TW202039554A - 抗ＴＮＦ－α抗體 - Google Patents

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賽巴斯汀 伊瑞葛來
達柯 斯克葛羅
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Abstract

本發明關於抗腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體、其抗原結合片段以及其用於預防和治療由TNF-α介導的病理性障礙之用途，該病理性障礙例如自體免疫疾病或者炎性障礙或病症，例如炎性關節炎(例如類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、軸突性脊椎關節炎)。

Description

抗TNF-α抗體
相關申請的交叉引用
本揭露要求2018年12月19日提交的美國臨時申請案號62/781668之優先權權益，該臨時申請藉由引用以其整體併入本文中。
本揭露關於抗腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體及其抗原結合片段，以及其用於治療由TNF-α介導的病理性障礙之用途，該病理性障礙例如自體免疫疾病或者炎性障礙或病症，例如炎性關節炎(例如類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、軸突性脊椎關節炎)。
生物分子正日益成為生物技術和製藥公司產品組合的一部分。該現象基於該等分子對於小分子具有高度特異性的能力。但是，生物治療劑有被宿主免疫系統識別為外來物的風險。實際上，單株抗體已經成為一類非常重要的生物藥物，但是由於抗體潛在的免疫原性，人們一直在關注其使用。一些接受該等藥物的患者產生抗藥物抗體(ADA)，該等抗體與各種潛在的臨床後果相關。
FDA和EMA兩者目前已批准包括阿達木單抗(adalimumab)的五種抗腫瘤壞死因子(TNF)-α生物藥劑用於類風濕性關節炎的治療(van Schouwenburg等人，(2013)Nat Rev Rheumatol.[自然綜述-風濕病]9(3)：164-72)。在一些患者中，抗體阿達木單抗觸發免疫反應，導致ADA的形成。ADA的形成係臨床上對用阿達木單抗治療無反應的原因之一，並且已經在患有類風濕性關節炎的患者中進行了描述(van de Putte等人(2004)Ann.Rheum.Dis.[風濕性疾病年鑒]63：508-516)。因此，需要相對於野生型阿達木單抗具有降低的免疫原性的經修飾的TNF-α抗體和其抗原結合片段。
許多因素會影響抗TNF-α生物藥劑的免疫原性：藥物的特徵和生物物理特性、患者的免疫系統活性、劑量、持續時間和投與途徑。對TNF-α治療性抗體如何引發免疫反應的見解有望引起使阿達木單抗的不良事件降至最低的策略的開發。
van Schouwenburg等人，(2014)Jrnl.Biol.Chem.[生物化學雜誌]289(50)：34482-88描述了用於與阿達木單抗結合的患者來源單株抗體的特徵。特別地，van Schouwenburg等人，(2014)分析了十六個B細胞殖株的可變區序列，並使用該等序列產生了一組11種ADA。重組表現了該等阿達木單抗ADA，並研究了其對阿達木單抗和阿達木單抗單點突變體的親和力和特異性。van Schouwenburg等人，(2014)顯示，在ADA陽性患者中，所有ADA都針對阿達木單抗上的小區域-框架區中的幾個熱點以及輕鏈和重鏈CDR中的位置。儘管如此，van Schouwenburg等人，(2014)注意到在不損害TNF-α結合或不在阿達木單抗上引入新的免疫原性表位之情況下，消除該等免疫原性決定簇中的一個或多個可能是不可能的(van Schouwenburg等人，(2014)，第34486頁)。
我們現已確定，可以修飾阿達木單抗的可變區以降低免疫原性，同時仍保留TNF-α結合活性。特別地，使所發現的位置和區域「反向突變」，即使一個或多個胺基酸殘基突變為相應框架基團的種系序列。藉由將抗體框架序列與衍生出抗體的種系序列進行比較來鑒定該等殘基。阿達木單抗重鏈可變區(VH)中的位置36和37(根據IMGT編號)和阿達木單抗輕鏈可變區(VL)中的位置67、68和69被視為阿達木單抗ADA的主要結合位置。然而，阿達木單抗中其他位置，例如VH I65、S114和VL G28、V99中的定點誘變也對減少阿達木單抗與ADA的結合具有良好的作用。
因此，本揭露關於基於阿達木單抗(HUMIRA中的活性成分)的結合區的抗腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體和其抗原結合片段。該等變體抗體和其抗原結合片段相對於野生型阿達木單抗在重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)或VH和VL兩者中具有突變。該等突變產生相對於野生型阿達木單抗具有降低的免疫原性和其他所需特性的抗體和抗原結合片段。
本文揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含如SEQ ID NO：26所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；和b)包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含：a)包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；和b)包含如SEQ ID NO：28所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含：a)包含如SEQ ID NO：26所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；和b)包含如SEQ ID NO：28所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VH在SEQ ID NO：4的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VL在SEQ ID NO：11的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體，該等抗體包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中：a)VH在SEQ ID NO：4的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變；並且b)VL在SEQ ID NO：11的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體，該等抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺 基酸序列的輕鏈，其中重鏈在SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體，該等抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中輕鏈在SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體，該等抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中：a)重鏈在SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變；並且b)輕鏈在SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VH在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VH在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中：a)VH在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變；並且b)VL在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體，該等抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中重鏈在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體，該等抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中輕鏈在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體，該等抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中：a)重鏈在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變；並且b)輕鏈在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
在較佳的實施方式中，針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段包含具有表1所闡述突變之一的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在較佳的實施方式中，針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段包含表2的行中所闡述的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。
本文另外揭露了針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含：a)重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區依序包含具有如SEQ ID NO：15所闡述的胺基酸序列的互補決定區(CDR)、具有如SEQ ID NO：2所闡述的胺基酸序列的CDR；和具有如SEQ ID NO：3所闡述的胺基酸序列的CDR；和b)輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區依序包含具有如SEQ ID NO：8所闡述的胺基酸序列的CDR、具有如SEQ ID NO：9所闡述的胺基酸序列的CDR；和具有如SEQ ID NO：10所闡述的胺基酸序列的CDR。
本文另外揭露了藥物組成物，該等藥物組成物包含根據本揭露的抗體或其抗原結合片段。
本文另外揭露了所揭露抗體或其抗原結合片段在製備用於治療由TNF-α介導的病理性障礙的藥物中之用途。
本文另外揭露了所揭露藥物組成物在製備用於治療由TNF-α介導的病理性障礙的藥物中之用途。
本文另外揭露了治療由TNF-α介導的病理性障礙之方法，所述方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的根據本揭露的抗體或其抗原結合片段。
本文另外揭露了治療由TNF-α介導的病理性障礙之方法，所述方法包括向有需要的受試者投與根據本揭露的藥物組成物。
本文另外揭露了編碼所揭露抗體和其抗原結合片段的分離的核酸分子、包含上述核酸分子中一種或多種的選殖和表現載體、包含上述選殖或表現載體中一種或多種的宿主細胞以及用於產生根據本揭露的抗體或其抗原結合片段的方法。
本文另外揭露了包含根據本揭露的抗體或其抗原結合片段和診斷標記的診斷試劑。
本文另外揭露了套組(kit)，該等套組包含根據本揭露的抗體或其抗原結合片段或根據本揭露的藥物組成物。
以下段落中提供了本發明的其他細節。
[圖1]顯示了與阿達木單抗相比，阿達木單抗抗體變體4和40的相 對結合。將阿達木單抗標準化並設定為100%相對結合。變體4(4%)和40(8%)對ADA的結合顯著較低。
[圖2]顯示在10mg/ml濃度的熱應激下，阿達木單抗和阿達木單抗抗體變體的流體動力學半徑增加。阿達木單抗(1)顯示從50℃開始流體動力學半徑增加，而變體(4)和(40)的流體動力學半徑沒有明顯變化。
[圖3]顯示了尺寸排阻層析之前和之後阿達木單抗和阿達木單抗抗體變體4和40的表現產量。尺寸排阻層析之後，變體4和40在HEK293T細胞中顯示更高的表現。
[圖4A-圖4C]顯示了40、70和100mg/ml濃度的抗體的溫度依賴性流體動力學半徑曲線。阿達木單抗的曲線在圖4A中，變體4的曲線在圖4B中，並且變體40的曲線在圖4C中。
一般事項
為了可以更容易地理解本發明，在整個具體實施方式中定義了某些術語。除非另外定義，否則本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同意義。
除非另外陳述，否則如本文所用的以下術語和短語意在具有以下含義：
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，也稱為惡病質素，係一種在抗腫瘤活性、免疫調節、炎症、厭食、惡病質、敗血性休克、病毒複製和造血中起作用的熟知細胞介素。TNF-α由多種細胞表現。如本文所用，「TNF-α」係指人TNF-α。關於人TNF-α的更多資訊，包括結構和序列資訊，可在UniProtKB-P01375和各種 參考文獻中找到，諸如Pennica等人，(1984)Nature[自然]312：724-29，Shirai等人(1985)Nature[自然]313：803-06；Wang等人，(1985)Science[科學]228：149-54。
表示為「X」或「Xaa」的胺基酸可以是表1第3欄所給出的相應位置的任何取代的胺基酸，也可以是表1第2欄所給出的相應位置的野生型胺基酸。
如本文所用，術語「抗體」係指免疫球蛋白家族的多肽，該多肽能夠非共價、可逆並以特異性方式結合相應的抗原。例如，天然存在的IgG抗體係包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的四聚體。每條重鏈由重鏈可變區(在本文縮寫為V H )和重鏈恒定區構成。重鏈恒定區由三個結構域即CH1、CH2和CH3構成。每條輕鏈由輕鏈可變區(在本文縮寫為V L )和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域CL構成。V H 和V L 區可以進一步細分為稱為互補決定區(CDR)的高變區，其間穿插有稱為框架區(FR)的較保守的區域。每個V H 和V L 由從胺基末端到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)以及經典補體系統的第一組分(Clq))的結合。
術語「抗體」包括但不限於：單株抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝抗體、嵌合抗體和抗獨特型(抗Id)抗體(包括，例如，針對本揭露抗體的抗Id抗體)。抗體可以屬於任何同種型/類別(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亞類(例如IgG 1 、IgG 2 、IgG 3 、IgG 4 、IgA 1 和IgA 2 )。
「互補決定結構域」或「互補決定區」(「CDR」)可互換地指V L 和V H 的高變區。CDR係抗體鏈的靶標蛋白結合位點，該結合位點具有針對此種靶標蛋白的特異性。每種人V L 或V H 中存在三個CDR(CDR1-3，從N末端依序編號)，該等CDR構成可變結構域的總計約15%-20%。CDR可以按其區域和順序 提到。例如，「VHCDR1」或「HCDR1」均指重鏈可變區的第一CDR。CDR在結構上與靶標蛋白的表位互補並因此直接負責結合特異性。剩餘的VL或VH區段(所謂的框架區)表現出較少的胺基酸序列變異(Kuby,Immunology[免疫學]，第4版，第4章，W.H.Freeman & Co.[W.H.弗裡曼公司],New York[紐約市],2000)。
CDR和框架區的位置可以使用本領域熟知的多種定義確定，例如，卡巴特(Kabat)、喬西亞(Chothia)、IMGT、AbM和組合定義(參見，例如，Johnson等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究],29：205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌],196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature[自然],342：877-883(1989)；Chothia等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌],227：799-817(1992)；Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29：207-209(2001)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌],273：927-748(1997))。抗原組合位元點的定義還在以下文獻中描述：Ruiz等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究],28：219-221(2000)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌],262：732-745(1996)；和Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊],86：9268-9272(1989)；Martin等人，Methods Enzymol.[酶學方法],203：121-153(1991)；和Rees等人，在Sternberg M.J.E.(編),Protein Structure Prediction[蛋白質結構預測],牛津大學出版社(Oxford University Press)，牛津郡(Oxford),141-172(1996)中。在組合的卡巴特和喬西亞編號方案中，在一些實施方式中，CDR對應於為卡巴特CDR、喬西亞CDR或兩者的一部分的胺基酸殘基。例如，在一些實施方式中，CDR對應於VH，例如哺乳動物VH，例如人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；和VL，例如哺乳動物VL，例如人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根據IMGT，VH中的CDR胺基酸殘基編號為約26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，並且VL中的CDR胺基酸殘基編號為約27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97 (CDR3)(根據「卡巴特」編號)。根據IMGT，可以使用程式IMGT/DomainGap Align確定抗體的CDR區。
輕鏈和重鏈兩者均分成結構同源性區和功能同源性區。術語「恒定」和「可變」係針對功能使用的。在該方面，應當理解輕鏈(VL)和重鏈(VH)兩個部分的可變結構域決定抗原識別和特異性。相反地，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定結構域賦予重要生物學特性，諸如分泌、經胎盤的移動性、Fc受體結合、補體結合等。按照慣例，恒定區結構域離抗體的抗原結合位點或者胺基末端越遠，其編號越大。N末端係可變區並且在C末端係恒定區；CH3和CL結構域實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端結構域。
如本文所用的術語「抗原結合片段」係指抗體中保留與抗原的表位特異性地相互作用(例如，藉由結合、空間位阻、穩定/去穩定、空間分佈)的能力的一個或多個部分。結合片段的實例包括但不限於單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv(sdFv)、F(ab)2片段、Fab片段、F(ab')2、片段F(ab')片段、由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；包含在鉸鏈區由二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；由VH和CH1結構域(和視需要鉸鏈的一部分)組成的Fd片段；由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；dAb片段(Ward等人，Nature[自然]341：544-546,1989)，該片段由VH結構域組成；和分離的互補決定區(CDR)、或抗體的其他表位結合片段。
此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH係由單獨的基因編碼的，但是可以使用重組方法將這兩個結構域藉由使它們能夠形成單一蛋白鏈的合成連接子接合，在該單一蛋白鏈中，VL區和VH區配對形成單價分子(被稱為單鏈Fv(「scFv」)；參見例如，Bird等人，Science[科學]242：423-426,1988；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.[美國國家科學院院刊]85：5879-5883,1988)。此類單鏈抗體也旨在涵蓋在術語「抗原結合片段」內。通常在VH和VL結構域之間存在 肽連接子。在較佳的實施方式中，本揭露的scFv具有如下一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。該等抗原結合片段係使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得的，並且以與完整抗體相同的方式針對效用來篩選該等片段。
抗原結合片段還可以摻入到單結構域抗體、大型抗體(maxibody)、微型抗體(minibody)、奈米抗體、胞內抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體、v-NAR和雙scFv中(參見，例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技術]23：1126-1136,2005)。可以將抗原結合片段移植到基於多肽諸如III型纖連蛋白(Fn3)的支架中(參見美國專利案號6,703,199，該專利描述了纖連蛋白多肽單體)。
可以將抗原結合片段摻入到包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，Protein Eng.[蛋白質工程]8：1057-1062,1995；和美國專利案號5,641,870)。
如本文所用的術語「單株抗體」或「Mab」係指從基本上均質的抗體群體中獲得的抗體，即，該群體中的單個抗體除了可能少量存在的天然突變以外係相同的。單株抗體對單個表位具有高度特異性。此種單株抗體可以由B細胞或雜交瘤的單個殖株產生。單株抗體也可以是重組的，即藉由蛋白質工程化產生。單株抗體也可以從噬菌體抗體文庫中分離得到。另外，與典型地包括針對各種決定簇或表位的各種抗體的多株抗體的製劑相反，每種單株抗體針對抗原的單個表位。使用噬菌體展示技術產生單株抗體的方法係本領域中已知的(Proetzel,G.,Ebersbach,H.(編)Antibody Methods and Protocols[抗體方法和方案].Humana Press[胡馬納出版社]ISBN 978-1-61779-930-3；2012)。在較佳的實施方式中，該抗TNF-α抗體係單株抗體。
如本文所用的術語「人抗體」包括具有可變區的抗體，其中框架區和CDR區均源自人源的序列。此外，如果抗體含有恒定區，則該恒定區也源自此類人序列，例如人種系序列或突變形式的人種系序列，或含有源自人框架序列分析的共有框架序列的抗體，例如，如Knappik等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]296：57-86,2000)中所述。在一個較佳的實施方式中，該抗TNF-α抗體係人抗體。
本揭露的人抗體可以包括不是由人序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由體外隨機誘變或位點特異性誘變、或藉由體內體細胞突變、或保守取代引入突變來促進穩定性或製備)。
「人源化」抗體係保留非人抗體的反應性同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，這可以藉由保留非人CDR區並用其人類對應物(即恒定區以及可變區的框架部分)置換抗體的其餘部分來實現。參見，例如，Morrison等人1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊],81：6851-6855；Morrison和Oi,1988,Adv.Immunol.[免疫學進展],44：65-92；Verhoeyen等人，1988,Science[科學],239：1534-1536；Padlan 1991,Molec.Immun.[分子免疫學],28：489-498；以及Padlan 1994,Molec.Immun.[分子免疫學],31：169-217。人工程化技術的其他實例包括但不限於在US 5,766,886中揭露的Xoma技術。在一些實施方式中，該抗TNF-α抗體係人源化或嵌合抗體。
可以基於如上述製備的鼠單株抗體的序列來製備本揭露的嵌合抗體或人源化抗體。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從感興趣的鼠雜交瘤獲得，並使用標準分子生物學技術工程化以含有非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，為了產生嵌合抗體，可以使用本領域中已知的方法將鼠可變區與人恒定區連接(參見例如，Cabilly等人的美國專利案號4,816,567)。為產生人源化抗體，可以使用本領域已知的方法將鼠CDR區插入人框架中。參見例如， Winter的美國專利案號5,225,539和Queen等人的美國專利案號5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。
如本文所用的術語「識別」係指抗體或其抗原結合片段發現並與其表位相互作用(例如，結合)，不管該表位係線性的還是構象的。術語「表位」係指抗原上與本揭露的抗體或抗原結合片段特異性結合的位點。表位可以從連續胺基酸或藉由蛋白質的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成。從連續胺基酸形成的表位典型地在暴露於變性溶劑時保留，而藉由三級折疊形成的表位用變性溶劑處理時典型地喪失。表位典型地包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個呈獨特空間構象的胺基酸。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術，例如，x射線結晶學和二維核磁共振(參見，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology[分子生物學中的方法中的表位作圖方案]，第66卷，G.E.Morris編輯(1996))或電子顯微術。「互補位」係識別抗原表位的抗體部分。
當在描述抗原(例如，蛋白質)和抗體、抗體片段或源自抗體的結合劑之間的相互作用的情形下使用時，短語「特異性結合」或「選擇性結合」係指確定蛋白質和其他生物製劑的異質群體中，例如，在生物樣本，例如血液、血清、血漿或組織樣本中抗原的存在的結合反應。例如，可以藉由競爭測定，例如競爭ELISA來確定特異性結合。在一些競爭測定中，如果標記的靶標與探針的結合被過量的未標記靶標競爭性抑制，則指示特異性結合。因此，在某些指明的免疫測定條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合劑與特定抗原的結合至少兩倍於背景並且基本上不以顯著的量與樣本中存在的其他抗原結合。在一個方面，在指明的免疫測定條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合劑與特定抗原的結合至少十(10)倍於背景並且基本上不以顯著的量與樣本中存在的其他抗原結合。在此類條件下與抗體或結合劑的特異性結合可能需要針對對特定蛋白質 的特異性對抗體或藥劑進行選擇。如果需要或適當，可以藉由扣除與來自其他物種(例如，小鼠或大鼠)或其他亞型的分子交叉反應的抗體來實現該選擇。可替代地，在一些方面，選擇與某些所需分子交叉反應的本揭露內容的抗體或抗體片段。
在一些實施方式中，本揭露的抗體或抗原結合片段的特異性結合係指以至少102M-1、至少5×102M-1、至少103M-1、至少5×103M-1、至少104M-1至少5×104M-1、至少105M-1、至少5×105M-1、至少106M-1、至少5×106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×1010M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、至少5×1012M-1、至少1013M-1、至少5×1013M-1、至少1014M-1、至少5×1014M-1、至少1015M-1或至少5×1015M-1的平衡常數(KA)結合。
在一些實施方式中，本揭露的抗體或抗原結合片段的特異性結合係指解離速率常數(KD)小於5×10-2M、小於10-2M、小於5×10-3M、小於10-3M、小於5×10-4M、小於10-4M、小於5×10-5M、小於10-5M、小於5×10-6M、小於10-6M、小於5×10-7M、小於10-7M、小於5×10-8M、小於10-8M、小於5×10-9M、小於10-9M、小於5×10-10M、小於10-10M、小於5×10-11M、小於10-11M、小於5×10-12M、小於10-12M、小於5×10-13M、小於10-13M、小於5×10-14M、小於10-14M、小於5×10-15M或小於10-15M或更低，並且以結合非特異性抗原(例如，HSA)的親和力至少兩倍的親和力結合靶標抗原。
如本文所用的術語「親和力」係指抗體與抗原之間在單個抗原位點處相互作用的強度。在每個抗原位點內，抗體「臂」的可變區藉由弱非共價力在許多位點處與抗原相互作用；相互作用越多，親和力越強。如本文所使用，針對IgG抗體或其片段(例如，Fab片段)的術語「高親和力」係指對靶標抗原具有10-8M或更小、10-9M或更小、或10-10M、或10-11M或更小、或10-12M或更小、 或10-13M或更小的KD的抗體。然而，對於其他抗體同種型，高親和力結合可以變化。例如，對於IgM同種型的高親和力結合係指具有10-7M或更小、或10-8M或更小的KD的抗體。一種用於測量親和力例如KD的合適測定包括使用BIACORE技術(例如藉由使用BIACORE 3000儀器(瑞典烏普薩拉市BIACORE公司(BIACORE,Uppsala,Sweden)))，該技術可以使用表面電漿共振技術測量相互作用的程度。
如本文所用，術語「親合力」係指抗體-抗原複合物的總體穩定性或強度的信息量度。它受三個主要因素控制：抗體表位親和力；抗原和抗體兩者的化合價；以及相互作用部分的結構排列。最終，該等因素限定了抗體的特異性，即，特定抗體與精確抗原表位結合的可能性。
術語「分離的抗體」係指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體。然而，特異性結合一種抗原的分離的抗體可以對其他抗原具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞物質和/或化學品。
術語「相應的人種系序列」係指編碼人可變區胺基酸序列或子序列的核酸序列，與由人種系免疫球蛋白可變區序列編碼的所有其他已知的或推斷的可變區胺基酸序列相比，該人可變區胺基酸序列或子序列與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高確定的胺基酸序列同一性。相應的人種系序列還可以指與全部其他評價的可變區胺基酸序列相比，與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列同一性的人可變區胺基酸序列或子序列。相應的人種系序列可以僅是框架區、僅是互補性決定區、係框架區和互補性決定區、可變區段(如上文所定義)，或包含可變區的序列或子序列的其他組合。可以使用本文所述的方法，例如，使用BLAST、ALIGN或本領域已知的另一種比對演算法比對兩個序列來確定序列同一性。相應的人種系核酸或胺基酸序列可以與參考可 變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
多種免疫測定方式可以用來選擇與特定蛋白特異性免疫反應的抗體。例如，常規地使用固相ELISA免疫測定來選擇與蛋白特異性免疫反應的抗體(關於可以用來確定特異性免疫反應性的免疫測定形式和條件的描述，參見，例如Harlow和Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual[使用抗體：實驗室手冊](1998))。典型地，特異性或選擇性結合反應將產生高於背景信號至少2倍和更典型地高於背景至少10至100倍的信號。
術語「平衡解離常數(KD，M)」係指解離速率常數(kd，時間-1)除以締合速率常數(ka，時間-1，M-1)。可以使用本領域的任何已知方法測量平衡解離常數。本揭露的抗體和片段通常將具有小於約10-6或10-7M或10-8M，例如，小於約10-9M或10-10M，在一些方面，小於約10-11M、10-12M或10-13M的平衡解離常數。
術語「生物利用率」係指投與至患者的給定量的藥物的全身性利用率(即，血液/血漿水平)。生物利用率係一個絕對術語，該絕對術語指示從所投與劑型到達總循環的藥物時間(速率)和總量(程度)的量度。
如本文所用的胺基酸殘基/位置的「修飾」或「突變」係指與起始胺基酸序列(例如，野生型序列)相比，一級胺基酸序列的變化，其中該變化係由涉及所述胺基酸殘基/位置的序列變化引起的。例如，典型的修飾包括用另一個胺基酸取代殘基(或在所述位置取代)(例如，保守或非保守取代)，在所述殘基/位置附近插入一個或多個胺基酸，以及缺失所述殘基/位置。「胺基酸突變」或其變化形式係指用不同的胺基酸殘基置換預定(起始)胺基酸序列中的現有胺基酸殘基。通常且較佳的是，與包含起始(或「野生型」)胺基酸序列的多肽相比，修飾使變體多肽的至少一種物理生物化學活性改變。例如，在抗體的情況下， 改變的物理生物化學活性可以是對靶標分子的結合親和力、結合能力和/或結合作用。
術語「包含」涵蓋「包括」以及「由......組成」，例如，「包含」X的組成物可以僅由X組成或可以包括另外的一些，例如X+Y。
除非另外特別說明或從上下文中顯而易見，否則如本文所用，關於數值的術語「約」應理解為在本領域的正常公差內，例如，在平均值的兩個標準差內。因此，「約」可以在該值的+/-10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.05%或0.01%內，較佳的是該值的+/-10%內。當在數值範圍或數字清單前使用時，術語「約」適用於系列中的每個數字，例如，短語「約1-5」應解釋為「約1-約5」，或例如，短語「約1、2、3、4」應解釋為「約1、約2、約3、約4等」。
短語「診斷標記」係指用於診斷患有特定疾病的受試者，監測患者治療，監測和/或評估特定樣本中的TNF-α水平或用於研究環境的標記。標記包括但不限於直接檢測到的標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及間接檢測到(例如藉由酶促反應或分子相互作用)的部分，諸如酶或配位基。診斷標記(例如化學發光標籤)可以與所揭露的抗TNF-α抗體或其抗原結合片段組合以產生診斷試劑。
如本文所用，關於患者的「選擇」用於指特定患者由於其具有預定標準而特別地從較大的患者組選出。類似地，「選擇性治療患者」係指向如下患者提供治療，該患者由於該特定患者具有預定標準而特別地從較大的患者組選出。類似地，「選擇性投與」係指向如下患者投與藥物，該患者由於該特定患者具有預定標準而特別地從較大的患者組選出。
單詞「基本上」不排除「完全」，例如，「基本上不含」Y的組成物可以完全不含Y。必要時，本揭露內容的定義中可以省略單詞「基本上」。
如本文所用，短語「基本上由......組成」係指方法或組成物中所包括的活性藥劑以及對該方法或組成物的預期目的無活性的任何賦形劑的類屬或種類。在一些方面，短語「基本上由......組成」明確地排除了包括除本揭露的抗TNF-α抗體或片段以外的一種或多種其他活性劑。在一些方面，短語「基本上由......組成」明確地排除了包括除本揭露的抗TNF-α抗體或片段和第二共同投與的藥劑以外的一種或多種其他活性劑。
術語「胺基酸」係指天然存在的、合成的和非天然的胺基酸，以及以類似於天然存在胺基酸的方式發揮作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸係由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後期經修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫、羧基基團、胺基基團和R基團結合的α-碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾的R基團(例如，正白胺酸)或經修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有如下結構的化合物，該結構與胺基酸的一般化學結構不同但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用。
術語「經保守修飾的變體」適用於胺基酸和核酸序列兩者。對於特定核酸序列，經保守修飾的變體係指編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的那些核酸，或者在該等核酸不編碼胺基酸序列的情況下，係指基本上相同的序列。由於遺傳密碼的簡並性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在由密碼子指定丙胺酸的每個位置，該密碼子可以改變為任何所述的相應密碼子而不改變編碼的多肽。此類核酸變異係「緘默變異」，該等變異係保守修飾變異中的一種。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了核酸的每種可能緘默變異。技術人員 應認識到，核酸中的每個密碼子(除了通常是甲硫胺酸的唯一密碼子的AUG和通常是色胺酸的唯一密碼子的TGG)均可以經修飾以產生功能上相同的分子。因此，在每個所述序列中均隱含了編碼多肽的核酸的每種緘默變異。
對於多肽序列，「經保守修飾的變體」包括對多肽序列的單個取代、缺失或添加，從而使某個胺基酸取代為化學上類似的胺基酸。提供功能上類似的胺基酸的保守取代表係本領域中熟知的。此類經保守修飾的變體係對多態變體、種間同源物和等位基因的補充，並且不排除該等多態變體、種間同源物和等位基因。以下8組含有互為保守取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見，例如，Creighton,Proteins[蛋白質](1984))。在一些方面，術語「保守序列修飾」用於指如下胺基酸修飾，其不顯著影響或改變含有該胺基酸序列的抗體的結合特徵。
如本文所用，術語「優化的」係指已經改變核苷酸序列以使用在生產細胞或生物體，通常真核細胞，例如酵母細胞、畢赤酵母(Pichia)細胞、真菌細胞、木黴(Trichoderma)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人細胞中為較佳的密碼子編碼胺基酸序列。優化的核苷酸序列被工程化以完全或盡可能多地保留最初由起始核苷酸序列編碼的胺基酸序列，該起始核苷酸序列也稱為「親本」序列。
在兩個或更多個核酸或多肽序列的情形下，術語「相同的百分比」或「同一性百分比」係指兩個或更多個序列或子序列相同的程度。如果兩個序列在正在比較的區域上具有相同的胺基酸序列或核苷酸序列，則它們係「相同的」。當在比較窗口或指定區域內進行比較和比對以在使用以下序列比較演算法之一 或藉由手動比對和目視檢查測量時獲得最大對應時，如果兩個序列具有規定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸(即，在規定區域上或在沒有規定時在整個序列上，60%同一性，視需要65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性)，則該兩個序列係「基本上相同的」。視需要，同一性存在於長度為至少約30個核苷酸(或10個胺基酸)的區域上，或更較佳的是在長度為100至500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)的區域上。
對於序列比較，典型地一個序列充當參考序列，將測試序列與該參考序列比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列和參考序列輸入到電腦中，必要時指定子序列座標，並且指定序列演算法程式參數。可以使用預設程式參數，或者可以指定替代參數。然後，序列比較演算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的「比較窗口」包括提及選自由以下組成之群組之多個鄰接位置中的任一個的區段：20至600個、通常約50至約200個、更通常約100至約150個，其中在將序列與相同數量的鄰接位置的參考序列最佳比對後，可以將兩個序列進行比較。用於比較的序列比對方法在本領域中係熟知的。例如藉由Smith和Waterman Adv.Appl.Math.[應用數學進展]2：482c(1970)的局部同源性演算法，藉由Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物學期刊]48：443(1970)的同源性比對演算法，藉由Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]85：2444(1988)的相似性方法研究，藉由該等演算法(威斯康辛州麥迪森的科學大道575號遺傳學電腦小組(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)的威斯康辛遺傳學套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的電腦實現，或藉由手動比對和目測檢查(參見例如，Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學實驗指南],2003)，可以進行用於比較的序列的最佳比對。
適用於確定序列同一性和序列相似性百分比的演算法的兩個實例係BLAST和BLAST 2.0演算法，該演算法分別描述於Altschul等人，Nuc.Acids Res.[核酸研究]25：3389-3402,1977；和Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]215：403-410,1990中。用於執行BLAST分析的軟體可藉由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開地獲得。該演算法包括首先藉由鑒定查詢序列中長度為W的短字來鑒定高評分序列對(HSP)，當與數據庫序列中的相同長度的字比對時，該長度為W的短字匹配或滿足一些正值閾值得分T。T被稱為鄰域字得分閾值(Altschul等人，同上)。該等最初的鄰域字命中點作為基礎，用於啟動搜索以找到含有其的更長HSP。字命中點沿著每個序列在兩個方向上擴展，遠至可以增加累積比對得分。對於核苷酸序列，使用參數M(一對匹配殘基的獎勵得分；總是>0)和N(錯配殘基的罰分；總是<0)計算累積得分。對於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累積得分。當出現以下情形時，字命中點向各方向的擴展終止：累積比對得分從其最大獲得值跌落數量X；由於一個或多個負評分殘基比對的累積，累積得分走向零或更低；或到達任一序列的一端。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用字長(W)11、期望值(E)10、M=5、N=-4和兩條股比較作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長3和期望值(E)10以及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]89：10915)比對(B)50、期望值(E)10、M=5、N=-4和兩條股比較作為預設值。
該BLAST演算法還對兩個序列之間的相似度進行統計學分析(參見，例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]90：5873-5787,1993)。由BLAST演算法提供的一種相似性量度係最小總和概率(P(N))，該最小總和概率提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的 概率的指示。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中的最小總和概率小於約0.2、更較佳的是小於約0.01、最較佳的是小於約0.001，則認為該核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比也可以使用已併入ALIGN程式(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.[電腦應用生物科學],4：11-17,1988)的演算法，利用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12、空位罰分4來確定。另外，兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已經併入GCG套裝軟體(可從南佛羅里達大學(University of South Florida)獲得)中的GAP程式(可從www.gcg.com獲得)中的Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.[分子生物學雜誌]48：444-453,1970)演算法，利用BLOSUM 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來確定。
除了上述序列同一性百分比之外，兩個核酸序列或多肽基本上相同的另一個指示係由第一核酸編碼的多肽與針對由第二核酸編碼的多肽產生的抗體進行免疫交叉反應，如下所述。因此，例如，在一個多肽與第二多肽僅因保守性取代而不同的情況下，該兩種肽典型地基本上相同。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示係兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交，如下所述。兩個核酸序列基本上相同的又另一個指示係可使用相同的引物來擴增序列。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，並且是指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物。作為本揭露一部分的核酸的實例包括cDNA、基因組DNA、重組DNA和RNA(例如，mRNA)。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾的骨架殘基或連接的核酸，該核酸係合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸類似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代 磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其經保守修飾的變體(例如，簡並密碼子取代)和互補序列以及明確指示的序列。具體地，如下文詳述，簡並密碼子取代可以藉由產生如下序列而實現，在該等序列中，一個或多個所選擇的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代(Batzer等人，(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究]19：5081；Ohtsuka等人，(1985)J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]260：2605-2608；和Rossolini等人，(1994)Mol.Cell.Probes[分子與細胞探針]8：91-98)。
在核酸的情形下，術語「可操地連接」係指兩個或更多個多核苷酸(例如，DNA)區段之間的功能關係。典型地，它係指轉錄調節序列與已轉錄序列的功能關係。例如，如果啟動子或增強子序列在適當的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子序列可操作地連接至編碼序列。通常，與轉錄序列可操作地連接的啟動子轉錄調節序列與轉錄序列在物理上鄰接，即它們係順式作用的。然而，一些轉錄調控序列如增強子不需要在物理上鄰接或位於極為接近該等轉錄調控序列增強其轉錄的編碼序列的位置。
該術語「多肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用來指胺基酸殘基的聚合物。該術語還適用於一個或多個胺基酸殘基係相應天然存在胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合物，並且適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外指示，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其經保守修飾的變體。
術語「受試者」包括人類和非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人類靈長類、綿羊、狗、牛、雞、 兩棲動物和爬行動物。除非在指出時，否則術語「患者」或「受試者」在本文中可互換地使用。
如本文所用，諸如「需要治療的患者」或「需要治療的受試者」的短語包括將受益於投與例如用於檢測、診斷程序和/或治療的本揭露的抗體或組成物的受試者，諸如哺乳動物受試者。
「IC50」(最大抑制濃度的一半)係指特定抗體或其片段抑制基線對照和最大可能信號之間的一半信號(50%)的濃度。
「EC50」(最大有效濃度的一半)係指特定抗體或其片段在特定的暴露時間或治療時間後誘導基線對照和最大可能作用之間的一半反應(50%)的濃度。例如，EC50係病毒感染減少50%時的抗體濃度。
「EC90」係指特定抗體或其片段在特定的暴露時間或治療時間後誘導對應於最大可能作用的90%的反應的濃度。例如，EC90係病毒感染減少90%時的抗體或其片段的濃度。
術語「治療」在本文中定義為向受試者或來自受試者的分離的組織或細胞系施加或投與根據本揭露的TNF-α抗體或抗原結合片段或包含所述抗TNF-α抗體的藥物組成物，其中該受試者患有特定疾病(例如，關節炎)、具有與該疾病相關的症狀或具有易產生該疾病的傾向(如果適用)，其中目的是治癒疾病(如果適用)，延緩疾病的發作，降低疾病的嚴重性，減輕、改善疾病的一種或多種症狀，改善疾病，減少或改善疾病的任何相關症狀或易產生疾病的傾向。術語「治療」包括治療懷疑患有疾病的患者以及患病或已診斷患有疾病或醫學病症的患者，並且包括抑制臨床復發。短語「降低可能性」係指延遲疾病、感染或障礙的發作或產生或進展。
術語「治療可接受的量」或「治療有效量」或「治療有效劑量」可互換地指足以實現所需結果(例如，降低疾病活性，抑制疾病進展等)的量。 在一些方面，治療上可接受的量不會誘導或引起不期望的副作用。可以藉由首先投與低劑量並且然後遞增地增加該劑量直至實現所需效果來確定治療上可接受的量。本揭露的分子的「預防有效劑量」和「治療有效劑量」可以分別預防疾病症狀發作或使疾病症狀的嚴重性降低，該疾病症狀包括與TNF-α活性相關的症狀。
術語「共同投與」係指個體的血液中同時存在兩種活性藥劑。與所揭露的抗體和抗原結合片段共同投與的活性劑(例如，其他治療劑)可以同時或依序遞送。
重組抗TNF-α抗體
本揭露提供了結合TNF-α並降低TNF-α活性、信號等的抗體和抗體片段(例如，抗原結合片段)。此外，本揭露提供了具有所需藥物動力學特徵和其他所需屬性，因此可以用於治療由TNF-α介導的病理性障礙，例如自體免疫疾病或炎性障礙的抗體。本揭露還提供了包含抗體和/或其片段的藥物組成物，以及製備和使用此類藥物組成物以預防並治療由TNF-α介導的病理性障礙，例如自體免疫疾病或炎性障礙的方法。
本揭露提供了特異性結合TNF-α的抗體或其抗原結合片段。本揭露的抗體或其抗原結合片段包括但不限於如以下實例中所述分離的人單株抗體或其抗原結合片段。
HUMIRA的活性成分阿達木單抗係一種眾所周知的TNF-α抗體。根據IMGT定義的阿達木單抗的重鏈CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)分別如SEQ ID NO：1-3的胺基酸序列所闡述。根據IMGT定義的阿達木單抗的輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)分別如SEQ ID NO：8-10的胺基酸序列所闡述。阿達木單抗V H 如SEQ ID NO：4的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：5的核酸序列編碼。阿達木單抗V L 如SEQ ID NO：11的胺基酸序列所闡述，該胺 基酸序列由SEQ ID NO：12的核酸序列編碼。阿達木單抗重鏈如SEQ ID NO：6的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：7的核酸序列編碼。阿達木單抗輕鏈如SEQ ID NO：13的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：14的核酸序列編碼。
投與患者阿達木單抗已顯示產生ADA，該ADA抑制阿達木單抗與TNF-α的結合。為了解決該問題，我們鑒定了阿達木單抗中對於TNF-α結合的關鍵殘基以及引起非所需免疫原性的關鍵殘基。採用種系指導的方法，我們在小心避免使參與TNF-α結合的殘基突變的情況下在阿達木單抗的VH和VL中產生了單突變和多突變。
現在已經確定阿達木單抗VH和重鏈的IMGT殘基D36、Y37、I65和S114(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107)適合於去免疫取代。此外，阿達木單抗VL和輕鏈的IMGT殘基G28、T66、L67、Q68、S69和V99(SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83)適合於去免疫取代。下表1提供了根據本揭露的基於阿達木單抗變體的抗TNF抗體和抗原結合片段的該等較佳的突變。
Figure 108146225-A0202-12-0027-76
Figure 108146225-A0202-12-0028-2
[表1]：根據本揭露的基於阿達木單抗變體的抗TNF抗體和抗原結合片段中的較佳的突變。突變位置基於SEQ ID NO：4/6和SEQ ID NO：11/13(第1欄)中的位置或IMGT編號(第2欄)。第3欄給出了每個位置的較佳的胺基酸突變(取代)。
基於以上所述，SEQ ID NO：26所闡述的胺基酸序列一般表示本發明的TNF-α抗體和抗原結合片段的V H ，而SEQ ID NO：28所闡述的胺基酸序列一般表示本發明的TNF-α抗體和抗原結合片段的V L 。類似地，SEQ ID NO：27所闡述的胺基酸序列一般表示本發明的TNF-α抗體和抗原結合片段的重鏈，而SEQ ID NO：29所闡述的胺基酸序列一般表示本發明的TNF-α抗體和抗原結合片段的輕鏈。
在一些實施方式中，本揭露的TNF-α抗體和抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：26所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(V H )；和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(V L )，其中SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。在一些實施方式中，本揭露的TNF-α抗體和抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(V H )；和包含如SEQ ID NO：28所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(V L )，其中SEQ ID NO：28中Xaa胺 基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。在一些實施方式中，本揭露的TNF-α抗體和抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：26所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；和包含如SEQ ID NO：28所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些實施方式中，本揭露的TNF-α抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含如SEQ ID NO：27所闡述的胺基酸序列；並且輕鏈包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列，其中SEQ ID NO：27中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。在一些實施方式中，本揭露的TNF-α抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列；並且輕鏈包含如SEQ ID NO：29所闡述的胺基酸序列，其中SEQ ID NO：29中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。在一些實施方式中，本揭露的TNF-α抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含如SEQ ID NO：27所闡述的胺基酸序列；並且輕鏈包含如SEQ ID NO：29所闡述的胺基酸序列，其中SEQ ID NO：27中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且SEQ ID NO：29中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些實施方式中，SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些實施方式中，SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些實施方式中，SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些實施方式中，SEQ ID NO：27中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些實施方式中，SEQ ID NO：29中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些實施方式中，SEQ ID NO：27中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且SEQ ID NO：29中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在某些方面，本揭露提供了特異性結合TNF-α的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列的VH結構域，該VH結構域具有表1的VH突變(D36S、D36N、Y37S、Y37F、I65T、S114A)中的至少一種。該VH的IMGT位置36、37、65和114分別對應於SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段具有表1的VH突變中的1種、2種、3種或4種。
在某些方面，本揭露提供了特異性結合TNF-α的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列的VL結構域，該VL結構域具有表1的VL突變(G28S、L67R、Q68E、S69T、T66S、V99F、T66N、V99I)中的至少一種。VL的IMGT位置28、66、67、68、69和99分別對應於SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段具有表1的VL突變中的1種、2種、3種或4種。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段具有表1的VH突變中的1種、2種、3種或4種並且沒有VL突變。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段具有表1的VL突變中的1種、2種、3種或4種並且沒有VH突變。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段具有表1的VH突變中的1種、2種、3種或4種和表1的VL突變中的1種、2種、3種或4種。
因此，本文揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VH在SEQ ID NO：4的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，VH和VL突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VL在SEQ ID NO：11的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，VH和VL突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中：VH在SEQ ID NO：4的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變；並且VL在SEQ ID NO：11的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，VH和VL突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VH在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，VH和VL突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VL在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，VH和VL突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中VH在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變；並且VL在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。 在一些實施方式中，VH和VL突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，VH和VL區闡述於表2的行中。
本文還揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中重鏈在SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，重鏈包含VH區，輕鏈包含VL區，並且VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中輕鏈在SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，重鏈包含VH區，輕鏈包含VL區，並且VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中：重鏈在SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變；並且輕鏈在SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，重鏈包含VH區，輕鏈包含VL區，並且VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中重鏈在IMGT位置36、37、65和114中的 一個或多個處突變。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，重鏈包含VH區，輕鏈包含VL區，並且VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中輕鏈在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，重鏈包含VH區，輕鏈包含VL區，並且VH和VL區闡述於表2的行中。
本文另外揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中：重鏈在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變；並且輕鏈在IMGT位置28、66、67、68、69和/或99中的一個或多個處突變。在一些實施方式中，重鏈和輕鏈突變選自表1中所闡述的突變。在一些實施方式中，重鏈包含VH區，輕鏈包含VL區，並且VH和VL區闡述於表2的行中。
本文揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體和其抗原結合片段，該抗體和其抗原結合片段包含表2的行中所闡述的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。
本文揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含重鏈可變區(VH)，所述輕鏈包含輕鏈可變區(VL)，其中所述VH和VL區闡述於表2的行中。
在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段具有VH Y37(IMGT)突變。在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：11的VL和包含VH Y37(IMGT)突變的SEQ ID NO：4的VH。
在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段具有VL S69(IMGT)突變。在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段包含有包含VL S69(IMGT)突變的SEQ ID NO：11的VL和SEQ ID NO：4的VH。
在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段具有VH Y37S(IMGT)。在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：11的VL和包含VH Y37S(IMGT)突變的SEQ ID NO：4的VH。
在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段具有VL S69T(IMGT)突變。在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段包含有包含VL S69T(IMGT)突變的SEQ ID NO：11的VL和SEQ ID NO：4的VH。
在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段具有VH Y37突變和VL S69(IMGT)突變。在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段包含有包含VL S69(IMGT)突變的SEQ ID NO：11的VL和包含VH Y37(IMGT)突變的SEQ ID NO：4的VH。
在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段具有VH Y37S突變和VL S69T(IMGT)突變。在較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段包含有包含VL S69T(IMGT)突變的SEQ ID NO：11的VL和包含VH Y37S(IMGT)突變的SEQ ID NO：4的VH。
在一個較佳的實施方式中，相對於野生型阿達木單抗，TNF-α抗體或其抗原結合片段具有VH Y37S(IMGT)突變，並且沒有VL突變。該抗體或抗原結合片段被稱為「變體4」或「v4」。根據IMGT定義的TNF-α抗體或抗原結合片段v4的重鏈CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)分別如SEQ ID NO：15、2和 3的胺基酸序列所闡述。根據IMGT定義的TNF-α抗體或抗原結合片段v4的輕鏈CDR(LCDR1、HCDR2、HCDR3)分別如SEQ ID NO：8-10的胺基酸序列所闡述。預期可以使用其他熟知的定義，例如卡巴特(Kabat)、喬西亞(Chothia)、組合的卡巴特和喬西亞編號方案來鑒定TNF-α抗體或抗原結合片段v4的CDR。
TNF-α抗體或抗原結合片段v4 VH如SEQ ID NO：16的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：17的核酸序列編碼。TNF-α抗體或抗原結合片段v4 VL如SEQ ID NO：11的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：12的核酸序列編碼。TNF-α抗體v4重鏈如SEQ ID NO：18的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：19的核酸序列編碼。TNF-α抗體v4輕鏈如SEQ ID NO：13的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：14的核酸序列編碼。
在另一個較佳的實施方式中，TNF-α抗體或其抗原結合片段具有VH Y37S(IMGT)突變和VL S69T(IMGT)突變。該抗體或抗原結合片段被稱為「變體40」或「v40」。根據IMGT定義的TNF-α抗體或抗原結合片段v40的重鏈CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)分別如SEQ ID NO：15、2和3的胺基酸序列所闡述。根據IMGT定義的TNF-α抗體或抗原結合片段v40的輕鏈CDR(LCDR1、HCDR2、HCDR3)分別如SEQ ID NO：8-10的胺基酸序列所闡述。預期可以使用其他熟知的定義，例如卡巴特、喬西亞、組合的卡巴特和喬西亞編號方案來鑒定TNF-α抗體或抗原結合片段v40(較佳的是TNF-α抗體v4)的CDR。
TNF-α抗體或抗原結合片段v40 VH如SEQ ID NO：16的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：17的核酸序列編碼。TNF-α抗體或抗原結合片段v40 VL如SEQ ID NO：20的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：21的核酸序列編碼。TNF-α抗體v4重鏈如SEQ ID NO：18的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：19的核酸序列編碼。TNF-α抗體v4輕鏈 如SEQ ID NO：22的胺基酸序列所闡述，該胺基酸序列由SEQ ID NO：23的核酸序列編碼。
本文揭露了針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區依序包含具有如SEQ ID NO：15所闡述的胺基酸序列的互補決定區(CDR)、具有如SEQ ID NO：2所闡述的胺基酸序列的CDR；和具有如SEQ ID NO：3所闡述的胺基酸序列的CDR；和輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區依序包含具有如SEQ ID NO：8所闡述的胺基酸序列的CDR、具有如SEQ ID NO：9所闡述的胺基酸序列的CDR；和具有如SEQ ID NO：10所闡述的胺基酸序列的CDR。
在一些實施方式中，針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段包含：包含如SEQ ID NO：16所闡述的胺基酸序列的三個CDR的重鏈可變區(VH)，和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的三個CDR的輕鏈可變區(VL)，其中該CDR根據IMGT、卡巴特、喬西亞或組合的卡巴特和喬西亞編號方案定義。在一個實施方式中，CDR根據IMGT定義。在一個實施方式中，CDR根據卡巴特定義。在一個實施方式中，CDR根據喬西亞定義。在一個實施方式中，CDR根據組合的卡巴特和喬西亞編號方案定義。
在一些實施方式中，VH包含如SEQ ID NO：16所闡述的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列。
在一些實施方式中，重鏈包含如SEQ ID NO：18所闡述的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列。
在一些實施方式中，針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段包含：包含如SEQ ID NO：16所闡述的胺基酸序列的三個CDR的重鏈可變區(VH)，和包含如SEQ ID NO：20所闡述的胺基酸序列的三個CDR的輕鏈可變區(VL)，其中該CDR根據IMGT、卡巴特、喬西亞或組合的卡巴 特和喬西亞編號方案定義。在一個實施方式中，CDR根據IMGT定義。在一個實施方式中，CDR根據卡巴特定義。在一個實施方式中，CDR根據喬西亞定義。在一個實施方式中，CDR根據組合的卡巴特和喬西亞編號方案定義。
在一些實施方式中，VH包含如SEQ ID NO：16所闡述的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：20所闡述的胺基酸序列。
在一些實施方式中，重鏈包含如SEQ ID NO：18所闡述的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含如SEQ ID NO：22所闡述的胺基酸序列。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段係選自嵌合抗體、人源化抗體和人抗體的抗體。TNF-α抗體較佳的是單株TNF-α抗體。
在一些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段係單株抗體。
TNF-α抗原結合片段較佳的是選自Fab、F(ab)2和scFv。
[表2]顯示了根據本揭露的較佳的TNF-α抗體和抗原結合片段的V H 和V L 區。
Figure 108146225-A0202-12-0038-77
Figure 108146225-A0202-12-0039-4
Figure 108146225-A0202-12-0040-5
Figure 108146225-A0202-12-0041-6
Figure 108146225-A0202-12-0042-7
表2：根據本揭露的TNF-α抗體和抗原結合片段中包含的V H 和V L 區。表格的每一行均指示特定變體(例如，變體1、變體2等)。第2欄提供了給定變體的V H 中相對於野生型阿達木單抗V H (SEQ ID NO：4)的突變，並且該突變為IMGT位置。第3欄提供了該變體的V L 中相對於野生型阿達木單抗V L (SEQ ID NO：11)的突變，並且該突變為IMGT位置。例如，變體35代表如下抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段具有如SEQ ID NO：4所闡述的V H 和Y37F突變(SEQ ID NO：4的位置32)和如SEQ ID NO：11所闡述的V L 和L67R突變(SEQ ID NO：11的位置54)。*VK1-33 FR3係指SEQ ID NO：11中具有以下突變的輕鏈：T66N、Q68E、V99I(IMGT)。**VK1-13 FR3係指SEQ ID NO：11中具有以下突變的輕鏈：T66S、Q68E、V99F(IMGT)。
[表3]闡述了阿達木單抗以及v4和v40 TNF-α抗體和抗原結合片段的CDR、V H 、V L 、全長重鏈和全長輕鏈的胺基酸序列，以及編碼該等分子的V H 、V L 、全長重鏈和全長輕鏈的核酸序列。值得注意的是，該等核酸序列可以針對哺乳動物細胞中的表現進行優化。
Figure 108146225-A0202-12-0043-78
Figure 108146225-A0202-12-0044-9
Figure 108146225-A0202-12-0045-10
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Figure 108146225-A0202-12-0052-17
表3：代表性序列，包括通用序列、v40和v4序列以及野生型阿達木單抗的序列。以「X」給出的胺基酸可以是表1第3欄給出的相應位置中的任何胺基酸，也可以是表1第2欄給出的相應位置中的阿達木單抗的野生型胺基酸。
本揭露的其他抗體包括如下抗體，其中V H 、V L 、重鏈或輕鏈框架區中的其他胺基酸(及其相應的編碼核酸)已突變；但與表3中所述的SEQ ID NO：26-29的一般TNF-α抗體和抗原結合片段胺基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%同一性。
本揭露的其他抗體或其抗原結合片段包括如下抗體或其抗原結合片段，其中CDR中的其他胺基酸(及其相應的編碼核酸)已突變，但CDR區中與表3中所述的SEQ ID NO：26-29的一般TNF-α抗體和抗原結合片段胺基酸序列的CDR區具有至少60%、70%、80%、90%或95%同一性。在一些方面，其包括突變胺基酸序列，其中與表3中所述的SEQ ID NO：26-29的一般TNF-α抗體和抗原結合片段胺基酸序列的CDR區相比，CDR區域中不超過1個、2個、3個、4個或5個其他胺基酸突變。
框架和Fc區的其他改變
本揭露提供了特異性抗TNF-α抗體和其抗原結合片段。該等抗體和片段可以包含對VH和/或VL內的框架殘基的其他修飾，例如以改善抗體的特性。進行此類框架修飾以降低抗體的免疫原性。
例如，一種方法係將一個或多個另外的框架殘基「回復突變」為相應的種系序列。更具體地，已經歷體細胞突變的抗體可以含有與衍生出抗體的種系序列不同的框架殘基。可以藉由將抗體框架序列與衍生出抗體的種系序列進行比較來鑒定此類殘基。為了使框架區序列恢復為其種系構型，可以藉由例如定點誘變將體細胞突變「回復突變」為種系序列。還旨在涵蓋此類「回復突變的」抗體。
另一種類型的框架修飾包括使框架區內或甚至一個或多個CDR區內的一個或多個殘基突變以去除T細胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。此方法也稱為「去免疫化」，並在Carr等人的美國專利公開號2003/0153043中有進一步詳細描述。
除了在框架或CDR區內進行的修飾之外或作為在框架或CDR區內進行的修飾的替代方案，可以將抗體工程化以包含Fc區內的修飾，典型地是為了改變抗體的一種或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外，抗體可以經化學修飾(例如，一個或多個化學部分可以附接於抗體)或經修飾以改變其糖基化，從而再次改變抗體的一種或多種功能特性。下文進一步詳細描述該等方面中的每一個。
在一個方面，修飾CH1的鉸鏈區，使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數量改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等人的美國專利案號5,677,425中進一步描述。改變CH1鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目，以便例如促進輕鏈和重鏈的組裝或增加或降低抗體的穩定性。
在另一個方面，使抗體或片段的Fc鉸鏈區突變以縮短抗體的生物半衰期。更具體地，將一個或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結構域介面區域中，使得抗體具有相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合而言受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。該方法在Ward等人的美國專利案號6,165,745中進一步詳細描述。
在又其他方面，藉由用不同的胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變抗體的效應子功能。例如，可以用不同的胺基酸殘基置換一個或多個胺基酸，使得抗體對效應配位基具有改變的親和力，但保留親本抗體的抗原結合能力。改變親和力的效應配位基可以是例如Fc受體或補體的C1組分。該方法描述於例如Winter等人的美國專利案號5,624,821和5,648,260中。
在另一個方面，選自胺基酸殘基的一個或多個胺基酸可以用不同的胺基酸殘基置換，使得抗體具有改變的C1q結合和/或降低或消除的補體依賴性細胞毒性(CDC)。該方法描述於例如Idusogie等人的美國專利案號6,194,551中。
在另一個方面，改變一個或多個胺基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力。該方法例如描述於Bodmer等人的PCT公開WO 94/29351中。在一個特定方面，對於IgG1亞類和κ同種型，將本公開的抗體或其抗原結合片段的一個或多個胺基酸置換為一個或多個同種異型胺基酸殘基。異型胺基酸殘基也包括但不限於IgG1、IgG2、和IgG3亞類的重鏈的恒定區以及κ同種型的輕鏈的恒定區，如由Jefferis等人，MAbs.[單株抗體]1：332-338(2009)所述的。
在又另一個方面，修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力和/或藉由修飾一個或多個胺基酸來增加抗體對Fcγ受體的親和力。該方法例如描述於Presta的PCT公開WO 00/42072中。此外，已經繪製了人IgG1上針對FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點，並且已經描述了具有改 善的結合的變體(參見Shields等人，J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]276：6591-6604,2001)。
如本文所使用的，術語「ADCC」或「抗體依賴性細胞毒性」活性係指細胞耗竭活性。ADCC活性可以藉由如熟悉該項技術者所熟知的標準ADCC測定來測量。
在還另一個方面，修飾抗體或片段的糖基化。例如，可以製備無糖基化的抗體(即，抗體缺乏糖基化)。可以改變糖基化以例如增加抗體對「抗原」的親和力。此類碳水化合物修飾可以藉由例如改變抗體序列內的一個或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一個或多個胺基酸取代，這消除了一個或多個可變區框架糖基化位點，從而消除了該位點的糖基化。此種無糖基化可以增加抗體對於抗原的親和力。此種方法描述於例如Co等人的美國專利案號5,714,350和6,350,861中。
另外或可替代地，可以製備具有改變的糖基化類型的抗體或片段，如具有減少量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加的二等分GlcNac結構的抗體。已經證明此類改變的糖基化模式增加了抗體的ADCC能力。此類碳水化合物修飾可以藉由例如在具有改變的糖基化機制的宿主細胞中表現抗體來完成。具有改變的糖基化機制的細胞已在本領域中描述，並且可用作宿主細胞，在該宿主細胞中表現重組抗體，從而產生具有改變的糖基化的抗體。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破壞的編碼岩藻糖基轉移酶的FUT8基因的細胞系，使得在此種細胞系中表現的抗體表現出低岩藻糖基化。Presta在PCT公開WO 03/035835中描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞，該細胞將岩藻糖附接至Asn(297)連接的碳水化合物的能力降低，還導致在該宿主細胞中表現的抗體的低岩藻糖基化(還參見Shields等人，2002,J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]277：26733-26740)。Umana等人在PCT公開WO 99/54342中描述了如下細胞系，該細胞系被 工程化以表現糖蛋白修飾性糖基轉移酶(例如，β(1,4)-N乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))，使得在工程化細胞系中表現的抗體顯示出增加的二等分GlcNac結構，該二等分GlcNac結構導致抗體的ADCC活性增加(還參見Umana等人，Nat.Biotech.[自然生物技術]17：176-180,1999)。
在另一個方面，修飾抗體或片段以增加其生物半衰期。可以採用多種方法。例如，可以如Ward的美國專利案號6,277,375中所述，引入以下突變中的一種或多種：T252L、T254S、T256F。可替代地，為了增加生物半衰期，可以在CH1或CL區內改變抗體，以含有取自IgG的Fc區的CH2結構域的兩個環的補救受體結合表位，如Presta等人的美國專利案號5,869,046和6,121,022中所述。
為了使抗體的ADCC活性最小化，Fc區內的特定突變產生了與效應子細胞具有最小相互作用的「Fc緘默」抗體。從總體上看，「IgG Fc區」用來定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，包括天然序列Fc區和變體Fc區。人IgG重鏈Fc區通常上定義為包含IgG抗體的從位置C226或從位置P230至羧基端的胺基酸殘基。Fc區中殘基的編號係卡巴特的EU索引的編號。例如，在抗體的產生或純化期間可以移除Fc區的C端離胺酸(殘基K447)。
緘默的效應子功能可以藉由抗體Fc區的突變獲得，並且在本領域已有描述：LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.[當前生物技術觀點]第20(6)卷：685-691)；和D265A(Baudino等人，2008,J.Immunol.[免疫學雜誌]181：6664-69)，還參見Heusser等人，WO 2012065950。緘默Fc IgG1抗體的實例係LALA突變體，該突變體在IgG1 Fc胺基酸序列中包含L234A和L235A突變。緘默lgG1抗體的另一個實例係DAPA(D265A，P329A)突變(US 6,737,056)。另一種緘默IgG1抗體包含N297A突變，該突變產生無糖基化/非糖基化的抗體。
Fc緘默抗體產生無或低ADCC活性，這意味著Fc緘默抗體表現出的ADCC活性低於50%的特定細胞裂解(低ADCC活性)，或低於1%的特定細胞裂解(無ADCC活性)。
Fc的較佳的修飾包括用於半衰期延長的「LS」突變(M428L、N434S(EU編號))和「YTE」突變(M252Y、S254T、T256E(EU編號))，以及用於效應子緘默的「DAPA」突變(D265A、P329A(EU編號))。
抗體和片段的產生
可以藉由本領域已知的任何手段產生抗TNF-α抗體和其抗原結合片段，該等手段包括但不限於重組表現、化學合成和酶促消化抗體四聚體，而全長單株抗體可以藉由例如雜交瘤或重組產生獲得。重組表現可以來自本領域已知的任何適當的宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本文揭露了編碼本文所述的抗體或抗原結合片段的分離的核酸分子或核酸分子組。在一些實施方式中，分離的核酸分子係互補DNA(cDNA)或信使RNA(mRNA)。
本揭露進一步提供了編碼本文所述的抗體的多核苷酸，例如，編碼包含如本文所述的互補性決定區的重鏈或輕鏈可變區或區段的多核苷酸。
v4抗體和抗原結合片段的V H 和V L 區由表3的SEQ ID NO：17和12的核酸序列編碼。v40抗體和抗原結合片段的V H 和V L 區如表3的SEQ ID NO：17和21的核酸序列所闡述。v4抗體和抗原結合片段的重鏈和輕鏈區由表3的SEQ ID NO：19和14的核酸序列編碼。v40抗體和抗原結合片段的重鏈和輕鏈區由表3的SEQ ID NO：19和23的核酸序列編碼。
在一些方面，編碼V H 的多核苷酸與SEQ ID NO：17的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 或100%核酸序列同一性(表3)。在一些方面，編碼V L 的多核苷酸與SEQ ID NO：12或21的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%核酸序列同一性(表3)。
在一些方面，編碼重鏈的多核苷酸與SEQ ID NO：19的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%核酸序列同一性(表3)。在一些方面，編碼輕鏈的多核苷酸與SEQ ID NO：14或23的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%核酸序列同一性(表3)。
其他較佳的核酸係編碼SEQ ID NO：26-29所闡述的重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈和輕鏈胺基酸序列的核酸，其中任何前述編碼序列中Xaa中的至少一個相對於野生型阿達木單抗突變。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：26所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(V H )，其中SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：28所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(V L )，其中SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：27所闡述的胺基酸序列的重鏈；其中SEQ ID NO：27中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：29所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中SEQ ID NO：29中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些方面，多核苷酸編碼如下多肽，其中SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些方面，多核苷酸編碼如下多肽，其中SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些方面，多核苷酸編碼如下多肽，其中SEQ ID NO：27中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些方面，多核苷酸編碼如下多肽，其中SEQ ID NO：29中Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)，其中該VH在SEQ ID NO：4的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中該VL在SEQ ID NO：11的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈，其中該重鏈在SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中該輕鏈在SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)，其中該VH在IMGT位置36、37、65和107中的一個或多個處突變。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中該VL在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈，其中該重鏈在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變。
在一些方面，多核苷酸編碼包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中該輕鏈在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含具有表1中所闡述突變中的至少一種的VH。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含具有表1中所闡述突變中的至少一種的VL。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含具有表1中所闡述突變中的至少一種的VL和具有表1中所闡述突變中的至少一種的VH。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含具有表1中所闡述突變中的至少一種的重鏈。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含具有表1中所闡述突變中的至少一種的輕鏈。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含具有表1中所闡述突變中的至少一種的重鏈和具有表1中所闡述突變中的至少一種的輕鏈。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含VH，其中所述VH區闡述於表2的行中。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含VL，其中所述VL區闡述於表2的行中。
在一些方面，多核苷酸編碼本揭露的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含VH，其中所述VH區闡述於表2的行中，和VL，其中所述VL區闡述於表2的行中。
本揭露的多核苷酸可以僅編碼抗TNF-α抗體或片段的可變區序列。它們還可以編碼抗體的可變區和恒定區。一些多核苷酸序列編碼包含例證的抗TNF-α抗體或片段的重鏈和輕鏈兩者的可變區的多肽。一些其他多核苷酸編碼分別與該等抗體之一的重鏈可變區和輕鏈可變區基本上相同的兩個多肽區段。
可以藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼抗TNF-α抗體或片段的現有序列來產生該多核苷酸序列。核酸的直接化學合成可以藉由本領域已知的方法完成，諸如Narang等人，Meth.Enzymol.[酶學方法]68：90,1979的磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.[酶學方法]68：109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.[四面體快報],22：1859,1981的二乙基亞磷醯胺法；和美國專利案號4,458,066的固體支持法。藉由PCR向多核苷酸序列引入突變可以如以下文獻中所述進行，例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification[PCR技術：DNA擴增的原理和應用],H.A.Erlich(編),Freeman Press[弗裡曼出版社]，紐約州紐約市[NY,NY],1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和應用指南],Innis等人(編),Academic Press[學 術出版社]，加利福尼亞州聖地牙哥[San Diego,CA],1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]19：967,1991；以及Eckert等人，PCR Methods and Applications[PCR方法和應用]1：17,1991。
在本揭露中還提供了用於產生上文描述的抗TNF-α抗體和片段的表現載體和宿主細胞。本文揭露了選殖和表現載體，該載體包含編碼上述抗TNF-α抗體和片段的一個或多個核酸分子或核酸分子組，其中該載體適合於重組產生該抗體或其抗原結合片段。
可以使用各種表現載體來表現編碼所揭露的抗TNF-α抗體和片段的多核苷酸。基於病毒和非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體和系統包括質體、附加型載體(典型地具有用於表現蛋白質或RNA的表現盒)以及人類人工染色體(參見例如，Harrington等人，Nat Genet.[自然遺傳學]15：345,1997)。例如，可用於在哺乳動物(例如，人)細胞中表現抗TNF-α抗體和片段的多核苷酸和多肽的非病毒載體包括pThioHis A、pThioHis B和pThioHis C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A、pEBVHis B和pEBVHis C(加利福尼亞州聖地牙哥市英傑公司(Invitrogen,San Diego,CA))，MPSV載體和本領域中已知用於表現其他蛋白質的多種其他載體。有用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒的載體，基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP愛巴病毒(HBP Epstein Barr virus)的載，牛痘病毒載體和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)。參見，Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.[微生物學年度評論]49：807,1995；和Rosenfeld等人，Cell[細胞]68：143,1992。
表現載體的選擇取決於要表現該載體的預期宿主細胞。典型地，表現載體含有與編碼抗TNF-α抗體或其片段的多核苷酸可操作地連接的啟動子和其他調節序列(例如，增強子)。在一些方面，採用誘導型啟動子以防止插入的序列在誘導條件之外的條件下表現。誘導型啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、 金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。可以在非誘導條件下、而不在偏向宿主細胞更好耐受其表現產物的編碼序列的群體的情況下擴大經轉化的生物體的培養。除了啟動子之外，還可能需要或期望其他調節元件以高效表現抗TNF-α抗體或其片段。該等元件典型地包括ATG起始密碼子和相鄰的核糖體結合位點或其他序列。此外，可以藉由包括適合於使用的細胞系統的增強子提高表現效率(參見例如，Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.[細胞分化中的結果和問題]20：125,1994；和Bittner等人，Meth.Enzymol.[酶學方法],153：516,1987)。例如，SV40增強子或CMV增強子可以用來增加哺乳動物宿主細胞中的表現。
表現載體還可以提供分泌訊息序列位置，以與由插入的抗TNF-α抗體或片段序列編碼的多肽形成融合蛋白。更常見的是，將插入的抗TNF-α抗體或片段序列在包括在載體中之前與訊息序列連接。用於接受編碼抗TNF-α抗體或片段VH和VL的序列的載體有時也編碼恒定區或其部分。此類載體允許將可變區表現為與恒定區的融合蛋白，從而產生完整抗體或其片段。典型地，此類恒定區係人恒定區。
本文揭露了包含一種或多種本文所述的選殖或表現載體的宿主細胞。用於容納和表現抗TNF-α抗體或片段鏈的宿主細胞可以是原核或真核的。大腸桿菌係一種可用於選殖並表現本揭露的多核苷酸的原核宿主。適合使用的其他微生物宿主包括芽孢桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷菌屬(Serratia)和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)種。在該等原核宿主中，還可以製備表現載體，該表現載體典型地含有與宿主細胞相容的表現控制序列(例如，複製的起點)。此外，存在任何數量的多種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子典型地視需要使用操縱子序列控制表現，並且具有核糖體結合位點序列等，以用於啟 動和完成轉錄和翻譯。其他微生物，諸如酵母，也可以用來表現抗TNF-α抗體或其片段。也可以使用與桿狀病毒載體組合的昆蟲細胞。
在其他方面，使用哺乳動物宿主細胞表現和產生本揭露的抗TNF-α抗體或片段。例如，它們可以是表現內源免疫球蛋白基因的雜交瘤細胞系(例如，骨髓瘤雜交瘤殖株)或含有外源表現載體的哺乳動物細胞系。該等包括任何正常非永生的或正常或異常的永生動物或人細胞。例如，已經開發了許多能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞和雜交瘤。利用哺乳動物組織細胞培養物表現多肽在例如Winnacker,From Genes to Clones[從基因到殖株],VCH Publishers[VCH出版社],N.Y.,N.Y.[紐約州紐約市],1987中進行了大體論述。用於哺乳動物宿主細胞的表現載體可以包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子和增強子(參見例如，Queen等人，Immumol.Rev.[免疫學評論]89：49-68,1986)，和必要的加工資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有源自哺乳動物基因或源自哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可以是組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的和/或可調控的或可調節的。可用啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松(dexamethasone)誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素誘導型CMV啟動子(諸如人立即早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-增強子組合。
用於引入含有感興趣的多核苷酸序列的表現載體的方法根據細胞宿主的類型而變化。例如，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可以用於其他細胞宿主(通常參見Sambrook等人，同上)。其他方法包括，例如，電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導的轉化、注射和顯微注射、生物轟擊法、 病毒體、免疫脂質體、聚陽離子：核酸軛合物(conjugate)、裸DNA、人工病毒體、與皰疹病毒結構蛋白VP22融合(Elliot和O'Hare,Cell[細胞]88：223,1997)、試劑增強的對DNA的吸收和離體轉導。對於重組蛋白的長期高產量生產，通常期望穩定的表現。例如，可以使用含有病毒複製起點或內源性表現元件和選擇性標記基因的表現載體來製備穩定表現抗TNF-α抗體或片段鏈的細胞系。在引入載體後，可以使細胞在富集培養基中生長1天-2天，然後將它們轉換為選擇性培養基。選擇性標記的目的是賦予選擇抗性，並且它的存在允許在選擇性培養基中成功地表現引入的序列的細胞生長。可以使用適合於細胞類型的組織培養技術來增殖抗性、穩定轉染的細胞。
在一些實施方式中，抗TNF-α抗體片段由單個核酸所編碼的單個多肽鏈構成，該單個核酸可以插入單個選殖或表現載體中。在其他實施方式中，抗TNF-α抗體或其片段由超過一種核酸所編碼的兩條多肽鏈構成，該核酸在本文中稱為「核酸分子組」。在一些實施方式中，將編碼第一鏈的核酸插入第一選殖或表現載體中，並將編碼第二鏈的核酸插入第二選殖或表現載體中。在該情況下，抗TNF-α抗體或其片段藉由選殖或表現載體組表現。可替代地，可以將兩種核酸都插入單個選殖或表現載體中。
本文揭露了一種產生本文所述的抗體和抗原結合片段之方法，該方法包括在足以表現所述抗體或其抗原結合片段的條件下培養本文所述的宿主細胞，之後從宿主細胞培養物純化和回收所述抗體或其抗原結合片段為一條多核苷酸鏈。
產生單株抗體的轉染瘤的產生
可以使用例如本領域中熟知的重組DNA技術和基因轉染方法的組合，在宿主細胞轉染瘤中產生本揭露的抗體(例如，Morrison,S.1985,Science[科學]229：1202)。
例如，為了表現抗體或其抗體片段，可以藉由標準分子生物學或生物化學技術(例如，使用表現感興趣的抗體的雜交瘤的DNA化學合成、PCR擴增或cDNA選殖)獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，並且可以將該等DNA插入表現載體中，使得將基因可操作地連接至轉錄和翻譯控制序列。在該上下文中，術語「可操作地連接」旨在指，將抗體基因連接至載體中，使得載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮其調節抗體基因的轉錄和翻譯的預期功能。表現載體和表現控制序列經選擇以與所用的表現宿主細胞相容。可以將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入單獨的載體中，或者更典型地，將兩種基因都插入同一表現載體中。藉由標準方法將抗體基因插入表現載體中(例如，連接抗體基因片段和載體上的互補限制位點，或如果不存在限制位點則進行鈍端連接)。本文所述抗體的輕鏈和重鏈可變區可以藉由以下方式用於產生任何抗體同種型的全長抗體基因：將該等輕鏈和重鏈可變區插入已經編碼所需同種型的重鏈恒定區和輕鏈恒定區的表現載體中，使得VH區段可操作地連接至載體內的一個或多個CH區段，並且VL區段可操作地連接至載體內的CL區段。另外或可替代地，該重組表現載體可以對協助該抗體鏈從宿主細胞中分泌的訊息肽(所謂的前導序列)進行編碼。可以將抗體鏈基因選殖至載體中，使得訊息肽框內連接至抗體鏈基因的胺基末端。該訊息肽可以是免疫球蛋白訊息肽或異源訊息肽(即，來自非免疫球蛋白的訊息肽)。
除了抗體鏈基因以外，本揭露的重組表現載體攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中的表現的調節序列。術語「調節序列」旨在包括啟動子、增強子和控制抗體鏈基因的轉錄或翻譯的其他表現控制元件(例如，多聚腺苷酸化信號)。此類調節序列描述於例如Goeddel 1990,Gene Expression Technology[基因表現技術].Methods in Enzymology[酶學方法]185,Academic Press[學術出版社],San Diego,CA[加利福尼亞州聖地牙哥市]中。熟悉該項技術者將理解，表現載體 的設計，包括調節序列的選擇，可取決於諸如待轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白質的表現水平等的因素。用於哺乳動物宿主細胞表現的調節序列包括引導哺乳動物細胞中高水平蛋白質表現的病毒元件，諸如源自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤的啟動子和/或增強子。可替代地，可以使用非病毒調節序列，諸如泛素啟動子或P-球蛋白啟動子。仍進一步，調節元件由來自不同來源的序列構成，如SRa啟動子系統，其含有來自SV40早期啟動子的序列以及人T細胞白血病病毒1型的長末端重複序列(Takebe,Y.等人，1988 Mol.Cell.Biol.[分子細胞生物學]8：466-472)。
除了抗體鏈基因和調控序列以外，本揭露的重組表現載體可以攜帶另外的序列，如調控載體在宿主細胞中的複製的序列(例如，複製起點)和選擇性標記基因。選擇性標記基因促進對已經引入載體的宿主細胞的選擇(參見例如，美國專利案號4,399,216、4,634,665和5,179,017，都屬於Axel等人)。例如，典型地，選擇性標記基因為已經引入載體的宿主細胞賦予對藥物諸如G418、潮黴素或胺甲喋呤的抗性。選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於進行胺甲喋呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞中)和neo基因(用於G418選擇)。
為了表現輕鏈和重鏈，使用標準技術用編碼重鏈和輕鏈的一種或多種表現載體轉染宿主細胞。不同形式的術語「轉染」旨在涵蓋多種通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞的技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染等。在原核或真核宿主細胞中表現本揭露的抗體在理論上係可能的。討論了抗體在真核細胞，例如哺乳動物宿主細胞、酵母或絲狀真菌中的表現，因為此類真核細胞，並且特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能組裝和分泌正確折疊且有免疫活性的抗體。
在一個特定實施方式中，根據本揭露的選殖或表現載體包含與合適啟動子序列可操作地連接的本揭露核酸編碼序列中的至少一種。
在一個特定實施方式中，根據本揭露的選殖或表現載體包含編碼具有如表2所闡述的VL的本揭露抗體或抗原結合片段的核酸。
在一個特定實施方式中，根據本揭露的選殖或表現載體包含編碼具有如表2所闡述的VH的本揭露抗體或抗原結合片段的核酸。
在一個特定實施方式中，根據本揭露的選殖或表現載體包含編碼具有如表2的行中所闡述的VH和VL的本揭露抗體或抗原結合片段的一種或多種核酸。
在一個特定實施方式中，根據本揭露的選殖或表現載體包含與合適啟動子序列可操作地連接的表3的核酸序列中的至少一種。
在一個特定實施方式中，根據本揭露的選殖或表現載體包含與合適啟動子序列可操作地連接的SEQ ID NO：12、14、17、19、21、23中的至少一種。
在一個特定實施方式中，根據本揭露的選殖或表現載體包含編碼SEQ ID NO：26-29中至少一種的至少一種核酸，該核酸與合適的啟動子序列可操作地連接，其中任何上述編碼序列中的Xaa相對於野生型阿達木單抗突變。
用於表現本揭露的重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub和Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]77：4216-4220中，該細胞與DH FR選擇性標記一起使用，例如如R.J.Kaufman和P.A.Sharp 1982,Mol.Biol.[分子生物學]159：601-621中所述)、CHOK1 dhfr+細胞系、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。特別地，為用於NSO骨髓瘤細胞，另一種表現系統係PCT公開WO 87/04462、WO 89/01036和EP 0 338 841中所示的GS基因表現系統。在一個實施 方式中，用於表現本揭露的重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括缺乏FUT8基因表現的哺乳動物細胞系，例如，如美國專利案號6,946,292中所述。
在將編碼抗體基因的重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養足以允許在宿主細胞中表現該抗體或將抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中的時間段來產生抗體。可以使用標準蛋白質純化方法從培養基回收抗體(參見，例如Abhinav等人2007,Journal of Chromatography[層析雜誌]848：28-37)。
在一個特定實施方式中，本揭露的宿主細胞係用如下一或多種表現載體轉染的宿主細胞，該表現載體具有編碼表3的v4或v40抗體或其抗原結合片段的VH和/或VL胺基酸序列的一種或多種核酸，該宿主細胞適用於表現其中的任何變體，該核酸與合適的啟動子序列可操作地連接。在一個特定實施方式中，本揭露的宿主細胞係用如下一或多種表現載體轉染的宿主細胞，該表現載體具有編碼表3的v4或v40抗體或其抗原結合片段的重鏈和輕鏈胺基酸序列的一種或多種核酸，該宿主細胞適用於表現其中的任何變體，該核酸與合適的啟動子序列可操作地連接。在一個特定實施方式中，本揭露的宿主細胞係用如下一或多種表現載體轉染的宿主細胞，該表現載體具有選自SEQ ID NO：12、14、17、19、21和23的一種或多種核酸，該宿主細胞適用於表現v4和v40抗體和片段，該核酸與合適的啟動子序列可操作地連接。
在一個實施方式中，本揭露的宿主細胞係用如下一或多種表現載體轉染的宿主細胞，該表現載體具有編碼本揭露的抗體或抗原結合片段的一種或多種核酸。
在一個特定實施方式中，本揭露的宿主細胞係用如下一或多種表現載體轉染的宿主細胞，該表現載體具有編碼本揭露的具有如表2所闡述的VH的 抗體或其抗原結合片段的一種或多種核酸，該宿主細胞適用於表現該抗體或抗原結合片段，該核酸與合適的啟動子序列可操作地連接。
在一個特定實施方式中，本揭露的宿主細胞係用如下一或多種表現載體轉染的宿主細胞，該表現載體具有編碼本揭露的具有如表2所闡述的VL的抗體或其抗原結合片段的一種或多種核酸，該宿主細胞適用於表現該抗體或抗原結合片段，該核酸與合適的啟動子序列可操作地連接。
在一個特定實施方式中，本揭露的宿主細胞係用如下一或多種表現載體轉染的宿主細胞，該表現載體具有編碼本揭露的具有如表2的行中所闡述的VH和VL的抗體或其抗原結合片段的一種或多種核酸，該宿主細胞適用於表現該抗體或抗原結合片段，該核酸與合適的啟動子序列可操作地連接。
在一個特定實施方式中，本揭露的宿主細胞係用具有表3的至少一種核酸的至少一種表現載體轉染的宿主細胞，該宿主細胞適用於表現本揭露的抗體或抗原結合片段，該核酸與合適的啟動子序列可操作地連接。
然後可以在合適的條件下進一步培養該等宿主細胞，以表現並產生本揭露的抗體或抗原結合片段。
免疫軛合物
在另一個方面，本發明的特徵在於與活性或治療部分，諸如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素軛合的本揭露的抗TNF-α抗體或其片段。此類軛合物在本文中稱為「免疫軛合物」。
包含一種或多種細胞毒素的免疫軛合物稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括有害於(例如，殺死)細胞的任何藥劑。實例包括紫杉酚(taxon)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼 (vinblastine)、秋水仙素(t.colchicin)、阿黴素(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoids)、普羅卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、和嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑還包括例如抗代謝物(例如胺甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶胺烯咪胺)、消融劑(例如氮芥(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chloraxnbucil)、美法侖(meiphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐星(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)和順式二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑、蒽環類(例如，柔紅黴素(doxorubicin)(舊稱道諾黴(daunomycin))和多柔比星(doxorubicin))、抗生素類(例如更生黴素(dactinomycin)(舊稱放線菌素素(actinomycin))、博來黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)和安麯黴素(anthramycin)(AMC))以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼和長春花鹼)。
可以使用本領域可用的連接子(linker)技術將細胞毒素軛合到本揭露的抗體。已經用來將細胞毒素與抗體軛合的連接子類型的實例包括但不限於腙、硫醚、酯、二硫化物以及包含肽的連接子。可以選擇例如易於被溶酶體分隔區內低pH剪切或易於被蛋白酶(如優先在腫瘤組織中表現的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D))剪切的連接子。
關於細胞毒素類型、連接子和使治療劑與抗體軛合的方法的進一步討論，還請參見Saito,G.等人2003,Adv.Drug Deliv.Rev.[先進藥物遞送評論]55：199-215；Trail,P.A.等人2003,Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫學和免 疫治療]52：328-337；Payne,G.2003,Cancer Cell[癌細胞]3：207-212；Allen,T.M.2002,Nat.Rev.Cancer[自然綜述-癌症]2：750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J 2002,Curr.Opin.Investig.Drugs[當前研究藥物觀點]3：1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.2001,Adv.Drug Deliv.Rev.[先進藥物遞送評論]53：247-264。
本揭露的抗體也可以與放射性同位素軛合以產生細胞毒性放射藥物，也稱作放射免疫軛合物。可以與抗體軛合的用於診斷或治療性用途的放射性同位素的實例包括但不限於碘131、銦111、釔90和鑥177。本領域中建立了用於製備放射免疫軛合物的方法。放射免疫軛合物的實例係可商業獲得的，包括ZEVALIN(DEC製藥公司(DEC Pharmaceuticals))和BEXXAR(寇里克薩製藥公司(Corixa Pharmaceuticals))，並且可以利用本揭露的抗體使用類似方法來製備放射免疫軛合物。
本揭露的抗體軛合物可用於修飾給定的生物反應，並且藥物部分不被解釋為限於經典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是擁有所希望的生物活性的蛋白或多肽。此類蛋白可以包括例如，酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白，例如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或，生物反應修飾劑，諸如像淋巴因子、白細胞介素-1(「IL-1」)、白細胞介素-2(「IL-2」)、白細胞介素-6(「IL6」)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(「GM-CSF」)、粒細胞集落刺激因子(「G-CSF」)，或其他生長因子。
用於將此類治療部分與抗體軛合的技術係公知的，參見例如，Amon等人1985,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"[癌症療法中用於藥物免疫靶向的單株抗體],Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy[單株抗體和癌症療法],Reisfeld等人，(編)，第243-56頁；Hellstrom等人1987,"Antibodies For Drug Delivery[用於藥物遞送的抗體]"，在Controlled Drug Delivery[藥物控制釋放](第2版),Robinson等人(編)，第623-53頁；Thorpe 1985,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review[癌症療法中細胞毒性劑的抗體載劑：評論]」,Monoclonal Antibodies[單株抗體]84：Biological And Clinical Applications[生物和臨床應用],Pinchera等人(編)，第475-506頁；Thorpe等人1982,Immunol.Rev.[免疫學綜述]62：119-58。
套組
本揭露還涵蓋用於治療患有由TNF-α介導的病理性障礙，例如自體免疫疾病或者炎性障礙或病症的患者的套組。此類套組包含治療有效量的根據本揭露的TNF-α抗體或其抗原結合片段，例如v4或v40(理想地作為藥物組成物的一部分)。另外，此類套組可以包含用於投與TNF-α抗體或抗原結合片段的工具(例如，自動注射器、注射筒和小瓶、預填充的注射筒、預填充筆)以及使用說明書。該等套組可以含有用於治療由TNF-α介導的病理性障礙，例如自體免疫疾病或者炎性障礙或病症的其他治療劑(如下所述)。此類套組還可包含用於投與TNF-α抗體或其抗原結合片段以治療患者的說明書。此類說明書可以提供用於所封閉的TNF-α抗體或抗原結合片段，例如v4或v40的劑量、投與途徑、方案和總治療持續時間。
短語「用於投與的工具」用於指示用於向患者系統地投與藥物的任何可用的工具，包括但不限於預填充的注射器、小瓶和注射器、注射筆、自動注射器、Ⅳ注射槽和注射袋、泵等。使用此類物品，患者可以自我投與藥物(即，在沒有醫生的幫助下投與用藥物)或醫生可以投與藥物。
本文揭露了包含如本文所述的抗體或抗原結合片段或藥物組成物的套組，其中該套組還包含使用說明書和用於向有需要的受試者投與所述抗體或其抗原結合片段或所述藥物組成物的工具。
治療和診斷用途
本揭露的抗體或蛋白質具有體外和體內診斷和治療用途。例如，可以投與培養中(例如體外或體內)或個體中(例如體內)的細胞該等分子來治療、預防或診斷多種障礙。
本文揭露了診斷試劑，該診斷試劑包含本文所述的抗體或抗原結合片段和診斷標記。
在一個方面，抗體或其抗原結合片段可用於檢測生物樣本中TNF-α的存在。如本文所用，術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些方面，生物樣本包含細胞或組織。在某些方面，此類組織包括正常組織和/或相對於其他組織表現較高水平TNF-α的癌性組織。
在一個方面，本揭露提供了一種檢測生物樣本中TNF-α的存在的方法。在某些方面，該方法包括使生物樣本與TNF-α抗體或片段在允許抗體與抗原結合的條件下接觸，和檢測抗體與抗原之間是否形成複合物。生物樣本可以包括但不限於尿液或血液樣本。
還包括一種診斷與TNF-α表現相關的障礙的方法。在某些方面，該方法包括使測試細胞與抗TNF-α抗體或片段接觸；藉由檢測抗體與TNF-α的結合來測定測試細胞中TNF-α的表現水平(定量或定性)；和比較測試細胞中TNF-α的表現水平與對照細胞(例如，與測試細胞具有相同組織來源的正常細胞或非病毒感染細胞)中TNF-α的表現水平，其中與對照細胞相比，測試細胞中TNF-α的較高存在水平指示存在與TNF-α相關的障礙。在某些方面，測試細胞獲自懷疑患有由TNF-α介導的病理性障礙的個體。
在某些方面，診斷或檢測方法諸如上述方法包括例如使用「FACS」測定檢測TNF-α抗體或片段與細胞的結合。
可以使用某些其他方法來檢測TNF-α抗體或片段的結合。此類方法包括但不限於本領域中已知的抗原結合測定，如諸如西方印跡(Western blot)、 放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、「夾心」免疫測定、免疫沈澱測定、螢光免疫測定、蛋白A免疫測定和免疫組織化學(IHC)。
在某些方面，標記TNF-α抗體或片段。標記包括但不限於直接檢測到的標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及間接檢測到(例如藉由酶促反應或分子相互作用)的部分，諸如酶或配位基。
在某些方面，將TNF-α抗體或片段固定在不溶性基質上。固定需要將抗TNF-α抗體或片段與溶液中游離的任何蛋白質分離。常規地，這係藉由如下方法來完成的：在測定程序之前使TNF-α抗體或片段不溶解，例如藉由吸附到水不溶性基質或表面上(Bennich等人，美國專利案號3,720,760)，或共價偶聯(例如使用戊二醛交聯)，或在TNF-α抗體或片段與TNF-α之間形成複合物後，例如藉由免疫沈澱，使TNF-α抗體或片段不溶解。
可以使用本揭露的TNF-α抗體或片段替代另一種TNF-α抗體或片段(例如，阿達木單抗)或除另一種TNF-α抗體或片段(例如，阿達木單抗)以外使用本揭露的TNF-α抗體或片段來進行診斷或檢測的任何上述方面。
本揭露的抗體和抗體片段(例如，抗原結合片段)可用於治療由TNF-α介導的病理性障礙、降低該病理性障礙的可能性或改善該病理性障礙。
本文另外揭露了本文所述的抗體或其抗原結合片段或藥物組成物用於治療由TNF-α介導的病理性障礙之用途。在一些實施方式中，將本文所述的抗體或其抗原結合片段或藥物組成物用於與一種或多種其他治療劑組合使用。
本文另外揭露了如本文所述的抗體或其抗原結合片段或藥物組成物在製備用於治療由TNF-α介導的病理性障礙的藥物中之用途。在一些實施方 式中，具有如本文所述的抗體或其抗原結合片段或藥物組成物的藥物用於與一種或多種其他治療劑組合使用。
本文另外揭露了一種治療由TNF-α介導的病理性障礙的方法，所述方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的如本文所述的抗體或其抗原結合片段或藥物組成物。在一些實施方式中，將本文如所述的抗體或其抗原結合片段或藥物組成物與一種或多種其他治療劑一起投與至受試者。
短語「由TNF-α介導的病理性障礙」涵蓋如下所有疾病和醫學病症，其中TNF-α直接或間接地引起該疾病或醫學病症，包括疾病或病症的原因、發展、進展、持續或病理。因此，該等術語包括與異常TNF-α水平相關或以其為特徵的病症和/或可以藉由降低或抑制靶標細胞或組織中TNF-α誘導的活性(例如，IL-1、IL-6的產生)來治療的疾病或病症。其包括自體免疫疾病和炎性障礙或病症，諸如關節炎、類風濕性關節炎或牛皮癬。其還包括過敏和過敏病症、超敏反應、慢性阻塞性肺病、囊性纖維化和器官或組織移植排斥。
例如，本揭露的抗體或片段可以用於治療心臟、肺、組合的心肺、肝、腎、胰腺、皮膚或角膜移植物的受者，包括同種異體移植排斥或異種移植排斥，以及用於預防移植物抗宿主疾病，諸如在骨髓移植後，和器官移植相關的動脈硬化。
本揭露的抗體或片段可用於(但不限於)治療、預防或改善自體免疫疾病和/或炎性病症和障礙，特別是病因包括自體免疫組分的炎性病症，諸如關節炎(例如類風濕性關節炎、慢性進行性關節炎和變形性關節炎)和風濕病，包括涉及骨質流失的炎性病症和風濕病，炎性疼痛，脊柱關節病，包括強直性脊柱炎，賴特綜合症，反應性關節炎，牛皮癬性關節炎，青少年特發性關節炎和腸病性關節炎，附著點炎，超敏反應(包括氣道超敏反應和皮膚超敏反應兩者)以及過敏。
本揭露的抗體或片段還可用於治療、預防或改善關節炎，較佳的是類風濕性關節炎、慢性漸進性關節炎、反應性關節炎、牛皮癬性關節炎、腸病性關節炎和變形性關節炎；風濕病；脊柱關節病；強直性脊柱炎；青少年牛皮癬；青少年特發性關節炎；賴特綜合症；超敏反應(包括氣道超敏反應和皮膚超敏反應兩者)；過敏；狼瘡(全身性紅斑狼瘡、SLE或狼瘡腎炎)；炎性肌肉障礙；多發性軟骨炎；硬化瘤；韋格納肉芽腫(Wegener granulomatosis)；皮肌炎；特發性口炎性腹瀉；史蒂芬-詹森綜合症(Steven-Johnson syndrome)；慢性活動性肝炎；重症肌無力；牛皮癬；特發性口炎性腹瀉；自體免疫性炎性腸病；潰瘍性結腸炎；克羅恩氏病(Crohn's disease)；腸易激綜合症；內分泌性眼病；格雷夫氏病(Grave's disease)；；筋膜類肉瘤病；多發性硬化；原發性膽汁性肝硬化；青少年糖尿病(I型糖尿病)；自體免疫血液學障礙；溶血性貧血；再生障礙性貧血；純紅血球性貧血；特發性血小板減少；眼色素層炎(前眼色素層炎、後眼色素層炎)；乾燥性角膜結膜炎；春季角膜結膜炎；纖維化；肺間質纖維化；特發性間質性肺炎；腎小球腎炎(有和沒有腎病症候群)；特發性腎病症候群或微小病變性腎病；腫瘤；皮膚炎性疾病；角膜炎症；肌炎；骨骼植入物鬆弛；代謝失調；動脈粥樣硬化；糖尿病和血脂異常；骨質流失；骨關節炎；骨質疏鬆症；阻塞性或炎性氣道疾病；氣喘；支氣管炎；塵肺；肺氣腫；急性和超急性炎性反應；急性感染；敗血性休克；內毒素性休克；成人呼吸窘迫症候群；腦膜炎；肺炎；嚴重燒傷；惡病質消耗綜合症；中風；白塞氏病(Bechet's disease)；皰疹性基質性角膜炎；化膿性汗腺炎；敗血症；視神經脊髓炎；皮膚感染；惡病質；慢性阻塞性肺病；心臟衰竭；川崎病(Kawasaki disease)；橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)；局部缺血；梗死；肛瘻；魚鱗癬；痤瘡；白斑病；斑禿；特應性皮炎；血管炎；毛髮苔癬；條紋狀苔癬；泛發性膿皰性牛皮癬；肌腱病；中小血管原發性血管炎；細支氣管炎；大血管血管炎，包括巨大細胞性動 脈炎；風濕性多肌痛；假體周圍骨質溶解；腎小球腎炎(有和沒有腎病症候群，例如，包括特發性腎病症候群或微小病變性腎病)；多發性骨髓瘤；其他類型的腫瘤、癌症；皮脂漏；胸腺瘤；原發性膽汁性肝硬化(PBC)；硬皮病；自體免疫性甲狀腺病；多發性肌炎；休格倫氏症(Sjögren's syndrome)；惡性貧血；特發性血小板減少性紫癜(ITP)；骨骼植入物鬆弛；代謝失調(諸如，肥胖、動脈粥樣硬化和其他心血管疾病，包括擴張型心肌炎、II型糖尿病和血脂異常)；愛迪生氏病(Addison's disease)；全身性硬化；自身炎性發熱綜合症；血液學障礙(包括例如，溶血性貧血、再生障礙性貧血、自體免疫性溶血性貧血(AIHA)、純紅血球性貧血和特發性血小板減少症)；皰疹樣皮炎；紅斑性天皰瘡；壞疽性膿皮病；魚鱗癬；毛孔性紅糠疹；酒渣(例如，膿疱性丘疹樣酒渣)；扁平苔蘚；過敏性接觸性皮炎；病毒感染和病毒感染的併發症(例如，人乳頭瘤病毒(HPV))；硬斑病；乾眼病；炎性肌肉疾病；自體免疫性外周神經病；動脈粥樣硬化血栓形成；自身炎性發熱綜合症；皮膚和黏膜大皰性疾病；骨新陳代謝疾病，包括骨關節炎、骨質疏鬆症和其他炎性關節炎；以及一般的骨質流失，包括與年齡有關的骨質流失，特別是牙周病、慢性念珠菌病和其他慢性真菌病。
在解剖學上，眼色素層炎可以是前眼色素層炎、中間眼色素層炎、後眼色素層炎或全眼色素層炎。其可以是慢性或急性的。眼色素層炎的病因可以是自體免疫性的或非感染性的，感染性的，與全身性疾病相關或白點綜合症。
在一個方面，本揭露提供了一種治療由TNF-α介導的病理性障礙，降低該病理性障礙的可能性或改善該病理性障礙的可能性之方法，該方法包括向患者投與本文揭露的抗體、抗體片段(例如，抗原結合片段)。在某些方面，由TNF-α介導的病理性障礙係自體免疫疾病或者炎性障礙或病症。以下病症清單包含用根據本揭露的抗體或其抗原結合部分治療的特別較佳的靶標：牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、軸突性脊椎關節炎和類風濕性關節炎。
組合療法
在某些情況下，將本揭露的抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)與一種或多種其他治療劑組合，該其他治療劑諸如其他抗病毒劑、抗過敏劑、抗噁心劑(或抗嘔劑)、鎮痛藥、細胞保護劑、免疫抑制劑及其組合。
如本文所用的術語「藥物組合」係指呈一個劑量單位形式的固定組合、或用於組合投與的非固定組合或多組分套組，其中兩種或更多種治療劑可以在同一時間獨立地投與或在時間間隔內單獨地投與，特別是在該等時間間隔允許組合配偶體顯示協作(例如協同)效應的情況下。
本揭露的抗體或片段可以與用於治療各種疾病、障礙和病症的其他藥劑和療法(本文中的「其他治療劑」)組合使用。
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療本揭露中描述的治療性病症或感染。這種投與涵蓋以基本上同時的方式共同投與該等治療劑，諸如以具有固定比率的活性成分的單個膠囊投與。可替代地，此種投與涵蓋在多個容器中或在每種活性成分的獨立容器(例如，膠囊、粉末和液體)中共同投與。可以將粉末和/或液體在投與之前重構或稀釋到所希望的劑量。此外，此種投與也涵蓋在大致相同的時間或在不同的時間以依序方式使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將在治療本文所述的病症或障礙中提供藥物組合的有益作用。
組合療法可提供「協同作用」並證明係「協同的」，即，當活性成分一起使用時實現的作用大於單獨使用各組分所產生的作用的總和。當活性成分為下述情形時可以獲得協同作用：(1)共同配製並以組合的單位劑量配製物的形式同時投與或遞送；(2)以單獨配製物的形式交替或平行遞送；或(3)藉由某種其他方案遞送。當以交替療法遞送時，可以在依序(例如藉由在單獨注射筒中不同的注射)投與或遞送單個組分時獲得協同作用。通常，在交替療法期間， 將有效劑量的每種活性成分依序地即順次地投與，而在組合療法中，將有效劑量的兩種或更多種活性成分一起投與。
在一個方面，本揭露提供了一種治療如本文所揭露的疾病或障礙之方法，該方法藉由向有需要的受試者投與抗TNF-α抗體或片段與其他治療劑的組合以例如治療或預防上述疾病來完成。
例如，本揭露的抗體可以與以下藥物組合使用：改良疾病的抗風濕藥(DMARD)，例如，金鹽、柳氮磺吡啶、抗瘧藥、胺甲喋呤、D-青黴胺、硫唑嘌呤、黴酚酸、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、米諾環素(minocycline)、來氟米特(leflunomide)、糖皮質激素；鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如環孢素A或FK 506；淋巴細胞再循環的調節劑，例如FTY720和FTY720類似物；mTOR抑制劑，例如雷帕黴素(rapamycin)、40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制特性的子囊黴素，例如ABT-281、ASM981等；皮質類固醇；環磷醯胺；硫唑嘌呤；來氟米特；咪唑立賓(mizoribine)；黴酚酸
Figure 108146225-A0202-12-0080-75
啉基乙酯；15-去氧精胍菌素或其免疫抑制性相似物、類似物或衍生物；免疫抑制性單株抗體，例如針對白血球受體的單株抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配位基；其他免疫調節化合物，例如重組結合分子，該重組結合分子具有CTLA4的細胞外結構域的至少一部分或其突變體，例如CTLA4中與非CTLA4蛋白質序列例如CTLA4Ig(例如指定為ATCC 68629)或其突變體例如LEA29Y接合的至少細胞外部分或其突變體；黏附分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或ICAM-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或化學治療劑，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑、多柔比星(doxorubicin)或5-氟尿嘧啶；其他抗TNF劑，例如TNF的單株抗體，例如英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗、CDP870，或TNF-RI或TNF-RII的受體構 建體，例如依那西普(Etanercept)、PEG-TNF-RI；促炎細胞介素的阻滯劑，IL-1阻滯劑，例如阿那白滯素或IL-1陷阱、卡那單抗(canakinumab)，IL-13阻滯劑，IL-4阻滯劑，IL-6阻滯劑，IL-17阻滯劑(諸如蘇金單抗(secukinumab)、布魯達路單抗(broadalumab)、伊克斯祖單抗(ixekizumab))；趨化因子阻滯劑，例如蛋白酶例如金屬蛋白酶的抑制劑或活化劑，抗IL-15抗體，抗IL-6抗體，抗IL-4抗體，抗IL-13抗體，抗CD20抗體，NSAID，諸如阿司匹林或抗感染劑(清單不限於所提及的藥劑)。
根據前述內容，本揭露在又另一個方面提供了一種如上所定義之方法，該方法包括例如同時或依序共同投與治療有效量的如本文所揭露的抗TNF-α抗體或其抗原結合部分，以及至少一種其他治療劑，該其他治療劑係免疫抑制藥、免疫調節藥、抗炎藥、化學治療藥或抗感染藥，例如如上所述。作為套組的一部分，可以將其他治療劑與抗TNF-α抗體或其抗原結合部分一起提供。
當本文所揭露的抗體或其抗原結合部分與免疫抑制療法、免疫調節療法、抗炎療法、化學療法或抗感染療法聯合投與時，共同投與的組合化合物的劑量將根據所用共藥物的類型，例如無論其為DMARD、抗IL-17抗體、IL-1阻滯劑或其他類型；所用特定藥物；所治療的病症等而變化。
藥物組成物
本文揭露了藥物組成物，該藥物組成物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑。
本文揭露了藥物組成物，該藥物組成物包含如本文所述的抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種其他治療劑。
為了製備包括抗TNF-α抗體或其片段的藥物或無菌組成物，將本揭露的抗體或片段與藥學上可接受的載劑或賦形劑混合。該組成物可以另外含有一種或多種適用於降低樣本或患者中的TNF-α活性的其他治療劑。
術語「藥物組成物」係指至少一種活性成分(例如，本揭露的抗體或片段)和至少一種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑的混合物。
「藥物」係指用於醫療的物質。
術語「藥學上可接受」意指由聯邦或州政府的監管機構批准或者列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍認可的藥典中適用於動物並且更特別地適用於人。
藥學上可接受的載劑包括在生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。該載劑應適合於靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊柱或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。在一個實施方式中，載劑應適合於皮下途徑。根據投與途徑，活性化合物(即抗體、免疫軛合物或雙特異性分子)可以包被在材料中以保護該化合物免受酸和可能使該化合物失活的其他自然條件的作用。
治療劑和診斷劑的配製物可以藉由與生理學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑以例如凍乾粉末、漿液、水性溶液、洗劑或懸浮液的形式混合來製備(參見例如，Hardman等人，Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治療的藥理學基礎],McGraw-Hill[麥格勞-希爾集團],New York,N.Y.[紐約州紐約市],2001；Gennaro,Remington：The Science and Practice of Pharmacy[雷明頓：藥學科學與實踐],Lippincott,Williams,and Wilkins[利平科特、威廉斯和威爾金斯出版公司],New York,N.Y.[紐約州紐約市],2000；Avis等人(編),Pharmaceutical Dosage Forms：parenteral Medications[藥物劑型：腸胃外用藥],Marcel Dekker[馬塞爾德克爾公司],NY[紐約市],1993；Lieberman等人(編),Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets[藥物劑型：片劑],Marcel Dekker[馬塞爾德克爾公司],NY[紐約市],1990；Lieberman等人(編),Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems[藥物劑型：分散系統],Marcel Dekker[馬塞爾德克爾公司],NY[紐約市],1990；Weiner和Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety[賦形劑毒性和安全性],Marcel Dekker,Inc.[馬塞爾德克爾公司],New York,N.Y.[紐約州紐約市],2000)。
抗TNF-α抗體或片段可以在小瓶中以凍乾物形式產生。凍乾物可以用水或適用於注射的藥物載劑重構。為了隨後靜脈內投與，將獲得的溶液通常進一步稀釋於載劑溶液中。
為治療劑選擇投與方案取決於若干種因素，包括感染嚴重性、症狀水平和生物基質中靶標細胞的可及性。在某些方面，投與方案使遞送至患者的與可接受水平的副作用一致的治療劑的量達最大。因此，遞送的生物製品的量部分地取決於特定實體和正在治療的病症的嚴重性。選擇抗體、細胞介素和小分子的適當劑量的指南係可獲得的(參見例如，Wawrzynczak,Antibody Therapy[抗體療法],Bios Scientific Pub.Ltd[Bios科學出版社有限公司],Oxfordshire,UK[英國牛津郡],1996；Kresina(編),Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis[單株抗體、細胞介素和關節炎],Marcel Dekker[馬塞爾德克爾公司],New York,N.Y.[紐約州紐約市],1991；Bach(編),Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases[自體免疫疾病中的單株抗體和肽療法],Marcel Dekker[馬塞爾德克爾公司],New York,N.Y.[紐約州紐約市],1993；Baert等人，New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]348：601-608,2003；Milgrom等人，New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]341：1966-1973,1999；Slamon等人，New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]344：783-792,2001；Beniaminovitz等人，New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]342：613-619,2000；Ghosh等人，New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]348：24-32,2003；Lipsky等人，New Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]343：1594-1602,2000)。
由臨床醫生，例如，使用本領域中已知或懷疑影響治療或預計影響治療的參數或因素確定適當的劑量。通常，劑量始於略小於最佳劑量的量並此後將其以小增量增加，直至相對於任何不利副作用，實現所期望的或最佳的效果。重要的診斷措施包括例如輸注反應症狀的診斷措施。
可以改變具有抗TNF-α抗體和片段的藥物組成物中活性成分的實際劑量水平，以便獲得一定量的活性成分，該量的活性成分有效地實現對於特定患者、組成物和投與方式的所需治療反應，而對患者沒有毒性。所選劑量水平取決於多種藥物動力學因素，包括抗體的活性；投與途徑；投與時間；抗體在患者中的半衰期；治療的持續時間；與所用特定組成物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料；正在治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康和既往病史；以及醫學領域中已知的類似因素。
調整劑量方案以提供最佳的所需反應(例如，治療反應)。例如，如由治療情況的緊急狀態所指示的，可以投與單次推注，可以隨著時間投與若干個分次劑量，或可以按比例減少或增加劑量。可以特別有利地以劑量單位形式配製胃外組成物以易於投與和實現劑量均勻性。如本文所使用，單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療受試者的物理上離散單位；每個單位含有經計算產生期望治療作用的預定量的活性化合物以及所需藥物載劑。本揭露內容的劑量單位形式的規格係依據以下因素指定的並且直接取決於以下因素：活性化合物的獨特特徵和要實現的特定治療效果、以及混配這種活性化合物用於治療個體的敏感性的技術中固有的限制。
包含抗體或其片段的組成物可以藉由連續輸注，或以例如一天、一週的間隔或每週1-7次按劑量提供。可藉由靜脈內、皮下、局部、口服、經鼻、經直腸、肌肉內、腦內或藉由吸入來提供劑量。特定劑量方案係涉及避免明顯不希望的副作用的最大劑量或給藥頻率的方案。
對於抗體或蛋白質的投與，劑量在約0.0001至150mg/kg宿主體重範圍內，諸如皮下投與5、15和50mg/kg，並且更通常0.01至5mg/kg宿主體重。例如劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg範圍內。示例性治療方案需要每週投與一次，每兩週一次，每三週一次，每四週一次，每個月一次，每3個月一次或每三至6個月一次。用於本揭露的抗TNF-α抗體或片段的劑量方案包括靜脈內投與1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或30mg/kg，其中使用以下給藥方案之一投與抗體：每四週六次劑量，然後每三個月一次；每三週一次；3mg/kg體重一次，隨後每三週1mg/kg體重。較佳的劑量(例如，成人劑量)為40mg、80mg和160mg，較佳的是皮下施用。
然後可以重複抗體的劑量並且各次投與可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2月、75天、3個月或至少6個月。
特定患者的有效量可能根據如下因素而變化，諸如所治療的病症、患者的整體健康狀況、投與的方法途徑和劑量以及副作用的嚴重性(參見例如，Maynard等人，A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice[良好臨床實踐的SOP手冊],Interpharm Press[Interpharm出版社],Boca Raton[博卡拉頓],Fla.[佛羅里達州],1996；Dent,Good Laboratory and Good Clinical Practice[良好實驗和良好臨床實踐],Urch Publ.[厄奇出版社],London,UK[英國倫敦],2001)。
投與途徑可以是藉由例如局部或皮膚應用，藉由靜脈內、腹膜內、腦內、肌肉內、眼內、動脈內、腦脊內、病灶內進行的注射或輸注，或藉由持續釋放系統或植入物(參見例如，Sidman等人，Biopolymers[生物聚合物]22：547-556,1983；Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.[生物醫學材料研究雜誌]15：167-277,1981；Langer,Chem.Tech.[化學技術]12：98-105,1982；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]82：3688-3692,1985；Hwang等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]77：4030-4034,1980；美國專利案號6,350,466和6,316,024)。必要時，組成物也可以包括增溶劑或用於減輕注射部位疼痛的局部麻醉藥諸如利多卡因，或兩者。此外，也可以採用經肺投與，例如藉由使用吸入器或霧化器以及具有霧化劑的配製物。參見例如，美國專利案號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，該等專利中的每一個均藉由引用以其整體併入本文中。
本揭露的組成物還可以藉由一種或多種投與途徑使用在本領域中已知的多種方法中的一種或多種來投與。如熟悉該項技術者將理解的，投與途經和/或模式將根據所需結果而變化。抗體的所選投與途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、經脊髓或其他腸胃外投與途徑，例如藉由注射或輸注。腸胃外投與可以代表除經腸和局部投與之外的投與模式，通常藉由注射，並且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、被膜下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。可替代地，本揭露的組成物可以藉由非腸胃外途徑投與，諸如局部、經表皮或經黏膜投與途徑，例如鼻內、口服、經陰道、經直腸、舌下或局部。在一個方面，藉由輸注投與本揭露的抗體。在另一個方面，皮下投與抗體。
如果本揭露的抗體在控釋或緩釋系統中投與，則可以使用泵來實現控釋或緩釋(參見Langer，見上文；Sefton,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.[CRC的生物醫學工程參考評論]14：20,1987；Buchwald等人，Surgery[外科手術]88：507,1980；Saudek等人，N.Engl.J.Med.[新英格蘭醫學雜誌]321：574,1989)。可以使用聚合物材料來實現抗體療法的控釋或緩釋(參見，例如，Medical Applications of Controlled Release[控釋的醫學應用],Langer和Wise(編),CRC Pres.[CRC出版社],Boca Raton,Fla.[佛羅里達州波卡拉頓市],1974；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance[受控的藥物生物利用率、藥物產物設計以及性能],Smolen和Ball(編),Wiley[威利出版公司],New York[紐約市],1984；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.[高分子科學雜誌-高分子化學評論]23：61,1983；還參見Levy等人，Science[科學]228：190,1985；During等人，Ann.Neurol.[神經病學紀事]25：351,1989；Howard等人，J.Neurosurg.[神經外科雜誌]71：105,1989；美國專利案號5,679,377；美國專利案號5,916,597；美國專利案號5,912,015；美國專利案號5,989,463；美國專利案號5,128,326；PCT公開號WO 99/15154；以及PCT公開號WO 99/20253)。用於緩釋配製物中的聚合物的實例包括但不限於聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)以及聚原酸酯。在一個方面，用於緩釋配製物的聚合物係惰性的，不含可浸出的雜質，在儲存時穩定，無菌並且可生物降解。可以將控制釋放系統或持續釋放系統放置在預防性或治療性靶附近，因此僅要求全身性劑量的一部分(參見例如，Goodson，於：Medical Applications of Controlled Release[控制釋放的醫學應用]，同上，第2卷，第115-138頁，1984)。
控釋系統在Langer,Science[科學]249：1527-1533,1990的評論中討論。可以使用熟悉該項技術者已知的任何技術來產生包含本發明的一種或多種抗體的緩釋配製物。參見例如，美國專利案號4,526,938；PCT公開WO 91/05548；PCT公開WO 96/20698；Ning等人，Radiotherapy & Oncology[放射療法與腫瘤學]39：179-189,1996；Song等人，PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology[PDA藥物科學與技術雜誌]50：372-397,1995；Cleek等人，Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.[關於生物活性材料控釋的國際研討會的議事錄]24：853-854,1997；和Lam等人，Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.[關於生物活性材 料控釋的國際研討會的議事錄]24：759-760,1997，該文獻中的每一個藉由引用以其整體併入本文中。
用於投與治療性組成物的各種方法係本領域中已知的。例如，在一個實施方式中，本揭露的治療組成物可以用無針皮下注射裝置投與，諸如美國專利案號5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中所示的裝置。可用於本揭露的熟知植入物和模組的實例包括：美國專利案號4,487,603，該專利顯示了一種用於以受控的速率分配藥物的可植入微輸注泵；美國專利案號4,486,194，該專利顯示了一種用於通過皮膚投與藥物的治療裝置；美國專利案號4,447,233，該專利顯示了一種用於以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國專利案號4,447,224，該專利顯示了一種用於連續藥物遞送的可變流量可植入輸注設備；美國專利案號4,439,196，該專利顯示了一種具有多室隔室的滲透藥物遞送系統；和美國專利案號4,475,196，該專利顯示了一種滲透藥物遞送系統。許多其他此類植入物、遞送系統和模組係熟悉該項技術者已知的。在較佳的實施方式中，用於投與抗TNF-α抗體和片段的工具選自注射筒、自動注射器、注射筆、小瓶和注射筒、輸注泵、貼片或輸注袋和針。
如果局部投與本揭露的抗體，則可以將其以油膏劑、乳膏劑、透皮貼片、洗劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠、溶液、乳液的形式或熟悉該項技術者熟知的其他形式配製。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms[雷明頓的藥物科學和藥物劑型簡介],第19版，Mack Pub.Co.[馬克出版公司],Easton,Pa.[賓夕法尼亞州伊斯頓市](1995)。對於不可噴霧的局部劑型，典型地使用黏性至半固體或固體形式，該形式包含與局部施加相容並在一些情況下具有大於水的動態黏度的載劑或一種或多種賦形劑。合適的配製物包括而不限於溶液、懸浮液、乳液、乳膏劑、油膏劑、粉末、搽劑、藥膏劑等，如果需要，對它們進行滅菌或與影響各種特性諸如像滲 透壓的助劑(例如，防腐劑、穩定劑、潤濕劑、緩衝劑或鹽)混合。其他合適的局部劑型包括可噴霧氣溶膠製劑，其中在一些情況下將活性成分與固體或液體惰性載劑組合包裝在具有加壓的揮發性物質(例如，氣體推進劑，諸如氟利昂(freon))的混合物中或擠瓶中。如果需要，還可以將保濕劑或濕潤劑添加至藥物組成物和劑型中。此類其他成分的實例係本領域熟知的。
如果鼻內投與包含抗體的組成物，則可以將其以氣溶膠形式、噴霧劑、霧化劑或以滴劑形式配製。特別地，根據本揭露使用的預防劑或治療劑可以在使用合適推進劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適氣體)的情況下，以來自加壓的包裝或霧化器的氣溶膠噴霧劑呈遞形式便利地遞送。在加壓的氣溶膠的情況下，可以藉由提供閥門來確定劑量單位，以遞送經計量的量。在吸入器或吹入器中使用的膠囊劑和藥筒(由例如明膠組成)可以配製成含有化合物和合適粉末基料諸如乳糖或澱粉的粉末混合物。
與其他治療劑，例如，免疫抑制劑、細胞介素、類固醇、化學治療劑、抗生素等共同投與或治療的方法在本領域中係已知的(參見例如，Hardman等人(編)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治療的藥理學基礎]，第10版，麥格勞-希爾集團(McGraw-Hill),New York,N.Y.[紐約州紐約市]；Poole和Peterson(編)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach[用於先進實踐的藥物治療學：實用方法],Lippincott,Williams & Wilkins[利平科特、威廉姆斯和威爾金斯出版社],Phila.,Pa.[賓夕法尼亞州費城市]；Chabner和Longo(編)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy[癌症化學療法和生物療法],Lippincott,Williams & Wilkins[利平科特、威廉姆斯和威爾金斯出版社],Phila.,Pa.[賓夕法尼亞州費城市])。治療劑的有效量可以使症狀減少至少10%；至少20%；至少約30%；至少40%或至少50%。
可以與抗TNF-α抗體組合投與的其他治療劑(例如，預防劑或治療劑)可以與本揭露的抗TNF-α抗體和片段相隔少於5分鐘、相隔少於30分鐘、相隔1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔約12小時至18小時、相隔18小時至24小時、相隔24小時至36小時、相隔36小時至48小時、相隔48小時至52小時、相隔52小時至60小時、相隔60小時至72小時、相隔72小時至84小時、相隔84小時至96小時或相隔96小時至120小時進行投與。可以在患者的同一訪視中投與兩種或更多種治療劑。
在某些方面，可以配製抗TNF-α抗體和片段以確保適當的體內分佈。例如，血腦屏障(BBB)排除許多高度親水性化合物。為了確保抗TNF-α抗體和片段穿過BBB(如果需要)，可以將它們配製在例如脂質體中。對於製造脂質體的方法，參見例如，美國專利案號4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質體可以包含被選擇性運輸至特定細胞或器官中，因此增強靶向藥物遞送的一個或多個部分(參見例如，Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.[臨床藥理學雜誌]29：685)。示例性的靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如，Low等人的美國專利案號5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化學與生物物理研究通訊]153：1038)；抗體(Bloeman等人，1995,FEBS Lett.[歐洲生化學會聯合會快報]357：140；Owais等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物劑化學療法]39：180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.[美國生理學雜誌]1233：134)；p 120(Schreier等人，1994,J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]269：9090)；還參見K.Keinanen；M.L. Laukkanen(1994)FEBS Lett.[歐洲生化學會聯合會快報]346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods[免疫方法]4：273。
本揭露提供了用於向有需要的受試者單獨或與其他療法組合投與包含抗TNF-α抗體和片段的藥物組成物的方案。組合療法(例如，預防劑或治療劑)可以同時或依序向受試者投與。組合療法的治療(例如，預防劑或治療劑)也可以是循環投與的。循環療法涉及投與第一療法(例如，第一預防劑或治療劑)一段時間，隨後投與第二療法(例如，第二預防劑或治療劑)一段時間，並且重複該依序投與，即，該循環，以減少對一種療法(例如，藥劑)的耐藥性產生，以避免或減少一種療法(例如，藥劑)的副作用和/或以改善療法的功效。
本揭露的組合療法的療法(例如，預防劑或治療劑)可以同時投與至受試者。術語「並行」不限於在完全相同的時間投與療法(例如，預防劑或治療劑)，而是意指將包含抗體或其片段的藥物組成物以一定順序並在一定時間間隔內投與至受試者，使得該抗體可以與一種或多種其他療法一起發揮作用，以提供與以其他方式投與相比增加的益處。例如，可以將每種療法在相同的時間或以任何次序依序在不同的時間點投與至受試者；然而，如果不在相同的時間投與，則應當在時間上充分接近地投與該療法，以提供所需的治療或預防作用。可以將每種療法以任何適當的形式並且藉由任何合適的途徑分別投與至受試者。在多個方面，將療法(例如，預防劑或治療劑)相隔少於15分鐘、相隔少於30分鐘、相隔少於1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔24小時、相隔48小時、相隔72小時、或相隔1週投與至受試者。在其他方面，在患者的同一訪視中向患者投與兩種或更多種療法(例如，預防劑或治療劑)。
組合療法的預防劑或治療劑可以在同一種藥物組成物中投與至受試者。可替代地，組合療法的預防劑或治療劑可以在單獨的藥物組成物中並行投與至受試者。預防劑或治療劑可以藉由相同或不同投與途徑投與至受試者。
本揭露的一個或多個實施方式的細節陳述於上文所附的說明書中。現在描述較佳的方法和材料，但類似或等效於本文所述的任何方法和材料也可以用於本揭露的實踐或測試。本揭露的其他特徵、目的和優點將從本說明書和申請專利範圍顯而易見。在本說明書和隨附申請專利範圍中，除非上下文另外明確說明，否則單數形式包括複數指代物。除非另外定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語均具有與本揭露所屬領域的普通技術人員通常所理解相同的意義。除非另外說明，否則適當時本說明書中引用的所有專利和出版物均藉由引用併入。提供以下實例以便更充分地說明本揭露的較佳的實施方式。該等實例決不應被解釋為限制由所附申請專利範圍限定的所揭露的主題的範圍。
實例
實例1：抗TNF-α抗體的產生和抗阿達木單抗Fab的產生；表現與純化
使用噬菌體展示技術產生單株抗體的方法係本領域中已知的(Proetzel,G.,Ebersbach,H.(編)Antibody Methods and Protocols[抗體方法和方案].Humana Press[胡馬納出版社]ISBN 978-1-61779-930-3；2012)。簡言之，如下產生本文所述的抗TNF-α抗體。
在GeneArt(德國雷根斯堡公司(Regensburg,Germany))合成各種阿達木單抗抗體變體和Fab ADA的重鏈和輕鏈DNA(參見van Schouwenburg等人，(2014)Jrnl.Biol.Chem.[生物化學雜誌]289(50)：34482-88)，並使用基於限制酶連接的選殖技術選殖到哺乳動物表現載體中。將所得質體共轉染到HEK293T細胞中。為了暫態表現抗體和Fab，使用聚乙烯亞胺(PEI；目錄號24765，聚合 科學公司(Polysciences,Inc.))將每種工程化鏈的等量載體共轉染到懸浮適應的HEK293T細胞中。典型地，用含有50μg編碼重鏈的表現載體和50μg編碼輕鏈的表現載體的DNA轉染以1-2 Mio細胞/ml的密度懸浮的100ml細胞。然後將重組表現載體引入宿主細胞中，並藉由進一步培養細胞7天的時段來產生構建體，以允許分泌到補充有0.1%普朗尼克酸(pluronic acid)、4mM麩醯胺酸和0.25μg/ml抗生素的培養基(HEK，無血清培養基)中。
然後，使用免疫親和層析從無細胞的上清液中純化由表現的構建體產生的阿達木單抗抗體變體和Fab。將經過過濾的條件培養基與300μl蛋白A樹脂(CaptivA PriMabTM，瑞普利金公司(Repligen))混合，用pH 7.4的PBS緩衝液平衡。用15倍柱體積的pH 7.4的PBS洗滌樹脂三次，然後分別用10倍柱體積的蛋白A洗脫緩衝液(50mM檸檬酸鹽、90mM NaCl，pH 2.5)洗脫抗體或Fab。
實例2：阿達木單抗抗體變體與TNF-α的表面電漿共振(SPR)結合分析
進行直接結合測定以表徵工程化抗體變體對TNF-α的結合。
使用重組人抗原作為分析物，對蛋白A捕獲的蛋白質測量動力學結合親和常數(K D )。在室溫下在BIAcore ® T200(瑞士格拉特布魯格市GE醫療公司(GE Healthcare,Glattbrugg,Switzerland))上進行測量。為進行親和力測量，將蛋白質在10mM NaP、150mM NaCl、0.05% Tween 20(pH 5.8)中稀釋並根據製造商的建議(GE醫療公司(GE Healthcare))使用標準程序固定在CM5研究級感測器晶片(GE醫療公司(GE Healthcare)，參考號BR-1000-14)的流動池上。為了用作參考，將一個流動池作為空白樣固定。藉由隨後在參考和測量流動池上注射分析物稀釋液系列獲得結合數據。納入零濃度樣本(僅操作緩衝液)以允許在數據評價期間進行雙重參考。為了進行數據評價，使用了雙重參考的傳感圖並分析瞭解離常數(K D )。若干阿達木單抗抗體變體以與野生型(WT)阿達木單抗相同的親和力範圍結合TNF-α(結果如表4所示)。
[表4]-阿達木單抗和抗體變體與TNF-α結合的解離常數(K D )
Figure 108146225-A0202-12-0094-18
Figure 108146225-A0202-12-0095-19
Figure 108146225-A0202-12-0096-20
*VK1-33 FR3係指具有以下突變的輕鏈：T66N、Q68E、V99I(IMGT)。
**VK1-13 FR3係指具有以下突變的輕鏈：T66S、Q68E、V99F(IMGT)。
實例3：阿達木單抗和阿達木單抗抗體變體與抗藥物抗體Fab(ADA)的相對結合
藉由使用Proteon XPR36系統(伯樂公司(Bio-Rad))進行SPR測量進行阿達木單抗和阿達木單抗抗體變體與ADA Fab的結合分析。
藉由胺偶聯使阿達木單抗和阿達木單抗抗體變體固定在Proteon GLC晶片(伯樂公司(Bio-Rad)參考號1765011)上。藉由注射用10mM NaP、150mM NaCl、0.05% Tween 20(pH 5.8)稀釋的ADA Fab獲取動力學數據。為了用作參考，將一個流動池作為空白樣固定。提取阿達木單抗抗體變體的最大反應率(Rmax)，標準化並與觀察到的阿達木單抗的最大反應率比較。表5顯示了阿達木單抗和阿達木單抗變體的相對結合水平。圖1顯示了與阿達木單抗相比變體4和40的相對結合。
[表5]-阿達木單抗和抗體變體與Fab ADA的相對結合水平
Figure 108146225-A0202-12-0096-21
Figure 108146225-A0202-12-0097-22
Figure 108146225-A0202-12-0098-23
Figure 108146225-A0202-12-0099-24
實例4：阿達木單抗和抗體變體的動態光散射(DLS)
藉由動態光散射(DLS，懷雅特公司(Wyatt))測量阿達木單抗和阿達木單抗抗體變體的聚集傾向。使用動態光散射藉由定量散射光中的動態波動來測量溶液中阿達木單抗變體的平移擴散係數。未經分級分離的阿達木單抗變體尺寸分佈提供了多分散性估算值以及流體動力學半徑，在10mg/ml的濃度下測量該參數。使用DynaPro TM 讀板儀(德國代恩巴赫市懷雅特技術歐洲有限公司(Wyatt Technology Europe GmbH,Dernbach,Germany))結合軟體DYNAMICS(7.1.0.25版，懷雅特公司(Wyatt))測定阿達木單抗變體在熱應激下的流體動力學半徑。在384孔板(384圓孔板，聚苯乙烯，德國朗根塞爾博多市賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific,Langenselbold,Germany))中測量了50μL未稀釋並過濾(0.22μm PVDF-過濾器(Millex®注射筒驅動的過濾器單元，美國比爾裡卡市密理博公司(Millipore,Billerica,USA)))的蛋白溶液。可以鑒定出熱應激的阿達木單抗樣本的較高分子量(MW)聚集體，但不能從阿達木單抗變體中鑒定出來。阿達木單抗顯示從50℃開始流體動力學半徑增加，而抗體變體4和40保持相同的半徑直到60℃(圖2)。
基於較少量的突變，與TNF-α相同的結合親和力(與阿達木單抗野生型相比)和與ADA的低相對結合，考慮將變體4和40進行進一步研究， 即表現研究和生物物理表徵，例如，依賴於熱應激濃度的動態光散射和差示掃描量熱法。
實例5-用阿達木單抗以及抗體變體4和40進行的表現研究和其他DLS實驗
為了進行表現研究，在HEK293T細胞中表現阿達木單抗以及抗體變體4和40(暫態轉染，參見實例1)。如圖3所示，阿達木單抗在HEK細胞中的表現至多87mg/L；抗體變體4顯示略微較佳的表現(95mg/L)，並且抗體變體40具有顯著更佳的表現產量(132mg/L)。藉由尺寸排阻層析精製後，抗體變體4(78mg/L)和變體40(112mg/L)的產量仍高於阿達木單抗的產量(65mg/L)。
為了進一步分析阿達木單抗以及抗體變體4和40，使樣本中的蛋白質濃度增加到100mg/ml，並在熱應激下使用DLS進行表徵，以測量流體動力學半徑的增加，該增加為聚集體形成的指標。濃度為70mg/ml的阿達木單抗顯示流體動力學半徑增加，從而指示在50℃以上形成聚集體，而變體4僅在高於60℃濃度為100mg/ml下顯示出少量的聚集體形成，並且變體40在最高測量濃度(100mg/ml)和溫度(60℃)下保持流體力學半徑。結果如圖4A-4C所示。
實例6：阿達木單抗以及抗體變體4和40的差示掃描量熱法(DSC)
使用量熱測量比較阿達木單抗與工程化的變體4和40的熱穩定性。在差示掃描微量熱計(Nano DSC，TA儀器公司(TA instruments))上進行量熱測量。池容積為0.5ml並且加熱速率為1℃/min。所有蛋白質以在PBS(pH 7.4)中1mg/ml的濃度使用。藉由與含有相同緩衝液的重複樣本(其中沒有蛋白質)進行比較來估計每種蛋白質的莫耳熱容。使用標準程序分析部分莫耳熱容和熔融曲線。對熱譜圖進行基線校正和濃度標準化。如表6所示，阿達木單抗、變體4和變體40顯示類似的Fab熔點(Tm)。
[表6]：野生型阿達木單抗以及抗體變體4和40的熔點。
Figure 108146225-A0202-12-0101-25
實例7：配製物
本文所述的抗TNF-α抗體係可以即用型液體配製物或凍乾物形式提供的單株抗體。為了隨後進行靜脈內投與，通常將凍乾物進一步稀釋到載劑溶液中以製備用於輸注的液體抗體溶液。選擇最穩定配製物的重要穩定性指示分析方法特別包括用於測定聚集水平的尺寸排阻層析、亞可見顆粒物測試和效力測試。
應理解，本文描述的實例和方面僅出於說明的目的，並且根據其進行的各種修改或改變對於熟悉該項技術者將是明瞭的，並包括在本申請的精神和範圍以及所附申請專利範圍的範圍內。
本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都藉由引用以其整體(或根據上下文指示)明確地併入，其引用程度與每個文獻均單獨藉由引用併入的程度相同。在存在衝突的情況下，以包括定義在內的本說明書為准。
<110> 諾華公司(Novartis AG) 達柯 斯克葛羅 賽巴斯汀 伊瑞葛來 希爾瑪 愛伯斯巴赫
<120> 抗TNF-α抗體
<130> PAT058234-PCT
<140> 隨同提交
<141> 隨同提交
<150> 62/781668
<151> 2018-12-19
<160> 29
<170> PatentIn 3.5版
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗的HCDR1
<400> 1
Figure 108146225-A0202-12-0102-31
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗以及變體4和變體40的HCDR2
<400> 2
Figure 108146225-A0202-12-0102-32
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗以及變體4和變體40的HCDR3
<400> 3
Figure 108146225-A0202-12-0102-33
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗的VH
<400> 4
Figure 108146225-A0202-12-0103-26
<210> 5
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗的DNA VH
<400> 5
Figure 108146225-A0202-12-0103-29
<210> 6
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗的重鏈
<400> 6
Figure 108146225-A0202-12-0103-30
Figure 108146225-A0202-12-0104-34
Figure 108146225-A0202-12-0105-35
<210> 7
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗的DNA重鏈
<400> 7
Figure 108146225-A0202-12-0105-36
Figure 108146225-A0202-12-0106-37
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗的LCDR1以及變體4和變體40
<400> 8
Figure 108146225-A0202-12-0106-38
<210> 9
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗以及變體4和變體40的LCDR2
<400> 9
Figure 108146225-A0202-12-0106-39
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗以及變體4和變體40的LCDR3
<400> 10
Figure 108146225-A0202-12-0106-40
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗和變體4的VL
<400> 11
Figure 108146225-A0202-12-0107-41
<210> 12
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗和變體4的DNA VL
<400> 12
Figure 108146225-A0202-12-0107-43
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗和變體4的輕鏈
<400> 13
Figure 108146225-A0202-12-0107-44
Figure 108146225-A0202-12-0108-45
<210> 14
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗和變體4的DNA輕鏈
<400> 14
Figure 108146225-A0202-12-0108-46
Figure 108146225-A0202-12-0109-49
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體4和變體40的HCDR1
<400> 15
Figure 108146225-A0202-12-0109-48
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體4和變體40的VH
<400> 16
Figure 108146225-A0202-12-0109-47
<210> 17
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體4和變體40的DNA VH
<400> 17
Figure 108146225-A0202-12-0110-50
<210> 18
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體4和變體40的重鏈
<400> 18
Figure 108146225-A0202-12-0110-51
Figure 108146225-A0202-12-0111-53
Figure 108146225-A0202-12-0112-54
<210> 19
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體4和變體40的DNA重鏈
<400> 19
Figure 108146225-A0202-12-0112-55
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體40的VL
<400> 20
Figure 108146225-A0202-12-0113-56
<210> 21
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體40的DNA VL
<400> 21
Figure 108146225-A0202-12-0113-57
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體40的輕鏈
<400> 22
Figure 108146225-A0202-12-0113-58
Figure 108146225-A0202-12-0114-59
<210> 23
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 變體40的DNA輕鏈
<400> 23
Figure 108146225-A0202-12-0114-61
Figure 108146225-A0202-12-0115-62
<210> 24
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK1-13 FR3
<400> 24
Figure 108146225-A0202-12-0115-63
<210> 25
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK1-33 FR3
<400> 25
Figure 108146225-A0202-12-0115-64
<210> 26
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 常規序列變體VH
<220>
<221> 31_Xaa
<222> (31)..(31)
<223> X可以是D(Asp)、S(Ser)或N(Asn)
<220>
<221> 32_Xaa
<222> (32)..(32)
<223> X可以是Y(Tyr)、S(Ser)或F(Phe)
<220>
<221> 58_Xaa
<222> (58)..(58)
<223> X可以是I(Ile)或T(Thr)
<220>
<221> 107_Xaa
<222> (107)..(107)
<223> X可以是S(Ser)或A(Ala)
<400> 26
Figure 108146225-A0202-12-0116-65
<210> 27
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 常規變體重鏈
<220>
<221> Xaa_31
<222> (31)..(31)
<223> X可以是D(Asp)、S(Ser)或N(Asn)
<220>
<221> Xaa_32
<222> (32)..(32)
<223> X可以是Y(Tyr)、S(Ser)或F(Phe)
<220>
<221> Xaa_58
<222> (58)..(58)
<223> X可以是I(Ile)或T(Thr)
<220>
<221> Xaa_107
<222> (107)..(107)
<223> X可以是S(Ser)或A(Ala)
<400> 27
Figure 108146225-A0202-12-0117-66
Figure 108146225-A0202-12-0118-67
<210> 28
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 常規變體VL
<220>
<221> Xaa_28
<222> (28)..(28)
<223> X可以是G(Gly)或S(Ser)
<220>
<221> Xaa_53
<222> (53)..(53)
<223> X可以是T(Thr)、S(Ser)或N(Asn)
<220>
<221> Xaa_54
<222> (54)..(54)
<223> X可以是L(Leu)或R(Arg)
<220>
<221> Xaa_55
<222> (55)..(55)
<223> X可以是Q(Gln)或E(Glu)
<220>
<221> Xaa_56
<222> (56)..(56)
<223> X可以是S(Ser)或T(Thr)
<220>
<221> Xaa_83
<222> (83)..(83)
<223> X可以是V(Val)、F(Phe)或I(Ile)
<400> 28
Figure 108146225-A0202-12-0119-68
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 常規變體輕鏈
<220>
<221> Xaa_28
<222> (28)..(28)
<223> X可以是G(Gly)或S(Ser)
<220>
<221> Xaa_53
<222> (53)..(53)
<223> X可以是T(Thr)、S(Ser)或N(Asn)
<220>
<221> Xaa_54
<222> (54)..(54)
<223> X可以是L(Leu)或R(Arg)
<220>
<221> Xaa_55
<222> (55)..(55)
<223> X可以是Q(Gln)或E(Glu)
<220>
<221> Xaa_56
<222> (56)..(56)
<223> X可以是S(Ser)或T(Thr)
<220>
<221> Xaa_83
<222> (83)..(83)
<223> X可以是V(Val)、F(Phe)或I(Ile)
<400> 29
Figure 108146225-A0202-12-0120-69

Claims (54)

  1. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：
    a.包含如SEQ ID NO：26所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；以及
    b.包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，
    其中SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  2. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：
    a.包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；以及
    b.包含如SEQ ID NO：28所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，
    其中SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  3. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：
    a.包含如SEQ ID NO：26所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；以及
    b.包含如SEQ ID NO：28所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，
    其中SEQ ID NO：26中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且SEQ ID NO：28中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段為抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中：
    a.該重鏈包含如SEQ ID NO：27所闡述的胺基酸序列；並且
    b.該輕鏈包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列，
    其中SEQ ID NO：27中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段為抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中：
    a.該重鏈包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列；並且
    b.該輕鏈包含如SEQ ID NO：29所闡述的胺基酸序列，
    其中SEQ ID NO：29中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段為抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中：
    a.該重鏈包含如SEQ ID NO：27所闡述的胺基酸序列；並且
    b.該輕鏈包含如SEQ ID NO：29所闡述的胺基酸序列，
    其中SEQ ID NO：27中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且SEQ ID NO：29中Xaa胺基酸中的至少一個與如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO：26中該Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：4所闡述的該胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  8. 如申請專利範圍第2項所述之針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO：28中該Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：11所闡述的該胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  9. 如申請專利範圍第3項所述之針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO：26中該Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：4所闡述的該胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且SEQ ID NO：28中該Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：11所闡述的該胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  10. 如申請專利範圍第4項所述之針對人TNF-α的抗體，其中SEQ ID NO：27中該Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：6所闡述的該胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  11. 如申請專利範圍第5項所述之針對人TNF-α的抗體，其中SEQ ID NO：29中該Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：13所闡述的該胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  12. 如申請專利範圍第6項所述之針對人TNF-α的抗體，其中SEQ ID NO：27中該Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：6所闡述的該胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同，並且其中SEQ ID NO：29中該Xaa胺基酸中的一個、兩個、三個或四個與如SEQ ID NO：13所闡述的該胺基酸序列的相同位置中的相應胺基酸不同。
  13. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中該VH在SEQ ID NO：4的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變。
  14. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)， 其中該VL在SEQ ID NO：11的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
  15. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中：
    a.該VH在SEQ ID NO：4的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變；並且
    b.該VL在SEQ ID NO：11的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
  16. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中該重鏈在SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變。
  17. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中該輕鏈在SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
  18. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中：
    a.該重鏈在SEQ ID NO：6的位置31、32、58和107中的一個或多個處突變；並且
    b.該輕鏈在SEQ ID NO：13的位置28、53、54、55、56和83中的一個或多個處突變。
  19. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中該VH在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變。
  20. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中該VL在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
  21. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含有包含如SEQ ID NO：4所闡述的胺基酸序列的重鏈可變區(VH)和包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，其中：
    a.該VH在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變；並且
    b.該VL在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
  22. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中該重鏈在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變。
  23. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中該輕鏈在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
  24. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體，該抗體包含有包含如SEQ ID NO：6所闡述的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列的輕鏈，其中：
    a.該重鏈在IMGT位置36、37、65和114中的一個或多個處突變；並且
    b.該輕鏈在IMGT位置28、66、67、68、69和99中的一個或多個處突變。
  25. 如申請專利範圍第1-3、7-9、13-15、19-21項中任一項所述之針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH和VL突變選自表1中所闡述的突變。
  26. 如申請專利範圍第4-6、10-12、16-18、22-24項中任一項所述之針對人TNF-α的抗體，其中所述重鏈和輕鏈突變選自表1中所闡述的突變。
  27. 如申請專利範圍第25項所述之針對人TNF-α的抗體或其抗原結合片段，其中所述VH和VL區闡述於表2的行中。
  28. 如申請專利範圍第26項所述之針對人TNF-α的抗體，其中該重鏈包含VH區並且該輕鏈包含VL區，並且其中該VH和VL區闡述於表2的行中。
  29. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含表2的行中所闡述的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之TNF-α抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段為TNF-α抗體。
  31. 一種針對人腫瘤壞死因子(TNF)-α的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：
    a.重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區依序包含具有如SEQ ID NO：15所闡述的胺基酸序列的互補決定區(CDR)、具有如SEQ ID NO：2所闡述的胺基酸序列的CDR、和具有如SEQ ID NO：3所闡述的胺基酸序列的CDR；以及
    b.輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區依序包含具有如SEQ ID NO：8所闡述的胺基酸序列的CDR、具有如SEQ ID NO：9所闡述的胺基酸序列的CDR、和具有如SEQ ID NO：10所闡述的胺基酸序列的CDR。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該VH包含如SEQ ID NO：16所闡述的胺基酸序列，並且所述VL包含如SEQ ID NO：11所闡述的胺基酸序列。
  33. 如申請專利範圍第31項所述之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段為抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含如SEQ ID NO：18所闡述的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含如SEQ ID NO：13所闡述的胺基酸序列。
  34. 如申請專利範圍第31項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該VH包含如SEQ ID NO：16所闡述的胺基酸序列，並且所述VL包含如SEQ ID NO：20所闡述的胺基酸序列。
  35. 如申請專利範圍第31項所述之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段為抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含如SEQ ID NO：18所闡述的胺基酸序列，並且所述輕鏈包含如SEQ ID NO：22所闡述的胺基酸序列。
  36. 如申請專利範圍第1至24和27至35項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段為選自嵌合抗體、人源化抗體和人抗體的單株抗體。
  37. 如申請專利範圍第1至24和27至35項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段係選自Fab、F(ab)2和scFv的抗原結合片段。
  38. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如申請專利範圍第1至24和27至35項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑。
  39. 如申請專利範圍第38項所述之藥物組成物，該藥物組成物還包含：一種或多種其他治療劑。
  40. 如申請專利範圍第1至24和27至35項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，或如申請專利範圍第38或39項所述之藥物組成物，該抗體或其抗原結合片段或藥物組成物用於在治療由TNF-α介導的病理性障礙中使用。
  41. 如申請專利範圍第40項所述之抗體或其抗原結合片段或藥物組成物，該抗體或其抗原結合片段或藥物組成物用於在治療自體免疫疾病或者炎性障礙或病症中使用。
  42. 如申請專利範圍第41項所述之抗體或其抗原結合片段或藥物組成物，該抗體或其抗原結合片段或藥物組成物用於在治療關節炎中使用。
  43. 如申請專利範圍第1至37項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第38或39項所述之藥物組成物在製備用來治療由TNF-α介導的病理性障礙的藥物中之用途。
  44. 如申請專利範圍第43項所述之用途，其中該病理性障礙係自體免疫疾病或者炎性障礙或病症。
  45. 如申請專利範圍第44項所述之用途，其中該自體免疫疾病或者炎性障礙或病症係關節炎。
  46. 如申請專利範圍第43項所述之用途，其中該藥物還包含其他治療劑或與其他治療劑組合投與。
  47. 一種分離的核酸分子或核酸分子組，該分離的核酸分子或核酸分子組編碼如申請專利範圍第1至37項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段。
  48. 如申請專利範圍第47項所述之分離的核酸分子或核酸分子組，該分離的核酸分子或核酸分子組係互補DNA(cDNA)或信使RNA(mRNA)。
  49. 一種選殖或表現載體，該選殖或表現載體包含一種或多種如申請專利範圍第48項所述之核酸分子或核酸分子組，其中該載體適用於重組產生該抗體或其抗原結合片段。
  50. 一種宿主細胞，該宿主細胞包含一種或多種如申請專利範圍第49項所述之選殖或表現載體。
  51. 一種用於產生如申請專利範圍第1至37項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括在足以表現所述抗體或其抗原結合片段的條件下培養如申請專利範圍第50項所述之宿主細胞，並且之後從該宿主細胞培養物中純化並回收所述抗體或其抗原結合片段。
  52. 一種診斷試劑，該診斷試劑包含如申請專利範圍第1至37項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，和診斷標記。
  53. 一種套組，該套組包含如申請專利範圍第1至37項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第38或39項所述之藥物組成物，其中該套組另外包含使用說明書和用於向有需要的受試者投與所述抗體或其抗原結合片段或所述藥物組成物的工具。
  54. 如申請專利範圍第53項所述之套組，其中該用於投與的工具包含注射筒、自動注射器、注射筆、小瓶和注射筒、輸注泵、貼片或輸注袋和針。
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