CN116940386A - 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及抗CD45‑吡咯并苯并二氮杂

Description

吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物以及其用途
较早的申请
本申请要求2020年9月25日提交的英国申请号GB2015226.0的优先权权益。所述优先申请以全文引用的方式并且出于任何和全部目的并入本文中，如同在本文中被完整阐述一般。
技术领域
本公开涉及新颖吡咯并苯并二氮杂䓬抗体-药物缀合物(PBD-ADC)以及其治疗用途。
背景技术
造血干细胞移植(HSCT)为一种能够用来自健康供给者的HSC或来自患者的基因改善/校正的HSC置换宿主造血干细胞(HSC)的强大治疗模式。此程序常常产生终身益处并且可有疗效地治疗许多恶性和非恶性血液和免疫疾病。在过去的60多年内，已有超过1,000,000个患者因广泛范围的血液和免疫疾病而进行移植，所述疾病包括白血病、血红蛋白病变、代谢疾病以及免疫缺陷。
然而，尽管HSCT有着广泛的治疗潜能，但它当前主要限于以其他方式不可医治的恶性疾病，并且据估计可受益于HSCT的患者中不到25％经历移植。这主要是归因于由当前实现成功的供给者HSC植入所必需的细胞毒性化学疗法和基于照射的调理产生的不希望的发病率/死亡率以及与移植物抗宿主疾病(GVHD)相关的风险。传统上，调理涉及在HSCT之前进行全身照射(TBI)和/或各种化学疗法。这些剂已被认为对在宿主骨髓(BM)中形成用于供给者HSC植入的“空间”来说是必需的，但它们为非特异性的并且诱导显著的附带损害。归因于经典调理方案的非特异性，它们导致有害的短期与长期并发症，包括多器官损害、粘膜炎、需要频繁红血细胞和血小板输注、不孕以及继发性恶性肿瘤。另外，这些剂引起严重并且延长的免疫消融，这使患者易患严重的并且有时为致命的机会性感染，从而需要长期住院治疗并且暴露于抗感染剂的毒性副作用。虽然许多工作已使得强度降低的调理(RIC)方法得到发展，但所述方法使用具有或不具有低剂量照射的较低剂量组合化学疗法，患者仍经历这些衰弱性副作用中的许多副作用。消除此类苛刻调理方案将显著改善HSCT并且扩展其用途。
另一种当前方法为使用靶向HSC的抗体。文献中论述了许多候选靶分子，包括CD13、CD33、CD34、CD44、CD45、CD49d:VLA-4、CD49f:VLA-6、CD59、CD84:CD150家族、CD90:Thyl、CD93、CD105:内皮素、CD117:cKit/SCF受体、CD123:IL-3R、CD126:IL-6R、CD133、CD135:Flt3受体、CD166:ALCAM、CD184:CXCR4、Prominin 2、红细胞生成素R、内皮细胞选择性粘附分子、CD244、Tiel、Tie2、MPL、G-CSFR或CSF3R、IL-1R、gp130、白血病抑制因子受体、制瘤素M受体、Embigin以及IL-18R。
发明内容
本公开至少部分基于以下发现：呈抗体药物缀合物(ADC)形式的抗CD45抗体与吡咯并苯并二氮杂细胞毒素的组合有效并且特异性地靶向并且消耗HSC。设计并且测试了一系列抗CD45 PBD ADC，并且确定当用于HSCT预调理时具有PBD弹头的ADC的子集令人意外地具有高功效。
如本文所用，术语“抗CD45 PBD ADC”是指其中抗体组分为抗CD45抗体并且药物组分包含吡咯并苯并二氮杂(PBD)(诸如PBD二聚体)的ADC。已显示PBD二聚体在DNA的小沟中形成序列选择性非扭曲并且有效的细胞毒性DNA链间交联。因此，典型地PBD能够结合至靶细胞DNA并且在靶细胞DNA的小沟中形成链间交联。
因此，本发明的第一方面提供了一种式(I)缀合物：
Ab-(DL)p(I)
其中：
Ab为结合至CD45的抗体；
L为使Ab连接至D的接头；
D为吡咯并苯并二氮杂䓬(PBD)，诸如PBD二聚体；
并且p优选为1至8。
在一些实施方案中，L可不存在，或简单地为抗体与PBD之间的共价键。
在一些实施方案中，接头为非可裂解接头。如本文所用，“非可裂解接头”用于指不容易因酶活性(诸如蛋白酶活性)而裂解的接头。非可裂解药物-接头的实例为本文所描述的药物-接头B4。本文呈现的数据表明，使用非可裂解接头可降低旁观者效应。在一些实施方案中，降低的旁观者效应为所需的。
非可裂解接头与其中接头合并有容易通过酶作用裂解的序列的可裂解药物-接头形成对比。举例来说，已知类别的可裂解接头合并有可容易通过蛋白酶(诸如组织蛋白酶)裂解的肽序列。可裂解药物-接头的实例为本文所描述的药物-接头B1。
在第一方面的优选实施方案中，本发明提供了一种式(I)缀合物：
Ab-(DL)p(I)
其中：
Ab为结合至CD45的抗体；
DL为：
(a)DLa：
其中：
RLL为用于连接至Ab的接头，所述接头为
其中
Q为：
其中QX使得Q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基；
X为：
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0(即b1和b2中仅一者可不为0)并且至少c1或c2＝0(即c1和c2中仅一者可不为0)；
GLL为连接至Ab的接头基团；
其中：
a)R11a与RC一起形成与其连接的C与N原子之间的双键；或
b)R11a为OH并且RC为：
其中方括号指示NO2基团为任选的；
m为0或1；
当C2与C3之间存在双键时，R2为甲基；
当C2与C3之间存在单键时，R2为H或
当C2’与C3’之间存在双键时，R12为甲基；
当C2’与C3’之间存在单键时，R12为H或或
(b)DLb：
其中X和GLL如上文所定义；
当C2与C3之间存在双键时，R22为甲基；
当C2与C3之间存在单键时，R22为H或
当C2’与C3’之间存在双键时，R32为甲基；
当C2’与C3’之间存在单键时，R32为H或并且
p为1至8。
本文所公开的抗CD45 PBD ADC有利地将允许在供给者细胞植入或移植之前改善预调理疗法的若干特征加以组合。
首先，并且如本文中别处所描述，在向受试者施用本文所公开的抗CD45 PBD ADC之后，优选使ADC快速地从受试者的系统清除，以使得对随后向受试者施用的任何CD45+ve供给者细胞的残留毒性降至最低。此ADC的快速清除可通过许多不同的机制来实现；举例来说，可对ADC的抗体部分进行选择、修饰或工程化，使得它在所关注的受试者体内具有短半衰期。在人受试者中，此类效应可通过对非人抗体(例如啮齿动物抗体，诸如大鼠抗体)进行选择来实现。
尽管有利地在受试者的系统中停留时间较短，但本文所公开的抗CD45 PBD ADC的高度特异性和有效的PBD弹头允许受试者的HSC(包括(至关重要地)‘真实’HSC)发生非常高水平的溶解。此细胞群体被认为是CD45+CD34+CD38-Lin-CD45RA-CD90+，但与更定向的祖细胞相比CD45的表达水平较低；由现有靶向疗法引起的不适当的溶解水平据信为次最佳移植结果的原因。
药物载量由每个抗体的药物单元数目p表示。药物载量可在每个抗体1至8个药物单元(D)范围内。对于组合物来说，p表示组合物中缀合物的平均药物载量，并且p在1至8范围内。
本公开还提供了包含本文所公开的抗CD45 PBD ADC的药物组合物。还提供了治疗血液学癌症的方法、使受试者准备进行造血干细胞移植的方法以及在受试者中植入干细胞的方法，所述方法使用本文所公开的抗CD45 PBD ADC。
附图说明
图1.
CD45在人细胞系和主要细胞上的表达水平。(A)人CD45在纯化的CD34+外周血干细胞(PBSC)和从普通供给者的脐带血(UCB)纯化的CD34+细胞上的表达水平。(B)各种人组织中的CD45 RNA表达的北方墨点分析(Northern blot analysis)。PBMN，外周血单核细胞。
图2.
在补体依赖性细胞毒性分析中抗人CD45 MAb、YTH24.5以及YTH54.12针对CD45+细胞显示协同溶解活性。将人CD45+OCIM1细胞用51Cr放射性标记并且在存在血清的情况下与单独YTH24.5、单独YTH54.12或与两种抗体一起孵育两小时。数据为三个重复孔的平均最大溶解百分比±标准偏差。
图3.
抗人CD45抗体在存在血清的情况下溶解并且在克隆源性分析中阻止集落形成。使用来自普通供给者的人CD34+细胞进行克隆源性分析，所述细胞在(A)不存在或(B)存在10％幼兔血清的情况下用10ug/mL大鼠IgG2b同型对照或10ug/mL的每种抗人CD45MAb(YTH24.5+YTH54.12)的混合物处理2小时，然后涂铺至补充细胞因子的半固体培养基中。示出了代表性数据。数据为三个重复孔的平均集落数目±标准偏差。下部图中示出了用对碘硝基四唑紫(INT)染色以使集落可视化的集落的代表图。
图4.
在存在血清的情况下用抗人CD45 MAb对人CD34+细胞进行离体处理阻止免疫缺陷NSG小鼠中人CD34+细胞的植入。(A)实验方案的示意图概述。在存在10％兔血清的情况下，将CD34+细胞与10ug/mL大鼠IgG2b同型抗体或10ug/mL的每种抗人CD45MAb(YTH24.5和YTH54.12)的混合物一起培养两小时，然后移植至亚致死量照射的NSG小鼠中。在移植后15至16周对小鼠进行淘汰并且使用流式细胞术针对人细胞系植入对造血组织进行分析。(B)在移植后15和16周从两个独立实验概括的数据，所述数据显示NSG小鼠的骨髓(BM)中人细胞系(hCD45+)的植入水平。通过曼-惠特尼检验(Mann-Witney test)对数据进行分析。
图5.
抗人CD45介导的肥皂草素内化对人CD45+细胞的特异性杀伤作用。将大鼠IgG2b同型对照、单独或与抗大鼠IgG-肥皂草素复合的YTH24.5和YTH54.12 MAb与CD45+Jurkat细胞一起培养72h。数据点为平均值±标准偏差。
图6.
抗人CD45-PBD特异性地杀死人CD45+细胞系(大鼠IgG2b单克隆抗体模式；rIgG2b)。在三个重复孔中在存在Mab或ADC的情况下，将人CD45+OCIM1和Jurkat细胞系以及人CD45-293T细胞培养72h。使用PrestoBlue细胞活力试剂测定细胞活力。数据点为平均值±标准偏差。示出了来自至少三个实验的代表性数据。
图7.
抗人CD45-PBD特异性地杀死人CD45+细胞系(人IgG1-AAA单克隆抗体模式；hIgG1-AAA)。在三个重复孔中在存在Mab或ADC的情况下，将人CD45+OCIM1和Jurkat细胞系以及人CD45-293T细胞培养72h。使用PrestoBlue细胞活力试剂测定细胞活力。数据点为平均值±标准偏差。呈现来自至少三个实验的代表性数据。
图8.
在克隆源性分析中，抗CD45-PBD杀死人CD34+克隆源性祖细胞。使用来自普通供给者的人CD34+细胞进行克隆源性分析，所述细胞用MAb或ADC处理2小时然后在三个重复孔中涂铺至补充细胞因子的半固体培养基中。在10-14天之后对集落进行评分并且相对于未处理的孔对表达进行分析。数据为三个不同供给者的平均值±标准偏差。
图9.
用非缀合抗CD45 MAb和CD45 PBD对人CD34+细胞进行离体处理阻止NSG小鼠中的植入。在存在单独Mab或ADC的情况下在消除克隆源性分析中的集落形成的剂量下，将普通人CD34+细胞培养4小时，然后移植至亚致死量照射的NSG小鼠中。在移植后第8周时通过流式细胞术对骨髓中的人的CD45+细胞进行分析。对中值进行绘图。
图10.
单剂量的3mg/kg抗人CD45-PBD非特异性地使人源化NSG小鼠中的骨髓细胞数目减少，并且人细胞系植入水平较低。为亚致死量照射的NSG小鼠移植普通人CD34+细胞，并且在移植后12周时在血液中检测到低水平的人植入。用Mab或ADC以3mg/kg或0.3mg/kg对小鼠进行处理，并且在Mab/ADC注射后2周时确定骨髓中的细胞含量。数据为每个处理队列的平均值±SEM。
图11.
PK研究。为非人源化NSG小鼠注射1mg/kg的抗人CD45 ADC并且进行连续血液采样。使用ELISA来确定血清中的抗体水平。(A)YTH24.5-rIgG2b-PBD，1mg/kg，[T1/2＝1.49天]；(B)YTH54.12-rIgG2b-PBD，1mg/kg，[T1/2＝1.53天]。
图12.
抗人CD45-PBD消耗人源化NSG小鼠的血液中的人CD45+细胞。为亚致死量照射的NSG小鼠移植普通人CD34+PBSC。在移植后8周时，将小鼠用0.3mg/kg或1mg/kg Mab或ADC处理。使用流式细胞术历时两周时间确定血液中的人CD45+水平的水平。(A)用PBS或0.3mg/kg和1mg/kg的单独Mab处理的人源化中的人CD45+水平。(B)用0.3mg/kg和1mg/kg的抗人CD45ADC处理的人源化中的人CD45+水平。
图13.
抗CD45-PBD消耗人源化NSG小鼠的血液、BM以及脾脏中的人CD45+细胞。在移植后8周时用0.3mg/kg或1mg/kg Mab或ADC对人源化NSG小鼠进行处理。在两周之后通过流式细胞术确定血液、骨髓、脾脏中的人CD45+水平。数据为平均值±SEM。
图14.
抗CD45 PBD消耗人源化NSG小鼠的骨髓中的人造血祖细胞。在移植后8周时用0.3mg/kg或1mg/kg Mab或ADC对人源化NSG小鼠进行处理。在处理后2周时对骨髓进行流式细胞术分析并且确定人CD45+、人CD34+以及人CD34+/CD38-细胞的数目。数据为平均值±SEM。
图15.
抗CD45-PBD完全耗尽人源化NSG小鼠的骨髓中的人HSC和MPP。在对人源化NSG小鼠处理后2周时对骨髓进行流式细胞术分析。确定免疫表型HSC、MPP以及ML的数目。数据为平均值±SEM。
图16.
抗CD45-PBD增强人源化NSG小鼠的骨髓中GFP+自体CD34+细胞的植入。近似方案时间线。
图17.
抗CD45-PBD增强人源化NSG小鼠的骨髓中GFP+自体CD34+细胞的植入。为亚致死量照射的NSG小鼠移植普通人CD34+PBSC。在移植后8周时，将小鼠用1mg/kg抗人CD45 Mab或ADC处理。在调理后两周时，小鼠从与第一次移植相同的人供给者接受GFP+人PBSC移植。在9周之后对骨髓进行流式细胞术。(A)骨髓中GFP+人CD45+细胞占总人CD45+细胞的百分比。(B)骨髓中GFP+人CD34+细胞占总人CD34+细胞的百分比。(C)骨髓中GFP+人HSC占总人HSC的百分比。HSC定义为CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+。(D)骨髓中GFP+人MLP占总人MLP的百分比。MLP定义为CD34+/CD38-/CD45RA+/CD90-。(E)骨髓中GFP+人MPP占总人MPP细胞的百分比。MPP定义为CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90-。使用普通单因素ANOVA将不同处理组与同型ADC组进行比较。处理组之间的统计显著性差异由星号指示。包括照射对照组仅供参考。
图18.
在NSG小鼠中抗CD45-PBD延迟白血病发作并且延长存活。将表达萤火虫荧光素酶的人CD45+Jurkat细胞移植至亚致死量照射的NSG小鼠中并且历经70天的时间通过生物发光成像并且针对发病迹象进行监测。(A)到第16天每个处理组的平均生物发光信号。(B)第70天时的存活曲线。
图19.
与c-Kit相比CD45在人CD34+细胞上的表达水平更高。CD34为造血谱系细胞的更广泛标记物。每个细胞的抗原密度由使用QuantiBRITE PE珠确定的每个抗原的平均分子数目表示。针对人AML细胞系、OCIM1、CD34+细胞团以及外周血干细胞的来自普通供给者的免疫表型确定的HSC、多能祖细胞(MPP)以及多淋巴样祖细胞(MLP)显示c-Kit(左)的水平。外周血单核细胞(PBMC)、T细胞、CD34+细胞团、HSC、MPP以及MLP上的CD45(右)的水平。
图20.
缀合至B1、B4、B2以及B7的抗人CD45抗体特异性地杀死人CD45+细胞系。在存在Mab、ADC或单独培养基的情况下5天之后，人CD45+OCIM1和Jurkat细胞系以及人CD45-Nalm6和293T细胞的细胞活力。A)OCIM1细胞、B)Jurkat、C)Nalm6以及D)HEK293T上的缀合至B1或B4的YTH24.5、YTH54.12以及同型的比较。E)OCIM1、F)Jurkat、G)Nalm6以及H)HEK293T上的缀合至B2和B7的YTH24.5、YTH54.12以及同型大鼠IgG2b抗体以及非缀合抗体的比较。数据点为平均值±标准偏差。示出了代表性数据。
图21.
在克隆源性分析中，缀合至B1、B4、B2以及B7的抗人CD45抗体YTH24.5和YTH54.12特异性地抑制集落形成。使用A)B1缀合或非缀合抗体、B)B4缀合或非缀合抗体、C)B2缀合或非缀合抗体以及D)B7缀合或非缀合抗体进行克隆源性分析。示出了三个供给者的汇集数据点(平均值±标准偏差)。
图22.
在AML的NSG模型中，缀合至B1、B4、B2以及B7的抗人CD45抗体延迟白血病发展并且延长存活。用以下各项处理的每个队列5个小鼠的各个队列的平均生物发光信号±标准偏差：A)B1缀合的YTH24.5、YTH54.12以及同型或非缀合抗体，B)B4缀合的YTH24.5和同型或非缀合抗体，C)B2缀合的YTH24.5和同型或非缀合抗体以及D)B7缀合的YTH24.5和同型或非缀合抗体。E)用不同ADC处理的所有队列的存活曲线。
图23.
在具有确定的AML的NSG小鼠中，缀合至B1、B4以及B2的抗人CD45抗体诱导肿瘤消退，延迟白血病发展并且延长存活。A)用非缀合或缀合抗体处理的每个队列5小鼠的各个队列的平均生物发光信号±标准偏差。B)用不同ADC处理的所有队列的存活曲线。
图24.
图5.用YTH24.5-B1对人源化小鼠进行调理增强同种异体人GFP+CD34+细胞的植入。将用来自一个人供给者的CD34+细胞人源化的小鼠用PBS或YTH24.5-B1处理，然后从另一人供给者移植GFP+CD34+细胞。在移植GFP+细胞之后8周时，对小鼠进行淘汰，通过流式细胞术针对以下各项对骨髓进行分析：A)总人CD45+细胞植入，B)GFP+人Cd45+细胞占所有人Cd45+细胞的百分比以及C)GFP+人CD34+占所有人CD34+细胞的百分比。数据点为平均值±标准偏差。进行非配对t检验分析。统计分析中不包括照射对照。
图25.
图6.在NSG小鼠中在同种异体干细胞移植模型中缀合至不同PBD有效负荷的抗CD45抗体的比较。将用来自一个人供给者的CD34+细胞人源化的小鼠用PBS或缀合至三种不同PBD有效负荷的同型YTH24.5(或YTH54.12)处理，然后从另一人供给者移植GFP+CD34+细胞。在移植GFP+细胞之后8周时，对小鼠进行淘汰，通过流式细胞术针对以下各项对骨髓进行分析：A)总人CD45+细胞植入，B)GFP+人CD45+细胞占所有人CD45+细胞的百分比以及C)GFP+人CD34+占所有人CD34+细胞的百分比。数据点为平均值±标准偏差。在同型ADC与抗CD45 ADC之间进行非配对t检验分析。统计分析中不包括照射对照。
具体实施方式
背景技术和临床需要
造血干细胞移植(HSCT)对于具有广泛范围恶性(包括急性骨髓性和急性成淋巴细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma)、骨髓瘤)和非恶性(例如血红蛋白病和骨髓衰竭)血液学病症以及遗传性疾病(例如原发性免疫缺陷[PID]和代谢疾病)的受试者来说为有疗效的。对于没有HLA匹配的供给者可用的具有造血系统遗传性病症的受试者来说，越来越多地使用基因疗法，所述基因疗法使用用校正的转基因病毒转导的自体造血干细胞(HSC)。
然而，对于HSCT与基因疗法两者，充分预调理为实现根除受试者自己的HSC并且为进来的移植物的形成壁龛所需的清髓所必需的。此外，在HSCT中，还使用免疫抑制来防止排斥并且实现供给者HSC的植入。
最常用的调理方法不靶向受试者自己的HSC。举例来说，照射(诸如全身照射)和DNA烷基化/修饰剂对多个器官系统、造血和非造血细胞以及造血微环境来说为高毒性的。这些苛刻调理方案有效杀死宿主受试者的免疫和壁龛细胞并且不利地影响多个器官系统，经常导致危及生命的并发症，诸如肝脏静脉阻塞性疾病、肠道粘膜炎以及肺炎。同样地，可归因于化学/放射疗法的晚期有害效应为普遍的。这些不希望的效应包括生长停滞、不孕、心脏毒性以及继发性恶性肿瘤。
这些毒性因为常规化学/放射疗法靶向任何分裂的细胞，不仅仅是受试者自己的HSC而产生。为完全实现HSCT的治病潜能，开发避免不希望的毒性的温和调理方案为必需的。需要可用于对受试者的组织(例如骨髓组织)进行调理同时减轻不希望的毒性并且使严重有害反应的发生率降至最低的新颖的优选非清髓性组合物和方法。还需要可选择性地消融靶组织中的内源性造血干细胞群体同时使此类疗法对非靶细胞和组织(诸如血小板、白血细胞以及红血细胞)的效应最小化或将所述效应消除的新颖疗法。
细胞溶解性单克隆抗体(MAb)提供在没有化学疗法的非血液学毒性的情况下实现骨髓抑制/免疫抑制的替代手段，因为抗体结合的特异性提供排除‘脱靶’毒性的所有的可能性。此方法的成功开发允许极大地改善受试者的结果并且极大地拓宽SCT和基因疗法的适用性。
基于抗体的调理的靶标
文献中论述了许多候选靶分子，包括CD13、CD33、CD34、CD44、CD45、CD49d:VLA-4、CD49f:VLA-6、CD59、CD84:CD150家族、CD90:Thyl、CD93、CD105:内皮素、CD117:cKit/SCF受体、CD123:IL-3R、CD126:IL-6R、CD133、CD135:Flt3受体、CD166:ALCAM、CD184:CXCR4、Prominin 2、红细胞生成素R、内皮细胞选择性粘附分子、CD244、Tiel、Tie2、MPL、G-CSFR或CSF3R、IL-1R、gp130、白血病抑制因子受体、制瘤素M受体、Embigin以及IL-18R[参见例如WO/2016/164502//Abadir等2019,Bone Marrow Transplantation；https://doi.org/ 10.1038/s41409-019-0445-0//Czechowicz等2019,Nature Communications；https:// doi.org/10.1038/s41467-018-08201-x//WO1995/013093]。
作为本文中部分描述的他们的研究的结果，本发明作者选择CD45作为其先导候选物。
先前，c-kit被认为是造血干细胞(HSC)上靶向调节剂的潜在靶标。然而，本发明人进行了在此描述的许多主要实验，这些主要实验表明与c-Kit相比，CD45作为HSC特异性靶标为优良的。
与c-Kit表达相比，在主要细胞类型上观察到基本上更大程度的CD45表达。c-Kit先前因其对HSC的巨大特异性而为无毒调理产品的候选靶标。然而，CD45的HSC表面表达水平显示基本上高于c-Kit(参见图19)。在一系列的外周和脐带干细胞类型中观察到与c-Kit受体相比CD45蛋白的水平高得多，这可解释抗CD45组合相对于靶向c-Kit的方法的优越性。
CD45在CD34+造血祖细胞上以高密度表达(图1A)，但在非造血组织上不存在(图1B)。在啮齿动物模型中，溶解性抗CD45 MAb可诱导发育不全[Dahlke,M.H.等(2002)；Blood99(10):3566-3572]，并且虽然不足以允许在免疫活性小鼠中植入，但能够有助于在非清髓性调理之后植入同种异体干细胞[Wulf,G.G.等(2003)；Blood 101(6):2434-2439]。本文中的图2中显示，大鼠IgG2b抗人CD45 MAb、YTH 24.5以及YTH54.12通过CD45+细胞系中的补体显示协同溶解活性。
这些MAb的组合完全消除了人CD34+选择的祖细胞在存在补体的情况下在甲基纤维素分析中产生髓系和红系集落的能力，证实这些抗体有效地杀死造血祖细胞(图3)。此外，在存在补体的情况下用YTH 24.5与YTH54.12的组合对人CD34+外周血干细胞进行离体处理在NSG小鼠中的所有谱系中完全阻止人造血作用的植入，证实这些抗体能够靶向人HSC(图4)。
临床中的YTH24.5和YTH54.12抗CD45 MAb
MAb YTH24.5和YTH54.12借助于其大鼠IgG2b Fc快速地从循环清除，产生小于12小时的半衰期，从而允许在最终抗体处理之后2天安全移植供给者HSC/基因校正的HSC[Krance,R.A.等(2003),Biol Blood Marrow Transplant 9(4):273-281.3]。
在一项临床研究中，在最小强度调理方案中，快速清除的溶解性抗CD45 MAbYTH24.5和YTH54.12与用于免疫抑制的阿仑单抗(Alemtuzumab)(抗CD52 MAb)一起用于骨髓抑制。据证实，这足以在13/16的PID儿科受试者中实现有疗效的植入[Straathof,K.C.等(2009),Lancet 374(9693):912-920.4]。重要的是，除可管理的过敏反应外，未观察到对非造血组织的显著毒性并且这些受试者没有与调理有关的后期效应。
然而，Staathof临床研究(同上)表明骨髓植入在一些受试者中为次最佳的，并且这可能阻碍现有的基于抗CD45的方法扩展至成人以及没有类似于在啮齿动物研究中观测到的基础免疫缺陷的受试者。不受任何特定理论限制，次最佳植入可能由真实HSC的不充分溶解引起(真实HSC被认为是CD45+CD34+CD38-Lin-CD45RA-CD90+，但可能与更定向的祖细胞相比具有更低的CD45表达水平)，使得形成的用于供给者HSC植入的壁龛不充足。因此，本发明作者通过增加针对人HSC的靶向处理的效能来寻求此方面的解决方案。
使用抗CD45 ADC作为调理剂的基本原理
本发明作者推断可通过开发进入抗体-药物缀合物的裸抗CD45抗体调理剂来增加调理剂的效能。
文献中已报道若干其他ADC方法。Czechowicz等2019(同上)报道了使用抗CD177肥皂草素ADC对宿主HSC的选择性和有效(报道为>99％)消耗。Palchaudhuri等已开发一种靶向鼠CD45的基于肥皂草素的免疫毒素，所述靶向鼠CD45的基于肥皂草素免疫毒素消耗鼠HSC，使同类系HSC能够在免疫活性小鼠中持久多谱系植入，并且在对非造血组织具有最小毒性的情况下使基因校正的鼠HSC能够在具有镰状细胞病的小鼠中植入[Palchaudhuri,R.等(2016),Nat Biotechnol 34(7):738-745//US10280225B2]。然而，Palchaudhuri使用不靶向人HSC的抗鼠CD45 MAb。WO2020/146432例示了具有鹅膏蕈碱(amanatin)弹头的抗CD45ADC用于促进接受CAR-T细胞疗法的用途。
此外，已使用活体成像显微术证实，大鼠IgG2b YTH24.5和YTH54.12基本上经由溶酶体路径内化(数据未显示)。抗体容易由靶细胞内化的事实支持这些抗体适合于基于ADC的方法的假设。具体地说，溶酶体路径在提供用于裂解抗体-药物接头的环境，由此在靶细胞中释放药物以便高特异性地杀死细胞中可为重要的。
为了证实这一原理，本发明作者已证实，与抗大鼠IgG肥皂草素复合的MAbYTH24.5和YTH54.12能够介导次纳摩尔水平的对人CD45+细胞系的杀伤作用，从而证实抗CD45ADC可由人细胞系内化(图5)。
在接下来的研究阶段中，本发明作者设法通过将肥皂草素有效负荷换成其他细胞毒性分子(诸如肥皂草素、单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E，MMAE)、蒽环类、鹅膏蕈碱、多卡霉素(duocarmycin)、加利车霉素(calicheamycin)、假单胞菌属外毒素A、α八叠球菌素以及喜树碱)实现进一步改善。通过此工作，令人意外地发现PBD有效负荷的子集当用于HSCT预调理时具有意外高的功效。
抗CD45 PBD ADC
如本文所用，术语“抗CD45 PBD ADC”是指其中抗体组分为抗CD45抗体并且药物组分包含吡咯并苯并二氮杂(PBD)(诸如PBD二聚体)的抗体药物缀合物(ADC)。已显示PBD二聚体在DNA的小沟中形成序列选择性非扭曲并且有效的细胞毒性DNA链间交联。因此，典型地PBD能够结合至靶细胞DNA并且在靶细胞DNA的小沟中形成链间交联。
因此，本公开提供了包含缀合至PBD有效负荷的抗CD45抗体的ADC。
在一些实施方案(其中DL＝DLa)中，本公开提供了一种具有通过缀合至如下文所定义的抗体的PBD部分中的一者上的N10位置连接的接头并且任选在非连接N10位置上加帽的PBD二聚体。
这些实施方案适合用于向受试者中的优选位点提供PBD化合物。缀合物允许释放不保留接头的任何部分的活性PBD化合物。不存在可能影响PBD化合物的反应性的残留(stub)。因此，式(I)缀合物可释放化合物RelA：
在本公开中，PBD二聚体与抗体之间的指定连接优选在细胞外为稳定的。在运输或递送至细胞中之前，抗体-药物缀合物(ADC)优选为稳定的并且保持完整，即抗体保持连接至药物部分。接头在靶细胞外为稳定的，并且可在细胞内部以某种有效速率裂解。有效接头将：(i)维持抗体的特异性结合特性；(ii)允许缀合物或药物部分的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，即未裂解，直到缀合物已递送或运输至其靶位点；并且(iv)维持PBD药物部分的细胞毒性、细胞杀伤作用或细胞生长抑制作用。可通过诸如质谱法、HPLC以及分离/分析技术LC/MS等标准分析技术来测量ADC的稳定性。
在式(I)缀合物的所需活化位点通过酶(诸如组织蛋白酶)对连接基团并且特别是对肽部分的作用来实现例如式RelA的化合物的递送。
在一些实施方案(其中DL＝DLb)中，通过抗体降解释放药物-接头。与上文关于接头稳定性所论述类似的考虑因素适用于这些实施方案，不过接头部分中不存在易裂解的特定基团。
抗体
在一个方面中，抗体为结合至CD45的抗体。
CD45也称为蛋白质酪氨酸磷酸酶受体C型(PTPRC)。蛋白质为具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性并且在造血来源的所有有核细胞中常常以高水平(5-10％的膜蛋白)表达的I型跨膜蛋白。CD45与许多免疫细胞蛋白质相互作用；举例来说，它已被证实为T细胞与B细胞抗原受体信号传导的必需调控剂。缺乏CD45的转基因小鼠患有SCID(Yoo等,2000)，而具有活化CD45突变的小鼠展现淋巴细胞增殖、自身抗体产生以及重度肾炎(Majeti等,2000)。
出于本公开的目的，CD45代表一种抗体-药物缀合物(ADC)方法的有吸引力的靶标，因为它选择性地在所有白细胞和造血祖细胞上表达，但在非造血组织上不存在(Straathof K等2009,DOI:10.1016/S0140-6736(09)60945-4)。
本文所描述的抗体可变结构域的CDR可通过本领域已知的任何适合的方法(例如使用任何适合的抗体编号方案)加以鉴定。CDR可使用Kabat编号方案(Kabat等,U.S.Department of Health and Human Services,1991)、Chothia编号方案(Chothia C,Lesk A M.J Mol Biol.(1987)196:901-17)或IMGT编号方案(Giudicelli V等NucleicAcids Res.(1997)25:206-11；Lefranc MP.Immunol Today(1997)18:509)中的任一者加以鉴定。熟练人员将了解，这些不同的CDR标记系统可给出稍微不同的结果，但在每种情况下，CDR均可由熟练人员容易地鉴定。
如本文所公开的CDR序列使用Kabat编号方案(Kabat等,U.S.Department ofHealth and Human Services,1991)鉴定和确定。
YTH 24.5
在一些实施方案中，抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有氨基酸序列为SEQ IDNO:5的VH CDR3。在一些实施方案中，VH结构域还包含氨基酸序列为SEQ ID NO:4的VH CDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VH CDR1。在一些实施方案中，抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VH CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:4的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VH CDR3。在一些实施方案中，抗体具有包含VH CDR1、VHCDR2以及VH CDR3的VH结构域，其中抗体包含具有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域的CDR序列。在优选实施方案中，抗体包含具有根据SEQ ID NO:1的序列的VH结构域。
抗体还可包含VL结构域。在一些实施方案中，抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR3。在一些实施方案中，VL结构域还包含氨基酸序列为SEQ ID NO:7的VL CDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VL CDR1。在一些实施方案中，抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VL CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:7的VL CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR3。在一些实施方案中，抗体具有包含VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3的VL结构域，其中抗体包含具有SEQ ID NO:2的序列的VL结构域的CDR序列。在优选实施方案中，抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有根据SEQ ID NO:2的序列。
在优选实施方案中，抗体包含VH结构域和VL结构域。优选地，VH包含SEQ ID NO:1的序列并且VL结构域包含SEQ ID NO:2的序列。
一个或多个VH和VL结构域可形成结合CD45的抗体抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗体为包含VH结构域和VL结构域的完整抗体，VH和VL结构域具有与SEQ ID NO:2配对的SEQ ID NO:1的序列。
在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:9的序列的重链，所述重链与具有SEQ ID NO:10的序列的轻链配对。在一些实施方案中，抗体为完整抗体，所述完整抗体包含两个各自具有SEQ ID NO:9的序列的重链，以及两个各自具有SEQ ID NO:10的序列的轻链。
在一些实施方案中，抗体为如WO1995/013093中所公开的YTH 24.5。
YTH 54.12
在一些实施方案中，抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有氨基酸序列为SEQ IDNO:15的VH CDR3。在一些实施方案中，VH结构域还包含氨基酸序列为SEQ ID NO:14的VHCDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:13的VH CDR1。在一些实施方案中，抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:13的VH CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:14的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:15的VH CDR3。在一些实施方案中，抗体具有包含VHCDR1、VH CDR2以及VH CDR3的VH结构域，其中抗体包含具有SEQ ID NO:11的序列的VH结构域的CDR序列。在优选实施方案中，抗体包含具有根据SEQ ID NO:11的序列VH结构域。
抗体还可包含VL结构域。在一些实施方案中，抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:18的VL CDR3。在一些实施方案中，VL结构域还包含氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VL CDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:16的VL CDR1。在一些实施方案中，抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:16的VL CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VL CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:18的VL CDR3。在一些实施方案中，抗体具有包含VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3的VL结构域，其中抗体包含具有SEQ IDNO:12的序列的VL结构域的CDR序列。在优选实施方案中，抗体包含具有根据SEQ ID NO:12的序列的VL结构域。
在优选实施方案中，抗体包含VH结构域和VL结构域。优选地，VH包含SEQ ID NO:11的序列并且VL结构域包含SEQ ID NO:12的序列。
一个或多个VH和VL结构域可形成结合CD45的抗体抗原结合位点。
在一些实施方案中，抗体为包含VH结构域和VL结构域的完整抗体，VH和VL结构域具有与SEQ ID NO:12配对的SEQ ID NO:11的序列。
在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:19的序列的重链，所述重链与具有SEQ ID NO:20的序列的轻链配对。在一些实施方案中，抗体为完整抗体，所述完整抗体包含各自具有SEQ ID NO:19的序列的两个重链，以及各自具有SEQ ID NO:20的序列的两个轻链。
在一些实施方案中，抗体为如WO1995/013093中所公开的YTH 54.12。
-------------------------------------------
YTH 24.5/54.12
在一些实施方案中，抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中：
(i)第一抗原结合结构域包含VH结构域以及任选的如本文以上在标题为“YTH24.5”的章节中所描述的VL结构域；并且
(ii)第二抗原结合结构域包含VH结构域以及任选的如本文以上在标题为“YTH54.12”的章节中所描述的VL结构域。
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在一个方面中，抗体为已如下文所描述进行修饰(或进一步修饰)的如本文所描述的抗体。在一些实施方案中，抗体为本文所公开的抗体的人源化、去免疫或表面重修型式。
如本文中别处所描述，在向受试者施用本文所公开的抗CD45 ADC之后，优选使ADC快速地从受试者的系统清除，以使得对随后可能向受试者施用的任何CD45+ve细胞的残留毒性降至最低。此ADC的快速清除可通过许多不同的机制来实现；举例来说，可对ADC的抗体部分进行选择、修饰或工程化，使得它在所关注的受试者体内具有短半衰期。在人受试者中，此类效应可通过对非人抗体(例如大鼠抗体)进行选择来实现。
因此，在一些情况下，抗体或其片段包含恒定区，所述恒定区可为全长恒定区。抗体可属于任何同型。抗体可为例如IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM。优选地，抗体可为IgM或IgG抗体。最优选地，抗体可为IgG1、IgG2或IgG3抗体。在一些情况下，抗体为全长抗体。抗体可为非人抗体。抗体可为鼠类啮齿动物抗体，即大鼠或小鼠抗体。抗体可为猴抗体。在一些情况下，抗体为大鼠IgG2抗体，更优选地为大鼠IgG2b抗体。此类非人抗体(优选大鼠抗体)如上文所描述具有使得抗体从人受试者的系统快速清除的优点。在抗体为如本文所描述的双互补位或双特异性抗体的一些情况下，抗体可为人同型杂合抗体(诸如人IgG2/IgG4杂合抗体)或大鼠/小鼠杂合抗体(诸如小鼠IgG2a/大鼠IgG2b杂合抗体)。
术语
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体地说覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、完整抗体以及抗体片段，只要它们展现所期望的生物学活性，例如结合CD45的能力即可。抗体可以为鼠抗体、大鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或源于其他物种。抗体为由能够识别和结合至特定抗原的免疫系统产生的蛋白质。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,第5版,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有由多种抗体上的CDR识别的许多结合位点，也称为表位。每种特异性结合至不同表位的抗体均具有不同的结构。因此，一种抗原可具有多于一种的相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合所关注的靶标的抗原的抗原结合位点的分子或其部分，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自体免疫疾病相关的自体免疫抗体的细胞。免疫球蛋白可属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD以及IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)或亚类，或同种异型(例如人G1m1、G1m2、G1m3、非-G1m1[即除G1m1外的任何同种异型]、G1m17、G2m23、G3m21、G3m28、G3m11、G3m5、G3m13、G3m14、G3m10、G3m15、G3m16、G3m6、G3m24、G3m26、G3m27、A2m1、A2m2、Km1、Km2以及Km3)。免疫球蛋白可源于任何物种，包括人、大鼠、鼠或兔起源。
如本文所用，“结合CD45”用于意指与非特异性配偶体(诸如牛血清白蛋白，BSA，基因库登录号CAA76847，版本号CAA76847.1 GI:3336842，记录更新日期：2011年1月7日下午02:30)相比，抗体以更高亲和力结合CD45。在一些实施方案中，当在生理条件下测量时，所述抗体以比所述抗体对BSA的缔合常数(Ka)高至少2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、104、105或106倍的缔合常数结合CD45。本文所公开的抗体可以高亲和力结合CD45。举例来说，在一些实施方案中，抗体可以等于或小于约10-6M(诸如1x10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或10-14)的KD结合CD45。
CD45(也称为蛋白质酪氨酸磷酸酶受体C型[PTPRC])为蛋白质酪氨酸磷酸酶信号传导分子家族的成员。在一些实施方案中，CD45多肽对应于基因库登录号CAA68669，版本号CAA68669.1，记录更新日期：2011年2月2日上午10:53。在一个实施方案中，编码CD45多肽的核酸对应于基因库登录号Y00638，版本号Y00638.1，记录更新日期：2011年2月2日上午10:53。在一些实施方案中，CD45多肽如UniProt记录P08575-3中所描述。在一些实施方案中，CD45多肽具有SEQ ID NO:21的序列。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和scFv片段；双体抗体；线性抗体；由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体、CDR(互补决定区)和任何上述免疫特异性结合至癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的抗体的表位结合片段，单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，即，包含该群体的各个抗体是同一的，除了可以微量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体针对单一抗原位点是高度特异的。另外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体均是针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以在不受其他抗体污染的情况下合成。修饰词“单克隆”表示抗体的特征获自基本上同质的抗体群体，并且不应被解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。举例来说，要根据本公开使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等(1975)Nature256:495描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(参见，US 4816567)。单克隆抗体还可使用Clackson等(1991)Nature,352:624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中所描述的技术从噬菌体抗体文库中分离或从携带完全人免疫球蛋白系统的转基因小鼠(Lonberg(2008)Curr.Opinion 20(4):450-459)中分离。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展现所需生物活性即可(US 4816567；以及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。嵌合抗体包括“灵长类化(primatized)”抗体，该灵长类化抗体包含源于非人灵长类(例如旧世纪猴(old world Monkey)或猿)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
本文中的“完整抗体”为包含VL和VH结构域，以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，所述效应子功能是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及下调细胞表面受体(诸如B细胞受体和BCR)。
依据它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将完整抗体归属于不同的“类别”。有五种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且这些类别中的几种可进一步划分成“亚类”(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型为熟知的。
抗体的修饰
可对本文所公开的抗体进行修饰。举例来说，为使它们对人受试者的免疫原性更低。这可使用本领域技术人员熟悉的多种技术中的任一种来实现。下文更详细地描述了这些技术中的一些。
人源化
用于降低非人抗体或抗体片段的体内免疫原性的技术包括称为“人源化”的技术。
“人源化抗体”是指包含人抗体的修饰的可变区的多肽的至少一部分，其中可变区的一部分(优选为基本上小于完整人可变结构域的部分)已由来自非人物种的相应序列取代，并且其中修饰的可变区至少连接至另一蛋白质的另一部分，优选为人抗体的恒定区。表述“人源化抗体”包括其中一个或多个互补决定区(“CDR”)氨基酸残基和/或一个或多个框架区(“FW”或“FR”)氨基酸残基被啮齿类动物或其他非人抗体中类似位点的氨基酸残基取代的人抗体。表述“人源化抗体”还包括包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的FR以及基本上具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式为含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。或者，以另一种方式来看，人源化抗体为还含有来自非人(例如鼠)抗体的选定的序列来代替人序列的人抗体。人源化抗体可包括不显著改变其结合和/或生物活性的来自相同或不同物种的保守氨基酸取代或非天然残基。此类抗体是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。
有一系列人源化技术，包括“CDR移植”、“导向选择”、“去免疫”、“表面重修(resurfacing)”(也称为“面饰法(veneering)”)、“复合抗体”、“人字符串内容优化(HumanString Content Optimisation)”和框架改组。
CDR移植
在该技术中，人源化抗体为人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特性的非人物种(供给者抗体)(诸如小鼠、大鼠、骆驼、牛、山羊或兔子)的CDR的残基替代(实际上，非人CDR被“移植”到人框架上)。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代(这可能发生在例如当特定FR残基对抗原结合具有显著影响时)。
另外，人源化抗体可包含在接受者抗体中或在导入的CDR或框架序列中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改进和最大化抗体性能。因此，一般来说，人源化抗体将包含至少一个和在一方面中两个可变结构域的全部，其中全部的或全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且全部的或基本上全部的FR区为人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，或人免疫球蛋白的至少一部分。
引导选择
所述方法由将对特定表位具特异性的给定非人抗体的VH或VL结构域与人VH或VL文库组合组成，并且针对所关注的抗原选择特定人V结构域。然后将所选的人VH与VL文库组合以生成完全人VHxVL组合。Nature Biotechnology(N.Y.)12,(1994)899-903中描述了所述方法。
复合抗体
在此方法中，将来自人抗体的氨基酸序列的两个或多个区段组合在最终抗体分子中。它们是通过将多个人VH和VL序列区段组合成诸多个组合来构建的，所述组合限制或避开了最终复合抗体V区中的人T细胞表位。在需要时，通过将有助于或编码T细胞表位的V区区段与避开T细胞表位的替代区段交换来限制或避开T细胞表位。US 2008/0206239A1中描述了此方法。
去免疫
此方法涉及从治疗性抗体(或其他分子)的V区移除人(或其他第二物种)T细胞表位。分析治疗性抗体V-区序列中是否存在MHC II类-结合基序，例如通过与MHC-结合基序的数据库(诸如存储在www.wehi.edu.au的“基序”数据库)比较来进行分析。或者，可使用计算线程方法(诸如由Altuvia等.(J.Mol.Biol.249 244-250(1995))设计的那些)来鉴定MHCII类结合基序；在这些方法中，测试了来自V-区序列的连续重叠肽与MHC II类蛋白的结合能。然后可将此数据与关于与成功呈递的肽有关的其他序列特征的信息(诸如两亲性、罗斯巴德基序(Rothbard motif)以及组织蛋白酶B和其他加工酶的切割位点)组合。
一旦确定了潜在的第二物种(例如人)T细胞表位，就可以通过改变一个或多个氨基酸来消除它们。修饰的氨基酸通常在T-细胞表位本身内，但就蛋白质的一级或二级结构而言也可能与所述表位相邻(并且因此，在一级结构中可能不相邻)。最典型地，改变是通过取代的方式，但在某些情况下氨基酸添加或缺失将更合适。
所有的改变都可通过重组DNA技术完成，因此最终的分子可通过使用已经确定的方法(诸如定点诱变)从重组宿主中表达来制备。然而，使用蛋白质化学或任何其他分子改变手段也是可能的。
表面重修
所述方法涉及：
(a)通过构建非人抗体可变区的三维模型来确定非人(例如啮齿动物)抗体(或其片段)的可变区的构象结构；
(b)使用来自足够数量的非人和人抗体可变区重链和轻链的x-射线晶体结构的相对可及性分布产生序列比对，以给出重链和轻链框架位置的集合，其中在98％的足够数量的非人抗体重链和轻链中比对位置是相同的；
(c)使用步骤(b)中产生的框架位置的集合，为要人源化的非人抗体定义重链和轻链表面暴露的氨基酸残基的集合；
(d)从人抗体氨基酸序列中鉴定重链和轻链表面暴露的氨基酸残基的集合，所述集合与步骤(c)中确定的表面暴露的氨基酸残基的集合是最接近相同的，其中来自人抗体的重链和轻链是或不是天然配对的；
(e)在要人源化的非人抗体的氨基酸序列中，将步骤(c)中确定的重链和轻链表面暴露的氨基酸残基的集合用步骤(d)中鉴定的重链和轻链表面暴露的氨基酸残基的集合取代；
(f)构建由步骤(e)中指定的取代产生的非人抗体可变区的三维模型；
(g)通过比较在步骤(a)和(f)中构建的三维模型，从在步骤(c)或(d)中鉴定的集合鉴定出在要人源化的非人抗体的互补决定区的任何残基的任何原子5埃以内的任何氨基酸残基；以及
(h)将步骤(g)中鉴定的来自人的任何残基变为原始的非人氨基酸残基，从而确定表面暴露的氨基酸残基的非人抗体人源化集合；前提条件为步骤(a)不必先进行，但必须在步骤(g)之前进行。
超人源化
所述方法将非人序列与功能性人种系基因谱系进行比较。选择那些编码与非人序列相同或密切相关的规范结构的人基因。选择CDR内具有最高同源性的那些所选人基因作为FR供体。最后，将非人CDR移植到这些人FR上。专利WO 2005/079479 A2中描述了此方法。
人字符串内容优化
此方法将非人(例如小鼠)序列与人种系基因谱系进行比较，并且将差异评分为人字符串内容(HSC)，人字符串内容在潜在MHC/T-细胞表位水平下定量序列。然后通过使HSC最大化而非使用全局同一性度量来对靶序列进行人源化，以产生多种不同的人源化变体(描述于Molecular Immunology,44,(2007)1986-1998中)。
框架改组
将非人抗体的CDR框内融合到涵盖所有已知重链和轻链人种系基因框架的cDNA池中。然后通过例如对噬菌体展示的抗体文库进行淘选来选择人源化抗体。这在Methods 36,43-60(2005)中有描述。
实施方案
QX
在一个实施方案中，Q为氨基酸残基。氨基酸可为天然氨基酸或非天然氨基酸。
在一个实施方案中，Q选自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg以及Trp，其中Cit为瓜氨酸。
在一个实施方案中，Q包含二肽残基。二肽中的氨基酸可为天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，二肽包含天然氨基酸。在接头为组织蛋白酶不稳定接头的情况下，二肽为组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。那么，二肽为组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方案中，Q选自：
C＝O-Phe-Lys-NH，
C＝O-Val-Ala-NH，
C＝O-Val-Lys-NH，
C＝O-Ala-Lys-NH，
C＝O-Val-Cit-NH，
C＝O-Phe-Cit-NH，
C＝O-Leu-Cit-NH，
C＝O-Ile-Cit-NH，
C＝O-Phe-Arg-NH，
C＝O-Trp-Cit-NH以及
C＝O-Gly-Val-NH；
其中Cit为瓜氨酸。
优选地，Q选自：
C＝O-Phe-Lys-NH，
C＝O-Val-Ala-NH，
C＝O-Val-Lys-NH，
C＝O-Ala-Lys-NH以及
C＝O-Val-Cit-NH。
最优选地，Q选自C＝O-Phe-Lys-NH、C＝O-Val-Cit-NH或C＝O-Val-Ala-NH。
所关注的其他二肽组合包括：
C＝O-Gly-Gly-NH，
C＝O-Gly-Val-NH
C＝O-Pro-Pro-NH以及
C＝O-Val-Glu-NH。
可使用其他二肽组合，包括由Dubowchik等,Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869描述的那些二肽组合，所述参考文献以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，Q为三肽残基。三肽中的氨基酸可为天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，三肽包含天然氨基酸。在接头为组织蛋白酶不稳定接头的情况下，三肽为组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。那么，三肽为组织蛋白酶的识别位点。特别关注的三肽接头为：
C＝O-Glu-Val-Ala-NH
C＝O-Glu-Val-Cit-NH
C＝O-αGlu-Val-Ala-NH
C＝O-αGlu-Val-Cit-NH
在一些实施方案中，Q为四肽残基。四肽中的氨基酸可为天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，四肽包含天然氨基酸。在接头为组织蛋白酶不稳定接头的情况下，四肽为组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。那么，四肽为组织蛋白酶的识别位点。特别关注的四肽接头为：
C＝O-Gly-Gly-Phe-Gly-NH；以及
C＝O-Gly-Phe-Gly-Gly-NH。
在一些实施方案中，四肽为：
C＝O-Gly-Gly-Phe-Gly-NH
在上述肽残基的表示中，C＝O-表示残基结合至RLL中的C＝O的位置，并且-NH表示残基结合至RLL中的NH的位置。
Glu表示谷氨酸的残基，即：
αGlu表示经由α链结合的谷氨酸的残基，即：
在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链受到化学保护。侧链保护基团可为如上文所讨述的基团。受保护的氨基酸序列可被诸如组织蛋白酶等酶裂解。举例来说，包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可由组织蛋白酶裂解。
氨基酸的侧链的保护基团为本领域中熟知的，并且在Novabiochem目录中有描述并且如上文所描述。
GLL
GLL可选自：
其中Ar表示C5-6亚芳基，例如亚苯基，并且X表示C1-4烷基。
在一些实施方案中，GLL选自GLL1-1和GLL1-2。在这些实施方案中的一些中，GLL为GLL1 -1。
在一些实施方案中，GLL为GLL10。
C5-6亚芳基：如本文所用的术语“C5-6亚芳基”是有关通过从芳族化合物的芳族环原子移除两个氢原子而获得的二价部分。
在此情形中，前缀(例如C5-6)表示环原子数目或环原子数目的范围，无论是碳原子还是杂原子。
环原子可全部为碳原子，如在“碳亚芳基”中，在这种情况下所述基团为亚苯基(C6)。
或者，环原子可包括一个或多个杂原子，如在“杂亚芳基”中。杂亚芳基的实例包括但不限于来源于以下的那些杂亚芳基：
N1：吡咯(唑)(C5)、吡啶(吖嗪)(C6)；
O1：呋喃(氧杂环戊烯)(C5)；
S1：噻吩(硫杂环戊二烯)(C5)；
N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；
N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；
N3O1：噁三唑(C5)；
N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；
N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；以及
N3：三唑(C5)、三嗪(C6)。
C1-4烷基：如本文所用的术语“C1-4烷基”是有关通过从具有1至4个碳原子的烃化合物的碳原子移除氢原子而获得的一价部分，所述一价部分可为脂族或脂环族，并且可为饱和的或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。如本文所用的术语“C1-n烷基”是有关通过从具有1至n个碳原子的烃化合物的碳原子移除氢原子而获得的一价部分，所述一价部分可为脂族或脂环族，并且可为饱和的或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括下文论述的烯基、炔基、环烷基等亚类。
X
X为：
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5。
a可为0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，a为0至3。在这些实施方案中的一些中，a为0或1。在其他实施方案中，a为0。在其他实施方案中，a为1。
b1可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施方案中，b1为0至12。在这些实施方案中的一些中，b1为0至8，并且可为0、2、3、4、5或8。在其他实施方案中，b1为2。
b2可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施方案中，b为0至12。在这些实施方案中的一些中，b2为0至8，并且可为0、2、4、5或8。在其他实施方案中，b2为8。
b1和b2中仅一者可不为0。
c1可为0或1。
c2可为0或1。
c1和c2中仅一者可不为0。
d可为0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，d为0至3。在这些实施方案中的一些中，d为1或2。在其他实施方案中，d为2。在其他实施方案中，d为5。
在X的一些实施方案中，a为0，b1为0，c1为1，c2为0并且d为2，并且b2可为0至8。在这些实施方案中的一些中，b2为0、4、5或8。在其他实施方案中，b2为8。
在X的一些实施方案中，a为1，b2为0，c1为0，c2为1，d为2，并且b1可为0至8。在这些实施方案中的一些中，b1为2。
a至d的其他实施方案
在X的一些其他实施方案中，a＝0至5，b1＝0，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0并且d＝0至5。
在这些其他实施方案中，a可为0、1、2、3、4或5。在这些其他实施方案中的一些中，a为0至3。在这些其他实施方案中的一些中，a为0或1，并且可为0。
在这些其他实施方案中，b2可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在这些其他实施方案中的一些中，b2为0至12。在这些其他实施方案中的一些中，b2为0至8，并且可为0、2、4或8。
在这些其他实施方案中，c1可为0或1。
在这些其他实施方案中，d可为0、1、2、3、4或5。在这些其他实施方案中的一些中，d为0至3。在这些其他实施方案中的一些中，d为1或2，并且可为2。
在X的这些其他实施方案中的一些中，a为0，c2为1并且d为2，并且b2可为0至8。在这些其他实施方案中的一些中，b2为0、4或8。
m
在一些实施方案中，m为0。
在一些实施方案中，m为1。
RC和R11a
在一些实施方案中，R11a与RC一起形成与其连接的C与N原子之间的双键。
在一些实施方案中，R11a为OH并且RC为：
其中方括号指示NO2基团为任选的。在这些实施方案中的一些中，NO2基团存在。
R2和R12
在一些实施方案中，R2与R12为相同的。
在一些实施方案中，C2与C3之间以及C2'与C3之间存在双键，并且R2与R12均为甲基。
在一些实施方案中，C2与C3之间以及C2'与C3之间存在单键，并且R2与R12均为H。
在一些实施方案中，C2与C3之间以及C2'与C3之间存在单键，并且R2与R12均为
R22和R32
在一些实施方案中，R22与R32为相同的。
在一些实施方案中，C2与C3之间以及C2’与C3之间存在双键，并且R22与R32均为甲基。
在一些实施方案中，C2与C3之间以及C2’与C3之间存在单键，并且R22与R32均为H。
在一些实施方案中，C2与C3之间以及C2’与C3之间存在单键，并且R22与R32均为
DL
在本公开的一些实施方案中，DL选自：
/>
其中RLL、X以及GLL如上文所描述。
在一些实施方案中，DL选自A1至A6。
在本公开的一些实施方案中，DL选自：
/>
/>
药物载量
药物载量为每个抗体(例如抗体)的PBD药物的平均数目。
可通过常规手段(诸如UV、反相HPLC、HIC、质谱法、ELISA分析以及电泳)来表征在来自缀合反应的ADC制剂中每个抗体的平均药物数目。还可确定以p表示的ADC数量分布。通过ELISA，可确定在特定ADC制剂中p的平均值(Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Sanderson等(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852)。然而，p(药物)值的分布因抗体-抗原结合和ELISA的检测限而不可识别。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA分析不能确定药物部分在什么位置连接至抗体，诸如重链或轻链片段或特定氨基酸残基。在一些情况下，可通过诸如反相HPLC或电泳等手段来实现均相ADC(其中p为来自具有其他药物载量的ADC的特定值)的分离、纯化以及表征。此类技术也适用于其他类型的缀合物。
对于本发明的抗体-药物缀合物，p受到抗体上连接位点的数目(即叠氮基团的数目)的限制。举例来说，抗体可具有仅一个或两个可连接至药物接头的叠氮基团。
典型地，在缀合反应期间，少于理论最大值的药物部分缀合至抗体。可以若干不同方式来控制ADC的载量(药物/抗体比率)，包括：(i)限制药物-接头中间物(D-L)或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，以及(ii)限制缀合反应时间或温度。
在抗体的超过一个亲核或亲电基团与药物-接头中间体或接头试剂随后与药物部分试剂反应的情况下，那么所得产物为ADC化合物的混合物，其中连接至抗体的药物部分的分布为例如1、2、3个等。液相色谱法(诸如聚合物反相(PLRP)和疏水相互作用(HIC))可根据药物载量值分离混合物中的化合物。可分离具有单一药物载量值(p)的ADC制剂，然而，这些单一载量值ADC仍可能为异质混合物，因为药物部分可经由接头连接至抗体上的不同位点。
因此，本公开的抗体-药物缀合物组合物包括抗体-药物缀合物化合物的混合物，其中抗体具有一个或多个PBD药物部分，并且其中药物部分可在不同氨基酸残基处连接至抗体。
在一个实施方案中，每个抗体的二聚体吡咯并苯并二氮杂基团的平均数目在1至8范围内。在一个实施方案中，所述范围选自1至4、1至4、2至4以及1至3。
在一些实施方案中，每个抗体有一个或两个二聚体吡咯并苯并二氮杂基团。
药物缀合物的制备
本公开的抗体药物缀合物可通过使式DLA或DLB的适当药物接头缀合至Ab来制备：
其中RL为适合于连接至Ab的接头，并且具有式IIb：
其中GL为适合于连接至Ab的接头基团；
其中X和GL如上文所定义。
以下在‘实施例'章节中在副标题‘ADC的制备’下阐述了适合的ADC缀合方法的实例。
药物接头可如例如WO2014/057074、WO2017/137553、WO2018/069490以及WO2018/192944中所描述进行合成。
具体地说，下表提供了关于特别关注的一些药物-接头的参考物。
/>
/>
C8的合成
分析型LC/MS条件
使用Waters Aquity H类SQD2进行正离子模式电喷雾质谱法。所用的流动相为溶剂A(含0.1％甲酸的水)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈)。
方法1：用于常规3分钟运行的梯度：初始组合物5％B保持超过25秒，然后历时1分钟35秒的时间从5％B增加至100％B。使组合物在100％B下保持50秒，然后在5秒内回到5％B并且在此保持5秒。梯度运行的总持续时间为3.0分钟。流速为0.8mL/分钟。在254nm下检测。柱：Waters Acquity UPLCTMBEH Shield RP18 1.7μm 2.1x50mm，50℃，装配有WatersAcquity UPLCTMBEH Shield RP18 VanGuard预柱，130A，1.7μm，2.1mm x 5mm。
方法2：用于15分钟运行的梯度：初始组合物5％B保持超过1分钟，然后历时9分钟的时间从5％B增加至100％B。使组合物在100％B下保持2分钟，然后在10秒内回到5％B并且在此保持2分钟50秒。梯度运行的总持续时间为15.0分钟。流速为0.8mL/分钟(用于3分钟运行)和0.6mL/分钟(用于15分钟运行)。在254nm下检测。柱：ACE Excel 2 C18-AR，2μ，3.0x100mm，装配有Waters Acquity UPLCTMBEH Shield RP18 VanGuard预柱，130A，1.7μm，2.1mm x 5mm。
(i)Alloc去保护
将四(三苯基膦)钯(0)(8.4mg，2mol％)添加至(1)(400mg，0.36mmol，1.0当量)(WO2017/137553中的化合物21)和吡咯烷(38μL，0.46mmol，1.25当量)于氯仿(10mL)中的溶液中。将反应物在室温下搅拌20分钟，LCMS显示完全反应。将反应混合物用氯仿(5mL)稀释，用饱和氯化铵水溶液(10mL)洗涤并且穿过Biotage相分离管以移除痕量的水。将DeloxanTM(1g)添加至有机相中并且在室温下搅拌60min。通过过滤移除Deloxan，用氯仿(5mL)洗涤并且将有机馏份在减压下蒸发，留下呈白色固体状的2(335mg，94％)。LC/MS，方法1，1.30min(ES+)m/z 1013.1([M+H]+)。
(ii)Boc去保护
将TFA(4.5mL)与水(0.5mL)的混合物冷却至0℃并且添加至2(320mg，0.31mmol)中。将所得溶液在0℃下搅拌2小时。添加水(5mL)和氯仿(10mL)并且通过添加固体碳酸氢钠将混合物碱化(pH 8)。通过穿过Biotage SPE筒柱将有机相移除，并且在减压下蒸发至干燥，留下呈灰白色固体状的3(216mg，77％)。LC/MS，方法1，1.23min(ES+)m/z 894.9([M+H]+)。
(iii)BCN HydraspaceTM偶联
将EDCI.HCl(86mg，0.45mmol，1.1当量)添加至3(200mg，0.22mmol，1.0当量)和BCN间隔子(108mg，0.26mmol，1.15当量)(WO 2018/146188中的化合物3)于氯仿(10mL)中的溶液中并且将所得反应物在室温下搅拌60min。LCMS显示不存在起始物质。将有机相用水(10mL)洗涤。使所得混合物穿过biotage相分离器以移除水并且蒸发至干燥，留下黄色固体，将所述黄色固体通过制备型HPLC纯化(梯度30-90％乙腈/水，历时9min。水中含有0.01％甲酸，但乙腈中不含酸)。将粗物质溶解于乙腈(1.3mL)和水(0.7mL)中并且以100uL批次进行注射。将产物收集在含有5％碳酸氢铵水溶液(2mL)的管中。将含有产物的级分合并，在减压下移除乙腈并且将所得水相用DCM(3x50mL)萃取。通过穿过Biotage相分离器将有机馏份干燥并且蒸发至干燥，留下呈淡黄色固体状的产物C8(75mg，26％)。LC/MS，方法2，6.78min(ES+)m/z 1295.3([M+H]+)。
抗CD45 PBD ADC的治疗用途
本公开的抗体和抗体药物缀合物的主要治疗应用包括用于治疗癌症，特别是血液学癌症，以及用于对受试者进行调理以便进行骨髓或造血干细胞移植和基因疗法。
如本文所用，术语“调理”可理解为意指通过选择性地消耗(即，通过细胞杀伤作用)受试者的内源性、自体造血干细胞、造血祖细胞和/或白细胞从而提供用于植入所移植的细胞的壁龛来使受试者准备进行使用含有造血干细胞的制剂的移植或进行基因疗法的过程。本文所公开的抗CD45 PBD ADC发挥表达CD45的细胞(即，CD45阳性细胞)的靶向细胞杀伤活性。典型地，此类细胞为造血系统的那些细胞。因此，本公开提供了供在疗法中使用的本文所公开的抗CD45 PBD ADC。
血液学癌症治疗
本公开提供了一种治疗血液学癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或包含此类ADC的组合物。还提供了一种供在治疗血液学癌症的方法中使用的如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或包含此类ADC的组合物，所述方法包括向有需要的受试者施用ADC或组合物。抗CD45 PBD ADC可为单一类型的如本文所描述的ADC，或可为如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC与如本文所描述的第二不同抗CD45PBD ADC的组合。类似地，所述方法可包括向有需要的受试者施用如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC，其中所述受试者已施用、正在施用或将施用如本文所描述的第二不同抗CD45 PBD ADC。
在一些情况下，在相同药物组合物内向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在另外一些优选情况下，以两种单独药物组合物的形式向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，同时向受试者施用第一抗CD45PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在向受试者施用第二抗CD45 PBD ADC之前向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在即将向受试者施用第二抗CD45 PBDADC之前向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在向受试者施用第二抗CD45PBD ADC之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48或72小时，优选之前至少2小时，最优选之前至少12小时向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在向受试者施用第二抗CD45 PBD ADC之前至少1、2、3、4、5、7、10、14、21、28、35、42或49天，优选至少1天，最优选之前至少7天向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。
在一些情况下，血液学癌症包含表达CD45的细胞。在一些情况下，血液学癌症可为CD45阳性的。在一些情况下，癌症可选自由以下组成的组：急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及霍奇金氏病。受试者可为哺乳动物，优选地，受试者为人。典型地，受试者为需要治疗血液学癌症的人(例如患者)，即患有或疑似患有血液学癌症的受试者。在一些情况下，受试者已被诊断为患有血液学癌症，并且因此需要如本文所描述的治疗。
在一些情况下，所述方法还可包括施用一种或多种其他治疗剂。举例来说，所述方法还可包括施用一种或多种抗癌剂。在一些情况下，所述方法还包括向受试者施用辐射和/或化学疗法。在一些情况下，所述方法还包括向受试者施用以下中的一者或多者：恩西地平(enasidenib)、吉瑞替尼(gilteritinib)、艾伏尼布(ivosidenib)、米哚妥林(midostaurin)、氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、利妥昔单抗(rituximab)、苯达莫司汀(bendamustine)、氮芥苯丁酸、依鲁替尼(ibrutinib)、伊德利塞(idelalisib)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、泼尼松龙(prednisolone)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)、卡非佐米(carfilzomib)、达雷木单抗(daratumumab)、沙利度胺(thalidomide)、帕比司他(panobinostat)、硼替佐米(bortezomib)、全反式视黄酸、三氧化砷、伊达比星(idarubicin)、柔红比星(daunorubicin)、阿糖胞苷、阿扎胞苷(azacitidine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、阿糖胞苷、依托泊苷(etoposide)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、5-氮杂胞苷、羟基脲、米哚妥林、长春新碱、类固醇、多柔比星(doxorubicin)、天冬酰胺酶、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、奈拉滨(nelarabine)、美法仑(melphalan)、苯达莫司汀、卡莫司汀(carmustine)(双氯乙基亚硝基脲，BCNU)、顺铂、卡铂(carboplatin)、白消安(busulphan)、曲奥舒凡(treosulphan)、噻替派(thiotepa)或全身照射。在一些优选情况下，所述方法还包括向受试者施用选自以下的一种或多种癌症治疗：柔红比星、伊达比星、米托蒽醌、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、吉妥珠单抗、5-氮杂胞苷、羟基脲、米哚妥林、长春新碱、类固醇、多柔比星、天冬酰胺酶、环磷酰胺、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、奈拉滨、达雷木单抗、美法仑、沙利度胺、来那度胺(lenolidamide)、硼替佐米、泊马度胺、卡非佐米(carfolizimib)、苯达莫司汀、卡莫司汀(双氯乙基亚硝基脲，BCNU)、顺铂、卡铂、利妥昔单抗、奥法木单抗、奥妥珠单抗、依鲁替尼、伊德利塞(idelasalib)以及本妥昔单抗。在一些情况下，所述方法还包括向受试者施用选自以下的一种或多种调理剂：白消安、曲奥舒凡、噻替派以及全身照射。在此类情况下，可将其他治疗剂与本文所描述的抗CD45 PBD ADC在相同药物组合物内配制；或优选地，可以单独制剂的形式施用其他治疗剂。可将其他治疗剂与本文所描述的抗CD45PBD ADC同时施用。可在一种或多种其他剂之前、之后或同时施用本文所描述的抗CD45 PBDADC。
使受试者准备进行造血干细胞移植
本公开还提供了一种使受试者准备进行造血干细胞移植的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物。在一些情况下，本公开提供了一种供在使受试者准备进行造血干细胞移植的方法中使用的如本文所描述的抗CD45PBD ADC或组合物，所述方法包括向有需要的受试者施用所述抗体、抗体药物缀合物或药物组合物。使受试者准备进行造血干细胞移植可包括对受试者进行调理以便植入造血干细胞或大体上由其组成。
如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物典型地引起对CD45阳性细胞的细胞杀伤作用。通常有利的是，在使用含有造血干细胞的制剂的移植或基因疗法之前，尽可能地减少受试者体内免疫效应细胞的数目，优选将其完全消除。因此，本公开的抗体、抗体药物缀合物或药物组合物提供对CD45阳性细胞，包括T细胞、NK细胞、淋巴细胞以及单核细胞的广谱细胞杀伤作用。这可使移植之后的移植排斥或移植物抗宿主疾病最小化。
如上文所论述，在一些情况下，使受试者准备进行造血干细胞移植可包括对受试者进行调理以便植入造血干细胞。因此，它可意指选择性地消耗(即，通过细胞杀伤作用)受试者的自体造血干细胞和/或白细胞以提供用于植入所移植的造血干细胞的壁龛的过程。在一些情况下，本文所描述的方法可为清髓性的、非清髓性的或强度降低的，优选为毒性降低的清髓性调理。典型地，受试者的自体造血干细胞包含缺陷或突变，所述缺陷或突变引起受试者的病症或疾病。因此，消耗或基本上消除受试者的自体造血干细胞并且将其用校正或健康的造血干细胞置换提供对疾病的治疗。
在一些情况下，用于移植至受试者中的造血干细胞为同种异体的。术语“同种异体”在本公开的上下文中可理解为意指供给者的造血干细胞，即，造血干细胞是分离自或来源于供给者，典型地为人供给者。造血干细胞不为受试者自己的造血干细胞，即它们不来源于受试者。在一些情况下，用于移植至受试者中的同种异体造血干细胞来自健康供给者，即未患与受试者相同的疾病的供给者，或优选未患任何疾病的供给者。在优选情况下，用于移植至受试者中的同种异体造血干细胞来自健康的HLA匹配的供给者。如本文所用，术语“HLA匹配”用于指供给者造血干细胞的人白细胞抗原(HLA)类型与受试者的HLA类型非常匹配。在一些情况下，供给者和受试者具有至少6种、优选至少8种并且最优选至少10种匹配的HLA标记物。在一些情况下，供给者可为与受试者半相合的(即，刚好一半的HLA标记物匹配)。在一些情况下，供给者可为受试者的兄弟姐妹、父母或孩子。
在本文所公开的方法中，所述同种异体造血干细胞移植可用于治疗恶性疾病或病症。在此类情况下，同种异体造血干细胞移植可用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓发育不良、骨髓增生性疾病、非霍奇金氏淋巴瘤以及霍奇金氏病。或者，在另外一些情况下，所述同种异体造血干细胞移植可用于治疗非恶性疾病或病症。在这些情况中的一些中，同种异体造血干细胞移植可用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：重度再生障碍性贫血症和其他骨髓衰竭病症、原发性免疫缺陷、原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、血红蛋白病以及遗传代谢性疾病。在一些情况下，同种异体造血干细胞移植可用于治疗(i)骨髓衰竭病症，诸如特发性重度再生障碍性贫血、范可尼贫血(Fanconi anaemia)、先天性角化不良、重度先天性嗜中性粒细胞减少症、舒-戴二氏综合征(Schwachmann-Diamond Syndrome)或戴-布二氏贫血(Diamond Blackfan anaemia)；(ii)原发性免疫缺陷，诸如SCID(例如新生儿SCID)、慢性肉芽肿病、维-奥二氏综合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、CD40配体缺陷、XLP、MHC II类缺陷或原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症；(iii)血红蛋白病，诸如镰状细胞病、β-地中海贫血重症；或(iv)遗传代谢性疾病，诸如贺勒氏综合征(Hurler syndrome)、X连锁肾上腺脑白质营养不良、α甘露糖苷贮积症或骨硬化病。在一些情况下，同种异体造血干细胞移植可用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：重度再生障碍性贫血和其他骨髓衰竭病症、血红蛋白病、原发性免疫缺陷、血红蛋白病、原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、遗传代谢性疾病、范可尼贫血、先天性角化不良、重度先天性嗜中性粒细胞减少症、舒-戴二氏综合征、戴-布二氏综合征、SCID(例如新生儿SCID)、慢性肉芽肿病、维-奥二氏综合症、CD40配体缺陷、XLP、MHC II类缺陷、原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、镰状细胞病、β-地中海贫血重症、贺勒氏综合征、α甘露糖苷贮积症、X连锁肾上腺脑白质营养不良以及骨硬化病。在此类情况下，受试者可为需要治疗所述疾病或病症中的一者或多者的人(例如患者)，即患有或疑似患有所述疾病或病症中的一者或多者的受试者。在一些情况下，受试者已被诊断为患有所述疾病或病症中的一者或多者，并且因此需要如本文所描述的治疗。
在一些情况下，用于移植至受试者中的同种异体造血干细胞为基因修饰的。在此类情况下，基因修饰的同种异体造血干细胞的移植可用于受试者的基因疗法。因此，本公开还提供了一种使受试者准备进行用于基因疗法的同种异体基因修饰造血干细胞移植的方法，所述方法包括施用本发明的抗体、本发明的抗体药物缀合物或本发明的药物组合物。典型地，受试者的自体造血干细胞包含导致疾病或病症的缺陷、疾病或突变。用于移植的基因修饰的同种异体造血干细胞可分离自或来源于供给者，并且例如通过基因疗法，例如通过用携带所需表达产物的基因的病毒载体转导，或通过使用例如TALEN或CRISPR技术进行基因/碱基编辑来进行离体处理。在用本发明的抗体、抗体药物缀合物或药物组合物调理之后，可将基因修饰的同种异体造血干细胞移植至受试者中，所述受试者可用于进行基因疗法以便治疗遗传血液疾病或病症、原发性免疫缺陷或遗传代谢性病症。举例来说，在用如本文所公开的抗CD45 PBD ADC调理之后，可将基因修饰的同种异体造血干细胞移植至受试者中以便治疗范可尼贫血，其中自体HSC为难以收获的；或以便治疗异染性脑白质营养不良(MLD)，其中过表达可为有益的；或以便进行CAR T细胞疗法。
在一些情况下，用于移植至受试者中的造血干细胞为自体的。术语“自体”在本公开的上下文中可理解为意指受试者自己的造血干细胞，即分离自或来源于受试者的造血干细胞。在一些情况下，用于移植至受试者中的造血干细胞可为受试者自己的造血干细胞。在本文所描述的方法中的一些中，自体造血干细胞移植可用于治疗恶性疾病或病症。在这些情况中的一些中，自体造血干细胞移植可用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及霍奇金氏病。在另外一些情况下，自体造血干细胞移植可用于治疗自体免疫疾病或病症。在一些此类情况下，自体造血干细胞移植可用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：多发性硬化、系统性硬化以及系统性红斑狼疮。在一些情况下，自体造血干细胞移植可用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、自体免疫疾病或病症、多发性硬化、系统性硬化、幼年炎性关节炎以及系统性红斑狼疮。
在一些情况下，用于移植至受试者中的造血干细胞为自体的并且基因修饰的。在此类情况下，基因修饰的自体造血干细胞的移植可用于受试者的基因疗法。因此，本公开还提供了一种使受试者准备进行自体基因修饰造血干细胞移植以用于基因疗法的方法，所述方法包括施用如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物。典型地，受试者的自体造血干细胞包含导致疾病或病症的缺陷、疾病或突变。用于移植的基因修饰的自体造血干细胞可分离自或来源于受试者，并且例如通过基因疗法进行离体处理，以校正缺陷、疾病或突变，使得造血干细胞不再引起疾病或病症。在一些情况下，用于移植的基因修饰的造血干细胞包含已例如通过用携带所需表达产物的基因的病毒载体转导、通过嵌合抗原受体(CAR)疗法或通过使用例如TALEN或CRISPR技术进行基因/碱基编辑而进行基因修饰的自体造血干细胞(即从要治疗的受试者分离的造血干细胞)或大体上由其组成。举例来说，可以已知方式使用包含编码腺苷脱氨酶(ADA)的基因或β-球蛋白基因的一种或多种病毒载体来将这些基因分别插入从具有ADA缺陷或血红蛋白病的受试者分离的造血干细胞中。类似地，利用使用CRISPR技术的基因/碱基编辑可来使BCL11A阻遏基因沉默，以使γ-球蛋白能够在从患有镰状细胞病和/或β-地中海贫血的受试者分离的造血干细胞中表达。在用如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物调理之后，移植此类基因校正(即基因修饰)的自体造血干细胞对于这些病症来说可为有疗效的。
因此，在一些情况下，用于移植至受试者中的造血干细胞可为基因修饰的自体造血干细胞。在本文所公开的方法中，在一些情况下，基因修饰的自体造血干细胞的移植可用于基因疗法。在一些情况下，基因修饰的自体造血干细胞的移植可用于基因疗法以便治疗遗传血液疾病或病症、原发性免疫缺陷或遗传代谢性病症。在一些情况下，基因修饰的自体造血干细胞的移植可用于基因疗法以便治疗(i)选自以下的遗传血液疾病或病症：血红蛋白病、输注依赖性血红蛋白病、镰状细胞病、β-地中海贫血重症以及范可尼贫血；(ii)选自以下的原发性免疫缺陷：SCID(例如新生儿SCID)、慢性肉芽肿病、原发性HLH以及维-奥二氏综合症；或(iii)选自以下的遗传代谢性病症：贺勒氏综合征、X-肾上腺脑白质营养不良以及异染性脑白质营养不良。在一些情况下，基因修饰的自体造血干细胞的移植可用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：遗传血液疾病或病症、原发性免疫缺陷、遗传代谢性病症、镰状细胞病、β-地中海贫血重症、范可尼贫血、原发性HLH、SCID(例如新生儿SCID)、慢性肉芽肿病、维-奥二氏综合症、贺勒氏综合征、圣菲利柏病(Sanfilippo disease)、X-肾上腺脑白质营养不良以及异染性脑白质营养不良。
在一些情况下，造血干细胞包含在组合物内。因此，在一些情况下，本文所描述的方法或医学用途是用于使受试者准备使用包含造血干细胞或大体上由其组成的组合物进行移植。组合物可为药物组合物并且可包含如本文所描述的药学上可接受的载体。在一些情况下，受试者随后施用或打算随后施用造血干细胞、造血干细胞群体或包含造血干细胞的组合物，其中造血干细胞为如本文所描述的同种异体、自体或基因修饰的自体造血干细胞。在一些情况下，本文所描述的方法或医学用途还包括向受试者施用造血干细胞，所述造血干细胞可为如本文所描述的同种异体、自体或基因修饰的自体造血干细胞。在一些情况下，本文所描述的方法或医学用途还包括向受试者施用造血干细胞群体，所述造血干细胞可为本文所描述的同种异体、自体或基因修饰的自体造血干细胞如。在一些情况下，本文所描述的方法或医学用途还包括向受试者施用包含造血干细胞和任选的药学上可接受的载体的组合物，其中造血干细胞为如本文所描述的同种异体、自体或基因修饰的自体造血干细胞。在一些情况下，所施用的造血干细胞植入受试者的靶组织中。优选地，所述靶组织为骨髓。
本公开还提供了一种在受试者中植入干细胞的方法，所述方法包括(a)向受试者施用有效量的如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物；以及(b)向受试者(优选向受试者的靶组织)施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。在一些情况下，本公开提供了一种在受试者中植入干细胞的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物；其中受试者随后施用(或打算随后施用)(优选向受试者的靶组织施用)干细胞群体，其中所施用的干细胞群体将植入受试者的靶组织中。在一些情况下，本公开提供了一种供在在受试者中植入干细胞的方法中使用的如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物，所述方法包括(a)向受试者施用有效量的如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物；以及(b)向受试者(优选向受试者的靶组织)施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。优选地，干细胞为造血干细胞，所述造血干细胞可为如本文所描述的同种异体、自体或基因修饰的自体造血干细胞。优选地，靶组织为骨髓。
在受试者中植入干细胞的方法可描述消耗或基本上消除(例如通过细胞杀伤作用)受试者的可能包含引起受试者的疾病或病症的突变或缺陷的自体干细胞，从而在骨髓干细胞壁龛中形成用于用健康干细胞置换受试者的自体干细胞的空间的过程。所述健康干细胞可来自健康供给者或可由已从受试者分离并且通过基因疗法处理以校正如上文所描述引起受试者的疾病或病症的缺陷或突变的干细胞产生。干细胞典型地为造血干细胞。干细胞群体可包含造血干细胞或大体上由其组成。在一些情况下，干细胞群体包含例如从健康供给者分离的外源性干细胞。在一些情况下，干细胞群体包含例如已进行基因修饰以校正疾病或遗传缺陷的受试者的自体干细胞。干细胞群体典型地包含健康或校正的干细胞，优选为健康或校正的造血干细胞。如上文所描述，健康干细胞，优选健康造血干细胞典型地来自健康供给者。校正的干细胞，优选校正的造血干细胞典型地来自受试者(即，为自体的)并且使用基因疗法进行离体处理以校正如上文所描述引起受试者的疾病或病症的缺陷或突变。健康或校正的干细胞典型地被移植至受试者中并且植入受试者的靶组织中。靶组织可为干细胞群体可被靶向的任何组织。靶组织优选为骨髓。因此，健康或校正的干细胞典型地为造血干细胞并且在移植后，整合至受试者骨髓中的造血系统中。
在一些优选情况下，在如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物已从受试者的靶组织清除或消散之后向受试者施用干细胞群体。这防止或降低了对所施用的干细胞群体的细胞毒性效应。因此，在一些情况下，在受试者的靶组织中如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物的浓度已降至不可检测的浓度之后向受试者施用干细胞群体。如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物从受试者的靶组织清除所必需的时间可使用本领域技术人员可获得的常规手段(例如通过检测受试者的靶组织中如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物的浓度)来确定。在一些情况下，在如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物已基本上从受试者的靶组织清除之后向受试者的靶组织施用干细胞群体。在一些情况下，“基本上清除”意味着受试者的靶组织中剩余的如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物的水平不诱导所移植的干细胞群体中的显著细胞死亡。举例来说，可在施用如本文所描述的抗CD45 PBDADC或组合物之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、21或更多天，优选至少1天，最优选至少2天向受试者的靶组织施用干细胞群体。施用如本文所描述的抗CD45 PBDADC或组合物与施用新的干细胞群体之间的时间过长将不合需要地使受试者暴露于持续时间延长的嗜中性粒细胞减少症。在一些情况下，可在施用如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物之后6至72小时、1至5天、1至7天或1至10天；优选约1至约7天向受试者(例如向受试者的靶组织)施用干细胞群体。
在一些情况下，本文所描述的方法或医学用途引起对受试者的靶组织的调理和干细胞的植入，并且在向受试者施用干细胞群体后四个月在受试者的靶组织(例如骨髓)中实现至少约5-100％供给者嵌合性，优选至少约50-100％，最优选至少约80-100％供给者嵌合性(即，来源于供给者的细胞百分比)。优选地，供给者嵌合性为完全的，即至少95％的供给者嵌合性。在一些情况下，供给者嵌合性为稳定高水平混合嵌合性，即至少50％的供给者嵌合性，所述嵌合性典型地为足以治病的。最优选地，供给者嵌合性为在骨髓样与淋巴样谱系两者中。所需的植入水平可取决于临床方案。对于血液学恶性肿瘤，至少约50-100％、优选至少约80-100％并且最优选完全供给者嵌合性为目标。对于非恶性病症，虽然完全供给者嵌合性仍为优选的，但混合嵌合性(例如30-70％，优选50-70％的供给者嵌合性)常常为有疗效的。有疗效所需的供给者嵌合性水平可取决于疾病。举例来说，对于稳定血红蛋白病，骨髓样谱系中30％的供给者嵌合性可为有疗效的；对于原发性免疫缺陷，甚至10-20％的供给者嵌合性也可为足够的。在一些情况下，本文所公开的包括向受试者移植基因修饰的自体造血干细胞例如用于基因疗法的方法或医学用途可在血液中在相关细胞谱系(例如骨髓样和/或淋巴样)中产生0.1-10个拷贝/细胞、优选0.5-4个拷贝/细胞以及最优选1-2个拷贝/细胞的病毒拷贝数。在一些情况下，本公开的方法引起对受试者的靶组织的调理和干细胞的植入，并且对根据本文所描述的方法治疗的受试者实现至少50％、优选至少60％、最优选至少80％的植入率。本文所描述的方法和组合物可提供增强或改善的植入效率，即所施用的干细胞群体(例如HSC)植入所调理的受试者靶组织(例如骨髓)中的效率。
受试者可为哺乳动物，最优选为人。受试者可患有、可已被诊断为患有或可疑似患有可通过造血干细胞移植治疗的疾病或病症。在一些情况下，受试者可患有、可已被诊断为患有或可疑似患有可通过基因疗法，任选使用造血干细胞移植治疗的疾病或病症。在一些情况下，受试者患有、已被诊断为患有或疑似患有癌症，优选为血液学癌症。在一些情况下，受试者患有、已被诊断为患有或疑似患有急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及霍奇金氏病。在一些情况下，受试者患有、已被诊断为患有或疑似患有非恶性疾病、病症或疾患。在一些情况下，受试者患有、已被诊断为患有或疑似患有选自由以下组成的组的病症或疾病：重度再生障碍性贫血或其他骨髓衰竭病症(诸如范可尼贫血、先天性角化不良、舒-戴二氏综合征、重度先天性嗜中性粒细胞减少症、戴-布二氏贫血)、原发性免疫缺陷(诸如SCID(例如新生儿SCID)、慢性肉芽肿病、维-奥二氏综合症、CD40配体缺陷、XLP、MHCII类缺陷、原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症)、血红蛋白病(优选输注依赖性血红蛋白病，诸如镰状细胞病、β-地中海贫血重症)、遗传代谢性疾病(诸如贺勒氏综合征、X连锁肾上腺脑白质营养不良、α甘露糖苷贮积症、骨硬化病、异染性脑白质营养不良、圣菲利柏病)或自体免疫病症(诸如多发性硬化、系统性硬化、幼年炎性关节炎、系统性红斑狼疮)。
在本公开的方法或医学用途中，受试者可为化疗难治的(即不能用化学疗法治疗，受试者患有对化学疗法(诸如传统化学疗法)不敏感的癌症)。在一些情况下，受试者为禁忌使用化学疗法和/或放射疗法的。在一些情况下，受试者具有免疫缺陷，任选为先天性免疫缺陷或获得性免疫缺损。在一些情况下，受试者具有预先存在的器官毒性(即对常规调理方案来说病得太重)、感染、自体免疫疾病、DNA或端粒修复病症，或不到1岁。在一些情况下，受试者为成年人。在一些情况下，受试者超过12岁，优选超过15岁，或最优选超过20岁。在一些情况下，受试者为免疫活性的，即不为免疫缺陷的。
本文所描述的使受试者准备进行造血干细胞移植的方法以及在受试者中植入干细胞的方法可用于治疗恶性疾病或病症。在一些情况下，恶性疾病或病症由表达CD45的细胞引起。在一些情况下，恶性疾病或病症为癌症。在优选情况下，恶性疾病或病症为血液学癌症。在一些情况下，恶性疾病或病症选自由以下组成的组：急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及霍奇金氏病。
本文所描述的使受试者准备进行造血干细胞移植的方法以及在受试者中植入干细胞的方法可用于治疗非恶性疾病、病症或疾患。在一些情况下，非恶性疾病、病症或疾患由表达CD45的细胞引起。在一些情况下，非恶性疾病、病症或疾患可选自由以下组成的组：重度再生障碍性贫血或其他骨髓衰竭病症(诸如范可尼贫血、先天性角化不良、舒-戴二氏综合征、重度先天性嗜中性粒细胞减少症、戴-布二氏贫血)、原发性免疫缺陷(诸如SCID、新生儿SCID、慢性肉芽肿病、维-奥二氏综合症、CD40配体缺陷、XLP、MHC II类缺陷、原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症)、输注依赖性血红蛋白病(诸如镰状细胞病、β-地中海贫血重症)、遗传代谢性疾病(诸如贺勒氏综合征、X连锁肾上腺脑白质营养不良、α甘露糖苷贮积症、骨硬化病、异染性脑白质营养不良、圣菲利柏病)或自体免疫病症(诸如多发性硬化、系统性硬化、幼年炎性关节炎、系统性红斑狼疮)。在一些优选情况下，本文所描述的使受试者准备进行造血干细胞移植的方法以及在受试者中植入干细胞的方法可用于治疗血红蛋白病变、范可尼贫血、慢性肉芽肿病和/或贺勒氏综合征。在一些最优选情况下，本文所描述的使受试者准备进行造血干细胞移植的方法以及在受试者中植入干细胞的方法可用于治疗镰状细胞贫血、β-地中海贫血和/或SCID(例如新生儿SCID)。
在本文所描述的治疗方法和医学用途中，如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物优选通过肠胃外施用进行施用。在本公开的方法和医学用途中，抗体、缀合物或组合物的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。
在本文所描述的治疗方法和医学用途中，如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物的适当剂量将例如取决于要治疗的疾病、受试者群组以及个别受试者的要求，但熟练人员将能够容易地确定适合的剂量方案。如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物可以单个剂量以一次连续施用或以多个剂量经一系列分开施用向受试者施用。如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物可在一天中向受试者施用一次。适合的初始剂量可为约1μg/kg至15mg/kg。适合的日剂量可在每千克受试者体重约1μg至100mg范围内。示例性剂量可在每千克受试者体重约0.1mg至约10mg范围内。在施用多个剂量的一些情况下，这些剂量可历经1周、2周、3周、4周、2个月、4个月、8个月、12个月、18个月、2年、3年、5年或更久的时间以分开施用的形式施用；优选在以多个剂量施用如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物的情况下，所述多个剂量历经2-4周的时间施用。示例性投用方案包含施用约4mg/kg的初始加载剂量，随后每周、两周或三周施用其他剂量的如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物的过程。可用其他给药方案。
组合疗法
如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或组合物可在本文所描述的本公开的方法和医学用途(即使受试者准备进行造血干细胞移植的方法以及在受试者中植入干细胞的方法)中组合使用。以上对本公开的方法或医学用途的其他特征的公开内容同样适用于如下文所描述使用抗CD45 PBD ADC的组合的本公开的方法或医学用途。
本公开还提供了一种使受试者准备进行造血干细胞移植的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC和如本文所描述的第二不同抗CD45 PBD ADC。本公开还提供了一种使受试者准备进行造血干细胞移植的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC，其中受试者已施用、正在施用或将施用如本文所描述的第二不同抗CD45 PBD ADC。
本公开还提供了一种供在使受试者准备进行造血干细胞移植的方法中使用的如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC和如本文所描述的第二不同抗CD45 PBD ADC，其中所述方法包括向有需要的受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。本公开还提供了一种供在使受试者准备进行造血干细胞移植的方法中使用的如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC，其中所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所描述的第一抗CD45 PBDADC和第二不同抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，第一抗CD45 PBD ADC可为如本文所描述的包含YTH24.5组的抗体的ADC，并且第二ADC可为如本文所描述的包含YTH54.12组的抗体的ADC。在一些情况下，第一抗CD45 PBD ADC可为如本文所描述的包含YTH54.12抗体组的抗体的ADC，并且第二抗CD45 PBD ADC可为如本文所描述的包含YTH24.5抗体组的抗体的ADC。
在一些情况下，在相同药物组合物内向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在另外一些优选情况下，以两种单独药物组合物的形式向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，同时向受试者施用第一抗CD45PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在向受试者施用抗CD45PBD ADC抗体之前向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在即将向受试者施用第二抗CD45 PBDADC之前向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在向受试者施用第二抗CD45PBD ADC之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48或72小时，优选之前至少1小时向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在向受试者施用第二抗CD45 PBD ADC之前至少1、2、3、4、5、7、10、14、21、28、35、42或49天，优选之前至少1天向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些优选情况下，在同一天依序向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。
本公开还提供了一种在受试者中植入干细胞的方法，所述方法包括(a)向受试者施用有效量的如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC和如本文所描述的第二不同抗CD45PBD ADC；以及(b)向受试者(优选受试者的靶组织)施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。本公开还提供了一种在受试者中植入干细胞的方法，所述方法包括(a)向受试者施用有效量的如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC，其中受试者已施用、正在施用或将施用有效量的如本文所描述的第二不同抗CD45 PBD ADC；以及(b)向受试者(优选受试者的靶组织)施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。本公开还提供了一种在受试者中植入干细胞的方法，所述方法包括(a)向受试者施用有效量的如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC，其中(i)受试者已施用、正在施用或将施用有效量的如本文所描述的第二不同抗CD45 PBD ADC；并且(ii)受试者将(优选向受试者的靶组织)施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。
本公开还提供了一种供在在受试者中植入干细胞的方法中使用的如本文所描述的第一抗CD45 PBD ADC和如本文所描述的第二不同抗CD45 PBD ADC，其中所述方法包括(a)向受试者施用有效量的第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC；以及(b)向受试者(优选受试者的靶组织)施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。本发明还提供了一种供在在受试者中植入干细胞的方法中使用的本发明的第一抗CD45PBD ADC，其中所述方法包括(a)向受试者施用有效量的第一抗CD45 PBD ADC和有效量的如本文所描述的第二不同抗CD45 PBD ADC；以及(b)向受试者(优选受试者的靶组织)施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。
在一些情况下，第一抗CD45 PBD ADC可为如本文所描述的包含YTH24.5抗体组的抗体的ADC，并且第二抗CD45 PBD ADC可为如本文所描述的包含YTH54.12抗体组的抗体的ADC。在一些情况下，第一抗CD45 PBD ADC可为如本文所描述的包含YTH54.12抗体组的抗体的ADC，并且第二ADC可为如本文所描述的包含YTH24.5抗体组的抗体的ADC。在一些情况下，在相同药物组合物内向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在另外一些优选情况下，以两种单独药物组合物的形式向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，同时向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBDADC。在一些情况下，在向受试者施用第二抗CD45 PBD ADC之前向受试者施用第一抗CD45PBD ADC。在一些情况下，在即将向受试者施用第二抗CD45 PBD ADC之前向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在向受试者施用第二抗CD45 PBD ADC之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48或72小时，优选之前至少1小时向受试者施用第一抗CD45PBD ADC。在一些情况下，在向受试者施用第二抗CD45 PBD ADC之前至少1、2、3、4、5、7、10、14、21、28、35、42或49天，优选之前至少1天向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在同一天依序向受试者施用第一抗CD45 PBD ADC和第二抗CD45 PBD ADC。在一些情况下，在施用第一抗CD45 PBD ADC和/或第二抗CD45 PBD ADC之后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、21或更多天，优选至少1天，最优选至少2天向受试者施用干细胞群体。在一些情况下，在施用第一抗CD45 PBD ADC和/或第二抗CD45 PBD ADC之后6至72小时、1至5天、1至7天或1至10天；优选1至7天向受试者施用干细胞群体。
本公开的方法和医学用途(即使用如本文所公开的单个抗CD45 PBD ADC或药物组合物的那些治疗方法或使用如本文所公开的抗CD45 PBD ADC或药物组合物的两种物质的组合的那些方法)还可包括施用一种或多种其他治疗剂。举例来说，所述方法还可包括向受试者施用一种或多种用于骨髓抑制的剂和/或用于免疫抑制的剂。在一些情况下，所述方法还可包括向受试者施用阿仑单抗、氟达拉滨和/或环磷酰胺中的一者或多者。在一些情况下，所述方法还可包括向受试者施用白消安、曲奥舒凡、噻替派、全身照射中的一者或多者。或者，在一些情况下，所述方法不包括施用其他用于骨髓抑制的剂和/或用于免疫抑制的剂。在一些情况下，所述方法还可包括施用治疗有效量的一种或多种化学治疗剂。举例来说，在一些情况下，所述方法还可包括向受试者施用以下中的一者或多者：柔红比星、伊达比星、米托蒽醌、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、吉妥珠单抗、5-氮杂胞苷、羟基脲、米哚妥林、长春新碱、类固醇、多柔比星、天冬酰胺酶、环磷酰胺、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、奈拉滨、达雷木单抗、美法仑、沙利度胺、来那度胺、硼替佐米、泊马度胺、卡非佐米、苯达莫司汀、卡莫司汀(双氯乙基亚硝基脲，BCNU)、顺铂、卡铂、利妥昔单抗、奥法木单抗、奥妥珠单抗、依鲁替尼、伊德利塞或本妥昔单抗。在此类情况下，可将其他剂与如本文所描述的抗CD45 PBD ADC或药物组合物同时施用。在一些情况下，可在一种或多种其他剂之前、之后或同时施用如本文所公开的抗CD45PBD ADC或药物组合物。可将如本文所公开的抗CD45 PBD ADC或药物组合物与例如细胞毒性剂、抗癌剂、肿瘤靶向抗体、目标疗法、路径抑制剂、免疫抑制剂或骨髓抑制剂组合或依序施用。在一些情况下，所述方法还可包括向受试者施用局部辐射和/或化学疗法。在一些情况下，所述方法不包括向受试者施用阿仑单抗(抗CD52抗体)或ATG(抗胸腺细胞球蛋白)。在一些情况下，所述方法不包括向受试者施用氟达拉滨。在一些情况下，所述方法不包括向受试者施用用于免疫抑制的低剂量环磷酰胺。在一些情况下，所述方法不包括向受试者施用阿仑单抗、ATG、氟达拉滨以及用于免疫抑制的低剂量环磷酰胺。在其中如本文所公开的抗CD45 PBD ADC或药物组合物用于在受试者中植入干细胞或用于使受试者准备进行基因疗法或进行使用含有造血干细胞的制剂的移植的方法中的一些情况下，可将一种或多种抗CD45 PBD ADC与放射疗法、化学疗法(诸如白消安、曲奥舒凡、美法仑以及其他物质)、免疫抑制剂(诸如氟达拉滨、环磷酰胺、阿仑单抗或其他物质)、抗微生物剂剂(例如抗病毒、抗真菌或抗细菌剂)、GvHD预防(诸如甲氨蝶呤、环孢菌素、他克莫司和/或其他物质)或GvHD治疗(诸如糖皮质激素、依鲁替尼、ECP、鲁索替尼英夫利昔单抗、西罗莫司或其他物质)组合施用。在本文所描述的治疗方法或医学用途的一些情况下，在一种或多种抗体或抗体药物缀合物(i)之前、(ii)与其同时和/或(iii)在其之后，优选与其同时和/或在其之后，最优选在其之后施用此类其他剂。
其他治疗实施方案
在一个方面中，本公开提供了一种在造血干细胞移植之前对受试者进行处理的方法，所述方法包括向受试者施用抗CD45 ADC。
本公开还提供了一种用于向受试者施用的组合物，所述组合物包含抗CD45 ADC。此类组合物适当时可含有药学上可接受的媒介物或赋形剂。
本公开还提供了抗CD45 ADC在用于在造血干细胞移植之前对受试者进行处理的药剂的制备中的用途。
在一个方面中，本公开提供了一种用于消融所选细胞群体并且对受试者的组织进行调理以便进行植入或移植(例如对人受试者进行调理以便进行造血干细胞移植)的方法。在某些实施方案中，本文公开的方法和组合物为非清髓性的。
通常，在要通过同种异体移植治疗的增生性疾病中，需要尽可能减少受试者体内免疫效应细胞的数目，优选将其完全消除。在此方面中，CD45用作靶抗原可为本文所公开的疗法的优势，因为CD45不限于T细胞：举例来说，它还在NK细胞、淋巴细胞以及单核细胞上表达。因此，本文所公开的抗CD45 ADC的广谱细胞杀伤作用使移植排斥最小化。
有利地，由于特异性地并且有效地靶向CD45+ve细胞，本文所公开的方法、分析以及组合物在诸如胸腺等组织中不引起显著的通常与传统调理方法(诸如照射)相关的‘非靶标’和/或‘脱靶’毒性。举例来说，相对于传统非靶向或最低限度靶向调理方案，在某些实施方案中，本文所公开的组合物和方法不诱导嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血，而是产生具有治疗关联性的稳定、混合嵌合性。换句话说，在某些实施方案中，本文所公开的方法和组合物能够选择性地消融或消耗靶组织(例如骨髓组织)的内源性干细胞壁龛，而不消耗或消融内源性嗜中性粒细胞或髓样细胞。在某些实施方案中，本文所公开的方法和组合物使得成熟内源性嗜中性粒细胞增加。在某些情况下，本文所公开的方法和组合物不消耗或消融内源性血小板。在其他实施方案中，本文所公开的方法和组合物不诱导受试者的贫血。可使用此类组合物和方法来例如校正、医治或以其他方式改善受影响的受试者的一种或多种疾病。
在某些实施方案中，本文公开了对受试者或受试者的靶组织进行调理以便进行植入的方法，此类方法包括通过向受试者施用有效量的抗CD45 PBD ADC选择性地消耗或消融受试者靶组织中的内源性干细胞(例如造血干细胞、HSC)或祖细胞(例如造血祖细胞、HPC)群体。典型地，一定比例的ADC由内源性干细胞群体内化，从而消耗或消融靶组织中的内源性干细胞群体并且对受试者进行调理以便植入所移植的细胞或细胞群体。
本文还公开了在受试者中植入干细胞的方法，此类方法包括：(a)向受试者施用有效量的抗CD45 PBD ADC，其中典型地ADC由内源性干细胞(例如造血干细胞)或祖细胞群体内化，从而选择性地消耗或消融受试者靶组织中的内源性干细胞群体；以及(b)向受试者的靶组织施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。
在某些情况下，本文还公开了治疗受试者的干细胞病症的方法，此类方法包括：(a)向受试者施用有效量的抗CD45 PBD ADC，其中典型地ADC由受试者的靶组织中的内源性干细胞(例如造血干细胞)或祖细胞群体内化，从而消耗或消融受试者靶组织中的内源性干细胞或祖细胞群体；以及(b)向受试者的靶组织施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入受试者的靶组织中。
可使用本文所公开的方法和组合物对受试者的组织(例如骨髓)进行调理以便进行植入或移植，并且在此类调理之后，向受试者的靶组织施用干细胞群体。在某些情况下，干细胞群体包含同种异体干细胞群体。在一些实施方案中，干细胞群体包含受试者的自体干细胞(例如已进行基因修饰以校正疾病或遗传缺陷的自体干细胞)。
在某些实施方案中，本文所公开的方法和组合物使得粒细胞集落刺激因子(GCSF)增加。在某些情况下，本文所公开的方法和组合物使得巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)增加。在某些实施方案中，本文所公开的方法和组合物使得内源性髓样细胞增加。不希望受任何特定理论或作用机制限制，在施用本文所公开的抗CD45 PBD ADC之后可能因受试者的内源性GCSF和/或MCSF增加而出现所观测到的内源性髓样细胞增加。因此，在某些实施方案中，因可能在本文所公开的方法和组合物之后发生的粒细胞集落刺激因子(GCSF)和/或巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)增加而出现此类内源性髓样细胞增加。在某些情况下，本文所公开的方法和组合物不消耗或消融内源性淋巴样细胞。
在某些情况下，在根据本文所公开的方法和组合物对受试者的靶组织进行调理之后，受试者的先天免疫被保留。在某些情况下，在根据本文所公开的方法和组合物对受试者的组织进行调理之后，受试者的获得性免疫被保留。在某些实施方案中，本文所公开的方法和组合物保留受试者的胸腺完整性。类似地，在一些实施方案中，本文所公开的方法和组合物保留受试者的血管完整性。
可使用本文所公开的方法和组合物对骨髓组织进行调理。在某些情况下，本文公开的抗CD45 PBD ADC可用于非清髓性调理，例如造血干细胞移植前的骨髓调理。
可使用本文所公开的方法和组合物对受试者的任何数目的靶组织，包括例如骨髓组织进行调理。如本文所用，术语“靶组织”通常指受试者中本文所公开的组合物和方法可选择性地靶向的任何组织。在某些实施方案中，此类靶组织包含内源性HSC或祖细胞群体(例如骨髓组织的干细胞壁龛)。在某些实施方案中，靶组织为或包含受试者的骨髓组织。
在某些情况下，本公开的组合物和方法可用于在受试者中进行非清髓性调理，例如造血干细胞或祖细胞移植前的骨髓调理。通过选择性地靶向CD45，本文所公开的预调理方法使有害作用的发生率和严重性最小化。举例来说，有害作用的发生率和严重性通常与传统调理方案相关，诸如粘膜炎，所述有害作用的发生率和严重性可最小化或在某些情况下被消除。类似地，使用本文所公开的方法和组合物对受试者进行调理使危及生命的血小板减少症、嗜中性粒细胞减少症以及红血细胞损失的发生率最小化，所有这些通常与传统调理方法相关，传统调理方法常常需要照射与细胞毒性药物两者。因此，在某些情况下，本文公开的组合物和方法被表征为非清髓性的。
治疗的量和时间过程取决于功效，功效可例如通过循环白血病细胞的数目或其他适合的指示物来评估。如果例如归因于补体C'活化，治疗使得细胞快速溶解，那么缓慢的施用速率为优选的。如果效应机制为相对慢的，例如几乎没有补体介导的溶解，那么更快的施用可为优选的。
抗体的施用可为在生理盐水或葡萄糖溶液或其他生理学上可接受的溶液中进行的。
术语
如本文所用，术语“干细胞”是指可分化成各种类型的细胞并且无限增殖以产生更多相同干细胞的未分化或部分分化的细胞。典型地，干细胞为细胞谱系中最早的细胞类型并且根据它们能够形成多种细胞类型(多能)以及它们能够自我更新来定义。如本文所用，“造血干细胞”是指可分化成造血谱系并且产生包括骨髓样(例如单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)以及淋巴样谱系(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的所有血细胞类型(诸如白血细胞和红血细胞)的干细胞。人造血干细胞可例如通过细胞表面标记物(诸如CD34+、CD90+、CD49f+、CD38以及CD45RA-)来鉴定。鼠造血干细胞可例如通过细胞表面标记物(诸如CD34-、CD133+、CD48-、CD150+、CD244-、cKit+、Seal+)以及缺乏谱系标记物(对B220、CD3、CD4、CD8、Macl、Grl以及Terl 19等来说为阴性)来鉴定。本文所描述的组合物和方法可用于消耗或消融任何干细胞，包括但不限于外周血干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、基因修饰的干细胞等。
如本文所用，术语“造血祖细胞”涵盖多能细胞，所述多能细胞定向至造血细胞谱系，通常不自我更新，并且能够分化成造血系统的若干细胞类型，诸如粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞、B细胞以及T细胞，包括但不限于短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞(MPP)、普通骨髓样祖细胞(CMP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)、巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)以及定向淋巴样祖细胞(CLP)。可在完全甲基纤维素分析中以集落形成单位细胞(CFU-C)的形式在功能上或使用本领域技术人员已知的分析通过检测细胞表面标记物(例如CD45、CD34+、Terl 19-、CD16/32、CD127、cKit、Seal)在表型上确定造血祖细胞的存在。
如本文所用，术语“消融(ablate和ablation)”通常指从靶组织(例如受试者的骨髓组织)部分或完全移除细胞(例如造血干细胞或祖细胞)群体。在某些情况下，此类消融包括从靶组织完全移除或消耗此类细胞。或者，在其他情况下，此类消融为从靶组织部分移除或消耗此类细胞(例如HSC或祖细胞)。举例来说，在某些情况下，本文所公开的方法和组合物使得靶组织的细胞(例如HSC或祖细胞)消耗至少约5％、10％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％。
如本文所用，术语“内化(internalized和internalization)”通常意味着剂和/或毒素被引入或以其他方式到达靶组织(例如骨髓)的一个或多个细胞(例如HSC或祖细胞)的细胞内区室。举例来说，剂和/或毒素可经由受体介导的方法(例如内吞方法)到达细胞的细胞内区室，其中细胞将仅在结合至特定受体后接受细胞外剂和/或毒素。在某些情况下，本文公开的剂和/或毒素由内源性干细胞(例如HSC)或祖细胞群体以至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的比率内化。
本文所用，术语“有效量”可理解为意指本公开的抗CD45 PBD ADC或药物组合物足以具有所需效应的量。典型地，它为足以消耗或基本上消除受试者的自体造血干细胞群体的量。熟练开业医师能够容易地确定有效量。
在一些实施方案中，有效量的本文所公开的ADC实现最大干细胞消耗(例如从受试者的靶组织消耗约90％、91％、92％、20 93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％、99.5％或更多的造血或祖细胞干细胞)。在一些实施方案中，根据受试者的体重来确定本文所公开的ADC的有效量。举例来说，在某些情况下，本文所公开的ADC的此类有效量为或包含介于约200-1mg/kg之间的一个或多个剂量。
包括其他形式
除非另外规定，否则在上文中包括这些取代基的熟知的离子、盐、溶剂合物以及受保护形式。举例来说，提到羧酸(-COOH)还包括其阴离子(羧酸根)形式(-COO-)、盐或溶剂合物以及常规受保护形式。类似地，提到氨基包括氨基的质子化形式(-N+HR1R2)、盐或溶剂合物(例如盐酸盐)以及氨基的常规受保护形式。类似地，提到羟基还包括其阴离子形式(-O-)、盐或溶剂合物以及常规受保护形式。
盐
制备、纯化和/或处理活性化合物的对应盐，例如药学上可接受的盐可为方便的或理想的。Berge等,J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中论述了药学上可接受的盐的实例。
举例来说，如果化合物为阴离子的或具有可为阴离子的官能团(例如-COOH可为-COO-)，那么可与适合的阳离子形成盐。适合的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子，诸如Na+和K+；碱土金属离子，诸如Ca2+和Mg2+；以及其他阳离子，诸如Al+3。适合的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些适合的取代的铵离子的实例为来源于以下的那些取代的铵离子：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苯甲胺、苯基苯甲胺、胆碱、葡甲胺和缓血酸胺以及氨基酸，诸如赖氨酸和精氨酸。常见季铵离子的实例为N(CH3)4 +。
如果化合物为阳离子的或具有可为阳离子的官能团(例如-NH2可为-NH3 +)，那么可与适合的阴离子形成盐。适合的无机阴离子的实例包括但不限于来源于以下无机酸的那些无机阴离子：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸以及亚磷酸。
适合的有机阴离子的实例包括但不限于来源于以下有机酸的那些有机阴离子：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸以及戊酸。适合的聚合有机阴离子的实例包括但不限于来源于以下聚合酸的那些聚合有机阴离子：单宁酸、羧甲基纤维素。
溶剂合物
制备、纯化和/或处理活性化合物的对应溶剂合物可为方便的或理想的。术语“溶剂合物”在本文中以常规意义使用，用于指溶质(例如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果溶剂为水，那么溶剂合物可方便地称为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。
本公开包括溶剂添加跨越PBD部分的亚胺键的化合物，下文对此进行说明，其中溶剂为水或醇(RAOH，其中RA为C1-4烷基)：
这些形式可称为PBD的甲醇胺和甲醇胺醚形式(如上文在关于R10的章节中所描述)。这些等式的平衡取决于发现化合物的条件以及所述部分本身的特性。
这些特定化合物可例如通过冻干以固体形式分离。
异构体
本公开的某些化合物可以一种或多种特定的几何、光学、对映异构体、非对映异构体、差向异构体、阻转异构体、立体异构体、互变异构体、构象或端基异构体形式存在，包括但不限于顺式和反式形式；E形式和Z形式；c形式、t形式和r形式；内形式和外形式；R形式、S形式和内消旋形式；D形式和L形式；d形式和l形式；(+)和(-)形式；酮基形式、烯醇形式和烯醇化物形式；顺式形式和反式形式；顺错形式和反错形式；α形式和β形式；轴向形式和平伏形式；船式、椅式、扭转式、信封式和半椅式；以及它们的组合，在下文中统称为“异构体”(或“异构体形式”)。
术语“手性”是指具有镜像配偶体不可重叠特性的分子，而术语“非手性”是指在镜像配偶体上可重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但关于原子或基团在空间上的排列不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且分子不为彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性以及反应性。可以高分辨率分析程序(诸如电泳和色谱法)对非对映异构体的混合物进行分离。
“对映异构体”是指化合物的彼此为不可重叠的镜像的两个立体异构体。
本文中所用的立体化学定义和惯例总体上遵循S.P.Parker编,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；以及Eliel,E.和Wilen,S.,“Stereochemistry of Organic Compounds”,John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994。本公开的化合物可含有不对称或手性中心，并且因此以不同的立体异构体形式存在。本公开的化合物的所有立体异构体形式(包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及它们的混合物，诸如外消旋混合物)旨在形成本公开的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子关于其一个或多个手性中心的绝对构型。使用前缀d和l或(+)和(-)来指定由化合物引起的平面偏振光的旋转的符号，其中(-)或l意指化合物为左旋的。前缀为(+)或d的化合物为右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体为相同的，除了它们为彼此的镜像。特定的立体异构体也可称为对映异构体，并且经常将此类异构体的混合物称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，外消旋混合物或外消旋体可在不具有立体选择性或立体特异性的化学反应或过程中产生。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种对映异构体物质的没有光学活性的等摩尔混合物。
注意，除了如下文关于互变异构体形式所论述，从如本文所用的术语“异构体”特别排除了结构(或构造)异构体(即差异在于原子之间的连接而不仅在于原子在空间中的位置的异构体)。举例来说，提到甲氧基-OCH3不应解释为提到其结构异构体羟甲基-CH2OH。类似地，提到邻氯苯基不应解释为提到其结构异构体间氯苯基。然而，提到一类结构很可能包括在所述类型的范围内的结构异构体形式(例如C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基以及叔丁基；甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基以及对甲氧基苯基)。
以上排除不涉及如例如以下互变异构体对中的互变异构体形式(例如酮基形式、烯醇形式以及烯醇化物形式)：酮/烯醇(以下说明)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮基以及硝基/异硝基。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能量势垒可相互转化的不同能量的结构异构体。举例来说，质子互变异构体(也称为质子性互变异构体)包括经由质子迁移的相互转化，诸如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。化合价互变异构体包括通过一些成键电子的重组发生的相互转化。
注意，术语“异构体”特别地包括具有一个或多个同位素取代的化合物。举例来说，H可呈任何同位素形式，包括1H、2H(D)以及3H(T)；C可呈任何同位素形式，包括12C、13C以及14C；O可呈任何同位素形式，包括16O和18O；等。
可合并至本公开的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟以及氯的同位素，诸如但不限于2H(氘，D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl以及125I。本公开的各种同位素标记化合物，例如其中合并了诸如3H、13C、14C等放射性同位素的那些同位素标记化合物。此类同位素标记化合物可用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术(诸如正电子发射断层成像术(PET)或单光子发射计算机断层成像术(SPECT))，包括药物或底物组织分布分析；或用于受试者的放射性治疗中。本公开的氘标记或取代的治疗性化合物可具有改善的DMPK(药物代谢和药代动力学)特性，DMPK特性涉及分布、代谢以及排泄(ADME)。用更重的同位素(诸如氘)取代可提供因更大的代谢稳定性产生的某些治疗优点，例如体内半衰期增加或剂量需求降低。18F标记的化合物可用于PET或SPECT研究。可大体上通过用容易获得的同位素标记试剂取代非同位素标记试剂进行下文所描述的方案或实施例和制备中所公开的程序来制备本公开的同位素标记化合物和其前药。另外，用更重的同位素(特别是氘，即2H或D)取代可提供由更大的代谢稳定性产生的某些治疗优点，例如体内半衰期增加或剂量需求降低或治疗指数改善。应理解，上下文中的氘被视为取代基。这种更重同位素(尤其是氘)的浓度可通过同位素富集因子来确定。在本公开的化合物中，未具体指定为特定同位素的任何原子意在代表所述原子的任何稳定同位素。
除非另外指明，否则提到特定化合物包括所有此类异构体形式，包括它们的(全部或部分)外消旋混合物和其他混合物。用于制备(例如不对称合成)和分离(例如分级结晶和色谱手段)此类异构体形式的方法为本领域中已知的，或通过以已知方式调整本文所教示的方法或已知方法而容易获得的。
用途
可使用本公开的缀合物在目标位置提供PBD化合物。
目标位置优选为CD45+靶细胞，包括血液学肿瘤与造血干细胞两者。
在一个实施方案中，与存在于增殖细胞群体(例如肿瘤细胞群体)中的抗原的量相比，在非增殖细胞群体中抗原不存在或以降低的水平存在。
在目标位置，接头可裂解以便释放PBD化合物，诸如RelA。因此，可使用缀合物选择性地向目标位置提供化合物RelA。
接头可由存在于目标位置的酶裂解。
目标位置可为体外、体内或离体。
本公开的抗体-药物缀合物(ADC)化合物包括具有抗癌活性效用的那些抗体-药物缀合物化合物。特别地，化合物包括通过接头与PBD药物部分(即毒素)缀合(即共价连接)的抗体。当药物未与抗体缀合时，PBD药物具有细胞毒性作用。因此，通过与抗体缀合来调节PBD药物部分的生物活性。本公开的抗体-药物缀合物(ADC)选择性地将有效剂量的细胞毒性剂递送至肿瘤组织，由此可实现更大的选择性，即更低的有效剂量。
因此，在一个方面中，本公开提供了一种如本文所描述的供在治疗中使用的缀合物化合物。
在准备进行造血干细胞移植以治疗对此类疗法敏感的非增生性疾病(诸如非恶性疾病)的情况下，本文涵盖的疗法可包括抗体治疗，(A)以移除骨髓中至少一定比例的干细胞，(B)并且在大多数情况下从移植接受者移除(残余)免疫活性细胞以降低排斥风险。
在增生性疾病，特别是增生性血液病的情况下，所述疗法还具有移除增殖性(例如白血病)细胞的目的和效应(C)。
天然地，效应(B)在以其他方式对应的自体移植中没有作用。在用于增生性疾病(诸如恶性疾病)的自体移植中，效应(A)和(C)为相关的。在基因改变的祖细胞的自体移植中，仅效应(A)为相关的。
因此，在各种实施方案中，目的可为通过移除造血细胞在骨髓中形成壁龛，同时移除能够产生移植排斥的免疫细胞。可专注于移除造血细胞，包括造血干细胞，并且在例如白血病中包括恶性细胞。
在一个方面中，本公开提供了一种用于在HSC移植之前对受试者进行预调理的如本文所描述的缀合物化合物。本发明疗法通常适用于治疗涉及造血干细胞移植的多种疾病。所移植的细胞可为自体的或同种异体的。
本公开的第一方面提供了缀合物化合物在用于治疗表达CD45的增生性疾病(诸如表达CD45的恶性疾病)的药剂的制造中的用途。在难治性/高风险血液学恶性肿瘤中，ADC可增强通过常规化学/放射疗法调理实现的细胞减少，因此在移植之前加强缓解并且降低复发的风险。恶性适应征的实例包括急性骨髓性白血病、骨髓发育不良、急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾患、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏病以及多发性骨髓瘤。CD45+ve急性骨髓性淋巴瘤(AML)的治疗为特别关注的。
本文公开的疗法还可适用于治疗非增生性疾病(诸如非恶性疾病)，其中同种异体造血干细胞的移植为有益的。通过同种异体干细胞移植可医治的疾患的实例包括原发性免疫缺陷(例如SCID、维-奥二氏综合症、慢性肉芽肿病、X连锁淋巴组织增生性疾病以及其他基因确定的联合免疫缺陷/自体免疫病症)、获得性和先天性(例如范可尼贫血、先天性角化不良、重度先天性嗜中性粒细胞减少症、舒-戴二氏综合征、戴-布二氏贫血)骨髓衰竭综合征、血红蛋白病(例如输注依赖性B-地中海贫血、镰状细胞病)、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、HIV/AIDS以及代谢性病症(例如粘多糖贮积症，诸如贺勒氏综合征、X连锁肾上腺脑白质营养不良以及骨硬化病)。
本文公开的疗法还可适用于治疗非增生性自体免疫疾病(诸如非恶性自体免疫疾病)，其中自体造血干细胞的移植为有益的。实例包括自体免疫病症系统性硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化以及幼年炎性关节炎。
本文公开的疗法还可适用于治疗遗传性病症，其中自体造血干细胞的基因疗法为有益的。此治疗可涉及已例如通过用携带所需表达产物的基因的病毒载体转导或通过使用例如TALEN或CRISPR技术的基因/碱基编辑进行基因操纵的自体HSC的移植。
举例来说，可以已知方式使用编码腺苷脱氨酶(ADA)或β-球蛋白基因的病毒载体将这些基因中的一个或两个基因分别插入来自具有ADA缺陷或血红蛋白病的受试者的HSC中。在调理疗法之后，基因校正的自体HSC的移植可对这些病症有疗效。
类似地，正在开发使用CRISPR技术的基因/碱基编辑来使BCL11A阻遏基因沉默，从而使γ-球蛋白能够表达以改善镰状细胞病和β-地中海贫血。
干细胞基因疗法的适应征的实例包括多种原发性免疫缺陷(ADA缺陷、γ-SCID、维-奥二氏综合症、X-CGD)、代谢性病症(例如X连锁肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、贺勒氏综合征)以及血红蛋白病(β-地中海贫血和镰状细胞病)。
为使基因疗法最有效，调理需要实现基因校正/编辑的自体HSC的植入。由于没有对非造血组织的脱靶毒性，本文所公开的ADC基本上加宽了这些技术的适用性，特别是在诸如镰状细胞贫血等疾病中，其中由于常规调理处理的毒性到此时为止存在有限的干细胞移植物摄入。
术语“增生性疾病”是有关体外或体内不需要的过量或异常细胞的不想要的或不受控制的细胞增殖，诸如赘生性或增生性生长。
增生性疾患的实例包括但不限于良性、恶化前以及恶性细胞增殖，包括但不限于赘瘤和肿瘤(例如淋巴瘤和白血病)。优选地，使用本文公开的ADC来加强血液学恶性肿瘤的缓解并且靶向HSC，从而在非恶性疾患中实现移植/基因疗法。
所关注的其他病症包括其中CD45过表达或其中CD45拮抗作用将提供临床益处的任何疾患。这些疾患可包括免疫病症或增生性疾病，诸如癌症，特别是转移性癌症。
本公开的抗体-药物缀合物(ADC)预期可用于治疗各种疾病或病症，例如以CD45(过)表达为特征的疾病或病症。示例性疾患或过度增生性病症包括良性或恶性肿瘤；白血病、血液病以及淋巴恶性肿瘤。其他包括神经元、胶质、星形细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、囊胚、炎性、血管生成以及免疫学(包括自体免疫性)病症。
通常，要治疗的疾病或病症为过度增生性疾病，诸如癌症。本文中要治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病或淋巴样恶性肿瘤。
本文所公开的组合物和方法可用于治疗或医治患有可受益于造血干细胞或祖细胞移植(包括例如自体、同种异体、基因修饰和基因疗法方法)的疾病(例如干细胞病症)(例如镰状细胞病)的受试者。如本文所用，短语“干细胞病症”泛指可通过对受试者的靶组织进行调理和/或通过消融靶组织中的内源性干细胞群体(例如从受试者的骨髓组织消融内源性HSC或祖细胞群体)和/或通过在受试者的靶组织中植入或移植干细胞来治疗或医治的任何疾病、病症或疾患。
在某些情况下，可使用本文所公开的抗CD45 PBD ADC来诱导实体器官移植耐受性(例如诱导关于肾脏移植的免疫原性耐受性)。在此类实施方案中，可使用本文所公开的ADC和方法从靶组织消耗或消融细胞群(例如从骨髓干细胞壁龛消耗HSC)。在此类从靶组织消耗细胞之后，可向移植接受者施用来自器官供给者的干细胞或祖细胞(例如来自器官供给者的HSC)的群体，并且在植入此类干细胞或祖细胞之后，实现短暂的稳定混合嵌合性，从而在不需要其他免疫抑制剂的情况下实现长期移植器官耐受性。
治疗方法
可将本公开的缀合物用于治疗方法中。还提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本公开的缀合物化合物。术语“治疗有效量”为足以显示对受试者的益处的量。此类益处可至少为至少一种症状的改善。实际施用量以及施用速率和时程将取决于治疗对象的性质和严重程度。治疗的处方(例如剂量的确定)在全科医师和其他医生的职责范围内。
本公开的化合物可单独或与其他治疗组合根据所要治疗的疾患同时或依序施用。治疗和疗法的实例包括但不限于化学疗法(施用活性剂，包括例如药物，诸如化学治疗剂)；手术；以及放射疗法。
“化学治疗剂”为可用于治疗癌症的化学化合物，无论作用机制如何。化学治疗剂的类别包括但不限于：烷化剂、抗代谢物、纺锤毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂以及激酶抑制剂。化学治疗剂包括在“靶向疗法”和常规化学疗法中使用的化合物。
化学治疗剂的实例包括：厄洛替尼(erlotinib)(Genentech/OSIPharm.)、多西他赛(docetaxel)(/>Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS号51-21-8)、吉西他滨(gemcitabine)(/>Lilly)、PD-0325901(CAS号391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺-二胺、二氯铂(II)，CAS号15663-27-1)、卡铂(CAS号41575-94-4)、帕西他赛(paclitaxel)(/>Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(/>Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS号85622-93-1，/> Schering Plough)、他莫昔芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，)以及多柔比星/>Akti-1/2、HPPD以及雷帕霉素(rapamycin)。
更多化学治疗剂的实例包括：奥沙利铂(Sanofi)、硼替佐米(Millennium Pharm.)、索坦(sutent)(/>SU11248，Pfizer)、来曲唑(/>Novartis)、伊马替尼甲磺酸盐(imatinib mesylate)(/>Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma、Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，SemaforePharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(fulvestrant)(/>AstraZeneca)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，/>Wyeth)、拉帕替尼(/>GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(lonafarnib)(SARASARTM，SCH 66336，ScheringPlough)、索拉非尼(sorafenib)(/>BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(gefitinib)(/>AstraZeneca)、伊立替康(irinotecan)(/>CPT-11，Pfizer)、替匹法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(不含克列莫佛(Cremophor))、帕西他赛的白蛋白工程化纳米粒子制剂(American PharmaceuticalPartners，Schaumberg，Il)、凡德他尼(vandetanib)(rINN，ZD6474，/>AstraZeneca)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、替西罗莫司(/>Wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、坎磷酰胺(canfosfamide)(/>Telik)、噻替派和环磷酰胺/>烷基磺酸盐，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)以及哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)以及乌瑞多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺以及三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；薯司他汀(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)以及比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；伊斯罗宾(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥，诸如氮芥苯丁酸、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)以及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)、卡奇霉素γ1l、卡奇霉素ωI1(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；达内霉素(dynemicin)、达内霉素A；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素(dactinomycin)、柔红比星、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星以及脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星、奈莫柔比星(nemorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、表硫雄醇、美雄酮(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺剂，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；乙酰葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；多弗酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗利散(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼(procarbazine)；/>多糖复合物(JHSNatural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A以及蛇形菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春花碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨/>双羟蒽醌；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；卡培他滨(capecitabine)(/>Roche)；依班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，诸如视黄酸；以及以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸以及衍生物。
“化学治疗剂”的定义中还包括：(i)用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括柠檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克罗米芬(keoxifene)、LY117018、奥那斯酮(onapristone)以及/>(柠檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))；(ii)抑制调控肾上腺中的雌激素产生的酶芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如4(5)-咪唑、氨鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、/>(依西美坦(exemestane)；Pfizer)、福美司坦(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、/>(伏氯唑(vorozole))、/>(来曲唑；Novartis)和/>(阿那曲唑(anastrozole)；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二噁烷核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂，诸如MEK抑制剂(WO 2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制参与异常细胞增殖的信号传导通路中的基因的表达的那些，例如PKC-α、Raf以及H-Ras，诸如奥利默森(oblimersen)(/>GentaInc.)；(vii)核糖酶，诸如VEGF表达抑制剂(如/>)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如/> rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，诸如/> rmRH；(ix)抗-血管生成剂诸如贝伐单抗(bevacizumab)(/>Genentech)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸以及衍生物。
“化学治疗剂”的定义中还包括治疗性抗体，诸如阿仑单抗(Campath)、贝伐单抗(Genentech)；西妥昔单抗(cetuximab)(/>Imclone)；帕尼单抗(panitumumab)(/>Amgen)、利妥昔单抗(rituximab)(/>Genentech/Biogen Idec)、奥法木单抗(ofatumumab)(/>GSK)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(PERJETATM、OMNITARGTM，2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(/>Genentech)、托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar,Corixia)以及抗体药物结合物奥星-吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)(/>Wyeth)。
具有作为与本公开的缀合物组合的化学治疗剂的治疗潜能的人源化单克隆抗体包括：阿仑单抗、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿利珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、贝伐单抗、莫星-比伐珠单抗(bivatuzumabmertansine)、莫星-坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、培戈-赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西弗丝妥珠单抗(cidfusituzumab)、西地妥珠单抗(cidtuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、非维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、奥星-吉妥珠单抗、奥星-艾诺妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫托珠单抗(motovizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺洛维珠单抗(nolovizumab)、奴马维珠单抗(numavizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、派弗西妥珠单抗(pecfusituzumab)、派妥珠单抗(pectuzumab)、帕妥珠单抗、培克珠单抗(pexelizumab)、来利珠单抗(ralivizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、瑞利伟珠单抗(reslivizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、来西维珠单抗(resyvizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、芦利珠单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、泰坦-他卡妥珠单抗(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、特非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、曲妥珠单抗、妥考妥珠单抗(tucotuzumab)西莫白介素、土库西妥珠单抗(tucusituzumab)、恩维珠单抗(umavizumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)以及维西珠单抗(visilizumab)。
除活性成分(即缀合物化合物)外，根据本公开并且用于根据本公开的用途的药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应为无毒的并且不应妨碍活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，所述施用途径可为经口或注射(例如经皮肤、皮下或静脉内)施用。
用于经口施用的药物组合物可为片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇，诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊可包含固体载体，诸如明胶。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病痛部位注射来说，活性成分将为肠胃外可接受的水溶液的形式，所述水溶液为无热原的并且具有适合的pH值、等渗性以及稳定性。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物(诸如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's Injection)、乳酸化林格氏注射液(Lactated Ringer's Injection))来制备合适的溶液。可按需要包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
制剂
虽然可单独使用(例如施用)缀合物化合物，但通常优选的是，以组合物或制剂形式呈现缀合物化合物。
在一个实施方案中，组合物为药物组合物(例如制剂(formulation/preparation)、药剂)，所述药物组合物包含如本文所描述的缀合物化合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个实施方案中，组合物为药物组合物，所述药物组合物包含如本文所描述的至少一种缀合物化合物以及本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分，包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填料、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、增香剂以及甜味剂。
在一个实施方案中，组合物还包含其他活性剂，例如其他治疗剂或预防剂。
在标准制药文本中可找到适合的载体、稀释剂、赋形剂等。参见例如Handbook of Pharmaceutical Additives,第2版(M.Ash和I.Ash编),2001(Synapse InformationResources,Inc.,Endicott,New York,USA)，Remington's Pharmaceutical Sciences,第20版,pub.Lippincott,Williams&Wilkins,2000；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients,第2版,1994。
本公开的另一方面是有关制备药物组合物的方法，所述方法包括混合至少一种[11C]放射性标记缀合物或缀合物样化合物(如本文所定义)以及本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的成分，例如载体、稀释剂、赋形剂等。如果配制成离散单元(例如片剂等)，那么每个单元含有预定量(剂量)的活性化合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是有关在合理医学判断范围内适合用于与所考虑的受试者(例如人)的组织接触使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症、符合合理利益/风险比的化合物、成分、材料、组合物、剂型等。每种载体、稀释剂、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须为“可接受的”。
制剂可通过药学领域中熟知的任何方法来制备。此类方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。一般来说，通过使活性化合物与载体(例如液体载体、细碎的固体载体等)均匀并且紧密地缔合，然后在必要时将产品成形来制备制剂。
制剂可制备成提供快速或缓慢释放；立即、延迟、定时或持续释放；或它们的组合。
适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液、悬浮液)，其中溶解、悬浮或以其他方式提供(例如在脂质体或其他微粒中)活性化合物。此类液体可另外含有其他药学上可接受的成分，诸如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、助悬剂、增稠剂以及使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。适合用于此类制剂中的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。通常，液体中活性成分的浓度为约1ng/ml至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中，并且可存储在冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在即将使用前添加无菌液体载体，例如注射用水。可从无菌粉末、颗粒以及片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
剂量
本领域技术人员将了解，缀合物化合物和包含缀合物化合物的组合物的适当剂量在不同受试者间可不同。确定最佳剂量一般将涉及在治疗益处的水平与任何风险或有害副作用之间进行平衡。所选剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性、施用途径、施用时间、化合物的排泄速率、治疗持续时间、组合使用的其他药物、化合物和/或材料、疾患的严重程度以及患者的物种、性别、年龄、体重、疾患、一般健康状况和既往医疗史。化合物的量和施用途径将最终由医师、兽医或临床医生酌定，不过通常剂量将被选择为在作用位点获得在不导致基本上有害或有毒的副作用的情况下实现所需效果的局部浓度。
施用可在整个治疗过程中以一个剂量、连续或间歇地(例如以适当的间隔划分的剂量)实现。确定最有效施用手段和剂量的方法为本领域技术人员熟知并且将随着用于疗法的制剂、疗法的目的、所治疗的一种或多种靶细胞以及所治疗的受试者而变化。可进行单次或多次施用，并且由治疗医师、兽医或临床医师选择剂量水平和模式。
一般来说，活性化合物的适合的剂量在每天每千克受试者体重约100ng至约25mg(更通常为约1μg至约10mg)范围内。当活性化合物为盐、酯、酰胺、前药等时，施用的量基于母体化合物来计算，并且因此要使用的实际重量按比例增加。
上文所描述的剂量可适用于缀合物(包括PBD部分和连至抗体的接头)或适用于有效量的所提供的PBD化合物，例如在接头裂解后可释放的量的化合物。
为预防或治疗疾病，本公开的ADC的适当剂量将取决于如上文定义的要治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、分子是出于预防还是治疗目的施用、先前疗法、受试者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判断。一次或通过一系列治疗将分子适当地施用给受试者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(如0.1-20mg/kg)的分子为用于向患者施用的初始候选剂量，例如通过一次或多次分开施用或通过连续输注。典型的日剂量可从约1μg/kg变化至100mg/kg或更大，这取决于上文所提到的因素。要向患者施用的示例性ADC剂量在每千克患者体重约0.1至约10mg范围内。对于几天或更长时间内的重复施用(取决于疾患)，维持治疗直到发生所需的对疾病症状的抑制。示例性给药方案包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，随后每周、两周或三周施用另外剂量的ADC的过程。可用其他剂量方案。通过常规技术和分析容易监测此疗法的进展。
治疗
如本文所用，在治疗疾患的情形中，术语“治疗”通常是有关对人或动物(例如在兽医学应用中)的实现某种所需治疗效果(例如抑制疾患进展)的治疗和疗法，并且包括降低进展速率、阻止进展速率、疾患消退、疾患改善以及疾患治愈。还包括作为预防性措施的治疗(即预防、防止)。
如本文所使用，术语“治疗有效量”涉及当根据所需治疗方案施用时，活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型有效产生与合理效益/风险比相称的一些所需治疗效果的量。
类似地，如本文所用，术语“预防有效量”是有关当根据所需治疗方案施用时，活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型有效产生与合理的效益/风险比相称的一些所需预防效果的量。
受试者/患者
受试者/患者可为动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋动物(例如袋鼠、袋熊)、单孔目动物(例如鸭嘴兽)、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类(例如小鼠)、兔类(例如兔子)、禽类(例如鸟)、犬类(例如狗)、猫类(例如猫)、马类(例如马)、猪类(例如猪)、绵羊类(例如绵羊)、牛类(例如奶牛)、灵长类动物、猿猴(例如猴或猿)、猴类(例如狨猴、狒狒)、猿类(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。
此外，受试者/患者可为其任何发育形式，例如胎儿。在优选实施方案中，受试者/患者为人。
在某些情况下，受试者为免疫活性的。或者，在某些实施方案中，受试者为免疫受损或免疫缺陷的。免疫缺陷可为先天性免疫缺陷。免疫缺陷可为获得性免疫缺陷，诸如HIV/AIDS。
发明声明
除本文所公开的其他方面和实施方案外，具体地说涵盖以下内容。
1.一种式(I)缀合物：
Ab-(DL)p(I)
其中：
Ab为结合至CD45的抗体；
L为使Ab连接至D的接头，任选其中接头为非可裂解接头；
D为吡咯并苯并二氮杂(PBD)，诸如PBD二聚体；
并且p为1至8。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中：
DL为：
(a)DLa：
其中：
RLL为用于连接至Ab的接头，所述接头为
其中
Q为：
其中QX使得Q为氨基酸残基、二肽残基、三肽残基或四肽残基；
X为：
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0并且至少c1或c2＝0；
GLL为连接至Ab的接头基团；
其中：
a)R11a与RC一起形成与其连接的C与N原子之间的双键；或
b)R11a为OH并且RC为：
其中方括号指示NO2基团为任选的；
m为0或1；
当C2与C3之间存在双键时，R2为甲基；
当C2与C3之间存在单键时，R2为H或
当C2’与C3’之间存在双键时，R12为甲基；
当C2'与C3'之间存在单键时，R12为H或或
(b)DLb：
其中X和GLL如上文所定义；
当C2与C3之间存在双键时，R22为甲基；
当C2与C3之间存在单键时，R22为H或
当C2’与C3’之间存在双键时，R32为甲基；
当C2’与C3’之间存在单键时，R32为H或并且
并且p为1至8。
3.根据声明2所述的缀合物，其中Q为氨基酸残基。
4.根据声明3所述的缀合物，其中Q选自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg以及Trp。
5.根据声明2所述的缀合物，其中Q为二肽残基。
6.根据声明5所述的缀合物，其中Q选自：C＝O-Phe-Lys-NH；C＝O-Val-Ala-NH；C＝O-Val-Lys-NH；C＝O-Ala-Lys-NH；C＝O-Val-Cit-NH；C＝O-Phe-Cit-NH；C＝O-Leu-Cit-NH；C＝O-Ile-Cit-NH；C＝O-Phe-Arg-NH；C＝O-Trp-Cit-NH以及C＝O-Gly-Val-NH。
7.根据声明6所述的缀合物，其中所述二肽选自：C＝O-Phe-Lys-NH；C＝O-Val-Ala-NH；C＝O-Val-Lys-NH；C＝O-Ala-Lys-NH；以及C＝O-Val-Cit-NH。
8.根据声明7所述的缀合物，其中所述二肽选自：C＝O-Phe-Lys-NH、C＝O-Val-Cit-NH或C＝O-Val-Ala-NH。
9.根据声明2所述的缀合物，其中Q为三肽残基。
10.根据声明9所述的缀合物，其中Q选自：C＝O-Glu-Val-Ala-NH；C＝O-Glu-Val-Cit-NH；C＝O-αGlu-Val-Ala-NH；以及C＝O-αGlu-Val-Cit-NH。
11.根据声明2所述的缀合物，其中Q为四肽残基。
12.根据声明11所述的缀合物，其中所述四肽选自：
C＝O-Gly-Gly-Phe-Gly-NH；以及
C＝O-Gly-Phe-Gly-Gly-NH。
13.根据声明12所述的缀合物，其中所述四肽为：
C＝O-Gly-Gly-Phe-Gly-NH。
14.根据声明2至13中任一项所述的缀合物，其中GLL选自：
其中Ar表示C5-6亚芳基，并且X表示C1-4烷基。
15.根据声明14所述的缀合物，其中GLL选自GLL1-1和GLL1-2。
16.根据声明15所述的缀合物，其中GLL为GLL1-1。
17.根据声明2至16中任一项所述的缀合物，其中a为0至3。
18.根据声明17所述的缀合物，其中a为0或1。
19.根据声明18所述的缀合物，其中a为0。
20.根据声明19所述的缀合物，其中a为1。
21.根据声明2至20中任一项所述的缀合物，其中b1为0至12。
22.根据声明21所述的缀合物，其中b1为0至8。
23.根据声明22所述的缀合物，其中b1为0、2、3、4、5或8。
24.根据声明23所述的缀合物，其中b1为2。
25.根据声明2至20中任一项所述的缀合物，其中b2为0至12。
26.根据声明25所述的缀合物，其中b2为0至8。
27.根据声明26所述的缀合物，其中b2为0、2、4或8。
28.根据声明27所述的缀合物，其中b2为8。
29.根据声明1至28中任一项所述的缀合物，其中c1为1。
30.根据声明1至28中任一项所述的缀合物，其中c2为1。
31.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中d为0至3。
32.根据声明32所述的缀合物，其中d为1或2。
33.根据声明32所述的缀合物，其中d为2。
34.根据声明1至30中任一项所述的缀合物，其中d为5。
35.根据声明2至16中任一项所述的缀合物，其中a为0，b1为0，c1为1，c2为0并且d为2，并且b2为0至8。
36.根据声明35所述的缀合物，其中b2为0、4、5或8。
37.根据声明36所述的缀合物，其中b2为8。
38.根据声明2至16中任一项所述的缀合物，其中a为1，b2为0，c1为0，c2为1，d为2，并且b1为0至8。
39.根据声明38所述的缀合物，其中b1为2。
40.根据声明2至39中任一项所述的缀合物，其中m为0。
41.根据声明2至39中任一项所述的缀合物，其中m为1。
42.根据声明2至41中任一项所述的缀合物，其中R11a与RC一起形成与其连接的C与N原子之间的双键。
43.根据声明2至41中任一项所述的缀合物，其中R11a为OH并且RC为：
其中方括号指示NO2基团为任选的。/>
44.根据声明43所述的缀合物，其中所述NO2基团存在。
45.根据声明2至44中任一项所述的缀合物，其中R2与R12为相同的。
46.根据声明45所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2'与C3之间存在双键，并且R2与R12均为甲基。
47.根据声明45所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2’与C3之间存在单键，并且R2与R12均为H。
48.根据声明45所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2’与C3之间存在单键，并且R2与R12均为
49.根据声明2至42中任一项所述的缀合物，其中R22与R32为相同的。
50.根据声明49所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2’与C3之间存在双键，并且R22与R32均为甲基。
51.根据声明49所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2’与C3之间存在单键，并且R22与R32均为H。
52.根据声明49所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2’与C3之间存在单键，并且R22与R32均为
53.根据声明2至39中任一项所述的缀合物，其中DL选自：
/>
54.根据声明2至39中任一项所述的缀合物，其中DL选自：
/>
/>
55.根据声明2至54中任一项所述的缀合物，其中p为1至4。
56.根据声明55所述的缀合物，其中p为2至4。
57.根据声明55所述的缀合物，其中p为1至3。
58.根据声明55所述的缀合物，其中p为2。
59.根据声明1至58中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VH CDR3。
60.根据声明1至59中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:4的VH CDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VHCDR1。
61.根据声明1至60中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VH CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:4的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VH CDR1。
62.根据声明1至60中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3，并且其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域的CDR序列。
63.根据声明1至62中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域。
64.根据声明1至63中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR3。
65.根据声明1至64中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:7的VL CDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VLCDR1。
66.根据声明1至65中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:7的VL CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VL CDR1。
67.根据声明1至63中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3，并且其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:2的序列的VL结构域的CDR序列。
68.根据声明1至67中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:2的序列的VL结构域。
69.根据声明1至58中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:15的VH CDR3。
70.根据声明1至58或69中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:14的VH CDR2和/或氨基酸序列为SEQ ID NO:13的VH CDR1。
71.根据声明1至58或69至70中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:15的VH CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:14的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:13的VH CDR1。
72.根据声明1至58中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3，并且其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:11的序列的VH结构域的CDR序列。
73.根据声明1至58或69至72中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQID NO:11的序列的VH结构域。
74.根据声明1至58或69至73中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有氨基酸序列为SEQ ID NO:18的VL CDR3。
75.根据声明1至58或69至74中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VL CDR2和/或氨基酸序列为SEQ IDNO:16的VL CDR1。
76.根据声明1至58或69至75中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:18的VL CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VL CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:16的VL CDR1。
77.根据声明1至58或69至73中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3，并且其中所述抗体包含具有SEQ IDNO:12的序列的VL结构域的CDR序列。
78.根据声明1至58或69至77中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQID NO:12的序列的VL结构域。
79.根据声明1至58中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中：
(iii)所述第一抗原结合结构域包含根据声明69至73中任一项的VH结构域以及根据声明50至54中任一项的VL结构域；并且
(iv)所述第二抗原结合结构域包含根据声明69至73中任一项的VH结构域以及根据声明60至64中任一项的VL结构域。
80.根据声明1至79中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为完整抗体。
81.根据声明1至80中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为人源化、去免疫或表面重修的。
82.根据声明1至80中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为非人抗体。
83.根据声明82所述的缀合物，其中所述抗体为大鼠抗体。
84.根据声明83所述的缀合物，其中所述抗体为大鼠IgG2b。
85.根据声明1至58中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:9的序列的重链。
86.根据声明1至58以及85中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ IDNO:10的序列的轻链。
87.根据声明1至58中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:19的序列的重链。
88.根据声明1至58以及87中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含具有SEQ IDNO:20的序列的轻链。
89.根据声明1至58中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为如WO1995/013093中所公开的YTH 24.5抗体。
90.根据声明1至58中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为如WO1995/013093中所公开的YTH 54.12抗体。
91.一种药物组合物，所述药物组合物包含声明1至90中任一项所述的缀合物以及任选的药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
92.一种药物组合物，所述药物组合物包含第一缀合物、第二缀合物以及任选的药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，其中：
(i)所述第一缀合物为根据声明59至68、85、86或89中任一项的缀合物；并且
(ii)所述第二缀合物为根据声明69至78、87、88或90中任一项的缀合物。
93.如声明92所述的药物组合物，其中：
(i)所述第一缀合物为根据声明86的缀合物；并且
(ii)所述第二缀合物为根据声明88的缀合物。
94.如声明91至93中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含治疗有效量的化学治疗剂。
95.根据声明1至90中任一项所述的缀合物或如声明91至94中任一项所述的药物组合物，所述缀合物或所述药物组合物供在治疗中使用。
96.一种治疗增生性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据声明1至90中任一项所述的缀合物或声明91至94中任一项所述的药物组合物。
97.根据声明96所述的方法，其中所述增生性疾病为癌症。
98.根据声明97所述的方法，其中所述癌症为血液学癌症。
99.根据声明98所述的方法，其中所述血液学癌症选自由以下组成的组：急性骨髓性白血病、骨髓发育不良、急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾患、骨髓发育不良、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金氏病以及多发性骨髓瘤。
100.根据声明97所述的方法，其中所述癌症为选自由以下组成的组的癌症：肝细胞癌、肝胚细胞瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、成神经细胞瘤、肾上腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、甲状腺髓样癌、骨骼肌癌、脂肪肉瘤、神经胶质瘤、威尔姆氏瘤(Wilms tumor)、神经内分泌肿瘤、急性骨髓性白血病、以及骨髓发育异常综合征。
101.一种使受试者准备进行造血干细胞移植的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据声明1至90中任一项所述的缀合物或声明91至94中任一项所述的药物组合物。
102.如声明101所述的方法，其中所述准备进行造血干细胞移植包括对所述受试者进行调理以便植入造血干细胞。
103.如声明101或102中任一项所述的方法，其中所述方法包括选择性地消耗或消融靶组织中的内源性造血干细胞(HSC)或祖细胞群体。
104.如声明101或103中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞为同种异体的。
105.如声明104所述的方法，其中所述造血干细胞移植用于治疗增生性疾病，任选其中所述增生性病症选自由以下组成的组：急性骨髓性白血病、骨髓发育不良、急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾患、骨髓瘤、骨髓发育不良、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金氏病以及多发性骨髓瘤。
106.根据声明105所述的方法，其中CD45存在于所述受试者中的增殖性肿瘤细胞上。
107.如声明104所述的方法，其中所述造血干细胞移植用于治疗非增生性疾病，任选其中所述非增生性疾病选自由以下组成的组：重度再生障碍性贫血、骨髓衰竭病症、原发性免疫缺陷、血红蛋白病、原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症以及遗传代谢性疾病。
108.如声明104或107中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞移植用于治疗：
(i)选自以下的骨髓衰竭病症：重度再生障碍性贫血、范可尼贫血、先天性角化不良、舒-戴二氏综合征、重度先天性嗜中性粒细胞减少症、戴-布二氏贫血；
(ii)选自以下的原发性免疫缺陷：SCID、慢性肉芽肿病、维-奥二氏综合症、CD40配体缺陷、XLP、MHC II类缺陷以及原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症；
(iii)选自以下的血红蛋白病：镰状细胞病、β-地中海贫血重症；或
(iv)选自以下的遗传代谢性疾病：贺勒氏综合征、X连锁肾上腺脑白质营养不良、α甘露糖苷贮积症以及骨硬化病。
109.如声明101或103中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞为自体的。
110.如声明109所述的方法，其中所述造血干细胞移植用于治疗增生性疾病，任选其中所述增生性疾病选自由以下组成的组：多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病。
111.如声明109所述的方法，其中所述造血干细胞移植用于治疗自体免疫疾病，任选其中所述自体免疫疾病选自由以下组成的组：多发性硬化、系统性硬化、幼年炎性关节炎以及系统性红斑狼疮。
112.如声明101或103中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞为基因修饰的自体造血干细胞。
113.如声明101至103或112中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞移植用于基因疗法。
114.如声明113所述的方法，其中所述基因疗法用于治疗遗传血液疾病、原发性免疫缺陷或遗传代谢性病症。
115.如声明113或114中任一项所述的方法，其中所述基因疗法用于治疗：
(i)选自以下的遗传血液疾病或病症：输注依赖性血红蛋白病、镰状细胞病、β-地中海贫血重症以及范可尼贫血；
(ii)选自以下的原发性免疫缺陷：SCID、慢性肉芽肿病、原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症以及维-奥二氏综合症；或
(iii)选自以下的遗传代谢性病症：贺勒氏综合征、圣菲利柏疾病、X-肾上腺脑白质营养不良以及异染性脑白质营养不良。
116.一种在受试者中植入干细胞的方法，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用有效量的根据声明1至90中任一项所述的缀合物或声明91至94中任一项所述的药物组合物；以及
(b)向所述受试者的靶组织施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入所述受试者的所述靶组织中。
117.一种选择性消耗或消融受试者靶组织中的内源性造血
干细胞(HSC)或祖细胞群体的方法，
所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据声明1至90中任一项所述的缀合物或声明91至94中任一项所述的药物组合物。
118.如声明103至117中任一项所述的方法，其中所述靶组织包含骨髓组织。
119.如声明101至118中任一项所述的方法，其中所述方法实现至少约90％的所述干细胞群体的植入。
120.如声明101至118中任一项所述的方法，其中所述方法在向所述受试者施用所述干细胞群体后四个月在所述靶组织中实现至少约20％供给者嵌合性。
121.如声明96至120中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
122.如声明121所述的方法，其中所述受试者为人。
123.如声明96至122中任一项所述的方法，其中所述受试者为免疫活性的。
124.如声明96至123中任一项所述的方法，其中所述向所述受试者施用有效量的根据声明1至76中任一项所述的缀合物的步骤包括向所述受试者施用：
(i)与以下物质组合的根据声明1至90中任一项的第一缀合物；
(ii)根据声明1至90中任一项的第二不同缀合物。
125.如声明124所述的方法，其中：
(i)所述第一缀合物为根据声明59至68、85、86或89中任一项的缀合物；并且
(ii)所述第二缀合物为根据声明69至78、87、88或90中任一项的缀合物。
126.如声明125所述的方法，其中：
(iii)所述第一缀合物为根据声明86的缀合物；并且
(iv)所述第二缀合物为根据声明88的缀合物。
127.根据声明1至90中任一项的缀合物或如声明91至94中任一项所述的药物组合物，所述缀合物或所述药物组合物供在根据声明82至112中任一项的方法中使用。
128.根据声明1至90中任一项的缀合物或如声明91至94中任一项所述的药物组合物在供在根据声明96至126中任一项的方法中使用的药剂的制造中的用途。
实施例
ADC的制备
抗体-药物缀合物YTH24.5-rIgG2-B1
将三(2-羧基乙基)膦(TCEP)于磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS)中的1mM溶液添加(2.9摩尔当量/抗体，0.51微摩尔，509μL)至抗体(26.3mg，175纳摩尔)于还原缓冲液中的约26mL溶液中，所述还原缓冲液含有PBS和2.4mM乙二胺四乙酸(EDTA；实际2.4mM但所需浓度1mM)，并且最终抗体浓度为1.0mg/mL。将还原混合物在+37℃下在孵育回转式振荡器中在温和(60rpm)振荡下加热2小时。将还原混合物在水浴中冷却至室温5min之后，将DMSO(2.5mL)添加至此还原的抗体溶液(26.3mg，175纳摩尔)中，得到10％(v/v)最终DMSO浓度以及1.0mg/mL的最终抗体浓度，并且在水浴中冷却至室温再持续5min。
B1’
然后，以于DMSO中的10mM储备溶液(8摩尔当量/抗体，1.40微摩尔，140μL)的形式添加B1’。将溶液在室温下混合1小时35min，然后通过添加N-乙酰基-L-半胱氨酸(7.01微摩尔，70.1μL，100mM)使缀合中止。在15min之后，使用填充有Superdex 200 PG的GEHealthcare HiLoadTM26/600柱将约1/3的反应混合物在AKTATMStart FPLC上纯化，用2.6mL/min PBS洗脱。将剩余的反应混合物留在冷冻机中过夜并且第二天通过如上文的制备型SEC-FPLC以大致相等的两份的形式进行纯化。汇集对应于缀合物单体峰的级分，使用15mL Amicon Ultracell 30kDa MWCO旋转过滤器浓缩，无菌过滤并且分析。
使用Thermo Scientific MAbPac 50mm x 2.1mm柱在Shimadzu Prominence系统上对还原的缀合物样品进行UHPLC分析，用水和乙腈的梯度洗脱，在214nm和330nm(B1’特异性)下显示非缀合轻链、连接至单个B1分子的轻链、非缀合重链以及连接至多达五个B1分子的重链的混合物，这与每个抗体1.94个B1分子的药物抗体比率(DAR)相符合。
使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4μm 4.6x150mm柱(具有4μm3.0x20mm保护柱)在Shimadzu Prominence系统上对缀合物样品进行UHPLC分析，用0.3mL/分钟的含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾以及10％异丙醇(v/v)的无菌过滤SEC缓冲液进行洗脱，在280nm下显示＞95％的单体纯度。UHPLC SEC分析给出于7.0mL中1.33mg/mL的最终缀合物浓度，所获得的缀合物质量为9.3mg(35％产率)。
抗体-药物缀合物YTH54.12-rIgG2-B1
将三(2-羧基乙基)膦(TCEP)于磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS)中的1mM溶液添加(1.6摩尔当量/抗体，257纳摩尔，257μL)至抗体(23.8mg，159纳摩尔)于还原缓冲液中的约23.5mL溶液中，所述还原缓冲液含有PBS和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，并且最终抗体浓度为1.0mg/mL。将还原混合物在+37℃下在孵育回转式振荡器中在温和(60rpm)振荡下加热2小时。将还原混合物在水浴中冷却至室温5min之后，将DMSO(2.25mL)添加至此还原的抗体溶液(23.8mg，159纳摩尔)中，得到10％(v/v)最终DMSO浓度以及1.0mg/mL的最终抗体浓度，并且在水浴中冷却至室温再持续5min。
然后以于DMSO中的10mM储备溶液(8摩尔当量/抗体，1.27微摩尔，127μL)的形式添加B1'。将溶液在室温下混合1小时35min，然后通过添加N-乙酰基-L-半胱氨酸(6.35微摩尔，63.5μL，100mM)使缀合中止。在15min之后，使用填充有Superdex 200 PG的GEHealthcare HiLoadTM26/600柱将约1/3的反应混合物在AKTATMStart FPLC上纯化，用2.6mL/min PBS洗脱。将剩余的反应混合物留在冷冻机中过夜并且第二天通过如上文的制备型SEC-FPLC以大致相等的两份的形式进行纯化。汇集对应于缀合物单体峰的级分，使用30kDa MWCO旋转过滤器浓缩，无菌过滤并且分析。
使用Thermo Scientific MAbPac 50mm x 2.1mm柱在Shimadzu Prominence系统上对还原的缀合物样品进行UHPLC分析，用水和乙腈的梯度洗脱，在214nm和330nm(B1’特异性)下显示非缀合轻链、连接至单个B1分子的轻链、非缀合重链以及连接至多达五个B1分子的重链的混合物，这与每个抗体1.90个B1分子的药物抗体比率(DAR)相符合。
使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4μm 4.6x150mm柱(具有4μm3.0x20mm保护柱)在Shimadzu Prominence系统上对缀合物样品进行UHPLC分析，用0.3mL/分钟的含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾以及10％异丙醇(v/v)的无菌过滤SEC缓冲液洗脱，在280nm下显示97％的单体纯度。UHPLC SEC分析给出于7.5mL中1.83mg/mL的最终缀合物浓度，所获得的缀合物质量为13.7mg(58％产率)。
实施例1.CD45在人造血组织上的特异性表达.
材料和方法
使用磁性活化细胞分选使用CD34微珠粒(Miltenyi Biotec)根据制造商的方案从动员外周血或脐带血纯化人CD34+细胞。使用抗人CD45-PE(克隆HI30)(Biolegend)和QuantiBRITE PE珠粒(BD)遵循制造商的说明书测定CD45水平。使用标准分子生物学技术进行北方墨点分析。
结果
参见图1。
在从动员外周血和脐带血纯化的CD34+细胞团的表面分别检测到约25,000和10,000个CD45分子。
CD45 mRNA表达限于胸腺脾脏和外周血，在脑、心脏、结肠、骨骼肌、肾脏、肝脏以及小肠中的表达较低或不存在。
结论
这些数据表明，在来自动员外周血和脐带血的普通CD34+细胞团上存在显著水平的细胞表面CD45。mRNA表达研究表明，CD45为特异性的并且在诸如胸腺、脾脏以及血液的造血组织中以高水平表达，而在非造血组织中不存在。心脏和肝脏中的CD45 RNA水平低是归因于存在污染造血细胞。这些数据表明，靶向CD45的抗体将特异性地靶向造血组织中表达CD45的细胞并且不靶向非造血组织。
实施例2.抗人CD45克隆YTH24.5和YTH54.12在细胞系上存在补体的情况下展示协 同溶解活性。
材料和方法
在37℃下将含1×106个人CD45+OCIM1细胞的100uL的完全培养基(RPMI 1640加上10％胎牛血清)用100μCi 51Cr铬酸钠放射性标记1h，随后用完全培养基洗涤三次。将标记的细胞在96孔板的三个重复孔中在5×104/mL下在存在单独YTH24.5、单独YTH54.12的情况下或与两种抗体一起在室温下孵育10min，然后以10％的最终浓度添加幼兔血清。将最终浓度为5％的Triton X-100添加至细胞的对照孔中直至确定最大溶解。将来自每个孔的50uL的上清液转移至每个孔中含有150uL闪烁液的白色壁板中。在孵育过夜之后在MicroBeta计数器(Trilux)中读取板。使用标准公式[(实验值-自发释放)/(最大载量-自发释放)x100]计算特定溶解的百分比并且以三个重复样品的平均值表示。
结果
参见图2。
YTH24.5在10ug/ml下对OCIM1细胞显示溶解活性，而YTH54.12在10ug/ml下对OCIM1细胞未展现溶解活性。
1:1比率的YTH24.5和YTH54.12在0.2ug/mL下展现最大细胞溶解。
结论
这些数据表明，在CDC分析中在10ug/mL下，与YTH54.12相比，YTH24.5针对CD45+细胞系具有更大溶解活性。然而，当在0.2ug/mL下以1:1比率使用时它们诱导协同溶解。已知YTH24.5和YTH54.12识别不同表位。
实施例3.在存在补体的情况下抗人CD45抗体抑制集落形成。
材料和方法
将冷冻保存的从普通供给者的动员外周血纯化的CD34+细胞解冻，并且在不存在或存在10％幼兔补体的情况下，在存在10ug/mL的YTH24.5和YTH54.12 Mab或10ug/mL同型对照或没有抗体的情况下以每毫升完全培养基(RPMI 1640加上10％胎牛血清)0.5×105个细胞培养2小时。将2×103个细胞转移至2ml的含Epo的StemMACS HSC-CFU完全培养基(Miltenyi Biotech)中并且充分混合。将0.5ml(500个细胞)涂铺至24孔板的三个重复孔中。在10-14天之间对集落进行计数。
结果
参见图3。
在不存在补体的情况下，抗人CD45处理的细胞产生与同型对照以及无抗体对照的情况下相同的集落数目。
在存在补体的情况下，YTH24.5和YTH54.12完全消除集落形成。
结论
这些数据表明，YTH24.5和YTH54.12具高度溶解性并且完全抑制从动员外周血纯化的普通人CD34+细胞的集落形成。CD34+细胞团包含真实HSC和更定向的祖细胞并且与成熟造血细胞和人细胞系(数据未显示)相比以更低水平表达CD45。因此，尽管CD34+细胞上的CD45水平较低，但在体外克隆源性分析中YTH24.5和YTH54.12保留其高溶解活性。
实施例4.用抗人CD45 MAb和补体处理人CD34+细胞阻止在免疫缺陷NSG小鼠中植 入细胞。
材料和方法
将冷冻保存的人CD34+细胞解冻并且与10ug/mL大鼠IgG2b同型抗体或10ug/ml的每种抗人CD45 MAb(YTH24.5和YTH54.12)的混合物一起培养10分钟，然后添加10％幼兔血清。在与血清一起孵育2小时之后，将细胞用PBS洗涤，然后静脉注射至已在137Cs照射器中接受2.5戈瑞(Gy)剂量的NSG小鼠中。在移植后15至16周对小鼠进行淘汰并且使用流式细胞术针对人细胞系植入对造血组织进行分析。
结果
参见图4。
同型对照加上补体处理的细胞在移植后15/16周时在骨髓中引起约50％的人CD45+细胞植入。
在存在YTH24.5+YTH54.12+补体的情况下离体处理的CD34+细胞在移植后15/16周时未植入NSG小鼠的骨髓中。
结论
YTH24.5和YTH54.12在存在补体的情况下高度有效地阻止NSG小鼠中人CD34+细胞的植入，而同型对照MAb在存在补体的情况下不抑制人细胞植入。通过产生ADC从而使用YTH24.5和/或YTH54.12将细胞毒性剂递送至抗体结合的细胞可使这些抗体的细胞杀伤能力增强。
实施例5.抗人CD45免疫毒素特异性地杀死人CD45+细胞。
材料和方法
在存在或不存在相等体积的18mM(4x)抗大鼠IgG-ZAP(肥皂草素缀合物)(Advanced Targeting Systems,Carlsbad,CA,US)的情况下，根据制造商的说明书将YTH24.5、YTH54.12以及同型对照抗体以4倍最终浓度在室温下在R10培养基中孵育15分钟。将50ul的Mab/抗大鼠IgG ZAP复合物与50uL 1x105个/ml Jurkat细胞一式三份地在平底96孔板的孔中在R10培养基中进行混合(最终细胞密度＝0.5×105个细胞/ml)。如先前所描述在孵育72h之后使用PrestoBlueTM细胞活力分析试剂测定细胞活力。
结果
参见图5。
在所测试的所有浓度下，用大鼠IgG2b同型对照±抗大鼠IgG肥皂草素缀合物处理的细胞展现高细胞活力(85-100％)。
在所测试的浓度下，用单独YTH24.5和YTH54.12处理的细胞显示活力(70-100％)。
用YTH24.5+抗大鼠IgG肥皂草素或YTH54.12+抗大鼠IgG肥皂草素处理的细胞显示剂量依赖性细胞杀伤作用。
结论
YTH24.5和YTH54.12显示能够内化抗大鼠IgG缀合的肥皂草素，从而诱导肥皂草素介导的CD45+细胞的细胞死亡。这证实，抗人CD45抗体在结合至CD45后内化并且因此可能被开发为ADC。
实施例6：抗CD45 PBD (大鼠IgG2b模式)特异性地杀死CD45+细胞系。
材料和方法
将OCIM1、Jurkat以及Nalm6细胞以0.5×105个/mL进行接种，在存在Mab或ADC或培养基的情况下(在三个重复孔中)在平底96孔板的孔中培养72小时。将293T细胞以9.3×103个细胞/孔接种于平底96孔板中并且使其附着于板持续长达24小时。随后将293T细胞在存在Mab或ADC或培养基的情况下(在三个重复孔中)培养72小时。将细胞活力试剂(Thermo Fisher Scientific)添加至每个孔中并且孵育长达1.5小时。使用FLUOstarOPTIMA微板读数器(BMG Labtech)检测每个孔的荧光强度。数据点为代表性实验的平均值±标准偏差。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果
参见图6和实施例8后的表格。
YTH24.5-PBD和YTH54.12-PBD在大鼠IgG2b模式中以在低pM范围内的EC50值特异性地杀死人CD45+OCIM1和Jurkat细胞。
同型对照-PBD在最高浓度下对OCIM1没有影响，但在Jurkat细胞上在最高浓度下观察到一些细胞死亡。
CD45-293T在所测试的所有浓度下均对ADC不敏感。
单独单克隆抗体对细胞的活力没有任何有害作用。
结论
这些数据表明，在大鼠IgG2b模式中抗人CD45 PBD有效并且特异性地杀死人CD45+细胞，两种抗人CD45克隆同等有效。
实施例7：抗CD45 PBD(人IgG1-AAA模式)特异性地杀死CD45+细胞系。
材料和方法
将OCIM1、Jurkat以及Nalm6细胞以0.5×105个/mL进行接种，在存在Mab或ADC或培养基的情况下(在三个重复孔中)在平底96孔板的孔中培养72小时。将293T细胞以9.3×103个细胞/孔接种于平底96孔板中并且使其附着于板持续长达24小时。随后将293T细胞在存在Mab或ADC或培养基的情况下(在三个重复孔中)培养72小时。将细胞活力试剂(Thermo Fisher Scientific)添加至每个孔中并且孵育长达1.5小时。使用FLUOstarOPTIMA微板读数器(BMG Labtech)检测每个孔的荧光强度。数据点为代表性实验的平均值±标准偏差。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果
参见图7和实施例8后的表格。
YTH24.5和YTH54.12在人IgG1-AAA模式中以在低pM范围内的EC50值特异性地杀死人CD45+细胞系。
CD45-ve 293T对ADC不敏感，并且在>100nM的浓度下观测到一些细胞杀伤作用。
结论
这些数据表明，抗人CD45 PBD在人IgG1-AAA模式中有效杀死人CD45+细胞，并且两种克隆显示同等细胞杀伤作用。
实施例8：抗人CD45 PBD杀死人CD34+克隆源性祖细胞
材料和方法
将冷冻保存的从三个普通供给者的动员外周血纯化的CD34+细胞解冻，并且在96孔U型底板中，在存在Mab、ADC或单独培养基的情况下以每毫升完全培养基培养(RPMI 1640加上10％胎牛血清)0.5×105个细胞培养2小时。将细胞混合并且将40uL转移至2mL的含Epo的StemMACS HSC-CFU完全培养基(Miltenyi Biotech)中并且充分混合。将0.5ml(250个细胞)涂铺至24孔板的三个重复孔中。在10-14天之间对集落进行计数。数据为三个供给者的平均值±标准偏差。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果
参见图8和实施例8后的表格。
YTH24.5和YTH54.12并且在人IgG1-AAA或大鼠IgG2b Mab模式中在所测试的浓度中的任一者下均不抑制集落形成，同型对照(仅大鼠IgG2b模式)也不抑制集落形成。
YTH24.5 PBD和YTH54.12 PBD并且在人IgG1-AAA中显示对集落形成的剂量依赖性抑制。
同型对照PBD(仅大鼠IgG2b模式)在较高浓度下抑制集落形成。
结论
在YTH24.5 PBD和YTH54.12 PBD的情况下在人与大鼠模式中观察到EC50在低pM范围内的对集落形成的特异性抑制，而同型对照PBD(大鼠IgG2b模式)对抑制集落形成不太有效，具有萘莫耳EC50值。这些数据证实，抗人CD45 PBD可在体外靶向并且杀死主要人CD45+CD34+细胞。
实施例6至8的概述：抗人CD45 PBD的体外EC50值的比较
结论
含有YTH24.5或YTH54.12抗体的抗CD45 PBD ADC具有特异性杀伤作用。
实施例9：在植入NSG小鼠中之前用ADC对HSC进行离体处理
材料和方法
在移植前一天用2.5戈瑞对成年雌性NSG小鼠进行亚致死量照射。将冷冻保存的从普通供给者的动员外周血纯化的CD34+细胞解冻，并且在存在Mab、ADC或单独培养基的情况下在完全培养基(RPMI 1640加上10％胎牛血清)中培养4小时。将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并且将含0.5×106个细胞的PBS静脉注射至小鼠的尾部静脉中。在移植后8周时通过流式细胞术来确定在小鼠骨髓中所移植的人细胞(hCD45+)的植入。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果
参见图9。
在移植之前用1nM和0.1nM的YTH24.5-PBD和YTH54.12-PBD处理人CD34+细胞阻止人CD45+细胞植入NSG小鼠的骨髓中。
事先用1nM和0.1nM的YTH24.5和YTH54.12裸MAb处理人CD34+细胞还阻止人CD45+细胞植入NSG小鼠的骨髓中。
以100nM使用的对照裸MAb使80％的人CD45+能够植入NSG小鼠的骨髓中。
结论
抗人CD45裸MAb与ADC均消除人CD34+HSC的植入。由于裸抗体阻止人细胞植入，所以它阻碍了对ADC的任何相加有效性的评估。认为裸抗体在注射至NSG小鼠中之后可消耗抗体结合的CD34+细胞，这可能是经由ADCP机制进行，因为NSG小鼠不具有功能性补体系统。抗人CD45 PBD有可能还可不依赖于PBD有效负荷消耗人CD45细胞。
实施例10：NSG小鼠中的剂量测定
材料和方法
为在非人源化NSG小鼠中进行剂量测定，经由尾部静脉为成年NSG小鼠静脉注射多达5mg/kg的非缀合Mab或ADC。历经2周的时间针对任何发病迹象定期对小鼠进行监测。如果在2天时间内发生快速重量减轻(>15％)，那么将小鼠淘汰。
为在人源化NSG小鼠中进行剂量测定，在移植前一天用2.5戈瑞对成年雌性NSG小鼠进行亚致死量照射。将冷冻保存的从普通供给者的动员外周血纯化的CD34+细胞解冻并且将含0.5×106个细胞的PBS静脉注射至尾部静脉中。在移植后12周时通过流式细胞术确定所有小鼠的血液中的人植入(人CD45+细胞)。将小鼠分配至处理队列，使得队列之间血液中的中值人植入尽可能类似。将小鼠用0.3mg/kg或3mg/kg Mab或ADC处理。在7天之后获取血液样品并且通过流式细胞术进行分析。在处理后14天时对小鼠的骨髓、血液以及脾脏进行分析。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果
注意到，在人(hIgG1-AAA)模式中，在≥3mg/kg下，6个注射YTH24.5-PBD ADC的小鼠中有4个并且6个用YTH54.12-PBD ADC处理的小鼠有1个因重量减轻而必须淘汰。
在大鼠(IgG2b)模式中用ADC处理的动物不需要淘汰。
以3mg/kg的剂量下，抗CD45(大鼠IgG2b)ADC使得人源化NSG小鼠的骨髓细胞含量降低(参见图10)。如由PBS对照组所指示，这些小鼠的骨髓中的人CD45+植入为低的(约6％)。
结论
这些数据表明，NSG小鼠对大鼠IgG2b抗体更好地耐受。大鼠IgG2b为优选模式，因为它先前已在人中作为调理剂使用并且具有适合的PK参数。更高剂量的抗人CD45PBD似乎对人源化小鼠的骨髓中的小鼠与人细胞均有影响，因此在后续鼠实验中使用1mg/kg或更低的剂量。此毒性可因旁观者效应而产生。
实施例11：PK研究
材料和方法
为成年(非人源化)NSG小鼠注射1mg/kg ADC。每种ADC使用三个小鼠。在注射后3h与168h之间从小鼠获取样品。使用重组人CD45(Bio-Techne)通过ELISA对血清样品进行分析。使用山羊抗大鼠IgG(H+L)(交叉吸收)和sulfoTAG链霉亲和素来检测YTH抗体的总量。使用抗药物抗体来检测缀合抗体的水平。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果
参见图11。
两种所分析的抗CD45 PBD ADC的PK型态类似，YTH54.12-PBD的AUC比YTH24.5-PBD大约1.5倍
结论
YTH24.5-PBD和YTH54.12-PBD显示类似的PK型态并且到注射后约4天时低于检测下限。这些数据支持先前的数据(未显示)，其中在注射后7天时裸MAb为不可检测的。
实施例12：抗人CD45-PBD消耗人源化NSG小鼠中的人CD45细胞
材料和方法
在移植前一天(第-57天)用2.5戈瑞对成年雌性NSG小鼠进行亚致死量照射。将冷冻保存的从普通供给者的动员外周血纯化的CD34+细胞解冻，并且将含0.5×106个细胞的PBS静脉注射至小鼠的尾部静脉中(第-56天)。在第-14天和第-1天对小鼠的血液中的人植入(人CD45+细胞)进行评估。将小鼠分配至处理队列，使得队列之间血液中的中值人CD45+植入尽可能类似。经由尾部静脉为小鼠静脉注射0.3mg/kg或1mg/kg Mab或ADC。在7天之后获取血液样品并且通过流式细胞术进行分析。在处理后两周时对小鼠的骨髓、血液以及脾脏进行分析。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果(1)
图12
在第8周在第-1天，45个移植的小鼠中有40个具有介于1.4％与28.4％之间(平均值＝6.10％)的血液人CD45+植入水平。将这40个小鼠分至具有类似中值植入水平的处理组中以便在第0天用裸抗体或ADC处理。
在人源化小鼠中1mg/kg抗CD45-PBD剂量为良好耐受的，没有观测到毒性迹象(如由用裸抗体或PBD-ADC处理后没有重量减轻所指示)。
1mg/kg YTH24.5和YTH54.12裸抗体使得人CD45+细胞的水平短暂降低，随后恢复(参见图12A)。
1mg/kg的YTH PBD-ADC或0.3mg/kg YTH 24.5PBD-ADC使得人CD45+细胞持久性丢失(参见图12B)。
结论/概述(1)
抗人CD45裸抗体使得血液中的hCD45+ve细胞短暂减少。相比之下，抗人PBD使得血液中的人CD45+细胞剂量依赖性并且长期减少。
结果(2)
图13至图15
抗CD45 ADC以剂量依赖性方式消耗人源化NSG小鼠的血液、骨髓以及脾脏中的人CD45+细胞。1mg/kg抗CD45 ADC有效地使血液中的人CD45+细胞百分比相较于3.39％(PBS)降至<0.6％；骨髓中相较于45.9％(PBS)降至<0.34％；并且脾脏中相较于39.5％(PBS)降至<0.12％(参见图13)。
抗CD45-PBD以剂量依赖性方式消耗人源化小鼠的骨髓中的人CD45+HSC和祖细胞。相较于约2.8×105个细胞(PBS)，1mg/kg抗CD45 ADC有效消耗至<3000个总人CD34+细胞；并且相较于1593个细胞(PBS)，消耗至<27个人CD34+/hCD38-细胞(参见图14)。
抗CD45 ADC以剂量依赖性方式消耗人源化小鼠的骨髓中的人CD45+造血干细胞和多能祖细胞。1mg/kg抗CD45 ADC诱导完全耗尽骨髓中的人HSC和MPP(参见图15)。
结论2.
YTH24.5-PBD和YTH54.12-PBD特异性地消耗人源化小鼠中的免疫表型确定的人HSC和定向祖细胞，这支持它们开发为调理剂。
实施例13：抗人CD45-PBD增强人源化NSG小鼠中第二移植物的植入。
材料和方法
在移植前一天(第-1天)用2.5戈瑞对成年雌性NSG小鼠进行亚致死量照射。将冷冻保存的从普通供给者的动员外周血纯化的CD34+细胞解冻，并且将含0.5×106个细胞的PBS静脉注射至小鼠的尾部静脉中(第0天)。在第8周对小鼠的血液中的人植入(人CD45+细胞)进行评估。将小鼠分配至处理队列，使得每个队列的血液中的中值人CD45+植入尽可能类似。经由尾部静脉为小鼠静脉注射1mg/kg Mab或ADC或者YTH MAb(各自0.5mg/kg)或YTHADC(各自0.5mg/kg)的组合。随后为小鼠移植慢病毒转导的绿色荧光蛋白(GFP)自体CD34+细胞(第10周)。为单独队列的亚致死量照射(非人源化)的NSG注射相同批次的GFP转导细胞，充当GFP+人细胞植入的阳性对照。在GFP+细胞移植之后九周，对小鼠进行淘汰并且获取血液、脾脏以及骨髓进行分析。
近似方案时间线参见图16。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果
图17.
充当GFP+转导细胞植入的阳性对照的照射的NSG小鼠表明，可通过任何基于抗体的调理剂实现的最高水平的GFP+水平为约80％(参见图17)。在所有其他处理组中，GFP-人细胞可来源于第一次移植，并且还来源于来自第二次移植的未转导的细胞。GFP+细胞仅来源于第二次移植。骨髓中的GFP+水平指示Mab或ADC作为调理剂以实现GFP+细胞植入的功效。
PBS、同型Mab、同型ADC、YTH24.5 Mab、YTH54.12 MAb或YTH MAb的组合显示GFP+人CD45+细胞占骨髓中的所有人CD45+细胞30-40％的背景植入水平(图17A)。
在骨髓中，与同型ADC处理组相比，YTH24.5 ADC和YTH54.12 ADC或两者的组合诱导的GFP+人CD45+细胞植入水平全部引起高达80％的更高GFP+细胞植入水平，表明抗人CD45 ADC能够通过消耗来自第一次移植的细胞增强GFP+植入。(图17A)。这些植入水平还反映在骨髓样(人CD33+)谱系和B细胞(人CD19+)谱系中(数据未显示)。
GFP+人造血祖细胞和HSC群体的分析显示与同型ADC对照(约40％)相比，用YTH24.5 ADC、YTH54.12 ADC以及组合ADC组处理的小鼠的骨髓中总人CD34+细胞中的GFP+CD34+水平增加(约80％)(图17B)。
对总人HSC、人MLP以及人MPP的分析表明，与同型ADC组(约50至60％)相比，YTH24.5 ADC和YTH54.12 ADC以及组合ADC组中>80％为GFP+(图17C至图17E)。
结论
在人源化小鼠中用抗CD45 ADC处理使得能够植入第二次移植的GFP+自体CD34+。所实现的植入为多谱系的，在成熟B细胞和骨髓样细胞中以及HSC和祖细胞亚群中检测到GFP+细胞。这些数据表明，抗CD45 ADC特异性地靶向和消耗人源化小鼠中的人CD45+细胞并且使得第二次移植的自体GFP+细胞的植入增强。
实施例14：在鼠白血病模型中抗人CD45-PBD显示抗白血病活性。
材料和方法
在注射细胞前一天用2戈瑞对成年NSG小鼠进行亚致死量照射。将含5×106个表达萤火虫荧光素酶的Jurkat细胞的PBS静脉注射至小鼠的尾部静脉中。在第二天，以1mg/kg的剂量将PBS、MAb或ADC静脉注射至尾部静脉中。在实验的持续时间内，针对发病迹象和重量减轻定期对小鼠进行监测。为进行成像，为小鼠腹膜内注射含3mg D-荧光素的PBS。最初用4％异氟烷将小鼠麻醉，然后维持在2％异氟烷下。在注射D-荧光素之后十分钟，使小鼠在IVIS Lumina III(PerkinElmer)内部成像。在Living Image软件中使用自动暴露设定捕获亚饱和图像。
所分析的ADC中所用的药物-接头(DL)为如本文所描述的“B1”。
结果
参见图18。
在注射Jurkat细胞的小鼠中观察到快速白血病发展。
施用抗人CD45裸抗体延迟白血病的发展，但延迟为短暂的。
在IVIS研究过程内施用抗CD45-ADC很大程度上延迟白血病的发作并且延长存活。
在第16天，与所有其他处理组相比，PBS、同型以及同型-ADC对照具有高50倍的信号。
在第16天，抗CD45 ADC信号明显低于抗CD45裸抗体组。
在第16天，与YTH24.5-ADC组(其中5个小鼠中有5个保持没有白血病)相比，YTH24.5裸抗体组具有高100倍的信号。
在第16天，与YTH54.12-ADC组(其中5个小鼠中有4个保持没有白血病)相比，YTH54.12裸抗体组具有高10倍的信号。
在第70天结束时，仅YTH24.5 ADC和YTH54.12 ADC组有存活的小鼠。
结论
在白血病异种模型中，YTH24.5和YTH54.12 MAb延迟疾病发作，并且相较于PBS、同型Mab以及同型ADC组赋予一定的存活优势。与裸抗人CD45 Mab处理组相比，抗人CD45 ADC进一步延迟疾病进展并且进一步延长白血病小鼠的存活。
实施例15：缀合至不同PBD有效负荷的抗CD45抗体的体外比较
材料和方法
以1.275x104个/mL的最终浓度接种OCIM1、Jurkat以及Nalm6细胞，并且在平底96孔板的孔中(一式三份)在存在大鼠IgG2b Mab或ADC或培养基的情况下持续5天。将293T细胞以每孔每100uL 9.3×103个细胞接种于平底96孔板中并且使其附着于板持续长达24小时。随后将293T细胞如上文所描述在存在大鼠IgG2b Mab或ADC或培养基的情况下(在三个重复孔中)进行培养。将细胞活力试剂(Thermo Fisher Scientific)添加至每个孔中并且孵育长达1.5小时。使用FLUOstar OPTIMA微板读数器(BMG Labtech)检测每个孔的荧光强度。使用Prism 8.0对数据进行绘图并且使用S形剂量-反应非线性回归来确定EC50值。数据点为代表性实验的平均值±标准偏差。
结果
参见图20和总表。
使同型和抗CD45特异性抗体缀合至具有不同效能和诱导旁观者效应的能力的不同有效负荷。针对在体外细胞活力分析中杀死CD45+和CD45-细胞系的能力对这些ADC进行比较。与缀合至B1的抗CD45抗体相比，缀合至B4的抗CD45抗体对CD45-阳性细胞的有效性高2倍至3倍，并且与同型-B1相比，同型-B4显示更小的非特异性毒性(图20A、图20B以及以上总表)。抗CD45-B2和抗CD45-B7 ADC也特异性地杀死抗原阳性细胞(图20E和图20F以及总表)，但与B1和B4 ADC相比不太有效。在抗原阴性Nalm6和HEK293T细胞系(图20C、图20D、图208G以及图20H和总表)的情况下，在所测试的最高浓度下存在抗CD45 ADC与同型ADC的非特异性细胞杀伤作用。
总表：不同抗CD45 ADC对细胞系的EC50值的比较。由3至4个独立实验确定EC50值。
/>
结论
所有抗CD45 ADC均对CD45+细胞系具特异性。然而，与B2和B7有效负荷相比，缀合至B1和B4的抗CD45特异性抗体对CD45+细胞系更有效。与同型-B1相比，同型-B4对CD45+细胞的毒性更小，很可能是因为前者中缺乏旁观者效应。
实施例16：克隆源性分析中不同有效负荷的比较
材料和方法
将冷冻保存的从健康供给者的动员外周血纯化的CD34+细胞解冻，洗涤并且在存在大鼠IgG2b同型ADC或大鼠IgG2b抗CD45 ADC或单独培养基的情况下以0.5×105个/mL的最终细胞密度再悬浮于RPMI-1640培养基加上10％胎牛血清中持续2小时。将1000个细胞转移至2ml的含Epo的StemMACS HSC-CFU完全培养基(Miltenyi Biotech)中并且充分混合。将0.5ml一式三份地涂铺至24孔板的孔中。在12-14天之后对集落进行计数。使用Prism 8.0对数据进行绘图并且进行S形剂量反应非线性回归。相对于未处理的细胞±标准偏差来表示从三个供给者汇集的数据。将EC50值确定为给出50％反应的浓度。
结果
参见图21和总表。
使抗CD45特异性和同型抗体缀合至不同的PBD有效负荷并且确定其在克隆源性分析中抑制集落形成的能力。克隆源性分析表明，缀合至B1和B4中的任一者的抗CD45抗体对抑制主要人CD34+细胞的集落形成具有类似效能，两种克隆之间没有显著差异(图21A和图21B以及以上总表)。同型-B1在所测试的最高浓度下引起对集落形成的抑制，而同型-B4在所测试的浓度下未显示抑制集落形成。抗CD45-B2和抗CD45-B7 ADC特异性地抑制集落形成，但与B1和B4 ADC相比不太有效(图21C和图21D以及总表)。同型-B2和同型-B7在所测试的最高浓度下引起对集落形成的非特异性抑制。
总表：克隆源性分析中缀合至B1、B4、B2以及B7的抗CD45抗体的比较。
ADC 平均EC50(pM) 数目
YTH24.5-B1 2.64 3
YTH54.12-B1 1.52 3
同型-B1 3,593.52 3
YTH24.5-B4 4.92 3
YTH54.12-B4 4.47 3
同型-B4 >100,000 3
YTH24.5-B2 32.71 3
YTH54.12-B2 23.86 3
同型-B2 21,215.98 3
YTH24.5-B7 35.53 3
YTH54.12-B7 45.10 3
同型-B7 72,118.56 3
结论
抗CD45-B1和抗CD45-B4在克隆源性分析中在抑制来自动员外周血的主要人CD34+细胞(其共表达CD45)的集落形成中同等有效。然而，同型-B4展现较小的非特异性毒性并且因此总的说来为优选的。抗CD45-B2和抗CD45-B7与抗CD45-B1和抗CD45-B4相比不太有效，并且在高浓度下同型-B2和同型-B7诱导非特异性杀伤作用。
实施例17.在NSG小鼠中在AML模型中不同有效负荷的比较
材料和方法
为NSG小鼠静脉内移植7.5x106个表达荧光素酶的fLuc+OCIM1细胞。在第二天，经由尾部静脉以1mg/kg或5mg/kg的剂量静脉注射非缀合大鼠IgG2b抗体或ADC。在实验的持续时间内针对发病迹象定期对小鼠进行监测。为进行成像，为小鼠腹膜内注射200μl的含15mg/mL D-荧光素(Regis Technologies)的PBS。随后用4％异氟烷将小鼠麻醉并且维持在2％异氟烷下。在注射D-荧光素之后十分钟，将小鼠前侧向上放在IVIS Lumina III(PerkinElmer)内部。在Living Image软件(4.5版)中使用自动暴露设定捕获亚饱和图像。还使用相同软件进行图像的定量和准备。
结果
参见图22。
使用NSG AML模型对缀合至不同PBD有效负荷的抗CD45特异性和同型抗体的相对抗白血病活性进行评估。对照组中的所有小鼠(非缀合抗体或同型ADC)均显示随时间推移增加的肿瘤信号(图22A至图22D)并且到第32天全部被淘汰(图22E)。YTH54.12-B1从第18天起显示增加的肿瘤信号(归因于在5小鼠中有1个中发展肿瘤)(图22A)。在YTH24.5-B1、YTH24.5-B4以及YTH24.5-B2处理的小鼠中检测到低肿瘤信号/不存在肿瘤信号(图22A、图22B以及图22C)。从第11天起在三个用YTH24.5-B7处理的小鼠中检测到增加的肿瘤信号(图22D)。
结论
在AML的NSG模型中，缀合至高效能有效负荷B1和B4以及较低效能B2和B7有效负荷的YTH24.5能够阻止肿瘤发展。与YTH24.5-B1相比，YTH54.12-B1稍微不太有效，因为YTH24.5-B1处理使得5个小鼠中有1个产生低肿瘤信号。YTH24.5-B7为最不有效的ADC，其中到实验结束时3/5的小鼠显示高水平的肿瘤信号。然而，与对照组相比，所测试的所有抗CD45 ADC均延长小鼠的存活。
实施例18.在NSG小鼠中在确定的AML模型中具有不同有效负荷的抗CD45 ADC的比 较
材料和方法
为NSG小鼠静脉内移植7.5x106个fLuc+OCIM1细胞。在注射AML细胞后10天时，经由尾部静脉以1mg/kg或5mg/kg的剂量静脉注射非缀合抗体或ADC。在实验的持续时间内针对发病迹象定期对小鼠进行监测。为进行成像，为小鼠腹膜内注射200μl的含15mg/mL D-荧光素(Regis Technologies)的PBS。随后用4％异氟烷将小鼠麻醉并且维持在2％异氟烷下。在注射D-荧光素之后十分钟，将小鼠前侧向上放在IVIS Lumina III(PerkinElmer)内部。在Living Image软件(4.5版)中使用自动暴露设定捕获亚饱和图像。还使用相同软件进行图像的定量和准备。
结果
参见图23。
在NSG AML模型中基于确定的肿瘤对缀合至不同PBD有效负荷的抗CD45特异性和同型抗体的相对抗白血病活性进行评估。在给予ADC处理之前，注射fLuc+OCIM1细胞的小鼠显示生物发光信号增加约5倍(图23A)。从实验开始起，非缀合抗体对照组以及同型-B1、同型-B4和同型-B2处理的小鼠全部产生增加的肿瘤信号(图23A)，并且到第39天这些小鼠中的所有小鼠均因发病而被淘汰(图23B)。抗CD45特异性ADC全部在处理7天内诱导肿瘤消退(图23A)，其中与YTH24.5-B1相比，YTH24.5-B4诱导稍微更长时间的低肿瘤信号。然而，YTH24.5-B2诱导最短时间的肿瘤消退并且肿瘤信号在10天内增加。在60天时，所有小鼠均带有肿瘤，但B2组中1/5的小鼠还活着，而YTH24.5-B1和YTH54.12-B4中4/5的小鼠还活着。
结论
在具有确定的AML的小鼠中，所测试的所有抗CD45-ADC均使得肿瘤信号消退并且与对照小鼠相比延长存活。然而，YTH24.5-B4在诱导持久性肿瘤消退以及延长存活方面最有效，随后为YTH24.5-B1和YTH24.5-B2，按这个顺序排列。
实施例19.在NSG小鼠中在同种异体干细胞移植模型中对YTH24.5-B1作为调理剂 的评估
材料和方法
在137Cs照射器中用2.5戈瑞对成年NSG小鼠(Charles River Laboratories)进行亚致死量照射。在第二天，为小鼠注射0.5×106个新解冻的冷冻保存的来自健康供给者的人CD34+细胞，使用29号MicroFine Plus胰岛素注射器(BD)于150μL PBS中经由尾部静脉进行注射。从移植后6周起定期对血液中的人细胞植入进行评估。在移植后10周时，将人源化NSG小鼠分配至如通过流式细胞术所确定具有类似血液中中值人CD45+细胞植入的队列中。为小鼠注射PBS或1mg/kg YTH24.5-B1。在处理之后16天时，为小鼠移植来自另一健康供给者的0.5x106个GFP+CD34+细胞。还为没有非人源化小鼠的照射的NSG移植来自同种异体健康供给者的GFP+CD34+作为GFP+CD34+细胞植入的对照。在移植GFP+细胞之后8周时，对小鼠进行淘汰并且获取血液、脾脏以及骨髓以通过流式细胞术进行分析。
结果
参见图24。
用YTH24.5-B1组调理的小鼠骨髓中的人CD45+细胞植入水平与PBS处理的组相比在统计学上显著更低(平均hCD45百分比分别＝9.08％和37.5％)(图24A)。然而，与PBS组(平均值＝2.1％)相比，在YTH24.5-B1(平均值＝29.0％)处理的情况下骨髓中GFP+hCD45+细胞占所有人CD45+细胞的百分比在统计学上显著更高(图24B)。照射对照小鼠具有41.3％的平均GFP+hCD45+水平。在骨髓中的人CD34+区室内，与PBS处理(平均值＝3.7％)相比，YTH24.5-B1也产生统计学上显著更高的GFP+hCD34+细胞水平(平均值＝56.6％)(图24C)。
结论
这些数据表明，YTH24.5-B1处理能够对人源化小鼠进行调理以使得能够植入来自同种异体人供给者的细胞，但PBS处理却不能。
实施例20.在NSG小鼠中在同种异体干细胞移植模型中具有不同有效负荷的抗 CD45 ADC的比较
材料和方法
实验程序如先前在实施例16中所描述，但进行以下修改。在移植后10周时为人源化NSG小鼠注射PBS或1mg/kg YTH24.5-B1、YTH54.12-B1、同型-B1、YTH24.5-B4以及同型-3376。以5mg/kg的剂量给予同型-B2和YTH24.5-B2。如先前所描述移植来自同种异体人供给者的0.5x106个GFP+CD34+并且在GFP+细胞移植后8周时进行分析。
结果
参见图25。
针对对人源化小鼠进行调理并且促进来自人同种异体供给者的GFP+CD34+细胞的植入的能力对具有不同PBD有效负荷的同型和抗CD45特异性抗体进行比较。用PBS处理随后移植GFP+CD34+同种异体细胞的小鼠的骨髓中的平均人CD45+细胞植入水平为14.12％(图25A)。同型-B1(平均hCD45+百分比＝35.34％)与YTH24.5-B1(平均hCD45+百分比＝16.45％)和YTH54.12-B1(平均hCD45+百分比＝16.34％相比以及同型-B4(平均hCD45+百分比＝15.22％)与YTH24.5-B4(平均hCD45+百分比＝7.34％)相比的人CD45+植入均没有统计显著性差异(图25A)。然而，与同型-B2(平均hCD45+百分比＝7.06％)相比，YTH24.5-B2使得人CD45+植入水平统计显著性降低(平均hCD45+百分比＝1.089％)。在照射对照队列(即在2.5戈瑞照射之后(没有其他事先调理或人源化)接受GFP+CD34+细胞的小鼠)中观察到最高水平的人CD45+细胞植入。
在PBS处理之后，平均骨髓中GFP+hCD45+细胞占所有人CD45+细胞的百分比为10.22％(图25B)。用同型-B1、YTH24.5-B1以及YTH54.12-B1处理的队列中的平均GFP+hCD45+植入百分比介于33.64％与55.56％之间，这与所有其他ADC或PBS组相比均更高(图25B)。然而，在同型-B1、YTH24.5-B1以及YTH54.12-B1之间GFP+人CD45+细胞百分比没有统计显著性差异。同型-B4与YTH24.5-B4相比以及同型-B2与YTH24.5-B2相比GFP+人CD45+细胞的百分比也均没有统计显著性差异。
当评估GFP+人CD34+细胞的水平(图23C)时，与同型ADC对照(平均值分别＝24.42％和14.92％)相比，接受YTH24.5-B4(平均值＝57.95％)和YTH24.5-B2(72.14％)的小鼠的骨髓中的GFP+人CD34+细胞在统计学上显著增加。虽然在同型-B1、YTH24.5-B1以及YTH54.12-B1队列中GFP+人CD34+百分比更高(分别为50.09％、59.13％以及69.40％)，但在此实验中在非特异性与抗CD45特异性B1 ADC之间没有差异。
结论
这些数据表明，具有不同效能和旁观者活性的有效负荷的抗CD45-PBD ADC在人源化小鼠中引起不同水平的人细胞消耗。令人意外地，同型-B1与抗CD45-B1 ADC似乎显示相等活性(高总人CD45+植入水平)，并且特异性与非特异性ADC活性中没有明显差异。在自体干细胞移植模型中未观测到此结果。在此实验中，与同型-B4相比，YTH24.5-B4产生显著水平的人CD45+细胞植入和GFP+人CD45+植入。虽然与同型-B2相比，YTH24.5-B2诱导显著水平的GFP+人CD34+细胞植入，但总人CD45+植入为低的。ADC剂量和其他参数(例如ADC处理后移植GFP+人CD34+细胞之前的时间)的进一步优化可为通过具有不同有效负荷的抗CD45 ADC进行最佳调理所必需的。
本发明的序列表部分
SEQ ID NO:1[YTH24.5 VH，CDR加下划线]
QVNLLQSGAALVKPGASVKLSCKASSYTFTDYYIHWVKQSHGKTLEWIGYINPKSGFTNYNEKFRRKATLTVDKSTNTAYMDISRLTSEDSATYYCTRRTGVIPMDAWGQGASVTVSS
SEQ ID NO:2[YTH24.5 VL，CDR加下划线]
DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSFVSSDGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEHDDLGVYYCGQASKIPLTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:3[YTH24.5VH，CDR1]
DYYIH
SEQ ID NO:4[YTH24.5 VH，CDR2]
YINPKSGFTNYNEKFRR
SEQ ID NO:5[YTH24.5 VH，CDR3]
RTGVIPMDA
SEQ ID NO:6[YTH24.5 VL，CDR1]
RSSQSFVSSDGNTYLN
SEQ ID NO:7[YTH24.5 VL，CDR2]
KVSNRLS
SEQ ID NO:8[YTH24.5 VL，CDR3]
GQASKIPLT
SEQ ID NO:9[YTH24.5重链(大鼠IgG2b，κ)]
QVNLLQSGAALVKPGASVKLSCKASSYTFTDYYIHWVKQSHGKTLEWIGYINPKSGFTNYNEKFRRKATLTVDKSTNTAYMDISRLTSEDSATYYCTRRTGVIPMDAWGQGASVTVSSAQTTAPSVYPLAPGCGDTTSSTVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGALSSDVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKVERRNGGIGHKCPTCPTCHKCPVPELLGGPSVFIFPPKPKDILLISQNAKVTCVVVDVSEEEPDVQFSWFVNNVEVHTAQTQPREEQYNSTFRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPSPIEKTISKPKGLVRKPQVYVMGPPTEQLTEQTVSLTCLTSGFLPNDIGVEWTSNGHIEKNYKNTEPVMDSDGSFFMYSKLNVERSRWDSRAPFVCSVVHEGLHNHHVEKSISRPPGK
SEQ ID NO:10[YTH24.5轻链(大鼠IgG2b，κ)]
DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSFVSSDGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEHDDLGVYYCGQASKIPLTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSMEQLTSGGATVVCFVNNFYPRDISVKWKIDGSEQRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLTKVEYERHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC
SEQ ID NO:11[YTH54.12 VH，CDR加下划线]
EVQLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPKKGLEWVASMSFAGSSTYYGDSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRSEDTATYYCARMYTTDYYLYWYFDFWGPGTMVTVSS
SEQ ID NO:12[YTH54.12 VL，CDR加下划线]
DVQMTQSPSYLAASPGESVSISCKASKSISNYLAWYQQKPGEANKILIYSGSTLQSGTPSRFSGSGSGTDFSLTIRNLEPEDFAVYYCQQYDEKPLTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:13[YTH54.12 VH，CDR1]
DYYMA
SEQ ID NO:14[YTH54.12 VH，CDR2]
SMSFAGSSTYYGDSVKG
SEQ ID NO:15[YTH54.12 VH，CDR3]
MYTTDYYLYWYFDF
SEQ ID NO:16[YTH54.12 VL，CDR1]
KASKSISNYLA
SEQ ID NO:17[YTH54.12 VL，CDR2]
SGSTLQS
SEQ ID NO:18[YTH54.12 VL，CDR3]
QQYDEKPLT
SEQ ID NO:19[YTH54.12重链(大鼠IgG2b，κ)]
EVQLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPKKGLEWVASMSFAGSSTYYGDSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRSEDTATYYCARMYTTDYYLYWYFDFWGPGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAPGCGDTTSSTVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGALSSDVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKVERRNGGIGHKCPTCPTCHKCPVPELLGGPSVFIFPPKPKDILLISQNAKVTCVVVDVSEEEPDVQFSWFVNNVEVHTAQTQPREEQYNSTFRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPSPIEKTISKPKGLVRKPQVYVMGPPTEQLTEQTVSLTCLTSGFLPNDIGVEWTSNGHIEKNYKNTEPVMDSDGSFFMYSKLNVERSRWDSRAPFVCSVVHEGLHNHHVEKSISRPPGK
SEQ ID NO:20[YTH54.12轻链(大鼠IgG2b，κ)]
DVQMTQSPSYLAASPGESVSISCKASKSISNYLAWYQQKPGEANKILIYSGSTLQSGTPSRFSGSGSGTDFSLTIRNLEPEDFAVYYCQQYDEKPLTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSMEQLTSGGATVVCFVNNFYPRDISVKWKIDGSEQRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLTKVEYERHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC
SEQ ID NO:21[人CD45]
MTMYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVTGQSPTPSPTGLTTAKMPSVPLSSDPLPTHTTAFSPASTFERENDFSETTTSLSPDNTSTQVSPDSLDNASAFNTTGVSSVQTPHLPTHADSQTPSAGTDTQTFSGSAANAKLNPTPGSNAISDVPGERSTASTFPTDPVSPLTTTLSLAHHSSAALPARTSNTTITANTSDAYLNASETTTLSPSGSAVISTTTIATTPSKPTCDEKYANITVDYLYNKETKLFTAKLNVNENVECGNNTCTNNEVHNLTECKNASVSISHNSCTAPDKTLILDVPPGVEKFQLHDCTQVEKADTTICLKWKNIETFTCDTQNITYRFQCGNMIFDNKEIKLENLEPEHEYKCDSEILYNNHKFTNASKIIKTDFGSPGEPQIIFCRSEAAHQGVITWNPPQRSFHNFTLCYIKETEKDCLNLDKNLIKYDLQNLKPYTKYVLSLHAYIIAKVQRNGSAAMCHFTTKSAPPSQVWNMTVSMTSDNSMHVKCRPPRDRNGPHERYHLEVEAGNTLVRNESHKNCDFRVKDLQYSTDYTFKAYFHNGDYPGEPFILHHSTSYNSKALIAFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVPLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS
SEQUENCE LISTING
<110> ADC治疗有限公司(ADC THERAPEUTICS SA)
免疫医疗有限公司(MEDIMMUNE LIMITED)
<120> 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物以及其用途
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<150> GB 2015226.0
<151> 2020-09-25
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Val Asn Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Thr Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Lys Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Thr Gly Val Ile Pro Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Phe Val Ser Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu His Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ala
85 90 95
Ser Lys Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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Asp Tyr Tyr Ile His
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Tyr Ile Asn Pro Lys Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Arg
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Arg Thr Gly Val Ile Pro Met Asp Ala
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Arg Ser Ser Gln Ser Phe Val Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
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<220>
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Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser
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Gly Gln Ala Ser Lys Ile Pro Leu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Val Asn Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Thr Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Lys Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Ile Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Thr Gly Val Ile Pro Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
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Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Ser Ser Asp Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro
180 185 190
Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys
210 215 220
Pro Thr Cys Pro Thr Cys His Lys Cys Pro Val Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Leu
245 250 255
Ile Ser Gln Asn Ala Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Glu Glu Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Met Gly Pro Pro Thr Glu Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Thr Ser Gly Phe Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu
370 375 380
Trp Thr Ser Asn Gly His Ile Glu Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Met Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val
405 410 415
Glu Arg Ser Arg Trp Asp Ser Arg Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Phe Val Ser Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu His Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ala
85 90 95
Ser Lys Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Arg Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Val Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser
195 200 205
Pro Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Met Ser Phe Ala Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Tyr Thr Thr Asp Tyr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Asn Lys Ile Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Glu Lys Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Ser Met Ser Phe Ala Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Met Tyr Thr Thr Asp Tyr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Gln Gln Tyr Asp Glu Lys Pro Leu Thr
1 5
<210> 19
<211> 456
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Met Ser Phe Ala Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Tyr Thr Thr Asp Tyr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala
115 120 125
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Ser Ser
130 135 140
Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Asp Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly
210 215 220
Ile Gly His Lys Cys Pro Thr Cys Pro Thr Cys His Lys Cys Pro Val
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Ile Leu Leu Ile Ser Gln Asn Ala Lys Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser Glu Glu Glu Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Phe Val
275 280 285
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Leu Val
340 345 350
Arg Lys Pro Gln Val Tyr Val Met Gly Pro Pro Thr Glu Gln Leu Thr
355 360 365
Glu Gln Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Thr Ser Gly Phe Leu Pro Asn
370 375 380
Asp Ile Gly Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Ile Glu Lys Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Asn Thr Glu Pro Val Met Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Met Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Asn Val Glu Arg Ser Arg Trp Asp Ser Arg Ala Pro Phe
420 425 430
Val Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Val Glu Lys
435 440 445
Ser Ile Ser Arg Pro Pro Gly Lys
450 455
<210> 20
<211> 214
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 20
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Asn Lys Ile Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Glu Lys Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Met Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Thr Val Val Cys Phe Val Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile
130 135 140
Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Gln Arg Asp Gly Val Leu
145 150 155 160
Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Val Glu Tyr Glu Arg His Asn Leu Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 21
<211> 1306
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Met Thr Met Tyr Leu Trp Leu Lys Leu Leu Ala Phe Gly Phe Ala Phe
1 5 10 15
Leu Asp Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro
20 25 30
Thr Gly Leu Thr Thr Ala Lys Met Pro Ser Val Pro Leu Ser Ser Asp
35 40 45
Pro Leu Pro Thr His Thr Thr Ala Phe Ser Pro Ala Ser Thr Phe Glu
50 55 60
Arg Glu Asn Asp Phe Ser Glu Thr Thr Thr Ser Leu Ser Pro Asp Asn
65 70 75 80
Thr Ser Thr Gln Val Ser Pro Asp Ser Leu Asp Asn Ala Ser Ala Phe
85 90 95
Asn Thr Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His
100 105 110
Ala Asp Ser Gln Thr Pro Ser Ala Gly Thr Asp Thr Gln Thr Phe Ser
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Asn Ala Lys Leu Asn Pro Thr Pro Gly Ser Asn Ala
130 135 140
Ile Ser Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr
145 150 155 160
Asp Pro Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser
165 170 175
Ser Ala Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn
180 185 190
Thr Ser Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Glu Thr Thr Thr Leu Ser Pro
195 200 205
Ser Gly Ser Ala Val Ile Ser Thr Thr Thr Ile Ala Thr Thr Pro Ser
210 215 220
Lys Pro Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu
225 230 235 240
Tyr Asn Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu
245 250 255
Asn Val Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn
260 265 270
Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys
275 280 285
Thr Ala Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly Val Glu
290 295 300
Lys Phe Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr
305 310 315 320
Ile Cys Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln
325 330 335
Asn Ile Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys
340 345 350
Glu Ile Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp
355 360 365
Ser Glu Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile
370 375 380
Ile Lys Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys
385 390 395 400
Arg Ser Glu Ala Ala His Gln Gly Val Ile Thr Trp Asn Pro Pro Gln
405 410 415
Arg Ser Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys
420 425 430
Asp Cys Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile
450 455 460
Ala Lys Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr
465 470 475 480
Lys Ser Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr
485 490 495
Ser Asp Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn
500 505 510
Gly Pro His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu
515 520 525
Val Arg Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu
530 535 540
Gln Tyr Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp
545 550 555 560
Tyr Pro Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser
565 570 575
Lys Ala Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile
580 585 590
Ala Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg
595 600 605
Ser Cys Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu
610 615 620
Lys Gln Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu
625 630 635 640
Thr Tyr Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu
645 650 655
Phe Gln Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala
660 665 670
Arg Lys Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro
675 680 685
Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly
690 695 700
Ser Asn Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg
705 710 715 720
Lys Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe
725 730 735
Trp Arg Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr
740 745 750
Arg Cys Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser
755 760 765
Met Glu Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn
770 775 780
Gln His Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val
785 790 795 800
Asn Lys Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe
805 810 815
Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu
820 825 830
Lys Leu Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro
835 840 845
Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile
850 855 860
Gly Ile Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp
865 870 875 880
Val Tyr Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val
885 890 895
Gln Val Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr
900 905 910
Asn Gln Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr
915 920 925
Leu His Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu
930 935 940
Glu Ala Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln
945 950 955 960
His Ile Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn
965 970 975
Val Ile Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu
980 985 990
Met Ser Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp
995 1000 1005
Ser Asp Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile
1010 1015 1020
Met Ser Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro
1025 1030 1035
Leu Lys Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg
1040 1045 1050
Lys Val Lys Val Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp
1055 1060 1065
Gln Glu Ile Cys Ala Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr
1070 1075 1080
Gly Asp Ile Glu Val Asp Leu Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr
1085 1090 1095
Tyr Thr Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp
1100 1105 1110
Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr Asn Trp Ser Val Glu
1115 1120 1125
Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile Ser Met Ile Gln Val
1130 1135 1140
Val Lys Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gly Asn Lys
1145 1150 1155
His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg Asp Gly Ser
1160 1165 1170
Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu Ser
1175 1180 1185
Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys Ala
1190 1195 1200
Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr
1205 1210 1215
Gln Phe Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn
1220 1225 1230
Gly Gln Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe
1235 1240 1245
Asp Asn Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn
1250 1255 1260
Pro Leu Gly Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala
1265 1270 1275
Glu Gly Ser Glu Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser
1280 1285 1290
Val Asn Gly Pro Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser
1295 1300 1305
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Gly Gly Phe Gly
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gly Phe Gly Gly
1

Claims (39)

1.一种式(I)缀合物：
Ab-(DL)p(I)
其中：
Ab为结合至CD45的抗体；
并且DL为DLb：
其中
X为：
其中a＝0至5，b1＝0至16，b2＝0至16，c1＝0或1，c2＝0或1，d＝0至5，其中至少b1或b2＝0并且至少c1或c2＝0；
GLL为连接至Ab的接头基团；
当C2与C3之间存在双键时，R22为甲基；
当C2与C3之间存在单键时，R22为H或
当C2’与C3’之间存在双键时，R32为甲基；
当C2’与C3’之间存在单键时，R32为H或并且
并且p为1至8。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中GLL选自：
其中Ar表示C5-6亚芳基，并且X表示C1-4烷基。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中GLL选自GLL1-1和GLL1-2。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中a为0至3。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中b1为0至12。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中b2为0至12。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中c1为1。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中c2为1。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中d为0至3。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中a为0，b1为0，c1为1，c2为0并且d为2，并且b2为0至8。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中a为1，b2为0，c1为0，c2为1，d为2，并且b1为0至8。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的缀合物，其中R22与R32为相同的。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2’与C3之间存在双键，并且R22与R32均为甲基。
14.根据权利要求12所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2’与C3之间存在单键，并且R22与R32均为H。
15.根据权利要求12所述的缀合物，其中C2与C3之间以及C2’与C3之间存在单键，并且R22与R32均为
16.根据权利要求1至11中任一项所述的缀合物，其中DL为：
17.根据权利要求1至11中任一项所述的缀合物，其中DL为：
18.根据权利要求1至17中任一项所述的缀合物，其中p为1至4。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5的VH CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:4的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:3的VH CDR1；
任选其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8的VL CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:7的VL CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:6的VL CDR1；
任选其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:2的序列的VL结构域。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:15的VH CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:14的VH CDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:13的VH CDR1；
任选其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:11的序列的VH结构域。
22.根据权利要求1至18或21中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含氨基酸序列为SEQ ID NO:18的VL CDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:17的VLCDR2以及氨基酸序列为SEQ ID NO:16的VL CDR1；
任选其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:12的序列的VL结构域。
23.根据权利要求1至18中任一项所述的缀合物，其中所述抗体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中：
(i)所述第一抗原结合结构域包含根据权利要求19的VH结构域和/或根据权利要求20的VL结构域；并且
(ii)所述第二抗原结合结构域包含根据权利要求21的VH结构域和/或根据权利要求22的VL结构域。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为完整抗体。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的缀合物，其中所述抗体为非人抗体；
任选其中所述抗体为大鼠抗体，诸如大鼠IgG2b。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的缀合物，所述缀合物用于治疗癌症。
27.一种药物组合物，所述药物组合物包含第一缀合物、第二缀合物以及任选的药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，其中：
(i)所述第一缀合物为根据权利要求19或20中任一项的缀合物；并且
(ii)所述第二缀合物为根据权利要求21或22中任一项的缀合物。
28.如权利要求1至26中任一项所述的缀合物或如权利要求27所述的组合物，所述缀合物或所述组合物供在治疗血液学癌症的方法中使用，所述方法包括向有需要的受试者施用所述缀合物或所述组合物；
任选其中所述血液学癌症选自由以下组成的组：急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及霍奇金氏病。
29.如权利要求1至26中任一项所述的缀合物或如权利要求27所述的组合物，所述缀合物或所述组合物供在使受试者准备进行造血干细胞移植的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用所述缀合物或所述组合物；
任选其中所述准备进行造血干细胞移植包括对所述受试者进行调理以便植入造血干细胞。
30.如权利要求29的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞为同种异体的。
31.如权利要求30的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞移植用于治疗任选选自由以下组成的组的恶性疾病或病症：急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓发育不良、骨髓增生性疾病、非霍奇金氏淋巴瘤以及霍奇金氏病。
32.如权利要求30的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞移植用于治疗任选选自由以下组成的组的非恶性疾病或病症：重度再生障碍性贫血、骨髓衰竭病症、原发性免疫缺陷、血红蛋白病、原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症以及遗传代谢性疾病。
33.如权利要求30或32中任一项的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞移植用于治疗：
(i)选自以下的骨髓衰竭病症：范可尼贫血、先天性角化不良、舒-戴二氏综合征；
(ii)选自以下的原发性免疫缺陷：SCID、慢性肉芽肿病、维-奥二氏综合症、CD40配体缺陷、XLP、MHC II类缺陷；
(iii)选自以下的血红蛋白病：镰状细胞病、β-地中海贫血重症；或
(iv)选自以下的遗传代谢性疾病：贺勒氏综合征、X连锁肾上腺脑白质营养不良以及骨硬化病。
34.如权利要求29的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞为自体的。
35.如权利要求34的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞移植用于治疗任选选自由以下组成的组的恶性疾病或病症：多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病。
36.如权利要求34的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞移植用于治疗任选选自由以下组成的组的自体免疫疾病或病症：多发性硬化、系统性硬化以及系统性红斑狼疮。
37.如权利要求29的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞为基因修饰的自体造血干细胞。
38.如权利要求29或37中任一项的供使用的缀合物或组合物，其中所述造血干细胞移植用于基因疗法；
任选其中所述基因疗法用于治疗遗传血液疾病或病症、原发性免疫缺陷或遗传代谢性病症，诸如：
(i)选自以下的遗传血液疾病或病症：血红蛋白病、输注依赖性血红蛋白病、镰状细胞病、β-地中海贫血重症、范可尼贫血以及原发性HLH；
(ii)选自以下的原发性免疫缺陷：SCID、慢性肉芽肿病以及维-奥二氏综合症；或
(iii)选自以下的遗传代谢性病症：贺勒氏综合征、X-肾上腺脑白质营养不良以及异染性脑白质营养不良。
39.如权利要求1至26中任一项所述的缀合物或如权利要求27所述的组合物，所述缀合物或所述组合物供在在受试者中植入干细胞的方法中使用，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用有效量的所述缀合物或所述组合物；以及
(b)向所述受试者的靶组织施用干细胞群体，其中所施用的干细胞群体植入所述受试者的所述靶组织中。
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