NO325823B1 - Humaniserte antistoffer, fremgangsmate for a fremstille humaniserte antistoffer og anvendelsen av slike. - Google Patents
Humaniserte antistoffer, fremgangsmate for a fremstille humaniserte antistoffer og anvendelsen av slike. Download PDFInfo
- Publication number
- NO325823B1 NO325823B1 NO19994870A NO994870A NO325823B1 NO 325823 B1 NO325823 B1 NO 325823B1 NO 19994870 A NO19994870 A NO 19994870A NO 994870 A NO994870 A NO 994870A NO 325823 B1 NO325823 B1 NO 325823B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- domain
- seq
- substituted
- sequence shown
- residues
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 41
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 26
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 20
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 14
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002137 anti-vascular effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 12
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims 11
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 10
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims 10
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims 8
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims 6
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 42
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 14
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 4
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 101000691459 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase N2 Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 150000007649 L alpha amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100026180 Serine/threonine-protein kinase N2 Human genes 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 210000002556 adrenal cortex cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001542 lens epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000006884 regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Steering Control In Accordance With Driving Conditions (AREA)
- Semiconductor Lasers (AREA)
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot humaniserte antistoffer, fremgangsmåter for å fremstille humaniserte antistoffer og anvendelse av slike. Spesielt er foreliggende oppfinnelse rettet mot fremgangsmåter for å fremstille humaniserte antistoff ved å bruke monovalente fagdisplaysystem og antistoff-mutanter fremstilt ved tilfeldig mutagenese av en liten del av kritiske grunnresidier fremstilt fra en enkel human grunnstruktur. Mer spesielt, er denne oppfinnelsen rettet mot humanisering av et murint antistoff som binder til vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF).
Bakgrunn for oppfinnelsen
Monoklonale antistoff (mAb) har et enormt potensiale som terapeutisk middel, spesielt når de kan bli brukt for å regulere definerte systemer. For eksempel er det i noen tilfeller ønskelig å regulere et system slik som angiogenese, hvor nye blodkapillærer blir dannet fra veggene i eksisterende små årer. Angiogenese er generelt viktig etter påføring av et sår eller infeksjon slik at kapillærvekst kan bli stimulert i naboområdet til det ødelagte vevet. Imidlertid er angiogenese også viktig ved tumorvekst, for at tumoren skal fortsette å vokse må tumoren indusere dannelsen av et kapillærnettverk som invaderer tumormassen.
Visse vekstfaktorer har blitt identifisert som regulerer angiogenese. Av spesiell interesse er vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) som ser ut til å være den forbindelsen som er nødvendig for at tumorer erverver deres rike blodforsyning. Molecular Biology of the Cell. 3rd Ed., Alberts et al., Garland Publishing, side 1154
(1994). Derfor kan for eksempel mAbs mot VEGF være nyttige av forskjellige grunner, inkludert anvendelse ved regulering av angiogenese og mer spesielt, som antitumormiddel. Et murint antiVEGF mAb A4.6.1 som blokkerer VEGF reseptorbinding har tidligere blitt beskrevet. Dette antistoffet har blitt vist å inhibere mitogen signalisering. Kim et al., Growth Factors 7, 53 (1992); Kim et al., Nature, 841
(1993).
De fleste mAbs inkludert anti-VEGF beskrevet over er avledet fra murin eller andre ikke-humane kilder, noe som begrenser deres kliniske effektivitet. Spesielt regarerer kroppen ofte med en immunogen respons mot ikke-humane antistoff hvorved antistoffene raskt blir fjernet fra systemet før en terapeutisk effekt inntreffer. I tillegg til immunogenitet av ikke-humant mAb som induseres når den blir administrert til mennesker, oppstår ytterligere begrensning på grunn av svak rekruttering av effektorfunksj on.
Som et middel for å omgå disse manglene kan antigenbindingsegenskapene til ikke-humant mAb bli overført til humane antistoffer gjennom en prosess kjent som antistoff "humanisering". Et humanisert antistoff inneholder aminosyresekvensen fra seks komplementærbestemmende regioner (CDR) (antigenbindingssetet til antistoff-molekylet) av opprinnelig eller korresponderende ikke-humant mAb, podet på en human antistoffstruktur. Derfor er humanisering av ikke-humane antistoff vanligvis reflektert til som CDR-poding. Det lave innholdet av ikke-human sekvens i slike humaniserte antistoff (~5%) har vist seg å være effektivt til å redusere immunigenisiteten og til å forlenge serum halveringstiden til antistoffene administrert til mennesker. Blant annet er humaniserte monoklonale antistoff ("kimære immunoglobuliner") beskrevet i US patent nr. 4,816,567.
Uheldigvis gir enkel poding av CDR sekvenser ofte humaniserte antistoff som binder antigen mye svakere enn opprinnelig ikke-humant mAb. For å få tilbake høy affinitet må antistoffet ytterligere bli bearbeidet for å fininnstille strukturen til antigenbindingsløkkene. Dette oppnås ved å erstatte nøkkelresidier i grunnstrukturregionene til antistoffVariable domener med tilpassede sekvenser fra opprinnelig murint antistoff. Disse gnmnstruktur-residiene er vanligvis involvert i å understøtte konformasjonen av CDR-løkkene, selv om noen grunnstrukturresidier i seg selv direkte kan komme i kontakt antigenet. Studier har blitt utført som viser viktigheten av visse gninnstrukturresidier for CDR-konformasjon og en omfattende liste over alle grunnstrukturresidiene som kan innvirke på antigenbinding har blitt sammenstilt. Chothia et al., J. Mol Biol. 224,487 (1992); Foote et al., J. Mol Biol 224,489 (1992). Den omfattende listen inkluderer omtrent fretti"fininnstillings"residier som potensielt kan bidra til CDR-strukturen. Selv om en høyere antigenaffinitet antagelig ville være resultatet av en redigering av hele settet av fininnstillingsresidier innen et humant antistoff for tilpasning til den korresponderende opprinnelige ikke-humane sekvensen, er dette generelt ikke ønskelig på grunn av økt risiko for immunogenisitet tilført ved å tillegge ytterligere elementer fra ikke-human sekvens. Ut i fra et terapeutisk standpunkt er det derfor å foretrekke å begrense grunnstrukturendringer til et minimum som gir et høyaffinitets humanisert antistoff.
Derfor er det ønskelig å identifisere et lite sett av endringer som er tilstrekkelig for å optimalisere binding, imidlertid er de påkrevde endringene forventet å være forskjellig fra ett humanisert antistoff til ett annet. For å oppnå det ønskede resultatet har en tilnærmingsmåte vært å identifisere en korrekt kombinasjon av mutasjoner ved å konstruere et panel av mutanter som har "mistenkte" grunnstrukturresidier erstattet av deres murine motstykker. Hver av disse variantene er laget og testet mot antigen, og deretter kombinert med andre varianter funnet å ha fordelaktige bindingsafifniteter. Imidlertid involverer denne metoden sykluser av individuell setedirigert mutagenese, isolering og screening, og er derfor ikke ønskelig på grunn av stort tidsforbruk og at den er langtekkelig.
Som en metode for å forenkle antistoffhumanisering har et antall forskjellige tilnærminger blitt utviklet. Se for eksempel Queen et al., PNAS USA 86,10029 (1989); Kettleborough et al, Protein Eng. 4,773 (1991); Tempest et al., Biotechnology 9,266
(1991) ; Padian, Mol. Immunol. 28,489 (1991): Roguska et al., PNAS USA 91, 969
(1994); Studnicka et al., Protein Eng. 7, 805 (1994); Allen et al., J. Immunol. 135,368
(1985); Carter et al., PNAS USA 89,4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151,2623
(1993); Eigenbrot et al., Proteins 18,49 (1994); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175,217
(1992) ; Kabat et al., Sequences of Proteins of hnmunological Interest,_(5th), Public Health Service, NTH, Bethesda, MD (1991); og Rosok et al., J. Biol. Chem. 271,22611
(1996).
Det er et formål ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe generelle metoder for raskt å selektere grunnstrukturmutasjoner som øker bindingen av humaniserte antistoff til deres kognate antigener hvori nåværende metoder av grurmstruktur-optimalisering basert på sykluser ved individuell setedirigert mutagenesescreening blir eliminert.
Det er også et formål å tilveiebringe raske metoder for å humanisere antistoffer som tilveiebringer antistoff med lav immunogenisitet og som utnytter en enkel human grunnstruktur som et generisk skjelett.
Det er et ytterligere formål ifølge foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe humaniserte antistoff som er mutert for å øke affiniteten til antigener i forhold til det initielle humaniserte antistoffet uten grunnstrukturendringer.
I tillegg er det et ytterligere formål ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe humaniserte antistoff som har en redusert eliminasjonshastighet og derved lengre rentensjon i kroppen etter systemisk administrering slik at lavere doser av materialet er tilgjengelig for systemisk administrering og kan gi terapeutisk effekt.
Det er også et ytterligere formål ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe humanisert monoklonale antistoff mot VEGF.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et humanisert antistoff mot vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) kjennetegnet ved at de komplementærbestemmende regioner (CDR) til et ikke-humant antistoff blir transplantert på en human grunnstruktur som omfatter VlKundergruppe I (VlkI) grunnstrukturen ifølge SEQ ID NO: 7 og Vh undergruppen HI (VrITT) grunnstrukturen ifølge SEQ ID NO: 10, der minst en av de representativt nummererte residiene 4 og 71 i VL-domenet er substituert med en forskjellig aminosyre, og minst tre av de representativt nummererte residiene 37, 67,69, 71, 73, 75,76, 78 og 94 i Vn-domenet er substituert med en forskjellig aminosyre, og der residiet 46 i VL-domenet eventuelt er substituert med aminosyren valin, og der residienummereringen er ifølge Kabat-nummereringen som vist i figuren 1.
Det initielle humaniserte anti-VEGF har en grunnstruktur avledet fra konsensus-sekvensen til de vanligste humane subklasser, dvs. Vlksubgruppe I (VikI) og Vh subgruppe m (VHnT) hvori CDR fra ikke-human anti-VEGF blir innpodet. Tilfeldig mutagenese av kritiske grunnstrukturerresidier av utgangskonstruksjonen produserte det humaniserte anti-VEGF beskrevet heri som har 125 ganger øket affinitet for antigenet i forhold til det utgangshumaniserte antistoff hvor ingen gruimstnikturendringer er foretatt. En enkel addisjonsmutasjon ga en ytterligere seks gangers økning i binding. Dette humaniserte anti-VEGF kan bli reprodusert ved fremgangsmåten beskrevet heri eller ved tradisjonelle rekombinante teknikker når sekveninformasjonen tilveiebragt heri er tilgjengelig.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for å humanisere et ikke-humant anti-vaskulært endotelial vekstfaktorantistoff, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: å transplantere komplementærbestemmende regioner (CDR) fra et ikke-humant antistoff til en human grunnstruktur som omfatter VLK-subgruppen I (Vlk-I) og VH-undergruppen HI (VHI1I); å substituere minst en av residiene 4 og 71 i VL-domenet med en forskjellig aminosyre og subsitutere minst 3 av residiene 37,67, 69,71, 73, 75, 76, 78 og 94 i Vn-domenet med en forskjellig aminosyre, der residienummereringen er iføgle Kabat-nummereringen vist i figure 1.
Fremgangsmåten medfører at det raskt produseres og identifiseres grunnstrukturmutasjoner som forbedrer binding av humaniserte antistoff til deres kognate antigener. I en foretrukken utførelsesform blir ikke-humant CDR podet på en human (VikT)-VhIII grunnstruktur. Tilfeldig mutagenese av et lite antall av kritiske grunnstruktur-residier ble også utført etterfulgt av en monovalent fremvisning av det resulterende biblioteket av antistoffmolekyler på overflaten av en filamentøs fag. De optimale grunnstruktursekvensene ble deretter identifisert ved affinitetsbasert seleksjon. Eventuelt, kan utvalgte antistoff ytterligere bli mutert for å erstatte fininnstillings-residiene som sitter på "Vl-Vh" grenseflaten med residier som er tilpasset det ikke-humane opprinnelige antistoffet.
Foreliggende oppfinnelsen angår videre anvendelse av det humaniserte antistoffet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av tumorvekst.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 viser aminosyresekvensen til murint A4.6.1. (SEQ ID nr. 6 og 9 for henholdsvis VLOg Vh domenene, humanisert A4.6.1 variant hu2.0, SEQ ID nr. 7 og 10 for henholdsvis Vlog Vh domenene, og humanisert A4.6.1 variant hu2.10 (SEQ ID nr. 8 og 11 for henholdsvis Vlog Vh domenene). Sekvensnummereringen er i overensstemmelse med Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,_
(5th), Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991) og feiltilpasning er indikert med stjerner (murin A4.6.1 vs hu2.0) eller kuler (hu2.0 vs. hu2.10). Variant hu2.0 inneholder bare CDR sekvenser (uthevet) fra murint antistoff innpodet på en human lettkjede K subgruppe I, tungkjede subgruppe HI grunnstruktur. Variant hu2.10 er konsensus humanisert klon ervervet fra fagsorteringseksperimentene beskrevet heri.
Figur 2 viser grunnstrukturresidier som er målet for randomisering.
Figur 3 viser fagemidkonstruksjonene for overflaterfemvisning av Fab-pHI-fusjoner på fag. Fagemid-konstruksjonene koder en humanisert versjon av Fab-fragmentet for antistoff A4.6.1 satt sammen til en del av M13 gen HI kappeprotein. Fusjonsproteinet består av Fab bundet til den karboksyterminale enden til den tunge kjeden til en enkel glutaminresidie (fra suppresjonen av et amber kodon i sup. E E. coli), deretter den C-terminale regionen til gen HI protein (residiene 249-406). Transformasjonen inn i F<+>E. coli, etterfulgt av superinfeksjon med M13K07 hjelperfag, produserer fagemidpartikler hvori en liten del av disse utviser en enkel kopi av fusjonsproteinet.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
A. Definisjoner
"Antistoff (Ab) og "immunoglobuliner" (lg) er glykoproteiner som har de samme struktuelleegenskaper. Mens antistoff utviser bindingsspesifisitet til et spesifikt antigen, inkluderer immunoglobulinet både antistoff og andre antistoff-lignende molekyler som mangler antigenspesifisitet. Polypeptider av den sistnevnte typen produseres for eksempel i lave nivåer av lymfesystemet og i økte nivåer av myelomer.
"Native antistoff og "native immunoglobuliner" er vanligvis heterotetramere glykoproteiner på omtrent 150.000 dalton, sammensatt av to identiske lette (L) kjeder og to identiske tunge (H) kjeder. Hver lette kjede er koblet til en tung kjede med en kovalent disulfidbinding, mens antallet disulfidbindinger varierer mellom tunge kjeder av forskjellig immunoglobulinisotype. Hver tunge og lette kjede har også intrakjededisulfidbroer med jevne mellomrom. Hver tunge kjede har i den ene enden et variabelt domene (Vh) etterfulgt av et antall konstante domener. Hver lette kjede har et variabelt domene i en ende og (Vl) et konstant domene i den andre enden. Det konstante domenet til den lette kjeden er sidestilt med det første konstante domenet til den tunge kjeden, og den lette kjedens variable domene er sidestilt med det variable domenet til den tunge kjeden. Man tror at spesielle aminosyreresidier danner en inter-fase mellom lett- og tungkjede variable domener. Clothia et al., J. Mol. Biol. 186,651,
(1985); Novotny et al., PNAS USA 82,4592 (1985).
Betegnelsen "variable" refererer til det faktum at visse deler av variabeldomener i stor utstrekning er forskjellig i sekvensen blant antistoff og benyttes i bindingen og spesifisiteten av hvert spesielle antistoff til dets spesielle antigen. Imidlertid er variasjonen ikke likt fordelt gjennom de variable domenene til antistoffene. Den er konsentrert i tre segmenter som kalles "komplementaritetsbestemmende regioner"
(CDR) eller "hypervariable regioner" både i den lette kjedens og tunge kjedens variable domene. De mer høyt konserverte delene av de variable domener blir kalt grunnstruktur (FR). De variable domenene til native tunge og lette kjeder omfatter hver fire FR-regioner, som stort sett har en "p-plate" konfigurasjon, bundet med tre CDR, som danner løkker som forbinder, og i noen tilfeller utgjør deler av "6-plate" strukturen. CDR i hver kjede holdes sammen tett nær FR-regionene og, sammen med CDR fra den andre kjeden, bidrar disse til dannelse av det antigenbindendesete til antistoffet. Kabat
et al., supra. De konstante domenene er ikke direkte involvert i binding av antistoff til antigen, men utviser forskjellige effektorfunksjoner, slik som deltagelse av antistoffet i antistoffavhengig cellulær toksisitet. Papainkutting av antistoff produserer to identiske antigenbindende fragmenter, kalt Fab-fragmenter, hver med et enkelt antigenbindende sete, og et "Fc"-fragment, der navnet reflekterer dets evne til å krystallisere raskt. Pepsinbehandling gir et F(ab')2-fragment som har to antigenkombinerende seter og som fortsatt i stand til å kryssbinde antigenet.
"Fv" er det minste antistoff-rfagmentet som inneholder et fullstendig antigen-
gjenkjennings- og bindingssete. Denne regionen består av en dimer av et tungt og et lett kjede variabelt domene i tett ikke-kovalent assosiering. Det er i denne konfigurasjonen at tre CDR fra hvert variabelt domene reagerer for å definere et antigenbindingssete på overflaten av Vh-Vldimer. Til sammen meddeler de seks CDR
antigenbindingsspesifisitet til antistoffet. Selv et enkelt variabelt domene (eller halvdelen av en Fv som omfatter bare tre CDR spesifikke for et antigen) har evnen til å gjenkjenne og binde antigenet, skjønt men lavere affinitet enn hele bindingssetet.
Et "Fab" fragment inneholder det konstante domenet til den lett kjeden og det første konstante domenet (CH1) til den tunge kjeden. Fab'-fragmentene er forskjellig fra Fab-fragmentene med et tilsegg på noen få residier i den karboksyterminale enden til tungkjede CH1-domenet inkludert en eller flere cysteiner fra antistoffhengsels-regionen. Fab -SH er betegnelsen heri for Fab' hvori cysteinresidien(e) i de konstante domenene
bærer en fri tiolgruppe. F(ab )2 antistoff-rfagmenter ble i utgangspunktet produsert som par av Fab'-fragmenter som har hengselscysteinet mellom seg. Andre kjemiske koblinger av antistoff-rfagmentene er også kjent.
De lette kjedene til antistoffene (immunoglobulinet) fra en hvilken som helst vertebrat
art kan tilordnes en av to distinkte typer, kalt kappa (k) og lambda ( X), basert på aminosyresekvensene til deres konstante domene.
Avhengig av aminosyresekvensen til det konstante domenet av deres tunge kjeder, kan immunoglobuliner bli tilodnet forskjellige klasser. Det er fem hovedklasser av immunoglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM og flere av disse kan ytterligere bli delt inn i subklasser (isotyper): for eksempel IgG-1, IgG-2, IgG-3 og IgG-4; IgA-1 og IgA-2.
De tunge kjede konstant domenene som korresponderer med forskjellige klasser av immunoglobuliner blir henholdsvis kalt a, delta, epsilon, y og u. Subenhetstrukturene og tredimensjonale konfigurasjonene av forskjellige klasser av immunoglobuliner er velkjente.
Betegnelsen "antistoff' blir brukt i den bredeste betydning og dekker spesielt enkle monoklonale antistoff (inkludert agonist- og antagonistantistoff), antistoff-sammensetninger med polyepitopisk spesifisitet, så vel som antistoff-fragmenter (for eksempel Fab, F(ab')2og Fv) så lenge de utviser ønsket biologisk aktivitet.
Betegnelsen "monoklonalt antistoff' som brukt heri refererer seg til antistoff ervervet fra en populasjon av vesentlig homogene antistoff, dvs. enkletantistoffene som omfatter populasjonen er identiske med unntak av mulige naturlige forekommende mutasjoner som kan være tilstede i en mindre mengde. Monoklonale antistoff er høyt spesifikke, og blir rettet mot et enkelt antigensete. Videre, i motsetning til konvensjonelle (polyklonale) antistoff-fremstillinger som typisk inkluderer forskjellige antistoff rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), blir hvert monoklonalt antistoff rettet mot en spesiell determinant på antigenet. I tillegg til deres spesifisitet, er de monoklonale antistoffene fordelaktige fordi de er syntetisert i hybridomkultur, og de er ikke kontaminert med andre immunoglobuliner. Betegnelsen "monoklonal" indikerer egenskapen til antistoffet som er ervervet fra en vesentlig homogen populasjon av antistoff, og skal ikke bli forstås som om de er produsert ifølge en hvilken som helst spesiell metode. For eksempel kan monoklonale antistoff som blir brukt i samsvar med foreliggende oppfinnelse bli fremstilt ved hybridommetoden først beskrevet av Kohler et al., Nature 256,495 (1975) eller de kan bli fremstilt ved rekombinante DNA-metoder, se for eksempel US patent nr. 4,816,567.
"Kimære" antistoff (immunoglobuliner) er antistoff hvori en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk eller homolog med korresponderende sekvenser i antistoff avledet fra en spesiell art eller tilhørende en spesiell antistoff-klasse eller subklasse, mens den gjenværende delen av kjeden (ene) er identisk eller homolog med korresponderende sekvenser i antistoffene avledet fra andre arter eller tilhørende en annen antistoffklasse eller subklasse, så vel som fragmenter av slike antistoff, så lenge de utviser ønsket biologisk aktivitet, US patent nr. 4,816,567.
"Humaniserte" former av ikke-humane (for eksempel) murine antistoff er kimære immunoglobuliner, immunoglobulinkjeder eller fragmenter derav (slik som Fv, Fab, Fab<t>, F(ab')2eller andre antigenbindende subsekvenser av antistoff) som inneholder minimal sekvens avledet fra ikke-humant immunoglobulin. For det meste er
humaniserte antistoff humane immunoglobuliner (resipient antistoff) hvori residier fra en komplementaritetsbestemmende region (CDR) fra resipienten er erstattet med residier fra en CDR fra en ikke-human art (donor antistoff) slik som mus, rotte eller kanin som har ønsket spesifisitet, affinitet og kapasitet. I noen tilfeller blir Fv grunnstruktur-residiene til humant immunoglobulin erstattet med korresponderende ikke-humane residier. Videre, kan humaniserte antistoff omfatte residier som verken er funnet i resipient-antistoff eller i den importerte CDR eller grunnstruktursekvenser. Disse modifiseringene er utført for ytterligere å forfine og optimalisere
antistoffutførelsen. Generelt vil humaniserte antistoff omfatte vesentlig alle eller minst en og typisk to variable domener hvori vesentlig alle CDR-regionene korresponderende til de fra et ikke-humant immunoglobulin, og alle eller vesentlig alle FR-regionene er fra en human immunoglobulin konsensussekvens. Humaniserte antistoff vil også eventuelt omfatte minst en del av en immunoglobulin konstant region (Fc), typisk den fra et humant immunoglobulin. For ytterligere detaljer se Jones et al., Nature 321, 522
(1986); Reichmann et al., Nature 332,323 (1988), og Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593 (1992).
"Ikke-immunogen i et menneske" betyr at ved å bringe humanisert antistoff i en terapeutisk effektiv mengde i kontakt med egnet vev fra et menneske, kan det ikke i noen vesentlig grad demonstreres en tilstand av sensitivitet eller resistens mot det humaniserte antistoffet ved administrering.
Som brukt heri, "vaskulær endotelial cellevekstfaktor" eller "VEGF" refererer til en mammalsk vekstfaktor som definert i US patent nr. 5,332,671, inkludert den humane aminosyresekvens i figur 1. Den biologiske aktiviteten til nativt VEGF er felles for enhver analog eller variant derav som er i stand til å fremme selektiv vekst av vaskulære endotelceller, men ikke fra bovine korneaendotelceller, linseepitelceller, binyrebarkceller, BHK-21 fibroblaster eller keratinocytter, eller som utviser et immun-epitop som er immunologisk kryssreaktiv med et antistoff indusert mot minst en epitop fra det korresponderende native VEGF.
"Sete-dirigert mutagenese" er en standardteknikk innen feltet, og blir utført ved å bruke en syntetisk oligonukleotidprimer som er komplementær med en enkelttrådet fag-NA som blir mutagenisert, med unntak av begrenset feiltilpasning, som representerer den ønskede mutasjonen. I korthet blir syntetiske oligonukleotider brukt som primere for å dirigere syntese av en tråd som er komplementær med fagen, og den resulterende dobbelt-trådete DNA blir transformert inn i fag-støttet vertsbakterie. Kulturene til de
transformerte bakteriene blir sådd ut i toppagar, som tillater plakkdannelse av enkle celler som har fag. Teoretisk vil 50% av de nye plakkene inneholde fag som har en enkelt tråd, den muterte formen; 50% vil ha originalsekvensen. Plakkene blir hybridisert med kinasebehandlet syntetisk primer ved en temperatur som tillater hybridisering av en fullstendig tilpasning, men som ved en feiltilpasning med originaltråden er tilstrekkelig til å forhindre hybridisering. Plakkene som hybridiserer med proben blir deretter selektert og dyrket, og DNA blir gjenvunnet.
"Ekspresjonssystem" refererer til DNA-sekvenser som inneholder en ønsket kodende sekvens og kontrollsekvenser som er operativt koblet, slik at vertene som transformeres med disse sekvensene er i stand til å produsere de kodede proteinene. For å effektuere transformering, kan ekspresjonssystem inkluderes i en vektor; imidlertid, kan det relevante DNA også bli integrert i vertskromosomet.
Heri blir "celle", "cellelinje" og "cellekultur" brukt om hverandre og alle slike betegnelser inkluderer avkom. Følgelig inkluderer "transformanter" eller "transformerte celler" primærcellen og kulturer avledet derfra uten hensyn til antallet. Det skal også forstås at ikke alt avkom behøver å være fullstendig identisk i DNA innhold, på grunn av tilsiktede eller utilsiktede mutasjoner. Mutant avkom som har samme funksjonalitet som de som det blir screenet for i de originale transformerte cellene er inkludert. Der distinkte betegnelser er tilsiktet, vil det gå klart fram fra sammenhengen.
"Plasmider" er betegnet med en liten p foran og/eller etterfulgt av store bokstaver og/eller nummer. Startsplasmidene heri er kommersielt tilgjengelige, offentlig tilgjengelig i ubegrensete mengder, eller kan konstrueres fra slike tilgjengelige plasmider i samsvar med publiserte prosedyrer. I tillegg er andre ekvivalente plasmider kjent innen fagfeltet og vil være opplagte for en som kjenner fagfeltet.
"Affimtetsbinding" refererer seg til styrken av totalsummen av ikke-kovalente interaksjoner mellom et enkelt antigen-bindingssete til et antistoff på en enkelt epitop. Lavaffinitetsantistoff som binder antigen svakt tenderer til å dissosiere lett, mens høy-affinitetsantistoff binder antigen tettere og forblir bundet lenger.
"Transformasjon" betyr introdusering av DNA i en organisme slik at DNA kan replikeres, enten som et ekstra kromosomalt element eller ved kromosomal integrasjon. Avhengig av vertscellen som blir brukt, blir transformasjonen gjort ifølge standardteknikker som er egnet for slike celler. Kalsiumbehandling som anvender
kalsiumklorid, som beskrevet av Cohen, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69,2119 (1972) og Mandel et al., J. Mol. Biol. 53,154 (1970) er generelt brukt for prokaryoter og andre
celler som inneholder vesentlig celleveggbarrierer. For pattedyrceller uten cellevegg er kalsiumfosfatpresipiteringsmetoden fra Graham og van der Eb, Virology 52,456 (1978) foretrukket. Generelle aspekter ved mammalske cellevertssystem-transformasjoner har blitt beskrevet av Axel i US patent nr. 4,399,216 utgitt 16. august 1983. Transformasjoner i gjær blir typisk utført ifølge metoden til Van Solingen et al., J. Bact. 130,946 (1977) og Hsiao et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76,3829 (1979). Imidlertid kan også andre metoder for å introdusere DNA i celler slik som nukleær injeksjon, elektroforering eller protoplastfusjon også bli brukt.
"Gjenvinning" eller "isolering" av et gitt fragment av DNA fra en restriksjonskutting betyr separasjon av kuttingen på polyakrylamid eller agarosegel ved elektroforese, identifisering av fragmenter av interesse ved å sammenligne dets mobilitet versus det markør-DNA-fragmentet med kjent molekylvekt har, fjerning av den delen av gelen som inneholder det ønskede fragmentet og separering av gelen fra DNA. Denne prosedyren er generelt kjent. Se for eksempel Lawn et al., Nucleic Acides Res. 9,6103 (1981) og Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8,4057 (1980).
"Ligering" refererer seg til prosessen for å danne fosfodiesterbindinger mellom to dobblt-trådede nukleinsyrerfagmenter. Hvis ikke annet er angitt kan ligeringen utføres ved å bruke kjente buffere og betingelser med 10 enheter av T4 DNA ligase, ("ligase") pr. 0,5 mg av omtrent ekvimolare mengder av DNA fragmenter som skal ligeres.
Betegnelsen "kontrollsekvenser" refererer til DNA sekvenser som er nødvendig for å uttrykke en operativ koblet kodende sekvens i en spesiell vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er egnet for prokaryoter inkluderer for eksempel en promoter, eventuelt en operatorsekvens, et ribosombindingssete og muligens andre enda dårligere forståtte sekvenser. Eukaryote celler er kjent for å benytte promotere, pplyadenylerings-signaler og enhancere.
Nukleinsyren er "operabelt koblet" eller "operativt koblet" når den er plassert i en funksjonell stilling med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en presekvens eller en sekretorisk leder operativ koblet til DNA for et polypeptid hvis den blir uttrykt som et preprotein som deltar i sekresjon av polypeptidet; en promoter eller enhancer er operativt koblet til en kodende sekvens hvis den innvirker på transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operativt koblet til en kodende sekvens hvis den blir posisjonert slik at den fremmer translasjon. Generelt betyr "operabelt koblet" eller "operativt koblet" at DNA sekvensene som er koblet er i nærheten og, i tilfelle av en sekretorisk leder, i nærheten og i leserammen. Imidlertid behøver ikke enhancerne å være i nærheten. Koblingen blir fullført ved ligering av hensiktsmessige restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer, da blir syntetiske oligonukleotid-adaptorer eller linkere brukt i overensstemmelse med konvensjonell praksis.
Som brukt heri, betegner "representativt nummerert" et posisjonstall av en residie i en spesiell sekvens og korresponderende posisjonsnummer i forskjellige sekvenser. Korresponderende posisjonsnummer er de posisjonene innen sekvensene, generelle humane antistoff grunnstruktursekvenser som er funksjonelt ekvivalente med de representative nummererte posisjonene som blir brukt i konstruksjonen av et humanisert antistoff.
Vanligvis refererer betegnelsene "aminosyre" og "aminosyrer" til alle naturlige forekommende L-a-aminosyrer. I noen utførelsesformer kan imidlertid aminosyrene være tilstede i polypeptidene eller peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse for å lette konfirmasjonsrestriksjon. Aminosyrene blir identifisert ved enten en enkel bokstav eller tre-bokstav-betegnelser:
Betegnelsen "aminosyresekvensvariant" refererer seg til molekyler med noen forskjeller i deres aminosyresekvenser sammenlignet med en nativ aminosyresekvens.
Substitusjonene varianter er de som har minst en aminosyreresidie i en nativ sekvens fjernet og en forskjellig aminosyre innført på dets plass i samme posisjon. Substitusjonene kan være enkle, hvor bare en aminosyre i molekylet har blitt substituert, eller de kan være multiple, hvor to eller flere aminosyrer har blitt substituert i samme molekyl.
Hybridisering blir fortrinnsvis utformet under "stringente betingelser" som betyr
(1) å anvende lav ionestyrke og høy temperatur for vasking, for eksempel, 0,015 natriumkloird/0,0015 M natriumsitrat/0,1% natriumdodesylsulfat ved 50°C, eller (2) å anvende under hybridiseringen et denatureringsmiddel, slik som formamid, for eksempel 50% (vol/vol) formamid med 0,1% bovint serum albumin/0,1% Ficoll/0,1% polyvinylpyrrolidon/50 nM natriumfosfatbuffer ved pH 6,5 med 750 mM natriumklorid, 75 mM natriumsitrat ved 42°C.
Et annet eksempel er bruk av 50°C formamid, 5 x SSC (0,75 molar NaCl, 0,075 M natriumsitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 6/8), 0,1% natriumpyrofosfat, 5 x Denhardfs løsning, sonikerte laksespermer DNA (50 ug/ml), 0,1% SDS, og 10% dekstransulfat ved 42°C, med vasker ved 42°C i 0,2 x SSC og 0,1% SDS. Enda et annet eksempel er å bruke hybridiseirngsbuffer av 10% dekstransulfat, 2 x SSC (natriumklorid/natriumsitrat) og 50% formamid ved 55°C, etterfulgt av en høystringens vask bestående av 0,1 x SSC som inneholder EDTA ved 55°C. Når en nukleinsyresekvens av et nukleinsyremolekyl er tilveiebragt, blir andre nukleinsyremolekyler som hybridiserer dertil under betingelser beskrevet over betraktet innenfor området av sekvensen.
Hvor aminosyresekvensene blir beskrevet er det å forstå at disse sekvensene kan bli reprodusert ved konstruksjon av aminosyresekvensen syntetisk eller ved mutasjon. Alternativt, er det å forstå at rekombinante teknikker kan bli brukt slik at DNA som koder for aminosyresekvensene blir gjenvunnet. DNA blir gjenvunnet ved å danne et bibliotek fra DNA som koder for de ønskede aminosyresekvensene. Probene blir deretter dannet basert på aminosyreskevensene. DNA hybridisering til probene blir deretter isolert og analysert for å bestemme om produktet kodet for av DNA er det ønskede produktet. Generelt blir cellene transformert med DNA (eller RNA) og ekspresjonsstudier blir utført.
B. Generell metodologi for humanisering av antistoff
Metodene beskrevet heri kan bli brukt for å humanisere et hvilket som helst antistoff. På samme måte er det å forstå at humanisert antistoff som er spesifikt beskrevet heri, humanisert anti-VEGF, kan bli reprodusert ved metoder beskrevet heri eller ved tradisjonelle rekombinante DNA-teknikker. Spesifikt, siden de kritiske grunnstruktur-residiemutasjonene er beskrevet heri, kan det humaniserte antistoffet bli reprodusert og ha samme mutasjoner uten å bli reprodusert ved å bruke mono valent fagfremvisnings-system. Heller, kan DNA som koder for de beskrevne aminosyresekvensene bli syntetisert eller reprodusert ved tradisjonele rekombinante DNA-teknikker. DNA produktet kan deretter bli uttrykt, identifisert og gjenvunnet. Alternativt kan sete-dirigert mutagenese bli utført på antistoffet ved kjente metoder innen fagfeltet, eller antistoffet kan bli syntetisert for å ha mutasjonene som er beskrevet heri.
En spesielt foretrukket metode for å produsere humanisert anitstoff beskrevet heri involverer følgende: • fremstille en antistoff fagmidvektor for monovalent fremvisning av Fab-fragmenter som har CDR-sekvenser transplantert ved sete-dirigert mutagenese på en vektor som koder for en human VlkI-Cki lett kjede og human Yi HI-C ly tunge kjede Fd; • konstruere antistoff Fab fagemidbibliotek ved tilfeldig mutagenese av et lite sett av selekterte kritiske grunnstrukturresidier; • uttrykke og rense de humaniserte Fab-fragmentene;
• selektere humaniserte Fab-varianter; og
• bestemme bindingsaffinitetene.
Disse trinnene behøver ikke å bli utført i noen spesiell rekkefølge. Disse trinnene er spesifikt beskrevet under i "spesifikt eksempel" men er generelt utført som følger: Fremstilling av antistoff- fagemidvektor for monovalent fremvisning av Fab- fragmenter Et antistoff som skal humaniseres blir først selektert og de komplementarites-bestemmende regionene (CDR) identifisert. CDR-sekvensene til antistoffet kan bli identifisert i samsvar med sekvensdeifnisjonen hos Kabat et al., supra. CDR-sekvensene blir transplantert ved setedirigert mutagenese på en vektor som koder for en human VlkI-Ckilett kjede og human VH ni-CHfyitung kjede Fd. Fab-kodende sekvens kan deretter bli subklonet inn i en fagemidvektor. Denne konstruksjonen koder for et initielt humanisert antistoff hvori C-terminalen til tungkjeden blir nøyaktig satt sammen med karboksyldelen til et fagkappeprotein. Fortrinnsvis blir en fagemidvektor selektert som tilveiebringer ekspresjon av både utskilt tung kjede eller tungkjedegen IQ fusjoner i supE suppressorstammer av E. coli.
Konstruksjon av antistoff Fab fagemid bibliotek
Basert på kumulative resultater fra humanisering av et antall ikke-humane antistoff på en human VlkI-Vh HI grunnstruktur, ble det overveiet at grunnstrukturendringer som kreves for å optimalisere antigensbinding er begrenset til noen undergrupper av residier. Se Carter et al., PNAS USA 89,4285 (1992), Presta et al., J. Immunol. 151,2623
(1993); Eigenbrot et al., Proteins 18,49-62 (1994); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175,217
(1992). Deretter ble en ny gruppe av residier utvalgt for randomisering. Randomiseringen av disse identifiserte nøkkelgninnstrukturresidiene tilveiebragte det ønskede biblioteket av Fab-varianter som skulle fremvises på overflaten av den filamentøse fagen. Spesielt har VLresidier 74 og V-residier 24,37, 67,69,71, 75,76, 78, 93, og 94 blitt utvalgt som nøkkelgruimstrukturresidier som er viktig for antigenbinding og mål for randomisering.
Ekspresjon og rensning av humaniserte Fab- fragmenter
Forskjellige metoder er kjent innen fagfeltet for å uttrykke og rense fragmenter. Som beskrevet heri, ble en E. coli stamme 34B8, en ikke-suppressor, transformert med fagemid pMB419, eller varianter derav. Enkle kolonier ble dyrket natten over ved 37°C i 5 ml 2YT som inneholder 50 ug/ml karbenicillin. Disse kulturene ble fortynnet i 200 ml AP5 medium, beskrevet i Chang et al., Gene 55,189 (1987) som inneholder 20Hg/ml karbenicillin og inkubert i 26 timer ved 30°C. Cellene ble pelletert ved 4000 x g og frosset ved -20°C i minst 2 timer. Cellepelletene ble deretter resuspendert i 5 ml 10 mM tris-HCl (pH 7,6) som inneholder 1 mM EDTA, rystet ved 4°C i 90 minutter og sentrifugert ved 10.000 x g i 15 minutter. Supernatanten ble satt på en 1 ml streptokokkprotein G-SEPHAROSE kolonne (en kolonne produsert i Pharmacia) og vasket med 10 ml 10 mM MES (pH 5,5). Det bundne Fab-fragmentet ble eluert med 2,5 ml 100 mM eddiksyre og umiddelbart nøytralisert med 0,75 ml IM TrisHCl, pH 8,0. Fab-fremstillingene ble buffer-byttet til PBS og konsentrert ved å bruke CENTRICON-30 konsentratorer (produsert av Amicon). Typiske utbytter av Fab var omtrent 1 mg/l kultur, post-protein G rensning. Renset Fab-prøver blekarakterisert vedelektrospray-massespektrometri og konsentrasjonene ble bestemt ved aminosyreanalsyer.
Seleksjon av humaniserte Fab- varianter
Renset merket antigen belegges på en mikrotiterplate. Beleggingsløsningen blir fjernet, brønnene blir blokkert og fagemid-stamløsningne blir tilsatt. Etter en periode blir brønnene vasket og bundet fage eluert og titrert. De gjenværende fagene eluert fra VEGF-belagte brønner og dyrket opp for anvendelse i neste seleksjonssyklus. Denne prosessen kan repeteres flere ganger for å erverve ønsket antall av kloner. For eksempel kan noen få dusin individuelle kloner bli selektert og sekvensert.
Bestemmelse av VEGF- bindings affiniteter
Assosisasjons- og disassosiasjonskonstanter for binding av humaniserte varianter til VEGF blir målt. Bindingsprofiler blir analysert og de varianter som viser de høyeste affiniteter blir selektert.
Administrering av humanisert anti- VEGF
Administrering av humanisert anti-VEGF kan bli ekstrapolert fra data presentert på murine anti-VEGF beskrevet i Kim et al., Growth Factors 7,53 (1992); Kim et al., Nature 362, 841 (1993). Spesielt demonstrerer Kim et al., at så lite som 10 ug to ganger ukentlig av VEGF antistoff resulterte i signifikant inhibering av tumorvekst. Maksimale effekter ble oppnådd med antistoffdoser på 50-100 \ ig.
Det følgende eksemplet har til hensikt bare å illustrere den beste metoden som man nå kjenner for å utøve oppfinnelsen, men oppfinnelsen er ikke betraktes som begrenset til detaljene i dette eksemplet.
SPESIFIKT EKSEMPEL 1
Konstruksjon av fagemidvektor og initiell humanisert anti- VEGF
Det murine anti-VEGF mAb A4.6.1 har tidligere blitt beskrevet av Kim et al., Growth Factors, 7, 53 (1992); Kim et al., Nature, 362, 841 (1993). Den første Fab-varianten til humanisert A4.6.1, hu2.0, ble konstruert ved setedirigert mutagenese ved å bruke deoksyuridin-inneholdende templat av plasmid pAK2 som koder for human Vlk-Ckilett kjede og human VhJU-ChIyitung kjede Fd fragment, Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992). De transplanterte A4.6.1 CDR sekvensene ble valgt i samsvar med sekvensdeifnisjonen til Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunolo<g>ical Interest (5th), Public Health Service, National Institutes of Health, MD (1991), unntatt CDR-H1 som er utvidet til å omfatte både sekvens- og strukturdefinisjoner, dvs. Vn-residier 26-35, Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987). Fab-kodende sekvenser ble subklonet inn i fagemidvektoren phGHamg3, Bass and Wells, Proteins, 8,309 (1990); Lowman et al., Biochem, 30,10832 (1991). Denne konstruksjonen, pMB4-19, koder for det initielle humaniserte A4.6.1 Fab, hu2.0, med den C-terminale enden av den tunge kjeden satt sammen eksakt på karboksyldelen av Ml3 gen HI kappeproteinet. pMB4-19 har samme oppbyggnming som pDH188, en tidligere beskrevet plasmid for monovalent fremvisning av Fab-fragmenter. Garrard et al., Biotechn. 9: 1373-1377 (1991). Betydelige forskjeller mellom pMB4-19 og pDH188 omfatter et kortere M13 gen UJ segment (kodoner 249-406) og anvendelse av et amberstoppkodon umiddelbart etterfulgt av antistoff tungkjede Fd fragment. Dette tillater ekspresjon av både utskilte tunge kjeder eller tung kjede-gen Ul fusjoner i supE suppressor stammer av E. coli.
Det initielle humaniserte A4.6.1 fragmentet (hu2.0) hvori CDR fra A4.6.1 ble podet på en humann VlkI-VhUJ grunnstruktur er vist i figur 1. VL-domenet til hu2.0 er vist i SEQ ID nr. 7 og VH domenet til hu2.0 er vist i SEQ ID nr. 10.
Alle residiene forskjellig fra podet CDR ble opprettholdt som den humane sekvensen. Bindingen av dette initielle humaniserte antistoffet til VEGF var så svak at den ikke kunne detekteres. Basert på relativ affinitet av andre svakt bindende humaniserte A4.6.1 varianter (data ikke vist) ble Kdfor binding av hu2.0 estimert til >7 uM. Dette står i kontrast til affinitet på 1,6 nM for en kimær Fab-konstruksjon som består av intakte Vlog Vh domener fra murint A4.6.1 og humane konstante domener. Således var binding av hu2.0 til VEGF minst 4.000 ganger redusert i forhold til kimæren.
Design av anti- VEGF Fab- fagemidbibliotek
Gruppen av grunnstrukturendringer som kreves for å optimalisere antigenbinding når en bruker humant VlkI-VhIII grunnstruktur ble utvalgt som vist i tabell 1 og figur 2. Humanisert A4.6.1 fagemidbibliotek ble konstruert ved setedirigert mutagenese ifølge metoden til Kunkel et al., Methods Enzymol. 204,125 (1991). Et derivat av pMB4-19 som inneholder TAA stopp tripletter ved Vh kodonet 24,37, 67 og 93 ble fremstilt for anvendelse som mutagenesetemplat (alle sekvenser var nummererte ifølge Kabat et al., supra.) Denne modifiseringen ble gjort for å forhindre etterfølgende bakgrunns- kontaminering av villtypesekvenser. Kodonene som var målet for randomiseringen var 4 og 71 (lett kjede) og 24,37, 67,69, 71,73,75,76,78, 93 og 94 (tung kjede).
Av interesse når en designer humanisert A4.6.1 fagemidbibliotek var at residiene som var målet for randomisering ble bredt fordelt utover Vlog Vh sekvensene. Begrensninger i lengden av syntetiske oligonukleotider krever at samtidig randomisering av hver av disse grunnstrukturposisjonene bare kan oppnås gjennom anvendelse av multiple oligonukleotider. Siden det totale antall av oligonukleotider øker, minsker imidlertid effektiviteten av mutagenesen (dvs. andelen av mutanter ervervet som inkorporerer en sekvens avledet fra alle de mutagene oligonukleotidene). For å omgå dette problemet ble to trekk inkorpoert i bibliotekskonstruksjonen. Det første var å fremstille fire forskjellige mutagenesetemplater som koder for hver av de mulige Vlgrunnstruktur-kombinasjoner. Dette var enkelt å utføre gitt den begrensete diversitet til lettkjede-gunnstrukturenbare fire forskjellige sekvenser), men var fordelaktig ved den eliminerte behovet for to oligonukleotider fra mutagenesestrategien. For det andre ble to 126 base oligonukleotider på forhånd satt sammen fra mindre syntetiske fragmenter. Dette gjorde det mulig å randomisere Vh kondonene 67,69,71, 73, 75, 76,93 og 94 med etenkelt langt oligonukleotid, heller enn to små. Sluttrandomiseringsmutagenese-strategien anvendte derfor bare to oligonukleotider samtidig på fire forskjellige templater.
Mer spesifikt, for å randomisere tungkjedekodonene 67,69, 71,73,75, 76,78,93 og 94 med et enkelt mutagent oligonukleotid, ble to 126-mer oligonukleotider på forhånd satt sammen fra 60 og 66-mer fragmenter ved témplatassistert enzymatisk ligering. Spesifikt ble 1,5 nmol av 5' fosforylert oligonukleotid GAT TTC CGT NYT ACT WTT
TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC (SEQ ID. NO. 12) eller GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC
TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC (SEQ ID NR. 1) kombinert
med 1,5 nmol AGC CTG CGC GCT GAT GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG (SEQ ID. NR. 2). De randomiserte kodonene er understreket og N representerer A/G/T/C; W representerer A/T; B representerer G/T/C; D representerer G/A/T; R representerer A/G; og Y representerer C/T ("/" representerer "eller"). Deretter ble 1,5 nmol av templat oligonukleotidet CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA (SEQ ID NR. 3), med komplementær sekvensen til de 5' ender av SEQ ID nr. 12 og 1 og den 3' enden av SEQ ID nr. 3 tilsatt for å hybridisere til hver ende til ligeringskoblingen. Til denne blandingen ble Taq ligase (termostabil ligase fra New England Biolabs) og buffer tilsatt, og reaksjonsblandingen ble utsatt for 40 runder med termiske sykluser (95°C i 1,25 minutter og 50°C i 5 minutter) for å syklisere templatoligonukleotiden mellom ligerte og uligerte koblinger. Produktet 126-mer oligonukleotid ble renset på en 6% urea/TBE polyakrylamid gel og ekstrahert fra polyakrylamid i buffer. De to 126-mer produktene ble kombinert i et likt forhold, etanol presipitert og tilslutt løst i 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. Det blandede 126-mer oligonukleotid produktet ble merket 504-01.
Randomisering av selektert grunnstruktur kodoner (VL4, 71; VH 24, 37,67,69, 71,73, 75,76,93, 94) ble således effektuert i to trinn. Først ble Vl randomisering oppnådd ved å fremstille tre ytterligere derivater av modifisert pMB4-19 templat. Grunnstruktur- kodonene 4 og 71 i lett kjede ble erstattet individuelt eller parvis ved å bruke to mutageniserte oligonukleotider GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG
(SEQ ID. NR. 13) og TCT GGG ACT GAT TAC ACT CTG ACC ATC (SEQ ID. NR. 4). Deoksyuridin-inneholdende templat ble fremstilt fra hver av disse nye derivatene. Sammen med originaltemplaten kodet disse fire konstruksjonene fra hver av de fire mulige lettkjede grunnstruktursekvens-kombinasjonene (se tabell 1).
Oligonukleotidene 504-01, blandingen av to 126-mer oligonukleotider, og CGT TTG
TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC
TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG (SEQ ID NR. 5) ble anvendt for å randomisere tungkjede grunnstrukturkodoner ved å bruke hver av de fire templatene som er beskrevet. De fire bibliotekene ble elektektoporert inn i E. coli XL-1 BLÅ CELLER (markørceller som produseres av Stratagene) og kombinert. Det totale antallet uavhengige transformanter ble beregnet til >1,2 x 10<8>, ca. 1,500 ganger høyere enn maksimumsantallet av DNA sekvenser i biblioteket.
Fra denne strategien ble hver av residiene 4 og 71 i lettkjeden og 24, 37,67,78 og 93 fra den tunge kjeden delvis randomisert for å tillate seleksjon av enten den murine A4.6.1, den humane VlkI-VhUI sekvensen, eller sekvenser som vanligvis finnes i andre humane og murine grunnstrukturer (tabell 1). Bemerk at randomiseringen av disse residiene ikke ble begrenset til et valg mellom human VlkI-VhUJ konsensus eller A4.6.1 grunnstruktursekvenser. Heller tillater inneslutning av ytterligere aminosyrer som vanligvis finnes i andre humane og murine grunnstruktursekvenser gjør det mulig ay ytterligere diversitet kan føre til seleksjon av tettere bindingsvarianter.
Noen av tungkjede grunnstrukturresidiene ble randomisert på en binær måte i forhold til humant VhIII og murint A4.6.1 grurmstruktur sekvenser. Residiene VH 71,73, 75 og 76 er posisjonert i en hårnålsløkke ved siden anantigenbindingssetet. Sidekjedene til Vh 71 og 73 er for det meste begravet i kanoniske antistoffstrukturer og deres potensielle rolle for konformasjonen til CDR-H2 og CDR-H3 er vel kjent. Kettleborough et al., Protein Eng. 4, 773 (1991): Carter et al., PNAS USA 89,4285 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175,217 (1992). På den annen side, selv om sidekjedene til VH 75 og 76 er løsningsmiddeleksponert (figur 2) har det allikevel blitt observert at disse to residiene også kan påvirke antigenbinding (Eigenbrot, Protein, 18,49, (1994), antagelig på grunn av den direkte antigenkontakt i noen antistoff-antigenkomplekser. På grunn av deres nærhet i sekvens og mulige gjensidig avhengighet ble VH, 71, 73, 75 og 76 randomisert sammen slik at bare to mulige kombinasjoner av dennee tetrade kunne bli selektert; enten alle human VhTH eller alle murin A4.6.1 sekvensene. Til slutt ble Vh residiene 69 og 94 randomisert, men bare for å representere VhIII og A4.6.1 sekvensene. Vh 69 og 94 ble ikke erstattet i tidligere antistoff humaniseringer, men fordi de er forskjellig mellom VhHI konsensus og A4.6.1 sekvenser (figur 1) og har blitt notert som potensielt viktige for en riktig CDR konformasjon (Foote et al., J. Mol. Biol. 224,487 (1992), ble de inkludert i denne randomiseringsstrategien.
Humanisert A4. 6. 1 Fab- bibliotek fremvist på overflaten av en fagemid
Mange systemer har blitt utviklet for funksjonell fremvisning av antistoff-fragmenter på overflaten av filamentøse fag, Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12,433 (1994). Disse inkluderer fremvisning av Fab eller enkeltkjedete Fv (scFv) fragmenter som fusjoner til enten gen EI eller gen VIH kappeproteiner hos Ml3 bakteriofag. Systemet valgt heri er lik det som er beskrevet ved Garrard et al., Biotechn. 9,1373 (1991) hvori et Fab-fragment er monovalent fremvist som et gen HJ fusjon (figur 3). Dette systemet har to spesielle trekk. Spesielt, til forskjell fra scFvs har Fab-fragmentene ingen tendens til å danne dimere arter hvis forekomst kan forhindre seleksjon av de som bindes tettest på grunn av aviditetseffekter. I tillegg eliminerer monovalensitet til det fremviste proteinet en annen potensiell kilde for aviditetseffekter som på annen måte ville være resultatet av tilstedeværelse av mange kopier av et protein på hver fagemidpartikkel, Bass and Wells, Proteins 8, 309 (1990); Lowman et al., Biochemistry 30, 10832 (1991).
Fagemidpartiklene som fremvises på de huminserte A4.6.1 Fab-fragmenter ble dyrket i E. coli XL-1 Blå celler. I korthet fikk cellene som innehar randomisert pMB4-19 konstruksjon vokse natten over ved 37°C i 25 ml 2YT medium som inneholdt 50 ug/ml karbenicillin og omtrent 10<10>M13K07 hjelperfage (Viera og Messing, Methods Enzymol. 153, 3 (1987). Fagemidstamløsningene ble renset fra kultursupernatantene ved presipitering med saltvannspolyetylenglykolløsning og resuspendert i 100 ul PBS (ca. 10<14>fagemid/ml).
Seleksjon av humanisert A4. 6. 1 Fab- varianter
Renset VEGF (100 ml ved 10 ug/ml i PBS) ble belagt på en mikrotiterplatebrønn natten over ved 4°C. Belegningsløsningen ble slått av og denne og en ubelagt brønn ble blokkert med 6% skummet melk i en time og vasket med PBS som inneholdt 0,05% TWEEN-20 (detergent). Deretter ble 10 ul av fagemidstamløsning fortynnet til 100 ul med 20 mM Tris (pH 7,5) som inneholdt 0,1% BSA og 0,05% TWEEN-20, tilsatt til hver brønn. Etter to timer ble brønnene vasket og bundet fag eluert med 100 ul 0,1 M glysin (pH 2,0) og nøytralisert med 25 fil IM Tris pH 8,0. En alikvot av dette ble brukt for å titrere antallet av fag som ble eluert. De gjenværende fagene som var eluert fra VEGF-belagte brønner ble dyrket for anvendelse i neste seleksjonssyklus. Totalt 8 seleksjonsrunder ble utført,hvorpå 20 individuelle kloner ble selektert og sekvensert (Sanger et al., PNAS USA 74, 5463 (1997)).
Varianter fra det humaniserte A4.6.1 Fab-fagemidbiblioteket ble deretter selektert basert på binding til VEGF. Anrikning av funksjonelle fagemid, målt ved å sammenligne titrene fra fag eluert fra en VEGF-belagt versus ubelagt mikrotiterplatebrønn, økte opp til den syvende runden med "affinity panning". Etter en ytterligere runde med sortering, ble 20 kloner sekvensert for å identifisere foretrukkete gninnstrukturresidier selektert ved hver randomisert posisjon. Disse resultatene som er summert i tabell 2, ga sterk konsensus blant de klonene som ble selektert. Ti av tyve kloner hadde identisk DNA sekvens, betegnet hu2.10. Av de 13 gnmnstrukturposisjonene som ble randomisert ble 8 substitusjoner selektert i hu2.10 (VL71; VH 37,71,73, 75, 76, 78 og 94). Interessant nok ble residiene VH 37 (Ile) og 78 (Val) hverken selektert som human VhUI eller murin A4.6.1 sekvens. Dette resultatet indikerer at noen grunnstrukturposisjoner kan dra nytte av å utvide diversiteten utover de målsøkte humane og opprinnelige murine grunnstruktursekvenser.
Forskjeller mellom hu2.0 og murint A4.6.1 antistoff er understreket. Antallet identiske kloner identifisert for hver fageselektert sekvens er indikert i parenteser. Strekene i sekvensene til fagselekterte kloner indikerer seleksjon av human VlkI-VhHI grunnstruktursekvens (dvs. som i hu2.0).
Det var fire andre unike aminosyresekvenser blant de gjenværende ti klonene som ble analysert: hu2.1, hu2.2, hu2.6 og hu2.7. Alle disse klonene i tillegg til hu2.10 inneholdt identiske grunnstruktursubstitusjoner ved posisjonene Vh37 (Ile), 78 (Val) og 94 (Lys), men bibeholdt human VhUI konsensus sekvens i posisjonene 24 og 94. Fire kloner hadde mistet den lettkjedekodende sekvens og bandt ikke VEGF når de ble testet i fag ELISA analyse (Cunningham et al., EMBO J, 13,2508 (1994)). Vi har av og til bemerket tap av tung- eller lettkjedesekvens med andre Fab-fagemidbiblioteker (upubliserte data) og disse klonene er antagelig selektert på basis av økt ekspresjon. Slike artifakter kan ofte bli minimalisert ved å redusere antall av sorteringssykluser eller ved å dyrke bibliotekene på fast medium.
Bestemmelse av VEGF- bindingsaffiniteter
Assosiasjons- (Kon) og dissosiasjons- (Koff) konstanter for binding av humanisert A4.6.1 Fab-varianter til VEGF121ble målt ved overflateplasmonresonnans (Karlsson et al., J. Immun. Methods 145,229 (1991)) på et Pharmacia BIAcore instrument. VEGF121var kovalent immobilisert på biosensor chip via primære aminogrupper. Binding av humanisert A4.6.1 varianter ble målt ved strømningsløsninger av Fab i PBS/0,05% TWEEN-20 (detergent) over chipen med en strørnningsrate på 20 ul/min. Ved å følge hver bindingsmåling ble gjenværende Fab fjernet fra den immobiliserte liganden med vasking med 5 ul 50 mM vandig HC1 ved 3 ul/min. Bindingsprofiler ble analysert av ikke-lineær regresjon ved å bruke en enkel monovalent bindingsmodell (BIA evalueringssoftware v2.0; Pharmacia).
Fag-selekterte varianter hu2.1, hu2.2 hu2.6, hu2.7 og hu2.10 ble uttrykt i E. coli ved å bruke risteflasker og Fab-fragmenter ble renset fra periplasmiske ekstrakter med protein G affinitetskromatografi. Gjenvunnet utbytte av Fab fra disse fem klonene varierte fra 0,2 (hu2.6) til 1,7 mg/l (hu2.1). Affiniteten til hver av disse variantene av antigen (VEGF) målt ved overflateplasmonresonnans på et BIAcore instrument vises i tabell 3. Analyse av disse bindingsdataene viste at konsensuklon hu2.10 utviste den høyeste affiniteten for VEGF av de fem varianter som ble testet. Således ble vårt Fab-fagemid bibliotek selektivt anriket for den tetteste bindende klonen. Beregnet Kdfor hu2.10 var 55 nM, minst 125 ganger sterkere enn for hu2.0 som ikke inneholdt grunnstrukturendringer (Kd> 7 uM). De andre fire selekterte variantene utviste alle svakere binding til VEGF som varierte ned til en KDpå 360 nM for den svakeste (hu2.7). Det som var interessant var at KDfor hu2.6,67 nM bare var svakere enn den for hu2.10 og kun en kopi av denne klonen ble funnet blant de tyve klonene som ble sekvensert. Dette kan skyldes et lavere nivå av ekspresjon og fremvisning, som var tilfelle når en uttrykte løselig Fab av denne varianten. Til tross for lavere ekspresjonsrate er denne varianten imidlertid nyttig som et humanisert antistoff.
Ytterligere forbedring av humanisert variant hu2. 10
Til tross for stor forbedring i antigenaffinitet av den intielle humaniserte varianten var bindingen av hu2.10 til VEGF fortsatt 35-ganger svakere enn et kimært Fab-fragment som inneholdt de murine A4.6.1 Vlog Vh domener. Denne betydelige forskjellen indikerer at ytterligere optimalisering av den humaniserte grunnstruktur kan være mulig gjennom ytterligere mutasjoner. Av fininnstillingsresidier identifisert av Foote et al., J. Mol. Biol. 196,901 (1992) var bare residiene VL46, VH2 og VH48 forskjellig i A4.6.1 versus human VikI-VhHI grunnstruktur (figur 1), men ble ikke randomisert i vårt fagebibliotek. En molekylær modell av humanisert A4.6.1 Fv fragment viste at Vl46 sitter ved Vl-Vh interfasen og kunne påvirke konfirmasjonen av CDRH3. Videre er denne aminosyren nesten alltid leucin i de fleste Vlkgrunnstrukturer (Kabat et al., supra), men den er valin i A4.6.1. Følgelig ble en Leu -» Val substitusjon gjennomført i denne posisjonen i en bakgrunn av hu2.10. Analyse av bindingskinetikken for denne nye varianten, hu2.10V indikerte en ytterligere seks gangers forbedring i Kdfor VEGF-binding. Kdfor hu2.10V (9.3 nM) var således innenfor 6 ganger den til den kimære. I motsetning til Vl46 ble ingen forbedring i bindingsafflniteten til hu2.10 observert ved erstatning av Vh 2 eller Vu 48 med korresponderende residier fra murin A4.6.1.
En del av forbedringen forut for siste endring i affinitet skyldtes en økning i assosiasjonskonstanten (Kon), som indikerer at Vl46 kan spille en rolle i preorganisseringen av antistoffstrukturen til en konformasjon som er mer egnet for antigenbinding. Andre mutasjoner som innvirker på antigenaffinitet skyldes primært endringer i dissosiasjonskonstanten (Koff) for binding. Sammenligning av hu2.1 og hu2.10 avslører en 5 gangers forbedring i affinitet for substitusjon av Vh residiene 71, 73, 75 med A4.6.1 sekvensen. Endring av VL-71 til A4.6.1 sekvens (Phe -> Tyr) hadde så og si ingen effekt på binding (hu2.2 vs. hu2.7), mens varianter med leucin ved VLbandt marginalt dårligere (<2 ganger) enn de med metionin, den naturlige forekommende residiene i både A4.6.1 og den humane VklI grunnstrukturen (hu2,2 vs. hu2.1). Sammenligning med andre humaniserte A4.6.1 varianter ikke vist her avslørte at VH94 Arg - > Lys endring resulterte i en 5 gangers forbedring i Kd, enten på grunn av direkte antigenkontakt med denne residien eller på grunn av en strukturell rolle i å opprettholde en riktig konformasjon av CDR-H3. Variant hu2.6 har tre sekvens-forskjeller i forhold til konsensusklonen hu2.10, men har ikke desto mindre en lik KD, dette indikerer at disse substitusjonene har liten effekt på antigenbinding. En neglisjerbar effekt på konservative endringer i Vl4 og 71 stemmer overens med bindingsdata for andre varianter, skjønt endringen i Vh 67 (Phe -> Thr) hadde liten effekt på binding..
Claims (29)
1.
Humanisert anti-vaskulær endothelial vekstfaktor-antistoff, karakteri
sert ved at de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) til et ikke-humant antistoff blir podet på en human grunnstruktur som omfatter Vlkundergruppe I (VlkI) gnmnstrukturen ifølge SEQ ID NO: 7 og VH undergruppen m (VHni)
grunnstrukturen ifølge SEQ DD NO: 10, der minst en av de representativt nummererte residiene 4 og 71 i VL-domenet er substituert med en forskjellig aminosyre, og minst tre
av de representativt nummererte residiene 37,67,69,71,73,75, 76, 78 og 94 i VH-domenet er substituert med en forskjellig aminosyre, og der residiet 46 i VL-domenet eventuelt er substituert med aminosyren valin, og der residienummereringen er ifølge Kabat-nummereringen som vist i figuren 1.
2.
Humanisert antistoff ifølge krav l,karakterisert vedat det har minst en av de følgende substitusjoner: ved Vl4 leucin og Vl71 tyrosin; og minst tre av de følgende substitusjoner: ved Vh37 isoleucin; ved Vh67 treonin; ved VH69 fenylalanin; ved VH75 alinin; ved VH76 serin; ved VH78 valin; og ved VH94 lysin.
3.
Humanisert antistoff ifølge krav l eller 2,karakterisertv e d at residiene 37, 78 og 94 i Vn-domenet er substituert med henholdsvis aminosyrene isoleucin, valin og lysin.
4.
Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat residiene 71, 73,75 og 76 i Vn-domenet er substituert med henholdsvis aminosyrene leucin, treonin, alanin og serin.
5.
Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat residiet 46 i VL-domenet er substituert med aminosyren valin.
6.
Humanisert antistoff ifølge ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 8 og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11.
7.
Humanisert antistoff iføgle et hvilket som helst av kravene 1 -5,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 8 der residiet 46 leucin er subsitutert med valin og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11.
8.
Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 8 der residiet 4 metionin og 71 tyrosin er substituert med henholdsvis leucin og fenylalanin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11, der residiet 67 fenylalanin er substituert med treonin.
9.
Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7, der residiet 71 fenylalanin er substituert med tyrosin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin; 78 leucin og 94 argjnin er substituert med henholdsvis isoleucin, valin og lysin.
10.
Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7 der residiene 4 metionin og 71 fenylalanin er substituert men henholdsvis leucin og tyrosin; ov VH-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin, 78 leucin og 94 arginin er substituert med henholdsvis isoleucin, valin og lysin.
11.
Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7, der residiet 4 metionin er substituert med leucin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin; 67 fenylalanin; 78 leucin og 94 arginin er resubstituert med henholdsvis isoleucin, treonin, valin og lysin.
12.
Fremgangsmåte for å humanisere et ikke-humant anti-vaskulært endotelial vekstfaktoranitstoff,karakterisert vedat det omfatter trinnene : transplantere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) fra et ikke-humant antistoff til en human grunnstruktur som omfatter VLK-subgruppen I (Vlk-I) og Vn-undergruppen HJ (VhID); substituere minst en av residiene 4 og 71 i VL-domenet med en forskjellig aminosyre og subsitutere minst 3 av residiene 37, 67,69,71, 73,75, 76,78 og 94 i Vn-domenet med en forskjellig aminosyre, der residienummereringen er iføgle Kabat-nummereringen vist i flgure 1.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat den humane grunnstrukturen omfatter, forut for substitusjon grunnstrukturen ifølge VlK-undergruppe I (VlkI) ifølge SEQ ID NO: 7 og Vn-undergruppen m (VHni) ifølge SEQ ID NO: 10.
14.
Fremgangsmåte ifølge krav 12 eller 13,karakterisert vedat det omfatter minst en av de følgende substitusjoner: ved Vl4 leucin og VL71 tyrosin; og minst tre av de følgende substitusjoner: ved VH37 isoleucin; ved VH67 treonin; ved Vn69 fenylalanin; ved VH75 alanin; ved VH76 serin; ved VH78 valin; og ved VH94 lysin.
15.
Fremgangsmåte ifølgeet hvilket som helst av kravene 12 -14,karakterisert vedat residiene 37,78 og 94 i Vn-domenet er substituert med henholdsvis aminosyrene isoleucin, valin og lysin.
16.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-15,karakterisertve d at residiene 71, 73, 75 og 76 er substituert med henholdsvis aminosyrene leucin, treonin, alanin og serin.
17.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-16,karakterisertve d at residiet 46 i VL-domenet er substituert med aminnosyren valin.
18.
Fremgangsmåte ifølge ifølge et hvilket som helst av kravene 12-16,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 8 og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ DD NO: 11.
19.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-17,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ DD NO: 8 der residiet 46 leucin er subsitutert med valin og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11.
20.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-16,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ DD NO: 8, der residiet 4 metionin og 71 tyrosin er substituert med henholdsvis leucin og fenylalanin; og VH-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11, der residiet 67 fenylalanin er substituert med treonin.
21.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-15,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ TD NO: 7, der residiet 71 fenylalanin er substituert med tyrosin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin; 78 leucin og 94 arginin er substituert med henholdsvis isoleucin, valin og lysin.
22.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-15,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7, der residiene 4 metionin og 71 fenylalanin er substituert men henholdsvis leucin og tyrosin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin, 78 leucin og 94 arginin er substituert med henholdsvis isoleucin, valin og lysin.
23.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav 12 - 15,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7, der residiet 4 metionin er substituert med leucin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin; 67 fenylalanin; 78 leucin og 94 arginin er resubstituert med henholdsvis isoleucin, treonin, valin og lysin.
24.
Fremgangsmåte ifølge kravene 12-17,karakterisertv e d at den ytterligere omfatter trinnene: fremvisning av Vl og Vn-domener med subsitutsjoner på et fagemid; bestemme om VEGF vil binde til VL- og VH-domenene ved substitusjoner; selektere humaniserte antistoff som vil binde til VEGF.
25.
Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11,karakterisert vedat det er et antistoff-fragment.
26.
Antistoffragment ifølge krav 25,karakterisert vedat det er et Fab, Fab, F(ab')2eller Fv-fragment.
27.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-24,karakterisert vedat det humane antistoffet er et antistoff-fragment.
28.
Fremgangsmåte ifølge krav 27,karakterisert vedat fragmenet er et Fab, Fab', F(ab')2eller Fv-fragment.
29..
Anvendelse av det humaniserte antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11, 25,26 og 29 for fremstilling av et medikament for behandling av tumorvekst.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US83350497A | 1997-04-07 | 1997-04-07 | |
PCT/US1998/006724 WO1998045332A2 (en) | 1997-04-07 | 1998-04-03 | Humanized antibodies and methods for forming humanized antibodies |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO994870D0 NO994870D0 (no) | 1999-10-06 |
NO994870L NO994870L (no) | 1999-12-06 |
NO325823B1 true NO325823B1 (no) | 2008-07-21 |
Family
ID=25264594
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19994870A NO325823B1 (no) | 1997-04-07 | 1999-10-06 | Humaniserte antistoffer, fremgangsmate for a fremstille humaniserte antistoffer og anvendelsen av slike. |
NO2017039C NO2017039I2 (no) | 1997-04-07 | 2017-08-01 | Bevacizumab - forlenget SPC |
NO2019045C NO2019045I1 (no) | 1997-04-07 | 2019-12-11 | Ranibizumab - Forlenget SPC |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO2017039C NO2017039I2 (no) | 1997-04-07 | 2017-08-01 | Bevacizumab - forlenget SPC |
NO2019045C NO2019045I1 (no) | 1997-04-07 | 2019-12-11 | Ranibizumab - Forlenget SPC |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
EP (6) | EP3260468A1 (no) |
JP (1) | JP4191258B2 (no) |
KR (2) | KR100856995B1 (no) |
CN (6) | CN101665536B (no) |
AT (4) | ATE314395T1 (no) |
AU (1) | AU740738B2 (no) |
BR (1) | BRPI9809388B8 (no) |
CA (1) | CA2286397C (no) |
CY (3) | CY1111345T1 (no) |
DE (3) | DE69832970T2 (no) |
DK (4) | DK2301580T3 (no) |
ES (4) | ES2380575T3 (no) |
HK (7) | HK1025338A1 (no) |
IL (3) | IL132239A0 (no) |
LT (1) | LTC0973804I2 (no) |
NO (3) | NO325823B1 (no) |
NZ (1) | NZ500077A (no) |
PT (5) | PT1695985E (no) |
SI (5) | SI0973804T1 (no) |
TR (1) | TR199902818T2 (no) |
WO (1) | WO1998045332A2 (no) |
ZA (2) | ZA982908B (no) |
Families Citing this family (210)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6582959B2 (en) | 1991-03-29 | 2003-06-24 | Genentech, Inc. | Antibodies to vascular endothelial cell growth factor |
US6884879B1 (en) | 1997-04-07 | 2005-04-26 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
DE122007000021I1 (de) * | 1997-04-07 | 2007-05-24 | Genentech Inc | Anti-vefg Antibodies |
US7365166B2 (en) | 1997-04-07 | 2008-04-29 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
US20020032315A1 (en) | 1997-08-06 | 2002-03-14 | Manuel Baca | Anti-vegf antibodies |
KR100856995B1 (ko) * | 1997-04-07 | 2008-09-04 | 제넨테크, 인크. | 인간화 항체 및 인간화 항체의 제조 방법 |
DK2016951T3 (da) | 1998-03-17 | 2012-09-24 | Genentech Inc | VEGF- og BMP1-homologe polypeptider |
EP1135498B1 (en) | 1998-11-18 | 2008-01-23 | Genentech, Inc. | Antibody variants with higher binding affinity compared to parent antibodies |
US20030035798A1 (en) * | 2000-08-16 | 2003-02-20 | Fang Fang | Humanized antibodies |
US6703020B1 (en) | 1999-04-28 | 2004-03-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF |
EP1185559A2 (en) | 1999-04-28 | 2002-03-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf |
US6346249B1 (en) * | 1999-10-22 | 2002-02-12 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods for reducing the effects of cancers that express A33 antigen using A33 antigen specific immunoglobulin products |
ATE353913T1 (de) | 2000-04-21 | 2007-03-15 | Fuso Pharmaceutical Ind | Neue collectine |
EP2792747A1 (en) | 2000-06-23 | 2014-10-22 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis |
EP2168980A1 (en) | 2000-06-23 | 2010-03-31 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogensis |
US20050123925A1 (en) | 2002-11-15 | 2005-06-09 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
WO2003068801A2 (en) * | 2002-02-11 | 2003-08-21 | Genentech, Inc. | Antibody variants with faster antigen association rates |
EP1551453A4 (en) | 2002-06-17 | 2007-04-25 | Us Gov Health & Human Serv | SPECIFICITY GRAFTING OF A MICE RESPONSE TO A HUMAN FRAME |
CA2513113A1 (en) | 2003-01-23 | 2004-08-05 | Genentech, Inc. | Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture |
MXPA05012723A (es) | 2003-05-30 | 2006-02-08 | Genentech Inc | Tratamiento con anticuerpos anti-vgf. |
JP2007528723A (ja) * | 2003-08-22 | 2007-10-18 | メディミューン,インコーポレーテッド | 抗体のヒト化 |
WO2005056781A1 (fr) | 2003-12-02 | 2005-06-23 | Institut Pasteur | Utilisation des proteines et des peptides codes par le genome d'une nouvelle souche de coronavirus associe au sras. |
US20060122377A1 (en) | 2004-02-19 | 2006-06-08 | Genentech, Inc. | CDR-repaired antibodies |
US8604185B2 (en) | 2004-07-20 | 2013-12-10 | Genentech, Inc. | Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use |
JP4947717B2 (ja) | 2004-07-20 | 2012-06-06 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | アンジオポエチン様4タンパク質のインヒビター、組み合わせ、およびそれらの使用 |
NZ598502A (en) | 2004-10-21 | 2013-07-26 | Genentech Inc | Use of vegf antagonists in intraocular neovascular disease treatment |
UA96139C2 (uk) | 2005-11-08 | 2011-10-10 | Дженентек, Інк. | Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1) |
ES2526204T3 (es) | 2006-01-05 | 2015-01-08 | Genentech, Inc. | Anticuerpos anti-EphB4 y métodos para usar los mismos |
ZA200806187B (en) | 2006-01-20 | 2009-10-28 | Genentech Inc | Anti-EphrinB2 antibodies and methods using same |
AR059851A1 (es) | 2006-03-16 | 2008-04-30 | Genentech Inc | Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso |
TW200812615A (en) | 2006-03-22 | 2008-03-16 | Hoffmann La Roche | Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2 |
MY157173A (en) * | 2006-05-25 | 2016-05-13 | Glaxo Group Ltd | Modified humanised anti-interleukin-18 |
JP2009539384A (ja) | 2006-06-06 | 2009-11-19 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 抗dll4抗体および抗dll4抗体使用の方法 |
CN1903880B (zh) * | 2006-08-02 | 2010-05-12 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 抗肿瘤血管内皮生长因子vegf-e抗原及其编码基因与应用 |
SI2056874T1 (sl) | 2006-08-21 | 2012-12-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Terapija tumorjev s protitelesom proti vegf |
CN101148474B (zh) * | 2006-09-21 | 2014-06-11 | 上海杰隆生物工程股份有限公司 | 人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法 |
KR20090097188A (ko) | 2006-12-19 | 2009-09-15 | 제넨테크, 인크. | 조기 종양의 치료 및 아주반트 및 네오아주반트 요법을 위한 vegh-특이적 길항제 |
WO2008143666A2 (en) | 2007-05-17 | 2008-11-27 | Genentech, Inc. | Crystal structures of neuropilin fragments and neuropilin-antibody complexes |
CN101754771B (zh) | 2007-05-17 | 2015-03-04 | 健泰科生物技术公司 | 抗神经毡蛋白2抗体对肿瘤转移的抑制 |
PE20090321A1 (es) | 2007-06-04 | 2009-04-20 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica |
HUE037409T2 (hu) | 2007-10-30 | 2018-08-28 | Genentech Inc | Antitest-tisztítás kationcserés kromatográfiával |
MX344733B (es) | 2007-11-09 | 2017-01-04 | Genentech Inc * | Composiciones y metodos de uso de la quinasa-1 similar al receptor de la activina. |
TWI580694B (zh) * | 2007-11-30 | 2017-05-01 | 建南德克公司 | 抗-vegf抗體 |
US9266967B2 (en) | 2007-12-21 | 2016-02-23 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
US20090162359A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
KR101671886B1 (ko) * | 2008-06-25 | 2016-11-04 | 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 | Vegf를 억제하는 안정하고 가용성인 항체 |
US8268314B2 (en) | 2008-10-08 | 2012-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies |
SG195558A1 (en) | 2008-10-14 | 2013-12-30 | Genentech Inc | Immunoglobulin variants and uses thereof |
NZ592591A (en) | 2008-11-03 | 2012-04-27 | Molecular Partners Ag | Binding proteins comprising ankyrin repeast domains that inhibit the vegf-a receptor interaction |
CN105214086B (zh) | 2008-11-22 | 2019-09-27 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 抗-vegf抗体与化学治疗联合用于治疗乳腺癌的应用 |
EP2382472B1 (en) | 2008-12-23 | 2015-05-06 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Methods and compositions for diagnostic use in cancer patients |
RU2598248C2 (ru) | 2009-04-02 | 2016-09-20 | Роше Гликарт Аг | Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab |
AU2010230855A1 (en) * | 2009-04-03 | 2012-01-12 | Vegenics Limited | Anti-VEGF-D antibodies |
EP2417156B1 (en) | 2009-04-07 | 2015-02-11 | Roche Glycart AG | Trivalent, bispecific antibodies |
EP2427479B1 (en) | 2009-05-07 | 2018-11-21 | The Regents of The University of California | Antibodies and methods of use thereof |
KR20120005021A (ko) | 2009-05-08 | 2012-01-13 | 제넨테크, 인크. | 인간화 항-egfl7 항체 및 그의 사용 방법 |
US9676845B2 (en) | 2009-06-16 | 2017-06-13 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
NZ596837A (en) | 2009-06-17 | 2014-02-28 | Abbvie Biotherapeutics Inc | Anti-vegf antibodies and their uses |
BR112012000735A2 (pt) | 2009-07-13 | 2016-11-16 | Genentech Inc | "métodos, kits e conjuntos de compostos" |
AR077595A1 (es) | 2009-07-27 | 2011-09-07 | Genentech Inc | Tratamientos de combinacion |
ES2513292T3 (es) | 2009-07-31 | 2014-10-24 | Genentech, Inc. | Inhibición de metástasis tumoral usando anticuerpos anti-G-CSF |
AU2010284446A1 (en) | 2009-08-15 | 2012-03-08 | Genentech, Inc. | Anti-angiogenesis therapy for the treatment of previously treated breast cancer |
MX2012002862A (es) | 2009-09-11 | 2012-08-15 | Genentech Inc | Metodo para identificar un paciente con una mayor probabilidad de responder a un agente anticancerigeno. |
RU2573915C2 (ru) | 2009-09-16 | 2016-01-27 | Дженентек, Инк. | Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение |
CA2772670A1 (en) | 2009-09-17 | 2011-03-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods and compositions for diagnostics use in cancer patients |
WO2011056497A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor type iib compositions and methods of use |
WO2011056502A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use |
CN102051396B (zh) * | 2009-11-04 | 2014-07-16 | 无锡天演生物技术有限公司 | 雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用 |
TWI505836B (zh) | 2009-12-11 | 2015-11-01 | Genentech Inc | 抗-vegf-c抗體及其使用方法 |
CA2783846C (en) | 2009-12-21 | 2021-01-19 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
AR079704A1 (es) | 2009-12-23 | 2012-02-15 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-bv8 y sus usos |
FR2955773B1 (fr) | 2010-02-01 | 2017-05-26 | Commissariat A L'energie Atomique | Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination |
CA2787952C (en) | 2010-02-23 | 2016-07-26 | Genentech, Inc. | Anti-angiogenesis therapy for the treatment of ovarian cancer |
AR080794A1 (es) | 2010-03-26 | 2012-05-09 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2 |
TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
AR081361A1 (es) | 2010-04-30 | 2012-08-29 | Molecular Partners Ag | Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a |
WO2011153243A2 (en) | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Genentech, Inc. | Anti-angiogenesis therapy for treating gastric cancer |
WO2011153224A2 (en) | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Genentech, Inc. | Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer |
CN102863533B (zh) * | 2010-06-21 | 2013-12-11 | 中国科学技术大学 | 抗体人源化改造方法 |
WO2012006503A1 (en) | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Genentech, Inc. | Anti-neuropilin antibodies and methods of use |
CN103270418A (zh) | 2010-07-19 | 2013-08-28 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 鉴定响应抗癌疗法的可能性升高的患者的方法 |
CN103109189A (zh) | 2010-07-19 | 2013-05-15 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 鉴定响应抗癌疗法的可能性升高的患者的方法 |
TW201208703A (en) | 2010-08-17 | 2012-03-01 | Roche Glycart Ag | Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with an anti-VEGF antibody |
WO2012025530A1 (en) | 2010-08-24 | 2012-03-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment |
WO2012068030A1 (en) | 2010-11-15 | 2012-05-24 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Treatment of cancer with elevated dosages of soluble fgfr1 fusion proteins |
JP5766296B2 (ja) | 2010-12-23 | 2015-08-19 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用 |
WO2012092539A2 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Antibodies to dll4 and uses thereof |
ES2899186T3 (es) * | 2010-12-31 | 2022-03-10 | Bioatla Inc | Humanización rápida de anticuerpos |
EP2681239B8 (en) | 2011-02-28 | 2015-09-09 | F. Hoffmann-La Roche AG | Antigen binding proteins |
MX342034B (es) | 2011-02-28 | 2016-09-12 | Hoffmann La Roche | Proteinas monovalentes que se unen a antigenos. |
RU2607014C2 (ru) | 2011-03-29 | 2017-01-10 | Рош Гликарт Аг | Fc варианты антитела |
ES2620644T3 (es) | 2011-04-01 | 2017-06-29 | Genentech, Inc. | Combinaciones de compuestos inhibidores de AKT y agentes quimioterapéuticos, y métodos de uso |
CA2833747C (en) | 2011-04-20 | 2022-10-18 | Asya Grinberg | Endoglin polypeptides and uses thereof |
CA2834776A1 (en) | 2011-05-03 | 2012-11-08 | Genentech, Inc. | Therapeutic apo2l/trail polypeptides and death receptor agonist antibodies |
WO2012172054A1 (en) | 2011-06-16 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Modified multimeric ubiquitin proteins binding vegf-a |
US9057728B2 (en) | 2011-07-12 | 2015-06-16 | Epitomics, Inc. | FACS-based method for obtaining an antibody sequence |
MX2014001736A (es) | 2011-08-17 | 2014-03-31 | Genentech Inc | Inhibicion de angiogenesis en tumores refractarios. |
WO2013082511A1 (en) | 2011-12-02 | 2013-06-06 | Genentech, Inc. | Methods for overcoming tumor resistance to vegf antagonists |
MX2014009565A (es) | 2012-02-10 | 2014-11-10 | Genentech Inc | Anticuerpos monocatenarios y otros heteromultimeros. |
SI2825558T1 (sl) | 2012-03-13 | 2019-08-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Kombinirana terapija za zdravljenje raka jajčnikov |
JP6312659B2 (ja) | 2012-05-31 | 2018-04-18 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | Pd−1系結合アンタゴニスト及びvegfアンタゴニストを用いた癌の治療方法 |
MX2014014804A (es) | 2012-06-27 | 2015-02-12 | Hoffmann La Roche | Metodo para la elaboracion de conjugados de la region fc de anticuerpos que comprenden por lo menos una entidad de union que se une especificamente a un objetivo y usos del mismo. |
MX354862B (es) | 2012-06-27 | 2018-03-23 | Hoffmann La Roche | Método para la producción de entidades dirigidas altamente selectivas hechas a la medida y biespecíficas que contienen dos entidades de unión diferentes. |
AR092027A1 (es) | 2012-07-13 | 2015-03-18 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares |
JP6464085B2 (ja) | 2012-08-07 | 2019-02-06 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 神経膠芽腫の治療のための併用療法 |
WO2014074218A1 (en) | 2012-11-12 | 2014-05-15 | Redwood Bioscience, Inc. | Compounds and methods for producing a conjugate |
US9310374B2 (en) | 2012-11-16 | 2016-04-12 | Redwood Bioscience, Inc. | Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate |
EP2920148B1 (en) | 2012-11-16 | 2019-06-12 | The Regents of the University of California | Pictet-spengler ligation for protein chemical modification |
FR2998579B1 (fr) | 2012-11-27 | 2015-06-19 | Commissariat Energie Atomique | Methode pour obtenir des anticorps humains specifiques d'un antigene par immunisation in vitro |
US20140154255A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Anti-vegf antibodies and their uses |
SG10201913932VA (en) | 2013-03-13 | 2020-03-30 | Genentech Inc | Antibody formulations |
CN105163765A (zh) | 2013-03-13 | 2015-12-16 | 伊麦吉纳博公司 | 与cd8的抗原结合构建体 |
WO2014190147A2 (en) | 2013-05-23 | 2014-11-27 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Methods of treating cancer |
CN104341504B (zh) | 2013-08-06 | 2017-10-24 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 双特异性抗体 |
US10456470B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-10-29 | Genentech, Inc. | Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma |
US10617755B2 (en) | 2013-08-30 | 2020-04-14 | Genentech, Inc. | Combination therapy for the treatment of glioblastoma |
EP3055329B1 (en) | 2013-10-11 | 2018-06-13 | F. Hoffmann-La Roche AG | Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies |
US20150202260A1 (en) | 2013-10-25 | 2015-07-23 | Acceleron Pharma, Inc. | Endoglin peptides to treat fibrotic diseases |
ES2875878T3 (es) | 2013-11-18 | 2021-11-11 | Formycon Ag | Composición farmacéutica de un anticuerpo anti-VEGF |
JP6745218B2 (ja) | 2013-11-27 | 2020-08-26 | レッドウッド バイオサイエンス, インコーポレイテッド | ヒドラジニル−ピロロ化合物及び複合体を生成するための方法 |
ES2746805T3 (es) | 2013-12-12 | 2020-03-06 | Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd | Anticuerpo de PD-1, fragmento de unión a antígeno del mismo y aplicación médica del mismo |
JP6608827B2 (ja) | 2013-12-20 | 2019-11-20 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ヒト化抗タウ(pS422)抗体及び使用方法 |
JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
JOP20200096A1 (ar) | 2014-01-31 | 2017-06-16 | Children’S Medical Center Corp | جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها |
WO2015138920A1 (en) | 2014-03-14 | 2015-09-17 | Novartis Ag | Antibody molecules to lag-3 and uses thereof |
WO2015148531A1 (en) | 2014-03-24 | 2015-10-01 | Genentech, Inc. | Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression |
AU2015241038A1 (en) | 2014-03-31 | 2016-10-13 | Genentech, Inc. | Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and OX40 binding agonists |
US20170232199A1 (en) | 2014-05-12 | 2017-08-17 | Formycon Ag | Pre-Filled Plastic Syringe Containing a VEGF Antagonist |
US10124070B2 (en) | 2014-06-06 | 2018-11-13 | Redwood Bioscience, Inc. | Anti-HER2 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
JP2017523776A (ja) | 2014-07-14 | 2017-08-24 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 膠芽腫の診断方法及びその治療用組成物 |
WO2016025647A1 (en) | 2014-08-12 | 2016-02-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine |
EP3180018B1 (en) | 2014-08-12 | 2019-07-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Synergistic tumor treatment with il-2 and integrin-binding-fc-fusion protein |
US20170281624A1 (en) | 2014-09-13 | 2017-10-05 | Novartis Ag | Combination therapies of alk inhibitors |
US20160137727A1 (en) | 2014-09-15 | 2016-05-19 | Genentech, Inc. | Antibody formulations |
EA201790737A1 (ru) | 2014-10-03 | 2017-08-31 | Новартис Аг | Комбинированная терапия |
MA41044A (fr) | 2014-10-08 | 2017-08-15 | Novartis Ag | Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer |
EP4245376A3 (en) | 2014-10-14 | 2023-12-13 | Novartis AG | Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof |
WO2016065329A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for inducing phagocytosis of mhc class i positive cells and countering anti-cd47/sirpa resistance |
CA2960297A1 (en) | 2014-11-10 | 2016-05-19 | Genentech, Inc. | Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof |
WO2016087416A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
EP3233918A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-10-25 | Novartis AG | Combination therapies |
WO2016106340A2 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for treating and diagnosing chemotherapy-resistant cancers |
CN107750164A (zh) | 2015-06-08 | 2018-03-02 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 使用抗ox40抗体和pd‑1轴结合拮抗剂治疗癌症的方法 |
EP3744732A1 (en) * | 2015-06-24 | 2020-12-02 | F. Hoffmann-La Roche AG | Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use |
EP3328418A1 (en) | 2015-07-29 | 2018-06-06 | Novartis AG | Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1 |
PT3317301T (pt) | 2015-07-29 | 2021-07-09 | Novartis Ag | Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3 |
WO2017019897A1 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Novartis Ag | Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3 |
EP4137158A1 (en) | 2015-08-07 | 2023-02-22 | Imaginab, Inc. | Antigen binding constructs to target molecules |
WO2017075212A1 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Genentech, Inc. | Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof |
HRP20220436T1 (hr) | 2015-11-03 | 2022-05-27 | Janssen Biotech, Inc. | Protutijela koja se specifično vežu na pd-1 i njihove uporabe |
US20190209697A1 (en) | 2015-11-05 | 2019-07-11 | The Regents Of The University Of California | Cells labelled with lipid conjugates and methods of use thereof |
EP3377040B8 (en) | 2015-11-18 | 2024-06-05 | SiO2 Medical Products, Inc. | Pharmaceutical package for ophthalmic formulations |
JP2019501687A (ja) | 2015-11-18 | 2019-01-24 | フォーマイコン アーゲーFormycon Ag | Vegf拮抗薬を収容したプレフィルドプラスチックシリンジ |
EP3377100A1 (en) | 2015-11-18 | 2018-09-26 | Formycon AG | Pre-filled pharmaceutical package comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist |
WO2017106656A1 (en) | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Novartis Ag | Antibody molecules to pd-1 and uses thereof |
AU2016381964B2 (en) | 2015-12-30 | 2024-02-15 | Kodiak Sciences Inc. | Antibodies and conjugates thereof |
EP3407868A1 (en) | 2016-01-26 | 2018-12-05 | Formycon AG | Liquid formulation of a vegf antagonist |
CN105481981B (zh) * | 2016-01-27 | 2019-03-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | 靶向vegf双特异性抗体及其用途 |
CA3019921A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Genentech, Inc. | Methods for monitoring and treating cancer |
MX2018012493A (es) | 2016-04-15 | 2019-06-06 | Genentech Inc | Métodos para controlar y tratar el cáncer. |
JP2019524706A (ja) | 2016-07-08 | 2019-09-05 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | Muc16陽性癌治療の応答性を評価するためのヒト精巣上体タンパク質4(he4)の使用 |
EP3481963A1 (en) | 2016-07-08 | 2019-05-15 | Genentech, Inc. | Methods for diagnosing and treating cancer by means of the expression status and mutational status of nrf2 and downstream target genes of said gene. |
TW201811369A (zh) | 2016-08-12 | 2018-04-01 | 美商建南德克公司 | Mek抑制劑、pd-1軸抑制劑及vegf抑制劑之組合療法 |
US10919958B2 (en) * | 2016-08-23 | 2021-02-16 | Medimmune Limited | Anti-VEGF-A antibodies and uses thereof |
US10350266B2 (en) | 2017-01-10 | 2019-07-16 | Nodus Therapeutics, Inc. | Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein |
CA3049656A1 (en) | 2017-01-10 | 2018-07-19 | Nodus Therapeutics | Combination tumor treatment with an integrin-binding-fc fusion protein and immune modulator |
WO2018160841A1 (en) | 2017-03-01 | 2018-09-07 | Genentech, Inc. | Diagnostic and therapeutic methods for cancer |
WO2018215580A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Formycon Ag | Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist |
WO2018217995A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Formycon Ag | Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist |
EP3630062A2 (en) | 2017-05-24 | 2020-04-08 | SiO2 Medical Products, Inc. | Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations |
JP7433910B2 (ja) | 2017-06-22 | 2024-02-20 | ノバルティス アーゲー | Cd73に対する抗体分子及びその使用 |
WO2018237173A1 (en) | 2017-06-22 | 2018-12-27 | Novartis Ag | ANTIBODY MOLECULES DIRECTED AGAINST CD73 AND CORRESPONDING USES |
WO2019020777A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Formycon Ag | LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST |
EP3731865A1 (en) | 2017-12-29 | 2020-11-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody |
CN112203679A (zh) | 2018-03-02 | 2021-01-08 | 科达制药股份有限公司 | Il-6抗体及其融合构建体和缀合物 |
EA202091710A1 (ru) | 2018-03-09 | 2021-02-16 | Агенус Инк. | Антитела против cd73 и способы их применения |
CA3097067A1 (en) | 2018-04-16 | 2019-10-24 | Onquality Pharmaceuticals China Ltd. | Method for preventing or treating side effects of cancer therapy |
US11746157B2 (en) | 2018-05-24 | 2023-09-05 | Janssen Biotech, Inc. | PSMA binding agents and uses thereof |
TW202015726A (zh) | 2018-05-30 | 2020-05-01 | 瑞士商諾華公司 | Entpd2抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法 |
WO2019232244A2 (en) | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Novartis Ag | Antibody molecules to cd73 and uses thereof |
CA3116324A1 (en) | 2018-10-18 | 2020-04-23 | Genentech, Inc. | Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer |
WO2020109343A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-06-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy for treatment of macular degeneration |
US20220185875A1 (en) | 2019-03-18 | 2022-06-16 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Bispecific antibody specifically bound to vegf and ang2 |
AU2020259404A1 (en) | 2019-04-19 | 2021-09-23 | Janssen Biotech, Inc. | Methods of treating prostate cancer with an anti- PSMA/CD3 antibody |
TW202108616A (zh) | 2019-05-03 | 2021-03-01 | 美商建南德克公司 | 用抗pd-l1抗體治療癌症之方法 |
KR20220005568A (ko) * | 2019-05-09 | 2022-01-13 | 제넨테크, 인크. | 항체의 제조 방법 |
JP7052149B2 (ja) | 2019-08-09 | 2022-04-11 | 安徽瀚海博▲シィン▼生物技▲シゥー▼有限公司 | 新型構造の抗vegf-抗pd1二重特異性抗体 |
JP2022548881A (ja) | 2019-09-18 | 2022-11-22 | ノバルティス アーゲー | Entpd2抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法 |
CN114786731A (zh) | 2019-10-10 | 2022-07-22 | 科达制药股份有限公司 | 治疗眼部病症的方法 |
CR20220461A (es) | 2020-03-13 | 2022-10-21 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-interleucina-33 y usos de estos |
CA3172449A1 (en) | 2020-03-27 | 2021-09-30 | Erik Hans MANTING | Ex vivo use of modified cells of leukemic origin for enhancing the efficacy of adoptive cell therapy |
CN113461824A (zh) | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 普米斯生物技术(珠海)有限公司 | 一种构建多特异性抗体的平台 |
WO2021202959A1 (en) | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Genentech, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods for cancer |
FR3110838B1 (fr) | 2020-05-28 | 2022-06-24 | Commissariat Energie Atomique | Complexe immunomodulateur et ses applications pour la thérapie |
JP2023531537A (ja) | 2020-06-30 | 2023-07-24 | メンドゥス・ベスローテン・フェンノートシャップ | 卵巣癌ワクチンでの白血病由来細胞の使用 |
CN114106190A (zh) | 2020-08-31 | 2022-03-01 | 普米斯生物技术(珠海)有限公司 | 一种抗vegf/pd-l1双特异性抗体及其用途 |
JP2023550028A (ja) | 2020-11-13 | 2023-11-30 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 固形腫瘍を治療するためのkrasg12c阻害剤及びvegf阻害剤を含む方法及び組成物 |
AU2022211682A1 (en) | 2021-01-22 | 2023-08-03 | Mendus B.V. | Methods of tumor vaccination |
US20240059789A1 (en) | 2021-01-28 | 2024-02-22 | Janssen Biotech, Inc. | Psma binding proteins and uses thereof |
KR20230157388A (ko) | 2021-03-12 | 2023-11-16 | 멘두스 비.브이. | 백신접종의 방법 및 cd47 차단의 용도 |
WO2022232503A1 (en) | 2021-04-30 | 2022-11-03 | Genentech, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods and compositions for cancer |
KR20240028452A (ko) | 2021-07-02 | 2024-03-05 | 제넨테크, 인크. | 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
EP4377351A1 (en) | 2021-07-28 | 2024-06-05 | F. Hoffmann-La Roche AG | Methods and compositions for treating cancer |
WO2023080900A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for classifying and treating kidney cancer |
WO2023144973A1 (ja) | 2022-01-27 | 2023-08-03 | 中外製薬株式会社 | 抗vegf抗体及びパクリタキセルと組み合わせて使用する抗pd-l1抗体を含む医薬組成物 |
WO2023142996A1 (zh) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | 上海岸阔医药科技有限公司 | 预防或治疗与抗肿瘤剂相关的疾病或病症的方法 |
WO2024062082A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Domain Therapeutics | Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use |
WO2024062072A2 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Domain Therapeutics | Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use |
WO2024062076A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Domain Therapeutics | Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use |
Family Cites Families (59)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
US4318980A (en) | 1978-04-10 | 1982-03-09 | Miles Laboratories, Inc. | Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label |
JPS6023084B2 (ja) | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
WO1981001145A1 (en) | 1979-10-18 | 1981-04-30 | Univ Illinois | Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs |
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4485045A (en) | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
US4640835A (en) | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4675187A (en) | 1983-05-16 | 1987-06-23 | Bristol-Myers Company | BBM-1675, a new antibiotic complex |
DD266710A3 (de) | 1983-06-06 | 1989-04-12 | Ve Forschungszentrum Biotechnologie | Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase |
US4544545A (en) | 1983-06-20 | 1985-10-01 | Trustees University Of Massachusetts | Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting |
US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
US4737456A (en) | 1985-05-09 | 1988-04-12 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Reducing interference in ligand-receptor binding assays |
DE3675588D1 (de) | 1985-06-19 | 1990-12-20 | Ajinomoto Kk | Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist. |
GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
US4791192A (en) | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
US5567610A (en) | 1986-09-04 | 1996-10-22 | Bioinvent International Ab | Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor |
GB8705477D0 (en) | 1987-03-09 | 1987-04-15 | Carlton Med Prod | Drug delivery systems |
US4975278A (en) | 1988-02-26 | 1990-12-04 | Bristol-Myers Company | Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells |
US5204244A (en) | 1987-10-27 | 1993-04-20 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
WO1989006692A1 (en) | 1988-01-12 | 1989-07-27 | Genentech, Inc. | Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function |
WO1990003430A1 (en) | 1988-09-23 | 1990-04-05 | Cetus Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
CA2345497A1 (en) * | 1988-10-28 | 1990-04-28 | Genentech, Inc. | Growth hormone variants and method for forming growth hormone variants |
US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
US5147638A (en) | 1988-12-30 | 1992-09-15 | Oklahoma Medical Research Foundation | Inhibition of tumor growth by blockade of the protein C system |
US5332671A (en) | 1989-05-12 | 1994-07-26 | Genetech, Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
US5229275A (en) | 1990-04-26 | 1993-07-20 | Akzo N.V. | In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies |
US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
JP3672306B2 (ja) * | 1991-04-10 | 2005-07-20 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | ファージミドを使用するヘテロ二量体受容体ライブラリー |
AU675916B2 (en) * | 1991-06-14 | 1997-02-27 | Genentech Inc. | Method for making humanized antibodies |
WO1994004679A1 (en) * | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
EP1136556B1 (en) | 1991-11-25 | 2005-06-08 | Enzon, Inc. | Method of producing multivalent antigen-binding proteins |
JP3571337B2 (ja) | 1992-02-11 | 2004-09-29 | セル ジェネシス,インコーポレーテッド | 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合 |
US5573905A (en) | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
ATE348110T1 (de) * | 1992-10-28 | 2007-01-15 | Genentech Inc | Hvegf rezeptor als vegf antagonist |
NZ258392A (en) | 1992-11-13 | 1997-09-22 | Idec Pharma Corp | Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona |
US5840301A (en) * | 1994-02-10 | 1998-11-24 | Imclone Systems Incorporated | Methods of use of chimerized, humanized, and single chain antibodies specific to VEGF receptors |
AU696764B2 (en) * | 1994-03-08 | 1998-09-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
US5534615A (en) | 1994-04-25 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Cardiac hypertrophy factor and uses therefor |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US6096871A (en) | 1995-04-14 | 2000-08-01 | Genentech, Inc. | Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life |
KR100856995B1 (ko) * | 1997-04-07 | 2008-09-04 | 제넨테크, 인크. | 인간화 항체 및 인간화 항체의 제조 방법 |
-
1998
- 1998-04-03 KR KR1019997009193A patent/KR100856995B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 SI SI9830876T patent/SI0973804T1/sl unknown
- 1998-04-03 WO PCT/US1998/006724 patent/WO1998045332A2/en active IP Right Grant
- 1998-04-03 EP EP16181733.3A patent/EP3260468A1/en not_active Withdrawn
- 1998-04-03 BR BRPI9809388A patent/BRPI9809388B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 EP EP05077948A patent/EP1695985B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 CN CN2009101470179A patent/CN101665536B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 PT PT05077948T patent/PT1695985E/pt unknown
- 1998-04-03 AT AT98918013T patent/ATE314395T1/de active
- 1998-04-03 ES ES10007444T patent/ES2380575T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 EP EP10181127A patent/EP2336190A3/en not_active Withdrawn
- 1998-04-03 JP JP54296498A patent/JP4191258B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 TR TR1999/02818T patent/TR199902818T2/xx unknown
- 1998-04-03 AT AT05077948T patent/ATE501170T1/de active
- 1998-04-03 CA CA2286397A patent/CA2286397C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 PT PT98918013T patent/PT971959E/pt unknown
- 1998-04-03 KR KR1019997009194A patent/KR100794454B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 IL IL13223998A patent/IL132239A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 DK DK10007444.2T patent/DK2301580T3/da active
- 1998-04-03 EP EP10010132A patent/EP2338915A3/en not_active Withdrawn
- 1998-04-03 ES ES06024703T patent/ES2349559T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 DE DE69832970T patent/DE69832970T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 DK DK98918013T patent/DK0971959T3/da active
- 1998-04-03 AT AT10007444T patent/ATE541586T1/de active
- 1998-04-03 AU AU71023/98A patent/AU740738B2/en not_active Expired
- 1998-04-03 DE DE69841815T patent/DE69841815D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 CN CN200910147016A patent/CN101838328A/zh active Pending
- 1998-04-03 ES ES05077948T patent/ES2361267T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 AT AT06024703T patent/ATE476664T1/de active
- 1998-04-03 CN CN2007101971402A patent/CN101210050B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 SI SI9830935T patent/SI2301580T1/sl unknown
- 1998-04-03 SI SI9830927T patent/SI1787999T1/sl unknown
- 1998-04-03 ES ES98918013T patent/ES2256935T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 CN CN2007101971417A patent/CN101210051B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 PT PT06024703T patent/PT1787999E/pt unknown
- 1998-04-03 PT PT10007444T patent/PT2301580E/pt unknown
- 1998-04-03 DE DE69842174T patent/DE69842174D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 EP EP98918013A patent/EP0971959B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 PT PT98917991T patent/PT973804E/pt unknown
- 1998-04-03 NZ NZ500077A patent/NZ500077A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 SI SI9830824T patent/SI0971959T1/sl unknown
- 1998-04-03 DK DK05077948.7T patent/DK1695985T3/da active
- 1998-04-03 CN CNB98805910XA patent/CN1191276C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 CN CN201410411945.2A patent/CN104231078A/zh active Pending
- 1998-04-03 SI SI9830930T patent/SI1695985T1/sl unknown
- 1998-04-03 EP EP10007444A patent/EP2301580B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 DK DK06024703.8T patent/DK1787999T3/da active
- 1998-04-06 ZA ZA982908A patent/ZA982908B/xx unknown
- 1998-04-06 ZA ZA982907A patent/ZA982907B/xx unknown
-
1999
- 1999-10-06 NO NO19994870A patent/NO325823B1/no not_active IP Right Cessation
- 1999-10-06 IL IL132240A patent/IL132240A/en not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-07-17 HK HK00104355A patent/HK1025338A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-05-24 IL IL175906A patent/IL175906A/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-12 HK HK07100445.4A patent/HK1095334A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-04-04 LT LTPA2007004C patent/LTC0973804I2/lt unknown
-
2008
- 2008-09-09 HK HK08109992.1A patent/HK1114622A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2008-09-09 HK HK08109991.2A patent/HK1114621A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-06-25 HK HK10106257.3A patent/HK1139425A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-10-12 CY CY20101100908T patent/CY1111345T1/el unknown
-
2011
- 2011-04-15 HK HK11103803.8A patent/HK1149501A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2011-06-02 CY CY20111100536T patent/CY1111520T1/el unknown
-
2012
- 2012-03-29 CY CY20121100322T patent/CY1112757T1/el unknown
-
2015
- 2015-05-21 HK HK15104841.6A patent/HK1204329A1/xx unknown
-
2017
- 2017-08-01 NO NO2017039C patent/NO2017039I2/no unknown
-
2019
- 2019-12-11 NO NO2019045C patent/NO2019045I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO325823B1 (no) | Humaniserte antistoffer, fremgangsmate for a fremstille humaniserte antistoffer og anvendelsen av slike. | |
DE60025015T2 (de) | Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen mittels inhibitoren von apoptose | |
JP4753578B2 (ja) | 合成抗体ファージライブラリー | |
JP6093715B2 (ja) | 免疫グロブリンドメインの工学的作製 | |
US7785903B2 (en) | Variable domain library and uses | |
CA2909921C (en) | Synthetic library of specific binding molecules | |
CA2562604C (en) | Preparation of scfv antibody fragments | |
US20050079574A1 (en) | Synthetic antibody phage libraries | |
AU2006329208B2 (en) | Methods for generating and screening fusion protein libraries and uses thereof | |
KR102637804B1 (ko) | 개과 항체 라이브러리 | |
JP2012505654A (ja) | 抗体をヒト化及び親和性成熟する方法 | |
JPH06510671A (ja) | キメラ抗体の製造−組合せアプローチ | |
JP2001509817A (ja) | 抗vegf抗体 | |
KR20160087766A (ko) | 신규 항체 라이브러리 제조방법 및 이로부터 제조된 라이브러리 | |
EP2305710A2 (en) | Synthetic antibody phage libraries | |
AU2010322202A1 (en) | Display of disulfide linked dimeric proteins on filamentous phage | |
KR20220026869A (ko) | 신규 항체 라이브러리 제조방법 및 이로부터 제조된 라이브러리 | |
Vellalore Maruthachalam | NEXT-GENERATION SEQUENCING AND MOTIF GRAFTING APPLICATIONS IN SYNTHETIC ANTIBODY DISCOVERY | |
CN118043079A (zh) | 免疫缀合物分子及其相关方法和组合物 | |
EP4126049A1 (en) | Fast-track humanisation of specific binding molecules |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |