TWI473815B

TWI473815B - 結合至人類IL-8、Gro-阿伐、Gro-貝他、Gro-伽馬以及ENA-78的抗體及其用途

Info

Publication number: TWI473815B
Application number: TW97113788A
Authority: TW
Inventors: Stephanie Jane Clegg; Eric Dobrzynski; Jonathan H Ellis; Volker Germaschewski; Alexis Paul Godillot; Zdenka Ludmila Jonak; Alan P Lewis; John R White
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 2007-04-17
Filing date: 2008-04-16
Publication date: 2015-02-21
Also published as: IL201440A; WO2008130969A3; TW200906855A; PE20090302A1; EP2146745A4; IL201440A0; WO2008130969A2; CA2684626A1; HK1136970A1; EP2146745A2; EA200970954A1; CR11116A; CA2684626C; CN101687035B; MY150525A; JP2010524469A; PT2146745E; ES2547475T3; BRPI0810250A2; US8828384B2

Description

結合至人類IL-8、Gro-阿伐、Gro-貝他、Gro-伽馬以及ENA-78的抗體及其用途

相關申請案的交互參照

本發明主張於2007年4月17日提出申請之美國臨時申請案60/912229的優先權，其以整體被併入作為參考文獻。

本發明有關於一種抗體，其具有多重專一性(multiple specificities)。特別地本發明之抗體結合(交叉反應)至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78。本發明亦涉及治療疾病或異常的方法，該疾病或異常的特徵在於人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78的一或多者之被升高或不平衡的位準，特別地COPD、骨關節炎(osteoarthritis)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、糜爛性關節炎(erosive arthritis)、氣喘(asthma)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、過敏性腸疾(inflammatory bowel disease)、牛皮癬(psoriasis)、移植排斥、痛風(gout)、癌(cancer)、急性肺臟損傷(acute lung injury)、急性肺病(acute lung disease)、敗血症(sepsis)、ARDS、周邊動脈疾病(peripheral artery disease)、全身性硬化(systemic sclerosis)、新生兒呼吸性窘迫症候群(neonatal respiratory distress syndrome)、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化(cystic fibrosis)、瀰漫性泛細支氣管炎(diffuse panbronchiolitis)、再灌注損傷(reperfusion injury)，和/或子宮內膜異位(endometriosis))的方法。

已公開的資料以及報導指出：CXCL趨化激素的ELRCXC次家族(ELRCXC subfamily of CXCL chemokines)的成員在一些疾病中是被升高的。有一總數為16個的CXCL家族成員。趨化激素被報導在一些發炎性疾病(包括COPD)中被上升－調節(up－regulated)，其中CXCL1－3、5，以及8亦分別地被知曉為Gro－－α、Gro－β、Gro－γ(Haskill,S.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,1990：87,7732－7736)、ENA－78(Wang,D.and Richmond,A.,Cytokine Reference.Oppenheim,J.J.and Feldman,M.ed.,Academic Press,London,1023－1027,Powerm C.A.et al.Gene.,1994：151,333－334)，以及IL－8(Iizasa,H.and Matsushima,K.,Cytokine Reference.Oppenheim,J.J.and Feldman,M.ed.,Academic Press,London,1061－1067,Matsushima,K.et al.,J.Exp.Med.1988：167,1883－1893)(Am.J.Respir.Crit Care Med.,163：349－355,2001,Am.J.Respir.Crit Care Med.,168：968－975,2003,Thorax,57：590－595,2002)。被假設這些趨化激素被延長並且被升高的表現可能涉及疾病的發展，諸如COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，或子宮內膜異位。這些CXC趨化激素被知曉透過吸引與活化CXCR1和/或CXCR2受體來刺激嗜中性球趨化性。因此抑制這些趨化激素可以防止發炎性細胞浸潤肺臟組織並因而防止組織損傷。本發明是有關透過使用一種具有結合至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78之能力的抗體(亦即一種五－專一性抗體)來抑制CXCR1以及CXCR2受體的活化。

本發明有關於一種抗體(免疫球蛋白)，其具有被包含在一個免疫球蛋白中的多重專一性。特別地本發明之抗體結合(交叉反應)至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78。本發明亦涉及以該抗體來治療疾病或異常，該疾病或異常的特徵在於人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78的一或多者之被升高或不平衡的位準，特別地COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，和/或子宮內膜異位的方法。

在一個方面，本發明有關於一種分離的抗體，其針對人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78具有多重專一性(或與其交叉反應)；因此我們定義本發明的抗體是一種五－專一性(或泛－ELR)抗體。抗體的定義包括抗體的一個抗原結合部分(或片段)以使得抗體結合部分(或片段)結合至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78。本發明的五－專一性抗體較佳地為鼠類單株、嵌合體、人類或人類化的。為免疑慮，本發明的五－專一性抗體不必然只結合至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78抗原，它也可以結合至其他相關的蛋白質(諸如人類GCP－2，或更可以結合至IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、ENA－78，以及GCP－2的非人類直系同源物)；換句話說，本發明的五－專一性抗體至少地結合至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78抗原。

較佳地，本發明的一個五－專一性抗體以平衡常數(equilibrium constant)，KD，如同由表面電漿共振所決定之低於10^－7 M，更佳地低於10^－8 M，以及尤佳地低於10^－9 M的數值結合至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78抗原的各個。

在一實施例中本發明包含有一種透過藉由利用本發明的一五－專一性抗體中和人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、GCP－2，以及ENA－78來抑制CXCR1以及CXCR2受體活化以降低嗜中性球趨化性的方法。

在一實施例中本發明有關於一種在一有需要的患者中透過投藥本發明的一個五－專一性抗體來降低嗜中性球趨化性的方法。

在一實施例中，一個五－專一性抗體結合至人類IL－8的KELRCQCIKTYSKP(序列辨識編號：54)的表位(epitope)內。

在一實施例中，本發明的一個五－專一性抗體是透過一種包含有下列步驟的方法而被產生：使用利用人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78還有一組五種多重抗原性胜肽(multiple antigenic peptides,MAPs)(各個MAP單元具有一個來自辨識編號：49－53之多肽的獨立序列)的混合物(雞尾酒)之RIMMs(Kilpatrick,K.E.,et al.Hybridoma.1997：16,381)類型的操作步驟。

LATELRSQSLQTLQG 序列辨識編號：49 SAKELRSQSIKTYSK 序列辨識編號：50 LRELRSVSLQTTQG 序列辨識編號：51 SPGPHSAQTEVIAT 序列辨識編號：52 ESGPHSANTEIIVK 序列辨識編號：53

不受到學理所限制，MAPs在免疫法操作步驟中提供兩種功能。首先，MAPs允許一種已知標的胺基酸序列對宿主免疫系統的一種選擇性多重呈現(selective multiple presentation)。其次，因為經由一個核心(諸如，但不限於離胺酸)而被連結的序列的多重複本，質量的增加提高了該序列的致免疫性超過獨立胜肽所具者(Francis,J.P.,et al.,Immunology,1991：73；249,Schott,M.E.,et al.,Cell.Immuno.1996：174：199－209,Tam,J.P.Proc.Natl.Acad.Sci.1988：85；5409－5413)。

被用來產生本發明的MAPs是由標的趨化激素的ELRCXC與GPHCA區以及附近被發現之保守性標的序列(例如序列辨識編號：49－53)的多重複本所構成。例示性MAP 組在第1圖中被說明。

在一實施例中，本發明的一個五－專一性抗體是透過一個包含有下列步驟的方法而被產生：a.將配於傳氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant(cFA))的人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78之混合物注射到一小鼠；b.將配於傳氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant(iFA))的人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78之混合物注射到小鼠；以及c.將配於傳氏不完全佐劑之人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78的混合物，還有一組五種多重抗原性胜肽(MAPs)注射到小鼠，各個MAP單元具有一個來自辨識編號：49－53之多肽的獨立序列；d.從小鼠分離出B細胞；e.融合B細胞與骨髓瘤細胞以形成分泌所欲五－專一性抗體的永生融合瘤細胞；以及f.從融合瘤的培養物上清液分離該五－專一性抗體，吾人可選擇性地將步驟c與d間之一配於PBS的人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78的混合物，與一組含有序列辨識編號：49－53的胺基酸序列之MAPs注射到小鼠。

在另一實施例中，本發明的一個五－專一性抗體是透過一個包含有下列步驟的方法而被產生：a.將配於傳氏完全佐劑的一組五種多重抗原性胜肽 (MAPs)注射到一小鼠，各個MAP單元具有一個來自辨識編號：49－53之多肽的獨立序列(之後被指為MAP組)；b.將配於傳氏不完全佐劑中的MAP組注射到小鼠；c.將一配於傳氏不完全佐劑中的所有人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78與該MAP組的混合物注射到小鼠；d.從小鼠分離出B細胞；e.融合B細胞與骨髓瘤細胞以形成分泌所欲五－專一性抗體的永生融合瘤細胞；以及f.從融合瘤的培養物上清液分離該五－專一性抗體。

若想要的話，吾人可選擇性地將步驟c與d間之一配於PBS的人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78的混合物，與一組含有序列辨識編號：49－53的MAPs注射到小鼠。

在另一實施例中，本發明涉及一種藉由前述方法所製造的五－專一性抗體。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地由含有序列辨識編號：1以及序列辨識編號：3之序列的核苷酸序列，或其保守性序列修飾所編碼之重與輕鏈可變區。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地由含有序列辨識編號：5以及序列辨識編號：7之序列的核苷酸序列，或其保守性序列修飾所編碼之重與輕鏈可變區。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有由含有序列辨識編號：9之序列的一核苷酸序列，或其保守性序列修飾所編碼之重鏈可變區。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地含有序列辨識編號：2以及序列辨識編號：4的胺基酸序列，或其保守性序列修飾的重與輕鏈可變區。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有重與輕鏈可變區，其分別地含有與序列辨識編號：2以及序列辨識編號：4的胺基酸序列至少90%、95%、98%或99%為相同的多肽。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地含有序列辨識編號：6以及序列辨識編號：8的胺基酸序列，或其保守性序列修飾的重與輕鏈可變區。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有重與輕鏈可變區，其分別地含有與序列辨識編號：6以及序列辨識編號：8的胺基酸序列至少90%、95%、98%或99%為相同的多肽。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地含有序列辨識編號：10以及12的胺基酸序列，或其保守性序列修飾的重與輕鏈可變區。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有重與輕鏈可變區，其分別地含有與序列辨識編號：10以及12的胺基酸序列至少90%、95%、98%或99%為相同的多肽。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有至少一可變區選自於(i)胺基酸序列辨識編號：2、4、6、8、10，或12；或(ii)一胺基酸序列，其與上面(i)的胺基酸序列任一者有至少90%、95%、98%，或99%為相同的。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有序列辨識編號：13、14、15、16、17，以及18的CDR序列；或CDR序列的一或數個可以是序列序列辨識編號：13、14、15、16、17，以及18的保守性序列修飾。在一實施例中，本發明有關於融合瘤或轉染瘤(transfectoma)，其製造一種含有序列辨識編號：13、14、15、16、17，以及18的CDR序列之五－專一性抗體。

在一實施例中，本發明有關於一種重組型真核或原核細胞，其製造一種含有序列辨識編號：13、14、15、16、17，以及18的CDR序列之五－專一性抗體。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有至少一CDR序列選自於(i)序列辨識編號：13、14、15、16、17，或18；或(ii)一個在(i)中所列示之序列的保守性序列修飾。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有一個序列辨識編號：15的多肽。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有至少4個CDR序列選自於由序列辨識編號：13、14、15、16、17，以及18所構成的群組；或一或數個CDR序列可以是序列辨識編號：13、14、15、16、17，以及18中所列示之序列的保守性序列修飾。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有重與輕鏈可變區，其分別地含有序列辨識編號：13、14，與15，以及序列辨識編號：16、17，與18的CDR胺基酸序列。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有序列辨識編號：19、20、21、22、23，以及24的CDR序列；或CDR 序列的一或數個可以是序列辨識編號：19、20、21、22、23，以及24中所列示之序列的保守性序列修飾。在一實施例中，本發明有關於一種融合瘤或轉染瘤，其製造一種含有序列辨識編號：19、20、21、22、23，以及24之CDR序列的五－專一性抗體。

在一實施例中，本發明有關於一種重組型真核或原核細胞，其製造含有序列辨識編號：19、20、21、22、23，以及24的CDR序列之五－專一性抗體。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有至少一CDR序列選自於(i)序列辨識編號：19、20、21、22、23，或24；或(ii)一個在(i)中所列示之序列的保守性序列修飾。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有一個序列辨識編號：21的多肽。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有至少4個CDR序列選自於由序列辨識編號：19、20、21、22、23，以及24所構成的群組；或一或數個CDR序列可以是序列辨識編號：19、20、21、22、23，以及24中所列示之序列的保守性序列修飾。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有重與輕鏈可變區，其分別地含有序列辨識編號：19、20，與21，以及序列辨識編號：22、23，與24的CDR胺基酸序列。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有序列辨識編號：25、26、27、28、29，以及30的CDR序列；或一或數個CDR序列可以是序列辨識編號：25、26、27、28、29，以及30中所列示之序列的保守性序列修飾。

在一實施例中，本發明有關於一種融合瘤或轉染瘤，其製造一種含有序列辨識編號：25、26、27、28、29，以及30之CDR序列的五－專一性抗體。

在一實施例中，本發明有關於一種重組型真核或原核細胞，其製造一種含有序列辨識編號：25、26、27、28、29，以及30的CDR序列之五－專一性抗體。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有至少一CDR序列選自於(i)序列辨識編號：25、26、27、28、29，或30；或(ii)一個在(i)中所列示之序列的保守性序列修飾。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有一個序列辨識編號：27的多肽。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有至少4個CDR序列選自於由序列辨識編號：25、26、27、28、29，以及30所構成的群組；或一或數個CDR序列可以是序列辨識編號：25、26、27、28、29，以及30中所列示之序列的保守性序列修飾。

在一實施例中，一個五－專一性抗體包含有重與輕鏈可變區，其分別地含有序列辨識編號：25、26，與27，以及序列辨識編號：28、29，與30的CDR胺基酸序列。

在一實施例中，本發明涉及一種製造一單株抗體的融合瘤，該單株抗體具有分別地由含有序列辨識編號：1、5，或9，或序列辨識編號：3或7之核苷酸序列的核苷酸序列所編碼的重或輕鏈可變區。

在一實施例中，本發明涉及一種製造一單株抗體的融合瘤，該單株抗體具有分別地含有序列辨識編號：2、6，或10，或序列辨識編號：4、8，或12之胺基酸序列，以及其保守性序列修飾的重或輕鏈可變區。

在一實施例中，本發明有關於一種重組型真核或原核宿主細胞，其製造具有分別地含有序列辨識編號：2、6，或10，或序列辨識編號：4、8，或12之胺基酸序列，以及其保守性序列修飾的重或輕鏈可變區的單株抗體。

在一實施例中，本發明有關於一種表現載體，其含有編碼一種五－專一性抗體之一可變重或輕鏈(分別地包含有序列辨識編號：13、14，以及15；或序列辨識編號：16、17，以及18之CDR序列)的核苷酸序列。

在一實施例中，本發明有關於一種表現載體，其包含有一編碼一種五－專一性抗體的CDR序列(選自於序列辨識編號：13、14、15、16、17，或18)之核苷酸序列。

在一實施例中，本發明有關於一種表現載體，其包含有編碼一種五－專一性抗體的至少4個CDR序列(選自於序列辨識編號：13、14、15、16、17，以及18)之核苷酸序列。

在一實施例中，本發明有關於一種含有序列辨識編號：31、32，或33之多核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種含有序列辨識編號：34、35，以及36之多核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有至少4個選自於由序列辨識編號：31、32、33、34、35，以及36之群組的多核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有編碼一種五－專一性抗體之可變重或輕鏈(分別地含有序列辨識編號：19、20，以及21；或22、23，以及24的CDR序列)的核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有編碼一種五－專一性抗體之一CDR序列(選自於由序列辨識編號：19、20、21、22、23，或24所構成的群組)之核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有編碼一種五－專一性抗體之至少4個CDR序列(選自於序列辨識編號：19、20、21、22、23，以及24)之核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有序列辨識編號：37、38，以及39之多核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有序列辨識編號：40、41，以及42之多核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有至少4個選自於由序列辨識編號：37、38、39、40、41，以及42之群組的多核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有編碼一種五－專一性抗體之一可變重鏈(含有序列辨識編號：25、26，以及27的CDR序列)之核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有編碼一種五－專一性抗體之一CDR序列(選自於序列辨識編號：25、26，或27)之核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有序列辨識編號：43、44，以及45之多核苷酸序列的表現載體。

在一實施例中，一五－專一性抗體具有分別地由含有序列辨識編號：11，以及序列辨識編號：47、59、61，或63之序列的核苷酸序列所編碼的重以及輕鏈。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地含有由與序列辨識編號：11，以及序列辨識編號：47、59、61，或63之序列為至少90%、95%、98%或99%是相同之序列的核苷酸序列所編碼的重以及輕鏈。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地含有序列辨識編號：46，以及序列辨識編號：48、60、62，或64之胺基酸序列的重以及輕鏈。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：48之胺基酸序列的重以及輕鏈。

在一實施例中，一個五－專一性抗體具有分別地包含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：60之胺基酸序列的重以及輕鏈。

在一實施例中，一五－專一性抗體具有分別地包含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：62之胺基酸序列的重以及輕鏈。

在一實施例中，一五－專一性抗體具有分別地包含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：64之胺基酸序列的重以及輕鏈。

在一實施例中，一五－專一性抗體具有分別地含有與序列辨識編號：46，以及序列辨識編號：48、60、62，或64至少有90%、95%、98%或99%的胺基酸序列是相同的多肽之重以及輕鏈。

在一實施例中，本發明有關於一種重組型真核或一原核宿主細胞，其製造一具有重或輕鏈(分別地含有序列辨識編號：46，或序列辨識編號：48、60、62，或64的胺基酸序列)的五－專一性抗體。

在一實施例中，本發明有關於一種重組型真核或一原核宿主細胞，其製造一具有重或輕鏈(分別地含有序列辨識編號：46，和序列辨識編號：48、60、62，或64的胺基酸序列)的五－專一性抗體。

在一實施例中，本發明有關於一種重組型真核或一原核宿主細胞，其製造一種具有重或輕鏈(分別地含有與序列辨識編號：46，或序列辨識編號：48、60、62，或64的胺基酸序列至少有90%、95%、98%或99%是相同的胺基酸序列)的五－專一性抗體。

在一實施例中，本發明有關於一種重組型真核或一原核宿主細胞，其製造一種具有重或輕鏈(分別地含有與序列辨識編號：46，和序列辨識編號：48、60、62，或64的胺基酸序列至少有90%、95%、98%或99%是相同的胺基酸序列)的五－專一性抗體。

在一實施例中，本發明有關於一種含有多核苷酸序列 (分別地包含有序列辨識編號：11，以及序列辨識編號：47、59、61，或63之序列)的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種含有多核苷酸序列(分別地包含有與序列辨識編號：11，和序列辨識編號：47、59、61，或63的序列至少有90%、95%、98%或99%是相同的序列)的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種含有一多核苷酸序列(含有序列辨識編號：11、47、59、61，或63之一序列)的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種含有一多核苷酸序列(含有分別地與序列辨識編號：11、47、59、61，或63的序列至少有90%、95%、98%或99%是相同的一序列)的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種含有多核苷酸序列(其編碼一種含有分別地具有序列辨識編號；46，以及序列辨識編號：48、60、62，或64的胺基酸序列的重與輕鏈之五－專一性抗體)的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種含有多核苷酸序列(其編碼一種含有分別地與序列辨識編號；46，以及序列辨識編號：48、60、62，或64的胺基酸序列至少有90%、95%、98%或99%是相同的胺基酸序列之重與輕鏈的五－專一性抗體)的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有一多核苷酸序列(其編碼一含有序列辨識編號：46、48、60、62，或64 的胺基酸序列之多肽)的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種包含有一多核苷酸序列(其編碼一含有與序列辨識編號：46、48、60、62，或64的胺基酸序列至少有90%、95%、98%或99%是相同的胺基酸序列之多肽)的表現載體。

在一實施例中，本發明有關於一種用於在一個單一宿主細胞中製造一種五－專一性抗體(免疫球蛋白)的方法，包含有下列步驟：(i)將該單一宿主細胞轉形以一第一DNA序列(編碼一含有序列辨識編號：46之多肽的重鏈)；以及一第二DNA序列(編碼一含有序列辨識編號：48、60、62，或64之一多肽的輕鏈)；以及(ii)表現該第一DNA序列以及該第二DNA序列以使得該免疫球蛋白重與輕鏈如同獨立的分子在該經轉形的單一宿主細胞中被製造；再者，此方法可被施行以使得該第一與第二DNA序列存在於不同載體中或該第一與第二DNA序列存在於一個單一載體中。

在一實施例中本發明有關於一種用於在一個單一宿主細胞中製造一種五－專一性抗體(免疫球蛋白)的方法，包含有下列步驟：(i)將該單一宿主細胞轉形以一第一DNA序列(編碼含有序列辨識編號：13、14，以及15的CDR領域之免疫球蛋白重鏈的至少一可變領域)；以及一第二DNA序列(編碼含有序列辨識編號：16、17，以及18的CDR領域之免疫球蛋白輕鏈的至少一可變領域)；以及(ii)表現該第一DNA序列以及該第二DNA序列以使得該免疫球蛋白重與輕鏈如同獨立的分子在該經轉形的單一宿主細胞中被製造；再者，此方法可被施行以使得該第一與第二DNA序列存在於不同載體中或該第一與第二DNA序列存在於一個單一載體中。

在一實施例中本發明有關於一種用於在一個單一宿主細胞中製造一種五－專一性抗體(免疫球蛋白)的方法，包含有下列步驟：(i)將該單一宿主細胞轉形以一第一DNA序列(編碼含有序列辨識編號：19、20，以及21的CDR領域之免疫球蛋白重鏈的至少一可變領域)；以及一第二DNA序列(編碼含有序列辨識編號：22、23，以及24的CDR領域之免疫球蛋白輕鏈的至少一可變領域)；以及(ii)表現該第一DNA序列以及該第二DNA序列以使得該免疫球蛋白重與輕鏈如同獨立的分子在該經轉形的單一宿主細胞中被製造；此方法可被施行以使得該第一與第二DNA序列存在於不同載體中或該第一與第二DNA序列存在於一個單一載體中。

在一實施例中本發明有關於在一免疫分析(諸如ELISA分析)中完全地或部分地阻斷任一前述五－專一性抗體結合到人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、ENA－78，以及GCP－2的抗體。在一實施例中，當抗體阻斷該五－專一性抗體的結合達超過10%、20%，40%或50%時，部分的阻斷發生。

在一實施例中，本發明有關於一種與任何前述五－專一性抗體競爭結合到人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、ENA－78，以及GCP－2的抗體。

在一實施例中，本發明有關於在一免疫分析(諸如ELISA分析)中完全地或部分地阻斷任一前述五－專一性抗體結合到人類IL－8的KELRCQCIKTYSKP(序列辨識編號：54)之表位的抗體。在一實施例中，當抗體阻斷該五－專一性抗體的結合達超過10%、20%，40%或50%時，部分的阻斷發生。

在一實施例中本發明有關於一種與任一前述五－專一性抗體競爭結合到人類IL－8的KELRCQCIKTYSKP(序列辨識編號：54)之表位的抗體。

在一實施例中，本發明有關於一包含有一前述五－專一性抗體以及一藥學上可接受的載劑之組成物。

在一實施例中，本發明有關於一種在一哺乳動物中治療或預防COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，和/或子宮內膜異位的方法，包含有對該哺乳動物投藥一有效數量之一前述五－專一性抗體。

在一實施例中本發明有關於一種前述五－專一性抗體用於治療疾病或異常，該疾病或異常的特徵在於人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78之一或數者被升高或不平衡的位準，尤其是COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，或子宮內膜異位。

在一個方面，本發明有關於一種前述五－專一性抗體用於在一哺乳動物中預防和/或治療COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，和/或子宮內膜異位。

在一個方面，本發明有關於一種前述五－專一性抗體在製造供使用在一哺乳動物中預防和/或治療COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，和/或子宮內膜異位之醫藥品的用途。

在一個方面，本發明有關於一種前述五－專一性抗體在製造用於在一哺乳動物中預防和/或治療COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，和/或子宮內膜異位之醫藥品的用途。

在一實施例中，上面的哺乳動物是人類。

發明的詳細說明

一個“經分離的五－專一性抗體(isolated penta－specific antibody)”或單單“五－專一性抗體”，如此處所用的，被意欲來指涉一種結合至並且因而與人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78交叉反應的抗體，以及基本上並不是具有不同抗原專一性的抗體，並且進一步地，是一種單一組成物。為免疑慮，本發明的專一性的抗體不必然只結合至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78抗原，它也可以發生於結合至其他相關的蛋白質(諸如人類GCP－2，或更可以結合至IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、ENA－78，以及GCP－2的非人類直系同源物)；換句話說，本發明之五－專一性抗體至少結合至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78。再者，一個經分離的五－專一性抗體基本上沒有其他細胞材料和/或化學品。一個五－專一性抗體，如本文中所用的，亦包括具有它們“親代”五－專一性抗體之結合特性的抗原結合片段和/或衍生物。本發明之五－專一性抗體可包含有兩個相同的重鏈以及兩個相同的輕鏈，形成典型的，兩側對稱的免疫球蛋白分子，由兩個各由一重鏈與一輕鏈所組成之異二聚體(heterodimers)組成。因此，本發明之五－專一性抗體可包含有2個相同抗原結合領域的複本(藉由一重鏈與一輕鏈的締合所形成)。雖然只具有一種結合領域，本發明之五－專一性抗體仍然可以結合至並且因而與人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78交叉反應。

如此處所用的，“抗體”亦被意指為“免疫球蛋白”。

如此處所用的，“交叉反應的一抗體”表示不只是結合到一種抗原也結合到其他抗原的抗體。

“中和(neutralizing)”，如此處所用的被意欲為指涉人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、GCP－2，或ENA－78的至少一生物活性的部份或完全抑制。舉例來說，人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、GCP－2，或ENA－78的生物活性之一是其誘導嗜中性球趨化性的能力。

一種測量一抗體之結合動力學的方法是透過表面電漿共振。術語“表面電漿共振(surface Plasmon resonance)”，如此處所用的，指涉一種允許透過偵測一生物感測器基質中之蛋白質濃度變化而供分析即時生物專一性的交互作用之光學現象，例如使用BIAcore system(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。有關於更多的描述，參見Jonsson,U.,et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51：19－26；Jonsson,U.,et al.(1991)Biotechniques 11：620－627；Johnsson,B.,et al.(1995)J.Mol.Recognit.8：125－131；以及Johnnson,B.,et al.(1991)Anal.Biochem.198：268－277。

術語“表位(epitope)”表示一能夠專一結合至一抗體的蛋白決定子(protein determinant)。表位通常由分子的化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)所構成並且通常具有專一的三維結構特徵，還有特定的電荷特徵。

一“單株抗體(monoclonal antibody)”或mAb(如同相反於多株抗體)如此處所用是意欲指涉製備單一分子組成物的抗體分子。舉例來說，一鼠類衍生的單株抗體(小鼠單株抗體)可以透過融合瘤技術(諸如標準Kohler and Milstein融合瘤方法學)而被製備。

抗體－製造細胞可以從實驗組被獲得並且透過標準技術(諸如原先由Kohler and Milstein所描述的融合瘤技術(1975,Nature 256：495－497)(亦參見，Brown et al.(1981)J.Immunol 127：539－46；Brown et al.(1980)J Biol Chem 255：4980－83；Yeh et al.(1976)PNAS 76：2927－31；and Yeh et al.(1982)Int.J.Cancer 29：269－75))被用來製備單株抗體。用於製造單株抗體融合瘤的技術是已知的(一般參見R.H.Kenneth,in Monoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses,Plenum Publishing Corp.,New York, N.Y.(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.,54：357－402；M.L.Gefter et al.(1977)Somatic Cell Genet.,3：231－36)。

術語“轉染瘤(transfectoma)”，如此處所用的，包括表現該抗體的重組型真核宿主細胞，諸如CHO細胞、NS/0細包、HEK293細胞、植物細胞，或真菌(包括酵母菌細胞)。

如此處所用的，“專一性(specific)”結合指涉抗體結合到一預定的抗原。典型地，抗體以一平衡常數，KD(對應於大約1×10^－7 M或更低)結合，並且以一對應於一KD(低於其有關結合至一預定抗原以外之非－專一性抗原(例如，BSA，酪蛋白)或一極為相關之抗原的親和力至少兩個量級)的親和力結合至該預定的抗原。片語“一辨識一抗原的抗體”以及“一對於一抗原為專一性的抗體”在此處與術語“一專一性地結合至一抗原的抗體”被交替地使用。

如此處所用的，術語“kd”(秒－1)，如此處所用的，是意欲指涉一特定的抗體－抗原－交互作用的解離速率常數(dissociation rate constant)。

術語“ka”(M×秒－1)，如此處所用的，是意欲指涉一特定的抗體－抗原－交互作用的締合速率常數(association rate constant)。

術語“KD”(M)，如此處所用的，是意欲指涉一特定的抗體－抗原－交互作用的平衡常數並且透過以ka除以kd而被獲得。

有關於核苷酸以及胺基酸序列修飾的“保守性序列修飾(conservative sequence modifications)”表示不會顯著地影響或改變由該核苷酸序列所編碼或含有該胺基酸序列之抗體的結合特性之改變。此類保守性序列修飾包括核苷酸與胺基酸置換、添加以及刪除。修飾可以透過該技藝中所知曉的標準技術而被引入序列，諸如定點突變(site－directed mutagenesis)以及PCR－媒介的突變(PCR－mediated mutagenesis)。保守性胺基酸置換包括其中胺基酸殘基被置換以一具有類似側鏈之胺基酸殘基者。具有類似側鏈之胺基酸殘基的家族在該技藝中已被界定。這些家族包括帶有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、貝他－分支的側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)以及芳香族側鏈(酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。因此，對於一個在一被專一地揭示之抗體中經預測為不重要的胺基酸殘基較佳地被置換以另一個來自相同側鏈家族的胺基酸殘基。因此在一個方面，本發明之五－專一性抗體包括所有該專一地被揭示之胺基酸序列的保守性序列修飾。

本發明亦含括如同被專一地揭示之胺基酸序列的“衍生物”，其中一或數個胺基酸殘基已被衍生，例如透過醯化作用或糖化作用，不會顯著地影響或改變含有該胺基酸序列之抗體的結合特性。

有關於核酸，術語“基本上的相同性”象徵兩個核酸，或其指定序列，當被最佳化地排列並且比較時是相同的，帶有適當的核苷酸插入或刪除，呈至少大約80%的核苷酸，通常至少大約90%至95%，並且更佳地至少大約98%至99.5%的核苷酸。另擇地，相同性當在選擇性雜交條件下片段將與股的互補股雜交。

有關於核苷酸以及胺基酸序列，術語“相同性”表示當與適當插入或刪除被最佳化排列並且比較時，介於兩個核酸或胺基酸序列的相同性程度。另擇地，當DNA片段在選擇性雜交條件下與股的互補股雜交，基本上的相同性存在。

兩個序列間的相同性百分比是一個由序列所共有之相同位置的數目的函數(亦即，%相同性＝相同位置的#/位置的總#乘以100)，考慮間隔的數目，以及各間隔的長度，其必須被引入以供兩個序列的最佳化排列。序列的比較以及介於兩個序列間的相同性百分比的決定可以如同在下面非限定實例中所述般使用一數學演算法而被達成。

兩個核苷酸或多肽序列之間的相同性百分比可以使用GCG軟體包中的GAP程式(得自於http：//www.gcg.com)，使用一NWSgapdna.CMP矩陣以及一為40、50、60、70，或80的間隔重量(gap weight)與一為1、2、3、4、5，或6的長度重量(length weight)而被決定。兩個核苷酸或胺基酸序列之間的相同性百分比也可以使用E.Meyers and W.Miller的演算法而被決定(Comput.App.Biosci.,4：11－14(1988))，其已被併入ALIGN程式(版本2.0)，使用一PAM120 重量殘基表、一為12的間隔長度懲罰(gap length penalty)以及一為4的間隔懲罰(gap penalty)。此外，兩個胺基酸序列間的相同性百分比可以使用NeedIleman and Wunsch演算法(J.Mol.Biol.48：444－453(1970))而被決定，其已被併入GCG軟體包的GAP程式(得自於http：//www.gcg.com)，使用一Blossum 62矩陣或一PAM250矩陣，以及一為16、14、12、10、8、6，或4的間隔重量與一為1、2、3、4、5，或6的長度重量。

一核酸是“被操作地連結(operably linked)”當它被置放在與另一個核酸序列的功能關係時。例如，若一啟動子或增強子影響一編碼序列的轉錄，它是操作地被連結至該序列。有關於調節序列的轉錄，被操作地連結表示要連結的DNA是鄰接並且，若需要時接合兩個蛋白質編碼區，鄰接以及在閱讀框架內。有關於轉換序列(switch sequences)，被操作地連結象徵序列可以造成轉換重組。

術語“載體(vector)”，如此處所用的，意欲指涉一能夠運輸另一個已被連結至它之核酸的核酸分子。一類載體為一“質體”，其指涉一個環狀雙股DNA環，額外的DNA片段可以被接合至其中。另一類載體是一病毒載體，其中額外的DNA片段可以被接合至病毒染色體組。特定載體可以在它們被引入的宿主細胞中自發性複製(例如具有一複製的細菌源點的細菌載體以及離合染色小體哺乳動物載體(episomal mammalian vectors))。其它載體(例如非離合染色小體哺乳動物載體)可以因為導入宿主細胞中而被併入一宿主細胞的染色體組中，並且因而隨著宿主的染色體組被複製。再者，特定載體能夠指導它們被操作地連接之基因的表現。此類載體在此處被稱為“重組型表現載體”(或單單，“表現載體”)。一般來說，表現載體在重組DNA技術中的應用通常是呈質體的形式。在本說明書中，“質體”與“載體”被交替地使用而質體是載體最常用的形式。然而，本發明意欲包括其他類型的表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒以及腺－相關的病毒)，其提供相同功能。

術語“重組型宿主細胞”(或單單“宿主細胞”)，如此處所用的，意欲指涉一重組型表現載體已被引入其中的細胞。應被理解的是，此術語意欲指涉不只特定標的細胞還有此一細胞的後代。但是特定修飾可能因為突變或環境影響而發生在後代，事實上，此後代可能不會相同於親代細胞，但是仍然被含括在如此處所用之術語“宿主細胞”的範疇中。重組型宿主細胞包括，例如轉染瘤，諸如CHO細胞、NS/0細胞，以及淋巴球細胞。

如此處所用的，術語“個體(subject)”包括任何人類或非人類動物。術語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物以及非－哺乳動物，諸如非－人類的靈長類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲類，爬蟲類等等。

1.抗體結構

完整的抗體(Intact Antibodies) 完整的抗體通常是含有至少兩個重與輕鏈的異集合體醣蛋白(heteromultimeric glycoproteins)。除了IgM之外，完整的抗體是大約150Kda的異集合體醣蛋白，由兩個相同的輕(L)鏈與兩個相同的重(H)鏈所組成。典型地，各個輕鏈是藉由一個共價雙硫鍵而連結至一重鏈，而不同免疫球蛋白同型的重鏈間的雙硫鍵結數目會改變。各個重與輕鏈也具有鏈內雙硫鍵。各重鏈在一端具有一個可變領域(V_H )接著是一些恆定區。各輕鏈於其另一端具有一可變領域(V_L )以及一恆定區；輕鏈的恆定區是與重鏈的第一恆定區排列且輕鏈可變領域是與重鏈的可變領域排列。大多數脊椎動物物種的抗體之輕鏈可以根據恆定區的胺基酸序列而被歸納成被稱為卡帕(Kappa)與拉目達(Lambda)的兩類之一。根據它們的重鏈之恆定區的胺基酸序列，人類抗體可以被歸納成5種不同類型，IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM。IgG與IgA可以被進一步分成子類(subclasses)，IgG1、IgG2，IgG3以及IgG4；與IgA1以及IgA2。物種變異體隨著具有至少IgG2a、IgG2b的小鼠與大鼠而存在。抗體的可變領域給予結合專一性，因為抗體與展現被稱為互補決定區(complementarity determining regions,CDR)的特定變異性之特定區。可變區的更為保守部分被稱為框架區(framework regions,FR)。完整的重與輕鏈的可變領域各含有4個透過3個CDRs而被連結的FR。各鏈中的CDRs透過FR區被維持在一起緊密靠近且來自其他鏈的CDRs促成抗體的抗原結合位址形成。恆定區不直接涉入抗體對抗原的結合但展現各種不同的效應功能(諸如參與抗體依賴性細胞－媒介的細胞毒殺(antibody dependent cell－mediated cytotoxicity,ADCC)、透過結合到Fcγ受體的吞噬作用、透過新生兒Fc受體(FcRn)的半衰期/清除速率與透過補體級聯之C1q組分的補體依賴性細胞毒殺)。人類IgG2恆定區缺少透過典型途徑來活化補體或媒介抗體－依賴性細胞毒殺的能力。IgG4恆定區缺少透過典型途徑來活化補體並且僅能微弱地媒介抗體－依賴性細胞毒殺的能力。基本上缺少這些效應功能的抗體可以被稱為‘非－溶解’抗體(‘non－lytic’antibodies)。

人類抗體 人類抗體可以透過一些為那些習於該技藝者所知曉的方法而被製造。人類抗體可以透過使用人類骨髓瘤或小鼠－人類雜骨髓瘤細胞株的融合瘤方法(參見Kozbor J.Immunol 133,3001,(1984)以及Brodeur,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp51－63(Marcel Dekker Inc,1987)而被製造。替代方法包括使用噬菌體庫或轉殖小鼠，兩者採用人類V區指令(參見Winter G,(1994),Annu.Rev.Immunol 12,433－455,Green LL(1999),J.Immunol.methods 231,11－23)。

轉殖小鼠的一些品系現在是可取得的，其中它們的小鼠免疫球蛋白基因座已被取代以人類免疫球蛋白基因片段(參見Tomizuka K,(2000)PNAS 97,722－727；Fishwild D.M (1996)Nature Biotechnol.14,845－851,Mendez MJ,1997, Nature Genetics,15,146－156)。因為抗原挑戰以使得小鼠能夠製造人類抗體的指令，自其感興趣的抗體可以被選出。

特別要注意的是Trimera^TM 系統(參見Eren R et al,(1998)Immunology 93：154－161)，其中人類淋巴球被移植到經照射的小鼠，Selected Lymphocyte Antibody System(SLAM，參見Babcook et al,PNAS(1996)93：7843－7848)，其中人類(或其他物種)淋巴球有效地提供一大量集中的活體外抗體製造操作步驟接著是被迴旋的(devonvulated)、限數稀釋以及選擇步驟與Xenomouse II^TM (Abgenix Inc)。替代方法是購自於使用Morphodoma^TM 技術的Morphotec Inc。

噬菌體呈現技術可以被用來製造人類抗體(及其片段)，參見McCafferty；Nature,348,552－553(1990)以及Griffiths AD et al(1994)EMBO 13：3245－3260。根據這個技術，抗體V領域基因呈框架地被選殖到絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的蛋白基因的主要或次要外套(coat)並且如同噬菌體顆粒表面上的功能性抗體片段被展示(通常利用一輔助者噬菌體的協助)。根據抗體的功能特性之選擇造成編碼展現這些特性的抗體之基因的選擇。噬菌體呈現技術可以被用來從人類B細胞(取自於感染上述疾病或異常的個體或另擇地來自未經免疫的人類受體(參見Marks；J.Mol.Bio.222,581－597,1991))所製得的庫中選擇抗原專一性的抗體。若一個包含有一個Fc領域的完整人類抗體是所欲的，需要再選殖展現衍生之片段的噬菌體到一哺乳動物表現載體(含有所欲的恆定區)中並且建立穩定的表現細胞株。

親和力成熟的技術(Marks；Bio/technol 10,779－783(1992))可以被用來增進結合親和力，其中初級人類抗體的親和力是透過連續地以天然變異體取代H與L鏈V區並且根據經增進的結合親和力來選定。這個技術的變異諸如“表位銘印(epitope imprinting)”現在是可用的參見WO93－06213。亦參見Waterhouse；Nucl.Acids Res 21,2265－2266(1993)。

嵌合與人類化的抗體 使用完整的非人類抗體來以它治療人類疾病或異常目前被確認有潛在的致免疫性的問題，特別是因為抗體的重複投藥，患者的免疫系統會將非－人類的完整抗體辨識為非－自我(non－self)並且發動一個中和反應。除了發展完全人類抗體(見上)以外，各種不同的技術經年地被發展以克服這些問題並且通常地需要在完整治療抗體中降低非－人類胺基酸序列的組成同時在從一經免疫的動物(例如小鼠、大鼠或兔)獲得非－人類抗體上維持相對簡易性。大體上兩種方法已被用來達成。第一個為嵌合抗體，其通常含有一非－人類(例如諸如小鼠的齧齒類)可變領域融合至一人類恆定區。因為一抗體的抗原－結合位址被定位在可變區內，嵌合抗體維持其對於抗體的結合親合力但需要人類恆定區的效應功能並且因而可以實施諸如上文中所述的效應功能。嵌合抗體典型地是使用重組DNA方法而被製造。編碼該抗體的DNA(例如cDNA)被分離並且使用習知操作步驟(例如透過使用可以專一地結合至編碼本發明的抗體之H與L鏈可變區之基因的寡核苷酸探針)而被定序。融合瘤細胞作為此DNA的代表性來源。一但被分離，DNA被置入表現載體中，該載體接著被轉染到宿主細胞(諸如不會製造除此之外之免疫球蛋白的E.coli 、COS細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中以獲得該抗體的合成。DNA可以透過將有關人類L與H鏈的編碼序列置換成對應的非－人類(例如鼠類)H與L恆定區而被修飾，參見例如Morrison；PNAS 81,6851(1984)。因此本發明的另一個實施例有提供一個嵌合抗體，其含有一V_H 領域(具有序列辨識編號：2、6，或10的序列)以及一V_L 領域(具有序列辨識編號：4、8，或12的序列)融合至一人類恆定區(其可以是一個IgG同型，例如IgG1)。

第二個方法需要人類化的抗體的產生，其中該抗體的非－人類內含物是透過人類化該可變區而被降低。用於人類化的兩種技術已獲得大眾化。第一個是透過CDR移植的人類化。CDRs建立接近抗體的N－端的環，其中它們形成一個設在由框架區所提供的支架上的表面。該抗體的抗原－結合專一性主要地是由拓樸學以及由其CDR表面的化學特性所界定的。這些特徵依次是由獨立的CDRs的構型，透過CDRs的相對特質，以及透過含有該CDR的殘基之側鏈的性質與特質所決定。在致免疫性方面的一個大的降低可以透過僅僅移植非－人類(例如鼠類)抗體(“供體”抗體)的CDRs到一適當的人類框架(“受體框架”)與恆定區上而被達成(參見Joneset al (1986)Nature 321,522－525以及Verhoeyen Met al (1988)Science 239,1534－1536)。然而，CDR移植本身可能不會造成抗原－結合特性的完全保留並且它常被發現到若明顯的抗原－結合親和力要被恢復的話，供體抗體的一些框架殘基在人類化的分子中需要被保留(有時候被稱為“回復突變”)(參見Queen Cet al (1989)PNAS 86,10,029－10,033,Co,Met al (1991)Nature 351,501－502)。在此例中，對非－人類供體抗體顯示最高序列同源性(典型第60%或更高)的人類V區可以從一個資料庫中被選出以提供人類框架(FR)。人類FRs的選擇可以從人類一致序列過個別的人類抗體而被做出。若需要的話，來自供體抗體的主要殘基可以被置換成人類受體框架以保留CDR構型。抗體的電腦模型化可以被用來協助鑑定此結構上重要的殘基，參見WO99/48523。

另擇地，人類化可以透過一“面飾(veneering)”的方法而被達成。獨特人類與鼠類免疫球蛋白重與輕鏈可變區的統計分析揭示暴露的殘基的準確型態在人類與鼠類抗體中是不同的，且大多數獨立的表面位置對於少數的不同殘基具有一強烈的偏好(參見Padlan E.A.et al ；(1991)Mol.Immunol.28,489－498以及Pedersen J.T.et al (1994)J.Mol.Biol.235；959－973)。因此透過取代在其框架區中之被暴露的殘基(不同於那些在人類抗體中常被發現到的)來降低一非－人類Fv的致免疫性是可行的。因為蛋白質抗原性可以利用表面可親性而被校正，表面殘基的取代足以使得小鼠可變區對於人類免疫系統來說是“看不見的”(亦參見 Mark G.E.et al (1994)inHandbook of Experimental Pharmacology vol.113 ：The pharmacology of monoclonal Antibodies,Springer－Verlag,pp105－134)。因為只有抗體的表面被改變，這個人類化的操作步驟被稱為“面飾”，作為配角的殘基維持不被干擾的。又一個替代方法在WO04/006955中被提出。

更多替代方法包括在WO04/006955中被提出的以及HumaneeringTM(Kalobios)的操作步驟(其利用細菌表現系統並且製造在序列上近似於人類生殖系列的抗體)(Alfenito－M Advancing Protein Therapeutics January 2007,San Diego,California)。另一個人類化的方法需要根據人類CDR區相對於那些供體小鼠抗體CDR區所具者的結構相似性而非抗體的其他區(諸如框架區)間的同源性來選擇人類受體框架。這個方法被知曉為Superhumanisation^TM (Evogenix Inc.；Hwang et al(2005)Methods 36：35－42)。

對於那些習於該技藝者來說術語“衍生的”意欲定義不只是來源(其意思是有關於材料的物理來源)也定義結構上相同於材料但並非衍生自參考來源的材料是清楚的。因此“在供體抗體中被發現到的殘基”不必然地純化自供體抗體。

抗體片段 在本發明的特定實施例中提供治療抗體，其為一種抗原結合片段。此片段可以是完整和/或人類化和/或嵌合抗體的功能性抗原結合片段，諸如上文中所述抗體的Fab、Fd、Fab’、F(ab’)₂ 、Fv、ScFv片段。缺少恆定區缺乏透過典型途徑來活化補體或媒介抗體－依賴性細胞毒殺作用的能力。此片段習知地是藉由完整的抗體之蛋白水解消化(透過例如木瓜酶消化)(參見例如，WO 94/29348)所製造但可以直接地從重組轉形的宿主細胞被製造。有關於ScFv的製造，參見Birdet al ；(1988)Science,242,423－426。此外，抗體片段可以使用各種不同如同下面所述的工程技術而被製造。

Fv片段相較於Fab片段似乎具有它們的兩個鏈之較低的交互作用能量。為了穩定V_H 以及V_L 領域的締合，它們以胜肽(Birdet al ；(1988)Science,242,423－426,Hustonet al ,PNAS,85,5879－5883)、雙硫橋(Glockshuber et al,(1990)Biochemistry,29,1362－1367)以及“洞中的凸出物(knob in hole)”突變(Zhu et al(1997),Protein Sci.,6,781－788)而被連結。ScFv片段可以透過對於習於該技藝者來說為已知的方法而被製造參見Witlowet al (1991)Methods companion Methods Enzymol,2,97－105以及Hustonet al (1993)Int.Rev.Immunol 10,195－219。ScFv可以在細菌細胞(諸如E.Coli )中被製造但是更典型地在真核生物細胞中被製造。ScFv的一個缺點是產物的單價(monovalency)，其因為多價結合，以及它們的短半衰期而排除一個增加的結合性(avidity)。要克服這些問題的嘗試包括透過化學偶合從含有一個額外C端半胱胺酸的ScFv(Adamset al (1993)Can.Res 53,4026－4034以及McCartneyet al (1995)Protein Eng.8, 301－314)或透過含有一個未配對C端半胱胺酸殘基之ScFv的自發性定點突變二聚作用所製造的二價(ScFv’)₂ (參見Kipriyanovet al (1995)Cell.Biophys 26,187－204)。另擇地，ScFv可以透過縮短胜肽連接子至3至12個殘基來形成“雙鏈抗體(diabodies)”而被強化以形成集合體，參見Holligeret al PNAS(1993),90,6444－6448。減少連接子可進一步造成ScFv三體(“三鏈抗體(tribodies)”，參見Korttet al (1997)Protein Eng,10,423－433)以及四體(“4鏈抗體(tetrabodies)”，參見Le Gallet al (1999)FEBS Lett,453,164－168)。二價ScFv分子的建構也可以透過遺傳學與蛋白二聚模組融合以形成“微型抗體(miniantibodies)”(參見Packet al (1992)Biochemistry 31,1579－1584)以及“微抗體(minibodies)”(參見Huet al (1996),Cancer Res.56,3055－3061)。ScFv－Sc－Fv串聯((ScFv)₂ )也可以透過藉著一個第三個胜肽連接子連結兩個ScFv單元而被製造，參見Kuruczet al (1995)J.Immol.154,4576－4582。雙專一性的雙鏈抗體可以透過兩個單鏈融合產物(具有來自一抗體的V_H 領域藉著一個短連接子被連結到另一個抗體的V_L 領域)的非共價締合而被製造，參見Kipriyanovet al (1998),Int.J.Can 77,763－772。此雙專一性的雙鏈抗體的穩定性可以透過如上文所述引入雙硫橋或“洞中的凸出物”突變或透過單鏈雙鏈抗體(ScDb)(其中兩個雜交ScFv片段透過一個胜肽連接子而被連結)的形成而被升高參見Kontermannet al (1999)J.Immunol.Methods 226 179－188。四價雙專一性分子可得自於例如藉由透過樞紐區將一ScFv片段融合到一IgG分子的CH3領域或至一Fab片段參見Colomaet al (1997)Nature Biotechnol.15,159－163。另擇地，四價雙專一性分子已透過雙專一性的單鏈雙鏈抗體的融合而被製造(參見Altet al ,(1999)FEBS Lett 454,90－94)。較小的四價雙專一性分子也可以透過利用一個含有螺旋－環－螺旋模組的連接子的ScFv－ScFv串聯的二聚化(Dibi微型抗體，參見Mulleret al (1998)FEBS Lett 432,45－49)或一個含有4個呈一預防分子內配對的位向的抗體可變領域(V_H 以及V_L )之單鏈分子(串聯雙鏈抗體，參見Kipriyanovet al ,(1999),J.Mol.Biol.293,41－56)而被形成。雙專一性F(ab’)2片段可以透過Fab’片段的化學偶合或透過經由白胺酸拉鍊的異二聚化(參見Shalabyet al ,(1992)J.Exp.Med.175,217－225 and Kostelnyet al (1992),J.Immunol.148,1547－1553)而被產生。亦可取得的是以經分離的V_H 或V_L 領域為主的所稱領域抗體(domain antibodies)(Domantis Ltd.)，參見US 6,248,516；US 6,291,158；US 6,172,197。

雜共軛抗體(heteroconjugate antibodies) 雜共軛抗體是亦形成本發明的一實施例的衍生物。雜共軛抗體是由兩個使用任何習用交聯法而被形成地共價地結合的抗體所組成。參見US 4,676,980。

其它修飾 本發明的抗體也可以在恆定區中併入任何其他修飾。例如抗體在它們的恆定區之保守性位置的糖化被知曉為在抗體功能上具有一深遠的影響，尤其諸如那些上述的效應功能，參見例如Boydet al (1996),Mol.Immunol.32,1311－1318。本發明之治療抗體的糖化變異體，其中一或數個醣部分被添加、置換、刪除或修飾是被預期的。一個天冬醯胺酸－X－絲胺酸或天冬醯胺酸－X－蘇胺酸模組的引入製造一個供醣部分之酵素接合的可能位址並且因而能夠被用來操作一抗體的糖化。在Rajuet al (2001)Biochemistry 40,8868－8876中，TNFR－IgG免疫粘附素(immunoadhesin)的末端液酸化(sialylation)是透過一個使用貝他－1,4－半乳糖轉移酶和/或阿伐,2,3液酸轉移酶的再半乳糖化(regalactosylation)和/或再液酸化的步驟而被增加。咸信增加末端液酸化會增加免疫球蛋白的半衰期。抗體，與大多數醣蛋白一樣，典型地自然被製造成如同糖型(glycoform)之混合物。此混合物在抗體於真核生物(尤其是哺乳動物細胞)中被製造時特別明顯。各種不同的方法已被發展來製造限定的糖型，參見Zhanget al Science(2004),303,371,Searset al ,Science,(2001)291,2344,Wackeret al (2002)Science,298 1790,Daviset al (2002)Chem.Rev.102,579,Hanget al (2001)Acc.Chem.Res 34,727。因此本發明涉及如此處所述之包含抗體之一限定數目(例如7或更少，例如5或更少諸如2或單個)的糖型的複數治療抗體(其可以是IgG同型，例如IgG1)。

根據本發明的衍生物也包括被偶合至一非－蛋白質聚合物(諸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)之本發明的治療抗體。蛋白質對PEG的共軛是一種已被建立之用以增加蛋白質半衰期，還有降低蛋白質之抗原性以及致免疫性的技術。使用帶有不同分子量以及類型(直線或分支)的PEG化已利用完整抗體還有Fab’片段而被研究，參見Koumenis I.L.et al (2000)Int.J.Pharmaceut. 198：83－95。一個特定實施例包含有本發明之一抗原－結合片段，但是不帶有a)透過典型途徑之補體的活化；以及b)媒介抗體－依賴性細胞毒殺的效應功能；(諸如一Fab片段或一scFv)偶合到PEG。咸信一抗體之Fc區以及各種不同Fc受體(FcγR)間的交互作用媒介抗體的效應功能，其包括抗體－依賴性細胞毒殺(ADCC)、補體的固定、吞噬作用與抗體的半衰期/清除。本發明之抗體的Fc區的各種不同修飾可以根據所欲的效應特性而被施行。特別地，人類恆定區(其基本上缺少a)透過典型途徑之補體的活化；以及b)媒介抗體－依賴性細胞毒殺的功能)包括IgG4恆定區、IgG2恆定區以及IgG1恆定區(它們含有像是例如EP0307434(WO8807089)、EP 0629 240(WO9317105)及WO2004/014953中所揭示在位置234、235、236、237、297、318、320和/或322之突變的特定突變)。在重鏈恆定區的CH2領域內之殘基235或237的突變(Kabat編號：EU索引系統)已分別地被描述來降低結合到FcγRI、FcγRII以及FcγRIII結合與因此降低抗體－依賴性細胞細胞毒殺 (ADCC)(Duncan et al.Nature 1988,332；563－564；Lund et al.J.Immunol.1991,147；2657－2662；Chappel et al.PNAS 1991,88；9036－9040；Burton and Woof,Adv.Immunol.1992,51；1－84；Morgan et al.,Immunology 1995,86；319－324；Hezareh et al.,J.Virol.2001,75(24)；12161－12168)。再者，一些報導亦已描述這些殘基中的某些涉入徵招或媒介補體依賴性細胞毒殺(CDC)(Morgan et al.,1995；Xu et al.,Cell.Immunol.2000；200：16－26；Hezareh et al.,J.Virol.2001,75(24)；12161－12168)。殘基235與237已因此雙雙被突變成丙胺酸殘基(Brett et al.Immunology 1997,91；346－353；Bartholomew et al.Immunology 1995,85；41－48；以及WO9958679)以降低兩者的補體媒介與FcγR媒介的效應。

吾人可以將一回收受體結合表位(salvage receptor binding epitope)併入抗體中以增加血清半衰期參見US 5,739,277。

目前有五種被認定的人類Fcγ受體，FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa以及新生兒FcRn。Shieldset al ,(2001)J.Biol.Chem 276,6591－6604證實一組常見的IgG1殘基涉及結合所有FcγRs，而FcγRII與FcγRIII採用這個常見組以外的不同位址。當被改變成丙胺酸：Pro－238、Asp－265、Asp－270，Asn297以及Pro－239，一群IgG1殘基降低對所有FcγRs的結合。所有都在IgG CH2領域中並且在鄰近連結CH1以及CH2的樞紐處群集。FcγRI只採用共有IgG1殘基以供結合，FcγRII與FcγRIII除了共有以外與不同殘基交互作用。某些殘基的改變僅降低對FcγRII(例如Arg－292)或FcγRIII(例如Glu－293)的結合。某些變異體顯示對FcγRII或FcγRIII的經增進的結合但不影響對其它抗體(例如Ser－267Ala增進對FcγRII的結合但對FcγRIII的結合是不受影響的)的結合。其它變異體顯示以對其他受體之結合的降低對FcγRII或FcγRIII之被增進的結合(例如Ser－298Ala增進結合至FcγRIII並且降低結合至FcγRII)。對於FcγRIIIa來說，最佳結合的IgG1變異體在Ser－298、Glu－333以及Lys－334具有組合之丙胺酸取代。咸信新生兒FcRn受體涉及保護IgG免於分解並且因而增強血清半衰期與穿胞運輸(transcytosis)跨越過組識(參見Junghans R.P(1997)Immunol.Res 16.29－57 and Ghetieet al (2000)Annu.Rev.Immunol.18,739－766)。被決定直接地與人類FcRn交互作用的人類IgG1殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311，Asn434以及His435。

本發明的治療多肽可以併入任何上面的恆定區修飾。

2.製造方法

本發明的抗體可以在轉殖生物中被製造，諸如山羊(參見Pollocket al (1999),J.Immunol.Methods 231：147－157)、雞(參見Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News 20：1－55)、小鼠(參見Pollocket al 出處同上)或植物(參見Doran PM,(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11,199－204,Ma JK－C(1998),Nat.Med.4；601－606.Baez Jet al ,BioPharm(2000)13：50－54, Stoger E et al；(2000)Plant Mol.Biol.42：583－590)。抗體也可以透過化學合成而被製造。然而，本發明的抗體典型地是使用對於那些習於該技藝者來說為熟知的重組型細胞培養技術來製造。編碼該抗體的一多核苷酸被分離並且被插入一可複製的載體(諸如一質體)中以供進一步的選殖(擴增)或在一宿主細胞中的表現。一種實用的表現系統是一麩胺酸合成酶系統(諸如由Lonza Biologics所販售的)，尤其地其中宿主細胞為CHO或NS0(見下)。編碼該抗體的多核苷酸是使用習知操作步驟(例如寡核苷酸探針)而易於被分離並且被定序。可被使用的載體包括質體、病毒、噬菌體、轉位子、袖珍染色體，其中質體是一種典型的實施例。通常此類載體更包括一訊號序列、複製源點、一或數個標記基因、一增強子要素、一被操作地連結至輕和/或重鏈多核苷酸以促進表現的啟動子與轉錄終止序列。編碼輕與重鏈的多核苷酸可以被插入個別的載體中並且同時地或依序地被引入相同的宿主細胞(例如透過轉形、轉染、電穿孔或轉導)或，若所欲時，重鏈與輕鏈兩者可以在此導入之前被插入相同載體。

對於那些習於該技藝者來說為立即明白的是，因為遺傳密碼的表現多型(redundancy)，對於那些此處所揭示者的替代性多核苷酸(將編碼本發明的多肽)也是可使用的。

訊號序列 本發明的抗體可以如同一融合蛋白(帶有一於成熟蛋白質的N端具有一專一性切割位址的異源性訊號序列)般被製造。該訊號序列理應被宿主細胞所辨識並且處理。對於真核宿主細胞來說，訊號序列可以是鹼性磷酸酶、青黴素酶、或熱穩定性腸毒素II領導子。對於酵母菌分泌來說，訊號序列可以是一酵母菌轉化酶領導子、α因子領導子或酸性磷酸酶領導子參見例如WO90/13646。在哺乳動物細胞系統中，病毒分泌領導子諸如單純皰疹gD訊號以及一天然免疫球蛋白訊號序列(諸如人類Ig重鏈)是可利用的。典型地訊號序列是呈閱讀框架地被接合到編碼本發明之抗體的多核苷酸。

複製源點 利用適於大多數革蘭－陰性細菌的pBR322、用於大多數酵母菌的2 μl質體以及用於大多數哺乳動物細胞之各種不同病毒源點(諸如SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV)的複製源點在該技藝中為已知的。對於被合併的哺乳動物表現載體來說，複製源點組成通常是不需要的，除非載體繁殖在E.Coli中是需要的。然而SV40 ori可被採用，因為它含有早期啟動子。

選擇標記 典型的選擇基因編碼(a)給予對抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素、甲氨喋呤或四環素)的抗性或(b)補體營養缺陷或複合培養基中沒有提供可供利用的養分或(c)兩者的組合的蛋白質。選擇方案需要阻止不含有載體(vector)或載體(vectors)之宿主細胞的生長。細胞(其已成功地被轉形以編碼本發明之治療多肽的基因)，因為藉由共－投遞的選擇標記所提供的藥物抗性而存活下來。一個實例是DHFR－選擇系統，其中轉形株在DHFR陰性宿主菌株中被產生(例如參見Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9：64－68)。在此系統中DHFR基因與本發明之抗體多核苷酸序列被共投遞且DHFR陽性細胞接著透過核苷撤回(nucleoside withdrawal)而被選出。若需要的話，DHFR抑制劑甲氨喋呤也可以被用來選擇帶有DHFR基因擴增的轉形株。透過將DHFR基因可操作地連接至本發明之抗體編碼序列或其功能衍生物，DHFR基因擴增造成感興趣之所欲抗體序列的伴隨擴增。對於這個DHFR/甲氨喋呤選擇與擴增來說，CHO細胞是一株特別實用的細胞株並且選擇使用DHFR系統來擴增並選擇宿主細胞的方法在該技藝中已被充分建立參見Kaufman R.J.et al J.Mol.Biol.(1982)159,601－621，有關於回顧，參見Werner RG,Noe W,Kopp K,Schluter M,”Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”,Arzneimittel－Forschung.48(8)：870－80,1998 Aug.。又一個實例是麩胺酸合成酶表現系統(Lonza Biologics)。有關於使用在酵母菌中的一適當選擇基因是trp1基因；參見Stinchcombet al Nature 282,35,1979。

啟動子 用於表現本發明之抗體的適當啟動子被操作地連結至編碼該抗體的DNA/多核苷酸。用於原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、貝他－內醯胺酶以及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸以及雜交啟動子諸如Tac。適用於在酵母菌細胞之表現的啟動子包括3－磷酸甘油酸激酶或其他糖解酵素例如尤其是烯醇酶、甘油醛3磷酸去氫酶、六碳糖激酶、丙酮酸去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸異構酶、3－磷酸甘油酸變位酶以及葡萄糖激酶。誘導的酵母菌啟動子包括尤其是酒精去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、重金屬蛋白質以及負責氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用的酵素。

用於在哺乳動物細胞系統之表現的啟動子包括尤其是RNA聚合酶II啟動子(包括病毒啟動子諸如多瘤、禽痘以及腺病毒(例如腺病毒2))、牛乳頭狀瘤病毒、鳥類肉瘤性病毒、細胞巨大病毒(特別是極早期基因啟動子)、反轉錄病毒、B型肝炎病毒、肌動蛋白、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子以及早期或晚期猴病毒40與非－病毒啟動子(諸如EF－1阿伐)(Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17)：5322))。啟動子的選擇是根據與被用來表現之宿主細胞的適當相容性。

增強子要素 若適當的話，例如用於在較高等的真核生物的表現，額外的增強子要素可以被包括在內以取代或還有那些位在上述啟動子中所發現的。適當的哺乳動物增強子序列包括來自血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白、重金屬蛋白質以及胰島素的增強子要素。另擇地，吾人可使用來自一真核生物細胞病毒的增強子要素諸如SV40增強子、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子、桿狀病毒增強子或鼠類IgG2a基因座(參見WO04/009823)。雖然此類增強子典型地以一相對於啟動子為上游的位址被定位在載體上，它們也可以位在別處例如未轉譯區之中或聚腺苷酸化訊號下游。增強子的選擇以及位置是根據與被用來表現之宿主細胞的適當相容性。

聚腺苷酸化/終止 在真核生物系統中，聚腺苷酸化訊號是被操作地連結至編碼本發明之抗體的多核苷酸。此訊號典型地位在開放閱讀框架的3’。在哺乳動物系統中，非限定實例訊號包括那些衍生自生長激素、延長因子－1阿伐以及病毒(例如SV40)基因或逆轉錄病毒長終端重覆序列。在酵母菌系統中聚腺苷酸化/終止訊號的非限定實例包括那些衍生自磷酸甘油酸激酶(PGK)以及酒精去氫酶1(ADH)基因者。在原核生物系統中聚腺苷酸化訊號典型地是不被需要的並且通常採用較短或更為限定的終止子序列來取代。聚腺苷酸化/終止序列的選擇是根據與被用來表現之宿主細胞的適當相容性。

其它用於被增強之產量的方法/要素 除了上面以外，其它可以被採用來增強產量的要素(features)包括染色體重組要素、插入序列(intron)以及宿主－細胞專一性的密碼子修飾。本發明之抗體的密碼子使用可以被修飾以適應宿主細胞的密碼子偏好(codon bias)以加強轉錄和/或產量(例如Hoekema A et al Mol Cell Biol 1987 7(8)：2914－24)。密碼子的選擇是根據與被用來表現之宿主細胞的適當相容性。

宿主細胞 用於選殖或表現編碼本發明之抗體的適當宿主細胞是，例如原核生物、酵母菌或較高等的真核生物細胞。適當的原核生物細胞包括真細菌例如腸內桿菌科諸如大腸桿菌屬(例如E.Coli(舉例來說ATCC 31,446；31,537、27,325)、腸內桿菌屬、伊文氏桿菌屬、克留氏菌屬變形桿菌屬、沙氏桿菌(例如鼠傷寒沙氏桿菌)、鋸桿菌屬(例如黏質沙雷氏菌)以及志賀桿菌屬)還有桿菌屬(諸如芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌)(參見DD 266 710)、假單胞菌屬(諸如綠膿桿菌)與鏈絲菌屬。在酵母菌宿主細胞中，酵母菌、粟酒裂殖酵母、克魯維酵母(例如ATCC 16,045；12,424；24178；56,500)、耶羅威亞酵母(EP402,226)、甲醇畢赤酵母菌(EP183,070，亦參見Peng et al J.Biotechnol.108(2004)185－192)、念珠菌屬、里氏木黴(EP244,234)、青黴菌、高山彎頸黴以及麴菌屬宿主諸如小巢狀麴菌與黑色麴菌也可以被思及。

雖然原核生物與酵母菌宿主細胞可以明確地被本發明所思及，然而典型地，本發明的宿主細胞為脊椎動物細胞。適當的脊椎動物宿主細胞包括哺乳動物細胞諸如COS－1(ATCC No.CRL 1650)COS－7(ATCC CRL 1651)、人類胚腎臟株293、、PerC6(Crucell)、幼倉鼠腎臟細胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC No：CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573)、中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO－K1，ATCC No：CCL 61)、DHFR－CHO細胞株諸如DG44(參見Urlaubet al ,(1986)出處同上)，特別地那些適用於懸浮培養的CHO細胞株、小鼠賽特利細胞、猴腎臟細胞、非洲綠猴腎臟細胞(ATCC CRL－1587)、HELA細胞、犬類腎臟細胞(ATCC CCL 34)、人類肺臟細胞(ATCC CCL 75)、Hep G2以及骨髓瘤或淋巴瘤細胞例如NS0(參見US 5,807,715)、Sp2/0、Y0。

因此在本發明的一實施例中提供一個經穩定轉形的宿主細胞，其包含有編碼如此處所述之治療抗體的一重鏈和/或輕鏈的載體。典型地此宿主細胞包含有一編碼輕鏈的第一載體以及一編碼該重鏈的第二載體。

此宿主細胞也可以進一步被處理或改造以修飾本發明之抗體的品質、功能和/或產量。非限定實例包括特定修飾(例如糖化)酵素以及蛋白摺疊帶位子(protein folding chaperones)的表現。

細胞培養方法 以編碼本發明之治療抗體的載體轉形的宿主細胞可以由任何為那些習於該技藝者所熟知的方法來被培養。宿主細胞可以被培養在攪拌培養瓶(spinner flasks)、震盪培養瓶(shake flasks)、滾瓶(roller bottles)或中空纖維系統但對於大規模生產來說攪拌槽反應器(stirred tank reactors)或袋式反應器(例如Wave Biotech,Somerset,New Jersey USA)特別被偏好用於懸浮培養。典型地攪拌槽被改造以供使用例如噴灑器、擋板或低剪葉輪的曝氣。對於氣泡塔(bubble column)與氣舉式反應器(air1ift reactor)來說，利用空氣或氧氣氣泡的直接曝氣可以被使用。若宿主細胞被培養在無血清的培養基中，培養基偏好被補充以一細胞保護劑(諸如普盧蘭尼克F－68)以協助預防細胞損傷(像是曝氣處理的結果)。根據宿主細胞特性，微載體(microcarriers)可以被用作為用於錨泊依賴性細胞株的生長物質或細胞可被適應於懸浮培養(其為典型的)。宿主細胞的培養，特別是脊椎動物宿主細胞可以採用各種不同的操作模式諸如批次、饋料－批次、重複批次處理(參見Drapeauet al (1994)cytotechnology 15：103－109)、延長的批次處理或灌注培養。雖然經重組轉形的哺乳動物宿主細胞可以被培養在含有血清的培養基(諸如含有胎牛血清的培養基)中，此類宿主細胞被偏好培養在若需要的話補充以一能量來源(諸如葡萄糖與合成生長因子(諸如重組型胰島素))的無合成血清的培養基(諸如Keenet al (1995)Cytotechnology 17：153－163中所揭示的或商業上可取得之培養基(諸如ProCHO－CDM或UltraCHO^TM (Cambrex NJ,USA))中。宿主細胞的無血清培養可能需要那些細胞適應生長在無血清條件中者。一種適應法是培養此宿主細胞在含有血清的培養基中並且重複地將80%的培養基更換成無血清的培養基，以使得宿主細胞在無血清條件中學習適應(參見例如Scharfenberg Ket al (1995)in Animal Cell technology：Developments towards the 21st century (Beuvery E.C.et al eds),pp619－623,Kluwer Academic Publisher)。

被分泌至培養基中之本發明的抗體可以使用各種不同技術而從培養基中被回收並且純化以提供一適於所欲用途的純化等級。舉例來說，當相較於含有治療抗體的培養基，本發明之治療抗體用於治療人類患者的用途典型地委託如同由還原SDS－PAGE所決定的至少95%純度、更典型地98%或99%純度。在第一例中，來自培養基的細胞碎片典型地使用離心接著為一使用例如微過濾、超過濾和/或深層過濾的上清液的澄清步驟而被移除。另擇地，抗體可以透過不需要先前離心地經由微過濾、超過濾或深層過濾而被收穫。各種不同的其他技術(諸如透析以及凝膠電泳)與層析技術(諸如羥基磷灰石(HA)、親和力層析法(選擇性地涉及一諸如聚組胺酸的親和力標籤系統)和/或疏水性交互作用層析法(HIC，參見US 5,429,746))是可利用的。在一實施例中，本發明的抗體，在各種不同的澄清步驟之後，使用蛋白質A或G親和力層析法接著更進一步的層析步驟(諸如離子交換和/或HA層析法、陰離子或陽離子交換、分子大小排斥層析與硫酸銨沉澱)而被捕獲。典型地，各種不同的移除步驟也可以被採用(例如使用例如一DV－20濾器的奈米過濾)。接著這些不同的步驟，一含有至少10mg/ml或更高(例如100mg/ml或更高)之本發明的抗體的純化(典型地單株)製備物被提供並且因而形成本發明的一實施例。達100mg/ml或更高的濃度可以透過超速離心而被產生。適當地此製備物基本上沒有本發明之抗體的聚集形式。

細菌系統特別地適用於抗體片段的表現。此片段是細胞內地或在細胞間質為局部的。不可溶細胞間質蛋白可以根據為那些習於該技藝者所熟知的方法(參見Sanchezet al (1999)J.Biotechnol.72,13－20以及Cupit PMet al (1999)Lett Appl Microbiol,29,273－277)所萃取並且再折疊以形成活化蛋白。

3.藥學組成物以及投藥模式

如上文中所述之本發明的抗體的經純化製備物，可以被併入藥學組成物以供治療那些諸如上面概述的人類疾病以及異常的用途。典型地此組成物進一步包含有一像是已知並且被一可接受之藥學顆粒所需要的藥學上可接受(亦即惰性)的載劑，參見例如Remingtons Pharmaceutical Sciences,16th ed,(1980),Mack Publishing Co.。此載劑的實例包括經滅菌的載劑諸如食鹽水、林葛爾氏溶液或葡萄糖溶液、以適當緩衝劑予以緩衝至一範圍為5至8的pH內。用於注射(例如藉著靜脈內、腹胺內、皮內、皮下、肌肉內或門靜脈內)或連續灌注的藥學組成物適當地沒有可見微粒物質並可包含從0.1mg至10g的治療抗體，典型地介於5mg與25mg的抗體。用於製備此藥學組成物之製備物的方法對於那些習於該技藝者為已知的。在一實施例中，藥學組成物包含有呈單位劑量形式從0.1 mg至10g之本發明的治療抗體，選擇性地連同供使用的指示。本發明之藥學組成物可以被凍乾(冷凍乾燥的)以供在投藥之前根據對於那些習於該技藝者為已知或顯而易見之方法的復原。若本發明之實施例包含有本發明之抗體(帶有IgG1同型)，一銅的螯合劑諸如檸檬酸(例如檸檬酸鈉)或EDTA或組胺酸可以被添加到該藥學組成物中以降低此同型之抗體的銅－媒介的分解，參見EP0612251。

用於投藥本發明之抗體的有效劑量以及治療攝生法通常是憑經驗地被決定並且視諸如患者的年齡、體重以及健康狀態與要被治療之疾病與異常的因素而定。此因素在臨床醫師的權限中。選擇適當劑量的諮詢可以在例如Smithet al (1977)Antibodies in human diagnosis and therapy,Raven Press,New York中被找到，但一般來說將是介於0.1mg與1g。在一實施例中，用於治療一人類患者的投藥攝生法為0.1mg至10g之本發明的治療抗體，被每周或每兩周一次皮下地被投藥或透過每1或2個月的靜脈內灌注。本發明的組成物也可以被預防地被使用。

4.臨床用途

本發明有關於一種結合至人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78的抗體。本發明亦涉及利用該抗體來治療疾病或異常的方法，該疾病或異常的特徵在於人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78之一或數者被升高或不平衡的位準，特別地COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，和/或子宮內膜異位，含有該抗體的藥學組成物以及製造方法。

本發明也有關於一抗體在製造一用於治療疾病或異常的醫藥品上的用途，該疾病或異常的特徵在於人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78之一或數者被升高或不平衡的位準，特別地COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷，或子宮內膜異位。雖然主要地有關於治療人類疾病或異常的本發明已被描述，本發明也具有在非－人類哺乳動物中治療類似疾病或異常的應用。

特定實施例 實施例1. 小鼠單株抗體656.35、197.2以及81.1的產生

一種對抗標的趨化激素(人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬，以及ENA－78)之五－專一性mAb的產生 多樣方法以及方案被用來免疫小鼠以試圖產生五－專一性mAbs。五－專一性mAbs是使用各種不同的多重抗原性胜肽(multiple antigenic peptides,MAPs)和/或完整標的趨化激素(IL－8、Gro－α、－β、－γ，以及ENA－78)被混合在傳氏完全或不完全佐劑(cFA或iFA)中的混合物，接著一在SJL/JOrlCrl小鼠品系中的經修飾重複免疫多重位址(modified Repetitive Immunization Multiple Sites,RIMMs)操作步驟而被產生。

MAPs或多重抗原性胜肽在免疫操作步驟中提供兩種功能。首先，MAPs允許一種已知標的胺基酸序列對宿主免疫系統的一種選擇性多重呈現。其次，因為經由一個核心(諸如，但不限於離胺酸)而被連結的序列的多重複本，質量的增加提高了該序列的致免疫性超過獨立胜肽所具者(Francis,J.P.,et al.,Immunology,1991：73；249,Schott,M.E.,et al.,Cell.Immuno.1996：174：199－209,Tam,J.P.Proc.Natl.Acad.Sci.1988：85；5409－5413)。第1圖是一組具有胺基酸序列序列辨識編號：49－53之MAPs的簡圖。MAPs中的一連接子可以是離胺酸以外的連接子。

一般免疫時間線(general immunization time line)： 在上面時間線之後的兩種不同的免疫操作步驟製造五－專一性mAbs：1.初次免疫(第0天)由所有標的趨化激素(各10 μg)混合在cFA的多重皮下注射(後軀、背以及頸)所構成。接著4次追加注射由所有標的趨化激素(各10 μg)混合在iFA中的混合物所構成。第5以及所有後續的追加注射由配於iFA的所有標的趨化激素以及所有線性MAPs(linear MAPs)之一雞尾酒(cocktail)所構成。在犧牲與灌注3天之前的最後一次追加注射由配於PBS中之所有標的趨化激素以及MAPs所構成並且經由一腹胺內(IP)注射而被投遞。

2.初次免疫(第0天)由所有五種線性MAPs(各10 μg)混合在cFA的多重皮下注射(後軀、背以及頸)所構成。接著4次追加注射由配於iFA的所有五種線性MAPs(各10 μg)的混合物所構成。第5以及所有後續的追加注射由配於iFA的所有線性MAPs以及所有標的趨化激素之一雞尾酒(cocktail)所構成。在犧牲與灌注3天之前的最後一次追加注射由配於PBS之所有線性MAPs以及所有標的趨化激素(各10 μg)所構成並且經由一腹胺內(IP)注射而被投遞。

實施例2. mAb對標的趨化激素(人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、GCP－2，以及ENA－78)的泛－結合(pan－binding)已經由一時間－分解螢光免疫螢光分析(time－resolved fluorescence immunofluorescent assay,TRFIA)而被確認

簡言之，各個抗原(人類IL－8、Gro－阿伐、Gro－貝他、Gro－伽馬、GCP－2，以及ENA－78，與hIL－18當使用時作為一陰性對照組)被個別地塗覆至一個96－井的免疫螢光平盤上。平盤接著被洗滌並且以一商業上可取得的封阻溶液(blocking solution)予以封阻。封阻溶液被清空且含有mAb的樣品被加入至各井中且被培養歷時40至60分鐘(這允許mAb結合至標的趨化激素)。平盤接著被再次洗滌且一偵測Ab被加入至各井。偵測試劑是如下列被分別地用於2X656.35、嵌合體(HcLc)以及人類化MAbs：經生物素化的抗－小鼠IgG、經生物素化的抗－人類IgG Fab2試劑，以及銪抗－人類IgG。偵測抗體被綴合到銪或生物素。在另一回合的洗滌以移除未結合的偵測Ab之後，一鏈黴抗生物素－銪被加入至生物素偵測的分析中。鏈黴抗生物素－銪結合至能夠允許偵測的生物素。在一最終洗滌以移除未結合的鏈黴抗生物素－銪之後，或於人類化MAb分析中在銪綴合二級抗體被洗滌之後，各井被填入螯合清潔劑溶液以活化銪產生螢光。所記錄的螢光越強是與出現在井中的偵測Ab(其直接地連結)之數量呈等比例並與趨化激素結合mAb之數量呈等比例。

第5A圖顯示小鼠656.35 mAb對標的人類趨化激素的結合。

第5B圖顯示嵌合體抗體(HcLc)mAb對人類標的趨化激素的結合。

第5C圖顯示人類化mAbs對人類標的趨化激素的結合。

實施例3. 藉由鼠類mAb的功能性泛－抑制是使用各種不同的方法被確認：CXCR2媒介的Ca ^2＋ 活動作用、人類嗜中性球趨化性，以及人類嗜中性球活化(CD11b表面表現)

一以鈣活動作用分析為基礎的微量平盤，FLIPR(螢光影像平盤讀取儀，Molecular Devices,Sunnyvale CA,[Schroeder,1996])被用於抗體在CHO－K1細胞(以hCXCR2與Gα16轉形並且穩定地表現hCXCR2與Gα16)之ELR＋趨化激素誘導的[Ca^2＋ ]i－移動作用上之中和效應的功能性特徵描述。

在分析的前1天，細胞以一為每井40000個細胞的濃度被平盤置於96井，黑壁、透明底部平盤(Packard View)中。在18至24小時後，培養基自細胞被吸出並且置換以100 μl含有伊格爾氏最低必需培養基(具有Earl’s鹽以及L－麩醯胺酸、0.1% BSA(Serologicals Corporation)、4 μM氟－4－乙醯氧甲基酯螢光指示劑染料(Fluo－4 AM)與2.5 mM丙磺舒)的負載培養基。細胞在含有此染料的培養基中於37℃下被培養歷時1小時。含有染料的培養基接著自細胞被吸出並且置換以不具有Fluo－4 AM但具有0.1%明膠(BSA被移除) 與2.5 mM丙磺舒的相同培養基。細胞於37℃下被培養歷時10分鐘且接著以KRH分析緩衝液[Krebs Ringer Henseleit(120 mM NaCl,4.6 mM KCl,1.03 mM KH₂ PO₄ ,25 mM NaHCO₃ ,1.0 mM CaCl₂ ,1.1 mM MgCl₂ ,11 mM葡萄糖,20 mM HEPES(pH 7.4))以及0.1%明膠與2.5 mM丙磺舒]洗滌3次。在最後一次緩衝液洗滌之後，具有0.1%明膠與2.5 mM丙磺舒的100 μl的KRH分析緩衝液被加入細胞並且在被置放於FLIPR(其中染料負載細胞被暴露於來自6瓦氬雷射的激發光(488 nm))之前被升溫至37℃歷時10分鐘。[Ca^2＋ ]i－移動作用如一Fluo－4當被結合至Ca^2＋時在516 nm的發射強度之結果被監測。發射強度的變化與細胞溶質鈣水準，[Ca^2＋ ]i是直接相關的。在監測基線歷時10秒鐘之後，50μl的3X ELR＋趨化激素，其以一抗體的濃度範圍被預－培養者，被加入至細胞平盤且資料被每秒收集歷時1分鐘，接著為一個呈3秒鐘間隔紀錄的額外半分鐘。最大細胞反應基準讀取被輸出以供在GraphPad Prism(v4.03)中作圖。

IC₅₀ 被定義為在3X EC₈₀ 趨化激素的預－處理期間，用以中和ELR＋趨化激素的一EC₈₀ 濃度之CXCR2媒介的刺激效用達50%所需的抗體濃度。對25 μM ATP的次級細胞反應被監測以測試細胞存活率[Sarau,1999]。

表：藉由3種鼠類mAb的ELR＋趨化激素誘導的鈣流動的抑制(按幾何級數平均的IC50，ug/ml)。(n＝3至6)(n.d.＝未決定的，N/A＝未測得的)

Schroeder KS,Neagle,BD.FLIPR：a new instrument for accurate,high throughput optical screening.J.Biomol.Screen .1996：1－75。

Sarau HM,Ames RS,Chambers J,Ellis C,Elshourbagy N,Foley JJ et al.Identification,molecular cloning,expression and characterization of a cysteinyl leukotrien receptor.Mbl.Pharmacol .1999；56：657－663。

IL－8刺激的人類嗜中性球趨化性的抑制亦使用一微－Boyden室(micro－Boyden chamber)而被證實。該微－Boyden裝置由兩個小胺室(一為上一為下的3－公忽多孔膜)所組成。下胺室被負載以趨化劑(亦即IL－8)或五－專一性mAb與趨化激素之混合物。上胺室含有經純化的非－活化人類嗜中性球。一但胺室被組合，從底部的井往上有一濃度梯度被形成，刺激嗜中性球趨化跨越膜。該分析被表示為一CI(趨化性指標(chemotactic index))，其為對一刺激劑起反應而趨化的細胞數目相對於未受刺激之趨化細胞數目的比例。在下胺室中以五－專一性mAb預培養的趨化激素(亦即IL－8)，劑量依賴地抑制以IL－8刺激的嗜中性球趨化性。IL－8於10 nM達到一為3.6±0.8的CI。IL－8與漸增濃度之五－專一性mAb(656.35)的預培養劑量依賴地抑制人類嗜中性球趨化性，顯著性在使用1 μg/ml的CI為2.2±0.6被達到。因為分析的數量與敏感性，其他趨化激素無法被檢驗(Gro－α、－β、－γ，以及ENA－78)。

經由監測CD11b之表面表現的經純化的人類嗜中性球活化的抑制。CD11b與Mac－1媒介至受質的吸附、聚集以及趨化性並且在經表面活化之嗜中性球被知曉是向上調節的(Molad,Y.,J.,et al.,Clin.Immunol.Immunopathol.1994：71；281－286)。簡言之，非－活化的人類嗜中性球被純化並且體外地以標的趨化激素(亦即IL－8)予以刺激或以帶有一趨化激素五－專一性mAb預培養的趨化激素刺激。資料被呈現為由於IL－8刺激之被設定最大CD11b表現之活化百分比。利用656.35 mAb之IL－7的預培養劑量依賴地抑制CD11b之表面表現的被增加水準並且因而象徵嗜中性球的活化的抑制(於0.01、0.1、1、10與50 μg/ml分別地79.9%±3.7，48.5%±7.2，28.7%±3.2，及31.6%±3.4)。

實施例4. 有關於各標的趨化激素(人類IL－8、Gro－貝他，以及ENA－78)的五專一性mAbs締合/解離值

用於Biacore分析的方法 有關於被稱為KL的實驗，兔子抗小鼠IgG－Fc(Biacore BR－1005－14)是根據製造商的指示藉由一級胺偶合而被固定於一個CM5晶片上。

有關於被稱為BE的實驗，藉由胺偶合而被直接地固定至晶片的經純化抗體被使用。

來自親代小鼠mAb的上清液或經純化的抗體被捕捉於抗－小鼠IgG－Fc表面。預定濃度的各個分析物(IL－8、Gro－beta，以及ENA－78)被通過經固定或補捉的抗體表面，一個獨立的捕捉事件被用於各個分析物注射。在分析物的各個注射之後，表面藉由注射一弱酸性溶液而被刷新(regenerated)，該弱酸性溶液移除被捕捉的抗體但是既不會顯著影響到抗小鼠mAb IgG－Fc表面施行另一次捕捉事件的能力也不會影響被直接地固定的抗體。一個緩衝液的注射亦被注射蓋過經抗體捕捉的表面且這被用於雙重參考(double referencing)。數據是使用機器所內建的分析軟體而被分析，採用結合的1：1模型。

實施例5

表位繪圖(epitope mapping) 656.35 mAb被表位繪圖並且被發現到結合人類IL－8的KELRCQCIKTYSKP(序列辨識編號：54)之內。因此在另一實施例中，本發明有關於一種結合人類IL－8的序列辨識編號：54之表位的五－專一性抗體。

實施例6.一種從具有序列辨識編號：56的重鏈序列，以及序列辨識編號：58的輕鏈序列的656.35被做出的嵌合體抗 體(此抗體將被指涉為嵌合體抗體)的656.35效力研究

－活體內研究：一種吸入性LPS急性肺臟發炎模型被用來檢驗該一五－專一性抗體抑制嗜中性球浸潤入非－人類靈長類的肺臟(NHPs－馬來猴)。簡言之，NHP(非－人類靈長類)被預先篩選有關健康以及對被外源性加入的IL－8(cynoIL－8)的反應性。選定的NHP接著在第一次LPS挑戰前五天參加基線樣品收集(血液以及支氣管肺泡灌洗術(bronchoalveolar lavage)－BAL)。挑戰的LPS由以一個克他明HCl的單一IM注射(~10 mg/)來鎮靜NHP所組成。一但NHP被鎮靜，麻醉劑經由一個丙泊酚(propofol)的靜脈內灌注(~0.2 mg/kg/min，若需要的話)被投藥。經麻醉的動物被置放在循環溫水加熱毯和/或在一循環熱水毯內且一眼潤滑劑(ophthalmic lubricant)被投藥給各個眼。動物接著被插管並且機械地通氣以供挑戰操作步驟。一個體積調節的正壓通氣機在操作步驟期間被使用(Stoelting Cat/Rabbit ventilator www.stoeltingco.com Cat#5019510)。脂多醣(LPS)挑戰是經由使用一DeVilbiss Ultraneb－99超音波噴霧器的噴霧吸入而被施行。經霧化的LPS以100 ug/ml被投藥歷時5分鐘。心率、體溫，以及呼吸速率在挑戰操作步驟期間被監測並且記錄。初次挑戰確認NHP對LPS起反應(增加的嗜中性球浸潤入肺臟以及被升高的cynoIL－8水準)。個別的NHP反應是藉由於挑戰後於6以及24－小時的樣品收集而被確認。

經初次LPS挑戰的NHP接著被隨機地分成兩組。在一個4－周的復原後全部參與的NHP經歷另一個基線樣品(血液以及BAL)。在基線測量4天之後實驗組接受一載劑的IV注射或一1 mg/kg的嵌合體抗體的注射。隔天NHP被再次挑戰以經吸入的LPS且用於分析的樣品在挑戰後6與24－小時被收集。在一個額外的復原期間之後，基線樣品從載劑NHP被收集，4天後這些NHP以10 mg/kg被處理以一單一嵌合體抗體的IV栓塞注射。隔日動物被暴露於一LPS挑戰且樣品於6與24－小時被收集以供分析。

LPS吸入是一種急性發炎模型，其刺激一造成增加的嗜中性球進入肺臟的浸潤的趨化性趨化激素(諸如IL－8)升高。有關於嵌合體抗體處理的主要效力參數為抑制嗜中性球浸潤進入以LPS挑戰的NHP的肺臟。嗜中性球浸潤在此急性發炎模型中於LPS挑戰之後的頭24小時發生，於該時間其他發炎過程變得更為顯著。

使用嵌合體抗體的預處理顯著地並且劑量依賴地抑制嗜中性球進入經LPS挑戰的NHP之肺臟的浸潤。使用嵌合體抗體的處理亦防止循環的嗜中性球的升高，同時不影響實際嗜中性球功能(亦即吞噬作用的細胞能力)。處理亦不會嚴重地影響其他細胞類型(諸如肺臟或循環中的巨噬細胞/單核球細胞)。參見第2圖。

實施例7

在人類化mAbs上的更多研究 多重人類化五－專一性抗體建構物已被製造，其中4者已被顯示緊密地結合，並且抑制所有標的趨化激素。(有關於各個序列，參見下面的序列資訊)。本分析由親和力測量(BiaCore)、鈣活動作用分析(活體外功能性分析，FLIPR)，以及CD11b人類與NHP嗜中性球刺激分析(體外功能性分析，流式細胞儀)所構成。

－BioCore 一種蛋白質A捕捉法被使用如下來產生有關於人類化以及嵌合建構物的動力學：蛋白質A是根據製造商的指示藉由一級胺偶合而被固定於一個CM5晶片上。經純化的人類化或嵌合抗體被捕捉在蛋白質A表面。預定濃度的各個分析物(IL－8、Gro－β，以及ENA－78)在捕捉之後被通過覆蓋抗體被捕捉的表面，一個獨立的捕捉事件被用於各個分析物注射。在分析物的各個注射之後，表面藉由注射一弱酸性溶液而被刷新，該弱酸性溶液移除被捕捉的抗體但是不會顯著地影響到蛋白質A施行另一次捕捉事件的能力。一個緩衝液的注射亦被注射覆蓋抗體被捕捉的表面且這被用於雙重參考。數據是使用機器所內建的分析軟體而被分析，採用結合的1：1模型。

親合力(KD)是藉由檢驗蛋白質的締合速率(ka)以及解離速率(kd)而被決定。

HcLc意指從具有序列辨識編號：56的重鏈序列，以及序列辨識編號：58的輕鏈序列而被做出的嵌合體抗體。

－功能性分析：使用CHO－K1 CXCR2(w/G α16)的鈣活動作用(FLIPR) 一以鈣活動作用分析為基礎的微量平盤，FLIPR(螢光影像平盤讀取儀，Molecular Devices,Sunnyvale CA,[Schroeder,1996])被用於抗體在CHO－K1細胞(以hCXCR2與Gα16轉形並且穩定地表現hCXCR2與Gα16)之ELR＋趨化激素誘導的[Ca^2＋ ]i－移動作用上之中和效應的功能性特徵描述。

在分析的前1天，細胞以一為每井40000個細胞的濃度被平盤置於96井，黑壁、透明底部的平盤(Packard View)中。在18至24小時後，培養基自細胞被吸出並且置換以100 μl含有伊格爾氏最低必需培養基(具有Earl’s鹽以及L－麩醯胺酸、0.1% BSA(Serologicals Corporation)、4 μM氟－4－乙醯氧甲基酯螢光指示劑染料(Fluo－4 AM)與2.5 mM丙磺舒)的負載培養基。細胞在含有此染料的培養基中於37℃下被培養歷時1小時。含有染料的培養基接著自細胞被吸出並且置換以不具有Fluo－4 AM但具有0.1%明膠(BSA被移除)與2.5 mM丙磺舒的相同培養基。細胞於37℃下被培養歷時10分鐘且接著以KRH分析緩衝液[Krebs Ringer Henseleit(120 mM NaCl,4.6 mM KCl,1.03 mM KH2PO4,25 mM NaHCO3,1.0 mM CaCl2,1.1 mM MgCl2,11 mM葡萄糖,20 mM HEOES(pH 7.4))以及0.1%明膠與2.5 mM丙磺舒]洗滌3次。在最後一次緩衝液洗滌之後，具有0.1%明膠與2.5 mM丙磺舒的100 μl的KRH分析緩衝液被加入細胞並且在被置放於FLIPR(其中染料負載細胞被暴露於來自6瓦氬雷射的激發光(488 nm))之前被升溫至37℃歷時10分鐘。[Ca^2＋ ]i－活動作用如一Fluo－4當被結合至Ca^2＋時在516 nm的發射強度之結果被監測。發射強度的變化與細胞溶質鈣水準，[Ca^2＋ ]i是直接相關的。在監測基線歷時10秒鐘之後，50μl的3X ELR＋趨化激素，其以一抗體的濃度範圍被預－培養者，被加入至細胞平盤且資料被每秒收集歷時1分鐘，接著為一個呈3秒鐘間隔紀錄的額外半分鐘。最大細胞反應基準讀取被輸出以供在GraphPad Prism(v4.03)中作圖。

IC₅₀ 被定義為在3X EC₈₀ 趨化激素的預－處理期間，用以中和ELR＋趨化激素的一EC₈₀ 濃度之CXCR2媒介的刺激效用達50%所需的抗體濃度。對25 μM ATP的依次級細胞反應被監測以測試細胞存活率[Sarau,1999]。

Sarau HM,Ames RS,Chambers J,Ellis C,Elshourbagy N,Foley JJ et al.Identification,molecular cloning,expression and characterization of a cysteinyl leukotrien receptor.Mol.Pharmacol .1999；56：657－663。

－體外CD11b人類嗜中性球刺激分析流式細胞儀是透過下面物理性細胞變化(大小以及外型－粒化(granulation))以及透過檢驗表面活化標記(被增加的CD11b表面表現)被用來檢驗人類化五－專一性抗體防止趨化激素誘導的人類經純化的嗜中性球活化的能力。嗜中性球對照組刺激劑fMLP被用來確認經純化的人類嗜中性球來活化的能力。參見第4圖。

序列資訊 總RNA從656.35、197.2以及81.1融合瘤細胞被萃取，重以及輕可變領域cDNA序列接著藉由反轉錄以及聚合酶鏈反應(RT－PCR)而被產生。用於RT－PCR的前向引子是一個對於鼠類免疫球蛋白基因領導子－序列專一的簡併引子而反向引子是對抗體恆定區(在本例中同型IgG2a/)專一的。引子是根據Jones and Bendig(Bio－Technology 9：88,1991)所描述的策略來設計。有關於兩種V－區序列的RT－PCR是二重複地被施行以供能夠正確的V－區序列的隨後確認。由RT－PCR所產生的V－區產物被選殖(Invitrogen TA Cloning Kit)且序列數據被獲得。此個過程對於81.1輕可變領域來說是不成功的。因此，被顯示在下面的胺基酸序列(序列辨識編號：12)因而是透過蛋白質定序從一在還原條件下進行的SDS－聚丙烯醯胺凝膠被分離出之輕鏈而被產生。

互補決定區(CDRs)被繪上底線。

有關於656.35之有關重與輕可變區的多核苷酸序列(序列辨識編號：1與3，分別地)：序列辨識編號：1 CAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGACGATATCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAACTACTGGATAGTTTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGGAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCACCTCATTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCACTGGGGCCAAGGGTCTCTGGTCACTGTCTCTGCA

序列辨識編號：3 GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGTCTGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGTCAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGCTGGTATCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATTACGCTACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTCAAGATTATTCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG

有關於656.35之有關重與輕可變區的多肽序列(序列辨識編號：2與4，分別地)：序列辨識編號：2 QVQLQQSGAELVRPGTSVTISCKASGYTFINYWIV WVKQRPGHGLEWIGDLYSGGGYTFYSENFKG KATLTADTSSSTAYMHLISLTSEDSAVYFCARSGYDRTWFAH WGQGSLVTVSA

序列辨識編號：4 DIKMTQSPSSMSASLGERVTITCQASQDIESYLS WYQQKPWKSPKTLIYYATRLAD GVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPPT FGAGTKLELKR

有關於656.35之有關重鏈CDRs的多肽序列(序列辨識編號：13、14、15，分別地)：序列辨識編號：13 NYWIV

序列辨識編號：14 DLYSGGGYTFYSENFKG

序列辨識編號：15 SGYDRTWFAH

有關於656.35之有關輕鏈CDRs的多肽序列(序列辨識編號：16、17、18，分別地)：序列辨識編號：16 QASQDIESYLS

序列辨識編號：17 YATRLAD

序列辨識編號：18 LQHGESPPT

有關於656.35之有關重鏈CDRs的多核苷酸序列(序列辨識編號：31、32、33，分別地)：序列辨識編號：31 AACTACTGGATAGTT

序列辨識編號：32 GATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGG

序列辨識編號：33 TCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCAC

有關於656.35之有關輕鏈CDRs的多核苷酸序列(序列辨識編號：34、35、36，分別地)：序列辨識編號：34 CAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGC

序列辨識編號：35 TACGCTACAAGGTTGGCAGAT

序列辨識編號：36 CTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACG

有關於197.2之有關重與輕可變區的多核苷酸序列(序列辨識編號：5與7，分別地)：序列辨識編號：5 GAGTTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTAATTAATCCTAAGTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACCAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATCACTGTGCAAGAGGAATGGGACTCCTCTTTGGTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA

序列辨識編號：7 GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCARAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTTTCCGTGCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG

有關於197.2之有關重與輕可變區的多肽序列(序列辨識編號：6與8，分別地)：序列辨識編號：6 EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNMN WVKQSNGKSLEWIGVINPKYGTTSYNQKFKG KATLTVDQSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYHCARGMGLLFGMDY WGQGTSVTVSS

序列辨識編號：8 DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLA WYQQKPGQPPKLLIYGASTRKS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSFPCT FGGGTKLEIKR

有關於197.2之有關重鏈CDRs的多肽序列(序列辨識編號：19、20、21，分別地)：序列辨識編號：19 DYNMN

序列辨識編號：20 VINPKYGTTSYNQKFKG

序列辨識編號：21 GMGLLFGMDY

有關於197.2之有關輕鏈CDRs的多肽序列(序列辨識編號：22、23、24)：序列辨識編號：22 KSSQSLLNSGNQKNYLA

序列辨識編號：23 GASTRKS

序列辨識編號：24 QNDHSFPCT

有關於197.2之有關重鏈CDRs的多核苷酸序列(序列辨識編號：37、38、39)：序列辨識編號：37 GACTACAACATGAAC

序列辨識編號：38 GTAATTAATCCTAAGTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGC

序列辨識編號：39 GGAATGGGACTCCTCTTTGGTATGGACTAC

有關於197.2之有關輕鏈CDRs的多核苷酸序列(序列辨識編號：40、41、42)：序列辨識編號：40 AAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCC

序列辨識編號：41 GGGGCATCCACTAGGAAATCT

序列辨識編號：42 CAGAATGATCATAGTTTTCCGTGCACG

有關於81.1之有關重鏈可變區的多核苷酸序列(序列辨識編號：9)：序列辨識編號：9 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCTTTCACTGTCTACGGCATGAACTGGGTGAGACAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAATGGATTGGAAATTTTGATCCTTACTTTAGTGTCACTTCCTACAACCAGAAGTTCCAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAAGAACCTCACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGAGCTGGGAAACCATTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

有關於81.1之有關重鏈可變區的多肽序列(序列辨識編號： 10)：序列辨識編號：10 EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTVYGMN WVRQSNGKSLEWIGNFDPYFSVTSYNQKFQD KATLTVDKSSSTAYMQLKNLTSEDSAVYFCARGSWETIFAY WGQGTLVTVSA

有關於81.1之有關重鏈CDRs的多肽序列(序列辨識編號：25、26、27，分別地)：序列辨識編號：25 VYGMN

序列辨識編號：26 NFDPYFSVTSYNQKFQD

序列辨識編號：27 GSWETIFAY

有關於81.1之有關重鏈CDRs的多核苷酸序列(序列辨識編號：43、44、45)：序列辨識編號：43 GTCTACGGCATGAAC

序列辨識編號：44 AATTTTGATCCTTACTTTAGTGTCACTTCCTACAACCAGAAGTTCCAGGAC

序列辨識編號：45 GGGAGCTGGGAAACCATTTTTGCTTAC

有關於81.1之有關輕可變區的多肽序列(序列辨識編號：12)：QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYAN WVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHV FGGGTKLTVLQPK

有關於81.1之有關輕鏈CDRs的多肽序列(序列辨識編號：28、29，以及30，分別地)：序列辨識編號：28 RSSTGAVTTSNYAN

序列辨識編號：29 GTNNRAP

序列辨識編號：30 ALWYSNHV

一嵌合體^＊多核苷酸序列(可變重區＋經密碼子最佳化的IgG1)序列辨識編號：55 CAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGACGATATCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAACTACTGGATAGTTTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGGAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCACCTCATTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCACTGGGGCCAAGGGTCACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

一嵌合體^＊多肽序列(可變重區＋經密碼子最佳化的IgG1)序列辨識編號：56 QVQLQQSGAELVRPGTSVTISCKASGYTFTNYWIVWVKQRPGHGLEWIGDLYSGGGYTFYSENFKGKATLTADTSSSTAYMHLISLTSEDSAVYFCARSGYDRTWFAHWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

一嵌合體^＊多核苷酸序列(可變輕區＋經密碼子最佳化的人類cK)序列辨識編號：57 GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGTCTGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGTCAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGCTGGTATCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATTACGCTACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTCAAGATTATTCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

嵌合體^＊多肽序列(可變輕區＋經密碼子最佳化的人類cK)序列辨識編號：58 DIKMTQSPSSMSASLGERVTITCQASQDIESYLSWYQQKPWKSPKTLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPPTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

嵌合體^＊意指由鼠類656.35抗體所製造的嵌合抗體

成熟重鏈的H0 DNA序列序列辨識編號：11 CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATCGTGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGACCTGTATAGCGGCGGCGGCTACACCTTCTACAGCGAGAACTTCAAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCGGCTACGACAGGACTTGGTTTGCTCACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

成熟重鏈的H0蛋白質序列序列辨識編號：46 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFINYWIVWVRQAPGQGLEWMGDLYSGGGYTFYSENFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYDRTWFAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

成熟輕鏈的L7 DNA序列序列辨識編號：47 GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCaagCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

成熟輕鏈的L7蛋白質序列序列辨識編號：48 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

成熟輕鏈的L8 DNA序列序列辨識編號：59 GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGACAGACTTCACCttcACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATatcGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCaagCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

成熟輕鏈的L8蛋白質序列序列辨識編號：60 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKILIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

成熟輕鏈的L10 DNA序列序列辨識編號：61 GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGcagGACtacACCCTGACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

成熟輕鏈的L10蛋白質序列序列辨識編號：62 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

成熟輕鏈的M0 DNA序列序列辨識編號：63 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGCCACCCTGTCACTGTCTCCCGGCGAAAGGGCAACCCTGAGCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCGAGAGCTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACTACGCCACCAGGCTGGCCGACGGCATTCCCGCCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACTCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCTGCAGCACGGCGAGAGCCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGT GTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

成熟輕鏈的M0蛋白質序列序列辨識編號：64 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCQASQDIESYLSWYQQKPGQAPRLLIYYATRLADGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

第1圖描述一個例示性的MAPs組以產生一個五－專一性抗體。為免疑慮，五個MAP胜肽單元被描述。各個單元含有一個選自於序列辨識編號：49－53之連接子胜狀的相同胺基酸序列。

第2圖顯示比較出現在BAL樣品中的嗜中性球的流式細胞儀數據。時段1、2以及3被呈現。黑色實心槓顯示LPS挑戰前5天的基線。灰色實心槓描述LPS挑戰後6－小時的BAL數據。嵌合體抗體治療顯著地並且劑量依賴地抑制嗜中性球浸潤。灰色陰影槓代表24－小時數據。(n＝6,^＊ p ≦0.05,≦0.01,誤差槓表示標準偏差)。

第3圖顯示總循環嗜中性球的血液學分析(細胞計數)。1 mg/kg(空心正方形，□)以及10 mg/kg(實心圓形，．)的嵌合體抗體(HcLc)的IV注射預防循環嗜中性球之經吸入的LPS刺激。1以及10 mg/kg治療相較於載劑NHP()均顯著地被降低且10 mg/kg相較於1 mg/kg(^＊ )也顯著地被降低。數據被呈現為每ul血液的總計數(n＝6,^＊ p ≦0.05 vs.1 mg/kg,≦0.01 vs.載劑,誤差槓表示標準偏差)。

第4圖顯示經人類IL－8刺激的嗜中性球活化的抑制(被增加的CD11b表面表現)。各種不同濃度的人類化五－專一性抗體與10 nM hIL－8在經純化之人類嗜中性球的加入前被預－培養。數據被表示為4個不同供體的平均值(n＝4)。槓表示標準誤。所有樣品與僅以hIL－8刺激的經純化之嗜中性球比較(在經純化之嗜中性球的添加之前沒有mAb)。人類化建構物H0L10以及H0M0在抑制經hIL－8刺激的CD11b表面表現上是較有效的。

第5A圖顯示小鼠656.35 mAb對標的人類趨化激素的結合。

第5B圖顯示嵌合體抗體(HcLc)mAb對人類標的趨化激素的結合。

第5C圖顯示人類化mAbs對人類標的趨化激素的結合。

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<160> 64

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 鼠類

<400> 1

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 鼠類

<400> 2

<210> 3

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<212> DNA

<213> 鼠類

<400> 3

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<211> 108

<212> PRT

<213> 鼠類

<400> 4

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> 鼠類

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<211> 119

<212> PRT

<213> 鼠類

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<212> PRT

<213> 鼠類

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<212> DNA

<213> 鼠類

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<212> PRT

<213> 鼠類

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<212> DNA

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 鼠類

<400> 13

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<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠類

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<212> PRT

<213> 鼠類

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<212> PRT

<213> 鼠類

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<213> 鼠類

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<212> PRT

<213> 鼠類

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<212> PRT

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<211> 5

<212> PRT

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<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠類

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<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠類

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 鼠類

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 33

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<212> DNA

<213> 鼠類

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<213> 鼠類

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<213> 鼠類

<400> 63

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<211> 214

<212> PRT

<213> 鼠類

<400> 64

Claims

一種抗體，分別地包含序列辨識編號：13、14與15；以及序列辨識編號：16、17與18之CDR胺基酸序列的重及輕鏈可變區。
一種表現載體，分別地包含編碼序列辨識編號：13、14與15；以及序列辨識編號：16、17與18之CDR胺基酸序列之抗體可變重或輕鏈的核苷酸序列。
一種重組型真核或原核細胞，包含如申請專利範圍第2項的表現載體。
一種用以在一個單一宿主細胞中製造抗體的方法，包含有下列步驟：(i)將該單一宿主細胞轉形一編碼含有序列辨識編號：13、14以及15之CDR域之免疫球蛋白重鏈之一可變域的第一DNA序列；以及一編碼含有序列辨識編號：16、17以及18之CDR域之免疫球蛋白輕鏈之一可變域的第二DNA序列；以及(ii)表現該第一DNA序列以及該第二DNA序列以使得該免疫球蛋白重與輕鏈以獨立的分子在該經轉形的單一宿主細胞中被製造。
如申請專利範圍第4項的方法，其中該第一以及第二DNA序列存在於不同的載體或該第一以及第二DNA序列存在於單一載體中。
一種抗體，分別地含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：48、60、62或64之胺基酸序列的重與輕鏈。
如申請專利範圍第6項的抗體，分別地含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：48之胺基酸序列的重與輕鏈。
如申請專利範圍第6項的抗體，分別地含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：62之胺基酸序列的重與輕鏈。
如申請專利範圍第6項的抗體，分別地含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：60之胺基酸序列的重與輕鏈。
如申請專利範圍第6項的抗體，分別地含有序列辨識編號：46以及序列辨識編號：64之胺基酸序列的重與輕鏈。
如申請專利範圍第1項的抗體，其為人類化。
如申請專利範圍第1項的抗體，其具有人類IgG1固定域。
如申請專利範圍第1項的抗體，其具有人類IgG4固定域。
一種藥學組成物，包含申請專利範圍第1、6、7、8、9、10、11、12或13項的抗體以及藥學上可接受的載劑。
一種如申請專利範圍第1、6、7、8、9、10、11、12 或13項之抗體的用途，用於製造下列治療或預防的醫藥品：COPD、骨關節炎、類風濕性關節炎、糜爛性關節炎、氣喘、動脈粥樣硬化、過敏性腸疾、牛皮癬、移植排斥、痛風、癌、急性肺臟損傷、急性肺病、敗血症、ARDS、周邊動脈疾病、全身性硬化、新生兒呼吸性窘迫症候群、氣喘以及COPD的惡化、囊腫纖維化、瀰漫性泛細支氣管炎、再灌注損傷和/或子宮內膜異位。
一種如申請專利範圍第1、6、7、8、9、10、11、12或13項之抗體的用途，用於製造降低嗜中性球趨化性的醫藥品。