TW201726716A - 抗體-細胞激素植入組合物及用於免疫調節的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供抗體-細胞激素植入組合物,其包括(例如)結合至介白素受體超家族成員(即,IL10R1)及刺激藉助該介白素受體超家族成員之細胞內信號傳導且刺激信號傳導之植入構築體。所提供之組合物發現以下用途:增強抗發炎細胞反應,及相對降低可以經加強抗發炎反應抵銷在治療、改善及預防上之免疫相關病症之促發炎性效應。本發明另外提供編碼該等分子之多核苷酸及載體及能夠產生分子之宿主細胞,以及製備及使用組合物之方法。
Description
本發明係關於結合至介白素-10受體(IL10R)、且更特定而言為激動劑且刺激藉助此受體之信號傳導之抗體-細胞激素植入組合物。
介白素10(IL-10)經鑑別為細胞激素合成抑制因子,其可對Th1輔助細胞及抗原呈遞細胞(APC)產生影響。IL-10為以結構域交換式非共價同二聚體形式存在之具有161個胺基酸之蛋白質,其以一個同二聚體對四個IL-10RI亞單位之化學計量比結合至高親和力IL-10受體I(IL-10RI),從而招募IL-10R2並藉助JAKI/TYK2路徑活化信號轉導。IL-10抑制促發炎性細胞激素(例如,IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、GM-CSF及反應性氧及氮中間體)之單核球及巨噬細胞合成,且已顯示在眾多自體免疫性之臨床前模型中具有強效能。認為IL-10效能係由其能夠抑制單核球、巨噬細胞及T細胞之活化及效應物功能引起的。然而,IL-10係具有非常寬的生物活性譜之多效性免疫調節細胞激素。IL-10已亦顯示可促進B細胞、NK細胞、細胞毒性及輔助性T細胞、肥胖細胞、顆粒球、樹突細胞、角質細胞及甚至內皮細胞之生長及分化,此指示其亦具有促發炎性功能(Moore 等人,Annu Rev Immunol.2001;19:683-765)。
IL-10作為治療劑用於治療自體免疫及發炎病況、特定而言發炎性腸病(IBD)可在動物模型系統以及遺傳學中得到支持。舉例而言,在齧齒類動物中IL-10之喪失可導致結腸炎自發發作。在人類中,9-16%之克隆氏病(Crohn’s Disease)患者具有NOD2突變,該突變與有缺陷或降低之IL-10產生相關,且20%之潰瘍性結腸炎(UC)患者之3’UTR攜載疾病相關性IL-10 SNP。最後,IL-10受體I中之某些突變引起克隆氏病之罕見、嚴重形式(Glocker等人,N Engl J Med.2009;361(21):2033-45)。
儘管存在強大的基因連鎖數據,但重組人類IL-10證明多達25μg/kg在健康志願者及特定患者群體中具有耐受性及安全性,且多達100μg/kg在接受者之子集中具有輕微效應;然而,對於特定患者群體僅發現輕微臨床效能,且由於缺乏效能而中斷了臨床研發。已進行研究之審查且已論述若干可能性的結果,例如,有限效能係由於IL-10之短半衰期而導致的靶標器官(結腸)之暴露較差引起的;IL-10之促發炎性效應在高劑量下顯現並且平衡了低劑量IL-10的抗發炎功效(Lindsay及Hodgson,Aliment Pharmacol Ther.2001;15(11)1709-1716)。與此可能性一致的是,高劑量之IL-10與升高之全身IFN-γ及新喋呤含量(發炎標記物)相關(Tilg等人,Gut 2002;50(2)191-5)。
已研發抗體-細胞激素植入組合物以生成賦予較佳特性之更有效治療劑,該較佳特性包括(例如)維持強抗發炎IL10功效,以及顯著降低促發炎性活性,且具有半衰期延長、可產生性及穩定性之其他益處。因此,該等組合物提供基於IL10之改良組合物用作治療劑。
本發明提供具有優於在診療所中已知且使用之構築體之較佳治療特性之抗體-細胞激素植入蛋白。具體而言,所提供之抗體-細胞激素植入蛋白維持天然或重組人類IL10之較佳抗發炎活性;然而,保留促發炎性活性之顯著降低。另外,抗體-細胞激素植入蛋白較重組人類IL10蛋白(rhIL10)傳達改良之半衰期、穩定性及可產生性。該等組合物之較佳性質產生較診療所先前使用或文獻中闡述之彼等較佳之治療組合物。因此,本發明提供結合至IL10受體且促進藉助IL10受體之信號傳導之抗體-細胞激素植入蛋白。本發明提供抗體-細胞激素植入蛋白,其包含:(i)免疫球蛋白重鏈序列,其包含重鏈可變區(VH)及由CH1區、CH2區及CH3區組成之重鏈恆定區,及(ii)免疫球蛋白輕鏈序列,其包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL);其中單體IL10分子係植入VH或VL之互補決定區(CDR)中。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:13之可變重鏈及包含SEQ ID NO:14之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:29之可變重鏈及包含SEQ ID NO:30之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:45之可變重鏈及包含SEQ ID NO:46之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:61之可變重鏈及包含SEQ ID NO:62之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:77之可變重鏈及包含SEQ ID NO:78之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:93之可變重鏈及包含SEQ ID NO:94之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:109之可變重鏈及包含SEQ ID NO:110之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:125
之可變重鏈及包含SEQ ID NO:126之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:141之可變重鏈及包含SEQ ID NO:142之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:157之可變重鏈及包含SEQ ID NO:158之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:173之可變重鏈及包含SEQ ID NO:174之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:189之可變重鏈及包含SEQ ID NO:190之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:205之可變重鏈及包含SEQ ID NO:206之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:222之可變重鏈及包含SEQ ID NO:223之可變輕鏈。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含SEQ ID NO:238之可變重鏈及包含SEQ ID NO:239之可變輕鏈。
在某些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含IgG類抗體Fc區。在具體實施例中,免疫球蛋白選自IgG1、IgG2或IgG4亞類Fc區。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白視情況含有至少一種調節(即,增加或降低)抗體或抗體片段至Fc受體之結合之修飾。抗體細胞激素植入蛋白之免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予經修飾效應物功能之修飾。在具體實施例中,免疫球蛋白重鏈包含賦予降低之效應物功能之突變,該突變係選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者。
在相關態樣中,本發明進一步提供編碼如本文所闡述之抗體細胞激素植入蛋白之至少重鏈及/或輕鏈蛋白之多核苷酸。在另一相關態樣中,
本發明進一步提供適於產生如本文所闡述之抗體細胞激素植入蛋白之宿主細胞。在具體實施例中,宿主細胞包含編碼抗體細胞激素植入蛋白之重鏈及/或輕鏈多肽之核酸。在再一態樣中,提供產生本發明之抗體細胞激素植入蛋白之方法,其包含在適於表現、形成及分泌抗體細胞激素植入蛋白之條件下培養如本文所闡述提供之宿主細胞,及自培養物回收抗體細胞激素植入蛋白。在另一態樣中,本發明進一步提供套組,其包含如本文所闡述之抗體細胞激素植入蛋白。
在另一相關態樣中,本發明進一步提供組合物,其包含如本文所闡述之抗體細胞激素植入蛋白及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中,本發明提供包含本發明之抗體細胞激素植入蛋白之醫藥組合物以投與個體。
在另一態樣中,本發明提供治療有需要之個體之免疫相關病症之方法,其包含向該個體投與治療有效量之如本文所闡述之本發明之抗體細胞激素植入蛋白。在另一態樣中,本發明提供用於治療或預防個體之免疫相關病症之抗體細胞激素植入蛋白。
在一些實施例中,患者具有免疫相關病症,例如,發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病(Sjogren’s disease)、貝西氏病(Behcet’s diseas)、類肉瘤病及移植物抗宿主病(GVHD)。在具體實施例中,發炎性腸病係克隆氏病或潰瘍性結腸炎。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與類固醇(例如,甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)、氫化可體松(hydrocortisone)、普賴松(prednisone)、普賴蘇濃(prednisolone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone))一起共投與。
在一些實施例中,本發明提供抗體細胞激素植入蛋白,其包含:(a)
重鏈可變區(VH),其包含互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3;及(b)輕鏈可變區(VL),其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3:及(c)介白素10(IL10)單體分子,其係植入VH或VL之CDR中。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含植入重鏈CDR中之IL10單體分子。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中IL10單體分子係植入選自互補決定區1(HCDR1)、互補決定區2(HCDR2)或互補決定區3(HCDR3)之區中。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含植入HCDR1中之IL10單體分子。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含植入輕鏈CDR中之IL10單體分子。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中IL10單體分子係植入選自互補決定區1(LCDR1)、互補決定區2(LCDR2)或互補決定區3(LCDR3)之區中。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含植入LCDR1中之IL10單體分子。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中在與天然IL10相比時,單核球可利用更少之T細胞及NK細胞活化來活化。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中抗體細胞激素植入蛋白具有長於天然IL10之半衰期。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中IL10單體分子由SEQ ID NO:209組成。
一種抗體細胞激素植入蛋白,包含IgG類抗體重鏈。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中IgG選自IgG1、IgG2或IgG4。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中在所植入IL10單體分子存在下抗體CDR之結合特異性有所降低。
抗體細胞激素植入蛋白,其中在所植入IL10單體分子存在下抗體CDR之結合特異性保留。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中抗體CDR之結合特異性係針對不同於IL10單體分子之結合特異性之抗原。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中抗體可變結構域之結合特異性係針對非人類抗原。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中抗體係人類化或人類抗體。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含:(i)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:193之HCDR1、(b)SEQ ID NO:194之HCDR2、(c)SEQ ID NO:195之HCDR3,及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:196之LCDR1、(e)SEQ ID NO:197之LCDR2及(f)SEQ ID NO:198之LCDR3;(ii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:97之HCDR1、(b)SEQ ID NO:98之HCDR2、(c)SEQ ID NO:99之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:100之LCDR1、(e)SEQ ID NO:101之LCDR2及(f)SEQ ID NO:102之LCDR3;(iii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:1之HCDR1、(b)SEQ ID NO:2之HCDR2、(c)SEQ ID NO:3之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:4之LCDR1、(e)SEQ ID NO:5之LCDR2及(f) SEQ ID
NO:6之LCDR3;(iv)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:17之HCDR1、(b)SEQ ID NO:18之HCDR2、(c)SEQ ID NO:19之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:20之LCDR1、(e)SEQ ID NO:21之LCDR2及(f)SEQ ID NO:22之LCDR3;(v)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:33之HCDR1、(b)SEQ ID NO:34之HCDR2、(c)SEQ ID NO:35之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:36之LCDR1、(e)SEQ ID NO:37之LCDR2及(f)SEQ ID NO:38之LCDR3;(vi)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:49之HCDR1、(b)SEQ ID NO:50之HCDR2、(c)SEQ ID NO:51之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:52之LCDR1、(e)SEQ ID NO:53之LCDR2及(f)SEQ ID NO:54之LCDR3;(vii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:65之HCDR1、(b)SEQ ID NO:66之HCDR2、(c)SEQ ID NO:67之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:68之LCDR1、(e)SEQ ID NO:69之LCDR2及(f)SEQ ID NO:70之LCDR3;(viii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:81之HCDR1、(b)SEQ ID NO:82之HCDR2、(c)SEQ ID NO:83之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:84之LCDR1、(e)SEQ ID NO:85之LCDR2及(f)SEQ ID NO:86之LCDR3;(ix)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:113之HCDR1、(b)SEQ ID NO:114之HCDR2、(c)SEQ ID NO:115之HCDR3;及輕鏈可變區,其包
含:(d)SEQ ID NO:116之LCDR1、(e)SEQ ID NO:117之LCDR2及(f)SEQ ID NO:118之LCDR3;(x)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:129之HCDR1、(b)SEQ ID NO:130之HCDR2、(c)SEQ ID NO:131之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:132之LCDR1、(e)SEQ ID NO:133之LCDR2及(f)SEQ ID NO:134之LCDR3;(xi)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:145之HCDR1、(b)SEQ ID NO:146之HCDR2、(c)SEQ ID NO:147之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:148之LCDR1、(e)SEQ ID NO:149之LCDR2及(f)SEQ ID NO:150之LCDR3;(xii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:161之HCDR1、(b)SEQ ID NO:162之HCDR2、(c)SEQ ID NO:163之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:164之LCDR1、(e)SEQ ID NO:165之LCDR2及(f) SEQ ID NO:166之LCDR3;(xiii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:177之HCDR1、(b)SEQ ID NO:178之HCDR2、(c)SEQ ID NO:179之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:180之LCDR1、(e)SEQ ID NO:181之LCDR2及(f) SEQ ID NO:182之LCDR3;(xiv)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:210之HCDR1、(b)SEQ ID NO:211之HCDR2、(c)SEQ ID NO:212之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:213之LCDR1、(e)SEQ ID NO:214之LCDR2及(f)SEQ ID NO:215之LCDR3;及(xv)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:226之HCDR1、(b)SEQ ID
NO:227之HCDR2、(c)SEQ ID NO:228之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:229之LCDR1、(e)SEQ ID NO:230之LCDR2及(f)SEQ ID NO:231之LCDR3。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含:(i)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:205,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:206;(ii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:109,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:110;(iii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:13,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:14;(iv)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:29,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:30;(v)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:45,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:46;(vi)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:61,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:62;(vii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:77,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:78;(viii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:93,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:94;(ix)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:125,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:126;(x)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:141,及輕鏈可變區(VL),
其包含SEQ ID NO:142;(xi)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:157,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:158;(xii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:173,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:174;(xiii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:189,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:190;(xiv)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:222,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:223;及(xv)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:238,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:239。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中抗體包含與降低之效應物功能對應之經修飾Fc區。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中經修飾Fc區包含選自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A及L235A中之一或多者之突變。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其中經修飾Fc區包含選自D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A、及P329G/L234A/L235A中之一或多者之突變之組合。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其由SEQ ID NO:193之HCDR1、SEQ ID NO:194之HCDR2、SEQ ID NO:195之HCDR3、SEQ ID NO:196之LCDR1、SEQ ID NO:197之LCDR2、SEQ ID NO:198之LCDR3、含有突變D265A/P329A之經修飾Fc區組成,且其中在與天然IL10相比時,抗體細胞激素植入蛋白具有更少之NK細胞活化。
一種經分離核酸,其編碼:(i)SEQ ID NO:246之可變重鏈及SEQ ID NO:247之可變輕鏈;(ii)SEQ ID NO:248之重鏈及SEQ ID NO:249之輕鏈;(iii)SEQ ID NO:242之可變重鏈及SEQ ID NO:243之可變輕鏈;及(iv)SEQ ID NO:244之重鏈及SEQ ID NO:245之輕鏈。
一種適於產生抗體細胞激素植入蛋白之重組宿主細胞,其包含編碼該蛋白之重鏈及輕鏈多肽及視情況分泌信號之核酸。
一種宿主細胞,其中細胞係哺乳動物細胞。
一種醫藥組合物,其包含抗體細胞激素植入蛋白及一或多種醫藥上可接受之載劑。
一種治療或預防有需要之個體之免疫相關病症之方法,其包含向該個體投與治療有效量之抗體細胞激素植入蛋白。
一種方法,其中免疫相關病症係選自由以下組成之群:發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病、貝西氏病、類肉瘤病及移植物抗宿主病(GVHD)。
一種方法,其中抗體細胞激素植入蛋白係與另一治療劑組合投與。
一種方法,其中治療劑係選自由以下組成之群之抗TNF劑:英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、戈利木單抗(golimumab)、那他珠單抗(natalizumab)及維多珠單抗(vedolizumab)。
一種方法,其中治療劑係選自由以下組成之群之胺基柳酸鹽藥劑:磺胺塞拉金(sulfasalazine)、美沙拉明(mesalamine)、巴柳氮
(balsalazide)、奧沙拉秦或5-胺基柳酸之其他衍生物。
一種方法,其中治療劑係選自由以下組成之群之皮質類固醇:甲基普賴蘇濃、氫化可體松、普賴松、布地奈德、美沙拉明及地塞米松。
一種方法,其中治療劑係抗細菌劑。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其用作治療劑用於治療或預防有需要之個體之免疫相關病症。
一種抗體細胞激素植入蛋白,其用作治療劑用於治療選自由以下組成之群之免疫相關病症:發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病、貝西氏病、類肉瘤病及移植物抗宿主病(GVHD)。
一種方法,其中抗體細胞激素植入蛋白係與另一治療劑組合投與。
一種方法,其中治療劑係選自由以下組成之群之抗TNF劑:英利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、戈利木單抗、那他珠單抗及維多珠單抗。
一種方法,其中治療劑係選自由以下組成之群之胺基柳酸鹽藥劑:磺胺塞拉金、美沙拉明、巴柳氮、奧沙拉秦或5-胺基柳酸之其他衍生物。
一種方法,其中治療劑係選自由以下組成之群之皮質類固醇:甲基普賴蘇濃、氫化可體松、普賴松、布地奈德、美沙拉明及地塞米松。
一種方法,其中治療劑係抗細菌劑。
「抗體」係指包含四聚體結構單元之免疫球蛋白家族之分子。每一四聚體均由兩對相同多肽鏈構成,每一對具有一條「輕鏈」(約25kDa)及一條「重鏈」(約50kDa至70kDa),其係藉助二硫鍵連接。公認的免
疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因,以及許多免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε,其又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。抗體可具有任一同型/類別(例如,IgG、IgM、IgA、IgD及IgE)或任一亞類(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。
將輕鏈及重鏈分成具有結構及功能同源性之區。術語「恆定」及「可變」係在結構及功能上使用。每一鏈之N末端定義主要負責抗原識別之具有約100個至110個或更多個胺基酸之可變(V)區或結構域。術語可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)分別係指輕鏈及重鏈之該等區。VH及VL之配對一起形成單一抗原-結合位點。除V區以外,重鏈及輕鏈含有恆定(C)區或結構域。免疫球蛋白C區之分泌形式係由三個C結構域(CH1、CH2、CH3)、視情況CH4(Cμ)及鉸鏈區構成。免疫球蛋白C區之膜結合形式亦具有膜及細胞內結構域。每一輕鏈在N末端具有VL,隨後在其另一端具有恆定結構域(C)。輕鏈(CL)及重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定結構域賦予重要生物性質,例如分泌、經胎盤運動性、Fc受體結合、補體結合及諸如此類。按照慣例,恆定區結構域之編號隨著其變得更加遠離抗體之抗原結合位點或胺基末端而增加。N末端係可變區且C末端係恆定區;CH3及CL結構域實際上分別包含重鏈及輕鏈之羧基末端結構域。將VL與VH比對並將CL與重鏈之第一恆定結構域比對。如本文所用,「抗體」涵蓋習用抗體結構及抗體之變化。因此,全長抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體及其抗體片段在此概念之範圍內。
抗體作為完整免疫球蛋白鏈或作為藉由利用各種肽酶消化而產生之多個充分描述之抗體片段存在。本文所用術語「抗體片段」係指抗體中保
留與抗原之表位特異性相互作用(例如藉由結合、空間阻礙、穩定/去穩定、空間分佈)之能力之一或多個部分。因此,例如,胃蛋白酶在鉸鏈區中之二硫鍵聯下方消化抗體以產生F(ab)’2,該F(ab)’2係Fab’之二聚體,該Fab’本身係藉由二硫鍵接合至VH-CH1之輕鏈。可在溫和條件下還原F(ab)’2以斷裂鉸鏈區中之二硫鍵聯,藉此將F(ab)’2二聚體轉化為Fab’單體。Fab’單體基本上係具有一部分鉸鏈區之Fab。Paul,Fundamental Immunology第3版(1993)。儘管各種抗體片段係關於完整抗體之消化來定義,但熟習此項技術者應瞭解該等片段可以化學方式或藉由使用重組DNA方法重新合成。如本文所用,「抗體片段」係指抗體中藉由修飾整個抗體而產生之一或多個部分,或使用重組DNA方法重新合成之彼等,其均保留結合特異性及功能活性。抗體片段之實例包括Fv片段、單鏈抗體(ScFv)、Fab、Fab'、Fd(Vh及CH1結構域)、dAb(Vh及經分離CDR);及該等片段之具有相同結合特異性之多聚體型式(例如,F(ab')2)。亦可將抗體片段納入細胞激素植入蛋白中以達成本發明中所提供之結合特異性及活性。
如本文所用「Fab」結構域包含重鏈可變結構域、恆定區CH1結構域、輕鏈可變結構域及輕鏈恆定區CL結構域。結構域之相互作用因在CH1結構域與CL結構域之間之二硫鍵而穩定。在一些實施例中,Fab之重鏈結構域之順序為N末端至C末端VH-CH,且Fab之輕鏈結構域之順序為N末端至C末端VL-CL。在一些實施例中,Fab之重鏈結構域之順序為N末端至C末端CH-VH,且Fab之輕鏈結構域之順序為CL-VL。儘管歷史上藉由木瓜蛋白酶消化完整免疫球蛋白鑑別了Fab,但在本發明之上下文中,「Fab」通常藉由任一方法重組產生。每一Fab片段關於抗原結合均為單
價,即其具有單一抗原-結合位點。
「互補決定結構域」或「互補決定區」(「CDR」)可互換地指VL及VH之超變區。CDR係抗體鏈中具有針對靶蛋白之特異性之靶蛋白結合位點。在每一人類VL或VH中存在三個CDR(CDR1-3,自N末端依次編號),其構成可變結構域之約15-20%。CDR在結構上與靶蛋白之表位互補且由此直接負責結合特異性。VL或VH之剩餘片段(所謂的框架區)展現較小之胺基酸序列變化(Kuby,Immunology,第4版,第4章.W.H.Freeman & Co.,New York,2000)。
可使用業內之各種熟知定義(例如Kabat、Chothia、國際ImMunoGeneTics數據庫(IMGT)及AbM(例如參見Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001);Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987);Chothia等人,Nature,342:877-883(1989);Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992);Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997)))確定CDR及框架區之位置。抗原組合位點之定義亦闡述於以下文獻中:Ruiz等人,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000);及Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001);MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996);及Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989);Martin等人,Methods Enzymol.,203:121-153(1991);及Rees等人,In Sternberg M.J.E.(編輯),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。
在Kabat下,VH中之CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3);且VL中之CDR胺基酸殘基編號為24-34
(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)。在Chothia下,VH中之CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)及95-102(HCDR3);且VL中之胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)及91-96(LCDR3)。藉由組合Kabat及Chothia二者之CDR定義,CDR係由人類VH中之胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)以及人類VL中之胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)組成。
如本文所使用之「抗體可變輕鏈」或「抗體可變重鏈」係指分別包含VL或VH之多肽。內源性VL係由基因區段V(可變)及J(接合)編碼的,且內源性VH係由V、D(多樣性)及J編碼的。VL或VH中之每一者包括CDR以及框架區(FR)。術語「可變區」或「V-區」可互換地指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之重鏈或輕鏈。V-區可為天然、重組或合成的。在此申請案中,抗體輕鏈及/或抗體重鏈有時可統稱為「抗體鏈」。如本文所提供及進一步闡述,「抗體可變輕鏈」或「抗體可變重鏈」及/或「可變區」及/或「抗體鏈」視情況包含納入CDR中之細胞激素多肽序列。
本文免疫球蛋白重鏈中包含(例如)CH2及CH3結構域之C末端部分為「Fc」結構域。如本文所用「Fc區」係指不包括第一恆定區(CH1)免疫球蛋白結構域之抗體之恆定區。Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白結構域,及IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白結構域,及該等結構域之撓性鉸鏈N末端。對於IgA及IgM,Fc可包括J鏈。對於IgG,Fc包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3及在Cγ1與Cγ之間之鉸鏈。業內應理解Fc區之邊界可變化,然而,通常將人類IgG重鏈Fc區定義為包含殘
基C226或P230至其羧基末端,使用編號係根據如Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,Va.)中之EU索引。「Fc區」可指呈分離形式之此區或在抗體或抗體片段之背景下之此區。「Fc區」包括Fc區之天然等位基因變體,例如,在CH2及CH3區中,包括(例如)調節效應物功能之修飾。Fc區亦包括不引起生物功能改變之變體。舉例而言,一或多個胺基酸自免疫球蛋白Fc區之N末端或C末端缺失,而不實質上喪失生物功能。舉例而言,在某些實施例中,C末端離胺酸係以替代或去除方式經修飾。在具體實施例中,Fc區中之一或多個C末端殘基經改變或去除。在某些實施例中,Fc中之一或多個C末端殘基(例如,末端離胺酸)缺失。在某些其他實施例中,Fc中之一或多個C末端殘基經替代胺基酸取代(例如,末端離胺酸經替代)。該等變體係根據業內已知之一般規則來選擇以便對活性具有最小效應(例如,參見Bowie等人,Science 247:306-1310,1990)。Fc結構域為免疫球蛋白(Ig)中由細胞受體(例如FcR)識別且與補體活化蛋白C1 q結合之部分。在CH2外顯子之5'部分中編碼之下鉸鏈區在抗體內提供撓性以結合至FcR受體。
「嵌合抗體」係如下抗體分子:其中(a)恆定區或其部分經改變、替代或交換,使得抗原結合位點(可變區)連接至不同或改變之類別、效應物功能及/或物種之恆定區或賦予嵌合抗體新的性質之完全不同的分子(例如,酶、毒素、激素、生長因子及藥物);或(b)可變區或其部分經具有不同或改變之抗原特異性之可變區改變、替代或交換。
「人類化」抗體係在人類中保留非人類抗體之反應性(例如,結合特異性、活性)同時具有較差免疫原性之抗體。此可藉由(例如)保留非人類
CDR區並用人類對應體替代抗體之剩餘部分達成。例如參見Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984);Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988);Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988);Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991);Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。
「人類抗體」包括具有可變區之抗體,在該等可變區中框架區及CDR區二者皆衍生自人類來源之序列。另外,若抗體含有恆定區,則該恆定區亦衍生自該等人類序列,例如人類種系序列或人類種系序列之突變型式或含有衍生自人類框架序列分析之共有框架序列的抗體(例如如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000中所闡述)。人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機誘變或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變或用於促進穩定性或製造之保守取代)。
術語「相應人類種系序列」係指與所有其他由人類種系免疫球蛋白可變區序列編碼之已知可變區胺基酸序列相比,編碼與參照可變區胺基酸序列或子序列具有最高測定胺基酸序列一致性之人類可變區胺基酸序列或子序列之核酸序列。相應人類種系序列亦可指與所有其他所評估可變區胺基酸序列相比,與參照可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列一致性之人類可變區胺基酸序列或子序列。相應人類種系序列可為僅框架區、僅互補決定區、框架及互補決定區、可變區段(如上文所定義)或包含可變區之序列或子序列之其他組合。可使用本文所闡述之方法(例如使用BLAST、ALIGN比對兩個序列或業內已知之另一比對算法)來測定序列一致性。相應人類種系核酸或胺基酸序列可與參照可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或
100%之序列一致性。可藉助(例如)可公開獲得之國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)及V-base確定相應人類種系序列。
如本文所用術語「化合價」係指多肽中潛在靶標結合位點之數量。每一靶標結合位點均特異性結合一個靶標分子或靶標分子上之特異位點。當多肽包含一個以上靶標結合位點時,每一靶標結合位點可特異性結合相同或不同的分子(例如,可結合至不同分子,例如,不同抗原或相同分子上之不同表位)。例如,習用抗體具有兩個結合位點且為二價的;「三價」及「四價」係指在抗體分子中分別存在三個結合位點及四個結合位點。抗體細胞激素植入蛋白可為單價(即,結合一個靶標分子)、二價或多價(即,結合一個以上靶標分子)。
在闡述靶標(例如蛋白質)與抗體細胞激素植入蛋白之間之相互作用之背景中使用時,片語「特異性結合」或「選擇性結合」係指決定靶標在蛋白質異質群體及其他生物產品中(例如在生物試樣(例如血液、血清、血漿或組織試樣)中)之存在之結合反應。因此,在某些指定條件下,具有具體結合特異性之抗體細胞激素植入蛋白至少兩倍於背景結合至具體靶標且並不實質上以顯著量結合存在於試樣中之其他靶標。在一實施例中,在指定條件下,具有具體結合特異性之抗體細胞激素植入蛋白至少十(10)倍於背景結合具體抗原且並不實質上以顯著量結合存在於試樣中之其他靶標。在該等條件下與抗體細胞激素植入蛋白之特異結合可需要針對其對具體蛋白之特異性來選擇抗體細胞激素植入蛋白。如本文所用,特異結合包括選擇性地結合至人類IL10R之抗體細胞激素植入蛋白且不包括與(例如)其他細胞激素受體超家族成員交叉反應之抗體細胞激素植入蛋白。在一些實施例中,選擇選擇性地結合至人類IL10R且與非人類靈長類動物IL10R(例
如,食蟹猴IL10R)交叉反應之抗體細胞激素植入蛋白。在一些實施例中,選擇選擇性地結合至人類IL10R且與另一靶標抗原反應之抗體植入蛋白。可使用各種格式來選擇與具體靶標抗原蛋白特異地反應之抗體細胞激素植入蛋白。舉例而言,固相ELISA免疫分析通常用於選擇與蛋白質特異性免疫反應之抗體(例如參見Harlow及Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998),其闡述可用於測定特異性免疫反應之免疫分析格式及條件)。通常,特異性或選擇性結合反應將產生至少兩倍於背景信號且更通常至少10倍至100倍於背景之信號。
術語「平衡解離常數(KD,M)」係指解離速率常數(kd,時間-1)除以締合速率常數(ka,時間-1,M-1)。可使用業內已知之任一方法量測平衡解離常數。本發明之抗體細胞激素植入蛋白將通常具有小於約10-7M或10-8M之平衡解離常數,例如,小於約10-9M或10-10M,在一些實施例中,小於約10-11M、10-12M或10-13M。在一些實施例中,經分離抗體細胞激素植入蛋白以約1nM或更小之平衡解離常數(KD)結合至人類IL10R。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白以小於1nM之KD結合至人類IL10R。在一些實施例中,抗體-細胞激素植入蛋白以在約0.5nM至約1.0nM範圍內之KD結合至人類IL10R。
如本文所用術語「結合區」係指抗體細胞激素植入蛋白中負責分子與IL10R間之特異結合之結構域。每一抗體細胞激素植入蛋白中存在至少一個該結合區且結合區中之每一者與其他可相同或不同。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白之結合區中之至少一者充當IL10R之激動劑。
術語「激動劑」可互換地指能夠活化受體以誘導完全或部分受體介導之反應之抗體細胞激素植入蛋白。舉例而言,IL10R之激動劑結合至
IL10R且誘導IL10R介導之細胞內信號傳導及/或細胞活化。抗體細胞激素植入蛋白刺激藉助IL10R之信號傳導,該IL10R在一些方面與天然配體hIL10類似。hIL10與IL10R之結合由於IκB之降解而誘導NFκB活化。在一些實施例中,可鑑別抗體細胞激素植入蛋白激動劑之以下能力:結合IL10R及誘導STAT3磷酸化,抑制促發炎性細胞激素(例如TNFα,IL1,IL6,IL12,IFNγ)之產生及/或巨噬細胞之分化及增殖;誘導T細胞(例如,CD8+ CTL或CD4+ Th細胞)增殖、存活、細胞溶解活性及/或細胞激素產生(例如,IFNγ,IL-10,IL-13,TNFα)或如本文在其他方面所闡述。
術語「經分離」在應用於核酸或蛋白時表示該核酸或蛋白基本上不含在天然狀態下與其結合之其他細胞組份。其較佳地呈均質狀態。其可呈無水溶液或水溶液形式。通常使用分析化學技術(例如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析)測定純度及均質性。為製劑中存在之主要物質之蛋白質係基本上純化的。具體而言,將經分離基因與開放閱讀框分開,該開放閱讀框位於該基因之側翼且編碼除目標基因之外之蛋白質。術語「經純化」表示在電泳凝膠中核酸或蛋白質產生基本上一個帶。具體而言,其意味著核酸或蛋白為至少85%純,更佳至少95%純,且最佳至少99%純。
術語「核酸」或「多核苷酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制,否則該術語涵蓋含有與參照核酸具有類似結合性質且以類似於天然核苷酸之方式代謝之天然核苷酸之已知類似物的核酸。除非另外指明,否則具體核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如,簡併密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定地,藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧次黃嘌呤核苷殘基取
代的序列可達成簡併密碼子取代(Batzer等人,Nucleic Acids Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);及Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用,其皆指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基係對應天然胺基酸之人造化學模擬物之胺基酸聚合物以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。
術語「胺基酸」係指天然及合成胺基酸以及以類似於天然胺基酸之方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係藉由基因代碼編碼之彼等以及稍後經修飾之彼等胺基酸,例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指具有與天然胺基酸相同之基本化學結構(亦即與氫、羧基、胺基及R基團結合之α-碳)之化合物,例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架,但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構但以類似於天然胺基酸之方式起作用的化學化合物。
「保守修飾之變體」適用於胺基酸序列及核酸序列二者。就具體核酸序列而言,經保守修飾之變體係指彼等編碼一致或基本上一致之胺基酸序列之核酸,或在該核酸不編碼胺基酸序列之情況下係指基本上一致之序列。由於基因代碼之簡併性,大量功能相同之核酸編碼任一給定蛋白質。例如,密碼子GCA、GCC、GCG及GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此,在丙胺酸由密碼子指定之每一情形下,可在不改變所編碼多肽下將該密碼子改變成所述之任一相應密碼子。該等核酸變化為「沉默變化」,其係保守
修飾變化之一種。本文中編碼多肽之每一個核酸序列亦闡述該核酸之每一可能的沉默變化。熟習此項技術者將認識到,核酸中之每一密碼子(AUG(其通常為甲硫胺酸之唯一密碼子)及TGG(其通常為色胺酸之唯一密碼子)除外)可經修飾以產生功能相同之分子。因此,編碼多肽之核酸之每一沉默變化暗含於每一所闡述序列中。
關於胺基酸序列,熟習此項技術者將意識到,在所編碼序列中改變、添加或缺失單一胺基酸或小百分比之胺基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列之個別取代、缺失或添加係「保守修飾之變體」,其中改變使得胺基酸經化學上類似之胺基酸取代。提供功能類似胺基酸之保守取代表已為熟習此項技術者所熟知。該等保守修飾變體亦包括且不排除多態變體、種間同系物及等位基因。以下8個群均含有之胺基酸互為保守取代:1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G);2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E);3)天門冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q);4)精胺酸(R)、離胺酸(K);5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V);6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W);7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T);及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(例如參見Creighton,Proteins(1984))。
「序列一致性之百分比」係藉由在比較窗口內比較兩個最佳比對之序列來測定,其中為了兩個序列之最佳比對,與不包含添加或缺失之參照序列(例如,多肽)相比,比較窗口中多核苷酸序列之部分如可包含添加或缺失(即,缺口)。該百分比係藉由以下來計算:測定在兩個序列中均出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基之位置之數量以得到匹配位置之數量,將匹配位置之數量除以比較窗口中之位置之總數,並將結果乘以100以得到序列一致性之百分比。
術語「相同」或「一致性」百分比在兩個或更多個核酸或多肽序列背景下係指兩條或更多條為相同序列之序列或子序列。若在針對最大對應性在比較窗或指定區中進行比較及比對(如使用下列序列比較算法中之一者或藉由人工比對及目測檢查所量測)時,兩個序列具有胺基酸殘基或核苷酸之指定相同百分比(亦即在指定區中或在未指定時在參照序列之整個序列中具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性),則兩個序列「實質上相同」。本發明提供分別與本文所例示之多肽或多核苷酸(例如,在SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206;SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:238SEQ ID NO:239中之任一者中例示之可變區;在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241中之任一
者中例示之可變區;在SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239中之任一者中例示之CDR;在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241中之任一者中例示之序列)基本上相同之多肽或多核苷酸。視情況,一致性存在於長度為至少約15個、25個或50個核苷酸之區中,或更佳地存在於長度為100至500個或1000個或更多個核苷酸之區中,或存在於參照序列之全長中。就胺基酸序列而言,一致性或基本一致性可存在於長度為至少5個、10個、15個或20個胺基酸、視情況長度為至少約25個、30個、35個、40個、50個、75個或100個胺基酸、視情況長度為至少約150個、200個或250個胺基酸之區中,或存在於參照序列之全長中。就較短胺基酸序列(例
如,20個或更少胺基酸之胺基酸序列)而言,在一或兩個胺基酸殘基根據本文所定義之保守取代經保守取代時存在基本一致性。
就序列比較而言,一個序列通常將作為參照序列與測試序列進行比較。在使用序列比較算法時,將測試序列及參照序列輸入電腦中,必要時指定子序列坐標,並指定序列算法程式參數。可使用缺省程式參數,或可指定替代參數。然後,序列比較算法將基於程式參數計算測試序列相對於參照序列之序列一致性百分比。
本文所用「比較窗口」包括對選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150個位置組成之群之多個鄰接位置中任一者的區段之參照,在該比較窗口中,可將序列與具有相同數量鄰接位置之參照序列在兩個序列經過最佳比對後進行比較。比對所比較序列之方法為業內所熟知。可藉由以下方式執行所比較序列之最佳比對:例如,藉由Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c之局部同源性算法,藉由Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443之同源性比對算法,藉由尋找Pearson及Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444之類似性方法,藉由電腦化實施該等算法(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA,Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)或藉由人工比對及目視檢查(例如,參見Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
適於測定序列一致性及序列相似性百分比之算法之兩個實例係BLAST及BLAST 2.0算法,其分別闡述於Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402及Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。
用於實施BLAST分析之軟體可經由National Center for Biotechnology Information公開獲得。該算法首先涉及藉由鑑別詢問序列中之代碼長度縮寫W來鑑別高評分序列對(HSP),在代碼與一個資料庫序列中具有相同長度之代碼進行比對時,其將與某一正臨限評分T相匹配或滿足其條件。T稱作相鄰代碼評分臨限值(Altschul等人,見上文)。該等初始相鄰重複代碼將作為引子以啟動發現含有其之更長HSP的搜索。將重複代碼沿每一序列之兩個方向延伸,儘量能夠使累積比對評分增加。對於核苷酸序列而言,累積評分係使用參數M(匹配殘基對之獎勵評分;始終大於0)及N(不匹配殘基之懲罰評分;始終<0)來計算。對於胺基酸序列而言,使用評分矩陣來計算累積評分。重複代碼在每一方向上之延伸在以下時候將停止:累積比對評分自其所達成之最大值降低了X數量;由於一或多個負評分殘基比對累加而使累積評分變為零或負值;或達到任一序列之端點。BLAST算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列而言)使用之缺省值有代碼長度(W)11、預期值(E)10、M=5、N=-4及兩條鏈之比較值。對於胺基酸序列而言,該BLASTN程式使用之缺省值有代碼長度3及預期值(E)10及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比對(B)50、預期值(E)10、M=5、N=-4及兩條鏈之比較值。
BLAST算法亦對兩個序列之間之類似性實施統計學分析(例如參見Karlin及Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供之一種類似性量度係最小和概率(P(N)),其指示兩個核苷酸或胺基酸序列之間藉由偶爾匹配之概率。舉例而言,若在比較測試核酸與參照核酸時最小和概率小於約0.2、更佳地小於約0.01且最佳地小於約
0.001,則可將該核酸視為與參照序列類似。
兩個核酸序列或多肽實質上相同之另一指示為由第一核酸編碼之多肽與針對由第二核酸編碼之多肽產生之抗體在免疫學上交叉反應,如下文所闡述。因此,該多肽通常與第二多肽實質上相同,舉例而言,其中兩種肽之區別僅在於保守取代。兩個核酸序列實質上相同之另一指示為兩個分子或其補體在嚴格條件下相互雜交,如下文所闡述。兩個核酸序列實質上相同之又一指示為可使用相同引物擴增序列。
術語「抗體細胞激素植入蛋白」或「抗體細胞激素移植物」或「經植入」意味著細胞激素直接納入抗體之CDR內,打斷CDR之序列。可將細胞激素納入HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3內。可將細胞激素納入HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3內並納入朝向CDR之N末端序列或朝向CDR之C末端序列。在某些情形中,納入抗體CDR內之細胞激素降低抗體與其靶標蛋白之結合特異性。在某些情形中,納入抗體CDR內之細胞激素不會降低抗體之結合特異性且其保留其對靶標之特異性。
「免疫相關病症」或「免疫疾病」係指免疫系統之功能障礙,其中身體自身之免疫系統攻擊健康組織。功能障礙可在免疫細胞之組份中,且包括活性過度及活性不足之免疫系統。
術語「個體(subject)」、「患者」及「個體(individual)」可互換地指哺乳動物,例如,人類或非人類靈長類動物哺乳動物。哺乳動物亦可為實驗室哺乳動物,例如,小鼠、大鼠、兔、倉鼠。在一些實施例中,哺乳動物可為農業哺乳動物(例如,馬、綿羊、牛、豬、駱駝科動物)或家養哺乳動物(例如,犬、貓)。
在一個實施例中,如本文所用術語「治療(treat、treating或treatment)」任一疾病或病症係指改善該疾病或病症(即,減緩或阻止或降低該疾病或其至少一種臨床症狀之發展)。在另一實施例中,「治療(treat、treating或treatment)」係指減輕或改善至少一個身體參數(包括患者不可識別之彼等)。在又一實施例中,「治療(treat、treating或treatment)」係指在身體上(例如,穩定可認識的症狀)、生理上(例如,穩定身體參數)或二者上調節疾病或病症。在又一實施例中,「治療(treat、treating或treatment)」係指預防或延遲疾病或病症之發作或發展或進展。
術語「治療上可接受之量」或「治療有效劑量」可互換地指足以實現期望結果(即,減少發炎、抑制疼痛、預防發炎、抑制或預防發炎反應)之量。在一些實施例中,治療可接受量並不誘導或引起不合意副效應。可藉由以下方式來測定治療可接受量:首先投與低劑量,且然後以遞增方式增加該劑量直至達成期望效應為止。「預防有效劑量」及「治療有效劑量」之激動性IL10抗體細胞激素植入蛋白可分別預防疾病症狀(包括與免疫相關病症相關之症狀)之發作或降低其嚴重程度。
術語「共投與」係指在個體中同時存在兩種(或更多種)活性藥劑。可同時或依序遞送共投與之活性劑。
如本文所用片語「基本上由……組成」係指方法或組合物中所包括活性醫藥藥劑之類或種以及任一對於方法或組合物之預期目的為無活性之載劑或賦形劑。在一些實施例中,片語「基本上由……組成」明確排除包含一或多種除激動劑IL10抗體細胞激素植入蛋白外之其他活性劑。在一些實施例中,片語「基本上由……組成」明確排除包含一或多種除激動劑IL10抗體細胞激素植入蛋白外之其他活性劑及另一共投與藥劑。
除非上下文另有明確指示,否則術語「一(a、an)」及「該」包括複數個指示物。
介白素-10(IL-10)係具有免疫刺激及免疫抑制活性之多功能、同二聚體免疫調節細胞激素。IL-10在經活化單核球及巨噬細胞中抑制多種促發炎性細胞激素之誘導,但為不成熟及成熟淋巴球、肥胖細胞及B細胞之共刺激物(綜述於Mosmann,Adv.Immunol.1994;56:1-26;Moore等人,Annu Rev Immunol.2001;19:683-765中)。本文提供包含融合至抗體之互補決定區(CDR)之單體IL-10之抗體細胞激素植入蛋白。抗體細胞激素植入蛋白顯示適宜用於人類患者中之性質,例如,其保留與天然或重組人類IL10類似之免疫抑制活性,然而,促發炎性效應有所降低。在整個說明書中亦證明了其他活性及特徵。因此,本發明提供較先前已知之IL10樣治療劑具有改良之治療特性之抗體細胞激素植入蛋白及抗體細胞激素植入蛋白在療法中之使用方法。
因此,本發明提供為IL10受體之激動劑且具有選擇性活性特性之抗體細胞激素植入蛋白。所提供之抗體細胞激素植入蛋白包含免疫球蛋白重鏈序列及免疫球蛋白輕鏈序列。每一免疫球蛋白重鏈序列包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH),其中重鏈恆定區由CH1、CH2及CH3恆定區組成。每一免疫球蛋白輕鏈序列包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。在每一抗體細胞激素植入蛋白中,單體IL10分子係植入VH或VL區之互補決定區(CDR)中。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含納入重鏈CDR中之單體IL10。在某些實施例中單體IL10係納入重鏈互補決定區1(HCDR1)
中。在某些實施例中單體IL10係納入重鏈互補決定區2(HCDR2)中。在某些實施例中單體IL10係納入重鏈互補決定區3(HCDR3)中。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含納入輕鏈CDR中之單體IL10。在某些實施例中單體IL10係納入輕鏈互補決定區1(LCDR1)中。在某些實施例中,單體IL10係納入輕鏈互補決定區2(LCDR2)中。在某些實施例中,單體IL10係納入輕鏈互補決定區3(LCDR3)中。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含納入CDR中之單體IL10,其中IL10序列係插入CDR序列中。插入可在CDR之起始處或附近,在CDR之中間區或在CDR之末端處或附近。在其他實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含納入CDR中之單體IL10,其中IL10序列替代所有或一部分CDR序列。替代可在CDR之起始處或附近,在CDR之中間區或在CDR之末端處或附近。替代可少至CDR序列之一或兩個胺基酸或多達整個CDR序列。
在一些實施例中,單體IL10視情況與一或多個肽連接體序列一起納入CDR序列中。在某些實施例中,一或多個肽連接體獨立地選自(Glyn-Ser)m序列、(Glyn-Ala)m序列或(Glyn-Ser)m/(Glyn-Ala)m序列之任一組合,其中每一n獨立地為1至5之整數且每一m獨立地為0至10之整數。在一些實施例中,肽連接體為(Gly4-Ser)m,其中m係0至10之整數。在一些實施例中,肽連接體為(Gly4-Ala)m,其中m為0至10之整數。
在一些實施例中,單體IL10不與肽連接體一起直接納入CDR中。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含IgG類抗體重鏈之免疫球蛋白重鏈。在某些實施例中,IgG重鏈係IgG1、IgG2或IgG4亞類中之任一者。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含選自已知之臨床上利用之免疫球蛋白序列之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。在某些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含為人類化序列之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。在其他某些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含為人類序列之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含選自種系免疫球蛋白序列之重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含免疫球蛋白可變結構域之結合特異性係針對不同於IL10單體之結合特異性之抗原的重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列。在一些實施例中,免疫球蛋白可變結構域之結合特異性在所植入細胞激素存在下保留。在某些實施例中,抗體結合特異性係針對非人類抗原。在其他實施例中,結合特異性係針對與IL10療法結合具有治療效用之所靶向之不同人類抗原。在某些實施例中,靶向免疫球蛋白之結合特異性向IL10組份傳遞其他治療益處。在某些實施例中,免疫球蛋白之結合特異性傳遞與IL10之協同活性。
在其他實施例中,免疫球蛋白之結合特異性因IL10植入細胞激素之存在而破壞。
抗體細胞激素植入蛋白包含納入每一異二聚體之VH或VL之互補決定區(CDR)之單體IL10分子。在一些實施例中,單體IL10分子與SEQ ID NO:209之胺基酸序列具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中,單體IL10分子包含SEQ ID NO:209之序列。在一些實施例中,單體IL10分子由SEQ ID NO:209之序列組成。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白賦予類似於人類IL10或重組人類IL10之抗發炎性質,且如與人類IL10或重組人類IL10相比,植入蛋白賦予降低之成比例之促發炎性活性。在一些實施例中,如與IL10比較,成比例之促發炎性活性降低至少百分之二十五(25%)。在一些實施例中,如與IL10比較,成比例之促發炎性活性降低至少百分之三十五(35%)。在一些實施例中,如與IL10比較,成比例之促發炎性活性降低至少約百分之五十(50%)。在一些實施例中,如與IL10比較,成比例之促發炎性活性降低至少約百分之六十五(65%)。在一些實施例中,如與IL10比較,成比例之促發炎性活性降低至少約百分之七十五(75%)。在一些實施例中,如與IL10比較,成比例之促發炎性活性降低至少約百分之八十(80%)。在一些實施例中,如與IL10比較,成比例之促發炎性活性降低超過百分之八十(80%)。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含具有賦予經修飾效應物功能之經修飾Fc之經修飾免疫球蛋白IgG。在某些實施例中,經修飾Fc區包含選自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A及L235A中之一或多者之突變。在具體實施例中,免疫球蛋白重鏈可包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:13之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性,及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:14之輕鏈可變區具有至少85%、
89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:29之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:30之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:45之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:46之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物
功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:61之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:62之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:77之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:78之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:93之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:94之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包括包含以下之每一者:(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:109之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:110之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:125之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性
及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:126之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:141之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:142之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:157之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:158之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之
IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:173之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:174之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:189之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:190之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及
P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:205之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:206之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:222之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:223之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈可變區,其與SEQ ID NO:238之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈可變區,其與SEQ ID NO:239之輕鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。免疫球蛋白鏈係選自IgG1、IgG2或IgG4之IgG類。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:15具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:16具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:31具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:32具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、
P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:47具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:48具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:63具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:64具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:79具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:80具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:95具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:96具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:111具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:112具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、
L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:127具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:128具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:143具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:144具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:159具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與
SEQ ID NO:160具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:175具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:176具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:191具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:192具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者
之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:207具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:208具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:224具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:225具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含(i)重鏈,其與SEQ ID NO:240具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性及(ii)輕鏈,其與SEQ ID NO:241具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致性。在某些實施例中,免疫球蛋白重鏈視情況包含賦予降低之效應物功能且選自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之任一者之突變或突變組合。
抗體細胞激素植入蛋白係藉由將單體IL10序列插入免疫球蛋白支架之CDR區中生成。產生重鏈及輕鏈免疫球蛋白鏈以生成最終抗體植入蛋白。抗體細胞激素植入蛋白賦予IL10之較佳治療抗發炎性質;然而,如與天然或重組人類IL10(rhIL10)相比,抗體細胞激素植入蛋白具有成比例降低之促發炎性活性。
為改造植入構築體,將包含全長IL10之殘基19-178及在殘基134與135之間之六個胺基酸序列之單體IL10(IL10M,SEQ ID NO:209)插入免疫球蛋白支架之CDR環中。可使用已用於臨床環境中之各種已知免疫球蛋白序列、處於目前發現及/或臨床研發中之已知免疫球蛋白序列、人類種系抗體序列以及新穎抗體免疫球蛋白鏈之序列中之任一者製備所植入之構築體。使用標準分子生物學方法利用編碼相關序列之重組DNA產生構築體。兩個實例性支架中之IL10M之序列稱作GFTX1及GFTX3且繪示於表1中。基於可用結構或同源性模型數據選擇IL10單體之插入點作為環之中點,然而,可朝向CDR環之一端或另一端調節插入點。
因此,本發明提供特異性結合至IL10R蛋白之抗體或其片段,其包含以重組方式插入異源抗體蛋白或多肽中以生成抗體細胞激素植入蛋白之IL10M蛋白。具體而言,本發明提供植入蛋白,其包含本文所闡述之抗體
或抗體之抗原結合片段或任何其他相關支架抗體多肽(例如,全抗體免疫球蛋白蛋白、Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH結構域、VH CDR、VL結構域、VL CDR等)及異源細胞激素蛋白、多肽或肽(例如,IL10M)。將蛋白質、多肽或肽融合或偶聯至抗體或抗體片段之方法為業內已知。例如參見美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號;歐洲專利第EP 307,434號及第EP 367,166號;國際公開案第WO 96/04388號及第WO 91/06570號;Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539;Zheng等人,1995,J.Immunol.154:5590-5600;及Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341。另外,可藉助基因改組、基序改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)之技術生成抗體細胞激素植入蛋白。可採用DNA改組來製備抗體細胞激素植入蛋白及/或改變抗體或其片段(例如,具有較高親和力及較低解離速率之抗體或其片段)之活性。通常參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號;Patten等人,1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33;Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82;Hansson,等人,1999,J.Mol.Biol.287:265-76;及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-313該等專利及出版物中之每一者均以全文引用方式併入本文中)。可藉由在重組之前經受隨機誘變(藉由易錯PCR)、隨機核苷酸插入或其他方法來改變抗體或其片段或所編碼抗體或其片段。可使編碼特異性結合至目標抗原蛋白之抗體或其片段之多核苷酸與一或多種異源細胞激素分子(例如,IL10M)之一或多個組份、基序、組段、部分、結構域、片段等重組,以製備如本文所提
供之抗體細胞激素植入蛋白。
抗體Fab含有6個CDR環,3個在輕鏈中(CDRL1、CDRL2、CDRL3)且3個在重鏈中(CDRH1、CDRH2、CDRH3),該等環可用作細胞激素蛋白之潛在插入位點。慮及結構及功能考慮以便確定將細胞激素插入哪個CDR環。由於CDR環大小及構象在不同抗體之間變化很大,故可針對每一具體抗體/蛋白組合憑經驗確定供插入之最佳CDR。另外,由於細胞激素蛋白將插入CDR環中,故此可對細胞激素蛋白之結構施加額外約束。舉例而言,細胞激素蛋白之胺基及羧基末端應容許在空間上被約束相對接近(約25Å)之可能性。另外,抗體細胞激素植入蛋白之生物活性不應依賴於寡聚。可用PDB結構之分析指示許多細胞激素蛋白(包括IL10)均屬此類別。
術語「IL10」或「介白素十」或「介白素-10」可互換地指α螺旋細胞激素家族成員,其中天然蛋白在調節及維持發炎過程中充當非共價同二聚體。介白素-10(IL10)係採用結構域交換架構之同二聚體細胞激素。呈天然形式時,IL10無法適於抗體移植,乃因無法形成結構域交換結構(即N末端及C末端均約束在環中)。然而,藉由在螺旋D與E之間插入6殘基序列((GGGSGG)(SEQ ID NO.251))產生之經改造單體IL10(IL10M)容許螺旋E及F(其交換至天然二聚體結構中之其他IL10單體中)回折至相同單體中並產生抗體細胞激素植入蛋白中所存在之結構(圖2)。(參見Josephson等人J.Biol.Chem.2000;275(18)13552-7)。Josephson等人證明具有六個胺基酸插入之IL10單體較野生型二聚體更熱穩定且亦能夠與IL10受體鏈α(IL10R1或IL10Rα)形成1:1。IL10M亦具有活體外活性,但其活性較野生型IL10小於9倍至18倍。IL10M之另一特徵為N末端及C末端在空間上彼此
接近,此使得經修飾細胞激素蛋白適於抗體移植。在激動劑抗體細胞激素植入蛋白之情況下,利用基本上由全長天然人類IL10之殘基19-178及在殘基134與135之間之6胺基酸連接體組成的單體IL10(IL10M)。在結構上,單體IL10(IL10M)在其全長內與胺基酸SEQ ID NO:209具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性且在植入抗體CDR中時保留優先激動劑活性。
免疫球蛋白鏈之CDR係藉由業內已知之熟知之編號系統確定,包括本文所闡述之彼等。舉例而言,已藉由使用闡述於以下文獻中之編號系統鑑別及定義CDR:(1)Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號方案),NIH公開案第91-3242號;及(2)Chothia,參見A1-Lazikani等人,(1997)「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins,」J.Mol.Biol.273:927-948。對於長度小於20個胺基酸之經鑑別CDR胺基酸序列,可耐受一或兩個保守胺基酸殘基取代同時仍保留期望之特異結合及/或激動劑活性。
另外可使用具有本文(例如,表1)所顯示之CDR及/或VH及/或VL序列中之一或多者之抗體作為起始材料來改造經修飾抗體細胞激素植入蛋白來製備本發明抗體細胞激素植入蛋白,該本發明植入蛋白可具有自起始抗體植入蛋白有所改變之性質。另一選擇為,可利用任何已知抗體序列作為支架來改造經修飾抗體細胞激素植入蛋白。舉例而言,可利用在臨床上利用之任一已知抗體作為起始材料支架來製備抗體植入蛋白。已知之抗體及相應免疫球蛋白序列包括(例如)帕利珠單抗(palivizumab)、阿裡羅單抗
(alirocumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、地土昔單抗(dinutuximab)、西庫努單抗(secukinumab)、埃羅庫單抗(evolocumab)、布利莫單抗(blinatumomab)、派姆單抗(pembrolizumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、維多珠單抗、司妥昔單抗(siltuximab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、瑞西巴庫單抗(raxibacumab),帕妥珠單抗(pertuzumab)、貝利木單抗(belimumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、地諾單抗(denosumab)、托珠單抗(tocilizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、卡那單抗(canakinumab)、戈利木單抗、優特克單抗(ustekinumab)、賽妥珠單抗、卡妥索單抗(catumaxomab)、依庫珠單抗(eculizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、那他珠單抗、貝伐珠單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、依法利珠單抗(efalizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、阿達木單抗、阿倫單抗(alemtuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、英利昔單抗、巴利昔單抗(basiliximab)、達克珠單抗(daclizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、阿昔單抗(abciximab)、莫羅單抗(muromonab)或其修飾物。已知抗體及免疫球蛋白序列亦包括種系抗體序列。框架序列可自包括種系抗體基因序列之公開DNA數據庫或公開參照文獻獲得。舉例而言,人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可參見「VBase」人類種系序列資料庫,以及Kabat,E.A.,等人,1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號;Tomlinson,I.M.,等人,1992 J.fol.Biol.227:776-
798;及Cox,J.P.L.等人,1994 Eur.J Immunol.24:827-836。在再其他實例中,來自可能處於早期發現及/或藥物研發中之其他已知實體之抗體及相應免疫球蛋白序列可類似地適合作為起始材料來改造經修飾抗體細胞激素植入蛋白。
可使用眾多種抗體/免疫球蛋白框架或支架,只要所得多肽包括至少一個適合納入細胞激素(例如,IL10M)之結合區即可。該等框架或支架包括5種主要個體基因型之人類免疫球蛋白或其片段,且包括其他動物物種之較佳具有人類化及/或人類態樣之免疫球蛋白。熟習此項技術者繼續發現並研發新穎抗體、框架、支架及片段。
可使用業內已知之方法生成抗體。為製備單株抗體,可使用業內已知之任一技術(例如,參見Kohler & Milstein,Nature 256:495-497(1975);Kozbor等人,Immunology Today 4:72(1983);Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,第77頁至第96頁.Alan R.Liss,Inc.1985)。產生單鏈抗體之技術(美國專利第4,946,778號)可適於產生用於本發明抗體細胞激素植入蛋白中之抗體。而且,可使用轉基因小鼠或其他生物體(例如其他哺乳動物)來表現及鑑別靈長類化或人類化或人類抗體。或者,可使用噬菌體展示技術來鑑別用於抗體細胞激素植入蛋白中且特異性結合至所選抗原之抗體及異聚體Fab片段。(例如參見McCafferty等人,上文文獻;Marks等人,Biotechnology,10:779-783,(1992))。
用於靈長類化或人類化非人類抗體之方法為業內所熟知。通常,靈長類化或人類化抗體將來自非靈長類動物或非人類來源之一或多個胺基酸殘基引入至其中。該等非靈長類動物或非人類胺基酸殘基通常稱為引入殘基,其通常取自引入可變結構域。人類化可基本上遵循Winter及同事之方
法(例如參見Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988)及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))藉由用齧齒類動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列實施。因此,該等人類化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號),其中實質上少於一個完整人類可變結構域已由來自非人類物種之相應序列所取代。實際上,靈長類化或人類化抗體通常係其中一些互補決定區(「CDR」)殘基及可能的一些框架(「FR」)殘基由來自起源物種(例如,齧齒類動物抗體)中之類似位點之殘基取代以賦予結合特異性之靈長類動物或人類抗體。
或者或另外,可利用在抗體中用人類可變區替代非人類抗體可變區同時相對於非人類抗體維持相同結合特徵或提供更好結合特徵之活體內方法將非人類抗體轉化至經改造人類抗體中。例如參見美國專利公開案第20050008625號、美國專利公開案第2005/0255552號。或者,可藉由依序盒式替代來生成人類V區段文庫,其中最初由人類序列之文庫替代參考抗體V區段之僅一部分;且然後在另一文庫篩選中重組所鑑別的在殘餘參考抗體胺基酸序列之情況下支持結合之人類「盒」,以生成完全人類V區段(參見美國專利公開案第2006/0134098號)。
用於製備抗體細胞激素植入蛋白之各種抗體或抗原結合片段可藉由酶或化學修飾完整抗體來產生,或使用重組DNA方法來重新合成(例如,單鏈Fv),或使用噬菌體展示文庫來鑑別(例如,參見McCafferty等人,Nature 348:552-554,1990)。舉例而言,可使用業內闡述之方法生成微小抗體,例如,Vaughan及Sollazzo,Comb Chem High Throughput Screen.4:417-30 2001。可藉由各種方法(包括雜交瘤植入或連接Fab'片段)產生雙
特異性抗體。例如參見Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990);Kostelny等人,J.Immunol.148,1547-1553(1992)。可使用噬菌體展示文庫或核糖體展示文庫、基因改組文庫鑑別單鏈抗體。該等文庫可自合成、半合成或天然及免疫勝任來源構築。因此,所選免疫球蛋白序列可用於製備如本文所提供之抗體細胞激素植入蛋白。
用於本發明中之抗體或抗原-結合分子進一步包括雙特異性抗體。雙特異性或雙功能性抗體係具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜合抗體。其他抗原結合片段或抗體部分包括二價scFv(雙價抗體)、抗體分子識別兩個不同表位之雙特異性scFv抗體、單一結合結構域(dAb)及微小抗體。可利用所選免疫球蛋白序列製備如本文所提供之抗體細胞激素植入蛋白。
可使用抗體之抗原結合片段(例如,Fab片段、scFv)作為結構單元來構築體抗體細胞激素植入蛋白,且其視情況包括多價格式。在一些實施例中,該等多價分子包含抗體之恆定區(例如,Fc)。
可藉由修飾抗體之一或兩個可變區(即,VH及/或VL)內(例如在一或多個CDR區內)之一或多個殘基來改造抗體細胞激素植入蛋白,且該等適應VH及/或VL區序列用於納入細胞激素以製備抗體細胞激素植入蛋白。可實施之一類可變區改造係CDR移植。抗體與靶抗原主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基相互作用。出於此原因,在個別抗體之間CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列更不同。CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用,可藉由構築表現載體來表現模擬特異性抗體之特性之重組抗體,該等表現載體包括來自特異性抗體移植至具有不同特性之不同抗體之框架序列上的CDR序列(例如,參見Riechmann,L.等人,
1998Nature332:323-327;Jones,P.等人,1986Nature321:522-525;Queen,C.等人,1989Proc.Natl.Acad.U.S.A.86:10029-10033;頒予Winter之美國專利第5,225,539號及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號;第5,585,089號;第5,693,762號及第6,180,370號)。在某些情況下,有益地使框架區內之殘基突變以維持或增強抗體之抗原結合能力(例如參見頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號;第5,585,089號;第5,693,762號及第6,180,370號)。
在一些態樣中,使VH及/或VL、CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變以藉此改良目標抗體之一或多個結合性質(例如,親和性)(此稱為「親和性成熟」)可有益於(例如)最佳化抗體與細胞激素植入蛋白之情況聯合之抗原結合。可實施定點誘變或PCR介導之誘變以引入突變,且可在如本文所闡述且於實例中提供之活體外或活體內分析及/或業內已知之替代或其他分析中評估對抗體結合之效應或所關注之其他功能性質。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。另外,通常改變CDR區內之不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。
經改造抗體或抗體片段包括已對VH及/或VL內之框架殘基進行修飾以例如改良抗體特性之彼等。在一些實施例中,進行該等框架修飾以降低抗體之免疫原性。例如,一種方法係將一或多個框架殘基「回復突變」成相應的種系序列。更特定而言,已經受體細胞突變之抗體含有與衍生出該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生出該抗體之種系序列來鑑別。為使框架區序列返回至其種系構形,可藉由(例如)定點誘變將體細胞突變「回復突變」成種系序列。該等「回復突變」抗體亦意欲由本發明所涵蓋。另一框架修飾涉及使框架區內或甚至一
或多個CDR區內之一或多個殘基突變,以去除T細胞表位,藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱作「去免疫化」且另外詳細闡述於Carr等人之美國專利公開案第2003/0153043號中。
用於製備抗體細胞激素植入蛋白之抗體或抗體片段之恆定區可為任一類型或亞型(若適當)且可選自欲藉由本發明方法治療之個體之物種(例如,人類、非人類靈長類動物或其他哺乳動物,例如,農業哺乳動物(例如,馬、綿羊、牛、豬、駱駝科動物)、家養哺乳動物(例如,犬、貓)或齧齒類動物(例如,大鼠、小鼠、倉鼠、兔)。在一些實施例中,用於抗體細胞激素植入蛋白中之抗體經改造以生成人類化或人類改造®抗體。在一些實施例中,用於抗體細胞激素植入蛋白中之抗體係人類抗體。在一些實施例中,抗體恆定區同型係IgG,例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在某些實施例中,恆定區同型係IgG1。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含IgG。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含IgG1 Fc。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白包含IgG2 Fc。
除在框架或CDR區內進行之修飾外或另一選擇為,用於製備抗體細胞激素植入蛋白之抗體或抗體片段可經改造以包括Fc區內之改質,通常改變抗體之一或多種功能性質,例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。另外,抗體或抗體片段可經化學修飾(例如,可將一或多個化學部分附接至該抗體)或經修飾以改變其醣基化以亦改變抗體細胞激素植入蛋白之一或多種功能性質。
在一實施例中,CH1之鉸鏈區經修飾以改變(例如增加或減少)鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數。舉例而言,藉由由Bodmer等人進一步闡述於美國專利第5,677,425號中之方法,其中改變CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數
以(例如)有利於輕鏈及重鏈之組裝或增加或降低抗體細胞激素植入蛋白之穩定性。在另一實施例中,抗體之Fc鉸鏈區經突變以改變抗體細胞激素植入蛋白之生物半衰期。更特定而言,將一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中,以使得抗體細胞激素植入蛋白具有相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合受損的葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A,SpA)結合。此方法另外詳細闡述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
本發明提供特異性結合至IL10R蛋白且具有延長之活體內半衰期之抗體細胞激素植入蛋白。在另一實施例中,修飾抗體細胞激素植入蛋白以增加其生物半衰期。各種方法均係可能的。亦可藉由將一或多種胺基酸修飾(即,取代、插入或缺失)引入IgG恆定結構域或其FcRn結合片段(較佳地Fc或鉸鏈Fc結構域片段)中生成具有增加之活體內半衰期之抗體細胞激素植入蛋白。舉例而言,可引入以下突變中之一或多者:T252L、T254S、T256F,如Ward等人之美國專利第6,277,375號中所闡述。例如參見國際公開案第WO 98/23289號;國際公開案第WO 97/34631號;及美國專利第6,277,375號。或者,為增加生物半衰期,在CH1或CL區內改變抗體細胞激素植入蛋白以含有取自IgG Fc區之CH2結構域之兩個環之補救受體結合表位,如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所闡述。在再其他實施例中,藉由使用不同胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變抗體細胞激素植入蛋白之效應物功能。舉例而言,可使用不同胺基酸殘基來替代一或多個胺基酸,使得抗體細胞激素植入蛋白具有對效應物配體有所改變之親和力但保留親代抗體之抗原結合能力。對其親和力有所改變之效應物配體可為(例如)Fc受體(FcR)或補體之C1組
份。此方法進一步詳細闡述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中,可利用不同胺基酸殘基替代選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸,使得抗體細胞激素植入蛋白具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細闡述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
含有該等突變之抗體細胞激素植入蛋白介導降低之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)或無抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中,IgG1恆定區之胺基酸殘基L234及L235經取代為Ala234及Ala235。在一些實施例中,IgG1恆定區之胺基酸殘基N267取代為Ala267。
在另一實施例中,改變一或多個胺基酸殘基藉此改變抗體細胞激素植入蛋白固定補體之能力。此方法進一步闡述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在又一實施例中,藉由修飾一或多個胺基酸對Fc區進行修飾以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加抗體細胞激素植入蛋白對Fc γ受體之親和力。此方法進一步闡述於Presta之PCT公開案WO00/42072中。另外,已定位人類IgG1上針對Fc γ Rl、Fc γ RII、Fc γ RIII及FcRn之結合位點,且已闡述具有經改良結合之變體(參見Shields,R.L.等人,2001 J.Biol.Chem.276:6591-6604)。
在另一實施例中,修飾抗體細胞激素植入蛋白之醣基化。舉例而言,可製備無醣基化抗體細胞激素植入蛋白(即缺少醣基化之抗體細胞激素植入蛋白)。可改變醣基化以(例如)增加抗體對「抗原」之親和力。該
等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來達成。舉例而言,可進行一或多個胺基酸取代以消除一或多個可變區框架醣基化位點,藉此消除該位點處之醣基化。該無醣基化可增加抗體對抗原之親和力。此一方法進一步詳細闡述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外或另一選擇為,可製備具有經改變醣基化類型之抗體細胞激素植入蛋白,例如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻醣基化抗體細胞激素植入蛋白或具有增加之二等分GlcNac結構之抗體。已證實,該等經改變醣基化型式可增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)在具有經改變醣基化機構之宿主細胞中表現抗體細胞激素植入蛋白來完成。具有經改變醣基化機構之細胞已於業內有所闡述且可用作其中表現重組抗體細胞激素植入蛋白之宿主細胞,藉此產生具有經改變醣基化之抗體細胞激素植入蛋白。舉例而言,Hang等人之EP 1,176,195闡述具有編碼岩藻糖基轉移酶之功能被破壞之FUT8基因之細胞系,使得在此一細胞系中表現之抗體細胞激素植入蛋白展現低岩藻醣基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述將岩藻糖附接至Asn(297)連接之碳水化合物之能力有所降低的變體CHO細胞系Lecl3細胞,亦導致在該宿主細胞中表現之抗體細胞激素植入蛋白之低岩藻醣基化(亦參見Shields,R.L.等人,2002 J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述經改造以表現醣蛋白修飾之醣基轉移酶(例如,β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))之細胞系,使得在經改造細胞系中表現之抗體細胞激素植入蛋白展現增加之二等分型GlcNac結構,從而增加抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人,1999 Nat.Biotech.17:176-180)。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白之一或多個結構域或區係經由連接體連接,例如,肽連接體,例如業內熟知之彼等(例如,參見Holliger,P.,等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,RJ.,等人(1994)Structure 2:1121-1123)。肽連接體可之長度有所變化,例如,連接體之長度可為1至100個胺基酸,通常連接體之長度為5至50個胺基酸,例如,長度為5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個胺基酸。
連接體之實例包括(但不限於)基於甘胺酸之連接體或gly/ser連接體G/S(例如(GmS)n),其中n係等於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之正整數,且m係等於0,1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之整數。在某些實施例中,一或多種連接體包括G4S重複,例如,Gly-Ser連接體GGGGS(SEQ ID NO:252)或(GGGGS)n,其中n係等於或大於1之正整數。舉例而言,n=1、n=2、n=3、n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一些實施例中,連接體包括GGGGS(SEQ ID NO:252)之多個重複,包括(但不限於)(GGGGS)3或(GGGGS)4。在一些實施例中,Ser可經Ala替代,例如,連接體G/A,例如(GmA)n,其中n係等於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之正整數且m係等於0,1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之整數。在某些實施例中,一或多種連接體包括G4A重複(GGGGA)(SEQ ID NO:253)或(GGGGA)n,其中n係等於或大於1之正整數。舉例而言,n=1、n=2、n=3、n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一些實施例
中,連接體包括GGGGA(SEQ ID NO:253)之多個重複。在其他實施例中,連接體包括GGGGS(SEQ ID NO:252)及GGGGA(SEQ ID NO:253)之組合及多倍體。
此外,抗體細胞激素植入蛋白可與標記物序列融合,例如有利於抗體細胞激素植入蛋白之純化之肽。在較佳實施例中,標記物胺基酸序列係六組胺酸肽,尤其例如提供於pQE載體中之標籤(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311),其中之許多係市面有售。如Gentz等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所闡述,舉例而言,六組胺酸提供植入蛋白之便利純化。可用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)血球凝集素(「HA」)標籤,該標籤對應於源於流行性感冒血球凝集素蛋白之表位(Wilson等人,1984,Cell 37:767);及「flag」標籤。
抗體亦可附接至固體載體,該等載體尤其可用於靶標抗原之免疫分析或純化。該等固體載體包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸(nylon)、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
鑑別抗體細胞激素植入蛋白之分析為業內已知且如本文所闡述。抗體細胞激素植入蛋白結合至IL10受體(IL10R)且促進、誘導、刺激引起抗發炎效應以及免疫刺激效應之細胞內信號傳導。
可使用業內已知之任一方法確定抗體細胞激素植入蛋白與IL10R之結合。舉例而言,可使用已知之技術(包括(但不限於)ELISA、西方墨點(Western blot)、表面電漿共振(例如,BIAcore)及流式細胞術)確定與IL10R之結合。
可使用業內已知之任一方法量測藉助IL10之細胞內信號傳導。舉例而言,藉助IL10R之活化促進STAT3活化及信號傳導。量測STAT3活化之方法在業內係標準的(例如,STAT3蛋白之磷酸化狀態、報導基因分析、下游信號傳導分析等)。藉助IL10之活化具有抗發炎效應,包括促發炎性細胞激素之抑制以及巨噬細胞之分化及增殖。另外,藉助IL10R之活化具有免疫刺激效應,包括刺激B細胞增殖、肥胖細胞增殖(例如,MC/9)及天然殺傷(NK)細胞增殖及經活化CD8+ T細胞之增殖,以及某些促發炎性細胞激素之誘導。量測細胞增殖之方法在業內係標準的(例如,3H-胸苷納入分析、CFSE標記)。量測細胞激素產生之方法在業內熟知(例如,ELISA分析、ELISpot分析)。在實施活體外分析中,可將與激動劑抗體細胞激素植入蛋白接觸之測試細胞或來自測試細胞之培養物上清液與尚未與激動劑抗體細胞激素植入蛋白接觸之對照細胞或來自對照細胞之培養物上清液及/或已與重組人類IL10(rhIL10)接觸之彼等相比較。
抗體細胞激素植入蛋白之IL10受體激動劑活性亦可離體及/或在活體內量測。在一些態樣中,可使用與未經治療之對照動物及/或以類似方式經rhIL10治療之動物相比,自經抗體細胞激素植入蛋白治療之動物離體之各種細胞類型之間之STAT3活化之方法顯示抗體植入蛋白在細胞類型之間之差異活性。較佳激動劑抗體細胞激素植入蛋白能夠活化並擴增CD8+ T細胞。舉例而言,可使用業內已知之任一方法(例如,藉由流式細胞術)量測CD8+ T細胞之活體內活化及擴增。激動劑抗體細胞激素植入蛋白可在刺激後在治療上用於抑制促發炎反應之程度。可在利用刺激藥劑(例如,LPS)處理之前、在此期間及/或在此之後在自經抗體細胞激素植入蛋白之動物分離之試樣中使用業內已知之任一方法量測促發炎性細胞激素之
含量,且可將結果與未經處理之對照動物及/或以類似方式經重組人類IL10(rhIL10)療法處理之動物相比較。較佳激動劑抗體細胞激素植入蛋白可在治療上用於預防、減輕、抑制或消除發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病、貝西氏病、類肉瘤病及移植物抗宿主病(GVHD)。激動劑抗體細胞激素植入蛋白在治療發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病、貝西氏病、類肉瘤病及移植物抗宿主病(GVHD)中之效能可藉由向個體投與治療有效量之抗體細胞激素植入蛋白並在投與抗體細胞激素植入蛋白之前及之後比較該個體來確定。激動劑抗體細胞激素植入蛋白在治療發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病、貝西氏病、類肉瘤病及移植物抗宿主病(GVHD)中之效能亦可藉由向測試個體投與治療有效量之抗體細胞激素植入蛋白並將測試個體與尚未投與抗體細胞激素植入蛋白之對照個體相比較及/或與利用rhIL10類似地處理之個體相比較來確定。
在另一態樣中,提供編碼抗體細胞激素植入蛋白之重鏈及輕鏈蛋白之經分離核酸。可藉由業內已知之任一方式產生抗體細胞激素植入蛋白,包括(但不限於)重組表現、化學合成及抗體四聚體之酶消化。重組表現可來自業內已知之任一適當宿主細胞,例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本文提供編碼以下之多核苷酸:在SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:205及SEQ ID NO:206中之任一者中例示之可變
區;在SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208中之任一者中例示之可變區;在SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:205及SEQ ID NO:206中之任一者中例示之CDR;在SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:207及SEQ ID NO:208中之任一者中例示之重鏈及輕鏈。
因此,本發明提供編碼本文所闡述之抗體細胞激素植入蛋白之重鏈及/或輕鏈多肽之多核苷酸,例如,如本文所闡述編碼包含互補決定區之重鏈或輕鏈可變區或區段之多核苷酸。在一些實施例中,編碼重鏈可變區之多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO:242及SEQ ID NO:246組成之群之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性之序列。在一些實施例中,編碼輕鏈可變區之多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:247組成之群之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性之序列。
在一些實施例中,編碼重鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:244之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中,編碼輕鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:245之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
在一些實施例中,編碼重鏈之多核苷酸與SEQ ID NO:248之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中,編碼輕鏈之多核苷酸與選自SEQ ID NO:249之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
多核苷酸可僅編碼抗體細胞激素植入蛋白之可變區序列。其亦可編碼抗體細胞激素植入蛋白之可變區及恆定區。一些多核苷酸序列編碼包含一種抗體細胞激素植入蛋白之重鏈及輕鏈之可變區之多肽。一些其他多核苷酸編碼兩個分別實質上與一種抗體細胞激素植入蛋白之重鏈及輕鏈之可變區相同之多肽區段。
在某些實施例中,多核苷酸或核酸包含DNA。在其他實施例中,多核苷酸或核酸包含可為單鏈或雙鏈之RNA。
在一些實施例中,提供包含編碼一或多種細胞激素植入蛋白或其片段及視情況分泌信號之核酸之重組宿主細胞。在某些實施例中,重組宿主細胞包含編碼抗體細胞激素植入蛋白或其片段及分泌信號之載體。在其他某些實施例中,重組宿主細胞包含編碼抗體細胞激素植入蛋白之兩個免疫球蛋白蛋白鏈及分泌信號之一或多個載體。在一些實施例中,重組宿主細胞包含編碼抗體細胞激素植入蛋白之兩個免疫球蛋白蛋白鏈及分泌信號之單一載體。在一些實施例中,重組宿主細胞包含兩個載體,一者編碼抗體細胞激素植入蛋白之異二聚體之重鏈免疫球蛋白蛋白鏈且另一者編碼輕鏈免疫球蛋白蛋白鏈,且每一者均包括分泌信號。重組宿主細胞可為原核或真核細胞。在一些實施例中,宿主細胞係真核細胞系。在一些實施例中,宿主細胞係哺乳動物細胞系。
另外,本發明提供產生抗體細胞激素植入蛋白之方法。在一些實施
例中,該方法包含以下步驟:(i)在適於表現、形成及分泌抗體細胞激素植入蛋白之條件下培養包含編碼抗體細胞激素植入蛋白之免疫球蛋白蛋白鏈之一或多種載體之宿主細胞,及(ii)回收抗體細胞激素植入蛋白。
可藉由重新固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼抗體細胞激素植入蛋白之多肽鏈之現有序列(例如,如本文所闡述之序列)產生多核苷酸序列。可藉由業內已知之方法實現核酸之直接化學合成,例如Narang等人,Meth.Enzymol.68:90,1979之磷酸三酯方法;Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979之磷酸二酯方法;Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981之二乙基亞磷醯胺方法;及美國專利第4,458,066號之固體載體方法。可如以下文獻中所闡述藉由PCR向多核苷酸序列引入突變:例如PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編輯),Freeman Press,NY,NY,1992;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編輯),Academic Press,San Diego,CA,1990;Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991;及Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991。
本發明亦提供用於產生上文所闡述之抗體細胞激素植入蛋白之表現載體及宿主細胞。可採用各種表現載體來表現編碼抗體細胞激素植入蛋白之免疫球蛋白多肽鏈或片段之多核苷酸。可使用基於病毒及非病毒之表現載體在哺乳動物宿主細胞中產生免疫球蛋白。非病毒載體及系統包括質粒、附加型載體(通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現盒)及人類人工染色體(例如參見Harrington等人,Nat Genet 15:345,1997)。舉例而言,可用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現抗體細胞激素植入蛋白多核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis
A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及業內已知用於表現其他蛋白質之諸多其他載體。有用病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒之載體、基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP艾伯斯坦-巴爾病毒(HBP Epstein Barr virus)之載體、牛痘病毒載體及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus,SFV)載體。參見Brent等人,上文文獻;Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995;及Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表現載體之選擇取決於擬表現載體之預期宿主細胞。通常,表現載體含有啟動子及其他可操作地連接至編碼抗體細胞激素植入蛋白之多核苷酸之調節序列(例如增強子)。在一些實施例中,採用可誘導啟動子來預防除在誘導條件下插入序列之表現。可誘導啟動子包括(例如)阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可在非誘導條件下擴增經轉變有機體之培養物,此並不偏離表現產物由宿主細胞較佳耐受之編碼序列群體。除啟動子以外,亦可需要或期望其他調節元件來有效表現抗體細胞激素植入蛋白之免疫球蛋白鏈或片段。該等元件通常包含ATG起始密碼子及毗鄰核糖體結合位點或其他序列。另外,可藉由納入適於所用細胞系統之增強子來增強表現效率(例如,參見Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994;及Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。舉例而言,可使用SV40增強子或CMV增強子來增加哺乳動物宿主細胞中之表現。
除由抗體細胞激素植入蛋白序列編碼之序列以外,表現載體亦可提供用於形成異源蛋白之分泌信號序列。更通常,抗體細胞激素植入蛋白之插入免疫球蛋白序列係在納入載體之前連接至信號序列。擬用於接收編碼
免疫球蛋白輕鏈及重鏈可變結構域之序列之載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體容許以具有恆定區之植入蛋白形式表現可變區,藉此使得產生完整抗體細胞激素植入蛋白或其片段。通常,該等恆定區係人類的。
用於具有及表現抗體細胞激素植入蛋白鏈之宿主細胞可為原核或真核細胞。大腸桿菌(E.coli)係一種可用於選殖及表現本發明多核苷酸之原核宿主。其他適用微生物宿主包括桿菌(bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))及其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)(例如沙門氏菌(Salmonella)、黏質沙雷氏菌(Serratia)及各種假單胞菌(Pseudomonas)屬)。在該等原核宿主中,亦可製備通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)之表現載體。此外,將存在任一數量之各種熟知啟動子,例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子通常視情況使用操縱因子序列控制表現,且具有用於引發及完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及諸如此類。亦可採用其他微生物(例如酵母)來表現抗體細胞激素植入蛋白。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
在一些較佳實施例中,使用哺乳動物宿主細胞來表現及產生本發明之抗體細胞激素植入蛋白。舉例而言,其可為具有外源表現載體之哺乳動物細胞系。該等細胞包括任一正常短命或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言,已研發許多能夠分泌完整免疫球蛋白之適宜宿主細胞系,包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、經轉變B細胞及雜交瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽通常論述於(例如)Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。用於哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現對照序列(例如複製起
點)、啟動子及增強子(例如參見Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)及必需處理資訊位點(例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點)及轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒之啟動子。適宜啟動子可為組成型、細胞類型特異性、時期特異性及/或可調變或可調節。有用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松可誘導MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素可誘導CMV啟動子(例如人類即刻早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子及業內已知之啟動子-增強子組合。
引入含有所關注多核苷酸序列之表現載體之方法端視細胞宿主之類型而有所變化。舉例而言,氯化鈣轉染通常用於原核細胞,而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主(通常參見Sambrook等人,見上文)。其他方法包括(例如)電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉變、注射及微注射、彈道方法、病毒體、免疫脂質體、多價陽離子:核酸偶聯物、裸DNA、人工病毒粒子、植入皰疹病毒結構蛋白VP22(Elliot及O'Hare,Cell 88:223,1997)、DNA之藥劑增強之吸收及離體轉導。對於重組蛋白之長期、高產率生產而言,通常將期望穩定表現。舉例而言,可使用含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選標記物基因之表現載體製備穩定表現抗體細胞激素植入蛋白免疫球蛋白鏈之細胞系。在引入載體後,可在更換為選擇性培養基之前使細胞在富集培養基中生長1-2天。可選擇標記物之目的在於賦予選擇抗性,且其存在容許生長在選擇性培養基中成功表現引入序列之細胞。可使用適用於細胞類型之組織培養技術增殖抗性穩定轉染細胞。
本發明提供包含與醫藥上可接受之載劑調配在一起之抗體細胞激素植入蛋白之醫藥組合物。視情況,醫藥組合物另外含有適於治療或預防給定病症之其他治療劑。醫藥上可接受之載劑增強或穩定組合物或有利於組合物之製備。醫藥上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及諸如此類。
本發明組合物可藉由業內已知之各種方法來投與。投與途徑及/或模式端視期望結果而變化。較佳藉由非經腸投與(例如,選自靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、動脈內或皮下中之任一者)來投與或靠近靶標之位點進行投與。醫藥上可接受之載劑適於藉由靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、動脈內、皮下、鼻內、吸入、脊柱或表皮投與中之任一或多者(例如,藉由注射或輸注)來投與。端視投與途徑,可於材料中對活性化合物(例如抗體細胞激素植入蛋白)進行包衣以保護化合物免受酸及可使化合物失活之其他天然條件的作用。在一些實施例中,醫藥組合物經調配用於靜脈內投與。在一些實施例中,醫藥組合物係用於皮下投與之調配物。
抗體細胞激素植入蛋白可單獨或與其他適宜組份組合製成氣溶膠調配物(即,其可「霧化」)以經由吸入投與。可將氣溶膠調配物置於加壓之可接受推進劑(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮及諸如此類)中。
在一些實施例中,醫藥組合物係無菌及流體的。可藉由(例如)以下方式來維持適當流動性:使用諸如卵磷酯等包衣,在分散液情形中維持所需粒徑,及使用表面活性劑。在許多情形中,較佳在組合物中包括等滲劑,例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)及氯化鈉。可藉由向組合物中納入延遲吸收劑(例如,單硬脂酸鹽及明膠)實現可注射組合物之長效吸收。在某些實施例中,可使用適當賦形劑(例如,蔗糖)以凍乾形式製備組合物用
於儲存。
可根據業內熟知及通常實踐之方法來製備醫藥組合物。醫藥上可接受之載劑部分地由所投與具體組合物以及由用於投與組合物之具體方法來確定。因此,本發明醫藥組合物有眾多種適宜調配物。可用於調配抗體細胞激素植入蛋白及確定適當投藥及排程之方法可參見(例如)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,University of the Sciences in Philadelphia,Eds.,Lippincott Williams & Wilkins(2005);及Martindale:The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press.及Martindale,Martindale:The Extra Pharmacopoeia,第31版,1996,Amer Pharmaceutical Assn,and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978,其每一者均以引用方式併入本文中。較佳地在GMP條件下製造醫藥組合物。通常,在醫藥組合物中採用治療有效劑量或靈驗劑量之抗體細胞激素植入蛋白。藉由熟習此項技術者已知之習用方法將抗體細胞激素植入蛋白調配成醫藥上可接受之劑型。調整劑量方案以提供期望反應(例如,治療反應)。在確定治療上或預防上有效之劑量時,可投與低劑量且然後以遞增方式增加直至達成期望反應且具有最少的不合意副作用或沒有不合意副作用為止。例如,可投與單次濃注劑,可隨時間投與若干個分次劑量或可根據治療狀況之緊急程度所指示按比例減少或增加劑量。尤其有利的係將非經腸組合物調配成劑量單位形式以便於投與及劑量均勻性。如本文所用之劑量單位形式係指適於作為單位劑量供欲治療個體使用之物理離散單元;各單元含有預定量之活性化合物,此預定量經計算與所需醫藥載劑一起產生期望治療效應。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量值可變以便獲得有效達成對具體患者有期望治療反應之量的活性成份、組合物及投與模式,且對患者無毒。所選劑量量端視各種藥物代謝動力學因素而定,該等因素包括所採用之本發明具體組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所採用具體化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所採用具體組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、狀況、一般健康情況及先前病史及類似因素。
在一些實施例中,藥理學組合物包含抗體細胞激素植入蛋白及一或多種其他藥理學藥劑之混合物。與本發明抗體細胞激素植入蛋白一起包括在混合物中之實例性第二藥劑包括(但不限於)抗發炎劑、免疫調節劑、胺基柳酸鹽及抗生素。適當選擇可取決於較佳調配、劑量及/或遞送方法。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與抗發炎劑一起共調配(即,以混合物提供或以混合物製備)。在具體實施例中,皮質類固醇抗發炎劑可結合抗體細胞激素植入蛋白使用。供使用之皮質類固醇可選自甲基普賴蘇濃、氫化可體松、普賴松、布地奈德、美沙拉明及地塞米松中之任一者。適當選擇將取決於調配及遞送傾向。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與免疫調節劑一起共調配。在具體實施例中,免疫調節劑選自6-巰嘌呤、硫唑嘌呤、環孢素A(cyclosporine A)、他克莫司(tacrolimus)及胺甲喋呤(methotrexate)中之任一者。在具體實施例中,免疫調節劑選自抗TNF劑(例如,英利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、戈利木單抗)、那他珠單抗及維多珠單抗。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白與胺基柳酸鹽藥劑一起共調配。在具體實施例中,胺基柳酸鹽選自磺胺塞拉金、美沙拉明、巴柳氮、奧沙拉秦或5-胺基柳酸之其他衍生物。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與抗細菌劑一起共調配。實例性抗細菌劑包括(但不限於)磺醯胺(例如,對胺苯磺醯胺(sulfanilamide)、磺胺二嗪鈉(sulfadiazine)、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、乙醯磺胺)、甲氧苄啶(trimethoprim)、喹啉酮(例如,萘啶酮酸(nalidixic acid)、西諾沙星(cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、司帕沙星(sparfloxaci)、氟羅沙星(fleroxacin)、培羅沙星(perloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)及吉米沙星(gemifloxacin))、烏洛托品(methenamine)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、青黴素(penicillin)(例如,青黴素G、青黴素V、甲氧西林(methicilin)、扼煞西林(oxacillin)、氯噻青黴素(cloxacillin)、二氯噻青黴素、萘夫西林(nafcilin)、胺苄青黴素(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、卡本西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)及必倍西林(piperacillin))、頭孢菌素(cephalosporin)(例如,頭孢若林(cefazolin)、頭孢力新(cephalexin)、頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢可若(cefaclor)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢呋辛酯(cefuroxime acetil)、氯碳頭孢(loracarbef)、西弗特坦(cefotetan)、頭孢雷特(ceforanide)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil)、頭孢布烯(cefibuten)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢妥侖匹酯(cefditoren pivorxil)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、
頭孢派酮(cefoperazone)、頭孢他啶(ceftazidime)及頭孢吡肟(cefepine))、碳青黴烯(carbapenem)(例如,亞胺培南(imipenem)、胺曲南(aztreonam))及胺基醣苷(例如,新黴素(neomycin)、康黴素(kanamycin)、鏈黴素(streptomycin)、慶大黴素(gentamicin)、妥布黴素(toramycin)、奈替米星(netilmicin)及阿米卡星(amikacin))。
在一些態樣中,抗體細胞激素植入蛋白係以製品(即,套組)提供。抗體細胞激素植入蛋白通常在小瓶或容器中提供。因此,製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器、溶液袋等。若適當,抗體細胞激素植入蛋白可呈液體或乾燥(例如,凍乾)形式。容器容納組合物,該組合物自身或與另一組合物組合有效用於製備用以治療、預防及/或改善免疫相關病症之組合物。標記或包裝插頁指示組合物用於治療、預防及/或改善免疫相關病症。如本文所闡述包含抗體細胞激素植入蛋白之製品(套組)視情況含有一或多種其他藥劑。在一些實施例中,製品(套組)含有抗體細胞激素植入蛋白及醫藥上可接受之稀釋劑。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係在同一調配物中(例如,作為混合物)以具有一或多種其他活性藥劑之製品(套組)提供。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係在單獨調配物中(例如,在單獨容器中)以具有第二或第三藥劑之製品(套組)提供。在某些實施例中,製品(套組)含有抗體細胞激素植入蛋白之等份試樣,其中該等份試樣提供一或多個劑量。在一些實施例中,提供用於多次投與之等份試樣,其中劑量係均勻或有所變化的。在具體實施例中,不同投藥方案係遞增或降低(若適當)。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白及第二藥劑之劑量
獨立地均勻或獨立地變化。在某些實施例中,製品(套組)包含選自抗發炎劑、免疫調節劑、胺基柳酸鹽及抗生素中之任一者之另一藥劑。一或多種其他藥劑之選擇將取決於劑量、遞送及欲治療之疾病病況。
抗體細胞激素植入蛋白可用於治療、改善或預防免疫相關病症。在一態樣中,本發明提供治療有需要之個體之免疫相關病症之方法,其包含向該個體投與治療有效量之如本文所闡述之抗體細胞激素植入蛋白。在一態樣中,本發明亦提供抗體細胞激素植入蛋白,其用作治療劑。在一些實施例中,提供抗體細胞激素植入蛋白用作治療或預防個體之免疫相關病症之治療劑。在一些實施例中,提供抗體細胞激素植入蛋白之用途,其用於製造用以治療有需要之個體之免疫相關病症之藥劑。在另一態樣中,本發明提供包含此一抗體細胞激素植入蛋白之組合物,其用於治療或改善有需要之個體之免疫相關病症。
出於治療目的,個體可具有免疫相關病症。出於預防性或預防性目的,個體可處於免疫相關病症之活性狀態之緩解中或可預料未來發作。在一些實施例中,患者具有免疫相關病症,懷疑患有免疫相關病症或處於免疫相關病症之緩解中。經受抗體細胞激素植入蛋白之治療之免疫相關病症通常自IL10受體信號傳導之活化得到益處,如本文所闡述。經受治療之免疫相關病症包括(但不限於)發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病、貝西氏病、類肉瘤病及移植物抗宿主病(GVHD)。
醫師或獸醫師可以低於達成期望治療效應所需要者之量開始醫藥組合物中所用抗體細胞激素植入蛋白之劑量,並逐漸增加劑量直至達成期望效應為止。一般而言,本發明組合物之有效劑量端視許多不同因素而變化,該等因素包括欲治療之特定疾病或病況、投與方式、靶標位點、患者之生理狀態、患者係人類抑或動物、所投與之其他醫藥及治療係預防性的抑或治療性的。治療劑量通常需要調定來最佳化安全性及效能。對於抗體細胞激素植入蛋白之投與,劑量在約0.0001mg/kg至100mg/kg、且更通常0.01mg/kg至5mg/kg宿主體重之範圍內。例如,劑量可為1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg之範圍內。若需要或期望,投藥可為每天、每週、二週、每月或更通常或更不通常的。實例性治療方案需要每週一次、每兩週一次或每月一次或每3至6個月一次進行投與。
抗體細胞激素植入蛋白可在單一或分開劑量中投與。抗體細胞激素植入蛋白通常係在多個時機下投與。若需要或期望,單一劑量之間之間隔可為每週、二週、每月或每年的。間隔亦可如藉由量測患者之血液中抗體細胞激素植入蛋白含量所指示而不規則。在一些方法中,對劑量進行調整以達成1-1000μg/ml、且在一些方法中25-300μg/ml之血漿抗體細胞激素植入蛋白濃度。或者,抗體細胞激素植入蛋白可以持續釋放調配物來投與,在該情形下需要較不頻繁之投與。劑量及頻率端視抗體細胞激素植入蛋白在患者中之半衰期而變化。一般而言,抗體細胞激素植入蛋白顯示長於天然細胞激素(例如IL10)之半衰期。投與劑量及頻率可端視治療為預防性抑或治療性而變化。對於預防性應用,一般而言,以相對較不頻繁之間隔經較長時間段投與相對較低之劑量。一些患者在其生命之持續時間期間繼續接受治療。對於治療性應用,一般而言,有時需要相對較短間隔之相
對較高之劑量直至減輕或終止疾病進展為止,且較佳地直至患者顯示疾病症狀之部分或完全改善為止。此後,可投與患者預防性方案。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與一或多種其他藥理學藥劑共投與。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白及其他一或多種藥劑係以混合物形式投與。在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白及其他一或多種藥劑係以單獨調配物形式投與。在某些實施例中,倘若利用單獨調配物,則投與係同時的。在某些實施例中,倘若利用單獨調配物,則投與係依序的。在某些實施例中,倘若利用單獨調配物,則投與係經由相同途徑。在某些實施例中,倘若利用單獨調配物,則投與係經由不同途徑。與抗體細胞激素植入蛋白共投與之實例性其他藥劑包括(但不限於)抗發炎劑、免疫調節劑、胺基柳酸鹽及抗生素。適當選擇可取決於較佳調配、劑量及/或遞送方法。抗體細胞激素植入蛋白亦可用於與用於治療免疫相關病症病況之另外建立之程序(例如,手術)之組合療法中。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與抗發炎劑共投與。在具體實施例中,皮質類固醇抗發炎劑可結合抗體細胞激素植入蛋白使用。供使用之皮質類固醇可選自甲基普賴蘇濃、氫化可體松、普賴松、布地奈德、美沙拉明及地塞米松中之任一者。適當選擇將取決於調配及遞送傾向。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與免疫調節劑共投與。在具體實施例中,免疫調節劑選自6-巰嘌呤、硫唑嘌呤、環孢素A、他克莫司及胺甲喋呤中之任一者。在具體實施例中,免疫調節劑選自抗TNF劑(例如,英利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、戈利木單抗)、那他珠單
抗及維多珠單抗。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與胺基柳酸鹽藥劑共投與。在具體實施例中,胺基柳酸鹽藥劑選自磺胺塞拉金、美沙拉明、巴柳氮、奧沙拉秦或5-胺基柳酸之其他衍生物。
在一些實施例中,抗體細胞激素植入蛋白係與抗細菌劑共投與。實例性抗細菌劑包括(但不限於)磺醯胺(例如,對胺苯磺醯胺、磺胺二嗪鈉、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、乙醯磺胺)、甲氧苄啶、喹啉酮(例如,萘啶酮酸、西諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星、氟羅沙星、培羅沙星、左氧氟沙星、加雷沙星及吉米沙星)、烏洛托品、呋喃妥因、青黴素(例如,青黴素G、青黴素V、甲氧西林、扼煞西林、氯噻青黴素、二氯噻青黴素、萘夫西林、胺苄青黴素、阿莫西林、卡本西林、替卡西林、美洛西林及必倍西林)、頭孢菌素(例如,頭孢若林、頭孢力新、頭孢羥胺苄、頭孢西丁、頭孢可若、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢呋辛酯、氯碳頭孢、西弗特坦、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢泊肟酯、頭孢布烯、頭孢地尼、頭孢妥侖匹酯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢派酮、頭孢他啶及頭孢吡肟)、碳青黴烯(例如,亞胺培南、胺曲南)及胺基醣苷(例如,新黴素、康黴素、鏈黴素、慶大黴素、妥布黴素、奈替米星及阿米卡星)。
圖1圖解說明IL10生物效應。IL10係抗發炎及促發炎性的,且重組人類IL10之固有促發炎性活性促成重組人類IL10在診療所之有限效能。改變IL10/IL10R相互作用容許設計選擇性抗發炎治療劑。
圖2圖解說明抗體細胞激素植入蛋白之結構。插入圖繪示插入抗體之CDR中之單體IL10。深色殘基繪示視情況納入抗體細胞激素植入蛋白中
之實例性Fc修飾。
圖3A-3B繪示重組人類IL10(rhuIL10,灰色正方形)及IgG-IL10M13抗體細胞激素植入蛋白(黑色三角形)之活體外生物分析之結果。圖3A圖解說明如與rhuIL10相比,IgG-IL10M13證明降低之促發炎性活性,如在CD8 T細胞分析中藉由IFN γ誘導所量測。在人類原代NK細胞、B細胞及肥胖細胞上以及使用顆粒酶-B作為讀出量測發現類似差異活性。圖3B圖解說明rhuIL10及IgG-IL10M13證明類似抗發炎活性,如在全血分析中藉由TNF α之抑制所量測。在量測IL6及IL8之抑制之分析中發現類似結果。
圖4繪示經利用rhuIL10(左圖)或IgG-IL10M13(右圖)刺激之人類全血中IL10依賴性pSTAT3信號傳導之CyTOF分析之結果。IL10誘導單核球之抗發炎活性;而T細胞、B細胞或NK細胞之活化誘導促發炎性細胞激素。相對於未刺激的細胞活性之倍數變化之結果係由熱圖(陰影變化)來繪示。左圖指示rhIL10在所有IL10敏感性細胞類型之間皆賦予刺激;然而,如在右圖中觀察到,IgG-IL10M13對T細胞、B細胞及NK細胞賦予較不強效之刺激,且程度與未刺激之細胞類似或略微高於未刺激之細胞;同時利用IgG-IL10M及rhIL10證明單核球及mDC細胞之刺激的類似功效。該等相關細胞類型(單核球,mDC)在發炎性腸病中係維持腸穩態之關鍵細胞。
圖5A-5D圖解說明在活體內分析中抗體細胞激素植入蛋白IgGIL10M13之改良特徵。圖5A-B繪示rhuIL10及IgGIL10M13之藥物動力學研究之結果。在靜脈內投與後,IgGIL10M13證明藥物動力學(半衰期)有所延長,乃因抗體細胞激素植入蛋白在五天後仍可檢測得到(圖5B),而rhuIL10在第一天後幾乎檢測不到(圖5A)。圖5C及5D繪示構築體之活體內活性之藥效學分析之結果。圖5C繪示結腸組織之活體內活性,
如藉由投藥後七十二(72)小時之pSTAT3信號傳導所量測。圖5D繪示如與rhuIL10相比,IgG-IL10M13之活體內反應之持續時間有所改良,如藉由在構築體投藥後在血液中因應LPS攻擊之TNF抑制所量測。當量測IFN γ時發現了類似結果。
圖6係抗體細胞激素植入蛋白之作用機制之代表。左圖顯示正常rhIL-10二聚體如何結合IL-10R1並始動強力STAT3信號傳導。右圖繪示植入抗體CDR中之IL10單體如何被約束以與IL-10R1具有較低效率之結合,且因此產生較弱STAT3信號。
圖7係代表抗體細胞激素植入蛋白之改良CMAX%之圖形。
圖8顯示抗體細胞激素植入蛋白具有延長之藥效學,從而在全血及腸中均產生較強pSTAT3信號。
藉由以下生成植入構築體IgGIL10M1、IgGIL10M2、IgGIL10M3、IgGIL10M4、IgGIL10M5、IgGIL10M6、IgGIL10M7、IgGIL10M8、IgGIL10M9、IgG1L10M10、IgGIL10M11、IgGIL10M12、IgGIL10M13、IgGIL10M14及IgGIL10M15:將單體IL10序列改造至各種免疫球蛋白支架之CDR區中,然後產生重鏈及輕鏈免疫球蛋白鏈,以生成最終蛋白構築體。IgGIL10M植入構築體賦予IL10之較佳治療抗發炎性質;然而,如與rhIL10相比,IgGIL10M植入構築體具有成比例降低之促發炎性活性。
為產生抗體細胞激素植入蛋白,將包含全長IL10之殘基19-178且在
殘基134與135之間具有6胺基酸連接體之單體IL10(IL10M)(SEQ ID NO:209)插入免疫球蛋白鏈支架之CDR環中。植入構築體係使用已用於臨床環境中之各種已知之免疫球蛋白序列以及種系抗體序列來製備。兩個實例性支架中之IL10M之序列(稱作GFTX1及GFTX3)繪示於表1中。基於可用結構或同源性模型數據選擇插入點為CDR環之中點。使用標準分子生物學方法利用編碼相關序列之重組DNA產生抗體細胞激素植入蛋白。
舉例而言,合成含有插入6個CDR中之一者中之IL-10M之每一抗體之可變區。經由PCR擴增編碼可變區之DNA,並將所得片段亞選殖至含有輕鏈恆定區或重鏈恆定及Fc區之載體中。以此方式,對應於IL-10M至6個CDR(L1,L2,L3,H1,H2,H3)中之每一者中之單一插入來製備IL-10M移植構築體。所得構築體顯示於表1中。重鏈及輕鏈載體之適當組合之轉染使得表現具有兩個移植之IL-10M分子(一個IL10單體在每一Fab臂中)之重組抗體。參見圖2。
選取哪個CDR用於細胞激素植入之選擇係基於以下參數來選取:所需要之生物學、生物物理性質及有利的發展特性。此時,建模軟體僅部分地可用於預測哪個CDR及CDR內之哪個位置將提供期望參數,因此可製備所有六種可能的抗體細胞激素移植物且然後以生物分析中進行評估。若達成所需要之生物活性,則解析關於抗體細胞激素植入分子如何與各別細胞激素受體相互作用之生物物理性質(例如結構解析)。
由於IL10移植至CDR中,則抗體細胞激素植入蛋白之抗體部分不再結合RSV,但賦予IL10配體影響與IL10受體之結合之獨特結構,如下文所論述。由於抗體部分而不存在脫靶效應。另外,已將抗體細胞激素植入蛋白之Fc部分修飾為關於ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)及CDC
(補體依賴性細胞毒性)完全沉默。
總之,基於結構來選取每一CDR中之插入點,假設移植至CDR中可為IL10受體之個別亞單位提供一定程度之立體阻礙。哪種CDR移植對於具體細胞激素最好之最終選擇係基於期望之生物學及生物物理性質。細胞激素受體之性質、細胞激素/受體相互作用及信號傳導之機制亦將起作用,且此係藉由比較每一個別抗體細胞激素分子之各別性質來進行。舉例而言,IL10植入輕鏈CDR1(CDRL1)中可產生活化單核球而非其他細胞(例如NK細胞)之期望生物活性。此在實例性抗體細胞激素植入蛋白IgGIL10M7及IgGIL10M13中可觀察到。
全血中之活體外功能研究揭露,與rhIL-10相比,在IgGIL10M13下促發炎性活性顯著降低。使用在診療所中支持rhIL10之促發炎性活性而研發之分析(Lauw等人,J Immunol.2000;165(5):2783-9),評價人類全血中IgGIL10M13之促發炎性活性。與重組人類未修飾之IL10相比,IgGIL10M13顯示類似功效。(圖3B)。
為評價促發炎性活性,剖析抗體細胞激素植入蛋白在CD8 T細胞中誘導干擾素γ(IFN-γ)之能力。分析IgGIL10M13自原代人類CD8+ T細胞引發IFN-γ或顆粒酶B(GrzB)之能力。在該等分析中吾人發現較重組人類IL-10(rhuIL10)抗體細胞激素植入蛋白證明顯著更不有效之促發炎性功能。參見圖3A。所顯示結果係在CD8 T細胞分析中針對IgGIL10M13及rhIL10而言,然而,在量測顆粒酶B以及利用其他測試抗體細胞激素植入蛋白(IgGIL10M7)之分析中發現了類似結果。此顯示IgG-IL10M13證明顯著低於rhuIL10之促發炎性活性,如在CD8 T細胞分析中藉由IFN-γ誘導所量測。在人類原代NK細胞、B細胞及肥胖細胞上以及使用顆粒酶-B作為讀出量測發現類似差異活性。
在用於刺激T細胞活化之植物血球凝集素(PHA)存在下,rhIL10引發顯著IFN-γ產生,其中IgGIL10M13顯示無活性(未顯示數據)。與表明
IgGIL10M13對T細胞具有有限信號傳導之信號傳導數據一致,在該等功能促發炎性分析中IgGIL10M13並不活化T細胞之細胞激素產生。總之,該等結果顯示抗體細胞激素植入蛋白具有抗發炎性質與IL10類似之期望性質,但在不限制劑量下,其具有不期望之促發炎性質。
人類PBMC及全血中之活體外信號傳導研究指示,IgGIL10M13具有比rhIL10更特異之信號傳導特性。使用CyTOF(基於FACS且組合質譜分析之方法),評價全血中多種不同細胞群體中之IgGIL10M13信號傳導(圖4)。IgGIL10M13僅在超過μM濃度上(多至1.8μM)在單核球、巨噬細胞及漿細胞樣樹突細胞上發出信號。相比之下,rhIL-10即使在低nM濃度下在T細胞、B細胞及NK細胞之其他細胞類型上發出信號。在rhIL10處理之全血中,所有IL10敏感性細胞類型皆可在100nM之濃度下活化,其中在單核球及髓樣樹突細胞上之信號最強且T細胞、NK細胞、B細胞及顆粒球具有中等活化。在基於人類功能細胞之分析中,此信號傳導使得因應IL10自T細胞及NK細胞產生IFN-γ及顆粒酶B並增殖B細胞;rhIL10之此免疫刺激活性已在高於抗發炎IC90低於5倍之暴露下在人類全血中觀察到。IgGIL10M13之更多選擇性細胞特性產生降低之效能限制性促發炎性活性,從而在診療所引起更好效能。
IL10在人類單核球、PBMC及全血中有效抑制LPS誘導之促發炎性細胞激素產生。IgGIL10M13在該等細胞類型中展現pM功效,但有效性較rhIL10小10倍。下文係在人類全血以及所選毒性物種之全血中針對IL-10或IgGIL10M13活性之功效比較。
功效計算係基於來自小鼠、食蟹猴或人類之離體全血分析。對於所測試之每一物種,均調定IgGIL10M13或rhIL10並評價其抑制LPS誘導之TNF-α產生之能力。IC50計算為引起總TNF-α信號之50%抑制之檢品含量。慮及每一分析之希爾斜率值(Hill slope value)利用以下等式計算IC90及IC30:logEC50=logECF-(1/希爾斜率)*lob(F/100-F)),其中ECF係給出總TNF-α信號之F%之反應之濃度。該等結果顯示於表2中。
在C57B1/6小鼠中評價IL10抗體細胞激素植入蛋白之半衰期。以0.2mg/kg皮下注射IL10抗體細胞激素植入蛋白,並在注射後5分鐘開始直至注射後144小時對血液進行取樣。與rhuIL10(T1/2大約1hr)(圖5A)相比,IgGIL10M13具有顯著半衰期延長(圖5B)。
皮下投與之IgGIL10M13能阻斷巨噬細胞及樹突細胞之發炎活性,但沒有rhIL10之效能限制性促發炎性活性。在經分離人類單核球及巨噬細胞、PBMC及人類全血中,IgGIL10M13顯示有效抗發炎活性(IC50為30pM),此與rhIL10之功效相當。然而,與rhIL-10相比,IgGIL10M13即
使高達μM含量亦沒有在T細胞及NK細胞上之信號傳導,因此,降低不期望之促發炎性活性。活體內藥理學研究證明,IgGIL10M13具有顯著長於天然IL-10之半衰期(在小鼠中分別1.8天對1hr)且在靶標組織血液及結腸中始終延長藥效學。利用IgGIL10M13之急性細胞激素釋放研究證明活體內活性與半衰期延長相稱。對於IgGIL10M7觀察到類似結果。
與延長之半衰期一致,抗體細胞激素植入蛋白亦證明改良之藥效學。在皮下投藥後在靶標組織(血液及結腸)中監測Phospho-STAT3(IL10R活化之標記物)。在投藥後至少長達72小時在兩種組織中均被檢測到增強之pSTAT3信號,且其在投藥後144小時不存在。參見圖5C。此特性係超過rhuIL-10之顯著改良,該rhuIL-10之信號在投藥後24小時不存在。圖5D繪示如與rhuIL10相比IgG-IL10M13之活體內反應之持續時間有所改良,如藉由在構築體投藥後因應LPS攻擊在血液中之TNF-α之抑制所量測。當量測IFN-γ時發現了類似結果。
在實施LPS攻擊後直接比較TNFα抑制之效能。利用媒劑、0.2mg/kg IgGIL10M13或等莫耳含量之rhuIL10對C57/BL6小鼠進行皮下投藥。然後抽出血液用於離體LPS攻擊以評價TNFα含量。IgGIL10M13證明在初始評價時間段具有相當效能,然而,在投藥後6小時直至至少48小時,IgGIL10M持續優於rhuIL10之效能,如藉由攻擊分析所量測。
抗體細胞激素植入蛋白(例如IgGIL10M13)將單體IL-10引入抗體之輕鏈CDRL1中(圖2)。在IL10之螺旋D與E之間插入6胺基酸甘胺酸-絲胺酸
連接體使得正常二聚體分子無法二聚化。因此,將IL10植入抗體支架中產生具有2個單體IL10分子之實體。然而,如在野生型IL10二聚體中一般,由於Fab臂之撓性,在IL10單體之間之角度及距離不固定,因此,影響其與IL10R1/R2受體複合物之相互作用(圖6)。特定而言,由於抗體植入,所植入IL10二聚體之角度變大且可變,使得在具有較低含量之IL10R1及R2之細胞(促發炎性細胞類型:B細胞、T細胞及NK細胞)上之信號轉導較不有效,而在具有高IL-10R1及R2之細胞(單核球)上之信號傳導更有效。IgGIL10M13之CryoEM突出顯示單體之間之額外撓性及較寬角度,證實與rhuIL10相比幾何學有所改變。在IgGIL10M13中IL10二聚體之較不受限之幾何學改變了其與IL10R複合物之相互作用。因此,IgGIL10M13抗體細胞激素植入蛋白之結構引起僅在具有高含量之IL10R1及R2之細胞類型上產生生產性信號之生物效應。
在C57Bl/6小鼠中評價抗體細胞激素植入蛋白之半衰期。在0.9%鹽水中以0.2mg/kg(10ml/kg劑量體積)皮下注射抗體細胞激素植入蛋白,且在注射後1小時開始且直至注射後144小時對血液進行取樣。在每一時間點將全血收集至肝素處理之管中並在4℃下以12,500rpm離心10分鐘。收集血漿上清液並在-80℃下儲存直至所有時間點皆經收集為止。使用兩種不同的免疫分析方法量測血漿中之抗體細胞激素植入蛋白含量,以使得能夠檢測抗體細胞激素植入蛋白之IL-10及抗體結構域。如圖7中所顯示,抗體細胞激素植入蛋白(IgGIL10M13)之cmax%為大約150小時。相比之下,rhIL-10為大約3.5小時。活體內藥理學研究證明IgGIL10M13具有顯著長於天然IL-10之半衰期(在小鼠中分別1.8天對1hr)。
在LPS攻擊前48小時至96小時投與IgGIL10M13之小鼠顯示促發炎性細胞激素產生之有效抑制。相比之下,rhIL10在等莫耳含量下在投藥後24h喪失抑制。IgGIL10M13處理之小鼠中之組織信號傳導之分析證明在投藥後長達96h在血液及靶標組織中均具有持久IL10受體信號傳導(pSTAT3),rhIL10信號傳導在投藥後24h前喪失(圖8)。概言之,與rhIL10相比,在小鼠中IgGIL10M13顯示延長之發炎抑制及延長之效能。
在分析培養基(RPMI 1640,具有麩醯胺酸(Hyclone)、10%熱去活化之FBS(Omega Scientific)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco)、50uM 2-巰基乙醇(Gibco)、10mM Hepes ph 7.4(Hyclone)、0.1mM非必需胺基酸(Hyclone)、1mM丙酮酸鈉(Hyclone)及1×人類胰島素/運鐵蛋白/硒(Gibco))中以10×以1000ng/ml製備IL-10抗體細胞激素植入蛋白。在分析培養基中以1:3連續稀釋每一10×IL-10抗體細胞激素植入蛋白儲備溶液以產生11點劑量調定。
在分析培養基中將人類全血稀釋至90%並輕柔混合。以n=3個孔(45μl/孔)中平鋪未刺激之經稀釋全血並添加分析培養基(5μl/孔)以使最終孔體積達到50μl。將脂多醣(LPS,Invivogen儲備溶液100μg/ml)以220ng/ml摻加至經稀釋全血中並輕柔混合。然後平鋪LPS摻加之全血,將IL-10蛋白添加至每一各別孔中,然後輕柔混合並在37℃培育器(5% CO2)中培育約20小時。然後輕柔混合各板並在室溫下以1400rpm離心5分鐘,且藉由將10μl/孔自分析板轉移至代用板來收穫上清液,以使用人類TNF-
α HTRF套組(Cisbio®)根據製造商之說明書進行TNFα檢測,且將結果與使用製造提供之對照生成之標準曲線相比較。
自來自Blutspende Zentrum Basel之血沉棕黃層分離末梢血單核細胞(PBMC)。利用15ml Ficoll-Paque PLUS®(GE Healthcare,17-1440-03)各自填充八個Leucosep管(Greiner,227290)/血沉棕黃層並離心(1分鐘,1000g,20℃)。在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(pH 7.4)(Gibco,10010-015)中以1:4稀釋血沉棕黃層並將35ml覆蓋至每一Ficoll梯度上。在離心(800g,20min,20℃)後,淋巴球分離至白血球層中。將此細胞層轉移至新鮮管並用PBS洗滌。藉由將細胞糰粒再懸浮於每管2ml蓋氏紅色血液溶解緩衝液(Gey’s red blood lysing buffer)(155mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM EDTA)來溶解紅血球。在培育5min後,用PBS將細胞洗滌兩次。在最後一次洗滌後,將PBMC再懸浮於T細胞培養基(TCM)中。TCM含有RPMI 1640(Gibco,21875-034)、10%胎牛血清(Gibco,10082147)、1%青黴素-鏈黴素(Gibco,15070063)、2mM GlutaMax(Gibco,35050-038)及50U/ml青黴素、50μg/ml鏈黴素。藉助40μm細胞篩濾器(BD Falcon,734-0002)過濾PBMC,以獲得單一細胞懸浮液並計數。根據Big Easy Magnet®(StemCell,18001)之製造商之方案使用人類CD8+ T細胞富集套組(StemCell,19053)自PBMC純化CD8+ T細胞。在分離後,洗滌細胞,計數並以1.8×106細胞/ml之濃度再懸浮於TCM中。用每孔2ml TCM將抗CD3/CD28塗佈之板(參見章節2.1.1)洗滌一次,隨後每孔在1ml中添加1.8×106個CD8+ T細胞。將板離心(5min,520g,20℃)並在細胞培育器(Binder)中在37℃、5% CO2、95%濕度下培育3天。
在培育三天後,自24孔板彙集經活化CD8+ T細胞並用TCM洗滌一次。對細胞進行計數,將其以3×106個細胞/ml再懸浮於TCM中並將300,000個細胞/孔在100μl中添加至Nunclon Delta Surface® 96孔圓底板(Thermo Scientific,163320)中。在單獨板中在TCM中以下列濃度製備兩倍於最終濃度之IL-10抗體細胞激素植入蛋白預稀釋液:40nM、4nM、0.4nM、0.04nM、0.004nM及0nM。將100μl該等預稀釋液以一式兩份添加至100μl細胞懸浮液中,產生20nM、2nM、0.2nM、0.02nM、0.002nM及0nM之最終抗體細胞激素植入蛋白濃度。將各板在37℃下培育48h。
在培育時段後,對各板進行離心(2min,970g,20℃)並丟棄上清液。將細胞糰粒再懸浮於200μl含有2ng/ml佛波醇-肉豆蔻酸酯-乙酸酯(Phorbol-myristate-acetate)(PMA,Sigma Aldrich,79346)、2.5μg/ml抗CD3(BD,555336)及1:1500 GolgiStop(BD,554724)之TCM中。將各板在37℃下培育5h以再刺激細胞。之後,對各板進行離心(2分鐘,970g,20℃),丟棄上清液並添加200μl冰冷PBS以洗滌細胞糰粒。在離心(2分鐘,970g,20℃)後,去除PBS並將細胞再懸浮於200μl含有2% Triton X-100(Serva,39795)之冰冷的200mMTtis-HCl緩衝液(pH 8.1)中以溶解細胞。使各板在冰上靜置15min並離心(10min,970g,4℃)以消除碎屑。將上清液小心轉移至新的96孔板中並冷凍用於儲存。為檢測干擾素-γ(上清液中之IFN-γ),根據製造商之方案使用人類IFN-γDuoSet® ELISA(R&Dsystems,DY285)。在所推薦之分析稀釋劑中以1:2稀釋如章節2.1.5
中所闡述獲得之上清液。為檢測上清液中之顆粒酶B(GrzB),根據製造商之方案使用人類Granzyme B® ELISA(Mabtech,3485-1H-20)。在所推薦之分析稀釋劑中以1:50稀釋上清液。藉由SpectraMax® 340PC讀板儀(Molecular Devices)獲取ELISA板之光學密度(OD)並藉由SoftMax® Pro軟體根據自動生成之標準曲線將其轉化為濃度。將數據輸出至Microsoft Excel,其中濃度係關於其稀釋因子來反算。
CyTOF係FACS/質譜技術,其用於藉由單一藥劑同時評價多個細胞群體之活化。將抗體細胞激素植入蛋白與人類全血一起培育20分鐘。在刺激後,用抗細胞特異性表面受體CD14、HLA-DR、CD4、CD8、CD19、CD56及信號傳導標記物pSTAT3之金屬偶聯抗體處理PBMC並藉由CyTOF加以分析。結果指示,所有劑量下之IgGIL10M13皆主要活化單核球及巨噬細胞細胞群體,且T細胞、B細胞、NK細胞及樹突細胞群體之活化極少。相反,rhIL-10將所有測試細胞群體活化至一定程度。
在C57Bl/6小鼠中評價抗體細胞激素植入蛋白之半衰期。在0.9%鹽水中以0.2mg/kg(10ml/kg劑量體積)皮下注射抗體細胞激素植入蛋白,並在注射後1小時開始且直至注射後144小時對血液進行取樣。在每一時間點將全血收集至肝素處理之管中並在4℃下以12,500rpm離心10分鐘。收集血漿上清液並在-80℃下儲存直至所有時間點皆經收集為止。使用兩種不同免疫分析方法量測血漿中之抗體細胞激素植入蛋白含量,以使得能夠檢測抗體細胞激素植入蛋白之IL-10及抗體結構域。第一方法利用推薦採用之市售1L-10 ELISA套組(BD OptEIA® Human IL10 ELISA Set,捕獲:
rhIL10/檢測:生物素-rhIL10)。第二方法由基於IL-10之捕獲及在GyroLab® xP Workstation(Gyros AB Uppsala,Sweden)上運行之基於Fc之檢測免疫分析組成。特定而言,所用試劑由生物素化人類IL-10捕獲(R&D Systems BAF217)及Alexaflu或647山羊抗人類IgG、Fcγ特異檢測(Jackson ImmunoResearch編號109-605-098)組成。該分析係在200nL CDs(Gyros編號P0004180)上使用Gyros批准之wizard方法運行。所用緩衝液為用於標準及試樣稀釋之Rexxip A®(Gyros編號P0004820)及用於檢測製劑之Rexxip F®(Gyros編號P0004825)。使用Gyrolab®數據分析軟體分析結果。
與延長之半衰期一致,抗體細胞激素植入蛋白亦證明改良之藥效學。在皮下投藥後在靶標組織(血液及結腸)中監測Phospho-stat3(pSTAT3)(IL10R活化之標記物)。在0.9%鹽水中以0.2mg/kg(10ml/kg劑量體積)皮下注射抗體細胞激素植入蛋白。在注射後1小時開始且直至注射後144小時收穫末端全血及結腸組織(迴盲腸接合處2cm)。將全血收集至含有1×磷酸酶抑制劑(皮爾斯哈爾特磷酸酶抑制劑混合劑(Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail))之肝素處理之管中並在冰上保持直至phospho-Stat3分析為止。在含有冷PBS及1×磷酸酶抑制劑之管中收集結腸組織。在該時間點收集所有組織後,將結腸組織轉移至含有鋼珠及700μl完全細胞溶解緩衝液之管中,該緩衝液含有PBS及10μM DTT、1×蛋白酶抑制劑混合劑、10×磷酸酶抑制劑混合劑及10×細胞溶解緩衝液(活性基序核提取套組)。在室溫下藉由組織溶解器以30rp將結腸組織均質化5分鐘。在4℃下將溶解組織以14,000×g離心10分鐘。收集上清液並在冰上儲
存直至phospho-STAT3分析為止。
在與全血及結腸組織收集及處理之同一天運行phospho-Stat3分析板(Meso Scale Discovery ® pSTAT3(Tyr705)分析)。使用所提供之含有1×磷酸酶抑制劑2、1×磷酸酶抑制劑3及1×蛋白酶抑制劑之1×MSD溶解緩衝液溶解冰冷的全血。在4℃下將全血之每一管以12,500rpm離心10分鐘。收集血漿並丟棄。將沈澱之全血再懸浮於220μl MSD溶解緩衝液+抑制劑中並充分渦旋。以50μl/孔將溶解之全血平鋪於phospho-STAT3分析板之各別孔中。使用Bradford分析(Pierce)實施結腸組織上清液蛋白檢測。然後以50μl/孔將結腸蛋白平鋪於phospho-STAT3分析板上。將各板在室溫下培育2小時,洗滌並用phospho-STAT3或總STAT3抗體(Meso Scale Discovery)處理。在MSD Sect或Imager 2400(Meso Scale Discovery)上針對相對螢光單位(RFU)分析各板。將全血phospho-STAT3 RFU正規化為總STAT3 RFU。將結腸蛋白phospho-STAT3 RFU正規化為負載蛋白濃度。在投藥後至少長達72小時在兩種組織中均檢測到增強之pSTAT3信號且其在投藥後144小時不存在。參見圖5,未顯示。此特性係超過rhuIL-10之顯著改良,該rhuIL-10之信號在投藥後24小時不存在。
在實施LPS攻擊後直接比較TNFα抑制之效能。在該分析中,利用媒劑、0.2mg/kg IgGIL10M13(10ml/kg劑量體積)或等莫耳含量之rhuIL-10對C57/B16小鼠進行皮下投藥。在投藥前、在投藥後1.5hr及投藥後長達144hr收集全血。將全血收集至肝素處理之管中。在血液收集前,製備分析培養基。分析培養基含有具有麩醯胺酸之RPMI 1640(Hyclone)以及10%熱去活化之FBS(Omega Scientific)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco)、50
μM 2-巰基乙醇(Gibco)、10mM Hepes ph 7.4(Hyclone)、0.1mM非必需胺基酸(Hyclone)及1mM丙酮酸鈉(Hyclone)。將小鼠全血以25μl/孔/複製/小鼠平鋪於384孔板上。將分析培養基添加至未刺激之對照孔中(25μl/孔)以使最終孔體積達到50μl。為進行LPS攻擊,將LPS(Invivogen,儲備溶液100μg/ml)以200ng/ml[在該分析中最終為100ng/ml]摻加至分析培養基中並輕柔混合。對於每一所需要之含有小鼠全血之孔,然後以25μl/孔平鋪LPS摻加之BCM。輕柔混合該板並在37℃培育器(5% CO2)中培育21小時。第二天,在室溫下將分析板以1400rpm離心5分鐘。收集每一孔之上清液並在-80℃下冷凍直至所有時間點皆分析為止。在分析所有時間點後,將上清液平鋪至MSD V-plex® Mouse Pro-Inflammatory Cytokine Assay Plate(Meso Scale Discovery)上。在MSD Sect或Imager 2400®(Meso Scale Discovery)上分析各板之TNFα(pg/ml)。
藉由檢查刺激MC/9(源於小鼠胎兒肝之肥胖細胞系)細胞增殖之能力來評價IL10抗體細胞激素植入蛋白之免疫刺激活性。首先,在單獨384孔板中在無T-STIM之生長培養基中以7×稀釋IL-10抗體細胞激素植入蛋白(7×=700ng/ml)。包括IL-4作為陽性對照(7×=1,000ng/ml,[最終]=143ng/ml)。其次,將30μl 1.67×104個細胞/ml MC/9細胞平鋪於TC處理之白色384孔板(500個細胞/孔)中之無T-STIM之培養基中(無需在分析前洗滌細胞)。第三,將5μl稀釋之IL-10抗體細胞激素植入蛋白添加至細胞中。使用板式混合器短暫地混合板且然後以1,000rpm進行脈衝旋轉。利用定製多孔蓋覆蓋板以使細胞暴露於空氣。第四,將板在37℃下培育72
小時。第五,將30μl Promega Cell Titer Glo®添加至細胞中,在室溫下培育10min並在Envision®上讀取(0.1sec讀取)。
如上文所闡述自人類血沉棕黃層分離PBMC。為分離B細胞,根據Big Easy Magnet®(Stemcell,18001)之製造商之方案使用人類B細胞富集套組®(Stemcell,19054)。在分離後,利用B細胞培養基(BCM)洗滌B細胞,計數並以4×105個細胞/ml之濃度再懸浮。BCM含有RPMI 1640、10%胎牛血清(Gibco,10082147)、1%青黴素-鏈黴素(Gibco,15070063)及2mM GlutaMax(Gibco,35050-038)、1%非必需胺基酸(Gibco,11140035)及1mM丙酮酸鈉(Gibco,11360-039)、50U/ml青黴素及50μg/ml鏈黴素。對經分離B細胞進行計數並以4×105個細胞/ml之濃度再懸浮於BCM中。為刺激B細胞,將8.4μg/ml抗CD40及40U/ml重組人類IL-2(R&D systems,202-IL-50)添加至懸浮液中。然後將B細胞在100μl中以4×104個細胞之濃度添加至Nunclon Delta Surface® 96孔圓底板(Thermo Scientific,163320)之孔中。在單獨板中製備兩倍於最終濃度之IL-10抗體植入蛋白預稀釋液。實施化合物之調定,獲得以下濃度:40nM、4nM、0.4nM、0.04nM、0.004nM及0nM。將100μl該等預稀釋液一式兩份添加至100μl細胞懸浮液中,得到20nM、2nM、0.2nM、0.02nM、0.002nM及0nM之最終化合物濃度及4.2mg/ml抗CD40及20U/ml重組IL-2之最終濃度。將該板在細胞培養培育器(37℃,5% CO2,95%濕度)中培育5天。在培育5天後,藉由胸苷納入分析確定B細胞之增殖。在37℃下利用每孔0.5μCi 3H-胸苷(ANAWA,ART-178)(於20μl BCM)將細胞脈衝培養時段之最後16h。使用TomTec 9600®收穫器,根據製造商之方案將細胞收穫至
膜上。將膜密封在袋中,添加閃爍液體並在閃爍計數器上量測放射性。對於抗體植入蛋白中之每一者,相對於各別背景細胞激素產生(「底部」)、相對於等莫耳濃度之rhuIL10下之增殖來計算20nM(「頂部」)下之增殖之百分比。使用以下公式計算所得最大值%:最大值%=(頂部化合物-底部化合物)/(頂部rhIL-10-底部rhIL-10)* 100
測定不同實驗系列之平均值,且若在多於兩個供體上量測化合物,則計算平均值之標準誤差(SEM)。
應瞭解,本文所闡述之實例及實施例係出於闡釋之目的,且基於其之各種修改或變化將為熟習此項技術者所瞭解且欲包括在本申請案之精神及範圍及隨附申請專利範圍之範圍內。出於所有目的,本文所引用之所有公開案、序列登錄號、專利及專利申請案皆以全文引用方式併入本文中。
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<220>
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<400> 253
Claims (41)
- 一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含:(a)重鏈可變區(VH),其包含互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3;及(b)輕鏈可變區(VL),其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3;及(c)植入至該VH或該VL之CDR中之介白素10(IL10)單體分子。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其包含植入至重鏈CDR中之IL10單體分子。
- 如請求項2之抗體細胞激素植入蛋白,其中該IL10單體分子係植入至選自HCDR1、HCDR2或HCDR3之區中。
- 如請求項3之抗體細胞激素植入蛋白,其包含植入至HCDR1中之IL10單體分子。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其包含植入至輕鏈CDR中之IL10單體分子。
- 如請求項5之抗體細胞激素植入蛋白,其中該IL10單體分子係植入至選自LCDR1、LCDR2或LCDR3之區中。
- 如請求項6之抗體細胞激素植入蛋白,其包含植入至LCDR1中之IL10單體分子。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其中當與天然IL10相比時,存在較少之T細胞及NK細胞活化。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其中該抗體細胞激素植入蛋白比天然IL10具有較長之半衰期。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其中該IL10單體分子係由SEQ ID NO:209組成。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其包含IgG類抗體重鏈。
- 如請求項11之抗體細胞激素植入蛋白,其中該IgG係選自IgG1、IgG2或IgG4。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其中抗體CDR之結合特異性在該植入IL10單體分子存在下係經降低的。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其中該等抗體CDR之結合特異性在該植入IL10單體分子存在下係經保留的。
- 如請求項14之抗體細胞激素植入蛋白,其中該等抗體CDR之結合特異性係針對與該IL10單體分子之結合特異性不同之抗原。
- 如請求項15之抗體細胞激素植入蛋白,其中該抗體可變結構域之結合特異性係針對非人類抗原。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其中該抗體係人類化或人類抗體。
- 一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含:(i)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:193之HCDR1、(b)SEQ ID NO:194之HCDR2、(c)SEQ ID NO:195之HCDR3,及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:196之LCDR1、(e)SEQ ID NO:197之LCDR2及(f)SEQ ID NO:198之LCDR3;(ii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:97之HCDR1、(b)SEQ ID NO:98之HCDR2、(c)SEQ ID NO:99之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:100之LCDR1、(e)SEQ ID NO:101之LCDR2及(f)SEQ ID NO:102之LCDR3;(iii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:1之HCDR1、(b)SEQ ID NO:2之HCDR2、(c)SEQ ID NO:3之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:4之LCDR1、(e)SEQ ID NO:5之LCDR2及(f)SEQ ID NO:6之LCDR3;(iv)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:17之HCDR1、(b)SEQ ID NO:18之HCDR2、(c)SEQ ID NO:19之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:20之LCDR1、(e)SEQ ID NO:21之LCDR2及(f)SEQ ID NO:22之LCDR3;(v)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:33之HCDR1、(b)SEQ ID NO:34之HCDR2、(c)SEQ ID NO:35之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:36之LCDR1、(e)SEQ ID NO:37之LCDR2及(f)SEQ ID NO:38之LCDR3;(vi)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:49之HCDR1、(b)SEQ ID NO:50之HCDR2、(c)SEQ ID NO:51之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:52之LCDR1、(e)SEQ ID NO:53之LCDR2及(f)SEQ ID NO:54之LCDR3;(vii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:65之HCDR1、(b)SEQ ID NO:66之HCDR2、(c)SEQ ID NO:67之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:68之LCDR1、(e)SEQ ID NO:69之LCDR2及(f)SEQ ID NO:70之LCDR3;(viii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:81之HCDR1、(b)SEQ ID NO:82之HCDR2、(c)SEQ ID NO:83之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:84之LCDR1、(e)SEQ ID NO:85之LCDR2及(f)SEQ ID NO:86之LCDR3;(ix)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:113之HCDR1、(b)SEQ ID NO:114之HCDR2、(c)SEQ ID NO:115之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:116之LCDR1、(e)SEQ ID NO:117之LCDR2及(f)SEQ ID NO:118之LCDR3; (x)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:129之HCDR1、(b)SEQ ID NO:130之HCDR2、(c)SEQ ID NO:131之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:132之LCDR1、(e)SEQ ID NO:133之LCDR2及(f)SEQ ID NO:134之LCDR3;(xi)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:145之HCDR1、(b)SEQ ID NO:146之HCDR2、(c)SEQ ID NO:147之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:148之LCDR1、(e)SEQ ID NO:149之LCDR2及(f)SEQ ID NO:150之LCDR3;(xii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:161之HCDR1、(b)SEQ ID NO:162之HCDR2、(c)SEQ ID NO:163之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:164之LCDR1、(e)SEQ ID NO:165之LCDR2及(f)SEQ ID NO:166之LCDR3;(xiii)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:177之HCDR1、(b)SEQ ID NO:178之HCDR2、(c)SEQ ID NO:179之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:180之LCDR1、(e)SEQ ID NO:181之LCDR2及(f)SEQ ID NO:182之LCDR3;(xiv)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:210之HCDR1、(b)SEQ ID NO:211之HCDR2、(c)SEQ ID NO:212之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:213之LCDR1、(e)SEQ ID NO:214之LCDR2及(f)SEQ ID NO:215之LCDR3;及(xv)重鏈可變區,其包含(a)SEQ ID NO:226之HCDR1、(b)SEQ ID NO:227之HCDR2、(c)SEQ ID NO:228之HCDR3;及輕鏈可變區,其包含:(d)SEQ ID NO:229之LCDR1、(e)SEQ ID NO:230之 LCDR2及(f)SEQ ID NO:231之LCDR3。
- 一種抗體細胞激素植入蛋白,其包含:(i)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:205,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:206;(ii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:109,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:110;(iii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:13,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:14;(iv)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:29,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:30;(v)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:45,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:46;(vi)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:61,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:62;(vii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:77,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:78;(viii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:93,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:94;(ix)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:125,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:126;(x)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:141,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:142; (xi)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:157,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:158;(xii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:173,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:174;(xiii)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:189,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:190;(xiv)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:222,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:223;及(xv)重鏈可變區(VH),其包含SEQ ID NO:238,及輕鏈可變區(VL),其包含SEQ ID NO:239。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其中該抗體包含與降低之效應物功能對應之經修飾Fc區。
- 如請求項20之抗體細胞激素植入蛋白,其中該經修飾Fc區包含選自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A及L235A中之一或多者之突變。
- 如請求項21之抗體細胞激素植入蛋白,其中該經修飾Fc區包含選自D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中之一或多者之突變組合。
- 一種抗體細胞激素植入蛋白,其係由以下組成:SEQ ID NO:193之 HCDR1、SEQ ID NO:194之HCDR2、SEQ ID NO:195之HCDR3、SEQ ID NO:196之LCDR1、SEQ ID NO:197之LCDR2、SEQ ID NO:198之LCDR3、含有突變D265A/P329A之經修飾Fc區,且其中當與天然IL10相比時,該抗體細胞激素植入蛋白具有較少之NK細胞活化。
- 一種編碼抗體細胞激素植入蛋白之經分離核酸,其包含:(i)SEQ ID NO:246之可變重鏈及SEQ ID NO:247之可變輕鏈;(ii)SEQ ID NO:248之重鏈及SEQ ID NO:249之輕鏈;(iii)SEQ ID NO:242之可變重鏈及SEQ ID NO:243之可變輕鏈;及(iv)SEQ ID NO:244之重鏈及SEQ ID NO:245之輕鏈。
- 一種適於產生如請求項24之抗體細胞激素植入蛋白之重組宿主細胞,其包含編碼該蛋白之重鏈及輕鏈多肽及視情況分泌信號之核酸。
- 如請求項25之宿主細胞,其中該細胞係哺乳動物細胞。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白及一或多種醫藥上可接受之載劑。
- 一種如請求項1至23中任一項之抗體細胞激素植入蛋白之用途,其用於製造用以治療或預防免疫相關病症之藥劑。
- 如請求項28之用途,其中該免疫相關病症係選自由以下組成之群:發炎性腸病、克隆氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病(Sjogren’s disease)、貝西氏病(Behcet’s disease)、類肉瘤病及移植物抗宿主病(graft versus host disease;GVHD)。
- 如請求項28之用途,其中該抗體細胞激素植入蛋白係與另一治療劑組合投與。
- 如請求項30之用途,其中該治療劑係選自由以下組成之群之抗TNF劑:英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、戈利木單抗(golimumab)、那他珠單抗(natalizumab)及維多珠單抗(vedolizumab)。
- 如請求項30之用途,其中該治療劑係選自由以下組成之群之胺基柳酸鹽藥劑:磺胺塞拉金(sulfasalazine)、美沙拉明(mesalamine)、巴柳氮(balsalazide)、奧沙拉秦(olsalazine)及5-胺基柳酸之其他衍生物。
- 如請求項30之用途,其中該治療劑係選自由以下組成之群之皮質類固醇:甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)、氫化可體松(hydrocortisone)、普賴松(prednisone)、布地奈德(budenisonide)、美沙拉明及地塞米松(dexamethasone)。
- 如請求項30之用途,其中該治療劑係抗細菌劑。
- 如請求項1之抗體細胞激素植入蛋白,其用作治療劑用於治療或預防有需要之個體之免疫相關病症。
- 如請求項35之抗體細胞激素植入蛋白,其用作治療劑用於治療選自由以下組成之群之免疫相關病症:發炎性腸病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、I型糖尿病、急性胰臟炎、眼色素層炎、修格連氏病、貝西氏病、類肉瘤病及移植物抗宿主病(GVHD)。
- 如請求項35之抗體細胞激素植入蛋白,其中該抗體細胞激素植入蛋白係與另一治療劑組合投與。
- 如請求項37之抗體細胞激素植入蛋白,其中該治療劑係選自由以下組成之群之抗TNF劑:英利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、戈利木單抗、那他珠單抗及維多珠單抗。
- 如請求項37之抗體細胞激素植入蛋白,其中該治療劑係選自由以下組成之群之胺基柳酸鹽藥劑:磺胺塞拉金、美沙拉明、巴柳氮、奧沙拉秦及5-胺基柳酸之其他衍生物。
- 如請求項37之抗體細胞激素植入蛋白,其中該治療劑係選自由以下組成之群之皮質類固醇:甲基普賴蘇濃、氫化可體松、普賴松、布地奈 德、美沙拉明及地塞米松。
- 如請求項37之抗體細胞激素植入蛋白,其中該治療劑係抗細菌劑。
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- 2021-08-26 US US17/458,028 patent/US20220127321A1/en not_active Abandoned
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