TWI422387B - 免疫球蛋白 - Google Patents

免疫球蛋白 Download PDF

Info

Publication number
TWI422387B
TWI422387B TW096118442A TW96118442A TWI422387B TW I422387 B TWI422387 B TW I422387B TW 096118442 A TW096118442 A TW 096118442A TW 96118442 A TW96118442 A TW 96118442A TW I422387 B TWI422387 B TW I422387B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
seq
human
light chain
heavy chain
Prior art date
Application number
TW096118442A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200808350A (en
Inventor
Jonathan Henry Ellis
Volker Germaschewski
Paul Andrew Hamblin
Ian Kirby
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38476914&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI422387(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB0610438A external-priority patent/GB0610438D0/en
Priority claimed from GB0611046A external-priority patent/GB0611046D0/en
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of TW200808350A publication Critical patent/TW200808350A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI422387B publication Critical patent/TWI422387B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Description

免疫球蛋白
一般而言，本發明係關於諸如抗體之免疫球蛋白領域且詳言之，關於適用於治療且診斷由人類介白素－18介導之病況之人類化抗體。
人類介白素－18(hIL－18)為細胞激素，其經合成作為生物學非活性之193個胺基酸之前驅體蛋白(Ushio等人，J.Immunol. 156：4274,1996)。例如，藉由卡斯蛋白酶－1(caspase－1)或卡斯蛋白酶－4裂解前驅體蛋白釋放出156個胺基酸之成熟蛋白(Gu等人，Science 275：206,1997；Ghayur等人，Nature 386：619,1997)，其展現包括共同刺激T細胞增殖、增強NK細胞細胞毒性、誘導T細胞及NK細胞產生IFN－γ且增強1型T輔助細胞(Th1)之分化的生物學活性(Okamura等人，Nature 378：88,1995；Ushio等人，J.Immunol. 156：4274,1996；Micallef等人，Eur.J.Immunol. 26：1647,1996；Kohno等人，J.Immunol. 158：1541,1997；Zhang等人，Infect.Immunol. 65：3594,1997；Robinson等人，Immunity 7：571,1997)。另外，IL－18為包括IL－8、腫瘤壞死因子－α(TNF－α)及前列腺素E 2(PGE 2)之人類單核細胞前發炎性介體之有效誘導物(Ushio,S.等人，J.Immunol.156：4274－4279,1996；Puren,A.J.等人，J.Clin.Invest.10：711－721,1997；Podolin等人，J.Immunol. submitted,1999)。
先前選殖之IL－1受體相關蛋白(IL－1Rrp)(Parnet等人，J.Biol.Chem. 271：3967,1996)被確定為IL－18受體之次單位(Kd＝18 nM)(Torigoe等人，J.Biol.Chem. 272：25737,1997)。IL－18受體之第二次單位展現與IL－1受體輔助蛋白之同源性且稱為AcPL(用於輔助蛋白類)。IL－1 Rrp及AcPL兩者之表現為IL－18誘導之NF－B及JNK之活化所必需的(Born等人，J.Biol.Chem. 273：29445,1998)。除NF－B及JNK外，IL－18經由IL－1受體結合激酶(IRAK)、p56lck(LCK)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)發信號(Micallef等人，Eur.J.Immunol. 26：1647,1996；Matsumoto等人，Biophys Biochem.Res.Comm. 234：454,1997；Tsuji－Takayama等人，Biochem.Biophys.Res.Comm. 237：126,1997)。
產生諸如IFN－γ、IL－2及TNF－β之前發炎性細胞激素之TH1細胞(Mosmann等人，J.Immunol.136：2348,1986)與調節許多包括以下疾病之自體免疫疾病相關：多發性硬化症(MS)、類風濕性關節炎(RA)、1型或胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、發炎性腸道疾病(IBD)及牛皮癬(Mosmann及Sad,Immunol.Today 17：138,1996)。因此，預期諸如IL－18之促TH1細胞激素之拮抗作用將抑制疾病發展。Il－18特異性mAb可用作拮抗劑。
已證實IL－18在自體免疫疾病之發展中之作用。相應地，已證實疾病發作之前不久非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠之胰腺及脾臟中IL－18之表現顯著增加(Rothe等人，J.Clin.Invest. 99：469,1997)。同樣，已展示在類風濕性關節炎患者之滑液中IL－18之含量顯著提高(Kawashima等人，Arthritis and Rheumatism 39：598,1996)。此外，已證實IL－18之投藥會增加鼠實驗性過敏腦脊髓炎(EAE)，一種為多發性硬化症之模型之Th1介導的自體免疫疾病之的臨床嚴重性。另外，已展示中和抗大鼠IL－18抗血清預防雌性Lewis大鼠之EAE之發展(Wildbaum等人，J.Immunol. 161：6368,1998)。因此，IL－18為發展用於自體免疫之新穎治療之理想目標。
Taniguchi等人，J.Immunol.Methods 206：107描述結合於四個不同抗原位點之七種鼠科動物抗人類IL－18單株抗體及六種大鼠抗人類IL－18單株抗體(mAb)。鼠科動物mAb中之一者(#125－2H)及六種大鼠mAb抑制KG－1細胞之IL－18誘發的IFN－γ產生，大鼠mAb展現比#125－2H之彼中和活性低10倍之中和活性。如藉由西方墨點分析所證實，三種鼠科動物mAb(但無一種大鼠mA)與膜結合人類IL－18激烈反應。另外，描述使用#125－2H及大鼠mAb偵測人類IL－18之酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)。此ELISA之偵測極限為10 pg/ml。
歐洲專利申請案EP 0 712 931揭示兩種小鼠抗人類IL－18 mAb：H1(IgG1)及H2(IgM)。如藉由西方墨點分析所證實，兩種mAb與膜結合人類IL－18反應，但不與膜結合人類IL－12反應。HI用於免疫親和層析方案中以純化人類IL－18且用於ELISA中以量測人類IL－18。H2用於放射免疫檢定中以量測人類IL－18。
中和IL－18抗體可能適用於減輕人之自體免疫疾病及相關症狀。由此，在此項技術中，需要高親和性IL－18拮抗劑，諸如人類介白素18之中和性單株抗體，其將會降低Th1細胞分化及增殖且因此減少自體免疫疾病及相關症狀。
在本說明書全文中提及之所有參考文獻係明確且全部以引用的方式併入本文中。
根據本發明，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含具有以下互補決定區(CDR)之重鏈及輕鏈：CDRH1：SEQ.I.D.NO：1 CDRH2：SEQ.I.D.NO：2 CDRH3：SEQ.I.D.NO：3 CDRL1：SEQ.I.D.NO：4 CDRL2：SEQ.I.D.NO：5 CDRL3：SEQ.I.D.NO：6
根據本發明，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含具有以下CDR之重鏈及輕鏈：CDRH1：SEQ.I.D.NO：1 CDRH2：SEQ.I.D.NO：2 CDRH3：SEQ.I.D.NO：3 CDRL1：SEQ.I.D.NO：4 CDRL2：SEQ.I.D.NO：5 CDRL3：SEQ.I.D.NO：6其中在輕鏈第71位之殘基係經見於供體抗體之相應殘基取代，該等CDR係源於該供體抗體。
對於熟習此項技術者而言，顯而易見術語"源於"意欲不僅在其實體起源(physical origin )之意義上定義材料之來源且亦定義結構上與該材料一致但不起源於提及來源之材料。因此，"見於供體抗體構架(CDR係源於該供體抗體構架)"之相應殘基無需自供體抗體構架純化。同樣，"源於供體抗體"之CDR無需自供體抗體純化。
除非另有指示，否則CDR及構架區(FR)及胺基酸之編號按照如在Kabat等人"Sequences of immunological interest",NIH中闡述之Kabat定義。
在本發明之另一態樣中，提供一種包含源於供體抗體且移植於人類受體構架上之CDR的人類化抗介白素－18抗體，該抗介白素18抗體包含具有在SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5及6中列出之序列之CDR，其中在該抗介白素－18抗體之輕鏈第71位上之殘基係與見於供體抗體構架中之相應位置上的殘基一致。
在本發明之另一態樣中，提供一種包含在SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5及6中列出之CDR之人類化抗介白素－18抗體，該抗體在輕鏈第71位上包含酪胺酸。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之CDR之重鏈及具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之CDR之輕鏈，其中該等輕鏈CDR係源於在供體抗體輕鏈之第71位上具有酪胺酸之供體抗體。
在本發明之另一態樣中，提供人類化抗介白素－18抗體，其包含來自供體抗體之CDR及在該人類化抗體之輕鏈第71位上之酪胺酸，其中供體抗體為2C10或其構架變異體(亦即，人類化抗體包含與2C10相同之CDR，但不同構架，參見美國專利第6,706,487號)。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)具有CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列且移植於人類重鏈受體構架上，及(b)具有CDR之輕鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於人類輕鏈受體構架上，其中該人類輕鏈受體構架包含源於SEQ.I.D.NO：38之構架區，其中SEQ.I.D.NO：38之第71位為酪胺酸。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)重鏈，其具有容許特異結合於人類IL－18之CDR；(b)輕鏈，其包含受體構架且包含具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列之CDR且在第71位上具有酪胺酸殘基。
輕鏈之CDR較佳定位於受體構架內之位置上，其在SEQ.I.D.NO：35中列出之序列內對應於SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出的序列的各別位置。輕鏈及/或重鏈較佳在人類患者中無免疫原性。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)包含CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列，及(b)包含CDR之輕鏈，該等CDR其包含具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於人類輕鏈受體構架上，其中該人類化抗介白素－18抗體之該輕鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列變異體的構架區，其中該變異體包含在第71位上之酪胺酸且其中該變異體包含與具有在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列之構架的75%或更大一致性。較佳地，該變異體包含與在SEQ.I.D.NO：38中列出之構架之80%或更大，例如81%、82%、83%、84%，更佳85%或更大，例如86%、87%、88%、89%，甚至更佳90%或更大，例如91%、92%、93%、94%，最佳95%或更大，例如96%、97%、98%、99%的一致性。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，該抗體包含：(a)CDR，其在SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5及6中列出且源於供體抗體，該供體抗體在該供體抗體輕鏈第71位上包含酪胺酸；(b)人類受體構架，該受體構架包含在人類輕鏈第71位上之苯丙胺酸；其中該抗介白素18抗體包含在輕鏈第71位上之酪胺酸。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)CDR，其在SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5及6中列出且源於供體抗體，該供體抗體包含在該供體抗體輕鏈第71位上之芳族胺基酸；(b)人類受體構架，該受體構架包含在輕鏈受體構架之第71位上之與部分(a)中之芳族胺基酸為不同類型的芳族胺基酸；其中抗介白素－18抗體包含具有在第71位上之芳族胺基酸且源於部分(a)之該抗體的輕鏈。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，當在37℃下藉由表面電漿共振量測(例如BiacoreTM ，較佳使用如在以下7.4.1中列出之BiacoreTM 3000器具及條件)時，該抗體顯示關於結合人類IL－18之300 pM或更小之平衡常數(KD)。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，該抗體包含如在SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5及6中列出之CDR且當在37℃下藉由表面電漿共振量測(較佳使用如在以下7.4.1中列出之BiacoreTM 3000器具及條件)時，顯示關於結合人類IL－18之300 pM或更小之平衡常數(KD)。
較佳地，當在37℃下，藉由表面電漿共振量測(較佳使用如在以下7.4.2中列出之BiacoreTM T100器具及條件)時，關於結合人類IL－18之抗體之平衡常數(KD)小於90 pM。更佳地，該平衡常數為70 pM或更小且更佳65 pM、60 pM、55pM或50pM或更小。
在本發明之另一態樣中，提供人類化抗介白素-18抗體，當在37℃下藉由表面電漿共振量測(例如，BiacoreTM ，較佳使用如在以下7.4.2中列出之BiacoreTM T100器具及條件)時，該抗體顯示關於結合人類IL-18之0.0002l/s或更 小 之解離常數或脫離率(off-rate)(kd )。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素-18抗體，該抗體包含：(a)包含源於供體抗體之CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列且移植於重鏈受體構架上，該重鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：37中列出之序列的構架區，其中重鏈第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位上之一或多個殘基與供體抗體重鏈中之相應殘基一致；(b)包含源於供體抗體之CDR之輕鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於輕鏈受體構架上，該輕鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列的構架區，其中輕鏈第71位及視情況第45、83、84、85位上之一或多個(例如，所有)殘基與供體抗體輕鏈中之相應殘基一致。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素-18抗體，其包含：(a)包含源於供體抗體之CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列且移植於人類重鏈受體構架上，該重鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：37中列出之序列的構架區，其中重鏈第27、28、29、93位上之殘基與供體抗體重鏈中之相應殘基一致；(b)包含源於供體抗體之CDR之輕鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於輕鏈受體構架上，該輕鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列的構架區，其中在該抗介白素－18抗體之輕鏈第71位上之殘基與供體抗體輕鏈中之相應殘基一致。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)包含源於供體抗體之CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列且移植於人類重鏈受體構架上，該重鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：37中列出之序列的構架區，其中在重鏈第27、28、29、39、40、93位上之殘基與供體抗體重鏈中之相應殘基一致；(b)包含源於供體抗體之CDR之輕鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於輕鏈受體構架上，該輕鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列的構架區，其中在輕鏈第71位上之殘基與供體抗體輕鏈中之相應殘基一致。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)包含源於供體抗體之CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列且移植於人類重鏈受體構架上，該重鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：37中列出之序列的構架區，其中在重鏈第27、28、29、36、39、40、71、89、91、93位上之殘基與供體抗體重鏈中之相應殘基一致；(b)包含源於供體抗體之CDR之輕鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於輕鏈受體構架上，該輕鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列的構架區，其中在輕鏈第71位上之殘基與在供體抗體輕鏈中之相應殘基一致。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)包含源於供體抗體之CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列且移植於人類重鏈受體構架上，該重鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：37中列出之序列的構架區，其中重鏈第27、28、29、93位上之殘基與供體抗體重鏈中之相應殘基一致；(b)包含源於供體抗體之CDR之輕鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於輕鏈受體構架上，該輕鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列的構架區，其中在輕鏈第71、45、83、84、85位上之殘基與在供體抗體輕鏈中之相應殘基一致。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)包含源於供體抗體之CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列且移植於人類重鏈受體構架上，該重鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：37中列出之序列的構架區，其中在重鏈第27、28、29、93、39、40位上之殘基與供體抗體重鏈中之相應殘基一致；(b)包含源於供體抗體之CDR之輕鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於輕鏈受體構架上，該輕鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列的構架區，其中在輕鏈第71、45、83、84、85位上之殘基與在供體抗體輕鏈中之相應殘基一致。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含：(a)包含源於供體抗體之CDR之重鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：1、2及3中列出之序列且移植於人類重鏈受體構架上，該重鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：37中列出之序列的構架區，其中在重鏈第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位上之殘基與供體抗體重鏈中之相應殘基一致；(b)包含源於供體抗體之CDR之輕鏈，該等CDR具有在SEQ.I.D.NO：4、5及6中列出之序列且移植於輕鏈受體構架上，該輕鏈受體構架包含源於在SEQ.I.D.NO：38中列出之序列的構架區，其中在輕鏈第71、45、83、84、85位上之殘基與在供體抗體輕鏈中之相應殘基一致。
在本發明之另一態樣中，提供一種包含重鏈及輕鏈之人類化抗介白素－18抗體，其中在25℃下，該抗體自結合於人類IL－18之脫離率(kd)與在37℃下，該抗體自結合於人類IL－18之脫離率(kd)之間的比為1：5或更小，且其中該抗體包含源於供體抗體之CDR及人類受體構架，且其中在人類受體構架之輕鏈之第71位上的殘基係經來自供體抗體之相應殘基取代。較佳使用如在以下7.4.2列出之BiacoreTM T100器具及條件量測脫離率。
在本發明之另一態樣中，提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含選自由SEQ.I.D.NO：9,SEQ.I.D.NO：17,SEQ.I.D.NO：21組成之群的重鏈；及選自由SEQ.I.D.NO：13,SEQ.I.D.NO：29組成之群的輕鏈。
尤其，本發明提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含SEQ.I.D.NO：9之重鏈及SEQ.I.D.NO：13之輕鏈或SEQ.I.D.NO：9之重鏈及SEQ.I.D.NO：29之輕鏈。
本發明亦提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含SEQ.I.D.NO：17之重鏈及SEQ.I.D.NO：13之輕鏈或SEQ.I.D.NO：17之重鏈及SEQ.I.D.NO：29之輕鏈。
本發明亦提供一種人類化抗介白素－18抗體，其包含SEQ.I.D.NO：21之重鏈及SEQ.I.D.NO：13之輕鏈或SEQ.I.D.NO：21之重鏈及SEQ.I.D.NO：29之輕鏈。
在本發明之另一態樣中，提供一種包含如上所述之抗介白素－18抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在本發明之另一態樣中，提供一種選擇治療使用之抗體(尤其為抑制配位體與受體之間的相互作用之抗體，諸如抗介白素－18抗體)的方法，該方法包含：(a)在30℃至45℃(較佳37℃)之間的溫度下，量測抗體對該抗體特異結合之抗原的結合親和性(例如，使用表面電漿共振，諸如BiacoreTM )；(b)在20℃至25℃之間的溫度(較佳25℃)下，量測抗體對該抗體特異結合之抗原的結合親和性(例如，使用表面電漿共振，諸如BiacoreTM )；(c)若(a)之親和性大於(b)之親和性，較佳若該(a)之親和性為步驟(b)之親和性的2倍或更大，更佳4倍或更大，則選擇該抗體用於治療使用。
在本發明之另一態樣中，提供一種選擇治療使用之抗體(尤其為抑制配位體與受體之間的相互作用之抗體，諸如抗介白素－18抗體)的方法，該方法包含：(a)在30℃至45℃之間的溫度(較佳37℃)下，量測抗體自該抗體特異結合之抗原的脫離率(例如，使用表面電漿共振，諸如BiacoreTM )；(b)在20℃至25℃之間的溫度(較佳25℃)下，量測抗體自該抗體特異結合之抗原的脫離率(例如，使用表面電漿共振，諸如BiacoreTM )；(c)若(a)之脫離率比(b)之慢，則選擇該抗體用於治療使用。
當術語"抗介白素－18"係指本發明之抗體時，其意謂此等抗體能夠中和人類介白素－18之生物學活性。然而，不排除此等抗體亦可能另外中和非人類靈長類動物(例如，恆河猴及/或獼猴)介白素－18之生物學活性。
4.人類化抗體
在治療人類疾病或病症中使用完整非人類抗體，尤其在重複投予該抗體後，隨之帶來目前非常確實之潛在免疫原性問題。亦即，患者之免疫系統可將該非人類完整抗體識別成非自身且產生中和反應。除發展完全人類抗體(見上文)之外，經過多年已經發展多種技術來克服此等問題且通常涉及減少在完整治療抗體中之非人類胺基酸序列之組成，同時保持自經免疫動物(例如小鼠、大鼠或兔子)獲得非人類抗體的相對容易性。已經廣泛地使用兩種方法來達成此目的。第一種為嵌合抗體，其通常包含與人類恆定區融合之非人類(例如，齧齒動物，諸如小鼠)可變結構域，參見Morrison(1984),PNAS,81,6851。因為抗體之抗原結合位點定位於可變區內，所以嵌合抗體保留其對抗原之結合親和性，但獲得人類恆定區之效應功能且因此能夠執行諸如前文描述之效應功能。通常使用重組DNA方法來產生嵌合抗體。編碼該等抗體之DNA(例如cDNA)係經分離且使用習知程序定序(例如藉由使用寡核苷酸探針，其能夠特異性結合編碼本發明之抗體之H及L鏈之基因，例如編碼上文所描述之SEQ.I.D.NO 1、2、3、4、5及6之DNA)。融合瘤細胞用作此DNA之典型來源。若需要表現嵌合抗體，則分離之編碼輕鏈及重鏈之整個成熟可變區之cDNA同框插入適當表現載體中，該等表現載體尤其含有通常具有人類起點之適當免疫球蛋白恆定區，連同信號序列、終止密碼子、啟動子、終止子及其他獲得抗體表現所需要之元件。隨後，此等載體轉染於諸如E.Coli、COS細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞之宿主細胞中，該等宿主細胞不另外產生免疫球蛋白以獲得抗體合成。可藉由用人類L及H鏈之編碼序列取代相應非人類(例如鼠科動物)H及L恆定區來修飾該DNA，例如參見Morrison；PNAS 81,6851(1984)。
第二種方法涉及產生人類化抗體，其中藉由人類化該等可變區來減少抗體之非人類內含物。人類化之兩種技術已經獲得普及。第一種係藉由CDR移植來人類化。CDR構建接近於抗體N端之環，其中該等環形成安放於由構架區提供之骨架中之表面。主要藉由構形且藉由其CDR表面之化學特性來定義抗體之抗原結合特異性。此等特徵又藉由個別CDR之構形，藉由CDR之相對部署，且藉由包含CDR之殘基之側鏈的本質及部署來確定。可藉由僅將非人類(例如鼠科動物)抗體("供體"抗體)之CDR移植於適當人類構架("受體構架")及恆定區上來達成免疫原性之大幅度降低(參見Jones等人(1986)Nature 321,522－525及Verhoeyen M等人(1988)Science 239,1534－1536)。然而，CDR移植本身可能不會使得完全保持抗原結合性質且頻繁發現若要恢復顯著抗原結合親和性，則需要在人類化分子中保留供體抗體之一些構架殘基(有時候稱為"回復突變")(參見Queen C等人(1989)PNAS 86,10,029－10,033,Co,M等人(1991)Nature 351,501－502)。在此情況下，可自資料庫選擇顯示與非人類供體抗體最大序列同源性(通常60%或更大)之人類V區以提供人類構架(FR)。可自人類一致抗體或個別人類抗體選擇人類FR。必要時，則將供體抗體之關鍵殘基取代入人類受體構架中以保留CDR構形。可使用抗體之電腦建模來幫助識別此等結構上重要之殘基，參見WO 99/48523。
或者，可藉由"表面修飾(veneering)"方法達成人類化。獨特人類及鼠科動物免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區之統計分析揭示人類及鼠科動物抗體中之暴露殘基之精確圖案不同，且多數個別表面位置對少量不同殘基具有強烈偏好(參見Padlan E.A.等人；(1991)Mol.Immunol.28,489－498及Pedersen J.T.等人，(1994)J.Mol.Biol.235；959－973)。因此，可能會藉由替代其構架區中之暴露殘基(其不同於通常見於人類抗體中之彼等殘基)降低非人類Fv之免疫原性。因為蛋白抗原性可能與表面可接近性相關，所以替代表面殘基可足以使得小鼠可變區對於人類免疫系統而言為"不可見"的(亦參見Mark G.E.等人(1994)inHandbook of Experimental Pharmacology，第113卷：The pharmacology of monoclonal Antib odies,Springer－Verlag，第105－134頁)。此人類化程序稱為"表面修飾"，因為僅改變抗體之表面，所以支撐殘基保持原狀。其他替代性方法包括在WO 04/006955中列出之方法及HumaneeringTM (Kalobios)之方法，其利用細菌表現系統且產生序列接近於人類生殖系之抗體(Alfenito－M Advancing Protein Therapeutics,January 2007,San Diego,California)。另外，人類化之最新方法包括根據人類CDR區與彼等供體小鼠抗體CDR區之結構相似性而非根據抗體之其他區(諸如構架區)之間的同源性來選擇人類受體構架。此方法亦稱為SuperhumanisationTM (Evogenix Inc.；Hwang等人(2005)Methods 36：35－42)。
因此，本發明係關於如在以上部分3中闡述之人類化抗體。此等人類化抗體較佳包含IgG同種型(諸如IgG1或IgG4)之人類恆定區。
在替代性實施例中，如在以上部分3中闡述之人類化可變區可與諸如非人類靈長類動物、大鼠、鼠科動物或兔之非人類恆定區("反嵌合體")融合。
對於熟習此項技術者而言，當然應顯而易見的是在SEQ.I.D.NO：37及SEQ.I.D.NO：38中列出之受體構架構成分別由VH及V基因編碼之免疫球蛋白胺基酸。如此，其包含受體抗體之構架區及CDR兩者。用SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5及6中列出之供體CDR取代受體抗體CDR且將所得序列與諸如彼等在SEQ.I.D.NO：39及SEQ.I.D.NO：40中列出之適當構架4序列結合，以便產生諸如在SEQ.I.D.NO：11及SEQ.I.D.NO：15中列出之完整免疫球蛋白可變區係同樣在熟習此項技術者之能力範圍內。
4.1.其他修飾
咸信抗體之Fc區與多種Fc受體(FcγR)之間的相互作用調節抗體之效應功能，其包括抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體結合、吞噬作用及抗體之半衰期/清除率。可視所要效應性質對本發明之抗體Fc區進行多種修飾。例如，於Fc區中使得另一溶胞抗體為非溶胞之特定突變係詳述於EP 0 629 240 B1及EP 0 307 434 B2中或可將補救受體結合抗原決定基併入抗體中以增加血清半衰期，參見US 5,739,277。目前，已有五種認可之人類Fcγ抗體：FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及新生FcRn。Shields等人，(2001)J.Biol.Chem 276,6591－6604證實一組通用IgG1殘基涉及結合所有FcγR，而FcγRII及FcγRIII利用此通用組之外的不同位點。當改變成丙胺酸時，一組IgG1殘基：Pro－238、Asp－265、Asp－270、Asn－297及Pro－239降低對所有FcγRs之結合。所有係處於IgG CH2結構域中且群集在鉸鏈結合CH1及CH2附近。儘管FcγRI僅僅利用IgG1殘基之通用組用於結合，但除通用組外，FcγRII及FcγRIII與不同殘基相互作用。一些殘基之改變會降低對FcγRII(例如，Arg－292)或FcγRIII(例如，Glu－293)之結合。一些變異體顯示經改善之對FcγRII或FcγRIII之結合，但不影響結合於另一受體(例如Ser－267Ala改善對FcγRII之結合，但不影響對FcγRIII之結合)。其它變異體展現改善之對FcγRII或FcγRIII之結合，同時降低對另一受體之結合(例如，Ser－298Ala改善對FcγRIII之結合且降低對FcγRII之結合)。對於FcγRIIIa，最佳結合IgG1變異體在Ser－298、Glu－333及Lys－334處具有組合之丙胺酸取代。咸信新生FcRn受體涉及抗體清除及穿過組織之轉胞吞作用(transcytosis)兩者(參見Junghans R.P(1997)Immunol.Res 16.29－57及Ghetie等人，(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739－766)。經確定直接與人類FcRn相互作用之人類IgG1殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及His435。因此，本發明係關於具有上述任一(或多個)殘基變化以改變半衰期/清除率及/或效應功能，諸如ADCC及/或補體溶解之本發明之抗體。
其它改變包括本發明之抗體之醣基化變異體。已知抗體在其恆定區中之保守位置處的醣基化對抗體功能，尤其效應功能(例如以上描述之彼等功能)具有深刻影響，例如參見Boyd等人，(1996)，Mol.Immunol.32,1311－1318。涵蓋本發明之治療抗體或其抗原結合片段之醣基化變異體，其中添加、取代、刪除或修飾一或多個碳水化合物部分。引入天冬醯胺酸－X－絲胺酸或天冬醯胺酸－X－蘇胺酸基元會形成用於碳水化合物部分之酶結合之潛在位點且因此可用以操縱抗體之醣基化。在Raju等人(2001)Biochemistry 40,8868－8876中，使用β－1,4－半乳醣基轉移酶及/或α－2,3－唾液酸轉移酶，經由再半乳糖基化及/或再唾液酸化之方法增加TNFR－IgG免疫黏附素之末端唾液酸化。咸信增加末端唾液酸化會增加免疫球蛋白之半衰期。與大多數醣蛋白一樣，抗體通常實際上以醣化形式之混合物產生。當在真核細胞，尤其哺乳動物細胞中產生抗體時，此混合物尤其明顯。已發展多種方法以製造所定義之醣化形式，參見Zhang等人，Science(2004),303,371,Sears等人，Science,(2001)291,2344,Wacker等人(2002)Science,298 1790,Davis等人(2002)Chem.Rev.102,579,Hang等人(2001)Acc.Chem.Res 34,727。因此，本發明係關於多種如本文所述之治療抗體(通常單株抗體)(其可能為IgG同型，例如IgG1)，其包含一定數目(例如7個或更少，例如5個或更少，如2個或一個)之該等抗體或其抗原結合片段之醣化形式。
本發明其他實施例包括與非蛋白聚合物(諸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯(polyoxyalkylene))偶合之本發明之治療抗體或其抗原結合片段。蛋白質與PEG之結合為一種已確立可增加蛋白質半衰期以及降低蛋白質之抗原性及免疫原性的技術。已研究出以不同分子量及形式(直鏈或分支鏈)之聚乙二醇化(PEGylation)用於完整抗體以及Fab'片段，參見Koumenis I.L.等人(2000)Int.J.Pharmaceut.198：83－95。
5.產生方法
本發明之抗體可在諸如以下之轉殖基因生物體中產生：山羊(參見Pollock等人(1999),J.Immunol.Methods 231：147－157)、雞(參見Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News 20：1－55)、小鼠(參見Pollock等人，上述文獻)或植物(參見Doran PM,(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11,199－204,Ma JK－C(1998),Nat.Med.4,601－606,Baez J等人，BioPharm(2000)13：50－54,Stoger E等人，(2000)Plant Mol.Biol.42：583－590)。抗體亦可藉由化學合成法產生。然而，通常使用熟悉此項技術者所熟知之重組細胞培養技術產生本發明之抗體。分離編碼抗體之聚核苷酸且插入可複製載體(諸如質體)中用於在宿主細胞中進一步選殖(擴增)或表現。一種適用的表現系統為麩胺酸合成酶系統(諸如，由Lonza Biologics出售)，尤其其中宿主細胞為CHO或NS0(參見下文)。編碼抗體之聚核苷酸容易分離且使用習知程序(例如，寡核苷酸探針)定序。可使用之載體包括質體、病毒、噬菌體、轉座子、微染色體，其中質體為典型實施例。通常，此等載體進一步包括可操作地與輕鏈及/或重鏈聚核苷酸相連之信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列以便促進表現。可將編碼輕鏈及重鏈之聚核苷酸插入獨立載體中且同時或依序引入(例如，藉由轉型、轉染、電穿孔或轉導)同一宿主細胞中，或若須要，則重鏈及輕鏈兩者可在此引入之前插入同一載體中。
熟悉此項技術者將立即顯而易見，歸因於遺傳編碼之冗餘，亦可獲得本文揭示之彼等之替代聚核苷酸，其將編碼本發明之聚核苷酸。
5.1信號序列
本發明之抗體可產生成為具有異源性信號序列之融合蛋白，其在成熟蛋白之N末端處具有特異裂解位點。信號序列將由宿主細胞識別且加工。對於原核宿主細胞，信號序列可為鹼性磷酸酶、青黴素酶或熱穩定腸毒素II前導序列。對於酵母分泌，該等信號序列可為酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列或酸性磷酸酶前導序列，例如，參見WO 90/13646。在哺乳動物細胞系統中，可獲得病毒分泌前導序列(例如單純性疱疹gD信號)及原生免疫球蛋白信號序列(諸如，人類Ig重鏈)。通常，信號序列於閱讀框架中連接於編碼本發明之抗體之聚核苷酸。
5.2複製起點
在此項技術中熟知複製起點，pBR322適於多數革蘭氏陰性細菌(gram－negative bacteria)，2μ質體適於多數酵母且諸如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV之多種病毒起點適於多數哺乳動物細胞。通常，除非在大腸桿菌(E.Coli)中需要載體增殖，否則完整哺乳動物表現載體不需要複製組份之起點。然而，由於SV40 ori含有早期啟動子，所以可使用SV40 ori。
5.3選擇標記
典型選擇基因編碼以下蛋白(a)對抗生素或其他毒素，例如胺苄青黴素、新黴素、甲胺喋呤或四環素之賦予抗性，或(b)補充營養缺陷型缺乏物或供應不可在複合培養基中得到之養分或(c)兩者之組合。選擇方案可包括抑制不含有載體之宿主細胞之生長。用編碼本發明之治療抗體之基因成功轉型之細胞由於(例如)藉由共傳遞之選擇標記賦予之抗藥性而存活。一個實例為DHFR－選擇系統，其中在DHFR陰性宿主菌株中產生轉型體(transformants)(例如，參見Page及Sydenham 1991 Biotechnology 9：64－68)。在此系統中，DHFR基因與本發明之抗體聚核苷酸序列共傳遞且隨後藉由核苷提取(nucleoside withdrawal)選擇DHFR陽性細胞。若需要，則亦使用DHFR抑制劑甲胺喋呤以選擇具有DHFR基因擴增之轉型體。藉由可操作地將DHFR基因連接於本發明之抗體編碼序列或其功能衍生物，DHFR基因擴增使得伴隨擴增所關注之所要抗體序列。CHO細胞為用於此DHFR/甲胺喋呤選擇之尤其適用細胞株且使用DHFR系統擴增且選擇宿主細胞之方法在此項技術中非常確實，參見Kaufman R.J.等人J.Mol.Biol.(1982)159,601－621，對於評述，參見Werner RG,Noe W,Kopp K,Schluter M,"Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals",Arzneimittel－Forschung.48(8)：870－80,1998 Aug。另一實例為麩胺酸合成酶表現系統(Lonza Biologics)。用於酵母中之適當選擇基因為trp1基因；參見Stinchcomb等人Nature 282,38,1979。
5.4啟動子
表現本發明之抗體之適當啟動子係可操作地連接於編碼該抗體之DNA/聚核苷酸。原核宿主之啟動子包括phoA啟動子、β－內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸及雜交啟動子，諸如Tac。適於在酵母細胞中表現之啟動子包括3－磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶，例如，烯醇酶、甘油醛3磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸異構酶、3－磷酸甘油酸變位酶及葡萄糖激酶。誘導性酵母啟動子包括醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白及負責氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用之酶。
在哺乳動物細胞系統中表現之啟動子包括RNA聚合酶II啟動子，其包括病毒啟動子，諸如多瘤病毒、禽痘病毒及腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大性病毒(尤其即刻早期基因啟動子)、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒、肌動朊(actin)、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus，RSV)啟動子及早期或晚期猿猴病毒40(Simian virus 40)及非病毒啟動子，諸如EF－1α(Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17)：5322)。啟動子之選擇可基於與用於表現之宿主細胞之適當相容性。
5.5強化子元件
在適於(例如)在高等真核生物中表現的情況下，可包括其他強化子元件來替代彼等發現定位於上述啟動子中之強化子元件或可包括其他強化子元件以及發現定位於上述啟動子中之彼等強化子元件。適當哺乳動物強化子序列包括來自球蛋白、彈性蛋白、白蛋白、胎蛋白、金屬硫蛋白及胰島素之強化子元件。或者，可使用來自真核細胞病毒之強化子元件，諸如SV40強化子、細胞巨大性病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子、桿狀病毒強化子或鼠科動物IgG2a基因座(參見WO 04/009823)。儘管此等強化子通常位於啟動子上游位點處載體上，但其亦可位於別處，例如在多聚腺嘌呤信號(polydenalytion signal)之未轉譯區或下游內。強化子之選擇及定位可基於與用於表現之宿主細胞之適當相容性。
5.6多聚腺嘌呤/終止
在真核生物系統中，多聚腺嘌呤信號係可操作地連接於編碼本發明之抗體之聚核苷酸。此等信號通常置放於開放閱讀框架之3'。在哺乳動物系統中，非限制性實例信號包括源於生長激素、延伸因子－1α及病毒(例如SV40)基因或反轉錄病毒長末端重複序列之彼等信號。在酵母系統中，多聚腺嘌呤/終止信號之非限制性實例包括源於磷酸甘油酸激酶(PGK)及醇脫氫酶1(ADH)基因之彼等多聚腺嘌呤/終止信號。在原核系統中，適常不需要多聚腺嘌呤信號且代之以通常使用較短且更確定之終止子序列。多聚腺嘌呤/終止序列之選擇可基於與用於表現之宿主細胞之適當相容性。
5.7增強產量之其他方法/元件
除以上外，可用以增強產量之其他特徵包括染色質重塑元件、內含子及宿主細胞特異性密碼子修飾。本發明之抗體之其密碼子選擇可經修飾以適應宿主細胞之密碼子偏倚性如此以增加轉錄物及/或產物產量(例如，Hoekema A等人Mol Cell Biol 1987 7(8)：2914－24)。密碼子之選擇可基於與用於表現之宿主細胞之適當相容性。
5.8宿主細胞
用於選殖或表現編碼本發明之抗體之載體的適當宿主細胞為原核細胞、酵母或高等真核細胞。適當原核細胞包括真細菌，例如，腸內菌科(enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌(Escherichia )，例如大腸桿菌(例如ATCC 31,446；31,537；27,325)，腸桿菌(Enterobacter )，伊文氏桿菌(Erwinia )，克雷伯氏桿菌變形桿菌(Klebsiella Proteus )，沙門氏菌(Salmonella )，例如鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium )，沙雷氏菌(Serratia )，例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans )及志賀桿菌(Shigella )以及芽胞桿菌(Bacilli )，諸如枯草桿菌(B.subtilis )及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis )(參見DD 266 710)，假單胞菌(Pseudomonas )，諸如綠膿桿菌(P.aeruginosa )及鏈球菌(Streptomyces )。在酵母宿主細胞中，亦涵蓋釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe )、刻魯維拉菌(Kluyveromyces )(例如ATCC 16,045；12,424；24,178；56,500)、耶氏酵母(yarrowia )(EP402,226)、甲醇酵母(Pichia Pastoris )(EP183,070，亦參見Peng等人J.Biotechnol.108(2004)185－192)、念株菌(Candida)、裏氏木黴(Trichoderma reesia )(EP244,234)、盤尼西林(Penicillin )、彎頸黴(Tolypocladium )及麴菌(Aspergillus) 宿主，諸如小巢狀麴菌(A.nidulans )及黑麴菌(A.niger )。
雖然本發明特定涵蓋原核及酵母宿主細胞，然而通常本發明之宿主細胞為脊椎動物細胞。適當脊椎動物宿主細胞包括哺乳動物細胞，諸如COS－1(ATCC No.CRL 1650)COS－7(ATCC CRL 1651)，人類胚腎細胞株293，PerC6(Crucell)，幼倉鼠腎細胞(BHK)(ATCC CRL.1632)，BHK570(ATCC NO：CRL 10314)，293(ATCC NO.CRL 1573)，中國倉鼠卵細胞CHO(例如CHO－K1，ATCC NO：CCL 61，DHFR－ CHO細胞株，諸如DG44(參見Urlaub等人，(1986)ibid)，尤其為適合於懸浮培養之彼等CHO細胞株)，小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cells)，猴腎細胞，非洲綠猴腎細胞(ATCC CRL－1587)，HELA細胞，犬腎細胞(ATCC CCL 34)，人類肺細胞(ATCC CCL 75)，Hep G2及骨髓瘤或淋巴瘤細胞，例如NS0(參見US 5,807,715)、Sp2/0、Y0。
因此，在本發明之一個實施例中，提供包含編碼如本文描述之治療抗體之重鏈及/或輕鏈之載體的穩定轉型之宿主細胞。通常，此等宿主細胞包含編碼該輕鏈之第一載體及編碼該重鏈之第二載體。
此等宿主細胞亦可進一步經設計或改造以改變本發明之抗體之品質、功能及/或產量。非限制性實例包括特異修飾(例如糖基化)酶及蛋白折疊伴隨蛋白之表現。
5.9細胞培養方法
用編碼本發明之治療抗體之載體轉型之宿主細胞可藉由熟習此項技術者已知之任何方法培養。宿主細胞可培養於旋轉燒瓶、搖瓶、轉瓶或中空纖維系統中，但對於大規模生產而言，較佳為尤其使用攪拌槽反應器或袋式反應器(例如，Wave Biotech,Somerset,New Jersey USA)用於懸浮培養。通常攪拌槽適於使用(例如)噴霧器、隔板或低剪切葉輪來通風。對於氣泡塔及氣舉式反應器，可使用空氣或氧氣泡直接通風。在無血清培養基中培養宿主細胞時，較佳使培養基補充有諸如泊洛尼克F－68(pluronic F－68)之細胞保護劑以幫助防止通風過程導致之細胞損壞。視宿主細胞之特徵而定，微載體可用作固著依賴性細胞株之生長基質或細胞可適於懸浮培養(其為典型的)。宿主細胞，尤其脊椎動物宿主細胞之培養可利用多種操作模式，諸如分批、分批饋入、重複分批過程(參見Drapeau等人(1994)cytotechnology 15：103－109)、擴展分批過程或灌注培養。儘管可在含血清培養基(此等培養基包含胎牛血清(FCS))中培養重組性轉型之哺乳動物宿主細胞，但較佳此等宿主細胞培養於(若需要)補充有諸如葡萄糖之能源及諸如重組性胰島素之合成生長因子之無血清合成培養基(諸如在Keen等人(1995)Cytotechnology 17：153－163中所揭示)或市售培養基(諸如ProCHO－CDM或UltraCHOTM (Cambrex NJ,USA))中。無血清培養之宿主細胞可需要適於在無血清條件中生長之彼等細胞。一種適應方法為在含血清培養基中培養此等宿主細胞且重複地將80%培養基換成無血清培養基，使得宿主細胞學會適應無血清條件(例如，參見ScharfenbergK 等人(1995)inAnimal Cell technology：Developments towards the 21st century (Beuvery E.C.等人編)，第619－623頁，Kluwer Academic publishers)。
可回收分泌於培養基中之本發明之抗體且使用多種技術自培養基純化以提供適於期望用途之純化程度。例如，使用本發明之治療抗體用於治療人類患者通常要求當與培養基包含之治療抗體相比時，至少95%純度(如藉由還原型SDS－PAGE測定)，更通常98%或99%純度。首先，通常使用離心自培養基移除細胞碎片，接著使用例如，微量過濾、超濾及/或深過濾進行上清液澄清步驟。或者，在不事先離心之情況下，可藉由微量過濾、超濾或深層過濾採集抗體。可利用多種其他技術，諸如透析及凝膠電泳及層析技術，諸如羥基磷灰石(HA)、親和層析(視情況包括親和標記系統，諸如聚組胺酸(polyhistidine))及/或疏水性相互作用層析(HIC，參見US 5,429,746)。在一實施例中，在多種澄清步驟之後，使用蛋白A或G親和層析，之後使用其他層析步驟，諸如離子交換及/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排阻層析及硫酸銨沉澱來捕捉本發明之抗體。通常，亦使用多種病毒移除步驟(例如，使用如DV－20過濾器之奈米過濾)。按照此等多種步驟，提供包含至少10 mg/ml或更多(例如100 mg/ml或更多)本發明之抗體之經純化(通常單株)製劑且因此形成本發明之實施例。藉由超速離心可產生100 mg/ml或更大之濃度。適當地，此等製劑大體上無聚集形式之本發明之抗體。
細菌系統尤其適於抗體片段之表現。此等片段定位於細胞內或細胞間質內。可根據熟習此項技術者已知之方法，提取不可溶周質蛋白且再折疊以形成活性蛋白，參見Sanchez等人(1999)J.Biotechnol.72,13－20及Cupit PM等人(1999)Lett Appl Microbiol,29,273－277。
6.醫藥組合物
如上文描述之本發明之抗體的經純化製劑(尤其單株製劑)可被併入用於治療諸如以上概述之彼等人類疾病及病症之醫藥組合物中。通常，此等組合物進一步包含如已知且由可接受之醫藥規範要求之醫藥學上可接受之(亦即惰性)載劑，例如，參見Remingtons Pharmaceutical Sciences，第16版，(1980),Mack Publishing Co。此等載劑之實例包括經適當緩衝劑緩衝至5至8範圍內之pH值之無菌載劑，諸如鹽水、林格氏溶液(Ringers solution)或右旋糖溶液。用於注射(例如，以靜脈內、腹膜內、皮內、皮下、肌內或門脈內(intraportal)方式)或連續輸液之醫藥組合物適當地無可見顆粒物質且可包含介於0.1 ng至100 mg之間的抗體，通常介於5 mg與25 mg之間的抗體。熟習此項技術者熟知製備此等醫藥組合物之方法。在一實施例中，醫藥組合物以單位劑型包含介於0.1 ng至100 mg之間的本發明之治療抗體，視情況連同使用說明書。根據熟習此項技術者熟知或顯而易見之方法，本發明之醫藥組合物可經凍乾(冷凍乾燥)以在投藥之前復水。若本發明之實施例包含具有IgG1同種型之本發明之抗體，則可將銅螯合劑，諸如檸檬酸鹽(諸如檸檬酸鈉)或EDTA或組胺酸添加至醫藥組合物中以降低銅介導之此同種型抗體之降解程度，參見EP 0 612 251。
投予本發明之抗體之有效劑量及治療療法通常憑經驗確定且視各因素，諸如患者之年齡、體重及健康狀態及待治療之疾病或病症而定。此等因素係在主治醫師之權限內。選擇適當劑量之指導可見於例如，Smith等人(1977)Antibodies in human diagnosis and therapy,Raven Press,New York，但通常介於1 mg與1000 mg之間。在一實施例中，治療罹患RA之人類患者之給藥療法為每週或每兩週皮下投予100 mg或左右(亦即，介於50 mg至200 mg之間)本發明之抗體(或其抗原結合片段)。亦可預防性地使用本發明之組合物。
視待治療之疾病或病症而定，可同時、獨立或依序使用包含治療有效劑量之本發明之抗體的醫藥組合物與有效劑量之另一藥物，諸如消炎劑，例如NSAID、甲胺喋呤、布西拉明(bucillamine)、硫代蘋果酸鈉(sodium thiomalate)或一或多種抗TNFα治療劑，例如EnbrelTM (依那西普(etanercept))、RemicadeTM (英利昔單抗(infliximab))、HumiraTM (阿達木單抗(adalimumab))及/或CDP870。本發明之抗體亦可與有效劑量之抗TNFα受體抗體組合使用，參見Davis MW等人(2000)Ann Rheum Dis 59(Suppl 1)：41－43。在其他實施例中，本發明之抗體亦可與有效劑量之針對IL－1/IL－1R(例如，KineretTM )、CTLA4－Ig、IL－6(參見Choy等人，(2002)Ann.Rheum.Dis 61(suppl 1)：54)、IL－8、IL－15、VEGF、IL－17、IL－18(參見Taylor等人(2001)Curr.Opin.Immunol.13：611－616)、抗ICAM及/或抗CD4抗體之藥劑，針對MMP家族成員，例如MMP－1、MMP－2、MMP－3及/或MMP－13之藥劑組合使用。本發明之抗體亦可用於與使用(例如)MabtheraTM (利妥昔單抗)除去已知涉及發炎過程之細胞，例如CD20陽性B細胞之藥劑組合。與本發明之抗體組合之其他治療劑包括抗血管生成治療劑，諸如整合素αvβ3之拮抗劑，Kringles 1－5(參見Sumariwalla P等人(2003)，Arthritis Res Ther 5：R32－R39)，可溶Flt－1(參見Miotla等人，(2000)Lab.Invest.80：1195－1205)，抗COX－2劑或抗OSM劑，諸如抗OSM抗體，參見WO 2005/095457，其全部內容尤其以引用的方式併入本文中且讀者特定參考該等文獻。適宜地，本發明亦涵蓋包含本發明之抗體或其抗原結合片段之一部分連同此等另一藥物，視情況連同使用說明書之套組的醫藥組合物。此等組合可能尤其適用於治療關節炎疾病/病症，諸如類風濕性關節炎。
7.臨床用途
本發明之抗體可用於治療性治療IL－18介導之疾病，諸如自體免疫疾病。尤其提及多發性硬化症、諸如類風濕性關節炎之關節炎疾病、1型糖尿病、發炎性腸道疾病(IBD)及牛皮癬。因此，本發明進一步包含一種治療罹患對hIL－18之中和起反應之疾病(諸如多發性硬化症、類風濕性關節炎、1型糖尿病、IBD、牛皮癬)的人類患者的方法，該方法包含投予該患者治療有效劑量之本發明之抗體，尤其包含具有在SEQ.I.D.NO：9中列出之序列之重鏈及具有在SEQ.I.D.NO：13中列出之序列之輕鏈的抗體。
亦提供本發明之抗體在製造用於治療上述疾病/病症中之任何一者(或更多者)的藥物中之用途。
7.例證
以下實例說明本發明之多種態樣。如在以下文獻中教示，執行所有通用選殖、連接反應及其他重組DNA技術：Maniatis等人，Molecular cloning(實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory，或Sambrook等人Molecular Cloning(實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory。本文中使用之載體系統及其他分子生物學方法揭示於WO 2005/095457中，其全部內容係以引用的方式併入本文中且讀者特定參考該等文獻。
7.1融合瘤可變區之選殖
在美國專利6,706,487中闡述親本大鼠抗體2C10。讀者特定參考此文獻。根據以上描述之連接於人類IgG1或C區(kappa C－regions)之公開的大鼠V區設計嵌合抗體2C10c。引入通用免疫球蛋白信號序列及轉譯起始密碼子ATG用於重鏈及輕鏈構築體。Hind III及BsiWI限制性核酸內切酶位點經設計以構造VL結構域且使得選殖於已含有人類C區(SEQ.I.D.NO：36)之哺乳動物表現載體中。Hind III及SpeI限制性核酸內切酶位點經設計以構造VH結構域且使得選殖於已含有人類γ1C區(SEQ.I.D.NO：34)之哺乳動物表現載體中。此產生自如在SEQ.ID.NO：33中展示之公開序列之構架4中的2C10 Vh區的兩個胺基酸變化(Kabat殘基107及108)。
藉由PCR且選殖於以上概述之表現載體中，使用重疊寡核苷酸構建全部編碼序列。序列核對後，使CHO細胞表現嵌合抗體。藉由r蛋白A瓊脂糖(rProtein A Sepharose)之親和層析，自細胞培養上清液純化產生之抗體。在活體外結合檢定中評估2C10之嵌合抗體以證實與親本大鼠2C10之可比較的效能。此係藉由在ELISA中測定結合人類或恆河猴IL18之EC50值(圖16及圖17)或在KG－1生物檢定中藉由抑制IFN－γ之釋放(參見圖15)而達成。
7.2人類化
7.2.1輕鏈人類化策略 對於2C10大鼠可變輕鏈序列，選擇與大鼠2C10可變輕鏈序列具有64%一致性(包括CDR)之人類生殖系受體構架(F_IGKV1D－12－1,SEQ.I.D.NO：38)。在電腦中(in silico)使生殖系V區與適當FR4組合，在此種情況下，J－區2小基因(Kabat Vol.II)基於序列相似性(SEQ.I.D.NO：40)。基於序列比較及對抗體功能的可能影響產生三種人類化變異體。構築體L1為大鼠CDR(使用Kabat定義)直接移植於以上選擇之人類受體構架中的移植物。構築體L2係基於L1，在殘基71處具有一個額外回復突變。構築體L3係基於L2，在殘基45、83、84及85處具有4個額外回復突變。參見表1。
7.2.2重鏈人類化策略 對於2C10大鼠可變重鏈序列，選擇與大鼠2C10可變重鏈具有59%一致性(包括CDR)之人類生殖系受體構架(Fp_IGHV1－f_2,SEQ.I.D.NO：37)。在電腦中使生殖系V區與適當FR4組合，在此種情況下，JH6小基因(Kabat Vol.II)基於序列相似性(SEQ ID No：39)。基於此構架設計三種人類化可變重鏈變異體。H1係大鼠CDR移植物(使用Kabat定義)，在殘基27、28、29及93處具有4個額外回復突變。此允許剛好在親本(亦即供體)抗體之CDR1上游產生極罕見胺基酸序列，其可構成CDR之一部分(如由Chothia所定義)。H2係基於在殘基39及40處具有兩個額外回復突變之H1。H3又基於在殘基36、71、89及91處具有另外4個額外回復突變之H2。參見表2。
表2：產生之人類化Vh變異體的概述
7.3 2C10C之人類化 藉由構建重疊寡核苷酸及PCR擴增重新合成人類化V區。引子包括限制性位點用於選殖於哺乳動物表現載體中及人類免疫球蛋白信號序列用於分泌。人類化V區選殖於哺乳動物表現載體中，如H1、H2及H3使用HindIII及SpeI選殖於含有人類γ1恆定區(human gamma 1 constant region)之哺乳動物表現載體中且如L1、L2及L3使用HindIII及BsiWI選殖於含有人類恆定區(human kappa constant region)之哺乳動物表現載體中。此產生人類IgG1同種型之人類化重鏈變異體及人類同種型之人類化輕鏈變異體。
7.3.1人類化重鏈及輕鏈抗體組合之表現 一式四份地瞬間轉染CHOK1細胞。檢定上清液抗體濃度且隨後藉由與2C10大鼠－人類嵌合體相比較用於活體外結合檢定。
對於每一燒瓶，藉由使51.4 μg輕鏈質體及8.6 μg重鏈質體與240 μg轉染脂質(此脂質描述於其全部內容係以引用的方式併入本文中之WO 2006/053783，實例13中)於8 ml培養基(OptiMEM/穀氨醯胺(glutamax)/5%FBS)中混合且將此混合物施用於兩個接近長滿CHOK1細胞之T175燒瓶中，在典型組織培養條件下，歷時72小時而執行較大規模之所有9個變異體之瞬間表現。亦使用搖瓶，以毫克量於多株CHO細胞系統中表現抗體且使用FPLC及蛋白A純化。
7.4活體外結合檢定
7.4.1 Biacore分析 以BiacoreTM 3000器具使用蛋白A於HBS－EP緩衝液(BiacoreTM )中捕捉抗體進行人類化2C10抗體之BiacoreTM 動力學分析。簡而言之，使用製造商推薦之方案，藉由一級胺偶合使蛋白A固定於CM5晶片上至約2000－4000共振單位(RU's)之密度。隨後，人類化抗體經過蛋白A表面且被捕捉至約200－500 RU's之量，在一段穩定時期之後，IL18(人類或恆河猴)在一定濃度下經過捕捉抗體表面且獲得結合感應圖(sensorgrams)。使用酸性溶離條件再生，使得捕捉抗體自蛋白A表面全部移除，且不會顯著降低表面結合能力。針對緩衝液注射替代IL18，所有曲線進行雙參考，且使用BiaEval 4.1中之全局擬合參數(global fit parameters)將資料與1：1結合模型擬合。使用相同蛋白A捕捉方法設計脫離率評級實驗，然而僅使用單一濃度之IL18(10 nM)。儘管使用與動力學分析相同之結合模型擬合資料，但由於所報導僅一種濃度之分析物用於脫離率，因此此值可用於評級而非給予精確動力學測量及用作選擇那些抗體可作進一步研究之方式。
在25℃之初始結果顯示所有構築體對人類IL18具有與大鼠2C10親本抗體類似之結合親和性。然而，當在37℃進行脫離率評級實驗時，與L2及L3構築體相比，L1構築體執行不佳，可見到脫離率增加(表3a及表3b)。
資料為兩個實驗之結果，(標準差) 資料為一個實驗之結果。
不但在37℃下執行不佳，且L1構築體在25℃下在結合於恆河猴IL18之親和性方面(表4a)亦最差。基於此等觀測，更詳細地研究所選擇的抗體在37℃下對人類及恆河猴IL18之結合。在表4b中展示之關於人類IL－18之資料為六個獨立測定之平均值(及標準差)。關於恆河猴IL－18之資料展示用於H1L2及H1L3之兩個實驗的平均值及標準差，而用於H3L2及H3L3之資料來自單一實驗。此資料之相對高標準差可能為在37℃下進行此實驗之結果。
當認為L1與L2構築體之間的差異為在輕鏈之第71位處經酪胺酸回復突變取代苯丙胺酸時，對L1構築體執行相對不佳感到意外。由於酪胺酸與苯丙胺酸兩者毫無疑問為芳族胺基酸，因此對構架結構中之此微小變化引起在37℃(而非25℃)下，在BiacoreTM 系統中所觀測到之顯著結果(在結合親和性方面)感到意外。
資料為一個實驗之結果。
選擇變異體H1L1、H1L2及H1L3用於在以下部分7.4.2中進一步分析。
7.4.2 Biacore分析T100資料 使用T100 BiacoreTM 機器進一步進行某些變異體抗體之特徵化。由於使用在較高溫度下使緩衝效應最小之線內除氣器，因此在較高溫度下在基線之敏感性、溫度控制及穩定性方面，此機器提供優於BiacoreTM 3000之優勢。其亦提供增強之軟體，諸如自動資料分析。
方法基本上與用於以上部分7.4.1之方法相同；蛋白A係藉由第一胺偶合，以介於2000－6000 RU之間的密度固定於CM5晶片上。在HBS－EP(BiacoreTM )中進行操作。捕捉抗IL18抗體至介於100－500 RU之間的密度，人類IL18以介於16 nM－0.0625 nM之間的濃度經過此捕捉表面，0 nM濃度(亦即僅僅注射捕捉抗體之緩衝液)用於雙參考。IL18之每一注射後之再生係藉由使用10 mM甘胺酸(pH 1.5)之兩次注射的輕度酸性溶離。此再生步驟自蛋白A表面移除捕捉抗體(且因此移除結合於其之任何IL18)。該再生不會顯著改變蛋白A表面結合隨後脈衝之抗體之能力，允許另一捕捉事件發生。使用T100機器固有之分析軟體，使用1：1之結合模型分析獲得之結合曲線。在指示之溫度下進行操作。
在15℃、20℃、25℃、32℃及37℃下分析H1L1及H1L2之結合 在多個溫度下，使用以上方法進行實驗。圖1展示溫度對結合率(on－rate)(ka)之影響，而圖2展示對脫離率(kd)之影響且圖3為對平衡常數(KD)之影響。表5詳述用以形成此等圖之動力學值。
表5：來自溫度變化實驗之動力學參數 資料來自單一實驗。
資料展示兩個測試抗體之結合率在測試之溫度範圍中類似，H1L2一般具有更快結合率，直至在37℃下H1L2具有較快結合率的最終值。然而，當觀察脫離率時，看到較大差異，在15℃、20℃、25℃下，兩個抗體具有類似脫離率，但在32℃及37℃下開始偏離，看到H1L1具有較快脫離率。此等變化反映在總平衡常數(其為kd/ka之函數)上，且指示H1L1與H1L2之間的差異主要在於如由脫離率(kd)所定義之抗體/IL18複合體之穩定性。
在25℃及37℃下，分析H1L1、H1L2、H1L3及嵌合2C10之結合 如上描述進行實驗。表6詳述獲得之動力學參數。在如在25℃及37℃兩者下由平衡常數KD定義之結合方面，資料展示H1L2為比H1L1佳之抗體，但動力學參數展示，在25℃下，H1L2具有比H1L1佳之結合率(ka)。在37℃下，位置反向指示在37℃下所看到的H1L2之優良結合更多歸因於脫離率(k d)，其指示使L2區別於L1之突變在較高溫度下給予IL18－抗體複合體增加的穩定性。
資料為許多獨立資料組(n)之平均值，展示平均值及標準差，括號內為標準差。在此資料組中包括對自在五個不同溫度下分析所獲得之H1L1及H1L2在25℃及37℃下操作的值。
7.4.3於IL18結合ELISA中評估2C10c人類化變異體 使用多種批量之純化抗體製劑，進行至少6次用九個人類化變異體之ELISA。圖4A－4C展示來自一個實驗之代表性資料，該實驗產生在表7中說明之EC50值分級。人類IL－18係固定於Nunc Maxisorp 96孔板上，使用2.5 μg/ml 16D10(非中和小鼠單株抗體)捕捉5 ng/ml重組性人類IL－18。以多種稀釋度添加抗IL－18人類化抗體。使用抗人類IgG Fc特異性過氧化物酶結合物(Sigma A0170)偵測結合之人類化抗體。
所有變異體之效能看來極接近於2C10嵌合體，表明人類化產生極少效能損失。儘管由若干次重複之此等檢定產生之EC50值確實產生變異體分級，但ELISA單獨不產生此等變異體之間的顯著差別(參見表7及圖4A－4C)。使用BiacoreTM 達成變異體之某些差別(部分7.4.1及7.4.2)，其在若干獨立重複實驗中，使用人類及恆河猴IL18(表8、圖5[人類]及圖6[恆河猴])產生僅4個經檢查較接近之變異體。
7.4.4於IL－18結合ELISA中評估2C10人類化H1變異體 用三個人類化H1變異體H1L1、H1L2及H1L3進行ELISA以在室溫下及在37℃下，於人類血清及阻滯溶液(block solution)(PBS 0.05% TWEEN具有1% BSA(w/v))中評估對人類IL－18之結合。人類化抗體變異體以2.5 μg/ml固定於Nunc Maxisorp 96孔板中。在室溫下或在37℃下，在人類血清或阻滯溶液中進行5 ng/ml重組性人類IL－18之捕捉。添加抗IL－18小鼠單株抗體16D10。使用抗小鼠過氧化物酶結合物偵測結合之小鼠抗體(Serotec MCA 1291P)。在表9中說明自研究資料產生之代表性EC50值。
三個人類化H1變異體之效能不受在此檢定中進行人類IL－18結合步驟時之自室溫至37℃之溫度的變化影響。當抗體存在於人類血清中時，觀測到較低結合信號。
7.4.5評估人類化H1變異體抗體在37℃下之穩定性 在37℃下，經14天之時限，在人類血清及磷酸鹽緩衝鹽水中評估三個人類化H1變異體H1L1、H1L2及H1L3之儲存穩定性。將抗體稀釋至50 μg/ml，在37℃，0、1、4、6、8及14天之培養期後，藉由IL－18結合ELISA評估穩定性。對於IL－18結合ELISA，將16D10(非中和小鼠單株抗體)固定於Nunc Maxisorp板上以捕捉5 ng/ml之重組性人類IL－18。添加在37℃時間過程培養中，在不同時間點取樣之抗IL－18人類化抗體。使用抗人類IgG Fc特異性過氧化物酶結合物偵測結合之人類化抗體。
基於在此檢定形式中人類化H1抗體變異體結合人類IL－18之能力，延長暴露於37℃之溫度中0、1、4、6、8及14天不會影響人類化H1抗體變異體之結合效能。
7.5在滑液存在下H1L2對人類IL18之結合 執行ELISA，其中50%人類滑液摻有500 ng/ml至0 ng/ml之重組性人類IL18。隨後，將在此溶液中含有之IL－18施加於塗覆有H1L2抗體之Maxisorp 96孔板(Nunc)之孔中。隨後，經由結合生物素之抗IL－18抗體(D045－6，MBL)及抗生蛋白鏈菌素－HRP偵測結合之IL－18。滴定於50%滑液(SF)中之重組性人類IL18產生幾乎與滴定於緩衝液中之人類重組性IL－18相同之曲線，僅在半最大值方面具有輕微變化。參見圖7。此甚至在更精密地模擬抗體在治療情境中將遇到之結合環境之50%人類SF存在下，證實抗體結合hIL－18之能力。
7.5.1在IL18結合蛋白(IL18bp)存在下，對IL18之結合 BiacoreTM 技術(BiacoreTM 3000)及ELISA用以測定在人類IL18bp存在下，H1L2是否仍可結合人類IL18。IL18bp對IL18具有高親和性且充當IL－18功能之天然抑制劑(圖8、圖9A及圖9B，表10及表11)。
藉由Biacore分析 簡而言之，藉由第一胺偶合，使蛋白A使固定於CM5晶片之表面上至約4000共振單位(RU)之密度。隨後，使重組性Fc－IL18結合蛋白(R&D系統)以3微克/毫升之濃度，以10微升/分鐘之流動速率經過1分鐘；此使得捕捉約1400 RU之IL18結合蛋白。隨後，使IL18以30 nM之濃度，以10微升/分鐘之流動速率經過捕捉之IL18結合蛋白表面，歷時5分鐘。此後，使10 nM濃度之大鼠2C10親本抗體，以30微升/分鐘之速率經過IL18結合蛋白/IL18表面，歷時3分鐘。若由2C10抗體辨別之IL18之抗原決定基干擾IL18結合蛋白相互作用之位點，則應看不到結合信號。圖10證實2C10結合於hIL－18，hIL－18又由hIL－18BP捕捉，指示2C10及hIL－18BP之結合位點不重疊。
藉由ELISA分析 於直接結合ELISA中測試人類化H1L2或2C10大鼠MAb對人類IL18捕捉結合之IL18bp之結合，其中重組性人類IL18bp－Fc融合蛋白(R&D系統#119－BP)以0.5 μg/ml塗覆於Nunc Maxisorp板上。將重組性人類IL18(室內(in house)試劑)以100 ng/ml添加至阻滯緩衝液中(含有1% w/v BSA之PBS)。添加0.5 ng/ml至1 μg/ml範圍內濃度之純化抗體。用抗人類輕鏈特異性HRP結合物(Sigma)或抗大鼠IgG HRP偵測結合之抗體。圖18A及圖18B說明獲得之結果。
7.6活體外生物檢定
7.6.1人類化構築體在中和IL18刺激之KG－1細胞株中IFN－γ釋放中的活性 此檢定量測抗體特定對於IL－18之中和活性且基於IL－18介導之KG－1細胞中之IFNγ的誘導。KG－1(ATCC #CCL－246)為組成性地表現功能IL－18受體且因此對外原性IL－18刺激起反應之人類骨髓單核細胞性細胞株。
評估所有九種人類化變異體抑制人類IL18刺激之KG－1細胞中之IFN－釋放的能力(表12及圖11)。
對基於BiacoreTM 分析展示對重組性人類及恆河猴IL18最佳親和性之四種較佳人類化變異體又執行至少6次重複實驗。圖8說明四種較佳人類化變異體及H1L1之代表性結果，且表13概述所有用源於CHOela細胞之同一批蛋白材料進行之此等檢定的結果。
在H1L1係與其他人類化變異體相比較之情況下，與經測試之其他四種人類化構築體相比且亦與2C10親本MAb相比，證實H1L1較低之效能。
用比較抑制IL－18刺激之KG－1細胞的INFγ釋放之能力的四種較佳單株抗體執行進一步之分析：2C10及源於2C10之人類化變異體(H1L1、H1L2及H1L3)。在37℃及5%CO2 下，藉由將50 ng/ml重組性人類IL－18及多種濃度之IL18特異性抗體(在2 μg/ml至7.8 ng/ml範圍內，以雙稀釋法)或陰性同種型對照(Synagis，抗RSV抗體)培養1小時，接著每孔添加3.105 個KG－1細胞，於96孔板中執行KG－1生物檢定。最後，在37℃，5%CO2 下，將板培養20－24小時。採集上清液且使用商業人類IFNγELISA套組(Biosource AHC4432；AHC4539)測定IFNγ之產生。
已執行三個實驗。將抑制IL－18刺激之IFNγ產生之結果關於陰性對照標準化。統計分析目的為在調整任何Synagis反應後，獲得每一實驗之每一mAb之IC50估計量。隨後，統計學上分析IC50估計量以產生具有95%信賴區間(亦即，統計學上似真範圍)之用於每一mAb之IC50的總估計量。最後，使用Dunnett測試，將每一人類化變異體與2C10比較。
圖12說明代表性實驗。表14及圖13展示具有95%信賴區間之每一單株抗體之IC50的總估計量及自具有p值及信賴區間之大鼠2C10之變化%。
與2C10相比，H1L1統計學上顯著地不太有效(p<0.001)。
儘管H1L3對2C10之比較不明確，但其他人類化變異體非顯著性地不同於2C10。
7.6.2 H1L2在中和經刺激之人類PBMC中釋放之IFN－γ中的活性 用重組性人類IL18及抗CD3抗體刺激來自三種供體之人類PBMC且研究添加連續稀釋之四種經選擇人類化抗體變異體之影響。對於每一供體親本，包括2C10抗體及IL18bp用於比較。對於三種供體中之兩種，IL18及抗CD3刺激失敗且未偵測到IFN－γ。對於其餘供體，在低濃度下結果極易變，但可藉由添加包括人類化變異體之多種抗IL18抗體達成IL18誘導之IFN－γ產生的完全抑制。參見圖14。
亦用使得IL18產生且與IFNγ釋放相關之LPS刺激之人類PBMC進行實驗。IFNγ之產生係由LPS以濃度依賴性方式誘導且以1 μg/ml之固定濃度添加2C10親本單株抗體完全抑制此刺激，指示效應係經IL18介導且內源IL18可被中和(資料未圖示)。此亦可在全血中得到證實，但2C10之抑制效應儘管為劑量依賴性，但不太明顯(資料未圖示)。圖9說明自用3個獨立供體且用親本大鼠單株2C10、H1L2及IL18bp抑制之實驗的結果。供體1及供體3產生類似結果，而供體2展示用LPS刺激後，無IFNγ釋放(未圖示)。可在10%或25%人類血清存在下，藉由添加>1 μg/ml抗體或IL18bp完全抑制IL18介導之IFN釋放。已可在10 ng/ml及以上觀測到抑制且在10%或25%人類血清存在下，於表11中展示此抑制之IC50值。
7.6.3對IL18同源基因(Orthologue)之結合之概述 使用ELISA及Biacore亦及KG－1細胞生物檢定檢查抗體與來自其他物種之IL18的結合。起初使用恆河猴/獼猴IL18之親本2C10及嵌合2C10c執行此結合但用一些人類化變異體重複。使用Biacore及ELISA，測試親本2C10對豬、小鼠及大鼠IL18之結合且測試4種最佳人類化變異體對恆河猴/獼猴及犬IL18之結合。用恆河猴/獼猴IL18及三種單株抗體、2C10嵌合體及代表性人類化變異體H3L3進行KG－1生物檢定。考慮到所有人類化變異體之相似性，此很可能代表產生之其他變異體(包括H1L2)(參見表15，圖8)。
表15：綜述2C10親本大鼠MAb、大鼠－人類嵌合體2C10c及經選擇之4種人類化變異體池的同源基因結合
7.7 IL18抗體之圓二色性及熱變性研究 圓二色性(CD)研究用以研究作為溫度函數(尤其25℃至37℃)之IL18抗體的二級結構變化。進行此等同一抗體之熱變性研究以測定其熱穩定性及其熔融溫度(Tm)。
CD方法：在Applied Photophysics Chirascan質譜儀上以0.5 nm步階及1 nm頻寬自180 nm－280 nm掃描獲得CD光譜。每點之擷取時間為5 s。將樣品在PBS中稀釋成約0.2 mg/ml且置放於1 mm徑長(pathlength)之細胞中。用設定在4℃、25℃及37℃之恆溫槽獲得每一蛋白之光譜。樣品之實際溫度係藉由置放於細胞內之液體本體內之探針加以測定且在設定溫度之約3℃範圍內。
Tm方法：將所有蛋白在1：1000 Sypro orange於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液中稀釋成0.2 mg/ml。使用Bioneer Exicycler器具，以每0.5℃之間隔，在620 nm(在490 nm激發)下量測螢光發射，同時使樣品溫度自10℃勻變至95℃，在每一溫度點等待10 s。使用Grafit，將變性曲線擬合於標準熔融等溫線。
正如所料，所有四種抗體之CD光譜之形狀的比較展示其結構為高度β折疊(beta sheet)且具有基本上相同之結構。如由CD揭示，在4℃－37℃之溫度範圍中，三種抗體：H1L1 H1L2 H1L3在其二級結構上未展示顯著變化。然而，2C10抗體嵌合體在此溫度範圍中確實展示結構之輕微減小。此與在以下表16中給出之熱穩定性趨勢一致。
H1L1、H1L2及H1L3顯然在遠超過37℃時穩定，在體溫下無任何變性徵象。因此，其在熱穩定性方面之差異在正常體溫及環境溫度下，不可能給與任何差異優勢。
 序列
SEQ.I.D.NO：1 GYYFHSEQ.I.D.NO：2 RIDPEDDSTKYAERFKDSEQ.I.D.NO：3 WRIYRDSSGRPFYVMDASEQ.I.D.NO：4 LASEDIYTYLTSEQ.I.D.NO：5 GANKLQDSEQ.I.D.NO：6 LQGSKFPLTSEQ.I.D.NO：7 MAAEPVEDNCINFVAMKFIDNTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNEDSEQ.I.D.NO：8 ATGGCTGCTGAACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATGAAAACCTGGAATCAGATTACTTTGGCAAGCTTGAATCTAAATTATCAGTCATAAGAAATTTGAATGACCAAGTTCTCTTCATTGACCAAGGAAATCGGCCTCTATTTGAAGATATGACTGATTCTGACTGTAGAGATAATGCACCCCGGACCATATTTATTATAAGTATGTATAAAGATAGCCAGCCTAGAGGTATGGCTGTAACTATCTCTGTGAAGTGTGAGAAAATTTCAACTCTCTCCTGTGAGAACAAAATTATTTCCTTTAAGGAAATGAATCCTCCTGATAACATCAAGGATACAAAAAGTGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTCCCAGGACATGATAATAAGATGCAATTTGAATCTTCATCATACGAAGGATACTTTCTAGCTTGTGAAAAAGAGAGAGACCTTTTTAAACTCATTTTGAAAAAAGAGGATGAATTGGGGGATAGATCTATAATGTTCACTGTTCAAAACGAAGACTAGSEQ.I.D.NO：9 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ.I.D.NO：10 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGTAAGGTGTCCGGCGAGATCAGCACCGGCTACTACTTCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGACAGCACCAAGTACGCCGAGCGGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGAGGACACCAGCACCGATACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTACCACCTGGCGGATCTACAGAGACAGCAGCGGCAGACCCTTCTACGTGATGGATGCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGASEQ.I.D.NO：11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSSEQ.I.D.NO：12 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGTAAGGTGTCCGGCGAGATCAGCACCGGCTACTACTTCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACCCCGAGGACGACAGCACCAAGTACGCCGAGCGGTTCAAGGACAGGGTGACCATGACCGAGGACACCAGCACCGATACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTACCACCTGGCGGATCTACAGAGACAGCAGCGGCAGACCCTTCTACGTGATGGATGCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCSEQ.I.D.NO：13 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ.I.D.NO：14 GATATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCAGCGTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCTGGCCAGCGAGGACATCTACACCTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAACAAGCTGCAGGACGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCAGCAAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCSEQ.I.D.NO：15 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKSEQ.I.D.NO：16 GATATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCAGCGTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGCCTGGCCAGCGAGGACATCTACACCTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAACAAGCTGCAGGACGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGGCAGCAAGTTCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGSEQ.I.D.NO：17 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ.I.D.NO：18 CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTGGGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAASEQ.I.D.NO：19 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSSEQ.I.D.NO：20 CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTGGGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGAGGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQ.I.D.NO：21 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ.I.D.NO：22 CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTTTGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGCAGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAASEQ.I.D.NO：23 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSSEQ.I.D.NO：24 CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGAGAAATAAGTACTGGATACTATTTCCACTTTGTGCGACGAAGGCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGAGTCACCATGACCGCAGACACATCTACAGACACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCASEQ.I.D.NO：25 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ.I.D.NO：26 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTSEQ.I.D.NO：27 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKSEQ.I.D.NO：28 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAASEQ.I.D.NO：29 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDEGDYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ.I.D.NO：30 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGAAGGGGATTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGSEQ.I.D.NO：31 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDEGDYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKSEQ.I.D.NO：32 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGAAGGGGATTACTATTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAASEQ.I.D.NO：33 EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGEISTGYYFHFVRRRPGQGLEWIGRIDPEDDSTKYAERFKDRATLTAQTSSNTAYLNLSSLTSEDTATYFCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ.I.D.NO：34 GAGGTCCAGCTACAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGACCTGGGACCTCTGTGAAGTTATCTTGCAAAGTTTCTGGCGAAATAAGTACAGGATACTATTTCCACTTTGTGAGGCGAAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATAGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATAGTACTAAATATGCTGAGAGGTTCAAAGACAGGGCGACGCTCACTGCACAAACATCCTCCAACACAGCCTACCTGAACCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACACTGCAACTTATTTTTGTACCACATGGCGGATATACCGAGATAGTTCTGGCCGCCCCTTCTATGTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ.I.D.NO：35 DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEDIYTYLTWYQQKPGKSPQLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKISGIQPEDEGDYFCLQGSKFPLTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ.I.D.NO：36 GACATTCAAATGACCCAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCTCCATCGAATGTCTGGCAAGTGAGGACATATACACTTATTTAACATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAAATAAGTTGCAAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGCACACAGTATTCTCTCAAGATCAGCGGCATACAACCTGAAGATGAAGGGGATTATTTCTGTCTACAGGGTTCCAAGTTTCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ.I.D.NO：37 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT SEQ.I.D.NO：38 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP SEQ.I.D.NO：39 WGQGTLVTVSS SEQ.I.D.NO：40 FGQGTKLEIK
圖1展示溫度對H1L1及H1L2結合率(ka)之影響。
圖2展示溫度對脫離率(kd)之影響。
圖3展示溫度對平衡常數(KD)之影響。
圖4A－4C展示來自一個實驗之代表性資料，該實驗產生在表中說明之EC50值分級。
圖5展示四種經選擇人類化變異體結合於人類IL18之EC50值。
圖6展示四種經選擇人類化變異體結合於恆河猴IL18之EC50值。
圖7展示在50%滑液(SF)存在下，H1L2對hIL 18之結合。滴定於50%SF中之重組性人類IL18產生幾乎與滴定於緩衝液中之人類重組性IL－18相同之曲線，僅在半最大值方面具有輕微變化。
圖8展示在KG1檢定中抑制IL－18刺激之IFN－γ產生。
圖9A及9B展示於10%及25%自體血清中，人類PBMCS供體3中抑制LPS刺激之IFN－γ產生。
圖10展示2C10結合於hIL－18，hIL－18又由hIL－18BP捕捉，指示2C10及hIL－18BP之結合位點不重疊。
圖11展示所有九種人類化變異體在KG－1細胞中抑制人類IL18刺激之IFN－γ釋放之能力。
圖12展示在KG－1細胞中抑制IL－18刺激之INFg產生。
圖13展示具有95%信賴區間之每一單株抗體之IC50的總估計量。
圖14展示KG－1細胞中抑制人類IL－18刺激之INF－γ產生。
圖15展示KG－1細胞中抑制恆河猴IL－18刺激之INFg產生。
圖16展示使用嵌合2C10之人類IL－18結合ELISA。
圖17展示使用2C10嵌合抗體之恆河猴IL－18結合ELISA。
圖18A及圖18B展示人類化H1L2或2C10大鼠MAb結合於人類IL18捕捉結合之IL18bp的結果。
<110> 英商葛蘭素集團有限公司<120> 免疫球蛋白<130> PB61990 <140> 096118442 <141> 2007－05－23 <150> GB0611046.4 <151> 2006－06－05 <150> GB0610438.4 <151> 2006－05－25 <160> 40 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CDRH1 <400> 1<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CDRH2 <400> 2<210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> CDRH3 <400> 3<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CDRL1 <400> 4<210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CDRL2 <400> 5<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CDRL3 <400> 6<210> 7 <211> 193 <212> PRT <213> 智人<400> 7<210> 8 <211> 582 <212> DNA <213> 智人<400> 8 <210> 9 <211> 456 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> H1 <400> 9<210> 10 <211> 1371 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> H1 <400> 10<210> 11 <211> 126 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> H1可變區<400> 11<210> 12 <211> 378 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> H1可變區<400> 12 <210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> L2 <400> 13<210> 14 <211> 642 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> L2 <400> 14<210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> L2可變區<400> 15 <210> 16 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> L2可變區<400> 16<210> 17 <211> 456 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> H2 <400> 17 <210> 18 <211> 1368 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> H2 <400> 18<210> 19 <211> 126 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> H2可變區<400> 19 <210> 20 <211> 378 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> H2可變區<400> 20<210> 21 <211> 456 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> H3 <400> 21 <210> 22 <211> 1368 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> H3 <400> 22<210> 23 <211> 126 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> H3可變區<400> 23 <210> 24 <211> 378 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> H3可變區<400> 24<210> 25 <211> 214 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> L1 <400> 25<210> 26 <211> 642 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> L1 <400> 26 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> L1可變區<400> 27<210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> L1可變區<400> 28<210> 29 <211> 214 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> L3 <400> 29 <210> 30 <211> 645 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> L3 <400> 30<210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> L3可變區<400> 31<210> 32 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> L3可變區<400> 32<210> 33 <211> 456 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 2c10溝鼠、智人IgG1嵌合體<400> 33<210> 34 <211> 1368 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 2c10溝鼠、智人IgG1嵌合體<400> 34<210> 35 <211> 214 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 2c10溝鼠、智人C嵌合體<400> 35<210> 36 <211> 642 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 2c10溝鼠、智人C嵌合體<400> 36 <210> 37 <211> 98 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 重鏈受體構架<400> 37<210> 38 <211> 95 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 輕鏈受體構架<400> 38<210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> JH6序列<400> 39<210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> J序列<400> 40
(無元件符號說明)

Claims (18)

  1. 一種人類化抗介白素-18抗體，其包含如SEQ ID NO：11所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO：15所示之輕鏈可變區。
  2. 如請求項1之人類化抗介白素-18抗體，其包含如SEQ ID NO：9所示之重鏈及如SEQ ID NO：13所示之輕鏈。
  3. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1或2之抗介白素-18抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  4. 如請求項1或2之抗體，其係作為藥物。
  5. 如請求項4之抗體，其中該藥物係用於治療自體免疫疾病。
  6. 如請求項5之抗體，其中該自體免疫疾病係選自由下列所組成之群：多發性硬化症、關節炎疾病、1型糖尿病、發炎性腸道疾病(IBD)及牛皮癬。
  7. 如請求項6之抗體，其中該關節炎疾病係類風濕性關節炎。
  8. 一種如請求項1或2之抗體之用途，其係用於製備治療自體免疫疾病之藥物。
  9. 如請求項8之用途，其中該自體免疫疾病係選自由下列所組成之群：多發性硬化症、關節炎疾病、1型糖尿病、發炎性腸道疾病(IBD)及牛皮癬。
  10. 如請求項9之用途，其中該關節炎疾病係類風濕性關節炎。
  11. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1所界定之抗體重鏈可 變區及/或抗體輕鏈可變區。
  12. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項2所界定之抗體重鏈及/或抗體輕鏈。
  13. 一種載體，其編碼如請求項1或2之抗體之重鏈及/或輕鏈。
  14. 一種穩定轉型之宿主細胞，其包含如請求項10之載體。
  15. 一種穩定轉型之宿主細胞，其包含編碼如請求項1或2之抗體之輕鏈之第一載體及編碼如請求項1或2之抗體之重鏈之第二載體。
  16. 一種產生如請求項1或2之抗體之方法，該方法包含在容許表現該抗體之條件下，培養一種以編碼該抗體之載體轉型或轉染的宿主細胞。
  17. 如請求項16之方法，其中將編碼該抗體輕鏈及編碼該抗體重鏈之聚核苷酸插入同一載體，且引入該宿主細胞。
  18. 如請求項16之方法，其中將編碼該抗體輕鏈及編碼該抗體重鏈之聚核苷酸插入不同載體，且同時或依序引入相同宿主細胞。
TW096118442A 2006-05-25 2007-05-23 免疫球蛋白 TWI422387B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0610438A GB0610438D0 (en) 2006-05-25 2006-05-25 Immunoglobulins
GB0611046A GB0611046D0 (en) 2006-06-05 2006-06-05 Immunoglobulins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200808350A TW200808350A (en) 2008-02-16
TWI422387B true TWI422387B (zh) 2014-01-11

Family

ID=38476914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW096118442A TWI422387B (zh) 2006-05-25 2007-05-23 免疫球蛋白

Country Status (22)

Country Link
US (5) US8133978B2 (zh)
EP (1) EP2027157B1 (zh)
JP (1) JP5420399B2 (zh)
KR (1) KR101416078B1 (zh)
AR (1) AR061115A1 (zh)
AU (1) AU2007267213B2 (zh)
BR (1) BRPI0711908B8 (zh)
CA (1) CA2652733C (zh)
CR (1) CR10468A (zh)
EA (1) EA017303B1 (zh)
ES (1) ES2514495T3 (zh)
IL (1) IL194995A0 (zh)
MA (1) MA30486B1 (zh)
MX (1) MX2008014842A (zh)
MY (1) MY157173A (zh)
NO (1) NO341921B1 (zh)
NZ (1) NZ572565A (zh)
PE (1) PE20080262A1 (zh)
SG (1) SG172625A1 (zh)
TW (1) TWI422387B (zh)
WO (1) WO2007137984A2 (zh)
ZA (1) ZA200809662B (zh)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
EP4001409A1 (en) 2006-03-31 2022-05-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
WO2007137984A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Glaxo Group Limited Modified humanised anti-interleukin-18 antibodies
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
MX342551B (es) 2007-09-26 2016-10-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
NZ602884A (en) 2008-04-11 2014-08-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
CA2734358A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Glaxo Group Limited Treatment of an autoimmune disease using il-18 antagonists
EP2685238B1 (en) 2008-08-27 2018-06-13 F. Hoffmann-La Roche AG Method to screen high affinity antibody
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010040736A2 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against il18 and/or the il-18 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and/or disorders associated with il-18 mediated signaling
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
JP5787446B2 (ja) 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
AU2010288663B2 (en) 2009-08-25 2016-02-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Velocity factor
CA2788758A1 (en) * 2010-02-09 2011-08-18 Andrew Ian Bayliffe Treatment of a metabolic disorder
NZ603045A (en) * 2010-04-07 2014-11-28 Abbvie Inc Tnf-alpha binding proteins
LT2643352T (lt) * 2010-11-23 2018-08-10 Glaxo Group Limited Antigeną onkostatiną m (osm) surišantys baltymai
KR102385507B1 (ko) 2010-11-30 2022-04-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자
US20130149308A1 (en) * 2011-08-12 2013-06-13 Genentech, Inc. Antibodies to il-1beta and il-18, for treatment of disease
JOP20200308A1 (ar) 2012-09-07 2017-06-16 Novartis Ag جزيئات إرتباط il-18
EP2924117B1 (en) 2012-11-21 2019-08-14 KM Biologics Co., Ltd. Novel human antibody against il-18
US10259842B2 (en) * 2013-05-15 2019-04-16 Medimmune, Llc Purification of recombinantly produced polypeptides
JP6442404B2 (ja) 2013-06-11 2018-12-19 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 再発寛解型多発性硬化症（ｒｒｍｓ）患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法
JP6130983B2 (ja) 2015-02-27 2017-05-17 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６関連疾患治療用組成物
WO2016186154A1 (ja) 2015-05-19 2016-11-24 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 多発性硬化症（ｍｓ）患者の新規治療適用判断方法
WO2017076805A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Use of an inhibitor of il18 for treatment of acute kidney injury
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
KR20200074160A (ko) 2017-10-20 2020-06-24 가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠 항il-6 수용체 항체를 함유하는 수술 후의 유착을 억제하기 위한 의약 조성물
WO2021206766A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Children's Hospital Medical Center Sars-cov-2 infection biomarkers and uses thereof
US11324750B2 (en) 2020-04-09 2022-05-10 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection
EP3892280A3 (en) 2020-04-09 2022-01-12 Children's Hospital Medical Center Sars-cov-2 infection biomarkers and uses thereof
WO2023286694A1 (ja) 2021-07-13 2023-01-19 国立大学法人東海国立大学機構 炎症性腸疾患を治療するための医薬組成物
WO2023056193A2 (en) * 2021-09-29 2023-04-06 Chimera Bioengineering, Inc. Il-18 variants and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000056771A1 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Corporation Recombinant il-18 antagonists useful in treatment of il-18 mediated disorders
US20050147610A1 (en) * 2003-11-12 2005-07-07 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
WO1992019759A1 (en) * 1991-04-25 1992-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
ES2145004T3 (es) 1991-08-21 2000-07-01 Novartis Ag Derivados de anticuerpos.
GB9125979D0 (en) 1991-12-06 1992-02-05 Wellcome Found Antibody
GB9412230D0 (en) 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
US6048972A (en) * 1994-07-13 2000-04-11 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant materials for producing humanized anti-IL-8 antibodies
EP0692536B1 (en) 1994-07-14 2000-11-22 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo IFN-Y production inducing protein and monoclonal antibody of the same
TW581771B (en) 1994-11-15 2004-04-01 Hayashibara Biochem Lab Recombinant production of a polypeptide for inducing interferon-gamma production, and monoclonal antibody against the polypeptide
JP2952750B2 (ja) * 1995-02-23 1999-09-27 株式会社林原生物化学研究所 モノクローナル抗体
AU740738B2 (en) * 1997-04-07 2001-11-15 Genentech Inc. Humanized antibodies and methods for forming humanized antibodies
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
CA2276216A1 (en) 1998-06-24 1999-12-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18
WO2001058956A2 (en) * 2000-02-10 2001-08-16 Abbott Laboratories Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using
CN1322897C (zh) 2000-02-21 2007-06-27 应用研究系统Ars股份公司 Il－18抑制剂的应用
US20020025317A1 (en) 2000-07-20 2002-02-28 Schering Ag Bispecific monoclonal antibodies to IL-12 and IL-18
WO2002030986A2 (en) * 2000-10-13 2002-04-18 Biogen, Inc. HUMANIZED ANTI-LT-β-R ANTIBODIES
WO2002032374A2 (en) 2000-10-18 2002-04-25 Immunex Corporation Methods for treating il-18 mediated disorders
WO2002066063A1 (fr) 2001-02-23 2002-08-29 Nippon Organon K.K. Traitements de maladies osseuses metaboliques
CN1671416B (zh) 2001-07-12 2013-01-02 杰斐逊·富特 超人源化抗体
UA78516C2 (en) 2001-08-10 2007-04-10 Applied Research Systems Use of inhibitors of il-18 for treatment and/or prevention of hypersensitivity disorders, and in particular of delayed-type hypersensitivity
CA2523912A1 (en) 2003-04-30 2004-11-11 Japan Science And Technology Agency Human antihuman interleukin-18 antibody, fragment thereof and method of using the same
US20050100965A1 (en) * 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
AU2005229457B2 (en) 2004-03-30 2010-11-25 Glaxo Group Limited Immunoglobulins
GB0425556D0 (en) 2004-11-19 2004-12-22 Glaxo Group Ltd Novel compounds
GB0600488D0 (en) 2006-01-11 2006-02-22 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
EP1987066B1 (en) 2006-02-22 2010-12-29 University of Zürich Methods for treating demyelinating diseases
WO2007137984A2 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 Glaxo Group Limited Modified humanised anti-interleukin-18 antibodies
CA2734358A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 Glaxo Group Limited Treatment of an autoimmune disease using il-18 antagonists

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000056771A1 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Corporation Recombinant il-18 antagonists useful in treatment of il-18 mediated disorders
US20050147610A1 (en) * 2003-11-12 2005-07-07 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1999年11月05日，Chen Y., et al.," Selection and Analysis of an Optimized Anti-VEGF Antibody: Crystal Structure of an Affinity-matured Fab in Complex with Antigen", J. Mol. Biol., 1999, Vol.293, P.865-881. *
NCBI GenBank: AAZ09147.1 *
NCBI GenBank:AAP44376 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP5420399B2 (ja) 2014-02-19
US8637018B2 (en) 2014-01-28
EA200802182A1 (ru) 2009-06-30
US10703814B2 (en) 2020-07-07
BRPI0711908B8 (pt) 2021-05-25
US9499617B2 (en) 2016-11-22
KR101416078B1 (ko) 2014-07-07
WO2007137984A2 (en) 2007-12-06
US20070292432A1 (en) 2007-12-20
MX2008014842A (es) 2009-02-17
MY157173A (en) 2016-05-13
KR20090023625A (ko) 2009-03-05
EP2027157B1 (en) 2014-08-06
US20140105894A1 (en) 2014-04-17
ZA200809662B (en) 2014-05-28
EP2027157A2 (en) 2009-02-25
MA30486B1 (fr) 2009-06-01
SG172625A1 (en) 2011-07-28
TW200808350A (en) 2008-02-16
IL194995A0 (en) 2011-08-01
US20190031753A1 (en) 2019-01-31
BRPI0711908B1 (pt) 2020-08-04
NO20084650L (no) 2008-12-19
US20170029497A1 (en) 2017-02-02
CR10468A (es) 2009-01-09
JP2009537608A (ja) 2009-10-29
WO2007137984A3 (en) 2008-01-24
PE20080262A1 (es) 2008-04-30
AU2007267213B2 (en) 2012-03-29
AR061115A1 (es) 2008-08-06
NZ572565A (en) 2011-04-29
US20120100137A1 (en) 2012-04-26
EA017303B1 (ru) 2012-11-30
NO341921B1 (no) 2018-02-19
AU2007267213A1 (en) 2007-12-06
CA2652733C (en) 2016-06-21
BRPI0711908A2 (pt) 2012-01-03
CA2652733A1 (en) 2007-12-06
ES2514495T3 (es) 2014-10-28
US8133978B2 (en) 2012-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI422387B (zh) 免疫球蛋白
US20210017270A1 (en) Antigen binding proteins to oncostatin m (osm)
CN101454343B (zh) 修饰的人源化的抗-干扰素-18抗体

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees