ES2380575T3

ES2380575T3 - Recipiente que contiene anticuerpos dirigidos contra VEGF

Info

Publication number: ES2380575T3
Application number: ES10007444T
Authority: ES
Inventors: Manuel Baca; Leonard G. Presta; James A. Wells; Leonard G. Lowman; Yvonne Man-Yee Chen
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2018-04-03
Also published as: PT1695985E; JP2001502922A; CN101210050B; ZA982907B; SI0973804T1; DK1787999T3; BRPI9809388B8; EP2301580A1; CN101665536B; EP0971959B1; CN101838328A; HK1139425A1; CN101210050A; ATE501170T1; ZA982908B; ATE541586T1; SI2301580T1; EP2336190A2; NO2017039I1; LTC0973804I2

Abstract

Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una etiqueta en o asociada con el recipiente, conteniendo el recipiente una composición que comprende como agente activo un anticuerpo humanizado dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF in vivo y/o se une a VEGF humano con un valor de la Kd no superior a 1 x 10-8 y/o tiene un valor DE50 no superior a 5 nM para inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF in vitro, teniendo el anticuerpo un dominio variable de la cadena pesada que comprende las regiones marco consenso del subgrupo III de la cadena pesada humana como se muestra en la SEQ ID NO: 11 y las regiones hipervariables CDRH1, CDRH2 y CDRH3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRH1: GYX1X2X3X4YGX5N (SEQ ID NO: 117), en el que X1 es D, T o E, X2 es F, W o Y, X3 es T, Q, G o S, X4 es H o N y X5 es M o I; CDRH2: WINTX1TGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 118), en el que X1 es Y o W; y CDRH3: YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NO: 119), en el que X1 es H o Y, X2 es Y, R, K, I, T, E o W, X3 es G, N, A, D, Q, E, T, K o S, X4 es S, T, K, Q, N, R, A, E o G y X5 es S o G; y que tiene un dominio variable de la cadena ligera que comprende las regiones marco consenso del subgrupo I de la cadena ligera kappa que se muestra en la SEQ ID NO: 12 y las regiones hipervariables CDRL1, CDRL2 y CDRL3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: CDR1: X1AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ID NO: 121), en el que X1 es R o S, X2 es S o N, X3 es Q o E, X4 es Q o D y X5 es I o L; CDRL2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 122); CDRL3: QQYSX1X2PWT (SEQ ID NO: 123), en el que X1 es T, A o N y X2 es V o T, en las que en comparación con la SEQ ID NO: 11, el dominio variable de la cadena pesada tiene una sustitución en uno cualquiera o más de los siguientes restos de las regiones marco consenso: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H y 94H, y en las que en comparación con la SEQ ID NO: 12, el dominio variable de la cadena ligera tiene bien una sustitución en, y solo en, el resto 46L de las regiones marco consenso o bien tiene sustituciones en los restos 4L y 46L de las regiones marco consenso, en las que la numeración de los restos es como se muestra en la Fig. 1

Description

Recipiente que contiene anticuerpos dirigidos contra VEGF.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

[0001] Esta invención se refiere generalmente a anticuerpos dirigidos contra VEGF y, en particular, a anticuerpos humanizados dirigidos contra VEGF.

Descripción de la técnica relacionada

[0002] Es bien sabido en la actualidad que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos. Entre estos se incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatías proliferativas o degeneración macular relacionada con la edad (AMD), artritis reumatoide, y psoriasis (Folkman y col. J. Biol. Chem. 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun y col. Annu. Rev. Physiol. 53: 217-239 (1991); y Garner A, Vascular diseases. En: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2ª Edición Marcel Dekker, NY, pp. 1625-1710 (1994)). En el caso de tumores sólidos, la neovascularización permite a las células tumorales adquirir una ventaja de crecimiento y una autonomía proliferativa en comparación con las células normales. De acuerdo con esto, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones tumorales y la supervivencia del paciente en el cáncer de mama así como en algunos otros tumores (Weidner y col. N Engl J Med 324: 1-6 (1991); Horak y col. Lancet 340: 1120-1124 (1992); y Macchiarini y col. Lancet

340: 145-146 (1992)).

[0003] La investigación de reguladores positivos de la angiogénesis ha dado como resultado muchos candidatos, incluyendo aFGF, bFGF, TGF-a, TNF-�, HGF, TNF-a, angiogenina, IL-8, etc., (Folkman y col. y Klagsbrun y col). Los reguladores negativos identificados hasta el momento incluyen trombospondina (Good y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 6624-6628 (1990)), el fragmento en el extremo N de 16 kilodalton de la prolactina (Clapp y col. Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), angiostatina (O’Reilly y col. Cell, 79: 315-328 (1994)) y endostatina (O’Reilly y col. Cell, 88: 277-285 (1996)).

[0004] El trabajo llevado a cabo en los últimos años ha establecido el papel clave del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la regulación de la angiogénesis normal y anormal (Ferrara y col. Endocr. Rev. 18: 425 (1997)). El hallazgo de que la pérdida de incluso un único alelo de VEGF da como resultado letalidad embriónica apunta a un papel irremplazable jugado por este factor en el desarrollo y la diferenciación de sistema vascular (Ferrara y col.). Además, VEGF ha demostrado ser un mediador clave de la neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara y col.). El ARNm de VEGF se expresa en exceso en la mayoría de tumores humanos examinados (Berkman y col. J Clin Invest 91: 153-159 (1993); Brown y col. Human Pathol. 26: 8691 (1995); Brown y col. Cancer Res. 53: 4727-4735 (1993); Mattern y col. Brit. J. Cancer. 73: 931-934 (1996); y Dvorak y col. Am J. Pathol. 146: 1029-1039 (1995)). También, la concentración de VEGF en fluidos oculares está muy correlacionada con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia (Aiello y col. N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994)). Además, recientes estudios han demostrado la localización de VEGF en las membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por AMD (Lopez y col. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37: 855-868 (1996)). Los Anticuerpos neutralizantes dirigidos contra VEGF suprimen el crecimiento de una variedad de líneas de células tumorales humanas en ratones sin pelo (Kim y col. Nature 362: 841-844 (1993); Warren y col. J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgström y col. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996); y Melnyk y col. Cancer Res. 56: 921-924 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos retinales isquémicos (Adamis y col. Arch. Ophthalmol. 114: 66-71 (1996)). Por tanto, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra VEGF u otros inhibidores de la acción de VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores sólidos y diversos trastornos neovasculares intraoculares.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0005] Tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona artículos de fabricación que comprenden anticuerpos humanizados dirigidos contra VEGF y variantes de anticuerpos dirigidos contra VEGF con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, que incluyen una fuerte afinidad de unión por VEGF; la capacidad de inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro; y la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por VEGF in vivo.

[0006] Los anticuerpos humanizados dirigidos contra VEGF o las variantes de anticuerpos dirigidos contra VEGF preferidos en la presente memoria descriptiva se unen a VEGF humano con un valor Kd no superior a aproximadamente 1 x 10-8 M y preferiblemente no más de aproximadamente 5 x 10-9 M. Adicionalmente, el anticuerpo humanizado o la variante dirigida contra VEGF puede tener un valor DE50 no superior a aproximadamente 5 nM para inhibir la proliferación inducida por VEGF de las células endoteliales in vitro Los anticuerpos humanizados o las variantes dirigidas contra VEGF de particular interés en la presente memoria descriptiva son aquellos que inhiben al menos aproximadamente un 50 % del crecimiento tumoral en un modelo de tumor A673 in vivo, a una dosis de anticuerpo de 5 mg/kg.

[0007] En una realización, el anticuerpo dirigido contra VEGF tiene un dominio variable de la cadena pesada y ligera, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos CDRH1 (GYX1FTX2YGMN, en la que X1 es T o D y X2 es N o H; SEQ ID NO: 128), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEQ ID NO: 2) y CDRH3 (YPX1YYGX2SHWYFDV, en la que X1 es Y o H y X2 es S o T; SEQ ID NO: 129). Por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada puede comprender las secuencias de aminoácidos de CDRH1 (GYTFTNYGMN; SEQ ID NO: 1), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEQ ID NO: 2) y CDRH3 (YPHYYGSSHWYFDV; SEQ ID NO: 3). Preferiblemente, las tres regiones hipervariables de la cadena pesada se proporcionan en una región marco humana, por ejemplo como una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula FR1-CDRH1-FR2-FR3-CDRH3-FR4.

[0008] Un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo dirigido contra VEGF preferido comprende la secuencia de aminoácidos EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX1FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGWI NTYTGEPTYAADFKRRTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3YYGX4SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 125), en la que X1 es T o D, X2 es N o H; X3 es Y o H and X4 es S o T. Una secuencia de dominio variable de la cadena pesada particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo I y comprende el dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7. Dichas secuencias preferidas del dominio variable de la cadena pesada se pueden combinar con las siguientes secuencias preferidas del dominio variable de la cadena ligera o con otras secuencias del dominio variable de la cadena ligera, con la condición de que el anticuerpo producido de esta manera se una el VEGF humano y cumpla los requerimientos de las reivindicaciones.

[0009] Las secuencias preferidas del dominio variable de la cadena ligera se pueden combinar con las secuencias del dominio variable de la cadena pesada anteriormente identificadas o con otras secuencias del dominio variable de la cadena pesada, con la condición de que el anticuerpo producido de esta manera retenga la capacidad de unirse a un VEGF humano y cumpla los requerimientos de las reivindicaciones. Por ejemplo, el dominio variable de la cadena ligera puede comprender regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRL1 (SASQDISNYLN; SEQ ID NO: 4), CDRL2 (FTSSLHS; SEQ ID NO: 5) y CDRL3 (QQYSTVPWT; SEQ ID NO: 6). Preferiblemente, se proporcionan las tres regiones hipervariables de la cadena ligera en una región marco humana, por ejemplo, como una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRL1-FR2CDRL2-FR3-CDRL3-FR4.

[0010] En una realización, la invención incorpora un dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo humanizado dirigido contra VEGF que comprende la secuencia de aminoácidos:

DIQX1TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 124), en la que X1 es M

o L. Una secuencia de dominio variable de la cadena ligera particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo I y comprende la secuencia del dominio variable de la SEQ ID NO: 8.

[0011] Un anticuerpo incorporado en la invención, tal como se ha definido en las reivindicaciones, puede ser una variante de un anticuerpo parental dirigido contra VEGF (dicho anticuerpo parental es preferiblemente un anticuerpo humanizado o humano dirigido contra VEGF), en el que la variante se une a VEGF humano y comprende una sustitución de aminoácido en una región hipervariable del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo parental dirigido contra VEGF La variante tiene preferiblemente una o más sustitución(es) en una o más región(es) hipervariables(s) del anticuerpo dirigido contra VEGF. Preferiblemente, la(s) sustitución(es) está(n) en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo parental. Por ejemplo, la(s) sustitución(es) de aminoácido(s) puede(n) estar en el dominio variable CDRH1 y/o CDRH3 de la cadena pesada. Preferiblemente, existen sustituciones en ambas de estas regiones hipervariables. Dichas variantes “maduradas por afinidad” se demuestra en la presente memoria descriptiva que se unen al VEGF humano más fuertemente que el anticuerpo parental dirigido contra VEGF a partir del cual se generan, es decir, tienen un valor de la Kd que es significativamente menor que el del anticuerpo parental dirigido contra VEGF. Preferiblemente, la variante tiene un valor DE50 de inhibición de la proliferación inducida por VEGF de las células endoteliales in vitro que es al menos aproximadamente 10 veces inferior, preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces inferior, y lo más preferible al menos aproximadamente 50 veces inferior, que el del anticuerpo parental dirigido contra VEGF. Una variante particularmente preferida es la variante Y0317 del Ejemplo 3 que tiene un CDRH1 I que comprende la secuencia de aminoácidos: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 126) y un CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 127). Estas regiones hipervariables y CDRH2 se proporcionan generalmente en una región marco humana, por ejemplo, dando como resultado un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116. Dichas secuencias del dominio variable de la cadena pesada se combinan opcionalmente con un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 124, y preferiblemente la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 115.

[0012] Se contemplan en la presente memoria descriptiva diversas formas del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo dirigido contra VEGF puede ser un anticuerpo de longitud completa (que tenga, por ejemplo, una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab’ o F(ab’)2). Además, el anticuerpo se puede marcar con una marca detectable, inmovilizarse en una fase sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico).

[0013] Se contemplan usos diagnósticos y terapéuticos para el anticuerpo. Una aplicación diagnóstica es un procedimiento para determinar la presencia de la proteína VEGF que comprende exponer una muestra sospechosa de contener la proteína VEGF al anticuerpo dirigido contra VEGF y determinar la unión del anticuerpo a la muestra. Para esto, se usa un kit que comprende el anticuerpo y las instrucciones para usar el anticuerpo para detectar la proteína VEGF.

[0014] También se dan a conocer: un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo, un vector que comprende este ácido nucleico, unido opcionalmente de manera operable para controlar las secuencias reconocidas por la célula hospedadora transformada con el vector; una célula hospedadora que comprende este vector, un procedimiento para producir el anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedadora de tal manera que se exprese el ácido nucleico y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo procedente del cultivo de la célula hospedadora (por ejemplo, procedente del medio de cultivo de la célula hospedadora). Se da a conocer también una composición que comprende el anticuerpo dirigido contra VEGF y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición para el uso terapéutico es estéril y se puede liofilizar. Se da a conocer también un procedimiento para tratar a un mamífero que padece un tumor o un trastorno de la retina, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo dirigido contra VEGF al mamífero.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0015]

Las Figs. 1A y 1B representan gráficamente las secuencias de aminoácidos del dominio variable pesado (SEQ ID NO: 9) y del dominio ligero (SEQ ID NO: 10) de muMAbVEGF A.4.6.1, el dominio variable pesado (SEQ ID NO: 7) y el dominio ligero (SEQ ID NO: 8) de F(ab) (F(ab)-12 humanizado y los marcos consenso humanos (hum III para el subgrupo III pesado (SEQ ID NO: 11), humK1 para el subgrupo I de K ligero (SEQ ID NO: 12)). La Fig 1A alinea las secuencia del dominio variable pesado y la Fig. 1B alinea las secuencias del dominio variable ligero. Los asteriscos indican las diferencias entre F(ab)-12 humanizado y el Mab de murino o entre F(ab)-12 y el marco humano. Las Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDR) están subrayadas.

La Fig. 2 es un diagrama de cinta del modelo de los dominios VL y VH del F(ab)-12 humanizado. El dominio VL se muestra en marrón con las CDR en castaño la cadena secundaria del resto L46 se muestra en amarillo. El dominio VH se muestra en púrpura con las CDR en rosa. Las cadenas secundarias de los restos VH cambiados de humano a murino se muestran en amarillo.

La Fig. 3 representa gráficamente la inhibición de la mitogénesis inducida por VEGF por el F(ab)-12 humanizado dirigido contra VEGF del Ejemplo 1. Se sembraron células endoteliales capilares derivadas de la corteza adrenal de bovino a la densidad de 6 X 103 células/pocillo en placas de seis pocillos, tal como se describe en el Ejemplo 1. Se añadieron tanto muMAb VEGF A.4.6.1 como rhuMAb VEGF (IgGI; F(ab)-12) a las concentraciones indicadas. Después de 2-3 horas, se añadió rhVEGF165 a la concentración final de 3 ng/ml. Después de cinco o seis días, las células se digirieron con tripsina y se contaron. Los valores que se muestran son promedios de determinaciones por duplicado. La variación desde el promedio no excede el 10 %.

La Fig. 4 muestra la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por el F(ab)-12 humanizado dirigido contra VEGF del Ejemplo 1. Se inyectaron células A673 de rabdomiosarcoma en ratones sin pelo BALB/c a la densidad de 2 x 106 por ratón. 24 horas después de comenzar la inoculación de células tumorales, se inyectaron los animales con un Mab del control, muMAb VEGF A4.6.1 o rhuVEGF MAb (IgGI; F(ab)-12) dos veces semanalmente, por vía intraperitoneal. La dosis del Mab del control fue de 5 mg/kg; los Mab dirigidos contra VEGF se administraron a 0,5 o 5 mg/kg, tal como se ha indicado (n = 10). Cuatro semanas después de la inyección de células tumorales, los animales se sometieron a eutanasia y se retiraron y pesaron los tumores. *: diferencia significativa cuando se compara con el grupo del control mediante ANOVA (p < 0,05)

Las Figs. 5A y 5B muestran las secuencias de aminoácidos de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente, del anticuerpo A4.6.1 de murino (SEQ ID NO: 10 para el VL y la SEQ ID NO: 9 para el VH) y las variantes hu2.0 del A4.6.1 humanizado (SEQ ID NO: 13 para el VL y la SEQ ID NO: 14 para el VH) y hu2.10 (SEQ ID NO: 15 para el VL y la SEQ ID NO: 16 para el VH) del Ejemplo 2. La numeración de la secuencia es de acuerdo con Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) y se indican las correspondencias por asteriscos (A4.6.1 de murino frente a hu2.0) o bolitas (hu2.0 frente a hu2. 10). La variante hu2.0 contiene solo las secuencias CDR (negrita) del anticuerpo de murino injertado en un marco consenso del subgrupo I de la cadena K ligera humana (SEQ ID NO: 12) y un marco consenso del subgrupo III de la cadena pesada (SEQ ID NO: 11). hu2. 10 fue el clon humanizado consenso obtenido de los experimentos de clasificación de fagos descritos en la presente memoria descriptiva.

La Fig. 6 representa gráficamente los restos del marco dirigidos para la aleatorización en el Ejemplo 2.

La Fig. 7 representa gráficamente la construcción del fagémido para la expresión superficial de las fusiones Fab-pIII en el fago. El fagémido codifica una versión humanizada del fragmento Fab del anticuerpo A4.6.1 fusionado a una porción de la proteína de revestimiento III del gen M13. La proteína de fusión consiste del Fab unido en el extremo carboxilo de la cadena pesada a un único resto de glutamina (procedente de la supresión de un codón ámbar en supE de E. coli), a continuación, la región terminal C de la proteína III del gen (restos 249-406). La transformación en F’ de E. coli, seguida por la superinfección con el fago auxiliar M13KO7 produce partículas de fagémido en las cuales una pequeña proporción de éstas muestran una única copia de la proteína de fusión.

Las Figs. 8A-E representan gráficamente la secuencia de nucleótidos bicatenaria (SEQ ID NO: 99) del vector phMB4-19-1.6 del anticuerpo de expresión del fago en el Ejemplo 3 y por consiguiente, las dos secuencias de aminoácidos codificadas (SEQ ID NOS 130 y 100).

Las Figs. 9A y 9B representan gráficamente una alineación de las secuencias de aminoácidos de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente, de las variantes dirigidas contra VEGF maduradas por afinidad en el ejemplo 3, en comparación a F(ab)-12 del Ejemplo I (SEQ DE ID NOS 8 y 7 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente). Las CDR están subrayadas y se designan por L, ligera, o H, cadena pesada, y los números 1-3. Los restos se numeran secuencialmente en los dominios VL y VH, por oposición al esquema de numeración de Kabat. Se muestra la molécula del molde, MB 1.6 (SEQ ID NOS 101 y 102 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente), junto con las variantes: H2305.6 (SEQ ID NOS 103 y 104 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente), Y0101 (SEQ ID NOS 105 y 106 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente), e Y0192 (SEQ ID NOS 107 y 108 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente). Se muestran las diferencias de los F(ab)-12 en las secuencias sombreadas.

Las Figs. 10A y 10B representan gráficamente una alineación de las secuencias de aminoácidos de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente, de las variantes dirigidas contra VEGF maduradas por afinidad del Ejemplo 3 en comparación con F(ab)-12 del Ejemplo 1 (SEQ ID NOS 8 y 7) de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente). Las CDR están subrayadas y se designan por L, ligera, o H, cadena pesada, y los números 1-3. Las variantes se designaron Y0243-1 (SEQ ID NOS 109 y 110 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente), Y0238-3 (SEQ ID NOS 111 y 112 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente), Y0313-1 (SEQ ID NOS 113 y 114 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente), e Y0317 (SEQ ID NOS 115 y 116 de los dominios variables ligero y pesado, respectivamente). Se muestran las diferencias de los F(ab)-12 en las secuencias sombreadas.

La Fig. 11 representa gráficamente los resultados del ensayo de actividad de HuVEC en el Ejemplo 3 para las variantes Y0238-3, Y0192 e Y0313.1 I así como el F(ab)-12 de longitud completa del Ejemplo 1.

La Fig. 12 representa gráficamente la inhibición de la mitogénesis inducida por VEGF por el F(ab)-12 de longitud completa del Ejemplo 1 (rhuMAb VEGF), un fragmento Fab del F(ab)-12 del Ejemplo 1 (rhuFab VEGF), y un fragmento Fab de la variante Y0317 madurada por afinidad del Ejemplo 3 (rhuFab VEGF (madurada por afinidad).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

I. Definiciones

[0016] El término “VEGF humano” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere al factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 165 aminoácidos, y relacionado con los factores de crecimiento celular endotelial vascular de 121, 189, y 206 aminoácidos, tal como se describe por Leung y col., Science 246: 1306 (1989), y Houck y col., Mol. Endocrin. 5: 1806 (1991) junto con las formas alélicas y procesadas que se producen naturalmente de aquellos factores de crecimiento.

[0017] La presente invención incorpora anticuerpos antagonistas dirigidos contra VEGF que son capaces de inhibir una o más de las actividades biológicas de VEGF, por ejemplo, su actividad mitogénica o angiogénica. Los antagonistas de VEGF actúan interfiriendo con la unión de VEGF a un receptor celular, incapacitando o matando células que se han activado mediante VEGF, o interfiriendo con la activación celular endotelial vascular tras la unión de VEGF a un receptor celular. Todo lo dicho apunta a la intervención de un antagonista de VEGF que deberá considerarse equivalente a los efectos de esta invención.

[0018] El término “receptor de VEGF” o “VEGFr” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un receptor celular de VEGF, ordinariamente un receptor superficial que se encuentra en las células endoteliales vasculares, así como sus variantes que retienen la capacidad de unirse a hVEGF. Un ejemplo de un receptor de VEGF es la tirosina cinasa de tipo fms (flt), un receptor transmembrana en la familia de la tirosina cinasa. DeVries y col., Science 255: 989 (1992); Shibuya y col., Oncogene 5: 519 (1990). El receptor flt comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular con actividad tirosina cinasa. El dominio extracelular está implicado en la unión de VEGF, mientras que el dominio intracelular está implicado en la transducción de la señal. Otro ejemplo de un receptor de VEGF es el receptor flk-1 (denominado también como KDR). Matthews y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 9026 (1991); Terman y col., Oncogene 6: 1677 (1991); Terman y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579 (1992). La unión de VEGF al receptor flt da como resultado la formación de al menos dos complejos de elevado peso molecular, que tienen un peso molecular aparente de

205.000 y 300.000 Daltons. Se cree que el complejo de 300.000 Dalton es un dímero que comprende dos moléculas receptoras unidas a una única molécula de VEGF.

[0019] El término “epítope de A4.6.1” cuando se usa en la presente memoria descriptiva, a no ser que se indique otra cosa, se refiere a la región del VEGF humano a la cual se une el anticuerpo A4.6.1 dado a conocer en Kim y col., Growth Factors 7: 53 (1992) y Kim y col. Nature 362: 841 (1993).

[0020] “Tratamiento” se refiere al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno así como a aquellos en los que se va a evitar el trastorno.

[0021] “Mamífero” a los efectos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo los seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoo, deportes, o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

[0022] “Anticuerpos” (Abs) e “inmunoglobulinas” (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen los anticuerpos y otras moléculas similares a la insulina que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos del último tipo, por ejemplo, se producen a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles crecientes por los mielomas.

[0023] Los “anticuerpos naturales” e “inmunoglobulinas naturales” son normalmente glicoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera tienen también puentes disulfuro intracadena regularmente separados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por numerosos dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V1) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos concretos forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada.

[0024] El término “variable” se refiere al hecho de que algunas porciones de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno concreto. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan la región marco (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprende cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan ampliamente una configuración de lámina �, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la lámina �. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), páginas 647-669). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan algunas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

[0025] El término “región hipervariable” cuando se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los restos de aminoácidos de una “región determinante de la complementariedad” o “CDR” (es decir, los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un “bucle hipervariable” (es decir, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 2632 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901917 (1987)). Los restos “Marco” o “FR” son aquellos restos del dominio variable diferentes de los restos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria descriptiva.

[0026] La digestión de los anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación a antígeno y es todavía capaz de reticular el antígeno.

[0027] “Fv” es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas de un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y de unirse al antígeno, aunque con una afinidad inferior que la del sitio de unión completo.

[0028] El fragmento Fab contiene también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos restos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteína(s) procedentes de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la designación en la presente memoria descriptiva para Fab’ en la que el(los) resto(s) de cisteína de los dominios constantes soportan un grupo tiol libre. Los fragmentos del anticuerpo F(ab’)2 se produjeron originalmente como parejas de fragmentos Fab’ que tenían cisteínas bisagra entre ellos. Se conocen también otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

[0029] Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (K) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

[0030] Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes tipos. Existen cinco tipos principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y algunos de estos pueden dividirse adicionalmente en subtipos (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a diferentes tipos de inmunoglobulinas se denominan a, 8, Щ, y, y μ, respectivamente. Se conocen bien las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de los diferentes tipos de inmunoglobulinas.

[0031] El término “anticuerpo” en la presente memoria descriptiva se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y los fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad biológica deseada.

[0032] “Fragmentos de anticuerpo” comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la unión al antígeno o su dominio variable. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv, los diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarios, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

[0033] El término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpo convencional (policlonal) que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se construye como requiriendo la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden realizar mediante el procedimiento del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler y col., Nature 256: 495 (1975), o se pueden llevar a cabo mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” se pueden aislar a través de bibliotecas de anticuerpos desplegados en fagos usando las técnicas descritas en Clackson y col., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks y col. J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo.

[0034] Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria descriptiva incluyen anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a un tipo o subtipo de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico con su homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otro tipo o subtipo de anticuerpo, así como los fragmentos de dichos anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos Nº 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

[0035] Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino son anticuerpos quiméricos que contienen la mínima secuencia derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de la región hipervariable del receptor se sustituyen por restos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los restos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente toda de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véanse Jones y col., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann y col., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

[0036] Los fragmentos de anticuerpo “Fv monocatenario” o “sFv” comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada de unión al antígeno. Para una revisión del sFv véase Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

[0037] El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH – VL). Usando un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

[0038] La expresión “anticuerpos lineales” cuando se usa a lo largo de esta solicitud se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata y col. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). De manera breve, estos anticuerpos comprenden una pareja de segmentos Fd en tándem (V11-C11I-V11-C11I) que forman una pareja de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

[0039] Una “variante” de anticuerpo dirigido contra VEGF, se refiere en la presente memoria descriptiva a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo “parental” dirigido contra VEGF en virtud de la adición, deleción y/o sustitución de uno o más resto(s) de aminoácidos en la secuencia del anticuerpo parental. En la realización preferida, la variante comprende una o más sustitución(es) de aminoácidos en una o más región(es) variables del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede comprender al menos una, por ejemplo, entre aproximadamente una y aproximadamente diez, y preferiblemente entre aproximadamente dos y aproximadamente cinco, sustituciones en una o más regiones hipervariables del anticuerpo parental. Ordinariamente, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con las secuencias del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo parental (por ejemplo, como en la SEQ ID NO: 7 u 8), más preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, y lo más preferible al menos un 95 %. Identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en la presente memoria descriptiva como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos con los restos del anticuerpo parental, tras la alineación de las secuencias y la introducción de huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de la secuencia. Ningún extremo N, extremo C, o extensiones, deleciones, o inserciones internas en la secuencia del anticuerpo deben construirse afectando a la identidad o la homología de las secuencia. La variante retiene la capacidad de unirse al VEGF humano y tiene preferiblemente propiedades que son superiores a las del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede tener una afinidad de unión más fuerte, capacidad potenciada para inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF y/o capacidad aumentada para inhibir la angiogénesis in vivo inducida por VEGF. Para analizar dichas propiedades, se debe comparar una forma Fab de la variante con una forma Fab del anticuerpo parental o una forma de longitud completa de la variante con una forma de longitud completa del anticuerpo parental, por ejemplo, debido a que se ha encontrado que el formato del anticuerpo dirigido contra VEGF afecta a su actividad en los ensayos de actividad biológica dados a conocer en la presente memoria descriptiva. La variante del anticuerpo de particular interés en la presente memoria descriptiva es una que expresa al menos aproximadamente 10 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces, y lo más preferible al menos aproximadamente 50 veces, la potenciación de la actividad biológica cuando se compara con el anticuerpo parental.

[0040] El anticuerpo “parental” en la presente memoria descriptiva es uno que está codificado por una secuencia de aminoácidos usada para la preparación de la variante Preferiblemente, el anticuerpo parental tiene una región marco humana y, si está presente, tiene región(es) constante(s) del anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humanizado o humano.

[0041] Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural con materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso del anticuerpo tal como se determinó mediante el procedimiento de Lowry, y lo más preferible más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos en el extremo N o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomasie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, se preparará el anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.

[0042] El término “epítopo etiquetado” cuando se usa en la presente memoria descriptiva se refiere al anticuerpo dirigido contra VEGF fusionado a un “epítopo etiqueta”. El polipéptido epítopo etiqueta tiene suficientes restos para proporcionar un epítopo contra el cual se puede realizar un anticuerpo, aún suficientemente corto para que no interfiera con la actividad del anticuerpo contra VEGF. El epítopo etiqueta es de manera preferible suficientemente único de tal manera que el anticuerpo contra el mismo no reacciona en cruzado sustancialmente con otros epítopos los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente al menos 6 restos de aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8-50 restos de aminoácidos (preferiblemente entre aproximadamente 9-30 restos). Los ejemplos incluyen el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Fiel y col. Mol. Cell. Biol.

8: 2159-2165 (1988)); la etiqueta c-myc, y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 del anterior (Evan y col., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)); y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborsky y col, Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)). En algunas realizaciones, el epítope etiqueta es un “epítopo de unión a receptor de tipo silvestre”. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “epítopo de unión a receptor de tipo silvestre” se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.

[0043] El término “agente citotóxico” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o produce la destrucción de las células. Se pretende que el término incluya isótopos radioactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tal como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos.

[0044] Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, Doxorubicina, 5-Fluorouracilo, Citosina arabinosido ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere (docetaxel), Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatino, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatino, Tenipósido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 4.675.187), Melfalan y otras mostazas de nitrógeno relacionadas.

[0045] El término “profármaco” tal como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco parental y es capaz de activarse o convertirse enzimáticamente en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615ª Reunión de Belfast (1986) y Stella y col., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt y col., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con aminoácidos D, profármacos glicosilados profármacos que contienen �-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

[0046] La palabra “marca” cuando se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo. La marca puede ser detectable por sí misma (por ejemplo, marcas de radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.

[0047] Por “fase sólida” se entiende una matriz no acuosa a la cual puede adherirse al anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas abarcadas en la presente memoria descriptiva incluyen las formadas parcial o completamente por vidrio (por ejemplo, vidrio poroso controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En algunas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término incluye también una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como la descrita en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.275.149.

[0048] Un “liposoma” es una vesícula pequeña compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que es útil para la administración de un fármaco (tal como los anticuerpos dirigidos contra VEGF dados a conocer en la presente memoria descriptiva y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición lípida de las membranas biológicas. Una molécula de ácido nucleico “aislado” es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislados es diferente que la de en la forma o composición que la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aislado se distinguen por tanto de la molécula de ácido nucleico ya que existen en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que expresan ordinariamente el anticuerpo en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

[0049] La expresión “secuencias control” se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida de manera operable en un organismo hospedador concreto. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

[0050] El ácido nucleico está unido de manera operable cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretora se une de manera operable al ADN de un polipéptido si se expresa en forma de una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se une de manera operable a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se une de manera operable a una secuencia de codificación si se sitúa de tal manera que facilita la traducción. Generalmente, “unido de manera operable” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de una líder secretora, continuas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porqué ser contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

[0051] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, las expresiones “célula”, “línea celular”, y “cultivo celular” se usan indistintamente y todas las mencionadas designaciones incluyen progenie. De esta manera, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la célula originalmente transformada. En el caso en el que se pretendan designaciones distintas, esto resultará claro con respecto al contexto.

II. Modos de llevar a cabo la invención

[0052] Los siguientes ejemplos de la presente memoria descriptiva describen la producción de anticuerpos humanizados y variantes dirigidos contra VEGF con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica que incluyen: (a) fuerte afinidad de unión por el antígeno de VEGF; (b) una capacidad de inhibir in vitro la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales; y (c) la capacidad de inhibir in vivo la angiogénesis inducida por VEGF.

[0053] Se pueden determinar las afinidades de los anticuerpos tal como se describe en los siguientes ejemplos de la presente memoria descriptiva. Los anticuerpos humanizados o variantes preferidos son aquellos que se unen al VEGF humano con un valor de la Kd no superior a aproximadamente 1 x 10-7 M; preferiblemente no superior a aproximadamente 1 x 10-8 M, y lo más preferible no superior a aproximadamente 5 x 10-9 M.

[0054] Aparte de los anticuerpos con fuerte afinidad de unión por VEGF humano, también es deseable seleccionar anticuerpos humanizados o variantes que tengan otras propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser uno que inhiba el crecimiento celular endotelial en respuesta a VEGF. En una realización, el anticuerpo puede ser capaz de inhibir la proliferación celular endotelial capilar en respuesta a una concentración eficaz casi máxima de VEGF (3 ng/ml). Preferiblemente, el anticuerpo tiene una valor de la dosis efectiva 50 (DE50) no superior a aproximadamente 5 nM, preferiblemente no más de aproximadamente 1 nM, y lo más preferible no más de aproximadamente 0,5 nM, para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales en este “ensayo de crecimiento celular endotelial”, es decir, a estas concentraciones el anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento celular endotelial inducido por VEGF in vitro en un 50 %. Un “ensayo de crecimiento celular endotelial” preferido implica cultivar células endoteliales capilares derivadas de corteza adrenal de bovino en presencia de medio Eagle modificado por Dulbecco con baja concentración de glucosa (DMEM) (GIBCO) suplementado con suero de ternera al 10 %, glutamina 2 mM, y antibióticos (medio de crecimiento), esencialmente tal como se describe en el Ejemplo I a continuación. Estas células endoteliales se siembran a una densidad de 6 x 103 células por pocillo, en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento. A continuación se añade tanto anticuerpo parental dirigido contra VEGF (control), como anticuerpo humanizado o variante dirigido contra VEGF a concentraciones que varían entre 1 y 5000 ng/ml. Después de 2-3 h, se añade VEGF purificado a una concentración final de 3 ng/ml. Para el control de la especificidad, se puede añadir cada anticuerpo a células endoteliales a la concentración de 5000 ng/ml, tanto solo como en presencia de 2 ng/ml de bFGF. Después de cinco

o seis días, las células s disocian por exposición a la tripsina y se cuentan en un contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Se pueden analizar los datos mediante un programa de ajuste de la curva de cuatro parámetros (KaleidaGraph).

[0055] El anticuerpo humanizado o variante dirigido contra VEGF preferido puede ser también uno que tenga actividad de supresión tumoral in vivo. Por ejemplo, el anticuerpo puede suprimir el crecimiento de las células A673 de rabdomiosarcoma humano o las células MDA-MB-435 de carcinoma de mama en ratones sin pelo. Para los estudios tumorales in vivo, se cultivan células A673 de rabdomiosarcoma humano (ATCC; CRL 1598) o células MDA_MB_435 (disponibles de la ATCC) en DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10 %, glutamina 2 mM y antibióticos, tal como se describe en el Ejemplo I a continuación. Ratones sin pelo BALB/c hembras, de 6-10 semanas de edad, se inyectaron por vía subcutánea con 2 x 106 células tumorales en la zona dorsal en un volumen de 200 μl. A continuación se trataron los animales con el anticuerpo humanizado o variante y un anticuerpo del control sin actividad en este ensayo. El Mab humanizado o variante dirigido contra VEGF se administró a una dosis de 0,5 y/o 5 mg/kg. Cada Mab se administró dos veces por vía intraperitoneal en un volumen de 100 μl, comenzando 24 h después de la inoculación de células tumorales. Se determinó el tamaño del tumor a intervalos semanales. Cuatro semanas después de la inoculación de células tumorales, los animales se sometieron a eutanasia y se retiraron y pesaron los tumores. Se puede llevar a cabo el análisis estadístico mediante ANOVA. Preferiblemente, el anticuerpo en este “ensayo tumoral in vivo” inhibe aproximadamente un 50-100 %, preferiblemente aproximadamente un 70-100 % y lo más preferible aproximadamente un 80-100 % el crecimiento de las células tumorales A673 humanas a una dosis de 5 mg/kg.

[0056] En la realización preferida, el anticuerpo humanizado o variante fracasa en estimular una respuesta antigénica tras la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo a un paciente humano. Si se estimula una respuesta inmunógena, preferiblemente, la respuesta será tal que el anticuerpo proporciona aún un beneficio terapéutico al paciente tratado con el mismo.

[0057] El anticuerpo humanizado o variante es también preferiblemente uno que es capaz de inhibir la angiogénesis inducida por VEGF en un ser humano, por ejemplo de inhibir el crecimiento tumoral humano y/o inhibir la angiogénesis intraocular en trastornos de la retina.

[0058] Los anticuerpos preferidos se unen al “epítopo A4.6.1” tal como se define en la presente memoria descriptiva. Para cribar los anticuerpos que se unen al epítopo en un VEGF humano unido por un anticuerpo de interés (por ejemplo, aquel que bloquea la unión del anticuerpo A4.6.1 al VEGF humano), se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, se puede llevar a cabo la cartografía del epítopo, por ejemplo, como se describe en Champe y col., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995), para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

[0059] Los anticuerpos incorporados en la invención tienen un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4, en la que “FR1-4” representa las cuatro regiones marco y “CDRH1-3” representa las tres regiones hipervariables de un dominio variable pesado del anticuerpo dirigido contra VEGF. Los FR1-4 se derivan de una “secuencia consenso” (es decir, los aminoácidos más comunes de un tipo, subtipo o subgrupo de cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas humanas) como en los ejemplos siguientes. Muchas secuencias de la región marco del anticuerpo humano se compilan en, por ejemplo, Kabat y col., más arriba. Se proporciona la FR variable pesada mediante una secuencia consenso de un subgrupo de inmunoglobulina humana tal como el que se compila en Kabat y col., más arriba. El subgrupo de la inmunoglobulina humana es un subgrupo III de cadenas pesadas humanas (por ejemplo, como en la SEQ ID NO: 11).

[0060] La secuencia FR variable pesada humana tiene sustituciones en la misma, por ejemplo, en la que el resto FR está sustituido por un resto no humano correspondiente (por “resto no humano correspondiente” se 5 entiende el resto no humano con la misma numeración de posición de Kabat que el resto humano de interés cuando las secuencias humanas y no humanas se alinean), pero la sustitución con el resto no humano no es necesaria. Por ejemplo, se puede seleccionar una sustitución en otro resto FR diferente del resto no humano corriente mediante la expresión del fago (véase el Ejemplo 2 a continuación). Los restos FR variables pesados que se sustituyen incluyen uno cualquiera de los números de restos: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H, 94H (numeración de

10 restos de Kabat empleada aquí). Preferiblemente, se sustituyen al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro de estos restos. Una combinación particularmente preferida. Una combinación particularmente preferida de sustituciones de FR es: 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H, y 94H.

[0061] Con respecto a las regiones hipervariables de la cadena pesada, estas tienen las secuencias de aminoácidos siguientes:

15 CDRH1

GYX1X2X3X4YGX5N (SEQ ID NO: 117), en la que X1 es D, T o E, pero preferiblemente es D o T;

X2 is F, W, o Y, pero preferiblemente es F; X3 es T. Q, G o S, pero preferiblemente es T; X4 es H o N; y

X5 es M o I, pero preferiblemente es M.

CDR2

20 WINTX,TGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 118), en la que X1 es Y o W, pero preferiblemente es Y.

CDRH3

YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NO: 119), en la que X1 es H o Y; X2 es Y, R, K, I, T, E, o W, pero preferiblemente es Y;

X3 es G, N, A, D, Q, E, T, K, o S, pero preferiblemente es G; X, es S, T, K, Q, N, R, A, E, o G, pero preferiblemente 25 es S o T; y

X, es S o G, pero preferiblemente es S.

[0062] El dominio variable de la cadena pesad comprende opcionalmente lo que se ha designado como “CDR7” dentro de la presente memoria descriptiva (es decir, que forma parte de) FR3 (véanse las Figs. 9B y 10B), en el que CDR7 puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos:

30 CDR7

X1SX2DX3X4X5X6TX7 (SEQ ID NO: 120), en la que X1 es F, I, V, L, o A, pero preferiblemente es F; X2 es A, L, V, o I, pero preferiblemente es L; X3 es T, V o K, pero preferiblemente es T; X, es S o W, pero preferiblemente es S; X5 es S, o K, pero preferiblemente es K; X6 es N, o S, pero preferiblemente es S; y X7 es V, A, L o I, pero preferiblemente es A.

35 [0063] Los anticuerpos de la realización preferida en la presente memoria descriptiva tienen un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula: FR1CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4, en la que "FR1-4" representa las cuatro regiones marco y “CDRL1-3” representa las tres regiones hipervariables de un dominio variable ligero del anticuerpo dirigido contra VEGF. Las FR1-4 se derivan de una “secuencia consenso” (es decir, los aminoácidos más comunes de un tipo, subtipo o

40 subgrupo de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas humanas) como en los siguientes ejemplo. La FR variable ligera se proporciona mediante una secuencia consenso de un subgrupo de inmunoglobulina humana tal como el que se compila en Kabat y col., más arriba. El subgrupo de la inmunoglobulina humana es el subgrupo I de las cadenas ligeras kappa humanas (por ejemplo, como en la SEQ ID NO: 12).

[0064] La secuencia FR variable ligera humana tiene sustituciones en la misma, por ejemplo, en las que el

45 resto FR humano se sustituye por un resto de ratón correspondiente, pero la sustitución con el resto no humano no es necesaria. Por ejemplo, se puede seleccionar un resto de sustitución diferente que el del resto no humano correspondiente mediante expresión del fago (véase el Ejemplo 2 a continuación). Preferiblemente solo se sustituye 46L. En otra realización, se sustituyen 4L y 46L (numeración del resto de Kabat empleada aquí).

[0065] Con respecto a las CDR, estas tienen las secuencias de aminoácidos como sigue:

CDRL1

X1AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ID NO: 121), en la que X1 es R o S, pero preferiblemente es S; X2 es S o N, pero preferiblemente es S;

X3 es Q o E, pero preferiblemente es Q; X4 es Q o D, pero preferiblemente es D; y X5 es I o L, pero preferiblemente es I.

CDRL2

FTSSLHS (SEQ ID NO: 122).

CDRL3

QQYSX1X2PWT (SEQ ID NO: 123), en la que X1 es T, A o N, pero preferiblemente es T; y X2 es V o T, pero preferiblemente es V.

[0066] Los anticuerpos humanizados dirigidos contra VEGF preferidos son aquellos que tienen las secuencias del dominio variable pesado y/o ligero de F(ab)-12 en el Ejemplo I y sus variantes tales como las formas maduradas por afinidad que incluyen las variantes Y0317, Y0313-1 e Y0238-3 en el Ejemplo 3, siendo Y0317 la variante preferida. Los procedimientos para generar anticuerpos humanizados de interés dirigidos contra VEGF se elaboran con más detalle a continuación.

A. Preparación de anticuerpos

[0067] Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos contra VEGF y generar variantes de anticuerpos dirigidos contra VEGF se describen en los ejemplos siguientes. Con el fin de humanizar un anticuerpo dirigido contra VEGF, se prepara el material de partida del anticuerpo no humano. Cuando se va a generar una variante, se prepara el anticuerpo parental. Las técnicas a modo de ejemplo para generar dicho material de partida del anticuerpo no humano y de los anticuerpos parentales se describirá en las siguientes secciones.

(i) Preparación del antígeno

[0068] El antígeno de VEGF que se va a usar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, VEGF intacto o un fragmento de VEGF (por ejemplo, un fragmento de VEGF que comprende el “epítope A4.6.1”). Otras formas de VEGF útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica. El antígeno de VEGF usado para generar el anticuerpo, es preferiblemente VEGF humano, por ejemplo, tal como se describe en Leung y col., Science 246:1306 (1989), and Houck y col., Mol. Endocrin. 5: 1806 (1991).

(ii) Anticuerpos policlonales

[0069] Los anticuerpos policlonales se cultivan preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que sea inmunógena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de la tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación mediante restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, en el que R y R1 son diferentes grupos alquilo.

[0070] Se inmunizaron los animales contra el antígeno, los conjugados inmunógenos, o los derivados combinando, por ejemplo 100 μg o 5 μg de la proteína o conjugado (de conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la disolución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales recibieron un refuerzo con 1/5 y 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después los animales se sometieron a sangrado y se evaluó el suero para determinar el título de anticuerpos. Los animales recibieron un refuerzo hasta la meseta del título. Preferiblemente, el animal recibió un refuerzo con el conjugado del mismo antígeno, pero se conjugó con una proteína diferente y/o a través de diferentes reactivos de reticulación. Se pueden realizar también conjugados en un cultivo celular recombinante como fusiones de proteínas. También, se utiliza de manera adecuada agregar agentes tales como alum para potenciar la respuesta inmune.

(iii) Anticuerpos monoclonales

[0071] Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden preparar mediante procedimientos de ADN recombinante (Patente de los Estados Unidos Nº 4.816.567).

[0072] En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster o un macaco, se inmuniza como se ha descrito anteriormente en la presente memoria descriptiva para estimular linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

[0073] Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

[0074] Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EE.UU. Se han descrito también líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol.,

133: 3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

[0075] El medio de cultivo en el cual se hacen crecer las células de hibridoma se evalúa para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA)

[0076] La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y col., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

[0077] Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, se pueden subclonar los clones limitando los procedimientos de dilución y crecimiento mediante procedimientos normalizados (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados a este efecto incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden hacer crecer in vivo como tumores de ascites en un animal.

[0078] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascites, o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, proteína a-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

[0079] El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (usando, por ejemplo, sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra forma la proteína de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos recombinantes en las células recombinantes hospedadoras. La producción recombinante de anticuerpos se describirá con más detalle a continuación.

(iv) Humanización y variantes de secuencias de aminoácidos

[0080] Los Ejemplos 1-2 siguientes describen procedimientos para la humanización de un anticuerpo dirigido contra VEGF. En algunas realizaciones, puede ser deseable generar variantes de secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos humanizados, particularmente cuando estas mejoran la afinidad de la unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo humanizado. El Ejemplo 3 describe metodologías para generar variantes de las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo dirigido contra VEGF con afinidad potenciada con respecto al anticuerpo parental.

[0081] Las variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo dirigido contra VEGF se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo dirigido contra VEGF, o mediante síntesis peptídica. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos en el interior de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos dirigidos contra VEGF de los ejemplos de la presente memoria descriptiva. Cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos después de la traducción del anticuerpo humanizado o variante de anticuerpo dirigida contra VEGF, de tal forma como cambiando el número o la posición de los sitios de glicosilación.

[0082] Un procedimiento útil para la identificación de algunos restos o regiones del anticuerpo dirigido contra VEGF que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina “mutagénesis de barrido de alanina”, tal como se describe en Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, un resto o grupo de restos diana se identifican (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferible alanina o polialanina) que afecta a la interacción de los aminoácidos con el antígeno de VEGF. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitución. De esta manera, mientras se predetermina el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos, la naturaleza de la mutación per se no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo el barrido de ala o la mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se criban las variantes del anticuerpo expresadas dirigidas contra el VEGF para la actividad deseada. La mutagénesis de barrido de alanina se describe en el Ejemplo 3.

[0083] Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxilo que varían en longitud de un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo dirigido contra VEGF con un resto metionilo en el extremo N o el anticuerpo fusionado con un epítopo etiqueta. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo dirigida contra VEGF incluyen la fusión del término N o C del anticuerpo dirigido contra VEGF de una enzima o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo (véase a continuación).

[0084] Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto aminoácido en la molécula de anticuerpo dirigida contra VEGF eliminado y un resto diferente insertado en su lugar. Los sitios de más interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero se contemplan también las alteraciones de FR. En la Tabla 1 se muestran la sustituciones conservativas bajo el encabezado de “sustituciones preferidas”. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, se pueden introducir, a continuación, más cambios sustanciales, denominados “sustituciones a modo de ejemplo” en la Tabla 1, o como se describe además a continuación en referencia a los tipos de aminoácidos, y cribarse los productos.

Tabla 1

Resto Original: Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones preferidas

Ala (A): val; leu; ile val

Arg (R): lys; gln; asn lys

Asn (N): gln; his; asp, lys; arg gln

Asp (D): glu; asn glu

Cys (C): ser; ala ser

Gln (Q): asn; glu asn

Glu (E): asp; gln asp

Gly (G): ala ala

His (H): asn; gln; lys; arg arg

Ile (I): leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L): norleucina; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K): arg; gln; asn arg

Met (M): leu; phe; ile leu

Phe (F): leu; val; ile; ala; tyr tyr

Pro (P): ala ala

Ser (S): thr thr

Thr (T): ser ser

Trp (W): tyr; phe tyr

Tyr (Y): trp; phe; thr; ser phe

Val (V): ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

[0085] Se llevan a cabo modificaciones sustanciales en la propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando

5 sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o en hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena secundaria. Los restos que se producen naturalmente se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de la cadena secundaria:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; 10 (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3): ácidos: asp, glu;

(4): básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5): restos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro; and

(6): aromáticos: trp, tyr, phe.

15 [0086] Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

[0087] Cualquier resto de cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo humanizado o variante dirigido contra VEGF se puede sustituir también, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. De manera inversa, se puede(n) añadir un(os) enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

[0088] Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional implica sustituir uno o más restos en las regiones hipervariables de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental a partir del cual se genera. Un medio conveniente para generar dichas variantes sustitucionales es la maduración por afinidad usando la expresión del fago (véase el Ejemplos 3 en la presente memoria descriptiva). De manera breve, algunos sitios de regiones hipervariables (por ejemplo sitios 6-7) están mutados para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se expresan de una manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones del producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes expresadas del fago se criban a continuación para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se da a conocer en la presente memoria descriptiva. Con el fin de identificar los sitios de las regiones hipervariables candidatas para la modificación, se puede llevar a cabo la mutagénesis de barrido de alanina (véase el Ejemplo 3) para identificar los restos de las regiones hipervariables que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el VEGF humano. Dichos restos de contacto y los restos adyacentes son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente memoria descriptiva. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe en la presente memoria descriptiva y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para desarrollo adicional.

[0089] Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el modelo de glicosilación original del anticuerpo. Por alterar se entiende eliminar uno o más restos de carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

[0090] La glicosilación de anticuerpos normalmente se encuentra tanto unida a N como unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato con la cadena secundaria de un resto de asparagina las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena secundaria de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares Nacetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque se puede usar también 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

[0091] La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se lleva a cabo convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga uno o más de las anteriores secuencias tripeptídicas descritas (para los sitios de glicosilación unidos a N). La alteración se puede llevar a cabo mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación unidos a O).

[0092] Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo dirigido contra VEGF se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se producen naturalmente) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al emplazamientos), mutagénesis mediante la PCR, y mutagénesis mediante casete de una variante preparada más temprano o de una versión no variante del anticuerpo dirigido contra VEGF.

(v) Anticuerpos humanos

[0093] Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de la línea germinal da como resultado la completa inhibición de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el estímulo del antígeno. Véase por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y Patentes de los Estados Unidos 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807. Se pueden derivar también anticuerpos humanos de bibliotecas de expresión de fagos (Hoogenboom y col., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol.,

222: 581-597 (1991); y Patentes de los Estados Unidos 5.565.332 y 5.573.905). Tal como se ha discutido anteriormente, se pueden generar también anticuerpos humanos mediante linfocitos T activados in vitro (véanse las Patentes de los Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275).

(vi) Fragmentos de anticuerpo

[0094] En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o variante dirigido contra VEGF es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117(1992) y Brennan y col., Science 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente mediante células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, se pueden recuperar directamente fragmentos Fab’-SH de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab’)2 se forma usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab’)2. De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos Fv, Fab o F(ab’)2 se pueden aislar directamente de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto.

(vii) Anticuerpos multiespecíficos

[0095] En algunas realizaciones puede ser deseable generar anticuerpos humanizados o variantes multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) que tengan especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo pueden unirse a dos epítopos diferentes de la proteína VEGF. Alternativamente un brazo dirigido contra VEGF se puede combinar con un brazo que se una a una molécula estimuladora sobre un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo, CD2 o CD3), o los receptores Fc de la IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) con el fin de focalizar los mecanismos de defensa celular de las células que expresan VEGF. Se pueden usar también anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos a las células que expresan VEGF. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a VEGF y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, alcaloide de la vinca, cadena A de la ricina, metotrexato o isótopo de hapteno radioactivo). Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos F(ab’)2 biespecíficos).

[0096] De acuerdo con otro enfoque para preparar anticuerpos biespecíficos, se puede genomanipular la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recubren desde el cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas secundarias de pequeños aminoácidos de la interfase del primer anticuerpo se sustituyen con cadenas secundarias más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) secundaria(s) más grande(s) sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo las grandes cadenas secundarias de aminoácidos con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como los homodímeros. Véase el documento WO96/27011 publicado el 6 de septiembre de 1996.

[0097] Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Se conocen bien en la técnica los agentes de reticulación adecuados, y se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.676.980, junto con numerosas técnicas de reticulación.

[0098] Se han descrito también en la bibliografía técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Se pueden preparar, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos usando el enlace químico. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab’)2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante ditiol de arsenito de sodio para estabilizar ditioles próximos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab’ generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab’-TNB se reconvierte a continuación en el Fab’-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. En una realización adicional, los fragmentos Fab’-SH recuperados directamente de E. coli se pueden acoplar químicamente in vitro para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp. Med 175:217-225 (1992).

[0099] Se han descrito también diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y jun se unieron a las porciones Fab’ de los dos diferentes anticuerpos mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento se puede utilizar también para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología del “diacuerpo” descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando por consiguiente dos sitios de unión a antígeno. Se ha informado también de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv monocatenarios (sFv). Véase Gruber y col., J. Immunol. 152: 5368 (1994). Alternativamente, el anticuerpo biespecífico puede ser un “anticuerpo lineal” producido tal como se describe en Zapata y col. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995).

[0100] Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos Tutt y col., J. Immunol. 147: 60 (1991).

(viii) Otras modificaciones

[0101] Se contemplan otras modificaciones del anticuerpo humanizado o variante dirigido contra VEGF. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo usado en la invención con respecto a la función efectora, con el fin, por ejemplo, de que potencie la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Se pueden introducir, por ejemplo resto(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo por tanto la formación del enlace disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener capacidad de internalización mejorada y/o muerte celular mediada por el complemento aumentada y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véanse Caron y col., J. Exp Med. 176: 119 -1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 29182922 (1992). Se pueden preparar también anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada usando reticuladores heterobifuncionales tal como se describe en Wolff y col., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede genomanipular un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y puede por tanto una lisis del complemento potenciada y capacidades de ADCC. Véase Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

[0102] La invención pertenece también a los inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito en la presente memoria descriptiva conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

[0103] Se han descrito anteriormente los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que se pueden usar incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de la diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAPS), el inhibidor de momordica charantia, la curcina, la crotina, el inhibidor de la saponaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos. Está disponible una variedad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados dirigidos contra VEGF. Los ejemplos incluyen212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re.

[0104] Los conjugados del anticuerpo y del agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como clorhidrato de dimetil adipimidato), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), bis-azido compuestos (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y los compuestos de flúor bis-activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026.

[0105] En otra realización, se puede conjugar el anticuerpo con un “receptor” (tal como estreptavidina) para la utilización en el predireccionamiento tumoral en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la eliminación de un conjugado sin unir de la circulación usando un agente de aclaramiento y a continuación, las administración de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleido).

[0106] Los anticuerpos dirigidos contra VEGF dados a conocer en la presente memoria descriptiva se pueden formular también como inmunoliposomas Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980): y Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.485.045 y

4.544.545. Se dan a conocer liposomas con tiempo de circulación aumentado en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.013.556.

[0107] Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase invertida con una composición lípida que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para dar como resultado liposomas con el diámetro deseado. Se pueden conjugar los fragmentos Fab’ del anticuerpo de la presente invención con los liposomas tal como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorubicina) está opcionalmente contenido en el interior del liposoma. Véase Gabizon y col., J. National Cancer Inst.81(19): 1484 (1989).

[0108] El anticuerpo usado en la presente invención se puede usar también en ADEPT conjugando el anticuerpo con una enzima activadora del profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase el documento WO81/01 145) en un fármaco anticanceroso activo. Véanse, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la Patente de los Estados Unidos Nº 4.975.278.

[0109] El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal manera que convierte este en su forma citotóxica más activa.

[0110] Las enzimas que son útiles en este procedimiento incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres, arilfosfatasa útil para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres, citosina desaminasa útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticancerosos, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como la proteasa de Serratia, la termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres, D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de aminoácidos-D; enzimas que escinden carbohidratos tales como �-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres. 1-lactamasa, útil para convertir fármacos derivatizados con -lactamas en fármacos libres, y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útil para convertir fármacos derivatizados y sus nitrógenos aminados con grupos fenoxiacetilo

o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos con actividad enzimática, conocidos también en la técnica como “abzimas”, para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Se pueden preparar conjugados de anticuerpo-abzima tal como se describe en la presente memoria descriptiva para la administración de la abzima a una población de células tumorales.

[0111] Las enzimas se pueden unir covalentemente a los anticuerpos dirigidos contra VEGF mediante técnicas bien conocidas en la materia tales como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales discutidos anteriormente. Alternativamente se pueden construir proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión al antígeno del anticuerpo usado en la presente invención unido a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima usando las técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Neuberger y col., Nature 312: 604-608 (1984)).

[0112] En algunas realizaciones de la invención, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar, por ejemplo, la penetración tumoral. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su semivida en suero. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión a un receptor silvestre en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, mediante mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epítopo en un péptido etiqueta que se fusiona a continuación con el fragmento de anticuerpo tanto en el extremo como en la parte media, por ejemplo, mediante síntesis de ADN o peptídica). Véase el documento WO96/32478 publicado el 17 de octubre de 1996.

[0113] El epítopo de unión al receptor silvestre constituye generalmente una región en la que cualquiera de uno

o más restos de aminoácidos procedentes de uno o dos bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Incluso de manera más preferible, se transfieren tres o más restos procedentes de uno o dos bucles del dominio Fc. Aún de manera más preferida, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3, o VH, o más de una de dichas regiones, del anticuerpo. Alternativamente, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o a la región VL, o ambas, del fragmento de anticuerpo.

[0114] En las realizaciones preferidas, el epítopo de unión al receptor silvestre comprende la secuencia: PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:17), y opcionalmente comprende además una secuencia seleccionada procedente del grupo que consiste en HQSLGTQ (SEQ ID NO: 18), HQNLSDGK (SEQ ID NO:19), HQNISDGK (SEQ ID NO: 20), o VISSHLGQ (SEQ ID NO: 21), particularmente cuando el fragmento de anticuerpo es un Fab o F(ab’)2; o el epítopo de unión al receptor silvestre es un polipéptido que contiene la(s) secuencia(s): HQNLSDGK (SEQ ID NO: 19), HQNISDGK (SEQ ID NO: 20), o VISSHLGQ (SEQ ID NO: 21) y la secuencia: PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 17).

[0115] Se incluyen también las modificaciones covalentes del anticuerpo humanizado o variante dirigido contra VEGF dentro del alcance de esta invención tal como se define en las reivindicaciones: se pueden preparar, si es aplicable, mediante síntesis química o mediante escisión enzimática o química del anticuerpo. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácidos dirigidos del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas secundarias seleccionadas o los restos en los extremos N o C. Se describen modificaciones covalentes a modo de ejemplo de polipéptidos en la Patente de los Estados Unidos 5.534.615. Un tipo preferido de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la manera que se muestra en las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

B. Vectores, células hospedadoras y procedimientos recombinantes

[0116] Para la producción recombinante del anticuerpo, se puede aislar el ácido nucleico que codifica éste e insertarse en un vector replicable para la clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. En otra realización, se puede producir el anticuerpo mediante la recombinación homóloga, por ejemplo, tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.204.244. E ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (usando, por ejemplo, sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción, por ejemplo, tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.534.615 otorgada el 9 de julio de 1996.

[0117] Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o la expresión del ADN en los vectores de la presente memoria descriptiva son las células procariotas, de levaduras, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados a este fin incluyen las eubacterias, tales como, por ejemplo, los organismos Gram negativos o Gram positivos, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P dado a conocer en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedador de clonación preferido de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas también otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3 110 (ATCC 27.325). estos ejemplos son ilustrativos más bien que limitantes.

[0118] Además de los procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son adecuados como hospedadores de clonación o expresión de los vectores que codifican anticuerpos dirigidos contra VEGF. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panadería, es la más comúnmente usada entre los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Sin embargo, otros numerosos géneros, especies, y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en la presente memoria descriptiva, tales como Schizosaccharomyces pombe; hospedadores de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedadores de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

[0119] Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de un anticuerpo glicosilado dirigido contra VEGF se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas y las correspondientes células hospedadoras de insectos permisivas tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Están públicamente disponibles una variedad de cepas víricas para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y se pueden usar dichos virus como el virus de la presente memoria descriptiva de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Se pueden utilizar también como hospedadores cultivos de células de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, y tabaco.

[0120] Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) ha llegado a ser un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 77: 4216 (1980)), células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de matriz humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci.

383: 44-68 (1982)); células MRC 5, células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

[0121] Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la producción de anticuerpo dirigido contra VEGF y el cultivo en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

[0122] Las células hospedadoras usadas para producir el anticuerpo dirigido contra VEGF usado en esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio Eagles Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Además, se pueden usar cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Enz. 58: 44 (1979), Barnes y col., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de los Estados Unidos Nos 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; documento WO 87/00195; o Patente de los Estados Unidos Re. 30.985 como medios de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCINTM), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se pueden incluir también cualesquiera otros suplementos necesarios a las concentraciones apropiadas que los expertos en la técnica conocerían. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH, y similares, son aquellas anteriormente usadas con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para la persona normalmente experta.

[0123] Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los desechos particulados, tanto de las células hospedadoras como de los fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter y col., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico de E. coli. De manera breve, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. los desechos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran generalmente en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa en cualquiera de las anteriores etapas para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.

[0124] La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La adecuabilidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier dominio Fc de la inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede usar la proteína A para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas y1, y2, o y4 humanas (Lindmark y col., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para y3 humana (Guss y col., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es con mucha frecuencia agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como las de vidrio poroso controlado o poli(poliestirendivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden conseguir con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC en fase inversa, la cromatografía sobre gel de sílice, la cromatografía sobre heparina, la cromatografía con SEPHAROSETM en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), la cromatofocalización, la SDS-PAGE, y la precipitación con sulfato de amonio están también disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

[0125] Tras cualquier etapa(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se puede someter a cromatografía de interacción hidrófoba a pH bajo usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, llevado a cabo preferiblemente a concentraciones salinas bajas (por ejemplo, de aproximadamente sal 0-0,25 M).

C. Formulaciones farmacéuticas

[0126] Se preparan formulaciones terapéuticas del anticuerpo para el almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizantes no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manos, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio, complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

[0127] La formulación en la presente memoria descriptiva puede contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación concreta que se está tratando, preferiblemente aquel con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí (véase Sección F a continuación). Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el objetivo pretendido.

[0128] Los ingredientes activos pueden estar también atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Se dan a conocer dichas técnicas en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).

[0129] Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0130] Se pueden preparar preparaciones de liberación continua. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación continua incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continua incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), o alcohol poli(vinílico)), poliláctidos (Patente de los Estados Unidos Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido lácticoácido glicólico y acetato de leuprólido, y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tales como acetato de etilen-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, algunos hidrogeles liberan proteínas durante periodos más cortos de tiempo. Cuando anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden considerar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares mediante el intercambio tiosulfuro-disulfuro, se puede conseguir la estabilización modificando los restos sulfidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de matrices poliméricas.

D. Usos no terapéuticos del anticuerpo

[0131] Incorporados en los artículos de fabricación de la invención se pueden usar como agentes de purificación por afinidad. En este procedimiento, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina Sephadex o un papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína VEGF (o uno de sus fragmentos) que se va a purificar, y en lo sucesivo el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína VEGF, que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampón glicina, pH 5,0, que eliminará la proteína VEGF del anticuerpo.

[0132] Los anticuerpos dirigidos contra VEGF pueden ser también útiles en ensayos diagnósticos de la proteína VEGF, detectando, por ejemplo, su expresión en células, tejidos, o suero específicos. Dichos procedimientos diagnósticos pueden ser útiles en el diagnóstico del cáncer.

[0133] Para las aplicaciones diagnósticas, el anticuerpo se marcará normalmente con un resto detectable. Están disponibles numerosas marcas que se pueden agrupar generalmente en las siguientes categorías:

(a): Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H, y 131I. El anticuerpo se puede marcar con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen y col., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, nueva York, Pubs. (1991) por ejemplo, y se puede medir la radioactividad usando el recuento por centelleo.

(b): Marcas fluorescentes tanto como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, están disponibles dansilo, lisamina, ficoeritrina y Texas Red. Se pueden conjugar las marcas fluorescentes con el anticuerpo usando, por ejemplo, las técnicas dadas a conocer en Current Protocols in Immunology, más arriba. Se puede cuantificar la fluorescencia usando un fluorímetro.

(c): Están disponibles diversas marcas enzima-sustrato y la Patente de los Estados Unidos Nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima cataliza generalmente una alteración química del sustrato cromógeno que se puede medir usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. Se han descrito anteriormente las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia. El sustrato quimioluminiscente llega a excitarse electrónicamente mediante una reacción química y puede a continuación emitir luz que se puede medir (usando, por ejemplo, un quimioluminómetro) o dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, la luciferasa de la luciérnaga y la luciferasa bacteriana, Patente de los Estados Unidos Nº 4.737.456), luciferina, 2,3dihidrftalzinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, � galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O’Sullivan y col., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nueva York, 73: 47-166 (1981).

[0134] Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:

(i): Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en la que la peroxidasa de hidrógeno oxida un colorante precursor (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3’,5,5’-tetrametil bencidina (TMB));

(ii): fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenilfosfato como sustrato cromógeno; y

(iii) �-D-galactosidasa (�-D-Gal) con un sustrato cromógeno (por ejemplo, p-nitrofenil-�-D-galactosidasa) o el sustrato fluorógeno 4.metilumbeliferil-�-D-galactoxidasa.

[0135] Están disponibles numerosas combinaciones de enzima-sustrato adicionales para los expertos en la técnica. Para una revisión de estas, véanse las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.275.149 y 4.318.980.

[0136] Algunas veces, la marca se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El técnico experto conocerá diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de tres amplias categorías de las marcas mencionadas anteriormente se puede conjugar con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente con la avidina y de esta manera, se puede conjugar la marca con el anticuerpo en esta manera indirecta. Alternativamente, para conseguir la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcas mencionadas anteriormente se conjugan con un anticuerpo dirigido contra hapteno (por ejemplo, anticuerpo dirigido contra digoxina). De esta manera, se puede conseguir la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo.

[0137] En otra realización, el anticuerpo dirigido contra VEGF no necesita marcarse, y se puede detectar su presencia usando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo contra VEGF.

[0138] Los anticuerpos incorporados en los artículos de fabricación de la presente invención se pueden emplear en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos de tipo sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

[0139] Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un patrón marcado de competir con el analito de la muestra de ensayo para la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína VEGF en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se llega a unir con los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se llega a unir, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de tal manera que el patrón y el analito que se unen con los anticuerpos se pueden separar convenientemente del patrón y el analito que permanecen sin unir.

[0140] Los ensayos de tipo sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una diferente porción inmunógena, o epítopo, de la proteína que se va a detectar. En un ensayo de tipo sándwich, el analito de la muestra de ensayo se une mediante un primer anticuerpo que se inmoviliza sobre un soporte sólido, y sucesivamente un segundo anticuerpo se une al analito, formando de esta manera un complejo de tres partes insoluble. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nº 4.376.110. El segundo anticuerpo puede por sí mismo marcarse con un resto detectable (ensayos de tipo sándwich directos) o se puede medir usando un anticuerpo contra la inmunoglobulina que está marcado con un resto detectable (ensayo de tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de tipo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es una enzima.

[0141] Para la inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser reciente o congelada o se puede incluir en parafina y fijarse, por ejemplo, con un conservante tal como formalina.

[0142] Se pueden usar también los anticuerpos para ensayos diagnósticos in vivo. Generalmente, el anticuerpo se marca con un radionucleido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32Por 35S) de tal manera que el tumor se puede localizar usando inmunogammagrafía.

E. Kits de diagnóstico

[0143] Por conveniencia, el anticuerpo incorporado en los artículos de fabricación de la presente invención se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para llevar a cabo el ensayo diagnóstico. Cuando el anticuerpo se marca con una enzima, el kit incluirá los sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Se pueden variar ampliamente las cantidades relativas de los diversos reactivos para proporcionar concentraciones en la disolución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, normalmente liofilizados, que incluyen excipientes que en disolución proporcionarán una disolución del reactivo que tenga la concentración apropiada.

F. Usos terapéuticos del anticuerpo

[0144] Para las aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos dirigidos contra VEGF incorporados en los artículos de fabricación de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable tal como la discutida anteriormente, incluyendo la que se puede administrar a un ser humano por vía intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante las rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los anticuerpos también se administran adecuadamente mediante las rutas intratumoral, peritumoral, intralesional, o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos. Se espera que la ruta intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovarios.

[0145] Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, tal como se ha definido anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, tanto si el anticuerpo se administra con objetivos preventivos como terapéuticos, antes de la terapia, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico a cargo del paciente. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos.

[0146] Los anticuerpos dirigidos contra VEGF son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos neoplásicos y no neoplásicos. Los neoplasmas y dolencias relacionadas que son susceptibles de tratamiento incluyen carcinomas de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas colorrectales, carcinomas de hígado, carcinomas de ovarios carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, los comas, arrenoblastomas, carcinomas de cuello de matriz, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de laringe, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwnnoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma, carcinomas del tracto urinario, carcinomas de tiroides, tumor de Wilm, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), y síndrome de Meig.

[0147] Las dolencias no neoplásicas que son susceptibles de tratamiento incluyen artritis reumatoide, psoriasis, ateroesclerosis, retinopatías diabéticas y otras proliferativas que incluyen retinopatía de los prematuros, fibroplasia retrolenticular, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, hiperplasias del tiroides (que incluyen la enfermedad de Grave), trasplante de tejido de la córnea y otro, inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, preeclampsia, ascites, derrame pericárdico (tal como el asociado con pericarditis), y derrame de pleura.

[0148] La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa que conduce a la pérdida visual en la población envejecida. La forma exudativa de la AMD se caracteriza por neovascularización coroidal y desprendimiento celular epitelial del pigmento de la retina. Debido a que la neovascularización coroidal se asocia con un drástico empeoramiento en el pronóstico, se espera que los anticuerpos contra VEGF de la presente invención sean especialmente útiles en la reducción de la gravedad de la AMD.

[0149] Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 μg/kg a aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, tanto, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, como mediante infusión continua. Una dosificación diaria o semanal típica puede oscilar entre aproximadamente 1 μg/kg y aproximadamente 20 mg/kg

o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante algunos días o más dependiendo de la dolencia, el tratamiento se repite hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se vigila fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales, incluyendo, por ejemplo, formación de imágenes radiográficas del tumor.

[0150] La eficacia del anticuerpo en la prevención o el tratamiento de la enfermedad se puede mejorar administrando el anticuerpo serialmente o en combinación con otro agente que sea eficaz para aquellos fines, tal como el factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factos de crecimiento de fibroblastos ácido o básico (FGF) o el facto de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, la proteína C, o la proteína S (véase Esmon y col., Publicación de Patente PCT Nº WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2 (véase Hudziak y col., Publicación de Patente PCT Nº WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, antimetabolitos del metabolismo de los ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de la pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol, o corticoesteroides. Dichos otros agentes pueden estar presentes en la composición que se está administrando o se pueden administrar por separado. También, el anticuerpo se administra adecuadamente en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, que implican tanto irradiación como administración de sustancias radioactivas.

[0151] Se puede atacar la vascularización de los tumores en la terapia de combinación. El anticuerpo y uno o más de otros antagonistas dirigidos contra VEGF se administran a pacientes que padecen tumores a dosis terapéuticamente eficaces tal como se determina por ejemplo observando, la necrosis del tumor o, si acaso, sus focos metastásicos. Esta terapia se continúa hasta que no se observan efectos beneficiosos adicionales o el examen clínico ni muestra trazas del tumor o cualquier foco metastásico. A continuación, se administra TNF, solo o en combinación con un agente auxiliar tal como un interferón alfa, beta, o gamma, anticuerpo dirigido contra HER2, heregulina, anticuerpo dirigido contra heregulina, factor D, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), o agentes que promueven la coagulación microvascular en tumores, tales como anticuerpos dirigidos contra proteína C, anticuerpos dirigidos contra proteína S, o proteína de unión a C4b ( véase Esmon y col., Publicación de Patente PCT Nº WO91/01753, publicada el 21 febrero de 1991), o calor o radiación.

[0152] Debido a que los agentes auxiliares variarán en su eficacia es deseable comparar su impacto sobre el tumor mediante el cribado de la matriz de forma convencional. La administración del anticuerpo dirigido contra VEGF y TNF se repite hasta que se consigue el efecto clínico deseado. Alternativamente, el anticuerpo dirigido contra VEGF se administra junto con el TNF y, opcionalmente, agente(s) auxiliares. En los casos en los que se encuentran tumores sólidos en las extremidades o en otras localizaciones susceptibles de aislamiento de la circulación general, los agentes terapéuticos descritos en la presente memoria descriptiva se administran al tumor u órgano aislado. Se puede administrar al paciente un antagonista del factor de crecimiento derivado de plaquetas o FGF (PDGF), tal como un anticuerpo neutralizante dirigido contra PDGF dirigido contra FGF junto con el anticuerpo dirigido contra VEGF. El tratamiento con anticuerpos dirigidos contra VEGF se puede suspender opcionalmente durante periodos de cicatrización de heridas o neovascularización deseables.

G. Artículos de fabricación

[0153] Tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una marca. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas, y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente mantiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la dolencia y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa con una disolución intravenosa o un vial que tenga un tope perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el anticuerpo dirigido contra VEGF. La marca en, o asociada con, el recipiente indica que la composición se usa para tratar la dolencia de elección. El artículo de fabricación puede contener además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, y prospectos con instrucciones para el uso.

EJEMPLO 1

[0154] Este ejemplo describe la producción de anticuerpos humanizados dirigidos contra VEGF con propiedades deseables desde un punto de vista terapéutico.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

[0155] Clonación de Mab A4.6.1 de murino y construcción de Fab quimérico de ratón-humano: el mAb A4.6.1 de murino dirigido contra VEGF ha sido descrito anteriormente por Kim y col., Growth Factors 7: 53 (1992) y Kim y col. Nature 362: 841 (1993). Se aisló el ARN total procedente de células de hibridoma que producían el Mab

A.4.6.1 dirigido contra VEGF usando RNAsol (TEL-TEST) y transcrito de manera inversa a ADNc usando el cebador Oligo-dT y el sistema SuperScript II (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Se sintetizaron los combinados degenerados del cebador de oligonucleótido, basados en las secuencias de aminoácidos en los extremos N de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, y se usaron como cebadores directos. Los cebadores inversos se basaron en las 4 secuencias marco obtenidas a partir del subgrupo kV de la cadena ligera de murino y del subgrupo II de la cadena pesada (Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Tras la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los fragmentos de ADN se ligaron a un vector de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA). Se secuenciaron ocho clones de cada una de las cadenas ligera y pesada. Un clon con una secuencia consenso para el dominio VL de la cadena ligera y uno con una secuencia consenso para el dominio VH de la cadena pesada se subclonaron respectivamente en el vector pEMX1 que contenía los dominios CL y CH1 (Werther y col. J. Immunol. 157: 49864995 (1996)), generando de esta manera una quimera de ratón-humano. Este F(ab) quimérico consistió en el dominio VH A4.6.1 completo de murino fusionado a un dominio CH1 humano en el aminoácido SerH113 y el dominio VL A4.6.1 completo de murino fusionado con un dominio CL humano en el aminoácido LysL107. La expresión y la purificación del F(ab) quimérico fueron idénticas a las de los F(ab) humanizados. El F(ab) quimérico se usó como patrón en los ensayos de unión.

[0156] Modelos gráficos informáticos de F(ab) de murino y humanizados: Se usaron las secuencias de los dominios VL y VH (Figs. 1A y 1B) para construir un modelo gráfico informático de los dominios VL-VH A4.6.1 de murino. Se usó este modelo para determinar que restos marco deben incorporarse en el anticuerpo humanizado. Se construyó también un modelo del F(ab) humanizado para verificar la correcta selección de los restos marco de murino. La construcción de los modelos se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente (Carter y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289 (1992) y Eigenbrot y col. J. Mol, Biol. 229: 969-995 (1993)).

[0157] Construcción de F(ab) humanizados: Se ha descrito anteriormente el plásmido pEMX1 usado para la mutagénesis y la expresión de los F(ab) en E. coli (Werther y col., más arriba). De manera breve, el plásmido contiene un fragmento de ADN que codifica una cadena ligera consenso del subgrupo I de K humano (VLKI-CL) y una cadena pesada consenso del subgrupo III humano (VHIII-CH1) y un promotor de la fosfatasa alcalina. Se ha descrito anteriormente el uso de las secuencias consenso de VL y VH (Carter y col., más arriba).

[0158] Para construir la primera variante F(ab) del F(ab)-1 A4.6.1 humanizado, se llevó a cabo la mutagénesis dirigida al emplazamiento (Kunkel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985)) en un molde de pEMX1 que contenía desoxiuridina: Las seis CDR de acuerdo con Kabat y col., más arriba, se cambiaron con la secuencia A4.6.1 de F(ab)-1 de murino que consistió por tanto de un marco humano completo (subgrupo I de K de VL y subgrupo III de VH) con las seis secuencias CDR completas de murino. Se construyeron los plásmidos del resto de variantes F(ab) a partir del molde del plásmido de F(ab)-1. Los plásmidos se transformaron en la cepa XL-1 Blue de

E. coli (Stratagene, San Diego, CA) para la preparación de ADN bicatenario y monocatenario. Para cada variante, el ADN que codificaba las cadenas ligera y pesada se secuenció completamente usando el procedimiento de los didesoxinucleótidos (Sequenase, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH). Se transformaron los plásmidos en la cepa 16C9 de E. coli, un derivado de MM294, se plaquearon sobre placas de caldo Luria que contenían 50 μg/ml de carbenicilina durante 5-8 h a 37 ºC. se añadieron 5 ml de cultivo a 500 ml de AP5-50 μg de carbenicilina y se dejaron crecer durante 20 h en un matraz de 4 l con agitación con deflectores a 30 ºC. Los medios AP5 consisten en. 1,5 g de glucosa, 11,0 g de Hycase SF, 0,6 g de extracto de levadura (certificado), 0,19 g de MgSO4 (anhidro), 1,07 g de NH4Cl, 3,73 g de KCl, 1,2 g de NaCl, 120 ml de trietanolamina 1 M, pH 7,4, hasta 1 l de agua y a continuación se filtraron en estéril a través de un filtro Sealkeen de 0,1 mm. Se cosecharon las células mediante centrifugación en una botella de centrífuga de 1 l a 3000xg y se retiró el sobrenadante. Después de congelar durante 1 h, se volvió a suspender el residuo en 25 ml de Tris 10 mM frío-EDTA 1 mM-sacarosa al 20 %, pH 8,0. Se añadieron 250 ml de benzamidina 0,1 M (Sigma, St. Louis, MO) para inhibir la proteolisis. Después de agitar suavemente en hielo durante 3 h, se centrifugó la mezcla a 40.000xg durante 15 min. A continuación se aplicó el sobrenadante a una columna CL4B de proteína G-Sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (0,5 ml de volumen de lecho) equilibrada con Tris 10 mM-EDTA 1 mM, pH 7,5. Se lavó la columna con 10 ml de Tris 10 mM-EDTA 1 mM, pH 7,5 y se eluyó con 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0, en 1,25 ml de Tris 1 M, pH 8,0. Se intercambió con tampón el F(ab) en PBS usando un Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) y se concentró hasta un volumen final de 0,5 ml. A continuación se hicieron avanzar los geles SDS-PAGE para dilucidar la pureza y se verificó el peso molecular de cada variante mediante espectrometría de masas por electropulverización.

[0159] Construcción y expresión de IgG quimérica y humanizada: Para la generación de variantes de IgG1 humanas de A4.6.1 quimérico (chIG1) y humanizado (huIgG1), se subclonaron los dominios VL y VH de F(ab)-12 de murino o humanizados apropiados, Tabla 2, por separado en los vectores pRK descritos anteriormente (Eaton y col., Biochemistry 25: 8343-8347 (1986)). Se verificó el ADN que codificaba la cadena ligera completa y la cadena pesada completa de cada variante mediante la secuenciación de los didesoxinucleótidos.

[0160] Para la expresión transitoria de las variantes, los plásmidos de la cadena pesada y de la cadena ligera se transfectaron simultáneamente en células 293 humanas (Graham y col., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977)), usando un procedimiento de alta eficacia (Gorman y col., DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3-10 (1990)). Se cambiaron los medios a medios exentos de suero y se cosecharon diariamente durante hasta cinco días. Se purificaron los anticuerpos a partir de los sobrenadantes combinados usando una columna CL-4B de proteína A-Sefarosa (Pharmacia). El anticuerpo eluido se intercambió con tampón en PBS usando un Centricon-30 (Amicon), se concentró hasta 0,5 ml, se filtró en estéril usando un Millex-GV (Millipore, Bedford, MA) y se almacenó a 4 ºC.

[0161] Para la expresión estable de la variante final de IgG1 humanizada (rhuMAb VEGF), se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) con vectores dicistrónicos designados para expresar simultáneamente las cadenas pesada y ligera (Lucas y col., Nucleic Acid Res. 24: 1774-79 (1996)). Se introdujeron los plásmidos en células DP 12, un derivado patentado de la línea de células CHO-K1 DUX B11 desarrollada por L. Chasin (Columbia University), mediante lipofección y se seleccionó para el crecimiento en medio exento de GHT (Chisholm, V. High efficiency gene transfer in mammalian cells. En: Glover, DM, Hames, BD. DNA Cloning 4. Mammalian systems. Oxford Univ. Press, Oxford pp 1-41 (1996)). Aproximadamente 20 clones no amplificados se seleccionaron aleatoriamente y se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos. Se vigiló la productividad específica relativa de cada colonia usando un ELISA para cuantificar la IgG humana de longitud completa acumulada en cada pocillo después de 3 días y un colorante fluorescente, Calcien AM, como un marcador sustituto del número de células viables por pocillo. Basándose en estos datos, se seleccionaron algunos clones sin amplificar para la amplificación adicional en presencia de concentraciones crecientes de metotrexato. Se seleccionaron los clones individuales que sobrevivieron a los 10, 50, y 100 nM de metotrexato y se transfirieron a placas de 96 pocillos para el cribado de la productividad. Un clon, que presento de manera reproducible una elevada productividad específica, se expandió en matraces con forma de T y se usó para inocular un cultivo giratorio Después de algunos pases, se usaron las células adaptadas a la suspensión para inocular los cultivos de producción en medios exentos de suero que contenían GHT suplementados con diversas hormonas e hidrolizados de proteínas. El fluido del cultivo celular cosechado que contenía VEGF de rhuMAb se purificó usando la columna CL-4B de proteína A-Sefarosa. La pureza después de esta etapa fue de ~99 %. Se llevó a cabo la posterior purificación hasta la homogeneidad usando una etapa de cromatografía de intercambio iónico. El contenido de endotoxina del anticuerpo final purificado fue < 0,10 eu/mg.

[0162] Cuantificación de F(ab) e IgG: Para cuantificar las moléculas de F(ab), se revistieron placas ELISA con 2 μg/ml de Fab de cabra dirigido contra IgG humana (Organon Teknika, Durham, NC) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4 ºC durante la noche y se bloquearon con PBD-albúmina de suero bovino al 0,5 % (tampón de bloqueo) a temperatura ambiente durante 1 h. Se adquirieron patrones (0,78 – 50 ng/ml de F(ab) humano) de Chemicon (Temecula, CA). Se incubaron diluciones en serie de las muestras en PBD-albúmina de suero bovino al 0,5 %polisorbato 20 al 0,05 % (tampón de ensayo) en placas durante 2 h. se detecto F(ab) unido usando peroxidasa de rábano picante-F(ab) de cabra revestido dirigido contra IgG humana (Organon Teknika), seguido por 3,3’,5,5’tetrametilbencidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. Las pacas se lavaron entre etapas. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). La curva patrón se ajustó usando un programa de ajuste de la curva de regresión no lineal de cuatro parámetros. Los puntos de datos que se mantuvieron en el intervalo de la curva patrón se usaron para calcular las concentraciones de F(ab) en las muestras. La concentración del anticuerpo de longitud completa se determinó usando Fc de cabra dirigido contra IgG humana (Cappel, Westchester, PA) para la captura y Fc de cabra dirigido contra IgG humana marcada con peroxidasa de rábano picante (Cappel) para la detección. Se usó IgG1 humana (Chemicon) como patrón.

[0163] Ensayo de unión a VEGF: Para medir la actividad de unión a VEGF de los F(ab), se revistieron placas ELISA con 2 μg/ml de F(ab’)2 de conejo dirigido contra Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) y se bloquearon con tampón de bloqueo (descrito anteriormente). Se incubó medio acondicionado diluido que contenía 3 ng/ml de KDR-IgG (Park y col., J. Biol. Chem. 269: 25646-25645 (1994)) en tampón de bloqueo en la placa durante 1h. Se incubaron patrones (6,9 - 440 ng/ml de F(ab)) quimérico y se incubó una serie doble de muestras con VEGF biotinilado 2 nM durante 1 h en tubos. Las disoluciones de los tubos se transfirieron a continuación a las placas ELISA y se incubaron durante 1 h. Tras el lavado, se detectó el VEGF biotinilado unido a KDR usando estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (Zymed, South San Francisco, CA o Sigma, St. Louis, MO) seguido por 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina como sustrato. Las curvas de titulación se ajustaron con un programa de ajuste de la curva de regresión no lineal de cuatro parámetros (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading PA). Se calcularon las concentraciones de las variantes de F(ab) que correspondían a la absorbancia en el punto medio de la curva de titulación del patrón y a continuación se dividieron por la concentración del patrón que correspondía a la absorbancia en el punto medio de la curva de titulación patrón. Los ensayos para la IgG de longitud completa fueron los mismos que para los F(ab) excepto en que el tampón de ensayo contenía suero humano al 10 %.

[0164] Ensayo del biosensor BIAcoreTM: se comparó la unión de VEGF de los F(ab) humanizados y quiméricos usando un biosensor BIAcoreTM (Karlsson y col. Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 6: 97-108 (1994)). Se determinaron las concentraciones de los F(ab) mediante al análisis cuantitativo de aminoácidos. Se acopló el VEGF a un chip biosensor CM-5 mediante los grupos amino primarios de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). Se midieron las cinéticas de disociación saturando el chip con F(ab) (35 μl de F(ab) 2 μM a un caudal de 20 μl/min) y a continuación se cambió de tampón (PBS-polisorbato 20 al 0,05 %). Se usaron puntos de datos entre 0 – 4500 s para el análisis de la cinética de disociación. Se obtuvo la constante de la velocidad de disociación (koff) a partir de la tangente de la gráfica del ln(R0/R) frente al tiempo, en el que R0 es la señal a t=0 y R es la señal en cada punto de tiempo.

[0165] Se midió la cinética de asociación mediante una serie doble de diluciones de F(ab) (0,0625 – 2 mM). La tangente, Ks, se obtuvo de la representación gráfica del ln(-dR/dt) frente al tiempo para cada concentración de F(ab) usando el software de evaluación de la cinética de BIAcoreTM tal como se describe en el manual del biosensor de Pharmacia. R es la señal a tiempo t. Se usaron los datos entre 80 y 168, 148, 128, 114, 102, y 92 s para 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, y 2 mM F(ab), respectivamente. Se obtuvo la constante de la velocidad de asociación (kon) a partir de la pendiente de la gráfica de Ks frente a la concentración de F(ab). Al final de cada ciclo, se eliminó el F(ab) unido inyectando 5 μl de HCl 50 mM a un caudal de 20 μl/min para regenerar el chip.

[0166] Ensayo de crecimiento celular endotelial: Se derivaron células endoteliales capilares de la corteza adrenal de bovino en presencia de medio Eagle modificado por Dulbecco con baja concentración de glucosa (DMEM) (GIBCO) suplementado con suero de ternera al 10 %, glutamina 2 mM, y antibióticos (medio de crecimiento), esencialmente tal como se ha descrito anteriormente (Leung y col. Science 246: 1306-1309 (1989)). Para los ensayos mitogénicos, se sembraron células endoteliales a una densidad de 6 x 103 células por pocillo, en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento. A continuación se añadieron tanto VEGF A.4.6.1 de muMAb como VEGF de rhuMAb a concentraciones que oscilaban entre 1 y 5000 ng/ml. Después de 2-3 h, se añadió rhVEG165 expresado en E. coli hasta una concentración final de 3 ng/ml. Para el control de la especificidad, se añadió cada anticuerpo a células endoteliales a la concentración de 5000 ng/ml, tanto solo como en presencia de 2 ng/m de bFGF Después de cinco o seis días, se disociaron las células mediante exposición a tripsina y se contaron en un contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL). La variación del promedio no superó el 10 %. Se analizaron los datos mediante un programa de ajuste de la curva de cuatro parámetros (KaleidaGraph).

[0167] Estudios tumorales in vivo: Se cultivaron células A673 de rabdomiosarcoma humano (ATCC; CRL 1598) tal como se ha descrito anteriormente en DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10 %, glutamina 2 mM y antibióticos (Kim y col. Nature 362: 841-844 (1993) y Borgström y col. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996)). Ratones sin pelo BALB/c hembras, de 6-10 semanas de edad, se inyectaron por vía subcutánea con 2 x 106 células tumorales en la zona dorsal en un volumen de 200 μl. A continuación se trataron los animales con VEGF A.4.6.1 de muMAb, VEGF de rhuMAb o un Mab del control dirigido contra la proteína gp120 (Kim y col. Nature 362: 841-844 (1993)). Se administraron ambos MAB dirigidos contra VEGF a las dosis de 0,5 y 5 mg/kg; se administró el Mab del control a la dosis de 5 mg/kg. Se administró cada Mab dos veces a la semana por vía intraperitoneal en un volumen de 100 μl, comenzando 24 h después de la inoculación de células tumorales. Cada grupo consistió en 10 ratones. Se determinó el tamaño del tumor a intervalos semanales. Cuatro semanas después de la inoculación de células tumorales, los animales se sometieron a eutanasia y se retiraron y pesaron los tumores. Se llevó a cabo el análisis estadístico mediante ANOVA.

RESULTADOS

[0168] Humanización: La secuencia consenso del subgrupo III de la cadena pesada humana y del subgrupo k I de la cadena ligera se usaron como marco para la humanización (Kabat y col., más arriba) (Figs. 1A y 1B). Este marco se ha usado satisfactoriamente en la humanización de otros anticuerpos de murino (Werther y col., más 5 arriba; Carter y col., más arriba, Presta y col. J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993); y Eigenbrot y col Proteins 18: 4962 (1994)). La CDR-H1 incluyó restos H26-H35. Las otras CDR fueron de acuerdo con Kabat y col., más arriba. Todas las variantes humanizadas se prepararon inicialmente y se cribaron para la unión como F(ab) expresados en

E. coli. Los rendimientos normales de los matraces de 500 ml con agitación fueron de 0,1-0,4 mg de F(ab).

[0169] Se usó el F(ab) quimérico como patrón en los ensayos de unión. En la variante inicial, F(ab)-1, los

10 restos de la CDR se transfirieron desde el anticuerpo de murino al marco humano y, basándose en los modelos de los F(ab) de murino y humanizados, se cambió el resto en la posición H49 (Ala en ser humano) col la Gly de murino. Además, los F(ab) que consistieron en la cadena pesada quimérica/cadena ligera de F(ab)-1 F(ab)-2) y cadena pesada de F(ab)-1/ cadena ligera quimérica de (F(ab)-3) se generaron y se ensayaron para la unión. F(ab)-1 que presentó una afinidad de unión mayor se redujo más de 1000 veces a partir del F(ab) quimérico (Tabla 2). Comparar

15 las afinidades de unión de F(ab)-2 y F(ab)-3 sugirió que los restos marco en el dominio VH de F(ab)-1 necesitaron alterarse con el fin de aumentar la unión.

Tabla 2: Unión de las variantes de F(ab) humanizadas dirigidas contra VEGFa

Variante: Plantilla Cambiosb Objetivo CE50 de F(ab)-X

CE50 del F(ab)c quimérico

Media: D.E. N

chimF(ab): F(ab) quimérico 1,0

F(ab)-1: FR humano CDR lineal intercambiado por AlaH49Gly > 1350 2

F(ab)-2: Quimera de cadena ligera de F(ab)-1 Cadena pesada > 145 3

F(ab)-3: Quimera de cadena ligera de F(ab)-1 Cadena pesada 2,6 0,1 2

F(ab)-4: F(ab)-1 ArgH71Leu AsnH73Thr Marco de conformación de CDR-H2 > 295 3

F(ab)-5: F(ab)-4 LeuL46Val Interfase VL-VH 80,9 6,5 2

F(ab)-6: F(ab)-5 LeuH78Ala Conformación de CDR-H1 36,4 4,2 2

F(ab)-7: F(ab)-5 IleH69Phe Conformación de CDR-H2 45,2 2,3 2

F(ab)-8: F(ab)-5 IleH69Phe LeuH78Ala Conformación de CDR-H2 Conformación de CDR-H1 9,6 0,9 4

F(ab)-9: F(ab)-8 GlyH49Ala Conformación de CDR-H2 > 150 2

F(ab)-10: F(ab)-8 AsnH76Ser Marco 6,4 1,2 4

F(ab)-11: F(ab)-10 LysH75Ala Marco 3,3 0,4 2

F(ab)-12: F(ab)-10 ArgH94Lys Conformación de CDR-H3 1,6 0,6 4

ª Se incubaron variantes de F(ab) dirigidas contra VEGF con VEGF biotinilado y a continuación se transfirieron a placas ELISA revestidas con KDR-IgG (Park y col., más arriba). b Los restos de murino están subrayados; los números de los restos están de acuerdo a Kabat y col., más arriba. c La media y la desviación estándar son el promedio de las relaciones calculadas para cada uno de los ensayos independientes; la CE50 del F(ab) quimérico fue de 0,049 ± 0,013 mg/ml (1,0 nM).

4 veces (Tabla 2). Las inspección de los modelos de los F(ab) de murino y humanizados sugirió que el resto L46, soterrado en la interfase VL-VH e interactuando con la CDR-H3 (Fig.2), puede jugar también un papel en la determinación de la conformación de la CDR-H3 y/o afectando la relación de los dominios VL y VH. Cuando la Val de murino se intercambió por la Leu humana en L46 de (F(ab)-5), la afinidad de la unión aumento en casi 4 veces 5 (Tabla 2). Estos otros restos marco soterrados se evaluaron basándose en los modelos moleculares: H49, H69 y H78. La posición H69 puede afectar la conformación de la CDR-H2 mientras que la posición H78 puede afectar la conformación de la CDR-H1 (Figura 2). Cuando cada una se cambió individualmente entre la humana y la homóloga de murino, la unión mejoró en 2 veces en cada caso (F(ab)-6 y F(ab)-7, Tabla 2). Cuando se cambiaron simultáneamente, la mejora en la unión fue de 8 veces (F(ab)-8, Tabla 2). El resto H49 se incluyó originalmente

10 como la Gly de murino, cuando se cambió por la Ala homóloga humana de consenso, la unión se redujo en 15 veces (F(ab)-9, Tabla 2).

[0171] En los dos restos de F(ab)-10 y F(ab)-11 en el bucle 3 del marco, se cambiaron las FR-3 por sus análogas de murino: AsnH76 por Ser de (F(ab)-10) de murino y LysH75 por Ala (F(ab)-11) de murino. Ambas afectaron una mejora relativamente pequeña en la unión (Tabla 2). Finalmente, en la posición H94, las secuencias

15 humana y de murino tienen más a menudo una Arg (Kabat y col., más arriba). En F(ab)-12, se sustituyó la Arg por la rara Lys que se encuentra en el anticuerpo de murino (Fig. 1A) y esto dio como resultado en la unión que fue menor de 2 veces del F(ab) quimérico (Tabla 2). Se comparó también el F(ab)-12 con el F(ab) quimérico usando el sistema BIAcoreTM (Pharmacia). Usando esta técnica, la Kd del F(ab)-12 humanizado fue 2 veces más débil que la del F(ab) quimérico debido a una kon más lenta y a una koff más rápida (Tabla 3).

20 Tabla 3: Unión de las variantes de F(ab) dirigidas contra VEGF a VEGF usando el sistemaa BIAcoreTM

Variante: Cantidad de (Fab) unido a (RU) Koff (s-1) Kon (M-1s -1) Kd (nM)

chim-F(ab)b: 4250 5,9 x 10-5 6,5 x 104 0,91

F(ab)-12: 3740 6,3 x 10-5 3,5 x 104 1,8

a La cantidad de F(ab) unido, en unidades de resonancia (RU), se midió usando un sistema BIAcore™ donde se inyectaron 2 μg de F(ab) en un chip que contenía VEGF inmovilizado con 2480 RU. Se midieron las cinéticas de disociación (koff) saturando el chip con F(ab) y a continuación vigilando la disociación tras cambiar a tampón. Se midieron las cinéticas de asociación (kon) usando una serie doble de diluciones de F(ab). Se calculó Kd, la constante de disociación del equilibrio como koff/kon. b chim-F(ab) es un F(ab) quimérico con dominios VL y VH de murino fusionados con lo dominios CL y CH1 pesados humanos

[0172] Se construyeron los mAb de longitud completa fusionando los dominios VL y VH del F(ab) quimérico y de la variante de F(ab)-12 con los dominios de la cadena ligera de la k humana y la cadena pesada la IgG1 humana.

25 El (F(ab)-12 de 12-IgG1 de longitud completa fusionado con la IgG1 humana) presentó una unión que fue 1,7 veces más débil que la IgG1 quimérica (Tabla 4). 12-IgG1 y la IgG1 quimérica se unieron ligeramente menos que el mAb A4.6.1 original (Tabla 4).

Tabla 4 Unión de variantes de IgG dirigidas contra VEGF a VEGFa

IgG1/chlgG1b

Variante: Promedio D.E. N

chIgG1: 1,0 2

murIgG1c: 0,759 0,001 2

12-IgG1d: 1,71 0,03 2

a Se incubaron variantes de IgG dirigidas contra VEGF con VEGF biotinilado y a continuación se transfirieron a placas ELISA revestidas con KDR-IgG (Park y col., (1994), más arriba). b chIgG1 es IgG1 quimérica con los dominios VL y VH de murino fusionados a las cadenas

pesadas de CL e IgG1 humanas; la CE50 de chlgG1 era de 0,113 ± 0,013 μg/ml (0,75 nM). c cmurIgG1 es muMAbVEGF A461 purificado de ascites. d 12-IgG1 son los dominios VL y VH de F(ab)-12 fusionados a las cadenas pesadas de CL e

IgG1 humanas

[0173] Estudios biológicos: Se compararon VEGF de rhuMAb y VEGF A.4.6.1 de muMAb respecto de su capacidad de inhibir la proliferación celular endotelial capilar de bovino en respuesta a una concentración eficaz casi máxima de VEGF (3 ng/ml). Tal como se ilustra en la Figura 3, los dos Mab fueron esencialmente equivalentes, en

5 potencia y eficacia. Los valores de la DE50 fueron respectivamente 50 ± 5 ng/ml y 48 ± 8 ng/ml (~0,3 nM). En ambos casos, se consiguió un 90 % de inhibición a la concentración de 500 ng/ml (~3 nM). Ni VEGF A.4.6.1 de muMAb ni VEGF de rhuMAb tuvieron ningún efecto sobre la proliferación basal o estimulada por bFGF de células endoteliales capilares, confirmando que la inhibición es específica de VEGF.

[0174] Para determinar si dicha equivalencia se aplica también a un sistema in vivo, se compararon los dos

10 anticuerpos para su capacidad de suprimir el crecimiento de células A673 de rabdomiosarcoma humano en ratones sin pelo. Los estudios previos han mostrado que VEGF A4.6.1 de muMAb tiene un efecto inhibidor drástico en este modelo tumoral (Kim y col. Nature 362: 841-844 (1993) y Borgström y col. Cancer Res 56: 4032-4039 (1996)). Tal como se muestra en la Figura 4, a ambas dosis ensayadas (0,5 y 5 mg/kg), los dos anticuerpos suprimieron marcadamente el crecimiento tumoral tal como se evaluó mediante las medidas de peso del tumor cuatro semanas

15 después de la inoculación celular. Las disminuciones en el peso del tumor en comparación con el grupo del control fueron respectivamente del 85 % y del 93 % en cada dosis en los animales tratados con VEGF A.4.6.1 de muMAb, frente al 90 % y el 95 % en aquellos tratados con VEGF de rhuMAb. Se obtuvieron resultados similares con la línea celular MDA-MB 435 de carcinoma de mama.

EJEMPLO 2 (ANTECEDENTES)

20 [0175] En este ejemplo, el anticuerpo A4.6.1 de murino dirigido contra VEGF discutido anteriormente se humanizó aleatorizando un pequeño conjunto de restos marco y mediante la expresión monovalente de la biblioteca resultante de moléculas de anticuerpo sobre la superficie de fagos filamentosos con el fin de identificar secuencias marco de alta afinidad mediante la selección basada en afinidad.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

25 [0176] Construcción de un vector fagémido dirigido contra VEGF, pMB4-19: El mAB A4.6.1 de murino dirigido contra VEGF se discutió anteriormente en el Ejemplo 1. La primera variante del Fab del A4.6.1 humanizado, hu2.0, se construyó mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento usando un molde del plásmido pAK2 que contenía desoxiuridina (Carter y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285-4289 (1992)) que codifica una cadena ligera VL KI-CKl y un fragmento Fd de la cadena pesada VHIII-CHIyI humana. Se seleccionaron las secuencias CDR

30 A4.6.1 trasplantadas de acuerdo con la definición de secuencia de Kabat y col., más arriba, excepto para COR-H1 que incluye los restos 26-35. Se subclonó el Fab que codifica la secuencia en el vector phGHamg3 fagémido (Bass y col. Proteins 8: 309-314 (1990) y Lowman y col. Biochemistry 30: 10832-10838 (1991)). Esta construcción, pMB4-19, codifica el Fab. Hu2.0 A4.6.1 humanizado inicial, con el extremo C de la cadena pesada fusionado precisamente con la porción carboxilo de la proteína revestida del gen III de M13. pMB4-19 es similar en la construcción a pDH188, un

35 plásmido descrito anteriormente para la expresión monovalente de los fragmentos Fab (Garrard y col. Biotechnology

9: 1373-1377 (1991)). Las notables diferencias entre pMB4-19 y pDH188 incluyen un segmento del gen III de M13 más corto (codones 249-406) y el uso de un codón de detención ámbar inmediatamente después del fragmento Fd de la cadena pesada del anticuerpo. Esto permite la expresión de las fusiones de la cadena pesada o la cadena ligera-gen II en las cepas supresoras supE de E. coli.

40 [0177] Expresión y purificación de un fragmento Fab A4.6.1 humanizado; Una cepa 24B8 no supresora de

E. coli se transformó con el fagémido pMB4-19, o sus variantes. Se hicieron crecer colonias individuales durante la noche a 37 ºC en 5 ml de 2YT que contenía 50 μg/ml de carbenicilina. Estos cultivos se diluyeron en 200 ml de medio AP5 (Chang y col. Gene 55: 189-196 (1987)) que contenía 20 μg/ml de carbenicilina y se incubaron durante 26 h a 30 ºC. Las células se aglomeraron a 4000 x g y se congelaron a -20 ºC durante al menos 2 h. A continuación, 45 los aglomerados celulares se volvieron a suspender en 5 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,6) que contenía EDTA 1 mM agitado a 4 ºC durante 90 min y se centrifugaron a 10.000 x g durante 15 min. se aplicó el sobrenadante a una columna de sefarosa con 1 ml de proteína G estreptocócica (Pharmacia) y se lavó con 10 ml de MES 10 mM (pH 5,5). El fragmento Fab unido se eluyó con 2,5 ml de ácido acético 100 mM y se neutralizó inmediatamente con 0,75 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Las preparaciones de Fab se intercambiaron con tampón en PBS y se concentraron

50 usando concentradores Centricon-30 (Amicon). Los rendimientos típicos de Fab fueron de ~ 1mg/l de cultivo, tras la purificación de la proteína G. Las muestras purificadas de Fab se caracterizaron mediante espectrometría de masas por electropulverización, y se determinaron las concentraciones mediante el análisis de los aminoácidos.

[0178] Construcción de la biblioteca del fagémido Fab dirigido contra VEGF: Se construyó la biblioteca del fagémido A4.6.1 humanizado mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento de acuerdo con el procedimiento de Kunkel y col. Methods Enzymol. 204: 125-139 (1991)). Se preparó un derivado de pMB4-19 que contenía tripletes de detención TAA en los codones 24, 37, 67 y 93 de VH para uso como el molde de la mutagénesis (la numeración de todas las secuencias de acuerdo con Kabat y col., más arriba). Esta modificación fue para evitar la contaminación antecedente posterior por las secuencias naturales. Los codones dirigidos para la aleatorización fueron el 4 y el 71 (cadena ligera) y el 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 (cadena pesada).

[0179] Con el fin de aleatorizar los codones 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 de la cadena pesada con un único oligonucleótido mutagénico, se preensamblaron dos oligonucleótidos de 126-mer a partir de los fragmentos 60 y 66-mer mediante ligadura enzimática ayudada por molde. Específicamente, se combinaron 1,5 nmol del oligonucleótido 5’ fosforilado 503-1 (5’-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3’ (SEQ ID NO: 22)) o 503-2 (5’-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3’ (SEQ ID NO: 23)) con 1,5 nmol de 503-3 (5’-AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG-3’ (SEQ ID NO: 24)) (codones aleatorizados subrayados. N=A/G/T/C; W=A/T; B=G/T/C; D=G/A/T; R=A/G; Y=C/T). A continuación, se añadieron 1,5 nmol del oligonucleótido molde (5’-CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3’ (SEQ ID NO: 25)), con la secuencia complementaria de los extremos 5’ de 503-12 y el extreme 3’ de 503-3, para hibridarse a cada extreme de la ligadura de unión. Se añadieron ligasa taq (ligasa termoestable de New England Biolabs) y tampón, y la mezcla de reacción se sometió a 40 ciclos de ciclación térmica (95 °C 1.25 min; 50 °C for 5 min) de forma que se cicla el oligonucleótido molde entre las uniones ligadas y no ligadas. El producto de los oligonucleótidos 126-mer se purificó en un gel de urea/poliacrilamida TBE al 6 % y se extrajo a partir de la poliacrilamida en tampón. Los productos 126-mer se combinaron en una relación igual, se precipitaron con etanol y finalmente se solubilizaron en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM. El producto de oligonucleótido 126-mer se marcó 504

01.

[0180] La aleatorización de los codones narco seleccionados (VL 4, 71; VH 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93, 94) se efectuó en dos etapas- Primeramente, se consiguió la aleatorización de VL preparando tres derivados adicionales del molde pMB4-19 modificado. Los codones marco 4 y 71 en la cadena ligera se sustituyeron individualmente o por parejas usando los dos oligonucleótidos mutagénicos 5’-GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG-3’ (SEQ ID NO: 26) 5’ y TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3’ (SEQ ID NO: 27). Se preparó un molde que contenía desoxiuridina a partir de cada uno de estos nuevos derivados. Junto con el molde original, estas cuatro construcciones se codificaron para cada una de las cuatro posibles combinaciones de la secuencia marco de la cadena ligera (Tabla 5).

[0181] Los oligonucleótidos 504-1, una mezcla de dos oligonucleótidos 126-mer (véase anteriormente), y 5’-CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG-3’ (SEQ ID NO: 28) se usaron para aleatorizar los codones marco de la cadena pesada usando cada uno de los cuatro moldes que se acaban de describir. Las cuatro bibliotecas se sometieron a electroporación en células XL-1 Blue de E. coli (Stratagene) y se combinaron. Se estimó el número total de transformantes independientes en > 1,2 x 108, aproximadamente 1.500 veces más que el número máximo de secuencias de ADN en la biblioteca.

[0182] Se han desarrollado una variedad de sistemas para la expresión funcional de los fragmentos de anticuerpo sobre la superficie del fago filamentoso. Winter y col., Ann. Rev. immunol. 12, 433 (1994). Estos incluyen la expresión de Fab o de los fragmentos Fv monocatenario (scFv) como fusiones tanto de las proteínas de revestimiento del gen III o del gen IV del bacteriófago M13. El sistema seleccionado en la presente memoria descriptiva es similar al descrito por Garrard y col., Biotechn, 9, 1373 (1991) en el que un fragmento Fab se expresa de manera monovalente como una fusión del gen III (Figura 7). Este sistema tiene dos notables características. En particular, a diferencia de los scFv, los fragmentos Fab no tienen tendencia a formar especies diméricas, la presencia de las cuales puede evitar la selección de los enlazadores más estrechos debido a efectos de la avidez. Adicionalmente, la monovalencia de la proteína expresada elimina una segunda fuente potencial de efectos de la avidez que de otra forma daría como resultado la presencia de múltiples copias de una proteína de cada partícula de fagémido. Bass y Wells, Proteins 8: 309 (1990) y Lowman y col., Biochemistry 30: 10832 (1991).

[0183] Las partículas de fagémido que expresaban los fragmentos Fab A4.6.1 humanizados se propagaron en células XL-1 Blue de E. coli. De manera breve, las células que cosechaban la construcción pMB4-19 aleatorizada se hicieron crecer durante la noche a 37 ºC en 25 ml de medio 2YT que contenía 50 μg de carbenicilina y aproximadamente 1010 fagos auxiliares M13KO7 (Vieira & Messing Methods Enzymol. 153: 3-11 (1987)). Se purificaron los depósitos madre de fagémidos a partir de los sobrenadantes del cultivo mediante precipitación con una solución salina de polietilenglicol, y se volvieron a suspender es 100 μl de PBS (~ 1014 fagémidos/ml).

[0184] Selección de variantes de Fab A4.6.1 humanizado: VEGF121 purificado (100 μl a 10 μg/ml en PBS) se revistió sobre un pocillo de una placa de microvaloración durante la noche a 4 ºC. La disolución de revestimiento se eliminó y este pocillo, además de un pocillo sin revestir, se bloquearon con leche desnatada al 6 % durante 1 h y se lavaron con PBS que contenía TWEEN 20TM al 0,05 % (detergente). A continuación se añadieron 10 μl de disolución 5 madre de fagémidos, se diluyeron hasta 100 μl con Tris 20 mM (pH 7,5) que contenía BSA al 0,1 % y TWEEN 20TM al 0,05 % a cada pocillo. Después de 2 horas, los pocillos se lavaron y los fagos unidos se eluyeron con 100 μl de glicina 0,1 M (pH 2,0), y se neutralizaron con 25 μl de Tris 1 M pH 8,0. Se usó una alícuota para titular el número de fagos eluidos. Los fagos restantes eluidos a partir del pocillo revestido con VEGF se propagaron para uso en el siguiente ciclo de selección. Se llevaron a cabo un total de 8 ciclos de selección después de los cuales se

10 seleccionaron y secuenciaron 20 clones individuales (Sanger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467 (1977)).

[0185] Determinación de las afinidades de unión de VEGF: Se midieron las constantes de las velocidades de asociación (kon) y disociación (koff) para la unión de variantes de Fab A4.6.1 a VEGF121 mediante resonancia de plasmón superficial (Karlsson y col. J. Immun. Methods 145: 229-240 (1991)) en un instrumento Pharmacia BIAcore. 15 Se inmovilizó VEGF121 covalentemente sobre el chip del biosensor mediante grupos amino primarios. Se midió la unión de variantes de Fab A4.6.1 humanizado mediante disoluciones fluidas de Fab en PBS/TWEEN 20TM al 0,05 % sobre el chip a un caudal de 20 μl/min. Tras cada medida de unión, el Fab residual se despojó del ligando inmovilizado lavando con 5 μl de una disolución acuosa de HCl 50 mM a 3 μl/min. se analizaron los perfiles de unión mediante una regresión no lineal usando un modelo de unión monovalente sencillo (software de evaluación BIA v2.0;

20 Pharmacia).

RESULTADOS

[0186] Construcción del A4.6.1 humanizado: Se construyó un fragmento Fab A4.6.1 humanizado inicial (hu2.0, Figs. 5A y 5B), en el que se injertaron las CDR de A4.6.1 en un marco VLKI-VHIII. Todos los demás restos en hu2.0 se mantuvieron como la secuencia humana. La unión de esta variante con VEGF fue por tanto demasiado

25 débil como para poderse detectar. Basándose en la afinidad relativa de otras variantes A4.6.1 humanizadas débilmente unidas, se estimó la KD de la unión de hu2.0 en > 7 μM. Esto contrasta con una afinidad de 1,6 nM por una construcción Fab quimérica consistente en los dominios VL y VH intactos de A4.6.1 de murino y los dominios constantes humanos. De esta manera, la unión de hu2.0 con VEGF se redujo al menos 4000 veces con respecto a la quimera.

30 [0187] Diseño de una biblioteca de anticuerpos: En la Tabla 5 y la Fig. 6 se muestran los grupos de cambios de marco respecto de la secuencia marco humana en la presente memoria descriptiva.

Tabla 5: Restos marco claves importantes para la unión del antígeno y el direccionamiento para la aleatorización

Resto marco: Resto consenso VKLIVHIII humano Resto A4.6.1 de murino Aleatorizacióna

VL: 4 Met Met Met, Leu

71: Phe Tyr Phe, Tyr

VH: 24 Ala Ala Ala, Val, Thr

37: Val Val Val, Ile

67: Phe Phe Phe, Val, Thr, Leu, Ile, Ala

69: Ile Phe Ile, Phe

71: Arg Leu Argb, LeubAspb, ThrbLysb, AlabAsnb, Serb

73: Asp Thr

75: Lys Ala

76: Asn Ser

78: Leu Ala Leu, Ala, Val, Phe

93: Ala Ala Ala, Val, Leu, Ser, Thr

94: Arg Lys Arg, Lys

a Diversidad de aminoácidos en la biblioteca de fagémidos b VH 71, 73, 75, 76 aleatorizado para dar como resultado todas la tétradas VHIII (L71/T73/A75/S76) de murino o todas las tétradas VHIII (R71/D73/K75/N76) humanas

[0188] Una preocupación al diseñar la biblioteca de fagémidos A4.6.1 humanizados fue que los restos dirigidos para la aleatorización se distribuyeran ampliamente a lo largo de las secuencias VL y VH. Las limitaciones en la longitud de los oligonucleótidos sintéticos requieren que la aleatorización simultánea de cada una de estas 5 posiciones marco se pueda conseguir solo mediante el uso de múltiples oligonucleótidos. Sin embargo, a medida que el número total de oligonucleótidos aumenta, la eficacia de la mutagénesis disminuye (es decir, la proporción de mutantes obtenidos que incorporan secuencias derivadas de todos los oligonucleótidos mutagénicos). Para soslayar este problema, se incorporaron dos características en la construcción de la biblioteca. La primera fue preparar cuatro moldes diferentes de mutagénesis que codifican cada una de las posibles combinaciones del marco de VL. Esto fue

10 sencillo y proporcionó la limitada diversidad del marco de la cadena ligera (solo 4 secuencias diferentes). En segundo lugar, dos oligonucleótidos de 126 bases se preensamblaron a partir de fragmentos sintéticos más pequeños Esto hace posible la aleatorización de los codones 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93 y 94 de VH con un único oligonucleótido largo, en vez de con dos más pequeños. La estrategia de mutagénesis con la aleatorización final empleó por tanto solo dos oligonucleótidos simultáneamente sobre cuatro diferentes moldes.

15 [0189] Selección de Fab A4.6.1 humanizados con unión estrecha: Se seleccionaron variantes de la biblioteca del fagémido Fab A4.6.1 humanizado basándose en la unión con VEGF. El enriquecimiento del fagémido funcional, tal como fue medido comparando los títulos de los fagos eluidos a partir de un pocillo de una placa de valoración sin revestir frente a una revestida con VEGF, aumentaron hasta el séptimo ciclo de selección. Después de un ciclo adicional de selección, se secuenciaron 20 clones para identificar los restos marco preferidos en cada

20 posición aleatorizada. Estos resultados, resumidos en la Tabla 6, desvelaron un fuerte consenso entre los clones seleccionados. Diez de los veinte clones tuvieron la secuencia de ADN idéntica, designada como hu2.10. De las treinta posiciones marco aleatorizadas, se seleccionaron ocho sustituciones en hu2.10 (VL 71; VH 37, 71, 73, 75, 76, 78 y 94). De manera interesante, los restos 37 (Ile) y 78 (Val) de VH se seleccionaron como ninguna de las secuencias de VHIII humanas o de A4.6.1 de murino. Este resultado sugiere que algunas posiciones marco pueden

25 beneficiarse de la extensión de la diversidad más allá de las secuencias marco humana diana y de murino parental.

Tabla 6: Secuencias seleccionadas del fagémido Fab A4.6.1 humanizado

Variante: Sustituciones de restos

VL: VH

4: 71 24 37 67 69 71 73 75 76 78 93 94

A4.6.1 de murino: M Y A V F F L T A S A A K

hu2.0 (CDR-injerto): M E A V F I R N K N L A R

Clones seleccionados a partir de fagos:

hu2.1 (2): - Y - I - - - - - - V - K

hu2.2(2): L Y - I - - - - - - V - K

hu2.6(1): L - - I T - L T A S V - K

Clones seleccionados a partir de fagos:

hu2.7(1): L - - I - - - - - - V - K

h2.10(10): - Y - I - - L T A S V - K

Las diferencias entre los anticuerpos hu2.0 y A4.6.1 de murino están subrayadas. El número de clones idénticos identificados para cada secuencia seleccionada a partir de fago se indica entre paréntesis. Las rayas en las secuencias de los clones seleccionadas a partir de fagos indican la selección de la secuencia marco VLKI-VHIII humana (es decir, como en hu2.0).

[0190] Hubo otras cuatro secuencias únicas de aminoácidos entre los restantes diez clones analizados: hu2.1, hu2.2, hu2.6 y hu2.7. Todos estos clones, además de hu2.10, contenían sustituciones marco idénticas en las posiciones 37 (Ile), 78 (Val) y 94 (Lys) de VH, pero retenían la secuencia consenso VHIII humana en las posiciones

5 24 y 93. Se ensayaron cuatro clones que habían perdido la secuencia de codificación de la cadena ligera y no se unían a VEGF cuando se ensayaron en el ensayo ELISA de fagos (Cunningham y col. EMBO J. 13: 2508-251 (1994)). Dichos artefactos se pueden minimizar a menudo reduciendo el número de ciclos de selección o propagando las bibliotecas en medios sólidos.

[0191] Expresión y afinidad de unión de las variantes A4.6.1 humanizadas: Las variantes hu2.1, hu2.2,

10 hu2.6, hu2.7 y hu2.10 seleccionadas a partir de fagos se expresaron en E. coli usando matraces con agitación y los fragmentos Fab se purificaron a partir de los extractos periplásmicos mediante la cromatografía de afinidad de la proteína G. Los rendimientos recuperados de Fab para estos cinco clones oscilaron entre 0,2 (hu2.6) y 1,7 mg/l (hu2.1). Se midió la afinidad de cada una de estas variantes por el antígeno (VEGF) mediante resonancia de plasmón superficial en un instrumento BIAcore (Tabla 7). El análisis de estos datos de unión desveló que el clon de

15 consenso hu2.10 poseía la afinidad más elevada por VEGF de las cinco variantes ensayadas. De esta manera, la librería del fagémido Fab se enriqueció selectivamente para el clon de unión más estrecha. La KD calculada para hu2.10 fue de 55 nM, al menos 125 veces más estrecha que para hu2.0, que no contiene cambios de marco (KD > 7 μM). Las otras cuatro variantes seleccionadas presentaron todas una unión a VEGF más débil, descendiendo hasta una KD de 360 nM para la más débil (hu2.7). De manera interesante, la KD de hu2.6, 67 nM, fue solo marginalmente

20 más débil que la de hu2.10, y todavía se encontró una única copia de este clon entre los 20 clones secuenciados. Esto puede deberse a un menor nivel de expresión y presentación, como fue el caso cuando se expresaba el Fab soluble de esta variante. Sin embargo, a pesar del menos índice de expresión, esta variante es útil como anticuerpo humanizado.

Tabla 7: Afinidad de unión a VEGF de las variantes de Fab A4.6.1 humanizadas

Variante: kon M-1s-1/104 koff 10-1s-1 KD nM KD(A4.6.1) KD(mut)

A4.6.1 quimera hu2.0: 5,4 ND 0,85 ND 1,6 > 7000** > 4000

Clones seleccionados a partir de fagos:

hu2.1: 0,70 18 260 170

hu2.2: 0,47 16 340 210

hu2.6: 0,67 4,5 67 40

hu2.7: 0,67 24 360 230

hu2.10: 0,63 3,5 55 35

*hu2.10V: 2,0 1,8 9,3 5,8

*hu2.10V = hu2.10 con mutación VL Leu- > Val Los errores estimados por Biacore en las medidas de unión son + /-25 %.

[0192] Mejora adicional de la variante hu2.1 humanizada: A pesar de la gran mejora en la afinidad por el antígeno sobre la variante humanizada inicial, la unión de hu2.10 a VEGF siguió siendo 35 veces más débil que la de un fragmento Fab quimérico que contenía los dominios VL y VH de A4.6.1 de murino. Esta considerable diferencia 30 sugirió que la optimización adicional del marco humanizado puede ser posible mediante mutaciones adicionales. De los restos de vernier identificados por Foote y Winter J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992), sólo los restos 46 de VL, 2 de VH y 48 de VH difirieron en el A4.6.1 frente al marco VLKI-VHIIII humano (Figs. 5A y 5B), pero no se aleatorizaron en la biblioteca de fagémidos de los inventores un modelo molecular del fragmento Fv A4.6.1 humanizado mostró que 46 de VL se asienta en la interfase VL-VH y podría influenciar la conformación de la CDR-H3. Además, este

aminoácido es casi siempre leucina en la mayoría de los marcos VLK (Kabat y col, más arriba), pero es valina en A4.6.1. De acuerdo con esto, se pudo hacer una sustitución Leu - > val en esta posición en el antecedente de hu2.10. El análisis de la cinética de unión de esta nueva variante, hu2.10V, indicó una mejora adicional de 6 veces en la KD para la unión de VEGF, demostrando la importancia de la valina en la posición 46 de VL en el anticuerpo

5 A4.6.1. La KD de hu2.10V (9,3 nM) fue de esta manera hasta de 6 veces de la de la quimera. En contraste con 46 de VL no se observó mejora en la afinidad de unión de hu2.10 para la sustitución tanto de 2 de VH como de 48 de VH con el resto correspondiente del A4.6.1 de murino.

EJEMPLO 3

[0193] En este ejemplo, se usaron la aleatorización de la CDR, la maduración por afinidad mediante la

10 expresión del fago Fab monovalente, y la combinación acumulada de mutaciones para potenciar la afinidad de un anticuerpo humanizado dirigido contra VEGF.

[0194] Construcción del anticuerpo humanizado pY101: el vector phMB4-19-1.6 del anticuerpo expresado en el fago (ver las Figs. 8A-E) se utilizó como parental. En esta construcción, el anticuerpo dirigido contra VEGF se expresó como un fragmento Fab, con su cadena pesada fusionada con el extremo N del g3p truncado. Tanto la

15 cadena ligera como la pesada están bajo el control del promotor phoA con una secuencia señal sTII en la dirección 5’ para la secreción en el periplasmio. Se realizaron mutaciones puntuales fuera de las regiones CDR mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento para potenciar la afinidad por el VEGF con los oligonucleótidos HL-242, HL243, HL-245, HL-246, HL254, HL-256, y HL-257, como se muestra en la Tabla 8 siguiente:

Tabla 8 Oligonucleótidos para las mutaciones dirigidas

[0195] La variante resultante se denominó Y0101 (Figs. 9A y 9B).

[0196] Construcción de la primera generación de bibliotecas anticuerpo-fago: para evitar la contaminación con las secuencias de tipo natural, se prepararon moldes con el codón de detención TAA en los sitios diana de la aleatorización, y se usaron para construir bibliotecas mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento con 25 oligonucleótidos mediante el codón degenerado NNS (en el que N es una mezcla equivalente de A, G, C, y T mientras que S es una mezcla equivalente de G y C) para la mutagénesis por saturación. Se escogieron VL1 y VH3 como candidatos potenciales para la potenciación por afinidad (Figs. 9A y B). Dentro de las CDR, se construyeron dos bibliotecas a partir de el molde pY0101. Se mutó VL1 usando el molde de detención de los oligonucleótidos HL248 y HL-249 (Tabla 9) y los oligonucleótidos de la biblioteca H-258 y HL-259 (Tabla 10). De forma similar, se

30 construyeron tres bibliotecas para VH3 usando el molde de detención de los oligonucleótidos HL-250, HL-251, y HL252 (Tabla 9), y los oligonucleótidos de la biblioteca HL-260, HL-261, y HL-262 (Tabla 10). La construcción de la biblioteca se resume en las Tablas 9 y 10 siguientes.

Tabla 9 Oligonucleótidos molde para mutagénesis

5 [0197] Los productos de las reacciones de mutagénesis aleatoria se electroporaron en células XL1-Blue de E. Coli (Stratagene) y se amplificaron por crecimiento durante 15-16 h con fagos auxiliares M 13KO7. Se estimó la complejidad de cada biblioteca, comprendida de 2 x 107 a 1,5 x 108 mediante plaqueado de la transformación inicial en placas de carbenicilina.

[0198] Selecciones por afinidad iniciales: Para cada ronda de selección, se cribaron aproximadamente 109

10 1010 fagos por unión a placas (Nunc Maxisorp de 96 pocillos) revestidas con 2 !g/ml de VEGF (recombinante; resto versión 9-109) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6 y bloqueado con leche instantánea al 5 % en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras 1-2 horas de unión a temperatura ambiente, en presencia de albúmina de suero bovino al 0,5 % y TWEEN 20™ al 0,05 % en PBS, y se retiró la disolución de fago, y la placa se lavó tres veces en PBS/TWEEN™ (TWEEN 20™ al 0,05 % en tampón PBS) Normalmente, para seleccionar mediante potenciación

15 por afinidad de variantes con velocidades de disociación más lentas, las placas se incubaron con tampón PBS/TWEEN™ durante un periodo de tiempo que aumentaba progresivamente para cada ronda de selección (del minuto 0 para la primera ronda, hasta 3 h para la novena ronda de selección). Tras eliminar el tampón PBS/TWEEN™, los fagos restantes se eluyeron con HCl 0,1 M e inmediatamente se neutralizaron con 1/3 de volumen de Tris 1 M, pH 8,0. Los fagos eluidos se propagaron por infección de células XL1-Blue de E. coli

20 (Stratagene) en el siguiente ciclo de selección.

[0199] Los datos de secuenciación desvelaron que ambas bibliotecas VL1, incluso tras la octava/novena ronda de clasificación, siguieron siendo diferentes, tolerando varios tipos de restos en los sitios de aleatorización. Por el contrario, las bibliotecas VH3 retuvieron solo los restos naturales o tuvieron sustituciones muy conservativas. Esto sugirió que el VL1 estuvo más expuesto al disolvente y quedó fuera de la interfase de unión. Por el contrario, VH3 no mostró sustituciones en la cadena secundaria demasiado distintas, y por tanto, estarían más íntimamente implicados en la unión con el antígeno.

[0200] Ensayos de afinidades de unión Fago-ELISA: Para cada una de estas bibliotecas, se ensayaron clones representativos (los representados por secuencias abundantes) para determinar sus afinidades con respecto a la del clon parental pY0101 en un ensayo fago-ELISA. En ese tipo de ensayo, en primer lugar los fagos se diluyeron en serie para determinar un título de saturación fraccional que se mantuvo constante y se utilizó para incubar con concentraciones variables de VEGF (partiendo de 200 nM a 0 nM) en disolución. A continuación, la mezcla se transfirió a placas prerrevestidas con VEGF (2 mg/ml) y bloqueadas con leche instantánea al 5 %, y se dejó equilibrar durante 1 h a temperatura ambiente. Después, la disolución de fago se retiró, y los fagos restantes unidos se detectaron con una disolución de anticuerpo de conejo dirigido contra fago mezclado con un conjugado de peroxidasa de rábano picante de anticuerpos de cabra dirigidos contra inmunoglobulina de conejo. Tras una hora de incubación a temperatura ambiente, la placa se reveló con una sustancia cromógena, la o-fenilendiamina (Sigma). La reacción se detuvo mediante la adición de ½ volumen de H2SO4 2,5 M. Se midió la densidad óptica a 492 nm en un lector espectrofotométrico para placas.

[0201] Aunque todos los clones seleccionados procedentes de las cinco bibliotecas mostraron afinidades más débiles o similares a las de pY0101 natural en el ensayo fago-ELISA, una variante concreta (pY0192) de la biblioteca HL-258 mostró una ventaja evidente (aproximadamente 10 veces) en el nivel de expresión o expresión en fago relativa al pY0101. Este clon contenía las mutaciones S24R, S26N, Q27E, D28Q, e I29L en la región VL (Fig. 9A). Además, se encontró que esta variante tenía una mutación falsa, M34I, en VH. Esta variante no mostró una diferencia significativa en su afinidad de enlace con VEGF comparada con la variante pY0101. Para mejorar el nivel de expresión de Fab en el fago, y la relación señal a ruido en los ensayos fago-ELISA, se incorporaron las sustituciones correspondientes en pY0192 de VL1 en el molde antecedente para construir ambos mutantes Ala del CDR y la segunda generación de bibliotecas dirigidas contra VEGF.

[0202] Cribado con Ala de las CDR del anticuerpo dirigido contra VEGF: Para determinar la energía con la que contribuye cada uno de los aminoácidos de las regiones CDR, y seleccionar de este modo mejores restos diana para la aleatorización, las regiones CDR se cribaron sustituyendo la alanina en cada resto. Se construyó cada mutante Ala mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento con un oligonucleótido sintético que codificaba la sustitución específica de alanina. Si Ala era el resto natural, se sustituía la Ser para ensayar el efecto de una sustitución en la cadena secundaria. Los clones de fago que tenían una sola mutación Ala se purificaron y ensayaron mediante fago-ELISA como se ha descrito anteriormente. Los resultados del cribado con Ala demostraron que la sustitución de Ala en diferentes posiciones puede tener un efecto, que oscila en reducciones de 2 a > 150 veces en la afinidad de unión al anticuerpo en comparación con pY0192. Además, se confirma una observación anterior de que VH3, pero no VL1, estaba implicado en la unión al anticuerpo. Los resultados del cribado con Ala de la CDR se resumen en la Tabla 11 siguiente:

Tabla 11: Afinidades relativas por VEGF de las variantes Fab cribadas con Ala

[0203] Los mayores efectos de las sustituciones de Ala se observaron en las CDR H1, H2, y H3, incluyendo Y27A (reducción de 34 veces en la afinidad), N31A, Y32A, W50A, N52A, Y99A, S106A y W108A (cada uno reducción > 150 veces); N35A (reducción de 66 veces), P100A (reducción de 38 veces) y F110A (reducción de 25 veces). Por el contrario, solo una sustitución VL afectó de forma importante a la afinidad de enlace, W96A (reducción > 150 veces). Estos resultados apuntan a las tres CDR de VH como los principales determinantes energéticos de la unión de Fab a VEGF, con cierta contribución del VL3.

[0204] Diseño de las bibliotecas de mutación de CDR de segunda generación: Se diseñaron dos bibliotecas adicionales con restos aleatorizados existentes en la versión Y0192 del anticuerpo dirigido contra VEGF basándose en la investigación de la estructura cristalina. En VH2, los restos 52-55 se aleatorizaron debido a que se encuentran en el interior de la interfase de unión con VEGF. Una región adicional del Fab, denominada "CDR7" (ver la Fig. 10B), también se dirigió para aleatorización debido a que varios restos de este bucle, aunque no entraban en contacto con VEGF, si lo hacían con los bucles VH del anticuerpo. Esto representaba sitios potenciales para mejorar la afinidad gracias a efectos secundarios debido a los restos de la interfase. Los restos L72, T74, y S77 se aleatorizaron en esta biblioteca CDR7.

[0205] Igualmente basándose en la estructura cristalina, se volvió a construir una de las bibliotecas originales de CDR para volver a evaluar el potencial de la maduración por afinidad en la CDR de VH1. Los restos 27, 28, y 3032 se aleatorizaron usando el nuevo antecedente Y0192.

[0206] Selecciones de segunda generación de bibliotecas dirigidas contra VEGF: Basándose en los resultados del cribado con Ala y en la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo (F(ab)-12), se construyeron un total de diecisiete bibliotecas usando el molde pY0192 y los oligonucleótidos molde de detención (que codifican un codón de detención en los sitios diana de aleatorización) YC-80, YC-100, YC-102, HL-263, y HL264 (Tabla 9 anterior). Los correspondientes oligonucleótidos de aleatorización (que utilizan NNS en los sitios a los que se dirige la se aleatorización) fueron YC81, YC-101, YC-103, HL-265, y HL-266 (Tabla 10 anterior). Los transformantes resultantes produjeron bibliotecas de complejidad variable de 6 x 107 a 5 x 108 lo que sugiere que las bibliotecas eran comprehensivas cubriendo todas las posibles variantes. Las bibliotecas de fagos se clasificaron en 7-8 usando las condiciones descritas en la Tabla 12 siguiente:

Tabla 12: Condiciones de las selecciones secundarias de las variantes de Fab

Ronda de selección: Tiempo de incubación (h) Disolución de Incubación Temp. de incubación ( ºC)

1: 0 Tampón ELISA temp. amb.

2: 1 VEGF 1 !M / ELISA temp. amb.

3: 2 VEGF 1 !M / ELISA temp. amb.

4: 18 VEGF 1 !M / ELISA temp. amb.

5: 37 VEGF 1 !M / ELISA temp. amb.

6: 17 h a temp. amb. / 30 h a 37 °C VEGF 1 !M / ELISA temp. amb./37 °C

7: 63 VEGF 1 !M / ELISA 37 °C

8: 121 VEGF 1 !M / ELISA 37 °C

5 [0207] El tampón ELISA contenía albúmina de suero bovino al 0,5 % y TWEEN 20™ al 0,05 % en PBS. VEGF se incluyó en el tampón de incubación para minimizar otra unión de los fagos al VEGF revestido sobre la superficie de la placa. La clasificación de dichas bibliotecas produjo enriquecimientos en fago superiores a de 7 a 8 rondas de selección.

[0208] Ensayos Fago-ELISA de los clones de segunda generación: Tras ocho rondas de selección, se

10 aislaron de diez a veinte clones de cada biblioteca en placas que contenían carbenicilina con colonias de E. coli (XL1) que se habían infectado con una combinación de fagos eluidos. Las colonias se aislaron y se hicieron crecer con un fago auxiliar para obtener ADN monocatenario para secuenciación. Se dedujeron las sustituciones de las CDR seleccionadas como las más favorables para unirse al VEGF a partir de las secuencias del ADN de los clones fagémidos. En la Tabla 13 siguiente se incluye un muestreo de los clones seleccionados.

Tabla 13: Secuencias de proteína de variantes dirigidas contra VEGF procedentes de bibliotecas Fab-Fago de segunda

generación

[0209] Cuando cierto número de clones se ensayaron junto al clon parental pY0192 en el ensayo fago-ELISA, ninguno mostró una mejora distintiva frente al clon parental. Esto podría explicarse por la escala temporal en la que se realizó el ensayo ( < 3 horas).

5 [0210] Para cuantificar la mejora en la unión del antígeno respecto al clon parental, los ADN de algunas variantes de anticuerpos contra VEGF se transformaron en E. coli cepa 34B8, expresado como Fab, y se purificó haciendo pasar el shockate periplásmico a través de una columna de proteína G (Pharmacia) como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior.

[0211] Variantes de combinación de las CDR: Para mejorar la afinidad de enlace de VEGF, mutaciones

10 adicionales encontradas mediante expresión en fago se combinaron en diferentes CDR para crear mutantes con múltiples CDR. En particular, se combinaron las mutaciones identificadas en las variantes de fago con la afinidad de enlace más mejorada procedentes de las bibliotecas VH1, VH2, y VH3 (Tabla 14) para probar la aditividad de sus contribuciones a la afinidad de enlace.

[0212] La versión Y0317 es equivalente a Y0313-1 excepto en que se eliminó la mutación antecedente en VL1, y su secuencia revertió a la de pY0101. Los efectos de mutar H101Y y S105T se ensayaron mediante la construcción de un mutante de reversión procedente de Y0238-3.

[0213] Análisis BI4core: Se calcularon las afinidades de unión a VEGF de los fragmentos Fab a partir de las constantes de velocidad de asociación y disociación medidas en un sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore-2000™ (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se activó un chip biosensor para el acoplamiento covalente de VEGF usando clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-car bodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de

5 acuerdo con las instrucciones del proveedor (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). VEGF se intercambió con tampón en acetato de sodio 20 mM, pH 4,8 y se diluyó hasta aproximadamente 50 mg/ml. Se inyectó una alícuota (35 ml) a un caudal de 2 !l/min para conseguir aproximadamente 700-1400 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Finalmente, se inyectó etanolamina 1 M como agente de bloqueo.

[0214] Para las medidas de la cinética, se inyectaron diluciones dobles en serie de Fab en tampón

10 PBS/TWEEN™ (TWEEN 20™ al 0,05 % en solución salina tamponada con fosfato) a 25 °C a un caudal de 10 !l/min. Se calcularon las velocidades de asociación y disociación mediante protocolos estandarizados (Karlsson y col. J. Immun. Methods 145: 229-240 (1991)). Las constantes de disociación en el equilibrio, las Kd procedentes de las medidas de resonancia de plasmón superficial (SPR) se calcularon como koff/kon. Los datos se muestran en la Tabla 15 siguiente.

[0215] Los datos de BIAcore™ de la Tabla 15 muestran que varios mutantes mejoraron su afinidad respecto de Y0192. Por ejemplo, una variante de CDRH1, Y0243-1, mostró una afinidad potenciada 4,1 veces, procedente de las mutaciones T28D y N31H. La variante Y0238-3 mostró una mejora de al menos 14 veces en la afinidad de enlace respecto de Y0192. Ambas mutaciones CDRH3 contribuyen a la afinidad mejorada en Y0238-3 porque la reversión

20 de T105 a S (variante Y0313-3) reduce la afinidad de Y0238-3 desde 0,15 nM a 0,65 nM (ver la Tabla 15). La mayor potenciación de la afinidad respecto de Y0192 se observó para Y0313-1, que contenía mutaciones CDRH3 combinadas con mutaciones CDRH1.

[0216] Ensayo de inhibición de VEGF basado en células: Se ensayaron varias versiones del anticuerpo A4.6.1 dirigido contra VEGF para determinar su capacidad para antagonizar VEGF (recombinante; versión 1-165) en 25 la inducción del crecimiento en HuVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana). Las placas de 96 pocillos se sembraron con 1000 HuVEC por pocillo y se aceleraron en medio de ensayo (F12: DMEM 50:50 suplementado con suero bovino fetal al 1,5 % diafiltrado) durante 24 h. La concentración de VEGF usado en la inducción de las células se determinó valorando en primer lugar la cantidad de VEGF que podía estimular un 80 % de la síntesis máxima de ADN. A continuación se añadió medio de ensayo reciente que contenía cantidades fijas de VEGF

30 (concentración final 0,2 nM), y se añadieron a continuación concentraciones crecientes de Fab o Mab contra VEGF. Tras 40 h de incubación, se midió la síntesis de ADN mediante la incorporación de timidina tritiada. Las células se pulsaron con 0.5 !Ci por pocillo de [3H]-timidina durante 24 h y se cosecharon para recuento, usando un contador gamma TopCount.

[0217] Los resultados (Fig. 11) muestran que la forma de longitud completa de la IgG de F(ab)-12 era significativamente más potente en la inhibición de la actividad de VEGF que la forma Fab (aquí, se usó Y0192) Sin embargo, ambas variantes Y0238-3 e Y0313-1 mostraron una inhibición de la actividad de VEGF incluso más potente que cualquiera de Fab o F(ab)-12 de Mab Y0192. Comparando las formas de Fab, la variante Y0313-1 5 parece > 30 veces más potente que el Fab natural. Debe tenerse en cuenta que la cantidad de VEGF (0,2 nM) usada en este ensayo es potencialmente limitante para la determinación de una CI50 precisa para el mutante. Por ejemplo, si la afinidad de unión (Kd) del mutante es de hecho < 0,2 nM, la CI50 de este experimento aparecerá mayor que en condiciones de una menor concentración de VEGF. Por tanto, el resultado respalda la conclusión de que la variante de afinidad mejorada tiene una afinidad mejorará al menos 30 veces para VEGF, y que esto bloquea

10 eficazmente la actividad de VEGF in vitro. Puesto que la variante Y0317 difiere de Y0313-1 solo en la reversión de la secuencia VL1 a la de tipo natural (Fig. 10A), se predice que Y0317 tendrá una actividad similar a la de Y0313-1.

[0218] La variante Y0317 (Fab) y la variante humanizada F(ab)-12 del Ejemplo 1 (longitud completa y Fab) se compararon por su capacidad para inhibir la proliferación de células endoteliales capilares de bovinos en respuesta a una concentración eficaz casi máxima de VEGF usando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. Como se ilustra en la

15 Figura 12, Y0317 fue marcadamente más eficaz en la inhibición de la proliferación de células endoteliales de capilares bovinos que las formas de longitud completa y Fab de F(ab)-12 en este ensayo. El Fab de Y0317 madurado por afinidad demostró un valor DE50 en este ensayo que era al menos aproximadamente 20 veces inferior al del Fab de F (ab)-12.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una etiqueta en o asociada con el recipiente, conteniendo el recipiente una composición que comprende como agente activo un anticuerpo humanizado dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF in vivo y/o se une a VEGF humano con un valor de la Kd no superior a 1 x 10-8 y/o tiene un valor DE50 no superior a 5 nM para inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF in vitro, teniendo el anticuerpo un dominio variable de la cadena pesada que comprende las regiones marco consenso del subgrupo III de la cadena pesada humana como se muestra en la SEQ ID NO: 11 y las regiones hipervariables CDRH1, CDRH2 y CDRH3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRH1: GYX1X2X3X4YGX5N (SEQ ID NO: 117), en el que X1 es D, T o E, X2 es F, W o Y, X3 es T, Q, G o S,

X4 es H o N y X5 es M o I;

CDRH2: WINTX1TGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 118), en el que X1 es Y o W; y

CDRH3: YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NO: 119), en el que X1 es H o Y, X2 es Y, R, K, I, T, E o W, X3 es

G, N, A, D, Q, E, T, K o S, X4 es S, T, K, Q, N, R, A, E o G y X5 es S o G; y que tiene un dominio variable de la cadena ligera que comprende las regiones marco consenso del subgrupo I de la cadena ligera kappa que se muestra en la SEQ ID NO: 12 y las regiones hipervariables CDRL1, CDRL2 y CDRL3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1: X1AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ID NO: 121), en el que X1 es R o S, X2 es S o N, X3 es Q o E, X4 es Q o D

y X5 es I o L;

CDRL2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 122);

CDRL3: QQYSX1X2PWT (SEQ ID NO: 123), en el que X1 es T, A o N y X2 es V o T,

en las que en comparación con la SEQ ID NO: 11, el dominio variable de la cadena pesada tiene una sustitución en uno cualquiera o más de los siguientes restos de las regiones marco consenso: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H y 94H, y en las que en comparación con la SEQ ID NO: 12, el dominio variable de la cadena ligera tiene bien una sustitución en, y solo en, el resto 46L de las regiones marco consenso o bien tiene sustituciones en los restos 4L y 46L de las regiones marco consenso,

en las que la numeración de los restos es como se muestra en la Fig. 1
2.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena ligera tiene una sustitución en, y solo en, el resto 46L de las regiones marco consenso.
3.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo tiene sustituciones en al menos dos de dichos restos de la cadena pesada.
4.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo tiene sustituciones en al menos tres de dichos restos de la cadena pesada.
5.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el anticuerpo tiene sustituciones en al menos cuatro de dichos restos de la cadena pesada.
6.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el anticuerpo tiene sustituciones en los restos 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H y 94H.
7.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que: en CDRH1, X1 es D o T, X2 es F, X3 es T yX5 es M; en CDRH2, X1 es Y; y en CDRH3, X2 es Y, X3 es G, X4 es S o T y X5 es S.
8.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que: en CDRL1, X1 es S, X2 es S, X3 es Q, X4 es D y X5 es I; y en CDRL3, X1 es T y X2 es V.
9.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos:

"CDR7" : X1SX2DX3X4X5X6TX7 (SEQ ID NO: 120), en la que X1 es F, I, V, L o A, X2 es A, L, V o I, X3 es T, V o K, X4 es S o W, X5 es S o K, X6 es N o S y X7 es V, A, L o I.
10.

El artículo d fabricación de acuerdo con la reivindicación 9, en el que en CDR7, X1 es F, X2 es L, X3 es T, X4 es S, X5 es K, X6 es S y X7 es A.
11.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 8.
12.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 11 en el que el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 8
13.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 116 y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 115.
14.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 116 y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 115.
15.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con un valor de la Kd no superior a aproximadamente 1 x10-8 M.
16.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 15 en el que el anticuerpo se une al VEGF humano con un valor de la Kd no superior a aproximadamente 5 x 10-9 M.
17.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
18.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el anticuerpo es una IgG humana.
19.

El artículo de fabricación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
20.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el anticuerpo es un Fab.
21.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la etiqueta indica que la composición se usa en un procedimiento de tratamiento médico.
22.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la etiqueta indica que la composición se usa para tratar un tumor.
23.

El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la etiqueta indica que la composición se usa para tratar un trastorno de la retina.
24.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente es una botella, vial o jeringuilla.
25.

El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente está formado a partir de vidrio o plástico.