TWI833026B - 新il-10變體蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及新IL-10變體蛋白，提供藉由形成單體來提高生產收率並抑制 免疫激活作用之新單體IL-10蛋白。
Description
本發明涉及變體蛋白，更具體地涉及生產性和免疫抑制能力提高的新IL-10變體蛋白及其用途。
白細胞介素10(以下，被稱為「IL-10」)係由被稱為細胞介素合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)的以約37kDa的非共價鍵偶聯的異源二聚體表現的抗-炎症性細胞介素。IL-10對免疫耐受性的誘導和維持起到重要作用，這種更好的抗-炎症特性係一直以來周知的。IL-10不僅抑制TNFα、IL-1、IL-6及IL-12而且抑制IL-2及INFγ之類的如同Th1細胞介素的促炎性細胞介素(pro-inflammatory cytokine)的分泌，並調節巨噬細胞、B細胞及T細胞的分化及增殖(Glocker等人，Ann.NY Acad.Sci.1246：102-107,2011；Moore等人，Annu.Rev.Immunol.19,683-765(2001)；Waal Malefyt等人，J.Exp.Med.174：915-924,1991),Williams等人，Immunol.113：281-292,2004)。並且，這係抗原呈遞的強力的抑制劑，不僅實現MHC II表現，而且抑制共刺激因子CD80及CD86的上調(Mosser & Yhang,Immunol.Rev.226：205-218,2008)。因這種特性，進行將IL-10用作炎症性腸病或牛皮癬之類的免疫疾病等治療劑之研究。
但是，據悉，IL-10具有還具有免疫刺激活性即正相反的作用之雙重特性。與此相關的是，具體而言，IL-10刺激B細胞激活，延長B細胞的生存，可貢獻於B細胞的類別轉換(class switching)。並且，可刺激NK細胞增殖和細胞介素生成，可起到促進CD8+ T細胞的特定亞群的增殖之生長因子作用(Mosser & Yhang,Immunol.Rev.226：205-218,2009；Cai等人，Eur.J.Immunol.29：2658-2665,1999；Santin等人，J.Virol.74：4729-4737,2000；Rowbottom等人，Immunol.160：3188-3193,1998)。據報導，人體中高劑量的IL-10(分別為20及25μg/kg)可增加INFγ的生產(Lauw等人，J.Immunol.,165：2783-2789,2000；Tilg等人，Gut 50：191-195,2002)。
對此，IL-10蛋白的第87位胺基酸異白胺酸與免疫激活相關，據報導，將其取代為丙胺酸時，可抑制免疫活性作用(Ding等人，J.Exp.Med.191(2)：213--223,2000)。但是，對於上述變體IL-10而言，確認到相比於野生型，與IL-10R1之親和性非常差，且存在為了實現同等的免疫抑制活性而需要高劑量的給藥的缺點。
另一方面，IL-10蛋白因結構特性，以重組蛋白生產時生成大量的不溶性凝聚體，這對生產性引起大問題。對此，在IL-10的二級結構上的第四及第五α-螺旋之間導入6個胺基酸的連接肽，由此開發不形成二聚體的單體IL-10(Josephson等人，J.Biol.Chem.275(18)：13552-13557,2000)，由於體內半衰期短且活性非常低，阻止了將其用作治療劑。這樣，為了克服低的體內穩定性，嘗試了以融合蛋白的形態表現IgA的Fc結構域(Westerhof等人，PLOS ONE,7(10)：e46460,2012)，但IL-10活性的恢復受到限制。
本發明意在解決包括上述問題在內的多種問題，其目的在於，提供更有效且體內穩定性及安全性得到確保的新IL-10變體蛋白。但是，本發明之保護範圍並不限定於上述目的。
根據本發明之一方面，提供以人白細胞介素-10(以下，IL-10)蛋白的成熟形態(mature form)為基準，在第116位的胺基酸天冬醯胺及第117位的胺基酸離胺酸之間插入具有6至12個胺基酸(a.a.)的長度的間隔肽的單體IL-10變體蛋白。
根據本發明之另一方面，提供包含以上述人白細胞介素-10蛋白的成熟形態(mature form)為基準，在第116位的胺基酸天冬醯胺及第117位的胺基酸離胺酸之間插入具有6至12個胺基酸的長度的間隔肽的單體IL-10變體蛋白的融合蛋白。
根據本發明之另一方面，提供對上述單體IL-10變體蛋白或上述融合蛋白進行編碼的多核苷酸。
根據本發明之另一方面，提供包含上述多核苷酸的重組載體。
根據本發明之另一方面，提供包含上述單體IL-10變體蛋白或上述融合蛋白作為有效成分的免疫抑制劑。
根據本發明之另一方面，提供包含上述單體IL-10變體蛋白或上述融合蛋白作為有效成分的免疫疾病治療劑。
根據本發明之另一方面，提供包含將治療有效量的上述單體IL-10變體蛋白或上述融合蛋白給藥到需要免疫抑制的個體的步驟的上述個體的免疫抑制方法。
本發明之一實施例的單體IL-10變體蛋白，不僅抑制IL-10蛋白的雙重特性之一的免疫激活作用，而且以單體形態表現，並增進生產效率，即使以
其他生理活性蛋白和融合蛋白形態表現，也依舊保持其活性，由此相比於以往IL-10變體蛋白，呈現優秀的特性，因此可用作新的免疫抑制劑和/或免疫疾病治療劑。
[圖1]為表示IL-10二聚體(左側)、上述IL-10二聚體的單體(中央)及根據本發明之一實施例插入間隔肽而具有穩定的單體結構的IL-10單體(右側)的三維結構之結構圖。
[圖2a]為將二聚體IL-10變體蛋白連接到Fc蛋白而構建的融合蛋白的生產過程中的非還原及還原條件下表示SDS-PAGE結果之圖片，圖2b為表示藉由SEC-HPLC分析來對最終純化的上述二聚體IL-10變體融合蛋白純度進行分析的結果的層析圖，圖2c為表示將本發明之實施例1及2的單體IL-10變體蛋白連接到Fc蛋白的融合蛋白的純化過程中執行SDS-PAGE分析的結果之圖片，圖2d為表示藉由SEC-HPLC分析來對最終純化的上述實施例1(上圖)及2(下圖)的單體IL-10變體融合蛋白的純度進行分析的結果之一系列層析圖，圖2e為表示本發明之比較例2的單體IL-10變體融合蛋白的非還原及還原條件下的SDS-PAGE分析結果之圖片，圖2f為表示藉由SEC-HPLC分析來對最終純化的上述比較例2的單體IL-10變體融合蛋白的純度進行分析的結果之層析圖。
[圖3a]為表示將本發明之實施例3的融合蛋白(PG-075-8)在暫態轉染的細胞中表現之後，利用protein A的純化工序中用於確認蛋白表現程度的非-還原條件(左側)及還原條件(右側)下的SDS-PAGE分析結果之圖片，圖3b為表示將上述融合蛋白(PG075-8)在暫態轉染的細胞中表現之後，利用protein A的純化工序中藉由SEC-HPLC分析來確認第10(A10)至第12分餾物
(A12)的純度的結果之層析圖，圖3c為表示將本發明之比較例3的融合蛋白(PG075-9)在暫態轉染的細胞中表現之後，利用protein A的純化工序中用於確認蛋白表現程度的非-還原條件(右側)及還原條件(左側)下的SDS-PAGE分析結果之圖片，圖3d為表示將上述融合蛋白(PG075-9)在暫態轉染的細胞中表現之後，利用protein A的純化工序中藉由SEC-HPLC分析來確認第11(A11)及第12分餾物(A12)的純度的結果之層析圖，圖3e為表示從將本發明之上述實施例3的融合蛋白(PG075-8)生產製備的穩定化細胞株(stable cell line)中用於確認上述融合蛋白的純化工序的蛋白表現程度的非-還原條件(左側)及還原條件(右側)下的SDS-PAGE分析結果之圖片，圖3f為表示在上述穩定細胞株中用於確認最終純化的融合蛋白(PG075-8)的純度的SEC-HPLC分析結果之層析圖。
[圖4a]為表示藉由FACS分析來調查對本發明之比較例1及2以及實施例1及2的IL-10融合蛋白的CD4+ T細胞增殖帶來的影響的結果之一系列長條圖，圖4b為定量化上述圖4a的結果的圖表，圖4c為表示藉由FACS分析來調查對本發明之比較例1及2以及實施例1及2的IL-10融合蛋白的CD8+ T細胞增殖帶來的影響的結果之一系列長條圖，圖4d為定量化上述圖4c的結果之圖表。
[圖5a]為表示分析影響對照組rhIL-10及本發明之比較例1及2以及實施例1及2的IL-10變體融合蛋白的處理濃度的骨髓來源肥大細胞的增殖能力的結果之圖表，圖5b為表示提高對照組rhIL-10和本發明之比較例1及實施例1的IL-10變體融合蛋白的處理濃度之後，分析對骨髓來源肥大細胞增殖帶來的影響的結果之圖表。
[圖6a]為表示比較例1的基於二聚體IL-10變體融合蛋白濃度的肥大細胞中的TNF-α分泌變化的分析結果之圖表，圖6b為表示本發明之實施例
1及2以及比較例2的基於單體IL-10變體融合蛋白濃度的肥大細胞中的TNF-α分泌變化的分析結果之圖表，圖6c為本發明之一實施例的融合蛋白PG075-8及比較例，表示二聚體IL-10變體蛋白(IL-10M-1；Fc-IL-10Vm)的肥大細胞中的TNF-α分泌抑制能力的分析結果之圖表，圖6d為表示本發明之一實施例的基於融合蛋白PG075-8的處理濃度的巨噬細胞中的TNF-α分泌抑制能力的分析結果之圖表。
[圖7]為表示藉由BLI分析來確認基於不同處理濃度的本發明之比較例1的二聚體IL-10變體融合蛋白(左側)及實施例1的單體IL-10變體融合蛋白(右側)與IL-10R1的親和度的結果之一系列感應圖。
[圖8a]為表示藉由BLI分析來分析比較例FcεRIα-Fc與小鼠IgE的親和度的結果之感應圖，圖8b為藉由BLI分析來分析本發明之實施例3的融合蛋白PG075-8(FcεRIα-Fc-IL-10Vm；下端)與小鼠IgE的親和度的結果之感應圖，圖8c為表示藉由BLI分析來分析本發明之實施例3的融合蛋白FcεRIα-Fc-IL-10Vm(PG075-8)與人IgE的親和度的結果之感應圖。
[圖9]為表示按多種途徑(靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射及皮下注射)將本發明之一實施例的融合蛋白給藥到實驗動物(大鼠)之後定量化最大330小時為止殘留在血清內的融合蛋白的量，由此執行藥物動力學分析的結果之圖表。
[圖10]為表示將本發明之一實施例的融合蛋白PG075-8給藥到實驗動物時調查是否出現白血球(A)、紅血球(B)及血小板(C)的數量變化的血液毒性分析結果的一系列圖表。
[圖11]調查本發明之一實施例的融合蛋白PG075-8在實際動物身上是否可減少過敏症狀，該圖為表示藉由OVA口服給藥來誘發被OVA致敏的小鼠患上飲食過敏之後，本發明之一實施例的PG075-8及比較例IgE TRAP給藥時腹
瀉症狀的變化(A)、從實驗結束後犧牲的小鼠測定的游離IgE濃度(B)、總IgE濃度(C)及過敏因子即血中肥大細胞內的脫粒酶(MCPT-1，肥大細胞蛋白酶-1)的濃度(D)的測定結果的一系列圖表。
根據本發明之一方面，提供以人白細胞介素-10(以下，IL-10)蛋白的成熟形態(mature form)為基準，在第116位的胺基酸天冬醯胺及第117位的胺基酸離胺酸之間插入具有6至12個胺基酸的長度的間隔肽的單體IL-10變體蛋白。
上述人白細胞介素-10蛋白的成熟形態可來源於UniProtKB P22301中記載的第19-178位胺基酸序列(序列識別號：46)。
在上述單體IL-10變體蛋白中，上述間隔肽可具有7至11個胺基酸、8至10個胺基酸或9個胺基酸的長度，並可具有6、7、8、9、10、11或12個胺基酸的長度。在本發明之具體方式中，上述間隔肽可為具有GGSGGSGGS(序列識別號：4)、(GGGSGG)n(單體：序列識別號：5，n為1或2的整數)、(G4S)n(單體：序列識別號：12，n為1或2的整數)、(GGS)n(n為2至4的整數)，(GS)n(n為3至6的整數)，或(GSSGGS)n(單體：序列識別號：13，n為1至2的整數)的胺基酸序列的間隔肽，形成上述間隔肽的胺基酸，若不誘發免疫原性，則可取代為其他種類的胺基酸，較佳的是可具有9個胺基酸之長度。
在本文獻中使用的術語「間隔肽(spacer peptide)」係指插入到特定蛋白內部，執行改變相關蛋白的結構和/或功能的作用的肽。在這個意思上，與連接其他融合配偶體的連接肽有區別，但是常規的連接肽可用作間隔肽。
本發明之一實施例的單體IL-10變體蛋白可包含序列識別號：1的胺基酸序列。
上述單體IL-10變體蛋白可為以人白細胞介素-10蛋白的成熟形態為基準，第87位的胺基酸異白胺酸取代為丙胺酸的單體IL-10變體蛋白，具體地可具有序列識別號：39的胺基酸序列。
若上述單體IL-10蛋白呈現形成單體IL-10的結構，則可與序列識別號：1或序列識別號：39的胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上的同一性，可全部包含哺乳動物來源蛋白。
根據本發明之另一方面，提供包含以上述人白細胞介素-10蛋白的成熟形態(mature form)為基準，在第116位的胺基酸天冬醯胺及第117位的胺基酸離胺酸之間插入具有6至12個胺基酸的長度的間隔肽的單體IL-10變體蛋白的融合蛋白。
本發明中使用的術語「融合蛋白」係指兩個以上的蛋白或蛋白內擔當特定功能的結構域連接成使各個蛋白或結構域擔當自身功能的重組蛋白(recombinant protein)。在上述兩個以上的蛋白或結構域之間可插入通常具有柔性結構的連接肽(linker peptide)。上述連接肽可包含AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(序列識別號：2)、GGSGG(序列識別號：3)、GGSGGSGGS(序列識別號：4)、GGGSGG(序列識別號：5)、(G4S)n(單體：序列識別號：12，n為1至10的整數)、(GGS)n(n為1至10的整數)、(GS)n(n為1至10的整數)、(GSSGGS)n(單體：序列識別號：13，n為1至10的整數)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(序列識別號：14)、EGKSSGSGSESKST(序列識別號：15)、GSAGSAAGSGEF(序列識別號：16)、(EAAAK)n(單體：序列識別號：17，n為1至10的整數)、CRRRRRREAEAC(序列識別號：18)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(序列識別號：19)、
GGGGGGGG(序列識別號：20)、GGGGGG(序列識別號：21)、AEAAAKEAAAAKA(序列識別號：22)、PAPAP(序列識別號：23)、(Ala-Pro)n(n為1至10的整數)、VSQTSKLTRAETVFPDV(序列識別號：24)、PLGLWA(序列識別號：25)、TRHRQPRGWE(序列識別號：26)、AGNRVRRSVG(序列識別號：27)、RRRRRRRR(序列識別號：28)、GFLG(序列識別號：29)、GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(序列識別號：30)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(序列識別號：31)、GGGGSGGGGSGGGGS(序列識別號：34)、GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(序列識別號：35)、RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP(序列識別號：36)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(序列識別號：37)、GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(序列識別號：38)、EPKSSDKTHTCPPCP(序列識別號：40)、EPKSCDKTHTCPPCP(序列識別號：41)、THTCPPCP(序列識別號：42)、GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(序列識別號：43)、AGSGGGGGSGGGGSGGGGS(序列識別號：44)及GGGSGGSTHTCPPCP(序列識別號：45)等。
上述融合蛋白可包含擔當其他功能的一種以上的融合配偶體蛋白(partner protein)，這種融合配偶體蛋白可為與靶蛋白特異性結合的抗體、上述抗體的抗原-結合片段、與上述靶蛋白特異性結合的抗體類似物、抗體的Fc區域、抗體Fc區域受體、上述抗體Fc區域受體或與其Fc區域結合的胞外結構域、二聚體化結構域、細胞介素或免疫調節肽。
在上述融合蛋白中，上述抗體的抗原結合片段可為Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、雙鏈單體(diabody)、三鏈單體(triabody)、單域抗體(sdAb，
single domain antibody)、VNAR或VHH，上述抗體類似物可為親合體(affibody)、人泛素(affilin)、阿非默(affimer)、阿非廷(affitin)、α體(alphabody)、抗運載蛋白(anticalin)、高親和性聚合體(avimer)、DARPin、Fynomer、Kunitz結構域肽(Kunitz domain peptide)、單抗體(monobody)、repebody、VLR或奈米CLAMP(nanoCLAMP)。上述抗體的Fc結構域可為IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc，可為上述Ig亞類中兩個以上的結構域(鉸鏈、CH2及CH3結構域等)混合而成的雜化Fc(hyFc)，上述IgG可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，尤其，以使對於Fcγ受體(FcγRc)及補體(C1q)的親和度降低的方式，擔當作為Fc的效應子(effector)功能的抗體-依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)或補體-依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)的官能基部分誘導變異的變體Fc和/或對於新生兒Fc受體(neonatal Fc receptor，FcRn)的選擇性親和度高且變異成血漿半衰期會增加的變體Fc。其中，上述雜化Fc(hyFc)可使用韓國專利第897938號、第1380732號、第1380729號等中記載的。更具體地，上述Fc區域可包含記載為序列識別號：6至9的胺基酸序列中的某一個胺基酸序列。上述「NTIG」係指選自由序列識別號：6及7形成的組中的雜化Fc(hyFc)蛋白的第18位及第196位胺基酸變異為其他胺基酸，由此不僅沒有如ADCC及CDC一樣的效應子功能，而且對於FcRn的選擇性親和度增加且血漿半衰期改善的修飾Fc結構域蛋白。像這樣，上述NTIG可包含選自由序列識別號：8及9形成的組中的胺基酸序列。
上述二聚體化結構域可為抗體的鉸鏈結構域、LIM/double zinc-finger motif)、RAG1結構域、HAT二聚體化結構域(HAT dimerization domain)、TRFH二聚體化結構域(TRFH dimerization domain)、Stat3二聚體化(Stat3 dimerization)或LFB1/HNF1二聚體化結構域(LFB1/HNF1 dimerization domain)，
但不限於此。上述細胞介素可為IL-4、IL-6、IL-α或TGF-β，上述免疫調節肽可為PD-L1或CTLA-4(CD152)。尤其，上述Fc結構域為融合配偶體蛋白時，可根據生成在鉸鏈部分上存在的半胱胺酸基之間的分子間二硫鍵形成二聚體。上述融合配偶體蛋白可連接在本發明之一實施例的單體IL-10變體蛋白的N-末端或C-末端中的任何部位。而且，這種情況下可藉由上述多種連接肽相連接。
本文中使用的術語「抗體」係免疫球蛋白(immunoglobulin)分子，係一種由2個相同的重鏈及2個相同的輕鏈結合而成的異四聚體蛋白，其藉由由上述輕鏈的可變區(VL)及上述重鏈的可變區(VH)構成的抗原結合部位(antigen-binding site)進行抗原特異性結合，由此誘發抗原特異性體液免疫反應(humoral immune response)。
本文獻中使用的術語「抗體的抗原-結合片段(antigen-binding fragment of antibody)」係具有來源於抗體的抗原結合能力的片段，其不僅包含利用蛋白切口酶切割抗體而生成的片段，而且包含重組方式中生成的單鏈片段，其中包含Fab、F(ab')2、scFv、雙鏈單體(diabody)、三鏈單體(triabody)、單域抗體(sdAb，single domain antibody)、VNAR或VHH。
本文獻中使用的術語「Fab」係抗原結合片段(fragment antigen-binding)，其為由作為蛋白水解酶的木瓜酶切割抗體分子而生成的片段，係VH-CH1及VL-CL的兩個肽的二聚體，由木瓜酶生成的其他片段被稱為可結晶片段(Fc，fragment crystallizable)。
本文獻中使用的術語「F(ab')2」係由作為蛋白水解酶的胃蛋白酶切割抗體而生成的片段中包含抗原結合部位的片段，表示上述兩個Fab由二硫鍵連接的四聚體的形態。由胃蛋白酶生成的其他片段被稱為pFc'。
本文獻中使用的術語「Fab'」係其結構與較弱的還原條件下分離上述F(ab')2而生成的Fab類似的分子。
本文獻中使用的術語「scFv」係「單鏈可變片段(single chain variable fragment)」的簡稱，雖然實際上不是抗體的片段，但是其為利用約25個胺基酸大小的連接肽連接抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)而製得的一種融合蛋白，據悉，其雖然並不是固有的抗體片段，但具有抗原結合能力(Glockshuber等人，Biochem.29(6)：1362-1367,1990)。
本文獻中使用的術語「diabody(雙鏈單體)」及「triabody(三鏈單體)」係指兩個及三個scFv分別由連接肽連接的形態的抗體片段。
本文獻中使用的術語「sdAb(單域抗體)」係由被稱為奈米抗體(nanobody)的抗體的單一可變區片段構成的抗體片段。據報導，主要使用來源於重鏈的sdAb，但來源於輕鏈的單一可變區片段也與抗原特異性結合。不同於由重鏈及輕鏈形成的常規的抗體，僅由單鏈的二聚體形成的鯊魚抗體的可變區片段形成的VNAR及由駱駝類抗體的可變區片段形成的VHH也包含在sdAb中。
本文獻中使用的「抗體類似物(antibody mimetic)」不同於兩個重鏈及兩個輕鏈形成異四聚體的四級結構來發揮功能的常規的全長抗體，包含如單抗體(monobody)、可變淋巴細胞受體(VLR)等一樣具有與由非抗體來源蛋白支架製備的抗體類似的功能即抗原結合能力的蛋白。這種抗體類似物包含來源於蛋白A的Z域的親合體(Affibody)(Nygren,P.A.,FEBS J.275(11)：2668-2676,2008)、來源於γ-B晶狀體蛋白(Gamma-B crystallin)或泛素(Ubiquitin)的人泛素(Affilin)(Ebersbach等人，J.Mol.Biol.372(1)：172-185,2007)、來源於半胱胺酸蛋白酶抑制劑(Cystatin)的阿非默(Affimer)(Johnson等人，Anal.Chem.84(15)：6553-6560,2012)、來源於Sac7d的阿非廷(Affitin)(Krehenbrink等人，J.Mol.Biol.383(5)：1058-1068,2008)、來源於三捲曲螺旋(Triple helix coiled coil)蛋白的α體(Alphabody)(Desmet等人，Nat.Commun.5：5237,2014)、來源於脂質運載蛋白(lipocalin)的抗運載蛋白(Anticalin)
(Skerra等人，FEBS J.275(11)：2677-2683,2008)、來源於多種膜受體的結構域的高親和性聚合體(Avimer)(Silverman等人，Nat.Biotechnol.23(12)：1556-1561,2005)、來源於錨蛋白重複模體(Ankyrin repeat motif)的DARPin(Stumpp等人，Drug Discov.Today.13(15-16)：695-701,2008)、來源於Fyn蛋白的SH3結構域的Fynomer(Grabulovski等人，J.Biol.Chem.282(5)：3196-3204,2007)、來源於多種蛋白抑制劑的Kunitz結構域的Kunitz結構域肽(Nixon and Wood,Curr.Opin.Drug Discov.Dev.9(2)：261-268,2006)、來源於纖網蛋白的第10位第3型結構域的單抗體(monobody)(Koide和Koide,Methods Mol.Biol.352：95-109,2007)、來源於碳水化合物結合模組32-2的nanoCLAMP(Suderman等人，Protein Exp.Purif.134：114-124,2017)、來源於盲鰻的可變淋巴細胞受體(variable lymphocyte receptor,VLR)(Boehm等人，Ann.Rev.Immunol.30203-220,2012)及基於上述VLR提高抗原親和性的repebody(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,109：3299-3304,2012)等。
在上述融合蛋白中，上述抗體Fc區域受體可為IgE Fc受體的α亞單位的胞外結構域。
根據本發明之另一方面，提供對上述單體IL-10變體蛋白或上述融合蛋白進行編碼的多核苷酸。
根據本發明之另一方面，提供包含上述多核苷酸的重組載體。
在上述重組載體中，上述多核苷酸可包含為可操縱地連接在調節序列的基因構建體形態。
本文獻中使用的術語「可操縱地連接(operably linked to)」係指目的核酸序列(例如，試管內轉錄/翻譯系統中或者宿主細胞中)以能夠使其表現的方式連接在上述調節序列的情況。
上述術語「調節序列」包含啟動子、增強子及其他調節因素(例，聚腺苷酸化信號)。調節序列包括指示所目的的核酸經常在多個宿主細胞中表現的序列、指示所目的的核酸僅在特定的組織細胞內表現的序列(例，組織特異性調節序列)以及指示所目的的核酸藉由特定信號來表現的序列(例，誘導性調節序列)。表現載體的設計可根據要轉化的宿主細胞的選擇及所需的蛋白表現的水平等因素而不同，這對於熟悉該項技術者來說係可以理解的。本發明之表現載體導入到宿主細胞中，可表現上述融合蛋白。在上述真核細胞及原核細胞中可表現的調節序列係熟悉該項技術者公知的。如上所述，它們通常包含擔當轉錄開始的調節序列及選擇性地擔當轉錄物的轉錄結束及穩定化的聚-A信號。追加的調節序列除了轉錄調節因子以外，可包含翻譯增強子和/或天然-組合或異源啟動子區域。例如，在哺乳類宿主細胞中可表現的調節序列包含CMV-HSV胸苷激酶啟動子、SV40、RSV-啟動子(勞氏肉瘤病毒)、人延伸因子1α-啟動子、糖皮質激素-誘導性MMTV-啟動子(莫洛尼小鼠腫瘤病毒)、金屬硫蛋白-誘導性或四環素-誘導性啟動子或者CMV擴增劑或SV40-擴增劑之類的擴增劑。為了實現神經細胞內的表現，可考慮使用神經微絲-啟動子(neurofilament-promoter)、PGDF-啟動子、NSE-啟動子、PrP-啟動子或thy-1-啟動子。上述啟動子係本領域公知的，並描述在文獻(Charron,J.Biol.Chem.270：25739-25745,1995)中。為了實現原核細胞內的表現，公開了包含lac-啟動子、tac-啟動子或trp啟動子的多個啟動子。除了可開始轉錄的因子以外，上述調節序列在本發明之一實施例的多核苷酸的下游(downstream)還可包含SV40-聚-A部位或TK-聚-A部位之類的轉錄結束信號。在本文獻中，適當的表現載體係本領域公知的，可列舉Okayama-Berg cDNA表現載體pcDV1(Parmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGX-27(專利第1442254號)、pX(Pagano等人，Science 255：1144-1147,1992)、酵母雙雜交(two-hybrid)載體、比方說pEG202
及dpJG4-5(Gyuris等人，Cell 75：791-803,1995)或原核表現載體、比方說Lambda gt11或pGEX(Amersham Pharmacia)。除了本發明之核酸分子以外，載體還可包含對分泌信號進行編碼的多核苷酸。上述分泌信號係熟悉該項技術者公知的。並且，根據使用的表現系統，可將融合蛋白引導為細胞區室(cellular compartment)的前導序列(leader sequence)，組合在本發明之一實施例的多核苷酸的編碼序列，較佳的是，翻譯的蛋白或將其蛋白直接分泌在細胞質周邊或細胞外介質的前導序列。
並且，本發明之載體例如可根據標準重組DNA技術製備，標準重組DNA技術例如包含平末端及黏性末端連接、用於提供適當末端的限制酶處理、為了防止不適當的結合，藉由鹼金屬磷酸鹽處理來去除磷酸基以及藉由T4 DNA連接酶的酶偶聯等。將對藉由化學合成或基因重組技術獲得的訊息肽進行編碼的DNA、對本發明之變體IL-10蛋白或包含其的融合蛋白進行編碼的DNA重組在包含適當的調節序列的載體中，由此可製備本發明之載體。包含上述調節序列的載體可以商業購買或製備，在本發明之一實施例中，將pBispecific載體用作骨架(backbone)。
上述表現載體還可包含對分泌訊息序列進行編碼的多核苷酸，上述分泌訊息序列誘導細胞內表現的重組蛋白向細胞外分泌，其可以為組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA，tissue plasminogen activator)訊息序列、HSV gDs(單純皰疹病毒糖蛋白Ds)訊息序列或生長激素訊息序列。
本發明之一實施例的上述表現載體可為在宿主細胞內可表現上述蛋白的表現載體，上述表現載體即使呈現質體載體、病毒載體、黏接質體載體、噬菌粒載體、人工人染色體等任何形態也無妨。
根據本發明之另一方面，提供包含上述單體IL-10變體蛋白或上述融合蛋白作為有效成分的免疫抑制用組成物。
而且，上述免疫抑制用組成物還可包含公知的免疫抑制劑成分(具有免疫抑制的功效的細胞介素，誘騙受體(Decoy receptor)，與免疫細胞的激活、分化等相關的配位基(ligand)及其抗體、可抑制免疫細胞的活性的抗體等)。這種公知的免疫抑制劑可為糖皮質激素、細胞增殖抑制劑(cytostatic agent)、抗-CD20抗體、抗-CD3抗體、抗-IL-2抗體、免疫親和素抑制劑(immunophilin inhibitor)、干擾素β、oipoid、TNFα結合蛋白、黴酚酸酯(mycophenolate)、芬戈莫德(fingolimod)或多球殼菌素(myriocin)。上述糖皮質激素可為潑尼松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)或氫化可的松(hydrocortisone)，上述細胞增殖抑制劑可為氮芥(nitrogen mustard)、亞硝基脲(nitrosourea)、鉑系配位錯合物(platinum coordination complex)、葉酸類似物(folic acid analogue)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、胺甲蝶呤(methotrexate)、放線菌素D(dactinomycin)、蒽環類藥物(anthracycline)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)或光輝黴素(mithramycin)。上述免疫親和素抑制劑可為環孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)或依維莫司(everolimus)。
根據本發明之另一方面，提供包含上述單體IL-10變體蛋白或上述融合蛋白作為有效成分的免疫疾病治療用藥學組成物。
在上述藥學組成物中，上述免疫疾病可為1型糖尿病、圓形脫毛症(alopecia areata)、抗磷脂抗體綜合症(antiphospholipid antibody syndrome)、風濕性關節炎、牛皮癬或牛皮癬性關節炎、多發性硬化症(multiple scelerosis)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、炎症性腸病(inflammatory bowel disease)、愛迪生氏病(Addison's disease)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、乾燥綜合症(Sjgren's syndrome)、格林-巴厘綜合症(Guillian-Barre syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌無力(Myasthenia gravis)、
炎症性肌病(inflammatory myophathy)、自體免疫性血管炎(autoimmune vasculitis)、自體免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、溶血性貧血(hemolytic anemia)、特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、硬皮病(scleroderma)、白斑症(vitiligo)、惡性貧血(pernicious anemia)、過敏性疾病或乳糜瀉(celiac disease)。
上述組成物可包含藥學上可接受的載體，除了上述載體以外，還可包含藥學上可接受的輔助劑、賦形劑或稀釋劑。
本文獻中使用的術語「藥學上可接受的」係指生理學上可接受的組成物，即為給藥到人身上時，通常不引起胃腸障礙、暈眩症之類的過敏性反應或與此類似的反應的組成物。作為上述載體、賦形劑及稀釋劑的例，可列舉乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯樹膠、褐藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油。並且，還可包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑及防腐劑等。
並且，本發明之一實施例的藥學組成物給藥到哺乳動物時，可使用本領域公知的方法進行劑型化，以便能夠實現活性成分的快速釋放或持續或遲延的釋放。劑型包含粉末、顆粒、片劑、乳液、糖漿、氣溶劑、軟質或硬質明膠膠囊、滅菌注射溶液、滅菌粉末形態。
本發明之一實施例的組成物能夠以多種途徑進行給藥，例如，可藉由口服、胃腸外給藥，例如藉由栓劑、經皮、靜脈、腹腔、肌內、病變內、鼻腔、脊椎管內進行給藥，並且可使用用於緩釋型或連續或重複釋放的移植裝置來給藥。給藥次數在所需範圍內每天給藥1次，或者分為多次進行給藥，給藥期間也不受特殊限制。
本發明之一實施例的組成物能夠與一般使用的藥學上可接受的載體一起劑型化為適合的形態。藥學上可接受的載體例如有水、適當的油、生理鹽水、水性葡萄糖及甘醇等之類的胃腸外給藥用載體等，還可包含穩定劑及保存劑。作為適合的穩定劑有亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸之類的抗氧化劑。作為適合的保存劑有苯紮氯銨、尼泊金甲酯或尼泊金丙酯及氯丁醇。並且，本發明之組成物根據其給藥方法或劑型，需要時可適當包含懸浮劑、助溶劑、穩定劑、等張劑、保存劑、吸附防止劑、表面活性劑、稀釋劑、賦形劑、pH調節劑、止痛劑、緩衝劑、抗氧化劑等。包括上述例示的內容，本發明中適合用的藥學上可接受的載體及製劑詳細記載於文獻[Remington's Pharmaceutical Sciences，最新版]中。
上述組成物給藥到患者的給藥量，根據包括患者的身高、體表面積、年齡、給藥的特定化合物、給藥時間及途徑、一般的健康狀態及同時給藥的其他藥物的多個因素而不同。藥學上的激活蛋白能夠以100ng/體重(kg)-10mg/體重(kg)的量進行給藥，更較佳的是，能夠以1至500μg/kg(體重)進行給藥，最較佳的是，能夠以5至50μg/kg(體重)進行給藥，具體地可藉由考慮上述因素來調節給藥量。
根據本發明之另一方面，提供包括將治療有效量的上述單體IL-10變體蛋白或上述融合蛋白給藥到需要免疫抑制的個體的步驟的上述個體的免疫抑制方法。
在上述方法中，需要上述免疫抑制的個體可為人或除了人以外的哺乳動物，也可為做過器官移植手術的患者或者作為患有免疫疾病的個體需要免疫抑制的患者。
而且，本發明之單體IL-10蛋白或包含其的融合蛋白以治療有效量進行給藥。
本文獻中使用的術語「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指以可適用於醫學治療的合理的受惠/危險比率治療疾病時充分的量，有效劑量水平可根據包括對象種類及重症度、年齡、性別、藥物的活性、對藥物的靈敏度、給藥時間、給藥途徑及排出比率、治療期間、同時使用的藥物的因素及其他醫藥領域中公知的因素而確定。本發明之組成物的治療有效量可為0.1mg/kg至1g/kg，更較佳的是可以為1mg/kg至500mg/kg，但是有效給藥量可根據患者的年齡、性別及病狀適當調節。
以下，藉由實施例及實驗例更詳細說明本發明。但是，本發明並不限定於以下公開的實施例及實驗例，而是能夠以相互不同的多種形態實現，以下的實施例及實驗例使本發明之公開變得完整，並且是為了給本發明所屬技術領域的普通技術人員完整地告知發明的範疇而提供的。
本發明人創作了多種單體人白細胞介素-10變體。具體地，分析IL-10蛋白的結構，考慮到形成二聚體IL-10蛋白時，IL-10的N末端和另一IL-10的C末端成對(pair)，由此創作出可使一個分子的IL-10的N末端和C末端成對(pair)的最起碼的連接肽(linker)長度。為了結合一個分子的IL-10蛋白的N末端部分和C末端部分，需要17.3Å的直線距離，並預測到N末端部分與C末端部分之間需要最小7個胺基酸以上的連接肽(linker)長度。此時，由於需要結合一個分子間N末端部分和C末端部分，因此預測到太長的連接肽反而成為妨礙末端間結合的因素，故而將9個胺基酸形成為最佳的連接肽長度，並預測到可設計成包括最大12個胺基酸連接肽長度的間隔肽。
具體地，本發明人確定具有如下清單1所示的結構的人白細胞介素-10變體蛋白序列，使用作為第二型限制酶的Bsa I和T4連接酶(ligase)，在
一個試管中使NTIG Fc子-載體、IL-10Vm子-載體及骨架載體(pBispecific Backbone；Genexine,Inc.)進行反應，由此製備載體構建體。
如上述表1所述，本發明之一實施例中，在IL-10蛋白的N-末端連接Fc結構域，由此形成二聚體，以可容易進行融合蛋白的分離純化步驟的形態創作IL-10變體蛋白。其中使用的Fc蛋白為由IgG1的鉸鏈部分和IgD及IgG4的雜交蛋白CH2及CH3部分構成的Fc變體(序列識別號：8及9)，在本文獻中出於方便將上述Fc變體命名為「NTIG」。在上述Fc變體蛋白和本發明一實施例的IL-10變體蛋白之間插入由序列識別號：2或3的胺基酸序列形成的連接肽1(linker 1)。在比較例1中使用的IL-10蛋白(序列識別號：10)將野生型人
白細胞介素-10蛋白的第87位胺基酸異白胺酸取代為丙胺酸，實施例1和實施例2的IL-10蛋白(序列識別號：39)也含有第87位胺基酸的取代。另一方面，實施例1和實施例2的IL-10蛋白(序列識別號：39)和比較例2的IL-10蛋白(序列識別號：11)在第116位的胺基酸天冬醯胺(N)和第117位的胺基酸離胺酸(K)之間插入肽，作為上述肽使用具有由序列識別號：4或5形成的胺基酸序列的間隔肽，尤其，包含由記載為比較例2的序列識別號：5的胺基酸序列形成的連接肽的IL-10蛋白(序列識別號：11)包含具有與Josephson等創作的單體IL-10蛋白相同的結構的單體IL-10(Josephson等人，J.Biol.Chem.275(18)：13552-13557,2000)。藉由PCR擴增及寡核苷酸合成製備對如上創作的各個融合蛋白的結構元件進行編碼的多核苷酸之後，利用Bsa I限制酶和T4連接酶將其亞選殖到NTIG子載體(sub-vector)及IL-10Vm子載體及骨架載體(pBispecific vector,Genexine,Inc.)之後，在一個試管(tube)中反應來製備最終載體構建體。利用賽默飛世爾(Thermo Fisher)公司的ExpiCHO套組(kit)，對如上製備的載體構建體執行暫態表現。具體地，在ExpiCHO-S細胞(cell)混合如上製備的載體構建體和套組內包含的ExpiFectamine試劑之後，在設置為8% CO2及37℃的條件的培養器中培養1天之後，將溫度降低至32℃，培養至第7天。
然後，執行Protein A捕獲純化，藉由非還原及還原條件下的SDS-PAGE分析，確認候補物質是否被純化，藉由考慮候補物質的pI值的劑型化緩衝液執行劑型化。利用Nano drop對結束劑型化的物質進行定量，利用SEC-HPLC確認最終純度。圖2a及圖2b表示利用SDS-PAGE及SEC-HPLC的IL-10M及培養及純化物的純度。圖2c及圖2d表示利用SDS-PAGE及SEC-HPLC的IL-10M-1、IL-10M-2純化物的純度。圖2e及圖2f表示利用SDS-PAGE及SEC-HPLC的IL-10M-3的培養及純化物的純度。
[表2]
其結果，如表2及圖2a至2f所示，生產非單體IL-10時(比較例1)，蛋白生產量少，表示最低的純度，生產單體IL-10時(實施例1及2及比較例2)，蛋白含量及純度大幅增加。另一方面，對於比較例2而言，雖然蛋白含量最高，但在純度方面上，本發明之實施例1的蛋白展示最高的82.7%的純度。
本發明人創作出與IgE特異性結合的受體FcεRIα和上述實施例1及比較例2的單體IL-10變體蛋白(IL-10Vm)由Fc蛋白連接的融合蛋白。
具體地，本發明人利用寡核苷酸合成及PCR，製備分別對具有下清單3所示的結構的融合蛋白進行編碼的多核苷酸之後，與上述實施例1的方法相同地亞選殖到FcεRIα子載體、NTIG Fc子載體及IL-10Vm子載體及骨架載體(pBispecific vector,Genexine,Inc.)之後，在一個試管(tube)中反應來製備最終載體構建體。
本發明人將作為上述融合蛋白的實施例3的FcεRIα-Fc-IL-10Vm命名為「PG075-8」，並將比較例3的FcεRIα-Fc-IL-10Vm命名為「PG075-9」。利用賽默飛世爾(Thermo Fisher)公司的ExpiCHO套組對如上所述製備的載體構建體進行暫態表現。具體地，在ExpiCHO-S細胞中混合如上所述製備的載體構建體和包含在套組內的ExpiFectamine試劑之後，在設置為8%的CO2及37℃的條件的培養箱中，培養1天之後，將溫度降低至32℃來進行250mL規模的培養，如此培養至第7天。
之後，進行蛋白A(Protein A)捕獲純化，藉由非還原及還原條件下的SDS-PAGE分析，確認候選物質是否被純化，藉由考慮候選物質的pI值的劑型化緩衝液執行劑型化。利用Nano drop對結束劑型化的物質進行定量，利用SEC-HPLC確認最終純度。圖3a及圖3b分別表示利用SDS-PAGE及SEC-HPLC的實施例3的FcεRIα-Fc-IL-10M(PG075-8)的培養及純化物的純度。圖3c及圖3d分別表示利用SDS-PAGE及SEC-HPLC的比較例3的FcεRIα-Fc-IL-10M(PG075-9)的培養及純化物的純度。
如上述圖3a至圖3d所示，對於本發明一實施例的IL-10Vm蛋白而言，當表現與作為活性藥物成分(API，active pharmaceutical ingredient)的FcεRIα相連接的形態的融合蛋白時，確認到實施例1的單體IL-10變體的生產收率及純度非常高，相反，當使用比較例2的以往的單體IL-10變體蛋白時，確認到蛋白收率及純度顯著降低。對此，本發明人在用於生產作為實際API的活性
蛋白與IL-10Vm蛋白一同連接的形態的融合蛋白的穩定細胞株的建立及實驗室規模的蛋白生產中使用本發明實施例1的IL-10Vm蛋白。
對此，本發明人將對上述實施例3-1中構建的融合蛋白進行編碼的基因構建體插入於pAD15表現載體(WO 2015/009052A)之後，利用Neon-轉染系統(Neon-transfection system)轉染於CHO DG44(from Dr.Chasin,Columbia University,USA)細胞。作為第一次篩選過程，使用沒有HT(5-羥色胺(5-hydroxytrypamine))的10%精製胎牛血清(dFBS)(Gibco，USA，30067-334)、MEMα(Gibco,12561,USA,Cat No.12561-049)、HT+(Gibco,USA,11067-030)培養基來進行HT篩選。之後，為了利用二氫葉酸還原酶(DHFR，dihydrofolate reductase)-系統來擴增表現基因，利用HT篩選的選殖體執行胺甲蝶呤(MTX)擴增。為了確保高的生產率的選殖體，在板上以微池的形態進行MTX擴增，並對確認到擴增的一種進行篩選之後，進行限制稀釋選殖(LDC，Limiting Dilution Cloning；96孔，30板)來確保最終細胞株。
在hyCellCHO培養基中，對最終確認的細胞株進行700mL分批培養，對培養第5天獲取的培養液進行Protein A純化來確認純化的蛋白，藉由SDS-PAGE及SEC-HPLC對純化的蛋白進行量及純度分析。
其結果，如圖3e及圖3f確認，可知從建立的穩定細胞株中正常表現本發明一實施例的融合蛋白。
為了確認在上述實施例中製備的融合蛋白的免疫抑制活性，本發明人利用由多個供體提供的全血來分析混合淋巴細胞反應。
為此，具體地，本發明人對10名的供體提供的全血進行Ficoll梯度離心分離，來分離外周血單核細胞。對分離的上述單核細胞的數進行計數之後，混合，以每小瓶(1mL)為5×106細胞的方式製備細胞培養瓶(CellSTACK)。
之後，溶解來自上述供體的細胞和受體的細胞之後，對細胞數進行計數，然後以1×106個細胞/ml的濃度進行再懸浮。將受體細胞分為反應細胞及刺激細胞之後，針對受體的刺激細胞和供體細胞照射3000 rad的γ射線來刺激。接著，利用cell trace violet(V450)對受體的反應細胞進行染色，並利用cell trace red(APC)對受體的刺激細胞及供體細胞進行染色。在補充有10%胎牛血清(FBS)的RPMI培養基200μl中，加入1×105個細胞的反應細胞和1×105個細胞的受體的反應細胞之後，混合。在37℃及5% CO2條件下，將混合的上述細胞培養6天。此時，以0.5μM的濃度處理比較例1及比較例2以及實施例1及實施例2的融合蛋白。上述培養結束之後，進行流式細胞螢光分選(FACS)分析。用於FACS分析的抗體使用BV650-結合抗-CD3抗體、藻紅蛋白(PE，phycoerythrin)-結合抗-PD1-抗體、PE-TR-結合抗-CD-14抗體、PE-TR-結合抗-CD19抗體、PerCp-結合抗-CD4抗體、Cy5.5-結合CD4抗體、別藻藍素(APC，allophycocyanine)-結合抗-CD8抗體、H7-結合抗-CD8抗體。
根據上述FACS分析結果，當使受體反應細胞和受體刺激細胞進行反應時(autologous，後面簡稱為「Auto(自體)」)，未呈現受體CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的增殖，但是，使受體反應細胞和供體刺激細胞進行反應時(allogenic，後面簡稱為「Allo(異源)」)，確認到受體CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的增殖(圖4a至圖4d)。如圖4a至圖4d所示，雖然並無大差異，但對於比較例1的二聚體IL-10融合蛋白而言，CD4+增殖抑制能力最強地呈現，相反，對於包含比較例2的以往的單體IL-10的融合蛋白而言，與陰性對照組並無差異。相反，包含本發明之實施例1及2的單體IL-10的融合蛋白與上述比較例
2相比，呈現更優秀的免疫抑制能力。同樣，確認到比較例1的二聚體IL-10融合蛋白的CD8+ T細胞增殖抑制能力也最高，本發明之實施例1及實施例2的單體IL-10融合蛋白與比較例1相比，雖然CD8+ T細胞增殖抑制能力更低，但與比較例2相比，CD8+ T細胞增殖抑制能力更高。
本發明人察看本發明之單體IL-10融合蛋白的免疫刺激活性。
具體地，在裝有包含10%胎牛血清、1%抗生素、rmSCF 20ng/ml及rmIL-3 10ng/ml的RPMI培養基的96孔板中，分注來源於骨髓的肥大細胞(BMMC)5×103個細胞/100μl/孔，並按濃度稀釋重組人白細胞介素-10和比較例1及2以及實施例1及2的IL-10融合蛋白之後，在上述96孔板處理各100μl，並在37℃及5% CO2條件下，培養4天。接著，為了測定上述肥大細胞的增殖程度，在96孔板中分注MTS試劑各20μl之後，在37℃的溫度條件下，將上述96孔板放入CO2培養箱中，反應2小時之後，利用酶標儀(microplate)在595nm下測定吸光度。
其結果，如圖5a及上述表4確認，陽性對照組rhIL-10的肥大細胞增殖能力最強，對於比較例1及2的IL-10融合蛋白而言，低於rhIL-10，但有一定的肥大細胞增殖能力。相反，本發明之實施例1及2的IL-10融合蛋白幾
乎不呈現肥大細胞增殖能力。這表示本發明之IL-10變體蛋白係IL-10的雙重活性中免疫激活特性完全被抑制的蛋白的結果。但是，對於上述實驗結果而言，由於可解釋為本發明之實施例1及2的融合蛋白表現為沒有任何活性的形態的結果，故而本發明人僅將rhIL-10、實施例1及比較例1的融合蛋白作為對象進一步提高處理濃度，執行相同分析。
其結果，如上述表5及圖5b所示，本發明之實施例1的融合蛋白僅在濃度非常高的100nM下呈現限制的肥大細胞增殖能力。但是，由於上述濃度係相比於體內給藥時使用的給藥量顯著高的濃度，因此體內給藥時肥大細胞刺激之類的免疫功能刺激效果幾乎沒有。
上述肥大細胞增殖能力分析之後，接著調查IL-10融合蛋白對肥大細胞中的腫瘤壞死因子-α分泌能力減少帶來的影響，即，免疫抑制活性。
為此，具體地，在裝有包含10%胎牛血清、1%抗生素、rmSCF 20ng/ml及rmIL-3 10ng/ml的RPMI培養基的96孔板中，分注來源於骨髓的肥大細胞(BMMC)1×104個細胞/50μl/孔，並按濃度稀釋重組人白細胞介素-10和
比較例1、2以及實施例1、2的IL-10融合蛋白之後，以3μg/mL稀釋抗-DNP IgE之後，在96孔板中加入各50μl，在37℃及5% CO2條件下，培養24小時。接著，將DNP-BSA(Antigen)稀釋為400ng/ml，在96孔板中加入各50μl之後，在37℃及5% CO2條件下，過夜反應。接著，在4℃下，以1500rpm的速度離心分離5分鐘之後，在新的96孔板中分注所回收的上清液150μl之後，利用腫瘤壞死因子-α酶聯免疫吸附測定套組(TNF-α ELISA kit)(Biolegend，USA)測定腫瘤壞死因子-α之濃度。
其結果，如上述表6及表7以及圖6a至圖6c確認，在比較例1(IL-10M)中，呈現濃度依賴性的腫瘤壞死因子-α抑制活性。此時，對於本發明實施例1的IL-10M-1及實施例2的IL-10M-2和比較例2的IL-10M-3而言，與比較例1類似地，呈現濃度依賴性的腫瘤壞死因子-α分泌減少能力，但在其濃度相比於比較例1高5倍左右的濃度下，呈現等同的活性。而且，對於本發明一實施例的PG075-8而言，在更低的濃度下，也呈現非常優秀的腫瘤壞死因子-α分泌抑制能力，從而可確認可有效阻斷IgE。綜合上述結果可見，本發明一實施例的IL-10變體蛋白與二聚體型IL-10變體蛋白相比，其免疫抑制活性更低，
但其為抑制IL-10的雙重特性之一的免疫活性增強作用時最有效，且在生產量及純度方面最有利的IL-10變體蛋白。
尤其，本發明一實施例的IL-10變體蛋白，相比於類似地表現為單體形態的比較例2的IL-10變體蛋白，呈現濃度依賴性的腫瘤壞死因子-α分泌刺激活性，當用作FceRIα被融合的融合蛋白時(實施例3)，確認到也對過敏反應抑制活性具有顯著效果。
本發明人確認本發明一實施例的PG075-8蛋白抑制肥大細胞中的腫瘤壞死因子-α分泌的能力，接著，調查是否在作為與腫瘤壞死因子-α介導炎症反應密切相關的免疫細胞的巨噬細胞中也可抑制腫瘤壞死因子-α分泌。
為此，具體地，以5×105個細胞/mL濃度準備RAW264.7細胞之後，在96孔板中分注各100μl之後，在37℃、5% CO2培養箱中，培養12小時。接著，依次稀釋本發明一實施例的PG075-8之後，處理在培養中的上述RAW264.7細胞。此時，在96孔板處理脂多糖(400ng/ml)各100μl，誘導腫瘤壞死因子-α表現。接著，在37℃、5% CO2培養箱中，培養12小時，分離150μl的上清液之後，以與上述實驗例3-1相同的方法測定包含在上清液的腫瘤壞死因子-α表現量(表8及圖6d)。
其結果，如表8及圖6d確認，本發明之一實施例的PG075-8融合蛋白濃度依賴性地抑制了巨噬細胞中的TNF-α的表現。
本發明人基於上述實驗例1至3的實驗結果，藉由生物層干涉儀(BLI，bio-layer interferometry)分析，對與比較例1及實施例1的融合蛋白的IL-10受體1(IL-10R1)的親和度進行分析。此時，作為對照組，使用未連接有FcεRIα而在雜化Fc區域由丙胺酸取代野生型IL-10的第87位胺基酸異白胺酸，從而連接有具有序列識別號：10的胺基酸序列的免疫激活功能被抑制的二聚體IL-10變體蛋白(IL-10V)的融合蛋白(IL-10V)及連接有上述IL-10V的融合蛋白中的IL-10變體蛋白的第116位胺基酸天冬醯胺(N)和第117位胺基酸離胺酸(K)之間插入間隔肽(GGSGGSGGS，序列識別號：4)的單體IL-10變體蛋白(IL-10Vm，序列識別號：39)的融合蛋白(Fc-IL-10Vm)。上述NTIG-IL-10Vm除了不連接FcεRIα之外，與本發明一實施例的PG075-8相同。
為此，首先，本發明人利用Dip and ReadTM Amine Reactive 2nd Generation(AR2G)Reagent Kit(forteBio,Cat No.18-5092)將IL-10R多聚組胺酸標籤(His-tag)蛋白附著於96孔板。具體地，在96孔板中分注D.W.200μl之後，插入包含在上述套組中的胺生物感測器(amine biosensor)，水合10分鐘。接著，追加分注D.W.200μl之後，以所需的樣品量的1/20，將EDC：NHS混合成1：1之後，稀釋於D.W.在96孔板中分注各200μl。接著，將IL-10R多聚組胺酸標籤蛋白稀釋於10mM乙酸(acetate)pH 5.0溶液使其成為10μg/mL之後，在上述96孔板中各加入200μl。之後，在96孔板中分別加入1M乙醇胺各200μl之後，將生物感測器板和樣板放入Octet-2設備，測定。測定結束之後，
在樣板中加入1×Kinetics緩衝液200μl之後，確定基線(baseline)。然後，以不同濃度(0、62.5、125、250、5000及1000nM)將在上述實施例中製備的NTIG-IL-10融合蛋白稀釋於1×Kinetic緩衝液之後，在樣板中分注200μl之後，利用Octet® K2設備進行生物層干涉儀分析，測定結合親和度。
其結果，如圖7及表9所示，本發明之一實施例的融合蛋白(NTIG-IL-10Vm)的Kd值為29.2nM，該值達到比較例1的單體IL-10融合蛋白(NTIG-IL-10V)的Kd值(11.1nM)的約三倍左右。因此，與IL-10R的親和力相比於比較例1的單體IL-10融合蛋白有所降低。以往研究結果也顯示，單體IL-10相比於二聚體IL-10蛋白，與IL-10R的親和性降低，因此可充分預測。相反，本發明之實施例3的融合蛋白(FcεRIα-Fc-IL-10Vm，PG075-8)的KD值小於0.001nM，與IL-10R的親和度更高。這係即使與作為API的FcεRIα連接，單體IL-10變體也對IL-10R具有充分的結合能力的結果。
本發明人藉由生物膜層干涉儀(BLI)分析，對實施例3中製備的融合蛋白(FcεRIα-Fc-IL-10Vm)與小鼠IgE及人IgE的親和度進行分析。
為此，首先，本發明人利用Dip and ReadTM Amine Reactive 2nd Generation(AR2G)Reagent Kit(forteBio,Cat No.18-5092)將作為對照組的沒
有IL-10Vm的FcεRIα-Fc蛋白及實施例3中製備的融合蛋白附著於96孔板。具體地，在96孔板中分注D.W.200μl之後，插入包含在上述套組中的胺生物感測器，水合10分鐘。接著，追加分注D.W.200μl之後，以所需的樣品量的1/20，將EDC：NHS混合成1：1之後，稀釋於D.W.在96孔板中分注各200μl。接著，將FcεRIα-Fc蛋白及FcεRIα-Fc-IL-10Vm融合蛋白稀釋於10mM乙酸(acetate)pH 5.0的溶液使其成為10μg/ml之後，在上述96孔板中各加入200μl。之後，在96孔板中分別加入1M乙醇胺各200μl之後，將生物感測器板和樣板放入Octet® K2設備，測定。測定結束之後，在樣板中加入1×Kinetics緩衝液200μl之後，確定基線(baseline)。然後，以不同濃度(50pM及3.125nM)將在上述實施例的抗-DNP小鼠IgE(Sigma)稀釋於1×Kinetic緩衝液之後，在樣板中分注200μl之後，利用Octet®K2設備進行生物層干涉儀分析，測定結合親和度。
其結果，如圖8a及表10所示，本發明之實施例的融合蛋白(FcεRIα-Fc-IL-10Vm，PG075-8)的KD值為0.284nM，相比於對照組FcεRIα-Fc融合蛋白稍微低，該等差異不是顯著差異，因此根據IL-10蛋白的附加，可確認與IgE的結合能力並不降低。與上述結果一同，為了測定本發明中使用的人FcεRIα與人IgE的結合度，本發明人利用上述方法分析實施例3的融合蛋白(PG075-8)與人IgE的結合親和度。
其結果，如圖8b及表11所示，本發明之一實施例的融合蛋白與人IgE也呈現類似於上述小鼠IgE的親和度。
本發明人為了確認本發明之融合蛋白在體內給藥時穩定性達到何種程度，執行藥物動力學分析。
具體地，將各組的3隻SD大鼠作為對象，以1mg/kg的給藥量，藉由靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射及皮下注射，分別按1.0mL/kg、1.0mL/kg、0.4mL/kg及1.0mL/kg的體積給藥本發明之一實施例的融合蛋白(PG075-8)之後，就靜脈注射而言，在0分鐘、5分鐘、1小時、5小時、10小時、24小時、48小時、72小時、120小時、168小時、240小時及336小時以及其他給藥方法(腹腔注射、肌肉注射及皮下注射)中除了5分鐘後測定以外，在與上述靜脈注射相同的時間段採集血清，利用人IgG4 Fc ELISA對上述融合蛋白進行定量。
其結果，如圖9所示，本發明之一實施例的融合蛋白與給藥途徑無關地根據時間的經過呈現緩慢的減少情況，這表示本發明之一實施例的融合蛋白在體內保持相當長時間的時間。
據報導，以往的重組IL-10提高給藥濃度，或者反復給藥時，血液內血紅蛋白濃度減少而出現貧血症狀，隨著血小板濃度減少，具有出現血小板減少症(thromocytopenia)的副作用(Tilg等人，J.Immunol.164(4)：2204-2209,2002；Fedorak等人，Gastroendocrinol.119(6)：1473-1482,2000)。對此，本發明人調查本發明一實施例的融合蛋白是否出現這種副作用。
為此，具體地，本發明人將雌性ICR小鼠作為對象，每組由3隻小鼠構成之後，按各組給藥0、50、150及300mg/kg劑量的PG075-8，在藥物給藥之後，第11天採血，並利用血球分析儀(XN-V，SYSMEX，JAPAN)分析白血球分類計數(white blood cell differential count)、紅血球總數(total RBC)及血小板總數(total platelet)。其結果，如圖10所示，當PG075-8給藥時，血球細胞等的數量無任何影響。
本發明人為了確認本發明之一實施例的融合蛋白PG075-8是否實際對過敏性疾病呈現效果，將被過敏誘發源卵白蛋白(OVA)致敏的實物動物作為對象，調查OVA口服給藥時產生的過敏症狀即腹瀉症狀改善何種程度。
具體地，針對Balb/c小鼠(koatech)，將OVA(ovalbumin)50μg及明礬(Alum)1mg的混勻溶液，間隔14天，口服給藥2次，致敏(sensitization)。接著，第28、30、32、34、36天，總共5次，間隔2天，口服給藥OVA 50mg，誘發腸道的飲食過敏。在該過程中，第31天給藥組成各組的藥物。分別調節莫耳數並計算之後，在第1組(對照組)中給藥磷酸緩衝液(PBS)，在第2組中給藥IgETRAP(5mg/kg)，在第3組中給藥本發明之一實施例的PG075-8(7.3mg/kg)。總共5次口服給藥OVA，並確認是否發生腹瀉，
第37天解剖小鼠，對屬於各組的小鼠分析小腸內肥大細胞的數量、血中IgE濃度及血中肥大細胞的脫粒酶濃度(MCPT-1，肥大細胞蛋白酶-1)。其結果，由圖11可知，屬於給藥本發明之一實施例的PG075-8的組的小鼠，相比於對照組及IgETRAP給藥組小鼠，可確認食品過敏緩解效果。
因此，作為與本發明之一實施例的IL-10Vm不同的融合伴侶適用FcεRIα的融合蛋白，抑制上述免疫細胞的激活、它們的功能尤其抗-炎症性細胞介素的分泌、抗原呈遞能力等，由此可使用在起源於過度激活的免疫功能的多種免疫相關疾病例如特應性疾病、飲食過敏、慢性自發性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria)、氣喘等過敏疾病的治療。
本發明參照上述實施例及實驗例進行說明，但這僅是示例性的，本發明技術領域的普通技術人員應當理解由此可實現多種變形及等同的其他實施例。因此，本發明之真正的技術保護範圍應當取決於所附的申請專利範圍之技術思想。
本發明之一實施例的單體IL-10變體蛋白和包含其的融合蛋白在免疫相關疾病的治療劑開發中非常有用。
Claims (16)
- 一種單體白細胞介素-10變體蛋白，其包含序列辨識號：1或39之胺基酸序列。
- 如請求項1所述之單體白細胞介素-10變體蛋白，其特徵在於，由記載為序列辨識號：1或39的胺基酸序列形成。
- 一種融合蛋白，其特徵在於，包含如請求項1所述之單體IL-10變體蛋白及融合配偶體蛋白(partner protein)，該融合配偶體蛋白選自由下列組成之群組：與靶蛋白特異性結合的抗體、抗體的抗原-結合片段、與靶蛋白特異性結合的抗體類似物、抗體的Fc區域、抗體Fc區域受體、與抗體Fc區域受體的Fc區域結合的胞外結構域、二聚體化結構域、細胞介素或免疫調節肽。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其特徵在於，所述抗體Fc區域由序列辨識號：6至9中的任一個胺基酸序列形成。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其特徵在於，所述抗體Fc區域受體為IgE Fc受體的α亞單位或其胞外結構域。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其特徵在於，所述抗體的抗原-結合片段為Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、雙鏈單體(diabody)、三鏈單體(triabody)、單域抗體(sdAb，single domain antibody)、VNAR或VHH。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其特徵在於，所述抗體類似物為親合體(affibody)、人泛素(affilin)、阿非默(affimer)、阿非廷(affitin)、α體(alphabody)、抗運載蛋白(anticalin)、高親和性聚合體(avimer)、DARPin、Fynomer、Kunitz結構域肽(Kunitz domain peptide)、單抗體(monobody)、repebody、VLR或奈米CLAMP(nanoCLAMP)。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其特徵在於，所述抗體的Fc區域為免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白M(IgM)的Fc區域或所述Ig亞類中的兩個以上抗體Fc區域內的結構域混合而成的雜化Fc。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其特徵在於，所述二聚體化結構域為抗體的鉸鏈結構域、LIM/雙鋅指模體(LIM/double zinc-finger motif)、RAG1結構域、HAT二聚體化結構域(HAT dimerization domain)、TRFH二聚體化結構域(TRFH dimerization domain)、Stat3二聚體化(Stat3 dimerization)或LFB1/HNF1二聚體化結構域(LFB1/HNF1 dimerization domain)。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其特徵在於，所述細胞介素為白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1α(IL-1α)或轉化生長因子-β(TGF-β)。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其特徵在於，所述免疫調節肽為計劃性死亡受體配位基1(PD-L1)或細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)分化簇152(CD152)。
- 一種多核苷酸，其特徵在於，對如請求項1所述之單體IL-10變體蛋白或如請求項3至11中任一項所述之融合蛋白進行編碼。
- 一種載體，其特徵在於，包含如請求項12所述之多核苷酸。
- 一種免疫抑制用藥學組成物，其特徵在於，包含如請求項1所述之單體白細胞介素-10變體蛋白或如請求項3至11中任一項所述之融合蛋白作為有效成分。
- 一種免疫疾病治療用藥學組成物，其特徵在於，包含如請求項1所述之單體白細胞介素-10變體蛋白或如請求項3至11中任一項所述之融合蛋白作為有效成分。
- 如請求項15所述之藥學組成物，其特徵在於，所述免疫疾病選自由1型糖尿病、圓形脫毛症(alopecia areata)、抗磷脂抗體綜合症(antiphospholipid antibody syndrome)、風濕性關節炎、牛皮癬或牛皮癬性關節炎、多發性硬化症(mutiple scelerosis)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、炎症性腸病(inflammatory bowel disease)、愛迪生氏病(Addison's disease)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、乾燥綜合症(Sjögren's syndrome)、格林-巴厘綜合症(Guillian-Barre syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌無力(Myasthenia gravis)、炎症性肌病(inflammatory myopathy)、自體免疫性血管炎(autoimmune vasculitis)、自體免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、溶血性貧血(hemolytic anemia)、特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、硬皮病(scleroderma)、白斑症(vitiligo)、惡性貧血(pernicious anemia)、過敏性疾病及乳糜瀉(celiac disease)組成之群組。
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