PL194562B1 - Sposób wytwarzania zmodyfikowanego polipeptydu stanowiącego przeciwciało przeciwko IgE, sposób poprawiania właściwości hamowania indukowanego ambrozją uwalniania histaminy przeciwciała, cząsteczki kwasu nukleinowego, cząsteczki przeciwciał, kompozycje i zastosowania cząsteczek przeciwciał - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego polipeptydu stanowiacego przeciwcialo przeciwko IgE, nie wykazujacego deaktywacji izomeryzacji aspartylowej i wykazujacego powinowactwo do czasteczki do- celowej jaka stanowi IgE, równe lub wyzsze niz niezmodyfikowany polipeptyd, znamienny tym, ze: a) identyfikuje sie reszty aspartylowe wykazujace tendencje do izomeryzacji; i b) podstawia sie alternatyw- ne reszty i przeszukuje otrzymane mutanty pod katem powinowactwa do czasteczki docelowej przez doj- rzewanie na zasadzie powinowactwa z zastosowaniem prezentacji na fagu, przy czym obejmuje to ponadto etapy, w których: (i) podstawia sie, poddaje delecji lub insercji jeden lub wiecej kodonów w genie kodujacym ten polipeptyd co skutkuje zmiana sekwencji aminokwasowej tego polipeptydu, z wytworzeniem biblioteki strukturalnie pokrewnych polipeptydów poddanych fuzji z bialkiem kapsydu faga, (ii) poddaje sie prezentacji pojedyncza kopie kazdego polipeptydu pokrewnego na powierzchni czastki fagemidowej zawierajacej DNA kodujacy ten polipeptyd; i c) poddaje sie selekcji zmodyfikowane polipeptydy, w których zmieniono reszte aspartylowa i które wykazuja powinowactwo do czasteczki docelowej równe lub wyzsze niz niezmodyfiko- wany polipeptyd. 6. Czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje, która wykazuje co najmniej 85% identycznosci sekwencji z sekwencja kodujaca oznaczona „e26” na fig. 13 (sekwencje o nu- merach identyfikacyjnych: 19 i 20), przy czym ta czasteczka kwasu nukleinowego koduje czasteczke przeciw- ciala obejmujaca reszty 32Glu, 27Lys i 28Pro CDRl domeny zmiennej lancucha lekkiego. 12. Kompozycja, znamienna tym, ze zawiera farmaceutycznie dopuszczalna zaróbke (farmaceu- tycznie dopuszczalne zaróbki) w domieszce z czasteczka przeciwciala okreslona w zastrz. 10. 13. Zastosowanie czasteczki przeciwciala okreslonej w zastrz. 10 do wytwarzania kompozycji do zmniejszania lub zapobiegania zaleznego od IgE wytwarzania histaminy. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zmodyfikowanego polipeptydu stanowiącego przeciwciało przeciwko IgE, nie wykazującego deaktywacji izomeryzacji aspartylowej i wykazującego powinowactwo do cząsteczki docelowej, jaką stanowi IgE, równe lub wyższe niż nie zmodyfikowany polipeptyd, sposób poprawiania właściwości hamowania indukowanego ambrozją uwalniania histaminy przeciwciała, cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące cząsteczki przeciwciał, cząsteczki przeciwciał, kompozycje zawierające te cząsteczki przeciwciał i zastosowania tych cząsteczek przeciwciał.

IgE należy do rodziny immunoglobulin, które zaangażowane są w odpowiedzi alergiczne, takie jak astma, alergie pokarmowe, nadwrażliwość typu 1 oraz rodzinne zapalenie zatok limfatycznych, które jest spowodowane wieloma czynnikami. IgE jest wydzielana przez komórki B lub limfocyty B i ulega ekspresji na ich powierzchni. IgE wiąże się komórkami B (jak również monocytami, granulocytami kwasochłonnymi i płytkami krwi) poprzez swój region Fc z receptorem IgE o niskim powinowactwie, znanym jako FcsRII. Po ekspozycji ssaka na alergen, komórki B niosące związane powierzchniowo przeciwciało IgE specyficzne wobec antygenu, ulegają „aktywacji” i przekształcają się w wydzielające IgE komórki plazmatyczne. Powstająca w wyniku tego, specyficzna wobec antygenu, IgE następnie krąży we krwi i zostaje związana na powierzchni komórek tucznych w tkankach oraz granulocytów zasadochłonnych we krwi, poprzez receptor o wysokim powinowactwie, znany jako FcsRI. Komórki tuczne i granulocyty zasadochłonne zostają w ten sposób uczulone na alergen. Następna ekspozycja na alergen powoduje sieciowanie FcsRI granulocytów zasadochłonnych i komórek tucznych, czego wynikiem staje się uwalnianie histaminy, leukotrienów i czynników aktywujących płytki krwi, czynników chemotaktycznych dla granulocytów kwasochłonnych i obojętnochłonnych oraz cytokin IL-3, IL-4, IL-5 i GM-SCF, które są odpowiedzialne za kliniczną nadwrażliwość i anafilaksję.

Patologiczny stan nadwrażliwości charakteryzuje się nadmierną odpowiedzią immunologiczną na alergen(y), której wynikiem są duże zmiany w tkankach, gdy alergen występuje w stosunkowo dużych ilościach lub gdy stan odporności humoralnej i komórkowej jest podwyższony.

Zmiany fizjologiczne w nadwrażliwości anafilaktycznej mogą obejmować silny skurcz oskrzelików i oskrzeli płuc, skurcz mięśni gładkich i rozszerzenie włosowatych naczyń krwionośnych. Predyspozycja do tego stanu wydaje się być, jednakże, wynikiem oddziaływań pomiędzy czynnikami genetycznymi i środowiskowymi. Powszechne alergeny środowiskowe, które indukują nadwrażliwość anafilaktyczną, występują w pyłku roślinnym, pokarmach, roztoczach kurzu domowego, sierści zwierząt, zarodnikach grzybowych i jadach owadów. Alergia atopowa jest związana z nadwrażliwością anafilaktyczną i obejmuje zaburzenia, np. astmę, alergiczny nieżyt nosa i zapalenie spojówek (gorączkę sienną), egzemę, pokrzywkę oraz alergie pokarmowe. Wstrząs anafilaktyczny, niebezpieczny, zagrażający życiu stan anafilaksji, jest, jednakże, zazwyczaj wywoływany przez użądlenia owadów lub lek podawany pozajelitowo.

Ostatnio stosowano strategię leczenia nadwrażliwości typu 1 lub nadwrażliwości anafilaktycznej, w której próbowano blokować wiązanie IgE z receptorem o wysokim powinowactwie (FcsRI) występującym na granulocytach i komórkach tucznych i w ten sposób zapobiegać uwalnianiu histaminy i innych czynników anafilaktycznych powstających w wyniku stanu patologicznego.

Opis patentowy numer WO 93/04173, opublikowany 3 marca 1993 r., opisuje chimery ludzkich IgE/IgG1, w których reszty IgG1 podstawia się za analogiczne reszty IgE. Będące przedmiotem jednoczesnego postępowania patentowego zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki twórców tego zgłoszenia, o numerze kolejnym 08/405617, opisuje humanizowane przeciwciała skierowane przeciw IgE, w których mysie przeciwciała skierowane przeciw ludzkiej IgE (MaE11) zastosowano do zapewnienia regionów CDR, które podstawiono w zrębie immunoglobuliny IgG1 (rhuMaE25). Technikę humanizacji opisano w Reichman, L. i in., (1988) Nature 332: 323 oraz w Jones, P.T. i in. (1986), Nature 321: 522.

O ile humanizację przeciwciał myszy opracowano w celu dostarczenia cząsteczek skierowanych przeciw IgE, które zapewniają podobne powinowactwo do IgE, jak mysie MaE11 bez immunogennej odpowiedzi wywoływanej przez to ostatnie przeciwciało (Shields i in., (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107: 308-312), w wyniku nie skonstruowano jeszcze przeciwciała skierowanego przeciw IgE o powinowactwie wobec IgE, które jest zdecydowanie lepsze, niż MaE11, czyli mysie przeciwciało skierowane przeciw IgE.

Zrekombinowane przeciwciała monoklonalne podlegają reakcjom degradacji, które wpływają na wszystkie polipeptydy lub białka, takim jak izomeryzacja reszt kwasu asparaginowego i asparaginy.

PL 194 562 B1

Jak przedstawiono na fig. 1A poniżej, reszty asparaginianu (I) w sekwencjach -Asp-Gly- mogą ulegać izomeryzacji do izoasparaginianu (III) poprzez półprodukt - cykliczny imid (II) (Geiger i Clarke, J. Biol. Chem. 262: 785-794 (1987)). Łańcuch boczny kwasu karboksylowego kwasu asparaginowego reaguje z atomem azotu grupy amidowej sąsiadującej glicyny z utworzeniem cyklicznego półproduktu kwasu asparaginowego (II), który następnie tworzy resztę - kwas izoasparaginowy-glicyna-(III). Równowagę, szybkość i zależność od pH tej reakcji badano w modelowych peptydach rozdzielanych przez wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami. (Oliyai i Borchardt, Pharm. Res. 10, 95-102 (1993)). Uważa się, że tendencja do podlegania izomeryzacji zależy również od lokalnej giętkości części cząsteczki zawierającej sekwencję -Asp-Gly- (Geiger i Clarke, supra).

Przykładem znanego przeciwciała, które podlega izomeryzacji kwasu asparaginowego jest silne przeciwciało skierowane przeciw IgE, znane jako rhuMabE-25 (E-25). Zjawisko to może występować spontanicznie, ale jego występowanie można również indukować, gdy E-25 inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 21 dni. Wynikiem końcowym jest wstawienie dodatkowej grupy metylowej do szkieletu polipeptydowego przeciwciała, co może prowadzić do zmian konformacyjnych i obniżenia powinowactwa wiązania. Badania E-25 z wariantami -c-Asp-Gly- oraz -izo-Asp-Gly w pozycji 32-33 VL wskazywały, że o ile zjawisko izomeryzacji można zminimalizować przez podstawienie reszty VL32 alaniną lub kwasem glutaminowym, wynikiem samego podstawienia jest trzykrotne zmniejszenie wiązania, Cacia i in., supra.

A zatem, istnieje duża potrzeba tworzenia ulepszonych polipeptydów, włącznie z przeciwciałami, które nie tylko nie wykazują „deaktywacji” zjawiska izomeryzacji aspartylu, ale również przejawiają powinowactwo wobec cząsteczki docelowej (np. antygenu) równe lub wyższe niż powinowactwo polipeptydu nie ulepszonego.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zmodyfikowanego polipeptydu stanowiącego przeciwciało przeciwko IgE, nie wykazującego deaktywacji izomeryzacji aspartylowej i wykazującego powinowactwo do cząsteczki docelowej jaką stanowi IgE, równe lub wyższe niż niezmodyfikowany polipeptyd, polegający na tym, że:

a) identyfikuje się reszty aspartylowe wykazujące tendencję do izomeryzacji; i

b) podstawia się alternatywne reszty i przeszukuje otrzymane mutanty pod kątem powinowactwa do cząsteczki docelowej przez dojrzewanie na zasadzie powinowactwa z zastosowaniem prezentacji na fagu, przy czym obejmuje to ponadto etapy, w których:

(i) podstawia się, poddaje delecji lub insercji jeden lub więcej kodonów w genie kodującym ten polipeptyd, co skutkuje zmianą sekwencji aminokwasowej tego polipeptydu, z wytworzeniem biblioteki strukturalnie pokrewnych polipeptydów poddanych fuzji z białkiem kapsydu faga, (ii) poddaje się prezentacji pojedynczą kopię każdego polipeptydu pokrewnego na powierzchni cząstki fagemidowej zawierającej DNA kodujący ten polipeptyd; i

c) poddaje się selekcji pollpeptydy, w których zmieniono resztę aspartylową i które wykazują powinowactwo do cząsteczki docelowej równe lub wyższe niż nie zmodyfikowany polipeptyd.

Korzystnie niezmodyfikowane przeciwciało posiada sekwencję, wskazaną jako „E25” na fig. 12 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 13-14].

Korzystniej podstawia się reszty Asp32Glu, Gln27Lys i Ser28Pro CDR1 domeny zmiennej łańcucha lekkiego.

Korzystniej dodatkowo podstawia się reszty Thr53Lys, AspSSSer, Ser57Glu i Asn59Lys CDR2 domeny zmiennej łańcucha ciężkiego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób poprawiania właściwości hamowania indukowanego ambrozją uwalniania histaminy przeciwciała, polegający na tym, że przeprowadza się sposób opisany powyżej.

PL 194 562 B1

Przedmiotem wynalazku jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, charakteryzująca się tym, że obejmuje sekwencję, która wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji z sekwencją kodującą oznaczoną „e26” na figurze 13 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 20], przy czym ta cząsteczką kwasu nukleinowego koduje cząsteczkę przeciwciała obejmującą reszty 32Glu, 27Lys i 28Pro CDR1 domeny zmiennej łańcucha lekkiego.

Korzystnie cząsteczka obejmuje sekwencję kodującą dla fragmentu przeciwciała e26 wybranego z grupy składającej się z: F(ab) [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 20], sFv [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22] lub F(ab)'2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 24 i 25].

Przedmiotem wynalazku jest też cząsteczka kwasu nukleinowego, charakteryzująca się tym, że posiada sekwencję, która wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji z sekwencją kodującą „e27” na figurze 13 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 21], przy czym ta cząsteczka kwasu nukleinowego koduje cząsteczkę przeciwciała obejmującą reszty 32Glu, 27Lys i 28Pro CDR1 domeny zmiennej łańcucha lekkiego.

Korzystnie cząsteczka posiada sekwencję kodującą dla fragmentu przeciwciała e27 wybranego z grupy składającej się z: F(ab) [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 21], sFv [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23] lub F(ab)'2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 24 i 26].

Przedmiotem wynalazku jest ponadto cząsteczka przeciwciała, charakteryzująca się tym, że posiada sekwencję łańcucha lekkiego i sekwencję łańcucha ciężkiego, które wykazują co najmniej 70% identyczności sekwencji z sekwencją łańcucha lekkiego i sekwencją łańcucha ciężkiego sekwencji wskazanej jako „e26” na figurze 13 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 20] oraz obejmuje reszty 32Glu, 27Lys i 28Pro CDR1 domeny zmiennej łańcucha lekkiego.

Korzystnie cząsteczka obejmuje sekwencję e26 wybraną z grupy składającej się z: fragmentu F(ab) [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19-20], fragmentu sFv [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22] lub F(ab)'2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 24-25].

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę (farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki) w domieszce z cząsteczką przeciwciała opisaną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie cząsteczki przeciwciała opisanej powyżej do wytwarzania kompozycji do zmniejszania lub zapobiegania zależnego od IgE wytwarzania histaminy.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie cząsteczki przeciwciała opisanej powyżej do wytwarzania kompozycji do leczenia zaburzenia zależnego od IgE.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto cząsteczka przeciwciała, charakteryzująca się tym, że posiada sekwencję łańcucha lekkiego i sekwencję łańcucha ciężkiego, które wykazują co najmniej 70% identyczności sekwencji z sekwencją łańcucha lekkiego i sekwencją łańcucha ciężkiego sekwencji oznaczonej „e27” na figurze 13 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 21] oraz obejmuje reszty 32Glu, 27Lys i 28Pro CDR1 domeny zmiennej łańcucha lekkiego.

Korzystnie cząsteczka obejmuje sekwencję e27 wybraną z grupy składającej się z: fragmentu F(ab) [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 21], fragmentu sFv [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23] lub F(ab)'2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 24 i 26].

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę (farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki) w domieszce z cząsteczką przeciwciała opisaną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie cząsteczki przeciwciała określonej powyżej do wytwarzania kompozycji do zmniejszania lub zapobiegania zależnego od IgE wytwarzania histaminy.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie cząsteczki przeciwciała określonej powyżej do wytwarzania kompozycji do leczenia zaburzenia zależnego od IgE.

Sposób ulepszania polipeptydu wykazującego powinowactwo do cząsteczki docelowej może obejmować kombinację etapów:

(1) identyfikacji reszt aspartylowych, które wykazują tendencję do izomeryzacji;

(2) podstawienie alternatywnych reszt i przeszukiwanie otrzymanych mutantów pod kątem powinowactwa do cząsteczki docelowej.

Zalecaną metodą podstawiania reszt jest dojrzewanie na zasadzie powinowactwa z zastosowaniem prezentacji przez fagi.

Zalecany polipeptyd jest przeciwciałem, a cząsteczka docelowa jest antygenem. Zalecane przeciwciało jest skierowane przeciw IgE, a zalecaną cząsteczką docelową jest IgE.

PL 194 562 B1

Najbardziej zalecany sposób poprawiania powinowactwa przeciwciała skierowanego przeciw

IgE E-25 może obejmować zastąpienie reszty 32Asp CDR-Ll VL przez Glu, wraz z modyfikacją reszt

27Gln, 28Ser i 31Tyr CDR-Ll VL na, odpowiednio, Lys, Pro i Gly. Zalecane przeciwciało E25 może być skierowane przeciw IgE i obejmować dodatkowe modyfikacje reszt CDR2 VH: 53Thr na Lys, 55Asp na

Ser, 57Ser na Glu i 59Asn na Lys.

Przeciwciało skierowane przeciw IgE może wykazywać poprawione powinowactwo wobec IgE.

W zalecanym rozwiązaniu, przeciwciało skierowane przeciw IgE zawiera reszty łańcucha ciężkiego i lekkiego obejmujące fragmenty sekwencji oznaczone „e27” i „e26 na figurze 2. Alternatywnie, przeciwciało skierowane przeciw IgE i może zawierać pełnej długości sekwencje łańcucha ciężkiego i lekkiego oznaczone „E27” i „E26” na figurze 12.

Kompozycja według wynalazku może zawierać przeciwciało skierowane przeciw IgE o poprawionym powinowactwie lub jego funkcjonalne fragmenty posiadające użyteczność farmaceutyczną.

Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest leczenie zaburzeń, w których pośredniczą IgE, poprzez podawanie cząsteczek przeciwciał według wynalazku lub jego funkcjonalnych fragmentów.

Inne aspekty wynalazku staną się oczywiste na podstawie poniższego opisu szczegółowego i zastrzeżeń.

Figura 1 jest porównaniem domen VH i VL pomiędzy mysim przeciwciałem MAE11, ludzkimi sekwencjami konsensu podgrupy III łańcucha ciężkiego (humlll) i podgrupy I lekkiego łańcucha κ (humK l) oraz fragmentem F(ab)-2, zmodyfikowanym fragmentem przeciwciała ludzkiego z resztami CDR i niektórymi resztami zrębu zmodyfikowanymi na reszty mysie.

Figura 2 jest porównaniem różnic sekwencji między domenami CDR łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego pomiędzy rhuMabe25, e426 oraz sekwencjami e26 i e27. Numeracja reszt na tej figurze jest kolejna, w przeciwieństwie do tej w pracy Kabat i in. Należy zauważyć, że sekwencje te są tylko fragmentami, a nie resztami ciężkiego i lekkiego łańcucha o pełnych długościach.

Figura 3 jest wykresem oznaczenia opartego na FACS, wskazującym na zdolność testowanego przeciwciała do hamowania wiązania IgE skoniugowanej z FLTC, z łańcuchem α receptora o wysokim powinowactwie, FcsRI, ulegającego ekspresji na komórkach CHO 3D10. Przedstawiono procenty hamowania przez mysie przeciwciało monoklonalne MaE11 ( ), humanizowane mAb4D5, będące kontrolą ujemną (|), F(ab)-2 (o), F(ab)-9 (·), F(ab)-ll (Δ) i F(ab)-12 (♦). Punkty danych są średnimi z trzech doświadczeń, z wyjątkiem punktu dla przeciwciała monoklonalnego 4D5, który odpowiada pojedynczej wartości doświadczalnej. Wyniki wskazują, że MaE11 i testowane F(ab) blokują wiązanie FITC-lgE z komórkami CHO 3D10, na których zachodzi ekspresja łańcucha a FcsRI.

Figura 4 jest wykresem opartego na FACS oznaczenia mierzącego wiązanie testowanego przeciwciała ze związaną z IgE podjednostką α receptora o wysokim powinowactwie, FceRI, ulegającą ekspresji na komórkach CHO 3D10. Procentowe wiązanie przez mysie przeciwciało monoklonalne MaE11 (o), humanizowany wariant 12 (♦), mysie przeciwciało monoklonalne MaE1, będące kontrolą dodatnią (·), mysie przeciwciało MOPC21, będące kontrolą ujemną (Δ) oraz humanizowane mAb4D5, będące kontrolą ujemną ( ). W skali arytmetycznej/liniowej średnie wartości fluorescencji kanału dla 0,1 pg/ml wynosiły: MPOC21, 7,3; MaE1, 32,1; MaE11, 6,4, hu4D5, 4,7 i huMaE11, 4,6. Wszystkie trzy mysie przeciwciała monoklonalne były mysimi izotypami IgG1, a oba humanizowane przeciwciała monoklonalne były ludzkimi izotypami IgG1. Punkty danych są średnimi z trzech doświadczeń. Wyniki wskazują, że MaE11 i F(ab)-12 nie wiążą się z posiadającymi związaną IgE komórkami CHO 3D10, na których zachodzi ekspresja łańcucha a FcsRI.

Figura 5 jest wykresem stosunku molowego przeciwciała skierowanego przeciw IgE wobec procentowego hamowania indukowanego ambrozją uwalniania histaminy. Przedstawiono e-25 (·) i e-26 (o). Wyniki wskazują, że postać F(ab) e26 wykazuje lepsze hamowanie indukowanego ambrozją uwalniania histaminy w sposób zależny od dawki, z połową maksymalnego hamowania przy stosunku molowym 44:1 (przeciwciało skierowane przeciw IgErRSIgE).

Figura 6 jest graficznym przedstawieniem wzbogacania na zasadzie powinowactwa po różnych turach, opisanych w części II przykładu 4, selekcji przez powinowactwo. Przedstawiono stosunek wzbogacenia wiązania dla każdej puli do tego dla typu dzikiego (Emut/Ewt). Wyniki wskazują, że biblioteki VL (reprezentowane przez „a” i „b”) wykazywały w coraz większym stopniu poprawione względne wzbogacenia, do około 10-krotnie wyższego niż typ dziki, po około 5-6 turach wzbogacania. Ponadto, biblioteki VH („c” i „d”) wykazywały około 3-krotną poprawę po 3 turach. Należy zauważyć, że „a” odpowiada bibliotece Fab-fag zmutowanej w resztach 27, 28, 30 i 31 C DR-1 VL, podczas gdy

PL 194 562 B1 „b” odpowiada mutacjom w pozycjach 30, 31, 32 i 34, a „c” i „d” są niezależnymi bibliotekami F(ab) z mutacjami reszt 101, 102, 103, 105 i 107.

Figura 7 jest wykresem obserwowanej gęstości optycznej wobec stężenia współzawodniczącego przeciwciała IgE w badaniu współzawodnictwa w fagowym oznaczeniu ELISA końcowych wariantów z kombinacji mutacji CDRl w e26 z mutacjami CDR2 VH w opisanych w części V przykładu 4 klonach 235-5.1, 235-5.2, 235-5.3 i 235-5.4, którym odpowiednio nadano nowe nazwy e27, e695, e696 i e697.

Figura 8 jest wykresem absorbancji przy długości fali 490 nm różnych poziomów stężeń przeciwciała skierowanego przeciw IgE: e25, e26 i e27, w opisanym w części VI przykładu 4 oznaczeniu na płytkach z biotyną.

Figura 9 wskazuje pozorne powinowactwa wiązania F(ab) dla e25, e26 i e27, zmierzone w układzie powierzchniowego rezonansu plazmonowego BIAcore TM-2000. 1,5-krotne kolejne rozcieńczenia fragmentów F(ab) przeciwciał wstrzykiwano nad chip IgE w buforze PBS/Tween (0,05% Tween-20 w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami) w temperaturze 25°C, stosując szybkość przepływu 20 μΙ/minutę. Przedstawione równowagowe stałe dysocjacji (Kd) obliczono na podstawie stosunku obserwowanych kon/ko_ff dla każdego wariantu Fab.

Figura 10 przedstawia sekwencję plazmidu p426, który zastosowano jako matrycę do konstruowania specyficznych dla biblioteki matryc stop w przykładzie 4.

Figura 11A. Diagram wstawki plazmidu pDH188, zawierającej DNA kodujący łańcuch lekki i łańcuch ciężki (zmienną i stałą domenę 1) Fab humanizowanego przeciwciała skierowanego przeciw receptorowi HER-2. VL i VH są zmiennymi regionami odpowiednio łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. Ck jest regionem stałym ludzkiego lekkiego łańcucha kappa. CH1g1 jest pierwszym stałym regionem ludzkiego łańcucha gamma 1. Oba regiony kodujące rozpoczynają się bakteryjną sekwencją sygnałową stII.

Fihura 11B. Schematyczny diagram całego plazmidu pDHISS, zawierającego wstawkę opisaną na fig. 11A. Po transformacji plazmidem komórek E. coli SR101 i dodaniu faga wspomagającego, plazmid ulega upakowywaniu w cząstkach fagowych. Niektóre z tych cząstek prezentują fuzję Fab-p II (gdzie p III jest białkiem kodowanym przez DNAgenu III M13).

Figura 12 przedstawia sekwencje pełnej długości łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego skierowanych przeciw IgE przeciwciał E25, E26 i E27.

Figura 13 przedstawia fragmenty F(ab) skierowanych przeciw IgE przeciwciał e26 i e27.

Figura 14 przedstawia fragmenty sFV skierowanych przeciw IgE przeciwciał e26 i e27.

Figura 15 przedstawia fragmenty F(ab)'2 skierowanych przeciw IgE przeciwciał e26 i e27.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1 przedstawia sekwencję zastosowanego w wynalazku plazmidu ekspresyjnego e426, przedstawionego również na figurze 10. Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha ciężkiego MaE11, przedstawioną na fig. 1.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha ciężkiego F(ab)-2, przedstawioną na fig. 1.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha ciężkiego humlII, przedstawioną na figurze 1.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego MaE11, przedstawioną na fig. 1.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego F(ab)2, przedstawioną na fig. 1.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego humlIl, przedstawioną na fig. 1.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego e26 i e27, przedstawioną na fig. 2.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego e426, przedstawioną na fig. 2.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego e25, przedstawioną na fig. 2.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha ciężkiego e27, przedstawioną na fig. 2.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha ciężkiego e25, e26 i e426, przedstawioną na fig. 2.

PL 194 562 B1

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego o pełnej długości e25, jak przedstawiono na fig. 12.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha ciężkiego o pełnej długości e25, jak przedstawiono na fig. 12.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego o pełnej długości e26, jak przedstawiono na fig. 12.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha ciężkiego o pełnej długości e26, jak przedstawiono na fig. 12.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha lekkiego o pełnej długości e27, jak przedstawiono na fig. 12.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18 przedstawia zmienną sekwencję łańcucha ciężkiego o pełnej długości e27, jak przedstawiono na fig. 12.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19 przedstawia fragment Fab zmienny łańcuch lekkiego e26 i e27, jak przedstawiono na fig. 13.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20 przedstawia fragment Fab zmiennego łańcucha ciężkiego e26, jak przedstawiono na fig. 13.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21 przedstawia fragment Fab zmiennego łańcucha ciężkiego e27, jak przedstawiono na fig. 13.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22 przedstawia fragment sFv e26, jak przedstawiono na fig. 14.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23 przedstawia fragment sFv e27, jak przedstawiono na fig. 14.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 24 przedstawia fragment F(ab)'2 zmiennego łańcucha lekkiego e26 i e27, jak przedstawiono na fig. 15.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 25 przedstawia fragment F(ab)'2 zmiennego łańcucha ciężkiego e26, jak przedstawiono na fig. 15.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 26 przedstawia fragment F(ab)'2 zmiennego łańcucha ciężkiego e27, jak przedstawiono na fig. 15.

Definicje

Terminy stosowane w tym zgłoszeniu należy interpretować zgodnie ze zwyczajnym i typowym znaczeniem dla specjalistów w tej dziedzinie. Jednakże, twórcy zgłoszenia pragną, aby poniższe terminy były rozumiane w sposób zdefiniowany szczególnie poniżej.

Termin „białko” lub „polipeptyd” w zamierzeniu mogą być stosowane wymiennie. Odnoszą się one do łańcucha dwóch (2) lub więcej aminokwasów, które są połączone ze sobą wiązaniami peptydowymi lub amidowymi, bez względu na modyfikacje potranslacyjne (np. glikozylację lub fosforylację). Szczególną intencją jest, aby przeciwciała wchodziły w zakres tej definicji. Zgodnie z wynalazkiem polipeptydy mogą zawierać więcej niż jedną podjednostkę, gdzie każdą podjednostkę koduje oddzielna sekwencja DNA.

Zwrot „zasadniczo identyczna” w odniesieniu do sekwencji polipeptydu przeciwciała należy rozumieć jako przeciwciało wykazujące co najmniej 70%, dogodnie 80%, dogodniej 90%, a najdogodniej 95% identyczności sekwencji z sekwencją polipeptydu odniesienia. Termin ten w odniesieniu do sekwencji kwasu nukleinowego należy rozumieć jako sekwencję nukleotydów wykazującą co najmniej około 85%, korzystnie 90%, korzystniej 95%, a najkorzystniej 97% identyczności sekwencji z sekwencją kwasu nukleinowego odniesienia. Dla polipeptydów długość porównywanych sekwencji wynosić będzie generalnie co najmniej 25 aminokwasów. Dla kwasów nukleinowych długością tą będzie co najmniej 75 nukleotydów.

Termin „identyczność” lub „homologia” należy rozumieć jako oznaczający procent reszt aminokwasowych w rozpatrywanej sekwencji, które są identyczne z resztami odpowiadającej sekwencji, z którą porównuje się rozpatrywaną sekwencję, po przyrównaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli jest to konieczne dla osiągnięcia maksymalnej procentowej identyczności dla całej sekwencji i nie uważając jakichkolwiek podstawień konserwatywnych jako części identyczności sekwencji. Ani przedłużeń końca N lub C, ani insercji nie należy interpretować jako obniżających identyczność lub homologię. Metody i programy komputerowe do przyrównywania sekwencji są znane w dziedzinie. Identyczność sekwencji można określać stosując oprogramowanie do analizy sekwencji (np. Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center,

PL 194 562 B1

1710 University Ave., Madison, Wl 53705). Oprogramowanie to dobiera podobne sekwencje przez ustalenie stopnia homologii różnych podstawień, delecji i innych modyfikacji.

Termin „przeciwciało” stosuje się w najszerszym znaczeniu i w szczególności obejmuje on przeciwciała monoklonalne (włącznie z przeciwciałami monoklonalnymi o pełnej długości), przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne (np. przeciwciała bispecyficzne) oraz fragmenty przeciwciał (np. Fab, F(ab)'2 i Fv), tak długo, dokąd wykazują one pożądaną aktywność biologiczną. Przeciwciała (Ab) i immunoglobuliny (Ig) są glikoproteinami posiadającymi takie same właściwości strukturalne. Podczas gdy przeciwciała wykazują specyficzność wiązania wobec określonego antygenu, immunoglobuliny obejmują zarówno przeciwciała, jak i inne cząsteczki podobne do przeciwciał, które pozbawione są specyficzności wobec antygenu. Polipeptydy tego ostatniego rodzaju wytwarzane są na przykład na niskich poziomach przez układ limfatyczny, a na podwyższonych poziomach - przez szpiczaki.

Natywne przeciwciała i immunoglobuliny są zazwyczaj heterotetramerycznymi glikoproteinami o masach cząsteczkowych około 150000 daltonów, składającymi się z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym mostkiem disiarczkowym, ale liczba wiązań disiarczkowych różni się pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotypów immunoglobulin. Każdy łańcuch ciężki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VH), po której występują liczne domeny stałe. Każdy łańcuch lekki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VL), a na drugim końcu domenę stałą. Stała domena łańcucha lekkiego położona jest na wysokości pierwszej stałej domeny łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego położona jest na wysokości domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się, że poszczególne reszty aminokwasowe tworzą granicę pomiędzy domenami zmiennymi łańcuchów lekkiego i ciężkiego (Clothia i in., J. Mol. Biol. 186, 651-66, 1985); Novotny i Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1995).

„Wyizolowanym” przeciwciałem jest przeciwciało, które zidentyfikowano i wydzielono i/lub odzyskano z wieloskładnikowego środowiska, w którym jest ono wytwarzane. Zanieczyszczające składniki ze środowiska jego wytwarzania są materiałami, które mogłyby zakłócać diagnostyczne lub terapeutyczne zastosowania przeciwciała i mogą obejmować enzymy, hormony i inne rozpuszczone substancje białkowe lub niebiałkowe.

W zalecanych rozwiązaniach, przeciwciało może być oczyszczone, jak można zmierzyć trzema różnymi metodami:

1) w stopniu wyzszym niż 95% wagowych przeciwciała, co można oł^r^^s^llcć metodą Lowry'ego, a najdogodniej w stopniu wyższym niż 99% wagowych;

2) w stopniu wyssai-czającym do otrzyma nia co najmniee 15 reszt N-koricowej lub wewnętrznee sekwencji aminokwasowej przy zastosowaniu sekwenatora ze zbiornikiem wirówkowym; lub

3) do homogenności w SDS-PAGE w wa runka ch redukujących lub nie redukujących z zastosowaniem barwienia błękitem Coomasiego lub, dogodnie, srebrem.

Wyizolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w zrekombinowanych komórkach, ponieważ co najmniej jeden ze składników naturalnego środowiska przeciwciała nie będzie obecny. Zazwyczaj jednakże, wyizolowane przeciwciało będzie przygotowywane przez co najmniej jeden etap oczyszczania.

„Specyficznym gatunkowo przeciwciałem”, np. ssaczym przeciwciałem skierowanym przeciw ludzkiej IgE jest przeciwciało, które posiada silniejsze powinowactwo wiązania dla antygenu z pierwszego gatunku ssaka od powinowactwa posiadanego przez nie dla homologu tego antygenu z drugiego gatunku ssaka. Zwykle, specyficzne gatunkowo przeciwciało „wiąże się specyficznie” z antygenem człowieka (tj. posiada wartość powinowactwa wiązania (Kd) nie wyższą niż około 1 x 10 ' M, dogodnie nie wyższą niż około 1 x 10⁸, a najdogodniej nie wyższą niż około 1 x 10⁹ M), ale posiada powinowactwo wiązania dla homologu antygenu z drugiego gatunku ssaka nie będącego człowiekiem, które jest co najmniej około 50-krotnie lub co najmniej 500-krotnie, lub co najmniej 1000-krotnie słabsze od jego powinowactwa wiązania dla antygenu człowieka. Specyficzne gatunkowo przeciwciało może być któregokolwiek z różnych typów przeciwciał, jak zdefiniowano powyżej, ale dogodnie jest przeciwciałem humanizowanym lub ludzkim.

Termin „mutant przeciwciała” odnosi się do wariantu sekwencji aminokwasowej przeciwciała, w której zmodyfikowano jedną lub więcej z reszt aminokwasowych. Taki mutant musi posiadać mniej niż 100% identyczności lub podobieństwa sekwencji do sekwencji aminokwasowej posiadającej co najmniej 75% identyczności lub podobieństwa sekwencji aminokwasowej do sekwencji aminokwasowej zmiennej domeny albo łańcucha ciężkiego, albo lekkiego przeciwciała, dogodnie co najmniej

PL 194 562 B1

80%, dogodniej co najmniej 85%, jeszcze dogodniej co najmniej 90%, a najdogodniej 95%. Ze względu na to, że opisany sposób ma zastosowanie w równym stopniu do obu polipeptydów, fragmentów i ich przeciwciał, terminy niekiedy wykorzystuje się wymiennie.

Termin „zmienna” w kontekście zmiennej domeny przeciwciał odnosi się do faktu, że niektóre części domen zmiennych w znacznym stopniu różnią się sekwencją pomiędzy przeciwciałami i wykorzystywane są w wiązaniu i specyficzności każdego określonego przeciwciała wobec jego określonego antygenu. Jednakże, zmienność nie jest równo rozłożona w zmiennych domenach przeciwciał. Skupia się ona w trzech odcinkach, nazwanych regionami determinującymi komplementarność (CDR), znanym także jako regiony hiperzmnienne, w domenach zmiennych zarówno lekkiego łańcucha, jak i ciężkiego łańcucha. Istnieją co najmniej dwie techniki określania CDR:

(1) podejście oparte na międzygatunkowej zmienności sekwencji (tj. Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD 1987); oraz (2) podejście oparte na badaniach krystalograficznych kompleksów antygen-przeciwciało (Chothia, C. i in. (1989), Nature 342: 877).

W odniesieniu do skierowanego przeciw IgE przeciwciała twórców zgłoszenia, niektóre CDR zdefiniowano stosując połączenie podejść Kabata i in. oraz Chothii i in. Bardziej konserwatywne części domen zmiennych nazywa się zrębem (FR). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawiera cztery regiony FR, w większości przyjmujące konfigurację struktury β, połączone przez trzy CDR, które tworzą pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzące część struktury β. CDR w każdym łańcuchu utrzymywane są ze sobą w bliskim sąsiedztwie przez regiony FR i z CDR z drugiego łańcucha, biorąc udział w tworzeniu miejsca wiążącego antygen przeciwciała (patrz Kabat i in.). Domeny stałe nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu przeciwciała z antygenem, ale wykazują różne funkcje efektorowe, jakie jak udział przeciwciała w zależnej od przeciwciał toksyczności komórkowej.

Termin „fragment przeciwciała” odnosi się do części przeciwciała o pełnej długości, generalnie regionu wiążącego antygen lub zmiennego. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab)'2 i Fv. Strawienie przeciwciał papainą prowadzi do powstawania dwóch identycznych fragmentów wiążących antygen, nazwanych fragmentem Fab, z których każdy posiada pojedyncze miejsce wiążące antygen oraz pozostającego fragmentu „Fc”, nazwanego tak ze względu na jego łatwość krystalizacji. Wynikiem trawienia pepsyną jest fragment F(ab)'2, który obejmuje dwa fragmenty wiążące antygen, które są zdolne do sieciowania antygenu oraz pozostającego innego fragmentu (który nazwano pFc'). Dodatkowe fragmenty mogą obejmować diaciała, przeciwciała liniowe, jednołańcuchowe cząsteczki przeciwciał oraz przeciwciała multispecyficzne tworzone z fragmentów przeciwciał. W znaczeniu tu stosowanym, „funkcjonalny fragment” w odniesieniu do przeciwciał, dotyczy fragmentów Fv, F(ab) i F(ab)'2.

Fragment Fv jest najmniejszym fragmentem przeciwciała, który zawiera pełne miejsce rozpoznające i wiążące antygen. Region ten składa się z dimeru jednej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i jednej łańcucha lekkiego, pozostających w silnym, niekowalencyjnym połączeniu (dimer Vh-V_l). W tej konfiguracji, trzy CDR każdej domeny zmiennej oddziałują definiując miejsce wiążące antygen na powierzchni dimeru Vh-V_l. Łącznie, sześć CDR nadaje przeciwciału specyficzność wiązania antygenu. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv, obejmująca tylko trzy CDR specyficzne wobec antygenu) posiada zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż z mniejszym powinowactwem niż całe miejsce wiążące.

Fragment Fab [oznaczany także jako F(ab)] zawiera także stałą domenę łańcucha lekkiego i pierwszą stałą domenę (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab dodatkowymi kilkoma resztami na karboksylowym końcu domeny CH1 łańcucha ciężkiego, włącznie z jedną lub więcej resztami cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab'-SH oznacza w niniejszym opisie Fab', w którym reszta(y) cystein(y) domeny stałej posiadają wolne grupy tiolowe. Fragmenty F(ab)' tworzy się przez rozszczepienie wiązania dwusiarczkowego cystein regionu zawiasowego produktu trawienia pepsyną, F(ab)'2. Specjalistom w tej dziedzinie znane są dodatkowe połączenia chemiczne fragmentów przeciwciał.

Lekkie łańcuchy przeciwciał (immunoglobulin) z jakiegokolwiek gatunku kręgowca można zaliczyć do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, nazwanych kappa (κ) i lambda (λ), w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domeny stałej.

W zależności od sekwencji aminokwasowych domeny stałej ich łańcuchów ciężkich, „immunoglobuliny” można zaliczyć do różnych klas. Istnieje co najmniej pięć (5) głównych klas immunoglobulin:

PL 194 562 B1

IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG-1, IgG-2,

IgG-3 i IgG-4; IgA-1 i IgA-2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich, które odpowiadają różnym klasom immunoglobulin, nazwano odpowiednio α, β, ε, γ i μ. Struktury podjednostek i konfiguracje przestrzenne różnych klas immunoglobulin są dobrze znane. Immunoglobuliną zalecaną do stosowania zgodnie w wynalazkiem jest immunoglobulina E.

Termin „przeciwciało monoklonalne” w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, dotyczy przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. pojedyncze przeciwciała tworzące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w małych ilościach. Przeciwciała monoklonalne wykazują wysoką specyficzność, jako skierowane przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów przeciwciał konwencjonalnych (poliklonalnych), które zazwyczaj obejmują różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne skierowane jest przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Poza ich specyficznością, przeciwciała monoklonalne są zalecane ze względu na to, że syntetyzowane są przez hodowlę hybrydomy, bez zanieczyszczenia innymi immunoglobulinami.

Określenie „monoklonalne” wskazuje na charakter przeciwciała, jako otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie należy go interpretować jako wymaganie wytwarzania przeciwciała jakąkolwiek określoną metodą. Na przykład przeciwciała monoklonalne przeznaczone do stosowania zgodnie z wynalazkiem, można otrzymywać metodą z wykorzystaniem hybrydom, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i Milsteina, Nature 256, 459 (1975), bądź można otrzymywać metodami rekombinacyjnymi, np. jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 816 567. Przeciwciała monoklonalne do stosowania w zgodzie z niniejszym wynalazkiem można także izolować z fagowych bibliotek przeciwciał, stosując techniki opisane w Clackson i in., Nature 352: 624-628 (1991), jak również w Marks i in., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991).

Przeciwciała monoklonalne w niniejszym opisie w szczególności obejmują przeciwciała (immunoglobuliny) „chimeryczne”, w których część łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest identyczna z, bądź homologiczna do odpowiadających sekwencji w przeciwciałach pochodzących z określonego gatunku lub należących do określonej klasy, bądź podklasy przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha(ów) jest identyczna z, bądź homologiczna do odpowiadających sekwencji w przeciwciałach pochodzących z innego gatunku lub należących do innej klasy, bądź podklasy przeciwciał, jak również fragmenty takich przeciwciał, tak długo, jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 816 567); Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 81,6851-6855 (1984).

„Humanizowane” postacie przeciwciał innych niż ludzkich (np. mysich) są chimeryczne immunoglobuliny, łańcuchy immunoglobulin lub ich fragmenty (takie jak Fv, Fab, Fab', F(ab')2 lub inne wiążące antygen subsekwencje przeciwciał), które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z immunoglobuliny innej niż ludzka. W większej części humanizowane przeciwciała są immunoglobulinami człowieka (przeciwciałem biorcą), w których reszty z regionu determinującego komplementarność (CDR) biorcy zastępuje się resztami z CDR gatunku innego niż człowiek (przeciwciała dawcy), takiego jak mysz, szczur lub królik, posiadającymi pożądaną specyficzność, powinowactwo i wydajność. W niektórych przypadkach, reszty zrębu Fv immunoglobuliny człowieka zastępuje się odpowiadającymi resztami innymi niż ludzkie.Ponadto, przeciwciało humanizowane może obejmować reszty, które nie występują ani w przeciwciele biorcy, ani w przeniesionych sekwencjach CDR lub zrębu. Modyfikacji tych dokonuje się w celu dalszego udoskonalania i optymalizacji skuteczności przeciwciała. Generalnie, humanizowane przeciwciało zawierać będzie zasadniczo całość co najmniej jednej, a zasadniczo dwóch domen zmiennych, w których całość, bądź zasadniczo całość regionów CDR odpowiada CDR immunoglobuliny innej niż ludzka, a całość, bądź zasadniczo całość regionów FR jest tymi sekwencji konsensu immunoglobuliny ludzkiej. Optymalnie, humanizowane przeciwciało będzie również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj immunoglobuliny ludzkiej. W celu zapoznania się z dalszymi szczegółami, patrz: Jones i in., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann i in., Nature 332, 323-329 (1988) oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992).

„Jednołańcuchowe Fv” lub „sFv” fragmenty przeciwciał zawierają domeny VH i VL przeciwciała, przy czym domeny te występują w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Generalnie, polipeptyd Fv zawiera dalej łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami VH i VL, który umożliwia tworzenie przez sFv struktury pożądanej do wiązania antygenu. W celu zapoznania się z przeglądem na temat sFv,

PL 194 562 B1 patrz Pluckthun, w: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore, red.,

Springer-Verlag, Nowy Jork, str. 269-315 (1994).

Termin „diaciała” odnosi się do małych fragmentów przeciwciał o dwóch miejscach wiązania antygenu, które to fragmenty zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL). Dzięki zastosowaniu łącznika, który jest zbyt krótki, aby umożliwiać tworzenie par pomiędzy dwiema domenami w tym samym łańcuchu, domeny zmusza się do tworzenia par z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenia dwóch miejsc wiążących antygen. Diaciała opisano pełniej w, na przykład, europejskim opisie patentowym numer EP 404 097; opisie patentowym numer WO 93/11161 oraz Hollinger i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Zwrot „funkcjonalny fragment lub analog” przeciwciała oznacza, że jest on związkiem posiadającym rodzaj aktywności biologicznej wspólny z przeciwciałem o pełnej długości. Na przykład, funkcjonalnym fragmentem lub analogiem przeciwciała skierowanego przeciw IgE jest taki fragment lub analog, który może wiązać się z immunoglobuliną IgE w taki sposób, że zapobiega to lub zasadniczo obniża zdolność takich cząsteczek do wiązania z receptorem o wysokim powinowactwie, FcsRI.

Termin „aminokwas” lub „aminokwasy” odnosi się do wszystkich naturalnie występujących L-α-aminokwasów. Aminokwasy identyfikuje się jak opisano dalej w niniejszym opisie w części A. Przygotowywanie przeciwciał: (iv) Tworzenie zmutowanych przeciwciał.

Termin „wariant aminokwasowy” odnosi się do cząsteczki o pewnych różnicach w sekwencjach aminokwasowych w porównaniu z natywną sekwencją aminokwasową.

Wariantami „podstawieniowymi” są warianty, które posiadają co najmniej jedną resztę aminokwasową w sekwencji aminokwasowej usuniętą i na jej miejsce wstawiony w tej samej pozycji inny aminokwas. Podstawienia mogą być pojedyncze, w których podstawia się tylko jeden aminokwas w cząsteczce lub mogą być wielokrotne, w których w tej samej cząsteczce podstawiono dwa lub więcej aminokwasów.

Wariantami „insercyjnymi” są te z jednym lub więcej aminokwasami wstawionymi bezpośrednio w sąsiedztwie aminokwasu w określonej pozycji natywnej sekwencji. Bezpośrednio w sąsiedztwie aminokwasu oznacza połączenie albo z α-karboksylową, albo z α-aminową grupą funkcyjną aminokwasu.

Wariantami „delecyjnymi” są te z usuniętym jednym lub więcej aminokwasami natywnej sekwencji aminokwasowej. Zazwyczaj warianty delecyjne posiadać będą jeden lub więcej aminokwasów wydeletowanych w określonym regionie cząsteczki.

Terminy „komórka”, „linia komórkowa” i „hodowla komórkowa” stosuje się wymiennie i wszystkie takie oznaczenia obejmują potomstwo. Jest także zrozumiałe, że całe potomstwo może nie być ściśle identyczne pod względem zawartości DNA z powodu zaplanowanych lub spontanicznych mutacji. Terminy te obejmują zmutowane potomstwo, które posiada taką samą funkcję lub właściwość biologiczną, jakiej poszukuje się w oryginalnie stransformowanej komórce.

„Komórkami gospodarza” stosowanymi w niniejszym wynalazku są generalnie gospodarze prokariotyczni lub eukariotyczni. Przykłady odpowiednich komórek gospodarza opisano w części B. Wektory, komórki gospodarza i metody rekombinacji: (vii) Selekcja i transformacja komórek gospodarza.

„Transformacja” oznacza wprowadzanie DNA do organizmu w taki sposób, aby DNA mógł ulegać replikacji, albo w postaci elementu pozachromosomalnego, albo dzięki integracji z chromosomem.

„Transfekcja” odnosi się do pobierania wektora ekspresyjnego przez komórkę gospodarza, niezależnie od tego, czy w rzeczywistości ulegają ekspresji jakiekolwiek sekwencje kodujące.

Terminy „stransfekowana komórka gospodarza” i „stransformowana” odnoszą się do wprowadzenia DNA do komórki. Komórkę nazywa się „komórką gospodarza i może ona być albo komórką prokariotyczną, albo eukariotyczną. Typowe prokariotyczne komórki gospodarza obejmują różne szczepy E. coli. Typowe eukariotyczne komórki gospodarza są komórkami ssaczymi, takimi jak komórki jajnika chomika chińskiego lub komórki pochodzenia ludzkiego. Wprowadzona sekwencja DNA może pochodzić z tego samego gatunku, co komórka gospodarza, lub innego gatunku, niż komórka gospodarza, lub może być hybrydową sekwencją DNA, zawierającą część obcego i część homologicznego DNA.

Terminy „zdolny do replikacji wektor ekspresyjny” i „wektor ekspresyjny” odnoszą się do odcinka DNA, zazwyczaj dwuniciowego, do którego może zostać wstawiony odcinek obcego DNA. Obcy DNA definiuje się jako heterologiczny DNA, który jest DNA nie występującym naturalnie w komórce gospodarza. Wektor stosuje się do przenoszenia obcego lub heterologicznego DNA do odpowiedniej komór12

PL 194 562 B1 ki gospodarza. Po znalezieniu się w komórce gospodarza, wektor może ulegać replikacji niezależnie od chromosomalnego DNA gospodarza i może powstawać kilka kopii wektora i wstawionego do niego (obcego) DNA.

Termin „wektor” oznacza konstrukcję DNA zawierającą sekwencję DNA, która jest połączona w sposób umożliwiający działanie z odpowiednią sekwencją kontrolującą, zdolną do przeprowadzania ekspresji DNA w odpowiednim gospodarzu. Takie sekwencje kontrolujące obejmują promotor do prowadzenia transkrypcji, ewentualną sekwencję operatora do kontrolowania takiej transkrypcji, sekwencję kodującą odpowiednie miejsca wiązania rybosomów przez mRNA oraz sekwencje, które kontrolują terminację transkrypcji i translacji. Wektorem może być plazmid, cząstka fagowa lub po prostu potencjalna wstawka genomowa. Po stransformowaniu nim odpowiedniego gospodarza, wektor może ulegać replikacji i działać niezależnie od genomu gospodarza, lub może, w niektórych przypadkach, sam ulegać integracji do genomu.

W niniejszym opisie, „plazmid” i „wektor niekiedy stosuje się zamiennie, ponieważ plazmid jest obecnie najpowszechniej stosowaną postacią wektora. Jednakże, wynalazek w zamierzeniu obejmuje takie inne postacie wektora, które pełnią równoważne funkcje i które są, bądź stają się, znane w nauce. Typowe wektory ekspresyjne do ekspresji w hodowlach komórek ssaczych oparte są na przykład na pRK5 (europejski opis patentowy nr EP 307 247), pSV16B (opis patentowy numer WO 91/08291) i pVL1392 (Pharmingen).

„Liposom” jest małym pęcherzykiem złożonym z różnego typu lipidów, fosfolipidów i/lub środków powierzchniowo czynnych, który jest użyteczny do dostarczania leku (takiego jak ujawniony w niniejszym opisie mutant przeciwciała i, ewentualnie, czynnik chemioterapeutyczny) ssakowi. Składniki liposomu są zwykle ułożone dwuwarstwowo, podobnie do ułożenia lipidów w błonach biologicznych.

Wyrażenie „sekwencje kontrolujące” odnosi się do sekwencji DNA koniecznych do ekspresji połączonej w sposób umożliwiający działanie sekwencji kodującej w określonym organizmie gospodarza. Sekwencje kontrolujące, które są odpowiednie dla organizmów prokariotycznych obejmują, na przykład, promotor, ewentualnie sekwencję operatora i miejsce wiązania rybosomu. O komórkach eukariotycznych wiadomo, że wykorzystują promotory, sygnały poliadenylacji i sekwencje wzmacniające.

„Wyizolowaną” cząsteczką kwasu nukleinowego jest cząsteczka kwasu nukleinowego, którą zidentyfikowano i oddzielono od co najmniej jednej zanieczyszczającej cząsteczki kwasu nukleinowego, która zazwyczaj towarzyszy jej w naturalnym źródle kwasu nukleinowego przeciwciała. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest inna niż w postaci lub układzie, w której występuje ona w przyrodzie. Dlatego też, wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego są odróżnialne od cząsteczki kwasu nukleinowego istniejących w naturalnych komórkach. Jednakże, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawartą w komórkach, w których zwykle zachodzi ekspresja przeciwciała, jeśli, na przykład, cząsteczka kwasu nukleinowego zajmuje w chromosomie położenie inne od tego w naturalnych komórkach.

Kwas nukleinowy jest „połączony w sposób umożliwiający działanie”, jeśli umieszczony został w zależności funkcjonalnej z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Może to być gen lub sekwencja(je) regulująca(e), które są połączone w taki sposób, aby umożliwić ekspresję genu, gdy odpowiednie cząsteczki (np. białek aktywatorów transkrypcyjnych) zawiązane są z sekwencją(ami) regulującą(ymi). Na przykład, DNA presekwencji lub lidera sekrecyjnego połączony jest w sposób umożliwiający działanie, jeśli ulega ekspresji jako prebiałko i uczestniczy w sekrecji polipeptydu; promotor lub sekwencja wzmacniająca połączone są w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą, jeśli wpływają na transkrypcję tej sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomu połączone jest w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą, jeśli wpływa ono on transkrypcję tej sekwencji; bądź miejsce wiązania rybosomu połączone jest w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą, jeśli jest ono tak umiejscowione, że ułatwia translację.

Generalnie, „połączona w sposób umożliwiający działanie” oznacza, że sekwencje połączone w sposób umożliwiający działanie sąsiadują ze sobą i w przypadku lidera sekrecyjnego sąsiadują ze sobą i pozostają w jednej w fazie odczytu. Jednakże, sekwencje wzmacniające nie muszą być sąsiadujące. Łączenie uzyskuje się przez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie występują, to zgodnie z konwencjonalnym postępowaniem praktycznym stosuje się syntetyczne adaptery i łączniki oligonukleotydowe.

„Traktowanie” odnosi się do zarówno traktowania terapeutycznego i profilaktycznego, jak i środków zapobiegawczych. Osobnicy potrzebujący traktowania obejmują tych już cierpiących na zaburzenie, jak i tych, u których należy zapobiegać wystąpieniu zaburzenia.

PL 194 562 B1 „Zaburzenie” jest jakimkolwiek stanem, który mógłby odnieść korzyść z traktowania polipeptydem. Obejmuje ono przewlekłe lub ostre zaburzenia i choroby, włącznie z tymi stanami patologicznymi, które predysponują ssaka do wystąpienia takiego zaburzenia.

Termin „czynnik immunosupresyjny” stosowany w niniejszym opisie w terapii pomocniczej, odnosi się do substancji, które działają hamująco lub maskująco na układ immunologiczny gospodarza, u którego wykonuje się przeszczep. Może on obejmować substancje, które hamują wytwarzanie cytokin, zmniejszają lub hamują ekspresję autoantygenów, bądź maskują antygeny MHC. Przykłady takich czynników obejmują 2-amino-5-arylo-5-podstawione pirymidyny (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 665 077), azatioprynę (lub cyklofosfamid w przypadku niekorzystnych reakcji na azatioprynę); bromokryptynę; glutaraldehyd (który maskuje antygeny MHC, jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 120 649); przeciwciała antyidiotypowe przeciw antygenom MHC i fragmentom NHC; cyklosporynę A; steroidy, takie jak glukokortykosteroidy. np. prednizon, metyloprednizon i deksametazon; antagonistów cytokin lub receptorów cytokin, włącznie z przeciwciałami skierowanymi przeciw interferonowi γ, β lub α; przeciwciała skierowane przeciw czynnikowi martwicy nowotworów β; przeciwciała skierowane przeciw czynnikowi martwicy nowotworów β; przeciwciała skierowane przeciw interleukinie 2 lub receptorowi IL-2; przeciwciałami skierowanymi przeciw L3T4; heterologiczną globulinę skierowaną przeciw limfocytom; przeciwciała pan-T, dogodnie przeciwciała skierowane przeciw CD3 lub CD4/CD4a; rozpuszczalny peptyd zawierający domenę wiążącą LFA-3 (opis patentowy numer WO 90/08187, opublikowany 26 lipca 1990 r.); streptokinazę; TGF-β; streptodornazę; RNA lub DNA z gospodarza; FK506; RS-61443; deoksyspergualinę; rapamycynę; receptor komórek T (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 114 721); fragmenty receptora komórek T (Offner i in., Science 251: 430-432 (1991); opis patentowy numer WO 90/11294 i opis patentowy numer WO 91/01133) oraz przeciwciała przeciw receptorowi komórek T (opis patentowy numer EP 340 109), takie jak T10B9. Czynniki te podaje się jednocześnie, bądź w innym czasie niż przeciwciało CD11a i stosuje się w takich samych lub niższych dawkach niż te podawane dotychczas w literaturze. Dogodny wspomagający czynnik immunosupresyjny zależał będzie od wielu czynników, włącznie z rodzajem traktowanego zaburzenia, włącznie z rodzajem przeprowadzanej transplantacji, jak również historii choroby pacjenta, ale na ogół tendencja jest taka, że czynnik wybiera się spośród cyklosporyny A, glukokortykosteroidu (najdogodniej prednizonu lub metyloprednizolonu), przeciwciała monoklonalnego OKT-3, azatiopryny, bromokryptyny, heterologicznej globiny skierowanej przeciw limfocytom oraz ich mieszanin.

Terminy „rak” i „rakowy” odnoszą się do lub opisują stan fizjologiczny u ssaków, który generalnie charakteryzuje się nieregulowanym wzrostem komórek. Przykłady raków obejmują, ale nie ograniczają się do raka, chłoniaka, blastomy, mięsaka i białaczki. Bardziej szczegółowo przykłady takich raków obejmują raka płaskokomorkowego, drobnokomórkowego raka płuc, nie drobnokomórkowego raka płuc, raka żołądka i jelita cienkiego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka wątroby, raka pęcherza moczowego, wątrobiaka, raka sutka, raka okrężnicy, raka okrężnicy i odbytnicy, raka trzonu macicy, raka gruczołów ślinowych, raka nerki, gruczolakoraka nerki, raka gruczołu krokowego, raka sromu, raka tarczycy, gruczolakoraka wątroby i różnych typów raka głowy i szyi.

„Ssak”, którego można poddawać traktowaniu odnosi się do jakiegokolwiek zwierzęcia sklasyfikowanego jako ssak, włącznie z człowiekiem, zwierzętami domowymi i hodowlanymi, naczelnymi innymi niż człowiek oraz zwierzętami z ogrodów zoologicznych, zwierzętami sportowymi lub domowymi, takimi jak psy, konie, koty, bydło itp.

Termin „wyznakowany epitopem”, gdy jest stosowany w niniejszym opisie, odnosi się do polipeptydu poddanego fuzji ze „znacznikiem epitopowym”. Polipeptyd znacznika epitopowego posiada wystarczającą liczbę reszt, dla zapewnienia epitopu, przeciw któremu można przygotować przeciwciało, a jest jeszcze dostatecznie krótki, aby nie zakłócał aktywności polipeptydu. Znacznik epitopowy dogodnie jest także zupełnie unikalny tak, aby skierowane przeciw niemu przeciwciało zasadniczo nie reagowało krzyżowo z innymi epitopami. Odpowiednie polipeptydy znacznikowe generalnie posiadają co najmniej 6 reszt aminokwasowych, a zazwyczaj pomiędzy 8 a 50 reszt aminokwasowych (dogodnie pomiędzy około 9 a 30 reszt). Przykłady obejmują polipetyd znacznikowy flu Ha i jego przeciwciało 12CA5 (Field i in., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); znacznik c-myc i skierowane przeciw niemu przeciwciała 8F9, 3C7, 6E10, G4, B8 i 9E10 (Evan i in., Moll. Celi. Biol. 5 (12): 3610-3616 (1985)) oraz znacznik glikoproteiny D wirusa opryszczki (gD) i jego przeciwciało (Paborsky i in., Protein Engineering 3 (6): 547-553 (1990)). W niektórych rozwiązaniach znacznikiem epitopowym jest „epitop wiążący receptor ratujący”.

PL 194 562 B1

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „epitop wiążący receptor ratujący odnosi się do epitopu regionu Fc cząsteczki IgG (np. IgG₁, IgG2, IgG₃ lub IgG₄), który jest odpowiedzialny za zwiększanie in vivo okresu półtrwania cząsteczki IgG w surowicy.

Termin „czynnik cytotoksyczny” w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do substancji, która hamuje lub zapobiega działaniu komórek i/lub powoduje niszczenie komórek. Termin w zamierzeniu obejmuje izotopy promieniotwórcze (np. J¹³¹, J¹²⁵, Y⁹⁰ i Re¹⁸⁶), czynniki chemioterapeutyczne oraz toksyny, takie jak aktywne enzymatycznie toksyny pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, bądź ich fragmenty.

„Czynnik chemioterapeutyczny” jest związkiem użytecznym w traktowaniu raka. Przykłady czynników chemioterapeu-tycznych obejmują adrimycynę, doksorubicynę, 5-fluorouracyl, cytarabinę („Ara-C”), cyklofosfamid, tiotepę, taksoterę (docetaksel), bulsulfan, cytoksynę, taksol, metotreksat, cisplatynę, melfalan, winblastynę, bleomycynę, etopozyd, ifosfamid, mitomycynę C, mitoksantron, winkrystynę, winorelbinę, karboplatynę, tenipozyd, daunomycynę, karminomycynę, aminopterynę, daktynomycynę, mitomycynę, esperamicyny (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 675 187), melfalan oraz inne zbliżone pochodne iperytu azotowego.

Termin „prolek” w znaczeniu stosowanym w tym zgłoszeniu odnosi się do prekursorowej lub pochodnej postaci substancji aktywnej farmaceutycznie, która jest mniej toksycz na dla komórek nowotworowych w porównaniu z lekiem macierzystym i jest zdolna do ulegania enzymatycznej aktywacji lub przekształcaniu w bardziej aktywny lek macierzysty, patrz np. Wilman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy”, Biochemical Society Transactions, 14, str. 375-382, 615 Meeting, Belfast (1986) oraz Stella i in., (red.), „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Direct Drug Drlivery, Borchardt i in., (red.), str. 247-267, Human Press (1985). Proleki obejmują, ale nie ograniczają się do proleków zawierających fosforan, proleków zawierających tiofosforan, proleków zawierających siarczan, proleków zawierających peptydy, proleków obejmujących zmodyfikowane D-aminokwasy, proleków glikozylowanych, proleków zawierających β-laktam, ewentualnie podstawionych proleków zawierających fenoksyacetamid lub ewentualnie podstawionych proleków zawierających fenyloacetamid, 5-fluorocytozynę i innych proleków 5-fluorourydynowych, które mogą ulegać przekształcaniu w bardziej aktywny, cytotoksyczny wolny lek. Przykłady leków cytotoksycznych, które można przeprowadzać w pochodne, aby uzyskać postać proleku do stosowania w tym wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do opisanych powyżej czynników chemioterapeutycznych.

Słowo „znacznik”, gdy stosuje je się w niniejszym opisie, odnosi się do wykrywalnego związku, który jest bezpośrednio lub pośrednio skoniugowany z przeciwciałem. Znacznik może sam być wykrywalny (np. znaczniki będące izotopami promieniotwórczymi lub znaczniki fluorescencyjne) lub, w przypadku znacznika enzymatycznego, może katalizować chemiczną zmianę związku lub kompozycji substratu, która jest wykrywalna.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „faza stała” oznacza niewodną matriks, do której może przylegać przeciwciało. Przykłady wchodzących w zakres tego terminu faz stałych obejmują te utworzone częściowo lub w całości ze szkła (np. szkła o kontrolowanej wielkości porów), polisacharydów (np. agarozy), poliakryloamidów, polistyrenu, alkoholu poliwinylowego i silikony. W niektórych rozwiązaniach, w zależności od kontekstu, fazę stałą może stanowić studzienka płytki do oznaczania; w innych jest ona kolumną do oczyszczania (np. kolumną do chromatografii powinowactwa). Termin ten obejmuje również nieciągłą fazę stałą z odrębnych cząstek, taką jak te opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 275 149.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, przeciwciało skierowane przeciw ludzkiej IgE oznacza przeciwciało, które wiąże się z ludzką IgE w taki sposób, że hamuje, bądź zasadniczo obniża wiązanie takiej IgE z receptorem o wysokim powinowactwie, FcoRI. Dogodnie jak tym przeciwciałem skierowanym przeciw IgE jest E-25.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „zaburzenie zależne od IgE” oznacza stan lub chorobę, która charakteryzuje się nadmiernym wytwarzaniem i/lub nadwrażliwością na IgE. W szczególności, należy go rozumieć jako obejmujący stany związane z nadwrażliwością anafilaktyczną i alergiami atopowymi, obejmującymi na przykład: astmę, alergiczny nieżyt nosa i zapalenie spojówek (gorączkę sienną), egzemę, pokrzywkę oraz alergie pokarmowe. Jednakże, zakres tego terminu obejmuje również groźny stan fizjologiczny wstrząsu anafilaktycznego, zazwyczaj powodowany przez użądlenia przez pszczoły i węże.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „dojrzewanie na zasadzie powinowactwa z zastosowaniem prezentacji przez fagi” (AMPD) odnosi się do procesu opisanego w Lowman i in., BioPL 194 562 B1 chemistry 30 (45): 10832-10838 (1991), patrz także Hawkins i in., J. Mol. Biol. 254: 689-896 (1992). Chociaż proces ten nie jest ściśle ograniczony do poniższego opisu, to można go krótko opisać następująco: kilka miejsc regionu hiperzmiennego (np. 6-7 miejsc) poddaje się mutacjom w celu utworzenia wszystkich możliwych podstawień aminokwasowych w każdym miejscu. Tak utworzone mutanty przeciwciała prezentowane są w monowalentny sposób przez cząstki faga włókienkowatego w postaci fuzji z produktem genu III M13, upakowanej w każdej cząstce.

Fagi eksprymujące różne mutanty można poddawać cyklicznie turom selekcji przez wiązanie, po którym następuje izolowanie i sekwencjonowanie tych mutantów, które wykazują wysokie powinowactwo. Metodę opisano także w opisie patentowym numer WO 92/09690, opublikowanym 11 czerwca 1992 r. Zmodyfikowaną procedurę, obejmującą prezentację puli na zasadzie powinowactwa opisano w Cunningham, B. C. i in., EMBO J. 13 (11), 2508-2515 (1994).

Metoda ta zapewnia sposób selekcjonowania nowych polipeptydów wiążących, obejmujący:

a) konstruowanie zdolnego do replikacji wektora ekspresyjnego zawierającego pierwszy gen, kodujący polipeptyd, drugi gen, kodujący co najmniej część naturalnego lub typu dzikiego białka kapsydu faga, gdzie geny pierwszy i drugi są heterologiczne oraz element regulujący transkrypcję, połączony w sposób umożliwiający działanie z genami pierwszym i drugim, w ten sposób tworząc fuzję genową, kodującą białko fuzyjne;

b) poddawanie wektora mutacjomw jednej I ubwięcej wybranychpozycjach w pi^r^^^y^m genie, w ten sposób tworząc rodzinę zbliżonych plazmidów;

c) transformowanie odpowiednich komórek gospodarza tymi plazmidami;

d) infekowanie stransformowanych komórek gospodarza fagiem wspomagającym, posiadającym gen kodujący białko kapsydu faga;

e) hodowanie stransformowanych, zainfekowanych komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do tworzenia zrekombinowanych cząstek fagemidowych, zawierających co najmniej część plazmidu i zdolnych do transformowania gospodarza, czyli w warunkach dobranych tak, aby nie więcej niż nieznaczna liczba cząstek fagemidowych prezentowała więcej niż jedną kopię białka fuzyjnego na powierzchni cząstki;

f) zejknięcie cząstek fagemidowych z cząsteczką docelową tak, aby co naamniej część cząstek fagemidowych wiązała się z cząsteczką docelową; oraz

g) wydzielanie cząstek fagemidowych, które wiążą się spośród tych, które nie ulegają wiązaniu.

Dogodnie, metoda obejmuje ponadto transformowanie odpowiednich komórek gospodarza zrekombinowanymi cząstkami fagemidowymi, które wiążą cząsteczkę docelową i powtarzanie etapów od d) do g) jeden lub więcej razy.

Alternatywnie, metoda dotyczy polipeptydów, które składają się z więcej niż jednej podjednostki, gdzie zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający element regulujący transkrypcję połączony w sposób umożliwiający działanie z DNA kodującym podjednostkę będącą przedmiotem zainteresowania poddaje się fuzji z białkiem kapsydu faga.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „fagowa biblioteka przeciwciał” odnosi się do biblioteki fagowej stosowanej do procesu dojrzewania na zasadzie powinowactwa opisanego powyżej oraz w Hawkins i in., J. Mol. Biol. 254: 889-896 (1992) i w Lowman i in., Biochemistry 30 (45): 10832-10838 (1991). Każda biblioteka zawiera region hiperzmienny (6-7 miejsc), dla którego tworzy się wszystkie możliwe podstawienia aminokwasowe. Tak utworzone mutanty przeciwciała prezentowane są w monowalentny sposób przez cząstki faga włókienkowatego w postaci fuzji z produktem genu III M13 upakowanych w każdej cząstce i ulegającej ekspresji na zewnątrz faga.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „temperatura pokojowa” lub „otoczenia” powinna wynosić 23°C-25°C.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „polipeptyd wiążący” oznacza jakikolwiek polipeptyd, który wiąże się z możliwym do wyselekcjonowania powinowactwem z cząsteczką docelową. Dogodnie, polipeptydem będzie białko, które najkorzystniej zawiera więcej niż około 100 reszt aminokwasowych. Zazwyczaj polipeptydem będzie hormon lub przeciwciało, bądź ich fragment.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „wysokie powinowactwo” oznacza stałą powinowactwa (Kd) < 10 M, a korzystnie < 10' M w warunkach fizjologicznych.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „cząsteczka docelowa” oznacza jakąkolwiek cząsteczkę, niekoniecznie białkową, dla której pożądane jest wytworzenie przeciwciała lub ligandu. Dogodnie jednakże, cząsteczką docelową będzie białko, a najdogodniej będzie ona antygenem. Jednakże, zakres tego terminu powinien w szczególności obejmować receptory, takie jak receptory hormonów.

PL 194 562 B1

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, cała numeracja reszt aminokwasowych immunoglobulin, włącznie z numeracją aminokwasów peptydów odpowiadających określonym częściom IgE, zmutowanych cząsteczek IgE oraz chimerycznych cząsteczek IgE, jaką przedstawiono w tym opisie, została przeprowadzona zgodnie z systemem numerowania reszt aminokwasowych immunoglobulin podanym w Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD 1987).

I. Sposób poprawiania powinowactwa do cząsteczek docelowych

A. Identyfikacja zdolnych do izomeryzacji reszt aspartylowych

W praktycznym stosowaniu niniejszego wynalazku, identyfikację zdolnych do izomeryzacji reszt aspartylowych wykazujących tendencję do izomeryzacji można przeprowadzić jakąkowiek techniką znaną specjalistom w tej dziedzinie. Na przykład, Cacia i in., Biochemistry 35, 1897-1903 (1996) opisują sposób, w którym skierowane przeciw IgE przeciw ciało E-25 (które zawiera reszty -Asp-Gly-) inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 21 dni. Identyfikację zizomeryzowanych -Asp-Gly- przeprowadzono przez analizę chromatograficzną i poprzez spektrometrię masową nie traktowanych i traktowanych proteazą fragmentów. Ze względu na to, że donoszono o występowaniu izomeryzacji reszt asparaginylowych (T. Geiger i S. Clarke, J. Biol. Chem. 262 (2), 785-794 (1987), niniejszy wynalazek można także korzystnie stosować w praktyce do systematycznego oceniania i ulepszania polipeptydów zawierających reszty asparaginylowe.

B. Selekcja zmienianych kolejno reszt, które poprawiają powinowactwo do cząsteczek docelowych

Dla specjalisty w tej dziedzinie dostępnych jest wiele technik, które umożliwiają optymalizację powinowactwa receptora. Zazwyczaj wszystkie te techniki obejmują podstawianie różnych reszt aminokwasowych w miejscu będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie analizę przez przeszukiwanie receptorowego powinowactwa zmutowanego polipeptydu. Techniką zalecaną do stosowania zgodnie z wynalazkiem jest dojrzewanie na zasadzie powinowactwa z zastosowaniem prezentacji przez fagi (Hawkins i in., J. Mol. Biol. 254: 869-896 (1992); Lowman i in., Biochemistry 3 (45): 10832-10838 (1991)). W skrócie, kilka miejsc regionu hiperzmniennego (np. 6-7 miejsc) poddaje się mutacjom w celu utworzenia wszystkich możliwych podstawień aminokwasowych w każdym z miejsc. Tak utworzone mutanty przeciwciała prezentowane są w monowalentny sposób przez cząstki faga włókienkowatego jako fuzje z produktem genu IIL M13 upakowane w każdej z cząstek. Fagi eksprymujące różne mutanty można cyklicznie poddawać turom selekcji przez wiązanie, a następnie izolować i sekwencjonować te mutanty, które wykazują najwyższe powinowactwo.

Metoda selekcjonowania nowych polipeptydów wiążących dogodnie wykorzystuje bibliotekę strukturalnie zbliżonych polipeptydów. Bibliotekę strukturalnie zbliżonych polipeptydów, poddanych fuzji z białkiem kapsydu faga, tworzy się przez mutagenezę i dogodnie pojedyncza kopia każdego ze zbliżonych polipeptydów jest prezentowana na powierzchni cząstki fagemidowej zawierającej DNA kodujący polipeptyd. Następnie te cząstki fagemidowe styka się z cząsteczką docelową i te cząstki, które posiadają najwyższe powinowactwa wobec cząsteczki docelowej wydziela się spośród tych o niższym powinowactwie. Polipeptydy wiążące z wysokim powinowactwem amplifikuje się następnie infekując gospodarza bakteryjnego i powtarza się etap wiązania współzawodniczego. Proces powtarza się do chwili otrzymania polipeptydów o pożądanym powinowactwie.

Alternatywnie, można również zastosować multiwalentnego faga (McCafferty i in., (1990) Nature 348: 552-554; Clackson i in., (1991) Nature 352, 624-628) do ekspresji losowych mutacji punktowych (utworzonych przez zastosowanie popełniającej błędy polimerazy DNA) w celu utworzenia biblioteki fragmentów przeciwciał na fagach, które można następnie przeszukiwać na zasadzie powinowactwa do antygenu. Hawkins i in., (1992) J. Mol. Biol. 254: 889-896.

Dogodnie, podczas procesu dojrzewania na zasadzie powinowactwa, zdolny do replikacji wektor ekspresyjny pozostaje pod silną kontrolą elementu regulującego transkrypcję, a warunki hodowli dobiera się tak, że liczba cząstek fagemidowych prezentujących więcej niż jedną kopię białka fuzyjnego jest mniejsza niż około 1%. Również dogodnie, liczba cząstek fegemidowych prezentujących więcej, niż jedną kopię białka fuzyjnego jest niższa niż 10% liczby cząstek fagemidowych prezentujących pojedynczą kopię białka fuzyjnego. Najdogodniej, liczba ta jest niższa niż 20%.

Zazwyczaj, zgodnie z wynalazkiem, wektor ekspresyjny będzie ponadto zawierał sekwencje sygnału sekrecji poddane fuzji z DNA kodującym każdą podjednostkę polipeptydu, a elementem regulującym transkrypcję będzie układ promotorowy. Dogodnie układy promotorowe wybiera się spośród promotorów LacZ, A_PL, TC, polimerazy T7, tryptofanowego i fosfatazy alkalicznej oraz ich kombinacji.

PL 194 562 B1

Zazwyczaj też, pierwszy gen kodował będzie białko ssacze, dogodnie białko będzie przeciwciałem skierowanym przeciw IgE. Przykłady dodatkowych przeciwciał podano w części II. A. Przygotowywanie przeciwciał, (vi) przeciwciała multispecyficzne (należy zauważyć jednakże, że przeciwciała nie muszą być multispecyficzne. Dodatkowe polipeptydy obejmują ludzki hormon wzrostu (hGH), N-metionylowany ludzki hormon wzrostu, bydlęcy hormon wzrostu, parathormon, tyroksynę, łańcuch A insuliny, łańcuch B insuliny, proinsulinę, łańcuch A relaksyny, łańcuch B relaksyny, prorelaksynę, hormony glikoproteinowe, takie jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon tyreotropowy (THS) i hormon luteinizujący, receptory hormonów glikoproteinowych, kalcytoninę, glukagon, czynnik VIII, płucny czynnik powierzchniowy, urokinazę, streptokinazę, ludzki tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA), bombezynę, czynnik IX, trombinę, hemopoetyczny czynnik wzrostu, czynnik narkizy nowotworów alfa i beta, enkefalinazę, albuminę surowicy ludzkiej, substancję hamującą przewody Mlillera, mysi peptyd związany z gonadotropiną, białka mikroorganizmów, takie jak betalaktamaza, białko czynnika tkankowego, inhibinę, aktywinę, naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu, receptory hormonów lub czynników wzrostu, integrynę, trombopoetynę, białko A lub D, czynniki reumatoidalne, czynniki wzrostu nerwów, takie jak NGF-β, płytkowy czynnik wzrostu, transformujące czynniki wzrostu (TGF), takie jak TGF alfa i TGF-beta, insulinopodobny czynnik wzrostu I i II, białka wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu, CD-4, DNazę, peptyd związany z latencją, erytropoetynę, czynniki osteoindukcyjne, interferony, takie jak interferon alfa, beta i gamma, czynniki stymulujące tworzenie kolonii (CSF), takie jak M-CSF, GM-CSF i G-CSF, interleukiny (II), takie jak IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, dysmutazę ponadtlenkową, czynnik przyspieszający rozkład, antygeny wirusowe, białka otoczki HIV, takie jak GP120, GP140, przedsionkowe peptydy natriuretyczne A, B lub C, immunoglobuliny oraz fragmenty któregokolwiek z wymienionych powyżej białek.

Dogodnie, pierwszy gen kodował będzie polipeptyd składający się z jednej lub więcej podjednostek, zawierający więcej niż około 100 reszt aminokwasowych i będzie ulegał ufałdowaniu z utworzeniem wielu sztywnych struktur drugorzędowych posiadających wiele reszt aminokwasowych zdolnych do oddziaływania z cząsteczką docelową. Dogodnie, pierwszy gen poddawać się będzie mutacjom kodonów odpowiadających tylko aminokwasom zdolnym do oddziaływania z cząsteczką docelową tak, że zachowywana będzie integralność sztywnych struktur drugorzędowych.

Zazwyczaj, zgodnie z wynalazkiem będzie się wykorzystywać faga wspomagającego wybranego spośród: M13KO7, M13R408, M13-VCS i Phi X174. Zalecanym fagiem wspomagającym jest M13KO7, a zalecanym białkiem kapsydu jest białko genu II kapsydu faga M13. Zalecanym gospodarzem jest E. coli i defektywne pod względem proteazy szczepy E. coli. Wykryto nowe warianty hGH wyselekcjonowane zgodnie z wynalazkiem. Skonstruowano fagemidowe wektory ekspresyjne, które zawierają możliwy do zahamowania kodon terminacji funkcjonalnie położony pomiędzy kwasami nukleinowymi kodującymi polipeptyd i białko kapsydu faga.

1. Wybór polipeptydów do prezentacji na powierzchni faga.

Powtarzane cykle selekcji „polipeptydu” stosuje się do selekcji pod kątem coraz wyższego powinowactwa wiązania poprzez fagemidową selekcję wielokrotnych zmian aminokwasowych, które selekcjonuje się przez wielokrotne cykle selekcji.

Po pierwszej turze selekcji fagemidowej, obejmującej pierwszy region selekcjonowanych aminokwasów w polipeptydzie liganda lub przeciwciała, przeprowadza się dodatkowe tury selekcji fagemidowej w innych regionach aminokwasów ligandu. Cykle selekcji fagemidowej powtarza się do uzyskania właściwości pożądanego powinowactwa. W celu zilustrowania tego procesu, w przykładzie 4 przeprowadzono prezentację przez fagi w cyklach prezentacja puli na zasadzie powinowactwa, kombinacje mutacji w różnych CDR itp.

Na podstawie powyższego będzie oczywiste, że reszty aminokwasowe, które tworzą domenę wiążącą polipeptydu, nie będą ze sobą kolejno połączone i mogą pozostawać w różnych podjednostkach polipeptydu. To znaczy, domena wiążąca zachowuje określoną strukturą drugorzędową w miejscu wiążącym, a nie strukturę piewszorzędową. A zatem, generalnie, mutacje będzie wprowadzać się do kodonów kodujących aminokwasy w określonej strukturze drugorzędowej w miejscach skierowanych na zewnątrz polipeptydu tak, aby mogły one potencjalnie oddziaływać z cząsteczką docelową.

Jednakże, nie jest wymagane, aby polipeptyd wybrany jako ligand lub przeciwciało dla cząsteczki docelowej wiązał się z tą cząsteczką normalnie. A zatem, na przykład, hormon glikoproteinowy, taki jak TSH, można wybrać jako ligand dla receptora FSH, a bibliotekę zmutowanych cząsteczek TSH wykorzystywać do wytworzenia nowych potencjalnych leków.

PL 194 562 B1

Zgodnie z wynalazkiem stosowany może być jakikolwiek polipeptyd, który wiąże się z cząsteczką docelową, w szczególności przeciwciała. Korzystnymi polipeptydami są te, które posiadają użyteczność farmaceutyczną. Przykładowe przeciwciała wymieniono w części II. A. Przygotowywanie przeciwciał (vi) przeciwciała multispecyficzne (należy zauważyć, że przeciwciała nie muszą być multispecyficzne). Bardziej zalecane polipeptydy obejmują hormon wzrostu, włącznie z ludzkim hormonem wzrostu, dez-N-metionylowanym ludzkim hormonem wzrostu i bydlęcym hormonem wzrostu, parathormon, hormon tyreotropowy; tyroksynę; łańcuch A insuliny; łańcuch B insuliny; prorelaksynę; mysi peptyd związany z gonadotropiną, białka mikroorganizmów, takie jak betalaktamaza, białko czynnika tkankowego, inhibinę, aktywinę, naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu, receptory hormonów lub czynników wzrostu, integrynę, trombopoetynę, białko A lub D; czynniki reumatoidalne, czynniki wzrostu nerwów, takie jak NGF-β, płytkopochodny czynnik wzrostu, fibroblastowy czynnik wzrostowy, taki jak aFGF i bFGF; nabłonkowy czynnik wzrostu; transformujący czynnik wzrostu (TGF), taki jak TGF alfa i TGF-beta, insulinopodobny czynnik wzrostu I i II, białka wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu, CD-4, DNazę, peptyd związany z latencją, erytropoetynę, czynniki osteoindukcyjne; takie jak na przykład część kapsydu HIV; immunoglobuliny oraz fragmenty któregokolwiek z wymienionych powyżej polipeptydów. Ponadto, jedną lub więcej wstępnie określonych reszt aminokwasowych polipeptydu można podstawić, wstawić lub wydeletować, na przykład w celu utworzenia produktów o ulepszonych właściwościach biologicznych. Ponadto, obejmują one fragmenty tych polipeptydów, szczególnie fragmenty aktywne biologicznie. Jeszcze bardziej zalecanymi polipeptydami zgodnie z wynalazkiem są ludzki hormon wzrostu i przedsionkowe natriuretyczne peptydy A, B i C, endotoksyna, subtylizyna, trypsyna i inne proteazy serynowe.

Jako hormony polipeptydowe mogą być stosowane polipeptydy, które można zdefiniować jakąkolwiek sekwencją aminokwasową wytwarzaną w pierwszej komórce, która wiąże się specyficznie z receptorem na komórce tego samego rodzaju (hormony autokrynne) lub komórce innego rodzaju (nie autokrynne) i wywołuje odpowiedź fizjologiczną charakterystyczną dla komórki posiadającej receptor. Do takich hormonów polipeptydowych należą cytokiny, limfokiny, hormony neurotroficzne i hormony polipeptydowe części gruczołowej przysadki mózgowej, takie jak czynnik wzrostu, prolaktyna, laktogen łożyskowy, hormon luteinizujący, hormon folikulotropowy, lipotropina β, lipotropina γ i endorfiny; podwzgórzowy czynnik hamujący uwalnianie hormonów, taki jak czynniki uwalniające kortykotropinę, hormon hamujący uwalnianie hormonu wzrostu; czynnik uwalniający hormon wzrostu oraz inne hormony polipeptydowe, takie jak przedsionkowe peptydy natriuretyczne A, B lub C.

2. Otrzymywanie pierwszego genu (genu 1), kodującego pożądany polipeptyd.

Gen kodujący pożądany polipeptyd (np. przeciwciało) można otrzymać metodami znanymi w nauce (patrz ogólnie, Sambrook i in., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1989)). Jeśli sekwencja genu jest znana, DNA kodujący gen można zsyntetyzować chemicznie (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963)). Jeśli sekwencja genu nie jest znana lub jeśli genu uprzednio nie wyizolowano, można go sklonować z biblioteki cDNA (wykonanej z RNA otrzymanego z odpowiedniej tkanki, w której pożądany gen ulega ekspresji), bądź z odpowiedniej biblioteki DNA genomowego. Następnie gen izoluje się stosując odpowiednią sondę. Dla bibliotek cDNA odpowiednie sondy obejmują przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne (pod warunkiem, że biblioteka cDNA jest biblioteką ekspresyjną), oligonukleotydy oraz komplementarne bądź homologiczne cDNA lub ich fragmenty. Sondy, które można zastosować do wyizolowania genu będącego przedmiotem zainteresowania z bibliotek DNA genomowego obejmują cDNA lub ich fragmenty, które kodują ten sam lub podobny gen, homologiczne genomowe DNA lub fragmenty DNA oraz oligonukleotydy. Przeszukiwanie biblioteki cDNA lub genomowej wybraną sondą prowadzi się stosując standardowe procedury, jak opisano w rozdziałach 12-12 w Sambrook i in., supra.

Alternatywnym sposobem wyizolowania genu kodującego polipeptyd (np. przeciwciało) będący przedmiotem zainteresowania jest zastosowanie techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), jak opisano w części 14 w Sambrook i in., supra. Sposób ten wymaga zastosowania oligonukleotydow, które będą hybrydyzować z genem będącym przedmiotem zainteresowania, a zatem przynajmniej część sekwencji DNAtego genu musi być znana w celu utworzenia oligonukleotydow.

Po wyizolowaniu genu, musi on zostać wstawiony do odpowiedniego wektora (dogodnie plazmidu) w celu amplifikacji, jak opisano ogólnie w Sambrook i in., supra.

3. Konstruowanie zdolnych do replikacji wektorów ekspresyjnych.

O ile dostępnych jest kilka typów wektorów i można je wykorzystać do praktycznego stosowania tego wynalazku, wektory plazmidowe są zalecanymi wektorami do stosowania w tym przypadku, poPL 194 562 B1 nieważ można je stosunkowo łatwo konstruować i łatwo amplifikować. Wektory plazmidowe generalnie zawierają szereg składników, włącznie z promotorem, sekwencjami sygnałowymi, genami selekcji fenotypowej, miejscami początku replikacji i innymi koniecznymi składnikami, które są znane specjalistom w tej dziedzinie.

Promotory najczęściej stosowane w wektorach prokariotycznych obejmują układ promotorowy lac Z, bakteriofagowy promotor APL (promotor wrażliwy na temperaturę, promotor tac (hybrydowy promotor trp-lac, który jest regulowany przez represor lac), promotor tryptofanowy i promotor bakteriofaga T7. Dla ogólnego opisu promotorów, patrz część 17 w Sambrook i in., supra. O ile są to najpowszechniej stosowane promotory, można również stosować inne odpowiednie promotory mikroorganizmów.

Promotorami zalecanymi do praktycznego wykorzystania w tym wynalazku są te, które można ściśle regulować tak, że można kontrolować ekspresję genu fuzyjnego. Jeśli ekspresja nie podlega kontroli, co prowadzi do występowania licznych kopii białka fuzyjnego na powierzchni fagemidu, to pojawia się wiele punktów wiązania fagemidu z cząsteczką docelową. Uważa się, że wynikiem tego wielopunktowego wiązania, nazywanego również „zachłannością” lub „efektem chelatacji” jest selekcjonowanie polipeptydów o fałszywie „wysokim powinowactwie”, powodowane przez prezentowanie wielu kopii białka fuzyjnego na cząstce fagemidowej rozmieszczonych bardzo blisko od siebie w sposób, który „chelatuje” cząsteczkę docelową. Gdy występuje wielopunktowe wiązanie, efektywna lub pozorna Kd może być tak wysoka, jak produkt pojedynczych Kd dla każdej kopii prezentowanego białka fuzyjnego.

Ścisła regulacja ekspresji białka fuzyjnego tak, że nie więcej niż nieznaczna liczba, tj. mniej niż około 1% cząstek fagemidowych zawiera wiele kopii białka fuzyjnego, rozwiązuje problem związany z „efektem cheletacji”, co umożliwia właściwą selekcję polipeptydów o wysokim powinowactwie. A zatem, zależnie od promotora, warunki hodowli gospodarza dobiera się tak, aby zapewnić maksymalizację liczby cząstek fagemidowych zawierających pojedynczą kopię białka fuzyjnego oraz minimalizację liczby cząstek fagemidowych zawierających wiele kopii białka fuzyjnego.

Zalecanymi promotorami stosowanymi w praktycznym wykorzystaniu tego wynalazku są promotor lac Z i promotor pho A, Promotor lac Z regulowany jest przez białko represorowe lac i, a zatem transkrypcję genu fuzyjnego można kontrolować przez manipulowanie poziomem białka represora lac. W celu zilustrowania, fagemid zawierający promotor lac Z namnaża się w szczepie komórek, które zawierają kopię genu represora lac i, represora promotora lac Z. Przykładowe szczepy komórek zawierających gen lac i obejmują JM 101 oraz XL-1 blue. Alternatywnie, komórki gospodarza można kotransfekować plazmidem zawierającym zarówno represor lac i, jak i promotor lac Z. Czasami obie powyższe techniki stosuje się jednocześnie, to jest cząstki fagemidowe zawierające promotor lac Z namnaża się w szczepach komórek zawierających gen lac i oraz szczepy komórek kotrarasfekuje się plazmidem zawierającym oba geny, lac Z i lac i.

Zazwyczaj, gdy ktoś chce uzyskać ekspresję genu, do powyższego stransformowanego gospodarza może dodać induktor, taki jak izopropylotiogalaktozyd (IPTG). W niniejszym wynalazku jednakże, etap ten pominięto w celu (a) minimalizacji ekspresji liczby fuzji genu III na fagemid oraz (b) zapobiegnięcia słabemu lub niewłaściwemu upakowywaniu fage-midów powodowanemu przez takie induktory, jak IPTG, nawet w niskich stężeniach. Zazwyczaj, gdy nie dodaje się żadnego induktora, liczba białek fuzyjnych na cząstkę fagemidową jest wyższa od 0,1 (liczba dużych białek fuzyjnych na liczbę cząstek fagemidowych). Najbardziej zalecanym promotorem stosowanym w praktycznym wykorzystaniu tego wynalazku jest pho A. Uważa się, że promotor ten regulowany jest przez poziom nieorganicznego fosforanu w komórce, gdzie fosforan działa zmniejszając aktywność promotora. A zatem, pozbawiając komórki fosforanu, można zwiększyć aktywność promotora. Pożądany wynik uzyskuje się przez hodowanie komórek w podłożu wzbogaconym w fosforan, takim jak 2YT lub LB, w ten sposób kontrolując ekspresję fuzji genu III.

Innym użytecznym składnikiem wektorów stosowanych w praktycznym wykorzystaniu tego wynalazku jest sekwencja sygnałowa. Sekwencja ta zazwyczaj zlokalizowana jest bezpośrednio na końcu 5' genu kodującego białko fuzyjne, a zatem będzie ulegała transkrypcji na końcu aminowym białka fuzyjnego. Jednakże, w niektórych przypadkach wykazano, że sekwencja sygnałowa zlokalizowana była w pozycjach innych niż koniec 5' genu kodującego białko mające ulegać sekrecji. Sekwencja ta kieruje białko, z którym jest połączona, w poprzek wewnętrznej błony komórki bakteryjnej. DNA kodujący sekwencję sygnałową można otrzymać w postaci fragmentu restrykcyjnego z jakiegokolwiek genu kodującego białko, które posiada sekwencję sygnałową. Odpowiednie prokariotyczne sekwencje sy20

PL 194 562 B1 gnałowe można otrzymać z genów kodujących, na przykład LamB lub OmpF (Wong i in., Gene 68:

193 (1983)), MalE, PhoA oraz innych genów. Zalecaną prokariotyczną sekwencją sygnałową do praktycznego stosowania w tym wynalazku jest sekwencja sygnałowa termostabilnej enterotoksyny II(STII)

E. coli, opisana przez Changa i in., Gene 55: 189 (1987).

Innym użytecznym składnikiem wektorów stosowanych w praktyce tego wynalazku są geny selekcji fenotypowej. Typowymi genami selekcji fenotypowej są te kodujące białka, które nadają komórkom gospodarza oporność na antybiotyki. Dla zilustrowania, łatwo jest wykorzystać w tym celu gen oporności na ampicylinę (amp) i gen oporności na tetracyklinę (tet).

Konstrukcje odpowiednich wektorów, zawierających wymienione powyżej elementy składowe, jak również gen kodujący opisany polipeptyd (gen 1), przygotowuje się stosując standardowe procedury rekombinacji DNA, jak opisano w Sambrook i in., supra. Wyizolowane fragmenty DNA przeznaczone do połączenia z utworzeniem wektora rozszczepia się, łączy się i liguje ze sobą w określonym porządku i orientacji, z utworzeniem pożądanego wektora.

DNA rozszczepia się stosując odpowiedni enzym lub enzymy restrykcyjne w odpowiednim buforze. Na ogół stosuje się 0,2-1 gg plazmidu lub fragmentów DNA z około 1-2 jednostkami odpowiedniego enzymu restrykcyjnego w objętości około 20 gl roztworu buforowego. Odpowiednie bufory, stężenia DNA oraz czasy i temperatury inkubacji podawane są przez producentów enzymów restrykcyjnych. Generalnie, odpowiednie są czasy inkubacji wynoszące około jednej lub dwóch godzin w temperaturze 37°C, chociaż kilka enzymów wymaga wyższych temperatur. Po inkubacji enzymy i inne zanieczyszczenia usuwa się przez ekstrakcję roztworu, w którym przeprowadzano trawienie mieszaniną fenolu i chloroformu, a DNA odzyskuje się z frakcji wodnej przez wytrącanie etanolem.

Dla ligacji fragmentów DNA ze sobą z utworzeniem funkcjonalnego wektora, końce fragmentów DNA muszą być kompatybilne ze sobą wzajemnie. W niektórych przypadkach końce będą kompatybilne bezpośrednio po trawieniu endonukleazą. Jednakże, może być konieczne najpierw przekształcenie lepkich końców, powstających zwykle w wyniku trawienia endonukleazami, w tępe końce, w celu uczynienia ich kompatybilnymi do ligacji. W celu uzyskania tępych końców, DNA traktuje się w odpowiednim buforze w ciągu co najmniej 15 minut w temperaturze 15°C 10 jednostkami fragmentu Klenowa polimerazy DNA I (Klenowem) w obecności czterech trifosforanów deoksynukleotydów. Następnie DNAoczyszcza się przez ekstrakcję fenolem-chloroformem i wytrącanie etanolem.

Rozszczepione fragmenty DNA można rozdzielać pod względem wielkości i selekcjonować stosując elektroforezę żelową DNA. DNA można poddawać elektroforezie albo w matriks agarozowym, albo poliakryloamidowym. Wybór matriks zależeć będzie od wielkości rozdzielanych fragmentów DNA. Po elektroforezie, DNA ekstrahuje się z matriks przez elektroelucję lub, jeśli jako matriks zastosowano agarozę o niskiej temperaturze topnienia, przez topienie agarozy i ekstrakcję z niej DNA, jak opisano w częściach 6.30-6.33 w Sambrook i in., supra.

Fragmenty DNA, które przeznaczone są do ligacji ze sobą (uprzednio strawione odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi tak, że końce każdego z fragmentów mających ulegać ligacji są kompatybilne), umieszcza się w roztworze w ilościach w przybliżeniu równomolowych. Roztwór zawierał będzie także ATP, bufor dla ligazy oraz ligazę, taką jak ligaza DNA T4, w ilości około 10 jednostek na 0,5 gg DNA. Jeśli fragment DNA ma zostać zligowany z wektorem, wektor najpierw przeprowadza się w postać liniową przez przecięcie odpowiednią(nimi) endonukleazą(ami) restrykcyjną(ymi). Liniowy wektor traktuje się następnie fosfatazą alkaliczną lub cielęcą fosfatazą jelitową. Traktowanie fosfatazą zapobiega samoligacji wektora podczas etapu ligacji.

Po ligacji, wektorem z wstawionym teraz obcym genem transformuje się odpowiednią komórkę gospodarza. Zalecanymi komórkami gospodarza dla celów tego wynalazku są prokarionty. Odpowiednie prokariotyczne komórki gospodarzy obejmują szczep M101 E. coli, szczep 294 E. coli K12 (numer ATCC 31 446), szczep W3110 E. coli (numer ATCC 27 325), E. coli X1776 (numer ATCC 31 537), E. coli XL-1 Blue (Stratagene) oraz E. coli B; jednakże, można również zastosować wiele innych szczepów E. coli, takich jak HB101, NM522, NM538, NM39 oraz wiele innych gatunków i rodzajów prokariontów. Poza wymienionymi powyżej szczepami E. coli, jako gospodarzy można również stosować laseczki, takie jak Bacillus subtilis, inne bakterie jelitowe, takie jak Salmonella typhimurium lub Serratia marcescans oraz różne gatunki Pseudomonas.

Transformację komórek prokariotycznych łatwo przeprowadza się stosując metodę z zastosowaniem chlorku wapniowego, jak opisano w części 1.82 w Sambrook i in., supra. Alternatywnie, do transformacji tych komórek można zastosować elektroporację (Neumann i in., EMBO J. D 841 (1982)). Stransformowane komórki selekcjonuje się poprzez wzrost w obecności antybiotyku, zazwyczaj tetraPL 194 562 B1 cykliny (tet) lub ampicyliny (amp), na które wykazują one oporność w wyniku obecności genów oporności tet i/lub amp w wektorze.

Po selekcji stransformowanych komórek, komórki te namnaża się w hodowli, a następnie izoluje się plazmidowy DNA (lub inny wektor ze wstawionym obcym genem). Plazmidowy DNA można wyizolować stosując metody znane w nauce. Dwiema odpowiednimi metodami są preparatyka DNA na małą skalę oraz preparatyka DNA na dużą skalę, jak opisano w częściach 1.25-1.33 w Sambrook i in., supra. Wyizolowany DNA można oczyszczać metodami znanymi w nauce, takimi jak ta opisana w części 1.40 w Sambrook i in., supra. Ten oczyszczony plazmidowy DNA analizuje się przez mapowanie restrykcyjne i/lub sekwencjonowanie DNA. Sekwencjonowanie DNA generalnie prowadzi się albo metodą Messinga i in., Nucleic Acid Res. 9: 309 (1981) lub metodą Maxama i in., Meth. Enzymol. 65: 499 (1980).

4. Fuzja genowa

Etap selekcji fagów na zasadzie powinowactwa według niniejszego wynalazku obejmuje wykonanie fuzji genu kodującego pożądany polipeptyd (genu 1) z drugim genem (genem 2) tak, że podczas transkrypcji tworzony jest gen fuzyjny. Genem 2 jest zazwyczaj gen białka kapsydu faga, a dogodnie jest to gen III białka kapsydu faga M13 lub jego fragment. Fuzję genów 1 i 2 można przeprowadzić przez wstawienie genu 2 w określone miejsce plazmidu, który zawiera gen 1, bądź przez wstawienie genu 1 w określone miejsce plazmidu, który zawiera gen 2.

Wstawianie genu do plazmidu wymaga, aby plazmid został przecięty w ściśle określonym położeniu, w którym gen ma zostać wstawiony. A zatem, w położeniu tym musi się znajdować miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną (dogodnie miejsce unikalne tak, aby plazmid podczas trawienia endonukleazą restrykcyjną przecinany był tylko w jednym miejscu). Plazmid trawi się, traktuje fosfatazą i oczyszcza, jak opisano powyżej. Następnie gen wstawia się do tego przeprowadzonego w postać liniową plazmidu przez ligację dwóch DNA ze sobą. Ligację można przeprowadzić, jeśli końce plazmidu są kompatybilne z końcami genu przeznaczonego do wstawienia. Jeśli zarówno do przecięcia plazmidu, jak i wyizolowania genu przeznaczonego do wstawienia zastosowano te same enzymy, DNA można bezpośrednio zligować ze sobą stosując ligazę, taką jak ligaza DNA bakteriofaga T4 i inkubując mieszaninę w temperaturze 16°C w ciągu 1-4 godzin w obecności ATP i buforu dla ligazy, jak opisano w części 1.68 w Sambrook i in., supra. Jeśli końce nie są kompatybilne, muszą one najpierw zostać przeprowadzone w tępe końce przez zastosowanie fragmentu Klenowa polimerazy DNA I lub polimerazy DNA bakteriofaga DNA T4, z których każda wymaga trifosforanów deoksyrybonukletydów do wypełnienia jednoniciowych lepkich końców strawionego DNA.

Alternatywnie, końce można przeprowadzić w tępe końce przez zastosowanie nukleazy, takiej jak nukleaza S1 lub nukleaza z fasoli złotej, z których obie działają obcinając lepkie końce pojedynczych nici DNA. Następnie DNA poddaje się ponownej ligacji, stosując ligazę, jak opisano powyżej. W niektórych przypadkach może być niemożliwe przeprowadzenie uzyskania tępych końców genu przeznaczonego do wstawienia, ponieważ została by zmieniona ramka odczytu regionu kodującego. W celu przezwyciężenia tego problemu można zastosować łączniki oligonukleotydowe. Łączniki służą jako most do łączenia plazmidu z genem przeznaczonym do wstawienia.

Łączniki te można sporządzić syntetycznie w postaci dwuniciowego lub jednoniciowego DNA, stosując standardowe metody. Łączniki posiadają jeden koniec kompatybilny z końcami genu przeznaczonego do wstawienia; łączniki najpierw liguje się z genem, stosując opisane powyżej metody ligacji.

Drugi koniec łączników projektuje się w taki sposób, aby był kompatybilny z plazmidem do ligacji. Podczas projektowania łączników należy zachować ostrożność, aby nie zniszczyć ramki odczytu genu przeznaczonego do wstawienia lub ramki odczytu genu zawartego w plazmidzie. W niektórych przypadkach konieczne może być zaprojektowanie łączników w taki sposób, aby częściowo kodowały aminokwas, bądź aby kodowały jeden lub więcej aminokwasów.

Pomiędzy genem 1 a genem 2 można wstawić DNA kodujący kodon terminacji. Takimi kodonami terminacji są UAG (amber), UAA (ocher) i UGA (opel), Microbiology, Davis i in., Harper & Row, Nowy Jork, 1980, str. 237, 245-47 i 274). Wynikiem ekspresji kodonu terminacji w komórce gospodarza typu dzikiego jest synteza produktu białkowego genu 1, nie połączonego z białkiem genu 2. Jednakże, wynikiem namnażania w supresorowej komórce gospodarza jest synteza wykrywalnych ilości białka fuzyjnego.

Takie supresorowe komórki gospodarza zawierają tRNA zmodyfikowany tak, że wstawia on aminokwas w pozycji kodonu terminacji mRNA, czego wynikiem staje się wytwarzanie wykrywalnych ilości białka fuzyjnego. Takie supresorowe komórki gospodarza są dobrze znane i opisane, np. supresorowy szczep E. coli (Bullock i in., BioTechnologies 5, 376-379 (1987)). Do umieszczenia takiego

PL 194 562 B1 kodonu terminacji w mRNA kodującym polipeptyd fuzyjny można zastosować jakąkolwiek dopuszczalną metodę.

Podlegający supresji kodon można wstawić pomiędzy pierwszym genem, kodującym polipeptyd a drugim genem, kodującym przynajmniej część białka kapsydu faga. Alternatywnie, podlegający supresji kodon terminacji można wstawić w miejscu przylegającym do miejsca fuzji przez zastąpienie tripletu ostatniego aminokwasu polipeptydu lub pierwszego aminokwasu białka kapsydu faga. Gdy fagemid zawierający podlegający supresji kodon namnaża się w supresorowej komórce, wynikiem jest wykrywalne wytwarzanie polipeptydu fuzyjnego, zawierającego polipeptyd i białko kapsydu. Gdy fagemid namnaża się w niesupresorowej komórce gospodarza, syntetyzowany jest polipeptyd, zasadniczo bez fuzji z białkiem kapsydu faga, z powodu terminacji przy wstawionym podlegającym supresji kodonie kodującym UAG, UAA lub UAG. W komórce niesupresorowej polipeptyd jest syntetyzowany i wydzielany z komórki gospodarza w wyniku nieobecności fuzyjnego białka kapsydu faga, które w innym przypadku zakotwiczają go w komórce gospodarza.

5. Zmiana (mutacja) genu 1 w wybranych pozycjach.

Gen 1, kodujący pożądany polipeptyd, można zmieniać przy jednym lub więcej wybranych kodonach. Jednakże, kodon odpowiadający zdolnej do izomeryzacji reszcie aspartylowej musi zostać zmieniony. Zmianę określa się jako podstawienie, delecję lub insercję jednego lub więcej kodonów w genie kodującym polipeptyd, czego wynikiem staje się zmiana sekwencji aminokwasowej polipeptydu w porównaniu z niezmienioną lub natywną sekwencją tego samego polipeptydu. Korzystnie, zmianami będą podstawienia co najmniej jednego aminokwasu jakimkolwiek innym aminokwasem w jednym lub więcej regionach cząsteczki. Zmiany można przeprowadzić różnymi metodami znanymi w nauce. Metody te obejmują, ale nie ograniczają się do mutagenezy za pośrednictwem oligonukleotydu oraz mutagenezy kasetkowej.

a. Mutageneza za pośrednictwem oligonukleotydu

Mutageneza za pośrednictwem oligonukleotydu jest zalecaną metodą przygotowywania wariantów genu 1 z podstawieniami, delecjami i insercjami. Technika ta jest dobrze znana w nauce, jak opisali Zoller i in., Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987). W skrócie, gen 1 zmienia się przez hybrydyzację oligonukleotydu kodującego pożądaną mutację z matrycą DNA, gdzie matrycą jest jednoniciowa postać plazmidu zawierającego niezmienioną lub natywną sekwencję DNA genu 1. Po hybrydyzacji stosuje się polimerazę DNA do zsyntetyzowania całej drugiej komplementarnej nici matrycy, która będzie zatem posiadać wprowadzony starter oligonukleotydowy i będzie kodować wybraną zmianę genu 1.

Generalnie, stosuje się oligonukleotydy o długości co najmniej 25 nukleotydów. Optymalny nukleotyd będzie posiadał od 12 do 15 nukleotydów, które są całkowicie komplementarne do matrycy po każdej stronie nukleotydu(ów) kodującego(ych) mutację. Zapewnia to właściwą hybrydyzację oligonukleotydu z jednoniciową cząsteczką DNA matrycy. Oligonukleotydy łatwo syntetyzuje się stosując techniki znane w nauce, takie jak ta opisana przez Crea i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA 75: 5765 (1978).

Matrycę DNA mogą tworzyć tylko te wektory, które albo pochodzą z wektorów bakteriofaga M13 (odpowiednie są powszechnie dostępne wektory M13mp18 i M13mp19), albo które zawierają jednoniciowe miejsce początku replikacji faga, jak opisali Viera i in., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987). A zatem, DNA, który ma być zmutowany, musi zostać wstawiony do jednego z tych wektorów w celu utworzenia jednoniciowej matrycy. Tworzenie jednoniciowej matrycy opisano w częściach 4.21-4.41 w Sambrook i in., supra.

W celu zmiany natywnej sekwencji DNA, oligonukleotyd hybrydyzuje się z jednoniciową matrycą w odpowiednich warunkach hybrydyzacji. Następnie dodaje się enzym polimeryzujący DNA, zazwyczaj fragment Klenowa polimerazy DNA I, w celu zsyntetyzowania komplementarnej nici matrycy z zastosowaniem oligonukleotydu jako startera syntezy. Ulega zatem utworzeniu cząsteczka heterodupleksu w taki sposób, że jedna nić DNA koduje zmutowaną postać genu 1, a druga nić (oryginalna matryca) koduje natywną, niezmienioną sekwencję genu 1. Tą cząsteczką heterodupleksu transformuje się następnie odpowiednią komórkę gospodarza, zazwyczaj prokarionta, takiego jak E. coli JM-101. Po namnożeniu komórek wysiewa się je na płytki agarozowe i przeszukuje stosując starter oligonukleotydowy wyznakowany promieniotwórcze ³²fosforanem w celu identyfikacji kolonii bakteryjnych, które zawierają zmutowany DNA.

Metodę opisaną bezpośrednio powyżej można zmodyfikować w taki sposób, aby ulegała utworzeniu cząsteczka heterodupleksu, w której obie nici plazmidu zawierają mutację(e). Modyfikacje są następujące.

PL 194 562 B1

Jednoniciowy nukleotyd hybrydyzuje się z jednoniciową matrycą, tak jak opisano powyżej. Mieszaninę trzech deoksyrybonukleotydów, deoksyryboadenozyny (dATP), deoksyryboguanozyny (dGTP) i deoksyrybotymidyny (dTTP) łączy się ze zmodyfikowaną tiodeoksycytozyną, nazwaną dCTP-(aS) (Amersham). Mieszaninę tą dodaje się do kompleksu matryca-oligonukleotyd. Po dodaniu do tej mieszaniny polimerazy DNA, utworzeniu ulega nić DNA identyczna z matrycą, z wyjątkiem zmutowanych zasad. Dodatkowo, ta nowa nić DNA zawierać będzie zamiast dCTP dCTP-(aS), która służy do jej ochrony przed trawieniem przez endonukleazy restrykcyjne. Po nacięciu nici matrycy w dwuniciowym heterodupleksie odpowiednim enzymem restrykcyjnym, nić matrycy można strawić nukleazą ExolII, bądź inną odpowiednią nukleazą, za regionem, który zawiera miejsce(a) przeznaczone do mutagenizacji. Reakcję tę następnie zatrzymuje się, w celu pozostawienia cząsteczki, która jest tylko częściowo jednoniciowa. Następnie tworzy się pełny, dwuniciowy homodupleks DNA, stosując polimerazę DNA w obecności wszystkich czterech trifosforanów deoksyrybonukleotydów, ATP i ligazy DNA. Tą cząsteczką homodupleksu można następnie stransformować odpowiednią komórkę gospodarza, takiego jak E. coli JM101, jak opisano powyżej.

Mutanty z podstawionym więcej niż jednym aminokwasem można tworzyć jedną z kilku metod. Jeśli aminokwasy położone są blisko siebie w łańcuchu polipeptydowym, można je poddawać mutacji jednocześnie, stosując jeden oligonukleotyd, który koduje wszystkie z pożądanych podstawień aminokwasowych. Jeśli, jednakże, aminokwasy położone są w pewnej odległości od siebie (oddzielone więcej niż około dziesięcioma aminokwasami), utworzenie pojedynczego oligonukleotydu, który koduje wszystkie pożądane zmiany jest trudniejsze. Zamiast tego, można wykorzystać jedną z dwóch alternatywnych metod.

W pierwszej metodzie, dla każdego z aminokwasów, który ma ulec podstawieniu, tworzy się oddzielny oligonukleotyd. Oligonukleotydy następnie poddaje się jednoczesnej hybrydyzacji z jednoniciowym DNA matrycy i druga nić, którą syntetyzuje się z matrycy, będzie kodować wszystkie z pożądanych podstawień aminokwasowych. Alternatywna metoda obejmuje dwie lub więcej tur mutagenezy dla utworzenia pożądanego mutanta. Pierwsza tura jest taka, jak opisano dla pojedynczych mutantów: DNA typu dzikiego stosuje się jako matrycę, oligonukleotyd kodujący pierwsze pożądane podstawienie(nia) aminokwasowe hybrydyzuje się z tą matrycą, a następnie utworzeniu ulega cząsteczka heterodupleksu DNA. W drugiej turze mutagenezy jako matrycę wykorzystuje się zmutowany DNA utworzony w pierwszej turze mutagenezy. A zatem, matryca ta już zawiera jedną lub więcej mutacji. Następnie z tą matrycą hybrydyzuje oligonukleotyd kodujący dodatkowe podstawienie(a) aminokwasowe, a uzyskana w wyniku nić DNA koduje mutacje zarówno z pierwszej, jak i drugiej tury mutagenezy. Uzyskany w wyniku DNA można zastosować jako matrycę w trzeciej turze mutagenezy i tak dalej.

b. Mutageneza kasetkowa

Metoda ta jest również zalecaną metodą przygotowywania wariantów genu 1 z podstawieniami, delecjami lub insercjami. Metoda ta oparta jest na tej opisanej przez Wellsa i in., Gene 34: 315 (1985). Materiałem wyjściowym jest plazmid (lub inny wektor) zawierający gen 1, czyli gen mający ulec mutacji. Identyfikuje się przeznaczony do mutowania kodon(y) w genie 1. Po każdej stronie zidentyfikowanego miejsca (miejsc) mutacji musi występować unikalne miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną. Jeśli takie miejsca restrykcyjne nie istnieją, można je utworzyć stosując opisaną powyżej metodę mutagenezy za pośrednictwem oligonukleotydu, w celu wprowadzenia ich w odpowiednich położeniach w genie 1. Po wprowadzeniu do plazmidu miejsc restrykcyjnych, plazmid przecina się w tych miejscach w celu przeprowadzenia go w postać liniową. Stosując standardowe procedury, syntetyzuje się dwuniciowy oligonukleotyd kodujący sekwencję DNA pomiędzy miejscami restrykcyjnymi, ale zawierający pożądaną(e) mutację(e). Dwie nici syntetyzuje się oddzielnie, a następnie hybrydyzuje ze sobą, stosując standardowe techniki. Ten dwuniciowy oligonukleotyd określa się jako kasetkę. Kasetkę tę projektuje się tak, aby posiadała końce 3' i 5' kompatybilne z końcami plazmidu przeprowadzonego w postać liniową tak, że można ją bezpośrednio ligować z plazmidem. Plazmid ten zawiera teraz zmutowaną sekwencję DNA genu 1.

6. Otrzymywanie DNA kodującego pożądane białko.

W alternatywnym rozwiązaniu, wynalazek ten obejmuje wytwarzanie pożądanego białka, zawierającego jedną lub więcej podjednostek. Każdą podjednostkę zazwyczaj koduje oddzielny gen. Każdy gen kodujący każdą z podjednostek można otrzymać metodami znanymi w nauce (patrz na przykład Część II). W niektórych przypadkach może być konieczne otrzymanie genu kodującego różne podjednostki z zastosowaniem oddzielnych technik wybranych spośród którychkolwiek z metod opisanych w Części II.

PL 194 562 B1

Jeśli konstruuje się zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, gdzie białko będące przedmiotem zainteresowania zawiera więcej niż jedną podjednostkę, wszystkie podjednostki mogą podlegać regulacji przez ten sam promotor, zazwyczaj zlokalizowany po stronie 5' DNA kodującego podjednostkę lub każda może podlegać regulacji przez ten sam promotor, zazwyczaj zlokalizowany po stronie 5' DNA kodującego podjednostki, bądź też każda może być regulowana przez oddzielny promotor zorientowany we właściwy sposób w wektorze tak, że każdy promotor jest połączony w sposób umożliwiający działanie z DNA, który w zamierzeniu ma regulować. Wybór promotorów przeprowadza się w sposób opisany w Części III powyżej.

Przy konstruowaniu zdolnego do replikacji wektora ekspresyjnego, zawierającego DNA kodujący będące przedmiotem zainteresowania białko posiadające wiele podjednostek, czytelnik może się zapoznać z fig. 11, na której przedstawiono, w celu zilustrowania, wektor kodujący wszystkie podjednostki fragmentu przeciwciała. Figura ta pokazuje, że ogólnie rzecz biorąc, jedna z podjednostek białka będącego przedmiotem zainteresowania będzie poddana fuzji z białkiem kapsydu faga, takim jak genu IIL M13. Ta fuzja genowa generalnie będzie zawierała swoją własną sekwencję sygnałową. Oddzielny gen koduje inną podjednostkę lub podjednostki i okazuje się, że każda podjednostka na ogół zawiera swoją własną sekwencję sygnałową. Fig. 11 pokazuje także, że pojedynczy promotor może regulować ekspresję obu podjednostek. Alternatywnie, każda podjednostka może być niezależnie regulowana przez różne promotory. Konstrukcję fuzyjną podjednostki białka będącego przedmiotem zainteresowania - białko kapsydu faga można przygotować w sposób opisany w Części IV powyżej.

Jeśli konstruuje się rodzinę wariantów białka wielopodjednostkowego, DNA kodujący każdą podjednostkę w wektorze można poddawać mutacjom w jednej lub więcej pozycjach w każdej podjednostce. Jeśli konstruuje się warianty wielopodjednostkowego przeciwciała, korzytsne miejsca mutagenezy odpowiadają kodonom kodującym reszty aminokwasowe zlokalizowane w regionach determinujących komplementarność (CDR) lekkiego łańcucha, ciężkiego łańcucha lub obu. CDR powszechnie określa się jako regiony hiperzmienne. Metody mutagenizowania DNA kodującego każdą podjednostkę białka będącego przedmiotem zainteresowania przeprowadza się zasadniczo jak opisano w Części V powyżej.

7. Przygotowywanie cząsteczki docelowej i wiązanie z fagemidern

Białka docelowe, takie jak receptory, można izolować ze źródeł naturalnych lub przygotowywać metodami rekombinacyjnymi, stosując procedury znane w nauce. W celu zilustrowania, receptory hormonów glikoproteinowych można przygotowywać techniką opisaną przez McFarlanda i in., Science 245: 494-499 (1989), nie glikozylowane postacie ulegające ekspresji w E. coli opisali Fuh i in., J. Biol. Chem. 265: 3111-31115 (1990). Inne receptory można przygotowywać standardowymi metodami.

Oczyszczone białko docelowe można połączyć z odpowiednim matriks, takim jak perełki agarozowe, perełki akryloamidowe, perełki szklane, celuloza, różne kopolimery akrylowe, żele metakrylanu hydroksyalkilowego, kopolimery poliakrylowe i polimetakrylowe, nylon, nośniki obojętne i jonowe oraz podobne. Połączenie białka docelowego z matriks można przeprowadzić metodami opisanymi w Methods in Enzymol. 44 (1976), bądź innymi sposobami znanymi w nauce.

Po połączeniu białka docelowego z matriks, immobilizowanej cząsteczce docelowej zapewnia się kontakt z biblioteką cząstek fagemidowych w warunkach odpowiednich do wiązania co najmniej części cząstek fagemidowych z immobilizowaną cząsteczką docelową. Zazwyczaj, warunki obejmujące pH, siłę jonową, temperaturę i podobne, naśladować będą warunki fizjologiczne.

Związane cząstki fagemidowe („cząstki wiążące”), posiadające wysokie powinowactwo wobec immobilizowanej cząsteczki docelowej, oddziela się od tych posiadających niskie powinowactwo (a zatem nie wiążących się z cząsteczką docelową) przez przemywanie. Cząstki wiążące można oddysocjowywać od immobilizowanej cząsteczki docelowej różnymi metodami. Metody te obejmują dysocjację przez współzawodnictwo przy zastosowaniu liganda typu dzikiego, zmianę pH i/lub siły jonowej oraz metody znane w nauce.

Odpowiednie komórki gospodarza infekuje się cząstkami wiążącymi i fagami wspomagającymi i komórki gospodarza hoduje się w warunkach odpwiednich do amplifikacji cząstek fagemidowych. Następnie cząstki fagemidowe zbiera się i proces selekcji powtarza jeden lub więcej razy, do wyselekcjonowania cząstek wiążących posiadających pożądane powinowactwo wobec cząsteczki docelowej.

Ewentualnie, bibliotekę cząstek fagemidowych można kolejno kontaktować z więcej niż jedną immobilizowaną cząsteczką docelową w celu poprawienia selektywności wobec określonej cząsteczki docelowej. Na przykład, częstym przypadkiem jest, że ligand, taki jak hGH, posiada więcej niż jeden naturalny receptor. W przypadku hGH, ligand hGH wiąże zarówno receptor hormonu wzrostu, jak

PL 194 562 B1 i receptor prolaktyny. Może być pożądane poprawienie selektywności hGH wobec receptora hormonu wzrostu w stosunku do receptora prolaktyny. Można to uzyskać najpierw kontaktując bibliotekę cząstek fagemidowych z immobilizowanym receptorem prolaktyny, a następnie kontaktując „cząstki wiążące” receptora prolaktyny o niskim powinowactwie lub cząstki niewiążące z immobilizowanym receptorem hormonu wzrostu i selekcjonowanie cząstek wiążących receptora hormonu wzrostu o wysokim powinowactwie. W tym przypadku, mutant hGH posiadający niższe powinowactwo wobec receptora prolaktyny powinien posiadać użyteczność terapeutyczną, nawet gdyby powinowactwo wobec receptora hormonu wzrostu było nieco niższe niż to hGH typu dzikiego. Taką samą strategię można wykorzystać do poprawy selektywności określonego hormonu lub białka wobec receptora odpowiedzialnego za jego funkcję podstawową, w stosunku do receptora odpowiedzialnego za jego usuwanie.

W innym rozwiązaniu tego wynalazku można uzyskać sekwencję aminokwasową będącą ulepszonym substratem. Sekwencje takie mogą być użyteczne do przygotowywania lepszych „miejsc przecinania” dla łączników białkowych, bądź lepszych substratów/inhibitorów proteaz. W rozwiązaniu tym nadającą się do immobilizacji cząsteczką (np. receptora hGH, biotyny-awidyny, bądź cząsteczkę zdolną do kowalencyjnego wiązania z matriks) poddaje się fuzji z genem III poprzez łącznik. Łącznik dogodnie będzie miał długość od 3 do 10 aminokwasów i będzie działał jako substrat proteazy. W opisany powyżej sposób skonstruuje się fagemid, w którym DNA kodujący region łącznika poddaje się losowym mutacjom w celu utworzenia losowej biblioteki cząstek fagemidowych o różnych sekwencjach aminokwasowych w miejscu połączenia. Bibliotekę cząstek fagemidowych immobilizuje się następnie na matriks i eksponuje na pożądaną proteazę. Cząstki fagemidowe, posiadające odpowiednie lub lepsze substratowe sekwencje aminokwasowe w liniowym dla pożądanej proteazy będą ulegały elucji jako pierwsze, tworząc wzbogaconą pulę cząstek fagemidowych kodujących odpowiednie łączniki. Te cząstki fagemidowe poddaje się następnie kilku kolejnym cyklom w celu utworzenia wzbogaconej puli cząstek kodujących sekwencje(ę) konsensowe(ą).

II. Tworzenie przeciwciał

Wyjściowe przeciwciało można przygotować stosując znane w nauce techniki przygotowywania takich przeciwciał. Przykładowe metody tworzenia przeciwciał opisano bardziej szczegółowo w poniższych częściach.

Przeciwciało może być skierowane przeciw antygenowi będącemu przedmiotem zainteresowania. Dogodnie, antygenem jest polipeptyd ważny biologicznie. Wynikiem podawania przeciwciała ssakowi cierpiącemu na chorobę lub zaburzenie może być korzyść terapeutyczna dla tego ssaka. Jednakże, bierze się także pod uwagę przeciwciała skierowane przeciw antygenom nie polipeptydowym (takim jak związane z nowotworem antygeny glikolipidowe; patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 091 178).

Jeśli antygen jest polipeptydem, może on być cząsteczką transbłonową (np. receptorem) lub ligandem, takim jak czynnik wzrostu. Przykładowe antygeny obejmują takie cząsteczki jak renina; hormon wzrostu, włącznie z ludzkim hormonem wzrostu i bydlęcym hormonem wzrostu; czynnikiem uwalniającym hormon wzrostu, parathormon, glukagon; czynniki krzepnięcia, takie jak białko C; przedsionkowy czynnik natriuretyczny; płucny czynnik powierzchniowy; aktywator plazminogenu, taki jak urokinaza moczu ludzkiego lub tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA); bombezyna; trombina; hemopoetyczny czynnik wzrostowy; czynnik nekrozy nowotworów alfa i beta; enkefalinaza; RANTES (regulowana przez aktywację chemokina eksprymowana i wydzielana przez normalne komórki T); ludzkie makrofagowe białko zapalne (MIP-1-alfa); albumina surowicy, taka jak albumina surowicy ludzkiej; substancję hamującą przewody Mullera; łańcuch A relaksyny; łańcuch B relaksyny; prorelaksyna; mysi peptyd związany z gonadotropiną; białko mikroorganizmu, takie jak beta-laktamaza; DNaza; IgE, antygen związany z cytotoksycznością limfocytów T (CTLA), taki jak CTLA-4; inhibina; aktywina; naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF); receptory hormonów lub czynników wzrostu; białko A lub D; czynniki reumatoidalne; czynnik neurotroficzny, taki jak pochodzący z kości czynnik neurotroficzny, neurotrofina 3, 4, 5 lub 6 (NT-3, NT-4, NT-5 lub NT-6), bądź czynnik wzrostu nerwów, taki jak NGF-β, płytkopochodny czynnik wzrostowy (PDGF), fibroblastowe czynniki wzrostowe, takie jak aFGF i bFGF; nabłonkowy czyn nik wzrostu (EGF); transformujący czynnik wzrostu (TGF), taki jak TGF-alfa i TGF-beta, włącznie z TGF-βΙ, TGF-βΣ, TGF-ββ, TGF^4 lub TGF-βδ; insulinopodobny czynnik wzrostu I i II (IGF-I i IGF-II), dez(1-3)-IGF-I (mózgowy IGF-I), białko wiążące insulinopochodny czynnik wzrostu; białka CD, takie jak CD3, CD4, CD8, CD19 i CD20; erytropoetyna; czynniki osteoindukcyjne; immunotoksyny; białko morfogenetyczne kości (BMP); interferon, taki jak interferon alfa, beta i gamma; czynniki stymulujące tworzenie kolonii (CSF), np. M-CSF, GM-CSF i G-CSF; interleukiny (IL),

PL 194 562 B1 np. IL-1 do IL-10; dysmutaza ponadtlenkowa, receptory komórek T; powierzchniowe białka błonowe;

receptory zasiedlania; adresyny; białka regulujące; integryny, takie jak CD11a, CD11b, CD11c, CD18 i ICAM, VLA-4 i VCAM; antygen związany z nowotworem, taki jak receptor HER2, HER3 lub HER4 oraz fragmenty któregokolwiek z wymienionych powyżej peptydów.

Zalecane cząsteczki docelowe dla przeciwciał obejmują białka CD, takie jak CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 i CD34; przedstawicieli rodziny receptorów ErbB, takich jak receptor EGF, receptor HER2, HER3 lub HER4; cząsteczki adhezji komórkowej, takie jak LFA-1, Mac12, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM i integryna αν/β3, obejmująca albo jej podjednostkę α, albo β (np. przeciwciała skierowane przeciw CD11a, CD18 lub CD11b); czynniki wzrostowe, takie jak VEGF; IgE; antygeny grupowe krwi; receptor f1k2/f1k3; receptor otyłości (OB); receptor mpl; CTLA-4; białko C itd. Szczególnie zalecaną cząsteczką docelową jest IgE.

Przeciwciało jest skierowane przeciw antygenowi pochodzącemu z pierwszego gatunku ssaka. Dogodnie, pierwszym gatunkiem ssaka jest człowiek. Jednakże, bierze się pod uwagę inne ssaki, takie jak zwierzęta hodowlane, z ogrodów zoologicznych lub domowe, np. jeśli zamierza się stosować przeciwciało do traktowania takich zwierząt. Antygen z pierwszego gatunku ssaka można wyizolować z jego źródła naturalnego w celu utworzenia skierowanego przeciw niemu przeciwciała. Jednakże, jak zauważono poniżej, komórki zawierające antygen można stosować jako immunogeny do przygotowywania przeciwciał. W innych rozwiązaniach, antygen wytwarza się na drodze rekombinacji lub stosuje się inne metody syntezy. Wybrane przeciwciało będzie normalnie posiadać wystarczająco silne powinowactwo wiązania antygenu. Na przykład, przeciwciało może wiązać antygen z pierwszego gatunku ssaka z wartością powinowactwa wiązania (Kd) nie wyższą niż około 1 x 10⁷ M, dogodnie nie wyższą niż około 1 x 10⁸, a najdogodniej nie wyższą niż około 1 x 10⁹ M). Powinowactwa można określić na przykład w oznaczeniu wysycania wiązania, enzymatycznym oznaczeniu immunosorpcyjnym (ELISA) i oznaczeniach współzawodnictwa (np. RIA).

Przeciwciało można również poddawać innym oznaczeniom aktywności biologicznej, np. w celu oceny jego skuteczności terapeutycznej. Takie oznaczenia są znane w nauce i zależą od docelowego antygenu oraz zamierzonego stosowania przeciwciała. Przykłady obejmują oznaczenie adhezji monowarstwy keratynocytów i oznaczenie odpowiedzi mieszanych limfocytów (MFR) dla CD11a (z których każde opisano w przykładzie poniżej), oznaczenie hamowania wzrostu nowotworu (jak opisano na przykład w opisie patentowym nr WO 89/06692), oznaczenia zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC) i zależnej od dopełniacza cytotoksyczności (CDC) (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 500 362) oraz oznaczenia aktywności agonistycznej lub hematopoezy (patrz opis patentowy nr WO 95/27062).

W celu przeszukania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z określonym epitopem na antygenie będącym przedmiotem zainteresowania (np. tych, które blokują wiązanie przeciwciała MHM24), można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, w celu określenia, czy przeciwciało wiąże się z epitopem będącym przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić mapowanie epitopów, np. w sposób opisany przez Champe i in., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995).

Następnie określa się specyficzność gatunkową przeciwciała. Powinowactwo wiązania przeciwciała z homologiem antygenu zastosowanego do wytworzenia antygenu (gdzie homolog pochodzi z „drugiego gatunku ssaka”) określa się stosując takie techniki, jak opisane powyżej. W zalecanych rozwiązaniach, drugim gatunkiem ssaka jest ssak nie będący człowiekiem, któremu przeciwciało będzie podawane w w badaniach przedklinicznych. Zgodnie z tym, drugim gatunkiem ssaka może być naczelny nie będący człowiekiem, taki jak rezus, makak jawajski, pawian, szympans i makak. W innych rozwiązaniach, drugim gatunkiem ssaka może być na przykład gryzoń, kot lub pies. Specyficzne gatunkowo przeciwciało będzie zazwyczaj posiadać powinowactwo wiązania z antygenem z drugiego gatunku ssaka nie będącego człowiekiem, które jest co najmniej około 50-krotnie lub co najmniej około 500-krotnie, lub co najmniej około 100-krotnie słabsze niż powinowactwo wiązania z antygenem z pierwszego gatunku ssaka. To powinowactwo wiązania będzie zazwyczaj takie, że specyficznego gatunkowo przeciwciała nie można skutecznie stosować do badań przedklinicznych z zastosowaniem drugiego gatunku ssaka.

Podczas gdy zalecanym to określania specyficzności gatunkowej (oraz oceny mutantów przeciwciał o ulepszonych właściwościach; patrz poniżej) jest określenie ilościowe powinowactwa wiązania przeciwciała, w innych rozwiązaniach wynalazku ocenia się, poza lub zamiast oznaczania powinowacPL 194 562 B1 twa, jedną lub więcej właściwości biologicznych przeciwciała specyficznego gatunkowo oraz mutanta przeciwciała. Przykładowe takie oznaczenia biologiczne opisano powyżej. Takie oznaczenia są szczególnie użyteczne, jeśli zapewniają one wskazanie co do terapeutycznej skuteczności przeciwciała. Zwykle, chociaż niekoniecznie, przeciwciała, które wykazują ulepszone właściwości w takich oznaczeniach, będą również posiadały wzmocnione powinowactwo wiązania. A zatem, w jednym rozwiązaniu wynalazku, gdzie wybranym oznaczeniem jest oznaczenie aktywności biologicznej inne niż oznaczenie powinowactwa wiązania, specyficzne gatunkowo przeciwciało będzie zazwyczaj wykazywać, przy zastosowaniu „materiału” (np. antygenu, komórki, tkanki, narządu lub całego zwierzęcia) pochodzącego z drugiego gatunku ssaka, „aktywność biologiczną”, która jest co najmniej około 50-krotnie lub około 500-krotnie, lub co najmniej 1000-krotnie mniej skuteczna niż jego aktywność biologiczna w odpowiadającym oznaczeniu przy zastosowaniu reagentów z pierwszego gatunku ssaka.

Specyficzne gatunkowo przeciwciało poddaje się następnie zmianom tak, aby utworzyć mutanta przeciwciała, który posiada silniejsze powinowactwo wiązania z antygenem z drugiego gatunku ssaka niż specyficzne gatunkowo przeciwciało.

Mutant przeciwciała dogodnie posiada powinowactwo wiązania z antygenem pochodzącym ze ssaka nie będącego człowiekiem, które jest co najmniej około 10-krotnie silniejsze, dogodnie co najmniej około 20-krotnie silniejsze, dogodniej co najmniej około 500-krotnie silniejsze, a niekiedy co najmniej około 100-krotnie lub 200-krotnie silniejsze niż powinowactwo wiązania specyficznego gatunkowo przeciwciała z antygenem.

Pożądane lub wymagane wzmocnienie powinowactwa wiązania zależeć będzie od początkowego powinowactwa wiązania przeciwciała specyficznego gatunkowo. Jednakże, zastosowane oznaczenie jest oznaczeniem aktywności biologicznej, mutant przeciwciała dogodnie posiada w wybranym oznaczeniu biologicznym aktywność biologiczną, która jest co najmniej około 100-krotnie lepsza, dogodnie co najmniej około 20-krotnie lepsza, dogodniej co najmniej około 50-krotnie lepsza, a niekiedy co najmniej około 100-krotnie lub 200-krotnie lepsza niż aktywność biologiczna specyficznego gatunkowo przeciwciała w tym oznaczeniu.

W celu utworzenia mutanta przeciwciała, do przeciwciała specyficznego gatunkowo można wprowadzić jedną lub więcej zmian aminokwasowych (np. podstawień reszt regionu zrębu, których wynikiem jest poprawienie powinowactwa wiązania mutanta przeciwciała z antygenem z drugiego gatunku ssaka. Przykłady reszt regionu zrębu, które można modyfikować obejmują te, które bezpośrednio niekowalencyjnie wiążą antygen (Amit i in., Science 233: 747-753 (1986); oddziałują z/wpływają na konformację CDR (Chothia i in., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)) i/lub uczestniczą w tworzeniu granicy VL-VH (opis patentowy numer EP 239 400 B1).

W niektórych rozwiązaniach, wynikiem modyfikacji jednej lub więcej takich reszt regionu zrębu jest wzmocnienie powinowactwa wiązania przeciwciała z anygenem z drugiego gatunku ssaka. Na przykład, w tym rozwiązaniu wynalazku można zmienić od około jednej, do około pięciu reszt zrębu. Niekiedy może to okazać się wystarczające do uzyskania mutanta przeciwciała odpowiedniego do stosowania w próbach przedklinicznych, nawet jeśli nie zmieniono żadnej z reszt regionu hiperzrmiennego. Zazwyczaj jednakże, mutant przeciwciała będzie zawierać dodatkowe zmiany w regionie hiperzmiennym.

Reszty regionu hiperzmiennego, które się zmienia, można zmieniać losowo, szczególnie jeśli początkowe powinowactwo wiązania specyficznego gatunkowo przeciwciała z antygenem z drugiego gatunku ssaka jest takie, że losowo wytwarzane mutanty przeciwciała można łatwo przeszukiwać.

Techniki wytwarzania przeciwciał, które mogą być specyficzne gatunkowo i dlatego wymagają modyfikowania zgodnie z opracowanymi w niniejszym opisie technikami, które są następujące.

A. Przygotowywanie przeciwciał (i) Przygotowywanie antygenów

Jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał można stosować rozpuszczalne antygeny lub ich fragmenty, ewentualnie skoniugowane z innymi cząsteczkami. W przypadku cząsteczek transbłonowych, takich jak receptory, jako immunogen można stosować ich fragmenty (np. zewnątrzkomórkową domenę receptora).

Alternatywnie, jako immunogen można zastosować komórki, w których zachodzi ekspresja cząsteczki transbłonowej. Takie komórki mogą pochodzić ze źródła naturalnego (np. linii komórek rakowych) lub mogą być komórkami, które stransformowano technikami rekombinacji tak, aby zachodziła w nich ekspresja cząsteczki transblonowej. Inne antygeny i ich postacie użyteczne do przygotowywania przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.

PL 194 562 B1 (ii) Przeciwciała poliklonalne

Przeciwciała poliklonalne dogodnie wywołuje się u innych niż człowiek ssaków przez wielokrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) iniekcje odpowiedniego antygenu i adiuwantu. Użyteczne może być skoniugowanie odpowiedniego antygenu z białkiem, które jest immunogenne dla immunizowanego gatunku, np. hemocyjaniną skałoczepa, albuminą surowicy, tyroglobuliną bydlęcą lub sojowym inhibitorem trypsyny z zastosowaniem czynnika bifunkcjonalnego lub przeprowadzającego w pochodne, na przykład estru maleimidobenzoilowego sulfosukcynimidu (koniugacja poprzez reszty cysteiny), N-hydroksysukcynimidu (poprzez reszty lizyny), glutaraldehydu, bezwodnika bursztynowego, chlorku tionylu lub R¹N=C=CR, gdzie R i R¹ są różnymi grupami alkilowymi.

Zwierzęta immunizuje się antygenem, immunogennymi koniugatami lub pochodnymi przez połączenie, np. 100 pg lub 5 pg białka, lub koniugatu (odpowiednio dla królików i myszy) z 3 objętościami kompletnego adiuwanta Freunda i wstrzykiwanie roztworu śródskórnie w wielu miejscach. Po miesiącu zwierzętom podaje się dawkę przypominającą wynoszącą od 1/5 do 1/10 pierwotnej ilości peptydu lub koniugatu w kompletnym adiuwancie Freunda przez podskórną iniekcję w wielu miejscach. Po od siedmiu do 14 dniach zwierzętom pobiera się krew i oznacza się miano przeciwciał w surowicy. Zwierzętom podaje się dawki przypominające dokąd miano nie osiągnie stałego poziomu. Dogodnie, zwierzęciu podaje się dawki przypominające koniugatu tego samego antygenu, ale skoniugowanego z innym białkiem i/lub innym odczynnikiem sieciującym. Koniugaty można również przygotowywać w białkach fuzyjnych w hodowlach zrekombinowanych komórek. Do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej korzystnie stosuje się czynniki precypitujące, takie jak ałun.

Wybrane przeciwciało ssacze będzie zazwyczaj posiadać dostatecznie silne powinowactwo wiązania z antygenem. Na przykład, przeciwciało może wiązać antygen ludzkiej IgE z wartością powinowactwa (Kd) nie wyższą niż około 1 x 10⁷ M, dogodnie nie wyższą niż około 1 x 10⁸, a najdogodniej nie wyższą niż około 1 x 10⁹ M. Powinowactwa przeciwciał można określać w oznaczeniu wysycania wiązania, enzymatycznym oznaczeniu immunosorpcyjnym (ELISA) lub oznaczeniach współzawodnictwa (np. oznaczeniach radioimmunologicznych).

W celu przeszukania pod kątem przeciwciał skierowanych przeciw ludzkiej IgE, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie wiązania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, w celu określenia, czy zachodzi wiązanie, można przeprowadzić mapowanie epitopów, np. w sposób opisany przez Champe i in., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995).

Podczas gdy zalecanym sposobem określania skuteczności polipeptydu lub przeciwciała jest ilościowe określenie powinowactwa wiązania przeciwciała, w innych rozwiązaniach wynalazku ocenia się, poza lub zamiast oznaczania powinowactwa, jedną lub więcej właściwości biologicznych. Takie oznaczenia są szczególnie użyteczne, jeśli zapewniają one wskazanie co do terapeutycznej skuteczności przeciwciała. Zwykle, chociaż niekoniecznie, przeciwciała, które wykazują ulepszone właściwości w takich oznaczeniach, będą również posiadały wzmocnione powinowactwo wiązania.

(iii) Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne są przeciwciałami, które rozpoznają pojedyncze miejsce antygenowe. Ich jednolita specyficzność czyni przeciwciała monoklonalne znacznie bardziej użytecznymi od przeciwciał poliklonalnych, które zazwyczaj zawierają przeciwciała rozpoznające wiele z różnych miejsc antygenowych.

Przeciwciała monoklonalne można przygotowywać stosując metodę z wykorzystaniem hybrydom, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i in., Nature, 256: 495 (1975), bądź można je przygotowywać metodami rekombinacji DNA (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567).

W metodzie z wykorzystaniem hybrydom, mysz lub innego odpowiedniego gospodarza zwierzęcego, takiego jak chomik lub makak, immunizuje się w opisany tu powyżej sposób, w celu wywołania limfocytów, które wytwarzają lub są zdolne do wytwarzania przeciwciał, które będą specyficznie wiązać się z białkiem zastosowanym do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Następnie limfocyty poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka stosując odpowiedni czynnik wspomagający fuzję, taki jak glikol polietylenowy, tworząc komórki hybrydom (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, str. 590-103 (Academic Press, 1986)).

Tak przygotowane komórki hybrydom wysiewa się i hoduje w odpowiednim podłożu hodowlanym, które dogodnie zawiera jedną lub więcej substancji hamujących wzrost lub przeżywanie nie tworzących fuzji, macierzystych komórek szpiczaka. Na przykład, jeśli macierzyste komórki szpiczaka pozbawione są enzymu fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (HGPRT lub HPRT),

PL 194 562 B1 podłoże hodowlane dla hybrydom zazwyczaj będzie zawierać hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (podłoże HAT), czyli substancje, które zapobiegają wzrostowi komórek defektywnych pod względem

HGPRT.

Zalecanymi komórkami szpiczaka są te, które z wysoką wydajnością ulegają fuzji, utrzumują stabilne wytwarzanie na wysokim poziomie przeciwciała przez wyselekcjonowane komórki wytwarzające przeciwciała i są wrażliwe na podłoże, takie jak podłoże HAT. Spośród nich, zalecanymi liniami komórek szpiczaka są mysie linie szpiczaka, takie jak te pochodzące od mysich nowotworów MOPC-21 i MPC-11, dostępnych z Salk Lnstitute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornia, USA oraz komórek SP-2 lub X63-AgS-653, dostępnych z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Do wytwarzania ludzkich przeciwciał mono-klonalnych opisano także linie komórek szpiczaka ludzkiego i heteroszpiczaka mysio-ludzkiego (Kozbar, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur i in., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1987)).

Podłoże hodowlane, w którym hoduje się komórki hybrydom, oznacza się pod kątem wytwarzania przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw antygenowi. Dogodnie, specyficzność wiązania przeciwciał monoklonalnych wytworzonych przez komórki hybrydom określa się przez immunoprecypitację lub w oznaczeniu wiązania in vitro, takim jak oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) lub enzymatyczne oznaczenie immunosorpcyjne (ELISA).

Po zidentyfikowaniu komórek hybrydom, które wytwarzają przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klony można zsubklonować poprzez procedury granicznych rozcieńczeń i hodować standardowymi metodami (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, str. 59-103, Academic Press, 1986)). Odpowiednie podłoża hodowlane do tego celu obejmują, na przykład, podłoże D-MEM lub RPMI-1640. Ponadto, komórki hybrydom można namnażać in vivo u zwierzęcia w postaci nowotworu wysiękowego.

Przeciwciała monoklonalne wydzielane przez subklony odpowiednio wydziela się z podłoża hodowlanego, płynu wysiękowego lub surowicy konwencjonalnymi procedurami oczyszczania immunoglobulin, takimi jak na przykład stosowanie białka A-Sepharose, chromatografia na hydroksyloapatycie, elektroforeza żelowa, dializa lub chromatografia powinowactwa.

DNA kodujący przeciwciała monoklonalne łatwo izoluje się i sekwencjonuje stosując konwencjonalne procedury (np. przez zastosowanie oligonukleotydowych sond, które są zdolne do specyficznego wiązania z genami kodującymi łańcuchy lekki i ciężki przeciwciał monoklonalnych). Komórki hybrydom służą jako zalecane źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu, DNA można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, które następnie przenosi się do komórek gospodarzy, takich jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które inaczej nie wytwarzają białka immunoglobuliny, w celu uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w zrekombinowanych komórkach gospodarza. Rekombinacyjne wytwarzanie przeciwciał zostanie opisane bardziej szczegółowo poniżej.

W dalszym rozwiązaniu, przeciwciała lub fragmenty przeciwciał można izolować z fagowych bibliotek przeciwciał utworzonych z zastosowaniem technik opisanych w McCafferty i in., Nature 348: 552-554 (1990). Clackson i in., Nature 352: 624-628 (1991) oraz Marks i in., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) opisują izolowanie odpowiednio przeciwciał mysich i ludzkich, z zastosowaniem bibliotek fagowych. Kolejne publikacje opisują wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (w zakresie nM) przez przetasowanie łańcuchów (Marks i in., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)), jak również kombinatoryczną infekcję i rekombinację in vivo jako strategię konstruowania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i in., Nuc. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993)). A zatem, techniki te są alternatywami tradycyjnych technik otrzymywania przeciwciał monoklonalnych przy zastosowaniu hybrydom do izolowania przeciwciał monoklonalnych.

DNA można również modyfikować, na przykład przez podstawianie sekwencji kodującej stałe domeny ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 816 567; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851 (1984)) lub przez kowalencyjne łączenie z polipeptydem immunoglobuliny.

Zazwyczaj, takie nieimmunoglobulinowe polipeptydy podstawia się w miejsce domen stałych przeciwciała lub podstawia się je w miejsce domen zmiennych jednego łączącego się z antygenem miejsca przeciwciała, w celu utworżenia chimerycznego przeciwciała biwalentnego, zawierającego jedno miejsce łączenia się z antygenem posiadające specyficzność wobec antygenu oraz drugie miejsce łączenia się z antygenem posiadające specyficzność wobec innego antygenu.

PL 194 562 B1 (iv) Tworzenie zmutowanych przeciwciał

Po zidentyfikowaniu i wyizolowaniu specyficznego gatunkowo przeciwciała, często użyteczne jest ono do tworzenia wariantu lub mutanta przeciwciała, w którym jedną lub więcej reszt aminokwasowych zmieniono w jednym lub więcej z hiperzmiennych regionów ssaczego przeciwciała. Alternatywnie lub ponadto, do przeciwciała ssaka można wprowadzić jedną lub więcej zmian (np. podstawień) reszt zrębu, jeśli ich wynikiem jest poprawienie powinowactwa wiązania mutanta przeciwciała z ludzką IgE. Przykłady reszt regionu zrębu, które można modyfikować obejmują te, które bezpośrednio niekowalencyjnie wiążą antygen (Amit i in., Science 233: 747-753 (1986); oddziałują z/wpływają na konformację CDR (Chothia i in., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)) i/lub uczestniczą w tworzeniu granicy VL-VH (opis patentowy numer EP 239 400 B1).

W niektórych rozwiązaniach, wynikiem modyfikacji jednej lub więcej takich reszt regionu zrębu jest wzmocnienie powinowactwa wiązania przeciwciała z anygenem człowieka. Na przykład, w tym rozwiązaniu wynalazku można zmienić od około jednej do około pięciu reszt zrębu.

Niekiedy może to okazać się wystarczające do uzyskania mutanta przeciwciała odpowiedniego do stosowania w próbach przedklinicznych, nawet jeśli nie zmieniono żadnej z reszt regionu hiperzmiennego. Zazwyczaj jednakże, mutant przeciwciała będzie zawierać dodatkową(e) zmianę(y) w regionie hiperzmiennym.

Reszty regionu hiperzmiennego, które się zmnienia, można zmieniać losowo, szczególnie jeśli początkowe powinowactwo wiązania specyficznego gatunkowo przeciwciała jest takie, że losowo wytwarzane mutanty przeciwciała można łatwo przeszukiwać.

Jedna z użytecznych procedur tworzenia mutantów przeciwciał jest znana jako „mutageneza przez skanowanie alaninowe” (Cunningham, B.C. i Wells, J. A. Science 244: 1081-10S5 (1989); Cunningham, B. C. i Wells, J. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 6434-6431 (1991)). Zgodnie z wynalazkiem, jedną lub więcej z reszt regionu hiperzmiennego można zastąpić resztą(ami) alaniny lub polialaniny w celu wpłynięcia na oddziaływania aminokwasów z antygenem z drugiego gatunku ssaka. Tę resztę(y) regionu hiperzmiennego, która wykazuje(ą) funkcjonalną wrażliwość na podstawienia, następnie analizuje się szczegółowo się przez wprowadzanie dalszych lub innych mutacji w lub dla miejsc podstawienia.

A zatem, jeśli miejsce wprowadzenia zróżnicowania sekwencji aminokwasowej jest wstępnie określone, nie ma potrzeby wstępnego określania natury mutacji per se. Utworzone w ten sposób mutanty alaninowe przeszukuje się pod kątem ich aktywności biologicznej, jak opisano w niniejszym opisie. Można dokonywać podobnych podstawień innymi aminokwasami, zależnie od pożądanej właściwości analizowanej przez skanowanie reszt reszt.

Zgodnie z wynalazkiem wykorzystać można także bardziej systematyczny sposób identyfikowania reszt aminokwasowych do modyfikowania. Według tego sposobu, identyfikuje się reszty regionu hiperzmiennego przeciwciała specyficznego gatunkowo, które uczestniczą w wiązaniu antygenu z pierwszego gatunku ssaka oraz te reszty regionu hiperzmiennego, które uczestniczą w wiązaniu homologu tego antygenu z drugiego gatunku ssaka.

Dla uzyskania tego, można przeprowadzić skanowanie alaninowe reszt regionu hiperzmiennego przeciwciała specyficznego gatunkowo, z testowaniem każdego mutanta alaninowego pod kątem wiązania z antygenami z pierwszego i drugiego gatunku ssaka.

W ten sposób identyfikuje się reszty regionu hiperzmiennego uczestniczące w wiązaniu antygenu z pierwszego gatunku ssaka (np. człowieka) i te uczestniczące w wiązaniu homologu antygenu z drugiego gatunku ssaka (np. innego niż człowiek).

Dogodnie, jako kandydatów do modyfikowania wybiera się tę resztę(y), która w znaczący sposób uczestniczy w wiązaniu antygenu z drugiego gatunku ssaka (np. ssaka innego niż człowiek), ale nie antygenu z pierwszego gatunku ssaka (np. człowieka).

W innym rozwiązaniu, do modyfikowania wybiera się tę resztę(y), która w znaczący sposób uczestniczy w wiązaniu antygenu z zarówno pierwszego, jak i drugiego gatunku ssaka.

W jeszcze dalszym, ale mniej zalecanym rozwiązaniu, do modyfikowania wybiera się te reszty, które uczestniczą w wiązaniu antygenu ludzkiej IgE, ale nie homologicznej IgE ssaka (nie człowieka). Taka modyfikacja może obejmować delecję reszty lub insercję jednej lub więcej reszt sąsiadujących z resztą będącą przedmiotem zainteresowania. Jednakże, zazwyczaj modyfikacja obejmuje podstawienie reszty innym aminokwasem.

Zwykle, można rozpocząć od podstawienia konserwatywnego, takiego jak te przedstawione w tabeli A poniżej, pod nagłówkiem „zalecane podstawienia”. Jeśli wynikiem takiego podstawienia jest

PL 194 562 B1 zmiana aktywności biologicznej (np. powinowactwa wiązania), wprowadza się bardziej zasadnicze zmiany, nazwane „przykładowe podstawienia” w tabeli A lub dalej opisane poniżej w odniesieniu do klas aminokwasów, i przeszukuje produkty.

Ta bel a A

Konserwatywne podstawienia reszt aminokwasowych

Reszta oryginalna	Przykładowe podstawienia	Zalecane podstawienia	Kodony DNA
Ala (A)	val, leu, ile	val	GCA, GCC, GCG, GCU
Arg (R)	lys, gin, asn	lys	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
Asn (N)	gin, his, lys, arg	gm	AAC, AAU
Asp(D)	gb	gb	GAC, GAU
Cys(C)	ser	ser	UGC, UGU
Gin (Q)	asn	asn	CAA, CAG
Glu (E)	asp	asp	GAA, GAG
Gly (G)	pro, ala	ala	GGA, GGC, GGG, GGU
His (H)	asn, gin, lys, arg	arg	CAC, CAU
Lle (L)	leu, val, met, ala, phe, norleucyna	leu	AUA, AUC, AUU
Leu (L)	norleucyna, ile, val, met, ala, phe	ile	UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
Lys (K)	arg, gin, asn	arg	AAA, AAG
Met (M)	leu, phe, ile	leu	AUG
Phe (F)	leu, val, ile, ala, tyr	leu	UUC, UUU
Pro (P)	ala	ala	CCA, CCC, CCG, CCU
Ser (S)	thr	thr	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
Thr (T)	ser	ser	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
Trp (W)	tyr, phe	tyr	UGG
Tyr (Y)	trp, phe, thr, ser	phe	UAC, UAU
Val (V)	ile, leu, met, phe, ala, norleucyna	leu	GUA, GUC, GUG, GUU

Jeszcze bardziej zasadniczych modyfikacji właściwości biologicznych przeciwciał dokonuje się przez wybór podstawień, które znacząco różnią się pod względem swojego wpływu na utrzymywanie (a) struktury szkieletu polipeptydowego w regionie podstawienia, na przykład jako konformacji struktury β lub helikalnej; (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym, bądź (c) wielkości łańcucha bocznego. Reszty zazwyczaj występujące podzielono na grupy w oparciu o wspólne właściwości łańcuchów bocznych:

(1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile;

(2) obojętne hydrofilowe: cys, ser, thr, asn, gin;

(3) kwaśne: asp, glu;

(4) zasadowe: his, lys, arg;

(5) reszty wpływające na orientację łańcucha: gly, pro; oraz (6) aromatyczne: trp, tyr, phe.

Podstawienia niekonserwatywne będą powodować wymianę przedstawiciela jednej z tych klas na przedstawiciela innej klasy.

Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące mutanty sekwencji aminokwasowych przygotowuje się różnymi metodami znanymi w nauce. Metody te obejmują, ale nie ograniczają się do mutagenezy za pośrednictwem oligonukleotydów (lub ukierunkowanej), mutagenezy przez PCR i mutagenezy ka32

PL 194 562 B1 setkowej wcześniej przygotowanej zmutowanej lub niezmutowanej wersji przeciwciała. Zalecaną metodą przygotowywania mutantów jest ukierunkowana mutageneza (patrz Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 82: 488 (1985)).

W niektórych rozwiązaniach, mutant przeciwciała będzie posiadał podstawioną tylko pojedynczą resztę regionu hiperzmiennego, np. od około dwóch do około piętnastu podstawień w regionie hiperzmiennym.

Zazwyczaj, mutant przeciwciała o ulepszonych właściwościach biologicznych będzie posiadał sekwencję arninokwasową wykazującą co najmniej 75% identyczności lub podobieństwa sekwencji aminokwasowej do sekwencji aminokwasowej domeny zmiennej albo ciężkiego, albo lekkiego łańcucha ssaczego przeciwciała skierowanego przeciw IgE, dogodniej co najmniej 80%, dogodniej co najmniej 85%, jeszcze dogodniej co najmniej 90%, a najdogodniej co najmniej 95%. Identyczność lub podobieństwo w odniesieniu do sekwencji definiuje się w niniejszym opisie jako procent reszt aminokwasowych w rozpatrywanej sekwencji, które są identyczne (tj. są takimi samymi resztami) lub podobne (tj. są resztami aminokwasowymi z tej samej grupy, w oparciu o wspólne właściwości łańcuchów bocznych, supra) do reszt przeciwciała specyficznego gatunkowo, po przyporządkowaniu sekwencji i, jeśli jest to konieczne, wprowadzeniu przerw, dla uzyskania maksymalnej procentowej identyczności sekwencji.

Alternatywnie, mutanty przeciwciał można tworzyć przez systematyczne mutacje regionów CDR łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała skierowanego przeciw IgE. Zalecana procedura tworzenia takich mutantów przeciwciał obejmuje stosowanie dojrzewania na zasadzie powinowactwa z wykorzystaniem prezentacji przez fagi (Hawkins i in., J. Mol. Biol. 254: 889-896 (1992) oraz Lowman i in., Biochemistry 30 (45): 10832-10S32 (1991)). O fuzjach z białkiem kapsydu bakteriofaga (Smith, Science 228: 1315 (1985); Scott i Smith, Science 249: 386 (1990); Cwirla i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 309 (1990); Devlin i in., Science 249: 404 (1990); praca przeglądowa Wellsa i Lowmana, Curx. Opin. Struct. Biol. 2: 597 (1992); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 223 409) wiadomo, że są użyteczne w przypisywaniu fenotypu prezentowanych białek lub peptydów genotypom cząstek bakteriofagowych, które je kodują. Stosowano również prezentację na fagach domen F(ab) przeciwciał (McCafferty i in., Nature 348: 552 (1990); Barbas i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978 (1991); Garrard i in., Biotechnol. 9 1373 (1991)).

Monowalentna prezentacja przez fagi obejmuje prezentację zbioru wariantów białka w postacji fuzji z białkiem kapsydu bakteriofaga w taki sposób, aby ograniczyć prezentowanie wariantów do tylko jednej kopii na kilka cząstek wirusowych (Bass i in., Proteins 8: 309 (1990). Dojrzewanie na zasadzie powinowactwa lub poprawianie równowagowych powinowactw wiązania różnych białek, uzyskiwano uprzednio przez stosowanie kolejno mutagenezy, monowalentnej prezentacji przez fagi, analizy funkcjonalnej i wprowadzania zalecanej mutacji i przedstawiono przykładowo w przypadku ludzkiego hormonu wzrostu (Lowman i Wells, J. Mol. Biol. 234: 564-578 (1993); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 534 617), jak również domen F(ab) przeciwciał (Barbas i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3S09 (1994); Yang i in., J. Mol. Biol. 254: 392 (1995).

Na cząstkach bakteriofagowych można konstruować biblioteki wielu (10⁶) wariantów białka, różniących się w określonych pozycjach ich sekwencji, w których każda z cząstek zawiera DNA kodujący określony wariant białka. Po cyklach oczyszczania na zasadzie powinowactwa z zastosowaniem immobilizowanego antygenu, izoluje się pojedyncze klony bakteriofagowe i na podstawie ich DNA przewiduje się sekwencje aminokwasowe prezentowanych przez nie białek.

(a) Przeciwciała humanizowane i ludzkie

Humanizacja jest techniką przygotowywania przeciwciała chimerycznego, w którym zasadniczo mniej niż całą ludzką domenę zmienną podstawiono odpowiadającą sekwencją z gatunku innego niż człowiek. Przeciwciało humanizowane posiada jedną lub więcej reszt aminokwasowych wprowadzonych do niego ze źródła innego niż ludzkie. Te nie ludzkie reszty aminokwasowe często określa się jako reszty „importowane”, które zazwyczaj pobiera się z „importowanej” domeny zmiennej. Humanizację można łatwo przeprowadzić postępując zgodnie z metodą Wintera i współpracowników (Jones i in., Nature 321: 522-525 (1986); Riechman i in., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i in., Science 239: 1534-1536 (1988)), przez podstawienie regionów determinujących komplementarość (CDR, od ang. Complementarity Determinig Regions) gryzonia lub sekwencji CDR, za odpowiadające sekwencje przeciwciała ludzkiego. Zgodnie z tym, takie „humanizowane” przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 816 567), w których zasadniczo mniej niż całą ludzką domenę zmienną podstawiono odpowiadającą sekwencją z gatunku innego niż

PL 194 562 B1 człowiek. Jak stosowano w praktyce w niniejszym wynalazku, humanizowane przeciwciała skierowane przeciw IgE posiadają niektóre reszty CDR i ewentualnie niektóre reszty FR, podstawione resztami z analogicznych miejsc przeciwciał mysich.

Wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno łańcuchów lekkich, jak i ciężkich do stosowania w przygotowywaniu przeciwciał humanizowanych jest bardzo ważny dla obniżania antygenowości. Zgodnie z tak zwaną metodą „najlepszego dopasowania”, sekwencję zmiennej domeny przeciwciała gryzonia przeszukuje się wobec całej biblioteki znanych sekwencji ludzkich domen zmiennych. Sekwencję ludzką, która jest najbardziej zbliżona do tej gryzonia, przyjmuje się następnie jako ludzki zrąb dla przeciwciała humanizowanego (Sims i in., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia i in., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)). Inna metoda wykorzystuje określony zrąb pochodzący z sekwencji konsensu wszystkich przeciwciał ludzkich określonej podgrupy łańcucha lekkiego lub ciężkiego. Ten sam zrąb można zastosować dla kilku różnych przeciwciał humanizowanych (Carter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta i in., J. Immunol. 151; 2623 (1993)).

Ponadto ważne jest, aby przeciwciała były humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa wobec anygenu i innych dogodnych właściwości biologicznych. Dla osiągnięcia tego celu, według zalecanego sposobu, humanizowane przeciwciała przygotowywuje się wykorzystując analizę sekwencji macierzystych i różnych teoretycznych humanizowanych produktów z zastosowaniem przestrzennych modeli sekwencji macierzystych i humanizowanych. Modele poszczególnych domen przeciwciała, na przykład domen VH i VL, konstruuje się osobno na podstawie sekwencji konsesów opartych na strukturach F(ab), które posiadają podobne sekwencje. Przestrzenne domeny immunoglobulin są powszechnie dostępne i znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, które ilustrują i prezentują przestrzenne struktury konformacyjne wybranych kandydatów sekwencji immunoglobulin. Przegląd tych prezentacji umożliwia analizę prawdopodobnej roli reszt w działaniu sekwencji immunoglobuliny potencjalnie będącej przedmiotem zainteresowania, tj. analizę reszt, które wpływają na zdolność potencjalnej immunoglobuliny do wiązania jej antygenu. Na przykład, w modelowaniu fragmentu F(ab)-12 w przykładzie 2, aby uzyskać zmutowaną zmutowaną sekwencję, w połączeniu z modelowaniem molekularnym zastosowano mysie MAE11 jako wyjściowy szablon reszt CDR i zrębu wybranych do modyfikacji.

Jako inny przykład wspomnieć można kontrolne przeciwciało Mab4b5. Zgodnie z wynalazkiem skonstruowano modele oparte na kilku strukturach Fab z banku danych o białkach Brookhaven (pozycje 1FB4, 2RHE, 2MCP, 3FAB, 1FBJ, 2HFL i 1REL). Jako pierwszy wybrano fragment F(ab) KOL (Marquart, M. i in., J. Mol. Biol. 141: 369-391 (1980)) jako szablon dla domen VL i VH, a następnie na tę strukturę nałożono dodatkowe struktury stosując współrzędne atomów ich łańcucha głównego (program INSIGHT, Biosym Technologies). Do modelowania pożądanego przeciwciała wykorzystuje się podobne programy i techniki.

Typową analizę z zastosowaniem modelowania molekularnego można przeprowadzić w następujący sposób. Odległość atomu Ca do analogicznego atomu Ca w każdej z nakładanych struktur oblicza się dla każdej pozycji danej reszty. Generalnie, jeśli wszystkie (lub prawie wszystkie) odległości Ca-Ca dla danej reszty są < A, to resztę tę włącza się do struktury konsensusowej. W niektórych przypadkach reszty struktury β zrębu będą spełniać te kryteria, podczas gdy pętle CDR mogą ich nie spełniać. Dla każdej z tych wybranych reszt oblicza się średnie współrzędne pojedynczych atomów N, Ca, O i CP, a następnie wprowadza się poprawki dla uzyskanych w wyniku odchyleń od niestandardowej geometrii wiązań przez 50 cykli minimalizacji energii z zastosowaniem komercjalnie dostępnego programu, takiego jak program DISCOVER (Biosym Technologies) z polem siłowym AMBER (Weiner, S. J. i in., J. Amer. Chem. Soc. 106: 765-784 (1984) i ustala się współrzędne atomów Ca. Do uzyskanej w wyniku struktury konsensusowej wprowadza się następnie łańcuchy boczne reszt o wysokiej konserwatywności, takich jak reszty cystein połączone mostkami disiarczkowymi. Następnie wprowadza się sekwencje domen VL i VH określonego przeciwciała, zaczynając od reszt CDR i kierując się tablicami konformacji CDR z Chothia i in. (Chothia, C i in., Nature 342: 877-883 (1989)). Konformacje łańcuchów bocznych wybiera się na podstawie krystalicznych struktur Fab, bibliotek rotamerów (Ponder, J. W. i Richards, F. M., J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)) oraz analizy upakowania. Ponieważ CDR3 VH może nie ulec podporządkowaniu powyższym kryteriom, można tworzyć modele na podstawie poszukiwania pętli o podobnej wielkości stosując program INSIGHT, otrzymywać je z zastosowaniem analizy upakowania i ekspozycji na rozpuszczalnik lub tworzyć stosując inne rutynowe i komercjalnie dostępne techniki. Zalecane jest poddanie modelu 5000 cykli minimalizacji energii.

PL 194 562 B1

W ten sposób można wybrać reszty zrębu i połączyć z sekwencjami biorcy i importowanymi tak, aby uzyskać pożądane cechy charakterystyczne przeciwciała, takie jak zwiększone powinowactwo wobec docelowego antygenu(ów). Generalnie, reszty CDR bezpośrednio i w najważniejszy sposób wpływają na wiązanie antygenu. Technikę tą zastosowano podczas tworzenia F(ab)-12 w przykładzie 2, gdzie zastosowano kombinacje reszt mysiego CDR, łącznie z modelowaniem molekularnym, do utworzenia fragmentu humanizowanego mysiego przeciwciała skierowanego przeciw IgE.

Alternatywnie, obecnie możliwe jest otrzymanie zwierząt (np. myszy) transgenicznych, które są zdolne, po immunizacji, do wytwarzania pełnego zestawu przeciwciał ludzkich przy braku wytwarzania immunoglobulin endogennych. Na przykład opisano, że wynikiem homozygotycznej delecji genu regionu łączącego ciężkiego łańcucha przeciwciała (JH) u myszy chimerycznych i o zmutowanej linii płciowej jest całkowite zahamowanie wytwarzania przeciwciał endogennych. Wynikiem przeniesienia układu układu genów immunoglobulinowych linii płciowej człowieka u takich myszy o zmutowanej linii płciowej będzie wytwarzanie ludzkich przeciwciał po stymulacji antygenem, Jakobovits i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits i in., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann i in., Year in Immunol. 7: 33 (1993) oraz Duchosal i in., Nature 355: 258 (1992). Przeciwciała ludzkie mogą również pochodzić z bibliotek prezentowanych na fagach (Hoogenboom i in., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks i in., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Vaughan i in., Nature Biotech. 14: 309 (1996)).

(b) Dodatkowe modyfikacje

Po wytworzeniu mutanta przeciwciała określa się aktywność biologiczną cząsteczki w porównaniu do przeciwciała specyficznego gatunkowo. Jak stwierdzono powyżej, może to obejmować określanie powinowactwa wiązania i/lub innych aktywności biologicznych przeciwciała. W zalecanym rozwiązaniu wynalazku, przygotowuje się zestaw mutantów przeciwciała, jak opisano powyżej i przeszukuje pod kątem powinowactwa wiązania z antygenem z drugiego gatunku ssaka. Jeden lub więcej mutantów przeciwciała wybranych w tym wstępnym przeszukiwaniu ewentualnie poddaje się jednemu lub więcej dalszych oznaczeń aktywności biologicznych w celu potwierdzenia, że mutant(y) przeciwciała o wzmocnionym powinowactwie są rzeczywiście użyteczne, np. do badań przedklinicznych. W zalecanych rozwiązaniach, mutant przeciwciała zachowuje zdolność do wiązania z antygenem z pierwszego gatunku ssaka, z powinowactwem wiązania podobnym, jak przeciwciało specyficzne gatunkowo.

Można to uzyskać przez uniknięcie zmieniania reszt regionu hiperzmiennego z prze-ciwciała skierowanego przeciw immunoglobulinom ludzkim, uczestniczących w wiązaniu antygenu. W innych rozwiązaniach mutant przeciwciała może mieć znacząco zmienione powinowactwo wiązania z antygenem z pierwszego gatunku ssaka (np. powinowactwo wiązania z antygenem jest korzystnie lepsze, ale może być gorsze niż w przypadku przeciwciała specyficznego gatunkowo).

Tak wybrany(e) mutant(y) przeciwciała można poddawać dalszym modyfikacjom, często zależnie od zamierzonego zastosowania przeciwciała. Takie modyfikacje mogą obejmować dalsze zmiany sekwencji aminokwasowej, fuzję z polipeptydem(ami) heterologicznym i/lub modyfikacje chemiczne, takie jak podano szczegółowo powyżej. Na przykład, dowolną resztę cysteiny nie biorącą udziału w utrzymywaniu właściwej konformacji mutanta przeciwciała, także można podstawić, na ogół seryną, w celu poprawienia oksydacyjnej stabilności cząsteczki i zapobiegnięcia zaburzeniom sieciowania. Odwrotnie, wiązanie(a) cysteinowe można wprowadzić do przeciwciała w celu poprawy jego stabilności (szczególnie, jeśli przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fv). Inny typ mutanta aminokwasowego wykazuje zmieniony wzór glikozylacji. Można to uzyskać przez delecję jednej lub więcej grup węglowodanowych występujących w przeciwciale i/lub dodanie jednego lub więcej miejsc glikozylacji, które nie są w nim obecne.G likozylacja przeciwciał jest zazwyczaj N-glikozylacją lub O-glikozylacją. N-glikozylacja odnosi się do połączenia reszty węglowodanowej z łańcuchem bocznym reszty asparaginy. Tripeptydowe sekwencje asparagina-X-seryna i asparagina-X-treonina, gdzie X jest dowolnym aminokwasem, z wyjątkiem proliny, są sekwencjami rozpoznawanymi przy enzymatycznym przyłączaniu reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy.

A zatem, obecność każdej z tych tripeptydowych sekwencji w polipeptydzie tworzy potencjalne miejsce glikozylacji. O-glikozylacja odnosi się do przyłączania cukru przez atom tlenu grupy eterowej, na przykład N-acetyloga-laktozoaminy, galaktozy, fukozy lub ksylozy związanej z hydroksyaminokwasem, najczęściej seryną lub treoniną, chociaż może zostać wykorzystana także 5-hydroksyprolina lub 5-hydroksylizyna. Dodanie miejsc glikozylacji do przeciwciała dogodnie przeprowadza się przez zmianę sekwencji aminokwasowej tak, aby zawierała ona jedną lub więcej z opisanych powyżej sekwencji

PL 194 562 B1 tripeptydowych (miejsca N-glikozylacji). Zmiany można również dokonać przez dodanie lub podstawienie resztami bądź treoniny w sekwencji oryginalnego przeciwciała (miejsca O-glikozylacji).

(v) Fragmenty przeciwciał

Do wytwarzania fragmentów przeciwciał opracowano różne techniki. Tradycyjnie fragmenty te powstawały przez trawienie proteolityczne nienaruszonych przeciwciał (patrz, np., Morimoto i in., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) oraz Brennan i in., Science 229: 81 (1985)). Jednakże, obecnie fragmenty te mogą być wytwarzane bezpośrednio przez zrekombinowane komórki gospodarza. Na przykład, fragmenty przeciwciał można izolować z dyskutowanych powyżej fagowych bibliotek przeciwciał. Alternatywnie, fragmenty F(ab')2-SH można bezpośrednio odzyskiwać z E. coli i chemicznie sprzęgać z utworzeniem fragmentów F(ab')2 (Carter i in., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Zgodnie z innym podejściem, fragmenty F(ab') można bezpośrednio izolować z hodowli zrekombinowanych komórek gospodarza. Inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał będą oczywiste dla specjalitów. W innych rozwiązaniach, wybranym przeciwciałem jest fragment pojedynczego łańcucha Fv (scFv) (zgłoszenie patentowe PCT numer WO 93/16185).

(vi) Przeciwciała multispecyficzne

Przeciwciała multispecyficzne posiadają specyficzność wiązania z co najmniej dwoma różnymi antygenami. O ile takie cząsteczki normalnie wiązać będą tylko dwa antygeny (tj. przeciwciała bispecyficzne, BsAb), wyrażenie to, gdy stosuje je się w niniejszym opisie, obejmuje przeciwciała o dodatkowych specyficznościach, takie jak przeciwciała trispecyficzne. Przykłady BsAb obejmują te z jednym ramieniem skierowanym przeciw antygenowi komórki nowotworowej, a drugim ramieniem skierowanym przeciw cząsteczce wywołującej cytotoksyczność, takie jak anty-FcyRl/anty-CD15, anty-p-185^HER2/FcyRIII (CD16), anty-CD3/anty-złośliwa komórka B (1D10), anty-CD3/anty-p185^HER2, anty-CD3/anty-p97, anty- CD3/anty-komórki raka nerki, anty-CD3/anty-OVCAR-3, anty-CD3/L-D1 (anty-komórki raka okrężnicy), anty-CD3/anty-analog hormonu stymulującego melanocyty, anty-receptor EGF/anty-CD3, anty-CD3/anty-CAMA1,anty-CD3/anty-CD19, anty-CD3/MoV18, anty-neuronalna cząsteczka adhezji komórkowej (NCAM)/anty-CD3,anty-białko wiążące folian (FBP)/anty-CD3, antyantygen związany ze wszystkimi rakami (AMOC-31/anty-CD3; BsAb z jednym ramieniem, które specyficznie wiąże się z antygenem nowotworowym i drugim ramieniem, które specyficznie wiąże się z toksyną, takie jak anty-saporyna/anty-Id-1, anty-CD22/anty-saporyna, anty-CD7/anty-saporyna, antyCD38/anty-saporyna, anty-CEA/anty-łańcuch A rycyny, anty-interferon α (LFN-a)/anty-idiotyp hybrydomy, anty-CEA/anty-alkaloid barwinka; BsAb skierowane przeciw prolekom aktywowanym przez enzym konwertujący, takie jak anty-CD30/anty-alkaliczna fosfataza (która katalizuje przekształcenie proleku fosforanu mitomycyny w alkohol mitomycyny); BsAb, które można stosować jako czynniki fibrynolityczne, takie jak anty-fibryna/anty-tkankowy aktywator plazminogenu (tPA), anty-fibryna/antyaktywator plazminogenu typu urokinazowego (uPA); BsAb do kierowania kom pleksów immunologicznych do powierzchniowych receptorów ko mórkowych, takie jak anty-lipoproteina o niskiej gęs- tości/anty-receptor Fc (np FcyRI, FcyRII lub FcyRIlL); BsAb do stosowania w leczeniu chorób zakaźnych, takie jak anty-CD3-anty-wirus opryszczki (HSV), anty-kompleks recepttor komórek T:CD3/anty-wirus grypy; anty-FcyR/anty-HIV; BsAb do wykrywania nowotworów in vitro i in vivo, takie jak anty-C^anty-^TUBE an^ty-^CEA/an^ty-^DpTA, an^ty-^p185HER2/an^ty-fia^pten^; BsA^b jako adwwanty szczepionek oraz BsAb jako narzędzia diagnostyczne, takie jak anty-lgG królika/anty-ferrytyna, antyperoksydarza chrzanowa (HRP)/anty-hormon, anty-somatostatyna/anty-substancja P, anty-HRP/antyFLTC, anty-CEA/anty-p-galaktozydaza.

Przykłady przeciwciał trispecyficznych obejmują anty-CD3/anty-CD4/anty-CD37, anty-CD3/anty-CD5/anty/CD37 oraz anty-CD3/anty-CD8/anty-CD37. Przeciwciała bispecyficzne można przygotowywać jako przeciwciała o pełnej długości lub jako fragmenty przeciwciał (np. F(ab')2 przeciwciał bispecyficznych).

Metody przygotowywania przeciwciał bispecyficznych są znane w nauce. Tradycyjne wytwarzanie bispecyficznych przeciwciał o pełnej długości oparte jest na koekspresji dwóch par ciężki łańcuchlekki łańcuch immunoglobulin, gdzie dwa łańcuchy posiadają różne specyficzności (Millstein i in., Nature 305: 537-539 (1983)). Z powodu losowego doboru łączenia ciężkich i lekkich łańcuchów immunoglobulin, hybrydomy (kwadromy) wytwarzają potencjalną mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna posiada właściwą bispecyficzną strukturę. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, którego zazwyczaj dokonuje się przez etapy chromatografii powinowactwa, jest raczej niewygodne, a wydajności produktu są niskie. Podobne procedury ujawniono w opisie patentowym numer WO93/08829 oraz w Traunecker i in., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).

PL 194 562 B1

Według innego podejścia, zmienne domeny przeciwciał o pożądanych specyficznościach wiązania (przeciwciała-miejsca wiązania antygenu) poddaje się fuzji z sekwencjami domen stałych immunoglobulin. Fuzja dogodnie występuje w stałej domenie ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, obejmując co najmniej część regionów zawiasowych, CH2 i CH3. Zalecane jest, aby co najmniej jedna z fuzji posiadała pierwszy region stały łańcucha ciężkiego (CH1), zawierający miejsce konieczne do wiązania łańcucha lekkiego. DNA kodujące fuzje łańcucha ciężkiego i, jeśli jest to pożądane, łańcucha lekkiego immunoglobulin wstawia się do odzielnych wektorów ekspresyjnych i kotransfekuje odpowiedni organizm gospodarza. Zapewnia to większą elastyczność w dobieraniu wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych w rozwiązaniu, w którym nierówne stosunki trzech zastosowanych w konstruowaniu łańcuchów polipeptydowych zapewniają optymalną wydajność. Możliwe jest, jednakże, wstawienie sekwencji kodujących dwa lub wszystkie trzy łańcuchy polipeptydowe do jednego wektora ekspresyjnego, jeśli wynikiem ekspresji co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych stosunkach jest wysoka wydajność, bądź jeśli stosunki nie mają szczególnego znaczenia.

W zalecanym rozwiązaniu tego podejścia, bispecyficzne przeciwciała składają się z hybrydowego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny o pierwszej specyficzności wiązania na jednym ramieniu, oraz hybrydowej pary ciężki łańcuch-lekki łańcuch immunoglobuliny (zapewniającej drugą specyficzność wiązania) na drugim ramieniu. Stwierdzono, że ta asymetryczna struktura ułatwia oddzielanie pożądanego bispecyficznego związku od niepożądanych kombinacji łańcuchów immunoglobulin, ponieważ obecność lekkiego łańcucha immunoglobuliny tylko w połowie bispecyficznej cząsteczki zapewnia łatwy sposób oddzielania. Podejście to ujawniono w opisie patentowym numer WO 94/04690. Dla dalszych szczegółów tworzenia bispecyficznych przeciwciał patrz, na przykład, Suresh i in., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).

Według innego podejścia, opisanego w światowym opisie patentowym numer WO 96/27011, w celu maksymalizacji procentu heterodimerów, które odzyskuje się z hodowli zrekombinowanych komórek, można utworzyć regiony kontaktów pomiędzy parą cząsteczek przeciwciał. Zalecane regiony kontaktów obejmują co najmniej część domeny CH3 stałej domeny przeciwciała. W metodzie tej jeden lub więcej małych łańcuchów bocznych aminokwasów z regionu kontaktu pierwszej cząsteczki przeciwciała zastępuje się dużymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyny lub tryptofanu). W regionie kontaktu drugiej cząsteczki przeciwciała tworzy się odpowiadające „szczeliny” o identycznej lub mniejszej wielkości od dużego łańcucha(ów) bocznego(ych) przez zastąpienie dużych łańcuchów bocznych mniejszymi (np. alaniny lub treoniny). Zapewnia to mechanizm zwiększania wydajności heterodimeru w stosunku do niepożądanych produktów końcowych, takich jak homodimery.

Przeciwciała bispecyficzne obejmują przeciwciała usieciowane lub „heterokoniugaty”. Na przykład, jedno z przeciwciał w heterokoniugacie może być sprzęgnięte z awidyną, a drugie z biotyną. Takie przeciwciała zaproponowano, na przykład, do kierowania komórek układu immunologicznego do niepożądanych komórek (opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4 676 980) oraz do traktowania infekcji HIV (opis patentowy numer WO 91/00360, opis patentowy numer WO 92/200373 i opis patentowy numer EP 03089). Przeciwciała będące heterokoniugatami można wykonać stosując jakiekolwiek dogodne metody sieciowania. Odpowiednie czynniki sieciujące są znane w nauce i ujawniono je w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 676 980, wraz z licznymi technikami sieciowania.

Techniki tworzenia przeciwciał bispecyficznych z fragmentów przeciwciał opisano w literaturze. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne można przygotowywać stosując wiązania chemiczne. Brennan i in., Science 229: 81 (1985) opisują procedurę, w której nienaruszone przeciwciała rozszczepia się proteolitycznie w celu utworzenia fragmentów F(ab')2. Fragmenty te redukuje się w obecności czynnika kompleksującego, ditiolu, arseninu sodowego, w celu stabilizacji sąsiadujących ditioli i zapobiegnięcia tworzenia międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych. Utworzone fragmenty F(ab') przekształca się następnie w pochodne tionitrobenzoesanu (TNB). Jedną z pochodnych Fab'-TNB przekształca się następnie ponownie w Fab'-tiol przez redukcję merkaptoetyloaminą i miesza się w równomolowej ilości z drugą pochodną Fab'-TNB, tworząc bispecyficzne przeciwciało. Utworzone przeciwciała bispecyficzne można stosować jako czynniki do selektywnej immobilizacji enzymów.

Ostatnie postępy umożliwiły bezpośrednie odzyskiwanie z E. coli fragmentów Fab'-SH, które można chemicznie sprzęgać z utworzeniem bispecyficznych przeciwciał. Shalaby i in., J, Exp. Med. 175: 217-225 (1992) opisują wytwarzanie w pełni humanizowanych bispecyficznych przeciwciał cząsteczki F(ab')2. E. coli oddzielnie wydzielają każdy z fragmentów Fab', które poddaje się bezpośrednio chemicznemu sprzęganiu in vitro, tworząc bispecyficzne przeciwciało. Tak utworzone bispecyficzne przeciwciało było zdolne do wiązania się z komórkami, w których zachodziła nadekspresja receptora

PL 194 562 B1

ErbB2 oraz normalnymi komórkami T, jak również wyzwalania aktywności litycznej ludzkich limfocytów cytotoksycznych wobec docelowego ludzkiego nowotworu piersi.

Opisano również różne techniki przygotowywania i izolowania fragmentów bispecyficznych przeciwciał bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek. Na przykład, wytwarzano bispecyficzne przeciwciała stosując motyw suwaka leucynowego. Kostelny i in., J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Peptydy suwaka leucynowego z białek Fos i Jun połączono z częściami Fab' dwóch różnych przeciwciał przez fuzję genową. Homodimery przeciwciał zredukowano w regionie zawiasowym z utworzeniem monomerów, a następnie ponownie utleniono, tworząc heterodimery przeciwciał. Metodę tę można także wykorzystać do wytwarzania homodimerów przeciwciał.

Opisana przez Hollingera i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) technika „diaciał” zapewniała alternatywny mechanizm przygotowywania fragmentów przeciwciał bispecyficznych. Fragmenty zawierają domenę zmienną ciężkiego łańcucha (Vh) połączoną z domeną zmienną lekkiego łańcucha (V_l) łącznikiem, który jest zbyt krótki, aby umożliwić tworzenie się par pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha. A zatem, wymusza się tworzenie par domen VH i VL jednego fragmentu z komplementarnymi domenami VL i VH drugiego fragmentu, w ten sposób tworząc dwa miejsca wiążące antygen. Doniesiono także o innej strategii przygotowywania fragmentów bispecyficznych przeciwciał przy zastosowaniu dimerów jednołańcuchowych Fv (sFv). Patrz Gruger i in., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

Uwzględnia się przeciwciała więcej niż dwuwartościowe. Na przykład, można przygotować przeciwciała trispecyficzne. Tutt i in., J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vii) Modyfikowanie funkcji efektorowych

Może być pożądane zmodyfikowanie przeciwciała według wynalazku pod względem funkcji efektorowych tak, aby na przykład wzmocnić skuteczność wiązania przeciwciała z IgE. Na przykład, do regionu Fc można wprowadzić reszty cystein(y), w ten sposób umożliwiając tworzenie w tym regionie międzyłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych.

Tak utworzone homodimeryczne przeciwciało może wykazywać ulepszoną zdolność do ulegania internalizacji i/lub podwyższoną zdolność zależnego od dopełniacza zabijania komórek bądź cytotoksyczność zależną od przeciwciał (ADCC) patrz Caron i in., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) oraz Shopes, B., J. Immunol. 148: 2918-2922 (1993). Alternatywnie, można zmodyfikować przeciwciało, które posiada podwójne regiony Fc i dzięki temu może wzmacniać zdolność lizy zależnej od dopełniacza i ADCC. Patrz Stevenson i in., Anti-cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

(viii) Immunokoniugaty

Opisano też przeciwciało skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym, takim jak czynnik chemioterapeutyczny, toksyna (np. aktywna enzymatycznie toksyna pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, lub ich fragmenty), lub izotop promieniotwórczy (tj. radiokoniugat) mogą być zawarte w immunokoniugatach.

Czynniki chemioterapeutyczne użyteczne w tworzeniu takich immunokoniugatów opisano powyżej. Enzymatycznie aktywne toksyny i ich fragmenty, które można stosować, obejmują łańcuch A toksyny błoniczej, niewiążące aktywne fragmenty toksyny błoniczej, łańcuch A egzotoksyny (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A modecyny, alfa sarcynę, białka z Aleurites fordii, białka diantyny, białka Phytolaca americana (PAP-I, PAP-II i PAP-S), inhibitor z Momordica charantia, kurynę, krotynę, inhibitor z Saponaria officinalis, geloninę, mitogellinę, restryktocynę, fenomycynę, enomycynę i trikotecenes. Do wytwarzania radiokoniugatów przeciwciał dostępne s^ą r^óżne ra-^dionu^klidy. ^Prz^ykła^dy o^bejmuj^{ą 212}Ε3η ¹³¹^ ^131|π, ⁹⁰Y ^{i 186}Re.

Koniugaty przeciwciała i czynnika cytotoksycznego przygotowywuje się stosując różne bifunkcjonalne czynniki sprzęgające białka, takie jak N-sukcynimidynylo-3-(2-pirydyloditiolo)propionian (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcjonalne pochodne imidoestrów (takie jak dimetyloimid kwasu adypinowego HCl), aktywne estry (takie jak suberynian disukcynimidylowy), aldehydy (takie jak glutąraldehyd), związki bis-azydowe (takie jak bis-p-(azydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bis-diazoniowe (takie jak bis-p(di-azoniobenzoilo)-etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak 2,6-diizocyjanian tolilenu) oraz bis-aktywne związki fluorowe (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen).

Na przykład, immunotoksynę rycynową można przygotować w sposób opisany w Vitetta i in., Science 238: 1098 (1987). Przykładowym czynnikiem chelatującym do koniugowania radionuklidu z przeciwciałem jest wyznakowany węglem-14 kwas 1-izotiocyjanianobenzylo-3-metylodietylenotriaminopentaoctowy (MX-DTPA), patrz opis patentowy nr WO 94/11026.

PL 194 562 B1

W innym rozwiązaniu, przeciwciało można skoniugować z „receptorem” (takim jak streptawidyna), w celu wykorzystania do wstępnego kierowania do nowotworów, gdzie pacjentowi podaje się koniugat przeciwciało-receptor, po czym usuwa się niezwiązany koniugat z krążenia stosując czynnik usuwający, a następnie podaje się „ligand” (np. awidynę), którą skoniugowano z czynnikiem cytotoksycznym (np. radionuklidem).

(ix) Immunoliposomy

Opisanym poniżej mutantom przeciwciał można również nadawać postać immunoliposomów. Liposomy zawierające przeciwciało przygotowuje się metodami znanymi w nauce, takimi jak opisane w Epstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3686 (1985); Hwang i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980) oraz opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o nr 4 485 045 i 4 544 545. Liposomy o przedłużonym czasie krążenia ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5 013 556.

Szczególnie użyteczne liposomy można tworzyć metodą odparowywania z odwróconymi fazami, o składzie lipidowym obejmującym fosfatydylocholinę, cholesterol i fosfatydyloetanoloaminę zmodyfikowaną PEG (PEG-PE). Liposomy przeciska się przez sączki o określonej wielkości porów w celu otrzymania liposomów o pożądanej średnicy. Zgodnie z wynalazkiem fragmenty Fab' przeciwciała można koniugować z liposomami w sposób opisany w Martin i in., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982), poprzez reakcję wymiany disiarczków. Liposomy zawierają ewentualnie czynnik chemioterapeutyczny (taki jak doksorubicynę), patrz Gabizon i in., J. National Cancer Inst. 81 (19): 1464 (1989).

(x) Zależna od przeciwciała terapia prolekiem aktywowanym enzymem (ADEPT)

Przeciwciało według niniejszego wynalazku można również stosować w ADEPT, przez koniugowanie przeciwciała z enzymem aktywującym prolek, który przekształca prolek (np. peptydylowy czynnik chemioterapeutyczny, patrz opis patentowy numer WO 81/01145) w aktywny lek przeciwrakowy, patrz na przykład opis patentowy numer WO 88/07378 i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 975 278.

Enzymatyczna składowa immunokoniugatu użytecznego w ADEPT obejmuje enzym zdolny do działania na prolek w taki sposób, aby przekształcać go w bardziej aktywną, cytotoksyczną postać.

Enzymy, które są użyteczne w sposobie według tego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do fosfatazy alkalicznej, użytecznej w przekształcaniu proleków zawierających fosforan w wolne leki; arylosulfatazy, użytecznej do przekształcania proleków zawierających siarczan w wolne leki; deaminazy cytozynowej, użytecznej do przekształcania nietoksycznej 5-fluorocytozyny w lek przeciwrakowy, 5-fluorouracyl; proteaz, takich jak proteaza Serratia, termolizyna, subtylizyna, karboksypeptydazy i katepsyny (takie jak katepsyny B i L), które są użyteczne do przekształcania proleków zawierających peptydy w wolne leki; D-alanylokarboksylopeptydaz, użytecznych do przekształcania proleków, które zawierają podstawniki D-aminokwasowe; enzymów rozszczepiających węglowodany, takich jak β-galaktozydaza i neuraminidaza, użytecznych do przekształcania glikozylowanych proleków w wolne leki; β-laktamazy, użytecznej do przekształcania leków przeprowadzonych w pochodne β-laktamowe w wolne leki; amidaz penicylinowych, takich jak amidaza penicyliny V lub amidaza penicyliny G, użytecznych do przekształcania leków podstawionych przy ich atomach azotu grup aminowych, odpowiednio, grupami fenoksyacetylową lub fenyloacetylową, w wolne leki. Alternatywnie, do przekształcania proleków w wolne, aktywne leki, można stosować przeciwciała posiadające aktywność enzymatyczną, znane również jako „abzymy” (Massey, Nature 320: 457-458 (1987)). Koniugaty przeciwciałoabzym można przygotowywać w sposób tu opisany dla dostarczania abzymu do populacji komórek nowotworowych.

Opisane tu enzymy można kowalencyjnie wiązać z mutantem przeciwciała technikami dobrze znanymi w nauce, takimi jak stosowanie opisanych powyżej heterobifunkcjonalnych odczynników sieciujących. Alternatywnie, stosując dobrze znane w nauce techniki rekombinacji DNA, można konstruować białka fuzyjne obejmujące co najmniej region wiążący antygen przeciwciała według wynalazku, połączony z co najmniej aktywną funkcjonalnie częścią enzymu według wynalazku (Neuberger i in., Nature 312: 604-608 (1984)).

(x) Fuzje przeciwciało-epitop wiążący receptor ratujący

W niektórych rozwiązaniach wynalazku może być pożądane stosowanie raczej fragmentu przeciwciała niż nienaruszonego przeciwciała, na przykład w celu zwiększenia przenikania do nowotworu. W tym przypadku, pożądane być może zmodyfikowanie fragmentu przeciwciała w celu zwiększenia jego okresu półtrwania w surowicy. Można to uzyskać, na przykład, przez wprowadzenie do fragmentu przeciwciała epitopu wiążącego receptor ratujący (np. przez mutację odpowiedniego regionu we fragPL 194 562 B1 mencie przeciwciała lub przez wprowadzenie epitopu do znacznika peptydowego, który następnie poddaje się fuzji z fragmentem przeciwciała albo na którymkolwiek z końców, albo w środku, np. przez syntezę DNA albo peptydu).

Epitop wiążący receptor ratujący dogodnie stanowi region, w którym którąkolwiek jedna lub więcej reszt aminokwasowych z jednej lub dwóch pętli domeny Fc przenosi się do analogicznej pozycji we fragmencie przeciwciała. Jeszcze dogodniej, przenosi się trzy lub więcej reszt z jednej lub dwóch pętli domeny Fc. Jeszcze dogodniej, epitop pobiera się z domeny CH2 regionu Fc (np. IgG) i przenosi do regionu CH1, CH3 lub VH, lub więcej niż jednego takiego regionu przeciwciała. Alternatywnie, epitop pobiera się z domeny CH2 regionu Fc i przenosi do regionu C_L lub regionu V_L, bądź obu regionów fragmentu przeciwciała.

(xii) Inne kowalencyjne modyfikacje przeciwciała

Cząsteczki przeciwciał według wynalazku mogą być kowalencyjnie modyfikowane. Można to przeprowadzić przez syntezę chemiczną lub przez enzymatyczne, bądź chemiczne rozszczepianie przeciwciała, jeśli to możliwe. Inne typy kowalencyjnych modyfikacji przeciwciała wprowadza się do cząsteczki przez poddawanie reakcji docelowych reszt aminokwasowych przeciwciała z organicznym czynnikiem przeprowadzającym w pochodne, który jest zdolny do reagowania z wybranymi łańcuchami bocznymi bądź resztami N- lub C-końcowymi.

Reszty cysteinylowe najczęściej poddaje się reakcji z α-chlorowcooctanami (i odpowiadającymi aminami), takimi jak kwas chlorooctowy lub chloroacetamid, w celu otrzymania pochodnych karboksymetylowych lub karboksyamidometylowych. Reszty cysteinylowe przeprowadza się w pochodne także przez reakcję z bromotrifluoroacetonem, kwasem α-bromo-β-(5-imidazoilo)propionowym, fosforanem chloroacetylowym, N-alkiloimidami, disiarczkiem 3-nitro-2-pirydylowym, disiarczkiem metylo-2-pirydylowym, p-chlorobenzoesanem rtęciowym, 2-chloro-4-nitrofenolem rtęciowym lub chloro-7-nitro-2-oksa-1,3-diazolem.

Rezszty histydylowe przeprowadza się w pochodne przez reakcję z dietylopirowęglanu w pH 5,5-7,0, ponieważ czynnik ten jest stosunkowo specyficzny wobec histydylowego łańcucha bocznego. Użyteczny jest również bromek para-bromofenacylu; reakcję dogodnie prowadzi się w 0,1 M kakodylanie sodowym o pH 6,0.

Reszty lizynylowe i aminokońcowe poddaje się reakcji z bezwodnikami kwasu bursztynowego lub innego kwasu karboksylowego. Przeprowadzanie w pochodne tymi czynnikami wywiera wpływ odwracania ładunku reszt lizynylowych. Inne odpowiednie odczynniki do przeprowadzania w pochodne reszt zawierających grupy α-aminowe obejmują imidoestry, takie jak metyloimid kwasu pikolinowego, fosforan pirydoksalu, pirydoksal, chloroborowodorek, kwas trinitrobenzenosulfonowy, O-metyloizomocznik, 2,4-pentanodion oraz katalizowaną przez transaminazę reakcję z glioksylanem.

Reszty arginylowe modyfikuje się przez reakcję z jednym lub kilkoma konwecjonalnymi odczynnikami, do których należą fenyloglioksal, 2,3-butanodion, 1,2-cykloheksanodion i ninhydryna. Przeprowadzanie w pochodne reszt argininy wymaga, aby reakcja prowadzona była w warunkach zasadowych, z powodu wysokiej wartości pK_a funkcyjnych grup guanidynowych. Ponadto, odczynniki te mogą reagować z grupami lizyny, jak również z grupami epsilon-aminowymi argininy.

Specyficznej modyfikacji reszt tyrozylowych, ze szczególnym uwzględnieniem wprowadzania znaczników spektralnych, można dokonać przez reakcję z aromatycznymi związkami diazoniowymi lub tetranitrometanem. Najczęściej do utworzenia, odpowiednio, pochodnych O-tyrozylowych i 3-nitrowych stosuje się N-acetyloimidizol i tetranitrometan. Reszty tyrozylowe joduje się stosując J lub

131

J w celu przygotowania wyznakowanych białek, znajdujących zastosowanie w oznaczeniu radioimmunologicznym.

Karboksylowe grupy boczne (aspartylową lub glutamylową) selektywnie modyfikuje się przez reakcję z karbodiimidami (R-N=C=C-R'), gdzie R i R' są różnymi grupami alkilowymi, takimi jak cykloheksylo-3-(2-morfolinylo-4-etylo)karbodiimid i 1-etylo-3-(4-azonio-4,4-dimetylopentylo)-karbodiimid. Ponadto, grupy aspartylowe i glutamylowe przekształca się w grupy asparaginylowe i glutaminylowe przez reakcję z solami amonowymi.

Reszty glutaminylowe i asparaginylowe często daeminuje się do odpowiadających reszt, odpowiednio, glutamylowych i aspartylowych. Reszty te deaminuje się w warunkach obojętnych lub zasadowych. Zgodnie z wynalazkiem mogą być stosowane deaminowane postacie tych reszt. Inne modyfikacje obejmują hydroksylację proliny i lizyny, fosforylację grup hydroksylowych reszt serylowych i treaonylowych, metylację grup α-aminowych łańcuchów bocznych lizyny, argininy i histydyny (T E. Creighton,

PL 194 562 B1

Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86 (1983), acetylację N-końcowej grupy aminowej oraz amidację dowolnej C-końcowej grupy karboksylowej.

Inny rodzaj modyfikacji kowalencyjnej obejmuje chemiczne lub enzymatyczne sprzęganie glikozydów z przeciwciałem. Procedury te są zalecane pod tym względem, że nie wymagają one wytwarzania przeciwciała w komórce gospodarza, która posiada zdolność prowadzenia N- lub O-glikozylacji. W zależności od zastosowanego sposobu sprzęgania, cukier(y) można przyłączać do (a) argininy i histydyny; (b) wolnych grup karboksylowych; (c) wolnych grup hydroksylowych, takich jak te cysteiny; (d) wolnych grup hydroksylowych, takich jak te seryny, treoniny lub hydroksyproliny; (reszt aromatycznych, takich jak te fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu; lub (f) grupy amindowej glutaminy. Metody te opisano w opisie patentowym nr WO 87/0533, opublikowanym 11 września 1987 r. oraz w Aplin i Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., str. 259-306 (1981).

Usunięcie jakichkolwiek grup węglowodanowych obecnych w przeciwciale można przeprowadzić chemicznie lub enzymatycznie. Deglikozylacja chemiczna wymaga ekspozycji przeciwciała na związek kwas trifluorometanosulfonowy lub związek równoważny. Wynikiem tego traktowania jest rozszczepienie większości lub wszystkich cukrów, z wyjątkiem cukru wiążącego (N-acetyloglukozoaminy lub N-acetylogalaktozoaminy), z pozostawieniem przeciwciała nienaruszonego. Chemiczną deglikozylację opisali Hakimuddin i in., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) oraz Edge i in., Anal. Biochem. 118: 131 (1981). Enzymatyczne rozszczepienie grup węglowodanowych przeciwciał można uzyskać przez zastosowanie różnych endo- i egzoglikozydaz, jak opisali Thotakura i in., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).

Inny rodzaj kowalencyjnej modyfikacji przeciwciała obejmuje łączenie przeciwciała z jednym z szeregu różnych polimerów niebiałkowych, np. glikolem polietylenowym, glikolem polipropylenowym lub polioksyloalkilenami, w sposób przedstawiony w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o nr 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 lub 4 179 337.

B. Wektory, komórki gospodarza i metody rekombinacji

W celu rekombinacyjnego wytwarzania mutanta przeciwciała, kodujący go kwas nukleinowy izoluje się i wstawia do zdolnego do replikacji wektora do dalszego klonowania (amplifikacji DNA) lub ekspresji. DNA kodujący mutanta przeciwciała monoklonalnego łatwo izoluje się i sekwencjonuje stosując konwencjonalne procedury (np. przez zastosowanie sond oligonukleotydowych, które są zdolne do specyficznego wiązania z genami kodującymi łańcuchy ciężki i lekki mutanta przeciwciała). Dostępnych jest wiele wektorów. Składowe wektora generalnie obejmują, ale nie ograniczają się do jednego lub więcej z następujących elementów składowych: sekwencji sygnałowej, miejsca początku replikacji, jednego lub więcej genów markerowych, elementu wzmacniającego, promotora i sekwencji terminacji.

(i) Sekwencja sygnałowa

Mutanta przeciwciała według tego wynalazku można wytwarzać rekombinacyjnie nie tylko bezpośrednio, ale także w postaci polipeptydu fuzyjnego z polipeptydem heterologicznym, którym jest dogodnie sekwencja sygnałowa lub inny polipeptyd, posiadający specyficzne miejsce rozszczepiania na końcu N dojrzałego białka lub polipeptydu. Wybraną heterologiczną sekwencją sygnałową dogodnie jest taka, która jest rozpoznawana i poddawana obróbce (tj. rozszczepiana przez peptydazę sygnałową) przez komórkę gospodarza. Dla prokariotycznej komórki gospodarza, która nie rozpoznaje i nie poddaje obróbce natywnej sekwencji sygnałowej gospodarza, sekwencję sygnałową podstawia się prokariotyczną sekwencją sygnałową wybraną, na przykład z grupy liderów alkalicznej fosfatazy, penicylinazy, Ipp lub termostabilnej enterotoksyny II. Dla sekrecji z drożdży, natywną sekwencję sygnałową można podstawić np. liderem inwertazy drożdżowej, liderem czynnika α (włącznie z liderami czynnika α Saccharomyces i Kluyveromyces) lub liderem kwaśnej fosfatazy, liderem glukomylazy C. albicans lub sygnałem opisanym w światowym opisie patentowym numer 9D/13646. Dla ekspresji w komórkach ssaczych, dostępne są ssacze sekwencje sygnałowe, jak również wirusowe lidery sekrecji, na przykład sygnał gD wirusa opryszczki. DNA dla takiego regionu prekursorowego liguje się w jednej ramce odczytu z DNA kodującym mutanta przeciwciała.

(ii) Miejsce początku replikacji

Zarówno wektory ekspresyjne, jak i klonujące zawierają sekwencję kwasu nukleinowego, która umożliwia replikację wektora w jednej lub więcej wybranych komórek gospodarza. Generalnie, w wektorach klonujących sekwencją tą jest sekwencja, która umożliwia replikację wektora niezależną od chromosomalnego DNA gospodarza i obejmuje ona sekwencje miejsc początku replikacji lub replikujące autonomicznie. Sekwencje takie są dobrze znane dla różnych bakterii, drożdży i wirusów. Miejsce

PL 194 562 B1 początku replikacji z plazmidu pBR322 jest odpowiednie dla większości bakterii Gram ujemnych, miejsce początku replikacji plazmidu 2 μ jest odpowiednie dla drożdży, a różne wirusowe miejsca początku replikacji (SV40, poliomy, adenowirusa, VSV lub BPV) są użyteczne dla wektorów klonujących dla komórek ssaczych. Generalnie, miejsce początku replikacji nie jest potrzebne w ssaczych wektorach ekspresyjnych (miejsce początku replikacji SV40 można zazwyczaj stosować, ponieważ zawiera ono wczesny promotor).

(iii) Gen selekcyjny

Wektory ekspresyjne i klonujące mogą zawierać gen selekcyjny, nazywany także markerem selekcyjnym. Typowe geny selekcyjne kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, neomycynę, metotreksat lub tetracyklinę, (b) komplementują niedobory auksotroficzne lub (c) dostarczają składniki odżywcze o krytycznym znaczeniu, niedostępne z podłóż złożonych, np. gen kodujący racemazę D-alaniny dla Bacillus.

Jeden z przykładów schematu selekcji wykorzystuje lek do zahamowania wzrostu komórki gospodarza. Te komórki, które zostały z powodzeniem stransformowane genem heterologicznym, wytwarzają białko nadające oporność na lek, a zatem przeżywają procedurę selekcji. W takiej selekcji przykładowo wykorzystuje się leki, takie jak neomycyna, kwas mykofenolinowy i higromycyna.

Innym przykładem odpowiednich markerów selekcyjnych dla komórek ssaczych są te, które umożliwiają identyfikację komórki kompetentnej do pobierania kwasu nukleinowego przeciwciała, takie jak geny DHFR, kinazy tymidynowej, metalotioneiny I i II, dogodnie pochodzące od naczelnych geny metalotioneiny, deaminazy adenozynowej, dekarboksylazy ornitynowej itp.

Na przykład, komórki stransformowane genem selekcyjnym DHFR najpierw identyfikuje się przez hodowanie wszystkich transformantów w podłożu hodowlanym, które zawiera metotreksat (Mtx), współzawodniczego antagonistę DHFR. Gdy wykorzystuje się DHFR, odpowiednią komórką gospodarza jest linia komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) defektywna pod względem aktywności DHFR.

Alternatywnie, komórki gospodarza (szczególnie gospodarza typu dzikiego, które zawierają endogenną DHFR) transformowane lub kotransformowane sekwencjami DNA kodującymi przeciwciało, białko DHFR typu dzikiego i inny marker selekcyjny, taki jak 3'-fosfotransferaza aminoglikozydowa (APH), można selekcjonować przez wzrost komórek w podłożu zawierającym czynnik selekcyjny dla markera selekcyjnego, taki jak antybiotyk aminoglikozydowy, np. kanamycynę, neomycynę lub G418 (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 965 199).

Odpowiednim genem selekcyjnym do stosowania w drożdżach jest gen trp1, obecny w plazmidzie drożdżowym Yrp7 (Stinchcomb i in., Nature 282: 39 (1979)). Gen trp1 zapewnia marker selekcyjny dla zmutowanego szczepu pozbawionego zdolności wzrostu w obecności tryptofanu, na przykład ATCC numer 44076 lub PAP4-1, Jones, Genetics 85: 12 (1977). Obecność lezji trp1 w genomie drożdżowych komórek gospodarza zapewnia efektywny sposób wykrywania transformacji przez wzrost w obecności tryptofanu. Podobnie, defektywne pod względem Leu2 szczepy drożdży (ATCC 20 622 lub 38 626) komplementuje się znanymi plazmidami posiadającymi gen Leu2.

Ponadto, wektory pochodzące z kolistego plazmidu 1,6 pm, pKDl, można stosować do transformowania drożdży Kluyveromyces. Alternatywnie, dla K. lactis opisywano układ ekspresyjny do wytwarzania na dużą skalę zrekombinowanej chymozyny cielęcej, Van der Berg, Bio/Technology 8: 135 (1990). Ujawniono również stabilne, występujące w wielu kopiach wektory ekspresyjne do sekrecji dojrzałej, zrekombinowanej albuminy surowicy ludzkiej przez przemysłowe szczepy Kluyveromyces, Fleer i in., Bio/Technology 9: 96S-975 (1991).

(iv) Promotor

Wektory ekspresyjne i klonujące zazwyczaj zawierają promotor, który jest rozpoznawany przez organizm gospodarza i jest połączony w sposób umożliwiający działanie z kwasem nukleinowym kodującym przeciwciało. Promotory odpowiednie do stosowania w gospodarzach prokariotycznych obejmują promotor phoA_r układy promotorowe β-laktamazowy i laktozowy, promotor alkalicznej fosfatazy, tryptofanowy układ promotorowy (trp) oraz promotory hybrydowe, takie jak promotor tac. Jednakże, odpowiednie są inne znane promotory bakteryjne. Promotory do stosowania w układach bakteryjnych będą także zawierały sekwencję Shine-Delgarno (S.D.) połączoną w sposób umożliwiający działanie z DNAkodującym przeciwciało.

Sekwencje promotorowe są znane dla eukariontów. Właściwie wszystkie geny eukariotyczne posiadają regiony bogate w AT, zlokalizowane około 25 do 30 zasad przed miejscem inicjacji tran42

PL 194 562 B1 skrypcji. Inną sekwencją, występującą od 70 do 80 zasad przed miejscem początku transkrypcji w wielu genach jest region CNCAAT, w którym N może być dowolnym nukleotydem. Na końcu 3' większości genów eukariotycznych znajduje się sekwencja AATAAA, która może być sygnałem do dołączania odcinka poli A na końcu 3' sekwencji kodującej. Wszystkie z tych sekwencji odpowiednio wstawia się do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych.

Przykłady odpowiednich sekwencji promotorowych do stosowania w gospodarzach drożdżowych obejmują promotory kinazy 3-fosfoglicerynianowej lub innych enzymów glikolitycznych, takich jak enolza, dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanowa, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza.

Innymi promotorami drożdżowymi, będącymi promotorami indukowalnymi, posiadającymi dodatkową zaletę kontrolowania transkrypcji przez warunki wzrostu są regiony promotorowe dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów degradujących związanych z metabolizmem azotowym, metalotioneiny, dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego oraz enzymów odpowiedzialnych za wykorzystywanie maltozy i galaktozy. Odpowiednie wektory i promotory stosowane do ekspresji w drożdżach opisano ponadto w opisie patentowym nr EP 73 657. Z promotorami drożdżowymi dogodnie stosuje się również drożdżowe sekwencje wzmacniające.

Transkrypcję przeciwciała z wektorów w ssaczych komórkach gospodarza kontrolują, na przykład, promotory otrzymane z genomów wirusów, takich jak wirus polioma, wirus ospy drobiu, adenowirus (taki jak adenowirus 2), wirus brodawczaka bydlęcego, małpi wirus mięsaka, cytomegalowirus, retrowirus, wirus zapalenia wątroby typu B, a najdogodniej małpi wirus 40 (SV40), z heterologicznych promotorów ssaczych, np. promotora aktyny lub promotora immunoglobuliny, z promotorów białek szoku cieplnego - pod warunkiem, że promotory takie są kompatybilne z układami komórek gospodarza.

Wczesny i późny promotor wirusa SV40 dogodnie uzyskuje się w postaci fragmentu restrykcyjnego SV40, który zawiera także wirusowe miejsce początku replikacji SV40. Natychmiastowy wczesny promotor cytomegalowirusa ludzkiego dogodnie otrzymuje się w postaci fragmentu restrykcyjnego HindlII E. Układ do ekspresji DNA w gospodarzach ssaczych z zastosowaniem wirusa brodawczaka bydlęcego jako wektora ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 419 446. Modyfikację tego układu opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 601 978. Alternatywnie, ekspresję cDNA ludzkiego interferonu β prowadzono w komórkach mysich pod kontrolą promotora kinazy tymidynowej z wirusa opryszczki. Alternatywnie, jako promotor można stosować długie powtórzenia terminalne wirusa mięsaka Rousa.

(v) Element wzmacniający

Transkrypcję DNA kodującego przeciwciało według tego wynalazku w wyższych organizmach eukariotycznych często zwiększa się przez wstawienie do wektora sekwencji wzmacniającej. Obecnie znanych jest wiele sekwencji wzmacniających z genów ssaczych (globiny, elestazy, α-fetoproteiny i insuliny). Zazwyczaj jednakże, stosuje się sekwencję wzmacniającą z wirusa komórek eukariotycznych. Przykłady obejmują sekwencję wzmacniającą położone po późnej stronie miejsca początku replikacji (bp 100-270), sekwencję wzmacniającą wczesnego promotora cytomegalowirusa, sekwencję wzmacniającą polioma po późnej stronie miejsca początku replikacji oraz sekwencje wzmacniające adenowirusów patrz także Yaniv, Nature 297: 17-18 (1962), gdzie przedstawiono elementy wzmacniające do aktywacji promotorów eukariotycznych. Sekwencję wzmacniającą można włączyć do wek-tora w położeniu 3'- lub 5'-końcowym w stosunku do sekwencji kodującej przeciwciało, ale dogodnie jest ona położona w miejscu po stronie 5' promotora.

(vi) Składowa odpowiedzialna za terminację transkrypcji

Wektory ekspresyjne stosowane w eukariotycznych komórkach gospodarza (komórki drożdży, grzybów, owadów, roślin, zwierząt, człowieka, bądź posiadające jądra komórki z organizmów wielokomórkowych) będą także zawierać sekwencje konieczne do terminacji transkrypcji i stabilizacji mRNA. Sekwencje takie są powszechnie dostępne z 5'-, a niekiedy 3'-końcowych regionów nie ulegających translacji eukariotycznych lub wirusowych DNA, bądź cDNA.

Regiony te zawierają odcinki nukleotydów ulegające transkrypcji w postaci poliadenylowanych fragmentów w nie ulegającej translacji części mRNA kodującego przeciwciało. Jedną z użytecznych składowych odpowiedzialnych za terminację transkrypcji jest region poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu, patrz opis patentowy numer WO 94/11026 i ujawniony w nim wektor ekspresyjny.

PL 194 562 B1 (vii) Selekcja i transformacja komórek gospodarza

Komórkami gospodarza odpowiednimi w niniejszym opisie do klonowania lub ekspresji DNA w wektorach są opisane powyżej komórki prokariotyczne, drożdży lub komórki wyższych organizmów eukariotycznych. Odpowiednie do tego celu prokariota obejmują bakterie właściwe, takie jak Gram-ujemne lub Gram-dodatnie organizmy, na przykład bakterie jelitowe, takie jak Escherichia, np. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, np. Salmonella typhimurium, Serratia, np. Serratia marcescens i Shigella, jak również gatunki z rodzaju Bacillus, takie jak B. subtilis i B. Licheniformis (np. B. licheniformis 41P ujawniony w opisie patentowym nr DD 266 710 opublikowanym 12 kwietnia 1989 roku), Pseudomonas, takie jak P. aeruginosa i Streptomyces. Zalecanym gospodarzem do klonowania E. coli jest E. coli 294 (ATCC 31 446), chociaż inne szczepy, takie jak E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537) i E. coli W3110 (ATCC 27 325) są odpowiednie. Przykłady te są raczej ilustrujące niż ograniczające.

Poza prokariota, odpowiednimi gospodarzami do klonowania lub ekspresji wektorów kodujących przeciwciała są mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak grzyby nitkowate lub drożdże. Saccharomyces cerevisiae lub zwykłe drożdże piekarskie, są najpowszechniej stosowane spośród gospodarzy będących mikroorganizmami należącymi do niższych eukariota. Jednakże, pewna liczba innych rodzajów, gatunków i szczepów jest powszechnie dostępna i użyteczna dla celów tego wynalazku, tak jak Schizosaccharomyces pombe; gospodarze z rodzaju Kluyveromyces, tacy jak, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii; yarrowia (europejski opis patentowy nr 402 226); Pichia pastoris (europejski opis patentowy nr 183 070); Candida; Trichoderma reesia (europejski opis patentowy nr 244 234); Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i gospodarze z rodzaju Aspergillus, tacy jak A. nidulans i A. niger.

Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji glikozylowanych przeciwciał pochodzą z organizmów wielokomórkowych. W zasadzie, odpowiednie są hodowle komórkowe dowolnych wyższych organizmów eukariotycznych, czy to hodowle pochodzące z kręgowców, czy bezkręgowców. Przykłady komórek bezkręgowców obejmują komórki roślin i owadów, Luckow i in., Bio/Technology 6, 47-55 (198S); Miller i in., Genetic Engineering, Setlow i in., red., tom 8, str. 227-279) (Plenam Publishing 1986); Mseda i in., Nature 315, 592-594 (1985). Zidentyfikowano liczne szczepy bakulowirusowe oraz warianty i odpowiadające permisyjne owadzie komórki gospodarza pochodzące z gospodarzy, takich jak Spodoptera frugiperda (gąsienica), Aedes aegypti (komar), Aedes albopictus (komar), Drososophila melanogaster (wywilżna karłówka) i Bombyx mori. Linią komórkową, która jest przedmiotem szczególnego zainteresowania jest linia komórek owadzich sf9. Szereg szczepów wirusowych do transfekcji jest powszechnie dostępnych, np. wariant L-1 Autographa californica NPV oraz szczep Bm-5 Bombyx mori NPV i takie wirusy mogą być stosowane jako wirusy zgodnie z wynalazkiem, w szczególności do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda. Ponadto, jako gospodarzy można także wykorzystywać hodowle komórek roślin bawełny, kukurydzy, ziemniaków, soi, petunii, pomidorów i tytoniu.

Jednakże, przedmiotem największego zainteresowania stały się komórki kręgowców i namnażanie komórek kręgowców w hodowlach (hodowlach tkankowych) stało się rutynową procedurą, patrz Tissue Culture, Academic Press, Kruse i Patterson, red. (1973). Przykładami użytecznych linii ssaczych komórek gospodarza są linia małpich komórek nerki CV1 stransformowana SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linia ludzkich komórek zarodkowych nerki (komórki 293 lub 293 zsubklonowane do wzrostu w hodowli zawiesinowej, Graham i in., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977); komórki nerki noworodków chomika (BHK, ATCC CCL 10), komórki jajnika chomika chińskiego/DHFR (CHO, Urlaub i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mysie komórki Sertoli'ego (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980); małpie komórki nerki (CVI ATCC CCL 70); komórki koczkodana zielonego (VERO-76, ATCC CRL-1587); komórki wątroby szczura rasy Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ludzkie komórki płuc (W138, ATCC CCL 75); ludzkie komórki wątroby (Hep G2, HB 8065); mysie komórki nowotworu sutka (MMT 060562, ATCC CC151); komórki TRL (Mather i in., Annals N. Y. Academy Sci. 383: 44-68 (1982)); komórki MRC 5; komórki FS4 i linia ludzkich komórek wątrobiaka (Hep G2).

Komórki gospodarza transformuje się opisanymi powyżej wektorami ekspresyjnymi lub klonującymi do wytwarzania przeciwciał i hoduje w konwecjonalnych podłożach odżywczych zmodyfikowanych w odpowiedni sposób do indukcji promotorów, selekcji transformantów lub amplifikowania genów kodujących pożądane sekwencje.

(viii) Hodowanie komórek gospodarza

Komórki gospodarza stosowane do wytwarzania mutanta przeciwciała według tego wynalazku można hodować w szeregu podłoży. Komercjalnie dostępne podłoża takie jak Ham's F10 (Sigma),

PL 194 562 B1

Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPML-1640 (Sigma) i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) są odpowiednie do hodowli komórek gospodarza. Ponadto, jako podłoże hodowlane dla komórek gospodarza można stosować dowolne podłoże opisane przez Ham i in., Meth. Enzymol. 58: 44 (1979), Barnes i in., Anal. Biochem. 102; 255 (1980), opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o nr 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 lub 5 122 469, światowy opis patentowy nr 87/00195 bądź ponowne wydanie opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 30 985. Jeśli jest to konieczne, każde z tych podłoży można uzupełnić hormonami i/lub innymi czynnikami wzrostowymi (takimi jak insulina, transferyna lub epidermalny czynnik wzrostu), solami (takimi jak chlorkami X, gdzie X jest atomem sodu, wapnia, magnezu; i fosforanami), buforami (takimi jak

TM

HEPES), nukleotydami (takimi jak adenozyna i tymidyna), antybiotykami (takimi jak GENTAMYCLN ), pierwiastkami śladowymi (zdefiniowanymi jako związki nieorganiczne zazwyczaj obecne w mikromolowym stężeniu końcowym) i glukozą, bądź równoważnym źródłem energii. Można również wprowadzić, znane specjalistom w tej dziedzinie, wszelkie inne konieczne uzupełnienia we właściwym stężeniu. Warunki hodowli, takie jak temperatura, pH i podobne są takie, jak te wcześniej stosowane dla komórek gospodarza wyselekcjonowanych do ekspresji i będą one oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.

(ix) Oczyszczanie przeciwciał

Jeśli stosuje się techniki rekombinacji, mutanta przeciwciała można wytwarzać wewnątrzkomórkowo, w przestrzeni periplazmatycznej lub może on ulegać bezpośrednio sekrecji do podłoża. Jeśli mutant przeciwciała wytwarzany jest wewnątrzkomórkowo, podczas pierwszego etapu usuwa się, na przykład przez wirowanie lub ultrafiltrację, stałe pozostałości albo komórki gospodarza, albo zlizowane fragmenty. Carter i in., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisują procedurę izolowania przeciwciał, które ulegają wydzielaniu do przestrzeni periplazmatycznej E. coli. W skrócie, odwirowaną masę komórkową rozmraża się w obecności octanu sodowego (pH 3,5), EDTA i fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) w ciągu około 30 minut. Szczątki komórkowe można usunąć przez wirowanie. Jeśli mutant przeciwciała wydzielany jest do podłoża, generalnie najpierw zatęża się supernatanty z takich układów ekspresyjnych, stosując komercjalnie dostępny sączek do zatężania białek, na przykład jednostkę do ultrafiltracji Amicon lub Millipore Pellicon. Na każdym z uprzednich etapów można włączyć inhibitor proteaz, taki jak PMSF, dla zahamowania proteolizy oraz antybiotyki dla zapobiegnięcia wzrostu przypadkowych zanieczyszczeń.

Kompozycję przeciwciała przygotowanego z komórek można oczyszczać stosując na przykład chromatografię na hydroksyloapatycie, elektroforezę żelową, dializę i chromatografię powinowactwa, przy czym zalecaną techniką oczyszczania jest chromatografia powinowactwa. To, czy białko A jest odpowiednie jako ligand w chromatografii powinowactwa, zależy od gatunku i izotypu domeny Fc immunoglobuliny, która jest obecna w mutancie przeciwciała. Białko A można stosować do oczyszczania przeciwciał, które są oparte na ludzkich ciężkich łańcuchach γ|, γ2 lub γ4 (Lindmark i in., J. Immunol Meth. 62: 1-13 (1983)). Białko G jest zalecane do wszystkich izotypów mysich i ludzkiego γ3 (Guss i in., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)).

Matriks, do której przyłącza się ligand powinowactwa, najczęściej jest agaroza, ale dostępne są inne matriks. Mechanicznie stabilne matriks, takie jak szkło o kontrolowanej wielkości porów lub poli(styrenodiwinylo)benzen umożliwiają większe szybkości przepływu i krótsze czasy obróbki niż można uzyskać dla agarozy. Jeśli mutant przeciwciała zawiera domenę CH3, użyteczna do oczyszczania jest żywica Bakerbond ABXTM (J. T Baker. Phillipsburg, NJ). Dostępne są również inne techniki oczyszczania białek, takie jak frakcjonowanie na kolumnach jonowymiennych, wytrącanie etanolem, HPLC z odwróconymi fazami, chromatografia na krzemionce, chromatografia na złożu heparynaSEPHAROSE™, chromatografia na żywicy aniono- lub kationowymien-nej (takiej jak kolumna z kwasem poliaspartylowym), chromatoogniskowanie, SDS-PAGE i wytrącanie siarczanem amonu, zależnie od odzyskiwanego mutanta przeciwciała.

Po wstępnym etapie(ach) oczyszczania, mieszaninę zawierającą mutanta przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania oraz zanieczyszczenia można poddawać chromatografii oddziaływań hydrofobowych w niskim pH, stosując bufor do elucji o pH pomiędzy około 2,5-4,5, dogodnie w niskim stężeniu soli (np. od około 0 do 0,25 M).

C. Postacie farmaceutyczne

Postacie terapeutyczne polipeptydu lub przeciwciała przygotowuje się do przechowywania jako postacie liofilizowane lub roztwory wodne, przez zmieszanie polipeptydu o pożądanym stopniu czystości z dowolnymi „farmaceutycznie dopuszczalnymi” nośnikami, zaróbkami lub stabilizatorami zazwyPL 194 562 B1 czaj wykorzystywanymi w tej dziedzinie (z których wszystkie określa się terminem „zaróbki”), na przykład czynnikami buforującymi, czynnikami stabilizującymi, środkami konserwującymi, środkami izotonizującymi, detergentami niejonowymi, przeciwutleniaczami i innymi różnorodnymi dodatkami (patrz

Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16, A. Osol, red. (1980)). Takie dodatki muszą być nietoksyczne dla biorcy w wykorzystywanych dawkach i stężeniach.

Czynniki buforujące pomagają utrzymywać pH w zakresie, który jest zbliżony do warunków fizjologicznych. Obecne są one korzystnie w stężeniu w zakresie od około 2 mM do około 50 mM. Odpowiednie czynniki buforujące do stosowania zgodnie z wynalazkiem mają obejmujmować kwasy zarówno organiczne, jak i nieorganiczne oraz ich sole, takie jak bufory cytrynianowe (np. mieszanina cytrynian monosodowy-cytrynian disodowy, mieszanina kwas cytrynowy-cytrynian trisodowy, mieszanina kwas cytrynowy-cytrynian monosodowy itp.), bufory bursztynianowe (np. mieszanina kwas bursztynowy-bursztynian monosodowy, mieszanina kwas bursztynowy-wodorotleneksodowy, mieszanina kwas bursztynowy-bursztynian disodowy itp.), bufory winianowe (np. mieszanina kwas winowy-winian sodowy, mieszanina kwas winowy-winian potasowy, mieszanina kwas winowy-wodorotlenek sodowy itp.), bufory fumaranowe (np. mieszanina kwas fumarowy-fumaran monosodowy itp.), bufory fumaranowe (np. mieszanina kwas fumarowy-fumaran monosodowy, mieszanina kwas fumarowy-fumaran disodowy, mieszanina fumaran monosodowy-fumaran disodowy itp.), bufory glukonianowe (np. mieszanina kwas glukonowy-glukonian sodowy, mieszanina kwas glukonowy-wodorotlenek sodowy, mieszanina kwas glukonowy-glukonian potasowy itp.), bufor szczawianowy (np. mieszanina kwas szczawiowy-szczawian sodowy, mieszanina kwas szczawiowy-wodorotlenek sodowy, mieszanina kwas szczawiowy-szczawian potasowy itp.), bufory mleczanowe (np. mieszanina kwas mlekowy-mleczan sodowy, mieszanina kwas mlekowy-wodorotlenek sodowy, mieszanina kwas mlekowy-mleczan potasowy itp.) i bufory octanowe (np. mieszanina kwas octowy-octan sodowy, mieszanina kwas octowy-wodorotlenek sodowy itp.). Dodatkowo można wymienić bufory fosforanowe, bufory histydynowe i sole trimetyloaminowe, takie jak Tris.

Konserwanty dodaje się w celu zahamowania wzrostu mikroorganizmów i dodaje się je w ilościach pozostających w zakresie od 0,2-1% (w/v). Odpowiednie konserwanty do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą obejmować fenol, alkohol benzylowy, metakrezol, paraben metylowy, paraben propylowy, chlorek oktadecylodimetylobenzyloamonowy, halogenki benzalkoniowe (np. chlorek, bromek, jodek), chlorek heksametoniowy, parabeny alkilowe, takie jak paraben metylowy lub propylowy, katechinę, rezorcynę, cykloheksanol i 3-pentanol.

Środki izotonizujące, określane czasami „stabilizatorami” są obecne w celu zapewnienia izotoniczności płynnych kompozycji według niniejszego wynalazku i obejmują poliwodorotlenowe alkohole cukrowe, dogodnie triwodorotlenowe lub wyższe alkohole cukrowe, takie jak gliceryna, erytrytol, arabitol, ksylitol, sorbitol i mannitol. Alkohole poliwodorotlenowe mogą być obecne w ilościach pozostających w zakresie pomiędzy 0,1% a 25% wagowych, dogodnie od 1% do 5%, biorąc pod uwagę względne ilości innych składników.

Stabilizatory odnoszą się do szerokiej kategorii zaróbek, które mogą różnić się funkcją od czynników spęczniających do dodatków, które solubilizują czynnik terapeutyczny lub zapobiegają denaturacji bądź przyleganiu do ściany pojemnika. Typowymi stabilizatorami mogą być poliwodorotlenowe alkohole cukrowe (wyliczone powyżej); aminokwasy, takie jak arginina, lizyna, glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, alanina, ornityna, L-leucyna, 2-fenyloalanina, kwas glutaminowy, treonina itd., cukry organiczne lub alkohole cukrowe, takie jak laktoza, trehaloza, stachioza, mannitol, sorbitol, ksylitol, rybitol, mioinozytol, galaktitol, glicerol i podobne, włącznie z cyklolitolami, takimi jak inozytol; glikol polietylenowy; polimery aminokwasowe; czynniki redukujące zawierające siarkę, takie jak mocznik, glutation, kwas tioktowy, tioglikolan sodowy, tioglicerol, α-monotioglicerol i tisiarczan sodowy; polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (t.j. < 10 reszt); białka, takie jak albumina surowicy ludzkiej, albumina surowicy bydlęcej, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylipirolidonowe pochodne monosacharydów, takich jak ksyloza, mannoza, fruktoza, glukoza; disacharydów, takich jak laktoza, maltoza, sacharoza i trisacharydów, takich jak rafinoza; polisacharydów, takich jak dekstran. Stabilizatory są obecne w zakresie od 0,1 do 10000 części wagowych na jedną część wagową białka aktywnego.

Niejonowe czynniki powierzchniowo czynne lub detergenty (znane również jako „czynniki zwilżające”) obecne są w celu wspomagania solubilizacji czynnika terapeutycznego jak również, aby chronić białko przed indukowaną mieszaniem agregacją, co umożliwia również eksponowanie preparatu na powierzchniowe naprężenie ścinające bez powodowania denaturacji białka. Odpowiednie nie46

PL 194 562 B1 jonowe czynniki powierzchniowo czynne obejmują polisorbaty (20, 80 itp.), polioksamery (184, 188 itp.), Pluronic®, poliole, polioksyetylenowane monoetery sorbitanu (Tween®-20, Tween®-80, itp.).

Niejonowe czynniki powierzchniowo czynne są obecne w zakresie od około 0,05 mg/ml do około

1,0 mg/ml, dogodnie od około 0,07 mg/ml do około 0,2 mg/ml.

Dodatkowe różnorodne zaróbki obejmują czynniki spęczniające (np. skrobię), czynniki chelatujące (np. EDTA), przeciwutleniacze (np. kwas askorbinowy, metioninę, witaminę E) i kosolwenty.

Postać według realizacji wynalazku może również zawierać, jeśli jest to konieczne w przypadku konkretnego wskazania, dla którego przeprowadza się traktowanie, więcej niż jeden składnik aktywny, dogodnie składniki wykazujące uzupełniające aktywności, które nie działają niekorzystnie na siebie nawzajem. Na przykład, może być pożądane zapewnienie ponadto czynnika immunosupresyjnego. Takie cząsteczki są dogodnie obecne w połączeniu w ilościach, które są skuteczne do zamierzonych celów.

Składniki aktywne mogą być również zamknięte w mikrokapsułkach przygotowanych, na przykład, technikami koacerwacji lub przez polimeryzację międzyfazową, na przykład mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych i mikrokapsułkach poli(metylometacylanowych), odpowiednio, w koloidalnych układzie dostarczania leku (na przykład liposomach, mikrokuleczkach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząstkach i nanokapsułkach), bądź w makroemulsjach. Takie techniki ujawniono w Remington's Pharmaceutical Science, wydanie 16, A. Osal, red. (1980).

Postacie, które mają być stosowane do podawania in vivo muszą być jałowe. Można to łatwo osiągnąć, na przykład przez sączenie przez jałowe sączki membranowe.

Można przygotować preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują połprzepuszczalne matriks ze stałych polimerów hydrofobowych zawierające mutanta przeciwciała, które to matriks występują w postaci artykułów o nadanym kształcie, np. błon lub mikrokapsułek.

Przykłady matriks o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (na przykład poli(2-hydroksyetylometakrylan) lub poli(winyloalkohol)), polilaktydy (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 773 919), kopolimery kwasu L-glutaminowego i L-glutaminianu etylowego, niedegradowalny octan etylenowinylowy, degradowalne kopolimery kwasu mlekowego i kwasu glikolowego, takie jak LUPRON DEPOT™ (iniekcyjne mikrokuleczki składające się z kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy i octanu leuprolidu) i kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy.

Podczas gdy polimery, takie jak octan etylenowinylowy i kwas mlekowy-kwas glikolowy umożliwiają uwalnianie cząsteczek w ciągu ponad 100 dni, pewne hydrożele uwalniają białka w ciągu krótszego okresu czasu.

Kiedy zamknięte w kapsułkach przeciwciała pozostają w organizmie przez długi czas mogą ulegać denaturacji lub agregacji w wyniku ekspozycji na wilgoć w temperaturze 37°C, co powoduje utratę aktywności biologicznej i ewentualne zmiany immunogenności. Można opracować praktyczne strategie mające zapewnić stabilizację w zależności od mechanizmu tych zmian. Na przykład, jeśli stwierdzi się, że mechanizm agregacji polega na wewnątrzcząsteczkowym tworzeniu wiązań S-S przez zmianę tio-disiarczek, to stabilizację można osiągnąć przez modyfikację reszt sulfhydrylowych, liofilizację z kwaśnych roztworów, kontrolowanie wilgotności, stosując odpowiednie dodatki i opracowując specyficzne kompozycje matriks polimerowych.

Ilość terapeutycznego polipeptydu, przeciwciała lub jego fragmentu, która będzie skuteczna w traktowaniu konkretnego zaburzenia lub stanu zależeć będzie od rodzaju zaburzenia lub stanu i można ją określić standardowymi technikami klinicznymi. Jeśli jest to możliwe, pożądane jest określenie krzywej dawka-odpowiedź i sprawdzenie kompozycji najpierw in vitro, a następnie w odpowiednim układzie modelu zwierzęcego przez testowaniem u ludzi. Jednakże, opierając się na istniejącej wiedzy, kompozycja farmaceutyczna skuteczna w sprzyjaniu przeżywania neuronów czuciowych może zapewniać miejscowe stężenie czynnika terapeutycznego w zakresie około od 5 do 20 ng/ml, a dogodnie w zakresie około od 10 do 20 ng/ml.

W kolejnym szczególnym rozwiązaniu wynalazku, kompozycja farmaceutyczna skuteczna w sprzyjaniu wzrostowi i przeżywania neuronów siatkówki może zapewnić miejscowe stężenie czynnika terapeutycznego w zakresie około od 10 do 100 ng/ml.

W zalecanym rozwiązaniu, wodny roztwór terapeutycznego polipeptydu, przeciwciała lub jego fragmentu podaje się przez iniekcję podskórną. Każda dawka może pozostawać w zakresie od około 0,5 pg do około 50 pg na kilogram masy ciała lub dogodniej, od około 3 pg do około 30 pg na kilogram masy ciała.

PL 194 562 B1

Schemat dawkowania przy podawaniu podskórnym może wahać się od podawania raz w tygodniu do podawania codziennego, w zależności od licznych czynników klinicznych, obejmujących rodzaj choroby, stan zaawansowania choroby i wrażliwość osobniczą na czynnik terapeutyczny.

D. Nie terapeutyczne zastosowania mutanta przeciwciała

Mutanty przeciwciał według wynalazku można stosować jako czynniki do oczyszczania na zasadzie powinowactwa. W procesie tym, przeciwciała immobilizuje się na fazie stałej, takiej jak żywica Sephadex lub bibuła filtracyjna, stosując metody dobrze znane w nauce. Immobilizowanego mutanta przeciwciała kontaktuje się z próbką zawierającą antygen, który ma zostać oczyszczony, a następnie nośnik przemywa się odpowiednim rozpuszczalnikiem, który usunie zasadniczo całość materiału próbki, z wyjątkiem oczyszczanego antygenu, który pozostaje związany z immobilizowanym mutantem przeciwciała. Wreszcie, nośnik przemywa się innym odpowiednim nośnikiem, takim jak bufor glicynowy, pH 5,0, który będzie uwalniał antygen z mutanta przeciwciała.

Zmutowane przeciwciała mogą być również użyteczne w oznaczeniach diagnostycznych, np. do wykrywania ekspresji antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w określonych komórkach, tkankach lub surowicy.

Do zastosowań diagnostycznych, mutanta przeciwciała będzie się zazwyczaj znakować wykrywalną grupą. Dostępne są liczne znaczniki, które można ogólnie podzielić na następujące kategorie.

(a) Izotopy promieniotwórcze, takie j ak ³⁶S, ¹⁴C, ¹²⁵5, ³H i ¹³¹J mutanta przeciwciała można wyznakować izotopem promieniotwórczym stosując techniki opisane na przykład w Current Protocols in Immunology, tomy 2-2, Coligen i in., red., Wiley-Lnterscience, New York, Pubs. (2 992), a promieniotwórczość można mierzyć stosując licznik scyntylacyjny.

(b) Dostępne są znacznik 3luor'escency-ne, taike j ak chelaty pierwiastkówziem i-zadloch jchelaty europu) lub fluoresceinę i jej pochodne, rodaminę i jej pochodne, dansyl, Lissaminę, fikoerytrynę i Texas Red. Znaczniki fluorescencyjne można koniugować z mutantem przeciwciała stosując techniki opisane na przykład w Current Protocols in Immunology, supra. Fluorescencję można określać ilościowo stosując fluorymetr.

(c) Dossępne są tóżne znaczmld enzym-substrat i opis patentowy StanówZjednoczonych Ameryki zapewnia przegląd niektórych z nich. Enzym generalnie katalizuje chemiczną zmianę chromogennego substratu, którą można mierzyć stosując różne techniki. Na przykład, enzym może katalizować zmianę barwy substratu, którą można mierzyć spektrofotometrycznie. Alternatywnie, enzym może zmieniać fluorescencję lub chemiluminescencję substratu. Techniki ilościowego określania zmian fluorescencji opisano powyżej.

Substrat chemiluminescencyjny uzyskuje wzbudzone elektrony w wyniku reakcji chemicznej, a następnie może emitować światło, które można mierzyć (stosując na przykład chemiluminometr) lub które dodtarcza energii akceptorowi fluorescencyjnemu. Przykłady znaczników enzymatycznych obejmują lucyferazy (np. lucyferazę świetlików i lucyferazę bakteryjną; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 737 456), lucyferynę, 2,3-dihydroftaloazynodiony, dehydrogenazę jabłczanową, ureazę, peroksydazę, taką jak peroksydaza chrzanowa (HRPO), alkaliczną fosfatazę, β-galaktozydazę, glukoamylazę, lizozym, oksydazy cukrów (np. oksydazę glukozową, oksydazę galaktozową i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową), oksydazy związków heterocyklicznych (takie jak urikaza i oksydaza ksantynowa), laktoperoksydazę, mikroperoksydazę i podobne. Techniki koniugowania enzymów z przeciwciałami opisano w O'Sullivan i in., Methods for thr Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, w: Methods in Enzym. (red. J. Langone i H. Van Vunakis), Academic Press, Nowy Jork, 73: 247-266 (2982).

Przykłady kombinacji enzym-substrat obejmują na przykład:

(i) Peroksydazę chrzanową (HRPO) z nadtlenkiem wodoru jako substratem, gdzie nadtlenek wodoru utlenia prekursor barwnika (np. ortofenylenodiaminę (OPD) lub chlorowodorek 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB));

(ii) Alkaliczną fosfatazę (AP), z fosforanem p-nitrofenylowym jako chromogennym substratem; i (iii) β-D-galaktozydazę (p-D-Gal), z substratem chromogennym (np. p-nitrofenylo-e-D-galaktozydem) lub substratem fluorogennym, 4-metyloumbelliferyl-p-e-galaktozydem.

Dla specjalistów w tej dziedzinie dostępne są liczne inne kombinacje enzym-substrat. W celu zapoznania się z ich ogólnym przeglądem, patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o nr 4 275 249 i 4 328 980.

Niekiedy znacznik koniuguje się pośrednio z mutantem przeciwciała. Specjalista będzie świadomy istnienia różnych technik, którymi to można osiągnąć. Na przykład, mutanta przeciwciała można

PL 194 562 B1 koniugować z biotyną, a którykolwiek znacznik z wymienionych powyżej trzech szerokich kategorii można koniugować z awidyną lub odwrotnie. Biotyna wiąże się selektywnie z awidyną, a zatem znacznik można koniugować z mutantem przeciwciała w taki pośredni sposób. Alternatywnie, dla uzyskania pośredniej koniugacji znacznika z mutantem przeciwciała, mutanta przeciwciała koniuguje się z małym haptenem (np. digloksyną), a jeden z wymienionych powyżej znaczników różnego typu koniuguje się z mutantem przeciwciała skierowanym przeciw haptenowi (np. przeciwciałem skierowanym przeciw digloksynie). A zatem, można uzyskać pośrednią koniugację znacznika z mutantem przeciwciała.

W innym rozwiązaniu wynalazku, mutant przeciwciała nie musi być znakowany, a jego obecność można wykrywać stosując znakowane przeciwciało, które wiąże się z mutantem przeciwciała.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można wykorzystywać w jakiejkolwiek znanej metodzie oznaczania, takiej jak oznaczenie współzawodniczego wiązania, bezpośrednie i pośrednie oznaczenia typu „sandwich” i oznaczenia immunoprecypitacji, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual for Techniques, str. 147-158 (CRC Press, Inc, 1987).

Oznaczenia wiązania współzawodniczego polegają na zdolności wyznakowanego standardu do współzawodnictwa z testowaną próbką o wiązanie z ograniczoną ilością mutanta przeciwciała. Ilość antygenu w testowanej próbce jest odwrotnie proporcjonalna do ilości standardu, który zostaje związany z przeciwciałem. Dla ułatwienia określania ilości standardu, który ulega wiązaniu, przeciwciała generalnie nie solubilizuje się przed i po współzawodnictwie. W wyniku, standard i testowaną próbkę, które zostały związane z przeciwciałem można dogodnie oddzielić od niezwiązanych standardu i testowanej próbki.

Oznaczenia typu „sandwich” obejmują stosowanie dwóch przeciwciał, z których każde jest zdolne do wiązania z odrębną immunogenną częścią lub epitopem, białka, które ma być wykrywane. W oznaczeniu typu „sandwich” przeznaczoną do analizy testowaną próbkę wiąże się z pierwszym przeciwciałem, które zimmobilizowano na stałym nośniku, a następnie z testowaną próbką wiąże się drugie przeciwciało, a zatem powstaje nierozpuszczalny trójskładnikowy kompleks, patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 376 110.

Drugie przeciwciało może samo być wyznakowane wykrywalną grupą (bezpośrednie oznaczenie typu „sandwich”) lub jego ilość można mierzyć stosując przeciwciało skierowane przeciw immunoglobulinie, które jest wyznakowane wykrywalną grupą (pośrednie oznaczenie typu „sandwich”). Na przykład, jednym z rodzajów oznaczeń typu „sandwich” jest oznaczenie EIISA, w którym to przypadku wykrywalną grupą jest enzym.

Do badań immunohistochemicznych, próbka nowotworu może być świeża lub zamrożona, bądź może zostać zatopiona w parafinie i utrwalona środkiem konserwującym, takim jak na przykład formalina.

Przeciwciała można stosować w oznaczeniach diagnostycznych in vivo. Generalnie, mutanta pirzedwctata zna^kuje s^ię ra^dionu^klidamⁱ (tatom ja^{k 111|}π, ⁹⁹·^ ¹⁴( ¹³¹J, ³H, ^32p to^{b 35s}) tato ^że nowotwór może zostać zlokalizowany przy zastosowaniu immunoscyntygrafii.

E. Zestawy diagnostyczne

Dla wygody, polipeptyd lub przeciwciało według wynalazku można dostarczyć w zestawie, tj. opakowanym zestawie odczynników we wcześniej określonych ilościach i z instrukcją prowadzenia oznaczenia diagnostycznego. Jeśli mutanta przeciwciała znakuje się enzymem, zestaw będzie zawierał wymagane przez enzym substraty i kofaktory (np. prekursor substratowy, który zapewnia wykrywalny chromofor lub flurofor). Ponadto, zestaw może obejmować inne dodatki, takie jak stabilizatory, bufory (np. bufor blokujący lub bufor lizujący) i podobne.

Względne ilości różnych odczynników mogą być zróżnicowane w szerokim zakresie w celu zapewnienia stężeń odczynników w roztworze, które zasadniczo optymalizują czułość oznaczenia. W szczególności, odczynniki do oznaczenia można dostarczać jako suche proszki, zazwyczaj liofilizowane, włącznie z zaróbkami, które po rozpuszczeniu zapewniać będą roztwór odczynnika posiadającego właściwe stężenie.

F. Zastosowania polipeptydu lub przeciwciała in vivo

Uwzględnia się, że polipeptyd lub przeciwciała według niniejszego wynalazku można stosować do traktowania ssaka. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało podaje się ssakowi inne mu niż człowiek w celu uzyskania, na przykład, danych przedklinicznych.

Przykładowe ssaki inne niż człowiek, które można poddawać traktowaniu obejmują naczelne inne niż człowiek, psy, koty, gryzonie i inne ssaki, na których przeprowadza się badania przedkliPL 194 562 B1 niczne. Takimi ssakami mogą być ustalone modele zwierzęce choroby, która ma być leczona przeciwciałem lub można je stosować do badań toksyczności przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. W każdym z tych rozwiązań, wykorzystując ssaka można przeprowadzić badania eskalacji dawki.

Przeciwciało lub polipeptyd podaje się jakimkolwiek odpowiednim sposobem, włącznie z podawaniem pozajelitowym, podskórnym, dootrzewnowym, dopłucnym i donosowym oraz, jeśli jest to pożądane, dla miejscowego traktowania immunosupresyjnego, podawaniem do miejsca zmian chorobowych. Infuzje pozajelitowe obejmują podawanie domięśniowe, dożylne, dotętnicze, dootrzewnowe lub podskórne. Ponadto, mutanta przeciwciała odpowiednio podaje się przez infuzję pulsacyjną, szczególnie zmniejszanych dawek mutanta przeciwciała. Dogodnie, dawki podaje się przez iniekcje, najdogodniej iniekcje dożylne lub podskórne, częściowo zależnie od tego, czy podawanie jest krótkotrwałe, czy przewlekłe.

Dla zapobiegania lub leczenia choroby, odpowiednie dawkowanie przeciwciała lub polipeptydu będzie zależało od rodzaju traktowanej choroby, stanu zaawansowania i przebiegu choroby, od tego, czy mutanta przeciwciała podaje się w celu zapobiegawczym, czy leczniczym, wcześniejszego leczenia, historii klinicznej pacjenta i odpowiedzi na mutanta przeciwciała oraz od uznania lekarza prowadzącego. Przeciwciało skierowane przeciw ludzkiej IgE odpowiednio podaje się pacjentowi jednorazowo lub seryjnie.

Zależnie od rodzaju i stanu zaawansowania choroby, początkową propozycją dawkowania do podawania pacjentowi jest od około 1 pg/kg do 150 mg/kg (np. 0,1-20 mg/kg) przeciwciała lub polipeptydu albo, na przykład, jednorazowe podanie lub więcej oddzielnych podań, albo przez ciągłą infuzję. Typowa dawka dzienna może pozostawać w zakresie od około 1 pg/kg do 100 mg/kg, zależnie od wymienionych powyżej czynników. W przypadku powtarzanego podawania w ciągu kilku dni lub dłużej, zależnie od stanu, traktowanie kontynuuje się do wystąpienia pożądanego zahamowania objawów choroby.

Jednakże, użyteczne mogą być inne schematy dawkowania. Postęp takiego leczenia łatwo monitoruje się konwencjonalnymi technikami i oznaczeniami. Przykładowy schemat dawkowania dla przeciwciała skierowanego przeciw LFA-1 lub przeciw ICAM-1 ujawniono w światowym opisie patentowym nr 94/04188.

Kompozycji mutanta przeciwciała będzie nadawać się postać, dawkować i podawać w sposób zgodny z zasadami dobrej praktyki medycznej. Czynniki, które należy wziąć pod uwagę w tym kontekście obejmują konkretne zaburzenie, które ma być traktowane, konkretnego ssaka, który ma być traktowany, stan kliniczny pojedynczego pacjenta, przyczynę zaburzenia, miejsce dostarczenia czynnika, sposób podawania, schemat podawania i inne czynniki znane praktykom medycznym.

Przeznaczona do podawania „terapeutycznie skuteczna ilość” mutanta przeciwciała będzie zależna od takich względów i jest ona najmniejszą ilością konieczną do zapobiegania, łagodzenia lub leczenia choroby lub zaburzenia. Mutantowi przeciwciała nie trzeba, ale ewentualnie można nadawać postać z jednym lub więcej czynnikami obecnie stosowanymi do zapobiegania lub leczenia interesującego nas zaburzenia. Skuteczna ilość takich innych czynników zależy od ilości obecnego w preparacie przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiej IgE, rodzaju zaburzenia lub leczenia oraz innych dyskutowanych powyżej czynników. Stosuje je się generalnie w takich samych dawkach i takimi samymi drogami podawania, jak opisano wcześniej w niniejszym opisie lub w około od 1 do 99% dotychczas wykorzystywanych dawek.

G. Produkty fabryczne

W innym rozwiązaniu wynalazku można dostarczyć produkt fabryczny, zawierający materiały użyteczne do opisanego powyżej traktowania zaburzenia. Produkt fabryczny obejmuje pojemnik i etykietę. Odpowiednie pojemniki obejmują, na przykład, butelki, fiolki, strzykawki i probówki. Pojemniki można tworzyć z różnych pateriałów, takich jak szkło lub plastik.

Pojemnik zawiera kompozycję, która jest skuteczna do traktowania określonego stanu i może posiadać wejście zapewniające jałowy dostęp (na przykład pojemnikiem może być worek lub fiolka z roztworem do podawania dożylnego lub posiadające zatyczkę, którą można przebić igłą do iniekcji podskórnych).

Czynnikiem aktywnym w kompozycji jest mutant przeciwciała. Etykieta na lub dostarczona łącznie z pojemnikiem wskazuje, że kompozycję stosuje się do traktowania wybranego stanu. Produkt fabryczny może ponadto zawierać drugi pojemnik, zawierający farmaceutycznie dopuszczalny bufor, taki jak sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami, roztwór Ringera i roztwór dekstrozy. Może on po50

PL 194 562 B1 nadto zawierać materiały pożądane z komercyjnego i użytkowego punktu widzenia, włącznie z innymi buforami, rozcieńczalnikami, sączkami, igłami, strzykawkami i wkładkami z instrukcjami użycia.

Poniższe przykłady podano w celu zilustrowania wynalazku, a nie jego ograniczania.

P r z y k ł a d 1

Przygotowywanie przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw IgE

Przygotowano osiem przeciwciał monoklonalnych (MAE10-MAE17) zdolnych do blokowania wiązania IgE z FceRL. Skierowane przeciw IgE przeciwciała monoklonalne przygotowano z supernatantów komórek U266B1 (ATCC TLB 196) stosując chromatografię powinowactwa na wyizolowanym przeciwciale IgE (MAEl Genentech). W celu uzyskania MAE12, pięć myszy BALB/c, w wieku szesciu tygodni, immunizowano przez iniekcję w poduszki łapy 10 g oczyszczonej IgE w adiuwancie Ribi'ego. W taki sam sposób przeprowadzono kolejne iniekcje od jednego do trzech tygodni po immunizacjach początkowych.

Trzy dni po ostatniej iniekcji usunięto i połączono pachwinowe i podkolanowe węzły chłonne i przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek przez przepuszczanie tkanki przez siatkę stalową. Komórki poddano fuzji w stosunku 4:1 z komórkami mysiego szpiczaka P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) w podłożu o wysokiej zawartości glukozy (DMEM) zawierającym 50% w/v glikol polietylenowy 4000.

W przypadku MAE14, MAE15 i MAE13 immunizacje przeprowadzono w podobny sposób, z tym wyjątkiem, że dla MAE13 stosowano 30 pg IgE na iniekcję i fragment IgE 315-347 (Kabat) stosowano jako dawkę uczulającą przed fuzją; dla MAE10 i MAE11 iniekcje przeprowadzono podskórnie w dwóch dawkach 100 pg, końcową dawka przypominająca wynosiła 50 fig, a do fuzji zastosowano komórki śledziony.

Komórki po fuzji wysiano następnie z gęstością 2 x 10⁵ na studzienkę w 96-studzienkowej płytkach do hodowli tkankowych. Po 24 godzinach dodano podłoże selekcyjne HAT (hipoksantyna/aminopteryna/tymidyna, Sigma, nr kat. H0262. Z 1440 posianych studzienek, 365 zawierało komórki rosnące po selekcji HAT.

Piętnaście dni po fuzji, supernatanty testowano pod kątem przeciwciał specyficznych wobec ludzkiej IgE stosując enzymatyczne oznaczenie immunosorpcyjne (ELISA). ELISA przeprowadzono w następujący sposób, ze wszystkimi inkubacjami prowadzonymi w temperaturze pokojowej.

Testowe płytki (Nunc Immunoplate) opłaszczano w ciągu 2 godzin szczurzym przeciwciałem skierowanym przeciw mysim IgG (Boehringer Mannheim, nr kat. 605-500) o stężeniu 1 ng/ml w 50 mM buforze węglanu sodowego, pH 9,6, następnie blokowano 0,5% albuminą surowicy bydlęcej w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami (PBS) w ciągu 30 minut, po czym czterokrotnie przemywano PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBST).

Dodawano testowane supernatanty i inkubowano w ciągu dwóch godzin z wytrząsaniem, a następnie czterokrotnie przemywano PBST.

Dodawano ludzką IgE (oczyszczoną z komórek U266, jak opisano powyżej) o stężeniu 0,5 pg/ml i inkubowano w ciągu 1 godziny z wytrząsaniem, a następnie czterokrotnie przemywano PBST.

Dodawano peroksydazę chrzanową skoniugowąną z kozim przeciwciałem skierowanym przeciw ludzkiej IgE (Kirkegarrd & Perry Labs, nrkat. 14-10-04, 0,5 mg/ml) w rozcieńczeniu 1:2500 i inkubowano w ciągu 1 godziny, a następnie czterokrotnie przemywano PBST.

Płytki wywoływano przez dodanie 100 pl/studzienkę roztworu zawierającego 10 mg dichlorowodorku o-fenylenodiaminowego (Sigma, #P8287) i 10 pl 30% roztworu nadtlenku wodoru w 25 ml buforu fosforanowocytrynianowego, pH 5,5 i inkubowanie w ciągu 15 minut.

Reakcję zatrzymano przez dodanie 100 pl/studzienkę 2,5 M kwasu siarkowego. Dane otrzymano przez odczytywanie absorbancji z płytek w automatycznym czytniku do płytek ELISA przy długości fali 490 nm. Dla MAE12, przetestowano 365 supernatantów i 100 okazało się specyficznych wobec ludzkiej IgE.

Podobną częstość specyficzności wobec IgE uzyskano testując inne przeciwciała. Wszystkie opisane w niniejszym opisie przeciwciała monoklonalne należały do izotypu IgG1, za wyjątkiem MA-E17, które było IgG2b oraz MAE14, które było IgG2a.

Każde z przeciwciał specyficznych wobec IgE testowano następnie w oznaczeniach komórkowych i płytkowych, w celu wyselekcjonowania przeciwciał, które wiążą się z IgE w taki sposób, że hamują wiązanie IgE z FcsRI i które nie są zdolne do wiązania z FCEH związanych z IgE.

Wyniki tych oznaczeń przedstawiono poniżej w tabeli 1 i tabeli 2.

PL 194 562 B1

T a b e l a 1

Podsumowanie właściwości mysich przeciwciał monoklonalnych (mAb) skierowanych przeciw HulgE

mAb	Immunogen	Schemat/-/dawka (g)	Źródło komórek B	Izotyp	Wiązanie IgE związanej z Fc RI1	Uwalnianie histaminy z PBL2 (ECso)	Llość zablokowanego Fc RI3 (ECs0)
MaE1	PS IgE	3 x 50	węzły chłonne	IgGl	0,05 g/ml	1 g/ml	0,3 g
MaE10	U266 IgE	2 x 100 1 x 50	śledziona	IgGl	brak wiązania przy 10 g/ml	> 100 g/ml	2,5 g
MaE11	U266 IgE	2 x 100 1 x 50	śledziona	IgGl	brak wiązania przy 10 g/ml	> 100 g/ml	0,6 g
MaE12	U266 IgE	3 x 30	węzły chłonne	IgGl	brak wiązania przy 10 g/ml	> 100 g/ml	0,8g
MaE13	U266 IgE	3 x 30	węzły chłonne	IgGl	brak wiązania przy 10 g/ml	> 10 g/ml	0,6 g
MaE14	U266 IgE	5 x 50	węzły chłonne	IgG2a	brak wiązania przy 10 g/ml	> 100 g/ml	2,5 g
MaE15	U266 IgE	5 x 50	węzły chłonne	IgGl	brak wiązania przy 10 g/ml	> 100 g/ml	0,6 g
MaE16	rHIgE aa315-547	5x 1	węzły chłonne	IgGl	brak wiązania przy 10 g/ml	> 100 g/ml	0,7 g
MaE17	rHIgE aa315-547	5x 1	węzły chłonne	IgG2b	brak wiązania przy 10 g/ml	> 100 g/ml	> 5,0 g

Ta bel a 2

Podsumowanie mysich przeciwciał skierowanych przeciw HulgE (ciąg dalszy)

mAb	Wiązanie z błonową IgE na U266BL (ECs°)4	Wiązanie z IgE na FcsRII (CD23) IM9 (EC50)5	Ilość blokująca wiązanie 1 pg IgE z FcsRII (EC50)6	Hamowanie syntezy IgE in vitrc>	Stała powinowactwa wobec IgE8(Kd)
MaEl	0,4 pg/ml	0,05 pg/ml	> 100 pg	(-)	5,4 x 10'8
MaE10	0,5 pg/ml	brak wiązania przy 10 pg/ml	2,5 pg	(-)	7 x 10'9
MaE11	0,15 pg/ml	brak wiązania przy 10 pg/ml	0,6 pg	(+)	3 x 10'8
MaE12	> 10 pg/ml	1 pg /ml	5,0 pg	(-)	4 x 10'7
MaEl 3	1 pg/ml	brak wiązania przy 10 pg/ml	0,7 pg/ml	(++)	5 x 10'8
MaE14	6 pg/ml	brak wiązania przy 10 pg/ml	2,5 pg/ml	(±)	14 x 10'8
MaE15	6 pg/ml	brak wiązania przy 10 pg/ml	0,6 pg/ml	(±)	7 x 10'8
MaE16	10 pg/ml	< 0,05 pg/ml	5 pg	(+)	nie oznaczano
MaE17	10 pg/ml	brak wiązania przy 10 pg/ml	5 pg	(++)	nie oznaczano

PL 194 562 B1

1. Oparte na FACS oznaczenia do analizy mysich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw iudzkiej IgE.

Testowanie wiązania mysich przeciwciał monokionainych skierowanych przeciw iudzkiej IgE z IgE na komórkach CHO 3D10 (FcsRL aifa +).

a. Komórki CHO 3D10 (stabiinie stransfekowane łańcuchem aifa FceRL, Hakimi i in., J. Bioi. Chem. 25: 22079), w iiości 5 x 10⁵ komórek na próbkę, inkubowano ze standardem IgE U266 (nr serii 13068-46) w stężeniu 10 gg/mi w objętości 100 gi buforu do FACS (0,1% BSA, 10 mM azydek sodowy w PBS, pH 7,4) w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie raz przemywano buforem do FACS. Wieikość wiązania IgE okreśia się przez inkubację próbki komórek z przyłączo ną IgE ze skoniugowaną z FITC poiikionainą surowicą króiika skierowaną przeciw iudzkiej IgG (Accurate Chem. Co. AXL-475F, nr serii 16) o stężeniu 50 gg/mi w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie trzy przemywania buforem do FACS.

b. Komórki z przyłączoną IgE inkubuje się z objętością 100 gi supernatantu z hodowii mysiej hybrydomy wydzieiającej przeciwciało skierowane przeciw IgE (stężenie mysiej IgG w zakresie od 1 do 20 gg/mi) w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie jedno przemywanie buforem do FACS. Jako dodatnią kontroię wiązania stosuje się monokionaine przeciwciało skierowane przeciw iudzkiej IgE (MaEi, Genentech) w stężeniu 10 gg/mi. Jako ujemną kontroię stosuje się przeciwciało monokionaine MAD 6P, Genentech), które nie rozpoznaje IgE.

c. Wiązanie przeciwciała monokionainego z IgE na komórkach CHO wykrywa się przez inkubowanie komórek ze skoniugowanym z FITC, oczyszczonym na zasadzie powinowactwa kozim F(ab')2 skierowanym przeciw mysim IgG (Organon Teknica, nr kat. 10711-0081) o stężeniu 20 gg/mi w ciągu 30 mi nut w temperaturze 4°C, a następnie trzy przemywania buforem do FACS. Komórki dodaje się do 400 gi buforu zawierającego 2 gg/mi jodek propidyny (Sigma, nr kat. P4170) w ceiu wybarwienia martwych komórek.

d. Komórki anaiizuje się stosując cytometr przepływowy Becton Dickinson FACSCAN. Bramki światła rozproszonego, przednią i boczną, położoną pod kątem 90 stopni, ustawia się na anaiizę homogennej popuiacji komórek. Z anaiizy wykiucza się martwe komórki, które barwią się jodkiem propidyny. Supernatanty z hodowii hybrydom, które nie wiążą IgE na komórkach CHO 3D10, uważa się za będące kandydatami do daiszego przeszukiwania.

2. Uwainianie histaminy z granuiocytów zasadochłonnych krwi obwodowej.

Krew pobrano na heparynę od normainych dawców i rozcieńczono w stosunku 1:4 zmodyfikowanym buforem Tyrodes (25 mM Tris, 150 mM NaCi, 10 mM CaCi2, MgCi2, 0,3 mg/mi HSA, pH 7,35), a następnie inkubowano z 1 nM iudzką IgE (ND) w temperaturze 4°C w ciągu 60 minut. Następnie do buforu Tyrodes zawierającego aibo mysie przeciwciała monokionaine skierowane przeciw IgE (10 mg/mi), aibo poiikionainą antysurowicę skierowaną przeciw immunogiobuiinom iudzkim, jako kontroię dodatnią, dodawano komórki i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut. Komórki osadzano, histaminę w supernatantach acetyiowano i zawartość histaminy oznaczano stosując zestaw RIA (AMAC, Inc., Wesbrook, Main). Oznaczano całkowitą zawartość histaminy w komórkach poddanych kiiku turom zamrażania-rozmrażania.

3. Biokowanie wiązania IgE skoniugowanej z Fitc z łańcuchem aifa FcsRL.

Wpływ przeciwciał na wiązanie IgE badano preinkubując IgE wyznakowaną Fitc z różnymi przeciwciałami MaE w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut w PBS zawierającym 0,1% BSA i 10 mM azydek sodowy, pH 7,4, a następnie inkubując kompieks z 5 x 10⁵ komórek 3D10 w temperaturze 4°C w ciągu 30 minut. Następnie komórki trzykrotnie przemywano i mierzono średnią fluorescencję kanału przy długości faii 475 nm. Jako kontroię stosowano mysie przeciwciało monokionaine skierowane przeciw iudzkiej IgE (Mae1), które nie biokuje wiązania IgE z łańcuchem aifa FcsRI.

4. Anaiiza wiązania mysiego przeciwciała skierowanego przeciw iudzkiej IgE z dodatnimi pod wzgiędem IgE komórkami B U266.

a. Komórki U266 B1 (dodatnie pod wzgiędem błonowej IgE) hoduje się w podłożu podstawowym wzbogaconym o 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicę cieięcą (Hycione, nr kat. A-1111-L), penicyiinę, streptomycynę (100 jednostek/mi) i L-giutaminę (2 mM).

b. Komórki (5 x 10⁵/próbkę) inkubuje się w objętości 100 gi buforu do FACS zawierającego mysie przeciwciała monokionaine skierowane przeciw iudzkiej IgE w stężeniu 10, 5, 1, 0,5 i 0,1 gg/mi w ciągu 30 minut na iodzie w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania z okrągłym dnem studzienek, a następnie dwukrotnie przemywa buforem do FACS. Jako kontroię dodatnią stosuje się przeciwciało monokionaine MAE1 (Genentech).

PL 194 562 B1

c. Komórki inkubuje się z objętością 100 μΙ buforu do FACS, zawierającego 50 gg/ml (roztwór podstawowy rozcieńczony 1:20) skoniugowanego z FITC, oczyszczonego na zasadzie powinowactwa koziego F(ab')2 skierowanego przeciw mysim IgG (Organon Teknica, nr kat. 10711-0084) w ciągu minut na lodzie, a następnie trzykrotnie przemywa buforem do FACS. Komórki dodaje się do 400 μΙ buforu do FACS zawierającego 2 gg/ml jodku propidyny w celu wybarwienia martwych komórek.

5. Oparte na FACS oznaczenia wiązania z komórkami B LM9 FceRII(CD23)+.

a. Ludzkie komórki B szpiczaka LM9 (ATCC CCL 159, Ann. N. Y Acad. Sci. 190: 221-234 (1972)) utrzymywano w podłożu podstawowym GIF z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, penicyliną, streptamycyną (100 jednostek/ml) i L-glutaminą (2 mM).

b. Komórki (próbki 5 x 10 komórek) inkubowano w objętości 100 gl buforu do FACS zawierającego standard IgE U266 w stężeniu 2 gg/ml w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania, a nas tępnie dwa razy przemywano buforem do FACS. Jako kontrole, komórki inkubowano w samym buforze lub buforze zawierającym 2 gg/ml ludzkiej IgG1 (Behring Diagnostics, nr kat. 400112, nr serii 801024).

c. Następnie komórki inkubowano z mysimi przeciw ciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw ludzkiej IgE w stężeniu od 0,1 do 10 gg/ml w ciągu 30 minut na lodzie. Jako kontrolę dodatnią zastosowano przeciwciało monoklonalne MAE1 (Genentech).

d. Następnie komóki inkubowano w 100 gl buforu do FACS zawierającego FITC skoniugowany z kozim F(ab')2 skierowanym przeciw mysim IgG (Organon Teknica, nr kat. 1711-0084) o stężeniu 50 gg/ml w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie trzykrotnie przemywano buforem do FACS.

e. Następnie, komórki dodawano do 400 gl buforu za wierającego 2 gg/ml jodku propidyny w celu wybarwienia martwych komórek.

f. Komórki analizowano stosując cytometr przepływowy Becton Dickenson FACSCAN. Bramki światła rozproszonego, przednią i boczną, położoną pod kątem 90 stopni, ustawia się na analizę homogennej populacji komórek i z analizy wyklucza się martwe komórki, które barwią się jodkiem propidyny. Komórki dodatnie pod względem FITC (wiążące IgE) analizowano tylko w stosunku do komórek wybarwionych skoniugowanym z FITC przeciwciałem króliczym skierowanym przeciw ludzkiej IgE.

g. W każdym doświadczeniu, jako kontrolę pozytywną określania poziomu CD23 na powierzchni komórek IM9, próbkę komórek wybarwiano mysimi przeciwciałami monoklonalnymi Leu 20 Becton Dickenson (skierowanymi przeciw CD23) o stężeniu 10 gg/ml w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie dwukrotnie przemywano. Następnie komórki inkubowano ze skoniugowanym z FITC, oczyszczonym na zasadzie powinowactwa kozim F(ab')2 skierowanym przeciw mysim IgG o stężeniu 50 gg/ml.

6. Blokowanie przez przeciwciało wiązania IgE skoniugowanej z FITC z receptorem IgE o niskim powinowactwie.

Wiązanie IgE wyznakowanej 40 nM FITC z receptorem IgE o niskim powinowactwie (CD23 lub FcsRI) ulegającym ekspresji na komórkach limfoblastycznych B IM-9 analizowano przez cytometrię przepływową stosując cytometr przepływowy FACSCAN.

Wpływ przeciwciał na wiązanie IgE wyznakowanej FLTC badano przez preinkubację IgE wyznakowanej FITC z mysimi przeciwciałami skierowanymi przeciw immunoglobulinom ludzkim w stężeniu od 0,1 do 10 gg/ml chimery, w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut, w PBS zawierającym 0,1% BSA i 10 mM azydek sodowy, pH 7,4, a następnie inkubację kompleksu z 5 x 10 komórek w temperaturze 4°C w ciągu 30 minut. Następnie komórki przemywano trzykrotnie i mierzono średnią fluorescencję kanału przy długości fali 475 nm.

7. Procedura oznaczania in vitro IgE

a. Monojądrzaste komórki krwi obwodowej pobrano od zdrowych dawców.

b. Komórki przemywano obficie PBS w celu usunięcia możliwie wielu płytek krwi.

c. Komórki monojądrzaste zliczano i ponownie zawie szano w podłożu w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml. Podłoże było mieszaniną DMEM z penicyliną i streptomycyną, 15% surowicą końską, IL-2 (25 U/ml) i IL-4 (20 ng/ml).

d. Przeciwciała dodawano w odpowiednim stężeniu w dniach 0, 5 i 8.

e. Hodowle inkubowano w 24-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych Falcon w ciągu 14 dni.

f. W 14 dniu usuwano supernatanty i oznaczano stężenia IgE stosując specyficzną wobec IgE procedurę ELISA.

PL 194 562 B1

8. Stałą powinowactwa (kd) mysiego przeciwciała monoklonalnego wobec ludzkiej IgE określano przez analizę wiązania równowagowego (Scatcharda).

a. IgE (allotypy ND i PS) poddano jodowaniu metodą z zastosowaniem chloraminy T i oddzielono od wolnego J na kolumnie PD10 z sephadex G-25 (Pharmacia, nr kat. 17-0851- 01) w buforze do RIA (PBS, 0,5% albumina surowicy bydlęcej (Sigma, nr kat. A-7S88), 0,05% Tween 20 (Sigma, nr kat. P-1379), 0,01% tiomerosol (Sigma, nr kat. T-5125), pH 7,4. Około 78-95% zliczeń po oczyszczaniu na kolumnie wytrącono 50% kwasem trichlorooctowym i aktywność właściwa preparatów jodowanej IgE pozostawała w zakresie od 1,6 do 13 pCi/pg, przyjmując 70% wydajność zliczania.

b. Do różnych stężeń nieznakowanej IgE (od 1 do 200 nM) w objętości końcowej 0,1 ml buforu do RIA w probówkach polipropylenowych o wymiarach 12 x 75 mm dodawano stałe stężenie J (około 5 x 10⁴ cpm). Następnie dodawano mysie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw ludzkiej IgE (20 mM stężenie końcowe) w objętości 0,1 ml buforu do RIA, do objętości końcowej oznaczenia wynoszącej 0,2 ml.

c. Próbki inkubowano w ciągu 16-18 godzin w temperaturze 25°C, z ciągłym wytrząsaniem.

d. Związaną i wolną J-lgE rozdzielano przez dodanie 0,3 ml mieszaniny oczyszczonego na zasadzie powinowactwa koziego przeciwciała skierowanego przeciw mysim IgG (Boehringer Mannheim, nr kat. 605-208), sprzęgniętego z aktywowaną CNBr Sepharose 4B (Pharmacia, nr kat. 17-0430-01) i nośnikowej białko A-sepharose (Replige, nr kat. LPA 300) w buforze do RIA i inkubowano w ciągu od 1 do 2 godzin w temperaturze 25°C, z ciągłym wytrząsaniem. Następnie dodawano bufor do RIA (1 ml) i probówki wirowano w ciągu 5 minut przy 400 x g. Próbki następnie mierzono w celu określenia zliczeń całkowitych. Supernatanty odsysano pipetą pasteurowską z cienko wyciągniętym końcem, próbki ponownie mierzono i obliczano stosunek zliczeń związanych do wolnych.

e. Analizę Scatcharda prowadzono wykorzystując program w języku Fortran (scanplot), oparty na programie Ligand, napisanym przez P. Munsona z HIH. Scatplot wykorzystuje dopasowywanie zależności części związanej w funkcji całości do równania działania mas, z zastosowaniem analizy regresji typu Rodbard.

P r z y k ł a d 2

Przygotowywanie humanizowanego MaE11

Wprowadzenie

Poniższy przykład opisuje różne preparaty humanizowanego MaE11, w którym różne reszty zmodyfikowano poprzez ukierunkowaną mutagenezę, otrzymując 12 wariantów fragmentu skierowanego przeciw IgE MaE11 [F(ab)1-12]. Reszty F(ab)12 zastosowano jako matrycę do utworzenia rhu-MaE25 lub E25, silnego przeciwciała skierowanego przeciw IgE, opisanego w zgłoszeniu numer PCT/US92/06860, złożonego 14 sierpnia 1992 r.

Metody

Mysie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw ludzkiej IgE, MaEll, przedstawione na figurze 1, zmodyfikowano przez ukierunkowaną mutagenezę (Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488) z zawierającej deoksyurydynę matrycy, obejmującej ludzki lekki łańcuch κ-podgrupy L i ludzki ciężki łańcuch podgrupy III (VH-CH1) w opartym na pUC199 plazmidzie pAK2 (Carter i in. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285), w celu otrzymania wariantu F(ab)-1. F(ab)-2 skonstruowano z matrycy F(ab)-1, a wszystkie inne humanizowane warianty F(ab) skonstruowano z matrycy F(ab)-2. Plazmidami stransformowano szczep JM101 E. coli w celu przygotowania dwu- i jednoniciowego DNA (Messing, J. (1979), Recomb. DNA Tech. Bull. 2: 43; Ausuble i in., Current Protocols in Molecular Biology, Część 1 (1997)).

Stosując metodę z wykorzystaniem dideoksynukleotydów, całkowicie zsekwencjonowano reszty łańcucha lekkiego i ciężkiego. Następnie DNA kodujący łańcuchy lekki i ciężki zsubklonowano w pochodnej plazmidu ekspresyjnego F(ab) E. coli, pAK19 (Carter i in., Biotechnology 10: 163). Pochodna pozbawiona jest reszt cystein regionu zawiasowego, które tworzą wiązania disiarczkowe pomiędzy łańcuchami ciężkimi we fragmentach F(ab')2. Fragmenty F(ab), w przeciwieństwie do przeciwciał IgG o pełnej długości, ułatwiały analizę umiarkowanie dużej liczby wariantów, ponieważ można było stosować ekspresję w E. coli zamiast technik hodowli komórek ssaczych.

Warianty te opisano w zgłoszeniu patentowym numer WO 93/04173, opublikowanym 4 marca 1993 r. Po określeniu najlepszego wariantu, zsubsklonowano go następnie w plazmidzie kodującym ludzką IgG1 o pełnej długości (patrz poniżej).

Plazmidami ekspresyjnymi stransformowano szczep MM294 E. coli (Meselon, M. i R. Yuan (1968), Nature 217: 1110) i pojedynczą kolonię namnażano w 5 ml podłoża 2YT z karbenicyliną

PL 194 562 B1 (100 pg/ml) w ciągu 5-8 godzin w temperaturze 37°C. Hodowlę (5 ml) dodawano następnie do 100 ml podłoża APS z karbenicyliną (100 pg/ml) i umożliwiano wzrost w ciągu 16 godzin w kolbie do wytrząsania o pojemności 500 ml w temperaturze 37°C. Hodowlę wirowano przy 4000 x g i usuwano supernatant. Po zamrażaniu w ciągu 1 godziny, osad ponownie zawieszano w 5 ml zimnego 10 mM Tris, 1 mM EDTA i 50 ul benzamidyny (Sigma, St. Louis), którą dodawano w celu zahamowania proteolizy. Po łagodnym wytrząsaniu na lodzie w ciągu 1 godziny, próbkę wirowano przy 10000 x g w ciągu 15 minut.

Supernatant nakładano na kolumę białko A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) (objętość złoża 0,5 ml), następnie przemywano 10 ml roztworu 3 M chlorku potasowgo/100 ml Tris, pH 8,0, po czym eluowano 100 mM kwasem octowym (2,5 ml), pH 2,8 w 1 M Tris, pH 8,0 (0,5 ml).

Bufor F(ab) wymieniono następnie na PBS stosując Centricon-30 (Amicon) i zatężano do objętości końcowej 0,5 ml. W celu sprawdzenia czystości, każdy fragment F(ab) poddawano elektroforezie w żelach do SDS-PAGE. Stężenia F(ab) określano wykorzystując 0,1%ε280 = 1,0. Współczynnik ekstynkcji określono wykorzystując stężenie białka na podstawie analizy składu aminokwasowego oczyszczonego F(ab)-2 i A280 tej samej próbki.

Wybrane fragmenty F(ab) analizowano bezpośrednio przez chromatografię cieczową/spektrometrię masową w celu potwierdzenia ich masy cząsteczkowej. Próbki wstrzykiwano na upakowaną kapilarę układu chromatografii cieczowej (Henzel, W. J. i in. (1990), Anal. Biochem. 187: 228) i bezpośrednio analizowano stosując spektrometr masowy Sciex API 3. Do kalibracji zastosowano postacie hormonu wzrostu o wyższym ładunku (m. cz. 22256,2), zmierzone przy zastosowaniu tych samych parametrów instrumentu.

W celu utworzenia humanizowanych wersji MaE11, będących ludzką IgG1 o pełnej długości, łańcuchy ciężki i lekki zsubklonowano oddzielnie w opisanych uprzednio plazmidach pRK (Gorman, C. M i in. (1990), DNA Protein Eng. Tech. 2: 3). Odpowiednimi plazmidami kodującymi ciężki i lekki łańcuch (zależnie od pożądanej zmiany(an) sekwencji) poddano kotransfekcji linię zarodkowych komórek nerki ludzkiej stransformownych adenowirusem, znaną jako 293 (Graham, F. L. i in. (1977), J. Gen. Virol. 36: 59) stosując procedurę zapewniającą wysoką wydajność (Graham i in., supra oraz Gorman, C. M., Science 221: 551).

Podłoża wymieniono na podłoża wolne od surowicy i zbierano codziennie w ciągu do pięciu dni. Przeciwciała oczyszczano z połączonych supernatantów stosując białko A-Sepharose CL-4B (Pharmacia). Bufor w wyeluowanym przeciwciale wymieniano na PBS przez sączenie molekularne na G25, zatężano przez ultrafiltrację stosując Centriprep-30 lub Centricon-100 (Millipore) i przechowywano w temperaturze 4°C. Stężenie przeciwciała oznaczano stosując ELISA z wiązaniem całkowitej IgG. Wyniki opisano w tabeli 3.

Oznaczenie z rozpuszczalnym receptorem

96-studzienkową płytkę do oznaczeń (Nunc) opłaszczano 0,05 ml chimerycznego receptora łańcuch α FcsRI IgG w buforze do opłaszczania (50 mM węglan, wodorowęglan, pH 9,6) w ciągu 12 godzin w temperaturze 4-8°C. Studzienki opróżniano przez odessanie płynu, dodawano 250 pl buforu do blokowania (PBS, 1% BSA, pH 7,2) i inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C. Na oddzielnej płytce do oznaczeń próbki i mysie MaE11 odniesienia miareczkowano w zakresie od 200 do 0,001 pg/ml dzięki rozcieńczeniem 1:4 buforem do oznaczania (0,5% BSA i 0,05% Tween 2o, PBS, pH 7,2) i dodawano równą objętość biotynylowanej IgE (O’Shannessy, D. J. i in. (1934), Immunol. Lett. 8: 273) o stężeniu 10 ng/ml, po czym inkubowano płytkę w ciągu 2-3 godzin w temperaturze 25°C. Opłaszczone FcsRl studzienki trzykrotnie przemywano PBS i 0,05% Tween 20 (Sigma), z każdej studzienki z próbką przenoszono 50 pl i inkubowano z wytrząsaniem w ciągu 30 minut w temperaturze 25°C. Dodawano roztwór streptawidyny-HRP (500 pg/ml, Sigma) rozcieńczony 1:5000 w buforze do oznaczania w ilości 50 pg/studzienkę, po czym płytkę inkubowano w ciągu 15 minut z wytrząsaniem i przemywano jak opisano uprzednio.

Dodawano pięćdziesiąt pg/studzienkę Microwell Proxidase Substrate (Kirkgaard & Perry Laboratories) i wywoływano reakcję barwną w ciągu 30 minut. Reakcję zatrzymywano przez dodanie równej objętości 1N HCl i mierzono absoprbancję przy długości fali 450 nm. Obliczano stężenie odpowiadające 50% hamowania przez wykreślenie procentu hamowania wobec stężenia przeciwciała blokującego z dopasowaniem do nieliniowej krzywej czteroparametrycznej z zastosowaniem analizy danych Kaleidagraph (Synergy Software). Wyniki podano w tabeli 3.

PL 194 562 B1

Oparte na FACS oznaczenie wiązania

Zdolność przeciwciała do hamowania wiązania IgE skoniugowanej z FITC (Goding, J. W. (1976), J. Immunol. Methods 13: 215) z łańcuchem α receptora o wysokim powinowactwie, FcsRl, ulegającego ekspresji na komórkach CHO 3D10 (Hakimi, J. i in. (1990) J. Biol. Chem. 265: 22079) określano przez cytometrię przepływową. Skoniugowaną z FLTC IgE (40 nM) preinkubowano z przeciwciałem) (^0,3-Ί ,0x ¹⁰® ^M) w ^tem^pera^turze ³⁷°C w c^iągu ³⁰ minut w ^buforze do ^FACS (PBą ^0,1% ^{BSA i 10} mM azydek sodowy, pH 7,4). Następnie kompleks inkubowano z 5 x 10 komórek CHO CD10 w temperaturze 4°C w ciągu 30 minut. Komórki trzykrotnie przemywano buforem do FACS i mierzono średnią fluorescencję kanału przy długości fali 475 nm, stosując cytometr przepływowy FACScan (Becton Dickinson). Jako kontrolę dodatnią zastosowano MaE1, mysie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw IgE, które nie blokuje wiązania z IgE z łańcuchem a FcsRI, a jako kontrolę ujemną użyto MOPC21 (Cappel), mysie przeciwciało monoklonalne, które nie rozpoznaje IgE. Wyniki przedstawiono na figurze 3.

Wiązanie przeciwciał z FcsRI z przyłączoną IgE

Wiązanie przeciwciała z ludzką IgE połączoną z podjednostką α FcsRI, ulegającą ekspresji na komórkach CHO CD10 mierzono w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C stosując ludzką IgE o stężeniu 10 pg/ml. Komórki trzykrotnie przemywano, po czym inkubowano w ciągu 30 minut z różnymi stężeniami albo mysich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw ludzkiej IgE, MaE1 lub MaE11 albo z humanizowanym wariantem 12 przeciwciała monoklonalnego [F(ab)12]. Jako kontrolę dla mysich przeciwciał monoklonalnych zastosowano MOPC21 (mysią IgG1), podczas gdy jako kontrolę dla F(ab)12 zastosowano humanizowane przeciwciało monoklonalne 4D5 (Carter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4282 (1992), ludzka IgG1.

Wiązanie mysich przeciwciał monoklonalnych wykrywano stosując skoniugowany z FITC kozi F(ab')2 skierowany przeciw mysim IgE (10 pg/ml).

Wiązanie humanizowanych przeciwciał monoklonalnych wykrywano stosując skoniugowany z FITC kozi F(ab')2 skierowany przeciw ludzkim IgG (50 pg/ml), które uprzednio oczyszczono na zasadzie powinowactwa na kolumnie z IgE, w celu minimalizacji reaktywności krzyżowej z IgE. Wyniki przedstawiono na figurze 4.

Komputerowe modele graficzne mysich i humanizowanych F(ab)

Sekwencje domen VL i VH F(ab) przestawione na fig. 1 zastosowano do utworzenia komputerowego modelu graficznego domen VL-VH mysiego MaE11. Model ten zastosowano następnie do określenia, które reszty zrębu powinny zostać wprowadzone do humanizowanego przeciwciała, w wyniku tworząc F(ab)-2. Utworzono również modele humanizowanych wariantów w celu weryfikacji właściwego wyboru mysich reszt zrębu. Tworzenie modeli przeprowadzono w sposób opisany w Carter i in., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285; Eigenbrot, C. i in. (1993) J. Mol. Biol. 229: 969.

Wyniki

Projektowanie humanizowanych przeciwciał MaE11

W niniejszych badaniach humanizowanych przeciwciał zastosowano ludzką sekwencję konsensusową. Pozostaje to w przeciwieństwie do innych technik humanizacji, które wykorzystują ludzkie sekwencje najbardziej zbliżone do będącej przedmiotem zainteresowania mysiej Ig. Sherman, C. W. i in. (1991), J. Irmunol. 147: 4366; Kettleborough, C. A. i in. (1991), Protein Eng. 4: 773; Tempest, P R. i in. (1991), Biotechnology 9: 266; Co, M. S. i in. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869; Routledge, E. G. (1991) Eur. J. Immunol. 21.: 2717.

Ta ludzka sekwencja konsensusowa składała się ze zrębu, opartego na podgrupie III VH i podgrupie I κ VL, jak zdefiniowano w Kabat i in. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5., National Lnstitute of Health, Bethesda, MD. F(ab)-1 utworzono przez przeniesienie sześciu CDR, wdług definicji Kabata, supra, do zrębu ludzkiej IgG1.

Wszystkie reszty zrębu zachowano jako reszty ludzkie. Wariant ten najlepiej można opisać jako prostą „zamianę CDR”. F(ab)-1 nie wykazywał wykrywalnego hamowania wiązania IgE z receptorem (tabela 3). O braku zdolności takich wariantów „zamiany CDR” do wiązania ich antygenów donoszono uprzednio. Carter i in., supra, Tempest i in., supra.

Należy zauważyć, że dokładnej sekwencji F(ab)-1 nie opisano w tabeli 3, jednakże sekwencję tę można wywnioskować przez podstawienie mysich reszt CDR MaE11 według Kabata (wskazanych w nawiasach) odpowiadającymi resztami ludzkimi. Figura 1 wskazuje regiony CDR według Kabata przez nawiasy po prawej i lewej stronie, podczas gdy regiony CDR według Chothia wskazano przez podkreślenie.

PL 194 562 B1

W celu ułatwienia interpretacji i zmniejszenia zamieszania, reszty ludzkie wpisano normalną czcionką, podczas gdy reszty mysie wpisano kursywą. Tam, gdzie wskazano podstawienia reszt, pierwsza reszta jest resztą zastępowaną, druga jest resztą wstawianą, liczba oznaczeniem pozycji w natywnej sekwencji według Kabata.

Wariant F(ab)-2 oparty jest na modelowaniu molekularnym. W cząsteczce tej do ludzkiego zrębu wprowadzono kilka mysich reszt zrębu. W F(ab)-2 zastosowano definicje regionów CDR według Kabat i in., supra (które oparte są na międzygatunkowej zmienności sekwencji), z wyjątkiem CDR-H1 i CDR-H2.

Definicje CDR-H1 oparte na zmienności sekwencji (Kabat i in., supra) różnią się znacząco od definicji opartych na badaniach krystalograficznych kompleksów antygen-przeciw-ciało (Chothia, C. i in. (1989), Nature 342: 877) (fig. 1). Dlatego też, CDR-H1 zdefiniowano ponownie tak, że objęty jest obiema definicjami, tj. ludzkie reszty 26-35.

Definicja CDR-H2, oparta na zmienności sekwencji (Kabat i in.) obejmuje więcej reszt niż ta oparta na strukturach kryształów przeciwciało-antygen (Chothia i in.) (patrz fig. 1: regiony CDR według Kabata podano w nawiasach, według Chothia zaznaczono przez podkreślenie).

Ponieważ nie poznano żadnej struktury krystalicznej, która wskazuje miejsca kontaktów przeciwciało-antygen dla ludzkich reszt 60-65 przeciwciała, CDR-H2 zmodyfikowano tak, aby obejmował definicję mieszaną obu definicji, tj. reszty ludzkie 50-58. W wyniku, w F(ab)-2 użyto krótszej wersji CDR-H2 w porównaniu z F(ab)-1.

W wyniku, utworzono F(ab)-2 z minimalną liczbą zmian reszt ludzkich na mysie, które uważano za wymagane do utrzymywania wiązania. Utworzono 10 dodatkowych wariantów w celu przetestowania wpływów zakrytych reszt na konformacje CDR, jak również dla oceny wyników przewidywania przez modelowanie molekularne znaczących reszt zrębu i sprawdzenia innych interesujących reszt.

Dla przetestowania wpływów zakrytych reszt na konformację CDR, skonstruowano F(ab)-3 do F(ab)-7, w których reszty mysie ponownie zamieniono na ludzkie. Jak wskazano w tabeli 4 (dla F(ab)-3 i F(ab)-4), łańcuchy boczne VL4 i VL33 wywierają minimalny wpływ na wiązanie i przypuszczalnie na konformację CDR-L1 w humanizowanym przeciwciele.

Modelowanie sugerowało, że reszta zrębu VH 24 mogłaby wpływać na konformację CDR-L1, a reszta VH 37 mogłaby wpływć na region kontaktu VL-VH. Jednakże, podstawienie reszty ludzkiej w pozycji VH 24 [F(ab)-5] lub VH37 [F(ab)-7] wykazało minimalne obniżenie wiązania. W przeciwieństwie, zastąpienie mysiej reszty Phe w pozycji zrębu VH 78 ludzką resztą Leu [F(ab)-6] spowodowało znaczące obniżenie wiązania. Modele sugerują, że reszta ta wpływa na konformację CDR-H1 i/lub CDR-H2.

We fragmentach od F(ab)-9 do F(ab)-12 badano zastąpienie ludzkich reszt mysimi. Wszystkie te cztery warianty wykazywały znaczącą poprawę wiązania w porównaniu z F(ab)-2 (patrz tabele 3 i 4 oraz fig. 3). W F(ab)-9, który wykazywał pięciokrotnie lepsze wiązanie od F(ab)-2, dwie reszty w CDR-H2 (według definicji Kabata i in., supra) zamieniono na reszty mysie: Ala VH 60 Asn i Asp H61 Pro. Podstawienie Pro mogło zmienić konformację i/lub sztywność CDR-H2, a Asn H60 uważa się za zakrytą w regionie kontaktu VL-VH, być może oddziałując z Asp VL1.

F(ab)-10, który wykazywał znacząco poprawione wiązanie w stosunku do F(ab)-2 był wariantem, w którym wszystkimi zakrytymi resztami (zdefiniowanymi jako reszty o dostępnym polu powierzchni mniejszym od 5% pla wolnego aminokwasu) w obu domenach, VL i VH, były reszty mysiego MaE11. Zasadniczo, F(ab)-10 można uważać za mysie MaEll, w którym na reszty ludzkie zmieniono tylko eksponowane, nie wchodzące w skład CDR reszty VL i VH.

W celu określenia, czy poprawione wiązanie F(ab)-10 spowodowane było przez jedną, czy przez kilka reszt, utworzono warianty F(ab)-ll i F(ab)-12. Jako podstawową matrycę, z której przygotowywano te warianty, zamiast F(ab)-2 zastosowano F(ab)-9, ponieważ wykazywał on pięciokrotnie poprawione wiązanie.

Modelowanie sugerowało, że łańcuchy boczne w pozycjach VH 63 i VH67 mogłyby wpływać na konformację CDR-H2. VH 63 uważana jest za część CDR-H2 według definicji Kabata i in., supra, ale nie według definicji Chothia i in., supra. VH 67 uważana jest za resztę zrębu według obu definicji. W F(ab)-ll, VH 63 i VH 67 były resztami mysimi, odpowiednio Leu i Ile. W F(ab)-12 tylko VH 67 zamieniono na mysią resztę Ile.

Zarówno w oznaczeniu wiązania rozpuszczalnego receptora (tabela 4), jak i oznaczeniu komórkowym (tabela 4, fig. 3), oba warianty, F(ab)-ll i F(ab)-12, wykazywały wiązanie, które było co najmniej tak dobre, jak wiązanie F(ab)-10, a lepsze niż F(ab)-9. Sugeruje to, że poprawione wiązanie F(ab)-10

PL 194 562 B1 nie było spowodowane zmianą upakowania wnętrza domeny VH pod wpływem reszt mysich, ale było wynikiem wpływu tylko jednej reszty, tj. VH 67.

F(ab)-8 skonstruowano zastępując ludzką resztę Glu w pozycji VL 55 mysią resztą Gly, jak również dokonując podobnego podstawienia w pozycji VL 57 Gly za Glu. W F(ab)-2 zastosowano reszty ludzkie, podczas gdy w F(ab)-8 podstawiono w tych pozycjach reszty mysie.

Jak można szybko domyślić się na podstawie tabeli 3, podstawienie tych reszt nie ma wpływu na wiązanie receptora.

Ta bel a 3

Warianty humanizowanego Mae11

Wariant	Zmiany w stosunku do F(ab)-2(a)	Stężenie przy 50% hamowania (ng/ml) średnia, odchylenie standardowe (b	F(ab)-X F(ab)-2	F(ab)-X MaE11
VL	VH
F(ab)-1	Leu 4 Met Arg 24 Lys Glu 55 Gly Gly 57 Glu	Val 24 Ala Ile 37 Val Thr57 Ser Ala 60 Asn Val 63 Leu Gly 65 Asn Phe 78 Leu	>100000	> 16,0(°)	> 560
F(ab)-2	-	-	6083, 1279	1,00	34
F(ab)-3	Leu 4 Met Met 33 Leu	-	9439, 508	1,60	53
F(ab)-4	Leu 4 Met	-	6770, 349	1,10	3,8
F(ab)-5	-	Val 24 Ala	9387, 733	1,60	52
F(ab)-6	-	Phe 18 Leu	17537, 4372	2,90	24
F(ab)-7	-	Ile 37 Val	8622, 107	1,40	48
F(ab)-8	Glu 55 Gly Gly 57 Glu	-	5799, 523	1,00	32
F(ab)-9	-	Ala 60 Asn Asp 61 Pro	1224, 102	0,20	6,8
F(ab)-10	Ala 13 Val Val 19 Ala Val 5S Ile Leu 78 Val Val 104 Leu	Val 48 Met Ala 49 Gly Ala 60 Asn Val 63 Leu Phe 67 Ile Ile 69 Val Met 82 Leu Leu 82c Ala	842, 130	0,14	4,7
F(ab)-11		Ala 60 Asn Asp 61 Pro Val 63 Leu Phe 67 Ile	416, 66	0,07	2,3
F(ab)-12	-	Ala 60 Asn Asp 61 Pro Phe 67 Ile	501, 84	0,08	2,8
MaE11	-	-	179, 63	0,03	1,0

^<a) Reszty mysie zapisano kursywą: numeracja reszt według Kabat i in.

^<b) Średnia i odchylenie standardowe z trzech oznaczeń z rozpuszczalnym receptorem <c Stosunek F(ab)X/F(ab)-2 > 16 oznacza, że wariant ten nie wykazywał wiązania nawet przy najwyższych stosowanych stężeniach F(ab)

PL 194 562 B1

Warianty F(ab) określone jako wykazujące wiązanie najbardziej zbliżone do mysiego MaE11, a mianowicie F(ab)-2, F(ab)-9, F(ab)-10 i F(ab)-12, zastosowano do utworzenia cząsteczek IgG1 pełnej długości.

Wiązanie tych cząsteczek w stosunku do wariantu F(ab)-2 lub MaE11 porównywalne było z wiązaniem wykazywanym przez fragmenty F(ab). Wyniki te podano w tabeli 4.

Ta bel a 4

Humanizowane warianty LgG1 MaEll

Wariant o pełnej długości	Stężenie przy 50% hamowania (ng/ml) średnia, odchylenie standardowe (a	Wariant X IgG1-2 (b)	Wariant X MaE11
IgG1-2	7569, 1042	1,00	16,9
IgG1-9	3493, 1264	0,46	7,8
IgG1-10	1118, 172	0,15	2,5
IgG1-12	1449, 226	0,19	3,2
MaE11	449, 53	0,06	1,0

Wiązanie MeE11 z FcsRLz przyłączoną IgE

Mysie MaE11 zapobiega wiązaniu wolnej IgE z FcsRI na komórkach tucznych, ale nie wyzwala uwalniania histaminy przez wiązanie z FcsR z przyłączoną IgE.

Jak przedstawiono na fig. 4, zarówno mysie MaE11, jak i humanizowany wariant 12 (IgG1-12), jak również ujemna kontrola izotypu, przeciwciało MOPC21 i ujemna kontrola izotypu, humanizowane przeciwciało 4D5 (Carter i in., supra), nie wiążą receptorów FcsR z przyłączoną IgE na komórkach CHO 3D10.

W przeciwieństwie, mysie przeciwciało MaE1, które wiąże się z IgE, ale nie zapobiega wiązaniu IgE z FcsR, wiązało FcsR z przyłączoną IgE. W przeciwieństwie do ludzkiej IgG1 (humanizowane 4D5), mysi izotyp IgG1 (reprezentowany przez MOPC21) wykazuje niespecyficzne wiązanie tła z około 10% tych komórek.

MaE11 nie wykazywało wybarwiania wyższego od kontroli MOPC21, a humanizowany wariant 12 nie powodował wybarwiania powyżej kontroli humanizowanego 4D5 (fig. 4).

Częściowe skanowanie alaninowe reszt CDR ważnych dla wiązania IgE

Sekwencje regionów CDR MaE11 wskazują przewagę reszt obdarzonych ładunkiem (fig. 1). CDR-L1 zawiera trzy reszty Asp, podczas gdy CDR-L3 posiada His, Glu i Asp. CDR-H3 posiada trzy reszty His.

Modele mysiego i humanizowanego MaE11 ilustrowały przestrzenną bliskość wszystkich tych naładowanych reszt (nie przedstawione).

W przeciwieństwie, pojedyncza reszta Asp 54 w CDR-H2 jest przestrzennie oddzielona od innych naładowanych reszt. W celu utworzenia wariantów, każdą z tych naładowanych reszt podstawiono alaninę przez ukierunkowaną mutagenezę (Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488).

W CDR-Ll, zmiana jednej z trzech Asp, Asp VL32b skutecznie znosiła wiązanie IgE [F(ab)-16; tabela 5], podczas gdy podstawienia innych reszt Asp wywierały minimalny wpływ [F(ab)-14; F(ab)-15],

Jednoczesna zmiana Glu VL93 i Asp VL94 na alaniny w CDR-L3 [Fa(ab)-17; tabela 5] także obniżała wiązanie, chociaż nie w takim samym stopniu, jak zastąpienie w pozycji VL32b.

Wynikiem pojedynczych podstawień trzech reszt His w CDR-H3 resztami Ala była albo nieznaczna poprawa wiązania [F(ab)-21], albo trzykrotne obniżenie wiązania [F(ab)-20 i F(ab)-22]. Jednakże, jednoczesna zmiana wszystkich trzech reszt His znosiła wiązanie [F(ab)-19],

Chociaż nie jest łatwo określić, czy obdarzone ładunkiem reszty uczestniczą w bezpośrednim wiązaniu z IgE, czy zapewniają jakąś stabilność konformacyjną ich odpowiednich CDR, warianty od F(ab)-13 do F(ab)-22 wykazują, że CDR-L1 i CDR-H3 są ważnymi determinantami wiązania z IgE.

PL 194 562 B1

Ta bel a 5

Humanizowane warianty reszt CDR F(ab) Maell

Wariant	Zmiany w stosunku do F(ab)-2 (a	Stężenie przy 50% hamowania (ng/ml) średnia, odchylenie standardowe (b	F(ab)-X F(ab)-2
VL	VH
F(ab)-2	—	—	6083, 1279	1,0
F(ab)-13	Asp 30 Ala Asp 32 Ala Asp 32b Ala		> 100 000	> 16,0 lc)
F(ab)-14	Asp 30 Ala	—	3452, 183	0,57
F(ab)-15	Asp 32 Ala	—	6384, 367	1,0
F(ab) -16	Asp 32b Ala	—	> 100 000	> 16,0
F(ab)-17	Glu 93 Ala Asp 94 Ala		17456, 7115	2,9
F(ab)-18	—	Asp 54 Ala	2066, 174	0,34
F(ab)-19		His 97 Ala His 100a Ala His 100c Ala	> 100 000	> 16,0
F(ab)-20	—	His 97 Ala	19427, 8360	3,2
F(ab)-21	—	His 100a Ala	2713, 174	0,45
F(ab)-22	—	His 100c Ala	15846, 8128	2,6

^<a) Reszty mysie zapisano kursywą: numeracja reszt według Kabat i in.

^<b) Średnia i odchylenie standardowe z trzech oznaczeń z rozpuszczalnym receptorem <c Stosunek F (ab) X/F (ab)-2 > 16 oznacza, że wariant ten nie wykazywał wiązania nawet przy najwyższych stosowanych stężeniach F(ab)

Podsumowanie i wniosek

Tworzenie funkcjonalnego, humanizowanego mysiego przeciwciała skierowanego przeciw IgE z MaE11 obejmuje podstawianie kilku mysich reszt zrębu w zrębie ludzkim. Ponadto, mapowanie naładowanych reszt CDR wskazało, że niektóre z nich są ważne w oddziaływaniu przeciwciało-lgE.

Zgodnie z wcześniejszymi badaniami (Carter i in., supra; Shearman, C. W. i in. (1991), J. Immunol. 147: 4366; Kettleborough, C. A. i in. (1991) Protein Eng. 4: 773; Tempest, P. R. (1991) Biotechnology 9: 266), warianty od F(ab)-1 do F(ab)-12 wskazują, że reszty zrębu mogą wywierać znaczący wpływ na działanie przeciwciała. Jest to szczególnie wyraźne, gdy rozważa się F(ab)-1, który jest produktem prostej zamiany CDR, w którym tylko sześć mysich CDR przeniesiono do ludzkiego zrębu. Potencjalne wyjaśnienie tego obejmuje CDR-H2. Zakryte hydrofobowe reszty w pozycjach VH63 i VH67 mogłyby wpływać na konformację CDR-H2. Utworzono warianty zawierające cztery kombinacje w pozycjach VH63 i H67, tj. odpowiednio mysich Leu i Ile [MaE11 i F(ab)-11], Val i Phe [F(ab)-2], leu i Phe [F(ab)-1] oraz Val i Ile [F(ab)-12]. Jasny wniosek z danych wiązania tych czterech wariantów wskazuje, że resztą ważną dla zapewnienia powinowactwa porównywalnego z tym dla mysiego MaE11 jest VH67, którą musi być mysia Ile. W F(ab)-1 resztą tą była ludzka Phe.

z 12 reszt zachowanych w F(ab)-1 jako ludzkie [w porównaniu z F(ab)-2] zmieniano oddzielnie w innych wariantach na reszty mysie. Trzy zmiany nie miały żadnego wpływu na wiązanie: VL4 [F(ab)-4]; VL55 i VL57 [F(ab)-8]. Podstawienia dwóch reszt: VH60 i VH 61 [F(ab)-9], poprawiały wiązanie, podczas gdy trzech obniżały wiązanie: VH24 [F(ab)-5]' VH37 [F(ab)-7] i VH78 [F(ab)-6].

Wariant F(ab)-10 zaprojektowano na podstawie hipotezy zasugerowanej przez Padlana (Padlan, E. A. (1991), Mol. Immunol. 28: 489), który zaproponował, że immunogenność przeciwciała mysiego można obniżyć przez zmianę tylko eksponowanych reszt zrębu. W wariancie tym hydrofobowe wnętrze zarówno domeny VL, jak i VH, innymi słowy, wariant był mysim MaE11, w którym tylko eksponowane reszty zrębu w VL i VH zamieniono na sekwencję ludzką. Chociaż F(ab)-10 wykazywał wiąPL 194 562 B1 zanie podobne do tego mysiego MaE11, zmiana w domenie pojedynczego aminokwasu, VH67, z ludzkiej na mysią dała w efekcie taką samą poprawę wiązania [F(ab)-12, IgG1-12].

Humanizowanym wariantem wykazującym wiązanie porównywalne z MaE11, który wymagał także najmniej zmian, był F(ab)-12. W wariancie tym zastąpiono tylko 5 ludzkich reszt zrębu mysimi (VL4, VH24, VH37, VH67 i VH78. Cztery z tych reszt określono przez modelowanie molekularne. Piątą, VH67, jak również reszty CDR-H2, VH60 i VH61, włączono dzięki zastosowaniu modeli molekularnych w próbach poprawy wiązania początkowego wariantu F(ab)-2.

Pr zy kł a d 3

Oznaczenie uwalniania histaminy

Wprowadzenie

Jest to oznaczenie uwalniania histaminy z komórek tucznych szczura (RMCHA), w którym ilościowo mierzy się aktywność biologiczną zrekombinowanego, humanizowanego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw IgE, w oparciu o zdolność przeciwciała do blokowania uwalniania histaminy z uczulanych alergenem komórek RBL 48. Ponadto, oznaczenie to wykonuje się w warunkach fizjologicznych, podobnych do tych w organizmie ludzkim. Linię komórek RBL 48 otrzymano z macierzystej linii komórek tucznych szczura, RBL 2H3, którą następnie stransfekowano podjednostką a ludzkiego receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcsRI). Gilfillan A. M i in., J. Immunol. 149(7): 2445-2451 (1992).

Metody

Komórki RBL 48 (Gilfillan i in., supra) hoduje się w sIMDM, podłożu Dulbecco zmodyfikowanym przez Iscove, wzbogaconym o 10% płodową surowicę cielęcą, 2 mM glutaminę i 500 pg/rnl aktywnej genetycyny (Gibco, nr kat. 860-1811) w kolbie do hodowli tkankowej T175 (Falcon, nr kat. 3028) w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 (Fischer, model nr 610). Komórki zbierano przez ekspozycję na 4 ml roztworu PBS/0,05% trypsyna/0,53 mM EDTA w ciągu 2 minut w temperaturze 37°C, a następnie wirowanie (400 x g, 10 minut) i ponowne zawieszanie w świeżym sIMDM. Komórki w zawiesinie zliczano stosując hemocytometr (Reicher-Jung) i ich gęstość doprowadzano do 0,4 x 10⁶ komórek/ml. Następnie komórki zaszczepiano w ilości 100 pl/studzienkę (40000 komórek/studzienkę) w wewnętrznych 60 studzienkach 96-studzienkowej płytki do hodowli tkankowych z dnem studzienek w kształcie litery U (Linbro) i hodowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 37° w nawilżanym inkubatorze w atmosferze 5% CO2. Po jednokrotnym przemyciu 200 pl sIMDM na studzienkę (przez aspirację), komórki preinkubowano w ciągu 30 minut z 90 pl/studzienkę roztworu rozcieńczalnika do oznaczania (sIMDM, 3 U/ml Na-heparyny) z IgE specyficzną wobec ambrozji (RSlgE, 10 ng/ml, 23,48 ng/ml całkowitej IgE, 1,4% osocze ludzkie specyficzne wobec ambrozji, North American Biological, nr serii 42-365054).

Po okresie preinkubacji do komórek dodawano 10 pl/studzienkę albo przeciwciała skierowanego przeciw IgE (rozcieńczonego w rozcieńczalniku do oznaczania, 0,06-39,4 pg/ml), albo rozcieńczalnika do oznaczania (dla kontroli całkowitego uwalniania histaminy, tła i ambrozji) i płytkę inkubowano w ciągu 24 godzin w inkubatorze w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C. Po inkubacji płyn znad komórek odsysano i je przemywano 3 x 200 pl sIMDM/studzienkę. Po przemywaniu komórki inkubowano ze 100 pl/studzienkę (1) 0,5% roztworu trition (dla całkowitego uwalniania histaminy), (2) buforu do uwalniania histaminy (HRB, 50% D2O, 0,8% NaCl, 1,3 mM CaC), sIMDM albo (3) antygenu ambrozji (NIH, nr kat. A-601-903A-185, 0,1 pg/ml w HRB) w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut i reakcję zatrzymywano przez umieszczenie na lodzie (100% D2O = 100% D2), 0,8% NaCl, 1,3 mM CaC)).

Płytkę wirowano w ciągu 5 minut przy 900 x g (2460 obrotów na minutę) w temperaturze 4°C, zbierano supernatanty i rozcieńczano 1/80 w PBS (1/1000 w PBS dla kontroli całkowitego uwalniania histaminy) do oznaczania histaminy z zastosowaniem Histamine Enzyme Immunoassay Kit (Immunotech, nr kat. 1153). Supernatanty (100 pl/studzienkę) przenoszono do probówek do przeprowadzania acylacji, zawierających proszek acylujący (z zestawu) i poddawano reakcji z 50 pl buforu do acylacji (z zestawu) w ciągu 30 minut w temperaturze otoczenia. Acylowaną histaminę (50 pl/studzienkę) przenoszono następnie do płytki przeznaczonej do koniugacji (z zestawu) i inkubowano z 200 pl/studzien-kę koniugatu histamina-acetylocholinoesteraza (z zestawu) w ciągu 18 godzin w temperaturze 4°C.

Po tej inkubacji, studzienki osuszano i przepłukiwano w celu usunięcia nie związanego koniugatu przez przemywanie 4 x 300 pl/studzienkę buforu do przemywania (zestaw Immunotech, nr kat. 1153). Dodawano chromogenny substrat (acetylotiocholina, ditionitrobenzoesan, 200 pl/studzienkę, z zestawu) i inkubowano w ciemności w temperaturze otoczenia w ciągu 30 minut. Reakcję zatrzymy62

PL 194 562 B1 wano przez dodanie roztworu do zatrzymywania (50 μΙ/studzienkę, z zestawu) i określano absorbancję przy długości fali 405 nm, z długością fali odniesienia 620 nm, w czytniku płytek SLT 340 ATCC. Intensywność absorbancji jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia histaminy (wyrażonego jako nM), które określa się na podstawie krzywej standardowej histaminy (z zestawu do enzymatycznego oznaczenia immunologicnego, AMAC). Procent całkowitego uwalniania histaminy obliczano na podstawie danych o stężeniu histaminy, a procent hamowania obliczano przyjmując 100% - całkowite uwalnianie histaminy. Wyniki przedstawiono na fig. 5.

Podsumowanie i wniosek

Wykres stosunku molowego przeciwciała skierowanego przeciw IgE wobec procentu hamowania indukowanego ambrozją uwalniania histaminy wskazuje, że postać F(ab) przeciwciała e26 posiada lepsze właściwości indukowanego ambrozją uwalniania histaminy niż postać F(ab) przeciwciała e25. E26 wykazuje indukowane ambrozją uwalnianie histaminy w sposób zależny od dawki, ze stosunkiem molowym odpowiadającym połowie maksymalnego hamowania wynoszącym 44:1 (przeciwciało skierowane przeciw IgE:RSIgE). W przeciwieństwie, e25 hamowało indukowane ambrozją uwalnianie histaminy tylko przy bardzo wysokim stosunku molowym (pomiędzy 200:1 a 1550:1 przeciwciała skierowanego przeciw IgE do RSlgE). Stosunek molowy odpowiadający połowie maksymalnego hamowania można ocenić na podstawie krzywej dla e25 na pomiędzy 400:1 a 500:1. Dlatego też, w oparciu o dane dotyczące stosunków molowych odpowiadających połowom maksymalnego hamowania, które są miarą powinowactwa wiązania cząsteczki, cząsteczka e26 wiąże się z RSlgE w przybliżeniu 10 razy lepiej niż cząsteczka e25.

Prz y kł a d 4

Przykład prezentacji przez fagi

Wprowadzenie

Przykład ten opisuje przeciwciała skierowane przeciw IgE o ulepszonym specyficznym powinowactwie, utworzone poprzez monowalentną prezentację przez fagi i selekcję fragmentów F(ab) pochodzących z humanizowanego przeciwciała E25 skierowanego przeciw IgE (Pesta i in., J. Immunol. 151: 2623 (1993).

Metody

I. Konstruowanie bibliotek monowalentnych F(ab)-fag

Skonstruowano kilka bibliotek F(ab). Jako wektor początkowy, wariant e25, zawierający w VL podstawienie D25E (dla wyeliminowania izomeryzacji izoAsp) poddano fuzji znanymi technikami, na przykład patrz Bass i in., Proteins 8: 309 (1990), z C-końcową domeną bakteriofagowego M13g3p. Plazmid ten, który był znany jako p426, przedstawiono na fig. 10. Najpierw F(ab)-faga „typu dzikiego”, p426, zastosowano jako matrycę do konstruowania specyficznych dla biblioteki matryc „stop”. Przez wprowadzenie kodonów stop (TAA lub TGA) unieczynniono oryginalną cząsteczkę, w ten sposób obniżając efekty tła oraz specyficzne dla matrycy (hybrydyzacyjne) odchylenie na etapach mutagenezy dla skonstruowania biblioteki (Lowman i Wells, Methods: Comp. Methods Enzymol. 3: 205 (1991)). Matryce te skonstruowano stosując ukierunkowaną mutagenezę jednoniciowej matrycy (Kunkel i in., Methods Enzymol. 204: 125 (1991), stosując oligonukleotydy wymienione w tableli 10.

Następnie te matryce stop zastosowano w drugiej turze mutagenezy, stosując oligonukleotydy wymienione w tabeli 11, w celu utwoorzenia bibliotek dla każdego ze wskazanych regionów CDR (zasady nukleotydów przedstawiono zgodnie z jednoliterową nomenklaturą IUPAC; N = A, G, C lub T; S = G lub C). Zdegenerowane kodony NNS zastosowano do uzyskania wszystkich dwudziestu aminokwasów w każdej z pozycji poddawanej losowemu podstawianiu, przy zastosowaniu 32 różnych możliwych kodonów. Kodon stop amber (TAG) koduje Gln w zastosowanym tu układzie supresorowym, tj. supresorowym szczepie supE XL-1 Blue; Bullock i in., Biotechniques 5, 376 (1987).

Obecność kodonu amber pomiędzy domeną łańcucha ciężkiego przeciwciała a domeną g3p faga umożliwia ekspresję prezentowanych przez fagi białek fuzyjnych tylko w supresorowych wobec kodonu amber szczepach E. coli, podczas gdy rozpuszczalne białko F(ab) można otrzymać z tej samej konstrukcji w niesupresorowych szczepach E. coli (Lowman i in., Biochemistry 30: 10832 (1991); Lowman i Wells, Methods Comp. Methods. Enzymol. 3: 205 (1991); Hoogenboom i in., Nucl. Acids Res. 19: 4133 (1991). Jednakże, inne kodony stop do stosowania w innych układach ekspresji fagów w E. coli są oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.

Produktami reakcji losowej mutagenezy stransformowano przez elektroporację komórki E. coli (Stratagene, XL-1 Blue) i zamplifikowano je hodując komórki przez noc w temperaturze 37°C z fagiem wspomagającym M13K07 (Vierra i Messing, Methods Enzymol. 153: (1987)).

PL 194 562 B1

Ta b l e l a 10

Oligonukleotydy matryc stop do pierwszej tury mutagenezy

Nr sekwencji oligonukleotydowej	Region	Sekwencja
HL-208	VL1	ACC TGC CGT GCC AGT TAA TAA GTC TAA TAA GAA GGT GAT AGC TAC
HL-2D9	VH3	GCC AGT CAG AGC GTC TAATAA TAA GGT TGAAGC TAC CTG AAC TGG T
HL-210	VH3	TGT GCT CGA GGC AGC TAA TAA TAA GGT TAA TGG TAA TTC GCC GTG TGG GG
HL-220	VL2	G AAA CTA CTG ATT TAC TAA TAA TAA TAA CTG GAG TCT GGA GTC
HL-221	VL3	CT TAT TAC TGT CAG CAA AGT TAA TAA TAA CCG TAA ACA TTT GGA CAG GGT ACC
HL-222	VH1	G TCC TGT GCA GTT TCT TAA TAA TAA TAA TAA TCC GGA TAC AGC TGG
HL-223	VH1	GCC TAC TCC ATC ACC TAA TAA TAA AGC TGAAAC TGG ATC CGT CAG
HL-224	VH2	GG GTT GCA TCG ATT TAA TAA TAA GGA TAA ACT TAA TAT AAC CCT AGC CTC AAG
HL-225	VL1	AAG CCG GTC GAC AGG TAA TAA GAT TAA TAC TAA AAC TGG TAT CAA CAG

Ta bel a 11

Specyficzne wobec biblioteki, zdegenerowane oligonukleotydy do drugiej tury mutagenezy

Nr sekwencji oligonukleotydowej	Region	Sekwencja
HL-212	VL1	ACC TGC CGT GCC AGT NNS NNS GTC NNS NNS GAA GGT GAT AGC TAC
HL-213	VH3	GCC AGT CAG AGC GTC NNS NNS NSS GGT NNS AGC TAC CTG AAC TGG
HL-214	VH3	TGT-GCT CGA GGC AGC NNS NNS NNS GGT NNS TGG NNS TTC GCC GTG TGG GG
HL-231	VL2	G AAA CTA CTG ATT TAC NNS NNS NNS NNS CTG GAG TCT GGA GTC
HL-232	VL3	CT TAT TAC TGT CAG CAA AGT NNS NNS NNS CCG NNS ACA TTT GGA CAG GGT ACC
HL-233	VH1	G TCC TGT GCA GTT TCT NNS NNS NNS NNS NNS TCC GGA TAC AGC TGG
HL-234	VH1	GTT TCT GGC TAC TCC ATC ACC NNS NNS NNS AGC NNS AAC TGG ATC CGT CAG
HL-235	VH2	GG GTT GCA TCG ATT NNS NNS NNS GGA NNS ACT NNS TAT AAC CCT AGC GTC A
HL-236	VL1	AAG CCG GTC GAC AGG NNS NNS GAT NNS TAC NNS AAC TGG TAT CAA CAG

II. Selekcje wiązania fagów

Do slekcji na zasadzie powinowactwa cząstek fagowych prezentujących warianty F(ab), fagi przygotowywano przez wytrącanie chlorkiem sodowym/glikolem polietylenowym (NaCl/PEG) z supernatantów hodowli E. coli. Fagi zawieszano w buforze PBS, następnie rozcieńczano w surowicy końskiej (nr katalogowy A-3311-D, Hyclone, Logan, UT) zawierającej 0,5% Tween™-20, tak jak nieprezentującego faga jako kontrolę ujemną. Jako kontrolę dodatnią F(ab)-faga e426 zmieszano z fagiem nieprezentującym i poddano selekcjom pozornym. 96-studzienkowe plastykowe płytki Maxisorp (Nunc) opłaszczano przez noc w temperaturze 4°C IgE o stężeniu 2 pg/ml (ludzka IgE, Genentech, nr serii 9957-36) w 50 mM buforze węglanu sodowego, pH 9.6. Następnie usuwano roztwór IgE, a płytki inku64

PL 194 562 B1 bowano z blokującym roztworem surowicy końskiej (bez Tween™-20) w ciągu dwóch godzin w temperaturze otoczenia.

Roztwór blokujący usuwano, a roztwór fagów inkubowano na płytkach w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie usuwano roztwór fagów i płytki 10 razy przemywano buforem PBS/Tween™-20 (0,05%). Studzienki wypełniano PBS/Tween i umożliwiano inkubację w ciągu dalszych 10 minut, po czym płytki ponownie przemywano 10 razy.

F(ab)-fagi pozostające związane z płytką eluowano 20 mM HCl, zobojętniano Tris-HCl, pH 8 i namnażano z fagiem wspomagającym w sposób opisany powyżej. Próbkę faga poddawano szeregowi kolejnych rozcieńczeń, mieszano ze świeżymi komórkami XL-1 Blue, wysiewano na płytki z odpowiednim antybiotykiem i zliczano CFU (jednostki koloniotwórcze) prezentujących F(ab) (opornych na karbenicylinę; CFUa) i nieprezentujących F(ab) (opornych na chloramfenikol; CFUc) wymywanych fagów. Wzbogacanie w (Emut) fagi prezentujące F(ab) w stosunku do nie prezentujących obliczano po każdej turze jako (CFUa/CFUc) dla wymytej puli podzielone przez (CFUa/CFUc) dla puli wyjściowej. Wzbogacanie dla kontrolnego faga typu dzikiego (Ewt) obliczano w taki sam sposób.

Kolejne tury selekcji na zasadzie powinowactwa przeprowadzano jak opisano powyżej, z wyjątkiem wydłużania w każdej turze okresu inkubacji po pierwszych 10 przemywaniach. Dla porównania efektywności selekcji fagów pomiędzy turami w warunkach wzrastającej surowości, współczynnik wzbogacenia dla każdej tury normalizowano wobec tego dla kontroli typu dzikiego. Stosunek wzbogacania wiązania dla każdej puli do tego dla typu dzikiego (Emut/Ewt) przedstawiono na fig. 6. Ponieważ w stanie równowagi większa frakcja wariantu o wysokim powinowactwie powinna pozostawać związana z płytką opłaszczoną IgE niż wariantu o niższym powinowactwie, warianty o wyższym powinowactwie powinny być odzyskiwane z wyższą wydajnością i dlatego wykazują wyższe względne wzbogacenia. Rzeczywiście, biblioteki VL1 wykazywały sukcesywnie poprawione względne wzbogacenia, aż do 10-krotnie wyższych od typu dzikiego względnych wzbogaceń po 5-6 turach selekcji.

Według tej miary, biblioteki VL1 wykazywały wyższą poprawę powinowactwa w stosunku do typu dzikiego niż biblioteki VH3. Różnica wyników pomiędzy dwoma zestawami bibliotek CDR może odzwierciedlać wyższy udział energetyczny VL1 w wiązaniu antygenu. Alternatywnie, CDR VH3 e25 może już być bardziej zoptymalizowany pod względem wiązania IgE, niż CDR VL1, umożliwiając zatem wyższą względną poprawę oddziaływań wiązania z udziałem VL1 poprzez podstawienia łańcuchów bocznych.

Sekwencjonowanie DNA wykazało, że większość wariantów F(ab)-fag z pierwszej biblioteki CDR1 VL (losowe podstawienia w pozycjach 27, 28, 39 i 32) posiadało zachowaną resztę D30 typu dzikiego, a preferencyjnie ulegało mutacji Y31G (tabela 15, w której klony z tury trzeciej oznaczono 212.3.x, a te z tury 6 oznaczono 212.6.x). Chociaż obserwowano różne podstawienia w pozycjach Q27 i S28, jeden klon, zawierający Q27K i S28P, dominował w puli fagów po sześciu turach selekcji. Klon ten zawierał również korzystne reszty D30 i G31, co sugeruje, że ta kombinacja łańcuchów bocznych może być optymalna dla wiązania IgE.

W drugiej bibliotece CDR1 VL (losowe podstawienia w pozycjach 30, 31,32 i 34) większość selektantów zachowywała reszty D30 i E32 typu dzikiego; wśród zsekwencjonowanych klonów obserwowano tylko D34 typu dzikiego. W bibliotece tej obserwowano różne rodzaje reszt w pozycji Y31. W dwóch klonach, 213-6.7 i 213-6.S (tabela 15), zaobserwowano dodatkową, rzekomą mutację G35S.

Analiza sekwencyjna klonów z biblioteki CDR3 VH po trzech turach selekcji wykazała, że biblioteka zasadniczo uległa ograniczeniu do pojedynczego klonu, tj. 214-3.1, posiadającego reszty typu dzikiego w pozycjach 101-103, z podstawieniami H105T i H107Y (tabela 15).

IV. Fagowe oznaczenia EIISA wyselekcjonowanych klonów F(ab)

W celu oceny wyników selekcji przez wiązanie fagów, fagami transformowano komórki E. coli XL-Blue i namnożano je w hodowli płynnej lub wysiewano na płytki zawierające antybiotyki. Z tych płytek losowo wybrano klony do sekwencjonowania i analizy przez współzawodniczę fagowe oznaczenie ELISA. (Cunningham i in., EMBO J. 13: 2508 (1994); Lowman, Rozdział 24, w: Methods in Molecular Biology, tom 87, S. Cabilly (red.), Humana Press Inc., Totawa, NJ (1997).

Dla oceny względnych powinowactw wiązania z IgE, fagi podawano miareczkowaniu na płytce opłaszczonej IgE, jak opisano powyżej, w celu normalizacji stężeń prezentowanych F(ab). Fagi wstępnie mieszano z szeregiem kolejnych rozcieńczeń IgE, następnie dodawano do płytki opłaszczonej IgE i inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemywano dziesięć razy PBS/Tween i dodawano roztwór króliczego przeciwciała skierowanego przeciw fagowi zmieszanego z kozią surowicą skierowaną przeciw immunoglobulinom królika, skoniugowaną z perokPL 194 562 B1 sydazą chrzanową. Po jednej godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej, płytki wywoływano z substratem chromogennym, o-fenylenodiaminą (Sigma). Reakcję zatrzymywano przez dodanie 1/2 objętości 2,5 M H2SO4. Stosując spektrofotometryczny czynnik płytek mierzono gęstość optyczną przy długości fali 490 nm. Dla każdego wariantu określano przez dodpasowywanie do każdego zestawu danych 4-parametrycznej krzywej (Lowman, Methods in Mol. Biol., supra). Względne powinowactwo wiązania określano dla każdego sklonowanego wariantu faga jako stosunek jego IC50 do LC50 faga wyjściowego e426 (tabele 15-16).

W niektórych przypadkach, pule fagów z danej tury selekcji testowano en masse w celu otrzymania oceny uśrednionego względnego powinowactwa populacji [IC50 (wt) / IC50 (mutant) wobec IgE. Na przykład, biblioteka CDR1, reszty 32, 33, 35 i 37, wykazywała tylko 3,6-krotnie poprawione powinowactwo w stosunku do e426 po pięciu turach selekcji, pomimo, że macierzysty wariant tej biblioteki (e26) okazał się posiadać 25-krotnie poprawione powinowactwo.

Dlatego też, biblioteki CDR1 VL tych określonych reszt dalej nie wykorzystywano. Z drugiej strony, pula fagów CDR2 VH wykazywała 6,2--krotnie poprawione powinowactwo w stosunku do swojego faga macierzystego, e426.

Utworzono również fagowe biblioteki domen CDR: CDR2 VL, reszty 54-57 i CDR3 VL, reszty 96-98, 99 i 100. Jednakże, podstawienia aminokwasowe w tych pozycjach nie doprowadziły to jakiegokolwiek wzbogacenia w stosunku do e426. Biblioteka fagowa utworzona dla CDR1 VH również nie doprowadziła do powstania jakiegokolwiek wzbogacenia w stosunku do 6426 i stwierdzono, że została zdominowana przez zanieczyszczającego faga e26. Sugeruje to, że w początkowych bibliotekach nie występował żaden wariant o powinowactwie wyższym od e26.

Biblioteki fagowe CDR domen CDR1 VL, reszty 27, 28, 30, 31, 32, 34, jak również CDRl VH, reszty 101, 102, 103, 105 i 107 przedstawiono w tabeli 15, podczas gdy CDR2 VH przedstawiono w tableli 16. W tabelach 15 i 16 bibliotek klonów, które nie wykazywały powinowactwa zauważalnie wyższego od powinowactwa e26, dalej nie wykorzystywano i nie określano współczynnika poprawy wiązania.

Ta bel a 15

Klony F(ab)-fag z selekcji wiązania IgE

Klon faga	Reszta CDR1 VL	Rreszta CDR3 VH	Krotność poprawy wiązania (fagowe oznaczenie ELISA)
27	28	30	31	32	34	101	102	103	105	107
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
e426	Q	S	D	Y	E	D	H	Y	F	H	H	-1-
212-3.1 (x2)	M	R	Y	G	-	-	-	-	-	-	-	nie określano
212-3.2	A	Y	N	G	-	-	-	-	-	-	-	3,5
212-3.3	G	G	Y	G	-	-	-	-	-	-	-	6,9
212-3.5	M	G	E	A	-	-	-	-	-	-	-	nie określano
212-6.1	E	Q	D	W	-	-	-	-	-	-	-	23
212-6.2	E	R	E	S	-	-	-	-	-	-	-	nie określano
212-6.4	E	H	D	W	-	-	-	-	-	-	-	23
212-6.5	S	N	S	G	-	-	-	-	-	-	-	nie określano
212-6.6	K	E	D	S	-	-	-	-	-	-	-	nie określano
212-6.7 (x8) (e26)	K	P	D	G								25
212-6.15	R	P	D	T	-	-	-	-	-	-	-	nie określano
212-6.16	R	S	D	G	-	-	-	-	-	-	-	nie określano
212-6.17	V	T	H	S	-	-	-	-	-	-	-	nie określano
213-3.1	-	-	D	D	C	D	-	-	-	-	-	nie określano

PL 194 562 B1 ciąg dalszy tabeli 15

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
213-3.2	-	-	H	D	S	D	-	-	-	-	-	nie określano
213-3.4	-	-	G	D	H	D	-	-	-	-	-	3,7
213-6.1	-	-	E	R	W	D	-	-	-	-	-	nie określano
213-6.3 (x2)	-	-	D	T	E	D	-	-	-	-	-	14
213-6.4	-	-	D	W	E	D	-	-	-	-	-	20
213-6.7 G33S	-	-	H	N	E	D	-	-	-	-	-	nie określano
213-6. S G33S	-	-	Y	S	N	D	-	-	-	-	-	14
213-6.9	-	-	W	G	E	D	-	-	-	-	-	nie określano
213-6.11	-	-	Y	S	E	D	-	-	-	-	-	nie określano
213-6-12	-	-	E	R	D	D	-	-	-	-	-	nie określano
213-6.13	-	-	H	E	E	D	-	-	-	-	-	nie określano
213-6.14	-	-	D	K	K	D	-	-	-	-	-	nie określano
213-6.15	-	-	D	R	Q	D	-	-	-	-	-	15
214-3.1 (x5)	-	-	-	-	-	-	H	Y	F	T	Y	2,7
214-3.6	-	-	-	-	-	-	H	Y	F	S	R	nie określano

Ta bel a 16 Klony fagowe CDR2 VH

Klon fagowy	Reszta CDR2 VH	Krotność poprawy wiązania
53	54	55	57	59
e426	T	Y	D	S	N	-1-
235-5.1	K	Y	S	E	K	nie określano*
235-5.2	K	W	H	E	M	nie określano*
235-5.3	K	W	W	E	A	nie określano*
235-5.4	H	Y	A	R	K	nie określano
235-5.5	K	Y	H	G	A	nie określano*

UWAGA: Uśrednione dla populacji względne powinowactwo fagów oszacowano na 6,2-krotnie poprawione w stosunku do e426

V. Połączone mutacje z przeszukiwania fagów

Mutacje w różnych miejscach białka często wykazują addytywny wpływ na jego funkcję (Wells, Biochemistry 29: 8509 (1990). Dlatego też, w celu poprawienia wiązania z IgE, połączono kilka mutacji z opisanych powyżej początkowych bibliotek fagowych.

W celu obniżenia prawdopodobieństwa zwiększenia immunogenności przeciwciała skierowanego przeciw IgE, zasięg mutacji E-25 powinien być jak najmniejszy. W wyniku, zastosowano tylko te mutacje wariantów fagowych, które wykazywały największą poprawę powinowactwa w niezależnych pomiarach.

Ponadto, częstość, z którą obserwowano dany klon fagowy może być uzależniona od poziomu ekspresji i/Lub stabilności proteolitycznej (Lowman i Wells, 1991, supra). Z biblioteki VL1 wybrano jeden określony klon, 212-6.7 którego nazwę zmieniono na e26, ponieważ wykazywał on powinowactwo 25-krotnie poprawione w stosunku do e426 w fagowych oznaczeniach ELISA (tabela 17).

Biblioteka CDR2 VH również wykazywała poprawę w stosunku do e426, chociaż poprawa ta zmierzona dla puli fagów była tylko 6,2-krotna. Powinowactwo puli fagów wskazuje na poprawione

PL 194 562 B1 powinowactwo wiązania dla co najmniej niektórych przedstawicieli, bez konieczności mierzenia powinowactwa wszystkich pojedynczych przedstawicieli. Zastosowanie puli fagów umożliwia także stwierdzenie, jak wysokie wzmocnienie powinowactwa uzyskano po danej turze oraz czy powinno się kontynuować selekcje na zasadzie powinowactwa (tj. po osiągnięciu maksymalnego powinowactwa puli nie jest prawdopodobne, aby kolejne tury doprowadziły do dodatkowego wzbogacenia). Dlatego też, stosowanie danych o powinowactwie puli jest bardzo użytecznym narzędziem przeszukiwania.

Było oczywiste, że mutacje w regionie CDR2 VH mogłyby działać addytywnie do mutacji w CDR1 VL, ponieważ pętle CDR2 VH są odległe od pętli CDR1 VL zarówno w strukturze krystalicznej, jak i modelach molekularnych. Jednakże, ponieważ niektóre kombinacje tych mutacji mogłyby nie mniej jednak być niekompatybilne, testowaliśmy cztery różne mutanty kombinacyjne: e26 w połączeniu z mutacjami występującymi w klonach 235-5.1,235-5.2, 235-5.3 i 235-5.4 (tablela 17).

Konstrukcje te wykonano przez mutagenezę metodą Kunkela (Kunkel i in., Methods Enzymol. 204: 125 (1991), stosując F(ab)-faga e26 jako matrycę i mutagenne oligonukleotydy kodujące mutacje w VH2.

Do porównania końcowych wariantów z kombinacjami mutacji CDR1 VL w e26 z mutacjami CDR2 VH w klonach 235-5.1, 235-5.2, 235-5.3 i 235-5.4 zastosowano fagowe oznaczenia ELISA (Lowman, Methods in Molecular Biology, tom 87, Cabillu (red.), Humana Press Inc., Totawa, N. J. (1997)). Przygotowano również rozpuszczalne białka F(ab) i porównano w płytkowym oznaczeniu z zastowaniem biotyny-IgE, którego wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 17 oraz na fig. 7.

Ta b l e l a 17

Fragment F(ab)	LC50 (nM)	Względne powinowactwo (krotność poprawy)
e426	1,500	-1-
e26	0,170	8,9
e27 (e26 + 235-5.1)	0,040	38
e695 (e26 + 235-5.2)	0,050	31
e696 (e26 + 235-5.3)	0,063	24
e697 (e26 + 235-5.4)	0,066	23

VI. Płytkowe oznaczenie z biotyną (oznaczenie współzawodnictwa z chimerą FcERI-LgG

Wprowadzenie

Celem tego przykładu jest porównanie współzawodnictwa różnych F(ab) skierowanych przeciw IgE z immobilizowaną chimerą receptora IgE o wysokim powinowactwie i IgG o wiązanie z biotynylowaną ludzką IgE w fazie roztworu, gdy do płytki opłaszczonej chimerą receptora IgE jednocześnie dodaje się F(ab) skierowany przeciw IgE i biotynylowaną IgE. Gdy wzrasta stężenie F(ab) skierowanego przeciw IgE, ilość biotynylowanej IgE, która może związać się z receptorem na płytce ulega obniżeniu, czego wynikiem jest niższa wartość gęstości optycznej mierzonej w spektrofotometrze.

Płytki maxisorp Nunc (nr kat. F96) opłaszczano w ciągu 24 godzin w temperaturze 4°C 100 ng/studzienkę FcsRl-lgG (Haak-Frendsho i in., J. Immunol. 151, 352 (1993), (Genentech, nr serii 2148-74 (6,4 mg/ml)) przez przygotowanie próbek 100 pl roztworu podstawowego o stężeniu 1 pg/ml w 50 nM buforze węglanu sodowego (pH 9,6). Płytki trzy razy przemywano buforem do przemywania w oznaczeniu ELISA (0,05% polisorbat 20 (Sigma) w PBS (pH 7,4)) i blokowano przez inkubację z 200 pl buforu do oznaczenia ELISA (sól fizjologiczna zbuforowana Tris, pH 4,45 z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej czystości do RIA, Sigma; 0,05% polisorbat 20 i 4 mM EDTA) w ciągu 60 minut. Po trzech przemywaniach buforem do przemywania, do płytki do ELISA dodawano w trzech powtórzeniach 100 pl kolejnych 2-krotnych rozcieńczeń F(ab) skierowanych przeciw IgE w buforze do oznaczeń, od 200 nM stężenia początkowego.

Rozcieńczenia wykonano wielokanałową pipetą Titertek®. Do każdej studzienki dodawano biotynylowaną IgE w buforze do oznaczeń (100 pl, rozcieńczenie 1/500 roztworu podstawowego o stężeniu 0,5 mg/ml) i mieszaninę inkubowano na wytrząsarce mikroobrotowej (Bellco) w ciągu 60 minut w temperaturze 25°C. IgE oczyszczono na zasadzie powinowactwa z supernatantu hodowlanego

PL 194 562 B1 szpiczaka U266B1 (ATCC T1B 196) i biotynylowano stosując hydrazyd biocytyny (O'Shannesy i in.,

Immunol. Lett. 8: 273 (1984); Pierce Chemical). Próbki przemywano 5 x buforem do przemywania i związaną IgE wykrywano z zastosowaniem 100 μΙ streptawidyny skoniugowanej z peroksydazą (Zymed) w rozcieńczeniu 1:3000, w ciągu 90 minut.

Następnie próbki ponownie przemywano 6 x buforem do przemywania, po czym dodawano 100 μl roztworu substratu (400 μg/ml dichlorowodorku o-fenylenodiaminy i 4 mM H2O2 w PBS) i inkubowano w ciągu 6 minut.

Reakcję zatrzymywano następnie 4,5 M H₂SO₄ (100 μ) i odczytywano absorbancję przy długości fali 490 nm w czytniku mikropłytek Uvmax (Molecular Devices). Na fig. 8 wykreślono absorbancję dla różnych poziomów stężeń fragmentów F(ab) przeciwciał e25, e26 i e27.

Wniosek

Wykres na fig. 8 wskazuje, że zarówno E26, jak i E27 posiadają wyższe od E25 powinowactwo wiązania z receptorem o wysokim powinowactwie, oraz że E27 wykazuje najwyższe powinowactwo.

VII. Oznaczenia BIAcore rozpuszczalnych białek F(ab)

Obliczono (Lofas i Johnson, J. Chem. Soc. Commun. 21, 1526-1528 (1990)) powinowactwa wiązania z receptorem dla kilku fragmentów F(ab) na podstawie stałych szybkości asocjacji i dysocjacji zmierzonych z zastosowaniem układu powierzchniowego rezonansu plazmonowego BIAcoreTM-2000 (BIAcore, Inc.). Chip bioczujnika aktywowano przez kowalencyjne sprzęganie IgE z zastosowaniem chlorowodorku N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimidu (NHS) zgodnie z instrukcjami producenta (BIAcore).

IgE rozcieńczano w 10 nM buforze octanu sodowego (pH 4,5), a następnie dalej rozcieńczano do stężenia około 30 μg/ml i wstrzykiwano nad chip dla otrzymania sygnału od 800 do 12400 jednostek odpowiedzi (RU) immobilizowanego materiału.

Ponieważ sygnał wyrażany w RU jest proporcjonalny do masy immobilizowanego materiału, odpowiada on zakresowi gęstości immobilizowanej IgE na matriks około od 0,4 do 6,5 pmoli/cm2. Ostatecznie, jako czynnik blokujący wstrzykiwano 1M etanoloaminę. Regeneracje prowadzono stosując 4,5 M MgC0.

Do pomiarów kinetycznych, nad chip IgE wstrzykiwano w temperaturze 25°C 1,5-krotne kolejne rozcieńczenia fragmentów F(ab) przeciwciał w buforze PBS/Tween (0,05% Tween-20 w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami) przy szybkości przepływu 20 μl/minutę (fig. 9).

Dane dysocjacji dopasowywano do modelu z jednym miejscem wiązania w celu otrzymania koff ± s.d. (odchylenie standardowe pomiarów).

Dla każdej krzywej asocjacji obliczano stałą szybkości pseudopierwszego rzędu (ks) i wykreślano w funkcji stężenia białka dla otrzymania kon ± s.e. (błąd standardowy dopasowania). Równowagowe stałe dysocjacji dla wiązania Fab:lgE, Kd, obliczano z pomiarów powierzchniowego rezonansu plazmonowego jako koff/kon.

Przy braku artefaktów doświadczalnych, takich jak ponowne wiązanie oddysocjowanego F(ab), obserwowana szybkość dysocjacji jest niezależna od stężenia F(ab).

Także, ponieważ równowagowa stała dysocjacji, Kd, jest odwrotnie proporcjonalna do koff, można dokonać oszacowania poprawy powinowactwa zakładając, że szybkość asocjacji (kon) jest stała dla wszystkich wariantów. Szybkości dysocjacji, wraz z obliczonym okresem półtrwania dysocjacji, przedstawiono w tabeli 18.

Ta bel a 18 Kinetyka dysocjacji

F(ab)	Koff χ 10'4 (sek'1)	t1/2	Poprawa (krotność)
e25	22 ± 4	5,3	-1-
e26	3,6 ± 0,2	41	7,7
e27 (e26 + 235-5.1)	0,98	116	22
e695 (e26 + 235-5.2)	0,94	122	23
e696 (e26 + 235-5.3)	1,4	83	16
e697 (e26 + 235-5.4)	1,5	77	15

PL 194 562 B1

VIII. Ekspresja i oczyszczanie F(ab)

W szczepie 34B8 E. coli przeprowadzono ekspresję skierowanego przeciw IgE F(ab) E-25 (Presta i in., J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993)) i wariantów w fagemidach pochodzących od p426 (fig. 10). Hodowle (10 ml) w podłożu 2YT z 50 pg/ml karbenicyliny inkubowano w ciągu 8 godzin w temperaturze 37°C, a następnie przenoszono do 1 litra zmodyfikowanego AP-5 zawierającego 50 pg/ml karbenicyliny i inkubowano w ciągu 24 godzin w temperaturze 37°C.

Hodowle wirowano w butelkach o pojemności 500 ml przy 7000 obrotów na minutę w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C. Osad zamrażano w ciągu co najmniej 3 godzin w temperaturze -20°C. Każdy z osadów z 500 ml hodowli zawieszano w objętości 12,5 ml zimnej 25% sacharozy w 50 mM Tris, pH 6,0, zawierającym 1 mM benzamidynę (Sigma) w temperaturze 4°C.

Zawiesinę solubilizowano przez mieszanie w temperaturze 4°C w ciągu 3 godzin. Zawiesinę wirowano przy 18000 obrotów na minutę w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C i ulegające ekspresji F(ab) w supernatancie oczyszczano przez chromatografię powinowactwa na białku G (Pharmacia). Kolumnę przemywano roztworem 10 mM Tris (pH 7,6) oraz 1 mM EDTA (pH 8,0), fragmenty F(ab) eluowano 2,5 objętościami kolumny 100 mM kwasu octowego (pH 3,0) i natychmiast przywracano obojętne pH przez dodanie 0,5 objętości 1M Tris, pH 8,0. Eluaty zatężano i bufor wymieniano na PBS stosując mikrokoncentratory centricon 30 (Amikon).

Stężenie białka oznaczano przez pomiar absorbancji przy długości fali 280 nm w spektrofotometrze (Beckman DU64), a czystość próbki oceniano stosując 4-20% żele do SDS-PAGE (Novex) w warunkach redukujących z 5% β-merkaptoetanolem.

IX. Wyniki i wniosek

Wyniki doświadczeń współzawodnictwa z fagowymi oznaczeniami ELISA wykazują, że podczas gdy F(ab)-fag e25 posiadał około 9-krotnie poprawione powinowactwo w stosunku do e426, kombinacyjne warianty e695, e696 i e697 wykazywały 20-40-krotną poprawę w stosunku do faga e426. Dodatkowe kombinacje mutacji otrzymanych dla fagów mogłyby dać w wyniku warianty przeciwciał o podobnie poprawionych powinowactwach.

Gdy rozpuszczalne białka F(ab) testowano w płytkowym oznaczeniu z biotyną-lgE, F(ab) e26 i F(ab) e27 wykazywały, odpowiednio, 10-krotną i 30-krotną poprawę w stosunku do e25 pod względem hamowania wiązania IgE z FcsRI-lgG. Określenie szybkości dysocjacji przez analizę BIAcore potwierdza te względne powinowactwa.

W szczególności, e26 i e27 wykazywały 7,7-krotnie i 22-krotnie wolniejsze szybkości dysocjacji niż e25. Dłuższe okresy półtrwania implikują, że IgE jest „zajęta” lub uczyniono ją niezdolną do wiązania z receptorem o wysokim powinowactwie przez dłuższy okres, czego wynikiem jest zatem poprawiona siła działania czynnika terapeutycznego skierowanego przeciw IgE.

A zatem, zarówno równowagowe, jak i kinetyczne dane wiązania potwierdzają wniosek, że F(ab) e26 i e27 wiążą IgE odpowiednio około 10-krotnie i 30-krotnie silniej niż e25. Oczekuje się, że przeciwciała o pełnej długości (IgG) zawierające mutacje odpowiadające F(ab) będą wykazywać podobne względne powinowactwa w stosunku do IgG e25.

PL 194 562 Β1

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Genentech, Inc.

(ii) tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania zmodyfikowanego polipeptydu stanowiącego przeciwciało przeciwko IgE, nie wykazującego deaktywacji izomeryzacji aspartylowej, i wykazującego powinowactwo do cząsteczki docelowej jaką stanowi IgE, równe lub wyższe niż niezmodyfikowany polipeptyd, sposób poprawiania właściwości hamowania indukowanego ambrozją uwalniania histaminy przeciwciała, cząsteczki kwasu nukleinowego, cząsteczki przeciwciała, kompożycje i zastosowania cząsteczek przeciwciała (iii) LICZBA SEKWENCJI: 26 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Genentech, Inc.

(B) ULICA: 1 DNA Way (C) MIASTO: South San Francisco (D) STAN: Kalifornia (E) KRAJ: STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD: 94080 (v) ZAPIS KOMPUTEROWY:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka 3.5 cala, 1.44 Mb (B) KOMPUTER: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: WinPatin (Genentech) (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNE ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: PCT/US98/13410 (B) DATA ZŁOŻENIA: 30 czerwca 1998 (C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:

(A) NAZWISKO: Svoboda, Craig G.

PL 194 562 Β1 (B) NUMER REJESTRACYJNY: 39 044 (C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ/NUMER W REJESTRZE: P1123PCT-A (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: 650/225-1489 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6127 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: kolista (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-6127 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: plazmid ekspresyjny (χί) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1:

GAATTCAACT	TCTCCATACT	TTGGATAAGG	AAATACAGAC	ATGAAAAATC	50
TCATTGCTGA	GTTGTTATTT	AAGCTTGCCC	AAAAAGAAGA	AGAGTCGAAT	100
GAACTGTGTG	CGCAGGTAGA	AGCTTTGGAG	ATTATCGTCA	CTGCAATGCT	150
TCGCAATATG	GCGCAAAATG	ACCAACAGCG	GTTGATTGAT	CAGGTAGAGG	200
GGGCGCTGTA	CGAGGTAAAG	CCCGATGCCA	GCATTCCTGA	CGACGATACG	250
GAGCTGCTGC	GCGATTACGT	AAAGAAGTTA	TTGAAGCATC	CTCGTCAGTA	300
AAAAGTTAAT	CTTTTCAACA	GCTGTCATAA	AGTTGTCACG	GCCGAGACTT	350
ATAGTCGCTT	TGTTTTTATT	TTTTAATGTA	TTTGTAACTA	GAATTCGAGC	400
TCGGTACCCG	GGGATCCTCT	CGAGGTTGAG	GTGATTTTAT	GAAAAAGAAT	450

ATCGCATTTC TTCTTGCATC TATGTTCGTT TTTTCTATTG CTACAAACGC 500

PL 194 562 B1

GTACGCTGAT	ATCCAGCTGA	CCCAGTCCCC	GAGCTCCCTG	TCCGCCTCTG	550
TGGGCGATAG	GGTCACCATC	ACCTGCCGTG	CCAGTCAGAG	CGTCGATTAC	600
GAAGGTGATA	GCTACCTGAA	CTGGTATCAA	CAGAAACCAG	GAAAAGCTCC	650
GAAACTACTG	ATTTACGCGG	CCTCGTACCT	GGAGTCTGGA	GTCCCTTCTC	700
GCTTCTCTGG	ATCCGGTTCT	GGGACGGATT	TCACTCTGAC	CATCAGCAGT	750
CTGCAGCCAG	AAGACTTCGC	AACTTATTAC	TGTCAGCAAA	GTCACGAGGA	800
TCCGTACACA	TTTGGACAGG	GTACCAAGGT	GGAGATCAAA	CGAACTGTGG	850
CTGCACCATC	TGTCTTCATC	TTCCCGCCAT	CTGATGAGCA	GTTGAAATCT	900
GGAACTGCTT	CTGTTGTGTG	CCTGCTGAAT	AACTTCTATC	CCAGAGAGGC	950
CAAAGTACAG	TGGAAGGTGG	ATAACGCCCT	CCAATCGGGT	AACTCCCAGG	1000
AGAGTGTCAC	AGAGCAGGAC	AGCAAGGACA	GCACCTACAG	CCTCAGCAGC	1050
ACCCTGACGC	TGAGCAAAGC	AGACTACGAG	AAACACAAAG	TCTACGCCTG	1100
CGAAGTCACC	CATCAGGGCC	TGAGCTCGCC	CGTCACAAAG	AGCTTCAACA	1150
GGGGAGAGTG	TTAAGCTGAT	CCTCTACGCC	GGACGCATCG	TGGCCCTAGT	1200
ACGCAAGTTC	ACGTAAAAAG	GGTATCTAGA	GGTTGAGGTG	ATTTTATGAA	1250
AAAGAATATC	GCATTTCTTC	TTGCATCTAT	GTTCGTTTTT	TCTATTGCTA	1300
CAAACGCGTA	CGCTGAGGTT	CAGCTGGTGG	AGTCTGGCGG	TGGCCTGGTG	1350
CAGCCAGGGG	GCTCACTCCG	TTTGTCCTGT	GCAGTTTCTG	GCTACTCCAT	1400
CACCTCCGGA	TACAGCTGGA	ACTGGATCCG	TCAGGCCCCG	GGTAAGGGCC	1450
TGGAATGGGT	TGCATCGATT	ACGTATGACG	GATCGACTAA	CTATAACCCT	1500
AGCGTCAAGG	GCCGTATCAC	TATAAGTCGC	GACGATTCCA	AAAACACATT	1550
CTACCTGCAG	ATGAACAGCC	TGCGTGCTGA	GGACACTGCC	GTCTATTATT	1600
GTGCTCGAGG	CAGCCACTAT	TTCGGTCACT	GGCACTTCGC	CGTGTGGGGT	1650
CAAGGAACCC	TGGTCACCGT	CTCCTCGGCC	TCCACCAAGG	GCCCATCGGT	1700
CTTCCCCCTA	GCACCCTCCT	CCAAGAGCAC	CTCTGGGGGC	ACAGCGGCCC	1750
TGGGCTGCCT	GGTCAAGGAC	TACTTCCCCG	AACCGGTGAC	GGTGTCGTGG	1800
AACTCAGGCG	CCCTGACCAG	CGGCGTGCAC	ACCTTCCCGG	CTGTCCTACA	1850
GTCCTCAGGA	CTCTACTCCC	TCAGCAGCGT	GGTGACCGTG	CCCTCCAGCA	1900
GCTTGGGCAC	CCAGACCTAC	ATCTGCAACG	TGAATCACAA	GCCCAGCAAC	1950

ACCAAGGTGG ACAAGAAAGT TGAGCCCAAA TCTTGTGACA AAACTCACAC 2000

PL 194 562 Β1

CTAGAGTGGC	GGTGGCTCTG	GTTCCGGTGA	TTTTGATTAT	GAAAAGATGG	2050
CAAACGCTAA	TAAGGGGGCT	ATGACCGAAA	ATGCCGATGA	AAACGCGCTA	2100
CAGTCTGACG	CTAAAGGCAA	ACTTGATTCT	GTCGCTACTG	ATTACGGTGC	2150
TGCTATCGAT	GGTTTCATTG	GTGACGTTTC	CGGCCTTGCT	AATGGTAATG	2200
GTGCTACTGG	TGATTTTGCT	GGCTCTAATT	CCCAAATGGC	TCAAGTCGGT	2250
GACGGTGATA	ATTCACCTTT	AATGAATAAT	TTCCGTCAAT	ATTTACCTTC	2300
CCTCCCTCAA	TCGGTTGAAT	GTCGCCCTTT	TGTCTTTAGC	GCTGGTAAAC	2350
CATATGAATT	TTCTATTGAT	TGTGACAAAA	TAAACTTATT	CCGTGGTGTC	2400
TTTGCGTTTC	TTTTATATGT	TGCCACCTTT	ATGTATGTAT	TTTCTACGTT	2450
TGCTAACATA	CTGCGTAATA	AGGAGTCTTA	ATCATGCCAG	TTCTTTTGGC	2500
TAGCGCCGCC	CTATACCTTG	TCTGCCTCCC	CGCGTTGCGT	CGCGGTGCAT	2550
GC-AGCCGGGC	CACCTCGACC	TGAATGGAAG	CCGGCGGCAC	CTCGCTAACG	2600
GATTCACCAC	TCCAAGAATT	GGAGCCAATC	AATTGTTGCG	GAGAACTGTG	2650
AATGCGCAAA	CCAACCCTTG	GCAGAACATA	TCCATCGCGT	CCGCCATCTC	2700
CAGCAGCCGC	ACGCGGCGCA	TCTCGGGCAG	CGTTGGGTCC	TGGCCACGGG	2750
TGCGCATGAT	CGTGCTCCTG	TCGTTGAGGA	CCCGGCTAGG	CTGGCGGGGT	2800
TGCCTTACTG	GTTAGCAGAA	TGAATCACCG	ATACGCGAGC	GAACGTGAAG	2850
CGACTGCTGC	TGCAAAACGT	CTGCGACCTG	AGCAACAACA	TGAATGGTCT	2900
TCGGTTTCCG	TGTTTCGTAA	AGTCTGGAAA	CGCGGAAGTC	AGCGCCCTGC	2950
ACCATTATGT	TCCGGATCTG	CATCGCAGGA	TGCTGCTGGC	TACCCTGTGG	3000
AACACCTACA	TCTGTATTAA	CGAAGCGCTG	GCATTGACCC	TGAGTGATTT	3050
TTCTCTGGTC	CCGCCGCATC	CATACCGCCA	GTTGTTTACC	CTCACAACGT	3100
TCCAGTAACC	GGGCATGTTC	ATCATCAGTA	ACCCGTATCG	TGAGCATCCT	3150
CTCTCGTTTC	ATCGGTATCA	TTACCCCCAT	GAACAGAAAT	TCCCCCTTAC	3200
ACGGAGGCAT	CAAGTGACCA	AACAGGAAAA	AACCGCCCTT	AACATGGCCC	3250
GCTTTATCAG	AAGCCAGACA	TTAACGCTTC	TGGAGAAACT	CAACGAGCTG	3300
GACGCGGATG	AACAGGCAGA	CATCTGTGAA	TCGCTTCACG	ACCACGCTGA	3350
TGAGCTTTAC	CGCAGGATCC	GGAAATTGTA	AACGTTAATA	TTTTGTTAAA	3400
ATTCGCGTTA	AATTTTTGTT	AAATCAGCTC	ATTTTTTAAC	CAATAGGCCG	3450

AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG 3500

PL 194 562 B1

AGTGTTGTTC	CAGTTTGGAA	CAAGAGTCCA	CTATTAAAGA	ACGTGGACTC	3550
CAACGTCAAA	GGGCGAAAAA	CCGTCTATCA	GGGCTATGGC	CCACTACGTG	3600
AACCATCACC	CTAATCAAGT	TTTTTGGGGT	CGAGGTGCCG	TAAAGCACTA	3650
AATCGGAACC	CTAAAGGGAG	CCCCCGATTT	AGAGCTTGAC	GGGGAAAGCC	3700
GGCGAACGTG	GCGAGAAAGG	AAGGGAAGAA	AGCGAAAGGA	GCGGGCGCTA	3750
GGGCGCTGGC	AAGTGTAGCG	GTCACGCTGC	GCGTAACCAC	CACACCCGCC	3800
GCGCTTAATG	CGCCGCTACA	GGGCGCGTCC	GGATCCTGCC	TCGCGCGTTT	3850
CGGTGATGAC	GGTGAAAACC	TCTGACACAT	GCAGCTCCCG	GAGACGGTCA	3900
CAGCTTGTCT	GTAAGCGGAT	GCCGGGAGCA	GACAAGCCCG	TCAGGGCGCG	3950
TCAGCGGGTG	TTGGCGGGTG	TCGGGGCGCA	GCCATGACCC	AGTCACGTAG	4000
CGATAGCGGA	GTGTATACTG	GCTTAACTAT	GCGGCATCAG	AGCAGATTGT	4050
ACTGAGAGTG	CACCATATGC	GGTGTGAAAT	ACCGCACAGA	TGCGTAAGGA	4100
GAAAATACCG	CATCAGGCGC	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TGACTCGCTG	4150
CGCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGAGCGGTA	TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT	4200
AATACGGTTA	TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG	AACATGTGAG	4250
CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	AGGAACCGTA	AAAAGGCCGC	GTTGCTGGCG	4300
TTTTTCCATA	GGCTCCGCCC	CCCTGACGAG	CATCACAAAA	ATCGACGCTC	4350
AAGTCAGAGG	TGGCGAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	CAGGCGTTTC	4400
CCCCTGGAAG	CTCCCTCGTG	CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT	GCCGCTTACC	4450
GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CCCTTCGGGA	AGCGTGGCGC	TTTCTCATAG	4500
CTCACGCTGT	AGGTATCTCA	GTTCGGTGTA	GGTCGTTCGC	TCCAAGCTGG	4550
GCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	GTTCAGCCCG	ACCGCTGCGC	CTTATCCGGT	4600
AACTATCGTC	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	CACGACTTAT	CGCCACTGGC	4650
AGCAGCCACT	GGTAACAGGA	TTAGCAGAGC	GAGGTATGTA	GGCGGTGCTA	4700
CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AAGGACAGTA	4750
TTTGGTATCT	GCGCTCTGCT	GAAGCCAGTT	ACCTTCGGAA	AAAGAGTTGG	4800
TAGCTCTTGA	TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGGTAGCGGT	ggtttttttg	4850
TTTGCAAGCA	GCAGATTACG	CGCAGAAAAA	AAGGATCTCA	AGAAGATCCT	4900
TTGATCTTTT	CTACGGGGTC	TGACGCTCAG	TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	4950

AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT 5000

PL 194 562 Β1

TAAATTAAAA	ATGAAGTTTT	AAATCAATCT	AAAGTATATA	TGAGTAAACT	5050
TGGTCTGACA	GTTACCAATG	CTTAATCAGT	GAGGCACCTA	TCTCAGCGAT	5100
CTGTCTATTT	CGTTCATCCA	TAGTTGCCTG	ACTCCCCGTC	GTGTAGATAA	5150
CTACGATACG	GGAGGGCTTA	CCATCTGGCC	CCAGTGCTGC	AATGATACCG	5200
CGAGACCCAC	GCTCACCGGC	TCCAGATTTA	TCAGCAATAA	ACCAGCCAGC	5250
CGGAAGGGCC	GAGCGCAGAA	GTGGTCCTGC	AACTTTATCC	GCCTCCATCC	5300
AGTCTATTAA	TTGTTGCCGG	GAAGCTAGAG	TAAGTAGTTC	GCCAGTTAAT	5350
AGTTTGCGCA	ACGTTGTTGC	CATTGCTGCA	GGCATCGTGG	TGTCACGCTC	5400
GTCGTTTGGT	ATGGCTTCAT	TCAGCTCCGG	TTCCCAACGA	TCAAGGCGAG	5450
TTACATGATC	CCCCATGTTG	TGCAAAAAAG	CGGTTAGCTC	CTTCGGTCCT	5500
CCGATCGTTG	TCAGAAGTAA	GTTGGCCGCA	GTGTTATCAC	TCATGGTTAT	5550
GGCAGCACTG	CATAATTCTC	TTACTGTCAT	GCCATCCGTA	AGATGCTTTT	5600
CTGTGACTGG	TGAGTACTCA	ACCAAGTCAT	TCTGAGAATA	GTGTATGCGG	5650
CGACCGAGTT	GCTCTTGCCC	GGCGTCAACA	CGGGATAATA	CCGCGCCACA	5700
TAGCAGAACT	TTAAAAGTGC	TCATCATTGG	AAAACGTTCT	TCGGGGCGAA	5750
AACTCTCAAG	GATCTTACCG	CTGTTGAGAT	CCAGTTCGAT	GTAACCCACT	5800
CGTGCACCCA	ACTGATCTTC	AGCATCTTTT	ACTTTCACCA	GCGTTTCTGG	5850
GTGAGCAAAA	ACAGGAAGGC	AAAATGCCGC	AAAAAAGGGA	ATAAGGGCGA	5900
CACGGAAATG	TTGAATACTC	ATACTCTTCC	TTTTTCAATA	TTATTGAAGC	5950
ATTTATCAGG	GTTATTGTCT	CATGAGCGGA	TACATATTTG	AATGTATTTA	6000
GAAAAATAAA	CAAATAGGGG	TTCCGCGCAC	ATTTCCCCGA	AAAGTGCCAC	6050
CTGACGTCTA	AGAAACCATT	ATTATCATGA	CATTAACCTA	TAAAAATAGG	6100
CGTATCACGA	GGCCCTTTCG	TCTTCAA 6127

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 121 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 194 562 Β1

(xi	.) OPIS	SEKWENCJI:	SEKWENCJA CYJNYM: 2:	0 NUMERZE	IDENTYFIKA-
Asp	Val Gln	Leu Gln Glu	Ser Gly Pro	Gly Leu Val	Lys Pro Ser
1		5		10	15
Gin	Ser Leu	Ser Leu Ala	Cys Ser Val	Thr Gly Tyr	Ser Ile Thr
		20		25	30
Ser	Gly Tyr	Ser Trp Asn	Trp Ile Arg	Gln Phe Pro	Gly Asn Lys
		35		40	45
Leu	Glu Trp	Met Gly Ser	Ile Thr Tyr	Asp Gly Ser	Ser Asn Tyr
		50		55	60
Asn	Pro Ser	Leu Lys Asn	Arg Ile Ser	Val Thr Arg	Asp Thr Ser
		65		70	75
Gin	Asn Gln	Phe Phe Leu	Lys Leu Asn	Ser Ala Thr	Ala Glu Asp
		80		85	90
Thr	Ala Thr	Tyr Tyr Cys	Ala Arg Gly	Ser His Tyr	Phe Gly His
		95		100	105
Trp	His Phe	Ala Val Trp	Gly Ala Gly	Thr Thr Val	Thr Val Ser
		110		115	120

Ser

121 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 3: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ: 121 aminokwasów
(B)	RODZAJ: Aminokwasowa
(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ix) CECHA:
(A)	NAZWA/KLUCZ: sztuczna
(B)	LOKALIZACJA: 1-121

(C) METODA IDENTYFIKACJI:

PL 194 562 B1 (D) INNE INFORMACJE: sekwencja F(ab) pochodząca z

MAE 11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 3:

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Tys

Asn

Thr

Phe

Tyr

L e u

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

121 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 121 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 4 :

Glu Val Gin Len Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

PL 194 562 B1

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Xaa 30

Ser

Asp

Tyr

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Ser

Asn

Gly

Ser

Asp

Thr

Tyr

Tyr

50

55

60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Arg

Phe

Phe

Xaa

Xaa

95

100

105

Xaa

Xaa

Xaa

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110 115 120

Ser

121 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM : 5:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

10 15

Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp

PL 194 562 B1

Tyr Asp Gly Asp Ser

Tyr Met Asn Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

35

Gin

Pro

Pro

Ile

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

iyr

Leu

Gly

Ser

50

55

60

Glu

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Phe

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

110 111 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 6:

(i)	CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
	(A)	DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów
	(B)	RODZAJ: aminokwasowa
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ix)	CECHA:
	(A)	NAZWA/KLUCZ: sztuczna
	(B)	LOKALIZACJA: 1-111
	(C)	METODA IDENTYFIKACJI:
	(D)	INNE INFORMACJE: sekwencja	lekkiego	łańcucha
		F(ab) pochodząca z	MAE11
(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0	NUMERZE	IDENTYFIKA-
		CYJNYM: 6:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

PL 194 562 B1

Gly Asp Arg Val

Thr 20

Ile Thr Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

110

111

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 111 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 7:

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

1

5

10

15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

20

20

30

Ile

Ser

Xaa

Xaa

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

PL 194 562 Β1

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu 50

Leu

Ile Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Ser

Leu

Glu

Ser 60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gln

Gln

Tyr

Asn

Ser

Leu

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

110

111

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 114 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa {ix} CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-114 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja lekkiego łańcucha pochodząca z MAEll (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 8:

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp

PL 194 562 B1

Gly

Glu Gly

Asp

Ser Tyr Leu Asn Trp 35

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly

40

45

Lys

Al a

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

110

114

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

{A} DŁUGOŚĆ: 114 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-114 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja lekkiego łańcucha pochodząca z MAE11 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 9:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

PL 194 562 B1

Gly Asp Arg Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

110

114

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1-: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 114 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-114 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja lekkiego łańcucha pochodząca 2 MAE11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 10:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

PL 194 562 Β1

Gly

Asp Arg Val

Thr 20

Ile Thr

Cys Arg

Ala 25

Ser

Gln

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Ly s

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

110

114

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 11: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 114 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-114 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha pochodząca z MAE11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 11:

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

PL 194 562 Β1

Gly

Ser

Leu Arg

Leu Ser Cys Ala 20

Val

Ser 25

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr 30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gln

Gly

110

114

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 114 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-114 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha pochodząca z MAE11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 12:

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

PL 194 562 Β1

Gly Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Val

Ser 25

Gly

Tyr Ser Ile

Thr 30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

110

114

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 13: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 218 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-218 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja lekkiego łańcucha pochodząca z MAE11 {xi} OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 13:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

PL 194 562 B1

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

G1 n

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

110

115

120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

125

130

135

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

140

145

150

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

170

175

180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

185

190

195

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

200

205

210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

215

218

PL 194 562 Β1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 451 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-451 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha pochodząca z MAEll (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 14:

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

PL 194 562 B1

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

140

145

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

230

235

240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

245

250

255

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

260

265

270

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

275

280

285

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

290

295

300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

305

310

315

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

320

325

330

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

335 340 345

PL 194 562 B1

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 350

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

365

370

375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

380

385

390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

395

400

405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

410

415

420

Trp

Gln

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

425

430

435

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

440

445

450

Lys

451 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 218 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-218 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja lekkiego łańcucha pochodząca z MAEll (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 15:

PL 194 562 Β1

Asp

Ile

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

1

5

10

15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Pro

Val

Asp

20

25

30

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

110

115

120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

125

130

135

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

140

145

150

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

170

175

180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

185

190

195

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

200

205

210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

215

218

PL 194 562 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 451 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-451 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha pochodząca z MAE11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 16:

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

PL 194 562 Β1

Ser

Ala

Ser

Thr Lys 125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 130

Pro Leu Ala Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

140

145

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

230

235

240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

245

250

255

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

260

265

270

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

275

280

285

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

290

295

300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

305

310

315

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

320

325

330

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

335

340

345

PL 194 562 B1

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro Gin Val 350

Tyr

Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

365

370

375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

380

385

390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

395

400

405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

410

415

420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

425

430

435

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

440

445

450

Lys

451 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 218 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-218 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja lekkiego łańcucha pochodząca z MAE11 (ii) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 17:

PL 194 562 Β1

Asp Ile Gin Leu Thr

5

Gly Asp Arg Val Thr

Gly Glu Gly Asp Ser

Lys Ala Pro Lys Leu

Gly Val Pro Ser Arg

Thr Leu Thr Ile Ser

Tyr Cys Gin Gin Ser

Thr Lys Val Glu Ile

110

Ile Phe Pro Pro Ser

125

Val Val Cys Leu Leu

140

Gin Trp Lys Val Asp

155

Ser Val Thr Glu Gin

170

Ser Thr Leu Thr Leu

185

Tyr Ala Cys Glu Val

200

Lys Ser Phe Asn Arg

Gin Ser Pro Ser Ser

Ile Thr Cys Arg Ala

Tyr Met Asn Trp Tyr

Leu Ile Tyr Ala Ala

Phe Ser Gly Ser Gly

Ser Leu Gin Pro Glu

His Glu Asp Pro Tyr

100

Lys Arg Thr Val Ala

115

Asp Glu Gin Leu Lys

130

Asn Asn Phe Tyr Pro

145

Asn Ala Leu Gin Ser

160

Asp Ser Lys Asp Ser

175

Ser Lys Ala Asp Tyr

190

Thr His Gin Gly Leu

205

Gly Glu Cys

Leu Ser Ala Ser Val

Ser Lys Pro Val Asp

Gin Gin Lys Pro Gly

Ser Tyr Leu Glu Ser

Ser Gly Thr Asp Phe

Asp Phe Ala Thr Tyr

Thr Phe Gly Gin Gly

105

Ala Pro Ser Val Phe

120

Ser Gly Thr Ala Ser

135

Arg Glu Ala Lys Val

150

Gly Asn Ser Gin Glu

165

Thr Tyr Ser Leu Ser

180

Glu Lys His Lys Val

195

Ser Ser Pre Val Thr

210

215

218

PL 194 562 Β1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 451 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna <B) LOKALIZACJA: 1-451 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha pochodząca z MAEll (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 18:

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

PL 194 562 B1

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser Val

Phe 130

Pro Leu Ala Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

leu

Val

140

1^5

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

i’5.0

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

1^0

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

^200

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

230

235

240

Gly

Pro

Ser

Vai

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

245

250

255

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

260

260

2270

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

275

229 0

285

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

290

22 50

2000

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

305

310

355

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

320

325

330

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

335

340

345

PL 194 562 Β1

Gin

Pro Arg

Glu

Pro 350

Gin

Val Tyr Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

365

370

375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

380

385

390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

395

400

405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

410

415

420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

425

430

435

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

440

445

450

Lys

451 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 19: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 218 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-218 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja lekkiego łańcucha

F(ab) pochodząca z MAEll (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 19:

PL 194 562 B1

Asp

Ile

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

1

5

10

15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Pro

Val

Asp

20

25

30

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95'

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

110

115

120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

125

130

135

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

140

145

150

Gin

Trp

Lys

Val'

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

170

175

180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

185

190

195

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

200

205

210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

215

218

100

PL 194 562 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 229 aminokwasów, (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-229 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha

F(ab) pochodząca z MAE 11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 20:

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

I lo

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Vał

Ser

110 115 120

PL 194 562 Β1

101

Ser

Ala

Ser Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

140

145

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

155

160

165

1 a

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys

Thr

His

Thr

229

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 21: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 229 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-229 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha

F{ab) pochodząca z MAE11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 21:

102

PL 194 562 Β1

Gl u

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Al a

Ser

Ile

Lys

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

140

145

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

dy

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Vał

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

103

PL 194 562 Β1

Lys Thr His Thr 229 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 22: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 248 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-248 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja sFv pochodząca z

MAE 11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 22:

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

85 90

104

PL 194 562 B1

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys Ala Arg Gly

Ser 100

His

Tyr

Phe

Gly

His 105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly

125

130

135

Ser

Asp

Ile

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

140

145

150

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Pro

Val

155

160

165

Asp

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

170

175

180

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

185

190

195

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

200

205

210

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

215

220

225

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

230

235

240

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

245

248

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 23: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 248 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna

PL 194 562 B1

105 (B) LOKALIZACJA: 1-248 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja sFv pochodząca z

MAE11

(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEKWENCJA	O NUMERZE i:	IDENTYFIKA-
CYJNYM	: 23
Glu Val Gin	Leu Val Glu	Ser Gly	Gly	Gly Leu Val	Gin Pro Gly
1	5			10	15
Gly Ser Leu	Arg Leu Ser	Cys Ala	Val	Ser Gly Tyr	Ser Ile Thr
	20			25	30
Ser Gly Tyr	Ser Trp Asn	Trp Ile	Arg	Gin Ala Pro	Gly Lys Gly
	35			40	45
Leu Glu Trp	Val Ala Ser	Ile Lys	Tyr	Ser Gly Glu	Thr Lys Tyr
	50			55	60
Asn Pro Ser	Val Lys Gly	Arg Ile	Thr	Ile Ser Arg	Asp Asp Ser
	65			70	75
Lys Asn Thr	Phe Tyr Leu	Gln Met	Asn	Ser Leu Arg	Ala Glu Asp
	80			85	90
Thr Ala Val	Tyr Tyr Cys	Ala Arg	Gly	Ser His Tyr	Phe Gly His
	95			100	105
Trp His Phe	Ala Val Trp	Gly Gin	Gly	Thr Leu Val	Thr Val Ser
	110			115	120
Ser Glu Gly	Gly Gly Ser	Glu Gly	Gly	Gly Ser Glu	Gly Gly Gly
	125			130	135
Ser Asp Ile	Gin Leu Thr	Gin Ser	Pro	Ser Ser Leu	Ser Ala Ser
	140			145	150
Val Gly Asp	Arg Val Thr	Ile Thr	Cys	Arg Ala Ser	Lys Pro Val
	155			160	165

106

PL 194 562 Β1

Asp Gly

Glu

Gly Asp 170

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys 175

Pro 180

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

185

190

195

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

200

205

210

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

215

220

225

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

230

235

240

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

245

248

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 24: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 218 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-218 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja lekkiego łańcucha

				F(ab)'2 pochodząca	z MAEłl
(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEKWENCJA O NUMERZE	IDENTYFIKA-
				CYJNYM: 24:
Asp Ile Gin	Leu	Thr	Gin	Ser Pro Ser Ser Leu Ser	Ala Ser	Val
1		5		10		15
Gly Asp Arg	Val	Thr	Ile	Thr Cys Arg Ala Ser Lys	Pro Val	Asp

PL 194 562 B1

107

Gly Glu Gly Asp

Ser 35

Tyr Leu

Asn

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

110

115

120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

125

130

135

Val

Val

cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

140

145

150

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

170

175

180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

185

190

195

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

200

205

210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

215

218

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 25: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 233 aminokwasy

108

PL 194 562 B1 (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-233 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha

F(ab)'2 pochodząca z MAE11 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKA·

CYJNYM: 25:

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

'Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

PL 194 562 Β1

109

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser 140

Gly

Gly

Thr Ala Ala 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Val 150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

230

233

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 233 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: sztuczna (B) LOKALIZACJA: 1-233 (C) METODA IDENTYFIKACJI:

(D) INNE INFORMACJE: sekwencja ciężkiego łańcucha

F{ab)'2 pochodząca z MAE11

110

PL 194 562 B1

(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEKWENCJA CYJNYM: 26	0 NUMERZE i:	IDENTYFIKA-
Glu Val Gin	Leu Val Glu	Ser Gly Gly	Gly Leu Val	Gln Pro Gly
1	5		10	15
Gly Ser Leu	Arg Leu Ser	Cys Ala Val	Ser Gly Tyr	Ser Ile Thr
	20		25	30
Ser Gly Tyr	Ser Trp Asn	Trp Ile Arg	Gln Ala Pro	Gly Lys Gly
	35		40	45
Leu Glu Trp	Val Ala Ser	Ile Lys Tyr	Ser Gly Glu	Thr Lys Tyr
	50		55	60
Asn Pro Ser	Val Lys Gly	Arg Ile Thr	Ile Ser Arg	Asp Asp Ser
	65		70	75
Lys Asn Thr	Phe Tyr Leu	Gin Met Asn	Ser Leu Arg	Ala Glu Asp
	80		85	90
Thr Ala Val	Tyr Tyr Cys	Ala Arg Gly	Ser His Tyr	Phe Gly His
	95		100	105
Trp His Phe	Ala Val Trp	Gly Gin Gly	Thr Leu Val	Thr Val Ser
	110		115	120
Ser Ala Ser	Thr Lys Gly	Pro Ser Val	Phe Pro Leu	Ala Pro Ser
	125		130	135
Ser Lys Ser	Thr Ser Gly	Gly Thr Ala	Ala Leu Gly	Cys Leu Val
	140		145	150
Lys Asp Tyr	Phe Pro Glu	Pro Val Thr	Val Ser Trp	Asn Ser Gly
	155		160	165
Ala Leu Thr	Ser Gly Val	His Thr Phe	Pro Ala Val	Leu Gin Ser
	170		175	180
Ser Gly Leu	Tyr Ser Leu	Ser Ser Val	Val Thr Val	Pro Ser Ser
	185		190	195
Ser Leu Gly	Thr Gin Thr	Tyr Ile Cys	Asn Val Asn	His Lys Pro
	200		205	210

PL 194 562 B1

111

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

215 220 225

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

230 233

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób v\tytwarzania zmodyfikowanego polipeptydu stanowiącego przeciwciało przeciwko IgE, eic wdOnaujcecos UgnOtywneji iasmcrdaneji ntonraflswcj i wdOnaujcecos oswieswneaws Us eacztceaki Useclswcj jnOą ttneswi IgE, rbwec lub wyżsac eiż eigemsydfiOswned osliocotdU, znamienny tym, żc:

   n) iUcetdfiOujc óię rcóatd nóonrtdlswc wdOnaujcec tceUceeję Us iasmcrdaneji; i

   b) osUótnwin óię nltcrentdwec rcóatd i oracóauOujc stradmnec mutnetd osU Octem oswieswnetwn Us eacótceaOi Useclswcj oraca Usjracwneic en anónUaic oswieswnetwn a anótsóswneicm orcacetneji en fngu, orad eadm sbcjmujc ts osenUts ctnod, w Otbrdeh:

   (i) osUótnwin óię, osUUnjc Uclceji lub ieócreji jcUce lub więecj OsUsebw w gceic OsUujcedm tce osliocotdU es óOutOujc aminec ócOwceeji nmiesOwnóswcj tcgs osliocotdUu, a wdtwsraceicm biblistcki ótruOturnleic osOrcwedeh osliocotdUbw osUUnedeh fuaji a binłOicm OnoódUu fngn, (ii) posUąje się przcactacji poje^d^a kosię kOnżUcg polipo-rtydU podrzwaocg ne powicraehei eacótOi fngcmiUswej anwicrnjcecj DNA OsUujced tce osliocotdU; i

   e) się sele-oji zmoSudkowano polipo-eydu, w Wóryde zr^^^r^^^s^ rrcztę aspertylowa i Otbrc wdOnaujc oswieswnetws Us eacótceaOi Useclswcj rbwec lub wdżóac eiż eicamsUdfiOswned osliocotdU.
2. 2. Sposób w^c^Ułic^ z^^tr^^. r, zznmieenn tym, Zż niecmoSudkowano przaciwaiało posiadU seOwceeję wóOnanec jnOs „E25” en fig. 12 (ócOwceejc s eumcrneh iUcetdfiOnedjedeh: 13-14).
3. 3. Sposób waCług zmóre. 2, zznmieeny t^r^, żż poSutawia się r^^^^ Glne2Lyd i Scr28Prs CDRl Usmced amiceecj łnńeuehn lcOOicgs.
4. 4. Sposób zantrz. 3, zznmieenn ttn, żż doSuraowo poSutawia sżę r^^^^ TT^r^^L^ydó

   Aóo55Scr, Scr5LGlu i Aóe59ydó CDR2 Usmced amiceecj łnńeuehn eiężOicgs.
5. 5. Sposób posrzwiasia właSciwadci hamowasia i ndukowasocg smOrzste swalniasia Sistamino oraceiweinłn, znamienny tym, żc oracorswnUan óię óosóbb sOrcślsed w anótra. 1.
6. 6. Czectaceeo Zo^^^u sekleinowacg, zznmieenn ttym Zż sSbjmuje es enjmeicj 85% iUcetdeaesśei ócOwceeji a ócOwceejc OsUujcec saeneasec „c26” en fig. 13 (zckwceejc s eumcrneh iUcetdfiOnedjedeh: 19 i 20), orad eadm tn eacutceaOn Ownzu euOlcieswcgs OsUujc eacótceaOę oraceiweinłn sbcjmujcec rcuatd 32Glu, 2LLdz i 28Prs CDRl Usmced amiceecj łnńeuehn lcOOicgs.

   L. żo^^^u neUleinowaggwagługzestrz.6, zznmieenn tt^m, żżoSbjmojeseCwacoje

   OsUujcec Uln frngmcetu oraceiweinłn c26 wdbrnecgs a gruod uOłnUnjcecj zię a: F(nb) (ócOwceejc s eumcrneh iUcetdfiOnedjedeh: 19 i 20), zFv (zcOwceejn s eumcrac iUcetdfiOnedjedm: 22) lub F(nb)'2 (ócOwceejc s eumcrneh iUcetdfiOnedjedeh: 24 i 25).
7. 8. Czacteceao Iw^^su nekleinowacg, zznmieenn ttym Zż ρ^ΐθ^ litra es enjmeicj 85% iUcetdeaesśei ócOwceeji a ócOwceeją OsUujcec „c2L” en fig. 13 (ócOwceejc s eumcrneh iUcetdfiOnedjedeh: 19 i 21), orad eadm tn eacztgeaOn Ownzu euOlcieswcgs OsUujc eacztgeaOę oraceiweinłn sbcjmujcec rczatd 32Glu, 2LLdz i 2pPrs CDRl Usmced amiceecj łnńeuehn lcOOicgs.
8. 9. żo^^^u nekieinowagg w^r^Ułie^ zantrz. Z, zznmieenn ttym, Zż ρ^ΐθ^ s^Co^^co^^ OsUujcec Uln frngmcetu oraceiweinłn c2L wdbrnecgs a gruod uOłnUnjcecj zię a: F(nb) (zckwceejc s eumcrneh iUcetdfiOnedjedeh: 19 i 21), zFv (zcOwceejn s eumcrac iUcetdfiOnedjedm: 23) lub F(nb)'2 (ócOwceejc s eumcrneh iUcetdfiOnedjedeh: 24 i 26).
9. 10. zznmieenn ttym żż ρ^ΐθ^ s^^o^^r^^^^ raSńecea l eCOiegg l seOwceeję łnńeuehn eiężOicgs, Otbrc wdOnaujc es enjmeicj L0% iUcetdeaesśei zckwceeji a zckwceejc łnńeuehn lcOOicgs i zckwceejc łnńeuehn eiężOicgs ócOwceeji wzOnanecj jnOs „c26” en fig. 13 (zckwce112

   PL 194 562 B1 cje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 20) oraz obejmuje reszty 32Glu, 27Lys i 2SPro CDRl domeny zmiennej łańcucha lekkiego.
10. 11. Cząątoecka przeciwciała weeług zaattz. 10, znamienna tym, że obejmuje sekwencję e2^6 wybraną z grupy składającej się z: fragmentu F(ab) (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19-20), fragmentu sFv (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22) lub F(ab)'₂ (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 24-25).
11. 12. Kompozycca, znamienna tym, że zawieea farmaceujecznie dopuuzccalną zaróbkę (farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki) w domieszce z cząsteczką przeciwciała określoną w zastrz. 10.
12. 13. Zastosowanie cząsteczki przeccwccH-a określonej w zastaz. 10 do wytwarzania kompozyccj do zmniejszania lub zapobiegania zależnego od IgE wytwarzania histaminy.
13. 14. Zastawanie cząsteczki przeciwcia-a określonee w zastez. 10 do wytwarzania kompozyccj do leczenia zaburzenia zależnego od IgE.
14. 15. Cząątoczka przeciwcia-a, znamienna tym, że pc^^ić^d^ sekwencj łańcucha lekkiego i sekwencję łańcucha ciężkiego, które wykazują co najmniej 70% identyczności sekwencji z sekwencją łańcucha lekkiego i sekwencją łańcucha ciężkiego sekwencji oznaczonej „e27” na fig. 13 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 21) oraz obejmuje reszty 32Glu, 27Lys i 28Pro CDR1 domeny zmiennej łańcucha lekkiego.
15. 16. Cząąseccka przeciwcia-a według zastez. 15, znamienna tym, że obejmuje sekwencj e27 wybraną z grupy składającej się z: fragmentu F(ab) (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 21), fragmentu sFv (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23) lub F(ab)'₂ (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 24 i 26).
16. 17. Kompooycje, znamienna tym, że zawiera farmaceujecznie dopuuzccalną zaróbkę ((armaceutycznie dopuszczalne zaróbki) w domieszce z cząsteczką przeciwciała określoną w zastrz. 15.
17. 18. Zastawanie cząsteczki przeciwcia-a określonej w ζθ-^ζ. 15 do wytwarzania kompozycj do zmniejszania lub zapobiegania zależnego od IgE wytwarzania histaminy.
18. 19. Zastawanie cząsteczki przeciwcia-a określonej w zassrz. 15 do wytwarzania kompozycj do leczenia zaburzenia zależnego od IgE.