CN117964758A - 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合 - Google Patents

抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合 Download PDF

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Abstract

本公开提供了结合CD38多肽(例如人和食蟹猴CD38多肽)的结合蛋白。例如，结合蛋白可以是单特异性、双特异性或三特异性结合蛋白，其具有至少一个结合CD38多肽的抗原结合结构域。本公开还提供了制备结合CD38多肽的结合蛋白的方法和这样的结合蛋白的用途。

Description

抗CD38抗体及与抗CD3和抗CD28抗体的组合
本发明申请是基于申请日为2018年10月9日，申请号为201880079045.9，发明名称为“抗CD38抗体及与抗CD3和抗CD28抗体的组合”的专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2017年10月10日提交的美国临时申请序列号62/570,655；2017年10月11日提交的美国临时申请序列号62/570,660；2018年5月24日提交的美国临时申请序列号62/676,221；和2018年8月3日提交的EP申请号EP18187186.4的优先权，所有都通过提述以其整体并入本文。
提交ASCII文本文件的序列表
以下提交的ASCII文本文件的内容通过提述以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名:183952029941seqlist.TXT，记录日期:2018年10月8日，大小:158KB)。
技术领域
本公开内容涉及结合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)的结合蛋白，包括具有至少一个结合CD38多肽的抗原结合结构域的单特异性、双特异性或三特异性结合蛋白，以及多核苷酸、宿主细胞、产生方法和与其相关的使用方法。
背景技术
基于单克隆抗体的生物治疗剂已成为新药开发的重要途径。单克隆抗体技术为特定细胞群体提供特异性靶向、精确信号递送和/或有效负载，并通过其Fc功能提供持久的生物学效应。抗体工程的努力已经允许开发多特异性抗体，其结合多种单克隆抗体的特异性用于各种生物学应用，扩展了抗体药物开发的范围。
CD38是有吸引力的药物靶标，因为它在多种淋巴肿瘤细胞的细胞表面上表达(参见Stevenson,G.T.(2006)Mol.Med.12:345-346)。(达雷木单抗，daratumumab)是一种被批准用于治疗多发性骨髓瘤的抗CD38抗体。然而，需要靶向CD38的治疗剂具有不同的作用模式和/或改善的性质，包括但不限于高亲和力结合CD38、人和食蟹猴CD38多肽之间的交叉反应性、结合淋巴瘤细胞(例如，多发性骨髓瘤大B细胞淋巴瘤细胞系)，以及诱导细胞凋亡和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和T细胞介导的抗肿瘤活性的能力。
发明内容
本文提供了结合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)的结合蛋白，其包括具有结合CD38多肽的至少一个抗原结合位点的单特异性、双特异性或三特异性结合蛋白。有利地，这些结合蛋白具有将T细胞募集到癌细胞附近，随后活化T细胞并通过颗粒酶/穿孔素机制促进活化的T细胞杀死相邻癌细胞的能力，从抗CD38抗体诸如(达雷木单抗)提供不同的抗肿瘤活性作用模式。此外，结合人和食蟹猴CD38多肽的能力允许在临床前毒理学研究中容易地测试结合蛋白，例如，以评价它们的安全性特征以供以后临床使用。
在一些实施方案中，本文提供了与人CD38多肽结合的单特异性结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白与人和食蟹猴CD38多肽交叉反应。在一些实施方案中，结合蛋白结合人同种型A和同种型E CD38多肽。在一些实施方案中，结合蛋白具有一个或多个以下特征(以任何组合)：结合人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，如通过SPR测定的；结合人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，KD为1.5nM或更低，如通过SPR测定的；结合在细胞表面上表达的人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；结合在细胞表面上表达的人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)，其表观KD为20nM、15nM、10nM、5nM、1nM或更低，如通过流式细胞术测定的；结合食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，如通过SPR测定的；结合食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，KD是3.5nM或更低，如通过SPR测定的；结合在细胞表面上表达的食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；结合在细胞表面上表达的食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)，其表观KD是7.5nM或更低，如通过流式细胞术测定的；结合人同种型E CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ IDNO:105的氨基酸序列)作为纯化的蛋白质，如通过ELISA测定的；结合在细胞表面上表达的人同种型E CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；在细胞表面诱导表达CD38的细胞的凋亡或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)；和与没有一个或多个突变的相同结合蛋白相比，具有一个或多个突变(例如，在Fc区中)导致与FcγRI和/或FcγRII的结合降低。对于示例性测定，参见实施例1、3和4。在一些实施方案中，KD在4℃或25℃测量。
在一些实施方案中，本文提供了与人CD38多肽结合的三特异性结合蛋白。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白结合(例如，同时)CD38多肽(例如，在细胞表面上表达的)和在第二细胞表面上表达的一种或多种其他靶抗原，由此募集与表达CD38多肽的细胞接近的第二细胞。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白结合(例如，同时)CD38多肽(例如，在细胞表面上表达的)和在T细胞表面上表达的一种或两种靶抗原，由此募集与表达CD38多肽的细胞接近的T细胞。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白活化T细胞和/或向T细胞提供CD28介导的共刺激信号。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白与人和食蟹猴CD38多肽交叉反应。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白结合人同种型A和同种型E CD38多肽。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白具有一个或多个以下特征(以任何组合)：结合人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，如通过SPR测定的；结合人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，KD是1.5nM或更低，如通过SPR测定的；结合细胞表面上表达的人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；结合在细胞表面上表达的人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列)，其表观KD是20nM、15nM、10nM、5nM、1nM或更低，如通过流式细胞术测定的；结合食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，如通过SPR测定的；结合食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQID NO:30的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，KD是3.5nM或更低，如通过SPR测定的；结合在细胞表面上表达的食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；结合在细胞表面上表达的食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQID NO:30的氨基酸序列)，其表观KD是7.5nM或更低，如通过流式细胞术测定的；结合人同种型E CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，如通过ELISA测定的；结合在细胞表面上表达的人同种型E CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ IDNO:105的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；在细胞表面诱导表达CD38的细胞的凋亡或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)；和与没有一个或多个突变的相同结合蛋白相比，具有一个或多个突变(例如，在Fc区中)导致与FcγRI和/或FcγRII的结合降低；诱导T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)增殖；诱导Bcl-xL的T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)表达；诱导CD38+细胞的凋亡；结合在细胞表面上表达的CD38和在T细胞表面上表达的一种或多种T细胞靶抗原；结合在细胞表面上表达的CD38、在T细胞表面上表达的CD28和在T细胞表面上表达的CD3；刺激T细胞受体的活化；诱导T细胞受体信号传导的共刺激(例如，由CD28介导)；和与没有一个或多个突变的相同结合蛋白相比具有一个或多个突变(例如，在Fc区中)导致PBMC的细胞因子释放(例如，IFN-γ、IL-2和/或TNF-α)的诱导减少；在CD38+靶细胞存在下，由PBMC诱导细胞因子释放(例如，IFN-γ和/或IL-6)。对于示例性测定，参见实施例1、3和4。在一些实施方案中，KD在4℃或25℃测量。
在一些实施方案中，本文提供了包含结合CD38多肽的抗原结合位点的结合蛋白，其中所述抗原结合位点包含:(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ IDNO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ IDNO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合位点包含:(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ IDNO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合位点包含：(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:87)或QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(SEQ ID NO:88)；其中FR2包含序列MHWVKEAPGQRLEWIGY(SEQ ID NO:90)或MHWVKEAPGQGLEWIGY(SEQ IDNO:91)；其中FR3包含序列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:93)或NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:94)；和其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:96)。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和/或所述VL结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和/或所述VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含含有SEQID NO:19的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和/或所述VL结构域包含SEQID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和/或所述VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，所述抗原结合位点包含:(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ IDNO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(SEQ IDNO:86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:87)或QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(SEQID NO:88)；其中FR2包含序列MHWVKEAPGQRLEWIGY(SEQ ID NO:90)或MHWVKEAPGQGLEWIGY(SEQ ID NO:91)；其中FR3包含序列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(SEQ IDNO:93)或NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:94)；和其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:96)。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和/或所述VL结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的抗体轻链。
在一些实施方案中，本文提供了一种结合蛋白，其包含结合CD38多肽的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包含:(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和/或所述VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，所述抗原结合位点与人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域交叉反应。在一些实施方案中，所述抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD38多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合位点结合所述包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD38多肽，平衡解离常数(KD)是2.1nM或更小。在一些实施方案中，所述抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的人同种型E CD38多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合位点结合所述包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽，平衡解离常数(KD)是1.3nM或更小。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述结合蛋白是嵌合或人源化抗体。在一些实施方案中，所述结合蛋白是人抗体。在一些实施方案中，所述结合蛋白是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含含有Fc区的一个或多个全长抗体重链。在一些实施方案中，所述Fc区是人Fc区，其包含降低或消除Fc受体结合和/或Fc区的效应子功能的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，根据EUIndex，所述人IgG1 Fc区在对应于人IgG1的234、235和329位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，根据EU Index，所述人IgG1Fc区在对应于人IgG1的298、299和300位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S298N、T299A和Y300S。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，根据EUIndex，所述人IgG4 Fc区在对应于人IgG4的228和409位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P和R409K。在一些实施方案中，根据EU Index，所述人IgG4 Fc区在对应于人IgG4的234和235位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A和L235A。在一些实施方案中，根据EU Index，所述人IgG4 Fc区在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，根据EU Index，所述人IgG4 Fc区在对应于人IgG4的233-237位的位置处包含氨基酸取代，其中所述序列EFLGG被PVAG代替。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含抗体F(ab)、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv或scFv片段。在一些实施方案中，所述结合蛋白与细胞毒性剂或标记物缀合。在一些实施方案中，所述结合蛋白是双特异性结合蛋白，其包含结合CD38多肽的第一抗原结合位点，和第二抗原结合位点。在一些实施方案中，所述结合蛋白是三特异性结合蛋白，其包含结合CD38多肽的第一抗原结合位点、第二抗原结合位点和第三抗原结合位点。在一些实施方案中，所述第一抗原结合位点结合人CD38多肽的胞外域，和其中所述第二和第三抗原结合位点各自结合T细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述第一抗原结合位点结合人CD38多肽的胞外域，和其中(a)所述第二抗原结合位点结合人CD28多肽，和所述第三抗原结合位点结合人CD3多肽，或(b)所述第二抗原结合位点结合人CD3多肽，和所述第三抗原结合位点结合人CD28多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种结合蛋白，其包含3个抗原结合位点，其各自结合一个或多个靶蛋白，其中所述3个抗原结合位点的至少一个与人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域交叉反应。在一些实施方案中，所述结合蛋白与包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:105的氨基酸序列的人CD38多肽交叉反应。在一些实施方案中，所述结合蛋白与包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽交叉反应。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含与人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域交叉反应的抗原结合位点，和各自结合T细胞表面蛋白的2个抗原结合位点。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含与人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域交叉反应的抗原结合位点，结合人CD28多肽的抗原结合位点，和结合人CD3多肽的抗原结合位点。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含形成所述3个抗原结合位点的4个多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区，和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对，和
其中：(a)所述VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ IDNO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ IDNO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(b)所述VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列，或
(c)所述VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含形成所述3个抗原结合位点的4个多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区，和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对，和
其中：(a)所述VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ IDNO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ IDNO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ IDNO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(b)所述VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或
(c)所述VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；所述VH1结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；所述VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；所述VH2结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；所述VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或所述VH3结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或所述VH3结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQID NO:6的氨基酸序列；所述VH3结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述VH3结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述VH3结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或所述VH3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，其中所述结合蛋白包含形成所述3个抗原结合位点的4个多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区，和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对，和
其中(a)所述VH1结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(b)所述VH2结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列，或
(c)所述VH3结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ IDNO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和所述VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述VH2结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和所述VL1结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述VH1结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和所述VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述VH2结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和所述VL1结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述VH1结构域包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和所述VL2结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；所述VH2结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和所述VL1结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；所述VH1结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和所述VL2结构域包含SEQID NO:85的氨基酸序列；或所述VH2结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和所述VL1结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH1结构域包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，所述VH3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或所述VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，所述VH3结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4的至少一个的长度独立地是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4的长度各自独立地是至少一个氨基酸。在一些实施方案中，(a)L1、L2、L3和L4各自独立地是0个氨基酸的长度或包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)；或(b)L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:57)，L3包含序列S，和L4包含序列RT；L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L3的长度是0个氨基酸，和L4的长度是0个氨基酸；L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L3的长度是0个氨基酸，和L4的长度是0个氨基酸；或L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，L2的长度是0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，和L4的长度是0个氨基酸。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的234和235位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A和L235A。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EUIndex，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EUIndex，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的228和409位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P和R409K。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG1铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG1的234、235和329位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG1铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG1的298、299和300位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S298N、T299A和Y300S。在一些实施方案中，根据EU Index，所述第二多肽链的铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的349、366、368和407位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；和其中根据EU Index，所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，根据EU Index，所述第二多肽链的铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W；和其中根据EU Index，所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的349、366、368和407位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了一种结合蛋白，其包含各自结合一个或多个靶蛋白的3个抗原结合位点，其中所述结合蛋白包含形成3个抗原结合位点的4个多肽链，其中第一所肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区，和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对，和
其中(a)所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG1铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG1的298、299和300位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S298N、T299A和Y300S；或(b)所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EUIndex，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，所述人IgG4铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG4的233-237位的位置处包含氨基酸取代，其中所述序列EFLGG被PVAG代替。在一些实施方案中，VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的至少一对形成结合CD38多肽的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的1、2或3对形成结合选自下组的抗原靶标的抗原结合位点：A2AR、APRIL、ATP二磷酸水解酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、NKG2D、NTP二磷酸水解酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。在一些实施方案中，VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的第一对形成结合人CD3多肽的抗原结合位点，VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的第二对形成结合人CD28多肽的抗原结合位点，和VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的第三对形成结合选自下组的人抗原靶标的抗原结合位点：A2AR、APRIL、ATP二磷酸水解酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、NKG2D、NTP二磷酸水解酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
在一些实施方案中，本文提供了一种多核苷酸类的试剂盒，其包含：(a)包含SEQID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:72的序列的第二多核苷酸，包含SEQ IDNO:74的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸；(b)包含SEQID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:76的序列的第二多核苷酸，包含SEQ IDNO:77的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸；(c)包含SEQID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:78的序列的第二多核苷酸，包含SEQ IDNO:79的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸；(d)包含SEQID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:72的序列的第二多核苷酸，包含SEQ IDNO:80的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸；(e)包含SEQID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:76的序列的第二多核苷酸，包含SEQ IDNO:82的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸；或(f)包含SEQID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:78的序列的第二多核苷酸，包含SEQ IDNO:83的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供了一种多核苷酸，其包含上述实施方案中任一项的结合蛋白。在一些实施方案中，本文提供了一种载体，其包含上述实施方案中任一项的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供了一种宿主细胞，其包含上述实施方案中任一项的多核苷酸类的试剂盒、多核苷酸或载体。在一些实施方案中，本文提供了一种产生结合蛋白的方法，所述方法包括培养上述实施方案中任一项的宿主细胞从而产生所述结合蛋白。在一些实施方案中，所述方案进一步包括从所述宿主细胞回收所述结合蛋白。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含上述实施方案中任一项的结合蛋白和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本文提供了一种预防和/或治疗患者中的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的至少一种上述实施方案中任一项的结合蛋白或上述实施方案中任一项的药物组合物。在一些实施方案中，所述结合蛋白是三特异性结合蛋白，其包含结合CD3的第一抗原结合位点、结合CD28的第二抗原结合位点和结合人CD38多肽的胞外域的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，至少一种结合蛋白与化疗剂共同施用。在一些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症是急性髓样白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，选择所述患者进行治疗，因为癌症的细胞在其细胞表面表达人CD38同种型E多肽(例如,如SEQ ID NO:105中所示)。在一些实施方案中，癌症细胞表达CD38和CD28。在一些实施方案中，癌细胞表达CD38而不表达CD28。
在一些实施方案中，本文提供了至少一种上述实施方案中任一项的结合蛋白或上述实施方案中任一项的药物组合物，其用于预防和/或治疗患者(例如，有此需要的患者，诸如患有癌症的患者)中的癌症。在一些实施方案中，本文提供了至少一种上述实施方案中任一项的结合蛋白或上述实施方案中任一项的药物组合物，其用于制备用于预防和/或治疗患者(例如，有此需要的患者，诸如患有癌症的患者)中的癌症的药物。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述结合蛋白是三特异性结合蛋白，其包含结合CD3的第一抗原结合位点、结合CD28的第二抗原结合位点和结合人CD38多肽的胞外域的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白与化疗剂共同施用。在一些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症是急性髓样白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，选择所述患者进行治疗，因为癌症的细胞在其细胞表面表达人CD38同种型E多肽(例如,如SEQ ID NO:105中所示)。在一些实施方案中，癌症细胞表达CD38和CD28。在一些实施方案中，癌细胞表达CD38而不表达CD28。
应理解，本文所述的多种实施方案的一个、一些或所有性质可以组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员而言会变得显而易见。通过下面的详细描述进一步描述本发明的这些和其他实方案。
本发明包括：
1.一种结合蛋白，其包含结合CD38多肽的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
2.项1的结合蛋白，其中所述抗原结合位点包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
3.项1或项2的结合蛋白，其中所述VH结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:87)或QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(SEQ ID NO:88)；其中FR2包含序列MHWVKEAPGQRLEWIGY(SEQID NO:90)或MHWVKEAPGQGLEWIGY(SEQ ID NO:91)；其中FR3包含序列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:93)或NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:94)；和其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:96)。
4.项1或项2的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
5.项4的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体轻链。
6.项1或项2的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
7.项6的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。
8.项1或项2的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
9.项8的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。
10.项1或项2的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
11.项10的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。
12.项1的结合蛋白，其中所述抗原结合位点包含:
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
13.项1或项12的结合蛋白，其中所述VH结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:87)或QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(SEQ ID NO:88)；其中FR2包含序列MHWVKEAPGQRLEWIGY(SEQ ID NO:90)或MHWVKEAPGQGLEWIGY(SEQ ID NO:91)；其中FR3包含序列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:93)或NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:94)；和其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:96)。
14.项1或项12的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
15.项14的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的抗体轻链。
16.一种结合蛋白，其包含结合CD38多肽的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
17.项16的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
18.项16或项17的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的抗体轻链。
19.项1-18中任一项的结合蛋白，其中所述抗原结合位点与人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域交叉反应。
20.项19的结合蛋白，其中所述抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD38多肽。
21.项20的结合蛋白，其中所述抗原结合位点结合所述包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD38多肽，平衡解离常数(KD)是2.1nM或更小。
22.项19的结合蛋白，其中所述抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的人同种型E CD38多肽。
23.项19-22中任一项的结合蛋白，其中所述抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽。
24.项23的结合蛋白，其中所述抗原结合位点结合所述包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽，平衡解离常数(KD)是1.3nM或更小。
25.项1-24中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是嵌合或人源化抗体。
26.项16-24中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人抗体。
27.项1-24中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
28.项1-24中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有Fc区的一个或多个全长抗体重链。
29.项28的结合蛋白，其中所述Fc区是人Fc区，其包含降低或消除Fc受体结合和/或Fc区的效应子功能的一个或多个突变。
30.项28的结合蛋白，其中所述Fc区是人IgG1 Fc区。
31.项30的结合蛋白，其中根据EU Index，所述人IgG1 Fc区在对应于人IgG1的234、235和329位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。
32.项30的结合蛋白，其中根据EU Index，所述人IgG1 Fc区在对应于人IgG1的298、299和300位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S298N、T299A和Y300S。
33.项28的结合蛋白，其中Fc区是人IgG4 Fc区。
34.项33的结合蛋白，其中根据EU Index，所述人IgG4 Fc区在对应于人IgG4的228和409位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P和R409K。
35.项33或项34的结合蛋白，其中根据EU Index，所述人IgG4 Fc区在对应于人IgG4的234和235位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A和L235A。
36.项33或项34的结合蛋白，其中根据EU Index，所述人IgG4 Fc区在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。
37.项1-24中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含抗体F(ab)、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv或scFv片段。
38.项1-37中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白与细胞毒性剂或标记物缀合。
39.项1-37中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是双特异性结合蛋白，其包含结合CD38多肽的第一抗原结合位点，和第二抗原结合位点。
40.项1-37中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是三特异性结合蛋白，其包含结合CD38多肽的第一抗原结合位点、第二抗原结合位点和第三抗原结合位点。
41.项40的结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点结合人CD38多肽的胞外域，和其中所述第二和第三抗原结合位点各自结合T细胞表面蛋白。
42.项41的结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点结合人CD38多肽的胞外域，和其中(a)所述第二抗原结合位点结合人CD28多肽，和所述第三抗原结合位点结合人CD3多肽，或(b)所述第二抗原结合位点结合人CD3多肽，和所述第三抗原结合位点结合人CD28多肽。
43.一种结合蛋白，其包含3个抗原结合位点，其各自结合一个或多个靶蛋白，其中所述3个抗原结合位点的至少一个与人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域交叉反应。
44.项43的结合蛋白，其中所述结合蛋白与包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:105的氨基酸序列的人CD38多肽交叉反应。
45.项43或项44的结合蛋白，其中所述结合蛋白与包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽交叉反应。
46.项43-45中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含与人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域交叉反应的抗原结合位点，和各自结合T细胞表面蛋白的2个抗原结合位点。
47.项46的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含与人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域交叉反应的抗原结合位点，结合人CD28多肽的抗原结合位点，和结合人CD3多肽的抗原结合位点。
48.项43-47的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含形成所述3个抗原结合位点的4个多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区，和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对，和
其中：
(a)所述VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(b)所述VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或
(c)所述VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
49.项48的结合蛋白，其中
(a)所述VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(b)所述VH1结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(c)所述VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(d)所述VH2结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(e)所述VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或
(h)所述VH3结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
50.项49的结合蛋白，其中
(a)所述VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或
(b)所述VH3结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
51.项50的结合蛋白，其中
(a)所述VH3结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；
(b)所述VH3结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；
(c)所述VH3结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；
(d)所述VH3结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；或
(e)所述VH3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列。
52.项43-47的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含形成所述3个抗原结合位点的4个多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区，和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对，和
其中：
(a)所述VH1结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL1结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(b)所述VH2结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL2结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或
(c)所述VH3结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
53.项52的结合蛋白，其中所述VH3结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和所述VL3结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
54.项53的结合蛋白，其中所述VH3结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
55.项48-54的结合蛋白，其中
(a)所述VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和所述VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
(b)所述VH2结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和所述VL1结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
(c)所述VH1结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和所述VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
(d)所述VH2结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和所述VL1结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
(e)所述VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和所述VL2结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；
(f)所述VH2结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和所述VL1结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；
(g)所述VH1结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和所述VL2结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；或
(h)所述VH2结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列，所述VH1结构域包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和所述VL1结构域包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
56.项55的结合蛋白，其中
(a)所述VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，所述VH3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或
(b)所述VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述VL1结构域包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，所述VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，所述VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，所述VH3结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和所述VL3结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
57.项48-56中任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3或L4的至少一个的长度独立地是0个氨基酸。
58.项48-56中任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3或L4的长度各自独立地是至少一个氨基酸。
59.项48-56中任一项的结合蛋白，其中(a)L1、L2、L3和L4各自独立地是0个氨基酸的长度或包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)；或(b)L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。
60.项48-56中任一项的结合蛋白，其中
(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:57)，L3包含序列S，和L4包含序列RT；
(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L3的长度是0个氨基酸，和L4的长度是0个氨基酸；
(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L3的长度是0个氨基酸，和L4的长度是0个氨基酸；或
(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，L2的长度是0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，和L4的长度是0个氨基酸。
61.项48-60中任一项的结合蛋白，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的234和235位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A和L235A。
62.项48-60中任一项的结合蛋白，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。
63.项48-60中任一项的结合蛋白，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的228和409位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P和R409K。
64.项48-60中任一项的结合蛋白，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的234、235和329位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。
65.项48-60中任一项的结合蛋白，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的298、299和300位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S298N、T299A和Y300S。
66.项48-65中任一项的结合蛋白，其中根据EU Index，所述第二多肽链的铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的349、366、368和407位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V，和其中根据EU Index，所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W。
67.项48-65中任一项的结合蛋白，其中根据EU Index，所述第二多肽链的铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W；和其中根据EU Index，所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的349、366、368和407位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
68.项48或项52的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
69.项48或项52的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
70.项48或项52的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
71.项48或项52的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
72.项48或项52的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
73.项48或项52的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，和所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
74.一种结合蛋白，其包含各自结合一个或多个靶蛋白的3个抗原结合位点，其中所述结合蛋白包含形成3个抗原结合位点的4个多肽链，其中第一所肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；和
其中：
(a)所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG1铰链-CH2-CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG1的298、299和300位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S298N、T299A和Y300S；或
(b)所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4 CH3结构域，和其中根据EU Index，所述铰链-CH2-CH3结构域各自在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。
75.项74的结合蛋白，其中VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的至少一对形成结合CD38多肽的抗原结合位点。
76.项74的结合蛋白，其中VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的1、2或3对形成结合选自下组的抗原靶标的抗原结合位点：A2AR、APRIL、ATP二磷酸水解酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、NKG2D、NTP二磷酸水解酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
77.项74的结合蛋白，其中VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的第一对形成结合人CD3多肽的抗原结合位点，VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的第二对形成结合人CD28多肽的抗原结合位点，和VH1和VL1、VH2和VL2以及VH3和VL3的第三对形成结合选自下组的人抗原靶标的抗原结合位点：A2AR、APRIL、ATP二磷酸水解酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、NKG2D、NTP二磷酸水解酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
78.一种多核苷酸类的试剂盒，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:72的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:74的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸；
(b)包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:76的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:77的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸；
(c)包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:78的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:79的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸；
(d)包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:72的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:80的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸；
(e)包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:76的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:82的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸；或
(f)包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:78的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:83的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸。
79.一种多核苷酸，其编码项1-77中任一项的结合蛋白。
80.一种载体，其包含项79的多核苷酸。
81.一种宿主细胞，其包含项78的多核苷酸类的试剂盒、项79的多核苷酸或项80的载体。
82.一种产生结合蛋白的方法，所述方法包括培养项81的宿主细胞从而产生所述结合蛋白。
83.项82的方法，其进一步包括从所述宿主细胞回收所述结合蛋白。
84.一种药物组合物，其包含项1-77中任一项的结合蛋白和药学上可接受的载体。
85.一种预防和/或治疗患者中的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的至少一种项1-73中任一项的结合蛋白或项84的药物组合物。
86.项85的方法，其中所述结合蛋白包含结合T细胞表面蛋白的一个抗原结合位点，和结合人CD38多肽的胞外域的另一个抗原结合位点。
87.项86的方法，其中所述结合蛋白是三特异性结合蛋白，其包含结合CD3的第一抗原结合位点、结合CD28的第二抗原结合位点和结合人CD38多肽的胞外域的第三抗原结合位点。
88.项85-87中任一项的方法，其中至少一种结合蛋白与化疗剂共同施用。
89.项85-88中任一项的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
90.项85-88中任一项的方法，其中所述癌症是急性髓样白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或B细胞淋巴瘤。
91.项85-90中任一项的方法，其中所述患者是人。
92.项85-91中任一项的方法，其中选择所述患者进行治疗，因为癌症的细胞在其细胞表面表达人CD38同种型E多肽。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局(Office)提供。
图1A显示使用流式细胞术使抗CD38抗体mAb1(上图)和isatuximab(下图)与SU-DHL-8人淋巴瘤细胞或MOLP-8人多发性骨髓瘤细胞结合。
图1B显示检测抗CD38抗体mAb1或isatuximab(未观察到结合)与在表面上表达食蟹猴CD38的细胞结合的流式细胞术结合测定的结果。
图2A-2I显示表征抗CD38抗体与人和食蟹猴CD38多肽结合的测定结果。图2A显示通过ELISA使人源化抗CD38抗体mAb2与可溶性人CD38(上图，“hCD38::Histag”)或食蟹猴CD38(上图，“cynoCD38::Histag”)结合，以及通过流式细胞术使mAb2与表达人CD83(下图，如所示的)或食蟹猴CD38(下图，如所示的)的细胞表面结合。图2B显示通过表面等离子体共振(SPR)使mAb2与人CD38(上图)或食蟹猴CD38(下图)结合。图2C显示通过ELISA使人源化抗CD38抗体mAb3与可溶性人CD38(上图，“hCD38::Histag”)或食蟹猴CD38(上图，“cynoCD38::Histag”)结合，以及通过流式细胞术使mAb3与表达人CD83(下图，如所示的)或食蟹猴CD38(下图，如所示的)的细胞表面结合。图2D显示通过SPR使mAb3与人CD38(上图)或食蟹猴CD38(下图)结合。图2E显示通过ELISA使人源化抗CD38抗体mAb5与可溶性人CD38(上图，“hCD38::Histag”)或食蟹猴CD38(上图，“cynoCD38::Histag”)结合，以及通过流式细胞术使mAb5与表达人CD83(下图，如所示的)或食蟹猴CD38(下图，如所示的)的细胞表面结合。图2F显示了通过SPR使mAb5与人CD38(上图)或食蟹猴CD38(下图)结合。图2G显示通过ELISA使人抗CD38抗体hhy1370与可溶性人CD38(上图，“hCD38::Histag”)或食蟹猴CD38(上图，“cynoCD38::Histag”)结合，以及通过流式细胞术使hhy1370与表达人CD83(下图，如所示的)或食蟹猴CD38(下图，如所示的)的细胞表面结合。图2H显示通过SPR使hhy1370与人CD38(上图)或食蟹猴CD38(下图)结合。图2I汇总了来自ELISA、SPR和FACS实验的结合数据，以及每个抗体VH(“H”)或VL(“L”)结构域与人V区序列从上到下的百分比同一性，对应于mAb2、mAb3、mAb4、mAb5和mAb6最后一行(1195HHKK-3未在下文中通过其VL/VH氨基酸序列描述)。
图2J显示在37℃温育72小时后mAb7和mAb1对SU-DHL-8细胞凋亡的浓度依赖性诱导。
图2K显示在NK92细胞的存在下，isatuximab和mAb1对SU-DHL-8细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
图2L显示在37℃4小时后，在NK92细胞的存在下，isatuximab(右)和mAb1(左)对SU-DHL-8细胞的浓度依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
图2M-2Q显示使用所示针对SU-DHL-8肿瘤细胞的抗CD38抗体的凋亡诱导测定的结果。通过经由流式细胞术测量双膜联蛋白V和碘化丙啶摄取来量化细胞凋亡。图2M显示每种抗体诱导的凋亡细胞的百分比。图2N-2Q显示抗CD38抗体mAb2(图2N)、mAb3(图2O)、mAb4(图2P)和mAb5(图2Q)对SU-DHL-8淋巴瘤细胞凋亡的剂量依赖性诱导，以及每种抗体的IC50。
图3A提供了包含形成结合以下3种靶蛋白的3个抗原结合位点的四条多肽链的三特异性结合蛋白的示意图：CD28、CD3和CD38。第一对多肽具有交叉方向的双可变结构域(VH1-VH2和VL2-VL1)，形成识别CD3和CD28的2个抗原结合位点，第二对多肽具有单可变结构域(VH3和VL3)，形成识别CD38的单个抗原结合位点。图3A中显示的三特异性结合蛋白使用具有“杵臼(knobs-into-holes)”突变的IgG4恒定区，其中杵在具有单个可变结构域的第二对多肽上。
图3B提供了基于SPR的测定的示意图，该测定用于检查抗CD38/抗CD28/抗CD3三特异性结合蛋白的每个抗原结合结构域结合其同源抗原的能力。
图3C显示用于检查CD38与抗CD38/抗CD28/抗CD3三特异性结合蛋白结合的基于SPR的测定的结果。在预结合CD3(中上)之后，在预结合CD28(右上)之后，在预结合CD3然后CD28(左下)之后，或在预结合CD28然后CD3(右下)之后，单独检查人CD38与三特异性结合蛋白的结合(左上)。
图4显示人CD3、CD28和CD38多肽与抗CD38/抗CD28/抗CD3三特异性结合蛋白的顺序结合，如通过SPR测定的。
图5汇总了所示三特异性结合蛋白对其同源抗原(人CD3、CD28和CD38)的结合亲和力，如通过SPR测量的。
图6A比较了人IgG1形式(第二片层)或三特异性结合蛋白形式的isatuximab抗原结合结构域与isatuximab、抗CD28和抗CD3抗原结合结构域的表观亲和力(根据图3A的形式；第一片层)用于结合人(上图)或食蟹猴(下图)CD38多肽，如通过流式细胞术测定的。
图6B-6D比较了三特异性结合蛋白CD38VH1xCD28supxCD3mid、CD38VH1xCD28cvnxCD3mid或单特异性抗CD38抗体mAb2与表达人或食蟹猴CD38多肽的细胞结合的表观亲和力，如通过流式细胞术测定的。图6B显示三特异性结合蛋白CD38VH1xCD28supxCD3mid与表达人(上图)或食蟹猴(下图)CD38多肽的细胞的结合。图6C显示三特异性结合蛋白CD38VH1xCD28cvnxCD3mid与表达人(上图)或食蟹猴(下图)CD38多肽的细胞的结合。图6D显示单特异性抗CD38抗体mAb2与表达人(上图)或食蟹猴(下图)CD38多肽的细胞的结合。
图6E比较了三特异性结合蛋白CD38HHY1370xCD28supxCD3mid或单特异性抗CD38抗体mAb6与表达人(上图)或食蟹猴(下图)CD38多肽的细胞结合的表观亲和力，如通过流式细胞术测定的。
图6F汇总了所示抗CD38x抗CD28x抗CD3三特异性结合蛋白对人CD38的结合亲和力，如通过SPR或流式细胞术(FACS)测量的。
图6G显示了缺乏抗CD38抗原结合结构域的三特异性结合蛋白ΔCD38VH1xCD28supxCD3mid对与表达人(上图)或食蟹猴(下图)CD38多肽的细胞结合的表观亲和力，如通过流式细胞术测定的。
图7A和7B显示确定多种抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性结合蛋白或对照抗体对人和恒河猴CD3、CD28和CD38多肽的结合亲和力的ELISA测定的结果。
图8A-8D显示使用所示抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白和对照抗体的来自三个不同人供体的PBMC的抗体介导的CD38+细胞特异性杀伤的结果。显示了使用多发性骨髓瘤细胞系RPMI8266(图8A)、NCI-H929(图8B)、KMS-26(图8C)和KMS-11细胞系(图8D)的代表性结果，并且在表N中提供了EC50值。在表O-Q中提供了通过使用NCI-H929、KMS-26和KMS-11细胞获得的EC50值。
图8E和8F显示使用所示具有变体Fc区的抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白和对照抗体的来自两个不同供体的PBMC的抗体介导的CD38+细胞特异性杀伤的结果。显示了使用CD38+KMS-11(图8D)和U266(图8E)细胞系的代表性结果，并且在表Q2和Q3中提供了EC50值。
图9A、9B和10显示用多种抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或对照抗体处理24小时的人T细胞的活化(CD69+)。图9A显示人CD3+T细胞的活化(CD69+)。图9B显示人CD3+CD4+T细胞的活化(CD69+)。图10显示人CD3+CD8+T细胞的活化(CD69+)。
图11A-11B显示如Stebbings,R.et al.(2007)J.Immunol.179:3325-3331中所述的基于干燥平板法用所示抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或对照抗体处理的人PBMC的体外细胞因子释放评估的结果。图11A显示使用5μg/mL的所示抗体的结果。图11B显示使用25ng/mL的所示抗体的结果。
图12A-12E显示了植入RPMI-8226多发性骨髓瘤细胞的CD34+脐带血细胞人源化NSG小鼠模型中抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白的体内活性。图12A显示用所示浓度的抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠的肿瘤体积变化。图12B显示用所示浓度的CD38(VHI)xCD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠在第18天的平均肿瘤体积。图12C显示用所示浓度的抗CD38(VHI)x CD28(sup)xCD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠的平均终末肿瘤重量。图12D显示用所示浓度的抗CD38(VHI)xCD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠在实验长度上的平均肿瘤生长曲线。图12E显示在用所示浓度的抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠的实验长度上的多个时间点的体重的平均变化。
图13A-13F显示了植入RPMI-8226多发性骨髓瘤细胞的PBMC人源化NSG小鼠模型中抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白的体内活性。图13A显示用所示浓度的抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠的肿瘤体积变化。图13B显示用所示浓度的抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠在第4天的肿瘤体积。图13C显示用所示浓度的抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠在第21天的肿瘤体积。图13D显示用所示浓度的抗CD38(VHI)x CD28(sup)xCD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠在第21天的平均肿瘤体积。图13E显示用所示浓度的抗CD38(VHI)xCD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠的平均末端肿瘤重量。图13F显示在用所述浓度的抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白处理的小鼠相对于用抗CD3/CD38双特异性抗体处理的小鼠在实验长度内的多个时间点的平均肿瘤体积。
图14A-14U显示使用非人灵长类动物中的抗CD38(VHI)x CD28(sup)xCD3(mid)、抗CD38(VHI)x CD28(cvn)x CD3(mid)、抗CD38(hhy1370)x CD28(sup)xCD3(mid)和抗CD38(hhy1370)xCD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白的剂量递增研究的结果。图14A显示在施用不同剂量的抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD3+T细胞的T细胞活化(CD69+)。图14B显示在施用不同剂量的抗CD38(VHI)x CD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD3+T细胞的T细胞活化(CD69+)。图14C显示施用不同剂量的抗CD38(hhy1370)x CD28(sup)xCD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD3+T细胞的T细胞活化(CD69+)。图14D显示在施用不同剂量的抗CD38(hhy1370)x CD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD3+T细胞的T细胞活化(CD69+)。图14E显示施用所示剂量的抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD4+T细胞百分比的变化。图14F显示施用所示剂量的抗CD38(VHI)x CD28(sup)xCD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD8+T细胞百分比的变化。图14G显示使用所示剂量的抗CD38(VHI)xCD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD4+T细胞百分比的变化。图14H显示施用所示剂量的抗CD38(VHI)x CD28(cvn)xCD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD8+T细胞百分比的变化。图14I显示施用所示剂量的抗CD38(hhy1370)x CD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD4+T细胞百分比的变化。图14J显示施用所示剂量的抗CD38(hhy1370)xCD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD8+T细胞百分比的变化。图14K显示施用所示剂量的抗CD38(hhy1370)xCD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD4+T细胞百分比的变化。图14L显示施用所示剂量的抗CD38(hhy1370)x CD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后循环CD8+T细胞百分比的变化。图14M显示施用12.5μg/kg的所示三特异性结合蛋白后6、24和48小时总CD4+T细胞的变化。图14N显示施用12.5μg/kg的所示三特异性结合蛋白后6、24和48小时的总NK细胞的变化。图14O显示施用12.5μg/kg的所示三特异性结合蛋白后6、24和48小时的总CD8+T细胞的变化。图14P显示施用12.5μg/kg的所示三特异性结合蛋白后6、24和48小时的总B细胞的变化。图14Q显示施用三种递增剂量(0.5、2.5、12.5μg/kg)的抗CD38(VH1)x CD28(sup)xCD3(mid)三特异性结合蛋白后6小时细胞因子水平的变化(结果来自标记为“117065”和“117066”的不同测试动物)。图14R显示施用三种递增剂量(0.5、2.5、12.5μg/kg)的抗CD38(VH1)x CD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后6小时细胞因子水平的变化(结果来自标记为“117067”和“117068”的不同试验动物)。图14S显示施用三种递增剂量(0.5、2.5、12.5μg/kg)的抗CD38(hhy1370)xCD28(sup)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后6小时细胞因子水平的变化(结果来自标记为“117069”和“117070”的不同测试动物)。图14T显示施用三种递增剂量(0.5、2.5、12.5μg/kg)的抗CD38(hhy1370)x CD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后6小时细胞因子水平的变化(结果来自标记为“117071”和“117072”的不同测试动物)。图14U显示施用三种递增剂量(0.5、2.5、12.5μg/kg)的所示三特异性结合蛋白后24小时细胞因子水平的变化(所有试验动物显示的结果)。
图14V和14W显示抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)和抗CD38(VHI)xCD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白在较高剂量的非人灵长类血液中诱导体内T细胞的消耗(给药后6小时)。
图14X和14Y显示抗CD38(HHY1370)x CD28(sup)x CD3(mid)和抗CD38(HHY1370x CD28(cvn)xCD3(mid)三特异性结合蛋白在较高剂量的非人灵长类血液中诱导体内T细胞的消耗(给药后6小时)。
图14Z和14AA显示施用抗CD38(VHI)x CD28(sup)x CD3(mid)或抗CD38(VHI)x CD28(cvn)xCD3(mid)三特异性结合蛋白后非人灵长类中的血液T细胞随时间变化的量。
图14AB和14AC显示施用抗CD38(HHY1370)x CD28(sup)x CD3(mid)或抗CD38(HHY1370)xCD28(cvn)x CD3(mid)三特异性结合蛋白后非人灵长类中的血液T细胞随时间变化的量。
图14AD和14AE显示在非人灵长类中施用100μg/kg剂量后具有结合的三特异性结合蛋白的CD4+T细胞的量。
图14AF和14AG显示在非人灵长类中施用100μg/kg剂量后具有结合的三特异性结合蛋白的CD8+T细胞的量。
图15A-15C显示多种Fc变体与人Fc受体FcγR I(图15A)、FcγR IIa(图15B)和FcγR IIIb/c(图15C)的结合或缺乏。测试的变体是人IgG1、人IgG4和具有FALA突变的人IgG4。
图16显示具有或不具有FALA突变的人IgG4与FcRn的结合。
图17汇总了NSG小鼠中所示三特异性结合蛋白(CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4、CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA、CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG1 LALA P329A和CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA)的PK参数。
图18A-18C显示与具有野生型或FALA变体Fc区的三特性异结合蛋白一起温育的人PBMC的Fc/FcR相互作用介导的(非特异性)IFN-γ(图18A)、IL-2(图18B)或TNF-α(图18C)的释放。
图18D显示CD38VH1xCD28supxCD3mid和CD38HHY1370xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白以及其IgG1和IgG4 Fc变体对人PBMC的体外活化。
图19A和19B显示通过三特异性结合蛋白CD38VH1xCD28supxCD3mid在CD4+(图19A)或CD8+(图19B)T细胞中诱导Bcl-xL需要CD3和CD28抗原结合结构域。条形图＝来自3个PBMC供体的平均值和s.d.。*p＝<0.009。
图19C和19D显示具有IgG4 FALA变体Fc的CD38VH1xCD28xCD3上调大于基准双特异性抗体的CD4+(图19C)或CD8+(图19D)T细胞中的Bcl-xL。条形图＝来自3个PBMC供体的平均值和s.d.。*p＝<0.045
图19E显示通过Jurkat T细胞报告细胞系中的IL-2表达测定的抗CD38x抗CD28x抗CD3三特异性结合蛋白的T细胞活化依赖于抗CD3抗原结合结构域。
图19F显示与具有突变的抗CD28、抗CD38或抗CD28、抗CD38和抗CD3以及基准的结合蛋白相比，CD38VH1xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白释放细胞因子TNF、IFNg、IL-2、IL-6和IL-10。
图19G显示由具有IgG4 FALA变体Fc的抗CD38x抗CD28x抗CD3三特异性结合蛋白、基准抗CD38x抗CD3双特异性抗体或同种型对照(具有突变结合结构域的IgG4 FALA变体Fc的三特异性结合蛋白)活化的T细胞的增殖。
图20显示由具有IgG4 FALA变体Fc的抗CD38x抗CD28x抗CD3三特异性结合蛋白、具有IgG4 FALA变体Fc和CD38、CD28或CD3抗原结合结构域中的突变的抗CD38x抗CD28x抗CD3三特异性结合蛋白，或同种型对照(具有三个突变结合结构域的IgG4 FALA变体Fc的三特异性结合蛋白)活化的T细胞的增殖。
图21显示在PBMC人源化NSG小鼠的NCI-H929-Luc播散性肿瘤模型中以所示剂量施用的CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA三特异性结合蛋白的体内抗肿瘤活性。
图22显示在PBMC人源化NSG小鼠的NCI-H929-Luc播散性肿瘤模型中以所示剂量施用的CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA三特异性结合蛋白的体内抗肿瘤活性。
图23A和23B显示了使用在体内研究中使用的人PBMC的具有CD38VH1xCD28supxCD3mid和CD38HHY1370xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白和基准抗CD38x抗CD3双特异性抗体的NCI-929-Luc细胞的有效体外肿瘤杀伤活性。以10:1的效应物:PBMC比例温育24小时后使用来自2个供体人源化NSG小鼠的人PBMC。
图23C显示与基准抗CD38x抗CD3双特异性抗体相比，以所示剂量在PBMC人源化NSG小鼠的NCI-H929-Luc播散性肿瘤模型中施用的CD38VH1xCD28supxCD3mid和CD38hhy1370xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白的优异体内抗肿瘤活性。通过以30μg/kg每周腹膜内(IP)注射施用结合蛋白。
图24A显示使用GloResponseTMIL2-luc2P Jurkat细胞(Promega)在CD38VH1/CD28supxCD3mid及其单个结合位点KO和10nM浓度的三重KO突变体刺激后的荧光素酶报告基因测定的结果。
图24B显示抗CD3xCD28 CODV-Fab抗体的优化。通过在体外使用人PBMC的细胞因子释放测定评估了CODV双特异性Fab的替代位置中α-CD3和α-CD28的最佳构型。基于24小时后上清液中IFN-γ和IL-2的分泌，确定远端CD28 x近端CD3为最佳定位。
图25显示CD38VH1/CD28supxCD3mid诱导原代T细胞中Bcl-2家族成员Bcl-xL的上调是CD28依赖性的。
图26显示三特异性Ab中的抗CD28提供了在体外支持原代T细胞增殖所必需的二级信号传导。
图27显示了由亲本抗体进行颜色编码的三特异性抗体的构型(左)。深色调(紫色或绿色)表示重链肽；浅色调表示轻链肽。还显示基于抗CD38 VH1Fab和CD28sup/CD3mid CODVFab的晶体结构的CD38VH1/CD28supxCD3mid三特异性抗体的结构模型(右)。
图28A和28B显示具有高(RPMI-8226；图28A)和低(KMS-11；图28B)CD38表面表达的多发性骨髓瘤(MM)细胞被与多种浓度的三特异性Ab一起温育的人PBMC有效裂解(E:T＝10:1)。通过结合位点KO突变证明了每个结合位点对杀伤活性的贡献，如所示的。
图29A-29C显示三特异性Ab的抗CD28supKO突变体在体外对CD38high、CD38mid和CD38low MM细胞显示出显著降低的抗肿瘤活性。显示了使用RPMI-8226(图29A)、U266(图29B)或KMS-11(图29C)细胞的测定。
图30显示CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA三特异性抗体治疗组中肿瘤负荷的降低在使用用体外扩增的人原代T细胞重构的NSG小鼠的播散性人多发性骨髓瘤细胞系模型中是剂量依赖性的和统计学差异的。
图31A和31B显示在存在原代人T细胞的情况下在体外通过CD38三特异性Ab对骨髓瘤细胞细胞溶解的重要显微镜分析。使用与用CellTrackerTM深红色染料标记的RPMI-8226骨髓瘤细胞系一起温育的人PBMC，使用阴性对照(三重KO三特异性；图31A)或CD38/CD28xCD3三特异性Ab(图31B)进行显微图像的延时摄影。在温育24小时后收集所呈现的图像。比例尺：50μm。
图32显示用于在Fc受体结合测定中进行分析而制备的IgG4的Fc区中的替代突变。示出了SEQ ID NO:111-116(分别从上到下)。
图33显示用于测量指定的IgG4 Fc变体与所示人Fc受体的亲和力的SPR测定的结果。
图34显示具有最小FcR结合的CD38三特异性结合蛋白减少了在体外人PBMC的非特异性细胞因子释放。分析了不同的FcR失活性突变(如所示)对人IgG4同种型的促炎作用。将人PBMC在培养基(未刺激)中或在骨髓瘤细胞RPMI-8226(经刺激)存在下温育，条形图表示通过ELISA测量的上清液IFN-γ水平。
图35显示具有最小FcR结合的CD38三特异性结合蛋白裂解具有不同CD38表达水平的人多发性骨髓瘤细胞。使用具有所示肿瘤靶标的人PBMC在体外评估具有IgG4或所示Fc突变的骨髓瘤细胞的细胞溶解。
图36显示使用人PBMC作为效应细胞测量的三特异性抗CD38/CD28/CD3 Ab和抗CD38抗体达雷木单抗对细胞系RPMI-8226、U266和KMS-11(E:T＝10:1)的体外细胞溶解活性的比较。
图37A-37D显示响应于CD38/CD3xCD28的体外T细胞亚群扩增的表征。通过在不存在外源细胞因子的情况下用350ng/孔的CD38三特异性Ab包被孔来进行T细胞亚群扩增的评估。在所指示的时间点测量T细胞群体。将三突变体三特异性ab用作阴性对照。流式细胞术用于确定如实施例12中所述的中枢和效应记忆性CD4 T细胞(图37A)、辅助T细胞(图37B)、中枢和效应记忆性CD8 T细胞(图37C)以及CMV pp65-特异性CD8细胞(图37D)。通过对来自用CD38三特异性或三阴性对照处理的HLA-A2 CMV+供体的PBMC进行五聚体染色，对CMV特异性pp65效应细胞进行了分析。
图38显示靶细胞上CD28表达对通过CD38/CD3xCD28的细胞溶解的易感性的贡献。使用CRISPR/Cas 9基因靶向在KMS-11细胞中敲除CD28，并将其在体外用作细胞溶解靶标。与亲本KMS-11相比，CD38表达被保留，而CD28被消除，如流式细胞术所证实(上图，KMS-11相对于KMS-11(CD28KO))。用WT或CD28无效三特异性检查CD28 KO细胞的细胞溶解(下图；三特异性相对于三特异性(CD28KO))。
图39显示CD38/CD28xCD3三特异性FALA突变体Ab对所示CD38+CD28-系的细胞溶解活性，所述CD38+CD28-系包括急性髓细胞白血病(AML(KG-1))、B细胞淋巴瘤(OCI-Ly19)、急性T淋巴细胞性白血病(ALL(KOPN8))和慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL(Z-138))。
图40显示通过α-CD28超激动剂的人PBMC的体外活化需要抗体的双价。
具体实施方式
本公开内容提供了包含至少一个结合CD38多肽的抗原结合位点的结合蛋白。
I.一般定义
如根据本公开所使用的，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数提及，除非内容另有明确说明。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种这样的分子的组合等。
应理解，本文所述的本公开的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案、“由(方面和实施方案)组成”和“基本上由(方面和实施方案)组成”。
如本文所使用的术语“多核苷酸”是指长度是至少10个核苷酸的单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。这样的修饰包括碱基修饰，诸如溴尿苷；核糖修饰，诸如阿拉伯糖苷和2',3'-双脱氧核糖；和核苷酸间键修饰，诸如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。术语“多核苷酸”具体包括单链和双链形式的DNA。
“分离的多核苷酸”是基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或它们的某些组合，其：(1)不与全部或部分多核苷酸结合，其中在自然界中发现分离的多核苷酸，(2)与天然不结合的多核苷酸结合，或(3)不作为较大序列的一部分出现在自然界中。
“分离的多肽”是这样的：(1)不含至少一些通常会发现的其他多肽，(2)基本上不含来自相同来源(例如来自相同的物种)的其他多肽，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或与其天然结合的其他物质分离，(5)不与“分离的多肽”天然结合的多肽部分结合(通过共价或非共价相互作用)，(6)与天然不结合的多肽可操作地结合(通过共价或非共价相互作用)，或(7)不存在于自然界。这样的分离的多肽可以由合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA，或它们任何组合编码。优选地，分离的多肽基本上不含在其天然环境中发现的会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其他)的多肽或其他污染物。
天然存在的抗体通常包含四聚体。每个这样的四聚体通常由两对相同的多肽链组成，每对具有一条全长“轻链”(通常具有约25kDa的分子量)和一条全长“重链”(通常具有约为50-70kDa的分子量)。本文所用的术语“重链”和“轻链”是指具有足够的可变结构域序列以赋予靶抗原特异性的任何免疫球蛋白多肽。每条轻链和重链的氨基末端部分通常包括约100至110或更多个氨基酸的可变结构域，其通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义负责效应子功能的恒定结构域。因此，在天然存在的抗体中，全长重链免疫球蛋白多肽包括可变结构域(VH)和3个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中VH结构域位于多肽的氨基末端和CH3结构域位于羧基末端，全长轻链免疫球蛋白多肽包括可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)，其中VL结构域位于多肽的氨基末端和CL结构域位于羧基末端。
人轻链通常被分类为κ和λ轻链，并且人重链通常被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA类似地细分为亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，可变区和恒定结构域通常通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。参见，例如，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul,W.,ed.,Raven Press,2nd ed.,1989)，其出于所有目的通过提述以其整体并入。每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。天然存在的抗体的可变结构域通常表现出由三个高变区连接的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构，也称为互补决定区或CDR。来自每对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，这可以使得能够结合特定的表位。从氨基末端到羧基末端，轻链和重链可变结构域通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
术语“CDR组”是指在能够结合抗原的单个可变区中出现的一组三个CDR。根据不同的系统，这些CDR的确切边界已经被不同地定义。由Kabat描述的系统(Kabat et al.,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)and(1991))不仅提供了一种适用于抗体的任何可变区域的明确的残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia and Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17；Chothia et al.,1989,Nature342:877-83)发现尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性，Kabat CDR中的某些亚部分仍采用几乎相同的肽骨架构象。这些亚部分被指定为L1、L2和L3，或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区域。这些区域可称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。定义与Kaba CDR重叠的CDR的其他边界由Padlan,1995,FASEB J.9:133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5):732-45；和Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77描述。其他CDR边界定义可能不严格遵循本文系统之一，但仍然会与Kabat CDR重叠，尽管根据特定残基或残基组或甚至整个CDR的预测或实验结果，它们可能会缩短或延长，这不显著影响抗原结合。本文使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的CDR，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。使用氨基酸序列鉴定预测的CDR是本领域中(诸如在Martin,A.C."Protein sequence and structure analysis of antibody variabledomains,"InAntibody Engineering,Vol.2.Kontermann R.,Dübel S.,eds.Springer-Verlag,Berlin,p.33–51(2010)中)公知的。还可以检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以通过其他常规方法(例如通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较确定序列高变区)来鉴定CDR的序列。编号的序列可以通过眼睛或者通过采用比对程序(诸如CLUSTAL程序套件之一)对齐，如Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22:4673-80中所述的。通常使用分子模型来正确描绘框架和CDR区，并且因此校正基于序列的分配。
在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或重链中的CDR/FR定义基于IMGT定义来确定(Lefranc et al.Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1):55-77；www.imgt.org)。
如本文所使用的术语“Fc”是指以单体形式或多聚体形式包含由抗体消化产生或通过其他方式产生的非抗原结合片段的序列的分子，并且可以包含铰链区。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选是人来源的，并且可以是任何免疫球蛋白。Fc分子由单体多肽组成，所述单体多肽可通过共价(即二硫键)和非共价结合而连接成二聚体或多聚体形式。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数量范围为1至4，取决于类别(例如，IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2和IgG4)。Fc的一个实例是由木瓜蛋白酶消化IgG产生的二硫键键合的二聚体。如本文所使用的术语“天然Fc”对于单体、二聚体和多聚体形式是通用的。
F(ab)片段通常包括一条轻链和一条重链的VH和CH1结构域，其中F(ab)片段的VH-CH1重链部分不能与另一条重链多肽形成二硫键。如本文所使用的，F(ab)片段还可包括一条轻链，其含有由氨基酸接头分离的两个可变结构域和一条含有由氨基酸接头分开的两个可变结构域和CH1结构域的重链。
F(ab')片段通常包括一条轻链和一条重链的一部分，其含有更多的恒定区(在CH1和CH2结构域之间)，从而可以在两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
如本文所使用的术语“结合蛋白”是指特异性结合至少一种靶抗原的非天然存在的(或重组或工程改造的)分子，例如，本公开的CD38多肽。
“重组”分子是通过重组方法制备、表达、产生或分离的分子。
本公开的一个实施方案提供了对1～3种靶抗原具有生物学和免疫学特异性的结合蛋白。本公开的另一个实施方案提供了包含编码形成这样的结合蛋白的多肽链的核苷酸序列的核酸分子。本公开的另一个实施方案提供了包含含有编码形成这样的结合蛋白的多肽链的核酸分子的表达载体。本公开的还一个实施方案提供了表达这样的结合蛋白的宿主细胞(即，包含编码形成这样的结合蛋白的多肽链的核酸分子或载体)。
如本文所使用的术语“可交换性”是指结合蛋白质形式内可变结构域的可互换性并且具有保留折叠和最终结合亲和力。“完全可交换性”是指交换式I的多肽链或式II的多肽链中的VH1和VH2结构域的顺序，并因此交换VL1和VL2结构域的顺序(即，颠倒顺序)同时保持如保留结合亲和力所证明的结合蛋白的完整功能的能力。此外，应该注意，名称VH和VL仅指最终形式中特定蛋白质链上的结构域位置。例如，VH1和VH2可以衍生自亲本抗体中的VL1和VL2结构域，并置于结合蛋白中的VH1和VH2位置。同样地，VL1和VL2可以衍生自亲本抗体中的VH1和VH2结构域，并置于结合蛋白中的VH1和VH2位置。因此，VH和VL名称是指当前位置而不是亲本抗体中的原始位置。因此，VH和VL结构域是“可交换的”。
如本文所使用的术语“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶标”是指能够被结合蛋白结合的分子或分子的一部分，并且另外能够用于动物产生能够结合该抗原表位的抗体。靶抗原可具有一个或多个表位。对于结合蛋白识别的每种靶抗原，结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。
“CD38”是分化簇38多肽，并且是在许多免疫细胞表面上发现的糖蛋白。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合一种或多种CD38多肽的胞外域。示例性CD38胞外域多肽序列包括但不限于人CD38的胞外域(例如，如SEQ ID NO:1所示的)和食蟹猴CD38的胞外域(例如，如SEQ ID NO:30所示的)。
术语“T细胞接合物”是指针对宿主免疫系统，更具体地是T细胞的细胞毒活性的结合蛋白以及针对肿瘤靶蛋白的结合蛋白。
术语“单特异性结合蛋白”是指特异性结合一种抗原靶标的结合蛋白。
术语“单价结合蛋白”是指具有一个抗原结合位点的结合蛋白。
术语“双特异性结合蛋白”是指特异性结合两个不同抗原靶标的结合蛋白。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白结合两种不同的抗原。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白结合相同抗原上的两个不同表位。
术语“二价结合蛋白”是指具有两个结合位点的结合蛋白。
术语“三特异性结合蛋白”是指特异性结合三个不同抗原靶标的结合蛋白。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白结合三种不同的抗原。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白结合相同抗原上的一个、两个或三个不同表位。
术语“三价结合蛋白”是指具有三个结合位点的结合蛋白。在特定实施方案中，三价结合蛋白可以结合一种抗原靶标。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以结合两个抗原靶标。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以结合三个抗原靶标。
“分离的”结合蛋白是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的蛋白。其天然环境的污染组分是会干扰结合蛋白的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，结合蛋白会被纯化：(1)通过Lowry方法测定至大于95重量％的抗体，并且最优选大于99重量％，(2)通过使用旋转杯测序仪至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或(3)使用考马斯蓝或优选银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE至均一性。分离的结合蛋白包括重组细胞内的原位结合蛋白，因为不存在结合蛋白的天然环境的至少一种组分。
如本文所使用的术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指存在的主要物质的化合物或物质(即，以摩尔计，它比组合物中的任何其他个体物质更丰富)。在一些实施方案中，基本上纯化的级分是组合物，其中所述物质包含至少约50％(基于摩尔)存在的所有大分子物质。在其他实施方案中，基本上纯的组合物会占组合物中存在的所有大分子物质的大于约80％、85％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，将物质纯化至基本均一(通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇，优选多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是抗原或结合蛋白结合的抗原区域。在某些实施方案中，当结合蛋白在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，称其特异性结合抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数≤10-8M时，更优选当平衡解离常数≤10-9M时，并且最优选当解离常数≤10-10M时，称结合蛋白特异性结合抗原。
结合蛋白的解离常数(KD)可以例如通过表面等离子体共振来确定。一般地，表面等离子体共振分析使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor；Piscataway，NJ)通过表面等离子体共振(SPR)测量配体(生物传感器基质上的靶抗原)和分析物(溶液中的结合蛋白)之间的实时结合相互作用。表面等离子体分析也可以通过固定分析物(结合蛋白质在生物传感器基质上)和呈递配体(靶抗原)来进行。如本文所使用的术语“KD”是指特定结合蛋白与靶抗原之间相互作用的解离常数。
提及结合蛋白时本文所用的术语“结合”是指结合蛋白或其抗原结合片段与含有表位的抗原结合的能力，其Kd至少约是1x 10-6M、1x 10-7M、1x10-8M、1x 10-9M、1x 10-10M、1x10-11M、1x 10-12M或更高，和/或以比其对非特异性抗原的亲和力大至少两倍的亲和力结合表位。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合两种或更多种抗原，例如人和食蟹猴CD38多肽。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合结构域和/或结合蛋白与人和食蟹猴CD38多肽(诸如CD38胞外域，诸如SEQ ID NO:1(人CD38同种型A)，SEQ ID NO:105(人CD38同种型E)和SEQ ID NO:30(食蟹猴CD38))“交叉反应”。当EC50在两种抗原的相似范围内时，与抗原1(Ag1)结合的结合蛋白与抗原2(Ag2)“交叉反应”。在本申请中，当Ag2的亲和力与Ag1的亲和力的比例等于或小于10(例如5、2、1或0.5)时，与Ag1结合的结合蛋白与Ag2交叉反应，亲和力用对于两种抗原相同的方法检测。
当两种抗原的亲和力非常不同时，与Ag1结合的结合蛋白与Ag2“不显著交叉反应”。如果结合反应太低，Ag2的亲和力可能无法测量。在本申请中，当在相同实验设定和相同的抗体浓度中结合蛋白与Ag2的结合反应小于相同结合蛋白与Ag1的结合反应的5％时，与Ag1结合的结合蛋白与Ag2不显著交叉反应。在实践中，使用的结合蛋白浓度可以是EC50或达到用Ag1获得的饱和平稳状态所需的浓度。
如本文所使用的术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域之间的一个或多个氨基酸残基，以为轻链和重链的结构域提供足够的迁移率以折叠成交叉双可变区免疫球蛋白。在序列水平，分别在可变域之间或在可变域和恒定域之间的转换处插入接头。可以鉴定结构域之间的转换，因为很好地理解了免疫球蛋白结构域的大致大小。结构域转变的精确位置可以通过定位不形成二级结构元件(诸如β-片层或α-螺旋)的肽段来确定，如实验数据所证明的，或者可以通过建模技术或二级结构预测来假设。本文描述的接头称为L1，其位于VL2的C末端和VL1结构域的N末端之间的轻链上；和L2，其位于VL1的C末端和CL结构域的N末端之间的轻链上。重链接头称为L3，其位于VH1的C末端和VH2结构域的N末端之间；和L4，其位于VH2的C末端和CH1结构域的N末端之间。
如本文所使用的术语“载体”是指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“载体”包括能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外的DNA区段的环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将额外的DNA区段插入病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本公开内容意图包括其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相等的功能。
如本文所使用的短语“重组宿主细胞”(或“宿主细胞”)是指其中已引入重组表达载体的细胞。重组宿主细胞或宿主细胞不仅意指特定的受试者细胞，还指这样的细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这样的后代实际上可能与亲本细胞不同，但是这样的细胞仍然包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。多种宿主细胞表达系统可用于表达结合蛋白，包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适的细菌表达载体的实例是pUC19。为了重组表达结合蛋白，用一种或多种携带编码结合蛋白多肽链的DNA片段的重组表达载体转化或转染宿主细胞，从而多肽链在宿主细胞中表达，并优选分泌到培养宿主细胞的培养基中，从中可以回收结合蛋白。
如本文所使用的术语“转化”是指细胞遗传特征的变化，并且当细胞被修饰为含有新DNA时已经转化。例如，细胞被转化，其中从其天然状态进行遗传修饰。转化后，转化DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为附加型元件瞬时维持而不被复制，或者可以作为质粒独立地复制。当DNA与细胞分裂复制时，认为细胞已被稳定转化。如本文所使用的术语“转染”是指细胞摄取外来或外源DNA，并且当外源DNA已被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。这样的技术可用于将一种或多种外源DNA分子引入合适的宿主细胞中。
如本文所用并且应用于物体的术语“天然存在的”是指物体可以在自然界中找到并且未被人操作的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从天然来源中分离并且未经人有意修饰的多核苷酸或多肽是天然存在的。类似地，如本文所使用的，“非天然存在的”是指在自然界中未发现或已经由人进行结构修饰或合成的物体。
如本文所使用的，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)；非天然氨基酸和类似物，诸如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸，和其它非常规氨基酸也可以是结合蛋白多肽链的合适组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。本文所使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
可以基于共同的侧链性质将天然存在的残基分成以下种类:
(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；
(2)极性亲水性：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；
(3)脂肪族：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；
(4)脂肪族疏水性：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；
(5)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(6)酸性：Asp、Glu；
(7)碱性：His、Lys、Arg；
(8)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(9)芳香族：His、Trp、Tyr、Phe；和
(10)芳香族疏水性：Phe、Trp、Tyr。
保守氨基酸取代可涉及将这些种类之一的成员与同一种类的另一成员交换。非保守替代可能涉及将这些种类中的一个的成员交换给另一个种类的成员。
本领域技术人员将能够使用公知的技术确定结合蛋白的多肽链的合适变体。例如，本领域技术人员可鉴定多肽链的合适区域，其可通过靶向不被认为对活性重要的区域而在不破坏活性的情况下改变。或者，本领域技术人员可以鉴定在相似多肽中保守的分子的残基和部分。另外，甚至可能对生物活性或结构重要的区域可以进行保守氨基酸取代而不破坏生物活性或不对多肽结构产生不利影响。
本文使用的术语“患者”包括人和动物受试者(例如哺乳动物，诸如狗、猪、马、猫、牛等)。
如本文所使用的术语“治疗”或“处理”是指治疗性治疗和预防性或预防措施。需要治疗的患者包括患有病症的患者以及易患病症的患者或要预防病症的患者。在具体的实施方案中，结合蛋白可用于治疗患有癌症的人，或易患癌症的人，或改善人受试者中的癌症。结合蛋白也可用于预防人类患者的癌症。在具体的实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、淋巴瘤、乳腺癌诸如Her2+乳腺癌、前列腺癌、生发中心B细胞淋巴瘤或B细胞急性淋巴母细胞白血病。
如本文所使用的术语“药物组合物”或“治疗组合物”是指当适当地施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。
如本文所使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指一种或多种适于实现或增强结合蛋白递送的制剂材料。
当用于指包含一种或多种结合蛋白的药物组合物时，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以产生期望的治疗结果的量或剂量。更具体地，治疗有效量是足以在一段时间内抑制与所治疗病况相关的一种或多种临床定义的病理过程的结合蛋白的量。有效量可以根据所使用的特异性结合蛋白而变化，并且还取决于与所治疗的患者相关的多种因素和病况以及病症的严重程度。例如，如果要在体内施用结合蛋白，则在临床前动物工作中获得的因素，诸如患者的年龄、体重和健康以及剂量反应曲线和毒性数据会是所考虑的因素之一。确定给定药物组合物的有效量或治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内。
本公开的一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和治疗有效量的结合蛋白。
II.抗CD38结合蛋白
本公开的某些方面涉及结合蛋白，其包含结合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)的抗原结合位点。在一些实施方案中，结合蛋白是单特异性的和/或单价的、双特异性的和/或二价的、三特异性的和/或三价的或多特异性的和/或多价的。
本文描述了示例性单特异性、双特异性或三特异性结合蛋白的多种特征。例如，在一些实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段与人CD38(例如，人CD38同种型A和/或同种型E多肽)和食蟹猴CD38交叉反应。在一些实施方案中，结合蛋白诱导CD38+细胞的凋亡。在一些实施方案中，结合蛋白将T细胞募集至CD38+细胞并任选地活化T细胞(例如，通过TCR刺激和/或共刺激)。
在一些实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合蛋白包含来自mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb2xCD28supxCD3midIgG4 FALA、mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A、mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA、mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA、mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A或mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA的抗体VH和/或VL结构域序列的1、2、3、4、5或6个CDR，如表G、H或I所示。
在一些实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在其他实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:87)或QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(SEQ IDNO:88)；其中FR2包含序列MHWVKEAPGQRLEWIGY(SEQ ID NO:90)或MHWVKEAPGQGLEWIGY(SEQID NO:91)；其中FR3包含序列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:93)或NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:94)；和其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:96)。在一些实施方案中，VL结构域从N末端到C末端包含序列FR1—CDR-L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3—FR4；其中FR1包含序列DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS(SEQ ID NO:97)；其中FR2包含序列MHWYQQKPGQPPRLLIY(SEQID NO:99)；其中FR3包含序列SRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:101)；其中FR4包含序列FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:103)。
在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或VL结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQID NO:17的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ IDNO:23的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或VL结构域包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和VL结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQID NO:17的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和VL结构域包含与SEQ IDNO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ IDNO:23的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和VL结构域包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和VL结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列；和VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的抗体轻链。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的抗体轻链。
在一些实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QGIRND(SEQ IDNO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH结构域从N末端到C末端包含序列，FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS(SEQ ID NO:89)；其中FR2包含序列MHWVRQAPGKGLEWVAV(SEQ ID NO:92)；其中FR3包含序列YYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:95)；并且其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQID NO:96)。在一些实施方案中，VL结构域从N末端到C末端包含序列，FR1—CDR-L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3—FR4；其中FR1包含序列AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS(SEQ ID NO:98)；其中FR2包含序列GWYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:100)；其中FR3包含序列SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC(SEQ ID NO:102)；并且其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQID NO:104)。
在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或VL结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；和VL结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQID NO:9的氨基酸序列；和VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗体重链或含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的抗体轻链。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含表G中所示的抗体序列的1、2、3、4、5或6个CDR序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含表H中所示的抗体序列的1、2、3、4、5或6个CDR序列，VH结构域序列，和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含表I中所示的抗体序列的1、2、3、4、5或6个CDR序列，VH结构域序列，和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含表I中所示的1、2、3或4个多肽序列。
表H.抗CD38(mAb1-7)和其他结合蛋白的可变结构域序列。
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注意：CDR序列在以上氨基酸序列中加粗和加下划线。
表I.结合蛋白的全长序列。
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表J.结合蛋白的全长多核苷酸序列。
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CD38多肽
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含结合人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域的抗原结合位点。用于确定抗原结合位点是否结合抗原的示例性测定在本文中描述并且是本领域已知的。在一些实施方案中，通过ELISA测定来确定结合，例如，如下文所述。在一些实施方案中，通过SPR测定确定结合，例如，如下文所述。在一些实施方案中，使用在其细胞表面上表达CD38多肽的细胞通过流式细胞术测定来确定结合，例如，如下文所述。参见，例如，实施例1、3和4。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合包含SEQ ID NO:1和/或30的氨基酸序列的纯化多肽或其片段(例如，通过ELISA或SPR测量的)。在一些实施方案中，当在细胞表面上表达时(例如，通过流式细胞术测量的)，本公开的结合蛋白结合多肽或包含SEQ ID NO:1和/或30的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合CD38同种型A多肽(例如，包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合CD38同种型E多肽(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列，并且不包含SEQ ID NO:1的完整氨基酸序列，由SEQ IDNO:105的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:105的氨基酸序列组成)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合CD38同种型A多肽(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)和CD38同种型E多肽(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列，并且不包含SEQ ID NO:1的完整氨基酸序列，由SEQ ID NO:105的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:105的氨基酸序列组成)。不希望受理论束缚的情况下，认为与CD38同种型E多肽结合可能是有利的，例如，将本公开的结合蛋白靶向表达CD38同种型E多肽的细胞。
人CD38同种型A胞外域多肽序列
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI(SEQ ID NO:1)
人CD38同种型E多肽序列
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRHFWECGSP(SEQ ID NO:105)
在一些实施方案中，人CD38多肽的胞外域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，食蟹猴CD38多肽的胞外域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
食蟹猴CD38多肽序列
RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI(SEQ ID NO:30)
结合CD38多肽的多特异性(例如，双特异性、三特异性或多特异性)结合蛋白
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是双特异性结合蛋白，其包含结合一种或多种CD38多肽的抗原结合位点和结合不同靶抗原的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是双特异性结合蛋白，其包含结合一种或多种CD38多肽的抗原结合位点和结合一种或多种CD38多肽的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是三特异性结合蛋白，其包含结合一种或多种CD38多肽的抗原结合位点、第二抗原结合位点和第三抗原结合位点。例如，在一些实施方案中，抗原结合位点之一结合一种或多种CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽的胞外域)，并且一个或两个抗原结合位点结合T细胞表面蛋白。在一些实施方案中，抗原结合位点之一结合一种或多种CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽的胞外域)，一个抗原结合位点结合人CD3多肽，和一个抗原结合位点结合人CD28多肽。人CD3和CD28多肽是本领域已知的。本文提供了结合人CD3和CD28多肽的示例性和非限制性抗体可变结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了包含三个抗原结合位点的结合蛋白，每个抗原结合位点结合一种或多种靶蛋白。在一些实施方案中，三个抗原结合位点中的至少一个结合人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域。在一些实施方案中，人CD38多肽包含SEQID NO:1的氨基酸序列，和/或食蟹猴CD38多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合蛋白包含结合人CD38多肽的胞外域和食蟹猴CD38多肽的胞外域的抗原结合位点和两个各自结合T细胞表面蛋白(例如，人CD28多肽和/或人CD3多肽)的抗原结合位点。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合一种或多种肿瘤靶蛋白(例如，一种或多种CD38多肽)和一种或多种T细胞靶蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白能够结合一种肿瘤靶蛋白(例如，一种或多种CD38多肽)和单个T细胞靶蛋白上的两种不同的表位。在一些实施方案中，结合蛋白能够结合一种肿瘤靶蛋白(例如，一种或多种CD38多肽)和两种不同的T细胞靶蛋白(例如CD28和CD3)。在一些实施方案中，结合蛋白能够结合一种T细胞靶蛋白和单个肿瘤靶蛋白(例如，一种或多种CD38多肽)上的两种不同表位。在一些实施方案中，结合蛋白能够结合一种T细胞靶蛋白和两种不同的肿瘤靶蛋白(例如，一种或多种CD38多肽和另一种肿瘤靶蛋白)。在一些实施方案中，结合蛋白的第一和第二多肽链形成靶向两种T细胞靶蛋白的两个抗原结合位点，并且结合蛋白的第三和第四多肽链形成结合一种或多种CD38多肽的抗原结合位点。在一些实施方案中，结合蛋白的第一和第二多肽链形成靶向两种肿瘤靶蛋白(例如，一种或多种CD38多肽和另一种肿瘤靶蛋白)的两个抗原结合位点，并且结合蛋白的第三和第四多肽链形成结合T细胞靶蛋白的抗原结合位点。在一些实施方案中，一种或多种T细胞靶蛋白是CD3和CD28中的一种或多种。
在一些实施方案中，结合蛋白特异性结合T细胞上的一种或多种CD38多肽和一种或多种靶蛋白，包括T细胞受体复合物。这些T细胞接合物结合蛋白能够将T细胞瞬时募集到靶细胞中，同时活化T细胞的溶细胞活性。T细胞上的靶蛋白的实例包括但不限于CD3和CD28等。上文提供了这样的抗原靶标或靶蛋白的其他实例。在一些实施方案中，可以通过将两种或更多种单特异性抗体(亲本抗体)的抗原结合结构域组合成一种抗体来产生三特异性结合蛋白。
双特异性结合蛋白形式
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是双特异性和/或二价结合蛋白，其包含四条多肽链，其形成结合一种或多种(例如，两种)不同抗原靶标或靶蛋白的四个抗原结合位点(例如，具有在国际公开号WO2012/135345中描述的结构)。在一些实施方案中，结合蛋白是二价和/或双特异性的。在一些实施方案中，结合蛋白是四价和/或四特异性的。在一些实施方案中，结合蛋白是四价和/或双特异性的。在一些实施方案中，至少一个抗原结合位点结合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽的胞外域)。
在一些实施方案中，结合蛋白包含两条多肽链，其具有由下式表示的结构：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
和两条多肽链具有下式表示的结构：
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
Fc包含免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定区；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
并且其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合CD38多肽的抗原结合结构域，并且VH2和VL2形成结合另一抗原靶标的抗原结合结构域。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合CD38多肽的抗原结合结构域，并且VH1和VL1形成结合另一抗原靶标的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，结合蛋白包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中第一多肽链包含
VL1-L1-VL2-L2-CL-Fc
和第二多肽链包含
VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
Fc包含免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定区；和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合CD38多肽的抗原结合结构域，并且VH2和VL2形成结合另一抗原靶标的抗原结合结构域。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合CD38多肽的抗原结合结构域，并且VH1和VL1形成结合另一抗原靶标的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，结合蛋白包含形成两个抗原结合位点的三条多肽链，其中第一多肽链包含
VL1-L1-VL2-L2-CL
第二多肽链包含
VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc
第三多肽链包含抗体Fc区
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
Fc包含免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定区；和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合CD38多肽的抗原结合结构域，并且VH2和VL2形成结合另一抗原靶标的抗原结合结构域。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合CD38多肽的抗原结合结构域，并且VH1和VL1形成结合另一抗原靶标的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，结合蛋白包含第一多肽链，其包含由下式表示的结构：
VL1-L1-VL2-L2-CL[I]
和包含由下式表示的结构的第二多肽链:
VH2-L3-VH1-L4-CH1[II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合CD38多肽的抗原结合结构域，并且VH2和VL2形成结合另一抗原靶标的抗原结合结构域。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合CD38多肽的抗原结合结构域，并且VH1和VL1形成结合另一抗原靶标的抗原结合结构域。
在上述任何双特异性结合蛋白中，除CD38之外的靶抗原可以是以下任何示例性抗原靶标：A2AR、APRIL、ATP二磷酸水解酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，一种IgE受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(还称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDL1)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为E-钙粘蛋白)、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也称为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、NKG2D、NTP二磷酸水解酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也称为IL33受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也称为IL7Ra的共同受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)。在一些实施方案中，一种或多种上述抗原靶标是人抗原靶标。
在上文描述的任何双特异性结合蛋白中，可以使用本文描述的任何接头或接头组合。例如，在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4中的至少一个的长度独立地是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4的长度各自独立地是至少1个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地是0个氨基酸的长度或包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:57)，L3包含序列S，L4包含序列RT。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L3的长度是0个氨基酸，L4的长度是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L3的长度是0个氨基酸，L4的长度是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，L2的长度是0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，L4的长度是0个氨基酸。
与CD38多肽结合的三特异性结合蛋白
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含四条多肽链，其形成结合一种或多种(例如，三种)不同抗原靶标或靶蛋白的三个抗原结合位点。在一些实施方案中，至少一个抗原结合位点结合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽的胞外域)。在一些实施方案中，第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区，和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含四条多肽链，其形成结合一种或多种(例如，三种)不同抗原靶标或靶蛋白的三个抗原结合位点。在一些实施方案中，至少一个抗原结合位点结合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽的胞外域)。在一些实施方案中，第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
和其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，第二和第三多肽链进一步包含与CH1连接的Fc区，Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域。
在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链具有交叉取向，其形成两个不同的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合对并形成第一抗原结合位点。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合对并形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第一抗原结合位点结合CD3多肽(例如，人CD3)，第二抗原结合位点结合CD28多肽(例如，人CD28)。在一些实施方案中，第二抗原结合位点结合CD3多肽(例如，人CD3)，并且第一抗原结合位点结合CD28多肽(例如，人CD28)。在一些实施方案中，第三多肽和第四多肽形成第三抗原结合位点。在一些实施方案中，VH3和VL3形成结合对并形成第三抗原结合位点。在一些实施方案中，第三抗原结合位点结合CD38多肽(例如，人和任选的食蟹猴CD38)。具有考虑用于本文的交叉取向的示例性结合蛋白质形式也在美国专利申请号15/487,243和国际申请号PCT/US2017/027488中描述。
在本文所述的任何双特异性、三特异性或多特异性结合蛋白的一些实施方案中，抗原结合位点结合CD38多肽(例如，人和任选的食蟹猴CD38)。在一些实施方案中，本文所述的任何双特异性、三特异性或多特异性结合蛋白的其他(例如，不结合CD38)抗原结合位点结合CD28或CD3。在一些实施方案中，VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA (SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH1结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL1结构域的包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL2结构域的包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL3结构域的包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH1结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL1结构域的包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL2结构域的包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL3结构域的包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH1结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL1结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL2结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ IDNO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ IDNO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL3结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ IDNO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH1结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL1结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH1结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL1结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL2结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL2结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和VL3结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL3结构域包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL3结构域包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或VL3结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQID NO:21的氨基酸序列，或VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，或VL3结构域包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和/或VL3结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQID NO:21的氨基酸序列，和VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和VL3结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和VL3结构域包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH3结构域包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列，和/或VL3结构域包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH3结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和/或VL3结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在本公开的任何三特异性结合蛋白的一些实施方案中，一个抗原结合结构域结合CD3多肽(例如，人CD3)，和一个抗原结合结构域结合CD28多肽(例如，人CD28)。在一些实施方案中，VH1结构域包含来自SEQ ID NO:49或51的三个CDR，如表H中所示，并且VL1结构域包含来自SEQ ID NO:50或52的三个CDR，如表H中所示。在一些实施方案中，VH2结构域包含来自SEQ ID NO:49或51的三个CDR，如表H中所示，并且VL2结构域包含来自SEQ ID NO:50或52的三个CDR，如表H中所示。在一些实施方案中，VH1结构域包含来自SEQ ID NO:53或84的三个CDR，如表H中所示，并且VL1结构域包含来自SEQ ID NO:54或85的三个CDR，如表H中所示。在一些实施方案中，VH2结构域包含来自SEQ ID NO:53或84的三个CDR，如表H中所示，并且VL2结构域包含来自SEQ ID NO:54或85的三个CDR，如表H中所示。
在一些实施方案中，VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，VL2结构域包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列，VH1结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和VL1结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH1结构域包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列，VL1结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，VH2结构域包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列，和VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，VL2结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，VH1结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和VL1结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，VH3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和VL3结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，VH3结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和VL3结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，和第四多肽链包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ IDNO:64的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，和第四多肽链包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，和第四多肽链包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，和第四多肽链包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，和第四多肽链包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ IDNO:71的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，和第四多肽链包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。
在某些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，第三多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，和第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，第三多肽链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，和第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，第三多肽链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，和第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，第二多肽链包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，第三多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，和第四条多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，第三多肽链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，和第四条多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，第三多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，和第四条多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
在上文描述的任何三特异性结合蛋白中，除CD38之外的靶抗原可以是以下任何示例性抗原靶标：A2AR、APRIL、ATP二磷酸水解酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，一种IgE受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(还称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDL1)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为E-钙粘蛋白)、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也称为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、NKG2D、NTP二磷酸水解酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也称为IL33受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也称为IL7Ra的共同受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)。在一些实施方案中，一种或多种上述抗原靶标是人抗原靶标。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
可以使用获得或衍生自任何人或非人抗体(包括例如，人、鼠或人源化抗体)的结构域或序列来制备本公开的结合蛋白。
接头
在一些实施方案中，接头L1、L2、L3和L4的范围是无氨基酸(长度＝0)至约100个氨基酸长，或小于100、50、40、30、20或15个氨基酸或更少。接头也可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸长。一种结合蛋白中的L1、L2、L3和L4可以全部具有相同的氨基酸序列，或者可以全部具有不同的氨基酸序列。
合适的接头的实例包括单个甘氨酸(Gly)残基；二甘氨酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有四个甘氨酸残基的肽；具有五个甘氨酸残基的肽；具有六个甘氨酸残基的肽；具有七个甘氨酸残基的肽；和具有八个甘氨酸残基的肽。可以使用氨基酸残基的其他组合，诸如肽GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、肽GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、肽TKGPS(SEQID NO:57)、肽GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和肽GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。上面列出的实施例不意图以任何方式限制本公开的范围，并且显示包含选自下组的随机选择的氨基酸的接头适用于结合蛋白：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸。关于接头序列的其他描述，参见例如，WO2012135345和国际申请号PCT/US2017/027488。
接头中氨基酸残基的同一性和序列可以根据在接头中实现所需的二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸最适合具有最大灵活性的接头。如果需要更刚性和延伸的接头，甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的某些组合是有用的。根据期望的性质，任何氨基酸残基可以被认为是与其他氨基酸残基组合的接头以构建所需更大的肽接头。
在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4中的至少一个的长度独立地是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4的长度各自独立地是至少1个氨基酸。在一些实施例中，L1的长度是L3的长度的至少两倍。在一些实施方案中，L2的长度是L4的长度的至少两倍。在一些实施例中，L1的长度是L3的长度的至少两倍，并且L2的长度是L4的长度的至少两倍。在一些实施方案中，L1的长度是3至12个氨基酸残基，L2的长度是3至14个氨基酸残基，L3的长度是1至8个氨基酸残基，L4的长度是1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度是5至10个氨基酸残基，L2的长度是5至8个氨基酸残基，L3的长度是1至5个氨基酸残基，L4的长度是1至2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度是7个氨基酸残基，L2的长度是5个氨基酸残基，L3的长度是1个氨基酸残基，L4的长度是2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度是10个氨基酸残基，L2的长度是10个氨基酸残基，L3的长度是0个氨基酸残基，L4的长度是0个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自具有0至15个氨基酸的独立选择的长度(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)，其中至少两个接头具有1至15个氨基酸(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)的长度。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自的长度是0个氨基酸。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含衍生自抗体可变结构域和抗体恒定结构域之间的连接处的天然存在的序列的序列(例如，如WO2012/135345中所述的)。例如，在一些实施方案中，接头包含在内源性VH和CH1结构域之间或在内源性VL和CL结构域(例如，κ或λ)之间的转换处发现的序列。在一些实施方案中，接头包含在内源性人VH和CH1结构域之间或在内源性人VL和CL结构域(例如，人κ或λ)之间的转换处发现的序列。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地是0个氨基酸的长度或包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。
在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:58)，L2包含序列TKGPS(SEQID NO:57)，L3包含序列S，和L4包含序列RT。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQID NO:55)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L3的长度是0个氨基酸，和L4的长度是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L3的长度是0个氨基酸，和L4的长度是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，L2的长度是0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，和L4的长度是0个氨基酸。
Fc区和恒定结构域
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含全长抗体重链或含有Fc区的多肽链。在一些实施方案中，Fc区是人Fc区，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在一些实施方案中，Fc区包括抗体铰链、CH1、CH2、CH3和任选的CH4结构域。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区包括下文描述的一种或多种突变。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包括一种或两种Fc变体。如本文所使用的术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰但仍包含补救受体(salvage receptor)FcRn(新生儿Fc受体)的结合位点的分子或序列。示例性Fc变体及其与补救受体的相互作用是本领域已知的。因此，术语“Fc变体”可包含人源化的非人天然Fc的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被除去的区域，因为它们提供了本发明的抗体样结合蛋白不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包含缺少一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列，或其中一个或多个Fc位点或残基被修饰，影响或参与：(1)二硫键形成，(2)与选定的宿主细胞不相容，(3)在选定的宿主细胞中表达时的N-末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)与除了补救受体之外的Fc受体的结合，或(7)抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中，Fc区包含一种或多种减少或消除Fc区的Fc受体结合和/或效应子功能的突变(例如，Fc受体介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC))。
在一些实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG1的234、235和/或329位的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是L234A、L235A和/或P329A。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG1的298、299和/或300位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S298N、T299A和/或Y300S。
在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其包含一个或多个减少或消除FcγI和/或FcγII结合的突变。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其包含一个或多个减少或消除FcγI和/或FcγII结合但不影响FcRn结合的突变。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG4的228和/或409位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S228P和/或R409K。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG4的234和/或235位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是F234A和/或L235A。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG4的228、234、235和/或409位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S228P、F234A、L235A和/或R409K。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG4的228、233-236和/或409位的取代处的包含氨基酸突变。在一些实施方案中，氨基酸突变是S228P；E233P、F234V、L235A和在236处的缺失；和/或R409K。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个突变以例如通过调节对纯化试剂的亲和力改善纯化。例如，众所周知，如果异二聚体形式的两个Fc区之一含有减少或消除与蛋白A结合的突变，则异二聚体结合蛋白可以从其同型二聚体形式中选择性地纯化，因为与任一种同型二聚体形式相比，异二聚体形式会具有基于蛋白A的纯化的中间亲和力，并且可以例如通过使用不同的pH从蛋白A中选择性洗脱(参见例如，Smith,E.J.et al.(2015)Sci.Rep.5:17943)。在一些实施方案中，突变包含根据EU Index，在对应于人IgG1或IgG4的435和436位的位置处的取代，其中氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，其进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，并且第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区；并且其中仅第一和第二Fc区中的一个在根据EU Index的对应于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含杵臼突变和一个或多个突变以改善纯化。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。
为了提高一些结合蛋白(例如，双特异性或三特异性结合蛋白)的产量，可以通过“杵臼”技术改变CH3结构域，该技术在例如国际公开号WO 96/027011、Ridgway et al.,1996,Protein Eng.9:617-21和Merchant et al.,1998,Nat.Biotechnol.16:677-81几个实例中详细描述。具体地，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。两个CH3结构域(两个重链)中的每一个可以是“杵”，而另一个是“臼”。二硫桥的引入进一步稳定了异二聚体(Merchant et al.,1998；Atwell et al.,1997,J.Mol.Biol.270:26-35)并提高了产率。在特定的实施方案中，杵位于具有单个可变结构域的第二对多肽上。在其他实施方案中，杵位于具有交叉取向的第一对多肽上。在其他实施方案中，CH3结构域不包括臼中的杵。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，三特异性结合蛋白)包含第二多肽链上的“杵”突变和第三多肽链上的“臼”突变。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含第三多肽链上的“杵”突变和第二多肽链上的“臼”突变。在一些实施方案中，“杵”突变包含根据EU Index，在对应于人IgG1或IgG4的354和/或366位的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S354C、T366W、T366Y、S354C和T366W，或S354C和T366Y。在一些实施方案中，“杵”突变包含根据EU Index，在对应于人IgG1或IgG4的354和366位的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，“臼”突变包含根据EUIndex，在对应于人IgG1或IgG4的407位和任选地349、366和/或368位的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y407V或Y407T，和任选的Y349C、T366S和/或L368A。在一些实施方案中，“臼”突变包含根据EU Index，在对应于人IgG1或IgG4的349、366、368和407位的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于的人IgG1或IgG4的366位和任选354位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是T366W或T366Y，和任选的S354C；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的407位和任选地349、366和/或368位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是Y407V或Y407T，和任选的Y349C、T366S和/或L368A。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的407位和任选349、366和/或368位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是Y407V或Y407T，和任选的Y349C、T366S和/或L368A；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的366位和任选的354位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是T366W或T366Y，和任选的S354C。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的366位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是T366W；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的366、368和/或407位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是T366S、L368A和/或Y407V。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的366、368和/或407位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是T366S、L368A和/或Y407V；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的366位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是T366W。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S354C和T366W；其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的349、366、368和407位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的349、366、368和407位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，其中第一Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG4的228、354、366和409位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P、S354C、T366W和R409K；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，其中第二Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG4的228、349、366、368、407和409位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，其中第一Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG4的228、349、366、368、407和409位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，其中第二Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG4的228、354、366和409位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P、S354C、T366W和R409K。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，其中第一Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG4的234、235、354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是F234A、L235A、S354C和T366W；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，其中第二Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG4的234、235、349、366、368和407位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，其中第一Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG4的234、235、349、366、368和407位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A和Y407V；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，其中第二Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG4的234、235、354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是F234A、L235A、S354C和T366W。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，其中第一Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG4的228、234、235、354、366和409位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P、F234A、L235A、S354C、T366W和R409K；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，其中第二Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第二Fc区在对应于人IgG4的228、234、235、349、366、368、407和409位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，其中第一Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第一Fc区在对应于人IgG4的228、234、235、349、366、368、407和409位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K；和其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，其中第二Fc区是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的人IgG4 Fc区，其中根据EU Index，第二Fc区，在对应于人IgG4的228、234、235、354、366和409位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P、F234A、L235A、S354C、T366W和R409K。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个突变以改善血清半衰期(参见例如，Hinton,P.R.et al.(2006)J.Immunol.176(1):346-56)。在一些实施方案中，根据EU Index，突变在对应于人IgG1或IgG4的428和434位的位置处包含取代，其中氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，其进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中根据EU Index，第一和/或第二Fc区在对应于人IgG1的428和434位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含杵和臼突变和一个或多个突变以改善血清半衰期。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个突变以改善例如IgG4的铰链区和/或二聚体界面的稳定性(参见例如，Spiess,C.et al.(2013)J.Biol.Chem.288:26583-26593)。在一些实施方案中，根据EU Index，突变在对应于人IgG4的228和409位的位置处的包含取代，其中氨基酸取代是S228P和R409K。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，其进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，和第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中第一和第二Fc区是人IgG4 Fc区；和其中根据EU Index，第一和第二Fc区在的对应于人IgG4的228和409位的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S228P和R409K。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含杵和臼突变和一个或多个突变以改善稳定性。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个突变以例如通过调节对纯化试剂的亲和力来改善纯化。例如，已知，如果异二聚体形式的两个Fc区之一含有减少或消除与蛋白A结合的突变，则异二聚体结合蛋白可以从其同型二聚体形式中选择性地纯化，因为与任一同型二聚体形式相比，异二聚体形式会具有基于蛋白A的纯化的中间亲和力，并且可以例如通过使用不同的pH从蛋白A中选择性洗脱(参见例如，Smith,E.J.et al.(2015)Sci.Rep.5:17943)。在一些实施方案中，根据EU Index，突变在对应于人IgG1或IgG4的435和436位的位置处包含取代，其中氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，其进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，和第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；并且其中根据EU Index，仅第一和第二Fc区中的一个在对应于人IgG1或IgG4的435和436位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含杵和臼突变和一个或多个突变以改善纯化。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个突变以改善血清半衰期(参见例如，Hinton,P.R.et al.(2006)J.Immunol.176(1):346-56)。在一些实施方案中，根据EU Index，突变在对应于人IgG1或IgG4的428和434位的位置处包含取代，其中氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，其进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，和第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中根据EU Index，第一和/或第二Fc区在对应于人IgG1的428和434位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含杵和臼突变和一个或多个突变以改善血清半衰期。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG4Fc区。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一种或多种突变以降低效应子功能，例如Fc受体介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中第一和第二Fc区是人IgG1 Fc区；并且其中根据EUIndex，第一和第二Fc区在对应于人IgG1的234和235位的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是L234A和L235A。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的Fc区是人IgG1 Fc区，并且其中根据EU Index，Fc区在对应于人IgG1的234和235位的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸酸取代是L234A和L235A。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中第一和第二Fc区是人IgG1 Fc区；并且其中根据EU Index，第一和第二Fc区在对应于人IgG1的234、235和329位的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的Fc区是人IgG1 Fc区，并且其中根据EU Index，Fc区在对应于人IgG1的234、235和329位的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的Fc区是人IgG4 Fc区，并且根据EU Index，Fc区在对应于人IgG4的234和235位的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是F234A和L235A。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，其进一步包含与CH1连接的第一Fc区，第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，和第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区，第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和其中根据EU Index，第一和第二Fc区在对应于人IgG4的234和235位的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是F234A和L235A。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含杵和臼突变和一种或多种突变以降低效应子功能。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。对于329位Fc突变的进一步描述，参见，例如，Shields,R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604和WO1999051642。
在一些实施方案中，上文描述的突变类型可以以任何顺序或组合进行组合。例如，本公开的结合蛋白可包含两个或更多个“杵”和“臼”突变，一个或多个突变以改善血清半衰期，一个或多个突变以改善IgG4稳定性，一个或多个突变以改善纯化，和/或一个或多个突变以减少上文所述的效应子功能。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含抗体片段，包括但不限于抗体F(ab)、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv或scFv片段。
测定
本公开内容提供了结合人和/或食蟹猴CD38多肽，诱导T细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)增殖，和/或诱导CD38+细胞凋亡的抗原结合蛋白。本文提供了用于测量这些参数和鉴定这样的结合蛋白的示例性测定法。例如，在一些实施方案中，通过SPR(例如，如下所述的)测量结合蛋白或其抗原结合片段与纯化的CD38多肽之间的结合亲和力，以及通过流式细胞术(例如，如下所述的)测量结合蛋白或其抗原结合片段与在细胞表面上表达的CD38多肽之间的结合亲和力。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白的抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD38多肽，其平衡解离常数(KD)是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、1nM或更小或0.8nM或更小，如通过使用在其细胞表面上表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD38多肽的细胞的流式细胞术测定所测量的，例如，如下文所述的。在一些实施方案中，抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽，其平衡解离常数(KD)是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、1nM或更小或0.75nM或更小，如通过使用在其细胞表面上表达包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽的细胞的流式细胞术测定所测量的，例如，如下文所述的。在一些实施方案中，抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD38多肽，其平衡解离常数(KD)是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、1nM或更小或0.83nM或更小，如通过使用包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD38多肽的SPR测定所测量的，例如，如下文所述的。在一些实施方案中，抗原结合位点结合包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽，其平衡解离常数(KD)是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、3.5nM或更小、1.5nM或更小或1nM或更小，如通过使用包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的食蟹猴CD38多肽的SPR测定所测量的，例如，如下文所述的。如本文所证明的，在一些实施方案中，本公开的结合蛋白可具有本文所述的一种或多种示例性结合特性。在一些实施方案中，KD在4℃或25℃测量。
在一些实施方案中，本公开的单特异性结合蛋白具有一个或多个以下特征：结合人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)作为纯化蛋白，如通过SPR或ELISA测定的；结合人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)作为纯化蛋白，其KD是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1.5nM或更小，如通过SPR或ELISA测定的；结合细胞表面上表达的人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；结合细胞表面上表达的人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)，其表观KD是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，如通过流式细胞术测定的；结合食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，如通过SPR或ELISA测定的；结合食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)作为纯化蛋白质，其KD是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，如通过SPR或ELISA测定的；结合在细胞表面上表达的食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；结合在细胞表面上表达的食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)，其表观KD是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，如通过流式细胞术测定的；结合人同种型E CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列)作为纯化蛋白，如通过SPR或ELISA测定；结合在细胞表面上表达的人同种型E CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；在其细胞表面诱导表达CD38的细胞的凋亡或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)；和与没有一个或多个突变的相同结合蛋白相比，具有一个或多个突变(例如，在Fc区中)导致与FcγRI和/或FcγRII的结合降低。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合在细胞表面上表达的CD38多肽(例如，人或食蟹猴)，其EC50是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，如通过流式细胞术测定的。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合CD38多肽(例如，人或食蟹猴)作为纯化蛋白质，其EC50是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，如通过ELISA测定的。在一些实施方案中，KD在4℃或25℃测量。
在一些实施方案中，本公开的三特异性结合蛋白具有一个或多个以下特征：诱导T细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)增殖；诱导Bcl-xL的T细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)表达；诱导CD38+细胞的凋亡(例如，如通过膜联蛋白V染色和/或碘化丙啶摄取测量的)；结合在细胞表面上表达的CD38和在T细胞表面上表达的一种或多种T细胞靶抗原；结合在细胞表面上表达的CD38、在T细胞表面上表达的CD28和在T细胞表面上表达的CD3；刺激T细胞受体的活化(例如，如通过CD69表达测量的)；诱导T细胞受体信号传导的共刺激(例如，如通过CD28介导的)；与没有一个或多个突变的相同结合蛋白相比，具有一个或多个突变(例如，在Fc区中)导致PBMC对细胞因子释放(例如，IFN-γ、IL-2和/或TNF-α)的诱导减少；在CD38+靶细胞存在下，通过PBMC诱导细胞因子释放(例如，IFN-γ和/或IL-6)(例如，如通过免疫测定测量的)；结合人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)作为纯化蛋白，如通过SPR或ELISA测定的；结合人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)作为纯化蛋白，其KD是1.5nM或更小，如通过SPR或ELISA测定的；结合细胞表面上表达的人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；结合在细胞表面上表达的人CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)，其表观KD是12nM或更小，如通过流式细胞术测定的；结合食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)作为纯化蛋白，如通过SPR或ELISA测定的；结合食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)作为纯化蛋白，其KD是3.5nM或更小，如通过SPR或ELISA测定的；结合在细胞表面上表达的食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；结合在细胞表面上表达的食蟹猴CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列)，其表观KD是7.5nM或更低，如通过流式细胞术测定的；结合人同种型E CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列)作为纯化蛋白，如通过SPR或ELISA测定的；结合在细胞表面上表达的人同种型E CD38多肽的胞外域(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列)，如通过流式细胞术测定的；诱导在其细胞表面上表达CD38的细胞的凋亡或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)；与没有一个或多个突变的相同结合蛋白相比，具有一个或多个突变(例如，在Fc区中)导致与FcγRI和/或FcγRII的结合降低。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合在细胞表面上表达的CD38多肽(例如，人或食蟹猴)，EC50是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，如通过流式细胞术测定的。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合CD38多肽(例如，人或食蟹猴)作为纯化蛋白，其EC50是20nM或更小、15nM或更小、12nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、2nM或更小、或1nM或更小，如通过ELISA测定的。
核酸
使用标准重组DNA方法构建编码形成结合蛋白的多肽的多核苷酸，将这些多核苷酸并入重组表达载体中，并将这样的载体导入宿主细胞中。参见例如，Sambrook et al.,2001,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,3rd ed.)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书进行，如本领域通常实现的，或如本文所述。除非提供具体的定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学和药物和药物化学结合使用的命名法和实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。类似地，常规技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送和患者治疗。
本公开的其他方面涉及分离的核酸分子，其包含编码本文所述的任何结合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60-83至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％的序列。至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同和/或表J中所示的序列。
本公开的某些方面涉及多核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸是载体(例如，表达载体)。所述试剂盒，尤其可用于产生本文所述的一种或多种结合蛋白，例如本公开的三特异性结合蛋白。在一些实施方案中，试剂盒包含在表J中所示的(例如，mAb2xCD28supxCD3mid IgG4FALA、mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A、mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA、mAb6xCD28supxCD3mid IgG4FALA、mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A或mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA的)一个、两个、三个或四个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸试剂盒包含：包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:72的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:74的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸试剂盒包含：包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:76的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:77的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸试剂盒包含：包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:78的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:79的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸试剂盒包含：包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:72的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:80的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸试剂盒包含：包含SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:76的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:82的序列的第三多核苷酸，和SEQID NO:81的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸试剂盒包含：包含SEQ IDNO:73的序列的第一多核苷酸，包含SEQ ID NO:78的序列的第二多核苷酸，包含SEQ ID NO:83的序列的第三多核苷酸，和包含SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸。
在一些实施方案中，分离的核酸与异源启动子可操作地连接以指导结合蛋白编码核酸序列的转录。启动子可以指指导核酸转录的核酸控制序列。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与结合蛋白的编码序列可操作地连接。启动子的实例可包括但不限于从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒，乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等)的基因组获得的启动子，来自异源真核启动子(诸如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、来自热休克启动子等)、CAG启动子(Niwa et al.,Gene 108(2):193-9,1991)、磷酸甘油酸激酶(PGK)-启动子、四环素诱导型启动子(Masui et al.,Nucleic Acids Res.33:e43,2005)、lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子，和酵母α-交配因子的启动子。编码本公开的结合蛋白的多核苷酸可以在组成型启动子、诱导型启动子或本文所述的任何其他合适的启动子或本领域技术人员容易识别的其他合适的启动子的控制下。
在一些实施方案中，将分离的核酸并入载体中。在一些实施方案中，载体是表达载体。表达载体可包括与待表达的多核苷酸可操作地连接的一种或多种调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。合适的增强子的实例可包括但不限于，来自哺乳动物基因的增强子序列(诸如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、胰岛素等)，以及来自真核细胞病毒的增强子序列(诸如在复制起点的后侧(bp100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子、腺病毒增强子等)。合适载体的实例可包括，例如，质粒、粘粒、附加体、转座子和病毒载体(例如，腺病毒、痘苗病毒、辛德比斯病毒(Sindbis-viral)、麻疹、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒载体等)。表达载体可用于转染宿主细胞，诸如，例如，细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。能够在宿主中表达和复制的生物学功能性病毒和质粒DNA载体是本领域已知的，并且可用于转染任何感兴趣的细胞。
本公开的其他方面涉及载体系统，其包含编码本文所述任何结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的一种或多种载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一多肽链的第一载体，编码结合蛋白的第二多肽链的第二载体，编码结合蛋白的第三多肽链的第三载体，和编码结合蛋白的第四多肽链的第四载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一和第二多肽链的第一载体，和编码结合蛋白的第三和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一和第三多肽链的第一载体，和编码结合蛋白的第二和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一和第四多肽链的第一载体，和编码结合蛋白的第二和第三多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的第一载体。载体系统的一个或多个载体可以是本文所述的任何载体。在一些实施方案中，一种或多种载体是表达载体。
分离的宿主细胞
本公开的其他方面涉及分离的宿主细胞，其包含一种或多种本文所述的分离的多核苷酸、多核苷酸试剂盒、载体和/或载体系统。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。昆虫宿主细胞的实例可包括，例如，果蝇(Dropophila)细胞(例如，S2细胞)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(例如，High FiveTM细胞)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如，Sf21或Sf9细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的实例可包括，例如，人胚胎肾细胞(例如，亚克隆用于悬浮培养中生长的293或293细胞)、Expi293TM细胞、CHO细胞、幼仓鼠肾细胞(例如BHK，ATCC CCL 10)，小鼠支持细胞(例如，TM4细胞)、猴肾细胞(例如，CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如，VERO-76、ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(例如，HELA、ATCC CCL 2)、犬肾细胞(例如，MDCK、ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝细胞(例如，BRL 3A、ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如，W138、ATCC CCL 75)、人肝细胞(例如，Hep G2、HB8065)、小鼠乳腺肿瘤细胞(例如，MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞、人肝细胞瘤系(例如，Hep G2)和骨髓瘤细胞(例如，NS0和Sp2/0细胞)。
本公开的其他方面涉及产生本文所述的任何结合蛋白的方法。在一些实施方案中，该方法包括a)在宿主细胞表达结合蛋白的条件下，培养包含分离的核酸、载体和/或载体系统(例如，本文所述的任何分离的核酸、载体和/或载体系统)的宿主细胞(例如，本文所述的任何宿主细胞)；b)从宿主细胞中分离结合蛋白。在表达蛋白质的条件下培养宿主细胞的方法是本领域普通技术人员公知的。从培养的宿主细胞中分离蛋白质的方法是本领域普通技术人员公知的，包括例如亲和层析(例如，包括蛋白A亲和层析然后进行尺寸排阻层析的两步亲和层析)。
在一些实施方案中，通过蛋白A亲和层析、κ轻链亲和层析(例如，根据制造商的说明书使用KappaSelect树脂；GE Healthcare)和任选的λ轻链亲和层析(例如，根据制造商的说明使用LambdaFabSelect树脂；GE Healthcare)纯化本公开的结合蛋白。在一些实施方案中，通过蛋白A亲和层析、λ轻链亲和层析(例如，根据制造商的说明书使用LambdaFabSelect树脂；GE Healthcare)和任选的κ轻链亲和层析(例如，根据制造商的说明使用KappaSelect树脂；GE Healthcare)纯化本公开的结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白包含两个Fc区，每个包含CH3结构域，并且根据EU Index，仅一个CH3结构域在对应于人IgG1或IgG4的435和436位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，依序通过蛋白A亲和层析，然后κ轻链亲和层析(例如，根据制造商的说明书使用KappaSelect树脂；GE Healthcare)，然后任选地λ轻链亲和层析(例如，根据制造商的说明使用LambdaFabSelect树脂；GE Healthcare)纯化本公开的结合蛋白。在一些实施方案中，依序通过蛋白A亲和层析，然后λ轻链亲和层析(例如，根据制造商的说明书使用LambdaFabSelect树脂；GE Healthcare)，然后任选地κ轻链亲和层析(例如，根据制造商的说明使用KappaSelect树脂；GE Healthcare)纯化本公开的结合蛋白。例如，在一些实施方案中，使结合蛋白与蛋白A接触，在适于将结合蛋白从包含0或2个含有氨基酸取代为H435R和Y436F的CH3结构域的结合蛋白分离的条件下从蛋白A洗脱，与κ轻链亲和介质接触(例如，如在KappaSelect中所用的树脂；GE Healthcare)，并在适于将结合蛋白从仅包含λCL结构域的结合蛋白分离的条件下从κ轻链亲和介质洗脱(例如，根据制造商的说明)。适用于蛋白A洗脱的条件是本领域已知的，包括但不限于pH4.5-2.8的分步洗脱梯度。在一些实施方案中，使用可用于蛋白质纯化蛋白质A或蛋白质A变体。在一些实施方案中，蛋白质A附接于基底或树脂，例如作为层析介质的一部分。在一些实施方案中，在从κ轻链亲和介质洗脱后，使结合蛋白与λ轻链亲和介质(例如，如在LambdaFabSelect树脂中所用的；GE Healthcare)接触，并在适合于将结合蛋白从仅包含κCL结构域的结合蛋白分离的条件下从λ轻链亲和介质中洗脱(例如，根据制造商的说明书)。在一些实施方案中，使用HIC色谱法检测本公开的结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白包含：第一多肽链，其包含λCL结构域；第二多肽链的CH3结构域，其根据EU Index，在对应于人IgG1或IgG4的354和366位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是S354C和T366W；第三多肽链的CH3结构域，其根据EU Index，在对应于人IgG1或IgG4的349、366、368、407、435和436位的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；和第四多肽链，其包含κCL结构域。在一些实施方案中，结合蛋白由宿主细胞产生。在一些实施方案中，从细胞培养基或宿主细胞提取物中纯化结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白由宿主细胞分泌或从宿主细胞产生和提取(例如，在与蛋白A接触之前)。在一些实施方案中，当与蛋白A接触时，结合蛋白在细胞培养基或宿主细胞提取物中。在一些实施方案中，结合蛋白从其他结合蛋白、多肽和/或其他细胞组分中纯化。
III.三特异性结合蛋白
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成结合一种或多种(例如，三种)不同抗原靶标或靶蛋白的三个抗原结合位点的四条多肽链。在一些实施方案中，第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链具有交叉取向，其形成两个不同的抗原结合位点。如上所述，第二和第三多肽链包括Fc区(例如，包含铰链-CH2-CH3结构域)。在一些实施方案中，一个或两个Fc区是人IgG4 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG4的228、233-236和/或409位的取代处包含氨基酸突变。在一些实施方案中，氨基酸突变是S228P；E233P、F234V、L235A和在236处的缺失；和/或R409K。在一些实施方案中，一个或两个Fc区是人IgG1 Fc区，其根据EUIndex，在对应于人IgG1的234、235和/或329位的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是L234A、L235A和/或P329A。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG1的298、299和/或300位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S298N、T299A和/或Y300S。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成结合一种或多种(例如三种)不同抗原靶标或靶蛋白的三个抗原结合位点的四条多肽链。在一些实施方案中，至少一个抗原结合位点结合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽的胞外域)。在一些实施方案中，第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL[I]
和第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1[II]
和第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1[III]
和第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；和
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
和其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，第二和第三多肽链进一步包含与CH1连接的Fc区，Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域。在一些实施方案中，一个或两个Fc区是人IgG4 Fc区，其根据EUIndex，在对应于人IgG4的233-236位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG4的228、233-236和/或409位的取代处包含氨基酸突变。在一些实施方案中，氨基酸突变是S228P；E233P、F234V、L235A和在236处的缺失；和/或R409K。在一些实施方案中，一个或两个Fc区是人IgG1Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG1的234、235和/或329位的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是L234A、L235A和/或P329A。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc区，其根据EU Index，在对应于人IgG1的298、299和/或300位的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S298N、T299A和/或Y300S。
在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合对并形成第一抗原结合位点。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合对并形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，VH3和VL3形成结合对并形成第三抗原结合位点。结合蛋白还可用于细胞活化、肿瘤靶向、细胞因子活性的中和、病毒感染的中和、多种信号传导事件的组合，以治疗癌症、关节炎和/或炎性病症。例如，在一些实施方案中，结合蛋白特异性结合选自以下的一种、两种或三种抗原靶标：A2AR、APRIL、ATP二磷酸水解酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，一种IgE受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(还称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDL1)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为E-钙粘蛋白)、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也称为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、NKG2D、NTP二磷酸水解酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也称为IL33受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也称为IL7Ra的共同受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)。在一些实施方案中，一种或多种上述抗原靶标是人抗原靶标。
在一些实施方案中，三个抗原结合位点之一结合CD3多肽(例如，人CD3多肽)，三个抗原结合位点之一结合CD28多肽(例如，人CD28多肽)，并且三个抗原结合位点之一结合第三多肽。在一些实施方案中，特异性结合除CD3或CD28之外的抗原靶标的抗原结合位点结合选自以下的抗原靶标：A2AR、APRIL、ATP二磷酸水解酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，一种IgE受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(还称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDL1)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为E-钙粘蛋白)、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也称为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、NKG2D、NTP二磷酸水解酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也称为IL33受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也称为IL7Ra的共同受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)。在一些实施方案中，一种或多种上述抗原靶标是人抗原靶标。
在上文描述的任何三特异性结合蛋白中，可以使用本文所述的任何接头或接头组合。例如，在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4中的至少一个的长度独立地是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4的长度各自独立地是至少1个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地是0个氨基酸的长度或包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自下组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:57)，L3包含序列S，L4包含序列RT。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L3的长度是0个氨基酸，L4的长度是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L3的长度是0个氨基酸，L4的长度是0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，L2的长度是0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，L4的长度是0个氨基酸。
IV.结合蛋白的用途
结合蛋白可以用于任何已知的测定方法，诸如竞争性结合测定，直接和间接夹心式测定，以及用于检测和定量一种或多种靶抗原的免疫沉淀测定。结合蛋白会以一种适合于所用测定方法的亲和力结合一种或多种靶抗原。
对于诊断应用，在某些实施方案中，可以用可检测部分标记结合蛋白。可检测部分可以是任何能够直接或间接产生可检测信号的部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In或67Ga；荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。
结合蛋白也可用于体内成像。用可检测部分标记的结合蛋白可以施用于动物，优选施用于血流中，并测定宿主中标记抗体的存在和位置。结合蛋白可以用在动物中通过无论是通过核磁共振、放射学还是本领域已知的其他检测手段可检测的任何部分标记。
对于临床或研究应用，在某些实施方案中，结合蛋白可以与细胞毒性剂缀合。已经使用与细胞毒性剂缀合的多种抗体(即抗体-药物缀合物)将细胞毒性有效负载靶向特定肿瘤细胞。细胞毒性剂和将试剂与抗体缀合的接头是本领域已知的；参见，例如，Parslow,A.C.et al.(2016)Biomedicines 4:14and Kalim,M.et al.(2017)DrugDes.Devel.Ther.11:2265-2276。
本公开还涉及一种试剂盒，其包含结合蛋白和用于检测生物样品中的靶抗原水平的其他试剂。这样的试剂可包括可检测标记、阻断血清、阳性和阴性对照样品和检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含组合物，其包含本文所述的任何结合蛋白、多核苷酸、载体、载体系统和/或宿主细胞。在一些实施方案中，所述试剂盒包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。所述容器容纳组合物本身，所述组合物是其本身或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病况的组合物组合，并且可具有无菌进入口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施方案中，标签或包装说明书指示该组合物用于预防、诊断和/或治疗选择的病况。或者，或另外，制品或试剂盒可进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
在一些实施方案中，将本公开的结合蛋白施用于有此需要的患者以治疗或预防癌症。在一些实施方案中，本公开涉及预防和/或治疗增殖性疾病或病症(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，该方法包括向患者施用治疗有效量的至少一种本文所述的结合蛋白或与其相关的药物组合物。在一些实施方案中，本公开涉及本文所述的至少一种结合蛋白或与其相关的药物组合物用于预防和/或治疗有此需要的患者中的增殖性疾病或病症(例如，癌症)的用途。在一些实施方案中，本公开涉及本文所述的至少一种结合蛋白或与其相关的药物组合物，其用于制备用于预防和/或治疗有此需要的患者中的增殖性疾病或病症(例如，癌症)的药物的用途。在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，结合蛋白包含结合T细胞表面蛋白的一个抗原结合位点和结合人CD38多肽的胞外域的另一个抗原结合位点，例如，如上文第II部分所述的。在一些实施方案中，结合蛋白包含结合人CD38多肽的胞外域的抗原结合位点、结合人CD28多肽的抗原结合位点和结合人CD3多肽的抗原结合位点。
在一些实施方案中，癌细胞在其细胞表面上表达人CD38同种型A多肽(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)。在一些实施方案中，癌细胞在其细胞表面上表达人CD38同种型E多肽(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列)。在一些实施方案中，基于癌细胞在其细胞表面上表达人CD38同种型E多肽(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列)，选择患者进行治疗。在一些实施方案中，癌症细胞表达CD38和CD28。在一些实施方案中，癌细胞表达CD38而不表达CD28。
在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、淋巴瘤、乳腺癌如Her2+乳腺癌、前列腺癌、生发中心B细胞淋巴瘤或B细胞急性淋巴母细胞白血病。在某些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，癌症是急性髓样白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或B细胞淋巴瘤。
在某些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。已经测试了抗CD38抗体用于治疗多发性骨髓瘤，诸如达雷木单抗和isatuximab。然而，虽然多发性骨髓瘤被认为是可治疗的，但几乎所有患者都不可避免地复发，导致治疗难治性疾病的发展。在一些实施方案中，癌症是复发性或难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，患者已经用先前的多发性骨髓瘤治疗进行了治疗。在一些实施方案中，将本公开的结合蛋白作为多发性骨髓瘤的第一、第二或第三线治疗施用于患者。在不希望受理论束缚的情况下，认为本公开的抗CD38x抗CD28x抗CD3结合蛋白可用于例如通过经由抗CD38(或抗CD28/抗CD38)将T细胞募集至肿瘤细胞，经由抗CD3/抗CD28活化参与的T细胞，和/或通过基于穿孔素/颗粒酶的机制杀死肿瘤细胞治疗多发性骨髓瘤。已经报道CD28为多发性骨髓瘤的新型癌症标志物。参见Nair,J.R.et al.(2011)J.Immunol.187:1243-1253。
在一些实施方案中，至少一种结合蛋白与一种或多种抗癌疗法(例如，本领域已知的任何抗癌疗法，诸如化疗剂或化疗法)组合施用(或待施用)。在一些实施方案中，至少一种结合蛋白在一种或多种抗癌疗法之前施用(或待施用)。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白与所述一种或多种抗癌疗法同时施用(或待施用)。在一些实施方案中，至少一种结合蛋白在一种或多种抗逆转录病毒疗法后施用(或待施用)。
V.结合蛋白治疗组合物及其施用
包含结合蛋白的治疗或药物组合物在本公开的范围内。这样的治疗或药物组合物可包含治疗有效量的结合蛋白或结合蛋白-药物缀合物，其与选择用于施用模式的药学上或生理学上可接受的配制剂相混合。
在所用的剂量和浓度下，可接受的配制剂材料优选对接受者无毒。
药物组合物可含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH、同渗容摩、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。合适的制剂材料包括但不限于，氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)，抗微生物剂，抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)，缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)，填充剂(诸如甘露醇或甘氨酸)，螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))，络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精、或羟丙基-β-环糊精)，填充剂，单糖，二糖和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)，蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)，着色剂，调味剂和稀释剂，乳化剂，亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，成盐抗衡离子(诸如钠)，防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)，溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)，糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)，悬浮剂，表面活性剂或润湿剂(诸如普流罗尼(pluronics)；PEG；脱水山梨醇酯；聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))，稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨糖醇)，张力增强剂(诸如碱金属卤化物-优选氯化钠或氯化钾-或甘露糖醇山梨糖醇)，递送媒介物，稀释剂，赋形剂和/或药物佐剂(参见例如，REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES(18th Ed.,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company1990)，及其后续版本，出于任何目的通过提述并入本文)。
最佳药物组合物会由技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和期望剂量来确定。这样的组合物可影响结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
药物组合物中的主要媒介物或载体可以是水性或非水性的。例如，用于注射的合适的媒介物或载体可以是水、生理盐水溶液或人造脑脊液，可能补充有用于肠胃外给药的组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。其他示例性药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可进一步包括山梨糖醇或合适的替代物。在本公开的一个实施方案中，通过将具有期望纯度的所选组合物与冻干饼或水溶液形式的任选配制剂混合，可以制备结合蛋白组合物用于储存。此外，可以使用合适的赋形剂，诸如蔗糖，将结合蛋白配制为冻干物。
可以选择本公开的药物组合物用于肠胃外递送或皮下递送。或者，可以选择组合物用于吸入或通过消化道递送，诸如口服。这样的药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。
制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。例如，缓冲剂用于将组合物保持在生理pH或略低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。
当考虑肠胃外施用时，使用的治疗组合物可以是无热原的、肠胃外可接受的、水溶液的形式，其在药学上可接受的媒介物中包含期望的结合蛋白。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中将结合蛋白配制为适当保存的无菌等渗溶液。另一种制剂可涉及用药剂配制期望分子，诸如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂质体，其提供了产品的受控或持续释放，所述产品然后可以通过贮库注射(depot injection)来递送。也可以使用透明质酸，这可以具有促进循环持续时间的效果。用于引入期望分子的其他合适方法包括可植入药物递送装置。
在一个实施方案中，可配制药物组合物用于吸入。例如，可以将结合蛋白配制为用于吸入的干粉。结合蛋白吸入溶液也可以用推进剂配制用于气溶胶递送。在又一个实施方案中，可以雾化溶液。
还考虑到某些制剂可以口服施用。在本公开的一个实施方案中，以这种方式施用的结合蛋白可以与或不与那些通常用于配制固体剂型诸如片剂和胶囊的载体一起配制。例如，当生物利用度最大化并且系统前降解最小化时，可设计胶囊以在胃肠道中的点释放制剂的活性部分。可以包括另外的试剂以促进结合蛋白的吸收。还可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一种药物组合物可以在与适合制备片剂的无毒赋形剂的混合物中包含有效量的结合蛋白。通过将片剂溶解在无菌水或另一种合适的媒介物中，可以以单位剂量形式制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
本公开的其他药物组合物对于本领域技术人员而言会是显而易见的，包括涉及持续或控制递送制剂中结合蛋白的制剂。用于配制多种其他持续或控制递送方法的技术，诸如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和贮库注射，也是本领域技术人员已知的。持续释放制剂的另外的实例包括成形制品形式的半透性聚合物基质，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯-乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物还可包括脂质体，其可通过本领域已知的几种方法中的任何一种制备。
用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤来完成。在冻干组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或溶液形式储存。另外，肠胃外组合物通常放入具有无菌进入口的容器中，例如，具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
一旦配制了药物组合物，就可以将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。这样的制剂可以以即用形式或以在施用前需要重构的形式(例如冻干)储存。
本公开还涵盖用于产生单剂量施用单位的试剂盒。试剂盒可各自包含具有干燥蛋白质的第一容器和具有含水制剂的第二容器。还包括在本公开范围内的是包含单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
治疗上使用的结合蛋白药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目的。本领域技术人员会理解，治疗的适当剂量水平会因此部分地取决于递送的分子，使用结合蛋白的适应症，施用的途径，以及患者的大小(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医生可以滴定剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果。
给药频率会取决于所用制剂中结合蛋白的药代动力学参数。一般而言，临床医生会施用组合物直至达到实现期望效果的剂量。因此，组合物可以作为单剂量，作为两个或更多个剂量(其可以包含或不包含相同量的期望分子)随时间施用，或者作为经由植入装置或导管的连续输注施用。适当剂量的进一步改进是本领域普通技术人员常规进行的，并且在他们常规执行的任务范围内。通过使用适当的剂量反应数据可以确定适当的剂量。
药物组合物的施用途径与已知方法一致，例如口服；通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)，脑室内，肌内，眼内，动脉内，门脉内或病灶内的途径的注射；通过持续释放系统；或通过植入装置。需要时，组合物可以通过推注(bolus injection)或通过输注或通过植入装置连续施用。
组合物还可以经由植入膜、海绵或其它适当的材料局部施用，期望的分子已被吸收或包封在其上。在使用植入装置的情况下，可以将装置植入任何合适的组织或器官中，并且可以经由扩散、定时释放推注或连续施用来递送期望分子。
实施例
以下实施例说明了本公开的具体实施方案及其多种用途。它们仅出于解释目的而提出，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
以下术语可以在本文的实施例和附图中互换使用，以指代特异性抗CD38抗原结合结构域或抗体:
抗CD38_C2-CD38-1:mAb1
抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1或CD38VH1:mAb2
抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3:mAb3
抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3:mAb4
抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3:mAb5
抗CD38_1370或CD38HHY1370:mAb6
抗CD38_SB19或isatuximab:mAb7。
实施例1:单克隆抗CD38抗体的生成和表征
以下实施例描述了单克隆抗CD38抗体的生成和表征。有利地，本文提供的抗体与人和猴CD38蛋白交叉反应，由此提供可用于安全性和临床研究的分子。这些抗体还能够通过凋亡和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀死CD38+细胞。
该实施例描述了用于从单个鼠B细胞生成CD38特异性和交叉反应性单克隆抗体的有效工作流程。
材料和方法
单克隆抗体的生成使用人CD38胞外域R45-I300(SEQ ID NO:1)生成针对人CD38的抗体。参见Q.Liu,I.Krilksunov,R.Graeff,C.Munshi,H.C.Lee,and Q.Hao 2005Structure13::1331-1339。将免疫原与佐剂一起直接施用于正常BalbC小鼠或转基因Trianni MiceTM(Trianni,San Francisco,CA)，其包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA，以刺激免疫应答。
使用衍生自具有不同标签和点突变的同种型A的多种重组CD38蛋白(SEQ ID NO:2、3、4和28)，以及包含来自R45-P203的CD38胞外域的CD38同种型E(SEQ ID NO:105)的带标签版本。通过在哺乳动物细胞中瞬时表达产生蛋白质。将编码DNA序列克隆到CMV增强子/启动子和SV40聚腺苷酸(polyA)信号下的哺乳动物表达质粒中。根据制造商的说明书，使用FreeStyleTMMAX 293表达系统，用表达质粒瞬时转染HEK293细胞(Invitrogen；#K9000-10)。
小鼠的免疫和单个B细胞选择
还从抗原阳性B细胞中直接分离抗CD38抗体，而不与骨髓瘤细胞融合。使用该方法，获得了几种抗CD38抗体，诸如mAb1(参见，SEQ ID No:5和6，分别用于VH和VL序列，和SEQID No:7和8，分别用于重链和轻链序列)。简言之，6-8周龄雌性BALB/c小鼠(S082342；Charles River Labs，Bar Harbor，ME)各自使用A.Wennerberg et al.(1993Am.J.Pathol.143:1050-1054)描述的经典方法在41天的过程中接受三轮免疫。将抗原腹膜内施用于小鼠的腹侧部位。最后一次注射后3天，处死小鼠并无菌分离脾脏并用新鲜的RPMI培养基洗涤。从脾脏释放淋巴细胞，和在使用包括一组荧光抗体和双重人和猴CD38蛋白的四色分选策略分选前，用RPMI培养基洗涤单细胞悬浮液两次，然后使用流式细胞术细胞分选来分离，以分离人/猴交叉反应性IgG-CD38特异性B细胞。将单个细胞直接分选到PCR管中以通过RT-PCR扩增VH和VL基因的同源对(T.Tiller,C.Busse and H.Wardemann2009J.Immunol.Methods350:183-193)。对得到的DNA进行测序。
根据制造商的说明书，使用FreeStyleTMMAX 293表达系统将得到的DNA克隆到分别编码人IgG1或人Ck结构域的哺乳动物表达载体中，用于在HEK293细胞中瞬时表达。通过蛋白A亲和层析(MabSelect,GE Heathcare)纯化批次。在无菌过滤前将洗脱液用PBS透析并储存在4℃。
通过在人免疫球蛋白转基因小鼠中的免疫生成抗体和使用杂交瘤技术选择
如Kilpatrick et al.1997Hybridoma 16:381389中所述的，使用P3X63-Ag8.653骨髓瘤细胞和人CD38的胞外域进行免疫、融合和筛选。使用Kilpatrick等人描述的RIMMS方法，包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的6-8周龄雌性转基因Trianni MiceTM各自在14天过程中每隔3-4天接受四轮免疫。沿着小鼠的背部和沿着腹部的六个并列部位将在RIBI佐剂(Sigma#T2684)中乳化的CD38蛋白皮下施用于靠近引流淋巴结的6个部位。最后一次注射后4天，处死小鼠。无菌分离双侧腘窝、浅表腹股沟、腋窝和鳃淋巴结，并用新鲜的RPMI培养基洗涤。从淋巴结释放淋巴细胞，在使用聚乙二醇与P3X63-AG8.653骨髓瘤细胞融合之前，用RPMI培养基洗涤单细胞悬浮液两次。融合后，将细胞混合物在37℃的培养箱中温育16-24小时。将得到的细胞配制物转移到选择性半固体培养基中，无菌铺板到100mm陪替平(Petri)皿中并在37℃温育。选择开始10天后，检查平板的杂交瘤生长，挑取可见的菌落并置于含有200μL生长培养基的96孔板中。将96孔板保持在37℃的培养箱中2至4天。使用该技术和上述免疫原，获得了几种抗CD38嵌合抗体，诸如mAb 6(参见SEQ ID No:9和10，分别用于VH和VL序列，和SEQ ID No:11和12，分别用于重链和轻链序列)。通过RT-PCR检索VH和VL序列，并通过如上所述的瞬时表达产生mAb 6。
对可溶性CD38胞外结构域的结合亲和力
使用BIAcore 2000(BIAcore Inc.,Uppsala,NJ)评价抗huCD38 mab的结合特性。简言之，将CM5 BIAcore生物传感器芯片对接到仪器中并在室温用250μL的1:1NHS/EDC活化。将小鼠抗人Fc IgG1(GE Healthcare#BR-1008-39)(在0.05M乙酸盐缓冲液中的13.5μg/mL，pH5)固定在流动池1中的活化芯片上。固定化以5μL/min的流速进行。然后通过注入55μL的乙醇胺-HCl，pH8.5封闭芯片，然后用50mM NaOH、1M NaCl洗涤5次。为了测量抗CD38 mab与人CD38蛋白或cyno CD38蛋白的结合，在BIAcore运行缓冲液(HBS-EP)中以2μg/mL使用抗体。从3至1000nM注射抗原(人CD38-histag(ID2)或cyno CD38-histag(ID3))。在完成注射阶段后，在BIAcore运行缓冲液中以相同的流速监测解离360秒。使用30μL的50mM NaOH-1MNaCl在注射之间再生表面。使用BIAsimulation软件分析各个传感图。
对表达人CD38的前B细胞的结合亲和力
通过流式细胞术测定抗CD38抗体与重组鼠前B::300.19细胞表面上表达的CD38的结合。重组细胞系由J.Deckket et al.2014Clin.Cancer Res20:4574-4583描述。将鼠前B::300.19CD38表达细胞以40,000个细胞/孔包被在96孔High Bind板(MSD L15XB-3)上，并在4℃加入100μL/孔的抗CD38抗体45分钟并用PBS1％BSA洗涤三次。在4℃加入100μL/孔的与Alexa488缀合的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch；#109-545-098)45分钟，并用PBS1％BSA洗涤三次。离心并通过添加200μl/孔PBS1％BSA重悬细胞并使用easyCyteTM8HT流式细胞计数系统读取来评价抗体结合。使用BIOST BIOST@T-BINDING和BIOST@T-SPEED软件分别估计表观KD和EC50值。
结果
使用流式细胞术将新分离的mAb1与人SU-DHL-8或MOLP-8细胞的结合与isatuximab的进行比较(图1A)。两种抗体均显示出对两种细胞系的高亲和力结合。然而，只有mAb1能够与表面上表达食蟹猴CD38的细胞结合(图1B)。
使用表面等离子体共振(SPR)检查与人和食蟹猴CD38多肽的可溶性胞外域的结合的新分离的抗体mAb1和mAb6。SPR结果汇总在表A中。
表A.通过SPR测定确定的抗体与hCD38和cCD38的可溶性胞外域的结合亲和力。
流式细胞术也用于检测mAb1和mAb6抗CD38抗体与其细胞表面上表达人或食蟹猴CD38多肽的鼠前B细胞的结合。结果显示在表B中。测试的两种抗体均显示出与表达前B::300.19huCD38-或cCD38的细胞的高亲和力结合。
表B.通过流式细胞术确定的抗体与鼠前B::300.10细胞表达的hCD38或cCD38的结合亲和力。
这些结果证明了以高亲和力结合人和食蟹猴CD38多肽的抗体的生成。与其他抗CD38抗体不同，这些抗体与可溶性细胞外形式的人和食蟹猴CD38多肽交叉反应或在哺乳动物细胞表面上表达。
实施例2:人源化抗CD38变体的计算机设计
该实施例描述了实施例1中生成的抗体的人源化。
在计算机中分析mAb1可变结构域的序列。用于免疫球蛋白(IMGT)定义的国际ImMunoGeneTics信息系统用于鉴定互补决定区(CDR)。
首先，并行地进行搜索以鉴定每个可变链的最接近的小鼠种系和人种系蛋白序列组合。这是使用基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Nucleic Acids Res.25:3389-3402)对小鼠和人种系蛋白序列数据库进行搜索来进行的。对于每个抗体链，找到最接近的V和J小鼠和人蛋白序列。通过V区识别百分比测量这种高蛋白序列同一性的鉴定。mAb1轻链和重链的搜索结果分别列于表C和D中。
表C.mAb1可变轻链最接近的人和小鼠(V&J)种系蛋白序列。
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表D.mAb1可变重链最接近的人和小鼠(V&J)种系蛋白序列。
接下来，筛选mAb1可变结构域序列的序列责任(liability)，诸如脱酰胺、酸性裂解、氧化或异天冬氨酸形成位点。通过藉由同源性的3D建模分析mAb1结构，以定义氨基酸残基如何以分子内或分子间方式相互作用。该步骤导致鉴定一组氨基酸残基，其对于mAb1功能性在结构上是重要的，如CDR构象和抗原结合。选择这些氨基酸残基以存在于人源化mAb1可变序列中。
将来自亲本鼠mAb1的CDR移植到相关框架上。基于上述分析，选择与IGKJ1*01偶联的人IGKV3-20*02和与IGHJ4*01偶联的人IGHV1-3*01，分别作为mAb1可变轻链和可变重链人源化的基础。mAb1轻链与选择的人IGKV3-20*02种系在V区上显示出64.52％的同一性。mAb1重链与选择的人IGHV1-3*01种系在V区上显示出69.39％的同一性。在人源化过程中，将亲本鼠mAb1 CDR移植到选择的种系框架之间以重构标准抗体可变序列。如上所述，注意到先前鉴定的mAb1氨基酸残基组在结构上对其功能很重要。如果需要，那些氨基酸残基在新产生的序列中被它们确切的相应mAb1残基取代。这对应于回复突变步骤以并入足够的亲本序列氨基酸残基。一些CDR突变被并入用于亲本CDR中的人源化和避免序列责任。新创建的轻和重可变序列用于生成人源化mAb1可变区的3D同源性模型。使用来自BIOVIADiscovery Studio套件的模型抗体框架(Model Antibody Framework)建立3D模型。
基于CDR移植方法，生成可变轻链的两个变体(VL1和VL3)和可变重链的四个变体(VH1、VH3、VH5和VH6)。在mAb1可变轻链和重链序列之间变化的氨基酸残基的特定组合及其人源化形式分别列于表E和表F中。
表E.mAb1可变轻链和人源化变体之间的序列差异。
表F.mAb1可变重链和人源化变体之间的序列差异。
与具有SEQ ID NO:6的mAb1序列的亲本VL相比，具有SEQ ID NO:14的人源化VL1变体显示总共22个突变(FR中18个和CDR中4个)。该变体衍生自与IGKJ1*01偶联的人种系IGKV3-20*02的框架，其由于对mAb结构、CDR构象以及因此对结合其靶标的负面影响的风险而进行了8次回复突变。使亲本CDR的四个位置突变以增加人源化比例或避免序列责任。
与具有SEQ ID NO:6的mAb1序列的亲本VL相比，具有SEQ ID NO:18的人源化VL3变体显示总共18个突变(FR中18个)。该变体衍生自与IGKJ1*01偶联的人种系IGKV3-20*02的框架，其由于对mAb结构、CDR构象以及因此对结合其靶标的负面影响的风险而进行了8次回复突变。
与具有SEQ ID NO:5的mAb1序列的亲本VH相比，具有SEQ ID NO:13的人源化VH1变体显示总共17个突变(FR中14个和CDR中3个)。该变体衍生自与IGHJ4*01偶联的人种系IGHV1-3*01的框架，其由于对mAb结构、CDR构象以及因此对结合其靶标的负面影响的风险而进行了11次回复突变。突变亲本CDR的三个位置以增加人源化比例或避免序列责任。
与具有SEQ ID NO:5的亲本VH mAb1序列相比，具有SEQ ID NO:17的人源化VH3变体显示总共14个突变(FR中14个)。该变体衍生自与IGHJ4*01偶联的人种系IGHV1-3*01的框架，其由于对mAb结构、CDR构象以及因此对结合其靶标的负面影响的风险而进行了11次回复突变。
与具有SEQ ID NO:5的mAb1序列的亲本VH相比，具有SEQ ID NO:21的人源化VH5变体显示总共11个突变(FR中11个)。该变体衍生自与IGHJ4*01偶联的人种系IGHV1-3*01的框架，其由于对mAb结构、CDR构象以及因此对结合其靶标的负面影响的风险而进行了14次回复突变。
与具有SEQ ID NO:5的mAb1序列的亲本VH相比，具有SEQ ID NO:23的人源化VH6变体显示总共12个突变(FR中12个)。该变体衍生自与IGHJ4*01偶联的人种系IGHV1-3*01的框架，其由于对mAb结构、CDR构象以及因此对结合其靶标的负面影响的风险而进行了13次回复突变。
对得到的轻和重人源化可变序列进行爆破以获得与免疫表位数据库(IEDB)数据库((PLos Biol(2005)3(3)e91)www.iedb.org)的序列相似性，以确保没有序列含有其中列出的任何已知的B或T细胞表位。
表G中列出了mAb1和人源化轻和重可变结构域的完整氨基酸可变序列。已将这些人源化轻和重可变结构域组合以生成mAb1的亲本可变结构域的几种人源化形式。mAb2可变结构域对应于人源化VH1与人源化VL1组合的结合。mAb3可变结构域对应于人源化VH3与人源化VL3组合的结合。mAb4可变结构域对应于人源化VH5与人源化VL3组合的结合。mAb5可变结构域对应于人源化VH6与人源化VL3组合的结合。表G中所示的三特异性结合蛋白在实施例4中有更详细的描述。
将如上所述的人源化VH和VL变体的相应编码DNA序列克隆到分别编码人IgG1或人Ck结构域的哺乳动物表达载体中，用于如实施例1中所述的瞬时表达和纯化。衍生自mAb1的全长人源化抗CD38变体的氨基酸序列列为mAb2(重链:HC1，SEQ ID NO:15；轻链:LC1，SEQID NO:16)、mAb3(重链:HC3，SEQ ID NO:19；轻链:LC3，SEQ ID NO:20)、mAb4(重链:HC5，SEQID NO:22；轻链:LC3，SEQ ID NO:20)和mAb5(重链:HC6，SEQ ID NO:24；轻链:LC3，SEQ IDNO:20)。
实施例3:抗CD38抗体的交叉反应性和凋亡诱导
接下来表征实施例2中产生的人源化抗CD38变体与人和食蟹猴CD38多肽的结合以及诱导细胞凋亡。
材料和方法
凋亡诱导试验
将细胞以2x 105个细胞/mL在完全培养基(RPMI-1640,10％FBS，2mM L-谷氨酰胺)中与1.5μg/mL(10nM)指定的抗体在37℃和5％CO2温育20小时。按照制造商的说明书(LifeTechnologies)用膜联蛋白V-FITC染色细胞。在具有BD FACSDiva软件的BD FACSAriaTM流式细胞仪上通过流式细胞术分析样品用于采集控制和数据分析(均为BD Biosciences)。
结果
检查了如上所述产生的选定的抗人CD38抗体的结合特性(图2A-2H)。使用ELISA和SPR检查抗体与可溶性人CD38和食蟹猴CD38的结合。ELISA数据用于确定抗体与人和食蟹猴CD38结合的EC50，用于人源化抗CD38抗体mAb2(图2A)、mAb3(图2C)、mAb4、mAb5(图2E)和人抗CD38抗体mAb6(图2I)。
还使用上述SPR测定评价人源化抗CD38变体或人抗CD38mAb与CD38的结合。SPR数据用于确定抗体与人和食蟹猴CD38结合的KD和koff，用于人源化抗CD38抗体mAb2(图2B)、mAb3(图2D)、mAb4、mAb5(图2F)和人抗CD38抗体mAb6(图2H)。结合数据汇总在表K中，显示所有抗CD38 mAb与具有相似结合特征的CD38结合。
表K.通过表面等离子体共振测定确定的抗CD38mAb与人CD38和食蟹猴CD38的可溶性胞外域的结合亲和力。
使用上述基于FACS的结合测定评估人源化抗CD38变体与表达CD38的细胞结合的能力。FACS数据用于确定抗体与人和食蟹猴CD38结合的EC50，用于人源化抗CD38抗体mAb2(图2A)、mAb3(图2C)、mAb4、mAb5(图2E)和人抗CD38抗体mAb6(图2G)。表L中列出的结合数据显示所有人源化抗CD38变体对细胞表面CD38表现出相似的结合亲和力。
表L.抗CD38 mAb与表达CD38的鼠前B::300.19细胞的结合亲和力。
来自三种测定的结合数据汇总于图2I中，以及VH和VL结构域与人V区的序列同一性。
接下来检查亲本mAb1抗体和mAb7诱导细胞凋亡的能力。两种抗体均增加膜联蛋白V染色和碘化丙啶(PI)摄取。用mAb7处理后，40％的细胞成为膜联蛋白V和PI的双阳性，而用mAb1处理的细胞中60％是双阳性。两种抗体在SU-DHL-8细胞中表现出类似的浓度依赖性凋亡作用(图2J)。类似地，两种抗体在NK92细胞存在下促进针对SU-DHL-8细胞的ADCC活性(图2K)，在37℃4小时后导致高达60％的细胞毒性和4-6pM的IC50(图2L)。
在计算机中鉴定CD38同种型E，并在来自多发性骨髓瘤患者和癌细胞系(MOLP-8、CU1702和CU2332)的NK细胞、PBMC和BMMC的转录水平上进行验证。使用有关人RefSeq转录物数据库发布20131216的BLASTN 2.2.26(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein databasesearch programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402.)程序通过核酸序列数据库筛选证明CD38同种型E。BLASTN程序在没有掩蔽序列低复杂性区域和至少考虑以下的情况下应用:与一片最少100个核酸残基长的人CD38同种型A核酸序列的98.5％同一性。从该筛选中突出显示的序列与CD38基因座重新对齐，以便被验证为人CD38基因的转录形式(相同的内含子-外显子基因组结构)。CD38同种型E核酸序列是被验证为人CD38基因的转录形式的序列之一。
还检测了抗CD38抗体结合人CD38同种型A和E的能力。为了评价与CD38同种型A和同种型E的结合，通过使用同种型A和同种型E蛋白(如实施例1中所述制备的)作为捕获抗原进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。用PBS中的0.5μg/孔的同种型包被96孔板，并向板中添加100μL/孔的抗体。将板在37℃温育1小时，并用含有0.05％Tween-20(PBS-T)的PBS洗涤5次。然后，向每个孔中添加100μL与辣根过氧化物酶缀合的1:25,000稀释的抗人IgG(JacksonRef:109-035-098)。在黑暗中在37℃温育1小时后，用PBS-T洗涤平板5次。通过添加TMB-H2O2缓冲液使抗体结合可见，并在450nm的波长读数。使用BIOST@T-SPEED软件估计EC50值。
测定多种抗体对CD38同种型A(SEQ ID NO:1)和同种型E(SEQ ID NO:105)的结合亲和力，如表L2所示。表M提供了多种抗CD38抗体的结合特性的比较。
表L2.基于通过ELISA测定的EC50，抗CD38抗体对CD38同种型A和E的结合亲和力。
抗体 CD38同种型A EC50(nM) CD38同种型E EC50(nM)
mAb1 0.11(CV 9％) 0.08(CV 7％)
mAb2 0.14(CV 13％) 0.10(CV 12％)
mAb6 0.47(CV 3.7％) 0.32(CV 5％)
mAb7 0.10(CV 7.1％) 未结合
表M.多种抗CD38抗体的结合特征。
抗CD38 H11(Santa Cruz) 达雷木单抗 mAb7 mAb1 mAb6
结合huCD38同种型A + + + + +
结合huCD38同种型E + - - + +
结合cyno CD38 + - - + +
总之，mAb7和mAb1在MOLP-8人多发性骨髓瘤细胞中诱导相似的凋亡，对SU-DHL-8细胞具有相似的浓度依赖性凋亡作用，并且对SU-DHL-8细胞具有相似的浓度依赖性ADCC活性。然而，只有mAb1以亚纳摩尔亲和力结合人和食蟹猴CD38并且结合CD38同种型A和E。
还通过如上所述的荧光激活细胞分选仪(FACS)评估人源化抗CD38变体诱导细胞凋亡的能力。先前已经鉴定了几种具有多种功能特性的抗CD38抗体，而其中一些可经由直接影响细胞增殖或凋亡介导体外杀伤CD38+细胞系。凋亡诱导测定的结果如图2M所示。除mAb6外，实施例1和2中生成的所有抗体均能诱导凋亡。抗CD38抗体mAb2、mAb3、mAb4和mAb5导致SU-DHL-8淋巴瘤细胞中凋亡的剂量依赖性诱导；每种抗体的IC50在图2N-2Q中提供。
实施例4:三特异性抗CD38结合蛋白的生成
接下来，以图3A中所示的三特异性形式分析实施例1-3中描述的所选抗CD38抗体的抗原结合结构域的结合特性。
当使用SPR将其他抗原结合结构域与其同源配体结合时，以三特异性形式(抗CD38x抗CD28x抗CD3)测试抗CD38抗原结合结构域的结合CD38的能力。顺序配体结合测定示于图3B。为了将三种抗原顺序结合到每种三特异性抗体，注射每种抗原的饱和浓度(>10KD)8分钟，然后解离5分钟。通过以30μl/min注射10mM甘氨酸-HCl pH 2.5 60秒进行表面再生。数据用1:1动力学结合模型拟合，并使用Biacore S200评价软件v 1.0进行分析。使用结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)计算平衡解离常数(KD)。
如图3C所示，这种基于SPR的测定显示，无论CD3和/或CD28抗原结合结构域是否也结合其同源抗原，三特异性结合蛋白能够结合CD38。示例性顺序结合测定的结果示于图4。通过SPR测量的动力学参数在表M2中提供。表M2.三特异性抗CD38x抗CD28x抗CD3结合蛋白与1、2或3种同源抗原的结合。
这些结果证明所有三种靶标可以同时结合三特异性结合蛋白。将三特异性结合蛋白与CD28、CD3或两者(以任一顺序)预结合不改变对CD38的结合动力学或结合亲和力。
接下来，通过SPR评估CD38SB19xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白的每个抗原结合结构域在饱和时具有和不具有其他两个抗原结合结构域的结合同源抗原的能力。表M3和M4显示了这些测定的结果。
表M3.没有其他靶标存在的靶标结合
靶标 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(M)
CD38 8.04E+05 1.41E-03 1.75E-09
CD28 1.16E+05 3.14E-04 2.71E-09
CD3 2.90E+04 6.73E-04 2.32E-08
表M4.与其他靶标在饱和时的靶标结合
靶标 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(M)
CD38 5.93E+05 1.44E-03 2.42E-09
CD28 1.05E+05 3.96E-04 3.77E-09
CD3 1.27E+05 2.36E-03 1.86E-08
如表M3和M4所示，通过与抗原预结合而饱和的两个靶标不影响第三靶标对CD38或CD28的动力学或结合亲和力。在CD3结合的情况下，预结合的CD38和/或CD28导致更快的动力学(对kon和koff值的约4倍影响)。
以三特异性形式测试抗CD38抗原结合结构域，其具有两个抗CD28抗原结合结构域(超激动剂，“sup”，和常规激动剂，“cvn”)和两个抗CD3抗原结合结构域(“mid”和“low”)。这些抗原结合结构域的可变结构域序列如下提供：抗CD28sup:SEQ ID NO:49(VH)和SEQ IDNO:50(VL)；抗CD28cvn:SEQ ID NO:51(VH)和SEQ ID NO:52(VL)；抗CD3mid:SEQ ID NO:53(VH)和SEQ ID NO:54(VL)；抗CD3low:SEQ ID NO:84(VH)和SEQ ID NO:85(VL)。检测三特异性结合蛋白结合的SPR测定结果如图5所示。三种抗CD38结合结构域在三特异性结合蛋白形式中具有与单特异性形式大致相同的结合亲和力。两种CD3结合结构域在单、双和三特异性形式中具有大致相同的结合亲和力。与单特异性相比，CD28结合结构域在双或三特异性形式中应略降低(但仍然是纳摩尔)结合亲和力。当其他两个抗原结合结构域饱和时，与其他两个抗原结合结构域未与抗原结合时相比，抗CD38SB19和抗CD28sup结合结构域具有相似的结合亲和力。然而，当其他两个抗原结合结构域饱和时，抗CD3mid结合结构域显示出更快的动力学。这些结果证明抗CD38、抗CD28和抗CD3结合结构域与三特异性结合蛋白形式相容。
还将本文生成的抗CD38抗原结合结构域与mAb7的现有抗CD38抗原结合结构域进行比较(分别参见，VH序列的SEQ ID NO:47和VL序列的SEQ ID NO:48)。通过流式细胞术确定三特异性分子与重组鼠前B::300.19细胞表面上表达的CD38的结合，并且平行测定相应的抗CD38单价抗体。重组细胞系由J.Deckket et al.2014Clin.Cancer Res 20:4574-4583描述。将鼠前B::300.19CD38表达细胞以40,000个细胞/孔包被在96孔High Bind板(MSDL15XB-3)上，并在4℃添加100μL/孔的三特异性分子45分钟并用PBS1％BSA洗涤三次。在4℃添加100μL/孔的与Alexa488缀合的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch；#109-545-098)45分钟，并用PBS1％BSA洗涤三次。离心并通过添加200μl/孔PBS1％BSA重悬细胞并使用easyCyteTM8HT流式细胞仪系统读取来评价抗体结合。使用BIOST@T-BINDING和BIOST@T-SPEED软件分别估计表观KD和EC50值。
如上所述使用流式细胞术检查mAb7或三特异性结合蛋白与mAb7抗CD38抗原结合结构域与在细胞表面上表达人或食蟹猴CD38多肽的鼠前B细胞的结合。如图6A所示，CD38xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白与mAb7抗CD38抗原结合结构域结合表达人CD38的细胞(左上)，其表观亲和力比mAb7单特异性抗体低8倍(右上)。mAb7单特异性抗体(右下)或具有mAb7抗CD38抗原结合结构域的三特异性结合蛋白(左下)均未与表达食蟹猴CD38的细胞结合。
还以三特异性形式测试人源化抗CD38抗体mAb2的结合结构域，以结合表达人或食蟹猴CD38多肽的细胞。如图6B-6D所示，与mAb7不同，具有mAb2抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28supxCD3mid和CD38xCD28cvnxCD3mid三特异性结合蛋白以及mAb2单特异性抗体能够结合人和食蟹猴CD38多肽。具有mAb2抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特异性结合蛋白与表达人CD38的细胞结合，其表观亲和力比亲本mAb2抗体低9倍(比较图6C上图，与图6D上图)。具有mAb2抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特异性结合蛋白与表达食蟹猴CD38的细胞结合，其表观亲和力比亲本mAb2抗体低7.5倍(比较图6C下图，与图6D下图)。具有mAb2抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白与表达人CD38的细胞结合，其表观亲和力比具有mAb2抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特异性结合蛋白低2.5倍(比较图6C上图，与图6B上图)。
还将人源化抗CD38抗体mAb6的结合结构域与mAb6单特异性抗体进行比较，以结合表达人或食蟹猴CD38多肽的细胞。虽然mAb6单特异性抗体与nM范围内表达人(右上)或食蟹猴(右下)CD38多肽的细胞结合(图6E)，但CD38xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白与mAb6抗CD38抗原结合结构域结合表达人(左上)或食蟹猴(左下)CD38多肽的细胞而没有饱和。
总之，发现CD38SB19xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白与人CD38结合的亲和力在相同的范围内，无论是通过SPR检测与重组人CD38的结合还是通过流式细胞术检测在细胞表面上表达的人CD38(图6F)。类似地，CD38VH1xCD28supxCD3mid/low(mAb2抗CD38结合结构域)和CD38VH1xCD28cvnxCD3mid/low三特异性结合蛋白(mAb2抗CD38结合结构域)与人CD38结合的亲和力在两种测定中也在相同的范围内。对于CD38HHY1370xCD28supxCD3mid(mAb6抗CD38结合结构域)，通过SPR测定结合人CD38的KD为1nM，而通过流式细胞术无法估计准确的EC50值。表M5中提供了具有多种抗CD38结合结构域的三特异性结合蛋白的表观KD值(通过FACS分析获得)的汇总。
表M5.通过流式细胞术测定获得的表观KD值的汇总
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如所预期的，缺乏抗CD38结合结构域的ΔCD38xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白不与表达人或食蟹猴CD38多肽的细胞结合(图6G)。这表明在该测定中观察到的结合对CD38抗原结合结构域是特异性的。
实施例5:含抗CD38 mAb2和抗CD38 mAb6的三特异性结合蛋白的体外和体内表征
以下实施例描述了表征含有衍生自mAb2和mAb6抗体的可变结构域的新型T细胞接合物的稳定性、结合特性和活性的实验。生成另外的抗CD38xCD28 x CD3抗体，其包含三特异性结合蛋白的抗CD38、CD3和CD28臂的变体。新的抗CD38/CD3/CD28抗体的不同之处在于：1)抗CD38结合结构域(mAb2或mAb6)；2)抗CD3结合结构域(CD3high或CD3low；参见，SEQ IDNO:84和85，分别用于抗CD3low VH和VL序列)；3)抗CD28结合结构域(CD28sup或CD28cvn)。在可能的组合中，设计、生产并随后测试各种功能的抗CD38 x CD28 x CD3的集合。
材料和方法
三特异性结合蛋白的产生和纯化
根据制造商的方案，使用ExpiFectamineTM293转染试剂盒(Thermo FisherScientific)将4种表达质粒瞬时转染到Expi293细胞中，产生三特异性结合蛋白。简言之，将25％(w/w)的每种质粒稀释到Opti-MEM中，与预稀释的ExpiFectamine试剂在室温(RT)混合20-30分钟，并加入Expi293细胞(2.5x106个细胞/ml)中。为了产生具有良好产率和纯度的三特异性结合蛋白通常使用最佳转染以确定质粒的最佳比例。
转染后4-5天，收集来自转染细胞的上清液并通过0.45μm过滤单元(Nalgene)过滤。使用3步法纯化上清液中的三特异性结合蛋白。首先，使用蛋白A亲和纯化，并使用“IgG洗脱缓冲液”(Thermo Fisher Scientific)洗脱结合的Ab。其次，将产物用PBS(pH7.4)透析过夜，用2次改变PBS缓冲液。在下一步骤之前，通过0.45μm过滤单元(Nalgene)过滤清除任何沉淀物。第三，使用尺寸排阻色谱(SEC)纯化(Hiload 16/600Superdex 200pg，或Hiload26/600Superdex 200pg，GE Healthcare)除去制剂中的聚集体和不同物质。在还原和非还原SDS-PAGE上分析级分，以在组合它们之前鉴定含有单体三特异性结合蛋白的级分。可以将纯化的抗体等分并长期储存在-80℃。
ELISA测定
使用ELISA或SPR方法分析纯化的抗体的结合特性。对于ELISA，使用三特异性结合蛋白中每个结合位点的相应抗原以在4℃使用2μg/ml PBS中的每种抗原(pH7.4)包被96孔免疫板(Nunc 439454，Thermo Fisher Scientific)过夜。使用PBS中的5％脱脂乳+2％BSA在室温封闭包被的板1小时，然后用PBS+0.25％Tween 20洗涤三次(Aqua Max 400，Molecular Devices)。制备抗体的连续稀释液(三特异性和对照抗体)并添加到ELISA板上(100μl/孔，一式两份)，在室温温育1小时，然后用PBS+0.25％Tween 20洗涤5次。
洗涤后，将HRP缀合的第二抗人Fab(1:5000，目录号109-035-097，JacksonImmunoResearch Inc)添加至各孔中，并在室温温育30分钟。用PBS+0.25％Tween 20洗涤5次后，向每个孔中添加100μl TMB微孔过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD，USA)。通过添加50μl 1M H2SO4终止反应，并使用SpectraMax M5(Molecular Devices)测量OD450，并使用SoftMax Pro6.3软件(Molecular Devices)分析。将最终数据转移至GraphPad Prism软件(GraphPad Software，CA，USA)，并如所示绘图。使用相同的软件计算EC50。
ELISA测定用于测定抗CD38xCD28xCD3三特异性抗体或同种型对照抗体(人IgG4)与人CD3(Cambridge Biologics LLC Cat#03-01-0051)、CD28(Cambridge Biologics LLCCat#03-01-0303)和CD38(Cambridge Biologics LLC Cat#03-01-0369)的结合。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗Fab二抗(Jackson ImmunoResearch Inc#109-035-097)检测结合的抗体。
体外细胞杀伤测定
使用不同的三特异性结合蛋白，将纯化的人PBMC用于针对多种癌细胞的体外杀伤测定。简言之，将杀伤试验设置在96孔V底板中。对于每个平板，来自每个供体的40ml PBMC以2x10^6个细胞/ml铺板，并且制备以2.5x10^5个细胞/ml(4μL染料染色至1x10^7个细胞)的30ml的PKH26(Sigma#MINI26)标记的靶细胞。首先将多种浓度的20μL/孔测试蛋白质或PMA添加到每个孔中，然后向每个孔中添加80μL/孔标记的靶细胞(2X10^4个细胞/孔)。然后向每个孔中添加100μL的PBMC，达到E:T＝10:1孔(2x10^5个细胞/孔)，并在37℃，5％CO2培养箱中温育24小时。旋转减慢细胞，并收集上清液用于测量细胞因子释放，或丢弃。用VividLIVE/DEADTM可固定紫色死细胞染色缓冲液(Fixable Violet Dead Cell Stainingbuffer)(Life Technology#L34955)染色细胞(通过将60μL Vivid试剂添加到60ml PBS中制备染色缓冲液)。通过在室温在黑暗中温育15分钟将细胞重悬浮于100μL染色缓冲液中。用1xPBS洗涤细胞后，将细胞重悬于含有0.5％仲甲醛的200μL PBS中，通过Fortessa流式细胞仪(Beckton Dickinson，San Jose，CA)收集PKH26+Vivid+癌细胞，然后使用Flowjo软件进行分析。杀伤百分比计算为特异性杀伤-自发杀伤/总细胞，并如所示绘制。
细胞因子释放测定
为了测量体外活化测定中的炎性细胞因子浓度，体外杀伤测定，CD34+脐带细胞人源化NSG小鼠的体内活化测定，以及毒性研究，收集细胞培养上清液，并根据制造商的方案使用Milliplex Human High Sensitivity T cell13-plex试剂盒(EMD Millipore)稀释血清样品。随后通过EMD Millipore 系统和/>Analyst 5.1软件对这些进行分析。
体内小鼠模型和功效研究
人CD34+造血干细胞移植的NSG小鼠(hu-CD34)用作体内小鼠模型。这些小鼠产生多谱系人免疫细胞，并且是用于免疫肿瘤学功效研究的有效平台(参见，例如，Shultz,L.D.et al.(2014)Cold Spring Harb.Protoc.2014:694-708)。通过注射CD34+造血干细胞产生Hu-CD34+NSG小鼠，显示包括T细胞、B细胞和一些其他群体的人免疫细胞群体的有效多谱系植入(McDermott,S.P.et al.(2010)Blood 116:193-200)。多谱系造血发生在12周内。植入稳定超过一年而没有移植物抗宿主病。
对于使用hu-CD34 NSG小鼠的功效研究，小鼠购自The Jackson Laboratory(Maine,USA)，并且在使用前验证人细胞群体。一般而言，在基质胶(BD Biosciences)(50％v/v)中混合的5x106个肿瘤细胞用于接种每只小鼠的肿瘤。一旦肿瘤大小达到100-150mm3的范围，选择小鼠并随机分到各组进行研究。每周3次以给定剂量静脉内给予抗体。每周监测体重1-3次。通过卡尺肿瘤测量1-3次/周测量肿瘤大小。当肿瘤大小达到1,500mm3时，或最后一次给药后24小时，终止所有小鼠。将末端血液样品(0.3mL)收集到血清分离管中，通过轻轻倒置五次混合，并置于管架中。末端肿瘤还在置入固定剂中用于免疫组织化学分析前收集并称重。
人PBMC人源化(hu-PBMC)NSG小鼠用作另一种体内小鼠模型。这些小鼠是通过从健康供体注射纯化的人PBMC产生的，其使用成人外周血单核细胞具有最快的植入率并且能够进行需要强效效应和记忆T细胞和NK细胞功能的短期研究，并且适合于由移植物抗宿主病引起的短期功效研究(3-4周)。
对于使用hu-PBMC NSG小鼠的功效研究，8-10周龄NSG小鼠(目录号:005557,NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)购自The Jackson Laboratory(Maine，USA)。用在基质胶(BD Biosciences)(50％v/v)中混合的5x106个肿瘤细胞皮下接种每只小鼠。一旦肿瘤大小达到50-100mm3的范围，就将来自健康供体的10x106个人PBMC腹膜内(IP)重建至每只小鼠。第二天验证人细胞重建。一旦肿瘤大小达到100-150mm3的范围，选择小鼠并随机分到各组进行研究。每周3次以给定剂量静脉内给予抗体。每周监测体重1-3次。通过卡尺肿瘤测量1-3次/周测量肿瘤大小。当肿瘤大小达到1,500mm3时或最后一次给药后24小时，终止所有小鼠。将末端血液样品(0.3mL)收集到血清分离管中，通过轻轻倒置五次混合，并置于管架中。收集末端肿瘤并称重，然后置于固定剂中用于免疫组织化学分析。
对于播散的hu-PMBC NSG小鼠模型，1-5x106个细胞在第0天静脉内注射至各小鼠。在第3天，进行基线亮度成像用于随机化。在第4天，将来自健康供体的10x106个人PBMC腹膜内(IP)重建至每只小鼠。使用指定剂量在第5、12、19天每周处理小鼠。在第10、17、24天进行每周亮度身体成像，以监测每只动物的肿瘤体积。在研究结束时，收集血液、脾脏、骨骼和骨髓用于组织病理学研究。
结果
通过ELISA测定测试抗体结合所有三种靶抗原的能力。CD38VH1xCD28supxCD3midIgG4、CD38VH1xCD28supxCD3low IgG4、CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4、CD38VH1xCD28cvnxCD3lowIgG4显示出与人和猴CD3和CD38相似的结合亲和力，但对具有CD28sup的CD28(人和猴具有相同的胞外域)的可变结合亲和力显示出更好的亲和力(图7A)。CD38VH1xCD28supxCD3mid和CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA变体以及IgG1 LALA P329A和NNAS变体均显示出与人CD3、CD28和CD38类似的结合(图7B)。
接下来，测试三特异性抗CD38xCD3xCD28结合蛋白变体诱导T细胞活化和抗体介导的肿瘤细胞杀伤的能力(图8A-8D)。图8A显示使用来自3个不同供体的PBMC在E:T＝10下对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226的CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4、CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4、CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4、CD38hhy1370xCD28cvnxCD3midIgG4的体外杀伤活性。计算杀伤活性的EC50并汇总在表N中。含有CD28sup的抗CD38xCD3xCD28三特异性结合蛋白均显示出更好的杀伤活性。还使用NCI-H929(图8B)、KMS-26(图8C)和KMS-11细胞系(图8D)检查了这些分子的体外杀伤活性。
具有IgG1 LALA P329A和NNAS变体或IgG4 FALA变体的抗CD38x抗CD3x抗CD28三特异性结合蛋白也显示体外杀伤多发性骨髓瘤KMS-11(图8E)和U266(图8F)细胞。计算每种抗体针对每种细胞系的EC50，并汇总于表Q2(KMS-11)和Q3(U266)中。
图9A、9B和10显示CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4和CD38VH1xCD28supxCD3low IgG4的体外T细胞活化谱。两种抗体均显示出对CD4和CD8 T细胞的类似激活活性。计算每种抗体针对每种细胞系的EC50，并汇总于表N(RPMI-8226)、表O(NCI-H929)、表P(KMS-26)和表Q(KMS-11)中。
表N:来自不同供体的PBMC的抗体介导的CD38+RPMI8266细胞的特异性杀伤
表O:来自不同供体的PBMC的抗体介导的CD38+NCI-H929细胞的特异性杀伤
/>
表P:来自不同供体的PBMC的抗体介导的CD38+KMS-26细胞的特异性杀伤
表Q:来自不同供体的PBMC的抗体介导的CD38+KMS-11细胞的特异性杀伤
表Q2:来自不同供体的PBMC的抗体介导的CD38+KMS-11细胞特异性杀伤(IgG1/4变体Fc)
表Q3:来自不同供体的PBMC的抗体介导的CD38+U266细胞特异性杀伤(IgG1/4变体Fc)
还通过用指定的抗体包被平板使用Stebbings,R.et al.(2007)(J.Immunol.179:3325-3331)中所述的方法，然后使用2种浓度的测试抗体(5μg/ml和25ng/ml)通过与人PBMC一起温育24小时，检查了由三特异性结合蛋白变体诱导的细胞因子产生(图11A和11B)。收集24小时培养物上清液并用于测量上述上清液中的IL2、IL6、IL10、IL12和TNF-α、IFN-γ浓度。CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4、CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4、CD38VH1xCD28cvnxCD3midIgG4、CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4均以5μg/ml刺激产生显著水平的IL2、TNF-α和IFN-γ，但未能以25ng/ml诱导任何细胞因子的可测量水平，剂量显示2种人源化NSG小鼠模型的体内功效。
如上所述，针对三特异性结合蛋白变体(图12A-13F)测试体内小鼠模型的抗肿瘤活性。图12A-12E显示了使用植入人MM细胞系RPMI-8226的人CD34+造血干细胞移植的NSG小鼠(hu-CD34)模型的体内功效研究的结果。CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4和基准(benchmarker)对照CD38xCD3双特异性抗体用于以指定剂量3QW(总共6个剂量)治疗具有肿瘤的小鼠。测量每只小鼠的体重和肿瘤生长并绘图(图12A和12E)。还绘制了每组的平均肿瘤生长曲线(图12D)，第18天肿瘤体积(图12B)和D19终末肿瘤重量(图12C)。与PBS对照相比，用CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4处理的所有组不仅显示统计功效，而且与对照CD38xCD3双特异性抗体相比，在1μg/kg剂量也显示出统计学上更好的功效。
图13A-13F显示了使用植入人MM细胞系RPMI-8226的人PBMC人源化NSG小鼠模型的体内功效研究的结果。CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4和基准对照CD38xCD3双特异性抗体用于以指定剂量3QW(总共8个剂量)治疗具有肿瘤的小鼠。测量每只小鼠的肿瘤生长并作图(图13A)。还绘制了每组的平均肿瘤生长曲线(图13F)，第4天肿瘤体积(开始治疗的那天；图13B)，第21天肿瘤体积(最后一次治疗的那天；图13C)，第21天平均肿瘤体积(图13D)和第22天终末肿瘤重量(图13E)。与PBS对照相比，用CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4处理的所有组不仅显示出统计功效，而且与对照CD38xCD3双特异性抗体相比，显示出在多剂量下统计学上更好的效力，这表明三特异性抗CD38/CD3/CD28抗体具有优异的体内抗肿瘤活性。
基准对照CD38xCD3双特异性抗体包含以下序列：
SEQ ID NO 108：基准重链1(结合CD38)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNWVRQAPGKGLEWV
SEINPQSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARY
GNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI
SRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWEQGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 109：基准重链2(结合CD3)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWV
GRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
VRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPGSGKPGSGKPGSQA
VVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGG
TNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFG
GGTKLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT
CVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV
LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREQMTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 110：基准轻链(结合CD38)
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDTWVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例6：用抗CD38 mAb2和含mAb6的三特异性结合蛋白的剂量递增研究
材料和方法
所有NHP研究均由Covance(Princeton,New Jersey,USA)根据Covance ICUCA方案进行。在所有研究中使用未经药物和蛋白质或未经蛋白质处理的雄性食蟹猴(CynomolgusMonkeys)。基于研究设计，选择猴并对每种三特异性结合蛋白进行分组。经由隐静脉静脉输注给予抗体1小时。对于低剂量(<10μg/kg)，连续几天给予增加的剂量，但是为了观察目的，对于更高剂量(>10μg/kg)具有1-2天的间隔。如所指出的，在每次剂量后所有动物的输注开始后0小时(仅第1天)、0.5小时(中间输注)、1小时和6小时收集血液样品。根据研究主任、病理学家和/或临床兽医的判断，收集了额外的计划外血液样本。在第60天将所有动物放回集群中。使用标准方法制备来自血液样品的PBMC和血清，并保存用于将来的分析。
来自经处理的非人灵长类动物的血液用针对T细胞标志物和人IgG，Fcγ片段的荧光缀合抗体染色，并在流式细胞仪上分析。
结果
使用含有mAb2的CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4，含有mAb6的CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4，含有mAb2的CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4和含有mAb6的CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4三特异性结合蛋白的剂量递增毒性研究在非人灵长类动物中进行。4种结合蛋白中的所有三个结合结构域与食蟹猴CD38/CD3/CD28多肽交叉反应。该研究旨在评估分子的潜在毒性特征。收集血样用于血清和PBMC分离。在每次给药后研究循环T细胞群(图14E-14H)，以及T细胞亚群活化(CD69+)(图14A-14D)。随着剂量递增，循环中CD4和CD8 T细胞的百分比降低。从2.5μg/kg剂量开始，显著的CD4和CD8 T细胞活化是显著的，表明对含mAb2和mAb6的分子具有有效的活化能力。用12.5μg/kg的所有蛋白质可见显著的循环T细胞缺失(图14I-14L)，再次与效力相关。循环T细胞的消耗是相当短暂的，在24-48小时后恢复预处理水平(图14M-14P)。还测量了几种细胞因子的血清水平。在12.5μg/kg观察到显著的IL-6和IL-10释放，所有分子相当短暂，在24小时返回基线(图14U)。
CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4(图14V)和CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4(图14W)均以较高剂量诱导血液中T细胞的消耗。类似地，CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4(图14X)和CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4(图14Y)也在较高剂量下诱导血液中T细胞的消耗。然而，在用四种三特异性结合蛋白中的任何一种处理后24小时，T细胞开始重新出现在血液中(图14Z-14AC)。图14AD和14AE显示施用100μg/kg剂量后与CD4+T细胞结合的CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4的量。图14AF和14AG显示施用100μg/kg剂量后与CD8+T细胞结合的CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4的量。这些数据清楚地证明，三特异性AbCD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4可以在延长的时间(48-72小时)内在体内与T细胞结合。
实施例7：通过Fc变体优化药代动力学/药效学
材料和方法
将C末端6-His标记的重组人FcγRI(R&D系统#1257-FC-050)、C末端带10-His标签的重组人FcγRIIA(R&D系统#1330-CD-050/CF)和C末端带HPC4标签的重组人FcγRIII(V158或F158)捕获至Biacore芯片。注射200、100和50nM的抗体2分钟，然后使用Biacore200以30μL/min的流速在HBS-P+、2mM CaCl2pH 7.4缓冲液中解离2分钟。显示在200nM的结合曲线。
使用C末端带HPC4标签的重组人新生儿Fc受体(FcRn)的ELISA测定用于测量具有不同Fc修饰的三特异性结合蛋白的结合特性。简言之，将重组人新生儿Fc受体(FcRn)用于包被ELISA板(Nunc 80040LE)(PBS中2μg/ml)过夜。将具有不同Fc修饰的连续稀释的三特异性结合蛋白添加到每个孔中，并在室温温育1小时，然后洗涤并用HRP标记的抗人IgG二抗温育。
结果
接着测定上述三特异性结合蛋白的变体与多种Fc受体的结合，以优化药代动力学(PK)/药效学(PD)。
如上所述，表征人Fc变体与FcγR I(图15A)、FcγR IIa(图15B)和FcγRIIIb/c(图15C)的结合。测试的变体是人IgG1、人IgG4和具有FALA突变的人IgG4(根据EU Index的F234A和L235A)，具有对照三特异性结合蛋白。
如图15A-15C所示，野生型IgG1和IgG4能够结合FcγR I和FcγR IIa，而不能结合FcγR IIIb/c，如先前报道的。IgG4 FALA突变消除了FcγR I和FcγR IIa结合。在不希望受理论束缚的情况下，认为消除FcγR I和FcγR IIa结合可通过去除通过Fc/FcγR相互作用的非预期聚类来改善PK/PD。
接下来，检查IgG4 FALA变体的结合FcRn。变体以及野生型IgG4与FcRn结合(图16)。这些结果证明IgG4 FALA突变不影响IgG4 Fc和FcRn之间的相互作用，暗示对结合蛋白半衰期的影响最小。
如在NSG小鼠中测定的，CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4、CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4FALA、CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG1 LALA P329A和CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA的PK参数汇总于图17中。通过消除与巨噬细胞中丰富的NSG特异性FcγRI的结合，IgG4 Fc修饰在NSG小鼠中显示出显著改善的半衰期和AUC。
实施例8:抗CD38三特异性结合蛋白的体外活化和体内抗肿瘤功效
材料和方法
细胞因子从人PBMC中释放
将人PMBC与100pM的结合蛋白一起温育24小时。收集上清液，并使用Drop Array板(一式三份)通过Luminex测量细胞因子。对于使用肿瘤靶细胞的实验，将人PMBC与100pM的抗体一起温育，并且与或不与RPMI-8226靶细胞以10:1E:T比例温育24小时。在PMBC与三特异性蛋白温育后收集上清液，并用MAP试剂盒测定细胞因子，并在系统上分析。
Bcl-xL测定
将来自PBMC(磁性)的阴性分选的T细胞与100nM平板结合的Ab一起温育1天。然后洗涤T细胞并用对T细胞标志物和Bcl-xL特异性的荧光缀合的抗体染色，并在流式细胞仪上分析。
T细胞增殖
将来自PBMC的阴性分选的T细胞(磁珠细胞分离)与平板结合的Ab(100nM)一起温育1至6天。在温育开始后的特定天数使用计数珠子通过流式细胞术计数总细胞。从第0天细胞计数(500个细胞/uL)计算倍数变化。来自3名PBMC供体的结果。
IL-2表达
将GloResponseTMIL2-luc2P Jurkat细胞与三特异性蛋白一起温育6小时，然后使用Bio-GloTM荧光素酶测定系统检测荧光素酶报告基因表达。
PBMC体外活化
测定用抗CD38xCD28xCD3三特异性抗体或对照IgG4结合蛋白处理的人PBMC细胞的活化(CD69+)。
在播散性肿瘤模型中的体内功效
对于播散性hu-PMBC NSG小鼠模型，在第0天将1-5×106个细胞静脉内注射到每个小鼠中。在第3天，进行基线亮度成像用于随机化。在第4天，将来自健康供体的10x106个人PBMC腹膜内(IP)重组至每只小鼠。使用指定剂量在第5、12、19天每周处理小鼠。在第10、17、24天进行每周亮度身体成像，以监测每只动物的肿瘤体积。在研究结束时，收集血液、脾脏、骨骼和骨髓用于组织病理学研究。
结果
与具有野生型Fc区(图18A)的类似结合蛋白相比，含有mAb2的抗CD38x抗CD28x抗CD3三特异性结合蛋白与IgG4 FALA变体Fc区在人PBMC中引起显著降低的非特异性IFN-γ释放水平。随着IL-2(图18B)和TNF-α(图18C)的释放观察到类似的结果。重要的是，这些Fc变体三特异性结合蛋白的细胞因子释放显著低于基准双特异性抗CD38x抗CD3双特异性抗体。这些结果暗示，由于非特异性细胞因子释放的减少，三特异性结合蛋白与Fc变体的安全性得到改善。
含有mAb2的CD38VH1xCD28supxCD3mid和含有mAb6的CD38HH71370xCD28supxCD3mid的IgG1和IgG4 Fc变体也导致人PBMC的体外活化(图18D)。
通过连接CD28进行免疫共刺激是T细胞存活和增殖所必需的；单独的TCR信号传导不会导致T细胞增殖(Sharmee and Allison(2015)Science348:56-61)。三特异性结合蛋白CD38VH1xCD28supxCD3mid导致CD4+和CD8+T细胞中Bcl-xL的诱导，而去除CD28或CD3抗原结合结构域消除了这种效应(图19A和19B)。如所预期的，这些结果证明CD3和CD28结合臂是在T细胞中抗CD38三特异性结合蛋白诱导Bcl-xL所需的，由此向T细胞递送促存活信号。三特异性结合蛋白的抗CD28臂对于T细胞中促存活Bcl-xL的上调是至关重要的。当与基准抗CD38x抗CD3双特异性抗体比较时，CD38VH1xCD28xCD3三特异性结合蛋白导致CD4+和CD8+T细胞中Bcl-xL的更大上调(图19C和19D)。
为了确定CD38VH1xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白对T细胞活化的主要驱动因子，使用Jurkat T细胞报告基因Jurkat系中含有人IL2启动子驱动荧光素酶报告基因的IL-2表达来测量活化。抗CD3结合结构域的敲除突变导致T细胞活化的消除，证明了T细胞活化是CD3连接的特异性作用(图19E)。这些结果表明，抗CD3是三特异性结合蛋白活化T细胞的主要驱动因子，抗CD28也对T细胞活化信号有显著贡献。还使用人PBMC检查细胞因子释放的主要驱动因子(图19F)。通过检测TNF、IFNg、IL-2、IL-6和IL-10的释放，发现CD3是细胞因子释放的主要决定因素。发现CD28的贡献最小。还发现具有抗CD38VH1的三特异性结合蛋白比基准比较物诱导更少的细胞因子释放。
还检查了T细胞增殖。使用具有IgG4 FALA变体Fc的抗CD38x抗CD28x抗CD3三特异性结合蛋白活化T细胞导致比基准或同种型对照更大的增殖(图19G)。在抗CD28或抗CD3抗原结合结构域突变时，这种活化减少(图20)。
接下来将人源化NSG小鼠模型用于体内实体瘤生长实验。在第6-8周用RPMI8226人骨髓瘤细胞植入小鼠。在第9周，通过ip注射引入人PBMC，重构hPBMC，并在第10-13周施用抗肿瘤治疗。将56只PBMC人源化NSG雌性小鼠在50％基质胶中植入500万个RPMI8226细胞，并选择小鼠并在植入后第5或6天随机进入研究中。该模型用作具有人成熟T细胞的小鼠的体内肿瘤模型。
还使用NCI-H929-Luc人骨髓瘤细胞和通过生物发光测定肿瘤生长，在播散性肿瘤生长的NSG小鼠模型中测定三特异性结合蛋白。具有IgG4 FALAFc变体的CD38VH1xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白在30μg/kg的该播散性肿瘤模型中显示出统计学上显著的剂量依赖性抗肿瘤功效(图21)。具有IgG4FALA Fc变体的CD38HHY1370xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白在30μg/kg和10μg/kg的该播散性肿瘤模型中也显示出统计学上显著的剂量依赖性抗肿瘤功效(图22)。
三特异性结合蛋白，含mAb2的CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA和含mAb6的CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA，显示使用来自两个供体的人源化NSG小鼠的人PBMC杀死针对NCI-H929-Luc骨髓瘤细胞的有效体外肿瘤杀伤活性(图23A&23B)。与基准双特异性抗体相比，CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA三特异性结合蛋白在播散性肿瘤模型中显示出优异的体内肿瘤活性(图23C)。如下确定与媒介物对照(PBS)比较的P值：CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA:p＝0.0023；CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA:p＝0.0088；基准双特异性CD38xCD3 Fab-scFv-Fc:p＝0.6045。
总之，这些结果证明具有变体Fc区的改进的抗CD38候选物显示出增加的半衰期、减少的非特异性细胞因子释放和更高的体内抗肿瘤功效。
实施例9:抗CD38三特异性结合蛋白的进一步表征
需要两个信号来刺激T细胞以获得最佳的效应子功能和持续的增殖。由T细胞受体(TCR)-CD3复合物介导的活化诱导转录活化，从而导致细胞因子分泌。第二表面膜蛋白CD28的参与刺激了另一种信号转导途径并抑制了程序性细胞死亡(Esensten JH,Helou YA等人Immunity 44:973-88(2016)；Hui E,Cheung J等人Science 355:1428-1433(2017))。在不存在第二信号的情况下，仅通过CD3的T细胞刺激通常导致活化诱导的细胞死亡(Chai JG，LechlerRI.Int Immunol.9：935-44(1997))。假设可以通过将针对这两个不同靶标的特异性组合来增加T细胞增殖。
图24A显示使用GloResponseTMIL2-luc2P Jurkat细胞(Promega)在10nM浓度的CD38VH1/CD28supxCD3mid及其单一结合位点KO和三重KO突变体刺激后进行的荧光素酶报告基因测定。这些数据说明了CD28对T细胞刺激(例如，NFAT信号传导)的贡献。
使用交叉双变量(CODV)双特异性Ab形式(Steinmetz A等人MAbs 8:867-878(2016))，评估α-CD3(信号1)和α-CD28(信号2)Fv的组合以确定这些细胞表面分子的双重参与是否可以刺激并维持T细胞活化(图24B)。使用中等亲和力(KD～20nM)抗CD3 Ab以避免引起高水平细胞因子释放并增加细胞因子释放综合征风险的高亲和力T细胞受体刺激。在双臂的两个位置上与先前示出支持T细胞增殖的超激动剂CD28 Ab组合测试了CD3激动剂(Waibler Z,Sender LY等人PLoS One 3:e1708(2008))。这些单价双特异性抗体在体外与人PBMC一起温育，并通过分泌干扰素-γ和IL-2来测量T细胞刺激。当两个方向是有活性时，观察到这些细胞因子的最佳释放，其中CD3在近端位置，CD28在远端位置(图24B)。然后选择该双臂与三特异性Ab形式中的抗CD38抗体配对(Xu L,Pegu A等人Science 358:85-90(2017))。
图25显示由CD38VH1/CD28supxCD3mid诱导的原代T细胞中Bcl-2家族成员Bcl-xL的上调是CD28依赖性的。这些数据说明了CD28对T细胞存活的贡献。
图26显示三特异性Ab中的抗CD28提供了在体外支持原代T细胞增殖所必需的二级信号传导。这些数据说明了CD28对T细胞增殖的贡献。
总之，这些数据显示CD38VH1/CD28supxCD3mid三特异性抗体中的抗CD28sup在体外T细胞活化、存活和增殖中提供了显著的功能。
图27显示了由亲本抗体编码的三特异性抗体的构型。还显示了基于抗CD38 VH1Fab和CD28sup/CD3mid CODV Fab(右图)的晶体结构获得的CD38VH1/CD28supxCD3mid三特异性Ab的结构模型。
图28A和28B显示具有高(RPMI-8226；图28A)和低(KMS-11；图28B)CD38表面表达的多发性骨髓瘤(MM)细胞被用各种浓度的三特异性Ab温育的人PBMC(E:T＝10:1)有效裂解。通过结合位点KO突变证明了每个结合位点对杀伤活性的贡献。这些数据表明CD38三特异性抗体通过识别CD38和CD28裂解人MM细胞。在多发性骨髓瘤细胞上表达的CD28通过CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA三特异性抗体提供二级靶标，显著增强其杀伤活性。
图29A-29C显示三特异性Ab的抗CD28supKO突变体在体外对CD38high、CD38mid和CD38low MM细胞显示出显著降低的抗肿瘤活性。所显示的是使用RPMI-8226(图29A)、U266(图29B)或KMS-11(图29C)细胞的测定。MM细胞上的CD28表达增加了它们对CD38三特异性抗体介导的细胞溶解的易感性。
图30显示使用用体外扩增的人原代T细胞重构的NSG小鼠在播散性人多发性骨髓瘤细胞系模型中的体内功效研究的结果。CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA三特异性抗体治疗组中肿瘤负荷的减少是剂量依赖性的并且在统计学上是不同的。因此，CD38三特异性抗体赋予对体内播散性人MM细胞肿瘤生长的保护。
显微镜研究进一步证明了体外由三特异性抗体介导的原代人T细胞对癌细胞的杀伤作用。图31A和31B显示了显示由CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA三特异性抗体介导的人PBMC裂解的RPMI-8226(人MM细胞，用CellTracker深红色染料标记)的显微图像。图31A显示了对照，而图31B显示了由CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA三特异性抗体介导的裂解。使用10:1E:T比例温育24小时。暴露于三重无效突变体对照Ab在24小时内诱导肿瘤细胞活力的最小变化(图31A)。相反，与活性CD38三特异性Ab一起温育诱导T细胞在肿瘤细胞周围的大量聚集，导致它们几乎完全裂解(图31B)。这些数据表明CD38/CD3xCD28三特异性抗体通过T细胞介导骨髓瘤细胞的细胞溶解。
实施例10：抗CD38三特异性结合蛋白的IgG4 Fc区中Fc受体结合位点的修饰减少非特异性炎症
抗体的Fc区与诱导非特异性炎症的单核细胞和NK细胞上的细胞受体结合，这可能使治疗受试者易患细胞因子释放综合征。通过测试消除了FcγI，FcγIIa,b和FcγIII结合的突变体，检查Fc受体在刺激细胞因子释放中的作用。为此目的，使用了不固定补体的IgG4同种型。
在使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor；Piscataway,NJ)的表面等离振子体共振(SPR)测定中的结合用于测量指定的IgG4 Fc变体与固定在芯片上的所示人Fc受体的亲和力。IgG4 Fc变体的使用量为150nM。使用ELISA通过将人FcRn抗原包被在板上来进行与人FcRn的结合。
先前已描述的Fc区中的突变(“FALA”)(Alegre ML,Peterson LJ等人Transplantation 57:1537-43(1994)；参见实施例7-9)消除了与所有Fc受体的结合(图32和33)。当测试非特异性细胞因子释放时，它废除了未刺激的PBMC中的IFN-γ释放，同时在存在表达CD38的肿瘤靶标的情况下允许最大刺激(图34，左侧相对于右侧，FALA)。该Fc突变体在表达不同水平的CD38的细胞中保留了与Fc野生型对照相当的其对骨髓瘤肿瘤靶标的细胞溶解活性(图35)。类似地，消除了与Fc受体结合的另一个突变的IgG4 Fc区(“PVA”，参见图32)(图33)也废除了未刺激的PBMC中的IFN-γ释放，同时在表达CD38的肿瘤靶标的存在下允许最大刺激(图34，左侧相对于右侧，PVA)，并在表达不同水平的CD38的细胞中保留了与Fc野生型对照相当的其对骨髓瘤肿瘤靶标的细胞溶解活性(图35)。
实施例11：抗CD38和抗CD28对三特异性结合蛋白的细胞溶解活性的贡献
产生每个结合位点或结合位点组合的三特异性Ab突变体，并测试其对具有高(RPMI-8226)和低(KMS-11)CD38以及CD28表面表达的多发性骨髓瘤细胞系的细胞溶解活性。
如以上图28A和28B所示，CD3特异性结合的突变废除了细胞溶解，而抗CD38和CD28无效突变显示出明显减少的杀伤作用，但是保留了一些残余功能，表明抗CD38和CD28两者都有助于肿瘤细胞杀伤。
与达雷木单抗(被批准用于治疗多发性骨髓瘤的α-CD38单克隆抗体；参见McKeageK.Drugs.76:275-81(2016))相比，三特异性Ab显示出在体外对表达CD38的不同细胞系(包括CD38high和CD38low多发性骨髓瘤细胞)显着提高3-4log的杀伤效力(图36)。
实施例12：CD38/CD3xCD28 Ab刺激中枢记忆性CD4和CD8、Th1和抗原特异性反应
为了确定CD38/CD3xCD28三特异性Ab是否可以增强细胞免疫功能，对体外扩增的T细胞的表型进行了评估。
材料和方法
从Research Blood Components,LLC(Boston,MA)收集的健康人类供体血液中分离出外周血单核细胞。如上所述，将PBMC添加至抗体包被的板(350ng/孔)(5x 105细胞/mL)中，并在37℃温育3天和7天。在特定时间点收集细胞，并通过流式细胞术分析T细胞亚群：(CCR7+CD45RO-)，Tcm(CCR7+CD45RO+)，Tem(CCR7-CD45RO+)，Tregs(CD4+Foxp3+CD25hi)。在流式染色之前，还用莫能菌素(GolgiStop)(BD Biosciences,CA)处理细胞至少6小时，以确定细胞内的细胞因子表达：Th1(CD4+IFN-γ+)，Th2(CD4+IL-4+)和Th17(CD4+IL-17+)。使用限于PBMC供体的HLA的荧光共轭五聚体(A*02:01/NLVPMVATV)(ProImmune,Oxford,UK)检测CMV pp65-特异性CD8+T细胞。PBMC从HemaCare(Van Nuys,CA)从已知CMV阳性人群和HLA类型的供体获得。来自对于限制性HLA类型阴性的供体的PMBC用作阴性对照。染色是根据制造商的方案进行的。
结果
在不存在细胞因子的情况下，将人PBMC与三特异性Ab或三突变体阴性对照一起温育7天。对CD4亚群的分析揭示了中枢记忆库中的最大增殖，效应记忆细胞的增加较小(图37A)。与Th2或Th17细胞相比，对CD4亚群的分析还揭示了Th1细胞的最大增殖(＞6倍)(图37B)。在CD8亚群中，到第7天，中枢记忆性CD8亚群增加＞150倍，而效应记忆细胞增加较少(图37C)。重要的是，针对使用四聚体染色的血清阳性HLA-A2供体中的pp65表位的对CMV的先前存在的抗原特异性CD8反应(Gratama JW,van Esser JW等人Blood98:1358-1364(2001))，与阴性对照相比，在存在CD38三特异性抗体的情况下增加>44倍(图37D)。
综上，这些数据表明，CD38三特异性Ab刺激Th1功能和保护性CD8记忆T细胞反应，这可能会增强体内的抗肿瘤免疫力。
实施例13：多发性骨髓瘤细胞上的CD28增加T细胞识别和细胞溶解
材料和方法
流式细胞术
如所描述的，使用QIFI试剂盒(Dako，Denmark，目录号K007811)通过流式细胞术确定所示肿瘤细胞系上的CD28和CD38水平(S4)。简要地，将小鼠抗人CD38(克隆AT13/5，小鼠IgG1，Santa Cruz Biotech，目录号59028)和抗人CD28(克隆CD28.2，小鼠IgG1，k，BioLegend，目录号3029123)用作主要抗体(10ug/ml)，用于使用制造商的方案检测细胞系上的表面CD38和CD28。使用QIFI试剂盒校准标准品和试剂盒提供的配方计算表面密度。
使用CRISPR介导的敲除产生CD28 KO人多发性骨髓瘤细胞系
对于KMS-11细胞系，使用CRISPR CD28人类基因敲除试剂盒(Origene)进行CD28的敲除。该试剂盒包含带有GFP嘌呤霉素功能盒的供体载体和两个不同的Cas-9载体，这两个Cas-9载体各自具有不同的预先设计的指导RNA(gRNA 1:TACCTGTTACTTGAATTGAA (SEQ IDNO:117)和gRNA 2:ATTTTTTGAGGTCTTCCAAT(SEQ ID NO:118)，分别靶向CD28外显子1和内含子1)。将细胞以3.105个细胞/孔的密度接种于6孔板中的RPMI 1640GlutaMAX培养基(补充有10％FBS)中，并在24小时后根据制造商的说明使用LipofectamineTM3000转染试剂(ThermoFisher Scientific)与所有三种载体一起共转染。转染48小时后添加嘌呤霉素，终浓度为0.5μg/mL。当使用6.25μL/孔的LipofectamineTM3000、1.25μg每个Cas-9/gRNA载体和2.5μg GFP-嘌呤霉素供体载体时，转染效率为30％。使用CD28 sgRNA CRISPR多合一慢病毒套装(Applied Biological Materials Inc.)在RPMI 8226细胞系上敲除CD28。它由一组表达Cas9基因、嘌呤霉素抗性基因和不同的sgRNA(靶向CD28外显子2的sgRNA 1:ATTGTCGTACGCTACAAGCA(SEQ ID NO:119)以及靶向CD28外显子3的sgRNA 2:CAAAAGGGCTTAGAAGGTCC(SEQ ID No:120)和sgRNA 3:CTATAGCTTGCTAGTAACAG(SEQ ID NO:121)的三种慢病毒多合一载体组成。使用旋转接种(spinoculation)方案感染细胞，其中将2.105个细胞与慢病毒颗粒(10UI细胞)、8μg/mL的聚凝胺和1:100ViralPlus转导增强剂(Applied Biological Materials Inc.)混合。将混合物在室温预温育20分钟，然后在32℃和800×g离心30分钟并接种于12孔板中。感染后48小时添加嘌呤霉素，终浓度为0.25μg/mL。使两种细胞系传代至少5次(或直至细胞活力变稳定)，之后通过流式细胞术(CD28 PE克隆28.2抗体-BioLegend)在蛋白水平上确认CD28敲低。然后将CD28阴性细胞在Sony SH800S细胞分选仪上分选，并在补充有0.25μg/mL或0.5μg/mL嘌呤霉素、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养基(ThermoFisher Scientific)中进行培养。然后通过有限稀5释和通过流式细胞术验证的CD28敲除并且通过PCR和Sanger测序使用下面
列出的正向和反向引物来克隆细胞。
表R.正向和反向引物列表。
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结果
将CD28并入到三特异性Ab中以改善T细胞增殖和存活；然而，当在多发性骨髓瘤细胞上评估细胞表面标志物时，发现大多数细胞系(>95％)表达CD28糖蛋白(表S)。
表S.CD28和CD38在人多发性骨髓瘤细胞系上的细胞表面表达。
据报道，CD28表达虽然在正常浆细胞中不存在(Almeida J等人British J.ofHaematol.107:121-131(1999))，但是在大约三分之一的新诊断患者的原发性骨髓瘤浆细胞上可以检测到(Mateo G等人Clin.Cancer Res.11:3661–3667(2005))。此外，它在骨髓瘤进展期间频率增加，并且与骨髓瘤的不良预后和侵袭性特征相关(Robillard N,Jego G等人Clin Cancer Res.4:1521-6(1998)；Nair JR,Carlson LM等人J Immunol.187:1243-53(2011))。
为了确定靶细胞上的CD28表达是否可以改善T细胞识别和裂解，比较了野生型相对于CD28无效三特异性Ab对三种具有不同程度的CD38和CD28表达的独立性骨髓瘤细胞系的活性。如以上在实施例9中所述和在图29A-29C中所示，在所有三个系上均观察到细胞溶解，无论CD38三特异性Ab的CD28表达水平如何；然而，针对所有细胞系，CD28无效三特异性Ab的细胞溶解活性降低了30-100倍，在显示最低CD38表达的KMS-11细胞系中最显著地降低(参见WT相对于ΔCD28，图29C相对于图29A或图29B)。
使用CRISPR介导的骨髓瘤靶细胞上CD28的敲除进一步证实了CD28对肿瘤细胞识别和裂解的贡献。与亲本系相比，在CD28KO KMS-11细胞上检测不到CD28表达(图38，上图，左侧相对于右侧)。CD28KO KMS-11细胞对T细胞细胞溶解的敏感性伴随地降低了10-100倍(图38，下图，左侧)。与该效应一致，与在CD38 KO靶细胞上的CD28无效突变体三特异性相比，用CD38三特异性未见到细胞溶解的差异(图38，下图，右侧)。
实施例14：CD38三特异性Ab对CD38+血液癌细胞系的细胞溶解
先前的实施例证明了三特异性抗CD38/CD3/CD28抗体，其促进多发性骨髓瘤细胞的细胞溶解。测试了这些抗体促进其他癌细胞系细胞溶解的能力。
如图39所示，CD38/CD28xCD3三特异性FALA突变体Ab具有靶向CD38+CD28-系的细胞溶解活性，所述CD38+CD28-系包括急性髓细胞白血病(AML(KG-1))、B细胞淋巴瘤(OCI-Ly19)、急性T淋巴细胞性白血病(ALL(KOPN8))和慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL(Z-138))。这表明三特异性抗CD38/CD3/CD28抗体对其他CD38+血液癌细胞系(包括为CD28-的那些)具有活性。
实施例15：通过α-CD28超激动剂的人PBMC的体外活化需要抗体的双价。
通过TGN1412(TGN)、单结合臂TGN1412(TGNslg)和单结合臂抗CD28sup(CD28supslg)的人PBMC的体外活化如所述进行(Findlay L,Eastwood D等人J Immunol Methods 352:1-12(2010))。如前所述，将105个人PBMC接种到用所示抗体(1ug/孔)干燥包被的聚丙烯96孔板上24小时。如实施例8所述，通过Luminex测量上清液中的细胞因子如IFN-γ、TNF-α和IL2。
包含CD28超激动剂的单一特异性还减少了用CD28超激动剂mAb(图40)所见的非特异性细胞因子释放，这先前与其在人体中作为天然IgG的不良作用相关(SuntharalingamG,Perry MR等人N Engl J Med355:1018-1028(2006))。相反，通过三特异性Ab的共同刺激提高了溶解和预防肿瘤的T细胞的效力和存活。更有趣的是，CD38三特异性Ab在体外优先扩增Th1和Tcm细胞群体，表现出不同于用于繁殖Treg诱导耐受性的α-CD3激动剂或α-CD28超激动剂单克隆抗体的重要特征(Penaranda C1,Tang Q,Bluestone JA.J Immunol.187:2015-22.(2011)；Tabares P,Berr S等人Eur JImmunol.44:1225-36(2014))。
综上，实施例1-15中提供的数据证明了三特异性抗CD38/CD3/CD28抗体，其通过接合两个T细胞信号受体并增强靶细胞识别来刺激有效的抗肿瘤免疫力。CD3和CD28结合触发了T细胞受体信号传导，从而上调Bcl-xl并抑制T细胞凋亡，提高T细胞效应子功能和存活。三特异性Ab的第三臂与CD38相互作用，CD38在多发性骨髓瘤细胞上高度表达。巧合地，CD28也在大多数骨髓瘤的细胞上表达。因此，三特异性Ab在增强T细胞活化和细胞溶解的同时改善了靶向性。优化的三特异性抗体比达雷木单抗(抗CD38 mAb治疗剂)更有效地裂解骨髓瘤细胞>1000倍，并且在人源化小鼠模型中显示出有效的体内抗肿瘤活性。
尽管本公开包括多种实施方案，但应理解，本领域技术人员会想到变化和修改。因此，意图是所附权利要求覆盖落入本公开范围内的所有这些等同变化。另外，这里使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所述主题。
除非明确地相反指出，否则本文所述的每个实施方案可以与任何其他一个或多个实施方案组合。特别地，除非明确地相反指出，否则被指示为优选或有利的任何特征或实施方案可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征或实施方案组合。
本申请中引用的所有参考文献通过提述明确并入本文。

Claims (10)

1.一种结合蛋白，其包含结合CD38多肽的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ IDNO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
2.权利要求1的结合蛋白，其中所述抗原结合位点包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列，含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列，和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列，含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列，和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
3.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中所述VH结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:87)或QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(SEQ ID NO:88)；其中FR2包含序列MHWVKEAPGQRLEWIGY(SEQ ID NO:90)或MHWVKEAPGQGLEWIGY(SEQ ID NO:91)；其中FR3包含序列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:93)或NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:94)；和其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:96)。
4.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
5.权利要求4的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体轻链。
6.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
7.权利要求6的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。
8.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
9.权利要求8的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。
10.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和所述VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
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