KR20000069147A - 인간화 항-ＣＤ11ａ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간화 항-CD11a 항체 및 그의 다양한 용도를 제공한다. 인간화 항-CD11a 항체는 인간 CD11a I-도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, ICAM-1을 발현하는 정상 인간 상피 각질세포에 대한 주르카트(Jurkat) 세포의 부착을 방해하기 위해 약 1 nM 이하의 IC50(nM) 값 및(또는) 혼합 림프구 반응 분석에서 약 1 nM 이하의 IC50(nM) 값을 갖는다.

Description

인간화 항-ＣＤ11ａ 항체 {Humanized Anti-CD11a Antibodies}
림프구 기능 관련 항원 1 (LFA-1; CD11a/CD18)은 면역 반응과 염증에 필수적인 세포 상호작용시 백혈구 부착에 관여한다 [Larson 등, Immunol. Rev. 114:181-217 (1990)]. LFA-1은 β2 인테그린 족의 일원이며, 유일한 α 서브유닛인 CD11a와 다른 β2 인테그린 수용체 Mac-1 및 p150,95에도 공통적인 β 서브유닛인 CD18로 이루어진다. LFA-1의 리간드는 백혈구, 내피세포 및 피부 섬유아세포 상에서 발현되는 세포간 부착 분자-1인 ICAM-1 [Dustin 등, J. Immunol. 137:245-254 (1986)]; 휴지기 내피세포 및 림프구 상에서 발현되는 ICAM-2 [de Fougerolles 등, J. Exp. Med. 174:253-267 (1991)]; 및 단핵구와 휴지기 림프구 상에서 발현되는 ICAM-3 [de Fougerolles 등, J. Exp. Med. 179:619-629 (1994)]을 포함한다.
LFA-1과 ICAM들에 대한 단클론 항체 (MAb)는 시험관 내에서, T세포 활성화 [Kuypers 등, Res. Immunol. 140:461 (1989)]; T세포 의존성 B세포 증식 [Fischer 등, J. Immunol. 136:3198-3203 (1986)]; 표적 세포 용해 [Krensky 등, J. Immunol. 131:611-616 (1983)]; 및 혈관 내피세포에의 T세포의 부착 [Lo 등, J. Immunol. 143:3325-3329 (1989)]을 포함한 몇가지 T세포 의존성 면역 기능을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 마우스에서, 항-CD11a MAb는 단백질 항원에 대한 관용성을 유발하고 [Tanaka 등, Eur. J. Immunol. 25:1555-1558 (1995)]; 심장 [Cavazzana-Calvo 등, Transplantation 59:1576-1582 (1995); Nakakura 등, Transplantation 55:412-417 (1993)], 골수 [Cavazzana-Calvo 등, Transplantation 59:1576-1582 (1995); van Dijken 등, Transplantation 49:882-886 (1990)], 각막 [He 등, Invest. Opthamol. Vis. Sci. 35:3218-3225 (1994)], 섬세포 [Nishihara 등, Transplantation Proc. 27:372 (1995)]와 갑상선 [Talento 등, Transplantation 55:418-422 (1993)] 동종이식편(allograft)의 생존을 연장시킨다.
인간에서, 항-CD11a MAb는 골수 이식 후 이식편 실패를 방지하고 [Fischer 등, Blood 77:249-256 (1991); Stoppa 등, Transplant Intl. 4:3-7 (1991)]; 코르티코스테로이드와 아자티오프린에 추가로 항-CD11a MAb로 예방 처리한 신장 동종이식편의 예비 임상 연구가 유망하다 [Hourmant 등, Transplantation 58:377-380 (1994)]. 이식편 거부 반응에 대한 현재의 치료법은 OKT3, 쥐 항-인간 CD3 MAb와 시클로스포린 A의 사용을 포함한다. OKT3 치료는 유효하지만 몇가지 바람직하지 않은 부작용을 갖는다; 이를 사용하면 종양 괴사 인자-α, 인터페론-γ, 인터루킨-1 및 인터루킨-6을 포함하는 수많은 사이토카인을 방출시켜 열, 오한 및 위장관 통증을 일으킨다 (리뷰는 문헌[Parlevliet 등, Transplant Intl. 5:234-246 (1992); Dantal 등, Curr. Opin. Immunol. 3:740-747 (1991)]을 참조). 시클로스포린 A는 유효하지만 또한 심각한 부작용을 갖는다 (리뷰는 문헌[Barry, Drugs, 44:554-566 (1992)]을 참조).
(발명의 개요)
본 발명은 인간화 항-CD11a 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 인간 CD11a의 I-도메인 (예를 들면, 이후 정의하는 바와 같은 "에피토프 MHM24")에 결합하고(하거나) 약 1×10-8M 또는 그 이상의 친화도로 CD11a에 결합한다. 바람직한 실시태양에서, 이 항체는 ICAM-1을 발현하는 정상 인간 상피 각질세포에 주르카트 (Jurkat) 세포가 부착하는 것을 방지하기 위해 약 1 nM 이하의 IC50 (nM) 값을 갖는다. 바람직한 인간화 항체는 복합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 약 1 nM 이하의 IC50 (nM) 값을 갖는 것이다. MLR 분석에서 인간화 항체에 대한 이러한 IC50은 이미 생체내 시험된 쥐 MAb 25.3에 대한 값보다 상당히 더 우수하다 [Fischer 등, Blood 77:249-256 (1991); Stoppa 등, Transplant Intl. 4:3-7 (1991); Hourmant 등, Transplantation 58:377-380 (1994)].
인간화 항-CD11a 항체는 도 1의 인간화 항체 MHM24 F(ab)-8의 CDR1 (GYSFTGHWMN; 서열 10) 및(또는) CDR2 (MIHPSDSETRYNQKFKD; 서열 11) 및(또는) CDR3 (GIYFYGTTYFDY; 서열 12)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및(또는) 도 1의 인간화 항체 MHM24 F(ab)-8의 CDR1 (RASKTISKYLA; 서열 13) 및(또는) CDR 2 (SGSTLQS; 서열 14) 및(또는) CDR3 (QQHNEYPLT; 서열 15)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 이 항체는 인간화 MHM24 항체 F(ab)-8의 하나 이상의 CDR들의 아미노산 서열 변이를 포함하며, 이러한 변이는 CDR 잔기 내에 또는 그 주변에 하나 이상의 아미노산 삽입(들), 및(또는) CDR 잔기 내에 또는 그 주변에 결실(들), 및(또는) CDR 잔기(들)의 치환을 포함한다 (치환이 그러한 변이를 발생시키기 위한 바람직한 유형의 아미노산 변형이다). 그러한 변이는 보통 약 1×10-8M 이하인 인간 CD11a에 대한 결합 친화도를 가질 것이다.
바람직한 실시태양에서, 인간화 항체는 도 1의 인간화 항체 MHM24 F(ab)-8의 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및(또는) 서열 5의 아미노산 서열 및(또는) 그의 아미노산 서열 변이를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본원에 설명하는 바와 같이, 인간 CD11a 항원에는 결합하지만 붉은털 원숭이 CD11a 항원에는 유의하게 결합하지 않는 인간화 항체를 붉은털 원숭이 CD11a에 결합하는 능력을 갖도록 재조합할 수 있다 (즉, "붉은털 원숭이화(rhesusized)" 항체). 이 실시태양에서, 붉은털 원숭이 CD11a에 결합하는 항체는 예를 들면, 서열 23의 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 다른 CDR들은 인간화 MHM24 항체 F(ab)-8에 대한 것과 동일할 수 있다. 따라서, 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 임의로 결합된, 서열 24의 "붉은털 원숭이화" 중쇄의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 다양한 형태의 항체가 고려된다. 예를 들면, 항-CD11a 항체는 완전한 길이의 항체 (예를 들면, 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는) 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')2)일 수 있다. 또한, 항체는 검출가능한 라벨로 표지되고(되거나), 고상 상에 고정되고(되거나) 이종 화합물 (예를 들면, 세포독성제)과 결합될 수 있다.
항체에 대하여 진단 및 치료 용도가 고려된다. 한 진단 용도에서, 본 발명은 CD11a 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 항-CD11a 항체에 노출시키고, 샘플에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 포함하는 CD11a 단백질의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. 이러한 용도를 위해, 본 발명은 항체와 CD11a 단백질을 검출하기 위해 항체를 사용하기 위한 지시서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 항체를 암호화하는 단리된 핵산; 임의로 벡터를 사용하여 형질전환된 숙주 세포에 의해 인지되는 대조 서열에 작동가능하게 연결되는, 상기 핵산을 포함하는 벡터; 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포; 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키고, 임의로 숙주 세포 배양물로부터 (예를 들면, 숙주 세포 배양 배지로부터) 항체를 회수하는 것을 포함하는 항체의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인간화 항-CD11a 항체 및 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유하는 조성물을 제공한다. 이러한 치료용 조성물은 멸균되며, 동결건조시킬 수도 있다. 본 발명은 또한 LFA-1 매개 장애로 고통받는 포유동물에게 약리학적 유효량의 인간화 항-CD11a 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 그러한 치료 용도를 위해, 포유동물에게 다른 면역 억제제 또는 부착 분자 길항제 (예를 들면, 다른 LFA-1 길항제 또는 VLA-4 길항제)를 인간화 항-CD11a 항체와 동시에 또는 그 전후에 공동투여할 수 있다.
본 발명은 일반적으로 인간화 항-CD11a 항체에 관한 것이다.
도 1A는 쥐 MHM24 경쇄 (서열 1), 인간화 MHM24 F(ab)-8 경쇄 (서열 2), 및 경쇄 서브그룹 κI의 인간 컨센서스 서열 (humκI)(서열 3)의 아미노산 서열의 도면이다.
도 1B는 쥐 MHM24 중쇄 (서열 4), 인간화 MHM24 F(ab)-8 중쇄 (서열 5), 중쇄 서브그룹 III의 인간 컨센서스 서열 (humIII)(서열 6) 및 실시예의 "붉은털 원숭이화" 항체 돌연변이 중쇄 (서열 24)의 아미노산 서열의 도면이다.
도 1A 및 도 1b에서, 서열의 초가변성에 기초한 초가변 영역 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]은 각괄호([])내에 넣고, F(ab)-항원 복합체의 구조에 기초한 초가변 루프 [Chothia 등, Nature 342:8767 (1989)]는 이탤릭체로 나타낸다. 잔기 번호는 삽입을 a, b 및 c로 나타내면서 캐뱃 (Kabat) 등에 따른다.
도 2는 인간 CD11a I-도메인 (서열 7) 및 붉은털 원숭이 CD11a I-도메인 (서열 8)의 서열을 도시하는 도면이다. β-스트랜드 및 α-헬릭스는 밑줄을 치고 문헌[Qu 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:10277-10281 (1995)]에 따라 표지하였다. 붉은털 원숭이 I-도메인 서열 (rhCD11a)은 인간 I-도메인과 단지 4가지 차이만을 보여준다. MHM24 MAb에 대한 결합 에피토프 (서열 9)는 굵은 선으로 나타냈다 [Champe 등, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)].
도 3은 쥐 MHM24 (검은 원), 키메릭 MHM24 (흰 삼각형), 인간화 HMH24 (HuIgG1) (검은 사각형) 및 인간 IgG1 이소타입 컨트롤 (+)에 의한 정상 인간 각질세포에 대한 인간 주르카트 T세포의 억제를 도시하는 그래프이다. 결합 백분율은 표지된 주르카트 세포의 형광에 의해 측정하였다.
도 4A 내지 도 4C는 정상 인간 각질세포에 대한 붉은털 원숭이 림프구 (도 4A), 평판 상에 피복된 재조합 인간 ICAM-1에 대한 붉은털 원숭이 림프구 (도 4B), 및 정상 인간 각질세포에 대한 붉은털 원숭이/인간 CD11a 키메라-형질감염된 293 세포 (도 4C)의 결합 억제를 도시한 그래프이다. 붉은털 원숭이-결합 MHM24 (RhIgG1) (검은 사각형), 항-CD18 MHM23 (검은 원), 인간 IgG1 이소타입 컨트롤 (+) (도 4A 및 도 4 C) 및 쥐 IgG1 이소타입 컨트롤 (+) (도 4B)에 의한 억제. 결합 백분율은 표지된 림프구 (도 4A 및 도 4B) 또는 표지된 293 세포 (도 4C)의 형광에 의해 측정하였다.
도 5는 인간 복합 림프구 반응 분석(MLR)이 쥐 MHM24 (검은 원), 인간 MHM24 (HulgG1) (검은 사각형), 및 인간 이소타입 IgG1 컨트롤 (검은 다이아몬드)에 의해 차단되는 것을 도시한 그래프이다. 자극 지수 백분율(% SI)은 Mab가 존재하지 않는 최대 반응에 대한 주어진 MAb 농도에서 반응의 비율이다. 데이타는 2개 이상의 상이한 자극제/반응제 쌍을 사용한 다수의 분석을 대표한다.
I. 정의
달리 지시하지 않으면, 용어 "CD11a"는 본원에서 사용될 때 임의의 동물로부터의, 바람직하게는 인간으로부터의 LFA-1의 알파 서브유닛을 나타낸다. CD11a는 분자의 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 합성 수단에 의해 (예를 들면, 재조합 DNA 기술을 이용하여) 생산할 수 있다. 인간 CD11a에 대한 아미노산 서열은 예를 들면, 유럽 특허 제362 526B1에 기재되어 있다.
용어 CD11a의 "I-도메인"은 문헌[Champe 등, J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995); 및(또는) Qu 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:10277-10281 (1995)]에 묘사된 이 분자의 영역을 나타낸다. 인간 CD11a I-도메인 (서열 7)과 붉은털 원숭이 CD11a I-도메인 (서열 8)의 아미노산 서열을 본원에서 도 2에 도시하였다.
용어 "에피토프 MHM24"는 본원에서 사용될 때 달리 지시하지 않는 한, MHM24 항체 (하기 실시예 참조)가 결합하는 인간 CD11a의 I-도메인 내의 영역을 나타낸다. 이 에피토프는 서열 9의 아미노산 서열과, 임의로 CD11a 및(또는) CD18의 다른 아미노산 잔기를 포함한다.
용어 "LFA-1 매개 장애"는 림프구 상의 LFA-1 수용체를 필요로하는 세포 부착 상호반응에 의해 유발된 병리 상태를 나타낸다. 그러한 장애의 예로는 건선을 포함한 염증성 피부 질환과 같은 T세포 염증 반응; 염증성 대장 질환 (예를 들면, 크론씨(Crohn's)병 및 궤양성 대장염)과 관련된 반응; 성인 호흡 곤란 증후군; 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 습진 및 천식과 같은 알레르기성 질환; T세포 침습과 만성 염증 반응을 수반하는 질환; 피부 과민성 반응 (덩굴옻나무 및 옻나무를 포함); 아테롬성 동맥경화증; 백혈구 부착 결핍; 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염, 전신성 루푸스 홍반증 (SLE), 당뇨병, 다중 경색증, 레이노드 (Reynaud's) 증후군, 자가면역 갑상선염, 경험적 자가면역 뇌척수염, 스조르젠 (Sjorgen's) 증후군, 아동기 발병 당뇨; 및 대개 결핵, 유육종증, 다근염, 육아종증염과 맥관염에서 발견되는 사이토카인 및 T림프구 매개된 지연과민성과 관련된 면역 반응; 악성 빈혈; 만성 폐색성 폐 질환 (COPD); 기관지염; 인슐린증 (insulintis); 비염; 두드러기; 사구체신염; 백혈구 누출을 수반하는 질환; CNS 염증성 장애; 패혈증 및 외상에 따르는 다기관 손상 증후군; 자가면역 용혈성 빈혈; 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 신성 증후군; 악성종양 (예를 들면, 만성 림프성 백혈병 또는 모상 세포성 백혈병과 같은 B세포 악성종양); 이식편 대 숙주 또는 숙주 대 이식편 질환을 포함한 모든 유형의 이식; HIV 및 리노바이러스 감염; 폐 섬유증; 종양 세포의 2차 기관으로의 침투 등을 포함한다.
보조 요법으로 본원에서 사용되는 용어 "면역억제제"는 이식편이 이식되는 숙주의 면역계를 억제하거나 차단하는 작용을 하는 물질을 나타낸다. 이는 사이토카인 생성을 억제하거나, 자기항원 발현을 하향조절 또는 억제하거나, MHC 항원을 차단하는 물질을 포함한다. 면역억제제의 예로는 2-아미노-6-아릴-5-치환 피리미딘 (미국 특허 제4,665,077호 참조), 아자티오프린 (또는 아자티오프린에 대해 부작용이 있는 경우 시클로포스파미드); 브로모크립틴; 글루타르알데히드 (미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같이 MHC 항원을 차단함); MHC 항원과 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항원; 시클로스포린 A; 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손과 같은 스테로이드; 항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체를 포함하는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제; 항-종양 괴사 인자-α 항체; 항-종양 괴사 인자-β 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체; 이종성 항-림프구 글로불린; 범T항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (국제 특허 출원 공개 제WO90/08187호, 1990.7.26 간행); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T세포 수용체 (미국 특허 제5,114,721호); T세포 수용체 단편 [Offner 등, Science 251:430-432 (1991); 국제 특허 출원 공개 제WO90/11294호 및 동 제WO91/01133호]; 및 T10B9와 같은 T세포 수용체 항체 (유럽 특허 제340,109호)를 포함한다. 이들 약제는 CD11a 항체와 동일 시간에 또는 다른 시간에 투여하고, 당업계에 알려진 바와 동일하거나 더 적은 투여량으로 사용한다. 바람직한 보조 면역억제제는 수행하는 이식의 유형 뿐만 아니라 환자의 병력을 포함하고, 치료하려는 장애의 유형을 포함하는 많은 인자에 의존할 것이지만, 일반적으로 시클로스포린 A, 글루코코르티코스테로이드 (가장 바람직하게는 프레드니존 또는 메틸프레드니졸론), OKT-3 단클론 항체, 아자티오프린, 브로모크립틴, 이종성 항-림프구 글로불린 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 약제가 전체적으로 바람직하다.
"처치"는 치료 처치와 예방 또는 방지 조치를 모두 나타낸다. 처치를 요하는 대상은 이미 장애를 갖고 있는 대상 뿐만 아니라 장애를 방지하고자 하는 대상을 포함한다.
처치를 위한 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본원에 사용되는 용어 "이식편"은 수여자에게 이식하기 위해 공여자로부터 유래된 생물학적 재료를 의미한다. 이식편은 예를 들면, 섬세포 및 신경 유래 세포 (예를 들면, 쉬반 세포)와 같은 단리된 세포, 신생아 양막과 같은 조직, 골수, 조혈 전구세포; 및 피부, 심장, 간, 비장, 췌장, 갑상선엽, 폐, 신장, 관 기관 (예를 들면, 내장, 혈관 또는 식도) 등의 기관과 같은 다양한 재료를 포함한다. 관 기관은 식도, 혈관 또는 담관의 손상 부분을 교체하기 위해 사용할 수 있다. 피부 이식편은 화상에서 뿐만 아니라, 손상된 내장에 대한 드레싱으로서 또는 횡경막 헤르니아와 같은 특정 결함을 차단하기 위해 사용할 수 있다. 이식편은 사체로부터 또는 살아있는 공여자로부터에 상관없이, 인간을 포함하는 모든 포유동물 기원으로부터 유래된다. 바람직하게는 이식편은 골수, 또는 심장과 같은 기관이고, 이식편의 공여자와 숙주는 HLA 클래스 II 항원에 대해 일치한다.
본원에서 사용되는 용어 "공여자"는 이식편이 유래되는 생존하는 또는 죽은 포유동물 종을 의미한다. 바람직하게는, 공여자는 인간이다. 인간 공여자는 바람직하게는 신체 검사에서 정상이고 동일한 주 ABO 혈액군에 속하는 자발적인 혈족 공여자이며, 이는 주 혈액군 장벽의 교차가 동종이식편의 생존을 손상시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 예를 들면, O형 공여자의 신장을 A형, B형 또는 AB형 수여자에게 이식할 수는 있다.
용어 "이식하다"와 그의 변화어는 이식이 동질유전자 이식이거나 (공여자와 수여자가 유전적으로 동일함), 동종 이질 이식이거나 (공여자와 수여자가 동일 종이지만 유전적 기원이 다름), 또는 이속간 이식이거나 (공여자와 수여자가 상이한 종임) 상관없이, 이식편을 숙주에 삽입하는 것을 의미한다. 따라서, 전형적인 계획에서 숙주는 인간이고, 이식편은 동일하거나 상이한 유전 기원의 인간으로부터 유래된 동질이식편(isograft)이다. 다른 계획에서 이식편은 예를 들면, 인간 수여자 숙주에 이식되는 비비의 심장과 같이 이식시킬 종과 상이한 종에서 유래되고, 계통발생적으로 매우 분리된 종의 동물, 예를 들면, 인간 숙주에 이식된 돼지 심장 판막, 또는 동물 베타 섬세포 또는 신경 세포를 포함한다.
숙주에 의한 "이식된 이식편의 관용성 증가"는 이식시킨 숙주 내에서 이식편의 생존이 연장되는 것을 의미하며, 즉, 외래 이식물을 보다 잘 관용하도록 숙주의 면역계를 억제하는 것을 의미한다.
"간헐적" 또는 "주기적" 투여는 특정 기간 동안 연속적이고 바람직하게는 1일 이상으로 분리시킨 규칙적 간격으로 투여하는 것이다.
장애의 "선택적 관용성"은 장애를 일으키는 특정 약제에 대한 숙주의 면역계에 의한 관용성을 의미하지만, 2차 동종이질 또는 이속간 이식편을 거부하는 숙주의 능력은 유지된다. 바람직하게는, 관용성은 면역계가 그렇지 않으면 무손상으로 유지되는 것이다.
용어 "LFA-1 길항제"는 LFA-1과 ICAM-1의 상호작용의 경쟁적 억제제로서 작용하는 분자를 의미한다. 그러한 분자의 예는 CD11a (예를 들면, 본원에 기재된 인간화 항-CD11a 항체) 또는 CD18, 또는 양쪽 모두에 대해 유도된 항체, ICAM-1에 대한 항체, 및 펩티드와 같은 다른 분자 (예를 들면, 펩티도미메틱 길항제)를 포함한다.
용어 "VLA-4 길항제"는 VLA-4와 VCAM의 상호작용의 경쟁적 억제제로서 작용하는 분자를 의미한다. 그러한 분자의 예로는 VLA-4 또는 VCAM에 대해 유도된 항체 및 다른 분자 (예를 들면, 펩티도미메틱 길항제)를 포함한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 단클론 항체 (완전한 길이의 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 다특이성 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체)와 원하는 생물 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 완전한 길이의 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 유도되는 큰 특이성을 갖는다. 또한, 대개 상이한 항원 결정군 (determinant)(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체들을 포함하는 통상의 (다클론) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 항원 결정군에 대해 유도된다. 수식어 "단클론"은 항체의 특성이 항체들의 실질적으로 동종 집단으로부터 얻어지는 것을 나타내며, 어떠한 특정 방법으로 항체를 생산하는 것을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌[Kohler 등, Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조할 수 있다. "단클론 항체"는 또한 예를 들면, 문헌[Clackson 등, Nature 352:624-628 (1991); 및 Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
본원에서 단클론 항체는 구체적으로, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부는 특정 종에서 유래된 항체의 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 상응하는 서열과 동일하거나 유사하지만, 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래된 항체의 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 상응하는 서열과 동일하거나 유사한 "키메릭" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라, 원하는 생물 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"으로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 상기 정의한 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
비인간 (예를 들면, 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 포함하는 키메릭 항체이다. 대부분, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여자 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수여자 항체)이다. 몇몇 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 항체 성능을 더욱 개량시키기 위해 이들 변형을 할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열의 것인 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌[Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Reichmann 등, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조하시오.
"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는, 항체의 VH및 VL도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 VH및 VL도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더욱 포함한다. sFv에 대한 리뷰는 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113권, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)]을 참조하시오.
용어 "디아바디"는 동일한 폴리페티드 사슬(VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타낸다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인을 다른 사슬의 상보적인 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들면, 유럽 특허 제404,097호; 국제 특허 출원 공개 제WO 93/11611호; 및 문헌[Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본 출원 전체에서 사용될 때 "선형 항체"라는 표현은 문헌[Zapata 등, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 나타낸다. 간략하게, 이들 항체는 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 순차(tandem) Fd 분편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 단일특이적일 수 있다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리된 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 저해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 라우리(Lowry)법으로 측정할 때 항체의 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상으로, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열 결정기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 잔기 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색제를 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 동질성으로 정제될 것이다. 항체의 천연 환경의 성분이 어느 하나도 존재하지 않을 것이므로, 단리된 항체는 재조합 세포 내에서 동일계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계로 제조될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "태그가 결합된(tagged) 에피토프"는 "에피토프 태그(tag)"에 융합된 항-CD11a 항체를 나타낸다. 에피토프 태그 폴리펩티드는 그에 대한 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기에는 충분한 잔기를 갖지만, CD11a 항체의 활성을 저해하지 않도록 충분히 짧다. 에피토프 태그는 바람직하게는 그에 대한 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차반응하지 않도록 충분히 독특하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기, 보통 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 9 내지 30개의 잔기)를 갖는다. 그 예로는 flu HA 태그 폴리펩티드와 그의 항체 12CA5 [Field 등, Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그와 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan 등, Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; 및 허피스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스 당단백질 D (gD)와 그의 항체 [Paborsky 등, Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)]를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 에피토프 태그는 "샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프"이다.
본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.
용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 저해하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들면, I131, I125, Y90및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들면 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이들의 단편을 포함하는 것으로 의도된다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소테어 (도세탁셀), 부술판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란과 다른 관련 질소 머스타드를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "전구약물"은 모약물에 비해 종양 세포에 대해 세포독성은 더 작지만 효소적으로 활성화되거나 전환되어 보다 활성인 모형태로 될 수 있는 제약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 나타낸다. 예를 들면, 문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986); 및 Stella 등, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 등(ed.), pp.247-267, Humana Press (1985)] 참조). 본 발명의 전구약물은 인산염 함유 전구약물, 티오인산염 함유 전구약물, 황산염 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산 변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물, 또는 임의 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기한 바와 같은 화학요법제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 결합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 자체로 검출될 수 있거나 (예를 들면, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
"고상"은 본 발명의 항체가 부착할 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고상의 예는 부분적으로 또는 전적으로 유리 (예를 들면, 조절된 다공성 유리), 다당류 (예를 들면, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 포함한다. 문맥에 따라 몇몇 실시태양에서, 고상은 분석판의 웰을 포함할 수 있고; 다른 것에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들면, 친화도 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 바와 같은 별개 입자의 비연속 고상을 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들면, 본원에 기재된 항-CD11a 항체 및 임의로, 화학요법제)을 포유동물에 전달시키기 위해 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 소낭(vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상 생물학적 막의 지질 배열과 유사한, 2층 구조로 배열된다.
"단리된" 핵산 분자는 보통 항체 핵산의 천연 공급원에서 함께 결합되어 있는 하나 이상의 오염물 핵산 분자로부터 동정하고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태나 상태는 아니다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 통상 항체를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하고, 여기에서 예를 들면 핵산 분자는 천연 세포의 핵산과 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"조절 서열"이라는 표현은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며; 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 DNA 서열이 접촉하여, 또는 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 상 내에 존재한다. 그러나, 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한효소 부위에서 결찰에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다.
본원에서 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환가능하게 사용되고, 그러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 일차 대상 세포 또는 전환의 수와 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손은 고의적 또는 우연적 돌연변이로 인해 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 이해된다. 처음 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우 이는 문맥으로부터 명백해 질 것이다.
II. 본 발명의 실시 양식
A. 항체 제조
비인간 CD11a 항체를 인간화하는 방법을 하기 실시예에서 설명한다. 항-CD11a 항체를 인간화하기 위해서 비인간 항체 출발 물질을 제조한다. 상기 항체의 제조를 위한 기술의 예는 하기 섹션에서 설명할 것이다.
(i) 항원 제조
항체 생산에 사용되는 CD11a 항원은 예를 들면 CD11a의 세포외 도메인의 가용성 형태 또는 CD11a의 다른 단편 (예를 들면, "MHM24 에피토프를 포함하는 CD11a 단편, 예를 들어 CD11a I-도메인 단편)일 수 있다. 별법으로, 세포 표면에서 CD11a를 발현하는 세포를 사용하여 항체를 생성시킬 수 있다. 상기 세포는 CD11a 및, 임의로, CD18을 발현하도록 형질전환될 수 있거나, 또는 다른 천연 세포 (예를 들면, 인간 림포블라스토이드(lymphoblastoid) 세포, 문헌[Hildreth et al., J. Immunol. 13:202-208 (1983)] 참조) 또는 주르카트 세포 (하기 실시예 참조)일 수 있다. 항체 생산에 유용한 CD11a의 다른 형태는 당업계의 기술자에게 명백할 것이다.
(ii) 다클론 항체
다클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제를 다수회 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사하여 동물 내에서 생성시킨다. 관련 항원을, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 삿갓조개(keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에, 2관능성 물질 또는 유도화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 결합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기에서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)를 사용하여 결합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물을 예를 들면, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 결합물 (각각 토끼와 마우스에 대해)을 3 부피의 프로인드(Freund) 완전 보조제와 혼합하고, 용액을 다수 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 결합물 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에, 동물을 원래의 양의 1/5 내지 1/10의 프로인드 완전 보조제 중의 펩티드 또는 결합물로 다수 부위에 피하 주사함으로써 부스팅시켰다. 7 내지 14일 후, 동물을 출혈시키고, 혈청을 항체 역가에 대해 분석하였다. 역가가 정체 (plateau)될 때까지 동물을 부스팅시킨다. 바람직하게는, 동물을 상이한 단백질에, 및(또는) 상이한 가교결합제를 통해 결합된 동일 항원의 결합물로 부스팅시킨다. 결합물은 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양에서 제조할 수 있다. 또한, 명반(alum)과 같은 응집제를 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.
(iii) 단클론 항체
단클론 항체는 문헌[Kohler 등, Nature, 256: 495 (1975)]에서 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)을 이용하여 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 면역화를 위해 사용된 단백질에 충분하게 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 백혈구를 유도하도록 마우스, 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 상기한 바와 같이 면역화시킨다. 별법으로, 백혈구를 시험관 내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 백혈구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].
이렇게 제조한 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 골수종 모세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배지 중에 접종하고 배양시킨다. 예를 들면, 골수종 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 높은 수준의 안정한 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것과 같은 쥐 골수종 세포주이다. 사람 골수종 세포주 및 마우스-사람 헤테로골수종 세포주가 또한 사람 단클론 항체의 생산에 대해 기술되었다 [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); 및 Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
하이브리도마 세포가 성장하는 배지를 항원에 대해 유도된 단클론 항체의 생산에 대해 분석하였다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 면역침강법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다.
단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들면 문헌[Munson 등, Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐차드 (Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [고딩, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]으로 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단클론 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로즈 (Sepharose), 히드록시아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다.
단클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 쉽게 분리되고 서열결정된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 기원으로서 작용한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이어서, 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜리(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체를 합성시킨다. 항체의 재조합 생산은 보다 상세하게 후술될 것이다.
(iv) 인간화 및 아미노산 서열 변이체
하기 실시예는 항-CD11a 항체의 인간화 방법을 설명한다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체의 아미노산 서열 변이체, 특히 인간화 항체의 결합 친화도 또는 다른 생물학적 특성이 개선된 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다.
인간화 항-CD11a 항체의 아미노산 서열 변이체는 인간화 항-CD11a 항체 DNA 내에 적절한 뉴클레오티드 변이를 도입하거나 펩티드 합성법에 의해 제조된다. 이러한 변이체는 예를 들면 인간화 항-CD11a 항체 F(ab)-8에 대해 나타낸 아미노산 서열 (예를 들어 서열 2 및 5) 내의 잔기의 결실, 및(또는) 이 서열 내로의 잔기의 삽입 및(또는) 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 만들어 목적하는 특성을 갖는 최종 구조체를 제조한다. 또한, 아미노산 변이는 글리코실화 부위의 숫자 또는 위치를 변경시키는 것과 같이 인간화 항-CD11a 항체의 후번역 처리를 변경시킬 수 있다.
변이 유발에 바람직한 위치를 갖는 인간화 항-CD11a 항체 폴리펩티드의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 변이 유발"로 언급된다. 여기서, 표적 잔기 또는 일군의 표적 잔기(예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전 잔기)가 확인되고 중성 또는 음하전 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환되어 아미노산의 CD11a 항원과의 상호작용에 영향을 준다. 이어서, 치환에 대해 관능적 감수성을 보이는 아미노산 위치는 치환 부위에 다른 변이를 도입하여 확인된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 변이 그 자체의 특성을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정 부위에서 변이의 효과를 분석하기 위해서 ala 스캐닝 또는 랜덤 변이 유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고 발현된 인간화 항-CD11a 항체 변이체를 목적 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열 내 삽입 뿐만 아니라 1개 내지 1백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및(또는) 카르복시 말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 인간화 항-CD11a 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 인간화 항-CD11a 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 펩티드의 인간화 항-CD11a 항체의 N-말단 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다 (하기 참조).
또다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 인간화 항-CD11a 항체 분자의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 대신에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 치환 변이 유발에 가장 흥미로운 부위는 초가변 루프를 포함하지만, FR 변이도 포함된다. 후술되는 실시예에서 표 IV는 변이될 수 있는 초가변 영역 잔기에 대한 지침을 제공한다. 항원 결합에 관여하는 초가변 영역 잔기 또는 FR 잔기는 일반적으로 비교적 보존적 방식으로 치환된다. 이러한 보존적 치환은 표 I의 "바람직한 치환" 부분에 나타내었다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변화시키면, 표 I에서 "치환의 예"로 나타내거나 아미노산 종류에 대해서 후술하는 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입되고 그 생성물이 스크리닝된다.
본래의 잔기 치환의 예 바람직한 치환
Ala(A) val; leu; ile val
Arg(R) lys; gln; asn lys
Asn(N) gln; his; lys; arg gln
Asp(D) glu glu
Cys(C) ser ser
Gln(Q) asn asn
Glu(E) asp asp
Gly(G) pro; ala ala
His(H) asn; gln; lys; arg arg
Ile(I) leu; val; met; ala;phe; norleu leu
Leu(L) norleu; ile; val;met; ala; phe ile
Lys(K) arg; gln; asn arg
Met(M) leu; phe; ile leu
Phe(F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
Trp(W) tyr; phe tyr
Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe
Val(V) ile; leu; met; phe;ala; norleu leu
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변화는 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선 배열, (b) 표적 부위에서 분자의 하전 또는 소수성 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선발함으로써 수행된다. 천연 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 분류된다:
(1) 소수성: norleu, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 한 종류의 구성 아미노산을 다른 종류의 구성 아미노산으로 교환시킬 것이다. 인간화 항-CD11a 항체의 적절한 배열의 유지에 관여하지 않는 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교결합을 억제할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가되어 그의 안정성 (특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우)을 개선시킬 수 있다.
항체의 아미노산 변이체의 다른 종류는 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 여기서 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다.
항체의 글리코실화는 일반적으로 N-결합 또는 O-연결이다. N-연결은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착함을 의미한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 아미노산임)은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 측쇄에 효소에 의해 부착되는 인식 서열이다. 따라서, 상기 트리펩티드 중의 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 어느 하나가, 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착됨을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 상기한 하나 이상의 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위). 또한, 변화는 본래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 치환에 의해 이루어질 수도 있다(O-연결 글리코실화 부위).
인간화 항-CD11a 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 올리고뉴클레오티드 매개 (또는 부위 지정) 변이 유발, PCR 변이 유발 및 인간화 항-CD11a 항체의 기제조된 변이체 또는 비변이체의 카세트 변이 유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
통상적으로, 인간화 항-CD11a 항체의 아미노산 서열 변이체는 중쇄 또는 경쇄 (예를 들어 서열 2 또는 5) 중의 어느 하나의 본래의 인간화 항체 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 서열을 가질 것이다. 상기 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 서열을 배열하고, 필요한 경우 최고의 서열 동일 비율을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에 보존적 치환 (상기 표 I에 정의된 바와 같음)을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고 인간화 항-CD11a 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 항체 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결실 또는 삽입 중 그 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주는 것으로서 간주되지 않는다.
(v) 생물학적 특성의 스크리닝
인간화 항-CD11a 항체에서 바람직한 것으로서 본원에서 확인된 특성을 갖는 항체를 스크리닝한다.
목적 항체에 의해 결합되는 CD11a 상의 에피토프에 결합하는 항체(예를 들어 CD11a에 대한 MHM24 항체의 결합을 차단하는 항체)를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차차단 분석법을 수행할 수 있다. 별법으로, 문헌[Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)]에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행하여 항체가 목적 에피토프에 결합하는지를 결정할 수 있다.
항체 친화도 (예를 들어 인간 CD11a 또는 붉은털 원숭이 CD11a)는 하기 실시예에 기술되는 바와 같은 말초 혈액 단핵세포 또는 붉은털 원숭이 백혈구를 사용한 포화 결합에 의해 결정할 수 있다. 항체 친화도를 결정하기 위한 상기 방법에 따르면, 백혈구 또는 붉은털원숭이 백혈구를 웰당 170 ㎕의 부피로 플레이트에 가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 세포를 수거하고 10회 세척한다. 이어서, 시료를 계수한다. 데이타를 분당 계수로부터 나노몰 농도로 변환시킨 후, 포화 플롯 (결합 대 총수)의 4-파라미터 곡선 피팅 (fitting)을 수행하여 Kd 값(대략치)을 정한다. 바람직한 인간화 항체는 약 1 x 10-7이하, 바람직하게는 약 1 x 10-8이하, 보다 바람직하게는 약 1 x 10-9이하, 가장 바람직하게는 약 2 x 10-10이하의 Kd값을 갖는, 인간 CD11a에 결합하는 것이다.
또한, "각질세포 단일층 부착 분석"에서 유익한 항부착성을 갖는 인간화 항체를 선발하는 것이 바람직하다. 바람직한 항체는 ICAM-1을 발현하는 정상 인간 상피 각질세포에 대한 주르카트 세포의 부착을 방해하기 위해 약 250 nM 이하; 바람직하게는 약 100 nM 이하, 보다 바람직하게는 약 1 nM 이하, 가장 바람직하게는 약 0.5 nM 이하의 IC50(nM) 값을 갖는 것이다. 상기 분석에 따르면, 정상 인간 상피 각질세포는 배양 플라스크로부터 제거되고, 5 x 105생존 세포/ml의 농도로 림프구 분석 배지에 재현탁된다. 0.1 ml/웰의 분취액을 이어서 평평 바닥 96웰 플레이트 중에서 철야 배양하고, 인터페론-감마를 100 단위/웰로 가하여 적절한 웰을 자극하였다. 주르카트 클론 E6-1 세포를 표지하고, 세척하고, 1 x 106세포/ml로 재현탁시키고, 500 ng/ml 항체에서 시작하여 2배 연속 희석물을 사용하여 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 각질세포 단일층으로부터 배지를 제거한 후, 0.1 ml/웰의 표지된 세포를 가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 웰을 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고 형광을 측정한다.
바람직한 인간화 항-CD11a 항체는 인간 림프구를 사용한 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 약 100 nM 이하; 바람직하게는 약 50 nM 이하, 보다 더 바람직하게는 약 5 nM 이하, 가장 바람직하게는 약 1 nM 이하의 IC50(nM)을 갖는 것이다. 인간 및 붉은털원숭이 MLR의 경우, 무관한 상기 두 도너로부터의 말초 혈액 림프구는 전체의 헤파린 처리 혈액으로부터 단리되고, 하기 실시예에 기술되는 바와 같이 첨가제와 함께 RPMI 1640(GIBCO사) 중에 3 x 106세포/ml의 농도로 재현탁된다. 자극 세포는 방사선 조사에 의해 비반응성으로 만든다. 웰당 1.5 x 105세포의 농도에서 반응 세포는 동수의 자극 세포와 96웰의 평평 바닥 플레이트 중에서 함께 배양된다. 10 nM의 농도에서 출발한 항체의 2배 연속 희석물을 배양물에 첨가하여 총 부피를 200 ㎕/웰로 만든다. 배양물을 5% CO2중에서 37℃에서 5일 동안 인큐베이션한 후, 1 μCi/웰의 [3H]티미딘을 16시간 동안 인가하고, [3H]티미딘 도입도를 측정한다.
(vi) 항체 단편
특정 실시형태에서, 인간화 CD11a 항체는 항체 단편이다. 항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 단백질의 단백질 분해성 소화에 의해 유래되었다 (예를 들면, 문헌[Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) 및 브렌난 (Brennan) 등, Science, 229: 81 (1985)]을 참조). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 위해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜리로부터 직접 회수하고 화학적으로 결합시켜 F(ab')2단편을 형성할 수 있다 [Carter 등, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]. 다른 방법에 따라, F(ab')2단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리시킬 수 있다. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기법은 숙련된 당업자에게 명백할 것이다.
(v) 다중특이적 항체
일부 실시형태에서, 2 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는, 다중특이적 (예를 들어 이중특이적) 인간화 CD11a 항체를 생성시키는 것이 바람직하다. 예시적인 이중특이적 항체는 CD11a 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 별법으로, 세포 방호 메카니즘을 CD11a 발현 세포에 집중시키기 위해 항-CD11a 암(arm)은 T-세포 수용체 분자 (예를 들어 CD2 또는 CD3)과 같은 백혈구에 대한트리거링(triggering) 분자, 또는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)과 같은 Fc 수용체에 결합하는 암과 조합될 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 CD11a를 발현하는 세포에 위치시킬 수 있다. 이들 항체는 CD11a 결합 암 및 세포독성제 (예를 들어 사포린, 항-인터페론-α, 빙카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)과 결합하는 암을 갖는다. 이중특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')2이중특이적 항체)으로서 제조할 수 있다.
이중특이적 항체의 다른 제조 방법에 따라, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 계면을 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 비율을 최대화하도록 유전공학적으로 처리할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킨다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보충적인 "공간"이 생성된다. 이렇게 하여 호모다이머와 같은 다른 원하지 않는 최종 생성물보다 헤테로다이머의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다 (1996년 9월 6일 발행된 WO96/27011 참조).
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "헤테로결합" 항체를 포함한다. 예를 들면, 헤테로결합물 내의 항체 중 하나는 아비딘과 결합되고, 다른 하나는 비오틴과 결합될 수 있다. 헤테로결합 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교결합 기법과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기술되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기법은 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌[Brennan 등, Science, 229: 81 (1985)]에서는 F(ab')2단편을 제조하기 위해 무손상 항체를 단백질 분해에 의해 절단시키는 절차를 기술하였다. 이들 단편은 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원되어 인근(vicinal) 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 제제로서 사용할 수 있다.
최근의 기술 발전에 의해 이. 콜리로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌고, 이는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 결합될 수 있다. 문헌[Shalaby 등, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2분자의 생산을 기술하였다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜리로부터 개별적으로 분비되고, 시험관 내에서 화학 결합시켜 이중특이적 항체를 형성한다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 사람 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 사람 유방암 표적에 대해 사람 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발시킨다.
재조합 세포 배양물로부터 이중특이적 항체 단편을 직접 제조하고 단리시키는 다양한 기법이 또한 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼(zippers)를 사용하여 생산되었다 [Kostelny 등, J. Immunol., 148(5); 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 호모다이머를 힌지 영역에서 환원시켜 모노머를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 헤테로다이머를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 호모다이머의 생산에 이용될 수 있다. 문헌[Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기술되어 있는 "디아바디 (diabody)" 기법에서는 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 메카니즘을 제공하였다. 단편은 동일 사슬 상의 2개의 도메인 사이를 짝지우기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH및 VL도메인은 다른 단편의 상보적인 VL및 VH도메인과 짝을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단일 사슬 Fv (sFv)를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 다른 방법이 또한 보고되었다 (문헌[Gruber 등, J. Immunol., 152: 5368 (1994)] 참조). 별법으로 이중특이적 항체는 문헌[Zapata 등, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)]에 기재된 바와 같이 생산된 "선형 항체"일 수 있다.
2 이상의 역가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt 등, J. Immunol. 147: 60 (1991)].
(viii) 다른 변형
인간화 CD11a 항체의 다른 변형도 고려된다. 예를 들면, 암 치료시에 항체의 유효성을 증가시키기 위해, 작동기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역에 도입하여, 이 영역에서 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생산된 호모다이머 항체는 증진된 내부이행(internalization) 능력 및(또는) 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포독성(ADCC)를 가질 수 있다. 문헌[Caron 등, J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992); 및 Shopes, B., J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)] 참조. 문헌[Wolff 등, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같이 헤테로이관능성 가교결합기를 사용하여 증진된 항종양 활성을 갖는 호모다이머 항체를 또한 제조할 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 유전공학적으로 처리할 수 있고, 이에 의해 보체 용해 및 ADCC 능력을 증진시킬 수 있다. 문헌[Stevenson 등, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)] 참조.
본 발명은 또한 화학요법제, 독소(예를 들면, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (예를 들면, 방사성결합물)에 결합된 본원에 기술한 항체를 포함하는 면역결합물에 관한 것이다.
그러한 면역결합물의 생산에 유용한 화학요법제는 상기 기술하였다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알루라이츠 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이놀라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노미신, 에노미신 및 트리코테센을 포함한다. 방사성결합된 항-CD11a 항체를 생산하기 위해 다양한 방사성핵종을 이용할 수 있다. 그 예로는211Bi,131I,90Y 및186Re를 포함한다.
항체 및 세포독성제의 결합은 다양한 2기능성 단백질 결합제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르 알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098(1987)]에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 방사성 뉴클레오티드를 항체에 결합시키기 위한 킬레이팅제의 예이다 (예를 들어 WO94/11026 참조).
다른 실시형태에서, 항체는 종양 예비 표적화에 사용하기 위한 "수용체" (예를 들어 스트렙타비딘)에 결합될 수 있고, 항체-수용체 결합체는 환자에게 투여된 후 정화제를 사용하여 비결합된 결합체를 순환물로부터 제거하고 이어서 세포독성제(예를 들어 방사성 핵종)에 결합된 "리간드"(예를 들어 아비딘)이 투여된다.
항-CD11a 항체는 또한 면역리포좀으로서 제조될 수도 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 공지의 방법에 의해 제조된다 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030(1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 4,544,545호]. 순환 시간이 증강된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)를 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 세공 크기를 갖는 필터를 통하여 압출하여 목적 직경을 갖는 리포좀을 생성시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 교환 반응을 통하여 문헌[Martin et al., Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 결합될 수 있다. 화학요법제(예를 들어 독소루비신)은 리포좀 내에 임의로 함유된다 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989) 참조].
본 발명의 항체는 또한 전구약물(예를 들어 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 항체를 결합시킴으로써 ADEPT에 사용될 수 있다 (예를 들어 WO88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조).
ADEP에 유용한 면역결합체의 효소 성분은 전구약물을 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전화시키는 방식으로 전구약물에 대해 작용할 수 있는 효소를 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 효소는 인산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제; 황산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물 분해 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 별법으로, 당업계에 "아브짐(abzyme)"으로도 알려진 효소 활성을 갖는 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다 (예를 들어 Massey, Nature 328:457-458(1987) 참조). 항체-아브짐 결합체는 아브짐의 종양 세포 군집으로의 전달에 대해서 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 효소는 상기 논의한 헤테로 2기능성 가교결합제의 사용과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 항-CD11a 항체에 공유결합될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어 Neuberger et al., Nature, 312:604-608(1984) 참조).
본 발명의 특정 실시형태에서, 예를 들어 종양 투과를 증가시키기 위해서 완전한 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 항체 단편은 그의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 변형되는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 단편에 도입함으로써 (예를 들어 항체 단편의 적절한 영역의 변이에 의해 또는 예를 들어 DNA 또는 펩티드 합성에 의해 항체 단편의 말단 또는 중앙에 융합되는 펩티드 태그에 에피토프를 도입함으로써) 달성될 수 있다 (1996년 10월 17일 공개된 WO96/32478 참조).
샐비지 수용체 결합 에피토프는 Fc 도메인의 하나 또는 두개의 루프로부터의 1 이상의 아미노산 잔기가 항체 단편의 유사 위치로 이전된 영역을 구성하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, Fc 도메인의 하나 또는 두개의 루프로부터의 3개 이상의 잔기가 이전된다. 보다 더 바람직하게는, 에피토프는 Fc 영역(예를 들어 IgG의)의 CH2 도메인으로부터 선발되어 항체의 CH1, CH3 또는 VH영역, 또는 하나 이상의 상기 영역으로 이전된다. 별법으로, 에피토프는 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 선발되어 항체 단편의 CL영역 또는 VL영역, 또는 두 영역 모두로 이전된다.
가장 바람직한 한 실시형태에서, 샐비지 수용체 결합 에피토프는 서열 (5'에서 3'으로) PKNSSMISNTP (서열 16)를 포함하고, 임의로 HQSLGTQ (서열 17), HQNLSDGK (서열 18), HQNISDGK (서열 19) 및 VISSHLGQ (서열 20)로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 추가로 포함하고, 특히 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')2이다. 가장 바람직한 다른 실시형태에서, 샐비지 수용체 결합 에피토프는 서열(들) (5'에서 3'으로) HQNLSDGK (서열 18), HQNISDGK (서열 19) 또는 VISSHLGQ (서열 20) 및 서열 PKNSSMISNTP (서열 16)를 함유하는 폴리펩티드이다.
또한, 인간화 항-CD11a 항체의 공유 결합 변형물도 본 발명의 범위에 포함된다. 이들은 화학적 합성 또는 적용가능한 경우 항체의 효소에 의한 분해 또는 화학적 분해에 의해 제조될 수 있다. 항체의 다른 종류의 공유결합 변형은 항체의 표적 아미노산 잔기를 선발된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도화제와 반응시켜 분자 내에 도입된다.
시스테이닐 잔기는 가장 통상적으로는 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 α-할로아세테이트 (및 대응하는 아민)과 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 생성시킨다. 또한, 시스테이닐 잔기는 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디술피드, 메틸 2-피리딜 디술피드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응하여 유도체화된다.
히스티딜 잔기는, 디에틸피로카르보네이트가 히스티딜 측쇄에 비교적 특이적이기 때문에 이 물질과 pH 5.5-7.0에서 반응하여 유도체화된다. 파라-브로모펜아실 브로마이드도 유용하고, 반응은 pH6.0에서 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 중에서 수행하는 것이 바람직하다.
리시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이들 물질을 사용한 유도체화는 리시닐 잔기의 하전을 역전시키는 효과를 갖는다. α-아미노 함유 잔기의 유도체화에 적합한 다른 시약은 이미도에스테르, 예를 들어 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로히드라이드, 트리니트로벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온, 및 글리옥실레이트와 트랜스아미나제-촉매화 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 1개 또는 수개의 통상의 시약, 예를 들면 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 관능기의 높은 pKa 때문에 알칼리 조건에서 반응을 수행할 것을 필요로 한다. 또한, 이들 물질은 아르기닌 엡실론-아미노기 뿐만 아니라 리신의 기들과 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특이적인 변형은 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시켜 분광 표지를 티로실 잔기에 도입시킬 때 특히 만들어질 수 있다. 가장 일반적으로는, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성한다. 티로실 잔기는125I 또는131I를 사용하여 요오드화시켜 방사성 면역 분석에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조한다.
카르복실 측쇄(아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R-N=C=N-R', 여기서 R 및 R'는 상이한 알킬기임), 예를 들어 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와 반응시켜 선택적으로 변형된다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건 하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
다른 변형은 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
다른 형태의 공유결합 변형은 항체에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소에 의한 커플링을 수반한다. 이러한 과정은 이들이 N- 또는 O-연결 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 항체의 생산을 요하지 않기 때문에 유리하다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 술프히드릴기, (d) 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것과 같은 유리 히드록실기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일에 간행된 WO87/05330 및 문헌[Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
항체에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 그의 균등 화합물에 대한 항체의 노출을 필요로 한다. 이러한 처리는 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 대부분의 또는 모든 당을 분해시키지만, 항체는 완전한 상태로 유지된다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 항체 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 분해는 문헌[Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987)]에 기재된 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
다른 형태의 항체의 공유결합 변형은 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 동4,791,192호 또는 제4,179,337호에 개시된 방법으로 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 결합시키는 것을 포함한다.
B. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명은 인간화 항-CD11a 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체를 제조하는 재조합 기술을 제공한다.
재조합 항체의 생산을 위해, 이 항체를 코딩하는 핵산을 단리하여 추가 클로닝용 (DNA의 증폭) 또는 발현용 복제가능 벡터에 삽입한다. 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 사용하여 (예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리하고 서열을 결정한다. 많은 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 벡터 성분은 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하고, 이에 제한되지 않는다.
(i) 신호 서열 성분
본 발명의 항-CD11a 항체는 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열인 이종성 폴리펩티드를 갖는 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 바람직하게 선택되는 이종성 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 처리되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 서열이다. 천연 항-CD11a 항체 신호 서열을 인식하지 못하고 처리하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열 안정성 엔테로톡신 II 리더로부터 선택되는 원핵생물 신호 서열에 의해 대체된다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyce) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더 또는 WO90/13646에 기재된 신호에 의해 대체될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순포진 바이러스 gD 신호를 사용할 수 있다.
상기 전구체 영역의 DNA는 항-CD11a 항체를 코딩하는 DNA에 인 프레임(in frame)으로 라이게이션된다.
(ii) 복제 기점 성분
발현 및 클로닝 벡터는 모두 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 세포의 염색체 DNA와 무관하게 독립적으로 복제할 수 있도록 만드는 서열이고, 복제 기점 또는 자동 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유동물 세포의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).
(iii) 선발 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선발가능 마커로도 불리는 선발 유전자를 함유할 수 있다. 대표적인 선발 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실러스(Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.
한 선발 개요의 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하여 선발 과정에서 생존하게 된다. 이러한 우성 선발의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 다른 예는 항-CD11a 항체 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 선발 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 먼저 동정된다. 야생형 DHFR이 사용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주이다.
별법으로, 항-CD11a 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 다른 선택가능한 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전화되 또는 동시형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선발가능 마커에 대한 선발 물질을 함유하는 배지 중에서의 세포 성장에 의해 선발될 수 있다 (미국 특허 제4,965,199호).
효모에 사용하기 적합한 선발 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979)). trp1 유전자는 트립토판 중에서의 성장능이 결여된 효모의 변이주(예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선발 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12(1977)). 효모 숙주 세포 게놈에 trp1 손상의 존재는 트립토판 부재하의 성장에 의해 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다. 이와 유사하게, Leu2-결여 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)은 Leu2 유전자를 함유하는 공지의 플라스미드로 보완된다.
또한, 1.6 ㎛ 환형 플라스미드 pKD1로부터 유래한 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 카프 키모신의 대량 생상용 발현 벡터는 케이. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되었다 (Van den Berg, Bio/Technology, 8:135(1990)). 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다카피수의 발현 벡터도 문헌에 개시되어 있다 (Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)).
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 항-CD11a 항체 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주세포에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터도 적합하다. 또한, 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 항-CD11a 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 것이다.
진핵생물을 위한 프로모터 서열도 공지되어 있다. 실질적으로, 모든 진핵세포 유전자는 전가 개시 부위로부터 약 25 내지 30 염기 상류에 위치한 AT 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시 부위 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역(여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 밀단에 코딩 서열의 3' 밀단에 폴리A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 모든 서열은 진핵세포 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 73,657에 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함계 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 항-CD11a 항체 전사는 예를 들어 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40(SV40)의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 수득된, 숙주 세포 시스템에 사용성인 프로모터에 의해 조절된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 중기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 단순포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 후에 마우스 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA 발현에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)] 참조. 별법으로, 라우스(rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 성분
고등 진핵세포에 의한 본 발명의 항-CD11a 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 종종 증가된다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)으로부터 알려져 있다. 그러나, 일반적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용한다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 츠로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 성분에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature, 287:17-18 91982)] 참조. 인핸서는 항-CD11a 항체 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 응집 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열은 진핵세포 또는 바이러스 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 항-CD11a 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026의 내용 및 발현 벡터 참조.
(vii) 숙주 세포의 선발 및 형질전환
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 또는 상기 기술된 고등 진핵세포이다. 상기 목적에 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아, 예를 들어 에셔리치아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜리 (E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실러스(Bacillus), 예를 들어 비. 섭틸리스(subtilis) 및 비. 리체니포르미스(licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공표된 DD 266,710에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사(aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 한가지 바람직한 이. 콜리 클로닝 숙주는 이. 콜리 294(ATCC31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜리 B, 이. 콜리 X1776(ATCC31,537) 및 이. 콜리 W3110 (ATCC27,325)도 적합하다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다.
원핵세포 외에, 필라멘트상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항-CD11a 항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 제빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클로이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(lactis), 케이. 프라길리스(fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스(thermotolerans) 및 케이. 막시아누스(marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아 (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(nidulans) 및 에이. 니게르(niger)가 통상 유용하게 사용된다.
글리코실화 항-CD11a 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 애데스 애깁티(Aedes aegypti) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터 유래한 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 다양한 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주를 구입할 수 있고, 상기 바이러스는 본 발명에 따라 본원의 바이러스로서, 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양체도 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크고, 척추동물 세포의 배양 (조직 배양)에서의 증식이 일반적인 방법으로 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배(胚) 신장 라인 (293 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1997)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Uraub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL 1785); 인간 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항-CD11a 항체 생산을 위한 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선발 또는 목적 유전자 코딩 유전자 증폭에 적합하게 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다.
(viii) 숙주 세포 배양
본 발명의 항-CD11a 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지 중에서 배양할 수 있다. 통상 사용가능한 배지, 예를 들어 Ham F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 Dulbecco 개질 Eagle 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz., 58:44(1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호, 제4,927,762호, 제4,560,655호 또는 제5,122,469호; WO90/03430, WO87/00195, 또는 미국 특허 등록 제30,985호]에 기재된 배지를 숙주 세포 배양 배지로서 사용할 수 있다. 이들 배지는 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자 (예를 들어 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들어 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 GENTAMYCIN (등록상표) 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물) 및 글루코스 및 등가의 에너지 공급원으로 필요에 따라 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 당업계의 숙련가에게 공지된 적합한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 사용된 조건이고, 당업계의 숙련가에게 자명하다.
(ix) 항-CD11a 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 떼, 항체는 세포내에서, 세포질 주변(periplasm) 공간에서 생산될 수 있거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 파쇄 입자, 숙주 세포 또는 용균 단편이 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌[Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜리의 세포질 주변 공간에 분비된 항체를 단리하는 방법이 기재되어 있다. 세포 페이스트는 아세트산나트륨(pH3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파쇄물은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우에는, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액은 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축하는 것이 바람직하다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계에 포함될 수 있고, 항생도제는 외래 오염물의 성장을 억제하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조되는 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파티드 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피, 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 조재하는 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기재로 한 항체의 정제에 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3을 위해 추천된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화도 리간드가 결합되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 사용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스는 세공 조절된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 사용하여 달성할 수 있는 것 보다 신속한 유속 및 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에는, Bakerbond ABX 수지(등록상표) (J.T. Baker, 미국 뉴저지주 Phillipsburg 소재)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온 교환 컬럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE(등록상표) 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어 폴리아스파르산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 회수되는 항체에 따라 사용가능하다.
예비 정제 단계(들) 후에, 목적 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5 내지 4.5의 pH의 용출 완충액을 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 저 pH 소수성 크로마토그래피에 적용할 수 있다.
C. 제약 제제
항체의 치료 제제는 목적 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형체 또는 안정화제와 함께 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조되어 보관된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 복용자에게 비독성이고, 완충액, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기산 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하여 일당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN(등록상표), PLURONICS (등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.
또한, 제제는 치료되는 특정 증상에 필요한 1 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 해로운 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합하여 존재하는 것이 적합하다.
또한, 활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제제도 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리9비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT (등록상표) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특성 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 장시간 동안 유지될 때, 이들 항체는 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집될 수 있고, 이것은 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 변화 가능성을 야기한다. 관련 메카니즘에 따라서 안정화를 위해 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자내 S-S 결합의 형성으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기를 개질시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고 수함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성할 수 있다.
D. 항체의 비치료적 사용
본 발명의 항체는 친화도 정제제로서 사용될 수 있다. 이 방법에서, 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 Sephadex 수지 또는 여과지와 같은 고체상 상에 고정된다. 고정된 항체는 정제되는 CD11a 단백질 (또는 그의 단편)을 함유하는 시료와 접촉한 후 지지체는 고정된 항체에 결합하는 CD11a 단백질을 제외하고 시료 내의 모든 물질을 실질적으로 제거하는 적합한 용매로 세척된다. 최종적으로, 지지체는 항체로부터 CD11a 단백질을 방출시키는 pH5.0의 글리신 완충액과 같은 다른 적합한 용매로 세척된다.
또한, 항-CD11a 항체는 CD11a 단백질의 진단법, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 그의 발현의 검출에 유용할 수 있다.
진단 용도를 위해, 항체는 일반적으로 검출가능 잔기로 표지될 것이다. 많은 표지를 사용할 수 있고, 다음과 같은 범주로 분류할 수 있다.
(a) 방사성 동위 원소, 예를 들어35S,14C,125I,3H 및131I. 항체는 문헌 [예를 들어 Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed., Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs., (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사성은 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정할 수 있다.
(b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, Lissamine, 피코에리트린 및 Texas Red를 사용할 수 있다. 형광 표지는 예를 들어 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 결합시킬 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 측정할 수 있다.
(c) 상이한 효소-기질 표지를 사용할 수 있고, 미국 특허 제4,275,149호는 이러한 몇몇 표지를 제공한다. 효소는 다양한 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 효소는 분광광도계로 측정될 수 있는 기질의 색깔 변화를 촉매화할 수 있다. 별법으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변형시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기한 바와 같다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 후, 측정될 수 있는(예를 들어 화학발광계를 사용하여) 광을 방출하거나 형광 수용체에 에너지를 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예를 들어 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈아진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스 옥시다제, 칼락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 결합시키는 기술은 문헌[O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone ＆ H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합물의 예는 예를 들어 (i) 염료 전구체 (예를 들어 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시키는 기질로서의 수소 퍼옥시다제와 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO); (ii) 알칼린 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 (iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어 p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제를 포함한다.
많은 다른 효소-기질 조합물이 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 조합물은 개요는 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호 참조.
때로, 표지는 항체에 간접적으로 결합된다. 숙련가는 이를 달성하는 다양한 기술을 이해할 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴에 결합될 수 있고, 상기 언급한 3개의 넓은 범주의 항체 중의 하나가 아비딘에 결합될 수 있거나, 이와 반대로 결합될 수도 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하여 표지가 상기 간접적인 방식으로 결합될 수 있다. 별법으로, 표지의 항체에 대한 간접적인 결합을 달성하기 위해 항체는 작은 합텐 (예를 들어 디곡신)에 결합되고, 상기한 상이한 종류의 표지 중의 하나가 항-합텐 항체 (예를 들어 항-디곡신 항체)와 결합된다. 이와 같이, 표지와 항체의 간접적인 결합을 달성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 항-CD11a 항체는 표지될 필요가 없고, 그의 존재는 항-CD11a 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 공지의 분석법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석법에 사용될 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)].
경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 시험 시료 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물질의 능력에 의존한다. 시료 내의 CD11a 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물질의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물질의 양의 결정을 용이하게 하기 위하여, 항체는 경쟁 전후에 불용화되어 항체에 결합되는 표준물질과 분석물이 결합되지 않은 표준물질과 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
샌드위치 분석법은 검출되는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석법에서, 시료 분석물은 고형 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 이어서 제2 항체는 분석물에 결합하여 불용성 3부분 복합체를 형성한다 (미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나(직접 샌드위치 분석) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 종류는 ELISA 분석법으로서, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.
면역조직화학법의 경우, 종양 시료는 신선하거나 동결된 것일 수 있거나 또는 예를 들어 포르말린과 같은 방부제와 함께 파라핀에 함침되어 고정될 수 있다.
또한, 항체는 체내 진단 분석에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 방사성 핵종 (예를 들어111In,99Tc,131I,125I,3H,32P 또는35S)으로 표지되어 이뮤노신티오그래피(immunoscintiography)를 사용하여 종양을 위치시킬 수 있다.
E. 진단 키트
편리성의 문제로서, 본 발명의 항체는 키트, 즉 소정량의 시약의 조합물의 패키지 및 진단 분석 수행 지침서로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소가 필요로 하는 기질 및 코팩터 (예를 들어 검출가능 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제, 예를 들어 안정화제, 완충액 (예를 들어 블록 완충액 또는 용균 완충액) 등이 포함될 수 있다. 상이한 시약의 상대적인 양은 분석법의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약 용액의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변경될 수 있다. 특히, 시약은 용해시에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있다.
F. 항체의 치료적 용도
본 발명의 항-CD11a 항체는 본원에서 설명된 상이한 LFA-1 매개 질환의 치료에 사용될 수 있다.
항-CD11a 항체는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 면역억제제 국소 처치가 필요한 경우, 병소내 투여(관류 또는 이식 전에 이식편을 항체와 접촉시키는 것을 포함)를 포함하여 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항-CD11a 항체는 특히 항체의 투여량을 줄이면서 펄스 주입에 의해 투여하는 것이 적합하다. 투여는 부분적으로는 투여가 단시간내인 것인지 장시간인 것인지에 따라 바람직하게는 주입, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
질병의 억제 또는 치료를 위해, 항체의 적합한 투여량은 상기한 바와 같은 치료되는 질병의 종류, 질병의 심도 및 경과에 따라 결정되고, 항체는 예방 또는 치료 목적, 사전 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 처방 의사의 판단에 따라 투여된다. 항체는 한번에 또는 일정 치료 기간에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
질병의 종류 및 심도에 따라, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (즉, 0.1 내지 20 mg/kg)이 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에 투여되는 초기 가능 투여량이다. 일반적인 1일 투여량은 상기 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 질환에 따라 치료는 질병의 증상이 목적 수준으로 억제될 때까지 유지된다. 그러나, 다른 투여 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료법의 진행은 통상의 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터할 수 있다. 투여 요법의 에는 WO94/04188에 개시되어 있다.
항체 조성물은 양호한 의학적 용례에 따른 방식으로 제제화 및 투여된다. 이를 위해 고려할 인자는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 조건, 질환의 원인, 항체 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획 및 기타 의사에게 알려진 기타 인자를 포함한다. 투여되는 항체의 "치료 유효량"은 상기 고려 사항에 의해 좌우되고, 류마티스성 관절염의 치료, 염증 반응의 감소, 면역자극원의 관용성 유도, 숙주에 의한 이식편의 거부 또는 그 반대의 경우를 야기하는 면역 반응의 억제 또는 이식된 이식편의 생존성 연장을 포함하여 LFA-1 매개 질환의 에방, 완화 또는 치료에 필요한 최소량이다. 이러한 양은 숙주에 독성이거나 숙주를 보다 감염되기 쉽게 만드는 양 미만인 것이 바람직하다.
항체는 반드시 그럴 필요는 없지만 문제 질환의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 1종 이상의 물질과 함께 임의로 제제화된다. 예를 들어, 류마티스성 관절염에서, 항체는 글루코코르티코스테로이드와 함께 투여된다. 또한, T세포 수용체 펩티드 요법은 자기면역 뇌척수염의 임상 증상을 억제하기에 적합한 부가 요법이다. 이식의 경우, 항체는 면역억제제 효과를 조절하기 위해 상기 정의된 면역억제제, 예를 들어 시클로스포린 A와 함께 또는 별개로 투여될 수 있다. 별법으로, VLA-4 길항제 또는 다른 LFA-1를 LFA-1 매개 질환을 앓는 포유동물에 투여할 수 있다. 상기 다른 약제의 유효량은 제제에 존재하는 항-CD11a 항체의 양, 치료되는 질환의 종류 및 상기 논의한 다른 인자에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 상기 사용된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99%의 양으로 사용된다.
G. 제품
본 발명의 또다른 실시형태에서, 상기 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 용기는 질환 치료에 유효한 조성물을 보유하고 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 정맥내 투여 용액 백 또는 피하주사 바늘이 침투가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 활성 물질은 항-CD11a 항체이다. 용기 상의 또는 용기에 부착된 라벨은 조성물이 대상 질환의 치료에 사용된다는 것을 나타낸다. 제품은 추가로 제약상 허용되는 완충액, 예를 들어 인산염 완충 염수, Ringer 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 사용 지침서와 함께 다른 완충액, 희석제, 여과기, 바늘, 시린지 및 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.
〈인간화 항-CD11a 항체의 제조〉
본 실시예는 쥐의 항-인간 CD11a 모노클로날 항체, MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983))의 인간화 및 시험관내 생물학적 효능에 관해 설명한다. 쥐 MHM 24에 대한 이전의 연구 결과에 따르면, 항-CD11a 항체와 마찬가지로 이것도 T 세포 기능을 억제할 수 있다 (Hildreth et al., J. Immunol. 134:3272-3280 (1985); Dougherty et al., Eur. J. Immunol. 17: 943-947(1987)). 쥐 MAb 및 인간 MAb는 둘다 인간 T 세포가 인간 각질세포에 부착하지 못하도록 하며, 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 비자기 백혈구에 대한 T 세포 증식 (MHC 클래스 II 항원에 대한 반응 모델)을 억제한다 (McCabe et al., Cellular Immunol. 150: 364-375 (1993)). 그러나, 쥐 MAb (Reimann et al., Cytometry, 17: 102-108 (1994)) 및 인간 MAb는 침팬치 CD11a를 제외한 비인간 영장류 CD11a와는 교차반응을 일으키지 않았다. 붉은털원숭이에서 예비 임상 실험에 쓸 수 있는 인간화 MAb를 얻기 위해, 가변 중쇄 도메인에서 상보성 결정 영역 중 하나인 CDR-H2의 잔기 4개를 교체하여 붉은털원숭이 CD11a에 결합하도록 인간화 MAb를 재조작했다. 붉은털원숭이 CD11a I-도메인의 클로닝 및 분자 모델화를 통해, 인간 CD11a I-도메인에서 리신 잔기가 붉은털원숭이 CD11a-I 도메인의 글루탐산으로 바뀌는 것이 쥐 MAb 및 인간 MAb가 붉은털원숭이 CD11a와 결합하지 않은 이유임을 알 수 있었다.
〈재료 및 방법〉
(a) 인간화 F(ab')s의 제작
쥐 항-인간 CD11a MAb, MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983); Hildreth et al., J. Immunol. 134: 3272-3280 (1985))를 클로닝하고 서열 분석했다. 대장균에서 F(ab)의 발현과 돌연변이 유발에 유용한 플라스미드를 얻기 위해 파지미드 pEMX1를 제작했다. pB0475의 유도체인 파지미드 pb0720 (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989))를 기재로 하여 제작된 pEMX1에는, 인간화 κ-하위군 I 경쇄 및 인간화 하위군 III 중쇄 (VH-CH1)를 코딩하는 DNA 단편과 공지된 또하나의 pUC119-기재 플라스미드인 pAK2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992))에서 유래한 알칼리성 포스파타제 프로모터 및 샤인 달가르노(Shine-Dalgarno) 서열이 포함되었다. 또한 유일한 SpeI 제한 위치를 F(ab) 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 사이에 도입했다.
인간화 MHM24의 제1 F(ab) 변형체인 F(ab)-1를 제작하기 위해, pEMX1에서 데옥시우리딘을 포함하는 주형에 부위 지정 돌연변이(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985))를 유발시키고, 6개의 CDR을 전부 MHM24 서열로 교체했다. 다른 F(ab) 변형체는 모두 F(ab)-1 주형으로부터 제작했다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA를 제조하기 위해서, 플라스미드로 대장균 균주 XL-1 블루 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 형질전환시켰다. 각각의 변형체에 대해, 디데옥시뉴클레오타이드 방법 (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.)을 사용하여 경쇄 및 중쇄의 서열을 완전히 분석했다. 플라스미드로 대장균 균주 16C9 (MM294의 유도체)를 형질전환시키고, 카르베니실린 5 ㎍/ml이 함유된 LB 플레이트에서 평판 배양하여, 단백질 발현을 위한 단일 콜로니를 선별해 냈다. 이 단일 콜로니를 37 ℃에서 5-8 시간 동안 100 ㎍/ml 카르베니실린 5 ml 중에서 증식시켰다. 이 5 ml 배양물을 500 ml AP5-100 ㎍/ml 카르베니실린에 가하고 37 ℃에서 4 L 배플 장착 진탕 플라스크 안에서 16 시간 동안 증식시켰다. APS 배지는 1.5 g 글루코오스, 11.0 Hycase SF, 0.6 g 효모 추출물 (보증된 것), 0.19 g MgSO4(무수), 1.07 g NH4Cl, 3.73 g KCl, 1.2 g NaCl, 120 ml 1 M 트리에탄올아민 (pH 7.4)을 물 1 L에 용해시켜서, 0.1 ㎛ Sealkeen 필터를 통해 멸균 여과한 것이다.
세포는 1 L 원심분리 용기 (Nalgene)로, 3000 x g으로 원심분리하고 상층물을 제거하여 회수했다. 1 시간 동안 냉동시킨 후, 펠렛을 25 ml의 냉각 10 mM MES-10 mM EDTA (pH 5.0) (완충액 A)에 재현탁시켰다. 0.1 M PMSF (Sigma) 250 ㎕를 첨가하여 단백질 가수분해를 억제하고, 스톡 10 mg/ml 달걀 화이트 리소짐 (Sigma) 3.5 ml를 가하여 박테리아 세포벽을 용해시켰다. 1 시간 동안 얼음 위에서 가만히 진탕시키고, 샘플을 15 분 동안 40,000 x g에서 원심분리했다. 상층물을 완충액 A를 사용하여 50 ml를 만들고 완충액 A로 평형화되어 있는 2 ml DEAE 컬럼에 로딩했다. 완전 통과한 것을 완충액 A로 평형화된 단백질 G-세파로오즈 CL-4B (Pharmacia) 컬럼 (0.5 ml 베드 부피)에 걸었다. 이 컬럼을 완충액 A 10 ml로 세척하고, 0.3 M 글리신 (pH 3.0) 3 ml를 사용하여 1 M 트리스 (pH 8.0) 1.25 ml 내로 용출했다. 그 다음 F(ab)를 Centricon-30 (Amicon)을 사용하여 PBS로 완충액을 교환하고, 최종 부피가 0.5 ml로 농축시켰다. 모든 F(ab)을 SDS-PAGE 겔로 영동시켜 순도를 확인하고, 각 변형체의 분자량은 전기분무 질량 분광법으로 밝혀냈다.
(b) 키메라 및 인간화 IgG의 제작
인간 IgG1 변형체인 키메라 (chIgG1) 및 인간화 (HuIgG1) MHM24를 만들기 위해, 적절한 쥐 또는 인간화 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인 (F(ab)-8, 표 II)를 공지된 별도의 pRK 벡터 (Gorman et al., DNA Protein Eng. Tech. 2: 3 (1990))로 서브클로닝했다. HuIgG1 경쇄 및 중쇄 플라스미드에 부위 지정 돌연변이 (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985))를 일으켜 알라닌 스캔 변형체를 제작했다. 각 변형체의 DNA 서열을 디데옥시뉴클레오타이드 서열 분석법으로 입증했다.
아데노바이러스로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977))을 중쇄 플라스미드 및 경쇄 플라스미드로 고효능 방법 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977); Gorman et al., Science, 221: 551 (1983))을 사용하여 동시 형질감염시켰다. 배지를 무혈청 배지로 교체하고, 5일이 될 때까지 매일 수거했다. 단백질 A-세파로오즈 CL-4B (Pharmacia)를 사용하여 항체가 모여있는 상층물로부터 항체를 정제했다. 용출된 항체를 Centriocon-30 (Amicon)을 사용하여 PBS로 완충액을 교체하고, 0.5 ml로 농축하고, Millex-GV (Millipore)를 사용하여 멸균 여과하고 4 ℃에서 보관했다.
항체의 농도는 전체 Ig 결합 ELISA를 사용하여 측정했다. 기준 물질인 인간화 항-p185HERIgG1 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992))의 농도를 아미노산 조성 분석을 통해 결정했다. 96-웰 플레이트에서 각 웰을 염소 항-인간 IgG F(ab')2(Cappel Laboratories, 미국 펜실바니아주 웨스트체스터 소재) 1 ㎍/ml로 4 ℃에서 24 시간 동안 코팅했다. 정제된 항체를 희석하고 코팅된 플레이트에 중복해서 가했다. 1.5 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 PBS-0.02 % 트윈 20으로 세척하고 양고추냉이 퍼옥시다제-융합 양 항-인간 IgG F(ab')2(Cappel)의 1 : 2000 희석액 0.1 ml를 첨가했다. 1.5 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 세척하고, 0.2 mg/ml o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 - 0.01 % 과산화수소 - PBS 0.1 ml를 첨가했다. 10 분 후, 2 M 황산으로 반응을 중지시키고, 490 nm에서 흡광도를 측정했다.
(c) 붉은털원숭이 CD11a I-도메인의 클로닝
RT-PCR과 인간 CD11a DNA 서열에서 유래한 프라이머를 사용하여 붉은털원숭이 I-도메인의 DNA 서열을 얻었다. 간단하게 설명하자면, FastTrack mRNA 정제 키트 (Invitrogen)를 사용하여 약 107붉은털원숭이 백혈구로부터 mRNA를 분리했다. mRNA 10 ㎍를 MuLV 역전사효소로 역전사시켰다. 그 다음 제1 가닥 cDNA를 아래의 프라이머를 사용하여 PCR 40 주기로 증폭시켰다.
5'-CACTTTGGATACCGCGTCCTGCAGGT-3'(순방향) (서열 21) 및
5'-CATCCTGCAGGTCTGCCTTCAGGTCA-3'(역방향) (서열 22).
아가로오즈 겔 전기영동을 통해 PCR 반응물로부터 예견된 크기의 단일 밴드를 정제했다. PCR 생성물을 제한 효소 Sse8387I (Takara)로 자르고, 동일한 제한 효소로 절단한 인간 CD11a-포함 플라스미드에 라이게이션시켰다. 인간 CD11a 서열에는 I-도메인의 양쪽에 하나씩 두 개의 Sse8387I 부위가 있다. 결과적으로 생성된 플라스미드는 인간 I-도메인을 붉은털원숭이 I-도메인으로 대체한 인간 CD11a로 이루어진 키메라를 코딩한다. DNA 서열 분석 결과는 인간과 붉은털원숭이 사이에 5 개의 아미노산이 다름을 보여주었다. 하나는 I-도메인의 N-말단 영역에 있으며 (Thr59Ser), 다른 4 개는 I-도메인 자체내에 있었다 (Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu, Val308Ala) (도 2).
(d) 주르카트 세포로의 F(ab) 및 IgG의 결합에 관한 FACScan 분석
4 ℃에서 45 분 동안, PBS-0.1 % BSA - 10 mM 나트륨 아지드 중의 인간화 및 비교용 항체의 일련의 희석액과 함께 106주르카트 세포의 분액을 인큐베이션시켰다. 세포를 세척한 후 4 ℃에서 45 분 동안 형광체 접합 염소 항-인간 F(ab')2(Organon Teknika, 미국 펜실바니아주 웨스트체스터 소재)에서 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, FACScan (Becton Dickinson, 미국 캘리포니아주 마우튼 뷰 소재)으로 분석했다. 8 x 103세포를 지정 형식으로 얻었으며, 전향 광 산란 대 측면 광 산란에 의해 차단되어 죽은 세포와 부스러기를 제외시켰다.
(e) 겉보기 Kd를 측정하기 위한 포화 결합
요오도-Gen (Pierce, 미국 일리노이스주 록포드 소재)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 방사선동위원소가 표지된 항체를 제조했다. 항체 50 ㎍ 및 1 mCi125I (DuPont, 미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)를 각각의 튜브에 첨가하고, 25 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 0.2 % 젤라틴이 함유된 행크스 밸런스 염 용액 (HBSS, Life Technologies, 미국 뉴욕주 글랜드 아일랜드 소재)으로 평형화된 PD-10 컬럼을 사용하여 남아있는 유리125I로부터 방사선동위원소 표지된 단백질을 정제했다.
림포사이트 세퍼레이션 미디움 (Lymphocyte Separation Medium; LSM, Organon Teknika, 미국 노쓰 캐롤라이나주 듀르햄 소재)을 제조업자의 지시대로 사용하여 두 명의 공여자로부터 얻은 헤파린 처리한 인간 말초혈에서 단핵 세포를 정제했다. 제동을 걸지 않고 25 ℃에서 40 분 동안 400 x g으로 혈액을 원심분리했다. LSM과 혈장 사이의 경계면에 있는 세포를 수거한 후, HBSS-0.2 % 젤라틴에 재현탁시켰다.
덱스트란 침강법으로 두 마리에서 얻은 헤파린 처리한 붉은털원숭이 말초혈에서 백혈구를 정제했다. 혈액을 PBS 중의 3 % 덱스트란 T500 (Pharmacia) 동부피로 희석하고, 30 분 동안 25 ℃에서 침전물이 흩트러지지 않도록 두었다. 침강시킨 후, 현탁액에 남아있는 세포를 수거하고, 5 분 동안 400 x g로 원심분리하여 펠렛화시켰다. 증류수와 2X HBSS를 사용하여 잔류 적혈구를 2회 저장성 용해시켜 제거했다. 적혈구를 용해시킨 후, 세포를 PBS로 세척한 후, HBSS - 0.2 % 젤라틴으로 재현탁시켰다.
말초혈 단핵 세포 (쥐 MHM24 및 HuIgG1) 또는 붉은털원숭이 백혈구 (MHM23, RhIgG1) 중 하나를 사용하여 포화 결합시켜 항체 친화도를 측정했다. 각각의 분석에서, 방사선동위원소 표지한 항체를 HBSS-0.2 % 젤라틴으로 시리즈로 희석하여 동일한 희석액을 4벌씩 만들었다. 동종 비표지 항체를 500 nM 최종 농도로 일련의 희석액 전체에 첨가하여 비특이적 결합율을 2회 반복 측정했다. 인간 림프구 또는 붉은털원숭이 백혈구를 웰 당 170 ㎕ 부피로 플레이트에 가했다. 플레이트를 궤도 플레이트 진탕기에서 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 세포를 SKATRON (상표) 세포 수확기 (Lier, 노르웨이 소재)를 사용하여 수거하고 0.25 % 젤라틴 및 0.1 % 나트륨 아지드 함유 PBS로 10 배 세척했다. 그 다음 샘플을 1 분 동안 LBK Wallac GammaMaster 감마 계수기 (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)로 계수했다. 데이터를 분당 카운트로부터 나노몰 농도로 변환시키고, 포화 그래프 (결합 대 전체)를 4-변수 곡선 최적화하여 겉보기 Kd(Kd(app)) 값을 얻었다.
(f) 각질세포 단일층 부착 분석
정상적인 인간 상피 각질세포 (Clonetics, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 트립신-EDTA를 사용하여 배양 플라스크로부터 꺼내어 원심분리하고, 림프구 분석 배지 (RPMI 1640 (Gibco)-10 % 태송아지 혈청 - 1 % 페니실린/스트렙토마이신)에 1 ml 당 살아있는 세포수가 5 x 105이 되도록 재현탁시켰다. 0.1 ml/웰의 분액을 96-웰 플레이트에서 밤새 배양하고, 적절한 웰을 인터페론-감마 (Genentech, 미국 캘리포니아 사우쓰 샌프란시스코 소재) 100 유닛/웰을 첨가하여 자극했다.
주르카트 클론 E6-1 세포 (ATCC, 미국 메릴랜드주 록빌) 또는 정제된 붉은털원숭이 림프구 (MLR 방법 참조)를 20 ㎍/ml 칼세인 AM (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유젠 소재)으로 37 ℃에서 45 분 동안 표지했다. 림프구 분석 배지로 3회 세척한 후, 주르카트 또는 붉은털원숭이 림프구 세포를 1 x 106세포/ml로 재현탁시키고, 30 분 동안 4 ℃에서 일련의 희석 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 각질세포 단일층으로부터 배지를 제거하고, 표지된 세포 0.1 ml/웰을 첨가하고 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 웰을 1회 세척시마다 37 ℃ 림프구 배지 0.2 ml/웰로 5회 세척하여, 부착되지 않은 세포를 제거했다. Cytofluro 2300 (Millipore, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)를 사용하여 형광을 측정했다.
인간 CD11a와 붉은털원숭이 I-도메인으로 이루어진 붉은털원숭이 - 인간 키메라 CD11a (Rh/HuCD11a)를 인간 CD11a를 코딩하는 데옥시우리딘-포함 주형 플라스미드 상에서 부위 지정 돌연변이 (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985))를 통해 제작했다. 4 개의 잔기가 변화되었다 (Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu, Val308Ala (도 2)). 아데노바이러스로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977))을 Rh/HuCD11a 및 인간 CD11b (EP 364,690)을 코딩하는 플라스미드로 고효능 방법 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977); Gorman et al., Science, 221: 551 (1983))을 사용하여 동시 형질감염시켰다. Rh/HuCD11a 형질감염 293 세포를 45 분 동안 37 ℃에서 칼세인 AM 20 ㎍/ml로 표지했다. 림프구 분석 배지로 3회 세척한 후, Rh/HuCD11a 형질감염 293 세포를 1 x 106세포/ml로 재현탁시키고, 30 분 동안 4 ℃에서 일련의 희석 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 각질세포 단일층으로부터 배지를 제거한 후, 표지된 293 세포 0.1 ml/웰을 첨가하고 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 그 웰을 한번 세척시 37 ℃ 림프구 배지 0.2 ml/웰로 5회 세척하여 비부착 세포를 제거했다. Cytofluor 2300을 사용하여 형광을 측정했다.
(g) ICAM 부착 분석
37 ℃에서 1 시간 동안 1 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG Fc (Caltag) 0.1 ml/웰로 Maxisorp (Nunc) 96-웰 플레이트를 코딩했다. PBS로 플레이트를 3회 세척한 후, 플레이트를 25 ℃에서 1 시간 동안 1 % BSA-PBS로 블록킹했다. 그 다음 이 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 50 ng/ml 재조합 인간 ICAM-IgG 0.1 ml/웰을 첨가하고 밤새 인큐베이션시켰다.
ICAM-IgG는 인간 IgG Fc로 융합된 인간 ICAM의 세포외 도메인 5개로 이루어졌다. 면역어드헤신 (immunoadhesin)인 인간 ICAM-1(Simmons et al., Cell 331: 624-627 (1988) 및 Staunton et al. Cell 52:925-933 (1988))의 발현용 플라스미드 pRK.5dICAMGaIg를 제작했다. 이것은 ICAM-1의 Ig형 도메인 5개, 서브틸리신 BPN'의 H64A 변형체에 의해 인식되는 아미노산 6개짜리 절단 부위 하나, 제네나제 (Genenase) I (Carter et al., Procteins: Structure, Function and Genetics 6: 240-248 (1989)) 및 인간 IgG1의 Fc 영역 (Ellison et al., Nucleic Acids Research 10:4071-4079 (1982))이 pRK5 벡터 (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347 (1986))에 들어있는 것이다. 인간 배아 신장 293 세포 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977))를 pRK.5dICAMGaIg 및 RSV-neo 플라스미드 (Gorman et al., Science, 221:551-553 (1983))로 안정적으로 형질감염시켜서 5 도메인 ICAM Ig (5dICAMIg)을 발현하는 세포주를 얻었다. 분비 5dICAMIg 20 ㎍/ml를 발현한 클론을 인간 IgG Fc에 결합하는 항체 (Caltag, 미국 캘리포니아주 부링게임 소재) 및 ICAM-1에 결합하는 항체 (BBIG-I1; R ＆ D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA)으로 선별했다. 이 세포주로부터 세포 배양 상층물을 0.01 M Hepes 완충액 (pH 7.0), 0.15 M NaCl (HBS)로 평형화한 단백질 A 컬럼 (ProsepA, Bioprocessing, Ltd., 영국 듀르햄 소재)으로 로딩하고, 컬럼을 HBS로 세척한 후, 0.01 M Hepes 완충액 (pH 7.0), 0.5 M NaCl, 0.5 M TMAC (테트라메틸 암모늄 클로라이드)로 세척하여 비특이적으로 결합된 물질을 제거했다. HBS를 사용하여 컬럼에서 TMAC 완충액을 완전히 씻어내고 5dICAMIg를 0.01 M Hepes 완충액 (pH 7.0), 3.5 M MgCl2및 10 % (w/v) 글리세롤로 용출했다. 단백질 A 푸울을 HBS에 대해 광범위하게 투석하고 농축했다.
정제된 붉은털원숭이 림프구 (MLR 방법 참조)를 45 분 동안 37 ℃에서 20 ㎍/ml 칼세인 AM (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유젠 소재)으로 표지했다. 림프구 분석 배지로 3회 세척한 후, 붉은털원숭이 림프구 세포를 1 x 106세포/ml로 재현탁시키고, 30 분 동안 4 ℃에서 일련의 희석 항체와 함께 인큐베이션시켰다. ICAM-IgG 코팅 플레이트로부터 배지를 제거한 후, 표지된 세포 0.1 ml/웰을 첨가하고 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 웰을 1회 세척시마다 37 ℃ 림프구 배지 0.2 ml/웰로 5회 세척하여, 부착되지 않은 세포를 제거했다. Cytofluro 2300 (Millipore, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)를 사용하여 형광을 측정했다.
(h) 일방향 혼합 림프구 반응 (MLR)
인간 및 붉은털원숭이 MLR 둘다에 있어서, 관련없는 두 공여자로부터 얻은 말초혈 림프구는 림포사이트 세퍼레이션 미디움 (Lymphocyte Separation Medium; LSM, Organon Teknika, 미국 노쓰 캐롤라이나주 듀르햄 소재)를 사용하여 전체 헤파린 처리 혈액에서 분리했다. 림프구를 RPMI 1640 (Gibco) (10 % 인간 AB 혈청 - 1 % 글루타민 - 1 % 페니실린/스트렙토마이신 - 1 % 불필수 아미노산 - 1 % 피루베이트 - 5 x 10-5M 2-β-메르캅토에탄올 - 50 ㎍/ml 젠타마이신 - 5 ㎍/ml 폴리믹신 B)에 3 x 106세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 세슘 일래디에이터로 자극 세포를 3000 rad로 조사하여 무반응 상태로 만들었다. 웰당 1.5 x 105농도의 반응 세포를 동수의 자극 세포와 함께 바닥이 평평한 96-웰 플레이트에서 공동배양했다. 각각의 항체의 일련의 2배 희석액을 배양물에 첨가하여 전체 부피가 웰당 200 ㎕가 되도록 했다. 배양물을 5일 동안 5 % CO2하의 37 ℃에서 인큐베이션시킨 후, 16 시간 동안 [3H]티미딘 1 μCi/웰로 펄스를 가했다. [3H]티미딘 혼입량을 벡크만 섬광 계수기로 측정했다. 분석을 3회 반복 수행했다. 인간화 항-인간 p185HER2MAb (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992))를 사용하여, HuIgG1 및 RhIgG1에 대한 이소타입 비교용으로 사용했다. 쥐 항-햄스터 tPA MAb (Genentech)를 사용하여 MHM23 MAb에 대한 이소타입 비교용 (쥐 IgG1)으로 사용했다. MAb25.3을 임뮨테크, 인크 (미국 메인주 웨스트브룩 소재)로부터 구입한 것이었다.
(i) 쥐 및 인간 MHM24의 컴퓨터 그래픽 모델
VL 및 VH 도메인의 서열 (도 1a 및 1b)을 사용하여 쥐 MHM24 VL-VH 도메인의 컴퓨터 그래픽 모델을 제작했다. 이 모델을 사용하여 어떤 골격 잔기가 인간화 항체로 도입되어야 하는지를 결정했다. F(ab)-8 모델도 제작하여 쥐의 골격 잔기의 정확한 선별 여부를 입증했다. 이 모델의 제작은 문헌 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992); Eigenbrot et al., J. Mol. Biol. 229: 969 (1993))에 기재된 대로 수행했다.
〈결과〉
(a) 인간화
인간 중쇄 하위군 III 및 경쇄 하위군 κ I에 대한 컨센서스 서열을 인간화를 위한 골격으로 사용했다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) (도 1a 및 1b). 이 골격은 다른 쥐 항체의 인간화에 성공적으로 사용된 적이 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993); Eigenbrot et al., Proteins 18:49-62 (1994)). 모든 인간화 변형체를 처음 만들고, 대장균에서 발현된 F(ab)로서 결합에 대해 스크리닝했다. 500 ml 진탕 플라스크로부터의 전형적인 수율은 0.2 - 0.5 mg F(ab)이었다. 질량 분광법을 통해, 각각의 F(ab)의 질량이 5 질량 단위 이내임이 입증되었다.
CDR-H1에는 잔기 H28-H35가 포함되었으며, 이것은 두 문헌 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및 (Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989))으로부터 모든 노출된 잔기를 포함한다. 다른 초가변 (hypervariable) 루프는 문헌 (Chothia et al., (1989))에 따라 정의했다. 경쇄 잔기 번호는 앞에는 L를 달았고, 중쇄 잔기 번호 앞에는 H자를 썼다.
주르카트 세포 상의 인간 CD11a로의 인간화 MHM24 변형체의 결합
EC50F(ab)/EC50F(ab)-2b
변형체 주형 변이a 목적 평균 표준편차 수(N)
F(ab)-1 인간 FR ArgH71Val 직쇄 CDR 교환 결합 없음 2
F(ab)-2 F(ab)-1 AlaH60AsnAspH61GlnSerH62LysValH63PheGlyH65Asp 확장된 CDR-H2 (Kabat et al. (1991)) 1.0 4
F(ab)-3 F(ab)-2 PheH67Ala 포장, CDR-H2 1.2 0.33 3
F(ab)-4 F(ab)-2 ValH71Arg 포장, CDR-H1, H2 2.9 1
F(ab)-5 F(ab)-2 AsnH73LysLysH75SerAsnH76Ser VH 내의 골격 루프 0.043 0.015 4
F(ab)-6 F(ab)-5 SerL53ThrGluL55Gln 확장된 CDR-L2 0.012 0.005 4
F(ab)-7 F(ab)-6 PheH27Tyr 확장된 CDR-H1 0.004 0.002 4
F(ab)-8 F(ab)-7 SerH75LysSerH76Asn VH 뒤부터 인간에서의 골격 루프 0.004 0.002 4
HuIgG1c 0.004 0.002 4
chIgG1d 0.006 0.005 4
a 쥐 잔기는 굵은 글씨로 나타냄. 잔기 번호는 문헌 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))에 따라 정해짐.
b 평균 및 표준편차는 각각의 독립적인 FACScan 분석에 대해 계산된 비의 평균이다. F(ab)-2에 대한 EC50은 771±320 ng/ml이었다.
c HuIgG1은 인간 불변 경쇄 및 중쇄에 융합된 F(ab)-8 VL 및 VH 도메인이다.
d chIgG1은 쥐 VL 및 VH 도메인과 인간 불변 경쇄 및 중쇄가 융합된 키메라 IgG이다.
초기 변형체 F(ab)-1에서는 CDR 잔기를 쥐 항체로부터 인간 골격으로 옮겼다. 또한 잔기 H71가 CDR-H1 및 CDR-H2의 구조에 영향을 주는 것으로 이미 입증되었기 때문에 (Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Tramontano J. Mol. Biol. 215:175 (1990)) 이 잔기를 인간 Arg에서 쥐 Val로 변화시켰다. 이 F(ab)는 검출가능한 결합도를 보여주지 않았다. F(ab)-2에서는 CDR-H2가 서열 기준 정의를 포함하도록 (즉, 잔기 H60-H65를 포함하도록) 확장되었다. 인간 CD11a로의 F(ab)-2의 결합에 대한 EC50은 771 ± 320 ng/ml이었으며, 이는 키메라 IgG1 (5.2 ± 3.0 ng/ml)의 EC50 보다는 148배 약한 값이었다.
이전의 인간화에서는 CDRH1 및 CDR-H2에 인접한 골격 루프 (FR-3)의 잔기가 결합에 영향을 줄 수 있다는 것이 발견된 바 있다(Eigenbrot et al., Proteins 18: 49-62 (1994)). F(ab)-5에서는 이 루프의 잔기 3개가 쥐의 대응 잔기로 변화되었으며, 이 변형체는 결합에 있어서 23배 개선되었음을 보여주었다 (표 II). L53 및 L55 우치에서 인간 잔기를 쥐의 잔기로 교체하면 (즉, SerL53Thr 및 GluL55Gln), 4배 더 추가로 결합이 개선되었다 (F(ab)-6, 표 II). 이는 효과적으로 구조 기준 정의 (잔기 L50-L52)로부터 서열 기준 정의 (잔기 L50-L56)로 CDR-L2를 전환했다. 그 다음 CDR-H1에서 PheH27을 쥐 Tyr로 바꾸면, 추가로 3배 더 개선되었다 (F(ab)-7, 표 II). 마지막으로, 쥐 및 인간화 MHM24의 모델을 기준으로 FR-3에서 3개 쥐 잔기 (H75 및 H76) 중 2개는 인간의 것으로 다시 바꾸었고, 이들 2개 잔기는 결합에 대해 아무런 영향도 미치지 않는 것으로 밝혀졌다 (표 II에서 F(ab)-7 및 F(ab)-8 참조). F(ab)-8에 대한 평균 EC50는 키메라 IgG1 보다 약간 더 나았다 (표 II). 인간의 것에서 쥐의 것으로의 변화가 전부다 결합의 개선을 야기시키는 것은 아니었다. PheH67은 결합에 영향을 주는 것으로 이전에 밝혀진 바 있었기 때문에 (Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993)) 쥐 Ala로 교체했지만, 아무런 영향도 나타나지 않았다 (F(ab)-3, 표 II). ValH71을 다시 인간 Arg로 변화시키면, 결합에서 3배 감소가 나타나며 (F(ab)-4, 표 II), 이는 F(ab)-1에 ValH71이 포함되어 있음을 뒷받침한다.
F(ab)-8로부터 VL 및 VH 도메인을 인간 IgG1 불변 도메인으로 옮겼다. 전체 길이 무손상 항체인 HuIgG1은 F(ab)-8에 동등한 EC50을 보여주었으며, 전체 길이 키메라 IgG1 (표 II)에 비해 개선되었다. HuIgG1의 모든 분석 데이타와 함께 알라닌 스캔 및 MLR 분석 (하기 참조)에 대한 표준치로서 그것을 사용하는 하는 것을 고려할 때, 인간 CD11a에 대한 HuIgG1의 EC50은 0.042 ± 0.072 nM (N=15)였다. 포화 결합 분석도 수행하여 겉보기 해리 상수 Kd(app): 0.15 ± 0.02 nM (쥐 MHM24) 및 0.15 ± 0.04 nM (HuIgG1) (표 II)를 결정했다.
인간 림프구 및 붉은털원숭이 백혈구로의 포화 결합에 의한 겉보기 Kd
muMHM24 Kd(app) nM HuIgG1 Kd(app) nM muMHM23 Kd(app) nM RhIgG1 Kd(app) nM
인간 공여자 1 0.16+/-0.01 0.11+/-0.08
인간 공여자 2 0.13+/-0.02 0.18+/-0.03
붉은털원숭이 공여자 1 3.9+/-0.31 3.9+/-1.04
붉은털원숭이 공여자 2 4.5+/-0.51 n.d.
붉은털원숭이 공여자 3 2.8+/-1.1a
붉은털원숭이 공여자 3 2.7+/-0.9
a 붉은털원숭이 공여자 3의 분석은 2회분의 RhIgG1을 사용하여 수행했으며, 이 분석은 Fc 수용체 상호작용을 억제하는 1 mg/ml 인간 IgG1의 존재하에 수행했다.
(b) CDR 잔기의 알라닌 스캔
어떤 CDR 잔기가 인간 CD11a로의 결합에 관여하는지 결정하기 위해, HuIgG1의 CDR 잔기에 대해 알라닌 스캔 (Cunningham et al., Science 244:1081 (1989))을 수행했다. 각각의 변형체를 주르카트 세포 상의 CD11a로의 결합에 대해 시험했다. 경쇄에서는 단지 CDR-L3만이 결합에 관여한다. HisL91은 큰 영향을 미치며 (표 IV), 이 측쇄가 부분적으로 파묻혀야 하므로 아마도 구조적인 변화를 유발했을 것이다. 잔기 AsnL92 및 TyrL94는 각각 3배, 12배로 결합을 감소시킴으로써, 더욱 적당한 영향을 미친다. 그러나 주의할 것은 이들 두 잔기를 동시에 알라닌 (및 GluL93Ala)으로 교체하는 것은 결합에 아무런 추가 영향도 미치지 않았다는 점이다 (변형체 L3, 표 IV).
중쇄에서는 CDR-H2 및 CDR-H3이 결합에 크게 관여한다. CDR-H1 잔기 TrpH33Ala는 큰 영향을 미치지만, 이는 TrpH33이 부분적으로 파묻혀야 하므로 구조적 변화에 기인했을 가능성이 높다. 결합에 관여하는 가장 중요한 단일 잔기는 CDR-H2의 AspH54이며, 이 잔기를 알라닌으로 변화시키는 것은 결합의 147배 감소시켰다 (표 IV). CDR-H2에서 결합에 관여하는 다른 잔기는 GluH56, GlnH61 및 LysH64 (표 IV) 등이 있다. CDR-H3에서는 TyrH97Ala가 11배, TyrH100cAla이 8배 결합을 감소시킨다. CDR-L3에서처럼, CDR-H3 잔기를 다수 알라닌으로 동시에 교체하면 결합에 있어서 추가적인 큰 감소는 전혀 일어나지 않았다 (표 IV에서 변형체 H3 대 TryH97Ala 및 TyrH99Ala 참조). 또한 인간화에 포함된 FR-3 잔기, LysH73도 또한 알라닌 또는 아르기닌으로 바꿀 경우 결합에서 5배 감소를 나타냈다 (표 IV).
(c) HuIgG1을 붉은털원숭이 CD11a에 결합하도록 재조작
쥐 MHM24 및 HuIgG1 둘다 붉은털원숭이 CD11a로의 결합에서 대략 1000배 감소를 나타냈으며, HuIgG1은 붉은털원숭이 CD11a에 대한 EC50이 45.6 ±40.4 nM (N=16)이었으며 이는 인간 CD11a에 대한 EC50 0.042 ± 0.072 nM와 대조적이다. 영장류 모델이 MHM24의 생물학적 특성, 독성, 효능을 평가하는데 중요하기 때문에, HuIgG1의 붉은털원숭이 CD11a로의 결합을 개선시키는 것이 유리한 것으로 간주되었다. 처음에는 붉은털원숭이에 있어서는 중요하지만 인간에 있어서는 중요하지 않은 잔기를 변이시키기 위해, 인간 CD11a 및 붉은털원숭이 CD11a에 결합하는데 중요한 MAb 초가변 영역 잔기를 결정했다. 따라서, 알라닌-스캔 변형체를 말초혈 림프구 상의 붉은털원숭이 CD11a에 대해서도 분석했다. 가장 중요한 발견은 다중 알라닌 돌연변이 변형체 중 하나인 변형체 H2가 HuIgG1 보다 붉은털원숭이 CD11a에 18배나 더 잘 결합했다는 점이다 (표 IV). 그러나 변형체 H2에 포함된 3개 잔기에서 개개의 돌연변이는 결합에서 극미한 개선만을 나타냈다 (HisH52Ala, 0.7배 개선, SerH53Ala 0.7배 개선, SerH55Ala, 1.3배 악화 (표 IV)). 이들 3개의 잔기에서 2중 돌연변이 시리즈는 HisH52Ala-SerH53Ala가 HuIgG1과 비교할 때 결합에서 77배 개선되어 최상이었다 (표 IV에서 변형체 H2A1, H2A2 및 H2A3 참조). 또한 AspH54가 인간 CD11a와 관련해서는 HuIgG1에서 가장 중요한 결합 잔기임에도 불구하고, AspH54Ala 및 GluH56Ala 변형체는 HuIgG1에 대해 3배 개선되었다 (표 IV).
붉은털원숭이 CD11a으로의 결합은 개선시키지만 인간 CD11a로의 결합을 감소시키지는 않는 H54 위치에서 단일 치환을 얻기 위해, H54 위치를 각종 아미노산으로 치환시켰다. 모든 치환이 크기 계수 이상으로 결합을 감소시킨 반면 AspH54Asn은 붉은털원숭이 결합을 10배 개선시켰다 (표 V)
AspH54에서의 아미노산 치환
AspH54 대체 아미노산 변형체 EC50/HuIgG1 EC50a
인간 CD11ab 붉은털원숭이 CD11ac
평균 표준편차
Ala 147 18 0.3
Asn 26 1 0.1
Gln 20 1 4.4
Glu 16 2 〉25
Ser 〉100 0.9
Arg 〉250 〉25
Lys 〉100 3.8
His 〉300 〉25
Thr 〉450 〉25
Met 〉150 〉25
Leu 〉300 〉25
a 인간 CD11a에 대한 EC50 HuIgG1 = 0.042 nM (표준편차 = 0.072, N=15), 붉은털원숭이 CD11a에 대한 EC50 HuIgG1 = 45.6 nM (표준편차 = 40.4, N=16)
b 이 값은 2회 분석의 평균값이다.
c 이 값은 단일 분석에 대한 값이다.
위치 H52-H53에서의 변화에 대해서 아무런 부가적 효과도 없었기 때문에, 위치 H54 및 H56의 각종 변화도 아울러 수행했다. 모든 변형체에서, H52 및 H53은 알라닌이었다. 한 시리즈에서 위치 H54는 Asn이었고, 위치 H56은 Glu (본래의 것), Ala, Asn 또는 Gln이었다. 이들 변형체 중 어떠한 것도 H2A1 변형체 보다 붉은털원숭이 CD11a 결합을 개선시키지 못했다 (표 VI). 다른 시리즈에서, 위치 H54는 Ala이고, 위치 H56은 Glu (본래의 것), Ala, Ser 또는 Asn이었으며, 이들 모두 변형체 H2A1 보다 나빴다. 세번째 시리즈에서, 위치 H54는 Ser이었고, 위치 H56은 Glu (본래의 것), Ala, Ser 또는 Asn이었다. 이들 가운데 두 개의 변형체가 H2A1 변형체 보다 붉은털원숭이 CD11a에 대한 결합이 개선되었다 (H2C11 및 H2C12, 표 VI). 이들 두 변형체의 붉은털원숭이 CD11a EC50은 H2C11의 경우 0.11 ± 0.11 nM (N = 9)이었고, H2C12의 경우 0.19 ± 0.08 nM (N=7)이었다. 이들 값은 인간 CD11a에 대한 HuIgG1의 EC50 (45.6 nM) 보다 3 내지 5배 약한 것이지만, 붉은털원숭이 CD11a에 대한 HuIgG1의 EC50 (45.6 nM)에 비해서는 240 내지 415배 개선된 것이다. H2C12는 하기에서 RhIgG1으로 명명될 것이다. 포화 결합 실험에서 얻은 겉보기 Kd값이 의미하는 것은 RhIgG1이 붉은털원숭이 CD11a에 결합할 뿐만 아니라, 쥐 MHM23이 붉은털원숭이 CD18에 결합했다는 것이다 (표 III).
HuIgG1-인간 CD11a 상호작용에서 AspH54는 가장 중요한 잔기였다 (표 IV). 이 잔기를 다른 아미노산으로 바꾸면, 결합을 상당히 감소시켰으며, 최소한의 감소는 Glu, Asn 및 Gln으로의 변화에 대해 일어났다. 그러나, HuIgG1-붉은털원숭이 CD11a 상호작용의 경우에는 AspH54를 Ala 또는 Asn로 바꾸면 결합이 개선된 것으로 보아 이 잔기가 악영향을 준다 (표 V). 인간 CD11a와 붉은털원숭이 CD11a로의 결합 사이에 이런 차이를 이해하기 위해, 후자를 붉은털원숭이 PBL 라이브러리로부터 클로닝했다. 도 2는 붉은털원숭이 CD11a I-도메인이 단지 4군데 위치 즉, 133, 189, 197, 308에서 인간 CD11a I-도메인과 다르다는 것을 보여준다. MHM24의 인간 CD11a 에피토프는 잔기 197-203인 것으로 이미 맵핑되어 있었으며 (Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995)), 여기에는 인간 Lys197에서 붉은털원숭이 Glu197로 붉은털원숭이에서의 변화가 포함되어 있다.
(d) 각질세포 세포 결합 분석
주르카트 세포 (LFA-1을 발현하는 인간 T- 세포)가 ICAM-1을 발현하는 정상적인 인간 상피 각질세포에 부착하는 것을 억제하는 쥐 MHM24, 키메라 IgG1 및 HuIgG1의 능력을 서로 비교했다. 이 3개 항체는 모두 유사한 IC50 값 (표 VII)으로 유사하게 수행했다 (도 ).
MHM24 변형체에 의한 세포 부착 차단
IC50 값 (nM)
mAb 주르카트:HuKa RhLyb:HuK RhLy:HuICAMc Rh/HuCD11ad:HuK
평균 표준편차 N 평균 표준편차 N 평균 표준편차 N
murMHM24 0.09
HuIgG1 0.13
chIgG1 0.10
RhIgG1 119 86 4 5.3 4.5 3 4.9 0.2 2
MHM23 1.6 1.5 3 1.2 1.4 0.1 2
a HuK=정상적인 인간 상피 각질세포
b RhLy=붉은털원숭이 림프구
c HuICAM=재조합 인간 ICAM-1
d Rh/HuCD11a=인간293세포로 형질감염된 붉은털원숭이 I-도메인을 가진 인간 CD11a
쥐 또는 인간화 MHM24 모두 붉은털원숭이 또는 게잡이원숭이 림프구가 인간 각질세포에 부착하는 것을 막지 못했다. 붉은털원숭이 림프구가 인간 각질세포에 부착하는 것을 차단하는 것에 대해 RhIgG1을 쥐 항-인간 CD18 항체 MHM23 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983); Hildreth et al., J. Immunol. 134:3272-3280 (1985))을 비교할 경우, RhIgG1이 MHM23 보다 74배 덜 효과적이었다 (도 4a, 표 VII). 그러나, 재조합 인간 ICAM-1을 (인간 각질세포 대신) 플레이트에 코팅할 경우에는 RhIgG1은 MHM23 보다 단지 4배 정도만 덜 효과적이었다 (도 4b, 표 VII). I-도메인이 붉은털원숭이의 것 (Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu, Val308Ala)으로 돌연변이된 인간 CD11a로 이루어진 키메라 CD11a로 인간 배아 신장 293 세포를 형질감염시켰다. 다시 RhIgG1은 이들 Rh/HuCD11a-293 세포가 인간 각질세포에 부착하지 못하도록 막는데 MHM23로부터 단지 4배 감소시켰다 (도 4c, 표 VII).
RhIgG1 (인간화 항-p185HER2 항체; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)) 및 MHM23 (쥐 MAb 354, 쥐 IgG1 항-햄스터 tPA)에 대한 비교용 이소형태 항체는 붉은털원숭이 림프구가 인간 각질세포 또는 재조합 ICAM-1으로 결합하는 것 (도 4a, 4b)이나 Rh/HuCD11a가 인간 각질세포에 결합하는 것 (도 4c)를 차단하지 못했다. 이것이 의미하는 것은, 붉은털원숭이 림프구: 인간 각질세포 분석에서 쥐 MHM23과 비교할 때 RhIgG1의 성능 감소는 붉은털원숭이 림프구와 (MHM23의 쥐 Fc와 비교할 때) HuIgG1의 인간 Fc와의 예상치 않은 상호작용에 의한 것은 아니라는 것이며, 이런 상호작용은 붉은털원숭이 CD11a에 결합하는데 유용한 RhIgG1의 농도를 감소시킬 수 있다. 재조합 인간 ICAM-1 데이터는 RhIgG1이 붉은털원숭이 림프구에 결합하고 쥐 MHM23은 물론 부착을 방지한다는 것을 보여준다 (도 4b, 표 VII). Rh/HuCD11a-293 데이터 (도 4c, 표 VII)는 RhIgG1이 인간 각질세포 상의 표적에 결합하지 않는다는 것을 보여주며 (HuIgG1과 비교), 만약 이런 결합이 이루어진다면, 붉은털원숭이 CD11a로 결합할 수 있는 RhIgG1의 농도를 감소시킬 것이다. 또한 RhIgG1의 붉은털원숭이 백혈구에 대한 Kd(app)는 붉은털원숭이 공여자 3과 유사했으며, 1 mg/ml 인간 IgG1의 추가는 없었다 (붉은털원숭이 1). 이것은 RhIgG1의 결합이 붉은털원숭이 CD11a에 특이적이라는 것을 암시한다.
(e) 혼합 림프구 반응 분석
MLR에서, HuIgG1은 쥐 MHM24 보다 2 배 더 약한 IC50 값을 나타냈다 (표 VIII, 도 5).
혼합된 림프구 반응 분석 결과
IC50 값 (nM)
mAba 평균 표준편차 N
murMHM24 0.19 0.06 3
HulgG1 0.38 0.14 4
mAb25.3 3.8 1.0 2
RhIgG1 23.4 11.4 2
MHM23 30.4 24.0 3
a murMHM24, HuIgG1 및 mAb 25.3을 인간 MLR에서 시험했고, RhIgG1 및 MHM23을 붉은털원숭이 MLR로 시험했다.
쥐 및 인간화 MAb 둘다 MAb 25.3보다 10 내지 20배 더 개선되었으며, 이는 이전에 생체내에서 시험된 바 있다 (Fisher et al., Blood 77:249-256 (1991); Stoppa et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991); Hourmant et al., Transplantation 58: 377-380 (1994)). 붉은털원숭이 결합 변형체 RhIgG1은 쥐 MHM23 보다 약간 더 나은 IC50값을 나타냈다 (표 VIII). 상이한 반응 : 자극 공여자를 독립적인 분석에 사용했으며, 그 결과는 그다지 다르지 않았다. 붉은털원숭이 CD11a에 대한 RhIgG1의 Kd는 인간 CD11a에 대한 HuIgG1의 Kd로부터 약 26배 감소했고 (표 III), 이는 MLR 분석에서 유도된 IC50 값에 반영되었다 (표 VIII).
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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:
Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro
1 5 10 11
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 7 amino acids
(B) TYPE: Amino Acid
(D) TOPOLOGY: Linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:
His Gln Ser Leu Gly Thr Gln
1 5 7
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 8 amino acids
(B) TYPE: Amino Acid
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His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys
1 5 8
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His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys
1 5 8
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Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln
1 5 8
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CACTTTGGAT ACCGCGTCCT GCAGGT 26
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CATCCTGCAG GTCTGCCTTC AGGTCA 26
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(D) TOPOLOGY: Linear
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Met Ile Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
1 5 10 15
Lys Asp
17
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24:
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(B) TYPE: Amino Acid
(D) TOPOLOGY: Linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
20 25 30
Gly His Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Met Ile Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Arg Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Tyr Phe Tyr Gly Thr
95 100 105
Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
Ser
121

Claims (25)

  1. 인간 CD11a I-도메인에 특이적으로 결합하는 인간화 항-CD11a 항체.
  2. 제1항에 있어서, CD11a 상의 에피토프 MHM24에 결합하는 인간화 항-CD11a 항체.
  3. Kd값이 약 1 x 10-8M 이하인, 인간 CD11a에 결합하는 인간화 항-CD11a 항체.
  4. ICAM-1을 발현하는 정상 인간 상피 각질세포에 대한 주르카트(Jurkat) 세포의 부착을 방해하기 위해 약 1 nM 이하의 IC50(nM) 값을 갖는 인간화 항-CD11a 항체.
  5. 혼합 림프구 반응 분석에서 약 1 nM 이하의 IC50(nM) 값을 갖는 인간화 항-CD11a 항체.
  6. 제1항에 있어서, 인간화 항체 MHM24 F(ab)-8의 CDR1 (서열 10), CDR2 (서열 11) 및 CDR3 (서열 12)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 인간화 항-CD11a 항체.
  7. 제6항에 있어서, 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항-CD11a 항체
  8. 제1항에 있어서, 인간화 MHM24 F(ab)-8의 CDR1 (서열 13), CDR2 (서열 14) 및 CDR3 (서열 15)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화 항-CD11a 항체.
  9. 제8항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항-CD11a 항체.
  10. 제1항에 있어서, 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화 항-CD11a 항체.
  11. 제1항에 있어서, 전체 길이의 항체인 인간화 항-CD11a 항체.
  12. 제11항에 있어서, 인간 IgG인 인간화 항-CD11a 항체.
  13. 제1항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  14. 제13항에 있어서, 항체 단편이 F(ab')2인 항체.
  15. 제1항에 있어서, 검출가능 표지로 표지된 항체.
  16. 제1항에 있어서, 고체상에 고정된 항체.
  17. 제1항에 있어서, 세포 독성제에 접합된 항체.
  18. CD11a 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 시료를 제1항의 항체에 노출시키는 단계 및 상기 항체의 시료에 대한 결합을 측정하는 단계를 포함하는, CD11a 단백질의 존재를 측정하는 방법.
  19. 제1항의 항체 및 CD11a 단백질을 검출하기 위한 항체의 사용 지시서를 포함하는 키트.
  20. 제1항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  21. 제20항의 핵산을 포함하는 벡터.
  22. 제21항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제22항의 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 인간화 항-CD11a 항체의 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 숙주 세포 배양물로부터 인간화 항-CD11a 항체를 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 인간화 항-CD11a 항체가 숙주 세포 배양 배지로부터 회수되는 방법.
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