MX2011001506A - Metodos para eliminar un contaminante utilizado cromatografia de membrana de intercambio de ion en desplazamiento de proteina indigena. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante, cuyos métodos comprenden los pasos secuenciales de: (a) pasar la composición a través de una membrana de intercambio de ión, en donde el polipéptido y la membrana tiene cargas opuestas, a condiciones operativas que comprenden un regulador de pH que tiene un pH lo suficientemente diferente del pI del polipéptido para mejorar la carga del polipéptido y una baja resistencia iónica para prevenir la protección de las cargas mediante los iones del regulador de pH, que causan que la membrana se una al polipéptido y al menos un contamínate, y (b) recuperar el polipéptido purificado del efluente.

Description

METODOS PARA ELIMINAR UN CONTAMINANTE UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE MEMBRANA DE INTERCAMBIO DE ION EN DESPLAZAMIENTO DE—PROTEINA INDIGENA Campo de la Invención Esta invención se refiere en general a la purificación de proteínas. En particular, la invención se refiere a métodos para eliminar un contaminante utilizando cromatografía de membrana de intercambio de ión en desplazamiento de proteína indígena.

Antecedentes de la Invención La purificación económica a gran escala de proteínas es un problema importante en aumento para la industria de la biotecnología. Generalmente, las proteínas se producen a través del cultivo celular, utilizando ya sea líneas celulares eucarióticas o procarióticas modificadas para producir la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen de esa proteína. Ya que las células típicamente utilizadas son organismos vivos, deben alimentarse con un medio de crecimiento en complejo, que contiene azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, usualmente suministrados de preparaciones de suero de animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos alimentada a las células y de los subproductos de las células mismas a una pureza suficiente Ref. 217383 para utilizarse como un terapéutico humano posee un reto formidable .

LOs procedimientos para la purificación de proteínas de residuos celulares inicialmente dependen del sitio de expresión de la proteína. Se puede causar que algunas proteínas se secreten directamente de la célula en el medio de crecimiento circundante; otras se hacen intracelularmente . Para las proteínas anteriores, el primer paso de un proceso de purificación involucra la lisis de la célula, que puede hacerse a través de una variedad de métodos, que incluyen esfuerzo cortante mecánico, choque osmótico, o tratamientos enzimáticos. Tal alteración libera el contenido completo de la celda en el homogenato, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su pequeño tamaño. Estos normalmente son eliminados por centrifugación diferencial o a través de filtración. Surge el mismo problema, aunque en menor escala, cuando se secretan proteínas directamente debido a la muerte natural de las células y la liberación de las proteínas de la célula hospedera intracelular en el curso de la corrida de la producción de la proteína.

Una vez que se ha obtenido la solución depurada que contiene la proteína de interés, su separación de las otras proteínas producidas por la célula usualmente se intenta utilizando una combinación de diferentes técnicas croraatográficas . Estas técnicas separan las mezclas de las proteínas sobre la base de su carga, grado de hidrofobicidad, o el tamaño. Varias diferentes resinas cromatográficas están disponibles para cada una de estas técnicas, permitiendo la adaptación exacta del esquema de purificación a la proteína en particular involucrada. La esencia de cada uno de estos métodos de separación es que se puede causar que las proteínas ya sea se muevan a diferentes velocidades hacia abajo a una gran columna, logrando una separación física que aumenta según pasan más hacia abajo de la columna, o se adhieren selectivamente al medio de separación, siendo entonces diferencialmente diluidas por diferentes solventes. En algunos casos, la proteína deseada se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna, y la proteína de interés no lo hace, es decir, la proteína de interés está presente en el "flujo directo".

Las Publicaciones referentes a la purificación de proteínas incluyen Fahrner at al., Biotechnol Genet Eng Rev. 2001; 18:301-27.

Un procedimiento de purificación a gran escala típico por lo generalmente se construye alrededor del uso de la proteína inmovilizada A como el paso de captura y purificación primario en combinación con otras operaciones de columna. Las operaciones de la columna de la proteína A, en general, suministra una pureza relacionada con el producto sobre el 98% con la mayor parte de las impurezas del proceso eliminadas en la fracción del flujo de paso. Debido a esto, las unidades operacionales del proceso resultante se consideran como siendo pasos de concentración, purificación o pulido, responsables de la separación de los isómeros relacionados con el producto y la eliminación de las cantidades restantes de proteínas de célula hospedera/ADN, la proteínas A deslavadas y los virus.

Breve Descripción de la Invención La invención en la presente se refiere a métodos para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido, y por lo menos un contaminante, cuyos métodos comprenden los pasos secuenciales de: (a) pasar la composición a través de una membrana de intercambio de ión, en donde el polipéptido y la membrana tiene cargas opuestas, a condiciones operativas que están comprendidas de regulador de pH que tiene un pH lo suficientemente diferente del pl del polipéptido para mejorar la carga del polipéptido y a una resistencia iónica baja efectiva para evitar la protección de las cargas a través de los iones reguladores del pH, que causan que la membrana se una al polipéptido, y al menos un contaminante, y (b) recuperar el polipéptido purificado a partir del efluente.

En una alternativa, la invención se refiere a un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y por menos un contaminante, cuyo método comprende los pasos secuenciales de: (a) pasar la composición a través de una membrana de intercambio de catión, en donde el polipéptido y la membrana tiene carga opuesta, a condiciones operativas comprendidas de un regulador de pH que tiene un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido y una conductividad de a aproximadamente 40 mS/cm, que causa que la membrana se una al polipéptido, y al contaminante, y (b) recuperar el polipéptido purificado a partir del efluente.

En otra alternativa, la invención se refiere a un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y por lo menos un contaminante, cuyo método que comprende los pasos secuenciales de: (a) pasar la' composición a través de una membrana de intercambio de anión, ¦ en donde el polipéptido y la membrana tiene una carga opuesta, a condiciones operativas comprendidas de un regulador de pH que tiene un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por arriba de pl del polipéptido y una conductividad de <_ aproximadamente 40 mS/cm, que causa que la membrana se una al polipéptido y a por lo menos un contaminante, y (b) recuperar el polipéptido purificado del efluente.

En un aspecto, el contaminante es una Proteína de Ovario de Hámster Chino (CHOP, por sus siglas en inglés) . En otro aspecto, el polipéptido comprende una región CH2/CH3. En aún otro aspecto, el polipéptido es un anticuerpo. En aún otro aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En otros aspectos, los métodos además comprenden someter la composición que comprende el polipéptido a uno o más pasos de purificación adicionales ya se antes, durante, o después de los pasos a a b, el paso de purificación es, en una alternativa, cromatografía de afinidad de proteína A, y, en otra alternativa, cromatografía de intercambio de ion, utilizando una columna o membrana operada en el modo de unión/elusión, flujo directo, o desplazamiento de proteína indígena .

Además, la invención proporciona la preparación de una composición farmacéutica, mediante la combinación del polipéptido purificado con un portador farmacéuticamente aceptable .

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Depuración de CHOP para el grupo del intercambio de anión mAb 1 a un pH 5.5, 6.0 mS/cm, Mustang™ S (pequeña escala, 0.18 mi MV, 667 MV/hora) .

Figura 2. Depuración de CHOP del grupo de intercambio de anión de mAb 2 a un pH de 5.5 y 6.4 mS/cm y a un pH de 8.0 y 5.0 mS/cm, Mustang™ S (en pequeña escala, 0.18 mi MV, 667 MV/hora) .

Figura 3. Rendimiento para el grupo del intercambio de anión de mAb 2 a un pH de 5.5 y 6.4 mS/cm y a un pH de 8.0 y 5.0 mS/cm, Mustang™ S (pequeña escala, 0.18 mi MV, 667 MV/hora) .

Figura 4. Depuración de CHOP para el grupo de la proteína A mAb 1 a un pH de 5.5, 3.2 mS/cm, Mustang ™ S (pequeña escala, 0.18 mi MV, 1333 MV/hora).

Figura 5. Capacidad de unión de CHOP (barras) y el anticuerpo (línea) para mAb 3 a un pH de 8.0, Mustang™ Q (pequeña escala, 0.35 mi MV, 600 MV/hora).

Figura 6. Rendimiento para el grupo del intercambio de catión mAb a un cambio de 8.0, Mustang™ Q (pequeña escala, 0.35 mi MV, 600 'MV/hora) .

Figura 7. Niveles de CHOP para mAb 4 a un pH de 8.0 y 4.0 mS/cm, Mustang™ Q (pequeña escala. 0.18 mi MV, 1333 MT/hora) y después un pH 5.5 y 6.1/cm, Mustang™ S (pequeña escala, 0.18 mi MV, 1333 MV/hora).

Figura 8. Depuración de CHOP para mAb 1 a un pH de 8.0 y 4.7 mS/cm sobre una columna de flujo rápido de Q-Sepharose que corre en el modo de flujo directo a 100 cm/hora (tiras) y además después se purifica sobre Mustang™ S en el modo de lotes (diamantes) y continua (gris sólido) aproximadamente a un pH de 5.5 y 6 mS/cm (pequeña escala, 0.18 mi MV, 538 MV/hora) .

Figura 9. Depuración de CHOP para mAb 1 a un pH de 5.5 y 6 mS/cm, Sartobind™ S (pequeña escala, 0.14 mi MV, 857 MV/hora) .

Figura 10. Depuración de CHOP para mAb 1 a un pH de 5.5 y 6 mS/cm, Mustang ™ S (pequeña escala, 0.18 mi MV) .

Figura 11. Depuración de CHOP para mAb 1 a un pH de 5.5 y 6/cm, Mustang™ S (escala piloto, de 10 mi MV, 546 MV/hora) .

Figura 12. Perfil de la producción de proteína en donde la cromatografía de intercambio de catión se corre en el modo de unión/elusión.

Figura 13. Perfil de la producción de proteína que reemplaza la cromatografía de intercambio catión que corre en el modo de unión/elusión con una membrana de intercambio de catión que corre en el modo de desplazamiento de proteína indígena .

Descripción Detallada de la Invención Definiciones En la presente, los intervalos o cantidades numéricas precedidas por el término "aproximadamente" expresamente incluyen el intervalo exacto o la cantidad numérica exacta.

La "composición" a ser purificada en la presente comprende el polipéptido de interés y uno o más contaminantes. La composición puede estar "parcialmente purificada" (es decir, ha sido sometida a uno o más pasos de purificación, tal como cromatografía de proteína A) o puede obtenerse directamente de una célula u organismo hospedero que produce el anticuerpo (por ejemplo, la composición puede comprender un fluido del cultivo celular cosechado) .

Como se utiliza en la presente, "polipéptido" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de diez aminoácidos. Preferiblemente, el polipéptido es una proteína de mamífero, los ejemplos de la cual incluyen: renina, una hormona de crecimiento, que incluye la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovino; factor de liberación de la hormona de crecimiento, la hormona paratiroidea ; hormona estimuladora de tiroides; lipoproteínas ; alfa-l-antitripsina; cadena de insulina A; cadena de insulina B, proinsulina, folículo que estimula la hormona; calcitonina, hormona luteinizante , glucagon, factores de coagulación tales como el factor de VIIIC, factor > IX, factor tisular, y el factor von Willebrands ; factores anti-coagulación, tales como la proteína C; factor natriurético atrial; agente tensioactivo de pulmón, un activador de plasminógeno, tal como urocinasa o la orina humana o un activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) ; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor alfa y beta de necrosis tumoral; encefalinasa; RANTES (regulado sobre la activación normalmente expresada y secretada de las célula T) ; proteína inflamatoria de macrófago humano (???-1-alfa) , una albúmina de suero tal como la albúmina de suero humano; una sustancia inhibidora de uellerian; cadena de relaxina A; cadena de relaxina B; prorrelaxina ; péptido asociado con gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa, DNasa; IgE; un antígeno asociado con el linfocito T citotóxico (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico, tal como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF) , neurotrófina-3 , -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-ß, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento de fibroblasto tal como aFGF y bFGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento transformante (TGF) , tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-ß?, TGF-P2, TGF-ß3, TGF-34, o TGF-ß?; factor de crecimiento de tipo insulina I y II (IGL-I e IGF-II); des (1-3 ) -IGF-1 (IGF-I de cerebro), proteínas de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (IGFBP) , proteínas CD, tales como CD3 , CD4 , CD8, CD19 y CD20, eritropoyetina, factores osteoinductores ; inmunotoxinas ; una proteína morfogenética ósea (BMP) , un interferón tal como el interferón-alfa , beta, y gama, factores estimuladores de colonia (CSF) , por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL) , por ejemplo, la IL-I a IL-10; superóxido de dismutasa; receptores de célula T, proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración de decaimiento; antígeno viral, tales como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores buscadores; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CD1 la, CDl Ib, CD1 le, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado con tumor tal como el receptor HER2 , HER3 o HER4 ; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de los polipéptidos antes listados, así como los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, que se unen a cualquiera de los polipéptidos antes descritos.

Un "contaminante" es un material que es diferente del producto del polipéptido deseado. El contaminante incluye, sin limitación: materiales de célula hospedera, tales como Proteínas de Ovario de Hámster Chino (CHOP) ; proteína A deslavada; ácido nucleico; una variante, fragmento, agregado, isómero o derivado del polipéptido deseado; otro polipéptido; endotoxina; contaminante viral; componente del medio del cultivo celular (por ejemplo, Garamicina; GENTAMYCIN®) , etc.

Un polipéptido de interés en la presente es uno que comprende una región CH2/CH3 y por consiguiente es adaptable para la purificación a través de la cromatografía de afinidad de proteína A. El término "región CH2/CH3" cuando se utiliza en la presente, se refiere a los residuos de aminoácido en la región Fe de una molécula de inmunoglobulina que interactúan con la proteína A. En modalidades preferidas, la región CH2/CH3 comprende una región CH2 intacta seguida por una región CH3 intacta, y más preferiblemente una región Fe de una inmunoglobulina. Los e emplos de polipéptidos que contiene la región CH2/CH3 incluyen anticuerpos, inmunoadhesinas y proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de interés fusionado con, o conjugado con, una región CH2/CH3.

En modalidades preferidas de la invención, el anticuerpo a ser purificado en la presente es un anticuerpo recombinante. Un "anticuerpo recombinante" es uno que ha sido producido en una célula hospedera que ha sido transformada o transfectada con ácido nucleico que codifica el anticuerpo, o produce el anticuerpo como un resultado de la recombinación homologa. "Transformación" y "transíección" se utilizan de manera intercambiable para referirse al procedimiento de introducir ácido nucleico en una célula. Después de la transformación o la transíección, el ácido nucleico puede integrarse en el genoma de la célula hospedera, o puede existir como un elemento extracromosómico . La "célula hospedera" incluye una célula en cultivo celular in vitro, así como una célula dentro de un animal hospedero. Los métodos para la producción recombinante de polipéptidos se describen en la Patente de E.U.A. No. 5,534,615, expresamente incorporada en la presente por referencia, por ejemplo.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa) , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpo, mientras retengan, o se modifiquen para comprender una región CH2/CH3 como se define en la presente.

El anticuerpo en la presente está dirigido contra un "antígeno" de interés. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que sufre de una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, los anticuerpos dirigidos contra antígenos no de polipéptido (tales como los antígenos, glicolípidos asociados con tumores, ver Patente de E.U.A. No. 5,091,178) también se contemplan. Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula de transmembrana (por ejemplo, receptor) o ligando tal como un factor de crecimiento. Los antígenos ilustrativos incluyen los polipéptidos explicados anteriormente. Los objetivos moleculares preferidos para los anticuerpos abarcados por la presente invención incluyen polipéptidos CD tales como CD3 , CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34, miembros de la familia del receptor HER, tales como el receptor de EGF (HERI) ,o el receptor HER2 , HER3 o HER4 ; moléculas de adhesión celular, tales como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1 VCA e integrina av/b3 que incluye ya sea sus subunidades a o b (por ejemplo, anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb) ; factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) , receptor mpl; CTLA-4, polipéptido C, etc. Los antígenos solubles o sus fragmentos, opcionalmente conjugado con otras moléculas, puede utilizarse como inmunógenos para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembrana, tales como receptores, fragmentos de éstos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) pueden utilizarse como inmunógeno. Alternativamente, las células que expresan la molécula de transmembrana pueden utilizarse como inmunógeno. Tales células pueden derivarse de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares cancerígenas) o pueden ser células que han sido transformadas a través de técnicas recombinantes para expresar la molécula de transmembrana.

Los ejemplos de anticuerpos a ser purificados en la presente incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos HER2 que incluyen trastuzumab (HERCEPTIN®) (Cárter et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), Patente de E.U.A. No. 5,725,856) pertuzumab (OMNI ARG™) ( OOl/00245) ; anticuerpos CD20 (ver a continuación); anticuerpos IL-8 (St John el al, Chest, 103:932 (1993), y Publicación Internacional No. O 95/23865) ; anticuerpos VEGF o del receptor VEGF que incluyen anticuerpos VEGF humanizados y/o madurados por afinidad tales como el anticuerpo huA4.6.1 VEGF humanizado bevacizumab (AVASTIN®) y ranibizumab (LUCENTIS®) (Kim el al, Growth Factors, 7:53-64 (1992), Publicación Internacional No. WO 96/30046, y WO 98/45331, publicada el 15 de octubre de 1998) ; anticuerpos PSCA (WO01/40309) ; anticuerpos CDlla que incluyen efalizumab (RAPTIVA®) (Patente de E.U.A. No. 5,622,700. WO 98/23761, Steppe et al, Transplant Intl. 4:3-7 (1991), y Hourmant et al, Transplantation 58:377-380 (1994)); y anticuerpos que se unen a IgE incluyendo omalizumab (XOLAIR®) (Presta el al, J. Immunol . 151:2623-2632 (1993), y Publicación Internacional No. WO 95/19181; Patente de E.U.A. No. 5,714,338, emitida el 3 de febrero de 1998 o la Patente de E.U.A. No. 5,091,313, emitida el 25 de febrero de 1992, WO¦ 93/04173 publicada el 4 de marzo de 1993, o Solicitud Internacional No. PCT/US98/13410 presentada el 30 de junio de 1998, Patente de E.U.A. No. 5,714,338); anticuerpos CD18 (Patente de E.U.A. No. 5,622,700, emitida el 22 de abril de 1997, o como en WO 97/26912, publicada el 31 de julio de 1997) ; anticuerpos del anticuerpo del receptor Apo-2 (WO 98/51793 publicada el 19 de noviembre de 1998) ; anticuerpos del Factor Tisular (TF) (Patente Europea No. 0 420 937 Bl otorgada el 9 de noviembre de 1994); anticuerpos de integrina a4-a7 (WO 98/06248 publicada el 19 de febrero de 1998) ; anticuerpos EGFR (por ejemplo, el anticuerpo 225 quimerizado o humanizado, cetuximab, ERBUTIX* como en WO 96/40210 publicada el 19 de diciembre de 1996); anticuerpos CD3 tales como 0KT3 (Patente de E.U.A. No. 4,515,893 emitida el 7 de mayo de 1985) ; anticuerpos CD25 o Tac tales como CH1-621 (S1MULECT®) y ???????® (Ver Patente de E.U.A. No. 5,693,762 emitida el 2 de diciembre de 1997) ; anticuerpos CD4 tales como el anticuerpo cM-7412 (Choy et al, Arthritis Rheum 39(l) :52-56 (1996)) ; anticuerpos CD52 tales como CAMPATH- 1H (ILEX/Berlex) (Riechmann et al, Nature 332:323- 337 (1988)) ; anticuerpos Fe tales como el anticuerpo M22 dirigido contra Fe ( RI como en Graziano et al, J. Immunol . 155 (10) : 4996-5002 (1995)) ; anticuerpos de antígenos carcinoembriónicos (CEA) tal como hMN-14 (Sharkey et al, Cáncer Res. 55(23Suppl) : 5935s-5945s (1995) ) ; anticuerpos dirigidos contra células epiteliales de pecho que incluyen huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 (Ceriani et al, Cáncer Res. 55(23) : 5852s-5856s (1995) ; y Richman et al, Cáncer Res. 55(23 Supp) : 5916s-5920s (1995)) ; anticuerpos que se unen a células de carcinoma de colon tales como C242 (Litton et al, Eur J. Immunol. 26(1) : 1-9 (1996)) ; anticuerpos CD38, por ejemplo, AT 13/5 (Ellis et al, J. Immunol. 155 (2) : 925-937 (1995)) ; anticuerpos CD33 tales como Hu M195 (Jurcic et al, Cáncer Res 55(Supl. 23) : 5908s-5910s (1995)) y CMA-676 o CDP771; anticuerpos EpCAM tales como 17-1 A (PANOREX®) ; anticuerpos GpIIb/IIIa tales como abciximab o c7E3 Fab (REOPRO®) ; anticuerpos RSV tales como MEDI -493 (SY AGIS®) ; anticuerpos CMV tales como PROTOVIR® ; anticuerpos VIH tales como PR0542; anticuerpos de hepatitis tales como el anticuerpo Hep B OSTAVIR®; el anticuerpos CA 125 OvaRex; el anticuerpos BEC2 del epítopo GD3 idiotípico; anticuerpo a?ß3 (por ejemplo, VITAXIN®; Medimmune) ; anticuerpo de carcinoma de célula renal humano tal como ch-G250; ING-1; el anticuerpo 17-lAn anti-humano (3622W94) ; el anticuerpo de tumor colorectal anti-humano (A33) ; el anticuerpo R24 de melanoma anti-humano dirigido contra gangliosida GD3 ; carcinoma de célula escamosa anti-humano (SF-25) ; el anticuerpo del antígeno de leucocito humano (HLA) tal como Smart ID10 y el anticuerpo DR anti-HLA Oncolym (Lym-1) ; el anticuerpos CD37 tal como TRU 016 (Trubion) ; el anticuerpo IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk) ; el anticuerpo anti-célula B, (Imferon); MAb que activa la célula B ( Immunogen/Aventis) ; 1D09C3 (Morphosys/GPC) ; LymphoRad 131 (HGS) ; anticuerpos Lym-1, tal como Lym-lY-90 (USC) o anti-Lym-1 Oncolym (USC/Pcrcgrinc) ; LlF 226 (Enhanced Lifesci.); anticuerpos BAFF (por ejemplo, WO 03/33658) ; anticuerpos del receptor BAFF (ver, por ejemplo, WO 02/24909); anticuerpos BR3 ; anticuerpo Blys tal como belimumab; LYMPHOSTAT-B™ ; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen) ; gomilixima (Idee 152; Biogen Idee); anticuerpo del receptor IL-6 tal como atlizumab (ACTEMRA™ ; Chugai/Roche) ; anticuerpo IL-15 tal como HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen) ; anticuerpo del receptor de quimocina, tal como el anticuerpo CCR2 (por ejemplo, MLN1202; Millieneum) ; anticuerpo anti -complemento, tal como el anticuerpos C5 (por ejemplo, eculizumab, 5G1.1; Alexion) ; formulación oral de inmunoglobulina humana (por ejemplo, IgPO; Protein Therapeutics) ; anticuerpo IL-12 tal como ABT-874 (CAT/Abbott) ; Teneliximab (BMS-224818 ; BMS) ; anticuerpos CD40, que incluyen S2C6 y sus variantes humanizadas (WO00/75348) y TNX 100 (Chiron/Tanox) ; anticuerpos TNF-a que incluyen cA2 o infliximab (RLMICADE®) , CDP571, MAK-195, adalimumab (HUMIRA™) , el fragmento del anticuerpo TNF-a pegilado tal como CDP-870 (Celltech) , D2E7 (Knoll) , anticuerpo policlonal anti-TNF-a (por ejemplo, PassTNF; Verigen) ; anticuerpos CD22 tal como LL2 o epratuzumab (LYMPHOCIDE® ; Immunomedics) , incluyendo epratuzumab Y-90 y, epratzumab 1-131, anticuerpo CD22 de Abiogen (Abiogen, Italy) , CMC 544 (Wyeth/Celltech) , combotox (UT Soutwestern) , BL22 (NIH) , y LympoScan Tc99 (Immunomedics) .

Los ejemplos de anticuerpos CD20 incluyen: "C2B8" , que ahora se denomina "rituximab" ("RITUXAN®") (Patente de E.U.A. No. 5,736,137); el anticuerpo de murino 2B8 marcado con itrio- [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEV ALIN®) comercialmente disponible de IDEC Pharmaceuticals , Inc. (Patente de E.U.A. No. 5,736,137; 2B8 depositado con el número de acceso en ATCC No. HB11388 el 22 de junio de 1993) ; IgG2a "Bl" de murino, también denominado "Tositumomab" , opcionalmente marcado con 131I para generar el anticuerpo "1311 -Bl" o "yodo 1131 tositumomab" (BEXXAR™) comercialmente disponible de Corixa (ver, también, la Patente de E.U.A. No. 5,595,721); el anticuerpo monoclonal de murino " F5" (Press et al., Blood 69 (2) : 584 -591 (1987)) y sus variantes que incluyen 1F5 "parchado con estructura" o humanizado (WO 2003/002607, Leung, S . ; depósito ATCC FIB-96450) ; el anticuerpo 2H7 de murino y 2H7 quimérico (Patente de E.U.A. No. 5,677,180); 2H7 humanizado (WO 2004/056312, Lowman et al.,); 2F2 (HuMax-CD20 ) , un anticuerpo de alta afinidad completamente humano activado en la molécula CD20 en la membrana celular de la célula B (Genmab, Dinamarca; ver, por ejemplo, Glennie y van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004/0167319) ; los anticuerpos monoclonales humanos representados en WO 2004/035607 y US2004/0167319 (Teeling et al.,); los anticuerpos que tienen cadenas de azúcar enlazadas a N-glicosida complejas unidas a la región Fe descrita en US 2004/0093621 (Shitara et al.,); anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno que se une CD20 (WO 2005/000901, Tedder et al.,) tal como HB20-3, HB20-4, HB20-25, y MB20-11; moléculas de unión a CD20 tales como las series AME de los anticuerpos, por ejemplo, los anticuerpos AME 33 como se establecen en WO 2004/103404 y US2005/0025764 (Watkins et al, Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); moléculas de unión CD20 tales como las descritas en US 2005/0025764 (Watkins et al.,); anticuerpos A20 o sus variantes tales como el anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) o IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics ) ; anticuerpos de unión a CD20 que incluyen Leu-16, 1H , o 2B8 reducidos con epítopo opcionalmente conjugados con IL-2, como en US 2005/0069545A1 y WO 2005/16969 (Carr et al..); el anticuerpo bioespecífico que se une a CD22 y CD20, por ejemplo, hLL2xhA20 (WO2005/14618 , Chang et al.); anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al, In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed. , p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Ilaisma el al, Blood 92: 184 (1998)); conjugado de auristatina E anti-CD20 (Seattle Genetics) ; anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope) ; terapia con MAb anti-CD20 (EpiCyte) ; y el anticuerpo anti-CD20 TRU 015 (Trubion) .

El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de existencia natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) , que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra una sola determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se construye como requiriendo la producción del anticuerpo a través de cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden hacerse a través de un método de hibridoma primero descrito por Kohler et al, Nature 256:495 (1975), o pueden hacerse a través métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No . 1 4,816,567) . En una modalidad más, los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse de las colecciones de fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al, Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks el al, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de murino y humanos, respectivamente, utilizando colecciones fago. Posteriormente las publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) a través de reorganización de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección de combinación y recombinación in vivo con una estrategia para construir muy grandes colecciones de fago (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). De esta forma, estas técnicas son alternativas viables para técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de los anticuerpos monoclonales . Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación de homocigotos del anticuerpo de región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de la línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción del < ¡ anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones : mutantes de la línea germinal dará como resultado una producción de anticuerpos humanos sobre un refuerzo de antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al. Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al, Nature 355:258 (1992).

Los anticuerpos monoclonales en la presente específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la cadena (s) es idéntica a, u homologas a las secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, mientras exhiban la actividad biológica deseada (Patente de E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81:6851-6855 (1984)).

El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (142) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; abat et al, Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD . (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos 26-32 Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (1), 53-55 /H2) y 96-101 (H3) en el domino variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Residuos de "estructura" o "FR" son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se define en la presente.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglob linas humanas (anticuerpo receptor) en donde los residuos de una región hipervariable del receptor están reemplazados por los residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) , tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región de estructura Fv (FR) de la inmunoglobulina humana están reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo o receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para además refinar el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y típicamente dos, de los dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a ser utilizados en la elaboración de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado "mejor adaptación", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se clasifica contra la colección completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que está más cercana a la del roedor después se acepta como la estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al, J. Immunol , 151: 2296 > (1993): Chothia et al, J. Mol. Biol . , 196:901 (1987)).

Otro método utiliza una estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Se puede utilizar la misma estructura para varios diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta el al, J. Immnol, 151 : 2623 (1993) ) .

Además, es importante que los anticuerpos se humanicen con la retención de una alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan a través de un procedimiento de análisis de las secuencias progenitoras y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de la secuencia progenitora y humanizada. Los modelos de inmunoglobulina tridimensional están comúnmente disponibles y son familiares para el experto en la técnica. Los programas de computadora están disponibles, los cuales ilustran y despliegan probables estructuras de conformación tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estas representaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de los residuos que influencian la habilidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a su antígeno. En esta forma, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias del receptor y de importación de tal forma que la característica del anticuerpo deseado, tal como una afinidad aumentada para el antígeno (s) objetivo, se logra. En general, los residuos CDR están directamente y más sustancialmente involucrados en la influencia de la unión del antígeno.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la unión del antígeno o su región variable. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab' , F(ab' )2; y los fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena individual; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivan a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysycal Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al, Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente a través células hospederas recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las colecciones de fago del anticuerpo explicadas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden directamente recuperarse de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). En otra modalidad, el F(ab' )2 se forma utilizando el GCN4 de cierre de leucina para promover el ensamble de la molécula F(ab' )2- De acuerdo con otro método, los fragmentos F(ab' )2 pueden aislarse directamente del cultivo celular hospedero recombinante . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el experto en la técnica o médico experto.

En otras modalidades, el anticuerpo a elegir es un fragmento Fv de cadena individual (scFv) . Ver WO 93/16185. Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena individual" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL, que permiten que el sFv forme la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds . Springer-Verlag, New York, pp . 269-315 (1994) .

El término "diacuerpo" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH - VL) . Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir el acoplamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a acoplarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:6444-6448 (1993).

La expresión "anticuerpos lineales" cuando se utiliza en esta solicitud se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Polypeptide Eng. 8 (10): 1057/62 (1995) . Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd tándem (VH-Ch1-VH-Ch1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser lineales, puede ser biespecxficos o monoespecífieos .

Los "anticuerpos multiespecíficos" tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes, en donde los epítopos usualmente forman diferentes antígenos. Ya que tales moléculas normalmente solamente se unirán a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecífieos , BsAbs), los anticuerpos con especificidades adicionales, tales como los anticuerpos triespecíficos están abarcados por esta expresión cuando se utiliza en la presente. Los ejemplos de BsAbs incluyen los que tienen un' brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y otro brazo dirigido contra una molécula de activación citotóxica tal como anti-FcYRl/anti-CD15 , anti-pl85HHR2/FcYRIII (CD16) , anti-CD3/ anti-célula B maligna (ID10, anti-CD3/anti-pl85HER2, anti-CD3/anti-p97 , anti-CD3/anti-carcinoma de célula renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3 , anti-CD3/L-Dl (anti-carcinoma de colon) , anti-CD3/anti-análogo de la horma estimuladora de melanocito; anti-receptor EGF/anti-CD3 , anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CD19 , anti -CD3/MoV18 , anti-molécula de adhesión celular neural (NCAM) /anti-CD3 , anti -proteína de unión de folato (FBP) /anti-CD3 , anti-antígeno asociado con carcinoma pan (AMOC-31) /anti-CD3 ; BsAbs con un brazo que se une específicamente a un antígeno de tumor y un brazo que se une a una toxina tal como una anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadena de ricina A, anti - interferón-OÍ (IFN-a) /anti-idiotipo de hibridoma; anti-CHA/anti-alcaloide vinca; BsAbs para convertir profármacos activados por enzima tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión del profármaco de fosfato de mitomicina a alcohol de mitomicina) ; BsAbs que puede utilizarse como agentes fibrinolíticos tales como anti-fibrina/anti-activador de plasminógeno tisular (tPA) , anti -fibrina/anti -activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA) ; BsAbs para activar complejos inmunitarios a receptores de superficie celular tales como anti - lipoproteína de baja densidad (LDL) /antireceptor Fe (por ejemplo, FCYRI , o FCYRIII) ; BsAbs para utilizarse en terapias de enfermedades infecciosas tales como anti -CD3/anti-virus de herpes simple (HSV) , anti-receptor de célula T: complejoCD3/anti-influenza, anti-FcYR/anti-HIV; BsAbs para detección de tumor in viLro o in vivo tal como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti -pl85HER2/anti -hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacuna; y BsAbs como herramientas de diagnóstico tales como anti-IgG/de conejo/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rábano picante (HRP) /anti-hormona, anti -somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti - ß-galactosidasa . Los ejemplos de anticuerpos triespecífieos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37 , anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos biespecífieos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos F(ab' )2) .

Los anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, los anticuerpos triespecífieos pueden prepararse. Tutt el al, J. Immunol . 147: 60 (1991) .

Un "anticuerpo desnudo" para los propósitos de la presente es un anticuerpo que no está conjugado con una fracción citotóxica o radiomarcada .

Un "anticuerpo intacto" en la presente es uno que comprende dos regiones de unión a antígeno, y una región Fe. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una región Fe funcional .

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas. Los que están en la necesidad de tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno, así como aquellos en los cuales el trastorno se va a prevenir.

Un "trastorno" es una afección que podría beneficiarse del tratamiento con el anticuerpo purificado como se describe en la presente. Este incluye tanto trastornos y enfermedades crónicas, y agudas como afecciones patologías que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.

La frase "cromatografía de intercambio de ión" se refiere a una técnica de separación en los donde los compuestos se separan con base en su carga neta. Las moléculas se clasifican ya sea como aniones (que tiene una carga negativa) o cationes (que tiene una carga positiva) . Algunas moléculas (por ejemplo, polipéptidos) pueden tener ambos grupos aniónico y catiónico.

Una membrana cromatografía de intercambio de ión se unirá a un compuesto con una carga positiva o negativa general. Los sitios de unión se localizan a lo largo de los poros del absorbente. El compuesto se transporta al sitio de unión a través de convección. Una membrana positivamente cargada (intercambiador de anión) se unirá a un compuesto con una carga negativa general. Inversamente, una membrana negativamente cargada (intercambiador de catión) se unirá a un compuesto con una carga positiva general.

Las membranas de intercambio de ión además pueden categorizarse ya sea como fuertes o débiles. Las membranas de intercambio de ión fuertes se cargan (ionizan) a través de un amplio intervalo de niveles de pH. Las membranas de intercambio de ión débiles se ionizan dentro de un estrecho intervalo de pH. Las cuatro químicas de intercambio de ión más comunes son: En general, las membranas de intercambio de ión tienen tamaños de poro de 0.1 a 100 µp?. Como una referencia, Sartobind Q (Sartorius AG) es una membrana de intercambio de anión fuerte que tiene un tamaño de poro nominal de 3-5 µ?? y está comercialmente disponible en un formato de capa individual o múltiple, y Mustang Q (Pall Corporation) es una membrana de intercambio de anión fuerte que tiene un tamaño de poro nominal de 0.8 µp\ y está igualmente comercialmente disponible en un formato de capa individual o múltiple. Como otra referencia, Sartobind S (Sartorius AG) es una membrana de intercambio de catión fuerte que tiene un tamaño de poro nominal de 3-5 µ?? y está comercialmente disponible en un formato de capa individual o de múltiple, y Mustang S (Pall 4 Corporation) es una membrana de intercambio de catión fuerte que tiene un tamaño de poro nominal de 0.8 µ?? similarmente está comercialmente disponible en un formato de capa individual o múltiple.

Una clasificación de tamaño de poro "nominal" describe la habilidad de la membrana para retener la mayor parte de las partículas a 60 a 98% el tamaño de poro clasificado .

El "pH" de una solución mide la acidez o alcalinidad con relación a la ionización de la muestra acuosa. El pH del agua es neutral, es decir, 7. La mayor parte de las lecturas de pH están en el intervalo de 0 a 14. Las soluciones con un [H+] mayor que el agua (pH menor de 7) son ácidas; las soluciones con un [H+] menor que el agua (pH mayor que 7) son básicas o alcalinas. El pH se puede medir utilizando un medidor de pH. El regulador de pH puede¦ ajustarse utilizando un ácido o base, como HCl o NaOH.

El "pl" o "punto isoeléctrico" de una molécula tal como un polipéptido se refiere al pH al cual el polipéptido contiene un número igual de cargas positivas y negativas. El pl puede calcularse de la carga neta de los residuos de aminoácidos del polipéptido o puede determinarse a través de enfoque isoeléctrico. La naturaleza anfotérica de los polipéptidos para tener tanto grupos aniónicos como catiónicos puede manipularse. El pH de un polipéptido puede disminuirse al punto donde el polipéptido deseado se comporta como un catión (que tiene una carga positiva) . Alternativamente, el pH de un polipéptido puede aumentarse al punto en donde el polipéptido deseado se comporta como un anión (que tiene una carga negativa) .

El término "conductividad" se refiere a la habilidad de una solución para conducir una corriente eléctrica entre dos electrodos. La unidad básica de conductividad es el Siemens (S) , anteriormente denominado mho. La conductividad es comúnmente expresada en unidades de mS/cm. Ya que la carga en los iones en su función facilita la conductancia de la corriente eléctrica, la conductividad de una solución es proporcional a su concentración iónica. Ambas mediciones se correlacionan bien con la resistencia iónica. La resistencia iónica está cercanamente relacionada con la concentración de electrolitos e indica qué tan efectivamente¡ la carga de un ión particular se protege o estabiliza a través de otros iones en un electrolito. La principal diferencia entre la resistencia iónica y la concentración de electrolitos es que la anterior es mayor si alguno de los' iones está más altamente cargado. Otra diferencia entre los dos es que la resistencia iónica refleja la concentración de iones libres, y no solamente cuánta sal se adiciona a la solución. La conductividad puede medirse utilizando un medidor de conductividad, tales como los varios modelos de medidores de conductividad Orion. La conductividad de una solución puede alterarse cambiando la concentración de los iones en la misma. Por ejemplo, la concentración de un agente regulador de pH y/o la concentración de una sal (por ejemplo, el cloruro de sodio, acetato de sodio, o cloruro de potasio) en la solución puede alterase con el fin de lograr la conductividad deseada. Preferiblemente, la concentración de sal de los varios reguladores de pH se modifica para lograr la conductividad deseada.

Para cromatografía de membrana, la "velocidad de flujo" usualmente se describe como volúmenes de membrana por hora (MV/h) .

Para cromatografía de membrana, la "densidad de la carga" por lo general se expresa en gramos de composición procesados por litro de membrana.

Un "regulados de pH" es una solución que resiste cambios en el pH a través de la acción de sus componentes conjugados de ácido-base. Se pueden utilizar varios reguladores de pH dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del regulador de pH como se describe en Buffers, A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).

Por "purificar" un anticuerpo de una composición comprende el anticuerpo y uno o más contaminantes que pretenden aumentar el grado de pureza del anticuerpo en la composición mediante la eliminación (completa o parcialmente) de por lo menos un contaminante de la composición. Un "paso de purificación" puede ser parte de un procedimiento de purificación general que da como resultado una composición "homogénea" . "Homogéneo" se utiliza en la presente para referirse a una composición que comprende por menos un 70% en peso del anticuerpo de interés, con base en el peso total de la composición, preferiblemente al menos aproximadamente 80% en peso, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% en peso, aún más preferiblemente al menos un 95% en peso.

Por "unión" de una molécula a una membrana de intercambio de ión significa exponer la molécula a la membrana de intercambio de ión bajo condiciones apropiadas (pH y/o conductividad) de tal forma que la molécula se inmoviliza reversiblemente en o sobre la membrana de intercambio de ión en virtud de interacciones electrostáticas entre la molécula y un grupo cargado o grupos cargados de la membrana de intercambio de ión.

Por "lavado" de la membrana de intercambio de ión significa pasar un regulador de pH apropiado a través o sobre la membrana de intercambio de ión.

Por "elución" de una molécula (por ejemplo, anticuerpo o contaminante) de una membrana de intercambio de ión significa eliminar la molécula de la misma.

Por cromatografía de membrana de "flujo directo" se refiere a la unión de las impurezas a la membrana, mientras el compuesto no se retiene.

La frase "modo mixto" se refiere a un absorbente que tiene la habilidad de separar compuestos con base en dos diferentes mecanismos, por ejemplo, una separación con base en las diferencias de hidrofilicidad/hidrofobicidad entre polipéptidos recubiertos en una separación con base en la carga neta. Esto por lo general se logra mediante el uso de un ligando multimodal que puede interactuar con una molécula objetivo en varias diferentes formas que incluyen la interacción iónica y la unión de hidrógeno o interacción hidrófoba. Los absorbentes como GE Healthcare Capto™ MMC y Capto™ Adhere son ejemplos de resinas cromatográficas de "modo mixto" .

Modos de Llevar a Cabo la Invención La invención en la presente proporciona métodos para la purificación de un polipéptido de una composición (por ejemplo, una solución acuosa) , que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes. La composición generalmente es una que resulta de la producción recombinante del polipéptido, pero puede ser que resulte de la producción del polipéptido a través de síntesis peptídica (u otros medios sintéticos) o el polipéptido puede purificarse de una fuente nativa del polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido es un polipéptido que contiene la región CH2/CH3.

En modalidades preferidas, el polipéptido que contiene la región CH2/CH3 es un anticuerpo.

Producción reco binante de anticuerpos Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico de codificación se aisla y se inserta en un vector replicable para además clonarse (amplificación de ADN) , o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, a través del uso de sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo) . Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia dej ; terminación de transcripción (por ejemplo, como se describe < en la Patente de E.U.A. No. 5,534.615, específicamente ' incorporada en la presente por referencia) .

Las células hospederas adecuadas para la clonación ; o expresión del ADN en los vectores en la presente son células procariotas, de levadura o eucarióticas superiores. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacteria, tal como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia , por ejemplo, E. coli, Enter obacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacílli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces . Un hospedero de clonación preferido E. coli es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), E. coli W3110 (ATCC 27,325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Además de los procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos o levaduras filamentosas son hospederos para clonación o expresión adecuados para vectores de codificación del anticuerpo. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de repostería común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos hospederos eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en la presente, tales como Schizosaccharomyces pombe; los hospederos de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24, 178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (A fCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa, Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo los hospederos Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospederas adecuadas para la expresión del anticuerpo glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células de las plantas e insectos . Numerosas cepas y variantes baculovirales y las células hospederas permisibles correspondientes de hospederos tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de fruta) , y Bombyx mori han sido identificados. Una variedad de cepas virales para la transfección están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante de la L-1 de Autographa' californica NPV y la cepa BM-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden utilizarse como el virus en la presente de. acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células Spodoptera frugiperda . Los cultivos celulares de planta de algodón, maíz, papa, frijol de soya, petunia, tomate y tabaco también pueden utilizarse como hospederos .

Sin embargo, hay un enorme interés en células de vertebrado, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) que se ha convertido en un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares hospederas de mamífero útiles incluyen, pero no se limitan a, células CV1 de riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; células de riñon embrionarias humanas (células 293 ó 293 subclonadas para el cultivo en el cultivo en suspensión, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)); células Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)), células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; célula de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442 ), células de pulmón humano (Wl 38, ATCC CCL, 75) , células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor de mama de ratón (MMT 060562 ATCC CCL51) ; Células TRI (Mather et al, Anales N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ; y las células de hepatoma humano (Hep G2) . Por lo general, las células CHO son preferidas para la expresión de anticuerpos, y puede ventajosamente utilizarse para producir los anticuerpos purificados de acuerdo con la presente invención.

Las células hospederas se transforman con los vectores de expresión o clonación antes mencionados para la producción del anticuerpo y se cultivan en un medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, selección de transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células hospederas utilizadas para producir el anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como FIO de Ham (Sigma) , Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio Eagle modificado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de estos medios descritos en Ham et al., Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al, Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de E.U.A. Re. 30,985 pueden, utilizarse como un medio de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios pueden complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transíerrina , o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , reguladores de pH (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (por ejemplo, Garamicina; GENTAMICIN®) , elementos de rastreo (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede incluirse a concentraciones apropiadas que serían conocidas por el experto en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son las previamente utilizadas con la célula hospedera seleccionada para la expresión, y serán evidente para el experto en la técnica .

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente , en el espacio periplásmico, o directamente secretarse en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso, los residuos de las partículas, ya sea células hospederas o células lisadas (por ejemplo, que resultan de la homogeneización) , se eliminan, por ejemplo, a través de. centrifugación o ultrafiltración . Cuando el anticuerpo se: secreta en el medio, los sobrenadantes de los sistemas de expresión pueden concentrarse utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon .

Método cromatográfico de Intercambio de Ion de Membrana de la Invención En la modalidad preferida de la invención, composición a ser sometida al método de purificación en la presente es un anticuerpo recombinante producido, preferiblemente un anticuerpo intacto, expresado a través de un cultivo celular hospedero recombinante de Ovario de Hámster Chino (CHO) . Opcionalmente , la composición ha sido sometida por lo menos a paso de purificación antes de la cromatografía de intercambio de ión de membrana. La composición contiene el anticuerpo de interés y uno o más contaminantes, tales como Proteínas del Ovario de Hámster Chino (CHOP) ; proteína A deslavada, ácido nucleico; una variante, fragmento agregado o derivado del anticuerpo deseado; otro polipéptido; endotoxina; contaminante viral; componente del medio de cultivo celular (por ejemplo, garamicina; GENTAMYCIN®) , etc.

Los ejemplos de procesos de purificación adicionales que pueden llevarse a cabo antes de, durante o después del método de cromatografía de intercambio de ión de membrana incluyen fraccionamiento de una cromatografía de interacción hidrófoba (por ejemplo, en PHENYL-SEPHAROSE™) , precipitación del etanol, precipitación térmica, precipitación de polietilenglicol (PEG) , enfoque isoeléctrico, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía en HEPARIN SEPHAROSE™, cromatografía de intercambio de anión, cromatografía de intercambio de catión, intercambio de ión en modo mixto, cromato-enfoque , SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de inducción de carga hidrófoba, filtración de flujo tangencial de alto rendimiento (HPTFF) , y cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando proteína A, proteína G, un anticuerpo, o un sustrato, ligando o antígeno específico como el reactivo de la captura) .

Cuando se utilizan técnicas recombinantes , el anticuerpo puede producirse intracelularmente , en el espacio periplásmico, o directamente secretarse en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso, el residuo de partículas, ya sea células hospedera o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, a través de centrifugación o filtración. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, las células hospedera recombinantes puede separarse del medio de cultivo celular a través de centrifugación o filtración, por ejemplo.

La mayor parte de la purificación ocurre durante la cromatografía de afinidad de la proteína A. La proteína A es una proteína de pared celular bacteriana que se une específicamente a la región Fe de los anticuerpos. Cuando se inmoviliza sobre el medio cromatográfico, la proteína A proporciona una técnica para purificar anticuerpos recombinantes, debido a que puede selectivamente unirse a los anticuerpos en soluciones completas, permitiendo que las impurezas fluyan directamente.

El protocolo básico de la columna de afinidad de la proteína A es directo: unión a aproximadamente un pH neutral y eluir a un pH ácido. La proteína A inmovilizada en la fase sólida se utiliza para purificar el polipéptido que contiene la región CH2/CH3. La fase sólida es preferiblemente una columna, que comprende una superficie de vidrio, sílice o agarosa de superficie para la inmovilización de la proteína A. Preferiblemente, la fase sólida es una columna de vidrio de poro controlado, una columna de ácido silícico, o una columna de agarosa entrelazada. Una columna MabSelect SuRe™, comercialmente disponible de GE Healthcare, es un ejemplo de una columna de proteína A de agarosa altamente entrelazada efectiva para purificar anticuerpos. Algunas veces, la columna ha sido recubierta con un reactivo, tal como glicerol, en un intento de prevenir la adherencia no específica a la columna. La columna PROSEP A™ comercialmente disponible de Millipore Corporation, es un ejemplo de una columna de vidrio de poro controlado de la proteína A que se recubre con glicerol. La fase sólida para la cromatografía de la proteína A se equilibra con un regulador de pH adecuado.

La preparación contaminada derivada de las células hospederas recombinantes se carga en la fase sólida equilibrada utilizando un regulador de pH de carga que puede ser el mismo que el regulador de pH de equilibrio. Como la preparación contaminada fluye a través de la fase sólida, el polipéptido se adsorbe en la proteína A inmovilizada, y los otros contaminantes (tales como las Proteínas de Ovario de Hámster Chino, CHOP, en donde el polipéptido se produce en una célula CHO) se unen no específicamente a la fase sólida.

El siguiente paso llevado a cabo secuencialmente implica eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida mediante el lavado de la fase sólida con una solución que contiene una sal, aminoácido, y/o solvente de electrolito hidrófobo en un paso de lavado intermedio. En modalidades preferidas, la sal en este lavado es fosfato de potasio, el aminoácido es arginina, y el electrolito hidrófobo es TEMAC y/o TEAC: Ya que puede estar presente un solo soluto en el lavado, en ciertas modalidades, se pueden utilizar dos o más de tales solutos. El soluto (s) preferiblemente se agrega a la solución regulada en su pH teniendo un pH aproximadamente neutral .

Después del paso de lavado intermedio del párrafo anterior, el polipéptido de interés se recupera de la columna. Esto se logra normalmente utilizando un regulador de pH de elución adecuado. El polipéptido puede, por ejemplo, eluirse de la columna utilizando un regulador de pH de elución que tiene un bajo pH, por ejemplo, en el intervalo de 2 a aproximadamente 5, y preferiblemente en el intervalo de 2.5 a aproximadamente 3.5. Los ejemplos de reguladores de pH de elución para este propósito incluyen reguladores de pH de citrato o acetato.

La cromatografía de intercambio ión de membrana se lleva a cabo como se reivindica en la presente. Primero se toma una decisión de si la membrana de intercambio de anión o catión se va a utilizar. Aunque el punto isoeléctrico (pl) de algunos anticuerpos está en el intervalo de aproximadamente 6.7 a 9.4, el pl de muchos anticuerpos es alto (por ejemplo, mayor de 8 y algunas veces mayor de 9) . En general, se puede utilizar una membrana de intercambio de catión para los anticuerpos con pl mayores de aproximadamente 8, y una membrana de intercambio de anión puede utilizarse para anticuerpos con pl menores de aproximadamente 8.

Para la cromatografía de intercambio de catión de membrana que se corre en el modo de desplazamiento de proteína indígena, el pH del material de carga se ajusta de¡ aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por debajo del pl del anticuerpo, la conductividad del material de carga se ajusta a < aproximadamente 40 mS/cm, dependiendo del pH, y el anticuerpo después se bombea a través de la membrana. En algunas modalidades, el pH del material de la carga se ajusta de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 unidades de pH, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades de pH, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 unidades de pH, o aproximadamente una unidad de pH por debajo del pl del anticuerpo. En otras modalidades, la conductividad del material de carga se ajusta a de aproximadamente 20 mS/cm o < aproximadamente 10 mS/cm, dependiendo del pH. Debido a que el pH de la carga es menor que el pl del anticuerpo, el anticuerpo (que se convierte en positivamente cargado) NO fluirá inicialmente . Más bien, el anticuerpo se unirá electrostáticamente a los grupos funcionales negativos del intercambiador de catión. Esto se debe a que el anticuerpo (positivo) y la membrana (negativa) tienen cargas opuestas. Ya que el pl de muchos contaminantes, por ejemplo, las proteínas de la célula hospedera, tales como CHOP, que se eluyen con el anticuerpo durante la cromatografía de afinidad de la proteína A son solo ligeramente diferente del pl del anticuerpo, es decir, los pl puede diferir en solamente aproximadamente de 0.5 a aproximadamente 0.2 unidades de pl , estos contaminantes, al igual que los anticuerpos "básicos",, también se unirán a la membrana. Sin desear estar unido a ninguna teoría, parece que la cromatografía de intercambio catión de membrana corre en el modo de desplazamiento de proteína indígena, a un pH y condiciones de conductividad que inducen la carga con una mínima protección iónica, los contaminantes se unen preferentemente a la membrana, o por el contrario efectivamente "desplazan" el anticuerpo de la membrana (RR Drager, FE Regnier Chromatogr. 359:147-55 (1986)), permitiendo que el anticuerpo se "eluya" de la matriz o fluya directamente después de la unión y se recupere en el efluente.

Para la cromatografía de intercambio de anión de membrana que se corre en el modo de desplazamiento de proteína indígena, el pH del material de la carga se ajusta de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por arriba del pl del anticuerpo, la conductividad del material de carga se ajusta a < aproximadamente 40 mS/cm, dependiendo del pH, y el anticuerpo después se bombea a través de la membrana. En algunas modalidades, el pH del material de la carga se ajusta de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 unidades de pH, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades de pH, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 unidades de pH, o aproximadamente una unidad de pH, por arriba del pl del anticuerpo. En otras modalidades, la conductividad del material de carga se ajusta a de aproximadamente 20 mS/cm o < aproximadamente 10 mS/cm, dependiendo del pH. Debido a que el pH de la carga es mayor que el pl del anticuerpo, el anticuerpo (que se convierte en negativamente cargado) NO fluirá directamente inicialmente . Más bien, el anticuerpo se unirá electrostáticamente a los grupos funcionales positivos del intercambiador de anión. Esto se debe a que el anticuerpo (negativo) y la membrana (positiva) tienen cargas opuestas. Ya que el pl de muchos contaminantes, por ejemplo, las proteínas de la célula hospedera, tales como CHOP, que se eluyen con el anticuerpo durante la cromatografía de afinidad de la proteína A es solo ligeramente diferente del pl del anticuerpo, es decir, los pl puede diferir en solamente aproximadamente de 0.5 a aproximadamente 0.2 unidades de pl, estos contaminantes, al igual que los anticuerpos "ácidos", también se unirán a la membrana. Sin desear estar unido a ninguna teoría, parece que la cromatografía de intercambio anión de membrana que corre en el modo de desplazamiento de proteína indígena, a un pH y condiciones de conductividad que inducen una carga con una mínima protección iónica, los contaminantes se unen preferentemente a ' la membrana, o por el contrario efectivamente "desplazan" el anticuerpo de la membrana (RR Drager, FE Regnier Chromatogr. 359:147-55 (1986)), permitiendo que el anticuerpo se "eluya" de la matriz o fluya directamente después de la unión y se recupere en el efluente.

En un ejemplo, la cromatografía de membrana se corre en ya sea un sistema de cromatografía estándar o un sistema de cromatografía normal como el AKTA™ Explorer (GE Healthcare) equipado con calibradores de presión, sensores y bomba más controladores de bomba. En este ejemplo, el dispositivo de membrana se instala en corriente abajo del calibrador de presión. En el ejemplo, el pH y los detectores de la conductividad se instalan en corriente abajo del dispositivo de membrana. Continuando con este ejemplo, el sistema se enjuaga vigorosamente con agua y después con regulador de pH de equilibrio antes de la instalación de la membrana. Continuando además con este ejemplo, el sistema con la membrana se enjuaga con regulador de pH de equilibrio hasta que el pH de la solución y la salida de la conductividad coincide con la especificación reguladora de pH de equilibrio (aproximadamente cinco volúmenes de membrana) y se observa una línea base estable. Continuando aún con este ejemplo, el material de alimentación se carga a través de una bomba a 333 - 2667 MV/hpra, pH 5.5 (para la purificación de un anticuerpo "básico" hipotético) o pH 8.0 (para la purificación de un anticuerpos "ácido" hipotético) , y una conductividad de aproximadamente 4 mS/cm. Continuando aún con este ejemplo, la retro-presión operativa, y los cambios de pH y conductividad durante la operación se registran. Finalmente, en este ejemplo, el polipéptido en el efluente de la membrana se recolecta inmediatamente cuando el rastro de la absorbencia ultravioleta (UV) 280 nm es de 0.2 unidades de absorbencia sobre la línea de base, la colección del agrupamiento se detiene una vez que el rastro UV a 280 nm está por debajo 0.2 unidades de absorbencia, y las muestras del grupo en la fracción del efluentes de membrana se ensayan para concentración de polipéptido, nivel de dímero/agregación, las proteínas de célula hospedera, ADN, y proteína A deslavada. El paso de recuperación típicamente se calcula utilizando el polipéptido cargado y el polipéptido en el efluente de la membrana. La membrana es tradicionalmente de un solo uso.

Con respecto a los ensayos analíticos, el contenido de polipéptido (concentración de anticuerpos) puede determinarse a través de la absorbencia 280 nm utilizando un espectrofotómetro Beckman. La agregación del anticuerpo puede determinarse a través de cromatografía de exclusión de tamaño. La proteína de la célula hospedera, por ejemplo, CHOP, los niveles pueden analizarse a través de un ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) . El ADN de la célula hospedera puede cuantificarse utilizando PCR TaqMAN (reacción de cadena de polimerasa) . La proteína A deslavada puede llevarse a cabo utilizando el método con base en el ELISA inmunoquímico recomendado por el vendedor de la resina de la proteína A.

Los siguientes reguladores de pH se designaron hipotéticamente y se ensayaron para utilizarse con la membrana S: (1) 89 mM de ácido acético, 127 mM de base Tris, 21 mM de ácido cítrico, pH 5.5, 6.0 mS/cm, (2) 28 mM de MKS, 95 mM de NaCl , pH 6.0 , 11 mS/cm, (3) 200 mM de NaOAc, pH 5.5, 12 mS/CRA, (4) 100 mM de NaOAc, pH 5.5, 6.4 mS/cm, y (5) 96 mM de ácido acético, 65 mM de TRIS, pH 5.0, 3.6 mS/cm.

Los siguientes reguladores de pH se designaron hipotéticamente y se ensayaron para utilizarse con la membrana Q: (1) 50 mM de TRIS, 15 mM de NaCl, pH 8.0, 4.3 mS/cm, (2) 25 mM de Tris, pH 8.0, 1.3 mS/cm ( 3) 60 mM de Tris, 1 18 mM de NaCl, pH 8.0, 15.7 mS/cm, (4) 50 mM de Tris, 50 mM de NaOAc , pH 8.0 , 7.0 mS/cm, (5) 25 mM de HEPES, 85 mM de NaOAc, pH 7.0, 6.5 mS/cm, y (6) 91 mM de ácido acético, 130 mM de Tris, pH 8.0 , 5.0 mS/cm.

Adicionalmente , cualquier sistema regulador de pH puede ajustarse en cuanto al pH hacia arriba o hacia abajo con la adición de ácido acético, ácido cítrico, HEPES, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, hidróxido de sodio, TRIS, y otros reguladores de pH ácidos y básicos para llegar a un pH adecuado. Cualquier sistema regulador de pH también puede ajustarse en cuanto a conductividad hacia arriba o hacia abajo utilizando agua purificada, agua para inyección (WFI) , acetato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de potasio, u otros reguladores que contienen baja o alta sal para llegar a una conductividad adecuada.

El desarrollo del paso de cromatografía de membrana de desplazamiento de proteína indígena es directo. El material de carga se corre a través de la membrana a varios intervalos de pH y conductividad. La retención del polipéptido, ya sea anticuerpo o contaminante, puede mejorarse cuando la molécula tiene una gran interacción electrostática. Las interacciones electrostáticas puede mejorarse cuando se operan bajo condiciones en donde los polipéptidos están altamente cargados, es decir, cuando se utiliza un regulador de pH que tiene un pH lo suficientemente diferente del pl del polipéptido, lo que mejora la carga del polipéptido, y una baja resistencia iónica para evitar la protección de las cargas a través de los iones regulados. En contraste las interacciones electrostáticas puede reducirse cuando se operan bajo condiciones en donde el polipéptido está pobremente cargado, es decir, cuando se utiliza un regulador de pH que tiene un pH lo suficientemente cerca el pl del polipéptido, reduciendo la carga del polipéptido, y una alta resistencia iónica para permitir la protección de las cargas a través de los iones reguladores. Como un resultado, los polipéptidos que tienen diferentes propiedades físico-químicas pueden separarse a través de adsorción de membrana mediante solución reguladora de pH de optimización. Algunas moléculas pueden retenerse en una membrana dada mientras otras fluyen directamente con base en la selección apropiada del pH y la resistencia iónica del regulador de pH.

La preparación del anticuerpo obtenida de acuerdo con el método de cromatografía de intercambio de ión de membrana de la presente puede someterse a pasos de purificación adicionales, si es necesario. Los pasos de purificación adicionales ilustrativos han sido explicados anteriormente.

Haciendo referencia a la Figura 12, un ejemplo de un esquema de purificación exitoso es un procedimiento de recuperación que abarca un paso de fraccionamiento inicial cromatografía de afinidad de proteína A, un paso de purificación intermedio de cromatografía de intercambio de catión que corre en el modo de unión/elución, y un paso de pulido final de cromatografía de intercambio de anión que corre en un modo de flujo directo.

Haciendo referencia a la Figura 13, un ejemplo de un esquema de purificación mejorado es un procedimiento de recuperación que abarca el paso de fraccionamiento inicial de la cromatografía de afinidad de proteína A, pero reemplazando la cromatografía de columna de intercambio de catión que corre en un modo de unión/elusión con una membrana de intercambio de catión que corre en un modo de desplazamiento de proteína indígena. Esto sería ventajoso por muchas razones, una razón es que los pasos intermedios y de pulido podrían combinarse en una operación continua, es decir, un solo paso.

Opcionalmente, el anticuerpo se conjuga a una o más moléculas heterólogas según se desee. La molécula heteróloga puede, por ejemplo, se una que aumente la vida media en suero del anticuerpo (por ejemplo, polietileno glicol, PEG) , o puede ser una etiqueta (por ejemplo, una enzima, una etiqueta fluorescente y/o radionúclidos) , o una molécula citotóxica (por ejemplo, una toxina, un fármaco quimioterapéutico, o un isótopo radiactivo, etc.) .

Una formulación terapéutica que comprende el anticuerpo, opcionalmente se conjuga con una molécula heteróloga, puede prepararse mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol , A. Ed. (1980) ) , en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizadores "Farmacéuticamente aceptables" son no tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen reguladores de pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tal como cloruro octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio ; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenes tales como metilo o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) , polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero o gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilo tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que inclúyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelatadores tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra- iones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) , y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ polietilenglicol (PEG) .

Los ingredientes activos también pueden insuflarse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, a través de técnicas de coacervación o a través de polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y poli- (metilmetacrilato) microcápsula, respectivamente, en sistemas de distribución de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .

La fórmula a ser utilizada para administración in vivo puede ser estéril. Esto se logra fácilmente a través de filtración a través de membranas de filtración estériles.

Las preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (vinil alcohol) ) , polilactidas (Patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y el acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutírico .

El anticuerpo purificado como se describe en la presente o la composición que comprende el anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable después se utiliza para varios usos de diagnósticos, terapéuticos u otros usos conocidos para tales anticuerpos y composiciones. Por ejemplo, el anticuerpo puede utilizarse para tratar un trastorno en un mamífero mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo a un mamífero.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración y no a manera de limitación. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan expresamente en la presente por referencia.

Ej emplos Introducción Las concentraciones del bio-reactor para anticuerpos monoclonales (mAb) se incrementan cuando se mejoran las condiciones del cultivo. Los lotes más grandes de mAb pueden ser difíciles de purificar utilizando cromatografía de columna tradicional. Las nuevas resinas con aumentadas capacidades de unión pueden no ser suficientes para evitar la necesidad de ciclar o correr múltiples columnas en paralelo. La inhabilidad de eficientemente manejar lotes más grandes podría impactar negativamente el costo de los bienes y la capacidad de la planta. Adicionalmente , la industria del bioprocesamiento necesita herramientas económicas, más convenientes con el fin de reducir el costo de los bienes. Las tecnologías de purificación desechables, pequeñas que pueden simultáneamente reducir los costos de validación y mano de obra son deseables. Como la industria evoluciona, las membranas de intercambio de ión pueden hacerse ventajosas para el procesamiento de mAb.

Aunque los métodos de cromatografía de columna son sólidos y confiables, generalmente tienen un bajo rendimiento de masa porque el funcionamiento de la separación depende de la difusión del poro. El producto y las impurezas deben difundirse lentamente en los poros para acceder los sitios de unión. En contraste, las membranas no están limitadas en cuando a difusión de poro. El funcionamiento de la separación depende de la velocidad de flujo y por consiguiente las membranas son capaces de rendimiento de masa mucho más alto comparado con las resinas. Las membranas también son más convenientes que las resinas porque no requieren cuerpos de columna, empaque/desempaque de columna, o calificación. Las membranas a escala industrial están disponibles en formatos en cartuchos o auto-encapsuladas que pueden disponerse después de sólo uso, además eliminando los costos de validación asociados con la reutilización y almacenamiento. Las membranas también son más pequeñas y significativamente más ligeras que las columnas con relleno de resina, lo que facilita su manejo dentro de una instalación de fabricación.

Las membranas también tienen algunos inconvenientes. Comparadas con las resinas son una tecnología relativamente nueva que aún no ha experimentado la amplia integración a escala industrial. Los tipos de membranas comercialmente disponibles y la selección bien caracterizada de ligandos están limitados. Las membranas también son significativamente más costosas que las resinas de intercambio de ión. Adicionalmente , no son un medio óptimo para llevar a cabo la unión y la cromatografía de elución a escala industrial. Las membranas tiene capacidades de unión relativamente bajas que son difíciles de compensar económicamente a través de delación-. Muchos de estos aspectos probablemente se resolverán cuando se desarrollen nuevas generaciones de membranas.

A pesar de los inconvenientes, las membranas han establecido un nicho en la purificación en corriente abajo. Las membranas de intercambio de ión han probado ser exitosas como un paso de seguimiento para la captura del mAb de la Proteína A. Las membranas son ideales en esta posición porque los niveles de impureza son bajos y, cuando se utilizan en el modo de flujo directo, la capacidad de unión ya no está limitada. La cromatografía de flujo directo se define como una operación cromatográfica en donde la proteína objetivo fluye a través del medio absorbente sin la unión mientras las impurezas apropiadamente cargadas se adsorben. Como extensión de la cromatografía de membrana, está una técnica que se capitaliza en una fuerza de repulsión establecida entre la membrana y el mAb de tal forma que la mayor parte de los sitios de unión permanecen disponibles para la adsorción de las especies CHOP opuestamente cargadas.

Este estudio se enfoca en la purificación de anticuerpos monoclonales utilizando membranas de intercambio de ión en el modo de desplazamiento de proteína indígena. El método difiere del flujo directo porque el mAb se procesa a través de la membrana a un pH y condiciones de conductividad que causan la adsorción del producto. Esto se logra operando a una baja resistencia iónica y a un pH por arriba del pl del mAb durante el intercambio de anión, y por debajo del pl del mAb durante el intercambio de catión. En estas condiciones, se estable una fuerza atrayente entre la membrana y el mAb que resulta en la adsorción del producto. La carga de la corriente de alimentación continúa más allá de la capacidad de penetración y el efluen-te -de la. membrana se recolecta en una forma purificada. Los datos experimentales para el modo de desplazamiento de proteína indígena muestran una alta purificación y rendimiento, que no son obvios dada la fuente interacción electrostática entre la membrana y el mAb .

Se seleccionaron cuatro mAb derivados de ADN recombinante para análisis con base en su intervalo de puntos isoeléctricos (pl 6.7 9.3, calculados con base en la secuencia de aminoácido) . Los cuatro mAb se produjeron en cultivos de células CHO en Genentech Inc. y se purificaron parcialmente con uno o más pasos de cromatografía de columna (Proteína A o Proteína A e intercambio de ión) . Las corrientes de alimentación se seleccionaron con base en los niveles residuales de Proteína de Ovario de Hámster Chino (CHOP) .

Este estudio explora la habilidad de las membranas de intercambio de ión Mustang™ S, Mustang Q, y Sartobind™ S para depurar CHOP a un pH y condiciones de conductividad que también causan la adsorción del mAb. La purificación y rendimiento de CHOP se investigaron como una función del pH, conductividad, densidad de carga, velocidad de flujo y tipo de membrana. El mejoramiento y regeneración de la membrana también se estudiaron, y se exploró la viabilidad del procesamiento continuo.

Materiales y Métodos Corriente de Alimentación Las corrientes de alimentación se tomaron de lotes de cultivo celular industrial, piloto o a pequeña escala (Genentech Inc., South San Francisco, California) inicialmente producidos para propósitos comerciales o de investigación. Cada corriente de alimentación se purificó parcialmente, lo que significa que las células se separaron y el fluido depurado se purificó sobre al menos un paso de cromatografía de columna (Proteína A o Proteína A e intercambio de ion) . Cada corriente de alimentación contuvo un anticuerpo monoclonal terapéutico objetivo (IgGl o IgG4) y un nivel cuantificable de impurezas de célula hospedera. La composición de cada corriente de alimentación varió dependiendo del proceso mAb individual y el nivel de purificación. En general, el pH de la corriente de alimentación fue de 5.5 8.0, la conductividad fue de 3.2 9.0 mS/cm, y la concentración del producto fue de 3.5 - 6.9 mg/ml . La Tabla 2 muestra las características de la corriente de alimentación para cada uno de los mAb utilizados en este estudio .

Cuantificación del mAb La concentración del mAb se determinó utilizando un escáner espectrofotométrico UV a 280 y 320 nm. Los niveles de CHOP fueron demasiado bajos para tener un efecto apreciable en la absorbencia UV. Las muestras conteniendo el mAb se diluyeron con diluyente no de interferencia apropiado en el intervalo de 0.1 a 1.0 AU. La preparación de la muestra y las lecturas de exploración de especulación se llevaron a cabo por duplicado y se registró el valor promedio. El coeficiente de adsorción para los mAb ensayados fue 1.45 - 1.70 (mg/ml)"1 cm"1. La absorbencia a 280 y 320 nm, el factor de dilución, longitud de la trayectoria (1 cm) , y el coeficiente de adsorción se utilizaron para calcular la concentración del mAb utilizando la ecuación conocida como la Ley de Beer-Lambert . ¦^280 ~~ A320 Concentración de Protéína (mg/ml) = x factor de dilución coef. abs.

Cuantificación de Proteínas de Célula Hospedera CHO (CHOP) Se utilizó un ensayo inmunoabsorbente enlazada a enzima (ELISA) para cuantificar los niveles de CHOP. Los anticuerpos anti-CHOP purificados por afinidad se inmovilizaron las cavidades de placas de microtitulación . Las diluciones de las muestras conteniendo CHOP, estándares, y controles, se incubaron en las cavidades, seguido por incubación con anticuerpos anti-CHOP de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante. La actividad enzimática de la peroxidasa de rábano picante se detectó con Diclorhidrato de o-fenilenodiamina . El CHOP se cuantificó mediante la lectura de la absorbencia a 492 nm en un lector de placas de microtitulación . Se utilizó un programa de adaptación de curva por computadora para genera la curva estándar y automáticamente calcular la concentración de la muestra. El intervalo del ensayo para ELISA fue de típicamente 5 ng/ml a 320 ng/ml. Para cada muestra, se ensayaron 2-4 diluciones y los valores se promediaron. Los valores CHOP se dividieron por la concentración del mAb y los resultados se reportaron en unidades de ppm (ng de CHOP/mg de mAb) . Las muestras de filtrado que exhibieron niveles CHOP por debajo del límite de cuantificación (LOQ) posteriormente se concentraron para obtener resultados cuantificables . Las muestras se concentraron 10 veces utilizando un filtro MWCO de 10 kD centrífugo Amicon® Ultra- 15 (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts) , y el centrífugo Eppendorf 5810R (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) a 5 - 25°C, y 3200 - 4000 rpm por 10 - 20 minutos.

Membranas Las membranas ensayadas fueron Mustang™ S y Q (Pall Corporation, East Hills, New York) y Sartobind™ S (Sartorius-Stedim Biotech S. A., Aubagne, Francia) . Mustang™ S y Sartobind™ S son membranas de intercambio de catión fuertes y Mustang ™ Q en una fuerte membrana de intercambio de catión. Mustang™ S y Sartobind™ S se modificaron con una forma de ácido sulfónico y Mustang™ Q se modificó con una forma de amina cuaternaria. Mustang™ S y Q se hicieron de poliétersulfona (PES) con poros de 0.8 µ??? y Sartobind™ S se hizo de celulosa regeneradas con poros de 3-5 µt?. Para aumentar la capacidad de unión cada fabricante combina múltiples capas de membrana en cada dispositivo. El número total de capas y espesores varía dependiendo del fabricante y el tamaño del dispositivo que se está fabricando. El volumen de la membrana (MV) es el volumen físico de la membrana (sólidos y espacios vacíos) y se mide en unidades de mi. SE utilizó una variedad de dispositivos de membrana que representan múltiples escalas en este estudio. La Tabla 2 enumera las especificaciones pertinentes para cada membrana ensayada.

Sistemas de Filtración Se llevaron a cabo las pruebas a pequeña escala de los Sistemas de Filtración con un AKTA Explorer™ 100 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut) , que es un sistema de purificación de proceso programable que incluye una bomba dosificadora, un sensor de presión y pH en línea, conductividad y un sensor UV. El sistema Explorer se programó y controló a través de una computadora con el software UNICORN™ v5.10 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut). Las pruebas a pequeña escala también se llevaron a cabo utilizando un sistema manual que consiste de una bomba peristáltica de conducción económica digital Masterflex® L/S® (Colé Parmer, Vernon Hills, Illinois) , el sensor de presión en línea DTX™ Plus TNF-R (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey) , y una balanza AND EK- 1200i (A&D Company, Ltd. , Tokio, Japón) . La balanza se utilizó para monitorear físicamente la velocidad de flujo de la bomba midiendo la acumulación de masa. La masa se convirtió en volumen asumiendo una densidad de corriente de flujo de 1.0 g/ml . La presión de los transductores en línea y la masa de la balanza se monitorearon continuamente utilizando un sistema de adquisición de datos en red NetDAQ™ 2640A/41A (Fluke, Everett, Washington) que estaba enlazado a una computadora operando el software versión 3.1.1 de Trendlink™ (Canary Labs Inc., Martinsburg, Pennsylvania) y RsCom versión 2.40 (A&D Company, Ltd. , Tokio, Japón) para la recolección de presión y masa, respectivamente. Los estudios mejorados se llevaron a cabo utilizando un AKTA Pilot™ (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut) operando el software UNICORN™ v5.10. El Pilot se equipo con una bomba más grande pero funcionalmente equivalente al Explorer.

Técnicas de Recolección de Muestra del Filtrado El filtrado se recolectó en tres diferentes formas. Las muestras y fracciones grab fueron las más comunes. Una muestra grab es una pequeña alícuota instantánea del filtrado tomado de una producción específica. Las fracciones son muestras de filtrado más grandes y se definen por los intervalos de producción. El filtrado también se recolectó como un solo gran grupo. El análisis de grupo es efectivo, pero las muestras y fracciones grab generalmente son más útiles para monitorear los niveles del mAb y CHOP porque las muestras consecutivas pueden combinarse para mostrar dos tendencias .

Experimental La materia prima experimental se eliminó del almacén frío (2-8°C o = 70°C) y se dejó equilibrar a temperatura ambiente. Después se ajustó opcionalmente el pH y/o conductividad a partir de las condiciones mostradas en la Tabla 1 utilizando el agente de titulación apropiado (es decir, 1.5 M de base tris o 1 M de ácido cítrico) o diluyente (agua purificada o 5 M de cloruro de sodio) . Después se filtró fuera del línea utilizando un filtro de 0.2 m Millipak-20 (Millipore Corporation, Billerica. Massachusetts) , AcroPak™ 20 (Pall Corporation, East Hills, New York) o de 1000 mi al vacío (Thermo Fisher Scientific, Rochester, New York) para eliminar cualquier precipitado que se hubiera formado durante el almacenamiento o acondicionamiento .

El sistema de filtración se preparó enjuagando las líneas de la carga y del filtrado utilizando agua purificada o regulador de pH apropiado. La membrana se colocó en línea en corriente debajo de la bomba de alimentación y el sensor de presión y después se enjuagó con 50 - 500 MV de agua purificada o reglador de pH de equilibrio. Después del enjuague, la alimentación se dirigió a la membrana y se cargó una cantidad variable a una velocidad de flujo constante de 333 - 2667 MV/hora. Durante la fase de carga el filtrado se muestreó según fue necesario. La membrana después opcionalmente se descartó con regulador de pH para recolectar cualquier producto residual. Para mantener la retención de las impurezas en la membrana, el regulador de pH de descarte (también conocido como regulador de pH de lavado) fue generalmente similar en pH e igual a o menor en conductividad para la alimentación.

En algunos casos el adsorbente de membrana se eluyó. La elución de la membrana solamente se llevó a cabo utilizando el Explorer o Pilot de tal forma que el agrupamiento podría facilitarse mediante el sensor UV en línea. La membrana se eluyó utilizando un regulador de pH alto en sal (20 mM de acetato de sodio y 350 mM de cloruro de sodio, pH 5.5 o 25 mM de tris y 250 mM de cloruro de sodio, pH 8.0) a una velocidad de flujo constante de 333 -2667 MV/hora y se combinó de 0.5 - 0.5 DO.

Procesamiento Continuo Los experimentos de procesamiento continuo se llevaron a cabo en AKTA Explorer.

Durante estos experimentos el flujo directo de la columna Q tuvo un pH ajustado en línea e inmediatamente se cargó en la membrana Mustang™ S. La columna Q se empacó con resina Q Sepharose Flujo Rápido (diámetro x longitud: 1.1 cm x 20 cm) . La salida de la columna se unió a la entrada de una conexión en T y el ajuste del pH se logró en línea dirigiendo la "Bomba B" a la entrada opuesta de la conexión en T. La conexión en T proporcionó la mezcla adecuada y la solución ajustada en pH se dirigió a la entrada de la membrana Mustang™ S. La velocidad de flujo a través de la columna se mantuvo a 100 cm/hora (1.58 ml/min) . La velocidad de flujo a través de la membrana fue ligeramente más alta (aproximadamente 2.2%) debido al fluido adicionado del ajuste del pH en línea.

Resultados Funcionamiento de la Membrana de Intercambio de Catión (CEX) a Pequeña Escala La combinación del intercambio de anión MAb 1 a un pH de 5.5 y 6.0 mS/cm se procesó sobre una membrana Mustang™ S de 0.18 mi a pequeña escala a una velocidad de flujo constante de 667 MV/hora. El pH del mAb 1 fue de 3.4 unidades de pH por debajo del pl y por consiguiente el anticuerpo estuvo positivamente cargado. Las muestras grab de alimentación y filtrado se a analizaron para mAb e impurezas de célula hospedera. La Figura 1 muestra que Mustang™ S inicialmente redujo CHOP de 38 a 4.3 ppm. CHOP se elevó ligeramente a 5.7 ppm como densidad de carga incrementada a 16,000 g/L. Los resultados también muestran que se logró un alto rendimiento, llegando a aproximadamente 100% después de 5000 g/L.

Para identificar mAb y las dependencias de carga, la combinación de intercambio de anión mAb 2 se procesó sobre Mustang S a pH de 5.5 y 8.0. La corriente de alimentación de mAb 2 se dividió en porciones iguales, la primera se mantuvo a un pH de 8.0 y 5.0 mS/cm, y la segunda se ajustó a un pH de 5.5 y 6.4 mS/cm utilizando 1M de ácido cítrico. Ambas corrientes de alimentación se procesaron sobre una membrana Mustang™ S de 0.18 mi a pequeña escala a una velocidad de flujo constante de 667 MV/hora. El mAb 2 a un pH de 5.5 y 8.0 estuvo por debajo del pl y por consiguiente positivamente cargado. Las muestras grab de alimentación y filtrado se analizaron y los resultados para CHOP se muestran en la Figura 2. A un pH de 5.5 Mustang S inicialmente redujo CHOP de 51 a 3.0 ppm, y similar a mAb 1. Los niveles se aumentaron con la densidad de la carga. El funcionamiento de la membrana disminuyó sustancialmente a un pH de 8.0, claramente demostrando que la adsorción de CHOP depende del pH. La Figura 3 muestra que el rendimiento es similar a ambas condiciones de pH, y = 96% es obtiene después de una densidad de carga de aproximadamente 5000 g/L.

Para evaluar el funcionamiento del adsorbente en una corriente de alimentación cruda, se proceso la combinación de Proteína A de mAb 1 a un pH de 5.5 y 3.2 mS/cm sobre una membrana 0.18 mi Mustang™ S a pequeña escala a una velocidad de flujo constante de 1333 MV/hora. La carga del mAb 1 fue de 3.4 unidades por debajo del pl calculado y por consiguiente el anticuerpo estuvo positivamente cargado. La carga, las fracciones del filtrado y las muestras de elución se analizaron y los resultados para CHOP se muestran en la Figura 4. Los datos muestran que Mustang™ S inicialmente redujo CHOP de 438 a 109 ppm. CHOP aumentó a 318 ppm cuando la densidad de la carga llegó a 55,300 g/L. La membrana se eluyó utilizando una solución conteniendo alta sal. Los iones de sal se utilizaron para proteger las cargas, de esta forma alterando las interacciones electrostáticas y causando que las proteínas se eliminaran de la superficie de la membrana y se movieran libremente a la fase móvil. El análisis de la combinación de elución muestra un enriquecimiento de impurezas confirmando que CHOP se une a la membrana debido a las fuerzas electrostáticas.

Funcionamiento de la Membrana de Intercambio de Anión (AEX) a pequeña escala Para propósitos de comparación se seleccionó el MAb 3 para la prueba utilizando una membrana de intercambio de anión por arriba del punto isoeléctrico de 7.7. Las proteínas son propensas a la desaminación y agregación a un alto pH por lo que las pruebas similares no se llevaron a cabo en los mAb 1 y 2. La combinación de intercambio de catión a un pH de 5.5 y 9 mS/cm se ajustó en cuanto a pl a 8.0 utilizando 1.5 M de base tris. La materia prima después se dividió en tres grupos separados y la conductividad se ajustó utilizando agua purificada. El primer grupo fue a 10 mS/cm, el segundo y tercer grupos se ajustaron a 7 mS/cm y 4 mS/cm, respectivamente. Los tres grupos se mantuvieron a un pH de 8.0. Cada corriente de alimentación después se procesó sobre 0.35 mi Mustang™ Q a pequeña escala a velocidad de flujo constante de 600 MV/hora. El mAb 3 a un pH de 8.0 fue de 0.3 unidades de pH por arriba del pl y por consiguiente el anticuerpo estuvo negativamente cargado. Los grupos de carga y filtrado se analizaron y los resultados para CHOP se muestran en la Figura 5. Los datos muestran que a 4 mS/cm, Mustang Q redujo CHOP de 180 a 0.6 ppm y que depuración de las impurezas disminuyó a conductividades más altas, presumiblemente debido a la protección iónica. La Figura 5 muestra que aunque el pH fue solamente de 0.3 unidades por arriba del pl, la carga del mAb 3 fue lo suficientemente fuerte para permitir la unión de > 10 mg/ml . Como la depuración de CHOP, la unión de mAb 3 también disminuyó a conductividades más altas. La Figura 6 muestra el rendimiento para mAb 3 que aumentó rápidamente, excediendo 96% después de aproximadamente 1000 g/L.

Proceso que Combina Membranas AED y CEX Se utilizó MAb 4 para ensayar la viabilidad de utilizar los pasos de desplazamiento de proteína indígena consecutivos utilizando ambas membranas de intercambio de anión y de catión. MAb 4 fue deseable porque su pl de 6.7 fue lo suficientemente bajo para procesar a condiciones de pH ambas por arriba y por debajo de punto isoeléctrico. El grupo de la proteína A a un pH 5.0 y 3.5 mS/cm se ajustó a pH de 8.0 y 4 mS/cm utilizando 1.5 M de base tris. La materia prima después se proceso sobre 0.1 8 mi de membrana Mustang Q a pequeña escala a una velocidad de flujo constante de 1333 MV/hora . El mAb 4 a un pH de 8.0 fue de 1.3 unidades por arriba del pl y por consiguiente el anticuerpo estuvo negativamente cargado. Las fracciones del filtrado Mustang™ Q se muestrearon y después recombinaron y ajustaron a un pH de 5.5 y 6.1 mS/cm utilizando 1M de ácido cítrico. El grupo recombinado después se procesó sobre una membrana de 0.18 mi Mustang™ S a pequeña escala a una velocidad de flujo constante de 1333 MV/hora. El mAb 4 a un pH de 5.5 fue de 1.2 unidades de pH por debajo del pl y por consiguiente el anticuerpo estuvo positivamente cargado. Las fracciones de carga y filtrado se analizaron y los resultados CHOP para ambas membranas se muestran en la Figura 7. Los datos muestran que Mustang™ Q inicialmente redujo CHOP de 1215 a 555 ppm, y los niveles establemente aumentaron a 726 ppm cuando la densidad de carga llegó a 1700 g/L. Los resultados también muestran que CHOP disminuyó a 375 ppm después de que las fracciones del filtrado Mustang™ Q recombinadas se ajustaron en cuanto a pH a 5.5.. La causa exacta de la disminución en CHOP es desconocida. Los resultados para la prueba posterior utilizando Mustang™ S muestran que los niveles de CHOP además se redujeron a 143 ppm, y de nuevo se aumentaron establemente a aproximadamente 168 ppm cuando la densidad de carga llegó a 1500 g/L. En general, los resultados demuestran que es factible combinar pasos de membranas para además reducir las impurezas de célula hospedera .

Un Proceso Continuo que Combina Columnas y Membranas Se utilizó MAb 1 para probar la viabilidad utilizando cromatografía de columna continuamente y en serie con membranas de intercambio de ión corriendo en el modo de desplazamiento de proteína indígena. Se realizaron dos corridas . Durante la Corrida 1 la columna y la membrana se analizaron de forma separada (modo en lotes) y durante la Corrida 2 la columna y la membrana se corrieron simultáneamente en serie (modo continuo) . Las operaciones por lotes para la Corrida 1 son como siguen. El grupo de Proteína A de mAb Acondicionado (pH 8.0 y 4.7 mS/cm) se cargó en una columna Q Sepharose de Flujo Rápido. El pH de la carga Q Seph FF load fue de 0.9 pH unidades por debajo del pl de tal forma que el anticuerpo estuvo positivamente cargado, dando como resultado una fuerza repulsiva entre la resina y el mAb. El modo de operación puede caracterizarse como cromatografía de columna de flujo directo tradicional. Las muestras grab de flujo directo se recolectaron en toda la corrida. La columna se cargó a aproximadamente 136 g/L de resina. El grupo Q Seph FF se recolectó y el pH se ajustó a 5.5 y 6 mS/cm utilizando 1M de ácido cítrico. Después se procesó sobre una membrana de 0.18 mi Mustang™ S a pequeña escala a 538 MV/hora para una densidad de cargo de aproximadamente 15,000 g/L de membrana. El pH de la carga de la membrana fue de aproximadamente 3.4 unidades por debajo del pl calculado y por consiguiente el anticuerpo estuvo positivamente cargado. Las muestras del efluente de la membrana se recolectaron en toda la corrida. La membrana Mustang™ S utilizada se descartó y la columna Q Seph FF se regeneró utilizando 0.5 M de NaOH y después se almaceno en 0.1 N de NaOH. La Corrida 2 se llevó a cabo en una forma similar a la Corrida 1; sin embargo el flujo directo de Q Seph FF se ajustó en cuanto a pH en línea y después se cargó inmediatamente en la membrana Mustang™ S. Las muestras grab de carga y columna/membrana se analizaron los resultados de CHOP se resumen para los experimentos por lote (Corrida 1) y continuos (Corrida 2) en la Figura 8. Los datos muestran que CHOP en el grupo de la Proteína A se redujo de 1450 ppm a aproximadamente 16.8 ppm sobre la columna Q Sepharose . Se debe observar que el valor del grupo Q de 16.8 ppm se calculó con base en los resultados de la muestra grab tomados en toda la corrida. Los resultados del lote y Mustang™ S continuos (12.7 y 11.1 ppm) muestran un buen convenio. En general, los datos demuestran que los pasos de unión de columna y membrana en un solo proceso continuo son factibles y producen resultados comparables con las operaciones por lotes tradicionales.

Comparación entre Fabricantes de Membranas La membrana Sartobind™ S se probó utilizando mAb 1 para comparar el funcionamiento entre los proveedores de membranas. El grupo de intercambio de anión de mAb 1 a un pH de 5.5 y 6 mS/cm se procesó sobre una membrana de 0.14 mi Sartobind™ S a pequeña escala a una velocidad de flujo constante de 857 MV/hora. El pl de carga del mAb 1 fue de 3.4 unidades de pH por debajo del pl y por consiguiente el anticuerpo estuvo positivamente cargado. Las fracciones de alimentación y filtrado se analizaron para CHOP y los resultados se muestran en la Figura 9. Los datos muestran que Sartobind™ ? inicialmente redujo CHOP de 29 a 3.3 ppm, y después de aproximadamente 11,500 g/L los niveles aumentaron ligeramente a 5.6 ppm. Los datos demuestran que las membranas Sartobind™ S y Mustang™ S tienen una adsorción CHOP similar. Efecto de la Velocidad de Flujo La depuración de CHOP Mustang™ S se estudió a 333 ~ 2667 MV/hora para probar el impacto de la velocidad de flujo. El grupo de intercambio de anión MAb 1 a un pH de 5.5 y 6 mS/cm se procesó sobre membranas de 0.18 mi Mustang de pequeña escala del mismo lote del dispositivo. La carga del mAb 1 fue de 3.4 unidades de pH por debajo del pl y por consiguiente el anticuerpo estuvo positivamente cargado. Las muestras grab de alimentación y filtrado se analizaron para CHOP y los resultados se muestran en la Figura 10. Los datos muestran que Mustang S inicialmente redujo CHOP de 45 aproximadamente 6.9 ppm. Después de 16,000 g/L el CHOP aumentó a un promedio de 8.7 ppm. Como se esperaba para un dispositivo de membrana no sometido a limitaciones de difusión de poro, los resultados muestran que la adsorción de CHOP es independiente de la velocidad de flujo.

Mej oramiento Se utilizó una membrana Mustang™ S a escala piloto para verificar la depuración de CHOP y el rendimiento después del mejoramiento. Se seleccionó un dispositivo de 16 capas de 10 mi porque era el dispositivo más pequeño completamente representativo disponible. Se consideró completamente representativo porque el número de capas de membrana, el plisado, y el ensamble del dispositivo fueron similares a cápsulas a escala industrial más grandes. El dispositivo de 10 mi representó un aumento de 55 veces en la escala del dispositivo a pequeña escala previamente estudiado. El grupo de intercambio de anión MAb 1 a un pH de I 5.5 y 6 mS/cm se procesó sobre un absorbente a escala piloto utilizando el AKTA Pilot™. Las carga del mAb 1 fue de 3.4 unidades de pH por debajo del pl y por consiguiente el anticuerpo estuvo positivamente cargado. Para averiguar el grado de reproducción la carga del mAb 1 se ensayó en el mismo dispositivo de 10 mi dos veces. Entre los ciclos la membrana se eluyó con un regulador de pH alto en sal (20 mM de acetato de sodio, 350 mM cloruro de sodio, pH 5.5) y se regeneró utilizando 0.5 M de NaOH. La velocidad de flujo para todas las fases fue de 546 MV/hora . Las muestras grab de alimentación y filtrado y el grupo de elución se analizaron para CHOP y los resultados se muestran en la Figura 11. Los datos muestran un buen grado de reproducción entre los ciclos, lo que indica que Mustang S puede regenerarse al menos una vez. El análisis de la muestra de elución mostró un enriquecimiento de impurezas, confirmando una segunda vez que CHOP se une a la membrana debido a las fuerzas electrostáticas. Una comparación con los resultados a pequeña escala para mAb 1 muestra un buen entendimiento para CHOP y el rendimiento. Los datos demuestran que los dispositivos a pequeña escala son capaces de pronosticar el rendimiento a gran escala.

Conclusión Las membranas de intercambio de ión demuestran ser efectivas en la eliminación de CHOP en un modo similar a la cromatografía en el modo de flujo directo pero a un pH y condiciones de conductividad que causan la unión del mAb. La técnica ha sido denominada cromatografía de membrana de intercambio de ión en desplazamiento de proteína indígena. Los resultados, ha demostrado que esta técnica puede utilizarse para depurar CHOP sin una pérdida sustancial del rendimiento que probablemente ocurriría con una columna rellena con resina tradicional dimensionada con el fin de mantener el rendimiento, pureza y tiempo del proceso. Los datos han demostrado que los mAb que han experimentado previamente purificación parcial utilizando Proteína A y cromatografía de columna de intercambio de ión además pueden purificarse a niveles CHOP menores de 10 ppm con rendimientos de > 96% utilizando Mustang™ S, Sartobmd S, y Mustang Q. Los bajos niveles de CHOP se mantuvieron a altas densidades de carga, y en algunos casos, el funcionamiento se mantuvo a 16,000 g/L. Los resultados han demostrado que la depuración de las impurezas depende del pH de la carga, y en general, disminuye con una mayor conductividad. Adicionalmente, los estudios de viabilidad demostraron que se pueden utilizar múltiples membranas en combinación con niveles de pureza reducidos adicionales y que la columna, y los pasos de la membrana pueden integrarse en un solo proceso de purificación continuo. Una comparación entre Mustang™ S y Sartobind™ S demostró similares depuraciones de impurezas. Aunque existen notables diferencias en las membranas, los resultados fueron similares y por lo tanto el mecanismo de eliminación de impurezas no depende de la membrana. Los resultados de las pruebas a velocidades de flujo en el intervalo de 333 - 2667 MV/hora fueron consistentes con la teoría y la literatura que reivindica que el funcionamiento de la membrana es independiente de las velocidades de flujo. Finalmente, los experimentos con un dispositivo intermediario que representa un aumento de 55 veces en escala mostraron un funcionamiento similar para una membrana a pequeña escala. Los datos confirman que los dispositivos a pequeña escala son capaces de pronosticar el funcionamiento en la escala de producción. Adicionalmente , la limpieza con cloruro de sodio seguido por hidróxido de sodio del dispositivo de escala piloto entre las corridas por duplicado mostró que los adsorbentes de membrana pueden regenerarse y utilizarse más de una vez sin una declinación en el funcionamiento.

La necesidad de mejores tecnologías de purificación es clara. El aumento de las concentraciones del bio-reactor puede sobrecargar la columna con base en las plataformas de purificación, y el reto puede no cumplirse solamente aumentando la capacidad de unión de la resina. Adicionalmente, para disminuir el costo de los bienés de la industria se necesitan herramientas más baratas, y más convenientes . Los adsorbentes de membrana son pequeños y desechables y pueden reducir los costos de validación y mano de obra mientras se aumenta la producción de masa. Los resultados experimentales para membranas de intercambio de ión operadas en el modo de desplazamiento de proteína indígena mostraron una alta depuración de impurezas y rendimiento, haciendo a esta técnica una opción atractiva para el bio-procesamiento .

Tabla 1: Características de la corriente de alimentación Producto Proceso en Nomenclatura PH Acond . Conc . Tipo corriente mS/cm g/i de arriba IgG mAb 1 Proteína A a Grupo de 5.5 3.2 5.9-6.9 1 8.9 Proteína A mAb 1 Protelna A Grupo de 5.5 6.0 4.8 1 8.9 seguido por Intercambio Flujo Directo de Anión de Intercambio de Anión a mAb 2 Proteína A Grupo de 8.0 5.0 5.4 1 9.3 seguido por Intercambio Flujo Directo de Anión de Intercambio de Anión mAb 3 Protelna A Grupo de 5.5 9.0 4.1 1 7.7 seguido por Intercambio Unión/Elución de Catión de Producto Proceso en Nomenclatura PH Acond . Conc . Tipo corriente mS/cm g/i de arriba IgG Intercambio de Catión mAb 4 Grupo de Grupo de 5.0 3.5 3.2 4 6.7 Proteina A a Proteína A Las muestras de materia prima se recolectaron de procesos industriales, piloto y a pequeña escala. a El pH del grupo y la conductividad se habían ajustado previamente para asegurar una adecuada estabilidad del producto. b El punto isoeléctrico (pl) se calculó con base en la secuencia de aminoácido para cada mAb.

Tabla 2: Características de la membrana Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. - Un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y por lo menos un contaminante, caracterizado porque comprende los pasos secuenciales de: a. pasar la composición a través de una membrana de intercambio de ión, en donde el polipéptido y la membrana tienen cargas opuestas, a condiciones operativas que comprenden un regulador de pH que tiene un pH suficiente y diferente del pl del polipéptido para mejorar la carga del polipéptido y una baja resistencia iónica efectiva para evitar la protección de las cargas mediante los iones reguladores de pH, que causan que la membrana se una al polipéptido y por lo menos un contaminante, y b. recuperar el polipéptido purificado del efluente.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la membrana de intercambio de ión tiene un tamaño de poro de 0.1 a 100 m.

3. - Un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y por lo menos un contaminante, caracterizado porque comprende los pasos secuenciales de: a. pasar la composición a través de una membrana de intercambio de catión, en donde el polipéptido de la membrana tienen cargas opuestas, a condiciones operativas que comprenden un regulador de pH que tiene un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido y una conductividad de < aproximadamente 40 mS/cm, que causa que la membrana se una al polipéptido y al menos un contaminante, y b. recuperar el polipéptido purificado del efluente .

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido .

5. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido .

7. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 1 unidad de pH por debajo del pl del polipéptido.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la conductividad es < aproximadamente 20 mS/cm.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la conductividad es <_ aproximadamente 10 mS/cm.

10. - Un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y por lo menos un contaminante, caracterizado porque comprende los pasos secuenciales de: a. pasar la composición a través de una membrana de intercambio de anión, en donde el polipéptido y la membrana tiene cargas opuestas, a condiciones operativas que comprenden un regulador de pH que tiene un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por arriba del pl del polipéptido y una conductividad de < aproximadamente 40 mS/cm, que causa que la membrana se una al polipéptido y por lo menos un contaminante, y b. recuperar el polipéptido purificado del efluente .

11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 unidades de pH por arriba del pl del polipéptido .

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades de pH por arriba del pl del polipéptido.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque pH es de aproximadamente 1 , a aproximadamente 2 unidades de pH por arriba del pl del polipéptido .

14.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 1 unidad de por arriba del pl del polipéptido.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la conductividad es de < aproximadamente 20 mS/cm.

16. - El método de conformidad con la reivindicación : 10, caracterizado porque la conductividad es < aproximadamente 10 mS/cm.

17. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la membrana es un adsorbente en modo mixto .

18. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el contaminante es una Proteína de Ovario de Hámster Chino (CHOP) .

19.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 á 18, caracterizado porque el polipéptido comprende una región CH2/CH3.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo.

21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque además comprende someter la composición que comprende el polipéptido a uno o más pasos de purificación adicionales ya sea antes, durante o después de los pasos a a b, el paso de purificación es cromatografía de afinidad de proteína A.

23.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque además comprende someter la composición que comprende el polipéptido a uno o más pasos de purificación adicionales ya sea antes, durante o después de los pasos a a b, el paso de purificación es cromatografía de intercambio de ión.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque además comprende someter la composición que comprende el polipéptido a uno o más pasos de purificación que corren continuamente durante los pasos a a b, el paso de purificación es cromatografía de intercambio de ión.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque además comprende preparar una composición farmacéutica mediante la combinación del polipéptido purificado con un potador farmacéuticamente aceptable. RESUMEN DE LA INVENCION Se describen métodos para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante, cuyos métodos comprenden los pasos secuenciales de: (a) pasar la composición a través de una membrana de intercambio de ión, en donde el polipéptido y la membrana tiene cargas opuestas, a condiciones operativas que comprenden un regulador de pH que tiene un pH lo suficientemente diferente del pl del polipéptido para mejorar la carga del polipéptido y una baja resistencia iónica para prevenir la protección de las cargas mediante los iones del regulador de pH, que causan que la membrana se una al polipéptido y al menos un contamínate, y (b) recuperar el polipéptido purificado del efluente.