CN102149724A - 使用原地蛋白质置换离子交换膜层析清除污染物的方法 - Google Patents

使用原地蛋白质置换离子交换膜层析清除污染物的方法 Download PDF

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Abstract

描述了用于自包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，该方法包括按序步骤：(a)使组合物通过离子交换膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的电荷，操作条件包括具有与所述多肽的pI具有与所述多肽的pI足够不同以增强多肽的电荷的pH和有效防止缓冲剂离子屏蔽电荷的低离子强度的缓冲液，这使得膜结合多肽和至少一种污染物，并(b)自流出液回收纯化的多肽。

Description

使用原地蛋白质置换离子交换膜层析清除污染物的方法
发明领域
一般地说，本发明涉及蛋白质纯化。具体地说，本发明涉及使用原地(indigenous)蛋白质置换离子交换膜层析清除污染物的方法。
发明背景
大规模的、经济的蛋白质纯化日益成为生物技术产业的重要问题。一般而言，通过细胞培养来生产蛋白质，使用通过插入含有感兴趣蛋白质的基因的重组质粒而改造成生成该蛋白质的真核或原核细胞系。由于通常所使用的细胞是活的有机体，因此必须给它们进料含有糖、氨基酸、和生长因子(通常自动物血清的制备物来供应)的复合生长培养基。将期望的蛋白质与进料给细胞的化合物混合物及与细胞自身的副产物分开至足以用作人治疗剂的纯度提出了艰难的挑战。
用于自细胞碎屑纯化蛋白质的规程首先取决于蛋白质表达的部位。一些蛋白质能自细胞直接分泌入周围的生长培养基中，其它蛋白质是胞内制备的。对于后一类蛋白质，纯化过程的第一步涉及裂解细胞，这可以通过多种方法来进行，包括机械剪切、渗压震扰、或酶处理。此类破坏将细胞的整个内含物释放入匀浆中，而且另外生成由于尺寸小而难以清除的亚细胞碎片。这些一般通过差速离心或通过过滤来清除。由于蛋白质生成运行的过程中细胞的天然死亡和胞内宿主细胞蛋白质的释放，直接分泌的蛋白质存在同样的问题，只是程度较小。
一旦获得含有感兴趣蛋白质的澄清溶液，通常使用不同层析技术的组合来试图将它与细胞生成的其它蛋白质分开。这些技术基于蛋白质的电荷、疏水性程度、或大小将蛋白混合物分开。这些技术每一种可利用数种不同层析树脂，从而容许为所涉及的具体蛋白质精确剪裁纯化方案。这些分离方法每一种的本质是能使蛋白质以不同速率沿长柱向下移动，从而实现随它们沿柱进一步向下移动时增大的物理分离，或者是能使蛋白质选择性粘附至分离介质，然后用不同溶剂差异洗脱。在一些情况中，当杂质特异性粘附至柱而感兴趣蛋白质不粘附至柱时，将期望蛋白质与杂质分开，也就是说，感兴趣的蛋白质存在于“流出液”中。
关注蛋白质纯化的出版物包括Fahrner et al.，Biotechnol Genet Eng Rev.2001；18：301-27。
一种典型的大规模纯化工艺的建立常常涉及采用固定化蛋白A作为初级捕捉和纯化步骤，与其它柱操作组合。蛋白A柱操作一般产生超过98％的产物相关纯度，大部分工艺杂质在流出级分中被洗掉。因为这一点，随之发生的工艺操作单元被认为是浓缩、纯化、或精制(polishing)步骤，负责将产物相关异构体分开及清除剩余量的宿主细胞蛋白质/DNA、浸出的(leached)蛋白A、和病毒。
发明概述
本文中的发明关注用于自包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，该方法包括按序步骤：(a)使组合物通过离子交换膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的电荷，操作条件包括具有与所述多肽的pI具有与所述多肽的pI足够不同以增强多肽的电荷的pH和有效防止缓冲剂离子屏蔽电荷的低离子强度的缓冲液，这使得膜结合多肽和至少一种污染物，并(b)自流出液回收纯化的多肽。
在一个备选方案中，本发明关注一种用于自包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，该方法包括按序步骤：(a)使组合物通过阳离子交换膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的电荷，操作条件包括具有低于多肽的pI约1个至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率的缓冲液，这使得膜结合多肽和至少一种污染物，并(b)自流出液回收纯化的多肽。
在另一个备选方案中，本发明关注一种用于自包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，该方法包括按序步骤：(a)使组合物通过阴离子交换膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的电荷，操作条件包括具有高于多肽的pI约1个至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率的缓冲液，这使得膜结合多肽和至少一种污染物，并(b)自流出液回收纯化的多肽。
在一方面，所述污染物是中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)。在另一方面，所述多肽包含CH2/CH3区。在又一方面，所述多肽是抗体。在还又一方面，所述抗体是单克隆抗体。
在其它方面，所述方法进一步包括在步骤a至b之前、期间或之后对包含多肽的组合物进行一个或多个别的纯化步骤，所述纯化步骤在一个备选方案中为蛋白A亲和层析，而在另一个备选方案中为离子交换层析，使用柱或膜，以结合/洗脱、流通(flow-through)、或原地蛋白质置换模式操作。
另外，本发明提供通过将纯化的多肽与药学可接受载体组合来制备药物组合物。
附图简述
图1。单抗1阴离子交换集合在pH 5.5，6.0mS/cm，MustangTM S(小规模，0.18mL MV，667MV/小时)的CHOP清除。
图2。单抗2阴离子交换集合在pH 5.5和6.4mS/cm及在pH 8.0和5.0mS/cm，MustangTM S(小规模，0.18mL MV，667MV/小时)的CHOP清除。
图3。单抗2阴离子交换集合在pH 5.5和6.4mS/cm及在pH 8.0和5.0mS/cm，MustangTM S(小规模，0.18mL MV，667MV/小时)的收率。
图4。单抗1蛋白A集合在pH 5.5，3.2mS/cm，MustangTM S(小规模，0.18mL MV，1333MV/小时)的CHOP清除。
图5。单抗3在pH 8.0，MustangTM Q(小规模，0.35mL MV，600MV/小时)的CHOP(柱)和抗体结合容量(线)。
图6。单抗3阳离子交换集合在pH 8.0，MustangTM Q(小规模，0.35mL MV，600MV/小时)的收率。
图7。单抗4在pH 8.0和4.0mS/cm，MustangTM Q(小规模，0.18mL MV，1333MV/小时)及然后pH 5.5和6.1mS/cm，MustangTM S(小规模，0.18mL MV，1333MV/小时)的CHOP水平。
图8。单抗1在pH 8.0和4.7mS/cm以100cm/小时流通模式(flow-throughmode)运行的Q Sepharose Fast Flow柱上(条纹)及然后进一步在大约pH 5.5和6mS/cm在分批(菱形)和连续(实心灰色)模式的MustangTM S上纯化(小规模，0.18mL MV，538MV/小时)的CHOP清除。
图9。单抗1在pH 5.5和6mS/cm，SartobindTM S(小规模，0.14mL MV，857MV/小时)的CHOP清除。
图10。单抗1在pH 5.5和6mS/cm，MustangTM S(小规模，0.18mL MV)的CHOP清除。
图11。单抗1在pH 5.5和6mS/cm，MustangTM S(中试规模，10mL MV，546MV/小时)的CHOP清除。
图12。蛋白质生产概要，其中阳离子交换层析以结合/洗脱模式(bind/elutemode)运行。
图13。蛋白质生产概要，将以结合/洗脱模式运行的阳离子交换层析用以原地蛋白质置换模式(indigenous protein displacement mode)运行的阳离子交换膜替换。
发明详述
定义
在本文中，术语“约”之后的数值范围或量明确包括精确的范围或精确的数值量。
本文中要纯化的“组合物”包含感兴趣的多肽和一种或多种污染物。所述组合物可以是“部分纯化的”(即已经进行过一个或多个纯化步骤，诸如蛋白A层析)或者可以是自生成抗体的宿主细胞或生物体直接获得的(例如所述组合物可以包含收获的细胞培养液)。
在用于本文时，“多肽”通常指具有多于约十个氨基酸的肽和蛋白质。优选的是，所述多肽是哺乳动物蛋白质，其例子包括：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(在激活后受到调节，正常情况下由T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，诸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物的蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素的或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；(促)红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如AIDS被膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2、HER3或HER4受体；及任何上文所列多肽的片段和/或变体，以及结合任何上文所列多肽的抗体，包括抗体片段。
“污染物”指与期望的多肽产物不同的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，诸如中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)；浸出的蛋白A；核酸；期望多肽的变体、片段、聚集物、异构体或衍生物；其它多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分(例如硫酸庆大霉素；
Figure BDA0000049597770000051
)等。
本文中感兴趣的多肽是包含CH2/CH3区并因此适合通过蛋白A亲和层析来纯化的多肽。术语“CH2/CH3区”在本文中使用时指免疫球蛋白分子Fc区中与蛋白A相互作用的那些氨基酸残基。在优选的实施方案中，CH2/CH3区包含完整CH2区，接着是完整CH3区，而且最优选免疫球蛋白的Fc区。含有CH2/CH3区的多肽的例子包括如下的抗体、免疫粘附素和融合蛋白，其包含与CH2/CH3区融合或偶联的感兴趣多肽。
在本发明的优选实施方案中，本文中要纯化的抗体是重组抗体。“重组抗体”指在经编码所述抗体的核酸转化或转染或者因同源重组而生成所述抗体的宿主细胞中生成的抗体。“转化”和“转染”可互换使用，指将核酸导入细胞中的过程。转化或转染后，该核酸可整合入宿主细胞基因组中，或者可作为染色体外元件存在。“宿主细胞”包括体外细胞培养物中的细胞以及宿主动物内的细胞。例如美国专利No.5,534,615记载了用于重组生产多肽的方法，通过述及明确收入本文。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们保留或经修饰而包含如本文中定义的CH2/CH3区。
本文中的抗体针对感兴趣的“抗原”。优选的是，所述抗原是在生物学上重要的多肽，而且对患有疾病或病症的哺乳动物施用所述抗体能在该哺乳动物中产生治疗好处。然而，还涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见美国专利5,091,178)的抗体。在抗原是多肽的情况中，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体(诸如生长因子)。例示性的抗原包括上文讨论的那些多肽。本发明所涵盖的抗体的优选分子靶物包括CD多肽，诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受体家族的成员，诸如EGF受体(HER1)、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和av/b3整联蛋白包括其a或b亚基(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；多肽C等。可以使用可溶性抗原或其片段(任选偶联至其它分子)作为免疫原来生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，可以使用这些的片段(例如受体的胞外域)作为免疫原。或者，可以使用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)或者可以是已经通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。
本文中要纯化的抗体的例子包括但不限于：HER2抗体，包括曲妥珠单抗(trastuzumab)(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美国专利No.5,725,856)和帕妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARGTM)(WO01/00245)；CD20抗体(见下文)；IL-8抗体(St John et al.，Chest，103：932(1993)，及国际公开No.WO 95/23865)；VEGF或VEGF受体抗体，包括人源化的和/或亲和力成熟的VEGF抗体，诸如人源化VEGF抗体huA4.6.1贝伐单抗
Figure BDA0000049597770000062
和拦你单抗(ranibizumab)
Figure BDA0000049597770000063
(Kim et al.，Growth Factors，7：53-64(1992)，国际公开No.WO 96/30046，及WO 98/45331，1998年10月15日公布)；PSCA抗体(WO01/40309)；CD11a抗体，包括依法利珠单抗(efalizumab)
Figure BDA0000049597770000064
(美国专利No.5,622,700，WO98/23761，Steppe et al.，Transplant Intl.4：3-7(1991)，及Hourmant et al.，Transplantation 58：377-380(1994))；结合IgE的抗体，包括奥玛珠单抗(omalizumab)
Figure BDA0000049597770000065
(Presta et al.，J.Immunol.151：2623-2632(1993)，及国际公开No.WO 95/19181；美国专利No.5,714,338，1998年2月3日公告或美国专利No.5,091,313,1992年2月25日公告，WO 93/04173，1993年3月4日公布，或国际申请No.PCT/US98/13410，1998年6月30日提交，美国专利No.5,714,338)；CD18抗体(美国专利No.5,622,700，1997年4月22日公告，或WO97/26912，1997年7月31日公布)；Apo-2受体抗体抗体(WO 98/51793，1998年11月19日公布)；组织因子(TF)抗体(欧洲专利No.0420937B1，1994年11月9日授权)；α4-α7整联蛋白抗体(WO 98/06248，1998年2月19日公布)；EGFR抗体(例如嵌合的或人源化的225抗体，西妥昔单抗(cetuximab)，
Figure BDA0000049597770000071
WO96/40210，1996年12月19日公布)；CD3抗体，诸如OKT3(美国专利No.4,515,893，1985年5月7日公告)；CD25或Tac抗体，诸如CHI-621
Figure BDA0000049597770000072
知
Figure BDA0000049597770000073
(参见美国专利No.5,693,762，1997年12月2日公告)；CD4抗体，诸如cM-7412抗体(Choy et al.Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；CD52抗体，诸如CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann et al.Nature 332：323-337(1988))；Fc受体抗体，诸如针对FcγRI的M22抗体(Graziano et al.J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995))；癌胚抗原(CEA)抗体，诸如hMN-14(Sharkey et al.Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995))；针对乳房上皮细胞的抗体，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani et al.Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；及Richman et al.Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；结合结肠癌细胞的抗体，诸如C242(Litton et al.Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis et al.J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；CD33抗体，诸如Hu M195(Jurcic et al.Cancer Res 55(23Suppl)：5908s-5910s(1995))和CMA-676或CDP771；EpCAM抗体，诸如17-1A
Figure BDA0000049597770000074
GpIIb/IIIa抗体，诸如阿昔单抗(abciximab)或c7E3Fab
Figure BDA0000049597770000075
RSV抗体，诸如MEDI-493
Figure BDA0000049597770000076
CMV抗体，诸如
Figure BDA0000049597770000077
HIV抗体，诸如PRO542；肝炎抗体，诸如Hep B抗体
Figure BDA0000049597770000078
CA 125抗体OvaRex；独特型GD3表位抗体BEC2；αvβ3抗体(例如
Figure BDA0000049597770000079
Medimmune)；人肾细胞癌抗体，诸如ch-G250；ING-1；抗人17-1An抗体(3622W94)；抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌(SF-25)；人白细胞抗原(HLA)抗体，诸如Smart ID 10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)；CD37抗体，诸如TRU 016(Trubion)；IL-21抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk)；抗B细胞抗体(Impheron)；B细胞靶向单抗(Immunogen/Aventis)；1D09C3(Morphosys/GPC)；LymphoRad 131(HGS)；Lym-1抗体，诸如Lym-1Y-90(USC)或抗Lym-1Oncolym(USC/Peregrine)；LIF226(Enhanced Lifesci.)；BAFF抗体(例如WO 03/33658)；BAFF受体抗体(参见例如WO 02/24909)；BR3抗体；Blys抗体，诸如belimumab；LYMPHOSTAT-BTM；ISF 154(UCSD/Roche/Tragen)；gomilixima(Idec 152；Biogen Idec)；IL-6受体抗体，诸如atlizumab(ACTEMRATM；Chugai/Roche)；IL-15抗体，诸如HuMax-Il-15(Genmab/Amgen)；趋化因子受体抗体，诸如CCR2抗体(例如MLN1202；Millieneum)；抗补体抗体，诸如C5抗体(例如eculizumab，5G1.1；Alexion)；人免疫球蛋白口服配制剂(例如IgPO；Protein Therapeutics)；IL-12抗体，诸如ABT-874(CAT/Abbott)；Teneliximab(BMS-224818；BMS)；CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)和TNX 100(Chiron/Tanox)；TNF-α抗体，包括cA2或英夫利昔单抗(infliximab)
Figure BDA0000049597770000081
CDP571、MAK-195、阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRATM)、PEG化TNF-α抗体片段，诸如CDP-870(Celltech)、D2E7(Knoll)、抗TNF-α多克隆抗体(例如PassTNF；Verigen)；CD22抗体，诸如LL2或依帕珠单抗(epratuzumab)(
Figure BDA0000049597770000082
Immunomedics)，包括依帕珠单抗Y-90和依帕珠单抗I-131、Abiogen的CD22抗体(Abiogen，Italy)、CMC 544(Wyeth/Celltech)、combotox(UT Soutwestern)、BL22(NIH)、和Lympo Scan Tc99(Immunomedics)。
CD20抗体的例子包括：“C2B8”，现在称作“利妥昔单抗”(rituximab)
Figure BDA0000049597770000083
(美国专利No.5,736,137)；钇[90]标记的2B8鼠抗体，称作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”
Figure BDA0000049597770000084
可以从IDEC Pharmaceuticals公司购买(美国专利No.5,736,137；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，编号HB11388)；鼠IgG2a“B1”，也称作“Tositumomab”，任选用131I标记以产生“131I-B1”或“碘131 tositumomab”抗体(BEXXARTM)，可以从Corixa购买(还可参见美国专利No.5,595,721)；鼠单克隆抗体“1F5”(Press et al.，Blood69(2)：584-591(1987))及其变体，包括“框架修补的”或人源化的1F5(WO2003/002607，Leung，S.；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利No.5,677,180)；人源化2H7(WO 2004/056312，Lowman et al.)；2F2(HuMax-CD20)，一种完全人的高亲和力抗体，靶向B细胞细胞膜中的CD20分子(Genmab，Denmark；参见例如Glennie and van de Winkel，Drug DiscoveryToday 8：503-510(2003)；Cragg et al.，Blood 101：1045-1052(2003)；WO2004/035607；US 2004/0167319)；WO 2004/035607和US 2004/0167319(Teeling et al.)中所列出的人单克隆抗体；US 2004/0093621(Shitara et al.)中所记载的Fc区结合有复杂N-糖苷连接的糖链的抗体；诸如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的与CD20结合的单克隆抗体和抗原结合片段(WO2005/000901，Tedder et al.)；诸如AME系列抗体的CD20结合分子，例如WO2004/103404和US 2005/0025764(Watkins et al.，Eli Lilly/Applied MolecularEvolution，AME)中所列出的AME 33抗体；诸如US 2005/0025764(Watkins etal.)中所记载的CD20结合分子；A20抗体或其变体，诸如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20和hA20)或IMMU-106(US 2003/0219433，Immunomedics)；CD20结合抗体，包括表位消减的Leu-16、1H4或2B8，任选偶联有IL-2，如US 2005/0069545A1和WO 2005/16969(Carr et al.)中的；与CD22和CD20结合的双特异性抗体，例如hLL2xhA20(WO 2005/14618，Changet al.)；单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可以从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得(Valentine et al.，于：Leukocyte Typing III，McMichael编，p.440，Oxford University Press(1987)；1H4(Haisma et al.，Blood 92：184(1998))；抗CD20auristatin E偶联物(SeattleGenetics)；抗CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope)；抗CD20单抗疗法(EpiCyte)；抗CD20抗体TRU 015(Trubion)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)来制备。在又一个实施方案中，可以从使用McCafferty et al.，Nature，348：552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库分离“单克隆抗体”。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Markset al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovitset al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.，7：33(1993)；及Duchosal et al.Nature 355：258(1992)。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.，Sequences of Polypeptides of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(即轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。
用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。
另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24：107-117(1992)；Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。在另一个实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4以促进F(ab′)2分子的装配来形成F(ab′)2。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。
在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得sFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
表述“线性抗体”在遍及本申请使用时指Zapata et al.，Polypeptide Eng，8(10)：1057-1062(1995)中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
“多特异性抗体”具有对至少两种不同表位的特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常只会结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。BsAb的例子包括一个臂针对肿瘤细胞抗原而另一个臂针对细胞毒性触发分子的BsAb，诸如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑色素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；一个臂特异性结合肿瘤抗原而另一个臂结合毒素的BsAb，诸如抗皂草素/抗Id-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱类；用于转变酶活化的前体药物的BsAb，诸如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化磷酸丝裂霉素前体药物转变成丝裂霉素醇)；可用作溶纤剂的BsAb，诸如抗血纤维蛋白/抗组织型纤溶酶原激活物(tPA)、抗血纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAb，诸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI或FcγRIII)；用于传染病治疗的BsAb，诸如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV；用于体外或体内肿瘤检测的BsAb，诸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的BsAb；及作为诊断工具的BsAb，诸如抗家兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特异性抗体的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。
为了本文中的目的，“裸抗体”或“裸露的抗体”指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
“完整抗体”在本文中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的是，完整抗体具有功能性Fc区。
“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。
“病症”指任何会受益于如本文所述纯化的抗体治疗的疾患。这包括慢性和急性这两类病症和疾病，及那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。
短语“离子交换层析”指一种分开技术，其中基于化合物的净电荷将它们分开。分子被归类为阴离子(具有负电荷)或阳离子(具有正电荷)。一些分子(例如多肽)可具有阴离子和阳离子两种基团。
离子交换层析膜会结合具有总体正或负电荷的化合物。结合位点位于吸附器(adsorber)的孔沿途。化合物通过对流被运输至结合位点。带正电荷的膜(阴离子交换剂)会结合具有总体负电荷的化合物。相反，带负电荷的膜(阳离子交换剂)会结合具有总体正电荷的化合物。
离子交换膜可以进一步归类为强的或弱的。强离子交换膜在宽范围的pH水平上带电荷(电离)。弱离子结合膜在窄pH范围内电离。四种最常见的离子交换化学是：
  离子结合类型   常用缩写   官能团
  强阴离子   Q   季铵
  弱阴离子   D   二乙胺
  强阳离子   S   磺酸
  弱阳离子   C   羧酸
一般而言，离子交换膜具有0.1至100μm的孔径。作为一种参照物，Sartobind Q(Sartorius AG)是一种强阴离子交换膜，其具有3-5μm的标称孔径且可以以单或多层形式购得，而Mustang Q(Pall Corporation)是一种强阴离子交换膜，其具有0.8μm的标称孔径且同样地可以以单或多层形式购得。作为另一种参照物，Sartobind S(Sartorius AG)是一种强阳离子交换膜，其具有3-5μm的标称孔径且可以以单或多层形式购得，而Mustang S(Pall Corporation)是一种强阳离子交换膜，其具有0.8μm的标称孔径且类似地可以以单或多层形式购得。
“标称(nominal)”孔径分级描述膜以60％至98％额定孔径保留大部分颗粒的能力。
溶液的“pH”测量相对于水样品电离的酸度或碱度。水的pH是中性的，即7。大多数pH读数的范围为0至14。具有比水高的[H+](pH小于7)的溶液是酸性的；具有比水低的[H+](pH大于7)的溶液是碱性的。pH可以使用pH计来测量。缓冲液pH可以使用酸或碱像HCl或NaOH来调节。
分子诸如多肽的“pI”或“等电点”指多肽含有相同数目的正和负电荷时的pH。pI可以根据多肽的氨基酸残基的净电荷来计算，或者可以通过等电聚焦来测定。可以利用多肽具有阴离子和阳离子两种基团的兼性性质。可以将多肽的pH降低至期望多肽表现为阳离子(具有正电荷)的点。或者，可以将多肽的pH升高至期望多肽表现为阴离子(具有负电荷)的点。
术语“电导率”指溶液在两个电极之间传导电流的能力。电导率的基本单位是西门子(S)，以前也叫做欧姆。电导率通常以mS/cm为单位来表述。既然溶液中离子上的电荷促进电流的传导，那么溶液的电导率与其离子浓度成正比。这两项度量都与离子强度紧密相关。离子强度与电解质的浓度密切相关，而且指示特定离子上的电荷多么有效地受到电解质中其它离子的屏蔽或稳定作用。离子强度与电解质浓度之间的主要区别在于一些离子带电荷程度越高，则前者越高。二者之间的另一项区别在于离子强度反映游离离子的浓度，而并非仅仅是向溶液中添加了多少盐。电导率可以使用电导率计来测量，诸如各种型号的Orion电导率计。溶液的电导率可以通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠、或氯化钾)的浓度来实现期望的电导率。优选的是，更改各种缓冲液的盐浓度来实现期望的电导率。
对于膜层析，“流速”通常描述为膜体积每小时(MV/h)。
对于膜层析，“载荷密度”常常表述为每升膜加工的组合物克数。
“缓冲液”指通过其酸-碱成对成分的作用来抵抗pH变化的溶液。Buffers.A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems，Gueffroy，D.，Ed.Calbiochem Corporation(1975)中记载了取决于例如期望的缓冲液pH而可采用的多种缓冲液。
自包含抗体和一种或多种污染物的组合物“纯化”所述抗体指通过自所述组合物清除(完全地或部分地)至少一种污染物来提高所述抗体在所述组合物中的纯度。“纯化步骤”可以是产生“均质”组合物的整个纯化过程的一部分。“均质的”在本文中用于指包含至少约70％(以重量计)感兴趣抗体(基于组合物总重)、优选至少约80％(以重量计)、更优选至少约90％(以重量计)、甚至更优选至少约95％(以重量计)的组合物。
使某分子“结合”至离子交换膜指在适宜条件(pH和/或电导率)下将所述分子暴露于所述离子交换膜，使得所述分子依靠所述分子与所述离子交换膜的带电荷基团之间的静电相互作用在所述离子交换膜中或上可逆固定化。
“清洗”离子交换膜指使适宜的缓冲液流过离子交换膜。
自离子交换膜“洗脱”某分子(例如抗体或污染物)指自其清除所述分子。
对于膜层析，“流通(flow through)”指杂质结合膜，同时化合物不保留。
短语“混合模式”指有能力基于两种不同机制(例如基于多肽间亲水性/疏水性差异的分开叠加基于净电荷的分开)将化合物分开的吸附剂。这常常通过使用可以以数种不同方式(包括离子相互作用和成氢键或疏水相互作用)与靶分子相互作用的多模式配体来实现。吸附剂像GE Healthcare CaptoTMMMC和CaptoTM Adhere是“混合模式”层析树脂的例子。
本发明的实施方式
本文中的发明提供了用于自包含多肽和一种或多种污染物的组合物(例如水溶液)纯化所述多肽的方法。所述组合物一般是源自多肽重组生产的组合物，但是可以是源自通过肽合成(或其它合成手段)进行的多肽生产的组合物，或者可以自多肽的天然来源纯化所述多肽。优选的是，所述多肽是含有CH2/CH3区的多肽。在优选的实施方案中，所述含有CH2/CH3区的多肽是抗体。
抗体的重组生产
为了重组生产抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一项或多项：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列(例如美国专利5,534,615中所记载的，通过述及明确收入本文)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Ehterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aerugmosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、k.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊蚊Aedes albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺
Figure BDA0000049597770000171
Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子包括但不限于用SV40转化的猴肾CV1细胞(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad Sci.383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤细胞(Hep G2)。通常，CHO细胞优选用于表达抗体，而且可有利地用于生成依照本发明纯化的抗体。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如硫酸庆大霉素；
Figure BDA0000049597770000181
)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解细胞的微粒碎片(例如源自匀浆)。如果将抗体分泌到培养基中，那么可以使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。
本发明的膜离子交换层析方法
在本发明的优选实施方案中，要进行本文中纯化方法的组合物是由中国仓鼠卵巢(CHO)重组宿主细胞培养物表达的重组生产的抗体，优选完整抗体。任选的是，所述组合物在膜离子交换层析之前已经进行过至少一个纯化步骤。所述组合物含有感兴趣的抗体和一种或多种污染物，诸如中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)；浸出的蛋白A(leached protein A)；核酸；期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物；其它多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分(例如硫酸庆大霉素；
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)，等。
可以在膜离子交换层析方法之前、期间、或之后实施的别的纯化规程的例子包括在疏水性相互作用层析(例如在PHENYL-SEPHAROSETM)上分级分离、乙醇沉淀、热沉降、聚乙二醇(PEG)沉淀、等电聚焦、反相HPLC、在硅土上层析、在HEPARIN SEPHAROSETM上层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、混合模式离子交换、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、hydrophic电荷诱导层析、高效切向流过滤(HPTFF)、和亲和层析(例如使用蛋白A、蛋白G、抗体、或特异性底物、配体或抗原作为捕捉试剂)。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，例如通过离心或过滤除去微粒碎片(宿主细胞或裂解碎片)。如果将抗体分泌到培养基中，那么可以例如通过离心或过滤将重组宿主细胞与细胞培养液分开。
大部分纯化在蛋白A亲和层析期间发生。蛋白A是一种细菌细胞壁蛋白质，其特异性结合抗体的Fc区。当被固定化到层析介质上时，蛋白A提供了一种用于纯化重组蛋白的技术，因为它能选择性结合复杂溶液中的抗体，容许杂质流通。
蛋白A亲和柱的基本方案是直截了当的：在大约中性pH结合并在酸性pH洗脱。使用在固相上固定化的蛋白A来纯化含有CH2/CH3区的多肽。固相优选是包含玻璃、硅土、或琼脂糖表面来固定化蛋白A的柱。优选地，固相是可控多孔玻璃柱、硅酸柱、或高度交联琼脂糖柱。可购自GE Healthcare的Mabselect SuReTM柱是有效纯化抗体的高度交联琼脂糖蛋白A柱的一个例子。有时，所述柱用试剂诸如甘油包被，试图防止对柱的非特异性粘附。可购自Millipore Corporation的PROSEP ATM柱是用甘油包被的蛋白A可控多孔玻璃柱的一个例子。用合适的缓冲液平衡用于蛋白A层析的固相。
在经过平衡的固相上使用可以与平衡缓冲液相同的加载缓冲液加载自重组宿主细胞衍生的污染制备物。随着污染制备物流过固相，多肽吸附至固定化蛋白A，而其它污染物(诸如中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)，在多肽是在CHO细胞中生成的情况中)非特异性结合至固相。
按序实施的下一个步骤必须除去结合至固相的污染物，其通过在中间清洗步骤中用含有盐、氨基酸、和/或疏水性电解质溶剂的溶液清洗固相进行。在优选的实施方案中，这次清洗中的盐是磷酸钾，氨基酸是精氨酸，而疏水性电解质是TEMAC和/或TEAC。虽然清洗中可存在单一溶质，但是在某些实施方案中，可使用两种或更多种此类溶质。优选将溶质添加至具有大致中性pH的pH缓冲溶液。
前一段的中间清洗步骤后，自柱回收感兴趣多肽。这通常使用合适的洗脱缓冲液来实现。可以例如使用具有低pH的洗脱缓冲液自柱洗脱多肽，例如在pH约2至约5的范围中，优选在pH约2.5至约3.5的范围中。用于此目的的洗脱缓冲液的例子包括柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液。
如本文中要求保护的那样实施膜离子交换层析。首选做出决定，是要采样阴离子还是阳离子交换膜。虽然一些抗体的等电点(pI)的范围为大约6.7至9.4，但是许多抗体的pI较高(常常＞8而且有时＞9)。一般而言，阳离子交换膜可用于pI大于约8的抗体，而阴离子交换膜可用于pI小于约8的抗体。
对于以原地蛋白质置换模式运行的膜阳离子交换层析，将加载材料的pH调节至低于抗体的pI约1个至约5个pH单位，将加载材料的电导率调节至≤约40mS/cm，这取决于所述pH，然后将抗体泵送过膜。在一些实施方案中，将加载材料的pH调节至低于抗体的pI约1个至约4个pH单位、约1个至约3个pH单位、约1个至约2个pH单位、或约1个pH单位。在其它实施方案中，将加载材料的电导率调节至≤约20mS/cm或≤约10mS/cm，这取决于所述pH。因为加载的pH小于抗体的pI，所以抗体(其已经成为带正电荷)不会最初流通。更准确的说，抗体会静电结合至阳离子交换剂的阴性官能团。这是因为抗体(阳性)和膜(阴性)具有相反的电荷。既然蛋白A亲和层析期间随抗体洗脱的许多污染物(例如宿主细胞蛋白质，诸如CHOP)的pI只是略微不同于抗体的pI，就是说，pI可仅仅相差约0.05个至约0.2个pI单位，那么这些污染物像“碱性”抗体一样还会结合至膜。不受理论束缚，表现出对于在产生最小离子屏蔽的情况中诱导电荷的pH和电导率条件下以原地蛋白质置换模式运行的膜阳离子交换层析，污染物优先结合膜，或以其它方式自膜有效“置换”抗体(RR Drager，FE Regnier，J Chromatogr.359：147-55(1986))，容许抗体在结合后流通或自基质“洗脱”并在流出液中回收。
对于以原地蛋白质置换模式运行的膜阴离子交换层析，将加载材料的pH调节至高于抗体的pI约1个至约5个pH单位，将加载材料的电导率调节至≤约40mS/cm，这取决于所述pH，然后将抗体泵送过膜。在一些实施方案中，将加载材料的pH调节至高于抗体的pI约1个至约4个pH单位、约1个至约3个pH单位、约1个至约2个pH单位、或约1个pH单位。在其它实施方案中，将加载材料的电导率调节至≤约20mS/cm或≤约10mS/cm，这取决于所述pH。因为加载的pH大于抗体的pI，所以抗体(其已经成为带负电荷)不会最初流过。更准确的说，抗体会静电结合至阴离子交换剂的阳性官能团。这是因为抗体(阴性)和膜(阳性)具有相反的电荷。既然蛋白A亲和层析期间随抗体洗脱的许多污染物(例如宿主细胞蛋白质，诸如CHOP)的pI只是略微不同于抗体的pI，就是说，pI可仅仅相差约0.05个至约0.2个pI单位，那么这些污染物像“酸性”抗体一样还会结合至膜。不受理论束缚，表现出对于在产生最小离子屏蔽的情况中诱导电荷的pH和电导率条件下以原地蛋白质置换模式运行的膜阴离子交换层析，污染物优先结合膜，或以其它方式自膜有效“置换”抗体(RR Drager，FE Regnier，J Chromatogr.359：147-55(1986))，容许抗体在结合后流通或自基质“洗脱”并在流出液中回收。
在一个例子中，在标准层析系统或定制层析系统像AKTATM Explorer(GE Healthcare)(其配备有压力计、传感器、和泵加泵控制器)上运行膜层析。在这个例子中，膜装置安装在压力计下游。在所述例子中，pH和电导率检测仪安装在膜装置下游。与这个例子连续的是，将该系统用水，然后用平衡缓冲液彻底冲洗，之后安装膜。与该例子进一步连续的是，将带膜的所述系统用平衡缓冲液冲洗，直至溶液pH和电导率出口匹配平衡缓冲液规格(约五个膜体积)且观察到稳定的基线。与这个例子甚至进一步连续的是，以333-2667MV/小时、pH 5.5(用于纯化假定的“碱性”抗体)或pH 8.0(用于纯化假定的“酸性”抗体)、和大约4mS/cm的电导率通过泵加载给料材料。与这个例子仍进一步连续的是，记录操作期间的操作反压力(operationbackpressure)、及pH和电导率变化。最后，在这个例子中，当280nm处的紫外线(UV)吸光度痕迹超出基线0.2个吸光度单位时立即收集膜流出液中的多肽，并一旦280nm处的UV痕迹低于0.2个吸光度单位停止集合收集，并对来自膜流出液级分中集合的样品测定多肽浓度、二聚体/聚集水平、宿主细胞蛋白质、DNA、和浸出的蛋白A。通常使用加载的多肽和膜流出液中的多肽来计算步骤回收。膜通常只使用一次。
关于分析测定法，可以使用Beckman分光光度计通过280nm处的吸光度来测定多肽含量(抗体浓度)。可以通过大小排阻层析来测定抗体聚集。可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来分析宿主细胞蛋白质(例如CHOP)水平。可以通过采用TaqMAN PCR(聚合酶链式反应)来定量宿主细胞DNA。可以使用蛋白A树脂卖主推荐的免疫化学基于ELISA的方法来实施浸出的蛋白A。
设计并测试下面的缓冲液，与S膜一起使用：(1)89mM乙酸，127mMTRIS碱，21mM柠檬酸，pH 5.5，6.0mS/cm，(2)28mM MES，95mM NaCl，pH6.0，11mS/cm，(3)200mM NaOAc，pH 5.5，12mS/cm，(4)100mM NaOAc，pH5.5，6.4mS/cm，和(5)96mM乙酸，65mM TRIS，pH 5.0，3.6mS/cm。
设计并测试下面的缓冲液，与Q膜一起使用：(1)50mM TRIS，15mMNaCl，pH 8.0，4.3mS/cm，(2)25mM TRIS，pH 8.0，1.3mS/cm，(3)60mM TRIS，118mM NaCl，pH 8.0，15.7mS/cm，(4)50mM TRIS，50mM NaOAc，pH 8.0，7.0mS/cm，(5)25mM HEPES，85mM NaOAc，pH 7.0，6.5mS/cm，和(6)91mM乙酸，130mM TRIS，pH 8.0，5.0mS/cm。
另外，可以通过添加乙酸、柠檬酸、HEPES、氢氯酸、磷酸、氢氧化钠、TRIS、或其它此类酸性和碱性缓冲剂来上调或下调任何缓冲系统的pH以达到合适的pH。还可以使用纯化的水、注射用水(WFI)、乙酸钠、氯化钠、磷酸钾、或其它此类低和高含盐缓冲剂来上调或下调任何缓冲系统的电导率以达到合适的电导率。
原地蛋白质置换膜层析步骤的展开(development)是直截了当的。以各种水平的pH和电导率运行加载材料通过膜。当分子具有较大的静电相互作用时，多肽(抗体或污染物)的保留能得到增强。当在多肽高度带电荷的条件下操作时，即当使用pH充分有别于多肽pI(这增强多肽的电荷)且离子强度低(这防止缓冲剂离子屏蔽电荷)的缓冲液时，静电相互作用能得到增强。相反，当在多肽带电荷较少的条件下操作时，即当使用pH充分接近多肽pI(这减弱多肽的电荷)且离子强度高(这容许缓冲剂离子屏蔽电荷)的缓冲液时，静电相互作用能得到减弱。结果是，通过优化缓冲溶液，具有不同物理-化学特性的多肽能通过膜吸附而被分开。基于缓冲液的pH和离子强度的恰当选择，有些分子能保留在给定膜上，而其它分子流动通过。
如果必要，依照本文中的膜离子交换层析方法获得的抗体制备物可进行额外的纯化步骤。上文已经讨论了例示性的进一步纯化步骤。
见图12，一个成功的纯化方案的一个例子是一种回收工艺，其需要初始分级步骤蛋白A亲和层析、中间纯化步骤以结合/洗脱模式运行的阳离子交换层析、和终末精制步骤(polishing step)以流通模式运行的阴离子交换层析。
见图13，一个改良纯化方案的一个例子是一种回收工艺，其需要初始分级步骤蛋白A亲和层析，但将以结合/洗脱模式运行的阳离子交换柱层析用以原地蛋白质置换模式运行的阳离子交换膜替换。由于许多原因，这会是有利的，一个原因是可以将中间和精制步骤组合成一个连续操作，即单个步骤。
任选的是，根据需要将所述抗体偶联至一种或多种异源分子。所述异源分子可以是例如延长抗体的血清半衰期的(例如聚乙二醇，PEG)，或者它可以是标记物(例如酶、荧光标记物和/或放射性核素)、或细胞毒性分子(例如毒素、化疗药物、或放射性同位素等)。
包含抗体(任选偶联有异源分子的)的治疗用配制剂可以通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备，采取冻干配制剂或水溶液的形式。“药学可接受的”载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980)。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
然后将如本文所述纯化的抗体或包含所述抗体和药学可接受载体的组合物用于对此类抗体和组合物已知的各种诊断、治疗或其它用途。例如，可以通过给哺乳动物施用有效量的所述抗体来使用所述抗体治疗哺乳动物中的病症。
为了例示而非为了限制，提供下列实施例。通过述及将说明书中所有引文的公开内容明确收入本文。
实施例
导言
单克隆抗体(单抗)的生物反应器滴度随细胞培养条件改进而升高。使用传统的柱层析可能难以纯化较大批次的单抗。结合容量增大的新树脂可能不足以消除循环或平行运行多个柱的需要。没有能力有效操作较大的批次可能负面地影响货物成本和工厂容量。另外，生物加工业需要更加方便、划算的工具来降低货物成本。因此能同时降低确认和劳动成本的小型、一次性使用的纯化技术是人们想要的。随着工业进化，离子交换膜可变得对单抗加工更加有利。
虽然柱层析方法是有力的且可靠的，但是它们一般具有较低的质量吞吐(mass throughout)，因为分开性能依赖于孔扩散。产物和杂质必须缓慢扩散入孔以达到结合位点。相反，膜不受孔扩散的限制。分开性能不依赖于流速，因此膜能够实现与树脂相比高得多的质量吞吐。膜还比树脂更加方便，因为它们不需要柱体、填充/清空柱、或定性。工业规模膜可以以能在使用一次后处置掉的筒或自我封装形式获得，进一步消除与再次使用和存储有关的确认费用。膜还比树脂填充柱更小且显著更轻，这便于在制造设备内操作。
膜确实具有一些缺点。与树脂相比，它们是一种相对较新的技术，仍然有待经历工业规模的广泛整合。商品化的膜的类型和完善表征的配体的选择是有限的。膜还显著比离子交换树脂更加昂贵。另外，它们不是实施工业规模结合和洗脱层析的最佳介质。膜具有相对较低的结合容量，这难以经由循环来经济地弥补。随着新一代膜的开发，许多这些问题有可能得到解决。
尽管有缺点，但是膜在下游纯化方面也有其独到之处。已经证明离子交换膜作为蛋白A单抗捕捉的后续步骤是成功的。膜在这个位置是理想的，因为杂质水平较低，而且当以流通模式使用时，结合容量不再是限制性的。流通层析定义为靶蛋白质流动通过吸附剂介质，不结合，而带适宜电荷的杂质被吸附的层析操作。延伸至膜层析，它是如下的一种技术，其利用膜与单抗之间建立的互斥力，使得大多数结合位点仍然可用于吸附带相反电荷的CHOP种类。
这项研究集中于使用原地蛋白质置换模式的离子交换膜来纯化单克隆抗体。该办法不同于流通，因为在引起产物吸附的pH和电导率条件下穿过膜来加工单抗。这是通过在低离子强度和阴离子交换期间高于单抗pI和阳离子交换期间低于单抗pI的pH操作而实现的。在这些条件下，在膜与单抗之间建立了吸引力，导致产物吸附。给料流加载持续而超出突破容量，而且以纯化的形式收集膜流出液。原地蛋白质置换模式的实验数据显示高度的纯化和收率，鉴于膜与单抗之间的强静电相互作用，这不是显而易见的。
基于它们的等电点范围(pI 6.7-9.3，基于氨基酸序列计算得出)，选择四种重组DNA衍生单抗进行分析。四种单抗都在Genentech Inc.在CHO细胞培养物中生成，而且用一个或多个柱层析步骤(蛋白A或蛋白A加离子交换)部分纯化。基于中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)的残余水平选择给料流。
这项研究探索离子交换膜MustangTM S、MustangTM Q、和SartobindTM S在也引起单抗吸附的pH和电导率条件下清除CHOP的能力。作为pH、电导率、加载密度、流速和膜类型的函数，调查CHOP纯化和收率。还研究了膜的放大和再生，而且探索了连续加工的可行性。
材料和方法
给料流
给料流取自最初为商业或科研目的生成的工业、中试、或小规模细胞培养批次(Genentech Inc.，South San Francisco，California)。将每个给料流部分纯化，意思是分出细胞，并以至少一个柱层析步骤(蛋白A或蛋白A加离子交换)纯化澄清的流体。每个给料流含有靶治疗性单克隆抗体(IgG1或IgG4)和可定量水平的宿主细胞杂质。每个给料流的组成随各单抗工艺和纯化水平而变化。一般而言，给料流pH为5.5-8.0，电导率为3.2-9.0mS/cm，而产物浓度为3.5-6.9mg/mL。表1显示了在这项研究中使用的每一种单抗的给料流特征。
单抗定量
使用280和320nm处的UV分光光度法扫描来测定单抗的浓度。CHOP水平太低，对UV吸光度没有可察觉的影响。将含有单抗的样品用适宜的非干扰性稀释剂稀释至0.1至1.0AU的范围内。一式两份地实施样品制备和分光光度法扫描读数，并记录平均值。所测试的单抗的吸收系数为1.45-1.70(mg/mL)-1cm-1。使用称作Beer-Lambert定律的方程式，使用280和320nm处的吸光度、稀释因子、路径长度(1cm)、和吸收系数来计算单抗抗体。
蛋白质浓度(mg/mL)＝[(A280-A320)/稀释系数]x稀释因子
CHO宿主细胞蛋白质(CHOP)定量
使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来定量CHOP水平。在微量滴定板孔上固定化亲和纯化的山羊抗CHOP抗体。在孔中温育含有CHOP的样品、标准品、和对照的稀释液，接着与偶联有辣根过氧化物酶的山羊抗CHOP抗体一起温育。用邻苯二胺二氢氯化物检测辣根过氧化物酶的酶活性。通过读取微量滴定板读数仪中492nm处的吸光度来定量CHOP。使用计算机曲线拟合程序来生成标准曲线，并自动计算样品浓度。ELISA的测定范围通常为5ng/ml至320ng/ml。对于每种样品，测定2-4个稀释度，并对数值取平均。将CHOP值除以单抗浓度，并以ppm为单位报告结果(ng CHOP/mg mAb)。
随后将展现出CHOP水平低于定量极限(LOQ)的滤出液样品浓缩以获得可定量的结果。使用
Figure BDA0000049597770000261
Ultra-15离心10kD MWCO滤器(MilliporeCorporation，Billerica，Massachusetts)和Eppendorf 5810R离心机(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)于5-25℃以3200-4000rpm离心10-20分钟，将样品浓缩10倍。
膜
所测试的膜是MustangTM S和Q(Pall Corporation，East Hills，New York)及SartobindTM S(Sartorius-Stedim Biotech S.A.，Aubagne，France)。MustangTM S和SartobindTM S是强阳离子交换膜，而MustangTM Q是强阴离子交换膜。MustangTM S和SartobindTM S经一种形式的磺酸修饰，而MustangTM Q经一种形式的季铵修饰。MustangTM S和Q由聚醚砜(PES)制成，0.8μm孔，而SartobindTM S由再生纤维素制成，3-5μm孔。为了提高结合容量，每家制造商将多层膜组合成每个装置。总层数和厚度随制造商和所制作的装置的尺寸而变化。膜体积(MV)指膜的物理体积(实体和空隙)，而且以mL为单位来测量。在这项研究中使用了代表多个规模的多种膜装置。表2列出了所测试的每种膜的有关规格。
过滤系统
用AKTA ExplorerTM 100(GE Healthcare，Fairfield，Connecticut)实施了小规模测试，这是一种可编程工艺纯化系统，包括集成计量泵、压力传感器、和在线pH，电导率，和UV传感器。经由运行UNICORNTM v5.10软件(GEHealthcare，Fairfield，Connecticut)的计算机对Explorer系统编程和控制。还使用手动系统实施了小规模测试，它包括
Figure BDA0000049597770000271
数字式经济型驱动蠕动泵(Cole Parmer，Vernon Hills，Illinois)、在线DTXTM Plus TNF-R压力传感器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey)、和AND EK-1200i天平(A&D Company，Ltd.，Tokyo，Japan)。使用天平通过测量质量累积来物理监测泵的流速。假设给料流密度为1.0g/mL，将质量换算成体积。使用NetDAQTM2640A/41A网络数据获取系统(Fluke，Everett，Washington)连续监测来自在线换能器的压力和来自天平的质量，该系统连接运行TrendlinkTM 3.1.1版(Canary Labs Inc.，Martinsburg，Pennsylvania)和RsCom version 2.40版(A&DCompany，Ltd.，Tokyo，Japan)软件来分别收集压力和质量的计算机。使用运行UNICORNTM v5.10软件的AKTA PilotTM(GE Healthcare，Fairfield，Connecticut)实施了放大研究。Pilot配备有较大的泵，但是功能上等同于Explorer。
滤出液样品收集技术
以三种不同方式收集滤出液。定时样品和级分是最常见的。定时样品(grab sample)指在特定吞吐时采集的较小的瞬时滤出液试样。级分指较大的滤出液样品，而且以吞吐范围来限定。还作为单一较大集合来收集滤出液。集合分析是有效的，但是定时样品和级分对于监测单抗和CHOP水平一般更加有用，因为能组合连续样品来显示趋势。
实验
自冷库(2-8℃或≤-70℃)取出给料，并容许平衡至室温。然后任选使用适宜的滴定剂(即1.5M tris碱或1M柠檬酸)或稀释剂(纯化的水或5M氯化钠)根据表1所示条件调节其pH和/或电导率。然后使用0.2μm Millipak-20(Millipore Corporation，Billerica，Massachusetts)、AcroPakTM 20(PallCorporation，East Hills，New York)或1000mL真空滤器(Thermo FisherScientific，Rochester，New York)将其离线过滤以除去冷藏或条件化(conditioning)期间可能形成的任何沉淀。
准备过滤系统，即使用纯化的水或适宜的缓冲液冲洗加载和滤出液管线。将膜在线安置到给料泵和压力传感器的下游，然后将其用50-500MV的纯化的水或平衡缓冲液冲洗。冲洗后，将给料引向膜，并以恒定流速333-2667MV/小时加载不同的量。在加载阶段期间，在必要时对滤出液采样。然后任选用缓冲液追逐(chase)膜以收集任何残余产物。为了维持杂质在膜上的保留，追逐缓冲液(chase buffer)(也称作清洗缓冲液)一般pH类似于给料且电导率等于或低于给料。
在一些情况中，洗脱膜吸附物。只使用Explorer或Pilot实施膜洗脱，因此可通过在线UV传感器来便于合并。使用高盐缓冲液(20mM乙酸钠和350mM氯化钠，pH 5.5或25mM tris和250mM氯化钠，pH 8.0)以恒定流速333-2667MV/小时洗脱膜，并合并0.5-0.5OD。
连续加工
在AKTA Explorer上实施了连续加工实验。在这些实验期间，在线调节Q柱流出液的pH，并立即加载到MustangTM S膜上。Q柱装有Q Sepharose FastFlow树脂(直径x长度：1.1cm x 20cm)。柱出口连接T形连接的入口，而且通过将“B泵”引向T形连接的对侧入口，在线实现pH调节。T形连接提供适当混合，而且经pH调节的溶液被引向MustangTM S膜的入口。通过柱的流速维持于100cm/小时(1.58mL/min)。由于在线pH调节添加的流体，通过膜的流速略微更高(大约2.2％)。
结果
小规模阳离子交换(CEX)膜性能
将处于pH 5.5和6.0mS/cm的单抗1阴离子交换集合在小规模0.18mLMustangTM S膜上以恒定流速667MV/小时加工。单抗1的pH低于pI 3.4个pH单位，因此抗体带正电荷。对给料和滤出液定时样品分析单抗和宿主细胞杂质。图1显示了MustangTM S最初将CHOP自38降低至4.3ppm。随加载密度升高至16,000g/L，CHOP略微升高至5.7ppm。结果还显示实现了高收率，在5000g/L后达到大约100％。
为了鉴定单抗和电荷依赖性，将单抗2阴离子交换集合在MustangTM S上以pH 5.5和8.0加工。将单抗2给料流分拆成相等的几个部分，第一部分维持于pH 8.0和5.0mS/cm，并将第二部分使用1M柠檬酸调节至pH 5.5和6.4mS/cm。将这两个给料流在小规模0.18mL MustangTM S膜上以恒定流速667MV/小时加工。pH 5.5和8.0的单抗2低于pI，因此带正电荷。分析给料和滤出液定时样品，而且CHOP的结果显示于图2。在pH 5.5，MustangTM S最初将CHOP自51降低至3.0ppm，而且与单抗1相似，水平随加载密度而升高。膜性能在pH 8.0实质性降低，清楚地证明CHOP吸附是pH依赖性的。图3显示这两个pH条件的收率是相似的，而且在加载密度为大约5000g/L后可到达≥96％。
为了以更粗制的给料流评估吸附器性能，将处于pH 5.5和3.2mS/cm的单抗1蛋白A集合在小规模0.18mL MustangTM S膜上以恒定流速1333MV/小时加工。单抗1加载低于计算pI 3.4个单位，因此抗体带正电荷。分析加载、滤出液级分、和洗脱样品，而且CHOP的结果显示于图4。数据显示MustangTM S最初将CHOP自438降低至109ppm。随加载密度逼近55,300g/L，CHOP升高至318ppm。使用含有高盐的溶液洗脱膜。使用盐离子来屏蔽电荷，如此破坏静电相互作用及引起蛋白质自膜表面解吸附并自由移动入流动相。对洗脱集合的分析显示杂质的富集，证实了CHOP由于静电力而结合膜。
小规模阴离子交换(AEX)膜性能
出于比较目的，选择单抗3使用阴离子交换膜在等电点7.7以上进行测试。因为蛋白质在高pH倾向于脱酰胺和聚集，所以没有对单抗1和2实施类似测试。使用1.5M tris碱将处于pH 5.5和9mS/cm的阳离子交换集合调节pH至8.0。然后将给料分拆成三个分开的集合，并使用纯化的水调节电导率。第一个集合处于10mS/cm，第二个和第三个集合分别调节至7mS/cm和4mS/cm。三个集合都维持于pH 8.0。然后将每个给料流在小规模0.35mL MustangTM Q上以恒定流速600MV/小时加工。处于pH 8.0的单抗3高于pI 0.3个pH单位，因此抗体带负电荷。分析加载和滤出液集合，而且CHOP的结果显示于图5。数据显示在4mS/cm，MustangTM Q将CHOP自180降低至0.6ppm，而且杂质清除在更高的电导率下降低，大概是由于离子屏蔽。图5显示虽然pH只高于pI 0.3个单位，但是单抗3上的电荷强得足以能够结合＞10mg/mL。像CHOP清除一样，单抗3结合也在更高的电导率下降低。图6显示单抗3的收率迅速升高，在大约1000g/L后超过96％。
组合AEX和CEX膜的工艺
使用单抗4来测试使用阴离子和阳离子两种交换膜采用连续原地蛋白质置换步骤的可行性。单抗4是合意的，因为它6.7的pI低得足以能够在高于和低于等电点的pH条件下加工。使用1.5M tris碱将处于pH 5.0和3.5mS/cm的蛋白A集合调节至pH 8.0和4mS/cm。然后将给料在小规模0.18mL MustangTM Q膜上以恒定流速1333MV/小时加工。处于pH 8.0的单抗4高于pI 1.3个单位，因此抗体带负电荷。对MustangTM Q滤出液级分采样，然后重组并使用1M柠檬酸调节至pH 5.5和6.1mS/cm。然后将重组集合在小规模0.18mL MustangTMS膜上以恒定流速1333MV/小时加工。处于pH 5.5的单抗4低于pI 1.2个pH单位，因此抗体带正电荷。分析加载和滤出液级分，而且两种膜的CHOP结果都显示于图7。数据显示MustangTM Q最初将CHOP自1215降低至555ppm，而且随加载密度逼近1700g/L，所述水平稳定升高至726ppm。结果还显示在重组MustangTM Q滤出液级分调节pH至5.5后，CHOP降低至375ppm。不知道CHOP降低的确切原因。使用MustangTM S的后续测试的结果显示CHOP水平进一步降低至143ppm，而且随加载密度逼近1500g/L再次稳定升高至大约168ppm。总之，结果证明组合膜步骤以进一步降低宿主细胞杂质是可行的。
组合柱和膜的一种连续工艺
使用单抗1来测试与以原地蛋白质置换模式运行的离子交换膜连续地及串联地使用柱层析的可行性。实施了两次运行。在运行1(Run 1)期间，分开分析柱和膜(分批模式)，而在运行2(Run 2)期间，同时串联运行柱和膜(连续模式)。运行1的分批操作如下。将条件化的单抗1蛋白A集合(pH 8.0和4.7mS/cm)加载到Q Sepharose Fast Flow柱上。Q Seph FF加载的pH低于pI 0.9个pH单位，所以抗体带正电荷，导致树脂与单抗之间的互斥力。操作模式可以表征为传统的流通柱层析。整个运行期间收集流通定时样品(flow throughgrab sample)。给柱加载大约136g/L树脂。收集Q Seph FF集合，并使用1M柠檬酸将pH调节至5.5和6mS/cm。然后将它在小规模0.18mL MustangTM S膜上以538MV/小时加工至加载密度大约15,000g/L膜。膜加载的pH低于计算pI大约3.4个单位，因此抗体带正电荷。整个运行期间收集膜流出液定时样品。丢弃用过的MustangTM S膜，并使用0.5M NaOH再生Q Seph FF柱，然后在0.1NNaOH中保存。以与运行1相似的方式实施运行2；然而，在线调节Q Seph FF流通的pH，然后立即加载到MustangTM S膜上。分析加载和柱/膜定时样品，而且分批(运行1)和连续(运行2)实验的CHOP结果汇总于图8。数据显示蛋白A集合中的CHOP在Q Sepharose柱上自1450ppm降低至大约16.8ppm。应当注意，Q集合的值16.8ppm是基于整个运行期间采集的定时样品的结果计算得出的。分批和连续MustangTM S结果(12.7和11.1ppm)显示良好的一致。总之，所述数据证明将柱和膜步骤连接成单个连续工艺是可行的，而且产生与传统分批操作相当的结果。
膜制造商间的比较
使用单抗1测试SartobindTM S膜以在膜供应商间比较性能。将处于pH 5.5和6mS/cm的单抗1阴离子交换集合在小规模0.14mL SartobindTM S膜上以恒定流速857MV/小时加工。单抗1加载pH低于pI 3.4个pH单位，因此抗体带正电荷。对给料和滤出液级分分析CHOP，而且结果显示于图9。数据显示SartobindTM S最初将CHOP自29降低至3.3ppm，而且在大约11,500g/L后，所述水平略微升高至5.6ppm。数据证明SartobindTM S和MustangTM S膜具有相似的CHOP吸附。
流速效应
以333-2667MV/小时研究MustangTM S CHOP清除以测试流速的影响。将处于pH 5.5和6mS/cm的单抗1阴离子交换集合在来自同一装置批次的四个分开的小规模0.18mL MustangTM S膜上加工。单抗1加载低于pI 3.4个pH单位，因此抗体带正电荷。对给料和流通定时样品分析CHOP，而且结果显示于图10。数据显示MustangTM S最初将CHOP自45降低至大约6.9ppm。在16,000g/L后，CHOP升高至平均8.7ppm。正如为未进行孔扩散(pore diffusion)限制的膜装置所预期的，结果显示CHOP吸附不依赖于流速。
放大
使用中试规模MustangTM S膜来检验放大时的CHOP清除和收率。选择10mL 16层装置，因为它是可得的最小的完全代表装置。因为膜层数、折叠、和装置装配与大得多的工业规模舱相似，所以它被认为是完全具有代表性的。10mL装置代表先前研究的小规模装置规模放大55倍。将处于pH 5.5和6mS/cm的单抗1阴离子交换集合在中试规模吸附器上使用AKTA PilotTM加工。单抗1加载低于pI 3.4个pH单位，因此抗体带正电荷。为了获得再现性意义，单抗1加载在相同10mL装置上测试两次。在循环之间，将膜用高盐缓冲液(20mM乙酸钠，350mM氯化钠，pH 5.5)洗脱并用0.5M NaOH再生。所有阶段的流速为546MV/小时。对给料和滤出液定时样品和洗脱集合分析CHOP，而且结果显示于图11。数据显示循环之间较高的再现性，指示MustangTM S能再生至少一次。对洗脱样品的分析显示杂质的富集，第二次证实了CHOP由于静电力而结合膜。与先前单抗1小规模结果的比较显示CHOP和收率良好的一致。数据证明小规模装置能够预测大规模性能。
结论
离子交换膜显示出在以如下模式除去CHOP方面是有效的，所述模式与流通模式层析相似，但pH和电导率条件引起单抗结合。该技术已被称作原地蛋白质置换离子交换膜层析。结果证明了这种技术可用于清除CHOP，而没有为了维持收率、纯度、和工艺时间而定尺寸的传统树脂填充柱有可能会发生的实质性收率损失。数据显示了先前使用蛋白A和离子交换柱层析进行过部分纯化的单抗使用MustangTM S、SartobindTM S、和MustangTM Q能得到进一步纯化，至CHOP水平低于10ppm且收率≥96％。低CHOP水平在高加载密度得到了维持，而且在有些情况中，效能维持至16,000g/L。结果显示了杂质清除取决于加载pH，而且一般而言随更高的电导率而降低。另外，可行性研究证明了可以组合使用多个膜以进一步降低杂质水平，而且可以将柱和膜步骤整合成单一连续纯化工艺。MustangTM S与SartobindTM S之间的比较显示了相似的杂质清除。虽然膜有显著的差异，但是结果是相似的，而且因此杂质清除机制不是膜依赖性的。流速范围333-2667MV/小时的测试结果与理论一致，而且文献宣称膜性能不依赖流速。最后，代表规模增大55倍的中间装置的实验显示与小规模膜相似的性能。数据证实了小规模装置能够预测生产规模时的性能。另外，重复运行之间用氯化钠接着用氢氧化钠清洁中试规模装置(pilot-scale device)显示膜吸附器能得到再生，而且使用超过一次且性能没有下降。
对更好的纯化技术的需要是清楚的。越来越高的生物反应器滴度可能使基于柱的纯化平台超负荷，而且仅仅提高树脂结合容量可能无法对付挑战。另外，为了降低产品成本，产业上需要更加方便、划算的工具。膜吸附器较小且一次性使用，而且能降低确认和劳动成本同时提高质量吞吐。以原地蛋白质置换模式操作的离子交换膜的实验结果显示高杂质清除和收率，使得这种技术成为生物加工的一个诱人选项。
表1：给料流特征
Figure BDA0000049597770000331
给料样品收集自工业、中试、和小规模工艺。
a先前已经调节集合pH和电导率以确保足够的产物稳定性。
b根据氨基酸序列为每种单抗计算等电点(pI)。
表2：膜特征
Figure BDA0000049597770000332
Figure BDA0000049597770000341

Claims (25)

1.一种用于自包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，该方法包括按序步骤：
(a)使组合物通过离子交换膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的电荷，操作条件包括具有与所述多肽的pI具有与所述多肽的pI足够不同以增强多肽的电荷的pH和有效防止缓冲剂离子屏蔽电荷的低离子强度的缓冲液，这使得膜结合多肽和至少一种污染物，并(b)自流出液回收纯化的多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述离子交换膜具有0.1至100μm的孔径。
3.一种用于自包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，该方法包括按序步骤：
(a)使组合物通过阳离子交换膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的电荷，操作条件包括具有低于多肽的pI约1个至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率的缓冲液，这使得膜结合多肽和至少一种污染物，并
(b)自流出液回收纯化的多肽。
4.权利要求3的方法，其中所述pH低于多肽的pI约1个至约4个pH单位。
5.权利要求3的方法，其中所述pH低于多肽的pI约1个至约3个pH单位。
6.权利要求3的方法，其中所述pH低于多肽的pI约1个至约2个pH单位。
7.权利要求3的方法，其中所述pH低于多肽的pI约1个pH单位。
8.权利要求3的方法，其中所述电导率为≤约20mS/cm。
9.权利要求3的方法，其中所述电导率为≤约10mS/cm。
10.一种用于自包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，该方法包括按序步骤：
(a)使组合物通过阴离子交换膜，其中所述多肽和所述膜具有相反的电荷，操作条件包括具有高于多肽的pI约1个至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率的缓冲液，这使得膜结合多肽和至少一种污染物，并
(b)自流出液回收纯化的多肽。
11.权利要求10的方法，其中所述pH高于多肽的pI约1个至约4个pH单位。
12.权利要求10的方法，其中所述pH高于多肽的pI约1个至约3个pH单位。
13.权利要求10的方法，其中所述pH高于多肽的pI约1个至约2个pH单位。
14.权利要求10的方法，其中所述pH高于多肽的pI约1个pH单位。
15.权利要求10的方法，其中所述电导率为≤约20mS/cm。
16.权利要求10的方法，其中所述电导率为≤约10mS/cm。
17.权利要求1至16任一项的方法，其中所述膜是混合模式吸附器。
18.权利要求1至17任一项的方法，其中所述污染物是中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)。
19.权利要求1至18任一项的方法，其中所述多肽包含CH2/CH3区。
20.权利要求19的方法，其中所述多肽是抗体。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
22.权利要求1至21任一项的方法，进一步包括在步骤a至b之前、期间或之后对包含多肽的组合物进行一个或多个别的纯化步骤，所述纯化步骤为蛋白A亲和层析。
23.权利要求1至21任一项的方法，进一步包括在步骤a至b之前、期间或之后对包含多肽的组合物进行一个或多个别的纯化步骤，所述纯化步骤为离子交换层析。
24.权利要求1至21任一项的方法，进一步包括在步骤a至b期间对包含多肽的组合物进行连续运行的一个或多个别的纯化步骤，所述纯化步骤为离子交换层析。
25.权利要求1至24任一项的方法，进一步包括通过将纯化的多肽与药学可接受载体组合来制备药物组合物。
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