ES2577579T3

ES2577579T3 - Factor de velocidad

Info

Publication number: ES2577579T3
Application number: ES10747844.8T
Authority: ES
Inventors: Michael Schraeml; Leopold Von Proff
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-08-25
Filing date: 2010-08-19
Publication date: 2016-07-15
Anticipated expiration: 2030-08-19
Also published as: CN102482344B; CA2770173A1; KR20120038522A; EP2470563B1; IL217242A; US9488661B2; JP2013501819A; US8617849B2; IL246733B; JP5412579B2; WO2011023623A1; CA2770173C; AU2010288663A1; CN102482344A; US20120156726A1; US20170212107A1; SG178546A1; US20140256915A1; KR101484375B1; MX357102B

Abstract

Método de obtención de un anticuerpo que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una multitud de anticuerpos; b) determinar la constante de velocidad de asociación de cada anticuerpo con su antígeno a 37 ºC y la constante de velocidad de asociación de cada anticuerpo con su antígeno a 13 ºC; c) calcular la relación entre la constante de velocidad de asociación a 37 ºC y la constante de velocidad de asociación a 13 ºC; d) seleccionar un anticuerpo con una relación de 10 o inferior, obteniéndose así un anticuerpo.

Description

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anticuerpo: antígeno FV ΔSº‡as [J/mol*K] EE [J/mol*K]

anticuerpo 9: 2 3 -10 5,8

anticuerpo 10: 5 3 -66 14

anticuerpo 11: 1 2 -35 4,1

anticuerpo 12: 5 2 -38 13

anticuerpo 13: 1 5 -14 1,3

anticuerpo 14: 2 5 9 6,6

anticuerpo 15: 1 5 -5,3 5,6

anticuerpo 16: 1 6 71 23

anticuerpo 17: 2 8 77 15

anticuerpo 18: 2 9 80 16

anticuerpo 19: 2 12 110 29

anticuerpo 20: 2 21 160 41

anticuerpo 21: 2 74 350 70

anticuerpo 22: 2 137 370 78

anticuerpo 23: 2 4 6 5,5

anticuerpo 24: 2 4 3,6 4,2

anticuerpo 25: 2 5 26 9,2

anticuerpo 26: 6 5 38 13

anticuerpo 27: 2 5 24 6,3

anticuerpo 28: 2 6 34 12

anticuerpo 29: 2 6 28 12

anticuerpo 30: 6 7 62 14

anticuerpo 31: 2 8 77 15

La Tabla 1 muestra los datos de 28 anticuerpos murinos, quiméricos humanos y murinos humanizados diferentes, fragmentos Fab y Fab'2 de origen murino o humano, la unión a seis antígenos diferentes. Los antígenos son todos antígenos proteinógenos, conformacionales, que difieren en su peso molecular. El factor de velocidad FV se 5 correlaciona con ΔSº‡as, por lo que los valores bajos de FV se correlacionan con valores negativos o bajos de ΔSº‡as. Se ha encontrado que una ΔSº‡as negativa indica una interacción entre anticuerpo y antígeno dirigida por la entalpía, los valores de ΔSº‡as positivos indican interacciones entrópicas/entálpicas y los valores de ΔSº‡as de tres dígitos significan interacciones dirigidas completamente por la entropía. Por lo tanto, en el presente documento, se informa de un método de selección de un anticuerpo que se une específicamente que comprende las siguientes 10 etapas:

a) proporcionar una multitud de anticuerpos; b) determinar la constante de velocidad de asociación de cada anticuerpo a su antígeno a 37 ºC y la constante de velocidad de asociación de cada anticuerpo a su antígeno a 13 ºC;

15 c) calcular la relación de la constante de velocidad de asociación a 37 ºC con respecto a la constante de velocidad de asociación a 13 ºC; d) seleccionar un anticuerpo que se une específicamente mediante la selección de un anticuerpo con una relación de 10 o inferior y un valor de ΔSº‡as de 100 J/mol*K o inferior.

20 En una realización, la selección es de un anticuerpo con un valor de ΔSº‡as de 50 J/mol*K o inferior.

Cuanto mayor es la ΔSº‡as, mayor es la probabilidad de la unión promiscua del anticuerpo.

Una ΔSº‡as baja o negativa se correlaciona con especificidad y con unión monoespecífica. 25

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Se ha encontrado que no es necesario determinar la termodinámica de la fase de asociación mediante la linealización de los datos de acuerdo con las ecuaciones de Eyring y de Arrhenius, cuando la tarea consiste en producir datos de alta calidad linealizables para calcular los parámetros con errores aceptables. Usando los métodos como se informa en el presente documento, basta con determinar los datos cinéticos a solo dos temperaturas, es decir, a 13 ºC y a 37 ºC.

Basándose en los datos experimentales, se determinan los valores de ka (37 ºC) y ka (13 ºC) mediante el uso de un modelo cinético apropiado. A partir de entonces, se calcula el factor de velocidad (FV) = ka (37 ºC)/ka (13 ºC), y se evalúa la ΔSº‡as de acuerdo con la curva característica presentada en la Figura 8.

Los valores de FV de dos dígitos se correlacionan con los valores de ΔSº‡as de tres dígitos, e indican un mayor riesgo de unión promiscua. Los datos de la Figura 8 se modelizaron mediante una función de asociación exponencial y = y0 + A1* (1-exp(-x/t1)) + A2* (1-exp(-x/t2)).

De acuerdo con la gráfica de la ecuación exponencial, se puede reducir al mínimo el riesgo de seleccionar un aglutinante dirigido por la entropía no deseado. La ΔSº‡as se estima mediante el parámetro sustituto FV. En contraste con ΔSº‡as, FV es un parámetro de acceso instrumentalmente fácil.

La Figura 8 muestra que la ΔSº‡as alcanza un valor de meseta en el parámetro de la ecuación Al = 399,74088 ± 36,60886 J/mol*K.

Los datos más relevantes se caracterizan por valores bajos de FV de menos de 10, y muestran desviaciones estándar de ΔSº‡as menores.

El parámetro de ajuste A2 (A2 = 198,50729 ± 29,933 J/mol*K) es ΔSº‡as en la inflexión de la curva.

Los anticuerpos con ΔSº‡as superior a A2 (ΔSº‡as > A2) son críticos, es decir, no se adaptan bien, para esfuerzos de procesamiento adicionales. La Figura 8 indica que la mayoría de los anticuerpos analizados muestran valores de FV inferiores a 10 (<10). Estos anticuerpos se pueden usar diagnóstica o farmacéuticamente.

Los anticuerpos con ΔSº‡as superior a A2, que se correlaciona con un FV de más de 50, muestran, por ejemplo, reactividad cruzada con otros antígenos.

Por lo tanto, en el presente documento, se informa de un método de selección de un anticuerpo de reacción cruzada que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una multitud de anticuerpos; b) determinar la constante de velocidad de asociación de cada anticuerpo a su antígeno a 37 ºC y la constante de velocidad de asociación de cada anticuerpo a su antígeno a 13 ºC; c) calcular la relación de la constante de velocidad de asociación a 37 ºC con respecto a la constante de velocidad de asociación a 13 ºC; d) seleccionar un anticuerpo de reacción cruzada mediante la selección de un anticuerpo con una relación de 50

o superior y un valor de ΔSº‡as de 200 J/mol*K o superior.

En una realización, la selección es de un anticuerpo con un valor de ΔSº‡as de 300 J/mol*K o superior.

La Figura 8 se puede segmentar en cuatro corredores (véase la Figura 9). Los factores 0 < FV < 20 indican un resultado de detección seleccionado. Los anticuerpos del segmento 3 muestran factores FV de más de 20 (FV > 20) y no se seleccionan debido a sus valores de ΔSº‡as aumentados.

Estos anticuerpos son sospechosos de unirse de forma promiscua al antígeno, y requieren análisis más detallados para aclarar el mecanismo de unión a la diana.

La clasificación de acuerdo con la Figura 9 se puede usar para realizar ensayos de detección de alto rendimiento basados en ΔSº‡as de grandes poblaciones de anticuerpos. Por ejemplo, en el proceso de humanización de anticuerpos, en el que se ensayan sistemáticamente las composiciones óptimas de cadena pesada y ligera humana para determinar su rendimiento óptimo, de manera similar al anticuerpo parental, se puede usar el método del que se informa en el presente documento.

Los anticuerpos 8, 9, 17, 18, 20, 21, 22 y 31 como los comprendidos en la Tabla 1 corresponden a diferentes etapas de un proceso de humanización. A los valores del FV, le puede seguir el proceso de humanización. El anticuerpo murino parental 8 muestra un bajo valor de FV y una ΔSº‡as negativa. El anticuerpo quimérico 9 muestra un FV todavía invariable, así como ΔSº‡as. Los anticuerpos totalmente humanizados, que son de diferentes combinaciones de secuencias de cadenas VLNH, muestran discrepancias en el FV y, por tanto, en la ΔSº‡as. Finalmente, se seleccionó el anticuerpo 31, que muestra el FV más bajo, así como ΔSº‡as, mientras que el anticuerpo 21 y el anticuerpo 20 no se seleccionaron debido a la inestabilidad termodinámica, la funcionalidad inferior en ensayos de

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cultivo celular y/o la unión promiscua al antígeno.

La Tabla 1 indica que el diagrama que se muestra en la Figura 9 también se puede usar para fragmentos de anticuerpos.

El método como el presentado en el presente documento también se puede usar para la obtención de anticuerpos o células productoras de anticuerpos, por ejemplo, las que proceden directamente de mezclas de células, en una realización, hibridoma o linfocitos B, o en otra realización, de un hibridoma o linfocito B depositado individualmente, en el que se excluyen los anticuerpos en estado de maduración potencialmente no homogéneo, debido a que es importante identificar anticuerpos completamente maduros con comportamiento de unión entálpico.

El método como el presentado en el presente documento se puede usar en formato de alto rendimiento. En general, los valores de ΔSº‡as se calculan a partir de mediciones que consumen mucho tiempo mediante el uso de un intervalo de temperaturas amplio y la mayor cantidad de puntos de datos como sea posible para obtener una buena correlación lineal destinada a calcular los parámetros del estado de transición de acuerdo con la ecuación de Eyring con R2> 95%.

En los métodos como los presentados en el presente documento mediante el uso de solo dos temperaturas, 13 ºC y 37 ºC, y el modelo cinético reducido “2 frente a 2”, se pueden obtener factores de velocidad precisos para la velocidad de asociación. Esto es esencial para las mediciones de ΔSº‡as de alto rendimiento. Al combinar la detección cinética de alto rendimiento para la identificación de anticuerpos que forman complejos con el antígeno altamente estables con la determinación de alto rendimiento de los factores de FV, se pueden seleccionar los mejores anticuerpos.

Por ejemplo, cuando los valores de FV de la Tabla 2 se relacionan con el diagrama de ΔSº‡as/FV, se puede observar que el anticuerpo monoclonal indicado como 1F8 no muestra una entropía de fase de asociación elevada. Esto también se ha confirmado en un formato experimental diferente. El valor medio de FV de las condiciones de los 16 tampones es de 4. El valor de FV de la tabla de referencia 1 es de 4 en condiciones de tampones similares. Dicho ejemplo da evidencia de la aplicabilidad de los análisis de ΔSº‡as de alto rendimiento mediante el uso de los factores de FV como un sustituto de ΔSº‡as.

Tabla 2: Matriz que muestra los factores de velocidad (FV = ka (37 ºC)/ka (13 ºC)) de las interacciones entre el anticuerpo 1F8/antígeno para las condiciones de 16 tampones diferentes. Todas las interacciones se midieron en PBS con concentraciones variables de KCl y diferentes valores de pH. Por lo tanto, el anticuerpo 1F8 podría llenar el segmento 1 de la Figura 9.

1F8: pH ↓

KCI [mM] →: 2,7 54 162 324

6,8: 2 4 6 4

7,0: 4 3 4 3

7,4: 4 5 4 4

7,8: 4 4 4 5

El anticuerpo seleccionado con un método como el presentado en el presente documento se puede producir de forma recombinante. Los métodos de producción recombinante de anticuerpos son conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el posterior aislamiento del anticuerpo y, normalmente, la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos como los mencionados anteriormente en una célula huésped, se pueden insertar ácidos nucleicos que codifican las respectivas cadenas ligeras y pesadas en vectores de expresión mediante métodos convencionales. La expresión se puede realizar en células huésped procariotas o eucariotas apropiadas como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6(R), levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se puede obtener de las células (sobrenadante o células después de la lisis). Los métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S. C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

La expresión "célula huésped", como se usa en la presente solicitud, indica cualquier tipo de sistema celular que se pueda diseñar para generar los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. En una realización, se usan células HEK293 y células CHO como células huésped. Como se usan en el presente documento, el término "célula", y las expresiones "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente, y dichas designaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, el término "transformantes" y la expresión "células transformadas" incluyen la célula objeto principal y los cultivos derivados de la misma, sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende

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como una fusión de KLH (hemocianina de lapa californiana) en coadyuvante de Freud completo.

La inmunización se realizó 4 veces: refuerzo inicial, 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del refuerzo inicial. La segunda y la tercera inmunización se realizaron usando coadyuvante de Freud incompleto. Se realizó i.v. el refuerzo final usando 100 μg de antígeno tres días antes de que tuviera lugar la fusión del hibridoma. La producción de cultivos primarios de hibridoma se realizó de acuerdo con Köhler y Milstein (Kohler, G., et al., Nature 256 (1975) 495-497). Se aislaron los hibridomas en placas de microtitulación de 96 pocillos (MTP), por dilución limitada y se exploraron para detectar la unión al antígeno mediante métodos ELISA de acuerdo con el manual del fabricante. Se transfirieron los cultivos de células de hibridoma primarios que mostraron formación de color positiva tras la unión al antígeno en ELISA al proceso de detección cinética.

Ejemplo 2

Preparación de la microplaca de sensor CM5

El sistema BIAcore A100 se preparó bajo el control del software V.1.1 de la siguiente manera: se montó un sensor BIAcore CM5 (serie S) en el sistema y se trató hidrodinámicamente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

En caso del análisis de un anticuerpo murino, se inmovilizó un anticuerpo anti-IgG de conejo policlonal <IgGFCγM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) en las celdas de flujo por medio de química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En caso de usarse anticuerpos quiméricos humanos o completamente humanizados, se inmovilizó el anticuerpo de cabra policlonal pAb<h-IgG,Fcg-Frag>G-IgG(IS) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) en todas las celdas de flujo por medio de química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En caso de usarse fragmentos Fab o Fab’2 de IgG murina, se inmovilizó el anticuerpo de cabra policlonal <MFab> G-IgG(IS) (Bethyl L. Cat. n.º A90-100A-5 v. 9.8.200) en todas las celdas de flujo por medio de química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En caso de usarse fragmentos Fab o Fab’2 de IgG humana o humanizada, se inmovilizó el anticuerpo de cabra policlonal <huFab’2>G-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) en todas las celdas de flujo por medio de química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 3

Detección cinética de sobrenadantes de cultivo de hibridomas primarios

Se procesaron sobrenadantes de cultivo de hibridomas de diferentes campañas de inmunización realizadas de acuerdo con el Ejemplo 1, como se indica a continuación.

Como referencia, se usaron los puntos 2 y 4 de una microplaca de sensor obtenida de acuerdo con el Ejemplo 2 (12, 5-4). Para capturar el anticuerpo sobre la superficie del sensor, se diluyeron a 1:5 sobrenadantes de cultivo de hibridomas con tampón de desplazamiento HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, P20 al 0,05 %, BIAcore) y se inyectaron a 30 μl/min durante 1 min. Seguidamente, se inyectó el antígeno respectivo a 30 μl/min durante un tiempo de asociación de 2 a 3 min. Se controló la fase de disociación durante 5 a 15 min. Finalmente, se regeneró la superficie con una inyección de 2 min de ácido fosfórico 100 mM.

Se preacondicionó el sensor mediante ciclos repetidos de captura de anticuerpo y regeneración.

Para la selección de los hibridomas primarios, se usó el siguiente procedimiento: se estableció un punto de referencia de unión tardía (BL) poco antes de que finalizara la inyección del antígeno. Se estableció un punto de referencia de estabilidad tardía (SL) poco antes de la finalización de la fase de disociación del complejo. Se visualizaron gráficamente los datos de BL y SL (Figura 1). Los datos se usaron para calcular la estabilidad del complejo con el antígeno usando la fórmula (XIV):

(XIV) (1-[BL (UR) -SL (UR) / BL (UR)]

(véase la Figura 2). Por ejemplo, los puntos de datos marcados con un círculo muestran una señal de respuesta al antígeno suficiente y una estabilidad del complejo del 100 %, mientras que el punto de datos marcado con un recuadro muestra una respuesta al antígeno insuficiente.

Por lo tanto, se han seleccionado los mejores hibridomas al 10 % de acuerdo con la señal de respuesta al antígeno y la estabilidad del complejo.

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El dispositivo BIAcore T100 se montó con un sensor BIAcore CM5 series-S, y se inmovilizó con 6000 UR de <IgGFCγM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., EE. UU.) en cada célula de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El experimento no optimizado usó anticuerpo de captura 40 nM a 20 μl/min, en tampón de HBS-EP (P20 al 0,05 %). El tampón de muestra fue el tampón del sistema, suplementado con 1 mg/ml de CMD (carboximetildextrano).

Se inyectó el antígeno tras la captura del anticuerpo secundario en 6 etapas de concentración de 1,2 nM, 4 nM, 11 nM, 33 nM, 100 nM y 300 nM, mediante lo que se usó 11 nM como control doble y se usó 0 nM como referencia. Se inyectó el antígeno a 100 μl/min durante una asociación de 2 min y una disociación de 5 min, seguido de un lavado con HBS-EP de 15 min a 30 μl/min y una regeneración con glicina 10 mM, pH 1,7, a 3 μl/min durante 3 min. Se realizaron medidas dependientes de la concentración a 4 ºC, 11 ºC, 18 ºC, 25 ºC, 32 ºC y 40 ºC.

Se usó el sistema optimizado como se describe anteriormente, pero con las excepciones de que se inyectó el anticuerpo que se iba a capturar durante un tiempo de asociación de 3 min a etapas de concentración diferentes de 100 nM a 15 ºC, 80 nM a 20 ºC, 60 nM a 25 ºC, 50 nM a 30 ºC, 40 nM a 35 ºC y 40 nM a 40 ºC.

Finalmente, se determinaron la cinética y la termodinámica usando el software de evaluación BIAcore.

Ejemplo 7

Determinación y cálculo del factor de velocidad

Se montó un sensor CM5 serie S en el sistema BIAcore T100.

En caso de usarse anticuerpos murinos, se inmovilizó un anticuerpo anti-IgG de conejo policlonal <IgGFCγM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) en las celdas de flujo por medio de química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El tampón de muestra fue el tampón del sistema suplementado con carboximetildextrano a 1 mg/ml para reducir los efectos inespecíficos de la matriz del sensor. Se realizaron mediciones cinéticas en el gradiente de temperatura de 13 ºC a 37 ºC a 100 μl/min.

Se realizaron las inyecciones de analito de antígeno de longitud completa humano sintético recombinante 1, antígeno humano recombinante 2 (10 kDa), quimera de FC humana de antígeno humano recombinante 3 (R & D Systems, 160 kDa), antígeno humano recombinante 4 (29 kDa) o antígeno humano recombinante 5 (72 kDa) durante 180 segundos. Se monitorizó la velocidad de disociación durante un máximo de 900 segundos. Las inyecciones de antígeno se repitieron en diferentes etapas de concentración de al menos cinco concentraciones. Como control, se analizó una etapa de concentración dos veces para controlar la reproducibilidad del ensayo. Se usó la celda de flujo 1 como referencia. Se usó una inyección de tampón en blanco en lugar de una inyección de antígeno para duplicar la referencia a los datos mediante la sustracción de la señal del tampón.

Antes de cada ensayo, se ajustaron los valores de URMÁX homogéneos en el intervalo de temperatura de 13 ºC a 37 ºC mediante experimentos de titulación con los respectivos anticuerpos para su presentación en la superficie del sensor (véase el apartado en el que se describen detalladamente los experimentos de titulación dependientes de la temperatura). Se midieron las cinéticas en el gradiente de temperatura de 13 ºC, 17 ºC, 21 ºC, 25 ºC, 29 ºC, 33 ºC y 37 ºC. Los sistemas de captura se regeneraron usando un lavado con el tampón de HBS-ET a 30 μl/min durante 15 s, antes de la regeneración con glicina 10 mM, pH 1,5 a 30 μl/min durante 15 s, seguida de una inyección de 1 min y una inyección de 30 segundos de glicina 10 mM a pH 1,7.

Los datos obtenidos se evaluaron de acuerdo con un modelo de interacción de Langmuir binario 1:1 para calcular las constantes de velocidad de asociación ka [1/Ms], las constantes de velocidad de disociación kd [1/s] y las constantes de afinidad resultantes KD [M] a las respectivas temperaturas. Los datos de equilibrio termodinámico se calcularon de acuerdo con la forma lineal y no lineal de la ecuación de van't Hoff. La termodinámica del estado de transición se calculó de acuerdo con las ecuaciones de Eyring y Arrhenius, usando, por ejemplo, el software de evaluación

BIAcore T100 V.1.1.1. La evaluación gráfica se realizó usando Origin 7SRI v. 7.0300.

El factor de velocidad (FV) se calculó como el cociente de las velocidades de asociación ka (1/Ms) del complejo de antígeno a 37 ºC y 13 ºC. Se usó la curva de ajuste de la asociación exponencial y = y0 + A1*(1-exp(-x/t1)) + A2* (15 exp(-x/t2)).

Ejemplo 8

Análisis del factor de velocidad de alto rendimiento

10 Se montó un sensor CM5 serie S en el sistema BIAcore T100 y se trataron los puntos de detección hidrodinámicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se inmovilizó el anticuerpo IgG de conejo policlonal <IgGFCγM> R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) a

15 4 kUR en los puntos de detección 1 y 5 de cada celda de flujo. Se inmovilizaron 800 UR de <IgGFCγM>R en los puntos 2 y 4 de cada celda de flujo. El acoplamiento se realizó a través de la química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tampón de muestra fue el tampón del sistema suplementado con carboximetildextrano a 1 mg/ml para reducir los efectos inespecíficos de la matriz del sensor.

20 El sistema de tampón básico fue PBS (solución salina tamponada con fosfato). Se ajustó el tampón a cuatro condiciones diferentes de pH: pH 6,8, pH 7,0, pH 7,4 y pH 7,8, y cuatro concentraciones de KCl diferentes: 2,7 mM, 54 mM, 162 mM y 324 mM. Se ensayaron dieciséis condiciones de tampón de muestra diferentes.

Se inyectaron los anticuerpos monoclonales que se iban a capturar a 10 μl/min durante 1 min en diferentes etapas

25 de concentración entre 60 nM a 37 ºC y 240 nM a 13 ºC para garantizar los valores de URMÁX homogéneos en las mediciones posteriores de interacción con el antígeno.

Se realizaron las mediciones cinéticas en el gradiente de temperatura de 13 ºC a 37 ºC a 30 μl/min. Se realizaron las inyecciones de analito de antígeno humano recombinante 1-84 (9,4 kDa) durante 180 segundos. Se monitorizó la

30 velocidad de disociación durante 600 segundos. Se repitieron las inyecciones de antígeno en dos etapas de concentración a 60 nM y 240 nM. Se usó una inyección de tampón en blanco en lugar de una inyección de antígeno para duplicar la referencia a los datos mediante la sustracción de la señal del tampón.

Se regeneró el sistema de captura usando un lavado durante 15 segundos con tampón de HBS-ET a 30 μl/min,

35 antes de la regeneración con glicina 10 mM, pH 1,5, a 30 μl/min durante 90 segundos, seguido de 2 inyecciones de 30 segundos del mismo tampón.

Se evaluaron los datos cinéticos de acuerdo con un modelo cinético de "2 frente a 2", que usa dos densidades de ligando diferentes de la matriz del sensor para calcular la cinética solo mediante el uso de dos concentraciones de

40 antígeno. Las constantes de velocidad de asociación ka [1/Ms], las constantes de velocidad de disociación kd [1/s] y las constantes de afinidad resultante KD [M] a las respectivas temperaturas se calcularon usando el software de evaluación BIAcore A100 1.1.

Los datos de equilibrio termodinámico se calcularon a partir de los datos cinéticos de acuerdo con la forma lineal de

45 la ecuación de Van't Hoff. Se calculó la termodinámica del estado de transición de acuerdo con las ecuaciones Eyring usando Excel. Se realizó la evaluación gráfica usando Origin 7SRI v. 7.0300. El factor de velocidad (FV) para la fase de asociación se calculó como el cociente de las velocidades de asociación de los complejos de antígeno ka (1/Ms) a 37 ºC y 13 ºC. El factor de velocidad para las velocidades de disociación se calculó como el cociente de kd (1/s) a 13 ºC y 37 ºC.

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Claims

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