JP5441885B2 - 新規化合物 - Google Patents
新規化合物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5441885B2 JP5441885B2 JP2010504204A JP2010504204A JP5441885B2 JP 5441885 B2 JP5441885 B2 JP 5441885B2 JP 2010504204 A JP2010504204 A JP 2010504204A JP 2010504204 A JP2010504204 A JP 2010504204A JP 5441885 B2 JP5441885 B2 JP 5441885B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- sequence
- gro
- pentaspecific
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hematology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Oncology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Neurology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
Description
本願は、2007年4月17日に出願された米国仮出願60/912229および2008年4月11日に出願された61/044132の優先権を主張するものであり、これらは出典明示よりそのまま本明細書の一部とされる。
本発明は、多重特異性を有する抗体に関する。特に、本発明の抗体はヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78と結合する(交差反応する)。本発明はまた、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78の1以上のレベルの上昇または不均衡を特徴とする疾病または障害、特に、COPD、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ARDS、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびCOPDの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および/または子宮内膜症を、前記抗体で処置する方法に関する。
LATELRSQSLQTLQG 配列番号49
SAKELRSQSIKTYSK 配列番号50
LRELRSVSLQTTQG 配列番号51
SPGPHSAQTEVIAT 配列番号52
ESGPHSANTEIIVK 配列番号53
a.マウスにフロイントの完全アジュバント(cFA)中、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78の混合物を注射する工程;
b.該マウスに、フロイントの不完全アジュバント(iFA)中、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78の混合物を注射する工程;および
c.該マウスに、フロイントの不完全アジュバント中、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78と、5つの多重抗原ペプチド(MAP)(各MAP単位は配列番号49〜53のポリペプチドに由来する1つの独立した配列を有する)のセットとの混合物を注射する工程;
d.該マウスからB細胞を単離する工程;
e.該B細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望の五重特異性抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成させる工程;および
f.該ハイブリドーマの培養上清から該五重特異性抗体を単離する工程
を含む方法により作出される。
a.マウスにフロイントの完全アジュバント中、5つの多重抗原ペプチド(MAP)(各MAP単位は配列番号49〜53のポリペプチドに由来する1つの独立した配列を有する)のセット(以下、MAPセットとも呼ぶ)を注射する工程;
b.該マウスに、フロイントの不完全アジュバント中、MAPセットを注射する工程;
c.該マウスに、フロイントの不完全アジュバント中、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78の全てとMAPセットとの混合物を注射する工程;
d.該マウスからB細胞を単離する工程;
e.該B細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望の五重特異性抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成させる工程;および
f.該ハイブリドーマの培養上清から該五重特異性抗体を単離する工程
を含む方法により作出される。
(i)前記の単一の宿主細胞を、配列番号46のポリペプチドを含む重鎖をコードする第一のDNA配列と、配列番号48、60、62または64のポリペプチドを含む軽鎖をコードする第二のDNA配列とで形質転換する工程;および
(ii)前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のDNA配列と前記第二のDNA配列を発現させる工程
を含む方法に関し、さらにこの方法は、前記の第一のDNA配列と第二のDNA配列が異なるベクターに存在するか、または前記の第一のDNA配列と第二のDNA配列が単一のベクターに存在するようにして行うことができる。
(i)前記の単一の宿主細胞を、配列番号13、14および15のCDRドメインを含む免疫グロブリン重鎖の可変ドメインを少なくともコードする第一のDNA配列と、配列番号16、17および18のCDRドメインを含む免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインを少なくともコードする第二のDNA配列とで形質転換する工程;および
(ii)前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のDNA配列と前記第二のDNA配列を発現させる工程
を含む方法に関し、さらにこの方法は、前記の第一のDNA配列と第二のDNA配列が異なるベクターに存在するか、または前記の第一のDNA配列と第二のDNA配列が単一のベクターに存在するようにして行うことができる。
(i)前記の単一の宿主細胞を、配列番号19、20および21のCDRドメインを含む免疫グロブリン重鎖の可変ドメインを少なくともコードする第一のDNA配列と、配列番号22、23および24のCDRドメインを含む免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインを少なくともコードする第二のDNA配列とで形質転換する工程;および
(ii)前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のDNA配列と前記第二のDNA配列を発現させる工程
を含む方法に関し、この方法は、前記の第一のDNA配列と第二のDNA配列が異なるベクターに存在するか、または前記の第一のDNA配列と第二のDNA配列が単一のベクターに存在するようにして行うことができる。
完全抗体
完全抗体は、通常、少なくとも2つの重鎖と2つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。IgMの他、完全抗体は、2つの同一の軽(L)鎖と2つの同一の重(H)鎖からなる、およそ150Kdaのヘテロ四量体糖タンパク質である。一般に、各軽鎖は、1つの共有結合的ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖は鎖内ジスルフィド橋も有する。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン(VH)とそれに続くいくつかの定常領域を有する。各軽鎖は、そのもう一方の末端に可変ドメイン(VL)と定常領域を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の第一の定常領域とアラインされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインされる。ほとんどの脊椎動物に由来する抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づきκおよびλと呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り付けることができる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ヒト抗体は、5つの異なるクラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに割り付けることができる。IgGおよびIgAは、サブクラス、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4と、IgA1およびIgA2にさらに細分することができる。少なくともIgG2a、IgG2bを有するマウスおよびラットでは変種は存在する。抗体の可変ドメインは、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる特定の多様性を示すある領域を有する抗体に結合特異性を付与する。可変領域のうち、より保存性の高い部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。完全重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ3つのCDRによって接続された4つのFRを含む。各鎖のCDRは、これらのFR領域によって近接して保持され、他の鎖に由来するCDRは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)、Fcγ受容体との結合を介した食作用、新生児Fc受容体(FcRn)を介した半減期/クリアランス速度および補体カスケードのC1q成分を介した補体依存性細胞傷害性における関与などの種々のエフェクター機能を発揮する。ヒトIgG2定常領域には、従来経路により補体を活性化する能力または抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力が無い。IgG4定常領域には従来経路により補体を活性化する能力が無く、抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力は微弱でしかない。これらのエフェクター機能は「非溶解型」抗体と呼ぶことができる。
ヒト抗体は、当業者に公知のいくつかの方法によって作製することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統を用い、ハイブリドーマ法によって作製することができる(Kozbor J.Immunol 133, 3001, (1984)およびBrodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)参照)。別法としてはファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用が含まれ、双方ともヒトV領域レパートリーを用いる(Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.Immunol.methods 231, 11-23参照)。
ヒト疾病または障害の処置における完全非ヒト抗体の使用には、特に抗体を繰り返し投与した際の潜在的免疫原性(すなわち、患者の免疫系が非ヒト完全抗体を非自己と認識し、中和応答を惹起する)という今や十分認識された問題を伴う。完全ヒト抗体の開発(上記参照)の他、これらの問題を克服するための様々な技術が長年にわたって開発されており、一般に、例えばマウス、ラットまたはウサギなどの免疫動物から非ヒト抗体を得る際の比較的容易さを保ちながら、完全な治療用抗体における非ヒトアミノ酸配列の組成を減らすことを含む。広義には、これを達成するために2つのアプローチが用いられてきた。第一には、キメラ抗体であり、これは一般にヒト定常領域に融合された非ヒト(例えば、マウスなどの齧歯類)可変ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は可変領域内にあるので、キメラ抗体は抗原に対するその結合親和性を保持しているが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得し、従って、前記のものなどのエフェクター機能を遂行することができる。キメラ抗体は一般に組換えDNA法を用いて作製される。抗体をコードするDNA(例えば、cDNA)を常法を用いて単離および配列配列決定する(例えば、本発明の抗体のH鎖およびL鎖可変領域をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる)。ハイブリドーマ細胞はこのようなDNAの典型的な供給源として役立つ。ひと度単離されれば、DNAは発現ベクターに入れ、次にこれを、そうでなければ、その抗体の合成を得るための免疫グロブリンタンパク質を産生することができない、大腸菌(E.Coli)、COS細胞、CHO細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞へトランスフェクトされる。DNAは、対応する非ヒト(例えば、ネズミ)HおよびL定常領域をヒトLおよびH鎖のコード配列で置換することにより改変してもよい(例えば、Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)参照)。よって、本発明の別の実施形態は、配列番号2、6または10の配列を有するVHドメインと配列番号4、8または12の配列を有するVLドメインをヒト定常領域(IgGイソ型、例えばIgG1のものであり得る)と融合させて含むキメラ抗体を提供する。
本発明の特定の実施形態では、抗原結合フラグメントである治療用抗体が提供される。このようなフラグメントは、完全抗体および/またはヒト化抗体および/またはキメラ抗体の機能的抗原結合フラグメント、例えば、前記の抗体のFab、Fd、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFvフラグメントであり得る。定常領域を欠くフラグメントは、従来経路により補体を活性化する能力または抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力を欠いている。従来、このようなフラグメントは、例えばパパイン消化(例えば、WO94/29348参照)によるなど、完全抗体のタンパク質加水分解消化により作製されるが、組換え的に形質転換された宿主細胞から直接生産することもできる。ScFvの作製に関しては、Bird et al ;(1988) Science, 242, 423-426を参照。さらに、抗体フラグメントは、下記のように種々の工学技術を用いて作製することもできる。
ヘテロコンジュゲート抗体は誘導体であり、これも本発明の一実施形態をなす。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便宜な架橋法を用いて形成された、共有結合的に連結された2つの抗体からなる。米国特許第4,676,980号参照。
本発明の抗体は、それらの定常領域に他のいずれの改変を組み込んでもよい。例えば、それらの定常領域の保存された位置における抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に、上記のものなどのエフェクター機能に対して著しい影響を及ぼすことが知られている(例えば、Boyd et al (1996), Mol.Immunol. 32, 1311-1318参照)。本発明の治療用抗体の変異体(1以上の炭水化物部分が付加、置換、欠失または修飾されている)のグリコシル化が意図される。アスパラギン−X−セリンまたはアスパラギン−X−トレオニンモチーフの導入は、炭水化物部分の酵素的付加のための潜在的部位を作り出し、従って、抗体のグリコシル化を操作するために使用することができる。Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876では、TNFR−IgGイムノアドヘシンの末端シアル化(sialyation)は、β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ(beta-1,4-galactosyltransferace)および/またはα−2,3−シアリルトランスフェラーゼを用いた再ガラクトシル化および/または再シアリル化のプロセスを介して高められた。末端シアリル化が高まると、免疫グロブリンの半減期が長くなると考えられている。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と共通して、一般に、本来グリコフォームの混合物として産生される。この混合物は特に、抗体が真核細胞、特に、哺乳類細胞で産生される場合に明らかである。定義されたグリコフォームを製造するために様々な方法が開発されている(Zhang et al Science (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem.Res 34, 727参照)。よって、本発明は、該抗体の所定数(例えば7以下、例えば5以下、例えば2または1)のグリコフォームを含む、本明細書に記載の複数の治療用抗体(IgGイソ型、例えばIgG1のものであり得る)に関する。
本発明の抗体は、ヤギ(Pollock et al (1999), J.Immunol.Methods 231:147-157参照)、ニワトリ(Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55参照)、マウス(Pollock et al前掲参照)または植物(Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590参照)などのトランスジェニック生物で生産することができる。また、抗体は化学合成によっても生産することができる。しかしながら、本発明の抗体は一般に、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて生産される。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞でのさらなるクローニング(増幅)または発現のための、プラスミドなどの複製可能なベクターに挿入する。有用な発現系の1つにグルタミン酸シンセターゼ系(Lonza Biologicsが販売しているものなど)があり、特に、この場合、宿主細胞はCHOまたはNS0である(下記参照)。抗体をコードするポリヌクレオチドは容易に単離され、常法(例えば、オリゴヌクレオチドプローブ)を用いて配列決定される。使用可能なベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾンが含まれ、プラスミドのミニ染色体は典型的な実施形態である。一般に、このようなベクターは、発現を助けるために軽鎖および/または重鎖ポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたシグナル配列、複製起点、1以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列をさらに含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドを別個のベクターに挿入し、同じ宿主細胞に同時にまたは逐次に導入してもよいし(例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは形質導入による)、あるいは所望により、このような導入の前に重鎖および軽鎖の双方を同じベクターに挿入することもできる。
本発明の抗体は、成熟タンパク質のN末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として生産してもよい。このシグナル配列は宿主細胞によって認識および処理されるはずである。原核宿主細胞では、シグナル配列はアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性内毒素IIリーダーであり得る。酵母分泌に関しては、シグナル配列は酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸性ホスファターゼリーダーであり得る(例えば、WO90/13646参照)。哺乳類細胞系では、単純ヘルペスgDシグナルおよび天然免疫グロブリンシグナル配列(ヒトIg重鎖など)などのウイルス分泌リーダーが利用可能である。一般に、シグナル配列は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとリーディングフレーム内で連結される。
複製起点は当技術分野で周知のものであり、グラム陰性菌にはpBR322が、ほとんどの酵母には2μプラスミドが、また、ほとんどの哺乳類細胞にはSV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPVなどの種々のウイルス起点が好適である。一般に、複製起点成分は、大腸菌でベクターの増殖が必要とされない限り、組込型哺乳類発現ベクターには必要でない。しかしながら、SV40 oriは、初期プロモーターを含むので使用可能である。
典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質またはその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、または(b)栄養要求性欠陥を補足する、もしくは複合培地で利用できない栄養素を供給するか、または(c)双方を組み合わせたタンパク質をコードする。選択スキームは、ベクターを含まないまたは含む宿主細胞の増殖を停止させることを含み得る。本発明の治療用抗体をコードする遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、例えば、同時に運ばれた選択マーカーによって付与された薬剤耐性のために生存する。一例として、DHFR陰性宿主株で形質転換体が生成されるDHFR選択系がある(例えば、Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68参照)。この系では、本発明の抗体ポリヌクレオチド配列と同時にDHFR遺伝子が運ばれ、その後、ヌクレオシドを抜き取ることではDHFR陽性細胞が選択される。必要であれば、DHFR遺伝子の増幅を伴う形質転換体を選択するために、DHFR阻害剤メトトレキサートも用いられる。本発明の抗体コード配列またはその機能的誘導体にDHFR遺伝子を作動可能なように連結することにより、DHFR遺伝子の増幅は所望の目的抗体配列の同時増幅をもたらす。CHO細胞は、このDHFR/メトトレキサート選択に特に有用な細胞系統であり、このDHFR系を用いて宿主細胞を増幅および選択する方法は当技術分野で十分確立されている(Kaufman R.J. et al J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621参照、総説としては、Werner RG, Noe W, Kopp K,Schluter M,“Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”, Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug参照)。さらなる例として、グルタミン酸シンセターゼ発現系(Lonza Biologics)がある。酵母での使用に好適な選択遺伝子はtrp1遺伝子である(Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979参照)。
本発明の抗体を発現させるのに好適なプロモーターを、抗体をコードするDNA/ポリヌクレオチドに作動可能なように連結させる。原核生物宿主のプロモーターとしては、phoAプロモーター、Β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター(Tacなど)が挙げられる。酵母細胞での発現に好適なプロモーターとしては、とりわけ、3−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはその他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセル酸ムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。誘導酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース/ガラクトース利用を担う酵素が挙げられる。
適宜であれば、例えば、高等真核生物(eukaroytics)で発現させる場合、上記のプロモーターにあることが分かっているものの代わりに、またはその上に、付加的なエンハンサーエレメントを含めることができる。好適な哺乳類エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトタンパク質、メタロチオニンおよびインスリン由来のエンハンサーエレメントが挙げられる。あるいは、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはネズミIgG2a遺伝子座(WO04/009823参照)などの真核(eukaroytic)細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメントを用いてもよい。このようなエンハンサーは一般にベクターの、プロモーターより上流の部位に位置するが、例えば、非翻訳領域内またはポリアデニル化(polydenalytion)シグナルの下流など他の場所に配置することもできる。エンハンサーの選択および配置は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
真核生物系では、ポリアデニル化シグナルを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに作動可能なように連結させる。このようなシグナルは一般に、オープンリーディングフレームの3’に置かれる。哺乳類系では、シグナルの限定されない例として、成長ホルモン、延長因子−1αおよびウイルス(例えば、SV40)遺伝子またはレトロウイルスの長い末端反復配列に由来するものが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化(polydenalytion)/ターミネーションシグナルの限定されない例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)およびアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH)遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは一般に必要でなく、その代わりに、もっと短い、もっと定義されたターミネーター配列を用いるのが通常である。ポリアデニル化/ターミネーション配列の選択は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
上記の他、収量を高めるために使用可能なその他の特徴として、クロマチンリモデリングエレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン改変が含まれる。転写物および/または生成物の収量を増すためなど、宿主細胞のコドンの偏りを順応させるために、本発明の抗体のコドン使用を改変することができる(例えば、Hoekema A et al Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24)。コドンの選択は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングまたは発現させるのに好適な宿主細胞は、例えば、原核細胞、酵母細胞または高等真核細胞である。好適な原核細胞としては、真正細菌、例えば、エシェリキカ属、例えば、大腸菌(E.Coli)(例えば、ATCC31,446;31,537;27,325)、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレビシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium))、セラチア属(例えば、レイ菌(Serratia marcescans))および赤痢菌属などの腸内細菌科、ならびにバチルス属、例えば、枯草菌(B.subtilis)およびB.リケニフォルミス(B. licheniformis)(DD266710参照)など、シュードモナス、例えば、緑膿菌(P.aeruginosa)および放線菌(Streptomyces)などが挙げられる。酵母宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)(例えば、ATCC16,045;12,424;24178;56,500)、ヤロウイア属(yarrowia)(EP402,226)、ピキア・パストリス(Pichia Pastoris)(EP183,070、Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照)、カンジダ(Candida)、トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(EP244,234)、ペニシリン、トリポクラジウム属(Tolypocladium)およびアスペルギルス属(Aspergillus)宿主、例えば、A.ニデュランス(A.nidulans)およびA.ニガー(A.niger)も意図される。
本発明の治療用抗体をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知のいずれの方法によって培養してもよい。宿主細胞はスピナーフラスコ、振盪フラスコ、回転瓶または中空繊維系で培養可能であるが、特に懸濁培養には攪拌タンクリアクターまたはバッグリアクター(例えば、Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA)が用いられ、大規模培養には好ましい。一般に、攪拌タンカーは、例えば、スパージャー、バッフルまたは低剪断性回転翼を用いた曝気に順応している。気泡カラムおよびエアーリフトリアクターでは、空気または酸素気泡を用いた直接曝気が使用可能である。宿主細胞を血清不含培養培地で培養する場合には、曝気プロセスの結果としての細胞損傷を防ぐ助けとするために、プルロニックF−68などの細胞保護剤を培地に供給するのが好ましい。宿主細胞の特徴によっては、足場依存性細胞系統のための増殖基板としてマイクロキャリアーを用いてもよいし、あるいはそれらの細胞を懸濁培養に順応させてもよい(これが一般的)。宿主細胞、特に、脊椎動物宿主細胞の培養には、回分法、流加法、反復回分法(Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109参照)、延長回分法または灌流培養法などの種々の操作様式が使用可能である。組換え的に形質転換された哺乳類宿主細胞は、ウシ胎児血清(FCS)を含む培地など、血清含有培地で培養可能であるが、このような宿主細胞は、Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163に開示されているものなどの合成血清不含培地、またはProCHO−CDMもしくはUltraCHO(商標)(Cambrex NJ, USA)などの市販の培地に、必要であれば、グルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンなどの合成増殖因子を加えたもので培養するのが好ましい。宿主細胞の血清不含培養では、それらの細胞が血清不含条件での増殖に順応している必要があり得る。1つの順応アプローチが、このような宿主細胞を血清含有培地で増殖させ、その培養培地の80%を血清不含培地に繰り返し交換し、それにより、宿主細胞が血清不含条件への順応を学ぶというものである(例えば、Scharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers参照)。
前記のような本発明の抗体の精製調製物は、上記で概説したものなどのヒト疾病および障害の処置に用いるための医薬組成物へと配合することができる。一般にこのような組成物はさらに、既知のような、また、許容される薬務により要求されるような薬学上許容される(すなわち不活性の)担体を含む(例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed, (1980), Mack Publishing Co.参照)。このような担体の例としては、好適なバッファーで5〜8の範囲のpHに緩衝させた生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液などの無菌担体が挙げられる。注射(例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内または門脈内による)または点滴用の医薬組成物は好適には目に見える粒状物質を含まず、0.1mg〜10gの治療用抗体、一般には5mg〜25mgの間の抗体を含み得る。このような医薬組成物の調製方法は当業者によく知られている。一実施形態では、医薬組成物は、単位投与形中に、0.1mg〜10gの本発明の治療用抗体を、所望により使用説明書とともに含む。本発明の医薬組成物は、周知の、当業者に自明の方法に従い、投与前に再構成するために、凍結乾燥させてもよい。本発明の実施形態は本発明の抗体をIgG1イソ型とともに含むが、このイソ型の抗体の銅媒介性の分解の程度を低減するために、該医薬組成物にクエン酸(例えば、クエン酸ナトリウム)またはEDTAまたはヒスチジンなどの銅キレート剤を加えてもよい(EP0612251参照)。
本発明は、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78と結合する抗体に関する。本発明はまた、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78の1以上のレベルの上昇または不均衡を特徴とする疾病または障害、特に、COPD、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ARDS、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびCOPDの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および/または子宮内膜症を該抗体、該抗体を含む医薬組成物で処置する方法、ならびに製造方法に関する。
実施例1. マウスモノクローナル抗体656.35、197.2および81.1の作製
標的ケモカイン(ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78)に対する五重特異性mAbの作製
上記のタイムラインに従い、2つの異なる免疫プロトコールにより汎特異的mAbを生産した。
1.初期免疫(0日目)は、cFA中に混合した全標的ケモカイン(各10μg)の複数回の皮下注射(後躯、背部および頚部)からなる。その後の4回の追加免疫は、iFA中に混合した全標的ケモカイン(各10μg)の混合物からなった。5回目およびその後の全追加免疫は、iFA中、全標的ケモカインと5種類全ての直鎖MAP(各10μg)のカクテルからなった。屠殺および融合3日前の最後の追加免疫は、PBS中、全標的ケモカインと直鎖MAPからなり、腹腔内(IP)注射によって送達した。
要するに、各抗原(ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γ、GCP−2およびENA−78ならびに陰性対照として用いる場合のhIL−18)を個々に96ウェル免疫蛍光プレートにコーティングする。次に、これらのプレートを洗浄し、市販のブロッキング溶液でブロッキングした。ブロッキング溶液を取り出し、mAbを含有するサンプルを各ウェルに加え、40〜60分間インキュベートした(これによりmAbを標的ケモカインと結合させる)。その後、これらのプレートを再び洗浄し、各ウェルに検出Abを加える。検出試薬は、2X656.35、キメラ(HcLc)およびヒト化MAbのそれぞれに関して次の通りであった:ビオチン化抗マウスIgG、ビオチン化抗ヒトIgG Fab2試薬およびユウロピウム抗ヒトIgG。検出抗体はユウロピウムまたはビオチンのいずれかにコンジュゲートさせる。結合していない検出Abを除去するためにもう一度洗浄を行った後、ビオチン検出アッセイにストレプトアビジン−ユウロピウムの溶液を加えた。ストレプトアビジン−ユウロピウムはビオチンと結合し、検出が可能となる。結合していないストレプトアビジン−ユウロピウムを除去するために最終の洗浄を行った後、またはヒト化MAbアッセイの場合には、ユウロピウム二次コンジュゲートを洗浄した後に、各ウェルにキレート洗剤溶液を満たし、ユウロピウムを活性化させて蛍光を生じさせる。記録される蛍光が大きいほど、ウェル中に存在する、直接連結されている検出Abの量と直接比例し、mAbと結合しているケモカインの量に比例する。
図5Bは、ヒト標的ケモカインと結合するキメラ抗体(HcLc)mAbを示す。
図5Cは、ヒト標的ケモカインと結合するヒト化mAbを示す。
hCXCR2およびGα16でトランスフェクトされ、それらを安定発現するCHO−K1細胞において、ELR+ケモカインにより誘導される[Ca2+]i動員に対する抗体の中和作用の機能的同定のため、マイクロタイタープレートに基づくカルシウム動員アッセイ、FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale CA, [Schroeder,1996])を用いた。
Biacore分析の方法
KLと呼ばれる実験に関しては、ウサギ抗マウスIgG−Fc(Biacore BR−1005−14)を、製造者の説明書に従い、第一級アミンカップリングによってCM5チップに固定する。
エピトープマッピング
656.35 mAbはエピトープマッピングされ、ヒトIL−8のKELRCQCIKTYSKP(配列番号54)と結合することが判明した。よって、別の実施形態では、本発明は、ヒトIL−8の配列番号54のエピトープ内で結合する五重特異性抗体に関する。
吸入LPS急性肺炎症モデルを用い、好中球の、非ヒト霊長類(NHP−カニクイザル)の肺への浸潤を阻害する五重特異性抗体の能力を調べた。要するに、NHP(非ヒト霊長類)を健康と外的に加えたカニクイザルIL−8(cynoIL−8)に対する応答性に関してプレスクリーニングした。次に、選択されたNHPに対して、最初のLPS投与の5日前にベースラインサンプル採取(血液および気管支肺胞洗浄−BAL)を行った。LPS投与は、ケタミンHCl(〜10mg/kg)1回のIM注射でNHPを鎮静させることからなった。NHPが鎮静したところで、プロポホールの静注(必要に応じて〜0.2mg/kg/分)により麻酔を施す。麻酔動物を循環温水加熱ブランケット上に置くか、かつ/または循環温風ブランケット内に入れ、各眼に眼用潤滑剤を投与する。その後、これらの動物に挿管し、抗原投与処置のために人工呼吸させる。処置の間、容量調節陽圧呼吸を用いる(Stoelting Cat/Rabbit ventilator www.stoeltingco.comカタログ番号5019510)。リポ多糖類(LPS)投与は、DeVilbiss Ultraneb−99超音波ネブライザーを用いたエアゾール吸入により行う。エアゾール化LPSを100μg/mlで5分間投与する。抗原投与処置の間、心拍数、体温および呼吸数をモニタリングし、記録する。初期抗原投与では、NHPがLPSに応答することを確認する(好中球の肺への浸潤の増加およびcynoIL−8レベルの上昇)。個々のNHP応答は、抗原投与6時間後と24時間後のサンプル採取によって確認した。
ヒト化mAbに対するさらなる研究
複数のヒト化五重特異性抗体構築物を作製したところ、そのうち4つは全標的ケモカインと強固に結合し、それらを阻害することが示された(各配列に関しては、下記の配列情報を参照)。この分析は親和性測定(BiaCore)、カルシウム動員アッセイ(in vitro機能アッセイ、FLIPR)およびCD11bヒトおよびNHP好中球刺激アッセイ(ex vivo機能アッセイ、フローサイトメトリー)からなった。
Aタンパク質捕捉法を用い、下記のようにヒト化およびキメラ構築物の動態を作製した:Aタンパク質を、製造者の説明書に従い、第一級アミンカップリングによってCM5チップに固定する。精製ヒト化またはキメラ抗体をAタンパク質表面に捕捉する。捕捉後、所定の濃度の各アナライト(IL8、Gro−βおよびENA−78)を抗体捕捉表面に流し、各アナライトの注入ごとに別個の捕捉事象を用いる。各アナライト注入後に、弱酸性溶液を注入することにより(これにより捕捉された抗体は除去されるが、Aタンパク質の、別の捕捉事象を行う能力には有意な影響は無い)表面を再生する。また、抗体捕捉表面にバッファーの注入を行い、これを二重参照に用いる。このデータを、1:1結合モデルを用い、機械に内蔵された分析ソフトウエアを用いて分析する。
hCXCR2およびGα16でトランスフェクトされ、それらを安定発現するCHO−K1細胞において、ELR+ケモカインにより誘導される[Ca2+]i動員に対する抗体の中和作用の機能的同定のため、マイクロタイタープレートに基づくカルシウム動員アッセイ、FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale CA, [Schroeder,1996])を用いた。
フローサイトメトリーを用い、物理的細胞変化(大きさおよび形状−顆粒化)を追跡することにより、また、表面活性化マーカーを調べることにより(CD11b表面発現の増加)、ケモカインにより誘導されたヒト精製好中球活性化を妨げるヒト化五重特異性抗体の能力を調べた。好中球制御刺激剤fMLPを用い、精製ヒト好中球の活性化能を確認した(図4参照)。
656.35、197.2および81.1ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出した後、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により重鎖および軽鎖可変ドメインcDNA配列を作製した。RT−PCRのフォワードプライマーは、ネズミ免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、リバースプライマーは、抗体定常領域、この場合にはIgG2a/κであった。プライマーは、Jones and Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991)により記載されている戦略に従って設計した。RT−PCRは、その後に正しいV領域配列の確認ができるように両V領域配列について2回行った。RT−PCRにより作出されたV領域鎖産物をクローニングし(Invitrogen TA Cloning Kit)、配列データを得た。このプロセスは81.1軽鎖可変ドメインでは上手くいかなかった。従って、下記に示すアミノ酸配列(配列番号12)は、還元条件下で泳動させたSDS−ポリアクリルアミドゲル上で単離した軽鎖のタンパク質配列決定を行うことにより作製した。
656.35の重鎖および軽鎖可変領域(それぞれ配列番号1および3)のポリヌクレオチド配列
配列番号1
CAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGACGATATCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAACTACTGGATAGTTTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGGAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCACCTCATTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCACTGGGGCCAAGGGTCTCTGGTCACTGTCTCTGCA
配列番号3
GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGTCTGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGTCAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGCTGGTATCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATTACGCTACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTCAAGATTATTCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
配列番号2
QVQLQQSGAELVRPGTSVTISCKASGYTFTNYWIVWVKQRPGHGLEWIGDLYSGGGYTFYSENFKGKATLTADTSSSTAYMHLISLTSEDSAVYFCARSGYDRTWFAHWGQGSLVTVSA
配列番号4
DIKMTQSPSSMSASLGERVTITCQASQDIESYLSWYQQKPWKSPKTLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPPTFGAGTKLELKR
配列番号13
NYWIV
配列番号14
DLYSGGGYTFYSENFKG
配列番号15
SGYDRTWFAH
配列番号16
QASQDIESYLS
配列番号17
YATRLAD
配列番号18
LQHGESPPT
配列番号31
AACTACTGGATAGTT
配列番号32
GATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGG
配列番号33
TCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCAC
配列番号34
CAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGC
配列番号35
TACGCTACAAGGTTGGCAGAT
配列番号36
CTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACG
配列番号5
GAGTTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTAATTAATCCTAAGTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACCAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATCACTGTGCAAGAGGAATGGGACTCCTCTTTGGTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA
配列番号7
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCARAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTTTCCGTGCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
配列番号6
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGVINPKYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYHCARGMGLLFGMDYWGQGTSVTVSS
配列番号8
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSFPCTFGGGTKLEIKR
配列番号19
DYNMN
配列番号20
VINPKYGTTSYNQKFKG
配列番号21
GMGLLFGMDY
配列番号22
KSSQSLLNSGNQKNYLA
配列番号23
GASTRKS
配列番号24
QNDHSFPCT
配列番号37
GACTACAACATGAAC
配列番号38
GTAATTAATCCTAAGTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGC
配列番号39
GGAATGGGACTCCTCTTTGGTATGGACTAC
配列番号40
AAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCC
配列番号41
GGGGCATCCACTAGGAAATCT
配列番号42
CAGAATGATCATAGTTTTCCGTGCACG
配列番号9
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCTTTCACTGTCTACGGCATGAACTGGGTGAGACAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAATGGATTGGAAATTTTGATCCTTACTTTAGTGTCACTTCCTACAACCAGAAGTTCCAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAAGAACCTCACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGAGCTGGGAAACCATTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
配列番号10
EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTVYGMNWVRQSNGKSLEWIGNFDPYFSVTSYNQKFQDKATLTVDKSSSTAYMQLKNLTSEDSAVYFCARGSWETIFAYWGQGTLVTVSA
配列番号25
VYGMN
配列番号26
NFDPYFSVTSYNQKFQD
配列番号27
GSWETIFAY
配列番号43
GTCTACGGCATGAAC
配列番号44
AATTTTGATCCTTACTTTAGTGTCACTTCCTACAACCAGAAGTTCCAGGAC
配列番号45
GGGAGCTGGGAAACCATTTTTGCTTAC
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHVFGGGTKLTVLQPK
配列番号28
RSSTGAVTTSNYAN
配列番号29
GTNNRAP
配列番号30
ALWYSNHV
CAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGACGATATCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAACTACTGGATAGTTTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGGAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCACCTCATTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCACTGGGGCCAAGGGTCACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
QVQLQQSGAELVRPGTSVTISCKASGYTFTNYWIVWVKQRPGHGLEWIGDLYSGGGYTFYSENFKGKATLTADTSSSTAYMHLISLTSEDSAVYFCARSGYDRTWFAHWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGTCTGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGTCAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGCTGGTATCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATTACGCTACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTCAAGATTATTCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
DIKMTQSPSSMSASLGERVTITCQASQDIESYLSWYQQKPWKSPKTLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPPTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
成熟重鎖のH0 DNA配列 配列番号11
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATCGTGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGACCTGTATAGCGGCGGCGGCTACACCTTCTACAGCGAGAACTTCAAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCGGCTACGACAGGACTTGGTTTGCTCACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIVWVRQAPGQGLEWMGDLYSGGGYTFYSENFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYDRTWFAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCaagCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGACAGACTTCACCttcACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATatcGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCaagCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGcagGACtacACCCTGACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGCCACCCTGTCACTGTCTCCCGGCGAAAGGGCAACCCTGAGCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCGAGAGCTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACTACGCCACCAGGCTGGCCGACGGCATTCCCGCCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACTCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCTGCAGCACGGCGAGAGCCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGT
GTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCQASQDIESYLSWYQQKPGQAPRLLIYYATRLADGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Claims (27)
- a.マウスにフロイント完全アジュバント(cFA)中、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78の混合物を注射する工程;
b.該マウスに、フロイント不完全アジュバント(iFA)中、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78の混合物を注射する工程;および
c.該マウスに、フロイント不完全アジュバント中、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78と、5つの多重抗原ペプチド(MAP)(各MAP単位は配列番号49〜53のポリペプチドから選択される1種の独立した配列を有する)のセットとの混合物を注射する工程;
d.該マウスからB細胞を単離する工程;
e.該B細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望の五重特異性抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成させる工程;および
f.該ハイブリドーマの培養上清から該五重特異性抗体を単離する工程
を含む、五重特異性抗体の作製方法。 - a.マウスにフロイント完全アジュバント中、5つの多重抗原ペプチド(MAP)(各MAP単位は配列番号49〜53のポリペプチドから選択される1種の独立した配列を有する)のセット(MAPセット)を注射する工程;
b.該マウスに、フロイント不完全アジュバント中、MAPセットを注射する工程;
c.該マウスに、フロイント不完全アジュバント中、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78の全てとMAPセットとの混合物を注射する工程;
d.該マウスからB細胞を単離する工程;
e.該B細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望の五重特異性抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成させる工程;および
f.該ハイブリドーマの培養上清から該五重特異性抗体を単離する工程
を含む、五重特異性抗体の作製方法。 - 請求項1または2の方法により作製された抗体。
- 配列番号13、14、15、16、17および18のCDR配列を含む五重特異性抗体を産生するハイブリドーマまたはトランスフェクトーマ。
- 配列番号13、14、15、16、17および18のCDR配列を含む五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核細胞。
- それぞれ配列番号13、14および15と、配列番号16、17および18のCDRアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γおよびENA−78に対して多重特異性を有する五重特異性抗体。
- COPD、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ARDS、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびCOPDの増悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および/または子宮内膜症を治療または予防するための医薬を製造するための請求項6に記載の五重特異性抗体の使用。
- それぞれ配列番号13、14および15、または配列番号16、17および18のCDR配列を含む五重特異性抗体の可変重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 配列番号34、35および36のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 配列番号31、32、33、34、35および36の群から選択される少なくとも4つのポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 単一の宿主細胞において五重特異性抗体(免疫グロブリン)を生産する方法であって、 (i)前記の単一の宿主細胞を、配列番号13、14および15のCDRドメインを含む該免疫グロブリン重鎖の可変ドメインを少なくともコードする第一のDNA配列と、配列番号16、17および18のCDRドメインを含む該免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインを少なくともコードする第二のDNA配列とで形質転換する工程;および
(ii)前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のDNA配列と前記第二のDNA配列を発現させる工程
を含む、方法。 - 該第一および第二のDNA配列が異なるベクター中に存在するか、または該第一および第二のDNA配列が単一のベクター中に存在する、請求項11記載の方法。
- 好中球の走化性を低下させるための医薬を製造するための請求項6に記載の五重特異性抗体の使用。
- それぞれ配列番号46と、配列番号48、60、62または64のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞。
- それぞれ配列番号46と、配列番号48、60、62または64のアミノ酸配列と、少なくとも90%、95%、98%または99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞。
- それぞれ配列番号11と、配列番号47、59、61または63の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- それぞれ配列番号11と、配列番号47、59、61または63の配列と、少なくとも90%、95%、98%または99%同一の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 配列番号11、47、59、61または63の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- それぞれ配列番号11,47、59、61または63の配列と少なくとも90%、95%、98%または99%同一の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- それぞれ配列番号46と、配列番号48、60、62または64のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- それぞれ配列番号46と、配列番号48、60、62または64のアミノ酸配列と、少なくとも90%、95%、98%または99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 単一の宿主細胞において抗体(免疫グロブリン)を生産する方法であって、
(i)前記の単一の宿主細胞を、配列番号46のポリペプチドを含む重鎖をコードする第一のDNA配列と、配列番号48、60、62または64のポリペプチドを含む軽鎖をコードする第二のDNA配列とで形質転換する工程;および
(ii)前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のDNA配列と前記第二のDNA配列を発現させる工程
を含む、方法。 - 該第一および第二のDNA配列が異なるベクター中に存在するか、または該第一および第二のDNA配列が単一のベクター中に存在する、請求項22記載の方法。
- それぞれ配列番号46と配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項6記載の抗体。
- それぞれ配列番号46と配列番号62のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項6記載の抗体。
- それぞれ配列番号46と配列番号60のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項6記載の抗体。
- それぞれ配列番号46と配列番号64のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項6記載の抗体。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US91222907P | 2007-04-17 | 2007-04-17 | |
US60/912,229 | 2007-04-17 | ||
US4413208P | 2008-04-11 | 2008-04-11 | |
US61/044,132 | 2008-04-11 | ||
PCT/US2008/060424 WO2008130969A2 (en) | 2007-04-17 | 2008-04-16 | Novel compounds |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010524469A JP2010524469A (ja) | 2010-07-22 |
JP5441885B2 true JP5441885B2 (ja) | 2014-03-12 |
Family
ID=39872910
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010504204A Expired - Fee Related JP5441885B2 (ja) | 2007-04-17 | 2008-04-16 | 新規化合物 |
Country Status (30)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8496932B2 (ja) |
EP (1) | EP2146745B1 (ja) |
JP (1) | JP5441885B2 (ja) |
KR (1) | KR101560841B1 (ja) |
CN (1) | CN101687035B (ja) |
AU (1) | AU2008243049B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0810250A8 (ja) |
CA (1) | CA2684626C (ja) |
CL (1) | CL2008001071A1 (ja) |
CO (1) | CO6251323A2 (ja) |
CR (1) | CR11116A (ja) |
CY (1) | CY1116671T1 (ja) |
DK (1) | DK2146745T3 (ja) |
DO (1) | DOP2009000236A (ja) |
EA (1) | EA024621B1 (ja) |
ES (1) | ES2547475T3 (ja) |
HK (1) | HK1136970A1 (ja) |
HR (1) | HRP20150937T1 (ja) |
HU (1) | HUE027584T2 (ja) |
IL (1) | IL201440A (ja) |
MA (1) | MA31310B1 (ja) |
MX (1) | MX2009011153A (ja) |
MY (1) | MY150525A (ja) |
NZ (1) | NZ580239A (ja) |
PE (1) | PE20090302A1 (ja) |
PL (1) | PL2146745T3 (ja) |
PT (1) | PT2146745E (ja) |
SI (1) | SI2146745T1 (ja) |
TW (1) | TWI473815B (ja) |
WO (1) | WO2008130969A2 (ja) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11046784B2 (en) | 2006-03-31 | 2021-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
MX369784B (es) | 2007-09-26 | 2019-11-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr). |
DK2708559T3 (en) | 2008-04-11 | 2018-06-14 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules |
US8324352B2 (en) | 2009-12-07 | 2012-12-04 | Decimmune Therapeutics, Inc. | Anti-inflammatory antibodies and uses therefor |
EP2534256A4 (en) * | 2010-02-09 | 2013-07-24 | Glaxosmithkline Llc | NEW USES |
CN108715614A (zh) | 2010-11-30 | 2018-10-30 | 中外制药株式会社 | 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子 |
WO2013166099A1 (en) | 2012-05-01 | 2013-11-07 | Glaxosmithkline Llc | Novel antibodies |
CA2882272C (en) | 2012-08-24 | 2023-08-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc.gamma.riib-specific fc region variant |
EP3597747B1 (en) | 2012-08-24 | 2023-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Mouse fcgammarii-specific fc antibody |
EP2970445A4 (en) | 2013-03-12 | 2017-02-22 | Decimmune Therapeutics Inc. | Humanized anti-n2 antibodies |
TWI612059B (zh) * | 2013-03-15 | 2018-01-21 | 美國禮來大藥廠 | 泛-ELR<sup>+</sup>CXC趨化因子抗體 |
US9290570B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-03-22 | Eli Lilly And Company | Pan-ELR+ CXC Chemokine Antibodies |
AU2014250434B2 (en) | 2013-04-02 | 2019-08-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant |
EP2796875B8 (en) * | 2013-04-23 | 2020-11-25 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Inhibitors of proteins specific for the secretome of a chondrocyte for use in the treatment of breast cancer metastasis |
JP6416224B2 (ja) * | 2013-05-17 | 2018-10-31 | セントル ナショナル デ ラ ルシュルシュ サイエンティフィーク(シーエヌアールエス) | 抗cxcl1抗体、抗cxcl7抗体および抗cxcl8抗体ならびにそれらの用途 |
JP6227191B1 (ja) | 2014-12-19 | 2017-11-08 | 中外製薬株式会社 | 抗ミオスタチン抗体、変異Fc領域を含むポリペプチド、および使用方法 |
KR102605798B1 (ko) | 2015-02-05 | 2023-11-23 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용 |
JP7141336B2 (ja) | 2015-12-25 | 2022-09-22 | 中外製薬株式会社 | 抗ミオスタチン抗体および使用方法 |
JP6527643B2 (ja) | 2016-08-05 | 2019-06-05 | 中外製薬株式会社 | Il−8関連疾患の治療用又は予防用組成物 |
SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
WO2019036605A2 (en) * | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Massachusetts Institute Of Technology | MULTIPLE SPECIFICITY BINDING AGENTS OF CXC CHEMOKINES AND USES THEREOF |
EP4116327A1 (en) | 2017-10-11 | 2023-01-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Human pd-l1 antibodies and methods of use therefor |
SG11202009010RA (en) | 2018-03-15 | 2020-10-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use |
CN117586412A (zh) * | 2018-03-23 | 2024-02-23 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 针对人pd-l1和pd-l2的双重特异性抗体及其使用方法 |
CA3092695A1 (en) | 2018-03-23 | 2019-09-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Human pd-l2 antibodies and methods of use therefor |
WO2021113697A1 (en) * | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Seagen Inc. | Anti-avb6 antibodies and antibody-drug conjugates |
US20220080044A1 (en) * | 2020-09-14 | 2022-03-17 | National Yang-Ming University | Method for preventing or treating peripheral arterial occlusive disease |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IE913192A1 (en) * | 1990-09-12 | 1992-02-25 | Scripps Research Inst | Active site of interleukin-8: polypeptide analogs and¹antibodies |
US6448379B1 (en) * | 1993-09-14 | 2002-09-10 | Chiron Corporation | IL8 inhibitors |
EP0833911B1 (en) * | 1995-06-07 | 2004-05-12 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Cdr-grafted anti-tissue factor antibodies and methods of use thereof |
GB0020685D0 (en) * | 2000-08-22 | 2000-10-11 | Novartis Ag | Organic compounds |
AR030753A1 (es) * | 2000-09-25 | 2003-09-03 | Smithkline Beecham Corp | Uso de moduladores-proteina de il-8, groalfa, grobeta, grogamma, nap-2, y ena-78, para tratar infecciones viricas |
WO2002030986A2 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Biogen, Inc. | HUMANIZED ANTI-LT-β-R ANTIBODIES |
ATE453668T1 (de) * | 2001-04-26 | 2010-01-15 | Dako Denmark As | Pan-spezifischer monoklonaler antikörper der gegen glycosiliertes hämoglobin gerichtet ist |
US20040022726A1 (en) * | 2002-06-03 | 2004-02-05 | Goldenberg David M. | Methods and compositions for intravesical therapy of bladder cancer |
ATE527278T1 (de) * | 2002-12-16 | 2011-10-15 | Genmab As | Humane monoklonale antikörper gegen interleukin 8 (il-8) |
JPWO2004060919A1 (ja) * | 2002-12-26 | 2006-05-11 | 中外製薬株式会社 | ヘテロ受容体に対するアゴニスト抗体 |
EP1610818A4 (en) * | 2004-03-03 | 2007-09-19 | Millennium Pharm Inc | MODIFIED ANTIBODIES AGAINST A PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTIGEN AND USE THEREOF |
WO2006074399A2 (en) * | 2005-01-05 | 2006-07-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Multispecific binding molecules comprising connecting peptides |
KR20080031001A (ko) * | 2005-06-02 | 2008-04-07 | 아스트라제네카 아베 | Cd20에 대한 항체 및 그의 용도 |
BRPI0611984A2 (pt) * | 2005-06-17 | 2009-07-07 | Imclone Systems Inc | uso de anticorpos igf-ir para fabricação de um medicamento para tratar um tumor ósseo |
GB0519398D0 (en) * | 2005-09-23 | 2005-11-02 | Antisoma Plc | Biological materials and uses thereof |
US20070161089A1 (en) * | 2005-11-08 | 2007-07-12 | Genentech, Inc. | Method of Producing Pan-Specific Antibodies |
US8454960B2 (en) * | 2008-01-03 | 2013-06-04 | The Scripps Research Institute | Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains |
-
2008
- 2008-04-15 CL CL2008001071A patent/CL2008001071A1/es unknown
- 2008-04-16 US US12/596,262 patent/US8496932B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-04-16 BR BRPI0810250A patent/BRPI0810250A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-04-16 PE PE2008000664A patent/PE20090302A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-04-16 DK DK08745931.9T patent/DK2146745T3/en active
- 2008-04-16 WO PCT/US2008/060424 patent/WO2008130969A2/en active Application Filing
- 2008-04-16 US US12/103,761 patent/US20080262203A1/en not_active Abandoned
- 2008-04-16 ES ES08745931.9T patent/ES2547475T3/es active Active
- 2008-04-16 JP JP2010504204A patent/JP5441885B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-04-16 NZ NZ580239A patent/NZ580239A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-04-16 EP EP08745931.9A patent/EP2146745B1/en not_active Not-in-force
- 2008-04-16 KR KR1020097023814A patent/KR101560841B1/ko active IP Right Grant
- 2008-04-16 EA EA200970954A patent/EA024621B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-04-16 TW TW97113788A patent/TWI473815B/zh not_active IP Right Cessation
- 2008-04-16 PL PL08745931T patent/PL2146745T3/pl unknown
- 2008-04-16 PT PT87459319T patent/PT2146745E/pt unknown
- 2008-04-16 HU HUE08745931A patent/HUE027584T2/en unknown
- 2008-04-16 CN CN2008800205593A patent/CN101687035B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-04-16 MY MYPI20094336 patent/MY150525A/en unknown
- 2008-04-16 SI SI200831489T patent/SI2146745T1/sl unknown
- 2008-04-16 CA CA2684626A patent/CA2684626C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-04-16 MX MX2009011153A patent/MX2009011153A/es active IP Right Grant
- 2008-04-16 AU AU2008243049A patent/AU2008243049B2/en not_active Ceased
-
2009
- 2009-10-08 DO DO2009000236A patent/DOP2009000236A/es unknown
- 2009-10-11 IL IL201440A patent/IL201440A/en not_active IP Right Cessation
- 2009-10-15 MA MA32279A patent/MA31310B1/fr unknown
- 2009-10-19 CO CO09116578A patent/CO6251323A2/es active IP Right Grant
- 2009-11-17 CR CR11116A patent/CR11116A/es unknown
-
2010
- 2010-05-14 HK HK10104687.8A patent/HK1136970A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-06-26 US US13/927,352 patent/US8828384B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-09-01 CY CY20151100768T patent/CY1116671T1/el unknown
- 2015-09-07 HR HRP20150937TT patent/HRP20150937T1/hr unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5441885B2 (ja) | 新規化合物 | |
EP2177536B1 (en) | Antibodies against amyloid-beta peptide | |
US20110105724A1 (en) | Novel compounds | |
JP5850860B2 (ja) | Cd127結合タンパク質 | |
US20120315267A1 (en) | Novel uses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110415 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20120309 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130305 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130605 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130702 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131101 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20131111 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131126 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131217 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5441885 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |