CN114302891A - 新的il-10变体蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的IL‑10变体蛋白，并且通过形成单体，提供生产产率高且免疫活化受抑制的新的单体IL‑10蛋白。

Description

新的IL-10变体蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及新的IL-10变体蛋白及其用途。特别地，本发明涉及其生产产率和免疫抑制活性得到增强的新的IL-10变体蛋白及其用途。
背景技术
白细胞介素10 (以下被称为"IL-10")是作为约37 kDa的非共价结合的同源二聚体表达的抗炎细胞因子，其称为细胞因子合成抑制因子(CSIF)。IL-10在免疫耐受的诱导和维持中起重要作用，并且这些占优势的抗炎性质早已为人所知。IL-10抑制促炎细胞因子例如TNFα、IL-1、IL-6和IL-12以及Th1细胞因子例如IL-2和INFγ的分泌，并且调控吞噬细胞、B细胞和T细胞的分化和增殖(Glocker等人，Ann. NY Acad. Sci. 1246: 102-107，2011；Moore等人，Annu. Rev. Immunol. 19: 683- 765 (2001)；Waal Malefyt等人，J. Exp. Med. 174: 915-924，1991)，Williams等人，Immunol. 113: 281-292，2004)。另外，它是抗原呈递的有力抑制剂，抑制MHC II类表达以及共刺激因子CD80和CD86的上调(Mosser &Yhang，Immunol. Rev. 226: 205-218，2008)。由于这些特性，已进行了各种研究，以使用IL-10作为用于炎性肠病或免疫相关疾病如银屑病的治疗剂。
然而，已知IL-10具有双重特性，其也具有免疫刺激活性的相反效应。在这方面，具体而言，IL-10刺激B细胞活化，延长B细胞的存活，并且可能促成B细胞的类别转换。它还可以刺激NK细胞增殖和细胞因子产生，并且可以充当促进CD8+ T细胞的特定亚群增殖的生长因子(Mosser & Yhang，Immunol. Rev. 226: 205-218，2009；Cai等人，Eur. J. Immunol. 29: 2658-2665，1999；Santin等人，J. Virol. 74: 4729-4737，2000；Rowbottom等人，Immunol. 160: 3188-3193，1998)。重要的是，已报道在人中高剂量的IL-10 (分别为20和25 μg/kg)可以增加IFNγ的产生(Lauw等人，J. Immunol.，165: 2783-2789，2000；Tilg等人，Gut 50: 191-195，2002)。
相应地，已报道IL-10蛋白的第87个氨基酸异亮氨酸涉及免疫活化，并且当由丙氨酸取代时，免疫活化可以被抑制(Ding等人，J. Exp. Med. 191 (2): 213-223，2000)。然而，在IL-10变体蛋白的情况下，已确认了与野生型相比，与IL-10R1的结合亲和性非常弱，并且因此，它的不利之处在于对于等价的免疫抑制活性需要高剂量的施用。
另一方面，由于IL-10蛋白的结构性质，当作为重组蛋白质生产时，生成大量的不溶性聚集物，其在生产率方面造成极大的问题。相应地，已通过在基于IL-10的二级结构的第四个和第五个α螺旋之间引入6 a.a.的接头肽，开发了并不形成二聚体的单体IL-10(Josephson等人，J. Biol. Chem. 275(18): 13552-13557，2000)，但它在体内具有短半衰期以及极低的活性，这是其作为治疗剂使用的障碍。为了克服在体内的这种低稳定性，尝试将IL-10表达为与IgA的Fc结构域连接的融合蛋白(Westerhof等人，PLOS ONE 7(10):e46460，2012)。但是，融合蛋白显示IL-10活性的有限恢复。
发明内容
技术问题
本发明是为了解决包括上述问题的各种问题，并且本发明的目的是提供更有效且体内稳定性和安全性得到增强的新的IL-10变体蛋白。然而，本发明的范围并不限于此。
发明概述
在本发明的一个方面，提供了单体IL-10变体蛋白，其中长度为6至12 a.a.的间隔肽插入在基于人白介素10 (IL-10)的成熟形式的第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间。
在本发明的另一个方面，提供了包含单体IL-10变体蛋白的融合蛋白，在所述单体IL-10变体蛋白中，长度为6至12 a.a.的间隔肽插入在基于人白介素10 (IL-10)的成熟形式的第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间。
在本发明的另一个方面，提供了编码单体IL-10变体蛋白或融合蛋白的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的重组载体。
在本发明的另一个方面，提供了用于免疫抑制的药物组合物，其包含单体IL-10变体蛋白或融合蛋白作为活性成分。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含单体IL-10变体蛋白或融合蛋白作为活性成分。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的单体IL-10变体蛋白或融合蛋白。
发明效果
根据本发明的一个实施方案的单体IL-10变体蛋白可以用作新的免疫抑制剂和/或治疗剂，其用于治疗自身免疫性疾病，抑制作为IL-10蛋白的双重作用之一的免疫活化，改善生产效率，以及维持其在与其它生理活性蛋白的融合蛋白形式中的活性。
附图说明
图1是说明IL-10二聚体(左)、IL-10二聚体的单体(中)；以及根据本发明的一个实施方案，通过插入间隔肽而具有稳定的单体结构的IL-10单体(右)的三维结构的结构图解。
图2A是显示通过将二聚体IL-10变体蛋白与Fc蛋白连接而构建的融合蛋白，在非还原条件和还原条件下的SDS-PAGE分析结果的照片；并且图2B是显示通过SEC-HPLC分析来分析最终纯化的二聚体IL-10变体融合蛋白的结果的色谱图；图2C是显示在融合蛋白的纯化程序中的SDS-PAGE分析结果的照片，所述融合蛋白包含与Fc区连接的根据本发明的实施例1和2的单体IL-10变体蛋白；图2D是显示使用SEC-HPLC分析，根据本发明的实施例1 (上)和2 (下)的最终纯化的单体IL-10变体融合蛋白的纯度的一系列色谱图；并且图2E是显示根据本发明的比较例2的单体IL-10变体融合蛋白的SDS-PAGE分析结果的照片；并且图2F是显示根据比较例2的最终纯化的单体IL-10变体融合蛋白的纯度的色谱图。
图3A是显示在转染细胞中瞬时表达融合蛋白后，在使用蛋白A纯化根据本发明的实施例3的融合蛋白(PG075-8)的过程中，在非还原条件(左)和还原条件(右)下的SDS-PAGE分析结果的照片；并且图3B是显示在从瞬时转染的细胞中纯化的过程中，在第10个级分(A10)至第12个级分(A12)中，根据本发明的融合蛋白的纯度的分析结果的色谱图；图3C是显示在瞬时转染的细胞中表达后，在使用蛋白A的本发明的融合蛋白的纯化程序中，在非还原条件(右)和还原条件(左)下的SDS-PAGE分析结果的照片；图3D是显示在从瞬时转染的细胞中纯化的过程中，在第11个级分(A11)和第12个级分(A12)中，根据本发明的融合蛋白(PG075-9)的纯度的分析结果的色谱图；图3E是显示根据纯化程序检查由稳定细胞系表达的根据本发明的实施例3的融合蛋白(PG075-8)的表达程度，在非还原条件(左)和还原条件(右)下的SDS-PAGE分析结果的照片，所述稳定细胞系制备用于产生融合蛋白；并且图3F是显示检查稳定细胞系中的最终纯化的融合蛋白(PG075-8)的纯度的SEC-HPLC分析结果的色谱图。
图4A是显示使用FACS分析，调查根据本发明的比较例1和2以及实施例1和2的IL-10融合蛋白对CD4+ T细胞增殖的作用的结果的一系列直方图；图4B是定量图4A的结果的图；图4C是显示使用FACS分析，调查根据本发明的比较例1和2以及实施例1和2的IL-10融合蛋白对CD4+ T细胞增殖的作用的结果的直方图；并且图4D是定量图4C的结果的图。
图5A是显示取决于处理的浓度，rhIL-10 (对照)与根据本发明的比较例1和2以及实施例1和2的IL-10变体融合蛋白对骨髓衍生的肥大细胞增殖的作用的分析结果的图；并且图5B是显示在增加变体融合蛋白的处理浓度后，rhIL-10 (对照)以及根据本发明的比较例1和实施例1的IL-10变体融合蛋白对骨髓衍生的肥大细胞增殖的作用的分析结果的图。
图6A是显示取决于处理的浓度，在用根据比较例1的二聚体IL-10变体融合蛋白处理的肥大细胞中，TNF-α分泌变化的分析结果的图；图6B是显示取决于处理的浓度，在用根据本发明的比较例2以及实施例1和2的单体IL-10变体融合蛋白处理的肥大细胞中，TNF-α分泌变化的分析结果的图；图6C是显示根据本发明的一个实施方案的融合蛋白PG075-8和作为对照的二聚体IL-10变体蛋白(IL-10M-1；Fc-IL-10Vm)，在肥大细胞中的TNF-α分泌抑制活性的分析结果的图；并且图6D是显示取决于处理的浓度，根据本发明的一个实施方案的融合蛋白PG075-8在巨噬细胞中的TNF-α分泌抑制活性的分析结果的图。
图7是显示通过BLI分析，取决于处理的浓度，根据比较例1的二聚体IL-10变体融合蛋白(左)和根据本发明的实施例1的单体IL-10变体融合蛋白(右)与IL-10R1的结合亲和力的分析结果的一系列传感图。
图8A是显示通过BLI分析，作为对照的FcεRIα-Fc与小鼠IgE的结合亲和力的分析结果的传感图；并且图8B是显示通过BLI分析，根据本发明的实施例3的融合蛋白PG075-8(FcεRIα-Fc-IL-10Vm；下)与小鼠IgE的结合亲和力的分析结果的传感图；并且图8C是显示通过BLI分析，根据本发明的实施例3的融合蛋白PG075-8 (FcεRIα-Fc-IL-10Vm)与人IgE的结合亲和力的分析结果的传感图。
图9是说明在经由各种途径(静脉内、腹膜内、肌内和皮下注射)，将根据本发明的实施方案的融合蛋白施用于实验动物(大鼠)后，通过定量保留在血清中至多330小时的融合蛋白的量的药代动力学分析结果的图。
图10是显示当根据本发明的一个实施方案的融合蛋白PG075-8施用于实验动物时，检查白血细胞(A)、红血细胞(B)和血小板(C)的数目是否改变的血液毒性分析结果的一系列图。
图11涉及根据本发明的一个实施方案的融合蛋白PG075-8是否减少实验动物中的过敏症状的调查结果。图11显示表示以下的分析结果的一系列图：(A)在经由OVA经口施用于OVA致敏小鼠诱导食物过敏后，分别施用根据本发明的一个实施方案的PG075-8和IgETRAP (对照)时，腹泻症状的变化；(B)在实验完成后，由处死小鼠确定的游离IgE的浓度；(C)总IgE的浓度，过敏指标；以及(D)作为过敏指标的在血液肥大细胞中的脱粒酶(肥大细胞蛋白酶-1，MCPT-1)的浓度。
具体实施方式
在本发明的一个方面，提供了单体IL-10变体蛋白，其中长度为6至12 a.a.的间隔肽插入在基于人白介素10 (IL-10)的成熟形式的第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间。
在单体IL-10变体蛋白中，人白介素10的成熟形式可以衍生自UniProtKB P22301中描述的第19个至第178个氨基酸的序列。
在单体IL-10变体蛋白中，间隔肽可以具有7至11 a.a.、8至10 a.a.或9 a.a.的长度，或者可替代地，间隔肽可以具有6、7、8、9、10、11或12 a.a的长度。在一个特定实施方案中，间隔肽可以是具有GGSGGSGGS(SEQ ID NO: 4)、(GGGSGG)n (单位：SEQ ID NO: 5，n为1或2的整数)、(G4S)n (单位：SEQ ID NO: 12，n为1或2的整数)、(GGS)n (n为2至4的整数)、(GS)n (n为3至6的整数)、或(GSSGGS)n (单位：SEQ ID NO: 13，n为1至2的整数)的氨基酸序列的肽。由间隔肽组成的氨基酸残基可以由其它类型的氨基酸取代，只要它们不诱导任何不利的免疫原性反应，并且优选地可以具有9 a.a的长度。
本文使用的术语“间隔肽”指插入特定蛋白质内，并且在改变蛋白质的结构和/或功能中起作用的肽。在这个意义上，它区别于连接其它融合配偶体的接头肽，但常规的接头肽可以用作间隔肽。
根据本发明的一个实施方案的单体IL-10变体蛋白可以包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
单体IL-10变体蛋白可以是其中基于人IL-10蛋白的成熟形式的第87个氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代的单体IL-10变体蛋白，并且优选地可以具有SEQ ID NO: 39的氨基酸序列。
单体IL-10变体蛋白可以与通过SEQ ID NO: 1或39表示的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性，只要它具有单体结构，并且它可以衍生自哺乳动物。
在本发明的另一个方面，提供了包含单体IL-10变体蛋白的融合蛋白，在所述单体IL-10变体蛋白中，长度为6至12 a.a.的间隔肽插入在基于人白介素10 (IL-10)的成熟形式的第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间。
如本文使用的，术语“融合蛋白”指这样的重组蛋白质，其中两个或更多个蛋白质或负责蛋白质中的特定功能的结构域进行连接，使得每个蛋白质或结构域负责其原始功能。具有柔性结构的接头肽一般可以插入两个或更多个蛋白质或结构域之间。接头肽可以具有下述氨基酸序列中的任何一种：AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 2)、GGSGG (SEQID NO: 3)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 4)、GGGSGG (SEQ ID NO: 5)、 (G4S)n (单位：SEQ IDNO: 12，n为1至10的整数)、(GGS)n (n为1至10的整数)、(GS)n (n为1至10的整数)、(GSSGGS)n (单位：SEQ ID NO: 13，n为1至10的整数)、KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:14)、EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 15)、GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 16)、(EAAAK)n (单位：SEQ ID NO: 17，n为1至10的整数)、CRRRRRREAEAC (SEQ ID NO: 18)、A (EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A (SEQ ID NO: 19)、GGGGGGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGGGG (SEQ ID NO: 21)、AEAAAKEAAAAKA (SEQ ID NO: 22)、PAPAP (SEQ ID NO: 23)、(Ala-Pro)n (n为1至10的整数)、VSQTSKLTRAETVFPDV (SEQ ID NO: 24)、PLGLWA (SEQ ID NO: 25)、TRHRQPRGWE (SEQID NO: 26)、AGNRVRRSVG (SEQ ID NO: 27)、RRRRRRRR (SEQ ID NO: 28)、GFLG (SEQ IDNO: 29)、GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE (SEQ ID NO: 30)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 31)、 GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:34)、GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP (SEQ ID NO: 35)、RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP (SEQ ID NO: 36)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 37)、GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 38)、 EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 40)、EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 41)、THTCPPCP (SEQ ID NO: 42)、GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP (SEQ ID NO: 43)、AGSGGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 44)、和GGGSGGSTHTCPPCP (SEQ ID NO: 45)。
融合蛋白可以包括执行不同功能的一种或多种融合配偶体蛋白。此类融合配偶体蛋白可以是与靶蛋白特异性结合的抗体、抗体的抗原结合片段、与靶蛋白特异性结合的抗体模拟物、抗体Fc区、抗体Fc区受体或抗体Fc区受体的细胞外结构域、二聚化结构域、细胞因子或免疫调节肽。
在融合蛋白中，抗体的抗原结合片段可以是Fab、F(ab')2 、Fab'、scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、sdAb (单结构域抗体)、VNAR 或VHH，并且抗体模拟物可以是亲和体、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体(monobody)、repebody、VLR或nanoCLAMP。Fc区可以是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc区，或者Fc区可以是其中上述Ig亚类的Fc区的两个或更多个结构域(铰链、CH2和CH3结构域)混合的杂合Fc (hyFc)，并且IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。更具体而言，Fc区可以是变体Fc区，其负责抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的功能部分(效应子)进行突变，以便降低对于Fcγ受体(FcγRc)和补体(C1q)的亲和力，和/或Fc变体区，其进行改造以改善对新生儿Fc受体(FcRn)的选择性亲和力，从而具有延长的血液半衰期。在其中，杂合Fc可以是韩国专利号897938、1380732和1380729等中描述的那些杂合Fc，或者变体Fc区可以是国际专利申请PCT/KR2020/006346中描述的修饰的免疫球蛋白Fc蛋白(NTIG)。更具体而言，Fc区可以含有选自SEQ ID NO: 6至9的氨基酸序列。本文使用的术语‘NTIG’指修饰的Fc结构域蛋白，其中包括选自SEQ ID NO:6和7的氨基酸序列的杂合Fc蛋白的第18个和第196个氨基酸突变为其它氨基酸，其缺乏效应子功能例如ADCC和CDC，但通过增加对于FcRn的选择性亲和力而具有改善的血液半衰期。NTIG可能含有选自SEQ ID NO: 8和9的氨基酸序列。
二聚化结构域可以是抗体的铰链结构域、LIM/双重锌指基序、RAG1结构域、HAT二聚化结构域、TRFH二聚化结构域、Stat3二聚化结构域或LFB1/HNF1二聚化结构域，但不限于此。细胞因子可以是IL-4、IL-6、IL-1α或TGF-β。免疫调节肽可以是PD-1L或CTLA-4(CD152)。特别地，如果Fc结构域是融合配偶体蛋白，则可以通过铰链区中存在的半胱氨酸基团之间生成的分子间二硫键形成二聚体。融合配偶体蛋白可以连接至根据本发明的一个实施方案的单体IL-10变体蛋白的N末端或C末端。另外，在这种情况下，融合配偶体蛋白可以通过上述各种接头肽连接至单体IL-10变体蛋白。
如本文使用的，术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其是通过结合两条相同的重链和两条相同的轻链而产生的异源四聚体蛋白质，并且通过由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成的抗原结合位点，执行抗原特异性结合，从而引起抗原特异性体液免疫应答。
如本文使用的，术语“抗体的抗原结合片段”指具有衍生自抗体的抗原结合能力的片段，并且包括通过用蛋白质切割酶切割抗体产生的片段以及以重组方式产生的单链片段两者，并且其实例包括Fab、F(ab')2、scFv、双链抗体、三链抗体、sdAb和VHH。
如本文使用的，术语“Fab”指通过用蛋白水解酶木瓜蛋白酶切割抗体分子产生的抗原结合抗体片段(抗原结合片段)，是VH-CH1和VL-CL的两个肽的异源二聚体，并且由木瓜蛋白酶产生的另一个片段被称为Fc (可结晶片段)。
如本文使用的，术语“F(ab')2”指在通过用作为蛋白酶的胃蛋白酶切割抗体产生的片段中包括抗原结合位点的片段，并且是其中两个Fab'通过二硫键连接的四聚体的形式。由胃蛋白酶产生的另一个片段被称为pFc'。
如本文使用的，术语“Fab”指具有与通过在弱还原条件下分离上述F(ab’)2而产生的Fab相似的结构的分子。
如本文使用的，术语“scFv”是“单链可变片段”的缩写，并且指这样的片段，其并非实际抗体的片段，而是通过经由大小为约25 a.a.的接头肽，将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接而制备的一种融合蛋白，并且已知即使该片段不是独特的抗体片段，也具有抗原结合能力 (Glockshuber等人，Biochem. 29(6): 1362-1367，1990)。
如本文使用的，术语“双链抗体”和“三链抗体”分别指以通过接头连接的两个和三个scFv形式的抗体片段。
如本文使用的，术语“单结构域抗体(sdAb)”指也被称为纳米抗体并且由抗体的单个可变区片段组成的抗体片段。主要使用衍生自重链的sdAb，但衍生自轻链的单个可变区片段也被报道与抗原特异性结合。与由重链和轻链组成的常规抗体不同，仅由单链二聚体组成的由鲨鱼抗体的可变区片段组成的VNAR以及由骆驼抗体的可变区片段组成的VHH也包括在sdAb中。
如本文使用的，术语“抗体模拟物”或可替代地“抗体类似物”是包括蛋白质的概念，所述蛋白质具有与由非抗体衍生的蛋白质支架制备的抗体类似的功能，例如单抗体和可变淋巴细胞受体(VLR)，即具有抗原结合能力，不同于其中两条重链和两条轻链形成异源四聚体的四级结构以发挥功能的正常全长抗体。此类抗体模拟物的实例包括衍生自蛋白A的Z结构域的亲和体(Nygren，P. A.，FEBS J. 275(11): 2668至2676，2008)、衍生自γ-B晶体蛋白或泛素的Affilin (Ebersbach等人，J. Mol. Biol. 372(1): 172-185，2007)、衍生自胱抑素的Affimer (Johnson等人，Anal. Chem. 84(15): 6553-6560，2012)、衍生自Sac7d的Affitin (Krehenbrink等人，J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-1068，2008)、衍生自三螺旋卷曲螺旋蛋白的Alphabody (Desmet等人，Nat. Commun. 5: 5237，2014)、衍生自脂质运载蛋白的Anticalin (Skerra等人，FEBS J. 275(11): 2677-2683，2008)、衍生自各种膜受体的结构域的Avimer (Silverman等人，Nat. Biotechnol. 23(12): 1556-1561，2005)、衍生自锚蛋白重复基序的DARPin (Stumpp等人，Drug Discov. Today. 13(15-16):695-701，2008)、衍生自Fyn蛋白的SH3结构域的Fynomer (Grabulovski等人，J. Biol. Chem. 282(5): 3196-3204，2007)、衍生自各种蛋白质抑制剂的Kunitz结构域的Kunitz结构域肽(Nixon和Wood，Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 9(2): 261-268，2006)、衍生自纤连蛋白的第10个3型结构域的单体(Koide和Koide，Methods Mol. Biol. 352: 95-109，2007)、衍生自碳水化合物结合模块32-2的nanoCLAMP (Suderman等人，Protein Exp. Purif. 134: 114-124，2017)、衍生自盲鳗的可变淋巴细胞受体(VLR) (Boehm等人，Ann. Rev. Immunol. 30: 203-220，2012)、以及基于VLR的改造为增强抗原亲和力的repebody(Lee等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，109: 3299-3304，2012)。
在融合蛋白中，抗体Fc区受体可以是IgE Fc受体的α亚基的细胞外结构域。
在本发明的另一个方面，提供了编码单体IL-10变体蛋白或融合蛋白的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的重组载体。
在重组载体中，多核苷酸可以以与调控序列可操作地连接的基因构建体的形式包含。
如本文使用的，术语“可操作地连接的”意指靶核酸序列(例如，体外转录/翻译系统或在宿主细胞中)以这样的方式与调控序列连接，使得靶核酸序列可以表达。
如本文使用的，术语“调控序列”意欲包括启动子、增强子和其它调控元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列的实例包括指导使得靶核酸在许多宿主细胞中不断表达的序列，指导使得靶核酸仅在特定组织细胞中表达的序列(例如，组织特异性调控序列)，以及指导使得表达由特定信号诱导的序列(例如，诱导型调控序列)。本领域技术人员可以理解，表达载体的设计可以根据因素例如待转化的宿主细胞的选择和所需的蛋白质表达水平而变。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞内，以表达融合蛋白。使得能够在真核细胞和原核细胞中表达的调控序列是本领域技术人员众所周知的。如上所述，这些调控序列一般包括负责转录起始的调控序列，以及任选地负责转录终止和转录物稳定的多聚A信号。除转录调控因子之外，另外的调控序列还可以包括翻译增强因子和/或天然组合的或异源的启动子区。例如，使得能够在哺乳动物宿主细胞中表达的可能的调控序列包括CMV-HSV胸苷激酶启动子、SV40、RSV (劳斯肉瘤病毒)启动子、人肾尿素1α启动子、糖皮质激素诱导MMTV (莫洛尼小鼠肿瘤病毒)启动子、金属硫蛋白或四环素诱导型启动子、或扩增剂如CMV扩增剂和SV40扩增剂。对于神经细胞中的表达，考虑可以使用神经丝启动子、PGDF启动子、NSE启动子、PrP启动子或thy-1启动子。上述启动子是本领域已知的，并且在文献(Charron，J. Biol. Chem. 270: 25739至25745，1995)中进行描述。对于在原核细胞中的表达，已公开了许多启动子，包括lac启动子、tac启动子或trp启动子。除能够启动转录的因子之外，调控序列还可以包括在根据本发明的一个示例性实施方案的多核苷酸的下游的转录终止信号，例如SV40-多聚A位点和TK-多聚A位点。在本说明书中，合适的表达载体是本领域已知的，并且其实例包括Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1 (Parmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pSPORT1 (GIBCO BRL)、pGX-27 (韩国专利号1442254)、pX (Pagano等人，Science 255: 1144-1147，1992)、酵母双杂交载体如pEG202和dpJG4-5 (Gyuris等人，Cell 75: 791-803，1995)、以及原核表达载体例如λgt11和pGEX (Amersham Pharmacia)。除本发明的核酸分子之外，载体还可以进一步包括编码分泌信号的多核苷酸。分泌信号是本领域技术人员众所周知的。此外，取决于所使用的表达系统，可以将根据本发明的一个示例性实施方案的融合蛋白引导至细胞区室的前导序列，与根据本发明的一个示例性实施方案的多核苷酸的编码序列组合，并且优选是能够将解码的蛋白质或其蛋白质直接分泌到细胞周质或细胞外培养基内的前导序列。
另外，本发明的载体可以例如通过标准重组DNA技术进行制备，并且标准重组DNA技术的实例包括平滑末端和粘附末端的连接、限制性酶处理以提供适当的末端、通过碱性磷酸酶处理去除磷酸基以防止不适当的结合、以及通过T4DNA连接酶的酶促连接。本发明的载体可以通过以下进行制备：重组通过化学合成或遗传重组技术获得的编码信号肽的DNA、根据本发明的一个示例性实施方案的免疫球蛋白Fc结构域变体蛋白、或编码含有其与含有适当调控序列的载体的融合蛋白的DNA。含有调控序列的载体可以商业上购买或制备，并且在本发明的一个示例性实施方案中，pBispecific主链载体(Genexine，Inc.，韩国)、pAD15载体、pGP30 (Genexine，Inc. 韩国)或pN293F载体(Y-Biologics，Inc.，韩国)用作主链载体。
表达载体可以进一步包括编码分泌信号序列的多核苷酸，并且分泌信号序列诱导在细胞中表达的重组蛋白质的细胞外分泌，并且可以是组织纤溶酶原激活物(tPA)信号序列、单纯疱疹病毒糖蛋白D (HSV gD)信号序列、或生长激素信号序列。
根据本发明的一个示例性实施方案的表达载体可以是能够在宿主细胞中表达蛋白质的表达载体，并且表达载体可以是任何形式，例如质粒载体、病毒载体、粘粒载体、噬菌粒载体或人工人染色体。
在本发明的另一个方面，提供了用于免疫抑制的药物组合物，其包含单体IL-10变体蛋白或融合蛋白作为活性成分。
药物组合物可以进一步含有已知的免疫抑制剂组分(具有免疫抑制效应的细胞因子、诱饵受体、涉及免疫细胞的活化和分化的配体以及针对该配体的抗体、以及能够抑制免疫细胞活性的抗体等)。这些已知的免疫抑制剂包括糖皮质激素、细胞抑制剂、抗CD20抗体、抗CD3抗体、抗IL-2抗体、亲免素抑制剂、干扰素β、阿片样物质、TNFα结合蛋白、霉酚酸酯、芬戈莫德或多球壳菌素。糖皮质激素可以是泼尼松、地塞米松或氢化可的松。细胞抑制剂可以是氮芥、亚硝基脲、铂配位络合物、叶酸类似物、硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、更生霉素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博来霉素或光神霉素。亲免素抑制剂可以是环孢菌素、他克莫司、西罗莫司或依维莫司。
根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含单体IL-10变体蛋白或融合蛋白作为活性成分。
在药物组合物中，免疫相关疾病可以是1型糖尿病、斑秃、抗磷脂抗体综合征、类风湿性关节炎、银屑病或银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、炎性肠病、艾迪生病、格雷夫斯病、干燥综合征、格巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、炎性肌病、自身免疫性血管炎、自身免疫性肝炎、出血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、白癜风、恶性贫血、过敏性疾病或慢性乳糜泻。
组合物可以含有药学上可接受的载体，并且除载体之外，还可以进一步包括药学上可接受的佐剂、赋形剂或稀释剂。
如本文使用的，术语“药学上可接受的”指这样的组合物，其是生理学上可接受的，并且当施用于人时，一般不引起变态反应，例如胃肠道病症和眩晕，或类似反应。载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，可以进一步含有填料、抗凝集剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂和防腐剂。
此外，当根据本发明的一个示例性实施方案的药物组合物施用于哺乳动物时，可以使用本领域已知的方法来配制药物组合物，以允许活性成分的快速、持续或延迟释放。制剂的实例包括粉末、颗粒、片剂、乳状液、糖浆剂、气溶胶、软或硬明胶胶囊、无菌可注射溶液和无菌粉末形式。
根据本发明的一个示例性实施方案的组合物可以通过各种途径进行施用，所述途径例如经口施用和胃肠外施用，例如栓剂、经皮、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鼻内或脊柱内施用，并且可以使用用于持续释放或者连续或重复释放的植入装置进行施用。施用可以在所需范围内一天执行一次或数次，并且可以以间隔如一周一次、一周两次和一个月一次来执行，并且施用的持续时间也没有特别限制。
根据本发明的一个示例性实施方案的组合物可以与常规的药学上可接受的载体一起以合适制剂进行配制。药学上可接受的载体的实例包括用于胃肠外施用的载体，例如水、适当的油、盐水溶液、水性葡萄糖和二醇，并且可以另外包括稳定剂和防腐剂。稳定剂的实例包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。合适防腐剂的实例包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和三氯叔丁醇。此外，取决于施用方法或制剂，需要时，根据本发明的一个实施方案的组合物可以含有助悬剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂(integerotonic agent)、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、无痛剂、缓冲剂、抗氧化剂等等。适合于本发明的药学上可接受的载体和制剂，包括上文举例说明的那些，在文献[Remington’s Pharmaceutical Sciences，最新版本]中得到详细描述。
组合物对患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身高、体表面积、年龄、施用的具体化合物、性别，施用的时间和途径，一般健康和同时施用的其它药物。可以以100 ng/体重(kg)至10 mg/体重(kg)，更优选1至500 μg/kg(体重)，且最优选5至50 μg/kg(体重)的量施用药物活性蛋白，但可以考虑上述因素来调整剂量。
在本发明的另一个方面，提供了抑制需要免疫抑制的受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的单体IL-10变体蛋白或融合蛋白。
受试者可以是人或除了人之外的哺乳动物，并且可以是已接受器官移植的患者或患有需要免疫抑制的免疫相关疾病的患者。
另外，本发明的单体IL-10变体蛋白或融合蛋白可以以治疗有效量施用。
如本文使用的，术语“治疗有效量”意指足以以适用于医学治疗的合理益处/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平是受试者的类型和严重性、年龄、性别、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、治疗持续时间、包括同时使用的药物的因素以及医学领域众所周知的其它因素。本发明的组合物的治疗有效量可以为0.1 mg/kg至1 g/kg，更优选1 mg/kg至500 mg/kg，但有效剂量可以根据患者的年龄、性别和状况，适当地进行调整。
实施例
在下文中，将通过实施例和实验例更详细地描述本发明。然而，本发明并不限于下文描述的实施例和实验例，并且可以以各种其它形式实施，并且提供下文描述的实施例和实验例，以使得本发明的公开内容完整，并且对本发明所属领域的技术人员充分传达本发明的内容。
实施例：单体人IL-10变体的制备。
本发明人已设计了各种单体人IL-10变体。具体而言，分析了IL-10蛋白的结构，并且考虑到一个IL-10分子的N末端与另一个IL-10分子的C末端配对，设计了最低限度的接头长度，以允许单个分子的IL-10的N末端和C末端形成一对，并且因此它们通过配对而形成二聚体。预计需要17.3Å的线性距离来结合单个IL-10分子的N末端和C末端，在N末端和C末端之间需要至少7 a.a的接头长度。在这种情况下，由于单个分子内的N末端部分和C末端部分应该组合，因此预计太长的接头可以成为两个末端之间结合的障碍，使得9 a.a.被配置为最佳接头长度，并且可以被设计为包括至多12 a.a的长度的间隔肽。
特别地，本发明人确定了具有下表1中所示构型的人IL-10变体蛋白序列，并且通过使用II型限制性酶、BsaI和T4连接酶，使NTIG Fc亚载体、IL-10Vm亚载体和主链载体(pBispecific Backbone；Genexine，Inc.)在单管中反应，分别制备了包含分别编码各种IL-10变体蛋白的多核苷酸的载体构建体。
表1
根据本发明的实施方案制备的融合蛋白的结构
Figure DEST_PATH_IMAGE002
如上表1中所述，在本发明的一个实施方案中，Fc区与IL-10蛋白的N末端连接，由此形成二聚体，并且IL-10变体蛋白被设计为可以促进融合蛋白的分离和纯化步骤的形式。本文使用的Fc蛋白是修饰的Fc区(SEQ ID NO: 8和9)，由IgG1的铰链以及其为IgD和IgG4的杂合蛋白的CH2和CH3组成，并且使用与国际专利申请PCT/KR2020/006346中描述的相同的修饰的Fc区。为方便起见，修饰的Fc区被称为"NTIG"。该PCT申请通过引用并入本文。设计在修饰的Fc区和根据本发明的一个实施方案的IL-10变体蛋白之间，插入由SEQ ID NO: 2或3的氨基酸序列组成的接头肽。比较例1中使用的IL-10蛋白是变体蛋白(SEQ ID NO: 10)，其通过用丙氨酸取代野生型人IL-10蛋白的第87个氨基酸异亮氨酸来抑制免疫活化，并且实施例2和3也包括第87个氨基酸的相同取代。同时，在实施例1和2以及比较例2中使用的IL-10蛋白(SEQ ID NO: 1和11)具有插入在第116个氨基酸的天冬酰胺(N)和第117个氨基酸赖氨酸(K)之间的间隔肽，并且特别是由通过SEQ ID NO: 4或5表示的氨基酸组成的间隔肽。特别地，根据比较例2的包含具有通过SEQ ID NO: 5表示的氨基酸序列的接头肽的IL-10蛋白(SEQ ID NO: 11)，含有与Joshepson等人设计的(Josephson等人，J. Biol. Chem. 275(18): 13552-13557，2000)相同的单体IL-10蛋白。通过PCR扩增和寡核苷酸合成来制备编码如上所述设计的每种融合蛋白的组分的多核苷酸，然后在使用BsaI限制性酶和T4连接酶，将其亚克隆到NTIG亚载体和IL-10Vm亚载体以及主链载体(pBispecific载体，Genexine，Inc.，韩国)内之后，通过使单个管中的反应混合物反应来制备最终载体构建体。使用由Thermo Fisher制造的ExpiCHO试剂盒暂时表达如上所述制备的载体构建体。具体而言，在将上文制备的载体构建体和试剂盒中包含的ExpiFectamine试剂与ExpiCHO-S细胞混合后，温育在具有8% CO2和37℃的条件的培养箱中执行1天，并且将温度降低至32°C至7天。
然后，执行蛋白A捕获纯化，并且通过在非还原条件和还原条件下的SDS-PAGE分析，确认候选材料是否得到纯化，并且用考虑到候选材料的pI值的配制缓冲液执行配制。使用Nano Drop来定量配制完成的候选材料，并且使用SEC-HPLC确定最终纯度。图2A和2B表示对于IL-10M的培养物和纯化材料，使用SDS-PAGE和SEC-HPLC的蛋白质纯度。图2C和2D分别表示对于IL-10M-1和IL-10M-2的培养物和纯化材料，使用SDS-PAGE和SEC-HPLC的蛋白质纯度。图2E和2F表示对于IL-10M-3的培养物和纯化材料，使用SDS-PAGE和SEC-HPLC的候选材料的纯度。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE004
根据本发明的实施方案的融合蛋白的生产结果
结果，如表2以及图2A至2F中所示，当生产非单体IL-10 (比较例1)时，产率很低并且显示了最低纯度，并且当生产单体IL-10 (实施例1和2以及比较例2)时，蛋白质含量和纯度显著增加。同时，尽管在比较例2中，蛋白质含量最高，但就纯度而言，本发明的实施例1的蛋白质显示了82.7%的最高纯度。
实施例3：FcεRI--Fc-IL-10Vm的制备
3-1：瞬时表达
本发明人设计了融合蛋白，其中与IgE特异性结合的受体FcεRIα、以及实施例1和比较例2的单体IL-10变体蛋白(IL-10Vm)与Fc蛋白连接。
具体而言，本发明人使用寡核苷酸合成和PCR扩增制备了编码具有下表3中所示构型的融合蛋白的多核苷酸，并且以与实施例1相同的方式，在将其亚克隆到FcεRIα亚载体、NTIG Fc亚载体、IL-10Vm亚载体和主链载体内之后，通过使单个管中的反应混合物反应来制备最终载体构建体。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE006
本发明人将实施例3的融合蛋白FcεRIα-Fc-IL-10Vm命名为"PG075-8"，并且将比较例3的FcεRIα-Fc-IL-10Vm命名为"PG075-9"。使用由Thermo Fisher制造的ExpiCHO试剂盒，瞬时表达如上所述制备的载体构建体。具体而言，在将上文制备的载体构建体和试剂盒中包含的ExpiFectamine试剂与试剂盒中的ExpiCHO-S细胞混合后，使混合物在8% CO2和37℃下温育1天。此后，将温度降低至32°C并且在250mL规模上培养直至第7天。
然后，执行蛋白A捕获纯化，并且通过在非还原条件和还原条件下的SDS-PAGE分析，确认候选材料是否得到纯化。然后，用考虑到候选材料的pI值的配制缓冲液执行配制。使用Nano Drop来定量配制的候选材料，并且使用SEC-HPLC确认最终纯度。图3A和3B分别表示对于根据实施例3的FcεRIα-Fc-IL-10Vm (PG075-8)的培养物和纯化材料，使用SDS-PAGE和SEC-HPLC的候选材料的纯度。图3C和3D分别表示对于比较例3的FcεRIα-Fc-IL-10Vm(PG075-9)的培养物和纯化材料，使用SDS-PAGE和SEC-HPLC的候选材料的纯度。
如图3A至3D中所示，确认了当根据本发明的一个实施方案的IL-10Vm蛋白作为与FcεRIα (其为API (活性药物成分))连接的融合蛋白表达时，它显示出显著的高产率和纯度，而当应用比较例2的现有单体IL-10变体蛋白时，IL-10变体蛋白的产率和纯度显著降低。相应地，本发明人使用根据本发明的实施例1的IL-10Vm变体蛋白，以便建立用于生产融合蛋白的稳定细胞系，在所述融合蛋白中，作为API的治疗活性蛋白与IL-10Vm蛋白连接，并且在实验室规模下制备候选材料。
3-2：稳定细胞系的建立和产生
相应地，本发明人将编码实施例3-1中构建的融合蛋白的基因构建体插入pAD15表达载体(WO2015/009052A)内，然后使用Neon转染系统(CHODG44)细胞对其进行转染。作为第一个筛选过程，使用不含HT (5-羟色胺)的10% dFBS (Gibco，USA，30067-334)、MEMα(Gibco，12561，USA，目录号12561-049)和HT+ (Gibco，USA，11067-030)培养基来执行HT筛选。随后，使用HT选择的克隆执行氨甲蝶呤(MTX)扩增，以便使用DHFR (二氢叶酸还原酶)系统扩增表达基因。MTX扩增在板上以小池的形式执行，以分离高生产率克隆，并且在筛选扩增得到确认的一个物类后，执行有限稀释克隆(LDC) (96孔，30块板)，以分离最终细胞系。
最终分离的细胞系在700 ml hyCellCHO培养基中进行温育，并且通过对在培养的第5天时获得的培养基执行蛋白A纯化来鉴定纯化的蛋白质，并且通过SDS-PAGE和SEC-HPLC分析纯化蛋白质的产率和纯度。
结果，如图3E和3F中确认的，确认了根据本发明的一个实施方案的融合蛋白在建立的稳定细胞系中正常表达。
实验例1：混合淋巴细胞应答分析
本发明人使用从多个供体提供的全血分析了混合淋巴细胞反应，以便确认实施例中制备的融合蛋白的免疫抑制活性。
具体而言，本发明人通过经由Ficoll梯度离心，将从10个供体提供的全血离心，来分离外周血单核细胞(PBMC)。在计数分离的单核细胞数目后，将细胞混合，并且用5x106个细胞/小瓶(1 mL)制备细胞原种。
然后，将从供体接受的细胞和受体的细胞解冻，计数细胞数目，然后以1x106个细胞/ml的浓度重悬浮。在将受体的细胞分离成反应细胞和刺激细胞后，通过用3000拉德的γ射线照射来刺激受体的刺激细胞和供体细胞。然后，受体的反应细胞用细胞痕量紫(V450)进行染色，并且受体的刺激细胞和供体细胞用细胞示踪红(APC)进行染色。将来自供体的1x105个反应细胞和来自受体的1x105个反应细胞加入200 μl补充有10% FBS的RPMI培养基中且混合。混合细胞在37°C和5% CO2下培养6天。分别以0.5 μM的浓度处理比较例1和2以及实施例1和2的融合蛋白。在培养完成后，执行FACS分析。FACS分析中使用的抗体是BV650缀合的抗CD3抗体、PE (藻红蛋白)缀合的抗PD1抗体、PE-TR缀合的抗CD-14抗体、PE-TR缀合的抗CD19抗体、PerCp缀合的抗CD4抗体、Cy5.5缀合的CD4抗体、APC (别藻蓝蛋白)缀合的抗CD8抗体、H7缀合的抗CD8抗体。
作为FACS分析的结果，当来自受体的反应细胞和来自受体的刺激细胞反应(自体的，下文缩写为'Auto')时，没有发现受体中的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞增殖，而当来自受体的反应细胞和来自供体的刺激细胞反应(同种异体的，缩写为"Allo")时，确认了受体中的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞增殖。如图4A至4D中所示，尽管不存在显著差异，但在比较例1的二聚体IL-10融合蛋白的情况下，显示了最强的CD4+增殖抑制活性，而在包括比较例2的常规单体IL-10的融合蛋白的情况下，不存在与阴性对照组的差异。另一方面，与比较例2相比，包括根据本发明的实施例1和2的单体IL-10变体蛋白的融合蛋白显示出更好的免疫抑制活性。类似地，CD8+ T细胞增殖抑制活性在比较例1的二聚体IL-10融合蛋白中也是最高的，并且根据本发明的实施例1和2的单体IL-10融合蛋白显示低于比较例2的CD8+ T细胞增殖抑制活性。
实验例2：肥大细胞增殖分析
本发明人已尝试调查了本发明的单体IL-10融合蛋白的免疫刺激活性。
特别地，将5x103个细胞/100 μl/孔的骨髓衍生的肥大细胞(BMMC)接种到含有RPMI培养基的96孔板中，所述RPMI培养基含有10% FBS、1%抗生素、rmSCF 20 ng/ml和rmIL-3 10 ng/ml，并且在将其以适当浓度稀释后，用重组人IL-10与根据比较例1和2以及实施例1和2的IL-10融合蛋白处理细胞。随后，将20 μl MTS试剂分配到96孔板内，以测量肥大细胞的增殖程度，然后将96孔板放入在37℃的温度下的CO2培养箱内，并且反应2小时，然后使用微板阅读器在595 nm处测量吸光度。
表4
浓度(pM) 0 0.5 2.9 14 72 360 2000
rhIL-10 1 1.01 1.06 1.21 1.37 1.55 1.63
比较例1 1 1.00 1.00 0.98 1.05 1.20 1.26
实施例1 1 1.06 1.03 1.02 1.03 1.02 1.00
实施例2 1 1.00 1.00 1.01 0.97 1.02 1.01
比较例2 1 0.99 1.03 1.18 1.20 1.25 1.40
结果，如图5A和表4中所示，用rhIL-10 (阳性对照)处理的肥大细胞的增殖是最强的，并且用比较例1和2的IL-10融合蛋白处理的肥大细胞的增殖低于用rhIL-10处理的细胞，但发现具有一定程度的肥大细胞增殖活性。另一方面，根据本发明的实施例1和2的IL-10融合蛋白显示很少的肥大细胞增殖活性。这是显示根据本发明的IL-10变体蛋白在IL-10的双重活性中具有完全抑制的免疫活化性质的结果。然而，在实验结果的情况下，可以解释为根据本发明的实施例1和2的融合蛋白以没有活性的形式表达，因此本发明人通过仅对于rhIL-10、根据实施例1和比较例1的融合蛋白增加处理的浓度，来执行相同的分析。
表5
浓度(nM) 0 0.004 0.02 0.04 0.16 0.63 2.5 10 40 100
rhIL-10 1 1 1 1.19 1.42 1.58 1.71 1.79 1.78 1.78
比较例1 1 0.99 0.99 0.97 1 1.19 1.35 1.36 1.35 1.35
实施例1 1 0.97 0.97 0.99 1.01 1.01 1 1.06 1.02 1.2
结果，如表5和图5B中所示，根据本发明的实施例1的融合蛋白仅在100 nM的极高浓度下显示有限的肥大细胞增殖活性。然而，由于该浓度显著高于用于体内施用的剂量，因此预计在体内施用时，将存在很少的免疫刺激效应例如肥大细胞增殖。
实验例3：免疫抑制活性分析
在分析肥大细胞增殖之后，调查了IL-10融合蛋白对减少肥大细胞中的TNF-α-分泌活性即免疫抑制活性的作用。
3-1：肥大细胞中的TNF-α分泌抑制活性的分析
为此，具体而言，将1x104个细胞/50 μl/孔的骨髓衍生的肥大细胞(BMMC)接种到含有RPMI培养基的96孔板中，所述RPMI培养基含有10% FBS、1%抗生素、rmSCF 20 ng/ml和rmIL-3 10 ng/ml，并且用稀释至适当浓度的重组人IL-10与根据比较例1和2以及实施例1和2的IL-10融合蛋白处理细胞。然后，将稀释至3 μg/mL和50 μl的抗DNP IgE加入96孔板中，并且在37°C和5% CO2条件下温育24小时。随后，将50 μl稀释至400 ng/mL的DNP-BSA(抗原)加入96孔板中，然后在37°C和5% CO2条件下反应过夜。然后，在4℃以1500 rpm的速度执行离心5分钟，将回收的150 μl上清液分配到新的96孔板中，并且使用TNF-α ELISA试剂盒(Biolegend，USA)测量TNF-α的浓度。
表6
浓度(n) 0 0.31 1.25 5 20
比较例1 0% 27% 37% 51% 51%
表7
浓度(n) 0 1.56 6 25 100
实施例1 0% 6.3% 27% 43% 45%
实施例3 0% 58% 65% 80% 83%
实施例2 0% 21% 33.6% 39% 46%
比较例2 0% 13% 31% 45% 49%
结果，在比较例1 (IL-10M)中，显示了浓度依赖性的TNF-α抑制活性，如表6和7以及图6A至6C中所示。此时，本发明的实施例1中的IL-10M-1和实施例2中的IL-10M-2以及比较例2中的IL-10M-3显示了类似于比较例1的浓度依赖性的TNF-α分泌抑制效应，但其浓度是比较例1的5倍。此外，根据本发明的一个实施方案的PG075-8即使在较低浓度下也显示出极佳的TNF-α分泌抑制活性，确认了IgE的有效阻断是可能的。总结上文结果，可以看出，根据本发明的一个实施方案的IL-10变体蛋白具有比二聚体IL-10变体蛋白更低的免疫抑制活性，但在抑制免疫刺激活性(IL-10的双重活性之一)方面最有效，并且就蛋白质的产率和纯度而言是最有利的。
特别地，确认了与类似地以单体形式表达的比较例2的IL-10变体蛋白相比，根据本发明的一个实施方案的IL-10变体蛋白显示出浓度依赖性的TNF-α分泌抑制活性，并且当它用作其中FcεR1α与之连接的融合蛋白(实施例3)时，它具有显著的变态反应抑制活性。
3-2：巨噬细胞中的LPS诱导的TNF-α分泌抑制活性的分析
本发明人调查了根据本发明的一个实施方案的PG075-8蛋白在巨噬细胞中是否具有TNF-a分泌抑制活性，所述巨噬细胞是与TNF-a介导的炎症反应密切相关的免疫细胞，确认了根据本发明的一个实施方案的PG075-8蛋白在肥大细胞中的TNF-a分泌抑制活性。
为此，将以5x105个细胞/mL的浓度制备的100 μL RAW264.7细胞分配到96孔板内，然后在5% CO2和37°C的培养箱中培养12小时。在将蛋白质以适当浓度序贯地稀释后，用根据本发明的一个实施方案的PG075-8蛋白质处理培养中的RAW264.7细胞。在这种情况下，通过在96孔板上用100 μL LPS (400 ng/mL)处理来诱导TNF-α表达。然后，在37℃和5% CO2的培养箱中温育12小时后，分离150 μL上清液，并且以与实验例3-1相同的方式，测量上清液中包含的TNF-α表达水平的量(表8和图6D)。
表8
根据本发明的一个实施方案的融合蛋白(PG075-8)在巨噬细胞中的TNF-α分泌抑制率
Figure DEST_PATH_IMAGE008
结果，如表8和图6D中所示，取决于处理的浓度，根据本发明的一个实施方案的PG075-8融合蛋白抑制巨噬细胞中的TNF-α表达。
实验例4：与IL-10受体的结合亲和力的分析
基于实验例1至3的实验结果，本发明人通过生物层干涉测量法(BLI)分析，分析了本发明的比较例1和实施例1的融合蛋白与IL-10受体1 (IL-10R1)的结合亲和力。此时，作为对照，使用其中不连接FcεRIα，并且具有通过SEQ ID NO: 10表示的氨基酸序列的二聚体IL-10变体蛋白(IL-10V) (其免疫刺激活性通过用丙氨酸取代野生型IL-10蛋白的第87个氨基酸异亮氨酸而受到抑制)与杂合Fc区连接的融合蛋白，以及其中具有在第116个氨基酸天冬酰胺(N)和第117个氨基酸赖氨酸(K)之间插入的间隔肽(GGSGGSGGS)的单体IL-10变体蛋白的融合蛋白(NTIG-IL-10Vm)。NTIG-IL-10Vm与根据本发明的一个实施方案的PG075-8相同，除了不连接FcεRIα之外。
为此，首先，本发明人使用Dip and ReadTM Amine Reactive 2nd Generation(AR2G) Reagent Kit (forteBio，目录号18-5092)，将IL-10R His标签蛋白附着到96孔板。具体而言，在96孔板中分配200 μl D.W.后，插入试剂盒中包括的胺生物传感器并水合10分钟。随后，在将另外200 μl D.W.分配到板中之后，EDC:NHS以1:1的比率在对应于所需样品的1/20的体积中混合，然后在D.W.中稀释，并且将200 μl分配到96孔板内。随后，将IL-10RHis标签蛋白在10 mM乙酸溶液(pH 5.0)中稀释至10 μg/ml，并且将200 μl分配到96孔板内。然后，将200 μl 1 M乙醇胺加入96孔板中，并且将生物传感器板和样品板插入Octet®K2 BLI分析仪内，并且测量信号。在测量完成后，将200 μl 1x动力学缓冲液加入样品板中，然后确定基线。随后，在上文实施例中制备的NTIG-IL-10融合蛋白在1x动力学缓冲溶液中以各种浓度(0、62.5、125、250、500和1000 nM)进行稀释，然后以200 μl分配到样品板中，然后使用Octet® K2 BLI分析仪执行BLI分析，以测量结合亲和力。
表9
参数 比较例1 实施例1 实施例3 (PG075-8)
K<sub>D</sub> (nM) 11.1±0.9 29.2±8.85 < 0.001
K<sub>on</sub> (1/Ms) 71100±6670 20550±2312 11,500±980
K<sub>dis</sub> (1/s) 0.0008 0.0006 < 1.0E-07
R<sup>2</sup> 0.97 0.97 0.98
结果，如图7和表9中所示，根据本发明的一个实施方案的融合蛋白(NTIG-IL-10Vm)具有29.2 nM的KD值，其为比较例1 (11.1 nM)的单体IL-10融合蛋白(NTIG-IL-10V)的约3倍。因此，发现NTIG-IL-10Vm与IL-10R的结合亲和力略低于比较例1的单体IL-10融合蛋白的结合亲和力。先前研究的结果也显示与二聚体IL-10蛋白相比，单体IL-10具有与IL-10R的更低的结合亲和力，因此它是完全可预测的。另一方面，本发明的实施例1的融合蛋白(FcεRIα-Fc-IL-10Vm，PG075-8)具有小于0.001 nM的KD值，指示了与IL-10R的更高的结合亲和力。这是显示尽管与FcεRIα (API)连接，但单体IL-10变体与IL-10R具有足够的结合亲和力的结果。
实验例5：IgE结合活性分析
本发明人通过生物层干涉测量法(BLI)分析，分析了实施例3中制备的融合蛋白(FcεRIα-Fc-IL-10Vm)与小鼠IgE和人IgE的结合亲和力。
为此，首先，本发明人使用Dip and ReadTM Amine Reactive 2nd Generation(AR2G) Reagent Kit (forteBio，目录号18-5092)，分别将不含IL-10Vm的FcεRIα-Fc融合蛋白(对照)和实施例3中制备的融合蛋白附着到96孔板。具体而言，在将200 μl D.W.分配到96孔板中之后，插入试剂盒中包括的胺生物传感器并水合10分钟。随后，在将另外200 μlD.W.分配到96孔板中之后，EDC:NHS以1:1的比率在对应于所需样品的1/20的体积中混合，然后在D.W.中稀释，并且将200 μl分配到96孔板内。随后，将FcεRIα-Fc融合蛋白和FcεRIα-Fc-IL-10Vm融合蛋白在10 mM乙酸溶液(pH 5.0)中稀释至10 μg/ml，并且将200 μl分配到96孔板内。然后，将200 μl 1 M乙醇胺加入96孔板中，并且将生物传感器板和样品板插入Octet® K2 BLI分析仪内，并且测量信号。在测量完成后，将200 μl 1x动力学缓冲液加入样品板中，然后确定基线。随后，抗DNP小鼠IgE抗体(Sigma，USA)在1x动力学缓冲溶液中以各种浓度(50 pM至3.125 nM)进行稀释，然后以200 μl分配到样品板中，然后使用Octet® K2BLI分析仪执行BLI分析，以测量结合亲和力。
表10
Figure DEST_PATH_IMAGE010
结果，如图8A和表10中所示，根据本发明的一个实施方案的融合蛋白(FcεRIα-Fc-IL-10Vm，PG075-8) 的KD值为0.284 nM，其低于作为对照的FcεRIα-Fc融合蛋白的KD值。尽管发现它略低于对照，但差异并不显著。因此，确认了根据本发明的一个实施方案的融合蛋白与IgE的结合亲和力并未由于IL-10蛋白的添加而降低。连同上文结果一起，本发明人使用上述方法分析了实施例3的融合蛋白(PG075-8)和人IgE的结合亲和力，以便测量本发明中使用的人IgE和人FcεRIα的结合亲和力。
表11
PG075-8 (FcεRIα-Fc-IL-10Vm)
平均K<sub>D</sub> (nM) 0.346
平均K<sub>on</sub> (1/Ms) 2.19x10<sup>5</sup>
平均K<sub>dis </sub>(1/s) 7.59x10<sup>-5</sup>
平均R<sup>2</sup> 0.9955
结果，如图8B和表11中所示，根据本发明的一个实施方案的融合蛋白显示出与小鼠IgE相似的与人IgE的结合亲和力水平。
实验例6：药代动力学分析
本发明人执行了药代动力学分析，以确认本发明的融合蛋白在体内施用时有多稳定。
具体而言，分别通过静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射和皮下注射，以1 mg/Kg体重的剂量，将根据本发明的一个实施方案的融合蛋白(PG075-8)施用于每组中的3只SD大鼠。在分别以1.0 mL/kg、1.0 mL/kg、0.4 mL/kg和1.0 mL/kg的体积施用后，在静脉内注射的情况下，在0分钟、5分钟、1小时、5小时、10小时、24小时、48小时、72小时、120小时、168小时、240小时和336小时，并且在其它施用方法(腹膜内注射、肌内注射和皮下注射)的情况下，在与静脉内注射相同的时间，除了在5分钟后的测量之外，收集血清并使用人IgG4 FcELISA来定量融合蛋白。
结果，如图9中所示，无论施用途径如何，根据本发明的一个实施方案的融合蛋白显示随着时间过去的适度减少，指示了根据本发明的一个实施方案的融合蛋白在体内稳定维持相当长的时间段。
实验例7：血液毒性分析
当增加施用剂量或应用重复施用时，常规的重组IL-10具有由于血液中的血红蛋白浓度降低的贫血症状、以及由于血液中的血小板浓度降低的血小板减少症的副作用(Tilg等人，J. Immunol. 164 (4): 2204-2209，2002；Fedorak等人，Gastroendocrinol.119(6): 1473-1482，2000)。相应地，本发明人调查了根据本发明的一个实施方案的融合蛋白是否显示出此类副作用。
为此，具体而言，本发明人准备了每组中的3只雌性ICR小鼠，并且将PG075-8以0、50、150和300 mg/kg的剂量施用于每组，并且在药物施用后的第11天时收集血液。然后，本发明人使用自动血液分析仪(XN-V，SYSMEX，日本)来计数白血细胞分类计数、总红血细胞(RBC)和总血小板。结果，如图10中所示，当施用PG075-8时，不存在对血细胞数目等的作用。
实验例8：对食物过敏的功效的分析
本发明人调查了通过向实验动物施用根据本发明的一个实施方案的融合蛋白PG075-8，腹泻症状(其为当OVA经口施用于由白蛋白(OVA)致敏的实验动物时发生的代表性过敏症状)是否得到缓解，以便确认融合蛋白对过敏疾病的疗效。
具体而言，Balb/c小鼠(Koatech，韩国)通过以14天的间隔两次腹膜内施用50 μgOVA (卵白蛋白)和1 mg铝佐剂(Alum)的溶液而致敏。然后，在第28、30、32、34和36天时，以2天的间隔经口施用50 mg OVA，总共5次，以诱导肠内的食物过敏。在此过程中，构成每组的药物在第31天时施用。分别地，第一组(对照组)中的磷酸盐缓冲溶液(PBS)、第二组中的IgETRAP (5 mg/kg)和第三组中根据本发明的一个实施方案的PG075-8 (7.3 mg/kg)，分别在计算摩尔数后进行施用。在OVA的经口施用总共施用5次时，对腹泻发生进行评分。在第37天时，处死小鼠并进行尸检。然后，分析每组的小鼠中的小肠中的肥大细胞数目、血液IgE浓度、血液肥大细胞中的脱粒酶浓度(MCPT-1，肥大细胞蛋白酶-1)的浓度。结果，如图11中所示，确认了与对照组和IgETRAP组相比，在属于用根据本发明的一个实施方案的PG075-8施用的组的小鼠中，缓解食物过敏的优良效应。
相应地，根据本发明的一个实施方案应用IL-10Vm和FcεRIα作为另一融合配偶体的融合蛋白抑制免疫细胞的活化及其功能，特别是抗炎细胞因子的分泌、抗原呈递活性等。因此，它可以用于治疗由免疫功能过度活化引起的各种免疫相关疾病，例如过敏性疾病如特应性疾病、食物过敏、慢性自发性荨麻疹、哮喘等等。
本发明已参考上述实施方案和实验例进行描述，但这些仅仅是示例性的，并且本领域的普通技术人员将了解，各种修改和等价的其它实施方案由此是可能的。因此，本发明真正的技术保护范围应该由所附权利要求的技术精神决定。
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<210> 1
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体IL-10变体
<400> 1
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Ser Lys
115 120 125
Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly
130 135 140
Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu
145 150 155 160
Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
165
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 2
Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 3
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔肽
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔肽
<400> 5
Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 赖氨酸缺失的修饰的Fc区
<400> 6
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
85 90 95
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210
<210> 7
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的Fc区
<400> 7
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
85 90 95
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 赖氨酸缺失的修饰的Fc区
<400> 8
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
85 90 95
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的Fc区
<400> 9
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
85 90 95
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 10
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体IL-10 I87A变体
<400> 10
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ala Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 11
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 先前的单体IL-10 I87A变体
<400> 11
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ala Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ser Lys Ala Val Glu
115 120 125
Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys
130 135 140
Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met
145 150 155 160
Thr Met Lys Ile Arg Asn
165
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 13
Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 14
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 15
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 16
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 17
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 18
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys
1 5 10
<210> 19
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 19
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
35 40 45
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 22
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 23
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 24
Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp
1 5 10 15
Val
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 25
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 26
Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 27
Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly
1 5 10
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 28
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 29
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 30
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 30
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp
1 5 10 15
Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gly Ser Gln Lys Ala Gly Val Asp Glu
20 25 30
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPA信号肽
<400> 32
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala
20 25
<210> 33
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FceRIa
<400> 33
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1 5 10 15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20 25 30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35 40 45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85 90 95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100 105 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115 120 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130 135 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165 170 175
Tyr Trp Leu Gln
180
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
Pro
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 36
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys
1 5 10 15
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
20 25 30
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
<210> 38
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 38
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
20 25
<210> 39
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体IL-10 I87A变体
<400> 39
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ala Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Ser Lys
115 120 125
Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly
130 135 140
Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu
145 150 155 160
Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
165
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 40
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 41
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 42
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 43
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
Lys Asn Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Thr Arg Gly Gly
20 25 30
Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 44
Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 46
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型人IL-10（成熟形式）
<400> 46
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160

Claims (19)

1. 一种单体IL-10变体蛋白，其中长度为6至12 a.a.的间隔肽插入在基于人白介素10(IL-10)的成熟形式的第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间。
2. 根据权利要求1的单体IL-10变体蛋白，其中所述蛋白由通过SEQ ID NO: 1或39表示的氨基酸序列组成。
3. 一种包含单体IL-10变体蛋白的融合蛋白，在所述单体IL-10变体蛋白中，长度为6至12 a.a.的间隔肽插入在基于人白介素10 (IL-10)的成熟形式的第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间。
4. 根据权利要求3的融合蛋白，其中所述单体IL-10变体蛋白由通过SEQ ID NO: 1或39表示的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求3的融合蛋白，其进一步包括发挥不同功能的一种或多种融合配偶体蛋白。
6.根据权利要求5的融合蛋白，其中所述融合配偶体蛋白是与靶蛋白特异性结合的抗体、抗体的抗原结合片段、与靶蛋白特异性结合的抗体模拟物、抗体Fc区、或抗体Fc区受体、抗体Fc区受体的细胞外结构域、二聚化结构域、细胞因子或免疫调节肽。
7. 根据权利要求6的融合蛋白，其中所述抗体Fc区由SEQ ID NO: 6至9中的任何一种氨基酸序列组成。
8. 根据权利要求6的融合蛋白，其中所述抗体Fc区受体是IgE Fc受体的α亚基或α亚基的细胞外结构域。
9. 根据权利要求6的融合蛋白，其中所述抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab')2 、Fab'、scFv、双链抗体、三链抗体、sdAb (单结构域抗体)、VNAR 或VHH。
10.根据权利要求6的融合蛋白，其中所述抗体模拟物是亲和体、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体、repebody、VLR或nanoCLAMP。
11.根据权利要求6的融合蛋白，其中所述抗体Fc区是IgG、IgA、IgD或IgM的Fc区，或者其中上述Ig亚类的Fc区的两个或更多个结构域混合的杂合Fc。
12.根据权利要求6的融合蛋白，其中所述二聚化结构域是抗体的铰链结构域、LIM/双重锌指基序、RAG1结构域、HAT二聚化结构域、TRFH二聚化结构域、Stat3二聚化结构域或LFB1/HNF1二聚化结构域。
13.根据权利要求6的融合蛋白，其中所述细胞因子是IL-4、IL-6、IL-1α或TGF-β。
14. 根据权利要求6的融合蛋白，其中所述免疫调节肽是PD-1L或CTLA-4 (CD152)。
15.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1或2的单体IL-10变体蛋白或者根据权利要求3至14中任一项的融合蛋白。
16.一种载体，其包含权利要求15的多核苷酸。
17.一种用于免疫抑制的药物组合物，其包含权利要求1或2的单体IL-10变体蛋白或者根据权利要求3至14中任一项的融合蛋白作为活性成分。
18.一种用于治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含权利要求1或2的单体IL-10变体蛋白或者根据权利要求3至14中任一项的融合蛋白作为活性成分。
19.根据权利要求18的药物组合物，其中所述免疫相关疾病是1型糖尿病、斑秃、抗磷脂抗体综合征、类风湿性关节炎、银屑病或银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、炎性肠病、艾迪生病、格雷夫斯病、干燥综合征、格巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、炎性肌病、自身免疫性血管炎、自身免疫性肝炎、出血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、白癜风、恶性贫血、过敏性疾病或慢性乳糜泻。
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