TW202325746A - Il10單體融合蛋白及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提出了一種IL10單體融合蛋白及其應用,涉及生物醫藥領域,所述融合蛋白包括抗體和IL-10單體。本發明所述的融合蛋白具有較強的靶向性,安全性得到顯著提高,且可有效治療或預防多種腫瘤或炎性疾病。
Description
本發明要求申請號為202111286063.4,申請日為2021年11月2日,發明名稱為IL10單體融合蛋白及其應用的中國發明專利申請的優先權,其全部內容藉由引用併入本文中。
本發明關於生物醫藥領域,具體地,關於融合蛋白及其應用,更具體地,關於一種融合蛋白、核酸、表達載體、重組細胞、所述融合蛋白或核酸或表達載體或重組細胞在製備藥物中的用途以及藥物組合物。
白介素10(Interleukin 10,IL-10,或IL10)也被稱為人類細胞因子合成抑制因子(CSIF),是一種抗炎細胞因子,屬於同源二聚體分泌物,目前臨床上的IL-10蛋白存在安全性問題,少量的天然二聚化的IL-10分子與其受體IL-10Rα高親和力結合後,進一步與IL-10Rβ結合,形成六聚體複合物並激活下游訊號,引起生物學功能反應。
目前的臨床IL-10藥物分子缺乏靶向性,藥物分子容易脫靶,並產生副作用;而大部分在開發的IL-10抗體融合蛋白,其設計思路是利用抗體靶向作用將IL-10引到局部環境中發揮作用。這些融合蛋白分子往往都具有正常的IL-10二聚體結構,但是由於IL-10二聚體與IL-10Rα高親和力結合,可能會影響抗體端的靶向作用,從而導致設計思路失敗,並且如果抗體端的活性需求劑量較大,則IL-10端的副作用仍然是一個棘手的問題。
因此,仍需積極探索靶向性強、副作用小的IL-10藥物,該研究方向對預防或治療腫瘤或炎性疾病具有重要意義。
本發明是基於發明人對以下問題的發現和認識作出的。
目前臨床IL-10藥物存在缺乏靶向性,藥物分子容易脫靶,不僅藥效不易發揮且容易產生副作用,發明人藉由對IL-10單體分子和抗體分子的連接方式進行探索,製備了一種包含IL-10單體分子和抗體分子的融合蛋白,所述融合蛋白中的IL-10分子在抗體結合靶細胞前IL-10呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞上抗原的結合,抗體結合抗原後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應,使得IL-10藥物的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮。
在本發明的第一方面,本發明提出了一種融合蛋白。根據本發明的實施例,包括抗體和IL-10單體,其中,所述抗體包括兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈,一條IL-10單體與抗體重鏈或輕鏈連接,所述IL-10單體的N末端不與抗體重鏈的C末端連接。天然IL-10分子為二聚體形式,根據本發明實施例的融合蛋白在抗體結合靶細胞前IL-10分子呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞的結合。抗體結合靶細胞後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應,且由於IL-10單體很難引發生物功能,所以IL-10單體融合蛋白不會產生天然二聚體IL-10分子或其抗體融合蛋白的給藥劑量限制,使得IL-10單體融合蛋白的給藥劑量得到顯著提高。所述融合蛋白能夠與更多的抗體分子搭配使用,使得融合蛋白的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮,且可治療或預防多種腫瘤或炎性疾病。
根據本發明的實施例,上述融合蛋白還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一。
根據本發明的實施例,每條抗體輕鏈包括VL區、CL區,每條抗體重鏈包括VH區、CH1區、CH2區、CH3區;所述IL-10單體的N末端與抗體輕鏈C末端相連,或所述IL-10單體的C末端與抗體輕鏈N末端相連,或所述IL-10單體的N末端與氫鏈VL區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與氫鏈CL區的N末端相連,或所述IL-10單體的C末端與抗體重鏈的N末端相連,或所述IL-10單體的N末端與重鏈VH區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與重鏈CH1區的N末端相連,或所述IL-10單體的N末端與重鏈CH2區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與重鏈CH3區的N末端相連。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體包括天然IL-10單體。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體為修飾後的天然IL-10單體,所述修飾包括下列(i)和(ii)的至少之一:(i)去除天然IL-10單體的N末端的前2個胺基酸;(ii)在第116位和117位胺基酸之間插入第一連接肽,所述第一連接肽為柔性連接肽。
將天然IL-10單體的N末端的前2個胺基酸去除後,IL-10單體的穩定性得到提升,同時在IL-10單體的第116位和117位胺基酸之間插入第一連接肽後,所述融合蛋白中的IL-10單體分子封閉,成為閉環IL-10單體分子(天然IL10二聚體的兩條IL10鏈是交錯在一起形成的,經過插入linker改造後,IL10單體可以獨立形成結構域,即閉環單體分子),同一融合蛋白中的兩個IL-10單體不會出現相互連接等干擾。
根據本發明的實施例,所述第一連接肽的胺基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
GGGSGG(SEQ ID NO:21)
根據本發明的實施例,所述IL-10單體具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:2)。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體與抗體重鏈或輕鏈藉由第二連接肽或/和第三連接肽連接。利用第二連接肽或/和第三連接肽將所述IL10單體與所述抗體重鏈或輕鏈相連後,使得所述融合蛋白中的抗體部分與相應靶細胞結合後,相互靠近的2個融合蛋白的IL-10單體更易形成二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合。
根據本發明的實施例,所述第二連接肽或/和第三連接肽可以是柔性連接肽或剛性連接肽。
根據本發明的實施例,所述第二連接肽具有SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列,所述第三連接肽具有SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列。
GSGSGSGS(SEQ ID NO:12)。
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:22)。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體與所述抗體的重鏈末端或輕鏈末端藉由所述第二連接肽連接。
根據本發明的實施例,所述第二連接肽的N末端與所述抗體輕鏈的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第二連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述抗體輕鏈的N末端相連;或所述第二連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述抗體重鏈的N末端相連。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體與所述抗體的重鏈末端或輕鏈末端藉由所述第三連接肽連接;
根據本發明的實施例,所述第三連接肽的N末端與所述抗體輕鏈的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述抗體輕鏈的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述抗體重鏈的N末端相連。
根據本發明的實施例,所述第三連接肽的N末端與所述輕鏈VL區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述輕鏈CL區的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述重鏈VH區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述重鏈CH1區的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述重鏈CH2區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述重鏈CH3區的N末端相連。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的輕鏈的VL區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的輕鏈CL區的N末端連接;或所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈VH區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈CH1區的N末端相連;或所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈CH2區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈CH3區的N末端相連。
根據本發明的實施例,所述抗體選自免疫細胞類抗體和腫瘤細胞類抗體。
根據本發明的實施例,所述抗體為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗-Her2抗體、抗CCR8抗體、抗VEGFR2抗體、抗claudin18.2抗體、抗CD39抗體、抗SMA4D抗體、抗GUCY2C抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM3抗體、抗TIGIT抗體、抗CD47抗體或抗TNFα抗體。
根據本發明的實施例,所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列。
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DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:6)。
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGSGSGSGSGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGSGSGSGSGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:7)。
GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGDTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:8)。
GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)。
在本發明的第二方面,本發明提出了一種核酸。根據本發明的實施例,所述核酸編碼第一方面所述的融合蛋白。根據本發明實施例的核酸編碼的融合蛋白中的IL-10分子在抗體部分結合靶細胞前呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞的結合;抗體結合靶細胞後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應;且由於IL-10單體很難引發生物功能,所以IL-10單體融合蛋白不會產生天然二聚體IL-10分子或其抗體融合蛋白的給藥劑量限制,使得IL-10單體融合蛋白的給藥劑量得到顯著提高。所述融合蛋白能夠與更多的抗體分子搭配使用,使得融合蛋白的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮,且可治療或預防多種腫瘤或炎性疾病。
根據本發明的實施例,所述核酸分子為DNA或RNA。
在本發明的第三方面,本發明提出了一種表達載體。根據本發明的實施例,所述表達載體包含第二方面所述的核酸。根據本發明實施例的表達載體導入合適的受體細胞後,可在調控系統的介導下,有效實現前面所述的融合蛋白的表達,獲得的融合蛋白中的IL-10分子在抗體部分結合靶細胞前呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞的結合;抗體結合靶細胞後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應;且由於IL-10單體很難引發生物功能,所以IL-10單體融合蛋白不會產生天然二聚體IL-10分子或其抗體融合蛋白的給藥劑量限制,使得IL-10單體融合蛋白的給藥劑量得到顯著提高。所述融合蛋白能夠與更多的抗體分子搭配使用,使得融合蛋白的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮,且可治療或預防多種腫瘤或炎性疾病。
在本發明的第四方面,本發明提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例,所述重組細胞攜帶第二方面所述的核酸、第三方面所述的表達載體或表達第一方面所述的融合蛋白。根據本發明實施例的重組細胞可用於前面所述的融合蛋白的表達和大量獲得,獲得的融合蛋白在抗體部分結合靶細胞前IL-10分子呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞的結合;抗體結合靶細胞後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應;且由於IL-10單體很難引發生物功能,所以IL-10單體融合蛋白不會產生天然二聚體IL-10分子或其抗體融合蛋白的給藥劑量限制,使得IL-10單體融合蛋白的給藥劑量得到顯著提高。所述融合蛋白能夠與更多的抗體分子搭配使用,使得融合蛋白的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮,且可治療或預防多種腫瘤或炎性疾病。
在本發明的第五方面,本發明提出了第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表達載體或第四方面所述的重組細胞在製備藥物中的用途。根據本發明的實施例,所述藥物用於治療或預防腫瘤或炎性疾病。根據本發明的具體實施例,所述藥物可有效治療或緩解腫瘤以及炎性疾病,且安全性較高。
在本發明的第六方面,本發明提出了一種藥物組合物。根據本發明的實施例,包含第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表達載體或第四方面所述的重組細胞。根據本發明的具體實施例的藥物可有效治療或緩解腫瘤以及炎性疾病,且具有較高的安全性。
根據本發明的實施例,上述藥物組合物還可以進一步包括如下附加技術特徵(i)和(ii)中的至少之一:
(i)根據本發明的實施例,所述藥物組合物用於治療或預防腫瘤或炎性疾病。
(ii)根據本發明的實施例,所述藥物組合物可包括:藥學上可接受的輔劑,所述藥學上可接受的輔劑包括穩定劑、濕潤劑、乳化劑、黏合劑、等滲劑的至少之一;所述藥物組合物呈片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、溶液劑、懸浮劑、凍乾製劑的至少一種。
在本發明的第七方面,本發明提出了一種在受試者中診斷、治療、預防或減輕與腫瘤或炎性疾病相關的疾病、病症或狀況的方法,其包括向上述受試者施用治療有效量的前述融合蛋白和/或前述藥物組合物。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出,部分將從下面的描述中變得明顯,或藉由本發明的實踐瞭解到。
下面詳細描述本發明的實施例,所述實施例的示例在圖式中示出。下面藉由參考附圖描述的實施例是示例性的,旨在用於解釋本發明,而不能理解為對本發明的限制。
此外,術語“第一”、“第二”僅用於描述目的,而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此,限定有“第一”、“第二”的特徵可以明示或者隱含地包括至少一個該特徵。在本發明的描述中,“多個”的含義是至少兩個,例如兩個,三個等,除非另有明確具體的限定。
本文中,術語“抗體”是能夠與抗原特異性結合的免疫球蛋白分子。包括兩條分子量較輕的輕鏈和兩條分子量較重的重鏈,重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)由二硫鍵連接形成一個四肽鏈分子。其中,肽鏈的胺基端(N端)胺基酸序列變化很大,稱為可變區(V區),羧基端(C端)相對穩定,變化很小,稱為恒定區(C區)。L鏈和H鏈的V區分別稱為VL和VH,L鏈的C區為CL,H鏈的C區包含CH1區、CH2區和CH3區。
天然IL-10分子為二聚體結構(包括兩條天然IL-10單體),天然IL-10分子與IL-10受體(IL-10R)結合方式如圖1-A所示,而IL-10單體對IL-10Rα的活性比天然IL-10二聚體弱10倍(具體實驗資料參考文獻:J Biol Chem. 2000 May 5;275(18):13552-7. doi: 10.1074/jbc.275.18.13552.),且幾乎無法介導與IL-10Rβ的進一步結合,因此很難激活下游訊號引起生物學功能反應,IL-10單體與IL-10受體結合方式如圖1-B所示。
因此,本發明將IL-10單體連接在所述抗體分子的不同部位(可以是對稱的或非對稱的結構)構建所述融合蛋白(IL-10單體融合蛋白),藉由所述抗體自身結構的空間位阻使IL-10單體被隔離開,當IL-10單體融合蛋白處於游離狀態時,即使IL-10單體與IL-10Rα結合也無法引起功能反應。只有當抗體端結合到靶細胞後,才能藉由聚集效應,將鄰近IL-10單體-IL-10Rα複合物聚攏,並進一步與IL-10Rβ結合形成複合物產生下游訊號並引發生物功能,具體結合方式如圖2所示,這樣可以避免藥物分子在沒有到達靶部位前IL-10分子對所述抗體的靶向性產生干擾,不會產生臨床副作用;且由於IL-10單體很難引發生物功能,所以IL-10單體融合蛋白不會產生天然二聚體IL-10分子或其抗體融合蛋白的給藥劑量限制,使得IL-10單體融合蛋白的給藥劑量得到顯著提高。同時,由於不同抗體的臨床使用劑量具有差異,當IL-10分子的使用劑量較低,會嚴重限制IL-10單體融合蛋白的中抗體靶標的選擇,因此,本發明獲得的所述融合蛋白為融合的抗體端發揮功能提供了更廣泛的空間,從而使所述IL-10單體融合蛋白能夠與更多的抗體分子搭配使用。
在一些實施方案中,本發明提出了一種融合蛋白,包括抗體和IL-10單體,其中,所述抗體包括兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈,一條IL-10單體與抗體重鏈或輕鏈連接,所述IL-10單體的N末端不與抗體重鏈的C末端連接。天然IL-10分子為二聚體形式,根據本發明的一些具體實施例的融合蛋白在抗體結合靶細胞前IL-10分子呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞的結合,抗體結合靶細胞後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應,使得融合蛋白的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮。
根據本發明的一些具體實施方案,每條抗體輕鏈包括VL區、CL區,每條抗體重鏈包括VH區、CH1區、CH2區、CH3區;所述IL-10單體的N末端與抗體輕鏈C末端相連,或所述IL-10單體的C末端與抗體輕鏈N末端相連,或所述IL-10單體的N末端與氫鏈VL區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與氫鏈CL區的N末端相連,或所述IL-10單體的C末端與抗體重鏈的N末端相連,或所述IL-10單體的N末端與重鏈VH區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與重鏈CH1區的N末端相連,或所述IL-10單體的N末端與重鏈CH2區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與重鏈CH3區的N末端相連。
根據本發明的一些具體實施方案,所述IL-10單體包括天然IL-10單體,所述天然IL-10單體具有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列。
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:1)
根據本發明的一些具體實施方案,所述IL-10單體包括修飾後的天然IL-10單體,所述修飾包括下列(i)和(ii)的至少之一:(i)去除天然IL-10單體的N末端的前2個胺基酸;(ii)在第116位和117位胺基酸之間插入第一連接肽,所述第一連接肽為柔性連接肽。
將天然IL-10單體的N末端的前2個胺基酸去除後,IL-10單體的穩定性得到提升,同時在IL-10單體的第116位和117位胺基酸之間插入第一連接肽後,所述融合蛋白中的IL-10單體分子成為閉環單體分子(天然IL10二聚體的兩條IL10鏈是交錯在一起形成的,經過插入linker改造後,IL10單體可以獨立形成結構域,即閉環單體分子),同一融合蛋白中的兩個IL-10單體不會出現相互連接等干擾。
根據本發明的一些具體實施方案,所述第一連接肽具有SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列。
GGGSGG(SEQ ID NO:21)
根據本發明的一些具體實施方案,所述IL-10單體具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:2)。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體與抗體重鏈或輕鏈藉由第二連接肽或/和第三連接肽連接。利用第二連接肽或/和第三連接肽將所述IL10單體與所述抗體重鏈或輕鏈相連後,使得所述融合蛋白中的抗體部分與相應靶細胞結合後,相互靠近的2個融合蛋白的IL-10單體更易形成二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合。
根據本發明的實施例,所述第二連接肽或/和第三連接肽不受特別限制,柔性連接肽或剛性連接肽均可。
根據本發明的實施例,所述第二連接肽具有SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列,所述第三連接肽具有SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列。
GSGSGSGS(SEQ ID NO:12)。
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:22)。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體與所述抗體的重鏈末端或輕鏈末端藉由所述第二連接肽連接。
根據本發明的實施例,所述第二連接肽的N末端與所述抗體輕鏈的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第二連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述抗體輕鏈的N末端相連;或所述第二連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述抗體重鏈的N末端相連。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體與所述抗體的重鏈末端或輕鏈末端藉由所述第三連接肽連接。
根據本發明的實施例,所述第三連接肽的N末端與所述抗體輕鏈的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述抗體輕鏈的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述抗體重鏈的N末端相連。
根據本發明的實施例,所述第三連接肽的N末端與所述輕鏈VL區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述輕鏈CL區的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述重鏈VH區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述重鏈CH1區的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述重鏈CH2區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述重鏈CH3區的N末端相連。
根據本發明的實施例,所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的輕鏈的VL區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的輕鏈CL區的N末端連接;或所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈VH區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈CH1區的N末端相連;或所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈CH2區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈CH3區的N末端相連。
根據本發明的一些具體實施方案,所述抗體選自免疫細胞類抗體和腫瘤細胞類抗體。
根據本發明的一些具體實施方案,所述抗體為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗-Her2抗體、抗CCR8抗體、抗VEGFR2抗體、抗claudin18.2抗體、抗CD39抗體、抗SMA4D抗體、抗GUCY2C抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM3抗體、抗TIGIT抗體、抗CD47抗體或抗TNFα抗體。
根據本發明的一些具體實施方案,所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所述的胺基酸序列;或所述融合蛋白具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列。
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在一些實施方案中,本發明提出了一種分離的核酸,所述核酸編碼第一方面所述的融合蛋白。根據本發明的一些具體實施方案中的核酸編碼的融合蛋白在抗體部分結合靶細胞前IL-10分子呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞的結合;抗體結合靶細胞後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應;且由於IL-10單體很難引發生物功能,所以IL-10單體融合蛋白不會產生天然二聚體IL-10分子或其抗體融合蛋白的給藥劑量限制,使得IL-10單體融合蛋白的給藥劑量得到顯著提高。所述融合蛋白能夠與更多的抗體分子搭配使用,使得融合蛋白的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮,且可治療或預防多種腫瘤或炎性疾病。
根據本發明的一些具體實施方案,所述核酸分子為DNA或RNA。
在一些實施方案中,本發明提出了一種表達載體,所述表達載體包含第二方面所述的核酸。在將上述核酸分子連接到載體上時,可以將核酸分子與載體上的控制元件直接或者間接相連,只要這些控制元件能夠控制核酸分子的翻譯和表達等即可。當然這些控制元件可以直接來自於載體本身,也可以是外源性的,即並非來自於載體本身。當然,核酸分子與控制元件進行可操作地連接即可。本文中“可操作地連接”是指將外源基因連接到載體上,使得載體內的控制元件,例如轉錄控制序列和翻譯控制序列等,能夠發揮其預期的調節外源基因的轉錄和翻譯的功能。根據本發明一些具體實施方案中的表達載體導入合適的受體細胞後,可在調控系統的介導下,有效實現前面所述的融合蛋白的表達,獲得的融合蛋白在抗體部分結合靶細胞前IL-10分子呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞的結合;抗體結合靶細胞後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應;且由於IL-10單體很難引發生物功能,所以IL-10單體融合蛋白不會產生天然二聚體IL-10分子或其抗體融合蛋白的給藥劑量限制,使得IL-10單體融合蛋白的給藥劑量得到顯著提高。所述融合蛋白能夠與更多的抗體分子搭配使用,使得融合蛋白的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮,且可治療或預防多種腫瘤或炎性疾病。
根據本發明的一些具體的實施方案,所述表達載體為真核表達載體。
在一些實施方案中,本發明提出了一種重組細胞,所述重組細胞攜帶第二方面所述的核酸、第三方面所述的表達載體或表達第一方面所述的融合蛋白。根據本發明具體實施例的重組細胞可用於前面所述的融合蛋白的表達和大量獲得,獲得的融合蛋白在抗體部分結合靶細胞前IL-10分子呈單體形式,無法與其受體結合,不會干擾抗體分子與靶細胞的結合;抗體結合靶細胞後,大量IL-10單體分子聚集,使得相互靠近的2個IL-10單體作為二聚體發揮作用,與IL-10受體進行結合,從而引起正常的生物學反應;且由於IL-10單體很難引發生物功能,所以IL-10單體融合蛋白不會產生天然二聚體IL-10分子或其抗體融合蛋白的給藥劑量限制,使得IL-10單體融合蛋白的給藥劑量得到顯著提高。所述融合蛋白能夠與更多的抗體分子搭配使用,使得融合蛋白的靶向性和安全性得到顯著提高,藥效得到充分發揮,且可治療或預防多種腫瘤或炎性疾病。
根據本發明的一些具體的實施方案,所述重組細胞為哺乳動物細胞,哺乳動物例如:人、猴、兔、犬、牛等;哺乳動物細胞如:人HEK-293F細胞或CHO-K1細胞。
根據本發明的一些具體實施方案,所述重組細胞不包括動物生殖細胞、受精卵或胚胎幹細胞。
在一些實施方案中,本發明提出了前面所述的融合蛋白、核酸、表達載體或重組細胞在製備藥物中的用途,所述藥物用於治療或預防腫瘤或炎性疾病。根據本發明的一些具體實施方案,所述藥物可有效治療或緩解腫瘤以及炎性疾病,且安全性較高。
在一些實施方案中,本發明提出了一種藥物組合物,包含前面所述的融合蛋白、核酸、表達載體或重組細胞。根據本發明的一些具體實施方案的藥物組合物可準確與所述藥物組合物中包含的所述抗體可以結合的靶細胞進行結合,在所述抗體和靶細胞結合前所述藥物組合物中的IL-10單體分子與IL-10受體結合活性較低,因此,所述IL-10單體不會干擾所述藥物組合物中包含的所述抗體的靶向性,並在所述藥物組合物包含的所述抗體與靶細胞結合後充分的發揮藥效,有效治療或緩解腫瘤以及炎性疾病,且具有較高的安全性。
根據本發明的一些具體實施方案,所述藥物組合物用於治療或預防腫瘤或炎性疾病。
根據本發明的一些具體實施方案,本發明提供的融合蛋白可以摻入適合受試者施用的藥物組合物中。通常,這些藥物組合物包括本發明提供的融合蛋白。
根據本發明的一些具體實施方案,所述藥物組合物進一步包括藥學上可接受的載體,包括任何溶劑、固體賦形劑、稀釋劑、黏合劑、崩解劑、或其他液體賦形劑、分散劑、矯味劑或懸浮劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、固體黏合劑、助流劑或潤滑劑,等等,適合於特有的目標劑型。除了任何常規的輔料與本發明的融合蛋白不相容的範圍,例如所產生的任何不良的生物效應或與藥學上可接受的組合物的任何其他組分以有害的方式產生的相互作用,它們的用途也是本發明所考慮的範圍。
例如,本發明的融合蛋白可摻入適用於胃腸外施用( 例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內) 的藥物組合物中。這些藥物組合物可以被製備成各種形式。例如液體、半固體和固體劑型等,包括但不限於液體溶液( 例如,注射溶液和輸注溶液)、分散劑或懸浮劑、片劑、丸劑、粉末、脂質體和栓劑。所述融合蛋白可藉由靜脈輸注射或肌肉內或皮下注射來施用。
本文使用的術語“治療”和“預防”以及源自於此的詞不必暗示100%或完全治療或預防。相反,存在不同程度的治療或預防,本領域普通技術人員認為所述治療或預防具有潛在的益處或治療效果。而且,本發明提供的治療或預防可包括正在治療或預防的疾病,如癌症的一種或多種病患或症狀的治療或預防。另外,為了本文的目的,“預防”可涵蓋延緩疾病或其症狀或病患的發作。
根據本發明的一些具體實施方案,本發明提供了一種在受試者中診斷、治療、預防或減輕與腫瘤或炎性疾病相關的疾病、病症或狀況的方法,其包括向上述受試者施用治療有效量的前述融合蛋白和/或前述藥物組合物。
下面參考具體實施例,對本發明進行描述,需要說明的是,這些實施例僅僅是描述性的,而不以任何方式限制本發明。
實施例中未注明具體技術或條件的,按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者,均為可以藉由市購獲得的常規產品。
實施例1 融合蛋白的構建
本實施例將IL-10單體插入到抗體分子(本實施例以抗PD-1抗體為例)的不同位置中以獲得融合蛋白,其中,IL-10單體分子的構建的具體實驗操作主要參考《分子克隆實驗指南》。天然IL-10單體分子序列如SEQ ID NO:1所示,在天然IL-10單體分子序列的116N、117K兩個位點之間插入如SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列的肽段(即,第一連接肽,linker1),同時去除天然IL-10單體的N末端的前2個胺基酸,從而形成本發明實施例的IL-10單體,其序列如SEQ ID NO:2所示;所述抗體重鏈如SEQ ID NO:3所示,抗體輕鏈如SEQ ID NO:6所示。
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:1)。
GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:2)。
GGGSGG(SEQ ID NO:21)
本實施例共構建7種融合蛋白,融合蛋白的具體結構如圖3所示(圖中展示了IL-10單體的插入位置);所述融合蛋白中IL-10單體與抗體分子的連接方式描述如下。
R0987:將IL-10單體插入到抗體輕鏈的VL、CL之間(位置1),並使用linker2(GSGSGSGS)進行連接,所得融合蛋白具有如SEQ ID NO:3(重鏈)和SEQ ID NO:5(輕鏈)所示的胺基酸序列,如圖3B所示。
R0988:將IL-10單體插入到抗體重鏈的VH、CH1之間(位置2),並使用linker2(GSGSGSGS)進行連接,所得融合蛋白具有如SEQ ID NO:4(重鏈)和SEQ ID NO:6(輕鏈)所示的胺基酸序列,如圖3C所示。
R0989:將IL-10單體插入到抗體重鏈的CH2、CH3之間(位置3),並使用linker2(GSGSGSGS)進行連接,所得融合蛋白具有如SEQ ID NO:7(重鏈)和SEQ ID NO:6(輕鏈)所示的胺基酸序列,如圖3D所示。
R0990:將IL-10單體藉由linker連接到抗體輕鏈的N端(位置4),並使用linker3(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)進行連接,所得融合蛋白具有如SEQ ID NO:3(重鏈)和SEQ ID NO:8(輕鏈)所示的胺基酸序列,如圖3E所示。
R0991:將IL-10單體藉由linker連接到抗體輕鏈的C端(位置5),並使用linker3(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)進行連接,所得融合蛋白具有如SEQ ID NO:3(重鏈)和SEQ ID NO:9(輕鏈)所示的胺基酸序列,如圖3F所示。
R0992:將IL-10單體藉由linker連接到抗體重鏈的N端(位置6),並使用linker3(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)進行連接,所得融合蛋白具有如SEQ ID NO:10(重鏈)和SEQ ID NO:6(輕鏈)所示的胺基酸序列,如圖3G所示。
R0993:將IL-10單體藉由linker連接到抗體重鏈的C端(位置7)並使用linker3(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)進行連接,所得融合蛋白具有如SEQ ID NO:11(重鏈)和SEQ ID NO:6(輕鏈)所示的胺基酸序列,如圖3H所示。
本發明實施例3-5中的對照分子(R0428、R0594、R0862、R0676、R0579、R1049)的結構圖如圖3I所示。
所述第二連接肽(linker2)和第三連接肽(linker3)為柔性或剛性連接肽,其中,所述第二連接肽具有如SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列,所述第三連接肽具有如SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列。
上述融合蛋白的重鏈和輕鏈的胺基酸序列如下表1所示,其中,用加粗斜體標註的序列GSGSGSGS(SEQ ID NO:12)是第二連接肽(linker2)的胺基酸序列,僅用加粗標註的序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:22)是第三連接肽(linker3)的胺基酸序列,僅用底線標註的序列GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:2)是改造後的IL-10單體的胺基酸序列。
[表1]
融合蛋白 | IL-10 單體插入位置 | 重鏈 | 輕鏈 |
R0987 | 輕鏈的VL、CL之間(位置1) | SEQ ID NO:3 (QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK) | SEQ ID NO:5 (DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKR GSGSGSGS GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN GSGSGSGS TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC) |
R0988 | 重鏈的VH、CH1之間(位置2) | SEQ ID NO:4 (QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSS GSGSGSGS GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN GSGSGSGS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK) | SEQ ID NO:6 (DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC) |
R0989 | 重鏈的CH2、CH3之間(位置3) | SEQ ID NO:7 (QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GSGSGSGS GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN GSGSGSGS GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK) | SEQ ID NO:6 (DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC) |
R0990 | 輕鏈的N端(位置4) | SEQ ID NO:3 (QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK) | SEQ ID NO:8 ( GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGDTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC) |
R0991 | 輕鏈的C端(位置5) | SEQ ID NO:3 (QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK) | SEQ ID NO:9 (DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN) |
R0992 | 抗體重鏈的N端(位置6) | SEQ ID NO:10 ( GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK) | SEQ ID NO:6 (DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC) |
R0993 | 抗體重鏈的C端(位置7) | SEQ ID NO:11 ( GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK) | SEQ ID NO:6 (DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC) |
實施例2 融合蛋白的製備
藉由常規方法構建、製備含目的基因(編碼實施例1中的融合蛋白)的質粒。將含有目的基因的質粒藉由與轉染試劑PEI形成陽離子複合物後,導入到宿主細胞Expi293,質粒在細胞內期間,質粒上的外源基因在細胞內發生轉錄翻譯,從而得到所述融合蛋白,具體實驗操作如下。
Expi293在37℃、8%二氧化碳、130rpm條件下培養,並在轉染前藉由細胞計數,將2E6的細胞接種至1L搖瓶中,培養體系約為300mL。配製轉染複合物準備轉染:首先將750μg目標質粒加入到含有15mLOpti-MEM試劑的50mL離心管中,輕輕混勻,標記為A管;將1.5mg轉染試劑PEI加入到含有15mLOpti-MEM試劑的50mL離心管中,輕輕混勻後,室溫培養5min,標記為B管;將B管PEI稀釋液逐滴加入到A管DNA稀釋液中,輕輕混勻後,室溫培養15min,培養結束後,將PEI-目標質粒複合物加入到Expi293細胞,置於37℃搖床中繼續培養,培養至D5-D10後收樣。
瞬轉細胞表達液經過9000rpm/20min離心,收集上清,再經過0.22μm濾膜除菌過濾。純化採用ProA親和層析。過程如下:使用AKTA avant 150層析設備,用至少5CV平衡緩衝液(10mM PBS)平衡層析柱(如MabSelectSuRe LX,GE),載入樣品至層析柱,使目標蛋白吸附在層析柱上而其他雜質穿透分離。完成上樣後使用至少5CV平衡緩衝液(10mM PBS)再次沖洗層析柱,隨後使用洗脫緩衝液(20mM NaAc,pH=3.4)洗脫目標蛋白,收集管中預先加入中和緩衝液(1M Tris,pH=8.0),中和緩衝液的加入體積根據洗脫樣品的預估含量而定,一般加入10%洗脫體積量。
IL-10單體融合蛋白表達資料如表2所示,除R0987表達量為97.731mg/mL外,其餘融合蛋白的瞬轉表達量均都大於100mg/L,R0990的表達量甚至達到194.409mg/L。一步親和純化後樣品經SEC-HPLC檢測,目標純度都在85%以上,R0989的純度甚至大於95%。樣品經SDS-PAGE檢測,顯示正確的輕重鏈分佈,電泳結果如圖4所示。得出結論,不同插入位置的IL-10單體融合蛋白均展現出良好的生產性質。
[表2]
樣品 | 蛋白量( mg ) | Titer(mg/L) | 一步純化後 SEC-Purity | ||
聚集體 (%) | 目標峰 (%) | 碎片 (%) | |||
R0987 | 26.076 | 97.731 | 12.39 | 85.56 | 2.05 |
R0988 | 29.574 | 111.632 | 12.78 | 85.35 | 1.87 |
R0989 | 37.921 | 141.098 | 3.07 | 95.77 | 1.16 |
R0990 | 52.003 | 194.409 | 5.38 | 90.77 | 3.85 |
R0991 | 45.921 | 170.571 | 4.89 | 94.94 | 0.17 |
R0992 | 52.958 | 191.448 | 6.14 | 89.25 | 4.61 |
R0993 | 33.037 | 124.242 | 5.32 | 93.45 | 1.23 |
實施例3 融合蛋白的體外活性
3.1 流式細胞螢光分選技術(FACS)檢測融合蛋白抗體端、IL-10單體端的結合活性
用含3%BSA的PBS buffer將所有融合蛋白分子、R0428(不含IL-10的陽性對照抗體,其重鏈胺基酸序列、輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:13、14所示)或R0594(IL-10-Fc融合蛋白對照,其胺基酸序列如SEQ ID NO:15所示,其中IL-10去除了天然IL-10的前2個胺基酸,未插入第一連接肽)蛋白分子稀釋成初始濃度400nM,體積180μl,3倍梯度稀釋(60μl樣品+120μl稀釋Buffer),共得到11個濃度梯度點。將CHO-mPD1或者CHO-hIL-10R細胞於250g條件下離心5min後棄去上清,用3%BSA的PBS buffer調整細胞密度為2E+06,按100μL/管均分到96孔V型板中;將上述稀釋好的融合蛋白分子加入到細胞中,100μL/孔,2-8℃培養0.5h;取出96孔板,250g離心5min,小心去上清後,加入3%BSA的PBS buffer 200μl/孔,再次250g離心5min,小心去上清;用含3%BSA的PBS buffer配製PE螢光二抗(1:500稀釋),按100μl/孔的體積添加至對應的96孔板中,重懸細胞,2-8℃培養30min;取出96孔板,250g離心5min,小心去上清後,加入含3%BSA的PBS buffer 200μl/孔,再次250g離心5min,小心去上清;用1xPBS按照100μL/孔的體積重懸,重懸後進行FACS檢測。
R0428的重鏈序列:
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:13)。
R0428的輕鏈序列:
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:14)。
R0594含兩條相同的肽鏈,其中一條鏈的胺基酸序列:
GQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGSGSGSGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKQLPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:15)。
抗體端結合活性檢測結果如圖5所示,融合蛋白R0987、R0988、R0989、R0991抗體端的活性比較強,R0990最弱。說明IL-10單體插入在輕鏈VL、CL之間,或者重鏈VH、CH1之間,重鏈CH2、CH3之間,輕鏈的C端並不會影響抗體的結合活性。
IL-10單體端對IL-10Rα的結合活性檢測結果如圖6所示,其中,融合蛋白R0989、R0993的IL-10單體端對IL-10Rα的結合活性明顯較弱,可能與IL-10單體插入位置都靠近抗體的C端部位有關,其餘融合蛋白對IL-10Rα的結合活性比較接近,與陽性對照分子R0594一致。說明插入到抗體結構域中的IL-10單體,經過重組表達後仍然可以形成預期的空間結構,並且正常結合IL-10Rα。
3.2 報告基因法檢測IL-10單體融合蛋白的IL-10單體端的活性。
用1640+10%FBS 將所有融合蛋白分子及對照蛋白分子R0579(IL-10-陽性抗體融合蛋白對照,其重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:23所示,其輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示,其中所述IL-10去除了天然IL-10的前2個胺基酸,未插入第一連接肽)稀釋成初始濃度20μg/mL,體積450μl,3倍梯度稀釋(150μl +300μl),共獲得9個濃度。細胞準備:取出正在培養的HEK293-hIL-10-Report gene cell (Cat#GM-C07927,Genomeditech)在顯微鏡下觀察,細胞貼壁正常、顆粒透亮,且密度適中的細胞可以作為實驗所用的效應細胞;將上述細胞用TE消化,終止消化後在300g條件下離心4min後去除上清,用1%FBS-PBS重懸後再清洗一遍;棄上清,最終使用培養基重懸細胞,細胞計數後調整細胞密度為5×10
5個/mL。按照上面的實驗設計先將稀釋好的藥物以50μL/孔的體積添加到對應的孔板中,再將上述重懸後的細胞也以50μL/孔的體積加入,在Medium only的孔裡補加100μL的培養基,Cell only 的孔中補加50μL的培養基,最終所有孔的終體積為100μL。將96孔板繼續在培養箱中培養16h。提前解凍Bright-LumiTM 螢火蟲螢光素酶檢測試劑,平衡至室溫。細胞培養16h後取出細胞培養板平衡至室溫10min(不宜超過30min)。每孔加入100μL Bright-LumiTM螢火蟲螢光素酶檢測試劑,室溫培養5-10min。使用多功能酶標儀中的化學發光模式檢測訊號。
檢測結果如圖7所示,報告基因的結果與Binding結果類似,融合蛋白R0989、R0993的IL-10單體端的結合活性較低,而陽性對照R0579的活性遠強於本次檢測的融合蛋白。報告基因法的檢測結果表明改造後的IL-10單體結合活性是低於二聚體形式的IL-10分子的。
實施例
4
融合蛋白對
MC38
腫瘤模型小鼠的影響
發明人在實施例3的檢測基礎上進行小鼠體內實驗,具體實驗操作如下。
細胞培養:MC38腫瘤細胞(來源:國家實驗細胞資源分享平台,資源編號:3111C0001CCC000523)培養在添加了10% FBS(inactivated fetal bovine serum,供應商:Gibco,貨號:10091148)、100 U/mL 盤尼西林和100 μg/mL鏈黴素的DMEM(供應商:Gibco,貨號:11965084)培養基中。培養箱溫度控制在37℃,補充5%二氧化碳。腫瘤細胞一周傳代兩次,以胰酶-EDTA消化。
接種:收集對數增長期的MC38腫瘤細胞,消化後250g條件下離心10分鐘。以冰冷的PBS洗滌兩次後進行細胞計數,調節PBS至細胞濃度為3×10
6個/mL。小鼠右側腹部提前剃毛備皮,每隻鼠接種0.1 mL細胞懸液,接種量即每隻3×10
5個腫瘤細胞。
分組:接種後第6-8天,測量所有動物的腫瘤並稱重。為避免初始腫瘤體積對治療有效性的影響,將小鼠根據腫瘤體積隨機分配成組,確保所有組的平均瘤體積相當,使治療效果在基線上具有可比性。
觀察:接種後,每天檢查動物的發病率和死亡率。治療開始後,將融合蛋白R0987、R0988、R0989、R0991、R0992、R0993以及R0862(即Isotype,陰性對照抗體;其重鏈胺基酸序列、輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:16、17所示)、R0428、R0676(IL-10-Fc融合蛋白對照,其胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示,其中所述IL-10去除了天然IL-10的前2個胺基酸,未插入第一連接肽))、R0579蛋白分子分別以0.61、0.61、0.61、0.61、0.61、0.61、0.5、0.5、0.3、0.6mg/kg的劑量對小鼠進行腹腔注射,Q3D×3(每3天給藥一次,一共給藥3次),每週3次測量腫瘤體積,檢查並記錄動物腫瘤生長以及治療對正常行為的影響,如行動能力、食物和水消耗、體重增加/損失、眼睛/毛髮/皮膚等的影響。
R0862的重鏈序列:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYDGSNKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRGVMYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:16)。
R0862的輕鏈序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQLRNNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:17)。
R0676含兩條相同的肽鏈,其中一條鏈的胺基酸序列:
DKTHTCPPCPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:18)。
R0579的重鏈序列:
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGA
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGS PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN(SEQ ID NO:23)
R0579的輕鏈序列:
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:14)。
實驗終點(Endpoints):實驗的主要終點是腫瘤生長是否被延緩或小鼠是否被治癒。根據每組腫瘤體積計算TGI (Tumor Growth Inhibition)。計算方法:兩組之間比較可用獨立樣本T檢驗。3組以上比較應用One-Way ANOVA。如果F值顯示有顯著性差異,可進行多組間的事後分析。資料使用GraphPad Prism處理,當p<0.05表示具有顯著性統計學差異。腫瘤體積V= 0.5a×b2,a和b分別為腫瘤的長、短徑。腫瘤生長抑制TGI(%)=[1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] ×100,Ti為第i天治療組的平均瘤體積,T0為治療開始時治療組的平均瘤體積,Vi為第i天溶劑對照組的平均瘤體積,V0為治療開始時溶劑對照組S的平均瘤體積。以TGI來表示藥物對腫瘤生長抑制的效果。
實驗結果如圖8所示,經融合蛋白R0987、R0991、R0993治療後的小鼠體內腫瘤生長速度降低,腫瘤體積較小;相比於單抗或IL-10融合蛋白,融合蛋白R0987、R0991、R0993具有更好的抑瘤效果。
實施例5 融合蛋白對CT26腫瘤模型小鼠的影響
發明人在實施例4所得實驗結果的基礎上對所述融合蛋白進行進一步驗證,具體實驗操作如下:
細胞培養:CT26腫瘤細胞(供應商:中國科學院細胞庫,貨號:NA)培養在添加了10% FBS(inactivated fetal bovine serum,供應商:Gibco,貨號:10091148)、100 U/mL 盤尼西林和100 μg/mL 鏈黴素的RPMI-1640(供應商:Gibco,貨號:11875085)培養基中。培養箱溫度控制在37℃,補充5%二氧化碳。腫瘤細胞一周傳代兩次,以胰酶-EDTA消化。
接種:收集對數增長期的細胞,消化後250g離心10分鐘。以冰冷的PBS洗滌兩次後計數,調節PBS中細胞濃度為1×10
6/mL。小鼠右側腹部提前剃毛備皮,每隻鼠接種0.1 mL細胞懸液,接種量即每隻1×10
5個腫瘤細胞。
分組:接種後第6-8天,測量所有動物的腫瘤並稱重。為避免初始腫瘤體積對治療有效性的影響,將小鼠根據腫瘤體積隨機分配成組,確保所有組的平均瘤體積相當,使治療效果在基線上具有可比性。
觀察:本研究方案中所涉及的動物使用和護理,在進行之前由廣東菲鵬製藥股份有限公司動物倫理委員會審查和批准。在研究期間,根據SPF動物房標準操作規程對動物進行護理和使用。接種後,每天檢查動物的發病率和死亡率。治療開始後,將融合蛋白R0987、R0991、R0993以及R0862、R0579、R0676、R1049(抗PD-1的單抗對照,其重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:19所示,輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示)蛋白分子分別以10、10、10、10、10、5、7.9mg/kg的劑量對小鼠進行腹腔注射,Q3D×3(每3天給藥一次,一共給藥3次),每週2次測量腫瘤體積,檢查並記錄動物腫瘤生長以及治療對正常行為的影響,如行動能力、食物和水消耗、體重增加/損失、眼睛/毛髮/皮膚等的影響。
R1049重鏈序列:
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:19)。
R1049輕鏈序列:
DTVLTQSPALAVSLGQRVTISCKASETVSSSMYSYIHWYQQKPGQQPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDVATYFCQQSWNPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:20)。
實驗終點(Endpoints):實驗的主要終點是腫瘤生長是否被延緩或小鼠是否被治癒。根據每組腫瘤體積計算TGI (Tumor Growth Inhibition),計算方法:兩組之間比較可用獨立樣本T檢驗。3組以上比較應用One-Way ANOVA。如果F值顯示有顯著性差異,可進行多組間的事後分析。資料使用GraphPad Prism處理,當p<0.05表示具有顯著性統計學差異。腫瘤體積V=0.5a×b2,a和b分別為腫瘤的長、短徑。腫瘤生長抑制TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100,Ti為第i天治療組的平均瘤體積,T0為治療開始時治療組的平均瘤體積,Vi為第i天溶劑對照組的平均瘤體積,V0為治療開始時溶劑對照組S的平均瘤體積。以TGI來表示藥物對腫瘤生長抑制的效果。根據具體實驗,生存曲線也作為衡量藥效的標準之一。
實驗結果如圖9所示,相對於融合蛋白R0987、R0993,經融合蛋白R0991治療後小鼠體內腫瘤生長速度顯著降低,腫瘤體積較小,具有更好的抑瘤效果。
在本說明書的描述中,參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中,對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且,描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外,在不相互矛盾的情況下,本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例,可以理解的是,上述實施例是示例性的,不能理解為對本發明的限制,本領域的普通技術人員在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
無
本發明的上述和/或附加的方面和優點結合下面附圖對實施例的描述將變得明顯和容易理解。
圖1是根據本發明實施例的天然IL-10分子及IL-10單體與IL-10受體結合方式的示意圖,其中,A表示天然IL-10分子與IL-10受體結合方式的示意圖,R1表示IL-10受體(IL-10Rα),R2表示IL-10受體(IL-10Rβ);B表示IL-10單體與IL-10受體結合方式的示意圖,R1表示IL-10受體(IL-10Rα),IL-10M1表示IL-10單體。
圖2是根據本發明實施例的融合蛋白中所述抗體與靶細胞上的抗原結合、IL-10單體與IL-10受體結合的示意圖,IL-10單體親和力較弱,靶向作用差,因此,抗體端可以正常發揮靶向作用,靶向腫瘤表面後,抗體的局部富集,可以將IL-10單體聚集在一起,變成二聚體IL-10(M)*2發揮作用,其中,IL-10R表示IL10RαRβ複合物,Her2表示人類表皮生長因子受體,是抗體靶向抗原的舉例,T-cell表示T細胞,Tumor表示腫瘤。
圖3是根據本發明實施例的IL-10單體插入抗體分子中的位置結構示意圖,其中,A表示IL-10單體在抗體上可插入的位置(位置1-位置7),B表示在抗體每條輕鏈的VL、CL之間(即位置1)插入一條IL-10單體的結構示意圖,並使用linker2連接,得到的融合蛋白分子命名為R0987;C表在抗體重鏈的VH、CH1之間(即位置2)插入一條IL-10單體的結構示意圖,並使用linker2連接,得到的融合蛋白分子命名為R0988;D在到抗體重鏈的CH2、CH3之間(即位置3)插入一條IL-10單體的結構示意圖,並使用linker2連接,得到的融合蛋白分子命名為R0989;E在抗體輕鏈的N端(即位置4)插入一條IL-10單體的結構示意圖,並使用linker2連接,得到的融合蛋白分子命名為R0990;F在抗體輕鏈的C端(即位置5)插入一條IL-10單體的結構示意圖,並使用linker3連接,得到的融合蛋白分子命名為R0991;G表示在抗體重鏈的N端(即位置6)插入一條IL-10單體的結構示意圖,並使用linker3連接,得到的融合蛋白分子命名為R0992;H表示在抗體重鏈的C端(即位置7)插入一條IL-10單體的結構示意圖,並使用linker3連接,得到的融合蛋白分子命名為R0993;I是本發明實施例3-5中的對照分子(R0428、R0594、R0862、R0676、R0579、R1049)的結構圖。
圖4是根據本發明實施例的融合蛋白R0987、R0988、R0989、R0990、R0991、R0992、R0993的SDS-PAGE檢測結果圖。
圖5是根據本發明實施例的融合蛋白採用流式法檢測抗體端結合活性的結果圖,其中,橫坐標(Ab conc. Log(nM))表示抗體濃度(nM),縱坐標MFI PE表示平均螢光強度。
圖6是根據本發明實施例的融合蛋白採用流式法檢測IL-10單體端結合活性的結果圖,其中,橫坐標(Ab conc. Log(nM))表示抗體濃度(nM),縱坐標MFI PE表示平均螢光強度。
圖7是根據本發明實施例的融合蛋白採用報告基因法檢測IL-10單體端結合活性的結果圖,其中,橫坐標(Ab conc. Log(µg/mL))表示抗體濃度(µg/mL),縱坐標(Lum)表示Luminescence螢光強度。
圖8是根據本發明實施例的融合蛋白治療MC38腫瘤模型小鼠後的小鼠體內腫瘤體積的統計分析結果圖,其中,橫坐標(Days post engraftment)表示小鼠移植後的天數,縱坐標(Tumor volume)表示腫瘤體積。
圖9是根據本發明實施例的融合蛋白治療CT26腫瘤模型小鼠後的小鼠體內腫瘤體積的統計分析結果圖,其中,橫坐標(Days post engraftment)表示小鼠移植後的天數,縱坐標(Tumor volume)表示腫瘤體積。
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Claims (17)
- 一種融合蛋白,其包括抗體和IL-10單體,其中,所述抗體包括兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈,一條所述IL-10單體與所述抗體的重鏈或輕鏈連接,所述IL-10單體的N末端不與所述抗體的重鏈的C末端連接。
- 如請求項1所述之融合蛋白,其中,所述抗體的每條輕鏈包括VL區、和CL區,所述抗體的每條重鏈包括VH區、CH1區、CH2區、和CH3區;所述抗體的每條輕鏈或每條重鏈連接有一條所述IL-10單體; 任選地,所述IL-10單體的N末端與所述抗體的輕鏈C末端相連;或 所述IL-10單體的C末端與所述抗體的輕鏈N末端相連;或 所述IL-10單體的N末端與所述抗體的輕鏈的VL區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與所述抗體的輕鏈的CL區的N末端相連;或 所述IL-10單體的C末端與所述抗體的重鏈的N末端相連;或 所述IL-10單體的N末端與所述抗體的重鏈VH區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與所述抗體的重鏈CH1區的N末端相連;或 所述IL-10單體的N末端與所述抗體的重鏈CH2區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端與所述抗體的重鏈CH3區的N末端相連。
- 如請求項1或2所述之融合蛋白,其中,所述IL-10單體包括天然IL-10單體。
- 如請求項1至3中任一項所述之融合蛋白,其中,所述IL-10單體包括修飾後的天然IL-10單體,所述修飾包括在第116位和117位胺基酸之間插入第一連接肽,所述第一連接肽為柔性連接肽; 任選地,所述第一連接肽具有SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列; 任選地,所述IL-10單體具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至4中任一項所述之融合蛋白,其中,所述IL-10單體與所述抗體的重鏈或輕鏈藉由第二連接肽和/或第三連接肽連接; 任選地,所述第二連接肽具有SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列,所述第三連接肽具有SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列。
- 如請求項5所述之融合蛋白,其中,所述IL-10單體與所述抗體的重鏈末端或輕鏈末端藉由所述第二連接肽連接;任選地, 所述第二連接肽的N末端與所述抗體的輕鏈的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或 所述第二連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述抗體的輕鏈的N末端相連;或 所述第二連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第二連接肽的C末端與所述抗體的重鏈的N末端相連。
- 如請求項5所述之融合蛋白,其中,所述IL-10單體與所述抗體的重鏈末端或輕鏈末端藉由所述第三連接肽連接; 所述第三連接肽的N末端與所述抗體的輕鏈的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或 所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述抗體的輕鏈的N末端相連;或 所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述抗體的重鏈的N末端相連。
- 如請求項5所述之融合蛋白,其中,所述第三連接肽的N末端與所述輕鏈的VL區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或 所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述輕鏈的CL區的N末端相連;或 所述第三連接肽的N末端與所述重鏈的VH區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或 所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述重鏈的CH1區的N末端相連;或 所述第三連接肽的N末端與所述重鏈的CH2區的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述IL-10單體的N末端相連;或 所述第三連接肽的N末端與所述IL-10單體的C末端相連,所述第三連接肽的C末端與所述重鏈的CH3區的N末端相連。
- 如請求項5所述之融合蛋白,其中,所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的輕鏈的VL區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的輕鏈的CL區的N末端連接;或 所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈的VH區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈的CH1區的N末端相連;或 所述IL-10單體的N末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈的CH2區的C末端相連,所述IL-10單體的C末端藉由所述第二連接肽與所述抗體的重鏈的CH3區的N末端相連。
- 如請求項1至9中任一項所述之融合蛋白,其中,所述抗體選自免疫細胞類抗體和腫瘤細胞類抗體; 任選地,所述抗體為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗Her2抗體、抗CCR8抗體、抗VEGFR2抗體、抗claudin18.2抗體、抗CD39抗體、抗SMA4D抗體、抗GUCY2C抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM3抗體、抗TIGIT抗體、抗CD47抗體或抗TNFα抗體; 任選地,所述抗體為抗PD-1抗體。
- 如請求項1至10中任一項所述之融合蛋白,其中,所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9所述的胺基酸序列;或 所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所述的胺基酸序列;或 所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列;或 所述融合蛋白具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列;或 所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8所述的胺基酸序列;或 所述融合蛋白具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列。
- 一種核酸,其特徵在於,所述核酸編碼如請求項1至11中任一項所述之融合蛋白。
- 一種表達載體,其特徵在於,所述表達載體包含如請求項12所述之核酸。
- 一種重組細胞,其特徵在於,所述重組細胞攜帶如請求項12所述之核酸、如請求項13所述之表達載體或表達如請求項1至11中任一項所述之融合蛋白。
- 一種如請求項1至11中任一項所述之融合蛋白、如請求項12所述之核酸、如請求項13所述之表達載體或如請求項14所述之重組細胞在製備藥物中的用途,所述藥物用於治療或預防腫瘤或炎性疾病。
- 一種藥物組合物,其包含如請求項1至11中任一項所述之融合蛋白、如請求項12所述之核酸、如請求項13所述之表達載體或如請求項14所述之重組細胞。
- 如請求項16所述之藥物組合物,其中,所述藥物組合物用於治療或預防腫瘤或炎性疾病。
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