JP2010527350A - 抗ニューロピリン2抗体による腫瘍転移の阻害 - Google Patents
抗ニューロピリン2抗体による腫瘍転移の阻害 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010527350A JP2010527350A JP2010508352A JP2010508352A JP2010527350A JP 2010527350 A JP2010527350 A JP 2010527350A JP 2010508352 A JP2010508352 A JP 2010508352A JP 2010508352 A JP2010508352 A JP 2010508352A JP 2010527350 A JP2010527350 A JP 2010527350A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nrp2
- cancer
- antibody
- tumor
- nhl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
本発明は、ニューロピリン−2(Nrp2)アンタゴニスト、特に、抗Nrp2抗体と、腫瘍転移の予防および処置におけるその使用に関する。
血管新生は種々の障害の病因に関与していることが現在十分に確立されている。これらとしては、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化症、後水晶体線維増殖症、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症(例えば、糖尿病性網膜症)のような眼内血管新生疾患、加齢関連横斑変性症(AMD)、血管新生緑内障、移植した角膜組織および他の組織の免疫拒絶、慢性関節リウマチおよび乾癬が挙げられる。非特許文献1;非特許文献2;および非特許文献3。
本発明は、少なくとも部分的に、Nrp2に対する高い親和性の機能ブロッキング抗体によって得られた実験結果に基づいている。この抗体を用いて得られた結果は、Nrp2がリンパ性内皮細胞(LEC)遊走の調節において役割を担うこと、そして、その機能が、VEGFレセプターの活性化の増強因子としての以前に割り当てられた役割を超えることを示している。さらに、これらの結果は、Nrp2のブロックがリンパ管新生の阻害と、リンパ節および遠位臓器への転移の劇的な減少につながることを実証している。
(定義)
用語「ニューロピリン」、「NRP」または「Nrp」は、交換可能に使用され、そして、Rossignol et al.(2000)Genomics 70:211−222に記載されるように、ニューロピリン−1(NRP1、Nrp1)、ニューロピリン−2(NRP2、Nrp2)、ならびにこれらのアイソフォームおよび改変体をまとめて称する。ニューロピリンは120〜130kDaの非チロシンキナーゼレセプターである。複数のNRP−1およびNRP−2スプライス改変体および可溶性アイソフォームが存在する。ニューロピリンの基本構造は、5つのドメインから構成される:3つの細胞外ドメイン(a1a2、b1b2およびc)、1つの膜貫通ドメインおよび1つの細胞質ドメイン。a1a2ドメインは、補体成分C1rおよびC1s(CUB)と相同であり、一般に、2つのジスルフィド架橋を形成する4つのシステイン残基を含む。b1b2ドメインは、第VおよびVIII凝固因子と相同である。cドメインの中央部分は、メプリン(meprin)、A5およびレセプターチロシンホスファターゼμタンパク質に対するその相同性に起因して、MAMと称される。a1a2ドメインおよびb1b2ドメインは、リガンドへの結合を担っているのに対し、cドメインは、ホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化に重要である。Gu et al.(2002)J.Biol.Chem.277:18069−76;HeおよびTessier−Lavigne(1997)Cell 90:739−51。
一局面では、本発明は、Nrp2機能のブロックが腫瘍転移を阻害することを示す実験データに基づく。
細胞の遊走および増殖の誘導は、今日までに記載されているVEGFCの中心的な細胞機能のうちの2つである(Joukov et al.,Embo J 16,3898−3911(1997))。したがって、抗Nrp2BでNrp2をブロックすると、LECの遊走はブロックしたが、増殖はブロックしなかった(図2、3)という本発明の知見は驚くべきものであった。この選択性は、Nrp2 siRNAノックダウン実験によって最近報告されているが、これは実験技術の限界によるものであった(Favier et al.,Blood 108,1243−1250(2006))。本明細書中に示されるデータは、Nrp2の機能的な選択性はまたインビボでも認められ、抗Nrp2B処理がVEGFC駆動性のリンパ管新生の低下をもたらしたが、血管透過性の低下はもたらさなかったことを示す(図2、3)。これらの観察は、抗Nrp2Bでの阻害が、単純にVEGFCシグナル伝達を中断させることによって機能するのではないことを示唆する。しかしながら、Nrp2のブロッキングが実際にVEGFレセプターリン酸化における限られた低下をもたらすということが決定され(図3)、これは、Nrp2の役割の1つがVEGFレセプター機能の増強であるという機構を支持している。このことは、異なるVEGFC誘導性の生理学的事象が異なるレベルのVEGFレセプター活性化を必要とし得るという可能性を高めた。したがって、レセプター活性の低下は、遊走に影響を与えるには十分であるが、増殖または血管透過性に影響を与えるには十分ではない場合がある。
Nrp2 KOマウスの解析は、Nrp2が発生段階のリンパ管新生の調節因子であり、この調節はおそらくはそのVEGFC補レセプターとしての役割を介するものであることを実証している(Yuan et al.,2002,上掲)。しかしながら、これらの変異体マウスは生後機能的なリンパ管を形成し、欠陥がリンパ管成長の阻害ではなく遅延を示すのか、または、別の分子メディエーターによる機能の補償が存在しているかのいずれかであることを示している。したがって、成熟なリンパ管の維持および成体でのリンパ管新生におけるNrp2の役割は不明なままである。発現解析(図4)は、リンパ管の維持におけるNrp2の役割を支持しない。興味深いことに、Nrp2は、腫瘍内および腫瘍に隣接するLN内に存在するリンパ管において強く発現されており、Nrp2がリンパ管の活性化もしくは成長において役割を担い得ることが示唆される。インビトロでの観察は、抗Nrp2BがこれらのプロセスにおけるNrp2の役割の評価において有効なツールであることを実証している。したがって、抗Nrp2Bを、角膜マイクロポケットアッセイを用いてインビボで試験した(図2)。抗Nrp2Bは、驚くべきことに、VEGFR3 ECDと同等に、VEGFC誘導性のリンパ管新生を効率的にブロックした。興味深いことに、抗Nrp2Bは、インビボでも選択的な阻害機能を示し、VEGFC誘導性の欠陥透過性に影響を及ぼさなかった。このことは、Nrp2がリンパ管新生に重要なプロセスである遊走を特異的に調節するというインビトロでの観察と合致しているが、血管透過性においては役割は担っていないようである。最後に、これらの抗Nrp2B処置された正常な成体動物は腸のリンパ管に対して何ら変化を示さず、Nrp2が成熟なリンパ管の維持において役割を担っていないことが確認された。
最も頻繁にはVEGFR3 ECDの使用によるVEGFC軸索の阻害は、転移を減少させるためのより一般に利用される戦略の一つである(Chen et al.,2005.上掲;He et al.,2002,上掲;Krishnan et al.,2003,上掲;Lin et al.,2005,上掲)。VEGFCは、リンパ管新生を開始し、それによって、LECと接触する表面積を増大させることによって、LECの接着特性もしくはサイトカイン発現を調節することによって、または、血管透過性を増大させることによって、転移を促進する可能性があり得る(AlitaloおよびCarmeliet,Cancer Cell 1,219−227(2002))。抗Nrp2Bは、VEGFC誘導性の成体におけるリンパ管新生の阻害を含む選択的なVEGFCにより媒介される機能を調節するので、次に、転移に対するNrp2のブロックの影響が検討された。混乱させる変数を最小限にし、そして、転移に対する抗Nrp2Bの役割を明白に評価するために、我々は、Nrp2のブロックが原発性腫瘍の成長に影響を及ぼさないモデルを選択し、さらに、研究において、同じ時点で全ての動物から摘出した(WithersおよびLee,Semin Radiat Oncol 16,111−119(2006))。
多数の臨床病理学研究が、VEGFCおよびVEGFR3の発現が多数のヒト癌におけるリンパ節転移および遠位への転移と相関していることが報告されている(Stacker et al.,Nat Rev Cancer,2002,上掲;Stacker et al.,Faseb J,2002,上掲およびHe et al.,2004,上掲において包括的に概説されている)。しかしながら、Nrp2の発現とその転移との関係性に関しては限られた情報しかない。実際、結び付けは、特に膵臓癌(Cohen et al.,Biochem Biophys Res Commun 284,395−403(2001);Fukahi et al.,Clin Cancer Res 10,581−590(2004))および肺癌(Kawakami et al.,Cancer 95,2196−2201(2002);Lantuejoul et al.,J Pathol 200,336−347(2003))における、Nrp2の発現と悪性との間でしかなされていない。同様に、Nrp2は、膵臓だけでなく、結腸腺癌、頭頚部扁平細胞癌腫、黒色腫、乳頭状甲状腺癌種および胸部の浸潤性管腺癌においてもまた、そのそれぞれのコントロール組織と比してより高いレベルで発現されることが見い出された(図9)。より重要なことには、これらの腫瘍を転移性の群と非転移性の群とに分けると、Nrp2の発現は、これらの腫瘍型の多くで、転移性の群において統計的により高いことが認められた。興味深いことに、これらの腫瘍型では全て腫瘍内リンパ管新生が確認され、そしてこれはさらに、リンパ節転移と相関していた(Achen et al.,2006,上掲;AchenおよびStacker,Int J Cancer 119,1755−1760(2006))。このことは、考察される実験上の知見が種々の腫瘍型を有するヒト患者へと拡張することが期待されることを示している。
本明細書における発明は、抗NRP2抗体の産生および使用を包含する。抗体を作製するための例示的な方法は、以下の節により詳細に記載される。
好ましい実施形態では、抗NRP2抗体は、独特のファージディスプレイアプローチを用いて選択される。このアプローチは、単一のフレームワークテンプレートに基づいた合成抗体ファージライブラリーの作製、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化された可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、標的NRP抗原に対して高い親和性を持つ候補抗体の選択、および選択した抗体の単離を伴う。
ファージライブラリーから作製された抗NRP2抗体はさらに、親抗体を上回る改善された物理的特性、化学的特性および/または生物学的特性を持つ抗体変異体を作製するように改変され得る。使用されるアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は好ましくは、選択したアッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも、少なくとも約10倍良好、好ましくは少なくとも約20倍良好、より好ましくは少なくとも約50倍良好、そしてときおり、少なくとも約100倍もしくは200倍良好なそのアッセイにおける生物学的活性を有する。例えば、抗NRP1抗体変異体は好ましくは、親抗NRP抗体の結合親和性よりも、少なくとも約10倍強力、好ましくは少なくとも約20倍強力、より好ましくは少なくとも約50倍強力、そしてときおり、少なくとも約100倍もしくは200倍強力なNRPに対する結合親和性を有する。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性疎水性:cys、ser、thr、asn、gln;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:his、lys、arg;
(5)鎖の方位に影響を及ぼす残基:gly、pro;そして
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
本発明の抗Nrp2抗体は、容易に入手可能な技術および物質を用いて、組換え的に生成され得る。
本発明の抗体は、直接的に組換えによって生成され得るだけでなく、異種ポリペプチド(好ましくは、成熟なタンパク質もしくはポリペプチドのN末端に特異的な切断部位を持つシグナル配列もしくは他のポリペプチド)と融合ポリペプチドとしても生成され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞よって認識およびプロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。ネイティブな抗体シグナル配列を認識もプロセシングもしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列で置き換えられる。酵母分泌物については、ネイティブなシグナル配列は、例えば、酵母インバーターゼリーダー、α因子リーダー(SaccharomycesおよびKluyveromycesのα因子リーダーを含む)、もしくは、酸性ホスファターゼリーダー、C.albicansのグルコアミラーゼリーダー、または、WO 90/13646に記載されるシグナルによって置き換えられ得る。哺乳動物細胞での発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー(例えば、単純疱疹ウイルスgDシグナル)が利用可能である。
発現ベクターおよびクローニングベクターは共に、1以上の選択した宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主の染色体DNAとは独立したベクターの複製を可能にするものであり、複製起点または自律複製配列が挙げられる。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドpBR322由来の複製起点は、多くのグラム陰性細菌に適しており、2μプラスミドの起点は酵母に適しており、そして、種々のウイルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV)は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない(代表的に、SV40起点は初期プロモーターを含んでいるという理由だけで使用され得る)。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリン)に対する耐性を与えるか、(b)栄養要求性欠陥を補完するか、または(c)複合培地からは利用可能でない重要な栄養分(例えば、Bacilliについて、D−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子)を供給するタンパク質をコードする。
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、そして抗体の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主と共に使用するのに適したプロモーターとしては、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌性プロモーターも適している。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、抗体をコードするDNAに対して作動可能に連結されたShine−Dalgarno(S.D.)配列を含む。
本発明の抗体をコードするDNAの高等真核生物による転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大される。哺乳動物遺伝子(グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン)に由来する多くのエンハンサー配列が現在公知である。しかしながら、代表的には、真核生物細胞であるウイルスに由来するエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側(bp100〜270)にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマのエンハンサーおよびアデノウイルスのエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関しては、Yaniv(1982)Nature 297:17−18もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して5’または3’の位置で、ベクターに接合され得るが、好ましくは、プロモーターの5’側の部位に位置する。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または、他の多細胞生物由来の有核細胞)において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5’(ときおり3’)の非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分に、ポリアデニル化されたフラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026およびこの文献に開示される発現ベクターを参照のこと。
本明細書中のベクターにおいてDNAをクローニングまたは発現させるために適切な宿主細胞は、上述した、原核生物、酵母またはより高級な真核生物の細胞である。この手順のために適した原核生物としては、以下が挙げられる:グラム陰性生物もしくはグラム陽性生物のような真正細菌(例えば、Enterobacteriaceae(例えば、Escherichia、例えば、E.coli)、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella(例えば、Salmonella typhimurium)、Serratia(例えば、Serratia marcescans)およびShigella、ならびにBacilli(例えば、B.subtilisおよびB.licheniformis(例えば、1989年4月12日に公開されたDD 266,710に開示されるB.licheniformis 41P))、Pseudomonas(例えば、P.aeruginosa)ならびにStreptomyces。1つの好ましいE.coliクローニング宿主は、E.coli 294(ATCC 31,446)であるが、E.coli B、E.coli X1776(ATCC 31,537)およびE.coli W3110(ATCC 27,325)のような他の株も適切である。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。
本発明の抗体を生成するために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。宿主細胞の培養には、Ham’s F10(Sigma)、基礎培地(Minimal Essential Medium)((MEM),(Sigma))、RPMI−1640(Sigma)およびダルベッコの改変イーグル培地((DMEM),Sigma)のような市販の培地が適している。さらに、Ham et al.(1979)Meth.Enz.58:44、Barnes et al.(1980)Anal.Biochem.102:255、米国特許第4,767,704号;同第4,657,866号;同第4,927,762号;同第4,560,655号;もしくは同第5,122,469号;WO 90/03430;WO 87/00195;または米国再発行特許第30,985号に記載される培地のいずれかが、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび/もしくは他の成長因子(例えば、インシュリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸)、緩衝剤(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬物)、微量元素(通常はμM範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補充され得る。当業者に公知の任意の他の必要な補充物もまた適切な濃度で含められ得る。温度、pHなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前から使用されているものであり、そして、当業者にとり明らかである。
組換え技術を用いる場合、抗体は、ペリプラズム空間において細胞内で生成され得るか、または、培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生成される場合、第一の工程として、宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれかの粒子状破片が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Carter et al.(1992)Bio/Technology 10:163−167は、E.coliのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡単に述べると、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTAおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で約30分かけて細胞のペーストを解凍させる。細胞破片は遠心分離により除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、一般に、このような発現系からの上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター(例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon製の限外濾過ユニット)を用いて濃縮される。タンパク質分解を阻害するため、PMSFのようなプロテアーゼインヒビターが上記工程のいずれかにおいて含められ得、そして、外来の汚染物の成長を防止するため、抗生物質が含められ得る。
抗体の治療用処方物は、凍結乾燥された処方物もしくは水溶液の形態で、所望の程度の純度を持つ抗体を、任意の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤もしくは安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.Ed.(1980))と混合することによって、保存のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、そして、以下のようなものが挙げられる:緩衝剤(例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸);抗酸化物質(アスコルビン酸およびメチオニンを含む);保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン類(例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン);カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノールおよびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン);単糖類、二糖類および他の糖質(グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む);キレート化剤(例えば、EDTA);糖類(例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール);塩形成対イオン(例えば、ナトリウム);金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);および/または非イオン性界面活性剤(例えば、TWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG))。
本発明の抗体は、哺乳動物を処置するために使用され得ることが企図される。例えば、一実施形態では、抗体は、臨床データを得る目的のために非ヒト哺乳動物に投与される。処置される例示的な非ヒト哺乳動物としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、および、臨床研究が行われる他の哺乳動物が挙げられる。このような哺乳動物は、抗体で処置されるべき疾患についての確立された動物モデルであり得るか、または、関心のある抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらに実施形態の各々において、用量増大研究が哺乳動物において行われ得る。例えば、抗体が抗NRP2抗体である場合、抗体は、固形腫瘍モデルにおける宿主のげっ歯類に対して投与され得る。
抗Nrp2Bを、先に記載されたように、ヒト合成抗体ファージライブラリーから単離した(Lee et al.,J Mol Biol 340,1073−1093 (2004))。簡単に述べると、重鎖相補性決定領域(CDR)内の溶媒に曝露される位置に合成的に多様性を導入することによって、単一のヒトフレームワークに対してファージディスプレイ合成抗体ライブラリーを構築した。ライブラリーの性能を高めるために、一価および二価の抗原結合フラグメント(Fab)ライブラリーを構築し、そして、アミノ酸組成およびCDRの長さを変化させることによって、多様なCDR−H3の多様性を探究した。次に、このライブラリーを、CDR−H3の長さの多様性を増やし、そして、天然に存在するCDR−H3配列のアミノ酸組成を模倣するように合わせたコドンを用いることによって拡大した。完全に合成のCDRが単一の足場上にディスプレイされるこれらのライブラリーを用いて、高親和性の抗体を生成した。単一の鋳型を用いた合成抗体ライブラリーの作製のための戦略および方法のさらなる詳細については、例えば、2003年12月11日に公開されたWO03/102157(この全開示は明示的に本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。
(材料および方法)
(細胞培養)
HMVEC−dLyAd − ヒト皮膚微小リンパ管内皮細胞(LEC)およびHUVECはCambrexから購入し、そして、EGM−2培地(Cambrex)中で培養した。C6 LacZ細胞はATCCから購入した。66C14は、親切にFred R Miller博士からご提供いただいた。腫瘍細胞は、10% FBSを補充したDMEM(Gibco)中で培養した。全ての細胞を、5% CO2、湿度95%のインキュベーターにおいて37℃に維持した。
96ウェルの黒−透明底プレート(VWR)を、37℃にて2時間、5μg/mlのフィブロネクチン(Invitrogen)でコーティングした。LECを回収し、アッセイ培地(0.1% BSA、EGM−2)中に3000細胞/100μlで再懸濁させ、ウェルに加えた。細胞を37℃にて16時間インキュベートした。BrdU標識溶液(Cell Proliferation ELISAキット;Roche)を加え、そして、細胞を37℃にてさらに24時間インキュベートした。BrdUの取り込みを、化学発光免疫アッセイによって決定した(各条件につき6ウェル)。
VEGFCにより媒介される遊走および増殖に対するNrp2の役割を検討した。これらは、VEGFCによって誘導される重要な細胞の活動である(Joukov et al.,Embo J 16,3898−3911(1997))。LECは、以前に、VEGFCに対して高度に応答性であることが示されている(Makinen et al.,Embo J 20,4762−4773(2001);Veikkola et al.,Faseb 17,2006−2013(2003);Whitehurst et al.,Lymphat Res Biol 4,119−142(2006))。トランスウェルシステム(transwell system)を用い、ヒトLECを上部チャンバに導入する一方で、VEGFCを底部チャンバに加え、遊走を促進した。その後、底部に遊走したLECを固定し、染色し(図2A)、そして、定量した(図2B)。VEGFR3の最初の3つの(リガンド結合)Igドメインを含むVEGFR3細胞外ドメインタンパク質(ECD)を、この実験および続く実験におけるVEGFCにより駆動される遊走のブロックについてのポジティブコントロールとして用いた(Makinen et al.,Nat Med 7,199−205(2001))。Nrp2の機能がLECの遊走に必要とされたかどうかを決定するために、VEGFCを加える直前に、上部チャンバ内の細胞に抗Nrp2B mAbを加えた。抗Nrp2Bは、VEGFCにより媒介されるLECの遊走を有意に低下させ得た(図2A、2B;p=0.004)。阻害レベルは、VEGFCにより媒介されるLECの遊走を完全に阻害したVEGFR3 ECDで見られたものよりも少なかった(図2A、2B;コントロールに対してp<0.001;抗Nrp2Bに対してp=0.002)。別のVEGFC応答性原発性細胞株であるHUVECを用いた場合も同様の結果が得られた。
(材料および方法)
(マウス角膜マイクロポケットアッセイ)
先に記載されたように、成体CD−1マウス(Charles−River)に麻酔をかけ、微小切開によって、上皮内に角膜の中心から1mmの場所に2×3mmのポケットを作製した(Polverini et al.,Methods Enzymol 198,440−450(1991))。リンパ管形成活性について試験する因子を不活性なヒドロン(hydron)ペレット(2×2mm)内に固定した。続いて、このペレットをポケットの底に埋め込んだ。動物を、2週間にわたって週2回、コントロール抗体(10mg/kg)、抗Nrp2B(10mg/kg)またはVEGFR3 ECD(25mg/kg)のIP処置を施した。続いて、動物を屠殺し、角膜を切開した。抗LYVE−1抗体(R&D Systems 1:500)を用いたホールマウントIHCによってリンパ管を可視化した。角膜を撮像し、そして、縁から生じているLYVE−1陽性のリンパ管を定量した。
成体C57BL6J雌性マウスの背部および側腹部を悌毛し、4つの処置領域に区分した。続いて、これらに、150μl 0.5%のエバンスブルー溶液をi.v.注射した。エバンスブルー溶液の注射から1時間後に、抗体(0.5mg/ml)を含むかまたは含まない、BSAまたはhVEGF(7.5μg/ml)を含有する20μlのPBSを、4つのゾーンのうちの1つに無作為に皮内注射した。1時間後、動物を屠殺し、皮膚を切開し、そして画像化した。各注射ゾーンについての皮膚サンプルを切り出し、そして、55℃にて48時間ホルムアミド溶液中でインキュベートして、青色の色素を抽出下。続いて、600nmにてこの溶液の吸光度を分光光度計で測定した。
インビトロでNrp2をブロッキングすることによって、LEC遊走の有意な低下が観察されたので、次に、Nrp2がインビボにおけるVEGFC機能の調節に必要とされるかどうかを検討した。本発明者らは、2つの十分に特徴付けられたVEGFCにより媒介されるインビボ活性−−リンパ管新生および血管透過性について検討した(Cao et al.,Circ Res 94,664−670(2004);Joukov et al.,J Biol Chem 273,6599−6602(1998);Kubo et al.,Proc Natl Acad Sci USA 99,8868−8873(2002);Saaristo et al.,Faseb J 16,1041−1049(2002))。リンパ管新生について検討するために、マウス角膜マイクロポケットアッセイ(Kubo et al.,2002,上掲)を利用した。このアッセイでは、VEGFCのペレットを成体マウスの血管のない角膜に導入した。14日間にわたり、VEGFCに応答して、リンパ管の密集した叢が縁から角膜内へと成長した(図2E;VEGFC処置で12,000ピクセル2であったのに対し、コントロールでは2284ピクセル2)。これらの脈管を、LYVE−1免疫組織化学(IHC)で標識し、その後定量した(図2D)。VEGFR3 ECDの全身投与は、このVEGFCにより誘導されるリンパ管新生をほぼ完全にブロックした(2671ピクセル2;p<0.001)。抗Nrp2Bはまた、角膜のリンパ管形成応答も効率的にブロックした(3281ピクセル2;p<0.001)。このブロックは、VEGFR3 ECDを用いて観察されたブロックの程度と同様であった(図2E、2D;p=0.67)。
(材料および方法)
(細胞遊走アッセイ)
改変したBoydenチャンバを8μMポアサイズのFalcon 24−マルチウェルインサートシステム(BD Biosciences)と共に用いて遊走アッセイを行った。プレートを、37℃にて2時間、5μg/mlのフィブロネクチン(Invitrogen)でコーティングした。100μlのアッセイ培地(0.1% GSA、EGM−2)中の細胞を、抗体有り/無しで底部チャンバに加えた。化学遊走物質を500μlアッセイ培地中、底部チャンバに加え、そして、細胞を37℃にて16時間インキュベートした。上部メンブレン上の細胞をスポンジスワブで除き、そして、底部表面上の細胞を70%エタノール中で固定し、Sytoxグリーン(Molecular Probes)で染色した。ウェルの全底部表面から像を撮り、そして、遊走した細胞の数をカウントした。(各条件につき6ウェル)。
コンフルエントなLECを、コントロールまたは抗Nrp2B抗体(10μg/ml)と共に、37℃にて5分間、2時間または20時間インキュベートした。細胞を、酵素を含まない細胞分離バッファー(Gibco)を用いて回収し、そして、5%正常マウス血清、2%正常ラット血清および10% 10μg/mlヒトIgGを含有するFACSバッファー(PBS、2% FBS、2mM EDTA、0.1%アジ化ナトリウム)中1:100のビオチニル化抗体と共にインキュベートした。FluoReporterミニ−ビオチン−xxタンパク質標識キット(Molecular Probes)を用いて抗体をビオチン化した。次いで、細胞をFACSバッファーで洗浄し、そして、ストレプトアビジン−PE(BD Biosciences)で染色した。データはFacsCaliburシステム(BD Biosciences)を用いて解析した。
サブコンフルエントなLECをコントロールまたは抗Nrp2B抗体(10μg/ml)と共に、100μlのMedium 199中、37℃にて30分間プレインキュベートし、次いで、1μg/mlのフィブロネクチン(Roche)でコーティングしたNUNC maxisorp平底96ウェルプレート(eBioscience)中に1ウェルあたり10,000細胞でプレーティングした。プレートを140gで1分間遠心分離して、基質との細胞の接触を同調させ、37℃にて30分間インキュベートした。次いで、プレートをPBSで3回洗浄し、そして−80℃にて凍結させた。細胞密度をCyQuantキット(Molecular Probes)を用いて決定した。
コンフルエントなHUVECを、コントロールまたは抗Nrp2B抗体の存在下もしくは非存在下、200ng/mlのVEGFCで10分間刺激した。細胞を溶解させ、そして、VEGFレセプターのシグナル伝達における役割を担うことが知られる多くのメディエーターについてアッセイした。総VEGFR2およびホスホ−VEGFR2のELISAアッセイ(DuoSet IC ELISAキット,R&D)を用いてVEGFR2の活性化を評価した。以前に記載されたように、VEGFR3−293細胞株と共にキナーゼレセプター活性化アッセイ(KIRA)を用いてVEGFR3の活性化を評価した(Sadick et al.,J Pharm Biomed Anal 19,883−891(1999))。簡単に述べると、全長Flagをタグ化されたヒトhVEGFR3を発現する安定な293細胞株を、刺激後のレセプターリン酸化についてアッセイした。5×104細胞を一晩栄養枯渇状態にし(DMEM+0.1% BSA)、次いで、40ng/ml VEGFA(Genentech South San Francisco,CA)または200ng/ml VEGFC(Genentech South San Francisco,CA)で8分間刺激した。細胞を1%トリトンおよびオルトバナジン酸ナトリウムを含有するPBS中で溶解させた。ELISAプレートを捕捉Flag抗体(Sigma St Louis,MO)でコーティングした。このプレートを一晩コーティングし(PBS+1μg/mlの抗体)、そして1時間ブロッキングした(PBS+0.5% BSA)。3回の洗浄の後(PBS+0.05% Tween 20)、溶解物を2時間加え、3回洗浄し、その後、リン酸検出抗体4G10(Upstate Lake Placed,NY)を2時間加えた。検出は、HRP抗体(Amersham Piscataway,NJ)およびTMB基質を用いて行った。プレートを450nmにて読み取った。BioSource製のサンドイッチELISAキットを用いて総AKT、ホスホ−AKT、総Erk1/2、ホスホ−Erk1/2、総Src、ホスホ−Src、総p38 MAPKおよびホスホ−p38 MAPKを評価した。
抗Nrp2BがVEGFCの作用を妨害するという知見は、抗Nrp2BがNrp2へのVEGFCの結合をブロックするという事実と一致した。さらに、抗Nrp2Bがインビトロおよびインビボの両方で選択的な機能のみをブロックするという事実は、大いに予想外であった。LECの遊走およびリンパ管新生の中断は観察されたものの、LECの増殖または血管透過性は観察されなかったことの1つの可能性のある説明は、抗Nrp2Bが、一般に、おそらくはLECの細胞外マトリクスへの接着を途絶させることによって、遊走を阻害し得るというものである。これを検討するため、多数のLECマイトジェンにより誘導される遊走に対する抗Nrp2Bの作用を評価した。抗Nrp2BはVEGF(図2C)、HGF(図3B)またはFGFにより誘導された遊走に対しいかなる作用も有さなかった。したがって、抗Nrp2Bは一般にLECの遊走を途絶さえなかった。さらに、抗Nrp2Bは、2つの細胞外マトリクス基質であるフィブロネクチンまたはコラーゲンに対するLECの接着に対してもいかなる作用も有さなかった。
(材料および方法)
(免疫組織化学)
18μmの組織切片を切断し、そして、ガラススライド上にマウントした。切片を一次抗体(抗Nrp2B(その発現が十分に特徴付けられたE12.5マウスの脊髄において行った1:500のコントロール染色)、抗LYVE−1(R&D、1:200)、抗PECAM−1(Benton Dickinson、1:500)、抗PROX−1(Chemicon、1:1000)またはKi67(Neovision、1:100))と共に4℃にて一晩インキュベートした。次いで、サンプルを、Alexa 488またはAlexa 568二次抗体(1:200;Molecular Probes)を用いて室温にて4時間染色した。二次抗体のみの染色をコントロールとして用いた。市販のキット(Roche)を用いてTUNNEL染色を行った。Zeiss Axiophot蛍光顕微鏡を用いて撮像した。各群6つの腫瘍の各々からの6つの像から血管およびリンパ管の領域を決定し、ImageJによって平均ピクセル数について評価した。
Nrp2が成体のリンパ管生物学において役割を担うかどうかを決定するために、成体のリンパ管におけるNrp2の発現を評価した。脈管系では、Nrp2の発現は、これまでに、静脈およびリンパ管において記載されている(Herzog et al.,Mech Dev 109,115−119(2001);Moyon et al.,Development 128,3359−3370(2001);Yuan et al.,Development 129,4797−4806(2002))。上述のように、培養中のLECはNrp2を強く発現する(追加図1)。しかしながら、本発明者らは、正常な成体マウスの結腸LYVE−1陽性リンパ管におけるIHCによってNrp2を検出することができなかった(図4A;ポジティブコントロールの染色については追加図4を参照のこと)。結腸は、かなり型にはまった様式のリンパ管の豊かな叢を有するので、結腸を評価した。本発明者らはまた、正常な成体マウスからのリンパ節(図4B)および皮膚のリンパ管におけるIHCによってもNrp2の発現を検出することができなかった。これらの結果は、Nrp2インサイチュハイブリダイゼーション(ISH)によって確認された。対照的に、同所移植もしくは異所移植した腫瘍に隣接するリンパ節におけるLYVE−1+リンパ管において、強いNrp2の発現が観察された(図4C)。これは、同所移植されたマウス乳腺癌株66c14(AslaksonおよびMiller,Cancer Res 52,1399−1405(1992))および異所移植されたラット神経膠芽細胞腫株C6(データ示さず)を含む多数の腫瘍株で観察された。Nrp2はまた、66c14、C6およびPC3(ヒト前立腺癌腫株)を含む多数の腫瘍株について、腫瘍周囲および腫瘍内のリンパ節においても観察された(図4D)。この発現は、腫瘍型の一部におけるISHによって確認された。
(材料および方法)
全ての動物研究は、NIHによって出版されたGuide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH Publication 85−23,1985改訂)に従った。Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)は全ての動物実験プロトコールを承認した。
66c14については、トリプシン処理により細胞を回収し、洗浄し、10μlのPBS中2×105細胞の濃度でPBS中に再懸濁させた。75mg/kgのケタミンおよび7.5mg/kgのキシラジンを用いてマウスに麻酔をかけ、そして、右前肢の下部に切開を設けた。10μl PBS中の2×105細胞を6〜8週齢の雌性balb−Cマウスの露出された第4乳房脂肪体に直接注射した。C6については、100μl PBS中の2×106腫瘍細胞を6〜8週齢の雌性balb−Cヌードマウスの右側腹部に皮下注射した。両方の研究セットについて、腫瘍成長を週3回モニタリングした。腫瘍が80〜120mm3の平均サイズに達すると、マウスをほぼ同一な群平均腫瘍サイズを与えるように選別し、処置を開始した。これを、各研究についての1日目とみなした。動物を、研究終了まで、コントロール抗体(10mg/kg)、抗Nrp2B(10mg/kg)またはVEGFR3 ECD(25mg/kg)で週2回IPにより処置した。全ての研究は3回繰り返し、再現性を確保した。
肺を10% NBF中に24時間含浸させ、その後、ヨウ素ベースのX線コンピュータ断層撮影用造影剤であるIsovue370(Bracco Diagnostics Inc,Princeton,NJ)をPBSで希釈した20%溶液中に24時間含浸させた。次いで、肺を20mlの大豆油(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を含む気管カニューレ中に含浸させ、そして、0.25ml/分の速度で灌流させた。大豆油を用いて過剰な造影剤を除き、そして、造影のためのバックグラウンド媒体を提供した。
転移阻害のための1つの主要なアプローチは、VEGFC軸索の阻害によるものである(Chen et al.,Cancer Res 65,9004−9011(2005);He et al.,J Natl Cancer Inst 94,819−825(2002);Krishnan et al.,Cancer Res 63,713−722(2003);Lin et al.,Cancer Res 65,6901−6909(2005))。Nrp2機能のブロッキングがまた、転移の発生を調節し得るかどうかを決定するため、肺転移の形成に対する抗Nrp2B処置の作用を2つの異なる腫瘍モデル66c14乳癌モデルおよびC6神経膠芽細胞腫モデルにおいて検討した。66c14は、Balb/cマウスの自然発生した乳癌由来のマウス乳腺癌株である(Aslakson and Miller,Cancer Res 52,1399−1405(1992))。これらの細胞は、VEGFCを発現し、リンパ系を介して肺に対して転移する(Aslakson and Miller,1992,上掲)。Balb/cマウスにおけるこれらの細胞の同所移植は、再現性のある腫瘍の発生と肺の転移とをもたらした。抗Nrp2B処置は、腫瘍の初期段階の成長速度に対して影響を及ぼさなかった(図5A)。VEGFR3 ECDは初期段階の腫瘍成長速度を劇的に低下させたので、あらゆるさらなる転移の解析から除外した。両方の処置アームからの同様のサイズの腫瘍を持つ動物のコホート(各群につきN=6)を、同時に屠殺し、そして、肺を切開して摘出して、転移性小結節の解析を容易にするために膨張させた。抗Nrp2Bは、コントロールのIgG処置動物(図5B、C)と比較して、平均3.5から0.8への、1肺あたりの目視により検出された転移性小結節の平均数の劇的な減少を引き起こした(P=0.03)。この結果を確認し、そして、目視による検査になじまなかった肺実質組織内の転移に本発明者らの評価を拡張させるため、本発明者らは、検死後に肺のマイクロ−CT解析(Li et al.,Technol Cancer Res Treat 5,147−155(2006))を行った。この解析は、抗Nrp2B処置した動物が、コントロール処置動物(図5D〜F)と比較したときに、肺転移数の減少を有したことを確認した。しかし、マイクロ−CT解析は両方の群における転移性小結節の大きな絶対数をもたらす目視による解析よりも感受性であった。マイクロ−CTはまた、肺内の総転移性負荷を決定することを可能にした。抗Nrp2B処置はまた、コントロール処置(1.78cm3)と比較して、総転移容積の減少(0.74cm3)をもたらした。さらに、この解析は、コントロール処置動物および抗Nrp2B処置動物の両方における肺の表面上には、膨大な数の病巣が存在していることを確認した。したがって、抗Nrp2Bは、表面から肺実質組織へと小結節を移動させるによって転移の減少を引き起こさなかった。
Claims (44)
- 必要とする哺乳動物被験体に有効量のニューロピリン−2(Nrp2)アンタゴニストを投与する工程を包含する、リンパ性内皮細胞の遊走を阻害するための方法。
- 前記哺乳動物被験体がヒト患者である、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト患者が癌と診断されている、請求項2に記載の方法。
- 前記ヒト患者が腫瘍転移を発症しているかまたは腫瘍転移を発症する危険性がある、請求項3に記載の方法。
- 前記転移がリンパ系における転移である、請求項4に記載の方法。
- 前記転移が遠隔の器官における転移である、請求項4に記載の方法。
- 前記癌が癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記癌が、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、消化管癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌(kidney or renal cancer)、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝性癌腫および種々の型の頭頚部癌、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL);急性リンパ芽球性白血病(ALL);毛様細胞性白血病;慢性骨髄芽球性白血病;移植後リンパ球増殖性障害(PTLD)、母斑症に伴う腹部脈管増殖、脳腫瘍に伴う浮腫およびメイグス症候群からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ腫が、軽度悪性/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL);小リンパ球性(SL)NHL;中等度悪性/濾胞性NHL;中等度悪性びまん性NHL;高度悪性免疫芽球性NHL;高度悪性リンパ芽球性NHL;高度悪性小型非切れ込み核細胞性NHL;巨大腫瘤病変NHL;マントル細胞リンパ腫;AIDS関連リンパ腫;およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記Nrp2アンタゴニストが抗Nrp2抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗Nrp2抗体が抗Nrp2B抗体である、請求項10に記載の方法。
- 前記抗Nrp2抗体が、YW68.4.2もしくはYW68.4.2.36の重鎖および/もしくは軽鎖可変ドメイン配列、または、これらのフラグメントもしくは改変体を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記抗Nrp2B抗体がYW68.4.2およびYW68.4.2.36、ならびにこれらのフラグメントからなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記抗Nrp2抗体が抗Nrp2A抗体である、請求項10に記載の方法。
- 前記抗Nrp2A抗体が、YW126.20の重鎖および/もしくは軽鎖可変ドメイン配列、または、これらのフラグメントもしくは改変体を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記抗Nrp2A抗体がYW126.20またはそのフラグメントである、請求項15に記載の方法。
- 腫瘍を担持する哺乳動物被験体に有効量のNrp2アンタゴニストを投与する工程を包含する、腫瘍性のリンパ管新生を阻害するための方法。
- 腫瘍を担持する哺乳動物被験体に有効量のNrp2アンタゴニストを投与する工程を包含する、腫瘍転移を阻害するための方法。
- 前記哺乳動物被験体がヒト癌患者である、請求項17または請求項18に記載の方法。
- 前記ヒト癌患者が腫瘍転移を発症しているかまたは腫瘍転移を発症する危険性がある、請求項19に記載の方法。
- 前記転移がリンパ系における転移である、請求項20に記載の方法。
- 前記転移が遠隔の器官における転移である、請求項20に記載の方法。
- 前記癌が癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記癌が、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、消化管癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌(kidney or renal cancer)、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝性癌腫および種々の型の頭頚部癌、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL);急性リンパ芽球性白血病(ALL);毛様細胞性白血病;慢性骨髄芽球性白血病;移植後リンパ球増殖性障害(PTLD)、母斑症に伴う腹部脈管増殖、脳腫瘍に伴う浮腫およびメイグス症候群からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ腫が、軽度悪性/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL);小リンパ球性(SL)NHL;中等度悪性/濾胞性NHL;中等度悪性びまん性NHL;高度悪性免疫芽球性NHL;高度悪性リンパ芽球性NHL;高度悪性小型非切れ込み核細胞性NHL;巨大腫瘤病変NHL;マントル細胞リンパ腫;AIDS関連リンパ腫;およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記Nrp2アンタゴニストが抗Nrp2抗体である、請求項19に記載の方法。
- 前記抗Nrp2抗体が抗Nrp2B抗体である、請求項26に記載の方法。
- 前記抗Nrp2B抗体が、YW68.4.2もしくはYW68.4.2.36の重鎖および/もしくは軽鎖可変ドメイン配列、または、これらのフラグメントもしくは改変体を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記抗Nrp2B抗体がYW68.4.2およびYW68.4.2.36、ならびにこれらのフラグメントからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記抗Nrp2抗体が抗Nrp2A抗体である、請求項26に記載の方法。
- 前記抗Nrp2A抗体が、YW126.20の重鎖および/もしくは軽鎖可変ドメイン配列、または、これらのフラグメントもしくは改変体を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記抗Nrp2A抗体がYW126.20またはそのフラグメントである、請求項31に記載の方法。
- YW68.4.2およびYW68.4.2.36、またはこれらのフラグメントもしくは改変体からなる群より選択される抗体の重鎖および/もしくは軽鎖可変領域配列を含む、抗Nrp2B抗体。
- 前記改変体が親和性成熟した改変体である、請求項33に記載の抗体。
- YW68.4.2およびYW68.4.2.36ならびにこれらのフラグメントからなる群より選択される、請求項33に記載の抗体。
- YW126.20の重鎖および/もしくは軽鎖可変領域配列、またはそのフラグメントもしくは改変体を含む、抗Nrp2A抗体。
- 前記改変体が親和性成熟した改変体である、請求項36に記載の抗体。
- YW126.20またはそのフラグメントである、請求項36に記載の抗体。
- 薬学的に受容可能なキャリアと混合した状態で請求項33〜38のいずれか1項に記載の抗体を含む組成物。
- 薬学的に受容可能なキャリアと混合した状態で有効量のNrp2アンタゴニストを含む、腫瘍転移の予防または処置のための薬学的組成物。
- 前記アンタゴニストが抗Nrp2抗体である、請求項40に記載の薬学的組成物。
- 前記抗Nrp2抗体がYW68.4.2、YW68.4.2.36およびYW126.20、ならびにこれらのフラグメントおよび改変体からなる群より選択される、請求項41に記載の薬学的組成物。
- 腫瘍転移の予防または処置において使用するためのNrp2アンタゴニスト。
- 腫瘍転移の予防または処置において使用するための抗Nrp2抗体。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/US2007/069179 WO2008143665A1 (en) | 2007-05-17 | 2007-05-17 | Inhibition of tumor metastasis by anti neuropilin 2 antibodies |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010527350A true JP2010527350A (ja) | 2010-08-12 |
JP5745840B2 JP5745840B2 (ja) | 2015-07-08 |
Family
ID=39301228
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010508352A Expired - Fee Related JP5745840B2 (ja) | 2007-05-17 | 2007-05-17 | 抗ニューロピリン2抗体による腫瘍転移の阻害 |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8648173B2 (ja) |
EP (1) | EP2152307B1 (ja) |
JP (1) | JP5745840B2 (ja) |
KR (1) | KR101520115B1 (ja) |
CN (1) | CN101754771B (ja) |
AU (1) | AU2007353778B9 (ja) |
BR (1) | BRPI0721660A2 (ja) |
CA (1) | CA2687247A1 (ja) |
CR (1) | CR11126A (ja) |
ES (1) | ES2469743T3 (ja) |
HK (2) | HK1134040A1 (ja) |
IL (1) | IL202005A (ja) |
MA (1) | MA31435B1 (ja) |
MX (1) | MX2009012421A (ja) |
NO (1) | NO20093542L (ja) |
UA (1) | UA99292C2 (ja) |
WO (1) | WO2008143665A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021521110A (ja) * | 2018-04-06 | 2021-08-26 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | 抗nrp2抗体を含む組成物及び方法 |
US11807687B2 (en) | 2019-10-03 | 2023-11-07 | Atyr Pharma, Inc. | Therapeutic compositions comprising anti-NRP2 antibodies |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2690281A1 (en) * | 2007-05-11 | 2008-11-20 | The Johns Hopkins University | Biomarkers for melanoma |
US20110091384A1 (en) * | 2009-10-13 | 2011-04-21 | The Johns Hopkins University | Biomarker for identification of melanoma tumor cells |
CN114717206A (zh) | 2013-03-15 | 2022-07-08 | Atyr 医药公司 | 组氨酰-trna合成酶-fc缀合物 |
WO2015095686A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Trustees Of Boston University | Assays and methods relating to the treatment of melanoma |
EP3612215A4 (en) | 2017-04-20 | 2021-05-26 | aTyr Pharma, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF Pneumonia |
EP3635007A1 (en) | 2017-06-06 | 2020-04-15 | STCube & Co., Inc. | Methods of treating cancer using antibodies and molecules that bind to btn1a1 or btn1a1-ligands |
CN114277152A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-04-05 | 张赟建 | 用于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的特异性基因及制备方法 |
CN114262683B (zh) * | 2022-03-01 | 2022-06-17 | 中国科学院动物研究所 | 一种表达vegfr3 d2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999029729A2 (en) * | 1997-12-09 | 1999-06-17 | Children's Medical Center Corporation | Antagonists of neuropilin receptor function and use thereof |
JP2007506754A (ja) * | 2003-09-23 | 2007-03-22 | ラドウィグ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ | 神経幹細胞の刺激のためのvegf−cまたはvegf−d物質および方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL117645A (en) | 1995-03-30 | 2005-08-31 | Genentech Inc | Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration |
DE69829891T2 (de) | 1997-04-07 | 2005-10-06 | Genentech, Inc., South San Francisco | Anti-VEGF Antikörper |
DK0971959T3 (da) | 1997-04-07 | 2006-05-15 | Genentech Inc | Humaniserede antistoffer og fremgangsmåder til dannelse af humaniserede antistoffer |
CA2313348A1 (en) | 1997-12-09 | 1999-06-17 | Children's Medical Center Corporation | Soluble inhibitors of vascular endothelial growth factor and use thereof |
US6417169B1 (en) * | 1998-04-23 | 2002-07-09 | Genesense Technologies Inc. | Insulin-like growth factor II antisense oligonucleotide sequences and methods of using same to inhibit cell growth |
US20030113324A1 (en) | 2001-10-01 | 2003-06-19 | Kari Alitalo | Neuropilin/VEGF-C/VEGFR-3 materials and methods |
CA2488441C (en) | 2002-06-03 | 2015-01-27 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
EP1439192A1 (en) * | 2003-01-15 | 2004-07-21 | Xerion Pharmaceuticals AG | Neuropilin-1 inhibitors |
UA96139C2 (uk) * | 2005-11-08 | 2011-10-10 | Дженентек, Інк. | Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1) |
-
2007
- 2007-05-17 WO PCT/US2007/069179 patent/WO2008143665A1/en active Application Filing
- 2007-05-17 UA UAA200913144A patent/UA99292C2/uk unknown
- 2007-05-17 EP EP07783895.1A patent/EP2152307B1/en active Active
- 2007-05-17 KR KR1020097026228A patent/KR101520115B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2007-05-17 MX MX2009012421A patent/MX2009012421A/es active IP Right Grant
- 2007-05-17 ES ES07783895.1T patent/ES2469743T3/es active Active
- 2007-05-17 US US12/598,537 patent/US8648173B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-05-17 CA CA002687247A patent/CA2687247A1/en not_active Abandoned
- 2007-05-17 BR BRPI0721660-2A patent/BRPI0721660A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-05-17 AU AU2007353778A patent/AU2007353778B9/en not_active Ceased
- 2007-05-17 JP JP2010508352A patent/JP5745840B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-05-17 CN CN200780053792.7A patent/CN101754771B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-11-09 IL IL202005A patent/IL202005A/en not_active IP Right Cessation
- 2009-11-24 CR CR11126A patent/CR11126A/es not_active Application Discontinuation
- 2009-12-07 MA MA32406A patent/MA31435B1/fr unknown
- 2009-12-16 NO NO20093542A patent/NO20093542L/no not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-03-01 HK HK10102110.9A patent/HK1134040A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-11-30 HK HK10111154.7A patent/HK1144556A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-06-11 US US13/915,363 patent/US8920805B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999029729A2 (en) * | 1997-12-09 | 1999-06-17 | Children's Medical Center Corporation | Antagonists of neuropilin receptor function and use thereof |
JP2007506754A (ja) * | 2003-09-23 | 2007-03-22 | ラドウィグ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ | 神経幹細胞の刺激のためのvegf−cまたはvegf−d物質および方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6012037571; FAVIER, B. et al.: '"Neuropilin-2 interacts with VEGFR-2 and VEGFR-3 and promotes human endothelial cell survival and mi' BLOOD Vol.108, No.4, 20060815, P.1243-1250 * |
JPN6012037574; NASARRE, P. et al.: '"Semaphorin SEMA3F has a repulsing activity on breast cancer cells and inhibits E-cadherin-mediated' NEOPLASIA Vol.7, No.2, 200502, P.180-189 * |
JPN6012037578; BIELENBERG, D.R. et al.: '"Semaphorin 3F, a chemorepulsant for endothelial cells, induces a poorly vascularized, encapsulated,' THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION Vol.114, No.9, 200411, P.1260-1271 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021521110A (ja) * | 2018-04-06 | 2021-08-26 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | 抗nrp2抗体を含む組成物及び方法 |
US11807687B2 (en) | 2019-10-03 | 2023-11-07 | Atyr Pharma, Inc. | Therapeutic compositions comprising anti-NRP2 antibodies |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2687247A1 (en) | 2008-11-27 |
BRPI0721660A2 (pt) | 2013-01-22 |
ES2469743T3 (es) | 2014-06-18 |
US20100172921A1 (en) | 2010-07-08 |
US20140234312A1 (en) | 2014-08-21 |
CN101754771A (zh) | 2010-06-23 |
WO2008143665A1 (en) | 2008-11-27 |
KR20100018567A (ko) | 2010-02-17 |
NO20093542L (no) | 2010-02-12 |
AU2007353778A1 (en) | 2008-11-27 |
JP5745840B2 (ja) | 2015-07-08 |
MA31435B1 (fr) | 2010-06-01 |
AU2007353778B9 (en) | 2014-04-03 |
EP2152307A1 (en) | 2010-02-17 |
IL202005A (en) | 2014-11-30 |
UA99292C2 (uk) | 2012-08-10 |
HK1144556A1 (en) | 2011-02-25 |
AU2007353778B2 (en) | 2013-11-07 |
IL202005A0 (en) | 2010-06-16 |
US8648173B2 (en) | 2014-02-11 |
MX2009012421A (es) | 2009-12-01 |
EP2152307B1 (en) | 2014-04-16 |
KR101520115B1 (ko) | 2015-05-13 |
CR11126A (es) | 2010-05-19 |
US8920805B2 (en) | 2014-12-30 |
CN101754771B (zh) | 2015-03-04 |
HK1134040A1 (en) | 2010-04-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5745840B2 (ja) | 抗ニューロピリン2抗体による腫瘍転移の阻害 | |
JP5197376B2 (ja) | ニューロピリンアンタゴニスト | |
US8466264B2 (en) | Crystal structures of neuropilin fragments and neuropilin-antibody complexes | |
RU2437677C2 (ru) | Ингибирование метастазов опухоли антителами против нейропилина-2 | |
NZ581282A (en) | INHIBITION OF TUMOR METASTASIS BY ANTI NEUROPILIN 2 (Nrp2) ANTIBODIES | |
NZ581286A (en) | CRYSTAL STRUCTURES OF Nrp1 and Nrp2 FRAGMENTS AND NEUROPILIN-ANTIBODY COMPLEXES |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100512 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100512 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120724 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20121024 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20121031 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130124 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130625 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130925 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20131002 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131225 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140526 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140926 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20141015 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150212 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150406 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150507 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5745840 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |