JP6467225B2 - 新規なヒト抗ｉｌ−１８抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトインターロイキン−１８（以下、「ヒトＩＬ−１８」という。）に結合し、その生理活性を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体及びその抗体断片、並びにそれらの利用方法に関する。この抗体及び抗体断片は、ＩＬ−１８が原因となって惹起される疾患の診断及び治療に有用である。

１９８９年において、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘発因子（ＩＧＩＦ）と言われていた。現在では、ＩＬ−１８がインターフェロン−γを誘発する能力以外にも各種機能を有するプロ炎症性サイトカインであることが知られている。ＩＬ−１８は、ＮＦ−κＢの活性化、Ｆａｓリガンドの発現、ＣＣ及びＣＸＣケモカインの両方の誘発、コンピテントヒト免疫不全ウイルスの産生増加などの機能を有する。ＩＬ−１８は、Ｔ細胞及びマクロファージ内でインターフェロン−γ産生を誘発する能力を有することから、Ｔｈ１型の免疫応答において重要な役割を果たし、先天性免疫及び後天性免疫の両方に関与する。ＩＬ−１８は、構造及び機能の両方の点でＩＬ−１ファミリーに関係する。ＩＬ−１８の構造、機能及び生理活性については総説が出されている（例えば、非特許文献１〜非特許文献５）。

細胞内プロ−ＩＬ−１８は、カスパーゼ１によってエンドトキシン刺激細胞で（非特許文献６、非特許文献７）、並びにカスパーゼ４、５及び６によってＦａｓ−Ｌ又は細菌ＤＮＡ刺激細胞で（非特許文献８）、タンパク質分解的に処理されて１８ｋＤａの活性型となる。プロ−ＩＬ−１８はまた、マスト細胞由来のキマーゼ（非特許文献９）、好中球プロテイナーゼ３（非特許文献１０）、カスパーゼ３（非特許文献１１）、セリンプロテアーゼであるエラスターゼ及びカテプシン（非特許文献１２）などの他のプロテアーゼによってもタンパク質分解的に活性化される。ヒト及びマウスの両方のＩＬ−１８ともリーダー配列を持たず、細胞による成熟ＩＬ−１８放出の機序については十分に解明されていない。

ＩＬ−１８の生理活性には、α−サブユニット（ＩＬ−１Ｒ−関連タンパク質−１又はＩＬ−１Ｒｒｐ１とも称されるＩＬ−１Ｒファミリーの１構成員）及びβ−サブユニット（ＩＬ−１８Ｒ付属タンパク質、ＩＬ−１８ＡＰ又はＡｃＰＬとも称される）という２つのサブユニットからなるヘテロ二量体ＩＬ−１８レセプター（ＩＬ−１８Ｒ）へのＩＬ−１８の結合が介在している。ＩＬ−１８ＲαサブユニットはＩＬ−１８に直接結合するが、シグナル伝達することはできない。ＩＬ−１８Ｒβ−サブユニットはそれ自体ではＩＬ−１８に結合しないが、α−サブユニットと共同で、シグナル伝達に必要な高親和性レセプター（ＫＤ＝約０．３ｎＭ）を形成する（非特許文献１３）。ＩＬ−１８Ｒαβ複合体を介したＩＬ−１８シグナル伝達は、ＩＬ−１Ｒ及びトール様レセプター（ＴＬＲ）系と類似している。ＩＬ−１８Ｒシグナル伝達は、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６などのシグナル伝達分子を使用し、ＩＬ−１の場合と同様の応答、例えば、ＮＩＫ、ＩκＢキナーゼ、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化を生じる。ＩＬ−１８の生理活性発現においてＩＬ−１８Ｒα及びシグナル伝達分子が必要であることは、それぞれＩＬ−１８Ｒαサブユニット（非特許文献１４）、ＭｙＤ８８（非特許文献１５）又はＩＲＡＫ（非特許文献１６）ノックアウト変異体を用いて確認されている。

ＩＬ−１８の亢進を伴う疾患として、これまで間質性肺炎（非特許文献１７）、成人性Ｓｔｉｌｌ病（非特許文献１８）、慢性閉塞性肺疾患（非特許文献１９）、代謝性骨疾患（特許文献１）、多発性硬化症（非特許文献２０）、糖尿病（非特許文献２０）、虚血性の腎障害（非特許文献２１）などが報告されている。また、ＩＬ−１８の亢進は、アトピー性皮膚炎（非特許文献２２）、肝臓及び腸管での重篤な臓器障害（非特許文献２３）など、いわゆるＴｈ１病の原因にもなる。

このような疾患以外にも、Ｔｈ１細胞に誘導される気管支喘息、その他の様々な疾患において、ＩＬ−１８の病態への関与が指摘されている。

ＩＬ−１８の産生又は活性の制御は、このようなＩＬ−１８依存性疾患の治療法として、あるいはＩＬ−１８の過剰産生が原因となり疾患の発症を誘導又は増悪する疾患の治療法として、極めて重要である。

米国特許出願公開第２００５０７４４３４号明細書 米国特許出願公開第２００５０１００９６５号明細書 米国特許出願公開第２００７０２９２４３２号明細書 米国特許第６７０６４８７号明細書 国際公開第２００４／０９７０１９号パンフレット

Dinarello, C. Et al. (1998) J. Leukoc. Biol.63: 658-654 Dinarello, C. A. (1999) Methods 19: 121-132 Dinarello, C. A. (1999) J. Allergy Clin.Immunol. 103: 11-24 McInnes. B.et. Al. (2000) Immunology Today 21: 312-315 Nakanishi,K. et al (2001) Ann. Rev. Immunol. 19: 423-474 Ghayur, T. et al. (1997) Nature 386: 619-623 Gu, et al. (1997) Science 275: 206-209 Tsutsui, H. et al. (1999) Immunity 11: 359-67 Omoto, Y. et al. (2006)J. Immunol. 177:8315-8319 Sugawara, S. et al. (2001) J. Immunol. 167:6568-6575 Akita, K. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26595-26603 Gracie J. A. Et al. (2003)Journal of Leukocyte Biology 73: 213-224 Sims, J.E. et al (2002) Current Opin. Immunol.14: 117-122 Hoshino K. et al (1999) J. Immunol. 162:5041-5044 Adachi O. et al. (1998) Immunity 9: 143-150 KanakarajP. et al. (1999) J. Exp. Med. 189: 1129-1138 Hoshino,T.et al. (2009) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 41: 661-670 Kawaguchi,Y. et al. (2001) Arthritis Rheum. 44: 1716-1717 Imaoka, H.et al. (2008) Eur. Respir. J. 31: 287-297 Nakanishi, K. et al. (2001) Annu. Rev.Immunol. 19: 423-474 Melnikov, V.Y. et al. (2001) J. Clin. Invest.107: 1145-1152 Konishi，H. et al. （2002） Proc． Natl． Acad． Sci． USA 99: 11340-11345 Nakanishi, K. et al. (2001) Annu. Rev.Immunol. 19: 423-474 Novick, D. et al. (1999) Immunity 10: 127-136 Arend, W.P. et al. (2008) Immunol. Rev. 223: 20-38 Tak PP. et al. (2006) Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 31: 109-116 Lei, SP. Et al. (1987) J. Bacteriol. 169: 4379-4383 T. Fukumoto et al. (1998) Nature Biotechnology 16: 267-270 Okamoto M. et al. (2002)Blood 99: 1289-98 AntibodyPhage Display Methods and protocols Edited by Philippa M. O’Brien and Robert Aitken Kimura T,. et al. (2008) AllergologyInternational 57: 367-3766 Hamasaki T. et al. (2005) J. Biochem. 138:433-442 Li, A. etal.(2003) Protein Expr Purif. 32:110-118

ヒトの生体内には、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と呼ばれるＩＬ−１８へ結合するタンパクが存在することが知られている。ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＬ−１８と結合することによってＩＬ−１８とＩＬ−１８レセプターとの結合を阻害し活性の調節をしている（非特許文献２４）。ヒトＩＬ−１８ＢＰの場合、ｍＲＮＡのスプライシングによって得られた４つのアイソフォーム（ＩＬ−１８ＢＰａ、ＩＬ−１８ＢＰｂ、ＩＬ−１８ＢＰｃ、ＩＬ−１８ＢＰｄ）が存在している（非特許文献２５）。このうちＩＬ−１８との親和性が最も高いのがＩＬ−１８ＢＰａであり、その中和能（ＩＣ_５０）は０．４ｎＭ程度とされている。ＩＬ−１８ＢＰは、活性を有していない前駆体のＩＬ−１８には結合しないが、成熟型（活性型）ＩＬ−１８には結合する特徴も有する。健常なヒトの血中ＩＬ−１８ＢＰ濃度は、０．５−０．７ｎｇ／ｍＬであるとされており、ＩＬ−１８ＢＰは、血中に存在している微量の成熟型ＩＬ−１８の活性を抑制している。

これらのことから、元々生体内に存在し、治療薬としても安全で、且つＩＬ−１８との作用メカニズムが明確なＩＬ−１８ＢＰを上記の疾患の治療剤として使用することが提案される。しかしながら、ＩＬ−１８ＢＰは血中半減期が３４−４０時間と短いため、薬効を維持するには頻回投与が必要になるなど改善の余地があった（非特許文献２６）。

それゆえ、ＩＬ−１８の生理活性をより生体内に近いメカニズムで中和する特異的なモノクローナル抗体を開発することができれば、ＩＬ−１８の関与する疾患、すなわち、ＩＬ−１８の発現量の変化に関連する疾患に対して、より安全且つ有効な治療手段になることが期待される。

このような背景のもと、これまでにＩＬ−１８活性抑制剤が複数取得されているが、ＩＬ−１８ＢＰが結合するＩＬ−１８の部位（ＩＬ−１８ＢＰ認識領域）と同じ部位に結合するものではなく、ＩＬ−１８ＢＰと同様の抑制メカニズムではないことが示されている（特許文献２、特許文献３）。これは、ＩＬ−１８抑制剤をスクリーニングする際にＩＬ−１８に存在するＩＬ−１８ＢＰ認識領域を露呈させ、それを維持することが困難であることを意味しており、結果として、ＩＬ−１８ＢＰと同様の抑制メカニズムに基づくＩＬ−１８活性抑制剤の取得が非常に困難であることを意味する。

本発明は、上記の課題に鑑み、生体内の天然のＩＬ−１８活性抑制剤であるＩＬ−１８ＢＰと同様の抑制メカニズムであり（いわゆるＩＬ−１８ＢＰ認識領域と同じ部位に結合する）、より安全で、かつ血中半減期の長い抗体分子を利用することでＩＬ−１８ＢＰよりも、より長期作動性のＩＬ−１８活性抑制剤の作出を達成したものである。

本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意に検討し本発明を完成させた。ファージディスプレイライブラリーからの抗体スクリーニング（パンニング）の際に通常用いられるターゲットタンパク質（この場合ＩＬ−１８）は、ＥＬＩＳＡプレートへ直接固相化されるのが通常である。これに対し、本発明者らは、液相法でのパンニングあるいは種々の既存抗ＩＬ−１８抗体を介してＩＬ−１８の配向、立体構造を制御した固相法など、パンニング時の条件を種々検討した。

その結果、本発明者らは、ＩＬ−１８ＢＰ認識領域を露呈させ、露呈状態を維持したＩＬ−１８を提示させることに成功した。

また本発明者らは、健常人の末梢血Ｂリンパ球より調製した免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖の可変領域（ＶＨ、ＶＬ）をコードする遺伝子を発現したファージディスプレイライブラリーから、所望の完全ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体の１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）の取得に成功した。

さらに、本発明者らは、この抗体断片及び当該断片に基づき作製された抗体が、ヒトＩＬ−１８の生理活性を阻害することを見出した。

すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な方法・物質として下記の発明を含むものである。

［１］：ヒトインターロイキン−１８（ヒトＩＬ−１８）に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体に反応しない、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。

［２］：ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。

［３］：Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１が、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｈ鎖のＣＤＲ２が、配列番号８のアミノ酸配列、又は、配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｈ鎖のＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｌ鎖のＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｌ鎖のＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｌ鎖のＣＤＲ３が、配列番号１２のアミノ酸配列、又は、配列番号１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、［１］又は［２］に記載の抗体。

［４］：Ｈ鎖可変領域が、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｌ鎖可変領域が、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列、又は、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれかに記載の抗体。

［５］：配列番号３若しくは５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体又はヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない、Ｈ鎖可変領域断片。

［６］：配列番号４若しくは６のアミノ酸配列、又は、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体又はヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない、Ｌ鎖可変領域断片。

［７］：［３］に記載の抗体のＨ鎖可変領域断片又は［５］に記載のＨ鎖可変領域断片と、［３］に記載の抗体のＬ鎖可変領域断片又は［６］に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体の１本鎖可変領域断片。

［８］：［３］に記載の抗体のＨ鎖可変領域断片若しくは［５］に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、［３］に記載の抗体のＬ鎖可変領域断片若しくは［６］に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の抗体の定常領域を連結してなる、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。

［９］：［８］に記載の抗体の断片。

［１０］：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＡｂ又はｓｃＦｖＦｃである、［９］に記載の断片。

［１１］：［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体又は［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片に、修飾剤が結合されてなる修飾抗体。

［１２］：［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体又は［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片をコードする遺伝子。

［１３］：配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する、［１２］に記載の遺伝子。

［１４］：［１２］又は［１３］に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。

［１５］：［１２］又は［１３］に記載の遺伝子が導入された形質転換体。

［１６］：［１２］又は［１３］に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体又は［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片を生産する方法。

［１７］：［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体、［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片又は［１１］に記載の修飾抗体を含むヒトＩＬ−１８の検出器具。

［１８］：［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体、［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片又は［１１］に記載の修飾抗体からなるヒトＩＬ−１８検出試薬を含む、ＩＬ−１８の発現量の変化に関連する疾患の診断キット。

［１９］：上記疾患が、ヒトＩＬ−１８亢進症である、［１８］に記載の診断キット。

［２０］：上記疾患が、アレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患からなる群から選択される、［１８］又は［１９］に記載の診断キット。

［２１］：上記疾患が、間質性肺炎、成人性Ｓｔｉｌｌ病、慢性閉塞性肺疾患、代謝性骨疾患、多発性硬化症、糖尿病、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息、並びに肝臓、腎臓及び腸管での重篤な臓器障害からなる群から選択される、［１８］〜［２０］のいずれかに記載の診断キット。

［２２］：［１８］〜［２１］のいずれかに記載の診断キットを用いて測定した被検試料中のヒトＩＬ−１８量に基づいて疾患を診断する方法。

［２３］：［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体、［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片又は［１１］に記載の修飾抗体を有効成分として含有する、ヒトＩＬ−１８活性阻害剤。

［２４］：［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体、［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片又は［１１］に記載の修飾抗体を有効成分として含有し、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８レセプターとの結合を阻害する、ヒトＩＬ−１８結合阻害剤。

［２５］：［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体、［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片又は［１１］に記載の修飾抗体を有効成分として含有する、インターフェロン−γ産生抑制剤。

［２６］：［１２］又は［１３］に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。

［２７］：［２３］に記載のヒトＩＬ−１８活性阻害剤、［２４］に記載のヒトＩＬ−１８結合阻害剤、［２５］に記載のインターフェロン―γ産生抑制剤、又は［２６］に記載の遺伝子治療剤を含む、ＩＬ−１８関連疾患の治療剤。

［２８］：上記疾患が、ヒトＩＬ−１８亢進症である、［２７］に記載の治療剤。

［２９］：上記疾患が、アレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患からなる群から選択される、［２７］又は［２８］に記載の治療剤。

［３０］：上記疾患が、間質性肺炎、成人性Ｓｔｉｌｌ病、慢性閉塞性肺疾患、代謝性骨疾患、多発性硬化症、糖尿病、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息、並びに肝臓、腎臓及び腸管での重篤な臓器障害からなる群から選択される、［２７］〜［２９］のいずれかに記載の治療剤。

［３１］：ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８レセプターとの結合の阻害用である、［２７］〜［３０］のいずれかに記載の治療剤。

［３２］：ヘルパーＴ１細胞からのインターフェロン―γ産生の阻害用である、［２７］〜［３１］のいずれかに記載の治療剤。

［３３］：［２７］〜［３２］のいずれかに記載の治療剤を投与することによるＩＬ−１８関連疾患の治療方法。

［３４］：ヒトＩＬ−１８をリンカーを介してビーズ形状の支持体に結合させた後、ヒトＩＬ−１８のＩＬ−１８ＢＰ認識領域を露呈及び維持する条件下でファージディスプレイライブラリーと該支持体を反応させることを含む、［１］〜［４］、［８］のいずれかに記載の抗体又は［５］〜［７］、［９］、［１０］のいずれかに記載の断片の作製方法。

［３５］：ヒトＩＬ−１８ＢＰ認識領域と同じ部位に結合する、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。

［３６］：ヒトＩＬ−１８活性を阻害する、［３５］に記載の抗体。

［３７］：ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８レセプターとの結合を阻害する、［３５］又は［３６］に記載の抗体。

［３８］：インターフェロン―γ（ＩＦＮ−γ）産生を阻害する、［３５］〜［３７］のいずれかに記載の抗体。

［３９］：エピトープがヒトＩＬ−１８の５３番目のリジンを含む領域である、［３５］〜［３８］のいずれかに記載の抗体。

［４０］：以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、［３５］〜［３９］のいずれかに記載の抗体。
（ａ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。

［４１］：以下（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む［４０］に記載のヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。
（ｅ）配列番号３又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号３又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。

［４２］：以下（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなる、ヒトＩＬ−１８に対するヒト由来の抗体のＨ鎖可変領域断片。
（ｅ）配列番号３又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号３又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。

［４３］：以下（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなる、ヒトＩＬ−１８に対するヒト由来の抗体のＬ鎖可変領域断片。
（ｇ）配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号４又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。

［４４］：［４０］に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片又は［４２］に記載のＨ鎖可変領域断片と、［４０］に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片又は［４３］に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ヒトＩＬ−１８に対するヒト由来の抗体の１本鎖可変領域断片。

［４５］：［４０］に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片又は［４２］に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、［４０］に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片又は［４３］に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、ヒトＩＬ−１８に対するヒト由来の抗体又はその断片。

［４６］：上記抗体の断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＡｂ、又はｓｃＦｖＦｃである［４５］に記載の抗体の断片。

［４７］：［３５］〜［４６］のいずれかに記載の抗体又はその断片に、修飾剤が結合されてなる修飾抗体。

［４８］：［３５］〜［４７］のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードする遺伝子。

［４９］：配列番号３〜６に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する［４８］に記載の遺伝子。

［５０］：［４８］又は［４９］に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。

［５１］：［４８］又は［４９］に記載の遺伝子が導入された形質転換体。

［５２］：［４８］又は［４９］に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト由来のヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体又はその断片を生産する方法。

［５３］：［３５］から［４６］のいずれかに記載の抗体又はその断片、又は［４７］に記載の修飾抗体を含むヒトＩＬ−１８の検出器具。

［５４］：［３５］から［４６］のいずれかに記載の抗体又はその断片、又は［４７］に記載の修飾抗体からなるヒトＩＬ−１８検出試薬を含む、被検試料中のヒトＩＬ−１８量を測定する疾患の診断キット。

［５５］：上記疾患が、ヒトＩＬ−１８亢進症である、［５４］に記載の診断キット。

［５６］：上記疾患が、アレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患からなる群から選択される１以上の疾患である、［５４］又は［５５］に記載の診断キット。

［５７］：上記疾患が、間質性肺炎、成人性Ｓｔｉｌｌ病、慢性閉塞性肺疾患、代謝性骨疾患、多発性硬化症、糖尿病、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息、並びに肝臓、腎臓及び腸管での重篤な臓器障害からなる群から選択される１以上の疾患である、［５４］〜［５６］のいずれかに記載の診断キット。

［５８］：［５４］〜［５７］のいずれかに記載の診断キットを用いて測定した被検試料中のヒトＩＬ−１８量に基づいて疾患を診断する方法。

［５９］：以下のいずれかのアンタゴニストを有効成分として含有する、ヒトＩＬ−１８活性阻害剤。
ｉ）［３５］〜［４６］のいずれかに記載の抗体又はその断片。
ｉｉ）［４７］に記載の修飾抗体。
ｉｉｉ）上記ｉ）又はｉｉ）のいずれかに記載の抗体、抗体の断片、又は修飾抗体が認識するヒトＩＬ−１８上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物。

［６０］：［５９］に記載のアンタゴニストを有効成分として含有する、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８レセプターとの結合を阻害するヒトＩＬ−１８結合阻害剤。

［６１］：［５９］に記載のアンタゴニストを有効成分として含有する、インターフェロン―γ産生抑制剤。

［６２］：［４８］又は［４９］に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。

［６３］：［５９］に記載のヒトＩＬ−１８活性阻害剤、［６０］に記載のヒトＩＬ−１８結合阻害剤、［６１］に記載のインターフェロン―γ産生抑制剤、又は［６２］に記載の遺伝子治療剤を含む疾患治療剤。

［６４］：上記疾患が、ヒトＩＬ−１８亢進症である、［６３］に記載の疾患治療剤。

［６５］：上記疾患が、アレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患からなる群から選択される１以上の疾患である、［６３］又は［６４］に記載の疾患治療剤。

［６６］：上記疾患が、間質性肺炎、成人性Ｓｔｉｌｌ病、慢性閉塞性肺疾患、代謝性骨疾患、多発性硬化症、糖尿病、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息、並びに肝臓、腎臓及び腸管などでの重篤な臓器障害からなる群から選択される１以上の疾患である、［６３］から［６５］のいずれかに記載の疾患治療剤。

［６７］：ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８レセプターとの結合を阻害する、［６３］から［６６］のいずれかに記載の疾患治療剤。

［６８］：ヘルパーＴ１細胞からのインターフェロン―γ産生を阻害する、［６３］から［６７］のいずれかに記載の疾患治療剤。

［６９］：［６３］から［６８］のいずれかに記載の疾患治療剤を投与することによる疾患の治療方法。

［７０］：ヒトＩＬ−１８をリンカーを介してビーズ形状の支持体に結合させた後、ヒトＩＬ−１８のＩＬ−１８ＢＰ認識領域を露呈及び維持する条件下でファージディスプレイライブラリーと該支持体を反応させることを含む、［３５］から［６９］のいずれかに記載の抗体又はその断片の作製方法。

さらに、本発明によれば、これまでのようにキメラ抗体又はヒト化抗体ではなく、ヒト由来のヒトＩＬ−１８に対する抗体及びその断片、並びにそれらの利用方法を提供できる。それゆえ、ヒトＩＬ−１８が直接又は間接的に関与する疾病の治療において、反復投与及び長期投与を行っても、顕著な治療効果と高い安全性とを維持した治療薬が期待される。

本発明のさらに他の目的、特徴、及び優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。

本発明のヒト抗ＩＬ−１８抗体及び抗体断片は、以下の特徴を有することから、より安全で、より効率的なＩＬ−１８アンタゴニストとして有用である。
（１）生体由来の天然のＩＬ−１８アンタゴニストであるＩＬ−１８ＢＰと同じ作用メカニズムを有する。
（２）ＩＬ−１８ＢＰと相乗的に作用することができる。
（３）既報のアンタゴニスト（ＩＬ−１８ＢＰ、その他抗体）と比較して、ＩＦＮ−γ産生抑制におけるＩＣ_５０が低いため、より低い濃度で投与できる。

抗ヒトＩＬ−１８抗体の結合活性試験の結果を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１８レセプター結合アッセイの結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、ＫＧ−１細胞を用いたＩＬ−１８レセプター結合アッセイの結果を示すグラフである。 組換えＩＬ−１８を用いた中和試験の結果を示すグラフである。 競合ＥＬＩＳＡによる抗ヒトＩＬ−１８抗体のエピトープ解析の結果を示すグラフである。 抗ヒトＩＬ−１８抗体及びＩＬ−１８ＢＰの存在下における、ＩＬ−１８レセプター結合アッセイの結果を示すグラフである。 ＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体を用いた抗ＩＬ−１８抗体のエピトープ解析の結果を示すグラフである。 抗ヒトＩＬ−１８抗体の、ＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとの複合体への反応性解析の結果を示すグラフである。

本発明の具体的態様について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。

（１）抗体及びその断片
本発明者らは、ヒトインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）に対するヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体について検討した。その結果、ファージディスプレイ法によって得られたヒト由来の１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）及び当該断片に由来する抗体が、ヒトＩＬ−１８により誘導されるシグナル伝達及びＩＦＮ−γ産生を阻害することを明らかにした。さらに、この１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）における、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列を同定した（配列番号１、２）。また、ヒトＩＬ−１８抗体のエピトープを解析した結果、ヒトＩＬ−１８の５３番目のリジンを含む領域であることが明らかになった。

一実施形態において、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体に反応しない抗体である。

ここで、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体がヒトＩＬ−１８に反応するとは、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体がヒトＩＬ−１８に結合することを意味する。より具体的には、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体のヒトＩＬ−１８に対する結合能が、ネガティブコントロール抗体のヒトＩＬ−１８に対する結合能よりも、有意に高いことを意味する。ネガティブコントロール抗体としては、ヒトＩＬ−１８を抗原としないことが明らかである抗体が使用でき、例えばヒト抗ＨＢｓ抗体が使用できる。ネガティブコントロール抗体又はヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体と、ヒトＩＬ−１８との結合能は、ＥＬＩＳＡ法等の通常の方法によって測定することができる。

また、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体がヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体に反応しないとは、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体のヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体に対する結合能が、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体のヒトＩＬ−１８に対する結合能よりも有意に低いことを意味する。ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体と、ヒトＩＬ−１８又はヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体との結合能は、ＥＬＩＳＡ法等の通常の方法によって測定することができる。

以下、用語「反応する」及び「反応しない」の意味は上述したものと同様である。

ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は組換え体であってもよい。組換え体とは、遺伝子工学的手法により作出された分子であることを意味する。ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は凍結乾燥されていてもよい。あるいは、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、薬学的に許容可能な担体と混合された組成物の形態であってもよい。

一実施形態において、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない抗体である。

一実施形態において、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、
Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１が、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｈ鎖のＣＤＲ２が、配列番号８のアミノ酸配列、又は、配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｈ鎖のＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｌ鎖のＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｌ鎖のＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｌ鎖のＣＤＲ３が、配列番号１２のアミノ酸配列、又は、配列番号１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる抗体であって、
ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体に反応しない抗体であるか、又は、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない抗体である。

一実施形態において、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、
Ｈ鎖可変領域が、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
Ｌ鎖可変領域が、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列、又は、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる抗体であって、
ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体に反応しない抗体であるか、又は、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない抗体である。

一実施形態において、Ｈ鎖可変領域断片は、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体又はヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない抗体断片である。

Ｈ鎖可変領域断片は、単独で又は任意のＬ鎖可変領域断片と組み合わせることによって、上記の反応性を示す。

Ｈ鎖可変領域断片とＬ鎖可変領域断片とを組み合わせるとは、Ｈ鎖可変領域断片とＬ鎖可変領域断片とを、完全長抗体、１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’_２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖＦｃ等の構造にすることを含む。

一実施形態において、Ｌ鎖可変領域断片は、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列、又は、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体又はヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない抗体断片である。

Ｌ鎖可変領域断片は、単独で又は任意のＨ鎖可変領域断片と組み合わせることによって、上記の反応性を示す。

一実施形態において、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体の１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、次のＨ鎖可変領域断片とＬ鎖可変領域断片とを連結したものである。
Ｈ鎖可変領域断片：
ＣＤＲ１が、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２が、配列番号８のアミノ酸配列、又は、配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、Ｈ鎖可変領域断片、又は
配列番号３若しくは５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域断片。
Ｌ鎖可変領域断片：
ＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３が、配列番号１２のアミノ酸配列、又は、配列番号１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、Ｌ鎖可変領域断片、又は
配列番号４若しくは６のアミノ酸配列、又は、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、Ｌ鎖可変領域断片。

一実施形態において、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、次のＨ鎖可変領域断片及び／又はＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の抗体の定常領域を連結したものである。
Ｈ鎖可変領域断片：
ＣＤＲ１が、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２が、配列番号８のアミノ酸配列、又は、配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、Ｈ鎖可変領域断片、又は
配列番号３若しくは５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域断片。
Ｌ鎖可変領域断片：
ＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３が、配列番号１２のアミノ酸配列、又は、配列番号１２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、Ｌ鎖可変領域断片、又は
配列番号４若しくは６のアミノ酸配列、又は、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、Ｌ鎖可変領域断片。

本実施形態に係る抗体又はその断片には、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）に示される抗体及びその断片が含まれる。

（ｉ）配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチドを含むＶＨ鎖断片（Ｈ鎖可変領域断片）。

ヒトＩＬ−１８に対するＨ鎖の相補性決定領域となるとは、単独で又は任意のＬ鎖可変領域断片と組み合わせることによって、ヒトＩＬ−１８に対する反応性を示すことを意味する。

配列番号３及び５には、ＶＨ鎖のアミノ酸配列が示される。配列番号７〜９には、このＶＨ鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列が示される。すなわち、配列番号３及び５に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号７）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号８）、９９番目〜１０９番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号９）に対応している。

（ｉｉ）配列番号３及び５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３及び５に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＨ鎖可変領域となるポリペプチドからなるＶＨ鎖断片（Ｈ鎖可変領域断片）。

（ｉｉｉ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチドを含むＶＬ鎖断片（Ｌ鎖可変領域断片）。

ヒトＩＬ−１８に対するＬ鎖の相補性決定領域となるとは、単独で又は任意のＨ鎖可変領域断片と組み合わせることによって、ヒトＩＬ−１８に対する反応性を示すことを意味する。

配列番号４及び６は、ＶＬ鎖のアミノ酸配列を示している。配列番号１０〜１２は、このＶＬ鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列を示している。すなわち、配列番号４及び６に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１０）、５２番目〜５８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１１）、９１番目〜１０１番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１２）に対応している。

（ｉｖ）配列番号４及び６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号４及び６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＩＬ−１８に対するＬ鎖可変領域となるポリペプチドからなるＶＬ鎖断片（Ｌ鎖可変領域断片）。

（ｖ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）のＶＨ鎖及び上記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のＶＬ鎖を連結してなる１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）。

（ｖｉ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）のＶＨ鎖及び／又は上記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のＶＬ鎖にヒト由来の定常領域を連結してなるヒト由来の抗体又はその断片。

（ｖｉｉ）エピトープがヒトＩＬ−１８の５３番目のリジンを含む領域であるヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。

上記（ｖ）及び（ｖｉ）において、ＶＨ鎖とＶＬ鎖とを連結する場合、通常、適当なペプチドリンカーなどによって連結される。このペプチドリンカーとしては、例えば、１０〜２５アミノ酸残基からなる任意の１本鎖ペプチドが用いられる。具体的なペプチドリンカーとしては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）_３が例示できる。

また、上記（ｖｉ）に記載の、ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖にヒト由来の定常領域を連結してなる抗体又はその断片（フラグメント）は、完全抗体（完全長抗体）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又は、少なくとも一部のＦｃ部を有するｓｃＡｂ若しくはｓｃＦｖＦｃであってもよい。なお、ｓｃＡｂとはｓｃＦｖにＬ鎖又はＨ鎖の定常領域の一部のドメイン（Ｃドメイン）が結合したものであり、ｓｃＦｖＦｃとはｓｃＦｖにＨ鎖のＣＨ１及びＣＨ２が結合したものである。

また、上記抗体は、抗体と構造的に関連したタンパク質も包含する意味、すなわち免疫グロブリンの意味である。さらに、本実施形態の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの何れのクラスでもよい。言い換えると、単量体であってもよいし、２量体、３量体、４量体、５量体といった多量体であってもよい。

ここで、上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。したがって、例えば、上記「配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」のポリペプチドは、上記「配列番号７〜９に示されるアミノ酸配列」のポリペプチドの変異ペプチドであり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味する。

例えば、「配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」は、配列番号７のアミノ酸配列と８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。配列番号７以外のアミノ酸配列においても同様である。

なお、上記「変異」は、後述のように本実施形態の抗体又はその断片を、治療薬として利用する場合（ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造又はヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具、診断キットなどとして利用する場合（ヒトに投与しない場合）には、特に制限されない。また、本実施形態の抗体又はその断片を、ヒトに投与する場合、抗原を認識するＣＤＲの高次構造を維持する範囲で、変異を行うことが好ましい。

なお、ＣＤＲは抗原を認識する領域であるため、ヒトＩＬ−１８は、本実施形態に係る抗体又はその断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）に認識される。したがって、少なくとも上記ＣＤＲを有する抗体又は断片は、ヒトＩＬ−１８を特異的に認識できる。すなわち、上記ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、少なくとも前記ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲを含み、それ以外は、ヒト由来のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列であってもよい。これにより、ヒトＩＬ−１８に対する特異性は保持される。ただし、ＣＤＲは、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域の１次構造と高次構造とによって、特異的に構築されている。このため、少なくとも前記ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲを含み、それ以外を、ヒト由来のＶＨ鎖及びＶＬ鎖からヒト抗ＩＬ−１８抗体を構成する場合、ヒトＩＬ−１８に対する特異性を有する抗体とすることが好ましい。例えば、少なくともＣＤＲの高次構造を維持することによって、ヒトＩＬ−１８に対する特異性を有する抗体とすることが好ましい。

後述する実施例に示すように、上記ｓｃＦｖについて詳細な解析を進めた結果、その作用・性質について以下の知見が得られた。
・ヒトＩＬ−１８及びサルＩＬ−１８と特異的に結合する。
・ヒトＩＬ−１８及びサルＩＬ−１８により誘導されるシグナル伝達及びＩＦＮ−γの産生を阻害する。

また、本実施形態の抗体又はその断片は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本実施形態の抗体又はその断片がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。すなわち、付加的なポリペプチドとしては、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等が挙げられる。

さらに、本実施形態の抗体及びその断片には、安定性及び抗体価を向上させるために、修飾剤が結合されていてもよい。すなわち、本実施形態の抗体及びその断片は、修飾抗体であってもよい。この修飾剤としては、例えば、糖鎖、高分子などが挙げられる。糖鎖修飾を行った場合には、その糖鎖が何らかの生理活性を有する可能性があるが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの単純な高分子修飾を行った場合にはそれ自体生理活性を示さない。さらに、ＰＥＧ化によって肝臓での吸収を抑制したり、血中での安定性を向上したりする可能性がある。つまり、修飾剤としては、ＰＥＧなどの単純な高分子が好ましい。

なお、本実施形態の抗体及びその断片の修飾剤による修飾は、前述の変異ペプチドの作製と同様に、治療薬として利用する場合には、ヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具、診断キットなどとして利用する場合には、特に制限されない。また、本実施形態の抗体又はその断片を、ヒトに投与する場合、抗原を認識するＣＤＲの高次構造を維持する範囲で、修飾することが好ましい。

本実施形態の抗体及びその断片は、ヒト由来のアミノ酸配列を有しているため、抗体の活性を阻止する抗抗体が形成される可能性は極めて低い。さらに、本実施形態の抗体及びその断片は、ヒトＩＬ−１８と強く結合することにより、ＩＦＮ−γ産生等の生理活性を阻害する作用があるため、ヒトＩＬ−１８によって惹起される種々の免疫応答を阻害することが期待される。よって、本実施形態の抗体及びその断片は、後述するヒトＩＬ−１８が直接又は間接的に関与する疾患の治療のために利用してもよい。

（２）遺伝子
本発明の実施形態には、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片をコードする遺伝子が含まれる。本実施形態には、配列番号１及び２に示される塩基配列からなる遺伝子、配列番号１及び２に示される塩基配列と８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子、配列番号３〜６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、これらの遺伝子をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として有する遺伝子、及びこれらの遺伝子の塩基配列の一部を改変した改変遺伝子などが含まれる。

上記の遺伝子は、ファージディスプレイライブラリーから取得した組換え遺伝子であり、天然に存在するものではない。また、上記の遺伝子はｃＤＮＡであってもよい。

上記の遺伝子は、上記実施形態の抗体又はその断片をコードしているので、適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入して、上記実施形態の抗体又はその断片を発現させることができる。

さらに、上記「遺伝子」は、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、配列番号１及び２に示される塩基配列からなる遺伝子、又は、配列番号３〜６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子をベクター配列につなぎ、これを適当な宿主で増幅させることにより、本実施形態の遺伝子を所望に増幅させることができる。また、本実施形態の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。また、後述するように、本実施形態の遺伝子は、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患用の遺伝子治療剤として利用してもよい。

（３）抗体及びその断片の取得方法・生産方法
上記「（１）抗体及びその断片」に記載の抗体及びその断片は、例えば、後述する実施例に示すように、いわゆるファージディスプレイ法（例えば、ＭＲＣ、ＵＣ、ＣＡＴ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＸＯＭＡ、Ｄｙａｘ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）及びＩＬ−１８分子上に存在するＩＬ−１８ＢＰ認識領域を露呈且つ維持させた状態でスクリーニングする方法を利用することにより、取得することができる。

そのため、本発明は、ＩＬ−１８がリンカーを介してビーズ形状の支持体に結合させた後、ＩＬ−１８のＩＬ−１８ＢＰ認識領域を露呈及び維持する条件下でファージディスプレイライブラリーと該支持体を反応させることを含む、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片の作製方法を含む。

また、上記「（１）抗体及びその断片」に記載の抗体及びその断片は、上記「（２）遺伝子」に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、生産することができる。なお、抗体及びその断片の取得方法及び生産方法は、これに限定されるものではない。

より具体的には、健常人の末梢血Ｂリンパ球からｍＲＮＡを抽出し、免疫グロブリン遺伝子のＶＨ鎖、ＶＬ鎖を、その両端を規定するプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、多様な配列を有するＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域集団を得る。次に、更にペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅して、Ｈ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のランダムな組み合わせによる多様なｓｃＦｖ ＤＮＡ集団を調製する。得られたｓｃＦｖ ＤＮＡをファージミドベクターに組込み、ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを作製する。このライブラリーの品質と多様性は有効な抗体を取得する上では非常に重要な因子となる。

ターゲットタンパクであるヒトＩＬ−１８は、通常第一選択としてプラスチックプレートに固相化するが、ＩＬ−１８分子上に存在するＩＬ−１８ＢＰ認識領域を露呈且つ維持させるために、適切な長さのリンカーを含むビオチン化試薬を用いて、ヒトＩＬ−１８をビオチン化する。リンカーの長さは、例えば３〜１００Åであり、例えば５〜５０Åであり、例えば１０〜３０Åである。

次に、このライブラリーをＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎマグネティックビーズに結合させたビオチン化ヒトＩＬ−１８と液相中で反応させ、洗浄により未反応のｓｃＦｖディスプレイファージを除去した後に、ヒトＩＬ−１８と結合しているｓｃＦｖファージクローンを酸で溶出する。分離したファージクローンからｓｃＦｖ ＤＮＡを調製し、これを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法にしたがって培養して目的のｓｃＦｖタンパクのみを得るというものである。

なお、配列番号１及び２は、ファージディスプレイ抗体法によって、取得したヒトＩＬ−１８に対する１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）をコードするｃＤＮＡの塩基配列である。また、配列番号３及び５は取得した抗ヒトＩＬ−１８抗体のＶＨ鎖のアミノ酸配列であり、配列番号４及び６は取得した抗ヒトＩＬ−１８抗体のＶＬ鎖のアミノ酸配列である。

ｓｃＦｖをコードする遺伝子は、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等を、発現させるｓｃＦｖをコードする遺伝子と機能的に結合させて発現させることができる。例えば、プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（非特許文献２７）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３タンパクのシグナル配列を用いることもできる。

前記のように発現されたｓｃＦｖは、宿主の細胞内外から分離し均一にまで精製することができる。本実施形態で発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にＨｉｓ ｔａｇ配列が付加されているので、ニッケルカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。このようにして得られたｓｃＦｖタンパク（ポリペプチド）は、後述する実施例に示すようにヒトＩＬ−１８に対する結合活性を有することが明らかになった。

本実施形態に係る抗体又はその断片のヒトＩＬ−１８に対する抗原結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ等の方法がある。例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトＩＬ−１８を固相化した９６穴プレートに目的の抗ＩＬ−１８抗体又は抗体断片を含む試料、例えば大腸菌の培養上清又は精製抗体を加える。次にアルカリホスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質パラニトロフェニルホスフェートを加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。

（４）組換え発現ベクター及び形質転換体
本発明の実施形態には、上記「（２）遺伝子」で説明した遺伝子、すなわち、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターが含まれる。例えば、配列番号１及び２に示される塩基配列からなる遺伝子、配列番号３〜６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。

このように、組換え発現ベクターは、上記実施形態の遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記実施形態に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。

上記実施形態の遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと上記実施形態の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から上記実施形態の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、上記実施形態に係る抗体又はその断片を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、上記実施形態に係る抗体又はその断片をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。

上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、上記「（２）遺伝子」で説明した、完全長抗体をコードする遺伝子の場合の宿主細胞としては、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等などの動物細胞が挙げられ、抗体断片をコードする遺伝子の場合の宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。

上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。

本実施形態の形質転換体は、上記「（２）遺伝子」で説明した遺伝子、すなわち、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、遺伝子が、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作手技）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されたことを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウス、ラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられている。なかでも、マウスは、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っており、実験動物・病態モデル動物として利用できる。ノックアウトマウス等は、上記抗体又はその断片の更なる機能解析、ヒトＩＬ−１８が関与する病気の診断方法の開発、その治療方法の開発などに有用である。

なお、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片は、本実施形態の組換え発現ベクターを用いて作製した、本実施形態の形質転換体によっても生産することが可能である。

（５）抗体及びその断片の利用方法
（５−１）ヒトＩＬ−１８の検出器具、精製用担体、検出試薬、疾患の診断キット、診断方法
上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体若しくはその断片、又は修飾抗体は、ヒトＩＬ−１８に対して、特異的に強く結合するため、後述するヒトＩＬ−１８の検出器具、精製用担体、検出試薬、疾患の診断キットなどに利用してもよい。

本実施形態の検出器具は、例えば、血液、尿などの試料中に含まれるヒトＩＬ−１８を検出する用途に用いることができる。さらに、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患の診断、治療効果の評価を行うための診断用、治療用に用いることができる。本実施形態のヒトＩＬ−１８の検出器具は、少なくとも「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体のＣＤＲのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。ヒトＩＬ−１８の検出器具は、種々の条件下でのＩＬ−１８の検出・測定などに利用できる。ヒトＩＬ−１８検出器具としては、例えば、ヒトＩＬ−１８と特異的に結合する、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片を基板（担体）上に固定化した抗体チップ、抗体カラム等が挙げられる。

また、本実施形態に係るヒトＩＬ−１８の精製用担体は、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体若しくはその断片、又は修飾抗体を含む。上記の精製用担体は、クロマトグラフィーにおいて通常使用される担体に対して、一般的な方法で抗体等を結合させることによって作製することができる。上記の精製用担体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるヒトＩＬ−１８の精製に利用できる。この精製方法は、上記実施形態の抗体又はその断片をヒトＩＬ−１８とそれ以外の物質の混合物に接触させて抗体又はその断片にヒトＩＬ−１８を吸着させる工程と、吸着したヒトＩＬ−１８を抗体又はその断片から脱着させ、採取する工程を含むものである。

本実施形態のヒトＩＬ−１８を検出するための試薬（ヒトＩＬ−１８検出試薬）は、上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体若しくはその断片、又は修飾抗体からなる。上記ヒトＩＬ−１８検出試薬によれば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイにより、被検試料中のヒトＩＬ−１８を迅速且つ正確に定性又は定量分析することができる。この標識イムノアッセイでは、上記抗体又はその断片は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いられる。また、これらの抗体及びその断片は、ヒトＩＬ−１８に特異的に反応し、免疫反応を呈するので、その免疫反応を標識物質を指標に測定すれば、被検試料中のごく微量のヒトＩＬ−１８を精度良く検出することができる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。

本実施形態の疾患の診断キットは、上記ヒトＩＬ−１８検出試薬を含む。上記診断キットは、被検試料中のヒトＩＬ−１８量を測定し、ＩＬ−１８の発現量の変化に関連する疾患を診断するために用いることができる。上記診断キットには、上記検出試薬以外にヒトＩＬ−１８の濃度指標となるヒトＩＬ−１８の標準品を含んでいてもよい。

本実施形態の診断方法は、上記診断キットを用いて被検試料（血液、体液、組織など）中のヒトＩＬ−１８量を測定し、その測定結果に応じて疾患の診断を行うものである。なお、上記「疾患」は、ＩＬ−１８の発現量の変化に関連する疾患であり、後述するヒトＩＬ−１８亢進症が含まれる。また、上記「疾患」としては、アレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患が例示され、より具体的には、間質性肺炎、成人性Ｓｔｉｌｌ病、慢性閉塞性肺疾患、代謝性骨疾患、多発性硬化症、糖尿病、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息、並びに肝臓、腎臓及び腸管での重篤な臓器障害などが例示される。

本実施形態のヒトＩＬ−１８の検出器具による検出方法は、ヒトＩＬ−１８を製造する際の工程管理及び製品の品質管理に有用である。また、本実施形態の疾患の診断キット及び診断方法は、組織及び体液におけるヒトＩＬ−１８のレベルを指標とする種々の感受性疾患の診断、各種疾患の治療評価、疾患の病態管理などを行うために極めて有用である。

一般に診断用に用いる抗体は、マウス、ウサギ、ヤギなどのヒト以外の動物を免疫して作成される。しかし、動物の免疫系では、自己の体を構成する分子に結合する抗体を産生するリンパ球は、排除又は不活性化される。つまり、動物を免疫して作成した抗ヒトＩＬ−１８抗体には、ヒトＩＬ−１８と動物のＩＬ−１８とで酷似した部分を抗原決定領域とした抗体は含まれない。

これに対し、上記実施形態の抗体は、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体を提示させたファージを含むファージライブラリーからスクリーニングされた抗体である。このファージには、動物のように抗体を排除又は不活性化する機構は存在しない。それゆえ、上記実施形態の抗体には動物の免疫では作製できない、ヒトその他の動物のＩＬ−１８に共通した抗原決定領域に結合特異性を示す抗ＩＬ−１８抗体が含まれる。このような抗体を本実施形態の検出器具及び診断キットに用いれば、ヒトのみならずサルをはじめとする各種動物疾患モデルにおけるＩＬ−１８関連疾患を診断することができる。

（５−２）ヒトＩＬ−１８活性阻害剤、結合阻害剤、ＩＦＮ−γ産生抑制剤、遺伝子治療剤
「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片は、ヒトＩＬ−１８に結合するとともに、ヒトＩＬ−１８レセプターへの結合を阻害してこのレセプターを介したシグナル伝達も阻害し、さらには、ヒトＩＬ−１８によって誘導されるＩＦＮ−γの産生も阻害する。したがって、当該抗体は、言い換えれば、ヒトＩＬ−１８アンタゴニストである。そして、このヒトＩＬ−１８アンタゴニストは、ヒトＩＬ−１８活性阻害剤として利用できる。

すなわち、本発明の実施形態には、以下の（Ｉ）〜（ＩＶ）のアンタゴニストを有効成分として含有するヒトＩＬ−１８活性阻害剤が含まれる。
（Ｉ）上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体。
（ＩＩ）上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体の断片。
（ＩＩＩ）上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片の修飾抗体。
（ＩＶ）上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に記載の抗体、抗体の断片、又は修飾抗体が認識するヒトＩＬ−１８上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物。

ここで、上記「ヒトＩＬ−１８活性阻害剤」は、ヒトＩＬ−１８の活性を抑制するものであり、ヒトＩＬ−１８レセプターへの結合を拮抗的に阻害するもの、又は、ヒトＩＬ−１８とＩＬ−１８レセプターとの複合体に結合して、シグナル伝達を阻害するものであってもよい。

また、本実施形態には、上記（Ｉ）〜（ＩＶ）のアンタゴニストを有効成分として含有し、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８レセプターとの結合を阻害するヒトＩＬ−１８結合阻害剤が含まれる。上記「ヒトＩＬ−１８結合阻害剤」は、ヒトＩＬ−１８レセプターへの結合も拮抗的に阻害するものであってもよい。

さらに、本実施形態には、上記（Ｉ）〜（ＩＶ）のアンタゴニストを有効成分として含有する、ＩＦＮ−γ産生抑制剤が含まれる。上記「ＩＦＮ−γ産生抑制剤」は、ＩＦＮ−γの産生を抑制するものであってよい。

また、上記「（２）遺伝子」で説明した遺伝子は、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患における遺伝子治療剤として利用してもよい。そのため、本発明の実施形態には、上記「（２）遺伝子」で説明した遺伝子を含む遺伝子治療剤が含まれる。この遺伝子治療剤は摂取後に上記実施形態の抗体又はその断片を体内で発現するように設計することによって、該治療剤を摂取後に体内で上記実施形態の抗体又はその断片を形成させ、上記阻害剤と同様の効果を持たせてもよい。

（５−３）疾患の治療剤
上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体又はその断片は、ヒト由来抗ヒトＩＬ−１８抗体の可変領域を有し、ヒトＩＬ−１８と強く反応して、ＩＬ−１８とＩＬ−１８レセプター間の結合に阻害作用を示す。さらに、ＩＬ−１８によって惹起される種々の免疫応答を阻害する（ＩＦＮ−γ産生を阻害）。そのため、上記のヒトＩＬ−１８活性阻害剤、ヒトＩＬ−１８結合阻害剤、ＩＦＮ−γ産生抑制剤、又は遺伝子治療剤は、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患（ＩＬ−１８関連疾患）の治療剤として利用してもよい。

上記「（１）抗体及びその断片」で説明した抗体は、ヒトＩＬ−１８を認識するヒト由来のヒト抗ヒトＩＬ−１８である。すなわち、この抗体のアミノ酸配列は、従来のキメラ抗体及びヒト化抗体とは異なり、すべてヒト由来である。したがって、上記実施形態の抗体の作用を阻止する抗体（抗抗体）が形成される虞はない。それゆえ、たとえ、この抗体を反復投与又は長期投与したとしても、高い安全性を保持したまま、効果も持続することができる。

本発明の実施形態には、上記のヒトＩＬ−１８活性阻害剤、ヒトＩＬ−１８結合阻害剤、ＩＦＮ−γ産生抑制剤、又は遺伝子治療剤を含む、疾患の治療剤が含まれる（以下、「疾患治療剤」という場合がある。）。疾患としては、ヒトＩＬ−１８亢進症が含まれる。ヒトＩＬ−１８亢進症とは、生体内外に由来する何らかの刺激によって過剰に産生された活性型のヒトＩＬ−１８が主因となって引き起こされる種々の疾患である。また、疾患としてはアレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患が例示され、より具体的には、間質性肺炎、成人性Ｓｔｉｌｌ病、慢性閉塞性肺疾患、代謝性骨疾患、多発性硬化症、糖尿病、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息、並びに肝臓、腎臓及び腸管での重篤な臓器障害が例示される。

なお、本実施形態の疾患治療剤は、体内でその効果を発揮すればよいので、例えば、配列番号１に示される塩基配列によりコードされるポリペプチド（又はこれを含むヒトＩＬ−１８活性阻害剤）を投与してもよいし、プロドラッグ化して体内で代謝されて当該ポリペプチドが発現されてもよい。すなわち、本実施形態の疾患治療剤は、上記（Ｉ）〜（ＩＶ）のヒトＩＬ−１８アンタゴニスト（ヒトＩＬ−１８活性阻害剤）又は上記遺伝子治療剤がプロドラッグ化されたものであってもよい。すなわち、体内で活性代謝物となるように修飾されていてもよい。

また、本実施形態の疾患治療剤は、１種類以上の賦形剤、１種類以上の結合剤、１種類以上の崩壊剤、１種類以上の滑沢剤、１種類以上の緩衝剤などの、医薬品として許容される添加物を含む組成物であってもよい。

なお、前述のように上記実施形態の抗体は、ＩＬ−１８刺激によるシグナル伝達及びＩＦＮ−γ産生を阻害するので、そのような特性を有する抗体とヒトＩＬ−１８との結合特異性を示すＩＬ−１８上の抗原決定領域を明らかにすれば、低分子化合物である疾患治療剤の開発への応用が可能となる。この抗原決定領域を、エピトープという。このエピトープは、アミノ酸の１次配列そのものである場合及びペプチド鎖の折り畳まれ方で構築された立体構造である場合がある。いずれの場合でも、例えば、Ｆｕｋｕｍｏｔｏらが提案した「モノクローナル抗体を用いた分子鋳型デザイン法」によって、エピトープの類似化合物（ミミック分子）をデザインすることができる（非特許文献２８）。ここで、「低分子化合物」とは、例えば、ペプチド、抗体などの比較的分子量の大きい化合物（分子量１万以上）のものではなく、一般に低分子医薬として用いられている、分子量１万未満、例えば、分子量３０００未満の化合物を示している。なお、低分子化合物の分子量は、小さいほど好ましい。

なお、上記低分子化合物として、ペプチド又はさらに低分子量の化合物を創製する場合、このミミック分子の分子構造に着目して分子設計を行う、いわゆるｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスによって、設計することができる。このように、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏによる分子設計を行うことにより、安価かつ迅速に、治療薬となりうる低分子化合物を、リード化合物として選抜できる。

具体的には、例えば、後述の実施例では、ヒト抗ヒトＩＬ−１８ｓｃＦｖ抗体のＣＤＲは、配列番号７〜９及び１０〜１２に示されている。一般に、抗体において、ＣＤＲは、抗原を認識する領域（部位）である。すなわち、ＣＤＲは、抗体の活性中心となる。つまり、実施例に示したｓｃＦｖは、ＣＤＲによって、ヒトＩＬ−１８を特異的に認識する。

したがって、このＣＤＲの高次構造と略一致（好ましくは完全に一致）するように、低分子化合物を設計すれば、その低分子化合物は、低分子医薬品として利用できる。言い換えれば、低分子化合物は、ＣＤＲのコンフォメーションに近づくように設計する。なお、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスの方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＳＢＤＤ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）、ＣＡＤＤ（Ｃｏｎｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）などにより、ＣＤＲが有する官能基及びＣＤＲの高次構造に基づいて、コンピューター上で設計できる。

このようにして設計した低分子化合物は、抗体のようなタンパク質（ペプチド）に比べて、安定性が高い。このため、この低分子化合物は、取り扱いやすい医薬品として利用できる。

（５−４）疾患治療剤の適用例−１
前述のように、上記実施形態のヒトＩＬ−１８活性阻害剤、ヒトＩＬ−１８結合阻害剤、ＩＦＮ−γ産生抑制剤、又は遺伝子治療剤は、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患の治療剤として使用してもよい。以下に、疾患治療剤の適用例を例示する。

間質性肺炎とは胸部Ｘ線画像上両側びまん性の陰影を認める疾患のうち、肺の間質（狭義では肺胞隔壁、広義では小葉間隔壁、胸膜近傍等を含む）を炎症の場とする２００種以上の疾患の総称である。このうち、原因が明らかでない間質性肺炎が多く存在している。久留米大学のグループは、ＩＬ−１８の生体内での役割を明らかにするために、マウスにＩＬ−２を投与してリンパ球を活性化させた状態で、ＩＬ−１８を投与した際の変化を観察した（非特許文献２９）。その結果、ＩＬ−１８の投与により間質性肺炎が惹起されることを見出し、間質性肺炎の病態形成にＩＬ−１８が深く係っていることを見出した。さらに、同グループは、ＩＬ−１８の過剰な作用発現を抑えることによって間質性肺炎の発症が抑えられると考え、この仮説を実証するためにＩＬ−１８レセプター（ＩＬ−１８Ｒα）ノックアウトマウスを用いて検討した結果、ＩＬ−１８の働きを抑えることによって間質性肺炎の発症が抑えられることを確かめている。

一方、後述の実施例６では、ヒト細胞であるＫＧ−１を用いて、本発明者が取得した抗ＩＬ−１８抗体にＩＬ−１８の作用発現を抑える能力があることを確認している。

このように、ＩＬ−１８は、ＩＬ−２と共同してリンパ球を刺激することにより、重篤な間質性肺炎を発症する。したがって、例えば、前述した疾患治療剤を間質性肺炎の治療に使用してもよい。

（５−５）疾患治療剤の適用例−２
成人発症Ｓｔｉｌｌ病は、高熱、多関節痛、皮疹を主徴とする全身性の炎症性疾患である。病因は明らかになっていないところも多いが、遺伝要因として、カナダよりＨＬＡＢ１７、Ｂ１８、Ｂ３５、ＤＲ２が連鎖することが報告されている。最近では、ＩＬ−１８などのサイトカイン遺伝子の多型性が発症のリスクとなる可能性が指摘されている。環境要因として、過去にヒトパルボウイルス、風疹ウイルス、ＥＢウイルス、エコーウイルス、サイトメガロウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、コクサッキーウイルス、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどのウイルス、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａなどの細菌感染後に発症した例が報告されている。したがって、ウイルス又は細菌の感染がＳｔｉｌｌ病の誘発因子と考える感染惹起説も提唱されている。また発症病態の形成にサイトカインが重要な役割を果たしていることも知られている。Ｓｔｉｌｌ病患者ではＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８が過剰に発現している。その中でも特にＩＬ−１８が著増していることが示されており、ＩＬ−１８がＳｔｉｌｌ病の原因の１つとして考えられている。したがって、ＩＬ−１８の作用発現を抑えることによってＳｔｉｌｌ病の発症が抑えられることが期待される。

後述の実施例６では、ヒト細胞であるＫＧ−１を用いて、本発明者が取得した抗ＩＬ−１８抗体にＩＬ−１８の作用発現を抑える能力があることを確認している。したがって、例えば、前述した疾患治療剤を成人発症Ｓｔｉｌｌ病等へ使用してもよい。

（５−６）疾患治療剤の適用例−３
ＩＬ−１８は、樹状細胞、マクロファージなどの免疫系の細胞だけでなく、皮膚ケラチノサイト、腸管上皮細胞、気道上皮細胞など、種々の非免疫系の細胞からも産生される。

また、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２の存在下で、様々な免疫系又は非免疫系の細胞から、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。一方、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２の非存在下で、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞から、ＩＬ−４、ＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカイン（ヘルパーＴ２細胞から産生するサイトカイン）の産生を誘導して、抗原非特異的にＩｇＥ産生を誘導する。

また、ＩＬ−１８は、抗原刺激を受けたＴｈ１細胞を刺激して、Ｔｈ１サイトカインに属するＩＦＮ−γの産生を増強するばかりか、Ｔｈ２サイトカインに属するＩＬ−９、ＩＬ−１３、さらに代表的なケモカインであるＩＬ−８の産生を誘導する。

また、ＩＬ−１８は、ＯＶＡ特異的Ｔｈ１型メモリーＴ細胞を移入したマウスに、経鼻的にＯＶＡと共に投与する（ＩＬ−１８とＯＶＡとを投与）ことにより、肺胞と間質内への好中球、リンパ球、マクロファージ、好酸球の強い湿潤像と、気道過敏性とを特徴とするＴｈ１型の気管支喘息を誘導できる。

また、ＩＬ−１８は、抗原／ＩｇＥ非依存的に、直接、肥満細胞及び好塩基球を刺激する。その結果、様々なサイトカイン及び化学伝達物質の産生を誘導し、自然型アトピー（ＩＬ−１８依存性炎症）を誘導する。

後述する実施例に示すように、本発明者が取得した抗ＩＬ−１８抗体は、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ系で、ＩＬ−１８の活性を抑制した。特に、この抗体は、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ産生抑制機能を有している。

以上より、ＩＬ−１８は、気管支喘息、自然型アトピー性皮膚炎などのアレルギー性炎症に重要であり、前述したヒトＩＬ−１８アンタゴニスト（前述の（Ｉ）〜（ＩＶ））は、その治療薬として使用しても構わない。

上記実施形態に係る抗体及びその断片は、ヒトＩＬ−１８レセプターへの結合を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体及びその断片である。したがって、ヒトＩＬ−１８が原因となる様々な炎症性疾患の治療薬（治療方法）又は予防薬（予防方法）として利用可能である。

また、本発明は、例えば、ｓｃＦｖ抗体のＣＤＲの高次構造に基づき、低分子化合物を設計することにより、ＩＬ−１８活性を抑制する低分子医薬品（化学合成薬剤）を開発する重要な手段を提供する。

前述のように、上記実施形態のヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、ＩＬ−１８レセプターへの結合を阻害する。したがって、この抗体は、上記以外にも、ＩＬ−１８が原因となって発症する、様々な疾患の治療と予防に有効となる。

本発明者らは、ヒト１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を提示するファージディスプレイライブラリーから、ＩＬ−１８に特異的に結合するｓｃＦｖの単離に成功した。この１本鎖可変領域断片も、ＩＬ−１８レセプターへの結合を、特異的に阻害することが可能である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。

（実施例１）サイトカインのビオチン化
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＡＣ_５−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（同仁化学）又はＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ_５ Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（同仁化学）を用いて、サイトカインであるヒトＩＬ−１８（ＭＢＬ）、サルＩＬ−１８（ｔｈｅｒｍｏ）、ラットＩＬ−１８（Ａｃｒｉｓ）、マウスＩＬ−１８（ＭＢＬ）、ヒトＩＬ−１β（フナコシ）、ヒトＩＬ−３３（ＭＢＬ）をビオチン化した。ビオチン化処理後のサイトカインのバッファーは、透析によりＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）に置換した。

（実施例２）抗ヒトＩＬ−１８抗体の単離
ヒトＢ細胞（例えば扁桃腺、脾臓）由来のｍＲＮＡからヒトＶＨ及びＶＬ ｃＤＮＡを使用して調製されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒトＩＬ−１８に対する抗体を単離した。用いた抗体ライブラリーは１０^１１種以上の多様な抗体分子を含む極めて優れたものであった。

標準の手順を使用してＢｉｏｍａｇ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）にビオチン化ヒトＩＬ−１８を結合させることにより、ヒトＩＬ−１８に特異的に結合するｓｃＦｖファージを取得した（非特許文献３０）。取得したｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅのｃｌｏｎｅ名を「４Ａ６Ｄ」及び「４Ａ６Ｓ」と命名した。取得したｓｃＦｖファージの結合活性は以下の方法で評価した。

（実施例３）抗ＩＬ−１８抗体の結合活性試験
取得したｓｃＦｖファージ、ｓｃＦｖ、及び定法（常法）により作成されるＩｇＧの結合活性はＥＬＩＳＡによって評価した。ビオチン化ヒトＩＬ−１８又はビオチン化マウスＩＬ−１８をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、２時間室温でインキュベートすることによってＩＬ−１８を固相化した。固相化後、ｐｌａｔｅをＰＢＳＴで洗浄し、取得したｓｃＦｖファージ、ｓｃＦｖ又はＩｇＧをｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体 ａｎｔｉ−Ｍ１３／ＨＲＰ（ＧＥヘルスケア）、ａｎｔｉ−Ｈｉｓ ｔａｇ／ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）、ａｎｔｉ−Ｖ５ ｔａｇ／ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ／ＨＲＰ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はａｎｔｉ−ｈＦｃ／ＨＲＰ（コスモバイオ、Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、２Ｎ 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。

ＩｇＧ分子型４Ａ６ＤとヒトＩＬ−１８の結合活性ならびにＩｇＧ分子型４Ａ６ＳとヒトＩＬ−１８の結合活性を図１に示した。４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓはネガティブコントロール抗体（ヒト抗ＨＢｓ抗体）と比較して有意にヒトＩＬ−１８への結合活性を有していた。

（実施例４）抗ＩＬ−１８抗体のシークエンス解析
取得した抗ＩＬ−１８抗体の塩基配列を確認した。単離したｓｃＦｖ 遺伝子のＶＨ鎖及びＶＬ鎖遺伝子のＤＮＡ塩基配列をＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。

４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１、２に示した。

なお、表１の配列番号３及び４には、４Ａ６ＤのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列を示しており、配列番号５及び６には、４Ａ６ＳのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列を示している。４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓでアミノ酸配列の異なる部位を下線部にて示している。

４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓの結合活性に重要なＣＤＲ（相補性決定領域）のアミノ酸配列を表２の配列番号７から１２に示している。

（実施例５）ＩＬ−１８レセプター結合アッセイ
（５−１）ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−１８レセプター結合アッセイ
抗ヒトＩＬ−１８抗体の機能を評価するために、ＩＬ−１８レセプター結合アッセイ系を構築した。

Ｃｏｖａｌｉｎｋ ｐｌａｔｅ（ｎｕｎｃ）にＩＬ−１８Ｒβ−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ）を１μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬ／ｗｅｌｌ入れて、室温で１時間インキュベート後、４℃で終夜インキュベートした。翌日、そのプレートをＰＢＳ（リン酸緩衝液）で洗浄し、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）−ＰＢＳでブロッキングした。ヒトＩＬ−１８（ＭＢＬ）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、ＩＬ−１８Ｒα−ｈＦｃ−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２μｇ／ｍＬの濃度に調製し、両者を５０μＬずつ混合した。さらに、取得した抗ＩＬ−１８抗体をＩＬ−１８／ＩＬ−１８Ｒα−ｈＦｃ−Ｈｉｓ混合液に加えた。この混合液を、ＩＬ−１８Ｒβ−ｈＦｃを固相化したＣｏｖａｌｉｎｋ ｐｌａｔｅに入れ、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴ（リン酸緩衝液−Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ−Ｈｉｓ ｔａｇ／ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、２Ｎ 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。

４Ａ６ＤによるヒトＩＬ−１８とＩＬ−１８レセプター間の結合阻害活性を図２に示した。４Ａ６Ｄはネガティブコントロール抗体（ヒト抗ＨＢｓ抗体）と比較して有意にヒトＩＬ−１８とＩＬ−１８レセプター間の結合を阻害した。

（５−２）ＫＧ−１細胞を用いたＩＬ−１８レセプター結合アッセイ
取得した抗ＩＬ−１８抗体のｎａｔｉｖｅなＩＬ−１８レセプターに対する結合阻害能を確認するため、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−２４６）を用いたＩＬ−１８レセプター結合アッセイ系を構築した。

ヒトＩＬ−１８（ＭＢＬ）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０５％ＮａＮ_３−２％ウサギ血清で１００ｎｇ／ｍＬに希釈し、取得した抗ＩＬ−１８抗体と混合し、室温で６０分インキュベートした。その後、標準的な技法（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを加えた培地）により培養されたＫＧ−１細胞（１×１０^５ｃｅｌｌｓ）にヒトＩＬ−１８／抗ＩＬ−１８抗体混合液を加え、氷上で反応させた。３０分後、遠心（１２００ｒｐｍ，３ｍｉｎ，４℃）により上清を除去し、ＩＬ−１８とＩＬ−１８レセプター間の結合を阻害しないビオチン化抗ＩＬ−１８抗体１２５−２Ｈ（ＭＢＬ）を加え、氷上で反応させた。３０分後、遠心（１２００ｒｐｍ，３ｍｉｎ，４℃）により上清を除去し、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥ（ＢＤ）を加え、氷上で３０分反応させた。反応後、遠心（１２００ｒｐｍ，３ｍｉｎ，４℃）により上清を除去し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０５％ＮａＮ_３−２％ウサギ血清でＫＧ−１細胞を浮遊させた。反応させたＫＧ−１細胞はＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ）により蛍光強度を測定した。

ＩｇＧ分子型４Ａ６ＤによるヒトＩＬ−１８とｎａｔｉｖｅなＩＬ−１８レセプター間の結合阻害活性を図３（ａ）及び（ｂ）に示した。ＩｇＧ分子型４Ａ６Ｄはネガティブコントロール抗体（ヒト抗ＨＢｓ抗体）と比較して有意にヒトＩＬ−１８とＩＬ−１８レセプター間の結合を阻害した。

（実施例６）抗ＩＬ−１８抗体の中和試験
（６−１）組換えＩＬ−１８を用いた中和試験
抗ヒトＩＬ−１８抗体の中和活性を試験するために、ＩＬ−１８活性をモニターするための試験として当技術分野で認められている、中和試験を行った。

簡単に述べると、その中和試験は、標準的な技法（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを加えた培地）により培養されたＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−２４６）を使用する。中和試験を行うため、ＫＧ−１細胞を３×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬで播種し、４日間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。４日後、ＫＧ−１細胞を３×１０^６ ｃｅｌｌ／ｍＬに調製し、最終濃度４ｎｇ／ｍＬになるように組換えＩＬ−１８及び取得した抗ＩＬ−１８抗体を加え、２４時間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。２４時間後の培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ産生量を製造業者の指示にしたがって、市販のＩＦＮ−γ定量ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。

その結果、図４に示すようにＩｇＧ分子型４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓは、ＫＧ−１細胞からのＩＦＮ−γ産生を阻害した。さらに４Ａ６Ｄ及び４Ａ６ＳのＩＣ_５０を算出した結果を表３に示す。４Ａ６Ｄ及び４Ａ６ＳのＩＣ_５０はそれぞれ０．００７ｎＭ、０．０１３ｎＭであった。これは４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓが既報のＩＬ−１８阻害剤の中和能を大きく凌駕することを実証している。

（６−２）ヒト細胞由来のｎａｔｕｒａｌ ＩＬ−１８を用いた中和試験
標準的な技法（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを加えた培地）により培養されたＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−２４６）及びＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＃ＴＩＢ−２０２）を使用した。中和試験を行うため、ＫＧ−１細胞を３×１０^５ ｃｅｌｌ／ｍＬで播種し、４日間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。またＴＨＰ−１細胞を３×１０^５ ｃｅｌｌ／ｍＬで播種し、２日間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。培養後のＫＧ−１細胞及びＴＨＰ−１細胞をそれぞれ６×１０^６ ｃｅｌｌ／ｍＬ、１×１０^６ ｃｅｌｌ／ｍＬに調製し、等量混合した。最終濃度１μｇ／ｍＬになるようにＬＰＳ（リポポリサッカライド、ＳＩＧＭＡ）及び取得した抗ＩＬ−１８抗体を加え、２４時間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。２４時間後の培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ産生量を製造業者の指示にしたがって、市販のＩＦＮ−γ定量ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。

結果を表４に示す。ＴＨＰ−１細胞及びＫＧ−１細胞単独にＬＰＳを加えてもＩＦＮ−γは産生されないが、ＴＨＰ−１、ＫＧ−１及びＬＰＳの３者が存在する時のみＩＦＮ−γを産生した。さらに４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓを加えることで、ＩＦＮ−γ産生が阻害された。以上の結果は、２種類のヒト細胞を用いることでｎａｔｕｒａｌなＩＬ−１８を産生し、その結果としてＩＦＮ−γを産生するアッセイ系の構築を実証した。また、以上の結果は、ＩｇＧ分子型４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓがヒト細胞由来のｎａｔｕｒａｌなＩＬ−１８を阻害することも実証した。

（６−３）Ｃｈｙｍａｓｅ切断型 ＩＬ−１８を用いた中和試験
Ｃｈｙｍａｓｅ切断型のＩＬ−１８は既報（非特許文献９）にしたがって調製した。

簡単に述べると、大腸菌を宿主として、前駆体であるｐｒｏＩＬ−１８を発現し、精製した。調製したｐｒｏＩＬ−１８（１００μｇ／ｍＬ）に、Ｃｈｙｍａｓｅ（フナコシ）を１０Ｕ加え、３７℃で８０分インキュベーションした。これをｃｈｙｍａｓｅ切断型のＩＬ−１８とした。

一方、ＫＧ−１細胞を３×１０^５ ｃｅｌｌ／ｍＬで播種し、４日間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。４日後、ＫＧ−１細胞を３×１０^６ ｃｅｌｌ／ｍＬに調製し、ｃｈｙｍａｓｅ切断型のＩＬ−１８を反応系の１／２０容量加え、さらに取得した抗ＩＬ−１８抗体を加え、２４時間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。２４時間後の培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ産生量を製造業者の指示にしたがって、市販のＩＦＮ−γ定量ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。

結果を表５に示す。ＩｇＧ分子型４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓを加えることで、ＩＦＮ−γ産生が阻害された。この結果は、４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓがｃｈｙｍａｓｅ切断型の活性型ＩＬ−１８を阻害することを実証している。

（実施例７）エピトープ解析（競合ＥＬＩＳＡ）
競合ＥＬＩＳＡ法により、取得した抗ＩＬ−１８抗体のエピトープ解析を行った。

ビオチン化ヒトＩＬ−１８をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、２時間室温でインキュベートすることによってヒトＩＬ−１８を固相化した。固相化後、ｐｌａｔｅをＰＢＳＴで洗浄し、抗マウスα９ ｓｃＦｖ−ｍＦｃ（ネガティブコントロール）或いは４Ａ６Ｄ ｓｃＦｖ−ｍＦｃをｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ヒトＩＬ−１８ＢＰａ−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ）を３０ｎｇ／ｍＬに１％ＢＳＡ−ＰＢＳで調製し、ｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体 ａｎｔｉ−ｈＦｃ／ＨＲＰ（コスモバイオ、Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、２Ｎ 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。

抗ヒトＩＬ−１８抗体のエピトープ解析の結果を図５に示す。４Ａ６Ｄは、ヒトＩＬ−１８ＢＰａ−ｈＦｃと競合することがわかった。これは、４Ａ６ＤとヒトＩＬ−１８ＢＰａが同一エピトープを認識しており、４Ａ６Ｄは生体内と同様の阻害様式を有することを意味する。

（実施例８）抗ヒトＩＬ−１８抗体及びＩＬ−１８ＢＰの存在下における、ＩＬ−１８レセプター結合アッセイ
上記「ＫＧ−１細胞を用いたＩＬ−１８レセプター結合アッセイ」を基として、取得した抗ＩＬ−１８抗体と同時にヒトＩＬ−１８ＢＰａ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）を添加することでその効果が相乗的かどうかを検証した。

結果を図６に示す。ＩｇＧ分子型４Ａ６Ｄ及びヒトＩＬ−１８ＢＰａが単独ではＫＧ−１細胞へのＩＬ−１８の結合を数十％阻害するのに対して、その両者が存在することで単独で加えるよりも高い阻害効果を示した。

（実施例９）交差反応性試験
上記「サイトカインのビオチン化」に記載したビオチン化ヒトＩＬ−１８（ＭＢＬ）、ビオチン化サルＩＬ−１８（ｔｈｅｒｍｏ）、ビオチン化ラットＩＬ−１８（Ａｃｒｉｓ）、ビオチン化マウスＩＬ−１８（ＭＢＬ）、ビオチン化ヒトＩＬ−１β（フナコシ）、ビオチン化ヒトＩＬ−３３（ＭＢＬ）をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、２時間室温でインキュベートすることによって各種サイトカインを固相化した。固相化後、ｐｌａｔｅをＰＢＳＴで洗浄し、取得した抗体をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体 ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ／ＨＲＰ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はａｎｔｉ−ｈＦｃ／ＨＲＰ（コスモバイオ、Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、２Ｎ 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。

結果を表６に示す。取得した抗ヒトＩＬ−１８抗体４Ａ６Ｄ及び４Ａ６Ｓは、ヒト及びサルＩＬ−１８への結合活性を示すが、ラット及びマウスＩＬ−１８への結合活性を示さなかった。一方、取得した抗ＩＬ−１８抗体は、他のＩＬ−１ファミリーであるＩＬ−１β及びＩＬ−３３への結合活性を有していなかった。

（実施例１０）エピトープ解析（Ａｌａ置換体を用いた反応性解析）
大腸菌を宿主として、野生型ヒトＩＬ−１８又はヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体を、ファクターＸａ 切断サイトをリンカーにしてＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケア）カラムに結合させた。その後、ファクターＸａを加えることにより野生型ヒトＩＬ−１８又はヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体を溶出した。溶出液中に含まれるファクターＸａは、Ｘａｒｒｅｓｔアガロース（ノバジェン）を用いて除去した。この溶出液を野生型ヒトＩＬ−１８又はヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体とした。

次に、これらのヒトＩＬ−１８をビオチン化後、ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、２時間室温でインキュベートすることによって固相化した。固相化後、ｐｌａｔｅをＰＢＳＴで洗浄し、ヒトＩＬ−１８ＢＰａ−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ）又はＩｇＧ分子型４Ａ６Ｄを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調製し、ｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体 ａｎｔｉ−ｈＦｃ／ＨＲＰ（コスモバイオ、Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｍ 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。

ＥＬＩＳＡの結果を図７に示す。ヒトＩＬ−１８ＢＰａ−ｈＦｃと同様に、４Ａ６Ｄは、野生型ヒトＩＬ−１８と比較して、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体への反応性が低下していた。これは、４Ａ６Ｄのエピトープとして、ヒトＩＬ−１８の５３番目のアミノ酸残基であるリジンが重要であることを意味し、かつ、ヒトＩＬ−１８ＢＰａもこの領域を認識していることを示している。すなわち４Ａ６ＤはヒトＩＬ−１８ＢＰａの認識部位と同じ領域をエピトープとして認識していることが示された。

（実施例１１）ＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとの複合体への反応性解析
ＥＬＩＳＡ法により取得した抗ＩＬ−１８抗体の、ＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとの複合体への反応性を評価した。

ビオチン化ヒトＩＬ−１８をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、１時間室温でインキュベートすることによってヒトＩＬ−１８を固相化した。ＰｌａｔｅをＰＢＳＴで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したヒトＩＬ−１８ＢＰａ−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬずつ加えた。３７℃で１時間インキュベーションすることで、ＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとの複合体を形成させた。そのｐｌａｔｅをＰＢＳＴで洗浄し、４Ａ６Ｄ ｓｃＦｖ−ｍＦｃをｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体 ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ／ＨＲＰ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｍ 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。

ＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとの複合体への反応性解析の結果を図８に示す。４Ａ６Ｄは、ＩＬ−１８と結合するが、ＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとの複合体とは反応しなかった。

本発明のヒトＩＬ−１８に対する抗体及びその断片は、ヒトＩＬ−１８が直接又は間接的に関与する疾病に対して利用可能性がある。

Claims (30)

1. Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１が、配列番号７のアミノ酸配列からなり、
   Ｈ鎖のＣＤＲ２が、配列番号８のアミノ酸配列からなり、
   Ｈ鎖のＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列からなり、
   Ｌ鎖のＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列からなり、
   Ｌ鎖のＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列からなり、
   Ｌ鎖のＣＤＲ３が、配列番号１２のアミノ酸配列からなる、ヒトインターロイキン−１８（ヒトＩＬ−１８）に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体に反応しない、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。
2. Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１が、配列番号７のアミノ酸配列からなり、
   Ｈ鎖のＣＤＲ２が、配列番号８のアミノ酸配列からなり、
   Ｈ鎖のＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列からなり、
   Ｌ鎖のＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列からなり、
   Ｌ鎖のＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列からなり、
   Ｌ鎖のＣＤＲ３が、配列番号１２のアミノ酸配列からなる、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８結合タンパク質（ヒトＩＬ−１８ＢＰ）との複合体に反応しない、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。
3. Ｈ鎖可変領域が、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
   Ｌ鎖可変領域が、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列、又は、配列番号４若しくは６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の抗体。
4. 配列番号３若しくは５のアミノ酸配列からなり、ヒトＩＬ−１８に反応し、ヒトＩＬ−１８のＫ５３Ａ変異体又はヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８ＢＰとの複合体に反応しない、Ｈ鎖可変領域断片。
5. 請求項１若しくは２に記載の抗体のＨ鎖可変領域断片又は請求項４に記載のＨ鎖可変領域断片と、請求項１又は２に記載の抗体のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体の１本鎖可変領域断片。
6. 請求項１若しくは２に記載の抗体のＨ鎖可変領域断片若しくは請求項４に記載のＨ鎖可変領域断片に、又は請求項１若しくは２に記載の抗体のＨ鎖可変領域断片若しくは請求項４に記載のＨ鎖可変領域断片、及び請求項１若しくは２に記載の抗体のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の抗体の定常領域を連結してなる、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体。
7. 請求項６に記載の抗体の断片であって、
   少なくとも請求項６に記載の抗体におけるＣＤＲを有し、ヒトＩＬ−１８を特異的に認識する、断片。
8. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＡｂ又はｓｃＦｖＦｃである、請求項７に記載の断片。
9. 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体又は請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片に、修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
10. 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体又は請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片をコードする遺伝子。
11. 配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する、請求項１０に記載の遺伝子。
12. 請求項１０又は１１に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
13. 請求項１０又は１１に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
14. 請求項１０又は１１に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体又は請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片を生産する方法。
15. 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体、請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片又は請求項９に記載の修飾抗体を含むヒトＩＬ−１８の検出器具。
16. 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体、請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片又は請求項９に記載の修飾抗体からなるヒトＩＬ−１８検出試薬を含む、ＩＬ−１８の発現量の変化に関連する疾患の診断キット。
17. 上記疾患が、ヒトＩＬ−１８亢進症である、請求項１６に記載の診断キット。
18. 上記疾患が、アレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患からなる群から選択される、請求項１６又は１７に記載の診断キット。
19. 上記疾患が、間質性肺炎、成人性Ｓｔｉｌｌ病、慢性閉塞性肺疾患、代謝性骨疾患、多発性硬化症、糖尿病、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息、並びに肝臓、腎臓及び腸管での重篤な臓器障害からなる群から選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の診断キット。
20. 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体、請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片又は請求項９に記載の修飾抗体を有効成分として含有する、ヒトＩＬ−１８活性阻害剤。
21. 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体、請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片又は請求項９に記載の修飾抗体を有効成分として含有し、ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８レセプターとの結合を阻害する、ヒトＩＬ−１８結合阻害剤。
22. 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体、請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片又は請求項９に記載の修飾抗体を有効成分として含有する、インターフェロン−γ産生抑制剤。
23. 請求項１０又は１１に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
24. 請求項２０に記載のヒトＩＬ−１８活性阻害剤、請求項２１に記載のヒトＩＬ−１８結合阻害剤、請求項２２に記載のインターフェロン―γ産生抑制剤、又は請求項２３に記載の遺伝子治療剤を含む、ＩＬ−１８関連疾患の治療剤。
25. 上記疾患が、ヒトＩＬ−１８亢進症である、請求項２４に記載の治療剤。
26. 上記疾患が、アレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患からなる群から選択される、請求項２４又は２５に記載の治療剤。
27. 上記疾患が、間質性肺炎、成人性Ｓｔｉｌｌ病、慢性閉塞性肺疾患、代謝性骨疾患、多発性硬化症、糖尿病、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息、並びに肝臓、腎臓及び腸管での重篤な臓器障害からなる群から選択される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の治療剤。
28. ヒトＩＬ−１８とヒトＩＬ−１８レセプターとの結合の阻害用である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の治療剤。
29. ヘルパーＴ１細胞からのインターフェロン―γ産生の阻害用である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の治療剤。
30. ヒトＩＬ−１８をリンカーを介してビーズ形状の支持体に結合させた後、ヒトＩＬ−１８のＩＬ−１８ＢＰ認識領域を露呈及び維持する条件下でファージディスプレイライブラリーと該支持体を反応させることを含む、請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の抗体又は請求項４、５、７、８のいずれか一項に記載の断片の作製方法。