JP2024020377A - 抗cd38抗体および使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】CD38ポリペプチド、例えば、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する結合タンパク質を提供する。【解決手段】結合タンパク質は、CD38ポリペプチドに結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを有する単一特異性、二重特異性、または三重特異性結合タンパク質である。本開示は、CD38ポリペプチドに結合する結合タンパク質を作製するための方法およびこのような結合タンパク質の使用も提供する。【選択図】図3A
Description
関連出願に対する相互参照
本出願は、2017年10月10日に出願された米国仮出願第62/570,655号、2017年10月11日に出願された米国仮出願第62/570,660号、2018年5月24日に出願された米国仮出願第62/676,221号、および2018年8月3日に出願されたEP出願第EP18187186.4号の優先権の利益を主張し、これらのすべてを参照によってその全体として本明細書に組み入れる。
本出願は、2017年10月10日に出願された米国仮出願第62/570,655号、2017年10月11日に出願された米国仮出願第62/570,660号、2018年5月24日に出願された米国仮出願第62/676,221号、および2018年8月3日に出願されたEP出願第EP18187186.4号の優先権の利益を主張し、これらのすべてを参照によってその全体として本明細書に組み入れる。
ASCIIテキストファイルでの配列表の提出
ASCIIテキストファイルでの以下の提出の内容を参照によってその全体として本明細書に組み入れる:配列表のコンピュータで読み込み可能な形式(CRF)(ファイル名:183952029941seqlist.TXT、記録日:2018年10月8日、サイズ:158KB)。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出の内容を参照によってその全体として本明細書に組み入れる:配列表のコンピュータで読み込み可能な形式(CRF)(ファイル名:183952029941seqlist.TXT、記録日:2018年10月8日、サイズ:158KB)。
本開示は、CD38ポリペプチドに結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを有する単一特異性、二重特異性、または三重特異性結合タンパク質を含む、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチド)に結合する結合タンパク質、ならびにそれに関連するポリヌクレオチド、宿主細胞、産生方法、および使用方法に関する。
モノクローナル抗体をベースとする生物治療薬は、新薬開発のための重要な手段となっている。モノクローナル抗体技術は、特異的ターゲティング、特定の細胞集団への正確なシグナル伝達送達および/またはペイロードをもたらし、そのFc機能を介して長期間持続する生物学的効果を提供する。抗体エンジニアリングにおける努力によって、様々な生物学的適用のために複数のモノクローナル抗体の特異性を組み合わせる多重特異性抗体を開発し、抗体薬物開発の範囲を広げることが可能になった。
CD38は、種々のリンパ系腫瘍細胞の細胞表面で発現されるため、魅力的な薬物標的である(非特許文献1を参照されたい)。DARZALEX(登録商標)(ダラツムマブ)は、多発性骨髄腫の処置において使用を承認された抗CD38抗体である。しかしながら、以下に限定されないが、CD38への高親和性結合、ヒトCD38ポリペプチドとカニクイザルCD38ポリペプチドの間の交差反応性、リンパ腫細胞(例えば、多発性骨髄腫、大細胞型B細胞リンパ腫細胞株)への結合、ならびにアポトーシスおよび/または抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)およびT細胞介在抗腫瘍活性を誘導する能力を含む、異なる作用方式および/または改良された特性を有するCD38を標的とする治療薬に対する需要が存在する。
Stevenson,G.T.(2006) Mol.Med.12:345~346頁
CD38ポリペプチドに結合する少なくとも1つの抗原結合部位を有する単一特異性、二重特異性、または三重特異性結合タンパク質を含む、CD38ポリペプチド(例えば、
ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチド)に結合する結合タンパク質が、本明細書において提供される。有利なことに、これらの結合タンパク質は、がん細胞の近位へとT細胞を動員し、次に、T細胞を活性化し、グランザイム/パーフォリン機構を介して活性化T細胞による隣接がん細胞の殺滅を促進し、DARZALEX(登録商標)(ダラツムマブ)のような抗CD38抗体に由来する抗腫瘍活性とは異なる作用方式を提供する能力を有する。さらに、ヒトCD38ポリペプチドとカニクイザルCD38ポリペプチドの両方に結合する能力により、例えば、後の臨床用途のためのそれらの安全性プロファイルを評価するために、前臨床毒性学研究において結合タンパク質を容易に試験することが可能になる。
ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチド)に結合する結合タンパク質が、本明細書において提供される。有利なことに、これらの結合タンパク質は、がん細胞の近位へとT細胞を動員し、次に、T細胞を活性化し、グランザイム/パーフォリン機構を介して活性化T細胞による隣接がん細胞の殺滅を促進し、DARZALEX(登録商標)(ダラツムマブ)のような抗CD38抗体に由来する抗腫瘍活性とは異なる作用方式を提供する能力を有する。さらに、ヒトCD38ポリペプチドとカニクイザルCD38ポリペプチドの両方に結合する能力により、例えば、後の臨床用途のためのそれらの安全性プロファイルを評価するために、前臨床毒性学研究において結合タンパク質を容易に試験することが可能になる。
一部の実施形態では、ヒトCD38ポリペプチドに結合する単一特異性結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトアイソフォームAおよびアイソフォームE CD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、以下の構成のうちの1つまたはそれ以上を(任意の組合せで)有する:SPRによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、1.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nM、15nM、10nM、5nM、1nM、またはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、3.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、7.5nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;ELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;その細胞表面でCD38を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導する;ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、FcγRIおよび/またはFcγRIIへの結合の減少をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域において)を有する。例示的なアッセイとして、実施例1、3、および4を参照されたい。一部の実施形態では、KDは、4℃または25℃で測定される。
一部の実施形態では、ヒトCD38ポリペプチドに結合する三重特異性結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、CD38ポリペプチド(例えば、細胞表面で発現される)および第2の細胞の表面で発現される1つまたはそれ以上の他の標的抗原に(例えば、同時に)結合し、それによって、CD38ポリペプチドを発現する細胞の近位に第2の細胞を動員する。一部の実施形態では
、三重特異性結合タンパク質は、CD38ポリペプチド(例えば、細胞表面で発現される)およびT細胞表面で発現される1つまたは2つの標的抗原に(例えば、同時に)結合し、それによって、CD38ポリペプチドを発現する細胞の近位にT細胞を動員する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、T細胞を活性化するおよび/またはT細胞にCD28介在性同時刺激シグナルをもたらす。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ヒトアイソフォームAおよびアイソフォームE CD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、以下の構成のうちの1つまたはそれ以上を(任意の組合せで)有する:SPRによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、1.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nM、15nM、10nM、5nM、1nM、またはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、3.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、7.5nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;ELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;その細胞表面でCD38を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導する;ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、FcγRIおよび/またはFcγRIIへの結合の減少をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域において)を有する;T細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)の増殖を誘導する;Bcl-xLのT細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)による発現を誘導する;CD38+細胞のアポトーシスを誘導する;細胞表面で発現されるCD38およびT細胞表面で発現される1つまたはそれ以上のT細胞標的抗原に結合する;細胞表面で発現されるCD38、T細胞表面で発現されるCD28、およびT細胞表面で発現されるCD3に結合する;T細胞受容体の活性化を刺激する;T細胞受容体のシグナル伝達の同時刺激を誘導する(例えば、CD28によって介在される場合);ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、PBMCによるサイトカイン放出(例えば、IFN-γ、IL-2、および/またはTNF-α)の誘導の低下をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域に)を有する;CD38+標的細胞の存在下でPBMCによるサイトカイン放出(例えば、IFN-γおよび/またはIL-6)を誘導する。例示的なアッセイとして、実施例1、3、および4を参照されたい。一部の実施形態では、KDは、4℃または25℃で測定される。
、三重特異性結合タンパク質は、CD38ポリペプチド(例えば、細胞表面で発現される)およびT細胞表面で発現される1つまたは2つの標的抗原に(例えば、同時に)結合し、それによって、CD38ポリペプチドを発現する細胞の近位にT細胞を動員する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、T細胞を活性化するおよび/またはT細胞にCD28介在性同時刺激シグナルをもたらす。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ヒトアイソフォームAおよびアイソフォームE CD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、以下の構成のうちの1つまたはそれ以上を(任意の組合せで)有する:SPRによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、1.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nM、15nM、10nM、5nM、1nM、またはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRによってアッセイされる場合、3.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、7.5nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;ELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;その細胞表面でCD38を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導する;ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、FcγRIおよび/またはFcγRIIへの結合の減少をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域において)を有する;T細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)の増殖を誘導する;Bcl-xLのT細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)による発現を誘導する;CD38+細胞のアポトーシスを誘導する;細胞表面で発現されるCD38およびT細胞表面で発現される1つまたはそれ以上のT細胞標的抗原に結合する;細胞表面で発現されるCD38、T細胞表面で発現されるCD28、およびT細胞表面で発現されるCD3に結合する;T細胞受容体の活性化を刺激する;T細胞受容体のシグナル伝達の同時刺激を誘導する(例えば、CD28によって介在される場合);ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、PBMCによるサイトカイン放出(例えば、IFN-γ、IL-2、および/またはTNF-α)の誘導の低下をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域に)を有する;CD38+標的細胞の存在下でPBMCによるサイトカイン放出(例えば、IFN-γおよび/またはIL-6)を誘導する。例示的なアッセイとして、実施例1、3、および4を参照されたい。一部の実施形態では、KDは、4℃または25℃で測定される。
一部の実施形態では、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパ
ク質であって、抗原結合部位が:(a)GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに/または(b)ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、抗原結合部位は:(a)GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに/または(b)ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合部位は:(a)GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに/または(b)ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む。一部の実施形態では、VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(配列番号86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(配列番号87)、またはQVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(配列番号88)を含み;FR2は、配列MHWVKEAPGQRLEWIGY(配列番号90)またはMHWVKEAPGQGLEWIGY(配列番号91)を含み;FR3は、配列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(配列番号93)またはNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(配列番号94)を含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号19のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号22のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗原結合部位は:(a)GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含
むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに(b)QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む。一部の実施形態では、VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(配列番号86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(配列番号87)、またはQVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(配列番号88)を含み;FR2は、配列MHWVKEAPGQRLEWIGY(配列番号90)またはMHWVKEAPGQGLEWIGY(配列番号91)を含み;FR3は、配列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(配列番号93)またはNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(配列番号94)含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
ク質であって、抗原結合部位が:(a)GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに/または(b)ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、抗原結合部位は:(a)GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに/または(b)ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合部位は:(a)GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに/または(b)ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む。一部の実施形態では、VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(配列番号86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(配列番号87)、またはQVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(配列番号88)を含み;FR2は、配列MHWVKEAPGQRLEWIGY(配列番号90)またはMHWVKEAPGQGLEWIGY(配列番号91)を含み;FR3は、配列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(配列番号93)またはNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(配列番号94)を含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号19のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号22のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗原結合部位は:(a)GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含
むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに(b)QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む。一部の実施形態では、VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(配列番号86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(配列番号87)、またはQVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(配列番号88)を含み;FR2は、配列MHWVKEAPGQRLEWIGY(配列番号90)またはMHWVKEAPGQGLEWIGY(配列番号91)を含み;FR3は、配列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(配列番号93)またはNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(配列番号94)含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
一部の実施形態では、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、抗原結合部位が:(a)GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに(b)QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含む、および/またはVLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号11のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号12のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、2.1nMまたはそれ以下の平衡解離定数(KD)で、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号105のアミノ酸配列を含むヒトアイソフォームE CD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、1.3nMまたはそれ以下の平衡解離定数(KD)で、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する。
上記実施形態のうちのいずれかの一部の実施形態では、結合タンパク質は、キメラまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒト抗体である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、Fc領域を含む1つまたはそれ以上の全長抗体重鎖を含む。一部の実施形態では、Fc領域は、Fc受容体結合および/またはFc領域のエフェクター機能を低減または排除する1つまたはそれ以上の変異を含むヒトFc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、ヒトIgG1
Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、ヒトIgG1 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである。一部の実施形態では、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~237位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、配列EFLGGがPVAGによって置きかえられる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、抗体F(ab)、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、またはscFv断片を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞毒性剤または標識にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CD38ポリペプチドに結合する第1の抗原結合部位および第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CD38ポリペプチドに結合する第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、第1の抗原結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、第2および第3の抗原結合部位はそれぞれ、T細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態では、第1の抗原結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、(a)第2の抗原結合部位は、ヒトCD28ポリペプチドに結合し、第3の抗原結合部位は、ヒトCD3ポリペプチドに結合するか、または(b)第2の抗原結合部位は、ヒトCD3ポリペプチドに結合し、第3の抗原結合部位は、ヒトCD28ポリペプチドに結合する。
Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、ヒトIgG1 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである。一部の実施形態では、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~237位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、配列EFLGGがPVAGによって置きかえられる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、抗体F(ab)、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、またはscFv断片を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞毒性剤または標識にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CD38ポリペプチドに結合する第1の抗原結合部位および第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CD38ポリペプチドに結合する第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、第1の抗原結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、第2および第3の抗原結合部位はそれぞれ、T細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態では、第1の抗原結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、(a)第2の抗原結合部位は、ヒトCD28ポリペプチドに結合し、第3の抗原結合部位は、ヒトCD3ポリペプチドに結合するか、または(b)第2の抗原結合部位は、ヒトCD3ポリペプチドに結合し、第3の抗原結合部位は、ヒトCD28ポリペプチドに結合する。
一部の実施形態では、それぞれ、1つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、3つの抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号1または配列番号105のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドと交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する抗原結合部位ならびにそれぞれT細胞表面タンパク質に結合する2つの抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する抗原結合部位、ヒトCD28ポリペプチドに結合する抗原結合部位、ならびにヒトCD3ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNG(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配
列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH1ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH2ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;またはVH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;またはVH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を
含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;またはVH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2
配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;またはVH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む;またはVH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4のうちの少なくとも1つは、独立して、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4は、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である。一部の実施形態では、(a)L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、0アミノ酸長であるかもしくはGGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含み;または(b)L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、GGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPK
AAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、L1は、配列GQPKAAP(配列番号58)を含み、L2は、配列TKGPS(配列番号57)を含み、L3は、配列Sを含み、L4は、配列RTを含む;L1は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である;L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である;またはL1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vである。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号62のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号65のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、
第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号67のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号68のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号70のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の
ポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNG(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配
列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH1ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH2ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;またはVH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;またはVH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を
含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;またはVH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2
配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;またはVH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む;またはVH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4のうちの少なくとも1つは、独立して、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4は、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である。一部の実施形態では、(a)L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、0アミノ酸長であるかもしくはGGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含み;または(b)L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、GGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPK
AAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、L1は、配列GQPKAAP(配列番号58)を含み、L2は、配列TKGPS(配列番号57)を含み、L3は、配列Sを含み、L4は、配列RTを含む;L1は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である;L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である;またはL1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vである。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号62のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号65のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、
第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号67のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号68のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号70のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の
ポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、それぞれ、1つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、結合タンパク質は、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し;
(a)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそ
れぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである;または(b)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~237位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、配列EFLGGがPVAGによって置きかえられる。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、ならびにVH3およびVL3のうちの少なくとも1対は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、ならびにVH3およびVL3のうちの1、2、または3対は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1からなる群から選択される抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第1の対は、ヒトCD3ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、VH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第2の対は、ヒトCD28ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、ならびにVH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第3の対は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137
、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1からなる群から選択されるヒト抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する。
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し;
(a)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそ
れぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである;または(b)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~237位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、配列EFLGGがPVAGによって置きかえられる。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、ならびにVH3およびVL3のうちの少なくとも1対は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、ならびにVH3およびVL3のうちの1、2、または3対は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1からなる群から選択される抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第1の対は、ヒトCD3ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、VH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第2の対は、ヒトCD28ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、ならびにVH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第3の対は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137
、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1からなる群から選択されるヒト抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットであって:(a)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号74の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;(b)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号77の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;(c)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号79の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;(d)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号80の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチド;(e)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号82の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチド;または(f)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号83の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含むキットが本明細書において提供される。
一部の実施形態では、上記実施形態のうちのいずれか1つの結合タンパク質を含むポリヌクレオチドが本明細書において提供される。一部の実施形態では、上記実施形態のうちのいずれか1つの結合タンパク質を含むポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書において提供される。
一部の実施形態では、上記実施形態のうちのいずれか1つのポリヌクレオチドのキット、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む宿主細胞が本明細書において提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質を産生する方法であって、結合タンパク質が産生されるように、上記実施形態のうちのいずれか1つの宿主細胞を培養することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、宿主細胞から結合タンパク質を回収することをさらに含む。
一部の実施形態では、上記実施形態のうちのいずれか1つの結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。
一部の実施形態では、患者のがんを防止および/または処置する方法であって、上記実施形態のうちのいずれか1つの少なくとも1つの結合タンパク質または上記実施形態のうちのいずれか1つの医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CD3に結合する第1の抗原結合部位、CD28に結合する第2の抗原結合部位、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも1つ結合タンパク質は、化学療法剤とともに同時投与される。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、またはB細胞リンパ腫である。一部の実施形態では、患者は、ヒトである。一部の実施形態では、がん細胞がそれらの細胞表面にヒトCD38アイソフォームEポリペプチド(例えば、配列番号105に示されるような)を発現するため、患者は、処置のために選択される。一部の実施形態では、がん細胞は、CD38およびCD28を発現する。一部の実施形態では、がん細胞は、CD38を発現し、CD28を発現しない。
一部の実施形態では、患者(例えば、がんを有する患者のような、それを必要とする患者)のがんを防止および/または処置する際に使用するための上記実施形態のうちのいずれか1つの少なくとも1つの結合タンパク質または上記実施形態のうちのいずれか1つの医薬組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、患者(例えば、がんを有する患者のような、それを必要とする患者)のがんを防止および/または処置するための医薬の製造において使用するための上記実施形態のうちのいずれか1つの少なくとも1つの結合タンパク質または上記実施形態のうちのいずれか1つの医薬組成物が本明細書において提供される。上記実施形態のうちのいずれかの一部の実施形態では、結合タンパク質は、CD3に結合する第1の抗原結合部位、CD28に結合する第2の抗原結合部位、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも1つ結合タンパク質は、化学療法剤とともに同時投与されるべきである。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、またはB細胞リンパ腫である。一部の実施形態では、患者は、ヒトである。一部の実施形態では、がん細胞がそれらの細胞表面にヒトCD38アイソフォームEポリペプチド(例えば、配列番号105に示されるような)を発現するため、患者は、処置のために選択される。一部の実施形態では、がん細胞は、CD38およびCD28を発現する。一部の実施形態では、がん細胞は、CD38を発現し、CD28を発現しない。
本明細書に記載の様々な実施形態の特性の1つ、一部、またはすべてを本発明の他の実施形態を形成するために組み合わせることができることが理解されるべきである。本発明のこれらの態様および他の態様は、当業者にとって明らかとなると予想される。本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに記載される。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含有する。カラーの図面を有するこの特許または特許出願の公報のコピーは、請求と必要な手数料の支払いにより特許庁によって提供されると予想される。
本開示は、CD38ポリペプチドに結合する少なくとも1つの抗原結合部位を含む結合タンパク質を提供する。
I.一般的定義
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別段に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。文脈によって別段に要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。この明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、別段に明確に定義されない限り、複数形を
含む。よって、例えば、「分子(a molecule)」への言及は、場合により、2つまたはそれ以上のこのような分子の組合せなどを含む。
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別段に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。文脈によって別段に要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。この明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、別段に明確に定義されない限り、複数形を
含む。よって、例えば、「分子(a molecule)」への言及は、場合により、2つまたはそれ以上のこのような分子の組合せなどを含む。
本明細書に記載の本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことが理解されよう。
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、少なくとも10ヌクレオチド長の一本鎖または二本鎖核酸ポリマーを指す。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態である。このような修飾として、ブロモウリジンなどの塩基修飾、アラビノシドおよび2’,3’-ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホロアニラデート(phoshoraniladate)およびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間連結修飾が挙げられる。具体的には、用語「ポリヌクレオチド」は、DNAの一本鎖および二本鎖形態を含む。
「単離されたポリヌクレオチド」は、(1)単離されたポリヌクレオチドが天然に見られるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連していない、(2)天然に連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、または(3)より大きな配列の一部として天然に生じない、ゲノム、cDNA、もしくは合成起源のポリヌクレオチドまたはそれらのいくつかの組合せである。
「単離されたポリペプチド」は、(1)通常、ともに見られる少なくともいくつかの他のポリペプチドを含まない、(2)同一供給源に由来する、例えば、同一種に由来する他のポリペプチドを本質的に含まない、(3)異なる種に由来する細胞によって発現される、(4)天然に会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の材料のうち少なくとも約50パーセントから分離されている、(5)「単離されたポリペプチド」が天然に会合しているポリペプチドの部分と会合していない(共有結合性または非共有結合性相互作用によって)、(6)天然には会合していないポリペプチドと作動可能に会合している(共有結合性または非共有結合性相互作用によって)、または(7)天然には生じないものである。このような単離されたポリペプチドは、ゲノムDNA、cDNA、mRNAもしくは他のRNAによってコードされるか、合成起源のものであるか、またはそれらの任意の組合せである。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その使用(治療的、診断的、予防的、研究的または他の)を干渉すると予想される、その天然環境において見られるポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
天然に存在する抗体は、典型的には、四量体を含む。このような四量体はそれぞれ、典型的には、2つの同じポリペプチド鎖対から構成され、各対は、1つの全長「軽」鎖(典型的には、約25kDaの分子量を有する)および1つの全長「重」鎖(典型的には、約50~70kDaの分子量を有する)を有する。用語「重鎖」および「軽鎖」は、本明細書で使用される場合、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識を担う約100から110個またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能を担う定常ドメインを定義する。したがって、天然に存在する抗体では、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン(VH)および3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を含み、VHドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、CH3ドメインは、カルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン(VL)および定常ドメイン(CL)を含み、VLドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に
あり、CLドメインは、カルボキシル末端にある。
あり、CLドメインは、カルボキシル末端にある。
ヒト軽鎖は、典型的には、カッパおよびラムダ軽鎖として分類され、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEとして定義する。IgGは、以下に限定されないが、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含むいくつかのサブクラスを有する。IgMは、以下に限定されないが、IgM1およびIgM2を含むサブクラスを有する。IgAは、以下に限定されないが、IgA1およびIgA2を含むサブクラスに同様に細分される。全長軽鎖および重鎖内で、可変および定常ドメインは、典型的には、約12個またはそれ以上のアミノ酸の「J」領域によって、約10個多いアミノ酸の「D」領域も含む重鎖と接続される。例えば、すべての目的のために参照によってその全体を本明細書に組み入れる、FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul,W.編、Raven Press、第2版、1989)を参照されたい。各軽鎖/重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、典型的には、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって接続された比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の同一の一般構造を示す。各対の2つの鎖に由来するCDRは、典型的には、特定のエピトープとの結合を可能にするフレームワーク領域によってアラインされる。軽鎖および重鎖可変ドメインの両方は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、典型的には、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。
用語「CDRセット」は、抗原に結合することが可能な、単一可変領域中に生じる3つのCDRの群を指す。これらのCDRの正確な境界は、異なる系によって様々に定義されている。Kabat(Kabatら、SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1987)および(1991))によって記載された系は、抗体のいかなる可変領域にも適用可能な明白な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、3つのCDRを定義する正確な残基境界も提供する。これらのCDRは、Kabat CDRと称されることがある。Chothiaおよび共同研究者(ChothiaおよびLesk、1987、J.Mol.Biol.196:901~17頁;Chothiaら、1989、Nature 342:877~83頁)は、Kabat CDR内の特定の一部分(sub-portion)が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンホメーションをとることを見出した。これらの一部分は、L1、L2、およびL3またはH1、H2、およびH3と表され、ここで、「L」および「H」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を表す。これらの領域は、Chothia CDRと呼ばれることもあり、これは、Kabat CDRと重複する境界を有する。Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界は、Padlan、1995、FASEB J. 9:133~39頁;MacCallum、1996、J.Mol.Biol. 262(5):732~45頁;およびLefranc、2003、Dev.Comp.Immunol. 27:55~77頁によって記載されている。さらに他のCDR境界定義は、本明細書の系のものを厳密にたどらない場合もあるが、それにもかかわらず、Kabat CDRと重複するが、それらは、特定の残基または残基の群または全CDRでさえも、抗原結合に有意に影響を与えないという予測または実験的知見を鑑みて、短縮されるかまたは延長される。本明細書で使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されるCDRを利用することができるが、ある特定の実施形態は、KabatまたはChothiaによって定義されるCDRを使用する。アミノ酸配列を使用する予測されるCDRの同定は、Antibody Engineering、第2巻. Kontermann R.、Dubel S.編 Springer-Verlag、Berlin、33~51頁(2010)中の、Martin,A.C.「Protein sequence and st
ructure analysis of antibody variable domains」においてなど、当技術分野で周知である。重鎖および/または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列はまた、配列超可変性の領域を決定するために、他の従来方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列との比較によって、CDRの配列を同定するために検査される。番号付けされた配列は、目視によって、またはThompson、1994、Nucleic Acids Res. 22:4673~80頁に記載されるようなCLUSTALスーツのプログラムのうちの1つのようなアラインメントプログラムを用いることによって、アラインすることができる。分子モデルは、フレームワークおよびCDR領域を正確に描写し、よって、配列ベースの割り当てを補正するために従来のように使用される。
ructure analysis of antibody variable domains」においてなど、当技術分野で周知である。重鎖および/または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列はまた、配列超可変性の領域を決定するために、他の従来方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列との比較によって、CDRの配列を同定するために検査される。番号付けされた配列は、目視によって、またはThompson、1994、Nucleic Acids Res. 22:4673~80頁に記載されるようなCLUSTALスーツのプログラムのうちの1つのようなアラインメントプログラムを用いることによって、アラインすることができる。分子モデルは、フレームワークおよびCDR領域を正確に描写し、よって、配列ベースの割り当てを補正するために従来のように使用される。
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖におけるCDR/FRの定義は、IMGT定義(Lefrancら Dev.Comp.Immunol.、2003、27(1):55~77頁;www.imgt.org)に基づいて決定されるべきである。
用語「Fc」は、本明細書で使用される場合、単量体形態であるか多量体形態であるかにかかわらず、抗体の消化に起因するかまたは他の手段によって産生され、ヒンジ領域を含有する非抗原結合断片の配列を含む分子を指す。天然Fcの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくは、ヒト起源のものであり、免疫グロブリンのいずれかである。Fc分子は、共有結合的(すなわち、ジスルフィド結合)および非共有結合的会合によって二量体形態または多量体形態に連結される単量体ポリペプチドから構成される。天然Fc分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス(例えば、IgG、IgA、およびIgE)またはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2、およびIgG4)に応じて1から4の範囲である。Fcの一例は、IgGのパパイン消化により生じるジスルフィド結合された二量体である。用語「天然Fc」は、本明細書で使用される場合、単量体、二量体、および多量体形態に対して包括的である。
F(ab)断片は、典型的には、1つの軽鎖ならびに1つの重鎖のVHおよびCH1ドメインを含み、F(ab)断片のVH-CH1重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができない。本明細書で使用される場合、F(ab)断片はまた、アミノ酸リンカーによって分けられた2つの可変ドメインを含有する1つの軽鎖ならびにアミノ酸リンカーによって分けられた2つの可変ドメインおよびCH1ドメインを含有する1つの重鎖を含むことができる。
F(ab’)断片は、典型的には、2つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、F(ab’)2分子を形成することができるように、1つの軽鎖および定常領域のより多く(CH1およびCH2ドメインの間)を含有する1つの重鎖の部分を含む。
用語「結合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、少なくとも1つの標的抗原、例えば、本開示のCD38ポリペプチドに特異的に結合する天然に存在しない(または組換えもしくは操作された)分子を指す。
「組換え」分子は、組換え手段によって、調製され、発現され、作製され、または単離されたものである。
本開示の一実施形態は、1から3つの間の標的抗原に対して生物学的および免疫学的特異性を有する結合タンパク質を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供す
る。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示のさらに別の実施形態は、このような結合タンパク質を発現する(すなわち、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードする核酸分子またはベクターを含む)宿主細胞を提供する。
る。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示のさらに別の実施形態は、このような結合タンパク質を発現する(すなわち、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードする核酸分子またはベクターを含む)宿主細胞を提供する。
用語「交換可能性(swapability)」は、本明細書で使用される場合、結合タンパク質形式内の、フォールディングおよび最終的な結合親和性を保持した可変ドメインの互換性を指す。「完全交換可能性」は、結合親和性の保持によって証明されるような結合タンパク質の完全機能を維持しながら、式Iのポリペプチド鎖または式IIのポリペプチド鎖中のVH1およびVH2ドメイン両方の順序、したがって、VL1およびVL2ドメインの順序を交換する(すなわち、順序を逆転する)能力を指す。さらに、注目すべきは、命名VHおよびVLは、最終形態における特定のタンパク質鎖上のドメインの位置のみを指すことである。例えば、VH1およびVH2は、親抗体中のVL1およびVL2ドメインに由来し、結合タンパク質中のVH1およびVH2位置中に位置する。同様に、VL1およびVL2は、親抗体中のVH1およびVH2ドメインに由来し、結合タンパク質中のVH1およびVH2位置に位置する。よって、VHおよびVL命名は、親抗体中の元の位置ではなく現在の位置を指す。したがって、VHおよびVLドメインは、「交換可能」である。
用語「抗原」または「標的抗原」または「抗原標的」は、本明細書で使用される場合、結合タンパク質によって結合されることができ、その抗原のエピトープに結合することが可能な抗体を産生するために動物において使用することがさらに可能な分子または分子の一部を指す。標的抗原は、1つまたはそれ以上のエピトープを有する場合がある。結合タンパク質によって認識される各標的抗原に関して、結合タンパク質は、標的抗原を認識する無傷の抗体と競合することが可能である。
「CD38」は、分化38ポリペプチドのクラスターであり、多くの免疫細胞表面に見られる糖タンパク質である。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する。例示的なCD38細胞外ドメインポリペプチド配列として、以下に限定されないが、ヒト38の細胞外ドメイン(例えば、配列番号1で表されるような)およびカニクイザルCD38の細胞外ドメイン(例えば、配列番号30で表されるような)が挙げられる。
用語「T細胞エンゲージャー(engager)」は、宿主の免疫系、より詳細にはT細胞の細胞傷害性活性を対象とする、ならびに腫瘍標的タンパク質を対象とする結合タンパク質を指す。
用語「単一特異性結合タンパク質」は、1つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
用語「一価の結合タンパク質」は、1つの抗原結合部位を有する結合タンパク質を指す。
用語「二重特異性結合タンパク質」は、2つの異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、2つの異なる抗原に結合する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、同じ抗原上の2つの異なるエピトープに結合する。
用語「二価の結合タンパク質」は、2つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。
用語「三重特異性結合タンパク質」は、3つの異なる抗原標的と特異的に結合する結合タンパク質を指す。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、3つの異なる抗原に結合する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、同じ抗原上の1つ、2つ、または3つの異なるエピトープに結合する。
用語「三価の結合タンパク質」は、3つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。特定の実施形態では、三価結合タンパク質は、1つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、三価の結合タンパク質は、2つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、3つの抗原標的に結合することができる。
「単離された」結合タンパク質は、その天然環境の成分から同定および分離および/または回収されたものである。その天然環境の夾雑物成分は、結合タンパク質の診断的または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む場合がある。一部の実施形態では、結合タンパク質は、(1)ローリー方法によって決定される場合、抗体の95重量%超、最も好ましくは、99重量%超まで、(2)スピニングカップシークエネーターの使用によって少なくとも15残基のN末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または(3)クーマシーブルー、もしくは好ましくは、銀染色を使用して、還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによって均一になるまで精製されことになる。単離された結合タンパク質は、組換え細胞内にin situの結合タンパク質を含むが、これは、結合タンパク質の天然環境の少なくとも1種の成分が存在しないからである。
用語「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」は、本明細書で使用される場合、存在する優先種である(すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である)化合物または種を指す。一部の実施形態では、実質的に精製された画分は、種が、存在するすべての高分子種の少なくとも約50%(モルベースで)を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種のうちの約80%、85%、90%、95%、または99%超を含む。また他の実施形態では、種は、本質的に均一となるまで精製され(夾雑物種を従来の検出方法によって組成物中で検出することができない)、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することが可能な任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基のような分子の化学的に活性な表面群化を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造的特徴および/または特異的な電荷特徴を有する。エピトープは、抗体または結合タンパク質が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、タンパク質および/または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するといわれる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、平衡解離定数が≦10-8Mである場合に、より好ましくは平衡解離定数が≦10-9Mである場合に、最も好ましくは解離定数が≦10-10Mである場合に、抗原に特異的に結合するといわれる。
結合タンパク質の解離定数(KD)は、例えば、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。一般的に、表面プラズモン共鳴分析は、リガンド(バイオセンサーマトリックス上の標的抗原)と分析物(溶液中の結合タンパク質)の間のリアルタイム結合相互作用を、BIAcoreシステム(Pharmacia Biosensor;Piscataway、NJ)を使用する表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定する。表面プラズモン分析はまた、分析物(バイオセンサーマトリクス上の結合タンパク質)を固定
化することおよびリガンド(標的抗原)を提示することによって実施することができる。用語「KD」は、本明細書で使用される場合、特定の結合タンパク質と標的抗原の間の相互作用の解離定数を指す。
化することおよびリガンド(標的抗原)を提示することによって実施することができる。用語「KD」は、本明細書で使用される場合、特定の結合タンパク質と標的抗原の間の相互作用の解離定数を指す。
用語「に結合する」は、結合タンパク質に言及して本明細書で使用される場合、結合タンパク質またはその抗原結合断片の、少なくとも約1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M、もしくはそれ以上のKdでエピトープを含有する抗原に結合する能力、および/または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも2倍より大きい親和性でエピトープに結合する能力を指す。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、2つまたはそれ以上の抗原、例えば、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する。
一部の実施形態では、本開示の抗原結合ドメインおよび/または結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチド、例えば、配列番号1(ヒトCD38アイソフォームA)、配列番号105(ヒトCD38アイソフォームE)および配列番号30(カニクイザルCD38)のようなCD38細胞外ドメインと「交差反応する」。抗原1(Ag1)に結合する結合タンパク質は、EC50が両方の抗原に対して同様の範囲内である場合、抗原2(Ag2)に対して「交差反応性」である。本出願では、Ag1に結合する結合タンパク質は、Ag1の親和性に対するAg2の親和性の比が10に等しいかまたは10未満(例えば、5、2、1または0.5)である場合(親和性は両方の抗原に関して同じ方法で測定される)、Ag1に結合する結合タンパク質は、Ag2に対して交差反応性である。
Ag1に結合する結合タンパク質は、親和性が2つの抗原に関して大きく異なる場合、Ag2に対して「有意に交差反応性ではない」。Ag2に関する親和性は、結合応答が低すぎる場合には測定不能である。本出願では、Ag1に結合する結合タンパク質は、Ag2に対する結合タンパク質の結合応答が同じ実験設定でかつ同じ抗体濃度でAg1に対する同じ結合タンパク質の結合応答の5%未満である場合、Ag2に対して有意に交差反応性ではない。実際には、使用される結合タンパク質の濃度は、EC50またはAg1で得られた飽和プラトーに達するのに必要とされる濃度である。
用語「リンカー」は、本明細書で使用される場合、軽鎖および重鎖のドメインがクロスオーバー二重可変領域免疫グロブリンにフォールディングするのに十分な可動性を提供するために、免疫グロブリンドメイン間に挿入された1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を指す。リンカーは、配列レベルで、それぞれ、可変ドメインの間または可変ドメインと定常ドメインの間の遷移部に挿入される。免疫グロブリンドメインのおよそのサイズが十分に理解されているため、ドメイン間の遷移部を特定することができる。ドメイン遷移部の正確な位置は、実験データによって実証されるように、またはモデリング技法もしくは二次構造予測によって推定することができるように、ベータシートまたはアルファへリックスのような二次構造エレメントを形成しないペプチドストレッチを位置付けることによって決定することができる。本明細書に記載のリンカーは、VL2のC末端とVL1ドメインのN末端の間の軽鎖上に位置するL1;およびVL1のC末端とCLドメインのN末端の間の軽鎖上に位置するL2と称される。重鎖リンカーは、VH1のC末端とVH2ドメインのN末端の間に位置するL3;およびVH2のC末端とCH1ドメインのN末端の間に位置するL4として知られている。
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、コーディング情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子(例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス)を指す。用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送することが可能である核酸分子を含む。1つのタイプのベクターは、追加のDNAセグメントを挿入することができる環状二本
鎖DNA分子を指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノム中に挿入することができるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することが可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」(または簡単に、「発現ベクター」)と称される。一般的に、組換えDNA技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態であるため、用語「プラスミド」および「ベクター」は、本明細書において互換的に使用することができる。しかし、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)のような発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
鎖DNA分子を指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノム中に挿入することができるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することが可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」(または簡単に、「発現ベクター」)と称される。一般的に、組換えDNA技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態であるため、用語「プラスミド」および「ベクター」は、本明細書において互換的に使用することができる。しかし、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)のような発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
語句「組換え宿主細胞」(または「宿主細胞」)は、本明細書で使用される場合、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。組換え宿主細胞または宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すことを意図する。変異または環境的影響のいずれかのために、特定の修飾が続く世代において起こる場合があるので、このような後代は、実際には、その親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用される場合、このような細胞は、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。結合タンパク質を発現させるために、細菌、酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物発現系(ならびにファージディスプレイ発現系)を含む多種多様な宿主細胞発現系を使用することができる。好適な細菌発現ベクターの一例は、pUC19である。結合タンパク質を組換えによって発現させるために、宿主細胞は、結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするDNA断片を運ぶ1つまたはそれ以上の組換え発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされ、その結果、宿主細胞においてポリペプチド鎖が発現され、好ましくは、宿主細胞が培養される培地中に分泌され、その培地から、結合タンパク質を回収することができる。
用語「形質転換」は、本明細書で使用される場合、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞は、新規DNAを含有するように改変されている場合に形質転換されている。例えば、その天然状態から遺伝的に改変されている細胞は、形質転換されている。形質転換後、形質転換DNAは、細胞の染色体中に物理的に組み込まれることによって細胞のものと組換えられるか、または複製されずにエピソームエレメントとして一過的に維持されるか、またはプラスミドとして独立して複製する場合がある。細胞は、DNAが細胞分裂とともに複製される場合に安定に形質転換されていると考えられる。用語「トランスフェクション」は、本明細書で使用される場合、細胞による外来または外因性DNAの取り込みを指し、細胞は、外因性DNAが細胞膜内に導入されている場合に「トランスフェクトされている」。いくつかのトランスフェクション技法が当技術分野において周知である。このような技法を使用して、1つまたはそれ以上の外因性DNA分子を好適な宿主細胞中に導入することができる。
本明細書で使用され、物体に対して適用される場合、用語「天然に存在する」は、その物体が自然の中で見出され、ヒトによって操作されていないという事実を指す。例えば、自然の中で供給源から単離することができ、ヒトによって意図的に改変されていない、生物(ウイルスを含む)中に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に存在する。同様に、「天然に存在しない」は、本明細書で使用される場合、自然の中で見出されない、または、ヒトによって構造的に改変または合成されている物体を指す。
本明細書で使用される場合、20種の従来のアミノ酸およびその略語は、従来の利用に従う。20種の従来のアミノ酸の立体異性体(例えば、D-アミノ酸);非天然アミノ酸およびα-,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来アミノ酸のような類似体も、結合タンパク質のポリペプチド鎖に関する好適な成分である。非従来アミノ酸の例として、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸(例えば、4-ヒドロキシプロリン)が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表示法では、標準的な利用および慣習に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向が、カルボキシル末端方向である。
天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいてクラスに分けることができる:
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro;
(2)極性親水性:Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr;
(3)脂肪族:Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro;
(4)脂肪族疎水性:Ala、Ile、Leu、Val、Pro;
(5)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(6)酸性:Asp、Glu;
(7)塩基性:His、Lys、Arg;
(8)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(9)芳香族:His、Trp、Tyr、Phe;および
(10)芳香族疎水性:Phe、Trp、Tyr。
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro;
(2)極性親水性:Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr;
(3)脂肪族:Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro;
(4)脂肪族疎水性:Ala、Ile、Leu、Val、Pro;
(5)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(6)酸性:Asp、Glu;
(7)塩基性:His、Lys、Arg;
(8)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(9)芳香族:His、Trp、Tyr、Phe;および
(10)芳香族疎水性:Phe、Trp、Tyr。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうち1つのメンバーの、同一クラスの別のメンバーとの交換に関与する。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、別のクラスに由来するメンバーとの交換に関与する。
当業者であれば、周知の技法を使用して、結合タンパク質のポリペプチド鎖の好適なバリアントを決定できると予想される。例えば、当業者は、活性にとって重要であると考えられていない領域を標的とすることによって、活性を破壊することなく変更することができるポリペプチド鎖の好適な領域を同定することができる。あるいは、当業者は、同様のポリペプチドの間で保存されている残基および分子の部分を同定することができる。さらに、生体活性にとってまたは構造にとって重要である領域でさえ、生体活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換に付される場合がある。
用語「患者」は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象(例えば、イヌ、ブタ、ウマ、ネコ、ウシなどのような哺乳動物)を含む。
用語「処置」または「処置する」は、本明細書で使用される場合、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。処置を必要とするものとして、障害を有するものおよび障害を有する傾向があるものまたは障害が防止されるべきものが挙げられる。特定の実施形態では、がんを有するヒト、もしくはがんに対して感受性のヒトを処置するために、またはヒト対象においてがんを軽快するために、結合タンパク質を使用することができる。結合タンパク質を、ヒト患者においてがんを防止するために使用することもできる。特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Her2+乳がんのような乳がん、前立腺がん、
胚中心B細胞リンパ腫またはB細胞急性リンパ芽球性白血病である。
胚中心B細胞リンパ腫またはB細胞急性リンパ芽球性白血病である。
用語「医薬組成物」または「治療用組成物」は、本明細書で使用される場合、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することが可能な化合物または組成物を指す。
用語「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、結合タンパク質の送達を達成または増強するのに好適な1つまたはそれ以上の製剤化材料を指す。
用語「有効量」および「治療有効量」は、1つまたはそれ以上の結合タンパク質を含む医薬組成物に関連して使用される場合、所望の治療結果をもたらすのに十分な量または投薬量を指す。より詳細には、治療有効量は、処置されている状態と関連する臨床上定義された病理過程のうちの1つまたはそれ以上をしばらくの期間阻害するのに十分な結合タンパク質の量である。有効量は、使用されている特定の結合タンパク質に応じて変化し、また、処置されている患者と関連する種々の因子および状態並びに障害の重症度に左右される。例えば、結合タンパク質がin vivoで投与される予定である場合、これらの因子の中でも、患者の年齢、体重、および健康ならびに前臨床動物研究において得られた用量応答曲線および毒性データのような因子が考慮される。所与の医薬組成物の有効量または治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
本開示の一実施形態は、薬学的に許容される担体および結合タンパク質の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
II.抗CD38結合タンパク質
本開示のある特定の態様は、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチド)に結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質に関する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、単一特異性および/もしくは一価、二重特異性および/もしくは二価、三重特異性および/もしくは三価、または多重特異性および/または多価である。
本開示のある特定の態様は、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチド)に結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質に関する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、単一特異性および/もしくは一価、二重特異性および/もしくは二価、三重特異性および/もしくは三価、または多重特異性および/または多価である。
例示的な単一特異性、二重特異性、または三重特異性結合タンパク質の様々な特徴が本明細書に記載されている。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質またはその抗原結合断片は、ヒトCD38(例えば、ヒトCD38アイソフォームAおよび/またはアイソフォームEポリペプチド)およびカニクイザルCD38と交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CD38+細胞のアポトーシスを誘導する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CD38+細胞へとT細胞を動員し、場合によりT細胞を活性化する(例えば、TCR刺激および/または同時刺激による)。
一部の実施形態では、結合タンパク質は:GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;またはESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は:GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、I
YPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;またはESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、表G、H、またはIに示されるように、mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG1 LALA P329A、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG1 NNSA、mAb6×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA、mAb6×CD28sup×CD3mid IgG1 LALA P329A、またはmAb6×CD28sup×CD3mid IgG1 NNSAの抗体VHおよび/またはVLドメイン配列に由来する1、2、3、4、5、または6個のCDRを含む。
YPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;またはESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、表G、H、またはIに示されるように、mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG1 LALA P329A、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG1 NNSA、mAb6×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA、mAb6×CD28sup×CD3mid IgG1 LALA P329A、またはmAb6×CD28sup×CD3mid IgG1 NNSAの抗体VHおよび/またはVLドメイン配列に由来する1、2、3、4、5、または6個のCDRを含む。
一部の実施形態では、結合タンパク質は:GYTFTSFN(配列番号31)またはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)またはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびにESVDSYGNGF(配列番号34)またはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)またはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。
一部の実施形態では、結合タンパク質は:GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;またはESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は:GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびにESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。他の実施形態では、結合タンパク質は:GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;またはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は:GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPG
QGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびにQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。
QGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびにQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。
一部の実施形態では、VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1--CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(配列番号86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(配列番号87)、またはQVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(配列番号88)を含み;FR2は、配列MHWVKEAPGQRLEWIGY(配列番号90)またはMHWVKEAPGQGLEWIGY(配列番号91)を含み;FR3は、配列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(配列番号93)またはNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(配列番号94)を含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)を含む。一部の実施形態では、VLドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4を含み;FR1は、配列DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS(配列番号97)を含み;FR2は、配列MHWYQQKPGQPPRLLIY(配列番号99)を含み;FR3は、配列SRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYC(配列番号101)を含み;FR4は、配列FGGGTKLEIK(配列番号103)を含む。
一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;および/またはVLドメインは、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少
なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;および/またはVLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;および/またはVLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;および/またはVLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは
、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および/または配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号19のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および/または配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号22のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および/または配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および/または配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および/または配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号19のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号22のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
一部の実施形態では、結合タンパク質は:GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ
酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;またはQGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は:GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびにQGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。
酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;またはQGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は:GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびにQGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。
一部の実施形態では、VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS(配列番号89)を含み;FR2は、配列MHWVRQAPGKGLEWVAV(配列番号92)を含み;FR3は、配列YYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(配列番号95)を含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)を含む。一部の実施形態では、VLドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4を含み;FR1は、配列AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS(配列番号98)を含み;FR2は、配列GWYQQKPGKAPKLLIY(配列番号100)を含み;FR3は、配列SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC(配列番号102)を含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号104)を含む。
一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;および/またはVLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含み;VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VHドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含
み;VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
み;VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号11のアミノ酸配列を含む抗体重鎖または配列番号12のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号11のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号12のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Gに示される抗体配列の1、2、3、4、5、または6個のCDR配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Hに示される抗体配列の、1、2、3、4、5、もしくは6個のCDR配列、VHドメイン配列、および/またはVLドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Iに示される抗体配列の、1、2、3、4、5、または6個のCDR配列、VHドメイン配列、および/またはVLドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Iに示される1、2、3、または4個のポリペプチド配列を含む。
CD38ポリペプチド
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位を含む。抗原結合部位が抗原に結合するか否かを決定するための例示的なアッセイは本明細書に記載されており、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、ELISAアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、SPRアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、それらの細胞表面にCD38ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって決定される。例えば、実施例1、3、および4を参照されたい。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位を含む。抗原結合部位が抗原に結合するか否かを決定するための例示的なアッセイは本明細書に記載されており、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、ELISAアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、SPRアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、それらの細胞表面にCD38ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって決定される。例えば、実施例1、3、および4を参照されたい。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号1および/または30のアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチドまたはその断片に結合する(例えば、ELISAまたはSPRによって測定されるように)。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、細胞の表面に発現される場合、配列番号1および/または30のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。(例えば、フローサイトメトリーによって測定されるように)。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)CD38アイソフォームAポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含むが配列番号1
の完全なアミノ酸配列を含まないか、配列番号105のアミノ酸配列からなるか、または配列番号105のアミノ酸配列から本質的になる)CD38アイソフォームEポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)CD38アイソフォームAポリペプチドおよび(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含むが配列番号1の完全なアミノ酸配列を含まないか、配列番号105のアミノ酸配列からなるか、または配列番号105のアミノ酸配列から本質的になる)CD38アイソフォームEポリペプチドに結合する。理論に拘束されることを望むものではないが、CD38アイソフォームEポリペプチドへの結合は、例えば、本開示の結合タンパク質をCD38アイソフォームEポリペプチドを発現する細胞に対して標的とする際に、有利であると考えられる。
の完全なアミノ酸配列を含まないか、配列番号105のアミノ酸配列からなるか、または配列番号105のアミノ酸配列から本質的になる)CD38アイソフォームEポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)CD38アイソフォームAポリペプチドおよび(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含むが配列番号1の完全なアミノ酸配列を含まないか、配列番号105のアミノ酸配列からなるか、または配列番号105のアミノ酸配列から本質的になる)CD38アイソフォームEポリペプチドに結合する。理論に拘束されることを望むものではないが、CD38アイソフォームEポリペプチドへの結合は、例えば、本開示の結合タンパク質をCD38アイソフォームEポリペプチドを発現する細胞に対して標的とする際に、有利であると考えられる。
ヒトCD38アイソフォームA細胞外ドメインポリペプチド配列
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI(配列番号1)
ヒトCD38アイソフォームEポリペプチド配列
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRHFWECGSP(配列番号105)
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI(配列番号1)
ヒトCD38アイソフォームEポリペプチド配列
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRHFWECGSP(配列番号105)
一部の実施形態では、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号30のアミノ酸配列を含む。
カニクイザルCD38ポリペプチド配列
RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI(配列番号30)
カニクイザルCD38ポリペプチド配列
RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI(配列番号30)
CD38ポリペプチドに結合する多重特異性(例えば、二重特異性、三重特異性、または多重特異性)結合タンパク質
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位および異なる標的抗原に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位および1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位および異なる標的抗原に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位および1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、 1つまたはそれ以上のCD38ポ
リペプチドに結合する抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。例えば、一部の実施形態では、抗原結合部位のう
ちの1つは、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合し、抗原結合部位のうちの1つまたは2つは、T細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの1つは、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合し、抗原結合部位のうちの1つは、ヒトCD3ポリペプチドに結合し、抗原結合部位のうちの1つは、ヒトCD28ポリペプチドに結合する。ヒトCD3およびCD28ポリペプチドは、当技術分野で公知である。ヒトCD3およびCD28ポリペプチドに結合する例示的かつ非限定的な抗体可変ドメインのアミノ酸配列が本明細書において提供される。
リペプチドに結合する抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である。例えば、一部の実施形態では、抗原結合部位のう
ちの1つは、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合し、抗原結合部位のうちの1つまたは2つは、T細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの1つは、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合し、抗原結合部位のうちの1つは、ヒトCD3ポリペプチドに結合し、抗原結合部位のうちの1つは、ヒトCD28ポリペプチドに結合する。ヒトCD3およびCD28ポリペプチドは、当技術分野で公知である。ヒトCD3およびCD28ポリペプチドに結合する例示的かつ非限定的な抗体可変ドメインのアミノ酸配列が本明細書において提供される。
一部の実施形態では、1つまたはそれ以上の標的タンパク質にそれぞれ結合する3つの抗原結合部位を含む結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、3つの抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する。一部の実施形態では、ヒトCD38ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、および/またはカニクイザルCD38ポリペプチドは、配列番号30のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位ならびにT細胞表面タンパク質(例えば、ヒトCD28ポリペプチドおよび/またはヒトCD3ポリペプチド)にそれぞれ結合する2つの抗原結合部位を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上の標的タンパク質(例えば、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチド)および1つまたはそれ以上のT細胞標的タンパク質に結合する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、1つの腫瘍標的タンパク質(例えば、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチド)および単一のT細胞標的タンパク質上の2つの異なるエピトープに結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、1つの腫瘍標的タンパク質(例えば、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチド)および2つの異なるT細胞標的タンパク質(例えば、CD28およびCD3)に結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、1つのT細胞標的タンパク質および単一の腫瘍標的タンパク質(例えば、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチド)上の2つの異なるエピトープに結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、1つのT細胞標的タンパク質および2つの異なる腫瘍標的タンパク質(例えば、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドおよび別の腫瘍標的タンパク質)に結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質の第1および第2のポリペプチド鎖は、2つのT細胞標的タンパク質を標的とする2つの抗原結合部位を形成し、結合タンパク質の第3および第4のポリペプチド鎖は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、結合タンパク質の第1および第2のポリペプチド鎖は、2つの腫瘍標的タンパク質(例えば、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドおよび別の腫瘍標的タンパク質)を標的とする2つの抗原結合部位を形成し、結合タンパク質の第3および第4のポリペプチド鎖は、T細胞標的タンパク質に結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のT細胞標的タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD3およびCD28である。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドおよびT細胞受容体複合体を含むT細胞上の1つまたはそれ以上の標的タンパク質に特異的に結合する。これらのT細胞エンゲージャー結合タンパク質は、標的細胞へとT細胞を一過的に動員し、同時に、T細胞の細胞溶解活性を活性化することが可能である。T細胞上の標的タンパク質の例として、とりわけ、CD3およびCD28が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原標的または標的タンパク質のさらなる例は、上に提供
される。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、2つまたはそれ以上の単一特異性抗体(親抗体)の抗原結合ドメインを組み合わせて1つの抗体とすることによって生成することができる。
される。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、2つまたはそれ以上の単一特異性抗体(親抗体)の抗原結合ドメインを組み合わせて1つの抗体とすることによって生成することができる。
二重特異性結合タンパク質形式
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、2つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する4つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖(例えば、国際公開第WO2012/135345号に記載された構造を有する)を含む二重特異性および/または二価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、二価および/または二重特異性である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、四価および/または四重特異性である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、四価および/または二重特異性である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合する。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、2つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する4つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖(例えば、国際公開第WO2012/135345号に記載された構造を有する)を含む二重特異性および/または二価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、二価および/または二重特異性である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、四価および/または四重特異性である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、四価および/または二重特異性である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合する。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、式:
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
で表される構造を有する2つのポリペプチド鎖を含み
2つのポリペプチド鎖は、式:
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
で表される構造を有し、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
で表される構造を有する2つのポリペプチド鎖を含み
2つのポリペプチド鎖は、式:
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
で表される構造を有し、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、2つの抗原結合部位を形成する2つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、
VL1-L1-VL2-L2-CL-Fc
を含み、
第2のポリペプチド鎖は、
VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc
を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
第1および第2のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
VL1-L1-VL2-L2-CL-Fc
を含み、
第2のポリペプチド鎖は、
VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc
を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
第1および第2のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、2つの抗原結合部位を形成する3つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、
VL1-L1-VL2-L2-CL
を含み、
第2のポリペプチド鎖は、
VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc
を含み、
第3のポリペプチド鎖は、抗体Fc領域を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
第1および第2のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
VL1-L1-VL2-L2-CL
を含み、
第2のポリペプチド鎖は、
VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc
を含み、
第3のポリペプチド鎖は、抗体Fc領域を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
第1および第2のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、式:
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
で表される構造を含む第1のポリペプチド鎖、および式:
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
で表される構造を含む第2のポリペプチド鎖を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、 CD38ポリペプチドに
結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
で表される構造を含む第1のポリペプチド鎖、および式:
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
で表される構造を含む第2のポリペプチド鎖を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、 CD38ポリペプチドに
結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
上に記載された二重特異性タンパク質のいずれかでは、CD38以外の標的抗原は、以下の例示的な抗原標的のいずれかである:A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(VTCN1としても公知)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(MCP-1としても公知)、CCL3(MIP-1aとしても公知)、CCL4(MIP-1bとしても公知)、CCL5(RANTESとしても公知)、CCL7(MCP-3としても公知)、CCL8(mcp-2としても公知)、CCL11(エオタキシンとしても公知)、CCL15(MIP-1dとしても公知)、CCL17(TARCとしても公知)、CCL19(MIP-3bとしても公知)、CCL20(MIP-3aとしても公知)、CCL21(MIP-2としても公知)、CCL24(MPIF-2/エオタキシン-2としても公知)、CCL25(TECKとしても公知)、CCL26(エオタキシン-3としても公知)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(IgEに対する受容体であるFCER2としても公知)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(B7-1としても公知)、CD86(B7-2としても公知)、CD122、CD137(41BBとしても公知)、CD137L、CD152(CTLA4としても公知)、CD154(CD40Lとしても公知)、CD160、CD272、CD273(PDL2としても公知)、CD274(PDL1としても公知)、CD275(B7H2としても公知)、CD276(B7H3としても公知)、CD278(ICOSとしても公知)、CD279(PD-1としても公知)、CDH1(E-カドヘリンとしても公知)、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(M-CSFとしても公知)、CSF-2(GM-CSFとしても公知)、CSF-3(GCSFとしても公知)、CX3CL1(SCYD1としても公知)、CXCL12(SDF1としても公知)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(IL25に対する受容体としても公知)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(b4インテグリンとしても公知)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(IL33に対する受容体としても公知)、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(IL7Raに対する補助受容体としても公知)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA
、Vstm3、WUCAM、およびXCR1(GPR5/CCXCR1としても公知)。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの1つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
、Vstm3、WUCAM、およびXCR1(GPR5/CCXCR1としても公知)。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの1つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
上に記載された二重特異性結合タンパク質のうちのいずれかでは、本明細書に記載された任意のリンカーまたはリンカーの組合せが使用される。例えば、一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4のうちの少なくとも1つは、独立して、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4は、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、0アミノ酸長であるかまたはGGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、GGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、L1は、配列GQPKAAP(配列番号58)を含み、L2は、配列TKGPS(配列番号57)を含み、L3は、配列Sを含み、L4は、配列RTを含む。一部の実施形態では、L1は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である。
CD38ポリペプチドに結合する三重特異性結合タンパク質
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、3つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および/または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合する。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、3つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および/または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合する。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、3つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および/または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合する。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結したFc領域をさらに含み、Fc領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結したFc領域をさらに含み、Fc領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。
一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖は、2つの別個の抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向を有する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、結合対を形成し、第1の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、結合対を形成し、第2の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第1の抗原結合部位は、CD3ポリペプチド(例えば、ヒトCD3)に結合し、第2の抗原結合部位は、CD28ポリペプチド(例えば、ヒトCD28)に結合する。一部の実施形態では、第2の抗原結合部位は、CD3ポリペプチド(例えば、ヒトCD3
)に結合し、第1の抗原結合部位は、CD28ポリペプチド(例えば、ヒトCD28)に結合する。一部の実施形態では、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドは、第3の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH3およびVL3は、結合対を形成し、第3の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第3の抗原結合部位は、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび場合によりカニクイザルCD38)に結合する。本発明における使用を企図したクロスオーバー配向を有する例示的な結合タンパク質形式は、米国特許出願第15/487,243号および国際出願第PCT/US2017/027488号にも記載されている。
)に結合し、第1の抗原結合部位は、CD28ポリペプチド(例えば、ヒトCD28)に結合する。一部の実施形態では、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドは、第3の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH3およびVL3は、結合対を形成し、第3の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第3の抗原結合部位は、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび場合によりカニクイザルCD38)に結合する。本発明における使用を企図したクロスオーバー配向を有する例示的な結合タンパク質形式は、米国特許出願第15/487,243号および国際出願第PCT/US2017/027488号にも記載されている。
本明細書に記載の二重特異性、三重特異性、または多重特異性結合タンパク質のいずれかにおける一部の実施形態では、抗原結合部位は、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび場合によりカニクイザルCD38)に結合する。一部の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性、三重特異性、または多重特異性結合タンパク質のいずれかの他の(例えば、CD38に結合していない)抗原結合部位は、CD28またはCD3に結合する。一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含む
CDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
CDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
一部の実施形態では、VH1ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL1ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL2ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
一部の実施形態では、VH1ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号
42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL1ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL2ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配
列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含むか、またはVL3ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含むか、またはVL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含むか、またはVL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含むか、またはVL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含むか、またはVL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含む、および/またはVL3ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、ならびに/またはVL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。
一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含む、および/またはVL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
本開示の三重特異性結合タンパク質のいずれかの一部の実施形態では、1つの抗原結合ドメインはCD3ポリペプチド(例えば、ヒトCD3)に結合し、1つの抗原結合ドメインは、CD28ポリペプチド(例えば、ヒトCD28)に結合する。一部の実施形態では、VH1ドメインは、表Hに示されているように、配列番号49または51に由来する3つのCDRを含み、VL1ドメインは、表Hに示されているように、配列番号50または52に由来する3つのCDRを含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、表Hに示されているように、配列番号49または51に由来する3つのCDRを含み、VL2ドメインは、表Hに示されているように、配列番号50または52に由来する3つのCDRを含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、表Hに示されているように、配列番号53または84に由来する3つのCDRを含み、VL1ドメインは、表Hに示されているように、配列番号54または85に由来する3つのCDRを含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、表Hに示されているように、配列番号53または84に由来する3つのCDRを含み、VL2ドメインは、表Hに示されているように、配列番号54または85に由来する3つのCDRを含む。
一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、
配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。
配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号65のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号67のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号68のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号70のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペ
プチド配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチドを含む。
プチド配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチド配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号62のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号65のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号67のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号68のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号70のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。
上に記載された三重特異性結合タンパク質のいずれかでは、CD38以外の標的抗原は、以下の例示的な抗原標的のいずれかである:A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(VTCN1としても公知)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(MCP-1としても公知)、CCL3(MIP-1aとしても公知)、CCL4(MIP-1bとしても公知)、CCL5(RANTESとしても公知)、CCL7(MCP-3としても公知)、CCL8(mcp-2としても公知)、CCL11(エオタキシンとしても公知)、CCL15(MIP-1dとしても公知)、CCL17(TARCとしても公知)、CCL19(MIP-3bとしても公知)、CCL20(MIP-3aとしても公知)、CCL21(MIP-2としても公知)、CCL24(MPIF-2/エオタキシン-2としても公知)、CCL25(TECKとしても公知)、CCL26(エオタキシン-3としても公知)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(IgEに対する受容体であるFCER2としても公知)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(B7-1としても公知)、CD86(B7-2としても公知)、CD122、CD137(41BBとしても公知)、CD137L、CD152(CTLA4としても公知)、CD154(CD40Lとしても公知)、CD160、CD272、CD273(PDL2としても公知)、CD274(PDL1としても公知)、CD275(B7H2としても公知)、CD276(B7H3としても公知)、CD278(ICOSとしても公知)、CD279(PD-1としても公知)、CDH1(E-カドヘリンとしても公知)、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(M-CSFとしても公知)、CSF-2(GM-CSFとしても公知)、CSF-3(GCSFとしても公知)、CX3CL1(SCYD1としても公知)、CXCL12(SDF1としても公知)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH
1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(IL25に対する受容体としても公知)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(b4インテグリンとしても公知)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(IL33に対する受容体としても公知)、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(IL7Raに対する補助受容体としても公知)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1(GPR5/CCXCR1としても公知)。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの1つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(IL25に対する受容体としても公知)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(b4インテグリンとしても公知)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(IL33に対する受容体としても公知)、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(IL7Raに対する補助受容体としても公知)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1(GPR5/CCXCR1としても公知)。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの1つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。
本開示の結合タンパク質は、例えば、ヒト、マウス、またはヒト化抗体を含む任意のヒトまたは非ヒト抗体から得られるかまたはそれに由来するドメインまたは配列を使用して調製することができる。
リンカー
一部の実施形態では、リンカーL1、L2、L3およびL4は、アミノ酸なし(長さ=0)から約100アミノ酸長、または100、50、40、30、20、または15アミノ酸未満またはそれ以下の範囲である。リンカーはまた、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸長である。1つの結合タンパク質におけるL1、L2、L3およびL4は、すべて同じアミノ酸配列を有するかまたはすべて異なるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、リンカーL1、L2、L3およびL4は、アミノ酸なし(長さ=0)から約100アミノ酸長、または100、50、40、30、20、または15アミノ酸未満またはそれ以下の範囲である。リンカーはまた、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸長である。1つの結合タンパク質におけるL1、L2、L3およびL4は、すべて同じアミノ酸配列を有するかまたはすべて異なるアミノ酸配列を有する。
好適なリンカーの例として、単一のグリシン(Gly)残基;ジグリシンペプチド(Gly-Gly);トリペプチド(Gly-Gly-Gly);4つのグリシン残基を有するペプチド;5つのグリシン残基を有するペプチド;6つのグリシン残基を有するペプチド;7つのグリシン残基を有するペプチド;および8つのグリシン残基を有するペプチドが挙げられる。ペプチドGGGGSGGGGS(配列番号55)、ペプチドGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、ペプチドTKGPS(配列番号57)、ペプチドGQPKAAP(配列番号58)、およびペプチドGGSGSSGSGG(配列番号59)のようなアミノ酸残基の他の組合せが使用される場合もある。上記で列挙された例は、決して本開示の範囲を限定するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメート、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される無作為に選択されたアミノ酸を含むリンカーが、結合タンパク質において好適であることが示されている。リンカー配列のさらなる説明については、例えば、WO2012135345および国際出願第PCT/US2017/027488号を参照されたい。
リンカー中のアミノ酸残基の同一性および配列は、リンカーにおいて達成するのに必要
な二次構造エレメントの種類に応じて変わる。例えば、グリシン、セリン、およびアラニンは、最大の可動性を有するリンカーにとって最良である。より強固な延長したリンカーが必要である場合には、グリシン、プロリン、トレオニン、およびセリンのいくつかの組合せが有用である。所望の特性に応じて、必要に応じて、より大きなペプチドリンカーを構築するために、任意のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と組み合わせてリンカーとして考えられる。
な二次構造エレメントの種類に応じて変わる。例えば、グリシン、セリン、およびアラニンは、最大の可動性を有するリンカーにとって最良である。より強固な延長したリンカーが必要である場合には、グリシン、プロリン、トレオニン、およびセリンのいくつかの組合せが有用である。所望の特性に応じて、必要に応じて、より大きなペプチドリンカーを構築するために、任意のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と組み合わせてリンカーとして考えられる。
一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4のうちの少なくとも1つは、独立して、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4は、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1の長さは、L3の長さの少なくとも2倍である。一部の実施形態では、L2の長さは、L4の長さの少なくとも2倍である。一部の実施形態では、L1の長さは、L3の長さの少なくとも2倍であり、L2の長さは、L4の長さの少なくとも2倍である。一部の実施形態では、L1は、3から12個のアミノ酸残基の長さであり、L2は、3から14個のアミノ酸残基の長さであり、L3は、1から8個のアミノ酸残基の長さであり、L4は、1から3個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、L1は、5から10個のアミノ酸残基の長さであり、L2は、5から8個のアミノ酸残基の長さであり、L3は、1から5個のアミノ酸残基の長さであり、L4は、1から2個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、L1は、7個のアミノ酸残基の長さであり、L2は、5個のアミノ酸残基の長さであり、L3は、1個のアミノ酸残基の長さであり、L4は、2個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、L1は、10個のアミノ酸残基の長さであり、L2は、10個のアミノ酸残基の長さであり、L3は、0個のアミノ酸残基の長さであり、L4は、0個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、L1、L2、L3、およびL4はそれぞれ、0から15個のアミノ酸(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸)から独立に選択された長さを有し、リンカーのうち少なくとも2つは、1から15個のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のアミノ酸)の長さを有する。一部の実施形態では、L1、L2、L3、およびL4はそれぞれ、0アミノ酸長である。
一部の実施形態では、L1、L2、L3、および/またはL4は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインの間の接合部に、天然に存在する配列に由来する配列を含む(例えば、WO2012/135345に記載されるように)。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、内因性VHおよびCH1ドメインの間、または内因性VLおよびCLドメイン(例えば、カッパまたはラムダ)の間の遷移部に見られる配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、内因性ヒトVHおよびCH1ドメインの間、または内因性ヒトVLおよびCLドメイン(例えば、ヒトカッパまたはラムダ)の間の遷移部に見られる配列を含む。
一部の実施形態では、L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、0アミノ酸長であるかまたはGGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、GGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、L1は、配列GQPKAAP(配列番号58)を含み、L2は、配列TKGPS(配列番号57)を含み、L3は、配列Sを含み、L4は、配列RTを含む。一部の実施形態では、L1は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、
L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である。
L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である。
Fc領域および定常ドメイン
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、全長抗体重鎖またはFc領域を含むポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトFc領域、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、抗体のヒンジ、CH1、CH2、CH3、場合によりCH4ドメインを含む。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、上に記載された変異のうちの1つまたはそれ以上を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、全長抗体重鎖またはFc領域を含むポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトFc領域、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、抗体のヒンジ、CH1、CH2、CH3、場合によりCH4ドメインを含む。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、上に記載された変異のうちの1つまたはそれ以上を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたは2つのFcバリアントを含む。用語「Fcバリアント」は、本明細書で使用される場合、天然Fcから改変されているが、サルベージ受容体、FcRn(新生児型Fc受容体)に対する結合部位を依然として含む分子または配列を指す。例示的なFcバリアント、およびそれらのサルベージ受容体との相互作用は、当技術分野で公知である。よって、用語「Fcバリアント」は、非ヒト天然Fcからヒト化されている分子または配列を含む場合がある。さらに、天然Fcは、本発明の抗体様結合タンパク質にとって必要ではない構造的特徴または生体活性を提供するため、除去することができる領域を含む。よって、用語「Fcバリアント」は、(1)ジスルフィド結合形成、(2)選択された宿主細胞との不適合性、(3)選択された宿主細胞における発現の際のN末端不均一性、(4)グリコシル化、(5)補体との相互作用、(6)サルベージ受容体以外のFc受容体への結合、または(7)抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)に影響を及ぼすかまたはそれに関与している、1つもしくはそれ以上の天然Fc部位もしくは残基を欠くか、または1つもしくはそれ以上のFc部位もしくは残基が改変されている分子または配列を含む。
一部の実施形態では、Fc領域は、Fc受容体結合および/またはFc領域のエフェクター機能(例えば、Fc受容体介在性抗体依存性細胞食作用(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)、および/または抗体依存性細胞傷害(ADCC))を低減または排除する1つまたはそれ以上の変異を含む。
一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および/または329位に対応する位置に1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、L234A、L235A、および/またはP329Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および/または300位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S298N、T299A、および/またはY300Sである。
一部の実施形態では、Fc領域は、FcγIおよび/またはFcγII結合を低減または排除する1つまたはそれ以上の変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、FcRn結合に影響を及ぼさないFcγIおよび/またはFcγII結合を低減または排除する1つまたはそれ以上の変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の2
28および/または409位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S228Pおよび/またはR409Kである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および/または235位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、F234Aおよび/またはL235Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、234、235、および/または409位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、および/またはR409Kである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、233~236、および/または409位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、S228P;E233P、F234V、L235A、および236における欠失;ならびに/またはR409Kである。
28および/または409位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S228Pおよび/またはR409Kである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および/または235位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、F234Aおよび/またはL235Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、234、235、および/または409位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、および/またはR409Kである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、233~236、および/または409位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、S228P;E233P、F234V、L235A、および236における欠失;ならびに/またはR409Kである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、精製試薬に対する親和性をモジュレートすることによって、精製を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ヘテロ二量体結合タンパク質は、ヘテロ二量体形態の2つのFc領域のうち1つがプロテインAへの結合を低減または排除する変異を含有する場合には、それらのホモ二量体形態から離して選択的に精製できることが知られており、これは、ヘテロ二量体形態が、いずれかのホモ二量体形態よりも、プロテインAベースの精製に対して中間の親和性を有し、例えば、異なるpHの使用によってプロテインAから選択的に溶出できるためである(例えば、Smith,E.J.ら(2015)Sci.Rep. 5:17943頁を参照されたい)。一部の実施形態では、変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の435および436位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、H435RおよびY436Fである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含む第2のポリペプチド鎖であって、第1のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第2のポリペプチド鎖と、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含む第3のポリペプチド鎖であって、第2のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド鎖とを含み;第1および第2のFc領域のうち一方のみは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の435および436位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、H435RおよびY436Fである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに精製を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。
一部の結合タンパク質(例えば、二重特異性または三重特異性結合タンパク質)の収率を改善するために、例えば、国際公開第WO96/027011号、Ridgwayら、1996、Protein Eng.9:617~21頁;およびMerchantら、1998、Nat.Biotechnol.16:677~81頁においていくつかの実施例を用いて詳細に記載されている「ノブイントゥーホール」技術によって、CH3ドメインを変更することができる。詳細には、2つのCH3ドメインの相互作用表面は、これら2つのCH3ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を増大するように変更される。2つのCH3ドメインの(2つの重鎖の)それぞれは「ノブ」である場合があるが、もう一方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し
(Merchantら、1998;Atwellら、1997、J.Mol.Biol.270:26~35頁)、収率を増大する。特定の実施形態では、ノブは、単一の可変ドメインを有するポリペプチドの第2の対上にある。その他の実施形態では、ノブは、クロスオーバー配向を有するポリペプチドの第1の対上にある。さらにその他の実施形態では、CH3ドメインは、ノブインホールを含まない。
(Merchantら、1998;Atwellら、1997、J.Mol.Biol.270:26~35頁)、収率を増大する。特定の実施形態では、ノブは、単一の可変ドメインを有するポリペプチドの第2の対上にある。その他の実施形態では、ノブは、クロスオーバー配向を有するポリペプチドの第1の対上にある。さらにその他の実施形態では、CH3ドメインは、ノブインホールを含まない。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質(例えば、三重特異性結合タンパク質)は、第2のポリペプチド鎖上に「ノブ」変異および第3のポリペプチド鎖上に「ホール」変異を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、第3のポリペプチド鎖上の「ノブ」変異および第2のポリペプチド鎖上の「ホール」変異を含む。一部の実施形態では、「ノブ」変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および/または366位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S354C、T366W、T366Y、S354CおよびT366W、またはS354CおよびT366Yである。一部の実施形態では、「ノブ」変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wである。一部の実施形態では、「ホール」変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の407位、場合により、349、366、および/または368位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Y407VまたはY407T、場合により、Y349C、T366S、および/またはL368Aである。一部の実施形態では、「ホール」変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vである。
一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の366位、場合により354位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、T366WまたはT366Y、場合によりS354Cであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の407位、場合により349、366、および/または368位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y407VまたはY407T、場合により、Y349C、T366S、および/またはL368Aである。
一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の407位、場合により349、366、および/または368位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y407VまたはY407T、場合によりY349C、T366S、および/またはL368Aであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の366位、場合により354位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、T366WまたはT366Y、場合によりS354Cである。
一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3
免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、T366Wであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の366、368、および/または407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、T366S、L368A、および/またはY407Vである。
免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、T366Wであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の366、368、および/または407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、T366S、L368A、および/またはY407Vである。
一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の366、368、および/または407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、T366S、L368A、および/またはY407Vであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、T366Wである。
一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wである。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。
一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、354、366、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、S354C、T366W、およびR409Kであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2お
よびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、349、366、368、407、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V、およびR409Kである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、349、366、368、407、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V、およびR409Kであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、354、366、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、S354C、T366W、およびR409Kである。
よびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、349、366、368、407、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V、およびR409Kである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、349、366、368、407、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V、およびR409Kであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、354、366、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、S354C、T366W、およびR409Kである。
一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234、235、354、および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234A、L235A、S354C、およびT366Wであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234、235、349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234、235、349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234、235、354、および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234A、L235A、S354C、およびT366Wである。
一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、234、235、354、366、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、S354C、T366W、およびR409Kであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒ
トIgG4の228、234、235、349、366、368、407、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V、およびR409Kである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、234、235、349、366、368、407、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V、およびR409Kであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、234、235、354、366、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、S354C、T366W、およびR409Kである。
トIgG4の228、234、235、349、366、368、407、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V、およびR409Kである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第1のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、234、235、349、366、368、407、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V、およびR409Kであり;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトIgG4 Fc領域であり、第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、234、235、354、366、および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228P、F234A、L235A、S354C、T366W、およびR409Kである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、血清半減期を改善するために1つまたはそれ以上の変異を含む(例えば、Hinton,P.R.ら(2006)J.Immunol.176(1):346~56頁を参照されたい)。一部の実施形態では、変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の428および434位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、M428LおよびN434Sである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含む第2のポリペプチド鎖であって、第1のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第2のポリペプチド鎖と、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含む第3のポリペプチド鎖であって、第2のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド鎖とを含み、第1および/または第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の428および434位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、M428LおよびN434Sである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに血清半減期を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、IgG4のヒンジ領域および/または二量体界面の、安定性を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む(例えば、Spiess,C.ら(2013) J.Biol.Chem.288:26583~26593頁を参照されたい)。一部の実施形態では、変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含む第2のポリペプチド鎖であって、第1のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第2のポリペプチド鎖と、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含む第3のポリペプチド鎖であって、第2のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド鎖とを含み;第1および第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域であり;第1および第2のFc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに安定性
を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。
を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、精製試薬に対する親和性をモジュレートすることによって、精製を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ヘテロ二量体結合タンパク質は、ヘテロ二量体形態の2つのFc領域のうち1つがプロテインAへの結合を低減または排除する変異を含有する場合には、それらのホモ二量体形態から離して選択的に精製できることが知られており、これは、ヘテロ二量体形態が、いずれかのホモ二量体形態よりも、プロテインAベースの精製に対して中間の親和性を有し、例えば、異なるpHの使用によってプロテインAから選択的に溶出できるためである(例えば、Smith,E.J.ら(2015)Sci.Rep. 5:17943頁を参照されたい)。一部の実施形態では、変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の435および436位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、H435RおよびY436Fである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含む第2のポリペプチド鎖であって、第1のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第2のポリペプチド鎖と、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含む第3のポリペプチド鎖であって、第2のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド鎖とを含み;第1および第2のFc領域のうち一方のみは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の435および436位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、H435RおよびY436Fである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに精製を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、血清半減期を改善するために1つまたはそれ以上の変異を含む(例えば、Hinton,P.R.ら(2006)J.Immunol.176(1):346~56頁を参照されたい)。一部の実施形態では、変異は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の428および434位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、M428LおよびN434Sである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含む第2のポリペプチド鎖であって、第1のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第2のポリペプチド鎖と、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含む第3のポリペプチド鎖であって、第2のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド鎖とを含み、第1および/または第2のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の428および434位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、M428LおよびN434Sである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに血清半減期を改善するための1つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、エフェクター機能、例えば、Fc受容体媒介性抗体依存性細胞食作用(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)、および/または抗体依存性細胞傷害(ADCC)を低減するための1つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびC
H3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;第1および第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域であり;第1および第2のFc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域であり、Fc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;第1および第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域であり;第1および第2のFc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域であり、Fc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域であり、Fc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含む第2のポリペプチド鎖であって、第1のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第2のポリペプチド鎖と、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含む第3のポリペプチド鎖であって、第2のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド鎖とを含み;第1および第2のFc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである。
H3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;第1および第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域であり;第1および第2のFc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域であり、Fc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含み、第1のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含み、第2のFc領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;第1および第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域であり;第1および第2のFc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域であり、Fc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域であり、Fc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、CH1に連結された第1のFc領域をさらに含む第2のポリペプチド鎖であって、第1のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第2のポリペプチド鎖と、CH1に連結された第2のFc領域をさらに含む第3のポリペプチド鎖であって、第2のFc領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド鎖とを含み;第1および第2のFc領域はそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびにエフェクター機能を低減するための1つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、第1および/または第2のFc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。329位のFc変異についてのさらなる記載として、例えば、Shields,R.L.ら(2001)J.Biol.Chem.276:6591~6604頁およびWO1999051642を参照されたい。
一部の実施形態では、上に記載された変異の種類は、任意の順序または組合せで組み合わせることができる。例えば、本開示の結合タンパク質は、2つもしくはそれ以上の「ノブ」および「ホール」変異、血清半減期を改善するための1つもしくはそれ以上の変異、IgG4の安定性を改善するための1つもしくはそれ以上の変異、精製を改善するための1つもしくはそれ以上の変異、ならびに/または上に記載されたエフェクター機能を低減するための1つまたはそれ以上の変異を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、以下に限定されないが、F(ab)、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、またはscFv断片を含む抗体断片を含む。
アッセイ
本開示は、ヒトおよび/もしくはカニクイザルCD38ポリペプチドに結合し、T細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)の増殖を誘導し、ならびに/またはCD38+細胞のアポトーシスを誘導する抗原結合タンパク質を提供する。これらのパラメータを測定し、このような結合タンパク質を同定するための例示的なアッセイが、本明細書において提供される。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質またはその抗原結合断片と精製されたCD38ポリペプチドの間の結合親和性は、SPRによって測定され(例えば、上に記載されているように)、結合タンパク質またはその抗原結合断片と細胞表面で発現されたCD38ポリペプチドの間の結合親和性は、フローサイトメトリーによって測定される(例えば、上に記載されているように)。
本開示は、ヒトおよび/もしくはカニクイザルCD38ポリペプチドに結合し、T細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)の増殖を誘導し、ならびに/またはCD38+細胞のアポトーシスを誘導する抗原結合タンパク質を提供する。これらのパラメータを測定し、このような結合タンパク質を同定するための例示的なアッセイが、本明細書において提供される。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質またはその抗原結合断片と精製されたCD38ポリペプチドの間の結合親和性は、SPRによって測定され(例えば、上に記載されているように)、結合タンパク質またはその抗原結合断片と細胞表面で発現されたCD38ポリペプチドの間の結合親和性は、フローサイトメトリーによって測定される(例えば、上に記載されているように)。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質の抗原結合部位は、例えば、上に記載されているように、それらの細胞表面に配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって測定される場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、1nMもしくはそれ以下、または0.8nMもしくはそれ以下の平衡解離定数(KD)で、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、例えば、上に記載されているように、それらの細胞表面に配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって測定される場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、1nMもしくはそれ以下、または0.75nMもしくはそれ以下の平衡解離定数(KD)で、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、例えば、上に記載されているように、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドを使用するSPRアッセイによって測定される場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、1nMもしくはそれ以下、または0.83nMもしくはそれ以下の平衡解離定数(KD)で、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗原結合部位は、例えば、上に記載されているように、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドを使用するSPRアッセイによって測定される場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、3.5nMもしくはそれ以下、1.5nMもしくはそれ以下、または1.0nMもしくはそれ以下の平衡解離定数(KD)で、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する。本明細書で実証されるように、一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、本明細書に記載の例示的な結合特性のうちの1つまたはそれ以上を有する。一部の実施形態では、KDは、4℃または25℃で測定される。
一部の実施形態では、本開示の単一特異性結合タンパク質は、以下の構成のうちの1つまたはそれ以上を有する:SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1.5nMもしくはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてのヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイ
トメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、20nMまたはそれ以下、15nMまたはそれ以下、12nMまたはそれ以下、10nMまたはそれ以下、5nMまたはそれ以下、2nMまたはそれ以下、1nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてのカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nMまたはそれ以下、15nMまたはそれ以下、12nMまたはそれ以下、10nMまたはそれ以下、5nMまたはそれ以下、2nMまたはそれ以下、1nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;その細胞表面でCD38を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導する;ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、FcγRIおよび/またはFcγRIIへの結合の減少をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域において)を有する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下のEC50で、細胞表面で発現されるCD38ポリペプチド(例えば、ヒトまたはカニクイザル)に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ELISAによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下のEC50で、精製タンパク質としてのCD38ポリペプチド(例えば、ヒトまたはカニクイザル)に結合する。一部の実施形態では、KDは、4℃または25℃で測定される。
トメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、20nMまたはそれ以下、15nMまたはそれ以下、12nMまたはそれ以下、10nMまたはそれ以下、5nMまたはそれ以下、2nMまたはそれ以下、1nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてのカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nMまたはそれ以下、15nMまたはそれ以下、12nMまたはそれ以下、10nMまたはそれ以下、5nMまたはそれ以下、2nMまたはそれ以下、1nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;その細胞表面でCD38を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導する;ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、FcγRIおよび/またはFcγRIIへの結合の減少をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域において)を有する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下のEC50で、細胞表面で発現されるCD38ポリペプチド(例えば、ヒトまたはカニクイザル)に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ELISAによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下のEC50で、精製タンパク質としてのCD38ポリペプチド(例えば、ヒトまたはカニクイザル)に結合する。一部の実施形態では、KDは、4℃または25℃で測定される。
一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は、以下の構成のうちの1つまたはそれ以上を有する:T細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)の増殖を誘導する;Bcl-xLのT細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)による発現を誘導する;CD38+細胞のアポトーシスを誘導する(例えば、アネキシンV染色および/またはヨウ化プロピジウムの取り込みによって測定される場合);細胞表面で発現されるCD38およびT細胞表面で発現される1つまたはそれ以上のT細胞標的抗原に結合する;細胞表面で発現されるCD38、T細胞表面で発現されるCD28、およびT細胞表面で発現されるCD3に結合する;T細胞受容体の活性化を刺激する(例えば、CD69発現によって測定される場合);T細胞受容体のシグナル伝達の同時刺激を誘導する(例えば、CD28によって介在される場合);1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、PBMCによるサイトカイン放出(例えば、
IFN-γ、IL-2、および/またはTNF-α)の誘導の低下をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域に)を有する;CD38+標的細胞の存在下でPBMCによるサイトカイン放出(例えば、IFN-γおよび/またはIL-6)を誘導する(例えば、イムノアッセイによって測定される場合);SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、1.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてのヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、12nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、3.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてのカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、7.5nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;その細胞表面でCD38を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導する;ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、FcγRIおよび/またはFcγRIIへの結合の減少をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域において)を有する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下のEC50で、細胞表面で発現されるCD38ポリペプチド(例えば、ヒトまたはカニクイザル)に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ELISAによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下のEC50で、精製タンパク質としてのCD38ポリペプチド(例えば、ヒトまたはカニクイザル)に結合する。
IFN-γ、IL-2、および/またはTNF-α)の誘導の低下をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域に)を有する;CD38+標的細胞の存在下でPBMCによるサイトカイン放出(例えば、IFN-γおよび/またはIL-6)を誘導する(例えば、イムノアッセイによって測定される場合);SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、1.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてのヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、12nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるヒトCD38ポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、3.5nMまたはそれ以下のKDで、精製タンパク質としてのカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、7.5nMまたはそれ以下の見かけのKDで、細胞表面で発現されるカニクイザルCD38ポリペプチド(例えば、配列番号30のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;SPRまたはELISAによってアッセイされる場合、精製タンパク質としてのヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、細胞表面で発現されるヒトアイソフォームE CD38ポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)の細胞外ドメインに結合する;その細胞表面でCD38を発現する細胞のアポトーシスまたは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘導する;ならびに1つまたはそれ以上の変異を有さない同じ結合タンパク質と比較して、FcγRIおよび/またはFcγRIIへの結合の減少をもたらす1つまたはそれ以上の変異(例えば、Fc領域において)を有する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、フローサイトメトリーによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下のEC50で、細胞表面で発現されるCD38ポリペプチド(例えば、ヒトまたはカニクイザル)に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ELISAによってアッセイされる場合、20nMもしくはそれ以下、15nMもしくはそれ以下、12nMもしくはそれ以下、10nMもしくはそれ以下、5nMもしくはそれ以下、2nMもしくはそれ以下、または1nMもしくはそれ以下のEC50で、精製タンパク質としてのCD38ポリペプチド(例えば、ヒトまたはカニクイザル)に結合する。
核酸
結合タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを組換え発現ベクター中に組み込み、このようなベクターを宿主細胞中に導入するために、標準組換えDNA方法が使用される。例えば、Sambrookら、2001、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版)を参照されたい。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野で通常達成されるように、または本明細書に記載されているように実施される。特別の定義が提供されない限り、本明細書に記載の解析化学、合成有機化学、ならびに医
学的および薬学的化学に関連して利用される命名法、ならびにその実験手順および技法は、周知のものであり、当技術分野において通常使用される。同様に、従来の技法は、化学的合成、化学的解析、医薬品製造、製剤化、送達、および患者の処置のために使用される。
結合タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを組換え発現ベクター中に組み込み、このようなベクターを宿主細胞中に導入するために、標準組換えDNA方法が使用される。例えば、Sambrookら、2001、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版)を参照されたい。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野で通常達成されるように、または本明細書に記載されているように実施される。特別の定義が提供されない限り、本明細書に記載の解析化学、合成有機化学、ならびに医
学的および薬学的化学に関連して利用される命名法、ならびにその実験手順および技法は、周知のものであり、当技術分野において通常使用される。同様に、従来の技法は、化学的合成、化学的解析、医薬品製造、製剤化、送達、および患者の処置のために使用される。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関連する。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号60~83と少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であ
る、および/または表Jに示されている配列を含む。
る、および/または表Jに示されている配列を含む。
本開示のある特定の態様は、ポリヌクレオチドのキットに関する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのうちの1つまたはそれ以上は、ベクター(例えば、発現ベクター)である。キットは、とりわけ、本明細書に記載の結合タンパク質のうちの1つまたはそれ以上、例えば、本開示の三重特異性結合タンパク質を産生する際に使用を見出すことができる。一部の実施形態では、キットは、表Jにおいて示されている1、2、3、または4つのポリヌクレオチドを含む(例えば、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG1LALA P329A、mAb2×CD28sup×CD3mid IgG1 NNSA、mAb6×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA、mAb6×CD28sup×CD3mid IgG1LALA P329A、またはmAb6×CD28sup×CD3mid
IgG1 NNSAのもの)。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号74の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号77の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号79の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号80の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号82の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号83の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。
IgG1 NNSAのもの)。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号74の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号77の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号79の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号80の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号82の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは:配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号83の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、単離された核酸は、結合タンパク質をコードする核酸配列の転写を指示するために異種プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、核酸の転写を指示する核酸制御配列を指す。第1の核酸配列は、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的に関連して位置する場合に、第2の核酸配列に作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、結合タンパク質のコード配列に作動可能に連結される。プロモーターの例として、以下に
限定されないが、ウイルス(ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(アデノウイルス2のような)、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、サルウイルス40(SV40)などのような)のゲノムから得られたプロモーター、異種真核細胞プロモーターから得られたプロモーター(アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどのような)、CAG-プロモーター(Niwaら、Gene 108(2):193~9頁、1991)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター(Masuiら、Nucleic Acids Res. 33:e43頁、2005)、lac系、trp系、tac系、trc系、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母アルファ接合因子のプロモーターを挙げることができる。本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構成プロモーター、誘導プロモーター、または本明細書に記載の任意の他の好適なプロモーターまたは当業者によって容易に認識される他の好適なプロモーターの制御下にある。
限定されないが、ウイルス(ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(アデノウイルス2のような)、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、サルウイルス40(SV40)などのような)のゲノムから得られたプロモーター、異種真核細胞プロモーターから得られたプロモーター(アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどのような)、CAG-プロモーター(Niwaら、Gene 108(2):193~9頁、1991)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター(Masuiら、Nucleic Acids Res. 33:e43頁、2005)、lac系、trp系、tac系、trc系、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母アルファ接合因子のプロモーターを挙げることができる。本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構成プロモーター、誘導プロモーター、または本明細書に記載の任意の他の好適なプロモーターまたは当業者によって容易に認識される他の好適なプロモーターの制御下にある。
一部の実施形態では、単離された核酸は、ベクター中に組み込まれる。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結された1つまたはそれ以上の調節配列を含む。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含む。好適なエンハンサーの例として、以下に限定されないが、哺乳動物遺伝子由来エンハンサー配列(例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-胎児タンパク質、インスリンなど)、および真核細胞ウイルス由来のエンハンサー配列(複製起点の後側のSV40エンハンサー(bp100~270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなどのような)を挙げることができる。好適なベクターの例として、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、およびウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、麻疹、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなど)を挙げることができる。発現ベクターは、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞のような宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる。宿主において発現および複製可能な生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドDNAベクターは、当技術分野で公知であり、目的の任意の細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかの第1、第2、第3、および第4のポリペプチド鎖をコードする1つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系に関する。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖をコードする第1のベクター、結合タンパク質の第2のポリペプチド鎖をコードする第2のベクター、結合タンパク質の第3のポリペプチド鎖をコードする第3のベクター、および結合タンパク質の第4のポリペプチド鎖をコードする第4のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第1および第2のポリペプチド鎖をコードする第1のベクター、ならびに結合タンパク質の第3および第4のポリペプチド鎖をコードする第2のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第1および第3のポリペプチド鎖をコードする第1のベクター、ならびに結合タンパク質の第2および第4のポリペプチド鎖をコードする第2のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第1および第4のポリペプチド鎖をコードする第1のベクター、ならびに結合タンパク質の第2および第3のポリペプチド鎖をコードする第2のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第1、第2、第3、および第4のポリペプチド鎖をコードする第1のベクターを含む。ベクター
系の1つまたはそれ以上のベクターは、本明細書に記載のベクターのいずれかである。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のベクターは、発現ベクターである。
系の1つまたはそれ以上のベクターは、本明細書に記載のベクターのいずれかである。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のベクターは、発現ベクターである。
単離された宿主細胞
本開示の他の態様は、本明細書に記載の1つまたはそれ以上の単離されたポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞、ポリヌクレオチドのキット、ベクター、および/またはベクター系に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞(例えば、大腸菌(E.coli)細胞)である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞(例えば、S.セレビシエ(S.cerevisiae)細胞)である。一部の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例として、例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)細胞(例えば、S2細胞)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞(例えば、High Five(商標)細胞)およびツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)細胞(例えば、Sf21またはSf9細胞)を挙げることができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の例として、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞(例えば、懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた293または293細胞)、Expi293TM細胞、CHO細胞、ベビーハムスター腎臓細胞(例えば、BHK、ATCC CCL 10)、マウスセルトリ細胞(例えば、TM4細胞)、サル腎臓細胞(例えば、CV1 ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(例えば、VERO-76、ATCC
CRL-1587)、ヒト子宮頸癌細胞(例えば、HELA、ATCC CCL 2)、イヌ腎臓細胞(例えば、MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝臓細胞(例えば、BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(例えば、W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝臓細胞(例えば、Hep G2、HB 8065)、マウス乳房腫瘍細胞(例えば、MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞、MRC 5細胞、FS4細胞、ヒト肝細胞腫系統(例えば、Hep G2)および骨髄腫細胞(例えば、NS0およびSp2/0細胞)を挙げることができる。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の1つまたはそれ以上の単離されたポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞、ポリヌクレオチドのキット、ベクター、および/またはベクター系に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞(例えば、大腸菌(E.coli)細胞)である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞(例えば、S.セレビシエ(S.cerevisiae)細胞)である。一部の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例として、例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)細胞(例えば、S2細胞)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞(例えば、High Five(商標)細胞)およびツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)細胞(例えば、Sf21またはSf9細胞)を挙げることができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の例として、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞(例えば、懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた293または293細胞)、Expi293TM細胞、CHO細胞、ベビーハムスター腎臓細胞(例えば、BHK、ATCC CCL 10)、マウスセルトリ細胞(例えば、TM4細胞)、サル腎臓細胞(例えば、CV1 ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(例えば、VERO-76、ATCC
CRL-1587)、ヒト子宮頸癌細胞(例えば、HELA、ATCC CCL 2)、イヌ腎臓細胞(例えば、MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝臓細胞(例えば、BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(例えば、W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝臓細胞(例えば、Hep G2、HB 8065)、マウス乳房腫瘍細胞(例えば、MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞、MRC 5細胞、FS4細胞、ヒト肝細胞腫系統(例えば、Hep G2)および骨髄腫細胞(例えば、NS0およびSp2/0細胞)を挙げることができる。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかを産生する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、a)宿主細胞が結合タンパク質を発現するような条件下で、単離された核酸、ベクター、および/またはベクター系(例えば、本明細書に記載の単離された核酸、ベクター、および/またはベクター系のいずれか)を含む宿主細胞(例えば、本明細書に記載の宿主細胞のいずれか)を培養する工程と;b)宿主細胞から結合タンパク質を単離する工程とを含む。タンパク質を発現するための条件下で宿主細胞を培養する方法は、当業者に周知である。例えば、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーを含む、2工程アフィニティークロマトグラフィー)を含む、培養宿主細胞からタンパク質を単離する方法は当業者に周知である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、KappaSelect樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)、場合によりラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、LambdaFabSelect樹脂を、製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)によって精製される。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、LambdaFabSelect樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)、場合によりカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、KappaSelect樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)によって精製される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、2つのFc領域を含み、2つのFc領域はそれぞれCH3ドメインを含み、C
H3ドメインの一方のみが、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の435および436位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、H435RおよびY436Fである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、順に、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、次いで、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、KappaSelect樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)、次いで場合により、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、LambdaFabSelect樹脂を、製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)によって精製される。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、順に、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、LambdaFabSelect樹脂を、製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)、次いで場合により、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、KappaSelect樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)によって精製される。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質を、プロテインAと接触させ、0または2つの、H435RおよびY436Fであるアミノ酸置換を含むCH3ドメインを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下でプロテインAから溶出し、カッパ軽鎖親和性媒体(例えば、KappaSelect樹脂において使用されるような;GE Healthcare)と接触させ、ラムダCLドメインのみを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下で(例えば、製造業者の使用説明書に従って)カッパ軽鎖親和性媒体から溶出する。プロテインA溶出に好適な条件は当技術分野で公知であり、制限するものではないが、pH4.5~2.8の段階的溶出勾配を含む。一部の実施形態では、タンパク質精製に有用なプロテインAまたはプロテインAのバリアントが用いられる。一部の実施形態では、プロテインAは、例えば、クロマトグラフィー媒体の一部として、基板または樹脂に付着される。一部の実施形態では、カッパ軽鎖親和性媒体からの溶出後、結合タンパク質を、ラムダ軽鎖親和性媒体(例えば、LambdaFabSelect樹脂において使用されるような;GE Healthcare)と接触させ、カッパCLドメインのみを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下で(例えば、製造業者の使用説明書に従って)、ラムダ軽鎖親和性媒体から溶出する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、HICクロマトグラフィーを使用して検出される。一部の実施形態では、結合タンパク質は:ラムダCLドメインを含む第1のポリペプチド鎖;EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換がS354CおよびT366Wである第2のポリペプチド鎖のCH3ドメイン;EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、407、435、および436位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R、およびY436Fである第3のポリペプチド鎖のCH3ドメイン;ならびにカッパCLドメインを含む第4のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、宿主細胞によって産生される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞培養培地または宿主細胞抽出物から精製される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、宿主細胞によって分泌されるかまたは宿主細胞から産生され、抽出される(例えば、プロテインAと接触させる前に)。一部の実施形態では、結合タンパク質は、プロテインAと接触させる場合に、細胞培養培地または宿主細胞抽出物中にある。一部の実施形態では、結合タンパク質は、他の結合タンパク質、ポリペプチド、および/または他の細胞成分から離して精製される。
H3ドメインの一方のみが、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の435および436位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、H435RおよびY436Fである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、順に、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、次いで、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、KappaSelect樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)、次いで場合により、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、LambdaFabSelect樹脂を、製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)によって精製される。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、順に、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、LambdaFabSelect樹脂を、製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)、次いで場合により、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー(例えば、KappaSelect樹脂を製造業者の使用説明書に従って使用する;GE Healthcare)によって精製される。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質を、プロテインAと接触させ、0または2つの、H435RおよびY436Fであるアミノ酸置換を含むCH3ドメインを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下でプロテインAから溶出し、カッパ軽鎖親和性媒体(例えば、KappaSelect樹脂において使用されるような;GE Healthcare)と接触させ、ラムダCLドメインのみを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下で(例えば、製造業者の使用説明書に従って)カッパ軽鎖親和性媒体から溶出する。プロテインA溶出に好適な条件は当技術分野で公知であり、制限するものではないが、pH4.5~2.8の段階的溶出勾配を含む。一部の実施形態では、タンパク質精製に有用なプロテインAまたはプロテインAのバリアントが用いられる。一部の実施形態では、プロテインAは、例えば、クロマトグラフィー媒体の一部として、基板または樹脂に付着される。一部の実施形態では、カッパ軽鎖親和性媒体からの溶出後、結合タンパク質を、ラムダ軽鎖親和性媒体(例えば、LambdaFabSelect樹脂において使用されるような;GE Healthcare)と接触させ、カッパCLドメインのみを含む結合タンパク質から離して結合タンパク質を単離するのに好適な条件下で(例えば、製造業者の使用説明書に従って)、ラムダ軽鎖親和性媒体から溶出する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、HICクロマトグラフィーを使用して検出される。一部の実施形態では、結合タンパク質は:ラムダCLドメインを含む第1のポリペプチド鎖;EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換がS354CおよびT366Wである第2のポリペプチド鎖のCH3ドメイン;EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、407、435、および436位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R、およびY436Fである第3のポリペプチド鎖のCH3ドメイン;ならびにカッパCLドメインを含む第4のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、宿主細胞によって産生される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞培養培地または宿主細胞抽出物から精製される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、宿主細胞によって分泌されるかまたは宿主細胞から産生され、抽出される(例えば、プロテインAと接触させる前に)。一部の実施形態では、結合タンパク質は、プロテインAと接触させる場合に、細胞培養培地または宿主細胞抽出物中にある。一部の実施形態では、結合タンパク質は、他の結合タンパク質、ポリペプチド、および/または他の細胞成分から離して精製される。
III.三重特異性結合タンパク質
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、3つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および/または三価の結合タンパク質である。一部の
実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は、2つの別個の抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向を有する。上述のように、第2および第3のポリペプチド鎖は、FC領域(例えば、ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む)を含む。一部の実施形態では、Fc領域のうちの一方または両方は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、233~236、および/または409位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、S228P;E233P、F234V、L235A、および236における欠失;ならびに/またはR409Kである。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および/または329位に対応する位置に1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、L234A、L235A、および/またはP329Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および/または300位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S298N、T299A、および/またはY300Sである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、3つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および/または三価の結合タンパク質である。一部の
実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は、2つの別個の抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向を有する。上述のように、第2および第3のポリペプチド鎖は、FC領域(例えば、ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む)を含む。一部の実施形態では、Fc領域のうちの一方または両方は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、233~236、および/または409位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、S228P;E233P、F234V、L235A、および236における欠失;ならびに/またはR409Kである。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および/または329位に対応する位置に1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、L234A、L235A、および/またはP329Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および/または300位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S298N、T299A、および/またはY300Sである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、3つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および/または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合する
。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結したFc領域をさらに含み、Fc領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、233~236、および/または409位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、S228P;E233P、F234V、L235A、および236における欠失;ならびに/またはR409Kである。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および/または329位に対応する位置に1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、L234A、L235A、および/またはP329Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および/または300位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S298N、T299A、および/またはY300Sである。
。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結したFc領域をさらに含み、Fc領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、233~236、および/または409位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、S228P;E233P、F234V、L235A、および236における欠失;ならびに/またはR409Kである。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および/または329位に対応する位置に1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、L234A、L235A、および/またはP329Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および/または300位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S298N、T299A、および/またはY300Sである。
一部の実施形態では、VH1とVL1は、結合対を形成し、第1の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH2とVL2は、結合対を形成し、第2の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH3とVL3は、結合対を形成し、第3の抗原結合部位を形成する。結合タンパク質はまた、がん、関節炎、および/または炎症性障害を処置するための細胞活性化、腫瘍ターゲティング、サイトカイン活性の中和、ウイルス感染の中和、多重シグナル伝達事象の組合せのために使用することができる。例えば、一部の実施形態では、具体的には、結合タンパク質は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(VTCN1としても公知)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B
7-4、C3、C5、CCL2(MCP-1としても公知)、CCL3(MIP-1aとしても公知)、CCL4(MIP-1bとしても公知)、CCL5(RANTESとしても公知)、CCL7(MCP-3としても公知)、CCL8(mcp-2としても公知)、CCL11(エオタキシンとしても公知)、CCL15(MIP-1dとしても公知)、CCL17(TARCとしても公知)、CCL19(MIP-3bとしても公知)、CCL20(MIP-3aとしても公知)、CCL21(MIP-2としても公知)、CCL24(MPIF-2/エオタキシン-2としても公知)、CCL25(TECKとしても公知)、CCL26(エオタキシン-3としても公知)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(IgEに対する受容体であるFCER2としても公知)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(B7-1としても公知)、CD86(B7-2としても公知)、CD122、CD137(41BBとしても公知)、CD137L、CD152(CTLA4としても公知)、CD154(CD40Lとしても公知)、CD160、CD272、CD273(PDL2としても公知)、CD274(PDL1としても公知)、CD275(B7H2としても公知)、CD276(B7H3としても公知)、CD278(ICOSとしても公知)、CD279(PD-1としても公知)、CDH1(E-カドヘリンとしても公知)、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(M-CSFとしても公知)、CSF-2(GM-CSFとしても公知)、CSF-3(GCSFとしても公知)、CX3CL1(SCYD1としても公知)、CXCL12(SDF1としても公知)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(IL25に対する受容体としても公知)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(b4インテグリンとしても公知)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(IL33に対する受容体としても公知)、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(IL7Raに対する補助受容体としても公知)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1(GPR5/CCXCR1としても公知)から選択される1、2、3つの抗原標的に結合する。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの1つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
7-4、C3、C5、CCL2(MCP-1としても公知)、CCL3(MIP-1aとしても公知)、CCL4(MIP-1bとしても公知)、CCL5(RANTESとしても公知)、CCL7(MCP-3としても公知)、CCL8(mcp-2としても公知)、CCL11(エオタキシンとしても公知)、CCL15(MIP-1dとしても公知)、CCL17(TARCとしても公知)、CCL19(MIP-3bとしても公知)、CCL20(MIP-3aとしても公知)、CCL21(MIP-2としても公知)、CCL24(MPIF-2/エオタキシン-2としても公知)、CCL25(TECKとしても公知)、CCL26(エオタキシン-3としても公知)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(IgEに対する受容体であるFCER2としても公知)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(B7-1としても公知)、CD86(B7-2としても公知)、CD122、CD137(41BBとしても公知)、CD137L、CD152(CTLA4としても公知)、CD154(CD40Lとしても公知)、CD160、CD272、CD273(PDL2としても公知)、CD274(PDL1としても公知)、CD275(B7H2としても公知)、CD276(B7H3としても公知)、CD278(ICOSとしても公知)、CD279(PD-1としても公知)、CDH1(E-カドヘリンとしても公知)、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(M-CSFとしても公知)、CSF-2(GM-CSFとしても公知)、CSF-3(GCSFとしても公知)、CX3CL1(SCYD1としても公知)、CXCL12(SDF1としても公知)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(IL25に対する受容体としても公知)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(b4インテグリンとしても公知)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(IL33に対する受容体としても公知)、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(IL7Raに対する補助受容体としても公知)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1(GPR5/CCXCR1としても公知)から選択される1、2、3つの抗原標的に結合する。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの1つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
一部の実施形態では、3つの抗原結合部位のうちの1つは、CD3ポリペプチド(例えば、ヒトCD3ポリペプチド)に結合し、3つの抗原結合部位のうちの1つは、CD28ポリペプチド(例えば、ヒトCD28ポリペプチド)に結合し、3つの抗原結合部位のうちの1つは、第3のポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、具体的には、CD3またはCD28以外の抗原標的に結合する抗原結合部位は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(VTCN1としても公知)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(MCP-1としても公知)、CCL3(MIP-1aとしても公知)、CCL4(MIP-1bとしても公知)、CCL5(RANTESとしても公知)、CCL7(MCP-3としても公知)、CCL8(mcp-2としても公知)、CCL11(エオタキシンとしても公知)、CCL15(MIP-1dと
しても公知)、CCL17(TARCとしても公知)、CCL19(MIP-3bとしても公知)、CCL20(MIP-3aとしても公知)、CCL21(MIP-2としても公知)、CCL24(MPIF-2/エオタキシン-2としても公知)、CCL25(TECKとしても公知)、CCL26(エオタキシン-3としても公知)、CCR3、CCR4、CD19、CD20、CD23(IgEに対する受容体であるFCER2としても公知)、CD24、CD27、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(B7-1としても公知)、CD86(B7-2としても公知)、CD122、CD137(41BBとしても公知)、CD137L、CD152(CTLA4としても公知)、CD154(CD40Lとしても公知)、CD160、CD272、CD273(PDL2としても公知)、CD274(PDL1としても公知)、CD275(B7H2としても公知)、CD276(B7H3としても公知)、CD278(ICOSとしても公知)、CD279(PD-1としても公知)、CDH1(E-カドヘリンとしても公知)、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(M-CSFとしても公知)、CSF-2(GM-CSFとしても公知)、CSF-3(GCSFとしても公知)、CX3CL1(SCYD1としても公知)、CXCL12(SDF1としても公知)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(IL25に対する受容体としても公知)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(b4インテグリンとしても公知)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(IL33に対する受容体としても公知)、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(IL7Raに対する補助受容体としても公知)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1(GPR5/CCXCR1としても公知)から選択される抗原標的に結合する。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの1つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
しても公知)、CCL17(TARCとしても公知)、CCL19(MIP-3bとしても公知)、CCL20(MIP-3aとしても公知)、CCL21(MIP-2としても公知)、CCL24(MPIF-2/エオタキシン-2としても公知)、CCL25(TECKとしても公知)、CCL26(エオタキシン-3としても公知)、CCR3、CCR4、CD19、CD20、CD23(IgEに対する受容体であるFCER2としても公知)、CD24、CD27、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(B7-1としても公知)、CD86(B7-2としても公知)、CD122、CD137(41BBとしても公知)、CD137L、CD152(CTLA4としても公知)、CD154(CD40Lとしても公知)、CD160、CD272、CD273(PDL2としても公知)、CD274(PDL1としても公知)、CD275(B7H2としても公知)、CD276(B7H3としても公知)、CD278(ICOSとしても公知)、CD279(PD-1としても公知)、CDH1(E-カドヘリンとしても公知)、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(M-CSFとしても公知)、CSF-2(GM-CSFとしても公知)、CSF-3(GCSFとしても公知)、CX3CL1(SCYD1としても公知)、CXCL12(SDF1としても公知)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(IL25に対する受容体としても公知)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(b4インテグリンとしても公知)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(IL33に対する受容体としても公知)、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(IL7Raに対する補助受容体としても公知)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1(GPR5/CCXCR1としても公知)から選択される抗原標的に結合する。一部の実施形態では、上記抗原標的のうちの1つまたはそれ以上は、ヒト抗原標的である。
上に記載された三重特異性結合タンパク質のうちのいずれかでは、本明細書に記載の任意のリンカーまたはリンカーの組合せを使用することができる。例えば、一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4のうちの少なくとも1つは、独立して、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4は、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、0アミノ酸長であるかまたはGGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、GGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、L1は、配列GQPKAAP(配列番号58)を含み、L2は、配列TKGPS(配列番号57)を含み、L3は、配列Sを含み、L4は、配列RTを含む。一部の実施形態では、L1は、配列GGGGSGGGGS(配列番号
55)を含み、L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である。
55)を含み、L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である。
IV.結合タンパク質に関する使用
結合タンパク質は、1つまたはそれ以上の標的抗原の検出および定量化のための、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような任意の公知のアッセイ方法において用いることができる。結合タンパク質は、用いられているアッセイ方法にとって適当である親和性で、1つまたはそれ以上の標的抗原と結合する。
結合タンパク質は、1つまたはそれ以上の標的抗原の検出および定量化のための、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような任意の公知のアッセイ方法において用いることができる。結合タンパク質は、用いられているアッセイ方法にとって適当である親和性で、1つまたはそれ以上の標的抗原と結合する。
診断適用のために、ある特定の実施形態では、結合タンパク質を検出可能な部分を用いて標識することができる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで産生可能である任意のものである。例えば、検出可能な部分は、3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In、もしくは67Gaのような放射性同位元素;フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンのような蛍光もしくは化学発光化合物;またはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素である。
結合タンパク質はまた、in vivoイメージングにとって有用である。検出可能な部分を用いて標識された結合タンパク質を、動物に、好ましくは、血流中に投与することができ、宿主における標識された抗体の存在および位置がアッセイされる。結合タンパク質を、核磁気共鳴、放射線学、または当技術分野で公知の他の検出手段によってなされるかどうかにかかわらず、動物において検出可能である任意の部分を用いて標識することができる。
臨床または研究適用のために、ある特定の実施形態では、結合タンパク質を細胞毒製剤にコンジュゲートさせることができる。細胞毒製剤に連結された様々な抗体(すなわち、抗体-薬物コンジュゲート)を使用して、細胞毒性ペイロードを特定の腫瘍細胞に対して標的とした。細胞毒製剤と抗体に対してその製剤をコンジュゲートするリンカーは、当技術分野で公知である;例えば、Parslow,A.C.ら(2016) Biomedicines 4:14頁およびKalim,M.ら(2017) Drug Des.Devel.Ther. 11:2265~2276頁を参照されたい。
本開示はまた、結合タンパク質および生体サンプルにおける標的抗原レベルを検出するのに有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性対照サンプル、ならびに検出試薬を含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の任意の結合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、ベクター系、および/または宿主細胞を含む組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、容器および容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書を含む。好適な容器として、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成される。容器は、それ自体でまたは別の組成物と組み合わせて、状態を処置、防止および/または診断するのに有効である組成物を保持し、かつ滅菌アクセスポートを有する(例えば、容器は、皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルである)。一部の実施形態では、ラベルまたは添付文書は、選択した状態を防止、診断、および/
または処置するために組成物が使用されることを示す。あるいは、またはさらに、製造品またはキットは、静菌性注射水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第2の(または第3の)容器をさらに含む場合がある。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジを含む、商業的およびユーザー的観点から望まれる他の材料をさらに含む場合がある。
または処置するために組成物が使用されることを示す。あるいは、またはさらに、製造品またはキットは、静菌性注射水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第2の(または第3の)容器をさらに含む場合がある。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジを含む、商業的およびユーザー的観点から望まれる他の材料をさらに含む場合がある。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、がんの処置または防止のために、それを必要とする患者に投与される。一部の実施形態では、本開示は、増殖性疾患または障害(例えば、がん)を防止および/または処置する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の結合タンパク質、またはそれに関連する医薬組成物のうちの少なくとも1つの治療有効量を患者に投与することを含む。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者の増殖性疾患または障害(例えば、がん)を防止および/または処置するための、本明細書に記載の結合タンパク質、またはそれに関連する医薬組成物のうちの少なくとも1つの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者の増殖性疾患または障害(例えば、がん)を防止および/または処置するための医薬の製造において使用するための本明細書に記載の結合タンパク質、またはそれに関連する医薬組成物のうちの少なくとも1つに関する。一部の実施形態では、患者は、ヒトである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、T細胞表面のタンパク質に結合する1つの抗原結合部位および、例えば、上の項目IIに記載されているように、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する別の抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位、ヒトCD28ポリペプチドに結合する抗原結合部位、およびヒトCD3ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む。
一部の実施形態では、がん細胞は、それらの細胞表面にヒトCD38アイソフォームAポリペプチド(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含む)を発現する。一部の実施形態では、がん細胞は、それらの細胞表面にヒトCD38アイソフォームEポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)を発現する。一部の実施形態では、がん細胞がそれらの細胞表面にヒトCD38アイソフォームEポリペプチド(例えば、配列番号105のアミノ酸配列を含む)を発現するため、患者は、処置のために選択される。一部の実施形態では、がん細胞は、CD38およびCD28を発現する。一部の実施形態では、がん細胞はCD38を発現するが、CD28を発現しない。
一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Her2+乳がんのような乳がん、前立腺がん、胚中心B細胞リンパ腫またはB細胞急性リンパ芽球性白血病である。ある特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。ある特定の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、またはB細胞リンパ腫である。
ある特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫の処置のために、ダラツムマブおよびイサツキシマブのような抗CD38抗体を試験してきた。しかし、多発性骨髄腫は処置可能であると考えられる一方で、ほとんどすべての患者で再発を避けることができず、処置-難治性疾患の発症をもたらす。一部の実施形態では、がんは、再発性または難治性多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、患者は、以前の多発性骨髄腫処置を用いて処置されてきた。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、多発性骨髄腫に関するファーストライン、セカンドライン、またはサードライン処置として患者に投与される。理論に拘束されることを望むものではないが、本開示の抗CD38×抗CD28×抗CD3結合タンパク質は、例えば、抗CD38(または抗CD28/抗CD
38)による腫瘍細胞へのT細胞の動員、抗CD3/抗CD28によりエンゲージされたT細胞の活性化、および/またはパーフォリン/グランザイムベースの機構を介する腫瘍細胞の殺滅によって、多発性骨髄腫を処置するのに有用であると考えられる。CD28は、多発性骨髄腫に対する新規がんマーカーとして報告されている。Nair,J.R.ら(2011) J.Immunol. 187:1243~1253頁を参照されたい。
38)による腫瘍細胞へのT細胞の動員、抗CD3/抗CD28によりエンゲージされたT細胞の活性化、および/またはパーフォリン/グランザイムベースの機構を介する腫瘍細胞の殺滅によって、多発性骨髄腫を処置するのに有用であると考えられる。CD28は、多発性骨髄腫に対する新規がんマーカーとして報告されている。Nair,J.R.ら(2011) J.Immunol. 187:1243~1253頁を参照されたい。
一部の実施形態では、少なくとも1つの結合タンパク質は、1つまたはそれ以上の抗がん治療(例えば、化学療法剤または治療のような、当技術分野で公知の任意の抗がん治療)と組み合わせて投与される(または投与されるべきである)。一部の実施形態では、少なくとも1つの結合タンパク質は、1回またはそれ以上の抗がん治療の前に投与される(または投与されるべきである)。一部の実施形態では、少なくとも1つの結合タンパク質は、1回またはそれ以上の抗がん治療と同時に投与される(または投与されるべきである)。一部の実施形態では、少なくとも1つの結合タンパク質は、1回またはそれ以上の抗レトロウイルス治療の後に投与される(または投与されるべきである)。
V.結合タンパク質治療用組成物およびその投与
結合タンパク質を含む治療用組成物または医薬組成物は、本開示の範囲内である。このような治療用組成物または医薬組成物は、治療有効量の結合タンパク質、または結合タンパク質-薬物コンジュゲートを、投与様式との適合性について選択された薬学的にまたは生理学的に許容される製剤と混合して含む場合がある。
結合タンパク質を含む治療用組成物または医薬組成物は、本開示の範囲内である。このような治療用組成物または医薬組成物は、治療有効量の結合タンパク質、または結合タンパク質-薬物コンジュゲートを、投与様式との適合性について選択された薬学的にまたは生理学的に許容される製剤と混合して含む場合がある。
許容可能な製剤材料は、好ましくは、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。
医薬組成物は、例えば、組成物のpH、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変、維持、または保存するための製剤材料を含有することができる。好適な製剤材料として、以下に限定されないが、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンのような)、抗微生物剤、抗酸化物質(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムのような)、緩衝液(ホウ酸塩、重炭酸、Tris-HCl、クエン酸、リン酸、または他の有機酸のような)、嵩高剤(マンニトールまたはグリシンのような)、キレート化剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)のような)、錯化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリンのような)、増量剤、単糖類、二糖類、および他の炭化水素(グルコース、マンノース、またはデキストリンのような)、タンパク質(血清アルブミン、ゼラチンまたは、免疫グロブリンのような)、着色剤、矯味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー(ポリビニルピロリドンのような)、低分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン(ナトリウムのような)、保存料(塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素のような)、溶媒(グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのような)、糖アルコール(マンニトールまたはソルビトールのような)、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤(プルロニック;PEG;ソルビタンエステル;ポリソルベート20またはポリソルベート80などのポリソルベート;トリトン;トロメタミン;レシチン;コレステロールまたはチロキサパル(tyloxapal)のような)、安定性増強剤(スクロースまたはソルビトールのような)、浸透圧増強剤(アルカリ金属ハロゲン化物-好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム-またはマンニトールソルビトールのような)、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または医薬アジュバント(例えば、いずれかの目的のために、参照によって本明細書に組み入れる、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版、A.R.Gennaro編、Mack Publishing Company
1990)および同一物のその後の版を参照されたい)。
1990)および同一物のその後の版を参照されたい)。
最適医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に応じて、熟練した技術者によって決定される。このような組成物は、結合タンパク質の物理的状態、安定性、in vivo放出の速度、およびin vivoクリアランスの速度に影響を及ぼす場合がある。
医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、本質的に、水性または非水性のいずれかである。例えば、注射用の好適なビヒクルまたは担体は、おそらくは非経口投与用組成物において一般的な他の材料を補充した、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液である。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な医薬組成物は、ソルビトールまたは好適な代用物をさらに含むことができる、約pH7.0~8.5のTris緩衝液、または約pH4.0~5.5の酢酸緩衝液を含む。本開示の一実施形態では、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意選択の製剤と混合することによって、結合タンパク質組成物を保存のために調製することができる。さらに、結合タンパク質は、スクロースのような適当な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
本開示の医薬組成物は、非経口送達または皮下用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入用または、経口的のような、消化管を介する送達用に選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は当業者の範囲内である。
製剤成分は、投与部位にとって許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液は、組成物を生理学的pHまたはわずかに低いpHに、典型的には、約5から約8のpH範囲内で維持するために使用される。
非経口投与が企図される場合には、使用するための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の結合タンパク質を含む、発熱物質不含の、非経口的に許容される水溶液の形態である。非経口注射用の特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、滅菌蒸留水中では、結合タンパク質が、適宜保存される滅菌等張性溶液として製剤化される。さらに別の調製は、製品の徐放または持続放出をもたらし、次いで、デポー注射によって送達することができる注射用ミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物(ポリ乳酸またはポリグリコール酸のような)、ビーズ、またはリポソームのような薬剤を用いる、所望の分子の製剤化に関与する。ヒアルロン酸も使用することができ、これは、循環における持続期間を促進する効果を有する。所望の分子の導入のための他の好適な手段として、埋め込み可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
一実施形態では、医薬組成物を吸入用に製剤化することができる。例えば、結合タンパク質を吸入用の乾燥散剤として製剤化することができる。エアゾール送達用に噴射剤を用いて、結合タンパク質吸入溶液も製剤化することができる。さらに別の実施形態では、溶液を噴霧することができる。
ある特定の製剤を経口投与することができることも企図される。本開示の一実施形態では、この様式で投与される結合タンパク質を、錠剤およびカプセル剤のような固体剤型の配合において習慣的に使用される担体を用いてまたは用いずに製剤化することができる。例えば、カプセル剤は、バイオアベイラビリティが最大化され、前全身性(pre-systemic)分解が最小化される場合に、胃腸管において製剤の活性部分をその時点で放出するよう設計することができる。結合タンパク質の吸収を促進するために、追加の薬剤を含めることができる。希釈剤、矯味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も用いることができる。
別の医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物における、有効量の結合タンパク質に関与する場合がある。滅菌水、または別の適当なビヒクル中に錠剤を溶解することによって、溶液を単位用量形態で調整することができる。好適な賦形剤として、以下に限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムのような不活性希釈剤;またはデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴムのような結合剤;またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクのような滑沢剤が挙げられる。
持続送達または制御送達製剤中の結合タンパク質に関与する製剤を含む、本開示の追加の医薬組成物が当業者には明らかであると予想される。リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射液のような種々の他の持続送達または制御送達手段を製剤化するための技法も当業者に公知である。持続放出調製物の追加の例として、成型品形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスとして、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメートのコポリマー、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、エチレン酢酸ビニル、またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸を挙げることができる。持続放出組成物として、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも挙げることができる。
in vivo投与のために使用されるべき医薬組成物は、典型的には、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合には、凍結乾燥および再構築前または後のいずれかで、この方法を使用する滅菌法を行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存することができる。さらに、非経口組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
医薬組成物が製剤化されると、医薬組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水されたもしくは凍結乾燥された粉末として、滅菌バイアル中で保存することができる。このような製剤は、すぐに使える形態で、または投与に先立って再構築を必要とする形態(例えば、凍結乾燥した)のいずれかで保存することができる。
本開示は、単回用量投与単位を産生するためのキットも包含する。キットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第1の容器と水性製剤を有する第2の容器の両方を含有することができる。また、単一および複数チャンバーの事前充填シリンジ(例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ(lyosyringe))を含有するキットも、本開示の範囲内に含まれる。
治療上用いられるべき結合タンパク質医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に応じて変わる。よって、当業者であれば、処置のための適当な投薬量レベルは、幾分かは、送達される分子、結合タンパク質が使用されている適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ(体重、体表面、または臓器の大きさ)および状態(年齢および全身の健康)に応じて変わることを認識していると予想される。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を用量設定し、投与経路を修正することができる。
投薬頻度は、使用されている製剤中の結合タンパク質の薬物動態パラメータに応じて変わる。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで組成物を投与することになる。したがって、組成物を、単回用量として、2回もしくはそれ以上の用量(同量の所望の分子を含有する場合も含有しない場合もある)として経時的に、または埋
め込みデバイスもしくはカテーテルによる連続注入として投与することができる。適当な投薬量のさらなる精緻化は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に実施される課題の範囲内である。適当な投薬量は、適当な用量応答データの使用によって確認することができる。
め込みデバイスもしくはカテーテルによる連続注入として投与することができる。適当な投薬量のさらなる精緻化は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に実施される課題の範囲内である。適当な投薬量は、適当な用量応答データの使用によって確認することができる。
医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従うものであり、例えば、経口的に;静脈内、腹腔内、大脳内(実質内)、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射によって;持続放出系によって;または埋め込みデバイスによって。所望の場合には、組成物をボーラス注射によって、または注入によって、もしくは埋め込みデバイスによって連続的に投与することができる。
組成物は、その上に所望の分子が吸収されているかまたはカプセル化されている膜、スポンジ、または他の適当な材料の埋め込みによって局所投与することもできる。埋め込みデバイスが使用される場合には、デバイスは、任意の好適な組織または臓器中に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、持効性ボーラス、または連続投与によるものである。
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態の例示、およびその様々な使用である。それらは、単に説明目的で示され、決して本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。
以下の用語は、特定の抗CD38抗原結合ドメインまたは抗体を指すために、本発明の実施例および図面において互換的に使用される:
抗CD38_C2-CD38-1:mAb1
抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1またはCD38VH1:mAb2
抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3:mAb3
抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3:mAb4
抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3:mAb5
抗CD38_1370またはCD38HHY1370:mAb6
抗CD38_SB19またはイサツキシマブ:mAb7。
抗CD38_C2-CD38-1:mAb1
抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1またはCD38VH1:mAb2
抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3:mAb3
抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3:mAb4
抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3:mAb5
抗CD38_1370またはCD38HHY1370:mAb6
抗CD38_SB19またはイサツキシマブ:mAb7。
モノクローナル抗CD38抗体の生成および特徴付け
以下の実施例は、モノクローナル抗CD38抗体の生成および特徴付けについて記載する。有利には、ヒトおよびサルCD38タンパク質と交差反応し、それによって安全性研究と臨床研究の両方のために使用することができる分子を提供する抗体が本明細書において提供される。これらの抗体は、アポトーシスおよび抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)によってCD38+細胞を死滅させることも可能である。
以下の実施例は、モノクローナル抗CD38抗体の生成および特徴付けについて記載する。有利には、ヒトおよびサルCD38タンパク質と交差反応し、それによって安全性研究と臨床研究の両方のために使用することができる分子を提供する抗体が本明細書において提供される。これらの抗体は、アポトーシスおよび抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)によってCD38+細胞を死滅させることも可能である。
この実施例は、単一のマウスB細胞に由来するCD38特異的かつ交差反応性モノクローナル抗体を生成するための効率的ワークフローについて記載する。
材料および方法
モノクローナル抗体の生成
ヒトCD38細胞外ドメインR45-I300(配列番号1)を使用して、ヒトCD38への抗体を生成した。Q.Liu、I.Krilksunov、R.Graeff、C.Munshi、H.C.Lee、およびQ.Hao 2005 Structure 13::1331~1339頁を参照されたい。ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽
鎖可変領域をコードするDNAを含む正常BalbCマウスまたはトランスジェニックTrianni Mice(商標)(Trianni、San Francisco、CA)のいずれかに対して、免疫原を、免疫応答を刺激するためにアジュバントとともに直接投与した。
モノクローナル抗体の生成
ヒトCD38細胞外ドメインR45-I300(配列番号1)を使用して、ヒトCD38への抗体を生成した。Q.Liu、I.Krilksunov、R.Graeff、C.Munshi、H.C.Lee、およびQ.Hao 2005 Structure 13::1331~1339頁を参照されたい。ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽
鎖可変領域をコードするDNAを含む正常BalbCマウスまたはトランスジェニックTrianni Mice(商標)(Trianni、San Francisco、CA)のいずれかに対して、免疫原を、免疫応答を刺激するためにアジュバントとともに直接投与した。
異なるタグと点突然変異を有するアイソフォームAに由来する様々な組換えCD38タンパク質を使用し(配列番号2、3、4、および28)、R45-P203由来のCD38細胞外ドメインを包含するCD38アイソフォームE(配列番号105)のタグ付けバージョンを使用した。哺乳動物細胞における一過的発現によってタンパク質を産生した。CMVエンハンサー/プロモーターとSV40ポリAシグナルの下で、コーディングDNA配列を哺乳動物発現プラスミドへとクローニングした。HEK293細胞(Invitrogen;番号K9000-10)を、製造業者の使用説明書に従って、FreeStyle(商標)MAX 293発現システムを使用して、発現プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトした。
マウスの免疫化および単一B細胞の選択
骨髄腫細胞に融合させずに、抗CD38抗体もまた、抗原陽性B細胞から直接単離した。この方法を使用して、mAb1のようないくつかの抗CD38抗体を得た(VHおよびVL配列については、それぞれ、配列番号5および6、ならびに重鎖および軽鎖配列については、それぞれ、配列番号7および8を参照されたい)。簡潔には、6~8週齢の雌BALB/cマウス(S082342;Charles River Labs、Bar Harbor、 ME)はそれぞれ、A. Wennerbergら(1993 Am.J.Pathol. 143:1050~1054頁)に記載された古典的方法を使用して、41日をかけて3回の免疫化を受けた。マウスの腹側の部位に抗原を腹腔内投与した。最後の注射の3日後に、マウスを屠殺し、脾臓を無菌で単離し、新鮮なRPMI培地で洗浄した。リンパ球を脾臓から放出させ、蛍光抗体と二重のヒトおよびサルCD38タンパク質のパネルを含む4色の選別戦略を使用して選別する前に、単一細胞の懸濁液をRPMI培地で2回洗浄し、次いで、フローサイトメトリー細胞選別を使用して分離し、ヒト/サル交差反応性IgG-CD38特異的B細胞を単離した。単一細胞をPCRチューブへと直接選別し、RT-PCRによってVHおよびVL遺伝子のコグネイト対を増幅させた(T.Tiller、C.BusseおよびH. Wardemann 2009 J.Immunol.Methods 350:183~193頁)。得られたDNAをシークエンシングした。
骨髄腫細胞に融合させずに、抗CD38抗体もまた、抗原陽性B細胞から直接単離した。この方法を使用して、mAb1のようないくつかの抗CD38抗体を得た(VHおよびVL配列については、それぞれ、配列番号5および6、ならびに重鎖および軽鎖配列については、それぞれ、配列番号7および8を参照されたい)。簡潔には、6~8週齢の雌BALB/cマウス(S082342;Charles River Labs、Bar Harbor、 ME)はそれぞれ、A. Wennerbergら(1993 Am.J.Pathol. 143:1050~1054頁)に記載された古典的方法を使用して、41日をかけて3回の免疫化を受けた。マウスの腹側の部位に抗原を腹腔内投与した。最後の注射の3日後に、マウスを屠殺し、脾臓を無菌で単離し、新鮮なRPMI培地で洗浄した。リンパ球を脾臓から放出させ、蛍光抗体と二重のヒトおよびサルCD38タンパク質のパネルを含む4色の選別戦略を使用して選別する前に、単一細胞の懸濁液をRPMI培地で2回洗浄し、次いで、フローサイトメトリー細胞選別を使用して分離し、ヒト/サル交差反応性IgG-CD38特異的B細胞を単離した。単一細胞をPCRチューブへと直接選別し、RT-PCRによってVHおよびVL遺伝子のコグネイト対を増幅させた(T.Tiller、C.BusseおよびH. Wardemann 2009 J.Immunol.Methods 350:183~193頁)。得られたDNAをシークエンシングした。
製造業者の使用説明書に従いFreeStyle(商標)MAX 293発現システムを使用して、得られたDNAを、HEK293細胞における一過的発現のためにそれぞれヒトIgG1またはヒトCkドメインをコードする哺乳動物発現ベクターへとクローニングした。バッチをプロテインAアフィニティークロマトグラフィー(MabSelect、GE Heathcare)によって精製した。溶出液をPBSに対して透析した後、滅菌濾過し、4℃で保存した。
ヒト免疫グロブリン導入遺伝子マウスにおける免疫化による抗体の生成およびハイブリドーマ技法を使用する選択
Kilpatrickら 1997 Hybridoma 16:381389頁に記載されているヒトCD38の細胞外ドメインを有するP3X63-Ag8.653骨髄腫細胞を使用して、免疫化、融合およびスクリーニングを実施した。Kilpatrickらによって記載されたRIMMS方法を使用して、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む6~8週齢の雌トランスジェニックTrianni Mice(商標)はそれぞれ、3~4日間隔で14日かけて4回の免疫化を受けた。RIBIのアジュバント(Sigma 番号T2684)中に乳化されたCD38タンパ
ク質を、マウスの背に沿った流入領域リンパ節の近位の6つの部位および腹部に沿った6つの並列部位に皮下投与した。最後の注射の4日後に、マウスを屠殺した。両側の膝窩、浅鼠径、腋窩および上腕のリンパ節を無菌で単離し、新鮮なRPMI培地で洗浄した。リンパ球をリンパ節から放出させ、ポリエチレングリコールを使用してP3X63-AG8.653骨髄腫細胞と融合させる前に、単一細胞の懸濁液をRPMI培地で2回洗浄した。融合後に、細胞混合物をインキュベーター中で、37℃にて16~24時間インキュベートした。得られた細胞調製物を選択的半固体培地中に移し、100mmのペトリ皿中に無菌でプレートアウトし、37℃でインキュベートした。選択開始の10日後に、ハイブリドーマの成長についてプレートを調査し、目に見えるコロニーをピックアップし、成長培地200μLを含有する96ウェルプレート中に置いた。96ウェルプレートを、インキュベーター中で、37℃にて2から4日間保持した。この技法、および上述の免疫原を使用し、mAb6のようないくつかの抗CD38キメラ抗体を得た(VHおよびVL配列については、それぞれ、配列番号9および10、ならびに重鎖および軽鎖配列については、それぞれ、配列番号11および12を参照されたい)。VHおよびVL配列をRT-PCRによって回収し、上述したように一過的発現によってmAb6を産生した。
Kilpatrickら 1997 Hybridoma 16:381389頁に記載されているヒトCD38の細胞外ドメインを有するP3X63-Ag8.653骨髄腫細胞を使用して、免疫化、融合およびスクリーニングを実施した。Kilpatrickらによって記載されたRIMMS方法を使用して、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む6~8週齢の雌トランスジェニックTrianni Mice(商標)はそれぞれ、3~4日間隔で14日かけて4回の免疫化を受けた。RIBIのアジュバント(Sigma 番号T2684)中に乳化されたCD38タンパ
ク質を、マウスの背に沿った流入領域リンパ節の近位の6つの部位および腹部に沿った6つの並列部位に皮下投与した。最後の注射の4日後に、マウスを屠殺した。両側の膝窩、浅鼠径、腋窩および上腕のリンパ節を無菌で単離し、新鮮なRPMI培地で洗浄した。リンパ球をリンパ節から放出させ、ポリエチレングリコールを使用してP3X63-AG8.653骨髄腫細胞と融合させる前に、単一細胞の懸濁液をRPMI培地で2回洗浄した。融合後に、細胞混合物をインキュベーター中で、37℃にて16~24時間インキュベートした。得られた細胞調製物を選択的半固体培地中に移し、100mmのペトリ皿中に無菌でプレートアウトし、37℃でインキュベートした。選択開始の10日後に、ハイブリドーマの成長についてプレートを調査し、目に見えるコロニーをピックアップし、成長培地200μLを含有する96ウェルプレート中に置いた。96ウェルプレートを、インキュベーター中で、37℃にて2から4日間保持した。この技法、および上述の免疫原を使用し、mAb6のようないくつかの抗CD38キメラ抗体を得た(VHおよびVL配列については、それぞれ、配列番号9および10、ならびに重鎖および軽鎖配列については、それぞれ、配列番号11および12を参照されたい)。VHおよびVL配列をRT-PCRによって回収し、上述したように一過的発現によってmAb6を産生した。
可溶性CD38細胞外ドメインに対する結合親和性
抗huCD38mabの結合特性を、BIAcore 2000(BIAcore Inc.、Uppsala、NJ)を使用して評価した。簡潔には、CM5 BIAcoreバイオセンサーチップを機器へとドッキングし、室温で、1:1のNHS/EDC 250μLで活性化した。マウス抗ヒトFc IgG1(GE Healthcare 番号BR-1008-39)(0.05Mの酢酸緩衝液中13.5μg/mL、pH5)をフローセル1中の活性化チップ上で固定化した。固定化は、流速5μL/分で行った。次いで、エタノールアミン-HCl(pH8.5)55μLの注射によってチップをブロックし、続いて、50mMのNaOH、1MのNaClで5回洗浄した。ヒトCD38タンパク質またはcynoCD38タンパク質への抗CD38mabの結合を測定するために、BIAcoreランニング緩衝液(HBS-EP)中2μg/mLの抗体を使用した。抗原(ヒトCD38-histag(ID2)またはcynoCD38-histag(ID3))を3から1000nM注射した。注射期の完了後、同じ流速で360秒間、BIAcoreランニング緩衝液中で解離をモニタリングした。50mMのNaOH-1MのNaCl 30μLを使用して、注射間に表面を再生した。BIAsimulationソフトウェアを使用して、個々のセンソグラムを解析した。
抗huCD38mabの結合特性を、BIAcore 2000(BIAcore Inc.、Uppsala、NJ)を使用して評価した。簡潔には、CM5 BIAcoreバイオセンサーチップを機器へとドッキングし、室温で、1:1のNHS/EDC 250μLで活性化した。マウス抗ヒトFc IgG1(GE Healthcare 番号BR-1008-39)(0.05Mの酢酸緩衝液中13.5μg/mL、pH5)をフローセル1中の活性化チップ上で固定化した。固定化は、流速5μL/分で行った。次いで、エタノールアミン-HCl(pH8.5)55μLの注射によってチップをブロックし、続いて、50mMのNaOH、1MのNaClで5回洗浄した。ヒトCD38タンパク質またはcynoCD38タンパク質への抗CD38mabの結合を測定するために、BIAcoreランニング緩衝液(HBS-EP)中2μg/mLの抗体を使用した。抗原(ヒトCD38-histag(ID2)またはcynoCD38-histag(ID3))を3から1000nM注射した。注射期の完了後、同じ流速で360秒間、BIAcoreランニング緩衝液中で解離をモニタリングした。50mMのNaOH-1MのNaCl 30μLを使用して、注射間に表面を再生した。BIAsimulationソフトウェアを使用して、個々のセンソグラムを解析した。
ヒトCD38発現preB細胞に対する結合親和性
組換えマウスプレB::300.19細胞表面で発現されるCD38への抗CD38抗体の結合を、フローサイトメトリーによって決定した。組換え細胞株は、J.Deckketら 2014 Clin.Cancer Res 20:4574~4583頁に記載されていた。マウスpreB::300.19 CD38発現細胞を、96ウェルHigh Bindプレート(MSD L15XB-3)上に40,000細胞/ウェルでコーティングし、抗CD38抗体100μL/ウェルを4℃で45分間添加し、PBS中1%のBSAで3回洗浄した。Alexa488(Jackson ImmunoResearch;番号109-545-098)とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG 100μL/ウェルを4℃で45分間添加し、PBS中1%のBSAで3回洗浄した。遠心分離とPBS中1%のBSA 200μl/ウェルを添加することによる細胞の再懸濁後に、抗体結合を評価し、Guava(登録商標) easyCyte(商標)8HTフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。見かけのKDおよびEC50値を、それぞれ、BIOST@T-BINDINGおよびBIOST@T-SPEEDソフトウェアを使用して推定した。
組換えマウスプレB::300.19細胞表面で発現されるCD38への抗CD38抗体の結合を、フローサイトメトリーによって決定した。組換え細胞株は、J.Deckketら 2014 Clin.Cancer Res 20:4574~4583頁に記載されていた。マウスpreB::300.19 CD38発現細胞を、96ウェルHigh Bindプレート(MSD L15XB-3)上に40,000細胞/ウェルでコーティングし、抗CD38抗体100μL/ウェルを4℃で45分間添加し、PBS中1%のBSAで3回洗浄した。Alexa488(Jackson ImmunoResearch;番号109-545-098)とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG 100μL/ウェルを4℃で45分間添加し、PBS中1%のBSAで3回洗浄した。遠心分離とPBS中1%のBSA 200μl/ウェルを添加することによる細胞の再懸濁後に、抗体結合を評価し、Guava(登録商標) easyCyte(商標)8HTフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。見かけのKDおよびEC50値を、それぞれ、BIOST@T-BINDINGおよびBIOST@T-SPEEDソフトウェアを使用して推定した。
結果
ヒトSU-DHL-8またはMOLP-8細胞への新たに単離したmAb1の結合を、フローサイトメトリーを使用して、イサツキシマブのものと比較した(図1A)。両方の抗体は、両方の細胞株に対して高親和性の結合を示した。しかしながら、mAb1だけが、それらの表面にカニクイザルCD38を発現する細胞に結合することができた(図1B)。
ヒトSU-DHL-8またはMOLP-8細胞への新たに単離したmAb1の結合を、フローサイトメトリーを使用して、イサツキシマブのものと比較した(図1A)。両方の抗体は、両方の細胞株に対して高親和性の結合を示した。しかしながら、mAb1だけが、それらの表面にカニクイザルCD38を発現する細胞に結合することができた(図1B)。
ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインへの結合を、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して、新たに単離された抗体mAb1およびmAb6について調査した。SPRの結果を表Aにまとめる。
また、フローサイトメトリーを使用して、それらの細胞表面にヒトまたはカニクイザルCD38ポリペプチドを発現するマウスpreB細胞へのmAb1およびmAb6抗CD38抗体の結合を調査した。結果を表Bに示す。試験した両方の抗体は、preB::300.19 huCD38またはcCD38発現細胞への高親和性の結合を示した。
これらの結果は、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの両方に、高い親和性で結合する抗体の生成を実証する。これらの抗体は、他のCD38抗体と異なり、可溶性細胞外形態の、または哺乳動物細胞表面で発現されたヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドと交差反応する。
ヒト化抗CD38バリアントのin silicoでの設計
この実施例は、実施例1で生成した抗体のヒト化について記載する。
この実施例は、実施例1で生成した抗体のヒト化について記載する。
mAb1可変ドメインの配列をin silicoで解析した。International ImMunoGeneTics information system for immunoglobulins(IMGT)の定義を使用して、相補性決定領域(CDR)を同定した。
最初に、並行して、検索を行って、各可変鎖に対する最も類似するマウス生殖細胞およびヒト生殖細胞タンパク質配列の組合せを同定した。これは、マウスおよびヒト生殖細胞タンパク質配列データベースに対して、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Nucleic Acids Res. 25:3389~3402頁)検索を使用して実施した。各抗体鎖に対して、最も類似するVおよびJマウスおよびヒトタンパク質配列を見つけた。このタンパク質配列の高い同一性の定量は、V領域同一性パーセンテージによって測定した。mAb1軽鎖および重鎖に対する検索の結果を、それぞれ、表CおよびDに表す。
次に、mAb1の可変ドメイン配列を、脱アミド化、酸分解、酸化、またはイソアスパルテート形成部位のような配列ライアビリティ(sequence liability)についてスクリーニングした。分子内または分子間でアミノ酸残基がどのように相互作用するかを定義するために、mAb1の構造を、相同性による3Dモデリングによって解析した。この工程により、CDRの立体構造および抗原結合のようなmAb1の機能性について構造的に重要であるアミノ酸残基の群の特定が導かれた。これらのアミノ酸残基を、ヒト化mAb1の可変配列に存在するよう選択した。
親マウスmAb1由来のCDRを、関連するフレームワーク上にグラフトした。上記解析に基づき、IGKJ1*01と連結したヒトIGKV3-20*02およびIGHJ4*01と連結したヒトIGHV1-3*01を、それぞれ、mAb1可変軽鎖および可変重鎖のヒト化に対する基礎となるよう選択した。mAb1軽鎖は、選択したヒトIGKV3-20*02生殖細胞と、V領域にわたって64.52%の同一性を示した。mAb1重鎖は、選択したヒトIGHV1-3*01生殖細胞と、V領域にわたって69.39%の同一性を示した。ヒト化プロセスの間、親マウスmAb1 CDRを、標準的抗体可変配列を再構成するために、選択された生殖細胞のフレームワーク間に移植した。上記で留意したように、その機能性に対して構造的に重要であるmAb1アミノ酸残基の以前に同定した群に注目した。必要な場合、これらのアミノ酸残基を、それらの正確に対応するmAb1残基によって新たに作成された配列中に再配置した。これは、適切な親配列のアミ
ノ酸残基を組み込む逆突然変異工程に相当する。一部のCDR変異を、ヒト化と親CDRにおける配列ライアビリティを避けることとの両方のために組み込んだ。新たに作成された軽鎖および重鎖可変配列を使用して、ヒト化mAb1可変領域の3D相同性モデルを生成した。3Dモデルは、BIOVIA Discovery Studio suiteからのModel Antibody Frameworkを使用して構築した。
ノ酸残基を組み込む逆突然変異工程に相当する。一部のCDR変異を、ヒト化と親CDRにおける配列ライアビリティを避けることとの両方のために組み込んだ。新たに作成された軽鎖および重鎖可変配列を使用して、ヒト化mAb1可変領域の3D相同性モデルを生成した。3Dモデルは、BIOVIA Discovery Studio suiteからのModel Antibody Frameworkを使用して構築した。
CDRグラフトの手法に基づき、可変軽鎖に関する2つのバリアント(VL1およびVL3)と可変重鎖に関する4つのバリアント(VH1、VH3、VH5およびVH6)を生成した。mAb1可変軽および重配列とそれらのヒト化バージョンの間で変化するアミノ酸残基の特定の組合せを、それぞれ、表Eと表Fに示す。
配列番号14を有するヒト化VL1バリアントは、配列番号6を有するmAb1配列の親VLと比較して、合計22個の変異(FRに18個およびCDRに4個)を示す。このバリアントは、mAbの構造、CDRの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた8個の逆突然変異を有するIGKJ1*01に連結したヒト生殖細胞IGKV3-20*02のフレームワークに由来した。親CDRの4つの位置が変異し、ヒト化速度が加速するかまたは配列ライアビリティが回避された。
配列番号18を有するヒト化VL3バリアントは、配列番号6を有するmAb1配列の親VLと比較して、合計18個の変異(FRに18個)を示す。このバリアントは、mAbの構造、CDRの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた8個の逆突然変異を有するIGKJ1*01に連結したヒト生殖細胞IGKV3-20*02のフレームワークに由来した。
配列番号13を有するヒト化VH1バリアントは、配列番号5を有するmAb1配列の親VHと比較して、合計17個の変異(FRに14個およびCDRに3個)を示す。このバリアントは、mAbの構造、CDRの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた11個の逆突然変異を有するIGHJ4*01に連結したヒト生殖細胞IGHV1-3*01のフレームワークに由来した。親CDRの3つの位置が変異し、ヒト化速度が加速するかまたは配列ライアビリティが回避された。
配列番号17を有するヒト化VH3バリアントは、配列番号5を有するmAb1配列の親VHと比較して、合計14個の変異(FRに14個)を示す。このバリアントは、mAbの構造、CDRの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた11個の逆突然変異を有するIGHJ4*01に連結したヒト生殖細
胞IGHV1-3*01のフレームワークに由来した。
胞IGHV1-3*01のフレームワークに由来した。
配列番号21を有するヒト化VH5バリアントは、配列番号5を有するmAb1配列の親VHと比較して、合計11個の変異(FRに11個)を示す。このバリアントは、mAbの構造、CDRの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた14個の逆突然変異を有するIGHJ4*01に連結したヒト生殖細胞IGHV1-3*01のフレームワークに由来した。
配列番号23を有するヒト化VH6バリアントは、配列番号5を有するmAb1配列の親VHと比較して、合計12個の変異(FRに12個)を示す。このバリアントは、mAbの構造、CDRの立体配置、したがって、その標的への結合に関する負の影響のリスクに起因してなされた13個の逆突然変異を有するIGHJ4*01に連結したヒト生殖細胞IGHV1-3*01のフレームワークに由来した。
得られた軽および重ヒト化可変配列を、Immune Epitope Data Base(IEDB)データベース((PLos Biol(2005) 3(3)e91頁)www.iedb.org)に対する配列類似性に関してブラストし、いずれの配列も、そこに列挙された公知のBまたはT細胞エピトープを一切含有しないことを確認した。
mAb1の完全なアミノ酸可変配列ならびにヒト化軽および重可変ドメインは、表Gに示される。これらのヒト化軽および重可変ドメインを組み合わせて、mAb1の親可変ドメインのいくつかのヒト化バージョンを生成した。mAb2可変ドメインは、ヒト化VL1と組み合わせたヒト化VH1の会合に相当する。mAb3可変ドメインは、ヒト化VL3と組み合わせたヒト化VH3の会合に相当する。mAb4可変ドメインは、ヒト化VL3と組み合わせたヒト化VH5の会合に相当する。mAb5可変ドメインは、ヒト化VL3と組み合わせたヒト化VH6の会合に相当する。表Gに示されている三重特異性結合タンパク質を実施例4においてより詳細に説明する。
1に上述したヒト化VHおよびVLバリアントの対応するコーティングDNA配列を、実施例1に記載している一過的発現および精製のために、それぞれ、ヒトIgG1またはヒトCkドメインをコードする哺乳動物発現ベクターへとクローニングした。mAb1に由来する全長ヒト化抗CD38バリアントのアミノ配列を、mAb2(重鎖:HC1、配列番号15;軽鎖:LC1、配列番号16)、mAb3(重鎖:HC3、配列番号19;軽鎖:LC3、配列番号20)、mAb4 重鎖:HC5、配列番号22;軽鎖:LC3
、配列番号20)、およびmAb5(重鎖:HC6、配列番号24;軽鎖:LC3、配列番号20)として列挙する。
、配列番号20)、およびmAb5(重鎖:HC6、配列番号24;軽鎖:LC3、配列番号20)として列挙する。
抗CD38抗体の交差反応性およびアポトーシス誘導
次に、実施例2で生成したヒト化抗CD38バリアントを、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドへの結合ならびにアポトーシス誘導について特徴付けた。
次に、実施例2で生成したヒト化抗CD38バリアントを、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドへの結合ならびにアポトーシス誘導について特徴付けた。
材料および方法
アポトーシス誘導アッセイ
表示した抗体1.5μg/mL(10nM)を含む完全培地(RPMI-1640、10%のFBS、2mMのL-グルタミン)中で、37℃にて20時間、5%のCO2とともに、2×105細胞/mLの細胞をインキュベートした。製造業者の使用説明書(Life Technologies)に従って、細胞をAnnexinV-FITCで染色した。acquisition controlとデータ解析のためのBD FACSD
ivaソフトウェアを有するBD FACSAria(商標)フローサイトメーター(いずれもBD Biosciences)で、フローサイトメトリーによってサンプルを解析した。
アポトーシス誘導アッセイ
表示した抗体1.5μg/mL(10nM)を含む完全培地(RPMI-1640、10%のFBS、2mMのL-グルタミン)中で、37℃にて20時間、5%のCO2とともに、2×105細胞/mLの細胞をインキュベートした。製造業者の使用説明書(Life Technologies)に従って、細胞をAnnexinV-FITCで染色した。acquisition controlとデータ解析のためのBD FACSD
ivaソフトウェアを有するBD FACSAria(商標)フローサイトメーター(いずれもBD Biosciences)で、フローサイトメトリーによってサンプルを解析した。
結果
上述したように産生した、選択された抗ヒトCD38抗体の結合特性を調査した(図2A~2H)。可溶性ヒトCD38およびカニクイザルCD38への抗体の結合を、ELISAおよびSPRを使用して調査した。ELISAのデータを使用して、ヒト化抗CD38抗体であるmAb2(図2A)、mAb3(図2C)、mAb4、mAb5(図2E)、およびヒト抗CD38抗体であるmAb6(図2I)について、ヒトおよびカニクイザルCD38への抗体結合のEC50を決定した。
上述したように産生した、選択された抗ヒトCD38抗体の結合特性を調査した(図2A~2H)。可溶性ヒトCD38およびカニクイザルCD38への抗体の結合を、ELISAおよびSPRを使用して調査した。ELISAのデータを使用して、ヒト化抗CD38抗体であるmAb2(図2A)、mAb3(図2C)、mAb4、mAb5(図2E)、およびヒト抗CD38抗体であるmAb6(図2I)について、ヒトおよびカニクイザルCD38への抗体結合のEC50を決定した。
CD38へのヒト化抗CD38バリアントまたはヒト抗CD38 mAbの結合も、上述のSPRアッセイを使用して評価した。SPRデータを使用して、ヒト化抗CD38抗体であるmAb2(図2B)、mAb3(図2D)、mAb4、mAb5(図2F)、およびヒト抗CD38抗体であるmAb6(図2H)について、ヒトおよびカニクイザルCD38への抗体結合のKDおよびKoffを決定した。結合データは表Kにまとめられ、すべての抗CD38 mAbが、類似する結合の特徴でCD38に結合することを示す。
CD38発現細胞に結合するためのヒト化抗CD38バリアントの能力を、上述のFACSベースの結合アッセイを使用して評価した。FACSデータを使用して、ヒト化抗CD38抗体であるmAb2(図2A)、mAb3(図2C)、mAb4、mAb5(図2E)、およびヒト抗CD38抗体であるmAb6(図2G)について、ヒトおよびカニクイザルCD38への抗体結合のEC50を決定した。表Lに示されている結合データは、すべてのヒト化抗CD38バリアントが、細胞表面のCD38に対して類似する結合親和性を示したことを示す。
3つのアッセイからの結合データを、ヒトV領域に対するVHおよびVLドメインの配列同一性と一緒に、図2Iにまとめる。
次に、アポトーシスを誘導する親mAb1抗体およびmAb7の能力を調査した。両抗体は、アネキシンV染色とヨウ化プロピジウム(PI)の取り込みを増加させた。細胞の40%は、mAb7による処置後に、アネキシンVとPIについて二重陽性となり、一方、mAb1で処置した細胞の60%が二重陽性であった。両抗体は、SU-DHL-8細胞において類似する濃度依存性アポトーシス効果を示した(図2J)。同様に、両抗体は、NK92細胞の存在下で、SU-DHL-8細胞に対するADCC活性を促進させ(図2K)、37℃で4時間後に、最大60%の細胞傷害と4~6pMのIC50をもたらした(図2L)。
CD38アイソフォームEをin silicoで同定し、多発性骨髄腫の患者由来のNK細胞、PBMC、およびBMMCならびにがん細胞株(MOLP-8、CU1702、およびCU2332)からの転写レベルで検証した。CD38アイソフォームEについては、Human RefSeq転写物データベースリリース20131216におけるBLASTN 2.2.26(Altschul、Stephen F.、Thomas
L. Madden、Alejandro A. Schaffer、Jinghui
Zhang、Zheng Zhang、Webb Miller、およびDavid J. Lipman(1997)、「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database
search programs」、Nucleic Acids Res. 25:3389~3402頁)プログラムを使用する核酸配列(nucleic sequence)データベースによるスクリーニングによって証明した。配列の低複雑度領域をマスキングすることなく、100核酸残基長のストレッチに関してヒトCD38アイソフォームAの核酸配列と少なくとも98.5%の同一性を最小限とみなしてBLASTNプログラムを適用した。このスクリーニングから強調される配列を、ヒトCD38遺伝子の転写形態(同じイントロン-エクソンのゲノム構造)であると検証されるように、CD38遺伝子の遺伝子座に関して再編成した。CD38アイソフォームEの核酸配列は、ヒトCD38遺伝子の転写形態であると検証された配列のものであった。
L. Madden、Alejandro A. Schaffer、Jinghui
Zhang、Zheng Zhang、Webb Miller、およびDavid J. Lipman(1997)、「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database
search programs」、Nucleic Acids Res. 25:3389~3402頁)プログラムを使用する核酸配列(nucleic sequence)データベースによるスクリーニングによって証明した。配列の低複雑度領域をマスキングすることなく、100核酸残基長のストレッチに関してヒトCD38アイソフォームAの核酸配列と少なくとも98.5%の同一性を最小限とみなしてBLASTNプログラムを適用した。このスクリーニングから強調される配列を、ヒトCD38遺伝子の転写形態(同じイントロン-エクソンのゲノム構造)であると検証されるように、CD38遺伝子の遺伝子座に関して再編成した。CD38アイソフォームEの核酸配列は、ヒトCD38遺伝子の転写形態であると検証された配列のものであった。
ヒトCD38アイソフォームAとEの両方に結合するための抗CD38抗体の能力も調査した。CD38アイソフォームAおよびアイソフォームEへの結合を評価するために、捕捉抗原としてアイソフォームAおよびアイソフォームEタンパク質(実施例1に記載したように調製した)を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を実施した。
96ウェルプレートを、PBS中0.5μg/ウェルのいずれかのアイソフォームでコーティングし、抗体100μL/ウェルをプレートに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、0.05%のTween-20(PBS-T)を含有するPBSで5回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした1:25,000希釈の抗ヒトIgG(Jackson Ref:109-035-098)100μLを各ウェルに添加した。 37℃で1時間、暗所でのインキュベーション後、プレートを
PBS-Tで5回洗浄した。TMB-H2O2緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、450nmの波長で読み取った。BIOST@T-SPEEDソフトウェアを使用してEC50値を推定した。
96ウェルプレートを、PBS中0.5μg/ウェルのいずれかのアイソフォームでコーティングし、抗体100μL/ウェルをプレートに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、0.05%のTween-20(PBS-T)を含有するPBSで5回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした1:25,000希釈の抗ヒトIgG(Jackson Ref:109-035-098)100μLを各ウェルに添加した。 37℃で1時間、暗所でのインキュベーション後、プレートを
PBS-Tで5回洗浄した。TMB-H2O2緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、450nmの波長で読み取った。BIOST@T-SPEEDソフトウェアを使用してEC50値を推定した。
CD38アイソフォームA(配列番号1)およびアイソフォームE(配列番号105)への様々な抗体の結合親和性を、表L2に示されるように決定した。表Mは、様々な抗CD38抗体に対する結合特性の比較を提供する。
結論として、mAb7とmAb1の両方は、MOLP-8ヒト多発性骨髄腫細胞において類似するアポトーシス、SU-DHL-8細胞に対して類似する濃度依存性アポトーシス作用、およびSU-DHL-8細胞に対して類似する濃度依存性ADCC活性を誘導する。しかし、mAb1だけが、ナノモル以下の親和性で、ヒトおよびカニクイザルCD38の両方に結合し、CD38アイソフォームAおよびEに結合した。
アポトーシスを誘導するヒト化抗CD38バリアントの能力は、上述したように蛍光活性化細胞選別機(FACS)によっても評価した。様々な機能特性を有するいくつかの抗CD38抗体が以前に同定されているが、これらのうちのいくつかは、細胞増殖またはア
ポトーシスに関する直接的影響により、CD38+細胞株のin vitroでの殺滅を媒介することができる。図2Mに示されるようなアポトーシス誘導アッセイの結果。実施例1および2で生成したすべての抗体は、mAb6を除いてアポトーシスを誘導することができた。抗CD38抗体であるmAb2、mAb3、mAb4、およびmAb5は、SU-DHL-8リンパ腫細胞においてアポトーシスの用量依存性誘導をもたらした;各抗体のIC50を図2Nから2Qに提供する。
ポトーシスに関する直接的影響により、CD38+細胞株のin vitroでの殺滅を媒介することができる。図2Mに示されるようなアポトーシス誘導アッセイの結果。実施例1および2で生成したすべての抗体は、mAb6を除いてアポトーシスを誘導することができた。抗CD38抗体であるmAb2、mAb3、mAb4、およびmAb5は、SU-DHL-8リンパ腫細胞においてアポトーシスの用量依存性誘導をもたらした;各抗体のIC50を図2Nから2Qに提供する。
三重特異性抗CD38結合タンパク質の生成
次に、実施例1~3に記載した選択した抗CD38抗体の抗原結合ドメインの結合特性を、図3Aに示した三重特異性形式において解析した。
次に、実施例1~3に記載した選択した抗CD38抗体の抗原結合ドメインの結合特性を、図3Aに示した三重特異性形式において解析した。
SPRを使用して、CD38のコグネイトリガンドが他の抗原結合ドメインに結合した場合に、抗CD38抗原結合ドメインをCD38に結合する能力について三重特異性形式(抗CD38×抗CD28×抗CD3)で試験した。連続的リガンド結合アッセイを図3Bに示す。それぞれの三重特異性Abへの3つの抗原の連続的結合のために、飽和濃度(>10KD)の各抗原を8分間注射し、続いて、5分間解離させた。10mMのグリシン-HCl pH2.5を30μl/分で60秒間注射することによって表面再生を行った。データを1:1動力学的結合モデルに適合させ、Biacore s200 Evaluation Software v 1.0を使用して解析した。会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)を使用して、平衡解離定数(KD)を計算した。
図3Cに示したように、このSPRベースのアッセイは、CD38のコグネイト抗原がまたCD3および/またはCD28抗原結合ドメインに結合したか否かにかかわらず、三重特異性結合タンパク質がCD38に結合することができることを示した。例示的な連続的結合アッセイの結果を図4に示す。SPRによって測定される場合の動力学的パラメータを表M2に提供する。
これらの結果は、3つすべての標的が同時に、三重特異性結合タンパク質に結合することができることを実証する。三重特異性結合タンパク質をCD28、CD3、またはその両方(いずれかの順序で)と事前結合させることによって、CD38に対する結合動力学または結合親和性は変化しなかった。
次に、CD38SB19×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質の
それぞれの抗原結合ドメインを、飽和した他の2つの抗原結合ドメインの有無にかかわらず、コグネイト抗原に結合する能力について、SPRによって評価した。表M3およびM4は、これらのアッセイの結果を示す。
それぞれの抗原結合ドメインを、飽和した他の2つの抗原結合ドメインの有無にかかわらず、コグネイト抗原に結合する能力について、SPRによって評価した。表M3およびM4は、これらのアッセイの結果を示す。
表M3およびM4で実証されるように、抗原との事前結合によって飽和した2つの標的を有することは、CD38またはCD28に対する第3の標的の動力学または結合親和性に影響を及ぼさなかった。CD3結合の場合には、事前結合したCD38および/またはCD28は、より速い動力学をもたらした(KonおよびKoff値におよそ4倍の影響を及ぼす)。
抗CD38抗原結合ドメインを、2つの抗CD28抗原結合ドメイン(スーパーアゴニスト、「sup」、および従来のアゴニスト、「cnv」)および2つの抗CD3抗原結合ドメイン(「mid」および「low」)とともに三重特異性形式で試験した。これらの抗原結合ドメインに関する可変ドメイン配列を以下のように提供する:抗CD28sup:配列番号49(VH)および配列番号50(VL);抗CD28cvn:配列番号51(VH)および配列番号52(VL);抗CD3mid:配列番号53(VH)および配列番号54(VL);抗CD3low:配列番号84(VH)および配列番号85(VL)。三重特異性結合タンパク質の結合を調査するSPRアッセイの結果を図5に示す。三重特異性結合タンパク質形式において、3つの抗CD38結合ドメインは、単一特異性形式とおおよそ同じ結合親和性を有した。両方のCD3結合ドメインは、単一特異性、二重特異性、および三重特異性形式において、おおよそ同じ結合親和性を有した。CD28結合ドメインは、単一特異性と比較して、二重特異性または三重特異性形式における結合親和性をわずかに低下させた(しがし、依然としてナノモルであった)。他の2つの抗原結合ドメインが飽和されている場合、抗CD38SB19および抗CD28sup結合ドメインは、他の2つの抗原結合ドメインが抗原に結合していない場合と比較して、類似する結合親和性を有した。しかしながら、抗CD3mid結合ドメインは、他の2つの抗原結合ドメインが飽和されている場合、より速い動力学を示した。これらの結果は、抗CD38、抗CD28、および抗CD3結合ドメインが、三重特異性結合タンパク質形式に関する使用に適合することを実証する。
本発明において生成した抗CD38抗原結合ドメインを、mAb7の既存の抗CD38抗原結合ドメイン(それぞれ、VH配列については配列番号47、VL配列については配列番号48を参照されたい)に対しても比較した。組換えマウスpreB::300.19細胞表面で発現されるCD38への三重特異性分子の結合をフローサイトメトリーによって決定し、対応する抗CD38の一価の抗体を並行してアッセイした。組換え細胞株については、J.Deckketら 2014 Clin.Cancer Res 20:4574~4583頁に記載されていた。マウスpreB::300.19のCD38発現細胞を、96ウェルHigh Bindプレート(MSD L15XB-3)上で、40,000細胞/ウェルでコーティングし、三重特異性分子100μL/ウェルを4℃で45分間添加し、PBS中1%のBSAで3回洗浄した。Alexa488とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch;番号109-545-098)100μL/ウェルを4℃で45分間添加し、PBS中1%のBSAで3回洗浄した。遠心分離とPBS中1%のBSA 200μl/ウェルを添加することによる細胞の再懸濁後に、抗体結合を評価し、Guava(登録商標) easyCyte(商標)8HTフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。見かけのKDおよびEC50値を、それぞれ、BIOST@T-BINDINGおよびBIOST@T-SPEEDソフトウェアを使用して推定した。
上述したように、フローサイトメトリーを使用して、それらの表面にヒトまたはカニクイザルCD38ポリペプチドを発現するマウスpreB細胞への、mAb7またはmAb7抗CD38抗原結合ドメインを有する三重特異性結合タンパク質の結合について調査した。図6Aに示されるように、mAb7抗CD38抗原結合ドメインを有するCD38×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質は、mAb7単一特異性抗体(右上)よりも8分の1低い見かけの親和性で、ヒトCD38を発現する細胞(左上)に結合した。mAb7単一特異性抗体(右下)もmAb7抗CD38抗原結合ドメインを有する三重特異性結合タンパク質(左下)もいずれも、カニクイザルCD38を発現する細胞に結合しなかった。
ヒト化抗CD38抗体mAb2の結合ドメインも、ヒトまたはカニクイザルCD38ポリペプチドを発現する細胞への結合について、三重特異性形式で試験した。図6B~6Dに示されるように、mAb7と異なり、mAb2抗CD38抗原結合ドメインを有するCD38×CD28sup×CD3midおよびCD38×CD28cvn×CD3mid三重特異性結合タンパク質、ならびにmAb2単一特異性抗体は、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの両方に結合することができた。mAb2抗CD38抗原結合ドメインを有するCD38×CD28cvn×CD3mid三重特異性結合タンパク質は、親mAb2抗体よりも9分の1低い見かけの親和性で(図6Cの上を図6Dの上と比較して)、ヒトCD38を発現する細胞に結合した。mAb2抗CD38抗原結合ドメインを有するCD38×CD28cvn×CD3mid三重特異性結合タンパク質は、親mAb2抗体よりも7.5分の1低い見かけの親和性で(図6Cの下を図6Dの下と比較して)、カニクイザルCD38を発現する細胞に結合した。mAb2抗CD38抗原結合ドメインを有するCD38×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質は、mAb2抗CD38抗原結合ドメインを有するCD38×CD28cvn×CD3mid三重特異性結合タンパク質よりも2.5分の1低い見かけの親和性で(図6Cの上を図6Bの上と比較して)、ヒトCD38を発現する細胞に結合した。
ヒト化抗CD38抗体mAb6の結合ドメインも、ヒトまたはカニクイザルCD38ポリペプチドを発現する細胞への結合について、mAb6単一特異性抗体に対して比較した。mAb6単一特異性抗体は、nMの範囲でヒト(右上)またはカニクイザル(右下)CD38ポリペプチドを発現する細胞に結合したが(図6E)、mAb6抗CD38抗原結合ドメインを有するCD38×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質
は、飽和していないヒト(左上)またはカニクイザル(左下)CD38ポリペプチドを発現する細胞に結合した。
は、飽和していないヒト(左上)またはカニクイザル(左下)CD38ポリペプチドを発現する細胞に結合した。
結論として、ヒトCD38へ結合するCD38SB19×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質に関する親和性は、SPRによって組換えヒトCD38への結合を調査したかまたはフローサイトメトリーによって細胞表面で発現されるヒトCD38への結合を調査したかにかかわらず、同じ範囲内にあることが分かった(図6F)。同様に、ヒトCD38への結合に対するCD38VH1×CD28sup×CD3mid/low(mAb2の抗CD38結合ドメイン)およびCD38VH1×CD28cvn×CD3mid/low三重特異性結合タンパク質(mAb2の抗CD38結合ドメイン)の親和性も、両方のアッセイで同じ範囲内であった。CD38HHY1370×CD28sup×CD3mid(mAb6の抗CD38結合ドメイン)では、ヒトCD38に結合するためのKDを、SPRによって1nMであると決定したが、正確なEC50値はフローサイトメトリーによって推定することができなかった。様々な抗CD38結合ドメインを有する三重特異性結合タンパク質の見かけのKD値(FACS分析によって得られる)の概要を表M5に提供する。
期待されたように、抗CD38結合ドメインを欠くΔCD38×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質は、ヒトまたはカニクイザルCD38ポリペプチドを発現する細胞に結合しなかった(図6G)。このことは、このアッセイで観察された結合が、CD38抗原結合ドメインに対して特異的であったことを示す。
抗CD38 mAb2および抗CD38 mAb6を含有する三重特異性結合タンパク質のin vitroおよびin vivoでの特徴付け
以下の実施例は、mAb2およびmAb6抗体に由来する可変ドメインを含有する新規T細胞エンゲージャーの安定性、結合特性、および活性を特徴付けるための実験について記載する。三重特異性結合タンパク質の抗CD38、CD3およびCD28アームのバリアントを含む追加の抗CD38×CD28×CD3抗体を生成した。新規の抗CD38/
CD3/CD28抗体は:1)抗CD38結合ドメイン(mAb2またはmAb6);2)抗CD3結合ドメイン(CD3highまたはCD3low;それぞれ、抗CD3low VHおよびVL配列についての配列番号84および85を参照されたい);3)抗CD28結合ドメイン(CD28supまたはCD28cvn)において異なる。可能な組合せ内で、抗CD38×CD28×CD3の回収を設計し、産生し、次に、様々な機能について試験した。
以下の実施例は、mAb2およびmAb6抗体に由来する可変ドメインを含有する新規T細胞エンゲージャーの安定性、結合特性、および活性を特徴付けるための実験について記載する。三重特異性結合タンパク質の抗CD38、CD3およびCD28アームのバリアントを含む追加の抗CD38×CD28×CD3抗体を生成した。新規の抗CD38/
CD3/CD28抗体は:1)抗CD38結合ドメイン(mAb2またはmAb6);2)抗CD3結合ドメイン(CD3highまたはCD3low;それぞれ、抗CD3low VHおよびVL配列についての配列番号84および85を参照されたい);3)抗CD28結合ドメイン(CD28supまたはCD28cvn)において異なる。可能な組合せ内で、抗CD38×CD28×CD3の回収を設計し、産生し、次に、様々な機能について試験した。
材料および方法
三重特異性結合タンパク質の産生および精製
製造業者の使用説明書に従って、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Thermo Fisher Scientific)を使用して、4つの発現プラスミドをExpi293細胞へと一過的にトランスフェクションすることによって、三重特異性結合タンパク質を産生した。簡潔には、25%(w/w)の各プラスミドをOpti-MEM中に希釈し、予め希釈したExpiFectamine試薬と、室温(RT)で20~30分間混合し、Expi293細胞中に添加した(2.5×106細胞/ml)。良好な収率および純度を有する三重特異性結合タンパク質を産生するために、プラスミドの最適な比率を決定するためのトランスフェクションの最適化が使用されることが多かった。
三重特異性結合タンパク質の産生および精製
製造業者の使用説明書に従って、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Thermo Fisher Scientific)を使用して、4つの発現プラスミドをExpi293細胞へと一過的にトランスフェクションすることによって、三重特異性結合タンパク質を産生した。簡潔には、25%(w/w)の各プラスミドをOpti-MEM中に希釈し、予め希釈したExpiFectamine試薬と、室温(RT)で20~30分間混合し、Expi293細胞中に添加した(2.5×106細胞/ml)。良好な収率および純度を有する三重特異性結合タンパク質を産生するために、プラスミドの最適な比率を決定するためのトランスフェクションの最適化が使用されることが多かった。
トランスフェクションの4~5日後、トランスフェクト細胞からの上清を回収し、0.45μmのフィルターユニット(Nalgene)を通して濾過した。上清中の三重特異性結合タンパク質を、3工程手順を使用して精製した。最初に、タンパク質Aアフィニティー精製を使用し、結合したAbを「IgG溶出緩衝液」(Thermo Fisher
Scientific)を使用して溶出した。第2に、生成物をPBS(pH7.4)に対して終夜透析し、PBS緩衝液を2回交換した。次の工程の前に、0.45μmのフィルターユニット(Nalgene)を通す濾過によって、すべての沈殿物を清澄化した。第3に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)精製(Hiload 16/600
Superdex 200pg、またはHiload 26/600 Superdex 200pg、GE Healthcare)を使用して凝集物を、分取で異なる種を除去した。画分を還元および非還元SDS-PAGEで解析し、それらを組み合わせる前に単量体三重特異性結合タンパク質を含有する画分を特定した。精製抗体をアリコートし、-80℃で長期間保存した。
Scientific)を使用して溶出した。第2に、生成物をPBS(pH7.4)に対して終夜透析し、PBS緩衝液を2回交換した。次の工程の前に、0.45μmのフィルターユニット(Nalgene)を通す濾過によって、すべての沈殿物を清澄化した。第3に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)精製(Hiload 16/600
Superdex 200pg、またはHiload 26/600 Superdex 200pg、GE Healthcare)を使用して凝集物を、分取で異なる種を除去した。画分を還元および非還元SDS-PAGEで解析し、それらを組み合わせる前に単量体三重特異性結合タンパク質を含有する画分を特定した。精製抗体をアリコートし、-80℃で長期間保存した。
ELISAアッセイ
精製抗体の結合特性を、ELISAまたはSPRのいずれかの方法を使用して解析した。ELISAでは、三重特異性結合タンパク質の各結合部位に対応する抗原を使用して、4℃で終夜96ウェルImmuno Plate(Nunc 439454、Thermo Fisher Scientific)をコーティングした(PBS(pH7.4)中2μg/mlの各抗体を使用する)。PBS中5%のスキムミルク+2%BSAを使用して、RTで1時間、コーティングしたプレートをブロックし、続いて、PBS+0.25%のTween 20で3回洗浄した(Aqua Max 400、Molecular Devices)。抗体(三重特異性および対照のAb)の連続希釈液を調製し、ELISAプレート上に添加し(二連で100μl/ウェル)、RTで1時間インキュベートし、続いて、PBS+0.25%のTween 20で5回洗浄した。
精製抗体の結合特性を、ELISAまたはSPRのいずれかの方法を使用して解析した。ELISAでは、三重特異性結合タンパク質の各結合部位に対応する抗原を使用して、4℃で終夜96ウェルImmuno Plate(Nunc 439454、Thermo Fisher Scientific)をコーティングした(PBS(pH7.4)中2μg/mlの各抗体を使用する)。PBS中5%のスキムミルク+2%BSAを使用して、RTで1時間、コーティングしたプレートをブロックし、続いて、PBS+0.25%のTween 20で3回洗浄した(Aqua Max 400、Molecular Devices)。抗体(三重特異性および対照のAb)の連続希釈液を調製し、ELISAプレート上に添加し(二連で100μl/ウェル)、RTで1時間インキュベートし、続いて、PBS+0.25%のTween 20で5回洗浄した。
洗浄後、HRPにコンジュゲートした二次抗ヒトFab(1:5000、カタログ番号109-035-097、Jackson ImmunoResearch Inc)を各ウェルに添加し、RTで30分間インキュベートした。PBS+0.25%のTween 20で5回洗浄した後、TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL、Gaithersburg、MD、USA)100μlを各ウ
ェルに添加した。1MのH2SO4 50μlを添加することによって反応を終結させ、SpectraMax M5(Molecular Devices)を使用してOD450を測定し、SoftMax Pro6.3ソフトウェア(Molecular Devices)を使用して解析した。最終データをGraphPad Prism software(GraphPad Software、CA、USA)に移し、示したようにプロットした。同じソフトウェアを使用してEC50を計算した。
ェルに添加した。1MのH2SO4 50μlを添加することによって反応を終結させ、SpectraMax M5(Molecular Devices)を使用してOD450を測定し、SoftMax Pro6.3ソフトウェア(Molecular Devices)を使用して解析した。最終データをGraphPad Prism software(GraphPad Software、CA、USA)に移し、示したようにプロットした。同じソフトウェアを使用してEC50を計算した。
ELISAアッセイを使用して、ヒトCD3(Cambridge Biologics LLC カタログ番号03-01-0051)、CD28(Cambridge Biologics LLC カタログ番号03-01-0303)、およびCD38(Cambridge Biologics LLC カタログ番号03-01-0369)への
抗CD38×CD28×CD3三重特異性抗体またはアイソタイプ対照抗体(ヒトIgG4)の結合を決定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗Fab二次抗体(Jackson ImmunoResearch Inc 番号109-035-097)を使用して、結合した抗体を検出した。
抗CD38×CD28×CD3三重特異性抗体またはアイソタイプ対照抗体(ヒトIgG4)の結合を決定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗Fab二次抗体(Jackson ImmunoResearch Inc 番号109-035-097)を使用して、結合した抗体を検出した。
in vitroでの細胞死滅アッセイ
様々な三重特異性結合タンパク質を使用する様々ながん細胞に対するin vitro死滅アッセイのために、精製されたヒトPBMCを使用していた。簡潔には、96ウェルV底プレートにおいて死滅アッセイを設定した。各プレートについて、各ドナーからのPBMC 40mlを2×10^6細胞/mlでプレーティングし、2.5x10^5細胞/mlのPKH26(Sigma 番号MINI26)30mlで標識した標的細胞(最大1×10^7個の細胞を染色するための色素4μL)を調製した。最初に、様々な濃度の20μL/ウェルの試験タンパク質またはPMAを、各ウェル中に添加し、続いて、80μL/ウェルの標識された標的細胞を、各ウェル中に添加した(2×10^4細胞/ウェル)。次いで、PBMC 100μLを、各ウェルに添加し、E:T=10:1ウェル(2×10^5細胞/ウェル)に達し、37℃にて5%のCO2インキュベーターで24時間インキュベートした。細胞を遠沈させ、上清をサイトカイン放出を測定するために回収するか、または破棄した。細胞を、Vivid LIVE/DEAD(商標)Fixable VioleT Dead Cell Staining緩衝液(Life Technology 番号L34955)を用いて染色した(染色緩衝液は、Vivid試薬60μLをPBS 60ml中添加することによって調製した)。暗所でRTにて15分間のインキュベーションによって細胞を染色緩衝液100μL中に再懸濁した。細胞を1×PBSを用いて洗浄した後、細胞を0.5%パラホルムアルデヒドを有するPBS 200μL中に再懸濁し、Fortessaフローサイトメーター(Beckton Dickinson、San Jose、CA)によってPKH26+Vivid+がん細胞を回収し、続いて、Flowjoソフトウェアを使用して解析した。死滅のパーセンテージを、特定の死滅-特発性死滅/総細胞として計算し、示されるようにプロットした。
様々な三重特異性結合タンパク質を使用する様々ながん細胞に対するin vitro死滅アッセイのために、精製されたヒトPBMCを使用していた。簡潔には、96ウェルV底プレートにおいて死滅アッセイを設定した。各プレートについて、各ドナーからのPBMC 40mlを2×10^6細胞/mlでプレーティングし、2.5x10^5細胞/mlのPKH26(Sigma 番号MINI26)30mlで標識した標的細胞(最大1×10^7個の細胞を染色するための色素4μL)を調製した。最初に、様々な濃度の20μL/ウェルの試験タンパク質またはPMAを、各ウェル中に添加し、続いて、80μL/ウェルの標識された標的細胞を、各ウェル中に添加した(2×10^4細胞/ウェル)。次いで、PBMC 100μLを、各ウェルに添加し、E:T=10:1ウェル(2×10^5細胞/ウェル)に達し、37℃にて5%のCO2インキュベーターで24時間インキュベートした。細胞を遠沈させ、上清をサイトカイン放出を測定するために回収するか、または破棄した。細胞を、Vivid LIVE/DEAD(商標)Fixable VioleT Dead Cell Staining緩衝液(Life Technology 番号L34955)を用いて染色した(染色緩衝液は、Vivid試薬60μLをPBS 60ml中添加することによって調製した)。暗所でRTにて15分間のインキュベーションによって細胞を染色緩衝液100μL中に再懸濁した。細胞を1×PBSを用いて洗浄した後、細胞を0.5%パラホルムアルデヒドを有するPBS 200μL中に再懸濁し、Fortessaフローサイトメーター(Beckton Dickinson、San Jose、CA)によってPKH26+Vivid+がん細胞を回収し、続いて、Flowjoソフトウェアを使用して解析した。死滅のパーセンテージを、特定の死滅-特発性死滅/総細胞として計算し、示されるようにプロットした。
サイトカイン放出アッセイ
CD34+臍帯細胞ヒト化NSGマウスにおけるin vitro活性化アッセイ、in vitro死滅アッセイ、in vivo活性化アッセイにおいて炎症性サイトカイン濃度を測定するために、および毒性研究のために、細胞培養上清を回収し、Milliplex Human High Sensitiity T細胞 13-plexキット(EMD Millipore)を使用して製造業者のプロトコールに従って血清サンプルを希釈した。次に、これらをEMD Millipore MAGPIX(登録商標)システム、およびMILLIPLEX(登録商標)Analyst 5.1ソフトウェアによって解析した。
CD34+臍帯細胞ヒト化NSGマウスにおけるin vitro活性化アッセイ、in vitro死滅アッセイ、in vivo活性化アッセイにおいて炎症性サイトカイン濃度を測定するために、および毒性研究のために、細胞培養上清を回収し、Milliplex Human High Sensitiity T細胞 13-plexキット(EMD Millipore)を使用して製造業者のプロトコールに従って血清サンプルを希釈した。次に、これらをEMD Millipore MAGPIX(登録商標)システム、およびMILLIPLEX(登録商標)Analyst 5.1ソフトウェアによって解析した。
in vivoマウスモデルおよび有効性の研究
ヒトCD34+造血幹細胞を移植されたNSGマウス(hu-CD34)を、in vivoマウスモデルとして使用した。これらのマウスは、複数系統のヒト免疫細胞を発達させ、癌免疫療法有効性研究の検証されたプラットフォームである(例えば、Shultz,L.D.ら(2014) Cold Spring Harb.Protoc. 2014:694~708頁を参照のこと)。hu-CD34+ NSGマウスは、CD34+造血幹細胞を注射することによって作成され、T細胞、B細胞、およびいくつかの他の集団を含むヒト免疫細胞集団の有効な複数系統移植を示す(McDermott,S.P.ら(2010) Blood 116:193~200頁)。複数系統造血発生は12週間以内に起こる。移植は、移植片対宿主病を伴わず、1年間にわたって安定である。
ヒトCD34+造血幹細胞を移植されたNSGマウス(hu-CD34)を、in vivoマウスモデルとして使用した。これらのマウスは、複数系統のヒト免疫細胞を発達させ、癌免疫療法有効性研究の検証されたプラットフォームである(例えば、Shultz,L.D.ら(2014) Cold Spring Harb.Protoc. 2014:694~708頁を参照のこと)。hu-CD34+ NSGマウスは、CD34+造血幹細胞を注射することによって作成され、T細胞、B細胞、およびいくつかの他の集団を含むヒト免疫細胞集団の有効な複数系統移植を示す(McDermott,S.P.ら(2010) Blood 116:193~200頁)。複数系統造血発生は12週間以内に起こる。移植は、移植片対宿主病を伴わず、1年間にわたって安定である。
hu-CD34 NSGマウスを使用する有効性研究のために、マウスをThe Jackson Laboratory(Maine、USA)から購入し、使用前にヒト細胞集団を検証した。一般的に、各マウスにおいて腫瘍を接種するために、Matrigel(BD Biosciences)(50%v/v)中で混合した5×106個の腫瘍細胞を使用した。腫瘍の大きさが100~150mm3の範囲に達すると、マウスを研究用に選択し、各群に無作為化した。抗体を、週に3回、所与の用量で静脈内に与えた。体重を週に1~3回モニターした。腫瘍の大きさを、ノギス腫瘍測定によって週に1~3回測定した。腫瘍の大きさが1,500mm3に達した場合、または最終投与の24時間後に、すべてのマウスを終結させた。最終血液サンプル(0.3mL)を、血清セパレーターチューブ中に回収し、穏やかに5回反転することによって混合し、チューブラックに入れた。最終腫瘍も回収し、秤量し、その後、免疫組織化学解析のために固定液中に入れた。
ヒトPBMCヒト化(hu-PBMC)NSGマウスを、別のin vivoマウスモデルとして使用した。これらのマウスは、健常なドナー由来の精製ヒトPBMCを注射することによって作成され、これらは、成人末梢血単核細胞を使用すると最も速い移植速度を有し、強力なエフェクターおよびメモリーT細胞ならびにNK細胞の機能を必要とする短期間の研究を可能にし、移植片対宿主病による短期間有効性研究(3~4週間)に好適である。
hu-PBMC NSGマウスを使用する有効性研究のために、8~10週齢のNSGマウス(カタログ番号:005557、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)をThe Jackson Laboratory(Maine,USA)から購入した。各マウスの皮下に、Matrigel(BD Biosciences)(50%v/v)中で混合した5×106個の腫瘍細胞を接種した。腫瘍の大きさが50~100mm3の範囲に達すると、健常なドナー由来の10×106個のヒトPBMCを各マウスに対して腹腔内に(IP)再構成させた。翌日、ヒト細胞再構成を検証した。腫瘍の大きさが100~150mm3の範囲に到達すると、マウスを研究用に選択し、各群に無作為化した。抗体を、週に3回、所与の用量で静脈内に与えた。体重を週に1~3回モニターした。腫瘍の大きさを、ノギス腫瘍測定によって週に1~3回測定した。腫瘍の大きさが1,500mm3に達した時点、または最終投与の24時間後に、すべてのマウスを終結させた。最終血液サンプル(0.3mL)を、血清セパレーターチューブ中に回収し、穏やかに5回反転することによって混合し、チューブラックに入れた。最終腫瘍も回収し、秤量し、その後、免疫組織化学解析のために固定液中に入れた。
播種hu-PMBC NSGマウスモデルでは、1~5×106個の細胞を、0日目に各マウス中に静脈内注射した。3日目にベースラインの輝度イメージングを無作為化のために得た。4日目に、健常なドナー由来の10×106個のヒトPBMCを各マウスに対
して腹腔内に(IP)再構成させた。5、12、19日目に、表示した用量を使用して、マウスを毎週処置した。各動物の腫瘍体積をモニターするために、10、17、24日目に、毎週、輝度身体像を得た。研究の終わりに、病理組織学研究のために、血液、脾臓、骨および骨髄を回収した。
して腹腔内に(IP)再構成させた。5、12、19日目に、表示した用量を使用して、マウスを毎週処置した。各動物の腫瘍体積をモニターするために、10、17、24日目に、毎週、輝度身体像を得た。研究の終わりに、病理組織学研究のために、血液、脾臓、骨および骨髄を回収した。
結果
3つの標的抗原すべてに結合する抗体の能力をELISAアッセイによって試験した。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28sup×CD3low IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3low IgG4は、ヒトおよびサルのCD3およびCD38に対して類似する結合親和性を示したが、CD28supに関して、CD28(ヒトおよびサルは、同一の細胞外ドメインを有する)に対する可変結合親和性は、より良好な親和性を示した(図7A)。CD38VH1×CD28sup×CD3midおよびCD38HHY1370×CD28sup×CD3mid IgG4 FALAバリアントならびにIgG1 LALA P329AおよびNNASバリアントはすべて、ヒトCD3、CD28、およびCD38に対して類似する結合を示した(図7B)。
3つの標的抗原すべてに結合する抗体の能力をELISAアッセイによって試験した。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28sup×CD3low IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3low IgG4は、ヒトおよびサルのCD3およびCD38に対して類似する結合親和性を示したが、CD28supに関して、CD28(ヒトおよびサルは、同一の細胞外ドメインを有する)に対する可変結合親和性は、より良好な親和性を示した(図7A)。CD38VH1×CD28sup×CD3midおよびCD38HHY1370×CD28sup×CD3mid IgG4 FALAバリアントならびにIgG1 LALA P329AおよびNNASバリアントはすべて、ヒトCD3、CD28、およびCD38に対して類似する結合を示した(図7B)。
次に、三重特異性抗CD38×CD3×CD28結合タンパク質バリアントを、T細胞活性化および抗体介在性腫瘍細胞死滅を誘導するそれらの能力について試験した(図8A~8D)。図8Aは、E:T=10の3名の異なるドナー由来のPBMCを使用して、ヒト多発性骨髄腫細胞株RPMI-8226に対するCD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38hhy1370×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、CD38hhy1370×CD28cvn×CD3mid IgG4、のin vitroでの死滅活性を示す。死滅活性のEC50を計算し、表Nにまとめた。CD28supを含有する抗CD38×CD3×CD28三重特異性結合タンパク質は両方、より良好な死滅活性を示した。これらの分子のin vitroでの死滅活性もNCI-H929(図8B)、KMS-26(図8C)、およびKMS-11細胞株を使用して調査した(図8D)。
IgG1 LALA P329AおよびNNASバリアント、またはIgG4 FALAバリアントを有する抗CD38×抗CD3×抗CD28三重特異性結合タンパク質はまた、多発性骨髄腫KMS-11(図8E)およびU266(図8F)細胞のin vitroでの死滅を示した。各細胞株に対する各抗体に関するEC50を計算し、表Q2(KMS-11)およびQ3(U266)にまとめた。
図9A、9B、および10は、CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4およびCD38VH1×CD28sup×CD3low IgG4のin vitroでのT細胞活性化プロファイルを示す。両抗体は、CD4およびCD8T細胞について類似する活性化の活性を示した。各細胞株に対する各抗体に関するEC50を計算し、表N(RPMI-8226)、表O(NCI-H929)、表P(KMS-26)、および表Q(KMS-11)にまとめた。
Stebbings,R.ら(2007)(J. Immunol. 179:3325~3331頁)に記載の方法を使用して、プレートを表示した抗体でコーティングし、続いて、2種の濃度の試験抗体(5μg/mlおよび25ng/ml)を使用して、ヒトPBMCと24時間インキュベートすることによって、三重特異性結合タンパク質バリアントによって誘導されるサイトカイン産生についても調査した(図11Aおよび11B)
。24時間の培養上清を回収し、上記したように上清中のIL2、IL6、IL10、IL12、およびTNF-α、IFN-γの濃度を測定するために使用した。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38hhy1370×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、CD38hhy1370×CD28cvn×CD3mid IgG4はすべて、5μg/mlの有意なレベルのIL2、TNF-α、およびIFN-γの産生を刺激したが、2つのヒト化NSGマウスモデルにおけるin vivo有効性を示す用量である、25ng/mlの測定可能なレベルのいずれのサイトカインの誘導にも失敗した。
。24時間の培養上清を回収し、上記したように上清中のIL2、IL6、IL10、IL12、およびTNF-α、IFN-γの濃度を測定するために使用した。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38hhy1370×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、CD38hhy1370×CD28cvn×CD3mid IgG4はすべて、5μg/mlの有意なレベルのIL2、TNF-α、およびIFN-γの産生を刺激したが、2つのヒト化NSGマウスモデルにおけるin vivo有効性を示す用量である、25ng/mlの測定可能なレベルのいずれのサイトカインの誘導にも失敗した。
上述したように、抗腫瘍活性を三重特異性結合タンパク質バリアントに関してin vivoマウスモデルで試験した(図12A~13F)。図12A~12Eは、ヒトMM細胞株RPMI-8226を移植したヒトCD34+造血幹細胞を移植したNSGマウス(hu-CD34)モデルを使用して、in vivoでの有効性試験の結果を示す。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4およびベンチマーカー対照CD38×CD3二重特異性抗体を使用して、表示した用量を3QW(合計6用量)で、腫瘍保有マウスを処置した。各マウスに関する体重および腫瘍成長を測定し、プロットした(図12Aおよび12E)。各群に関する平均腫瘍成長曲線(図12D)、18日目の腫瘍体積(図12B)および19日目の最終腫瘍重量(図12C)もプロットした。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4で処置したすべての群は、PBS対照と比較した統計的有効性を示しただけでなく、対照のCD38×CD3二重特異性抗体と比較した1μg/kgの統計的により良好な有効性も示した。
図13A~13Fは、ヒトMM細胞株RPMI-8226と移植したヒトPBMCヒト化NSGマウスモデルを使用してin vivoでの有効性試験の結果を示す。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4およびベンチマーク対照CD38×CD3二重特異性抗体を使用して、表示した用量を3QW(合計8用量)で、腫瘍保有マウスを処置した。各マウスに関する腫瘍成長を測定し、プロットした(図13A)。各群に関する平均腫瘍成長曲線(図13F)、4日目の腫瘍体積(処置の開始日;図13B)、21日目の腫瘍体積(最終処置の日;図13C)、21日目の平均腫瘍体積(図13D)および22日目の最終腫瘍重量(図13E)もプロットした。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4で処置したすべての群を、PBS対照と比較して統計的有効性を示しただけでなく、対照のCD38×CD3二重特性抗体と比較した複数用量で統計的に良好な有効性も示し、三重特異性抗CD38/CD3/CD28抗体による優れたin vivoでの抗腫瘍活性を示した。
ベンチマーク対照CD38×CD3二重特異性抗体は、以下の配列を含んだ:
配列番号108:ベンチマーク重鎖1(CD38に結合する)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNWVRQAPGKGLEWVSEINPQSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号109:ベンチマーク重鎖2(CD3に結合する)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPGSGKPGSGKPGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREQMTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号110:ベンチマーク軽鎖(CD38に結合する)
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDTWVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号108:ベンチマーク重鎖1(CD38に結合する)
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配列番号109:ベンチマーク重鎖2(CD3に結合する)
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配列番号110:ベンチマーク軽鎖(CD38に結合する)
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抗CD38 mAb2およびmAb6含有三重特異性結合タンパク質に関する用量漸増研究
材料および方法
すべてのNHP研究は、Covance ICUCAプロトコールに従って、Covance(Princeton、New Jersey、USA)によって行った。薬物およびタンパク質ナイーブまたはタンパク質ナイーブ雄カニクイザルをすべての研究において使用した。研究設計に基づき、各三重特異性結合タンパク質について、サルを選択し、グループ化した。伏在静脈を介して、1時間、静脈内注入することによって抗体を与えた。漸増用量を、低用量(<10μg/kg)で連日与えたが、1~2日の間隔を空けて、観察を目的として高用量(>10μg/kg)で与えた。特定したように、各投与後に、すべての動物に関して、注入開始から0時間目(1日目のみ)、0.5時間目(中間の注入)、1、および6時間目に血液サンプルを回収した。追加の予定外の血液サンプルを、研究責任者、病理学者、および/または臨床獣医師の裁量で回収した。60日目に、すべての動物をコロニーに返却した。標準的方法を使用して、PBMCと血清を血液サンプルから調製し、将来の解析のために保存した。
材料および方法
すべてのNHP研究は、Covance ICUCAプロトコールに従って、Covance(Princeton、New Jersey、USA)によって行った。薬物およびタンパク質ナイーブまたはタンパク質ナイーブ雄カニクイザルをすべての研究において使用した。研究設計に基づき、各三重特異性結合タンパク質について、サルを選択し、グループ化した。伏在静脈を介して、1時間、静脈内注入することによって抗体を与えた。漸増用量を、低用量(<10μg/kg)で連日与えたが、1~2日の間隔を空けて、観察を目的として高用量(>10μg/kg)で与えた。特定したように、各投与後に、すべての動物に関して、注入開始から0時間目(1日目のみ)、0.5時間目(中間の注入)、1、および6時間目に血液サンプルを回収した。追加の予定外の血液サンプルを、研究責任者、病理学者、および/または臨床獣医師の裁量で回収した。60日目に、すべての動物をコロニーに返却した。標準的方法を使用して、PBMCと血清を血液サンプルから調製し、将来の解析のために保存した。
処置した非ヒト霊長類由来の血液を、T細胞マーカーおよびヒトIgG、Fcγ断片に対して蛍光的にコンジュゲートした抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
結果
mAb2含有CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、およびmAb6含有CD38hhy1370×CD28sup×CD3mid IgG4、mAb2含有CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、およびmAb6含有CD38hhy1370×CD28cvn×CD3mid IgG4三重特異性結合タンパク質を使用する用量漸増毒性研究を非ヒト霊長類で行った。4つの結合タンパク質における3つの結合ドメインはすべて、カニクイザルCD38/CD3/CD28ポリペプチドと交差反応性である。分子の潜在的毒性プロファイルを評価するためにこの研究を考案した。血清およびPBMCの単離のために血液サンプルを回収した。T細胞亜集団の活性化
(CD69+)(図14A~14D)と一緒に、循環T細胞集団を各投与後に調査した(図14E~14H)。循環するCD4およびCD8 T細胞のパーセンテージは、用量漸増とともに低下した。有意なCD4およびCD8 T細胞活性化は、2.5μg/kgの用量での開始で顕著であり、mAb2およびmAb6含有分子に関する有効な活性化能力を示唆した。有意な循環T細胞の欠失は、12.5μg/kgのすべてのタンパク質で見られ(図14I~14L)、再度、有効性と相関した。循環T細胞の欠失はむしろ一過的であり、24~48時間後に処置前のレベルに戻った(図14M~14P)。いくつかのサイトカインの血清レベルも測定した。すべての分子に関して12.5μg/kgで、有意なIL-6およびIL-10放出が確認されたが、これはむしろ一過的であり、24時間でベースラインに戻った(図14U)。
mAb2含有CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、およびmAb6含有CD38hhy1370×CD28sup×CD3mid IgG4、mAb2含有CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、およびmAb6含有CD38hhy1370×CD28cvn×CD3mid IgG4三重特異性結合タンパク質を使用する用量漸増毒性研究を非ヒト霊長類で行った。4つの結合タンパク質における3つの結合ドメインはすべて、カニクイザルCD38/CD3/CD28ポリペプチドと交差反応性である。分子の潜在的毒性プロファイルを評価するためにこの研究を考案した。血清およびPBMCの単離のために血液サンプルを回収した。T細胞亜集団の活性化
(CD69+)(図14A~14D)と一緒に、循環T細胞集団を各投与後に調査した(図14E~14H)。循環するCD4およびCD8 T細胞のパーセンテージは、用量漸増とともに低下した。有意なCD4およびCD8 T細胞活性化は、2.5μg/kgの用量での開始で顕著であり、mAb2およびmAb6含有分子に関する有効な活性化能力を示唆した。有意な循環T細胞の欠失は、12.5μg/kgのすべてのタンパク質で見られ(図14I~14L)、再度、有効性と相関した。循環T細胞の欠失はむしろ一過的であり、24~48時間後に処置前のレベルに戻った(図14M~14P)。いくつかのサイトカインの血清レベルも測定した。すべての分子に関して12.5μg/kgで、有意なIL-6およびIL-10放出が確認されたが、これはむしろ一過的であり、24時間でベースラインに戻った(図14U)。
CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4(図14V)およびCD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4(図14W)は両方、より高い用量で、血中のT細胞の欠乏を誘導した。同様に、CD38hhy1370×CD28sup×CD3mid IgG4(図14X)およびCD38hhy1370×CD28cvn×CD3mid IgG4(図14Y)もまた、より高い用量で、血中のT細胞の欠乏を誘導した。しかし、T細胞は、4つの三重特異性結合タンパク質のいずれかで処置した24時間後の血中に再度出現し始めた(図14Z~14AC)。図14ADおよび14AEは、100μg/kg用量投与後のCD4+T細胞に結合したCD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4の量を示す。図14AFおよび14AGは、100μg/kg用量投与後のCD8+T細胞に結合したCD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4の量を示す。これらのデータにより、三重特異性Ab CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4が、時間を延長した場合(48~72時間)に、in vivoでT細胞に結合することができることが明確に実証された。
Fcバリアントによる薬物動態/薬力学の最適化
材料および方法
C末端6-Hisタグ付き組換えヒトFcγ RI(R&D Systems 番号1257-FC-050)、C末端10-Hisタグ付き組換えヒトFcγ RIIA(R&D Systems 番号1330-CD-050/CF)およびC末端HPC4タグ付き組換えヒトFcγRIII(V158またはF158)をBiacoreチップに捕捉した。200、100および50nMの抗体を2分間注射し、続いて、Biacore
200を使用して、30μL/分の流速で、HBS-P+、2mM CaCl2(pH7.4)緩衝液中で2分解離された。200nMの結合曲線を示した。
材料および方法
C末端6-Hisタグ付き組換えヒトFcγ RI(R&D Systems 番号1257-FC-050)、C末端10-Hisタグ付き組換えヒトFcγ RIIA(R&D Systems 番号1330-CD-050/CF)およびC末端HPC4タグ付き組換えヒトFcγRIII(V158またはF158)をBiacoreチップに捕捉した。200、100および50nMの抗体を2分間注射し、続いて、Biacore
200を使用して、30μL/分の流速で、HBS-P+、2mM CaCl2(pH7.4)緩衝液中で2分解離された。200nMの結合曲線を示した。
C末端HPC4タグ付き組換えヒトNeonatal Fc Receptor(FcRn)を使用するELISAアッセイを使用して、様々なFc修飾を有する三重特異性結合タンパク質の結合特性を測定した。簡潔には、組換えヒトNeonatal Fc Receptor(FcRn)を使用して、終夜、ELISAプレート(Nunc 80040LE)をコーティングした(PBS中2ug/ml)。様々なFc修飾を有する連続希釈した三重特異性結合タンパク質を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートし、続いて、HRP標識した抗ヒトIgG二次抗体ともに洗浄およびインキュベートした。
結果
次に、上述の三重特異性結合タンパク質のバリアントを、薬物動態(PK)/薬力学(PD)を最適化するために様々なFc受容体への結合についてアッセイした。
次に、上述の三重特異性結合タンパク質のバリアントを、薬物動態(PK)/薬力学(PD)を最適化するために様々なFc受容体への結合についてアッセイした。
ヒトFcバリアントを、上述したように、FcγR I(図15A)、FcγR IIa(図15B)、およびFcγR IIIb/c(図15C)への結合について特徴付け
た。試験したバリアントは、ヒトIgG1、ヒトIgG4、および対照三重特異性結合タンパク質に関してFALA変異を有するヒトIgG4(EUインデックスに従い、F234AおよびL235A)であった。
た。試験したバリアントは、ヒトIgG1、ヒトIgG4、および対照三重特異性結合タンパク質に関してFALA変異を有するヒトIgG4(EUインデックスに従い、F234AおよびL235A)であった。
図15A~15Cにおいて示したように、野生型IgG1およびIgG4は、以前に報告されたように、FcγR IおよびFcγR IIaに結合することができるが、FcγR IIIb/cには結合することができなかった。IgG4 FALA変異によって、FcγR IおよびFcγR IIa結合が排除された。理論に拘束されることを望むものではないが、FcγR IおよびFcγR IIa結合を排除することによって、Fc/FcγRの相互作用を介する意図しないクラスター形成を取り除くことによりPK/PDを改善することができると考えられる。
次に、FcRnへの結合についてIgG4 FALAバリアントを調査した。野生型IgG4と同様に、バリアントはFcRnに結合した(図16)。これらの結果により、IgG4 FALA変異が、IgG4とFcRnの間の相互作用に影響を及ぼさないことが実証され、結合タンパク質の半減期に関する最小限の影響を意味する。
NSGマウスにおいて決定されたように、CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4FALA、CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG1 LALA P329A、およびCD38HHY1370×CD28sup×CD3mid IgG4 FALAのPKパラメータを図17にまとめる。IgG4 Fcの改変により、マクロファージに豊富に存在するNSG-特異的FcγRIへの結合を排除することによる、NSGマウスにおける半減期およびAUCの有意な改善が示された。
抗CD38三重特異性結合タンパク質のin vitroでの活性化およびin vivoでの抗腫瘍有効性
材料および方法
ヒトPBMCからのサイトカイン放出
ヒトPMBCを、100pMの結合タンパク質と24時間インキュベートした。上清を回収し、Drop Arrayプレートを使用するLuminexによって、サイトカインを測定した(三連で)。腫瘍標的細胞を使用する実験では、ヒトPMBCを、10:1のE:T比で、24時間、抗体100pMと(RPMI-8226標的細胞の有無にかかわらず)インキュベートした。PMBCを三重特異性タンパク質とともにインキュベートした後、上清を回収し、MILLIPLEX(登録商標) MAPキットを用いてサイトカインについてアッセイし、MAGPIX(登録商標) Systemで解析した。
材料および方法
ヒトPBMCからのサイトカイン放出
ヒトPMBCを、100pMの結合タンパク質と24時間インキュベートした。上清を回収し、Drop Arrayプレートを使用するLuminexによって、サイトカインを測定した(三連で)。腫瘍標的細胞を使用する実験では、ヒトPMBCを、10:1のE:T比で、24時間、抗体100pMと(RPMI-8226標的細胞の有無にかかわらず)インキュベートした。PMBCを三重特異性タンパク質とともにインキュベートした後、上清を回収し、MILLIPLEX(登録商標) MAPキットを用いてサイトカインについてアッセイし、MAGPIX(登録商標) Systemで解析した。
Bcl-xLアッセイ
PBMCから負選別(磁性)したT細胞を、100nMのプレートに結合したAbとともに、1日間インキュベートした。次いで、T細胞を洗浄し、T細胞マーカーおよびBcl-xLに特異的な蛍光的にコンジュゲートした抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
PBMCから負選別(磁性)したT細胞を、100nMのプレートに結合したAbとともに、1日間インキュベートした。次いで、T細胞を洗浄し、T細胞マーカーおよびBcl-xLに特異的な蛍光的にコンジュゲートした抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
T細胞の増殖
PBMCから負選別した(磁性ビーズ細胞分離)T細胞を、プレートに結合したAb(100nM)とともに、1から6日間インキュベートした。インキュベーション開始の特定日数後に、ビーズの計数を使用するフローサイトメトリーによって、細胞総数を計数した。0日目の細胞計数(500細胞/uL)から倍率変化を計算した。結果は3名のPBMCドナーに由来する。
PBMCから負選別した(磁性ビーズ細胞分離)T細胞を、プレートに結合したAb(100nM)とともに、1から6日間インキュベートした。インキュベーション開始の特定日数後に、ビーズの計数を使用するフローサイトメトリーによって、細胞総数を計数した。0日目の細胞計数(500細胞/uL)から倍率変化を計算した。結果は3名のPBMCドナーに由来する。
IL-2の発現
GloResponse(商標)IL2-luc2P Jurkat細胞を、三重特異性タンパク質と6時間インキュベートし、次いで、Bio-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を検出した。
GloResponse(商標)IL2-luc2P Jurkat細胞を、三重特異性タンパク質と6時間インキュベートし、次いで、Bio-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を検出した。
in vitroでの活性化におけるPBMC
抗CD38×CD28×CD3三重特異性抗体または対照のIgG4結合タンパク質で処置したヒトPBMC細胞の活性化(CD69+)を決定した。
抗CD38×CD28×CD3三重特異性抗体または対照のIgG4結合タンパク質で処置したヒトPBMC細胞の活性化(CD69+)を決定した。
播種腫瘍モデルにおけるin vivoでの有効性
播種hu-PMBC NSGマウスモデルでは、1~5×106個の細胞を、0日目に各マウス中に静脈内注射した。3日目に、ベースラインの輝度イメージングを無作為化のために得た。4日目に、健常なドナー由来の10×106個のヒトPBMCを各マウスに対して腹腔内に(IP)再構成させた。5、12、19日目に、表示した用量を使用して、マウスを毎週処置した。各動物の腫瘍体積をモニターするために、10、17、24日目に、毎週、輝度身体像を得た。研究の終わりに、病理組織学研究のために、血液、脾臓、骨および骨髄を回収した。
播種hu-PMBC NSGマウスモデルでは、1~5×106個の細胞を、0日目に各マウス中に静脈内注射した。3日目に、ベースラインの輝度イメージングを無作為化のために得た。4日目に、健常なドナー由来の10×106個のヒトPBMCを各マウスに対して腹腔内に(IP)再構成させた。5、12、19日目に、表示した用量を使用して、マウスを毎週処置した。各動物の腫瘍体積をモニターするために、10、17、24日目に、毎週、輝度身体像を得た。研究の終わりに、病理組織学研究のために、血液、脾臓、骨および骨髄を回収した。
結果
IgG4 FALAバリアントFc領域を有するmAb2含有抗CD38×抗CD28×抗CD3三重特異性結合タンパク質は、野生型Fc領域を有する類似する結合タンパク質と比較して、ヒトPBMCにおける非特異的IFN-γ放出レベルを著しく低下させた(図18A)。IL-2(図18B)およびTNF-α(図18C)の放出に関して、同様の結果が観察された。重要なことに、サイトカイン放出は、ベンチマーク二重特異性抗CD38×抗CD3二重特異性抗体に対するよりも、これらのFcバリアント三重特異性結合タンパク質で有意に低かった。これらの結果は、非特異的サイトカイン放出の低下に起因するFcバリアントに関する三重特異性結合タンパク質の安全性プロファイルの改善を意味する。
IgG4 FALAバリアントFc領域を有するmAb2含有抗CD38×抗CD28×抗CD3三重特異性結合タンパク質は、野生型Fc領域を有する類似する結合タンパク質と比較して、ヒトPBMCにおける非特異的IFN-γ放出レベルを著しく低下させた(図18A)。IL-2(図18B)およびTNF-α(図18C)の放出に関して、同様の結果が観察された。重要なことに、サイトカイン放出は、ベンチマーク二重特異性抗CD38×抗CD3二重特異性抗体に対するよりも、これらのFcバリアント三重特異性結合タンパク質で有意に低かった。これらの結果は、非特異的サイトカイン放出の低下に起因するFcバリアントに関する三重特異性結合タンパク質の安全性プロファイルの改善を意味する。
mAb2含有CD38VH1×CD28sup×CD3midおよびmAb6含有CD38HH71370×CD28sup×CD3midの両方のIgG1およびIgG4 Fcバリアントによって、ヒトPBMCのin vitroでの活性化ももたらされた(図18D)。
CD28のライゲーションによる免疫共刺激は、T細胞の生存および増殖に必要であり;TCRシグナル伝達は、単独でT細胞の増殖をもたらさない(SharmeeおよびAllison(2015)Science 348:56~61頁)。三重特異性結合タンパク質CD38VH1×CD28sup×CD3midにより、CD4+とCD8+の両方のT細胞においてBcl-xLの誘導がもたらされるが、CD28またはCD3抗原結合ドメインのいずれかを除去することにより、この作用が排除された(図19Aおよび19B)。これらの結果は、期待された通り、CD3およびCD28結合アームの両方が、抗CD38三重特異性結合タンパク質によるT細胞におけるBcl-xL誘導に必要であり、それによって、T細胞への生存促進シグナルが送達されることを実証する。三重特異性結合タンパク質の抗CD28アームは、T細胞における生存促進性Bcl-xLの上方調節に対して重要である。ベンチマーク抗CD38×抗CD3二重特異性抗体と比較する場合、CD38VH1×CD28×CD3三重特異性結合タンパク質によって、CD4+およびCD8+ T細胞におけるBcl-xLのより程度の高い上方調節がもたらされた(図19Cおよび19D)。
CD38VH1×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質によるT細胞活性化の主要な駆動因子を決定するために、ヒトIL2プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーターを含有するJurkat T細胞レポーターJurkat株中のIL-2発現を使用して、活性化を測定した。抗CD3結合ドメインのノックアウト変異によって、T細胞活性化の排除が導かれ、T細胞の活性化がCD3ライゲーションの特異的作用であることが実証された(図19E)。これらの結果は、抗CD3が三重特異性結合タンパク質によるT細胞活性化の主要な駆動因子であること、および抗CD28もT細胞活性化シグナルに対して有意に寄与することを示す。サイトカイン放出の主要な駆動因子についても、ヒトPBMCを使用して調査した(図19F)。TNF、IFNg、IL-2、IL-6、およびIL-10の放出を調査することによって、CD3がサイトカイン放出の主要な決定因子であることが判明した。CD28の寄与は最も少ないことが分かった。抗CD38VH1を有する三重特異性結合タンパク質は、ベンチマークコンパレーターよりも少ないサイトカイン放出しか誘導しないことも判明した。
T細胞の増殖についても調査した。IgG4 FALAバリアントFcを有する抗CD38×抗CD28×抗CD3三重特異性結合タンパク質を使用するT細胞の活性化により、ベンチマークまたはアイソタイプ対照よりも多い増殖がもたらされた(図19G)。この活性化は、抗CD28または抗CD3抗原結合ドメインの変異の際に低下した(図20)。
次に、in vivoでの固形腫瘍成長実験のために、ヒト化NSGマウスモデルを使用した。6~8週目に、RPMI8226ヒト骨髄腫細胞をマウスに移植した。9週目にヒトPBMCをip注射によって導入し、hPBMCを再構成し、10~13週目に抗腫瘍治療を投与した。56頭の雌のPBMCヒト化NSGマウスに、50%のマトリゲル中5百万個のRPMI8226細胞を移植し、移植の5または6日後に、マウスを選択して研究への無作為化した。このモデルは、ヒト成熟T細胞を有するマウスのin vivo腫瘍モデルとしての役割を果たす。
NCI-H929-Lucヒト骨髄腫細胞を使用し、バイオルミネセンスにより腫瘍成長をアッセイする播種腫瘍成長のNSGマウスモデルにおいて、三重特異性結合タンパク質もアッセイした。IgG4 FALA Fcバリアントを有するCD38VH1×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質は、30μg/kgで、この播種腫瘍モデルにおいて、統計的に有意な、用量依存性抗腫瘍有効性を示した(図21)。IgG4 FALA Fcバリアントを有するCD38HHY1370×CD28sup×CD3mid三重特異性結合タンパク質もまた、30μg/kgおよび10μg/kgで、この播種腫瘍モデルにおいて、統計的に有用な、用量依存性抗腫瘍有効性を示した(図22)。
三重特異性結合タンパク質であるmAb2含有CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4 FALAおよびmAb6含有CD38hhy1370×CD28sup×CD3mid IgG4 FALAは、2頭のドナーヒト化NSGマウス由来のヒトPBMCを使用して、NCI-H929-Luc骨髄腫細胞に対して有効なin vitro腫瘍死滅活性を示した(図23Aおよび23b)。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA三重特異性結合タンパク質は、播種腫瘍モデルにおいて、ベンチマーク二重特異性抗体と比較して、優れたin vivo腫瘍活性を示した(図23C)。ビヒクル対照(PBS)との比較のP値を以下のように決定した:
CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA:p=0.0023;CD38HHY1370×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA:p=0.0088;ベンチマーク二重特異性CD38×CD3 Fab-scFv-Fc:p=0.6045。
CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA:p=0.0023;CD38HHY1370×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA:p=0.0088;ベンチマーク二重特異性CD38×CD3 Fab-scFv-Fc:p=0.6045。
まとめると、これらの結果は、半減期の増加、非特異的サイトカイン放出の低下、およびより高いin vivo抗腫瘍有効性を示す、バリアントFc領域を有する改善された抗CD38候補物質を実証する。
抗CD38三重特異性結合タンパク質のさらなる特徴付け
最適なエフェクター機能および増殖維持のために、T細胞を刺激するための2つのシグナルが必要とされる。T細胞受容体(TCR)-CD3複合体に介在される活性化によって、サイトカイン分泌をもたらす転写活性化が誘導される。第2の表面膜タンパク質であるCD28の会合により、代わりのシグナル伝達経路が刺激され、プログラム細胞死が阻害される(Esensten JH、Helou YAら Immunity 44:973~88頁(2016);Hui E、Cheung Jら Science 355:1428~1433頁(2017))。第2のシグナルの非存在下で、CD3のみによるT細胞刺激によって、典型的には、活性化誘導細胞死がもたらされる(Chai JG、Lechler RI. Int Immunol. 9:935~44頁(1997))。T細胞の増殖は、これらの2つの異なる標的に対する特異性を組み合わせることによって増加すると仮定された。
最適なエフェクター機能および増殖維持のために、T細胞を刺激するための2つのシグナルが必要とされる。T細胞受容体(TCR)-CD3複合体に介在される活性化によって、サイトカイン分泌をもたらす転写活性化が誘導される。第2の表面膜タンパク質であるCD28の会合により、代わりのシグナル伝達経路が刺激され、プログラム細胞死が阻害される(Esensten JH、Helou YAら Immunity 44:973~88頁(2016);Hui E、Cheung Jら Science 355:1428~1433頁(2017))。第2のシグナルの非存在下で、CD3のみによるT細胞刺激によって、典型的には、活性化誘導細胞死がもたらされる(Chai JG、Lechler RI. Int Immunol. 9:935~44頁(1997))。T細胞の増殖は、これらの2つの異なる標的に対する特異性を組み合わせることによって増加すると仮定された。
図24Aは、10nMの濃度のCD38VH1/CD28sup×CD3midならびにその単一の結合部位KOおよび三重性KO突然変異体による刺激後にGloResponse(商標)IL2-luc2P Jurkat細胞(Promega)を使用して行ったルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。これらのデータは、T細胞刺激(例えば、NFATシグナル伝達)に対するCD28の寄与について例証する。
クロスオーバー二重可変(CODV)二重特異性Ab形式(Steinmetz Aら
MAbs 8:867~878頁(2016))を使用して、αーCD3ε(シグナル1)およびα-CD28(シグナル2)Fvの組合せを評価し、これらの細胞表面分子の二重会合によってT細胞活性化が刺激され、維持されるかどうかを決定した(図24B)。媒体親和性(KD~20nM)抗CD3ε Abを使用して、高レベルのサイトカイン放出を引き起こし、サイトカイン放出症候群のリスクを増加させる高親和性T細胞受容体刺激を回避した。T細胞の増殖を支持することが以前に示されたスーパーアゴニストのCD28 Abと組み合わせた二重アームの両方の位置で、このCD3アゴニストを試験した(Waibler Z,Sender LYら PLoS One 3:e1708頁(2008))。これらの一価の二重特異性抗体をin vitroでヒトPBMCとともにインキュベートし、インターフェロン-γとIL-2の分泌によってT細胞刺激を測定した。両方の配向が活性であったが、これらのサイトカインの最適な放出は、近位のCD3と遠位のCD28で観察された(図24B)。次いで、この二重アームを、三重特異性Ab形式の抗CD38抗体との対合のために選択した(Xu L,Pegu Aら Science 358:85~90頁(2017))。
MAbs 8:867~878頁(2016))を使用して、αーCD3ε(シグナル1)およびα-CD28(シグナル2)Fvの組合せを評価し、これらの細胞表面分子の二重会合によってT細胞活性化が刺激され、維持されるかどうかを決定した(図24B)。媒体親和性(KD~20nM)抗CD3ε Abを使用して、高レベルのサイトカイン放出を引き起こし、サイトカイン放出症候群のリスクを増加させる高親和性T細胞受容体刺激を回避した。T細胞の増殖を支持することが以前に示されたスーパーアゴニストのCD28 Abと組み合わせた二重アームの両方の位置で、このCD3アゴニストを試験した(Waibler Z,Sender LYら PLoS One 3:e1708頁(2008))。これらの一価の二重特異性抗体をin vitroでヒトPBMCとともにインキュベートし、インターフェロン-γとIL-2の分泌によってT細胞刺激を測定した。両方の配向が活性であったが、これらのサイトカインの最適な放出は、近位のCD3と遠位のCD28で観察された(図24B)。次いで、この二重アームを、三重特異性Ab形式の抗CD38抗体との対合のために選択した(Xu L,Pegu Aら Science 358:85~90頁(2017))。
図25は、CD38VH1/CD28sup×CD3midによって誘導された初代T細胞におけるBcl-2ファミリーのメンバーであるBcl-xLの上方調節がCD28依存性であることを示す。これらのデータは、T細胞の生存に対するCD28の寄与について例証する。
図26は、三重特異性Abの抗CD28が、in vitroで、初代T細胞の増殖を支持するのに必須の二次的シグナル伝達をもたらしたことを示す。これらのデータは、T細胞の増殖に対するCD28の寄与について例証する。
まとめると、これらのデータは、CD38VH1/CD28sup×CD3mid三重特異性抗体における抗CD28supが、in vitroで、T細胞の活性化、生存および増殖における重要な機能性をもたらすことを示す。
図27は、親抗体によってコードされる三重特異性抗体の構造を示す。抗CD38 VH1 FabおよびCD28sup/CD3mid CODV Fab(右)の結晶構造に基づいて得られたCD38VH1/CD28sup×CD3mid三重特異性Abの構造モデルも示される。
図28Aおよび28Bは、高い(RPMI-8226;図28A)および低い(KMS-11;図28B)CD38表面発現を有する多発性骨髄腫(MM)細胞を、様々な濃度の三重特異性AbとともにインキュベートしたヒトPBMC(E:T=10:1)によって効率的に溶解したことを示す。各結合部位による死滅活性への寄与を、結合部位のKO変異によって実証した。これらのデータは、CD38三重特異性抗体が、CD38とCD28の両方を認識することによりヒトMM細胞を溶解したことを実証する。多発性骨髄腫細胞で発現されるCD28により、その死滅活性を有意に増強するCD38VH1/CD28sup×CD3mid_FALA三重特異性抗体による二次標的がもたらされた。
図29A~29Cは、三重特異性Abの抗CD28sup KO突然変異体が、in vitroで、CD38high、CD38midおよびCD38low MM細胞に対して著しく低下した抗腫瘍活性を示したことを示す。RPMI-8226(図29A)、U266(図29B)、またはKMS-11(図29C)細胞を使用するアッセイを示す(図29C)。MM細胞におけるCD28発現によって、CD38三重特異性抗体に介在される細胞溶解に対するそれらの感受性が増加した。
図30は、in vitroで増幅されたヒト初代T細胞で再構成されたNSGマウスを使用する、播種ヒト多発性骨髄腫細胞株モデルにおけるin vivoでの有効性研究の結果を示す。CD38VH1/CD28sup×CD3mid_FALA三重特異性抗体処置群における腫瘍負荷の低下は、用量依存性であり、統計的に異なった。よって、CD38三重特異性抗体によって、in vivoでの播種ヒトMM細胞の腫瘍成長に対する保護が与えられた。
顕微鏡研究により、in vitroで、三重特異性抗体に介在される初代ヒトT細胞によるがん細胞の死滅がさらに実証された。図31Aおよび31Bは、CD38VH1/CD28sup×CD3mid_FALA三重特異性抗体に介在されるヒトPBMCによって溶解されたRPMI-8226(CellTracker Deep Red染料で標識したヒトMM細胞)を実証する顕微鏡画像を示す。図31Aは対照を示すが、図31Bは、CD38VH1/CD28sup×CD3mid_FALA三重特異性抗体に介在される溶解を示す。24時間のインキュベーションでは、10:1のE:T比を使用した。三連のヌル突然変異体対照Abへの曝露によって、24時間にわたり、腫瘍細胞の生存率には最小限の変化しか誘導されなかった(図31A)。対照的に、活性CD38三重特異性Abとのインキュベーションにより、腫瘍細胞の周囲にT細胞の実質的なクラスター形成が誘導され、それらのほぼ完全な溶解がもたらされた(図31B)。これらのデータにより、CD38/CD3×CD28三重特異性抗体がT細胞による骨髄腫細胞の細胞溶解を介在したことが実証される。
抗CD38三重特異性結合タンパク質のIgG4 Fc領域におけるFc受容体結合部位の改変により非特異的炎症が低減される
抗体のFc領域は、非特異的炎症を誘導する単球およびNK細胞上の細胞受容体に結合
し、処置対象をサイトカイン放出症候群に罹りやすくする場合がある。サイトカイン放出を刺激する際のFc受容体の役割を、FcγI、FcγIIa,bおよびFcγIII結合を排除した突然変異体を試験することによって調査した。このために、補体を固定しないIgG4アイソタイプを使用した。
抗体のFc領域は、非特異的炎症を誘導する単球およびNK細胞上の細胞受容体に結合
し、処置対象をサイトカイン放出症候群に罹りやすくする場合がある。サイトカイン放出を刺激する際のFc受容体の役割を、FcγI、FcγIIa,bおよびFcγIII結合を排除した突然変異体を試験することによって調査した。このために、補体を固定しないIgG4アイソタイプを使用した。
BIAcoreシステム(Pharmacia Biosensor;Piscataway、NJ)を使用する表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイにおける結合を使用して、チップ上に固定した表示されたヒトFc受容体に対する特定のIgG4 Fcバリアントの親和性を測定した。150nMで、IgG4 Fcバリアントを使用した。ELISAを使用し、プレート上にヒトFcRn抗原をコーティングすることによって、ヒトFcRnへの結合を行った。
以前に記載された(Alegre ML、Peterson LJら Transplantation 57:1537~43頁(1994);実施例7~9も参照されたい)Fc領域における変異(「FALA」)により、すべてのFc受容体への結合が排除された(図32および33)。非特異的サイトカイン放出について試験する場合、刺激されていないPBMCでは、IFN-γの放出が抑制されたが、一方、CD38を発現した腫瘍標的の存在下で、最大限の刺激が可能となった(図34、左対右、FALA)。このFc突然変異体は、異なるレベルのCD38を発現する細胞において、Fc野生型対照に匹敵する骨髄腫腫瘍標的上でその細胞溶解活性を保持した(図35)。同様に、Fc受容体(図33)への結合を排除した別の変異したIgG4 Fc領域(「PVA」、図32を参照されたい)もまた、刺激されていないPBMCにおけるIFN-γ放出を抑制したが、一方、CD38を発現した腫瘍標的の存在下で、最大限の刺激を可能とし(図34、左対右、PVA)、異なるレベルのCD38を発現する細胞において、Fc野生型対照に匹敵する骨髄腫腫瘍標的上でその細胞溶解活性を保持した(図35)。
三重特異性結合タンパク質の細胞溶解活性に対する抗CD38および抗CD28の寄与
各結合部位または結合部位の組合せに関する三重特異性Ab突然変異体を生成し、高い(RPMI-8226)または低い(KMS-11)CD38およびCD28の表面発現を有する多発性骨髄腫細胞株に対するそれらの細胞溶解活性について試験した。
各結合部位または結合部位の組合せに関する三重特異性Ab突然変異体を生成し、高い(RPMI-8226)または低い(KMS-11)CD38およびCD28の表面発現を有する多発性骨髄腫細胞株に対するそれらの細胞溶解活性について試験した。
図28Aおよび28Bにおいて上に示したように、CD3特異的結合の変異は細胞溶解を抑制したが、一方、抗CD38およびCD28のヌル変異は死滅の著しい低下を示し、しかしながら、一部の残りの機能は保持され、抗CD38とCD28の両方が腫瘍細胞の死滅に寄与することを示した。
ダラツムマブ(多発性骨髄腫の処置に対して承認されたα-CD38モノクローナル抗体;McKeage K. Drugs. 76:275~81頁(2016)を参照されたい)と比較して、三重特異性Abは、CD38highとCD38lowの両方の多発性骨髄腫細胞を含む様々なCD38発現細胞株に対して、in vitroで、3~4logの顕著に高い死滅効力を示した(図36)。
CD38/CD3×CD28 Abは、セントラルメモリーCD4およびCD8、Th1ならびに抗原特異的応答を刺激する
CD38/CD3×CD28三重特異性Abが細胞の免疫機能を増強することができるかどうかを決定するために、in vitroで拡大されたT細胞の表現型を評価した。
CD38/CD3×CD28三重特異性Abが細胞の免疫機能を増強することができるかどうかを決定するために、in vitroで拡大されたT細胞の表現型を評価した。
材料と方法
Research Blood Components,LLC(Boston、MA)により回収された健常なヒトドナーの血液から、末梢血単核細胞を単離した。PBMCを、以前に上記したように、抗体をコーティングしたプレート(350ng/ウェル)に添加し(5×105細胞/mL)、37℃で3および7日間インキュベートした。特定の時点で、細胞を回収し、T細胞のサブセット:ナイーブ(CCR7+ CD45RO-)、Tcm(CCR7+ CD45RO+)、Tem(CCR7- CD45RO+)、Tregs(CD4+ Foxp3+ CD25hi)についてフローサイトメトリーで解析した。細胞内のサイトカイン発現:Th1(CD4+ IFN-γ+)、Th2(CD4+ IL-4+)、およびTh17(CD4+ IL-17+)を決定するために、フロー染色の少なくとも6時間前に、細胞をモネシン(GolgiStop)(BD Biosciences、CA)でも処置した。PBMCドナーのHLA(A*02:01/NLVPMVATV)(ProImmune、Oxford、UK)に限定される蛍光標識五量体(fluorescent-conjugated pentamer)を使用して、CMV pp65-特異的CD8+ T細胞を検出した。公知のCMV陽性集団およびHLA型を有するドナー由来のHemaCare(Van Nuys、CA)から、PBMCを得た。限定しているHLA型に対して陰性のドナー由来のPMBCを陰性対照として使用した。製造業者のプロトコールにより染色を行った。
Research Blood Components,LLC(Boston、MA)により回収された健常なヒトドナーの血液から、末梢血単核細胞を単離した。PBMCを、以前に上記したように、抗体をコーティングしたプレート(350ng/ウェル)に添加し(5×105細胞/mL)、37℃で3および7日間インキュベートした。特定の時点で、細胞を回収し、T細胞のサブセット:ナイーブ(CCR7+ CD45RO-)、Tcm(CCR7+ CD45RO+)、Tem(CCR7- CD45RO+)、Tregs(CD4+ Foxp3+ CD25hi)についてフローサイトメトリーで解析した。細胞内のサイトカイン発現:Th1(CD4+ IFN-γ+)、Th2(CD4+ IL-4+)、およびTh17(CD4+ IL-17+)を決定するために、フロー染色の少なくとも6時間前に、細胞をモネシン(GolgiStop)(BD Biosciences、CA)でも処置した。PBMCドナーのHLA(A*02:01/NLVPMVATV)(ProImmune、Oxford、UK)に限定される蛍光標識五量体(fluorescent-conjugated pentamer)を使用して、CMV pp65-特異的CD8+ T細胞を検出した。公知のCMV陽性集団およびHLA型を有するドナー由来のHemaCare(Van Nuys、CA)から、PBMCを得た。限定しているHLA型に対して陰性のドナー由来のPMBCを陰性対照として使用した。製造業者のプロトコールにより染色を行った。
結果
ヒトのPBMCを、サイトカインの非存在下で、三重特異性Abまたは三連の変異陰性対照とともに、7日間インキュベートした。CD4サブセットの解析により、セントラルメモリープールにおいて最も多い増殖が明らかとなり、エフェクターメモリー細胞ではより少ない増加しかなかった(図37A)。また、CD4サブセットの解析により、Th2またはTh17細胞(図37B)と比較したTh1細胞(6倍を超える)の最も高い増殖も明らかとなった(図37B)。CD8サブセットでは、7日目までに、セントラルメモリーCD8サブセットにおいて150倍を超える増加があり、エフェクターメモリー細胞では、増加はより少なかった(図37C)。重要なことに、四量体染色(Gratama
JW、van Esser JWら Blood 98:1358~1364頁(2001))を使用する血清陽性HLA-A2ドナーのpp65エピトープを対象とするCMVに対する既存の抗原特異的CD8の応答は、陰性対照と比較して、CD38三重特異性の存在下で44倍を超えて増加した(図37D)。
ヒトのPBMCを、サイトカインの非存在下で、三重特異性Abまたは三連の変異陰性対照とともに、7日間インキュベートした。CD4サブセットの解析により、セントラルメモリープールにおいて最も多い増殖が明らかとなり、エフェクターメモリー細胞ではより少ない増加しかなかった(図37A)。また、CD4サブセットの解析により、Th2またはTh17細胞(図37B)と比較したTh1細胞(6倍を超える)の最も高い増殖も明らかとなった(図37B)。CD8サブセットでは、7日目までに、セントラルメモリーCD8サブセットにおいて150倍を超える増加があり、エフェクターメモリー細胞では、増加はより少なかった(図37C)。重要なことに、四量体染色(Gratama
JW、van Esser JWら Blood 98:1358~1364頁(2001))を使用する血清陽性HLA-A2ドナーのpp65エピトープを対象とするCMVに対する既存の抗原特異的CD8の応答は、陰性対照と比較して、CD38三重特異性の存在下で44倍を超えて増加した(図37D)。
まとめると、これらのデータは、CD38三重特異性Abが、Th1機能およびin vivoで抗腫瘍免疫を増強する傾向のある保護的CD8メモリーT細胞応答を刺激することを示す。
多発性骨髄腫細胞上のCD28は、T細胞の認識と細胞溶解を増加させる
材料および方法
フローサイトメトリー
記載したように(S4)、QIFIキット(Dako、Denmark、カタログ番号K007811)を使用するフローサイトメトリーによって、表示した腫瘍細胞株上のCD28およびCD38のレベルを決定した。簡潔には、マウス抗ヒトCD38(クローンAT13/5、マウスのIgG1、Santa Cruz Biotech、カタログ番号59028)および抗ヒトCD28(クローンCD28.2、マウスIgG1、k,B
ioLegend、カタログ番号3029123)を、製造業者のプロトコールを使用して、細胞株上の表面CD38およびCD28を検出するために、一次抗体(10ug/ml)として使用した。QIFIキットの較正標準物質およびキットによって提供された配合を使用して、表面密度を計算した。
材料および方法
フローサイトメトリー
記載したように(S4)、QIFIキット(Dako、Denmark、カタログ番号K007811)を使用するフローサイトメトリーによって、表示した腫瘍細胞株上のCD28およびCD38のレベルを決定した。簡潔には、マウス抗ヒトCD38(クローンAT13/5、マウスのIgG1、Santa Cruz Biotech、カタログ番号59028)および抗ヒトCD28(クローンCD28.2、マウスIgG1、k,B
ioLegend、カタログ番号3029123)を、製造業者のプロトコールを使用して、細胞株上の表面CD38およびCD28を検出するために、一次抗体(10ug/ml)として使用した。QIFIキットの較正標準物質およびキットによって提供された配合を使用して、表面密度を計算した。
CRISPR介在性ノックアウトを使用するCD28 KOヒト多発性骨髄腫細胞株の生成
KMS-11細胞株では、CRISPR CD28ヒトノックアウトキット(Origene)を使用して、CD28のノックアウトを実施した。キットは、GFP-ピューロマイシンの機能的カセットを含むドナーベクターと、異なる予め設計されたガイドRNA(CD28のエクソン1およびイントロン1をそれぞれ標的とするgRNA 1:TACCTGTTACTTGAATTGAA(配列番号117)およびgRNA 2:ATTTTTTGAGGTCTTCCAAT(配列番号118))をそれぞれ有する2つの別個のCas-9ベクターとを含有する。10%のFBSを補充したRPMI 1640 GlutaMAX Medium中、3.105細胞/ウェルの密度で、細胞を6ウェルプレート中に播種し、製造業者の使用説明書に従って、Lipofectamine(商標)3000 Transfection Reagent(ThermoFisher Scientific)を使用して、3つのベクターすべてを用い、24時間後に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、最終濃度0.5μg/mLのピューロマイシンを添加した。6.25μL/ウェルのLipofectamine(商標)3000、各Cas-9/gRNAベクター1.25μgおよびGFP-ピューロマイシンドナーベクター2.5μgを使用する場合、トランスフェクション効率は30%であった。CD28sgRNA CRISPRオールインワンレンチウイルスセット(Applied Biological Materials Inc.)を使用して、RPMI 8226細胞株上でCD28のノックアウトを実施した。これは、Cas9遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子および様々なsgRNA(CD28エクソン2を標的とするsgRNA 1:ATTGTCGTACGCTACAAGCA(配列番号119)およびsgRNA 2:CAAAAGGGCTTAGAAGGTCC(配列番号120)およびCD28エクソン3を標的とするsgRNA 3:CTATAGCTTGCTAGTAACAG(配列番号121))を発現する3つのレンチウイルスオールインワンベクターのセットからなる。レンチウイルス粒子(10UI/細胞)、8μg/mLのポリブレンおよび1:100のViralPlus Transduction Enhancer(Applied Biological Materials Inc.)と混合した2.105細胞を用いるスピノキュレーションプロトコールを使用して、細胞を感染させた。混合物を、室温で20分間プレインキュベートし、次いで、32℃にて、800×gで30分間遠心分離し、12ウェルプレート中に播種した。感染の48時間後に、最終濃度0.25μg/mLでピューロマイシンを添加した。両細胞株を少なくとも5回(または細胞生存率が安定となるまで)継代した後、フローサイトメトリーによって、タンパク質レベルでCD28のノックダウンを確認した(CD28PE Clone 28.2抗体-BioLegend)。次いで、CD28陰性細胞を、Sony SH800S Cell Sorterで選別し、0.25μg/mLまたは0.5μg/mLのピューロマイシン、100ユニット/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific)を補充した培地中で培養した。次いで、限定希釈によって細胞をクローニングし、フローサイトメトリーによってならびに以下に列挙したフォワードおよびリバースプライマーを使用するPCRおよびSangerシークエンスによってCD28ノックアウトを検証した。
KMS-11細胞株では、CRISPR CD28ヒトノックアウトキット(Origene)を使用して、CD28のノックアウトを実施した。キットは、GFP-ピューロマイシンの機能的カセットを含むドナーベクターと、異なる予め設計されたガイドRNA(CD28のエクソン1およびイントロン1をそれぞれ標的とするgRNA 1:TACCTGTTACTTGAATTGAA(配列番号117)およびgRNA 2:ATTTTTTGAGGTCTTCCAAT(配列番号118))をそれぞれ有する2つの別個のCas-9ベクターとを含有する。10%のFBSを補充したRPMI 1640 GlutaMAX Medium中、3.105細胞/ウェルの密度で、細胞を6ウェルプレート中に播種し、製造業者の使用説明書に従って、Lipofectamine(商標)3000 Transfection Reagent(ThermoFisher Scientific)を使用して、3つのベクターすべてを用い、24時間後に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、最終濃度0.5μg/mLのピューロマイシンを添加した。6.25μL/ウェルのLipofectamine(商標)3000、各Cas-9/gRNAベクター1.25μgおよびGFP-ピューロマイシンドナーベクター2.5μgを使用する場合、トランスフェクション効率は30%であった。CD28sgRNA CRISPRオールインワンレンチウイルスセット(Applied Biological Materials Inc.)を使用して、RPMI 8226細胞株上でCD28のノックアウトを実施した。これは、Cas9遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子および様々なsgRNA(CD28エクソン2を標的とするsgRNA 1:ATTGTCGTACGCTACAAGCA(配列番号119)およびsgRNA 2:CAAAAGGGCTTAGAAGGTCC(配列番号120)およびCD28エクソン3を標的とするsgRNA 3:CTATAGCTTGCTAGTAACAG(配列番号121))を発現する3つのレンチウイルスオールインワンベクターのセットからなる。レンチウイルス粒子(10UI/細胞)、8μg/mLのポリブレンおよび1:100のViralPlus Transduction Enhancer(Applied Biological Materials Inc.)と混合した2.105細胞を用いるスピノキュレーションプロトコールを使用して、細胞を感染させた。混合物を、室温で20分間プレインキュベートし、次いで、32℃にて、800×gで30分間遠心分離し、12ウェルプレート中に播種した。感染の48時間後に、最終濃度0.25μg/mLでピューロマイシンを添加した。両細胞株を少なくとも5回(または細胞生存率が安定となるまで)継代した後、フローサイトメトリーによって、タンパク質レベルでCD28のノックダウンを確認した(CD28PE Clone 28.2抗体-BioLegend)。次いで、CD28陰性細胞を、Sony SH800S Cell Sorterで選別し、0.25μg/mLまたは0.5μg/mLのピューロマイシン、100ユニット/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific)を補充した培地中で培養した。次いで、限定希釈によって細胞をクローニングし、フローサイトメトリーによってならびに以下に列挙したフォワードおよびリバースプライマーを使用するPCRおよびSangerシークエンスによってCD28ノックアウトを検証した。
結果
CD28を三重特異性Ab中に組み込み、T細胞の増殖および生存を改善した;しかしながら、細胞表面のマーカーを多発性骨髄腫細胞上で評価した場合、細胞株の大多数(>95%)は、CD28糖タンパク質を発現することが判明した(表S)。
CD28を三重特異性Ab中に組み込み、T細胞の増殖および生存を改善した;しかしながら、細胞表面のマーカーを多発性骨髄腫細胞上で評価した場合、細胞株の大多数(>95%)は、CD28糖タンパク質を発現することが判明した(表S)。
CD28の発現は、正常な血漿細胞上には存在しないが(Almeida Jら British J.of Haematol. 107:121~131頁(1999))、新たに診断された患者のおよそ3分の1において、主要な骨髄腫血漿細胞上で検出される(Mateo Gら Clin.Cancer Res. 11:3661~3667頁(2005))ことが報告されている。さらに、これは、骨髄腫の進行中に頻度が増加し、予後不良と骨髄腫の悪性度の高い特徴と相関する(Robillard N、Jego Gら Clin Cancer Res. 4:1521~6頁(1998);Nair JR、Carlson LMら J Immunol. 187:1243~53頁(2011))。
標的細胞上のCD28の発現がT細胞の認識および溶解性を改善することができるかどうかを決定するために、様々な度合いのCD38およびCD28発現を有する3つの独立した骨髄腫株上の野生型対CD28ヌル三重特異性Abの活性を比較した。実施例9において上で注記し、図29A~29Cにおいて示したように、CD38三重特異性AbによるCD28の発現レベルにかかわらず、細胞溶解は3つの株すべてで観察された;しかしながら、すべての細胞株に対して、CD28ヌル三重特異性Abの細胞溶解活性は、30~100分の1まで低下し、最も低いCD38発現を示したKMS-11細胞株で実質的減少が最大であった(WT対ΔCD28、図29C対図29Aまたは図29Bを比較されたい)。
腫瘍細胞の認識および溶解に対するCD28の寄与について、骨髄腫標的細胞上のCD28のCRISPR介在性ノックアウトを使用してさらに確認した。CD28の発現は、親株と比較して、CD28KO KMS-11細胞上で検出不能であった(図38、上のパネル、右対左)。T細胞の細胞溶解に対するCD28KO KMS-11細胞の感受性は、10~100分の1倍同時に低下した(図38、下のパネル、左)。この効果と一致して、CD38 KO標的細胞上のCD28ヌル突然変異体の三重特異性と比較して、CD38三重特異性では細胞溶解における差は見られなかった(図38、下のパネル、右)。
CD38+血液がん細胞株に対するCD38三重特異性Abの細胞溶解
以前の実施例は、多発性骨髄腫細胞の細胞溶解を促進する三重特異性抗CD38/CD3/CD28抗体について実証する。他のがん細胞株の細胞溶解を促進するこれらの抗体の能力を試験した。
以前の実施例は、多発性骨髄腫細胞の細胞溶解を促進する三重特異性抗CD38/CD3/CD28抗体について実証する。他のがん細胞株の細胞溶解を促進するこれらの抗体の能力を試験した。
図39に示したように、CD38/CD28×CD3三重特異性FALA突然変異体Abは、急性骨髄性白血病(AML(KG-1))、B細胞リンパ腫(OCI-Ly19)、急性Tリンパ球性白血病(ALL(KOPN8))、および慢性リンパ球性リンパ腫(CLL(Z-138))を含むCD38+CD28-株を標的とする細胞溶解活性を有した。これは、三重特異性抗CD38/CD3/CD28抗体が、CD28-であるものを含む他のCD38+血液がん細胞株に対する活性を有することを実証する。
α-CD28スーパーアゴニストによるヒトPBMCのin vitroでの活性化には抗体の二価性が必要とされる
TGN1412(TGN)、単一結合アームTGN1412(TGNslg)および単一結合アーム抗CD28sup(CD28supslg)によるヒトPBMCのin vitroでの活性化を記載されているように実施した(Findlay L、Eastwood Dら J Immunol Methods 352:1~12頁(2010))。以前に記載されているように、表示した抗体で24時間ドライコーティングしたポリプロピレン96ウェルプレート(1ug/ウェル)上に、105個のヒトPBMCを播種した。上清中のIFN-γ、TNF-α、およびIL2のようなサイトカインを、実施例8に記載したLuminexによって測定した。
TGN1412(TGN)、単一結合アームTGN1412(TGNslg)および単一結合アーム抗CD28sup(CD28supslg)によるヒトPBMCのin vitroでの活性化を記載されているように実施した(Findlay L、Eastwood Dら J Immunol Methods 352:1~12頁(2010))。以前に記載されているように、表示した抗体で24時間ドライコーティングしたポリプロピレン96ウェルプレート(1ug/ウェル)上に、105個のヒトPBMCを播種した。上清中のIFN-γ、TNF-α、およびIL2のようなサイトカインを、実施例8に記載したLuminexによって測定した。
CD28スーパーアゴニストが単一の特異性を含むことによって、ヒトにおける天然のIgGのように、その悪影響を以前より伴う(Suntharalingam G、Perry MRら N Engl J Med 355:1018~1028頁(2006))CD28スーパーアゴニストmAb(図40)に関して見られる非特異的サイトカイン放出も低減した。代わりに、三重特異性Abによる同時刺激によって、腫瘍を溶解し、腫瘍に対して保護するT細胞の効力および生存が増加した。より興味深いことに、CD38三重特異性Abは、in vitroで、Th1およびTcm細胞集団を優先的に増幅し、Tregを伝播させ耐性を誘導するために使用されるα-CD3アゴニストまたはα-CD28スーパーアゴニストモノクローナルAbと異なる重要な構成を示す(Penaranda C1、Tang Q、Bluestone JA. J Immunol.
187:2015~22頁(2011);Tabares P、Berr sら Eur J Immunol. 44:1225~36頁(2014))。
187:2015~22頁(2011);Tabares P、Berr sら Eur J Immunol. 44:1225~36頁(2014))。
まとめると、実施例1~15において表示されるデータは、2つのT細胞シグナル伝達受容体を会合させ、標的細胞の認識を増強することによって、有効な抗腫瘍免疫を刺激する三重特異性抗CD38/CD3/CD28抗体を実証する。CD3およびCD28結合によって、Bcl-xLを上方調節し、T細胞のアポトーシスを阻害するT細胞受容体シグナル伝達が誘発され、T細胞のエフェクター機能および生存が増加した。多発性骨髄腫細胞上で高度に発現される三重特異性Abの第3のアームがCD38と相互作用した。同時に、CD28は、ほとんどの骨髄腫由来の細胞上でも発現され;したがって、三重特異性Abは、標的化を改善すると同時に、T細胞の活性化と細胞溶解も増強した。最適化された三重特異性抗体は、抗CD38 mAb治療薬であるダラツムマブより1000倍超もより有効に骨髄腫細胞を溶解し、ヒト化マウスモデルにおいて有効なin vivoでの抗腫瘍活性を示した。
本開示は、様々な実施形態を含むが、変形および修正が当業者にとって生じることが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲が、本開示の範囲内にあるこのような均等な変形をすべて網羅することが意図される。さらに、本明細書で使用される項目の見出しは、単に構成上の目的に過ぎず、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書に記載された各実施形態は、逆に明確に指示されていなければ、任意の他の実施形態(複数可)と組み合わせることができる。特に、好ましいかまたは有利であることが示されている任意の構成または実施形態を、逆に明確に指示されていなければ、好ましいかまたは有利であると示されている任意の他の構成(複数可)または実施形態(複数可)と組み合わせることができる。
この出願で引用されたすべての参照文献は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
Claims (92)
- CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、抗原結合部位は:
(a)GYTFTSFN(配列番号31)またはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)またはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに
(b)ESVDSYGNGF(配列番号34)またはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)またはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメイン
を含む前記結合タンパク質。 - 抗原結合部位は、
(a)GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに
(b)ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメイン
を含む、請求項1に記載の結合タンパク質。 - VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(配列番号86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(配列番号87)、またはQVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(配列番号88)を含み;FR2は、配列MHWVKEAPGQRLEWIGY(配列番号90)またはMHWVKEAPGQGLEWIGY(配列番号91)を含み;FR3は、配列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(配列番号93)またはNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(配列番号94)を含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)を含む、請求項1または2に記載の結合タンパク質。
- VHドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の結合タンパク質。
- 配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項4に記載の結合タンパク質。
- VHドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の結合タンパク質。
- 配列番号19のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項6に記載の結合タンパク質。
- VHドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の結合タンパク質。
- 配列番号22のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項8に記載の結合タンパク質。
- VHドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の結合タンパク質。
- 配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号20のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項10に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は:
(a)GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに
(b)QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメイン
を含む、請求項1に記載の結合タンパク質。 - VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(配列番号86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(配列番号87)、またはQVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(配列番号88)を含み;FR2は、配列MHWVKEAPGQRLEWIGY(配列番号90)またはMHWVKEAPGQGLEWIGY(配列番号91)を含み;FR3は、配列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(配列番号93)またはNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(配列番号94)含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)含む、請求項1または12に記載の結合タンパク質。
- VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項1または12に記載の結合タンパク質。
- 配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項14に記載の結合タンパク質。
- CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、抗原結合部位が:
(a)GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに
(b)QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメイン
を含む前記結合タンパク質。 - VHドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の結合タンパク質。
- 配列番号11のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号12のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項16または17に記載の結合タンパク質。
- 抗体結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する、請求項1~18のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドに結合する、請求項19に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、2.1nMまたはそれ以下の平衡解離定数(KD)で、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドに結合する、請求項20に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、配列番号105のアミノ酸配列を含むヒトアイソフォームE CD38ポリペプチドに結合する、請求項19に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する、請求項19~22のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、1.3nMまたはそれ以下の平衡解離定数(KD)で、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する、請求項23に記載の結合タンパク質。
- キメラまたはヒト化抗体である、請求項1~24のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- ヒト抗体である、請求項16~24のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- モノクローナル抗体である、請求項1~24のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- Fc領域を含む1つまたはそれ以上の全長抗体重鎖を含む、請求項1~24のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- Fc領域は、Fc受容体結合および/またはFc領域のエフェクター機能を低減または排除する1つまたはそれ以上の変異を含むヒトFc領域である、請求項28に記載の結合タンパク質。
- Fc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である、請求項28に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG1 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである、請求項30に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG1 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299
、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである、請求項30に記載の結合タンパク質。 - Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である、請求項28に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである、請求項33に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである、請求項33または34に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である、請求項33または34に記載の結合タンパク質。
- 抗体F(ab)、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、またはscFv断片を含む、請求項1~24のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 細胞毒性剤または標識にコンジュゲートされる、請求項1~37のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- CD38ポリペプチドに結合する第1の抗原結合部位および第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である、請求項1~37のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- CD38ポリペプチドに結合する第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である、請求項1~37のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 第1の抗原結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、第2および第3の抗原結合部位はそれぞれ、T細胞表面タンパク質に結合する、請求項40に記載の結合タンパク質。
- 第1の抗原結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、(a)第2の抗原結合部位は、ヒトCD28ポリペプチドに結合し、第3の抗原結合部位は、ヒトCD3ポリペプチドに結合するか、または(b)第2の抗原結合部位は、ヒトCD3ポリペプチドに結合し、第3の抗原結合部位は、ヒトCD28ポリペプチドに結合する、請求項41に記載の結合タンパク質。
- それぞれ、1つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、3つの抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する前記結合タンパク質。
- 配列番号1または配列番号105のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドと交差反応する、請求項43に記載の結合タンパク質。
- 配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドと交差反応する、請求項43または44に記載の結合タンパク質。
- ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する抗原結合部位ならびにそれぞれT細胞表面タンパク質に結合する2つの抗原結合部位を含む、請求項43~45のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する抗原結合部位、ヒトCD28ポリペプチドに結合する抗原結合部位、ならびにヒトCD3ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む、請求項46に記載の結合タンパク質。
- 3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む、請求項43~47のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - (a)VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む;
(b)VH1ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む;
(c)VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む;
(d)VH2ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む;
(e)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR
-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む;または
(h)VH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む、請求項48に記載の結合タンパク質。 - (a)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む;または
(b)VH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む、請求項49に記載の結合タンパク質。 - (a)VH3ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む;
(b)VH3ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;
(c)VH3ドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;
(d)VH3ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;または
(e)VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項50に記載の結合タンパク質。 - 3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む、請求項43~47のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む、請求項52に記載の結合タンパク質。
- VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項53に記載の結合タンパク質。
- (a)VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含
み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;
(b)VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;
(c)VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;
(d)VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む
(e)VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;
(f)VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;
(g)VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;または
(h)VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む、請求項48~54のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - (a)VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む;または
(b)VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項55に記載の結合タンパク質。 - L1、L2、L3またはL4のうちの少なくとも1つは、独立して、0アミノ酸長である、請求項48~56のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- L1、L2、L3またはL4は、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である、請求項48~56のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- (a)L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、0アミノ酸長であるかもしくはGGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含み;または(b)L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、GGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む、請求項48~56のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- (a)L1は、配列GQPKAAP(配列番号58)を含み、L2は、配列TKGPS(配列番号57)を含み、L3は、配列Sを含み、L4は、配列RTを含む;
(b)L1は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である;
(c)L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である;または
(d)L1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である、請求項48~56のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである、請求項48~60のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である、請求項48~60のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである、請求項48~62のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである、請求項48~60のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである、請求項48~60のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 第2のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wである、請求項
48~65のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 第2のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vである、請求項48~65のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号62のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む、請求項48または52に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号65のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む、請求項48または52に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号67のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む、請求項48または52に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号68のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む、請求項48または52に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号70のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む、請求項48または52に記載の結合タンパク質。
- 第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む、請求項48または52に記載の結合タンパク質。
- それぞれ、1つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し;
(a)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである;または
(b)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のCH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である前記結合タンパク質。 - VH1およびVL1、VH2およびVL2、ならびにVH3およびVL3のうちの少なくとも1対は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成する、請求項74に記載の結合タンパク質。
- VH1およびVL1、VH2およびVL2、ならびにVH3およびVL3のうちの1、2、または3対は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、I
L5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1からなる群から選択される抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項74に記載の結合タンパク質。 - VH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第1の対は、ヒトCD3ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、VH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第2の対は、ヒトCD28ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、ならびにVH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第3の対は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1からなる群から選択されるヒト抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する、請求項74に記載の結合タンパク質。
- ポリヌクレオチドのキットであって:
(a)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号74の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;
(b)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号77の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配
列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;
(c)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号79の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;
(d)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号80の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチド;
(e)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号82の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチド;または
(f)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号83の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号81の配列を含む第4のポリヌクレオチド
を含む前記キット。 - 請求項1~77のいずれか1項に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項79に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 宿主細胞であって、請求項78に記載のポリヌクレオチドのキット、請求項79に記載のポリヌクレオチド、または請求項80に記載のベクターを含む前記宿主細胞。
- 結合タンパク質を産生する方法であって、結合タンパク質が産生されるように、請求項81に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
- 宿主細胞から結合タンパク質を回収することをさらに含む、請求項82に記載の方法。
- 請求項1~77のいずれか1項に記載の結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 患者のがんを防止および/または処置する方法であって、請求項1~73のいずれか1項に記載の少なくとも1つの結合タンパク質または請求項84に記載の医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む前記方法。
- 結合タンパク質は、T細胞表面タンパク質に結合する1つの抗原結合部位とヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する別の抗原結合部位を含む、請求項85に記載の方法。
- 結合タンパク質は、CD3に結合する第1の抗原結合部位、CD28に結合する第2の抗原結合部位、およびヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である、請求項86に記載の方法。
- 少なくとも1つ結合タンパク質は、化学療法剤とともに同時投与される、請求項85~87のいずれか1項に記載の方法。
- がんは、多発性骨髄腫である、請求項85~88のいずれか1項に記載の方法。
- がんは、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、またはB細胞リンパ腫である、請求項85~88のいずれか1
項に記載の方法。 - 患者は、ヒトである、請求項85~90のいずれか1項に記載の方法。
- がん細胞がそれらの細胞表面にヒトCD38アイソフォームEポリペプチドを発現するため、患者は、処置のために選択される、請求項85~91のいずれか1項に記載の方法。
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