CN101754771B - 抗神经毡蛋白2抗体对肿瘤转移的抑制 - Google Patents

抗神经毡蛋白2抗体对肿瘤转移的抑制 Download PDF

Info

Publication number
CN101754771B
CN101754771B CN200780053792.7A CN200780053792A CN101754771B CN 101754771 B CN101754771 B CN 101754771B CN 200780053792 A CN200780053792 A CN 200780053792A CN 101754771 B CN101754771 B CN 101754771B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
fragment
purposes
cancer
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200780053792.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101754771A (zh
Inventor
吴雁
梁伟清
瑞安·J·沃茨
阿尼尔·D·巴格里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of CN101754771A publication Critical patent/CN101754771A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101754771B publication Critical patent/CN101754771B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了Nrp2拮抗剂(诸如抗Nrp2抗体)及其在肿瘤转移的预防和治疗中的用途。

Description

抗神经毡蛋白2抗体对肿瘤转移的抑制
发明领域
本发明关注神经毡蛋白-2(Nrp2)拮抗剂(尤其是抗Nrp2抗体)及其在肿瘤转移的预防和治疗中的用途。
发明背景
现在完全确立了血管发生涉及多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病变例如糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman等，J.Biol.Chem.267，10931-10934(1992)；Klagsbrun等，Annu.Rev.Physiol.53，217-239(1991)；Garner A.，“Vasculardiseases”，在Garner A和Klintworth GK编的《Pathobiology of Ocular Disease.ADynamic Approach》第2版(Marcel Dekker，NY，1994)中，第1625-1710页。
在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman等，Nature 339，58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner等，N.Engl.J.Med.324，1-6(1991)；Horak等，Lancet 340，1120-1124(1992)；Macchiarini等，Lancet340，145-146(1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman，Nat Med 1(1)，27-31(1995))。
当前公认转移对大多数(估计有90％)源自实体瘤的死亡负有责任(Gupta和Massague，Cell 127，679-695(2006))。转移的复杂过程涉及一系列不同步骤，包括肿瘤细胞脱离原发性肿瘤，肿瘤细胞内侵入淋巴管或血管，及肿瘤细胞在第二部位外侵和生长。对许多肿瘤类型中区域性淋巴结的分析提示淋巴脉管系统是人类癌症扩散的一个重要途径。此外，在几乎所有癌瘤中，肿瘤细胞在淋巴结中的存在是最重要的不利预后因素。虽然先前认为此类转移唯一地涉及恶性细胞沿肿瘤附近现有淋巴管通行，但是最近的实验性研究和临床病理学报告(综述见Achen等，Br J Cancer 94，1355-1360(2006)及Nathanson，Cancer 98，413-423(2003))提示淋巴管发生能被实体瘤诱导且能促进肿瘤扩散。这些和其它最新研究提示靶向淋巴系统和淋巴管发生可能是限制癌症转移发生的一种有用治疗策略，这会给许多患者带来显著好处。
VEGFC，血管内皮细胞因子(VEGF)家族的一个成员，是研究得最好的淋巴发育介导物之一。VEGFC在肿瘤细胞中的过表达显示出促进肿瘤相关淋巴管发生，导致增强的到达区域性淋巴结的转移(Karpanen等，Faseb J 20，1462-1472(2001)；Mandriota等，EMBO J 20，672-682(2001)；Skobe等，NatMed 7，192-198(2001)；Stacker等，Nat Rev Cancer 2，573-583(2002)；Stacker等，Faseb J16，922-934(2002))。还已经将VEGFC表达与许多人类癌症的肿瘤相关淋巴管发生和淋巴结转移关联起来(综述见Achen等，2006，见上文)。另外，对VEGFC介导的信号传导的阻断已经显示出在小鼠中遏制肿瘤淋巴管发生和淋巴结转移(Chen等，Cancer Res 65，9004-9011(2005)；He等，J.NatlCancer Inst 94，819-825(2002)；Krishnan等，Cancer Res 63，713-722(2003)；Lin等，Cancer Res 65，6901-6909(2005))。
已知VEGFC结合至少两种细胞表面受体家族，即酪氨酸激酶VEGF受体和神经毡蛋白(Nrp)受体。
在三种VEGF受体中，VEGFC能结合VEGFR2和VEGFR3，导致受体二聚化(Shinkai等，J Biol Chem 273，31283-31288(1998))、激酶活化和自磷酸化(Heldin，Cell 80，213-223(1995)；Waltenberger等，J.Biol Chem 269，26988-26995(1994))。磷酸化的受体诱导多种底物的活化，导致血管发生和淋巴管发生(Ferrara等，Nat Med 9，669-676(2003))。
神经毡蛋白(neuropilin，Nrp)家族由两种同源蛋白质构成，神经毡蛋白-1(Nrp1)和神经毡蛋白-2(Nrp2)。在VEGF受体之外，VEGFC还结合Nrp2，其最初被鉴定为第3类脑信号蛋白受体和轴突导向的介导物(Favier等，Blood108，1243-1250(2006)；Soker等，J Cell Biochem 85，357-368(2002))。多项证据暗示Nrp2涉及血管和淋巴系统的发育。纯合Nrp2突变体显示出出生前小淋巴管和毛细胞的严重减少(Yuan等，Development 129，4797-4806(2002))。此外，在纯合Nrp1突变体小鼠中看到的明显的胚胎致死性血管缺陷受到Nrp2功能丧失的增强，导致更早的致死性(Takashima等，Proc Natl Acad Sci USA99，3657-3662(2002))。然而，Nrp2在调控成人血管和淋巴生物学中的作用，及更具体的说在转移中的作用是未知的。
Nrp具有短的胞内结构域，尚未知道它们具有任何酶促活性或信号传导活性。已经提出，Nrp通过增强配体-VEGF受体结合而发挥增强VEGFR信号传导的功能(Favier等，2006，见上文；Soker等，2002，见上文)。另外sema3F(即Nrp2的脑信号蛋白配体)已经显示出在体外和在体内调控内皮细胞行为(Bielenberg等，J Clin Invest 114，1260-1271(2004)；Favier等，Blood 1243-1250(2006))。然而，最近的报告已经提出另一种可能性，即Nrp可能独立于VEGF受体或脑信号蛋白功能而发挥功能来调控内皮细胞(EC)迁移(Murga等，Blood 105，1992-1999(2005)；Pan等，Cancer Cell 11，53-67(2007)；Wang等，J Biol Chem 278，48848-48860(2003))。
抗VEGF中和性抗体在裸鼠中遏制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等，Nature 362，841-844(1993)；Warren等，J.Clin.Invest.95，1789-1797(1995)；等，Cancer Res.56，4032-4039(1996)；Melnyk等，Cancer Res.56，921-924(1996))，而且在缺血性视网膜病症模型中还抑制眼内血管发生。Adamis等，Arch.Ophthalmol.114，66-71(1996)。因此，抗VEGF单克隆抗体或其它VEGF作用抑制剂是有希望用于治疗肿瘤和多种眼内新血管病症的候选物。此类抗体记载于例如1998年1月14日公开的EP 817,648和1998年10月15日公开的WO98/45331和WO98/45332。抗VEGF抗体之一，贝伐单抗(bevacizumab)已获FDA批准与化疗方案联合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。而且，贝伐单抗正在许多进行中的治疗各种癌症适应证的临床试验中进行研究。
其它一些抗VEGF抗体和抗Nrp1抗体也是已知的，而且记载于例如Liang等，J Mol Biol 366，815-829(2007)；Pan等，Cancer Cell 11，53-67(2007)；及Liang等，J Biol Chem 281，951-961(2006)。
发明概述
本发明至少部分基于用针对Nrp2的高亲和力功能阻断性抗体得到的实验结果。用此抗体得到的结果指示，Nrp2在调控淋巴内皮细胞(LEC)迁移中发挥作用，而且它的功能延伸超出其先前指派为VEGF受体活化增强剂的作用。另外，这些结果证明了阻断Nrp2导致对淋巴管发生的抑制及淋巴结或远距器官转移的明显降低。
一方面，本发明关注一种用于抑制淋巴内皮细胞迁移的方法，包括对有需要的哺乳动物受试者施用有效量的神经毡蛋白-2(Nrp2)拮抗剂。
另一方面，本发明关注一种用于抑制肿瘤淋巴管发生的方法，包括对荷瘤哺乳动物受试者施用有效量的神经毡蛋白-2(Nrp2)拮抗剂。
又一方面，本发明关注一种用于抑制肿瘤转移的方法，包括对荷瘤哺乳动物受试者施用有效量的神经毡蛋白-2(Nrp2)拮抗剂。
在所有实施方案中，所述哺乳动物受试者优选是人患者，诸如人癌症患者，其可以是已经诊断或可以是有风险发生转移的人癌症患者。
在一个实施方案中，所述癌症选自下组：癌瘤或癌(carcinoma)，淋巴瘤(lymphoma)，母细胞瘤(blastoma)，肉瘤(sarcoma)，和白血病(leukemia)。
在另一个实施方案中，所述癌症选自下组：鳞状细胞癌(squamous cellcancer)，小细胞肺癌(small-cell lung cancer)，非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer)，肺的腺癌(adenocarcinoma of the lung)，肺的鳞癌(squamous carcinomaof the lung)，腹膜癌(cancer of the peritoneum)，肝细胞癌(hepatocellularcancer)，胃癌(gastric cancer)，胃肠癌(gastrointestinal cancer)，胰腺癌(pancreaticcancer)，成胶质细胞瘤(glioblastoma)，宫颈癌(cervical cancer)，卵巢癌(ovariancancer)，肝癌(liver cancer)，膀胱癌(bladder cancer)，肝肉瘤(hepatoma)，乳腺癌(breast cancer)，结肠癌(colon cancer)，结肠直肠癌(colorectal cancer)，子宫内膜癌或子宫癌(endometrial or uterine carcinoma)，唾液腺癌(salivary glandcarcinoma)，肾癌(kidney or renal cancer)，肝癌(liver cancer)，前列腺癌(prostatecancer)，外阴癌(vulval cancer)，甲状腺癌(thyroid cancer)，肝的癌瘤(hepaticcarcinoma)和各种类型的头颈癌(various types of head and neck cancer)，B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)，慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia，CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)；毛细胞性白血病(Hairy cell leukemia)；慢性成髓细胞性白血病(chronicmyeloblastic leukemia)；移植后淋巴增生性病症(post-transplantlymphoproliferative disorder，PTLD)，与瘢痣病相关的异常血管增殖(abnormalvascular proliferation associated with phakomatoses)，与脑瘤相关的水肿(edemaassociated with brain tumors)，和梅格斯氏综合征(Meigs′syndrome)。
在又一个实施方案中，B细胞淋巴瘤选自下组：低级/滤泡性(lowgrade/follicular)非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma，NHL)；小淋巴细胞性(small lymphocytic，SL)NHL；中级/滤泡性(intermediate grade/follicular)NHL；中级弥漫性(intermediate grade diffuse)NHL；高级成免疫细胞性(highgrade immunoblastic)NHL；高级成淋巴细胞性(high grade lymphoblastic)NHL；高级小无核裂细胞性(high grade small non-cleaved cell)NHL；大块病(bulky disease)NHL；套细胞性淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS相关淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia)。
不受限制，所述Nrp2拮抗剂可以是抗Nrp2抗体，包括抗Nrp2B和抗Nrp2A抗体，诸如例如抗体YW68.4.2、YW68.4.2.36、YW126.20、及其片段和变体，诸如亲和力成熟的变体。
另一方面，本发明关注一种抗Nrp2B抗体，其包含选自下组的抗体的重链和/或轻链可变区(域)序列：YW68.4.2、YW68.4.2.36和它们的片段或变体。
又一方面，本发明关注一种抗Nrp2A抗体，其包含YW126.20的重链和/或轻链可变区(域)序列，或其片段或变体。
本发明进一步关注一种组合物，其包含与药学可接受载体混和的权利要求33-38任一项的抗体。
又一方面，本发明关注一种药物组合物，其用于肿瘤转移的预防或治疗，包含与药学可接受载体组合的有效量的Nrp2拮抗剂。
其它方面，本发明关注Nrp2拮抗剂，其用于肿瘤转移的预防或治疗，及Nrp2拮抗剂(诸如抗Nrp2抗体)在肿瘤转移的预防或治疗中的用途。
附图简述
图1。抗Nrp2B单抗的表征。(A)Nrp2上的Sema和VEGF结合区相对于抗Nrp2B表位区的示意图。(B)ELISA测定法，其证明了抗Nrp2B结合hNrp2ECD(实心正方形)和hNrp2的B1-B2结构域(实心圆形)，但不结合hNrp1ECD(空心正方形)或hNrp2的A1-A2结构域(空心圆形)。(C)抗Nrp2B对VEGFC结合Nrp2的阻断。将渐增量的单抗与用人Nrp2ECD(5μg/ml)包被的板一起预温育1-2小时，接着添加预滴定的生物素化人VEGFC(1nM)达15分钟。用链霉亲合素-HRP偶联物来检测所结合的VEGFC的百分比。(D)抗Nrp2B对VEGF165结合Nrp2的阻断。(E)对Sema3F结合LEC的阻断。在存在或缺乏抗Nrp2B的情况中将LEC与含有融合有碱性磷酸酶(AP)的Sema3F(REF)的条件培养基一起温育。用相同的显色时间以比色法检测自所结合的Sema3F-AP衍生的AP活性。用AP没有观察到结合(左图)。抗Nrp2B不阻断Sema3F结合LEC(中图)。使用Nrp2ECD作为阻断结合的阳性对照(右图)。比例尺
图2。抗Nrp2B在体外和在体内降低VEGFC诱导的功能。(A)在存在或缺乏抗Nrp2B(50μg/ml)或VEGFR3 ECD(50μg/ml)的情况中应答200ng/ml VEGFC 18小时而发生的染色LEC迁移的代表性图像。(B)对应答200ng/ml VEGFC而发生的LEC迁移的定量(n＝6只每种条件)。(C)对在存在或缺乏抗Nrp2B(50μg/ml)或VEGFR3ECD(50μg/ml)的情况中应答10ng/ml VEGF165而发生的LEC迁移的定量。N＝6只每种条件。(D)对来自(E)中所述角膜微袋测定法的像素计数的定量。*p＜0.05(E)LYVE-1染色的角膜的代表性图像，例示了角膜内放置150ng VEGFC团粒(P)及抗Nrp2B(10mg/kg每周两次)或VEGFR3 ECD(25mg/kg每周两次)系统性处理的效果。LYVE-1染色被假着色成红色以便于显现。*p＜0.05；误差条代表均值的标准误差。
图3。Nrp2B处理导致VEGF受体活化的降低且抑制Nrp2/VEGF受体复合物形成。(A)用对照抗体(10μg/ml；绿色线)或抗Nrp2B(10μg/ml)处理5分钟(蓝色线)或20小时(红色线)后LEC表面上的Nrp2、VEGFR2和VEGFR3水平的FACS分析。(B)对在存在或缺乏抗Nrp2B(50μg/ml)或VEGFR3ECD(50μg/ml)的情况中应答20ng/ml HGF而发生的LEC迁移的定量。N＝6只每种条件。(C)LEC中的VEGFR2磷酸化水平，是使用识别总VEGFR2或酪氨酸磷酸化的VEGFR2的抗体通过ELISA测定法检测的。在存在或缺乏抗Nrp2B(10μg/ml)或VEGFR3ECD(10μg/ml)的情况中添加VEGFC(浓度如所记录的)达10分钟以诱导VEGFR2磷酸化，n＝3只每种条件。抗Nrp2B(10μg/ml)处理的细胞中的VEGFR2磷酸化水平显著不同于200ng/ml的VEGFC刺激，而且一致地位于由175ng/nl和150ng/ml VEGFC诱导的磷酸化水平之间。(D)对在存在或缺乏抗Nrp2B(10μg/ml)或VEGFR3ECD(10μg/ml)的情况中应答VEGFC(浓度如所记录的)而发生的LEC迁移的定量。在50ng/ml VEGFC的情况中或在用VEGFR3ECD阻断时记录到迁移的显著降低。*p＜0.05；误差条代表均值的标准误差。每个实验最少重复三次。(E)CO-IP
图4。Nrp2在荷瘤小鼠的淋巴系统中表达。(A-D)正常成年小鼠的(A)肠和(B)淋巴结中标记淋巴系统的LYVE-1染色(左栏-红色)、Nrp2染色(中栏-绿色)和叠加。在任一器官中，Nrp2信号不与LYVE-1标记的淋巴系统共定位。在肠绒毛的纤维基质核心内和在淋巴结生发中心内存在罕见的Nrp2染色的炎症细胞。(C)在来自荷瘤动物的淋巴结中，Nrp2信号不与LN窦内衬LYVE-1阳性淋巴管共定位。还存在别的Nrp2染色的炎症细胞。(D)在66c14肿瘤内的淋巴管中也看到强烈的Nrp2染色。在肿瘤细胞上也能看到微弱的膜染色。只用二抗染色的对照不显示任何信号。框示区域在插图内以高放大倍数显示。比例尺，A-C为***，而D为**。
图5。抗Nrp2B处理导致66c14肿瘤模型中肺部转移的减少。(A)下文所分析的66c14肿瘤模型研究的肿瘤体积均值图。一旦肿瘤达到100mm3的平均尺寸，就给动物每周两次i.p.服用10mg/kg抗Nrp2B或对照抗体，并在整个研究期间如此服药。(B)通过目测检查对对照和抗Nrp2B处理的动物中每只肺的转移性小结数目的定量。(C)来自对照(左)和抗Nrp2B(右)处理的动物的肺的代表性图像。在固定前通过右心室灌注使肺膨胀。小结以白色着重显示以便于显现。(D，E)代表性的micro-CT扫描的肺的三维透视图，展示了对照(D)和抗Nrp2B(E)处理的动物中的转移性小结(红色)。纵断面(顶插图)和横断面(底插图)的位置分别以黑色和红色虚线标示。此分析证实了大多数小结在肺的表面上。(F)通过肺部micro-CT分析对每只肺的转移小结数目的定量。(G)体外培养的66c14肿瘤细胞的表面上的Nrp2水平的FACS分析。(H)肺部小结的H&E染色，展示了转移性肿瘤细胞。误差条代表均值的标准误差。比例尺，C为***，而H为**。
图6。抗Nrp2B处理导致C6肿瘤模型中肺部转移的减少。(A)下文所分析的C6肿瘤模型研究的肿瘤体积均值图。一旦肿瘤达到100mm3的平均尺寸，就给动物每周两次i.p.服用抗Nrp2B(10mg/kg)、VEGFR3 ECD(25mg/kg)或对照抗体(10mg/kg)，并在整个研究期间如此服药。(B)通过目测检查对对照、VEGFR3 ECD和抗Nrp2B处理的动物中每只肺的转移性小结数目的定量。(C)来自对照(左)、VEGFR3 ECD(中)和抗Nrp2B(右)处理的动物的肺的代表性图像。在固定前通过右心室灌注使肺膨胀。小结以白色着重显示以便于显现。(D)代表性的micro-CT扫描的肺的三维透视图，展示了对照(左)和抗Nrp2B(右)处理的动物中的转移性小结(红色)。纵断面(顶插图)和横断面(底插图)的位置分别以黑色和红色虚线标示。此分析证实了大多数小结在肺的表面上。(E)体外培养的66c14肿瘤细胞的表面上的Nrp2水平的FACS分析。(F)肺部小结的H&E染色，展示了转移性肿瘤细胞。误差条代表均值的标准误差。比例尺，C为***，而F为**。
图7。抗Nrp2B处理导致肿瘤淋巴管的减少。(A，B)对用对照抗体或抗Nrp2B处理的66c14肿瘤中血管密度(A)(通过PECAM-1IHC来检测)和淋巴管密度(B)(通过LYVE-1IHC来检测)的定量。管密度是自来自每组6个肿瘤每一个的6幅代表性图像测定的，通过ImageJ评估像素数目均值。(C)用对照抗体(左栏)、VEGFR3 ECD(中栏)或抗Nrp2B(右栏)处理的C6肿瘤中PECAM-1染色的血管(顶行)和LYVE-1染色的淋巴管(中行和底行)的代表性图像。中行中框示的区域在底行中以更高放大倍数显示。对血管(顶图)和淋巴管(底图)密度的定量位于这些图像的右边。(D)来自第4天(收获1)和第11天(收获2)收获的抗Nrp2B处理动物(底图)的LYVE-1染色的肿瘤展示出与对照处理动物(顶图)相比对淋巴管的破坏。相对于生长曲线的收获日期显示在左边。误差条代表均值的标准误差。比例尺***。
图8。抗Nrp2B处理导致功能性肿瘤淋巴管的减少及导致达到主要淋巴结的转移的延迟。(A，B)皮内淋巴管造影术后唯独在LYVE-1IHC标记的淋巴管(红色)中看到聚苯乙烯荧光微珠(绿色)。A中的框示区域在B中以更高放大倍数显示。(C-D)抗Nrp2B处理导致C6(C)(P＝0.035)和66c14(D)(P＝0.005)肿瘤内Evans蓝的减少，指示这些经过处理的肿瘤内功能性淋巴系统的减少。(E)在对照(黑色)和抗Nrp2B(红色)处理的小鼠的耳中植入肿瘤后各个时间点的具有含有表达β-gal的C6肿瘤细胞的SLN的动物的百分比。抗Nrp2B处理导致细胞达到SLN延迟(p＝0.006)。N＝7只动物每种处理条件每个时间点。
图9。Nrp2在不同人恶性肿瘤中的表达。(A-F)正常结肠与结肠直肠腺癌(A)、正常头颈组织与头颈鳞状细胞癌(B)、正常胰腺与胰腺腺癌(C)、正常皮肤与恶性黑素瘤(D)、正常甲状腺与乳头状甲状腺癌(E)、及正常乳腺与Her2浸润性导管腺癌(F)中Nrp2表达的Affymetrix HG-U133A和B微阵列数据。每个数据点代表一名患者。
图10。抗Nrp2B抗体YW68.4.2和YW68.4.2.36Fab片段的氨基酸序列。
图11。抗Nrp2A抗体YW126.20Fab片段的氨基酸序列。
图12。抗Nrp2A抗体YW126.20轻链可变域序列与人κ1序列的比对。
图13。抗Nrp2A抗体YW126.20重链可变域序列与人III(hum III)序列的比对。
增图1。体外培养的LEC的表面上VEGF轴受体水平的FACS分析。培养的LEC上的Nrp1、Nrp2、VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的FACS分析。
增图2。抗Nrp2B不阻断VEGF165诱导的迁移。(A-B)在存在或缺乏抗Nrp1B、抗Nrp2B(50μg/ml)或这两种抗体(50μg/ml)的情况中应答200ng/mlVEGF 18小时处理的HUVEC(A)和LEC(B)迁移的定量。*p＜0.05；误差条代表均值的标准误差。
增图3。抗Nrp2B对VEGFC介导的增殖和血管通透性及相关胞内信号传导的影响。(A)在存在或缺乏抗Nrp2B(50μg/ml)或VEGFR3 ECD(50μg/ml)的情况中由200ng/ml VEGFC诱导的LEC增殖的定量，通过BrdU掺入来测定(n＝6/每种条件)。(B)小鼠皮肤血管通透性测定法。图像是自同一动物采集的。蓝色染剂代表抗Nrp2B(10mg/kg)或VEGFR3 ECD(25mg/kg)系统性处理后应答VEGFC皮内投递而发生的自血管系统泄漏的Evan氏蓝。(C)通透性测定法中自皮肤样品提取的Evan氏蓝染料的定量。所示数值是6次独立实验的平均值。*p＜0.05；误差条代表均值的标准误差。
增图4。抗Nrp2B不阻断Sema3F诱导的生长锥塌陷。(A)用罗丹明偶联的鬼笔环肽染色的E 17.5海马生长锥的图像。对照生长锥在每个轴突的尖端显示富含大的肌动蛋白的结构，这些被Sema3F处理减少。抗Nrp2B(50μg/ml)不阻断此塌陷。与之形成对比的是，Nrp2ECD(10ug/ml)确实阻断此塌陷。(B)抗Nrp2免疫组织化学的质量控制。图像显示了一个识别Nrp2的噬菌体衍生克隆，其在对新鲜的冷冻切片进行的IHC中起作用。Nrp2蛋白质表达与使用原位杂交看到的Nrp2表达(Chen等，Neuron 19，547-559(1997))相似。此抗体随后用于对新鲜的冷冻肿瘤切片进行的IHC。(比例尺，主图＝**μm，插图＝**μm)
发明详述
定义
术语“神经毡蛋白(neuropilin)”、“NRP”或“Nrp”可互换使用，指神经毡蛋白-1(NRP1，Nrp1)、神经毡蛋白-2(NRP2，Nrp2)及其同等型(isoform)和变体全体，如Rossignol等(2000)Genomics 70：211-222中所述。神经毡蛋白是120-130
kDa非酪氨酸激酶受体。有多种NRP-1和NRP-2剪接变体和可溶性同等型。神经毡蛋白的基本结构包含五个结构域：三个胞外结构域(a1a2、b1b2和c)、一个跨膜结构域、和一个胞质结构域。a1a2结构域与补体成分C1r和C1s(CUB)同源，其一般包含四个半胱氨酸残基，形成两个二硫键。b1b2结构域与凝结因子V和VIII同源。c结构域的中央部分称为MAM，因为它与跨膜肽酶(meprin)、A5和受体酪氨酸磷酸酶μ蛋白同源。a1a2和b1b2结构域负责配体结合，而c结构域对于同型二聚化或异型二聚化是至关重要的。Gu等(2002)J.Biol.Chem.277：18069-76；He and Tessier-Lavigne(1997)Cell 90：739-51。
“神经毡蛋白介导的生物学活性”一般指其中神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白-2发挥重大作用的生理性或病理性事件。此类活性的非限制性例子有胚胎神经系统发育或神经元再生、血管发生(包括血管造型)、肿瘤发生和肿瘤转移过程中的轴突导向。
如本文中所使用的，“神经毡蛋白-2介导的生物学活性”或“Nrp2介导的生物学活性”一般指其中Nrp2发挥重大作用的生理性或病理性事件，诸如例如增强VEGF受体活化及特别是调控淋巴内皮细胞(EC)迁移的能力、在成人淋巴管发生(尤其是肿瘤淋巴管发生)和肿瘤转移中的作用。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各抗体个体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等(1975)Nature 256：495记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等(1991)Nature 352：624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性，其中所述抗体的重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源(美国专利No.4,816,567；Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等(1986)Nature321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-329；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
“物种依赖性抗体”指对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力强于对来自第二哺乳动物物种的该抗原同系物的亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原(即结合亲和力(Kd)数值不超过大约1×10-7M，优选不超过大约1×10-8M，且最优选不超过大约1×10-9M)，但是对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力比对人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍、或至少大约500倍、或至少大约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文所定义的各种类型抗体中的任一种，但是优选人源化抗体或人抗体。
在用于本文时，“抗体突变体”或“抗体变体”指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性抗体必然具有小于100％的序列同一性或相似性。在一个优选的实施方案中，抗体突变体所具有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见下文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
在用于本文时，“抗体可变域(区)”指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架区(FR)氨基酸序列的那部分。VH指重链可变域(区)。VL指轻链可变域(区)。依照本发明所使用的方法，归为CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991))来限定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也依照Kabat。
在用于本文时，术语“互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗体可变域中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个CDR，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自如Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即大约是轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的残基(即大约是轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothiaand Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。在有些情况中，互补决定区可以包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸。例如，抗体4D5重链的CDRH1包含氨基酸26-35。
“框架区”(以下的FR)指可变域中CDR残基以外的残基。每个可变域通常具有四个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定义的，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和102-113(HCFR4)。在有些情况中，在CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸时，FR残基将做相应的调整。例如，当CDRH1包含氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于1-25位，而FR2残基位于36-49位。
在用于本文时，“密码子集”指用于编码期望变异氨基酸的一套不同核苷酸三联体序列。可以通过例如固相合成来合成一套寡核苷酸，其包括呈现密码子集所提供的核苷酸三联体的所有可能组合并编码期望氨基酸组的序列。一种标准形式的密码子命名是IUB代码，其是本领域已知的且在本文中有记载。密码子集通常以3个斜体大写字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，“非随机密码子集”在用于本文时指编码部分、优选完全满足本文所述氨基酸选择标准的选定氨基酸的密码子集。在某些位置具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的，例如TRIM法(Knappek等(1999)J.Mol.Biol.296：57-86)；Garrard和Henner(1993)Gene 128：103)。此类具有某些密码子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成仪来合成(可购自例如Applied Biosystems，Foster City，CA)，或者可以通过商业途径获得(例如购自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，一套具有特定密码子集的合成寡核苷酸通常包括具有不同序列(在整个序列中由密码子集所建立的差异)的多种寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本发明使用时，具有容许与可变域核酸模板杂交的序列，而且还可以但非必须包含可用于例如克隆目的的限制酶位点。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。此区由紧密结合(该结合的本质可以是共价的，例如在scFv中)的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR或其子集共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是通常亲和力低于完整结合位点。
“Fab”片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域(CH1)。F(ab′)2抗体片段包含一对Fab片段，这对Fab片段一般通过它们之间的铰链半胱氨酸在它们羧基末端附近共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，在Rosenburg and Moore编的《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第113卷中，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH及VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448。
表述“线性抗体”指Zapata等(1995)Protein Eng，8(10)：1057-1062中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性的。
在用于本文时，“文库”或“库”指众多抗体或抗体片段序列(例如本发明的多肽)，或者编码这些序列的核酸，这些序列在根据本发明方法导入这些序列的变异氨基酸组合方面是不同的。
“噬菌体展示”是一种将变异多肽作为与外壳蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌体(例如丝状噬菌体)颗粒表面上的技术。噬菌体展示的效用在于能够对随机化蛋白质变体的大型文库快速且高效分选那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列的实情。肽和蛋白质文库在噬菌体上的展示已经用于对数以百万计的多肽筛选那些具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示法已经用于展示小随机肽和小蛋白，其通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来实现。Wells and Lowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3：355-362，及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白时以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示一个拷贝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。亲合效应(avidity effect)相对于多价噬菌体得到了降低，使得分选基于内在的配体亲和力，而且使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。Lowman and Wells(1991)Methods：Acompanion to Methods in Enzymology 3：205-0216。
“噬菌粒”是具有细菌复制起点(例如Co1E1)和噬菌体基因间区拷贝的质粒载体。噬菌粒可利用任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ类噬菌体。质粒一般也包含抗生素抗性的可选择标志物。克隆入这些载体的DNA区段可以像质粒一起而扩增。在给容纳这些载体的细胞提供生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式变成滚环复制，以生成质粒DNA的一条链的拷贝，并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括这样的噬菌粒，它们包含与异源多肽基因连接成基因融合物的噬菌体外壳蛋白基因或其片段，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。
术语“噬菌体载体”指包含异源基因且能够复制的双链复制型噬菌体。噬菌体载体具有容许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。噬菌体优选是丝状噬菌体，诸如M13、f1、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或者是λ类噬菌体，诸如λ、21、82、424、434等或其衍生物。
在用于本文时，“溶剂可及位置”指源抗体或抗原结合片段重链和轻链可变区中根据抗体或抗原结合片段的结构、结构系综(ensemble)和/或建模结构确定为潜在触及溶剂和/或接触分子(诸如抗体特异性抗原)的氨基酸残基位置。这些位置通常发现于CDR中和蛋白质外部上。如本文所定义的抗体或抗原结合片段的溶剂可及位置可使用本领域已知的多种算法来确定。优选的是，溶剂可及位置是使用来自抗体三维模型的坐标而确定的，优选使用计算法程序，诸如InsightII程序(Accelrys，San Diego，CA)。溶剂可及位置还可以使用本领域已知的算法来确定(例如Lee and Richards(1971)J.Mol.Biol.55，379和Connolly(1983)J.Appl.Cryst.16，548)。溶剂可及位置的确定可使用适于蛋白质建模的软件和自抗体得到的三维结构信息来进行。可用于这些目的的软件包括SYBYL Biopolymer Module软件(Tripos Associates)。一般和优选的是，若算法(程序)要求用户输入大小参数，计算中所使用的探针的“大小”设为半径大约1.4埃或更小。另外，Pacios(1994)Comput.Chem.18(4)：377-386记载了使用供个人计算机用的软件确定溶剂可及区域和面积的方法。
“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、ephrin、Del-1、酸性(aFGF)和碱性(bFGF)成纤维细胞生长因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、Leptin、Midkine、神经毡蛋白、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin、Proliferin、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streit andDetmar(2003)Oncogene 22：3172-3179；Ferrara和Alitalo(1999)NatureMedicine 5(12)：1359-1364；Tonini等(2003)Oncogene 22：6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1)；Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206。
“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或直接或间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。应当理解，抗血管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF-A的抗体、VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂诸如GleevecTM(Imatinib Mesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streit and Detmar(2003)Oncogene 22：3172-3179(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara和Alitalo(1999)Nature Medicine5(12)：1359-1364；Tonini等(2003)Oncogene 22：6549-6556(例如列举已知抗血管发生因子的表2)；Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。
术语“VEGF”和“VEGF-A”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等(1989)Science 246：1306和Houck等(1991)Mol.Endocrin，5：1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。
“VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中涉及VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。一种优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为贝伐单抗(bevacizumab；BV；AvastinTM)的抗体。
抗VEGF抗体“贝伐单抗(Bevacizumab，BV)”，也称为“rhuMAb VEGF”或是依照Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgG1框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而大约7％的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量且是糖基化的。
术语“VEGFC”和“VEGF-C”可互换使用，指419个氨基酸的人类多肽(SwissProt：VEGFC_HUMAN P49767)及其非人哺乳动物直向同系物，首次记载于Joukov et al.，EMBO J 15，290-98(1996)及EMBO J 15，1751(1996)。
术语“Nrp2拮抗剂”在本文中用于指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰Nrp2调控淋巴内皮细胞(EC)迁移或在成人淋巴管发生(尤其是肿瘤淋巴管发生)和肿瘤转移的能力的分子。
“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括但不限于其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子。VEGF拮抗剂包括但不限于抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。如本文中所使用的，术语“VEGF拮抗剂”明确包括结合神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白-2(Nrp-1和/或Nrp-2)且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性的分子，包括抗体、抗体片段、其它结合性多肽、肽、和非肽小分子，包括但不限于抗Nrp1和抗Nrp2抗体及与Nrp1和Nrp2起交叉反应的抗体，前提是它们能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性。如此，术语“VEGF活性”明确包括神经毡蛋白介导的VEGF生物学活性(如上文所定义的)。
“脑信号蛋白拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰脑信号蛋白活性(包括但不限于其与一种或多种脑信号蛋白受体的结合)的分子。脑信号蛋白拮抗剂包括但不限于抗脑信号蛋白抗体及其抗原结合片段、特异性结合脑信号蛋白由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗脑信号蛋白受体抗体和脑信号蛋白受体拮抗剂诸如脑信号蛋白的小分子抑制剂。如本文中所使用的，术语“脑信号蛋白拮抗剂”明确包括结合神经毡蛋白-1和/或神经毡蛋白-2(Nrp-1和/或Nrp-2)且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰脑信号蛋白活性的分子，包括抗体、抗体片段、其它结合性多肽、肽、和非肽小分子，包括但不限于抗Nrp1和抗Nrp2抗体及与Nrp1和Nrp2起交叉反应的抗体，前提是它们能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰脑信号蛋白活性。如此，术语“脑信号蛋白活性”明确包括神经毡蛋白介导的第3类脑信号蛋白生物学活性(如上文所定义的)。所述生物学活性包括例如胚胎神经系统发育和神经元再生期间的神经突生长抑制效应。
“治疗”或“处理”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。
“病症”指任何会受益于治疗的疾患。例如，患有或需要预防异常血管发生(过度的、不当的或失控的血管发生)或血管通透性的哺乳动物。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；及特别是肿瘤(癌症)转移。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric orstomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatose)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。
术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib(TarcevaTM)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和多西他塞(doxetaxel)(-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如erlotinib(TarcevaTM))和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如核酸)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专利No.4,675,187)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体或衍生物形式。参见例如Wilman(1986)“Prodrugs in CancerChemotherapy”，Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast和Stella等(1985)“Prodrugs：A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt等，编，pp.247-267，HumanaPress。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。
“小分子”在本文中定义为具有低于约500道尔顿的分子量。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
表述“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
在用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化子”和“(经)转化细胞”包括原代受试细胞及由其衍生的培养物，不管传代的次数。还应理解，所有后代在DNA内容上可能不是精确相同的，这是由于有意或无意的突变。包括与最初对转化细胞所筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在意指不同的名称时，上下文会有清楚表述。
本发明的实施方式
一方面，本发明基于证明了对Nrp2功能的阻断抑制肿瘤转移的实验数据。
多步骤转移过程中的一项关键事件涉及肿瘤细胞自原发性肿瘤块外出。对于实体瘤，淋巴系统常常为离开的细胞提供途径。已知VEGF是许多肿瘤模型中淋巴管发生和转移的一种关键调控物，而且对VEGF轴的抑制被认为是抑制转移发生的一种有希望的策略。在本发明之前，Nrp2，即VEGFC的一种共同受体，尚未被视为抑制肿瘤转移的靶物，可能是由于在成年Nrp2突变型小鼠中缺少淋巴系统缺陷。
作为本发明的依据的研究(在下文实施例中呈现)支持Nrp2在肿瘤淋巴管发生和转移中的重要作用，只是部分通过调控VEGFR3信号传导来实现的。另外，实施例中所列出的数据证明了肿瘤内功能性淋巴管的存在，并且显示了用抗Nrp2B进行的治疗导致这些功能性淋巴系统(functional lymphatic)的减少。
Nrp2调节选择性VEGFC功能，部分经由不依赖VEGF受体活化的机制
对细胞迁移和增殖的诱导是至今已有记载的VEGFC的两项中枢细胞功能(Joukov等，Embo J 16，3898-3911(1997))。如此，本发明关于抗Nrp2B对Nrp2的阻断LEC迁移但不阻断LEC增殖的发现(图2和图3)是令人惊讶的。最近以Nrp2 siRNA敲低实验报告了此选择性，但是此选择性归于实验技术限制(Favier等，Blood 108，1243-1250(2006))。本文中所呈现的数据显示了在体内也记录到Nrp2的功能选择性，其中抗Nrp2B处理导致VEGFC驱动的淋巴管发生的降低，但是血管通透性不降低(图2和图3)。这些观察结果提示用抗Nrp2B进行的抑制并非仅仅通过破坏VEGFC信号传导来发挥功能。然而，已经确定了对Nrp2的阻断确实导致VEGF受体磷酸化的适度降低(图3)，这支持如下机制，其中Nrp2的一项作用是增强VEGF受体功能。这提出了如下的可能性，即不同的VEGFC诱导的生理学事件可能要求不同水平的VEGF受体活化。如此，受体活化的降低可能足以影响迁移，但是不足以影响增殖或血管通透性。
为了测试这一点，将VEGF受体磷酸化的VEGFC剂量应答与LEC迁移的剂量应答进行比较(图3)。导致与用抗Nrp2B处理时所看到的等同的受体磷酸化水平的VEGFC剂量不降低或抑制迁移。这指示单独受体活化降低不是抗Nrp2B的功能阻断效应的原因。
因此，调查了阻断Nrp2可选择性影响迁移的其它机制，诸如对粘附或运动的调控。抗Nrp2B处理对由VEGF165(图2)、HGF(图3)或FGF-2诱导的LEC介导的粘附或迁移没有任何影响，指示它一般不通过破坏运动来影响迁移。另外，已经提出sema3F(Nrp2的另一种配体)可能调控LEC或EC迁移，起化学排斥物的作用(Bielenberg等，J Clin Invest 114，1260-1271(2004)；Favier等，Blood 108，1243-1250(2006))。然而，抗Nrp2B抗体不抑制或强化sema3F对Nrp2的结合(图1)或sema3F对响应性神经元的功能性效应(增图4)。如此，不太可能的是，抗Nrp2B对VEGFC诱导的迁移的降低可通过调控sema3F功能来解释。
还评估了抗Nrp2B对Nrp2/VEGF受体复合物形成的影响。与Nrp1形成对比，Nrp2在缺乏配体的情况中与VEGFR2和VEGFR3形成复合物(Favier等，2006，见上文；Karpanen等，Faseb J20，1462-1472(2006))。重要的是，抗Nrp2B强烈抑制这些复合物的形成。在Nrp2不仅对于VEGF受体功能提升而言是重要的事实之外，此观察结果支持如下的模型，其中Nrp2提供别的功能性来特异性调控迁移，潜在地给VEGF受体复合物输送别的机制。
Nrp2在调控成人淋巴管发生中发挥重要作用
对Nrp2KO小鼠的分析证明了Nrp2是发育性淋巴管发生的调控物，大概是经由其作为VEGFC共同受体的作用(Yuan等，2002，见上文)。然而，这些突变型小鼠在出生后形成功能性淋巴系统，指示或是该缺陷代表对淋巴生长的延迟而非对淋巴生长的抑制或是有来自另一分子介导物的功能补偿。因此，尚未知道Nrp2在维持成熟淋巴系统和调控成人淋巴管发生中的作用。表达分析(图4)不支持Nrp2在维持淋巴系统中的作用。有趣的是，Nrp2在肿瘤中和肿瘤附近的LN内存在的淋巴系统中强烈表达，提示Nrp2可能在已被活化的或正在生长的淋巴系统中发挥作用。体外观察结果证明了抗Nrp2B是评估Nrp2在这些过程中的作用的有效工具。因此，使用角膜微袋测定法在体内测试抗Nrp2B(图2)。抗Nrp2B有效阻断VEGFC诱导的淋巴管发生，令人惊讶地等同于VEGFR3 ECD。有趣的是，抗Nrp2B在体内也展现出选择性抑制功能，未能影响VEGFC诱导的血管通透性。这符合如下的体外观察结果，即Nrp2特异性调控迁移，即对淋巴管发生而言重要的一种过程，但是不太可能在血管通透性中发挥作用。最后，这些抗Nrp2B处理的正常成年动物没有展现出肠淋巴系统的任何变化，证实了Nrp2在成熟淋巴系统的维持中不发挥作用。
Nrp2抑制导致肿瘤内功能性淋巴系统的减少和转移的降低-可能是通 过抑制肿瘤细胞经由淋巴途径离开主要肿瘤块
对VEGFC轴的抑制(最常见的是通过使用VEGFR3 ECD来实现)是最常用于降低转移的策略之一(Chen等，2005.见上文；He等，2002，见上文；Krishnan等，2003，见上文；Lin等，2005，见上文)。VEGFC能促进转移，可能是通过启动淋巴管发生，由此增加与LEC接触的肿瘤细胞表面积，通过调控LEC粘附特性或细胞因子表达或通过提高血管通透性(Alitalo和Carmeliet，Cancer Cell 1，219-227(2002))。由于抗Nrp2B选择性调控VEGFC介导的功能，包括抑制VEGFC诱导的成人淋巴管发生，下面，调查了阻断Nrp2对转移的影响。为了将混杂变量降至最低及为了不含糊地评估抗Nrp2B对转移的作用，我们挑选了如下的模型，其中阻断Nrp2不影响原发性肿瘤生长，并且进一步地在研究中的同一时间点收获所有动物(Withers和Lee，SeminRadiat Oncol 16，111-119(2006))。
在66c14及C6肿瘤模型二者中，根据目测，抗Nrp2B处理导致转移性肺小结的显著减少(图5和图6)。这得到了更加灵敏和定量的micro-CT技术的证实(Li等，Technol Cancer Res Treat 5，147-155(2006))。由于用VEGFR3处理的原发性肿瘤大小缩小，不可能在66c14肿瘤中比较抗Nrp2B和VEGFR3 ECD处理。然而，此分析在C6肿瘤中得以进行，因为它们的生长不受VEGFR3 ECD处理影响。与角膜微型袋测定法一样，抗Nrp2B处理导致与VEGFR3 ECD相比等同的对转移的阻断。
对原发性肿瘤的组织学分析指示我们主要不是在影响肿瘤细胞。如此，我们评估肿瘤细胞可利用的两种潜在转移路径：血管和淋巴系统(图7)。抗Nrp2B处理不影响血管的结构或密度。基于体外数据和体内角膜微型袋数据，假设阻断Nrp2应当导致肿瘤淋巴系统减少。抗Nrp2B处理没有显著降低淋巴系统的密度，而且再一次地，与VEGFR3 ECD处理程度等同。然而，这两种处理在所得淋巴系统的形态方面确实不同。VEGFR3 ECD处理导致通过表现不健康的淋巴细胞相连接的稀疏淋巴网络的形成。另一方面，抗Nrp2B处理导致分离的表现健康的淋巴细胞的短管和口袋的发生。这些差异进一步支持如下的模型，其中Nrp2并非仅仅起增强VEGF受体活化的作用，而是还带来独特的功能性以介导VEGFC生物学。这些结果也证明了，对于所测试的实验范例，抗Nrp2B起抑制淋巴管发生的作用(图7)。然而，不能排除抗Nrp2B也破坏肿瘤内更多已建立的淋巴管。
我们还试图确定肿瘤内淋巴系统是否是功能性的并因此有能力促进转移。使用淋巴管造影术来鉴定罕见的功能性肿瘤内淋巴系统(图8)。所使用的技术分析能力不足以测定肿瘤内功能性淋巴系统的比例。然而，它们有可能代表总的淋巴群中的一小部分(Padera等，Mol Imaging 1，9-15(2002))。因为有可能的是我们降低了总淋巴管密度同时没有伤害功能性淋巴管(其可以具有不同的对抗Nrp2B的敏感性)，所以我们评估了阻断Nrp2对功能性淋巴管形成的影响。抗Nrp2B降低功能性管的形成，由此将对肿瘤淋巴系统的影响与所观察到的转移降低更加直接地联系起来。
最后，为了证实减少功能性淋巴系统的后果，评估了抗Nrp2B对向SLN的转移的影响。SLN是肿瘤细胞在经由淋巴系统离开肿瘤后遇到的第一个组织。如此，它代表了远距器官转移中的最早步骤之一(Stracke和Liotta，In Vivo6，309-316(1992))。如预期的那样，抗Nrp2B处理导致SLN微转移发生的延迟，与较少的细胞自原发性肿瘤块外流的观点一致。这与VEGFC通过诱导淋巴增生和增加癌细胞到达淋巴结的传输而提高转移的证据一致(Hoshida等，Cancer Research 66，8065-8075(2006))。如此，大部分证据指向如下的机制，即阻断Nrp2导致功能性肿瘤淋巴系统减少，由此防止肿瘤细胞通过离开原发性肿瘤块而启动转移过程。
Nrp2作为转移靶物
许多临床病理学研究报告了VEGFC和VEGFR3的表达与许多人类癌症中的淋巴结转移和远距转移有关(广泛综述见Stacker等，Nat RevCancer，2002，见上文；Stacker等，Faseb J，2002，见上文；和He等，2004，见上文)。然而，关于Nrp2表达及其与转移的关系的信息是有限的。事实上，只是建立了Nrp2表达与恶性肿瘤之间的联系，特别是胰腺癌(Cohen等，Biochem Biophys Res Commun 284，395-403(2001)；Fukahi等，Clin Cancer Res10，581-590(2004))和肺癌(Kawakami等，Cancer 95，2196-2201(2002)；Lantuejoul等，J Pathol 200，336-347(2003))中。类似地发现，与它们的相应对照组织相比，不仅在胰腺中，而且在结肠腺癌、头和颈鳞状细胞癌、黑素瘤、乳头状甲状腺癌和浸润性乳腺导管腺癌中，Nrp2以更高水平表达(图9)。更重要的是，当这些肿瘤细分成转移组和非转移组时，注意到在大多数这些肿瘤类型中在转移组中Nrp2表达是统计学上更高的。有趣的是，这些肿瘤类型都证实了肿瘤内淋巴管发生，而且进一步与淋巴结转移相关(Achen等，2006，见上文；Achen和Stacker，Int J Cancer 119，1755-1760(2006))。这指示所讨论的实验发现预计延伸至患有各种肿瘤类型的人类患者。
总之，本文中所讨论的和下文实施例中所呈现的数据显示了Nrp2在调控VEGFC驱动的细胞迁移中发挥作用，而且提供了Nrp2可能经由多种机制(包括增强VEGF受体活化和不依赖VEGF受体信号传导的机制)来起作用的证据。另外，使用抗Nrp2B阻断Nrp2功能导致成年小鼠中VEGFC诱导的淋巴管发生的显著降低。此处理还导致转移的降低，可能是经由功能性淋巴系统发育的降低。连同在许多人肿瘤中进行的Nrp2表达分析，这些数据提示Nrp2是用于调控转移的有效靶物。
抗Nrp2抗体的生成
本发明包括抗Nrp2抗体的生成和使用。产生抗体的示例性方法在以下章节中有更详细的描述。
用衍生自哺乳动物物种的NRP2抗原选出抗NRP2抗体。抗原优选是人NRP2(hNRP2)。然而，来自其它物种的NRP2，诸如鼠NRP2(mNRP2)，也可用作靶抗原。来自各种哺乳动物物种的NRP2抗原可分离自天然来源。在其它实施方案中，所述抗原是重组生产的或者是利用本领域已知的其它合成方法而制备的。
所选的抗体通常将具有足够强的针对NRP2抗原的结合亲和力。例如，所述抗体结合hNRP2的Kd值可不超过约5nM，优选不超过约2nM，而更优选不超过约500pM。例如，抗体亲和力可由基于表面等离振子共振的测定法(如实施例所述的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(如RIA的)来测定。
而且，所述抗体可进行其它生物学活性测定法，如，用以评估其作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于靶抗原并意图用于抗体。实例包括HUVEC抑制测定法(如下文实施例所述的)；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO89/06692所述的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)；和激动剂活性或造血作用测定法(参见WO95/27062)。
为了筛选能结合感兴趣的抗原上的特定表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测试，如Antibodis，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)所述的。另外，可进行表位作图，如Champe等(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394所述的，来确定抗体是否结合感兴趣的表位。
从合成的抗体噬菌体文库中产生抗NRP2抗体
在一个优选的实施方案中，利用独特的噬菌体展示法来选择抗NRP2抗体。该方法包括产生基于单个框架模板的合成抗体噬菌体文库，设计可变域内的足够的多样性，展示具有多样化可变域的多肽，选择对靶NRP抗原具有高亲和力的候选抗体，和分离所选的抗体。
噬菌体展示方法的详情可在例如2003年12月11日公开的WO03/102157中找到。
在一个方面，抗体文库可通过在抗体可变域的至少一个CDR中突变溶剂可及的和/或高度多变的位置来产生。一些或全部CDR可用本文提供的方法来突变。在一些实施方案中，优选突变CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库，由此产生多样的抗体文库。
例如，可产生这样的抗体可变域文库，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3中溶剂可及的和/或高度多变的位置上有突变。产生的另一种文库在CDRL1、CDRL2和CDRL3中有突变。这些文库也可互相结合使用以产生具有期望亲和力的结合物。例如，在一或多轮选择对靶抗原结合的重链文库后，在其它轮次的选择中可将轻链文库替换入重链结合物群中以提高结合物的亲和力。
文库优选通过用重链序列可变区CDRH3区中的变异氨基酸替代原始氨基酸来产生。所得文库可包含多种抗体序列，其中序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区中。
在一个方面，文库在人源化抗体4D5序列、或人源化抗体4D5序列的框架氨基酸序列的背景中产生。文库优选通过用DVK密码子集编码的氨基酸至少替代重链残基95-100a来产生，其中DVK密码子集用于编码这些位置中每个位置的变异氨基酸集。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)7。在一些实施方案中，文库通过用DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)6(NNK)。在另一个实施方案中，文库通过用DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)5(NNK)。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的另一个例子包括序列(NNK)6。根据本文所述标准，本领域技术人员可确定合适寡核苷酸序列的其它例子。
在另一个实施方案中，利用不同的CDRH3设计来分离高亲和力结合物和分离针对各种表位的结合物。该文库中产生的CDRH3的长度范围是11至13个氨基酸，尽管也可产生不同于此的长度。通过用NNK、DVK和NVK密码子集也可拓展H3多样性，以及在N和/或C-末端处的更有限的多样性。
CDRH1和CDRH2中也可产生多样性。CDR-H1和H2多样性的设计遵循目标为模拟所述带有如下修饰的天然抗体全集的策略，所述修饰使多样性较前述设计更紧密地与天然多样性相匹配。
对于CDRH3中的样性，可分开构建多个文库，它们具有不同长度的H3，然后组合起来以选择针对靶抗原的结合物。合并多个文库并用前述和本文下述的固体支持物选择和溶液分选法来选择。可采用多种选择策略。例如，一种变化涉及在结合至固相的靶物上选择，然后分选可能在融合多肽上存在的标签(如抗gD标签)，然后再一次在结合至固相的靶物上分选。或者，文库可首先在结合至固相表面的靶物上选择，然后用靶抗原浓度逐渐减低的溶液相结合来分选所洗脱的结合物。利用不同分选方法的组合来最低限度地只选择高度表达的序列并选择许多不同的高亲和力克隆。
针对靶NRP2抗原的高亲和力结合物可由文库分离。H1/H2区中的有限多样性可降低简并性约104至105倍并允许为更多高亲和力结合物提供更大的H3多样性。利用在CDRH3中具有不同类型多样性的文库(如利用DVK或NVT)可分离能与靶抗原的不同表位结合的结合物。
对于如上所述合并的文库中分离的结合物，已经发现亲和力可通过提供轻链中的有限多样性来进一步提高。在该实施方案中，轻链多样性如下产生，在CDRL1中：氨基酸第28位由RDT编码；氨基酸第29位由RKT编码；氨基酸第30位由RVW编码；氨基酸第31位由ANW编码；氨基酸第32位由THT编码；任选地，氨基酸第33位由CTG编码；在CDRL2中：氨基酸第50位由KBG编码；氨基酸第53位由AVC编码；任选地，氨基酸第55位由GMA编码；在CDRL3中：氨基酸第91位由TMT或SRT或这两者编码；氨基酸第92位由DMC编码；氨基酸第93位由RVT编码；氨基酸第94位由NHT编码；和氨基酸第96位由TWT或YKG或这两者编码。
在另一个实施方案中，产生在CDRH1、CDRH2和CDRH3区中具有多样性的一个或多个文库。在该实施方案中，用各种长度的H3区并主要用密码子集XYZ和NNK或NNS来产生CDRH3中的多样性。用各寡核苷酸形成文库并合并，或者合并寡核苷酸来形成文库子集。该实施方案的文库可针对结合至固相的靶物进行分选。分离自多次分选的克隆可利用ELISA测定法来筛选特异性和亲和力。对于特异性，克隆可以针对期望靶抗原以及其它非靶抗原进行筛选。然后，在溶液结合竞争ELISA测定法或点竞争测定法中对那些针对靶NRP1抗原的结合物筛选亲和力。可以用如上所述制备的XYZ密码子集由所述文库分离高亲和力结合物。可方便地在细胞培养中以高产率将这些结合物制备成抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，可能希望产生在CDRH3区长度方面具有更大多样性的文库。例如，可能希望产生CDRH3区的长度范围为约7至19个氨基酸的文库。
由这些实施方案中的文库分离的高亲和力结合物可方便地在细菌和真核细胞培养中以高产率产生。可设计载体以方便地去除如下序列如gD标签、病毒外壳蛋白成分序列，和/或增加恒定区序列来高产率地产生全长抗体或抗原结合片段。
可以将CDRH3中有突变的文库与包含不同型式的其它CDR(例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2)的文库组合。因此，例如，在一个实施方案中，将CDRH3文库与CDRL3文库组合，所述CDRL3文库用预先确定的密码子集在第28、29、30、31、和/或32位有变异氨基酸的人源化4D5抗体序列的背景中产生。在另一个实施方案中，将CDRH3有突变的文库与包含变异CDRH1和/或CDRH2重链可变域的文库组合。在一个实施方案中，CDRH1文库用第28、30、31、32和33位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。CDRH2文库可用预先确定的密码子集用第50、52、53、54、56和58位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。
抗NRP2抗体突变体
可进一步修饰噬菌体文库产生的抗NRP2抗体以产生抗体突变体，所述突变体具有比亲本抗体改善了的物理、化学和/或生物学性质。当所用的测定法是生物学活性测定法时，优选抗体突变体在所选测定法中的生物学活性比亲本抗体在该测定法中的生物学活性好至少约10倍，优选好至少约20倍，更优选好至少约50倍，有时好至少约100倍或200倍。例如，优选抗NRP1抗体突变体针对NRP的结合亲和力比亲本抗NRP抗体的结合亲和力强至少约10倍，优选强至少约20倍，更优选强至少约50倍，有时强至少约100倍或200倍。
为了产生抗体突变体，将一处或多处氨基酸改变(如替代)导入亲本抗体的一个或多个高变区。或者/另外，可将框架区残基的一处或多处改变(如替代)导入亲本抗体，这些改变导致抗体突变体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所改善。要修饰的框架区残基的实例包括那些直接非共价结合抗原的(Amit等(1986)Science 233：747-753)；相互作用于/影响CDR构象的(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)；和/或参与VL-VH界面的(EP 239400B1)的残基。在某些实施方案中，一个或多个这类框架区残基的修饰导致抗体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所增强。例如，在本发明的该实施方案中，可改变约1个至约5个框架残基。有时，这可足以产生适用于临床前试验中的抗体突变体，甚至其中没有高变区残基被改变。可是通常，抗体突变体将包含别的高变区改变。
改变的高变区残基可以是随机改变的，尤其是在其中亲本抗体的起始结合亲和力使得这类随机产生的抗体突变体可方便地被筛选出来。
可用于生成此类抗体突变体的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham and Wells(1989)Science 244：1081-1085)。这里，一个或多个高变区残基用丙氨酸或多丙氨酸残基替代，以影响氨基酸与来自第二哺乳动物物种的抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它突变，推敲那些对替代展现出功能敏感性的高变区残基。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。如本文所述对如此生成的丙氨酸突变体筛选它们的生物学活性。
通常，从保守替代诸如下文显示在标题“优选替代”下的那些开始。如果此类替代导致生物学活性(例如结合亲和力)的改变，那么可以引入下表中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。
优选替代：
  原始残基 例示替代   优选替代
  Ala(A) val；leu；ile   val
  Arg(R) lys；gln；asn   lys
  Asn(N) gln；his；lys；arg   gln
  Asp(D) glu   glu
  Cys(C) ser   ser
  Gln(Q) asn   asn
  Glu(E) asp   asp
  Gly(G) pro；ala   ala
  His(H) asn；gln；lys；arg   arg
  Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸   leu
  Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe   ile
  Lys(K) arg；gln；asn   arg
  Met(M) leu；phe；ile   leu
  Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr   leu
  Pro(P) ala   ala
  Ser(S) thr   thr
  Thr(T) ser   ser
  Trp(W) tyr；phe   tyr
  Tyr(Y) trp；phe；thr；ser   phe
  Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸   leu
对抗体生物学特性的甚至更实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性、亲水性的：cys、ser、thr、asn、gln；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；及
(6)芳香族的：trp、tyr、phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
在另一个实施方案中，利用噬菌体展示(见上)，对为修饰而选择的位点进行亲和力成熟。
编码氨基酸序列突变体的核酸分子由本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于，寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变早先制备的突变或非突变型式的亲本抗体。制备突变体的优选方法是定点诱变(参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)。
在某些实施方案中，抗体突变体仅有单个高变区残基被替代。在其它实施方案中，有亲本抗体的两个或更多个高变区残基被替代，如约2个至约10个高变区替代。
通常，生物学特性得到改善的抗体突变体所具有的氨基酸序列与亲本抗体重链或轻链可变域的氨基酸序列有至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，和最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与亲本抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见上文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。
产生抗体突变体后，测定该分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上所示，这可包括测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的一个优选实施方案中，制备一组抗体突变体并筛选针对抗原(诸如NRP1或其片段)的结合亲和力。任选将该初始筛选中选出的一个或多个抗体突变体进行一种或多种其它生物学活性测定法以确证结合亲和力增强的抗体突变体是真正有用的，例如可用于临床前研究。
这样选出的抗体突变体可进一步修饰，修饰时常取决于抗体的预期用途。此类修饰可包括进一步改变氨基酸序列，融合异源多肽和/或共价修饰，诸如下文所详述的那些。对于氨基酸序列改变，示例性的修饰上文有详述。例如，也可替代任何不涉及保持抗体突变体正确构象的半胱氨酸残基，一般替代为丝氨酸，用以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可向抗体中加入半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段，诸如Fv片段时)。另一类氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块和/或增加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点来实现。抗体糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列之任一产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)。在抗体上增加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使之包含一个或多个上述的三肽序列来方便地实现(用于N-连接的糖基化位点)。也可在原始抗体序列中通过添加、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生改变(用于O-连接的糖基化位点)。
载体、宿主细胞和重组方法
本发明的抗Nrp2抗体可使用易于得到的技术和材料而重组生产。
为了重组生产抗NRP2抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码抗体的DNA易于使用常规规程分离或合成(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的DNA特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(i)信号序列构件
本发明的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码抗体的DNA连接。
(ii)复制起点构件
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
(iii)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一种竞争性拮抗剂的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的生长来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白质、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。
适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等(1979)Nature 282：39)。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones(1977)Genetics 85：12。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似地，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg(1990)Bio/Technology 8：135。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer等(1991)Bio/Technology 9：968-975。
(iv)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与抗体核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体受到例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)基因组，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及此热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参阅Reyes等(1982)Nature 297：598-601。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参阅Yaniv(1982)Nature297：17-18。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
(vi)转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参阅WO 94/11026及其中披露的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31，446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16，045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24，178)、K.waltii(ATCC 56，500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36，906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊蚊Aedes albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等(1977)J.Gen Virol.36：59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather(1980)Biol.Reprod.23：243-251)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等(1982)Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝肉瘤系(HepG2)。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
(viii)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等(1979)，Meth.Enz.58：44；Barnes等(1980)，Anal.Biochem.102：255；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(ix)抗体纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等(1992)Bio/Technology10：163-167记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等(1986)EMBO J.5：1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖所能获得的更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何预备性纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度进行(例如大约0-0.25M盐)。
药用配制剂
抗体的治疗用配制剂可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Osol，A.Ed.，1980)混合，以冻干剂型或水溶液的形式制备供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，可能希望进一步提供免疫抑制剂、抗癌剂、抗血管发生剂、抗肿瘤剂、细胞毒剂和/或化疗剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。
治疗用途
设想了本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。例如，在一个实施方案中，给非人哺乳动物施用抗体用以获得临床前数据。示例性的要治疗的非人哺乳动物包括非人灵长类动物、犬、猫、啮齿类动物和其它临床前研究所用的哺乳动物。这类哺乳动物可以是用抗体治疗的疾病的已确立的动物模型，或者可用于研究目的抗体的毒性。在这些实施方案的每一个中，可以在哺乳动物中进行剂量放大研究。例如，当抗体是抗NRP2抗体时，将它施用给实体瘤模型的宿主啮齿类动物。
另外/或者，抗体用于治疗人，例如患有能由施用抗体而受益的疾病或病症的患者。
本发明涵盖肿瘤淋巴管发生的预防和治疗、肿瘤转移的预防和肿瘤、及抗血管发生癌症疗法，即一种新的癌症治疗策略，其目标在于抑制提供营养以支持肿瘤生长所需的肿瘤血管发育。本发明明确包括在原发性位置处抑制肿瘤的瘤生长，以及在继发性位置处预防和/或治疗肿瘤转移，因而容许其它治疗剂攻击肿瘤。本文中要治疗(包括预防)的癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。更具体的，本发明抗体能治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌(carcinoid carcinoma)、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、和多发性骨髓瘤。
设想了在用于治疗各种疾病诸如肿瘤时，本发明的抗体可以与其它适用于相同或相似疾病的治疗剂组合在一起。在用于治疗癌症时，本发明的抗体可以与常规癌症疗法(诸如手术、放疗、化疗或其组合)组合使用。
在某些方面，可用于与本发明抗体一起构成组合癌症疗法的其它治疗剂包括其它抗血管发生剂。许多抗血管发生剂已得到鉴定并且是本领域已知的，包括Carmeliet和Jain(2000)所列的那些。
在一个方面，本发明的抗体与VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂(诸如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂及其任何组合)组合使用。或者/另外，两种或更多种抗NRP1抗体可共施用给患者。在一个更优选的实施方案中，本发明的抗NRP1A或抗NRPB抗体与抗VEGF抗体组合使用以产生叠加或协同效应。优选的抗VEGF抗体包括那些与抗hVEGF抗体A4.6.1结合相同表位的抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是bevacizumab(贝伐单抗)或ranibizumab(兰尼单抗)。
在一些其它方面，可用于与本发明抗体一起构成组合肿瘤疗法的其它治疗剂包括涉及肿瘤生长的其它因子(诸如EGFR、ErbB2(也称为Her2)、ErbB3、ErbB4、或TNF)的拮抗剂。优选的是，本发明的抗NRP1抗体可以与靶向一种或多种酪氨酸激酶受体(诸如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体)的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)组合使用。许多治疗性小分子RTKI是本领域已知的，包括但不限于vatalanib(PTK787)、erlotinibOSI-7904、ZD6474ZD6126(ANG453)、ZD1839、sunitinibsemaxanib(SU5416)、AMG706、AG013736、ImatinibMLN-518、CEP-701、PKC-412、Lapatinib(GSK572016)、AZD2171、sorafenibXL880、和CHIR-265。
本发明的抗NRP抗体，单独的或与第二治疗剂(诸如抗VEGF抗体)组合的，都可进一步与一种或多种化疗剂组合使用。多种化疗剂可用于与本发明一起构成组合治疗方法。所设想的示例性的和非限制性的化疗剂列表在本文“定义”小节中有提供。
当抗NRP抗体与第二治疗剂共施用时，可首先施用第二治疗剂，然后施用抗NRP抗体。然而，也设想了同时施用或首先施用抗NRP抗体。第二治疗剂的合适剂量就是当前所用的那些，而且可以由于该药剂与抗NRP抗体的组合(协同)作用而降低。
为了预防或治疗疾病，抗体的合适剂量将取决于要治疗的疾病的类型、疾病的严重性和进程、是为了预防还是为了治疗目的而施用抗体的、以前的疗法、患者的临床史和对抗体的应答、和主治医师的判断。合适的是，抗体在一次或在一系列治疗中施用于患者。
根据疾病类型和严重性，例如，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体是向患者施用的初始候选剂量，无论是一次或多次分开给药，或者通过连续输注。根据上述因素，典型的每日剂量的范围可以是约1μg/kg至约100mg/kg或更多。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据状况，治疗持续到发生疾病症状所希望的消退。然而，可以用其它剂量方案。在一个优选的方面，本发明的抗体每两至三周施用一次，剂量范围为约5mg/kg至约15mg/kg。更优选的是，这类剂量给药方案与化疗方案组合使用，作为治疗转移性结肠直肠癌的一线疗法。在一些方面，化疗方案包括传统的高剂量间歇性给药。在一些其它方面，用更小且更频繁的剂量施用化疗剂而无预定的中断(“节奏性化疗(metronomic chemotherapy)”)。本发明疗法过程可容易地用常规技术和测定法来监测。
抗体组合物将以与优良医学实践一致的方式配成剂型、定剂量(dosed)、和施用。本文考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状况、病症成因、药剂投递位置、施用方法、施用计划、和医学从业人员已知的其它因素。要施用的抗体的“治疗有效量”将根据这类考量而决定，而且是预防、改善、或治疗疾病或病症所必需的最小量。抗体不必是但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂配制成剂型。这类其它药剂的有效量取决于存在于配方中的抗体量、病症或治疗法的类型、和以上讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。一般而言，疾病或病症的改善或治疗包括减轻一种或多种症状或与疾病或病症相关的医学问题。对于癌症，药物的治疗有效量可实现以下一项或组合：减少癌细胞数；缩小肿瘤尺寸；抑制(即降低到某种程度和/或停止)癌细胞浸润入周围组织；抑制肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻一种或多种与癌症相关的症状。到药物可防止已有癌细胞生长和/或杀死已有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。在一些实施方案中，本发明的组合物可用于防止受试者或哺乳动物中疾病或病症的发作或复发。
以下实施例仅仅意图例示本发明的实施，而非作为限制提供的。本文中所引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录作为参考。
实施例
实施例1：抗Nrp2B抗体的生成和表征
抗Nrp2B是如先前所述自人合成抗体噬菌体文库分离的(Lee等，J MolBiol 340，1073-1093(2004))。简言之，在单一人框架上通过在重链互补决定区(CDR)内溶剂暴露位置处引入合成多样性而构建噬菌体展示的合成抗体文库。为了改进文库性能，构建了单价和二价抗原结合片段(Fab)文库，并通过改变氨基酸位置和CDR长度探索了不同CDR-H3多样性。然后通过提高CDR-H3长度的可变性和使用模拟天然CDR-H3序列氨基酸组成的特制密码子而扩张了文库。使用在单一支架上展示完全合成的CDR的这些文库，生成了高亲和力抗体。关于用单一模板生成合成抗体的策略和方法的进一步详情，参见例如2003年12月11日公布的WO03/102157，通过述及明确将其完整公开内容收入本文。
对抗Nrp克隆的选择规程由本领域已知的固体支持的分选和溶液结合的分选的各种组合组成。在固体支持的分选中，用以5ug/ml浓度包被在NUNC96孔Maxisorp免疫板上的靶抗原淘选抗体噬菌体文库。在溶液结合的分选方法中，将噬菌体文库与浓度递减的生物素化抗原一起在溶液中温育，然后通过包被在96孔Maxisorp板上的中性亲合素(2-5μg/ml)捕捉。递减的浓度容许在淘选中应用更多的严格性以钓到更紧密的结合物。
作为组合固体支持的分选与溶液结合的分选的结果，来自VH文库的一个克隆(YW68.4)和来自VHVL文库的另一个克隆(YW126.20)被鉴定为NRP-2结合物。进行了一系列体外测定法来检查所选出的新抗NRP抗体的特性和活性，包括结合亲和力测定法(诸如BIAcore)和阻断测定法(诸如脑信号蛋白诱导的生长锥塌陷(collapse)测定法和HUVEC测定法)。
改造首次用于实验的克隆的CDR以改进其亲和力和稳定性，并生成了抗Nrp2抗体YW68.4.2和YW68.4.2.36。将CHO细胞表达的mNrp2(a1a2b1b2)-His、hNrp2(a1a2b1b2)-Fc融合蛋白、和昆虫细胞表达的hNrp2(b1b2)用于抗体筛选和表征。将抗Nrp2B噬菌体抗体(最初称作YW68.4.2.36)的VL和VH区分别克隆入哺乳动物表达载体。在哺乳动物CHO细胞中表达抗Nrp2B人IgG1或mIgG2a，并用蛋白A亲和柱纯化。
抗Nrp2B抗体YW68.4.2和YW68.4.2.36的氨基酸序列显示于图10。抗Nrp2A抗体YW126.20的氨基酸序列显示于图11。抗Nrp2A抗体YW126.20轻链可变域序列与人κ1序列的比对显示于图12。抗Nrp2A抗体YW126.20重链可变域序列与人III(hum III)序列的比对显示于图13。
在下面的实验中，使用了抗Nrp2B抗体YW68.4.2.36，其在下文中会称作《抗Nrp2B》。此抗体被靶向至Nrp2的凝血因子V/VII(b1-b2)结构域(图1A)，因为这些结构域是VEGFC结合神经毡蛋白所需要的(Karpanen等，Faseb J20，1462-1472(2006))。另外，此抗体以相似的亲和力结合鼠和人Nrp2，但是不结合Nrp1(图1B)。已经证实了抗Nrp2B专门结合人Nrp2的b1-b2结构域，且不结合CUB(a1-a2)结构域，它们主要负责脑信号蛋白结合(Chen等，Neuron21，1283-1290(1998)；Giger等，Neuron 21，1079-1092(1998))。
为了测定抗Nrp2B IgG1抗体的结合亲和力，使用了用BIAcoreTM-3000仪器进行的表面等离振子共振(SRP)测量。首先，用包被有家兔抗人IgG的CM5生物传感器芯片捕捉抗Nrp2B人IgG至达到大约200个响应单位(RU)。为了动力学测量，于25℃以30μl/min流速分开注射PBT缓冲液(含0.05％(v/v)Tween20的PBS)中两倍连续稀释的小鼠或人Nrp2(a1a2b1b2)(0.5nM至250nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(3.2版BIAcore评估软件)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)以比率koff/kon来计算。
根据表面等离振子共振测量的评估，抗Nrp2B以4.9nM的Kd结合鼠Nrp，而以5.3nM的Kd结合人Nrp2。
在ELISA形式和基于细胞的结合测定法二者中测试了抗Nrp2B阻断VEGFC结合Nrp2的能力。
为了基于ELISA的结合特异性测试，将在PBST缓冲液(含0.5％(w/v)BSA的PBT缓冲液)中三倍连续稀释的抗Nrp2B IgG(0.002nM至500nM)与1μg/ml抗原包被的96孔Maxisorp板一起温育至少1小时，并用PBT缓冲液清洗板。用在PBST缓冲液中1∶2500稀释的抗人抗体HRP偶联物检测所结合的抗体，用TMB底物显色大约5分钟，用1M H3PO4淬灭，并于450nm处分光光度法读数。
为了评估对Nrp2结合VEGF的阻断，首先将三倍连续稀释的抗Nrp2B IgG与在PBST缓冲液中包被NRP2-Fc(5μg/ml)的96孔Maxisorp板一起温育2小时，接着添加生物素化的VEGF165或VEGFC(全长)达15分钟。用链霉亲合素-HRP偶联物检测结合至Nrp2的生物素化VEGF的量。
为了评估细胞结合，如先前所述实施生物素化VEGF165或VEGFC对LEC的结合(Jia等，J Biol Chem 281，13493-13502(2006))，并用链霉亲合素-碱性磷酸酶偶联物检测结合。如先前所述实施Sema3F结合(Chen等，1998，见上文)。
抗Nrp2B强烈阻断VEGFC结合Nrp2(图1C)和用全长Nrp2转染的HEK-293细胞。由于Nrp2也能结合VEGF(Gluzman-Poltorak等，J Biol Chem275，29922(2000))，有可能是利用相同的结构域，还测试了抗Nrp2B阻断VEGF165结合Nrp2的能力。抗Nrp2B也以相似的IC50(0.1nM)强烈阻断VEGF165结合Nrp2(图1D)。然而，抗Nrp2B不能够阻断Sema3F结合强烈表达Nrp2的LEC(图1E)(增图1)。这些结果与如下的先前的观察结果一致，即a1-a2结构域主要负责脑信号蛋白结合，而b1-b2结构域主要负责VEGF结合(图1A)。
实施例2：抗Nrp2B在体外选择性阻断VEGFC介导的功能
材料和方法
细胞培养
HMVEC-dLyAd-人真皮淋巴微管内皮细胞(LEC)和HUVEC购自Cambrex，并在EGM-2培养基(Cambrex)中培养。C6 LacZ细胞购自ATCC。66C14是由Fred R Miller博士馈赠的。肿瘤细胞在补充有10％FBS的DMEM(Gibco)中培养。所有细胞维持在37℃、5％CO2、95％湿度培养箱中。
细胞增殖测定法
将96孔黑色透明底的板(VWR)用5μg/ml纤连蛋白(Invitrogen)于37℃包被2小时。收获LEC，以3000细胞/100μl重悬在测定培养基(0.1％BSA，EGM-2)中，并添加至孔。将细胞于37℃温育16小时。添加BrdU标记溶液(细胞增殖ELISA试剂盒；Roche)，并将孔于37℃再温育24小时。通过化学发光免疫测定法测定BrdU掺入(每种条件6个孔)。
结果
检查了Nrp2在VEGFC介导的迁移和增殖中的作用。这些是由VEGFC诱导的关键细胞活性(Joukov等，Embo J 16，3898-3911(1997))。先前已经显示了LEC高度响应VEGFC(Makinen等，Embo J 20，4762-4773(2001)；Veikkola等，Faseb 17，2006-2013(2003)；Whitehurst等，Lymphat Res Biol 4，119-142(2006))。使用一种透孔(transwell)系统，将人LEC引入顶室，而将VEGFC添加至底室以促进迁移。然后对迁移至底部的LEC固定，染色(图2A)和定量(图2B)。在此实验和后续实验中使用包含VEGFR3头三个(配体结合)Ig结构域的VEGFR3胞外结构域蛋白(ECD)作为阳性对照来阻断VEGFC驱动的迁移(Makinen等，Nat Med 7，199-205(2001))。为了确定Nrp2功能是否是LEC迁移所需要的，将抗Nrp2B单抗添加至顶室中的细胞，之后立即添加VEGFC。抗Nrp2B能够显著降低VEGFC介导的LEC迁移(图2A，2B；p＝0.004)。抑制水平小于用VEGFR3ECD看到的，后者完整抑制VEGFC介导的LEC迁移(图2A，2B；与对照比的p＜0.001；与抗Nrp2B比的p＝0.002)。使用另一种VEGFC响应性原代细胞系HUVEC获得了相似的结果。
因为抗Nrp2B也阻断VEGF165结合Nrp2，所以评估了Nrp2在调控VEGF165介导的迁移中的作用。如先前所述，VEGF165在LEC中强烈诱导迁移(Hirakawa等，Am J Pathol 162，575-586(203)；Hong等，Faseb J 18，1111-1113(2004)；Makinen等，Embo J 20，4762-4773(2001)；Veikkola等，Faseb J 17，2006-2013(2003))。使用一种交叉物种反应性抗VEGF抗体(B20.4.1)作为阳性对照来阻断此VEGF驱动的迁移(Liang等，J Biol Chem 281，951-961(2006))。有趣的是，抗Nrp2B对VEGF165介导的迁移没有任何影响(图2C)，可能是由于Nrp1的存在(增图1)。利用抗Nrp1单抗，抗Nrp1B(Pan等，Cancer Cell 11，53-67(2007))阻断Nrp1功能显著降低VEGF介导的迁移，证实了此假说(增图2)。与单独用抗Nrp1B看到的抑制相比，添加抗Nrp1B和抗Nrp2B二者不导致对迁移的任何进一步抑制(增图2)，指示Nrp2在VEGF165介导的迁移中不发挥作用。
接着，调查了抗Nrp2B对VEGFC诱导的LEC增殖的影响。显著地，抗Nrp2B对LEC增殖没有影响，而VEGFR3 ECD提供了强烈阻断(增图3)，与先前的报告一致，即Nrp2 siRNA未能抑制VEGFC在内皮细胞中诱导的增殖(Favier等，Blood 108，1243-1250(2006))。如此，Nrp2表现出对于VEGFC驱动的迁移而非增殖是重要的。
然后，测试了抗Nrp2B调控脑信号蛋白功能的能力。我们使用海马神经元生长锥塌陷测定法，其先前证明了Nrp2是Sema3F介导的富含肌动蛋白的结构收回所需要的(Pozas等，2001)。添加抗Nrp2B对脑信号蛋白诱导的塌陷没有任何影响，而添加重组的Nrp2 A1A2结构域或Nrp2 ECD完全抑制此塌陷(增图4)。此结果与我们先前的观察结果一致，即抗Nrp2B不结合脑信号蛋白结合区且不干扰Sema3F结合Nrp2。如此，抗Nrp2B起如下作用，即阻断Nrp2功能的特定方面，抑制VEGFC而非VEGF或Sema3F介导的细胞应答。
实施例3：抗Nrp2B在体内阻断VEGFC介导的淋巴管发生
材料和方法
小鼠角膜微袋测定法
麻醉成年CD-1小鼠(Charles-River)，并如先前所述通过显微解剖在上皮中距角膜中心1mm创建2x3mm的一个袋(Polverini等，Methods Enzymol 198，440-450(1991))。将要测试淋巴管发生活性的药剂在惰性Hydron团粒(2x2mm)中固定化。然后将该团粒植入该袋的基部中。将动物用对照抗体(10mg/kg)、抗Nrp2B(10mg/kg)或VEGFR3 ECD 25mg/kg IP处理，每周两次，持续2周。然后处死动物并解剖角膜。通过用抗LYVE-1抗体(R&D Systems1∶500)进行的全标本包埋IHC显现淋巴系统。对角膜照相，并对自边缘产生的LYVE-1阳性淋巴管定量。
小鼠皮肤管通透性测定法
将成年C57BL6J雌性小鼠的背部和侧部刮毛，并分成4个测试区。然后给它们i.v.注射150μl 0.5％Evan氏蓝溶液。注射Evan氏蓝后1小时，皮内注射20μl含BSA或hVEGF(7.5μg/ml)、有或无抗体(0.5mg/ml)的PBS，随机地在四个区之一进行。1小时后，处死动物，并对皮肤解剖和照相。切出每个注射区的皮肤样品，并在甲酰胺溶液中于55℃温育48小时以提取蓝色染料。然后用分光计于600nm测量溶液的吸光度。
结果
在体外通过阻断Nrp2观察到LEC迁移的显著降低后，接着检查了Nrp2是否是在体内调控VEGFC功能所需要的。我们研究了两种已经很好表征了的VEGFC介导的体内活性-成年淋巴管发生和管通透性(Cao等，Circ Res 94，664-670(2004)；Joukov等，J Biol Chem 273，6599-6602(1998)；Kubo等，Proc Natl Acad Sci USA 99，8868-8873(2002)；Saaristo等，Faseb J 16，1041-1049(2002))。为了研究淋巴管发生，利用了鼠角膜微袋测定法(Kubo等，2002，见上文)。在此测定法中，将VEGFC团粒引入成年小鼠的无血管角膜中。在14天里，应答VEGFC，稠密的淋巴管丛自边缘生长入角膜中(图2E；VEGFC处理的12,000像素2相比于对照的2284像素2)。将这些管通过LYVE-1免疫组织化学(IHC)标记并随后定量(图2D)。系统施用VEGFR3 ECD几乎完全阻断此VEGFC诱导的淋巴管发生(2671像素2；p＜0.001)。抗Nrp2B也有效阻断角膜淋巴管发生应答(3281像素2；p＜0.001)。此阻断在程度上以使用VEGFR3 ECD观察到的阻断相似(图2E，2D；p＝0.67)。
为了评估管通透性，使用了miles测定法(Brkovic和Sirois，J Cell Biochem100，727-37(2007)；Eriksson等，Circulation 107，532-1538(2003))。此测定法使用皮内注射VEGFC来诱导管通透性及血管内注射Evans蓝染色作为示踪剂来检测和定量皮肤血管的通透性(增图3)。显著地，抗Nrp2B处理对VEGFC诱导的通透性没有影响，与用VEGFR3 ECD处理观察到的阻断形成对比(p＝0.038)。与我们在体外看到的情况一致，这些结果证明了Nrp2表现出对于选择性VEGFC介导的体内功能而言是重要的。
实施例4：抗Nrp2B通过抑制Nrp2/VEGF受体复合物形成而调控VEGFC功能
材料和方法
细胞迁移测定法
使用改良Boyden隔室(chamber)实施了迁移测定法，其具有8μM孔径Falcon 24多孔插入系统(BD Biosciences)。将板用5μg/ml纤连蛋白(Invitrogen)于37℃温育2小时。将100μl有或无抗体的测定培养基(0.1％BSA，EGM-2)中的细胞添加至上室。将500μl测定培养基中的化学引诱物添加至下室，并将细胞于37℃温育16小时。用海绵刷除去上膜上的细胞，而将下表面上的细胞在70％乙醇中固定并用Sytox绿(Molecular Probes)染色。对孔的整个下表面采集图像，并对迁移细胞的数目计数(每种条件6个孔)。
FACS分析
将汇合的LEC与对照抗Nrp2B抗体(10μg/ml)一起于37℃温育5分钟、2小时或20小时。用无酶细胞解离缓冲液(Gibco)收获细胞，并与在含5％正常小鼠血清、2％正常大鼠血清和10％10μg/ml人IgG的FACS缓冲液(PBS，2％FBS，2mM EDTA，0.1％叠氮钠)中1∶100稀释的生物素化抗体一起温育。抗体是使用FluoReporter迷你-生物素-xx蛋白质标记试剂盒(Molecular Probes)生物素化的。然后将细胞用FACS缓冲液清洗并用链霉亲合素-PE(BD Biosciences)染色。用FacsCalibur系统(BD Biosciences)分析数据。
细胞粘附测定法
将亚汇合的LEC在100μl培养基199中与对照或抗Nrp2B抗体(10μg/ml)一起于37℃预温育30分钟，然后以10,000细胞/孔分配入经1μg/ml纤连蛋白(Roche)包被的NUNC maxisorp平底96孔板(eBioscience)中。将板以140g离心1分钟以使细胞与基底(substrate)的接触同步，并于37℃温育30分钟。然后将板用PBS清洗3次，并于-80℃冷冻。用CyQuant试剂盒(Molecular Probes)测定细胞密度。
VEGF受体信号传导测定法
在存在或缺少对照或抗Nrp2B抗体的情况中将汇合的HUVEC用200ng/mlVEGFC刺激10分钟。溶解细胞并测定已知在VEGF受体信号传导中发挥作用的许多介导物。使用总VEGFR2和磷酸-VEGFR2 ELISA测定法(DuoSet ICELISA kit，R&D)来评估VEGFR2活化。如先前所述使用激酶受体活化测定法(KIRA)及VEGFR3-293细胞系来评估VEGFR3活化(Sadick等，J PharmBiomed Anal 19，883-891(1999))。简言之，在刺激后对表达全长的、带Flag标签的人hVEGFR3的稳定293细胞系测定受体磷酸化。将5×104个细胞饥饿过夜(含.1％BSA的DMEM)，然后用40ng/ml VEGFA(Genentech South SanFrancisco，CA)或200ng/ml VEGFC(Genentech South San Francisco，CA)刺激8分钟。在含有1％Triton和原钒酸钠的PBS中溶解细胞。用捕捉用Flag抗体(Sigma St Louis，MO)包被ELISA板。将板包被(PBS+1μg/ml抗体)过夜并封闭(PBS+0.5％BSA)1小时。3次清洗(PBS+0.05％Tween 20)后，添加溶胞物达2小时，清洗三次，接着添加磷酸-检测用抗体4G10(UpstateLake Placed，NY)达2小时。用HRP抗体(Amersham Piscataway，NJ)和TMB底物实施检测。于450nm处对板读数。使用来自BioSource的三明治ELISA试剂盒评估了总AKT、磷酸-AKT、总Erk1/2、磷酸-Erk1/2、总Src、磷酸-Src、总p38MAPK和磷酸-p38MAPK。
结果
抗Nrp2B干扰VEGFC作用的发现与它阻断VEGFC结合Nrp2的事实一致。另外，它只阻断体外和体内二者选择性功能的事实是高度出乎意料的。关于为什么观察到对LEC迁移和淋巴管发生的破坏但没有观察到对LEC增殖或血管通透性的破坏的一种可能解释是抗Nrp2B可能通常抑制迁移，这可能是通过破坏LEC粘附至胞外基质来实现的。为了测试这一点，评估了抗Nrp2B对多种LEC促运动素(motogen)诱导的迁移的影响。抗Nrp2B对VEGF(图2C)、HGF(图3B)或FGF诱导的迁移没有任何影响。因此，抗Nrp2B一般不破坏LEC迁移。此外，抗Nrp2B对LEC粘附两种胞外基质底物即纤连蛋白或胶原蛋白没有任何影响。
第二种可能性是抗Nrp2B单抗引起Nrp2的内化(Jaramillo等，Exp Cell Res312，2778-2790(2006))。因为Nrp2与VEGFR3形成复合物，甚至在缺少配体的情况中(Favier等，2006，见上文；Karkkainen和Alitalo，Semin Cell Dev Biol13，9-18(2002))，所以这能导致VEGFR3的选择性共内化，影响特定的VEGFC介导的功能。此可能性得到了如下发现的进一步确认，即VEGFC驱动的血管通透性是由VEGFR2而非VEGFR3介导的(Joukov等，1998，见上文)。为了考查此可能性，将LEC与抗Nrp2B一起于37℃温育5分钟、2小时或20小时，然后用针对Nrp2、VEGFR2和VEGFR3的抗体实施FACS分析以测定细胞表面上的受体水平。在这两种处理间没有观察到差异，提示抗Nrp2B不引起Nrp2、VEGFR2或VEGFR3的显著内化(图3A)。
因为已经提出Nrp2增强VEGF受体信号传导(Favier等，2006，见上文)，接下来研究了抗Nrp2B对VEGFR2和VEGFR3活化的影响，其中VEGFC刺激导致受体二聚化和自磷酸化。与在先的体外和体内数据一致，VEGFR 3ECD完全阻断VEGFC介导的VEGFR2(图3C；p＜0.001)和VEGFR3磷酸化。抗Nrp2B处理导致VEGFR2(图3C；p＜0.001)和VEGFR3活化降低，但是程度显著低于VEGFR3 ECD处理(p＜0.001)。此观察结果提出了如下可能性，即抗Nrp2B的选择性抑制活性可能是迁移和增殖对VEGF受体活化有不同要求的结果，其中迁移要求比增殖更高水平的受体活化。为了考查此可能性，评估了VEGFR2磷酸化对VEGFC刺激的剂量应答(图3C)。一致地观察到由抗Nrp2B处理引起的VEGFR2磷酸化降低等同于用175ng/ml或150ng/ml VEGFC刺激得到的VEGFR2磷酸化。然后，实施了迁移对VEGFC刺激的剂量应答分析(图3D)。已经记录到用175ng/ml或150ng/ml VEGFC刺激的LEC与用200ng/mlVEGFC刺激的LEC等同地迁移。事实上，直至VEGFC水平降低至50ng/ml才观察到显著的迁移降低。我们因此推理，由抗Nrp2B诱导的VEGFR2磷酸化降低自身不足以降低迁移。
我们另外评估了抗Nrp2B对由VEGF受体介导的下游信号传导事件的影响。用抗Nrp2B处理或者用175ng/ml或150ng/ml VEGFC刺激不显著降低分别调控VEGFR2介导的增殖、通透性和运动性的Erk1/2、Akt或p38 MAPK活化，与用Nrp1观察到的相似(Pan等，2007)。这指示Nrp2可能通过与增强VEGF受体活化或下游信号传导不同的机制来调节LEC迁移和淋巴管发生。
最后，我们测试了抗Nrp2B对Nrp2/VEGF受体复合物形成的影响。如先前所报告的，可以在存在或缺少VEGFC的情况中用VEGFR2和VEGFR3免疫共沉淀Nrp2(Favier等，2006见上文；Karpanen等，2006，见上文)(图3E)。此相互作用被抗Nrp2B显著降低(图3E)。此结果提示Nrp2/VEGF受体复合物对于特定的VEGFC介导的功能而言是重要的。此外，Nrp2的作用不是专门应答配体刺激而增强VEGF受体信号传导。
实施例5：Nrp2在肿瘤相关淋巴系统中表达
材料和方法
免疫组织化学
切出18μm组织切片并安装到玻璃载玻片上。将切片与一抗一起于4℃温育过夜，所述抗体为抗NRP2B(1∶500，在E12.5小鼠脊髓中实施对照染色，那里的表达已经很好地表征)、抗LYVE-1(anti-R&D，1∶200)、抗PECAM-1(Benton Dickinson，1∶500)、抗PROX-1(Chemicon，1∶1000)、或Ki67(Neovision 1∶100)。然后将样品用Alexa 488或Alexa 568二抗(1∶200；Molecular Probes)于室温染色4小时。使用只用二抗进行的染色作为对照。用商品化试剂盒(Roche)实施TUNNEL染色。用Zeiss Axiophot荧光显微镜捕捉图像。自来自每组6个肿瘤中每一个的6幅代表性图像测定血管和淋巴管面积，通过ImageJ评估像素数均值。
结果
为了确定Nrp2是否在成年淋巴生物学中发挥作用，评估了Nrp2在成年淋巴系统中的表达。在管系统内，先前已经记载了静脉和淋巴系统中的Nrp2表达(Herzog等，Mech Dev 109，115-119(2001)；Moyon等，Development 128，3359-3370(2001)；Yuan等，Development 129，4797-4806(2002))。如上所述，培养的LEC强烈表达Nrp2(增图1)。然而，我们在正常成年小鼠的结肠LYVE-1阳性淋巴管中通过IHC检测不到Nrp2(图4A；阳性对照染色见增图4)。评估了结肠，因为它具有相当千篇一律式样的(stereotyped pattern)淋巴管丰富丛。我们在来自正常成年小鼠的淋巴结的淋巴管(图4B)和皮肤内通过IHC也检测不到Nrp2表达。这些结果得到了Nrp2原位杂交(ISH)的证实。与之形成对比的是，在原位或异位移植的肿瘤附近的淋巴结中的LYVE-1阳性淋巴管中观察到强烈的Nrp2表达(图4C)。这在许多肿瘤系中观察到，包括原位移植的鼠乳腺腺癌系66c14(Aslakson和Miller，Cancer Res 52，1399-1405(1992))和异位移植的大鼠成胶质细胞瘤系C6(数据未显示)。在许多肿瘤系的肿瘤周围和肿瘤内淋巴系统中也观察到Nrp2(图4D)，包括66c14、C6和PC3(人前列腺癌系)。此表达通过ISH在一些肿瘤类型中得到证实。
实施例6：抗Nrp2B降低多种肿瘤模型中的肺部转移
材料和方法
所有动物研究都依照NIH(NIH出版物85-23，1985年修订版)出版的实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)。实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care和Use Committee，IACUC)批准了所有动物方案。
肿瘤模型
对于66C14，将细胞通过胰蛋白酶处理来收获，清洗，并以2×105个细胞/10μl PBS的浓度重悬于PBS。使用75mg/kg氯胺酮(ketamine)和7.5mg/kg赛拉嗪(xylazine)麻醉小鼠，并在右前肢下面做一切口。将10μl PBS中的2×105个细胞直接注射入6-8周龄雌性balb-C小鼠的暴露的第4乳腺脂肪垫中。对于C6，将100μl PBS中的2×106个肿瘤细胞皮下注射入6-8周龄雌性balb-C裸鼠的右侧。对这两组研究，每周3次监测肿瘤生长。当肿瘤达到80-120mm3的平均尺寸时，分选小鼠以给出几乎相同的肿瘤大小组均值，并开始处理。这视为每项研究的第1天。每周两次用对照抗体(10mg/kg)、抗Nrp2B(10mg/kg)或VEGFR3 ECD 25mg/kg IP处理动物，直至研究结束。所有研究重复3次以确保再现性。
在研究结束时，将动物麻醉并用4％PFA灌注。收获肿瘤，防冻处理并冷冻在OCT(Tissue-Tek)中。经由右室灌注10ml PBS接着4％PFA使肺膨胀，并实施转移病灶的目测计数，之后进行Micro-CT分析。
通过异位植入C6肿瘤细胞入耳中来评估SLN转移。简言之，在肿瘤细胞植入前一天，将一组动物用对照抗体(10mg/kg)或抗Nrp2B(10mg/kg)预处理，且之后每周进行两次。将1×105个C6 lacZ细胞皮下注射入70只雌性balb/c裸鼠的耳中。在第3、6、9、13和15天处死小鼠，并通过皮肤淋巴管造影术来鉴定前哨淋巴结，随后解剖出来。将淋巴结匀浆，并对溶胞物测定β-半乳糖苷酶活性(Pierce)。
如下对对照和荷瘤小鼠实施了皮内淋巴管造影术。将2μl含有1％20nm聚苯乙烯荧光微珠(Molecular Probes)的Evans蓝染料(3％，以重量计)皮内注射于肿瘤的顶点。让动物恢复2小时，然后处死。小心地解剖出肿瘤，不要包括肿瘤周围组织。或是将它们固定，然后进行组织化学分析，或是在甲酰胺中温育以提取Evans蓝并用分光光度计以OD600测量来定量。
肺的Micro-CT分析
将肺在10％NBF中浸泡24小时，然后在基于碘的x射线计算体层照相术对比剂Isovue370(Bracco Diagnostics Inc，Princeton，NJ)在PBS中稀释的20％溶液中浸泡24小时。然后将肺浸泡在大豆油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中，并经气管插管用20ml大豆油以0.25ml/min的速率灌注。使用大豆油来除去过量的对比剂并为成像提供背景介质。
用VivaCT(SCANCO Medical，Basserdorf，Switzerland)x射线显微计算体层照相术(micro-CT)系统离体对小鼠肺成像。获得纵向探测图像(与常规平面x-射线相当)来为一系列micro-CT图像片的轴向获取限定起点和终点。选择轴向图像的位置和数目来提供对肺的完全覆盖。将肺浸泡在作为背景介质的大豆油中。通过以45kV的能级、160μA的电流和450毫秒的积分时间操作x-射线管来生成micro-CT图像。获得了21μm各向同性分辨率(isotropicresolution)的轴向图像。通过半自动图像分析算法获得了肺肿瘤估值(数目和体积)，该算法包括由受过训练的阅读人进行的检查步骤。相对于正常肺的多孔网状结构，肺肿瘤表现为高强度的实体块。这是由于肺内所包含的实体结构(支气管和肺泡壁、肿瘤、气管、纵隔)对碘对比剂的吸收。通过油灌注步骤自充气的空间清除掉过量的对比剂。通过一系列图像加工步骤提取潜在的肿瘤块。该图像分析软件是公司内部开发的。它以C++书写，并采用Analyze(AnalyzeDirect Inc.，Lenexa，KS，USA)图像分析软件函数库。该算法采用强度阈值处理(intensity thresholding)、形态过滤(morphological filtering)和区域生长(region-growing)来提取所有潜在肿瘤块。通过对为了开发算法而任意选出的5个肺的直方图分析确定了强度阈值(1480个Hounsfield单位)，并选择最佳的阈值来包括肿瘤三维像素(voxel)和排除任何背景信号。应用形态(糜烂、膨胀)和区域生长操作来连接高强度的三维像素区及清除在细支气管和肺泡的薄壁中找到的类似强度的任何三维像素。区域生长步骤要求2300个相连三维像素的最小体积(大于0.0231mm3)才能接受为物体(块)。然后由受过训练的阅读人用Analyze 3D显像软件评估所鉴定的物体。根据物体的外观和它在肺内的定位，将各个物体接受或拒绝为可能的肿瘤。拒绝位于肺以外的(例如纵隔、外来组织碎屑)物体或类似装有血的管的物体。对每个肺测定了肿瘤计数、各个肿瘤体积和总体肿瘤体积。此分析技术得到了一种已经很好建立的肿瘤转移模型的确认。通过此micro-CT技术，继以肺的系列组织学分析，对11只原位移植有4T1乳腺腺癌肿瘤细胞的动物评估了肺部转移。肺肿瘤体积估值与肿瘤大小的组织学估值(像素计数；增图5)高度相关(r＝0.9，p＝0.0002)。
结果
抑制转移的一种主要办法是经由对VEGFC轴的抑制(Chen等，CancerRes 65，9004-9011(2005)；He等，J Natl Cancer Inst 94，819-825(2002)；Krishnan等，Cancer Res 63，713-722(2003)；Lin等，Cancer Res 65，6901-6909(2005))。为了确定阻断Nrp2功能是否也能调控转移的发生，在两种不同肿瘤模型-66c14乳腺癌模型和C6成胶质细胞瘤模型中测试了抗Nrp2B处理对肺转移形成的影响。66c14是一种鼠乳腺腺癌系，衍生自Balb/c小鼠中的自发性乳腺肿瘤(Aslakson和Miller，Cancer Res 52，1399-1405(1992))。这些细胞表达VEGFC，并经淋巴系统转移至肺(Aslakson和Miller，1992，见上文)。这些细胞在Balb/c小鼠中的原位移植导致可再现的肿瘤和肺转移的发生。抗Nrp2B处理不影响肿瘤的原发性生长速率(图5A)。因为VEGFR3 ECD不显著降低原发性肿瘤生长速率，所以将它排除于任何进一步转移分析之外。同时处死来自这两种处理分支的一组具有相似大小肿瘤的动物(N＝每组6只)，并解剖出肺，使其膨胀以便于分析转移性小结。与对照IgG处理的动物相比，抗Nrp2B引起每个肺的肉眼可见转移性小结平均数目的显著降低(图5B，C)，平均值从3.5降至0.8(P＝0.03)。为了证实此结果及延伸我们的评估至不易进行肉眼检查的肺实质内的转移，我们在尸检后对肺实施了micro-CT分析(Li等，Technol Cancer Res Treat 5，147-155(2006))。此分析证实了，与对照处理的动物相比，抗Nrp2B处理的动物具有肺转移数目的降低(图5D-F)。然而，micro-CT分析比目测分析更加灵敏，得出这两个组中更大的转移性小结绝对数。micro-CT还容许我们测定肺内的总转移负荷。与对照处理(1.78cm3)相比，抗Nrp2B处理还导致总转移体积的降低(0.74cm3)。另外，此分析证实了在对照和抗Nrp2B这两种处理的动物中，绝大多数病灶在肺的表面上。因此，通过将小结从表面移位至肺实质，抗Nrp2B不引起转移的减少。
如实施例4中所述实施的FACS分析指示Nrp2而非VEGFR2或VEGFR3在66c14肿瘤细胞上表达。这提出了如下可能性，即抗Nrp2B处理直接影响肿瘤细胞行为以影响转移。鉴于抗Nrp2B处理缺乏对原发性肿瘤生长的影响，这是不太可能的。另外，抗Nrp2B在体外对肿瘤细胞增殖、凋亡或迁移没有任何影响。然而，为了考查转移的降低是由于抗Nrp2B对肿瘤细胞的影响的可能性，我们还评估了抗Nrp2B对C6大鼠成胶质细胞瘤模型的影响。这些细胞没有以可察觉的程度在其表面上表达Nrp2(图6E)，表达VEGFC，且认为经由淋巴系统转移至肺(Bernstein和Woodard，1995)。另外，它们已经被工程化改造以表达β-半乳糖苷酶，其能用作标志物以便于检测肿瘤细胞。
在裸鼠中皮下移植这些细胞导致肿瘤和肺转移的一致发生。抗Nrp2B处理不影响这些肿瘤的原发性生长速率(图6A)。另外，VEGFR3 ECD在该肿瘤模型中不显著降低原发性肿瘤生长速率。这容许比较VEGFR3 ECD和抗Nrp2的抗转移效应。再次，处死来自所有处理分支的具有相似大小肿瘤的动物(N＝10)，解剖出肺，并使其膨胀以便于分析转移性小结。抗Nrp2B和VEGFR3 ECD这两种处理都引起每个肺的肉眼可见转移性小结平均数目的降低(图6B，C)。用抗Nrp2B记录到的降低与用VEGFR3 ECD看到的相当。肺的micro-CT分析证实了这些发现(图6D)并验证了在所有处理分支中绝大多数转移定位至肺的表面。通过这两种肿瘤模型中的组织学证实了小结是转移病灶(图5H和6G)。另外，全身尸检没有揭示任一肿瘤模型中其它器官表面上的小结。
虽然在上文描述中参照某些实施方案例示了本发明，但是本发明不限于此。实际上，根据上面的描述，在本文所显示和描述之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。
通过述及将整篇说明书中引用的所有参考文献及其中引用的参考文献完整收入本文。

Claims (63)

1.一种抗Nrp2B抗体或其片段，其中所述抗体或片段包含
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的YW68.4.2抗体的轻链可变域序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKL
LIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYT
TPPTFGQGTKVEIK
和重链可变域序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTITSSGIHWVRQAPGKGLE
WVARITPYDGSTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA
VYYCARYRGTLLFDYWGQGTLVTVSS
其中CDRL1如SEQ ID NO:1的氨基酸残基24-34所示；CDRL2如SEQ IDNO:1的氨基酸残基50-56所示；CDRL3如SEQ ID NO:1的氨基酸残基89-97所示；CDRH1如SEQ ID NO:1的氨基酸残基240-249所示；CDRH2如SEQ ID NO:1的氨基酸残基264-280所示且CDRH3如SEQ ID NO:1的氨基酸残基313-321所示；或
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的YW68.4.2.36抗体的轻链可变域序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKL
LIYSASFLYSGVPGRFSGSGSGTDDTLTISSLQPEDFATYYCQQHYT
TPPTFGQGTKVEIK
和重链可变域序列
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTITSSGIHWVRQAPGKGLE
WVARITPYDGSTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA
VYYCARYGGRLLFDYWFQGTLVTVSS
其中CDRL1如SEQ ID NO:2的氨基酸残基24-34所示；CDRL2如SEQ IDNO:2的氨基酸残基50-56所示；CDRL3如SEQ ID NO:2的氨基酸残基89-97所示；CDRH1如SEQ ID NO:2的氨基酸残基240-249所示；CDRH2如SEQ ID NO:2的氨基酸残基264-280所示且CDRH3如SEQ ID NO:2的氨基酸残基313-321所示。
2.权利要求1的抗Nrp2B抗体或其片段，其是YW68.4.2、YW68.4.2.36、或其片段，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
3.权利要求1的抗Nrp2B抗体或其片段，其是YW68.4.2.36或其片段，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
4.权利要求1的抗Nrp2B抗体或其片段，其是双特异性的，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
5.权利要求2的抗Nrp2B抗体或其片段，其是双特异性的，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
6.权利要求3的抗Nrp2B抗体或其片段，其是双特异性的，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
7.权利要求1的抗Nrp2B抗体或其片段，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
8.权利要求1-7任一项的抗Nrp2B抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是嵌合的或人源化的。
9.一种组合物，其包含与药学可接受载体混和的权利要求1-8任一项的抗体或其片段。
10.一种药物组合物，其用于肿瘤转移的预防或治疗，包含与药学可接受载体组合的有效量的权利要求1-8任一项的抗Nrp2B抗体或其片段。
11.抗Nrp2B抗体或其片段在制备用于在哺乳动物受试者中抑制淋巴内皮细胞迁移的药物中的用途，其中所述抗体或片段包含
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的YW68.4.2抗体的轻链可变域序列
DIQMTQSPSSLSASVGDPVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKL
LIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYT
TPPTFGQGTKVEIK
和重链可变域序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTITSSGIHWVRQAOGKGLE
WVARITPYDGSTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA
VYYCARYRGTLLFDYWGQGTLVTVSS
其中CDRL1如SEQ ID NO:1的氨基酸残基24-34所示；CDRL2如SEQ IDNO:1的氨基酸残基50-56所示；CDRL3如SEQ ID NO:1的氨基酸残基89-97所示；CDRH1如SEQ ID NO:1的氨基酸残基240-249所示；CDRH2如SEQ ID NO:1的氨基酸残基264-280所示且CDRH3如SEQ ID NO:1的氨基酸残基313-321所示；或
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的YW68.4.2.36抗体的轻链可变域序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQOKPGKAPKL
LIYSASALYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOQHYT
TPPTFGQGTKVEIK
和重链可变域序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTITSSGIHWVRQAPGKGLE
WVARITPYDGSTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA
VYYCARYRGRLLFDYWGQGTLVTVSS
其中CDRL1如SEQ ID NO:2的氨基酸残基24-34所示；CDRL2如SEQ IDNO:2的氨基酸残基50-56所示；CDRL3如SEQ ID NO:2的氨基酸残基89-97所示；CDRH1如SEQ ID NO:2的氨基酸残基240-249所示；CDRH2如SEQ ID NO:2的氨基酸残基264-280所示且CDRH3如SEQ ID NO:2的氨基酸残基313-321所示。
12.权利要求11的用途，其中所述抗Nrp2B抗体或其片段是YW68.4.2、YW68.4.2.36、或其片段，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
13.权利要求11的用途，其中所述抗Nrp2B抗体或其片段是YW68.4.2.36或其片段，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
14.权利要求11的用途，其中所述抗Nrp2B抗体或其片段是双特异性的。
15.权利要求12的用途，其中所述抗Nrp2B抗体或其片段是双特异性的。
16.权利要求13的用途，其中所述抗Nrp2B抗体或其片段是双特异性的。
17.权利要求11的用途，其中所述抗Nrp2B抗体片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
18.权利要求14的用途，其中所述抗Nrp2B抗体片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
19.权利要求15的用途，其中所述抗Nrp2B抗体片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
20.权利要求16的用途，其中所述抗Nrp2B抗体片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
21.权利要求11-20任一项的用途，其中所述抗Nrp2B抗体或其片段是嵌合的或人源化的。
22.权利要求21的用途，其中所述哺乳动物受试者是人患者。
23.权利要求22的用途，其中所述人患者已经诊断有癌症。
24.权利要求23的用途，其中所述人患者已经发生或有风险发生肿瘤转移。
25.权利要求24的用途，其中所述转移在淋巴系统中或在远距器官中。
26.权利要求23-25任一项的用途，其中所述癌症选自下组：小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，肺的鳞癌，腹膜癌，胃癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；和慢性成髓细胞性白血病。
27.权利要求23-25任一项的用途，其中所述癌症选自下组：肝的癌瘤、胃肠癌，子宫癌和各种类型的头颈癌。
28.权利要求23-25任一项的用途，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。
29.权利要求23-25任一项的用途，其中所述癌症为鳞状细胞癌。
30.权利要求11-20和22-25任一项的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
31.权利要求21任一项的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
32.权利要求26任一项的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
33.权利要求27任一项的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
34.权利要求28任一项的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
35.权利要求29任一项的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
36.权利要求30的用途，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
37.权利要求31-35任一项的用途，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
38.抗Nrp2B抗体或其片段在制备用于在人癌症患者中预防或治疗肿瘤转移的药物中的用途，其中所述抗体或片段包含
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的YW68.4.2抗体的轻链可变域序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKL
LIYSASFLYSCVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYT
TPPTFGQGTKVEIK
和重链可变域序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTITSSGIHWVRQAPGKGLE
WVARITPYDGSTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA
VYYVARYRGTLLFDYWGQGTLVTVSS
其中CDRL1如SEQ ID NO:1的氨基酸残基24-34所示；CDRL2如SEQ IDNO:1的氨基酸残基50-56所示；CDRL3如SEQ ID NO:1的氨基酸残基89-97所示；CDRH1如SEQ ID NO:1的氨基酸残基240-249所示；CDRH2如SEQ ID NO:1的氨基酸残基264-280所示且CDRH3如SEQ ID NO:1的氨基酸残基313-321所示；或
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的YW68.4.2.36抗体的轻链可变域序列
DIQMTQSPSSLSASVCDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKL
LIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYT
TPPTFGQGTKVEIK
和重链可变域序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTITSSGIHWVRQAPGKGLE
WVARITPYDGSTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA
VYYCARYRGRLLFDYWGQGTLVTVSS
其中CDRL1如SEQ ID NO:2的氨基酸残基24-34所示；CDRL2如SEQ IDNO:2的氨基酸残基50-56所示；CDRL3如SEQ ID NO:2的氨基酸残基89-97所示；CDRH1如SEQ ID NO:2的氨基酸残基240-249所示；CDRH2如SEQ ID NO:2的氨基酸残基264-280所示且CDRH3如SEQ ID NO:2的氨基酸残基313-321所示。
39.权利要求38的用途，其中所述抗Nrp2B抗体或其片段是YW68.4.2.36或其片段，其中所述片段选自下组：Fab、F(ab’)2、和scFv片段。
40.权利要求38的用途，其中所述抗Nrp2B抗体或其片段是双特异性的。
41.权利要求38-40任一项的用途，其中所述癌症选自下组：小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，肺的鳞癌，腹膜癌，胃癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；和慢性成髓细胞性白血病。
42.权利要求38-40任一项的用途，其中所述癌症选自下组：肝的癌瘤、胃肠癌，子宫癌和各种类型的头颈癌。
43.权利要求38-40任一项的用途，其中所述癌症为肝细胞癌或结肠直肠癌。
44.权利要求38-40任一项的用途，其中所述癌症为鳞状细胞癌。
45.权利要求38-40任一项的用途，其中所述肿瘤转移在淋巴系统中。
46.权利要求41的用途，其中所述肿瘤转移在淋巴系统中。
47.权利要求42的用途，其中所述肿瘤转移在淋巴系统中。
48.权利要求43的用途，其中所述肿瘤转移在淋巴系统中。
49.权利要求44的用途，其中所述肿瘤转移在淋巴系统中。
50.权利要求38-40任一项的用途，其中所述肿瘤转移在远距器官中。
51.权利要求41的用途，其中所述肿瘤转移在远距器官中。
52.权利要求42的用途，其中所述肿瘤转移在远距器官中。
53.权利要求43的用途，其中所述肿瘤转移在远距器官中。
54.权利要求44的用途，其中所述肿瘤转移在远距器官中。
55.权利要求38-40、46-49和51-54任一项的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
56.权利要求41的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
57.权利要求42的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
58.权利要求43的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
59.权利要求44的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
60.权利要求45的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
61.权利要求50的用途，其还包括施用抗VEGF抗体。
62.权利要求55的用途，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
63.权利要求56-61任一项的用途，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
CN200780053792.7A 2007-05-17 2007-05-17 抗神经毡蛋白2抗体对肿瘤转移的抑制 Expired - Fee Related CN101754771B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2007/069179 WO2008143665A1 (en) 2007-05-17 2007-05-17 Inhibition of tumor metastasis by anti neuropilin 2 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101754771A CN101754771A (zh) 2010-06-23
CN101754771B true CN101754771B (zh) 2015-03-04

Family

ID=39301228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780053792.7A Expired - Fee Related CN101754771B (zh) 2007-05-17 2007-05-17 抗神经毡蛋白2抗体对肿瘤转移的抑制

Country Status (17)

Country Link
US (2) US8648173B2 (zh)
EP (1) EP2152307B1 (zh)
JP (1) JP5745840B2 (zh)
KR (1) KR101520115B1 (zh)
CN (1) CN101754771B (zh)
AU (1) AU2007353778B9 (zh)
BR (1) BRPI0721660A2 (zh)
CA (1) CA2687247A1 (zh)
CR (1) CR11126A (zh)
ES (1) ES2469743T3 (zh)
HK (2) HK1134040A1 (zh)
IL (1) IL202005A (zh)
MA (1) MA31435B1 (zh)
MX (1) MX2009012421A (zh)
NO (1) NO20093542L (zh)
UA (1) UA99292C2 (zh)
WO (1) WO2008143665A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110997724A (zh) * 2017-06-06 2020-04-10 斯特库伯株式会社 使用结合btn1a1或btn1a1-配体的抗体和分子治疗癌症的方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2690281A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 The Johns Hopkins University Biomarkers for melanoma
US20110091384A1 (en) * 2009-10-13 2011-04-21 The Johns Hopkins University Biomarker for identification of melanoma tumor cells
CN114717206A (zh) 2013-03-15 2022-07-08 Atyr 医药公司 组氨酰-trna合成酶-fc缀合物
WO2015095686A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Trustees Of Boston University Assays and methods relating to the treatment of melanoma
EP3612215A4 (en) 2017-04-20 2021-05-26 aTyr Pharma, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF Pneumonia
EP3773718A4 (en) * 2018-04-06 2022-01-19 aTyr Pharma, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS WITH ANTI-NRP2 ANTIBODIES
AU2020358854A1 (en) 2019-10-03 2022-05-26 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-NRP2 antibodies
CN114277152A (zh) * 2022-01-14 2022-04-05 张赟建 用于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的特异性基因及制备方法
CN114262683B (zh) * 2022-03-01 2022-06-17 中国科学院动物研究所 一种表达vegfr3 d2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999029729A2 (en) * 1997-12-09 1999-06-17 Children's Medical Center Corporation Antagonists of neuropilin receptor function and use thereof
WO1999029858A1 (en) * 1997-12-09 1999-06-17 Children's Medical Center Corporation Soluble inhibitors of vascular endothelial growth factor and use thereof
US20030113324A1 (en) * 2001-10-01 2003-06-19 Kari Alitalo Neuropilin/VEGF-C/VEGFR-3 materials and methods

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
DE69829891T2 (de) 1997-04-07 2005-10-06 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-VEGF Antikörper
DK0971959T3 (da) 1997-04-07 2006-05-15 Genentech Inc Humaniserede antistoffer og fremgangsmåder til dannelse af humaniserede antistoffer
US6417169B1 (en) * 1998-04-23 2002-07-09 Genesense Technologies Inc. Insulin-like growth factor II antisense oligonucleotide sequences and methods of using same to inhibit cell growth
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP1439192A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-21 Xerion Pharmaceuticals AG Neuropilin-1 inhibitors
AU2004275798A1 (en) * 2003-09-23 2005-04-07 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) VEGE-Cor VEGE-D materials and methods for stimulation of neural stem cells
UA96139C2 (uk) * 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999029729A2 (en) * 1997-12-09 1999-06-17 Children's Medical Center Corporation Antagonists of neuropilin receptor function and use thereof
WO1999029858A1 (en) * 1997-12-09 1999-06-17 Children's Medical Center Corporation Soluble inhibitors of vascular endothelial growth factor and use thereof
US20030113324A1 (en) * 2001-10-01 2003-06-19 Kari Alitalo Neuropilin/VEGF-C/VEGFR-3 materials and methods

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Benoit Favier et al..Neuropilin-2 interacts with VEGFR-2 and VEGFR-3 and promotes human endothelial cell survival and migration.《Blood》.2006,第108卷(第4期),1243-1250. *
Diane R.Bielenberg et al..Semaphorin 3F,a chemorepulsant for endothelial cells,induces a poorly vascularized,encapsulated,nonmetastatic tumor phenotype.《Journal of clinical investigation》.2004,第114卷(第9期),1260-1271. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110997724A (zh) * 2017-06-06 2020-04-10 斯特库伯株式会社 使用结合btn1a1或btn1a1-配体的抗体和分子治疗癌症的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2687247A1 (en) 2008-11-27
BRPI0721660A2 (pt) 2013-01-22
ES2469743T3 (es) 2014-06-18
US20100172921A1 (en) 2010-07-08
US20140234312A1 (en) 2014-08-21
CN101754771A (zh) 2010-06-23
WO2008143665A1 (en) 2008-11-27
JP2010527350A (ja) 2010-08-12
KR20100018567A (ko) 2010-02-17
NO20093542L (no) 2010-02-12
AU2007353778A1 (en) 2008-11-27
JP5745840B2 (ja) 2015-07-08
MA31435B1 (fr) 2010-06-01
AU2007353778B9 (en) 2014-04-03
EP2152307A1 (en) 2010-02-17
IL202005A (en) 2014-11-30
UA99292C2 (uk) 2012-08-10
HK1144556A1 (zh) 2011-02-25
AU2007353778B2 (en) 2013-11-07
IL202005A0 (en) 2010-06-16
US8648173B2 (en) 2014-02-11
MX2009012421A (es) 2009-12-01
EP2152307B1 (en) 2014-04-16
KR101520115B1 (ko) 2015-05-13
CR11126A (es) 2010-05-19
US8920805B2 (en) 2014-12-30
HK1134040A1 (en) 2010-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101754771B (zh) 抗神经毡蛋白2抗体对肿瘤转移的抑制
CN101326196B (zh) 神经纤毛蛋白拮抗剂
CN101743253B (zh) 神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构
TWI505836B (zh) 抗－ｖｅｇｆ－ｃ抗體及其使用方法
TW200924794A (en) Novel antibodies
CN103193888B (zh) 神经毡蛋白片段与神经毡蛋白抗体复合物的晶体结构
RU2437677C2 (ru) Ингибирование метастазов опухоли антителами против нейропилина-2
NZ581282A (en) INHIBITION OF TUMOR METASTASIS BY ANTI NEUROPILIN 2 (Nrp2) ANTIBODIES
NZ581286A (en) CRYSTAL STRUCTURES OF Nrp1 and Nrp2 FRAGMENTS AND NEUROPILIN-ANTIBODY COMPLEXES

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1144556

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1144556

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150304

Termination date: 20170517

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee