T细胞)可以少于约10⁸个细胞、少于约5×10⁷个细胞、少于约10⁷个细胞、少于约5×10⁶个细胞、少于约10⁶个细胞、少于约5×10⁵个细胞或少于约10⁵个细胞的剂量施用于成人。儿科患者的剂量可减少约100倍。在替代的实施方案中，本文所述的任何免疫细胞(例如T细胞)可以10⁵-10⁹个细胞，或10⁵-10⁸个细胞，或10⁶-10⁸个细胞的剂量施用于患者。

本发明的受试者(即患者)是哺乳动物，典型地，是灵长类动物，诸如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴或猿。受试者可以是男性或女性，且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物。在一些实施例中，患者或受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结果(诸如细胞因子释放综合征(CRS))的经验证的动物模型。在本发明的一些实施方案中，所述受试者患有癌症、处于患癌的风险中、或处于癌症缓解中。

癌症可以是实体癌或“液体肿瘤”，诸如影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症，也称为造血系统和淋巴组织的肿瘤，特别包括白血病和淋巴瘤。例如，液体肿瘤包括急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(包括各种淋巴瘤，诸如套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、腺瘤、鳞状细胞癌、喉癌、胆囊癌和胆管癌、视网膜癌(诸如成视网膜细胞瘤))。

优选地，根据本发明的癌症是如上所述的影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症。典型地，该癌症是多发性骨髓瘤或与多发性骨髓瘤相关。

在一些实施方案中，所述受试者患有感染性疾病或病症或处于感染性疾病或病症的风险中，诸如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。

在一些实施方案中，该疾病或病症是自身免疫或炎性疾病或病症，诸如关节炎(例如类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、牛皮癣、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘、和/或与移植相关的疾病或病症。

本发明还涉及治疗方法，尤其是过继细胞疗法，优选过继T细胞疗法，其包括向有此需要的受试者施用前述组合物。

在一些实施方案中，将细胞或组合物施用于受试者，诸如患有如上所述的癌症或任何一种疾病或处于罹患如上所述的癌症或任何一种疾病的风险中的受试者。在一些方面，这些方法由此通过减轻表达由工程化细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负担来治疗(例如改善)疾病或病症(诸如与癌症有关的疾病或病症)的一种或多种症状。

用于过继细胞疗法的细胞施用方法是已知的，且可与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性T细胞疗法在例如Gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)中有描述。例如，参见Themeli等(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。

在一些实施方案中，通过自体转移进行细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法，其中从将接受细胞疗法的受试者或从来自此类受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，所述细胞衍生自需要治疗的受试者(例如患者)，且在分离和加工后将所述细胞施用于同一受试者。

在一些实施方案中，通过同种异体转移进行细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继性T细胞疗法，其中从将接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在该实施方案中，然后将细胞施用给同种的不同受试者(例如第二受试者)。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上相同。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上相似。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。在一些实施方式中，当免疫细胞被修饰以降低内源TCR和HLA的I类分子的表达时，HLA匹配不太重要。

向有此需要的受试者施用至少一种根据本发明的细胞可以与一种或多种其他治疗剂组合或与另一种治疗干预组合，以同时或以任何顺序依次进行。在一些情况下，将这些细胞与另一种在时间上足够接近的疗法共同施用，以使细胞群增强一种或多种其他治疗剂的效果，反之亦然。在一些实施方案中，在一种或多种其他治疗剂之前施用细胞群。在一些实施方案中，在一种或多种其他治疗剂之后施用细胞群。

对于癌症治疗，组合的癌症治疗可以包括但不限于癌症化疗剂、细胞毒性剂、激素、抗血管生成素、放射性标记化合物、免疫疗法、外科手术、冷冻疗法和/或放疗。

常规的癌症化疗剂包括烷化剂、抗代谢物、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制剂和B-raf酶抑制剂。

烷化剂包括氮芥类(诸如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥)、乙烯胺和亚甲基胺衍生物(诸如六甲蜜胺、噻替哌)、烷基磺酸盐(诸如白消安)、亚硝基脲(诸如卡莫司汀、洛莫司汀、雌莫司汀)、三氮烯(诸如达卡巴嗪、甲基苄肼、替莫唑胺)和含铂抗肿瘤剂(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂)。

抗代谢物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨

阿糖胞苷

氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨

羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞

蒽环类抗生素包括柔红霉素、多柔比星

表柔比星、伊达比星。其他抗肿瘤抗生素包括放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌。

拓扑异构酶抑制剂包括托泊替康、伊立替康(CPT-11)、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷或米托蒽醌。

微管抑制剂包括雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉烷(诸如紫杉醇、多西紫杉醇和卡巴他赛)和长春花生物碱(诸如长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁)。

B-raf酶抑制剂包括维莫非尼(Zelboraf)，达拉非尼(Tafinlar)和康奈非尼(Braftovi)。

免疫疗法包括但不限于免疫检查点调节剂(即抑制剂和/或激动剂)、细胞因子、免疫调节单克隆抗体、癌症疫苗。

优选地，在根据本发明的过继性T细胞疗法中施用细胞与施用免疫检查点调节剂组合。实例包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体和/或EP2/4腺苷受体(包括A2AR)的抑制剂(例如特异性结合并抑制其活性的抗体)。优选地，免疫检查点调节剂包含抗PD-1和/或抗PDL-1抑制剂(例如，抗PD-1和/或抗PDL-1抗体)。

本发明还涉及包含本文所述的工程化免疫细胞的组合物在制备用于治疗受试者的癌症、感染性疾病或病症、自身免疫性疾病或病症或炎症性疾病或病症的药物中的用途。

具体实施方式

实施例1-在人CD8+T细胞(SUV39H1敲除的T细胞)中失活SUV39H1

用含有gRNA的Cas9核糖核蛋白颗粒(RNP)电穿孔活化的人CD8+T细胞，所述gRNA靶向SUV39H1基因的外显子以进行缺失。电穿孔后4天通过RT-qPCR观察到SUV39H1表达的一致降低，表明敲除成功(图1)。

实施例2-人SUV39H1KO T细胞的记忆表型分析

为观察对CD8+T细胞的记忆表型重要的中央记忆T细胞表面标志物的表达，用αCD3+αCD28珠刺激实施例1的SUV39H1KO T细胞一周，然后通过流式细胞术分析。中央记忆T细胞标志物CCR7、CD27和CD62L在SUV39H1KO细胞中显示增加的表达水平。结果在图2A-2C中分别显示为与每个供体的Mock相比，CCR7、CD27和CD62L的几何MFI的倍数变化。另外，构成中央记忆细胞亚群的CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+细胞的部分在SUV39H1 KO细胞中增加。结果在图3A中显示为代表性FACS图，并且在图3B中显示为与Mock每个供体相比的CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+细胞倍数变化频率。敲除SUV39H1增加了中央记忆细胞的部分。

实施例3-人SUV39H1KO T细胞上免疫检查点受体的表达

对实施例2的细胞评价其两种重要的免疫检查点受体PD-1和TIM-3的表达。PD-1的总体表达水平不变，并且TIM-3的表达水平降低。在SUV39H1KO中观察到TIM3-PD1+(其被认为是非耗竭的活化细胞)的部分增加和TIM3+PD1-细胞的部分降低。图4A显示了表达PD-1和TIM-3的细胞亚群的频率结果((a)TIM-3阳性、PD-1阴性，(b)TIM-3阳性、PD-1阳性，(c)TIM-3阴性、PD-1阳性，(d)TIM-3阴性、PD-1阴性)，以及，图4B显示了与Mock每个供体相比，TIM-3的几何MFI的倍数变化。因此，敲除SUV39H1减少了T细胞耗竭。

实施例4-在人SUV39H1KO T细胞上主转录因子、T-bet、EOMES和TCF-1的表达

对实施例2的细胞评价主转录因子、T-bet、EOMES和TCF-1的表达。T-bet表达协调增加的效应物承诺和功能，EOMES表达定义增加的效应物功能，且TCF-1表达控制自我更新。EOMES和TCF-1与T-bet的平衡决定了T细胞分化。SUV39H1KO使得T-bet的表达水平降低，如图5A所示，与Mock每个供体相比的几何MFI的倍数变化。EOMES和TCF-1的表达水平不变。还分析了T-bet与EOMES或TCF-1的平衡。EOMES-阳性/T-bet-阴性和TCF-1-阳性/T-bet-阴性部分在SUV39H1KO中增加(图5B-5E)。结果在图5C和5E中显示，为与Mock每个供体相比的各种细胞亚群的频率，且表明SUV39H1KO的效应物样表型降低。代表性FACS图如图5B和5D所示。

实施例5-连续刺激后人SUV39H1KO T细胞的增殖

用αCD3+αCD28珠每周一次刺激SUV39H1被敲除的CD8+T细胞，持续4周。图6描述了SUV39H1KO CD8+T细胞的细胞数目和动力学，并显示SUV39H1KO细胞在连续刺激后表现出增殖增加。三个不同供体的结果显示为与第1周接种相比细胞数量的倍数变化。增殖潜力是记忆细胞的关键特征和抗肿瘤功效的重要预测因素。

总之，实施例1-5的结果显示敲除CD8+T细胞中的SUV39H1导致a)中央记忆标志物CCR7、CD27和CD62L的总体表达水平增加，和中央记忆细胞亚群CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+细胞的部分增加；b)TIM-3的表达水平降低，c)效应物功能调节剂、T-bet的表达水平降低，以及T-bet阴性细胞部分的增加使转录因子的平衡朝着效应物样表型较少的方向转变，和d)在连续刺激后增殖增加。

实施例6-CAR T细胞的产生

用含有编码第二代抗CD19 CAR基因的慢病毒载体转导人CD8+T细胞。图7A显示10个供体的表达CAR的T细胞的百分比。图7B显示对于代表性供体，在xCelligence装置中以2:1的效应物:靶标比例对CD19阳性Raji细胞的杀伤。图7C显示来自代表性供体的6×10⁶个CAR T细胞注射(第4天)后在NSG小鼠中注射5×10⁵个细胞后NALM-6细胞的生长，显示为肿瘤细胞生物荧光强度。结果显示CAR T细胞在体外对CD19阳性Raji细胞表现出细胞毒活性，且还在NSG小鼠中消除CD19阳性NALM-6细胞。

实施例7-在CART细胞(SUV39H1KO CAR T细胞)中失活SUV39H1

从PBMC中纯化总CD3+或CD8+T细胞，并如实施例6所述用CAR转基因慢病毒转导，所述CAR转基因已经用CAR转基因慢病毒转导。然后用含有靶向SUV39H1基因的gRNA的Cas9RNP电穿孔细胞，所述gRNA靶向SUV39H1外显子以进行缺失。敲除细胞(SUV39H1KO T细胞)保留并显示出稳健的CAR表达，且在电穿孔后4天通过RT-qPCR检测显示出SUV39H1表达的一致降低(图8A-8B)。具体地，图8A和8C分别描述了CD8+和CD3+T细胞的CAR表达，而图8B描述了SUV39H1表达的缺失。Western blotting进一步证实了图8B中SUV39H1蛋白的耗竭，且依赖于SUV39H1活性的H3K9me3的水平在SUV39H1KO T细胞中总体上降低(图8D)。

实施例8-SUV39H1KO CAR T细胞的记忆表型、主转录因子表达、基因表达谱和增殖

为观察对CD8+T细胞的记忆表型重要的中央记忆T细胞表面标志物的表达，将实施例7的SUV39H1KO CAR T细胞用αCD3+αCD28珠刺激一周，然后通过流式细胞术分析。这允许特异性观察SUV39H1缺失对CAR T细胞增殖的影响。此后，每周分析SUV39H1KO CAR T细胞的记忆表型、基因表达谱和细胞数目。每周一次刺激后，在SUV39H1KO CAR T细胞中构成中央记忆细胞亚群的CCR7+ CD45RO+ CD27+ CD62L+细胞的部分增加。结果在图9A中显示为与Mock每个供体相比显示中央记忆细胞表型的细胞的百分比。图9B显示了与Mock相比中央记忆细胞亚群中的倍数变化。另外，敲除CAR T细胞中的SUV39H1使得TIM-3的表达水平降低(图10A)，T-bet的表达水平降低(图10B)和T-bet阴性细胞的频率增加(图10C)。使用总CD3+细胞制备的SUV39H1KO CAR T细胞获得了类似的结果。

用αCD3+αCD28珠每周一次刺激细胞，持续4周。每周刺激SUV39H1KO CD8+ CAR T细胞期间细胞数目的倍数变化和动力学描绘于图11和12中，且显示这些SUV39H1KO CAR T细胞在连续刺激后显示增加的体外增殖和持久性，是体内抗肿瘤功效的关键预测因子。

就在产生后和第一次刺激前，在4个不同供体中进行CAR T细胞转录组的Nanostring分析(定量mRNA水平)。图13说明SUV39H1KO CAR T细胞显示转录因子STAT3、STAT5A和STAT5B的表达水平增加。这些转录因子在细胞因子受体、促进干性和记忆形成的转录因子TCF7以及中央记忆标志物CD27和SELL(编码CD62L)的下游起作用。这些结果证实SUV39H1KO CAR T细胞具有干细胞样表型，且更能接受细胞因子信号传导。

每周一次刺激后CAR T细胞的Nanostring分析显示SUV39H1KO CAR T细胞表达较低水平的糖酵解酶(图14A)和效应物细胞因子(图14B)。相反，图14C显示CAR T细胞具有增加的细胞因子受体基因IL7R、IL21R和IL6ST的水平，其与记忆功能和干性相关的转录因子(特别地LEF1)相关。这些结果表明，与Mock相比，SUV39H1KO CAR T细胞在每周一次刺激后分化较少。

在三轮每周刺激后，SUV39H1KO CAR T细胞具有增加的干性和记忆相关基因的表达水平(图15A)，以及降低的效应细胞因子和抑制性天然杀伤细胞受体的表达水平(图15B)，表明降低的末端效应物细胞分化。最后，SUV39H1KO和Mock CAR T细胞在HAVCR2(编码TIM-3)和LAG3，CD274(编码PD-L1)和EOMES的耗竭标志物的表达水平上没有显著差异(图15C)。这些结果支持SUV39H1KO CAR T细胞比Mock CAR T细胞对末端分化更具抗性且维持干细胞和记忆特征的结论。

实施例9-SUV39H1KO CAR T细胞的细胞毒性功能

通过针对表达荧光素酶的NALM-6细胞的体外杀伤试验评价SUV39H1缺失对CAR T细胞的细胞毒性的影响。简言之，将5×10⁴个NALM-6细胞添加至U形底板中，然后以2:1的效应物:靶标比例加入效应物细胞。培养板过夜，添加荧光素后，用读板器定量存活的NALM-6细胞的生物荧光。在总CD3+或纯化的CD8+的SUV39H1KO和Mock CAR T细胞的细胞毒性功能之间未发现显著差异(图16)。

实施例10-SUV39H1KO CAR T细胞的代谢适配度

使用市售细胞外通量分析仪(Seahorse,Agilent)在每周刺激期间的不同时间点检查SUV39H1KO CAR T细胞的代谢特征。对细胞外酸化速率(有氧糖酵解的量度)和氧消耗速率(线粒体呼吸的量度)进行定量。简言之，每孔添加1.5×10⁵个细胞，并在分析仪中进行两种不同的测定。分别在存在葡萄糖和丙酮酸(糖酵解和线粒体呼吸的初始底物)的情况下进行一项测定，并且在不存在葡萄糖和丙酮酸的情况下进行另一项测定。在葡萄糖和丙酮酸的存在下确定，SUV39H1KO CAR T细胞以与Mock相似的程度参与有氧糖酵解(图17A)，但显示出少量增加的糖酵解储备(在添加线粒体呼吸抑制剂寡霉素后计算并对应于细胞外酸化速率的这种特异性增加)(图17B)。类似地，在葡萄糖和丙酮酸的存在下，SUV39H1KO和Mock CAR T细胞也参与类似有效的线粒体呼吸(图18A)。然而，在不存在葡萄糖和丙酮酸盐的情况下，SUV39H1KO CAR T细胞具有增加的线粒体呼吸(图18A)。最后，线粒体ATP产生的定量(在添加呼吸抑制剂寡霉素后，在葡萄糖和丙酮酸存在下计算并对应于氧消耗速率的这种特异性降低)显示，在超过三轮的每周刺激后，SUV39H1KO CAR T可继续用该途径产生更多的ATP(图18B)。这些结果与SUV39H1KO CAR T细胞比Mock CAR T细胞在代谢上更适配的想法一致，且在不利条件下在转换能量来源方面更灵活，即在抑制线粒体呼吸后转换为更多糖酵解或在缺乏葡萄糖和丙酮酸时增加线粒体呼吸。

实施例11-人SUV39H1 CAR T细胞的体内抗肿瘤功效

急性成淋巴细胞性白血病的异种模型用于研究SUV39H1对人CAR T细胞的抗肿瘤功效的作用(图19A)。简言之，将表达荧光素酶的2.5×10⁵个NALM-6细胞静脉内注射到NSG小鼠的尾部，且通过生物荧光(IVIS,Perkin Elmer)纵向跟踪它们的体内生长。在肿瘤注射后第3天，输注10⁶个CAR T细胞、Mock或SUV39H1 KO。对于两个不同的供体，SUV39H1KO CART细胞表现出更强的抗肿瘤反应和增强的NSG小鼠的存活(图19B)。将CAR T细胞的剂量增加到2×10⁶导致完全的肿瘤排斥(图20A)和10只小鼠中9只存活(图20B)。

实施例12-具有失活的内源TCR和失活的SUV39H1的CAR T细胞的产生

如Eyquem等，Nature 543:113-117(2017)中所示，CRISPR-Cas9 RNP用于将CAR基因引入T细胞受体α恒定(TRAC)基因座，产生具有显著降低或几乎消除的内源TCR表达的T细胞。该过程如图21A所示。用(1)Cas9 RNP，所述Cas9 RNP含有靶向TRAC基因座的第一外显子，优选接近5’端的gRNA(gRNA序列的实例：5’C*A*G*GGUUCUGGAUAUCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU酸*U*U*U3’，其中星号表示2’-O-甲基3’硫代磷酸酯)(SEQ ID NO:16)，和(b)编码抗CD19 CAR的供体AAV电穿孔人T细胞。所得T细胞在内源TRAC启动子的控制下表达CAR。T细胞还用含有靶向SUV39H1基因的gRNA的Cas9 RNP并行电穿孔，所述gRNA靶向SUV39H1的外显子以进行缺失。选择并扩增表达抗CD19 CAR的细胞。图21B-C显示这些细胞表现出SUV39H1表达降低和内源TCR表达降低。

图21B显示了在各种滴度量的AAV下CAR阳性的CD4+和CD8+T细胞的百分比，以及CAR+细胞中CAR表达的几何平均荧光强度。后者显示稳定的CAR表达，与AAV感染的多重性无关，证实成功掺入TRAC基因座中并通过内源TRAC启动子控制CAR表达。图21C显示了通过RT-qPCR测量的SUV39H1的表达。结果显示在TRAC gRNA存在下成功且有效地缺失SUV39H1且不依赖于AAV转导。因此，用该方案产生的T细胞证实了TRAC基因座中CAR的敲入和SUV39H1的特异性缺失。

实施例13-具有失活的SUV39H1和降低的ITAM活性的CART细胞的产生

产生编码抗CD19 CAR的核酸，其中ITAM2和ITAM3从CD3ζ的细胞内信号传导区域失活或缺失(ITAM-还原的CAR)。CAR具有至少一个共刺激结构域(例如CD28)，或两个或更多个共刺激结构域(CD27、CD28、4-1BB和/或OX40)。根据实施例7或实施例9，将编码CAR的核酸引入人T细胞，并敲除SUV39H1。

因此，使用实施例7的方法产生表达该抗-CD19、ITAM-减少的CAR，且表现出SUV39H1表达减少的细胞。使用实施例9的方法产生表达抗CD19、ITAM减少的CAR，且表现出SUV39H1表达减少和内源TCR表达减少的细胞。评价所得细胞的中央记忆细胞表型(CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+)、连续刺激后的增殖以及耗竭特征(TIM-3、PD-1、LAG-3表达)。

Claims

1.修饰的免疫细胞，其中SUV39H1基因失活，所述细胞包含：

T细胞受体(TCR)α恒定区基因，其通过插入编码抗原特异性受体的核酸序列而失活，所述抗原特异性受体特异性结合抗原，任选地嵌合抗原受体(CAR)或异源TCR，

其中任选地，所述抗原是孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、p95HER2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2,3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、BCMA、Lewis Y、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gplOO、胚胎癌抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSMA)、雌激素受体、孕激素受体、ephrinB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7或Wilms Tumor 1(WT-1)。

2.修饰的免疫细胞，其包含编码SUV39H1抑制剂，任选地显性阴性SUV39H1基因的核酸，所述细胞包含：

3.修饰的免疫细胞，其中所述SUV39H1基因失活且其表达嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含：

a)细胞外抗原结合结构域，其特异性结合抗原，

b)跨膜结构域，

c)任选地一个或多个共刺激结构域，

d)细胞内信号传导结构域，其包含修饰的CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中ITAM2和ITAM3已失活，

4.修饰的免疫细胞，其包含编码SUV39H1抑制剂，任选地显性阴性SUV39H1基因的核酸，且其表达嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含：

a)细胞外抗原结合结构域，其特异性结合抗原，

b)跨膜结构域，

c)任选地一个或多个共刺激结构域，

5.权利要求1-4任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述细胞是T细胞、T细胞祖细胞、造血干细胞、iPSC、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+和CD8+T细胞、或NK细胞、或T_N细胞、T_SCM、T_CM或T_EM细胞。

6.权利要求1-4任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T调节细胞。

7.权利要求1-6任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述CAR包含：(a)细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域，(c)任选地一个或多个共刺激结构域，和(d)细胞内信号传导结构域。

8.权利要求7所述的修饰的免疫细胞，其中所述细胞外抗原结合结构域是scFv，任选地特异性结合癌抗原的scFv。

9.权利要求7或8所述的修饰的免疫细胞，其中所述跨膜结构域来自CD28、CD8或CD3-ζ。

10.权利要求7-9任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述一个或多个共刺激结构域选自下组：4-1BB、CD28、ICOS、OX40和DAP10。

11.权利要求7-10任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ多肽或其片段，任选地CD3-ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中基于免疫受体酪氨酸的活化基序2(ITAM2)和基于免疫受体酪氨酸的活化基序3(ITAM3)失活。

12.前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述T细胞还包含第二抗原特异性受体，任选地TCR或CAR，其特异性结合第二抗原。

13.前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞，其中SUV39H1表达降低至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

14.前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞，其中内源TCR表达降低至少约75％、80％、85％、90％或95％。

15.前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞是自体的。

16.前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞是同种异体的。

17.前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞，其中所述HLA-A基因座失活。

18.权利要求17所述的修饰的免疫细胞，其中HLA的I类表达降低至少约75％、80％、85％、90％或95％。

19.前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞，其表达两种CAR，结合第一抗原的第一CAR和结合第二抗原的第二CAR。

20.无菌药物组合物，其包含前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞。

21.试剂盒，其包含前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞，以及递送装置或容器。

22.使用前述权利要求任一项所述的修饰的免疫细胞或药物组合物或试剂盒治疗患者的方法，所述患者患有与抗原相关的疾病，或处于与抗原相关的疾病的风险中，任选地为癌症，所述方法通过向所述患者施用治疗有效量的所述免疫细胞或药物组合物。

23.权利要求22所述的方法，其中所述免疫细胞是CAR T-细胞，且向患者施用少于约5×10⁷个细胞，任选地约10⁵至约10⁷个细胞的剂量。

24.权利要求22或23所述的方法，其中向患者施用第二治疗剂，任选地一种或多种癌症化疗剂、细胞毒性剂、激素、抗血管生成素、放射性标记化合物、免疫疗法、外科手术、冷冻疗法和/或放疗。

25.权利要求22或23所述的方法，其中向患者施用免疫检查点调节剂。

26.权利要求25所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是特异性结合PD1、PDL1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体或A2AR的抗体，或其其他抑制剂。