CN108602870A - 抗体细胞因子嫁接组合物及用于免疫调节的方法 - Google Patents

抗体细胞因子嫁接组合物及用于免疫调节的方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供抗体细胞因子嫁接蛋白，其结合白细胞介素10受体并通过白细胞介素10受体刺激胞内信号传导。本公开提供的抗体细胞因子嫁接蛋白可用于增强抗炎细胞反应，并减少免疫相关疾病的治疗、改善和预防中的促炎作用。另外，本公开提供了编码抗体细胞因子嫁接蛋白的多核苷酸和载体、能够产生抗体细胞因子移植蛋白的宿主细胞，以及将抗体细胞因子移植蛋白与其他治疗剂组合用于治疗免疫相关病症的方法。

Description

抗体细胞因子嫁接组合物及用于免疫调节的方法
技术领域
本公开涉及结合白细胞介素-10受体(IL10R)并刺激通过该受体的信号传导的抗体-细胞因子嫁接(engrafted)组合物。
背景技术
白细胞介素10(IL10)被鉴定为细胞因子合成抑制因子，对Th1辅助细胞和抗原呈递细胞(APC)发挥作用。作为结构域交换的非共价同型二聚体存在的161个氨基酸的蛋白质，IL10以一同型二聚体对四IL-10RI亚单位的化学计量结合高亲和力IL-10受体I(IL-10RI)，从而招募IL-10R2并通过JAKI/TYK2途径激活信号转导。IL-10抑制促炎细胞因子(例如，IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、GM-CSF、活性氧及氮中间体)的单核细胞及巨噬细胞合成，且已在许多自体免疫的临床前模型中显示出强效力。认为IL10功效是由于其抑制单核细胞，巨噬细胞和T细胞的激活和效应功能的能力。然而，IL10是一种多效性免疫调节细胞因子，具有非常广泛的生物活性。IL10还显示促进B细胞、NK细胞、细胞毒性和辅助性T细胞、肥大细胞、粒细胞、树突细胞、角质形成细胞甚至内皮细胞的生长和分化，表明它也具有促炎症功能(Moore等人，Annu Rev Immunol.2001；19:683-765)。
L10作为治疗自身免疫性和炎症性疾病，特别是炎症性肠病(IBD)的治疗剂，在动物模型系统和遗传学中得到支持。例如，在小鼠和具有IL-10R缺陷的小鼠中敲除IL10会形成自发的结肠炎发作。在人中，9-16％的克隆病(Crohn’s Disease)患者具有与IL10产生缺陷或降低相关的NOD2突变，并且20％的溃疡性结肠炎(UC)患者在3'UTR中携带疾病相关的IL10SNP。最后，人体中IL-10R1的某些突变导致罕见的严重形式的克隆病(Glocker等人，NEngl J Med.2009；361(21):2033-45)。
尽管有强大的基因连锁数据，但多达25μg/kg重组人IL10在健康志愿者和特定患者群体中显示了耐受性和安全性，且多达100μg/kg重组人IL-10在接受者的子集中具有轻微影响；然而，对于特定患者群体仅发现轻微的临床疗效，且由于缺乏效力而停止临床开发。已经对这些研究进行了评估，并且已经确定了结果的几种可能性，例如，有限的效力是由于IL10的短半衰期导致靶器官(结肠)暴露不良引起的；IL10的促炎效应在高剂量时表达出来并且抵消了低剂量IL10的抗炎效力(Lindsay及Hodgson,Aliment PharmacolTher.2001；15(11)1709-1716)。与此可能性一致的是，高剂量的IL10与升高的系统性IFNγ、粒酶和新喋呤(neopterin)水平相关，这与炎症增加有关(发炎标记)相关(Tilg等人，Gut 2002；50(2)191-5)。
已开发抗体细胞因子嫁接蛋白，以产生更有效的IL10治疗剂，其赋予改善的特征以解决重组人IL10的临床缺陷。这种改善的治疗特征包括强的抗炎IL10效力和促炎活性的显著降低、延长的半衰期、易于施用和稳定性。因此，本公开提供了改进的IL10抗体细胞因子嫁接蛋白和治疗免疫相关病症的方法。
发明概述
本公开内容提供了抗体-细胞因子嫁接蛋白，其具有优于临床上已知和使用的重组IL10和IL10构建体的优选治疗谱。具体而言，提供了维持天然或重组人IL10的所需抗炎活性的抗体细胞因子嫁接蛋白；然而，保留了促炎症活性的显著降低。另外，与重组人IL10蛋白相比，抗体细胞因子嫁接蛋白表达出改善的半衰期，稳定性和易于施用。这些组合物的优选性质产生优于临床上使用或在文献中描述的那些组合物的优选治疗组合物。本公开因此提供抗体细胞因子嫁接蛋白，其结合并促进通过IL10受体的信号传导并刺激某些细胞类型。本发明提供抗体细胞因子嫁接蛋白，其包含:(i)免疫球蛋白重链序列，其包含重链可变区(VH)及包含CH1区、CH2区及CH3区的重链恒定区，及(ii)免疫球蛋白轻链序列，其包含轻链可变区(VL)及轻链恒定区(CL)；其中单体IL10分子嫁接至VH或VL的互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:13的可变重链及包含SEQ ID NO:14的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQID NO:29的可变重链及包含SEQ ID NO:30的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:45的可变重链及包含SEQ ID NO:46的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:61的可变重链及包含SEQ ID NO:62的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:77的可变重链及包含SEQ ID NO:78的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQID NO:93的可变重链及包含SEQ ID NO:94的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:109的可变重链及包含SEQ ID NO:110的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:125的可变重链及包含SEQ ID NO:126的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:141的可变重链及包含SEQ ID NO:142的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:157的可变重链及包含SEQ ID NO:158的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:173的可变重链及包含SEQ ID NO:174的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:189的可变重链及包含SEQ ID NO:190的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ IDNO:205的可变重链及包含SEQ ID NO:206的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:222的可变重链及包含SEQ ID NO:223的可变轻链。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包括包含SEQ ID NO:238的可变重链及包含SEQ ID NO:239的可变轻链。
在某些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含IgG类抗体Fc区。在具体实施方案中，免疫球蛋白选自IgG1、IgG2或IgG4亚类Fc区。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白任选含有至少一种调节(即，增加或降低)抗体或抗体片段至Fc受体的结合的修饰。抗体细胞因子嫁接蛋白的免疫球蛋白重链任选包含赋予经修饰效应物功能的修饰。在具体实施方案中，免疫球蛋白重链包含赋予降低的效应物功能的突变，该突变选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中的任意者。
在相关方面中，本公开进一步提供至少编码如本文所述的抗体细胞因子嫁接蛋白的重链和/或轻链蛋白的多核苷酸。在另一相关方面中，本公开进一步提供适于产生如本文所述的抗体细胞因子嫁接蛋白的宿主细胞。在具体实施方案中，宿主细胞包含编码抗体细胞因子嫁接蛋白的重链和/或轻链多肽的核酸。在再一方面中，提供产生本公开的抗体细胞因子嫁接蛋白的方法，其包含在适于表达、形成及分泌抗体细胞因子嫁接蛋白的条件下培养如本文所述提供的宿主细胞，及从培养物回收抗体细胞因子嫁接蛋白。在另一方面中，本公开进一步提供试剂盒，其包含如本文所述的抗体细胞因子嫁接蛋白。
在另一相关方面中，本公开进一步提供组合物，其包含如本文所述的抗体细胞因子嫁接蛋白及可药用载体。在一些实施方案中，本公开提供包含本公开的抗体细胞因子嫁接蛋白的药物组合物，以施用于个体。
在另一方面中，本公开提供治疗有需要的个体中免疫相关病症的方法，其包含对该个体施用治疗有效量的如本文所述的本公开的抗体细胞因子嫁接蛋白。在另一方面中，本公开提供用于治疗或预防个体中免疫相关病症的抗体细胞因子嫁接蛋白。
在一些实施方案中，患者具有免疫相关病症，例如，炎症性肠病、克隆病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥综合征(Sjogren’sdisease)、白塞病(Behcet’s diseas)、结节病及移植物抗宿主病(GVHD)。在具体实施方案中，炎症性肠病是克隆病或溃疡性结肠炎。
在一些实施方案中，本公开提供抗体细胞因子嫁接蛋白，其包含:
(a)重链可变区(VH)，其包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3；及
(b)轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；及
(c)白细胞介素10(IL10)单体分子，其嫁接至VH或VL的CDR。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子嫁接至重链CDR。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中重链CDR选自HCDR1、HCDR2或HCDR3。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子嫁接至HCDR1。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子嫁接至轻链CDR。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中轻链CDR选自LCDR1、LCDR2或LCDR3。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子嫁接至LCDR1。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中在与IL10相比时，该抗体细胞因子嫁接蛋白具有较低的T细胞或NK细胞激活。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中该抗体细胞因子嫁接蛋白具有比rhIL10半衰期长的半衰期。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子由SEQ ID NO:209组成。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其进一步包含IgG类抗体重链。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IgG类重链选自IgG1、IgG2或IgG4。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中在所嫁接IL10单体分子存在下，CDR与靶蛋白的结合特异性降低。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中在所嫁接IL10单体分子存在下，CDR与靶蛋白的结合特异性保留。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中CDR与靶蛋白的结合特异性与IL10单体分子的细胞因子受体结合特异性不同。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中CDR的结合特异性是针对非人抗原。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中该抗体细胞因子嫁接蛋白是人源化的或人的抗体细胞因子嫁接蛋白。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其包含:
(i)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:193的HCDR1、(b)SEQ ID NO:194的HCDR2、(c)SEQ ID NO:195的HCDR3，及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:196的LCDR1、(e)SEQ IDNO:197的LCDR2及(f)SEQ ID NO:198的LCDR3；
(ii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:97的HCDR1、(b)SEQ ID NO:98的HCDR2、(c)SEQ ID NO:99的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:100的LCDR1、(e)SEQ IDNO:101的LCDR2及(f)SEQ ID NO:102的LCDR3；
(iii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1、(b)SEQ ID NO:2的HCDR2、(c)SEQ ID NO:3的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:4的LCDR1、(e)SEQ ID NO:5的LCDR2及(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iv)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:17的HCDR1、(b)SEQ ID NO:18的HCDR2、(c)SEQ ID NO:19的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:20的LCDR1、(e)SEQ IDNO:21的LCDR2及(f)SEQ ID NO:22的LCDR3；
(v)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:33的HCDR1、(b)SEQ ID NO:34的HCDR2、(c)SEQ ID NO:35的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:36的LCDR1、(e)SEQ ID NO:37的LCDR2及(f)SEQ ID NO:38的LCDR3；
(vi)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:49的HCDR1、(b)SEQ ID NO:50的HCDR2、(c)SEQ ID NO:51的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:52的LCDR1、(e)SEQ IDNO:53的LCDR2及(f)SEQ ID NO:54的LCDR3；
(vii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:68的LCDR1、(e)SEQ IDNO:69的LCDR2及(f)SEQ ID NO:70的LCDR3；
(viii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:81的HCDR1、(b)SEQ ID NO:82的HCDR2、(c)SEQ ID NO:83的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:84的LCDR1、(e)SEQ IDNO:85的LCDR2及(f)SEQ ID NO:86的LCDR3；
(ix)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:113的HCDR1、(b)SEQ ID NO:114的HCDR2、(c)SEQ ID NO:115的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:116的LCDR1、(e)SEQ IDNO:117的LCDR2及(f)SEQ ID NO:118的LCDR3；
(x)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:129的HCDR1、(b)SEQ ID NO:130的HCDR2、(c)SEQ ID NO:131的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:132的LCDR1、(e)SEQ IDNO:133的LCDR2及(f)SEQ ID NO:134的LCDR3；
(xi)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:145的HCDR1、(b)SEQ ID NO:146的HCDR2、(c)SEQ ID NO:147的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:148的LCDR1、(e)SEQ IDNO:149的LCDR2及(f)SEQ ID NO:150的LCDR3；
(xii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:161的HCDR1、(b)SEQ ID NO:162的HCDR2、(c)SEQ ID NO:163的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:164的LCDR1、(e)SEQ ID NO:165的LCDR2及(f)SEQ ID NO:166的LCDR3；
(xiii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:177的HCDR1、(b)SEQ ID NO:178的HCDR2、(c)SEQ ID NO:179的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:180的LCDR1、(e)SEQ ID NO:181的LCDR2及(f)SEQ ID NO:182的LCDR3；
(xiv)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:210的HCDR1、(b)SEQ ID NO:211的HCDR2、(c)SEQ ID NO:212的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:213的LCDR1、(e)SEQ ID NO:214的LCDR2及(f)SEQ ID NO:215的LCDR3；及
(xv)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:226的HCDR1、(b)SEQ ID NO:227的HCDR2、(c)SEQ ID NO:228的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:229的LCDR1、(e)SEQ IDNO:230的LCDR2及(f)SEQ ID NO:231的LCDR3。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其包含:
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:205，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:206；
(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:109，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:110；
(iii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:13，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:14；
(iv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:29，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:30；
(v)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:45，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:46；
(vi)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:61，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:62；
(vii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:77，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:78；
(viii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:93，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:94；
(ix)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:125，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:126；
(x)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:141，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:142；
(xi)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:157，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:158；
(xii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:173，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:174；
(xiii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:189，及轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO:190；
(xiv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:222，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:223；及
(xv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:238，及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:239。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其进一步包含与降低的效应物功能对应的经修饰Fc区。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中经修饰Fc区包含选自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A及L235A中的一个或多个的突变。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中经修饰Fc区选自D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A、及P329G/L234A/L235A。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其包含SEQ ID NO:193的HCDR1、SEQ ID NO:194的HCDR2、SEQ ID NO:195的HCDR3、SEQ ID NO:196的LCDR1、SEQ ID NO:197的LCDR2、SEQ ID NO:198的LCDR3、含有突变D265A/P329A的经修饰Fc区，且其中与IL10相比时，抗体细胞因子嫁接蛋白具有更低的NK细胞激活。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中CDR的结合特异性是对非人靶标。
抗体细胞因子嫁接蛋白，其中抗体细胞因子嫁接蛋白具有比rhIL10半衰期长的半衰期。
分离的核酸，其包含:
(i)重链可变区编码多核苷酸序列SEQ ID NO:246及轻链可变区编码多核苷酸序列SEQ ID NO:247；
(ii)重链编码多核苷酸序列SEQ ID NO:248及轻链编码多核苷酸序列SEQ ID NO:249；
(iii)重链可变区编码多核苷酸序列SEQ ID NO:242及轻链可变区编码多核苷酸序列SEQ ID NO:243；和
(iv)重链编码多核苷酸序列SEQ ID NO:244及轻链编码多核苷酸序列SEQ ID NO:245。
适于产生抗体细胞因子嫁接蛋白的重组宿主细胞，其包含编码该抗体细胞因子嫁接蛋白的重链及轻链多肽及任选分泌信号的核酸。
宿主细胞，其中细胞是哺乳动物细胞。
药物组合物，其包含抗体细胞因子嫁接蛋白及可药用载体。
治疗或预防有需要的个体的免疫相关病症的方法，其包含向该个体施用治疗有效量的抗体细胞因子嫁接蛋白。
方法，其中免疫相关病症选自:炎症性肠病、克隆病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥综合征、白塞病、结节病及移植物抗宿主病(GVHD)。
方法，其中抗体细胞因子嫁接蛋白是与另一治疗剂组合施用。
方法，其中治疗剂是选自以下的抗TNF剂:英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、培舍珠单抗(certolizumab)、戈利木单抗(golimumab)、那他珠单抗(natalizumab)及维多珠单抗(vedolizumab)。
方法，其中治疗剂是选自以下的氨基水杨酸盐物质(agent):柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、5-氨基水杨酸盐(mesalamine)、巴柳氮(balsalazide)、奥沙拉秦(olsalazine)和5-对氨水杨酸(5-aminosalicylic acid)的其他衍生物。
方法，其中治疗剂是选自以下的皮质类固醇:甲泼尼龙(methylprednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone)、布地奈德(budenisonide)、5-氨基水杨酸盐及地塞米松(dexamethasone)。
方法，其中治疗剂是抗细菌剂。
激活有需要的患者中的单核细胞的方法，其包括施用抗体细胞因子嫁接蛋白。
方法，其中单核细胞被激活，且T细胞或NK细胞未被激活。
方法，其中施用抗体细胞因子嫁接蛋白减少TNFα的产生。
抗体细胞因子嫁接蛋白用于治疗免疫相关病症的用途，该抗体细胞因子嫁接蛋白包含:
(i)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:193的HCDR1、(b)SEQ ID NO:194的HCDR2、(c)SEQ ID NO:195的HCDR3和轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:196的LCDR1、(e)SEQ IDNO:197的LCDR2、及(f)SEQ ID NO:198的LCDR3；及(ii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:97的HCDR1、(b)SEQ ID NO:98的HCDR2、(c)SEQ ID NO:99的HCDR3和轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:100的LCDR1、(e)SEQ ID NO:101的LCDR2、及(f)SEQ ID NO:102的LCDR3。
抗体细胞因子嫁接蛋白用作治疗剂用于治疗选自以下的免疫相关病症:炎症性肠病、克隆病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥综合征、白塞病、结节病及移植物抗宿主病(GVHD)。
用途，其中抗体细胞因子嫁接蛋白是与另一治疗剂组合施用。
用途，其中治疗剂是选自以下的抗TNF剂:英利昔单抗、阿达木单抗、塞妥珠单抗、戈利木单抗、那他珠单抗及维多珠单抗。
用途，其中治疗剂是选自以下的氨基水杨酸盐物质:柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸盐、巴柳氮、奥沙拉秦和5-对氨水杨酸的其他衍生物。
用途，其中治疗剂选自以下的皮质类固醇:甲泼尼龙、氢化可的松、泼尼松、布地奈德、5-氨基水杨酸盐及地塞米松。
用途，其中治疗剂是抗细菌剂。
附图简述
图1显示IL10的生物学效应，其作用的细胞类型，以及这些生物效应是抗炎还是促炎。抗体细胞因子嫁接蛋白降低图右侧所示的促炎生物学效应。
图2显示IL10抗体细胞因子嫁接蛋白的结构。插入图描述了插入抗体LCDR1中的单体IL10。深色残基描述了任选掺入抗体细胞因子嫁接蛋白中的示例性Fc修饰。
图3A-3B描述重组人IL10(rhIL10，灰色方块)和IgGIL10M13抗体细胞因子嫁接蛋白(黑色三角形)的体外生物测定结果。图3A说明与通过CD8T细胞测定中的IFNγ诱导测定的rhIL10相比，IgGIL10M13显示降低的促炎活性。使用粒酶-B作为读出度量，在人原代NK细胞，B细胞和肥大细胞上发现了类似的差异活性。图3B说明rhIL10和IgGIL10M13显示出与通过全血测定中TNFα的抑制所测定的相似的抗炎活性。
图4描述用等摩尔量重组人IL10rhIL10(左图)或IgGIL10M13(右图)刺激的人全血中IL10依赖性pSTAT3信号转导的CyTOF分析结果。IL10在单核细胞中诱导抗炎活性；并且T，B或NK细胞的激活诱导促炎细胞因子。通过热图(阴影的变化)描述未受刺激的细胞活性倍数变化的结果。左图表明rhIL10赋予所有IL10敏感细胞类型的刺激(具有轮廓)；然而，如右图所示，IgGIL10M13对T细胞，B细胞和NK细胞的刺激作用较小，其水平与未刺激的细胞相似或略高于未受刺激的细胞；而用IgG-IL10M和rhIL10证明了刺激单核细胞(概述的)和mDC细胞的相似效力。这些相关细胞类型(单核细胞，mDC)是维持炎症性肠病中肠道稳态的关键细胞。
图5A-5D说明抗体细胞因子嫁接蛋白IgGIL10M13在体内测定中的改进特征。图5A-B描述rhIL10和IgGIL10M13的药代动力学研究的结果。静脉内施用后，IgGIL10M13表达出延长的药代动力学(半衰期)，因为抗体细胞因子嫁接蛋白在4.4天后仍可检测到(图5B)，而rhIL10具有约1小时的半衰期(图5A)。图5C和5D描述抗体细胞因子嫁接蛋白的体内活性的药效学测定结果。图5C描述在给药后七十二(72)小时通过pSTAT3信号转导测定的结肠组织中的体内活性。图5D描述与rhIL10相比IgGIL10M13的体内反应的改善的持续时间，如通过施用IgGIL10M13后响应于LPS攻击的TNFα的抑制所测定的。
图6是LPS攻击模型的结果，证明IgGIL10M13在LPS攻击后48小时减少TNFα诱导。
图7是表示IL10抗体细胞因子嫁接蛋白的提高的％CMAX的图。
图8描述当用rhIL10或IgGIL10M13刺激时，来自健康个体和患者的各种免疫细胞中pSTAT3活性的CyTOF数据。
图9A-9C是显示与rhIL10相比，IgGIL10M13在PHA刺激的人全血中具有降低的促炎活性的图示。图9D显示了用rhIL10和IgGIL10M13的滴定实验图。
图10A-10B描述与抗体细胞因子嫁接蛋白的聚集性质相比，当通过接头与Fc缀合时IL10野生型或单体的聚集性质。
图11是ELISA数据，显示IL10抗体细胞因子嫁接蛋白仍然与RSV结合。
图12表示IL10抗体细胞因子嫁接蛋白的作用机制。左图显示正常rhIL10二聚体如何结合IL-10R1，并启动强烈的pSTAT3信号转导。右图描述了植入抗体CDR中的IL10单体如何被限制为与IL-10R1的结合效率较低，从而产生较弱的pSTAT3信号。
图13A-C是嫁接至帕利珠单抗的LCDR1中的IL10单体的晶体结构分辨率。
定义
“抗体”是指包含四聚体结构单位的免疫球蛋白家族的分子。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)，通过二硫键连接。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其转而分别限定免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是任何同种型/类(例如，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)，或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。
轻链和重链均分为结构和功能同源区域。术语“恒定”和“可变”在结构上和功能上使用。每条链的N-端定义约100至110个或更多个氨基酸的可变(V)区或结构域，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指轻链和重链的这些区域。VH和VL配对在一起形成单个抗原结合位点。除了V区，重链和轻链都含有恒定(C)区或结构域。分泌形式的免疫球蛋白C区由三个C结构域CH1、CH2、CH3，任选CH4(Cμ)和铰链区组成。膜结合形式的免疫球蛋白C区还具有膜结构域和胞内结构域。每条轻链在N-端具有VL，接着在其另一端是恒定结构域(C)。轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要生物性质，例如分泌、胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等类似性质。按照惯例，恒定区结构域的编号随其变得更加远离抗体的抗原结合位点或氨基端而增加。N端是可变区且C端是恒定区；CH3及CL结构域实际上分别包含重链及轻链的羧基端结构域。VL与VH对齐(align)，CL与重链的第一个恒定结构域对齐。如本文中使用的，“抗体”包括常规抗体结构和抗体的变体。因此，全长抗体、嵌合抗体和人源化抗体、人抗体、及其抗体片段都在这个概念的范围内。
抗体可以作为完整的免疫球蛋白链存在，或可以作为通过各种肽酶消化产生的充分表征的抗体片段存在。本文所用术语“抗体片段”是指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原表位特异地相互作用(例如由结合、空间阻碍、稳定/去稳定、空间分布)的能力。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下方消化抗体，产生F(ab’)2，即Fab’的二聚体，其自身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab’)2可以在温和条件下还原，以断开铰链区中的二硫键，由此将F(ab’)2二聚体转化成Fab’单体。Fab’单体实质上是具有部分铰链区的Fab。Paul，Fundamental Immunology，第3版(1993)。尽管根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但本领域技术人员将明了这些片段可以通过化学方法或使用重组DNA方法重头合成。如本文中使用的，“抗体片段”是指抗体的一个或多个部分，可以通过完整抗体的修饰来产生，或使用重组DNA方法重头合成，其保留结合特异性和功能活性。抗体片段的实例包括Fv片段、单链抗体(ScFv)、Fab、Fab’、Fd(Vh和CH1结构域)、dAb(Vh和分离的CDR)；和这些片段的具有相同结合特异性的多聚体形式(例如，F(ab’)2)。还可以将抗体片段并入细胞因子嫁接蛋白中，以获得本公开中提供的结合特异性和活性。
本文使用的“Fab”结构域包含重链可变结构域、恒定区CH1结构域、轻链可变结构域和轻链恒定区CL结构域。这些结构域的相互作用可以通过CH1和CL结构域之间的二硫键稳定。在一些实施方案中，Fab的重链结构域按顺序从N-末端至C-末端为VH-CH，Fab的轻链结构域按顺序从N-末端至C-末端为VL-CL。在一些实施方案中，Fab的重链结构域按顺序从N-末端至C-末端为CH-VH，Fab的轻链结构域按顺序为CL-VL。尽管Fab在历史上通过完整免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化而获得鉴定，但在本公开中，典型地可以通过任何方法重组产生“Fab”。就抗原结合而言，每个Fab片段是单价的，即，其具有单个抗原结合位点。
“互补性决定结构域”或“互补性决定区(“CDR”)”可互换来指VL和VH的超变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合部位，具有针对该靶蛋白的特异性。在每个人VL或VH中各有三个CDR(CDR1-3，从N-末端按顺序编号)，占可变区的约15-20％。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并且因此直接负责结合特异性。VL或VH的剩余序列，称为框架区(FR)，在氨基酸序列中呈现较少变化(Kuby，Immunology，第4版，第4章，W.H.Freeman&Co.，New York，2000)。
可以使用本领域各种公知的定义来确定CDR和框架区的位置，例如，Kabat，Chothia，国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)和AbM(参见，例如，Johnson等，Nucleic AcidsRes.,29:205-206(2001)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196:901-917(1987)；Chothia等，Nature,342:877-883(1989)；Chothia等，J.Mol.Biol.，227:799-817(1992)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.，273:927-748(1997))。以下也描述了抗原结合位点的定义:Ruiz等，Nucleic Acids Res.,28:219–221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等，J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)；Martin等，Methods Enzymol.，203:121-153(1991)；和Rees等，见Sternberg M.J.E.(编辑)，Protein Structure Prediction(蛋白结构预测)，牛津大学出版社，Oxford，141-172(1996)。
根据Kabat，VH中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸残基编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，人VH中CDR由氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)组成，人VL中CDR由氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。
如本文中使用的“抗体可变轻链”或“抗体可变重链”是指分别包含VL或VH的多肽。内源性VL由基因区段V(可变)和J(连接)编码，而内源性VH由V、D(多样性)和J编码。每个VL或VH各包括CDR以及框架区(FR)。术语“可变区”或“V区”可互换地指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重链或轻链。V区可自然出现、重组或合成。在本申请中，抗体轻链和/或抗体重链有时可以统称为“抗体链”。如本文所提供和进一步阐述的，“抗体可变轻链”或“抗体可变重链”和/或“可变区”和/或“抗体链”任选地包含嫁接至CDR中的细胞因子多肽序列。
如本文所公开的，包含例如CH2和CH3结构域的免疫球蛋白重链的C-端部分是“Fc”结构域。如本文中使用的“Fc区”是指抗体的恒定区，不包括第一恒定区(CH1)免疫球蛋白结构域。Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及在这些结构域的N-端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ之间的铰链。在本领域中，将理解Fc区的边界可以变化，然而，使用根据Kabat等(1991，NIH Publication 91-3242，National Technical Information Service，Springfield，Va.)中的EU指数进行编号，通常人IgG重链Fc区被定义为包含残基C226或P230至其羧基-末端。“Fc区”可以指分离的该区域或存在于抗体或抗体片段中的该区域。“Fc区”包括Fc区的天然等位基因变体(例如，在CH2和CH3区域中)、包括例如调节效应子功能的修饰。Fc区还包括不导致生物功能改变的变体。例如，从免疫球蛋白的Fc区的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸，而基本上不丧失生物功能。例如，在某些实施方案中，C-末端赖氨酸被修饰而替代或去除。在某些实施方案中，改变或去除Fc区中的一个或多个C-末端残基。在某些实施方案中，缺失Fc中的一个或多个C-末端残基(例如，末端赖氨酸)。在某些其他实施方案中，Fc中的一个或多个C-末端残基被其他氨基酸(例如，末端赖氨酸被置换)取代。根据本领域已知的一般规则来选择这样的变体，以对活性具有最小的影响(参见，例如，Bowie等，Science 247:306-1310，1990)。Fc结构域是细胞受体(例如，FcR)所识别的免疫球蛋白(Ig)的部分，并且补体激活蛋白C1q与其结合。在CH2外显子的5’部分中编码的下铰链区提供了抗体内用于结合FcR受体的灵活性。
“嵌合抗体”是这样的抗体:其中(a)恒定区，或其部分，被改变、置换、或交换，从而使抗原结合位点(可变区)连接至类别、效应子功能和/或物种不同或改变的恒定区、或连接至可以赋予嵌合抗体新特性的完全不同分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子和药物；或(b)可变区，或其部分，被改变、替换或交换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性(例如，结合特异性、活性)同时在人体中具有较低免疫原性的抗体。例如，这可以通过保留非人CDR区并用人对应物替代剩余的抗体部分来实现。参见，例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44:65-92(1988)；Verhoeyen等，Science，239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)。
“人抗体”包括具有可变区的抗体，在该可变区中框架区和CDR区都衍生自人来源的序列。此外，若抗体含有恒定区，则该恒定区也衍生自这些人序列，如人种系序列、或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体(例如，如Knappik等人，J.Mol.Biol.296:57-86,2000中所阐述)。人抗体可包括并非由人序列编码的氨基酸残基(例如由体外随机诱变或定点诱变或由体内体细胞突变引入的突变、或用于促进稳定性或制备的保守取代)。
术语“相应的人种系序列”是指这样的核酸序列，所述核酸序列编码的人可变区氨基酸序列或子序列，与人种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其他已知可变区氨基酸序列相比，与参照可变区氨基酸序列或子序列具有最高的确定氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以指，与所有其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参照可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以是仅仅框架区、仅仅互补决定区、框架和互补性决定区、可变区段(如上定义的)，或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文中描述的方法来确定序列同一性，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域已知的其他比对算法来比对两个序列。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参照可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。可以通过公众可利用的国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)和V-数据库上，确定相应的人种系序列。
本文中使用的术语“价”是指多肽中的潜在靶结合位点的数量。每个靶结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的特定位点。多肽包含一个以上靶结合位点时，每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以结合不同的分子，例如，不同的抗原，或同一分子上的不同表位)。例如，常规抗体具有两个结合位点且是二价的；“三价”和“四价”指在抗体分子中分别存在三个结合位点及四个结合位点。抗体细胞因子嫁接蛋白可为单价(即，结合一个靶标分子)、二价或多价(即，结合一个以上靶标分子)。
短语“特异性结合”或“结合特异性”，在描述原始抗体靶标(例如抗原)与抗体细胞因子嫁接蛋白和细胞因子嫁接之前和之后的相互作用中使用。在一定的指定免疫试验条件下，具有特定结合特异性的抗体细胞因子嫁接蛋白与其原始靶标的结合至少两倍于背景，并且基本上不明显结合样品中存在的其他靶标。在一个实施方案中，在指定的条件下，具有特定结合特异性的抗体细胞因子嫁接蛋白与其原始靶标的结合至少十(10)倍于背景，并且基本上不明显结合样品中存在的其他靶标。在这样的条件下，与抗体细胞因子嫁接蛋白的特异性结合可能需要抗体细胞因子嫁接蛋白已经针对其对特定靶的特异性进行过选择。用于确定结合特异的方法是，例如，固相ELISA免疫试验常规用于选择与蛋白质具有特异性免疫反应的抗体(对于可以用于确定特定的免疫反应性的免疫试验形式和条件的描述参见例如，Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998))。
在本文所用，“细胞因子受体结合特异性”或“细胞因子受体特异性”包括选择性结合IL10R受体的抗体细胞因子嫁接蛋白，且不包括与其他细胞因子受体超家族成员交叉作用的细胞因子。在一些实施方案中，选择选择性结合人IL10R且与非人类灵长类动物IL10R(例如，食蟹猴IL10R)交叉反应的抗体细胞因子嫁接蛋白。在一些实施方案中，选择选择性结合人IL10R的抗体嫁接蛋白。
术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1，M-1)。可以使用本领域任何已知方法来测定平衡解离常数。本公开的抗体细胞因子嫁接蛋白通常将具有小于约10-7或10-8M的平衡解离常数，例如，小于约10-9M或10-10M，在一些实施方案中，小于约10-11M、10-12M或10-13M。
术语“IL10”或“白细胞介素10”或“白细胞介素-10(IL-10)”可互换地指有效的抗炎细胞因子，其能够下调巨噬细胞的激活并减少抗原呈递和树突状细胞的成熟。包含全长天然人残基19-178的IL10用于构建激动剂抗体细胞因子嫁接蛋白。如本文所公开的人IL10在其全长上与GenBank登录号No:NP_000563的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。编码IL10蛋白的人IL10核酸在其全长上与GenBank登录号No:NM_000572发表的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
“单体IL10”或“IL10M”是指分子，其与SEQ ID NO:209的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，单体IL10分子包含SEQ ID NO:209的序列。在一些实施方案中，单体IL10分子由SEQ ID NO:209的序列组成。
术语“激动剂”是指能够激活受体以诱导全部或部分受体介导的应答的抗体细胞因子嫁接蛋白。例如，IL10R激动剂结合IL10R并诱导IL10R介导的细胞内信号传导和/或细胞激活。抗体细胞因子嫁接蛋白刺激通过IL10R的信号传导，在某些方面与天然配体人IL10类似。hIL10与IL10R的结合由于IκB降解，诱导NFκB激活。在一些实施方案中，可通过以下能力鉴别抗体细胞因子嫁接蛋白激动剂:结合IL10R并诱导STAT3磷酸化，抑制促炎细胞因子(例如TNFα，IL1，IL6，IL12，IFNγ)的产生，和/或分化和增殖巨噬细胞；诱导T细胞(例如CD8+CTL或CD4+Th细胞)增殖、存活、细胞溶解活性和/或细胞因子产生(例如，IFNγ，IL10，IL-13，TNFα)或如本文别处描述的能力。
应用于核酸或蛋白时，术语“分离的”表示，核酸或蛋白基本上不含天然状态下与其结合的其他细胞组分。优选是均质状态的。其可以是干的或水溶液。通常使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱，来测定纯度和均质性。作为制备物中的主要物质存在的蛋白是基本上纯化的。特别地，分离的基因与位于该基因两侧并且编码目标基因以外的其他蛋白的开放阅读框分开。术语“纯化的”表示，核酸或蛋白在电泳凝胶上基本上只产生一个条带。特别地，其表示核酸或蛋白为至少85％纯，更优选至少95％纯和最优选至少99％纯。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单-或双-链形式的聚合物。除非另外指出，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其与参照核酸具有相似的结合特性并且以类似于天然核苷酸的方式代谢。除非另外指出，否则一个具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体地，可以通过产生其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，来实现简并密码子置换(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换表示氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然的氨基酸聚合物和非天然的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然的和合成的氨基酸，以及以天然氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸、以及之后修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基础化学结构的化合物，即，结合氢、羧基基团、氨基基团和R基团的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构但以天然氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。
“保守修饰的变体”对氨基酸和核酸序列都适用。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上相同的序列。由于遗传密码子的简并性，任何给定的蛋白都可以由多个功能上相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个被密码子规定为丙氨酸的位置，可以将该密码子改变成所述任何相应密码子，而不改变编码的多肽。这样的核酸变体是“沉默变体”，其是保守修饰变体的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述核酸的每个可能的沉默变体。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是编码甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是编码色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，在每个描述的序列中都隐含了编码多肽的核酸的每个沉默变体。
关于氨基酸序列，本领域技术人员将意识到，“保守修饰变体”是对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的置换、删除或添加，从而在编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小比例的氨基酸，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域公知的。这样的保守性修饰变体是的多态变体、种间同源物和等位基因以外的变体，并且不排除多态变体、种间同源物和等位基因。以下八组各自含有互为保守性置换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。
通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中为了两个序列的最佳比对，与不包含添加或删除的参照序列(例如，多肽)相比，比较窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加或删除(即，缺口)。该百分比通过如下计算:确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量来产生匹配位置的数量，以匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100来产生序列同一性百分比。
与两个或更多个核酸或多肽序列相关的术语“相同”或百分比“同一性”是指，两个或更多个序列或子序列是相同序列。当使用以下序列比较算法之一或通过人工比对和目视观察测定，在比较窗口或指定区域中为最大对应性而进行比较和比对时，如果两个序列具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定的区域中，或在没有指定时，在参照序列的整个序列上，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。本公开提供分别与本文中示例的多肽或多核苷酸(例如，SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:189、SEQ IDNO:190、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206；SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239任一个中示例的可变区；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:79、SEQID NO:80、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ IDNO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241任一个中示例的可变区；SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ IDNO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:238和SEQ ID NO:239任一个中示例的CDR)基本上相同的多肽或多核苷酸。任选地，同一性存在于至少约15、25或50个核苷酸长的区域上，或更优选存在于100至500或1000个或更多个核苷酸长的区域上，或全长参照序列上。关于氨基酸序列，同一性或实质上的同一性可以存在于至少5、10、15或20个氨基酸长度，任选至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸长度，任选至少约150、200或250个氨基酸长度的区域上，或全长参照序列上。对于较短的氨基酸序列，例如，20或更少氨基酸的氨基酸序列，当一个或两个氨基酸残基根据本文中定义的保守性置换被保守性置换时，存在实质上的同一性。
对于序列比较，通常一个序列作为参照序列，测试序列与其进行比较。使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机中，如果需要，随后指定子序列的坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定替换的参数。基于程序参数，序列比较算法随后计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。
如本文中使用的，“比较窗口”包括，具有选自20至600，通常约50至约200，更常见约100至约150的任一连续位置数的区段，在所述窗口中序列可以与具有相同连续位置数的参照序列在两个序列最佳对齐后进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。例如，可以通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI)，或通过人工比对和目视观察(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995年增补)，进行用于比较的序列的最佳比对。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的两个算法实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1977)，Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)，J.Mol.Biol.215:403-410。用于进行BLAST分析的软件可以通过National Centerfor Biotechnology Information公开获得。该算法涉及:首先通过鉴定查询序列中字长W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，其中所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一定的正值阈值分数T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等，上引文)。这些初始的相邻字命中物作为种子用于启动搜索，以发现含有它们的较长HSP。字命中物沿着每个序列在两个方向延伸，只要累积比对得分可以增加即可。对于核苷酸序列，使用参数M(给予一对匹配残基的奖励分；总是>0)和N(给予错配残基的罚分；总是<0)，计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当:累积比对得分从其最大获得值下降数量X；由于累积一个或多个负评分残基比对，累积得分变为零或低于零；或达到任一个序列的末端时，停止字命中物在各方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)以11的字长(W)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4和双链比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP参数使用3的字长和10的期望值(E)以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)，50的比对(B)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4和双链比较，作为缺省值。
BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。一种由BLAST算法提供的相似性量度是最小和概率(P(N))，其指示两个核苷酸或氨基酸序列之间碰巧发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参照核酸比较中的最小和概率为小于约0.2，更优选小于约0.01和最优选小于约0.001，则认为核酸与参照序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的一个指示是，由第一个核酸编码的多肽与针对第二个核酸编码的多肽产生的抗体具有免疫上的交叉反应，如下文所述。因此，例如当多肽与第二多肽的差异仅在于保守性置换时，两个肽通常基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子或其互补物在严格条件下彼此杂交，如下文所述。两个核苷酸序列基本上相同的再一个指示是，可以使用相同引物来扩增该序列。
术语“抗体细胞因子嫁接蛋白”或“抗体细胞因子嫁接物”或“嫁接”是指至少一种细胞因子直接掺入抗体的CDR内、中断CDR的序列。细胞因子可以并入HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3中。细胞因子可以掺入HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3中、并且向着CDR的N-端序列或向着CDR的C-端序列掺入。掺入CDR内的细胞因子可降低抗体部分与其靶蛋白的特异性结合，或抗体细胞因子嫁接蛋白可保持其与其靶蛋白的特异性结合。
“免疫相关病症”或“免疫疾病”是指免疫系统功能障碍，其中身体自身的免疫系统攻击健康组织。功能障碍可能在免疫细胞的成分中，并且包括活性过度及活性不足的免疫系统。
术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换表示哺乳动物，例如，人或非人灵长类哺乳动物。哺乳动物也可以是实验室哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠。在一些实施方案中，哺乳动物可以是农业哺乳动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼)或家养哺乳动物(例如，犬、猫)。
如本文中使用的，在一个实施方案中，对于任何疾病或病症，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指减轻疾病或病症(即，减缓或停止或减少疾病的发展或其至少一个临床症状)。在另一个实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指缓解或减轻至少一个身体参数，包括患者不可辨别的那些参数。在再另一个实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)，或两者上调节疾病或病症。在再另一个实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“预防(prophylaxis)”是指防止或延迟疾病或病症的发作或发展或进展。
术语“治疗上可接受的量”或“治疗有效剂量”可互换表示足以实现所需结果(即，减小炎症，抑制疼痛，防止炎症，抑制或防止炎症反应)的量。在一些实施方案中，治疗上可接受的量不诱导或导致不想要的副作用。可以通过首先施用低剂量，并且随后逐渐递增剂量直至实现所需效果，来确定治疗上可接受的量。IL10抗体细胞因子嫁接蛋白的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别防止疾病症状的发作或导致疾病症状严重性的降低，所述疾病症状包括免疫相关病症的症状。
术语“共施用”是指两种(或更多种)活性剂同时存在于个体中。共施用的活性剂可以同时或相继递送。
如本文中使用的，短语“基本上由……组成”是指，包括在方法或组合物中的上位或下位概念的活性药剂、以及用于方法或组合物的预期目的的任何无活性载体或赋形剂。在一些实施方案中，短语“基本上由……组成”明确排除包含除IL10抗体细胞因子嫁接蛋白的以外的一种或多种其他的活性剂。在一些实施方案中，短语“基本上由……组成”明确排除包含除IL10抗体细胞因子嫁接蛋白和第二共施用药剂之外的多种其他活性剂。
除非上下文另有明确指示，否则术语「一(a、an)」及「该」包括复数个指示物。
发明详述
IL10抗体细胞因子嫁接蛋白
白细胞介素-10(IL10)是具有免疫刺激活性和免疫抑制活性的多功能同型二聚体免疫调节细胞因子。IL10抑制激活的单核细胞和巨噬细胞中许多促炎细胞因子的诱导，但是它是未成熟和成熟淋巴细胞，肥大细胞和B细胞的共刺激剂(综述于Mosmann,Adv.Immunol.1994；56:1-26；Moore等人，Annu Rev Immunol.2001；19:683-765中)。本文提供了包含嫁接至抗体的互补决定区(CDR)中的单体IL10的抗体细胞因子嫁接蛋白。抗体细胞因子嫁接蛋白显示出适用于人类患者的特性，例如，它们保留与天然或重组人IL10类似的免疫抑制活性，但是促炎效应降低。
因此，本公开提供了抗体细胞因子嫁接蛋白，其是IL10受体的激动剂，具有选择性活性特性。提供的抗体细胞因子嫁接蛋白包含免疫球蛋白重链序列和免疫球蛋白轻链序列。每个免疫球蛋白重链序列包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，其中重链恒定区由CH1、CH2和CH3恒定区组成。每个免疫球蛋白轻链序列包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。在每种抗体细胞因子嫁接蛋白中，将单体IL10分子嫁接入VH或VL区的互补决定区(CDR)中。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含嫁接至重链CDR中的单体IL10。在某些实施方案中单体IL10是嫁接至重链互补决定区1(HCDR1)中。在某些实施方案中单体IL10是嫁接至重链互补决定区2(HCDR2)中。在某些实施方案中单体IL10是嫁接至重链互补决定区3(HCDR3)中。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含嫁接至轻链CDR中的单体IL10。在某些实施方案中单体IL10嫁接至轻链互补决定区1(LCDR1)中。在某些实施方案中单体IL10嫁接至轻链互补决定区2(LCDR2)中。在某些实施方案中单体IL10嫁接至轻链互补决定区3(LCDR3)中。在优选实施方案中，单体IL10嫁接至轻链互补决定区1(LCDR1)中。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含嫁接至CDR中的单体IL10，其中将IL10序列插入CDR序列。嫁接的IL10可在CDR的N-端部分处或附近，在CDR的中间区或在CDR的C-端部分处或附近。在其他实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含嫁接至CDR的单体IL10，其中IL10序列替代所有或一部分CDR序列。替代可在CDR的起始处或附近，在CDR的中间区或在CDR的末端处或附近。替代可少至CDR序列的一或两个氨基酸，或多达整个CDR序列。
在一些实施方案中，将单体IL10直接嫁接至没有肽接头的CDR中。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含IgG类抗体重链的免疫球蛋白重链。在某些实施方案中，IgG重链是IgG1、IgG2或IgG4亚类中的任何一个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含选自已知的临床使用的免疫球蛋白序列的重链和轻链免疫球蛋白序列。在某些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含为人源化序列的重链和轻链免疫球蛋白序列。在其他某些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含为人序列的重链和轻链免疫球蛋白序列。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含选自种系免疫球蛋白序列的重链和轻链免疫球蛋白序列。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列，抗体细胞因子嫁接蛋白包含重链和轻链免疫球蛋白序列，其具有免疫球蛋白可变结构域与不同于IL10单体的细胞因子受体结合特异性的靶标的结合特异性。在一些实施方案中，免疫球蛋白可变结构域的结合特异性在嫁接的细胞因子存在下保留。在某些实施方案中，抗体结合特异性针对非人抗原。在其他实施方案中，结合特异性针对与IL10疗法联合具有治疗效用的靶标。在某些实施方案中，调节免疫球蛋白的结合特异性将额外的治疗益处传递给IL10组分。在某些实施方案中，免疫球蛋白的结合特异性与IL10单体传递协同活性。
在其他实施方案中，免疫球蛋白的结合特异性因IL10嫁接细胞因子的存在而减小。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白赋予类似于人IL10或重组人IL10的抗炎特性，并且与人IL10或重组人IL10相比，嫁接蛋白赋予降低比例的促炎活性。在一些实施方案中，与IL10相比，比例促炎症活性降低至少百分之二十五(25％)。在一些实施方案中，与IL10相比，比例促炎症活性降低至少百分之三十五(35％)。在一些实施方案中，与IL10相比，比例促炎症活性降低至少约百分之五十(50％)。在一些实施方案中，与IL10相比，比例促炎症活性降低至少约百分之六十五(65％)。在一些实施方案中，与IL10相比，比例促炎症活性降低至少约百分之七十五(75％)。在一些实施方案中，与IL10相比，比例促炎活性降低至少约百分之八十(80％)。在一些实施方案中，与IL10相比，比例促炎症活性降低超过百分之八十(80％)。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含经修饰的免疫球蛋白IgG，该IgG具有赋予改变的效应子功能的经修饰的Fc。在某些实施方案中，经修饰的Fc区包含选自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A和L235A中的一种或多种的突变。在具体的实施方案中，免疫球蛋白重链可以包含赋予降低的效应子功能的突变或突变组合，所述突变或突变组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234A/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:13的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:14的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:29的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:30的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:45的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:46的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:61的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:62的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:77的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:78的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:93的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:94的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含各自包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:109的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:110的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:125的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:126的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:141的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:142的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:157的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:158的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:173的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:174的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:189的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:190的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:205的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:206的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:222的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:223的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链可变区，其与SEQ ID NO:238的重链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链可变区，其与SEQ ID NO:239的轻链可变区具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。免疫球蛋白链是选自IgG1、IgG2或IgG4的IgG类。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:15具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:16具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:31具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:32具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:47具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:48具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:63具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:64具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:79具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:80具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:95具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:96具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:111具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:112具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:127具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:128具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:143具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:144具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:159具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:160具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:175具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:176具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:191具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:192具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:207具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:208具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A及P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:224具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:225具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含(i)重链，其与SEQ ID NO:240具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性和(ii)轻链，其与SEQ ID NO:241具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链任选包含赋予降低的效应物功能的突变或突变组合，该突变或突变体组合选自D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A中的任意个。
经改造和修饰的抗体细胞因子嫁接蛋白
通过将单体IL10序列嫁接至免疫球蛋白支架的CDR区中，产生抗体细胞因子嫁接蛋白。产生重链和轻链免疫球蛋白链，以产生最终的抗体嫁接蛋白。抗体细胞因子嫁接蛋白赋予IL10优选的治疗性抗炎特性；然而，与天然或重组人IL10(rhIL10)相比，抗体细胞因子嫁接蛋白具有降低的比例促炎症活性。
为了改造嫁接构建体，将包含全长IL10的残基19-178和残基134和135之间的六氨基酸序列的单体IL10(IL10M，SEQ ID NO:209)嫁接至免疫球蛋白支架的CDR环中。可以使用已经用于临床情况的多种已知免疫球蛋白序列、目前发现和/或临床开发中已知的免疫球蛋白序列、人种系抗体序列以及新型抗体免疫球蛋白链的序列中的任意种制备经嫁接的构建体。使用标准分子生物学方法，采用编码相关序列的重组DNA来产生抗体细胞因子嫁接蛋白。两个示例性支架中的IL10M序列称为GFTX1和GFTX3，并在表1中描述。根据可用的结构或同源性模型数据选择用于IL10单体的插入点作为环的中点，然而，插入点可以调整到CDR环的一端或另一端。
因此，本公开提供细胞因子受体特异性结合IL10R蛋白的抗体细胞因子嫁接蛋白或其片段，其包含重组插入异源抗体蛋白或多肽中以产生抗体细胞因子嫁接蛋白的IL10M蛋白。特别地，本公开提供嫁接蛋白，其包含本文中所述抗体或抗体的抗原结合片段或任意其他相关支架抗体多肽(例如，全长免疫球蛋白蛋白质、Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域、VL CDR等)和异源细胞因子蛋白、多肽或肽，例如IL10M。用于将蛋白质、多肽或肽与抗体或抗体片段缀合的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利No.5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利No.EP 307,434和EP 367,166；国际公开WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539；Zheng等，1995,J.Immunol.154:5590-5600；和Vil等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341。此外，通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总称为“DNA改组”)技术，可以产生抗体细胞因子嫁接蛋白。DNA改组可以用于制备抗体细胞因子嫁接蛋白和/或改变抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和性和较低离解速率的抗体或其片段)。一般参见，美国专利No.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等，1999,J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-313(这些专利和出版物均引入作为参考)。可以在重组前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变抗体或其片段，或编码的抗体或其片段。编码特异性结合目的抗原蛋白的抗体或其片段的多核苷酸可以与一个或多个异源细胞因子(例如IL10M)的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组，以制备如本文提供的抗体细胞因子嫁接蛋白。
抗体Fab含有六个CDR环，3个在轻链中(CDRL1、CDRL2、CDRL3)且3个在重链中(CDRH1、CDRH2、CDRH3)，这些环可用作细胞因子蛋白的潜在插入位点。考虑结构及功能上的考量以便确定将细胞因子插入哪个CDR环。由于CDR环大小及构象随不同抗体变化很大，故可针对每一具体抗体/蛋白组合凭经验确定供插入的最佳CDR。另外，由于细胞因子蛋白将插入CDR环中，故可对细胞因子蛋白的结构施加额外约束。例如，细胞因子蛋白的氨基及羧基末端应容许在空间上约束而相对接近(约)的可能性。另外，抗体细胞因子嫁接蛋白的生物活性不应依赖于寡聚。
IL10是采用结构域交换结构(domain swapped architecture)的同型二聚体细胞因子。天然形式中，IL10无法适于抗体嫁接，因为无法形成结构域交换结构(即N端及C端均约束在环中)。然而，由于在螺旋D与E之间插入6残基序列((GGGSGG)(SEQ ID NO.251))产生的经改造单体IL10(IL10M)容许螺旋E及F(其交换至天然二聚体结构中的其他IL10单体中)回折至相同单体中(参见Josephson等人J.Biol.Chem.2000；275(18)13552-7)并产生抗体细胞因子嫁接蛋白中所存在的结构，如图2和图13所示。Josephson等人证实具有六个氨基酸插入的IL10单体较野生型二聚体更热稳定且还能够与IL10受体链α(IL10R1)形成1:1相互作用。IL10M也具有活体外活性，尽管其活性较野生型IL10小于9倍至18倍。IL10M的另一特征为N末端及C末端在空间上彼此接近，此使得经修饰细胞因子蛋白适于抗体嫁接。
另外可使用具有本文(例如，表1)所显示的CDR和/或VH和/或VL序列中的一个或多个的抗体作为起始材料来改造经修饰抗体细胞因子嫁接蛋白，来制备本发明抗体细胞因子嫁接蛋白(具有与起始抗体不同的性质)。备选地，可利用任何已知抗体序列作为支架来改造经修饰抗体细胞因子嫁接蛋白。例如，可利用在临床上使用的任意已知抗体作为起始材料支架来制备抗体嫁接蛋白。已知的抗体及相应免疫球蛋白序列包括(例如)帕利珠单抗(palivizumab)、阿里罗单抗(alirocumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼沃鲁单抗(nivolumab)、地土昔单抗(dinutuximab)、西库努单抗(secukinumab)、埃罗库单抗(evolocumab)、布利莫单抗(blinatumomab)、派姆单抗(pembrolizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、维多珠单抗、司妥昔单抗(siltuximab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab),帕妥珠单抗(pertuzumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、地诺单抗(denosumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、卡那单抗(canakinumab)、戈利木单抗、优特克单抗(ustekinumab)、培舍珠单抗、卡妥索单抗(catumaxomab)、依库珠单抗(eculizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、那他珠单抗、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、依法利珠单抗(efalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、阿达木单抗、阿伦单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、英利昔单抗、巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿昔单抗(abciximab)、莫罗单抗(muromonab)或其修饰物。已知抗体及免疫球蛋白序列也包括种系抗体序列。框架序列可从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献获得。例如，人重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可参见“VBase”人种系序列数据库，以及Kabat,E.A.,等人，1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号；Tomlinson,I.M.,等人，1992J.fol.Biol.227:776-798；及Cox,J.P.L.等人，1994Eur.J Immunol.24:827-836。还有其他实例中，来自可能处于早期发现和/或药物研发中的其他已知实体的抗体及相应免疫球蛋白序列可类似地改造作为起始材料来改造经修饰抗体细胞因子嫁接蛋白。
可使用众多种抗体/免疫球蛋白框架或支架，只要所产生的多肽包括至少一个适合插入细胞因子(例如，IL10M)的结合区即可。这样的框架或支架包括5种主要独特型的人免疫球蛋白或其片段，且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化和/或人方面。本领域技术人员继续发现并开发新的抗体、框架、支架及片段。
可使用本领域已知的方法产生抗体。为了制备单克隆抗体，可以使用本领域已知的任何技术(例如，参见Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等人，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,第77页至第96页.Alan R.Liss,Inc.1985)。产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号)可适于产生用于本公开的抗体细胞因子嫁接蛋白中的抗体。而且，转基因小鼠或其他生物体如其他哺乳动物可用于表达和鉴定灵长类或人源化或人抗体。备选地，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合用于抗体细胞因子嫁接蛋白的选定抗原的抗体和异源Fab片段。(例如参见McCafferty等人，上文文献；Marks等人，Biotechnology,10:779-783,(1992))。
用于灵长类化或人化非人抗体的方法为本领域熟知。通常，灵长类化或人化抗体将来自非灵长类动物或非人来源的一或更多个氨基酸残基引入其中。这样的非灵长类动物或非人氨基酸残基通常称为引入残基，其通常取自引入可变结构域。人化可基本上遵循Winter及同事的方法(例如，参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988)及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。因此，这些人化抗体为嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中实质上少于一个完整人可变结构域已由来自非人物种的相应序列所取代。实际上，灵长类化或人化抗体通常是其中一些互补决定区(“CDR”)残基及可能的一些框架(“FR”)残基由来自起源物种(例如，啮齿类动物抗体)中的类似位点的残基取代以赋予结合特异性的灵长类动物或人抗体。
备选或另外，可利用在抗体中用人可变区替代非人抗体可变区同时相对于非人抗体维持相同结合特征或提供更好结合特征的体内方法将非人抗体转化至经改造的人抗体中。例如参见美国专利公开案第20050008625号、美国专利公开案第2005/0255552号。备选地，可通过顺序盒式替代来生成人V段文库，其中最初由人序列的文库替代仅一部分的参考抗体V段；且在残余参考抗体氨基酸序列的背景下支持结合的经鉴定的人“盒”然后在另一文库筛选中重组以完全生成人V段(参见美国专利公开案第2006/0134098号)。
用于制备抗体细胞因子嫁接蛋白的各种抗体或抗原结合片段可由完整抗体的酶修饰或化学修饰来产生，或使用重组DNA方法来从头合成(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库来鉴定(例如，参见McCafferty等人，Nature 348:552-554,1990)。例如，可使用本领域所述的方法生成微小抗体(minibody)，例如，Vaughan及Sollazzo,Comb Chem HighThroughput Screen.4:417-302001。可由各种方法(包括杂交瘤嫁接或Fab'片段连接)产生双特异性抗体。例如参见Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。可使用噬菌体展示文库或核糖体展示文库、基因改组文库鉴定单链抗体。这样的文库可以由合成的、半合成的或天然的和免疫活性的来源构建。因此所选择的免疫球蛋白序列可用于制备本文提供的抗体细胞因子嫁接蛋白。
用于本公开中的抗体或抗原结合分子进一步包括双特异性抗体。双特异性或双功能性抗体是具有两个不同重链/轻链对及两个不同结合位点的人工杂合抗体。其他抗原结合片段或抗体部分包括二价scFv(双抗体)、抗体分子识别两个不同表位的双特异性scFv抗体、单一结合结构域(dAb)及微小抗体。可利用所选免疫球蛋白序列制备如本文所提供的抗体细胞因子嫁接蛋白。
抗体的抗原结合片段(例如Fab片段，scFv)可以用作构建抗体细胞因子嫁接蛋白的结构单元，并且任选地包括多价格。在一些实施方案中，此类多价分子包含抗体的恒定区(例如Fc)。
可通过修饰抗体的一个或两个可变区(即VH和/或VL)内的一个或多个残基(例如在一个或多个CDR区内)来改造抗体细胞因子嫁接蛋白，并且此类改造的VH和/VL区序列用于掺入细胞因子，用来制备抗体细胞因子嫁接蛋白。一种可以进行的可变区改造是CDR嫁接。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原相互作用。出于此原因，在各个抗体间的CDR内氨基酸序列比CDR外的序列更加多样化。CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，有可能通过构建表达载体来表达模拟特定抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括来自特异性抗体的CDR序列，该特异性抗体嫁接至具有不同特性的不同抗体的构架序列上(例如，参见Riechmann,L.等人，1998Nature332:323-327；Jones,P.等人，1986Nature321:522-525；Queen,C.等人，1989Proc.Natl.Acad.U.S.A.86:10029-10033；颁予Winter的美国专利第5,225,539号及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号及第6,180,370号)。在某些情况下，突变构架区内的残基以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(例如参见颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号及第6,180,370号)。
在一些方面，使VH和/或VL、CDR1，CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)，称为“亲和力成熟”，可以是有益的，例如，优化与细胞因子嫁接蛋白背景结合的抗体的抗原结合。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可以如本文所述和实施例中提供的在体外或体内测定法和/或在领域已知的和/或备选或其他测定法来评估对抗体结合或目的其他功能性质的影响。可以引入保守修改。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。而且，CDR区内通常不超过1、2、3、4或5个残基被改变。
经改造的抗体或抗体片段包括那些已对VH和/或VL内的框架残基进行修饰，例如，以改良抗体特性。在一些实施方案中，进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或更多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地，经过体细胞突变的抗体含有与衍生出该抗体的种系序列不同的框架残基。此类残基可由比较抗体框架序列与衍生出该抗体的种系序列来鉴定。为使框架区序列返回至其种系构型，可由(例如)定点诱变将体细胞突变“回复突变”成种系序列。此类“回复突变的”抗体也意在由本公开所涵盖。另一框架修饰涉及使框架区内、或甚至一个或更多CDR区内的一个或更多残基突变，以去除T细胞表位，以此降低抗体的潜在免疫原性。此方法也称作“去免疫化”且进一步详细阐述于Carr等人的美国专利公开第2003/0153043号中。
用于制备抗体细胞因子嫁接蛋白的抗体或抗体片段的恒定区可以是任何类型或亚型，若适当，并且可以选择来自要用本发明方法治疗的受试者的物种(例如，人、非人灵长类动物或其他哺乳动物，例如，农业哺乳动物(例如，马、羊、牛、猪、骆驼科动物)、家养哺乳动物(例如，犬、猫)或啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、兔)。在一些实施方案中，用于抗体细胞因子嫁接蛋白中的抗体经改造以生成人化或人改造抗体。在一些实施方案中，用于抗体细胞因子嫁接蛋白中的抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体恒定区同型是IgG，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在某些实施方案中，恒定区同型是IgG1。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含IgG。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含IgG1Fc。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白包含IgG2Fc。
除在框架或CDR区内进行的修饰外或备选地，用于制备抗体细胞因子嫁接蛋白的抗体或抗体片段可被改造以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或更多种功能性质，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒性。另外，抗体或抗体片段可经化学修饰(例如，可将一个或更多个化学部分连接至该抗体)或经修饰以改变其糖基化，再次改变抗体细胞因子嫁接蛋白的一种或更多种功能性质。
在一个实施方案中，CH1的铰链区经修饰以便改变(例如增加或减少)铰链区中的半胱胺酸残基数。例如，由Bodmer等人进一步阐述于美国专利第5,677,425号中的方法，其中改变CH1铰链区中的半胱胺酸残基数量以(例如)促进轻链及重链的组装或增加或降低抗体细胞因子嫁接蛋白的稳定性。在另一实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以改变抗体细胞因子嫁接蛋白的生物半衰期。更具体地，将一个或更多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，以便使抗体细胞因子嫁接蛋白具有受损的葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A，SpA)结合，相对于天然Fc铰链结构域SpA结合。此方法进一步详细阐述于Ward等人的美国专利第6,165,745号中。
本公开提供特异性结合IL10R蛋白的抗体细胞因子嫁接蛋白，其具有延长的体内半衰期。在另一实施方案中，修饰抗体细胞因子嫁接蛋白以增加其生物半衰期。多种方法是可能的。也可由将一种或更多种氨基酸修饰(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc结构域片段)中，生成具有增加的体内半衰期的抗体细胞因子嫁接蛋白。例如，可引入以下突变中的一个或更多个:T252L、T254S、T256F，如Ward等人的美国专利第6,277,375号中所阐述。例如参见国际公开第WO 98/23289号；国际公开第WO97/34631号；及美国专利第6,277,375号。备选地，为增加生物半衰期，在CH1或CL区内改变抗体细胞因子嫁接蛋白以含有取自IgG的Fc区CH2的结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号和第6,121,022号中所阐述。在其他实施方案中，由使用不同氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体细胞因子嫁接蛋白的效应物功能。例如，可使用不同氨基酸残基来替代一个或更多个氨基酸，以使抗体细胞因子嫁接蛋白对效应物配体具有改变的亲和力但保留亲代抗体的抗原结合能力。对其亲和力有所改变的效应物配体可为(例如)Fc受体(FcR)或补体的C1组份。此方法进一步详细阐述于Winter等人的美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中。
在另一实施方案中，可利用不同氨基酸残基替代选自氨基酸残基的一个或更多个氨基酸，以使抗体细胞因子嫁接蛋白具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细阐述于Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。
含有此类突变的抗体细胞因子嫁接蛋白介导降低的或无抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被Ala234和Ala235取代。在一些实施方案中，IgG1恒定区的氨基酸残基N267被Ala267取代。
在另一实施方案中，改变一个或更多个氨基酸残基由此改变抗体细胞因子嫁接蛋白固定补体的能力。此方法进一步阐述于Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中。
在另一实施方案中，通过修饰一个或更多个氨基酸对Fc区进行修饰，以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体细胞因子嫁接蛋白对Fcγ受体的亲和力。此方法进一步阐述于Presta的PCT公开WO00/42072中。另外，已经绘制了针对FcγR1，FcγRII，FcγRIII和FcRn的人IgG1上的结合位点且已阐述具有经改良的结合的变体(参见Shields,R.L.等人，2001J.Biol.Chem.276:6591-6604)。
在另一实施方案中，修饰抗体细胞因子嫁接蛋白的糖基化。例如，可制备无糖基化抗体细胞因子嫁接蛋白(即缺少糖基化的抗体细胞因子嫁接蛋白)。可改变糖基化以(例如)增加抗体对“抗原”的亲和力。此类糖类修饰可由(例如)改变抗体序列内的一个或更多个糖基化位点来达成。例如，可进行一个或更多个氨基酸取代以实现消除一个或更多个可变区框架糖基化位点，由此消除该位点处的糖基化。此无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法进一步详细阐述于Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中。
此外或备选地，可制备具有改变的糖基化类型的抗体细胞因子嫁接蛋白，例如具有降低的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体细胞因子嫁接蛋白或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。这种糖类修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体细胞因子嫁接蛋白来完成。具有改变的糖基化机构的细胞已在本领域阐述且可用作宿主细胞，其中表达重组抗体细胞因子嫁接蛋白，由此产生具有改变的糖基化的抗体细胞因子嫁接蛋白。例如，Hang等人的EP 1,176,195阐述功能被破坏的FUT8基因的细胞系，其具有编码岩藻糖基转移酶，这样在此细胞系中表达的抗体细胞因子嫁接蛋白展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO 03/035835阐述变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的糖类的能力有所降低，还导致在该宿主细胞中表达的抗体细胞因子嫁接蛋白的低岩藻糖基化(也参见Shields,R.L.等人，2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342阐述细胞系，其被改造以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡糖氨基转移酶III(GnTIII))，以使在改造的细胞系中表达的抗体细胞因子嫁接蛋白展现增加的二等分型GlcNac结构，其导致增加的抗体ADCC活性(还参见Umana等人，1999Nat.Biotech.17:176-180)。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白的一个或更多个结构域或区经由接头连接，例如，肽接头，例如本领域熟知的那些(例如，参见Holliger,P.,等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,RJ.,等人(1994)Structure 2:1121-1123)。肽接头长度可有所变化，例如，接头的长度可为1至100个氨基酸，通常接头的长度为5至50个氨基酸，例如，长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。
在一些实施方案中，单体IL10任选地与一个或更多个肽接头序列插入CDR序列中。在某些实施方案中，一个或更多个肽接头独立地选自(Glyn-Ser)m序列、(Glyn-Ala)m序列或(Glyn-Ser)m/(Glyn-Ala)m序列的任何组合，其中每个n独立地为1至5的整数，并且每个m独立地为0至10的整数。在一些实施方案中，肽接头为(Gly4-Ser)m，其中m为0至10的整数。在一些实施方案中，肽接头为(Gly4-Ala)m，其中m是0-10的整数。接头的实例包括但不限于某些实施方案，一个或更多个接头包括G4S重复，例如Gly-Ser接头GGGGS(SEQ ID NO:252)或(GGGGS)m，其中m是等于或大于1的正整数。例如、m＝1、m＝2、m＝3、m＝4、m＝5和m＝6、m＝7、m＝8、m＝9和m＝10。在一些实施方案中，接头包括GGGGS(SEQ ID NO:252)的多个重复，包括但不限于(GGGGS)3或(GGGGS)4。在一些实施方案中，Ser可以用Ala取代，例如接头G/A如(GGGGA)(SEQ ID NO:253)或(GGGGA)m，其中m是等于或大于1的正整数。在一些实施方案中，接头包括GGGGA(SEQ ID NO:253)的多个重复。在其他实施方案中，接头包括GGGGS(SEQ IDNO:252)和GGGGA(SEQ ID NO:253)的组合和多个GGGGS(SEQ ID NO:252)和GGGGA(SEQ IDNO:253)。
此外，抗体细胞因子嫁接蛋白可与标记序列连接，该标记序列例如促进抗体细胞因子嫁接蛋白的纯化的肽。在优选实施方案中，标记氨基酸序列是六组胺酸肽，例如提供于pQE载体中的标签(QIAGEN,Inc.，9259Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)等，其中的一些是市售的。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所阐述，例如，六组胺酸提供嫁接蛋白的方便纯化。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，该标签对应于衍生自流行性感冒血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984,Cell 37:767)，和”flag”标签。
抗体也可以连接到固体支持物上，其对于靶标抗原的免疫测定或纯化尤其有用。这种固体载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
抗体细胞因子嫁接蛋白活性的测定
鉴定抗体细胞因子嫁接蛋白的测定为本领域已知且如本文所述。抗体细胞因子嫁接蛋白结合至IL10受体(IL10R)且促进、诱导、刺激导致抗炎效应以及免疫刺激效应的细胞内信号传导。
可使用本领域已知的任一方法确定抗体细胞因子嫁接蛋白与IL10R的结合。例如，可使用已知的技术(包括但不限于ELISA、Western印迹、表面等离振子共振(例如，BIAcore)及流式细胞术)确定与IL10R的结合。
可使用本领域已知的任一方法测定通过IL10的细胞内信号传导。例如，通过IL10R的激活促进STAT3磷酸化及信号传导。测定STAT3激活的方法在本领域是标准的(例如，STAT3蛋白的磷酸化状态、报道基因分析、下游信号传导测定等)。通过IL10的激活具有抗炎效应，包括促炎细胞因子的抑制以及巨噬细胞的分化及增殖。另外，通过IL10R的激活具有免疫刺激效应，包括刺激B细胞增殖、肥胖细胞增殖(例如，MC/9)及天然杀伤(NK)细胞增殖及激活的CD8+T细胞的增殖，以及某些促炎细胞因子的诱导。测定细胞增殖的方法在本领域是标准的(例如，3H-胸苷掺入测定、CFSE标记)。测定细胞因子产生的方法在本领域内是公知的(例如，ELISA分析、ELISpot分析)。在进行体外测定中，可将与激动剂抗体细胞因子嫁接蛋白接触的测试细胞或来自该测试细胞的培养物上清与尚未与激动剂抗体细胞因子嫁接蛋白接触的对照细胞或来自该对照细胞的培养物上清和/或已与重组人IL10(rhIL10)接触的对照细胞或来自该对照细胞的培养物上清相比较。
抗体细胞因子嫁接蛋白的IL10受体激动剂活性也可离体和/或体内测定。在一些方面中，可使用与未处理的对照动物和/或用rhIL10类似处理的动物相比，离体测定用抗体细胞因子嫁接蛋白处理的动物的多种细胞类型之间的STAT3激活的方法，用于显示抗体嫁接蛋白在细胞类型之间的差异活性。优选的抗体细胞因子嫁接蛋白具有激活和扩增单核细胞的能力。例如，可使用本领域已知的任意方法(例如，由流式细胞术)测定单核细胞的体内激活及扩增。抗体细胞因子嫁接蛋白在治疗上可用于抑制刺激后的促炎反应水平。促炎细胞因子的水平可以使用本领域已知的任何方法，在用刺激剂(例如，LPS)处理之前，期间和/或之后，在用抗体细胞因子嫁接蛋白处理的动物分离的样品中测定，并且结果可以与未处理对照动物和/或用重组人IL10(rhIL10)疗法类似处理的动物进行比较。优选的激动剂抗体细胞因子嫁接蛋白在治疗上可用于预防、减轻、抑制或消除炎症性肠病、克隆病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥综合征、白塞病、结节病及移植物抗宿主病(GVHD)。激动剂抗体细胞因子嫁接蛋白的功效可以通过向个体施用治疗有效量的抗体细胞因子嫁接蛋白并在施用抗体细胞因子嫁接蛋白之前和之后比较个体来确定。激动剂抗体细胞因子嫁接蛋白在治疗炎症性肠病、克隆病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥综合征、白塞病、结节病及移植物抗宿主病(GVHD)中的功效也可以通过向个体施用治疗有效量的抗体细胞因子嫁接蛋白并将测试个体与未施用抗体细胞因子嫁接蛋白的对照个体和/或与用rhIL10类似处理的个体进行比较来确定。
编码抗体细胞因子嫁接蛋白的多核苷酸
在另一方面中，提供编码抗体细胞因子嫁接蛋白的重链及轻链蛋白的分离的核酸。可由本领域已知的任意方式产生抗体细胞因子嫁接蛋白，包括(但不限于)重组表达、化学合成及抗体四聚体的酶消化。重组表达可来自本领域已知的任意适当宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本文提供编码以下的多核苷酸:SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:205及SEQ ID NO:206中的任一个所示的可变区；SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208中的任一个所示的可变区；SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ IDNO:205及SEQ ID NO:206中的任一个所示的CDR；SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:207及SEQ ID NO:208中的任一个所示的重链及轻链。
因此，本发明提供编码本文所述的抗体细胞因子嫁接蛋白的重链和/或轻链多肽的多核苷酸，例如，如本文所述编码包含互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些实施方案中，编码重链可变区的多核苷酸包含与SEQ ID NO:242的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的多核苷酸包含与SEQ ID NO:243的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性的序列。、
在一些实施方案中，编码重链可变区的多核苷酸包含与SEQ ID NO:246的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的多核苷酸包含与SEQ IDNO:247的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性的序列。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:244的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:245的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:248的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与选自SEQ ID NO:249的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
多核苷酸可编码抗体细胞因子嫁接蛋白的可变区序列。其也可编码抗体细胞因子嫁接蛋白的可变区及恒定区。一些多核苷酸序列编码包含抗体细胞因子嫁接蛋白的重链及轻链的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码两个分别实质上与抗体细胞因子嫁接蛋白的重链及轻链的可变区相同的多肽区段。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸包含DNA。在其他实施方案中，多核苷酸或核酸包含可为单链或双链的RNA。
在一些实施方案中，提供包含编码一种或多种细胞因子嫁接蛋白或其片段及任选分泌信号的核酸的重组宿主细胞。在某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码抗体细胞因子嫁接蛋白或其片段及分泌信号的载体。在其他某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码抗体细胞因子嫁接蛋白的两条免疫球蛋白蛋白链及分泌信号的一个或更多个载体。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含编码抗体细胞因子嫁接蛋白的两条免疫球蛋白蛋白链及分泌信号的单一载体。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含两个载体，一个编码抗体细胞因子嫁接蛋白的异二聚体的重链免疫球蛋白蛋白链且另一个编码轻链免疫球蛋白蛋白链，且每一个均包括分泌信号。重组宿主细胞可为原核或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞系。
另外，本发明提供产生抗体细胞因子嫁接蛋白的方法。在一些实施方案中，该方法包含以下步骤:(i)在适于表达、形成及分泌抗体细胞因子嫁接蛋白的条件下培养包含编码抗体细胞因子嫁接蛋白的免疫球蛋白蛋白链的一个或多个载体的宿主细胞，及(ii)回收抗体细胞因子嫁接蛋白。
可由固相DNA从头合成或由PCR诱变编码抗体细胞因子嫁接蛋白的多肽链的现有序列(例如，如本文所述的序列)产生多核苷酸序列。可由本领域已知的方法实现核酸的直接化学合成，例如Narang等人，Meth.Enzymol.68:90,1979的磷酸三酯方法；Brown等人，Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺(diethylphosphoramidite)方法；及美国专利第4,458,066号的固相支持物方法。可如以下文献中所阐述由PCR向多核苷酸序列中引入突变:例如PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编辑),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Innis等人(编辑),Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19:967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1:17,1991。
本发明也提供用于产生上文所阐述的抗体细胞因子嫁接蛋白的表达载体及宿主细胞。可采用多种表达载体来表达编码抗体细胞因子嫁接蛋白的免疫球蛋白多肽链或片段的多核苷酸。可使用基于病毒及非病毒的表达载体在哺乳动物宿主细胞中产生免疫球蛋白。非病毒载体及系统包括质粒、附加型载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)及人类人工染色体(例如参见Harrington等人，Nat Genet 15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达抗体细胞因子嫁接蛋白多核苷酸及多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV载体及本领域已知用于表达其他蛋白质的诸多其他载体。有用病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40、乳头瘤病毒、HBP艾伯斯坦-巴尔病毒(HBPEpstein Barr virus)的载体、豆苗病毒载体及塞姆利基森林病毒(Semliki Forestvirus，SFV)载体。参见Brent等人，上文文献；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于待表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体含有启动子及其他有效连接至编码抗体细胞因子嫁接蛋白的多核苷酸的调节序列(例如增强子)。在一些实施方案中，采用诱导型启动子来预防除在诱导条件下插入序列的表达。诱导型启动子包括，例如，阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。转化的生物体可以在非诱导条件下扩大培养，不偏向编码序列的表达产物被宿主细胞更耐受的群体。除了启动子，对于有效表达抗体细胞因子嫁接蛋白的免疫球蛋白链或片段，还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近的核糖体结合位点或其他序列。此外，可以通过包含适用于所使用的细胞系统的增强子来增强表达效率(参见，例如，Scharf等，ResultsProbl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等，Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
除由抗体细胞因子嫁接蛋白序列编码的序列以外，表达载体也可提供用于形成异源蛋白的分泌信号序列。更常见的，包含在载体中之前，插入的抗体细胞因子嫁接蛋白的免疫球蛋白序列与信号序列有效连接。用于接收编码免疫球蛋白轻链及重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这样的载体允许可变区表达为具有恒定区的抗体细胞因子嫁接蛋白，从而导致产生完整抗体细胞因子嫁接蛋白或其片段。通常，这样的恒定区是人的。
用于携带和表达抗体细胞因子嫁接蛋白链的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆菌(E.coli)是用于克隆和表达本公开的多核苷酸的一种原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌(bacilli)，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，可以存在任何数量的各种公知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统、或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选具有操作子序列，并且具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物，如酵母，也可以用于表达抗体细胞因子嫁接蛋白。还可以使用昆虫细胞结合杆状病毒载体。
在一些优选实施方案中，将哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本公开的抗体细胞因子嫁接蛋白。例如，它们可以是携带外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常的非永生化的或正常或异常的永生化的动物或人细胞。例如，已经研发了各种能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽，一般性地讨论于例如Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.，1987。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等，Immunol.Rev.89:49-68，1986)，和必需的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有源自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调节或可调控的。有用的启动子包括，但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松-诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目标多核苷酸序列的表达载体的方法可以根据细胞宿主的类型而改变。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其他细胞宿主(总地参见Sambrook等，上引文)。其他方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和微注射、生物导弹法、病毒颗粒、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、嫁接至疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliot and O'Hare，Cell 88:223，1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。对于长期、高产量的重组蛋白生产，常常将需要稳定的表达。例如，可以使用表达载体制备稳定表达抗体细胞因子嫁接蛋白免疫球蛋白链的细胞系。引入载体后，可以在转换至选择培养基之前，允许细胞在富集培养基中生长1-2天。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，其存在允许成功表达引入的序列的细胞在选择培养基中生长。使用适于细胞类型的组织培养技术，可以使抗性、稳定转染的细胞增殖。
包含抗体细胞因子嫁接蛋白的组合物
提供包含与药物学上可接受的载体配制在一起的抗体细胞因子嫁接蛋白的药物组合物。任选地，药物组合物另外含有适用于治疗或预防给定疾病的其他治疗剂。药物学上可接受的载体增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。药物学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
本公开的药物组合物可以通过本领域已知的各种方法来施用。施用途径和/或方式可以根据所需结果来改变。优选施用是胃肠道外施用(例如，选自静脉内、肌内、腹腔内、鞘内、动脉内或皮下中的任意种)，或接近靶位点施用。药物学上可接受的载体适用于静脉内、肌内、腹腔内、鞘内、动脉内、皮下、鼻内、吸入、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物，例如，抗体细胞因子嫁接蛋白，可以包裹在材料中，以保护化合物免受酸和其他可能使化合物失活的自然条件的作用。在一些实施方案中，药物组合物配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，药物组合物配制用于皮下施用。
抗体细胞因子嫁接蛋白，单独或结合其他合适的组分，可以制成气溶胶制剂(即，它们可以被“喷雾”)，以通过吸入施用。气溶胶制剂可以放入加压的可接受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
在一些实施方案中，药物组合物是无菌的且是流体。例如，通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况中通过维持所需的颗粒大小、或通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇，以及氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝或明胶，来实现可注射组合物的长期吸收。在某些实施方案中，可以使用合适的赋形剂(例如，蔗糖)，将组合物制成冻干形式用于储存。
可以根据本领域公知的和常规实践的方法，制备药物组合物。药物学上可接受的载体部分决定于所施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法。因此，存在各种合适的本公开的药物组合物的制剂。适用于配制抗体细胞因子嫁接蛋白以及确定合适的剂量和时间表的方法可以见于，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，University of the Sciences in Philadelphia，编辑，Lippincott Williams&Wilkins(2005)；和Martindale:The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press；以及Martindale,Martindale:The Extra Pharmacopoeia，第31版，1996，Amer Pharmaceutical Assn；以及Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978，将每篇文献按引用并入本文中。药物组合物优选在GMP条件下制备。通常，在药物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的抗体细胞因子嫁接蛋白。通过本领域技术人员已知的常规方法，将抗-GITR抗体配制成药物学上可接受的剂型。调节剂量方案，以提供所需的应答(例如，治疗应答)。在确定治疗或预防有效剂量中，可以施用低剂量，然后逐渐递增，直至获得所需应答和最小或没有不合需要的副作用。例如，可以施用单个大丸剂(bolus)，可以在一段时间内施用几个分剂量，或可以按照治疗情况的紧急性所指示的，按比例地降低或增加剂量。尤为有利的是，为了易于施用和剂量的均一性，配制单位剂型的肠胃外组合物。本文中所用的单位剂型是指，适宜作为单元剂量用于待治疗受试者的物理上分开的单位；每个单位含有经计算可以产生所需治疗效果的预定量的活性化合物和所需的药物载体。
本公开的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以获得对于特定患者、组合物和施用方式而言可以有效实现所需治疗应答的活性成分量，而对患者没有毒性。选定的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括使用的本公开特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，待使用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质，待治疗患者的年龄、性别、重量、状况、整体健康和之前的医疗史，以及类似因素。
与第二药剂(agent)的共配制
在一些实施方案中，药物组合物包含抗体细胞因子嫁接蛋白及一种或多种其他药剂的混合物。与本发明抗体细胞因子嫁接蛋白一起包含在混合物中的示例性第二种药剂包括(但不限于)抗炎剂、免疫调节剂、氨基水杨酸盐及抗生素。适当选择可取决于优选的制剂、剂量和/或递送方法。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白是与抗炎剂一起共配制(即，以混合物提供或以混合物制备)。在具体实施方案中，皮质类固醇抗炎剂可与抗体细胞因子嫁接蛋白组合使用。可用的皮质类固醇选自甲泼尼龙、氢化可的松、泼尼松、布地奈德、5-氨基水杨酸盐及地塞米松中的任意个。适当的选择将取决于制剂及递送倾向。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白是与免疫调节剂一起共配制。在具体实施方案中，免疫调节剂选自6-巯嘌呤、硫唑嘌呤、环孢素A(cyclosporine A)、他克莫司(tacrolimus)及胺甲喋呤(methotrexate)中的任意个。在具体实施方案中，免疫调节剂选自抗TNF剂(例如，英利昔单抗、阿达木单抗、培舍珠单抗、戈利木单抗)、那他珠单抗及维多珠单抗。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白与氨基水杨酸盐物质一起共配制。在具体实施方案中，氨基水杨酸盐选自柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸盐、巴柳氮、奥沙拉秦或5-对氨水杨酸的其他衍生物。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白是与抗细菌剂一起共配制。示例性抗细菌剂包括(但不限于)磺胺类药(例如，磺胺(sulfanilamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、磺胺异噁唑(sulfisoxazole)、磺胺醋酰(sulfacetamide))、甲氧苄啶(trimethoprim)、喹诺酮类(例如，萘啶酸(nalidixic acid)、西诺沙星(cinoxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟罗沙星(fleroxacin)、培罗沙星(perloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)及吉米沙星(gemifloxacin))、乌洛托品(methenamine)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、青霉素(penicillin)(例如，青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicilin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林、萘夫西林(nafcilin)、氨苄西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)及哌拉西林(piperacillin))、头孢菌素(cephalosporin)(例如，头孢唑林(cefazolin)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢呋辛酯(cefuroxime acetil)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢替坦(cefotetan)、头孢雷特(ceforanide)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil)、头孢布烯(cefibuten)、头孢地尼(cefdinir)、头孢妥仑匹酯(cefditoren pivorxil)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢他啶(ceftazidime)及头孢吡肟(cefepine))、碳青霉烯(carbapenem)(例如，亚胺培南(imipenem)、氨曲南(aztreonam))及氨基糖苷(例如，新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、庆大霉素(gentamicin)、妥布霉素(toramycin)、奈替米星(netilmicin)及阿米卡星(amikacin))。
制品/试剂盒
在一些方面中，抗体细胞因子嫁接蛋白是以制品(即，试剂盒)提供。抗体细胞因子嫁接蛋白通常在小瓶或容器中。因此，制品包含容器及位于该容器上或与该容器相连的标签或包装插页。适宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器、溶液袋等。根据情况，抗体细胞因子嫁接蛋白可以是液体或干燥(例如，冻干)形式。容器容纳组合物，该组合物自身或与另一组合物组合有效用于制备用以治疗、预防和/或改善免疫相关病症的组合物。标签或包装插页指示组合物用于治疗、预防和/或改善免疫相关病症。如本文所述包含抗体细胞因子嫁接蛋白的制品(试剂盒)任选含有一种或多种其他药剂。在一些实施方案中，制品(试剂盒)含有抗体细胞因子嫁接蛋白及可药用稀释剂。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白是在同一制剂中(例如，作为混合物)以具有一种或多种其他活性剂的制品(试剂盒)提供。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白是在单独制剂中(例如，在单独容器中)以具有第二种或第三种药剂的制品(试剂盒)提供。在某些实施方案中，制品(试剂盒)含有抗体细胞因子嫁接蛋白的等份试样，其中该等份试样提供一个或更多个剂量。在一些实施方案中，提供用于多次施用的等份试样，其中剂量是均匀或有所变化的。在具体实施方案中，不同施用方案是递增或降低(若适当)。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白及第二种药剂的剂量独立地均匀变化或独立变化。在某些实施方案中，制品(试剂盒)包含选自抗炎剂、免疫调节剂、氨基水杨酸盐及抗生素中的任意个的另一药剂。一种或多种其他药剂的选择将取决于剂量、递送及待治疗的疾病病症。
抗体细胞因子嫁接蛋白在免疫相关病症中的治疗及使用方法
待治疗或预防的病症
抗体细胞因子嫁接蛋白可用于治疗、改善或预防免疫相关病症。在一方面中，本发明提供治疗有需要的个体的免疫相关病症的方法，其包含向该个体施用治疗有效量的如本文所述的抗体细胞因子嫁接蛋白。在一方面中，本发明也提供抗体细胞因子嫁接蛋白，其用作治疗剂。在一些实施方案中，提供抗体细胞因子嫁接蛋白用作治疗或预防个体的免疫相关病症的治疗剂。在一些实施方案中，提供抗体细胞因子嫁接蛋白的用途，其用于制备用以治疗有需要的个体的免疫相关病症的药物。在另一方面中，本公开提供包含该抗体细胞因子嫁接蛋白的组合物，其用于治疗或改善有需要的个体的免疫相关病症。
出于治疗目的，个体可具有免疫相关病症。出于预防性或预防性目的，个体可处于免疫相关病症的活性状态的缓解中或可预料未来发作。在一些实施方案中，患者具有免疫相关病症，怀疑患有免疫相关病症或处于免疫相关病症的缓解中。经受抗体细胞因子嫁接蛋白的治疗的免疫相关病症通常从如本文所述的IL10受体信号传导的激活得到益处。经受治疗的免疫相关病症包括(但不限于)炎症性肠病、克隆病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥综合征、白塞病、结节病及移植物抗宿主病(GVHD)。
抗体细胞因子嫁接蛋白的施用
医生或兽医可以以低于实现所需治疗效果所要求的水平施用药物组合物中的抗体细胞因子嫁接蛋白的开始剂量，并且逐渐提高剂量，直至实现所需效果。通常，本公开组合物的有效剂量根据许多不同因素而改变，所述因素包括待治疗的特定疾病或病症、施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人或动物、施用的其他药物、和治疗是预防性的或是治疗性的。治疗剂量一般需要滴定，以优化安全性和功效。对于抗体细胞因子嫁接蛋白施用，剂量范围为约0.0001至100mg/kg宿主体重，并且更常见地为0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。按照需要或期望的，剂量施用可以以每天、每周、每两周、每月、或更高或更低的频率进行。一个示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次或每月一次、或每3至六个月一次施用。
抗体细胞因子嫁接蛋白可以单剂或分剂量施用。抗体细胞因子嫁接蛋白通常多次施用。按照需要或期望的，单次剂量之间的间隔可以为每周、每两周、每月或每年。如通过测量患者的抗体细胞因子嫁接蛋白的血液水平所指示的，间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调节剂量来实现1-1000μg/ml的血浆抗体细胞因子嫁接蛋白浓度，并且在一些方法中，为25-300μg/ml。或者，抗体细胞因子嫁接蛋白可以作为持续释放制剂来施用，在该情况中，需要较少频率的施用。剂量和频率可以根据抗体细胞因子嫁接蛋白在患者中的半衰期来改变。通常，抗体细胞因子嫁接蛋白显示出比天然细胞因子(例如IL10)长的半衰期。剂量和施用频率可以根据治疗是预防性的或是治疗性的来改变。通常在预防性应用中，在长时间段中，以相对不太频繁的间隔，施用相对低的剂量。一些患者在其一生中持续接受治疗。通常在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直至疾病进展得到减慢或终止，并且优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以给予患者预防性方案。
与第二种药剂的共施用
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白是与一种或多种其他药剂共施用。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白及其他一种或多种药剂是以混合物形式施用。在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白及其他一种或多种药剂是以单独制剂形式施用。在某些实施方案中，倘若使用单独制剂，则同时施用。在某些实施方案中，倘若使用单独制剂，则依序施用。在某些实施方案中，倘若使用单独制剂，则施用是经由相同途径。在某些实施方案中，倘若使用单独制剂，则施用是经由不同途径。与抗体细胞因子嫁接蛋白共施用的示例性其他药剂包括(但不限于)抗炎剂、免疫调节剂、氨基水杨酸盐及抗生素。适当选择可取决于优选的制剂、剂量和/或递送方法。抗体细胞因子嫁接蛋白也可用于与用于治疗免疫相关病症病症的其他已建立的程序(例如，手术)的组合疗法中。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白与抗炎剂共施用。在具体实施方案中，皮质类固醇抗炎剂可结合抗体细胞因子嫁接蛋白使用。可使用的皮质类固醇可选自甲泼尼龙、氢化可的松、泼尼松、布地奈德、5-氨基水杨酸盐及地塞米松中的任意个。适当选择将取决于制剂及递送倾向。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白与免疫调节剂共施用。在具体实施方案中，免疫调节剂选自6-巯嘌呤、硫唑嘌呤、环孢素A、他克莫司及胺甲喋呤中的任意个。在具体实施方案中，免疫调节剂选自抗TNF剂(例如，英利昔单抗、阿达木单抗、培舍珠单抗、戈利木单抗)、那他珠单抗及维多珠单抗。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白是与氨基水杨酸盐物质共施用。在具体实施方案中，氨基水杨酸盐物质选自柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸盐、巴柳氮、奥沙拉秦或5-对氨水杨酸的其他衍生物。
在一些实施方案中，抗体细胞因子嫁接蛋白是与抗细菌剂共施用。示例性抗细菌剂包括(但不限于)磺胺类药(例如，磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺醋酰)、甲氧苄啶、喹诺酮类(例如，萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、培罗沙星、左氧氟沙星、加雷沙星及吉米沙星)、乌洛托品、呋喃妥因、青霉素(例如，青霉素G、青霉素V、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、替卡西林、美洛西林及哌拉西林)、头孢菌素(例如，头孢唑林、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢西丁、头孢克洛、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢呋辛酯、氯碳头孢、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟酯、头孢布烯、头孢地尼、头孢妥仑匹酯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶及头孢吡肟)、碳青霉烯(例如，亚胺培南、氨曲南)及氨基糖苷(例如，新霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星及阿米卡星)。
实施例
实施例1:免疫球蛋白-IL10嫁接构建体的产生
由以下生成嫁接构建体IgGIL10M1、IgGIL10M2、IgGIL10M3、IgGIL10M4、IgGIL10M5、IgGIL10M6、IgGIL10M7、IgGIL10M8、IgGIL10M9、IgGIL10M10、IgGIL10M11、IgGIL10M12、IgGIL10M13、IgGIL10M14及IgGIL10M15:将单体IL10序列改造至多种免疫球蛋白支架的CDR区中，然后产生重链及轻链免疫球蛋白链，以生成最终蛋白构建体。IgGIL10M嫁接构建体赋予IL10的优选的治疗抗炎性质；然而，如与rhIL10相比，IgGIL10M嫁接构建体具有成比例降低的促炎活性。
为产生抗体细胞因子嫁接蛋白，将包含全长IL10的残基19-178且在残基134与135之间具有6氨基酸接头的单体IL10(IL10M)(SEQ ID NO:209)插入免疫球蛋白链支架的CDR环中。嫁接构建体是使用已用于临床环境中的多种已知的免疫球蛋白序列以及种系抗体序列来制备。两个示例性支架中的IL10M的序列(称作GFTX1及GFTX3)示于表1中。基于可用结构或同源性模型数据选择插入点为CDR环的中点。使用标准分子生物学方法，利用编码相关序列的重组DNA来产生抗体细胞因子嫁接蛋白。
例如，合成含有插入六个CDR中的一个中的IL-10M的每一抗体的可变区。经由PCR扩增编码可变区的DNA，并将所得片段亚克隆至含有轻链恒定区或重链恒定及Fc区的载体中。以这种方式制备IL10M抗体细胞因子嫁接蛋白，其对应于将IL10M插入六个CDR(L1，L2，L3，H1，H2，H3)中的每一个中。所得构建体示于表1中。重链及轻链载体的适当组合的转染使得表达具有两个嫁接的IL-10M分子(在每一Fab臂中一个IL10单体)的重组抗体。参见图2。
选取哪个CDR用于细胞因子嫁接的选择是基于以下参数来选取:所需要的生物学、生物物理性质及有利的发展特性。此时，建模软件仅部分地可用于预测哪个CDR及CDR内的哪个位置将提供期望参数，因此可制备所有六种可能的抗体细胞因子嫁接物，然后在生物分析中进行评估。若得到所需要的生物活性，则解析抗体细胞因子嫁接分子的生物物理特性，例如结构分辨率
如下所述，通过将IL10嫁接至CDR中，抗体细胞因子嫁接蛋白的抗体部分呈现具有独特结构的IL10单体，其影响与IL10受体的结合。由于抗体部分，没有脱靶效应。此外，已将抗体细胞因子嫁接蛋白的Fc部分修饰为关于ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)及CDC(补体依赖性细胞毒性)完全沉默。
总之，基于结构来选取每一CDR中的插入点，假设嫁接至CDR中可为IL10受体的各个亚单位提供一定程度的立体阻碍。哪种CDR嫁接对于具体细胞因子最好的最终选择是基于期望的生物学及生物物理性质。细胞因子受体的性质、细胞因子/受体相互作用及信号传导的机制也将起作用，并且通过比较每种抗体细胞因子嫁接分子的各自特性来解决这个问题。例如，将IL10嫁接至轻链CDR1(CDRL1)中产生了激活单核细胞而不是其他细胞如NK细胞的所需生物活性。这在示例性抗体细胞因子嫁接蛋白IgGIL10M7和IgGIL10M13中可观察到。
表1
实施例2:抗体细胞因子嫁接蛋白具有抗炎活性
使用在临床中开发的支持rhIL10的促炎活性的测定法(Lauw等，J Immunol.2000；165(5):2783-9)，剖析了IgGIL10M13在人全血中的促炎活性。为了评估促炎活性，分析抗体细胞因子嫁接蛋白在激活的原代人CD8T细胞中诱导干扰素γ(IFNγ)或粒酶B的能力。通过IFNγ产生测量，发现抗体细胞因子嫁接蛋白，如IgGIL10M13，显示出比重组人IL10(rhIL10)显著更低的促炎活性。该数据如图3A所示。在测量粒酶B以及其他示例性抗体细胞因子嫁接蛋白(IgGIL10M7)的测定中发现了类似的结果(数据未显示)。与rhIL10相比，IgGIL10M13显示出显著降低的促炎活性，表明它可以比rhIL10更好地治疗免疫相关疾病，因为IgGIL10M13可以在更广泛的剂量范围内给药。
为了检测抗炎活性，测试抗体细胞因子嫁接蛋白和rhIL10在人全血中抑制LPS诱导的TNFα的能力。该数据显示在图3B中，其中增加浓度的rhIL10或IgGIL10M13减少TNFα的产生。注意，rhIL10和IgGIL10M13曲线相似，表明两种分子都具有有效的抗炎活性。
总之，这些结果显示抗体细胞因子嫁接蛋白具有与IL10类似的所需特性(具有抗炎特性)，但没有剂量限制和不需要的促炎性质。
实施例3:IL10依赖性信号传导
人PBMC和全血中的体外信号传导研究表明，与rhIL10相比，抗体细胞因子嫁接蛋白，如IgGIL10M13，具有更特异的信号传导特征。使用CyTOF，一种利用质谱法的基于FACS的方法，通过pSTAT3检测评估全血中多个不同细胞群中的抗体细胞因子嫁接蛋白信号传导(图4)。抗体细胞因子嫁接蛋白如IgGIL10M13仅在高于μM浓度(高达1.8μM)的单核细胞、巨噬细胞和浆细胞样树突细胞上诱导pSTAT3信号。已知所有这些细胞类型都具有增加的IL10受体表达。rhIL10在单核细胞上诱导pSTAT3信号，但也在其他细胞类型如T细胞，B细胞和NK细胞上诱导pSTAT3信号。甚至在低nM浓度的rhIL10时也可以看到这种情况。在用100nM浓度的rhIL10处理的全血中，在单核细胞和骨髓树突细胞上观察到最强的pSTAT3信号，T细胞、NK细胞、B细胞和粒细胞具有额外的中度激活。pSTAT3信号传导的功能性后果导致来自CD8T细胞和NK细胞的IFNγ和粒酶B产生的增加。响应于rhIL10信号传导，还存在B细胞的增殖。在比抗炎IC90低5倍的暴露下观察到rhIL10在人全血中的这种促炎活性。抗体细胞因子嫁接蛋白(如IgGIL10M13)的更具选择性的细胞特性导致促炎活性降低，导致更好的抗炎功效。
实施例4:抗体细胞因子移植蛋白在多种物种中的信号传导
rhIL10有效抑制人单核细胞、PBMC和全血中LPS诱导的促炎细胞因子产生。抗体细胞因子嫁接蛋白IgGIL10M13对靶细胞表现出pM效力，尽管比rhIL10效力低10倍。表2是人全血以及所选毒性物种的全血中IL10或IgGIL10M13活性的效力比较。
效力计算基于来自小鼠、食蟹猴或人的离体全血测定。对于测试的每个物种，滴定IgGIL10M13或rhIL10并评估抑制LPS诱导的TNFα产生的能力。IC50计算为引起总TNFα信号50％抑制的分子水平。IC90s和IC30s的计算考虑了每个测定的Hill斜率值，其公式如下:logEC50＝logECF-(1/Hill斜率)*lob(F/100-F))，其中ECF是给出总TNFα信号的F％响应的浓度。
表2
实施例5:评价抗体细胞因子嫁接蛋白的药代动力学
rhIL10具有短的半衰期，限制其靶组织暴露并且需要对患者进行多次给药。在C57Bl/6小鼠中评估抗体细胞因子嫁接蛋白的半衰期。以0.2mg/kg皮下注射抗体细胞因子嫁接蛋白(例如IgGIL10M13)，并在注射后5分钟开始采血，直至注射后144小时。与具有约1小时半衰期的rhIL10相比，IgGIL10M13具有显著延长的半衰期，延长约4.4天(图5B)(图5A)。
实施例6:抗体细胞因子嫁接蛋白的药效学评价
与延长的半衰期一致，抗体细胞因子嫁接蛋白也显示出改善的药效学。在皮下施用IgGIL10M13后，在小鼠结肠中监测磷酸化STAT3(pSTAT3)，IL10受体激活和信号传导的标记。在给药后至少72小时后，在结肠中检测到增强的pSTAT3信号，并且在给药后144小时不存在。见图5C。该特征是对rhIL10的显著改善，该信号在给药后24小时不存在。如通过抗体细胞因子嫁接蛋白给药后响应于LPS攻击的血液中TNFα的抑制所测量的，图5D描绘了与rhIL10相比，IgGIL10M13体内反应的改善持续时间。
实施例7.抗体细胞因子嫁接蛋白在小鼠模型中的功效
进行LPS攻击后TNFα抑制功效的直接比较。对于重组IL10和IgGIL10M13计算C57/BL6小鼠皮下给予载体，或110nmol/小鼠的等摩尔水平的IL10。然后腹腔内递送LPS来攻击小鼠，以评估IL10依赖性TNFα水平的抑制。在0.5小时的初始评估时间段，IgGIL10M13显示出与rhIL10相当的功效，然而，在达到给药后至少48小时的时候，通过TNFα产生测量，IgGIL10M13对rhIL10具有优异的功效。该数据如图6所示。
实施例8:抗体细胞因子嫁接蛋白具有改善的暴露
在C57Bl/6小鼠中评估抗体细胞因子嫁接蛋白的峰值血清浓度(C max)。将0.9％盐水中的抗体细胞因子嫁接蛋白0.2mg/kg(10ml/kg剂量体积)皮下注射，并在注射后1小时和注射后144小时开始采血。在每个时间点将全血收集到肝素处理的管中，并在4℃以12,500转/分钟离心10分钟。收集血浆上清并储存在-80℃直至所有时间点均已收集。使用两种不同的免疫测定法测定血浆中的抗体细胞因子嫁接蛋白水平，以能够检测IL10，和抗体细胞因子嫁接蛋白的抗体结构域。如图7所示，抗体细胞因子嫁接蛋白(例如IgGIL10M13)在100小时内保持大于60％的Cmax。相反，rhIL10水平在3.5小时内降至20％Cmax以下。
实施例9:抗体细胞因子嫁接蛋白仅作用于人患者的某些细胞类型
如前所述(参见下文实施例3和材料和方法)对来自人健康供体和患有克隆病的患者的免疫细胞进行CyTOF。如图8中的图所示，IgGIL10M13仅刺激单核细胞，并且通过pSTAT3水平测量的刺激与rhIL10相当。单核细胞是炎症相关疾病(例如克隆病和溃疡性结肠炎)的靶细胞，并且表达非常高水平的IL10受体。然而，图9还显示了rhIL10的不需要的促炎作用，例如，对CD4T细胞，CD8T细胞和NK细胞的pSTAT3信号传导增加。值得注意的是，IgGIL10M13对正常人细胞或克隆病患者细胞均未显示出这种不需要的促炎作用。这表明IgGIL10M13具有更大，更安全的治疗指数，因为抗体细胞因子嫁接蛋白的施用将仅作用于期望的细胞类型而不作用于其他细胞类型，例如CD8T细胞，其仅会恶化免疫相关病症，例如克隆病和溃疡性结肠炎。
实施例10:与rhIL10相比，IgGIL10M13在PHA刺激的人全血中具有降低的促炎活性
尽管广泛的临床数据将遗传性IL10缺陷与IBD易感性联系起来，但rhIL10在IBD临床试验中仅显示出轻微的功效(Herfarth等，Gut 2002:50(2):146-147)。对试验数据的回顾性分析表明，rhIL10的功效受其内在的促炎活性如IFNγ的增加产生的限制。如前所述，在基于人功能细胞的测定中，rhIL10信号传导导致T细胞和NK细胞产生IFNγ和粒酶B.
从患有克隆病的患者中取出全血，且在用rhIL10、IgGIL10M13和单独的PHA刺激后测量IFNγ的水平。该数据显示在图9A-9C中。增加剂量的rhIL10导致IFNγ产生急剧增加，然后平稳。相反，在用IgGIL10M13处理这些细胞时，几乎没有观察到IFNγ的产生，表明IgGIL10M13不诱导或仅诱导来自T细胞或NK细胞的非常低水平的IFNγ产生。
用这些患者供体样品进行另外的滴定实验。在该实验中，测量来自供体患者血清的IL10水平，发现其在1.5至5飞摩尔(fM)的范围内，尽管科学文献报道患者IL10水平可高达20fM(Szkaradkiewicz等人，Arch.Immunol.Ther Exp 2009:57(4):291-294)。将rhIL10以2飞摩尔(fM)，2pM，2nM和200nM的固定浓度施用于供体患者细胞。对于这些固定浓度的rhIL10，施用增加浓度的抗体细胞因子嫁接蛋白IgGIL10M13，并测定IFNγ产生。数据显示在图9D中。在2fM和2pM的固定浓度下，IgGIL10M13与rhIL10竞争并将IFNγ的产生减少至基线水平。在2nM的固定浓度下，通过纳摩尔浓度的IgGIL10M13减少IFNγ的产生。最后，在200nM rhIL10的固定过量浓度下，仅观察到IgGIL10M13的IFNγ产生的非常少地减少。这表明在IL10的生理水平，IgGIL10M13竞争掉(competed out)IL10，减少IFNγ的产生和不希望的促炎作用。
实施例11:抗体细胞因子嫁接蛋白的聚集特性
在IBD的临床试验中，观察到rhIL10具有非常短的半衰期；然而，考虑到这种分子的聚集特性，不要求简单Fc融合至IL10二聚体来延长半衰期。图10A显示了与Fc连接的IL10野生型和与Fc连接的IL10单体的聚集。然而，如图10B所示，抗体细胞因子嫁接蛋白的抗体结构阻止IL10聚集，从而促进给药的便利。此外，降低聚集具有减少对治疗剂的免疫反应和产生抗药物抗体的益处。
实施例12:保留抗体细胞因子嫁接蛋白的结合
帕利珠单抗是抗RSV抗体，并且被选择作为细胞因子嫁接的抗体结构。该抗体具有已知的结构优点，并且其靶标是RSV，非人类靶标。非人靶标的选择是为了确保抗体细胞因子嫁接蛋白与脱靶人抗原的结合不会产生毒性。将IL10M嫁接至帕利珠单抗后，不确定最终的IL10抗体细胞因子嫁接蛋白是否仍然与RSV靶蛋白结合。通过ELISA测定，尽管存在IL10M，IL10抗体细胞因子嫁接蛋白仍然与RSV靶蛋白结合。该数据如图11所示。
实施例13:抗体细胞因子嫁接蛋白的结构构象导致细胞类型之间的不同活性
抗体细胞因子嫁接蛋白(例如IgGIL10M13)将单体IL10(SEQ ID NO:209)掺入抗体的轻链CDR1中(图2)。在IL10的螺旋D和E之间插入6个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸接头使得正常异二聚体分子不能进行结构域交换二聚化。因此，将IL10M嫁接至抗体中导致抗体细胞因子嫁接蛋白具有2个单体IL10分子。然而，由于抗体Fab臂的灵活性，如野生型IL10二聚体中一样，IL10单体之间的角度和距离不固定，因此影响其与IL10R1/R2受体复合物的相互作用。这在图12中以图形方式显示。具体地，由于抗体植入，嫁接的IL10二聚体的角度更大且可变，使得在促炎细胞类型(例如CD4和CD8T细胞，B细胞和NK细胞)上发现的具有较低IL10R1和R2表达水平的细胞的信号转导效率较低。相反，抗体细胞因子嫁接蛋白在具有高IL-10R1和R2表达的细胞(例如单核细胞)上更有效地发放信号。IgGIL10M13的一类平均负染色EM研究突出了单体之间的额外灵活性和更宽的角度，证实与rhIL10相比，几何位置(geometry)发生了改变。IgGIL10M13中IL10二聚体的较少限制的几何位置改变其与IL10R复合物的相互作用。因此，IgGIL10M13抗体细胞因子嫁接蛋白的结构导致仅在具有高水平IL10R1和R2表达的细胞类型上产生生产信号的生物学效应。
实施例14:IgGIL10M13的晶体结构
将IgGIL10M13Fab在20mM HEPES pH 8.0，150mM NaCl中浓缩至16.2mg/ml，并直接用于悬滴蒸汽扩散结晶试验。通过将0.2μl蛋白质溶液与0.2μl储存液混合并针对50μl相同的储存液平衡来设置结晶筛选。20℃下，20％PEG3350，200mM乙酸镁，pH7.9的储存液中3-4周后出现用于数据收集的晶体。在收集数据之前，将晶体浸泡在补充有20％乙二醇的储存液中并在液氮中快速冷却。
使用ADSC Quantum 315R检测器在ALS光束线5.0.3处收集衍射数据。使用HKL2000软件包(Otwinowski和Minor。(1997)Methods in Enzymology，276册:MacromolecularCrystallography，A部分，第307-326页)对数据进行索引和缩放。将IgGIL10M13Fab的数据在空间群P21中处理至2.40埃，其中单元尺寸a＝80.6埃，b＝104.7埃，c＝82.8埃，α＝90°，β＝115.3°，γ＝90°。采用PHASER(McCoy等人，(2007)J.Appl.Cryst.40:658-674)，用帕利珠单抗Fab结构(PDB代码:2HWZ)和单体IL10结构(PDB代码:1LK3)作为搜索模型，通过分子置换解析结构。链A)。顶部分子置换溶液在不对称单元中含有2分子的IgGIL10M13Fab。最终模型在COOT(Emsley&Cowtan(2004)Acta Cryst.D60:2126-2132)中构建，并用PHENIX(Adams等，(2010)Acta Cryst.D66,213-221)精制。Rwork和Rfree值分别为18.8％和23.9％，理想键长和键角的均方根(r.m.s)偏差值分别为0.005和0.882°。
整体结构
IgGIL10M13Fab在不对称单元中以2个分子结晶，两者具有相似的构象。两个分子的电子密度图相似。总体结构(图13A)显示Fab和嫁接单体IL10(IL10M)可采用共线排列(白色Fab轻链，黑色Fab重链，深灰色IL10M)。图13B显示了CDR-L1中嫁接点的近视图。三个侧翼CDR残基用深灰色棒显示。虚线表示由于缺少电子密度而无法在模型中拟合的结构部分，可能是由于这些区域中的结构灵活性。这两个区域包括紧接在嫁接点后的IL10M的N末端6个残基以及IL10M中的螺旋4和5之间的8个残基，其包括插入的6残基接头(GGGSGG)(SEQ IDNO:251)。在嫁接的IL10M分子和Fab重链的部分之间还存在3对氢键相互作用(图13C)。这些包括R138和N104(侧链)，R135和D56(侧链)，以及N38和K58(骨架/侧链)。
材料和方法
抗炎试验(LPS-攻击人体全血)
在测定培养基(RPMI 1640，含有谷氨酰胺(Hyclone)、10％热灭活的FBS(OmegaScientific)、1％青霉素/链霉素(Gibco)、50uM 2-巯基乙烯(Gibco)、10mM Hepes pH 7.4(Hyclone)、0.1mM非必需氨基酸(Hyclone)、1mM丙酮酸钠(Hyclone)和1x人胰岛素/转铁蛋白/硒(Gibco))中以1000ng/ml制备10x的IL10抗体细胞因子嫁接蛋白。测定培养基中的每IL10抗体细胞因子嫁接蛋白的10x储液1:3连续稀释，以产生11点剂量滴定。
在测定培养基中将人全血稀释至90％并轻柔混合。将未刺激的稀释全血置于n＝3个孔(45μl/孔)中，并添加测定培养基(5μl/孔)以使最终孔体积达到50μl。将脂多糖(LPS，Invivogen储液100μg/ml)以220ng/ml掺入稀释的全血中并轻柔混合。然后将掺入LPS的全血铺板，将IL10蛋白加入各孔中，然后轻柔混合并在37℃培养箱，5％CO2中孵育约20小时。然后将平板轻柔混合并在室温下以1400转/分钟离心5分钟，并通过使用人TNF-αHTRF试剂盒(Cisbio)，根据制造商的说明，从测定板10μl/孔转移至用于TNFα检测的代用板(proxyplate)来收获上清，且结果与使用制造商提供的对照产生的标准曲线进行比较。
促炎测定(人原代CD8T细胞激活)
从Blutspende Zentrum Basel的血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMC)。每个血沉棕黄层的八个Leucosep管(Greiner，227290)各自装入15ml Ficoll-Paque PLUS(GEHealthcare，17-1440-03)并离心(1分钟，1000g，20℃)。在磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.4(Gibco，10010-015)中1:4稀释血沉棕黄层，并将35ml覆盖在每个Ficoll梯度上。离心(800g，20分钟，20℃)后，淋巴细胞分离成白细胞层。将该细胞层转移到新管中并用PBS洗涤。通过每管中在2ml Gey红血细胞裂解液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA)中重悬细胞沉淀来裂解红细胞。温育5分钟后，用PBS洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，将PBMC重悬于T细胞培养基(TCM)中。TCM含有RPMI 1640(Gibco，21875-034)、10％胎牛血清(Gibco，10082147)、1％青霉素-霉素(Gibco，15070063)、2mM GlutaMax(Gibco，35050-038)和50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素。通过40μm细胞过滤器(BD Falcon，734-0002)过滤PBMC以获得单细胞悬液并计数。根据制造商Big Easy Magnet(StemCell，18001)的方案，使用人CD8+T细胞富集试剂盒(StemCell，19053)从PBMC中纯化CD8+T细胞。分离后，洗涤细胞，计数并重悬于TCM中，浓度为1.8×106个细胞/ml。将抗CD3/CD28包被的平板(参见2.1.1节)用每孔2mlTCM洗涤一次，然后每孔加入1ml的1.8×106CD8+T细胞。将板离心(5分钟，520g，20℃)并在37℃、5％CO2、95％湿度的细胞培养箱(Binder)中孵育3天。
用IL10抗体细胞因子嫁接蛋白刺激
孵育三天后，从24孔板合并激活的CD8+T细胞，并用TCM洗涤一次。计数细胞，以3x106个细胞/ml重悬于TCM中，并将100μl中的300,000个细胞加入Nunclon Delta Surface96孔圆底板的每个孔中(Thermo Scientific，163320)中。单独板中，在TCM中以下浓度(40、4、0.4、0.04、0.004和0nM)制备IL10抗体细胞因子嫁接蛋白预稀释液，其浓度为最终浓度的两倍。将100μl这些预稀释液一式两份加入到100μl细胞悬液中，得到的抗体细胞因子嫁接蛋白的最终浓度为20、2、0.2、0.02、0.002和0nM。将板在37℃下孵育48小时。
PMA和抗CD3刺激和Golgistop
孵育期后，将板离心(2分钟，970g，20℃)并弃去上清。将细胞沉淀重悬于200μl含有2ng/ml佛波醇-肉豆蔻酸乙酸酯(PMA，Sigma Aldrich，79346)、2.5μg/ml抗CD3(BD，555336)和1:1500GolgiStop(BD，554724)的TCM中。将板在37℃温育5小时以重新刺激细胞。然后，将板离心(2分钟，970g，20℃)，弃去上清并加入200μl冰冷的PBS以洗涤细胞沉淀。离心(2分钟，970g，20℃)后，除去PBS，将细胞重新悬浮于含有2％Triton X-100(Serva，39795)的200μl冰冷的200mM Tris-HCl缓冲液(pH8.1)中来裂解细胞。将板在冰上放置15分钟并离心(10分钟，970g，4℃)以除去碎片。将上清小心地转移到新的96孔板中并冷冻储存。为了检测，根据制造商的方案使用干扰素-(上清中的IFN-人ELISA(R&D systems，DY285)。如2.1.5节所述获得的上清以1:2稀释。为了检测上清中的粒酶B(GrzB)，根据制造商的方案使用人粒酶ELISA(Mabtech，3485-1H-20)。将上清以1:50稀释在推荐的分析稀释液中。ELISA板的光密度(OD)由Spectra340PC读板仪(Molecular Devices)获得，并通过Pro软件根据自动生成的标准曲线转换为浓度。数据输出至Microsoft Excel，其中根据稀释因子反推出浓度。
IL10依赖性信号传导
CyTOF是FACS/质谱技术，用于同时评估单一药剂对多种细胞群的激活。将抗体细胞因子嫁接蛋白与人全血孵育20分钟。刺激后，用针对细胞特异性表面受体CD14、HLA-DR、CD4、CD8、CD19、CD56和信号传导标记pSTAT3的金属缀合抗体处理PBMC，并通过CyTOF进行分析。结果表明，所有剂量的IgGIL10M13主要激活单核细胞和巨噬细胞细胞群，几乎没有T细胞、B细胞、NK细胞和树突细胞群的激活。相反，rhIL10在一定程度上激活了所有测试的细胞群。
药代动力学评价
在C57Bl/6小鼠中评估抗体细胞因子嫁接蛋白的半衰期。将0.9％盐水中的抗体细胞因子嫁接蛋白0.2mg/kg(10ml/kg剂量体积)皮下注射，并且在注射后1小时和注射后144小时开始采血。在每个时间点将全血收集到肝素处理的管中，并在4℃以12,500转/分钟离心10分钟。收集血浆上清并储存在-80℃直至所有时间点均已收集。使用两种不同的免疫测定法测定血浆中的抗体细胞因子嫁接蛋白水平，以能够检测IL10和抗体细胞因子嫁接蛋白的抗体结构域。第一种方法使用推荐使用的市售1L-10ELISA试剂盒(BD人IL10ELISA Set，捕获:rhIL10/检测:生物素-rhIL10)。第二种方法包括基于IL10的捕获和基于Fc的检测免疫测定，其在xP工作站(Gyros AB Uppsala，瑞典)上运行。具体地，所用试剂包括生物素化的人IL10捕获(R&D Systems BAF217)和Alexafluor 647山羊抗人IgG，Fcγ特异性检测(Jackson ImmunoResearch#109-605-098)。使用Gyros批准的向导方法(Gyros-approved wizard method)在200nL CD(Gyros#P0004180)上进行测定。使用的缓冲液是用于标准和样品稀释的Rexxip A(Gyros#P0004820)和用于检测制备的RexxipF(Gyros#P0004825)。使用数据分析软件进行结果分析。
药效学评价
与延长的半衰期一致，抗体细胞因子嫁接蛋白也显示出改善的药效学。在皮下给药后，在靶组织(血液和结肠)中监测磷酸化stat3(pSTAT3)，IL10R激活的标志物。将0.9％盐水中的抗体细胞因子嫁接蛋白0.2mg/kg(10ml/kg剂量体积)皮下注射。从注射后1小时开始和注射后144小时开始收获末端全血和结肠组织(在回肠-盲肠连接处2cm)。将全血收集到含有1x磷酸酶抑制剂(Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail)的肝素处理的管中，并保持在冰上直至磷酸化-Stat3测定。将结肠组织收集在含有冷PBS和1x磷酸酶抑制剂的管中。在时间点收集所有的组织后，将结肠组织转移到含有钢珠和700μl含有10μMDTT的PBS、1x蛋白酶抑制剂混合物、10x磷酸酶抑制剂混合物和10x细胞裂解缓冲液的完整细胞裂解缓冲液的管中(Active Motif Nuclear Extraction Kit)。在室温下通过组织裂解器以30rps将结肠组织匀浆5分钟。将裂解的组织在14,000xg，4℃下离心10分钟。收集上清并储存在冰上直至磷酸化-STAT3测定。
在全血和结肠组织收集和处理的同一天进行磷酸化-Stat3测定板(Meso ScalepSTAT3(Tyr705)测定)。使用提供的1x MSD裂解缓冲液裂解冰冷的全血，所述缓冲液含有1x磷酸酶抑制剂2、1x磷酸酶抑制剂3和1x蛋白酶抑制剂。将每管全血在4℃下以12,500转/分钟离心10分钟。收集血浆并丢弃。将沉淀的全血重悬于220μlMSD裂解缓冲液+抑制剂中并彻底涡旋。将裂解的全血以50μl/孔接种到磷酸化-STAT3测定板的各孔中。使用Bradford Assay(Pierce)进行结肠组织上清蛋白检测。然后将结肠蛋白以50μl/孔置于磷酸化-STAT3测定板上。将板在室温下温育2小时，洗涤，并用磷酸化-STAT3或总STAT3抗体(Meso Scale Discovery)处理。在MSD扇形成像仪(MSD Sector Imager)2400(Meso ScaleDiscovery)上分析平板的相对荧光单位(RFU)。将全血磷酸化-STAT3 RFU标准化为总STAT3RFU。将结肠蛋白磷酸化-STAT3 RFU标准化为加载的蛋白质浓度。在给药后至少72小时在两种组织中检测到增强的pSTAT3信号，并且在给药后144小时不存在。参见图5，未示出。该特征是对rhIL10的显著改善，rhIL10在给药后24小时不存在其信号。
离体疗效
进行LPS攻击后TNFα抑制功效的直接比较。在该测定中，C57/Bl6小鼠皮下施用载体、0.2mg/kg IgGIL10M13(10ml/kg剂量体积)或等摩尔水平的rhIL10。在施用后1.5小时和施用后144小时之前收集全血。将全血收集到肝素处理的管中。在采血之前，制备测定培养基。测定培养基含有具有谷氨酰胺的RPMI 1640(Hyclone)，含10％热灭活的FBS(OmegaScientific)、1％青霉素/链霉素(Gibco)、50μM2-巯基乙烯(Gibco)、10mM Hepes pH 7.4(Hyclone)、0.1mM Non-必需氨基酸(Hyclone)和1mM丙酮酸钠(Hyclone)。将小鼠全血以25μl/孔/重复/小鼠置于384孔板上。将测定培养基加入未刺激的对照孔(25μl/孔)中以使最终孔体积达到50μl。对于LPS攻击，将LPS(Invivogen，原种100μg/ml)以200ng/ml[100ng/ml最终测定]掺入测定培养基中并轻柔混合。然后将掺入LPS的BCM以25μl/孔接种于含有小鼠全血的每个所需孔中。将板轻柔混合并在37℃培养箱，5％CO 2中温育21小时。第二天，将测定板在室温下以1400转/分钟离心5分钟。收集每个孔的上清并在-80℃冷冻直至所有时间点均已测定。一旦可以分析所有时间点，将上清接种到MSD小鼠Pro-Inflammatory细胞因子测定板(Meso Scale Discovery)上。在MSD扇形成像仪(Meso ScaleDiscovery)上分析平板的TNFα(pg/ml)。
免疫刺激分析
MC/9细胞增殖
通过检测刺激MC/9(源自小鼠胎肝的肥大细胞系)细胞增殖的能力来评估IL10抗体细胞因子嫁接蛋白的免疫刺激活性。首先，将IL10抗体细胞因子嫁接蛋白在不含T-STIM(7X＝700ng/ml)的生长培养基中以7X在不同的384孔板中稀释。包括IL-4作为阳性对照(7X＝1,000ng/ml，[终浓度]＝143ng/ml)。其次，将30μl的1.67×104细胞/ml MC/9细胞置于没有T-STIM的培养基中的白色384孔TC处理的板(500细胞/孔)中(不需要在测定之前洗涤细胞)。第三，将5μl稀释的IL10抗体细胞因子嫁接蛋白加入细胞中。使用平板混合器将板短暂混合，然后以1,000转/分钟脉冲旋转。用定制的多孔盖覆盖板以使细胞通气。第四，将板在37℃下孵育72小时。第五，向细胞中加入30μlPromegaCell Titer在室温下孵育10分钟并在上读取(0.1秒读数)。
B细胞增殖
如上所述从人血沉棕黄层分离PBMC。为了分离B细胞，根据制造商的Big Easy(Stemcell，18001)方案使用人B cell enrichment(B细胞富集试剂盒)(Stemcell，19054)。分离后，用B细胞培养基(BCM)洗涤B细胞，计数并以4×105细胞/ml的浓度重悬。BCM含有RPMI 1640、10％胎牛血清(Gibco，10082147)、1％青霉素-链霉素(Gibco，15070063)和2mM GlutaMax(Gibco，35050-038)、1％非必需氨基酸(Gibco，11140035)和1mM丙酮酸钠(Gibco，11360-039)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。计数分离的B细胞，并以4×105细胞/ml的浓度重悬于BCM中。为了刺激B细胞，将8.4μg/ml抗CD40和40U/ml重组人IL-2(R&D系统，202-IL-50)加入悬液中。然后将B细胞以4×104细胞的浓度以100μl加入NunclonDelta96孔圆底板(Thermo Scientific，163320)的孔中。在不同的板中制备最终浓度加倍的IL10抗体嫁接蛋白预稀释液。进行化合物的滴定，获得以下浓度:40、4、0.4、0.04、0.004和0nM。将100μl这些预稀释液一式两份加入到100μl细胞悬液中，得到化合物的最终浓度为20、2、0.2、0.02、0.002和0nM，终浓度为4.2mg/ml抗CD40和20U/ml重组IL-2。将板在细胞培养箱(37℃，5％CO 2，95％湿度)中温育5天。温育5天后，通过胸苷掺入测定法测定B细胞的增殖。培养期间的最后16小时，在20μlBCM中，37℃下，每孔用0.5μCi3H-胸苷(ANAWA，ART-178)脉冲细胞。根据制造商的流程，使用TomTec收获器，将细胞收获到膜上。将膜密封在袋中，加入闪烁液并在闪烁计数器上测量放射性。对于每种抗体嫁接蛋白，相对于相应的背景细胞因子产生(“底部”)，相对于等摩尔浓度的rhIL10的增殖计算20nM(“上”)的增殖百分比。使用以下公式计算得到的最大值％:
最大值％＝(上部化合物-底物化合物)/(上部rhIL-10-底物rhIL-10)*100
确定不同实验系列的平均值，如果在两个以上的供体上测量化合物，则计算平均值的标准误差(SEM)。
应理解，本文描述的实施例和实施方案是出于说明性目的，并且本领域技术人员将建议对其进行各种修改或改变，这些各种修改或改变将包括在本申请和所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、序列号、专利和专利申请均出于所有目的，通过引用完整并入本文。

Claims (46)

1.抗体细胞因子嫁接蛋白，其包含:
(a)重链可变区(VH)，包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3；和
(b)轻链可变区(VL)，包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和
(c)嫁接至VH的CDR中或VL的CDR中的白细胞介素10(IL10)单体分子。
2.权利要求1的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子嫁接至重链CDR中。
3.权利要求2的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中重链CDR是HCDR1、HCDR2或HCDR3。
4.权利要求3的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子嫁接至HCDR1中。
5.权利要求1的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子嫁接至轻链CDR中。
6.权利要求5的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中轻链CDR是LCDR1、LCDR2或LCDR3。
7.权利要求6的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子嫁接至LCDR1中。
8.权利要求1-7中任一项的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中与重组人IL10相比，抗体细胞因子嫁接蛋白能够较少地激活T细胞或NK细胞。
9.权利要求1-7中任一项的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中抗体细胞因子嫁接蛋白具有比rhIL10半衰期长的半衰期。
10.权利要求1的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IL10单体分子由SEQ ID NO:209组成。
11.权利要求1的抗体细胞因子嫁接蛋白，其还包含IgG类抗体重链。
12.权利要求11的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中IgG类重链选自IgG1、IgG2或IgG4。
13.权利要求1的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中在嫁接的IL10单体分子存在下，CDR与靶蛋白的结合特异性降低。
14.权利要求1的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中在嫁接的IL10单体分子存在下，CDR与靶蛋白的结合特异性保留。
15.权利要求14的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中CDR的结合特异性不同于IL10单体分子的细胞因子-受体结合特异性。
16.权利要求14的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中CDR的结合特异性针对非人靶标。
17.权利要求1的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中VH或VL是人源化的或人的。
18.抗体细胞因子嫁接蛋白，其包含:
(i)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:193的HCDR1、(b)SEQ ID NO:194的HCDR2、(c)SEQ ID NO:195的HCDR3，及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:196的LCDR1、(e)SEQ IDNO:197的LCDR2及(f)SEQ ID NO:198的LCDR3；
(ii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:97的HCDR1、(b)SEQ ID NO:98的HCDR2、(c)SEQID NO:99的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:100的LCDR1、(e)SEQ ID NO:101的LCDR2及(f)SEQ ID NO:102的LCDR3；
(iii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:1的HCDR1、(b)SEQ ID NO:2的HCDR2、(c)SEQID NO:3的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:4的LCDR1、(e)SEQ ID NO:5的LCDR2及(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；
(iv)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:17的HCDR1、(b)SEQ ID NO:18的HCDR2、(c)SEQID NO:19的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:20的LCDR1、(e)SEQ ID NO:21的LCDR2及(f)SEQ ID NO:22的LCDR3；
(v)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:33的HCDR1、(b)SEQ ID NO:34的HCDR2、(c)SEQID NO:35的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:36的LCDR1、(e)SEQ ID NO:37的LCDR2及(f)SEQ ID NO:38的LCDR3；
(vi)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:49的HCDR1、(b)SEQ ID NO:50的HCDR2、(c)SEQID NO:51的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:52的LCDR1、(e)SEQ ID NO:53的LCDR2及(f)SEQ ID NO:54的LCDR3；
(vii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:68的LCDR1、(e)SEQ ID NO:69的LCDR2及(f)SEQ ID NO:70的LCDR3；
(viii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:81的HCDR1、(b)SEQ ID NO:82的HCDR2、(c)SEQ ID NO:83的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:84的LCDR1、(e)SEQ ID NO:85的LCDR2及(f)SEQ ID NO:86的LCDR3；
(ix)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:113的HCDR1、(b)SEQ ID NO:114的HCDR2、(c)SEQ ID NO:115的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:116的LCDR1、(e)SEQ IDNO:117的LCDR2及(f)SEQ ID NO:118的LCDR3；
(x)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:129的HCDR1、(b)SEQ ID NO:130的HCDR2、(c)SEQ ID NO:131的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:132的LCDR1、(e)SEQ IDNO:133的LCDR2及(f)SEQ ID NO:134的LCDR3；
(xi)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:145的HCDR1、(b)SEQ ID NO:146的HCDR2、(c)SEQ ID NO:147的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:148的LCDR1、(e)SEQ IDNO:149的LCDR2及(f)SEQ ID NO:150的LCDR3；
(xii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:161的HCDR1、(b)SEQ ID NO:162的HCDR2、(c)SEQ ID NO:163的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:164的LCDR1、(e)SEQ IDNO:165的LCDR2及(f)SEQ ID NO:166的LCDR3；
(xiii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:177的HCDR1、(b)SEQ ID NO:178的HCDR2、(c)SEQ ID NO:179的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:180的LCDR1、(e)SEQ IDNO:181的LCDR2及(f)SEQ ID NO:182的LCDR3；
(xiv)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:210的HCDR1、(b)SEQ ID NO:211的HCDR2、(c)SEQ ID NO:212的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:213的LCDR1、(e)SEQ IDNO:214的LCDR2及(f)SEQ ID NO:215的LCDR3；或
(xv)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:226的HCDR1、(b)SEQ ID NO:227的HCDR2、(c)SEQ ID NO:228的HCDR3；及轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:229的LCDR1、(e)SEQ IDNO:230的LCDR2及(f)SEQ ID NO:231的LCDR3。
19.抗体细胞因子嫁接蛋白，其包含:
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:205；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:206；
(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:109；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:110；
(iii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:13；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:14；
(iv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:29；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:30；
(v)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:45；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:46；
(vi)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:61；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:62；
(vii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:77；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:78；
(viii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:93；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:94；
(ix)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:125；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:126；
(x)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:141；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:142；
(xi)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:157；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:158；
(xii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:173；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:174；
(xiii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:189；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:190；
(xiv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:222；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:223；及
(xv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:238；及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:239。
20.根据权利要求1-19中任一项的抗体细胞因子嫁接蛋白，其还包含与降低的效应子功能相应的经修饰的Fc区。
21.权利要求20的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中经修饰的Fc区包含选自D265A、P329A、P329G、N297A、L234A和L235A中的一个或多个的突变。
22.权利要求21的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中经修饰的Fc区选自D265A/P329A、D265A/N297A、L234A/L235A、P329A/L234A/L235A和P329G/L234A/L235A。
23.抗体细胞因子嫁接蛋白，其由以下组成:SEQ ID NO:193的HCDR1、SEQ ID NO:194的HCDR2、SEQ ID NO:195的HCDR3、SEQ ID NO:196的LCDR1、SEQ ID NO:197的LCDR2、SEQ IDNO:198的LCDR3、含有突变D265A/P329A的经修饰的Fc区；并且其中与rhIL10相比时，抗体细胞因子嫁接蛋白具有较少的T细胞或NK细胞激活。
24.权利要求23的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中CDR的结合特异性针对非人靶标。
25.权利要求23的抗体细胞因子嫁接蛋白，其中抗体细胞因子嫁接蛋白具有比rhIL10半衰期长的半衰期。
26.分离的核酸，其包含:
(i)编码重链可变区的多核苷酸序列SEQ ID NO:246和编码轻链可变区的多核苷酸序列SEQ ID NO:247；
(ii)编码重链的多核苷酸序列SEQ ID NO:248和编码轻链的多核苷酸序列SEQ ID NO:249；
(iii)编码重链可变区的多核苷酸序列SEQ ID NO:242和编码轻链可变区的多核苷酸序列SEQ ID NO:243；或
(iv)编码重链的多核苷酸序列SEQ ID NO:244和编码轻链的多核苷酸序列SEQ ID NO:245。
27.适用于产生抗体细胞因子嫁接蛋白的重组宿主细胞，其包含权利要求26的编码抗体细胞因子嫁接蛋白的重链多肽和轻链多肽的核酸，以及任选的分泌信号。
28.权利要求27的宿主细胞，其中细胞是哺乳动物细胞。
29.药物组合物，其包含权利要求1-26中任一项的抗体细胞因子嫁接蛋白和可药用载体。
30.治疗或预防有需要的个体的免疫相关病症的方法，其包括向个体施用治疗有效量的权利要求1的抗体细胞因子嫁接蛋白。
31.权利要求30的方法，其中免疫相关病症选自:炎症性肠病、克隆病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥综合征、白塞病、结节病和移植物抗宿主病(GVHD)。
32.权利要求30的方法，其中抗体细胞因子嫁接蛋白与另一种治疗剂组合施用。
33.权利要求32的方法，其中治疗剂是选自以下的抗TNF剂:英利昔单抗、阿达木单抗、培舍珠单抗、戈利木单抗、那他珠单抗及维多珠单抗。
34.权利要求32的方法，其中所述治疗剂是选自以下的氨基水杨酸盐物质:柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸盐、巴柳氮、奥沙拉秦和5-对氨水杨酸的其他衍生物。
35.权利要求32的方法，其中治疗剂是选自以下的皮质类固醇:甲泼尼龙、氢化可的松、泼尼松、布地奈德、5-氨基水杨酸盐及地塞米松。
36.如权利要求32所述的方法，其中治疗剂是抗细菌剂。
37.在有需要的患者中激活单核细胞的方法，其包括施用权利要求1-25中任一项的抗体细胞因子嫁接蛋白。
38.权利要求37的方法，其中单核细胞被激活，T细胞或NK细胞不被激活。
39.权利要求37的方法，其中抗体细胞因子嫁接蛋白的施用减少TNFα的产生。
40.抗体细胞因子嫁接蛋白在免疫治疗相关疾病中的用途，所述抗体细胞因子嫁接蛋白包含:
(i)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:193的HCDR1、(b)SEQ ID NO:194的HCDR2、(c)SEQ ID NO:195的HCDR3；和轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:196的LCDR1、(e)SEQ IDNO:197的LCDR2和(f)SEQ ID NO:198的LCDR3；或
(ii)重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:97的HCDR1、(b)SEQ ID NO:98的HCDR2、(c)SEQID NO:99的HCDR3；和轻链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:100的LCDR1、(e)SEQ ID NO:101的LCDR2和(f)SEQ ID NO:102的LCDR3。
41.权利要求40的抗体细胞因子嫁接蛋白在治疗免疫相关病症中的用途，所述免疫治疗相关疾病选自：炎症性肠病、克隆病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、急性胰腺炎、葡萄膜炎、干燥综合征、白塞病、结节病和移植物抗宿主病(GVHD)。
42.权利要求40的用途，其中所述抗体细胞因子嫁接蛋白与另一种治疗剂组合施用。
43.权利要求42的用途，其中治疗剂是选自以下的抗TNF剂:英利昔单抗、阿达木单抗、培舍珠单抗、戈利木单抗、那他珠单抗及维多珠单抗。
44.权利要求42的用途，其中治疗剂是选自以下的氨基水杨酸盐物质:柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸盐、巴柳氮、奥沙拉秦和5-对氨水杨酸的其他衍生物。
45.权利要求42的用途，其中治疗剂是选自以下的皮质类固醇:甲泼尼龙、氢化可的松、泼尼松、布地奈德、5-氨基水杨酸盐及地塞米松。
46.如权利要求42的用途，其中所述治疗剂是抗细菌剂。
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