ES2210778T3 - Anticuerpos anti-ige mejorados y procedimiento de mejora de polipeptidos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para ajustar la afinidad de un polipéptido para una molécula objetivo mediante una combinación de pasos, que incluyen: (1) la identificación de residuos aspárticos que son propensos a la isomerización; (2) la sustitución de residuos alternativos y chequeo de los mutantes resultantes por afinidad contra la molécula objetivo. En una situación predefinida, el procedimiento de sustituir residuos es maduración de afinidad con exhibición de fagos (AMPD). En otras situaciones predefinidas, el polipéptido es un anticuerpo y la molécula objetivo es un antígeno. En otra situación, el anticuerpo es un anti-IgE y la molécula objetivo un IgE. En otra situación, la invención se refiere a un anticuerpo anti-IgE que tiene afinidad mejorada para IgE.

Description

Anticuerpos anti-IgE mejorados y procedimiento de mejora de polipéptidos.

Antecedentes de la invención

La presente invención hace referencia a la inmunoglobulina E (IgE), a los antagonistas de IgE, a los anticuerpos anti-IgE capaces de unirse a la IgE humana y a un procedimiento para mejorar polipéptidos, incluyendo los anticuerpos anti-IgE.

La IgE es un miembro de la familia de inmunoglobulinas que media las respuestas alérgicas inmediatas como el asma, las alergias alimentarias, la hipersensibilidad de tipo 1 y la inflamación del sinus familiar muy extendida. La IgE se secreta por y se expresa en la superficie de las células B o linfocitos B. La IgE se une a las células B (así como a los monocitos, eosinófilos y plaquetas) por su región Fc con un receptor de IgE de baja afinidad, conocido como Fc\varepsilonRII. Después de la exposición de un mamífero a un alergeno, las células B que portan el anticuerpo IgE unido a su superficie y específico para el antígeno se "activan" y se transforman en células plasmáticas secretoras de IgE. La IgE específica del alergeno resultante circula a través del torrente sanguíneo y permanece unida a la superficie de los mastocitos en los tejidos y en los basófilos en la sangre, a través del receptor de alta afinidad, también conocido como Fc\varepsilonRI. En consecuencia, los mastocitos y los basófilos se sensibilizan contra el alergeno. Posteriores exposiciones al alergeno causan una unión cruzada del Fc\varepsilonRI basofílico y de mastocistos, dando como resultado una liberación de histamina, leucotrienos y factores activadores de plaquetas, y factores quimiotáctiso de eosinófilos y citoquinas IL-3, IL-4, IL-5 y GM-CSF que son responsables de la hipersensibilidad clínica y la anafilaxis.

La condición patológica de hipersensibilidad se caracteriza por una respuesta inmune excesiva a (un) alergeno(s), dando como resultado cambios tisulares importantes si el alergeno está presente en cantidades relativamente grandes o si el estado inmune humoral o celular ya se halla a un nivel elevado.

Los cambios fisiológicos en la hipersensibilidad anafiláctica pueden incluir una constricción intensa de los bronquiolos y bronquios de los pulmones, la contracción del músculo liso y la dilatación de capilares. La predisposición a esta condición, parece sin embargo ser el resultado de una interacción entre factores genéticos y ambientales. Los alergenos ambientales comunes que inducen la hipersensibilidad anafiláctica se hallan en el polen, los alimentos, los ácaros del polvo doméstico, los epitelios de animales, las esporas de hongos y los venenos de insectos. La alergia atópica se asocia con la hipersensibilidad anafiláctica e incluye los trastornos de, p.ej., el asma, la rinitis alérgica y la conjuntivitis (fiebre del heno), el eczema, la urticaria y las alergias alimentarias. Sin embargo, el choque anafiláctico, una condición de grave riesgo para la vida, es provocado generalmente por picaduras de insectos o medicación parenteral.

Hasta hace poco, se seguía una estrategia de tratamiento para la hipersensibilidad de Tipo 1 o la hipersensibilidad anafiláctica que trataba de bloquear la unión de la IgE con el receptor de alta afinidad (Fc\varepsilonRI) hallado en los basófilos y mastocitos y en consecuencia evitar la liberación de histamina y otros factores anafilácticos que generaban la condición patológica.

La patente internacional WO 93/04173, publicada el 4 de Marzo de 1993 describe las quimeras humanas IgE/IgG1, en donde los residuos de IgG1 se sustituyen por los residuos análogos de IgE. La solicitud de patente americana USSN 08/405.617 describe los anticuerpos humanizados anti-IgE, en donde un anticuerpo murino dirigido contra la IgE humana (MaE11) se utilizó para proporcionar las regiones CDR que se sustituyeron en una región de entramado de inmunoglobulina IgG1 (rhuMaE25). Una técnica de humanización es la descrita por Reichman, L. y col., (1988) Nature 332:323 y en Jones, P.T. y col., (1986), Nature 321:522.

Aunque la humanización de anticuerpos murinos se ha desarrollado para proporcionar moléculas anti-IgE que proporcionen una afinidad por la IgE similar a la de la molécula MaE11 murina, pero sin la respuesta inmunogénica proporcionada por ésta última (Shields y col., (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107:308-312), todavía no se ha obtenido ninguna construcción de un anti-IgE con afinidad por la IgE que sea definitivamente mejor que MaE11 o que un anticuerpo anti-IgE murino.

Los anticuerpos monoclonales recombinantes se someten a reacciones de degradación que afectan a todos los polipéptidos o proteínas, como la isomerización de residuos de ácido aspártico y asparraguina. Tal como se muestra en la Fig. A, más adelante, los residuos de aspartato (I) en las secuencias -Asp-Gly- pueden isomerizarse a isoaspartato (III) mediante un intermediario de imida cíclico (II). (Geiger & Clarcke, J. Biol. Chem., 262:768-794 (1987)). La cadena lateral de ácido carboxílico del ácido aspártico (I) reacciona con el nitrógeno de la amida de la glicina adyacente para formar un intermediario de ácido aspártico cíclico (II), que a continuación se convierte en una residuo de
–ácido isoaspártico-glicina- (III). El equilibrio, la velocidad y la dependencia del pH de esta reacción se han estudiado en modelos peptídicos por separado mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. (Oliyai & Borchardt, Pharm. Res. 10:95-102 (1993)). La tendencia a llevar a cabo la isomerización se cree que también depende de la flexibilidad local de la porción de la molécula que contiene la secuencia -Asp-Gly- (Geiger & Clarke, supra).

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Un ejemplo de un conocido anticuerpo que sufre la isomerización a ácido aspártico es el potente anticuerpo anti-IgE, conocido como rhuMabE-25 (E-25). Este suceso puede tener lugar espontáneamente, pero puede inducirse su realización cuando se incuba el E-25 a 37ºC durante 21 días. El resultado final es la inserción de un grupo metilo en el esqueleto polipeptídico del anticuerpo, que puede producir cambios y reducción de la afinidad de unión. Un estudio de E-25 con -c-Asp-Gly- y variantes de iso-Asp-Gly- en la posición VL 32-33 indicó que mientras la isomerización puede minimizarse mediante sustitución de alanina o ácido glutámico para el residuo VL32, la propia sustitución da como resultado una reducción de la unión de tres veces, Calcia y col., supra.

En consecuencia, existe una gran necesidad para crear polipéptidos mejorados, incluyendo anticuerpos, que no sólo presenten el suceso de "desactivación" de la isomerización del aspartil, sino que también exhiban afinidad por la molécula diana (p.ej., el antígeno) en igual o mayor intensidad que la afinidad de los polipéptidos no mejorados.

La presente invención hace referencia a un procedimiento para mejorar un polipéptido que tenga afinidad por una molécula diana mediante una combinación de etapas, que incluyen: (1) la identificación de residuos aspartil que son propensos a la isomerización; (2) la sustitución de residuos alternativos y el rastreo de los mutantes resultantes por su afinidad contra la molécula diana. En una realización preferida, el procedimiento de sustitución de residuos es la maduración de la afinidad con la expresión de fagos (AMPD). En una realización preferida, el polipéptido es un anticuerpo y la molécula diana es un antígeno. En una realización preferida, el anticuerpo es un anti-IgE y la molécula diana es la IgE.

En una realización aún más preferida, la invención hace referencia a un procedimiento para mejorar la afinidad del anticuerpo anti-IgE E-25 mediante el reemplazamiento del residuo de VL CDR-L1 32Asp con Glu, junto con la modificación de los residuos de VL CDR-L1 27Gln, 28Ser y 31Tyr a Lys, Pro y Gly, respectivamente. En una realización más preferida, el anticuerpo anti-IgE E-25 tiene modificaciones adicionales en los residuos de VH CDR2: 53Thr a Lys, 55Asp a Ser, 57Ser a Glu y 59Asn a Lys.

En otra realización, la invención hace referencia a un anticuerpo anti-IgE que tiene una afinidad mejorada por IgE.

En una realización preferida, el anticuerpo anti-IgE comprende los residuos de cadena ligera y pesada que contienen los fragmentos de secuencia marcada "e27" y "e26" en la Figura 2. Alternativamente, el anticuerpo anti-IgE comprende las secuencias de cadena ligera y pesada completas marcadas como "E27" y "E26" en la Figura 12.

La presente invención hace referencia a una composición de anti-IgE, o fragmentos funcionales de éste, de afinidad mejorada y de utilidad farmacéutica. La presente invención también hace referencia a un artículo de fabricación que comprende un anticuerpo anti-IgE de afinidad mejorada.

En otra realización, la presente invención hace referencia a los anticuerpos de la invención para utilizar en un procedimiento de reducción o inhibición de la producción de histamina mediada por IgE.

En otra realización, la presente invención hace referencia a los anticuerpos de la invención o a los fragmentos funcionales de éstos para utilizar en un procedimiento de tratamiento de un trastorno mediado por IgE.

Otros aspectos de la invención serán evidentespartir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Descripción resumida de las figuras

La Fig. 1 es una comparación de los dominios VH y VL entre el anticuerpo murino MAE11, las secuencias consenso humanas del subgrupo III de cadena pesada (humIII) y el subgrupo I de cadena \kappa ligera (hum\kappal) y el fragmento F(ab)-2, un fragmento de anticuerpo humano modificado con residuos CDR y algunos residuos de la región de entramado modificados a murinos.

La Fig. 2 es una comparación de las diferencias entre los dominios CDR de cadena ligera y de cadena pesada entre rhuMabe25, e426 y las secuencias e26 y e27. La numeración de los residuos aquí es consecutiva, opuesta a la de Kabat y col. También se ha de remarcar que estas secuencias son únicamente fragmentos y no los residuos exactos de las cadenas ligera y pesada de tamaño completo.

La Fig. 3 es una gráfica de un ensayo de FACS que indica la capacidad del anticuerpo analizado para inhibir la unión de la IgE conjugada con FITC con la cadena \alpha del receptor de alta afinidad Fc\varepsilonRI expresado en las células de CHO3D10. Se representa: el porcentaje de inhibición por el anticuerpo mAb murino MaE11 ( ), el control negativo humanizado mAb4D5 (\blacksquare),F(ab)-2 (\circ), F(ab)-9 (\bullet), F(ab)-11(\Delta) y F(ab)-12 (\blacktriangle). Los puntos de los resultados son el promedio de tres experimentos, excepto para mAb4D5, que es un solo valor experimental. Los resultados indican que MaE11 y los F(ab)s analizados bloquean la unión de IgE-FITC con las células CHO 3D10 que expresan la cadena-\alpha de Fc\varepsilonRI.

La Fig. 4 es una gráfica que representa un ensayo de FACS que cuantifica la unión del anticuerpo analizado con la IgE asociada con la subunidad-\alpha del receptor de alta afinidad Fc\varepsilonRI expresado en las células CHO 3D10. El porcentaje de unión del anticuerpo murino mAb maE11 (\circ), la variante humanizada 12 (\blacktriangle), el anticuerpo murino control mAb MaE1 (\bullet), el anticuerpo control negativo, murino MOPC21 (\Delta) y el mAb4D5, anticuerpo humanizado control negativo ( ). En una escala aritmética/lineal, los valores de fluorescencia del canal para 0,1 \mug/ml fueron: 7,3 para MPOC21, 32,1 para MaE1, 6,4 para MaE11, 4,7 para hu4D5 y 4,6 para huMaE11. Todos estos mAbs murinos eran isotipos de IgG1 murinas y los mAbs humanizados eran isotipos de la IgG1 humana. Cada punto de los resultados es el promedio de tres experimentos. Los resultados indican que MaE11 y F(ab)-12 no se unen con la IgE asociada con la cadena-\alpha Fc\varepsilonRI que se expresa en las células CHO 3D10.

La Fig. 5 es una gráfica de la proporción molar del anticuerpo anti-IgE respecto al porcentaje de inhibición de la liberación de histamina inducida por la ambrosía. Se muestran el E-25 (\bullet) y el e-26 (\circ). Los resultados indican que la forma F(ab) del e26 tiene una inhibición superior de la liberación de histamina inducida por ambrosía de forma dependiente de la dosis con una proporción molar de inhibición media máxima de 44:1 (anti-IgE:RSIgE).

La Fig. 6 es una representación gráfica del enriquecimiento de la afinidad después de varias rondas de selección de la afinidad descritas en el apartado II del Ejemplo 4. Se expresa la proporción de enriquecimiento de la unión para cada grupo respecto al de tipo salvaje (Emut/Ewt). Los resultados indican que las librerías VL (representadas por "a" & "b") expresaron sucesivamente enriquecimientos relativamente mejorados, hasta unas 10 veces superior al de tipo salvaje al cabo de 5-6 ciclos de enriquecimiento. Además, las librerías de VH ("c" y "d") presentaron aproximadamente una mejora de tres veces al cabo de 3 rondas. A remarcar que "a" corresponde a la librería de fagos Fab mutada en los residuos de VL CDR-1 27, 28, 30 y 31; mientras que "b" corresponde con las mutaciones en los residuos 30, 31, 32 & 34; y "c" y "d" son las librerías F(ab) independientes con mutaciones en los residuos 101, 102, 103, 103, 105 & 107.

La Fig. 7 es una gráfica de la densidad óptica observada respecto a la concentración del anticuerpo competidor de IgE en un estudio de competición ELISA de fagos de las variantes finales a partir de las combinaciones de las mutaciones de VL CDR1 en e26 con las mutaciones de VH CDR2 en los clones 235-5.1, 235-5.2, 235-5.3 y 235-5.4, renombrados como e27, e695, e696 y e697, respectivamente, descritos en la parte V del Ejemplo 4.

La Fig. 8 es una gráfica de la absorbancia a 490 nm de niveles de concentraciones diversas del anticuerpo anti-IgEe25, e26 y e27 en el ensayo en placa de biotina descrito en el apartado VI del Ejemplo 4.

La Fig. 9 indica la afinidad de unión aparente F(ab) de e25, e26 y e27, tal como se cuantificó mediante el sistema de resonancia de un plasmón de superficie BIAcore TM-2000. Se inyectaron diluciones de 1,5 seriadas de fragmentos de anticuerpo F(ab) en el chip de IgE en tampón PBS/Tween (Tween-20 al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato) a 25ºC utilizando una velocidad de flujo de 20 \mul/min. Las constantes de disociación en equilibrio (Kd) mostradas se calcularon a partir del cociente K_{on}/K_{off} observado para cada variante Fab.

La Fig. 10 es un listado de secuencias del plásmido p426 que se utilizó como molde para la construcción de moldes de parada específicos de librerías en el Ejemplo 4. La Fig. 11-A es un diagrama del inserto del plásmido pDH188 que contiene el DNA que codifica para la cadena ligera y la cadena pesada (dominio variable y constante 1) del anticuerpo humanizado Fab dirigido contra el receptor HER-2. VL y VH son las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, respectivamente. C_{k} es la región constante de la cadena ligera Kappa. CH1_{G1} es la primera región constante de la cadena 1 gamma humana. Ambas regiones codificantes se inician con la secuencia señal bacteriana de stII.

La Fig. 11-B es un diagrama esquemático del plásmido entero pDH188 que contiene el inserto descrito en la Fig. 11-A. Después de la transformación de las células E. coli SR101 con el plásmido y de la adición del fago auxiliar, el plásmido se empaqueta en las partículas fágicas. Algunas de estas partículas expresan la fusión de Fab-p III (en donde p III es la proteína codificada por el DNA del gen III de M13).

La Fig. 12 representa los residuos de cadena ligera y pesada de tamaño completo de los anticuerpos anti-IgE E25, E26 y E27.

La Fig. 13 representa los fragmentos F(ab) de los anticuerpos anti-IgE e26 y e27.

La Fig. 14 representa los fragmentos sFV de anticuerpos anti-IgE e26 y e27.

La Fig. 15 representa los fragmentos F(ab)'2 de los anticuerpos anti-IgE e26 y e27.

La SEC ID Nº 1 representa la secuencia del plásmido de expresión e426 utilizado en la invención, también indicado en la Figura 10.

La SEC ID Nº 2 representa la secuencia de cadena pesada variablede MaE11 indicado en la Fig. 1.

La SEC ID Nº 3 representa la secuencia de cadena pesada variable de F(ab)-2 indicada en la Fig.1.

La SEC ID Nº 4 representa la secuencia de cadena pesada variable de humIII indicada en la Fig. 1.

La SEC ID Nº 5 representa la secuencia de cadena ligera variable de MaE11 indicada en la Fig.1.

La SEC ID Nº 6 representa la secuencia de cadena ligera variable de F(ab)-2 indicada en la Fig. 1.

La SEC ID Nº 7 representa la secuencia de cadena ligera variable de humIII indicada en la Fig. 1.

La SEC ID Nº 8 representa la secuencia de cadena ligera variable de e26 y e27 indicadas en la Fig. 2.

La SEC ID Nº 9 representa la secuencia de cadena ligera variable de e426 indicada en la Fig. 2.

La SEC ID Nº 10 representa la secuencia de cadena ligera variable de e25 indicada en la Fig. 2.

La SEC ID Nº 11 representa la secuencia de cadena pesada variable de e27 indicada en la Fig. 2.

La SEC ID Nº 12 representa la secuencia de cadena pesada variable de e25, e26 y e426 indicadas en la Fig. 2.

La SEC ID Nº 13 representa la secuencia de cadena ligera variable de tamaño completo de e25, tal como se indica en la Fig. 12.

La SEC ID Nº 14 representa la secuencia de cadena pesada de tamaño completo de e25, tal como se indica en la Fig. 12.

La SEC ID Nº 15 representa la secuencia de cadena ligera de tamaño completo de e26, tal como se indica en la Fig. 12.

La SEC ID Nº 16 representa la secuencia de cadena pesada de tamaño completo de e26, tal como se indica en la Fig. 12.

La SEC ID Nº 17 representa la secuencia de cadena ligera de tamaño completo de e27, tal como se indica en la Fig. 12.

La SEC ID Nº 18 representa la secuencia de cadena pesada de tamaño completo de e27, tal como se indica en la Fig. 12.

La SEC ID Nº 19 representa el fragmento Fabde cadena ligera variable de e26 y e27, tal como se indica en la Fig. 13.

La SEC ID Nº 20 representa el fragmento Fab de cadena pesada variable de e26, tal como se indica en la Fig. 13.

La SEC ID Nº 21 representa el fragmento Fab de cadena pesada variable de e27, tal como se indica en la Fig. 13.

La SEC ID Nº 22 representa el fragmento sFv de e26 tal como se indica en la Fig. 14.

La SEC ID Nº 23 representa el fragmento sFv de e27 tal como se indica en la Fig. 14.

La SEC ID Nº 24 representa el fragmento F(ab)'2 de cadena ligera variable para e26 y e27, tal como se indica en la Fig. 15.

La SEC ID Nº 25 representa el fragmento F(ab)'2 de cadena pesada variable para e26 tal como se indica en la Fig. 15.

La SEC ID Nº 26 representa el fragmento F(ab)'2 de cadena pesada variable para e27 tal como se indica en la Fig. 15.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La mención de referencias particulares, solicitud de patente y patentes en esta solicitud debería interpretarse como referencias incorporadas en el texto de la especificación.

Definiciones

Los términos utilizados en esta solicitud se han de interpretar según el significado común y típico utilizado por los expertos en la materia. Sin embargo, los solicitantes desean que los términos siguientes tengan las definiciones que se especifican a continuación:

Los términos "proteína" o "polipéptido" se utilizan de modo indistinto. Estos hacen referencia a una cadena de dos (2) o más aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos o amidas, sin tener en cuenta la modificación post-traduccional (p.ej., la glicosilación o la fosforilación). Los anticuerpos se hallan específicamente dentro del ámbito de esta definición.

Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender más de una subunidad, en donde cada subunidad está codificada por una secuencia separada de DNA.

La frase "esencialmente idéntico" respecto a una secuencia polipeptídica de anticuerpo debe interpretarse como un anticuerpo que presente por lo menos el 70%, preferentemente el 80%, más preferentemente el 90% y más preferentemente el 95% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de referencia. El término en relación con una secuencia de ácido nucleico debería interpretarse como una secuencia de nucleótidos que presente por lo menos el 85%, preferentemente el 90%, más preferentemente el 95% y todavía más preferentemente el 97% de identidad de secuencia en relación con la secuencia de ácido nucleico. Para los polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación será generalmente de por lo menos 25 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud será generalmente de por lo menos 75 nucleótidos.

El término "identidad" u "homología" debe interpretarse como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos de una secuencia correspondiente con la que se compara, después del alineamiento de secuencias e introducción de huecos, si fuera necesario para lograr el máximo porcentaje de identidad para la secuencia completa, y sin considerar las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Ni las extensiones del extremo N- o C-terminal, ni las inserciones deben interpretarse como reductoras de la identidad u homología. Los procedimientos y los programas informáticos para el alineamiento son bien conocidos en la materia. La identidad de secuencia puede también cuantificarse utilizando programas de análisis de secuencia (p.ej., Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, Centro de Biotecnología de la Universidad de Winsconsin, 1710University Ave., Madison, WI 53705). Este programa casa las secuencias similares asignando grados de homología a las diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones.

El término "anticuerpo" se utiliza en sentido amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de tamaño completo), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (p.ej., los anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos (p.ej., Fab, F(ab')_{2} y Fv), siempre que presenten la actividad biológica deseada. Los anticuerpos (Abs) y las inmunoglobulinas (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan una especificidad de unión para un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto dichos anticuerpos como las moléculas similares a anticuerpos y que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de la última clase se producen, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles aumentados por los mielomas.

Los anticuerpos nativos y las inmunoglobulinas son generalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, variando el número de uniones disulfuro entre las cadenas pesadas de distintos isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena ligera y pesada también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de cadena pesada. Se cree que los residuos aminoacídicos determinados forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia y col., J. Mol. Biol. 186:651-66, 1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4592-4596 (1985).

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente del entorno en el que se ha producido. Los componentes contaminantes de su entorno de producción son materiales que podrían interferir con las utilizaciones diagnósticas o terapéuticas del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará de forma cuantificable mediante por lo menos tres procedimientos distintos: 1) a un grado de pureza superior al 95% en peso del anticuerpo, determinado por el procedimiento de Lowry y más preferentemente a, o superior al 99% en peso; 2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal, o de la secuencia interna utilizando un secuenciador "spinning cup"; o 3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando Coomasie blue o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, ya que por lo menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará generalmente con por lo menos una etapa de purificación.

Un "anticuerpo dependiente de la especie", p.ej, un anticuerpo anti-IgE humana de mamífero, es un anticuerpo que tiene una afinidad de unión mayor por un antígeno de una primera especie de mamífero que por un homólogo de dicho antígeno de una segunda especie de mamífero. Habitualmente, los anticuerpos dependientes de especie "se unen específicamente" a un antígeno humano (es decir, tienen un valor de afinidad de unión (Kd) no superior a aproximadamente 1x10^{-7} M, preferentemente no superior a aproximadamente 1x10^{-8} M y más preferentemente de aproximadamente 1x10^{-9} M), pero tiene una afinidad de unión por un homólogo del antígeno de una especie de mamífero no-humano que es por lo menos 50 veces, o por lo menos 500 veces, o por lo menos 1000 veces, más débil que su afinidad por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos, tal como se definió anteriormente, pero preferentemente es un anticuerpo humano o humanizado.

El término "anticuerpo mutante" hace referencia a una variante de secuencia aminoacídica de un anticuerpo, en donde se han modificado uno o más de los residuos aminoacídicos. Dicho mutante tiene necesariamente menos del 100% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia aminoacídica que tiene por lo menos el 75% de identidad o similitud de secuencia aminoacídica del dominio variable de cadena ligera o pesada del anticuerpo, preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, todavía más preferentemente al menos el 90% y aún más preferentemente al menos el 95%. Ya que el procedimiento de la invención se aplica por igual a polipéptidos, anticuerpos y fragmentos de lo mismo, estos términos se utilizan a menudo indistintamente.

El término "variable" en el contexto de dominio variable de anticuerpos, hace referencia al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en su secuencia entre los anticuerpos, y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular para su antígeno determinado. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones de determinación de la complementariedad (CDRs), también conocidas como regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Existen por lo menos dos técnicas para la determinación de CDRs: (1) una aproximación basada en la variabilidad de secuencia entre especies (p.ej., Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunlogical interest (National Institute of Health, Bethesda, MD 1987); y (2) una aproximación basada en los estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia, C. y col., (1989), Nature 342:877). Respecto al anticuerpo anti-IgE de la solicitud, ciertas CDRs se definieron combinando las aproximaciones de Kabat y col. Y Chothia y col. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de entramado (FR). Los dominios variables de las cadenas nativas ligera y pesada comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando en gran medida una configuración en hoja-\beta, conectada por las tres CDRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura en hoja-\beta. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat y col.). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo con un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de
anticuerpo.

El término "fragmento de anticuerpo" hace referencia a una porción de un anticuerpo de tamaño completo, generalmente al fragmento de unión del antígeno o la región variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen el Fab, Fab', F(ab')_{2} y fragmentos Fv. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, denominado así por su capacidad para cristalizar rápidamente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos fragmentos de unión al antígeno, capaces de unirse de forma cruzada con el antígeno, y otro fragmento residual (denominado pFc'). Fragmentos adicionales pueden incluir los diacuerpos, los anticuerpos lineales, las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y los anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpos. Tal como se utiliza aquí, "fragmento funcional", con respecto a los anticuerpos, hace referencia a fragmentos Fv, F(ab) y F(ab')_{2}.

Un fragmento "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión al antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena ligera y de cadena pesada en asociación estrecha, no-covalente (dímero V_{H}-V_{L}). En esta configuración, interactúan las tres CDRs de cada dominio variable para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. En conjunto, las seis CDRs proporcionan al anticuerpo especificidad de unión por el antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente las tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que la de todo el sitio de unión.

El fragmento Fab (también denominado como F(ab)) también contiene el dominio constante de cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab', en el que el residuo(s) de cisteína(s) de los dominios constantes tiene un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab') se producen mediante corte del enlace disulfuro en las cisteínas de la bisagra del producto de digestión con pepsina de F(ab')_{2}. Los acoplamientos químicos adicionales de fragmentos de anticuerpo son conocidos por los expertos en la materia.

Las cadenas ligeras de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden asignarse claramente a uno de los dos tipos distintos, denominados kapa (\kappa) y lambda (\lambda), según las secuencias aminoacídicas de sus dominios constantes.

Dependiendo de las secuencias aminoacídicas del dominio constante de sus cadenas pesadas, las "inmunoglobulinas" se pueden incluir en clases distintas. Existen por lo menos cinco (5) clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y algunas de éstas pueden además dividirse en subclases (isotipos), p.ej., IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de cadenas pesadas que corresponden con las distintas clases de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. La inmunoglobulina preferida para utilizar con la presente invención es la inmunoglobulina E.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza, aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpo individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que suceden y pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos a un sitio antigénico único. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes distintos (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales presentan la ventaja de que pueden ser sintetizados mediante cultivo de hibridomas, sin contaminarse con otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, obtenido a partir de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como una producción del anticuerpo que necesite de un procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden producirse por el procedimiento del hibridoma, descrito en primer lugar por Kohler y Milstein, Nature 256, 495 (1975), o pueden realizarse mediante procedimientos recombinantes, p.ej., tal como se describe en la patente americana U.S.P. 4.816.567. Los anticuerpos monoclonales para utilizar con la presente invención pueden también aislarse de librerías de anticuerpos de fagos utilizando técnicas descritas en Clackson y col., Nature 352:624-628 (1991), así como también en Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales de lapresente invención incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie en particular, o pertenecientes a una clase o subclase determinada de anticuerpo, mientras que la(s) cadena(s) restante(s)es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, al igual que los fragmentos de dichos anticuerpos siempre y cuando presenten la deseada actividad biológica (USP 4.816.567); Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855 (1984).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no-humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de lo mismo (como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no-humana. Mayoritariamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor), en donde se reemplazan residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor por residuos de una CDR de una especie no-humana (anticuerpo donante) como el ratón, la rata o el conejo, con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. A veces, los residuos de la región de entramado Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no-humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se hallen ni en el anticuerpo receptor, ni en las secuencias de entramado o CDR importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar y mejorar posteriormente la realización del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todos los dominios variables o por lo menos uno y típicamente dos, en el que todas o esencialmente todas las regiones CDR corresponden con las de una inmunoglobulina no-humana y todas o esencialmente todas las regiones FR corresponden con las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En el caso óptimo, el anticuerpo humanizado también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver: Jones y col., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann y col., Nature 332, 323-329 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Bioll. 2, 593-596 (1992).

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. En general, el polipéptido Fv comprende además un engarce polipeptídico entre los dominios VH y VL, que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión con el antígeno. Para una revisión sobre sFV, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer Verlag, New York, pág. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" hace referencia a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión al antígeno. Dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Utilizando un engarce que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear así dos sitios de unión antigénicos. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en, por ejemplo, la patente europea EP 404.087; la patente internacional WO 93/11161 y en Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

El término "fragmento funcional o análogo" de un anticuerpo es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa común con un anticuerpo de tamaño completo. Por ejemplo, un fragmento funcional o un análogo de un anticuerpo anti-IgE es uno que pueda unirse a una inmunoglobulina IgE de tal forma que evite o reduzca esencialmente la capacidad de dicha molécula para unirse al receptor de alta afinidad, Fc\varepsilonRI.

Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" hacen referencia a todos los L-\alpha-aminoácidos que se producen de forma natural. Los aminoácidos se identifican tal como se describe más adelante en la sección A. Preparación de anticuerpos: (iv) Generación de anticuerpos mutantes. El término "variante de aminoácido" hace referencia a moléculas con alguna diferencia en sus secuencias aminoacídicas comparadas con las secuencias aminoacídicas nativas.

Las variantes "de sustitución" son aquellas en las que por lo menos se ha retirado un residuo aminoacídico de una secuencia nativa y en su lugar se ha colocado un residuo aminoacídico distinto en la misma posición. Las sustituciones pueden ser sencillas, si únicamente se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, si se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula. Las variantes "insercionales" son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a una posición aminoacídica en particular en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido quiere decir conectado al grupo funcional \alpha-carboxilo o \alpha-amino del aminoácido. Las variantes "delecionales" son aquellas con uno o más aminoácidos eliminados en la secuencia aminoacídica nativa. En general, las variantes delecionales tendrán uno o dos aminoácidos delecionados en una región determinada de la molécula.

Los términos "célula" o "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan aquí indistintamente y todas estas denominaciones incluyen la progenie. Se sobreentenderá que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en contenido de DNA, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene las mismas funciones o propiedades biológicas que las rastreadas en las células transformadas originalmente.

Las "células huésped" utilizadas en la presente invención son generalmente huéspedes procariotas o eucariotas. Ejemplos de células huéspedes adecuados se describen en la Sección B. Vectores. Células huéspedes y procedimientos recombinantes: (vii) Selección y transformación de células huéspedes.

La "transformación" significa la introducción de DNA en un organismo a fin de que el DNA sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica.

La "transfección" hace referencia a la incorporación de un vector de expresión por una célula huésped, independientemente de que se expresen o no las secuencias codificantes.

Los términos "célula huésped transfectada" y "transformada" hacen referencia a la introducción de DNA en una célula. La célula se denomina "célula huésped" y puede ser procariota o eucariota. Las células huéspedes procariotas incluyen diversas cepas de E. coli. Las células huéspedes eucariotas típicas son las de mamífero, como las células de ovario de hámster chino o las de origen humano. La secuencia de DNA introducida puede proceder de la misma especie que la célula huésped o de una especie distinta, o puede ser una secuencia de DNA híbrido, que contenga DNA foráneo y DNA homólogo.

Los términos "vector de expresión replicable" y "vector de expresión" hacen referencia a un fragmento de DNA, generalmente de cadena doble, que puede tener insertado un fragmento de DNA foráneo. El DNA foráneo se define como DNA heterólogo, o sea un DNA que no se halla de forma natural en la célula huésped. El vector se utiliza para transportar el DNA foráneo o heterólogo a una célula huésped adecuada. Una vez en la célula húesped, el vector se puede replicar de forma independiente al DNA cromosómico del huésped y pueden generarse varias copias del vector y de su DNA insertado (foráneo).

El término "vector" hace referencia a una construcción de DNA que contiene una secuencia de DNA que está unida operativamente a una secuencia control adecuada capaz de efectuar la expresión del DNA en un huésped adecuado. Dichas secuencias control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operativa opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia codificante adecuada para los sitios de unión del mRNA a ribosomas y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula fágica, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformados en un huésped adecuado, el vector puede replicarse y funcionar de forma independiente del genoma del huésped, o puede en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En las especificaciones presentes, "plásmido" y "vector" son a veces intercambiables, ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vector que ejerzan una función equivalente, los cuales son bien conocidos en la materia. Los vectores de expresión típicos para la expresión en un cultivo de células de mamífero, por ejemplo, están basados en pRK5 (patente europea 307.247), pSV16B (patente internacional WO 91/08291) y pVL1392 (Pharmigen).

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivo que es útil para la liberación de un fármaco (como los anticuerpos mutantes descritos en la presente invención y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se distribuyen normalmente en una formación de bicapa, similar a la distribución lipídica de la membrana biológica.

El término "secuencias control" hace referencia a secuencias de DNA para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo en particular. La secuencia control que es adecuada para los procariotas, por ejemplo, incluye un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas. Las células eucariotas conocidas utilizan promotores, señales de poliadenilación y secuencias intensificadoras de la transcripción.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante que esté normalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta tanto en la forma o disposición de la que se halla normalmente en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen en consecuencia de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada también incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que normalmente expresan el anticuerpo si, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se halla en una localización cromosómica distinta a la de las células naturales.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se lo coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo un gen y una secuencia(s) reguladoras que esté conectada de dicha manera para permitir la expresión del gen cuando se unan las moléculas adecuadas (p.ej., proteínas activadoras transcripcionales) con la secuencia(s). Por ejemplo, el DNA de una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al DNA de un polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o secuencia intensificadora de la transcripción está unida operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de DNA que se unen son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en la misma fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en dianas de restricción adecuadas. Si estas dianas no existen, se utilizan adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o engarces de acuerdo con la práctica convencional.

El término "tratamiento" hace referencia al tratamiento terapéutico y al profiláctico o a las medidas preventivas. Los necesitados de tratamiento incluyen los que presentan el trastorno, así como aquellos en los que la enfermedad se ha de prevenir.

Un "trastorno" es cualquier condición que podría beneficiarse del tratamiento con el polipéptido. Esto incluye los trastornos o enfermedades crónicos y agudos, incluyendo las condiciones patológicas, que predisponen al mamífero a dicho trastorno en cuestión.

El término "agente inmunosupresor" tal como se utiliza aquí para la terapia adjunta hace referencia a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del huésped en el que se ha trasplantado un injerto. Esto podría incluir sustancias que suprimen la producción de citoquinas, regulan negativamente o suprimen la expresión del propio antígeno, o enmascaran los antígenos MHC. Ejemplos de dichos agentes incluyen las pirimidinas 2-amino-5-aril sustituidas (ver la patente U.S.P. 4.665.077), la azatioprina (o la ciclosfosfamida, en el caso de reacción adversa a la azatioprina); la bromocriptina; el glutaraldehido (que enmascara los antígenos MHC, tal como se describe en la patente americana U.S. 4.120.649); los anticuerpos anti-idiotípicos para los antígenos MHC y los fragmentos NHC; la ciclosporina A; los esteroides como los glucocorticoides, p.ej., la prednisona, la metilprednisona y la dexametasona; la citoquina o los antagonistas del receptor de la citoquina incluyendo los anticuerpos anti-interferón-\gamma, -\beta o -\alpha,los anticuerpos anti-factor-\alpha de necrosis tumoral; los anticuerpos anti-factor-\beta de necrosis tumoral; los anticuerpos anti-interleucina-2 y los anticuerpos anti-IL-2-receptor; los anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocítica heteróloga; los anticuerpos pan-T, preferentemente anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; el péptido soluble que contiene un dominio de unión LFA-3 (patente internacional WO 90/08187 publicada el 26 de julio de 1990); la estreptoquinasa; el TGF-\beta;la estreptodornasa; el RNA o el DNA del huésped; FK506; RS-61443; la desoxipergualina; la rapamicina; el receptor de célula T (patente americana U.S. 5.114.721); los fragmentos del receptor de célula T (Offner y col., Science 251:430-432 (1991); la patente internacional WO 90/11924; y WO 91/01133); y los anticuerpos del receptor de célula T (patente europea EP 340.109) como el T10B9. Estos agentes se administran al mismo tiempo o por separado a partir del anticuerpo CD11a y se utilizan a igual o inferior dosis que la indicada en la materia. El agente inmunosupresor adicional preferido dependerá de muchos factores, incluyendo el tipo de trastorno a tratar, el tipo de trasplante a realizar, así como del historial del paciente, pero una preferencia general es que el agente se seleccione a partir de la ciclosporina A, un glucocorticosteroide (más preferentemente la prednisona o la metilprednisona), el anticuerpo monoclonal OKT-3, la azatioprina, la bromocriptina, la globulina anti-linfocítica heteróloga, o una mezcla de los anteriores.

Los términos "cáncer" y "canceroso" hacen referencia o describen la condición fisiológica de mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cánceres incluyen pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más específicos de dichos cánceres incluyen el cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorectal, el carcinoma endometrial, el carcinoma de glándula salival, el cáncer de riñón, el cáncer renal, el cáncer de próstata, el cáncer vulvar, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "mamífero" con propósitos de tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo el hombre, los animales domésticos y de granja, los primates no humanos, los animales del zoo, de competición, o los de compañía, como los perros, caballos, gatos, vacas, etc.

El término "etiquetado con un epitopo" cuando se utiliza aquí hace referencia a un polipéptido fusionado con una "etiqueta epitópica". Dicho polipéptido etiquetado epitópicamente tiene los suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el que pueda generarse un anticuerpo, siendo lo suficientemente corto para no interferir con la actividad del polipéptido. La etiqueta epitópica también es lo bastante única para que el anticuerpo dirigido contra éste no reaccione de forma cruzada con otros epitopos. En general, un polipéptido etiquetado epitópicamente tiene por lo menos 6 residuos aminoacídicos, por lo general entre 8-50 residuos de aminoácidos (preferentemente entre 9-30 residuos). Ejemplos incluyen el polipéptido con la etiqueta HA del virus de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field y col., Mol. Cell Biol. 8:2159-2165 (1988)); la etiqueta de c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 contra dichos epitopos (Evan y col., Mol. Cell Biol 5(12):3610-3616 (1985)); y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo (Paborsiky y col., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). En algunas realizaciones, la etiqueta epitópica es un "epitopo de unión al receptor salvaje".

Tal como se utiliza aquí, el término "epitopo de unión al receptor salvaje" hace referencia a un epitopo de la región Fc de una molécula de IgG (p.ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de incrementar in vivo la vida media en suero de la molécula de IgG.

El término "agente citotóxico" tal como se utiliza aquí hace referencia a una sustancia que inhibe o evita el funcionamiento de las células y/o causa la destrucción de las mismas. El término pretende incluir los isótopos radiactivos (p.ej., I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), los agentes quimioterapéuticos y las toxinas como las toxinas activas enzimáticamente de bacterias, hongos, plantas o animales, o fragmentos de lo mismo.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico de utilidad en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, la doxorubicina, el 5-fluorouracilo, la citosina arabinósido ("Ara-C"), la ciclofosfamida tiotepa, el taxotero (docetaxel), el busulfan, la citoxina, el taxol, el metrotexato, la cisplatina, el melfalán, la vinblastina, la bleomicina, el etoposido, la ifosfamida, la mitomicina C, la mitoxantrona, la vincristina, la vinorelbina, la carboplatina, el tenipósido, la daunomicina, la carminomicina, la aminopterina, la dactinomicina, la mitomicina, las esperamicinas (ver la patente americana U.S. 4.675.187), el melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas.

El término "profármaco" tal como se utiliza en esta solicitud hace referencia a un precursor o a una forma derivada de una sustancia activa farmacéuticamente, que es menos citotóxica para las células tumorales comparada con el fármaco parental y es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse en la forma parental más activa. Ver, p.ej., Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14 pág. 375-382, 615 Meeting, Belfast (1986) y Stella y col., (ed.), "Prodrugs. A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y col., (ed.), pag. 247-267, Human Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a los profármacos que contienen fosfato, tiofosfato, sulfato o un péptido, a los profármacos modificados con D-aminoácidos, los glicosilados, los que contienen \beta-lactama, los que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o fenilacetamida sustituida, los profármacos de 5-fluorocitosina y otros 5-fluorouridina, que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico y más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden convertirse en una forma profármaco para utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

El término "marca" cuando se utiliza aquí, hace referencia a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo. La marca puede ser por ella misma detectable (p.ej., marcas radioisotópicas o fluorescentes) o en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable.

Tal como se utiliza aquí, "fase sólida" significa una matriz no acuosa en la que puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Ejemplo de fases sólidas abarcadas aquí incluyen las formadas parcialmente o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio poroso controlado), polisacáridos (p.ej., agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En algunas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (p.ej., una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, como las descritas en la patente americana U.S. 4.275.149.

Tal como se utiliza aquí, el anticuerpo anti-IgE humana hace referencia a un anticuerpo que se une a la IgE humana de forma que inhibe o reduce esencialmente la unión de dicha IgE con el receptor de alta afinidad, Fc\varepsilonRI. Preferentemente, este anticuerpo anti-IgE es el E-25.

Tal como se utiliza aquí, el término "trastorno mediado por IgE" hace referencia a una condición o enfermedad que se caracteriza por la sobreproducción de y/o hipersensibilidad a la inmunoglobulina IgE. Específicamente, debería interpretarse que incluye las condiciones asociadas con la hipersensibilidad anafiláctica y las alergias atópicas, incluyendo por ejemplo: el asma, la rinitis alérgica y la conjuntivitis (fiebre del heno), el eczema, la urticaria y las alergias alimentarias. Sin embargo, también se abarca en el ámbito de dicho término la condición fisiológica grave de choque anafiláctico, causada generalmente por picaduras de abeja o serpiente o por medicación parenteral.

Tal como se utiliza aquí, ``maduración de la afinidad utilizando expresión de fagos (AMPD) hace referencia a un proceso descrito por Lowman y col., Biochemistry 30(45).10832-10838 (1991), ver también Hawkins y col., J. Mol. Biol. 254:889-896 (1992). Aunque no está estrictamente limitado a la descripción siguiente, este proceso puede describirse de forma resumida como: en primer lugar, se mutan diversos sitios de regiones hipervariables (p.ej., 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones aminoacídicas posibles en cada sitio. A continuación, los anticuerpos mutantes, así generados, se expresan de forma monovalente a partir de partículas de fagos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Y por último, se pueden seleccionar los fagos que expresen los diversos mutantes mediante varias rondas de selección de su unión, seguido por el aislamiento y secuenciación de los mutantes que expresan una alta afinidad de unión. El procedimiento también se describe en la patente internacional WO 92/09690, publicada el 11 de junio de 1992. Un procedimiento modificado que implica la expresión del conjunto de afinidad se describe en Cunningham, B.C. y col., EMBO J. 13(11), 2508-1515
(1994).

De este modo, se proporciona un procedimiento para la selección de polipéptidos de unión que comprende: a) la construcción de un vector de expresión replicable que comprende un primer gen que codifica para un polipéptido, un segundo gen que codifica por lo menos para una porción de una proteína de la cubierta del fago natural o de tipo salvaje, en donde el primer y segundo gen son heterólogos y unido operativamente hay un elemento regulador de la transcripción, con lo que se forma un gen de fusión que codifica para una proteína de fusión; b) mutar el vector en una o más posiciones seleccionadas dentro del primer gen, con lo que se forma una familia de plásmidos relacionados; c) transformar las células huésped adecuadas con los plásmidos; d) infectar las células huésped transformadas con un fago auxiliar que tenga un gen que codifique para la proteína de la cubierta del fago; e) cultivar las células huésped infectadas y transformadas en condiciones adecuadas para la formación de partículas de fagémidos recombinantes que contengan por lo menos una porción del plásmido y sean capaces de transformar el huésped, y ajustar las condiciones de modo que solo una cantidad pequeña de partículas de fagémidos exprese más de una copia de la proteína de fusión en su superficie; f) contactar las partículas de fagémidos con una molécula diana, para que por lo menos una parte de las partículas del fagémido se una a la molécula diana; y g) separar las partículas del fagémido que se unan de las que no lo hagan. Preferentemente, el procedimiento comprende además la transformación de células huésped adecuadas con partículas de fagémidos recombinantes que se unen a la molécula diana y la repetición de las etapas d) a g) una o más veces.

Alternativamente, el procedimiento incluye los polipéptidos compuestos de más de una subunidad en donde el vector de expresión replicable, quecomprende un elemento regulador de la transcripción unido operativamente al DNA que codifica para la subunidad de interés, se fusiona con la proteína de la cubierta del fago.

Tal como se utiliza aquí, el término "librería de fagos de anticuerpos" hace referencia a la librería de fagos utilizada en la maduración del proceso de afinidad descrito anteriormente y por Hawkins y col., J. Mol. Biol. 254:889-896 (1992) y en Lowman y col., Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991). Cada librería comprende una región hipervariable (p.ej., 6-7 sitios) para la que se generan todas las sustituciones aminoacídicas posibles. Los mutantes de anticuerpos así generados se expresan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula y se expresan en el exterior del fago.

Tal como se utiliza aquí, la "temperatura ambiente" debería ser de unos 23-25ºC.

Tal como se utiliza aquí, "polipéptido de unión" se refiere a cualquier polipéptido que se une con una afinidad seleccionable a una molécula diana. Preferentemente, el polipéptido será una proteína que contenga de forma más preferente unos 100 residuos de aminoácidos. Típicamente, el polipéptido será una hormona o un anticuerpo o un fragmento de lo mismo.

Tal como se utiliza aquí, "alta afinidad" significa una afinidad constante (Kd) de <10^{-5} M y preferentemente <10^{-7} M en condiciones fisiológicas.

Tal como se utiliza aquí, "molécula diana" significa cualquier molécula, no necesariamente una proteína, para la cual es deseable producir un anticuerpo o ligando. Preferentemente, sin embargo, la diana será una proteína y más preferentemente la diana será un antígeno. Sin embargo, los receptores como los receptores de hormonas deberían estar incluidos dentro del ámbito de este término.

Tal como se utiliza aquí, toda numeración de residuos de aminoácidos de inmunoglobulinas, incluyendo la numeración de aminoácidos de péptidos que corresponden con porciones específicas de IgE, moléculas de IgE mutantes y moléculas de IgE quiméricas que aparecen aquí se realiza de acuerdo con el sistema de numeración de residuos de aminoácidos de inmunoglobulinas de Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD 1987).

Modos para llevar a cabo la invención I. Procedimiento para mejorar la afinidad por la molécula diana A. Identificación de residuos isomerizables de aspartil

En la práctica de la invención, la identificación de residuos de aspartil isomerizables con tendencia a la isomerización puede realizarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia. Por ejemplo, Cacia y col., Biochemistry 35:1897-1903 (1996), describen un proceso en donde el anticuerpo anti-IgE (que contiene los residuos -Asp-Gly-) se incuba a 37ºC durante 21 días. La identificación de Asp-Gly isomerizado se efectuó mediante cromatografía y análisis de espectrometría de masas de fragmentos tratados y no tratados con proteasa. Ya que se ha publicado que la isomerización también sucede con residuos de asparraguinil (T. Geiger y S. Clarke, J. Biol. Chem. 262(2), 785-794 (1987), la presente invención puede también realizarse preferentemente para la evaluación sistemática y mejoramiento de polipéptidos que contengan residuos de asparraguinil.

B. Selección de residuos alternativos que mejoran la afinidad por la molécula diana

Están disponibles muchas técnicas que permiten a un experto en la materia la optimización de la afinidad del receptor. En general, todas estas técnicas implican la sustitución de diversos residuos de aminoácidos en el sitio de interés, seguido por un análisis de rastreo de la afinidad del receptor del polipéptido mutante. Una técnica preferida para la utilización con la presente invención es la maduración de la afinidad utilizando la expresión de fagos (Hawkins y col., J. Mol. Biol. 254:889-896 (1992); Lowman y col., Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991)). En resumen, se mutan algunos sitios de regiones hipervariables (p.ej., 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones aminoacídicas posibles en cada sitio. Los mutantes de anticuerpos así generados se expresan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Los fagos que expresan los diversos mutantes se pueden seleccionar mediante varias rondas de selección de la unión, seguido por el aislamiento y la secuenciación de los mutantes que expresen una alta afinidad de unión.

El procedimiento de selección de nuevos polipéptidos de unión utiliza preferentemente una librería de polipéptidos relacionados estructuralmente. La librería de polipéptidos relacionados estructuralmente, fusionada con una proteína de la cubierta del fago, se produce mediante mutagénesis y preferentemente, se expresa una copia de cada polipéptido relacionado en la superficie de la partícula del fagémido que contiene el DNA que codifica para el polipéptido. Estas partículas de fagémido se contactan a continuación con una molécula diana y aquellas partículas que tienen la mayor afinidad para la diana se separan de las que tienen menor afinidad. Las partículas que se unen con una alta afinidad se amplifican mediante infección de un huésped bacteriano y se repite la etapa de unión competitiva. El proceso se repite hasta obtener los polipéptidos de la afinidad deseada.

Alternativamente, también se pueden utilizar fagos multivalentes (McAcaffery y col., (1990) Nature 348, 552-554; Clackson y col., (1991), Nature 352, 624-628) para expresar mutaciones puntuales aleatorias (generadas mediante la utilización de una polimerasa de DNA propensa a errores) para generar una librería de fragmentos de anticuerpo de fagos, que a continuación podría cribarse por su afinidad por el antígeno. Hawkins y col., (1992) J. Mol. Biol. 254:889-896.

Preferentemente durante el proceso de maduración de la afinidad, el vector de expresión replicable se halla bajo el control estrecho del elemento regulador de la transcripción y las condiciones de cultivo se ajustan de modo que la cantidad, o número de partículas de fagémidos que expresen más de una copia de la proteína de fusión en la superficie de la partícula sea inferior a aproximadamente el 1%.Preferentemente, la cantidad de partículas de fagémidos que expresen más de una copia de la proteína de fusión debe ser inferior al 10% de la cantidad de partículas de fagémido que expresen una sola copia de la proteína de fusión. Más preferentemente, la cantidad ha de ser inferior al 20%.

En general, en el procedimiento de la presente invención, el vector de expresión contendrá además una secuencia señal secretora fusionada al DNA que codifica para cada subunidad del polipéptido y el elemento regulador de transcripción será un sistema de promotor. Los sistemas de promotores preferidos se seleccionan de entre: los promotores LacZ, \lambda_{PL}, TC, T7 polimerasa, triptófano y de la fosfatasa alcalina y combinaciones de lo mismo.

Asimismo, el primer gen codificará para una proteína de mamífero, siendo preferentemente un anticuerpo anti-IgE. Ejemplos de anticuerpos adicionales se muestran en la sección II.A. La preparación de anticuerpos, (vi) anticuerpos multiespecíficos (a tener en cuenta que los anticuerpos no necesitan ser multiespecíficos). Los polipéptidos adicionales incluyen la hormona de crecimiento humano (hGH), la hormona de crecimiento N-metionil humana, la hormona de crecimiento bovina, la hormona tiroidea, la cadena A de la insulina, la cadena B de la insulina, la pro-insulina, la cadena A de la relaxina, la cadena B de la relaxina, la pro-relaxina, las hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (THS) y la hormona leutinizante (LH), los receptores hormonales glicoproteicos, la calcitonina, el glucagón, el factor VIII, el surfactante de pulmón, la uroquinasa, el activador del plasminógeno de tipo tisular humano (t-PA), la bombesina, el factor IX, la trombina, el factor de crecimiento hematopoyético, el factor de necrosis tumoral alfa y beta, la encefalinasa, la albúmina sérica humana, la sustancia inhibidora mülleriana, el péptido asociado a gonadotrofinas, una proteína microbiana como la beta-lactamasa, la proteína del factor tisular, la inhibina, la activina, el factor de crecimiento del endotelio vascular, los receptores de hormonas o de factores de crecimiento, la integrina, la trombopoyetina, la proteína A o D, los factores reumatoides, los factores de crecimiento neuronal como el NGF-\beta, el factor de crecimiento plaquetario, los factores de crecimiento transformantes (TGF) como el TGF-alfa y el TGF-beta, el factor I y II de crecimiento similar a la insulina, las proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, el CD-4, la DNasa, el péptido asociada a la latencia, la eritropoyetina, los factores osteoinductivos, los interferones como el interferón-alfa, -beta, -gamma, los factores estimulantes de la formación de colonias (CSFs) como el M-CSF, GM-CSF y el G-CSF, las interleucinas (Ils) como la IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, la superóxido dismutasa, el factor acelerador de la desintegración, el antígeno viral, las proteínas de la cubierta de VIH como la GP120, GP140, los péptidos natriuréticos atriales A, B o C, las inmunoglobulinas y los fragmentos de cualquiera de las anteriores proteínas mencionadas.

Preferentemente, el primer gen codificará para un polipéptido de uno o más subunidades que contienen más de 100 residuos de aminoácidos aproximadamente y que se plegarán para formar una pluralidad de estructuras secundarias rígidas que expresan una pluralidad de aminoácidos capaces de interaccionar con la diana. Preferentemente, el primer gen estará mutado en los codones correspondientes con únicamente los aminoácidos capaces de interaccionar con la diana, de modo que se mantendrá la integridad de las estructuras secundarias rígidas.

Normalmente, el procedimiento de la presente invención utilizará un fago auxiliar seleccionado de entre: M13KO7, M13R408, M13-VCS y PhiX174. El fago auxiliar preferido es M13KO7 y la proteína de la cubierta preferida es la proteína de la cubierta del gen II del fago M13. El huésped preferido es E. coli y las cepas deficientes en proteasas de E. coli. Se han detectado nuevas variantes de hGH seleccionadas por el procedimiento de la presente invención. Los vectores de expresión de fagémidos se construyeron con un codón de terminación suprimible, localizado funcionalmente entre los ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido y la proteína de la cubierta del fago.

1. Elección de polipéptidos para la expresión en la superficie de un fago

Se utilizan ciclos repetidos de selección del polipéptido para seleccionar una unión de afinidad cada vez superior por el fagémido, seleccionando múltiples cambios de aminoácidos que a su vez se seleccionan mediante múltiples ciclos de selección. Después de un primera tanda de selección de fagémidos, implicando una primera región de selección de aminoácidos en el ligando o el polipéptido anticuerpo, se llevan a cabo varias tandas adicionales de selección de fagémidos en otras regiones o aminoácidos del ligando. Los ciclos de selección del fagémido se repiten hasta lograr las propiedades de afinidad deseadas. Para ilustrar este proceso, en el Ejemplo 4 se detalla la expresión de fagos en diversos ciclos, la afinidad agrupada, la combinación de mutaciones de CDRs distintos, etc.

De lo anterior, se apreciará que los residuos aminoacídicos que forman el dominio de unión del polipéptido no estarán unidos secuencialmente y pueden hallarse en subunidades diferentes del polipéptido. Es decir, el dominio de unión se traza con una estructura secundaria particular en el sitio de unión y no en la estructura primaria. En consecuencia, las mutaciones se introducirán generalmente en codones que codifiquen para aminoácidos dentro de una estructura secundaria determinada, en sitios dirigidos lejos del interior del polipéptido para tener el potencial de interactuar con la diana.

Sin embargo, no hay necesidad de que el polipéptido elegido como ligando o anticuerpo para una molécula diana se una normalmente con dicha diana. En consecuencia, por ejemplo, puede elegirse como ligando para el receptor FSH una hormona glicoproteica como la TSH y en el procedimiento de la presente invención, se utiliza una librería de moléculas TSH mutantes para producir candidatos de nuevos fármacos.

Esta invención contempla en consecuencia cualquier polipéptido que se una a una molécula diana, en particular los anticuerpos. Los polipéptidos preferidos son aquellos que tienen una utilidad farmacéutica. Ejemplos de anticuerpos son los citados en la sección II.A. La preparación de anticuerpos (iv) anticuerpos multiespecíficos (a remarcar que los anticuerpos no necesitan ser multiespecíficos). Los polipéptidos preferidos incluyen: la hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana N-metionil y la hormona de crecimiento bovino; la hormona paratiroide; la hormona estimulante del tiroides; la hormona tiroidea; la cadena A de la insulina; la cadena B de la insulina; la prorelaxina; el péptido asociado con la gonatropina murina; una proteína microbiana, como la beta-lactamasa; la proteína del factor tisular; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; los receptores de las hormonas o factores de crecimiento; la integrina; la trombopoyetina; la proteína A o la D; los factores reumatoides; el factor de crecimiento neuronal como el NGF-\beta; el factor de crecimiento derivado de plaquetas; el factor de crecimiento de fibroblastos como el aFGF y el bFGF, el factor de crecimiento epitelial; el factor de crecimiento transformante (TGF) como el TGF-alfa y el TGF-beta; el factor de crecimiento similar a la insulina -I y -II; las proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; CD-4; DNasa; el péptido asociado a la latencia; la eritropoyetina; los factores osteoinductores, como por ejemplo, una porción de la cubierta de VIH; las inmunoglobulinas; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente. Además, se pueden sustituir, insertar, o delecionar uno o más residuos aminoacídicos predeterminados en el polipéptido, por ejemplo, para producir productos con propiedades biológicas mejoradas. Además, se incluyen fragmentos de estos polipéptidos, especialmente los fragmentos activos biológicamente. Polipéptidos todavía más preferidos de la presente invención son la hormona de crecimiento humana y los péptidos natriuréticos atriales A, B y C, la endotoxina, la subtilisina, la tripsina y otras serina proteasas.

También son preferidos los polipéptidos como las hormonas, que pueden definirse como cualquier secuencia aminoacídica producida en un primera célula que se une específicamente a un receptor en el mismo tipo celular (hormonas autocrinas), o en un segundo tipo celular (no-autocrinas), y están causadas por una respuesta fisiológica característica de la célula portadora del receptor. Entre dichas hormonas polipeptídicas se hallan las citocinas, las linfocinas, las hormonas neurotróficas y las hormonas polipeptídicas adenohipofisarias como hormonas de crecimiento, la prolactina, el lactógeno placental, la hormona luteinizante, la hormona estimulante del folículo, la \beta-lipotropina, la \gamma-lipotropina y las endorfinas; la hormona inhibidora de la liberación hipotalámica como los factores de liberación de conicotropina, la hormona inhibidora de liberación de la hormona de crecimiento, el factor de liberación de la hormona de crecimiento; y otras hormonas polipeptídicas como los péptidos A, B, o C natriurétricos atriales.

2. Obtención de un primer gen (Gen 1) que codifica para el polipéptido deseado

El gen que codifica para el polipéptido deseado (p.ej. anticuerpo) puede obtenerse mediante procedimientos conocidos en la materia (ver, Sambrook y col., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Si la secuencia del gen es conocida, el DNA que codifica para el gen puede ser sintetizado químicamente (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)). Si la secuencia del gen no es conocida, o si el gen todavía no ha sido aislado, se puede clonar a partir de una librería de cDNA (generada a partir del RNA obtenido de un tejido adecuado en el que se exprese el gen deseado), o a partir de una librería de DNA genómica. A continuación, se aísla el gen utilizando una sonda adecuada. Para las librerías de cDNA, sondas adecuadas incluyen los anticuerpos monoclonales o policlonales (siempre que la librería de cDNA sea una librería de expresión), los oligonucleótidos y los cDNAs complementarios u homólogos o fragmentos de lo mismo que codifiquen para el mismo o un gen similar, los DNAs genómicos homólogos o los fragmentos de DNA y oligonucleótidos. El cribaje de la librería de cDNA o genómica con la sonda seleccionada se lleva a cabo utilizando los procedimientos estándares tal como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook y col., supra.

Un procedimiento alternativo para el aislamiento del gen que codifica para el polipéptido (p.ej., un anticuerpo) de interés es utilizar la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como se describe en la sección 14 de Sambrook y col., supra. Este procedimiento requiere la utilización de oligonucleótidos que se hibridarán con el gel de interés, con lo que por lo menos parte de la secuencia del DNA para este gen debe ser conocida con el fin de generar los oligonucleótidos.

Después de haber aislado el gen, éste puede insertarse en un vector aislado (preferentemente un plásmido) para su amplificación, tal como se describe en Sambrook y col., supra.

3. Construcción de vectores de expresión replicables

Aunque diversos tipos de vectores están disponibles y pueden utilizarse para practicar esta invención, son preferibles los vectores plasmídicos para su utilización en la presente invención, ya que pueden construirse con relativa facilidad y pueden amplificarse rápidamente. Los vectores plasmídicos contienen generalmente una gran variedad de componentes incluyendo el promotor, las secuencias señales, genes de selección fenotípica, sitios de origen de replicación y otros componentes necesarios conocidos por los expertos en la materia.

Los promotores más comúnmente utilizados en vectores procariotas incluyen el sistema del promotor de lac Z, el promotor pho A de la fosfatasa alcalina, el promotor \lambdaPL (promotor sensible a la temperatura), el promotor tac (un promotor híbrido trp-lac que se regula por el represor lac), el promotor del triptófano y el promotor del bacteriófago T7. Para descripciones generales de promotores ver la sección 17 de Sambrook y col., supra. Aunque éstos son los promotores más comúnmente utilizados, también se pueden utilizar otros promotores microbianos adecuados.

Los promotores preferidos para la práctica de la presente invención son aquellos que pueden regularse estrechamente, de modo que pueda controlarse la expresión del gen de fusión. Si la expresión es incontrolada, se producen copias múltiples de la proteína de fusión en la superficie del fagémido, con lo que existirían múltiples puntos de unión del fagémido con la diana. Esta unión en múltiples puntos, también denominada "avidez" o "efecto quelante" se cree que da como resultado la selección de polipéptidos falsos de "elevada afinidad", causada por las copias múltiples de la proteína de fusión expresadas en la partícula del fagémido, que se hallan en estrecha proximidad unas con otras de tal forma que "quelan" la diana. Cuando ocurren puntos múltiples de unión, la Kd efectiva o aparente puede ser tan alta como el producto individual de las Kds para cada copia de la proteína de fusión expresada.

Mediante una estrecha regulación de la expresión de la proteína de fusión se consigue que una cantidad mínima, es decir, inferior a aproximadamente el 1% de partículas de fagémidos contengan copias múltiples de la proteína de fusión. De este modo, se supera el efecto "quelante", permitiendo la selección exacta de polipéptidos de afinidad elevada. En consecuencia, dependiendo del promotor, las condiciones de cultivo del huésped se ajustan para maximizar el número de partículas de fagémidos que contienen una copia única de la proteína de fusión y minimizar así el número de partículas de fagémidos que contienen copias múltiples de la proteína de fusión.

Los promotores preferidos utilizados para la práctica de la presente invención son el promotor de lac Z y el promotor pho A. El promotor lac Z se regula mediante laproteína represora de lac, lac i, y en consecuencia la transcripción del gen de fusión puede controlarse mediante manipulación del nivel de la proteína represora de lac. Como ejemplo, el fagémido que contiene el promotor lac Z se crece en una cepa celular que contiene una copia del gen represor lac i, un represor para el promotor lac Z. Ejemplos de cepas celulares que contienen el gen lac i incluyen la JM 101 y la XL-blue-1. Alternativamente, la célula huésped puede cotransfectarse con un plásmido que contenga el represor lac i y el promotor lac Z. Ocasionalmente, se utilizan ambas técnicas simultáneamente, es decir, las partículas de fagémidos que contienen el promotor lac Z se crecen en cepas celulares que contienen el gen lac i y las cepas celulares se cotransfectan con un plásmido que contiene los genes lac Z y lac i. Generalmente, cuando se desea expresar un gen, se añade un inductor como el isopropiltiogalactosidasa (IPTG) al huésped transfectado. Sin embargo, en la presente invención, esta etapa se ha omitido para (a) minimizar la expresión de las fusiones del gen III por número de fagémidos y (b) para evitar el empaquetamiento ineficiente o incorrecto del fagémido causado por los inductores como el IPTG, incluso a bajas concentraciones. Típicamente, cuando no se añade inductor, el número de proteínas de fusión por partícula de fagémido es de aproximadamente 0,1 (número global de proteínas de fusión de las partículas de fagémidos). El promotor más preferido utilizado en la práctica de la presente invención es el pho A. Este promotor se cree que se regula por el nivel de fosfato inorgánico en la célula, actuando dicho fosfato celular negativamente sobre la actividad del promotor. En consecuencia, al agotarse el fosfato de las células, la actividad del promotor se incrementa. El resultado deseado es lograr que las células que crecen en un medio enriquecido en fosfato como el 2YT o el LB controlen la expresión del gen de fusión III.

Otro componente útil de los vectores utilizado para la práctica de la presente invención es una secuencia señal. Esta secuencia está localizada inmediatamente 5' al gen que codifica para la proteína de fusión, y por ello se transcribirá en el extremo amino-terminal de la proteína de fusión. Sin embargo, en algunos casos, se ha demostrado que la secuencia señal se localiza en posiciones distintas al 5' del gen que codifica la proteína a secretar. Estas secuencias dirigen la proteína al lugar donde se une por la membrana interna de la célula bacteriana. El DNA que codifica para la secuencia señal puede obtenerse como un fragmento de digestión por enzimas de restricción a partir de cualquier gen que codifique para una proteína que tenga una secuencia señal. Las secuencias señal procariotas adecuadas pueden obtenerse de genes que codifican, por ejemplo, para LamB u OMpF (Wong y col., Gene 68; 193 (1983)), MaIE, PhoA y otros genes. Una secuencia señal procariota preferida en la práctica de la presente invención es la secuencia señal II de la enterotoxina estable al calor de E. coli (STII), tal como se describe por Chang y col., Gene 55:189(1987)).

Otro componente de utilidad en los vectores utilizados en la práctica de la presente invención son los genes de selección fenotípica. Los genes de selección fenotípica característicos son los que codifican para proteínas que confieren resistencia a antibióticos a la célula huésped. Por ejemplo, el gen de la resistencia a la ampicilina (amp) y el de la resistencia a la tetraciclina (tet) se utilizan fácilmente con este propósito.

La construcción de vectores adecuados que comprendan los componentes anteriores, así como el gen que codifica para el polipéptido descrito (gen 1) se preparan utilizando los procedimientos del DNA recombinante, tal como se describe en Sambrook y col., supra. Los fragmentos de DNA aislados que se han de combinar para formar el vector se cortan, se transforman sus extremos en romos y se ligan juntos en un orden y orientación específicos para generar el vector deseado.

El DNA se corta utilizando la enzima o enzimas de restricción adecuadas en un tampón adecuado. En general, se utilizan aproximadamente 0,2-1 \mug de plásmido o de los fragmentos de DNA con aproximadamente 1-2 unidades de la enzima de restricción adecuada en unos 20 \mul de solución tampón. Los tampones, las concentraciones del DNA y los tiempos y temperaturas de incubación adecuados son las especificadas por los fabricantes de las enzimas de restricción. En general, son adecuados tiempos de incubación de aproximadamente 1-2 horas a 37ºC, aunque algunos enzimas requieren temperaturas superiores. Después de la incubación, las enzimas y otros componentes se eliminan mediante extracción de la solución de digestión con una mezcla de fenol y cloroformo y el DNA se recupera de la fracción acuosa mediante precipitación con etanol.

Para ligar los fragmentos de DNA y formar un vector funcional, los extremos de los fragmentos de DNA deben ser compatibles unos con otros. En algunos casos, los extremos serán directamente compatibles después de la digestión con endonucleasas. Sin embargo, puede ser necesario convertir en primer lugar los extremos protuberantes producidos por digestión con endonucleasas en extremos romos para hacerlos compatibles para la ligación. Para producir extremos romos, el DNA se trata con un tampón adecuado durante por lo menos 15 minutos a 15ºC con 10 unidades del fragmento Klenow de la DNA polimerasa I (Klenow) en presencia de cuatro desoxinucleótidos trifosfatos. El DNA se purifica a continuación mediante extracción fenol-cloroformo y precipitación con etanol.

Los fragmentos de DNA cortados pueden separarse por tamaño y seleccionarse mediante electroforesis de DNA en gel. El DNA puede migrarse en una electroforesis en una matriz de agarosa o de poliacrilamida. La selección de la matriz dependerá del tamaño de los fragmentos de DNA a separar. Después de la electroforesis, se extrae el DNA de la matriz mediante electroelución, o, si se utiliza agarosa de baja temperatura de fusión como matriz, mediante fusión de la agarosa y extracción del DNA de ésta, tal como se describe en las secciones 6.30-6.33 de Sambrook y col., supra.

Los fragmentos de DNA que se han de ligar juntos (digeridos previamente con las enzimas de restricción de modo que los extremos de cada fragmento a ligar sean compatibles) se ponen en solución en aproximadamente cantidades equimolares. La solución también contendrá ATP, tampón de ligasa y una ligasa como la T4 DNA ligasa a aproximadamente 10 unidades por cada 0,5 \mug de DNA. Si el fragmento de DNA se ha de ligar en el vector, éste se lineariza cortándolo con la endonucleasas(s) de restricción adecuada(s). El vector linearizado se trata a continuación con fosfatasa alcalina o fosfatasa intestinal vacuna. El efecto de la fosfatasa evita la propia ligación del vector durante la etapa de ligación.

Después de la ligación, el vector con el gen foráneo, ahora insertado, se transforma en una célula huésped adecuada. Las procariotas son las células huésped preferidas para esta invención. Las células huésped procariotas adecuadas incluyen la cepa de E. coli M101. La cepa 294 de E. coli K12 (ATCC número 31.446), la cepa W3110 (ATCC número 27.325), E. coli X1776 (ATCC número 31.537), E. coli XL-blue (Stratagene) y E. coli B; sin embargo, también pueden utilizarse otras muchas cepas de E. coli como HB101, NM522, NM538, NM539 y otras especies y géneros procariotas. Además de las cepas de E. coli citadas anteriormente, también se pueden utilizar como huéspedes bacilos como Bacillus subtilis, otras enterobacteriáceas como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y diversas otras especies de Pseudomonas.

La transformación de las células procariotas se logra fácilmente utilizando el procedimiento del cloruro cálcico, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra. Alternativamente, para transformar estas células puede utilizarse la electroporación (Neumann y col, EMBO J. 1:841 (1982)). Las células transformadas se seleccionan mediante crecimiento con un antibiótico, generalmente la tetraciclina (tet) o la ampicilina (amp), para el que se vuelven resistentes debido a la presencia de genes de resistencia tet y/o amp en el vector.

Después de la selección de las células transformadas, estas células se crecen en cultivo y se aísla el DNA plasmídico (u otro vector con el gen foráneo insertado). El DNA plasmídico puede aislarse utilizando procedimientos conocidos en la materia. Dos procedimientos adecuados son la preparación a pequeña escala de DNA y la preparación a gran escala del DNA, tal como se describe en las secciones 1.25-1.33 de Sambrook y col., supra. El DNA aislado puede purificarse mediante procedimientos conocidos en la materia como los descritos en la sección 1.40 de Sambrook y col., supra. Este DNA plasmídico purificado se analiza a continuación mediante mapeo por restricción y/o secuenciación del DNA. La secuenciación del DNA se realiza generalmente mediante el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam y col., Meth. Enzymol. 65:499 (1980).

4. Gen de fusión

La etapa de afinidad de fagos de la presente invención contempla la fusión del gen que contiene el polipéptido deseado (gen 1) con un segundo gen (gen 2), de modo que se genera un gen de fusión durante la transcripción. El gen 2 es típicamente un gen de una proteína de la cubierta de un fago, y preferentemente es la proteína de la cubierta del gen III del fago M13, o un fragmento de lo mismo. La fusión de los genes 1 y 2 se puede lograr insertando el gen 2 en un sitio determinado en un plásmido que contenga el gen 1, o insertando el gen 1 en un sitio determinado en un plásmido que contenga el gen 2.

La inserción de un gen en un plásmido requiere que el plásmido sea cortado en la localización precisa donde se ha de insertar el gen. En consecuencia, debe ser en una diana de endonucleasa de restricción (preferentemente una diana única de modo que el plásmido sólo se corte en una localización única durante la digestión con la endonucleasa de restricción). El plásmido se digiere, se elimina el fosfato libre mediante reacción con fosfatasa y se purifica tal como se describió anteriormente. A continuación se inserta el gen en este plásmido linearizado ligando los dos DNAs juntos. La ligación se logra si los extremos del plásmido son compatibles con los extremos del gen a insertar. Si se utilizan las mismas enzimas de restricción para cortar el plásmido y para aislar el gen a insertar, los DNAs se pueden ligar juntos directamente utilizando una ligasa como la T4 DNA ligasa de bacteriófago e incubando la mezcla a 16ºC durante 1-4 horas en presencia de ATP y tampón ligasa, tal como se describe en la sección 1.68 de Sambrook y col., supra. Si los extremos no son compatibles, en primer lugar deben convertirse en romos utilizando el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I o la T4 DNA polimerasa, requiriendo ambas los cuatro desorribonucleósidos trifosfatos para rellenar los extremos protuberantes del DNA digerido. Alternativamente, los extremos se pueden convertir en romos utilizando una nucleasa como la nucleasa S1 o la nucleasa del frijol, ya que ambas funcionan cortando las cadenas protuberantes del DNA. El DNA se religa a continuación utilizando una ligasa, tal como se describió anteriormente. En algunos casos, puede que no sea posible convertir los extremos del gen a insertar en romos, debido a que el marco de lectura de la región codificante se alteraría. Para solventar dicho problema, se pueden utilizar engarces nucleotídicos. Los engarces sirven como un puente para conectar el plásmido con el gen a insertar. Estos engarces se pueden realizar sintéticamente como DNA de cadena doble o de cadena sencilla utilizando procedimientos estándares. Los engarces tienen un extremo compatible con los extremos del gen a insertar; los engarces se ligan en primer lugar a este gen utilizando los procedimientos de ligación descritos anteriormente. El otro extremo de los engarces se diseña para ser compatible con el plásmido para la ligación. En el diseño de los engarces, se debe tener cuidado en no destruir el marco de lectura del gen a insertar o el marco de lectura del gen contenido en el plásmido. En algunos casos, puede ser necesario diseñar los engarces de modo que codifiquen para parte de un aminoácido, o que codifiquen para uno o más aminoácidos.

Entre el gen 1 y el gen 2, puede insertarse el DNA que codifica para un codón de terminalización, como los codones de terminalización UAG (ámbar), UAA (ocre) y UGA (ópalo), Microbiolgoy, Davis y col., Harper & Row, New York, 1980, pp. 237, 245-247 y 274). El codón de terminalización expresado en una célula huésped de tipo salvaje da como resultado la síntesis del producto proteico del gen 1 sin la proteína del gen 2 unida. Sin embargo, el crecimiento en una célula huésped supresora da como resultado la síntesis de cantidades detectables de la proteína fusionada. Dichas células huésped supresoras contienen un tRNA modificado para insertar un aminoácido en la posición del codón de terminalización del mRNA, dando como resultado la producción de cantidades detectables de la proteína de fusión. Dichas células huésped supresoras se han descrito y son bien conocidas, como por ejemplo la cepa supresora de E. coli (Bullock y col., BioTechnologies 5, 376-379 (1987)). Puede utilizarse cualquier procedimiento aceptable para colocar un codón de terminalización en el mRNA que codifique para el polipéptido de fusión.

El codón suprimible puede insertarse entre el primer gen que codifica para un polipéptido y un segundo gen que codifica para por lo menos una porción de una proteína de la cubierta del fago. Alternativamente, el codón de terminalización suprimible puede insertarse adyacente al sitio de fusión, reemplazando el último triplete aminoacídico en el polipéptido o el primer aminoácido en la proteína de la cubierta del fago. Cuando se hace crecer el fagémido que contiene el codón suprimible en una célula huésped supresora, se obtiene una producción detectable de un polipéptido de fusión que contiene el polipéptido y la proteína de la cubierta. Cuando el fagémido se crece en una célula huésped no-supresora, el polipéptido se sintetiza esencialmente sin la fusión de la proteína de la cubierta del fago debido a la terminación en el triplete suprimible insertado que codifica para UAG, UAA o UGA. En la célula no supresora, el polipéptido se sintetiza y secreta a partir de la célula huésped debido a la ausencia de proteína fusionada de la cubierta del fago, que en otrascircunstancias le anclaría a la pared de la célula huésped.

5. Alteración (mutación) del gen 1 en posiciones seleccionadas

El gen que codifica para el polipéptido deseado, puede alterarse en uno o más codones seleccionados. Sin embargo, debe cambiarse el codón correspondiente con el residuo aspartil isomerizable. Una alteración se define como una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones en el gen que codifica para el polipéptido, dando como resultado un cambio en la secuencia aminoacídica del polipéptido comparado con la secuencia inalterada o nativa del mismo polipéptido. Preferentemente, las alteraciones se realizarán mediante sustitución de por lo menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en una o más regiones de la molécula. Las alteraciones pueden producirse mediante diversos procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen pero no se limitan a la mutagénesis mediada por oligonucleótidos y la mutagénesis de cassette.

a. Mutagénesis mediada por oligonucleótidos

La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es el procedimiento preferido para la preparación de variantes de sustitución, delecióne inserción del gen 1. Esta técnica es bien conocida en la materia tal como se describe por Zoller y col., Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987). En resumen, el gen 1 se altera hibridando un oligonucleótido que codifica para la mutación deseada con un molde de DNA, siendo el molde la forma de cadena sencilla del plásmido que contiene la secuencia de DNA inalterada o nativa del gen 1. Después de la hibridación, se utiliza una DNA polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria y completa del molde que incorporará en consecuencia el cebador oligonucleotídico y codificará para las alteraciones seleccionadas del gen 1.

Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a15 nucleótidos completamente complementarios con el molde en cada lado del nucleótido(s) que codifica para la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido hibridará correctamente con la molécula de DNA de cadena sencilla. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas conocidas en la materia, tal como se describe por Crea y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765 (1978).

El molde de DNA puede generarse únicamente por aquellos vectores derivados de los vectores del bacteriófago M13 (son adecuados los vectores generalmente disponibles M13mp18 y M13mp19), o aquellos vectores que contienen un origen de replicación de fago de cadena sencilla, tal como se describe por Viera y col., Meth. Enzymol. 153:3 (1987). En consecuencia, el DNA que se ha de mutar se inserta en uno de estos vectores con el fin de generar un molde de cadena sencilla. La producción del molde de cadena sencilla se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook y col., supra.

Para alterar la secuencia nativa del DNA, se hibrida el oligonucleótido con el molde de cadena sencilla en condiciones de hibridación adecuadas. A continuación, se añade una enzima de polimerización del DNA, generalmente el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I, para sintetizar la cadena complementaria del molde utilizando el oligonucleótido como cebador para la síntesis. De esta forma se forma una molécula heterodúplex, de modo que una cadena de DNA codifica para la forma mutada del gen 1 y la otra cadena (el molde original) codifica para la secuencia inalterada, nativa del gen 1. Esta molécula heterodúplex se transforma a continuación en una célula huésped adecuada, generalmente un procariota como E. coli JM-101. Después de crecer las células, se las coloca en placas de agarosa y se rastrean utilizando el cebador oligonucleotídico marcado isotópicamente con fosfato^{-32} para identificar las colonias bacterianas que contienen el DNA mutado.

El procedimiento descrito antes puede modificarse para crear una molécula heterodúplex en la que ambas cadenas plasmídicas contengan la mutación (mutaciones). Las modificaciones son las siguientes: el oligonucleótido de cadena sencilla se anilla al molde de cadena sencilla, tal como se describió anteriormente. Una mezcla de tres desorribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTTP) se combina con un desorribonucleótido modificado tio-desoxirribocitosina denominado dCTP-(aS) (Amersham). Esta mezcla se añade al complejo molde-oligonucleótido. Tras la adición de la DNA polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de DNA idéntica al molde excepto para las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de DNA contendrá dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerla de la digestión por enzimas de restricción. Después de que la cadena molde del heterodúplex de cadena doble se corte con una enzima de restricción adecuada, se puede digerir la cadena molde con la exonucleasa ExoIII o con otra nucleasa adecuada que pase por la región que contiene el sitio(s) a mutagenizar. La reacción se para a continuación para dejar una molécula que es sólo parcialmente de cadena sencilla. A continuación, se forma un homodúplex de DNA de cadena doble completa utilizando la DNA polimerasa en presencia de los cuatro desorribonucleótidos trifosfatos, ATP y DNA ligasa. Esta molécula homodúplex puede transformarse seguidamente en una célula huésped adecuada, como por ejemplo E. coli JM101, tal como se describió anterior-
mente.

Los mutantes con más de un aminoácido a sustituir pueden generarse de diversas formas. Si los aminoácidos se localizan muy próximos en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifique para todas las sustituciones aminoacídicas deseadas. Si, por el contrario, los aminoácidos se localizan a cierta distancia unos de otros (separados por más de aproximadamente 10 aminoácidos), es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique para todos los cambios deseados. En su lugar, se pueden utilizar uno o dos procedimientos alternativos.

En el primer procedimiento, se genera un oligonucleótido para cada aminoácido a sustituir. A continuación, se anillan los oligonucleótidos con el DNA molde de cadena sencilla simultáneamente y se sintetiza la segunda cadena de DNA a partir del molde, la cual codificará para todas las sustituciones aminoacídicas deseadas. El procedimiento alternativo implica dos o más tandas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera tanda, es tal como se describió para los mutantes simples: se utiliza DNA de tipo salvaje para el molde y el oligonucleótido que codifica para la primera sustitución (sustituciones) se anilla con este molde, generándose la molécula de DNA heterodúplex. La segunda tanda de mutagénesis utiliza el DNA mutado producido en la primera tanda de mutagénesis como molde. De este modo, este molde ya contiene uno o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica para la sustitución (sustituciones) aminoacídica deseada adicional se anilla a continuación con este molde y de este modo la cadena resultante de DNA codifica ahora para mutaciones procedentes de la primera y segunda tanda de mutagénesis. El DNA resultante se puede utilizar como un molde en una tercera ronda de mutagénesis y así sucesivamente.

b. Mutagénesis en cassette

Este procedimiento es también un procedimiento preferido para preparar variantes de sustitución, deleción e inserción del gen 1. El procedimiento se basa en lo descrito por Wells y col., Gene 34:315 (1985). El material inicial es el plásmido (u otro vector) que comprenda el gen 1, el gen a mutar. En primer lugar se identifica el codón o codones del gen 1 a mutar. Si no existieran dianas de restricción, se pueden generar utilizando el procedimiento de mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrito anteriormente para introducirlas en las localizaciones adecuadas en el gen 1. Después de introducir las dianas de restricción en el plásmido, se lineariza el plásmido cortándolo por dichas dianas. Se sintetiza un oligonucleótido de cadena doble que codifique para la secuencia del DNA entre las dianas de restricción pero que contenga la mutación (mutaciones) deseada, utilizando los procedimientos estándares. Las dos cadenas se sintetizan separadamente y luego se hibridan juntas utilizando técnicas estándares. Este oligonucleótido de cadena doble se denomina el cassette. Este cassette está diseñado para tener extremos 3' y 5' que sean compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de modo que se pueda ligar directamente con el plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de DNA mutada del gen 1.

6. Obtención del DNA que codifica para la proteína deseada

En una realización alternativa, la presente invención contempla la producción de variantes de una proteína deseada que contiene una o más subunidades. Cada subunidad está codificada típicamente por genes separados. Cada uno de los genes que codifican para cada subunidad puede obtenerse por procedimientos conocidos en la materia (ver, por ejemplo, Sección II). En algunos casos, puede ser necesario obtener el gen que codifica para cada una de las diversas subunidades utilizando técnicas separadas, seleccionadas a partir de cualquiera de los procedimientos descritos en la Sección II.

Cuando se construye un vector de expresión replicable en donde la proteína de interés contiene más de una subunidad, todas las subunidades pueden regularse por el mismo promotor, localizado generalmente en 5' del DNA que codifica para la subunidad codificante; o cada una puede regularse por el mismo promotor, localizado generalmente en 5' del DNA que codifica para las subunidades, o cada una puede regularse por un promotor individual orientado de forma adecuada en el vector, de modo que cada promotor esté unido operativamente al DNA que se ha de regular. La selección de promotores se lleva a cabo tal como se describe en la Sección II anterior.

Al construir un vector de expresión replicable que contenga el DNA que codifica para la proteína de interés con subunidades múltiples, se invita al lector que se dirija a la Figura 11, donde, como ejemplo, se ha esquematizado un vector que muestra el DNA que codifica para cada subunidad de un fragmento de anticuerpo. Esta figura muestra que, en general, una de las subunidades de la proteína de interés se fusionará con una proteína de la cubierta del fago, por ejemplo del gen III de M13. Este gen de fusión contendrá generalmente su propia secuencia señal. Un gen separado codificará para la otra subunidad o subunidades y es evidente que cada subunidad tendrá su propia secuencia señal. La Figura 11 también muestra que un sólo promotor puede regular la expresión de ambas subunidades. Alternativamente, cada subunidad puede regularse de forma independiente por un promotor distinto. La proteína de fusión de la construcción de la proteína de la cubierta del fago y subunidad de interés se puede realizar tal como se describe en la Sección IV anterior.

Cuando se construye una familia de variantes de la proteína deseada de multi-subunidades, se puede mutar el DNA que codifica para cada subunidad en el vector, en una o más posiciones en cada subunidad. Cuando se construyen variantes de anticuerpos de multi-subunidades, las dianas preferidas de mutagénesis corresponden con los codones que codifican para los residuos aminoacídicos localizados en las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena ligera, la cadena pesada, o de ambas cadenas. Las CDRs son generalmente referidas como las regiones hipervariables. Los procedimientos para mutagenizar el DNA que codifica para cada subunidad de la proteína de interés se llevan a cabo esencialmente tal como se describe en la Sección V anterior.

7. Preparación de una molécula diana y unión con el fagémido

Las proteínas diana, como los receptores, pueden aislarse de fuentes naturales o prepararse mediante procedimientos recombinantes bien conocidos en la materia. Como ejemplo, pueden prepararse los receptores de hormonas glicoproteicas mediante las técnicas descritas en McFarland y col., Science 245:494-499 (1989), las formas no-glicosiladas expresadas en E. coli se describen por Fuh y col., J. Biol. Chem. 265:3111-3115 (1990). Otros receptores pueden prepararse mediante procedimientos estándares.

La proteína diana purificada puede unirse a una matriz adecuada como bolas de agarosa, bolas de acrilamida, bolas de vidrio, celulosa, diversos copolímeros acrílicos, geles de hidroxialquil metacrilato, copolímeros poliacrílicos y polimetacrílicos, nylon, vehículos neutros e iónicos y similares. La unión de la proteína diana con la matriz puede lograrse mediante los procedimientos descritos en Methods in Enzymol. 44 (1976), o mediante otros conocidos en la materia.

Después de la unión de la proteína diana con la matriz, la diana inmovilizada se pone en contacto con la librería de partículas fagémidas en condiciones adecuadas, para la unión de por lo menos una de las partículas de fagémidos con la diana inmovilizada. Normalmente, las condiciones de pH, fuerza iónica, temperatura y otras similares simularán las fisiológicas.

Las partículas de fagémidos ("ligandos") que tienen una alta afinidad por la diana inmovilizada se separan de las que tienen una baja afinidad (y en consecuencia no se unen a la diana) mediante lavado. Los ligandos se pueden disociar de la diana inmovilizada mediante diversos procedimientos. Estos procedimientos incluyen la disociación competitiva de la diana inmovilizada mediante diversos procedimientos. Estos incluyen la disociación competitiva utilizando el ligando de tipo salvaje, la alteración del pH y/o la fuerza iónica y otros procedimientos conocidos en la materia.

Las células huésped adecuadas se infectan con los ligandos y el fago auxiliar y se cultivan las células huésped en condiciones adecuadas para la amplificación de las partículas de fagémidos. Dichas partículas se recogen a continuación y se repite el proceso de selección una o más veces hasta seleccionar los ligandos que tengan la deseada afinidad por la molécula diana.

Opcionalmente, la librería de partículas de fagémidos se puede contactar secuencialmente con más de una diana inmovilizada para mejorar la selectividad por una diana en particular. Por ejemplo, a menudo sucede que el ligando tiene más de un receptor natural, como en el caso de la HGH en donde tanto el receptor de la hormona de crecimiento, como el receptor de la prolactina se unen al ligando hGH. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la selectividad de hGH por el receptor de la hormona de crecimiento respecto al receptor de la prolactina. Ello podría lograrse, en primer lugar, poniendo en contacto la librería de partículas de fagémidos con el receptor de la prolactina, eluyendo los que presenten una baja afinidad (es decir, inferior a la hGH de tipo salvaje) por el receptor de la prolactina y a continuación contactando los "ligandos" de baja afinidad o los no-ligandos con la prolactina con el receptor de la hormona de crecimiento inmovilizado y seleccionando los ligandos de alta afinidad por el receptor de la hormona de crecimiento. En este caso una hGH mutante con afinidad menor por el receptor de la prolactina podría tener una utilidad terapéutica, incluso si la afinidad por el receptor de la hormona de crecimiento fuera algo inferior que la hGH de tipo salvaje. Esta misma estrategia se puede utilizar para mejorar la selectividad de una hormona o proteína determinada por su receptor de función primaria sobre su receptor de aclaramiento.

En otra realización de la presente invención, se puede obtener una secuencia aminoacídica del sustrato mejorada. Esto puede ser útil para realizar mejor las "dianas de corte" para los engarces proteicos, o para los sustratos/inhibidores de proteasas. En esta realización, se fusiona un receptor de una molécula inmovilizada (p.ej., hGH), biotina-avidina, o una molécula capaz de unirse covalentemente con una matriz al gen III a través de un engarce. El engarce tendrá preferentemente de 3 a 10 aminoácidos de longitud y actuará como un sustrato para una proteasa. Se construirá un fagémido, tal como se describió anteriormente, donde el DNA que codifica para la región del engarce se mutará aleatoriamente para producir una librería aleatoria de partículas de fagémidos con secuencias aminoacídicas distintas en los sitios de unión. Las partículas de fagémidos de la librería se inmovilizan en una matriz y se exponen a una proteasa adecuada. A continuación, se eluirán las partículas de fagémido que tengan las secuencias aminoacídicas del sustrato preferidas o mejores en la región lineal para la proteasa deseada, produciendo en primer lugar un grupo enriquecido de partículas de fagémidos que codifican para engarces preferidos. Estas partículas de fagémidos se seleccionan más veces para producir un grupo enriquecido de partículas que codifiquen para la(s) secuencia(s) consenso.

II. Generación de anticuerpos

El anticuerpo inicial puede prepararse utilizando técnicas disponibles en la materia o en la generación de dichos anticuerpos. Ejemplos de procedimientos para la generación de anticuerpos se describen con más detalle en las secciones siguientes.

El anticuerpo está dirigido contra un antígeno de interés. Preferentemente, dicho antígeno es un polipéptido importante biológicamente y la administración del anticuerpo a un mamífero que sufre de una enfermedad o trastorno puede resultar en un beneficio terapéutico en dicho mamífero. Sin embargo, también se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antígenos no-polipeptídicos (como los antígenos glicolipídicos asociados con tumores; ver la patente americana U.S. 5.091.178).

Si el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembrana (p.ej., un receptor) o un ligando como un factor de crecimiento. Ejemplos de antígenos incluyen las moléculas como la renina; la hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; el factor de liberación de la hormona de crecimiento; la hormona paratiroidea; el glucagón; los factores de coagulación como la Proteína C; el factor natriurético atrial; el tensoactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, como la uroquinasa de la orina humana o el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA); la bombesina; la trombina; el factor de crecimiento hematopoyético; el factor de crecimiento hematopoyético; el factor de necrosis tumoral alfa y beta; la encefalinasa; RANTES (activación regulada normalmente expresada y secretada por células T); la proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); una albúmina sérica como la seroalbúmina humana; la sustancia inhibidora Muellerian; la cadena-A de la relaxina; la cadena-B de la relaxina; la prorelaxina; el péptido asociado a la gonadotropina murina; una proteína microbiana, como la beta-lactamasa; la DNasa; la IgE, un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), como el CTL-4; la inhibina; la activina; los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF); los receptores de las hormonas o factores de crecimiento; la proteína A o la D; los factores reumatoides; un factor neurotrófico como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF); la neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6, o un factor de crecimiento nervioso como el NGF-\beta. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); los factores de crecimiento de fibroblastos como el aFGF y el bFGF; el factor de crecimiento epitelial (EGF); el factor de crecimiento transformante (TGF), como el TGF-alfa y el TGF-beta, incluyendo el TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4, o el TGF-\beta5; el factor-I y -II de crecimiento similar a la insulina (IGF-I y IGF-II)des (1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; las proteínas CD como CD3, CD4, CD8, CD19y CD20; la eritropoyetina; los factores osteoinductores; las inmunotoxinas; una proteína morfogenética del hueso (BMP); un interferón como el interferón-alfa, -beta y -gamma; los factores estimuladores de la formación de colonias (CSFs), p.ej., M-CSF, GM-CSF y G-CSF; las interleucinas (Ils), p.ej., IL-1 a IL-10; la superóxido dismutasa; los receptores de células T; las proteínas de la membrana celular; los receptores autoguiados; las adresinas: proteínas reguladoras; las integrinas como el CD11a, CD11b, CD11c, CD18 y ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado al tumor como el receptor HER2, HER3 o HER4; y los fragmentos de cualquiera de los péptidos listados anteriormente.

Las dianas moleculares preferidas para los anticuerpos abarcados por la presente invención incluyen las proteínas CD como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34; los miembros de la familia del receptor ErbB como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; las moléculas de adhesión celular como LFA-1, Mac12, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y la integrina \alphav/\beta3 incluyendo las subunidades \alpha o \beta de lo mismo (p.ej., los anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); los factores de crecimiento como el VEGF; la IgE; los antígenos de grupos sanguíneos; el receptor flk2/flk3; el receptor de obesidad (OB); el receptor mpl; CTLA-4; la proteína C, etc. Una diana preferida especialmente es la IgE.

El anticuerpo se genera contra el antígeno derivado de una primera especie de mamífero. Preferentemente, la primera especie de mamífero es humana. Sin embargo, también se contemplan otras especies de mamíferos, como por ejemplo los animales de granja, los animales de compañía, del zoo, si el anticuerpo pretende utilizarse para tratar dichos mamíferos. El antígeno de la primera especie de mamífero puede aislarse de una fuente natural con el propósito de generar un anticuerpo contra dicho antígeno. Sin embargo, tal como se indica más adelante, las células que contienen el antígeno pueden utilizarse como inmunógenos para generar anticuerpos. En otras realizaciones, el antígeno se produce de forma recombinante o utilizando procedimientos sintéticos. El anticuerpo seleccionado tendrá normalmente una afinidad de unión suficientemente fuerte por el antígeno. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse al antígeno de la primera especie de mamífero con un valor de afinidad de unión (Kd) no superior a 1 x 10^{-7} M, preferentemente no superior a 1 x 10^{-8} M y más preferentemente no superior a 1 x 10^{-9} M. Las afinidades del anticuerpo se pueden determinar mediante, por ejemplo, ensayos de unión por saturación; ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA); y ensayos de competición (p.ej., RIAs).

También, el anticuerpo puede someterse a otros ensayos de actividad biológica, p.ej., con el fin de evaluar su eficacia como un agente terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la materia y dependen del antígeno diana y de la utilización pretendida para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de adhesión en monocapa de queratinocitos y el ensayo de la respuesta de linfocitos mezclados (MFR) a CD11a (descritos en el Ejemplo de más adelante); los ensayos de inhibición del crecimiento tumoral (por ejemplo, tal como se describe en la patente internacional WO 89/06692); los ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y de citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) (patente americana U.S. 5.500.362); y la actividad agonística o los ensayos hematopoyéticos (ver la patente internacional WO 95/27062).

Para rastrear los anticuerpos que se unen a un epitopo determinado sobre el antígeno de interés (p.ej., los que bloquean la unión del anticuerpo MHM24), se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado rutinario como el descrito en Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y Davis Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar el mapeo de epitopos, p.ej., tal como se describe en Champe y col., J Biol Chem 270:1388-1384 (1995), para determinar si el anticuerpo se une a un epitopo de interés.

A continuación, se determina la dependencia de especies del anticuerpo. La afinidad de unión del anticuerpo por un homólogo del antígeno utilizado para el anticuerpo (si el homólogo es de una "segunda especie de mamífero") se valora utilizando técnicas como las descritas anteriormente. En realizaciones preferidas, la segunda especie de mamífero es un mamífero no humano al que se le administrará el anticuerpo en estudios preclínicos. Según ello, la segunda especie de mamífero puede ser un primate no humano, como el rhesus, cynomologus, baboon, chimpancé y macaco. En otras realizaciones, la segunda especie de mamífero puede ser, por ejemplo, un roedor, un gato o un perro. El anticuerpo dependiente de especie tendrá normalmente una afinidad de unión por el antígeno de la segunda especie de mamífero que por lo menos sea de aproximadamente 50 veces, o por lo menos 100 veces, mayor que su afinidad de unión por el antígeno de la primera especie. Normalmente, esta afinidad de unión será tal que el anticuerpo dependiente deespecie no podrá ser utilizado eficazmente para estudios preclínicos con la segunda especie de mamífero.

Mientras que el procedimiento preferido de la presente invención para determinar la dependencia de especie (y para la evaluación de anticuerpos mutantes con propiedades mejoradas; ver más adelante) es cuantificar la afinidad del anticuerpo. En otras realizaciones de la invención, se evalúan una o más propiedades biológicas del anticuerpo dependiente de especie y del anticuerpo mutante además de, o en lugar de, las determinaciones de la afinidad de unión. Ejemplos de tales ensayos biológicos se han descrito con anterioridad. Dichos ensayos son de particular utilidad cuando proporcionan una indicación sobre la eficacia terapéutica del anticuerpo. Normalmente, aunque no es necesario, los anticuerpos que presentan propiedades mejoradas en dichos ensayos, tendrán también una afinidad de unión incrementada. En consecuencia, en una realización de la invención, en donde el ensayo de elección sea un ensayo de actividad biológica en lugar de un ensayo de afinidad de unión, el anticuerpo dependiente de especie tendrá normalmente una "actividad biológica" utilizando un "material" (p.ej., antígeno, célula, tejido, órgano o el animal entero) de la segunda especie de mamífero de por lo menos 50 veces, o por lo menos 500 veces, o por lo menos 1000 veces, menos eficaz que su actividad biológica en un ensayo correspondiente utilizando reactivos de la primera especie de mamífero.

El anticuerpo dependiente de especie se altera a continuación para generar un anticuerpo mutante que tenga una mayor afinidad de unión por el antígeno de la segunda especie de mamífero, que el anticuerpo dependiente de especie. El anticuerpo mutante tendrá preferentemente una afinidad de unión por el antígeno del mamífero no humano de por lo menos 10 veces, preferentemente de por lo menos 20 veces, más preferentemente de por lo menos 500 veces e incluso de por lo menos 100 ó 200 veces superior a la afinidad de unión por el antígeno del anticuerpo dependiente de especie. El incremento en la afinidad de unión deseado o requerido dependerá de la afinidad de unión inicial del anticuerpo dependiente de especie. Sin embargo, cuando el ensayo utilizado es un ensayo de actividad biológica, el anticuerpo mutante tiene preferentemente actividad biológica en el ensayo de elección que es por lo menos 100 veces, preferentemente de por lo menos 20 veces, más preferentemente de por lo menos 50 veces e incluso de por lo menos 100 ó 200 veces mejor que la actividad biológica del anticuerpo dependiente de especie en dicho ensayo.

Para generar el anticuerpo mutante, se introducen una o más alteraciones de residuos aminoacídicos (p.ej., sustituciones) de la región de entramado en el anticuerpo dependiente de especie, con lo que el resultado es una mejora en la afinidad de unión del anticuerpo mutante por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Ejemplo de residuos de la región de entramado a modificar incluyen aquellos residuos que no se unen covalentemente con el antígeno (Amit y col., Science 233; 747-753 (1986)); los que interactúan con/efectúan la conformación de una CDR (Chothia y col., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); y/o participan en la interfície VL-VH (patente europea EP 239400 B1). En algunas realizaciones, la modificación de uno o más residuos de la región de entramado da como resultado un incremento de la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Por ejemplo, en esta realización de la invención, pueden alterarse desde aproximadamente uno a 5 residuos de la región de entramado. A veces, esto puede ser suficiente para generar un anticuerpo mutante adecuado para utilizar en ensayos clínicos, aún cuando ninguno de los residuos de la región hipervariable se haya alterado. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo mutante comprenderá alteraciones adicionales de la región hipervariable.

Los residuos de la región hipervariable que están alterados pueden cambiarse aleatoriamente, especialmente si la afinidad inicial de unión del anticuerpo dependiente de especie por el antígeno de la segunda especie de mamífero es tal que los anticuerpos mutantes producidos aleatoriamente pueden rastrearse fácilmente.

Las técnicas para la producción de anticuerpos, que pueden ser dependientes de especies y en consecuencia requieren una modificación de acuerdo con las técnicas elaboradas aquí, son las siguientes:

A. Preparación de anticuerpos (i) Preparación de antígenos

Los antígenos solubles o los fragmentos de lo mismo, opcionalmente conjugados con otras moléculas, pueden utilizarse como inmunogenes para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembrana, como los receptores, los fragmentos de éstos (p.ej., el dominio extracelular del receptor) pueden utilizarse como el inmunógeno. Alternativamente, pueden utilizarse como el inmunógeno las células que expresan la molécula transmembrana. Dichas células pueden derivarse de una fuente natural (p.ej., las líneas celulares cancerosas) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas de recombinación para expresar la molécula transmembrana. Otros antígenos y formas de lo mismo útiles para la preparación de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la materia.

(ii) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se producen preferentemente en mamíferos no humanos mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc), o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y de un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína inmunogénica en la especia a inmunizar, p.ej., la hemocianina de la lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoilo sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), la N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), el glutaraldehido, el anhídrido succínico, el cloruro de tionilo, o R^{1}N=C=CR, en donde R y R^{1} son grupos alquil distintos.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, los conjugados inmunogénicos, o derivados, mediante lacombinación de, p.ej., 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde, los animales se reestimulan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o del conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De 7 a 14 días después, se sangran los animales y se analiza el suero para el título de anticuerpos. Los animales se reestimulan hasta alcanzar una titulación en la meseta de producción de anticuerpos. Preferentemente, el animal se reestimula con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína distinta y/o a través de un reactivo de unión cruzada distinto. Los conjugados también se pueden realizar en fusiones de proteínas en cultivo de células recombinantes. Para incrementar la respuesta inmune, son también adecuados los agentes agregantes como el alumbre.

El anticuerpo de mamífero seleccionado tendrá normalmente una afinidad de unión suficientemente fuerte por el antígeno. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse al antígeno anti-IgE humano con una afinidad de unión (Kd) no superior a aproximadamente 1 x 10^{-7} M, preferentemente no superior a 1 x 10^{-8} M y más preferentemente no superior a 1 x 10^{-9} M. Las afinidades del anticuerpo se pueden determinar mediante unión por saturación; ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA); y ensayos de competición (p.ej., radioinmunoensayos).

Para rastrear los anticuerpos anti-IgE humanos, se puede realizar un ensayo de unión cruzada rutinario como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y Davis Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar el mapeo de epitopos, p.ej., tal como se describe en Champe y col., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) para determinar la unión.

Aunque el procedimiento preferido para la determinación de la eficacia del polipéptido o del anticuerpo es a través de la cuantificación de la afinidad de unión del anticuerpo, otras realizaciones prevén la evaluación de uno o más propiedades biológicas del anticuerpo, además de, o en lugar de los determinantes de la afinidad de unión. Dichos ensayos son particularmente útiles si proporcionan una indicación como por ejemplo la eficacia terapéutica del anticuerpo. Normalmente, aunque no es necesario, los anticuerpos que muestran propiedades mejoradas en dichos ensayos, tendrán también una afinidad de unión incrementada.

(iii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos que reconocen un sitio antigénico único. Su especificidad uniforme hace que los anticuerpos monoclonales sean mucho más útiles que los anticuerpos policlonales, que generalmente contienen anticuerpos que reconocen una variedad de sitios antigénicos distintos.

Los anticuerpos monoclonales pueden generarse utilizando el procedimiento del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o pueden generarse mediante procedimientos del DNA recombinantes (patente americana U.S. 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado, como un hámster o un mono macaco, se inmuniza ,tal como se describió anteriormente, para generar linfocitos que producirán o serán capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente con la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. A continuación, los linfocitos se utilizan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, como el polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 590-103 (Academic Press, 1986).

Las células de hibridomas, así preparadas, se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HART), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente la hipoxantina, la aminopeterina y la timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de las células deficientes en HPGRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de forma eficiente, soportan niveles estables y elevados de producción de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionados y son sensibles a un medio como el HAT. Entre éstas, las líneas de células de mieloma preferidas están las líneas de mieloma murino, como las derivadas de tumores murinos, MOPC-21 y MPC-11, disponibles por el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA; y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles por el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las líneas celulares de mieloma humano y del heteromieloma murino-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbar, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. New York, 1987).

El medio de cultivo en donde crecen las células del hibridoma se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridomas se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y crecer mediante procedimientos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986)). El medio adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, el medio D-MEM o el RPMI-1640. Además, las células del hibridoma pueden crecerse in vivo como tumores de ascitas en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, el fluido de ascitas, o el suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales como, por ejemplo, la proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por afinidad.

El DNA que codifica para los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (p.ej., utilizando sondas oligonucleotídicas, que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridomas sirven como fuente preferida de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, que se transfieren a células huésped como las células E. coli, las células de mono COS, las células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de otra forma no producirían proteína inmunoglobulina, con el fin de obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describirá con más detalle más adelante.

En otra realización, se pueden aislar los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos de librerías de fagos de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature 348:552-554 (1990). Clackson y col., Nature 352:624-628 (1991); y Marks y col., J. Mol. Biol. 222:587-591 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando librerías de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango de nM) mediante barajamiento de cadenas (Marks y col., Biol Technology 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatorial y la recombinación in vivo como una estrategia para la construcción de librerías grandes de fagos (Waterhouse y col., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). En consecuencia, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento anticuerpos monoclonales.

El DNA también puede modificarse, por ejemplo, mediante sustitución de la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera murinas por las secuencias humanas homólogas (patente americana U.S. 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)), o mediante unión covalente con el polipéptido de inmunoglobulina.

Típicamente, dichos polipéptidos no-inmunoglobulínicos se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación al antígeno de un anticuerpo, para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación al antígeno con especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación al antígeno con especificidad por un antígeno distinto.

(vi) Generación de anticuerpos mutantes

Una vez identificados y aislados los anticuerpos dependientes de especie, es generalmente útil generar un anticuerpo variante o mutante, en donde uno o más residuos aminoacídicos están alterados en una o más regiones variables del anticuerpo de mamífero. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden introducir una o más alteraciones (p.ej., sustituciones) de los residuos de la región de entramado en el anticuerpo de mamífero si ello da como resultado una mejora de la afinidad de unión del anticuerpo mutante para la IgE humana. Ejemplos de residuos de regiones de entramado a modificar incluyen aquellos que no se unen covalentemente con el antígeno de forma directa (Amit y col., Science 233: 747-753 (1986)); interactúan con/producen la conformación de CDR (Chothia y col., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); y/o participan en la interfaz VL-VH (patente europea EP 239 400 B1). En ciertas realizaciones, la modificación de uno o más residuos de la región de entramado da como resultado un incremento de la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno humano. Por ejemplo, en esta realización de la presente invención, pueden alterarse desde aproximadamente uno a cinco residuos de la región de entramado. Algunas veces, esto puede ser suficiente para obtener un anticuerpo mutante adecuado para la utilización en ensayos preclínicos, aún cuando ninguno de los residuos de las regiones hipervariables se haya alterado. Sin embargo, el anticuerpo mutante comprenderá en general una alteración o alteraciones de la región hipervariable adicionales.

Los residuos de la región hipervariable que están alterados pueden cambiarse aleatoriamente, especialmente si la afinidad de unión inicial del anticuerpo dependiente de especie es tal que los mutantes de anticuerpos producidos aleatoriamente pueden rastrearse fácilmente.

Un procedimiento de utilidad para la generación de anticuerpos mutantes se conoce como "mutagénesis de cribaje de alaninas" (Cunningham,B.C. y Wells, J.A. Science 244:1081-1085 (1989); Cunningham, B.C. y Wells, J.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 6434-6437 (1991)). En este procedimiento, se reemplazan uno o más residuos de la región hipervariable por alanina o por residuos de polialanina para modificar la interacción de los aminoácidos con el antígeno de la segunda especie de mamífero. Aquellos residuos de la región hipervariable que demuestran sensibilidad funcional con las sustituciones se perfeccionan a continuación, introduciendo más sustituciones u otras mutaciones en los sitios de sustitución. En consecuencia, mientras que el sitio para la introducción de una variación de secuencia aminoacídica está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita predeterminarse. Los mutantes alanina producidos de esta manera se rastrean por su actividad biológica, tal como se describe aquí. Pueden obtenerse sustituciones similares con otros aminoácidos, dependiendo de la propiedad deseada impartida por los residuos rastreados.

La invención también proporciona un procedimiento más sistemático para la identificación de residuos aminoacídicos a modificar. De acuerdo con este procedimiento, se identifican los residuos de la región hipervariable en el anticuerpo dependiente de especie que están implicados en la unión con la primera especie de mamífero y los residuos de la región hipervariable implicados en la unión con un homólogo del antígeno de la segunda especie de mamífero. Para lograrlo, puede realizar un rastreo de alaninas de los residuos de la región hipervariable del anticuerpo dependiente de especie, en donde cada mutante alanina se analiza por su unión con la primera y segunda especie de mamífero. A continuación, se identifican los residuos de la región hipervariable implicados en la unión con el antígeno de la primera especie de mamífero (p.ej., humano) y los implicados en la unión con el homólogo del antígeno de la segunda especie de mamífero (p.ej., no humano). Preferentemente, los residuos implicados significativamente en la unión con el antígeno de la segunda especie de mamífero, (p.ej., mamífero no humano), pero no con el antígeno de la primera especie de mamífero (p.ej., humano) se eligen como candidatos para la modificación. En otra realización, los residuos implicados significativamente en la unión con el antígeno de la primera y la segunda especie de mamífero se seleccionan para ser modificados. En otra realización, pero menos preferida, los residuos implicados en la unión con el antígeno de la IgE humana, pero no con la IgE de mamífero homóloga (no-humana), se seleccionan para su modificación. Dicha modificación puede implicar la deleción del residuo o la inserción de uno o más residuos adyacentes al residuo de interés. Sin embargo, la modificación implica normalmente la sustitución del residuo por otro aminoácido.

Típicamente, se debería comenzar con una sustitución conservadora como las que se muestran en la Tabla A de más adelante, bajo el título de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio de la actividad biológica (p.ej., la afinidad de unión), entonces se introducen más cambios esenciales, denominados "ejemplos de sustituciones" en la Tabla A, o como se describe más adelante referente a las clases de aminoácidos, y luego se procede a realizar un rastreo de los productos.

TABLA A

2

Se logran modificaciones incluso en las propiedades biológicas más esenciales de los anticuerpos mediante selección de las sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o hélice; (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basados en las propiedades de la cadena lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, ther, asn, gln;

(3) acídicos: asp, glu;

(4) básicos: his, lys, arg;

(5) residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro, y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras implican el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro de otra clase.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican para los mutantes de secuencia se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o mutagénesis dirigida), mutagénesis por PCR y mutagénesis de cassette de un mutante preparado con anterioridad o una versión no-mutante del anticuerpo dependiente de especie. El procedimiento preferido para generar los mutantes es la mutagénesis dirigida (ver Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)).

En algunas realizaciones, el anticuerpo mutante tendrá únicamente un residuo de región hipervariable sustituido, p.ej., desde dos a quince sustituciones de la región hipervariable, aproximadamente.

Generalmente, el anticuerpo mutante con propiedades biológicas mejoradas tendrá una secuencia aminoacídica con por lo menos el 75% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia aminoacídica del dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo anti-IgE humana de mamífero, más preferentemente con por lo menos el 80%, más preferentemente del 85% por lo menos, incluso más preferentemente del 90% por lo menos y aún más preferentemente de por lo menos el 95%. La identidad o similitud con respecto esta secuencia se define aquí como el porcentaje en la secuencia candidata de residuos aminoacídicos que son idénticos (es decir, los mismos residuos) o similares (es decir, residuo aminoacídico del mismo grupo según las propiedades de su cadena lateral común, supra) con los residuos del anticuerpo dependientes de especie, después de alinear las secuencias y de introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia.

Alternativamente, los anticuerpos mutantes se pueden generar mediante mutación sistemática de las regiones CDR de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-IgE. El procedimiento preferido para la generación de dichos anticuerpos mutantes implica la utilización de la maduración de la afinidad utilizando la expresión de fagos (Hawkins y col., J. Mol. Biol. 254:889-896 (1992) y Lowman y col, Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991)). Las fusiones con la proteína de la cubierta del bacteriófago (Smith, Science 228:1315 (1985); Scott y Smith, Science 249:386 (1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:309 (1990); Devlin y col., Science 249:404 (1990); revisado por Wells y Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:597 (1992); patente americana U.S. 5.223.409) son conocidas por ser útiles para unir el fenotipo de las proteínas o péptidos expresados con el genotipo de las partículas bacteriófagas que los codifican. También se han expresado en fagos los dominios F(ab) de anticuerpos (McCafferty y col., Nature 348:552 (1990); Barbs y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978 (1991); Garrard y col., Biotechnol. 9:1373 (1991)).

La expresión de fagos monovalentes consiste en la expresión de un grupo de proteínas variantes como fusiones con una proteína de la cubierta del bacteriófago, de modo que se limita la expresión de los variantes a únicamente una copia por varias partículas fágicas (Bass y col., Proteins 8:309 (1990). La maduración de la afinidad, o la mejora de las afinidades de unión en el equilibrio de diversas proteínas, ya se alcanzó con anterioridad con otras proteínas tras sucesivas aplicaciones de mutagénesis, expresión de fagos monovalentes, análisis funcional y adición de mutaciones preferidas, como se ejemplifica en el caso de la hormona de crecimiento humana (Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564-578 (1993); patente americana U.S. 5.5434.617), así como los dominios F(ab) de anticuerpos (Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:3809 (1994); Yang y col., J. Mol. Biol. 254:392 (1995).

Se pueden construir librerías de muchas variantes de proteínas (10^{6}), que difieren en posiciones definidas en su secuencia, en partículas de bacteriófagos, conteniendo cada una el DNA que codifica para la variante de proteína determinada. Después de varios ciclos de purificación de la afinidad utilizando un antígeno inmovilizado, los clones individuales de bacteriófagos se aíslan y se deduce la secuencia aminoacídica de su proteína expresada a partir de su DNA.

(a) Anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos

La humanización es una técnica para la realización de un anticuerpo quimérico, en donde por lo menos en esencia un dominio variable intacto humano se ha sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no-humana. Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos introducidos en él procedentes de una fuente no-humana. Estos residuos aminoacídicos no-humanos son a menudo referidos como residuos de "importación", los cuales se toman de forma característica de un dominio variable "de importación". La humanización puede realizarse en esencia según el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechman y col., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las regiones determinantes de la complementariedad de roedores (CDRs) o secuencias CDR por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Según ello, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente americana U.S. 4.816.567) en donde se ha sustituido menos de un dominio variable humano por la secuencia correspondiente de una especie no-humana. Tal como se practica en la presente invención, los anticuerpos anti-IgE humanizados tienen residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR sustituidos por residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos
murinos.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar en la realización de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado "del mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo murino se rastrea en la librería completa de secuencias de dominios variables humanos conocidos. Entonces, se acepta la secuencia humana más cercana a la de roedor como la región de entramado humana para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Otro procedimiento utiliza una región de entramado determinada derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo determinado de cadenas ligeras y pesadas. La misma región de entramado puede utilizarse para diversos anticuerpos humanizados distintos (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J Immunol, 151.2623 (1993)).

También es importante que los anticuerpos se humanicen reteniendo la afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y de los diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos para los dominios de anticuerpos determinados, por ejemplo, dominios VH y VL, se construyen separadamente a partir de las secuencias consenso basadas en las estructuras F(ab), que tienen secuencias similares. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares a los expertos en la materia. Están disponibles programas informáticos que ilustran y muestran las estructuras de conformación tridimensional probables de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. El examen de estas estructuras permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de la inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influencien la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. Por ejemplo, en el modelaje del fragmento F(ab)-12 en el Ejemplo 2, se utilizó el anticuerpo murino MAE11 como un molde de inspiración para CDR y los residuos de la región de entramado a modificar junto con el modelaje molecular para lograr la secuencia mutante.

Como otro ejemplo, se puede mencionar el anticuerpo control Mab4d5. Aquí, los modelos se construyeron basándose en varias estructuras Fab procedentes del banco de proteínas de Brookhaven (entradas 1FB4, 2RHE, 2MCP, 3FAB, 1FBJ, 2HFL y REI). El fragmento KOL de F(ab) (Marquart, M y col., J Mol Biol 141:369-391 (1980)) como primera elección como molde para los dominios VL y VH y sobre éste se superpusieron las estructuras adicionales utilizando las coordenadas atómicas de la cadena principal (programa INSIGHT, Biosym Technologies). Se utilizaron programas y técnicas similares para el modelaje del anticuerpo deseado.

Un análisis típico utilizando el modelaje molecular se puede realizar de la manera siguiente: se calcula la distancia desde el C\alpha del molde al análogo C\alpha en cada una de las estructuras superpuestas para cada posición de residuo dado. En general, si todas (o casi todas) las distancias C\alpha-C\alpha para un residuo dado son \leq 1 \ring{A}, entonces dicha posición se incluye en la estructura consenso. En algunos casos, los residuos de la región de entramado de la hoja-\beta satisfarán estos criterios, mientras que los bucles de CDR puede que no lo hagan. Para cada uno de estos residuos seleccionados, se calculan las coordenadas para los átomos individuales de N, V\alpha, C, O y C\beta y luego se corrigen las desviaciones resultantes de la geometría de enlaces no estándares mediante 50 ciclos de minimización de energía, utilizando un programa disponible comercialmente como el programa DISCOVER (Biosym Technologies) con el campo de fuerza AMBER (Weiner, SJ y col., J Amer Chem Soc 106:765-784 (1984)) y se fijan las coordenadas C\alpha. A continuación se incorporan residuos altamente conservados de cadenas laterales, como los residuos de cisteína de los puentes disulfuro, en la estructura consenso resultante. A continuación, se incorporan las secuencias de los dominios VL y VH del anticuerpo determinado iniciándose con los residuos CDR y utilizando las tabulaciones de las conformaciones CDR de Chothia C. y col., Nature 342:877-883 (1989)) como guía. Las conformaciones de cadena lateral se eligen sobre la base de estructuras cristalinas Fab, las librerías de rotámeros (Ponder, JW & Richards, F.M., J Mol Biol 193:775-791 (1987)) y las consideraciones de empaquetamiento. Ya que a VH-CDR3 no se le puede asignar un modelo según los criterios anteriores, se pueden crear modelos a partir de una búsqueda de bucles de tamaño similar utilizando el programa INSIGHT, derivado de la utilización de consideraciones de empaquetamiento y exposición a solventes, o puede crearse utilizando otras técnicas rutinarias disponibles comercialmente. Es preferible someter el modelo a 5000 ciclos de energía de minimización.

De esta manera, los residuos de entramado pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras y de importación a fin de lograr las características deseadas del anticuerpo, como por ejemplo una afinidad incrementada por el antígeno(s) diana. En general, los residuos CDR están implicados directa y esencialmente en la modificación de la unión al antígeno. Esta técnica se utilizó en la creación de F(ab)-12 en el Ejemplo 2, en donde se utilizó una combinación de residuos CDR murinos junto con el modelaje molecular para crear un fragmento de anticuerpo anti-IgE murino humanizado.

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (p.ej., ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión cadena pesada-ligera (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulinas humanas de línea germinal en dichos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos dirigidos contra el antígeno. Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immunol 7:33 (1993); y Duchosal y col. Nature 355:258 (1992). Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de librerías de fagos (Hoogenboom y col., J Mol Biol 227:381 (1991); Marks y col., J Mol Biol 222:581-597 (1991); Vaughan y col., Nature Biotech 14:309 (1996)).

(b) Modificaciones adicionales

Después de la producción del anticuerpo mutante, se determina la actividad biológica de esta molécula respecto al anticuerpo dependiente de especie. Tal como se indicó anteriormente, esto puede implicar la determinación de la afinidad de unión y/o otras actividades biológicas del anticuerpo. En una realización preferida de la invención, se preparó un panel de anticuerpos mutantes y se rastreó por su afinidad de unión por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Opcionalmente, uno o más de los anticuerpos mutantes seleccionados de este rastreo inicial, se sometieron a uno o más ensayos de actividad biológica para confirmar que el anticuerpo(s) mutante(s) con una afinidad de unión incrementada, era efectivamente de utilidad, p.ej., en estudios preclínicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo mutante retiene la capacidad para unirse al antígeno de la primera especie de mamífero con una afinidad de unión similar al anticuerpo dependiente de especie. Esto se puede lograr evitando la alteración de residuos de la región hipervariable implicados en la unión con el antígeno por parte del anticuerpo anti-humano. En otras realizaciones, el anticuerpo mutante puede tener una afinidad de unión con el antígeno alterada de forma significativa respecto al anticuerpo de la primera especie de mamífero (p.ej., la afinidad de unión por dicho antígeno es preferentemente mejor, pero puede ser peor que la del anticuerpo dependiente de especie).

El anticuerpo(s) mutante(s) así seleccionado(s) puede(n) someterse a modificaciones posteriores, dependiendo a menudo de la utilización pretendida del anticuerpo. Dichas modificaciones pueden implicar una alteración posterior de la secuencia aminoacídica, la fusión con un polipéptido(s) heterólogo y/o modificaciones covalentes como las elaboradas más adelante. Respecto a las alteraciones de secuencia aminoacídica, se han elaborado con anterioridad ejemplos de modificaciones. Por ejemplo, cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo mutante puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la unión cruzada anómala. A la inversa, (a) se pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como un fragmento Fv). Otro tipo de mutante aminoacídico puede contener un patrón de glicosilación alterado. Esto puede lograrse delecionando una o más porciones de carbohidratos en el anticuerpo y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos es típicamente N- u O-. La N-glicosilación hace referencia a la unión de la porción de carbohidratos con la cadena lateral de un residuo de asparraguina. Las secuencias tripeptídicas asparraguina-X-serina y asparraguina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato con la cadena lateral de la asparraguina. En consecuencia, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La O-glicosilación hace referencia a la unión de un azúcar a través de un oxígeno del éter; por ejemplo, N-acetilgalactosamina, galactosa, fucosa o xilosa unida a un hidroxiaminoácido, más comúnmente la serina o la treonina, aunque también pueden utilizarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra de forma conveniente alterando la secuencia aminoacídica, de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de N-glicosilación). La alteración también puede realizarse mediante adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de O-glicosilación).

(v) Fragmentos de anticuerpos

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan de anticuerpos intactos mediante digestión proteolítica (ver, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biotechnology and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science 229:81 81985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos F(ab')_{2}-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter y col., BiolTechnology 10.163-167 (1992)). De acuerdo con otra aproximación, los fragmentos F(ab') se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para un experto en la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv). (Solicitud de patente internacional PCT WO 93/16185).

(vi) Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión de por lo menos dos antígenos distintos. Mientras que dichas moléculas sólo se unirán normalmente a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs), los anticuerpos con especificidades adicionales como los anticuerpos triespecíficos están incluidos por la propia expresión, cuando se utilizan aquí. Ejemplos de BsAbs incluyen los anticuerpos con un brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula activadora de la citotoxicidad como el anti-Fc\gammaRI/anti-CD15, anti-p185^{HER2}/Fc\gammaRIII (CD16), anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10), anti-CD3/anti-p185^{HER2}, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de células renales, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma de colon), anti-CD3/anti-análogo de la hormona estimulante de melanocitos, anti-receptor EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adhesión de célula nerviosa (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de unión al folato (FBP)/anti-CD3, anti-pan antígeno asociado con carcinoma (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs con un brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo que se une a una toxina como la anti-saporina/anti-id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadena A de la ricina,anti-interferón-\alpha (IFN-\alpha)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-vinca alcaloide; BsAbs para convertir los fármacos activados por enzimas como el anti-CD30/anti- fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión del profármaco mitomicina fosfato a mitomicina alcohol); BsAbs que pueden utilizarse como agentes fibrinolíticos como el anti-fibrina/anti-activador del plasminógeno tisular (tPA), anti-fibrina/anti-uroquinasa-tipo activador del plasminógeno (uPA), BsAbs para dirigir complejos inmunes a los receptores celulares como el anti- lipoproteína de baja densidad (LDL)/anti-receptor Fc (p.ej., Fc\gammaFI, Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII); BsAbs para utilizar en la terapia de enfermedades infecciosas como un anti-CD3-anti-virus herpes simplex (HSV), receptor anti-célula T: complejo CD3 /anti-influenza, anti-Fc\gammaR/anti-HIV, BsAbs para la detección tumoral in vitro o in vivo como el anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185^{HER2}/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacunas y BsAbs como herramientas diagnósticas como anti-IgG de conejo/anti-ferritina, anti-peroxidas de rábano (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-\beta-galactosidasa. Ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen el anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y el anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (p.ej., anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).

Los procedimientos para generar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia. La producción tradicional de los anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-ligera de inmunoglobulina con especificidades distintas (Millestein y col., Nature 305:537-539 (1983)). Debido al reordenamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza generalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y produce un rendimiento pobre. Procedimientos similares se describen en la patente internacional WO 93/08829 y en Traunecker y col., EMBO J 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con una aproximación distinta, los dominios de las variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación antígeno-anticuerpo) se fusionan con las secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. La fusión se realiza preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, comprendiendo por lo menos la bisagra y las regiones CH2 y CH3. Es preferible que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión con la cadena ligera, esté presente en por lo menos una de las fusiones. Los DNAs que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, para la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una mayor flexibilidad en el ajuste de la proporción mutua de los tres fragmentos polipeptídicos, cuando se utilizan proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas en la construcción que proporcionarán rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión, cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones equivalentes dé como resultado rendimientos elevados o cuando las proporciones no sean relevantes.

En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadenas ligera-pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporcionan una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, al igual que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo la mitad de la molécula biespecífica también proporciona una vía fácil de separación. Esta aproximación se describe en la patente internacional WO 94/04690. Para mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, ver por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

De acuerdo con otra aproximación descrita en la patente internacional WO 96/27011, se puede diseñar la interfaz entre una pareja de moléculas de anticuerpos para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprenderá por lo menos parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas de aminoácidos pequeñas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales grandes (p.ej., tirosina o triptófano). En la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo, se crean "cavidades" compensatorias de igual o similar tamaño con la cadena (cadenas) lateral grande, reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes con cadenas menores (p.ej., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero por encima de los productos finales no deseados como, por ejemplo, los homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen los anticuerpos unidos de forma cruzada o los "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede conjugarse con la avidina y el otro con la biotina. Dichos anticuerpos se han diseñado, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune contra células no deseadas (patente americana U.S. 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (patente internacional WO 91/00360, WO92/200373 y patente europea EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden utilizarse utilizando procedimientos de unión cruzada adecuados. Los agentes de unión cruzada adecuados son bien conocidos en la materia y se describen en la patente americana U.S. 4.676.980, junto con diversas técnicas de unión cruzada.

Las técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos están también descritas en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando la unión química. Brennan y col., Science 229:81 81995) describen un procedimiento en donde los anticuerpos se cortan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito sódico, agente acomplejante de ditiol, para estabilizar los ditioles y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos F(ab')_{2} generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados del Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'- TNB para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico producido se puede utilizar como agente para la inmovilización selectiva de enzimas.

El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pueden ser acoplados químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico humanizado F(ab')_{2}. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente en E. coli y se sometió al acoplamiento químico in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a las células que sobrexpresaban el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos contra las dianas de tumores de mama humanos.

Se han descrito diversas técnicas para generar y aislar los fragmentos de anticuerpos biespecíficos del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos distintos mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la realización de fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado con un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un engarce, que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Según ello, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios VH y VL complementarios de otro fragmento, formando en consecuencia sitios de unión antigénica. También se ha publicado otra estrategia para la realización de fragmentos de anticuerpo biespecíficos, mediante la utilización de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv). Ver Gruger y col., J. Immunol 152:5368 (1994).

También se consideran los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt y col., J. Immunol 147:60 (1991).

(vii) Diseño de la función efectora

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención respecto a su función efectora, a fin de, por ejemplo, incrementar la eficacia del anticuerpo para unirse a IgE. Por ejemplo, se pueden introducir residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces intracatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o de eliminación de células mediada el complemento y de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver Caron y col., J Exp Med 176:1191-1195 (1992) y Shopes B, J. Immunol, 148:2918-2922 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga regiones duales y pueda tener en consecuencia una lisis por complemento y capacidades ADCC incrementadas. Ver Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

(viii) Inmunoconjugados

La invención también abarca los inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito aquí y conjugado con un agente citotóxico, como un agente quimioterapéutico, toxina (p.ej., una toxina activa enzimáticamente procedente de bacterias, hongos, plantas o de origen animal, o fragmentos de lo mismo), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos de utilidad en la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito con anterioridad. Las toxinas activas enzimáticamente y los fragmentos que pueden utilizarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos de no unión de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas diantinas. Las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, la curina, la crotina, el inhibidor de la Sapaonaria officinallis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la pheomicina, la enomicina y los tricotecenos. Están disponibles diversos radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen el Bi^{212}, I^{131}, In^{131}, Y^{90} y el Re^{186}.

Los conjugados del anticuerpo y del agente citotóxico se realizan utilizando diversos agentes acoplantes de proteínas bifuncionales como el N-succinimidil-3-(2-piriditiol) propionato (SPDP), el iminotiolano (IT), los derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetil adipimidato HCl), los ésteres activos (como el disuccinimidil suberato), los aldehidos (como el dimetil adipimidato HCl), los aldehidos (como el glutaraldehido), los compuestos de bisazido (como la bis-p-(azidobenzoil)hexanediamida), los derivados de bis-diazonium (como la bis-p(diazonio-benzoil)-etilen-diamina), los diisocianatos (como el tolieno 2,6-diisocianato) y los compuestos de flúor bis-activo (como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse tal como se describe por Vitetta y col., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilén tetraamino-pentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14es un ejemplo de agente quelante para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Ver la patente internacional WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse con una"molécula receptora" (como la estreptavidina) para la utilización en el premarcaje del tumor cuando el conjugado anticuerpo- moléculareceptora se administra al paciente, seguido por la eliminación del conjugado no unido de la circulación, utilizando un agente de eliminación y luego administrando un "ligando" (p.ej. la avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (p.ej., un radionucleótido).

(ix) Inmunoliposomas

Los anticuerpos mutantes descritos aquí pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen anticuerpos se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, como los descritos en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA y patente americana U.S. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un tiempo de circulación incrementado se describen en la patente americana U.S. 5.013.556.

Los liposomas de especial utilidad se pueden generar mediante el procedimiento de la evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina PEG- modificada (PEG-PE). Los liposomas se criban a través de filtros de tamaño de poro definido para rendir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas, tal como se describe en Martin y col., J Biol. Chem 257:286-288 (1982), mediante una reacción de intercambio de disulfuros. Un agente quimioterapéutico (como la Doxorubicina) puede estar opcionalmente contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon y col., J National Cancer Inst 81 (19):1484 (1989).

(x) Terapia profármaco mediada por enzimas y dependiente de anticuerpos (ADEPT)

El anticuerpo de la presente invención también puede utilizarse en la terapia ADEPT, mediante conjugación del anticuerpo con una enzima de activación profármaco que convierte un profármaco (p.ej., un agente quimioterapéutico peptidil, ver la patente internacional WO81/01 145) en un fármaco anti-cáncer activo. Ver, por ejemplo, la patente internacional WO 88/07378 y la patente americana U.S. 4.975.278.

El componente enzimático del inmunoconjugado de utilidad para la terapia ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco, de tal modo que lo convierte en su forma citotóxica más activa.

Las enzimas que se utilizan en el procedimiento de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la fosfatasa alcalina útil para la conversión de los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; la arilsulfatasa útil para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; la citosina desaminasa útil para convertir la 5-fluorocitosina no-tóxica en el fármaco anti-cáncer, el 5-fluorouracil; las proteasas como la proteasa de Serratia, la termolisina, la subtilisina, las carboxipeptidasas y las catepsinas (como las catepsinas B y L), que son útiles para convertir los profármacos que contienen un péptido en fármacos libres; las D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir los profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; las enzimas que cortan carbohidratos como la \beta-galactosidasa y la neuraminidasa útiles para convertir los profármacos glicosilados en fármacos libres; la \beta-lactamasa útil para convertir los fármacos modificados con \beta-lactamas en fármacos libres; y las amidasas de la penicilina, como la amidasa V de penicilina o la amidasa G de penicilina, útiles para convertir los fármacos modificados con grupos feniloxiacetil o fenilacetil en sus nitrógenos de aminas, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la materia como "abzimas", pueden utilizarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos libres activos (Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzimas pueden prepararse tal como se describe aquí para la liberación de la abzima a una población de células tumorales.

Las enzimas de la presente invención pueden unirse covalentemente con el anticuerpo mutante mediante técnicas bien conocidas en la materia, tal como la utilización de los reactivos de unión cruzada y heterobifuncionales discutidos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión, que comprenden por lo menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención unida a por lo menos una porción activa funcionalmente de una enzima de la invención, se pueden construir utilizando técnicas del DNA recombinantes bien conocidas en la materia (Neuberger y col., Nature 312:604-608 (1984)).

(xi) Fusiones epitópicas de unión del receptor de recuperación con el anticuerpo

En algunas realizaciones de la presente invención, puede ser deseable utilizar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, por ejemplo, para incrementar la penetración en el tumor. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de incrementar su vida media en el suero. Ello se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epitopo de unión del receptor de recuperación con el fragmento de anticuerpo (p.ej., mediante mutación de la región adecuada en el fragmento de anticuerpo, o mediante la incorporación del epitopo en una etiqueta peptídica que se fusiona con el fragmento de anticuerpo en cualquier extremo, o en mitad de la molécula, p.ej., mediante síntesis de DNA o peptídica).

El epitopo de unión del receptor de recuperación constituye una región en donde se transfiere cualquier residuo(s) de aminoácido(s) de uno o dos bucles de un dominio Fc a una posición análoga en el fragmento del anticuerpo. Más preferentemente, se transfieren tres o más residuos de uno o dos bucles del dominio Fc. Aún más preferentemente, el epitopo se obtiene del dominio CH2 de la región Fc (p.ej., de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o VH, o a más de una de dichas regiones, del anticuerpo. Alternativamente, el epitopo se obtiene del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o VL, o ambas, del fragmento de anticuerpo.

(xii) Otras modificaciones covalentes del anticuerpo

Se incluyen dentro del ámbito de la presente invención las modificaciones covalentes del anticuerpo. Éstas se pueden realizar mediante síntesis química o mediante corte enzimático o químico del anticuerpo, si es posible. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar los residuos aminoacídicos diana del anticuerpo con un agente modificador orgánico, capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales.

Los residuos cisteinil se hacen reaccionar generalmente con \alpha-haloacetatos (y las aminas correspondientes), como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para proporcionar derivados carboximetil o carboxiamidometil. Los residuos cisteinil también se modifican mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, el ácido a-bromo-\beta-(5-imidozoil)propiónico, el cloroacetil fosfato, las N-alquilmaleimidas, el 3-nitro-2-piridil disulfuro, el metil 2-piridil disulfuro, el p-cloromercuribenzoato, el 2-cloromercura-4-nitrofenol, o el cloro-7-nitrobenceno-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidil se modifican por la reacción con el dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0, ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidil. También se utiliza el para-bromofenacil bromuro; cuya reacción se lleva a cabo en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinil y amino-terminales se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La modificación de estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinil. Otros reactivos adecuados para la modificación de residuos que contienen \alpha-amino incluyen los imidoésteres como el metil picolinimidato, el fosfato de piridoxal, el piridoxal, el cloroborohidruro, el ácido trinitrobencenosulfónico, la O-metilisourea, la 2,4-pentanediona y la reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los residuos arginil se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, como el fenilglioxal, el 2,3-butanediona, el 1,2-ciclohexanediona y la nihidrina. La modificación de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al pK_{a} elevado del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo amino-épsilon de la arginina.

La modificación específica de los residuos de tirosil puede realizarse, con interés particular para la introducción de marcajes espectrales en los residuos de tirosil mediante la reacción con compuestos de diazonio aromático o con tetranitrometano. Más comúnmente, el N-acetilimidizol y el tetranitrometano se utilizan para formar especies de O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosil se yodinan con I^{125} o I^{131} para preparar las proteínas marcadas de utilidad en radioinmunoensayos.

Los grupos laterales carboxil (aspartil o glutamil) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N=C=C-R'), en donde R y R' son grupos alquil distintos, como el 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o el 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos aspartil y glutamil se convierten en residuos asparraguinil y glutaminil mediante reacción con iones amonio.

Los residuos glutaminil y asparraguinil se desaminan frecuentemente en los residuos glutamil y aspartil correspondiente. Estos residuos se desamidan en condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos seril o treonil, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos en el anticuerpo. Estos procedimientos presentan la ventaja de que no requieren la producción del anticuerpo en una célula huésped con capacidad de glicosilación para N- u O-glicosilación. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar (azúcares) puede unirse en: (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxil libres; (c) grupos sulfidril libres como los de la cisteína; (d) grupos hidroxil libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, la tirosina o el triptófano; o (f) el grupo amida o glutamina. Estos procedimientos se describen en la patente internacional WO 87/05330 publicada el 11 de setiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pp. 259-306 (1981).

La eliminación de porciones de carbohidratos presentes en el anticuerpo puede lograrse enzimática o químicamente. La desglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo con el compuesto ácido trifluorometansulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado el corte de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el anticuerpo intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin y col., Arch. Biochem. Biophys 259:52 (1987) y por Edge y col., Anal Biochem 118:131 (1981). El corte enzimático de las porciones de carbohidratos en los anticuerpos puede lograrse mediante la utilización de una diversidad de endo- y exo-glicosidasas, tal como se describe por Thotakura y col., Meth Enzymol 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo con uno de los diversos polímeros no-proteicos, p.ej., el polietilén glicol, el polipropilén glicol, o los polioxialquilenos, en la forma descrita en las patentes americanas U.S. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 o 4.179.337.

B. Vectores, células huésped y procedimientos recombinantes

La invención también proporciona el ácido nucleico que codifica para una anticuerpo mutante, tal como se describe aquí, los vectores y las células huésped que comprenden el ácido nucleico y las técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo mutante.

Para la producción recombinante del anticuerpo mutante, se aísla y se inserta el ácido nucleico codificante en un vector replicable para el posterior clonaje (amplificación del DNA) o expresión. El DNA que codifica para el anticuerpo monoclonal mutante se aísla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (p.ej., utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo mutante). Muchos vectores están actualmente disponibles. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador de la transcripción, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción.

(i) Componente de la secuencia señal

El anticuerpo mutante de la presente invención puede producirse de forma recombinante, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que preferentemente es una secuencia señal u otro polipéptido con una diana de corte específica en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferentemente una señal que pueda ser reconocida y procesada (es decir, cortada por la peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconozcan ni procesen la secuencia señal nativa del anticuerpo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, procedente del grupo de la alcalina fosfatasa, la penicilinasa, Ipp, o los líderes de la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal nativa puede sustituirse, por ejemplo, por el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor-\alpha (incluyendo los líderes del factor-\alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en la patente internacional WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, se dispone de las secuencias señal de mamífero así como los líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simplex.

El DNA para dicha región precursora se liga en el mismo marco de lectura con el DNA que codifica para el anticuerpo mutante.

(ii) Origen del componente de replicación

Tanto los vectores de expresión como de clonaje contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonaje esta secuencia es una que permite la replicación del vector de forma independiente a la del DNA cromosómico del huésped, e incluye los orígenes de replicación o las secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias se conocen en una gran variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es adecuado para las levaduras y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonaje en células de mamífero. En general, el origen de replicación del componente no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 puede ser utilizado de forma característica tan sólo porque contiene el promotor temprano).

(iii) Componente del gen de selección

Los vectores de expresión y clonaje pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, p.ej., la ampicilina, la neomicina, el metrotexato, o la tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suplementan nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, p.ej., el gen que codifica para la D-alanina racemasa de Bacilli.

Un ejemplo de esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y en consecuencia sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante, son la utilización de los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables para las células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico del anticuerpo, como los genes de DHFR, timidina quinasa, metalotioneína-I y -II, preferentemente metalotioneínas de primates, adenosina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican en primer lugar mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contenga metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo del DHFR. Si se utiliza el DHFR de tipo salvaje, una célula huésped adecuada es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR.

Alternativamente, las células huésped (en particular los huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno, transformados o co-transformados con las secuencias de DNA que codifican para el anticuerpo, la proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable como la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH), pueden seleccionarse mediante crecimiento celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, como por ejemplo un antibiótico aminoglicosídico, p.ej., la kanamicina, la neomicina, o el G418. (Patente americana, U.S. 4.965.199).

Un gen de selección adecuado para utilizar con levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido Yrp7 (Stinchcomb y col., Nature 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer sin triptófano, por ejemplo ATCC 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics 85:12 (1977). El porcentaje de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona así un entorno eficaz para la detección de la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De modo similar, las cepas de levadura Leu2-deficientes (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan por los plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido circular 1,6 \mum pKD1 pueden utilizarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina vacuna recombinante se reportó para K. lactis, Van den Berg, Biol Technology 8.135 (1990). También se han descrito los vectores multicopias y de expresión estable para la secreción de albúmina humana recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer y col., Biol Technology 9.968-975 (1991).

(iv) Componentes del promotor

Los vectores de clonaje y expresión contienen generalmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico del anticuerpo. Los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas de promotor de la \beta-lactamasa y de la lactosa, la alcalina fosfatasa, un sistema de promotor del triptófano (trp) y los promotores híbridos como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Los promotores para la utilización en sistemas de bacterias también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al DNA que codifica para el anticuerpo.

Se conocen las secuencias promotoras de eucariotas. En teoría, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Otra secuencia que se halla a 70-80 pares de bases cadena arriba del sitio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de muchos genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli-A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en los vectores de expresión eucariota.

Ejemplos de secuencias promotoras para utilizar con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa o las enzimas glicolíticas, como la enolasa, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras que son promotores inducibles, con la ventaja de proporcionar una transcripción controlada mediante las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas de degradación asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneina, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen en la patente europea EP 73.657. Las secuencias intensificadoras de la transcripción de levaduras también se utilizan ventajosamente con los promotores de levaduras.

La transcripción de anticuerpos a partir de los vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por los promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma de aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el virus Simian 40 (SV40), por promotores heterólogos de mamífero, p.ej., el promotor de la actina o un promotor de una inmunoglobulina y por promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma adecuada como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral de replicación de SV40. El promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus se obtiene de forma adecuada como un fragmento de restricción HindIII. Un sistema para la expresión de DNA en huéspedes de mamífero que utiliza el virus del papiloma aviar como vector se describe en la patente americana U.S. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente americana U.S. 4.601.978. Alternativamente, el cDNA del interferón-\beta humano se ha expresado en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus herpes simplex. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous puede utilizarse como promotor.

(v) Componentes del elemento intensificador

La transcripción de un DNA que codifica para el anticuerpo de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa a menudo insertando una secuencia intensificadora de la transcripción en el vector. Actualmente, se conocen muchas secuencias intensificadoras de la transcripción de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, se utilizará generalmente una secuencia intensificadora de un virus de célula eucariota. Ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en el sitio tardío del origen de replicación (pb 100-270), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador del sitio tardío del origen de replicación del polioma y los intensificadores de adenovirus. Ver también, Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) con elementos intensificadores para la activación de promotores eucariotas. El intensificador puede ayustarse en el vector en una posición 5' ó 3' de la secuencia codificante del anticuerpo, pero se localiza preferentemente en 5' del promotor.

(vi) Componentes de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (células de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias están disponibles comúnmente desde las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de los DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica para el anticuerpo. Un componente de la terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver la patente internacional WO94/11026 y el vector de expresión aquí descrito.

(vii) Selección y transformación de células huésped

En la presente invención, las células huésped adecuadas para el clonaje o la expresión del DNA en los vectores son las procariotas, las levaduras o las células eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen las eubacterias, como los organismos Gram negativos o las Gram positivo, por ejemplo, Enterobacteria como Escherichia, p.ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ej., Salmonella typhimurium, Serratia marcescans y Shigella, así como también Bacilli como B. subtilis y B. licheniformis (p.ej., B. Licheniformis 41P descrito en DD 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonajes de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque también son adecuadas otras cepas de E. coli B., E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes.

Además de los microbios procariotas, los eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes adecuados para el clonajes o para la expresión de vectores que codifican para un anticuerpo. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura del pan, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, están disponibles otros géneros, especies y cepas que son de utilidad en la presente invención, como los huéspedes de Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces como, por ejemplo, K.lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K.wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa; Schawannimyces como Schwanniomyeces occidentalis; y hongos filamentosos como p.ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocadium y Aspergillus como A. Nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilados derivan de organismos multicelulares. En principio, cualquier cultivo celular de eucariotas superiores es factible, bien sean cultivos de vertebrados o de invertebrados. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos, Luckow y col., BiolTechnology 6:47-55 (1988); Miller y col., Genetic Engineering, Setlow y col., eds. Vol 8, pp. 277-279 (Plenam publising 1986); Mseda y col., Nature 315:592-594 (1985). Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las células huésped de insecto permisivas como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una línea celular de interés especial es la línea celular de insecto sf9. En la actualidad, existen diversas cepas virales para la transfección de disponibilidad pública, p.ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV. Dichos virus pueden utilizarse como el virus de elección de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Además, los cultivos de células de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también pueden utilizarse como huéspedes.

Sin embargo, se ha prestado un mayor interés a las células de vertebrados, con lo que su propagación en cultivo (cultivo de tejidos) ha devenido un procedimiento de rutina. Ver Tissue Culture. Academic Press, kruse y Patterson, eds. (1973). Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos de utilidad son la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrional humana (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col.,J Gen Virol 36:59 (1977)); las células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216 (1980)); las células de Sertoli de ratón (TM4, Maher, Biol Reprod 23:243-251 (1980)); las células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); las células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); las células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y la línea de hepatoma humano (Hep G2).

Para la producción del anticuerpo, las células huésped se transforman con los vectores de clonaje o expresión anteriormente descritos y se cultivan en medio nutritivo modificado adecuadamente para la inducción de promotores, selección de transformantes, o amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de células huésped

Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo mutante de la presente invención pueden cultivarse en diversos medios. Medios disponibles comercialmente y adecuados para el cultivo de células huésped son el Ham F10 (Sigma), el Medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma) y el Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma). Además, pueden utilizarse como medio de cultivo para células huésped, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enzymol 58:44 (1979), Barnes y col., Anal Biochem 102:255 (1980), patente americana U.S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; la patente internacional WO 87/00195 o la patente americana U.S. Patent Re. 30.985. Cualquiera de estos medios se puede suplementar si fuera necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferrina, o el factor epitelial de crecimiento), sales (como los X-cloruros, en donde X es sodio, calcio, magnesio; y fosfatos), tampones (como el HEPES), nucleótidos (como la adenosina y la timidina), antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™, oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes generalmente a concentraciones finales del orden micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario puede también incluirse a concentraciones adecuadas, según los criterios del experto en la materia. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares, son las anteriormente utilizadas con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes a un experto en la materia.

(ix) Purificación de anticuerpos

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo mutante puede producirse intracelularmente en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo mutante se produce intracelularmente, en una primera etapa se eliminan los restos celulares, bien células huésped o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter y col., Biol Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para el aislamiento de anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico de E. coli. En resumen, el sedimento celular, como una pasta, se resuspende en acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares se eliminan a continuación mediante centrifugación. Si el anticuerpo mutante se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran en primer lugar mediante un filtro de concentración proteica disponible comercialmente, por ejemplo, la unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa A como el PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes
fortuitos.

La composición de anticuerpos preparado a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, la cromatografía de hidroxilapatita, la electroforesis en gel, la diálisis y la cromatografía de afinidad, siendo ésta última la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies e isótopos del dominio de Fc de inmunoglobulina presentes en el anticuerpo mutante. La proteína A se puede utilizar para purificar los anticuerpos basados en las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2 o \gamma4 humanas (Lindmark y col., J Immunol Meth 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humano (Guss y col., EMBO J 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la que generalmente se une el ligando de afinidad es frecuentemente la agarosa, pero también hay disponibles otras matrices. Las matrices estables mecánicamente como las de vidrio poroso controlado o las de poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento menores que los alcanzados con la agarosa. Si el anticuerpo mutante comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXTM (J. T. Baker, Phillispsburg, NJ) es útil para la purificación. También están disponibles, dependiendo del anticuerpo mutante a recuperar, otras técnicas para la purificación de proteínas como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía de SEPHAROSE™ o una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido aspártico), el cromatoenfoque, SDS-PAGE y la precipitación con sulfato amónico.

Después de cualquier etapa(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo mutante de interés y los contaminantes pueden someterse a una cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo, utilizando un tampón de elución a un pH de aproximadamente 2,5-4,5, realizado preferentemente a concentraciones bajas de sal (p.ej., desde aproximadamente 0-0,25 M de sal).

C. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del polipéptido o anticuerpo se preparan para el almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas, mezclando el polipéptido que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables utilizados comúnmente en la materia (denominados todos ellos "excipientes"). Por ejemplo, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificadores, detergentes no-iónicos, antioxidantes y diversos otros aditivos. (Ver Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, A. Osol, Ed. (1980)). Dichos aditivos no deben ser tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones utilizadas.

Los agentes ayudan a mantener el pH en un intervalo aproximado a las condiciones fisiológicas y preferentemente están presentes a una concentración en el rango de aproximadamente 2 mM a 50 mM. Los agentes tamponantes adecuados para utilizar con la presente invención incluyen los ácidos orgánicos e inorgánicos y las sales de lo mismo, como los tampones de citrato (p.ej., mezcla de citrato disódico-monosódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), los tampones de succinato (p.ej., mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (p.ej., mezcla de ácido tartárico-tartrato sódico, ácido tartárico-tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (p.ej., mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (p.ej., mezcla de ácido glucónico-gliconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gliconato potásico, etc.), tampones de oxalato (p.ej., mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato potásico, etc.), tampones de lactato (p.ej., mezcla de ácido láctico-lactato sódico, mezcla de ácido láctico-hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato potásico, etc.) y tampones de acetato (p.ej., mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.). Adicionalmente, se puede también mencionar en este apartado a los tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina como el Tris.

Para retrasar el crecimiento microbiano se añaden conservantes a una concentración del 0,2%-1% (p/v). Conservantes adecuados para utilizar con la presente invención incluyen el fenol, el bencil-alcohol, el meta-cresol, el metil parabén, el propil parabén, el octadecildimetilbencil amonio cloruro, los haluros de benzalconio (p.ej., el cloruro, el bromuro, el yoduro), el cloruro de hexametonio, los alquil parabenos como el metil o el propil parabén, el catecol, el resorcinol, el ciclohexanol y el 3-pentanol.

Los isotonificadores conocidos también como "estabilizantes" están presentes para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente invención e incluyen los alcoholes de azúcar polihídricos, preferentemente los alcoholes de azúcar trihídrico o superiores, como la glicerina, el eritritiol, el arabitol, el xilitol y el manitol. Los alcoholes polihídricos se pueden presentar en una cantidad entre el 0,1% al 25% en peso, preferentemente del 1% al 5% teniendo en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes.

Los estabilizantes hacen referencia a una amplia categoría de excipientes con funciones variables, desde un agente espesante a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del recipiente. Estabilizantes típicos pueden ser los alcoholes de azúcar polihídricos (enumerados anteriormente); los aminoácidos como la arginina, la lisina, la glicina, la glutamina, la asparraguina, la histidina, la alanina, la ornitina, la L-leucina, la 2-fenilalanina, el ácido glutámico, la treonina, etc.; los azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar como la lactosa, la trehalosa, el manitol, el sorbitol, el xilitol, el ribitol, el mioinisitol, el galactitol, el glicerol y similares, incluyendo los ciclitoles como el inositol; el polietilén glicol; los polímeros de aminoácidos; los agentes reductores que contienen azufre, como la urea, el glutatión, el ácido tióico, el tioglicolato sódico, el tioglicerol, el \alpha-monotioglicerol y el sodio tiosulfato; los polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, < 10 residuos); las proteínas como la albúmina sérica humana, la albúmina sérica bovina, la gelatina o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos, como los monosacáridos de polivinilpirrolidona, como la xilosa, la manosa, la fructosa, la glucosa; los disacáridos como la lactosa, la maltosa, la sacarosa y los trisacáridos como la rafinosa; los polisacáridos como el dextrán. Los estabilizantes sehallan a una concentración de 0,1 a 10.000 partes en peso por peso de proteína activa.

Los tensoactivos no-iónicos o detergentes (también conocidos como "agentes humectantes") están presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agregación, que también permite que la formulación se exponga a fuerzas de corte superficial sin causar la desnaturalización de la proteína. Los tensoactivos no-iónicos adecuados incluyen los polisorbatos (20, 80, etc.), los polioxámeros (184, 188, etc.), los polioles Pluronic®, los monoéteres de polioxietilén sorbitán (Tween®-20, Tween®-80, etc.). Los tensoactivos no-iónicos están presentes en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 0,05 mg/ml a 1,0 mg/ml, preferentemente a aproximadamente 0,07 mg/ml a 0,2 mg/ml. Diversos excipientes adicionales incluyen los agentes espesantes (p.ej., el almidón), los agentes quelantes (p.ej., EDTA), los antioxidantes (p.ej., el ácido ascórbico, la metionina, la vitamina E) y los cosolventes.

La formulación presente también puede contener más de un compuesto activo, según sea necesario para la indicación particular a tratar, preferentemente serán aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente unas con otras. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente inmunosupresor. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades efectivas para el propósito específico.

Los ingredientes activos también pueden incluirse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de liberación del fármaco coloidal (por ejemplo los liposomas, las microsferas de albúmina, las microemulsiones, las nano-partículas y las nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, A. Osal, Ed. (1980).

Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas estériles.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo mutante, estando dichas matrices en la forma de artículos moldeados, p.ej., películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato), o el poli(vinilalcohol), los poliláctidos (patente americana U.S.3.773.319), los copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamina, el etilén vinil-acetato no degradable, los copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como elLUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas del copolímero ácido láctico-ácido glicólico y el leuprolido acetato), y poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como el etilén vinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante aproximadamente 100 días, algunos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Se pueden elaborar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares mediante el intercambio de tio-sulfuros, la estabilización puede lograrse modificando los residuos sulfidrilos, liofilizando las soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices con polímeros específicos.

La cantidad de polipéptido terapéutico, anticuerpo o fragmento de lo mismo que será efectiva en el tratamiento de un trastorno determinado dependerá de la naturaleza o condición del trastorno y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándares. Si es posible, es deseable determinar la curva de dosis-respuesta y las composiciones farmacéuticas de la invención, primero in vitro y luego en sistemas de modelos animales de utilidad antes de probarlo en humanos. Sin embargo, según el conocimiento general en la materia, una composición farmacéutica efectiva en promover la supervivencia de neuronas sensoriales puede proporcionar una concentración de agente terapéutico de entre 5 y 20 ng/ml y, preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 ng/ml. En una realización específica adicional de la invención, una concentración farmacéutica efectiva en promover el crecimiento y la supervivencia de las neuronas retinales puede proporcionar una concentración de agente terapéutico local de entre 10 ng/ml y 100 ng/ml.

En una realización preferida, una solución acuosa de polipéptido terapéutico, anticuerpo o fragmento de lo mismo se administra mediante inyección subcutánea. Cada dosis puede variar desde aproximadamente 0,5 \mug a 50 \mug por kilogramo de peso corporal, o más preferentemente, desde aproximadamente 3 \mug a 30\mug por kilogramo de peso corporal.

El esquema de dosificación para la administración subcutánea puede variar desde una vez a la semana a diariamente, dependiendo de diversos factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, gravedad de la enfermedad y sensibilidad del individuo al agente terapéutico.

D. Utilizaciones no-terapéuticas del anticuerpo mutante

Los anticuerpos mutantes de la invención pueden utilizarse como agentes de purificación de la afinidad. En dicho proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida como la resina de Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado mutante se pone en contacto con una muestra que contiene el antígeno a purificar, y en consecuencia, se lava el soporte con un solvente adecuado que eliminará esencialmente todo el material en la muestra, excepto el antígeno a purificar, que se une al anticuerpo mutante inmovilizado. Por último, el soporte se lavó con otro solvente adecuado, como el tampón glicina a pH 5,0, que liberará el antígeno del anticuerpo mutante.

Los anticuerpos mutantes también pueden ser útiles en ensayos diagnósticos, p.ej., para la detección de la expresión de un antígeno de interés en células y tejidos específicos o en suero.

Para aplicaciones diagnósticas, el anticuerpo mutante estará marcado típicamente con una porción detectable. Numerosos marcajes están disponibles, los cuales se pueden agrupar en las siguientes categorías:

(a) Radioisótopos, como S^{36}, C^{14}, I^{125}, H^{3} y I^{131}. El anticuerpo mutante puede marcarse con el radioisótopo utilizando técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, vol 1-2, Coligen y col., Ed., Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991) por ejemplo, y la radioactividad puede cuantificarse utilizando el contaje por centelleo.

(b) Marcajes fluorescentes como por ejemplo, los quelatos térreos raros (quelatos de europio), o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, el dansilo, la lisamina, la ficoeritrina y el Texas Red. Los marcajes fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo mutante utilizando técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro.

(c) Marcajes de enzima-sustrato. En la patente americana U.S. 4.275.149 se proporciona una revisión de algunos de estos marcajes. La enzima cataliza generalmente una alteración química del sustrato cromogénico que puede cuantificarse utilizando diversos moldes. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede cuantificarse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describieron anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se torna electrónicamente excitable mediante una reacción química, pudiéndose así generar luz que puede cuantificarse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo), o también puede ceder energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcajes enzimáticos incluyen la luciferasa (p.ej., la luciferasa de la libélula y la luciferasa bacteriana; patente americana U.S. 4.737.456), la luciferina, las 2,3-dihidroftalacinedionas, la malato deshidrogenasa, la ureasa, la peroxidasa como la peroxidasa de rábano (HRPO), la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la glucosamilasa, la lisozima, las oxidasas de sacárido (p.ej., la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), las oxidasas heterocíclicas (como la uricasa y la xantina oxidasa), la lactoperoxidasa, la microperoxidasa y similares. Las técnicas para la conjugación de enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan y col., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981).

Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen entre otros:

(i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor del colorante (p.ej., la ortofenilén diamina (OPD) o el 3,3',5,5'-tetrametil bencidina hidrocloruro (TMB));

(ii) la fosfatasa alcalina (AP) con el p-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y

(iii) la \beta-D-galactosidasa (\beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico (p.ej., p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa) o el sustrato fluorogénico 4-metillumbeliferil-\beta-D-galactosidasa.

El experto en la materia hallará también muchas otras combinaciones disponibles de enzimas-sustrato. Para una revisión general de dichas combinaciones ver las patentes americanas U.S. 4.275.149 y 4.318.980.

Algunas veces, el marcaje se conjuga indirectamente con el anticuerpo mutante. El experto en la materia estará al corriente de las muy diversas técnicas para realizarlo. Por ejemplo, el anticuerpo mutante puede conjugarse con biotina, y cualquiera de las tres amplias categorías de marcajes mencionados puede conjugarse con la avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente con la avidina y en consecuencia, el marcaje puede conjugarse con el anticuerpo mutante de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr una conjugación indirecta del marcaje con el anticuerpo mutante, el anticuerpo mutante se conjuga con un pequeño hapteno (p.ej., la digloxina) y uno de los tipos distintos de marcajes mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo mutante anti-hapteno (p.ej., anticuerpo anti-digloxin). En consecuencia, se puede lograr la conjugación indirecta del marcaje con el anticuerpo mutante.

En otra realización de la invención, el anticuerpo mutante no necesita marcarse y la presencia del mismo puede detectarse utilizando un anticuerpo marcado que se una con el anticuerpo mutante.

Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, como los ensayos de unión competitivos, ensayos de sándwich directos e indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technique, pp. 147-158 (CRC Press. Inc. 1987).

Los ensayos de unión competitiva se apoyan en la capacidad de un estándar marcado para competir con una muestra test por la unión a una cantidad limitada de anticuerpo mutante. La cantidad de antígeno en la muestra test es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une con los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, generalmente se insolubilizan los anticuerpos antes o después de la competición. Como resultado, el estándar y la muestra test que se unen a los anticuerpos pueden separarse de forma adecuada a partir del estándar y la muestra test que permanecen no unidos.

Los ensayos de sándwich implican la utilización de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica distinta, o epitopo, o la proteína a detectar. En un ensayo de sándwich, la muestra test a analizar se une mediante un primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido y después un segundo anticuerpo se une a la muestra test, formando así un complejo de tres partes insoluble. Ver por ejemplo, la patente americana U.S. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar marcado con una porción detectable (ensayos sándwich directos), o puede cuantificarse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se marca con una porción detectable (ensayo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo sándwich es un ensayo ELISA, en donde la porción detectable es una enzima.

Para inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser fresca o congelada o puede estar incluida en parafina y fijada con un conservante, por ejemplo, como la formalina.

Los anticuerpos pueden utilizarse para ensayos diagnósticos in vivo. En general, el anticuerpo mutante está marcado con un radionucleótido (como In^{111}, Tc^{99}, C^{14}, I^{131}, H^{3}, P^{32} o S^{35}) de modo que el tumor puede localizarse utilizando inmunoescintiografía.

E. Equipos diagnósticos

Por conveniencia, el polipéptido o el anticuerpo de la presente invención pueden proporcionarse en un equipo, es decir, una combinación de reactivos empaquetados en cantidades predeterminadas con las instrucciones para realizar el ensayo diagnóstico. Si el anticuerpo mutante se marca con una enzima, el equipo incluye los sustratos y cofactores necesarios para la enzima (p.ej., un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o el fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos como estabilizantes, tampones (p.ej., un tampón global o un tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que optimicen esencialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, generalmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivo con la concentración adecuada.

F. Utilizaciones in vivo para el polipéptido o el anticuerpo

Se contempla que los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención puedan utilizarse para el tratamiento de un animal. El anticuerpo puede administrarse a un animal no humano con el propósito, por ejemplo, de obtener resultados preclínicos. Ejemplos de mamíferos no humanos a tratar incluyen los primates no humanos, los perros, los gatos, los roedores y otros mamíferos en los que se pueden desarrollar estudios preclínicos. Dichos mamíferos pueden establecerse como modelos animales para una enfermedad a tratar con el anticuerpo o pueden utilizarse para estudiar la toxicidad del anticuerpo de interés. Los estudios de aumento progresivo de la dosis deben realizarse con mamíferos.

El anticuerpo o el polipéptido se administran mediante cualquiera medio conocido, incluyendo el parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, la administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo mutante se administra adecuadamente mediante un pulso de infusión, en particular con dosis decrecientes de anticuerpo mutante. Preferentemente, la dosis se proporciona mediante inyecciones, más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte si la administración es de corta durada o es crónica.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación adecuada del anticuerpo o polipéptido dependerá del tipo de enfermedad a tratar, de la gravedad y duración de la enfermedad, de si el anticuerpo mutante se administra para prevenir o con propósitos terapéuticos antes de la terapia, de la historia clínica del paciente, de la respuesta al anticuerpo mutante y de la discreción del médico. El anticuerpo anti-IgE humana se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo gravedad de la enfermedad, de 1 \mug/Kg a 150 mg/Kg (p.ej., 0,1-20 mg/Kg) aproximadamente de anticuerpo o polipéptido corresponden con una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, mediante una o más administraciones separadas, o mediante una infusión continua. Una dosificación diaria típica puede hallarse en el intervalo de 1 \mug/Kg a 100 mg/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la gravedad de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta la deseada desaparición de los síntomas. Sin embargo, se pueden utilizar otros regímenes de dosificación. El progreso de la terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Un ejemplo de régimen de dosificación para un anticuerpo anti-LFA o anti-ICAM-1 se describe en la patente internacional WO 94/04188.

La composición de anticuerpo mutante se formulará, dosificará y administrará de acuerdo con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen la enfermedad particular a tratar, el mamífero en particular que se trata, la condición clínica del paciente, la causa de la enfermedad, el lugar de liberación del agente, el procedimiento de la administración, el esquema de administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad efectiva terapéuticamente" del anticuerpo mutante a administrar se regirá por dichas consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar, o tratar una enfermedad o trastorno. Aunque no es necesario, el anticuerpo mutante se formula opcionalmente con uno o más agentes utilizados normalmente para prevenir o tratar la enfermedad en cuestión. La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad de anti-IgE humana presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Estos se utilizan generalmente con las mismas dosificaciones y con las vías de administración utilizadas anteriormente, o aproximadamente desde el 1 al 99% de las dosificaciones utilizadas aquí.

G. Artículos de fabricación

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales de utilidad para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados por diversos materiales como plástico o vidrio. El recipiente mantiene una composición que es efectiva para el tratamiento de la condición y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el anticuerpo mutante. La etiqueta en, o asociada con, el recipiente indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la condición de elección. El artículo o el producto fabricado pueden comprender además un segundo recipiente que comprenda un tampón aceptable farmacéuticamente, como la solución salina tamponada con fosfato, la solución de Ringer y la solución de dextrosa. Puede incluirse además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para su uso.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como vía de ilustración y no como limitación.

Ejemplos Ejemplo I Preparación de anticuerpos monoclonales contra IgE

Se prepararon ocho anticuerpos monoclonales (MAE10-MAE17) con la capacidad de bloquear la unión de IgE con Fc\varepsilonRI. Los anticuerpos monoclonales contra IgE se prepararon a partir de sobrenadantes de células U266B1 (ATCC TIB 196) utilizando la cromatografía de afinidad con un anticuerpo anti-IgE aislado (Genentech MAE1). Para MAE12, cinco ratones hembras BALB/c de seis semanas, se inmunizaron en las almohadillas de sus patas con 10 \mug de IgE purificada con adyuvante de Ribi. Se realizaron inyecciones siguientes de igual manera al cabo de 1 y 3 semanas después de las inmunizaciones iniciales. Tres días después de la inyección final, se extrajeron los nódulos linfáticos poplíteos y se agruparon, y se generó una suspensión celular pasando el tejido a través de un tamiz metálico. Las células se fusionaron a una proporción de 4:1 con el mieloma de ratón P3X63-Ag.653 (ATCC CRL 1580) en glucosa elevada (DMEM) que contiene el 50% de polietilén glicol 4000 p/v. Para MAE 14, MAE15 y MAE13, las inmunizaciones se realizaron de forma similar, excepto que para MAE13, se utilizaron 30 \mug de IgE por inyección y se analizó el fragmento 315-347 de IgE (Kabat) como un estímulo de perfusión. Para MAE10 y MAE11, las inyecciones se realizaron subcutáneamente en dos dosis de 100 \mug y un estímulo final de 50 \mug y las células del bazo se utilizaron para las fusiones.

Las células fusionadas se plaquearon a continuación a una densidad de 2x10^{5} por pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Al cabo de 24 horas, se añadió el medio selectivo HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina,Sigma, #H0262). De 1440 pocillos plaqueados, 365 contenían células en crecimiento después de la selección con HAT.

Quince días después de la fusión, los sobrenadantes se analizaron para la presencia de anticuerpos específicos para IgE humana utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El ELISA se realizó de la manera siguiente, con todas las incubaciones a temperatura ambiente. Las placas test (inmunoplacas Nunc) se recubrieron durante 2 horas con anti-IgG de ratón (Boehringer Mannheim, #605-500) a 1 \mug/ml en tampón carbonato sódico 50 mM, pH 9,6, luego se bloquearon con albúmina sérica bovina al 0,5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos, luego se lavaron 4 veces con PBS y Tween-20 al 0,05% (PBST). Los sobrenadantes se añadieron e incubaron dos horas con agitación, luego se lavaron cuatro veces con PBST. La IgE humana (purificada a partir de células U266, tal como se describió anteriormente) se añadió a 0,5 \mug/ml y se incubó durante 1 hora con agitación, luego se lavó cuatro veces con PBST. Se añadió la peroxidasa de rábano conjugada con anticuerpo de cabra anti-IgE humana (Kirkegarrd & Perry Labs., #14-10-04, 0,5 mg/ml) a una dilución de 1:2500 y se incubó durante 1 hora. A continuación se lavó cuatro veces con PBST. Las placas se revelaron añadiendo 100 \mul/pocillo de una solución que contenía 10 mg de o-feniléndiamina dihidrocloruro (Sigma, #P8287) y 10 \mul de una solución de peróxido de hidrógeno al 30% en 25 ml de tampón citrato-fosfato a pH 5,0 y se incubó durante 15 minutos. La reacción se paró añadiendo 100 \mul/pocillo de ácido sulfúrico 2,5M. Los resultados se obtuvieron leyendo lasplacas en un lector de placas ELISA automatizado a una absorbancia de 490 nm. Para MAE12, se analizaron 365 sobrenadantes y 100 fueron específicos para la IgE humana. Frecuencias similares de especificidad IgE se obtuvieron cuando se rastreó para los otros anticuerpos. Todos los anticuerpos monoclonales descritos aquí fueron del isotipo IgG excepto para MAE17, que fue IgG2b, y para MAE14, que fue IgG2a.

Cada uno de los anticuerpos específicos para IgE se analizó posteriormente en ensayos celulares y en placa para seleccionar los anticuerpos unidos a IgE que inhibían la unión de IgE con Fc\varepsilonRI y que no son capaces de unirse a la IgE unida a FCEH. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 1 y en la Tabla 2 siguientes:

TABLA 1

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TABLA 2

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1. Ensayos FACS para el análisis de monoclonales murinos anti-IgE. Rastro de la unión del monoclonal murino anti-IgE humana con la IgE en CHO 3D 10 (Fc\varepsilonRI alfa +).

a. Las células CHO 3D10 (transfectante de cadena estable alfa FceRI. Hakin y col., J Biol Chem 25:22079) a 5x10^{5} células por muestra se incuban con U266 IgE estándar (lote nº 13068-46) a 10 \mug/ml en 100 \mul de tampón FACS (BSA al 0,1%, azida sódica 10 mM en PBS, pH 7,4) durante 30 minutos a 4ºC seguido por un lavado con tampón FACS. La cantidad de unión de IgE se determina mediante incubación de una alícuota de células que presentan la IgE con un anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG humana conjugado con FITC (Accurate Chem. Co. AXL- 475F, lote nº 16) a 50 \mug/ml durante 30 minutos a 4ºC, seguido por tres lavados con tampón FACS.

b. Las células que expresaban la IgE se incubaron con 100 \mul de sobrenadantes de hibridoma de anti-IgE humana de origen murino (concentración de IgG murina desde 1 a 20 \mug/Ml) durante 30 minutos a 4ºC seguido por un lavado con tampón FACS. Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-IgE humana de Genentech (MaE1) a 10 \mug/ml como control positivo para la unión. El anticuerpo monoclonal (MAD 6P) que no reconoce la IgE se utilizó a 10 \mug/ml como un control negativo.

c. La unión del anticuerpo monoclonal a la IgE humana en las células CHO se detectó incubando las células con 20 \mug/ml de anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra F(ab')2 altamente purificado y FITC-conjugado (Organon Teknica, #10711-0081) durante 30 minutos a 4ºC seguido por tres lavados con tampón FACS. Las células se añadieron a 400 \mul de tampón que contenía 2 \mug/ml de yoduro de propidio (Sigma, #P4170) para teñir las células muertas.

d. Las células se analizaron con un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSAN. La luz dispersada hacia adelante y la dispersada a 90ºC del eje del haz lumínico se ajustan para analizar una población una población de células homogénea. Las células muertas que se tiñen con yoduro de propidio se excluyen del análisis. Los sobrenadantes del hibridoma que no se unen con IgE en las células CHO 3D10 se consideraron candidatos para posterior rastreo.

2. Liberación de histamina de basófilos de sangre periférica. La sangre heparinizada se obtuvo de donantes normales y se diluyó 1:4 en un tampón de Tyrodes modificado (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, Cl_{2}Ca 10 mM, MgCl2 10 mM, 0,3 mg/ml de HSA, pH 7,35) y luego se incubó con IgE humana 1 nM (ND) a 4º durante 60 minutos. Las células se añadieron al tampón Tyrodes que contenía los Abs monoclonales murinos anti-IgE (10 mg/ml) o un antisuero policlonal anti-humano como control positivo y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Las células se plaquearon, se acetiló la histamina en los sobrenadantes y se determinó la cantidad de histamina mediante un equipo de RIA (AMAC, Inc. Wesbrook, Main). La histamina total se determinó a partir de células sometidas a diversas rondas de congelación-descongelación.

3. Bloqueo de la unión de IgE conjugada con FITC a la cadena alfa de Fc\varepsilonRI. El efecto de los anticuerpos sobre la unión de IgE se estudió preincubando la IgE marcada con FITC con diversos anticuerpos MaE a 37ºC durante 30 minutos con PBS y BSA al 0,1% y azida de sodio 10 mM a pH 7,4, incubándose a continuación el complejo con 5x10^{5} células 3D10 a 4ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron a continuación tres veces y se cuantificó la fluorescencia media a 475 nm. Se utilizó un mAb murino anti-IgE humana (Mae1) que no bloquea la unión de IgE con la cadena alfa de Fc\varepsilonRI, como control.

4. Análisis de la unión del anticuerpo murino anti-IgE humana a la membrana de células B U266 IgE positivas

a. Las células U266B1 (membrana IgE +) se cultivan con medio base suplementado con suero vacuno fetal inactivado al calor al 15% (Hyclone, #A-111-L), penicilina, estreptomicina (100 unidades/ml) y L-glutamina (2 mM).

b. Las células (5x10^{5}/alícuota) se incuban en 100 \mul de tampón FACS con anticuerpos monoclonales anti-IgE humanos a 10, 5, 1, 0,5 y 0,1 \mug/ml durante 30 minutos en hielo en placas de microtitulación de fondo redondo seguido por dos lavados con tampón FACS. El anticuerpo monoclonal MAE1 de Genentech se utilizó como control positivo.

c. Las células se incubaron en 100 \mul de tampón FACS que contenía 50 \mug/ml (1:20 de solución madre) un anti-IgE murina de cabra purificado por afinidad F(ab')2 y conjugado a FITC (Organon Tekinka, #1711-0084) durante 30 minutos en hielo y seguido por tres lavados con tampón FACS. Las células se añadieron a 400 \mul de tampón FACS que contenía yoduro de propidio a 2 \mug/ml para teñir las células muertas.

5. Ensayos de unión FACS a FceRI en células B IM9 (CD23)+

a. El mieloma de célula B humana IM9 (ATCC CCL 159, Ann N.Y. Acad. Sci 190:221-234 (1972) se mantuvo en medio base GIF con suero bovino fetal inactivado al calor al 10%, penicilina, estreptomicina (100 unidades/ml) y L-glutamina (2 mM).

b. Las células (5x10^{5}/alícuota) se incubaron en 100 \mul de tampón FACS con la IgE U266 estándar a 3 \mug/ml durante 30 minutos a 4ºC en placas de microtitulación de 96 pocillos seguido por 2 lavados con tampón FACS. Como un control, las células se incubaron en tampón solo o tampón que contenía 2 \mug/ml de IgG1 humana (Behring Diagnostics, cat. 400112, lote nº 801024).

c. Las células se incubaron con anticuerpos monoclonales murinos anti-IgE humana a 0,1-10 \mug/ml durante 30 minutos en hielo. Se utilizó el anticuerpo monoclonal MAE1 como control positivo.

d. Las células se incubaron en 100 \mul de tampón FACS que contenía el anticuerpo anti-IgG murina de cabra F(ab')_{2} conjugado con FITC (Organon Teknika, #1711-0084) durante 30 minutos a 4ºC seguido de 3 lavados con el tampón FACS.

e. A continuación, se añadieron las células a 400 \mul de tampón que contenía yoduro de propidioa 2 \mug/ml para teñir las células muertas.

f. Las células se analizaron con un citómetro de flujo FACSCAN Becton Dickenson. Los canales para la dispersión de luz hacia delante y la dispersión a 90 grados del eje del haz lumínico se ajustaron para analizar una población homogénea de células, excluyéndose del análisis las células muertas teñidas con el yoduro de propidio. Las células FITC positivas (unión a IgE) se analizaron en relación con las células teñidas con sólo el anti-IgE humana de conejo conjugado con FITC.

g. En cada experimento, como un control positivo para determinar el nivel de CD23 en la superficie de las células IM9, se tiñó una alícuota de células con el monoclonal murino Leu 20 de Becton Dickinson (anti-CD23) a 10 \mug/ml durante 30 minutos y a 4ºC seguido por dos lavados. A continuación, las células se incubaron con anti-IgE murina de cabra purificado por afinidad F(ab')2 y conjugado con FITC a una concentración de 50 \mug/ml.

6. Anticuerpo bloqueante de la unión de la IgE conjugada con FITC con el receptor de IgE de baja afinidad

La unión de IgE marcada con FITC 40 nM con el receptor de IgE de baja afinidad (CD23 o Fc\varepsilonRI) expresado en la célula IM-9 de linfoblastos B se analizó mediante citometría de flujo en un citómetro FACSCAN. El efecto de los anticuerpos sobre la unión de IgE marcada con FITC se estudió preincubando la IgE-FITC con los anticuerpos quimeras murinos anti-humanos a 0,1-10 \mug/ml, a 37ºC y durante 30 minutos en PBS que contenía BSA al 0,1% y azida de sodio 10 mM a pH 7,4, e incubando luego el complejo con 5x10^{5} células a 4ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron a continuación tres veces y se cuantificó la fluorescencia media en el canal de 475 nm.

7. Protocolo de ensayo IgE in vitro

a. Se separaron las células mononucleares de sangre periférica de donantes normales.

b. Las células se lavaron extensamente con PBS para eliminar cuantas plaquetas fuera posible.

c. Las células mononucleares se contaron y resuspendieron en medio a 1x10^{6} células/ml.El medio fue una mezcla de DMEM con penicilina y estreptomicina, suero de caballo al 15%, IL-2 (25 U/ml) e IL-4 (20 ng/ml).

d. Los anticuerpos se añadieron a concentraciones adecuadas el día 0, 5 y 8.

e. Los cultivos se incubaron en placas de cultivo de tejidos Falcon de 24 pocillos durante 14 días.

f. El día 14, los sobrenadantes se extrajeron y se analizaron sus concentraciones de IgE mediante un protocolo ELISA específico de IgE.

8. Constante de afinidad (Kd) del mAb murino para la IgE humana determinada por el análisis de unión en equilibrio (Scatchard)

a. Los alotipos de IgE (ND y PS) se yodinaron con el procedimiento de T cloramina y se separaron del NaI^{125} libre con una columna PD10 Sephadex G25 (Pharmacia, #17-0851-01)) en tampón RIA; PBS, albúmina sérica bovina al 0,5% (Sigma #A-7888), Tween-20 al 0,05% (Sigma, #P-1379), timerosol al 0,01% (Sigma, #T-5125); pH 7,4. Aproximadamente, el 78-95% de los contajes post-columna se precipitaron con ácido tricloroacético al 50% y la actividad específica de las preparaciones yodinadas de IgE se hallaron entre 1,6 a 13 \mugCi/\mug asumiendo una eficiencia del contaje del 70%.

b. Se añadió una concentración fija de I^{125} (aproximadamente 5x10^{4} cpm) a concentraciones diversas de IgE no marcado (1 a 200 nM) en un volumen final de 0,1 ml de tampón RIA en tubos de ensayo de polipropileno de 12 x 75 mm. A continuación se añadieron los mAbs anti-IgE humana (concentración final de 20 mM) en 0,1 ml de tampón de RIA para un volumen de ensayo final de 0,2 ml.

c. Las muestras se incubaron durante 16-18 horas a 25ºC en agitación continua.

d. La IgE-I^{125} unida y libre se separó mediante adición de 0,3 ml de la mezcla de anticuerpo anti-IgG murina de cabra purificado por afinidad (Boehringer Mannheim, #605-208) y acoplado a Sepharose 4B activada con CNBr (Pharmacia, #17-0430-01) y la proteína Sepharose A de vehículo (Repligen, #IPA 300) en tampón RIA, incubándose durante 1-2 horas a 25ºC en continua agitación. El tampón RIA (1 ml) se añadió a continuación y los tubos se centrifugaron durante 5 minutos a 400xg. Seguidamente, se realizó el contaje de las muestras para determinar el número total de cuentas. Los sobrenadantes se aspiraron con una pipeta Pasteur muy fina, las muestras se volvieron a contar y se calculó la proporción de cuentas unidas respecto a las libres.

e. El análisis de Scatchard se realizó utilizando un programa de Fortran (Scanplot) basado en el programa Ligand diseñado por P. Munson en el NIH. El Scanplot utiliza una ecuación de acción de masas para ajustar la unión como una función del total utilizando un análisis de regresión de tipo Rodbard.

Ejemplo 2 Preparación del MaE11 humanizado Introducción

El siguiente ejemplo describe diversas preparaciones de MaE11 humanizado, en donde los residuos se modificaron mediante mutagénesis dirigida para llegar a 12 variantes de anti-IgE MaE11 [F(ab)1-12]. Los residuos de F(ab)12 se utilizaron como el molde para crear rhuMaE25 o E25, un anticuerpo anti-IgE muy potente, descrito en la solicitud de patente americana U.S. 92/06860, registrada el 14 de agosto de 1992.

Procedimientos

El MAb MaE11 murino anti-IgE humana, mostrado en la Figura 1, se modificó mediante mutagénesis dirigida (Kunkel, T.A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488) a partir de un molde con desoxiuridina que contenía una cadena ligera del subgrupo I de k humana y de la cadena pesada del subgrupo III humana (VH-CH) en un plásmido derivado de pUC-119, pAK2 (Carter y col., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 para obtener la variante F(ab)-1. F(ab)-2 se construyó a partir del molde de F(ab)-1 y todas las otras variantes F(ab) humanizadas se construyeron a partir de un molde de F(ab)-2. Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli JM101 para la preparación de DNA de cadena sencilla y doble (Messing, J. (1979), Recomb. DNA Tech. Bull. 2:43, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Unit 1 (1997)). Tanto los residuos de cadena pesada como ligera se secuenciaron completamente utilizando el procedimiento de los didesoxinucleótidos. El DNA que codifica para las cadenas ligera y pesada se subclonó a continuación en un derivado del plásmido de expresión de E. coli F(ab), pAK19 (Cartere y col. (1992), Biotechnology 10:163). El derivado carecía de las cisteínas bisagras que forman los disulfuros entre las cadenas pesadas en los fragmentos F(ab')_{2}. Los fragmentos F(ab), en oposición a los anticuerpos IgG de tamaño completo, facilitaron el análisis de un amplio número de variantes ya que podía utilizarse la expresión en E. coli en lugar de en cultivo de células de mamífero. Estas variantes individuales se describen en la patente europea WO 93/04173 publicada el 4 de Marzo de 1993. Una vez determinada la mejor variante, se subclonó a continuación en un plásmido que codificaba para una IgG1 humana de longitud completa (ver más adelante).

Los plásmidos de expresión se transformaron en la cepa de E. coli MM294 (Meselon, M. y R. Yuan (1968), Nature 217:1110), y se creció una sola colonia en 5 ml de medio 2YT-carbenicilina (100 \mug/ml) durante 5-8 horas a 37ºC. El cultivo (5 ml) se añadió a 100 ml de medio AP5-carbenicilina (100 \mug/ml) y se permitió que creciera durante 16 horas en un recipiente de agitación de 500 ml a 37ºC. El cultivo se centrifugó a 4.000 xg y se eliminó el sobrenadante. Después de congelar durante 1 hora el sedimento, éste se resuspendió en 5 ml de Tris 10 mM, EDTA 1 mM y 50 \mul de benzamidina 0,1 M (Sigma, St. Louis), el último de los cuales se añadió para inhibir la proteolisis. Después de una agitación suave en hielo durante 1 hora, la muestra se centrifugó a 10.000xg durante 15 minutos. El sobrenadante se aplicó a una columna CL-4B de Sepharose-proteína A (Pharmacia) (0,5 ml de volumen del lecho de la columna) y luego se lavó con una solución de 10 ml de cloruro potásico 3M/100 ml de Tris, pH 8,0 seguido por la elución con ácido acético 100 mM (2,5 ml) pH 2,8, en Tris 1 M a pH 8,0 (0,5 ml).

El tampón F(ab) se intercambió a continuación con PBS utilizando una Centricon-30 (Amicon) y concentrado a un volumen final de 0,5 ml. Los geles de SDS-PAGE de cada uno de los fragmentos F(ab) se migraron para su purificación. Se determinaron las concentraciones F(ab) utilizando un \varepsilon_{280} del 0,1% al 1,0. El coeficiente de extinción se determinó utilizando la concentración de la proteína a partir de un análisis aminoacídico del F(ab)-2 purificado y una A_{280} para la misma muestra.

Los fragmentos F(ab) se analizaron directamente mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas para confirmar su peso molecular. Las muestras se inyectaron en un sistema de cromatografía líquida empaquetada por capilaridad (Henzel, W.J. y col. (1990), Anal. Biochem. 187:228) y se analizaron directamente con un espectrómetro de masas Sciex API 3. Los estados de carga superior de la hormona de crecimiento humana (p.m. 22.256,2) obtenidos utilizando los mismos parámetros instrumentales que los utilizados para las muestras, fueron los utilizados para la calibración.

Para la generación de versiones de IgG1 humana de longitud completa del MaE11 humanizado, las cadenas pesada y ligeras se subclonaron separadamente en plásmidos pRK descritos anteriormente (Gorman, C.M. y col., (1990), DNA Protein Eng Tech. 2:3). Los plásmidos de cadenas pesadas y ligeras adecuados (dependiendo del cambio(s) en la secuencia deseado) se contransfectaron en una línea celular de riñón embrionario transformada por adenovirus, conocida como 293 (Graham, FL y col., (1977), J Gen. Virol. 36:59), utilizando un procedimiento de alta eficiencia (Graham y col., supra & Gorman, CM, Science 221:551). El medio se cambió a uno libre de suero y el sobrenadante se cosechó diariamente hasta los 5 días. Los anticuerpos se purificaron a partir de los sobrenadantes agrupados utilizando una columna proteína A-Sepharose CL 4B (Pharmacia). El tampón del anticuerpo eluido se cambió por PBS mediante filtración en gel G25, se concentró mediante ultracentrifugación utilizando una Centriprep-30 o Centricon-100 (Millipore) y se guardaron a 4ºC. La concentración del anticuerpo se determinó utilizando un ELISA de unión a IgG total. Los resultados se describen en la Tabla 4.

Ensayo de receptor soluble

Una placa de ensayo de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con 0,05 ml del receptor quimérico de IgG-cadena alfa de Fc\varepsilonRI con tampón adecuado (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 6,9) durante 12 horas a 4-8ºC. Los pocillos se aspiraron y se añadió 250 \mul de tampón bloqueante (PBS, BSA al 1%, pH 7,2) y se incubó durante 1 hora a 4ºC. En una placa de ensayo separada, las muestras y el MaE11 murino de referencia se titularon desde 200 a 0,001 \mug/ml mediante diluciones 1:4 con tampón de ensayo (BSA al 0,5% y Tween-20 al 0,005%, PBS, pH 7,2). A continuación, se añadió un volumen igual de IgE biotinilada a 10 ng/ml (O-Shannessy, D.J. y col., (1984), Immunol Let. 8:273) seguido por la incubación de la placa durante 2-3 horas a 25ºC. Los pocillos recubiertos con Fc\varepsilonRI se lavaron tres veces con PBS y Tween-20 al 0,05% (Sigma) y 50 \mul de los pocillos de la muestra se transfirieron e incubaron con agitación durante 30 minutos a 25ºC. Una solución de estreptavidina-HRP (500 \mug/ml, Sigma), diluido a 1:5000 en un tampón de ensayo, se añadió a 50 \mul/pocillo seguido por la incubación de la placa durante 15 minutos en agitación y lavados posteriores tal como se describió con anterioridad. Se añadieron 50 \mul/pocillo de sustrato de peroxidasa de micropocillo (Kirkgaard & Perry Laboratories) se añadió y se reveló el color durante 30 minutos. La reacción se paró añadiendo un volumen igual de HCl 1N y se cuantificó la absorbancia a 450 nm. La concentración de inhibición al 50% se calculó trazando el porcentaje de inhibición respecto a la concentración de anticuerpo bloqueante con un ajuste de curva de cuatro parámetros no lineales, utilizando la aplicación de análisis de datos de Kaleidagraph (Synergie Software). Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ensayos de unión FACS

Se determinó la capacidad del anticuerpo para inhibir la unión de la IgE conjugada con FITC (Goding, J.W. (1976), J. Immunol. Methods 13:215) con la cadena-\alpha del receptor Fc\varepsilonRI de alta afinidad expresado en las células CHO 3D10 (Hakimi, J. y col., (1990), J. Biol Chem. 265:2279) mediante citometría de flujo. La IgE conjugada con FITC (40 nM) se preincubó con el anticuerpo (0,3-1,0 x 10^{-6}M) a 37ºC durante 30 minutos en tampón FACS (PBS y BSA al 0,1% y azida de sodio 10 mM, pH 7,4). El complejo se incubó entonces con 5 x 105 células CHO CD10 a 4ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron tres veces con tampón FACS y se cuantificó la fluorescencia media a 475 nm en un citómetro de flujo FACSCAN (Becton Dickinson). El anticuerpo MaE1, un mAb murino anti-IgE humana no bloquea la unión de IgE con la cadena-\alpha de Fc\varepsilonRI, se utilizó como un control positivo y MOPC21 (Cappel, un monoclonal murino que no reconoce la IgE, se utilizó como control negativo. Los resultados se describen en la Figura 3.

Unión de anticuerpos contra la IgE asociada con Fc\varepsilonRI

La unión del anticuerpo con la IgE humana asociada con la subunidad-\alpha del Fc\varepsilonRI se expresó en células CHO 3D10 con 10 \mug/ml de IgE humana durante 30 minutos a 4ºC. Las células se lavaron tres veces, seguido de una incubación de 30 minutos con concentraciones diversas de mAbs murinos anti-IgE humana MaE1 o MaE11, o la variante mAb humanizada 12[F(ab)12]. Se utilizó MOPC21 (IgG1 murina) como control para los mAbs murinos, mientras que el mAb 4D5 humanizado (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), IgG1 humana) se utilizó como un control para F(ab)12. La unión de mAbs murinos se detectó con un anticuerpo de cabra F(ab')_{2} anti-IgE murina conjugado con FITC (10 \mug/ml). La unión del mAb humanizado se detectó con un anticuerpo de cabra
F(ab')_{2} anti-IgG humana y conjugado con FITC (50 \mug/ml), que se había purificado por afinidad con una columna de IgE para minimizar la reactividad cruzada con IgE. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Modelos gráficos informáticos de F(ab)'s murinos y humanizados

Las secuencias de los dominios VL y VH de F(ab) de la Fig. 1 se utilizaron para construir un modelo gráfico informático de los dominios VL-VH de MaE11. Este modelo se utilizó para determinar los residuos de la región de entramado que deberían incorporarse en el anticuerpo humanizado que dieron como resultado la creación del F(ab)-2. También se construyeron modelos de las variantes humanizadas para verificar la correcta selección de los residuos de la región de entramado murina. La construcción de los modelos se realizó tal como se describió por Carter y col., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285; Eigenbrolt, C. y col., (1993), J. Mol Biol 229:969.

Resultados Diseño de anticuerpos MaE11 humanizados

El estudio actual de anticuerpos humanizados utilizó una secuencia consenso humana, al contrario de otras técnicas humanizadas que utilizaron secuencias humanas más cercanas a la Ig murina de interés. Shearman, C.W. y col., (1991), J. Immunol. 147:4366; Kettleborough,CA y col., (1991),Protein Eng. 4:773; Tempest, PR y col.,(1991),Biotechnology 9:266; Co, MS y col. (1991), Proc. Natl. Acad. USA 88.2869; Routledge, E.G. (1991), Eur J Immunol, 21:2117. Esta secuencia consenso humana consistió de una región de entramado basada en el subgrupo III de VH humana y el subgrupo I de VL\kappa, tal como se define en Kabat y col. (1991). Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 5ª ed., National Institute of Health, Bethesda, MD. El F(ab)-1 se creó injertando las seis CDRs, tal como definió Kabat, supra, en una región de entramado de IgG1 humana. Todos los residuos de la región de entramado se mantuvieron como humanos. Esta variante se describe mejor como una "CDR de canje". El F(ab)-1 no mostró inhibición detectable de la unión de IgE con el receptor (Tabla 3). El fallo de dichas variantes de "CDR de canje" para unir sus antígenos se ha publicado con anterioridad. Carter y col., supra; Tempest y col., supra. Se ha de remarcar que la secuencia exacta de F(ab)-1 no se describe en la Tabla 3, sin embargo, esta secuencia puede deducirse por los residuos Kabat de CDR murinos de MaE11 sustituidos (indicados en corchetes) para los residuos humanos correspondientes. La Figura 1 indica las CDRs de Kabat enmarcadas por corchete, mientras que las CDRs de Chothia se han subrayado.

Con el fin de ayudar a la interpretación y reducir la confusión, los residuos humanos están escritos en un tipo de letra normal, mientras que los murinos aparecen en cursiva. Si las sustituciones de residuos están indicadas, el primer residuo es el que se reemplaza, el segundo residuo es el que se inserta y el número es la designación de Kabat de la secuencia nativa.

La variante F(ab)-2 se basó en el modelo molecular. En esta molécula, se incorporaron residuos de varias regiones de entramado murinas en la región de entramado. En F(ab)-2, se utilizó la definición de las CDR proporcionadas por Kabat y col., supra (basadas en la variabilidad de la secuencia interespacial) excepto para CDR-H1 y CDR-H2.

Las definiciones de CDR-H11 basadas en la variabilidad de secuencia (Kabat y col., supra), o en los estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia, C. y col., (1989), Nature 342:877) difieren significativamente (Fig. 1). En consecuencia, el CDR-H11 se redefinió para incluir ambas definiciones, es decir, los residuos humanos 26-35.

La definición de CDR-H2 basada en la variabilidad de secuencias (kabat y col.) contiene más residuos que la basada en las estructuras cristalinas de antígeno-anticuerpo (Chothia y col.) [ver figura 1: las CDRs de Kabat se indican entre corchetes, las de Chothia se subrayan]. Ya que ninguna de las estructuras cristalinas descritas indicaban contactos anticuerpo-antígeno para los residuos 60-65 del anticuerpo humano, se modificó CDR-H2 para incluir un híbrido de ambas definiciones, es decir, los residuos 50-58. Como resultado, en F(ab)-2, se utilizó una versión más corta de CDR-H2 comparada con F(ab)-1.

Como resultado, se creó un F(ab)-2 con la cantidad mínima de cambios de residuos humanos a murinos que se creyó eran necesarios para el mantenimiento de la unión. Se crearon 10 variantes adicionales con el fin de analizar los efectos de esconder residuos en las conformaciones de CDR, así como de evaluar los efectos predictivos del modelaje molecular de los residuos de la región de entramado y de examinar otros residuos de interés.

Para analizar los efectos de residuos escondidos en la conformación de CDR, se construyeron F(ab)-3 a F(ab)-7 en los que los residuos murinos se cambiaron por los humanos. Tal como se indica en la Tabla 4 (por F(ab)-3 & F(ab)-4), las cadenas laterales en VL4 y VL33 tienen efectos mínimos sobre la unión y presuntamente sobre la conformación de CDR-L1 en el anticuerpo humanizado.

El modelaje sugirió que el residuo de la región marco VH24 puede afectar a la conformación de CDR-L1 y VH37 podría afectar a la interfaz de VL-VH. Sin embargo, la sustitución del residuo humano en VH24[F(ab)-5] o VH3[F(ab)-7] mostró una reducción mínima sobre la unión. En cambio, el reemplazamiento de la Phe murina en la posición de la región de entramado VH78 con la Leu humana [F(ab)-6] causaba una reducción significativa de la unión. Los modelos sugieren que este residuo está influenciando la conformación de CDR-H1 y/o CDR-H2.

Se examinó la sustitución de residuos humanos por murinos en F(ab)-9 a F(ab)-12. Todas estas 4 variantes presentaron una mejora esencial en la unión, comparadas con F(ab)-2 (ver Tabla 3, 4 y Fig. 3). En la variante F(ab)-9, que presentó una mejora en la unión de 5 veces respecto a F(ab)-2, dos residuos en CDR-H2 (según se definió por Kabat y col., supra) se cambiaron por residuos murinos: AlaVH60 Asn y AspH61Pro. La sustitución por Pro pudo haber alterado la conformación de CDR-H2 y/o la rigidez y la de AsnH60 anticipó su entierro en la interfaz VL-VH, posiblemente al interactuar con AspVL1.

F(ab)-10, que presentó una mejora esencial de la unión en relación con F(ab)-2, fue una variante en la que todos los residuos (definidos como residuos de área de superficie accesible inferior al 5% de los aminoácidos libres) en ambos dominios, VL y VH, fueron los del MaE11 murino. En esencia, el F(ab)-10 puede ser como un MaE11 murino en el que únicamente se han cambiado los residuos expuestos no-CDR en VL y VH por residuos humanos.

Para determinar si la unión mejorada de F(ab)-10 se debió no sólo a uno o a pocos residuos, se crearon las variantes F(ab)-11 y F(ab)-12. En lugar de F(ab)-2, se utilizó F(ab)-9 como el molde base a partir del cual preparar estas variantes, porque presentó una unión cinco veces mejorada. El modelaje sugirió que las cadenas laterales en VH 63 y VH67 podrían afectar la conformación de CDR-H2. VH 63 se considera parte de CDR-H2, tal como se define por Kabat y col., supra, pero no por Chothia y col., supra. VH 67 se considera un residuo de la región de entramado en ambas definiciones. En F(ab)-11, VH 63 y VH 67 eran residuos murinos Leu e Ile, respectivamente. En F(ab)-12, únicamente se cambió VH 67 a Ile murina.

En ambos, el receptor soluble (Tabla 4) y los ensayos celulares (Tabla 4, Fig. 3), las variantes F(ab)-11 y F(ab)-12 presentaron una unión que fue por lo menos tan buena como la de F(ab)10, y mejor que la de F(ab)-9. Esto sugiere que la unión mejorada de F(ab)-10 no fue debida al re-empaquetamiento del dominio VH interior con los residuos murinos, sino al efecto de un solo residuo, es decir VH 67.

El F(ab)-8 se construyó sustituyendo el residuo humano VL 55 Glu por el murino Gly, así como sustituciones similares en VL 57 Gly por Glu. En el F(ab)-2 utilizaron residuos humanos, mientras que en el F(ab)-8 se sustituyeron por residuos murinos en estas posiciones. Tal como se puede ver a partir de la Tabla 3, la sustitución de estos residuos no tuvo ningún efecto sobre la unión del receptor.

TABLA 3

5

(a) Los residuos murinos están en cursiva: número de los residuos de acuerdo con Kabat y col.

(b) Media y desviación estándar de estos ensayos de receptor soluble.

(c) Una proporción de F(ab)-x/F(ab)-2 > 16 significa que esta variante no presenta ningún suceso de unión incluso a las mayores concentraciones de F(ab) utilizadas.

Las variantes F(ab) que presentaron una unión similar a la de MaE11 murino, que fueron: F(ab)-2, F(ab)-9, F(ab)-10 y F(ab)12, se utilizaron para generar las moléculas de IgG1 de tamaño completo. La unión de estas moléculas en relación con la variante F(ab)-2 o MaE11 fue comparable a la unión presentada por los fragmentos F(ab). Estos resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

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Unión de MaE11 al receptor Fec\varepsilonRI asociado a IgE

El anticuerpo murino MaE11 evita la unión de IgE libre con el Fc\varepsilonRI. Tal como se muestra en la Fig. 4, tanto el MaE11 murino como la variante 12 (IgG1-12), como el anticuerpo control de isotipo negativo MOPC21 y el humanizado control de isotipo negativo 4D5 (Carter y col., supra) no se unió con el Fc\varepsilonRI asociado con IgE en las células CHO 3D10. En cambio, el anticuerpo MaE11 murino, que se une a IgE pero no evita la unión de IgE con el Fc\varepsilonRI, se unió al Fc\varepsilonRI asociado a IgE. Al contrario que la IgG1 humana control (4D5 humanizado), el isotipo de IgG1 murina (representado por MOPC21) presenta un ruido de fondo inespecífico de unión de aproximadamente el 10% en estas células. El MaE11 no se tiño respecto al control MOPC21 y la variante humanizada 12 no se tiñó respecto al control humanizado 4D5 (Fig. 4).

Rastreo parcial por alaninas de los residuos CDR importantes en la unión de IgE:

Las secuencias de las CDRs de MaE11 indican una preponderancia de residuos cargados (Fig. 1). La CDR-L1 contiene tres residuos Asp, mientras que CDR-L3 posee His, Glu y Asp. La CDR-H3 tiene tres residuos de His. Los modelos de MaE11 murinos y humanizados ilustran la proximidad espacial de todos estos residuos cargados (no mostrado). En cambio, la Asp 54 en CDR-H2 está espacialmente separada de los otros residuos cargados. La alanina se sustituyó, mediante mutagénesis dirigida (kunkel, T.A. (1985), Proc. Nac. Acad. Sci. USA 82:488), para cada uno de estos residuos cargados para generar variantes. En CDR-L1, la alteración de uno de los tres residuos Asp, Asp VL32b, eliminó eficazmente la unión de IgE [F(ab)-16; Tabla 5], mientras que la sustitución de los otros residuos Asp tuvieron un efecto mínimo [F(ab)-14; F(ab)-15]. La alteración simultánea del cambio deglu VL93 y Asp VL94 por alanina en CDR-L3 [F(ab)-17; Tabla 5], también redujo la unión, aunque no con la misma extensión que la sustitución de VL32b. La sustitución individual de los tres residuos de His en CDR-H3 con ala dio como resultado la unión ligeramente mejorada [F(ab)-21] o una reducción de tres veces de la unión [F(ab)-20 & F(ab)-22]. Sin embargo, la alteración simultánea de los tres residuos His eliminó la unión [F(ab)-19]. Aunque no se determina fácilmente si los residuos cargados están implicados en la unión directa a IgE o proporcionan cierta estabilidad conformacional a sus CDRs respectivas, las variantes F(ab)-13 a F(ab)-22 muestran que CDR-L1 y CDR-H3 son determinantes importantes en la unión a IgE.

TABLA 5

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(a) Los residuos murinos están en cursiva: número de los residuos de acuerdo con Kabat y col.

(b) Media y desviación estándar de estos ensayos de receptor soluble.

(c) Una proporción de F(ab)-x/F(ab)-2 > 16 significa que esta variante no presenta ningún suce- so de unión incluso a las mayores concentraciones de F(ab) utilizadas.

Resumen y conclusiones

La creación de un anticuerpo anti-IgE murina, humanizado y funcional a partir de MaE11 implica la sustitución de varios residuos de la región murina de entramado en la región de entramado humana. Además, el mapeo de los residuos de CDR cargados indicó que algunos de éstos son importantes en la interacción de anticuerpo-IgE.

De acuerdo con los estudios anteriores (Carter y col., supra; Shearman, C.W. y col., (1991), J. Immunol. 147:4366; kettelborough, C.A. y col., (1991), Protein Eng. 4:773; Tempest, P.R. (1991), Biotechnology 9.266), las variantes F(ab)-1 a F(ab)-12 indican que los residuos de la región de entramado pueden tener un efecto significativo sobre la función del anticuerpo. Esto se acentúa cuando se tiene en consideración el F(ab)-1, que es un cambio directo de CDR en el que únicamente 6 residuos de CDR murina se transplantaron a los residuos de la región de entramado humana. Una explicación posible implica la CDR-H2. Los residuos hidrofóbicos escondidos en las posiciones VH63 y VH67 podrían afectar a la conformación de CDR-H2. Las variantes se crearon conteniendo cuatro combinaciones en las posiciones VH63 y H67, es decir, Leu murina e Ile, respectivamente [MaE11 y F(ab)-11], Val y Phe [F(ab)-2], Leu y Phe [F(ab)-1] y Val e Ile [F(ab)-12]. La inferencia clara de los resultados de unión de estas cuatro variantes indica que el residuo importante es VH67, que debe ser la Ile murina con el fin de proporcionar la afinidad comparable al MaE11 murino. En F(ab)-1, este residuo fue el humano Phe.

De los 12 residuos retenidos en F(ab)-1 como humanos [comparado con F(ab)-2], 8 se cambiaron separadamente a murinos en otras variantes. Tres cambios no tuvieron ningún efecto sobre la unión: VL4[F(ab)-4]; VL55 y VL57
[F(ab)-8]. Dos sustituciones de residuos: VH60 y VH61 [F(ab)-9], mejoraron la unión, mientras que tres la redujeron: VH24 [F(ab)-5]; VH37[F(ab)-7] y VH78 [F(ab)-6].

La variante F(ab)-10 se diseñó según la hipótesis sugerida por Padlan (Padlan,E.A. (1991), Mol. Immunol. 28:489), que propuso que la inmunogenicidad del anticuerpo murino se puede reducir cambiando únicamente los residuos de la región de entramado. En esta variante, se conservó el interior hidrofóbico de los dominios VL y VH, en otras palabras, únicamente los residuos expuestos de la región de entramado en VL y VH del MaE11 murino se cambiaron por la secuencia humana. Aunque F(ab)-10 presentó una unión muy similar a la de MaE11 murino, un cambio en un solo aminoácido de un dominio , VH67 de humano a murino produjo la misma mejora en la unión [F(ab)-12, IgG1-12].

La variante humanizada que presentó una unión comparable con el MaE11 murino y que también requirió cambios mínimos, fue F(ab)-12. Esta variante reemplazó sólo 5 residuos de la región de entramado por residuos murinos (VL4, VH24, VH37, VH67 y VH78). Cuatro de estos residuos se determinaron mediante modelaje molecular. El quinto, VH67, así como los residuos de CDR-H2, VH60 y VH61, se incluyeron utilizando modelos moleculares en un esfuerzo para mejorar la unión de la variante inicial F(ab)-2.

Ejemplo 3 Ensayo de liberación de histamina Introducción

Este ensayo es un ensayo de liberación de histamina de mastocitos de rata (RMCHA) que cuantifica la actividad biológica de un anticuerpo anti-IgE monoclonal, humanizado y recombinante, según su capacidad para bloquear la liberación de histamina de células RBL 48 sensibilizadas por un alergeno. Además, la determinación se realiza en condiciones fisiológicas similares a las del cuerpo humano. La línea celular RBL 48 se derivó de la línea de mastocitos de rata parental RBL 2H3, que fue transfectada con la subunidad-\alpha del receptor de la IgE humana de elevada afinidad (Fc\varepsilonRI). Gilfillan A.M: y col., J. Immunol. 149(7):2445-2451 (1992).

Procedimientos

Las células RBL 48 (Gilfillan y col., supra) se crecieron en medio sIMDM, medio Dulbecco modificado por Iscove, y suplementado con suero fetal vacuno al 10%, glutamina 2 mM y 500 \mug/ml de geneticina (Gibco, #860-1811) en un frasco de cultivo de tejidos T175 (Falcon #3028) a 37ºC en un incubador con atmósfera de humedad y CO_{2} al 5% (Fischer, modelo #610). Las células se cosecharon exponiéndolas a 4 ml de solución PBS/tripsina al 0,05%/EDTA 0,53 mM durante 2 minutos a 37ºC, seguido de centrifugación (400 xg, 10 min) y se resuspendieron en sIMDM fresco. Las células en la suspensión se contaron con un hemocitómetro (Reichert-Jung) y la densidad se ajustó a 0,4x10^{6} células/ml. Las células se sembraron a continuación a 100 \mul/pocillo (40.000 células por pocillo) en el interior de 60 pocillos de placas de 96 pocillos, de fondo cóncavo para cultivo de tejidos (Linbro) y se cultivaron durante 24 horas a 37ºC en el incubador con atmósfera de humedad y CO_{2} al 5%. Después de un lavado con 200 \mul/pocillo de sIMDM (mediante aspiración), las células se preincubaron durante 30 minutos con 90 \mul/pocillo de una solución de diluyente del ensayo (sIMDM, 3U/ml Na-heparina) y con IgE específica para ambrosía (RSIgE, 10 ng/ml, 23,48 ng/ml de IgE total, plasma humano específico contra ambrosía al 1,43%, North American Biological lote#42-365054).

Después del período de preincubación, se añadieron 10 \mul/pocillo de anticuerpo anti-IgE (diluido en diluyente de ensayo, 0,06-39,4 \mug/ml) o diluyente de ensayo (para una liberación total de histamina, ruido de fondo y controles de alergia a ambrosía) a las células y la placa se incubó durante 24 horas en el incubador a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después de la incubación, las células se aspiraron y se lavaron 3x con 200 \mul/pocillo de sIMDM. Después del lavado, las células se incubaron con (1) 100 \mul/pocillo de solución de Triton al 0,5% (para la liberación total de histamina), o (2) con tampón de liberación de histamina (HRB, D_{2}O al 50%, NaCl al 0,8%, CaCl_{2} 1,3 mM, sIMDM, o (3) con antígeno de ambrosía (NIH #A-601-903A-185, 0,1 \mug/ml en HRB) a 37ºC durante 30 minutos y la reacción se paró colocándola en hielo. (D_{2}O al 100% = D_{2}O al 100%, NaCl al 0,8%, CaCl2 1,3 mM).

La placa se centrifugó durante 5 minutos a 900xg (2460 rpm) a 4ºC y los sobrenadantes se cosecharony diluyeron a 1/80 en PBS (1/1000 en PBS para el control de liberación total de histamina), para la determinación de histamina utilizando el equipo de Inmunoensayo enzimático de histamina (Immunotech #1153). Los sobrenadantes (100 \mul/pocillo) se transfirieron a tubos de acilación que contenían polvo de acilación (por equipo) y se hicieron reaccionar con 50 \mul de tampón de acilación (por equipo) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La histamina acilada (50 \mul/pocillo) se transfirió a una placa de conjugación (por equipo) y se incubó con 200 \mul/pocillo de conjugado de histamina-acetilcolinesterasa (por equipo) durante 18 h a 4ºC.

Después de esta incubación, se retiró el líquido de los pocillos y éstos se lavaron para eliminar el conjugado no unido lavándolos cuatro veces con 300 \mul/pocillo de tampón de lavado (equipo Immunotech, #1153). Luego, se añadió el sustrato cromatogénico (acetiltiocolina, ditionitrobenzoato, 200 \mul/pocillo, por equipo) y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se paró mediante adición de la solución de parada (50 \mul/pocillo, por equipo) y se determinó la absorbancia a 405 nm con una referencia de 620 nm en un lector de placas SLT 340 ATTC. La intensidad de la absorbancia es inversamente proporcional a la concentración de histamina (expresada en nM), determinada a partir de la curva estándar de histamina (del equipo de inmunoensayo enzimático, AMAC). El porcentaje de liberación total de histamina se calculó a partir de los resultados de la concentración de histamina y el porcentaje de inhibición se calculó como el 100% - liberación total de histamina. Los resultados se indican en la Fig. 5.

Resumen y conclusiones

El gráfico de la proporción molar de anti-IgE respecto al porcentaje de inhibición de la liberación de histamina inducida por ambrosía indica que la forma F(ab) del anticuerpo e26 tiene propiedades superiores de liberación de histamina inducida por ambrosía que la forma F(ab) del anticuerpo e25. El e26 inhibe la liberación de histamina inducida por ambrosía de forma dependiente de la dosis con una proporción molar al 50% de inhibición máxima de 44:1 (anti-IgE:RSIgE). En cambio, e25 sólo inhibe la liberación de histamina inducida por ambrosía a una proporción molar muy elevada (entre 200:1 a 1550:1, antiIgE:RSIgE). La proporción molar al 50% de inhibición máxima para la curva de e25 podría estimarse entre 400:1 a 500:1. En consecuencia, basándose en los resultados de proporción molar al 50% de inhibición máxima, que es una medida de la afinidad de unión de una molécula, la molécula e26 se une a RSIgE aproximadamente 10 veces mejor que la molécula e25.

Ejemplo 4 Ejemplo de la expresión de fagos Introducción

Este ejemplo describe la afinidad específica de anticuerpos anti-IgE de afinidad mejorada generados mediante expresión de fagos monovalentes y la selección de fragmentos F(ab) derivados del anticuerpo anti-IgE humanizado E25 (Presta y col., J. Immunol. 151:2623 (1993).

Procediemientos I. Construcción de librerías de fagos F(ab) monovalentes

Se construyeron diversas librerías F(ab). Como vector inicial, se fusionó una variante de e25 que contenía la sustitución de VL D32E (para eliminar la isomerización de IsoAsp) con el dominio C-terminal del bacteriófago M13g3p mediante técnicas conocidas, ver por ejemplo Bass y col., Proteins 8:309 (1990). Este plásmido, conocido como p426 se muestra en la Fig. 10. En primer lugar, el fago-F(ab) de "tipo salvaje", p426, se utilizó como molde para la construcción de moldes de "parada" de librerías específicas. Introduciendo codones de parada (TAA o TGA), se inactivó la molécula original, con lo que se reducen los efectos de ruido de fondo y el sesgo (hibridación) de moldes específicos en las etapas de mutagénesis para la construcción de la librería (Lowman & Wells, Methods: Comp Methods Enzymol 3:205 (1991)). Estos moldes se construyeron utilizando la mutagénesis dirigida con un molde de cadena sencilla (Kunkel y col., Methods Enzymol. 204:125 (1991)), con los oligonucleótidos indicados en la Tabla 10.

A continuación, estos moldes de parada se utilizaron en una segunda ronda de mutagénesis, utilizando los oligos listados en la Tabla 11, para generar librerías en cada una de las regiones CDR indicadas. Los codones degenerados NNS se utilizaron para producir los 20 aminoácidos en una de las regiones CDR indicadas. (Las bases nucleotídicas se indican en letras minúsculas según la nomenclatura de la IUPAC; N=A, G, C o T; S=G o C). Los codones degenerados NNS se utilizaron para generar los 20 aminoácidos en cada una de las posiciones, utilizando 32 codones posibles distintos. Un codón de parada ámbar (TAG) codifica para Gln en el sistema supresor utilizado aquí; es decir, la cepa XL-1 Blue supresora supE; Bullock y col., Biotechniques 5:376 (1987). La presencia de un codón ámbar entre el dominio de cadena pesada y el dominio g3p en el fago permite la expresión de la proteína de fusión expresada en el fago únicamente en las cepas supresoras ámbar de E. coli, mientras que la proteína F(ab) soluble puede obtenerse con esta misma construcción en cepas no supresoras de E. coli (Lowman y col., Biochemistry 30:10832 (1991); Lowman y Wells, Methods Comp. Methods. Enzymol. 3:205 (1991); Hoogenboom y col., Nucl. Acids. Res. 19:4133 (1991). Sin embargo, otros codones de parada para utilizar en sistemas de expresión de fagos de E. coli serán evidentes para los expertos en la materia.

Los productos de la reacción de mutagénesis aleatoria se transformaron en células E. coli (Stratagene, XL-Blue) mediante electroporación y se amplificaron creciéndolas a 37ºC con el fago auxiliar M13K07 (Vierra y Messing, Methods Enzymol, 153 (1987)).

TABLA 10 Oligos de los moldes de parada para la primera ronda de mutagénesis

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TABLA 11 Oligos degenerados, librería-específicos para la segunda ronda de mutagénesis

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II. Selecciones de unión de fagos

Para seleccionar partículas de fagos que expresan las variantes F(ab) por su afinidad, los fagos se prepararon mediante precipitación con cloruro sódico/polietilén glicol (NaCl/PEG) a partir de los sobrenadantes del cultivo de E. coli. Los fagos se resuspendieron en PBS, luego se diluyeron en suero de caballo (catálogo A-3311-D, Hyclon, Logan UT) que contenía Tween™-20 al 0,05%, así como un fago que no expresa como control negativo. Como control positivo, un fago F(ab) e326 de "tipo salvaje" se mezcló con un fago que no expresa y se sometió a selecciones de prueba.

Placas de plástico de 96 pocillos Maxisorp (Nunc) se recubrieron con 2 mg/ml de IgE (IgE humana; Genentech lote #9957-36) en carbonato sódico 50 mM, pH 9,6, durante toda la noche a 4ºC. La solución de IgE se retiró y las placas se incubaron con una solución bloqueante de suero de caballo (sin Tween™-20) durante 2 horas a temperatura ambiente.

La solución bloqueante se eliminó y la solución de fagos se incubó en las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, la solución de fagos se eliminó y las placas se lavaron 10 veces con tampón PBS/Tween™-20 (0,05%). Los pocillos se rellenaron con PBS/Tween y se dejó incubar durante otros 10 minutos, después de lo cual las placas se lavaron de nuevo 10 veces.

Los fagos-F(ab) que permanecieron unidos a la placa se eluyeron con HCl 20 mM, se neutralizaron con Tris-HCl pH 8,0 y se propagaron con fagos auxiliares tal como se describió anteriormente. Una alícuota de fagos se diluyó seriadamente, se mezcló con células XL-Blue frescas, se plaqueó en placas de antibiótico adecuado y se procedió a contar el número de CFUs (unidades formadoras de colonias) de fagos eluidos que expresaban F(ab) (carbenicilina resistentes; CFUa) o no expresaban F(ab) (cloramfenicol resistentes; CFUc). Se calculó el enriquecimiento (Emut) de fagos que expresaban F(ab) sobre los que no expresaban en cada ronda como CFUa/CFUc), para el grupo eluido dividido por (CFUa/CFUc) para el grupo inicial. El enriquecimiento para los fagos control de tipo salvaje (Ewt) se calculó de la misma manera.

Se llevaron a cabo rondas sucesivas de selección de afinidad tal como se describió anteriormente, excepto que el período de incubación después de los 10 lavados se incrementó en cada ronda. Con el fin de comparar la eficiencia de la selección de fagos de ronda a ronda en condiciones de astringencia creciente, el factor de enriquecimiento en cada ronda se normalizó con el del control de tipo salvaje. La proporción del enriquecimiento en la unión para cada agrupado respecto al de tipo salvaje (Emut/Ewt) se muestra en la Figura 6. Ya que en el equilibrio, una fracción mayor de una variante de alta afinidad debería unirse a la placa de IgE que la variante de menor afinidad, las variantes de mayor afinidad deberían recuperarse de forma más eficiente y en consecuencia expresar enriquecimientos relativos mayores. De hecho, las librerías mostraron enriquecimientos relativos mejorados sucesivamente, hasta aproximadamente enriquecimientos relativos 10 veces superior al de tipo salvaje después de 5-6 rondas de selección. Mediante esta medida, las librerías VL1 mostraron una mayor mejora en la afinidad respecto a las de tipo salvaje que las librerías VH3. Esta diferencia de resultados entre los dos grupos de librerías CDR podría reflejar una contribución energética mayor de la unión al antígeno por VL1. Alternativamente, la CDR de VH3 de e25 ya puede estar casi más optimizada para la unión a IgE que la VL1 CDR, lo que permite una mejora relativa mayor en las interacciones de unión que implican VL1 a través de sustituciones de cadenas laterales.

La secuenciación de DNA mostró que la mayor parte de variantes de fagos F(ab) de la primera librería VL CDR1 (posiciones aleatorias 27, 28, 39 y 31) habían conservado el residuo de tipo salvaje D30, y mutado preferentemente Y31G (Tabla 15, en donde los clones de la ronda 3 se designaron por 212-3.x y los de la ronda 6 se designaron 212-6.x). Aunque se observaron diversas sustituciones en las posiciones Q27 y S28, un clon, que contenía Q27K y S28P, dominó el grupo de fagos al cabo de 6 rondas de selección. Este clon también contenía los residuos preferidos D30 y G31, lo que sugiere que esta combinación de cadenas laterales puede ser óptima para la unión de IgE.

En la segunda librería VL CDR1 (posiciones aleatorias 30, 31, 32 y 34), se muchos fagos seleccionados conservaron residuos de tipo salvaje como el D30 y el E32; únicamente el residuo de tipo salvaje D34 se observó en los clones secuenciados. En esta librería, se observaron diversos tipos de residuos en Y31. También se observó una mutación falsa G33S en dos clones, 213-6.7 y 213-6.8 (Tabla 15).

El análisis de secuencia de los clones de la librería VH CDR3 al cabo de 3 rondas de selección mostró que la librería había convergido principalmente a un único clon, es decir, 214-3.1, que tenía residuos de tipo salvaje en las posiciones 101-103, con sustituciones H105T y H107Y (Tabla 15).

IV. Ensayos ELISA de fagos de clones F(ab) seleccionados

Para evaluar los resultados de las selecciones de unión de fagos, los fagos se transfectaron en células E. coli XL-1 Blue y se propagaron en medio de cultivo líquido, o se plaquearon en placas que contenían antibiótico. Los clones se picaron de estas placas para su secuenciación y análisis de unión mediante el ELISA de fagos competitivo (Cunningam y col., EMBO J. 13:2508 (1994); Lowman, Chapter 24, en Methods in Molecular Biology, vol, 87, S. Cabilly (ed.), Humana Press Inc., Totawa, NJ (1997).

Para evaluar las afinidades de unión a IgE relativas, los fagos se titularon en una placa recubierta con IgE tal como se describió anteriormente para normalizar las concentraciones de F(ab) expresadas. Los fagos se premezclaron con diluciones seriadas de IgE, luego se añadieron a una placa recubierta con IgE y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron a continuación diez veces con PBS/Tween, y se añadió una solución de anticuerpo anti-fagos de conejo mezclado con un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano. Al cabo de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se revelaron con un sustrato cromogénico, o-fenilendiamina (Sigma). La reacción se paró con adición de 1/2 volúmenes de H_{2}SO_{4} 2,5 M y a continuación se leyó a una densidad óptica de 490 nm en un lector de placas espectrofotométrico. Se determinó el IC50 para cada variante ajustando una curva de 4 parámetros para cada grupo de resultados (Lowman, Methods in Molecular Biol., supra). La afinidad de unión relativa de cada variante de fago clonada se determinó como la proporción de su IC50 respecto al fago inicial e426 (Tabla

\hbox{15-16).}

En algunos casos, los grupos de fagos de una ronda de selección se analizaron en masa con el fin de obtener una estimación de la afinidad relativa media de la población [IC50(wt)/IC50(mutante)] para IgE. Por ejemplo, en la librería VL CDR1, los residuos 32, 33, 35 y 37 mostraron una afinidad mejorada 3,6 veces respecto a e426 al cabo de 5 rondas de selección, aún cuando la variante parental de esta librería (e26) parecía haber mejorado su afinidad unas 25 veces. En consecuencia, no se continuó la selección de esta librería VL-CDR1 con estos residuos particulares. Por otra parte, el grupo de fagos VH CDR2 mostró una mejora de la afinidad del orden de 6,2 veces respecto a su fago parental e426.

También se crearon librerías de fagos de dominios CDR, VLCDR2, residuos 54-57 y VL-CDR3, residuos 96-98, 99 y 100. Sin embargo, las sustituciones aminoacídicas en estas posiciones no produjeron ningún enriquecimiento respecto al e426. Una librería de fagos generada para VH CDR1, residuos 26-30, tampoco generó ningún enriquecimiento respecto a e26 y se halló que estaba principalmente compuesta por el fago contaminante e-26. Ello sugiere que en la librería inicial, no había variantes de mayor afinidad que el e26.

Las librerías de fagos de dominios CDR, VL CDR, residuos 27, 28, 30, 31, 32, 34, así como VH CDR1, residuos 101, 102, 103, 105 y 107 están indicados en la Tabla 15, mientras que VH CDR2 se indica en la Tabla 16. Con las librerías de clones (Tablas 15 y 16) que no indicaron una afinidad apreciable superior a la de e26 no se prosiguió con su selección ni se determinó el factor de mejora.

TABLA 15

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11

TABLA 16

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Nota: La afinidad de fagos relativa a la media poblacional se estimó en una mejora de 6,2 veces respec- to a e426.

V. Mutaciones combinadas del rastreo de fagos

Mutaciones en distintos sitios dentro de la proteína expresan a menudo un efecto aditivo sobre la función proteica (Well, Biochemistry 29:8509 (1990). En consecuencia, se combinaron diversas mutaciones de las librerías de fagos iniciales, descritas anteriormente, para mejorar la unión a IgE.

Con el fin de reducir la probabilidad de incrementar la inmunogenicidad del anticuerpo anti-IgE, la extensión de las mutaciones desde E-25 necesitó minimizarse. Como resultado, únicamente se utilizaron las mutaciones de las variantes de fagos que expresaban la mayor mejora en la afinidad cuando se cuantificó de forma independiente. Además, la frecuencia con la que se observó un clon de fago dado puede estar relacionada con el nivel de expresión y/o la estabilidad proteolítica (Lowman & Wells, 1991, supra). Se eligió un clon particular de la librería VL1, 212-6.7- redenominado e26, porque presentaba una afinidad 25 veces mejorada respecto a los ensayos ELISA de fagos (Tabla 17).

La librería VH CDR2 también demostró mejoras en la afinidad respecto al e426, aunque dicha mejora fue únicamente de 6,2 veces según la cuantificación realizada con los fagos agrupados. En los fagos agrupados, se demostró una afinidad de unión mejorada por lo menos para algunos miembros del grupo sin tener que cuantificar la afinidad de todos los miembros. La utilización de fagos agrupados también permite la identificación de cómo se ha obtenido dicho incremento de afinidad después de una ronda y si las selecciones de afinidad deberían o no continuarse (es decir, una vez la afinidad del grupo ha alcanzado un máximo, rondas posteriores probablemente no confieren un enriquecimiento adicional). Por ello, la utilización de la afinidad agrupada es una herramienta de rastreo muy útil.

Fue evidente que las mutaciones en la región VH CDR2 podrían funcionar de forma aditiva con las de VLCDR1, porque el bucle de VH CDR2 se halla lejos del bucle del bucle VL CDR1 en la estructura cristalizada y el modelo molecular. Sin embargo, ya que algunas combinaciones de estas mutaciones pueden ser incompatibles, se analizaron cuatro combinaciones distintas de mutantes: e26 combinado con las mutaciones halladas en los clones 235-5.1, 235-5.2, 235-5.3 y 235-5.4 (Tabla 17). Estas construcciones se realizaron mediante mutagénesis de Kunkel (Kunkel y col., Methods Enzymol 204:125 (1991)) utilizando el fago F(ab) e26 como molde, con oligos mutagénicos que codificaban para las mutaciones VH2.

Los ensayos ELISA de fagos (Lowman, Methods in Molecular Biology, vol 87, Cabilly (ed), Humana Press Inc., Totawa, NJ (1997)) se utilizaron para comparar las variantes finales de las combinaciones de mutaciones VL CDR1 en e26 con las mutaciones de VH CDR2 en los clones 235-5.1, 235-5.2, 235-5.3 y 235-5.4. Las proteínas solubles F(ab) también se prepararon y se compararon en un ensayo de placas de IgE-biotina, que se muestra más adelante en la Tabla 17 y en la Fig. 7.

TABLA 17

13

VI. Ensayo en placas de biotina (Ensayo de competición de la quimera FcERI-IgG)

Introducción. El propósito de este ejemplo es comparar cuán diferente compiten los anti-IgE F(ab)s con una quimera de IgG-receptor de IgE de alta afinidad inmovilizada por unirse a la IgE humana biotinilada en fase de solución, cuando se añaden simultáneamente el anti-IgE F(ab) y la biotina-IgE a una placa recubierta con la quimera de IgE receptor. A medida que la concentración de anti-IgE F(ab) incrementa, la cantidad de IgE-biotina que puede unirse al receptor en la placa disminuye, dando como resultado un valor de densidad óptica inferior al cuantificarse por el espectrofotómetro.

Las placas de maxisorp Nunc (catálogo nºF96) se recubrieron con 100 ng/pocillo de Fc\varepsilonRI-IgG (Haak-Frendsho y col., J. Immunol 151, 352 (1993), (Genentech, lote #2148-74 (6,4 mg/ml)) añadiendo una alícuota de 100 \mul de una solución madre de 1 \mug/Ml en tampón carbonato sódico 50 nM (pH 9,6) durante 12 a 24 horas a 4ºC. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado ELISA (polisorbato 20 al 0,05% (Sigma) en PBS (pH 7,4)) y se bloquearon incubando con 200 \mul de tampón de ensayo de ELISA (solución salina tamponada con Tris, pH 4,45 con albúmina sérica bovina de grado RIA al 0,5%, Sigma; polisorbato 20 al 0,05% y EDTA 4 mM) durante 60 minutos. Después de 3 lavados, se añadieron 100 \mul de diluciones x2 seriadas de F(ab)s anti-IgE en tampón de ensayo a una concentración inicial de 200 nM a la placa de ELISA por triplicado. Las diluciones se realizaron con una pipeta multicanal Titertek®. Se añadió IgE biotinilada en tampón de ensayo (100 \mul, dilución 1/500 de la solución madre a 0,5 mg/ml) a todos los pocillos y la mezcla se incubó en una agitador miniorbital (Bellco) durante 60 minutos a 25ºC. La IgE se purificó por afinidad a partir del sobrenadante del cultivo de mieloma (ATCC TIB 196) U266B1 y se biotiniló utilizando biotina hidrazida (O'Shannessy y col., Immunol Lett. 8:273 (1984); Pierce Chemical). Las muestras se lavaron 5 veces con tampón de lavado y la IgE se detectó con 100 \mul de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Zymed) a 1:3000 durante 90 minutos. Las muestras se lavaron de nuevo 6x con tampón de lavado seguido de la adición de 100 \mul de solución sustrato (400 \mug/ml de o-fenilendiamina dihidrocloruro y H_{2}O_{2} 4 mM en PBS), incubándose durante 6 minutos. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 4,5 M (100 \mul) y la absorbancia se leyó a 490 nm en un lector de placas Uvmax (Molecular Devices). En la Figura 8 se han representado las absorbancias a diversas concentraciones de F(ab) de los fragmentos de anticuerpos F(ab)e25, e26 y e27.

Conclusión: las curvas en la Fig. 8 indican que tanto E26 como E27 tienen mayor afinidad que E25 por el receptor de alta afinidad, siendo el E27 quien presentó la mayor afinidad.

VII. Ensayos de BIAcore de proteínas F(ab)solubles

Las afinidades de unión al receptor de diversos fragmentos F(ab) se calcularon (Lofas & Johnson, J chem Soc. Commun. 21, 1526-1528 (1990)) a partir de las constantes de las tasas de disociación y asociación cuantificadas mediante el sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcoreTM-2000 (BIAcore, Inc). Un chip biosensor que se activó para la unión covalente de IgE utilizando N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida hidrocloruro (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIAcore). La IgE se diluyó en tampón acetato sódico 10 mM (pH 4,5) y luego se diluyó a aproximadamente 30 \mug/ml y se inyectó sobre el chip para obtener una señal de 800 a 12.400 unidades de respuesta (RU) del material inmovilizado. Dado que la señal en RU es proporcional a la masa del material inmovilizado, ello representa un intervalo de densidades de IgE inmovilizada sobre la matriz de aproximadamente 0,4 a 6,5 pmol/cm^{2}. Por último, se inyectó la etanolamina 1 M como agente bloqueante. Y se llevaron a cabo regeneraciones con MgCl_{2} 4,5 M.

Para las cuantificaciones cinéticas, se inyectaron diluciones x1,5 seriadas de los fragmentos F(ab) sobre el chip de IgE en tampón PBS/Tween (Tween-20 al 0,05% en tampón fosfato salino) a 25ºC utilizando una velocidad de flujo de 20 \mul/min. [Fig. 9].

Los resultados de la disociación se ajustaron a un modelo de un sitio para obtener k_{off} +/- d.e. (desviación estándar de las cuantificaciones). Para cada curva de asociación, se calcularon las constantes de la velocidad de pseudo-primer orden y se representaron como una función de la concentración proteica para obtener la k_{on} +/- d.e. (error estándar de ajuste). Las constantes del equilibrio de disociación para la unión de Fab:IgE, Kd, se calcularon a partir de las cuantificaciones SPR como K_{off}/K_{on}. En ausencia de artefactos experimentales, como la re-unión de F(ab) disociado, la tasa de disociación es independiente de la concentración de F(ab). También, ya que la constante de equilibrio de disociación Kd, es inversamente proporcional a la K_{off}, puede obtenerse una estimación de la mejora de afinidad asumiendo que la tasa de asociación (K_{on}) es constante para todas las variantes. Las tasas de disociación (K_{off}), junto con la vida media calculada de la disociación, se muestran en la Tabla 18.

TABLA 18

14

VIII. Expresión y purificación de F(ab)

En la cepa de E. coli 34B8, se expresaron el F(ab) anti-IgE E-25 (Presta y col., J. Immunol 151:2623-2632 (1993)) y las variantes de fagémidos derivados de p426 (Fig. 10). Los cultivos de inóculos (10 ml) se incubaron en medio 2YT con 50 \mug/ml de carbenicilina durante 8 horas a 37ºC y luego se transfieron a 1 litro de AP-5 modificado que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Los cultivos se centrifugaron en botellas de 500 ml a 7000 rpm durante 15 minutos y a 4ºC. El sedimento se congeló durante por lo menos 3 horas a -20ºC. Cada sedimento procedente de 500 ml se resuspendió en 12,5 ml de sacarosa fría al 50% en Tris 50 mM a pH 8,0 con benzamidina 1 mM (Sigma) a 4ºC. La suspensión se solubilizó mediante agitación a 4ºC durante 3 horas. La suspensión se centrifugó a 18.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC y los F(ab)s expresados en el sobrenadante se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína G (Pharmacia). La columna se lavó con una solución de Tris 10 mM (pH 7,6) y EDTA 1 mM (pH 8,0) y los F(ab)s se eluyeron con 2,5 volúmenes de columna de ácido acético 100 mM (pH 3,0) e inmediatamente se alcanzó un pH neutro con 0,5 volúmenes de Tris 1 M pH 8,0. Los eluidos se concentraron y se intercambió el tampón contra PBS con microcentradores centricon 30 (Amicon). La concentración de proteína se determinó mediante absorbancia a 280 nm con un espectofotómetro (Beckamn DU 64) y la pureza de la muestra se evaluó utilizando geles SDS-PAGE al 4-20% (Novex) en condiciones reductoras con \beta-mercaptoetanol al 5%.

IX. Resultados y conclusiones

Los resultados de los experimentos de competición fagos-ELISA muestran que mientras el fago-F(ab) e26 presentó una mejora de 9x de la afinidad respecto al e27, las variantes de combinación e695, e696 y e697 mejoraron 20-40 veces respecto al fago e426. Las combinaciones adicionales de mutaciones derivadas de fagos produjeron variantes de anticuerpos con afinidades mejoradas de forma similar.

Cuando se analizaron las proteínas solubles F(ab) en un ensayo de placas de biotina-IgE, el F(ab)e26 y el F(ab)e27 fueron aproximadamente 10 y 30 veces mejores, respectivamente, respecto a e25, en la inhibición de la unión de IgE con Fc\varepsilonRI-IgG. La determinación de la tasa de disociación mediante análisis BIAcore soporta estas afinidades relativas. En particular, e26 y e27 presentaron tasas de disociación 7,7 y 22 veces más lentas que el e25. Un vidas media mayor implica que la IgE está "ocupada" o se ha vuelto incapaz de unirse al receptor de alta afinidad durante un período mayor, dando como resultado una mejor potencia de la actividad terapéutica anti-IgE.

En consecuencia, los resultados de la unión en equilibrio y de su cinética soportan la conclusión de que los F(ab)s e26 y e27 se unen más estrechamente a la IgE en aproximadamente 10 a 30 veces, respectivamente, que el e25. Asimismo, se espera que los anticuerpos de tamaño completo (IgGs) que contienen las mutaciones correspondientes F(ab) expresen afinidades relativas similares a la IgG e25.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos anti-IgE mejorados y procedimiento para mejorar los polipéptidos

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 26

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 1 DNA Way

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAIS: USA

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMATO INFORMÁTICO

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: 3,5 pulgadas, 144 Mb disco blando

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: WinPatin (Genentech)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FECHA ACTUAL DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/ABOGADO

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Sbovoda, Craig G.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO. 39.044

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: P1123PCT

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN.

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 650/225-1489

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650/952-9881

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6127 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:

15

16

17

18

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC Nº.12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC Nº.13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 218 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC Nº.14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 451 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 218 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 451 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 218 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 451 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 218 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 229 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 229 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 248 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.23:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 248 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:

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54

55

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº24:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 218 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24:

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56

57

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.25:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 233 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 25:

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58

59

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº.26:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 233 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 26:

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60

61

Claims (17)

1. Procedimiento para preparar un polipéptido modificado que es un anticuerpo anti-IgE que no presenta desactivación de la isomerización de aspartil y que tiene una afinidad por una molécula diana, la IgE, igual o superior a la de un polipéptido no modificado; comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

(a) identificación de los residuos aspartil que son propensos a la isomerización,

(b) sustitución de residuos alternativos y rastreo de los mutantes resultantes según su afinidad por la molécula diana, mediante maduración de la afinidad utilizando la presentación de fagos; comprendiendo dicho proceso:

(i)

sustitución, deleción o inserción de uno o más codones en el gen que codifica para el polipéptido, dando como resultado un cambio en la secuencia aminoacídica del polipéptido, con lo que se prepara una librería de polipéptidos relacionados estructuralmente fusionados a una proteína de la cubierta del fago,

(ii)

presentación de una sola copia de cada polipéptido relacionado en la superficie de la partícula del fagémido, que contiene el DNA que codifica para el polipéptido y

(c) selección de los polipéptidos modificados en los que se ha cambiado un residuo aspartil y presentan una afinidad por la molécula diana igual o superior a la de un polipéptido no modificado.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo no modificado tiene la secuencia indicada como "E25" en la Figura 12. [Sec. ID. Nº 13-14].

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los residuos sustituidos son los residuos de cadena ligera variable de CDR1 Asp32Glu, Gln27Lys y Ser28Pro.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los residuos sustituidos adicionalmente son los residuos de cadena pesada variable de CDR2 Thr53Lys, Asp55Ser, Ser57Glu y Asn59Lys.

5. Procedimiento para mejorar las propiedades de inhibición de la liberación de histamina inducida por ambrosía de un anticuerpo que comprende llevar a cabo el procedimiento de la reivindicación 1.

6. Molécula de anticuerpo que tiene una secuencia de cadena ligera y una secuencia de cadena pesada, con por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera y la secuencia de cadena pesada de "e26" de la Figura 13 [Sec ID Nº 19 y 20] y que comprende los residuos de cadena ligera variable de CDR1 32Glu, 27Lys y 28Pro.

7. Molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende una secuencia de e26 seleccionada de entre el grupo que consiste en: fragmento F(ab) [Sec ID Nº 19-20], Fragmento sFv [Sec ID Nº 22], F(ab)=_{2}[Sec ID Nº 24-25] o la secuencia e26 de la Figura 12 [Sec ID Nº 15 y 16].

8. Molécula de anticuerpo que tiene una secuencia de cadena ligera y una secuencia de cadena pesada con por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera y la secuencia de cadena pesada de "e27" de la Figura 13 [Sec ID Nº 19 y 21] y que comprende los residuos de cadena ligera variable de CDR1 32Glu, 27Lys y 28 Pro.

9. Molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende una secuencia de e27 seleccionada de entre el grupo que consiste en: fragmento F(ab), [Sec ID Nº 19 y 21], fragmento sFv [Sec ID Nº 23] F(ab)=_{2} [Sec ID Noº 24 y 26] o la secuencia de e27 de la Figura 12 [Sec ID Nº 17 y 18].

10. Molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia con por lo menos el 85% de identidad de secuencia con una que codifica para "e26" de la Figura 13 [Sec ID Nº 19 y 20], en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica para la molécula de anticuerpo que comprende los residuos de cadena ligera variable CDR1 32Glu, 27Lys y 28 Pro.

11. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, que tiene una secuencia codificante para un fragmento del anticuerpo e26 seleccionada de entre el grupo que consta de: F(ab) [Sec ID Nº 19 y 20], sFv[Sec ID Nº 22], F(ab)=_{2}[Sec ID Nº 24 y 25] o la secuencia de e26 de [Sec ID Nº 15 y 16].

12. Molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia con por lo menos el 85% de identidad de secuencia con una secuencia codificante para el "e27" de la Figura 13 [Sec ID Nº 19 y 21], en dondedicha molécula de ácido nucleico codifica para una molécula de anticuerpo que comprende los residuos de cadena ligera variable CDR1 32Glu, 27Lys y 28Pro.

13. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12, que tiene una secuencia que codifica para un fragmento del anticuerpo e27 seleccionado de entre el grupo que consiste en: F(ab)[Sec ID Nº 19 y 21], sFv[Sec ID Nº 23], F(ab)=_{2}[Sec ID Nº 24 y 26] o la secuencia de e27 de la Figura 12 [Sec ID Nº 17 y 18].

14. Composición que comprende un excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s) junto con la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.

15. Molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, para utilizar en un procedimiento de reducción o prevención de la producción de histamina mediada por IgE en un mamífero.

16. Molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, para la utilización en un procedimiento de tratamiento de un trastorno mediado por IgE en un mamífero.

17. Molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el trastorno mediado por IgE es el asma, la rinitis alérgica, la fiebre del heno, el eczema, la urticaria, la alergia alimentaria o el choque anafiláctico.