CN1268176A - 改进的抗lgE抗体以及改进多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过多步组合来调节多肽对靶分子亲和力的方法,该方法包括下列步骤:(1)鉴定倾向于异构化的天冬氨酰基残基;(2)以替换残基替代和筛选所得突变体对靶分子的亲和力。在一个较佳的实例中,替代残基的方法是用噬菌体展示的亲和力成熟法(AMPD)。在另一个较佳的实例中,多肽是抗体,靶分子是抗原。在另一个较佳的实例中,抗体是抗IgE,靶分子是IgE。在另一个实例中,本发明涉及具有对IgE亲和力有所改进的抗IgE抗体。

Description

改进的抗IgE抗体以及改进多肽的方法
                      发明背景
本发明设计免疫球蛋白E(IgE)、IgE拮抗剂、能结合人IgE的抗IgE抗体，以及一种改进多肽(包括抗IgE抗体)的方法。
IgE是介导变应性应答(如广泛遭受的哮喘、食物过敏、I型超敏反应和家族性(familiar)窦炎)的免疫球蛋白家族中的一个成员。IgE由B细胞或B淋巴细胞分泌并表达在细胞表面。IgE通过其针对低亲和力IgE受体(称为FcεRII)的Fc区域结合B细胞(以及单核细胞、嗜酸性粒细胞和血小板)。在哺乳动物接触变应原时，携带对抗原特异性的、表面结合的IgE抗体的B细胞被“激活”并发育成分泌IgE的浆细胞。然后，产生的变应原特异性的IgE通过血液循环，通过高亲和力受体(也称为FCεRI)结合到组织中肥大细胞以及血液中的嗜碱性粒细胞的表面上。从而，使肥大细胞和嗜碱性粒细胞对变应原致敏。随后与变应原的接触引起嗜碱性粒细胞和肥大细胞的FcεRI交联，从而导致释放出引起临床超敏反应和过敏症状的组胺、白细胞三烯和血小板激活因子、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞趋化因子和细胞因子IL-3、IL-4、IL-5和GM-CSF。
病理学超敏症状的特征是，如果存在相当大量的变应原或如果体液和细胞免疫状态处于增强水平，对变应原的过度免疫应答将导致大量组织变化。
过敏性超敏反应的生理性变化可以包括肺细支气管和支气管强烈收缩、平滑肌收缩和毛细管扩张。然而，该病征的诱因似乎是遗传因素和环境因素之间的相互作用而引起的。诱导过敏性超敏反应的常见环境性变应原见于花粉、食物、屋尘螨、动物毛发皮屑、真菌孢子和昆虫毒液。特应性变应原与过敏性超敏反应有关，并诱导了诸如哮喘、变应性关节炎和结膜炎(枯草热)、湿疹、荨麻疹和食物过敏。然而，昆虫叮咬或非肠胃道药物治疗(parental medication)通常会激发过敏性休克，一种威胁生命的有害的过敏性反应。
最近，对I型超敏反应或过敏性超敏反应已经获得一种治疗方案，它试图阻断IgE与嗜碱性粒细胞以及肥大细胞上发现的高亲和力受体(FcεRI)结合，从而防止组胺和其它过敏性因子的释放而导致产生病理状态。
1993年3月4日公开的WO93/04173描述了人IgE/IgG1嵌合体，其中IgG1残基被类似的IgE残基替代。申请人的待批申请USSN08/405,617描述了人源化的抗IgE抗体，其中用针对人IgE的鼠抗体(MaE11)来提供CDR区域代替到IgG1免疫球蛋白框架(rhuMaE25)内。Reichman，L.等人(1988)Nature 332：323和Jones，P.T.等人(1986)，Nature 321：522中描述了人源化技术。
尽管已经建立了人源化的鼠抗体来提供抗IgE分子(它提供了与鼠MaE11相似的对IgE的亲和力，而后者不会引发免疫原性应答(Shields等人，(1995)，Int.Arch.Allergy Immunol.107：308-312))，然而这仍然没有构建出对IgE的亲和力明确优于MaE11或鼠抗IgE的抗IgE。
重组单克隆抗体将经历影响所有多肽或蛋白的降解反应，例如天冬氨酸和天冬酰胺残基的异构化。如下图A所示，-Asp-Gly-序列中的天冬氨酸残基(I)能通过环状酰亚胺中间产物(II)异构化成异天冬氨酸(III)(Geiger & Clarke，J.Biol.Chem.262：785-794(1987))。天冬氨酸(I)的羧酸侧链和毗邻甘氨酸的酰胺氮反应，形成环状的天冬氨酸中间物(II)，进而形成-异天冬氨酸-甘氨酸-残基(III)。该反应的平衡、速率以及pH依赖性已经在通过反向高效液相层析分离的模型肽中进行了研究(Oliyai & Borchardt，Pharm Res.10，95-102(1993))。据信，经历异构化作用的趋势还取决于含有-Asp-Gly-序列的分子部分的局部柔韧性(Geiger & Clarke，同上)。
Figure A9880843100061
经历了天冬氨酸异构化的一种已知的抗体例子是称为rhuMabE-25的强效抗IgE抗体E-25(E-25)。该行为可能自发产生，也可以使E25于37℃培育21天来诱导产生。最后的结果是抗体多肽骨架中插入一个额外的甲基，这能导致构型变化和结合亲和力减少。用带有VL32-33位的-c-Asp-Gly-以及-异-Asp-Gly-变体的E-25研究表明，尽管用丙氨酸或甘氨酸替代残基VL32可以最大程度地减小异构化行为，但是替代本身会导致结合力减少3倍。Cacia等人，同上。
因此，迫切需要产生改进的多肽(包括抗体)，它不仅不表现出天冬氨酸异构化的“失活”行为，而且应显示出与靶分子(例如抗原)的亲和力等于或大于未改进多肽亲和力。
                           概述
本发明涉及通过多步组合来改进对靶分子有亲和力的多肽的方法，该方法包括：(1)鉴定易异构化的天冬氨酰残基；(2)用其它残基替代，并筛选所产生的对靶分子有亲和力的突变体。在一个较佳的实例中，替代残基的方法是用噬菌体展示亲和力成熟(affinity maturation)(AMPD)。在另一个较佳的实例中，多肽是抗体，靶分子是抗原。在另一个较佳的实例中，抗体是抗IgE，靶分子是IgE。
在还有一个更佳的实例中，本发明涉及一种改进抗IgE抗体E-25亲和力的方法，该方法是用Glu取代VL CDR-L1残基32Asp，以及将VL CDR-L1残基27Gln，28Ser和31Tyr分别修饰成Lys，Pro和Gly。在还有一个更佳的实例中，E-25抗IgE抗体在VH CDR2残基中有额外的修饰：53Thr变成Lys，55Asp变成Ser，57Ser变成Glu，以及59Asn变成Lys。
在另一个实例中，本发明涉及对IgE的亲和力有所改进的抗IgE抗体。
在一个较佳的实例中，抗IgE抗体包含重链和轻链残基，它们包含图2中标记为“e27”和“e26”的序列片段。或者，抗IgE抗体包含图12中标记为“E27”或“E26”的全长重链和轻链序列。
本发明还涉及一种具有药物用途的亲和力改进的抗IgE或其功能性片段的组合物。本发明还涉及包含亲和力改进的抗IgE抗体的产品。
在还有一个实例中，本发明涉及一种减少或抑制IgE介导组胺产生的方法。
在还有一个实例中，本发明还涉及一种治疗IgE介导疾病的方法，该方法是给予本发明的抗体或其功能性片段。
本发明的其它方面将从下列详细描述和权利要求中明显看出。
                         附图简述
图1是鼠抗体MAE11、人重链亚型III(humIII)以及轻链κ亚型I(humκI)的共有序列以及片段F(ab)-2(一种具有CDR残基、且某些框架残基被修饰成鼠残基的修饰的人抗体片段)之间VH和VL结构域的比较。
图2是rhuMabe25，e426和序列e26和e27之间轻链和重链CDR结构域之间的不同的比较。本文的残基编号是连续的，与Kabat等人的不同。还应注意，这些序列只是片段，而不是真实的全长重链和轻链残基。
图3是FACS为基础的试验，该图表明了受测试抗体抑制FITC偶联的IgE结合表达在CHO 3D10细胞上的高亲和力FcεRI受体α链的能力。图中示出了鼠单抗MaE11(□)、阴性对照人源化的单抗4D5(■)、F(ab)-2(○)、F(ab)-9(●)、F(ab)-11(△)和F(ab)-12(▲)的抑制百分数。数据点是三次实验的平均值，除单抗mAb4D5外，它是一次实验的数值。结果表明，MaE11和测试的F(ab)阻断了FITC-IgE与表达FcεRIα链的CHO 3D10细胞的结合。
图4是FACS为基础的试验的图，它测定了受测试抗体与CHO 3D10细胞上表达的高亲和力受体FcεRI的α亚基所载的IgE的结合。图中示出了鼠单抗MaE11(○)、人源化变体12(▲)、阳性对照鼠单抗MaE1(●)、阴性对照抗体鼠MOPC21(△)、以及阴性对照人源化单抗4D5(□)的结合百分数。在算术/线性规模上，0.1μg/ml时的平均通道荧光数值为：MPOC21，7.3；MaE1，32.1；MaE11，6.4；hu4D5，4.7；和huMaE11，4.6。所有三种鼠单抗是鼠同种型IgG1，二种人源化单抗是人同种型IgG1。数据点是三个实验的平均值。结果表明，MaE11和F(ab)-12不结合载有IgE的表达FcεRIα链的CHO 3D10细胞。
图5是抗IgE对豚草诱导的组胺释放的抑制百分数的摩尔比。图中显示了E-25(●)和e-26(○)。结果表明，e26的F(ab)形式以剂量依赖方式很好地抑制了豚草诱导的组胺释放，最大半数抑制的摩尔比为44∶1(抗IgE∶RSIgE)。
图6示出了实施例4部分II中描述的各轮亲和力选择后的亲和力富集情况。图中显示了每一合并物的结合富集物与野生型之比(Emut/Ewt)。结果表明，VL文库(用＂a＂&＂b＂表示)连续展示了改进的相对富集，在5-6轮富集后比野生型高大约10倍。另外，VH文库(＂c＂和＂d＂)在约3轮后表现出提高大约3倍。注意，＂a＂对应于在VL CDR-1残基27、28、30和31位突变的Fab-噬菌体文库，而＂b＂对应于30、31、32和34位突变，而＂c＂和＂d＂是在残基101、102、103、105和107有突变的独立F(ab)文库。
图7显示了在最终变体的噬菌体ELISA竞争性研究中，观察到的光密度对IgE竞争性抗体的浓度，该最终的变体通过e26中VL CDR1突变和克隆235-5.1、235-5.2、235-5.3和235-5.4中VH CDR2突变组合而得，分别重新命名为e27，e695，e696和e697(如实施例4部分V所述)。
图8显示了各种浓度水平的e25，e26和e27抗IgE抗体在实施例4部分VI中描述的生物素平板试验中的490nm吸收值。
图9表示了e25，e26和e27d F(ab)表观结合亲和力，用BIAcore TM-2000表面等离子体激元(plasmon)共振系统来测定。将PBS/Tween缓冲液(0.05％Tween-20，以磷酸盐缓冲液配)作1.5倍连续稀释的F(ab)抗体片段，于25℃以20微升/分钟的流速注射在IgE芯片上。所示的平衡解离常数(Kd)从每个Fab变体观察到的kon/koff比值计算得到。
图10是质粒p426的序列表，该质粒在实施例4中作为模板用来构建文库特异性终止模板。
图11。A.质粒pDH188插入物的框图，它含有的DNA编码针对HER-2受体的Fab人源化抗体的轻链和重链(可变区和恒定区1)。VL和VH分别是轻链和重链的可变区。Cκ是人κ轻链的恒定区。CH1G1是人γ1链的第一恒定区。两个编码区均从细菌stII信号序列开始。
B.含有11A所述插入物的整个质粒pDH188的示意图。在将质粒转化入大肠杆菌SR101细胞中并加入辅助噬菌体后，质粒被包装入噬菌体颗粒中。这些颗粒中一些展示了Fab-pIII融合(其中pIII是M13基因III DNA编码的蛋白质)。
图12表示抗IgE抗体E25、E26和E27的全长重链和轻链残基。
图13表示抗IgE抗体e26和e27的F(ab)片段。
图14表示抗IgE抗体e26和e27的sFV片段。
图15表示抗IgE抗体e26和e27的F(ab)′2片段。
SEQ ID NO：1表示用于本发明的表达质粒e426的序列，另如图10所示。
SEQ ID NO：2表示图1所示的MaE11的可变重链序列。
SEQ ID NO：3表示图1所示的F(ab)-2的可变重链序列。
SEQ ID NO：4表示图1所示的humIII的可变重链序列。
SEQ ID NO：5表示图1所示的MaE11的可变轻链序列。
SEQ ID NO：6表示图1所示的F(ab)-2的可变轻链序列。
SEQ ID NO：7表示图2所示的humIII的可变轻链序列。
SEQ ID NO：8表示图2所示的e26和e27的可变轻链序列。
SEQ ID NO：9表示图2所示的e426的可变轻链序列。
SEQ ID NO：10表示图2所示的e25的可变轻链序列。
SEQ ID NO：11表示图2所示的e27的可变重链序列。
SEQ ID NO：12表示图2所示的e25，e26和e426的可变重链序列。
SEQ ID NO：13表示图12所示的e25的全长可变轻链序列。
SEQ ID NO：14表示图12所示的e25的全长重链序列。
SEQ ID NO：15表示图12所示的e26的全长轻链序列。
SEQ ID NO：16表示图12所示的e26的全长重链序列。
SEQ ID NO：17表示图12所示的e27的全长轻链序列。
SEQ ID NO：18表示图12所示的e27的全长重链序列。
SEQ ID NO：19表示图13所示的e26和e27的可变轻链Fab片段。
SEQ ID NO：20表示图13所示的e26的可变重链Fab片段。
SEQ ID NO：21表示图13所示的e27的可变重链Fab片段。
SEQ ID NO：22表示图14所示的e26的sFv片段。
SEQ ID NO：23表示图14所示的e27的sFv片段。
SEQ ID NO：24表示图15所示的e26和e27的可变轻链F(ab)′2片段。
SEQ ID NO：25表示图15所示的e26的可变重链F(ab)′2片段。
SEQ ID NO：26表示图15所示的e27的可变重链F(ab)′2片段。
                      较佳实例详述
整篇本申请中提及的特定文献、专利申请和专利应被视为纳入本说明书作为参考。
定义：
整篇申请中采用的术语应被理解成具有本领域普通技术人员通常所知的典型的意义。然而，申请人希望给予下列术语如下特定定义：
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。该定义范围中特别提到了抗体。
本发明的多肽可包含一个以上的亚基，每个亚基一条由分开的DNA序列编码。
关于抗体多肽序列的短语“基本上相同”应理解成，抗体表现出与参照多肽序列至少70％的序列相同(较佳的为80％，更佳的90％，最佳的为95％)。关于核酸序列的短语应理解成，核苷酸序列表现出和参照核酸序列至少有约85％的序列相同(较佳的90％，更佳的95％，最佳的为97％)。对于多肽，比较序列的长度通常至少为25个氨基酸。对于核酸，长度通常至少为75个核苷酸。
术语“相同性”或“同源性”应理解成是指，在序列排列对齐并引入空隙(如果需要)从而使整个序列达到最大的序列相同百分比之后，并且不考虑保守替代作为序列相同性的一部分时，候选序列中和与其比较的对应序列中残基相同的氨基酸残基的百分数。N端或C端延伸或插入不应被理解成是减少了相同性或同源性。用于序列排列对比的方法和计算机程序是本领域所熟知的。用序列分析软件(例如，序列分析软件包，Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Ave.，Madison，WI 53705)可以测定序列相同性。该软件通过指定不同替代、缺失和其它修饰同源度来相容类似的序列。
术语“抗体”被最广义地使用，并且具体地包括：单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构性质的糖蛋白。抗体对特定抗原表现出结合特异性，而免疫球蛋白则包括抗体以及缺失抗原特异性的其它抗体样分子。后一类多肽(例如)由淋巴系统低水平产生，由骨髓瘤高水平产生。
天然抗体和天然免疫球蛋白通常是约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端是恒定区。轻链的恒定区与重链的第一恒定区相对排列，轻链的可变区与重链的可变区相对排列。据信特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面(Clothia等人，J.Mol.Biol.186，651-66，1985；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，4592-4596(1985))。
“分离的”抗体是经鉴定的和分离的和/或回收自产生它的环境组分的抗体。其产生环境中的污染性组分是会干扰抗体的诊断或治疗性用途的物质，可能包括酶、激素和其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在较佳的实例中，抗体纯化用至少三种不同方法测定：1)经Lowry法测定，按抗体重量计高于95％，最好高于99％；2)其纯度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个N末端残基或内部氨基酸序列；或3)用考马斯蓝或较佳的用银染法，在还原或非还原条件下作SDS-PAGE测定时达到均质。分离的抗体包括存在于重组细胞内的原位抗体，因为该抗体的天然环境的至少一种组分是不存在的。但是，通常，分离的抗体经至少一步纯化步骤制得。
“依赖于动物种类的抗体”，例如哺乳动物抗人IgE抗体，是这样一种抗体，它对来自第一种哺乳动物的抗原的结合亲和力比其对来自第二种哺乳动物的该抗原同源物更强。通常，依赖于动物种类的抗体“特异性结合”人抗原(即，结合亲和力(kd)数值不超过大约1×10-7，较佳的不超过大约1×10-8，最佳的不超过1×10-9M)，但是对第二种非人哺乳动物抗原同源物的结合亲和力比其对人抗原的结合亲和力至少弱50倍、或至少弱约500倍、或至少弱约1000倍。依赖于动物种类的抗体可以上述的任何类型的抗体，但是较佳的是人源化抗体或人抗体。
术语“抗体突变体”指抗体的氨基酸序列变体，其中一个或多个氨基酸残基已被修饰。这些突变体与原氨基酸序列的相同性或相似性必定低于100％，与抗体的重链或轻链可变区的氨基酸序列的氨基酸序列相同性或相似性至少为75％，较佳的至少80％，更佳的至少85％，还要佳的至少90％，最佳的至少95％。由于本发明的方法同样适用于多肽、抗体和其片段，因此这些术语有时可互换。
在抗体可变区中术语“可变”指这样一个事实：可变区的某些部分在不同抗体序列中有很大的不同，这些部分用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体可变区中。它集中在轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)(也称为超变区)的三个节段中。测定CDR至少有两种技术：(1)以物种交叉序列变异性为基础的方法(即，Kabat等人，免疫学感兴趣的蛋白的测序(National Institute of Health，Bethesda，MD 1987))；和(2)以抗原-抗体复合物的晶体图学研究为基础的方法(Chothia，C.等人(1989)，Nature 342：877)。关于本申请人的抗IgE抗体，某些CDR是通过Kabat等人和Chothia等人的方法的组合来确定的。可变区中更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包含四个FR区，它们大多数采取β折叠构型，由三个形成环的CDR连接β折叠结构(在某些情况下形成β折叠的一部分)。每条链中的CRD通过FR区和另一条链的CDR紧密毗邻在一起，形成抗体的抗原结合部位(见Kabat等人)。恒定区不直接参与抗体和抗原的结合，但是表现出不同效应功能，例如参与抗体的抗体依赖型细胞毒性。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段，每个片段有单个抗原结合部位)，以及一个残余的“Fc”片段(如此称呼是因为它很容易结晶)。用胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段(它具有两个能与抗原交联的抗原结合片段)以及一个残余的其它片段(称为pFc′)。其它片段可包括二抗体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子和抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的，关于抗体的术语“功能性片段”是指Fv，F(ab)和F(ab′)2片段。
“Fv”是最小的抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。该区域由紧密、非共价关联的一个重链和一个轻链可变区的二聚物(VH-VL二聚物)组成。在该构型中，各可变区中的三个CDR相互作用，确定了VH-VL二聚物表面上的抗原结合位点。6个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半，只包含对抗原有特异性的三个CDR)也能识别并结合抗原，只是其亲和力比整个结合位点低。
Fab片段(还称为F(ab))还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。由于在重链CH1区的羧基端增加了几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)，使Fab′片段和Fab片段不相同。Fab′-SH在本文命名为Fab′，其中恒定区的半胱氨酸残基有一个游离的巯基。通过F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处二硫键的断裂，产生Fab′片段。抗体片段的其它化学偶联方式也是已知的。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，“免疫球蛋白”可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1，IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。用于本发明的较佳的免疫球蛋白是免疫球蛋白E。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一群基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规(多克隆)抗体制剂(通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等人，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567)制得。用于本发明的单克隆抗体也可用例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离获得。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)(其中重链和/或轻链的一部分与特定动物种类衍生的、或是属于特定的抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而链的其余部分则与另一动物衍生的、或是属于另一抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源)以及这些抗体的片段，只要这些片段具有所需的生物活性即可(US4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其它抗原结合性亚序列)，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者的互补决定区(CDR)残基被非人(供者抗体)(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠或兔抗体)的CDR残基代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被对应的非人残基代替。另外，人源化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于导入的CDR或构架序列中的残基。作这些修饰能进一步提高和优化抗体性能。通常，人源化抗体包含了基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最好还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的Fc部分。更详细的情况参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
“单链Fv”或＂sFv＂抗体片段包括抗体的VH和VL区，其中这些区在一条多肽链中。通常，Fv多肽还包括VH和VL区间的多肽接头，该接头可使sFv形成结合抗原所需的结构。关于sFv综述可见Pluckthun在《单克隆抗体药理学》(ThePharmacology of Monoclonal antibodies)，113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，269-315页(1994)。
术语“二抗体”指有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包括重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接在同一多肽链(VH-VL)中。由于采用一个短得无法使同一链上两可变区间产生配对的接头，使此二区域与另一链中的互补区配对，形成了两个抗原结合位点。二抗体在例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中有更详细的描述。
术语“抗体的功能性片段或类似物”是指一种化合物具有与全长抗体相同的定性的生物活性。例如，抗IgE抗体的功能性片段或类似物是能结合IgE免疫球蛋白从而阻止或大大减少该分子结合高亲和力受体FcεRI的能力的片段或类似物。
术语“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸。氨基酸的确定见下文章节A“抗体制备：(iv)突变型抗体的产生”中的描述。术语“氨基酸”变体指与天然的氨基酸序列相比其氨基酸序列有一些不同的分子。
“替代型”变体是指天然序列中的至少一个氨基酸残基被除去并在相同位置插入不同氨基酸的那些变体。替代可以是单个，即分子中只有一个氨基酸被替代，或可以是多个，即同一分子中有两个或多个氨基酸被替代。“插入型”变体是天然序列中在紧靠特定位置处的氨基酸插入一个或多个氨基酸的那些变体。紧靠一个氨基酸是指，与该氨基酸的α羧基或α氨基官能团相连。“缺失型”变体是天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被除去的那些变体。通常，缺失型变体在分子特定区域内有一个或两个氨基酸缺失。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换使用，所有这些命名均包括子代。也应理解，由于有意或无意的突变，所有子代也许在DNA内容上不精确相同。其包括了在原始转化细胞中筛选出具有相同功能或生物活性的突变型子代。
本发明所用的“宿主细胞”通常是原核或真核宿主。章节B“载体、宿主细胞和重组方法：(vii)宿主细胞的选择和转化”中描述了合适的宿主细胞的例子。
“转化”指将DNA导入生物体内，从而使该DNA能复制成染色体外元件或整合到染色体内。
“转染”指宿主细胞摄取表达载体，不论是否实际上表达了任何编码序列。
术语“转染的宿主细胞”和“转化的”指将DNA导入细胞内。该细胞被称为“宿主细胞”，它可以是原核或真核细胞。典型的原核宿主细胞包括各种大肠杆菌菌株。典型真核宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞或人源细胞。导入的DNA序列可以与宿主细胞种类相同或不同，或可以是杂交的DNA序列，含有一些外来DNA和一些同源DNA。
术语“可复制的表达载体”和“表达载体”指一段DNA序列，通常是双链，其中可能插入了一段外来DNA。外来DNA定义成异源DNA，它不能在天然的宿主细胞中发现。载体用来将外来或异源DNA运输入合适的宿主细胞。一旦进入宿主细胞，载体能不依赖于宿主染色体DNA而独立复制，可能会产生几个拷贝的载体及其插入(外来)的DNA。
术语“载体”指一种DNA构建物，它含有的DNA序列与能使DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列操作性相连。这些控制序列包括实现转录的启动子、控制该转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或简单地是潜在的基因组插入物。一旦转化到合适宿主中，该载体能不依赖于宿主基因组进行复制和起作用，或在一些情况下，其本身整合入基因组中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是目前最常用的载体形式。然而，本发明还包括起等价功能的其它形式的载体，它们是本领域中已知的。哺乳动物细胞培养表达的典型的表达载体例如以pRK5(EP307,247)，pSV16B(WO91/08291)和pVL1392(Pharmingen)为基础。
“脂质体”是由不同种类的脂质、磷酯和/或表面活性剂组成的小的囊泡，它可用来相哺乳动物输送药物(例如本文公开的抗体突变体，以及任选的一种化疗剂)。脂质体的组分通常排列成双层形式，其与生物膜的脂质排列相似。
表达“控制序列”指在特定宿主生物体中表达DNA序列所必需的操作性相连的编码序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选的操纵子序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
“分离的”核酸分子是经鉴定并与抗体核酸天然来源中通常与其伴随的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。一种分离的核酸分子与其天然发现的形式或环境中不同。因此，当其存在于天然细胞中时，分离的核酸分子能和核酸分子区分开来。然而，分离的核酸分子包括包含在通常表达抗体的细胞内的核酸分子(例如核酸分子在与其天然细胞中不同的染色体位置上)。
当核酸和另一核酸序列置于功能上相关的位置时，则称核酸“操作性相连”。这可以是基因和调控序列，它们相连后允许在合适分子(转录激活蛋白)结合调控序列时表达基因。例如，如果它表达成前蛋白(preprotein)参与多肽的分泌，则将前序列(presequence)或分泌性前导序列的DNA与多肽DNA操作性相连；如果它影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列操作性相连；或如果它影响序列的转录，则核糖体结合位点与编码序列操作性相连；或如果它放置的位置能促进翻译，则核糖体结合位点和编码序列操作性相连。通常，“操作性相连”指相连的DNA相连是毗邻的，就分泌性前导序列而言，是毗邻且在读框内的。然而，增强子不一定要毗邻。连接通过常规限制性位点处的连接来实现。如果这种位点不存在，则根据常规实践采用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“处理”指治疗性处理和预防性措施。需要处理的患者包括已经患有疾病以及有待预防疾病的那些人。
“疾病”是可从本文多肽的处理获益的任何病征。这包括慢性和急性失调或疾病，包括使哺乳动物容易患该疾病的病理学症状。
本文所用的用于辅助治疗的术语“免疫抑制剂”指能抑制或掩蔽植入移植物的宿主的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达、或掩蔽MHC抗原的物质。这些抗原的例子包括2-氨基-5-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077)、咪唑硫嘌呤(或环磷酰胺，在咪唑硫嘌呤有副反应的情况下)；溴隐亭(bromocryptine)；戊二醛(掩蔽了MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中所述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇如糖皮质类固醇，例如强的松、甲基强的松和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素γ、β或α的抗体；抗肿瘤坏死因子α抗体；抗肿瘤坏死因子β抗体；抗白细胞介素-2抗体和IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体，较佳的是抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LAF-3结合域的可溶性肽(WO90/08187，1990年7月26日公开)；链激酶；TGF-β；链道酶；宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；纳巴霉素；T细胞受体(美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等人，Science 251：430-432(1991)；WO90/11294；和WO91/01133)；和T细胞受体抗体(EP340,109)如T10B9。这些试剂可同时给予，或和CD11a抗体分开给予，并采用和现有技术描述的相同或较少的剂量。较佳的辅助性免疫抑制剂将取决于许多因素，包括待处理疾病的类型(包括进行移植的类型)、以及患者的病史，但是总体上来说，优先选择环孢菌素A、糖皮质类固醇(最佳的是强的松或甲基强的松)、OKT-3单克隆抗体、咪唑硫嘌呤、溴隐亭、异源抗淋巴细胞球蛋白或它们的混合物。
术语“癌”或“癌的”是描述哺乳动物中典型特征为无控制性的细胞生长的生理性症状。癌症例子包括，但不局限于，癌、淋巴瘤、胚母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特定的癌症例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肠胃癌、胰癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳房癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌和各种类型的头颈癌。
需要治疗的“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物、非人灵长类、以及动物园、运动场动物，或宠物，如狗、马、猫、奶牛等。
本文所用的术语“标记的表位”指多肽与“表位标记”融合。表位标记多肽具有足够的残基来提供一个表位，针对该表位能够制得抗体，但是该表位又短得足以不干扰该多肽的活性。较佳的，表位标记也是相当独特的，从而使针对它的抗体基本上不会和其它表位发生交叉反应。合适的标记多肽通常具有6个氨基酸残基，通常在大约8-50个氨基酸残基之间(较佳的在大约9-30个残基之间)。例子包括：flu HA标记多肽及其抗体12CA5(Field等人，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988))；c-myc标记和针对它的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等人，Mol.Cell.Biol.5(12)：3610-3616(1985))；以及单纯性疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体(Paborsky等人，Protein Engineering 3(6)：547-552(1990))。在某些实例中，表位标记是“补救受体结合表位”。
本文所用的术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)Fc区的一个表位，它负责提高IgG分子的体内血清半衰期。
术语“细胞毒剂”在此指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90、和Re186)、化疗剂和毒素(例如来自细菌、真菌、植物或动物的酶促活性毒素或其片段)。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂包括例如阿霉素(Adriamycin)、阿霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、Taxotere(docetaxel)、Bulsulfan、细胞毒素(cytoxin)、红豆杉醇、甲氨蝶呤、顺氯铵铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞宾(vinorelbine)、卡铂、替尼泊甙、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、更生霉素、丝裂霉素、Esperamicins(参见美国专利4,675,187)、美法仑以及其它相关的氮芥。
本申请所用的术语“前体药物(prodrug)”指药学活性物质的前体或衍生形式，其对肿瘤细胞的细胞毒性低于亲代药物，并且能够被酶促激活或转化成较高活性的亲代形式。例如参见Wilman，“癌症化疗中的前体药物”(Prodrugs in CancerChemotherapy)，Biochemical Society Transaction 14，375-382页，第615次会议，Belfast(1986)和Stella等人，“前体药物：定靶药物释放的化学方法”(Prodrug：AChemical Approach to Targeted Drug Delivery)，Directed Drug Delivery，Borchardt等编辑，247-267页，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括(但不限于)：含磷酸盐的前体药物、含硫代磷酸盐的前体药物、含硫酸盐的前体药物、含肽的前体药物、经D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、含β内酰胺的前体药物、含任选地取代的含苯氧基乙酰胺的前体药物或任选地含取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物，它们可以被转化为细胞毒性更高的游离药物。可以衍生成为本发明所用前体药物形式的细胞毒性药物的例子，包括但不限于前文所述的化疗剂。
本文所用的词语“标记”指直接或间接与抗体偶联的可检测化合物或组合物。标记自身可以被检测到(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，如果是酶标记，它们可催化化合物或组合物底物发生可检测的化学转变。
本文所用的术语“固相”指本发明抗体可粘附于其上的非水性基质。固相的例子在此包括：部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷形成的固相。在某些实例中，根据上下文，固相可能包括测试板的孔；而在其它实例中，可能是纯化柱(例如亲和层析柱)。该术语还包括分散的颗粒构成的不连续固相，如美国专利No.4,275,149中所述的。
本文所用的术语“抗人IgE抗体”指能结合人IgE从而抑制或大大减少该IgE与高亲和力受体FcεRI结合的抗体。较佳的该抗IgE抗体是E-25。
本文所用的术语“IgE介导的疾病”指特征为过量产生IgE和/或对免疫球蛋白IgE超敏的症状或疾病。它应被具体理解成包括与过敏性超敏反应和特应性过敏反应有关的，例如包括：哮喘、变应性关节炎和结膜炎(枯草热)、湿疹、荨麻疹和食物过敏。然而，该术语的范围也包括通常由于蜜蜂或蛇叮咬或母代药物治疗引起的严重的过敏性休克的生理性症状。
“用噬菌体展示的亲和力成熟(AMPD)”在此指Lowman等人在Biochemistry30(45)：10832-10838(1991)中描述的方法，另见Hawkins等人，J.Mol.Biol.254：889-896(1992)。尽管不严格局限于下列描述，该方法简单如下：使几个超变区位点(例如6-7位点)突变，产生在每个位点所有可能的氨基酸替代。以单价方式从丝状噬菌体颗粒中将如此产生的抗体突变体展示和包装作为每个颗粒的M13的基因III产物的融合物。表达不同突变体的噬菌体可以循环通过多轮的结合选择，然后对展示高亲和力的那些突变体进行分离并测序。该方法在WO92/09690(1992年6月11日授权)中另有描述。Cunningham，B.C.等人在EMBO J.13(11)，2508-2515(1994)中描述包括合并亲和力展示的改进的方法。
该方法提供了选择新的结合性多肽的方法，该方法包括：a)构建一个可复制的表达载体，该载体包含编码多肽的第一基因，编码至少一部分天然或野生型噬菌体包被蛋白的第二基因(其中第一和第二基因是异源的)，以及与第一和第二基因操作性相连的转录调控元件，从而形成编码融合蛋白的基因融合物；b)在第一基因中一个或多个选定位置使载体突变，从而形成相关质粒的一个家族；c)用质粒转化合适的宿主细胞；d)用具有编码噬菌体包被蛋白基因的辅助噬菌体感染转化的宿主细胞；e)在适合形成重组噬菌粒(该噬菌粒含有质粒的至少一部分并能转化宿主)的条件下，培养转化的感染的宿主细胞，，调节该条件使少量噬菌粒颗粒在颗粒表面上展示一个以上拷贝的融合蛋白；f)使噬菌粒颗粒和靶分子接触，从而使噬菌粒颗粒的至少一部分结合靶分子；和g)分开结合与未结合的噬菌粒颗粒。较佳的，该方法还包括用结合靶分子的重组噬菌粒颗粒转化合适的宿主细胞，并重复步骤d)至g)一次或多次。
另外，该方法包括由多个亚基组成的多肽，其中可复制表达载体包含的转录调控元件与编码感兴趣亚基的DNA操作性相连，将该亚基与噬菌体包被蛋白融合。
本文所用的术语“抗体噬菌体文库”指用于上述以及Hawkins等人，J.Mol.Biol.254：889-896(1992)、以及Lowman等人，Biochemistry 30(45)：10832-10838(1991)中描述的亲和力成熟方法的噬菌体文库。每个文库包含一个超变区(例如6-7个位点)所产生的所有可能的氨基酸替代。在丝状噬菌体颗粒中以单价形式将这样产生的抗体突变体展示成与包装入每个颗粒并在噬菌体外部表达的M13的基因III产物的融合物。
本文所用的术语“室温”或“环境温度”应为23-25℃。
本文所用的术语“结合性多肽”指以可选择的亲和力结合靶分子的任何多肽。较佳的是，多肽将是最好含有超过约100个氨基酸残基的蛋白。通常，多肽是激素或抗体或其片段。
本文所用的术语“高亲和力”指在生理条件下，亲和常数(Kd)小于10-5，较佳的是小于10-7M。
本文所用的术语“靶分子”指任何分子，不一定是蛋白质，希望针对该分子产生抗体或配体。然而，较佳的靶是蛋白，最佳的靶是抗原。然而，受体(例如激素受体)应特别包括在该术语范围内。
如本文所用的，免疫球蛋白氨基酸残基的所有编号(包括对应于IgE、突变型IgE分子以及本文出现的嵌合IgE分子的特异性部分的肽的氨基酸编号)是根据Kabat等人，感兴趣的免疫球学蛋白的序列(National Institute of Health，Bethesda，MD 1987)中的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统来进行编号的。
发明实施方式
I.提高靶分子亲和力的方法
A.可异构化的天冬氨酰残基的鉴定
在实施本发明时，容易异构化的可异构化天冬氨酰残基可用本领域普通技术人员已知的任何技术来鉴定。例如Cacia等人，Biochemistry 35，1897-1903(1996)中描述了一种方法，其中在37℃培育抗IgE抗体E-25(它含有-Asp-Gly-残基)21天。对未经处理的和经蛋白酶处理的片段进行色谱和质谱分析，鉴定出异构化的-Asp-Gly-。由于已经报道天冬酰胺酰残基会发生异构化(T.Geiger和S.Clarker，J.Biol.Chem.262(2)，785-794(1987))，本发明最好还进行系统性评价和改进含天冬酰胺酰残基的多肽。
B.提高靶分子亲和力的替换残基的选择
本领域技术人员可以用许多技术来优化受体亲和力。通常，这些技术全部涉及感兴趣位点处的各种氨基酸残基的替代，然后筛选分析突变型多肽的受体亲和力。用于本发明的较佳的方法是采用噬菌体展示的亲和力成熟(Hawkins等人，J.Mol.Biol.254：889-896(1992)；Lowman等人，Biochemistry 30(45)：10832-10838(1991))。简言之，使几个超变区位点(例如6-7个位点)发生突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。从丝状噬菌体颗粒中以单价方式将如此产生的抗体突变体展示和包装作为每个颗粒中的M13的基因III产物的融合物。表达不同突变体的噬菌体可循环通过数轮结合选择，然后分离展示高亲和力的那些突变体并测序。
选择新的结合性多肽的方法宜采用结构上相关的多肽的文库。和噬菌体包被蛋白融合的结构上相关的多肽的文库通过诱变来产生，较佳的是，将单拷贝的每个相关多肽展示在含有编码该多肽的DNA的噬菌粒颗粒表面上。然后使这些噬菌粒颗粒接触靶分子，将对靶亲和力最高的那些颗粒与亲和力较低的颗粒分开。然后通过感染细菌宿主扩增高亲和力结合物，并重复竞争性结合步骤。重复该方法直至获得具有所需亲和力的多肽。
另外，还可用多价噬菌体(McCafferty等人，(1990)，Nature 348，552-554；Clackson等人，(1991)，Nature 352，624-628)来表达随机的点突变(用易错DNA聚合酶)，以产生噬菌体抗体片段文库，然后通过对抗原的亲和力来筛选。Hawkins等人，(1992)，J.Mol.Biol.254：889-896。
较佳的是，在亲和力成熟方法中，可复制表达载体是在转录调控元件牢牢控制，并调节培育条件使颗粒表面展示多拷贝融合蛋白的噬菌粒颗粒数量或数目低于1％。另外较佳的是，展示多拷贝融合蛋白的噬菌粒颗粒数量少于展示单拷贝融合蛋白的噬菌粒颗粒数量的10％。最佳的该数量低于20％。
通常，在本发明的方法中，表达载体还含有与编码多肽各亚基的DNA融合的分泌性信号序列，转录调控元件将是启动子系统。较佳的启动子系统选自：LacZ，λPL，TC，T7聚合酶、色氨酸和碱性磷酸酶启动子以及它们的组合。
另外，第一基因通常编码哺乳动物蛋白，较佳的是，蛋白是抗IgE抗体。II.A.＂抗体制备，(vi)多特异性抗体＂部分中列举了其它抗体(但是应注意，该抗体不一定是多特异性的)。其它多肽包括人生长激素(hGH)、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素原、松弛素A链、松弛素B链、松弛素原、糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(THS)和促黄体素(LH)、糖蛋白激素受体、降钙素、胰高血糖素、因子VIII、肺表面活性物质、尿激酶、链激酶、人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、铃蟾肽、因子IX、凝血酶、造血生长因子、肿瘤坏死因子α和β、脑啡肽酶、人血清白蛋白、米勒抑制性物质、小鼠促性腺素相关肽、微生物蛋白，如β内酰胺酶、组织因子蛋白、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、激素或生长因子的受体、整联蛋白、血小板生成素、蛋白A或D、类风湿因子、神经生长因子(如NGF-β)、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)、胰岛素样生长因子I和II、胰岛素样生长因子结合蛋白、CD-4、DNA酶、潜伏相关肽(latency associated peptide)、促红细胞生成素、骨诱导因子(osteoinductive factor)、干扰素(如干扰素α、β和γ)、集落刺激因子(CSF)(如M-CSF、GM-CSF和G-CSF)、白细胞介素(IL)(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子、病毒抗原、HIV包膜蛋白如GP120、GP140、心钠素A、B或C、免疫球蛋白、和上述任一蛋白的片段。
较佳的是，第一基因编码的多肽具有一个或多个亚基，它含有大约100个以上的残基并折叠形成多个刚性二级结构，展示了多个氨基酸能和靶相互作用。较佳的是，第一基因将仅仅在对应于能和靶相互作用的氨基酸的密码子处发生突变，这样将能保留刚性二级结构的完整性。
通常，本发明的方法采用的辅助噬菌体选自：M13KO7、M13R408、M13-VCS和Phi X 174。较佳的辅助噬菌体是M13KO7，较佳的包被蛋白是M13噬菌体基因II包被蛋白。较佳的宿主是大肠杆菌，以及蛋白酶缺陷的大肠杆菌株。已经检测了本发明方法选出的新的hGH变体。构建噬菌粒表达载体，该载体含有可抑制的终止密码子，其功能性地位于编码多肽以及噬菌体包被蛋白的核酸之间。
1.展示在噬菌体表面上的多肽的选择
用重复的“多肽”选择循环来选出越来越高的结合亲和力，方法是用噬菌粒选择多个氨基酸变化，用多个循环选择来选择。在第一轮噬菌粒选择(涉及配体或抗体多肽中第一选择区的氨基酸)后，在配体的其它区域或氨基酸上进行其它轮噬菌粒选择。重复噬菌粒选择循环，直至获得所需的亲和性质。为了描述该方法，实施例4中噬菌体展示以循环方式进行。合并亲和力从不同CDR的组合突变等。
从上文可以理解，多肽结合结构域的氨基酸残基不是连续连接的，可能在多肽的不同亚基上。即，结合区域与结合位点处的特定二级结构(而不是一级结构)相符。因此，通常是将突变导入编码特定二级结构中从多肽内部指向外部的位点处氨基酸的密码子，因此它们有和靶相互作用的可能。
然而，选择作为针对靶分子的配体或抗体的通常不需要能和该靶结合。因此，例如，可选择糖蛋白激素如TSH作为FSH受体的配体，在本发明的方法中用突变型TSH分子的文库来产生新的候选药物。
因此，本发明考虑了结合靶分子的任何多肽，尤其是抗体。较佳的多肽是具有制药用途的那些多肽。抗体的例子在II.A.＂抗体的制备(iv)多特异性抗体＂部分(注意，抗体不必是多特异性的)中有所描述。更佳的多肽包括：生长激素(包括人生长激素、脱-N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素)、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、甲状腺素、胰岛素A链、胰岛素B链、松弛素原、小鼠促性腺素相关肽、微生物蛋白(如β内酰胺酶)、组织因子蛋白、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、激素或生长因子的受体、整联蛋白、血小板生成素、蛋白A或D、类风湿因子、神经生长因子(如NGF-β)、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子(如aFGF和bFGF)、外皮生长因子、转化生长因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)、胰岛素样生长因子I和II、胰岛素样生长因子结合蛋白、CD-4、DNA酶、潜伏相关肽(latency associated peptide)、促红细胞生成素、骨诱导因子(osteoinductive factor)、例如，HIV包膜蛋白的一部分、免疫球蛋白、和上述任一蛋白的片段。另外，例如多肽上的一个或多个预定的氨基酸残基可以被替代、插入或缺失，产生生物性能改进的产物。另外，还包括这些多肽的片段，尤其是生物学活性片段。本发明的其它更佳的多肽是人生长激素和心钠素A、B和C、内毒素、枯草溶菌素、胰蛋白酶和其它丝氨酸蛋白酶。
另外较佳的多肽激素是如下定义的任何氨基酸序列，它们产生于第一细胞中，特异性结合同一类细胞上的受体(自分泌激素)或第二种细胞的受体(非自分泌)，并引起携带受体的细胞特征性生理应答。这些多肽激素是细胞因子、淋巴因子、神经营养激素和腺垂体多肽激素如生长激素、催乳素、胎盘催乳激素、促黄体素、促卵泡激素、β-促脂解素、γ-促脂解素和内啡肽、下丘脑释放抑制激素如促皮质素释放因子、生长激素释放-抑制激素、生长激素-释放因子；和其它多肽激素如心钠素A、B或C。
2.获得编码所需多肽的第一基因(基因1)
编码所需多肽(如抗体)的基因可用本领域已知的方法获得(大致参见，Sambrook等人，分子生物学实验指南，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，(1989))。如果基因序列是已知的，则可用化学方法合成编码基因的DNA(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1963))。如果基因序列未知，或如果该基因以前未被分离，则可从cDNA文库(从表达所需基因的合适组织获得的RNA制得)或合适的基因组DNA文库克隆获得。然后用合适的探针分离基因。对于cDNA文库，合适的探针包括单克隆或多克隆抗体(只要该cDNA文库是表达文库)、寡核苷酸、以及互补的或同源的cDNA或其片段。可用来从基因组DNA文库中分离感兴趣基因的探针包括：编码相同或相似基因的cDNA或其片段、同源的基因组DNA或DNA片段、以及寡核苷酸。用Sambrook等人(同上)第10-12章描述的标准程序，用所选探针筛选cDNA或基因组文库。
分离编码感兴趣多肽(例如抗体)的基因的另一种方法是用Sambrook等人(同上)14章中描述的聚合酶链反应方法(PCR)。该方法需要采用与感兴趣基因杂交的寡核苷酸，因此，为了产生寡核苷酸，必须知道该基因的至少一些DNA序列。
在分离得到基因后，可将其插入扩增用合适载体(较佳的是质粒)，如Sambrook等人(同上)大致描述的那样。
3.构建可复制的表达载体
尽管可获得几种类型的载体并可用来实施本发明，但是质粒载体是此处所用的较佳的载体，因为它们的构建相对容易，并容易扩增。质粒载体通常含有各种组件，包括启动子、信号序列、表型选择基因、复制起始位点、以及本领域普通技术人员所知的其它必需的组件。
原核载体中最常用的启动子包括：lacZ启动子系统、碱性磷酸酶phoA启动子、噬菌体λPL启动子(温度敏感型启动子)、tac启动子(受lac阻遏子调控的杂交的trp-lac启动子)、色氨酸启动子、以及噬菌体T7启动子。关于启动子的通常描述，参见Sambrook等人(同上)第17章。尽管这些是最常用的启动子，但是也可采用其它合适的微生物启动子。
用于实施本发明的较佳的启动子是能牢牢调控从而控制融合基因表达的那些启动子。如果表达不受控制，在噬菌粒表面上将产生多拷贝的融合蛋白，则可能靶和噬菌粒多点附着。认为该多点附着(也称为“亲合性”或“螯合效应”)会导致选出假的“高亲和力”多肽(由于展示在噬菌粒颗粒上的多拷贝融合蛋白相互紧密毗邻，从而“螯合”靶)。当发生多点附着时，有效或表观Kd可能和每一拷贝的展示的融合蛋白的单个Kd的乘积一样高。
通过牢牢调控融合蛋白的表达，从而使不超过少量(即少于约1％)的噬菌粒颗粒含有多拷贝融合蛋白，就克服了“螯合效应”，使得能合适地选择高亲和力多肽。因此，根据启动子，调节宿主的培养条件使含有单拷贝融合蛋白的噬菌粒颗粒数最大，并使含有多拷贝融合蛋白的噬菌粒颗粒数最小。
用于实施本发明的较佳的启动子是lacZ启动子和phoA启动子。lacZ启动子受lac阻遏蛋白lac i调控，因此融合基因的转录能通过调节lac阻遏蛋白的水平来加以控制。通过此描述方法，使含有lac Z启动子的噬菌粒在含有一拷贝lac i阻遏基因(lacZ启动子的阻遏物)的细胞株中生长。含有lac i基因的典型的细胞株包括JM101和XL-1 blue。另外，宿主细胞可用含有阻遏物lac i和lac Z启动子的质粒共同转染。有时，上述两种技术可同时采用，即使含有lac Z启动子的噬菌粒颗粒在含有lac i基因的细胞株中生长，并用含有lac Z和lac i基因的质粒共转染细胞株。通常当希望表达一个基因时，在上述转染的宿主中加入一个诱导物如异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。然而，在本发明中，该步骤被删除，以便(a)最大程度地减少每个噬菌粒数的基因III融合物的表达和(b)防止诱导物(如IPTG)即使在低浓度下引起的较差的或不合适的噬菌粒包装。通常，在没有加入诱导物时，每个噬菌粒颗粒的融合蛋白数量高于0.1(堆积(bulk)噬菌粒颗粒的融合蛋白数)。用来实施本发明的最佳的启动子是pho A。认为该启动子受细胞中无机磷酸盐水平的调控，其中磷酸盐起下调启动子活性的作用。因此，通过损耗细胞中的磷酸盐，启动子的活性可以增加。通过使细胞在富含磷酸盐的培养基(如2YT或LB)中生长来获得所需的结果，从而控制基因III融合物的表达。
用于实施本发明的载体中另一个有用的组件是信号序列。该序列通常位于紧靠编码融合蛋白基因的5′端，因此将转录到融合蛋白的氨基端。然而，在某些情况下，已经证实该信号序列位于除编码待分泌蛋白的基因5′端外的其它位置。该序列使其连接的蛋白靶向通过细菌细胞的内膜。编码信号序列的DNA可以从编码具有信号序列的蛋白的任何基因中以限制性内切核酸酶片段的形式获得。合适的原核信号序列可以从编码(例如)LamB或OmpF(Wong等人，Gene 68；193(1983))，MaIE，PhoA的基因和其它基因获得。实施本发明的一种较佳的原核信号序列是大肠杆菌热稳定的肠毒素II(STII)信号序列(如Chang等人，Gene 55：189(1987)中所述)。
用来实施本发明的载体的另一个有用的组件是表型选择基因。典型的表型选择基因是编码的蛋白能赋予宿主细胞抗生素抗性的那些基因。作为描述，为了该目的可采用氨苄青霉素抗性基因(amp)和四环素(tet)抗性基因。
用Sambrook等人(同上)中描述的标准重组DNA程序制得包含上述组件以及编码所需多肽的基因(基因1)的合适载体构建物。切割待组合而形成载体的分离的DNA片段、修饰并以特定次序和方向连接，产生所需的载体。
DNA用合适缓冲液中的合适限制性反应酶切割。通常，在大约20微升的缓冲液中，将大约1-2单位的合适的限制性酶用于大约0.2-1μg的质粒或DNA片段。合适的缓冲液、DNA浓度、以及培育时间和温度由限制性酶的生产商指定。通常，37℃培育1至2小时就足够了，但是有几种酶需要更高的温度。在培育后，用苯酚和氯仿混合液抽提消化溶液，除去酶和其它污染物，通过乙醇沉淀从水性组分中回收DNA。
为了将DNA片段连接在一起形成功能性载体，DNA片段的末端必须相互相容。在某些情况下，末端在内切核酸酶消化后直接相容。然而，可能需要将内切核酸酶消化通常产生的粘性末端首先转变成平头来使它们适用于连接。为了使末端变平，用合适的缓冲液以及10单位DNA聚合酶I的Klenow片段(Klenow)在四种脱氧核苷三磷酸存在下15℃处理DNA至少15分钟。然后用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀纯化DNA。
经切割的DNA片段可用DNA凝胶电泳来作大小来分离和选择。DNA可以电泳通过琼脂糖或聚丙烯酰胺基质。基质的选择取决于待分离DNA片段的大小。在电泳后，用电泳洗脱从基质中抽提出DNA，或如果已经用熔点低的琼脂糖作为基质，则可融化琼脂糖并从中抽提出DNA(如Sambrook等人(同上)6.30-6.33章所述)。
将大约等摩尔量的待连接在一起的DNA片段(先用合适的限制性酶消化，使得待连接的每个片段的末端相容)放入溶液中。该溶液中还含有ATP、连接酶缓冲液以及连接酶(如T4 DNA，10单位/0.5μgDNA)。如果要将DNA片段连接入载体中，则首先用合适的限制性内切核酸酶切割使载体线性化。然后用碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶处理线性化的载体。磷酸化防止了连接步骤期间载体自身连接。
在连接后，将现在插入了外来基因的载体转化入合适的宿主细胞中。对于本发明来说，原核细胞是较佳的宿主细胞。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌株M101、大肠杆菌株294(ATCC号31,446)、大肠杆菌株W3110(ATCC号27,325)、大肠杆菌X1776(ATCC号31,537)、大肠杆菌XL-1 Blue(stratagene)和大肠杆菌B；然而，也可采用大肠杆菌的其它许多菌株例如HB101、NM522、NM538、NM539以及其它许多种属的原核细胞。除了上述的大肠杆菌株系外，也可用杆菌如枯草芽胞杆菌、其它肠杆菌如鼠伤寒杆菌或粘质沙雷菌以及各种假单胞菌属作为宿主。
原核细胞的转化很容易用Sambrook等人(同上)1.82章节描述的氯化钙方法来实现。或者，可用电穿孔来转化这些细胞(Neumann等人，EMBO J.1：841(1982))。通过在抗生素(通常是四环素(tet)或氨苄青霉素(amp))上的生长来选择转化的细胞，由于载体上存在的tet和/或amp抗性基因而赋予转化细胞抗性。
在选出转化的细胞后，使这些细胞在培养基中生长，然后分离质粒DNA(或插入了外来基因的其它载体)。质粒DNA可用本领域已知的方法来分离。两种合适的方法是如Sambrook等人(同上)1.25-1.33章节中描述的小规模DNA制备和大规模DNA制备方法。然后用本领域已知的方法(如Sambrook等人(同上)1.40章节中描述的方法)纯化分离的DNA。然后用限制性图谱和/或DNA测序分析该纯化的质粒DNA。DNA测序通常用Messing等人，Nucleic Acids Res.9：309(1981)中的方法或用Maxam等人，Meth.Enzymol.65：499(1980)中的方法来进行。
4.基因融合
本发明的噬菌体亲和步骤打算将包括所需多肽的基因(基因1)和第二个基因(基因2)融合，从而在转录时产生融合基因。基因2通常是噬菌体的包被蛋白基因，较佳的是噬菌体M13包被蛋白基因III或其片段。基因1和2的融合可通过将基因2插入含基因1质粒中特定位点内来实现，或通过将基因1插入含基因2质粒中特定位点内来实现。
将基因插入质粒内需要使质粒在插入基因的精确位置处切开。因此，在该位点必须有限制性内切核酸酶位点(较佳的是一个唯一的位点，这样质粒在被限制性内切核酸酶消化时只有一个位置被切开)。如上所述对质粒进行消化、磷酸化和纯化。然后将两个DNA连接在一起，将基因插入该线性化质粒内。如果质粒的末端与待插入基因的末端相容，则实现连接。如果用相同的限制性酶切割质粒以及分离的待插入的基因，则用连接酶(如噬菌体T4 DNA连接酶)并在ATP和连接酶缓冲液存在下于16℃培育混合物1-4小时，就可将DNA直接连接在一起(如Sambrook等人(同上)1.68章所述)。如果末端不相容，则必须首先用DNA聚合酶I的Klenow片段或噬菌体T4DNA聚合酶将它们变成平头，这两种聚合酶均需要四种脱氧核糖核苷三磷酸来填平消化的DNA的悬垂的单链末端。或者，可以用核酸酶(如核酸酶S1)或绿豆核酸酶将末端变平，这两种酶的功能是将DNA悬垂的单链切去。然后如上所述用连接酶重新连接DNA。在某些情况下，可能不能将待插入基因的末端变平，因为这样会改变编码区的读框。为了克服这个问题，可采用寡核苷酸接头。接头作为桥梁来连接质粒和待插入基因。这些接头可用标准方法合成制成双链或单链DNA。接头的一个末端与待插入基因的末端相容；首先用上述连接方法连接接头和该基因。设计接头另一末端使其和连接用质粒相容。在设计接头时，必须小心不要破坏待插入基因的读框或质粒中所含基因的读框。在某些情况下，可能需要设计接头，从而使它们编码氨基酸的一部分或编码一个或多个氨基酸。
在基因1和基因2之间可以插入终止密码子，例如终止密码子UAG(琥珀)、UAA(赭石)和UGA(乳白)(Microbiology，Davis等人，Harper & Row，New York，1980，237页，245-247页以及274页)。终止密码子在野生型宿主细胞中的表达导致合成基因1蛋白产物而没有连接基因2蛋白。然而，在抑制性宿主细胞中的生长导致合成可检测量的融合蛋白。该抑制性宿主细胞含有tRNA，该tRNA经修饰在mRNA的终止密码子位置中插入了一个氨基酸，从而导致产生可检测量的融合蛋白。这些抑制性宿主细胞是众所周知的，并且在Bullock等人，BioTechnologies 5，376-379(1987)中有所描述，例如大肠杆菌抑制性菌株。可采用任何可接收的方法将终止密码子放入编码融合多肽的mRNA中。
在编码多肽的第一基因以及编码至少一部分噬菌体包被蛋白的第二基因之间可以插入可抑制密码子。或者，通过取代多肽中最后一个氨基酸三联体或噬菌体包被蛋白中第一个氨基酸，将可抑制的终止密码子插入毗邻融合位点处。当含有可抑制密码子的噬菌粒在抑制性宿主细胞中生长时，它产生可检测量的含有多肽以及包被蛋白的融合多肽。当噬菌粒在非抑制性宿主细胞中生长时，由于插入的可抑制的三联体密码UAG、UAA或UGA的终止作用，合成的多肽基本上不和噬菌体包被蛋白融合。在无抑制性细胞中，由于不存在融合的噬菌体包被蛋白，合成的多肽从宿主细胞中分泌出来(否则它会附着在宿主细胞上)。
5.基因1在选定位置上的改变(突变)
编码所需多肽的基因1的一个或多个所选密码子可以改变。然而，对应于可异构化的天冬氨酸残基的密码子必须改变。改变定义为：编码多肽的基因中一个或多个密码子发生替代、缺失或插入，从而导致多肽的氨基酸序列与未改变的相同多肽的天然序列相比有所改变。较佳的是，这种改变是用其它任何氨基酸代替分子一个或多个区域中的至少一个氨基酸。改变可用本领域已知的各种方法来产生。这些方法包括(但不局限于)寡核苷酸介导的诱变以及盒式诱变。
a.寡核苷酸介导的诱变
寡核苷酸介导的诱变是用来制备基因1的替代型、缺失型和插入型变体的较佳的方法。该技术是本领域所熟知的，如Zoller等人，Nucleic Acids Res 19：6487-6504(1987)所述。简言之，基因1这样来改变：使编码所需突变的寡核苷酸与DNA模板杂交，该模板是单链形式的质粒，含有基因1的未改变的或天然的DNA序列。杂交后，用DNA聚合酶合成模板的整个第二条互补链，从而掺入了该寡核苷酸引物并编码基因1中所选的变化。
通常，采用的寡核苷酸的长度至少为25个核苷酸。最优的寡核苷酸是在突变的核苷酸编码两侧均有12至15个和模板完全互补的核苷酸。这确保寡核苷酸能与单链DNA模板分子合适地杂交。用例如Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：5765(1978)中描述的本领域已知的技术很容易合成寡核苷酸。
DNA模板只能用从噬菌体M13载体(通常获得的M13mp18和M13mp19载体是合适的)衍生的那些载体、或是含有单链噬菌体复制起点的那些载体来产生(如Viera等人，Meth.Enzymol.153：3(1987)中所述)。因此，待突变的DNA必须插入这些载体之一内以便产生一个单链模板。单链模板的产生在Sambrook等人(同上)4.21-4.41章节中有所描述。
为了改变天然的DNA序列，在合适的杂交条件下使寡核苷酸和单链模板杂交。然后加入DNA聚合酶(通常是DNA聚合酶I的Klenow片段)，用寡核苷酸作为合成引物，合成模板的互补链。这样形成了异源双链体，一条DNA链编码突变型基因1，另一条链(原来的模板)编码天然的未改变的基因1的序列。然后将该异源双链体分子转化入合适的宿主细胞(通常是原核细胞如大肠杆菌JM-101)。在细胞生长后，将它们接种到琼脂糖平板上，用32P放射性标记的寡核苷酸引物筛选，以鉴定含有突变DNA的细菌菌落。
可对上面描述的方法进行修改，从而产生一个同源双链体分子，其中质粒的两条链含有突变。修改如下：如上所述使单链寡核苷酸和单链模板退火。将三种脱氧核糖核苷酸(脱氧核糖腺苷酸(dATP)、脱氧核糖鸟苷酸(dGTP)和脱氧核糖胸苷酸(dTTP))和经修饰的硫代脱氧核糖胞苷酸(称为dCTP-(aS)，Amersham)合并。将该混合物加入模板寡核苷酸复合物中。在该混合物中加入DNA聚合酶后，产生了除突变碱基外与模板相同的DNA链。另外，这条新的DNA链将含有dCTP-(aS)代替dCTP，其作用是保护它以免限制性内切核酸酶消化。在异源双链体的模板链被合适的限制性酶切开后，可以用ExoIII核酸酶或其它合适的核酸酶消化模板链通过含有已诱变位点的区域。然后终止反应，留下只有部分单链的分子。然后用DNA聚合酶在所有四种脱氧核糖核苷三磷酸、ATP以及DNA连接酶存在下形成完全双链的DNA同源双链体。然后可以如上所述将该同源双链体分子转化入合适的宿主细胞(如大肠杆菌JM101)中。
一个以上氨基酸被替代的突变体可用几种方法来产生。如果氨基酸在多肽链中紧靠在一起，可用一条编码所有所需氨基酸替代的寡核苷酸同时进行突变。但是，如果氨基酸相互之间相隔一定距离(相隔超过10个氨基酸)，则更难产生一条编码所有所需变化的寡核苷酸。而是，可以用一种或两种替换方法。
第一种方法是，对于每个待替代的氨基酸各产生一条分开的寡核苷酸。然后使诸寡核苷酸和单链模板DNA同时退火，从模板上合成的第二链DNA将编码所有所需的氨基酸替代。另一种方法涉及用两轮或多轮诱变来产生所需的突变体。第一轮如单突变体所述那样：用野生型DNA作为模板，使编码第一个所需氨基酸替代的寡核苷酸和该模板退火，然后产生异源双链体DNA分子。第二轮诱变采用第一轮诱变中产生的突变的DNA作为模板。因此，该模板已经含有一个或多个突变。然后使编码其它所需氨基酸替代的寡核苷酸和该模板退火，现在得到的DNA链编码了第一和第二轮诱变的突变。该所需的DNA可用作第三轮诱变中的模板，如此类推。
b.盒式诱变
该方法也是一种制备基因1的替代型、缺失型、和插入型变体的较佳的方法。该方法根据的是Wells等人，Gene 34：315(1985)中描述的方法。起始材料是包含基因1(待突变的基因)的质粒(或其它载体)。鉴定待突变的基因1中的密码子。在鉴定的突变位点的两侧必须有一个唯一的限制性内切核酸酶位点。如果没有这样的限制性位点存在，则可以用上述寡核苷酸介导的诱变方法来产生，以将它们导入基因1中合适的位置内。在限制性位点已经导入质粒内后，在这些位点切割质粒，使其线性化。用标准程序合成编码限制性位点之间DNA序列(但含有所需的突变)的双链寡核苷酸。分开合成两条链，然后用标准技术将它们杂交在一起。该双链寡核苷酸称为盒。该盒被设计成3′和5′端与线性化质粒末端两相容，这样它能直接连接质粒。现在该质粒含有基因1的突变的DNA序列。
6.获得编码所需蛋白的DNA
在另一个实例中，本发明包括产生含有一个或多个亚基的所需蛋白的变体。每个亚基通常由分开的基因编码。编码每个亚基的每个基因能用本领域已知的方法获得(例如见部分II)。在某些情况下，可能需要用选自本文章节II中所述方法的分离技术来获得编码不同亚基的基因。
在构建含有一个以上亚基的感兴趣蛋白可复制表达载体时，所有亚基可由相同的启动子来调控(该启动子通常位于编码亚基的DNA的5′)，或每个亚基可以由相同的启动子来调控(该启动子通常位于编码亚基的DNA的5′)，或每个亚基可以由在载体中合适取向的分开的启动子来调控，使得每个启动子和待调控的DNA操作性相连。启动子的选择如上文章节III中所述那样进行。
在构建含有编码具有多个亚基的感兴趣蛋白的DNA的可复制表达载体时，读者可参看图11，该图通过描述图示了该载体，图中显示了编码抗体片段每个亚基的DNA。该图大致表明，感兴趣蛋白的一个亚基将和噬菌体包被蛋白(如M13基因III)融合。该基因融合物通常含有其自身信号序列。分开的基因编码其它的亚基，显然每个亚基通常都具有其自身的信号序列。图11还显示单个启动子能调控两个亚基的表达。或者，每个亚基可以受不同启动子独立调控。感兴趣蛋白亚基-噬菌体包被蛋白融合构建物可以如上文章节IV所述那样制得。
在构建所需多亚基蛋白变体家族时，载体中编码各亚基的DNA可以在各亚基的一个或多个位置上发生突变。在构建多亚基抗体变体时，较佳的诱变位点对应于编码位于轻链、重链或两条链互补决定区(CDR)内氨基酸残基的密码子。CDR通常指超变区。诱变编码感兴趣蛋白各亚基DNA的方法基本上如上文章节V所述那样进行。
7.制备靶分子并和噬菌粒结合
靶蛋白(如受体)可以分离自天然来源，或用本领域已知的程序用重组方法制得。通过描述，糖蛋白激素受体可用McFarland等人，Science 245：494-499(1989)中描述的技术制得，大肠杆菌中表达的非糖基化形式如Fuh等人，J.Biol.Chem.265：3111-3115(1990)中所述那样。其它受体可用标准方法制得。
纯化的靶蛋白可以和合适的基质(如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸羟烷酯凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子性载体等)连接。靶蛋白和基质的连接可用如Methods in Enzymol.44(1976)中描述的方法或本领域已知的其它方法来实现。
在靶蛋白连接基质后，在适合噬菌粒颗粒的至少一部分与固定化靶标结合的条件下，使固定化的靶标与噬菌体克隆文库接触。通常，该条件(包括pH、离子强度、温度等)将模拟生理条件。
对固定化靶标高亲和力的结合的噬菌粒颗粒(“结合物”)通过洗涤和低亲和力的那些分开。结合物可用各种方法从固定化靶标上解离下来。这些方法包括用各种方法从固定化靶标上竞争性解离下来。这些方法包括用野生型配体的竞争性解离、改变pH和/离子强度以及本领域已知的方法。
用结合物和辅助噬菌体感染合适的宿主细胞，在适合扩增噬菌粒颗粒的条件下培育该宿主细胞。然后收集噬菌粒颗粒，重复该选择步骤一次或多次，直至收集到对靶分子具有所需亲和力的结合物。
任选地，噬菌粒颗粒文库可以依次和多个固定化靶标接触，以提高对特定靶标的选择性。例如，通常的情况是，配体(如hGH)具有多个天然受体。在hGH的例子中，生长激素受体和催乳素受体均结合hGH配体。可能希望使hGH对生长激素受体的选择性高于对催乳素受体的选择性。这可以这样实现：首先使噬菌粒颗粒文库接触固定化的催乳素受体，洗脱出对催乳素受体亲和力低(即低于野生型hGH)的那些，然后使催乳素亲和力低的“结合物”或未结合物与固定化的生长激素受体接触，然后选择高亲和力的生长激素受体结合物。在这种情况下，对催乳素受体亲和力较低的hGH突变体将具有治疗用途，即使其对生长激素受体的亲和力稍微低于野生型hGH。相同的策略也可用来使特定激素或蛋白对其一级功能受体的选择性高于对其清除性受体的选择性。
在本发明的另一个实例中，可以获得一种改进的底物氨基酸序列。它们可用来为蛋白接头制得更佳的“切割位点”，或用于更佳的蛋白酶底物/抑制剂。在该实例中，将固定化分子(如hGH)受体、生物素-亲和素、或能和基质共价连接的分子通过一个接头和基因III融合。该接头的长度宜为3-10个氨基酸，它将作为蛋白酶的底物。噬菌粒将如上所述那样构建，其中使编码接头区域的DNA随机突变，以产生连接位点有不同氨基酸序列的随机化的噬菌粒颗粒文库。然后将该噬菌粒颗粒文库固定在基质上，并接触所需的蛋白酶。在线性区域内具有所需蛋白酶的较佳底物氨基酸序列的噬菌粒颗粒将被洗脱出来，首先产生编码较佳接头的噬菌粒颗粒的富集合并物。然后使这些噬菌粒颗粒循环几次，产生编码共有序列的颗粒的富集合并物。
II.抗体的产生
起始抗体可用本领域中可获得的技术或产生这种抗体的技术制得。产生抗体的典型方法在下文中有更详细的描述。
抗体针对感兴趣的抗原。较佳的，抗原是在生物学上重要的多肽，将其抗体给予患某种疾病或失调的哺乳动物会导致在该哺乳动物体内产生治疗效果。然而，本发明还包括针对非多肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原，见美国专利5,091,178)的抗体。
当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(如受体)或配体(如生长因子)。典型的抗原包括：分子如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；胰高血糖素；凝血因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(tPA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES趋化因子(活化后可调节的、正常T细胞表达并分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；米勒抑制性物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白；如β内酰胺酶；DNA酶；IgE，一种细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子、神经营养因子(如骨衍生神经神经营养因子BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(如aFGF和bFGF)；外皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5)；胰岛素样生长因子I和II(IGF-1和IGF-11)，des(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD-4蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD9和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子(osteoinductive factor)；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(Il)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；整联蛋白如CD11a，CD11b，CD11c，CD18和ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；上述任一肽的片段。
本发明包括的抗体的较佳分子靶包括CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；ErbB受体家族成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞附着分子，如LFA-1、Mac12、p150，95，VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flk3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。一种特别佳的靶标是IgE。
抗体针对从第一种哺乳动物衍生的抗原而产生。较佳的，第一种哺乳动物是人。然而，也可考虑其它哺乳动物，如农场动物、宠物或动物园动物，例如在要用这种抗体用来治疗这些哺乳动物时。第一种哺乳动物的抗原可以从其天然来源分离获得，以便产生针对它的抗体。然而，如下所述，可用包含该抗原的细胞作免疫原来制备抗体。在其它实例中，抗原用重组方法或其它合成方法制得。选出的抗体通常对抗原有足够强的结合亲和力。例如，抗体可以不超过约1×10-7M(较佳的不超过1×10-8，最佳的不超过约1×10-9M)的结合亲和力(Kd)数值结合第一种哺乳动物的抗原。抗体亲和力例如可用饱和结合；酶联免疫吸附试验(ELISA)；以及竞争性试验(如RIA)来测定。
另外，可对抗体作其它生物活性试验，例如来评价其作为治疗剂的效力。这些试验是本领域已知的，取决于靶抗原和抗体的预期用途。例子包括角化细胞单层粘附试验和针对CD11a的混合淋巴细胞应答(MFR)试验(在下文实施例中均有描述)；肿瘤生长抑制试验(如WO98/06692中描述的)；抗体依赖型细胞毒性(ADCD)和补体介导的细胞毒性(CDC)试验(美国专利5,500,362)；以及拮抗剂活性或血细胞生成试验(见WO95/27062)。
为了筛选能结合感兴趣抗原特定表位的抗体(例如封闭MHM24抗体结合的那些)，可进行如《抗体实验指南》Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow和David Lane编辑(1988)中描述的常规的交叉封闭试验。或者，可进行如Champe等人，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)中描述的表位图谱，来确定抗体是否结合感兴趣的表位。
然后测定抗体对动物种类的依赖性。用上述技术评估抗体对用来产生抗体的抗原的同系物(该同系物来自第二种哺乳动物)的结合亲和力。在较佳的实例中，第二种哺乳动物是非人哺乳动物，在临床前期研究中将抗体给予该动物。因此，第二种哺乳动物可以是非人灵长类，如恒猴、猕猴、狒狒、黑猩猩和短尾猿。在其它实例中，第二种哺乳动物例如可以是啮齿类动物、猫或狗。通常，依赖于动物种类的抗体对第二种非人哺乳动物抗原的结合亲和力比其对第一种哺乳动物抗原的结合亲和力至少弱大约50倍、或至少弱大约500倍或至少弱大约100倍。该结合亲和力通常是不能有效应用的依赖于动物种类的那类抗体对于第二种哺乳动物体内的临床前期研究。
尽管本发明中测定动物种类依赖性(以及评价具有改进性能的抗体突变体；见下文)的较佳的方法是定量测定抗体结合亲和力，但是在本发明的其它实例中，除了或代之以结合亲和力测定外，还评价了依赖于动物种类的抗体和抗体突变体的一种或多种生物性质。典型的这些生物试验如上所述。当这些试验指明了抗体的治疗效力时，它们是特别有用的。通常，在这些试验中显示出性能有所改进的抗体也会具有增强的结合亲和力(但不一定)。因此，在本发明的一个实例中，当所选试验是结合亲和力试验以外的生物活性试验时，采用第二种哺乳动物的“材料”(例如抗原、细胞、组织、器官或整个动物)时依赖于动物种类的抗体通常具有“生物活性”，该活性的效果比其在采用来自第一种哺乳动物的制剂的对应试验中生物活性低至少约50倍，或至少低500倍，或至少低约1000倍。
然后改变依赖于动物种类的抗体，以产生对第二种哺乳动物抗原的结合亲和力比依赖于动物种类的抗体更强的抗体突变体。较佳的是，该抗体突变体对非人哺乳动物抗原的结合亲和力比依赖于动物种类抗体对抗原的结合亲和力强至少约10倍，较佳的强至少约20倍、更佳的强至少约500倍，有时至少强约100倍或200倍。所需的结合亲和力的增强将取决于依赖于动物种类的抗体的最初的结合亲和力。然而，所用的试验是生物活性试验，较佳的是抗体突变体在所选试验中的生物活性比依赖于动物种类的抗体在该试验的生物活性至少高大约100倍，较佳的至少好约20倍，更佳的至少好大约50倍，有时至少好大约100倍或200倍。
为了产生抗体突变体，在依赖于动物种类的抗体的构架区残基中可以导入一个或多个氨基酸变化(例如替代)(例如替代被导入一个或多个变化中)，其结果是抗体突变体对第二种哺乳动物抗原的结合亲和力有所改进。用来修饰的构架区残基的例子包括：直接非共价结合抗原的残基(Amit等人，Science 233：747-753(1986))；与CDR构型相互作用或影响该构型的残基(Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；和/或参与VL-VH界面的残基(EP239400B1)。在某些实例中，一个或多个这些构架区残基的修饰导致抗体针对第二种哺乳动物的抗原的结合亲和力有所增强。例如，在本发明的该实例中，约1至5个构架区残基可以改变。有时，这足以产生适合用于临床前期试验的抗体突变体，即使没有一个超变区残基发生改变。但是，抗体突变体通常将包括额外的超变区变化。
发生改变的超变区残基可以随机变化，尤其是当依赖于动物种类的抗体对第二种哺乳动物的初始结合亲和力是能容易筛选出随机产生的抗体突变体的那类亲和力。
下文描述了用来产生依赖于动物种类因而需要修饰的抗体技术：
A.抗体的制备
(i)抗原的制备
任选地偶联于其它分子的可溶性抗原或其片段，可用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子(如受体、这些受体的片段(例如受体的胞外结构域))可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。这些细胞可以从天然来源(例如癌细胞系)衍生获得，或可以是经重组技术表达跨膜分子的转化细胞。用来制备抗体的其它抗原及其形式对于本领域技术人员来说是显而易见的。
(ii)多克隆抗体
多克隆抗体宜通过多次皮下(sc)注射或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在非人哺乳动物中产生。用双功能或衍生化试剂可以将相关抗原和在待免疫接种动物中有免疫原性的蛋白(例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)偶联，这些衍生试剂例如是马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、亚硫酰氯或R1N＝C＝R(其中R和R1是不同的烷基基团)。
用抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物：混合100微克或5微克蛋白或偶联物(分别针对家兔或小鼠)和3体积的弗氏完全佐剂，并将溶液注射入真皮内多个部位。1个月后，用弗氏完全佐剂中肽或偶联物初始用量的1/5至1/10皮下多点注射加强免疫动物。7-14天后，对动物取血，测定血清的抗体滴度。对动物加强免疫，直至达到滴度平稳。较佳的是，用相同抗原、但偶联了不同蛋白和/或通过不同交联剂偶联的偶联物对动物加强免疫。偶联物还可在重组细胞培育蛋白融合物中制得。另外，可适当采用聚集试剂(如明矾)来增强免疫应答。
所选的哺乳动物抗体通常对抗原有足够强的结合亲和力。例如，抗体能以不高于大约1×10-7M(较佳的不高于大约1×10-8，最佳的不高于大约1×10-9M)的结合亲和力(Kd)数值结合人抗IgE抗原。抗体亲和力可用饱和结合；酶联免疫吸附试验(ELISA)以及竞争性试验(例如放射性免疫试验)来测定。
为了筛选人抗IgE抗体，可以进行如《抗体实验指南》Cold Spring HarborLaboratory，Harlow和David Lane编辑(1988)中描述的常规的交叉连接试验。或者，可进行如Champe等人，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)中描述的表位图谱来确定结合。
尽管测定多肽或抗体效力的较佳的方法是通过定量测定抗体结合亲和力，但是除了或代之以结合亲和力测定外，其它实例预计也能评价抗体的一种或多种性质。当这些试验指明了抗体的治疗效力时，它们是特别有用的。通常，在这些试验中显示出性能有所改进的抗体也会具有增强的结合亲和力(但不一定)。
(iii)单克隆抗体
单克隆抗体是识别单个抗原性位点的抗体。它们均一的特异性使得单克隆抗体比通常含有识别各种不同抗原性位点的抗体的多克隆抗体有用得多。
单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等人，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567)制得。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠或猕猴)，以诱导淋巴细胞，而淋巴细胞产生或能产生特异性结合免疫接种用蛋白的抗体。或者，淋巴细胞可在体外受免疫。然后用合适的融合剂(如聚乙二醇)来融合淋巴细胞和骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))。
将这样制得的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中，使其生长，该培养基中最好含有一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基中通常加入了次黄嘌呤、氨基碟呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质抑制了HGPRT缺陷型细胞的生长。
较佳的骨髓瘤细胞是能有效融合、支持所选抗体生成细胞稳定而高水平产生抗体、且对诸如HAT培养基之类的培养基敏感的那些细胞。其中较佳的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，如从MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(购自Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA)衍生的细胞系和SP-2或X63-Ag8-653细胞(购自美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA)。另外，用来生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系也已有所描述(Kozbar，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal antibody Production Techniques andApplications，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
测定杂交瘤细胞生长的培养液中有无针对抗原的单克隆抗体产生。较佳的是，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性宜通过免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA))来测定。
在鉴定出产生具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序亚克隆该克隆，并用标准方法使其生长(Goding，《单克隆抗体理论和实践》，59-103页，Academic Press，1986)。用于此目的的合适的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可作为动物体内腹水肿瘤在体内生长。
用常规的免疫球蛋白纯化步骤(如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)，将亚克隆分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水体液或血清中分离出来。
很容易分离获得编码单克隆抗体的DNA并用常规步骤对其测序(例如，用能与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的较佳来源。一旦分离出后，可将DNA放入表达载体中，然后将该载体转移到宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。抗体的重组生产在下文有更详细地描述。
在另一个实例中，可以采用McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)所述的技术从产生的抗体噬菌体文库中分离获得抗体或抗体片段。Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库来分离鼠和人抗体。以后的出版物描述了通过链改组(Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992))、以及组合性感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))，来生产高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些方法是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的变化方案。
也可对DNA进行修饰，例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列来代替同源的鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或共价连接到免疫球蛋白多肽。
通常，这些非免疫球蛋白多肽取代了抗体的恒定区，或者它们取代了抗体中一个抗原结合位点的可变区，产生了一个嵌合的二价抗体，该抗体包含对一个抗原有特异性的抗原结合位点和对一不同抗原有特异性的另一个抗原结合位点。
(iv)抗体突变体的产生
一旦鉴定并分离了依赖于动物种类的抗体，它通常被用来产生抗体变体或突变体，其中哺乳动物抗体中一个或多个超变区中的一个或多个氨基酸残基发生改变。或者，或另外，在哺乳动物抗体中可导入一个或多个构架区残基变化(例如替代)，而这些变化导致抗体突变体对人IgE的结合亲和力有所改进。用来修饰的构架区残基的例子包括：直接非共价结合抗原的残基(Amit等人，Science 233：747-753(1986))；与CDR构型相互作用或影响该构型的残基(Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；和/或参与VL-VH界面的残基(EP239 400B1)。在某些实例中，一个或多个这类构架区残基的修饰导致抗体针对人抗原的结合亲和力有所增强。例如，在本发明的该实例中，约1至5个构架区残基可以改变。有时，这足以产生适合用于临床前期试验的抗体突变体，即使没有一个超变区残基发生改变。但是，抗体突变体通常将包括额外的超变区变化。
发生改变的超变区残基可以随机变化，尤其是当依赖于动物种类的抗体的初始结合亲和力是能容易筛选出随机产生的抗体突变体的那些。
一种有用的产生抗体突变体的方法称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham，B.C.和Wells，J.A.Science 244：1081-1085(1989)；Cunningham，B.C.和Wells，J.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，6434-6437(1991))。在此，用丙氨酸或聚丙氨酸残基取代一个或多个超变区残基，来影响氨基酸和第二种哺乳动物抗原的相互作用。那些在功能上表现出对替代敏感的超变区残基再通过在替换位点处引入进一步的或其他的突变来精制(refine)。这样，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先确定的，但是突变本身的性质不必预先确定。如本文所述，筛选以这种方式产生的丙氨酸突变体是否有生物活性。用其它氨基酸可尝试类似的替代，这取决于扫描残基能否赋予的所需的性能。
本发明还提供了更系统性的方法来鉴定待修饰的氨基酸残基。根据该方法，鉴定处依赖于动物种类的抗体中涉及结合第一种哺乳动物抗原的超变区残基以及涉及结合第二种哺乳动物的该抗原同系物的那些超变区残基。为了实现这个目的，可以用丙氨酸扫描依赖于动物种类的抗体的超变区残基，测试每个丙氨酸突变体与第一和第二种哺乳动物抗原的结合。从而鉴定出涉及结合第一种哺乳动物(例如人)抗原的超变区残基和涉及结合第二种哺乳动物(例如非人)此抗原同系物的那些超变区残基。较佳的是，选择明显参与结合第二种哺乳动物(如非人类哺乳动物)抗原、但不结合第一种哺乳动物(如人)抗原的那些残基作为修饰的候选物。在另一个实例中，选择明显参与结合第一和第二种哺乳动物抗原的那些残基来进行修饰。在还有一个但不是较佳的实例中，选择参与结合人IgE抗原、但不结合同系的哺乳动物(非人)IgE的那些残基进行修饰。这些修饰可包括残基缺失或毗邻感兴趣残基处插入一个或多个残基。然而，修饰通常涉及用另一氨基酸替代该残基。
通常，可以从表A标题“较佳的替代”中所示的那些保守性替代开始。如果这种替代导致生物活性(如结合亲和力)改变，那么可引入表A中“典型替代”所命名的、或如下文按氨基酸类型进一步描述的更充实的改变，然后筛选产物。
           表A
   氨基酸残基的保守性替代
最初的残基     典型替代 较佳的替代 DNA密码子
Ala(A) val，leu，ile val GCA，GCC，GCG，GCU
Arg(R) lys，gln，asn lys AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，CGU
Asn(N) gln，his，lys，arg gln AAC，AAU
Asp(D) glu glu GAC，GAU
Cys(C) ser ser UGC，UGU
Gln(Q) asn asn CAA，CAG
Glu(E) asp asp GAA，GAG
Gly(G) pro，ala ala GGA，GGC，GGG，GGU
His(H) asn，gln，lys，arg arg CAC，CAU
Ile(I) leu，val，met，ala，phe，正亮氨酸 leu AUA，AUC，AUU
Leu(L) 正亮氨酸，ile，val，met，ala，phe ile UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，CUU
Lys(K) arg，gln，asn arg AAA，AAG
Met(M) leu，phe，ile leu AUG
Phe(F) leu，val，ile，ala，tyr leu UUC，UUU
Pro(P) ala ala  CCA，CCC，CCG，CCU
Ser(S) thr thr AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，UCU
Thr(T) ser ser ACA，ACC，ACG，ACU
Trp(W) tyr，phe tyr UGG
Tyr(Y) trP，phe，thr，ser phe UAC，UAU
Val(V) ile，leu，met，phe，ala，正亮氨酸 leu GUA，GUC，GUG，GUU
通过选择在下列方面效应明显不同的替代来在抗体生物性质中实现更充实的修饰：(a)维持替代区域中多肽骨架的结构，例如折叠或螺旋构型；(b)维持靶位置处分子的电荷或疏水性；或(c)维持侧链体积。根据共同的侧链性质，天然存在的残基被分成下列几类：
(1)疏水的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水的：cys，ser，thr，asn，gln；
(3)酸性的：asp，glu；
(4)碱性的：his，lys，arg；
(5)影响链取向的残基：gly，pro；和
(6)芳香类的：trp，tyr，phe.
非保守性取代需要用这些类别中一类的某种氨基酸替换另一类的某种氨基酸。
编码氨基酸序列突变体的核酸分子可用本领域中已知的各种方法来制得。这些方法包括，但不局限于，对早期制得的突变体或非突变型依赖于动物种类的抗体进行寡核苷酸介导的(定点)诱变、PCR诱变或盒式诱变。制备突变体的较佳的方法是定点诱变(见Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488，1985)。
在某些实例中，抗体突变体只有单个超变区残基被替代，例如从大约2个到515个超变区替代。
通常，生物性质有所改进的抗体突变体的氨基酸序列和哺乳动物抗人IgE抗体重链或轻链可变区的氨基酸序列有至少75％的氨基酸序列相同性或相似性(较佳的至少80％，更佳的至少85％，还要佳的至少90％，最佳的为至少95％)。该序列的相同性或相似性在此定义成：在序列排列对齐并引入空隙(如果需要)从而达到最大的序列相同百分比之后，候选序列中和依赖于动物种类的抗体残基中相同(即同一残基)或相似(即根据上文共同侧链性质的同一组中的氨基酸)的氨基酸残基百分数。
或者，抗体突变体可通过抗IgE抗体重链和轻链的CDR区域系统性突变来产生。产生这些抗体突变体的较佳的方法包括采用噬菌体展示的亲和力成熟(Hawkins等人，J.Mol.Biol.254：889-896(1992)和Lowman等人，Biochemistry 30(45)：10832-10838(1991))。已经知道，噬菌体包被蛋白融合可用来关联展示的蛋白或肽的表型和编码它们的噬菌体颗粒基因型(Smith，Science 228：1315(1985)；Scott和Smith，Science249：386(1990)；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8：309(1990)；Devlin等人，Science 249：404(1990)；Wells和Lowman，Curr.Opin.Struct.Biol.2：597(1997)中的回顾；美国专利5,223,409(1990))。抗体的F(ab)结构域也已经被展示在噬菌体上(McCafferty等人，Nature 348：552(1990)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7978(1991)；Garrard等人，Biotechnol.9：1373(1991))。
单价噬菌体展示包括将一组蛋白变体展示成和噬菌体包被蛋白的融合物，从而将变体的展示限制在仅仅几个噬菌体颗粒才有一个拷贝(Bass等人，Proteins8：309(1990))。以前已经通过连续应用诱变、单价噬菌体展示、功能性分析以及加入有利的突变而实现了亲和力成熟或改进了各种蛋白的平衡结合亲和力，例如以人生长激素(Lowman & Wells，J.Mol.Biol.234：564-578(1993)；美国专利5,534,617)，或以抗体的F(ab)结构域(Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3809(1994)；Yang等人，J.Mol.Biol.254：392(1995))为例子。
在噬菌体颗粒上可以构建许多(106)蛋白变体(它们在序列中不同的指定位置上有所不同)的文库。每一个颗粒含有编码该特定蛋白变体的DNA。在亲和力纯化多轮后，用固定的抗原分离出个别噬菌体克隆，从它们的DNA推导出它们展示的蛋白的氨基酸序列。
(a)人源化和人抗体
人源化是一种制备嵌合抗体的技术，其中基本上不到一个完整的人可变区被非人种类的对应序列替代。人源化抗体中导入了一个或多个非人源氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“导入的”残基，它们通常取自“导入的”可变区。人源化可基本上根据Winter及其合作者(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))所述的方法来进行，用啮齿类互补决定区(CDR)或CDR序列来取代人抗体的对应序列。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上不到一个完整的人可变区被非人动物的对应序列取代。如本发明所实践的，人源化抗体有一些CDR残基以及可能还有一些FR残基被鼠抗体中类似部位的残基取代。
选择人轻链和重链可变区用来制备人源化抗体对于降低抗原性来说是非常重要的。根据所谓的“最佳配合”方法，用已知的人可变区序列的整个文库来筛选啮齿类抗体的可变区序列。然后，采用最接近啮齿类的人序列作为人源化抗体的人构架区(Sims等人，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法采用衍生自所有人抗体轻链或重链特定亚组共有序列的特定构架。同一构架区可用于几个不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immnol.，151：2623(1993))。
更重要的是，抗体的人源化应保留对抗原的高亲和力以及其它有利的生物性能。为达到这一目的，一个较佳方法是，通过亲代序列和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念上(conceptual)的人源化产物来制得人源化抗体。根据具有相似序列的F(ab)结构，分别从共有序列构建特定抗体结构域(例如VH和VL结构域)的模型。免疫球蛋白的三维模型是本领域技术人员通常能获得的和熟知的。可得到能描述和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。观察这些显示结果，就能分析残基在候选免疫球蛋白序列中可能起的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。例如，在实施例2中制作片段F(ab)-12的模型时，用鼠MAE11作为模板来启发待修饰的CDR和构架残基的灵感，并结合分子模型来获得突变体序列。
可以提到的另一个例子是对照抗体Mab4d5。在这里，以Brookhaven蛋白数据库的几个Fab结构为基础构建了该模型(条目1FB4、2RHE、2MCP、3FAB、1FBJ、2HFL和1REI)。首先，选择F(ab)片段KOL(Marquart，M等人，J.Mol.Biol.141：369-391(1980))作为VL和VH结构域的模板，然后利用它们的主链原子坐标(INSIGHT程序，Biosym Technologies)将另外的结构叠加在该结构上。利用类似的程序和技术来制作所需抗体的模型。
采用分子模型的一种典型分析可如下进行：对每个给定的残基位置计算各叠加结构中模板Cα和类似物Cα之间的距离。通常，如果对于给定的残基而言，所有(或几乎所有)的Cα-Cα距离均小于等于1，那么该位置被包括在共有结构内。在某些情况下，β折叠构架残基将满足这些标准，而CDR环却不能。对每个这些选定残基计算个别N、Cα、C和O以及Cβ原子的平均坐标，用商业上可获得的程序(例如DISCOVER程序(Biosym Technologies))和AMBER力场通过50轮能量减到最小法的校正所得到的与非标准键几何结构的偏差(Weiner，S，J，等人，J.Amer.Chem.Soc.106：765-784(1984))，然后固定Cα坐标。然后将高度保守残基的侧链(例如二硫键桥半胱氨酸残基)掺入所得的共有结构中。然后，掺入特定抗体VL和VH结构域的序列，以CDR残基为开始，用Chothia等人(Chothia，C.等人，Nature 342：877-883(1989))的CDR构型列表作为指南。根据Fab晶体结构、旋转异构体文库(Ponder，J.W.&Richards，F.M.，J.Mol.Biol.193：775-791(1987))以及填充因素来选择侧链构型。由于VH-CDR3不可能用上述标准来指定，因此可以用INSIGHT程序搜寻大小相似的环来产生模型，用堆积和溶剂接触因素(solvent exposure consideration)来衍生，或用其它常规的和商业上能获得的技术来产生。较佳的是使该模型经历能量减到最小法5000轮。
这样，可以从接受序列和导入序列选择获得构架残基并组合，从而获得所需的抗体性能，例如对靶抗原的亲和力提高。通常，CDR残基直接并最基本地参与影响抗原结合。在实施例2中产生F(ab)-12时采用了该技术，其中使用了鼠CDR残基的组合，与分子模型结合产生人源化的鼠抗IgE抗体片段。
另外，现在已经可以生产能在免疫后产生人抗体全部组成但不产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合的和种系突变型小鼠中抗体重链连接区(JH)纯合缺失导致内源性抗体产生完全被抑制。将人种系免疫球蛋白阵列转移到这些种系突变型小鼠中会在抗原攻击时导致产生人抗体。Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；和Duchosal等人，Nature 355：258(1992)。人抗体也可从噬菌体展示文库衍生获得(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Vaughan等人，NatureBiotech 14(1996))。
(b)额外的修饰
在产生抗体突变体后，测定该分子相对于依赖于动物种类的抗体的生物活性。如上所述，这可能包括测定抗体的结合亲和力和/或抗体的其它生物活性。在本发明的一个较佳的实例中，如上制得一组抗体突变体，并筛选其对第二种哺乳动物抗原的结合亲和力。对从该初次筛选选出的一种或多种抗体突变体任选地进行一个或多个生物活性试验，以确认具有增强的结合亲和力的抗体突变体确实可用于(例如)临床前期研究。在较佳的实例中，抗体突变体保留了结合第一种哺乳动物抗原的能力，此结合亲和力与依赖于动物种类的抗体相似。这可通过避免改变参与抗人抗体结合抗原的可变区残基来实现。在其它实例中，抗体突变体对第一种哺乳动物(抗原)的结合亲和力明显改变(例如对该抗原的结合亲和力最好是比依赖于动物种类的抗体好，但也可能比它差)。
可对这样选出的抗体作进一步修饰，这通常取决于抗体的预期用途。这些修饰可包括进一步改变氨基酸序列、与异源多肽融合和/或共价修饰(如下文所述的)。关于氨基酸序列变化，上文描述了典型的修饰。例如，未参与维持抗体突变体合适构型的任何半胱氨酸残基也可以被替代(通常被丝氨酸替代)，以改进分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反，(a)抗体中可以加入半胱氨酸键以改进其稳定性(特别是当抗体是抗体片段(如Fv片段)时)。另一类氨基酸突变体具有改变的糖基化方式。这可通过抗体中发现的一个或多个糖部分缺失，和/或加入抗体中不存在的一个或多个糖基化位点来实现。抗体的糖基化通常是N或O相连。N相连指糖部分连接在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸以及天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是糖部分酶促连接到天冬酰胺侧链上的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列的存在产生了一个潜在的糖基化位点。O相连的糖基化是指，糖通过醚氧连接；例如，N-乙酰葡糖胺、半乳糖、岩藻糖或木糖与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)键合。在抗体中加入糖基化位点可通过改变氨基酸序列，从而使其含有一个或多个上述三肽序列(对于N相连的糖基化位点来说)来方便地实现。改变还可通过在原来抗体序列中加入或代之以一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来制得(对于O相连的糖基化位点来说)。
(v)抗体片段
制备抗体片段的各种技术已经发展起来。在传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白酶消化来获得的(例如参见，Morimoto等人，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，现在这些片段可用重组宿主细胞来直接制得。例如，如上所述，抗体片段可从抗体噬菌体文库中分离获得。或者，可从大肠杆菌中直接回收得到F(ab′)2-SH片段，并化学交联形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab′)片段可直接从重组宿主细胞培养中分离获得。制备抗体片段的其它方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。在其它实例中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。(PCT专利申请WO93/16185)。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体对至少两种不同抗原有结合特异性。尽管这些分子通常只结合两种抗原(即为双特异性抗体，BsAb)，但是具有额外特异性的抗体如三特异性抗体也包括在本文所用的该表达含义内。BsAb的例子包括一个臂针对某肿瘤细胞抗原、另一个臂针对细胞毒性触发分子的那些抗体，如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗促黑素细胞激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛(pan)癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；一个臂特异性结合肿瘤抗原、一个臂结合毒素的双特异性抗体，如抗皂草素/抗ID-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻蛋白A链、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻蛋白A链、抗干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱；转变酶激活前体药物的双特异性抗体，如抗CD30/抗碱性磷酸酶(催化丝裂霉素磷酸前体药物变成丝裂霉素醇)；可用作纤溶剂的双特异性抗体，如抗纤维蛋白/抗组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、抗纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)、用来将免疫复合物靶向细胞表面受体的双特异性抗体，例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)、用来治疗感染性疾病的双特异性抗体，如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流感病毒、抗FcγRI/抗HIV、用来体外或体内肿瘤检测的双特异性抗体，如抗CEA/抗-EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的双特异性抗体；以及用作诊断工具的双特异性抗体，如抗家兔IgG/抗转铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗抑生长素/抗P物质、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β半乳糖苷酶。三特异性抗体的例子包括：抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。双特异性抗体可以制成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是该领域中已知的。制备全长双特异性抗体的传统方法是根据两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对共同表达(Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四杂交物)可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常采用亲和层析方法，这是相当费力的，且产物得率很低。WO93/08829以及Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659(1991)公开了类似的方法。
根据不同的方法，使具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。最好与免疫球蛋白重链恒定区融合，至少包括部分铰链区、CH2和CH3区。最好是至少在一个融合物中有含轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入分开的表达载体中，并且共同转染入合适的宿主生物体中。在构建时采用不相等比例的三种多肽链来提供最优得率的实例中，这为调节三个多肽片段相互比例提供了很大的灵活性。然而，当至少两个多肽链以相等比例表达导致高产率，或比例无关紧要时，可以将两个或所有三个多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在该方法的一个较佳实例中，双特异性抗体由一个臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称的结构有利于将所需的双特异性抗体从不需要的免疫球蛋白链组合物中分离出来，因为免疫球蛋白轻链只存在于双特异性分子的一半中，这提供了容易分离的方式。该方法公开在WO94/04690中。关于产生双特异性抗体的更详细的情况例如可参见Suresh等人，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
根据WO96/27011中描述的另一种方法，一对抗体分子间的界面可经工程改造成使得从重组细胞培养中回收获得的异二聚物达到最大的百分数。较佳的界面包含抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，第一抗体分子界面上的一个或多个氨基酸小侧链被较大的侧链(如酪氨酸或色氨酸)代替。通过用较小的侧链(如丙氨酸或苏氨酸)来代替大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上形成与大侧链大小相同或相似的补偿“空穴”。这样就提供了一个使得异二聚物的产率高于其它不需要产物(如均二聚物)的方法。
双特异性抗体包括交联的或“异偶联”的抗体。例如，异偶联物中的一个抗体可以与亲和素结合，另一个与生物素结合。例如，已有建议用这种抗体来使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)以及用来治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。异偶联抗体可用任何方便的交联方法来制得。合适的交联剂是本领域中已知的，美国专利No.4,676,980中公开了合适的交联剂以及许多交联技术。
从抗体片段制备双特异性抗体的方法在文献中也已有所描述。例如，可通过化学键来制备双特异性抗体。Brennan等人，Science，229：81(1985)描述了这样一种方法，其中将完整的抗体蛋白水解断裂成F(ab′)2片段。在二巯基复合试剂亚砷酸钠存在下还原这些片段，使连位(vincinal)二巯基稳定，并防止分子间形成二硫键。然后将产生的Fab′片段转变成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通过巯基乙胺还原将一个Fab′-TNB衍生物重新转变成Fab′-巯基，再与另一个Fab′-TNB衍生物等摩尔量混合形成双特异性抗体。制得的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
最近的进展实现了从大肠杆菌中直接回收获得可化学交联形成双特异性抗体的Fab′-SH片段。Shalaby等人，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的制备过程。使各Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，然后在体外进行定向化学交联，形成双特异性抗体。这样形成的双特异性抗体能结合过度表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，并触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳房肿瘤靶的裂解活性。
直接从重组细胞培养制备和分离双特异性抗体片段的各种方法已有描述。例如，利用亮氨酸拉链可制得双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。通过基因融合，使Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两个不同抗体的Fab′部分连接。在铰链区还原抗体均二聚物，形成单体，然后重新氧化形成抗体异二聚物。该方法也可用来制备抗体均二聚物。Hollinger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中描述的“二抗体”技术为制备双特异性抗体片段提供了另一种机制。这些片段包括通过一个接头将重链可变区(VH)连接到轻链可变区(VL)，该接头非常短，使得同一链上的两个结构域之间不能发生配对。因此，一个片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成了两个抗原结合位点。采用单链Fv(sFv)二聚物制备双特异性抗体片段的另一种策略也已有报道。见Gruger等人，J.Immunol.，152：5368(1994)。
也可考虑采用具有两价以上的抗体。例如，可制得三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。
(vii)效应器功能的工程改造
在效应器功能方面可能希望改进本发明的抗体，以增强抗体(例如)结合IgE的效果。例如，可在Fc区域中引入半胱氨酸残基，从而在该区域中形成链间二硫键。这样制得的均二聚抗体可能有改进的内化能力和/或提高的补体介导细胞杀伤能力和依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1993)。或者，可将抗体工程改造成具有双Fc区，从而可能增强的补体裂解和ADCC能力。见Stevenson等人，Anti-Cancer DrugDesign 3：219-230(1989)。
(viii)免疫偶联物
本发明还涉及包含与细胞毒性制剂偶联的本文所述抗体的免疫偶联物，细胞毒性制剂例如是化疗剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)、或放射活性同位素(即放射偶联物)。
用来产生这些免疫偶联物的化疗剂在上文已有描述。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿浓杆菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、α-八叠球菌、Aleurites fordii蛋白、香石竹(dianthin)蛋白、Phytolaca americana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、momordica charantia抑制剂、箭毒素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制剂、gelonin、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和tricothecenes。各种放射性核素可用来制备放射性偶联的抗体。例子包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
抗体与细胞毒性剂的偶联物可用各种双功能蛋白偶联剂制得，偶联剂例如是N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨酸二甲酯(dimethyl adipimidate)HCL)、活性酯(如辛二酸琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二叠氮化合物(如二-对-(叠氮苯甲酰基)己二胺)、二重氮衍生物(如二-对-(重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可根据Vitetta等Science238：1098(1987)所述的那样制备蓖麻毒素免疫毒素。C-14标记的1-异硫氰酸基苯基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用来偶联放射性核苷酸与抗体的典型的螯合剂。见WO94/11026。
在另一个实例中，抗体可以与“受体”(如链霉亲和素)偶联，用来预先靶向肿瘤，其中将抗体-受体偶联物给予患者，然后用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，再给予与细胞毒性试剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲和素)。
(ix)免疫脂质体
本文公开的抗体突变体也可配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体的制备方法是本领域中已知的，如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；和美国专利No.4,485,045和4,544,545。美国专利No.5,013,556中公开了循环时间增加的脂质体。
特别有用的脂质体可通过反向蒸发方法用包含卵磷脂、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物制得。将脂质体挤压通过限定孔径的滤膜，获得有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab′片段可如Martin等人，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述的那样通过二硫键互换反应与脂质体偶联。脂质体中可以任选地含有化疗剂(如阿霉素)。见Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
(x)依赖于抗体的酶介导的前体药物治疗(ADEPT)
将抗体与激活前体药物的酶(能将前体药物(如肽基化疗剂，见WO81/01145)转变成有活性的抗癌药)偶联，本发明的抗体还可用于ADEPT。例如参见WO88/07378和美国专利No.4,975,278。
用于ADEPT的免疫偶联物的酶成分，包括能作用于前体药物将其转变成更具活性和细胞毒性形式的酶。
用于本发明方法的酶包括(但不局限于)：用于将含磷酸酯的前体药物转变成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸酯的前体药物转变成游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒性5-氟胞嘧啶转变成抗癌药物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽前体药物转变成游离药物的蛋白酶，如锯齿(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；用于转变含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化前体药物转变成游离药物的糖断裂酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将β-内酰胺衍生的药物转变成游离药物的β-内酰胺酶；以及用于将胺基氮分别经苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可用具有酶活性的抗体(也称为抗体酶(abzyme))将本发明的前体药物转变成游离的活性药物(Massey，Nature 328：457-458(1987))。抗体-抗体酶偶联物可如本文所述的那样制得，以将抗体酶递送至肿瘤细胞群中。
利用本领域已知的技术(如用上述的异双功能交联剂)使本发明的酶与抗体突变体共价结合。或者，利用本领域中熟知的重组DNA技术(Neuberger等人，Nature，312：604-608(1984))，可以构建出融合蛋白，它包含本发明抗体的至少抗原结合区和与之相连的本发明酶的至少一个功能活性部分。
(xi)抗体补救性受体结合表位融合
在本发明的某些实例中，可能希望采用抗体片段而不是完整的抗体，例如来提高肿瘤穿透(penetration)。在这种情况下，可能希望对抗体片段进行修饰，以提高其血清半衰期。例如，这可通过在抗体片段中掺入补救受体结合表位来实现(例如，通过抗体片段中合适区域内的突变，或通过在肽尾端中掺入此表位，然后通过DNA或肽合成融合入抗体片段末端或中部)。
较佳的，补救受体结合表位宜构成一个区域，其中Fc区的一个或两个环的任何一个或多个氨基酸残基被转移到抗体片段的类似位置上。更佳的是，Fc区中一个或两个环的三个或更多残基被转移。还要佳的是，此表位取自(例如IgG的)Fc区中CH2区，并被转移到抗体CH1、CH3或VH区、或一个以上的此类区域中。或者，此表位取自Fc区的CH2区，并被转移到抗体片段的CL区或VL区或这两者中。
(xii)抗体的其它共价修饰
抗体的共价修饰包括在本发明的范围内。它们可以通过化学合成制得或通过抗体的酶促或化学断裂制得(如果适用的话)。通过使抗体所靶向的氨基酸残基和能与所选侧链或N或C端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体其它类型的共价修饰导入该分子内。
最通常是使半胱氨酰残基与α-卤代乙酸酯(以及对应的胺)(如氯乙酸或氯乙酰胺)起反应，产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基还可通过和下列物质反应来衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对-氯汞基苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚、或氯-7-硝基苯并-2--1，3-二唑。
组氨酰基残基通过和二乙基焦碳酸(diethylpyrocarbonate)在pH5.5-7.0下反应来衍生，因为该试剂对组氨酰基侧链有相对特异性。还可用对溴苯甲酰甲基化溴；该反应宜在pH6.0的0.1M卡可酸钠中进行。
赖氨酰基和氨基端残基和琥珀酸酐或其它羧酸酸酐反应。这些试剂的衍生处理具有逆转赖氨酰基残基电荷的效应。衍生处理含α氨基的残基的其它合适试剂包括亚氨酸酯，如吡啶亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)、吡哆醛磷酸、吡哆醛、氯氢硼化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶催化的和乙醛酸反应。
精氨酰基残基通过与一种或几种常规试剂反应来修饰，它们是苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和水合茚三酮。精氨酸残基的衍生处理需要反应在碱性条件下进行，因为胍官能团的pKa高。另外，这些试剂可以和赖氨酸基团以及精氨酸的ε氨基基团反应。
酪氨酰基残基的特异性修饰可以这样进行，特别感兴趣的是通过和芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记导入酪氨酰基残基内。最常见的是，分别用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷来形成O-乙酰酪氨酰基种类和3-硝基衍生物。用125I或131I使酪氨酰基残基碘化，来制备用于放射性免疫试验的标记蛋白。
羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过和碳化二亚胺(R-N＝C＝C-R′)反应来选择性修饰，其中R和R′是不同的烷基基团，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-(4-氮-4，4-二甲基苯基)碳化二亚胺。另外，天冬氨酰基和谷氨酰残基通过和铵离子反应转变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基有时会脱酰胺化，分别变成对应的谷氨酰基和天冬氨酰基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式在本发明的范围内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α氨基的甲基化(T.E.Creighton，《蛋白质结构和分子性质》，W.H.Freeman&Co.San Francisco，79-86页(1983))、N端胺的乙酰化、以及任一C端羧基的酰胺化。
其它类型的共价修饰包括用化学和酶方法偶联糖苷于抗体。这些程序的优点在于，它们不需要在宿主细胞中产生具有N或O相连糖基化能力的抗体。根据采用的偶联方式，糖可以和下列物质连接：(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离的羧基；(c)游离的巯基，如半胱氨酸的巯基；(d)游离的羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基；(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法在1987年9月11日公开的WO87/05330中，以及Aplin和Wriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，259-306(1981)中有所描述。
除去抗体中的糖部分可用化学方法或酶方法来实现。化学去糖基化需要抗体接触化合物三氟甲烷磺酸或等价的化合物。该处理导致大多数或除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外所有的糖均断裂，同时保持抗体完整。Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)以及Edge等人，Anal.Biochem.118：131(1981)中描述了化学去糖基化。酶法断裂抗体上的糖部分可以用Thotakura等人，Meth.Enzymol.138：350(1987)中描述的各种外切和内切糖苷酶来实现。
抗体的其它类型的共价修饰包括以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中描述的方式连接抗体和各种非蛋白类聚合物之一(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)。
B.载体、宿主细胞和重组方法
本发明还提供了编码本文公开的抗体突变体的分离的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞，以及用来制备该抗体突变体的重组方法。
抗体突变体的重组生产方法是，分离获得编码抗体的核酸并插入可复制的载体中作进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码单克隆抗体突变体的DNA很容易分离并用常规步骤来测序(如，利用能特异性结合编码抗体突变体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。可采用许多种载体。载体组件通常包括(但不局限于)下列中的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(i)信号序列组件
本发明的抗体突变体不仅可以通过重组方法直接制得，还可以制成和异源多肽(最好是信号序列，或成熟蛋白或多肽的N端有特异性断裂位点的其它多肽)的融合多肽。所选的异源信号序列最好是能被宿主细胞识别并加工(如被信号肽酶断裂)的序列。由于原核宿主细胞不能识别和加工天然的抗体信号序列，所以用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核生物信号序列来代替抗体信号序列。对于酵母菌分泌，天然的信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母菌属和克鲁维酵母属α因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、C.albicans葡糖淀粉酶前导序列或WO90/13646中描述的信号取代。在哺乳动物细胞中表达时，可采用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列(如单纯疱疹gD信号)。
将该前体区域的DNA与读框中编码抗体突变体的DNA相连。
(ii)复制起点组件
表达和克隆载体均含有能使该载体在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是能使载体不依赖宿主染色体DNA独立复制的序列，它包括复制起点或自主复制序列。对于各种细菌、酵母和病毒的这些序列是熟知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰阴性细菌，2μ质粒(复制)起点适用于酵母，各种病毒(复制)起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制组件起点(通常用SV40起点只是因为它含有早期启动子)。
(iii)选择基因组件
表达和克隆载体可以含有选择基因(也称为可选择标记物)。典型的选择基因编码出的蛋白：(a)提供了对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素、新霉素、氨甲碟呤或四环素)的抵抗力；(b)弥补了营养缺陷型；或(c)提供了不能从复合培养基获得的关键的营养物，如编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
筛选方案的一个例子采用药物来使宿主细胞生长停滞。异源基因成功转化的那些细胞产生了抵抗药物的蛋白，从而在筛选方案中存活下来。这些显性选择例子采用的药物是新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物的合适的可选择标记的另一个例子是能鉴定感受态细胞摄取抗体突变体核酸的那些标记物，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II(较佳的是灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，将所有转化体培养在含氨甲碟呤(Mtx，一种DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中，首先鉴定出DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺失的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，使细胞在含有针对可选择标记物的选择剂(如氨基糖苷抗生素，如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中生长，可选择出转化或共转化了编码抗体、野生型DHFR蛋白和另一可选择标记物(如氨基葡糖苷3′-磷酸转移酶(APH))的DNA序列的宿主细胞(尤其是含有内源DHFR的野生型宿主细胞)。见美国专利No.4,965,199。
适用于酵母的选择基因是酵母质粒Yrp7中的trp1基因(Stinchcomb等人，Nature，282：39(1979))。trp1基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如，ATCC No.44076或PEP4-1)提供了选择标记物。Jones，Genetics，85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中的trp1损毁为在没有色氨酸存在下生长时检测转化提供了有效的环境。同样，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)可用已知携带Leu2基因的质粒来弥补。
此外，从1.6μm环状质粒pKD1获得的载体可用来转化克鲁维酵母属酵母。另外，已经报道了在K.lactis中大规模制备重组小牛凝乳酶的表达系统(Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990))。利用克鲁维酵母属工业菌株来分泌成熟的重组人血清白蛋白的稳定多拷贝表达载体也已被公开。Fleer等人，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
(iv)启动子组件
表达和克隆载体通常含有被宿主生物体识别并与抗体核酸操作性相连的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂交的启动子如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是适用的。用于细菌系统的启动子还含有与编码抗体的DNA操作性相连的Shine-Dalgarno(SD)序列。
真核细胞的启动子序列也是已知的。基本上所有的真核基因在转录起始位点上游约25-30碱基处有富含AT的区域。在许多基因的转录起始点上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是在编码序列的3′端加入polyA尾区的信号。所有这些序列均能适当地插入真核表达载体中。
用于酵母宿主细胞的合适的启动子序列例子包括：3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶(如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶)的启动子。
其它酵母启动子(是可诱导的启动子，其额外优点是转录受生长条件的控制)是下述酶的启动子区：是醇脱氢酶2、同种细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮新陈代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和利用麦芽糖和半乳糖的酶。用于酵母表达的合适的载体和启动子在EP73,657中有进一步的描述。酵母增强子还可与酵母启动子一起使用有好处。
通过从病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最佳的猴病毒40(SV40))基因组获得的启动子，从异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)，从热休克启动子，可以控制载体在哺乳动物宿主细胞中的抗体转录，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。
可以另含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段的形式方便地获得SV40病毒的早期和晚期启动子。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以HindIII E限制性片段的形式方便地获得。美国专利No.4,419,446中公开了用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中描述了该系统的一种改进方案。另外，人β-干扰素cDNA可在单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下，在小鼠细胞中表达。另外，Rous肉瘤病毒的长末端重复序列可用作启动子。
(v)增强子元件组件
在载体中插入增强子序列通常能增强编码本发明抗体的DNA在高级真核细胞的转录。现已从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)知道了许多增强子序列。但是，通常采用的是真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起始区(bp100-270)晚期侧(late side)上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起始区晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。另见Yaniv，Nature，297：17-18(1982)关于激活真核启动子的增强元件部分。增强子可剪接入载体中抗体编码序列的5′或3′位上，但是较佳的是在启动子的5′位。
(vi)转录终止组件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其它多细胞生物的带核细胞)的表达载体还含有转录终止和mRNA稳定化所需的序列。这些序列通常从真核或病毒DNA或cDNA的5′端(有时是3′)非翻译区获得。这些区域含有的核苷酸节段转录成编码抗体的mRNA非翻译部分的聚腺苷酸化片段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素聚腺苷酸化区域。见WO94/11026和该文公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择及转化
用于克隆或表达本文所述的载体中DNA的合适宿主细胞是上述的原核细胞、酵母或高级真核细胞。用于此目的的合适的原核细胞包括真细菌类，如革兰阴性或革兰阳性菌，例如肠杆菌科如埃希杆菌属(如大肠杆菌、肠杆菌、欧文菌、克雷伯杆菌)、沙门菌属(如，鼠伤寒沙门菌)、沙雷菌属(如，粘质沙雷菌属)、志贺菌属，和杆菌属(如枯草芽胞杆菌和藓样芽胞杆菌(如DD266,710，1989年4月12日公开的藓样芽胞杆菌41P))、假单胞菌(如绿脓假单胞菌)和链霉菌。一个较佳的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31446)，但是其它菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31537)和大肠杆菌W3110(ATCC27325)也是适用的。这些例子只用于描述，没有限制性。
除了原核细胞外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适于用作编码抗体载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母菌(即常见的面包酵母)是低级真核宿主微生物中最为常见的。然而，通常可得到和采用其它许多种、属和菌株，裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属宿主，如乳克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wicheramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、K.thermotolerans和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；yarrowia[EP402,226]；巴士德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；念珠菌属；Trichoderma reesia[EP244,234]；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌如链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、Tolypocladium和曲霉属(Aspergillus)如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞从多细胞生物获得。理论上，任何高级真核细胞培养均可工作，无论是脊椎动物还是无脊椎动物培养。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫的细胞，Luckow等人，Bio/Technology 6，47-55(1988)；Miller等人，Genetic Engineering，Setlow等人编辑，第8卷，277-279页(Plenam publishing 1986)；Mseda等人，Nature 315，592-594(1985)。各种杆状病毒株和变体和对应的来自宿主如草地夜蛾、埃及伊蚊、白纹伊蚊、黑尾果蝇和家蚕的相应的允许昆虫细胞已被鉴定。感兴趣的特定细胞系是昆虫细胞系sf9。用于转染的各种病毒株(例如，苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕的Bm-5株)是公众可获得的，这些病毒可用作本发明中所述的病毒，尤其可用于转染草地夜蛾细胞。另外，也可用棉、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养作为宿主。
然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，且脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规手段。见《组织培养》，Academic Press，Kruse和Patterson编辑(1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系例子是：SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾细胞系(293或在悬浮培养中生长的293亚克隆细胞，Graham等人，J.Gen.Virol.36：59(1977))；乳仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
为了生产抗体用上述表达或克隆载体转化宿主细胞，并将宿主细胞培养在常规的营养培养基中，培养基经适当变化以适合诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。
(viii)培养宿主细胞
用来生产本发明抗体突变体的宿主细胞可在各种培养基中培养。商业上可获得的培养基如Ham′s F10(Sigma)、极限必需培养(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，Ham等人，Meth.Enz.，58：44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.，102：255(1980)，美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任一培养基可用作(本发明)宿主细胞的培养基。所有这些培养基中可以按需添加入激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如X氯化物，其中X是钠、钙、镁；和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药)、微量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)以及葡萄糖或等价能源。另外也可加入合适浓度的本领域技术人员已知的其它必需补充物。培养条件，如温度、pH等，与前述选择宿主细胞表达时所用条件一样，这对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
(ix)抗体纯化
当采用重组技术时，抗体突变体可产生在细胞内(周质空间内)或被直接分泌到培养基中。如果抗体突变体产生在细胞内，则第一步是(例如)通过离心或超离心除去宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分泌入大肠杆菌周质空间的抗体的分离过程。简言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下冻融细胞浆状物约30分钟。离心除去细胞碎片。若抗体突变体被分泌到培养基中，则通常首先用商业上购得的蛋白浓缩滤膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)浓缩该表达系统的上清液。在前述任何步骤中均可加入抑制蛋白水解的蛋白酶抑制剂(如PMSF)，还可加入抗生素来防止外来污染物的生长。
例如，可用羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞中制得的抗体组合物，其中亲和层析是较佳的纯化方法。蛋白A作为亲和配体的合适性取决于抗体突变体中免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用来纯化以人γ1、γ2或γ4重链为基础的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3，建议采用蛋白G(Guss等人，EMBO J.5：1567-1575(1986))。用作亲和配体附着的基质通常是琼脂糖，但是也可采用其它基质。机械上稳定的基质(如控制孔径的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)能达到比琼脂糖更快的流速，操作时间更短。当抗体突变体包含CH3区时，可用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)来纯化。根据待回收的抗体突变体，还可采用其它蛋白纯化方法，如在离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反向HPLC、硅胶层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的肝素SEPHAROSETM层析、聚焦层析、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在初步纯化后，可对包含感兴趣的抗体突变体和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，采用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，最好是在低盐浓度(如约0-0.25M盐浓度)下进行。
C.药物制剂
将具有所需纯度的多肽与本领域中采用的任选的“药学上可接受”的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些均称为“赋形剂”，例如缓冲剂、稳定化剂、防腐剂、等渗剂、非离子性洗涤剂、抗氧化剂和其它杂类添加剂)混合，制成多肽或抗体的水性溶液形式的治疗剂或冻干制剂保藏(见Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.编辑(1980))。这些添加剂必须在所采用的剂量和浓度下对接受者没有毒性。
缓冲剂有助于维持pH在大致为生理条件的范围内。它们的浓度最好在大约2mM至50mM内。适用于本发明的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸钠等)、琥珀酸盐缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠等)、延胡索酸盐缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸钠混合物)、延胡索酸盐缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)、以及乙酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。因此，还提出了磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三乙胺盐如(Tris)。
加入防腐剂以阻止微生物生长，加入量在0.2-1％(w/v)范围内。用于本发明的合适的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯基氯化铵、亚苄基野芹(benzalconium)卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、氯化己烷双胺、对羟苯甲酸烷酯(如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
等渗剂有时称为“稳定剂”，其存在是为了确保本发明的液体组合物的等渗性，包括多羟基糖醇，较佳的是三羟或更多羟基的糖醇，例如甘油、丁四醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多元醇存在的量在0.1-25％(重量)之间，较佳的在1-5％之间(将其它成分的相对量考虑在内)。
稳定剂指广义的赋形剂，其功能从填充剂到使治疗剂溶解或有助于防止变性或粘附在容器壁上的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(如上所述)；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、木苏糖、甘露糖、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱苷肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即小于10个残基)；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖、如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖如蜜三糖；多糖如葡聚糖。稳定剂的含量范围为每份重量活性蛋白中有0.1-10,000重量份。
非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)的存在有助于溶解治疗剂以及保护治疗剂避免受搅动引起的凝集，它还允许制剂接触遭受应力的剪切表面而不会引起蛋白变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯山梨糖醇单醚(吐温-20、吐温-80等)。非离子性表面活性剂的含量约为0.05毫克/毫升至1.0毫克/毫升，较佳的约0.07毫克/毫升至约0.2毫克/毫升。
其它各种赋形剂包括填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。
本文的制剂还含有待治疗特定病征所需的多种活性化合物，较佳的是相互间没有不利影响的有互补活性的那些化合物。例如，可能还希望提供一种免疫抑制剂。这种分子宜以组合形式存在，其量对期望目的有效。
活性组分还可包裹在(例如)通过团聚技术或界面聚合制得的微胶囊中，例如分别在羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，在胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微珠、微乳剂(microemulsion)、纳颗粒和纳胶囊)或巨乳剂(macroemulsion)中。这些技术公开在Osol，A.编辑的Remington′s PharmaceuticalSciences 16版(1980)中。
用于体内给药的制剂必须无菌。这很容易通过无菌滤膜过滤来实现。
可以制得缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗体突变体的固体疏水聚合物半渗透基质，其中基质是成形制品，如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚-(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不能降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯组成的可注射的微珠)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸的聚合物能持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化的抗体长时间停留在体内时，它们会由于暴露在37℃水分下而变性或凝聚，从而导致生物活性损失，且免疫原性可能会改变。可以根据涉及的机理来设计合理策略以稳定化。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代-二硫键互换而形成了分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、自酸性溶液中冻干、控制湿度程度、采用合适的添加剂和开发特殊的聚合物基质组合物来达到稳定化。
在治疗特定疾病或状况中，治疗性多肽、抗体或其片段的有效量将取决于疾病或状况的性质，并且能用标准临床技术来测定。在可能的时候，希望首先在体外测定本发明药物组合物的剂量反应曲线，然后在人体内测试前在有用的动物模型系统中测定。然而，根据本领域常规知识，有效促进感觉神经元存活的药物组合物可提供在大约5至20ng/ml之间的局部治疗剂浓度，较佳的在大约10-20ng/ml之间。在本发明的另一个具体实例中，有效促进视网膜神经元生长和存活的药物组合物可提供在大约10-100ng.ml之间的局部治疗剂浓度。
在一个较佳的实例中，通过皮下注射给予治疗性多肽、抗体或其片段的水溶液。每剂的范围在大约0.5微克至50微克/千克体重，或更佳的，在3微克至30微克/千克体重。
皮下给药的剂量方案可以从一周一次到每日一次，这取决于许多临床因素，包括疾病类型、疾病严重程度以及患者对治疗剂的敏感程度。
D.抗体突变体的非治疗性应用
本发明的抗体突变体可用作亲和纯化试剂。在该方法中，用本领域已知的方法将抗体固定在固相(如Sephadex树脂或滤纸)上。使固定的抗体突变体与含待纯化抗原的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤载体，除去样品中除与固定化抗体突变体结合的抗原外基本上所有的物质。最后，用另一合适的溶剂(如甘氨酸缓冲液pH5.0)洗涤，将抗原从抗体突变体上释放下来。
抗体突变体也可用于诊断试验，例如检测具体细胞、组织或血清中感兴趣抗原的表达。
对于诊断性应用，抗体突变体通常用可检测物质作标记。可采用许多标记，它们通常分成下列几类：
(a)放射性同位素，如36S、14C、125I、3H和131I。抗体突变体可根据(例如)《现代免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)，第1和2卷，Coligen等编辑，Wiley-Interscience，New York，Pubs.，(1991)中所述的方法用放射性同位素作标记，放射活性可用闪烁计数来测定。
(b)荧光标记，例如可采用稀土螯合剂(铕螯合剂)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白和Texas红。例如可用《现代免疫学方法》(同上)所述的方法来偶联荧光标记和抗体突变体。荧光可用荧光计来定量分析。
(c)可采用各种酶-底物标记，美国专利No.4,275,149综述了其中的一些标记。酶通常能催化显色底物发生化学变化，该变化可用各种方法来测定。例如，酶可以催化底物，使其发生能用分光光度计来测定的颜色变化。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。定量测定荧光变化的方法如上所述。化学发光底物通过化学反应被电激发，然后可发射可测定(例如通过化学发光计)的光或提供能量给荧光接受器。酶标记的例子包括萤光素酶(如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。O′Sullivan等人在《酶学方法》(Method in Enzym.)(J.Langone&H.Van.Vunakis编辑)，Academic press，New York，73：147-166(1981)的“制备酶抗体偶联物用于酶免疫试验的方法”(Method for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)中描述了偶联酶和抗体的方法。
酶-底物组合的例子包括，例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)和作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)和作为显色底物的对硝基苯磷酸；以及
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和显色底物(如对硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。
本领域技术人员还可采用其它各种酶-底物组合。关于这些组合的综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
有时，标记可以间接地与抗体突变体偶联。本领域技术人员应该知道实现这一目的的各种方法。例如，抗体突变体可以与生物素偶联，而上述三大类标记则与亲和素偶联，或两者互换。生物素选择性地结合亲和素，从而通过这一间接的方式将标记和抗体突变体偶联起来。另外，为了间接地偶联标记和抗体突变体，可使抗体突变体与小的半抗原(如洋地黄毒苷(digloxin))偶联，而上述不同类型的标记中的一种则与抗半抗原抗体突变体(如抗洋地黄毒苷抗体)偶联。这样，就间接地将标记和抗体突变体偶联起来。
在本发明的另一个例子中，不必对抗体突变体作标记，它的存在可用与抗体突变体结合的标记的抗体来检测。
本发明的抗体可用于任何已知的测试方法，如竞争性结合试验，直接和间接夹心试验和免疫沉淀试验。Zola，《单克隆抗体技术手册》(Monoclonal Antibodies：AManual of Techniques)，147-158页(CRC Press，Inc.1987)。
竞争性结合试验取决于标记的标准品与测试样品竞争结合有限量抗体突变体的能力。试样中抗原的量与结合抗体的标准品的量成反比。为了测定已结合标准品的量，抗体通常在竞争前后为不溶性的。这样就能方便地将已结合抗体的标准品和测试样品从仍未结合的标准品和测试样品中分离出来。
夹心试验包括采用两种抗体，每种抗体能结合待检测蛋白的不同的免疫原性部分或表位。在一个夹心试验中，待分析的测试样品与固定在固相载体上的第一抗体结合，然后，第二抗体与测试样品结合，从而形成了不溶性的三组分复合物。例如见美国专利No.4,376,110。第二抗体本身可用可检测物质标记(直接夹心试验)，或可利用标记了可检测物质的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心试验)。例如，一类夹心试验是ELISA试验，在该种情况下，可检测物是酶。
对于免疫组织化学，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或可包埋在石蜡中并用防腐剂(例如福尔马林)来固定。
抗体也可用于体内诊断试验。通常，抗体用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记，这样通过免疫闪烁显影可确定肿瘤的位置。
E.诊断用试剂盒
为方便起见，本发明的多肽或抗体可以试剂盒形式提供，即将预定剂量的试剂与进行诊断试验的说明书组合包装。当抗体突变体用酶作标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(如提供可检测发色团或荧光团的前体底物)。另外，还可包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲液(如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以差别很大，溶液中提供的试剂浓度能使试验灵敏度基本达到最优。特别是，试剂可以干粉形式(通常是冻干的)提供，包括在溶解时能提供浓度合适的试剂溶液的赋形剂。
F.多肽或抗体的体内应用
预计本发明的多肽或抗体可用来治疗哺乳动物。在一个实例中，将抗体给予非人哺乳动物以获得(例如)临床前期数据。待处理的典型的非人哺乳动物包括非人灵长类、狗、猫、啮齿类动物和其它能进行临床前期研究的哺乳动物。这些哺乳动物可以是已经建立的待用抗体治疗疾病的动物模型、或可用来研究感兴趣抗体的毒性的动物模型。在每个实例中，可在哺乳动物中进行剂量逐步增加的研究。
抗体或多肽可通过任何合适的方法给予，这些方法包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内给药，如果需要局部免疫抑制治疗，可以是病变区内给药。肠胃外灌输包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下给药。另外，抗体突变体可通过脉冲灌输、特别是减少的抗体突变体剂量来适当地给予。较佳的，药剂通过注射给予，更佳的是静脉内或皮下注射给予，这部分取决于给药是瞬时性还是慢性的。
为了预防或治疗疾病，抗体或多肽的合适剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、给予抗体突变体是出于预防目的还是治疗目的、以往的治疗、患者的临床史以及对抗体突变体的反应、和主治医师的判断。抗人IgE抗体可以通过一次或连续治疗适当地给予患者。
根据疾病的类型和严重程度，大约1微克/千克至150毫克/千克(例如0.1-20毫克/千克)抗体或多肽是给予患者的初始候选剂量，无论是通过一次或多次分开的给药还是连续灌输。根据上述因素，典型的每日剂量可能在大约1微克/千克至100毫克/千克或以上的范围内。对于超过几天或更长时间内的重复给药，根据病征，应维持治疗直至疾病症状受到所需的抑制。然而，可采用其它剂量方案。这种治疗的进程很容易用常规技术和试验来监测。一种典型的抗LFA-1或抗ICAM-1抗体的剂量方案公开在WO94/04188中。
抗体突变体组合物将以良好的医学实践相一致的方式配制、服药或给药。在本文上下文中考虑的因素包括待处理的特定的疾病、待处理的特定的哺乳动物、患者个体的临床状况、病因、输递试剂的部位、给药方法、给药方案以及医生所知的其它因素。所给予抗体突变体的“治疗有效量”将由这些考虑因素决定，并且是预防、改进或治疗疾病或失调所需的最少量。抗体突变体不需要、但可任选地和目前使用的一种或多种试剂配制在一起，以预防或治疗所讨论的疾病。其它这些试剂的有效量取决于制剂中抗人IgE的量、疾病或治疗的类型、以及上述的其它因素。这些试剂的用量和给药途径通常和上文所用的相同，或者约为上文所用剂量的1-99％。
G.产品
在本发明另一个实例中，提供了一种含有用于治疗上述疾病的物质的产品。产品包括一个容器和一个标签。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射管和试管。容器可用诸如玻璃或塑料之类的各种物质制成。容器中盛放了可有效治疗病征的组合物，还可以含有一个无菌入口(例如，容器可以是盛静脉内注射用溶液的袋或有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是抗体突变体。容器上的或附带的标签标明该组合物可治疗所选病征。产品还可包含第二个容器，该容器含有药学上可接受的缓冲液，如磷酸缓冲盐溶液、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。它还可包括从商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和装有使用说明书的包装。
通过描述(而非限定)方式提供下列实施例。
                       实施例
                      实施例1
针对IgE的单克隆抗体的制备
制备能阻断IgE结合FcεRI的8种单克隆抗体(MAE10-MAE17)。用分离的抗IgE抗体(Genentech MAE1)作亲和层析，从U266B1细胞(ATCC TIB 196)上清液制得针对IgE的单克隆抗体。对于MAE12，对5只6周龄BALB/c雌性小鼠足垫用10微克纯化的IgE(Ribi佐剂配制)免疫。在初次免疫后第一和第三周以相同方式进行注射。最后一次注射三天后，取出腹股沟和腿弯部淋巴结合并，使这些组织通过钢网纱制得单细胞悬液。使细胞在含50％w/v聚乙二醇4000的高葡萄糖(DMEM)中和小鼠骨髓瘤P3X63-Ag8.653(ATCC CRL 1580)以4∶1的比例融合。对于MAE14、MAE15和MAE13以类似方式进行免疫，不同的是：对于MAE13，每次注射用30微克IgE，测定IgE片段315-347(Kabat)作为融合前强化；对于MAE10和MAE11，以两剂100微克皮下注射，最后一次用50微克强化，用脾细胞进行融合。
然后将融合细胞以2×105/孔的密度接种到96孔组织培养板中。24小时后加入HAT选择性培养基(次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷，Sigma，#H0262)。在接种的1440个孔中，365个孔在HAT选择后含有生长的细胞。
融合后15天，用酶联免疫吸附试验(ELISA)测试上清中是否存在对人IgE特异的抗体。ELISA如下进行，所有培育在室温下进行。用50mM pH9.6碳酸钠缓冲液配制的1微克/毫升大鼠抗小鼠IgG(Boehringer Mannheim，#605-500)包被测试板(Nunc Immunoplate)2小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)含0.5％牛血清白蛋白封闭30分钟，然后用含0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤四次。加入测试的上清液，振摇培育2小时，然后用PBST洗涤四次。加入0.5微克/毫升人IgE(如上所述从U266细胞纯化获得)，振摇培育1小时，然后用PBST洗涤四次。加入稀释度为1∶2500的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgE(Kirkegarrd & Perry Labs，#14-10-04，0.5毫克/毫升)，培育1小时，然后用PBST洗涤四次。加入100微升/孔含10毫克邻苯二胺二盐酸盐(Sigma，#P8287)和10微升30％过氧化氢(配制在25毫升pH5.0磷酸柠檬酸缓冲液中)，培育15分钟，使板孔显色。加入100微升/孔2.5M硫酸终止反应。用自动化ELISA平板读数仪读取490nm吸收值。对于MAE12，测试了365份上清液，其中100份对人IgE有特异性。在筛选其它抗体时，获得了相似的IgE特异性频率。本文描述的所有单克隆抗体均是IgG1同种型，除了MAE17(是IgG2b同种型)和MAE14(是IgG2a同种型)外。
在细胞为基础的平板试验中进一步测试各IgE特异性抗体，选出以抑制IgE结合FcεRI的方式结合IgE、且不能结合FCEH结合的IgE的抗体。下表1和2中列出了这些试验的结果。
                             表1
                  鼠抗HuIgE单克隆抗体性能的归纳
    单抗    免疫原  方案/剂量(克) B细胞来源   同种型 结合FcεRI-结合的IgE1   PBL组胺释放2(EC50)    阻断FcR13(EC50)的量
   MaE1     PSIgE     3x50   淋巴结    IgG1 0.05克/毫升   1克/毫升    0.3克
  MaE10   U266IgE    2x100，1x50     脾    IgG1 在10克/毫升下不结合 ＞100克/毫升    2.5克
  MaE11   U266IgE    2x100，1x50     脾    IgG1 在10克/毫升下不结合 ＞100克/毫升    0.6克
  MaE12   U266IgE     3x30   淋巴结    IgG1 在10克/毫升下不结合 ＞100克/毫升    0.8克
  MaE13   U266IgE     3x30   淋巴结    IgG1 在10克/毫升下不结合 ＞100克/毫升    0.6克
  MaE14   U266IgE     5x50   淋巴结   IgG2a 在10克/毫升下不结合 ＞100克/毫升    2.5克
  MaE15   U266IgE     5x50   淋巴结    IgG1 在10克/毫升下不结合 ＞100克/毫升    0.6克
  MaE16  rHIgE aa315-547      5x1   淋巴结    IgG1 在10克/毫升下不结合 ＞100克/毫升    0.7克
  MaE17  rHIgE aa315-547      5x1   淋巴结   IgG2b 在10克/毫升下不结合 ＞100克/毫升   ＞5.0克
                         表2
                      鼠抗HuIgE的归纳(续)
   单抗   结合U266BL上的膜IgE(EC50)4 结合FcεRII(CD23)上的IgE(EC50)5 阻断1微克IgE结合FcεRII的量(EC50)6  体外IgE合成的抑制7 IgE8的亲和常数(Kd)
   MaE1     0.4微克/毫升 0.05微克/毫升   ＞100微克     (-)    5.4×10-8
  MaE10     0.5微克/毫升 在10微克/毫升下没有结合     2.5微克     (-)     7×10-9
  MaE11    0.15微克/毫升 在10微克/毫升下没有结合     0.6微克     (+)     3×10-8
  MaE12   ＞10微克/毫升   1微克/毫升     5.0微克     (-)     4×10-7
  MaE13     1微克/毫升 在10微克/毫升下没有结合   0.7微克/毫升     (++)     5×10-8
  MaE14     6微克/毫升 在10微克/毫升下没有结合   2.5微克/毫升     (±)    1.4×10-8
  MaE15     6微克/毫升 在10微克/毫升下没有结合   0.6微克/毫升     (±)     7×10-8
  MaE16     10微克/毫升 ＜0.05微克/毫升     5微克     (+)        ND
  MaE17     10微克/毫升 在10微克/毫升下没有结合     5微克     (++)        ND
1.用于分析鼠抗人IgE单克隆抗体的FACS为基础的试验。结合CHO3D10(FcεRIα+)上的IgE的鼠抗人IgE单克隆的筛选
a.使5×105细胞/每份样品的CHO 3D10细胞(FcεRIα链稳定转染子，Hakimi等人，J.Biol.Chem.25：22079)与配制在100微升FACS缓冲液(0.1％BSA，10mM叠氮钠，PBS配，pH7.4)中的10微克/毫升的U266 IgE标准品(批号13068-46)4℃培育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤一次。使等份负载了IgE的细胞与50微克/毫升多克隆FITC偶联的家兔抗人IgG(Accurate Chem.Co.AXL-475F，批号16)4℃培育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤三次，测定IgE结合的量。
b.使载有IgE的细胞与鼠抗人IgE杂交瘤上清液(鼠IgG的浓度在1至20微克/毫升之间)4℃培育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤一次。用10微克/毫升Genetech的单克隆抗人IgE(MaE1)作为结合的阳性对照。用10微克/毫升不识别IgE的Genetech的单克隆(MAD6P)作为阴性对照。
c.如下所述检测单克隆抗体与CHO细胞上人IgE的结合：使细胞和20微克/毫升偶联FITC、亲和纯化的F(ab′)2山羊抗小鼠IgG(Organon Teknica，#10711-0081)4℃培育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤三次。将细胞加入含2微克/毫升碘化丙锭(Sigma，#P4170)的400微升缓冲液中，对死亡细胞染色。
d.在Becton Dickinson FACSCAN流式细胞计上分析细胞。设定正向光散射器和90度侧向散射门，分析细胞均质群。不分析排除碘化丙锭染色的死亡细胞。将不结合CHO 3D10细胞上IgE的杂交瘤上清液作为进一步筛选的候选物。
2.外周血嗜碱细胞释放组胺。从正常献血者获得肝素化血液，1∶4稀释在改进的Tyrodes缓冲液(25mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，MgCl2，0.3毫克/毫升HAS，pH7.35)中，然后和1nM人IgE(ND)4℃培育60分钟。然后将细胞加入含有鼠单克隆抗IgE抗体(10毫克/毫升)或多克隆抗人抗血清(作为阳性对照)的Tyrodes缓冲液中，37℃培育30分钟。沉淀细胞，使上清液中的组胺乙酰化，用RIA试剂盒(AMAC，Inc.Webrook，Main)测定组胺含量。测定受几轮冻融的细胞的总组胺。
3.阻断FITC偶联的IgE与FcεRIα链的结合。研究抗体对IgE结合的效应，方法是在含0.1％BSA和10mM叠氮钠的PBS(pH7.4)中预先37℃培育FITC标记的IgE和各种MaE抗体30分钟，然后4℃培育混合物和5×105 3D10细胞30分钟。然后洗涤细胞三次，测定475纳米下的平均通道荧光值。用不阻断IgE结合FcεRIα链的鼠抗人IgE单抗(Mae1)作为对照。
4.分析鼠抗人IgE与膜IgE阳性B细胞U266的结合。
a.将U266B1细胞(膜IgE阳性)培养在添加了15％热灭活胎牛血清(Hyclone，#A-1111-L)、青霉素、链霉素(100单位/毫升)和L-谷氨酰胺(2mM)的基础培养基中。
b.将细胞(5×105/等份)培育在含10、5、1、0.5和0.1微克/毫升鼠抗人IgE单抗的100微升FACS缓冲液中，在96孔圆底微量滴定板中冰上培育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。用Genentech的单克隆MAE1作为阳性对照。
c.将细胞培育在含50微克/毫升(1∶20原液)偶联FITC的F(ab′)2亲和纯化的山羊抗小鼠IgE(Organon Teknika，#1711-0084)的100微升FACS缓冲液中，于冰上培育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤三次。将细胞加入含有2微克/毫升碘化丙锭的400微升FACS缓冲液中，对死亡细胞染色。
5.对FcεRII(CD23)+B细胞IM9进行FACS为基础的结合试验。
a.将IM9人B细胞骨髓瘤(ATCC CCL 159 Ann.N.Y.Acad.Sci.190：221-234(1972))维持在含有10％热灭活胎牛血清、青霉素、链霉素(100单位/毫升)和L-谷氨酰胺(2mM)的GIF基础培养基中。
b.将细胞(5×105等份)培育在含2微克/毫升U266IgE标准品的100微升FACS缓冲液中，在96孔微量滴定板中4℃培育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。将细胞培育在单独缓冲液或含有2微克/毫升人IgG1(Behring Diagnostics，目录号400112，批号801024)的缓冲液中作为对照。
c.然后使细胞和0.1-10微克/毫升的鼠抗人IgE单克隆抗体于冰上培育30分钟。用Genetech单克隆抗体MAE1作为阳性对照。
d.然后在含有50微克/毫升偶联FITC的F(ab′)2山羊抗小鼠IgG(Organon Teknika，#1711-0084)的100微升FACS缓冲液中4℃培育细胞30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤三次。
e.然后将细胞加入含2微克/毫升碘化丙锭的400微升缓冲液中，对死亡细胞染色。
f.在Becton Dickenson FACSCAN流式细胞计上分析细胞。设定正向光散射器和90度侧向散射器门，分析细胞均质群，分析排除被碘化丙锭染色的死亡细胞。相对于单用FITC家兔抗人IgE染色的细胞分析FITC阳性细胞(IgE结合)。
g.用10微克/毫升的Becton Dickinson鼠单抗Leu20(抗-CD23)4℃染色细胞等份30分钟，然后洗涤两次，作为测定各实验中IM9细胞表面CD23水平的阳性对照。然后使细胞和50微克/毫升偶联FITC的F(ab′)2亲和纯化的山羊抗鼠IgG一起培育。
6.抗体阻断偶联FITC的IgE与低亲和力IgE受体的结合
在FACSCAN流式细胞计上用流式细胞计数法分析40nM FITC标记的IgE与B淋巴母细胞IM-9上表达的低亲和力IgE受体(CD23或FcεRI)的结合。研究抗体对FITCIgE结合的效应，方法是在含0.1％BSA和10mM叠氮钠的PBS(pH7.4)中预先37℃培育FITC IgE和0.1-10微克/毫升鼠抗人抗体30分钟，然后4℃培育混合物与5×105细胞30分钟。然后洗涤细胞三次，测定475纳米下的平均通道荧光值。
7.IgE体外试验方法
a.从正常献血者分离外周血单核细胞。
b.用PBS充分洗涤细胞，尽可能多的除去血小板。
c.计数单核细胞，重悬于培养基中至1×106细胞/毫升。培养基是具有青霉素、链霉素、15％马血清、IL-2(25U/毫升)和IL-4(20ng/毫升)的DMEM混合液。
d.在第0、5和8天加入适当浓度的抗体。
e.在24孔Falcon组织培养板中培育培养物14天。
f.在第14天，取出上清液，用IgE特异性ELISA方法测定IgE浓度。
8.用平衡结合(Scatchard)分析测定鼠单克隆抗体对人IgE的亲和常数(kd)。
a.RIA缓冲液中的IgE(用氯胺T方法碘化ND和PS同种异型，用PD10sephadexG25柱(Pharmacia，#17-0851-01)与游离的125I Na分离)，缓冲液为：PBS，0.5％牛血清白蛋白(Sigma，#A-7888)、0.05％吐温20(Sigma，#P-1379)、0.01％硫柳汞(Sigma，#T-5125)，pH7.4。用50％三氯乙酸沉淀了大约78-95％的柱后计数，碘化IgE制备物的比活在1.6-13μCi/微克范围内(假定计数效率为70％)。
b.将固定浓度的125I(约5×104cpm)加入不同浓度(1-200nM)的未标记的IgE中(在12×75毫米聚丙烯试管，RIA缓冲液最终体积为0.1毫升)。然后加入含鼠抗人IgE单抗(20mM最终浓度)的0.1毫升RIA缓冲液至最终试验体积为0.2毫升。
c.25℃培育样品16-18小时并持续搅拌。
d.如下分离结合的和游离的125I IgE：加入偶联于CNBr活化Sepharose4B(Pharmacia，#17-0430-01)和载体蛋白A sepharose(Repligen，#IPA300)珠上的亲和纯化的山羊抗小鼠IgG(Boehringer Mannheim，#605-208)的0.3毫升混合物(以RIA缓冲液配)，25℃培育1至2小时并持续搅拌。然后加入RIA缓冲液(1毫升)，400xg离心试管5分钟。然后计数样品以确定总计数。用巴斯德移液管小心吸出上清液，对样品重新计数，计算出结合的和游离的计数对比。
e.用NIH的P.Munson编写的配体程序为基础的Fortran程序(scanplot)进行Scatchard分析。Scatplot采用质量作用方程式配合结合数作为用Rodbard型回归分析总数的函数。
                           实施例2
                       人源化Mae11的制备
引言：
下列实施例描述人源化MaE11的各种制备，其中通过定点诱变修饰残基，获得12个抗IgE MaE11变体[F(ab)1-12]。用F(ab)12的残基作为模板，产生rhuMaE25或E25(1992年8月4日提交的申请PCT/US92/06860中描述的一种高效抗IgE抗体)。
                          方法：
如图1所示，从pUC119-为基础的质粒pAK2(Carter等人(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285)中含有人k亚型I轻链和人亚型III重链(VH-CH1)的含脱氧尿嘧啶模板，通过定点诱变(Kunken，T.A.(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488)修饰了鼠抗人IgE单抗MaE11，获得变体F(ab)-1。F(ab)-2从F(ab)-1模板构建得到，而其它所有人源化F(ab)变体从F(ab)-2模板构建得到。将质粒转化入大肠杆菌JM101中，用于制备双链和单链DNA(Messing，J.(1979)，Recomb.DNA Tech.Bull.2：43；Ausuble等人，《现代分子生物学方法》，第1单元(1997))。用双脱氧法对全部轻链和重链残基测序。然后，将编码轻链和重链的DNA亚克隆到大肠杆菌F(ab)表达载体pAK19(Carter等人，(1992)，Biotechnology 10：163)中。此衍生物缺少形成F(ab′)2片段中重链间二硫键的铰链半胱氨酸。与全长IgG抗体相反，F(ab)片段有助于分析较大量的变体，因为可采用大肠杆菌表达(而不是哺乳动物细胞)培养技术。这些单个变体在1993年3月4日公开的申请WO93/04173中有所描述。一旦确定了最佳变体，可将其随后亚克隆到编码全长人IgG1的质粒中(见下文)。
将表达质粒转化入大肠杆菌MM294株(Meselon，M和R.Yuan(1968)，Nature217：1110)中，使单菌落在5毫升2YT培养基-羧苄青霉素(100微克/毫升)中37℃生长5-8小时。然后将5毫升培养物加入到100毫升AP5培养基-羧苄青霉素(100微克/毫升)中，使其在500毫升摇瓶中37℃生长16小时。4000xg离心培养物，除去上清液。冷冻1小时后，将沉淀其重悬于5毫升冰冷的10mM Tris，1mM EDTA和50微升0.1M苄脒(Sigma，St.Louis)中，加入后者是为了抑制蛋白水解。在冰上轻微振摇1小时后，10000xg离心样品15分钟。将上清液加入蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱(0.5毫升床体积)中，然后用10毫升3M氯化钾溶液/100毫升Tris(pH8.0)洗涤，再用2.5毫升100mM乙酸(pH2.8)洗脱到1M Tris(pH8.0)(0.5毫升)中。
然后用Centricon-30(Amicon)使F(ab)缓冲液交换成PBS，并浓缩至最终体积为0.5毫升。对每个F(ab)片段进行SDS-PAGE以确认纯度。用0.1％ε280为1.0来测定F(ab)浓度。用纯化的F(ab)-2的氨基酸分析得到的蛋白浓度以及该样品的A280来确定消光系数。
用液相色谱/质谱法直接分析所选F(ab)片段，以确认其分子量。将样品注射入压缩的毛细管液相色谱系统(Henzel，W.J.等人(1990)，Anal.Biochem.187：228)，用SciexAPI3质谱仪直接分析。将人生长激素较高的电荷状态(m.w.22，256.2)(用和样品所用相同的仪器参数获得)来标定。
为了产生全长人IgG1版的人源化MaE11，将重链和轻链分开亚克隆到以前描述的pPK质粒(Gorman，C.M.等人，(1990)，DNA Protein Eng.Tech.2：3)中。用高效的方法(Graham等人，同上；Gorman，C.M.，Science 221：551)，将合适的重链和轻链质粒(取决于所希望的序列变化)共转染到腺病毒转化的人胚肾细胞系(称为293细胞，Graham，F.L.等人(1977)，J.Gen.Virol.36：59)中。将培养基变成无血清并每天收获培养基至第5天。用蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)从合并的上清液中纯化抗体。通过G25凝胶过滤将洗脱抗体的缓冲液交换成PBS，用Centriprep-30或Centricon-100(Millipore)进行超滤浓缩，并4℃保藏。用总IgG结合ELISA测定抗体浓度。结果显示在表4中。
可溶性受体试验：
用0.05毫升含FcεRIα链IgG嵌合受体的包被缓冲液(50mM碳酸盐、碳酸氢盐，pH9.6)于4-8℃包被96孔试验板(Nunc)12小时。吸出孔中液体，加入250微升封闭缓冲液(PBS，1％BSA，pH7.2)，4℃培育1小时。在分开的试验板中，用试验缓冲液(0.5％BSA和0.05％吐温20，PBS，pH7.2)以1∶4的稀释度将样品和参照鼠MaE11从200微克/毫升滴定到0.001微克/毫升，加入相同体积的10ng/毫升生物素化IgE(O-Shannessy，D.J.等人(1984)，Immunol.let.8：273)，然后25℃培育平板2-3小时。用PBS和0.05％吐温20(Sigma)洗涤FcεRI包被的孔三次，从样品孔中转移50微升，25℃搅拌培育30分钟。每孔加入50微升链霉亲和素-HRP(500微克/毫升，Sigma)溶液(1∶5000稀释在试验缓冲液中)，然后搅动培育平板15分钟，如前所述那样洗涤。每孔加入50微升微孔过氧化物酶底物(Microwell Peroxidase Substrate)(Kirkgaard &Perry Laboratories)，显色30分钟，加入等体积1N HCl终止反应，在450纳米下测定吸收值。用Kaleidagraph数据分析应用软件(Synergy Software)通过非线性四参数曲线匹配绘制抑制百分数对封闭抗体浓度，计算50％抑制时的浓度。结果显示在表3中。
FACS为基础的结合试验：
用流式细胞计测定抗体抑制偶联FITC(Goding，J.W.(1976)，J.Immunol.Methods13：215)的IgE结合CHO 3D10细胞上表达的高亲和力FcεRI受体α链(Hakimi，J.等人，(1990)，J.Biol.Chem.265：22079)的能力。使FITC偶联的IgE(40nM)在FACS缓冲液(PBS，0.1％BSA，和10mM叠氮钠，pH7.4)中和抗体(0.3-1.0×10-6M)预先37℃培育30分钟。然后4℃培育混合物和5×105CHO CD10细胞30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞三次，在FACScan流式细胞计(Becton Dickinson)上475纳米下测定平均通道荧光值。用不阻断IgE结合FcεRIα链的鼠抗人IgE单抗作为阳性对照，不识别IgE的鼠单抗MOPC21(Cappel)作为阴性对照。结果显示在图3中。
抗体和载有IgE的FcεRI结合：
使抗体与CHO 3D10细胞上表达的FcεRIα亚基所结合的人IgE(10微克/毫升人IgE)4℃结合30分钟。洗涤细胞三次，然后用不同浓度的鼠抗人IgE单抗MaE1或MaE11或人源化单抗变体12[F(ab)12]培育30分钟。用MOPC21(鼠IgG1)作为鼠单抗对照，而用人源化4D5单抗(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285(1992)，人IgG1)作为F(ab)12的对照。鼠单抗的结合用FITC偶联的F(ab′)2山羊抗小鼠IgE(10微克/毫升)检测。人源化单抗用FITC偶联的F(ab′)2山羊抗人IgG(50微克/毫升)检测，它已经IgE柱亲和纯化而最大程度地减少了与IgE的交叉反应性。图4中描述了该结果。
鼠和人源化F(ab′)的计算机图表模型
用图1的F(ab)VL和VH结构域序列构建鼠MaE11 VL-VH结构域的计算机图表模型。随后用该模型来确定那些构架残基应被掺入人源化抗体导致产生F(ab)-2。还构建人源化变体的模型来验证鼠构架残基的正确选择。如Carter等人(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285；Eigenbrot，C.等人(1993)，J.Mol.Biol.229：969中描述的那样构建模型。
                          结果：
人源化MaE11抗体的设计：
人源化抗体的此次研究采用人共有序列。这与采用接近感兴趣鼠Ig的人序列的其它人源化技术相反。Shearman，C.W.等人(1991)，J.Immunol.147：4366；Kettleborough，C.A.等人(1991)，Protein Eng.4：773；Tempest，P.R.等人，(1991)，Biotechnology 9：266；Co.M.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2869；Routledge，E.G.(1991)，Eur.J.Immunol.21：2717。此人共有序列包括以人VH亚型III和VLk亚型I为基础的构架(如Kabat等人(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Instituteof Health，Bethesda，MD中所述)。如Kabat(同上)所述的那样，将6个CDR移植到人IgG 1构架上，产生F(ab)-1。所有的构架残基保留为人的残基。该变体最好描述成直率的“CDR交换”。F(ab)-1未显示出对IgE结合受体有可检测的抑制作用(表3)。这类“CDR交换”的变体不能结合其抗原在以前已有报道。(Carter等人，同上；Tempest等人，同上)。注意到表3中没有描述F(ab)-1的确切序列，但是，该序列可通过用MaE11鼠Kabat CDR残基替代对应人残基(用括号表示)来推断。图1中的右侧和左侧括号表明了Kabat CDR，而Chothia CDR用下划线表示。
为了帮助解释和减少混淆，用正常字体书写人残基，而鼠残基用斜体表示。在表示残基替代时，第一个残基是被取代的残基，第二个残基是插入的残基，数字是天然序列的Kabat编号。
F(ab)-2变体根据的是分子模型。在该分子中，将几个鼠构架残基掺入人构架中。在F(ab)-2中，采用Kabat等人(同上，根据种间序列差异)提供的CDR定义(除CDR-H1和CDR-H2外)。
根据序列差异的CDR-H1定义(Kabat等人，同上)与根据抗原-抗体复合物的晶体学研究的定义(Chothia，C.等人(1989)，Nature 342：877)有明显不同(图1)。因此，对CDR-H1重新定义以包括两者，即人残基26-35。
根据序列差异的CDR-H2定义(Kabat等人)所含有的残基比根据抗体-抗原晶体结构的残基(Chothia等人)多[见图1：Kabat CDR用括号表示，Chothia CDR用下划线表示]。由于对抗体人残基60-65没有发现表明抗体-抗原接触的晶体结构，因此修饰CDR-H2，使其包括两种定义的混合，即包括人残基50-58。结果，在F(ab)-2中，用较短版本的CDR-H2与F(ab)-1比较。
结果，产生人到鼠残基变化最少的F(ab)-2，认为这些变化是维持结合所需的。产生其它10个变体，以便测试包埋残基对CDR构型的影响，并评价有意义构架残基的分子模型的预定效应，和检查其它感兴趣的残基。
为了测试包埋残基对CDR构型的影响，构建F(ab)-3和F(ab)-7，其中将鼠残基变回人残基。如表4(F(ab)-3和F(ab)-4)所示，VL4和VL33处侧链对结合的影响最小，可能对人源化抗体中的CDR-L1的构型影响最小。
模型提示，构架残基VH24可能影响CDR-L1构型，VH37能影响VL-VH界面。然而，在VH24[F(ab)-5]或VH37[F(ab)-7]处替代成人残基显示结合能力减少得最少。相反，用人Leu[F(ab)-6]代替构架位置VH78处的鼠Phe会引起结合明显减少。该模型表明，该残基影响CDR-H1和/或CDR-H2的构型。
F(ab)-9至F(ab)-12检查了人残基被鼠残基取代的情况。所有这四种变体均显示出结合比F(ab)-2有大幅提高(见表3、4和图3)。在显示出结合比F(ab)-2高5倍的F(ab)-9中，将CDR-H2中的两个残基(如Kabat等人，同上所定义的)变成鼠残基：AlaVH 60 Asn和Asp H61 Pro。Pro替代能改变CDR-H2构型和/或刚性，Asn H60预计包埋在VL-VH界面，可能与Asp VL1相互作用。
表现出结合比F(ab)-2大大提高的F(ab)-10是这样一种变体，其中VL和VH结构域中的所有包埋残基(定义成可及表面积低于游离氨基酸的5％的残基)是鼠MaE11的残基。实际上，F(ab)-10可被认为是鼠MaE11，其中只有VL和VH中外露的非CDR残基被变成了人残基。
为了确定F(ab)-10的结合性提高是由于一个或几个残基，产生变体F(ab)-11和F(ab)-12。用F(ab)-9(并非F(ab)-2)作为基本模板来制备这些变体，因为它表现出结合提高5倍。模型表明，VH63和VH67处的侧链能影响CDR-H2的构型。如Kabat等人(同上)所确定的那样(但并非如Chothia等人(同上)所确定的那样)，认为VH63是CHR-H2的一部分。VH67是两种定义中的一个构架残基。在F(ab)-11中，VH63和VH67分别是鼠残基Leu和Ile。在F(ab)-12中，只有VH67被变成鼠Ile。
在可溶性受体试验(表4)和细胞为基础的试验(表4，图3)中，F(ab)-11和F(ab)-12均表现出至少和F(ab)-10一样佳、比F(ab)-9更佳的结合。这表明，F(ab)-10的结合提高并不是由于VH结构域内部重包装入鼠残基所致，而是仅仅受一个残基(即VH67)的影响。
构建F(ab)-8，用鼠Gly取代人VL55残基Glu，并在VL57处将Gly类似地替代成Glu。F(ab)-2采用人残基，而F(ab)-8的这些位置替代为鼠残基。从表3可迅速归纳出，这些残基的替代对受体结合没有影响。
                      表3
                人源化Mae11变体
变体 从F(ab)-2变化(a) 50％抑制时的浓度(ng/ml)平均值，标准偏差(b) F(ab)-XF(ab)-2 F(ab)-XMaE11
  VL   VH
 F(ab)-1   Leu 4 MetArg 24 LysGlu 55 GlyGly 57 Glu   Val 24 AlaIle 37 VaThr 57 SerAla 60 AsnVal 63 LeuGly 65 AsnPhe 78 Leu   ＞100,000 ＞16.0(c) ＞560
 F(ab)-2   -   -   6083,1279 1.0 34
 F(ab)-3   Leu 4 MetMet 33 Leu   -   9439,508 1.6 53
F(ab)-4 Leu 4 Met - 6770,349 1.1 3.8
 F(ab)-5   -   Val 24 Ala   9387,733 1.6 52
 F(ab)-6   -   Phe 78 Leu   17,537,4372 2.9 24
 F(ab)-7   -   Ile 37 Val   8622,107 1.4 48
 F(ab)-8   Glu 55 GlyGly 57 Glu   -   5799,523 1.0 32
 F(ab)-9   -   Ala 60 AsnAsp 61 Pro   1224,102 0.20 6.8
 F(ab)-10   Ala 13 ValVal 19 AlaVal 58 IleLeu 78 ValVal 104 Leu   Val 48 MetAla 49 GlyAla 60 AsnVal 63 LeuPhe 67 IleIle 69 ValMet 82 LeuLeu 82c Ala   842,130 0.14 4.7
 F(ab)-11   -   Ala 60 AsnAsp 61 ProVal 63 LeuPhe 67 Ile   416,66 0.07 2.3
 F(ab)-12   -   Ala 60 AsnAsp 61 ProPhe 67 Ile   501,84 0.08 2.8
  MaE11   -   -   179,63 0.03 1.0
(a)鼠残基用斜体字表示；残基数根据Kabat等人的编号。
(b)三个可溶性受体试验的平均值和标准偏差
(c)F(ab)X/F(ab)-2比值大于16指，该变体即使在采用最高F(ab)浓度下也不表现出结合。
用经测定结合性最接近鼠MaE11的F(ab)变体，即F(ab)-2、F(ab)-9、F(ab)-10和F(ab)-12，来产生全长IgG1分子。这些分子相对于F(ab)-2或MaE11的结合与F(ab)片段表现的结合性相当。表4中报道了这些结果。
                           表4
                     人源化MaE11 IgG1变体
全长变体 50％抑制时的浓度(ng/ml)平均值，标准偏差(a)     变体XIgG1-2(b)    变体XMaE11
 IgG1-2     7569,1042      1.0    16.9
 IgG1-9     3493,1264      0.46     7.8
 IgG1-10     1118,172      0.15     2.5
 IgG1-12     1449,226      0.19     3.2
  MaE11      449,53      0.06     1.0
MaE11与载有IgE的FcεRI的结合
鼠MaE11阻止游离的IgE与肥大细胞上的FcεRI结合，但是不通过结合载有IgE的FcεRI触发组胺释放。如图4所示，鼠MaE11和人源化变体12(IgG1-12)以及阴性同种型对照抗体MOPC21和阴性同种型对照人源化4D5(Carter等人，同上)不结合CHO 3D10细胞上载有IgE的FcεRI。相反，结合IgE但不阻止IgE结合FcεRI的鼠MaE1能结合载有IgE的FcεRI。与人IgG1对照(人源化4D5)不同的是，鼠IgG1同种型(用MOPC21表示)对这些细胞表现出约10％的非特异性本底结合。MaE11不产生高于MOP21对照的染色，人源化变体12不产生高于人源化4D5对照的染色(图4)。
部分丙氨酸扫描IgE结合中重要的CDR残基：
MaE11 CDR的序列表明带电荷残基占优势(图1)。CDR-L1含有三个Asp残基，而CDR-L3具有His，Glu和Asp。CDR-H3具有三个His残基。鼠和人源化MaE11模型说明了所有这些带电荷残基在空间上毗邻(未显示)。相反，CDR-H2中单独的Asp54在空间上与其它带电荷残基分开。用定点诱变(Kunkel，T.A.(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)以丙氨酸代替这些带电荷残基的每一个，产生变体。在CDR-L1中，改变三个Asp残基中的一个(Asp VL32b)变化就有效地废除了IgE结合[F(ab)-16；表5]，而替代其它Asp残基有最小的影响[F(ab)-14；F(ab)-15]。在CDR-L3中同时将Glu VL93和Asp VL94变为丙氨酸也减少了结合，但是没有达到和VL32b处取代相同的程度。CDR-H3中的三个His各单独替代成Ala导致结合稍有提高[F(ab)-21]，或结合减少三倍[F(ab)-20和F(ab)-21]。然而，同时改变三个His残基消除了结合[F(ab)-19]。尽管不容易确定带电荷残基是否参与直接结合IgE或为其各自CDR提供了某种构型稳定性，但是变体F(ab)-13至F(ab)-22表明，CDR-L1和CDR-H3是IgE结合中重要的决定簇。
                    表5
            人源化Mae11 F(ab)CDR残基变体
变体 从F(ab)-2变化(a) 50％抑制时的浓度(ng/ml)平均值，标准偏差(b) F(ab)-XF(ab)-2
VL  VH
 F(ab)-2 -  -  6083,1279 1.0
 F(ab)-13 Asp 30 AlaAsp 32 AlaAsp 32bAla  -  ＞100,000 ＞16.0(c)
 F(ab)-14 Asp 30 Ala  -  3452,183 0.57
 F(ab)-15 Asp 32 Ala  -  6384,367 1.0
 F(ab)-16 Asp 32bAla  -  ＞100,000 ＞16.0
 F(ab)-17 Glu 93 AlaAsp 94 Ala  -  17,456,7115 2.9
 F(ab)-18 -  Asp 54 Ala  2066,174 0.34
 F(ab)-19 -  His 97 AlaHis 100aAlaHis 100cAla  ＞100,000 ＞16.0
 F(ab)-20 -  His 97 Ala  19,427,8360 3.2
 F(ab)-21 -  His 100aAla  2713,174 0.45
 F(ab)-22 -  His 100cAla  15,846,8128 2.6
(a)鼠残基用斜体字表示；残基数根据Kabat等人的编号。
(b)三个可溶性受体试验的平均值和标准偏差
(c)F(ab)X/F(ab)-2比值大于16指，该变体即使在采用最高F(ab)浓度下也不表现出结合。
                       归纳和结论
从MaE11产生功能性人源化鼠抗IgE抗体涉及将几个鼠构架残基替代入人构架残基中。另外，带电荷CDR的图谱表明，这些残基中有一些对于抗体-IgE相互作用很重要。
变体F(ab)-1至F(ab)-12表明构架残基可能对抗体功能有明显影响，这与以前的研究(Carter等人，同上；Shearman，C.W.等人(1991)，J.Immunol.147：4366；Kettleborough，C.A.等人(1991)，Protein Eng.4：773；Tempest，P.R.(1991)，Biotechnology9：266)一致。在考虑其中只有6个鼠CDR残基被移植到人构架残基上的直率CDR交换的F(ab)-1时，特别强调这一点。对此，可能的解释包括CDR-H2。VH63和VH67位包埋的疏水性残基能影响CDR-H2的构型。产生在VH63和H67位置含有四种组合的诸变体，即分别是鼠Leu和Ile[MaE11和F(ab)-11]，Val和Phe[F(ab)-2]、Leu和Phe[F(ab)-1]和Val和Ile[F(ab)-12]。从这四种变体的结合数据清楚地推断表明，重要的残基是VH67，它必须是鼠Ile，以便提供和鼠MaE11相当的亲和力。在F(ab)-1中，该残基是人Phe。
在保留成人残基的F(ab)-1中的12个残基[与F(ab)-2比较]中，将8个残基分开变成其它变体中的鼠残基。三个变化对结合没有影响：VL4[F(ab)-4]；VL55和VL57[F(ab)-8]。两个残基替代(VH60和VH61[F(ab)-9])提高了结合，而三个减少了结合：VH24[F(ab)-5]；VH37[F(ab)-7]和VH78[F(ab)-6]。
用Padlan(Padlan，E.A.(1991)，Mol.Immunol.28：489)提出的假设设计变体F(ab)-10，他提出鼠抗体免疫原性可通过只改变外露的构架残基来降低。在该变体中，VL和VH结构域的疏水性内部，换句话说，变体是VL和VH中仅仅外露构架残基被改变成人序列的鼠MaE11。尽管F(ab)-10表现出结合能力与鼠MaE11接近，但是单个氨基酸区域的变化(VH67从人变为鼠)使结合能力有同样的提高[F(ab)-12，IgG1-12]。
表现出结合能力与鼠MaE11相当、且要求变化最少的人源化变体是F(ab)-12。该变体只有5个人构架残基被小鼠残基取代(VL4、VH24、VH37、VH67和VH78)。用分子模型测定这四个残基。为了提高最初的变体F(ab)-2的结合能力，用分子模型将第5个残基VH67以及CDR-H2残基VH60和VH61包括在内。
                           实施例3
                          组胺释放试验
引言：
这是一个大鼠肥大细胞组胺试验(RMCHA)，它根据抗体阻断变应原致敏的RBL48细胞释放组胺的能力来定量测定重组人源化单克隆抗IgE抗体的生物活性。另外，该测定在与人体内相似的生理条件下进行。RBL48细胞系从母代大鼠肥大细胞系RBL2H3衍生获得，随后转染了高亲和力人IgE受体(FcεRI)α亚基。Gilfillan A.M.等人，J.Immunol.149(7)：2445-2451(1992)。
方法：
使RBL48细胞(Gilfillan等人，同上)在润湿的5％CO2培养箱(Fischer，#610型)于T175组织培养瓶(Falcon#3028)内sIMDM(Iscove改进的Dulbecco培养基，其中添加了10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，和500微克/毫升活性遗传霉素(Gibco，#860-1811))中37℃生长。收获细胞，方法是使细胞和PBS/0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA的4毫升溶液37℃接触2分钟，然后离心(400xg，10分钟)并重悬于新鲜sIMDM中。用血细胞计数器(Reichert-Jung)计数悬浮液中的细胞，调节细胞至0.4×106细胞/毫升。然后在96孔U型组织培养板(Linbro)60孔内以100微升/孔(40,000细胞/孔)的密度接种细胞，然后在湿润的5％CO2培养箱中37℃培养24小时。在用200微升/孔sIMDM通过吸放洗涤一次后，使细胞和90微升/孔含豚草特异性IgE(RSIgE，10ng/ml，23.48ng/ml总IgE，1.43％豚草特异性人血浆，North American Biological，批号#42-365054)的试验稀释液(sIMDM，3U/ml肝素钠)预先培育30分钟。
在预培育期后，将10微升/孔的抗IgE抗体(稀释在试验稀释液中，0.06-39.4微克/毫升)或试验稀释液(用于总组胺释放、本底和豚草对照)加入细胞中，在5％CO2培养箱中37℃培育平板24小时。培育后，抽吸细胞，用200微升/孔的sIMDM洗涤3次。在洗涤后，用100微升/孔的(1)0.5％氚溶液(用于总组胺释放)、(2)组胺释放缓冲液(HRB、50％D2O，0.8％NaCl，1.3mM CaCl2，sIMDM，或(3)豚草抗原(NIH#A-601-903A-185，0.1微克/毫升，以HRB配)37℃培育细胞30分钟，将其置于冰上终止反应。(100％D2O＝100％D2O，0.8％NaCl，1.3mM CaCl2)。
4℃、900xg(2460rpm)离心平板5分钟，收获上清液，1/80稀释在PBS中(对于组胺释放对照，1/1000稀释在PBS中)，用组胺酶免疫试验试剂盒(Immunotech#1153)测定组胺。将上清液(100微升/孔)转移到含有酰化粉末(每一试剂盒)的酰化试管中并和50微升酰化缓冲液(每一试剂盒)室温下反应30分钟。然后将酰化的组胺(50微升/孔)转移到偶联平板(每一试剂盒)中，和200微升/孔组胺-乙酰胆碱酯酶偶联物(每一试剂盒)4℃培育18小时。
在该培育后，对孔作印迹，并用4X 300微升/孔洗涤缓冲液(Immunotech试剂盒，#1153)洗涤来除去不结合的偶联物。加入显色底物(乙酰基硫胆碱、二硫硝基苯甲酸酯，200微升/孔，每一试剂盒)，于暗处室温培育30分钟。加入终止溶液(50微升/孔，每一试剂盒)终止反应，在SLT 340 ATTC平板读数仪上测定405纳米的吸收值和620纳米的参比值。从组胺标准曲线(得自酶免疫试验试剂盒，AMAC)看出，吸收强度和组胺浓度(用nM表示)呈反比。从组胺浓度数据计算总组胺释放百分数，用100％总组胺释放计算抑制百分数。结果显示在图5中。
归纳和结论：
抗IgE摩尔比对豚草诱导组胺释放的抑制百分数的图线表明，e26抗体的F(ab)形式所具有的豚草诱导组胺释放性能优于e25抗体的F(ab)形式。E26以依赖于剂量的方法抑制豚草诱导的组胺释放，半数最大抑制摩尔比为44∶1(抗IgE∶RSIgE)。相反，e25只在非常高的摩尔比(在200∶1至1550∶1抗IgE∶RSIgE之间)抑制豚草诱导的组胺释放。e25曲线的半数最大抑制摩尔比估计在400∶1至500∶1之间。因此，根据半数最大抑制摩尔比值数据(它是分子结合亲和力的一个衡量标准)，e26分子与RSIgE的结合比e25分子好10倍。
                         实施例4
                    噬菌体展示实施例
引言：
该实施例描述了通过单价噬菌体展示产生特异性亲和力改进的抗IgE抗体，以及选择衍生自E25人源化抗IgE抗体的F(ab)片段(Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993))。
方法：
1.构建单价F(ab)-噬菌体文库
构建了几个F(ab)文库。用已知的技术(例如参见Bass等人，Proteins 8：309(1990))，使含有VL替代D32E(以消除IsoAsp异构化)的e25变体与噬菌体M13g3p的C端结构域融合，作为起始载体。该质粒称为p426，显示于图10中。首先，用“野生型”F(ab)-噬菌体p426作为模板来构建文库特异性“终止”模板。通过导入终止密码子(TAA或TGA)，使原来的分子灭活，从而减少构建文库时诱变步骤(Lowman & Wells，Methods：Comp.Methods Enzymol.3：205(1991))中的本底效应和模板特异性(杂交)偏性(bias)。用单链模板定向诱变和表10列出的寡核苷酸构建这些模板(Kunkel等人，Methods Enzymol.204：125(1991))。
随后，将这些终止模板用于第二轮诱变，采用表11列出的寡核苷酸来产生在每个指定CDR区域中的文库。用NNS简并密码子在每个指定CDR区域内产生所有20种氨基酸。(核苷酸碱基用单字母IUPAC名称表示；N＝A、G、C或T；S＝G或C)。用32种不同的可能密码子在每个随机化位置用NNS简并密码子产生所有20种氨基酸。琥珀终止密码子(TAG)在这里采用的抑制系统(即，supE抑制株XL-1 Blue)中编码Gln；Bullock等人，Biotechnique 5，376(1987)。存在于重链抗体结构域和噬菌体上g3p结构域之间的琥珀密码子允许噬菌体展示的融合蛋白只表达在大肠杆菌琥珀抑制株中，而用相同构建物可在大肠杆菌非抑制株中能获得可溶性F(ab)蛋白(Lowman等人，Biochemistry 30：10832(1991)；Lowman和Wells，Methods Comp.Methods.Enzymol.3：205(1991)；Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.19：4133(1991))。然而，本领域技术人员显然还可采用用于其它大肠杆菌噬菌体表达系统的其它终止密码子。
用电穿孔将随机诱变反应产物转化到大肠杆菌细胞(Stratagene，XL-1 blue中，使细胞和M13K07辅助噬菌体37℃生长过夜而扩增(Vierra和Messing，Methods Enzymol.153：(1987))。
                            表10
                  用于第一轮诱变的终止模板寡核苷酸
寡核苷酸序列号 区域   序列
 HL-208  VL1  ACC TGC CGT GCC AGT TAA TAA GTC TAA TAA GAA GGT GAT AGC TAC
 HL-209  VH3  GCC AGT CAG AGC GTC TAA TAA TAA GGT TGA AGC TAC CTG AAC TGG T
 HL-210  VH3  TGT GCT CGA GGC AGC TAA TAA TAA GGT TAA TGG TAA TTC GCC GTG TGG GG
 HL-220  VL2  G AAA CTA CTG ATT TAC TAA TAA TAA TAA CTG GAG TCT GGA GTC
 HL-221  VL3  CT TAT TAC TGT CAG CAA AGT TAA TAA TAA CCG TAA ACA TTT GGA CAG GGTACC
 HL-222  VH1  G TCC TGT GCA GTT TCT TAA TAA TAA TAA TAA TCC GGA TAC AGC TGG
 HL-223  VH1  GCC TAC TCC ATC ACC TAA TAA TAA AGC TGA AAC TGG ATC CGT CAG
 HL-224  VH2  GG GTT GCA TCG ATT TAA TAA TAA GGA TAA ACT TAA TAT AAC CCT AGC CTCAAG
 HL-225  VL1  AAG CCG GTC GAC AGG TAA TAA GAT TAA TAC TAA AAC TGG TAT CAA CAG
                       表11
             用于第二轮诱变的文库特异的简并寡核苷酸
    HL-212     VL1     ACC TGC CGT GCC AGT NNS NNS GTC NNS NNS GAAGGT GAT AGC TAC
    HL-213     VH3     GCC AGT CAG AGC GTC NNS NNS NSS GGT NNS AGCTAC CTG AAC TGG
    HL-214     VH3     TGT GCT CGA GGC AGC NNS NNS NNS GGT NNS TGGNNS TTC GCC GTG TGG GG
    HL-231     VL2     G AAA CTA CTG ATT TAC NNS NNS NNS NNS CTGGAG TCT GGA GTC
    HL-232     VL3     CT TAT TAC TGT CAG CAA AGT NNS NNS NNS CCGNNS ACA TTT GGA CAG GGT ACC
    HL-233     VH1     G TCC TGT GCA GTT TCT NNS NNS NNS NNS NNS TCCGGA TAC AGC TGG
    HL-234     VH1     GTT TCT GGC TAC TCC ATC ACC NNS NNS NNS AGCNNS AAC TGG ATC CGT CAG
    HL-235     VH1     GG GTT GCA TCG ATT NNS NNS NNS GGA NNS ACTNNS TAT AAC CCT AGC GTC AAG
    HL-236     VL1     AAG CCG GTC GAC AGG NNS NNS GAT NNS TAC NNSAAC TGG TAT CAA CAG
II.噬菌体结合选择
为了亲和选择噬菌体颗粒展示的F(ab)变体，用氯化钠/聚乙二醇(NaCl/PEG)沉淀从大肠杆菌培养上清液制得噬菌体。将噬菌体悬浮于PBS缓冲液中，然后稀释到含有0.05％吐温TM-20，以及作为阴性对照的非展示噬菌体的马血清(目录号A-3311-D，Hyclone，Logan，UT)中。作为阳性对照，使“野生型”e426 F(ab)-噬菌体与非展示噬菌体混合并进行模拟选择。
用50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)配制的2微克/毫升IgE(人IgE；Genentech批号#9957-36)包被Maxisorp96孔板(Nunc)4℃过夜。然后除去IgE溶液，使平板和马血清封闭溶液(没有吐温TM-20)一起室温下培育2小时。
除去封闭溶液，将噬菌体溶液在平板上室温培育1小时。然后，除去噬菌体溶液，用PBS/吐温TM-20(0.05％)缓冲液洗涤平板10次。在孔中加满PBS/吐温，使其再培育10分钟，然后再洗平板10次。
用20mM HCl洗脱保持结合平板的F(ab)噬菌体，用pH8的Tris-HCl中和，然后如上所述用辅助噬菌体增殖。连续洗脱等份噬菌体，和新鲜的XL-1 Blue细胞混合，接种到合适的抗生素平板上，计数展示F(ab)(抗羧苄青霉素；CFUa)或不展示F(ab)(氯霉素；CFUc)的洗脱噬菌体的CFU数(菌落形成单位数)。每一轮展示F(ab)相对不展示F(ab)噬菌体的富集数(Emut)计算成洗脱合并物的(CFUa/CFUc)除以起始合并物的(CFUa/CFUc)。野生型对照噬菌体的富集数(Ewt)以相同方式计算。
随后如上所述进行亲和选择，只是在前10次洗涤后每一轮的培育时间增加。为了比较在增加严谨性的条件下每轮之间的噬菌体选择效率，将每一轮的富集系数标准化成野生型对照的富集系数。图6显示了每一合并物的结合性富集与野生型的结合性富集之比(Emut/Ewt)。由于在平衡时高亲和力变体结合IgE平板的组分应比低亲和力变体多，因此亲和力较高的变体应被更有效地回收，因此展示出更高的相对富集。实际上，VL1文库显示了逐次改进的相对富集，在5-6轮选择后相对富集比野生型高大约10倍。通过这一衡量标准，VL1文库显示出其亲和力相对于野生型的改进程度高于VH3文库。两组CDR文库之间结果的不一致性可能反映出VL1为抗原结合提供了更多的能量。或者，e25的VH3 CDR可能已经比VL1 CDR更优化适合IgE结合，从而允许VL1通过侧链替代在结合相互作用中提供更高的相对改进。
DNA测序表明，第一VL CDR1文库的大多数F(ab)噬菌体变体(随机化位置27、28、39和31)具有保守的野生型残基D30，和优选突变的Y31G(表15，其中第3轮的克隆命名为212-3.x，从第6轮的克隆命名为212-6.x)。尽管在Q27和S28位观察到各种替代，但是在6轮选择后噬菌体合并物中主要是含有Q27K和S28P的一种克隆。该克隆还含有较佳的残基D30和G31，这提示这种侧链组合对于IgE结合可能是最优的。
在第2个VL CDR1文库(随机化位置30、31、32和34)中，大多数选择子具有保守的野生型残基D30和E32；在测序的克隆中只观察到野生型D34。在该文库，在Y31位发现了各种残基类型。在两个克隆213-6.7和213-6.8中发现了额外的一个乱真的突变G33S(表15)。
3轮选择后VH CDR3文库的克隆的序列分析表明，该文库已经基本上集中成一个克隆，即214-3.1，它在101-103位具有野生型残基，并有替代H105T和H107Y(表15)。
IV.所选F(ab)克隆的噬菌体ELISA试验
为了评价噬菌体结合选择的结果，将噬菌体转染入大肠杆菌XL-1 Blue细胞中，在液体培养中增殖或接种到含抗生素平板上。从这些平板随机挑取克隆进行测序和用竞争性噬菌体-ELISA进行结合分析。(Cunningham等人，EMBO J.13：2508(1994)；Lowman，《分子生物学方法》第87卷第24章，Cabilly编著，Humana Press Inc.Totawa，NJ(1997))。
为了评价相对的IgE结合亲和力，如上所述将噬菌体在包被IgE的平板上滴定，使展示F(ab)的浓度标准化。预先混合噬菌体和连续稀释的IgE，然后加到包被IgE的平板上，室温培育1小时。然后用PBS/吐温洗涤平板10次，加入辣根过氧化物酶和山羊抗家兔的偶联物混合的家兔抗噬菌体抗体溶液。室温培育1小时后，用显色底物邻苯二胺(Sigma)使平板显色。加入1/2体积的2.5M硫酸，终止反应，在分光光度平板读数仪上测定490纳米下的光密度。使4参数曲线与每一数据组匹配，测得每一变体的IC50(Lowman，《分子生物学方法》，同上)。根据其IC50与起始噬菌体e426的IC50的比值确定每一克隆噬菌体变体的相对结合亲和力(表15-16)。
在一些情况下，全部测试给定轮选择的噬菌体合并物，以估计对IgE的群体平均相对亲和力[IC50(野生型)/IC50(突变型)]。例如，VL CDR1文库残基32、33、35和37表明在5轮选择后亲和力只比e426提高了3.6倍，即使该文库的亲代变体(e426)表现出亲和力提高25倍。因此，不再继续研究这些特定残基的VL-CDR1文库。另一方面，VH CDR2噬菌体合并物显示出亲和力比其亲代e426噬菌体提高6.2倍。
还产生了CDR结构域VL CDR2残基54-57以及VL CDR3残基96-98、99和100的噬菌体文库。然而，这些位置上的氨基酸替代不能产生超过e426的富集。针对VHCDR1残基26-30产生的噬菌体文库产生的富集也不超过e26，并且发现主要是污染性e26噬菌体。这表明在最初文库中没有变体的亲和力高于e26。
表15中报道了CDR结构域VL CDR1残基27、28、30、31、32、34以及VH CDR1残基101、102、103、105和107的噬菌体文库，而表16中报道了VH CDR2。在表15和16中，对未表现出亲和力显著高于e26的克隆文库不作继续研究，也不测定结合性能提高系数。
                            表15
              IgE结合性能选择(产生)的F(ab)-噬菌体克隆
  噬菌体克隆     VL CDR1残基     VH CDR3残基 结合性能提高倍数(噬菌体ELISA)
 27  28  30  31  32  34 101 102 103 105 107
    e426  Q  S  D  Y  E  D  H  Y  F  H  H     -1-
  212-3.1(x2)  M  R  Y  G  --  --  --  --  --    未测定
    212-3.2  A  Y  N  G  --  --  --  --  --     3.5
    212-3.3  G  G  Y  G  --  --  --  --  --     6.9
    212-3.5  M  G  E  A  --  --  --  --  --    未测定
    212-6.1   E  Q   D  W  --  --  --  --  --  --  --     23
    212-6.2   E  R   E  S  --  --  --  --  --  --  --   未测定
    212-6.4   E  H   D  W  --  --  --  --  --  --  --     23
    212-6.5   S  N   S  G  --  --  --  --  --  --  --   未测定
    212-6.6   K  E   D  S  --  --  --  --  --  --  --   未测定
      212-6.7(x8)(e26)   K  P   D  G  --  --  --  --  --  --  --     25
    212-6.15   R  P   D  T  --  --  --  --  --  --  --   未测定
    212-6.16   R  S   D  G  --  --  --  --  --  --  --   未测定
    212-6.17   V  T   H  S  --  --  --  --  --  --  --   未测定
    213-3.1  --  --   D  D  C  D  --  --  --  --  --   未测定
    213-3.2  --  --   H  D  S  D  --  --  --  --  --   未测定
    213-3.3  --  --   D  W  Q  D  --  --  --  --  --     8.8
    213-3.4  --  --   G  D  H  D  --  --  --  --  --     3.7
    213-6.1  --  --   E  R  W  D  --  --  --  --  --   未测定
  213-6.3(x2)  --  --   D  T  E  D  --  --  --  --  --     14
    213-6.4  --  --   D  W  E  D  --  --  --  --  --     20
  213-6.7G33S  --  --   H  N  E  D  --  --  --  --  --   未测定
  213-6.8G33S  --  --   Y  S  N  D  --  --  --  --  --     14
    213-6.9  --  --   W  G  E  D  --  --  --  --  --   未测定
    213-6.11  --  --   Y  S  E  D  --  --  --  --  --   未测定
    213-6-12  --  --   E  R  D  D  --  --  --  --  --   未测定
    213-6.13  --  --   H  E  E  D  --  --  --  --  --   未测定
    213-6.14  --  --   D  K  K  D  --  --  --  --  --   未测定
    213-6.15  --  --   D  R  Q  D  --  --  --  --  --     15
  214-3.1(x5)  --  --  --  --  --  --  H  Y  F  T  Y     2.7
    214-3.6  --  --  --  --  --  --  H  Y  F  S  R   未测定
                    表16
               VH CDR2噬菌体克隆
  噬菌体克隆                    VH CDR2残基  结合性能提高倍数
    53     54     55     57     59
   e426     T     Y     D     S     N     -1-
  235-5.1     K     Y     S     E     K   未测定*
  235-5.2     K     W     H     E     M   未测定*
  235-5.3     K     W     W     E     A   未测定*
  235-5.4     H     Y     A     R     K   未测定*
  235-5.5     K     Y     H     G     A   未测定*
*注意：估计群体平均相对噬菌体亲和力比e426高6.2倍。
V.噬菌体筛选得到的组合突变
蛋白质中不同位点处突变通常展示出对蛋白功能的加和效应(Wells，Biochemistry29：8509(1990))。因此，组合上述初始噬菌体文库的几个突变，以改进与IgE的结合。
为了减小提高抗IgE抗体免疫原性的可能性，需要使E-25的突变程度减小到最低程度。因此，只采用在独立测定时展示出亲和力提高程度最大的噬菌体变体的突变。另外，给定噬菌体克隆被观察到的频率可能与表达水平和/或蛋白水解稳定性有关(Lowaman&Wells，1991，同上)。从VL1文库选择一个特定克隆212-6.7，重新命名为e26，因为它在噬菌体-ELISA试验中表现出亲和力比e426高25倍(表17)。
VH CDR2文库也表现出亲和力比e426有所改进，虽然测得的这一提高是对合并噬菌体测定而言为6.2倍。该合并噬菌体亲和力表明合并物中的至少一些成员具有改进的结合亲和力，而不必测定所有单个成员的亲和力。用合并噬菌体还能鉴定在给定轮后亲和力增强了多少，是否应继续亲和力选择(即一旦合并物的亲和力达到最大值，随后轮选择不可能提供额外的富集)。因此，合并物亲和力数据是一种非常有用的筛选工具。
显然，VH CDR2区域中的突变可以和VL CDR1中的那些突变加和起作用，因为在晶体结构和分子模型中，VH CDR2环远离VL CDR1环。
然而，由于这些突变的一些组合可能不相容，我们测试了四个不同的组合突变体：e26与克隆235-5.1、235-5.2、235-5.3和235-5.4中发现的突变组合(表17)。这些构建物用e26 F(ab)噬菌体作为模板，用编码VH2突变的诱变性寡核苷酸通过Kunkel诱变(Kunkel等人，Methods Enzymol.204：125(1991))来制得。
用噬菌体ELISA试验(Lowman，《分子生物学方法》第87卷，Cabilly编辑，HumanaPress Inc.，Totawa，NJ(1997))比较e26中VL CDR1突变和克隆235-5.1、235-5.2、235-5.3和235-5.4中VH CDR2突变的组合形成的最终变体。还制得可溶性F(ab)蛋白，在生物素-IgE平板试验中比较，报道在下表17和图7中。
                              表17
      F(ab)片段     IC50(nm)   相对亲和力(提高倍数)
        e426      1.5         -1-
         e26      0.17         8.9
   e26(e26+235-5.1)      0.040          38
   e695(e26+235-5.2)      0.050          31
   e696(e26+235-5.3)      0.063          24
   e697(e26+235-5,4)      0.066          23
VI.生物素平板试验(FcERI-IgG嵌合体竞争试验)
引言：本实施例的目的是为了比较在抗IgE F(ab)和生物素-IgE同时加入包被IgE受体嵌合体的平板中时，不同的抗IgE F(ab)是如何与固定化高亲和力IgE受体IgG嵌合体，竞争结合溶液相内生物素化的人IgE。随着抗IgE F(ab)浓度的增加，能结合平板上受体的生物素IgE的量减少，产生低的光密度值(经分光光度计测得)。
通过加入等份100微升的1微克/毫升原液(以50nm碳酸钠缓冲液(pH9.6)配)，用100微克/孔的FcεRI-IgG(Haak-Frendsho等人，J.Immunol.151，352(1993)(Genentech，批号#2148-74(6.4毫克/毫升))4℃包被Nuc maxisorp平板(目录号F96)12至24小时。用ELISA洗涤缓冲液(0.05％聚山梨醇酯20(Sigma)，以PBS配制，pH7.4)洗涤平板3次，通过和200微升ELISA试验缓冲液(Tris缓冲盐溶液，pH4.45，含0.5％RIA级牛血清白蛋白，Sigma；0.05％聚山梨醇酯20和4mM EDTA)一起培育60分钟进行封闭。用洗涤缓冲液洗3次后，将100微升连续2倍稀释的试验缓冲液中初始浓度为200nM的抗IgE F(ab)加入ELISA平板中一式三份。用Titertek多通道移液管进行稀释。将试验缓冲液(100微升，0.5毫克/毫升原液1/500稀释)配的生物素化IgE加入所有孔内，在微轨道摇动器(Bellco)上25℃培育混合物60分钟。从U266B1骨髓瘤(ATCC TIB196)培养上清液中亲和纯化出IgE，用生物胞素酰肼生物素化(O′Shannessy等人，Immunol Lett.8：273(1984)；Pierce Chemical)。用洗涤缓冲液洗涤样品5次，结合的IgE用1∶3000的100微升过氧化物酶偶联的链霉亲和素(Zymed)检测90分钟。然后用洗涤缓冲液再洗6次，加入100微升底物溶液(400微克/毫升邻苯二胺二盐酸盐和4mM H2O2，以PBS配制)，培育6分钟。然后用4.5M硫酸(100微升)终止反应，在Uvmax微量板读数仪(Molecular Devices)上读取490纳米吸收值。图8中绘出了e25、e26和e27 F(ab)抗体片段不同F(ab)浓度水平的吸收值。
结论：图8中曲线表明，E26和E27对高亲和力受体的亲和力高于E25，E27显示出最高的亲和力。
VII.可溶性F(ab)蛋白的BIAcore试验
从用BIAcoreTM-2000表面等离子体共振系统(BIAcore，Inc.)测得的缔合和解离速率常数计算出几种F(ab)片段的受体结合亲和力(Lofas & Johnson，J.Chem.Soc.Commun.21，1526-1528(1990))。根据生产商(BIAcore)说明书，用N-乙基N′-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化生物传感器芯片来共价连接IgE。将IgE稀释到10nM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中，再将其进一步稀释成大约30微克/毫升，然后注射在芯片上，获得800-12400固定化物质响应单位(RU)的信号，由于RU中的信号与固定化物质的质量成比例，这表示基质上的固定化IgE密度范围约为0.4-6.5皮摩尔/平方厘米。最后，注射1M乙醇胺作为封闭剂。用4.5MMgCl2再生。
为了动力学测定，在25℃以20微升/毫升的流速将1.5倍连续稀释的F(ab)抗体片段(以PBS/吐温缓冲液配制(0.05％吐温-20，磷酸盐缓冲液配制))注射到IgE芯片上[图9]。
将解离数据与单点(one-site)模型匹配，以获得koff±s.d.(测定值的标准偏差)。计算每一缔合曲线的拟一级速率常数(ks)，绘成蛋白浓度函数以获得kon±s.e.(匹配值的标准误差)。从SPR测定值计算Fab∶IgE结合的平衡解离常数Kd(koff/kon)。在不存在实验人为现象(如解离的F(ab)重新结合)时，观察到的离去速度不依赖于F(ab)浓度。同样，由于平衡解离常数Kd与koff成反比，假定所有变体的缔合速率(kon)是恒定的，则可以估计亲和力提高倍数。表18中显示了离去速率以及计算出的解离半衰期。
                      表18
                    解离动力学
      F(ab)  Koff×10-4(秒-1)     t1/2(分钟)     提高倍数
       e25      22±4        5.3       -1-
       e26     3.6±0.2        41       7.7
 e27(E26+235-5.1)       0.98        118       22
 e695(E26+235-5.2)       0.94        122       23
 e696(E26+235-5.3)       1.4        83       16
 e697(E26+235-5.4)       1.5        77       15
WIII.F(ab)表达和纯化
在大肠杆菌菌株34B8中表达抗IgE F(ab)E-25(Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993))和衍生自p426的噬菌粒中的变体(图10)。37℃培育含50微克/毫升羧苄青霉素的2YT培养基中的牙签培养物(10毫升)8小时，然后转移到1升含50微克/毫升羧苄青霉素的修饰的AP-5中，37℃培育24小时。4℃、7000rpm离心500毫升瓶中培养物15分钟。-20℃冷冻沉淀至少3小时。将每500毫升沉淀悬浮于12.5毫升冰冷的25％蔗糖(用4℃、含1mM苄脒的50mM Tris pH8.0配制)中。4℃搅拌3小时，使悬浮液溶解。4℃、18000rpm离心悬浮液15分钟，用蛋白G(Pharmacia)亲和层析纯化上清液中表达的F(ab)。用10mM Tris(pH6.7)和1mM EDTA(pH8.0)的溶液洗柱，用2.5倍柱体积的100mM乙酸(pH3.0)洗脱F(ab)，立即用0.5体积的1M TrispH8.0返回中性pH。用centricon 30 microcentrator(Amicon)浓缩洗脱液并用PBS交换缓冲液。用分光光度计(Beckman DU64)测定280nM下吸收值，以确定蛋白浓度，在5％β-巯基乙醇的还原条件下用4-20％SDS PAGE凝胶(Novex)评价样品纯度。
IX.结果和结论：
噬菌体-ELISA竞争性实验的结果表明，尽管e26 F(ab)-噬菌体的亲和力比e426提高约9倍，但是组合变体e695、e696和e697比e426-噬菌体提高20-40倍。噬菌体衍生的突变的叠加组合能产生具有类似改进的亲和力的抗体变体。
当在生物素-IgE平板试验中测试F(ab)可溶性蛋白时，e26 F(ab)和e27 F(ab)在抑制IgE结合FcεRI-IgG方面分别比e25提高大约10倍和30倍。BIAcore分析的离去速率测定支持了这些相对亲和力。特别是，e26和e27显示出离去速率比e25低7.7倍和22倍。更长的半衰期意味着，IgE被“占据”或不能更长时间地结合高亲和力受体，因此导致抗IgE治疗剂的效能提高。
因此，平衡和动力学结合数据均支持了这样一个结论，即e26和e27 F(ab)与IgE的结合分别比e25牢固大约10倍和30倍。含有相应F(ab)突变的全长抗体(IgG)预计将展示出和e25 IgG相似的相对亲和力。序列表(1)一般信息：(i)申请人：Genentech，Inc.(ii)发明名称：改进的抗IgE抗体以及改进多肽的方法(iii)序列数目：26(iv)通信地址：
(A)地址：Genentech，Inc.
(B)街道：1 DNA Way
(C)城市：South San Francisco
(D)州：California
(E)国家：USA
(F)ZIP：94080(v)计算机可读形式：
(A)记录介质类型：3.5英寸，1.44Mb软盘
(B)计算机：IBM PC兼容型
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：WinPatin(Genentech)(vi)本申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：Svoboda，Craig G.
(B)登记号：39,044
(C)参考/案卷号：P1123PCT(ix)通讯信息：
(A)电话：650/225-1489
(B)电传：650/952-9881(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：6127碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：环状(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC  50TCATTGCTGA GTTGTTATTT AAGCTTGCCC AAAAAGAAGA AGAGTCGAAT 100GAACTGTGTG CGCAGGTAGA AGCTTTGGAG ATTATCGTCA CTGCAATGCT  150TCGCAATATG GCGCAAAATG ACCAACAGCG GTTGATTGAT CAGGTAGAGG  200GGGCGCTGTA CGAGGTAAAG CCCGATGCCA GCATTCCTGA CGACGATACG  250GAGCTGCTGC GCGATTACGT AAAGAAGTTA TTGAAGCATC CTCGTCAGTA  300AAAAGTTAAT CTTTTCAACA GCTGTCATAA AGTTGTCACG GCCGAGACTT  350ATAGTCGCTT TGTTTTTATT TTTTAATGTA TTTGTAACTA GAATTCGAGC  400TCGGTACCCG GGGATCCTCT CGAGGTTGAG GTGATTTTAT GAAAAAGAAT  450ATCGCATTTC TTCTTGCATC TATGTTCGTT TTTTCTATTG CTACAAACGC  500GTACGCTGAT ATCCAGCTGA CCCAGTCCCC GAGCTCCCTG TCCGCCTCTG  550TGGGCGATAG GGTCACCATC ACCTGCCGTG CCAGTCAGAG CGTCGATTAC  600GAAGGTGATA GCTACCTGAA CTGGTATCAA CAGAAACCAG GAAAAGCTCC  650GAAACTACTG ATTTACGCGG CCTCGTACCT GGAGTCTGGA GTCCCTTCTC  700GCTTCTCTGG ATCCGGTTCT GGGACGGATT TCACTCTGAC CATCAGCAGT  750CTGCAGCCAG AAGACTTCGC AACTTATTAC TGTCAGCAAA GTCACGAGGA  800TCCGTACACA TTTGGACAGG GTACCAAGGT GGAGATCAAA CGAACTGTGG  850CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT  900GGAACTGCTT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC  950CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG  1000AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC  1050ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG  1100CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA  1150GGGGAGAGTG TTAAGCTGAT CCTCTACGCC GGACGCATCG TGGCCCTAGT  1200ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCTAGA GGTTGAGGTG ATTTTATGAA  1250AAAGAATATC GCATTTCTTC TTGCATCTAT GTTCGTTTTT TCTATTGCTA  1300CAAACGCGTA CGCTGAGGTT CAGCTGGTGG AGTCTGGCGG TGGCCTGGTG  1350CAGCCAGGGG GCTCACTCCG TTTGTCCTGT GCAGTTTCTG GCTACTCCAT  1400CACCTCCGGA TACAGCTGGA ACTGGATCCG TCAGGCCCCG GGTAAGGGCC  1450TGGAATGGGT TGCATCGATT ACGTATGACG GATCGACTAA CTATAACCCT  1500AGCGTCAAGG GCCGTATCAC TATAAGTCGC GACGATTCCA AAAACACATT  1550CTACCTGCAG ATGAACAGCC TGCGTGCTGA GGACACTGCC GTCTATTATT  1600GTGCTCGAGG CAGCCACTAT TTCGGTCACT GGCACTTCGC CGTGTGGGGT  1650CAAGGAACCC TGGTCACCGT CTCCTCGGCC TCCACCAAGG GCCCATCGGT  1700CTTCCCCCTA GCACCCTCCT CCAAGAGCAC CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC  1750TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG  1800AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA  1850GTCCTCAGGA CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA  1900GCTTGGGCAC CCAGACCTAC ATCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC  1950ACCAAGGTGG ACAAGAAAGT TGAGCCCAAA TCTTGTGACA AAACTCACAC  2000CTAGAGTGGC GGTGGCTCTG GTTCCGGTGA TTTTGATTAT GAAAAGATGG  2050CAAACGCTAA TAAGGGGGCT ATGACCGAAA ATGCCGATGA AAACGCGCTA  2100CAGTCTGACG CTAAAGGCAA ACTTGATTCT GTCGCTACTG ATTACGGTGC  2150TGCTATCGAT GGTTTCATTG GTGACGTTTC CGGCCTTGCT AATGGTAATG  2200GTGCTACTGG TGATTTTGCT GGCTCTAATT CCCAAATGGC TCAAGTCGGT  2250GACGGTGATA ATTCACCTTT AATGAATAAT TTCCGTCAAT ATTTACCTTC  2300CCTCCCTCAA TCGGTTGAAT GTCGCCCTTT TGTCTTTAGC GCTGGTAAAC  2350CATATGAATT TTCTATTGAT TGTGACAAAA TAAACTTATT CCGTGGTGTC  2400TTTGCGTTTC TTTTATATGT TGCCACCTTT ATGTATGTAT TTTCTACGTT  2450TGCTAACATA CTGCGTAATA AGGAGTCTTA ATCATGCCAG TTCTTTTGGC  2500TAGCGCCGCC CTATACCTTG TCTGCCTCCC CGCGTTGCGT CGCGGTGCAT  2550GGAGCCGGGC CACCTCGACC TGAATGGAAG CCGGCGGCAC CTCGCTAACG  2600GATTCACCAC TCCAAGAATT GGAGCCAATC AATTCTTGCG GAGAACTGTG  2650AATGCGCAAA CCAACCCTTG GCAGAACATA TCCATCGCGT CCGCCATCTC  2700CAGCAGCCGC ACGCGGCGCA TCTCGGGCAG CGTTGGGTCC TGGCCACGGG  2750TGCGCATGAT CGTGCTCCTG TCGTTGAGGA CCCGGCTAGG CTGGCGGGGT  2800TGCCTTACTG GTTAGCAGAA TGAATCACCG ATACGCGAGC GAACGTGAAG  2850CGACTGCTGC TGCAAAACGT CTGCGACCTG AGCAACAACA TGAATGGTCT  2900TCGGTTTCCG TGTTTCGTAA AGTCTGGAAA CGCGGAAGTC AGCGCCCTGC  2950ACCATTATGT TCCGGATCTG CATCGCAGGA TGCTGCTGGC TACCCTGTGG  3000AACACCTACA TCTGTATTAA CGAAGCGCTG GCATTGACCC TGAGTGATTT  3050TTCTCTGGTC CCGCCGCATC CATACCGCCA GTTGTTTACC CTCACAACGT  3100TCCAGTAACC GGGCATGTTC ATCATCAGTA ACCCGTATCG TGAGCATCCT  3150CTCTCGTTTC ATCGGTATCA TTACCCCCAT GAACAGAAAT TCCCCCTTAC  3200ACGGAGGCAT CAAGTGACCA AACAGGAAAA AACCGCCCTT AACATGGCCC  3250GCTTTATCAG AAGCCAGACA TTAACGCTTC TGGAGAAACT CAACGAGCTG  3300GACGCGGATG AACAGGCAGA CATCTGTGAA TCGCTTCACG ACCACGCTGA  3350TGAGCTTTAC CGCAGGATCC GGAAATTGTA AACGTTAATA TTTTGTTAAA  3400ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC CAATAGGCCG  3450AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG  3500AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC  3550CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCTATGGC CCACTACGTG  3600AACCATCACC CTAATCAAGT TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA  3650AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC  3700GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA  3750GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC  3800GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCC GGATCCTGCC TCGCGCGTTT  3850CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA  3900CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG  3950TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCGCA GCCATGACCC AGTCACGTAG  4000CGATAGCGGA GTGTATACTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG AGCAGATTGT  4050ACTGAGAGTG CACCATATGC GGTGTGAAAT ACCGCACAGA TGCGTAAGGA  4100GAAAATACCG CATCAGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG  4150CGCTCGGTCG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(A)长度：121氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser1                5                  10                  15Gln Ser Leu Ser Leu Ala Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
             20                  25                  30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys
             35                  40                  45Leu Glu Trp Met Gly Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Ser Asn Tyr
             50                  55                  60Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser
             65                  70                 75Gln Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asp
             80                  85                  90Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His
             95                 100                 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
            110                 115                 120Ser121(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：121氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID N0：3：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1               5                  10                  15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
             20                  25                  30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
             35                  40                  45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr
             50                  55                  60Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
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            140                 145                 150Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
            155                 160                 165Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
            170                 175                 180Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
            185                 190                 195Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
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             95                 100                 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            110                 115                 120Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
            125                 130                 135Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
            140                 145                 150Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val
            155                 160                 165Asp Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
            170                 175                 180Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu
            185                 190                 195Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
            200                 205                 210Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
            215                 220                 225Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
            230                 235                 240Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            245         248(2)SEQ ID NO：24的信息：(i)序列特征：
(A)长度：218氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1               5                  10                  15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp
             20                  25                  30Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
             35                  40                  45Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
             50                  55                  60Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
             65                  70                  75Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
             80                  85                  90Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
             95                 100                 105Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
            110                 115                 120Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
            125                 130                 135Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
            140                 145                 150Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
            155                 160                 165Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
            170                 175                 180Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
            185                 190                 195Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
            200                 205                 210Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            215         218(2)SEQ ID NO：25的信息：(i)序列特征：
(A)长度：233氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1               5                  10                  15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
             20                  25                  30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
             35                  40                  45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr
             50                  55                  60Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
             65                  70                  75Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
             80                  85                  90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His
             95                 100                 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            110                 115                 120Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
            125                 130                 135Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
            140                 145                 150Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
            155                 160                 165Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
            170                 175                 180Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            185                 190                 195Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
            200                 205                 210Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
            215                 220                 225Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            230         233(2)SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征：
(A)长度：233氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1               5                  10                  15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
             20                  25                  30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
             35                  40                  45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr
             50                  55                  60Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
             65                  70                  75Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
             80                  85                  90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His
             95                 100                 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            110                 115                 120Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
            125                 130                 135Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
            140                 145                 150Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
            155                 160                 165Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
            170                 175                 180Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            185                 190                 195Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
            200                 205                 210Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
            215                 220                 225Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            230         233

Claims (31)

1.一种调节多肽对靶分子亲和力的方法，该方法包括：
a)鉴定倾向于异构化的天冬氨酰基残基；和
b)用替换残基替代，并筛选所得突变体对靶分子的亲和力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)用噬菌体展示来使亲和力成熟。
3.根据权利要求2所述的方法，其中多肽是抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中抗体是抗IgE抗体，靶分子是IgE。
5.根据权利要求4所述的方法，其中抗体是图12所示＂E25＂的序列[SEQ ID NO：13-14]。
6.根据权利要求5所述的方法，其中替代的残基是轻链可变区CDR1残基Asp32Glu，Gln27Lys和Ser28Pro。
7.根据权利要求6所述的方法，其中额外的替代残基是重链可变区CDR2残基Thr53Lys，Asp55Ser，Ser57Glu和Asn59Lys。
8.一种抗体分子，它包含选自F(ab)片段[SEQ ID NO：19-20]、sFv片段[SEQ IDNO：22]或F(ab′)2[SEQ ID NO：24-25]的e26序列。
9.一种抗体分子，它具有与图12的＂e26＂序列[SEQ ID NO：15-16]基本上相同的序列。
10.一种抗体分子，它包含选自F(ab)片段[SEQ ID NO：19和21]、sFv片段[SEQID NO：23]或F(ab′)2[SEQ ID NO：24和26]的e27序列。
11.一种抗体分子，它具有与图12的＂e27＂序列[SEQ ID NO：17-18]基本上相同的序列。
12.一种改进的抗体或其功能性片段，它因采用权利要求1所述的方法而具有改进的抑制豚草诱导组胺释放的性能。
13.一种改进的抗体或其功能性片段，它因采用权利要求2所述的方法而具有改进的抑制豚草诱导组胺释放的性能。
14.一种核酸分子，它具有编码选自F(ab)、sFv和F(ab′)2的e26抗体片段的序列。
15.一种核酸分子，它具有与编码e26的序列基本上相同的序列。
16.一种核酸分子，它具有编码选自F(ab)、sFv和F(ab′)2的e27抗体片段的序列。
17.一种核酸分子，它具有与编码e27的序列基本上相同的序列。
18.一种核酸分子，它编码的抗体因采用权利要求1所述的方法而具有改进的抑制豚草诱导组胺释放的性能。
19.一种核酸分子，它编码的抗体因采用权利要求2所述的方法而具有改进的抑制豚草诱导组胺释放的性能。
20.一种组合物，它包含药学上可接受的赋形剂与e26抗体分子的混合物，该抗体分子具有选自F(ab)[SEQ ID NO：19-20]；sFv[SEQ ID NO：22]和F(ab′)2[SEQ IDNO：24-25]的序列。
21.一种组合物，它包含药学上可接受的赋形剂和抗体的混合物，该抗体具有的序列与图12的＂e26＂[SEQ ID NO：15-16]基本上相似。
22.一种组合物，它包含药学上可接受的赋形剂和e27抗体分子的混合物，该抗体分子具有选自F(ab)[SEQ ID NO：19和20]、sFv[SEQ ID NO：23]和F(ab′)2[SEQ IDNO：24和26]的序列。
23.一种组合物，它包含药学上可接受的赋形剂和抗体分子的混合物，该抗体分子具有的序列与图12的＂e27＂[SEQ ID NO：17-18]基本上相似。
24.一种减少或防止哺乳动物体内IgE介导产生组胺的方法，该方法包括给予治疗有效量的e26抗体，该抗体具有选自F(ab)[SEQ ID NO：1 9-20]、sFv[SEQ ID NO：22]和F(ab′)2[SEQ ID NO：24-25]的序列。
25.一种减少或防止哺乳动物体内IgE介导产生组胺的方法，该方法包括给予治疗有效量的抗体，该抗体具有的序列与图12的＂e26＂[SEQ ID NO：15-16]基本上相似。
26.一种减少或防止哺乳动物体内IgE介导产生组胺的方法，该方法包括给予治疗有效量的e27抗体，该抗体具有选自SEQ ID NO：15-16的序列。
27.一种减少或防止哺乳动物体内IgE介导产生组胺的方法，该方法包括给予治疗有效量的抗体，该抗体具有的序列与图12的＂e27＂[SEQ ID NO：17-18]基本上相似。
28.一种治疗IgE介导疾病的方法，该方法包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的选自F(ab)[SEQ ID NO：19-20]、sFv[SEQ ID NO：22]和F(ab′)2[SEQ ID NO：24-25]的e26抗体序列片段。
29.一种治疗IgE介导疾病的方法，该方法包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的抗体，该抗体具有的序列与图12的＂e26＂[SEQ ID NO：15-16]基本上相似。
30.一种治疗IgE介导疾病的方法，该方法包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的e27抗体分子，该抗体分子具有选自SEQ ID NO：15-16的序列片段。
31.一种治疗IgE介导疾病的方法，该方法包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的抗体分子，该抗体分子具有的序列与图12的＂e27＂[SEQ ID NO：17-18]基本上相似。
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