MX2008014842A

MX2008014842A - Anticuerpos humanizados contra interleuquina-18 modificados.

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Publication number: MX2008014842A
Application number: MX2008014842A
Authority: MX
Inventors: Paul Andrew Hamblin; Jonathan Henry Ellis; Volker Germaschewski; Ian Kirby
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2007-05-23
Publication date: 2009-02-17
Also published as: KR20090023625A; US8637018B2; EP2027157A2; WO2007137984A3; KR101416078B1; US20170029497A1; AR061115A1; BRPI0711908A2; MA30486B1; WO2007137984A2; CA2652733C; US20070292432A1; US20140105894A1; JP5420399B2; BRPI0711908B1; EA200802182A1; BRPI0711908B8; TWI422387B; ZA200809662B; CR10468A

Abstract

La presente invención describe anticuerpos humanizados contra IL-18, procedimientos de fabricación y procedimientos de tratamiento con dichos anticuerpos. Además, se describen procedimientos de selección usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial para identificar anticuerpos con potencial terapéutico.

Description

ANTICUERPOS HUMANIZADOS CONTRA INTERLEUQUIN A-18 MODIFICADOS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere de forma general al campo de las inmunoglobulinas tales como anticuerpos y en particular un anticuerpos humanizados, de utilidad en el tratamiento y diagnóstico de afecciones mediadas por interleuquina-18 humana. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interleuquina-18 humana (hlL-18) es una citoquina que se sintetiza en forma de una proteína precursora de 193 aminoácidos biológicamente inactiva (Ushio y cois., J. Immunol. 156:4274, 1996). La escisión de la proteína precursora, por ejemplo por caspasa-1 o caspasa-4, libera la proteína madura de 156 aminoácidos (Gu y cois., Science 275:206, 1997; Ghayur y cois., Nature 386:619, 1997), que muestra actividades biológicas que incluyen la coestimulación de la proliferación de linfocitos T, la potenciación de la citotoxicidad de los linfocitos NK, la inducción de la producción de IFN-? por los linfocitos T y los linfocitos NK, y la potenciación de la diferenciación de los linfocitos auxiliares T de tipol (Th1) (Okamura y cois., Nature 378:88, 1995; Ushio y cois., J. Immunol. 156:4274, 1996; Micallef y cois., Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Kohno y cois., J. Immunol. 158:1541, 1997; Zhang y cois., Infecí. Immunol. 65:3594, 1997; Robinson y cois., Immunity 7:571, 1997). Además, IL-18 es un inductor eficaz de los mediadores proinflamatorios en monocitos humanos, que incluyen IL-8, el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), y la prostaglandina E 2 (PGE 2 ) (Ushio, S. y cois., J. Immunol. 156:4274-4279, 1996; Puren, A. J. y cois., J. Clin. Invest. 10:711-721, 1997; Podolin y cois., J. Immunol. presentado, 1999). La proteína relacionada con el receptor IL-1 (IL-1Rrp) previamente clonada (Parnet y cois., J. Biol. Chem. 271:3967, 1996) se identificó como una subunidad del receptor IL-18 (Kd=18 nM) (Torigoe y cois., J. Biol. Chem. 272:25737, 1997). Una segunda unidad del receptor IL-18 muestra homología con la proteína accesoria del receptor IL-1, y se ha denominado AcPL (tipo proteína accesoria). Es necesaria la expresión tanto de IL-1 Rrp como de AcPL para la activación inducida por IL-18 de NF-?? y JNK (Born y cois., J. Biol. Chem. 273:29445, 1998). Además de NF-?? y JNK, IL-18 envía señales a través de la quinasa asociada al receptor IL-1 (IRAK), p56lck (LCK), y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) (Micallef y cois., Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Matsumoto y cois., Biophys Biochem. Res. Comm. 234:454, 1997; Tsuji-Takayama y cois., Biochem. Biophys. Res. Comm.237:126, 1997). Los linfocitos TH1, que producen citoquinas proinflamatorias tales como IFN-?, IL-2 y TNF-ß (Mosmann y cois., J. Immunol. 136:2348, 1986), han sido implicados en la mediación de muchas enfermedades autoinmunitarias, que incluyen la esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide (AR), diabetes de tipo 1 o insulinodependiente (DMID), enfermedad inflamatoria del intestino (Ell), y soriasis (Mosmann y Sad, Immunol. Today 17:138, 1996). Así, sería de esperar que el antagonismo de una citocina promotora de TH1 tal como IL-18 inhibiera el desarrollo de las enfermedades. Podrían usarse mAb específicos de IL-18 como antagonista. Se ha demostrado el papel de IL-18 en el desarrollo de enfermedades auto inmunitarias. En consecuencia, se ha demostrado que la expresión de IL-18 está significativamente aumentada en el páncreas y el bazo de los ratones diabéticos no obesos (NOD) inmediatamente antes del inicio de la enfermedad (Rothe y cois., J. Clin. Invest. 99:469, 1997). De forma similar, se ha demostrado que los niveles de IL-18 están marcadamente elevados en el líquido sinovial de los pacientes de artritis reumatoide (Kawashima y cois., Arthritis and Rheumatism 39:598, 1996). Además, se ha demostrado que la administración de IL-18 aumenta la gravedad clínica de la encefalomielitis alérgica experimental en ratones (EAE), una enfermedad autoinmunitaria mediada por Th1 que es modelo para la esclerosis múltiple. Además, se ha demostrado que la neutralización del antisuero contra IL-18 de rata evita el desarrollo de EAE en ratas de Lewis hembra (Wildbaum y cois., J. Immunol. 161:6368, 1998). En consecuencia, IL-18 es una diana deseable para el desarrollo de un tratamiento novedoso contra la autoinmunidad. Taniguchi y cois., J. Immunol. Methods 206:107, describen siete anticuerpos monoclonales (mAb) de murino y seis de rata contra IL-18 humana, que se unen a cuatro sitios antigénicos diferentes. Uno de los mAb murinos (#125-2H), y los seis mAb de rata inhiben la producción de IFN-? inducida por IL-18 en las células KG-1, donde los mAb de rata muestran actividades neutralizadoras 10 veces menores que la de #125-21-1. Tal como se muestra mediante análisis por transferencia Western, tres de los mAb murinos, pero ninguno de los mAb de rata, son fuertemente reactivos con IL-18 humana unida a la membrana. Además, se describe un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para detectar IL-18 humana utilizando #125-2H y un mAb de rata. El limite de detección de este ELISA es 10 pg/ml. La solicitud de patente europea EP 0 712 931 describe dos mAb de ratón contra IL-18 humana, H1 (lgG1) y H2 (IgM). Como se muestra mediante ensayo de transferencia Western, ambos mAb reaccionan con IL-18 humana unida a la membrana, pero no con IL-12 humana unida a la membrana. Hl se utiliza en un protocolo de cromatografía inmunoquímica para purificar IL-18 humana, y en un ELISA para medir IL-18 humana. H2 se utiliza en un radioinmunoensayo para medir IL-18 humana. La neutralización con anticuerpos de IL-18 puede ser potencialmente útil para aliviar enfermedades autoinmunitarias y síntomas relacionados en el hombre. Por lo tanto existe una necesidad en la técnica de un antagonista de IL-18 con afinidad elevada, tal como un anticuerpo monoclonal neutralizador de interleuquina 18 humana, que reduciría la diferenciación y la proliferación de los linfocitos Th1 y así las enfermedades autoinmunitarias y síntomas relacionados. Todas las referencias que se mencionan en toda esta memoria descriptiva se incorporan de forma expresa y completa a la presente memoria por referencia. 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tiene las siguientes regiones determinantes de la complementariedad (CDR): CDRH1:SEC. ID. N°: 1 CDRH2:SEC. ID. N°: 2 CDRH3:SEC. ID. N°: 3 CDRL1 :SEC. ID. N°: 4 CDRL2:SEC. ID. N°: 5 CDRL3:SEC. ID. N°: 6 De acuerdo con la presente invención se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tiene las siguientes regiones determinantes de la complementariedad (CDR): CDRH1:SEC. ID. N°: 1 CDRH2:SEC. ID. N°: 2 CDRH3-.SEC. ID. N°: 3 CDRL1 :SEC. ID. N°: 4 CDRL2:SEC. ID. N°: 5 CDRL3:SEC. ID. N°: 6 en las que el resto de la posición 71 de la cadena ligera está sustituido por el resto correspondiente que se encuentra en el anticuerpo donante del que se derivan las CDR.

Para los expertos en la técnica será obvio que el término "derivado" se pretende que defina no sólo la fuente en el sentido de que sea el origen físico del material sino también para definir material que es estructuralmente idéntico al material pero cuyo origen no sea la fuente de referencia. Así, el resto correspondiente "que se encuentra en la estructura del anticuerpo donante del que se derivan las CDR" no tiene que purificarse necesariamente a partir de la estructura del anticuerpo donante. De forma similar, las CDR "derivadas de un anticuerpo donante" no tienen que ser purificadas necesariamente a partir del anticuerpo donante. Las CDR y las regiones estructurales (FR) y la numeración de los aminoácidos siguen, a no ser que se indique lo contrario, la definición de Kabat tal como se describe en Kabat y cois "Sequences of immunological interest", NIH. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende CDR que se derivan de un anticuerpo donante injertado sobre una estructura receptora humana, anticuerpo contra interleuquina 18 que comprende CDR que tienen las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 en las que el resto de la posición 71 de la cadena ligera de dicho anticuerpo contra interleuquina 18 es idéntico al resto que se encuentra en la posición correspondiente de la estructura del anticuerpo donante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, anticuerpo que comprende una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada que tiene CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 y una cadena ligera que tiene CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6, en la que dichas CDR de la cadena ligera se derivan de un anticuerpo donante que tiene una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera del anticuerpo donante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende CDR de un anticuerpo donante y una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera de dicho anticuerpo humanizado, en el que el anticuerpo donante es 2C10 o una variante estructural del mismo (es decir el anticuerpo humanizado comprende las mismas CDR que 2C10 pero una estructura diferente, véase la patente de Estados Unidos 6.706.487). En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que tiene CDR con las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora y (b) una cadena ligera que tiene CDR con las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera humana receptora, en la que dicha estructura de cadena ligera humana receptora comprende regiones estructurales derivadas de la SEC. ID. N°: 38, en la que la posición 71 de la SEC. ID. N°: 38 es una tirosina. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que tiene CDR que permiten la unión específica a IL-18 humana; (b) una cadena ligera que comprende una estructura receptora y que tiene CDR con las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 y que tiene un resto tirosina en la posición 71. Las CDR de la cadena ligera preferiblemente están localizadas en posiciones de la estructura receptora que corresponden a las posiciones respectivas de las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 dentro de la secuencia que se describe en las SEC. ID. N°: 35. La cadena ligera y/o la cadena pesada preferiblemente no son inmunógenas en un paciente humano. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 y; (b) una cadena ligera que comprende CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera humana receptora, en la que dicha estructura de cadena ligera receptora de dicho anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 comprende regiones estructurales derivadas a partir.de una variante de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que dicha variante comprende una tirosina en la posición 71 y, en la que dicha variante comprende una identidad del 75% o superior con la estructura que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38. Preferiblemente dicha variante comprende una identidad del 80% o superior por ejemplo 81%, 82%, 83%, 84%, más preferiblemente 85% o superior por ejemplo 86%, 87%, 88%, 89%, incluso más preferiblemente 90% o superior por ejemplo 91%, 92%, 93%, 94%, lo más preferiblemente 95% o superior por ejemplo 96%, 97%, 98%, 99% con la estructura que se describe en la SEC. ID. N°: 38. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 derivadas de un anticuerpo donante, anticuerpo donante que comprende una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera del anticuerpo donante; (b) una estructura receptora humana, estructura receptora que comprende una fenilalanina en la posición 71 de la cadena ligera humana; en la que el anticuerpo contra interleuquina 18 comprende una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 derivadas de un anticuerpo donante, anticuerpo donante que comprende un aminoácido aromático en la posición 71 de la cadena ligera del anticuerpo donante; (b) una estructura receptora humana, estructura receptora que comprende en la posición 71 de la estructura de cadena ligera receptora un tipo de aminoácido aromático diferente del aminoácido aromático de la parte (a); en el que el anticuerpo contra interleuquina 18 comprende una cadena ligera que tiene en la posición 71 un aminoácido aromático derivado del anticuerpo de la parte (a). En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18, anticuerpo que presenta una constante de equilibrio (KD) de 300 pM o inferior con respecto a la unión de IL-18 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo Biacore™, preferiblemente usando un instrumento Biacore™ 3000 y las condiciones que se describen en 7.4.1 más adelante) a 37°C. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende CDR tal como se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 y presenta una constante de equilibrio (KD) de 300 pM o inferior con respecto a la unión de IL-18 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (preferiblemente usando un instrumento Biacore™ 3000 y las condiciones que se describen en 7.4.1 más adelante) a 37°C. Preferiblemente la constante de equilibrio (KD) del anticuerpo con respecto a la unión de IL-18 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (preferiblemente usando un instrumento Biacore™ T100 y las condiciones que se describen en 7.4.2 más adelante) a 37°C es inferior a 90 pM. Más preferiblemente, la constante de equilibrio es 70 pM o inferior y todavía más preferiblemente, 65 pM, 60 pM, 55 pM, o 50 pM o inferior. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18, anticuerpo que presenta una constante de disociación o velocidad de disociación (kd) de 0,0002 /s o más con respecto a unión de IL-18 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo Biacore™, preferiblemente usando un instrumento Biacore™ T100 y las condiciones que se describen en 7.4.2 más adelante) a 37°C. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada receptora, estructura de cadena pesada receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que uno o más resto/s de la/s posición/es 27, 28, 29, 93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 de la cadena pesada son idénticas al resto correspondiente de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en las SEC. ID. N°: 38, en la que la posición 71 y opcionalmente uno o más (por ejemplo todos) el/los resto/s de la/s posición/es 45, 83, 84, 85 de la cadena ligera son idénticos al resto correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo donante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 93 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que el resto de la posición 71 de la cadena ligera de dicho anticuerpo contra interleuquina 18 es idéntico al resto correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo donante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 39, 40, 93 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que el resto de la posición 71 de la cadena ligera es idéntico al resto correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo donante.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 36, 39, 40, 71, 89, 91, 93 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que el resto de la posición 71 de la cadena ligera es idéntico al resto correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo donante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. NT: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 93 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que los restos de las posiciones 71, 45, 83, 84, 85 de la cadena ligera son idénticos a los restos correspondientes de la cadena ligera del anticuerpo donante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 93, 39, 40 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que los restos de las posiciones 71, 45, 83, 84, 85 de la cadena ligera son idénticos a los restos correspondientes de la cadena ligera del anticuerpo donante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que los restos de las posiciones 71, 45, 83, 84, 85 de la cadena ligera son idénticos a los restos correspondientes de la cadena ligera del anticuerpo donante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que la relación entre la velocidad de disociación (kd) de dicho anticuerpo de la unión a IL-18 humana a 25°C y velocidad de disociación (kd) de dicho anticuerpo de la unión a IL-18 humana a 37°C es 1:5 o inferior, y, en el que dicho anticuerpo comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante y una estructura receptora humana, y, en el que un resto de la posición 71 de la cadena ligera de la estructura receptora humana está sustituido por el resto correspondiente del anticuerpo donante. La velocidad de disociación se mide preferiblemente usando un instrumento Biacore™ T100 y las condiciones que se describen en 7.4.2 más adelante. En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada que se selecciona a partir del grupo constituido por: SEC. ID. N°: 9, SEC. ID. N°: 17, SEC. ID. N°: 21; y una cadena ligera que se selecciona a partir del grupo constituido por: SEC. ID. N°: 13, SEC. ID. N°: 29. En particular, la invención proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 9 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 13 o una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 9 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 29.

La invención también proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 17 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 13 o una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 17 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 29. La invención también proporciona un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 21 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 13 o una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 21 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 29. En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo contra interleuquina 18 tal como se ha descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de selección de un anticuerpo (en particular un anticuerpo que inhibe la interacción entre un ligando y un receptor tal como un anticuerpo contra interleuquina 18) para uso terapéutico, procedimiento que comprende; (a) medir la afinidad de unión (usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore™) del anticuerpo por un antígeno al que el anticuerpo se une específicamente a una temperatura entre 30 y 45°C (preferiblemente 37°C); (b) medir la afinidad de unión (usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore ) del anticuerpo por un antígeno al que el anticuerpo se une específicamente a una temperatura entre 20 y 25°C (preferiblemente 25°C); (c) seleccionar dicho anticuerpo para uso terapéutico si la afinidad de (a) es superior a la afinidad de (b), preferiblemente si dicha afinidad de (a) es de 2 veces o más, más preferiblemente 4 veces o más la afinidad de la etapa (b). En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de selección de un anticuerpo (en particular un anticuerpo que inhibe la interacción entre un ligando y un receptor tal como un anticuerpo contra interleuquina 18) para uso terapéutico, procedimiento que comprende; (a) medir la velocidad de disociación (usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore™) del anticuerpo de un antígeno al que el anticuerpo se une específicamente, a una temperatura entre 30 y 45°C (preferiblemente 37°C); (b) medir la velocidad de disociación (usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore™) del anticuerpo de un antígeno al que el anticuerpo se une específicamente a una temperatura entre 20 y 25°C (preferiblemente 25°C); (c) seleccionar dicho anticuerpo para uso terapéutico si la velocidad de disociación de (a) es menor que la velocidad de disociación de (b). El término "contra interleuquina-18" en lo que se refiere a anticuerpos de la invención quiere decir que tales anticuerpos pueden neutralizar la actividad biológica de interleuquina-18 humana. Sin embargo no se excluye que dichos anticuerpos además puedan neutralizar la actividad biológica de interleuquina-18 de primates no humanos (por ejemplo rhesus y/o macaco). Breve Descripción de los Dibujos Ahora se describirá la inveción adicionalmente con referencia a las figuras, en las cuales: La Figura 1 muestra el efecto de la temperatura sobre el índice de activación (ka) de H1 L1 y H1L2. La Figura 2 muestra el efecto de la temperatura sobre el índice de desactivación {kd). La Figura 3 muestra el efecto de la temperatura sobre la constante de equilibrio (KD). Las Figuras 4A-4C muestran los datos representativos de un experimnto que generó los valores EC50 ilustrados en la tabla 7. La Figura 5 muestra los valores EC50 de cuatro variantes humanizadas seleccionadas que se enlazan con la IL18 humana. La Figura 6 muestra los valores EC50 de cuatro variantes humanizadas seleccionadas que se enlazan con IL18 de Rhesus. La Figura 7 muestra el enlace de H1L2 con la IL18 humana en la presencia de fluido sinovial al 50 por ciento. La Figura 8 muestra la inhibición de la producción de IFNy estimulada por IL18 en un ensayo de KG1. Las Figuras 9A y 9B muestran la inhibición de la producción de IFNy estimulada por LPS en un donador de PBMCS humano en el suero autólogo al 10 por ciento y al 25 por ciento, respectivamente. La Figura 10 muestra el enlace de 2C10 con hlL18 capturada por ML18BP. La Figura 11 muestra la capacidad de las nueve variantes humanizadas para inhibir la liberación de IFNy estimulada por IL18 humana en células KG1. La Figura 12 muestra la inhibición de la producción de IFNy estimulada por IL-18 mediante las variantes H1 y 2C10 en células KG1. La Figura 13 muestra los datos de IC50 para las variantes H1 con un intervalo de confianza del 95 por ciento. La Figura 14 muestra la inhibición de la producción de IFNy estimulada por IL-18 humana en células KG1. La Figura 15 muestra la inhibición de la producción de IFNy estimulada por IL-18 de Rhesus en células KG1. La Figura 16 muestra los resultados de un ELISA de enlace de IL-18 humana utilizando 2C10 quimérico. La Figura 17 muestra los resultados de un ELISA de enlace de IL-18 de Rhesus utilizando 2C10 quimérico. Las Figuras 18A y 18B muestran los resultados de ELISAs de enlace utilizando H1L2 y 2C10, respectivamente, que se enlazan con IL-18BP enlazada con IL-18 humana. 4. Anticuerpos humanizados El uso de anticuerpos no humanos intactos en el tratamiento de enfermedades o trastornos humanos conlleva los ahora bien establecidos problemas de la potencial capacidad inmunógena, especialmente tras la administración repetida del anticuerpo. Es decir el sistema inmunitario del paciente puede reconocer el anticuerpo intacto no humano como extraño y generar una respuesta de neutralización. Además de desarrollar anticuerpos completamente humanos (véase arriba) se han desarrollado diversas técnicas en estos años para superar estos problemas y generalmente implican reducir la composición de las secuencias de aminoácidos no humanas en el anticuerpo terapéutico intacto a la vez que se mantiene la relativa facilidad de la obtención de anticuerpos no humanos en un animal inmunizado por ejemplo ratón, rata o conejo. En términos generales se han utilizado dos estrategias para lograrlo. La primera son anticuerpos quiméricos, que generalmente comprenden un dominio variable no humano (por ejemplo de roedor tal como ratón) fusionado a una región constante humana, véase Morrison (1984), PNAS, 81, 6851. Debido a que el sitio de unión de antígenos de un anticuerpo está localizado en las regiones variables, el anticuerpo quimérico mantiene su afinidad de unión por el antígeno pero adquiere las funciones efectoras de la región constante humana y por lo tanto, es capaz de realizar funciones efectoras tal como se describe anteriormente. Los anticuerpos quiméricos se producen típicamente usando procedimientos de recombinación de ADN. El ADN que codifican los anticuerpos (por ejemplo ADNc) se aisla y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas H y L del anticuerpo de la invención, por ejemplo ADN que codifica las SEC. ID. N° 1, 2, 3, 4, 5 y 6 que se describen más arriba). Las células de ibridoma sirven de fuente habitual de dicho ADN. Si se desea expresar el anticuerpo quimérico, se insertan en marco ADNc que codifican las regiones variables maduras completas de las cadenas ligera y pesada en vectores de expresión apropiados que contienen, entre otras, regiones constantes de inmunoglobulinas apropiadas, habitualmente de origen humano, junto con secuencias de señalización, codones de terminación, promotores, terminadores y otros elementos necesarios para obtener la expresión del anticuerpo. Tales vectores se transfectan después en células huésped, tales como E.Coli, células COS, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulinas obteniendo la síntesis del anticuerpo. El ADN puede modificarse sustituyendo la secuencia codificante de las cadenas L y H humanas por las correspondientes regiones constantes H y L no humanas (por ejemplo murinas), véase por ejemplo Morrison; PNAS 81, 6851 (1984). La segunda estrategia implica la generación de anticuerpos humanizados en los que el contenido no humano del anticuerpo se reduce humanizando las regiones variables. Dos técnicas de humanización se han hecho populares. La primera es la humanización mediante injerto de CDR. Las CDR forman bucles cerca del extremo N del anticuerpo, donde forman una superficie montada sobre un andamiaje que proporcionan las regiones estructurales. La especificidad de unión a antígenos del anticuerpo queda definida principalmente por la topografía y por las características químicas de la superficie de sus CDR. Estas características, a su vez, vienen determinadas por la conformación de las CDR individuales o por la disposición relativa de las CDR, y por la naturaleza y disposición de las cadenas laterales de los restos que comprenden las CDR. Es posible lograr un gran descenso de la capacidad inmunógena injertando únicamente las CDR de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) (anticuerpos "donantes") sobre una estructura adecuada ("estructura receptora") y regiones constantes (véase Jones y cois (1986) Nature 321,522-525 y Verhoeyen M y cois (1988) Science 239, 1534-1536). Sin embargo, el injerto de CDR en sí, puede no lograr que se mantengan completamente las propiedades de unión a antígenos y, con frecuencia, se encuentra que deben mantenerse algunos restos de la estructura del anticuerpo donante (que algunas veces se denominan "contramutaciones") en la molécula humanizada si quiere recuperarse una afinidad de unión de antígenos significativa (véase Queen C y cois. (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M y cois. (1991) Nature 351, 501-502). En este caso, pueden elegirse en una base de datos regiones V humanas que muestren la mayor homología entre las secuencias (habitualmente del 60% o superior) con el anticuerpo donante no humano, para proporcionar la estructura (FR) humana. La selección de las FR humanas puede realizarse o por consenso de anticuerpos humanos o por anticuerpos humanos individuales. Cuando es necesario se sustituyen restos clave del anticuerpo donante en la estructura receptora humana para conservar la conformación de las CDR. Puede utilizarse la construcción de modelos por ordenador para ayudar a identificar dichos restos estructuralmente importantes, véase el documento W099/48523. De forma alternativa, la humanización puede lograrse mediante un procedimiento de "contrachapado". Un análisis estadístico de regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas humanas y murinas, reveló que los patrones precisos de los restos expuestos son diferentes en los anticuerpos humanos y murinos y la mayoría de las posiciones superficiales individuales presentan una fuerte preferencia por un pequeño número de residuos diferentes (véase Padlan E.A. y cois; (1991) Mol.lmmunol.28, 489-498 y Pedersen J.T. y cois (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973). Por lo tanto, es posible reducir la capacidad inmunógena de una Fv no humana sustituyendo los restos expuestos de sus regiones estructurales que difieren de los que habitualmente se encuentran en los anticuerpos humanos. Debido a que la capacidad antigénica de las proteínas puede correlacionarse con la accesibilidad a la superficie, la sustitución de los restos superficiales puede ser suficiente para que la región variable murina sea "invisible" para el sistema ¡nmunitario humano (véase también Mark G.E. y cois (1994) en Handbook oí Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal antibodies, Springer-Verlag, páginasl 05-134). Este procedimiento de humanización se denomina "contrachapado" debido a que sólo se altera la superficie del anticuerpo, los restos de soporte se mantienen inalterados. Estrategias alternativas adicionales incluyen las que se describen en el documento WO04/006955 y en el procedimiento de Humaneering™ (Kalobios), que utiliza los sistemas de expresión bacterianos y produce anticuerpos cuya secuencia es similar a la línea germinal humana (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, enero de 2007, San Diego, California). Otra estrategia reciente para la humanización, implica la selección de estructuras receptoras humanas basándose en la similitud estructural entre las regiones CDR humanas y las regiones CDR del anticuerpo murino donante, en vez de basarse en la homología entre otras regiones del anticuerpo tales como regiones estructurales. Este procedimiento se conoce también como un Superhumanisation™ (Evogenix Inc.; Hwang y cois (2005) Methods 36:35-42;. Así, la presente invención se refiere anticuerpos humanizados tal como se describe en la sección 3 anterior. Dichos anticuerpos humanizados preferiblemente comprenden una región constante humana de un isotipo IgG, tal como IgG 1 o lgG4. En realizaciones alternativas, las regiones variables humanizadas tal como se describen en la sección 3 anterior pueden fusionarse con una región constante no humana ("quimera inversa") por ejemplo de primates no humanos, de rata, murina o de conejo. Por supuesto, para los expertos en la técnica será obvio que las estructuras receptoras que se describen en las SEC. ID. N°: 37 y 38 constituyen aminoácidos de inmunoglobulinas codificados por un gen VH y Vkappa respectivamente. Por tanto, comprenden tanto las regiones estructurales como las CDR del anticuerpo receptor. La sustitución de las CDR del anticuerpo receptor por las CDR del donante que se describen en las SEC. ID. N°: 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 y la asociación de las secuencias resultantes con secuencias estructurales adecuadas tales como las que se describen en las SEC. ID. N°: 39 y SEC. ID. N°: 40, para producir una región variable completa de inmunoglobulina tales como las que se describen en las SEC. ID. N°: 11 y SEC. ID. N°: 15 está claramente dentro de las capacidades de una persona experta. 4.1. Otras modificaciones Se cree que la interacción entre la región Fe de un anticuerpo y diversos receptores de Fe (FcyR) media las funciones efectoras del anticuerpo que incluyen la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fijación de complemento, la fagocitosis y la semivida/aclaramiento del anticuerpo. Pueden realizarse diversas modificaciones a la región Fe de los anticuerpos de la invención dependiendo de la propiedad efectora que se desee. Por ejemplo, en los documentos EP 0 629 240 B1 y EP 0 307 434 B2, se detallan mutaciones específicas en la región Fe para que un anticuerpo lítico se convierta en no lítico, o se puede incorporar un grupo de unión a receptores de rescate al anticuerpo para aumentar las semivida en suero, véase el documento US 5.739.277. Actualmente existen cinco receptoresFcy humanos, FcyR (I), FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y FcRn neonatal. Shields y cois, (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604 demostraron que un conjunto común de restos de lgG1 está implicado en la unión de todas las FcyR, mientras que FcyRIl y FcyRIII utilizan sitios diferentes que no pertenecen a este conjunto común. Un grupo de restos de lgG1 redujo la unión a todas las FcyR cuando se cambió a alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 y Pro-239. Todos están en el dominio CH2 de IgG y agrupadas cerca de la bisagra que une CH1 y CH2. Aunque FcyRI utiliza únicamente el conjunto común de restos de IgG 1 para la unión, FcyRIl y FcyRIII interactúan con restos diferentes además de los del conjunto común. La alteración de algunos restos, redujo únicamente la unión a FcyRIl (por ejemplo Arg-292) o FcyRIII (por ejemplo Glu-293). Algunas variantes mostraron una unión mejorada a FcyRIl o FcyRIII pero no afectaron la unión al otro receptor (por ejemplo Ser-267Ala mejoró la unión a FcyRIl pero no afectó a la unión FcyRIII). Otras variantes mostraron una unión mejorada a FcyRIl o FcyRIII reduciendo la unión al otro receptor (por ejemplo Ser-298Ala mejoró la unión a FcyRIII y redujo la unión a FcyRIl). Para FcyRIIIa, las mejores variantes de unión de I gG 1 presentaban sustituciones combinadas de alanina en Ser-298, Glu-333 y Lys-334. Se cree que el receptor FcRn neonatal está implicado tanto en el aclaramiento de los anticuerpos como en la transcitosis a través de los tejidos (véase Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 y Ghetie y cois (2000) Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766). Los restos de lgG1 humana que se determinó que ¡nteractúan directamente con FcRn humana incluyen Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 y His435. La presente invención por lo tanto se refiere a anticuerpos de la invención que tienen uno (o más) cualesquiera de los cambios de los restos que se detallan anteriormente para modificar las semivida/aclaramiento y/o funciones efectoras tales como ADCC y/o lisis por complemento. Otras modificaciones incluyen variantes de glucosilación de los anticuerpos de la invención. Se sabe que la glucosilación de los anticuerpos en posiciones conservadas de sus regiones constantes tiene un profundo efecto sobre las funciones de los anticuerpos, en particular sobre las funciones efectoras tales como las que se describen anteriormente, véase por ejemplo, Boyd y cois (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Se contemplan las variantes de glucosilación de los anticuerpos terapéuticos o de sus fragmentos de unión de antígenos de la presente invención a los que se añade, se sustituye, se elimina o se modifica uno o más restos carbohidrato. La introducción de un motivo asparragina-X-serina o asparragina-X-treonina crea un sitio potencial para la unión enzimática de restos carbohidrato y, por lo tanto, puede usarse para manipular la glucosilación de un anticuerpo. En Raju y cois (2001) Biochemistry 40, 8868-8876 se aumentó la sialiación terminal de una immunoadhesina TNFR-lgG mediante un procedimiento de regalactosilación y/o resialilación usando beta-1, 4-galactosiltransferasa y/o alfa, 2,3 sialiltransferasa. Se cree que el aumento de la sialilación terminal aumenta la semivida de la inmunoglobulina. Los anticuerpos, al igual que la mayoría de las glucoproteínas, se producen en la naturaleza en forma de un mezcla de glucoformas. Esta mezcla es particularmente obvia cuando los anticuerpos se producen en células eucariotas, en particular en células de mamífero. Se ha desarrollado una variedad de procedimientos para preparar glucoformas definidas, véase Zhang y cois Science (2004), 303, 371, Sears y cois, Science, (2001) 291, 2344, Wacker y cois (2002) Science, 298 1790, Davis y cois (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang y cois (2001) Acc.Chem.Res 34, 727. Así, la invención se refiere a una pluralidad de anticuerpos terapéuticos (habitualmente monoclonales) (que pueden ser del isotipo IgG, por ejemplo I gG 1 ) tal como se describe en la presente memoria que comprenden un número definido (por ejemplo 7 o menos, por ejemplo 5 o menos, tal como dos o uno solo) glucoforma(s) de dichos anticuerpos o sus fragmentos de unión de antígenos. Realizaciones adicionales de la invención incluyen anticuerpos terapéuticos de la invención o sus fragmentos de unión de antígenos acoplados a polímero no proteínico tal como polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquileno. La conjugación de proteínas a PEG es una técnica establecida para aumentar la semivida de las proteínas, así como para reducir la capacidad antigénica e inmunógena de las proteínas. Se ha investigado el uso de la PEGilación con diferentes pesos moleculares y estilos (lineal o ramificado) con anticuerpos intactos así como con fragmentos Fab', véase Koumenis I.L. y cois (2000) Int. J.Pharmaceut. 198:83-95. 5. Procedimientos de producción Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse en organismos transgénicos tales como cabras (véase Pollock y cois (1999), J. Immunol. Methods 231:147-157), pollos (véase Morrow KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55), ratones (véase Pollock y cois referencia anterior) o plantas (véase Doran PM, (2000) Curr. Opinión Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J y cois, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E y cois; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590). Los anticuerpos también pueden producirse por síntesis química. Sin embargo, los anticuerpos de la invención habitualmente se producen usando tecnología de cultivo celular recombinante, notorio para los expertos en la técnica. Se aisla un polinucleótido que codifica el anticuerpo y se inserta en un vector replicable tal como un plásmido para su clonación (amplificación) adicional, o su expresión en una célula huésped. Un sistema de expresión de utilidad es un sistema de glutamato sintetasa (tales como los que comercializa Lonza Biologics), en particular cuando la célula huésped es CHO o NS0 (véase más adelante). El polinucleótido que codifica el anticuerpo se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo sondas de oligonucleótidos). Los vectores que pueden usarse incluyen plásmidos, virus macrófagos, transposones, minicromosomas de los que los plásmidos son una realización típica. Generalmente dichos vectores incluyen además una secuencia de señalización, origen de replicación, uno o más genes testigo, un elemento potenciador, un promotor y secuencias de terminación de la transcripción ligadas operablemente al polinucleótido de la cadena ligera y/o pesada para facilitar su expresión.. Los polinucleótidos que codifican las cadenas ligera y pesada pueden insertarse en vectores separados e introducirse (por ejemplo mediante transformación, transfección, electroporación o transducción) en la misma célula huésped de forma concurrente o secuencial o, si se desea, tanto la cadena pesada como la cadena ligera deben insertarse en el mismo vector antes de dicha introducción. Para los expertos en la técnica, será obvio inmediatamente que debido a la redundancia del código genético, hay disponibles polinucleótidos alternativos a los descritos en la presente invención que codificarán los polipéptidos de la invención. 5.1 Secuencias de señalización Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse en forma de proteína de fusión con una secuencia de señalización heteróloga que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura. La secuencia de señalización debería ser reconocida y procesada por la célula huésped. Para las células huésped procariotas, la secuencia de señalización puede ser una secuencia codificadora de fosfatasa alcalina, penicilinasa, o enterotoxina termoestable II. Para la secreción por las levaduras, las secuencias de señalización pueden ser una secuencia codificadora de invertasa, una secuencia codificora del factor a o de fosfatasa ácida, véase por ejemplo el documento WO90/13646. En los sistemas de células de mamífero, están disponibles las secuencias codificadoras secretoras víricas, tales como la señal gD del herpes simplex gD y una secuencia de señalización de inmunoglobulina nativa (tal como la cadena pesada de Ig humana). Habitualmente, la secuencia de señalización se liga en el marco de lectura al polinucleótido que codifica el anticuerpo de la invención. 5.2 Origen de replicación Los orígenes de replicación son notorios en la técnica, siendo pBR322 adecuado para la mayoría de las bacterias gram negativas, el plásmido 2µ para la mayoría de las levaduras y diversos orígenes víricos tales como los de SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV para la mayoría de células mamíferas. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para los lectores de expresión mamíferos integrados, a no ser que sea necesaria la propagación de vectores en E. Coli. Sin embargo, puede usarse ori de SV40 dado que contiene el promotor temprano. 5.3 Marcador de selección Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo a ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina o (b) complementan deficiencias auxotróficas o proporcionan nutrientes no disponibles en los medios complejos o (c) combinaciones de ambas. El esquema de selección puede implicar detener el crecimiento de la célula huésped que no contiene el vector o vectores. Las células que han sido transformadas con éxito con los genes que codifican el anticuerpo terapéutico de la presente invención sobreviven debido por ejemplo a la resistencia a fármacos que confiere el marcador de selección coadministrado. Un ejemplo es el sistema de selección DHFR, en el que se generan transformantes en cepas huésped negativas para DHFR (por ejemplo véase Page y Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68). En este sistema, el gen DHFR se coadministra con secuencias de polinucleótidos de anticuerpos de la invención y las células positivas para DHFR se seleccionan después retirando el nucleósido. Si fuera necesario, también se emplean el inhibidor de DHFR metotrexato para seleccionar los transformantes con amplificación del gen DHFR. Ligando operablemente el gen DHFR a las secuencias que codifican el anticuerpo de la invención o sus derivados funcionales, la amplificación del gen DHFR produce la amplificación concomitante de las secuencias de anticuerpos de interés. Las células CHO son una línea celular particularmente interesante para esta selección mediante DHFR/metotrexato y en la técnica se han establecido procedimientos para amplificar y seleccionar células huésped usando el sistema DHFR, véase Kaufman R.J. y cois J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621, para una revisión, véase Werner RG, Noe W, Kopp K.Schluter M, "Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug. Un ejemplo adicional, es el sistema de expresión de glutamato sintetasa (Lonza Biologics). Un gen de selección adecuado para utilizar y levaduras es el gen t r p 1 ; véase Stinchcomb y cois Nature 282, 38, 1979. 5.4 Promotores Los promotores adecuados para expresar anticuerpos de la invención, están ligados operablemente al ADN/polinucleótido que codifica el anticuerpo. Los promotores para huéspedes procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas de promotores de la beta-lactamasa y la lactosa, promotores de la fosfatasa alcalina, triptófano e híbridos, tales como Tac. Los promotores adecuados para la expresión en en células de levaduras incluyen 3-fosfoglicerato quínasa u otras enzimas glucolíticas, por ejemplo enolasa, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa 6 fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa y glucoquinasa. Los promotores de levaduras inducibles incluyen alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, metalotioneína y enzimas responsables del metabolismo del nitrógeno o de la utilización de maltosa/galactosa. Los promotores para la expresión en sistemas de células de mamífero incluyen promotores de la polimerasa de ARN II, que incluyen promotores víricos tales como polioma, difteria aviar y adenovirus (por ejemplo adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (en particular el promotor del gen temprano inmediato), retrovirus, virus de la hepatitis B, actina, promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y el virus de simio 40 (SV40) temprano o tardío y los promotores no víricos tales como EF-1alfa (Mizushima y Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322. La elección del promotor puede basarse en la competitividad adecuada con la célula huésped que se usa para la expresión. 5.5 Elemento potenciador Cuando sea apropiado, por ejemplo para la expresión en eucariotas superiores, pueden incluirse elementos potenciadores adicionales en lugar o además de los que se encuentran localizados en los promotores que se describen anteriormente. Las secuencias potenciadoras adecuadas de mamífero, incluyen elementos potenciadores de globina, elastasa, albúmina, fetoproteína, metalotionina e insulina. De forma alternativa, puede usarse un elemento potenciador de un virus de células eucariotas, tal como el potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma, el potenciador de baculovirus o el sitio lgG2a murino (véase el documento WO04/009823). Aunque dichos potenciadores están habitualmente localizados en el vector en un sitio aguas arriba del promotor, también pueden estar localizados en cualquier otro lugar, por ejemplo dentro de la región no traducida o aguas abajo de la señal de poliadenilacion. La elección y posición del potenciador puede basarse en la competitividad adecuada con la célula huésped que usa para la expresión. 5.6 Poliadenilación/Terminación En los sistemas eucariotas, las señales de poliadenilacion están ligadas operablemente al polinucleótido que codifica el anticuerpo de esta invención. Dichas señales se encuentran típicamente en posición 3' del marco de lectura abierto. En los sistemas mamíferos, señales de ejemplo no limitantes incluyen las que se derivan de las hormonas de crecimiento, factor de elongación-1 alfa y genes víricos (por ejemplo SV40) o repeticiones terminales largas de retrovirus. En los sistemas de levaduras, ejemplos no limitantes de señales de poliadenilación/terminación incluyen las de los genes de fosfoglicerato quinasa (PGK) y de alcohol deshidrogenasa 1 (ADH). En los sistemas procariotas, las señales de poliadenilacion habitualmente no son necesarias y en vez de eso, es habitual emplear secuencias terminadoras más cortas y más definidas. La elección de las secuencias de poliadenilación/terminación puede basarse en la competitividad adecuada con la célula huésped que se usa para la expresión. 5.7 Otros procedimientos/elementos para rendimientos mejorados Además de lo anterior, otras estrategias que pueden emplearse para potenciar los rendimientos incluyen elementos de remodelación de la cromatina, modificación de intrones y de codones específicos de la célula huésped. El uso de los codones del anticuerpo de esta invención puede modificarse para acomodar un sesgo de codones de la célula huésped de forma que aumente el rendimiento del transcrito y/o del producto (por ejemplo Hoekema A y cois Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24). La elección de los codones puede basarse en la competitividad adecuada con la célula huésped que se usa para la expresión. 5.8 Células huésped Las células huésped adecuadas para la clonación o los vectores de expresión que codifican anticuerpos de la invención son células procariotas, de levaduras o eucariotas superiores. Las células procariotas adecuadas incluyen eubacteria por ejemplo enterobacteriaceae tales como Escherichia por ejemplo E.Coli (por ejemplo ATCC 31,446; 31,537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia por ejemplo Serratia marcescans y Shigella así como Bacilos tales como B.subtilis y B.licheniformis (véase el documento DD 266 710), Pseudomonas tales como P.aeruginosa y Streptomyces. De las células huésped de levaduras, se contemplan también Saccharomyces cerevisiae, schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), yarrowia (EP402, 226), Pichia Pastoris (EP183, 070, véase también Peng y cois J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244, 23?), Penicillin, Tolypocladium y huéspedes Aspergillus tales como A.nidulans y A.niger.

Aunque la invención contempla específicamente las células huésped de lavadura y procariotas, sin embargo habitualmente, las células huésped de la presente invención son células de vertebrados. Las células huésped de vertebrados adecuadas incluyen células de mamíferos tales como COS-1 (ATCC N.° CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), la línea renal embrionaria humana 293, PerC6 (Crucell), células renales de hámster neonato (BHK) (ATCC CRL. 632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO. CRL 1573), células de ovario de hámster chino (por ejemplo CHO-K1, ATCC NO: CCL 61, la línea celular DHFR-CHO tal como DG44 (véase Urlaub y cois, (1986) referencia anterior), en particular las líneas celulares de CHO adaptadas para cultivo en suspensión, células sertoli de ratón, células renales de mono, células renales de mono verde africano (ATCC CRL-1587), células HELA, células renales caninas (ATCC CCL 34), células pulmonares humanas (ATCC CCL 75), Hep G2 y células de mieloma o linfoma por ejemplo NSO (véase el documento US 5.807.715), Sp2/0, YO. Así, en una realización de la invención, se proporciona una célula huésped transformada de forma estable, que comprende un vector que codifica una cadena pesada y/o cadena ligera del anticuerpo terapéutico tal como se describe en la presente memoria. Habitualmente, dichas células huésped comprenden un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que codifica dicha cadena pesada. Dichas células huésped también pueden manipularse por ingeniería genética adicionalmente o adaptarse para modificar la calidad, función y/o rendimiento del anticuerpo de esta invención. Ejemplos no limitantes incluyen la expresión de enzimas específicas de modificación (por ejemplo glucosilación) y chaperonas de plegamiento de proteínas. 5.9 Procedimientos de cultivo celular. Las células huésped transformadas con vectores que codifican los anticuerpos terapéuticos de la invención pueden cultivarse mediante cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica. Las células huésped pueden cultivarse en frascos en agitación centrifuga, frascos en agitación, frascos de cultivo o sistemas de fibra hueca, pero para la producción a gran escala es preferible el uso de reactores con tanques agitados o reactores con bolsas (por ejemplo Wave Biotech, Somerset, New Jersey EE. UU.) en particular para los cultivos en suspensión. Habitualmente, los tanques en agitación se adaptan para poder ser aireados usando por ejemplo tubos burbujeadores, pantallas o impulsores de baja cizalla. Para las columnas de burbujas en los reactores de extracción por aire, puede utilizarse la aireación directa con burbujas de aire u oxígeno. Aunque las células huésped se cultivan en un medio de cultivo sin suero, se prefiere que el medio esté suplementado con un agente de protección celular tal como pluronic F-68 para ayudar a evitar daños celulares producidos por el proceso de aireación. Dependiendo de las características de la célula huésped, pueden usarse microportadores como sustratos de crecimiento para las líneas celulares dependientes de anclaje por las células pueden adaptarse a un cultivo en suspensión (que es lo habitual). El cultivo de las células huésped, en particular de las células huésped de vertebrados puede utilizar una variedad de modos de operación tales como procesamiento en lotes, alimentación en lotes o lotes repetidos (véase Drapeau y cois (1994) cytotechnology 15: 103-109), proceso en lotes prolongados o cultivo con perfusión. Aunque las células huésped transformadas por vía recombinante pueden cultivarse en medios que contienen suero, y dichos medios comprenden suero bovino fetal (FCS), se prefiere que dichas células huésped se cultiven el medio sintético sin suero, tal como se describe en Keen y cois (1995) Cytotechnology 17:153-163, o en medios disponibles comercialmente, tales como ProCHO-CDM o UltraCHO™ (Cambrex NJ, EE. UUI), suplementados, cuando sea necesario con una fuente de energía tal como glucosa y factores de crecimiento sintéticos tales como insulina recombinante. El cultivo sin suero de células huésped puede necesitar que esas células se adapten al crecimiento en condiciones sin suero. Una estrategia de adaptación es cultivar las células huésped en medio que contiene suero y repetidamente intercambiar el 80% de medios de cultivo por medio sin suero, de forma que las células huésped aprendan a adaptarse a condiciones de falta de suero (véase por ejemplo Scharfenberg K y cois (1995) en Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. y cois eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers). Los anticuerpos de la invención que se segregan al medio pueden recuperarse del medio y purificarse usando una variedad de técnicas que proporcionen un grado de purificación adecuado para el uso que se pretenda. Por ejemplo, el uso de anticuerpos terapéuticos de la invención para el tratamiento de pacientes humanos habitualmente requiere de una pureza de al menos el 95%, determinada mediante SDS-PAGE reductora, más habitualmente una pureza del 98% o del 99%, comparada con el medio que comprende los anticuerpos terapéuticos. En primer lugar, habitualmente se eliminan los deshechos celulares en medio de cultivo usando centrifugación seguida de una etapa de aclaramiento del sobrenadante, usando por ejemplo microfiltración, ultraf i Itración y/o filtración profunda. De forma alternativa, el anticuerpo puede recogerse mediante microfiltración, ultrafiltración o filtración profunda sin la centrifugación anterior. Hay disponible una variedad de otras técnicas tales como técnicas de diálisis y electroforesis en gel y técnicas cromatográficas tales como hidroxiapatita (HA), cromatografía de afinidad (que opcionalmente utiliza un sistema de marcado por afinidad tal como polihistidina) y/o cromatografía por interacción hidrófoba (HIC, véase el documento US 5,429,746). En una realización, los anticuerpos de la invención, siguiendo diversas etapas de aclaramiento, se capturan usando cromatografía de afinidad con Proteína A o G, seguida de etapas cromatográficas adicionales tales como cromatografía por intercambio iónico y/o HA, cromatografía de intercambio anionico o catiónico, cromatografía por exclusión de tamaño y precipitación con sulfato de amonio.

Habitualmente, también se emplean diversas etapas para la eliminación de virus (por ejemplo nanofiltración usando por ejemplo un filtro DV-20). Después de estas diversas etapas, se proporciona una preparación purificada (habitualmente monoclonal) que comprende al menos 10 mg/ml o más por ejemplo 100 mg/ml o más del anticuerpo de la invención y por lo tanto forma una realización de la invención. La concentración de 100 mg/ml o superior puede regenerarse mediante ultracentrifugación. Habitualmente dichas preparaciones están sustancialmente libres de formas agregadas de anticuerpos de la invención. Los sistemas bacterianos son particularmente adecuados para la expresión de fragmentos de anticuerpos. Dichos fragmentos se localizan intracelularmente o en el periplasma. Las proteínas periplasmáticas insolubles pueden extraerse y plegarse formando proteínas activas de acuerdo con procedimientos conocidos para los expertos en la técnica, véase Sánchez y cois (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 y Cupit PM y cois (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277. 6. Composiciones farmacéuticas Las preparaciones de anticuerpos de la invención purificadas (en particular las preparaciones monoclonales) tal como se describen más arriba, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de enfermedades y trastornos humanos tales como los que se indican anteriormente. Habitualmente dichas composiciones pueden comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable (es decir inerte) tal como se conoce y requiere la práctica farmacéutica aceptable, véase por ejemplo Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16a ed, (1980), Mack Publishing Co. Ejemplos de tales vehículos incluyen vehículos esterilizados tales como solución salina, solución de Ringer o solución de dextrosa, tamponadas con tapones adecuados en el intervalo de 5 a 8. Las composiciones farmacéuticas inyectables (por ejemplo intravenosas, intraperitoneales, intradérmicas, subcutáneas, intramusculares o intraportales) o de infusión continua, de forma adecuada, están libres de materia particulada visible y pueden comprender entre 0.1 ng y 100 mg de anticuerpo, habitualmente entre 5 mg y 25 mg de anticuerpo. Los procedimientos para la preparación de dichas composiciones farmacéuticas son notorios para los expertos en la técnica. En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden entre 0,1 ng y 100 mg de los anticuerpos terapéuticos de la invención en forma monodosis, opcionalmente junto con las instrucciones de uso. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden liofilizarse para su reconstitución antes de la administración de acuerdo con procedimientos notorios u obvios para los expertos en la técnica. Cuando las realizaciones de la invención comprenden anticuerpos de la invención con un isotipo lgG1, puede añadirse un quelante de cobre tal como citrato (por ejemplo citrato sódico) o EDTA o histidina a la composición farmacéutica para reducir el grado de degradación mediada por cobre de los anticuerpos de este isotipo, véase EP 0 612251.

Las dosis eficaces y las posologías de tratamiento para la administración del anticuerpo de la invención generalmente se determinan por vía empírica y dependen de factores tales como la edad, peso y estado de salud del paciente y la enfermedad o trastorno a tratar. Dichos factores están dentro el ámbito del médico a cargo. Las directrices para seleccionar las dosis apropiadas pueden encontrarse por ejemplo en Smith y cois (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, Nueva York pero generalmente estarán entre 1 mg y 1000 mg. En una realización, la posología para tratar a un paciente humano que padece AR es de 100 mg o en ese entorno (es decir entre 50 mg y 200 mg) de anticuerpo de la invención (o sus fragmentos de unión de antígenos) administrados por vía subcutánea una vez a la semana o cada dos semanas. Las composiciones de la presente invención también pueden usarse de manera profiláctica. Dependiendo de la enfermedad o trastorno a tratar, las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención pueden usarse de forma simultánea, separada o secuencial con una cantidad eficaz de otro medicamento tal como un agente antiinflamatorio por ejemplo un AINE, metotrexato, bucilamina, tiomalato sódico con uno o más de un tratamiento contra TNF alfa tal como Enbrel™ (etanercept), Remicade™ (infliximab), Humira™ (adalimumab) y/o CDP870. Los anticuerpos de la invención pueden usarse combinados con una cantidad eficaz de un anticuerpo contra el receptor de TNF-alfa, véase Davis MW y cois (2000) Ann Rheum Dis 59 (Supl 1): 41-43. En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse combinados con una cantidad eficaz de un agente dirigido contra IL-1/IL-1R (por ejemplo Kineret™), CTLA4-Ig, IL-6 (véase Choy y cois, (2002) Ann. Rheum. Dis 61(suppl 1): 54), IL-8, IL-15, VEGF, IL-17, IL-18 (véase Tailor y cois (2001) Curr.Opin.lmmunol.13: 611-616), anti-ICAM y/o anticuerpos contra CD4, agentes dirigidos contra un miembro de la familia MMP por ejemplo MMP-1, 2,3 y/o 13. Los anticuerpos de la invención también pueden usarse combinados con un agente que restringe las células que se sabe que están implicadas en el proceso inflamatorio, por ejemplo linfocitos B positivos para CD20 usando por ejemplo Mabthera™ (Rituximab). Otros tratamientos combinados con anticuerpos de la invención incluyen jerarquías contrarias a la angiogénesis tales como antagonistas de la integrina a?ß3, Kringles 1-5 (véase Sumariwalla P y cois (2003), Arthritis Res Ther 5:R32-R39.), Flt-1 soluble (véase Miotla y cois, (2000) Lab.lnvest. 80:1195-1205), un agente contra COX-2 o un agente contra OSM tal como un anticuerpo contra OSM, véase el documento WO2005/095457, cuyo contenido completo se incorpora específicamente a la presente memoria por referencia y al que se refiere específicamente al lector. De forma conveniente, la presente invención contempla una composición farmacéutica que comprende un kit de partes del anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígenos del mismo junto con esos otros medicamentos opcionalmente junto con instrucciones de uso. Estas combinaciones pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de enfermedades/trastornos artríticos, tales como artritis reumatoide. 7. Usos clínicos Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en tratamientos terapéuticos de enfermedades mediadas por IL-18 tales como enfermedades autoinmunitarias. Se hace mención particular a la esclerosis múltiple, enfermedades artríticas, tales como artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, enfermedad inflamatoria del intestino (EN) y soriasis. Así, la invención comprende además un procedimiento de tratamiento de un paciente humano que padece una enfermedad que responde a la neutralización de hlL-18 (tal como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, EN, soriasis), procedimiento que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención, en particular un anticuerpo que tiene una cadena pesada con una secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 9 y una cadena ligera que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 13. Se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una (o más) cualquiera de las enfermedades/trastornos mencionados anteriormente.

TABLA A Descripción de proteínas o Identificador de la polinucleótidos (PN) secuencia (SEC. ID. N° :) CDRH1 1 CDRH2 2 CDRH3 3 CDRL1 4 CDRL2 5 CDRL3 6 IL-18 humana 7 PN de IL-18 humana 8 Cadena pesada H1 (región 9 variable + constante) Cadena pesada H1 (PN) 10 Región variable de H1 11 Región variable de H1 (PN) 12 Cadena ligera L2 (región 13 variable + constante) Descripción de proteínas o Identif icador de la polinucleótidos (PN) secuencia (SEC. ID. N° :) Cadena ligera L2 (PN) 14 Región variable de L2 15 Región variable de L2 (PN) 16 Cadena pesada H2 (variable + 17 constante) Cadena pesada H2 (PN) 18 Región variable de H2 19 Región variable de H2 (PN) 20 Cadena pesada H3 (variable + 21 constante) Cadena pesada H3 (PN) 22 Región variable de H3 23 Región variable de H3 (PN) 24 Cadena ligera L1 (región 25 variable y constante) Cadena ligera L1 (PN) 26 Descripción de proteínas o Identificador de la polinucleótidos (PN) secuencia (SEC. ID. N° :) Región variable de L1 27 Región variable de L1 (PN) 28 Cadena ligera L3 (región 29 variable + constante) Cadena ligera L3 (PN) 30 Región variable de L3 31 Región variable de L3 (PN) 32 Quimera de 2c10 de rata-lgG1 33 humana Quimera de 2c10 de rata-lgG1 34 humana (PN) Quimera de 2c10 de rata- 35 CKappa humana Quimera de 2c10 de rata- 36 CKappa humana (PN) Estructura de la cadena pesada 37 receptora Descripción de proteínas o Identificador de la polinucleótidos (PN) secuencia (SEC. ID. N° :) Estructura de la cadena ligera 38 receptora Secuencia de aminoácidos de JH6 añadida a la SEC. ID. N°: 39 37 Secuencia de aminoácidos de Jkappa 2 añadida a la SEC. ID. 40 N°: 38 7. Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustran los diversos aspectos de esta invención. Todos los procedimientos generales de clonación, ligado y otras tecnologías de ADN recombiante se realizan de la forma general que se enseña en Maniatis y cois, Molecular cloning (A laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratory, o Sambrook y cois Molecular Cloning (A laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratory. Los sistemas vectoriales y los procedimientos de biología molecular adicionales que se usan en la presente memoria se describen en el documento WO2005/095457, cuyo contenido completo se incorpora a la presente memoria por referencia y al que se refiere específicamente al lector. 7.1 Clonación de regiones variables de hibridomas El anticuerpo progenitor de rata 2C10 se describe en la patente de Estados Unidos 6.706.487. Se refiere al lector específicamente a este documento. Se diseñó un anticuerpo quimérico 2C10c basándose en las regiones V de rata que se describen anteriormente unidas a regiones de lgG1 o kappa C humanas. Se introdujo una secuencia de señalización de inmunoglobulinas genérica y un codón de inicio de la traducción ATG para las construcciones de cadenas pesadas y ligeras. Se diseñaron sitios de restricción para endonucleasas Hind III y BsiWI para enmarcar el dominio VL y permitir la clonación en vectores de expresión mamíferos que contenían la región Ckappa humana (SEC. ID. N°: 36). Se diseñaron sitios de restricción para endonucleasas Hind III y Spel para enmarcar el dominio VH y permitir la clonación en vectores de expresión mamíferos que contenían la región ?1 C humana (SEC. ID. N°: 34). Esto produjo un cambio de dos aminoácidos para la región 2C10 Vh en la estructura 4 (Kabat restos 107 y 108) en la secuencia publicada tal como se muestra en la SEC. ID. N°: 33. Se utilizaron oligonucleótidos superpuestos para construir la secuencia codificante completa mediante PCR y clonación en los sectores de expresión que se describen anteriormente. Después de la verificación de las secuencias, el anticuerpo quimérico se expresó en células CHO. El anticuerpo producido se purificó a partir de los sobrenadantes del cultivo celular mediante cromatografía por afinidad en sefarosa con rProtein A. Los anticuerpos quiméricos de 2C10 se evaluaron en ensayos de unión in vitro para demostrar que la potencia era comparable al 2C10 progenitor de rata. Esto se logró determinando los valores de CE50 para la unión a IL-18 humano o de mono rhesus en ELISA (Figuras 16 y 17) o mediante la inhibición de la liberación de IFN-? en un bioensayo con KG-1, véase la Figura 15. 7.2 Humanización 7.2.1 Estrategia de humanización de la cadena ligera Para la secuencia de la cadena ligera variable de 2C10 de rata, se seleccionó una estructura receptora de línea germinal humana (FJGKV1D-12-1, SEC. ID. N°: 38) que tenía una identidad del 64% (incluyendo las CDR) con la secuencia de la cadena ligera variable 2C10 de rata. La región V de la línea germinal se combinó por ordenador con una FR4 adecuada, en este caso el minigen kappa 2 de la región J (Kabat Vol.ll) basándose en la similitud de las secuencias (SEC. ID. N°: 40). Se generaron tres variantes humanizadas basándose en la comparación entre las secuencias y el posible impacto sobre la función del anticuerpo. La construcción L1 era un injerto directo de CDR de rata (usando la definición de Kabat) en la estructura receptora humana seleccionada anteriormente. La construcción L2 estaba basada en L1 con con una contramutación adicional en el resto 71. La construcción L3 estaba basada en L2 con 4 contramutaciones adicionales en los restos 45, 83, 84 y 85. Véase la Tabla 1.

Tabla 1: Resumen de las variantes de VL humanizadas generadas 7.2.2 Estrategia de humanización de la cadena pesada Para la secuencia de la cadena pesada variable de 2C10 de rata, se seleccionó una estructura receptora de línea germinal humana (Fp_IGHV1 -f_2, SEC. ID. N°: 37) que tenía una identidad del 59% (incluyendo las CDR) con la secuencia de la cadena pesada variable 2C10 de rata. La región V de la línea germinal se combinó por ordenador con una FR4 adecuada, en este caso el mini-gen JH6 de la región J (Kabat Vol.ll) basándose en la similitud de las secuencias (SEC. ID. N°: 39). Se diseñaron tres variantes de cadenas pesadas variables humanizadas basándose en esta estructura. H1 es un injerto de las CDR de rata (usando la definición de Kabat con 4 contramutaciones adicionales en los restos 27, 28, 29 y 93). Esto permitió tener una secuencia de aminoácidos muy inusual justo aguas arriba de CDR1 del anticuerpo progenitor (es decir donante) que puede constituir partes de la CDR (tal como lo definió Chothia). H2 estaba basada en H1 con dos contramutaciones adicionales en los restos 39 y 40. A su vez, H3 estaba basada en H2 con otras 4 contramutaciones adicionales en los restos 36, 71, 89 y 91. Véase la Tabla 2. Tabla 2: Resumen de las variantes de Vh humanizadas generadas Estruc¬ EstructuContramuNúmero Secuen¬ Constura ras receptaciones total de cia de trucreceptoras/ en el aa contramurata ción tora plantilla n.° (Kabat) taciones original humana H1 Fp_IGHV1- 27 4 Y E f_2 (SEC. 28 T I ID. N°: 37) 29 L S 93 A T H2 H1 39 6 Q R Estruc¬ EstructuContramuNúmero Secuen¬ Constura ras receptaciones total de cia de trucreceptoras/ en el aa contramurata ción tora plantilla n.° (Kabat) taciones original humana 40 A R H3 H2 36 10 W F 71 E A 89 V T 91 Y F 7.3 Humanización de 2C10C Se sintetizaron regiones V humanizadas de novo mediante la construcción de oligonucleótidos superpuestos y amplificación por PCR. Los cebadores incluían sitios de restricción para su clonación en vectores de expresión mamíferos y secuencias de señalización de inmunoglobulinas humanas para la secreción. Las regiones humanizadas se clonaron en vectores de expresión mamíferos como H1, H2 y H3 usando Hindlll y Spel en vectores de expresión mamíferos que contenían la región constante gamma 1 humana y como L1, L2 y L3 usando Hindlll y BsiWI en vectores de expresión de mamíferos que contenían la región constante kappa humana. Esto generó variantes de la cadena pesada humanizada del isotipo lgG1 humano y variantes de la cadena ligera humanizada del isotipo kappa. 7.3.1 Expresión de combinaciones de anticuerpos con cadenas pesadas y ligeras humanizadas Se transfectaron temporalmente células CHOK1 por cuadruplicado. Los sobrenadantes se ensayaron para determinar la concentración de anticuerpos y después se usaron en ensayos de unión in vitro comparando con una quimera 2C10 de rata y ser humano. La expresión transitoria a mayor escala de las nueve variantes se realizó mezclando, para cada matraz 51.4 µg de plásmido con cadena ligera y 8.6 µg de plásmido con cadena pesada con 240 de lípido de transfección (este lípido se describe en el documento WO2006/053783, ejemplo 13, cuyo contenido completo se incorpora a la presente memoria por referencia) en 8 mi de medio (OptiMEM/ glutamax/ FBS al 5%) y aplicando esta mezcla a dos matraces T175 de células CHOK1 cultivadas casi a confluencia durante 72 horas en condiciones típicas de cultivo tisular. Los anticuerpos se expresaron también en un sistema de células CHO en una cantidad de mg usando matraces agitados y se purificaron utilizando FPLC y Proteína A. 7.4 Ensayos de unión ¡n vitro 7.4.1 Análisis por Biacore Se realizó un análisis cinético Biacore™ de los anticuerpos humanizados 2C10 en un aparato Biacore™ 3000 usando captura de anticuerpos con Proteína A en tampón HBS-EP (Biacore™).

Resumiendo, la Proteína A se inmovilizó sobre un chip CM5 mediante acoplamiento de amina primaria, usando el protocolo recomendado por el fabricante, a densidades de aproximadamente 2000-4000 unidades de resonancia (RU). El anticuerpo humanizado después se pasó sobre la superficie de la Proteína A y se capturó a niveles de aproximadamente 200-500 RU, después de un periodo de estabilización, se pasó IL-18 (humana o de Rhesus) sobre la superficie del anticuerpo capturado a concentraciones definidas y se obtuvieron los sensogramas de unión. La regeneración, usando condiciones de elución ácidas, logró la separación total del anticuerpo de la superficie de la Proteína A y no redujo significativamente la capacidad de unión de la superficie. Todas las curvas se referenciaron por duplicado a una inyección de tampón en lugar de IL-18 y los datos se ajustaron en un modelo de unión 1:1 usando los parámetros de ajuste global del programa BiaEval 4.1. Los experimentos de clasificación de la velocidad de disociación se diseñaron usando el mismo procedimiento de captura con Proteína A, sin embargo sólo se utilizó una única concentración de IL-18 (10 nM). Aunque los datos se ajustaron usando el mismo modelo de unión que en el análisis cinético, dado que únicamente se utilizó una concentración del analito en la velocidad de disociación, este valor es útil para clasificar más que para proporcionar una medición cinética exacta y se utilizó como método para seleccionar qué anticuerpos se investigarían adicionalmente. Los resultados iniciales a 25°C indicaron que todas las construcciones presentaban afinidades de unión a IL-18 humana similares al anticuerpo progenitor 2C10 de rata. Sin embargo, cuando se realizó un experimento de clasificación de la velocidad de disociación a 37°C, las construcciones con L1 dieron resultados deficientes comparados con los de las construcciones L2 y L3 pudiendo observarse un aumento en las velocidades de disociación (Tablas 3a y 3b). Tabla 3a: Parámetros cinéticos para el análisis por Biacore de anticuerpos contra IL-18 humanos, ensayados a 25°C.

Anticuerpo ka Kd KD (pM) 2C10c 2.55e6 (7e4) 3.5e-5 (4.2e-6) 13.9 (2.2) H1L1 1.4e6 4.7e-5 33.2 H1L2 1.3e6 (1.4e5) 3.85e-5 ( .5e-5) 30.3 (8.7) H1L3 1.25e6 (2.1e4) 2.8e-5 (5.7T-6) 22.5 (7.2) H2L1 1.03e6 (1.0?5) 3.35e-5 (1.1e-5) 33.5 (13.4) H2L2 1.4e6 (1.4e5) 2.8e-5 (0.0) 20.1 (1.8) Anticuerpo ka Kd KD (pM) H2L3 1.15e6 (7e5) 2.8e-5 (2.8e-6) 23.8 (0.7) H3L1 2.5e6 (4.2e5) 4.7e-5 (9.9e-6) 19.4 (7.6) H3L2 2.6e6 (2.8e5) 4.3e-5 (3.6e-6) 16.5 (2.7) H3L3 1.7e6 (4.2e5) 4.0e-5 (5.7e-6) 24.2 (9.3) Datos de los resultados de dos experimentos, (desviación estándar) Tabla 3b: Clasificación de la velocidad de disociación en el análisis por Biacore de la unión de IL-18 humana a anticuerpos humanizados contra IL-18 capturados con Proteína A, ensayados Anticuerpo Kd 2C10c 7,01e-5 H1L1 1.62E-4 Anticuerpo Kd H1L2 4,81e-5 H1L3 5,54e-5 H2L1 9,93e-5 H2L2 4,15E-5 H2L3 4,62E-5 H3L1 1,3E-4 H3L2 8,22e-5 H3L3 7,01e-5 Los datos son el resultado de un experimento. Además de los resultados deficientes a 37°C, las construcciones con L1 también fueron las peores en cuanto a la afinidad de unión a IL-18 de Rhesus (Tabla 4a) a 25°C. Basándose en estas observaciones, los anticuerpos seleccionados se investigaron en mayor detalle para determinar la unión a IL-18 humana y de Rhesus a 37°C. Los datos que se muestran en la Tabla 4b para IL-18 humana son la media (y la desviación estándar) de seis determinaciones diferentes. Los datos para la IL-18 de Rhesus muestran la media y la desviación estándar de los experimentos para H1L2 y H1L3, mientras que los datos para H3L2 y H3L3 son de un único experimento. Las desviaciones estándar comparativamente elevadas de estos datos probablemente son debidas a que este experimento se realizó a 37°C. El hecho de que las construcciones con L1 dieran resultados relativamente deficientes es sorprendente considerando que la diferencia entre las construcciones con L1 y L2 es la sustitución de una contramutación de una fenilalanina por una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera. Tanto la tirosina como la fenilalanina, son por supuesto aminoácidos aromáticos, así que no se esperaba el hecho de que un cambio sutil en la estructura provocara unos resultados tan marcados (en términos de afinidad de unión) que se observaron en el sistema Biacore™ a 37°C (pero no a 25°C). Tabla 4a: Parámetros cinéticos del análisis por Biacore de la unión de IL-18 de Rhesus a construcciones de anticuerpos humanizados ensayadas a 25°C.

Anticuerpo ka Kd KD (pM) 2C10c 1.2E6 6.6e-5 54.7 H1L1 4.3E5 1.6E-4 380 H1L2 4.3E5 4.7e-5 108 H1L3 5.8E5 6.4e-5 109 Anticuerpo ka Kd KD (pM) H2L1 2.9E5 1.8E-4 627 H2L2 5.3E5 5.5e-5 104 H2L3 4.7E5 8.8-5 189 H3L1 9.1E5 1.4E-4 1 9 H3L2 1.1E6 6.6e-5 59.6 H3L3 1.0E6 7.0e-5 69.1 Los datos son el resultado de un experimento.

Tabla 4b: Parámetros cinéticos del análisis por Biacore de la unión de IL-18 humana y de Rhesus a construcciones de anticuerpos humanizados seleccionados ensayadas a 37°C.

Anticuerpo/ ka Kd KD (pM) IL-18 H1L2 IL-18 humana 7.75e5 (2.9e4) 1.38e-4 (1.7e-5) 197 (66.3) IL-18 de 1.01e6 (9.2e5) 1.40T-4 (2.1e-5) 139 (8.5) Rhesus Anticuerpo/ ka Kd KO (pM) IL-18 H1L3 IL-18 humana 7.12e5 (2.5e4) 1.18e-4 (1.9e-5) 188 (81) IL-18 de 1.08e6 (2.2e5) 1.86e-4 (6.1e-5) 170 (21.9) Rhesus H3L2 IL-18 humana 1.52e6 (4.9e5) 1.45e-4 (2.2e-5) 105 (39.6) IL-18 de 1.85e6 1.19e-4 64.3 Rhesus H3L3 IL-18 humana 1.49e6 (4.5e5) 1.52e-4 (1.7e-5) 110 (36.1) IL-18 de 1.79e6 1.35e-4 75.6 Rhesus Las variantes H1L1, H1L2 y H1L3 se seleccionaron para su análisis ulterior en la sección 7.4.2 más adelante. 7.4.2 Datos del análisis por Biacore T100 La caracterización de ciertos anticuerpos variantes se llevó a cabo mediante el aparato T100 Biacore™. Este aparato presenta ventajas con respecto al Biacore™ 3000, en lo que se refiere a sensibilidad, control de temperatura y estabilidad de base a temperaturas superiores debido al uso de un desgasificador en línea que minimiza los efectos del tampón a temperaturas superiores. También ofrece programas mejorados tales como análisis de datos automático. La metodología fue básicamente la misma que para el procedimiento que se usa en la sección 7.4.1 anterior; la Proteína A se movilizó en un chip CM5 a densidades de entre 2000-6000 RU mediante acoplamiento de amina primaria. Los ciclos se realizaronen HBS-EP (Biacore™). Los anticuerpos contra IL-18 se capturaron a densidades de entre 100-500 RU, se pasó IL-18 humana sobre esta superficie capturada a concentraciones entre 16 y 0.0625 nM, con una concentración de 0 nM (es decir una inyección sólo de tampón de anticuerpo capturado) como doble referencia. La regeneración tras cada inyección de IL-18 se realizó mediante elución con ácido suave usando dos inyecciones de glicina 10 mM, pH 1.5. Esta etapa de regeneración elimino el anticuerpo capturado de la superficie de la Proteína A (y por lo tanto toda la IL-18 unida a ella). La regeneración no alteró significativamente la capacidad de la superficie de la proteína de unirse a lotes posteriores de anticuerpo, permitiendo que se produjera otro evento de captura. Las curvas de unión obtenidas se analizaron usando al programa de análisis inherente al aparato T100 usando el modelo de unión 1:1. Los ciclos se realizaron a las temperaturas que se indica. Análisis de unión de H1L1 y H1L2 a 15°C, 20°C, 25°C, 32°C y 37°C El experimento se realizó usando el procedimiento anterior a diversas temperaturas. La Figura 1 muestra el efecto de la temperatura sobre la velocidad de asociación (ka), mientras que la Figura 2 muestra el efecto sobre la velocidad de disociación (kd) y la Figura 3 el efecto sobre la constante de equilibrio (KD). La Tabla 5 detalla los valores cinéticos que se usaron para crear estas figuras.

Tabla 5: Parámetros cinéticos aparte del experimento de variación de la temperatura Los datos son de un único experimento.

Los datos muestran que las velocidades de asociación de los dos anticuerpos analizados son similares en el intervalo de temperatura analizado, y H1L2 generalmente tiene una velocidad de asociación más rápida hasta el valor final a 37°C cuando H1L2 tiene una velocidad de asociación más rápida. Sin embargo, se observa una diferencia mayor cuando se analizan las velocidades de disociación, los dos anticuerpos tienen velocidades de disociación similares a 15°C, 20°C, 25°C, pero comienzan a divergir a 32°C y 37°C, donde la velocidad de disociación más rápida se observa con H1L1. Estos cambios se reflejan en la constante de equilibrio global (que está en función de kd/ka), e indican que la diferencia entre H1L1 y H1L2 está principalmente en la estabilidad del complejo anticuerpo/IL-18 tal como se define mediante la velocidad de disociación (kd). Análisis de la unión de H1L1, H1L2, H1L3 y 2C10 quimérico a 25°C y 37°C Los experimentos se realizaron tal como se describen anteriormente. La Tabla 6 detalla los parámetros cinéticos obtenidos. Los datos muestran que H1L2 es un anticuerpo mejor que H1L1 en lo que se refieren a la unión definida mediante la constante de equilibrio KD tanto a 25°C como a 37°C, pero los parámetros cinéticos muestran que, a 25°C, H1L2 tiene una mejor velocidad de asociación (ka) que H1L1. A 37°C la posición se invierte, lo que indica que la unión superior que se observa a 37°C para H1L2 se debe más a la velocidad de disociación (kd), lo que indica que la mutación que diferencia a L2 de L1 confiere una mayor estabilidad del complejo IL-18-anticuerpo a temperaturas superiores.

Tabla 6: Cinética de la unión de H1L1, H1L2, H1L3 y 2C10 quimérico a IL-18 humana a 25 °C y 37°C IL18 Humana a 25°C Anticuerpo Ka Kd KD (pM) H1 L1 2.49e6 7.94e-5 33.1 (n = 4) (4.41e5) (1.02e-5) (9.3) H1 L2 2.88e6 4.32e-5 16.3 (n=4) (7.39e5) (9.75T-6) (7.0) N1 L3 2.36e6 4.53e-5 22.0 (n=3) (9.89e5) (7.46T-6) (9.9) Quimera 2C10 6.88e6 5.22e-5 9.1 (n=3) (3.22e6) (8.94T-5) (4.7) IL18 Humana a 37°C Anticuerpo Ka Kd KD (pM) H1L1 5.64e6 4.58e-4 94.3 Anticuerpo Ka Kd KD (pM) (n=6) (2.42e6) (1.02T-4) (39.6) H1 L2 4.86e6 1.98e-4 46.0 (n=6) (1.88e6) (5.20e-5) (18.8) N1 L3 6.43e6 2.11 e-4 64.8 (n=3) (6.10e6) (4.84T-5) (57.3) Quimera 2C10 2.55e7 5.62e-4 22.9 (n=2) (1.25e7) (2.97e-4) (3.5) Los datos son la media de un número de conjuntos de datos separados (n), se muestran la media y la desviación estándar, con la desviación estándar entre paréntesis. Los valores para los ciclos a 25°C y 37°C para H1L1 y H1L2 obtenidos a partir de la crisis a cinco temperaturas diferentes incluyen en este conjunto de datos. 7.4.3 Evaluación de las variantes humanizadas de 2C10c en un ELISA de unión a IL- 8 Se realizó un ELISA con las nueve variantes humanizadas al menos seis veces usando diversos lotes de preparación de anticuerpos purificada. Las Figuras 4A-4C muestran datos representativos de un experimento que generó la clasificación de los valores de CE50 que se ilustra en la Tabla 7. Se inmovilizó IL-18 humana en placas de 96 pocilios Nunc Maxisorp usando 2.5 µ9/??? de 16D10 (anticuerpo monoclonal de ratón no neutralizador) para capturar 5 ng/ml de IL-18 recombinante humana. Los anticuerpos humanizados contra IL-18 se añadieron a diversas diluciones. Los anticuerpos humanizados unidos se detectaron usando conjugado específico de Fe contra IgG humano (Sigma A0170).

Tabla 7: Valores crecientes de CE50 de las variantes humanizadas de 2C10 {expresadas en fag/ml]) *Todos los ET estaban entre 0.001 y 0.002 La potencia de todas las variantes parecen ser muy similar a la quimera 2C10, lo que sugiere que la humanización había provocado muy poca pérdida de la potencia. Aunque los valores de CE50 generados por varias repeticiones de estos ensayos sí generaron una clasificación de las variantes, el ELISA por sí solo no permitió una distinción clara entre estas variantes (véase la Tabla 7 y las Figuras 4A-4C). Se logró una cierta distinción entre las variantes usando Biacore™ (secciones 7.4.1 y 7.4.2) lo que provocó que sólo cuatro variantes se examinarán en más detalle en diversos experimentos repetidos independientes usando y IL-18 humana y de rhesus (Tabla 8, Figura 5 [humana] y 6 [rhesus]).

Tabla 8: Valores de CE50 de seis experimentos repetidos independientes para cuatro variantes humanizadas seleccionadas para determinar la unión a IL-18 humana. 7.4.4 Evaluación de variantes de H1 humanizadas de 2C10 en un ELISA de unión a IL-18 Se realizó un ELISA con las tres variantes de H1 humanizadas; H1L1, H1L2 y H1L3 para evaluar la unión a IL-18 humana a temperatura ambiente y a 37 °C tanto en suero humano como en solución de bloqueo (PBS TWEEN al 0.05% con BSA al 1% (p/v)). Las variantes del anticuerpo humanizado se movilizaron sobre placas de 96 pocilios Maxisorp a 2.5 pg/ml. La captura de 5 ng/ml de IL-18 humana recombinante se realizó o a temperatura ambiente o a 37°C en suero humano o en solución de bloqueo. Se añadió anticuerpo monoclonal de ratón contra IL-18 16D10. El anticuerpo de ratón unido se detectó usando conjugado de kappa de ratón con peroxidasa (Serotec MCA 1291 P). Los valores de CE50 que se generaron a partir de los datos del estudio se ilustran en la Tabla 9.

Tabla 9 - Valores de CE50 de variantes de H1 humanizadas de 2C10 a temperatura ambiente y a 37 °C CE50 Error (ng/ml) estándar Incubaciones a temperatura ambiente En presencia de suero: Quimera 2C10 7.296 0.358 H1L1 10.189 0.512 H1L2 9.791 0.471 H1L3 8.989 0.411 En tampón de bloqueo: Quimera 2C10 3.814 0.068 H1 L1 3.315 0.136 H1L2 3.552 0.079 H1L3 3.790 0.133 CE50 Error (ng/ml) estándar Incubaciones a 37°C En presencia de suero: Quimera 2C10 10.140 1.254 H1L1 12.069 0.740 H1L2 9.791 0.471 H1L3 11.438 1.861 En tampón de bloqueo: Quimera 2C10 3.794 0.114 H1 L1 3.430 0.104 H1L2 3.404 0.145 H1L3 3.334 0.222 La potencia de las tres variantes de H1 humanizadas no se ve afectada por los cambios de la temperatura a la que se realiza la etapa de unión a IL-18 humana, desde temperatura ambiente a 37°C en este ensayo. Se observan señales de unión más débiles cuando los anticuerpos están en suero humano. 7.4.5 Evaluación de la estabilidad de anticuerpos con variantes de H1 humanizadas a 37°C La estabilidad en almacenamiento de las tres variantes de H1 humanizadas H1L1, H1 L2 y H1L3 se evaluó durante un período de tiempo de 14 días a 37°C tanto en suero humano como en solución salina tamponada con fosfato. Los anticuerpos se diluyeron a 50 pg/ml, la estabilidad se evaluó mediante un ELISA de unión a IL-18 unión, después del período de incubación de 0, 1, 4, 6, 8, y 14 días a 37°C. Para el ELISA de unión a IL-18, 16D10 (anticuerpo monoclonal de ratón no neutralizante) se inmovilizó sobre placas Nunc Maxisorp para capturar 5 ng/ml de IL-18 humana recombinante. Se añadieron los anticuerpos humanizados contra IL-18 muestreados en tiempos diferentes durante el transcurso de la incubación a 37°C. Los anticuerpos humanizados unidos se detectaron usando conjugado específico de Fe contra IgG humano. La exposición prolongada a una temperatura de 37°C durante 0, 1, 4, 6, 8 y 14 días no afectó a la potencia de unión de las variantes del anticuerpo H1 humanizado basándose en su capacidad de unirse a IL-18 humana en este formato de ensayo. 7.5 Unión de H1L2 a IL-18 humana en presencia de líquido sinovial Se realizó un ELISA en el que al líquido sinovial humano al 50% se añadió IL-18 humana recombinante de desde 500 ng/ml hasta 0 ng/ml. La IL-18 contenida en esta solución se aplicó después a pocilios de una placa de 96 pocilios Maxisorp (Nunc) recubierta con el anticuerpo H1L2. La IL-18 unida se detectó después mediante un anticuerpo biotinilado contra IL-18 (D045-6, MBL) y estreptavidina-HRP. La valoración de IL-18 humana recombinante en líquido sinovial (SF) al 50% produjo casi la misma curva en la valoración de IL-18 recombinante humana en tampón solamente con un ligero desplazamiento del valor máximo. Véase la Figura 7. Esto demuestra la capacidad del anticuerpo de unirse a hlL-18 incluso en presencia de líquido sinovial humano al 50% que imita mejor el entorno de unión que encontrará el anticuerpo en una situación terapéutica. 7.5.1 Unión a IL-18 en presencia de proteína de unión de IL-18 (IL18PP) Se usó la tecnología Biacore™ (Biacore™ 3000) y ELISA para determinar si H1L2 todavía puede unirse a y L18 en presencia de IL18bp humana. IL18bp tiene una afinidad elevada por IL-18 y actúa como inhibidor natural de la función de IL-18 (Figura 8, Figura 9 A y B, Tabla 10 y Tabla 11). Análisis mediante Biacore En resumen, se inmovilizó Próteína A sobre un chip CM5 con una densidad de aproximadamente 4000 unidades de resonancia (RU) mediante acoplamiento de amina primaria. La proteína de unión a Fc-IL-18 recombinante (R&D Systems), se pasó después a una concentración de 3µ^/??? con un caudal de ??µ?/minuto durante un minuto; esto produjo una captura de aproximadamente 1400 RU de la proteína de unión de IL-18. Después se pasó IL-18 sobre la proteína de unión de IL-18 capturada a una concentración de 30 nM, un caudal de "??µ?/minuto durante 5 minutos. Después de esto, el anticuerpo progenitor 2C10 de rata se pasó a una concentración de 10 nM sobre la superficie de proteína de unión de IL-18/IL-18 durante 3 minutos con un caudal de 30µ?/?t?????? durante 3 minutos. Si interfiriera el epítopo reconocido por el anticuerpo 2C10 anticuerpo en IL-18 con el sitio de interacción de la proteína de unión de IL-18, entonces no se observaría ninguna señal de unión. La Figura 10 demuestra que 2C10 se une a hlL-18 que a su vez había sido capturado por hlL-18BP, lo que indica que los sitios de unión para C10 y hlL-18BP no están superpuestos.

Tabla 10: Efecto de IL-18BP sobre las células sinoviales que segregan IFNy en la artritis reumatoide (RA) Estado de Muestra IL- Control IL-12 IL-18 1L-12 + IL-18 18BP RA1 — ND 0.63 ND 1.63 + ND 0.29 ND 0.13 RA2 — ND 0.85 ND 0.70 + ND 0.10 ND 0.10 Estado de Muestra IL- Control IL-12 IL-18 1L-12 + IL-18 18BP RA3 — ND 1.06 ND 1.62 + ND 0.32 ND 0.40 Kawashima, M. y Miossec, P., Arthritis & Rheumatism, Vol. 48, N.°. 3 (Marzo de 2003), páginas 631 - 637 Análisis mediante ELISA La unión de MAb humanizado de rata H1L2 o 2C10 a I L 18bp capturada unida a IL-18 humana se analizó en ELISA de unión directa en el que se recubrió la proteína de fusión IL18bp humana-Fc (R&D Systems #119-BP) sobre placas Nunc Maxisorp a 0.5 g/ml. Se añadió IL-18 (en reactivo de la casa) a 100 ng/ml en tampón de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1% p/v). Los anticuerpos purificados se añadieron a concentraciones que variaban en el intervalo de 0.5 ng/ml a ^µg/m . El anticuerpo unido se detectó con un conjugado de inmunoglobulina específica contra la cadena ligera kappa humana y HRP (Sigma) o contra IgG de rata HRP. Las Figuras 18A y B ilustran los resultados obtenidos. 7.6 Bioensayos in vitro 7.6.1 Actividad de las construcciones humanizadas sobre la neutralización de la liberación de IFN-v estimulada con IL18 en la línea celular KG-1 Este ensayo mide la actividad neutralizadora de un anticuerpo específico para IL-18 y se basa en la inducción mediada por IL-18 de IFNy en células KG-1. KG-1 (ATCC #CCL-246) es una línea celular mielomonocítica que expresa de forma constitutiva el receptor funcional IL-18 y, por lo tanto, responde a la estimulación con IL-18 exógena. Se evaluaron las nueve variantes humanizadas para determinar su capacidad de inhibir la liberación de IFN-? estimulada por IL-18 células KG-1 (Tabla 12 y Figura ^^).

Tabla 12: Valores de CI50 para la neutralización de IL-18 recombinante humano en un bioensayo en KG-1 usando las nueve variantes humanizadas.

Anticuerpo CI50 H1 L1 0.071 H1 L2 0.033 H1L3 0.027 Anticuerpo CI50 H2L1 0,145 H2L2 0.054 H2L3 0.046 H3L1 0.027 H3L2 0.035 H3L3 0.034 2C10(1) 0.042 2C10(2) 0.039 Se realizaron al menos seis experimentos repetidos adicionales en cuatro variantes humanizadas preferidas que habían demostrado la mejor afinidad por IL-18 humana recombinante y de rhesus basándose en el análisis por Biacore™. La Figura 8 ilustra un resultado representativo para las cuatro variantes humanizadas preferidas y para H1L1, y la Tabla 13 resume los resultados de estos ensayos realizados todos con el mismo material del 11 de proteínas derivado de células CHOela.

Tabla 13: Valores de CI50 para la neutralización de IL-18 recombinante humana en un bioensayo en KG-1 usando 4 ó 5 variantes humanizadas seleccionadas.

CI50 media IL-18 H1L1 H1L2 H1L3 H3L2 H3L3 para bp 2C10 Expt. 1 0.046 n.d. 0.062 0.064 0.064 0.057 n.d. fuera fuera fuera fuera fuera Expt.2 de n.d. de de de de n.d. límites límites límites límites límites Expt.3 0.074 n.d. 0,109 0,144 0.090 0.091 n.d. Placa 1 Expt.3 0.075 n.d. 0.173 0.156 0.128 0.115 n.d. Placa 2 fuera fuera Expt.4 0.017 0.091 0.017 0.044 de 0.016 de límites límites Expt.5 (Est. 0.075 0.757 0.122 0.085 0.072 0.056 0.054 CI50 media IL-18 H1L1 H1L2 H1L3 H3L2 H3L3 para bp 2C10 Expt.5 (Est. 0.044 0.180 0.047 0.046 0.039 0.038 0.034 CE50) Expt.6 fuera fuera (Est. de 0.078 0.023 0.021 de 0.013 0.007 CE80) límites límites Expt.6 (Est. 0.020 0.069 0.019 0.019 0.015 0.016 0.01 CE50) En los casos en los que H1L1 se comparó con otras variantes humanizadas, H1L1 demostró una potencia menor comparada con las otras cuatro construcciones humanizadas analizadas y también comparada con el MAb progenitor 2C10. Se realizaron análisis adicionales con los cuatro anticuerpos monoclonales, que se compararon para determinar la capacidad de inhibir la liberación de IFNy estimulada por IL-18 por las células KG-1: 2C10 y las variantes humanizadas derivadas de 2C10 (H1L1, H1L2 y H1L3). El bioensayo con KG-1 se realizó en placas de 96 pocilios incubando 50 ng/ml de IL-18 humana recombinante y diversos concentraciones de los anticuerpos específicos para IL-18 (que variaban en el intervalo de 2 pg/ml a 7.8 ng/ml, en diluciones dobles) o un control negativo con otro isotipo (Synagis, anti-RSV anticuerpo) durante 1 hora a 37°C y 5%C02, seguido de la adición de 3.105 células KG-1 por pocilio. Las placas se incubaron finalmente durante 20-24 horas a 37°C, C02 al 5%. El sobrenadante se recolectó y se determinó la producción de IFNy usando un kit ELISA DE IFNy humano comercial (Biosource AHC4432; AHC4539). Se han realizado tres experimentos. Los resultados para la inhibición de la producción de IFNy estimulada por IL-18 se normalizaron con el control negativo. El análisis estadístico se encaminó a obtener una estimación de la CI50 para cada mAb en en cada experimento tras el ajuste para las respuestas en Synagis. Las estimaciones de las CI50 se analizaron después estadísticamente produciendo una estimación global de la CI50 para cada mAb con un intervalo de confianza del 95% (es decir un intervalo estadísticamente plausible). Cada variante humanizada finalmente se comparó con 2C10 usando la prueba de Dunnett. La Figura 12 ¡lustra un experimento representativo. La Tabla 14 y la Figura 13 muestran una estimación global de las CI50 para cada anticuerpo monoclonal con un intervalo de confianza del 95% y un cambio porcentual con respecto al 2C10 de rata con valores p e intervalos de confianza.

Tabla 14: Valores de CI50 para la neutralización de la producción de IFNY estimulada por IL-18 en el bioensayo con KG-1 H1L1 es de forma estadísticamente significativa menos potente que 2C10 (p<0.001). Las otras variantes humanizadas no son significativamente diferentes de 2C10, aunque la comparación entre H1L3 y 2C10 está al límite. 7.6.2 Actividad de H1L2 sobre la neutralización de la liberación de IFN-Y en PBMC (células mononucleares de sangre periférica) humanas estimuladas Se estimularon PBMC humanas de tres donantes con IL-18 humana recombinante y anticuerpo contra CD3 y se estudió el efecto de la adición de una dilución en serie de cuatro variantes de anticuerpos humanizados seleccionadas. Para cada anticuerpo 2C10 progenitor donante y se incluyó IL18bp como comparación. Para dos de los tres donantes, la estimulación con IL-18 e Ig contra CD3 no tuvo éxito y no se detectó IFN-?. Para el resto de los donantes, los resultados fueron muy variables a concentraciones bajas, pero pudo lograrse una inhibición completa de la producción de IFNy por IL-18 añadiendo diversos anticuerpos contra IL-18 que incluían las variantes humanizadas. Véase la Figura 14. También se realizaron experimentos con PBMC humanas estimuladas con LPS que provoca la producción de IL-18 y la liberación asociada de IFNy. La producción de IFNy se indujo mediante LPS de forma dependiente de la concentración y la adición de anticuerpo monoclonal 2C10 progenitor a una concentración fija de 1 µ^/?t>? inhibió completamente esta estimulación, lo que indica que el efecto está mediado por IL-18 y que la IL-18 endógena puede ser neutralizada (no se muestran datos). Esto pudo demostrarse también en sangre completa, pero el efecto de inhibición con 2C10, aunque dependiente de la dosis, fue menos evidente (no se muestran datos). La Figura 9 ilustra los resultados de un experimento con 3 donantes independientes y la inhibición con 2C10 monoclonal progenitor de rata, H1L2 y IL18bp. Los donantes 1 y 3 dieron resultados similares, mientras que el donante 2 no mostró liberación de IFNy en la estimulación con LPS (no se muestra). La liberación de IFNy mediada por IL-18 puede inhibirse completamente en presencia de suero humano al 10% o 25% añadiendo >^g/ml de anticuerpo o IL18bp. La inhibición puede observarse ya a 10 ng/ml y más, y los valores de CI50 para esta inhibición en presencia de suero humano al 10% o 25% se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11: Valores de CI50 para la inhibición de la liberación de IFNy estimulada por LPS provocada mediante la neutralización de IL-18 endógena usando 2C10, H1L2, o IL18bp en presencia de suero humano IL18bp H1L2 2C10 Donante 1 suero 0.024 0.102 0.023 al 10% Donante 1 suero 0.064 0.113 0.069 al 25% Donante 3 suero 0.032 0.042 0.033 al 10% Donante 3 suero 0.046 0.108 0.086 al 25% 7.6.3 Resumen de unión a ortólogos de IL-18 Se examinó la unión de anticuerpo con IL-18 de otras especies usando ELISA y Biacore y también bioensayo con células KG-1. Inicialmente esto se realizó usando 2C10 progenitor y 2C10c quimérico para IL-18 de rhesus/macaco pero se repitió con algunas de las variantes humanizadas. Se analizó 2C10 progenitor para determinar la unión a IL-18 de cerdo, ratón y rata y se analizaron las 4 variantes humanizadas mejores para determinar la unión a IL-18 de rhesus/macaco y perro usando Biacore y ELISA. Se realizó un bioensayo con KG-1 con IL-18 de rhesus/macaco y tres anticuerpos monoclonales, 2C10 quimérico y de forma representativa para las variantes humanizadas, H3L3. Dada la similitud entre todas las variantes humanizadas, es probable que esto sea representativo para otras variantes generadas, incluyendo H1L2 (véase Tabla 15, Figura 8). Tabla 15: Resumen de la unión de ortólogos de MAb 2C10 progenitor de rata, 2C10c quimera de rata y humano y un grupo seleccionado de 4 variantes humanizadas IL-18 de IL-18 de IL-18 de IL-18 de ratón y Rhesus/macaco perro cerdo rata MAb 2C10 de ELISA (+) ELISA (-) ND ND rata KG-1 (+) IL-18 de IL-18 de IL-18 de IL-18 de ratón y Rhesus/macaco perro cerdo rata 2C10 ELISA ( + ) ELISA (-) ELISA (-) ELISA (-) quimérico KG-1 (+) Biacore™ Biacore™ Biacore™ (rata/humano) Biacore™ ( + ) (-) (-) (-) Humanizados ELISA ( + ) ELISA (-) ELISA (-) ELISA (-) (H1L2, H1L3, KG-1 ( + ) sólo H3L1, H3L3) H3L3 analizado Biacore™ (+) ND no determinado; + unión detectable 7.7 Estudios de dicroismo circular y desnaturalización térmica de anticuerpos contra IL-18 Se usaron estudios de dicroismo circular (DC) para estudiar los cambios estructurales secundarios de los anticuerpos contra IL-18 en función de la temperatura, en especial desde 25°C a 37°C. Los estudios de desnaturalización térmica de estos mismos anticuerpos se realizaron para determinar su estabilidad térmica y sus temperaturas de fusión (Tf.) Procedimiento de DC: los espectros de DC se obtuvieron en un espectrómetro Applied Photophysics Chirascan que barría desde 180nm hasta 280nm en etapas de 0.5 nm y con una anchura de banda de 1nm. El tiempo de adquisición por cada punto fue de 5 segundos. Las muestras se diluyeron a ~ 0.2 mg/ml en PBS y se introdujeron en una cubeta con una longitud de recorrido de 1 mm. Los espectros de cada proteína se obtuvieron con el baño termostático fijado a 4°C, 25°C y 37°C. Las temperaturas reales de las muestras se determinaron mediante una sonda introducida en el líquido de la cubeta y estaban en ~3°C de la temperatura fijada. Procedimiento de Tf: todas las proteínas se diluyeron a 0.2 mg/ml en naranja Sypro en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1:1000. La emisión de fluorescencia se midió a 620 nm (excitación a 490 nm) usando un aparato Bioneer Exicycler en cada intervalo de 0.5°C mientras la temperatura de la muestra se incrementaba desde 10°C a 95°C esperando 10 segundos a cada temperatura. Las curvas de desnaturalización se ajustaron en una isoterma de fusión estándar usando Grafit. Tal como se esperaba, la comparación de la forma de los espectros de DC de los cuatro anticuerpos mostró que su estructura era de lámina beta y esencialmente con la misma arquitectura. En el intervalo de temperatura desde 4°C a 37°C los tres anticuerpos: H1L1 H1L2 H1L3 no muestran cambios significativos en su estructura secundaria, según se reveló mediante DC. Sin embargo, el anticuerpo quimera 2C10 si mostró un ligero descenso de la estructura en este intervalo de temperaturas. Esto es consistente con la pauta de estabilidad térmica que se presenta en la Tabla 16 siguiente.

Tabla 16: Desnaturalización térmica de anticuerpos contra IL-18 H1L1, H1L2 y H1L3 son claramente estables mucho más allá de 37°C sin signos de desnaturalización a la temperatura corporal. Por lo tanto es improbable que la diferencia entre sus estabilidades térmicas confiera ventajas diferenciales a las temperaturas corporales y ambientales normales.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tiene las siguientes regiones determinantes de la complementariedad (CDR): CDRH1:SEC. ID. N°: 1 CDRH2:SEC. ID. N°: 2 CDRH3:SEC. ID. N°: 3 CDRL1 :SEC. ID. N°: 4 CDRL2:SEC. ID. N°: 5 CDRL3:SEC. ID. N°: 6

2. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tiene las siguientes CDR: CDRH1:SEC. ID. N°: 1 CDRH2:SEC. ID. N°: 2 CDRH3:SEC. ID. N°: 3 CDRLV.SEC. ID. N°: 4 CDRL2:SEC. ID. N°: 5 CDRL3:SEC. ID. N°: 6 en las que el resto de la posición 71 de la cadena ligera está sustituido por el resto correspondiente que se encuentra en el anticuerpo donante del que se derivan las CDR.

3. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende CDR que se derivan de un anticuerpo donante injertado sobre una estructura receptora humana, anticuerpo contra interleuquina 18 que comprende CDR que tienen las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 en las que el resto de la posición 71 de la cadena ligera de dicho anticuerpo contra interleuquina 18 es idéntico al resto que se encuentra en la posición correspondiente de la estructura del anticuerpo donante.

4. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, anticuerpo que comprende una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera.

5. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada que tiene CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 y una cadena ligera que tiene CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6, en el que dichas CDR de la cadena ligera se derivan de un anticuerpo donante que tiene una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera del anticuerpo donante.

6. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende CDR de un anticuerpo donante y una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera de dicho anticuerpo humanizado, en el que el anticuerpo donante es 2C10 o una variante estructural del mismo (es decir comprende las mismas CDR pero una estructura diferente de 2C10, véase la patente de Estados Unidos 6.706.487).

7. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que tiene CDR con las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora y (b) una cadena ligera que tiene CDR con las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre estructura de cadena ligera humana receptora, en el que dicha estructura de cadena ligera humana receptora comprende la SEC. ID. N°: 38 y en la que posición 71 de la cadena ligera es una tirosina.

8. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 y; (b) una cadena ligera que comprende CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera humana receptora, en el que dicha estructura de cadena ligera receptora de dicho anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 es una variante de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que dicha variante comprende una tirosina en la posición 71 y, en la que dicha variante comprende una identidad del 75% o superior con la estructura que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38.

9. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 derivadas de un anticuerpo donante, anticuerpo donante que comprende una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera del anticuerpo donante; (b) una estructura receptora humana, estructura receptora que comprende una feniialanina en la posición 71 de la cadena ligera humana; en el que el anticuerpo contra interleuquina 18 comprende una tirosina en la posición 71 de la cadena ligera.

10. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) CDR que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 derivadas de un anticuerpo donante, anticuerpo donante que comprende un aminoácido aromático en la posición 71 de la cadena ligera del anticuerpo donante; (b) una estructura receptora humana, estructura receptora que comprende, en la posición 71 de la estructura de cadena ligera receptora, un tipo de aminoácido aromático diferente del aminoácido aromático de la parte (a); en el que el anticuerpo contra interleuquina 18 comprende una cadena ligera que tiene en la posición 71 un aminoácido aromático derivado del anticuerpo de la parte (a).

11. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18, anticuerpo que presenta una afinidad de unión (KD) de 90 pM o superior con respecto a IL- 8 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo Biacore™ T100) a 37°C.

12. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende CDR tal como se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 y presenta una afinidad de unión (KD) de 90 pM o superior con respecto a IL-18 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo Biacore™ T100) a 37°C.

13. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18, anticuerpo que presenta una velocidad de disociación (kd) de 0.0002 (1/s) o inferior con respecto a unión de IL-18 humana cuando se mide mediante resonancia de plasmón superficial (por ejemplo Biacore™ T100) a 37°C.

14. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada receptora, estructura de cadena pesada receptora que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que uno o más resto/s de la/s posición/es 27, 28, 29, 93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que tiene una secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que la posición 71 y opcionalmente uno o más (por ejemplo todos) resto/s de la/s posición/es 45, 83, 84, 85 de la cadena ligera son idénticos al resto correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo donante.

15. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que tiene una secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 93 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que tiene una secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que el resto de la posición 71 de la cadena ligera de dicho anticuerpo contra interleuquina 18 es idéntico al resto correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo donante.

16. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 39, 40, 93 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que el resto de la posición 71 de la cadena ligera es idéntico al resto correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo donante.

17. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura receptora que comprende regiones estructurales derivadas de la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 36, 39, 40, 71, 89, 91, 93 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que el resto de la posición 71 de la cadena ligera es idéntico al resto correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo donante.

18. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que tiene una secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 93 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que tiene una secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que los restos de las posiciones 71, 45, 83, 84, 85 de la cadena ligera son idénticos a los restos correspondientes de la cadena ligera del anticuerpo donante.

19. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 93, 39, 40 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que tiene una secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que los restos de las posiciones 71, 45, 83, 84, 85 de la cadena ligera son idénticos a los restos correspondientes de la cadena ligera del anticuerpo donante.

20. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2 y 3 injertadas sobre una estructura de cadena pesada humana receptora, estructura de cadena pesada receptora que tiene la secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 37, en la que los restos de las posiciones 27, 28, 29, 93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 de la cadena pesada son idénticos a los restos correspondientes de la cadena pesada del anticuerpo donante; (b) una cadena ligera que comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante, CDR que tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 injertadas sobre una estructura de cadena ligera receptora, estructura de cadena ligera receptora que tiene una secuencia que se describe en la SEC. ID. N°: 38, en la que los restos de las posiciones 71, 45, 83, 84, 85 de la cadena ligera son idénticos a los restos correspondientes de la cadena ligera del anticuerpo donante.

21. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada que se selecciona a partir del grupo constituido por: SEC. ID. N°: 9, SEC. ID. N°: 17, SEC. ID. N°: 21; y una cadena ligera que se selecciona a partir del grupo constituido por: SEC. ID. N°: 13, SEC. ID. N°: 29.

22. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 9 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 13 o una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 9 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 29.

23. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 17 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 13 o una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 17 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 29.

24. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 21 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 13 o una cadena pesada de la SEC. ID. N°: 21 y una cadena ligera de la SEC. ID. N°: 29.

25. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende: (a) una cadena pesada que tiene CDR que permiten la unión específica a IL-18 humana; (b) una cadena ligera que comprende una estructura receptora que tiene CDR con las secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 4, 5 y 6 y que tiene un resto tirosina en la posición 71.

26. Un anticuerpo humanizado contra interleuquina-18 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que la relación entre la velocidad de disociación {kd) de dicho anticuerpo en la unión a IL-18 humana a 25°C y velocidad de disociación {kd) de dicho anticuerpo en la unión a IL-18 humana a 37°C es 1:5 (o 1: menos de 5), y, en el que dicho anticuerpo comprende CDR derivadas de un anticuerpo donante y una estructura receptora humana, y, en el que un resto de la posición 71 de la cadena ligera de la estructura receptora humana está sustituido por el resto correspondiente del anticuerpo donante.

27. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 26, en el que las CDR tienen secuencias que se describen en las SEC. ID. N°: 1, 2, 3, 4, 5 y 6.

28. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27, en el que el resto de la posición 71 de la cadena ligera de la estructura receptora humana es un aminoácido aromático, preferiblemente fenilalanina, y el resto correspondiente en el anticuerpo donante es un tipo diferente de aminoácido aromático, preferiblemente tirosina.

29. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo contra interleuquina 18 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

30. Uso de un anticuerpo contra interleuquina 18 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como esclerosis múltiple, enfermedades artríticas tales como artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, enfermedad inflamatoria del intestino (Eli) y soriasis.

31. Uso de la reivindicación 31 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide.

32. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como esclerosis múltiple, enfermedades artríticas tales como artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) y soriasis.

33. Un procedimiento de tratar a un paciente humano que padece una enfermedad autoinmunitaria tal como esclerosis múltiple, enfermedades artríticas tales como artritis reumatoide, diabetes de tipo 1, enfermedad inflamatoria del intestino (EN) y soriasis, procedimiento que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

34. Un procedimiento para la producción de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, procedimiento que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica dicho anticuerpo en condiciones que permitan la expresión de dicho anticuerpo.

35. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que dichas condiciones incluyen cultivar dicha célula huésped en dicho medio de cultivo sin suero.

36. El procedimiento de la reivindicación 34 ó 35, en el que dicha célula huésped es una célula de mamífero.

37. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicha célula huésped es CHO o NSO.

38. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que la célula CHO es una célula CHO DHFR' antes de la transfección o transformación con dicho polinucleótido.

39. Un procedimiento de selección de un anticuerpo (en particular un anticuerpo que inhibe la interacción entre un ligando y un receptor tal como un anticuerpo contra interleuquina 18 que se describe en la presente memoria) para uso terapéutico, procedimiento que comprende: (a) medir la afinidad de unión (usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore™) del anticuerpo por un antígeno al que el anticuerpo se une específicamente a una temperatura entre 30 y 45°C (preferiblemente 37°C); (b) medir la afinidad de unión (usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore™) del anticuerpo por un antígeno al que el anticuerpo se une específicamente a una temperatura entre 20 y 25°C (preferiblemente 25°C); (c) seleccionar dicho anticuerpo para uso terapéutico si la afinidad de (a) es superior a la afinidad de (b), preferiblemente si dicha afinidad de (a) es 2 veces o más, más preferiblemente 4 veces o más la afinidad de la etapa (b).

40. Un procedimiento de selección de un anticuerpo (en particular un anticuerpo que inhibe la interacción entre un ligando y un receptor tal como un anticuerpo contra interleuquina 18 que se describe en la presente memoria) para uso terapéutico, procedimiento que comprende: (a) medir la velocidad de disociación (usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore™) del anticuerpo de un antígeno al que el anticuerpo se une específicamente, a una temperatura entre 30 y 45°C (preferiblemente 37°C); (b) medir la velocidad de disociación (usando por ejemplo resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore™) del anticuerpo de un antígeno al que el anticuerpo se une específicamente, a una temperatura entre 20 y 25°C (preferiblemente 25°C); (c) seleccionar dicho anticuerpo para uso terapéutico si la velocidad de disociación de (a) es menor que la velocidad de disociación de (b).