ES2469743T3 - Inhibición de la metástasis tumoral por anticuerpos anti neuropilina 2 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo anti Nrp2B biológicamente activo, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende: (a) la secuencia de región variable de cadena ligera: y la secuencia de región variable de cadena pesada: del anticuerpo YW68.4.2 cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 10A; o (b) la secuencia de región variable de cadena ligera: y la secuencia de dominio variable de cadena pesada : del anticuerpo YW68.4.2.36 cuya secuencia de aminoácidos se muestran en la Figura 10B.

Description

Inhibici�n de la metástasis tumoral por anticuerpos anti neuropilina 2.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a antagonistas de neuropilina 2 (Nrp2), especialmente anticuerpos anti Nrp2, y su uso en la prevención y tratamiento de metástasis tumoral.

Antecedentes de la invención

Se ha establecido bien ahora que la angiog�nesis est� implicada en la patog�nesis de diversos trastornos. Estos incluyen tumores sólidos y metástasis, aterosclerosis, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamación crónica, enfermedades neovasculares intraoculares tales como retinopat�as proliferativas, por ejemplo, retinopat�a diab�tica, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de tejido corneal trasplantado y otros tejidos, artritis reumatoide y psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53: 217-239 (1991); y Garner A., “Vascular diseases”, En: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2� Edición (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710.

En el caso del crecimiento tumoral, la angiog�nesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a neoplasia, y para proporcionar alimento para el crecimiento o metástasis del tumor. Folkman et al., Nature 339: 58 (1989). La neovascularizaci�n permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con las células normales. Un tumor habitualmente comienza como una única célula aberrante que puede proliferar solamente hasta un tamaño de unos pocos milímetros cúbicos debido a la distancia de los lechos capilares disponibles, y puede permanecer “durmiente” sin crecimiento adicional y diseminaci�n durante un periodo de tiempo largo. Algunas células tumorales cambian después al fenotipo angiog�nico para activar células endoteliales que proliferan y maduran a nuevos vasos sanguíneos capilares. Estos vasos sanguíneos de nueva formación no solamente permiten el crecimiento continuado del tumor primario, sino también la diseminaci�n y recolonizaci�n de células tumorales metast�sicas. En consecuencia, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones tumorales y la supervivencia del paciente en cáncer de mama as� como en varios otros tumores. Weidner et al., N. Engl. J. Med 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340: 145-146 (1992). Los mecanismos precisos que controlan el cambio angiog�nico no se entienden bien, pero se cree que la neovascularizaci�n de la masa tumoral resulta del equilibrio neto de una multitud de estimuladores e inhibidores de la angiog�nesis (Folkman Nat Med 1(1): 27-31 (1995)).

Se acepta actualmente que las metástasis son responsables de la amplia mayoría, estimado en el 90 %, de las muertes de tumores sólidos (Gupta y Massague, Cell 127, 679-695 (2006)). El complejo proceso de metástasis implica una serie de etapas distintas que incluyen la separación de células tumorales del tumor primario, intravasaci�n de células tumorales en vasos linfáticos o sanguíneos, y extravasaci�n y crecimiento de células tumorales en sitios secundarios. El análisis de ganglios linfáticos regionales en muchos tipos tumorales sugiere que la vasculatura linfática es una vía importante para la diseminaci�n de c�nceres humanos. Además, en casi todos los carcinomas, la presencia de células tumorales en ganglios linfáticos es el factor de pronóstico adverso más importante. Aunque se ha pensado previamente que dichas metástasis implicaban exclusivamente el paso de células malignas a lo largo de vasos linfáticos preexistentes cerca de los tumores, estudios experimentales e informes cl�nico patológicos recientes (revisados en Achen et al., Br J Cancer 94 (2006), 1355-1360 y Nathanson, Cancer 98, 413-423 (2003)) sugieren que la linfangiog�nesis puede inducirse por tumores sólidos y pueden promover la propagación tumoral. Estos y otros estudios recientes sugieren que la dirección a vasos linfáticos y linfangiog�nesis puede ser una estrategia terapéutica útil para restringir el desarrollo de metástasis de cáncer, lo que tendría un beneficio significativo para muchos pacientes.

VEGFC, un miembro de la familia del factor de células endoteliales vasculares (VEGF), es uno de los mediadores mejor estudiados del desarrollo linfático. Se ha mostrado que la sobreexpresi�n de VEGFC en células tumorales promueve la linfoangiog�nesis asociada a tumor, dando como resultado metástasis potenciada a ganglios linfáticos regionales (Karpanen et al., Faseb J20, 1462-1472 (2001); Mandriota et al., EMBOJ 20, 672-682 (2001); Skobe et al., Not Med 7, 192-198 (200)); Stacker et al., Nat Rev Cancer 2, 573-583 (2002); Stacker et al., Faseb J 16, 922-934 (2002)). La expresión de VEGFC también se ha correlacionado con linfangiog�nesis asociada a tumor y metástasis de ganglios linfáticos para varios c�nceres humanos (revisado en Achen et al., 2006. mencionado anteriormente). Además, se ha mostrado que el bloqueo de la se�alizaci�n mediada por VEGFC suprime la linfangiog�nesis tumoral y la metástasis de ganglios linfáticos en ratones (Chen et al., Cancer Res 65, 9004-9011 (2005); He et al., J. Natl Cancer Inst 94, 8190825 (2002); Krishnan et al., Cancer Res 63, 713-722 (2003); Lin et al., Cancer Res 65, 69016909 (2005)).

Se sabe que el VEGFC se une con al menos dos familias de receptores de superficie celular, los receptores tirosina quinasa de VEGF y los receptores neuropilina (Nrp).

De los tres receptores de VEGF, VEGFC puede unirse con VEGFR2 y VEGFR3 lo que conduce a dimerizaci�n del receptor (Shinkai et al., J Biol Chem 273, 31283-31288 (1998)), activación de quinasa y autofosforilaci�n (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995); Waltenberger et al., J Biol Chem 269, 26988-26995 (1994)). El receptor fosforilado induce la activación de múltiples sustratos lo que conduce a angiog�nesis y linfangiog�nesis (Ferrara et al., Nat Med 9, 669676 (2003)).

La familia de la neuropilina (Nrp) comprende dos proteínas homólogas, neuropilina 1 (Nrp1) y neuropilina 2 (Nrp2). Además de los receptores de VEGF, VEGFC también se une con Nrp2, que se identificó inicialmente como receptor de semaforina de clase 3 y mediador de la orientación de axones (Favier et al., Blood 108, 1243-1250 (2006); Soker et al., J Cell Biochem 85, 357-368 (2002)). Múltiples líneas de pruebas implican a Nrp2 en el desarrollo de los sistemas vascular y linfático. Los mutantes de Nrp2 homocigotos muestran una grave reducción de vasos linfáticos pequeños y capilares de forma prenatal (Yuan et al., Development 129, 4797-4806 (2002)). Además, el defecto vascular letal embrionario y drástico visto en ratones mutantes para Nrp1 homocigotos se potencia por la pérdida de la función de Nrp2 lo que conduce a letalidad más temprana (Takashima et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 36573662 (2002)). Sin embargo, el papel de Nrp2 en la modulación de la biología vascular y linfática del adulto, y más específicamente la metástasis se desconoce.

Las Nrp tienen dominios intracelulares cortos que no se conoce que tengan ninguna actividad enzim�tica o de se�alizaci�n. Se ha propuesto que las Nrp actúan para potenciar la se�alizaci�n de VEGFR potenciando la unión del receptor de VEGF-ligando (Favier et al., 2006, mencionado anteriormente; Soker et al., 2002, mencionado anteriormente). Adicionalmente, se ha mostrado que sema3F, el ligando de semaforina de Nrp2, modula el comportamiento celular endotelial in vitro e in vivo (Bielenberg et al., J Clin Invest 114, 1260-1271(2004); Favier et al., Blood 1243-1250, (2006)). Sin embargo, informes recientes han sugerido una posibilidad alternativa de que las Nrp puedan actuar de forma independiente de los receptores de VEGF o la función de semaforina para modular la migración de células endoteliales (EC) (Murga et al., Blood 105, 1992-1999 (2005); Pan et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007); Wang et al., J Biol Chem 278, 48848-48860 (2003)).

Los anticuerpos neutralizadores anti VEGF suprimen el crecimiento de diversas líneas celulares tumorales humanas en ratones desnudos (Kim et al., Nature 362: 841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgstr�m et al., Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56: 921-924 (1996)) y también inhiben la angiog�nesis intraocular en modelos de trastornos retinales isqu�micos. Adamis et al., Arch. Ophthalmol.

114: 66-71 (1996). Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales anti VEGF u otros inhibidores de la acción de VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores y diversos trastornos neovasculares intraoculares. Dichos anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento EP 817.648 publicado el 14 de enero de 1998; y en los documentos WO98/45331 y WO98/45332, ambos publicados el 15 de octubre de 1998. Uno de los anticuerpos anti VEGF, bevacizumab, se ha aprobado por la FDA para su uso en combinación con un régimen de quimioterapia para tratar el cáncer colorrectal metast�sico (CRC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Se est� investigando bevacizumab en muchos ensayos cl�nicos en curso para tratar diversas indicaciones de cáncer.

Tambi�n se conocen otros anticuerpos anti VEGF y anticuerpos anti Nrp1 y se describen, por ejemplo, en Liang et al., J Mol Biol 366, 815-829 (2007); Pan et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007; y Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)).

El documento US 2003/113324 se refiere a la identificación de moduladores de la unión de ligando VEGF-C o VEGF-D con la proteína transmembrana del sistema nervioso neuropilina 2.

El documento WO 99/29858 se refiere a ADNc que codifica una proteína de neuropilina soluble (sNP) que se aísla de células productoras de neuropilina (NP) o se obtiene por ingeniería genética de forma recombinante a partir de ADN que codifica NP.

El documento WO 99/29729 se refiere a antagonistas de la función del receptor de neuropilina y uso de los mismos en el tratamiento de cáncer, particularmente cáncer metast�sico, y enfermedades angiog�nicas.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en resultados experimentales obtenidos con un anticuerpo de bloqueo de función de alta afinidad para Nrp2. Los resultados obtenidos con este anticuerpo indican que Nrp2 desempeña un papel en la modulación de la migración de células endoteliales linfáticas (LEC), y que su función se extiende más all� de su papel previamente asignado como un potenciador de la activación del receptor de VEGF. Además, los resultados demuestran que el bloqueo de Nrp2 conduce a una inhibición de la linfangiog�nesis y una reducción drástica de la metástasis de ganglios linfáticos y órganos distantes.

En un aspecto como se define en las reivindicaciones la invención se refiere a medios para inhibir la migración de células endoteliales linfáticas, administrando a un sujeto mamífero que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de neuropilina 2 (Nrp2). En otro aspecto como se define en las reivindicaciones la invención se refiere a medios para inhibir la linfangiog�nesis tumoral, administrando a un sujeto mamífero portador de tumor una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de neuropilina 2 (Nrp2).

En otro aspecto más como se define en las reivindicaciones la invención se refiere a medios para inhibir la metástasis tumoral, administrando a un sujeto mamífero portador de tumor una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de neuropilina 2 (Nrp2).

En todas las realizaciones, el sujeto mamífero preferentemente es un paciente humano, tal como un paciente de cáncer humano, al que se le puede haber diagnosticado o puede estar en riesgo de desarrollar metástasis.

En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.

En otra realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de ri��n o renal, cáncer de hígado, cáncer de pr�stata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, linfoma de linfocitos B, leucemia linfoc�tica crónica (CLL), leucemia linfobl�stica aguda (ALL); leucemia de tricoleucitos; y leucemia mielobl�stica crónica.

En otra realización más, el linfoma de linfocitos B se selecciona del grupo que consiste en linfoma no de Hodgkin folicular/de grado bajo (NHL); NHL linfoc�tico pequeño (SL); NHL folicular/de grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunobl�stico de grado alto; NHL linfobl�stico de grado alto; NHL de células no escindidas pequeño de grado alto; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom.

El antagonista de Nrp2 es un anticuerpo anti Nrp2B seleccionado de los anticuerpos YW68.4.2, YW68.4.2.36, y fragmentos de los mismos como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo que comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en YW68.4.2, YW68.4.2.36 como se define en las reivindicaciones.

La invención se refiere además a una composición que comprende un anticuerpo de la invención en mezcla con un vehículo farmac�uticamente aceptable.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de metástasis tumoral que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de Nrp2B de la invención en mezcla con un vehículo farmac�uticamente aceptable. En otros aspectos como se define en las reivindicaciones, la invención se refiere a anticuerpos antagonistas de Nrp2 para su uso en la prevención o tratamiento de metástasis tumoral.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Caracterización de mAb Anti Nrp2B. (A) Representación esquemática de regiones de unión a VEGF y Sema en Nrp2 en relación con regiones epit�picas Anti Nrp2B. (B) Ensayo de ELISA que demuestra unión de Anti Nrp2B con ECD de hNrp2 (cuadrados rellenos) y dominios B1-B2 de hNrp2 (círculos rellenos), pero no ECD de hNrpI (cuadrados abiertos) o los dominios A1-A2 de hNrp2 (círculos abiertos). (C) Bloqueo de la unión de VEGFC con Nrp2 por Anti Nrp2B. Se preincubaron cantidades crecientes de mAb con placas recubiertas con Nrp2 ECD humano (5 !g/ml) durante 1-2 horas, seguido de la adición de VEGFC humano biotinilado prevalorado (1 nM) durante 15 minutos. El porcentaje de VEGFC unido se detect� por conjugados de estreptavidina-HRP. (D) Bloqueo de la unión de VEGF165 con Nrp2 por Anti Nrp2B. (E) Bloqueo de la unión de Sema3F con LEC. Las LEC se incubaron con medio acondicionado que contenía Sema3F fusionado con fosfatasa alcalina (AP) (REF), en presencia o ausencia de Anti Nrp2B. La actividad AP derivada de Sema3F-AP unido se detect� de forma colorim�trica con los mismos tiempos de desarrollo. No se observ� unión con AP (panel izquierdo). El Anti Nrp2B no bloque� la unión de Sema3F con LEC (paneles medios). Se us� Nrp2 ECD como un control positivo para bloquear la unión (panel derecho). Barra de escala. Figura 2. El Anti Nrp2B reduce la función inducida por VEGFC in vitro e in vivo. (A) Imágenes representativas de LEC teñidas que migran en respuesta a 200 ng/ml de VEGFC durante 18 horas en presencia o ausencia de Anti Nrp2B (50 !g/ml) o VEGFR3 ECD (50 !g/ml). (B) Cuantificación de la migración de LEC en respuesta a 200 ng/ml de VEGFC (n=6 para cada condición). (C) Cuantificación de la migración de LEC en respuesta a VEGF165 10 ng/ml en presencia o ausencia de Anti Nrp2B (50 !g/ml) o VEGFR3 ECD (50 !g/ml). N=6 para cada condición. (D) Cuantificación de los recuentos de p�xeles de un ensayo de microbolsillo corneal descrito en (E). *p<0,05 (E) Imágenes representativas de córnea teñida con LYVE-1, que ilustra los efectos de la colocación intracorneal de microgr�nulos de 150 ng de VEGFC (P) y tratamiento sist�mico con Anti Nrp2B (10 mg/kg dos veces por semana) o VEGFR3 ECD (25 mg/kg dos veces por semana). La tinción con LYE-1 se ha seudocoloreado de rojo para facilitar la visualización. *p<0,05; las barras de Error representan el error t�pico de la media. Figura 3. El tratamiento con Nip2B da como resultado una reducción en la activación del receptor de VEGF e inhibe la formación del complejo Nrp2/receptor de VEGF. (A) Análisis de FACS de los niveles de Nrp2, VEGFR2 y VEGFR3 en la superficie de LEC después del tratamiento con anticuerpo de control (10 !g/ml; línea verde) o Anti Nrp2B (10 !g/ml) durante 5 minutos (línea azul) o 20 horas (línea roja). (B) Cuantificación de la migración de LEC en respuesta a HGF 20 ng/ml en presencia o ausencia de Anti Nrp2B (50 !g/ml) o VEGFR3 ECD (50 !g/ml). N=6 para cada condición. (C) Nivel de fosforilaci�n de VEGFR2 en LEC detectado por ensayo de ELISA usando anticuerpos que reconocen VEGFR2 total o fosforilado con tirosina. Se a�adi� VEGFC (concentración según se indica) durante 10 minutos en presencia o ausencia de Anti Nrp2B (10 !g/ml) o VEGFR3 ECD (10 !g/ml) para inducir la fosforilaci�n de VEGFR2, n=3 para cada condición. El nivel de fosforilaci�n de VEGFR2 en células tratadas con anti Nrp2B (10 !g/ml) fue significativamente diferente de la estimulaci�n con VEGFC a 200 ng/ml y queda uniformemente entre el nivel de fosforilaci�n inducido por 175 ng/nl y 150 ng/ml de VEGFC. (D) Cuantificación de la migración de LEC en respuesta a VEGFC (concentración como se indica) en presencia o ausencia de Anti Nrp2B (10 !g/ml) o VEGFR3 ECD (10 !g/ml). Se observaron reducciones significativas en la migración a 50 ng/ml de VEGFC o cuando se bloque� con VEGFR3 ECD. *p<0,05; las barras de Error representan el error t�pico de la media. Cada experimento se repitió un mínimo de tres veces. (E) CO-IP Figura 4. Se expresa Nrp2 en los vasos linfáticos de ratones portadores de tumores. (A-D) tinción con LYVE-1 (columna izquierda – rojo) que marca vasos linfáticos, tinción con Nrp2 (columna media -verde) y la superposición en el (A) intestino y (B) ganglio linfático de ratones adultos normales. La señal de Nrp2 no se colocaliza con vasos linfáticos marcados con LYVE-1 en ninguno de los órganos. Est�n presentes células inflamatorias con tinción de Nrp2 poco común dentro del núcleo fibroestromal de las vellosidades intestinales y dentro de los centros germinales de ganglios linfáticos. (C) En ganglios linfáticos de animales portadores de tumores, la señal de Nrp2 s� se colocaliza con vasos linfáticos positivos para LYVE-1 que revisten los senos de LN. También est�n presentes células inflamatorias con tinción de Nrp2 adicionales. (D) También se ve tinción de Nrp2 fuerte en vasos linfáticos dentro de tumores 66c14. También puede verse tinción débil en células tumorales. Los controles teñidos solo de forma secundaria no mostraron ninguna señal. Las áreas encuadradas se muestran a alto aumento dentro de los insertos. Barra de escala *** para A-C y ** para D. Figura 5. El tratamiento con Anti Nrp2B da como resultado una reducción de la metástasis pulmonar en el modelo de tumor 66c14. (A) Gráfica del volumen tumoral medio del estudio de modelo de tumor 66c14 analizada posteriormente. Se dosific� a los animales dos veces por semana i.p. con Anti Nrp2B 10 mg/kg o anticuerpo de control una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de 100 mm3 y se les dosific� durante todo el estudio. (B) Cuantificación por inspección visual del número de nódulos metast�sicos por pulmón en animales tratados con control y Anti Nrp2B. (C) Imágenes representativas de pulmones de animales tratados con control (izquierda) y Anti Nrp2B (derecha). Los pulmones se inflaron antes de la fijación por perfusi�n ventricular cardiaca derecha. Los nódulos se destacan en blanco para facilitar su visualización. (D, E) representación tridimensional de pulmones con exploración de micro CT representativos que demuestran nódulos metast�sicos (rojo) en animales tratados con control (D) y Anti Nrp2B (E). Las posiciones de la sección longitudinal (inserto superior) y la sección transversal (inserto inferior) se indican por las líneas de puntos negra y roja respectivamente. Este análisis confirma que la mayoría de los nódulos est� en la superficie de los pulmones. (F) Cuantificación del número de nódulos metast�sicos por pulmón por análisis de Micro CT de los pulmones. (G) Análisis de FACS de los niveles de Nrp2 en la superficie de células tumorales 66c14 cultivadas in vitro. (H) Tinción con H y E de un nódulo pulmonar que demuestra células tumorales metast�sicas. Las barras de error representan el error t�pico de la media. Barra de escala *** para C y ** para H. Figura 6. El tratamiento con Anti Nrp2B da como resultado una reducción de la metástasis pulmonar en el modelo de tumor C6.

(A) Gráfica del volumen tumoral medio del estudio de modelo de tumor C6 analizado posteriormente. Se dosific� a los animales dos veces por semana i.p. con Anti Nrp2B (10 mg/kg), VEGFR3 ECD (25 mg/kg) o anticuerpo de control (10 mg/kg) una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de 100 mm3 y se les dosific� durante todo el estudio. (B) Cuantificación por inspección visual del número de nódulos metast�sicos por pulmón en animales tratados con control, VEGFR3 ECD y Anti Nrp2B. (C) Imágenes representativas de pulmones de animales tratados con control (izquierda), VEGFR3 ECD (media) y Anti Nrp2B (derecho). Los pulmones se inflaron antes de la fijación por perfusi�n ventricular cardiaca derecha. Los nódulos se destacan en blanco para facilitar la visualización. (D) Representaciones tridimensionales de pulmones explorados mediante micro CT representativos que demuestran nódulos metast�sicos (rojo) en animales tratados con control (izquierda) y Anti Nrp2B (derecha). Las posiciones de la sección longitudinal (inserto superior) y la sección transversal (inserto inferior) se indican por las líneas de puntos negra y roja respectivamente. Este análisis confirma que la mayoría de los nódulos est� en la superficie de pulmones. (E) Análisis de FACS de los niveles de Nrp2 en la superficie de células tumorales 66c14 cultivadas in vitro. (F) Tinción con H y E de un nódulo pulmonar que demuestra células tumorales metast�sicas. Las barras de error representan el error t�pico de la media. Barra de escala *** para C y ** para F. Figura 7. El tratamiento con Anti Nrp2B da como resultado una reducción de los vasos linfáticos tumorales. (A, B) Cuantificación de la densidad de vasos vasculares (A) como se detecta por IHC de PECAM-1 y densidad de los vasos linfáticos (B) como se detecta por 1H-IC de LYVE-1 en tumores 66c14 tratados con anticuerpo de control o Anti Nrp2B. La densidad de los vasos se determin� a partir de 6 imágenes representativas de cada uno de 6 tumores por grupo, se evalu� con respecto a número de p�xeles medio por ImageJ. (C) Imágenes representativas de vasos teñidos con PECAM-1 (fila superior) y vasos linfáticos teñidos con LYVE-1 (filas media e inferior) en tumores C6 tratados con anticuerpo de control (columna izquierda), VEGFR3 ECD (columna media) o Anti Nrp2B (columna derecha). Las áreas encuadradas representadas en la fila media se presentan en la fila inferior a mayor aumento. La cuantificación de la densidad de vasos vasculares (gráfica superior) y linfáticos (gráfica inferior) est� a la derecha de estas imágenes. (D) Tumores teñidos con LYE-1 de animales tratados con Anti Nrp2B (paneles inferiores) recogidos el día 4 (Recogida 1) y el día 11 (recogida 2) demuestran alteración de los vasos linfáticos en comparación con animales tratados con control (paneles superiores). Las fechas de la recogida en relación con las curvas de crecimiento se muestran a la izquierda. Las barras de error representan el error t�pico de la media. Barra de escala ***. Figura 8. El tratamiento con Anti Nrp2B da como resultado una reducción de los vasos linfáticos tumorales funcionales y conduce a un retardo en la metástasis al ganglio linfático primario. (A, B) Se ven microperlas fluorescentes de poliestireno (verdes) exclusivamente en vasos linfáticos marcados con IHC de LYVE-1 (rojo) después de linfangiograf�a intrad�rmica. El área encuadrada en A se muestra a mayor aumento en B. (C-D) El tratamiento con Anti Nrp2B da como resultado una reducción de azul de Evans dentro de tumores C6 (C) (P=0,035) y 66c14 (D) (P=0,005), lo que indica una reducción en los vasos linfáticos funcionales dentro de esos tumores tratados. (E) porcentaje de animales con SLN que contienen células tumorales C6 que expresan 1-gal en diversos puntos temporales después de la implantación tumoral en los oídos de ratones de control (negro) y tratados con Anti Nrp2B (rojo). El tratamiento con Anti Nrp2B da como resultado un retardo de la llegada de células al SLN (p=,006). N=7 animales por condición de tratamiento por punto temporal. Figura 9. Expresión de Nrp2 en diferentes tumores malignos humanos. (A-F) Datos de micromatrices de Affymetrix HG-U 133A y B GeneChip� para la expresión de Nrp2 en colon normal y adenocarcinoma colorrectal (A), tejidos de cabeza y cuello normales y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (B), páncreas normal y adenocarcinoma pancreático (C), piel normal y melanoma maligno (D), tiroides normal y carcinoma tiroideo papilar (E) y mama normal y adenocarcinoma ductal de infiltración de Her2 (F). Cada punto de datos representa un paciente. Figura 10. Secuencias de amino�cidos de fragmentos Fab del anticuerpo anti Nrp2B YW68.4.2 y YW68.4.2.36. Figura 11. Secuencia de amino�cidos del fragmento Fab del anticuerpo anti Nrp2A YW

126.20 Figura 12. Alineamiento de secuencia de dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti NrpA YW

126.20 con la secuencia de kl humana. Figura 13. Alineamiento de la secuencia de dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti Nrp2A YW126.20 con la secuencia humana III (hum III).

Figura complementaria 1. Análisis de FACS de los niveles de los receptores del eje de VEGF en la superficie de LEC cultivadas in vitro. Análisis de FACS de Nrp1, Nrp2, VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3 en LEC cultivadas.

Figura complementaria 2. El anti Nrp2B no bloquea la migración inducida por VEGF165. (A-B) Cuantificación de la migración de HUVEC (A) y LEC (B) en respuesta a 200 ng/ml de VEGF durante 18 horas en presencia o ausencia de Anti Nrp1B, Anti Nrp2B (50 !g/ml) o ambos anticuerpos (50 !g/ml). *p<0,05; las barras de Error representan el error t�pico de la media.

Figura complementaria 3. Efectos del Anti Nrp2B en la proliferaci�n mediada por VEGFC y la permeabilidad vascular y se�alizaci�n intracelular asociada. (A) Cuantificación de la proliferaci�n de LEC inducida por VEGFC 200 ng/ml en presencia o ausencia de Anti Nrp2B (50 !g/ml) o VEGFR3 ECD (50 !g/ml) como se determina por la incorporación de BrdU (n=6 por condición). (B) Ensayo de permeabilidad vascular de piel de ratón. Se tomaron imágenes de la piel del mismo animal. La mancha azul representa filtración de azul de Evans de la vasculatura en respuesta a suministro intrad�rmico de VEGFC después del tratamiento sist�mico con Anti Nrp2B (10 mg/kg) o VEGFR3 ECD (25 mg/kg). (C) Cuantificación del colorante azul de Evans extraído de muestras de piel en el ensayo de permeabilidad. Los valores mostrados son la media de 6 experimentos independientes. *p<0.05; las barras de Error representan el error t�pico de la media.

Figura complementaria 4. El Anti Nrp2B no bloquea el colapso del cono de crecimiento inducido por Sema3F. (A) Imágenes de conos de crecimiento del Hipocampo E 17.5 teñidos con faloidina conjugada con rodamina. Los conos de crecimiento de control muestran grandes estructuras ricas en actina en la punta de cada ax�n, que se reducen con el tratamiento de Sema3F. El Anti Nrp2B (50 !g/ml) no bloquea este colapso. Por el contrario, el Nrp2 ECD (10 !g/ml) s� bloquea este colapso. (B) Control de calidad para inmunohistoqu�mica anti Nrp2. La imagen muestra un clon derivado de fago que reconoció Nrp2 que actúa en IHC en secciones congeladas nuevas. La expresión de la proteína Nrp2 es similar a la expresión de Nrp2 como se ve usando hibridación in situ (Chen et al., Neuron 19, 547559 (1997)). Este anticuerpo se us� posteriormente para IHC en secciones de tumor congeladas nuevas. (Barra de escala para imágenes principales = **!m y para imágenes insertas = **!m.

Descripci�n detallada de la invención

Definiciones

Los términos “Neuropilina”, “NRP” o “Nrp” se usan de forma intercambiable y se refieren de forma colectiva a

neuropilina 1 (NRP1, Nrp1), neuropilina 2 (NRP2, Nrp2) y sus isoformas y variantes, como se describe en Rossignol et al. (2000) Genomics 70: 211-222. Las neuropilinas son receptores no de tirosina quinasa de 120 a 130 kDa. Hay múltiples variantes de corte y empalme e isoformas solubles de NRP-1 y NRP-2. La estructura básica de las neuropilinas comprende cinco dominios: tres dominios extracelulares (a1a2, b1b2 y c), un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. El dominio a1a2 es homólogo de los componentes del complemento Clr y Cls (CUB), que generalmente contienen cuatro restos de ciste�na que forman dos enlace disulfuro. El dominio b1b2 es homólogo de los factores de coagulación V y VIII. La parte central del dominio C se designa como MAM debido a su homología con las proteínas meprina, A5 y tirosina fosfatasa receptora !. Los dominios a1a2 y b2b2 son responsables de la unión al ligando, mientras que el dominio c es crítico para la homodimerizaci�n o heterodimerizaci�n. Gu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 18069-76; He y Tessier-Lavigne (1997) Cell 90: 739-51.

La “actividad biológica mediada por neuropilina” se refiere en general a los acontecimientos fisiológicos o patológicos en los que la neuropilina 1 y/o neuropilina 2 desempeña un papel sustancial. Son ejemplos no limitantes de dichas actividades la orientación de los axones durante el desarrollo del sistema nervioso embrionario o regeneración neuronal, angiog�nesis (incluyendo modelaci�n vascular), tumorog�nesis y metástasis tumoral.

La “actividad biológica mediada por neuropilina 2” o “actividad biológica mediada por Nrp2”, como se usa en el

presente documento, se refiere en general a acontecimientos fisiológicos o patológicos en los que la Nrp2 desempeña un papel sustancial, tales como, por ejemplo, potenciación de la activación del receptor de VEGF y, en particular, la capacidad para modular la migración de células endoteliales linfáticas (EC), papel en linfangiog�nesis de adultos, especialmente linfangiog�nesis tumoral y metástasis tumoral.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespec�ficos (por ejemplo, anticuerpos biespec�ficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad biológica deseada.

La expresión “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de

una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antig�nico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (ep�topos), cada anticuerpo

monoclonal se dirige contra un único determinante en el ant�geno. El modificador “monoclonal” indica que el

anticuerpo se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usar de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por el método de hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, o pueden prepararse por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N� 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 y Marks et al. (1991) J. Mop Biol. 222: 581-597, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica de u homóloga de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas es idéntico a u homólogo de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, as� como fragmentos de dichos anticuerpos siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos N� 4.816.567; y Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de región marco conservada (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprender� sustancialmente todos de al menos uno, normalmente dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprender� al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.

Un “anticuerpo dependiente de especie” es uno que tiene una afinidad de unión más fuerte por un ant�geno de una

primera especie de mamífero de la que tiene por un homólogo de ese ant�geno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie “se une específicamente” con un ant�geno humano (es decir tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferentemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 M y más preferentemente no más de aproximadamente 1 x 10-9 M) pero tiene una afinidad de unión por un homólogo del ant�geno de una segunda especie de mamífero no humano que es de al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión por el ant�geno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos que se han definido anteriormente, pero preferentemente es un anticuerpo humanizado o humano.

Como se usa en el presente documento, “mutante de anticuerpo” o “variante de anticuerpo” se refiere a una variante

de secuencia de amino�cidos del anticuerpo dependiente de especie en la que uno o más de los restos de amino�cidos del anticuerpo dependiente de especie se han modificado. Dichos mutantes tienen necesariamente menos del 100 % de identidad o similitud de secuencia con el anticuerpo dependiente de especie. En una realización preferida, el mutante de anticuerpo tendr� una secuencia de amino�cidos que tiene al menos 75 % de identidad o similitud de secuencia de amino�cidos con la secuencia de amino�cidos del dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo dependiente de especie, más preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 85 %, más preferentemente al menos 90 %, y más preferentemente al menos 95 %. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en el presente documento como el porcentaje de restos de amino�cidos en la secuencia candidata que son idénticos (es decir el mismo resto) o similares (es decir restos de amino�cidos del mismo grupo basándose en propiedades de cadena lateral comunes, véase posteriormente) con los restos de anticuerpo dependientes de especie, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Se interpretar� que ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N terminales, C terminales o internas en la secuencia de anticuerpo fuera del dominio variable afecta a la identidad o similitud de secuencia.

Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente

natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificar� (1) a más del 95 % en peso del anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y más preferentemente más del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de amino�cidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta su homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estar� presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparar� por al menos una etapa de purificación.

Como se usa en el presente documento, “dominio variable de anticuerpo” se refiere a las partes de las cadenas ligeras y pesadas de las moléculas de anticuerpo que incluyen secuencias de amino�cidos de regiones determinantes de complementariedad (CDR); es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) y Regiones Marco conservadas (FR). VH se refiere al dominio variable de la cadena pesada. VL se refiere al dominio variable de la cadena ligera. De acuerdo con los métodos usados en la presente invención, las posiciones de amino�cidos asignadas a CDR y FR pueden definirse de acuerdo con Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991)). La numeración de amino�cidos de los anticuerpos o fragmentos de unión a ant�geno también es de acuerdo con la de Kabat.

Como se usa en el presente documento, la expresión “Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR; es decir CDR1, CDR2 y CDR3) se refieren a los restos de amino�cidos de un dominio variable de anticuerpo cuya presencia es necesaria para la unión a ant�geno. Cada dominio variable normalmente tiene tres regiones CDR identificadas como CDR1, CDR2 y CDR3. Cada región determinante de complementariedad puede comprender

restos de amino�cidos de una “región determinante de complementariedad” como se define por Kabat (es decir

aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el domino variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5� Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un “bucle hipervariable” (es decir aproximadamente los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-10 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J Mol. Biol. 196: 901-917). En algunos casos, una región determinante de complementariedad puede incluir amino�cidos tanto de una región CDR definida de acuerdo con Kabat como un bucle hipervariable. Por ejemplo, la CDR1 de la cadena pesada del anticuerpo 4D5 incluye los amino�cidos 26 a 35.

Las “regiones marco conservadas” (en lo sucesivo en el presente documento FR) son los restos de dominio variable distintos de los restos de CDR. Cada dominio variable normalmente tiene cuatro FR identificadas como FR1, FR2, FR3 y FR4. Si las CDR se definen de acuerdo con Kabat, los restos de FR de cadena ligera se sitúan aproximadamente en los restos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) y 98-107 (LCFR4) y los restos de FR de cadena pesada se sitúan aproximadamente en los restos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) y 103113 (HCFR4) en los restos de cadena pesada. Si las CDR comprenden restos de amino�cidos de bucles hipervariables, los restos de FR de cadena ligera se sitúan aproximadamente en los restos 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) y 97-107 (LCFR4) en la cadena ligera y los restos de FR de cadena pesada se sitúan aproximadamente en los restos 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) y 102-113 (HCFR4) en los restos de cadena pesada. En algunos casos, cuando la CDR comprende amino�cidos tanto de una CDR como se define por Kabat como los de un bucle hipervariable, los restos de FR se ajustarán en consecuencia. Por ejemplo, cuando la CDRH1 incluye los amino�cidos H26-H35, los restos de FR1 de cadena pesada est�n en las posiciones 1-25 y los restos de FR2 est�n en las posiciones 36-49.

Como se usa en el presente documento, “conjunto de codones” se refiere a un conjunto de diferentes secuencias de

tripletes de nucleótidos usadas para codificar amino�cidos variantes deseados. Puede sintetizarse un conjunto de oligonucle�tidos, por ejemplo, por síntesis de fase sólida, incluyendo secuencias que representan todas las combinaciones posibles de tripletes de nucleótidos proporcionados por el conjunto de codones y que codificarán el grupo deseado de amino�cidos. Una forma convencional de designación de codones es la del código IUB, que se conoce en la técnica y se describe en el presente documento. Un conjunto de codones normalmente se representa

por 3 letras mayúsculas en cursiva, por ejemplo, NNK, NNS, XYZ, DVK y similares. Un “conjunto de codones no aleatorios”, como se usa en el presente documento, se refiere por lo tanto a un conjunto de codones que codifica

amino�cidos seleccionados que cumplen parcialmente, preferentemente completamente, los criterios para la selección de amino�cidos como se describen en el presente documento. La síntesis de oligonucle�tidos con “degeneración” de nucleótidos seleccionados en ciertas posiciones se conoce bien en la técnica, por ejemplo, el enfoque de TRIM (Knappck et al. (1999) J. Mol. Biol. 296: 57-86); Garrard y Henner (1993) Gene 128: 103). Dichos conjuntos de oligonucle�tidos que tienen ciertos conjuntos de codones pueden sintetizarse usando sintetizadores de ácido nucleico comerciales (disponibles de, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA) o pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, MD). Por lo tanto, un conjunto de oligonucle�tidos sintetizados que tienen un conjunto de codones particular normalmente incluir� una pluralidad de oligonucle�tidos con diferentes secuencias, las diferencias establecidas por el conjunto de codones dentro de la secuencia general. Los oligonucle�tidos, como se usan de acuerdo con la invención, tienen secuencias que permiten la hibridación con un molde de ácido nucleico de dominio variable y también pueden, pero no es necesario, incluir sitios de enzimas de restricción útiles para, por ejemplo, fines de clonaci�n.

Un fragmento “Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión de ant�geno completo. Esta región consiste en un d�mero de un dominio variable de cadena pesada y uno de ligera en asociación estrecha, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en scFv. Es en esta configuración en la que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a ant�geno en la superficie del d�mero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR o un subconjunto de las mismas confieren especificidad de unión a ant�geno del anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDR específicas para un ant�geno) tiene la capacidad de reconocer y unirse con el ant�geno, aunque habitualmente a una menor afinidad que el sitio de unión completo.

El fragmento “Fab” contiene un dominio variable y constante de la cadena ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 comprenden un par de fragmentos Fab que generalmente est�n unidos de forma covalente cerca de sus extremos carboxilo terminal por ciste�nas de bisagra entre ellos. También se conocen en la técnica otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Los fragmentos de anticuerpo “Fv monocatenario” o “scFv” comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en el que estos dominios est�n presentes en una cadena polipept�dica individual. Generalmente el polip�ptido Fv comprende además un enlazador polipept�dico entre los dominios VH y VL, que permite que el scFv forme la estructura deseada para unión a ant�geno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a ant�geno,

comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipept�dica (VH y VL). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a ant�geno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.

La expresión “anticuerpos lineales” se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en t�ndem (VH-CHl-VH-CHl) que, junto con polip�ptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a ant�geno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespec�ficos o monoespec�ficos.

Como se usa en el presente documento, “biblioteca” se refiere a una pluralidad de secuencias de anticuerpo o

fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, polip�ptidos de la invención), o los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias, siendo las secuencias diferentes en la combinación de amino�cidos variantes que se introducen en estas secuencias de acuerdo con los métodos de la invención.

“Presentación de fagos” es una técnica por la que se presentan polip�ptidos variantes como proteínas de fusión al

menos a una parte de la proteína de cubierta en la superficie del fago, por ejemplo, fago filamentoso, partículas. Una utilidad de la presentación de fagos est� en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes proteicas seleccionadas de forma aleatoria pueden separarse rápida y eficazmente en las secuencias que se unen con un ant�geno diana con alta afinidad. La presentación de bibliotecas de p�ptidos y proteínas en fagos se ha usado para explorar millones de polip�ptidos con respecto a los que tienen propiedades de unión específicas. Se han usado métodos de presentación de fagos polivalentes para presentar p�ptidos aleatorios pequeños y proteínas pequeñas mediante fusiones con el gen III o gen VIII del fago filamentoso. Wells y Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 355-362, y referencias citadas en la misma. En una presentación de fagos monovalentes, se fusiona una biblioteca de proteínas o p�ptidos con un gen III o una parte del mismo, y se expresa a niveles bajos en presencia de proteína del gen III de tipo silvestre de modo que las partículas de fago presenten una copia o ninguna de las proteínas de fusión. Los efectos de avidez se reducen en relación con el fago polivalente de modo que la selección se basa en la afinidad de ligando intrínseca, y se usan vectores fag�midos, que simplifican las manipulaciones de ADN. Lowman y Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymoloy 3: 205-0216.

Un “fag�mido” es un vector plasm�dico que tiene un origen bacteriano de replicaci�n, por ejemplo, ColE1, y una copia de una región interg�nica de un bacteri�fago. El fag�mido puede usarse en cualquier bacteri�fago conocido, incluyendo bacteri�fago filamentoso y bacteri�fago lambdoide. El pl�smido generalmente también contendr� un marcador seleccionable para resistencia a antibióticos. Los segmentos de ADN clonados en estos vectores pueden propagarse como pl�smidos. Cuando las células que albergan estos vectores se proporcionan con todos los genes necesarios para la producción de partículas de fago, el modo de replicaci�n del pl�smido cambia a replicaci�n en círculo rodante para generar copias de una cadena del ADN plasm�dico y partículas de fago empaquetadas. El fag�mido puede formar partículas de fago infecciosas o no infecciosas. Este término incluye fag�midos que contienen un gen de proteína de recubrimiento de fago o fragmento del mismo unido con un gen de polip�ptido heter�logo como un gen de fusión de modo que el polip�ptido heter�logo se presenta en la superficie de la partícula de fago.

La expresión “vector de fago” significa una forma replicativa bicatenaria de un bacteri�fago que contiene un gen

heter�logo y capaz de replicarse. El vector de fago tiene un origen de replicaci�n de fago que permite la replicaci�n de fago y la formación de partículas de fago. El fago es preferentemente un bacteri�fago filamentoso, tal como un fago M 13, f1, fd, Pf3 o un derivado del mismo, o un fago lambdoide, tal como lambda, 21, fi80, fi81, 82, 424, 434, etc., o un derivado de los mismos.

Como se usa en el presente documento, “posición accesible al disolvente” se refiere a una posición de un resto de

amino�cido en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo fuente o fragmento de unión a ant�geno que se determina, basándose en su estructura, conjunto de estructuras y/o estructura modelada del anticuerpo o fragmento de unión a ant�geno, que est� potencialmente disponible para acceso al disolvente y/o contacto con una molécula, tal como un ant�geno específico de anticuerpo. Estas posiciones normalmente se encuentran en las CDR y en el exterior de la proteína. Las partes accesibles al disolvente de un anticuerpo o fragmento de unión a ant�geno, como se definen en el presente documento, pueden determinarse usando cualquiera de varios algoritmos conocidos en la técnica. Preferentemente, las posiciones accesibles al disolvente se determinan usando coordenadas de un modelo tridimensional de un anticuerpo, preferentemente usando un programa inform�tico tal como el programa InsightII (Accelrys, San Diego, CA). También pueden determinarse posiciones accesibles al disolvente usando algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Lee y Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379 y Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548). La determinación de posiciones accesibles al disolvente puede realizarse usando software adecuado para modelaci�n de proteínas e información estructural tridimensional obtenida de un anticuerpo. El software que puede utilizarse para estos fines incluye software de Módulo de Biopol�meros SYBYL (Tripos Associates). Generalmente y preferentemente, cuando un algoritmo (programa) requiere un parámetro de tamaño introducido por el usuario, el “tamaño” de una sonda que se usa en el cálculo se ajusta a un radio de aproximadamente 1,4 Angstrom o menor. Además, la determinación de las regiones accesibles al disolvente y métodos de área usando software para ordenadores personales se ha descrito por Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386.

Un “factor o agente angiog�nico” es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de vasos sanguíneos, por

ejemplo, promueve la angiog�nesis, el crecimiento de células endoteliales, la estabilidad de los vasos sanguíneos y/o la vasculog�nesis, etc. Por ejemplo, los factores angiog�nicos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, VEGF y miembros de la familia de la VEGF, PIGF, familia de PDGF, familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), ligandos de TIE (Angiopoyetinas), efrinas, Del-1, factores de crecimiento de fibroblastos: ácido (aFGF) y básico (bFGF), Folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersi�n (SF), Interleucina-8 (IL-8), Leptina, Midkina, neuropilinas, factor de crecimiento Placentario, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de Plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento derivado de Plaquetas, especialmente PDGF-BB o PDGFR-beta, Pleiotropina (PTN), Progranulina, Proliferina, factor de crecimiento Transformante alfa (TGF-alfa), factor de crecimiento Transformante beta (TGF-beta), factor de necrosis Tumoral alfa (TNF-alfa), etc. También incluiría factores que aceleran la curación de heridas, tales como hormona del crecimiento, factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-I), VIGF, factor de crecimiento epid�rmico (EGF), CTGF y miembros de su familia, y TGF alfa y TGF-beta. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22: 3172-3179; Ferrara y Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22: 6549-6556 (por ejemplo, la Tabla 1 que enumera factores angiog�nicos conocidos); y Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8: 200-206.

Un “agente antiangiog�nesis” o “inhibidor de la angiog�nesis” se refiere a una sustancia de bajo peso molecular, un

polinucle�tido, un polip�ptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhiben la angiog�nesis, vasculog�nesis o permeabilidad vascular indeseable, directa o indirectamente. Debería entenderse que el agente antiangiog�nesis incluye los agentes que se unen con y bloquean la actividad angiog�nica del factor de crecimiento o su receptor. Por ejemplo, un agente antiangiog�nesis es un anticuerpo u otro antagonista de un agente angiog�nico como se ha definido anteriormente, por ejemplo, anticuerpos para VEGF-A o para el receptor de VEGF-A (por ejemplo, receptor KDR o receptor Flt-1), inhibidores anti PDGFR tales como Gleevec™ (Mesilato de Imatinib). Los agentes antiangiog�nesis también incluyen inhibidores de angiog�nesis nativos, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22: 3172-3179 (por ejemplo, la Tabla 3 que enumera la terapia de antiangiog�nica en melanoma maligno); Ferrara y Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22: 6549-6556 (por ejemplo, la Tabla 2 que enumera factores antiangiog�nicos conocidos); y Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8: 200-206 (por ejemplo, la Tabla 1 que enumera agentes antiangiog�nicos usados en ensayos cl�nicos).

El término “VEGF” o “VEGF-A’’ como se usa en el presente documento se refiere al factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 165 amino�cidos y factores de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 121, 189 y 206 amino�cidos relacionados, como se describe en Leung et al. (1989) Science 246: 1306, y Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5: 1806, junto con las formas al�licas y procesadas de origen natural de los mismos. El término “VEGF” también se refiere a VEGF de especies no humanas tales como ratón, rata o primate. En ocasiones el VEGF de una especie específica se indica por términos tales como hVEGF para VEGF humano,

mVEGF para VEGF murino, etc. El término “VEGF” también se usa para hacer referencia a formas truncadas del

polip�ptido que comprende los amino�cidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 165 amino�cidos. La referencia a cualquiera de dichas formas de VEGF puede identificarse en la presente solicitud, por ejemplo, por “VEGF (8-109)”, “VEGF (1-109)” o “VEGF165”. Las posiciones de amino�cidos para un VEGF nativo “truncado” se enumeran como se indica en la secuencia de VEGF nativa. Por

ejemplo, la posición de amino�cido 17 (metionina) en el VEGF nativo truncado también es la posición 17 (metionina) en el VEGF nativo. El VEGF nativo truncado tiene afinidad de unión por los receptores KDR y Flt-1 comparable al VEGF nativo.

Un “anticuerpo anti VEGF” es un anticuerpo que se une con VEGF con suficiente afinidad y especificidad.

Preferentemente, el anticuerpo anti VEGF de la invención puede usarse como un agente terapéutico en la dirección e interferencia con enfermedades o afecciones en las que est� implicada la actividad de VEGF. Un anticuerpo anti VEGF habitualmente no se unir� con otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, ni otros factores de crecimiento tales como PlGF, PDGF o bFGF. Un anticuerpo anti VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que se une con el mismo ep�topo que el anticuerpo monoclonal anti VEGF A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. Más preferentemente, el anticuerpo VEGF es un anticuerpo monoclonal anti VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599, incluyendo pero sin limitación un anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; Avastin™).

El anticuerpo anti VEGF “Bevacizumab (BV)”, también conocido como “rhuMAb VEGF” o “Avastin�”, es un anticuerpo monoclonal anti VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599. Comprende regiones marco conservadas de IgG1 humano mutadas y regiones determinantes de complementariedad de unión a ant�geno del anticuerpo monoclonal murino anti hVEGF A.4.6.1 que bloquea la unión de VEGF humano con sus receptores. Aproximadamente el 93 % de la secuencia de amino�cidos de Bevacizumab, incluyendo la mayor parte de sus regiones marco conservadas, deriva de IgG1 humano, y aproximadamente el 7 % de la secuencia deriva del anticuerpo murino A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149.000 dalton y est� glucosilado.

Los términos “VEGFC” y “VEGF-C” se usan de forma intercambiable, y se refieren a un polip�ptido humano de 419 amino�cidos (SwissProt: VEGFC_HUMAN P49767), y ort�logos de mamífero no humano de los mismos, descritos por primera vez por Joukov et al., EMBO J 15, 290-98 (1996), y EMBO J 15, 1751 (1996).

La expresión “antagonista de Nrp2” se usa en el presente documento para hacer referencia a una molécula capaz de

neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con la capacidad de Nrp2 para modular la migración de células endoteliales linfáticas (EC), o linfangiog�nesis del adulto, especialmente linfangiog�nesis tumoral y metástasis tumoral.

Un “antagonista de VEGF” se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con actividades de VEGF incluyendo, pero sin limitación, su unión con uno o más receptores de VEGF. Los antagonistas de VEGF incluyen, sin limitación, anticuerpos anti VEGF y fragmentos de unión a ant�geno de los mismos, moléculas receptoras y derivados que se unen específicamente con VEGF secuestrando de este modo su unión con uno o más receptores, anticuerpos anti receptor de VEGF y antagonistas del receptor de VEGF tales como moléculas pequeñas inhibidoras de las tirosina quinasas VEGFR. La expresión “antagonista de VEGF”, como se usa en el presente documento, incluye específicamente moléculas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, otros polip�ptidos de unión, p�ptidos y moléculas pequeñas no pept�dicas, que se unen con neuropilina 1 y/o neuropilina 2 (Nrp1 y/o Nrp2) y son capaces de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de VEGF incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos anti Nrp1 y anti Nrp2 y anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con Nrp1 y Nrp2, siempre que sean capaces de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de VEGF. Por lo tanto, la expresión “actividades de VEGF” incluye específicamente actividades biológicas mediadas por neuropilina (como se ha definido anteriormente en el presente documento) de VEGF.

Un “antagonista de semaforina” se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o

interferir con las actividades de semaforina incluyendo, pero sin limitación, su unión con uno o más receptores de semaforina. Los antagonistas de semaforina incluyen, sin limitación, anticuerpos anti semaforina y fragmentos de unión a ant�geno de los mismos, moléculas receptoras y derivados que se unen específicamente con semaforina secuestrando de este modo su unión con uno o más receptores, anticuerpos anti receptor de semaforina y antagonistas del receptor de semaforina tales como moléculas pequeñas inhibidoras de semaforinas. La expresión

“antagonista de semaforina”, como se usa en el presente documento, incluye específicamente moléculas, incluyendo

anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, otros polip�ptidos de unión, p�ptidos y moléculas pequeñas no pept�dicas, que se unen con neuropilina 1 y/o neuropilina 2 (Nrp1 y/o Nrp29) y son capaces de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de semaforina incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos anti Nrp1 y anti Nrp2 y anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con Nrp1 y Nrp2, siempre que sean capaces de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de semaforina. Por lo tanto, la expresión “actividades de semaforina” incluye específicamente actividades biológicas mediadas por neuropilina (como se ha definido anteriormente en el presente documento) de semaforinas de clase 3. Dichas actividades biológicas incluyen, por ejemplo, efecto inhibidor del crecimiento de neuritas durante el desarrollo del sistema nervioso embrionario y regeneración neuronal.

“Tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los que

necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno as� como en los que va a prevenirse el trastorno.

Un “trastorno” es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento. Por ejemplo, los mamíferos que padecen o

necesitan profilaxis contra angiog�nesis anómala (angiog�nesis excesiva, inapropiada o descontrolada) o permeabilidad vascular. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos para tratar en el presente documento incluyen tumores malignos y benignos; tumores malignos linfoides y no leucemias; y, en particular, metástasis tumoral (cáncer).

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se

caracterizan normalmente por crecimiento celular desregulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos c�nceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer del hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de ri��n o renal, cáncer de hígado, cáncer de pr�stata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, as� como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no de Hodgkin (NHL) de grado bajo/folicular; NHL linfoc�tico pequeño (SL); NHL folicular/de grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunobl�stico de grado alto; NHL linfobl�stico de grado alto; NHL de células no escindidas pequeño de grado alto; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfoc�tica crónica (CLL); leucemia linfobl�stica aguda (ALL); leucemia de tricoleucitos; y leucemia mielobl�stica crónica.

La expresión “composición antineopl�sica” se refiere a una composición útil en el tratamiento de cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo, por ejemplo, “agente antineopl�sico”. Los ejemplos de agentes

terap�uticos (agentes antineopl�sicos) incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, agentes quimioterap�uticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citot�xicos, agentes usados en radioterapia, agentes antiangiog�nesis, agentes apopt�ticos, agentes anti tubulina y otros agentes para tratar el cáncer, tales como anticuerpos anti HER-2, anticuerpos anti CD20, un antagonista del receptor de factor de crecimiento epid�rmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de tirosina quinasa), inhibidor de HER1/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™)), inhibidores del factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (Mesilato de Imatinib)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizadores) que se unen con una o más de las siguientes dianas ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o receptor o receptores de VEGF, TRAIL/Apo2, y otros agentes químicos orgánicos y bioactivos, etc. También se incluyen combinaciones de los mismos en la invención.

La expresión “agente citot�xico” como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o provoca la destrucción de células. Se pretende que la expresión incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterap�uticos, y toxinas tales como toxinas enzim�ticamente activas de origen bacteriano, f�ngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un “agente quimioterap�utico” es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes

quimioterap�uticos incluyen un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterap�uticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN�; alquil sulfonatos tales como busulf�n, improsulf�n y piposulf�n; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenetiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotec�n); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas del nitrógeno tales como clorambucilo, clomafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfal�n, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammalI y caliqueamicina omega1 (véase, por ejemplo, Agnew (1994) Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; y esperamicina; as� como crom�foro de neocarzinostatina y crom�foros antibióticos de cromoprote�na enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-Lnorleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN� (incluyendo morfolino doxorrubicina, cianomorfolino doxorrubicina, 2pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorrubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofen�lico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fálico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andr�genos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fálico tal como ácido frol�nico; aceglatona; gluc�sido de aldofosfamida; ácido aminolevul�nico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etogl�cido; nitrato de galio, hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofil�nico; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo de polisac�ridos PSK� (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuaz�nico; triacicuona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobrom�n; gacitosina; arabin�sido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL� (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.), formulación de nanopart�culas obtenidas por ingeniería de albúmina, sin Cremophor de paclitaxel ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y docetaxel TAXOTERE� (Rh�ne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina GEMZAR�; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etop�sido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE�; novantrona; tenip�sido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotec�n (Camptosar, CPT-11) (incluyendo el régimen de tratamiento de irinotec�n con 5-FU y leucovorina); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatino, incluyendo el régimen de tratamiento de oxaliplatino (FOLFOX); inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™)) y VEGF-A que reducen la proliferaci�n celular y sales, ácidos o derivados farmac�uticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Tambi�n se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas en tumores tales como antiestr�genos y moduladores de receptores de estr�genos selectivos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX�), raloxifeno, droloxifeno, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estr�geno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE�, exemestano AROMASIN�, formestanio, fadrozol, vorozol RIVISOR�, letrozol FEMARA� y anastrozol ARIMIDEX�; y antiandr�genos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide y goserelina; as� como troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano nucle�sido citosina); oligonucle�tidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresión de genes en rutas de se�alizaci�n implicadas en la proliferaci�n de células aberrantes, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (por ejemplo, ribozima ANGIOZYME�) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas de terapia g�nica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN�, vacuna LEUVECTIN� y vacuna VAXID�; rIL-2 PROLEUKIN�; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN�; rmRH ABARELIX�; Vinorelbina y Esperamicinas (véase Patente de Estados Unidos N� 4.675.187), y sales, ácidos o derivados farmac�uticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El término “prof�rmaco” como se usa en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmac�uticamente activa que es menos citot�xica para células tumorales en comparación con el fármaco parental y es capaz de activarse enzim�ticamente o convertirse en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Wilman (1986) “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions. 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast y Stella et al. (1985). “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al, (ed.), pp. 247-267, Humana Press. Los prof�rmacos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, prof�rmacos que contienen fosfato, prof�rmacos que contienen tiofosfato, prof�rmacos que contienen sulfato, prof�rmacos que contienen p�ptido, prof�rmacos modificados por amino�cido D, prof�rmacos glucosilados, prof�rmacos que contienen 1-lactama, prof�rmacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o prof�rmacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros prof�rmacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citot�xico más activo. Los ejemplos de fármacos citot�xicos que pueden derivatizarse en una forma de prof�rmaco para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, los agentes quimioterap�uticos descritos anteriormente.

Se define en el presente documento que una “molécula pequeña” tiene un peso molecular por debajo de

aproximadamente 500 Dalton.

Una molécula de ácido nucleico “aislada” es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que est� habitualmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico de anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o situación en la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen por lo tanto de la molécula de ácido nucleico como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan el anticuerpo en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico est� en una localización cromos�mica diferente de la de células naturales.

La expresión “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilaci�n y potenciadores.

El ácido nucleico est� “unido operativamente” cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor est� unido operativamente con ADN para un polip�ptido si se expresa como una preprote�na que participa en la secreción del polip�ptido, un promotor o potenciador est� unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas est� unido operativamente con una secuencia codificante si se posiciona para facilitar

la traducción. Generalmente, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que est�n unidas son

contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, los adaptadores de oligonucle�tidos sintéticos o enlazadores se usan de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “célula” “línea celular” y “cultivo celular” se usan de forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen descendencia. Por lo tanto, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados de ella independientemente del

n�mero de transferencias. También se entiende que toda la descendencia puede no ser exactamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica para la que explora en la célula transformada originalmente. Cuando se pretendan designaciones distintas, resultar� evidente a partir del contexto.

Modos de llevar a cabo la invención

En un aspecto, la presente invención se basa en datos experimentales que demuestran que el bloqueo de la función de Nrp2 inhibe la metástasis tumoral.

Un acontecimiento clave en el proceso multietapa de la metástasis implica la salida de una célula tumoral de la masa tumoral primaria. Para tumores sólidos, el sistema linfático con frecuencia proporciona una vía para las células que se separan. Se sabe que el VEGF es un modulador clave de la linfangiog�nesis y la metástasis en muchos modelos tumorales, y la inhibición del eje de VEGF se considera una estrategia prometedora para inhibir el desarrollo de metástasis. Antes de la presente invención, no se ha considerado que Nrp2, un correceptor para VEGFC, sea una diana para inhibir la metástasis tumoral, posiblemente debido a la falta de defectos sist�micos linfáticos en ratones mutantes para Nrp2 adultos.

Los estudios que subyacen en la presente invención, que se presentan en los ejemplos posteriores, apoyan un papel importante de la Nrp2 en la linfangiog�nesis y metástasis tumoral, solamente en parte por modulación de la se�alizaci�n de VEGFR3. Adicionalmente, los datos expuestos en los ejemplos demuestran la presencia de vasos linfáticos funcionales dentro de tumores y muestran que el tratamiento con Anti Nrp2B da como resultado una reducción de estos vasos linfáticos funcionales.

Funciones del VEGFC selectivo regulado por Nrp2, en parte mediante un mecanismo independiente de la activación del receptor de VEGF

La inducción de la migración y la proliferaci�n celular son dos de las funciones celulares centrales del VEGFC descritas hasta la fecha (Joukov et al., Embo J 16, 3898-3911 (1997)). Por lo tanto, el presente hallazgo de que el bloqueo de Nrp2 con Anti Nrp2B bloque� la migración pero no la proliferaci�n de LEC (Figura 2, 3) fue sorprendente. Esta selectividad se ha indicado recientemente con experimentos de anulación de ARNip de Nrp2, pero se atribuyó a limitaciones técnicas experimentales (Favier et al., Blood 108, 1243-1250 (2006)). Los datos presentados en el presente documento muestran que también se observ� selectividad funcional de Nrp2 in vivo, en la que el tratamiento con Anti Nrp2B dio como resultado una reducción de linfangiog�nesis conducida por VEGFC pero no permeabilidad vascular (Figura 2, 3). Estas observaciones sugieren que la inhibición con Anti Nrp2B no actúa simplemente alterando la se�alizaci�n de VEGFC. Sin embargo, se ha determinado que el bloqueo de Nrp2 dio como resultado una reducción modesta de la fosforilaci�n del receptor de VEGF (Figura 3) lo que apoya un mecanismo en el que uno de los papeles del Nrp2 es potenciar la función de receptores de VEGF. Esto plante� la posibilidad de que diferentes acontecimientos fisiológicos inducidos por VEGFC puedan requerir diferentes niveles de activación del receptor de VEGF. Por lo tanto, una reducción de la activación del receptor puede ser suficiente para afectar la migración, pero no la proliferaci�n o la permeabilidad vascular.

Para ensayar esto, la respuesta a dosis de VEGFC de la fosforilaci�n del receptor de VEGF se compar� con la respuesta a dosis de la migración de LEC (Figura 3). Las dosis de VEGFC que condujeron a un nivel de fosforilaci�n de receptor equivalente al visto con el tratamiento con Anti Nrp2B no redujeron o inhibieron la migración. Esto indicó que la reducción de la activación del receptor solamente no explicaba los efectos de bloqueo de la función de Anti Nrp2B.

Por lo tanto, se investigaron otros mecanismos por los que el bloqueo de Nrp2 puede afectar selectivamente a la migración tal como modulación de la adhesión o movilidad. El tratamiento con Anti Nrp2D no tuvo ningún efecto en la adhesión o migración mediada por LEC inducida por VEGF165 (Figura 2), HGF (Figura 3) o FGF-2, lo que indica que en general no afect� a la migración alterando la movilidad. Adicionalmente, se ha propuesto que sema3F, otro ligando de Nrp2, puede modular la migración de LEC o EC, actuando como un quimiorrepelente (Bielenberg et al., J Clin Invest 1 14, 1260-1271 (2004); Favier et al., Blood 108, 1243-1250 (2006)). Sin embargo, el anticuerpo Anti Nrp2B no inhibió ni potenci� la unión de sema3F con Nrp2 (Figura 1) o los efectos funcionales de sema3F en neuronas sensibles (Figura Complementaria 4). Por lo tanto, es poco probable que la reducción de la migración inducida por VEGFC por Anti Nrp2B pueda explicarse por modulación de la función de sema3F.

El efecto de Anti Nrp2B en la formación del complejo de receptor de VEGF/Nrp2 también se ha evaluado. A diferencia de Nrp1, Nrp2 forma un complejo con VEGFR2 y VEGFR3 en ausencia del ligando (Favier et al., 2006, mencionado anteriormente; Karpanen et al., Faseb J 20, 1462-1472 (2006)). Resulta importante que Anti Nrp2B inhibe fuertemente la formación de estos complejos. Esta observación, además del hecho de que Nrp2 es significativa para más que solamente el aumento de la función del receptor de VEGF, apoya un modelo en el que Nrp2 proporciona funcionalidad adicional para modular específicamente la migración, potencialmente transportar maquinaria adicional al complejo del receptor de VEGF.

Nrp2 desempeña un papel importante en la modulación de la linfangiog�nesis del adulto

El análisis de ratones KO para Nrp2 demuestra que Nrp2 es un modulador de la linfangiog�nesis del desarrollo, supuestamente mediante su papel como un co-receptor de VEGFC (Yuan et al., 2002, mencionado anteriormente). Sin embargo, estos ratones mutantes forman vasos linfáticos funcionales después del nacimiento, lo que indica que el defecto representa un retardo en lugar de la inhibición del crecimiento linfático o que hay una compensación funcional por otro mediador molecular. Por lo tanto, el papel de Nrp2 en el mantenimiento de vasos linfáticos maduros y la modulación de linfangiog�nesis del adulto no se ha conocido. El análisis de expresión (Figura 4) no apoya un papel de Nrp2 en el mantenimiento de los vasos linfáticos. Resulta interesante que Nrp2 se expresa fuertemente en los vasos linfáticos que est�n presentes en tumores y dentro de LN adyacentes a tumores, lo que sugiere que Nrp2 puede desempeñar un papel en vasos linfáticos activados o en crecimiento. Las observaciones in vitro demuestran que Anti Nrp2B es una herramienta eficaz en la evaluación del papel de Nrp2 en estos procesos. Por lo tanto, el Anti Nrp2B se ensay� in vivo usando el ensayo de microbolsillo corneal (Figura 2). El Anti Nrp2B bloque� eficazmente una linfangiog�nesis inducida por VEGFC, de forma sorprendentemente equivalente a VEGFR3 ECD. Resulta interesante que el Anti Nrp2B demostr� función inhibidora selectiva in vivo también, no afectando a la permeabilidad vascular inducida por VEGFC. Esto se corresponde con las observaciones in vitro de que Nrp2 modula específicamente la migración, un proceso importante para la linfangiog�nesis, pero es poco probable que desempeñe un papel en la permeabilidad vascular. Finalmente, estos animales adultos normales tratados con Anti Nrp2B no demostraron ningún cambio en los vasos linfáticos intestinales, lo que confirma que Nrp2 no desempeña un papel en el mantenimiento de vasos linfáticos maduros.

La inhibición de Nrp2 conduce a una reducción en los vasos linfáticos funcionales dentro del tumor y una reducción en la metástasis, probablemente inhibiendo que células tumorales dejen la masa tumoral principal mediante la vía linfática

La inhibición del eje de VEGFC, más frecuentemente mediante el uso de VEGFR3 ECD, es una de las estrategias más habitualmente utilizadas para reducir la metástasis (Chen et al., 2005. mencionado anteriormente; He et al., 2002, mencionado anteriormente; Krishnan et al., 2003, mencionado anteriormente; Lin et al., 2005, mencionado anteriormente). El VEGFC puede facilitar la metástasis potencialmente iniciando linfangiog�nesis, aumentando de este modo el área superficial de células tumorales en contacto con LEC, modulando las propiedades adhesivas de las LEC o expresión de citocinas o aumentando la permeabilidad vascular (Alitalo y Carmeliet, Cancer Cell 1, 219227 (2002)). Dado que el Anti Nrp2B modula las funciones mediadas por VEGFC selectivas incluyendo inhibición de linfangiog�nesis del adulto inducida por VEGFC, a continuación, se investigaron los efectos del bloqueo de Nrp2 en la metástasis. Para minimizar las variables de confusión y para evaluar sin ambigüedades el papel del Anti Nrp2B en la metástasis, los inventores eligieron modelos en los que el bloqueo de Nrp2 no afecta al crecimiento tumoral primario y recogieron además todos los animales en el mismo punto temporal en el estudio (Withers y Lee, Semin Radiat Oncol 16, 111-119 (2006)).

En modelos tumorales tanto 66c14 como C6, el tratamiento con Anti Nrp2B dio como resultado una reducción significativa de los nódulos de pulmón metast�sicos por inspección visual (Figura 5, 6). Esto se confirm� por la técnica de micro CT más sensible y cuantitativa (Li et al., Technol Cancer Res Treat 5, 147-155 (2006)). La comparación de tratamientos con Anti Nrp2B y VEGFR3 ECD no fue posible en tumores 66c14 debido a una reducción del tamaño tumoral primario con tratamiento con VEGFR3. Sin embargo, este análisis se realizó en tumores C6 ya que su crecimiento no se vio afectado por el tratamiento de VEGFR3 ECD. Como con el ensayo de microbolsillo corneal, el tratamiento con Anti Nrp2B dio como resultado un bloqueo equivalente de metástasis en comparación con VEGFR3 ECD.

El análisis histológico del tumor primario indicó que no se estaba afectando principalmente a células tumorales. Por lo tanto, se evaluaron las dos vías metast�sicas potenciales que estaban disponibles para células tumorales: vasos sanguíneos y vasos linfáticos (Figura 7). El tratamiento con Anti Nrp2B no afect� a la estructura o densidad de los vasos sanguíneos. Basándose en los datos in vivo de microbolsillo corneal e in vitro, se plante� la hipótesis de que el bloqueo de Nrp2 daría como resultado una reducción de los vasos linfáticos tumorales. El tratamiento con Anti Nrp2B redujo drásticamente la densidad de los vasos linfáticos, y, de nuevo, hasta un grado equivalente al del tratamiento con VEGFR3 ECD. Sin embargo, estos dos tratamientos s� difirieron en la morfología de los vasos linfáticos resultantes. El tratamiento con VEGFR3 ECD condujo a la formación de redes linfáticas dispersas revestidas por células linfáticas de apariencia poco sana. El tratamiento con Anti Nrp2B, por otro lado, condujo al desarrollo de vasos cortos y bolsillos de células linfáticas de apariencia sana aisladas. Estas diferencias apoyan adicionalmente un modelo en el que Nrp2 no actúa simplemente para aumentar la activación del receptor de VEGFC, sino que también proporciona funcionalidad única para mediar en la biología de VEGFC. Estos resultados también demuestran que para los paradigmas experimentales ensayados, el Anti Nrp2B actúa para inhibir la linfangiog�nesis (Figura 7). Sin embargo, no puede descartarse que el Anti Nrp2B también altere vasos linfáticos más establecidos dentro de tumores.

Tambi�n se buscó determinar si los vasos linfáticos intratumorales eran funcionales y por lo tanto competentes para facilitar la metástasis. Se us� linfangiograf�a para identificar vasos linfáticos intratumorales funcionales poco comunes (Figura 8). La técnica usada no fue adecuadamente analítica para determinar la proporción de vasos linfáticos intratumorales que eran funcionales. Sin embargo, probablemente representen una fracción pequeña de la población linfática total (Padera et al., Mol Imaging 1, 9-15 (2002)). Dado que era posible que se estuviera reduciendo la densidad linfática total sin afectar a los vasos funcionales (que pueden tener diferente sensibilidad a Anti Nrp2B), se evaluaron los efectos de bloquear Nrp2 en la formación de vasos linfáticos funcionales. El Anti Nrp2B redujo la formación de vasos funcionales, ligando de este modo de forma más directa los efectos en vasos linfáticos tumorales con la reducción observada en metástasis.

Finalmente, para confirmar la consecuencia de reducción de los vasos linfáticos funcionales, se evaluaron los efectos de Anti Nrp2B en la metástasis al SLN. El SLN es el primer tejido que encuentra las células tumorales después de salir del tumor mediante los vasos linfáticos. Por lo tanto, representa una de las etapas más tempranas en metástasis de órganos distantes (Stracke y Liotta, In Vivo 6, 309-316 (1992)). Como se ha predicho, el tratamiento con Anti Nrp2B dio como resultado un retardo del desarrollo de la micromet�stasis del SLN, coherente con la idea de que estaban saliendo menos células de la masa tumoral primaria. Esto es coherente con las pruebas de que el VEGFC aumenta la metástasis induciendo hiperplasia linfática y suministro aumentado de células cancerosas a ganglios linfáticos (Hoshida et al., Cancer Research 66, 8065-8075 (2006)). Por lo tanto, el peso de las pruebas apunta a un mecanismo por el que el bloqueo de Nrp2 conduce a una reducción de los vasos linfáticos tumorales funcionales, evitando de este modo que las células tumorales inicien el proceso metast�sico saliendo de la masa tumoral primaria.

Nrp2 como una diana de metástasis.

Numerosos estudios cl�nico-patológicos han indicado que la expresión de VEGFC y VEGFR3 se correlaciona con metástasis de ganglios linfáticos y metástasis distal en varios c�nceres humanos (revisado exhaustivamente en Stacker et al., Nat Rev Cancer, 2002, mencionado anteriormente; Stacker et al., Faseb J. 2002, mencionado anteriormente, y He et al., 2004, mencionado anteriormente). Sin embargo, hay información limitada en relación con la expresión de Nrp2 y su relación con la metástasis. De hecho, solo se han hecho conexiones entre la expresión de Nrp2 y malignidad, particularmente en cáncer pancreático (Cohen et al., Biochem Biophys Res Commun 284, 395403 (2001); Fukahi et al., Clin Cancer Res 10, 581-590 (2004)) y cáncer del pulmón (Kawakami et al., Cancer 95, 2196-2201 (2002); Lantuejoul et al., J Pathol 200, 336-347(2003)). Se descubrió de forma similar que Nrp2 se expresaba a niveles mayores en comparación con sus tejidos de control respectivos, no solamente en adenocarcinoma pancreático sino también en col�nico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma, carcinoma de tiroides papilar y adenocarcinoma ductal de infiltración de la mama (Figura 9). De forma más importante, cuando estos tumores se subdividieron en grupos metast�sicos y no metast�sicos, se observ� que la expresión de Nrp2 era estadísticamente superior en el grupo metast�sico en la mayoría de estos tipos tumorales. Resulta interesante que estos tipos tumorales tienen todos linfangiog�nesis intratumoral confirmada que además se ha correlacionado con metástasis de los ganglios linfáticos (Achen et al., 2006, mencionado anteriormente; Achen y Stacker, Int J Cancer 119, 1755-1760 (2006)). Esto indica que se espera que los hallazgos experimentales analizados se extiendan a pacientes humanos con diversos tipos tumorales.

En conclusión, los datos analizados en el presente documento y presentados en los Ejemplos posteriores muestran que Nrp2 desempeña un papel en la modulación de la migración celular conducida por VEGF y proporcionan pruebas de que Nrp2 puede actuar mediante múltiples mecanismos incluyendo la potenciación de la activación del receptor de VEGF y mecanismos independientes de la se�alizaci�n del receptor de VEGF. Adicionalmente, el bloqueo de la función de Nrp2 usando Anti Nrp2B da como resultado una reducción drástica de la linfangiog�nesis inducida por VEGFC en ratones adultos. Este tratamiento también da como resultado una reducción de la metástasis, probablemente mediante una reducción del desarrollo de vasos linfáticos funcionales. Estos datos, junto con análisis de la expresión de Nrp2 en varios tumores humanos, sugieren que Nrp2 es una diana válida para modular la metástasis.

Producci�n de anticuerpos Anti Nrp2

La invención en el presente documento incluye la producción y uso de anticuerpos anti NRP2.

Los anticuerpos anti NRP2 se seleccionan usando un ant�geno de NRP2 derivado de una especie de mamífero. Preferentemente el ant�geno es NRP2 humana (hNRP2). Sin embargo, también pueden usarse como el ant�geno diana la NRP2 de otras especies tales como NRP2 murina (mNRP2). Los ant�genos de NRP2 de diversas especies de mamífero pueden aislarse de fuentes naturales. En otras realizaciones, el ant�geno se produce de forma recombinante o se realiza usando otros métodos idénticos conocidos en la técnica.

El anticuerpo seleccionado normalmente tendr� una afinidad de unión suficientemente fuerte por el ant�geno de NRP2. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse con hNRP2 con un valor de Kd de no más de aproximadamente 5 nM, preferentemente no más de aproximadamente 2 nM y más preferentemente no más de aproximadamente 500 pM. Las afinidades del anticuerpo pueden determinarse por un ensayo basado en resonancia de plasm�n superficial (tal como el ensayo BIAcore como se describe en los Ejemplos); el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA); y ensayos de competición (por ejemplo, RIA), por ejemplo.

Adem�s, el anticuerpo puede someterse a otros ensayos de la actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como un producto terapéutico. Dichos ensayos se conocen en la técnica y dependen del ant�geno diana y su uso pretendido para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de inhibición de HUVEC (como se describe en los ejemplos posteriores); ensayos de inhibición del crecimiento de células tumorales (como se describe en el documento WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) (Patente de Estados Unidos 5.500.362); y ensayos de actividad agonista o hematopoyesis (véase documento WO 95/27062).

Para explorar con respecto a anticuerpos que se unen con un ep�topo particular en el ant�geno de interés, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Como alternativa, puede realizarse mapeo de ep�topos, por ejemplo como se describe en Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 1388-1394, para determinar si el anticuerpo se une con un ep�topo de interés.

Mutantes de anticuerpo Anti NRP2

Los anticuerpos anti NRP2 ejemplificados en el presente documento, que se generaron a partir de bibliotecas de fagos, pueden modificarse adicionalmente dentro del alcance de las reivindicaciones para generar mutantes de anticuerpo con propiedades físicas, químicas y/o biológicas mejoradas sobre el anticuerpo parental. Cuando el ensayo usado es un ensayo de actividad biológica, el mutante de anticuerpo preferentemente tiene una actividad biológica en el ensayo elegido que es al menos aproximadamente 10 veces mejor, preferentemente al menos aproximadamente 20 veces mejor, más preferentemente al menos aproximadamente 50 veces mejor, y en ocasiones al menos aproximadamente 100 veces o 200 veces mejor, que la actividad biológica del anticuerpo parental en ese ensayo.

Los anticuerpos anti Nrp2 de la invención pueden someterse a modificaciones, dentro del alcance definido en las reivindicaciones, dependiendo con frecuencia del uso pretendido del anticuerpo. Dichas modificaciones pueden implicar la alteración de la secuencia de amino�cidos, fusión con polip�ptido o polip�ptidos heter�logos y/o modificaciones covalentes tales como las elaboradas posteriormente. Con respecto a alteraciones de la secuencia de amino�cidos, posteriormente, se elaboran modificaciones a modo de ejemplo posteriormente. Por ejemplo, puede sustituirse también cualquier resto de ciste�na no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del mutante de anticuerpo, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, pueden añadirse enlace o enlaces de ciste�na al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv). Otro tipo de mutante de amino�cido tiene un patrón de glucosilaci�n alterado. Esto puede conseguirse suprimiendo uno o más restos de carbohidratos hallados en el anticuerpo, y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilaci�n que no est�n presentes en el anticuerpo. La glucosilaci�n de anticuerpos es normalmente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripept�dicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier amino�cido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzim�tica del resto de carbohidrato con la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de una de estas secuencias tripept�dicas en un polip�ptido crea un sitio de glucosilaci�n potencial. La glucosilaci�n ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiamino�cido, más habitualmente serina o treonina,

5 aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glucosilaci�n al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de amino�cidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripept�dicas anteriormente descritas (para sitios de glucosilaci�n ligados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilaci�n ligados a O).

10 Modificaciones ilustrativas:

Normalmente se comenzaría con una sustitución conservativa tal como la mostrada posteriormente bajo el

encabezamiento de “sustituciones preferidas”. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio de la actividad

15 biológica (por ejemplo, afinidad de unión), entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados “sustituciones ilustrativas” en la siguiente tabla, o como se describe adicionalmente posteriormente en referencia a las clases de amino�cidos, y se exploran los productos.

Sustituciones preferidas: 20

Resto original

Sustituciones ilustrativas Sustituciones preferidas

Ala (A)

val; leu; ile val

Arg (R)

lys; gln; asn lys

Asn (N)

gln; his; lys; arg gln

Asp (D)

glu glu

Cys (C)

ser ser

Gln (Q)

asn asn

Glu (E)

asp asp

Gly (G)

pro; ala ala

His (H)

asn; gln; lys; arg arg

Ile (I)

leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L)

norleucina; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K)

arg; gln; asn arg

Met (M)

leu; phe; ile leu

Phe (F)

leu; val; ile; ala; tyr leu

Pro (P)

ala ala

Ser (S)

thr thr

Thr (T)

ser ser

Trp (W)

tyr; phe tyr

Tyr (Y)

trp; phe; thr; ser phe

Val (V)

ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

Se consiguen aún más modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de los anticuerpos seleccionado sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipept�dica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la

25 carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobo: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

30 (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr, asn, gln;

(3)

ácidos: asp, glu;

(4)

b�sicos: his, lys, arg;

(5)

restos que influyen en la orientación de cadena: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes de secuencia de amino�cidos se preparan por diversos métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, mutag�nesis mediada por oligonucle�tidos (o dirigida), mutag�nesis por PCR y mutag�nesis de casete de una versión mutante preparada anteriormente o una versión no mutante del anticuerpo parental. El método preferido para preparar mutantes es la mutag�nesis dirigida (véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 488).

Vectores, células hospedadoras y métodos recombinantes

Los anticuerpos anti Nrp2 de la invención pueden producirse de forma recombinante, usando técnicas y materiales fácilmente obtenibles.

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti NRP2, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para clonaci�n adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aísla o sintetiza fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleot�dicas que son capaces de unirse específicamente con ADN que codifica las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Est�n disponibles muchos vectores. Los componentes de vectores generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicaci�n, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

(i) Componente de secuencia señal

El anticuerpo de la presente invención puede producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polip�ptido de fusión con un polip�ptido heter�logo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polip�ptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N terminal de la proteína o el polip�ptido maduro. Las secuencia señal heter�loga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal de anticuerpo nativo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina estable frente al calor II. Para secreción de levadura la secuencia señal nativa puede sustituirse por, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor a (incluyendo líderes del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces), o líder de fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, est�n disponibles secuencias señal de mamífero as� como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

El ADN para dicha región precursora est� ligado en fase de lectura con el ADN que codifica el anticuerpo.

(ii) Componente de origen de replicaci�n

Los vectores tanto de expresión como de clonaci�n contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonaci�n esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromos�mico del hospedador, e incluye orígenes de replicaci�n o secuencias de replicaci�n autónoma. Dichas secuencias se conocen bien para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicaci�n del pl�smido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen de pl�smido 2 ! es adecuado para levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonaci�n en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicaci�n no es necesario para vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 puede usarse normalmente solamente porque contiene el promotor temprano).

(iii) Componente del gen de selección

Los vectores de expresión y clonaci�n pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección t�picos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotr�ficas o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora.

Las células que se transforman con éxito con un gen heter�logo producen una proteína que confiere resistencia farmacol�gica y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofen�lico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotione�na I y II, preferentemente genes de metalotione�na de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular de ovario de h�mster Chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR.

Como alternativa, las células hospedadoras (particularmente hospedadores de tipo silvestre que contienen DHFR end�geno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican anticuerpo, proteína de DHFR de tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminogluc�sido 3’-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminogluc�sido, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Véase Patente de Estados Unidos N� 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el pl�smido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 39). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en tript�fano, por ejemplo, ATCC N� 44076 o PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85: 12. La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona entonces un ambiente eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de tript�fano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan por pl�smidos conocidos que portan el gen Leu2.

Adem�s, pueden usarse vectores derivados del pl�smido circular de 1,6 !m pKD1 para transformación de levaduras Kluyveromyces. Como alternativa, se ha indicado un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternero recombinante para K. lactis. Van den Berg (1990) BiolTechnology 8:135. También se han desvelado vectores de expresión de múltiples copias estables para la secreción de albúmina de suero humano recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al. (1991) Bio/Technology 9: 968-975.

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonaci�n habitualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo hospedador y est� unido operativamente con el ácido nucleico del anticuerpo. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor de phoA, los sistemas promotores de 1-lactamasa y lactosa, alcalina fosfatasa, un sistema promotor de tript�fano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S. D.) unida operativamente con el ADN que codifica el anticuerpo.

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada de 70 a 80 bases cadena arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3’ de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli A al extremo 3’ de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucol�ticas, tales como enolasa, gliceraldeh�do-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfo-fructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotione�na, gliceraldeh�do-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en expresión de levadura se describen adicionalmente en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levadura también se usan provechosamente con promotores de levadura.

La transcripción de anticuerpos de vectores en células hospedadoras de mamíferos se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus, (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferentemente virus de Simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heter�logos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral de replicaci�n de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. Se desvela un sistema para expresar ADN en hospedadores mamíferos usando el virus del papiloma bovino como un vector en la Patente de Estados Unidos N� 4.419.446. Se describe una modificación de este sistema en la Patente de Estados Unidos N� 4.601.978. Véase también Reyes et al. (1982) Nature 297: 598-601 sobre la expresión del ADNc de interfer�n 1 humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Como alternativa, puede usarse la repetición terminal larga del virus del sarcoma de rous como el promotor.

(v) Componente de elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención por eucariotas superiores se aumenta con frecuencia insertando una secuencia potenciadora en el vector. Se conocen ahora muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoprote�na e insulina). Normalmente, sin embargo, se usar� un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicaci�n (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicaci�n y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv (1982) Nature 297: 17-18 sobre la potenciación de elementos para la activación de promotores eucariotas. El

potenciador también puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5’ o 3’ de la secuencia codificante de anticuerpo, pero se localiza preferentemente en un sitio 5’ del promotor.

(vi) Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (células de levadura, de hongo, de insecto, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias est�n disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5’ y ocasionalmente 3’, de ADN eucariota o viral o ADNc. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilaci�n de hormona del crecimiento bovina. Véase documento WO94/11026 y el vector de expresión desvelado en el mismo.

(vii) Selección y transformación de células hospedadoras

Son células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores del presente documento las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Shigella, as� como Bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P desvelado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedador de clonaci�n de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Adem�s de procariotas, son hospedadores de clonaci�n o expresión adecuados para vectores codificantes de anticuerpos microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levadura. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadero común, es el más habitualmente usado entre los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Sin embargo, est�n disponibles habitualmente varios otros géneros, especies y cepas, y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070); Candida: Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospara crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora. Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glucosilado derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Est�n disponibles públicamente diversas cepas virales para transfecci�n, por ejemplo, la variante L-1 de NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 de NPV de Bombyx mori, y dichos virus pueden usarse como el virus en el presente documento de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfecci�n de células de Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse como hospedadores cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, el mayor interés ha sido en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero útiles son la línea CV1 de ri��n de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de ri��n embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al. (1977) J. Gen Virol. 36: 59); células de ri��n de cría de h�mster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de h�mster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216); células de sertoli de ratón (TM4, Mather (1980) Biol. Reprod. 23: 243-251); células de ri��n de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de ri��n de cercopiteco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de ri��n canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al. (1982) Annals N. Y Acad Sci. 383: 44-68); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonaci�n anteriormente descritos para producción de anticuerpos y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de las células hospedadoras

Las células hospedadoras usadas para producir el anticuerpo de la presente invención pueden cultivarse en diversos medios. Son adecuados para cultivar las células hospedadoras medios disponibles en el mercado tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma). Además, puede usarse como medio de cultivo para las células hospedadoras cualquiera de los medios descritos en Ham et al. (1979) Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al (1980) Anal. Biochem.102: 255, Patentes de Estados Unidos N� 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de Estados Unidos Re. 30.985. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epid�rmico), sales (tal como cloruro sádico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como fármaco

GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a

concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que se conocería por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la célula hospedadora seleccionada para expresión, y resultarán evidentes para el experto habitual en la materia.

(ix) Purificación de anticuerpos

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse de forma intracelular, en el espacio peripl�smico o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce de forma intracelular, como una primera etapa, los residuos de partículas, bien células hospedadoras o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugaci�n o ultrafiltraci�n. Carter et al. (1992) Biol/Technology 10: 163-167 describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio peripl�smico de E. coli. Brevemente, las pasta celular se descongela en presencia de acetato sádico (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los residuos celulares pueden retirarse por centrifugaci�n. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltraci�n Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la prote�lisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatograf�a de hidroxilapatita, electroforesis en gel, di�lisis y cromatograf�a de afinidad, siendo la cromatograf�a de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que est� presente en el anticuerpo. Puede usarse proteína A para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humano (Guss et al. (1986) EMBOJ. 5: 15671575). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero est�n disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio poroso controlado o poli(estirendivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos de lo que puede conseguirse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. También est�n disponibles otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatograf�a en sílice, cromatograf�a en heparina, cromatograf�a de SEPHAROSE™ en una resina de intercambio ani�nico o cati�nico (tal como una columna de ácido poliasp�rtico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio dependiendo del anticuerpo para recuperar.

Despu�s de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatograf�a de interacción hidrófoba de pH bajo usando un tampón de eluci�n a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferentemente realizado a concentraciones salinas bajas (por ejemplo, de aproximadamente 0 a 0,25 M de sal).

Formulaciones farmacéuticas

Se preparan formulaciones terapéuticas del anticuerpo para almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales

(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16� edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o

soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido asc�rbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos tales como metilo o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polip�ptido de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; pol�meros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; amino�cidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosac�ridos, disac�ridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos met�licos (por ejemplo complejos de proteína-Zn); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

La formulación del presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trate, preferentemente los que tengan actividades complementarias que no se afecten de forma adversa entre s�. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente inmunosupresor, un agente anticanceroso, un agente antiangiog�nico, un agente antineopl�sico, un agente citot�xico y/o un agente quimioterap�utico. Dichas moléculas estarán presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin pretendido.

Los principios activos también pueden atraparse en microc�psulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervaci�n o por polimerizaci�n interfacial, por ejemplo, microc�psula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microc�psula de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de forma coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopart�culas y nanoc�psulas) o en macroemulsiones.

Dichas técnicas se desvelan en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16� edición, Osol, A. Ed. (1980).

La formulación para usar para administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.

Pueden prepararse preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de pol�meros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microc�psulas. Los ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poli�steres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietilmetacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de Estados Unidos N� 3.773.919), copol�meros de ácido Lglut�mico y y etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copol�meros de ácido l�ctico-ácido glic�lico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copol�mero de ácido l�ctico�cido glic�lico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibut�rico. Aunque pol�meros tales como etilen-vinil acetato y ácido l�ctico-ácido glic�lico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando permanecen en el cuerpo anticuerpos encapsulados durante un tiempo largo, estos pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de su exposición a humedad a 37 �C, dando como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Puede idearse estrategias racionales para estabilizaci�n dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es una formación de enlaces S-S intermoleculares mediante intercambio de tio-disulfuro, puede conseguirse estabilizaci�n modificando los restos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polim�rica específicas.

Usos terapéuticos

Se contempla que los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar un mamífero. En una realización, el anticuerpo se administra a un mamífero no humano para los fines de obtener datos precl�nicos, por ejemplo. Los mamíferos no humanos a modo de ejemplo para tratar incluyen primates no humanos, perros, gatos, roedores y otros mamíferos en los que se realizan estudios precl�nicos. Dichos mamíferos pueden ser modelos animales establecidos para una enfermedad para tratar con el anticuerpo o pueden usarse para estudiar la toxicidad del anticuerpo de interés. En cada una de estas realizaciones, pueden realizarse estudios de aumento de dosis en el mamífero. Cuando el anticuerpo es un anticuerpo anti NRP2, se puede administrar a un roedor hospedador en un modelo de tumor sólido, por ejemplo.

Adem�s, o como alternativa, el anticuerpo se usa para tratar a un ser humano, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad o trastorno que podría beneficiarse de la administración del anticuerpo.

La presente invención abarca la prevención y tratamiento de linfangiog�nesis tumoral, la prevención y tratamiento de metástasis tumoral y terapia de cáncer antiangiog�nica, una nueva estrategia de tratamiento del cáncer dirigida a inhibir el desarrollo de vasos sanguíneos tumorales requeridos para proporcionar nutrientes para apoyar el crecimiento tumoral. La invención incluye específicamente inhibir el crecimiento neopl�sico de un tumor en el sitio primario as� como prevenir y/o tratar la metástasis de tumores en los sitios secundarios, permitiendo de este modo atacar los tumores por otros productos terapéuticos. Los ejemplos de cáncer para tratar (incluyendo prevención) en el presente documento incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos c�nceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de ri��n o renal, cáncer de hígado, cáncer de pr�stata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, as� como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no de Hodgkin (NHL) de grado bajo/folicular; NHL linfoc�tico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunobl�stico de grado alto; NHL linfobl�stico de grado alto; NHL de células no escindidas pequeñas de grado alto; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfoc�tica crónica (CLL); leucemia linfobl�stica aguda (ALL); leucemia de tricoleucitos; y leucemia mielobl�stica crónica. Más particularmente, los c�nceres que son susceptibles de tratamiento por los anticuerpos de la invención incluyen cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no de Hodgkin (NHL), cáncer de células renales, cáncer de pr�stata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer ovárico, mesotelioma y mieloma múltiple.

Se contempla que cuando se usan para tratar diversas enfermedades tales como tumores, los anticuerpos de la invención pueden combinarse con otros agentes terapéuticos adecuados para las mismas enfermedades o similares. Cuando se usan para tratar cáncer, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en combinación con terapias de cáncer convencionales, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas.

En ciertos aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para terapia de cáncer de combinación con el anticuerpo de la invención incluyen otros agentes antiangiog�nicos. Se han identificado muchos agentes antiangiog�nicos y se conocen en la técnica, incluyendo los enumerados en Carmeliet y Jain (2000).

En un aspecto, el anticuerpo de la invención se usa en combinación con un antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF tal como anticuerpos anti VEGF, variantes de VEGF, fragmentos del receptor de VEGF solubles, apt�meros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos neutralizadores anti VEGFR, inhibidores de tirosina quinasas de VEGFR y cualquier combinación de los mismos. Como alternativa, o además, pueden coadministrarse dos o más anticuerpos anti NRP 1 al paciente. En una realización más preferida, el anticuerpo anti NRP1A o anti NRPB de la invención se usa en combinación con un anticuerpo anti VEGF para generar efectos aditivos o sin�rgicos. Los anticuerpos preferidos anti VEGF incluyen los que se unen con el mismo ep�topo que el anticuerpo anti hVEGF A4.6.1. Más preferentemente, el anticuerpo anti VEGF es bevacizumab o ranibizumab.

En algunos otros aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para terapia de tumor de combinación con el anticuerpo de la invención incluyen antagonista de otros factores que est�n implicados en el crecimiento tumoral, tales como EGFR, ErbB2 (también conocido como Her2) ErbB3, ErbB4 o TNF. Preferentemente, el anticuerpo anti NRP1 de la invención puede usarse en combinación con moléculas pequeñas inhibidoras de receptor tirosina quinasa (RTKI) que se dirigen a uno o más receptores de tirosina quinasa tales como receptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de EGF y receptores de PDGF. Se conocen en la técnica muchas moléculas pequeñas RTKI terapéuticas, incluyendo, pero sin limitación, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA�), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA�), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT�), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC�), MLN-518, CEP-701, PKC-412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE�, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR�), XL880 y CHIR-265.

El anticuerpo anti Nrp de la invención, bien solo o bien en combinación con un segundo agente terapéutico (tal como un anticuerpo anti VEGF) puede usarse además en combinación con uno o más agentes quimioterap�uticos. Puede usarse diversos agentes quimioterap�uticos en los métodos de tratamiento combinados de la invención. Una lista a modo de ejemplo y no limitante de agentes quimioterap�uticos contemplados se proporciona en el presente

documento bajo “Definición”.

Cuando el anticuerpo anti Nrp se coadministra con un segundo agente terapéutico, el segundo agente terapéutico puede administrarse en primer lugar, seguido por el anticuerpo anti Nrp. Sin embargo, la administración simultánea o administración del anticuerpo anti Nrp en primer lugar también se contempla. Son dosificaciones adecuadas para el segundo agente terapéutico las usadas en la actualidad y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y anticuerpo anti Nrp.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo depender� del tipo de enfermedad para tratar, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial cl�nico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del m�dico a cargo. El anticuerpo se administra de forma adecuada al paciente en un momento o durante una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 !g/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, bien, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o bien por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 !g/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. En un aspecto preferido, el anticuerpo de la invención se administra cada dos a tres semanas, a una dosis que varía de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg. Más preferentemente, dicho régimen de dosificación se usa en combinación con un régimen de quimioterapia como la terapia de primera línea para tratar el cáncer colorrectal metast�sico. En algunos aspectos, el régimen de quimioterapia implica la administración intermitente de alta dosis tradicional. En algunos aspectos adicionales, los agentes quimioterap�uticos se administran usando dosis más pequeñas y más frecuentes sin descansos programados (“quimioterapia metron�mica”). El progreso de la terapia de la invención se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

La composición de anticuerpo se formular�, dosificar� y administrar� de una manera coherente con la buena práctica m�dica. Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trate, el mamífero particular que se trate, la afección clónica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los

practicantes m�dicos. La “cantidad terapéuticamente eficaz” del anticuerpo para administrar estar� dominada por

dichas consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, aliviar o tratar un trastorno o enfermedad. El anticuerpo se formula opcionalmente, aunque no es necesario, con uno o más agentes usados en la actualidad para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con las vías de administración que se han usado anteriormente en el presente documento o de aproximadamente 1 a 99 % de las dosificaciones empleadas hasta la fecha. Generalmente, el alivio o tratamiento de una enfermedad o trastorno implica la reducción de uno o más síntomas o problemas m�dicos asociados con el trastorno o enfermedad. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede conseguir uno o una combinación de lo siguiente: reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, reducir en algún grado y/o detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir la metástasis tumoral; inhibir, en algún grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco puede evitar el crecimiento y/o destruir células cancerosas existentes, puede ser citost�tico y/o citot�xico. En algunas realizaciones, puede usarse una composición de la presente invención para evitar la aparición o reaparición de la enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero.

Se pretende que los ejemplos siguientes meramente ilustren la práctica de la presente invención y no se proporcionan como limitación.

Ejemplos

Ejemplo 1

Generaci�n y caracterización de anticuerpos anti Nrp2B

El anti Nrp2B se aisl� de bibliotecas de fagos de anticuerpos sintéticos humanos como se ha descrito previamente (Lee et al., J Mol Biol 340, 1073-1093 (2004)). Brevemente, se construyeron bibliotecas de anticuerpos sintéticos presentados en fagos en un único armazón humano introduciendo diversidad sintética en posiciones expuestas al disolvente dentro de las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR). Para mejorar el rendimiento de la biblioteca, se construyeron bibliotecas de fragmentos monovalentes y bivalentes de unión a ant�geno (Fab), y se exploraron diferentes diversidades de CDR-H3 variando la composición de amino�cidos y la longitud de la CDR. La biblioteca se expandió después aumentando la variabilidad de la longitud de CDR-H3 y usando codones adaptados que imitaban la composición de amino�cidos de las secuencias de CDR3-H3 naturales. Usando estas bibliotecas con CDR completamente sintéticas presentadas en un único armazón se generaron anticuerpos de alta afinidad. Para más detalles de estrategias y métodos para generar bibliotecas de anticuerpos sintéticos con un único molde, véase, por ejemplo, el documento WO03/102157 publicado el 11 de diciembre de 2003.

Los procedimientos de selección para clones anti Nrp consistieron en diversas combinaciones de clasificaciones de soporte sólido y de unión en solución que se conocen en la técnica. En clasificaciones de soporte sólido, la biblioteca de fagos de anticuerpos se explor� con ant�geno diana que recubr�a una inmunoplaca NUNC de 96 pocillos Maxisorp a una concentración de 5 !g/ml. En el método de clasificación de unión en solución, se incub� una biblioteca de fagos con concentración decreciente de ant�geno biotinilado en solución, que después se captur� por neutravidina que recubr�a la placa Maxisorp de 96 pocillos (2-5 !g/ml). La concentración decreciente permitió una mayor rigurosidad en la selección para buscar agentes de unión más estrechos.

Como resultado de combinar las clasificaciones de soporte sólido y de unión en solución, se identificó un clon de una biblioteca de VH (YW68.4) y otro de una biblioteca de VHVL (YW126.20) como agentes de unión de NRP-2. Se realizó una serie de ensayos in vitro para examinar las propiedades y actividades de los nuevos anticuerpos anti NRP seleccionados, incluyendo ensayos de afinidad de unión (tales como BIAcore) y ensayos de bloqueo (tales como ensayo de colapso de cono de crecimiento inducido por Semaforina y ensayos de HUVEC).

Las CDR de clones sin tratamiento previo se modificaron por ingeniería genética para mejorar su afinidad y estabilidad y se generaron anticuerpos anti Nrp2 YW68.4.2 y YW68.4.2.36. Se usaron proteínas de fusión mNrp2 (a1a2b1b2)-His, hNrp2 (a1a2b1b2)-Fc expresada en células CHO y hNrp2 (b1b2) expresada en células de insecto para exploración y caracterización de anticuerpos. Las regiones VL y VH del anticuerpo de fago anti Nrp2B (originalmente designado YW68.4.2.36) se clonaron en un vector de expresión de mamíferos respectivamente. El anti Nrp2B IgG 1 humano o mlgG2a se expres� en células CHO de mamífero y se purificó con columna de afinidad de proteína A.

Las secuencias de amino�cidos de los anticuerpos anti Nrp2B YW68.4.2 y YW68.4.2.36 se muestran en la Figura 10. La secuencia de amino�cidos del anticuerpo anti Nrp2A YW126.20 se muestra en la Figura 11. El alineamiento de la secuencia de dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti Nrp2A YW126.20 con la secuencia K1 humana se muestra en la Figura 12. El alineamiento de la secuencia de dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti Nrp2A YW126.20 con la secuencia humana III (hum III) se muestra en la Figura 13.

En los siguientes experimentos, se us� el anticuerpo anti Nrp2B YW68.4.2.36, que se denominar� en lo sucesivo en el presente documento “Anti Nrp2B”. Este anticuerpo se dirigió a los dominios del factor V/VII de coagulación (b1-b2) de Nrp2 (Figura 1A), ya que estos dominios se requieren para la unión de VEGFC con neuropilinas (Karpanen et al., Faseb J 20, 1462-1472 (2006)). Además, este anticuerpo se une con afinidad similar con Nrp2 murina y humana pero no se une con Nrp1 (Figura 1B). Se ha confirmado que el anti Nrp2B se une exclusivamente con los dominios b1-b2 y no se une con los dominios CUB (a1-a2) de Nrp2 humana, que son principalmente responsables de la unión con semaforina (Chen et al., Neuron 21, 1283-1290 (1998); Giger et al., Neuron 21, 1079-1092 (1998)).

Para determinar las afinidades de unión de anticuerpos IgG1 anti Nrp2B, se us� la medición de resonancia de plasm�n superficial (SRP) con un instrumento BIAcore™-3000. En primer lugar, se capturaron IgG humanos anti Nrp2B por microplacas biosensoras CM5 recubiertas de IgG de conejo anti humano para conseguir aproximadamente 200 unidades de respuesta (UR). Para las mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie dobles de Nrp2 humana o de ratón (a1a2b1b2) (de 0,5 nM a 250 nM) por separado en tampón de PBT (PBS con Tween 20 0,05 % (v/v) a 25 �C con un caudal de 30 !l/minuto. Se calcularon las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociaci�n (koff) usando un modelo de unión de Langmuir de uno a uno sencillo (Software de BIAcore Evaluation versión 3.2). La constante de disociaci�n en equilibrio (KD) se calcul� como la relación koff/kon.

El anti Nrp2B se une con Nrp murina con una Kd de 4,9 nM y con Nrp2 humana con una Kd de 5,3 nM como se evalúa por la medición por resonancia de plasm�n superficial.

La capacidad del Anti Nrp2B para bloquear la unión de VEGFC con Nrp2 se ensay� tanto en formato de ELISA como en ensayos de unión basados en células.

Para ensayos de especificidad de unión basados en ELISA, se incubaron diluciones en serie triples de IgG Anti Nrp2B (de 0,002 nM a 500 nM) en tampón PBST (tampón de PBT con BSA 0,5 % (p/v)) con placas Maxisorp de 96 pocillos recubiertas con ant�geno 1 !g/ml durante al menos 1 hora, y las placas se lavaron con tampón de PBT. Se detectaron anticuerpos unidos con conjugados de HRP anti anticuerpo humano diluidos 1:2500 en tampón de PBST, se desarrollaron con sustrato TMB durante aproximadamente 5 minutos, se detuvieron con H3PO4 1M y se leyeron espectrofotom�tricamente a 450 nm.

Para evaluar el bloqueo de Nrp2 de la unión con VEGF, se incubaron en primer lugar diluciones en serie triples de IgG anti Nrp2B con una placa Maxisorp de 96 pocillos recubierta con NRP2-Fc (5 !g/ml) en tampón de PBST durante 2 horas, seguido de adición de VEGF165 biotinilado o VEGFC (longitud completa) durante 15 minutos. La cantidad de unión de VEGF biotinilado con Nrp2 se detect� por conjugados de estreptavidina-HRP.

Para evaluar la unión celular, se llev� a cabo unión de VEGF165 biotinilado o VEGFC con LEC como se ha descrito previamente (Jia et al., J Biol Chem 281, 13493-13502 (2006)) y la unión se detect� por conjugados de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Se realizó unión de Sema3F como se ha descrito previamente (Chen et al., 1998, mencionado anteriormente).

El anti Nrp2B bloque� fuertemente la unión de VEGFC con Nrp2 (Figura 1C) y las células HEK-293 se transfectaron con Nrp2 de longitud completa. Dado que la Nrp2 también se puede unir con VEGF (Gluzman-Poltorak et al., J Biol Chem 275, 29922 (2000)), probablemente utilizando los mismos dominios, también se ensay� la capacidad del anti Nrp2B para bloquear la unión de VEGF165 con Nrp2. El anti Nrp2B también bloquea fuertemente la unión de VEGF165 con Nrp2 (Figura 1D) con una CI50 similar (0,1 nM). Sin embargo, el Anti Nrp2B no fue capaz de bloquear la unión de Sema3F con LEC (Figura 1E) que expresa fuertemente Nrp2 (Figura Complementaria 1). Estos resultados son coherentes con observaciones previas de que los dominios a1-a2 son principalmente responsables de la unión de semaforina y los dominios b1-b2 de la unión de VEGF (Figura 1 A).

Ejemplo 2

El anti Nrp2B bloquea las funciones mediadas por VEGFC selectivas in vitro

Materiales y métodos

Cultivos celulares

Se obtuvieron HMVEC-dLyAd - Células Endoteliales Microvasculares Linfáticas D�rmicas Humanas (LEC) y HUVEC de Cambrex y se cultivaron en medio EGM-2 (Cambrex). Se obtuvieron células C6 LacZ de ATCC. Las 66C14 fueron un amable regalo del Dr. Fred R Miller. Las células tumorales se cultivaron en DMEM (Gibco) complementado con FBS al 10 %. Todas las células se mantuvieron a 37 �C en un incubador de CO2 5 %, humedad al 95 %.

Ensayo de proliferaci�n celular

Se recubri� una placa de fondo transparente-negro de 96 pocillos (VWR) con Fibronectina 5 !g/ml (Invitrogen) a 37 �C durante 2 horas. Las LEC se recogieron y resuspendieron en medio de ensayo (BSA 0,1 %, EGM-2) 3000 células/100 !l y se añadieron a los pocillos. Las células se incubaron a 37 �C durante 16 horas. Se a�adi� solución de marcaje BrdU (kit de ELISA de Proliferaci�n Celular; Roche) y las células se incubaron durante 24 horas adicionales a 37 �C. La incorporación de BrdU se determin� por inmunoensayo de quimioluminiscencia (6 pocillos por condición).

Resultados

Se examin� el papel de la Nrp2 en la migración y proliferaci�n mediada por VEGFC. Estas son actividades celulares clave inducidas por VEGFC (Joukov et al., Embo J 16, 3898-3911 (1997)). Se ha mostrado previamente que las LEC son altamente sensibles a VEGFC (Makincn et al., Embo J 20, 4762-4773 (2001); Veikkola et al., Faseb 17, 20062013 (2003); Whitehurst et al., Lymphat Res Biol 4, 119-142 (2006)). Usando un sistema de transwell, se introdujeron LEC humanas en la cámara superior mientras que se a�ad�a VEGFC a la cámara inferior para promover la migración. Después se fijaron las LEC que migraban al fondo, se tiñeron (Figura 2A) y se cuantificaron (Figura 2B). La proteína de dominio extracelular (ECD) de VEGFR3, que comprendía los tres primeros dominios de Ig (de unión a ligando) de VEGFR3 se us� como un control positivo para bloquear la migración conducida por VEGFC en este y posteriores experimentos (Makinen et al., Nat Med 7, 199-205 (2001)). Para determinar si se requería la función de Nrp2 para migración de LEC, se añadieron mAb Anti Nrp2B a células en la cámara superior inmediatamente antes de la adición de VEGFC. El anti Nrp2B fue capaz de reducir significativamente la migración de LEC mediada por VEGFC (Figura 2A, 2B; p=0,004). El nivel de inhibición fue menor que el visto con VEGFR3 ECD, que inhibía completamente la migración de LEC mediada por VEGFC (Figura 2A, 2B; p<0,001 frente al control; p=0,002 frente a Anti Nrp2B). Se obtuvieron resultados similares usando otra línea celular primaria sensible a VEGFC, HUVEC.

Dado que el Anti Nrp2B también bloqueaba la unión de VEGF165 con Nrp2, se evalu� el papel de Nrp2 en la modulación de la migración mediada por VEGF165. VEGF165 indujo fuertemente la migración en LEC como se ha descrito previamente (Hirakawa et al., Am J Pathol 162, 575-586 (203); Hong et al., Faseb J 18, 1111-1113 (2004); Makinen et al., Embo J 20, 4762-4773 (2001); Veikkola et al., Faseb J 17, 2006-2013 (2003)). Se us� un anticuerpo anti VEGF de reacción cruzada entre especies (B20.4.1) como un control positivo para bloquear esta migración conducida por VEGF (Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)). Resulta interesante que el Anti Nrp2B no tuvo ningún efecto en la migración mediada por VEGF165 (Figura 2C), posiblemente debido a la presencia de Nrp1 (Figura Complementaria 1). El bloqueo de la función de Nrp1 utilizando el mAb Anti Nrp1, Anti Nrp1B (Pan et al Cancer Cell 11, 53-67 (2007)) redujo drásticamente la migración mediada por VEGF, confirmando esta hipótesis (Figura Complementaria 2). La adición tanto de Anti Nrp1B como de Anti Nrp2B no dio como resultado ninguna inhibición adicional de la migración en comparación con la inhibición vista con Anti Nrp1B solamente (Figura Complementaria 2), lo que indica que Nrp2 no desempeña un papel en la migración mediada por VEGF165.

A continuación, se investigó el efecto del Anti Nrp2B en la proliferaci�n de LEC inducida por VEGFC. Notablemente, el Anti Nrp2B no tuvo ningún efecto en la proliferaci�n de LEC mientras que VEGFR3 ECD proporcion� un bloqueo fuerte (Figura Complementaria 3), de acuerdo con informes previos en los que el ARNip de Nrp2 no consiguió inhibir la proliferaci�n inducida por VEGFC en células endoteliales (Favier et al., Blood 108, 1243-1250 (2006)). Por lo tanto, parece que la Nrp2 es importante para la migración conducida por VEGFC pero no la proliferaci�n.

Despu�s, se ensay� la capacidad del Anti Nrp2B para modular la función de semaforina. Los inventores usaron el ensayo de colapso de cono de crecimiento neuronal del hipocampo, que ha demostrado previamente que se requiere Nrp2 para la retracción mediada por Sema3F de las estructuras ricas en actina (Pozas et al., 2001). La adición de Anti Nrp2B no tuvo ningún efecto en el colapso inducido por semaforina mientras que la adición del dominio AIA2 de Nrp2 recombinante o ECD de Nrp2 inhibía este colapso completamente (Figura Complementaria 4). Este resultado es coherente con la observación previa de los inventores de que el Anti Nrp2B no se une con la región de unión a semaforina y no interfiere con la unión de Sema3F con Nrp2. Por lo tanto, el Anti Nrp2B actúa para bloquear aspectos específicos de la función de Nrp2, inhibiendo respuestas celulares mediadas por VEGFC pero no VEGF o Sema3F.

Ejemplo 3

El anti Nrp2B bloquea la linfangiog�nesis mediada por VEGFC in vivo

Materiales y métodos

Ensayo de microbolsillos corneales de ratón

Se anestesi� a ratones CD-1 adultos (Charles-River) y se cre� un bolsillo de 2 x 3 mm del centro de la córnea en el epitelio por microdisecci�n como se ha descrito previamente (Polverini et al., Methods Enzymol 198, 440-450 (1991)). Los agentes para ensayar con respecto a actividad linfangiog�nica se inmovilizaron en un microgr�nulo de hidr�n inerte (2 x 2 mm). El microgr�nulo se implant� después en la base del bolsillo. Se trat� a los animales con anticuerpo de control (10 mg/kg), Anti Nrp2B (10 mg/kg) o VEGFR3 ECD 25 mg/kg IP dos veces por semana durante 2 semanas. Después se sacrificó a los animales y se diseccionaron las córneas. Los vasos linfáticos se visualizaron por IHC de montaje completo con anticuerpo anti LYVE-1 (R&D Systems 1:500). Las corneas se fotografiaron y se cuantificaron los vasos linfáticos positivos para LYVE-1 que surgían del limbo.

Ensayo de permeabilidad de vasos de la piel de ratones

Las espaldas y los flancos de ratones hembra C57BL6J adultos se afeitaron y se dividieron en 4 áreas de ensayo. Se les inyect� i.p. 150 !l de solución de azul de Evans 0,5 %. 1 hora después de la inyección de azul de Evans, se inyectaron 20 !l de PBS que contenía BSA o hVEGF (7,5 !g/ml) con o sin anticuerpo (0,5 mg/ml) por vía intrad�rmica, aleatoriamente en una de las cuatro zonas. 1 hora después, los animales se sacrificaron y la piel se diseccion� y se capturaron imágenes de ella. Se cortaron muestras de piel para cada zona de inyección y se incubaron en solución de formamida a 55 �C durante 48 horas para extraer el colorante azul. La absorbancia de la solución se midió después con un espectrómetro a 600 nm.

Resultados

Habiendo observado una reducción significativa en la migración de LEC bloqueando la Nrp2 in vitro, se examin� a continuación si se requería Nrp2 para modular la función de VEGFC in vivo. Los inventores estudiaron dos actividades in vivo mediadas por VEGFC bien caracterizadas, linfangiog�nesis del adulto y permeabilidad vascular (Cao et al., Circ Res 94, 664-670 (2004); Joukov et al., J Biol Chem 273, 6599-6602 (1998); Kubo et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 8868-8873 (2002); Saaristo et al., Faseb J 16, 1041-1049 (2002)). Para estudiar la linfangiog�nesis, se utilizó el ensayo de microbolsillo corneal murino (Kubo et al., 2002, mencionado anteriormente). En este ensayo, se introdujo un microgr�nulo de VEGFC en la córnea avascular de un ratón adulto. Durante 14 días, en respuesta al VEGFC, creció un plexo denso de vasos linfáticos en la córnea del limbo (Figura 2E; 12.000 pixeles2 con tratamiento de VEGFC frente a 2284 pixeles2 en control). Estos vasos se marcaron con inmunohistoqu�mica de LYVE-1 (IHC) y posteriormente se cuantificaron (Figura 2D). La administración sist�mica de VEGFR3 ECD bloque� casi completamente esta linfangiog�nesis inducida por VEGFC (2671 pixeles2; p<0,001). El anti Nrp2B también bloque� eficazmente la respuesta linfangiog�nica corneal (3281 pixeles2; p<0,001). Este bloqueo fue de grado similar al bloqueo observado usando VEGFR3 ECD (Figura 2E, 2D; p=0,67).

Para evaluar la permeabilidad vascular, se us� el ensayo de miles (Brkovic y Sirois, J Cell Biochem 100, 727-37 (2007); Eriksson et al., Circulation 107, 532-1538 (2003)). Este ensayo usa inyección intrad�rmica de VEGFC para inducir la permeabilidad vascular e inyección intravascular de colorante azul de Evans como un indicador para detectar y cuantificar la permeabilidad en vasos cut�neos (Figura Complementaria 3). Notablemente, el tratamiento con Anti Nrp2B no tuvo ningún efecto en la permeabilidad inducida por VEGFC, a diferencia del bloqueo observado con el tratamiento con VEGFR3 ECD (p=0,038). Estos resultados demuestran que, coherentemente con lo que se observa in vitro, Nrp2 parece ser importante para funciones mediadas por VEGFC selectivas in vivo.

Ejemplo 4

El anti Nrp2B modula la función de VEGFC inhibiendo la formación del complejo de Nrp2/receptor de VEGF

Materiales y métodos

Ensayo de migración celular

Se realizaron ensayos de migración usando una cámara de Boyden modificada con un sistema de inserto de 24 multipocillos Falcon de tamaño de poro de 8 !M (BD Biosciences). Las placas se recubrieron con Fibronectina 5 !g/ml (Invitrogen) durante 2 horas a 37 �C. Se añadieron células en 100 !l de medio de ensayo (BSA 0,1 %, EGM-2) con/sin anticuerpos a la cámara superior. Se a�adi� quimioatrayente a la cámara inferior en 500 !l de medio de ensayo, y las células se incubaron a 37 �C durante 16 horas. Las células en la membrana superior se retiraron con un hisopo de esponja y las células en la superficie inferior se fijaron en etanol al 70 % y se tiñeron con verde Sytox (Molecular Probes). Se capturaron imágenes en la superficie inferior completa del pocillo, y se cont� el número de células migradas (6 pocillos por condición).

An�lisis de FACS

Se incubaron LEC confluyentes con anticuerpos Anti Nrp2B de control (10 !g/ml) durante 5 minutos, 2 horas o 20 horas a 37 �C. Las células se recogieron con tampón de disociaci�n de células sin enzimas (Gibco), y se incubaron con anticuerpo biotinilado a 1:100 en tampón de FACS (PBS, FBS 2 %, EDTA 2 mM, azida sádica 0,1 %) que contenía suero de ratón normal al 5 %, suero de rata normal al 2 % e IgG humana 10 !g/ml al 10 %. Los anticuerpos se biotinilaron usando el kit de marcaje de proteína xx-mini biotina FluoReporter (Molecular Probes). Las células se lavaron después con tampón de FACS y se tiñeron con estreptavidina-PE (BD Biosciences). Los datos se analizaron con el sistema FacsCalibur (BD Biosciences).

Ensayo de adhesión celular

Se preincubaron LEC subconfluyentes en 100 !l de Medio 199 con anticuerpos de control o Anti Nrp2B (10 !g/ml) durante 30 minutos a 37 �C, después se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano maxisorp NUNC (eBioscience) recubiertas con Fibronectina 1 !g/ml (Roche) a 10.000 células por pocillo. Las placas se centrifugaron durante 1 minuto a 140 g para sincronizar el contacto de las células con el sustrato, y se incubaron a 37 �C durante 30 minutos. Las placas se lavaron después 3 veces con PBS, y se congelaron a -80 �C. La densidad celular se determin� con el kit CyQuant (Molecular Probes).

Ensayos de se�alizaci�n del receptor de VEGF

Se estimularon HUVEC confluyentes durante 10 minutos con 200 ng/ml de VEGFC en presencia o ausencia de anticuerpos de control o Anti Nrp2B. Las células se lisaron y se ensayaron con respecto a muchos mediadores que se sabe que desempeñan un papel en la se�alizaci�n del receptor de VEGF. La activación de VEGFR2 se evalu� usando ensayos de ELISA de VEGFR2 total y fosfo VEGFR2 (kit de ELISA DuoSet IC, R&D). La activación de VEGFR3 se evalu� usando un ensayo de activación del receptor quinasa (KIRA) con una línea celular VEGFR3-293 como se ha descrito previamente (Sadick et al., J Pharm Biomed Anal 19, 883-891(1999)). Brevemente, se ensayaron líneas celulares 293 estables que expresaban hVEGFR3 humano marcado con Flag de longitud completa con respecto a fosforilaci�n del receptor después de estimulaci�n. Se priv� de alimentos a 5 x 104 células durante una noche (DMEM con BSA 1 %) y después se estimularon con VEGFC 40 ng/ml (Genentech South San Francisco, CA) o VEGFC 200 ng/ml (Genentech South San Francisco, CA) durante 8 minutos. Las células se lisaron en PBS que contenía triton 1 % y ortovanadato sádico. Las placas de ELISA se recubrieron con anticuerpo Flag de captura (Sigma St Louis, MO). Las placas se recubrieron (PBS + 1 !g/ml de anticuerpo) durante una noche y se bloquearon (PBS + BSA 0,5 %) durante 1 hora. Después de 3 lavados (PBS + Tween 20 0,05 %), se añadieron lisados durante 2 horas, se lavaron tres veces, seguido de adición de anticuerpo de fosfodetecci�n 4G 10 (Upstate Lake Placed, NY) durante 2 horas. La detección se realizó con anticuerpo de HRP (Amersham Piscataway, NJ) y sustrato de TMB. Las placas se leyeron a 450 nm. Se evaluaron la AKT total, fosfo AKT, Erk1/2 total, fosfo Erk1/2, Src total, fosfo Src, MAPK p38 total y MAPK y fosfo p38 usando kits de ELISA de tipo s�ndwich de BioSource.

Resultados

El hallazgo de que el Anti Nrp2B interfiere con las acciones de VEGFC fue coherente con el hecho de que bloquea la unión de VEGFC con Nrp2. Además, el hecho de que bloquee solamente las funciones selectivas tanto in vitro como in vivo era bastante inesperado. Una posible explicación de por qué se observ� una alteración de la migración de LEC y linfangiog�nesis pero no de la proliferaci�n de LEC o permeabilidad vascular es que el Anti Nrp2B puede inhibir en general la migración, posiblemente alterando la adhesión de LEC con la matriz extracelular. Para ensayar esto, se evalu� el efecto del Anti Nrp2B en la migración inducida por varios mit�genos de LEC. El anti Nrp2B no tuvo ningún efecto en la migración inducida por VEGF (Figura 2C), HGF (Figura 3B) o FGF. Por lo tanto, el Anti Nrp2B no alter� en general la migración de LEC. Además, el Anti Nrp2B no tuvo ningún efecto en la adhesión de LEC con fibronectina o col�geno, dos sustratos de matriz extracelular.

Una segunda posibilidad es que el mAb Anti Nrp2B puede provocar la internalizaci�n de Nrp2 (Jaramillo et al., Exp Cell Res 312, 2778-2790 (2006)). Dado que Nrp2 forma un complejo con VEGFR3, incluso en ausencia del ligando (Favier et al., 2006, mencionado anteriormente; Karkkainen y Alitalo, Semin Cell Dev Biol 13, 9-18 (2002)), esto podría dar como resultado una cointernalizaci�n selectiva de VEGFR3, que afectar� a funciones mediadas por VEGFC específicas. Esta posibilidad se valid� adicionalmente por el hallazgo de que la permeabilidad vascular conducida por VEGFC est� mediada por VEGFR2 y no VEGFR3 (Joukov et al., 1998, mediado anteriormente). Para abordar esta posibilidad, las LEC se incubaron con Anti Nrp2B a 37 �C durante 5 minutos, 2 horas o 20 horas y después se realizó análisis de FACS con anticuerpos contra Nrp2, VEGFR2 y VEGFR3 para determinar el nivel de los receptores en la superficie celular. No se observaron diferencias entre los tratamientos, lo que sugiere que el Anti Nrp2B no provocó internalizaci�n significativa de Nrp2, VEGFR2 o VEGFR3 (Figura 3A).

Dado que se ha propuesto que la Nrp2 aumenta la se�alizaci�n del receptor de VEGF (Favier et al., 2006, mencionado anteriormente), a continuación se estudi� el efecto del Anti Nrp2B en la activación de VEGFR2 y VEGFR3, en el que la estimulaci�n de VEGFC conduce a dimerizaci�n del receptor y autofosforilaci�n. De acuerdo con los datos in vitro e in vivo anteriores, VEGFR3 ECD bloque� completamente la fosforilaci�n de VEGFR2 (Figura 3C; p<0,001) y VEGFR3 mediada por VEGFC. El tratamiento con anti Nrp2B dio como resultado una reducción de la activación de VEGFR2 (Figura 3C; p<0,001) y VEGFR3, pero en un grado significativamente menor que el tratamiento con VEGFR3 ECD (p<0,001). Esta observación plante� la posibilidad de que la actividad inhibidora selectiva de Anti Nrp2B pudiera ser un resultado de requisitos diferenciales de la activación del receptor de VEGF para migración y proliferaci�n, requiriendo esa migración niveles mayores de activación del receptor que proliferaci�n. Para abordar esta posibilidad, se evalu� la respuesta a dosis de la fosforilaci�n de VEGFR2 a estimulaci�n por VEGFC (Figura 3C). Se observ� uniformemente que la reducción de la fosforilaci�n de VEGFR2 provocada por tratamiento con Anti Nrp2B fue equivalente a la fosforilaci�n de VEGFR2 obtenida estimulando con VEGFC 175 ng/ml o 150 ng/ml. Después, se realizó un análisis de respuesta a dosis de la migración a estimulaci�n de VEGFC (Figura 3D). Se ha observado que las LEC estimuladas con VEGFC 175 ng/ml o 150 ng/ml migraron de forma equivalente a células estimuladas con VEGFC 200 ng/ml. De hecho, no se observ� una reducción significativa en la migración hasta que los niveles de VEGFC se redujeron a 50 ng/ml. Los inventores razonaron por lo tanto que la reducción de la fosforilaci�n de VEGFR2 inducida por Anti Nrp2B era, por s� sola, insuficiente para reducir la migración. Los inventores evaluaron adicionalmente el efecto del Anti Nrp2B en acontecimientos de se�alizaci�n corriente abajo mediados por receptores de VEGF. El tratamiento con Anti Nrp2B o estimulaci�n con VEGFC 175 ng/ml o 150 ng/ml no redujo significativamente la activación de Erk1/2, Akt o p38 MAPK que modulan la proliferaci�n, permeabilidad y movilidad de VEGFR2 respectivamente, de forma similar a lo que se observa con Nrp1 (Pan et al., 2007). Esto indicó que la Nrp2 podría regular la migración de LEC y linfangiog�nesis por un mecanismo distinto de la potenciación de la activación del receptor de VEGF o se�alizaci�n corriente abajo.

En último lugar, se ensay� el efecto de Anti Nrp2B en la formación del complejo de Nrp2/receptor de VEGF. Como se ha indicado previamente, la Nrp2 puede coinmunoprecipitarse con VEGFR2 y VEGFR3 en presencia o ausencia de VEGFC (Favier et al., 2006 mencionado anteriormente; Karpanen et al., 2006, mencionado anteriormente) (Figura 3E). Esta interacción se redujo drásticamente por Anti Nrp2B (Figura 3E). Este resultado sugiere que el complejo de Nrp2/receptor de VEGF es importante para funciones mediadas por VEGFC específicas. Además, el papel de Nrp2 no es exclusivamente potenciar la se�alizaci�n del receptor de VEGF en respuesta a estimulaci�n por ligando.

Ejemplo 5

Nrp2 se expresa en vasos linfáticos asociados con tumor

Materiales y métodos

Inmunohistoqu�mica

Se cortaron secciones tisulares de 18 !m y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se incubaron durante una noche con anticuerpo primario (anti NRP2B (tinción de control 1:500 realizada en médula espinal de ratón E12.5 en la que la expresión se ha caracterizado bien), anti LYVE-1 (anti-R&D, 1:200), anti PECAM-1 (Benton Dickinson, 1:500), anti PROX-1 (Chemicon, 1: 1000) o Ki67 (Neovision 1:100) a 4 �C. Después las muestras se tiñeron con anticuerpos secundarios Alexa 488 o Alexa 568 (1:200; Molecular Probes) durante 4 horas a TA. Se us� tinción solamente con secundario como control. Se realizó tinción con TUNNEL con un kit comercial (Roche). Se capturaron imágenes con un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot. Se determin� el área de vasos sanguíneos y linfáticos a partir de 6 imágenes representativas de cada uno de 6 tumores por grupo, evaluadas con respecto a número de pixeles medio por ImageJ.

Resultados

Para determinar si Nrp2 desempeña un papel en la biología linfática del adulto, se evalu� la expresión de Nrp2 en vasos linfáticos del adulto. Dentro del sistema vascular, se ha descrito previamente la expresión de Nrp2 en venas y vasos linfáticos (Herzog et al., Mech Dev 109, 115-119 (2001); Moyon et al., Development 128, 3359-3370 (2001); Yuan et al., Development 129, 4797-4806 (2002)). Como se ha descrito anteriormente, las LEC en cultivo expresan fuertemente Nrp2 (Figura Complementaria 1). Sin embargo, los inventores fueron incapaces de detectar Nrp2 por IHC en vasos linfáticos positivos para LYVE-1, col�nicos, de ratones adultos normales (Figura 4A; para tinción de control positiva véase Figura Complementaria 4). El colon se evalu�, dado que tiene un plexo rico de vasos linfáticos con un patrón bastante estereotipado. Los inventores tampoco pudieron detectar la expresión de Nrp2 por IHC dentro de vasos linfáticos de ganglios linfáticos (Figura 4B) y piel de ratones adultos normales. Estos resultados se confirmaron por la hibridación in situ (ISH) de Nrp2. Por el contrario, se observ� fuerte expresión de Nrp2 en vasos linfáticos LYVE-1 + en ganglios linfáticos adyacentes a tumores trasplantados de forma ortot�pica o heterot�pica (Figura 4C). Esto se observ� con varias líneas tumorales incluyendo la línea de adenocarcinoma de mama murina trasplantada de forma ortot�pica, 66c14 (Aslakson y Miller, Cancer Res 52, 1399-1405 (1992)) y la línea de glioblastoma de rata trasplantada de forma heterot�pica, C6 (datos no mostrados). También se observ� Nrp2 en vasos linfáticos peritumorales e intratumorales (Figura 4D) para varias líneas tumorales incluyendo 66c14, C6 y PC3 (línea de carcinoma de pr�stata humano). Esta expresión se confirm� por ISH en un subconjunto de tipos tumorales.

Ejemplo 6

El anti Nrp2B reduce la metástasis pulmonar en modelos tumorales múltiples

Materiales y métodos

Todos los estudios animales fueron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por el NIH (Publicación de NIH 85-23, revisada en 1985). Un Comité de Cuidado y Uso Animal Institucional (IACUC) aprob� todos los protocolos animales.

Modelos tumorales

Para 66C14, se recogieron células por tripsinizaci�n, se lavaron y se resuspendieron en PBS a una concentración de 2 x 105 en 10 !l de PBS. Los ratones se anestesiaron usando ketamina 75 mg/kg y xilacina 7,5 mg/kg, y se realizó una incisión por debajo de la extremidad delantera derecha. Se inyectaron 2 x 105 células en 10 !l de PBS directamente en la 4� almohadilla adiposa mamaria expuesta de ratones balb-C hembra de 6-8 semanas de edad. Para C6, se inyectaron 2 x 106 células tumorales en 100 !l de PBS por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos balb-C hembra de 6-8 semanas de edad. Para ambos conjuntos de estudios, el crecimiento tumoral se control� 3 veces por semana. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 80-120 mm3, los ratones se clasificaron para proporcionar tamaños tumorales medios de grupo casi idénticos y se comenzó el tratamiento. Este se consider� el día 1 de cada estudio. Los animales se trataron con anticuerpo de control (10 mg/kg), Anti Nrp2B (10 mg/kg) o VEGFR3 ECD 25 mg/kg IP dos veces por semana hasta la terminación del estudio. Todos los estudios se repitieron 3 veces para asegurar la reproducibilidad.

Al final del estudio los animales se anestesiaron y se perfundieron con PFA 4 %. Los tumores se recogieron, se crioprotegieron y se congelaron en OCT (Tissue-Tek). Los pulmones se inflaron mediante una perfusi�n ventricular derecha de 10 ml de PBS seguido de PFA al 4 %, y se realizaron recuentos visuales de lesiones metast�sicas antes de análisis con Micro CT.

Se evalu� la metástasis de SLN por implantación heterot�pica de células tumorales C6 en el oído. Brevemente, se pretrat� a una cohorte de animales con anticuerpo de control (10 mg/kg) o Anti Nrp2B (10 mg/kg), un día antes de la implantación de células tumorales, y dos veces por semana a continuación. Se inyectaron 1 x 105 Células C6 lacZ por vía subd�rmica en el oído de 70 ratones desnudos balb/c hembra. Los ratones se sacrificaron el día 3, 6, 9, 13 y 15, y se identificaron ganglios linfáticos centinelas por linfangiograf�a cut�nea y posteriormente se diseccionaron. Los ganglios linfáticos se homogeneizaron y el lisado se ensay� con respecto a actividad 1-galactosidasa (Pierce).

Se realizó linfangiograf�a intrad�rmica en ratones de control y portadores de tumores de la siguiente manera. Se inyectaron 2 !l de colorante azul de Evans (3 % en peso) que contenía microperlas fluorescentes de poliestireno de 20 nm 1 % (Molecular Probes) por vía intrad�rmica en la parte superior del tumor. Se permitió que los animales se recuperaran durante 2 horas y después se sacrificaron. Los tumores se diseccionaron con cuidado de no incluir el tejido peritumoral. Se fijaron y después se analizaron de forma histoqu�mica o se incubaron en formamida para extraer el azul de evans y se cuantificaron con una medición de DO600 por espectrofotómetro.

An�lisis de micro CT de los pulmones

Los pulmones se sumergieron en NBF 10 % durante 24 horas, después se sumergieron en una solución al 20 % de un agente de constaste de tomografía computarizada por rayos x basado en yodo, Isovue370 (Bracco Diagnostics Inc, Princeton, NJ), se diluyó con PBS durante 24 horas. Después los pulmones se sumergieron en y se perfundieron mediante la c�nula de la tráquea con 20 ml de aceite de soja (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a una velocidad de 0,25 ml/minuto. El aceite de soja se us� para retirar el exceso de agente de contraste y proporcionar un medio de fondo para la captura de imágenes.

Se capturaron imágenes de los pulmones de ratones ex vivo con un sistema de microtomograf�a computarizada (micro CT) de rayos x VivaCT (SCANCO Medical, Basserdorf, Suiza). Se obtuvo una imagen de exploración sagital, comparable con un rayo x planar convencional, para definir el punto de comienzo y final para la adquisición axial de una serie de cortes de imágenes de micro CT. La localización y el número de imágenes axiales se seleccionaron para proporcionar cobertura completa del pulmón. Los pulmones se sumergieron en aceite de soja como el medio de fondo. Las imágenes de micro CT se generaron manejando el tubo de rayos x a un nivel de energía de 45 kV, una corriente de 160 !A y un tiempo de integración de 450 milisegundos. Se obtuvieron imágenes axiales a una resolución isot�pica de 21 !m. Los estimados tumorales pulmonares (número y volumen) se obtuvieron por un algoritmo de análisis de imágenes semiautomático que incluye una etapa de inspección por un lector entrenado. Los tumores pulmonares aparecen como masas sólidas hiperintensas en relación con estructuras de tipo malla, porosas del pulmón normal. Esto se debe a la absorción del agente de contraste de yodo por estructuras sólidas (paredes bronquiales y alveolares, tumores, tráquea, mediastino) contenidas dentro del pulmón. El exceso de agente de contraste se elimin� de los espacios aéreos llenos por la etapa de perfusi�n de aceite. Se extrajeron masas tumorales potenciales por una serie de etapas de procesamiento de imágenes. El software de análisis de imágenes se desarroll� de forma interna. Se escribió en C++ y emple� las bibliotecas de función de software de análisis de imágenes Analyze (AnalyzeDirect Inc., Lenexa, KS, Estados Unidos). El algoritmo emplea determinación de umbrales de intensidad, filtración morfológica y crecimiento de regiones para extraer todas las masas tumorales potenciales. Se determin� un umbral de intensidad (1480 Unidades Hounsfield) por análisis de histogramas de 5 pulmones arbitrarios empleados para el desarrollo de algoritmos y se seleccion� el umbral óptimo para incluir v�xeles tumorales y excluir cualquier señal de fondo. Se aplicaron operaciones morfológicas (erosión, dilatación) y crecimiento de región para conectar regiones hiperintensas de v�xeles y para retirar cualquier v�xel de densidad similar hallado en las paredes finas de los bronquiolos y alvéolos. La etapa de crecimiento de región requiere un volumen mínimo de 2300 v�xeles conectados (más de 0,0231 mm3) para aceptarse como un objeto (masa). Los objetos identificados se valoraron después por un lector entrenado con el software de visualización Analyze 3D. Se aceptaron o rechazaron objetos individuales como posibles tumores basándose en la apariencia del objeto y su localización dentro del pulmón. Los objetos se rechazaron si residían fuera del pulmón (por ejemplo, mediastino, residuos tisulares extraños) o se asemejaban a un vaso lleno de sangre. El recuento tumoral, volumen tumoral individual y volumen tumoral total se determin� para cada pulmón. Esta técnica analítica se valid� con un modelo de metástasis tumoral bien establecido. Se evaluaron once animales con trasplante ortot�pico de células tumorales de adenocarcinoma mamario 4T1 con respecto a metástasis pulmonar por esta técnica de micro CT seguida de análisis histológico en serie de los pulmones. Las estimaciones de volumen tumoral de pulmón estaban altamente correlacionadas (r = 0,9, p = 0,0002) con estimaciones histológicas del tamaño tumoral (recuento de p�xeles; Figura Complementaria 5).

Resultados

Un enfoque principal para inhibir la metástasis ha sido mediante inhibición del eje de VEGFC (Chen et al., Cancer Res 65, 9004-9011 (2005); He et al., J Natl Cancer Inst 94, 819-825 (2002); Krishnan et al., Cancer Res 63, 713-722 (2003); Lin et al., Cancer Res 65, 6901-6909 (2005)). Para determinar si el bloqueo de la función de Nrp2 también podría modular el desarrollo de metástasis, se ensayaron los efectos del tratamiento con Anti Nrp2B en la formación de metástasis pulmonar en dos modelos tumorales diferentes, el modelo de cáncer de mama, 66c14, y el modelo de glioblastoma C6. 66c14 es una línea de adenocarcinoma mamario murino derivada de un tumor mamario espontáneo en un ratón Balb/c (Aslakson y Miller, Cancer Res 52, 1399-1405 (1992)). Estas células expresan VEGFC y metastatizan mediante el sistema linfático a los pulmones (Aslakson y Miller, 1992, mencionado anteriormente). El trasplante ortot�pico de estas células en ratones Balb/c dio como resultado el desarrollo reproducible de tumores y metástasis pulmonar. El tratamiento con Anti Nrp2B no afect� a la velocidad de crecimiento primaria de los tumores (Figura 5A). Dado que VEGFR3 ECD redujo drásticamente la velocidad de crecimiento de tumores primarios se excluyó de cualquier análisis posterior de metástasis. Se sacrificó una cohorte de animales (N=6 de cada grupo) con tumores de tamaño similar de ambas ramas del tratamiento simultáneamente, y los pulmones se diseccionaron y se inflaron para facilitar el análisis con respecto a nódulos metast�sicos. El anti Nrp2B provocó una reducción drástica del número medio de nódulos metast�sicos detectados visualmente por pulmón en comparación con animales tratados con IgG de control (Figura 5B, C), de una media de 3,5 a 0,8 (P = 0,03). Para confirmar este resultado y extender la evaluación de los inventores a la metástasis dentro del par�nquima de pulmón que no era susceptible a examen visual, los inventores realizaron un análisis de micro CT (Li et al., Technol Cancer Res Treat 5, 147-155 (2006)) de los pulmones después de la necropsia. Este análisis confirm� que los animales tratados con Anti Nrp2B tuvieron una reducción del número de metástasis pulmonares en comparación con animales tratados con control (Figura 5D-F). Sin embargo, el análisis de micro CT fue más sensible que el análisis visual dando como resultado un número absoluto mayor de nódulos metast�sicos en ambos grupos. El micro CT también permitió a los inventores determinar la carga metast�sica total dentro del pulmón. El tratamiento con Anti Nrp2B también dio como resultado una reducción del volumen metast�sico total (0,74 cm3) en comparación con el tratamiento de control (1,78 cm3). Adicionalmente, este análisis verificó que la amplia mayoría de las lesiones estaban en la superficie de pulmones tanto en animales de control como los tratados con Anti Nrp2B. Por lo tanto, el Anti Nrp2B no provocó una reducción en la metástasis desplazando los nódulos de la superficie al par�nquima del pulmón.

El análisis de FACS, realizado como se ha descrito en el Ejemplo 4, indicó que Nrp2, pero no VEGFR2 o VEGFR3, se expresaba en células tumorales 66c14. Esto plante� la posibilidad de que el tratamiento con Anti Nrp2B estaba afectando al comportamiento de las células tumorales directamente para influir en la metástasis. Esto era poco probable dada la falta de efecto en el crecimiento tumoral primario con tratamiento con Anti Nrp2B. Adicionalmente, el Anti Nrp2B no tuvo ningún efecto en la proliferaci�n de células tumorales, apoptosis o migración in vitro. Sin embargo, para abordar la posibilidad de que la reducción de la metástasis se debiera a los efectos del Anti Nrp2B en células tumorales, los inventores también evaluaron el efecto del Anti Nrp2B en el modelo de glioblastoma de rata C6. Estas células no expresan Nrp2 en su superficie en un grado apreciable (Figura 6E), expresan VEGFC y se cree que metastatizan al pulmón mediante el sistema linfático (Bernstein y Woodard, 1995). Adicionalmente, se han modificado por ingeniería genética para expresar beta galactosidasa, lo que puede usarse como un marcador para facilitar la detección de células tumorales.

El trasplante subcutáneo de estas células en ratones desnudos dio como resultado el desarrollo uniforme de tumores y metástasis pulmonar. El tratamiento con Anti Nrp2B no afect� a la velocidad de crecimiento primaria de estos tumores (Figura 6A). Adicionalmente, el VEGFR3 ECD no redujo drásticamente la velocidad de crecimiento tumoral primario en este modelo tumoral. Esto permitió comparar los efectos antimetast�sicos de VEGFR3 ECD y Anti Nrp2. De nuevo, se sacrificó una cohorte de animales (N=10) con tumores de tamaño similar de todas las ramas de tratamiento y los pulmones se diseccionaron y se inflaron para facilitar el análisis con respecto a nódulos metast�sicos. El tratamiento tanto con Anti Nrp2B como con VEGFR3 ECD, provocó una reducción en el número medio de nódulos metast�sicos detectados visualmente por pulmón (Figura 6B, C). La reducción observada con Anti Nrp2B fue comparable a la vista con VEGFR3 ECD. El análisis de micro CT de los pulmones confirm� estos hallazgos (Figura 6D) y verificó que la amplia mayoría de la metástasis se localizaba en la superficie de los pulmones en todas las ramas del tratamiento. Se confirm� que los nódulos eran lesiones metast�sicas por histología en ambos modelos tumorales (Figura 5H y 6G). Adicionalmente, la necropsia general no revel� nódulos en la superficie de otros órganos en ninguno de los modelos tumorales.

Aunque en la descripción anterior la invención se ha ilustrado con referencia a ciertas realizaciones, no se limita de este modo. De hecho, diversas modificaciones además de las mostradas y descritas en el presente documento resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y pueden quedar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo anti Nrp2B biol�gicamente activo, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende:

   (a) la secuencia de región variable de cadena ligera:

   y la secuencia de región variable de cadena pesada:

   del anticuerpo YW68.4.2 cuya secuencia de amino�cidos se muestra en la Figura 10A; o

   (b) la secuencia de región variable de cadena ligera:

   y la secuencia de dominio variable de cadena pesada:

   del anticuerpo YW68.4.2.36 cuya secuencia de amino�cidos se muestran en la Figura 10B.

   25 2. El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende las secuencias de región variable de cadenas pesada y ligera del anticuerpo YW68.4.2.36 cuya secuencia de amino�cidos se muestra en la Figura 10B.
2. 3. El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que: 30

   (i)

   comprende el anticuerpo YW68.4.2 cuya secuencia de amino�cidos se muestra en la Figura 10A o el anticuerpo YW68.4.2.36 cuya secuencia de amino�cidos se muestra en la Figura 10B; o

   (ii)

   es un fragmento anti Nrp2B biol�gicamente activo del anticuerpo de (i).

   35 4. El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 3, que:

   (i)

   comprende el anticuerpo YW68.4.2.36 cuya secuencia de amino�cidos se muestra en la Figura 10B; o

   (ii)

   es un fragmento anti Nrp2B biol�gicamente activo del anticuerpo de (i).

   40 5. El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, que es el anticuerpo YW68.4.2.36 cuya secuencia de amino�cidos se muestra en la Figura 10B, o un fragmento del mismo.

3. 6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es biespec�fico.

   45 7. El fragmento de anticuerpo anti Nrp2B de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, F(ab’)2 y scFv.

4. 8.

   El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de cualquier reivindicación anterior, que es quimérico o humanizado.

5. 9.

   Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en mezcla con un vehículo farmac�uticamente aceptable.

6. 10.

   Una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de metástasis tumoral que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en mezcla con un vehículo farmac�uticamente aceptable.

7. 11.

   El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en un método de tratamiento m�dico en un sujeto mamífero.

8. 12.

   El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el sujeto mamífero es un paciente humano.

9. 13.

   El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 12 en donde se ha diagnosticado cáncer a dicho paciente humano.

10. 14.

    El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en un método para inhibir la linfangiog�nesis tumoral en un sujeto mamífero portador de tumor.

11. 15.

    El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde sujeto mamífero es un paciente de cáncer humano.

12. 16.

    El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 15, en donde dicho paciente humano ha desarrollado o est� en riesgo de desarrollar metástasis tumoral.

13. 17.

    El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en un método de tratamiento terapéutico, profiláctico o preventivo de metástasis tumoral en un paciente de cáncer humano.

14. 18.

    El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 15 a 17, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de ri��n o renal, cáncer de hígado, cáncer de pr�stata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, linfoma de linfocitos B, leucemia linfoc�tica crónica (CLL); leucemia linfobl�stica aguda (ALL); leucemia de tricoleucitos; y leucemia mielobl�stica crónica.

15. 19.

    El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde dicha metástasis est� en el sistema linfático o en un órgano distante.

16. 20.

    El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en donde dicho uso comprende además la administración de un anticuerpo antagonista anti VEGF.

17. 21.

    El anticuerpo anti Nrp2B o fragmento de anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho anticuerpo anti VEGF es bevacizumab.