BRPI0711908A2

BRPI0711908A2 - anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, composiÇço farmacÊutica, uso de um anticorpo anti-interleucina 18, e, mÉtodos de tratamento de um paciente humano afetado com uma doenÇa auto-imune, de produÇço de um anticorpo e de seleÇço de um anticorpo

Info

Publication number: BRPI0711908A2
Application number: BRPI0711908-9A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Henry Ellis; Volker Germaschewski; Paul Andrew Hamblin; Ian Kirby
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2007-05-23
Publication date: 2012-01-03
Also published as: WO2007137984A2; SG172625A1; JP2009537608A; NO341921B1; NO20084650L; BRPI0711908B8; KR20090023625A; CA2652733C; EA200802182A1; US8637018B2; US9499617B2; MX2008014842A; MY157173A; IL194995A0; EP2027157A2; KR101416078B1; US20140105894A1; EA017303B1; JP5420399B2; ZA200809662B

Abstract

ANTICORPO ANTI-INTERLEUCINA- 18 HUMANIZADO, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA, USO DE UM ANTICORPO ANTI-INTERLEUCINA 18, E, MÉTODOS DE TRATAMENTO DE UM PACIENTE HUMANO AFETADO COM UMA DOENÇA AUTO-IMUNE, DE PRODUÇçO DE UM ANTICORPO E DE SELEÇçO DE UM ANTICORPO A presente invenção descreve anticorpos anti-IL- 18 humanizados, métodos de fabricação e métodos de tratamento com referidos anticorpos. Ainda são descritos os métodos de triagem usando, por exemplo, ressonância de plasmon de superficie para identificar anticorpos com potencial terapêutico.

Description

"ANTICORPO ANTI-INTERLEUCINA-18 HUMANIZADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM ANTICORPO ANTI- INTERLEUCINA 18, E, MÉTODOS DE TRATAMENTO DE UM PACIENTE HUMANO AFETADO COM UMA DOENÇA AUTO-IMUNE, DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO E DE SELEÇÃO DE UM ANTICORPO"

1. CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se geralmente ao campo de imunoglobulinas como anticorpos e particularmente a anticorpos humanizados, utilizáveis no tratamento e diagnóstico de condições mediadas por interleucina-18 humana.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A interleucina-18 amam (hIL-18) é uma citocina que é sintetizada como uma proteína precursora de 193 aminoácidos biologicamente inativa (Ushio et ai., J. Immunol. 156:4274, 1996). Clivagem da proteína precursora, por exemplo por caspase-1 ou caspase-4 libera a proteína madura de 156 aminoácidos (Gu et al., Science 275:206, 1997; Ghayur et al., Nature 386:619, 1997), que demonstra atividades biológicas que incluem o co- estímulo de proliferação de células T, a melhora de citotoxicidade de células NK, a indução de produção de IFN-γ por células T e células NK, e a potenciação de diferenciação de tipo 1 auxiliar T (Thl) (Okamura et al., Nature 378:88, 1995; Ushio et al., J. Immunol. 156:4274, 1996; Micallefet al., Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Kohno et al., J. Immunol. 158:1541, 1997; Zhang et al., Infect. Immunol.65:3594, 1997; Robinson et al., Immunity 7:571, 1997). Além disso, IL-18 é um indutor eficaz de mediadores pró- inflamatórios de monócitos humanos, incluindo IL-8, um fator α de necrose de tumor (TNF-α) e prostaglandina E 2 (PGE 2) (Ushio, S. et al., J. Immunol. 156:4274-4279, 1996; Puren, A. J. et al., J. Clin. Invest. 10:711-721, 1997; Podolin et al., J. Immunol. apresentado, 1999). A proteína relacionada com receptor IL-1 previamente clonada (IL-1 Rrp) (Parnet et ai., J. Biol. Chem. 271:3967, 1996) foi identificada como uma subunidade do receptor de IL-18 (Kd= 18 nM) (Torigoe et al., J. Biol. Chem. 272:25737, 1997). Uma segunda subunidade do receptor de IL-18 demonstra homologia para a proteína acessória do receptor de IL-I e foi chamada AcPL (para tipo de proteína acessória). A expressão de tanto IL-I RrP e AcPL são requeridas para a ativação de NF-κΒ e JNK induzida por IL- 18 (Born et al., J. Biol. Chem. 273:29445, 1998). Além de NF-κΒ e JNK, os sinais de IL-18 através da quinase associada com receptor de IL-I (IRAK), p561ck (LCK), e proteína quinase ativada por mitogenes (MAPK) (Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Matsumoto et al., Biophys Biochem. Res. Comm. 234:454, 1997; Tsuji- Takayama et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237:126, 1997).

As células THl que produzem citocinas pró-inflamatórias como IFN-γ, IL-2 e TNF-β (Mosmann et al., J. Immunol. 136:2348, 1986), foram implicadas na mediação de muitas doenças auto-imunes, incluindo esclerose múltipla (MS), artrite reumatóide (RA), diabetes tipo 1 ou dependente de insulina, (IDDM), doença inflamatória intestinal (IBD), e psoríase (Mosmann e Sad, Immunol. Today 17:138, 1996). Assim, antagonismo de uma citocina promotora de THl como IL-18 deve ser esperado para inibir o desenvolvimento da doença. Os mAbs específicos de IL-1 podem ser usados como um antagonista.

O papel de IL-18 no desenvolvimento de doenças auto-imunes foi demonstrado. Conseqüentemente, foi demonstrado que a expressão de IL- 18 é significantemente aumentada no pâncreas e baço de camundongos diabéticos mono obesos (NOD) imediatamente antes do início da doença (Rothe et al., J. Clin. Invest. 99:469, 1997). Similarmente, os níveis de IL-18 tem mostrado ser marcadamente elevados no fluido sinovial de pacientes com artrite reumatóide (Kawashima et al., Arthritis and Rheumatism 39:598, 1996). Além disso, foi demonstrado que a administração de IL-18 aumenta a severidade clínica de encefalomielite alérgica experimental de murinos (EAE), uma doença auto-imune mediada por Th 1, que é um modelo para esclerose múltipla. Além disso, foi mostrado que a neutralização de anti-soro de IL_18 anti-rato evita o desenvolvimento de EAE em ratos Lewis fêmeas (Wildbaum et al., J. Immunol. 161:6368, 1998). Conseqüentemente, L-18 é um alvo desejável para o desenvolvimento de uma nova terapêutica para autoimunidade.

Taniguchi et al., J. Immunol. Methods 206:107, descrevem anticorpos monoclonais IL-18 anti-humano sete de murinos e seis de ratos de (mAbs) que ligam a quatro sítios antigênicos distintos. Um dos mAbs de murinos (#125-21-1), e os mAbs dos sis ratos inibem a produção de IFN-γ induzida por IL-18 por células KG-1, com os mAbs de ratos demonstrando atividades neutralizantes 10 vezes menores do que de #125-2H. Como demonstrado por análise de Western blot, três dos mAbs de murinos, mas nenhum dos mAbs de ratos, são fortemente reativos com IL-18 humano ligado a membrana. Além disso, um teste de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para detectar IL-18 humano é descrito, usando g #125-2H e um mAb de rato. O limite de detecção deste ELISA é 10 pg/ml.

O pedido de patente européia EP 0 712 931 descreve dois mAbs IL-18 anti-humano de camundongo, Hl (IgGl) e H2 (IgM). Como demonstrado por análise Western blot, ambos mAbs reagem com IL-18 humano ligado a membrana, mas não com IL-12 humano ligado a membrana. HI é usado em um protocolo de cromatografia de imuno-afinidade para purificar IL-18 humano, e em um ELISA para medir IL-18 humano. H2 é usado em um radioimunoteste para medir IL-18 humano.

A neutralização de anticorpos IL-18 pode ser potencialmente utilizável para aliviar doenças auto-imunes e sintomas relacionados em homens. Assim, existe a necessidade na técnica para um antagonista de IL-18 de alta afinidade, como um anticorpo monoclonal neutralizante para interleucina 18 humana, que iria reduzir a diferenciação e proliferação de células Thl e, assim, doenças auto-imunes e sintomas relacionados.

Todas as referências mencionadas em todo o relatório são expressamente e completamente incorporadas aqui por referência.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, provê-se um anticorpo anti-interleucina-18 humanizado compreendendo uma cadeia pesada e cadeia leve tendo as seguintes regiões de determinação de complementaridade (CDRs):

CDRHl :SEQ.I.D.NO:l CDRH2:SEQ.I.D.NO:2 CDRH3 :SEQ.I.D.NO:3 CDRLl :SEQ.I.D.NO:4 CDRL2:SEQ.I.D.NO:5 CDRL3 :SEQ.I.D.NO:6

De acordo com a presente invenção, provê-se um anticorpo anti-interleucina-18 humanizado compreendendo uma cadeia pesada e cadeia leve tendo as seguintes CDRs:

CDRHl :SEQ.I.D.NO:l CDRH2:SEQ.I.D.NO:2 CDRH3:SEQ.I.D.NO:3 CDRLl :SEQ.I.D.NO:4 CDRL2:SEQ.I.D.NO:5 CDRL3 :SEQ.I.D.NO:6

em que o resíduo na posição 71 da cadeia leve é substituído pelo resíduo correspondente encontrado no anticorpo doador do qual os CDRs são derivados.

Será evidente para os versados na técnica, que o termo "derivado" se destina a definir não somente a fonte no sentido de ser a origem "física" para o material, mas também para definir o material que é estruturalmente idêntico ao material que não se origina da fonte de referência. Assim, o resíduo correspondente "encontrado na armação do anticorpo doador do qual os CDRs são derivados" não precisa necessariamente ser purificado a partir da armação do anticorpo doador. Similarmente, CDRs "derivados de um anticorpo doador" não precisam necessariamente ser purificados de um anticorpo doador.

CDRs e regiões de armação (FR) e numeração de aminoácidos seguem, salvo especificado em contrário a definição de Kabat como especificado em Kabat et al "Seqüences de immunological interest", NIH.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador enxertado sobre uma armação de aceitador humano cujo anticorpo anti-interleucina 18 compreende CDRs tendo seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 em que o resíduo na posição 71 da cadeia leve de referido anticorpo anti-interleucina 18 é idêntico ao resíduo encontrado na posição correspondente em uma armação do anticorpo doador.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo CDRs especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 cujo anticorpo compreende uma tirosina na posição 71 da cadeia leve.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo uma cadeia pesada tendo CDRs especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 e uma cadeia leve tendo CDRs especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 em que referidos CDRs de cadeia leve são derivados de um anticorpo doador tendo uma tirosina na posição 71 da cadeia leve do anticorpo doador.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo CDRs de um anticorpo doador e uma tirosina na posição 71 da cadeia leve de referido anticorpo humanizado em que o anticorpo doador é 2C10 ou uma variante de armação do mesmo (isto é o anticorpo humanizado compreende os mesmos CDRs mas uma armação diferente como 2C10, ver patente US 6.706.487).

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo;

(a) uma cadeia pesada tendo CDRs com as seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana e

(b) uma cadeia leve tendo CDRs com as seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve humana em que referida armação de aceitador de cadeia leve humana compreende regiões de armação derivadas de SEQ.I.D.NO: 38 em que posição 71 de SEQ. I. D. NO: 38 é uma tirosina.

Em outro aspecto da presente invenção provê-se um anticorpo anti-interleucina-18 humanizado compreendendo;

(a) uma cadeia pesada tendo CDRs permissivos de ligação específica a IL-18 humano;

(b) uma cadeia leve compreendendo uma armação de aceitador e tendo CDRs com as seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 4, 5 e 6 e tendo um resíduo de tirosina na posição 71.

As CDRs da cadeia leve estão preferivelmente localizadas nas posições dentro da armação de aceitador que correspondem às posições respectivas das seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 4, 5 e 6 dentro da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:35. A cadeia leve e/ou a cadeia pesada é preferivelmente não imunogênica em um paciente humano.

Em outro aspecto da presente invenção provê-se um anticorpo anti-interleucina-18 humanizado compreendendo; (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs tendo seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2 e 3, e

(b) uma cadeia leve compreendendo CDRs tendo seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve humana em que referida armação de aceitador de cadeia leve de referido anticorpo anti-interleucina-18 humanizado compreende regiões de armação derivadas de uma variante da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:38 em que referida variante compreende uma tirosina na posição 71 e em que referida variante compreende 75% ou identidade maior para a armação tendo a seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 38. Preferivelmente referida variante compreende 80% ou mais, por exemplo 81 %, 82%, 83%, 84%, mais preferivelmente 85% ou mais, por exemplo 86%,87%,88%,89%, ainda mais preferivelmente 90% ou mais, por exemplo 91 %, 92%, 93%, 94%, o mais preferivelmente 95% ou mais, por exemplo 96%, 97%, 98%, 99% identidade para a armação especificada em SEQ.I.D.NO:38.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado cujos anticorpos compreendem;

(a) CDRs especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 derivadas de um anticorpo doador cujo anticorpo doador compreende uma tirosina na posição 71 da cadeia leve do anticorpo doador;

(b) uma armação de aceitador humano cuja armação de aceitador compreende uma fenilalanina na posição 71 da cadeia leve humana;

em que o anticorpo anti-interleucina 18 compreende uma tirosina na posição 71 da cadeia leve.

(a) CDRs especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 derivadas de um anticorpo doador cujo anticorpo doador compreende um aminoácido aromático na posição 71 da cadeia leve do anticorpo doador;

(b) a armação de aceitador humano cuja armação de aceitador compreende na posição 71 da armação de aceitador de cadeia leve um tipo diferente de aminoácido aromático do aminoácido aromático na parte (a);

em que o anticorpo anti-interleucina 18 compreende uma cadeia leve tendo na posição 71 um aminoácido aromático derivado de um anticorpo de parte (a).

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado cujo anticorpo exibe uma constante de equilíbrio (KD) de 3OOpM ou menos com relação a ligação de IL-18 humano quando medida por ressonância de plasmon de superfície (por exemplo Biacore™, preferivelmente usando um instrumento Biacore™ 3000 e condições como especificado em 7.4.1 abaixo) a 37 C.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado cujo anticorpo compreende CDRs como especificado em SEQ.I.D.NO:l, 2, 3, 4, 5 e 6 e exibe uma constante de equilíbrio (KD) de 300pM ou menos com relação à ligação de IL-18 humano quando medida por ressonância de plasmon de superfície (preferivelmente usando um instrumento Biacore™ 3000 e condições como especificado em 7.4.1 abaixo) a 37°C.

Preferivelmente a constante de equilíbrio (KD) do anticorpo com relação à ligação de IL-18 humano quando medida por ressonância de plasmon de superfície (preferivelmente usando um instrumento Biacore™ TlOO e condições como especificado em 7.4.2 abaixo) a 37°C é menor do que 90pM. Mais preferivelmente, a constante de equilíbrio é 70pM ou menor e ainda mais preferivelmente, 65pM, 60pM, 55pM, ou 50pM ou menos.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado cujo anticorpo exibe uma taxa de dissociação ou constante de dissociação (kd) de 0,0002 l/s ou mais com relação à ligação de IL-18 humano quando medida por ressonância de plasmon de superfície (por exemplo Biacore™, preferivelmente usando um Biacore™ T100 instrumento e condições como especificado em 7.4.2 abaixo) a 37°C.

(a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador, cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada cuja armação de aceitador de cadeia pesada compreende regiões de armação derivadas de seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 37 em que um ou mais resíduo/s de posição/s 27, 28, 29, 93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 de uma cadeia pesada é idêntico ao resíduo correspondente em uma cadeia pesada de anticorpo doador;

(b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 38, em que posição 71 e opcionalmente um ou mais (por exemplo todos) resíduo/s de posição/s 45, 83, 84, 85 da cadeia leve são idênticos ao resíduo correspondente em uma cadeia leve de anticorpo doador.

(a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, 93 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador; (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO:4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:38 em que resíduo na posição 71 da cadeia leve de referido anticorpo anti-interleucina 18 é idêntico aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

(a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, 39, 40, 93 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador;

(b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 38 em que resíduo na posição 71 da cadeia leve são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

(a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, 36, 39, 40, 71, 89, 91, 93 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador;

(b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 38 em que resíduo na posição 71 da cadeia leve são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

(a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, 93 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador;

(b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 38 em que resíduos nas posições 71, 45, 83, 84, 85 da cadeia leve são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo; (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, 93, 39, 40 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador;

(a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, 93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador;

Em outro aspecto da invenção, provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que uma relação entre constante de dissociação (kd) de referido anticorpo da ligação a IL-18 humano a 25°C para constante de dissociação (kd) de referido anticorpo da ligação a IL-18 humano a 37°C é 1:5 ou menor, e em que referido anticorpo compreende CDRs derivadas de um anticorpo doador e a armação de aceitador humano, e em que um resíduo na posição 71 da cadeia leve da armação de aceitador humano é substituído pelo resíduo correspondente do anticorpo doador. A constante de dissociação é preferivelmente medida usando um instrumento Biacore™ TlOO e condições como especificado em 7.4.2 abaixo.

Em outro aspecto da invenção provê-se um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo uma cadeia pesada selecionada dentre o grupo consistindo de: SEQ.I.D.NO: 9, SEQ.I.D.NO: 17, SEQ.I.D.NO: 21; e uma cadeia leve selecionada dentre o grupo consistindo de: SEQ.I.D.NO: 13, SEQ.I.D.NO: 29.

Em particular, a invenção provê um anticorpo anti- interleucina-18 humanizado compreendendo uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO: 9 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 13 ou uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO: 9 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 29.

A invenção também provê um anticorpo anti-interleucina-18 humanizado compreendendo uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO: 17 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 13 ou uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO: 17 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 29.

A invenção também provê um anticorpo anti-interleucina-18 humanizado compreendendo uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO: 21 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 13 ou uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO: 21 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 29.

Em outro aspecto da invenção provê-se uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-interleucina 18 como acima descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável..

Em outro aspecto da invenção provê-se um método de seleção de um anticorpo (particularmente um anticorpo que inibe a interação entre um ligando e um receptor como um anticorpo anti-interleucina 18) para uso terapêutico cujo método compreende:

(a) medir a afinidade de ligação (usando por exemplo ressonância de plasmon de superfície, como Biacore™) do anticorpo para um antígeno ao qual o anticorpo especificamente liga a uma temperatura entre 30 a 45°C(preferivelmente 37°C);

(b) medir a afinidade de ligação (usando por exemplo ressonância de plasmon de superfície como Biacore™) do anticorpo para um antígeno ao qual o anticorpo especificamente liga a uma temperatura entre 20 a 25°C (preferivelmente 25°C);

(c) selecionar referido anticorpo para uso terapêutico se a afinidade de (a) for maior do que a afinidade de (b), preferivelmente se referida afinidade de (a) for 2 vezes ou mais, mais preferivelmente 4 vezes ou mais, do que a afinidade de etapa (b).

(a) medir a constante de dissociação (usando por exemplo ressonância de plasmon de superfície como Biacore™) do anticorpo a partir do antígeno ao qual o anticorpo especificamente liga, a uma temperatura entre a 45°C(preferivelmente 37°C);

(b) medir a constante de dissociação (usando por exemplo ressonância de plasmon de superfície como Biacore™) do anticorpo a partir do antígeno ao qual o anticorpo especificamente liga a uma temperatura entre 20 a 25°C (preferivelmente 25°C);

(c) selecionar referido anticorpo para uso terapêutico se a constante de dissociação de (a) for mais lenta do que a constante de dissociação de (b).

O termo "anti-interleucina-18" como tal refere-se a anticorpos da invenção significa que tais anticorpos são capazes de neutralizar a atividade biológica de interleucina-18 humana. Ele não exclui no entanto que tais anticorpos pode também além disso neutralizar a atividade biológica de interleucina-18 de primata não humano (por exemplo rhesus e/ou cinomolgo).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção será agora ainda descrita com referência às figuras, em que

Figura 1 mostra o efeito de temperatura sobre a constante de associação (ka) de H1 L1 e H1 L2;

Figura 2 mostra o efeito de temperatura sobre a constante de dissociação (kd);

Figura 3 mostra o efeito de temperatura em uma constante de equilíbrio (KD);

Figuras 4A-4C mostram dados representativos de um experimento que geraram os valores de EC50 ilustrados em tabela 7;

Figura 5 mostra valores de EC50 de quatro variantes humanizadas selecionadas ligando a IL18 humano;

Figura 6 mostra valores de EC50 de quatro variantes humanizadas selecionadas ligando a IL18 rhesus;

Figura 7 mostra ligação de Hl L2 a IL18 humano na presença de 50% fluido sinovial;

Figura 8 mostra a inibição de produção de IFN-γ estimulada por IL18 em um teste KG1;

Figura 9A e 9B mostram a inibição de produção de IFN-γ estimulada por LPS em um doador de PBMCS humano em um soro autólogo a 10% e 25%, respectivamente;

Figura 10 mostra ligação de 2C10 a hIL18 capturado por hIL18BP;

Figura 11 mostra a capacidade de nove variantes humanizadas para inibir a liberação de IFN-γ estimulada por IL18 humano em células KG1;

Figura 12 mostra inibição de produção de IFN-γ estimulada por IL-18 pelas variantes Hl e 2C10 em células KG1;

Figura 13 mostra os dados de IC50 para as variantes de Hl com um intervalo de confiança de 95%;

Figura 14 mostra inibição de produção de IFN-γ estimulada por IL-18 humano em células KGl;

Figura 15 mostra inibição de produção de IFN-γ estimulada por IL-18 rhesus em células KG1;

Figura 16 mostra os resultados de um ELISA de ligação a IL- 18 humano usando 2C10 quimérico;

Figura 17 mostra os resultados de um ELISA de ligação a IL- 18 rhesus usando 2C10 quimérico e

Figuras 18A e 18B mostram os resultados de ELISAs de ligação usando H1L2 e 2C10 respectivamente, ligando a IL-18BP ligado a IL- 18 humano.

4. ANTICORPOS HUMANIZADOS

O uso de anticorpos não humanos intactos no tratamento de doenças ou distúrbios humanos carrega consigo os problemas agora bem estabelecidos de imunogenicidade em potencial, especialmente quando da administração repetida do anticorpo. Isto é, o sistema imune do paciente pode reconhecer o anticorpo intacto não humano como não-próprio e montar uma resposta neutralizante. Além de desenvolver anticorpos completamente humanos (ver acima), várias técnicas foram desenvolvidas com o passar dos anos para superar estes problemas e geralmente envolvem reduzir a composição de seqüências de aminoácidos não humanos no anticorpo terapêutico intacto enquanto retendo a facilidade relativa na obtenção de anticorpos não humanos de um animal imunizado, por exemplo camundongo, rato ou coelho. Amplamente, duas abordagens tem sido usadas para alcançar isto. A primeira inclui anticorpos quiméricos, que geralmente compreendem um domínio variável não humano (por exemplo roedor como camundongo) fundido a uma região constante humana,, ver Morrison (1984), PNAS, 81, 6851. Porque o sítio de ligação ao antígeno de uma anticorpo está localizado dentro das regiões variáveis, o anticorpo quimérico retém sua afinidade de ligação para o antígeno mas adquire as funções de efetuador da região constante humana e é assim capaz de realizar funções de efetuador como descrito supra. Os anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos usando métodos de DNA recombinantes. DNA codificando os anticorpos (por exemplo cDNA) é isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de ligar especificamente a genes codificando as cadeias H e L do anticorpo da invenção, por exemplo DNA codificando SEQ. I. D. NO 1, 2, 3, 4, 5 e 6 descritas supra). As células de hibridoma servem como uma fonte típica deste DNA. Se for desejado expressar o anticorpo quimérico, os cDNAs isolados codificando as regiões variáveis maduras completas das cadeias leves e pesadas são inseridos no quadro em vetores de expressão apropriados, que contém, inter alia, regiões constantes de imunoglobulina apropriadas, geralmente de origem humana, junto com seqüências de sinal, códons de parada, promotores, terminadores, e outros elementos como necessário para obter expressão do anticorpo. Estes vetores são então transfectados em células hospedeiras como E. coli, células COS, células CHO, ou células de mieloma, que não produzem de outra forma proteína de imunoglobulina para obter síntese do anticorpo. O DNA pode ser modificado por substituição da seqüência de codificação para cadeias LeH humanas para as regiões constantes HeL não humanas correspondentes (por exemplo murinos), ver, por exemplo Morrison, PNAS 81, 6851 (1984).

A segunda abordagem envolve a geração de anticorpos humanizados em que o teor não humano do anticorpo é reduzido por humanização das regiões variáveis. Duas técnicas para humanização ganharam popularidade. A primeira é a humanização por enxerto de CDR. Os CDRs constroem laços próximos do N-término do anticorpo onde eles formam uma superfície montada em um andaime provido pelas regiões de armação. A especificidade de ligação a antígeno do anticorpo é principalmente definida pela topografia e por características químicas de sua superfície de CDR. Estes aspectos são, por sua vez, determinados pela conformação de CDRs individuais, pela disposição relativa das CDRs, e pela natureza e disposição das cadeias laterais dos resíduos compreendendo as CDRS. Uma grande diminuição em imunogenicidade pode ser obtida por enxerto somente das CDRs de anticorpos não humanos (por exemplo murinos) (anticorpos "doadores") sobre uma armação humana apropriada ("armação de aceitador") e regiões constantes (ver Jones et al (1986) Nature 321, 522-525 e Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536). No entanto, o enxerto de CDR per se pode não resultar na retenção completa de propriedades de ligação a antígeno e é com freqüência verificado que alguns resíduos de armação do anticorpo doador não precisam ser conservados (às vezes referidos como "retro-mutações") na molécula humanizada se uma afinidade de ligação a afinidade significante for recuperada (ver Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502). Neste caso, as regiões V humanas mostrando a maior homologia de seqüência (tipicamente 60% ou mais) para o anticorpo de doador não humano podem ser selecionadas de uma base de dados a fim de prover a armação humana (FR).

A seleção de FRs humanos pode ser feita ou de anticorpos humanos individuais ou consenso humano. Onde necessário, os resíduos chave do anticorpo doador são substituídos na armação de aceitador humano para preservar conformações de CDR. A modelagem em computador de anticorpo pode ser usada para ajudar a identificar estes resíduos estruturalmente importantes, ver W099/48523.

Alternativamente, humanização pode ser obtida por um processo chamado "veneering". Uma análise estatística de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana e murino singulares revelou que os padrões precisos de resíduos expostos são diferentes em anticorpos humanos e murinos, e a maior parte das posições de superfície individuais tem uma preferência forte para um número pequeno de diferentes resíduos (ver Padlan E.A. et al; (1991) Mollmmunol. 28, 489-498 e Pedersen JT. et al (1994) J. MoI. Biol. 235; 959-973). Assim, é possível reduzir a imunogenicidade de um Fv não humano por substituição de resíduos expostos em suas regiões de armação que diferem das geralmente encontradas em anticorpos humanos. Porque a antigenicidade de proteína pode estar correlacionada com acessibilidade à superfície, a substituição dos resíduos de superfície pode ser suficiente para tornar a região variável de camundongo "invisível" para o sistema imune humano (ver também Mark G. E. et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, ppl05-134). Este procedimento de humanização é referido como um "veneering" porque somente a superfície do anticorpo é alterada, os resíduos de suporte permanecendo não afetados. Outras abordagens alternativas incluem as especificadas em W004/006955 e o processo de Humaneering™ (Kalobios), que faz uso de sistemas de expressão bacteriana e produz anticorpos que estão próximo da linhagem germinal humana em seqüência (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, Janeiro 2007, San Diego, Califórnia). Outra, abordagem recente para a humanização envolve a seleção de armações de aceitador humano com base em similaridade estrutural das regiões de CDR humana para as das regiões de CDR de anticorpo de camundongo doador em vez de em homologia entre outras regiões do anticorpo como as regiões de armação.

Este processo é também conhecido como Superhumanisation™ (Evogenix Inc.; Hwang et al (2005) Methods 36:35-42).

Assim, a presente invenção refere-se a anticorpos humanizados como especificado em seção 3 acima. Estes anticorpos humanizados preferivelmente compreendem uma região constante humana de um isótopo de IgG, como IgGI ou lgG4.

Em formas de realização alternativas, as regiões variáveis humanizadas como especificadas na seção 3 acima podem ser fundidas com uma região constante não humana ("quimera reversa") como um primata, rato, murino ou coelho não humano).

Será evidente para os versados na técnica que as armações de aceitador especificadas em SEQ. I. D. NO: 37 e 38 constituem aminoácidos de imunoglobulina codificados por um gene VH e Vkappa, respectivamente. Como tal, eles compreendem as regiões de armação e as CDRs do anticorpo do aceitador. Está de acordo com o conhecimento do versado substituir as CDRs do anticorpo do aceitador com as CDRs do doador, especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 e associar as seqüências resultantes com 4 seqüências de armação apropriadas, como as especificadas em SEQ. I. D. NO: 39 e SEQ. I. D. NO: 40, de modo a produzir uma região variável de imunoglobulina completa, como especificado em SEQ. I. D. NO: lie SEQ. I.

D. NO: 15.

4.1. Outras Modificações

A interação entre a região Fc de um anticorpo e vários receptores de FC (FcyR) media, como se acredita, as funções de efetuador do anticorpo que incluem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fixação de complemento, fagocitose e meia-vida/ depuração do anticorpo. Várias modificações para a região Fc de anticorpos da invenção podem ser realizadas dependendo da propriedade do efetuador desejada. Por exemplo, mutações específicas na região Fc para tornar um anticorpo, de outra forma lítico, em não lítico, são detalhadas em EP 0 629 240 Bl e EP 0 307 434 B2 ou pode-se incorporar um epítopo de ligação a receptor de salvamento no anticorpo para aumentar a meia-vida no soro, ver US 5 739 277. Existem cinco receptores de Fcy humanos, atualmente reconhecidos, FcyR (I), FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e FcRn neonatal. Shields et al, (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604 demonstraram que um conjunto comum de resíduos de IgGl está envolvido na ligação de todos os FcyRs, enquanto FcyRII e FcyRIII utilizam sítios distintos fora deste conjunto comum. Um grupo de resíduos IgGI reduziu a ligação a todos FcyRs quando alterados em alanina: Pro-238, Asp-265, Asp- 270, Asn-297 e Pro-239. Todos estão no domínio CH2 de IgG e agrupados próximo do gancho unindo CHl e cH2. Enquanto FcyRI utiliza somente o conjunto comum de resíduos de IgGl para ligação, FcyRII e FcyRIII interagem com resíduos distintos além do conjunto comum. Alteração de alguns resíduos reduziu a ligação somente a FcyRII (por exemplo Arg-292) ou FcyRIII (por exemplo Glu-293). Algumas variantes mostraram ligação melhorada a FcyRII ou FcyRIII mas não afetam a ligação ao outro receptor (por exemplo Ser-267Ala melhorou a ligação a FcyRII mas a ligação a FcyRIII não foi afetada). Outras variantes demonstraram melhorada ligação a FcyRII ou FcyRIII com redução na ligação ao outro receptor (por exemplo Ser-298Ala melhorou a ligação a FcyRIII e reduziu a ligação a FcyRII). Para FcyRIIIa, as variantes de IgGI de melhor ligação tem substituições de alanina combinadas em Ser-298, Glu-333 e Lys-334. O receptor FcRn neonatal está envolvido, como se acredita tanto na depuração do anticorpo como na transcitose através dos tecidos (ver Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 e Ghetie et al (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766). Os resíduos de IgGI humana determinados para interagir diretamente com FcRn humano, incluem Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435. A presente invenção assim refere-se aos anticorpos da invenção tendo qualquer uma (ou mais) das mudanças de resíduo detalhadas acima para modificar a meia-vida/ depuração e/ou funções do efetuador como ADCC e/ou Iise do complemento.

Outras modificações incluem variantes de glicosilação dos anticorpos da invenção. A glicosilação de anticorpos em posições conservadas em suas regiões constantes é conhecida como tendo um efeito profundo em função do anticorpo, particularmente funcionamento do efetuador, como descrito acima, ver por exemplo, Boyd et al (1996), MoI. Immunol. 32, 1311- 1318. As variantes de glicosilação dos anticorpos terapêuticos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção em que uma ou mais porções de carboidratos é adicionada, substituída, deletada ou modificada são contemplados. A introdução de um motivo de asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina cria um sítio em potencial para a fixação enzimática de porções de carboidratos e pode assim ser usada para manipular a glicosilação de um anticorpo. Em Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876, a sialiação terminal de uma imunoadesina TNFR-IgG foi aumentada através de um processo de regalactosilação e/ou resialilação usando beta-1, 4- galactosiltransferace e/ou alfa, 2,3 sialiltransferase. O aumento na sialilação terminal aumenta, como se acredita, a meia-vida da imunoglobulina. Os anticorpos, em comum com a maior parte das glicoproteínas, são tipicamente produzidos na natureza como uma mistura de glicoformas. Esta mistura é particularmente aparente quando anticorpos são produzidos em células eucarióticas, particularmente de mamíferos. Vários métodos foram desenvolvidos para fabricar glicoformas definidas, ver Zhang et al Science (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem.Res 34, 727. Assim, a invenção refere-se a uma pluralidade de anticorpos terapêuticos (tipicamente monoclonais), (que podem ser de isotipo IgG, por exemplo IgGI) como descrito aqui, compreendendo um número definido (por exemplo 7 ou menor, por exemplo 5 ou menor como duas ou uma única) glicoforma (s) de referido anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos.

Outras formas de realização da invenção incluem anticorpos terapêuticos da invenção ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos copulados a um polímero não proteináceo como polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol ou polioxialquileno. A conjugação de proteínas para PEG é uma técnica estabelecida para aumentar a meia-vida de proteínas, assim como reduzir a antigenicidade e imunogenicidade de proteínas. O uso de PEGuilação com diferentes pesos moleculares e estilos (linear ou ramificado) foi investigado com anticorpos intactos assim como fragmentos Fab', ver Koumenis I. L. et al (2000) Int. J. Pharmaceut. 198:83-95. 5. Métodos de produção

Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos em organismos transgênicos como cabras (ver Pollock et al (1999), J. Immunol. Methods 231:147-157), galinhas (ver Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55), camundongos (ver Pollock et al ibid) ou plantas (ver Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat. Med. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590). Anticorpos também podem ser produzidos por síntese química. No entanto, anticorpos da invenção são tipicamente produzidos usando tecnologia de cultivo de células recombinantes bem conhecida dos versados na técnica. Um polinucleotídeo codificando o anticorpo é isolado e inserido em um vetor replicável como um plasmídeo para outra clonagem (amplificação) ou expressão em uma célula hospedeira. Um sistema de expressão utilizável é um sistema glutamato sintetase (como vendido por Lonza Biologics), particularmente onde a célula hospedeira é CHO ou NSO (ver abaixo). O polinucleotídeo codificando o anticorpo é prontamente isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo sondas de oligonucleotídeos). Os vetores que podem ser usados incluem plasmídeo, vírus, fago, transposons, mini-cromossomos, dos quais os plasmídeos são uma forma de realização típica. Geralmente, estes vetores ainda incluem uma seqüência de sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento melhorador, um promotor e seqüências de terminação de transcrição ligadas operativamente ao polinucleotídeo de cadeia leve e/ou pesada de modo a facilitar a expressão. Polinucleotídeo codificando as cadeias leve e pesada podem ser inseridos em vetores separados e introduzidos (por exemplo por transformação, transfecção, eletroporação ou transdução) na mesma célula hospedeira de modo concorrente ou seqüencial ou, se desejado, tanto a cadeia leve como a cadeia pesada pode ser inserida no mesmo vetor antes desta introdução.

Será imediatamente aparente para o versado na técnica que devido à redundância do código genético, polinucleotídeos alternativos aos descritos aqui são também disponíveis que irão codificar os polipeptídeos da invenção.

5.1 - Seqüências de sinal

Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos como uma proteína de fusão com uma seqüência de sinal heteróloga tendo um sítio de clivagem específico no término N da proteína madura. A seqüência de sinal deve ser reconhecida e processada pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas, a seqüência de sinal pode ser uma dos líderes de fosfatase alcalina, penicilinase, ou enterotoxina II estável em calor. Para a secreção de levedura, as seqüências de sinal podem ser um líder de levedura invertase, líder de fator a, ou líderes de ácido fosfatase, ver, por exemplo, WO 90/13646. Em sistemas de células de mamíferos, os líderes secretórios virais como sinal gD de herpes simples e uma seqüência de imunoglobulina nativa (como cadeia pesada de Ig humana) são disponíveis. Tipicamente, a seqüência de sinal é ligada na matriz de leitura a polinucleotídeo codificando o anticorpo da invenção.

5.2 Origem de replicação

A origem de replicação é bem conhecida na técnica com pBR322 apropriado para a maior parte de bactérias gram-negativas, plasmídeo 2 μ para a maior parte de leveduras e várias origens virais como SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV para a maior parte das células de mamíferos. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero integrados, salvo se a propagação do vetor for requerida em E. coli. No entanto, o SV40 ori pode ser usado porque ele contém o promotor prematuro.

5.3 Marcador de seleção

Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina ou (b) complementam as deficiências auxotróficas ou suprem nutrientes não disponíveis nos meios de complexo ou (c) combinações de ambos. O esquema de seleção pode envolver parar o crescimento das células hospedeiras que não contém vetor ou vetores. As células, que foram transformadas com sucesso com os genes codificando o anticorpo terapêutico da presente invenção, sobrevivem devido a, por exemplo, resistência às drogas conferida pelo marcador de seleção co- distribuído. Um exemplo é o sistema de seleção DHFR em que os transformantes são gerados em cepas hospedeiras negativas para DHFR (por exemplo, ver Page e Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68). Neste sistema, o gene DHFR é co-distribuído com seqüências de polinucleotídeo de anticorpo da invenção e células positivas para DHFR então selecionadas por retirada de nucleosídeos. Se requerido, o metotrexato de inibidor de DHFR é também empregado para selecionar os transformantes com amplificação de gene DHFR. Por ligação operativamente do gene DHFR ás seqüências codificando anticorpo da invenção ou derivados funcionais das mesmas, a amplificação de gene DHFR resulta em amplificação concomitante das seqüências de anticorpo desejadas de interesse. As células CHO são uma linhagem de células particularmente utilizável para esta seleção de DHFR/ metotrexato e métodos de amplificação e seleção de células hospedeiras usando o sistema DHFR são bem conhecidos na técnica, ver Kaufinan RJ. et al J. MoI. Biol. (1982) 159, 601-621, para estudo de revisão, ver Werner RG, Noe W, Kopp K5Schluter M," Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug. Um outro exemplo é o sistema de expressão de glutamato sintetase (Lonza Biologies). Um gene de seleção apropriado para uso em Iev é o gene trpl; ver Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979.

5.4 Promotores

Os promotores apropriados para expressão de anticorpos da invenção são ligados operativamente a DNA/ polinucleotídeo codificando o anticorpo. Os promotores para hospedeiros procarióticos incluem promotor phoA, sistemas de promotores beta-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, triptofano e promotores híbridos, como Tac. Os promotores apropriados para expressão em células de levedura incluem 3- fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, enolase, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofructoquinase, glicose 6 fosfato isomerase, 3- fosfoglicerato mutase e glucoquinase. Os promotores de levedura indutíveis incluem álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, ácido fosfatase, metalotioneína e enzimas responsáveis para metabolismo de nitrogênio ou utilização de maltose/galactose.

Os promotores para expressão em sistemas de células de mamíferos incluem promotores de RNA polimerase II, incluindo promotores virais, como polioma, epitelioma contagioso das aves e adenovírus (por exemplo adenovírus 2), vírus papilloma bovino, vírus do sarcoma das aves, citomegalovírus (em particular o promotor do gene prematuro imediato), retrovírus, vírus hepatite B, actina, promotor do vírus do sarcoma de rous (RSV) e vírus de símio prematuro ou tardio 40 e promotores não virais como EF-I alfa (Mizushima e Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322. A escolha do promotor pode ser baseada em compatibilidade apropriada com a célula hospedeira usada para expressão.

5.5 Elemento melhorador

Quando apropriado, por exemplo para expressão em eucarióticos superiores, elementos melhoradores adicionais podem ser incluídos em vez de ou também como os encontrados localizados nos promotores descritos acima. As seqüências melhoradoras de mamíferos apropriados incluem elementos melhoradores de globina, elastase, albumina, fetoproteína, metalotionina e insulina. Alternativamente, pode-se usar um elemento melhorador de um vírus da célula eucariótica, como melhorador SV40, melhorador do promotor prematuro de citomegalovírus, melhorador de polioma, melhorador baculoviral ou locus lgG2a murino (ver W004/009823). Apesar destes melhoradores estarem tipicamente localizados no vetor em um sítio a montante do promotor, eles também podem estar localizados em outros locais, por exemplo, dentro da região não traduzida ou a jusante do sinal de poliadenilação. A escolha e posicionamento de melhorador podem ser baseadas em compatibilidade apropriada com a célula hospedeira usada para expressão.

5.6. Poliadenilação/ terminação

Em sistemas eucarióticos, os sinais de poliadenilação são ligados operativamente ao polinucleotídeo codificando o anticorpo desta invenção. Estes sinais são tipicamente colocados 3' da matriz de leitura aberta, em sistemas de mamíferos, os sinais de exemplos não limitativos incluem os derivados de hormônios do crescimento, fator de alongamento 1 -alfa, e genes virais (por exemplo SV40) ou repetições terminais longas retrovirais. Em sistemas de levedura, os exemplos não limitativos de sinais de poliadenilação/ terminação incluem os derivados dos genes fosfoglicerato quinase (PGK) e álcool desidrogenase 1 (ADH). Em sistema procariótico, os sinais de poliadenilação são tipicamente não requeridos como é, ao contrário, comum empregar seqüências de terminador mais curtas e mais definidas. A escolha de seqüências de poliadenilação/ terminação pode ser baseada em compatibilidade apropriada com a célula hospedeira usada para expressão.

5.7. Outros métodos/ elementos para rendimentos melhorados

Além do acima, outros aspectos que podem ser empregados para melhorar rendimentos incluem elementos de remodelagem de cromatina, introns e modificação de códon específico para hospedeiro / célula. O uso de códons do anticorpo desta invenção pode ser modificado para se acomodar à polarização de códons da célula hospedeira de modo a aumentar o rendimento de transcrito e/ou produto (por exemplo Hoekema A et al MoI Cell Biol 1987 7(8):2914-24). A escolha de códons pode ser baseada em compatibilidade apropriada com a célula hospedeira usada para expressão.

5.8. Células hospedeiras

As células hospedeiras apropriadas para clonagem ou vetores de expressão codificando anticorpos da invenção são células procarióticas, levedura ou eucarióticas superiores. As células procarióticas apropriadas incluem eubactérias, por exemplo enterobacteriaceae como Escherichia por exemplo E.Coli (for exemplo ATCC 31.446; 31.537; 27.325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella por exemplo Salmonella typhimurium, Serratia por exemplo Serratia marcescans e Shigella assim como Bacilli como B.subtilis e B. Iicheniformis (ver DD 266 710), Pseudomonas como P. aeruginosa e Streptomyees. Dentre as células hospedeiras de leveduras, Saccharomyces eerevisiae, schizosaceharomyees pombe, Kluyveromyces (por exemplo ATCC 16.045; 12.424; 24178; 56.500), yarrowia (EP402, 226), Piehia Pastoris (EP183, 070, ver também Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Triehoderma reesia (EP244, 234J, hospedeiros de Penieillin, Tolypocladium e Aspergillus como A.nidulans e A.niger são também contemplados.

Apesar de células hospedeiras procarióticas e de levedura serem especificamente contempladas pela invenção, tipicamente, no entanto, células hospedeiras da presente invenção são células de vertebrados. As células hospedeiras de vertebrados apropriadas incluem células de mamíferos, como COS-I (ATCC No.CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), linhagem de rim embriônico humano 293, PerC6 (Crucell), células de rim de hamster bebê (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), células de ovário de hamster chinês CHO (por exemplo CHO-K1, ATCC NO: CCL 61, linhagem de células DHFR- CHO como DG44 (ver Urlaub et al, (1986) ibid), particularmente as linhagens de células CHO adaptadas para cultura em suspensão, células Sertoli de camundongos, células de rim de macaco, células de rim de macaco verde africano (ATCC CRL-15 87), células HELA, células de rim canino (ATCC CCL 34), células de pulmão humano (ATCC CCL 75), células Hep G2 e mieloma ou linfoma, por exemplo NSO (ver US 5.807.715), Sp2/0, YO.

Assim, em uma forma de realização da invenção, provê-se uma célula hospedeira estavelmente transformada, compreendendo um vetor codificando uma cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo terapêutico como aqui descrito. Tipicamente, estas células hospedeiras compreendem um primeiro vetor codificando a cadeia leve e um segundo vetor codificando a cadeia pesada.

Estas células hospedeiras também podem ser ainda engenheiradas ou adaptadas para modificar a qualidade, função e/ou rendimento do anticorpo desta invenção. Os exemplos não limitativos incluem expressão de enzimas de modificação específicas (por exemplo glicosilação) e cuidadoras de duplicação de proteínas.

5.9. Métodos de cultivo de células

As células hospedeiras transformadas com vetores codificando os anticorpos terapêuticos da invenção podem ser cultivadas por qualquer método bem conhecido do versado na técnica. As células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos giratórios, frascos agitados, garrafas rolando, ou sistemas de fibras ocas, mas é preferido para uma produção em larga escala que reatores de tanques agitados ou reatores de sacos (por exemplo, Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA) sejam usados particularmente para culturas em suspensão. Tipicamente, os tanques agitados são adaptados para aeração usando por exemplo pulverizadores, anteparos ou impulsores de baixo cisalhamento. Para colunas de borbulhamento e reatores de elevação de ar aeração direta com ar ou bolhas de oxigênio podem ser usados. Onde as células hospedeiras são cultivadas em um meio de cultura isento de soro, prefere-se que o meio seja suplementado com um agente positivo para células como Pluronic F-68 para ajudar a evitar dano à célula como um resultado do processo de aeração. Dependendo das características da célula hospedeira, ou micro-veículos podem ser usados como substratos de crescimento para linhagens de células dependentes de ancoragem ou as células podem ser adaptadas para cultura em suspensão (que é típica). O cultivo de células hospedeiras, particularmente células hospedeiras de vertebrados pode usar uma variedade de modos operacionais como batelada, batelada alimentada, processamento em batelada repetida (ver Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109), processo em batelada estendida, ou cultura de perfusão. Apesar das células hospedeiras de mamífero recombinantemente transformadas poderem ser cultivadas em meio contendo soro, estes meios cloreto de metileno soro de bezerro fetal (FCS), prefere-se que estas células hospedeiras sejam cultivadas em meio isento de soro sintético, como descrito em Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163, ou meios comercialmente disponíveis como ProCHO-CDM ou UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), suplementado quando necessário com uma fonte de energia como glicose e fatores de crescimento sintéticos como insulina recombinante. O cultivo sem soro de células hospedeiras pode requerer que estas células sejam adaptadas para crescer em condições isentas de soro. Uma abordagem de adaptação é para cultivar estas células hospedeiras em meio contendo soro e trocando repetidas vezes 80% do meio de cultura pelo meio isento de soro, de modo que as células hospedeiras aprendem a se adaptar em condições isentas de soro (ver por exemplo Scharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 2 Ist century (Beuvery E. C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers).

Anticorpos da invenção secretados no meio podem ser recuperados e purificados do meio usando várias técnicas para prover um grau de purificação apropriado para o uso pretendido, por exemplo, o uso de anticorpos terapêuticos da invenção para o tratamento de pacientes humanos tipicamente ordena pelo menos 95% de pureza, como determinado por SDS- PAGE de redução, mais tipicamente 98%, ou 99% de pureza, quando comparado com o meio de cultura compreendendo os anticorpos terapêuticos. No primeiro caso, os resíduos celulares do meio de cultura são tipicamente removidos usando centrifugação seguido por uma etapa de clarificação do sobrenadante usando, por exemplo, micro-filtração, ultra-filtração, e/ou filtração de profundidade. Alternativamente, o anticorpo pode ser coletado por micro-filtração, ultra-filtração ou filtração de profundidade sem antes centrifugar. Várias outras técnicas como diálise e eletroforese de gel e técnicas de cromatografia como hidroxiapatita (HA), cromatografia de afinidade (opcionalmente envolvendo um sistema de etiqueta de afinidade, como poli-histidina) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica (HIC, ver US 5 429 746) são disponíveis. Em uma forma de realização, os anticorpos da invenção, após várias etapas de clarificação, são capturados usando cromatografia de afinidade de proteína A ou G seguido por outras etapas de cromatografia como cromatografia de troca iônica e/ou HA, troca aniônica ou catiônica, cromatografia de exclusão de tamanho e precipitação de sulfato de amônio. Tipicamente, várias etapas de remoção de vírus também são empregadas (por exemplo, nano-filtração usando por exemplo um filtro DV- 20). Após estas várias etapas, uma preparação purificada (tipicamente monoclonal) compreendendo pelo menos 10 mg/ml ou mais, por exemplo 100 mg/ml ou mais do anticorpo da invenção são providos e, assim, formam uma forma de realização da invenção. A concentração a 100 mg/ml ou mais pode ser gerada por ultra-centrifugação. De modo apropriado, estas preparações são substancialmente isentas de formas agregadas de anticorpos da invenção.

Os sistemas bacterianos são particularmente apropriados para a expressão de fragmentos de anticorpo. Estes fragmentos estão localizados intracelularmente ou dentro do periplasma. As proteínas periplásmicas insolúveis podem ser extraídas ou reduplicadas para formar proteínas ativas de acordo com os métodos conhecidos do versado na técnica, ver Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 e Cupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277.

6. Composições farmacêuticas

As preparações purificadas de anticorpos da invenção (particularmente preparações monoclonais) como descrito supra, podem ser incorporadas nas composições farmacêuticas para uso no tratamento de doenças humanas e distúrbios como os descritos acima. Tipicamente, estas compreendendo ainda compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável (isto é, inerte) como conhecido e chamado para uma prática farmacêutica aceitável, ver por exemplo Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16a. ed, (1980), Mack Publishing Co. Exemplos de tais veículos incluem veículo esterilizado como solução salina, solução de Ringers, ou solução de dextrose, tamponadas com tampões apropriados a pH na faixa de 5 a 8. As composições farmacêuticas para injeção (por exemplo intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intramuscular, ou intraportal) ou infusão contínua são livres de modo apropriado de material particulado visível e podem compreender entre 0,1 ng a 100 mg de anticorpo, tipicamente entre 5 mg e 25 mg de anticorpo. Métodos para a preparação destas composições farmacêuticas são bem conhecidos do versado na técnica. Em uma forma de realização, composições farmacêuticas compreendem entre 0,1 ng a 100 mg de anticorpos terapêuticos da invenção em forma de dosagem unitária, opcionalmente junto com instruções para uso. As composições farmacêuticas da invenção podem ser liofilizadas (secadas por congelamento) para reconstituição antes da administração de acordo com os métodos bem conhecidos do versado na técnica. Onde as formas de realização da invenção compreendem anticorpos da invenção com um isotipo IgGl, um quelator de cobre como citrato (por exemplo citrato de sódio) ou EDTA ou histidina pode ser adicionado à composição farmacêutica para reduzir o grau de degradação mediada por cobre de anticorpos deste isotipo, ver EP 0 612 251.

As doses eficazes e regimes de tratamento para administração do anticorpo da invenção são geralmente determinadas empiricamente e são dependentes de fatores como idade, peso e estado da saúde, do paciente, e doença e distúrbio a ser tratado. Estes fatores estão de acordo com as considerações do médico atendente. A guia para selecionar doses apropriadas pode ser encontrada em por exemplo Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York mas geralmente estará entre 1 mg e 1000 mg. Em uma forma de realização, o regime de dosagem para tratamento de um paciente humano afetado com RA é 100 mg ou em torno deste valor (isto é entre 50 mg a 200 mg) de anticorpo da invenção (ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) administrado subcutaneamente por semana ou a cada duas semanas. As composições da presente invenção podem ser também usadas de modo profilático.

Dependendo da doença ou distúrbio a ser tratado, composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da invenção podem ser usadas simultaneamente, separadamente ou seqüencialmente com uma quantidade eficaz de outro medicamento como um agente anti-inflamatório, por exemplo NSAID, metotrexato, bucilamina, tiomalato de sódio ou um ou mais de um tratamento anti-TNF alfa como Enbrel™ (etanercept), Remicade™ (infliximab), Humira™ (adalimumab) e/ou CDP870. Anticorpos da invenção podem ser usados em combinação com uma quantidade eficaz de um anticorpo de receptor anti-TNF-alfa, ver Davis MW et al (2000) Ann Rheum Dis 59 (Suppl 1): 41-43. Em outras formas de realização, anticorpos da invenção pode ser usados em combinação com uma quantidade eficaz de um agente dirigido contra; IL- 1/IL-l R (por exemplo Kineret™), CTLA4-lg, IL-6 (ver Choy et al, (2002) Ann. Rheum. Dis 61 (suppl 1): 54), IL-8, IL-15, VEGF, IL-17, IL-18 (ver Taylor et al (2001) Curr.Opin. Immunol.13: 611-616), anticorpos anti-ICAM e/ou anti-CD4, agentes dirigidos contra um membro da família de MMP por exemplo MMP- 1, 2,3 e/ou 13. Anticorpos da invenção também podem ser usados em combinação com um agente que ablata as células conhecidas como estando envolvidas em processo inflamatório, por exemplo células B positivas para CD20 usando por exemplo Mabthera™ (Rituximab). Outras terapias em combinação com anticorpos da invenção incluem terapias anti-angiogênicas, como antagonistas da integrina ανβ3, Kringles 1-5 (ver Sumariwalla P et al (2003), Arthritis Res Ther 5:R32-R39.), Flt-I solúvel (ver Miotla et al, (2000) Lab. Invest. 80:1195-1205), um agente anti-COX-2 ou um agente anti-OSM como um anticorpo anti-OSM, ver W02005/095457, cujos conteúdos são especificamente incorporados aqui por referência e aos quais o leitor deve fazer especificamente referência. De modo conveniente, a composição farmacêutica compreendendo um kit de partes do anticorpo da invenção ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo junto com outros medicamentos opcionalmente junto com instruções para uso é também contemplada pela presente invenção. Estas combinações podem ser particularmente utilizáveis no tratamento de doenças artríticas/distúrbios como artrite reumatóide.

7. Usos clínicos

Anticorpos da invenção podem ser usados em tratamentos terapêuticos de doenças mediadas por IL-18 como doenças auto-imunes. Faz- se menção particular a esclerose múltipla, doenças artríticas como artrite reumatóide, Diabete tipo 1, doença inflamatória intestinal (IBD) e psoríase. Assim, a invenção ainda compreende um método de tratamento de um paciente humano afetado com uma doença respondente à neutralização de hIL-18 (como esclerose múltipla, artrite reumatóide, Diabete tipo 1, IBD, psoríase) cujo método compreende a administração ao referido paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, particularmente um anticorpo tendo uma cadeia pesada com uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:9 e uma cadeia leve tendo a seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:13.

Uso de um anticorpo da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de qualquer uma (ou mais) das doenças / distúrbios acima mencionados é também provido.

Tabela A

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7. Exemplificação

Os seguintes exemplos ilustram vários aspectos da invenção. Toda a tecnologia geral de clonagem, ligação e outras de DNA recombinantes são realizados como geralmente ensinado em Maniatis et al, Molecular cloning (A laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratory, ou Sambrook et al Molecular Cloning (A laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratory. Os sistemas de vetor e métodos de biologia molecular adicionais usados aqui são descritos em WO2005/095457, cujos conteúdos são especificamente incorporados aqui por referência e aos quais o leitor deve fazer especificamente referência.

7.1 Clonagem de regiões variáveis de hibridoma O anticorpo 2C10 de rato parental é especificado na patente US 6 706 487. O leitor deve fazer referência específica a este documento. Um anticorpo quimérico 2C10c foi projetado com base nas regiões V de rato publicadas, descritas acima, unidas às regiões Kappa C ou IgGl humano.

Uma seqüência de sinal de imunoglobulina genérica e códon de parada de tradução ATG foram introduzidos para as construções de cadeia pesada e leve. Os sítios de endonuclease de restrição Hind III e BsiWI foram projetados para armar o domínio VL e permitir a clonagem em vetores de expressão de mamíferos já contendo a região kappa C humana (SEQ.I.D.NO: 36). Os sítios de endonuclease de restrição Hind III e SpeI foram projetados para armar o domínio VH e permitir a clonagem em vetores de expressão de mamíferos já contendo a região C Y1 humana (SEQ.I.D.NO: 34). Isto resultou em mudança de dois aminoácidos para a região 2C10 Vh em armação 4 (resíduos Kabat 107 e 108) da seqüência publicada, como mostrado em SEQ.I.D.NO: 33.

Os oligonucleotídeos de sobreposição foram usados para construir a seqüência de codificação completa por PCR e clonagem em vetores de expressão descritos acima. Após verificação da seqüência, o anticorpo quimérico foi expressado em células CHO. O anticorpo produzido foi purificado dos sobrenadantes de cultura de células por cromatografia de afinidade em Proteína A Sepharose. Os anticorpos quiméricos de 2C10 foram avaliados em testes de ligação in vitro para demonstrar uma potência comparável a 2C10 rato parental. Isto foi obtido por determinação dos valores de EC50 para ligação a IL18 humano ou rhesus em ELISA (Figuras 16 e 17) ou por inibição de liberação de IFN-γ em bio-teste de KG-I, ver Figura 15.

7.2 Humanização

7.2.1 Estratégia de Humanização de cadeia leve

Para a cadeia leve variável 2C10 de rato, uma armação de aceitador de linhagem germinal humana foi selecionada (F_JGKV1 D-12-1, SEQ.I.D.NO:38) que tinha 64 % de identidade (incluindo CDRs) com a se de cadeia leve variável 2C10 de rato. A região V de linhagem germinal foi combinada em silico com um FR4 apropriado, neste caso o minigene kappa 2 de região J (Kabat Vol. II) com base na similaridade de seqüência (SEQ.I.D.NC):40). Três variantes humanizadas foram geradas com base na comparação de seqüência e o possível impacto na função do anticorpo. A construção Ll foi um enxerto direto de CDRs de rato (usando a definição de Kabat) na armação de aceitador humano selecionada acima. A construção L2 foi baseada em Ll com uma retro - mutação adicional em resíduo 71. A construção L3 foi baseada em L2 com 4 retro - mutações adicionais em resíduos 45, 83, 84 e 85. Ver Tabela 1.

Tabela 1: Tabela 1: Sumário de variantes VL humanizadas geradas

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7.2.2 Estratégia de Humanização de cadeia pesada

Para a seqüência de cadeia pesada variável de rato 2C10 uma armação de aceitador de linhagem germinal humana foi selecionada (Fp- IGHVI -f_2, SEQ.I.D.NO:37) que tinha 59% de identidade (incluindo CDRs) com a cadeia pesada variável 2C10 de rato. A região V de linhagem germinal V foi combinada in silico com um FR4 apropriado, neste caso o minigene JH6 (Kabat Vol. II) baseado em uma similaridade de seqüência (SEQ ID No:39). Três variantes de cadeia pesada variáveis humanizadas foram projetadas com base nesta armação. Hl é um enxerto de CDRs de rato (usando a definição de Kabat com 4 retro-mutações adicionais em resíduos 27, 28, 29 e 93. Isto permitiu uma seqüência de aminoácido muito incomum logo a montante de CDRl de anticorpo parental (isto é doador ) que pode constituir parte do CDR (como definido por Chothia). H2 foi baseado em Hl com duas retro- mutações adicionais em resíduos 39 e 40. H3 foi, por sua vez, baseado em H2 com outras 4 retro-mutações adicionais em resíduos 36, 71,89 e 91. Ver Tabela 2.

Tabela 2: Sumário de variantes de Vh humanizado geradas

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7.3 Humanização de 2C10C

As regiões V humanizadas foram sintetizadas de novo por acúmulo de oligonucleotídeo de sobreposição e amplificação PCR. Os iniciadores incluíram sítios de restrição para clonagem em vetores de expressão de mamíferos e seqüências de sinal de imunoglobulina humana para secreção. As regiões V humanizadas foram clonadas em vetores de expressão de mamíferos como Hl, H2 e H3, usando vetores de expressão de mamíferos HindHI e SpeI contendo a região constante gama 1 humana e como L1, L2 e L3 usando HindIII e BsiWI em vetores de expressão de mamíferos contendo a região constante kappa humana. Isto gerou variantes de cadeia pesada humanizadas de isotipo IgGl humano e variantes de cadeia leve humanizadas de isotipo kappa humano.

7.3.1 - Expressão de combinações de anticorpo de cadeia pesada e leve humanizado

As células CHOKl foram transfectadas transientemente em quadruplicata. Os sobrenadantes foram testados para concentração de anticorpo e então usados em testes de ligação in vitro por comparação para quimeras 2C10 rato-humano.

A expressão transiente em maior escala para todas as 9 variantes foi realizada por misturação, para cada frasco, de 51,4 ug de plasmideo de cadeia leve e 8,6 ug de plasmídeo de cadeia pesada com 240 ug de lipídeo de transfecção (este lipídeo é descrito em WO 2006/ 053783, exemplo 13, cujos conteúdos completos são incorporados aqui por referência) em 8 ml de meio (OptiMEM/ glutamax/ 5% FBS) e aplicando esta mistura a dois frascos Tl75 quase confluentes de células CHOKl durante 71 h, sob condições de cultura em tecido típica. Os anticorpos também foram expressados em um sistema de células CHO policlonais a uma quantidade de mg usando frascos agitados e purificados usando FPLC e proteína A.

7.4 Testes de ligação In vitro

7.4.1 Análise Biacore

Análise cinética Biacore™ dos anticorpos 2C10 humanizados foi realizada em um a instrumento Biacore™ 3000 usando captura Proteína A dos anticorpos em tampão HBS-EP (Biacore™). Brevemente, proteína A foi imobilizada em um chip CM5 por copulação de amina primária, usando o protocolo das instruções do fabricante, em densidades em torno de 2000 - 4000 unidades de ressonância (RU). O anticorpo humanizado foi então passado sobre a superfície de proteína A e capturado em níveis em torno de 200 - 500 Rus após um período de estabilização, IL18 (humano ou Rhesus) foi passado sobre a superfície do anticorpo capturado em concentrações definidas e sensorgramas de ligação foram obtidos. A regeneração, usando condições de eluição ácidas resultaram em remoção total do anticorpo capturado da superfície de proteína A, e não reduziram de modo significante a capacidade de ligação da superfície. Todas as curvas foram de referência dupla contra uma injeção de tampão em vez de IL-18 e os dados foram ajustados ao modelo de ligação 1:1 usando os parâmetros de ajuste global em BiaEval 4.1. As experiências de classificação de constante de dissociação foram especificadas usando o mesmo método de captura de proteína A, no entanto somente uma única concentração de IL18 foi usada (10 nM). Apesar dos dados serem ajustados usando o mesmo modelo de ligação como a análise cinética, somente uma concentração do analito foi usada na constante de dissociação e é registrada, este valor é utilizável para a classificação em vez de dar uma medida cinética exata e foi usado como um modo de selecionar quais anticorpos devem ser ainda investigados.

Resultados iniciais a 25 0C indicaram que todas as construções tinham afinidades de ligação similares para IL18 humano como o anticorpo parental 2C10 de rato. No entanto, quando uma experiência de classificação de constante de dissociação foi realizada a 37°C, as construções Ll tiveram um desempenho pobre comparado com as construções L2 e L3 com um aumento visto nas constantes de dissociação (Tabela 3a e 3b).

Tabela 3a: Parâmetros cinéticos para análise Biacore de anticorpos anti- IL18 humano, testado a 25°C.

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Dados expressam o resultado de duas experiências (desvio padrão)

Tabela 3b: Análise Biocore de classificação de constante de dissociação de IL18 humano ligando a anticorpos anti-IL-18 humanizados capturados em proteína A, testados a 37°C

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Dados expressam o resultado de uma experiência. Assim como de realização fraca a 37°C, as construções Ll também tiveram um pior desempenho em termos de afinidade para a ligação a IL18 Rhesus (tabela 4a) a 25 °C. Com base nestas observações, anticorpos selecionados foram investigados em maiores detalhes para ligação a IL18 humano e Rhesus a 37°C. Os dados mostrados na tabela 4b para IL-18 humano é a média (e desvio padrão) de seis determinações separadas. Os dados para IL-18 Rhesus mostra a média e desvio padrão de duas experiências para H1L2 e H1L3, enquanto os dados para H3L2 e H3L3 são de uma única experiência. Os desvios padrões comparativamente elevados destes dados são provavelmente um resultado de condução desta experiência a 37°C.

O fato de que as construções Ll tiveram um desempenho relativamente pobre é surpreendente quando se considera a diferença entre Ll e a construção L2 é a substituição de uma fenilalanina por uma retro-mutação de tirosina na posição 71 da cadeia leve. Tanto a fenilalanina como tirosina são, como evidente, aminoácidos aromáticos, assim o fato de que esta mudança sutil na estrutura da armação pode dar resultados marcados (em termos de afinidade de ligação) observada no sistema Biacore ™ a 37°C, mas não a 25 0C) foi inesperado.

Tabela 4a: Parâmetros cinéticos para análise Biacore de ligação de IL-18 Rhesus para construções de anticorpo humanizado testadas a 25 °C.

<table>table see original document page 43</column></row><table> Dados expressam o resultado de um experimento.

Tabela 4b: Parâmetros cinéticos para análise Biacore de ligação de IL18 humano e Rhesus a construções de anticorpo humanizado selecionadas, testadas a 37°C

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As variantes H1L1, HlL2 e HlL3 foram selecionadas para outra análise na seção 7.4.2 abaixo.

7.4.2 Dados Tl00 da Análise Biacore

Caracterização de alguns anticorpos variantes foi ainda realizada usando a máquina Tl00 Biacore™. Esta máquina oferece vantagens sobre a Biacore™ 3000, em termos de sensibilidade, controle de temperatura e estabilidade da linha de base em temperaturas maiores devido ao uso de um desgaseificador em linha que minimiza os efeitos de tampão em maiores temperaturas. Ele também oferece um software melhorado, como análise de dados automática.

A metodologia foi basicamente a mesma para o método usado na seção 7.4.1 acima. A proteína A foi imobilizada em um chip CM5 em densidades de entre 2000-6000 RU's por copulação de amina primária. Os ciclos foram realizados em HBS-EP (Biacore™). Os anticorpos anti-IL18 foram capturados em densidades de entre 100-500 RUs, IL18 humano foi passado sobre esta superfície capturada em concentrações entre 16-0,0625 nM, com concentração de OnM (isto é, uma injeção somente de tampão de anticorpo capturado) usado para uma referência dupla. A regeneração após cada injeção de IL18 foi por eluição ácida suave usando duas injeções de 10 mM glicina, pH 1,5. Esta etapa de regeneração removeu o anticorpo capturado da superfície da proteína A (e assim qualquer IL18 ligado à mesma). A regeneração não alterou de modo significante a capacidade de superfície da proteína A para ligar pulsos subseqüentes de anticorpo, permitindo a ocorrência de outro evento de captura. As curvas de ligação obtidas foram analisadas usando o software de análise inerente à máquina T100 usando o modelo 1:1 de ligação. Os ciclos foram realizados nas temperaturas indicadas.

Análise de ligação de HlLl e H1L2 a 15°C, 20 0C, 25°C, 32°C e 37°C

O experimento foi realizado usando o método acima em várias temperaturas. Figura 1 mostra o efeito de temperatura sobre a constante de associação (ka), enquanto a Figura 2 mostra o efeito sobre a constante de dissociação (kd) e Figura 3 o efeito sobre a constante de equilíbrio (KD). Tabela 5 detalha os valores cinéticos usados para criar estas figuras.

Tabela 5: Parâmetros cinéticos da experiência de variação de temperatura

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Os dados expressam uma única experiência.

Os dados mostram que as constantes de associação dos dois anticorpos testados são similares sobre a faixa de temperatura testada, com H1L2 geralmente tendo uma constante de associação mais rápida até o valor final de 37°C, quando H1L2 tem uma constante de associação mais rápida. No entanto, uma maior diferença é vista quando procurando nas constantes de associação, os dois anticorpos tem constantes de associação similares a 15°C, 20°C, 25°C, mas começam a divergir a 32°C e 37°C, com a constante de associação mais rápida vista para HlLl. Estas mudanças são refletidas na constante de equilíbrio global, (que é uma função de kd/ka), e indica que a diferença entre HlLl e HlL2 é principalmente na estabilidade do complexo anticorpo / IL18 como definido pela constante de dissociação (kd).

Análise de ligação de H1L1, H1L2, H1L3 e 2C10 quimérico a 25°C e 37°C

As experiências foram realizadas como descrito acima. A tabela 6 detalha os parâmetros cinéticos obtidos. Os dados mostram que HlL2 é um melhor anticorpo do que HlLl em termos de ligação, como definido pela constante de equilíbrio KD, tanto a 25 0C como a 37°C, mas os parâmetros cinéticos mostram que a 25°C, H1L2 tem uma melhor constante de associação (ka) do que HlLl. A 37°C, a posição é invertida indicando que a ligação superior vista a 37°C por H1L2 é maior devido à constante de dissociação (kd), indicando que a mutação que diferencia L2 de Ll confere uma aumentada estabilidade do complexo IL18- anticorpo em maiores temperaturas.

Tabela 6: Cinéticas de ligação de H1L1, H1L2, H1L3 e 2C10 quimérico a IL18 humano a 25°C 0 e 37°C

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Os dados expressam a média de vários conjuntos de dados separados (n), a média e desvio padrão são mostrados, com o desvio padrão em parêntese. O valor para os ciclos a 25°C e 37°C para HlLl e H1L2 obtidos da análise em cinco temperaturas diferentes são incluídos neste conjunto de dados. 7.4.3 - Avaliação de variantes de 2C10c humanizado em ELISA de ligação a ILl 8 ELISA com todas as nove variantes humanizadas foi realizado pelo menos 6 vezes usando várias bateladas de preparação de anticorpo purificado. Figuras 4A -4C mostram dados representativos de uma experiência que gerou a classificação do valor de EC50 ilustrado na tabela 7. IL-18 humano foi imobilizado em placas de 96 cavidades Nunc Maxisorp usando 2,5 ug/ml de 16D10 (anticorpo monoclonal camundongo não neutralizante) para capturar 5 ng/ml de IL-18 humano recombinante. Os anticorpos humanizados anti-IL-18 foram adicionados em várias diluições. Os anticorpos humanizados ligados foram detectados usando conjunto IgG Fc anti-humano peroxidase específico (Sigma AO170).

Tabela 7 - Aumento dos valores de EC50 de variantes humanizadas de 2C10 (expressado em [μg/ml])

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* Todos SE estavam entre 0,001 e 0,002

A potência de todas as variantes pareceu estar muito próxima da quimera 2C10 sugerindo que a humanização tinha resultado em uma perda pequena de potência. Apesar dos valores de EC50 gerados por várias repetições destes testes gerar de fato uma classificação de variantes, ELISA sozinha não permitiu uma distinção clara entre estas variantes (ver tabela 7 e figuras 4A-4C). Uma determinada distinção de variantes foi obtida usando Biacore ™. (seções 7.4.1 e 7.4.2) que resultou em somente 4 variantes sendo examinadas mais próximo em várias experiências de repetição independentes usando IL18 humano e rhesus (tabela 8, figura 5 [humano] e 6 [rhesus].

Tabela 8: Valores EC50 de seis experiências de repetição independentes com quatro variantes humanizadas selecionadas para ligação a IL-18 humano.

<table>table see original document page 47</column></row><table> H3L3 0,035 0,028 0,018 0,021 0,025 0,025 0,0253 0,006 7.4.4 - Avaliação de variantes Hl humanizadas 2C10 em ELISA de ligação de IL-18

Elisa foi realizada com três variantes Hl humanizadas: HlLl, H1L2 e H1L3 para avaliar a ligação a IL-18 humano em temperatura e a 37°C tanto em soro humano como em solução de bloqueio (PBS 0,05% TWEEN com 1% BSA (peso/volume)). As variantes de anticorpo humanizado foram imobilizadas em placas de 96 cavidades Nunc Maxisorp a 2,5 μg/ml. A captura de 5 ng/ml de IL-18 humano recombinante foi realizada ou em temperatura ambiente ou 37°C em soro humano ou solução de bloqueio. O anticorpo monoclonal camundongo anti-IL-18 16D10 foi adicionado. O anticorpo de camundongo ligado foi detectado usando conjugado kappa anti-camundongo peroxidase (Serotec MCA 129 IP). Os valores de EC50 representativos gerados a partir dos dados do estudo são ilustrados na tabela 9.

Tabela 9 - Valores de EC50 de variantes Hl humanizadas 2C10 em temperatura ambiente e a 37°C

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A potência de três variantes Hl humanizadas não é afetada pela mudança da temperatura em que a etapa de ligação de IL-18 humano é realizada, de temperatura ambiente a 37°C neste teste. Os sinais de ligação menores foram observados quando os anticorpos estão presentes em soro humano.

7.4.5 - Avaliação de estabilidade de anticorpos variantes Hl humanizados a 37°C

A estabilidade ao armazenamento de três variantes Hl humanizado: HlLl, H1L2 e H1L3 foi avaliada durante um período de tempo de 14 dias a 37°C, em tanto soro humano como solução salina tamponada com fosfato. Os anticorpos foram diluídos a 50 μg/ml, a estabilidade foi avaliada por ELISA de ligação a IL-18 seguindo períodos de incubação a 37°C de 0, 1, 4, 6, 8 e 14 dias. Para ELISA de ligação a IL-18, 16 DlO (anticorpo monoclonal de camundongo não neutralizante) foi imobilizado em placas Nunc Maxisorp para capturar 5 ng/ml IL-18 humano recombinante. Os anticorpos humanizados anti-IL-18 amostradas em diferentes pontos de tempo sobre a incubação no curso de tempo a 37°C foram adicionados. Os anticorpos humanizados ligados foram detectados usando conjugado peroxidase específica IgG Fc anti-humano.

A exposição prolongada a uma temperatura de 37°C durante 0, 1, 4, 6, 8 e 14 dias não afetou a potência de ligação das variantes de anticorpo Hl humanizado com base em sua capacidade de ligar a IL-18 humano neste formato de teste.

7.5. - Ligação de H1L2 a IL18 humano na presença de fluido sinovial

Um ELISA foi realizado onde 50% de fluido sinovial humano foi salpicado com IL18 humano recombinante na faixa de 500 ng/ml a 0 ng/ml. IL-18 contido nesta solução foi então aplicado ás cavidades da placa de 96 cavidades Maxisorp (Nunc) revestida com anticorpo H1L2. IL-18 ligado foi então detectado através de um anticorpo anti-IL-18 biotinilado (D045-6, MBL) e estreptavidina - HRP. A titulação de IL18 humano recombinante em 50% fluido sinovial (SF) produziu quase a mesma curva que a titulação de IL-18 recombinante humano em tampão com somente um deslocamento leve no valor meio-máximo. Ver figura 7. Isto demonstra a capacidade do anticorpo de ligar hIL-18 mesmo na presença de 50% SF humano que imita mais intimamente o meio de ligação que o anticorpo irá encontrar em um ambiente terapêutico.

7.5.1 - Ligação a IL18 na presença de proteína de ligação a IL18 (IL18bp)

A tecnologia Biacore™ (Biacore™ 3000) e ELISA foram usados para determinar se HlL2 pode ainda ligar IL18 humano na presença de IL18bp humano. IL18bp tinha uma alta afinidade para ILl8 e atua como um inibidor natural de função de IL-18 (Figura 8, Figura 9 A e B, Tabela IOe Tabela 11).

Análise por Biacore

Brevemente, proteína A foi imobilizada em um chip CM5 para uma superfície a uma densidade em torno de 4000 unidades de ressonância (Rus) por copulação de amina primária. A proteína de ligação Fc-IL 18 recombinante (R&D Systems) foi então passada sobre a uma concentração de 3 μg/ml a uma vazão de 10 μΐ/minuto durante 1 min, isto resultou na captura em torno de 1400 RU's de proteína de ligação ILl 8. IL18 foi então passado sobre a superfície da proteína gerar IL18 capturada a uma concentração de 30 nM, a uma vazão de 10 μΐ/minuto durante 5 min. Após isto, o anticorpo parente 2C10 de rato a uma concentração de 10 nM foi passado sobre a proteína de ligação 1118 / superfície de IL18 durante 3 min a uma vazão de 30 μl/minuto durante 3 minutos. Caso o epítopo reconhecido por anticorpo 2C10 sobre IL18 interfira com o sítio de interação para a proteína de ligação IL18, então nenhum sinal de ligação pode ser visto. A figura 10 demonstra que 2C10 é ligado a hIL-18 que, por sua vez, foi capturado por hIL-18BP, indicado que os sítios de ligação para 2C10 e ML-18BP não estão em sobreposição. Tabela 10: Efeito de IL-18BP em secreção de IFN γ de células sinoviais (RA) de artrite reumatóide

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Kawashima M e Miossec P Arthritis & Rheumatism VoI 48 No 3 (March 2003) pp 631 - 637

Análise por ELISA

A ligação de H1L2 humanizado ou Mab rato 2C10 para IL18 humano ligado capturado IL18bp foi testado em ELISAs de ligação direta onde proteína de fusão IL18bp-Fc humana recombinante (R& D Systems no. 199-BP) foi revestida em placas de Nunc Maxisorp a 0,5 μg/ml. IL18 humano recombinante (em reagente da empresa) foi adicionado a 100 ng/ml em tampão de bloqueio (PBS contendo 1% peso/volume BSA). Os anticorpos purificados foram adicionados em concentrações na faixa de 0,5 ng/ml a 1 μg/ml. O anticorpo ligado foi detectado com conjugado de HRP específico de cadeia leve kappa anti-humano (Sigma) ou HRP IgG anti-rato. Figura 18A e B ilustra os resultados obtidos.

7.6 Bioteste in vitro

7.6.1 - Atividade de construções humanizadas em neutralização de liberação de IFN-γ estimulado por IL18 em linhagem de células KG-I

Este teste mede a atividade de neutralização de anticorpo específico para IL-18 e é baseado na indução mediada por IL-18 de IFN-γ em células KG-1. KG-I (ATCC # CCL- 246) é uma linhagem de células mielomonocíticas humanas que expressam constitutivamente receptor de IL- 18 funcional e, assim, responde a estímulo com IL-18 exógeno. Todas as nove variantes humanizadas foram testadas por sua capacidade de inibir a IibIL- (C1-C8) de IFN-γ estimulado por IL-18 humano em células KG-I (tabela 12 e figura 11).

Tabela 12: Valores IC50 para neutralização de IL-18 humano recombinante em bioteste KG-I usando todas as nove variantes humanizadas

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Pelo menos 6 outras experiências de repetição foram realizadas em quatro variantes humanizadas preferidas que tinham mostrado melhor afinidade para IL-18 humano e rhesus recombinante em análise Biacore ™. A figura 8 ilustra um resultado representativo para quatro variantes humanizadas preferidas e para HlLl, e tabela 13 resume os resultados destes testes, todos realizados com o mesmo material de batelada de proteína de células CHOe la.

Tabela 13: Valores IC50 para neutralização de IL18 humano recombinante em bioteste KG-I usando 4 ou 5 variantes humanizadas selecionadas

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Em casos onde H1L1 foi comparado com outras variantes humanizadas, H1L1 demonstrou uma menor potência comparado com as outras quatro construções humanizadas testadas e também comparado com MAb parental 2C10.

Outra análise foi realizada com os quatro anticorpos monoclonais preferidos, que foram comparados para a capacidade de inibir a liberação de IFN-γ estimulado por IL-18 por células KG-1: 2C10 e as variantes humanizadas derivadas de 2C10 (H1L1, H1L2 e H1L3). O bioteste de KG-I foi realizado em placas de 96 cavidades por incubação de 50 ng/ml de IL_18 humano recombinante e várias concentrações de anticorpos específicas para IL18 (na faixa de 2 μg/ml a 7,8 ng/ml, em diluições duplas), ou um controle de isotipo negativo (Synagis, anticorpo anti-RSV) durante 1 h a 37°C e 5% CO2, seguido por adição de 3,5 IO5 KG-I célula por cavidade. As placas foram finalmente incubadas durante 20 - 24 h a 37°C, 5% CO2. O sobrenadante foi coletado e a produção de IFN-γ foi determinada usando um kit ELISA IFN-γ humano comercial (Biosource AHC4432; AHC4539).

Três experiências foram realizadas. Os resultados para a inibição de produção de IFN-γ estimulada por IL-18 foram normalizados para o controle negativo. A análise estatística visou ganhar uma estimativa de IC50 para cada mAb em cada experiência seguindo o ajuste por uma resposta de Synagis. As estimativas de IC50 foram então estatisticamente analisadas para produzir uma estimativa global de IC50 para cada mAb com um intervalo de confiança de 95% (isto é, uma faixa estatisticamente plausível). Cada variante humanizada foi finalmente comparada de novo com 2C10 usando teste de Dunnett. A figura 12 ilustra uma experiência representativa. A tabela 14 e figura 13 mostram uma estimativa global de IC50 para cada anticorpo monoclonal com um intervalo de confiança e mudança % de 2C10 de rato com valores ρ e intervalos de confiança.

Tabela 14: Valores IC50 para neutralização de produção de IFN-γ estimulado por IL18 em bioteste KG-1.

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HlLl é estatisticamente significantemente menos potente do que 2C10 (p< 0,001).

As outras variantes humanizadas não foram significativamente diferentes de 2C10, apesar da comparação para HlL3 versus 2C10 ser limítrofe.

7.6.2 - Atividade de H1L2 em neutralização de liberação de IFN-γ em PBMCs humanos estimulados

PBMC humano de três doadores foram estimulados com IL18 humano recombinante e anticorpo anti-CD3 e o efeito de adição de uma série de diluição das quatro variantes de anticorpo humanizado selecionado estudadas. Para cada doador, anticorpo 2C10 parente e IL18bp foram incluídos para comparação. Para dois dos três doadores ILl8 e anti-CD3, o estímulo não teve sucesso e nenhum IFN-γ foi detectado. Para o doador restante, os resultados foram muito variáveis em baixas concentrações mas uma inibição completa de produção de IFN-γ induzida por IL18 pode ser obtida por adição de vários anticorpos anti-IL18 incluindo variantes humanizadas. Ver figura 14.

As experiências também foram realizadas com PBMCs humanos estimulados por LPS que resulta em produção de IL18 e liberação de IFN-γ associada. A produção de IFN-γ foi induzida por LPS em uma modo dependente da concentração e adição de anticorpo monoclonal parental 2C10 em uma concentração fixa de 1 μg/ml completamente inibiu este estímulo, indicando que o efeito é mediado por IL18 e que IL18 endógeno pode ser neutralizado (dados não mostrados). Isto pode ser também demonstrado em sangue total mas o efeito de inibição com 2C10, apesar de dependente da dose, foi menos evidente (dados não mostrados). A figura 9 ilustra resultados da experiência com 3 doadores independentes e inibição com 2C10, HlL2 e I118bp monoclonal de rato parental. Os doadores 1 e 3 deram resultados similares, enquanto o doador 2 não mostrou liberação de IFN-γ em estímulo com LPS (não mostrado). A liberação de IFN-γ mediada por IL18 pode ser completamente inibida na presença de 10% ou 25% de soro humano por adição de > 1 μg/ml anticorpo ou IL18bp. A inibição já pode ser observada a 10 ng/ml e acima e os valores de IC50 para esta inibição na presença de 10% ou 25% de soro humano são mostrados na tabela 11.

Tabela 11: Valores de IC50 para inibição de liberação de IFN-γ estimulada por LPS causada por neutralização de IL18 endógeno usando 2C10, H1L2 ou IL18bp na presença de soro humano

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7.6.3 Sumário de ligação a ortólogos de IL18

A ligação de anticorpo com IL18 de outras espécies foi examinada usando ELISA e Biacore e também bioteste de células KG-1. Este foi inicialmente realizado usando 2C10 parental e 2C10c quimérico para IL18 rhesus / cinomolgo mas foi repetida com algumas das variantes humanizadas. 2C10 parental foi testado para ligação a IL18 de porco, camundongo e rato e as 4 melhores variantes humanizadas foram testadas para ligação a IL18 de rhesus / cinomolgo e cachorro usando Biacore e ELISA. O bioteste KG-I foi realizado com IL18 de rhesus / cinomolgo e três anticorpos monoclonais, 2C10 quimérico e de modo representativo para as variantes humanizadas, H3L3. Dada a similaridade de todas as variantes humanizadas, isto é provável de ser representativo para outras variantes geradas incluindo H1L2 (ver tabela 15, figura 8).

Tabela 15: Visão geral de ligação de ortólogo de Mab rato parental 2C10, quimera rato- humano 2C10c e reunião selecionada de 4 variantes humanizadas

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7.7 - Estudos de dicroísmo circular e desnaturação térmica de anticorpos IL18

Os estudos de dicroísmo circular (CD) foram usados para estudar as mudanças estruturais secundárias dos anticorpos IL18 como uma função de temperatura, especialmente de 25 0C a 37°C. Os estudos de desnaturação térmica destes mesmos anticorpos foram conduzidos para determinar sua estabilidade térmica e suas temperaturas de fusão (Tm).

Método CD: Os espectros de CD foram adquiridos em um espectrômetro Chirascan da Applied Photophysics com varredura de 180 nm - 280 nm em etapas de 0,5 nm e uma largura de banda de 1 nm. O tempo de aquisição por ponto foi 5 s. As amostras foram diluídas a ~ 0,2 mg/ml em PBS e colocadas em uma célula de comprimento de trajeto de 1 mm. Os espectros de cada proteína foram tomados com o banho termostático fixado a 4 °C, 25 °C e 37°C. As temperaturas reais das amostras foram determinadas por uma sonda colocada dentro do corpo do líquido dentro da célula e estavam em ~3 °C da temperatura fixada. Método Tm: Todas as proteínas foram diluídas a 0,2 mg/ml em Sypro laranja 1: 1000 em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A emissão de fluorescência foi medida a 620 nm (excitação a 490 nm) usando um instrumento Bioneer Exicycler a cada intervalo de 0,5 0C enquanto a mesma temperatura subiu de 10 0C a 95 0C esperando IOsa cada ponto de temperatura. As curvas de desnaturação foram ajustadas a uma isoterma de fusão padrão usando Grafit.

Como esperado, a comparação da forma dos espectros de CD de todos os quatro anticorpos mostrou sua estrutura como sendo altamente beta-folha e de essencialmente a mesma arquitetura. Na faixa de temperatura de 4 0C - 37°C, os três anticorpos:

H1L1

H1L2

H1L3

não mostram mudanças significantes em sua estrutura secundária, como revelado por CD. NO entanto, a quimera de anticorpo 2C10 não mostra uma diminuição leve na estrutura nesta faixa de temperatura. Isto é consistente com a tendência de estabilidade térmica dada na tabela 16 abaixo.

Tabela 16: Desnaturação térmica de anticorpos IL18

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Tm = desnaturação/temperatura de fusão

H1L1, H1L2 e H1L3 foram claramente estáveis bem além de 37°C, sem sinais de qualquer desnaturação em temperatura do corpo. Sua diferença em estabilidade térmica é assim improvável de conferir quaisquer vantagens diferenciais em temperaturas do corpo normais e ambientes.

Claims

1. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada e cadeia leve tendo as seguintes regiões de determinação de complementaridade (CDRs): CDRHl :SEQ.I.D.NO:l CDRH2:SEQ.I.D.NO:2 CDRH3 :SEQ.I.D.NO:3 CDRLl :SEQ.I.D.NO:4 CDRL2:SEQ.I.D.NO:5 CDRL3 :SEQ.I.D.NO:6.

2. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada e cadeia leve tendo as seguintes CDRs: CDRHl :SEQ.I.D.NO:l CDRH2:SEQ.I.D.NO:2 CDRH3 :SEQ.I.D.NO:3 CDRLl :SEQ.I.D.NO:4 CDRL2:SEQ.I.D.NO:5 CDRL3:SEQ.I.D.NO:6 em que o resíduo na posição 71 da cadeia leve é substituído pelo resíduo correspondente encontrado no anticorpo doador do qual os CDRs são derivados.

3. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender CDRs derivadas de um anticorpo doador enxertado sobre uma armação de aceitador humano cujo anticorpo anti-interleucina 18 compreende CDRs tendo seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 em que o resíduo na posição 71 da cadeia leve de referido anticorpo anti- interleucina 18 é idêntico ao resíduo encontrado na posição correspondente na armação do anticorpo doador.

4. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender CDRs especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2, 3, 4, 5 e -6 cujo anticorpo compreende uma tirosina na posição 71 da cadeia leve.

5. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada tendo CDRs especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2 e 3 e uma cadeia leve tendo CDRs especificadas em SEQ.I.D.NO: 4, 5 e 6 em que referidos CDRs de cadeia leve são derivados de um anticorpo doador tendo uma tirosina na posição 71 da cadeia leve do anticorpo doador.

6. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender CDRs de um anticorpo doador e uma tirosina na posição 71 da cadeia leve de referido anticorpo humanizado em que o anticorpo doador é 2C10 ou uma variante de armação do mesmo (isto é compreende os mesmos CDRs mas uma armação diferente como 2C10, ver patente US 6.706.487).

7. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender; (a) uma cadeia pesada tendo CDRs com as seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana e (b) uma cadeia leve tendo CDRs com as seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve humana em que referida armação de aceitador de cadeia leve humana compreende SEQ.I.D.NO: 38 e em que posição 71 da cadeia leve é uma tirosina.

8. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender; (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs tendo seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2 e 3 e (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs tendo seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve humana em que referida armação de aceitador de cadeia leve de referido anticorpo anti-interleucina-18 humanizado é uma variante da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:38 em que referida variante compreende uma tirosina na posição 71 e em que referida variante compreende 75% ou identidade maior para a armação tendo a seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:38.

9. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de os anticorpos compreendem (a) CDRs especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 derivadas de um anticorpo doador cujo anticorpo doador compreende uma tirosina na posição 71 da cadeia leve do anticorpo doador; (b) a armação de aceitador humano cuja armação de aceitador compreende uma fenilalanina na posição 71 da cadeia leve humana; em que o anticorpo anti-interleucina 18 compreende uma tirosina na posição 71 da cadeia leve.

10. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender: (a) CDRs especificadas em SEQ.I.D.NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 derivadas de um anticorpo doador cujo anticorpo doador compreende um aminoácido aromático na posição 71 da cadeia leve do anticorpo doador; (b) a armação de aceitador humano cuja armação de aceitador compreende na posição 71 da armação de aceitador de cadeia leve um tipo diferente de aminoácido aromático do aminoácido aromático na parte (a); em que o anticorpo anti-interleucina 18 compreende uma cadeia leve tendo na posição 71 um aminoácido aromático derivado de um anticorpo de parte (a).

11. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de que o anticorpo exibe uma afinidade de ligação (KD) de 90pM ou maior com relação a IL-18 humano quando medida por ressonância de plasmon de superfície (por exemplo Biacore™ T100) a 37°C.

12. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende CDRs como especificado em SEQ.I.D.NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6 e exibe uma afinidade de ligação (KD) de 90pM ou maior com relação a IL-18 humano quando medida por ressonância de plasmon de superfície (por exemplo Biacore™ T100) a 37°C.

13. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de que o anticorpo exibe uma constante de dissociação (kd) de 0,0002 (l/s) ou menos com relação à ligação de IL-18 humano quando medida por ressonância de plasmon de superfície (por exemplo Biacore™ T100) a 37°C.

14. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador, cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada cuja armação de aceitador de cadeia pesada tem uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 37 em que um ou mais resíduo/s de posição/s 27, 28, 29, 93, 39, - 40, 36, 71, 89, 91 da cadeia pesada é idêntico ao resíduo correspondente em uma cadeia pesada de anticorpo doador; (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: - 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve tem uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 38 em que posição 71 e opcionalmente um ou mais (por exemplo todos) resíduo/s de posição/s 45, 83, 84, 85 da cadeia leve são idênticos ao resíduo correspondente em uma cadeia leve de anticorpo doador.

15. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: -1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada tem uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, 93 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador; (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve tem uma seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 38 em que resíduo na posição 71 da cadeia leve de referido anticorpo anti-interleucina 18 é idêntico ao resíduo correspondente em uma cadeia leve de anticorpo doador.

16. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada tem a seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, -39, 40, 93 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador; (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve tem uma seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 38 em que resíduo na posição 71 da cadeia leve são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

17. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador compreende regiões de armação derivadas da seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:37 em que resíduos nas posições -27, 28, 29, 36, 39, 40, 71, 89, 91, 93 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador; (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve tem uma seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 38 em que resíduo na posição 71 da cadeia leve são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

18. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO:l, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada tem uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO:37 em que resíduos nas posições 27, -28, 29, 93 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador; (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve tem uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 38 em que resíduos nas posições 71, 45, 83, 84, 85 da cadeia leve são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

19. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: -1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada tem uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, 93, 39, 40 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador; (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: -4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve tem uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 38 em que resíduos nas posições 71, 45, 83, 84, 85 da cadeia leve são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

20. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma cadeia pesada compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 1, 2 e 3 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia pesada humana cuja armação de aceitador de cadeia pesada tem uma seqüência especificada em SEQ. I. D. NO: 37 em que resíduos nas posições 27, 28, 29, -93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 de uma cadeia pesada são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia pesada de anticorpo doador; (b) uma cadeia leve compreendendo CDRs derivadas de um anticorpo doador cujas CDRs têm seqüências especificadas em SEQ. I.D. NO: 4, 5 e 6 enxertadas sobre uma armação de aceitador de cadeia leve cuja armação de aceitador de cadeia leve tem uma seqüência especificada em SEQ.I.D.NO: 38 em que resíduos nas posições 71, 45, 83, 84, 85 da cadeia leve são idênticos aos resíduos correspondentes na cadeia leve de anticorpo doador.

21. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada selecionada dentre o grupo consistindo de: SEQ.I.D.NO: 9, SEQ.I.D.NO: 17, SEQ.I.D.NO: 21; e uma cadeia leve selecionada dentre o grupo consistindo de: SEQ.I.D.NO: 13, SEQ.I.D.NO: 29.

22. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO:9 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 13 ou uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO:9 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO:29.

23. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO: 17 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 13 ou uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO: 17 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO:29.

24. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO:21 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO: 13 ou uma cadeia pesada de SEQ.I.D.NO:21 e uma cadeia leve de SEQ.I.D.NO:29.

25. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma cadeia pesada tendo CDRs permissivos de ligação específica a IL-18 humano; (b) uma cadeia leve compreendendo uma armação de aceitador tendo CDRs com as seqüências especificadas em SEQ. I. D. NO: 4, 5 e 6 e tendo um resíduo de tirosina na posição 71.

26. Anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que uma relação entre constante de dissociação (kd) de referido anticorpo da ligação a IL-18 humano a 25 °C para constante de dissociação (kd) de referido anticorpo da ligação a IL-18 humano a 37°C é 1:5 (ou l:menor do que 5), em que referido anticorpo compreende CDRs derivadas de um anticorpo doador e a armação de aceitador humano, e em que um resíduo na posição 71 da cadeia leve da armação de aceitador humano é substituído pelo resíduo correspondente do anticorpo doador.

27. Anticorpo humanizado de acordo com reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as CDRs têm seqüências especificadas em SEQ.I.D.NO: 1,2,3,4, 5 e 6.

28. Anticorpo humanizado de acordo com reivindicação 26 ou -27, caracterizado pelo fato de que o resíduo na posição 71 da cadeia leve da armação de aceitador humano é um aminoácido aromático, preferivelmente fenilalanina, e o resíduo correspondente no anticorpo doador é um tipo diferente de aminoácido aromático, preferivelmente tirosina.

29. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo anti-interleucina 18 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

30. Uso de um anticorpo anti-interleucina 18 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças auto-imunes como esclerose múltipla, doenças artríticas como artrite reumatóide, Diabete tipo 1, doença inflamatória intestinal (IBD) e psoríase.

31. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de artrite reumatóide.

32. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 28 caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de doenças auto- imunes como esclerose múltipla, doenças artríticas como artrite reumatóide, Diabete tipo 1, doença inflamatória intestinal (IBD) e psoriase.

33. Método de tratamento de um paciente humano afetado com uma doença auto-imune como esclerose múltipla, doenças artríticas como artrite reumatóide, Diabete tipo 1, doença inflamatória intestinal (IBD) e psoriase caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao referido paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.

34. Método de produção de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando referido anticorpo sob condições permissivas para a expressão de referido anticorpo.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que referidas condições incluem cultivar referida célula hospedeira em um meio de cultura isento de soro.

36. Método de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que referida célula hospedeira é uma célula de mamífero.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é CHO ou NSO.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a célula CHO é uma célula CHO DHFR" antes da transfecção ou transformação com referido polinucleotídeo.

39. Método de seleção de um anticorpo (particularmente um anticorpo que inibe a interação entre um ligando e um receptor como um anticorpo anti-interleucina 18 aqui descrito) para uso terapêutico caracterizado pelo fato de que compreende: (a) medir a afinidade de ligação (usando por exemplo ressonância de plasmon de superfície como Biacore™) do anticorpo para um antígeno ao qual o anticorpo especificamente liga a uma temperatura entre 30 a 45°C (preferivelmente 37°C); (b) medir a afinidade de ligação (usando por exemplo ressonância de plasmon de superfície como Biacore™) do anticorpo para um antígeno ao qual o anticorpo especificamente liga a uma temperatura entre 20 a 25°C (preferivelmente 25°C); (c) selecionar referido anticorpo para uso terapêutico se a afinidade de (a) for maior do que a afinidade de (b), preferivelmente se referida afinidade de (a) é 2 vezes ou maior, mais preferivelmente 4 vezes ou mais, do que a afinidade de etapa (b).

40. Método de seleção de um anticorpo (particularmente um anticorpo que inibe a interação entre um ligando e um receptor como um anticorpo anti-interleucina 18 aqui descrito) para uso terapêutico, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) medir a constante de dissociação (usando por exemplo ressonância de plasmon de superfície como Biacore™) do anticorpo a partir do antígeno ao qual o anticorpo especificamente liga, a uma temperatura entre 30 a 45°C (preferivelmente 37°C); (b) medir a constante de dissociação (usando por exemplo ressonância de plasmon de superfície como Biacore™) do anticorpo a partir do antígeno ao qual o anticorpo especificamente liga a uma temperatura entre 20 a 25°C (preferivelmente 25°C); (c) selecionar referido anticorpo para uso terapêutico se a constante de dissociação de (a) for mais lenta do que constante de dissociação de (b).