CZ300724B6 - Zpusob prípravy modifikovaného polypeptidu, anti-IgE protilátka, molekula nukleové kyseliny, farmaceutický prostredek a použití - Google Patents

Abstract

Zpusob prípravy modifikovaného polypeptidu, kterým je anti-IgE protilátka, pomocí kombinace kroku, které jsou: (1) urcení zbytku asparagové kyseliny, které jsou náchylné k izomerizaci; (2) nahrazení alternativními zbytky a hromadné testování výsledných mutací na jejich afinitu k cílové molekule metodou afinitní maturace za pomoci prezentace determinanty na povrchu fága (APMD). Molekula anti-IgE protilátky a prípravek, který ji obsahuje.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu zdokonalení polypeptidů, který má afinitu ke své cílové molekule, pomocí kombinace těchto kroků: (1) určení zbytků asparagové kyseliny, které jsou náchylné k izomerizaci; (2) jejich záměna jinými aminokyselinovými zbytky a testování afinity io výsledných mutací k jejich cílové molekule.

Dosavadní stav techniky iš Předkládaný vynález se týká imunoglobulínu E (IgE), antagonistů IgE, anti-IgE protilátek, schopných se vázat k lidskému IgE a způsobem zdokonalení polypeptidů, včetně anti-IgE protilátek.

IgE je členem skupiny imunoglobulínů, které zprostředkují alergické odpovědi jako jsou astma, hypersenzitivita typu 1 a záněty dutin různého původu. IgE je vylučován a vystaven na povrchu B-buněk neboli lymfocytů. IgE se váže na B-buftky (rovněž na monocyty, eozinofily a krevní destičky) prostřednictvím vazby své Fc oblasti na IgE receptor, který je nízkoafinní a je znám pod označením FceRII. Když je organizmus savce vystaven vlivu alergenu, jsou B-buňky nesoucí na svém povrchu vázané IgE protilátky specifické pro daný antigen, „aktivovány“ a vyvíjejí se na plazmatické buňky, sekretující IgE. Výsledný IgE, specifický k danému antigenu, pak koluje v krevním oběhu a váže se na povrch žímých buněk v tkáních a k bazofilním granulocytům v krvi prostřednictvím vysoceafinního receptoru, který je také znám jako FceRI. Žímé buňky a bazofilní granulocyty se tak stávají citlivé na alergen. Následná expozice alergenu způsobí vazbu bazofilních granulocytů na FceRI žímých buněk, což má za následek uvolnění histaminu, leukotrienů a faktorů aktivujících krevní destičky, eozinofilních a neutrofilních chemotaktických faktorů a cytokinů IL-3, IL-4, IL—5 a GM-CSF, které jsou zodpovědné za klinickou hypersenzitivitu a anafylaxii.

Patologický stav přecitlivělosti je charakterizován přehnanou imunitní odpovědí na alergen (aler35 geny), jejímž výsledkem jsou zřetelné tkáňové změny, jestliže je alergen přítomen v poměrně velkém množství, nebo jestliže stav humorální a buněčné imunitní odpovědi je na zvýšené úrovni.

Fyziologické změny během anafylaktické přecitlivělosti mohou zahrnovat zúžení průdušinek a průdušek v plících, stažení hladkého svalstva a rozšíření kapilár. Predispozice k tomuto stavu však jak se zdá, vyplývá z interakce mezi faktory genetickými a faktory vnějšího prostředí. Běžné alergeny vnějšího prostředí, které indukují anafylaktickou přecitlivělost, jsou nacházeny v pylu, potravě, mezi roztoči, žijícími v prachu v domácnosti, spórách hub a hmyzích jedech. Atopická alergie je spojena s anafylaktickou přecitlivělostí a zahrnuje poruchy jako např. astma, alergická rýma a zánět oční spojivky (senná rýma), ekzém, koprivka a alergie na potravu. Avšak anafylak45 tický šok, tento anafylaktický stav ohrožující život, je obyčejně vyvolán bodnutím hmyzího žihadla nebo parenterálním podáním léku.

Nedávno byla pro hypersenzitivitu typu I nebo anafylaktickou hypersenzitivitu používána taková léčebná strategie, která se pokoušela zabránit vazbě IgE na vysoceafínní receptor (FceRI), který so se nalézá na bazofilních granulocytech a žímých buňkách, a tedy zabránit uvolnění histaminu a jiných anafylaktických faktorů, které mají za následek patologický stav.

Ve WO 93/04173, publikovaném 4. března 1993, jsou popisovány chiméry lidských IgE/IgG 1, kde zbytky v IgGl jsou nahrazeny za analogické IgE zbytky. Přihlašovatelova souběžná přihláška USSN 08/405 617 popisuje zušlechtěné anti-IgE protilátky, kde myší protilátky proti lidskému IgE (MaEl 1) byly použity k substituování jejich CDR oblastí do IgG 1 imunoglobulinové podpůrné oblasti (rhuMaE25). Technika takovéhoto zušlechtění je popsána v Reichman, L. a kol., (1988) Nátuře 332: 323 a v Jones, P.T. a kol·, (1986), Nátuře 321: 522.

Zatímco pro zušlechťování myších protilátek bylo potvrzeno, že poskytuje molekuly anti-IgE, které vykazují podobnou afinitu k IgE jako myší MaEl 1 avšak bez imunogenní odpovědi vyvolané později (Shields a kol·, (1995) Int. Arch. Aliergy Immunol. 107: 308-312), dosud nebyly zkonstruovány anti-IgE s výrazně lepší afinitou k IgE než má MaEl I nebo myší anti-IgE.

io

Rekombinantní monoklonální protilátky podléhají degradačním reakcím, jež působí na všechny polypeptidy nebo proteiny, jako je izomerizace zbytků asparagové kyseliny a asparaginu. Jak je ukázáno na Obr. A dole, zbytky kyseliny asparagové (I) v sekvencích -Asp-Oly- mohou izomerizovat na kyselinu izoasparagovou (III) přes cyklický imid jako meziprodukt (II). (Geiger & is Clarke, J. Biol. Chem. 262: 785-794 (1987)). Karboxylová kyselina postranního řetězce kyseliny asparagové (I) reaguje s dusíkem aminové skupiny sousedního glycinu za vzniku cyklického meziproduktu kyseliny asparagové (II), který pak vytvoří zbytky kyseliny izoasparagové a glycinu (III). Rovnováha, rychlost a závislost na pH u této reakce byla studována na modelových peptidech dělených pomocí HPLC na reverzní fázi. (Oliyai & Borchardt, Pharm Res. 10: 95-102 (1993)). Má se za to, že tendence k uskutečnění izomerizace také závisí na ohebnosti místního úseku molekuly, který obsahuje sekvencí -Asp-Oly- (Geiger & Clarke, J. Biol. Chem. 262: 785— 794(1987)).

Příkladem známé protilátky, u které probíhá izomerizace asparagové kyseliny je účinná anti-IgE protilátka, známá jako rhuMabE-25 (E-25). Tato událost může nastat spontánně, její vznik však může být indukován, když je E-25 inkubována 21 dní při teplotě 37 °C. Konečným výsledkem je inzerce další methylové skupiny do polypeptidové kostry protilátky, což může mít za následek konformační změny a snížení vazebné afinity. Studie E-25 s variantami -c-Asp-Gly- a -izo-Asp-Gly- na pozici VL 32-33 naznačily, že zatímco izomerizační děj může být minima30 lizován substitucí alaninu nebo kyseliny glutamové za zbytek VL32 , substituce sama má za následek trojnásobné snížení vazebné schopnosti. Cacia a kol., viz výše.

Tedy existuje silná potřeba pro vytváření zdokonalených polypeptidu, včetně protilátek, u ktetých nejen že neprobíhá „deaktivující“ izomerizace kyseliny asparagové, ale které vykazují afinitu k cílové molekule (tj. antigenů) stejnou nebo větší než je afinita polypeptidu výchozího.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobu zdokonalení polypeptidu, který má afinitu ke své cílové molekule, pomocí kombinace těchto kroků: (1) určení zbytků asparagové kyseliny, které jsou náchylné k izomerizaci; (2) jejich záměna jinými zbytky a testování výsledných mutací na jejich afinitu k cílové molekule. Ve výhodném provedení je substituce zbytků provedena metodou afinitní maturace s prezentací na fágových partikulích (AMPD). V jiném výhodném provedení je polypeptidem protilátka a cílovou molekulou je antigen. V jiném výhodném provedení je protilátkou anti-IgE a cílovou molekulou je IgE.

V ještě výhodnějším provedení se vynález týká způsobu zvýšení afinity anti-IgE protilátky E-25 zaměněním zbytku 32Asp v VL CDR-L1 za Glu, spolu s modifikací zbytků v VL CDR-L1 a to

-2JUVlín DO

27Gln za Lys, 28Ser za Pro a 3 lTyr za Gly. V ještě výhodnějším provedení má E-25 další modifikace zbytků v VH CDR2: 53Thr za Lys, 55Asp za Ser, 57Ser za Glu a 59Asn za Lys.

V jiném provedení se vynález týká anti-IgE protilátky se zvýšenou afinitou k IgE.

Ve výhodném provedení anti-IgE protilátka obsahuje těžký a lehký řetězec, ve kterých jsou obsaženy úseky sekvencí, které jsou v obrázku 2 označeny „e27“ a „e26“. Jinou možností je, že anti-IgE protilátka obsahuje celé délky sekvencí těžkého a lehkého řetězce, které jsou v obrázku 12 označeny „E27“ a „E26“.

io

Předkládaný vynález se také týká prostředků se zvýšenou afinitou anti-IgE nebo jeho funkčních fragmentů, které mají farmaceutické použití. Předkládaný vynález se také týká výrobků obsahujících anti-IgE protilátky se zvýšenou afinitou.

V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu jak snížit nebo inhibovat tvorbu histaminu, prostředkovanou IgE.

V ještě jiném provedení se předkládaný vynález také týká způsobu léčení p nemoci vyvolané IgE, pomocí podání protilátek, připravených podle tohoto vynálezu, nebo jejich funkčních fragmentů.

Jiné aspekty vynálezu se stanou zřejmé z následujícího podrobného popisu a patentových nároků. Podrobný popis výhodných provedení

Zmínky o jednotlivých odkazech, patentových přihláškách a patentech v této přihlášce by měly být považovány za odkazy, zahrnuté do textu.

Termíny použité v této žádosti by měly být chápány v jejich běžném a typickém významu, jakje chápou osoby s běžnými zkušenostmi v oboru. Přihlašovatelé si presto přejí, aby pro následující termíny byly podány zvláštní definice, které jsou uvedeny dále:

Termíny „protein“ nebo „polypeptid“ se mohou vzájemně zaměňovat. Označují řetězec dvou (2) nebo více aminokyselin, které jsou vzájemně vázány peptidovou nebo aminovou vazbou, bez ohledu na posttranslační modifikace (např. glykosylace nebo fosforylace). Za předmět v rámci této definice jsou považovány zvláště protilátky.

Polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou obsahovat více než jednu podjednotku, přičemž každá podjednotka je kódována zvláštní sekvencí DNA.

Výraz,,značně shodný“ ve vztahu k sekvenci polypeptidu protilátky má být chápán tak, že protilátka vykazuje přinejmenším 70%, výhodněji 80%, ještě výhodněji 90% a nejvýhodněji 95% sekvenční shodu se sekvencí referenčního polypeptidu. Tento tennín ve vztahu k sekvenci nukleové kyseliny má být chápán tak, že sekvence nukleotidů vykazuje přinejmenším 85%, výhodněji 90%, ještě výhodněji 95% a nej výhodněji 97% sekvenční shodu se sekvencí referenční nukleové kyseliny. Pro polypeptidy bude délka porovnávací sekvence obecně přinejmenším 25 aminokyselin. Pro nukleové kyseliny bude délka obecně přinejmenším 75 nukleotidů.

Termín „shoda“ nebo „homologie“ má být chápán že znamená procento aminokyselinových zbytků v kandidátské sekvenci, které jsou shodné se zbytkem v odpovídající sekvenci, s níž je srovnávána, po seřazení jejich sekvencí a zavedení mezer, pokud jsou nezbytné pro dosažení maximální procentuální shody pro celou sekvenci, přičemž se za součást sekvenční shody nepovažují žádné konzervativní substituce. Ani prodloužení na N-konci nebo C-konci, ani vložené úseky nemají být chápány jako snížení shody nebo homologie. Metody a počítačové programy pro porovnání jsou v oboru dobře známy. Shoda sekvencí může být měřena za pomoci softwaru pro sekvenční analýzu (např. Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group,

-3CZ 300724 B6

University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave, Madison, WI 53705). Tento software porovnává podobné sekvence tím, že připisuje stupně homologie různým substitucím, delecím a jiným modifikacím.

Termín „protilátka“ je užíván v nejširším smyslu a zvláště označuje monoklonální protilátky (včetně monoklonálních protilátek o plné délce řetězců), polyklonální protilátky, multispecifické protilátky (např. bispecifické protilátky) a fragmenty protilátek (např. Fab, F(ab')₂ a Fv), pokud vykazují požadovanou biologickou aktivitu. Protilátky (Abs) a imunoglobuliny (Igs) jsou glykoproteiny, které mají shodné strukturální charakteristiky. Zatímco protilátky vykazují vazebnou ío specificitu k určitému antigenu, imunoglobuliny zahrnují jak protilátky, tak i jiné protilátkám podobné molekuly, které postrádají specificitu pro antigen. Posledně jmenované polypeptidy jsou např. produkovány v nízkých hladinách mízním systémem a ve zvýšené míře myelomy.

Přirozené protilátky a imunoglobuliny jsou obvykle heterotetramemí glykoproteinyo hmotnosti asi 200 000 daltonů, složené ze dvou totožných lehkých (L) řetězců a dvou totožných těžkých (H) řetězců. Každý lehký řetězec je vázán k těžkému řetězci jednou ko valen tni disulfíd iekou vazbou, zatímco počet disulfidických vazeb mezi těžkými řetězci různých imunoglobulinových izotypů kolísá. Každý těžký a lehký řetězec má také pravidelně rozmístěné intrařetězcové disulfidické můstky. Každý těžký řetězec má na jednom konci variabilní doménu (VH), následovanou řadou konstantních domén, Každý lehký řetězec má na jednom konci variabilní doménu (VL) a konstantní doménu na svém druhém konci. Konstantní doména lehkého řetězce je přiřazena k první konstantní doméně těžkého řetězce a variabilní doména lehkého řetězce je přiřazena k variabilní doméně těžkého řetězce. Má se za to, že určité aminokyselinové zbytky tvoří rozhraní mezi variabilními doménami lehkého a těžkého řetězce (Clothia a kol., J. Mol. Biol. 186,

651-66, 1985); Novotný a Haber, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 82, 4 592-4 596 (1985).

„Izolovaná“ protilátka je taková, která byla rozeznána a oddělena anebo získána ze složek prostředí v němž byla vytvořena. Kontaminující složky prostředí v němž je produkována jsou materiály, které by mohly interferovat s diagnostickým nebo léčebným použitím protilátky a mohou zahrnovat enzymy, hormony a jiné proteinové ěi neproteinové látky rozpuštěné v roztoku. Ve výhodném provedení bude čištění protilátek měřeno pomocí nejméně třech různých metod: 1) do více než 95% čistoty protilátky podle váhy, jak je zjišťováno pomocí Lowryho metody, nej výhodněji do více než 99% čistoty podle váhy; 2) do stupně postačujícího k získání přinejmenším 15 zbytků aminokyselinové sekvence buď z N-konce nebo z vnitřního úseku pomocí sekvenátoru typu „spinning cup“; nebo 3) do homogenity pomocí SDS-PAGE za redukujících nebo neredukujících podmínek za použití Coomasie modři nebo výhodněji barvení pomocí stříbra. Izolované protilátky zahrnují protilátky insitu uvnitř rekombinantních buněk, protože přinejmenším jedna složka přirozeného prostředí protilátky nebude přítomna. Obyčejně však izolovaná protilátka bude připravena pomocí nejméně jednoho purifíkaěního kroku.

„Druhově specifická protilátka“ např. savčí anti-Iidská IgE protilátka, je taková protilátka, která má silnější vazebnou afinitu k antigenu z jednoho savčího druhu, než má pro homolog tohoto antigenu z druhého savčího druhu. Normálně se druhově specifická protilátka „váže specificky“ k lidskému antigenu (tj. má hodnotu vazebné afinity (Kd) ne vyšší než 1 χ 10”⁷ M, výhodněji ne vyšší než 1x10“⁸M a nej výhodněji ne vyšší než 1x10~⁹M), ale má vazebnou afinitu k homologu tohoto antigenu, pocházejícímu z jiného savčího druhu (ne člověka) přinejmenším 50krát nebo přinejmenším 500krát nebo přinejmenším lOOOkrát slabší, než je její vazebná afinita k lidskému antigenu. Druhově specifická protilátka může patřit ke kterémukoli z různých typů protilátek definovaných výše, ale převážně se jedná o zušlechtěnou nebo lidskou protilátku.

Termín „mutovaná protilátka“ označuje aminokyselinovou sekvenční variantu protilátky, kde byl jeden nebo více aminokyselinových zbytků pozměněn. Taková mutanta má nezbytně nižší než 100% shodu nebo podobnost s aminokyselinovou sekvencí, jež má přinejmenším 75% aminokyselinovou sekvenční shodu nebo podobnost s aminokyselinovou sekvencí variabilní doménou buď těžkého nebo lehkého řetězce protilátky, výhodněji přinejmenším 80%, výhodněji přinej-4v-zj υυ menším 85%, výhodněji přinejmenším 90% a nej výhodněji přinejmenším 95%. Protože způsob, který je předmětem tohoto vynálezu, se uplatňuje stejně jak na polypeptidy, protilátky ajejich fragmenty, při používání se tyto termíny zaměňují,

Termín „variabilní“ ve vztahu k variabilní doméně protilátek, označuje skutečnost, že jisté části variabilních domény se mezi protilátkami ve svých sekvencích rozsáhle odlišují a jsou užívány při vazbě a při určování specificity každé jednotlivé protilátky k jejímu určitému antigenu.Avšak variabilita není ve variabilních doménách protilátek rovnoměrně rozložena. Je soustředěna do tří úseků, nazývaných oblasti určující komplementaritu (CDR), také známé jako hypervariabilní io oblasti, které se nacházejí ve variabilních doménách jak lehkých, tak těžkých řetězců. Existují nejméně dvě techniky pro určení CDR: (1) přístup založený na mezidruhové sekvenční variabilitě (např. Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nationallnstitute of Health, Bethesda, MD 1987); a (2) přístup založený na krystalografických studiích komplexů antigenprotilátka (Chothia, C. a kol, (1989), Nátuře 342\ 877). Se zřetelem na anti-IgE protilátky přihlašovatele, určité CDR byly definovány pomocí kombinace přístupů Kabat a kol. a Chothia a kol. Konzervativnější části variabilních domén se nazývají podpůrné oblasti (framework - FR). Každá variabilní doména přirozených těžkých a lehkých řetězců obsahuje čtyři FR oblasti, převážně zaujímají uspořádání β-listu, spojené třemi CDR, které tvoří spojovací smyčky a v některých případech vytvářejí Část struktury β-lístu. CDR v každém řetězci jsou udržovány vzájemně v těsné blízkosti pomocí FR oblastí a spolu sCDR druhého řetězce přispívají k vytvoření vazebného místa pro antigen příslušné protilátky (viz Kabat a kol.). Konstantní domény se přímo neúčastní na vazbě protilátky k antigenu, ale vykazují různé efektorové funkce, jako je účast protilátky na vzniku buněčné toxicity, závislé na protilátkách.

Termín „fragment protilátky“ označuje část z plné délky protilátky, obecně oblast, která váže antigen nebo variabilní oblast. Příklady fragmentů protilátek jsou fragmenty Fab, Fab', F(ab')₂ a Fv. Štěpení protilátek papainem vytváří dva shodné fragmenty, které vážou antigen, nazývané fragmenty Fab, každý s jedním místem pro vazbu antigenu a zbylý „Fc“ fragment, nazývaný tak pro svou schopnost snadno krystalovat. Působením pepsinu vzniká fragment F(ab')2, kteiý má dva fragmenty, které se vážou k antigenu a jsou schopny křížově pospojovat antigen, a další zbytkový fragment (který se nazývá pFc'). Další fragmenty mohou zahrnovat diabodia, lineární protilátky, jednořetězcové molekuly protilátek a multispecifické protilátky, vytvářené z proti látkových fragmentů.

Pokud je zde používán termín „funkční fragment“ ve vztahu k protilátkám, označuje fragmenty Fv, Fab a F(ab')₂.

Fragment „Fv“ je minimální fragment protilátky, který obsahuje kompletní místo pro rozeznání antigenu a vazebné místo. Tato oblast sestává z dimeru variabilních domén jednoho těžkého a jednoho lehkého řetězce, které jsou v těsném, nekovalentním spojení (VH-VL dimer). Je v takovém uspořádaní, že tři CDR každé variabilní oblasti interagují na povrchu VH-VL dimeru při vytváření místa, které váže antigen. Společně šest CDR propůjčuje protilátce specifícitu vazby k antigenu. Avšak i pouze jedna variabilní doména (nebo polovina Fv - obsahující pouze tři CDR specifické pro antigen) má schopnost rozpoznat a vázat antigen, třebaže s nižší afinitou než má celé vazebné místo.

Fragment Fab [také označovaný jako F(ab)] také obsahuje konstantní doménu lehkého řetězce a první konstantní doménu těžkého řetězce (CHI). Fragmenty Fab' se liší od fragmentů Fab přidáním několika zbytků na karboxylovém konci CHI domény těžkého řetězce včetně jednoho nebo více cysteinů z otočné oblasti protilátky. Fab -SH je zde používáno pro označení Fab', v němž má cysteinový zbytek (cysteinové zbytky) konstantní domény volnou thiolovou skupinu. Fragmenty F(ab ) jsou vytvářeny štěpením disulfidické vazby cysteinů v otočné oblasti produktů pepsinového štěpení tj. F(ab')₂ fragmentů. Další chemické spojování fragmentů protilátek je známé osobám s běžnou zkušeností v tomto oboru.

-5CZ 300724 B6

Lehké řetězce protilátek (imunoglobulin) ze kteréhokoli druhu obratlovce mohou být přirazeny k jednomu ze dvou zřetelně odlišných typů, nazývaných kappa (k) a lambda (λ), založených na aminokyselinových sekvencích jejich konstantních domén.

V závislosti na aminokyselinových sekvencích konstantních domén jejich těžkých řetězců jsou „imunoglobuliny“ přiřazeny k různým třídám. Existuje nejméně pět (5) hlavních tříd imunoglobulinů: IgA, IgD, IgE, IgG a IgM a některé z nich mohou být dále děleny na podtřídy (izotypy), např. IgG—1, IgG-2, IgG-3 a IgG-4; IgA—1 a IgA-2. Konstantní domény těžkých řetězců, které odpovídají různým třídám imunoglobulinů jsou nazývány α, δ, ε, γ a μ. Struktury io subjednotek a trojrozměrná uspořádání různých tříd imunoglobulinů jsou dobře známá. Pro použití v tomto předkládaném vynálezu je dávána přednost imunoglobulinů E.

Termín „monoklonální protilátka“ je zde používán pro označení protilátky, získané z populace značně homogenních protilátek, tj. jednotlivé protilátky tvořící populaci jsou totožné, vyjma možných, přirozeně se vyskytujících mutací, které mohou být přítomny v minimálních množstvích. Monoklonální protilátky jsou vysoce specifické a jsou namířeny proti jednomu antigennímu místu. Oproti běžným (polyklonálním) proti látkovým přípravkům, které běžně obsahují různé protilátky, namířené proti různým determinantám (epitopům), monoklonální protilátka je namířena proti jedné determinantě na antigenu. Navíc k jejich specificitě, monoklonální proti20 látky mají výhodu v tom, že jsou syntetizovány hybridomovými kulturami, které nejsou kontaminovány jinými imunoglobuliny. Výraz „monoklonální“ naznačuje charakter protilátky, totiž že je získána ze značně homogenní populace protilátek a nemá být chápán tak, že je vyžadována produkce protilátky nějakým zvláštním postupem. Například monoklonální protilátky, které se budou používat podle předkládaného vynálezu, mohou být vytvořeny hybridomovou metodou poprvé popsanou v Kohler a Milstein, Nátuře 256, 495 (1975) nebo mohou být vytvořeny rekombinantním způsobem, např. jak je popsáno v US 4 816 567. Monoklonální protilátky, které se budou používat podle předkládaného vynálezu, mohou být také izolovány z fágových knihoven protilátek pomocí techniky, popsané v Clackson a kol., Nátuře 352: 624-628 (1991) a rovněž v Marks a kok, J Mol. Biol. 222: 581-597 (1991).

Monoklonální protilátky zde zvláště zahrnují „chimemí“ protilátky (imunoglobuliny) v nichž část těžkého anebo lehkého řetězce je shodná nebo homologní s odpovídajícími sekvencemi v protilátkách, odvozených z určitých druhů nebo patřících k určité třídě nebo podtřídě protilátek, zatímco zbytek řetězce (řetězců) je shodná nebo homologní s odpovídajícími sekvencemi v proti35 látkách, odvozených z jiných druhů nebo patřících kjiné třídě nebo podtřídě protilátek, a rovněž fragmenty takových protilátek, pokud vykazují požadovanou biologickou aktivitu (US 4 816 567); Morrison a kok, Proč. Nati. Acad, Sci. 81, 6 851-6 855 (1984).

„Zušlechtěné“ formy jiných než lidských protilátek (např. myších) jsou chimemí imunoglobu40 liny, imunoglobulínové řetězce nebo jejich fragmenty (jako jsou Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ nebo jiné protilátkové sekvence, které se vážou k antigenu), které obsahují minimální sekvenci, odvozenou z jiných než lidských imunoglobulinů. zvětší části jsou zušlechtěné protilátky lidské imunoglobuliny (protilátka příjemce), v nichž zbytky v oblasti určující komplementaritu (CDR) u příjemce jsou nahrazeny zbytky z CDR jiného druhu než člověka (protilátka dárce) jako je myš, krysa nebo králík, jež má požadovanou specificitu, afinitu a kapacitu. V některých případech jsou zbytky v podpůrné oblasti Fv lidského imunoglobulinů zaměněny za odpovídající zbytky zjiného druhu. Dále mohou zušlechtěné protilátky obsahovat zbytky, které nenacházíme ani v protilátce příjemce, ani ve vnesených sekvencích CDR nebo podpůrných oblastí. Tyto modifikace jsou prováděny, aby se dále zjemnilo a optimalizovalo uspořádání protilátky. Všeobecně řečeno, zušlech50 těné protilátky budou obsahovat v podstatě přinejmenším jednu a typicky dvě variabilní domény, v nichž všechny anebo v podstatě všechny CDR oblasti odpovídají CDR zjiného než lidského imunoglobulinů a všechny anebo v podstatě všechny FR oblasti odpovídají lidské konsenzuální imunoglobulinové sekvenci. V optimálním případě budou zušlechtěné protilátky také obsahovat přinejmenším část konstantní oblasti imunoglobulinů (Fc), typicky konstantní oblasti z lidského

-6UUVZA*t DU imunoglobulinu. Další podrobnosti viz: Jones a kol., Nátuře 321, 522-525 (1986); Reichmann a kok, Nátuře 332, 323—329 (1988) a Presta, Curr, Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992).

„Jednořetězcový Fv“ nebo „sFv“ fragmenty protilátky obsahují VH a VL domény protilátky, přičemž tyto oblasti jsou přítomny ve formě jednoho polypeptídového řetězce. Obecně Fv polypeptid dále obsahuje polypeptidový linker mezi VH a VL doménami, který umožňuje aby sFv vytvořil strukturu požadovanou pro vazbu antigenu. Jako přehled o sFv viz Pluckthun v The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, sv. 113, Rosenburg a Moore ed. SpringerVeriag, New York, str. 269-315 (1994).

io

Termín „diabodie“ (diabodies) označuje malé fragmenty protilátek se dvěma vazebnými místy pro antigen, tyto fragmenty obsahují těžký řetězec variabilní domény (VH) spojený s lehkým řetězcem variabilní domény (VL) v jednom polypeptidickém řetězci (VH-VL). Při použití linkeru, který je natolik krátký, že neumožňuje párování mezi dvěma doménami téhož řetězce, domény jsou nuceny se párovat s komplementárními doménami jiného řetězce a vytvořit dvě místa, která vážou antigen. Diabodie jsou podrobněji popsány např, v EP 404 097; WO 93/11161 a Hollinger a kol., Proč. Natí Acad, Sci. USA 90: 6 444-6 448 (1993).

Výraz „funkční fragment nebo analog“ protilátky je sloučenina, která má biolgickou aktivitu stejnou, jako protilátka s nezkráceným polypeptidovým řetězcem. Například funkční fragment nebo analog anti-ígE protilátky je takový, který je schopen se vázat k imunoglobulinu IgE takovým způsobem, že zabrání nebo podstatně sníží schopnost této molekuly vázat se k vysoceafinnímu receptoru FceRI.

Termín „aminokyselina“ a „aminokyseliny“ označuje všechny přirozeně se vyskytující L-<xaminokyseliny. Aminokyseliny jsou označovány, jak je zde dále popsáno v sekci A. Příprava aminokyselin: (iv) Vytváření mutovaných protilátek. Termín „aminokyselinová varianta“ označuje molekuly s některými odchylkami v jejich aminokyselinové sekvenci od přirozeně se vyskytující aminokyselinové sekvence.

„Substituční“ varianty j sou takové, které maj í nej méně jeden aminokyselinový zbytek v přirozené sekvenci odstraněn a na stejnou pozici je vložena odlišná aminokyselina. Substituce mohou být jednoduché, kde byla nahrazena pouze jedna aminokyselina v celé molekule, nebo mohou být víceČetné, kdy byly nahrazeny dvě nebo více aminokyselin v téže molekule. „Inzerční“ varianty mají vloženy jednu nebo více aminokyselin bezprostředně vedle aminokyseliny na určité pozici v přirozené sekvenci. Bezprostředně vedle aminokyseliny znamená, že je spojena s funkční α-karboxylovou skupinou nebo α-aminoskupinou aminokyseliny. „Deleční“ varianty jsou takové, které mají jednu nebo více aminokyselin v přirozené aminokyselinové sekvenci odstraněny. Obyčejně budou mít deleční varianty jednu nebo více aminokyselin odstraněny v určité oblasti molekuly.

Termíny „buňka“, „buněčná linie“ a „buněčná kultura“ jsou při používání zaměňovány a všechna taková označení zahrnují potomstvo. Je dohodnuto, že veškeré potomstvo nemusí být přesně shodné, pokud se týká DNA obsahu, což je způsobeno úmyslnými nebo neuváženými mutacemi. Je sem také zahrnuto mutované potomstvo, které má tytéž funkce nebo biologické vlastnosti, které jsou vyhledávány u původně transformovaných buněk.

„Hostitelské buňky“ používané v předkládaném vynálezu jsou obecně prokaryotičtí nebo eukaryotičtí hostitelé. Příklady vhodných hostitelských buněk jsou popsány v sekci B. Vektory, hostitelské buňky a rekombinacní metody: (vii) Selekce a transformace hostitelských buněk.

„Transformace“ znamená vnesení DNA do organizmu tak, že DNA je repliko vatě Iná buď jako extrachromozomální element nebo díky integraci do chromozomu.

„Transfekce“ označuje přijmutí expresního vektoru hostitelskou buňkou bez ohledu na to, zdaje jakákoli kódující sekvence ve skutečnosti exprimována.

-7CZ 300724 B6

Termín „transfekovaná hostitelská buňka” a „transformovaný” označuje vnesení DNA do buňky. Buňka se nazývá „hostitelská buňka“ a může být buď prokaryotická nebo eukaryotická. Typické prokaryotické hostitelské buňky jsou různé kmeny E. coli. Typické eukaryotické hostitelské buňky jsou savčí, jako jsou buňky z vaječníku čínského křečka (Chinese hamster ovary cells) nebo buňky lidského původu. Vnesená DNA sekvence může pocházet ze stejného druhu jako hostitelská buňka, může pocházet z jiného druhu než hostitelská buňka nebo to může být hybridní DNA sekvence, která obsahuje některé cizí a některé homologní DNA.

to Termín ,aplikovatelný expresní vektor“ a „expresní vektor“ označují kusy DNA, obvykle dvojvláknové, která může mít vložený kus cizí DNA. Cizí DNA je definována jako heterologní DNA, což je DNA, která se přirozeně nenalézá v hostitelské buňce. Vektor se používá k přenosu cizí nebo heterologní DNA do vhodné hostitelské buňky. Jakmile se nachází v hostitelské buňce, vektor se může replikovat nezávisle na hostitelské chromozomální DNA a může se tak vytvořit několik kopií vektoru a v něm vložené (cizí) DNA.

Termín „vektor“ znamená DNA konstrukt obsahující DNA sekvenci, která je operativně vázána ke vhodným kontrolním sekvencím, schopným ovlivňovat expresi DNA ve vhodném hostiteli. Takové kontrolní sekvence zahrnují promotor ovlivňující transkripci, popřípadě operační sekven20 ce pro kontrolu této transkripce, sekvenci kódující vhodná ribozomální vazebná místa pro mRNA a sekvence, které kontrolují ukončení transkripce a translace. Vektor může být plazmid, fágová částice nebo jednoduše genomický inzert. Pokud je jednou transformován do vhodného hostitele, vektor se může replikovat a fungovat nezávisle na genomu hostitele, nebo se může v některých případech integrovat do samotného genomu. V tomto výčtu se používání výrazů „plazmid“ a „vektor“ vzájemně zaměňuje, protože v současnosti je plazmid obecněji užívaná forma vektoru. Avšak vynález hodlá zahrnout jiné formy vektoru, takové, které mohou poskytnout rovnocenné funkce, a které jsou známé v tomto oboru. Typické expresní vektory pro expresi v savčích buněčných kulturách např. jsou založeny na pRK5 (EP 307 247), pSV16B (WO 91/08291) a pVL1392 (Pharmigen).

„Lipozóm“ je malý váček, složený z různých typů lipidů, fosfolipidů anebo povrchově aktivních látek, který je vhodný pro přenos léčiv (jako jsou zde popisované mutované protilátky nebo popřípadě chemoterapeutická činidla) do savců. Složky lipozómu se obvykle nacházejí ve dvojvrstevném uspořádání, podobném uspořádání lipidů v biologických membránách.

Výraz „kontrolní sekvence“ označuje DNA sekvence nezbytné pro expresi operačně vázaných kódujících sekvencí v určitém hostitelském organizmu. Kontrolní sekvence, které jsou vhodné např. pro prokaryota, obsahují promotor, popřípadě operační sekvence a ribozomální vazebné místo. O eukaryotických buňkách se ví, že využívají promotory, polyadenylační signály a zesilovače.

„Izolovaná“ molekula nukleové kyseliny je taková molekula nukleové kyseliny, která je rozeznána a oddělena od přinejmenším jedné kontaminující molekuly nukleové kyseliny s níž je obyčejně sdružena v přirozeném zdroji nukleových kyselin, kódujících protilátky. Tvar nebo uspořádání izolované molekuly nukleové kyseliny jsou jiné, než v jakých se nachází v přírodě. Izolované molekuly nukleové kyselinyjsou proto rozlišitelné od molekul nukleové kyseliny, jak existují v přirozených buňkách. Ale izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahuje molekulu nukleové kyseliny obsaženou v buňce, která obyčejně exprimuje protilátku, kde se však např. umístění molekuly nukleové kyseliny na chromozomu liší od umístění v přirozené buňce.

Nukleová kyselina je „operačně vázaná“ když je umístěna do místa s funkčním vztahem s jinou sekvencí nukleové kyseliny. Může to být gen a regulační sekvence, které jsou spojeny takovým způsobem, zeje umožněna exprese genu, pokud jsou vhodné molekuly (např. proteiny aktivující transkripci) vázány k regulační sekvenci (sekvencím). Například DNA kódující presekvenci neboli sekreční vedoucí sekvenci je operačně vázaná k DNA pro polypeptid, pokud je exprimo-8C£ JUU/Z4 BO vána jako preprotein, který se účastní sekrece polypeptidu; promotor nebo zesilovač je operačně vázán ke kódující sekvenci, jestliže ovlivňuje transkripci sekvence; nebo vazebné místo na ribozomu je operačně vázáno ke kódující sekvenci, jestliže ovlivňuje transkripci sekvence; nebo vazebné místo na ribozomu je operačně vázáno ke kódující sekvenci, jestliže je umístěno tak, že usnadňuje translaci. Obecně řečeno, „operačně vázaná“ znamená, že vázané DNA sekvence spolu sousedí a v případě sekreční vedoucí sekvence spolu sousedí a rovněž navazují jejich Čtecí rámce. Avšak zesilovače nemusí bezprostředně sousedit. Spojení se provádí ligaci ve vhodných restrikčních místech. Pokud taková místa neexistují, použijí se, jak je v praxi běžné, syntetické oligonukleotidy nebo adaptéry.

io „Ošetření“ označuje jak léčbu, tak proťylaktická nebo preventivní opatření. Osoby, které potřebují ošetření jsou jak ty, které již poruchou trpí, tak ty, u kterých má být vzniku poruchy zabráněno.

„Porucha“ je jakýkoli stav, který by se mohl zlepšit po ošetření pomocí polypeptidu. Patří sem chronické a akutní poruchy nebo nemoci, včetně těch patologických stavů, které predisponují savce ke vzniku poruchy.

Termín „imunosupresivní prostředek“ používaný zde pro přídavnou terapii, označuje sloučeniny, které působí tak, že potlačují nebo maskují imunitní systém hostitele, jemuž je štěp transplanto20 ván. Sem patří sloučeniny, které potlačují produkci cytokinů, snižují nebo potlačují expresi autoantigenů, nebo maskují MHC antigeny. Příklady takových prostředků jsou 2-amino-5-aryl-5pyrimidiny (viz US 4 665 077), azathioprin (nebo cyklofosfamid, v případě nepříznivé reakce na azathioprin), bromocryptin; glutaraldehyd (který maskuje MHC antigeny, popsáno v US 4 120 649); anti-idiotypické protilátky proti MHC antigenům a NHC fragmentům; cyklosporin

A; steroidy jako je glukokortikosteroidy, např. prednizon, metylprednizon a dexamethazon; cytokin nebo antagonisté cytokinových reeeptorů jako jsou protilátky proti interferonům -γ, -β nebo -α; protilátky proti tumor neerosis faktoru a; protilátky proti tumor neerosis faktoru β; protilátky proti interleukinu-2 a protilátky proti reeeptorů pro interleukin-2; protilátky proti L3T4; heterologní antilymfocytámí globulin; protilátky pan-T, výhodně protilátky anti-CD3 nebo anti-CD4/CD4a; rozpustný peptid obsahující vazebnou doménu kLFA-3 (WO 90/08187 publikováno 26.7.1990); streptokináza; TGF-β; streptodomáza; RNA nebo DNA z hostitele; FK506; RS-61443; deoxyspergualin; rapamycin; receptor T-buněk (US 5 114 721); fragmenty reeeptorů

T-buněk (Offher a kol., Sdewce 251: 430-432 (1991); WO 90/11294 a WO 91/01133) a proti35 látky proti reeeptorů T-buněk (EP 340 109) jako jsou T10B9. Tyto prostředky jsou podávány buď současně sCDlla protilátkami nebo vjiných časových okamžicích a jsou užívány v týchž nebo menších dávkách, než se v oboru obyčejně používají. Výhodný přídavný imunosupresivní prostředek závisí na mnoha faktorech, včetně typu léčené poruchy, typu provedené transplantace a historie pacienta, ale obecné se dává přednost výběru ze skupiny cyklosporin A, glukokortiko40 steroid (nejvýhodněji prednizon nebo methylprednizolon), monoklonální protilátky OKT-3, azathioprin, bromocryptin, heterologní antilymfocytámí globulin nebo směsi uvedených látek.

Termín „rakovina“ nebo „rakovinný“ označuje nebo popisuje takový fyziologický stav u savce, kteiý lze typicky charakterizovat jeho nekontrolovaným buněčným růstem. Příklady rakovin jsou mimo jiné karcinom, lymfom, blastom, sarkom a leukémie. Zvláštními příklady těchto rakovin jsou rakovina dlaždicových buněk, rakovina malých plieních buněk, rakovina „non-small“ plicních buněk, rakovina trávicího ústrojí, rakovina slinivky, glioblastom, rakovina děložního čípku, rakovina vaječníků, rakovina jater, rakovina močového měchýře, hepatom, rakovina prsu, rakovina tlustého střeva, rakovina konečníku, rakovina děložní sliznice, rakovina slinných žláz, rako50 vina ledvin, rakovina ledvinových pánviček, rakovina prostaty, rakovina rodidel, rakovina štítné žlázy, hepatokarcinom a různé typy rakoviny hlavy a hrdla.

-9CZ 300724 B6 „Savec“ pro účely ošetřování označuje kteréhokoli živočicha, patřícího mezi savce, včetně lidí, domácích a farmových zvířat, primátů mimo člověka, zvířata v zoologických zahradách, zvířata užívaná pro sport, zvířata chovaná pro zábavu, jako jsou psi, koně, kočky, hovězí dobytek atd.

Termín „označený epítopem“ zde použitý, označuje polypeptid, který je zfázován s “epitopovou značkou“. Polypeptid epitopové značky má dosti zbytků, že poskytuje epitop, proti němuž může vzniknout protilátka, je však natolik krátký, že neinterferuje s aktivitou polypeptidu. Je výhodné, když epitopová značka je natolik jedinečná, že protilátky proti ní namířené v podstatě křížově nereagují sjinýmí epitopy. Vhodné značkové polypeptidy mají obecně nejméně 6 aminokyseliio nových zbytků a obvykle 8 až 50 aminokyselinových zbytků (s výhodou mezi 9 až 30 zbytky). Příkladem jsou flu HA epitopová značka a její protilátka 12CA5 (Field a kok, Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); značka c-myc a protilátky 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 a 9E10 proti ní (Evans a kol., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3 610-3 616 (1985)) a značka glykoproteinu D viru herpes simplex (gD) a její protilátka (Paborsky a kok, Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)). Při jistých provedeních je epitopovou značkou „záchranný epitop vázaný k reeeptorů“.

Zde používaný termín „záchranný epitop vázaný k reeeptorů“ označuje epitop Fc oblasti molekuly IgG (např. IgG_b IgG₂, IgG₃ nebo IgG₄), který odpovídá za zvýšení invivo poločasu IgG molekuly v séru.

Termín „cytotoxický prostředek“ je zde použit k označení látky, která inhibuje nebo brání funkci buněk anebo způsobuje destrukci buněk. Je zamýšleno aby termín zahrnoval radioaktivní izotopy (např. I¹³¹, I^12S, Y⁹⁰ a Re¹⁸⁶), chemoterapeutické prostředky a toxiny, jako jsou enzymaticky aktivní toxiny bakteriálního, houbového, rostlinného nebo živočišného původu, nebo jejich fragmenty.

„Chemoterapeutický prostředek“ je chemická sloučenina užitečná při léčení rakoviny. Příklady chemoterapeutických prostředků jsou Adrimycin, Doxorubicin, 5-fluorouracil, cytozin arabinozid („ara-C“), Cyclophosphamide, thiotepa, Taxotere (docetaxel), Bulsulphan, Cytoxin, Taxol, Methotrexata, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposide, Ifosfamide, Mitomy30 cin C, Mitoxantrone, Vincristin, Vinorelbine, Carboplatin, Teniposide, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, esperamyciny (viz US 4 675 187), Melphalan a jiné příbuzné dusíkaté látky.

Termín „prekurzor léku je použit v této přihlášce k označení prekurzoru nebo derivované formy farmaceuticky účinné látky, která je méně cytotoxická k nádorovým buňkám ve srovnání s vlastním lékem aje schopna být enzymaticky aktivována nebo převedena do aktivnější formy vlastního léku. Viz např. Willman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy,“ Biochemical Society Transactions, 14, str. 375-382, 615 Meeting, Belfast (1986) a Stella a kol., (vyd.), „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,“ Directed Drug Delivery, Borchardt a kok, (vyd.), str. 247-267, Human Press (1985). Prekurzoiy léků v této přihlášce zahrnují mimo jiné prekurzory léků obsahující fosforečnan, prekurzory léků obsahující thiofosforečnan, prekurzoiy léků obsahující síran, prekurzory léků obsahující peptid, prekurzory léků obsahující modifikované D-aminokyseliny, glykozylované prekurzory léků, prekurzory léků obsahující β-laktamový kruh, volitelně substituované prekurzory léků obsahující fenoxyacetamid nebo volitelně substi45 tuované prekurzory léků obsahující fenylacetamid, prekurzory léků obsahující 5-fluorocytozin a jiné 5-fluorouridiny, které mohou být přeměněny na aktivnější cytotoxický volný lék. Příklady cytotoxických léků, které mohou být pozměněny na prekurzorovou formu pro použití v rámci tohoto vynálezu, jsou mimojiné chemoterapeutické prostředky uvedené výše.

Slovo „značení“ pokud je zde použito, označuje detekovatelnou sloučeninu nebo prostředek, které jsou přímo nebo nepřímo připojeny k protilátce. Značení může být detekovatelné buď samo o sobě (např. radioizotopové značení nebo fluorescenční značení) nebo, jako v případě enzymatického značení může kata lyžovat chemické změny substrátové sloučeniny nebo prostředku, které jsou detekovatelné.

_ m _

ML JUU/Z4 Βϋ

Zde používaný výraz „pevná fáze“ znamená ve vodě nerozpustnou základní hmotu, k níž se může přichytit protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu. Příkladem zde použitých pevných fází jsou ty, které jsou vytvořeny Částečně nebo úplně ze skla (např. sklo s kontrolovanou velikostí pórů), polysacharidy (např. agaróza), polyakrylamidy, polystyren, polyvinylalkohol a silikony. Při některých provedeních, podle souvislostí, může pevná fáze zahrnovat jamku testovací destičky; v jiných provedeních je to purifikaění sloupec (např. sloupec afinitní chromatografie). Tento termín také zahrnuje nespojitou pevnou fázi oddělených částic, jako jsou ty, které jsou popsány v US 4 275 149.

io

Zde používaný výraz protilidská IgE protilátka znamená protilátku, která se váze k lidskému IgE takovým způsobem, že inhibuje nebo podstatně snižuje vazbu takového IgE na vysoceafinní receptor FceRI s výhodou je touto anti-IgE protilátkou E-25.

is Zde používaný termín „porucha vyvolaná IgE“ znamená stav nebo nemoc, která je charakterizována nadprodukcí imunoglobulinu IgE anebo přecitlivělostí k imunoglobulinu IgE. Přesněji interpretováno, jedná se o stavy spojené s anafylaktickou přecitlivělostí a atopickými alergiemi, včetně např. astmatu, alergické rýmy a zánětu oční spojivky (senná rýma), ekzému, kopřivky a alergií na potravu. Avšak i vážný fyziologický stav anafylaktického šoku, který je obyčejně vyvolán včelím žihadlem, hadím uštknutím nebo parenterálním podáním léku je také v rámci tohoto termínu zahrnut.

Zde používaný výraz „afinitní maturace s prezentací na fágových partikulích“ (AMPD) označuje postup popsaný v Lowman a kol., Biochemistry 30(45): 10 832-10 838 (1991), viz též Hawkins a kol., J. Mol. Biol. 254: 889-896 (1992). Proces může být krátce popsán takto (provedení však není na tento popis doslovně omezeno): několik míst v hypervariabílní oblasti (např. 6 až 7 míst) je mutováno tak, aby byly vytvořeny všechny možné aminokyselinové substituce v těchto místech. Takto vytvořené mutované protilátky jsou prezentovány v monovalentní podobě na fágových částicích vláknitého fága, jako fůze s produktem genu III fága Ml3, který je zabalen v každé fágové částici. Fág exprimující různé mutanty může projít cykly vazebné selekce a následující izolace a sekvenování těch mutant, které vykazují vysokou afinitu. Postup je také popsán v WO 92/09690, vydáno 11.6.1992. Modifikovaný postup, obsahující prezentaci spojené afinity, je popsán v Cunningham, B.C. a kol., EMBOJ. 13(11), 2 508-2 515 (1994).

Postup poskytuje metodu pro výběr nových vazebných polypeptidů, skládající se z těchto kroků: a) konstrukce replikovatelného expresního vektoru, obsahujícího první gen, kódující polypeptid, druhý gen, kódující přinejmenším část přirozeného nebo standardního fágového obalového proteinu, kde první a druhý gen jsou heterologní, a transkripěně regulační prvek, operačně vázaný k prvnímu a druhému genu, čímž je vytvořena genová fuze, kódující fúzní protein; b) mutování vektoru na jedné nebo více vybraných pozicích uvnitř prvního genu čímž je vytvořena rodina příbuzných plazmidů; c) transformaci vhodných hostitelských buněk těmito plazmidy; d) infekce transformovaných hostitelských buněk pomocným fágem, který má gen kódující protein fágového obalu; e) kultivace transformovaných infikovaných hostitelských buněk v podmínkách, vhodných pro tvorbu rekombinantních fágemídových částic, obsahujících přinejmenším část plazmidu a schopných transformovat hostitele, podmínky jsou uspořádány tak, že pouze malé množství fágemídových částic prezentuje více než jednu kopii fuzního proteinu na povrchu své částice; f) umožnění styku fágemídových částic s cílovou molekulou tak, že přinejmenším část fágemidových částic se k cílové molekule váže; e) oddělení fágemídových částic, které se vážou od těch, které nikoli, s výhodou metoda dále obsahuje transformaci vhodných hostitelských buněk těmi rekombinantními fágemidovými částicemi, které se vázaly k cílové molekule a opakování kroků d) až g) jednou nebo vícekrát.

Jako další možnost, metoda zahrnuje polypeptidy, skládající se z více než jedné subjednotky, kdy repli kováte lný expresní vektor, obsahující transkripěně regulační prvek, operačně vázaný k DNA kódující požadovanou subjednotku, je fúzován s fágovým obalovým proteinem.

-llcz 300724 B6

Zde používaný termín „protilátková fágová knihovna“ označuje fágovou knihovnu používanou v afinitním maturačním procesu popsaném výše a v Hawkins a kol., J. Mol. Biol. 254: 889-896 (1992) a v Lowman a kol,, Biochemistry 30(45): 10 832-10 838 (1991), Každá knihovna obsa5 huje hypervariabilní oblast (tj. 6 až 7 míst) na nichž jsou vytvořeny všechny možné aminokyselinové substituce. Takto vytvořené mutované protilátky jsou prezentovány v monovalentní podobě fágovými částicemi jako fuze s produktem genu III fága M13, který je zabalen v každé fágové částici a vystaveny na povrchu fága.

io Zde používaná „teplota místnosti“ má být 23 °C až 25 °C.

Zde používaný termín „vazebný polypeptid“ označuje jakýkoli polypeptid, který se váže se selektivní afinitou k cílové molekule, s výhodou bude polypeptid protein, a nej výhodněji takový, který obsahuje více než 100 aminokyselin. V typickém případě bude polypeptid hormon nebo protilátka nebo jejich fragmenty.

Zde používaný termín „vysoká afinita“ označuje afinitní konstantu (Kd)<10 ⁵M, výhodněji <10^-7 M za fyziologických podmínek.

Zde používaný termín „cílová molekula“ označuje jakoukoli molekulu, nemusí to být nezbytně protein, proti níž je žádoucí vytvořit protilátky nebo ligand. Dává se však přednost tomu, že cílem bude protein a nejvíce se preferuje, když cílem bude antigen. Avšak i receptory, jako jsou receptory pro hormony, by měly být zvláště v tomto termínu zahrnuty.

Zde používané číslování aminokyselinových zbytků v imunoglobulinech, včetně číslování aminokyselin v peptidech, odpovídajících určitým částem IgE, mutovaných IgE molekul a chimemích IgE molekul je prováděno systémem číslování aminokyselinových zbytků v imunoglobulinech podle Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD 1987).

Způsoby provedení vynálezu

I. Metody zdokonalení afinity k cílové molekule

A. Určení izomerizovatelných zbytků kyseliny asparagové.

Při praktickém provádění předkládaného vynálezu může být určení izomerizovatelných zbytků kyseliny asparagové, náchylných k izomerizaci, provedeno kterýmkoli postupem, známým osobám s běžnou zkušeností v tomto oboru. Například Cacia a kol., Biochemistry 35, 1897-1903 (1996) popisuje postup, kdy anti-IgE protilátka E-25 (která obsahuje zbytky -Asp-Gly-) je inkubována při 37 °C po dobu 21 dní. Určení izomerizovaných -Asp-Gly- bylo uskutečněno chromatografickou a hmotnostní spektrometrickou analýzou fragmentů po působení proteázy a bez tohoto působení. Protože bylo popsáno, že izomerizace nastává u zbytků kyseliny asparagové (T. Geiger a S. Clarke, J. Biol. Chem. 262(2), 785-794 (1987), předkládaný vynález může také být použit pro systematické hodnocení a zdokonalení polypeptidů, obsahujících zbytky kyseliny asparagové.

B. Výběr alternativních zbytků, zdokonalujících afinitu k cílové molekule

Osoby s běžnou zkušeností v tomto oboru mají na výběr mnoho technik, které umožňují optimalizaci aktivity pro receptor. Typicky všechny tyto techniky používají substituci různých aminokyselinových zbytků ve studovaném místě po čemž následuje hromadné vyšetřování receptorové aktivity u mutovaných polypeptidů. Výhodná technika pro použití v rámci předkládaného vynálezu je afinitní maturace s prezentací na fágových partikulích (Hawkins a kol., J. Mol. Biol. 254: 889-896 (1992); Lowman a kol., Biochemistry 30(45): 10 832-10 838 (1991). Krátce řečeno, několik míst v hypervariabilní oblasti (např. 6 až 7 míst) je mutováno tak, aby byly vytvořeny

CZ JUU7Z4 B6 všechny možné aminokyselinové substituce v těchto místech. Takto vytvořené mutované protilátky jsou prezentovány v monovalentní podobě částicemi filamentózního fága jako fuze s produktem genu III fága M13, který je zabalen v každé fágové Částici. Fág exprimující různé mutanty může projít cykly vazebné selekce a následující izolace a sekvenování těch mutant, které vykazují vysokou afinitu.

Způsob selekce nových vazebných polypeptidů s výhodou používá knihovnu strukturálně příbuzných polypeptidů. Knihovna strukturálně příbuzných polypeptidů, fúzovaná k proteinu fágového obaluje vytvořena mutagenezí aje výhodné, když jedna kopie každého příbuzného polypeptidu je prezentována na povrchu fágemidové částice, obsahující DNA, která tento polypeptid kóduje. Tyto fágemidové částice jsou pak uvedeny do styku s cílovou molekulou a ty částice, které mají nejvyšší afinitu pro cílovou molekulu jsou odděleny od těch, které mají afinitu nízkou. Částice s vysokou afinitou jsou pak pomnoženy pomocí infekce bakteriálních hostitelů a krok kompetitivního vázání k cílové molekule je opakován. Postup je opakován, dokud nejsou získány poly15 peptidy s požadovanou afinitou.

Jinou možností je použít multivalentního fága (McCafferty a kol. (1990), Nátuře 348, 552-554; Clackson a kol. (1991), Nátuře 352, 624-628) pro exprimování náhodných bodových mutací (vytvořených pomocí DNA polymerázy se sklonem k chybám) a vytvořit tak knihovnu fágových proti látkových fragmentů, která pak může být hromadně prohledávána na základě jejich afinity k antigenu. Hawkins a kol., (1992) J. Mol Biol 254: 889-896.

Je výhodné, když během afinita ího naturačního procesu je replikovatelný expresní vektor pod pevnou kontrolou transkripčně regulačního elementu a kultivační podmínky jsou nastaveny tak, že množství nebo počet fágemidových částic, prezentujících více než jednu kopii fíizního proteinu na svém povrchu je menší než 1 %. Je též výhodné, když množství fágemidových částic prezentujících více než jednu kopii fuzního proteinu je menší než 10 % z množství fágemidových částic prezentujících jednu kopii fuzního proteinu. Nejvýhodnější množství je menší než 20 %.

V metodě, která je předmětem tohoto vynálezu je typické, že expresní vektor bude dále obsahovat sekreční signální sekvence, fúzované kDNA kódující každou subjednotku polypeptidu a transkripčně regulačním elementem bude promotorový systém. Výhodné promotory jsou vybírány z těchto systémů: LacZ, X_PL, TC, T7 polymeráza, tryptofan a alkalická fosfatáza ajejich kombinace.

Také je typické, že první gen bude kódovat savčí protein, s výhodou to bude anti-IgE protilátka. Další protilátky jsou uvedeny v sekci II.A. Příprava protilátek (vi) multispecifické protilátky (nutno mít na paměti, že protilátky nemusí být multispecifické). Mezi další polypeptidy jsou zahrnuty lidský růstový hormon (hGH), N-methionylový derivát lidského růstového hormonu, hovězí růstový hormon, hormon prištítných tělísek, thyroxin, A-řetězec inzulínu, B-řetězec inzulínu, proinzulín, A-řetězec relaxínu, B-řetězec relaxínu, prorelaxín, glykoproteinové hormony jako je hormon stimulující folikuly (FSH), hormon stimulující štítnou žlázu (TSH) a luteinizační hormon (LH), glykoproteinové receptory hormonů, kalcitonin, glukagon, faktor VIII, povrchově aktivní látky plic, urokináza, streptokináza, lidský aktivátor plazminogenu tkáňového typu (tPA), bombesin, faktor IX, thrombin, krvetvorný růstový faktor, tumor necrosis faktory alfa a beta, lidský sérový albumin, mullerian-inhibující substance, myší peptid asociovaný s gonadotropinem, mikrobiální protein jako je β-laktamáza, protein tkáňového faktoru, inhibin, aktivin, růstový faktor cévní výstelky, receptory pro hormony nebo růstové faktory, integrin, thrombopoíetin, protein A nebo D, reumatoidní faktory, nervové růstové faktory jako jsou NGF-β, růstový faktor krevních destiček, transformační růstové faktory (TGF) jako jsou TGF-alfa a

TGF-beta, insulinu podobný růstový faktor-I a -II, vazebné proteiny insulinu podobného růst.faktoru, CEM, DNáza, latency-associated peptid, erythropoietin, kostní růstové faktory, interferony jako jsou interferon-alfa, -beta a -gama, faktory stimulující růst kolonií (CSFs) jako jsou M-CSF, GM-CSF a G-CSF, interleukiny (lis) jako jsou IL—1, IL-2, IL-3, IL-4, superoxid dismutáza, faktory urychlující rozpad, virové antigeny, obalové proteiny HIV jako jsou GP120,

-13CZ 300724 B6

GP140, atrial natriuretic peptidy A, B nebo C, imiinoglobuliny a fragmenty kteréhokoli zvýše uvedených proteinů.

Je výhodné, když první gen bude kódovat polypeptid jedné nebo více subjednotek, obsahující více než 100 aminokyselinových zbytků a bude prostorově uspořádán aby vytvořil většinu pevných sekundárních struktur, které budou prezentovat většinu aminokyselin schopných interakce s cílovou molekulou. Je výhodné, když první gen bude v kodonech odpovídajících pouze aminokyselinám, schopným interagovat s cílovou molekulou, takže integrita pevných sekundárních struktur bude zachována.

io

Normálně metoda, která je předmětem tohoto vynálezu, používá pomocného fága vybraného ze skupiny: M13K.O7, M13R408, M13-VCS a Phi X 174. Výhodný pomocný fág je M13KO7 a výhodný obalový protein je M13 gen—IL Výhodný hostitel je £. coli, kmeny £. coli deficientní na proteázu. Byly detekovány nové varianty hGH, vybrané metodou, která je předmětem tohoto vynálezu. Fágemidové expresní vektory byly konstruovány tak, že obsahují suprimovatelný terminační kodon, funkčně umístěný mezi nukleovými kyselinami kódujícími polypeptid a protein fágového obalu.

1. Výběr polypeptidů pro prezentaci na povrchu fága

Opakované kroky selekce „polypeptidu“ se používají při selekci fágemidů pro výběr stále vyšší a vyšší afinity vazby z mnoha aminokyselinových změn. Po prvním kroku selekce fágemidů, zahrnující první oblast selekce aminokyselin v ligandů nebo polypeptidu protilátky se provádějí další kroky selekce fágemidů pro jiné oblasti nebo aminokyseliny v ligandů. Cykly selekce fágemidů se opakují, dokud nejsou dosaženy požadované afinitní vlastnosti. Pro ilustraci tohoto procesu byly opakované kroky provedeny v příkladu 4 - prezentace fága. Spojená afinita, kombinace mutací z různých CDR, atd.

/předchozího plyne, že aminokyselinové zbytky, které tvoří vazebnou doménu polypeptidu, nebudou sekvenčně spojeny a mohou být umístěny na různých subjednotkách polypeptidu. Tedy vazebná doména rozeznává určitou sekundární strukturu na místě vazby a nikoli strukturu primární. Tedy obecně, mutace se budou vnášet do kodonů, kódujících aminokyseliny uvnitř určité sekundární struktury na místech spíše vzdálených od vnitřku molekuly, takže budou mít možnost interagovat s cílovým místem.

Není však požadováno, aby polypeptid, vybraný jako ligand nebo protilátka proti cílové molekule, se k této cílové molekule normálně vázal. Tak například, jako ligand pro FSH receptor může být vybrán glykoproteinový hormon jako je TSH, a knihovna mutovaných TSH molekul se použije v rámci postupu, který je předmětem tohoto vynálezu, pro vytvoření nových kandidátů na lék.

Tento vynález tedy uvažuje jakýkoli polypeptid, který se váže na cílovou molekulu, zvláště pak protilátky. Přednost mají ty polypeptidy, které mají farmaceutické uplatnění. Příklady protilátek jsou vyjmenovány v oddílu II. A. Příprava protilátek (vi) multispecifické protilátky (nutno mít na paměti, že protilátky nemusí být multispecifické). Větší přednost je dávána těmto polypeptidům:

růstový hormon, včetně lidského růstového hormonu, des-N-methionylový derivát lidského růstového hormonu, a hovězí růstový hormon; hormon príštítných tělísek; hormon stimulující štítnou žlázu; thyroxin; A-řetězec inzulínu; B-řetězec inzulínu; prorelaxín; myší peptid asociovaný s gonadotropinem, mikrobiální protein jako je β-laktamáza; protein tkáňového faktoru; inhibin; aktivin; růstový faktor cévní výstelky; receptory pro hormony nebo růstové faktory;

integrin; thrombopoietin; protein A nebo D; reumatoidní faktory; nervové růstové faktory jako jsou NGF-β; růstový faktor odvozený z krevních destiček; růstové faktory fibroblastů jako jsou aTGF a bTGF, epidermální růstový faktor; transformační růstový faktor (TGF) jako je TGF-alfa a TGF-beta; insulinu podobný růstový faktor-I a -II; vazebné proteiny insulinu podobného růstového faktoru; CD-4; DNáza; latency-associated peptid; erythropoietin; kostní růstové fakto. 1Λ _

CZ JUU7Z4 B6 ry; jako je napr. část obalu HIV; imunoglobuliny; a fragmenty kteréhokoli zvýše uvedených proteinů. Navíc je možno jeden nebo více předem určených aminokyselinových zbytků v polypeptidu substituovat, vložit nebo odebrat, např. při vytváření produktů s vylepšenými biologickými vlastnostmi. Dále sem jsou zahrnuty fragmenty těchto polypeptidů, zvláště o biologicky aktivní fragmenty. Ještě větší přednost je v tomto vynálezu dávána lidskému růstovému hormonu, „atrial natriuretic“ peptidům A, B nebo C, endotoxinu, subtilizinu, trypsinu a jiným serinovým proteázám.

Dále jsou výhodné polypeptidové hormony, které lze definovat jako jakékoli sekvence amino10 kyselin, vytvářené jednou buňkou, které se specificky vážou na receptory na povrchu buňky buď téhož buněčného typu (autokrinní hormony) nebo jiného buněčného typu (non-autokrinní hormony) a vyvolávají fyziologickou odpověď, charakteristickou pro buňky, nesoucí receptory. Mezi takové polypeptidové hormony patří cytokiny, lymfokíny, neutrofilní hormony a adenohypofyzámí polypeptidové hormony, jako je růstový hormon, prolaktin, placentámí laktogen, luteini15 začni hormon, hormon stimulující folikuly, β-Iipotropin, γ-lipotropin a endorfiny; hormon inhibující uvolňování z hypothalamu jako jsou faktory uvolňující kortikotropin, hormon inhibující uvolňování růstového hormonu, faktor uvolňující růstový hormon ajiné polypeptidové hormony, jako jsou „atrial natriuretic“ peptidy A, B nebo C.

2. Získání prvního genu (gen 1) kódujícího požadovaný peptid

Gen kódující požadovaný peptid (napr. protilátku) může být získán postupy, známými v oboru (obecně viz Sambrook a kol., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989)). Pokud je sekvence genu známa, může být DNA, kódující gen, chemicky syntetizována (Merrifield, J.Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963)). Pokud sekvence genu známa není, nebo jestliže gen ještě nebyl dříve izolován, může být klonován z cDNA knihovny (připravené z RNA, získané z vhodné tkáně, v níž je požadovaný gen exprimován), nebo z vhodné genomové knihovny. Gen je potom izolován pomocí vhodné próby. Pro cDNA knihovny jsou vhodnými próbami monoklonální nebo polyklonální protilátky (za předpokladu, že cDNA knihovna je expresní knihovna), oligonukleotidy a komplementární nebo homologní cDNA nebo jejich fragmenty. Próby, které lze použít pro izolaci genu, o který se jedná, z genomových knihoven, jsou cDNA nebo jejích fragmenty, které kódují tentýž nebo podobný gen, homologní genomové DNA nebo DNA fragmenty a oligonukleotidy. Hromadné prohledávání cDNA nebo genomové knihovny pomocí vybrané próby se provádí standardními postupy, jak jsou popsány v kapitolách 10 až 12 Sambrook a kol., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989).

Jiným způsobem izolace genu, kódujícího požadovaný polypeptid (např. protilátku), je použití metodiky polymerázové řetězové reakce (PCR), jak je popsána v sekci 14 Sambrook a kol.,

Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989). Tato metoda vyžaduje použití oligonukleotidů, které budou hybridizovat s požadovaným genem, tedy přinejmenším část DNA sekvence tohoto genu musí být známa, aby bylo možno připravit oligonukleotidy.

Poté, co byl gen izolován, může být kvůli amplifikací vložen do vhodného vektoru (s výhodou plazmidu), jak je obecně popsáno v Sambrook a kol., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989).

3. Konstrukce replikujících se expresních plazmidů

Třebaže je k dispozici několik typů vektorů a lze je použít k provedení tohoto vynálezu, je zde dávána přednost plazmidovým vektorům, protože je lze relativně snadno konstruovat a mohou se snadno atnplifikovat. Plazmidové vektory obecně obsahují rozličné složky, mezi něž patří promotor, signální sekvence, fenotypově selektivní geny, místa počátku replikace ajiné nezbytné komponenty, jak je známo osobám s běžnou zkušeností v tomto oboru.

-15CZ 300724 B6

Mezi promotory, nejběžněji používané v prokaryotických vektorech, patří systém promotoru lac Z, promotor alkalické fosfatázy pho A, promotor bakteriofága IPL (promotor citlivý na teplotu), promotor tac (hybridní trp-lac promotor, který je regulován represorem lac), tryptofa5 nový promotor a promotor bakteriofága T7. Pro obecný popis promotorů viz sekci 17 v Sambrook a kol, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989). Zatímco toto jsou nejběžněji používané promotory, je možno rovněž použít i jiné vhodné mikrobiální promotory.

io Promotory výhodné pro realizaci předmětu tohoto vynálezu jsou takové, které lze dobře regulovat, takže exprese fúzního proteinu může být kontrolována. Pokud není exprese kontrolována a vede to k objevení se mnoha kopií fúzního proteinu na povrchu fágemidu, může to mít za následek mnohoěetné přichycení fágemidu k cílové molekule. Má se za to, že takové mnohotné přichycení, také nazývané „avidita“ nebo „chelátový efekt“, má za následek selekci falešných „vysoceafinních“ polypeptidů, a je způsobeno tím, že na fágemidové částici se vyskytuje ve vzájemné těsné blízkosti mnoho kopií fúzního proteinu tak, že s cílovou molekulou reagují chelačním typem vazby. Když se uskuteční mnohoěetné přichycení, výsledná nebo zdánlivá Kd se může rovnat součinu jednotlivých Kd pro každou kopii prezentovaného fúzního proteinu.

Pomocí těsné regulace exprese fúzního proteinu tak, že pouze minimální množství, tj. méně než asi 1 %, fágemidových částic obsahuje více kopií fúzního proteinu, je zamezeno „chelátovému efektu“ a umožněna vhodná selekce vysoceafinních polypeptidů. Tedy v závislosti na promotoru, kultivační podmínky jsou upraveny tak, aby byl maximalizován počet fágemidových částic, obsahujících jednu kopii fúzního proteinu a minimalizován počet fágemidových částic, obsahují25 cích více kopií fúzního proteinu.

Promotory výhodné pro realizaci předmětu tohoto vynálezu jsou promotor lac Z a promotor pho A. Promotor lac Z je regulován lac represorovým proteinem lac i, a tedy transkripci fúzního genu lze kontrolovat manipulací s hladinou lac represorového proteinu. Pro ilustraci, fágemid ao obsahující promotor lac Z je pěstován na buněčném kmeni, který obsahuje kopii represorového genu lac i, který je represorem pro promotor lac Z. Příkladem buněčných kmenů, které obsahují gen láci, jsou JM 101 a modré XL-1. Jinou možností je, že hostitelské buňky mohou být kotransfekovány plazmidem, obsahujícím jak represor lac i, tak promotor lac Z. V některých případech mohou být obě výše uvedené techniky použity současně, tj. fágemidové částice obsa35 hující promotor lac Z jsou pěstovány na buněčných kmenech, který obsahuje gen íaci, a tyto buněčné kmeny jsou kotransfekovány plazmidem, obsahujícím jak gen pro lac Z, tak gen pro lac i. Normálně, pokud chce někdo exprimovat gen, k výše uvedenému transfekovanému hostiteli by měl přidat induktor, jako je izopropyl thiogalaktozid (IPTG). V předkládaném vynálezu však je tento krok vynechán aby se (a) minimalizovala exprese fúzí genu III na počet fágemidových částic a (b) aby se zabránilo slabému nebo nevhodnému pakování fágemidových částic, které způsobují induktory, jako je IPTG, a to dokonce i v nízkých koncentracích. V typickém případě, když není přidán žádný induktor, počet fúzních proteinů na fágemidovou částici je vyšší než 0,1 (počet všech fúzních proteinů na počet fágemidových částic). Nej výhodnější promotor užívaný pro realizaci tohoto vynálezu je pho A. Má se za to, že tento promotor je regulován výší hladiny anorganického fosfátu v buňce, přičemž fosfát snižuje aktivitu promotoru. Tedy tím, že jsou buňky zbaveny fosfátu, je možno zvýšit aktivitu promotoru. Požadovaného výsledku je dosaženo pěstováním buněk v médiu obohaceném fosfátem, jako je např. 2YT nebo LB, čímž je kontrolována exprese fúzních genů III.

Jiná užitečná složka vektorů, používaných pro realizaci předmětu tohoto vynálezu, je signální sekvence. Tato sekvence je obyčejně umístěna bezprostředně proti směru přepisu (směr 5') od genu, kódujícího fuzní protein a bude tedy přepisována naNH2-konci fúzního proteinu. Nicméně v někteiých bylo ukázáno, že je signální sekvence umístěna na jiném místě, než na 5 konci genu, kódujícího protein, jež má být sekretován. Tato sekvence nasměruje protein, k němuž je přichy55 cena, přes vnitřní membránu bakteriální buňky. DNA kódující signální sekvenci může být získá1Á na působením restrikční endonukleázy jako fragment z kteréhokoli genu, kódujícího protein se signální sekvencí. Vhodné prokaryotické signální sekvence lze získat z genů kódujících například LaMB nebo OmpF (Wong a kol., Gene 68: 193 (1983)), MalE, PhoA a jiných genů. Výhodná prokaryotická signální sekvence pro realizaci tohoto vynálezu je signální sekvence z teplotně odolného enterotoxinu II(STII) £. coli, jak je popsáno v Chang a kol., Gene 55: 189 (1987).

Jiná užitečná složka vektorů, používaných pro realizaci předmětu tohoto vynálezu, jsou fenotypově selektivní geny. Typické fenotypově selektivní geny jsou takové, které kódují proteiny, jež propůjčují hostitelským buňkám rezistenci proti antibiotikům. Pro ilustraci, gen pro ampicilinoio vou rezistenci (amp) a gen pro tetracyklinovou rezistenci (tet), jsou pro tento účel snadno použitelné.

Konstrukce vhodných vektorů, nesoucích výše uvedené komponenty a rovněž geny, kódující popsaný polypeptíd (gen 1), jsou připraveny pomocí standardních DNA rekombinačních postupů, jak jsou popsány v Sambrook a kol., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor, New York, (1989). Izolované DNA fragmenty, které mají dohromady vytvořit vektor, jsou štěpeny a spojovány ve specifickém pořadí a orientaci, aby vytvořily požadovaný vektor.

DNA je štěpena pomocí vhodného restrikčního enzymu nebo enzymů ve vhodném pufru. Obecně se používá asi 0,2 až 1 pg plazmidu nebo fragmentů DNA spolu s asi 1 až 2 jednotkami vhod20 ného restrikčního enzymu v asi 20 μΐ roztoku pufru. Vhodné pufry, koncentrace DNA, inkubační doby a teploty jsou uvedeni výrobci restrikčních enzymů. Obecně jsou vhodné inkubační doby asi jedna až dvě hodiny při teplotě 37 °C, třebaže některé enzymy vyžadují vyšší teploty. Po inkubaci jsou enzymy a ostatní složky odstraněny extrakcí štěpícího roztoku pomocí směsi fenolu a chloroformu a DNA je z vodné frakce získána srážením pomocí etanolu.

Aby bylo možno spojit DNA fragmenty dohromady, aby vytvořily funkční vektor, konce DNA musí být vzájemně kompatibilní. V některých případech jsou konce kompatibilní přímo po Štěpení endonukleázou. Avšak může být nezbytné napřed převést lepivé konce, obecně vznikající endonukleázovým štěpením, na tupé konce, aby byla umožněno jejich vzájemné spojení. Aby došlo k zarovnání konců, na DNA je působeno deseti jednotkami Klenowova fragmentu DNA polymerázy I (Klenow) ve vhodném pufru po dobu nejméně 15 minut při teplotě 15 °C v přítomnosti čtyř deoxynukleotidtrifosfátů. DNA je poté čištěna fenol-chloroformovou extrakcí a srážením pomocí etanolu.

Štěpené DNA fragmenty mohou být rozděleny podle vělikosti a vybrány pomocí gelové elektroforézy DNA. DNA může být elektroforézována buď v agarózovém nebo polyakrylamidovém prostředí. Výběr prostředí závisí na velikosti DNA fragmentů, které se mají rozdělit. Po elektroforéze je DNA z prostředí gelu eluována elektroelucí nebo pokud byla jako gelové prostředí použita nízkotající agaróza, pak roztavením této agarózy a extrakcí DNA z ní, jak je popsáno v sekcích 6.30—6.33 v Sambrook a kol., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989).

Fragmenty DNA, které mají být spojeny dohromady (předem štěpené vhodnými restrikčními enzymy tak, že konce každého fragmentu, který bude ligován jsou kompatibilní), jsou přidány do roztoku asi v ekvimolámích množstvích. Tento roztok bude též obsahovat ATP, ligázový pufr a ligázu, jako je T4 ligáza v množství 10 jednotek na 0,5 pg DNA. Jestliže má být do vektoru ligován fragment DNA, vektor je napřed linearizován rozštěpením vhodnou restrikční endonuleázou (endonukleázami). Linearizovaný vektor je pak ošetřen alkalickou fosfatázou nebo fosfatázou z telecího střeva. Toto ošetření fosfatázou zabrání šelf-ligaci vektoru v průběhu ligačního so kroku.

Po ligaci je vektor s vloženým cizím genem transformován do vhodné hostitelské buňky. Při realizaci tohoto vynálezu je dávána přednost prokaryotům jako hostitelským buňkám. Vhodné prokaryotické hostitelské buňky jsou kmen £. coli M101, E. coli K12 kmen 294 (ATCC číslo 31 446), E. coli kmen W3110 (ATCC číslo 27 325), £. coli kmen X1776 (ATCC číslo 31 537),

- 17CZ 300724 B6

E. coli XL·-! Blue (stratagene) a E. coli B; nicméně mnohé další kmeny E. coli, jako jsou HB101, MN522, MN 538, NM539 a mnoho dalších druhů a rodů prokaryotů je možno použít rovněž. Mimo kmeny E. coli uvedené výše, mohou také být jako hostitelé použity bacily, jako je Bacillus subtilis, jiné enterobaktérie, jako je Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescens a různé druhy Pseudomonas.

Transformace prokaryotických hostitelských buněk je snadno provedena pomocí metody s chloridem vápenatým, jak je popsáno v sekci 1.82 v Sambrook a kol., Moleeular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989). Jinou možností, jak provést transit) formaci těchto buněk je použití elektroporace (Neumann a kol., EMBOJ. 1: 841 (1982)). Transformované buňky jsou vybírány pomocí růstu v přítomnosti antibiotik, běžně tetraeyklinu (tet) nebo ampicilinu (amp), proti nimž se stanou resistentní vlivem přítomnosti tet anebo amp genů ve vektoru.

Po selekci transformovaných buněk, jsou pěstovány kultury těchto buněk a plazmidová DNA (nebo DNA jiného vektoru s vloženým cizím genem) je izolována. Plazmidová DNA se může izolovat pomocí postupů v oboru známých. Dvěma vhodnými metodami jsou příprava DNA v malém množství a izolace velkého množství DNA jak jsou popsány v sekcích 1.25-1.33 v Sambrook a kol., Moleeular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989). Izolovaná DNA je potom čištěna pomocí postupů v oboru známých, jako jsou ty, popsané v sekci 1.40 v Sambrook a kol., Moleeular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989). Tato purifikovaná plazmidová DNA je potom analyzována restrikčním mapováním anebo pomocí sekvenování DNA. DNA sekvenování je obecně prováděno buď postupem Messing a kol., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) nebo metodou Maxam a kok, Meth.

£rtzyzwo/. 65: 499 (1980).

4. Genová fúze

Krok fágové afinity v předkládaném vynálezu vyžaduje fúzování genu, obsahujícího požadovaný polypeptid (gen 1) ke druhému genu (gen 2) tak, že během transkripce je vytvořen fúzní gen. Gen 2 je obyčejně gen pro obalový protein fága aje to přednostně gen III pro obalový protein fága Ml 3 nebojeho fragment. Fúze genů 1 a 2 může být provedena vložením genu 2 do určitého místa v plazmidu, který obsahuje gen 1, nebo vložením genu 1 do určitého místa v plazmidu, který obsahuje gen 2.

Vložení genu do plazmidu vyžaduje, aby byl plazmid rozštěpen přesně v místě, do kterého má být gen vložen, Tedy zde musí být místo pro restrikční endonukleázu (s výhodou jediné takové místo, takže plazmid bude v průběhu štěpení restrikční endonukleázou rozštěpen na tomto jediném místě). Plazmid je štěpen, opracován fosfatázou a čištěn, jak je popsáno výše. Poté je do tohoto linearizovaného plazmidu vložen gen pomocí ligace dvou DNA dohromady. Ligace může být provedena, pokud jsou konce plazmidu kompatibilní s konci vkládaného genu. Když jsou použity stejné restrikční enzymy pro štěpení jak plazmidu, tak pro izolaci genu, který má být do něho vložen, DNA mohou být ligovány přímo za použití ligázy jako je třeba ligáza z bakteriofága T4, a inkubace směsi probíhá po dobu 1 až 4 hodiny při 16 °C v přítomnosti ATP a ligázového pufru jak je popsáno v sekci 1.68 v Sambrook a kol., Moleeular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989). Pokud konce nejsou kompatibilní, musí být nejprve zarovnány pomocí Klenovova fragmentu DNA polymerázy I nebo DNA polymerázy bakteriofága T4, přičemž obě vyžadují všechny 4 deoxyribonukleotidtrifosfáty pro zaplnění přečnívajících jednořetězcových konců štěpené DNA. Jinou možností, jak zarovnat konce, je použití nukleázy jako je nukleáza Sl nebo mung-bean nukleáza, kdy obě způsobí odstřižení přečnívajících jednořetězcových úseků DNA. DNA je potom ligována pomocí ligázy, jak bylo popsáno výše. V některých případech může být nemožné zarovnat konce vkládaného genu, protože by se pozměnil čtecí rámec. Aby se obešel tento problém, mohou se užít oligonukleotidy, Linkery slouží jako můstky, spojující plazmid a vložený gen. Tyto linkery mohou být vytvořeny synte55 ticky jako dvouřetězcové nebo jednořetězcové DNA pomocí standardních postupů. Linkery mají _ 1 2 _ jeden konec kompatibilní s konci vkládaného genu; linkery jsou napřed ligovány k tomuto genu pomocí ligačních postupů uvedených výše. Druhý konec línkem je navržen tak, aby byl kompatibilní pro ligací s plazmidem. Při navrhování linkerů musí být věnována pozornost tomu, aby nedošlo k narušení čtecího rámce vkládaného genu nebo čtecího rámce genu, obsaženého aminokyseliny nebo že kódují jednu či více aminokyselin.

Mezi genem 1 a genem 2 může být vložena DNA, kódující terminační kodony, jako jsou terminační kodóny UAG (amber), UAA (ochre) a UGA (opel), Microbiology, Davies a kol., Harper & io Row, New York, 1980, str. 237, 245 až 47 a 274). Terminační kodóny exprimované v hostitelských buňkách standardního typu mají za následek syntézu bílkovinného produktu genu 1 bez připojeného proteinu genu 2. Avšak výsledkem růstu v supresorových hostitelských buňkách vede k syntéze detekovatelných množství fúzovaného proteinu. Takové supresorové hostitelské buňky obsahují tak modifikované tRNA, které vloží aminokyselinu na pozici terminačního kodónu v mRNA, což vede k syntéze detekovatelných množství fázovaného proteinu. Takové supresorové hostitelské buňky jsou dobře známy a popsány, jako jsou E. coli supresorový kmen (Bullock a kol., Biotechnologie 5, 376-379 (1987)). Pro umístění terminačního kodónu v mRNA, kódující fuzní polypeptid, lze použít jakoukoli vhodnou metodu.

Suprimovatelné kodóny mohou být vloženy mezi genem 1, kódujícím polypeptid a druhým genem 2, kódujícím přinejmenším část proteinu fágového obalu. Jiná možnost je, suprimovatelné terminační kodóny mohou být vloženy vedle fuzního místa tak, že zamění poslední aminokyselinový triplet v polypeptidu nebo první aminokyselinu v proteinu fágového obalu. Když je fágemid, obsahující suprimovatelný terminační kodón, pěstován v supresorových hostitelských buňkách, následkem je detekovatelná syntéza množství fúzovaného polypeptidu, obsahujícího polypeptid a protein fágového obalu. Když je fágemíd pěstován v nesupresorových hostitelských buňkách, následkem je syntéza polypeptidu v podstatě bez fuze s proteinem fágového obalu, což je způsobeno terminací na vloženém suprimovatelném terminaČním kodónu, kódujícím UAG, UAA a UGA. V nesupresorových buňkách je polypeptid syntetizován a sekretován z hostitels30 kých buněk kvůli nepřítomnosti fúzovaného proteinu fágového obalu, který jej jinak ukotví k hostitelských buňce.

5. Změny (mutace) genu 1 na vybraných místech.

Gen 1, kódující požadovaný polypeptid, může být změněn na jednom nebo více vybraných místech. Avšak zbytky, odpovídající izomerizovatelným zbytkům kyseliny asparagové změněny být musí. Změna je definována jako náhrada, odstranění nebo vložení jednoho nebo více kodonů do genu kódujícího polypeptid, které mají za následek změnu aminokyselinové sekvence polypeptidu ve srovnání s nezměněnou nebo přirozenou sekvencí téhož polypeptidu. Je výhodné provést změny náhradou přinejmenším jedné aminokyseliny jakoukoli jinou aminokyselinou, v jedné nebo více oblastech molekuly. Změny lze provést pomocí množství postupů, v oboru známých. Takovými postupy jsou mimo jiné mutageneze pomocí oligonukleotidů a mutageneze pomocí kazet.

a) Mutageneze pomocí oligonukleotidů

Metodě mutageneze pomocí oligonukleotidů je dávána přednost při přípravě substitučních, delečních a inserčních variant genu 1. Tato technika je v oboru dobře známa a je popsána v Zoller a kol., Nucleic Acids Res. 10: 6 487-6 504 (1987). Krátce řečeno, gen 1 je změněn pomocí hybri50 dizace oligonukleotidů, kódujícího požadovanou mutaci k DNA matrici, přičemž matrice je ve formě jednořetězcového plazmídu, obsahujícího nezměněnou neboli přirozenou formu DNA sekvence genu 1. Po hybridizaci je použita DNA polymeráza pro syntézu celého druhého řetězce matrice, který tak do sebe zabuduje oligonukleotidový primer a bude kódovat zvolenou změnu v genu 1.

- 19CZ 300724 B6

Obecně se používají oligonukleotidy dlouhé přinejmenším 25 nukleotidů. Optimální oligonukleotid bude mít délku 12 až 15 nukleotidů, které jsou zcela komplementární k matrici na každou stranu od nukleotidu (nukleotidů), které kódují mutaci. Tím je zajištěno, že olígonukleotid bude hybridizovat vhodným způsobem k jednořetězcové molekule DNA matrice. Oligonukleotidy je možno snadno syntetizovat pomocí postupů známých v oboru, jako je např, popsaná v Crea a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 75: 5 765 (1978).

DNA matrice může být vytvořena pouze pomocí těch vektorů, které jsou odvozeny buď od vektorů bakteriofága M13 (jsou vhodné běžně dostupné M13mpl8 a M13mpl9) nebo vektorů, ío které obsahují počátek replikace od jednořetězcového fága, jak je popsáno v Viera a kol., Meth.

Enzymol. 153: 3 (1987). Tedy DNA, která má být mutována, musí být vložena do jednoho ztěchto vektorů, aby byla vytvořena jednořetězcová matrice. Příprava jednořetězcové matrice je popsána v sekcích 4.21-4.41 v Sambrook a kok, Moleeular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989).

Pro změnění přirozené DNA sekvence je za vhodných hybrid izačních podmínek k jednořetězcové matrice hybridizován olígonukleotid. Potom je přidán DNA polymerizační enzym, obvykle Klenowův fragment DNA polymerázy I, aby nasyntetizoval komplementární řetězec matrice, přičemž pro tuto syntézu využije olígonukleotid jako primer. Je tak vytvořena hetero20 duplexní molekula, kde jeden řetězec DNA kóduje mutovanou formu genu 1 a druhý řetězec (původní matrice) kóduje přirozenou, nezměněnou sekvenci genu 1. Tato heteroduplexní molekula je potom transformována do vhodné hostitelské buňky, obvykle prokaryotické jako je E. coli JM-I01. Po kultivaci buněk jsou tyto vysety na agarové plotny a hromadně prohledávány pomocí oligonukleotidového primerú, radioaktivně označeného ³²-fosforem, a jsou tak zjištěny ty bakteriální kolonie, obsahující mutovanou DNA.

Metody popsané bezprostředně výše mohou být pozměněny tak, že je vytvořena homoduplexní molekula, kde oba řetězce plazmidu obsahují mutaci (mutace). Změny jsou následující: jednořetězcový olígonukleotid je teplotně hybridizován kjednořetězcové matrici, stejně jak bylo popsáno výše. Směs tri deoxyribonukleotidů, deoxyriboadenozin (dATP), deoxyriboguanozin (dGTP), deoxyribocytozin (dGTP) a deoxyribothymidin (dTIP) se smíchá s modifikovaným thio-deoxyribocytozinem zvaným dCTP-(aS) (Amersham). Tato směs je přidána ke komplexu matrice-oligonukleotid. Po přidání DNA polymerázy k této směsi je vytvořen řetězec DNA totožný s matricí, vyjma mutovaných baží. Navíc tento nový řetězec DNA bude obsahovat dCTP-(aS) namísto dCTP, což mu poskytuje ochranu před štěpením restrikčními endonukleázami. Poté co jsou v matricovém řetězci dvouřetězcového heteroduplexu vytvořeny zlomy pomocí vhodného restrikčního enzymu, matricový řetězec může být štěpen pomocí nukleázy Exo III nebo jiné vhodné nukleázy za oblastí, která obsahuje místo (místa), které má být mutováno (mutována). Reakce je pak zastavena, aby byly zachovány molekuly, které jsou pouze částečně jednořetězcové. Dále je vytvořen kompletní dvouřetězcový DNA homoduplex pomocí DNA polymerázy za přítomnosti všech čtyř deoxynukleotid trifosfátů, ATP a DNA ligázy. Tato homoduplexní molekula může být transformována do vhodné hostitelské buňky jako je E. coli JMlOfjakje výše popsáno.

Mutanty, u kterých má být nahrazena více než jedna aminokyselina, mohou být vytvořeny několika postupy. Pokud se aminokyseliny nacházejí v polypeptidovém řetězci blízko sebe, mohou být mutovány současně pomocí jednoho oligonukleotidů, který kóduje všechny požadované aminokyselinové substituce. Pokud se však aminokyseliny nacházejí v nějaké vzdálenosti jedna od druhé, (odděleny více než asi 10 aminokyselinami), je obtížnější vytvořit jeden oligo50 nukleotid, který kóduje všechny požadované změny. Místo toho lze použít jednu ze dvou alternativních metod.

V první metodě je vytvořen oddělený olígonukleotid pro každou aminokyselinu, která bude substituována. Oligonukleotidy jsou pak společně teplotně hybridizovány kjednořetězcové matrici, a druhý řetězec DNA, který je podle matrice syntetizován, bude kódovat všechny

požadované záměny aminokyselin. Alternativní metoda obsahuje dva nebo více kroků mutageneze pro vytvoření požadovaných mutant. První krok je stejný, jakje popsáno pro jednoduché mutanty: standardní typ DNA je použit jako matrice, oligonukleotid, kódující první požadovanou aminokyselinovou záměnu je k této matrici teplotně hybridizován a je tak vytvořena hetero5 duplexní molekula DNA. Ve druhém kroku mutageneze se využívá mutovaná DNA, vytvořená v prvním kroku mutageneze jakožto matrice. Tedy tato matrice již obsahuje jednu nebo více mutací. Oligonukleotid, kódující další požadovanou aminokyselinovou záměnu (záměny) je potom teplotně hybridizován k této matrici a výsledný řetězec DNA nyní kóduje mutace jak z prvního tak z druhého kroku mutageneze. Tato výsledná DNA může být použita jako matrice i o pro třetí krok mutageneze atd.

b) Mutageneze pomocí kazet

Tato metoda je také přednostně užívanou metodou pro přípravu substitučních, delečních a ís inzerčních variant genu 1. Metoda je založena na popisu v Wells a kol., Gene 34: 315 (1985).

Výchozím materiálem je plazmid (nebo jiný vektor), obsahující gen 1, gen který má být mutován. Napřed je určen kodon (kodony) v genu 1, který má být mutován. Na každé straně určeného mutačního místa (míst) musí existovat jedinečné místo pro restrikční endonukleázu. Pokud tu žádné takové místo není, může být vytvořeno pomocí výše uvedené metody mutageneze pomocí oligonukleotidů a vnést je tak na vhodná místa do genu 1. Poté, co byla restrikční místa do plazmidu vnesena, plazmid je na těchto místech rozštěpen a tím linearizován. Pomocí standardních postupů je nesyntetizován dvojřetězcový oligonukleotid, kódující sekvenci DNA mezi oběma restrikčními místy, ale obsahující požadovanou mutaci (mutace). Oba dva řetězce jsou syntetizovány odděleně a poté spolu hybridizovány standardními metodami. Takovýto dvojřetěz25 cový oligonukleotid se nazývá kazeta. Tato kazeta je navržena tak, aby měla 3' a 5'konce kompatibilní s konci linearizovaného plazmidu, takže může být přímo do plazmidu ligována. Takto připravený plazmid nyní obsahuje mutovanou DNA sekvenci genu 1.

6. Získání DNA kódující žádaný protein

Při jiném provedení je možno tento vynález využít pro produkci variant požadovaného proteinu, skládajícího se z jedné nebo více podjednotek. V typickém případě je každá podjednotka kódována zvláštním genem. Každý gen kódující každou podjednotku může být získán postupem, který je v oboru známý (viz např. sekce II). V některých případech může být nezbytné získat gen, kódující různé podjednotky pomocí dělících technik, vybraných z některých metod popsaných v sekci II.

Když je konstruován replikační expresní vektor, kde požadovaný protein obsahuje více než jednu podjednotku, všechny podjednotky mohou být regulovány týmž promotorem, který je umístěn typicky proti směru přepisu od DNA, kódující subjednotky, nebo každá z nich může být regulován zvláštním promotorem, který je ve vektoru vhodně orientován tak, že je operativně vázán k DNA, kterou má regulovat. Výběr promotorů se provádí tak, jak je popsáno výše v sekci III.

Pro konstrukci replikačního expresního vektoru, který obsahuje DNA, kódující požadovaný protein jež má více podjednotek, odkazujeme zájemce na obrázek 11, kde je pro ilustraci uveden diagram vektoru, s uvedením všech podjednotek fragmentu protilátky. Tento obrázek ukazuje, že obecně bude jedna z podjednotek požadovaného proteinu fúzována s obalovým proteinem fága, jako je např. gen III fága Ml3. Tato genová fuze bude obyčejně obsahovat vlastní signální sekvenci. Oddělené geny kódují další podjednotku nebo podjednotky a je zřejmé, že každá so podjednotka má svou vlastní signální sekvenci. Obrázek 11 také ukazuje, že jeden promotor může regulovat expresi obou podjednotek. Jinou možností je, že každá podjednotka může být nezávisle regulována odlišným promotorem. Protein požadované fúzní konstrukce podjednotkaobalový protein může být vytvořen tak, jakje popsáno výše v sekci IV.

-21 cz 300724 B6

Když je konstruována celá skupina variant požadovaného proteinu, složeného z mnoha podjednotek, DNA kódující každou podjednotku ve vektoru může být mutována v každé podjednotce na jedné nebo více pozicích. Když je konstruována varianta protilátky, složená z mnoha podjednotek, je dávána přednost takovým místům pro mutagenezí, která odpovídají aminokyselino5 vým kodonům, jež kódují aminokyselinové zbytky, umístěné v oblastech určujících komplementaritu (CDR) buď v lehkém řetězci, v těžkém řetězci nebo v obou těchto řetězcích. CDR jsou obecně označovány jako hypervariabilní oblasti. Postupy pro mutování DNA kódující každou podjednotku požadovaného proteinu, jsou prováděny v podstatě tak, jak je popsáno výše v sekci V.

7. Příprava cílové molekuly a vazba s fágemidem

Cílové proteiny, jako jsou receptory, mohou být izolovány z přirozených zdrojů nebo připraveny rekombinančními metodami, v oboru známými. Pro ilustraci, glykoproteinovéTeceptory hormonů mohou být připraveny technikou popsanou v McFarland a kol., Science 245: 494-499 (1989), neglykosylované formy mohou být exprimované v E. coli jsou popsány ve Fuh a kol., J. Biol. Chem. 265: 3111-3115 (1990). Jiné receptory mohou být připraveny standardními metodami.

Čištěný cílový protein může být přichycen ke vhodnému nosiči jako jsou částice agarózy, částice polyakrylamidu, skleněné částice, různé akrylové kopolymeiy, hydroxylalkyl methakrylátové gely, polyakrylové a polymethakiylové kopolymery, nylon, neutrální a iontové nosiče a podobně. Přichycení cílového proteinu k nosiči lze provést metodami popsanými v Methods in Enzymol. 44 (1976) nebo jinými způsoby známými v oboru.

Po přichycení cílového proteinu k nosiči, je takto imobilizovaná cílová molekula uvedena do kontaktu s knihovnou fágemidových částic za podmínek, vhodných pro vazbu přinejmenším části fágemidových částic k imobilizované cílové molekule. Normálně budou podmínky, včetně pH, iontové síly, teploty a podobně, napodobovat podmínky fyziologické.

Vázané fágemidové částice, které mají vysokou afinitu k imobilizované cílové molekule jsou promytím odděleny od těch, které mají afinitu nízkou (a tedy se nevážou k cílové molekule). Vázané fágemidové částice pak lze od imobilizované cílové molekuly oddělit rozličnými metodami. Tyto metody zahrnují kompetitivní disociaci od imobilizované cílové molekuly řadou rozličných metod. Tyto metody zahrnují kompetitivní disociaci pomocí standardního typu ligandu, změnou pH anebo iontové síly ajiné postupy, v oboru známé.

Vhodné hostitelské buňky jsou infikovány eluovanými fágemidovými částicemi s vysokou aktivitou spolu s pomocným fágem a jsou dále kultivovány za podmínek vhodných pro amplifikaci těchto fágemidových částic. Fágemidové částice jsou pak sebrány a selekční krok je opako40 ván jednou nebo vícekrát, dokud se nevýše lektují fágemidové částice s požadovanou afinitou k cílové molekule.

Popřípadě je možno dát postupně do kontaktu knihovnu fágemidových částic s více než jednou imobilizovanou cílovou molekulou, aby došlo k vylepšení jejich selektivity pro určitou cílovou molekulu. Například se často stává, že ligand jako hGH, má více než jeden přirozený receptor. V případě hGH se váží k hGH ligandu vážou jak receptory pro hGH, tak receptory prolaktinové. Může být žádoucí chtít zdokonalit selektivitu hGH pro receptory k růstovému hormonu více než k receptorů prolaktinovému. Toho lze dosáhnout tím, že napřed je knihovna fágemidových částic kontaktována s imobilizovaným prolaktinovým receptorem a potom se provede kontakt fágemi50 dových částic, které se k imobilizovanému prolaktinovému receptorů vázaly s nízkou afinitou nebo se nevázaly vůbec, s imobilizovaným receptorem pro růstový hormon, a selektovat mezi nimi ty, které se vážou k vysoceafinnímu receptorů pro růstový hormon. V tomto případě mutanty hGH, které mají sníženou afinitu pro prolektinový receptor, mohou být terapeuticky užitečné, dokonce i kdyby jejich afinita k receptorů pro růstový hormon byla poněkud nižší, než no u standardního typu hGH. Tatáž strategie může být použita pro zlepšení selektivity určitého hormonu nebo proteinu pro jeho primární funkční receptor oproti receptoru vychytávacímu.

V jiném provedení tohoto vynálezu může být získána vylepšená aminokyselinová sekvence u substrátu. To může být užitečné při vytváření lepších „štěpných míst“ pro proteinové linkery nebo pro lepší substrátové inhibitory proteáz. Při tomto provedení je imobilizovatelná molekula receptoru (např. pro hGH), biotin-avidin (nebo molekula schopná kovalentně se vázat k nosiči), fúzována s genem III pomocí linkeru. Je dávána přednost linkeru dlouhému od 3 do 10 aminokyselin, který bude fungovat jako substrát pro proteázy. Fágemid bude konstruován stejně, jak io bylo popsáno výše, přičemž DNA kódující oblast linkeru bude náhodně mutována, aby poskytla náhodnou knihovnu fágemidových částic s různými aminokyselinovými sekvencemi ve spojovacím místě. Knihovna fágemidových Částic je potom mobilizována na nosiči a vystavena požadované proteáze. Fágemidové částice, které mají výhodné či lepší aminokyselinové sekvence pro požadovanou proteázu ve spojovací oblasti, budou eluovány a vytvoří tak obohacené soubory fágemidových částic, kódujících výhodné linkery. Tyto fágemidové částice projdou několika obohacovacími kroky a vytvoří obohacený soubor částic, kódujících konsenzuální sekvenci (sekvence).

II. Vytváření protilátek

Výchozí protilátky mohou být připraveny pomocí technik dostupných v rámci oboru nebo vytvářejících takové protilátky. Příklady metod pro vytváření protilátek jsou popsány podrobněji v následujících sekcích.

Protilátky jsou namířeny proti antigenům, které jsou pro nás zajímavé, s výhodou je antigen biologicky důležitý polypeptid, podání protilátek savcovi, který má nemoc nebo trpí poruchou, může mít za následek příznivý léčebný účinek pro tohoto savce. Nicméně se zde uvažují i protilátky namířené proti nepolypeptidovým antigenenům (jako glykolipidové antigeny spojené s nádory; viz US patent 5 091 178).

Pokud je antigen polypeptid, může to být transmembránová molekula (např. receptor (nebo ligand jako je růstový faktor. Příkladem antigenů jsou mimo jiné molekuly jako renin; růstové hormony, včetně lidského růstového hormonu a hovězího růstového hormonu; faktor uvolňující růstový hormon; hormon příštítných tělísek; glukagon, srážecí faktory, jako je ProteinC; „atrial natriuretic“ faktor; povrchově aktivní látky plic, aktivátory plazminogenu, jako jsou urokináza nebo lidský aktivátor plazminogenu (tPA) močového původu nebo tkáňového typu; bombesin, thrombin, krvetvorný růstový faktor, tumor necrosis faktory alfa a beta, enkefalináza; RANTES (regulovaná aktivace T-buněk normálně exprimujících a sekretujících); lidský makrofágový zánětlivý protein (MIP-1-alpha); sérový albumin jako je hovězí sérový albumin; mullerian40 inhibující substance, A-řetězec relaxínu; B-řetězec relaxínu; prorelaxín; myší peptid asociovaný s gonadotropinem; mikrobiální protein jako je β-laktamáza; DNáza; IgE, antigen spojený s cytotoxickými T-buňkami (CTLA) jako je CTLA-4; inhibin; aktivin; růstové faktory cévní výstelky (VEGF); receptory pro hormony nebo růstové faktory; protein A nebo D, reumatoidní faktory, neurotrofní faktory jako jsou neurotrofhí faktor odvozený z kostí (BDNF), neutrophin-3,

-4, -5 nebo -ó (NT-3, NT-A NT-5 nebo NT-6 nebo nervové růstové faktory jako je NGF-β, růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF), růstové faktory fibroblastů jako jsou aFGF a bFGF, epidermální růstový faktor EGF); transformační růstové faktory (TGF) jako jsou TGF-alpha a TGF-beta, včetně TGF-βΙ, TGFJ32, TGFJ33, TGF^4 nebo TGF-jtf; insulinu podobný růstový faktor-I a -II (IGF-1 a IGF—II) des(t-3)-IGF-l (IGF-1 mozku), vazebný protein insulinu podobného růstového faktoru; CD proteiny jako jsou CD3, CD4, CD8, CD19 a CD20; erythropoietin, kostní růstové faktory, imunotoxiny; morfogenetický protein kostí (BMP); interferony jako jsou interferon-alfa, -beta a -gama, faktory stimulující růst kolonií (CSFs) jako jsou např. M-CSF, GM-CSF a G-CSF, interleukiny (lis) jako jsou IL-l až IL—10; superoxid dismutáza; receptory T-buněk; proteiny membránového povrchu; adresiny; regulační proteiny;

integriny jako jsou CDlla, CDllb, CDllc, CD18 a ICAM, VLA-4 a VCAM; antigeny

-23CZ 300724 B6 asociované s nádory jako jsou receptory HER2, HER3 nebo HER4 a fragmenty kteréhokoli z výše uvedených proteinů.

Jako molekulární cílová místa pro protilátky, kterým je dávána přednost v rámci tohoto vynálezu, jsou CD proteiny jako jsou CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 a CD34; členové skupiny ErbB reeeptorů jako jsou EGF receptor, receptory HER2, HER3 nebo HER4; molekuly adherující k buňkám jako jsou LFA-1, Mac 12, p 150,95, VLA-4 ICAM-1 VCAM a integrin αν/β3 včetně bud jejich α nebo β podjednotek (např. anti-CDlla, antiCD18 nebo anti-CDllb protilátky); růstové faktory jako je VEGF; IgE; antigeny krevních skupin; receptor flk2/flk3; obezity receptor io (OB); mpl receptor; CTLA^l; protein C atd. Zvláště výhodnou cílovou molekulou je IgE.

Napřed je vyvolána protilátka proti antigenu, odvozenému z jednoho druhu savce. Je výhodné, když tento první druh savce je člověk. Avšak jsou uvažovány i jiné druhy savců jako jsou zvířata chovaná na farmách, v domácnostech nebo v zoologických zahradách, např. když je zamýšleno pro léčení těchto savců používat protilátky. Antigen z prvního druhu savce může být, za účelem vytvoření protilátek proti němu, izolován ze svého přirozeného zdroje. Avšak, jak je uvedeno níže, i buňky obsahující antigen mohou být použity jako imunogeny pro vyvolání protilátek. Při jiných provedeních je antigen produkován rekombinantními postupy nebo je vytvořen jinými syntetickými metodami. Selektované protilátky budou normálně mít silnou vazebnou afinitu k antigenu. Například, protilátka se může vázat k antigenu z prvního druhu savce s hodnotou vazebné afinity (Kd) ne větší než asi 1 χ 10“⁷ M, výhodněji ne větší než asi 1 χ 10“⁸ M a nejvýhodněji ne větší než asi 1 χ 10'⁹ M. Afinity protilátek lze určit vazbou do nasycení; testem ELISA a kompetičními testy (např. RIA).

Protilátky mohou být též podrobeny jiným testům biologické aktivity, např. aby byla určena jejich léčebná účinnost. Takové pokusy jsou v oboru známé a závisejí na cílovém antigenu a zamýšleném použití protilátek. Příkladem testu jsou adhezní test na jednobuněčné vrstvě keratinocytů a test odpovědi smíšených lymfocytů (MFR) pro CD1 la (oba jsou popsány v příkladech dále); testy inhibiee růstu nádoru (jak je popsáno např. v WO 89/06692); test na protilátkách závislé buněčné cytotoxicity (ADCC) a test cytotoxícíty zprostředkované komplementem (CDC) (US pat, 5 500 362); a test aktivity agonistů nebo testy krvetvorby (viz WO 95/27062).

Vyhledávání protilátek, které se vázou k určitému epitopu antigenu, který je pro nás zajímavý (např. ty, které blokují vazbu protilátky MHM24), je možno provést běžnými zkříženými, bloko35 vacími testy, jak je popsáno v Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Ed Harlow a David Lané (1988). Jinou možností je provést mapování epitopu např. tak, jak je popsáno v Champe a kol., J. Biol. Chem. 270: 1 388-1 394 (1995), aby se zjistilo, zda se protilátka váže k epitopu, který je pro nás zajímavý.

Poté se určuje druhová závislost protilátky. Vazebná afinita protilátky k homologům antigenu, který byl použit pro vyvolání protilátky (kde homolog pochází z jiného druhu savce) se určuje pomocí technik, které byly popsány výše. Ve výhodném provedení, se druhý druh savce liší od člověka a protilátka mu bude podávána během předklinických studií. Tedy tímto druhým savcem může být primát jako např. makak rhesus, cynomolgus, pavián, šimpanz a makak. Při jiném provedení může být druhým savčím druhem např. hlodavec, kočka nebo pes. Druhově závislá protilátka bude normálně mít vazebnou afinitu pro antigen, pocházející z druhého savčího druhu přinejmenším 5 Okřát, nebo přinejmenším 500krát nebo přinejmenším lOOkrát slabší, než je vazebná afinita pro antigen, pocházející z prvého druhu savce. Tato vazebná afinita bude normálně taková, že druhově závislé protilátky nemohou být účinně používány pro předklinická studia u druhého druhu savce.

Třebaže je běžně v tomto vynálezu při určování druhové závislosti (a pro hodnocení mutované protilátky s vylepšenými vlastnostmi; viz níže) dávána přednost měření vazebné afinity, při jiných provedeních vynálezu jsou hodnoceny jedna nebo více biologických vlastností druhově závislé protilátky, buď spolu s určováním vazebné afinity nebo namísto ní. Příklady takových

9/1 .

CZ JWI7Z4 B6 biologických testů jsou popsány výše. Tyto testy jsou zvláště užitečné tam, kde umožňují zjištění léčebných účinků protilátky. Normálně, nikoli však nezbytně, protilátky které vykazují vylepšené vlastnosti v takovýchto pokusech, mají též zvýšenou vazebnou afinitu. Tak v jednom z provedení vynálezu, kde byl jako test použit jiný test biologické aktivity než je test vazebné afinity, druhově závislá protilátka bude normálně mít „biologickou aktivitu“ při použití „materiálu“ (např. antigen, buňka, tkáň, orgán nebo celý živočich) z druhého savčího druhu přinejmenším SOkrát, nebo přinejmenším 500krát nebo přinejmenším lOOkrát méně efektivní, než je jeho biologická aktivita v odpovídajícím testu, kde byl použit materiál pocházející z prvého druhu savce.

io Druhově závislá protilátka je pak změněna tak, že se vytvoří mutovaná protilátka, která má silnější vazebnou afinitu pro antigen z druhého savčího druhu, než druhově závislá protilátka. Je výhodné, když má mutovaná protilátka vazebnou afinitu pro antigen, pocházející ze savčího druhu, jiného než je Člověk, přinejmenším 1 Okřát silnější, výhodněji přinejmenším 20krát silnější, ještě výhodněji přinejmenším SOOkrát silnější a někdy přinejmenším lOOkrát nebo 200krát silnější než je vazebná afinita druhově závislé protilátky pro antigen, Zesílení žádané nebo vyžadované vazebné afinity bude záviset na výchozí vazebné afinitě druhově závislé protilátky. Ať je použit jakýkoli biologický test, je výhodné, když má mutovaná protilátka biologickou aktivitu ve zvoleném testu přinejmenším lOOkrát lepší, výhodněji přinejmenším 20krát lepší, ještě výhodněji přinejmenším 50krát lepší a někdy přinejmenším 1 OOkrát nebo 200krát lepší, než je biologická aktivita druhově závislé protilátky v tomtéž testu.

Při vytvoření mutované protilátky mohou být vneseny jedna nebo více aminokyselinových změn (např. substituce jsou provedeny v jedné nebo více podobách (např. substituce) do podpůrné oblasti druhově závislé protilátky, přičemž výsledkem je vylepšení vazebné afinity mutované protilátky k antigenu, pocházejícímu z druhého savčího druhu. Příkladem zbytků podpůrné oblasti, které mohou být modifikovány jsou ty, které se přímo nekovalentně vážou k antigenu (Amit a kol., Science 233: 747-753 (1986)); interagují a ovlivňují prostorové uspořádání CDR (Chothia a kol, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); anebo jsou umístěny na rozhraní VL-VH (EP 239 400 Bl). Při určitých provedeních mají modifikace jednoho nebo více takových zbytků v podpůrné oblasti za následek vylepšení vazebné afinity protilátky k antigenu, pocházejícímu z druhého savčího druhu. Například může být při takovémto typu provedení vynálezu změněno jeden až pět zbytků v podpůrné oblasti. Někdy to může být dostatečné pro vytvoření mutované protilátky vhodné pro použití v předklinických testech, dokonce i v případě, že nebyl změněn žádný zbytek v hypervariabílní oblasti. Běžně však bude mutovaná protilátka obsahovat další změny v hypervariabílní oblasti.

Zbytky v hypervariabílní oblasti, které jsou měněny, mohou být zaměňovány náhodně, zvláště když výchozí vazebná afinita druhově závislé protilátky k antigenu, pocházejícímu z druhého savčího druhu je taková, že tyto náhodně vytvořené mutované protilátky mohou být snadno hromadně prohledávány.

Postupy pro vytváření protilátek, které mohou být druhově závislé a proto vyžadují modifikaci podle zde vypracovaných technik, jsou tyto:

A. Příprava protilátek (i) Příprava antigenu

Pro vytváření protilátek mohou být použity rozpustné antigeny nebo jejich fragmenty, obojí případně konjugované s jinými molekulami. Pro transmembránové molekuly, jako jsou reeeptory, mohou být použity jako imunogen jejich fragmenty (např. extracelulámí doména reeeptorů). Jinou možností je použít jako imunogen buňky, které tuto transmembránovou molekulu exprimují. Takové buňky mohou být odvozeny z přirozeného zdroje (např. linie nádorových buněk) nebo to mohou být buňky, které byly transformovány pomocí rekombinantní techniky tak, aby

-25CZ 300724 B6 exprimovaly transmem bráno vou molekulu. Jiné antigeny a jejich formy, použitelné pro přípravu protilátek, jsou známy osobám se zkušeností v tomto oboru.

(ii) Polyklonální protilátky

Polyklonální protilátky jsou s výhodou vyvolávány u jiných savců než je člověk, pomocí mnohotných subkutánních (sc) nebo intraperitoneálních (ip) injekcí dotyčného antigenu spolu s adjuvans. Může být užitečné konjugovat dotyčný antigent. s proteinem, který, je imunogenní pro imunizovaný druh, např, keyhole limpet hemokyanin, sérový albumin, hovězí thyreoglobulin nebo trypsinový inhibitor ze sojových bobů pomocí bifunkčního nebo derivatizujícího činidla, jako je například maleiniminobenzoylový ester sulfosukcinimidu (konjugace přes cysteinové zbytky), N-hydroxysukcinimid (konjugace přes lyzinové zbytky), glutaraldehyd, anhydrid kyseliny jantarové, thionylchlorid nebo R^]N-C^CR, kde R a R¹ jsou různé alkylové skupiny.

Zvířata jsou imunizována antigenem, imunogenními konjugáty nebo deriváty tak, že se spojí např. 100 pg (pro králíky) nebo 5 pg (pro myši) proteinu nebo konjugátu se třemi objemy Freundova kompletního adjuvans a roztok se podává injekcí intradermálně na více místech. Po měsíci je zvířatům podána posilující dávka 1/5 až 1/10 původního množství peptidu nebo konjugátu ve Freundově kompletním adjuvans injekcí subkutánně na více místech. Sedm až 14 dní později je zvířatům odebrána krev v séru je zjištěn titr protilátek. Zvířatům jsou podávány posilující dávky, pokud jejich titr nedosáhne plato. Je výhodné, když je zvířeti podávána posilující dávka obsahující sice konjugát téhož antigenu, ale konjugovaný s jiným proteinem anebo konjugovaný pomocí jiného činidla. Konjugáty mohu být také vytvořeny v kulturách rekombinantních buněk proteinovou fúzí. Pro zvýšení imunitní odpovědi jsou také vhodná agregační činidla jako je alutn.

Vybraná savčí protilátka bude mít normálně dostatečně silnou vazebnou aktivitu k antigenu. Například protilátka se může vázat k lidskému anti-IgE antigenu s hodnotou vazebné afinity (Kd) ne vyšší než 1 x ΙΟ^-7 M, výhodněji ne vyšší než 1 x 10 ⁸ M, a nejvýhodněji ne vyšší než 1 x 10“⁹ M. Afinity protilátek lze určit vazbou do nasycení; testem ELISA a kompetičními testy (např. radioimunologický test).

Při hledání lidských anti-IgE protilátek je možno použít běžný křížový test, jak je popsán v Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlowa David Lané (1988). Popřípadě je možno pro určení vazby provést mapování epitopu, např. jak je popsáno v Champe a kol., 7. Biol. Chem.21^. 1388-1394(1975).

Třebaže je při zjišťování efektivity polypeptidu nebo protilátky dávána přednost měření vazebné afinity, při jiných provedeních vynálezu se provádějí hodnocení jedné nebo více biologických vlastností protilátky, buď spolu s určováním vazebné afinity nebo namísto ní. Takové testy jsou zvláště užitečné tam, kde poskytnou informace o léčebné účinnosti protilátky. Je běžné, nikoli však nezbytné, že protilátky, které vykazují vylepšené vlastnosti v takových testech, budou také mít zvýšenou vazebnou afinitu.

(iii) Monoklonální protilátky

Monoklonální protilátky jsou protilátky, které rozpoznávají jediné antigenní místo. Jejich jednot45 ná specificita činí monoklonální protilátky mnohem užitečnější oproti polyklonálním protilátkám, které obvykle obsahují protilátky, jež rozpoznávají více rozličných antigenních míst.

Monoklonální protilátky lze připravit pomoci metody hybridomů, prvně popsané v Kohler a kol., Nátuře, 256: 495 (1975), nebo mohou být vytvořeny pomocí metod rekombinantní DNA (US. č, 4 816 567).

V hybridomové metodě je myš nebo jiný vhodný hostitelský živočich, jako je křeček nebo makak, imunizován jak je výše uvedeno, aby byl vyvolán vznik lymfocytů produkujících nebo schopných produkovat protilátky, které se budou specificky vázat k proteinu použitému pro

- 2A .

CZ JUU724 B6 imunizaci. Jinou možností je imunizovat lymfocyty in vitro. Lymfocyty jsou pak pomocí vhodného fúzního Činidla, jako je polyetylenglykol, fúzovány s myelomovými buňkami, a vytvoří tak hybridomovou buňku (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, str. 59—103 (Academie Press, 1986)).

Takto připravené hybridomové buňky jsou vysety a pěstovány ve vhodném kultivačním médiu, které s výhodou obsahuje jednu nebo více sloučenin, jež inhibují růst nebo přežívání nefúzovaných, rodičovských myelomových buněk. Například, pokud rodičovské myelomové buňky postrádají enzym hypoxantin guanin fosfory bosyltransferázu (HGPRT nebo HPRT), kultivační io médium pro hybridomy bude typicky obsahovat hypoxantin, aminopterin a thymidin (HAT médium), sloučeniny které zabraňují růstu HGPRT-deficientních buněk.

Výhodné jsou takové myelomové buňky, které efektivně fuzují, poskytují stabilní vysokou hladinu produkce protilátky ve vy selektovaných, protilátky produkujících buňkách a jsou citlivé is k médiu jako je HAT. Mezi takové výhodné linie myelomových buněk patří linie myších myelomových buněk, jako jsou ty, odvozené z myších nádorů MOPC-21 a MPC-11, které jsou dostupné v Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, a buňky SP-2 nebo X-63-Ag8-653, které jsou dostupné v Americké sbírce typových kultur, Rockville,

Maiyland USA. Byla též popsána produkce lidských monoklonálních protilátek v lidských 20 myelomových buněčných liniích a hybridních heteromyelomových buněčných liniích myščlověk (Kozbar, J. immunol. str. 133: 3 001 (1984); Brodeur a kol., Monoclonal Antibody

Production Techniques and Applications, str. 51—63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Kultivační médium, ve kterém se hybridomové buňky pěstují, se testuje na přítomnost mono25 klonálních protilátek, namířených proti antigenu. Dává se přednost zjišťování vazebné specificity monoklonálních protilátek, produkovaných hybridomovými buňkami, pomocí imunoprecipitace nebo pomocí in vitro vazebného testu, jako je radioimunotogický test (RIA) nebo test ELISA.

Poté co je zjištěno, že hybridomové buňky protilátky požadované specificity, afinity anebo 30 aktivity, klony mohou být subklonovány omezením ředících postupů a pěstovány standardními postupy (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, str. 59—103 (Academie Press,

1986)). Vhodná kultivační média pro tento účel jsou např. média D-MEM nebo RPMI-1640.

Navíc mohou být hybridomové buňky pěstovány in vivo jako ascity na savcích.

Monoklonální protilátky, vylučované subklony, jsou z kultivačního média, ascitové tekutiny nebo séra odděleny vhodným způsobem pomocí běžných postupů, používaných pro čištění imunoglobulinů, jako jsou např. protein-A Sepharosa, chromatografie na hydroxylapatitu, gelová elektroforéza, dialýza nebo afinitní chromatografie.

DNA kódující monoklonální protilátky je možno snadno izolovat a sekvenovat pomocí běžných postupů (např. pomocí oligonukleotidových sond, které se jsou schopny specificky vázat ke genům, kódujícím těžký a lehký řetězec monoklonální protilátky).

Hybridomové buňky slouží jako přednostní zdroj takové DNA. Pokud je DNA jednou izolována, může být vložena do expresních vektorů, které jsou pak vneseny do hostitelských buněk jako jsou kmeny E. coli, opičí buňky COS, buňky pocházející z vaječníků čínského křečka (CHO) nebo myelomové buňky, které jinak neprodukují imunoglobulinové proteiny, aby tak byla dosažena syntéza monoklonálních protilátek v hostitelské buňce. Rekombinantní tvorba protilátek bude dále popsána podobněji.

V dalším provedení, protilátky nebo proti látkové fragmenty lze izolovat z proti látkových fágových knihoven, vytvořených technikami popsanými vMcCafferty a kol., /Vtf/Mre 348: 552-554 (1990). Clackson a kot, Nátuře 352: 624-628 (1991) a Marks a kol., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) popisují izolací myších a lidských protilátek pomocí fágových knihoven. Násle55 dující publikace popisují produkci vysoceafinních (v oblasti nM) lidských protilátek pomocí

-27CZ 300724 Bó promíchání sekvence řetězce (Marks a kol., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)) a rovněž kombinovaná infekce a in vivo rekombinace, jako strategie pro konstrukci velmi velkých fágových knihoven (Waterhouse a kol., Nuc. Acids, Res. 21: 2 265-2 266 (1993)). Tyto techniky jsou tedy použitelné alternativy pro izolaci monoklonálních protilátek vedle tradiční hybrido5 mové techniky monoklonálních protilátek.

DNA může být také pozměněna, například nahrazením kódujících sekvencí pro lidskou konstantní doménu lehkého řetězce a lidskou konstantní doménu těžkého řetězce za homologní myší sekvence (US patent 4 816 567; Morrison a kol., Proč. Natí Acad, Sci. USA 81: 6 851 io (1984)) nebo kovalentním spojením s imunoglobulinovým polypeptidem.

Typicky je takovými neimunoglobulinovými polypeptidy zaměňována konstantní doména protilátky nebo jsou zaměňovány za variabilní doménu jednoho vazebného místa v protilátce, a vytvoří se tak chimemí dvoj vazná protilátka, obsahující jedno vazebné místo, mající specificitu pro jeden antigen a druhé vazebné místo, mající specificitu pro jiný antigen.

(iv) Vytváření mutovaných protilátek

Jakmile je jednou druhově závislá protilátka zjištěna a izolována, často je užitečné vytvoření variant protilátky nebo jejích mutant, kde je změněn jeden nebo několik aminokyselinových zbytků v jedné nebo několika hypervariabilních oblastech savčí protilátky. Jinou možností nebo navíc, do podpůrné oblasti savčí protilátky může být vnesena jedna nebo více změn (např. substitucí) zbytků, které budou mít za následek vylepšení vazebné afinity mutované protilátky k lidskému IgE. Příkladem modifikovatelných zbytků podpůrné oblasti jsou ty, které se nekovalentně vážou přímo na antigen (Amit a kol., Science 233: 747-753 (1986); interagují a ovlivňují konformaci CDR (Chothia a kol., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); anebo jsou umístěny na rozhraní VL-VH (EP 239 400 Bl). Při určitých provedeních mají modifikace jednoho nebo více takových zbytků v podpůrné oblasti za následek vylepšení vazebné afinity protilátky k lidskému antigenů. Například může být při takovémto typu provedení vynálezu změněno jeden až pět zbytků v podpůrné oblasti. Někdy to může být dostatečné pro vytvoření mutované protilátky vhodné pro použití v předklinických testech, dokonce i v případě, že nebyl změněn žádný zbytek v hypervariabilní oblasti. Běžně však bude mutovaná protilátka obsahovat další změnu (změny) v hypervariabilní oblasti.

Zbytky v hypervariabilní oblasti, které jsou měněny, mohou být zaměňovány náhodně, zvláště když výchozí vazebná afinita druhově závislé protilátky je taková, že tyto náhodně vytvořené mutované protilátky mohou být snadno hromadně prohledávány.

Jeden užitečný postup pro vytváření mutovaných protilátek je známa jako „mutageneze vyhledáváním alaninových zbytků“ (Cunningham, B. C. a Wells, J. A. Science 244: 1 081-1 085 (1989);

Cunningham, B. C. a Wells, J. A. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A 84, 6 434-6 437 (1991)). Zde je jeden nebo více zbytků v hypervariabilní oblasti nahrazeno alaninovým nebo polyalaninovým zbytkem, aby byla ovlivněna interakce aminokyselin s antigenem druhého savčího druhu. Ty zbytky v hypervariabilní oblasti, které ukazují funkční citlivost na substituci, jsou dále studovány zaváděním jiných mutací buď na místech substituce nebo v jejich blízkosti. Tak, zatímco místo pro vnášení variant v aminokyselinové sekvenci je předem určeno, povaha mutace jako takové nemusí být předem určena. Ala-mutace, vytvářené tímto způsobem, jsou testovány na jejich biologickou aktivitu, jak je zde popsáno. Podobné substituce lze provést s jinými aminokyselinami v závislosti na požadované vlastnosti, zprostředkované vyhledávanými zbytky.

Vynález také poskytuje systematičtější metodu pro určování aminokyselinových zbytků, vhodných pro modifikaci. Touto metodou se určují zbytky v hypervariabilní oblasti druhově závislé protilátky, které se účastní vazby k antigenů jednoho savčího druhu a ty zbytky v hypervariabilní oblasti, které se účastní vazby k antigenů druhého savčího druhu. Jsou tak zjištěny zbytky v hypervariabilní oblasti, které se účastní vazby k antigenů prvého savčího druhu (např. člověka)

CZ JWI724 B6 a ty, které se účastní vazby k homologu tohoto antigenu, který však pochází z druhého savčího druhu (např. jiného než člověk). Je výhodné, když ty zbytky, které se významně účastní vazby k antigenu druhého savčího druhu (např. savce jiného než člověk), ale nikoli vazby k antigenu prvního savčího druhu (např. člověka), jsou vybrány jako kandidáti pro modifikaci. Vjiném provedení, ty zbytky, které se významně účastni vazby k antigenům, pocházejících jak z prvního tak druhého savčího druhu jsou vybrány pro modifikaci. V ještě dalším, ale méně výhodném provedení, jsou pro modifikaci vybrány ty zbytky, které se účastní vazby k antigenu z lidského IgE, ale nikoli vazby k homolognímu (nikoli lidskému) IgE. Taková modifikace může zahrnovat deleci zbytku nebo vložení jednoho nebo více zbytků v sousedství zbytků, které jsou zajímavé.

i o Běžně však modifikace znamená náhradu zbytku j inou aminokyselinou.

V typickém případě je možno začít s konzervativní substitucí, jako jsou ty, které jsou uvedeny níže v tabulce A pod hlavičkou „výhodné substituce“. Pokud mají takové substituce za následek změnu biologické aktivity (např. vazebné afinity), potom podstatnější změny, označené v tabulce A jako „příklady substitucí“ nebo jak jsou popsány dále v odkazu na třídy aminokyselin, potom jsou zavedeny do molekuly a produkty jsou prohledávány a testovány.

-29CZ 300724 B6

Tabulka A

Konzervativní substituce aminokyselinových zbytků

Původní zbytek	Příklady substituci	Výhodné substituce	DNA kodony
Ala (A)	Val, Leu, Ile	Val	GČA, GCC, GCG, GCU
Aíg(R)	Lys, Gly, Asn	Lys	AGA. AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
Asn (N)	Gin, His, Lys, Arg	Gin	AAC.AAU
Asp(D)	Glu	Glu	GAC, GAU
Cys(C)	Ser	Ser	UGC, UGU
Gin (Q)	Asn	Asn	CAA, CAG
Glu (E)	Asp	Asp	GAA, GAG
Gly(G)	Pro, Ala	Ala	GGA, GGC, GGG, GGU
His (H)	Asn, Gin, Lys, Arg	Arg	CAC, CAU
lle(l)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucin	Leu	AUA, AUC, AUU
Leu (L)	norleucin, Ile, Val, Met, Ala, Phe	lfe	UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
Lys(K)	Arg, Gin, Asn	Arg	AAA.AAG
Met(M)	Leu, Phe, Ile	Leu	AUG
Phe(F)	Leu, Val, Afa, Tyr	Leu	UUC, UUU
Pro (P)	Ala	Ala	CCA, CCC, CCG, CCU
Ser(S)	Thr	Thr	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
Thr(T)	Ser	Ser	ACA, ACC, ACG, ACU
Trp(W)	Tyr, Phe	Tyr	UGG
Tyr(Ý,	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe	UAC, UAU
Val (V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala, norleucin	Leu	GUA.AUC, GUG, GUU

Ještě podstatnější modifikace v biologických vlastnostech protilátek je dosaženo pomocí výběru substitucí, které se významně liší v jejich vlivu na udržování: (a) struktury kostry polypeptidů v oblasti substituce, například struktury listu nebo šroubovicové struktury; (b) náboje nebo hydrofobicity molekuly na cílovém místě, nebo (c) objemu postranního řetězce. Přirozeně se vyskytující zbytky lze rozdělit do skupin na základě obecných vlastností jejich postranního řetězce:

(1) hydrofobní: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

ΊΛ (2) neutrální hydrofilní: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

(3) kyselé: Asp, Glu;

(4) zásadité: His, Lys, Arg;

(5) zbytky, které ovlivňují orientaci řetězce: Gly, Pro, a (6) aromatické: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativní substituce způsobí záměnu člena jedné z těchto skupin za člena jiné skupiny.

Molekuly nukleových kyselin, kódující sekvenci aminokyselinových mutant lze připravit různýio mi metodami, známými v oboru. Tyto metody zahrnují mimo jiné mutagenezi pomocí oligonukleotidu (neboli místně specifická), PCR mutageneze a mutageneze pomocí kazet buď dříve připravené mutanty nebo nemutované verze druhově závislé protilátky. Při přípravě mutant je dávána přednost místně specifické mutagenezi (viz Kunkel, Proč. Natí Acad, Sci. USA 82: 488 (1995)).

Při jistých provedeních bude mít mutovaná protilátka zaměněnou pouze jednu aminokyselinu v hypervariabilní oblasti, například od dvou do asi patnácti substitucí v hypervariabilní oblasti.

Běžně bude mít mutovaná protilátka s vylepšenými biologickými vlastnostmi takovou amino20 kyselinovou sekvenci, která vykazuje přinejmenším 75% shodu nebo podobnost aminokyselinové sekvence s aminokyselinovou sekvencí variabilní domény buď těžkého nebo lehkého řetězce savčí protilátky proti lidskému IgE, výhodněji přinejmenším 80%, výhodněji přinejmenším 85%, ještě výhodněji přinejmenším 90% a nejvýhodněji přinejmenším 95%. Shoda nebo podobnost, pokud se týká této sekvence, je zde definována jako procento aminokyselinových zbytků v kandidátské sekvenci, které jsou shodné (tj. tentýž zbytek) nebo podobné (tj. aminokyselinový zbytek z téže skupiny, pokud se týká obecných vlastností postranních řetězců, viz výše) se zbytky druhově závislé protilátky po vzájemném porovnání sekvencí a zavedení mezer v sekvenci, pokud je to nezbytné pro dosažení maximálního procenta sekvenční shody.

Jinou možností je vytvoření mutované protilátky systematickým mutováním CDR oblastí těžkých a lehkých řetězců anti-ígE protilátky. Výhodná metoda pro přípravu takových mutovaných protilátek je použití afinitní maturace $ prezentací na fágových partikulích (Hawkins a kol., J. Mol. Biol. 254: 889-896 (1992) a Lowman a kol., Biochemistry 30(45): 10 832-10 838 (1991). Fúze s proteinem obalu bakterifága (Smith, Science 228: 1 315 (1985); Scot a Smith,

Science 249: 386 (1990); Cwirla a kol., Proč. Natí Acad, Sci. USA 8: 309 (1990); Devlin a kol., Science 249: 404 (1990); přehled viz Wells a Lowman, Curr. Opin. Struet. Biol. 2: 597 (1992); US pat. 5 223 409) jsou známy jako užitečné pro spojení fenotypu prezentovaných proteinů nebo peptidů s genotypem bakteriofágových částic, které je kódují. F(ab) domény protilátek byly také prezentovány na fágu (McCafferty a kok, Naiure 348: 552 (1990); Barbas a kol., Proč. Natí

Acad, Sci. USA 88: 7978 (1991); Garrad a kol., Biotechnol. 9: 1373 (1991)).

Monovalentní prezentace na fágu spočívá v prezentaci souboru proteinových variant jako fúzí s obalovým proteinem bakteriofága takovým způsobem, aby byla prezentace omezena pouze na počet jedné kopie na několik fágových partikulí (Bass a kol., Proteins 8: 309 (1990). Afinitní maturace nebo vylepšení rovnovážných vazebných afinit různých proteinů bylo dříve dosahováno pomocí postupné aplikace mutageneze, monovalentní prezentace na fágu, funkční analýzy a přidávání výhodných mutací, jak uvedeno na příkladu v případě lidského růstového hormonu (Lowman & Wells, J. Mol. Biol. 234: 564-578 (1993); US pat. 5 534 617) rovněž F(ab) domén protilátek (Barbas a kol,, Proč. Natí Acad, Sci. USA9l·. 3 809 (1994); Yang a kol., J. Mol.

so Bioí 254: 392 (1995).

Knihovny obsahující mnoho (10⁶) proteinových variant, lišících se v definovaných pozicích své sekvence, mohou být konstruovány na bakteriofágových partikulích, zniehž každá obsahuje

-31 CZ 300724 B6

DNA kódující zvláštní variantu proteinu. Po krocích afínitního čištění za použití imobil izo váného antigenu, jsou jednotlivé klony bakteriofága izolovány a z jejich DNA je odvozena aminokyselinová sekvence na nich prezentovaného proteinu.

(a) /ušlechtěné a lidské protilátky /ušlechtění je postup pro vytvoření chimemí protilátky, kde podstatně menší úsek než je celá lidská variabilní doména, je nahrazen odpovídající sekvencí jiného druhu než je člověk. U zušlechtěné protilátky jeden nebo více aminokyselinových zbytků, které jsou do ní vneseny, pochází ze zdroje, který není lidského původu. Tyto aminokyselinové zbytky, které nejsou io lidského původu, jsou často označované jako „importované“ zbytky, a obyčejně pocházejí z “importované“ variabilní domény, /ušlechtění může být v podstatě provedeno podle metody

Winter a spolupracovníci (Jones a kol., Nátuře 32\\ 522-525 (1986); Reichman a kol., Nátuře 332·. 323-327 (1988); Verhoyen a kol., Science239\ 1 534-1 536 (1988)), pomocí substituce oblastí určujících komplementaritu (complementarity determiníng regions-CDR s) u hlodavců, za odpovídající sekvence lidské protilátky. Tedy takové „zušlechtěné“ protilátky jsou chimemí protilátky (US patent 4 816 567), kde podstatně menší úsek než celá lidská variabilní doména, je nahrazeno odpovídající sekvencí jiného druhu než je člověk. Jak je prakticky provedeno v předkládaném vynálezu, zušlechtěné IgE protilátky mají některé CDR zbytky a možno i některé FR zbytky nahrazeny zbytky z analogických míst v myších protilátkách,

Výběr lidských variabilních domén, jak lehké, tak těžké, které budou použity pro vytvoření zušlechtěných protilátek, je velmi důležitý pro snížení antigenicity. Pomocí tzv. metody „nejlepší shody“ je sekvence variabilní domény protilátky hlodavce porovnávána s celou knihovnou známých sekvencí lidských variabilních domén. Lidská sekvence, která je nejbližší sekvenci hlodavce je potom použita jako lidská kostra pro zušlechtěnou protilátku (Sims a kol., 1 Immunol. 151: 2 296 (1993); Chothia a kok, /. Mol. Bioí 196: 90 (1987)). Jiná metoda používá zvláštní kostru, odvozenou z konsenzuální sekvence všech lidských protilátek určité skupiny lehkých nebo těžkých řetězců. Tatáž kostra může být použita pro několik různých zušlechtěných protilátek (Carter a kol., Proč. Nati Aead, Sci. USA 89: 4 285 (1992); Presta a kok, J. Immunol.

151:2623 (1993)).

Dále je důležité, že protilátky mají být zuŠlechtěny a přitom si podržet vysokou afinitu k antigenu a ostatní výhodné biologické vlastnosti. Aby bylo dosaženo tohoto cíle, tak pomocí metody, které je dávána přednost, jsou zušlechtěné protilátky připravovány postupem, kdy jsou výchozí sekvence a různé koncepce zušlechtěných protilátek analyzovány pomocí trojrozměrných modelů. Modely pro určité domény protilátek, např. VH a VL domény, jsou konstruovány odděleně od konsenzuálních sekvencí založených na strukturách F(ab), které mají vzájemně sekvence podobné. Trojrozměrné modely imunoglobu línů jsou obecně dostupné a jsou běžně známé osobám se zkušenostmi v tomto oboru. Jsou dostupné počítačové programy, které vykreslí a zobrazí pravděpodobné trojrozměrné konformační struktury vybraných kandidátů imunoglobu línových sekvencí. Prozkoumání těchto zobrazení umožní analýzu pravděpodobné úlohy jednotlivých aminokyselinových zbytků pro fungování kandidátské imunoglobulinové sekvence, tj. analýzu zbytků které mají vliv na schopnost imunoglobulinového kandidáta se vázat ke svému antigenu. Například při modelování fragmentu F(ab)—12 v příkladu 2 byla použita myší MAE11 jako vzor, které zbytky v CDR a podpůrné oblasti molekulárním modelováním modifikovat, aby se dospělo k mutované sekvenci.

Jako další příklad je možno zmínit kontrolní protilátku Mab4d5. Byly zde konstruovány modely, založené na strukturách několika Fab z Brookhavenské proteinové datové banky (položky 1FB4,

2RHE, 2MCP, 3FAB, 1FBJ, 2HFL a 1REI). F(ab) fragment KOL (Marquart, M, a kol., J. Mol. Biol. 141: 369-391 (1980)) byl vybrán první, jako matrice pro domény VL a VH a další struktury byly pak přes tuto strukturu předkládány, přičemž byly použity souřadnice atomů jejich hlavního řetězce (program INSIGHT, Bíosym Technologies). Podobné programy a techniky jsou použity pro modelování požadované protilátky.

Typická analýza, využívající molekulární modelování, může být provedena následujícím způsobem: Vzdálenost mezi Ca matrice a Ca analogu u každé z překládaných struktur je vypočtena pro pozici každého daného zbytku. Obecně jestliže všechny (nebo téměř všechny) vzdálenosti Ca-Ca pro daný zbytek jsou < l A, potom je tato pozice zahrnuta do konsenzuální sekvence. V něktetých případech budou zbytky kostry p—listu splňovat tato kritéria, zatímco smyčky CDR nemusí. Pro každý z těchto vybraných zbytků jsou vypočteny průměrné souřadnice jednotlivých atomů N, Ca, C a Cp, a poté opraveny výsledné odchylky od geometrie nestandardních vazeb 50 cykly energetické minimalizace pomocí komerčně dostupného programu jako je program DISCOVER ío (Biosym Technologies) se silovým polem AMBER (Wiener, S. J. a kol., J.Amer. Chem. Soc. 106: 765-784 (1984)) a souřadnice Ca byly zafixovány. Postranní řetězce vysoce konzervativních zbytků, jako jsou cysteiny spojené disuífidickými můstky, jsou pak do výsledné konsenzuální sekvence vloženy. Dále jsou vloženy sekvence VL a VH domén určité protilátky, počínaje CDR zbytky a za pomoci tabelovaných CDR konformací z Chothia a kot (Chothia a kol., Nátuře 342: 877-883 (1989)) jako návodu. Konformace postranních řetězců jsou vybrány na základě krystalických struktur Fab, rotamerových knihoven (Ponder, J. W. & Richards, F. M., J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)) a úvah o možném uspořádání. Protože VH-CDR3 nemusí být určitelná pomocí výše uvedených kritérií, mohou být pomocí programu INSIGHT na základě výsledků výzkumu podobně velikých smyček vytvořeny modely, odvozené pomocí úvah o mož20 ném uspořádání a vlivu rozpustidla, nebo vytvořeny pomocí jiné běžné a komerčně dostupné techniky. Je žádoucí podrobit model 5000 cyklům energetické minimalizace.

Tímto způsobem mohou být vybrány zbytky tvořící kostru a spojeny recipientní a importované sekvence tak, že jsou dosaženy požadované charakteristiky protilátky, jako je například zvýšená afinita k cílovému antigenu. Obecně řečeno, zbytky v CDR se přímo a nejpodstatněji podílejí na ovlivnění vazby s antigenem. Tato technika byla použita při vytváření F(ab}~12 v příkladu 2, kde bylo pro aminokyselinové zbytky z myší CDR použito molekulární modelování a vytvořen zušlechtěný fragment myší anti-Ige protilátky.

Jinou možností nyní je vytvořit transgenní živočichy (např. myš), kteří jsou schopni v důsledku imunizace produkovat plný repertoár lidských protilátek za nepřítomnosti tvorby endogenního imunoglobulinu. Například bylo popsáno, že homozygotní delece spojovacích oblastí (JH) genu pro těžký řetězec protilátky v chimemí a zárodečné linii myši, má za následek kompletní inhibiei tvorby endogenních protilátek. Přenos uspořádání lidského imunoglobulinového genu ze zárodečné linie do takovéto zárodečné mutované myší linie bude mít po expozici k antigenu za následek tvorbu lidských protilátek. Jakobovits a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 90: 2 551 (1993); Jakobovits a kol., Nátuře 362: 255-258 (1993); Bruggermann a kol., Year in Immunol. 7: 33 (1993) a Duchosal a kol., Nátuře 355: 258 (1992). Lidské protilátky mohou být také odvozeny z fágových knihoven, kde jsou prezentovány na povrchu fágové partikule (Hoogenboom a kol.,

J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks a kol., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Vaughan a kol., Nátuře Biotech. 14:309 (1996)).

(b) Další modifikace

Po produkci mutovaných protilátek je určována a porovnána biologická aktivita získané molekuly vzhledem k druhově závislým protilátkám. Jak bylo zmíněno výše, může se jednat o určování vazebné afinity anebo jiných biologických aktivit protilátky. Při výhodném provedení tohoto vynálezu, je připraven panel mutovaných protilátek, kteiý je pak hromadně prohledáván na základě vazebné afinity k antigenu, pocházejícího z druhého savčího druhu. Jedna nebo více mutovaných protilátek, vybraných během tohoto počátečního prohledávání, jsou případně podro50 beny jednomu nebo dalším testům biologické aktivity aby se potvrdilo, že mutovaná protilátka (protilátky) se zvýšenou vazebnou afinitou jsou skutečně použitelné, například predklinická studia. Ve výhodném provedení simutovaná protilátka podrží schopnost vázat se k antigenu, pocházejícího z prvního savčího druhu s vazebnou afinitou podobnou, jako druhově závislá protilátka. Toho lze dosáhnout tím, že se vyhneme změnám těch zbytků v hypervariabilní oblasti anti lidské protilátky, které se účastní vazby antigenu. V jiném provedení, může mít mutovaná protilátka výrazně pozměněnou vazebnou afinitou k antigenu, pocházejícího z prvního savčího druhu (například vazebná afinita je výrazně lepší, ale může být i horší než má druhově závislá protilátka).

Takto vybraná mutovaná protilátka (protilátky) může být podrobena dalším modifikacím, které často závisí na zamýšleném použití protilátky. Tyto modifikace mohou zahrnovat další změny aminokyselinové sekvence, fúzí s heterologním peptidem (peptidy) anebo kovalentní modifikace, jako jsou vypracovány níže. Pokud se týká změn aminokyselinové sekvence, příklady modifikací io byly vypracovány výše. Například kterékoli cysteinové zbytky, které se neúčastní udržování patřičné konformace mutované protilátky mohou být také substituovány, obecně serinem, aby se zvýšila stabilita molekuly vůči oxidaci a zabránilo vzniku chybných křížových vazeb. Naopak, (a) cysteinová vazba (vazby) může být do protilátky přidána, aby se zvýšila její stabilita (zvláště když protilátkou je fragment protilátky, jako je například fragment Fv). Jiný typ aminokyselinové mutanty má změněný způsob glykosylace. Toho lze dosáhnout odstraněním jedné nebo více cukerných koster, nacházejících se v protilátce anebo přidáním jednoho nebo více glykosylačních míst, která v protilátce nejsou přítomna. Glykosylační skupiny v protilátkách jsou typicky vázány buď na atom dusíku nebo kyslíku (N-vázané nebo O-vázané). N-vázaná označuje připojení cukerné kostry k postrannímu řetězci asparaginového zbytku. Tripeptidové sekvence asparagin20 X-serin a asparagin-X-threonin, kde x je kterákoli aminokyselina kromě prolinu, jsou rozpoznávacími sekvencemi pro enzymatické připojení cukerné kostry k postranímu řetězci asparaginu. Tedy přítomnost kterékoli z těchto tripeptidových sekvencí v polypeptidů vytváří potenciální glykosylační místo. O-vázaná glykosylace označuje připojení cukerné kostry prostřednictvím atomu kyslíku v éterové funkční skupině; například N-acetylgalaktozamin, galaktóza, fukóza nebo xylóza vázané k hydroxyaminokyselině, nejběžněji serin nebo threonin, ačkoli mohou být také použity 5-hydroxyprolin nebo 5-hydroxylyzin. Přidání glykosylačních míst do protilátek se běžně dosahuje změnou aminokyselinové sekvence tak, že obsahuje jednu nebo více výše popsaných tripeptidových sekvencí (pro N-vázaná glykosylační místa). Změna může být také provedena přidáním nebo substitucí jednoho nebo více serinových nebo threoninových zbytků k sekvenci původní protilátky (pro O-vázaná glykosylační místa).

(v) Fragmenty protilátek

Byly vyvinuty různé techniky pro vytvoření proti látkových fragmentů. Tradičně byly tyto fragmenty odvozeny pomocí proteolytického štěpení intaktních protilátek (viz např. Morimoto a kol,, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) a Brennan a kol., Science 229: 81 (1985)).

Nyní však mohou být tyto fragmenty produkovány přímo rekombinantnímí hostitelskými buňkami. Například fragmenty protilátek mohou být izolovány v protilátkových fágových kniho40 ven, probíraných výše. Jinou možností je získání fragmentů F(ab')2~SH přímo z E. coii a chemicky spojit a vytvořit tak fragmenty F(ab)₂ (Carter a kol., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Pomocí jiného přístupu, mohou být fragmenty F(ab') přímo izolovány z kultury rekombinantních hostitelských buněk. Jiné techniky pro tvorbu protilátkových fragmentů budou zřejmé pro osoby s praxí v tomto oboru. V jiném provedení je vybraná protilátka jednořetězcový Fv fragment (scFv). (PTC patentová přihláška WO 93/16185).

(vi) Multispecifícké protilátky

Multispecifické protilátky mají vazebnou speeifieitu nejméně pro dva odlišné antigeny. Zatímco takové molekuly normálně vážou pouze dva antigeny (tj. bispecifické protilátky, BsAbs), proti50 látky s dalšími specificitami, jako jsou trispecifické protilátky, jsou zahrnuty pod tímto zde používaným označením. Příklady BsAbs jsou takové, jejichž jedno rameno je namířeno proti antigenu nádorových buněk a druhé rameno je namířeno proti molekule spouštějící cytotoxicitu jako je anti-FcyRI/anti-CD15, anti-p 1 SS^^/FcyRIII (CD16), antí-CD3/anti-maligní B buňka (ID10), anti-CD3/anti-pl85^HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-ledvinový karcinom, anti7Λ _

CZ 3W724 B6

CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-Dl (proti rakovině tlustého střeva), anti-CD3/anti-melanocyty stimulujícímu hormonovému analogu, anti-EGF RECEPTOR/anti-CD3, anti-CD3/antiCAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-adhezní molekule neurálních buněk (NCAM)/anti-CD3, anti-vazebnému proteinu k folátu (FBP)/anti-CD3, anti-antigenu spojenému s„pan“ karcinomem (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs s jedním ramenem, které se specificky váže k nádorovému antigenu a jedním ramenem, které se váže k toxinu jako je a nti-saporin/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporin, anti-CD7/antÍ-saporin, anti-CD38/anti-saporin, anti-CEA/anti-ricinový A řetězec, anti-CD22/antÍ-saporin, anti-CD7/anti-saporin, anti-GD38/anti-sporin, anti-CEA/anti-ricinový A řetězec, anti-interferon-a(IFN-a)/anti-idiotyp hybriio domu, anti-CEA/anti-alkaloid vinca; BsAbs pro konverzní enzymy pro aktivované prekurzory léků, jako je anti CDlO/anti-alkalické fosfatáza (která katalyzuje konverzi prekurzoru mitomycin fosfátu na mitomycin alkohol); BsAbs které mohou být použity jako fibrinolytická Činidla, jako je anti-fibrin/anti-aktivátor tkáňového plazminogenu (tPA), anti-fíbrin/anti-aktivátor piazminogenu urokinázového typu (uPA), BsAbs pro nasměrování imunních komplexů kreceptorům buněčného povrchu jako je anti-lipoproteinu s nízkou hustotou (LDL)/anti/Fc receptor (například FcyRI, FcyRII nebo FcyRIII); BsAbs pro použití v léčení infekčních nemocí jako je anti-CD3anti-herpes simplex virus (HSV), anti-T buněčný receptor: CD3 komplex/anti-chřipka, antiFcyR/anti-HIV, BsAbs pro detekci nádoru in vitro nebo in vivo jako jsou anti-CEA/antiEOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85^HER2/anti-hapten; BsAbs jako adjuvans vakcín a

BsAbs jako diagnostické prostředky jako jsou anti—králičí IgG/anti-ferntm, anti-křenová peroxidáza (HRP)/anti-hormon, anti-somatostatin/anti-substance P, anti-HRP/anti-FITC, antiCEA/anti-ff-galaktozidáza. Příklady trispecifických protilátek zahrnuje takové jako jsou antiCD3/anti-CD4/anti-€D3 7, anti-CD3/anti-CD4/anti-CD3 7, anti-CD3/anti-CD8/anti-CD3 7. Bispecifické protilátky mohou být připraveny buď jako protilátky o plné délce nebo jako fragmenty protilátek (například F(ab')2 bispecifických protilátek).

Postupy pro vytvoření bispecifických protilátek jsou v oboru známé. Tradiční příprava bispecifických protilátek o plné délce je založena na společné expresi dvou párů těžkých a lehkých imunoglobulinových řetězců, kde dva řetězce mají odlišné specificity (Millstein a kok,

Nátuře 305: 537-539 (1983)). Díky náhodnému uspořádávání těžkých a lehkých imunoglobulinových řetězců, tyto hybridomy (kvadromy) produkují potenciálně směs 10 různých proti látkových molekul, z nichž pouze jedna má správnou bispecifickou strukturu. Vyčištění správné molekuly, které je obvykle prováděno pomocí kroků afinitní chromatografie, je poněkud pracné a výtěžky produktu jsou nízké. Podobné postupy jsou popsány v WO 93/08829 a v Traunecker akok,£jWSO. J. 10: 3655-3659 (1991).

Pomocí různých přístupů, jsou proti látkové variabilní domény s požadovanou vazebnou specificitou (spojující se místa protilátka-antigen) fúzovány k sekvencím konstantní domény imunoglobulinu. Fúze se provádí přednostně s konstantní doménou těžkého řetězce imunoglobulinů, která obsahuje přinejmenším část otočné oblasti, CH2 a CH3 oblasti. Je výhodné mít první konstantní oblast těžkého řetězce (CHl), obsahující místo nezbytné pro vazbu lehkého řetězce přítomnou přinejmenším v jedné z fúzí. DNA kódující fúzované imunoglobulinové těžké řetězce a pokud je to požadováno i lehký řetězec imunoglobulinů, jsou vloženy do oddělených expresních vektorů a ty jsou kotransfekovány do vhodného hostitelského organizmu. To poskytuje velkou pružnost při úpravě vzájemných poměrů tří polypeptidových fragmentů v provedení, kdy nestejné poměry tří polypeptidových řetězců použitých při konstrukci, poskytují optimální výtěžek. Je však možné vložit kódující sekvence dvou nebo všech třech polypeptidových řetězců do jednoho expresního vektoru, pokud exprese přinejmenším dvou polypeptidových řetězců ve stejném poměru má za následek vysoký výtěžek nebo když vzájemné poměry nemají zvláštní so význam.

Ve výhodném provedení tohoto přístupu jsou bispecifické protilátky složeny z hybridního těžkého imunoglobulinového řetězce s první vazebnou specificitou na jednom rameni a z hybridního imunoglobulinového páru těžký retězec-Iehký řetězec (poskytujícího druhou vazebnou specificitu) na druhém rameni. Bylo zjištěno, že tato asymetrická struktura usnadňuje

-35CZ 300724 B6 oddělení požadovaných bispecifických složek od nechtěných kombinací imunoglobul i nových řetězců, protože přítomnost lehkého imunoglobulinového řetězce v pouze jedné polovině bispecifické molekuly usnadňuje způsob separace. Tento přístup je popsán v WO 94/04690. Další podrobnosti přípravy bispecifických protilátek viz například v Suresh a kol., Methods in Enzymology 121:210(1986).

Podle jiného přístupu, popsaného v WO 96/27011, může být navržen takový povrch dotyku mezi párem proti látkových molekul, že bude maximalizováno procento heterodimerů, získávaných z rekombinantní buněčné kultury. Výhodné uspořádání obsahuje přinejmenším Část CH3 domény io z konstantní domény protilátky. V této metodě je jeden nebo více malých postranních řetězců aminokyselin z povrchu dotyku první protilátkové molekuly nahrazen za velký postranní řetězec (řetězce) (například tyrozín za tryptofan). Kompenzační „dutiny“ stejné nebo podobné velikosti jako je velký postranní řetězec (řetězce) jsou vytvořeny na povrchu dotyku druhé proti látkové molekuly tím, že se zamění velké postranní aminokyselinové řetězce za malé (například alanin za threonin). To poskytuje mechanizmus pro zvýšení výtěžku heterodimerů oproti jiným nežádoucím koncovým produktům, jako jsou například homodimery.

Bispecifické protilátky zahrnují křížově vázané protilátky, neboli „heterokonjugáty“. Například jedna z protilátek v heterokonjugátu může být spojena s avidinem, jiná s biotinem. Takové proti20 látky, byly například navrženy aby zaměřily buňky imunního systému na nežádoucí buňky (US patent 4 676 980) a pro léčení HIV infekcí (WO 91/00360, WO 92/200373 a EP 03089). Heterokonjugované protilátky mohou být připraveny pomocí kterékoli běžné metody, vytvářející křížové vazby, Vhodná činidla, vytvářející křížové vazby jsou dobře v oboru známé a jsou popsány v US patent 4 676 980 spolu s množstvím technik pro vytváření křížových vazeb.

Techniky pro vytvoření bispecifických protilátek z protilátkových fragmentů byly také v literatuře popsány. Bispecifické protilátky lze například připravit pomocí chemického spojení. Brennan a kol., Science 229: 81 (1985) popisuje postup, kde jsou výchozí protilátky proteolyticky štěpeny a připraveny tak fragmenty F(ab')₂- Tyto fragmenty jsou redukovány v přítomnosti arsenitanu sodného - činidla vytvářejícího komplex s dithiolovou skupinou, aby byly stabilizovány dithiolové skupiny a zabránilo se tak tvorbě mezimolekulámích disulfidických vazeb. Vytvořené F(ab') fragmenty jsou převedeny na thionitrobenzoátové (TNB) deriváty. Jeden z Fab'-TNB derivátů je potom redukcí merkaptoethylaminem převeden zpět na Fab-thiol a je smíchán s ekvimolámím množstvím jiného Fab-TNB derivátu a vytvořena bispecifícká proti35 látka. Vytvořené bispecifické protilátky se mohou použít jako činidla pro selektivní imobilizaci enzymů.

Soudobý pokrok usnadnil přímé získání fragmentů Fab'-SH z E.coli, které pak mohou být chemicky spojovány a vytvářet bispecifické protilátky. Shalaby a kol., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) popisuje tvorbu zušlechtěné bispecifické molekuly F(ab')₂. Každý fragment Fab' byl odděleně sekretován z E. coli a podroben řízenému chemickému spojení in vitro pro vytvoření bispecifické protilátky. Takto vytvořená bispecifícká protilátka se byla schopna vázat na buňky vykazující nadprodukci represoru ErbB2 a normálním lidským T buňkám a rovněž spustit lytickou aktivitu lidských cytotoxických lymfocytů proti cílovému lidskému nádoru prsu.

Byly také popsány různé techniky pro přípravu a izolaci fragmentů bispecifické protilátky přímo z rekombinantní buněčné kultury. Například bispecifické protilátky byly vytvářeny pomocí techniky leucinových zipů. Kostelny a kol., J Immunol. 148(5): 1 547—1 553 (1992). Peptidy obsahující leucinové zipy, připravené z proteinů Fos a Jun, byly pomocí genové fúze připojeny kFab' částem dvou různých protilátek. Proti látkové homodimery byly redukovány v otočné oblasti aby se vytvořily monomery a poté byly opět oxidovány aby se vytvořily heterodimery protilátek. Technologie „diabodií“ popsaná v Hollinger a kol., Proč. Naď. Aead, Sci. USA 90: 6444—6448 (1993) poskytuje alternativní mechanizmus přípravy bispecifických protilátkových fragmentů. Fragmenty obsahují variabilní doménu těžkého řetězce (V_H) spojenou s variabilní doménou lehkého řetězce (V_L) pomocí linkeru, který je však příliš krátký, aby umožnil párování

CZ 3W724 B6 mezi těmito dvěma doménami téhož řetězce. Tím jsou domény (V_H) a (V_L) jednoho fragmentu nuceny se párovat s komplementárními (V_H) a (V_L) doménami jiného fragmentu, čímž vytvoří dvě místa pro vazbu antigenu. Byla také popsána jiná strategie pro přípravu fragmentů bispecifícké protilátky pomocí jednořetězcových Fv(sFv) dimerů. Viz Gruger a kol., J. immunol. 152:

5368(1994).

Jsou uvažovány i protilátky s více než jednou vazebnou možností. Například mohou být připraveny trispecifícké protilátky. Tutt a kol., J. Immunol. 147: 60 (1991).

ío (vii) Ovlivňování efektorové funkce

Někdy může být žádoucí modifikovat protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pokud se týká jejich efektorové funkce, jakoje např. zvýšení efektivity vazby protilátky k IgE. Například mohou být do oblasti Fc vneseny cysteinové zbytky, Čímž se umožní vznik interřetčzcové disuf fídické vazby v této oblasti. Takto vytvořené homodimerní protilátky mohou mít zvýšenou, ís komplementem zprostředkovanou schopnost usmrcovat buňky a buněčnou cytotoxicitu, závislou na protilátkách (ADCC). Viz Caron a kol., J. Exp. Med 176: 1191-1195 (1992) a Shopes, B„

J. Immunol. 148: 2918-2922 (1993). Jinou možností je zkonstruovat protilátku, která má zdvojené Fc oblasti a může tedy mít zvýšenou účinnost lýzy za pomoci komplementu a ADCC schopnost. Viz. Stevenson a kol., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989), (viii) Imunokonjugáty

Vynález se také týká imunokonjugátů, které obsahují zde popsané protilátky konjugované s cytotoxickými činidly, jako jsou chemoterapeutická činidla, toxin (např. enzymaticky aktivní toxin bakteriálního, houbového, rostlinného nebo živočišného původu, nebo jeho fragmenty), nebo radioaktivní izotop (tj. radiokonjugát).

Chemoterapeutická činidla, užitečná pro tvorbu takových imunokonjugátů byla popsána výše. Enzymaticky aktivní toxiny ajejích fragmenty, které je možno použít jsou difterický řetězec A, nevazebné aktivní fragmenty difterického toxínů, A řetězec exotoxinu (z Pseudomonas 30 aeruginosa), A řetězec ricinu, A řetězec abrinu, A řetězec modecinu, alfa-sarcin, proteiny z Aleurites fordii, proteiny dianthinu, proteiny z Phytolaca americana (PAPI, PAPII a PAP-S), inhibitor momordica charantia, curin, crotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin a tricotheceny. Pro tvorbu značených protilátek, konjugovanvch s radioizotopy, jsou k dispozici různé radioizotopy. Mezi příklady lze uvést ²¹²Bi, ^,3‘I, ^lIn,

Konjugáty protilátky s cytotoxickým činidlem jsou vytvářeny pomocí různých bifiinkěních činidel, které vážou proteiny, jako jsou N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithiol) propionát (SPDP), iminothiolan (IT), bifunkční deriváty imidoesterů (jako je dimetyladimidát HCI), aktivní estery (jako je disukcinimidyl suberét) aldehydy (jako je glutaraldehyd), bi-azido sloučeniny (jako je bis-/?-(azidobenzoyl) hexandiamin), bis-diazoniové deriváty (jako je bis-p(diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), diizokyanáty (jako je toluen 2,6-diizokyanát) a bis—aktivní fluorové sloučeniny (jakoje l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Například ricinový ímunotoxin může být připraven jak bylo popsáno ve Vitetta a kol., Science 238: 1098 (1987). l-izothiokyanobenzyl-3-methyl45 diethylen triaminopentaoctová kyselina značená ¹⁴C (MX-DTPA) je příkladem chelačního činidla, vhodného pro konjugací radioizotopu s protilátkou. Viz WO 94/11026.

Při jiném provedení může být protilátka konjugována k “reeeptorů“ (jako je streptavidin) pro použití proti nádoru, kdy konjugát protilátka-receptor je podán pacientovi, následuje odstranění nenavázaného konjugátu z oběhu pomocí vychytávacího činidla a poté podání „ligandů“ (např. avidin), který je konjugován s cytotoxickým činidlem (např. radioizotopem).

-37CZ 300724 B6 (ix) Imunolipozómy

Mutované protilátky, které zde byly popsány, mohou být také vytvořeny ve formě imunolipozómů. Lipozomy obsahující protilátku se připravují postupy, které jsou v oboru známé, jako jsou popsány v Epstein a kok, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 82: 3 688 (1985); Hwang a kol., Proč.

Nati. Acad, Sci. USA 77: 4030 (1980) a US patent 4 485 045 a 4 544 545. Lipozomy s prodlouženou dobou cirkulace jsou popsány v US patent 5 013 556.

Zvláště vhodné lipozomy je možno připravit pomocí metody odpaření reverzní fáze se směsí lipidů, která obsahuje fosfatidylcholin, cholesterol a PEG-derivát fosfatidylethanolaminu io (PEG-PE). Lipozomy jsou pak protlačeny filtry o definované velikosti pórů, aby byly získány lipozomy požadovaného průměru. Protilátkové fragmenty Fab', které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být konjugovány s lipozomy, jak je popsáno v Martin a kol., J. Biol.

Chem. 257: 286-288 (1982) pomocí disulfidické výměnné reakce. V lipozómu je případně obsaženo chemoterapeutické činidlo (jako je Doxorubicin). Viz Gabizon a kol., J. National is Cancer Inst. 81(19): 1484(1989).

(x) Léčba lékovým prekurzorem, který je konvertován enzymem vázaným s protilátkou (ADEPT)

Protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, se mohou také používat v metodě ADEPT tak, že jsou konjugovány s enzymem, který převádí prekurzor léku (např. na peptidyl vázané chromoterapeutické činidlo, viz. WO 81/01145) na aktivní protinádorový lék. Viz například WO 88/07378 a US patent 4 975 278.

Mezi enzymové složky imunokonjugátu, vhodné pro ADEPT, patří kterýkoli enzym který je schopen působit na prekurzor léku takovým způsobem, že jej přemění na jeho aktivnější, cytotoxickou formu.

Mezi enzymy, které jsou užitečné pro metodu tohoto vynálezu, patří mimo jiné alkalická fosfatáza, vhodná pro přeměnu lékových prekurzoru obsahujících fosfát na volné léky; aryl30 sulfatáza, vhodná pro přeměnu lékových prekurzorů obsahujících sulfát na volné léky; cytozin deamináza, vhodná pro přeměnu lékových prekurzorů obsahujících netoxický 5-fluorocytozin na protinádorový lék, 5-fluorouracÍl; proteázy, jako jsou např. proteázy ze serratie, thermolyzin, subtilisin, karboxypeptidázy a kathepsiny (jako jsou například kathepsiny B a L), které jsou vhodné pro přeměnu prekurzorů obsahujících peptidy na volné léky; D-alany (karboxypeptidázy, které jsou vhodné pro přeměnu prekurzorů obsahujících D-aminokyselinové substituenty; enzymy štěpící sacharidy, jako je β-galaktozidáza a neuraminidáza, které jsou vhodné pro přeměnu prekurzorů obsahujících sacharidové substituenty na volné léky; β-laktamáza vhodná pro přeměnu léků obsahujících β-laktam na jejich volné lékové formy; a penicilín amidázy, jako je penicilinová v amidáza nebo penicilinová g amidázy, vhodné pro přeměnu léků, obsahujících na dusíkovém atomu jejich aminoskupiny fenoxyacetylové nebo feny lacety lové skupiny, na jejich volné lékové formy. Jinou možností je použít protilátky s enzymatickou aktivitou, také v oboru známých jako „abzymy“, pro přeměnu prekurzorů léků, které jsou předmětem tohoto vynálezu, na aktivní volné formy těchto léků (Massey, Nature 328: 457- 458 (1987)). Konjugáty protilátka-abzym mohou být připraveny tak, jak je zde popsáno pro dopravení abzymu přímo k populaci nádorových buněk.

Enzymy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být kovalentně vázány k mutovaným protilátkám pomocí postupů v oboru dobře známých, jako je použití heterob(funkčních zesíťujících činidel, která byla probírána výše. Jinou možností je konstruovat fúzní proteiny, obsahující přinejmenším oblast která váže antigen, pocházející z protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, vázanou přinejmenším k funkčně aktivní částí enzymu, který je předmětem tohoto vynálezu, pomocí rekombinantních DNA technik, dobře v oboru známých (Neuberger a kol., Nature 312: 604-608 (1984)).

ΊΟ _ (xi) Fáze protilátky s epitopem pro ochranný receptor

Při některých provedeních tohoto vynálezu může být žádoucí použít fragment protilátky namísto celé nepoškozené protilátky, aby se například zvýšila schopnost pronikat do nádoru. V takovém případě může být žádoucí pozměnit protilátkový fragment tak, aby se zvýšil jeho poločas v séru.

Toho lze dosáhnout například zabudováním vazebného epitopu pro ochranný receptor do fragmentu protilátky (například mutací vhodné oblasti ve fragmentu protilátky nebo zabudováním epitopu do peptidového označovače, kteiý je potom fúzován s fragmentem protilátky na některém jeho konci nebo uprostřed, například pomocí DNA syntézy či syntézy peptidů).

io Vazebný epitop pro ochranný receptor s výhodou obsahuje oblast, kde jeden nebo více aminokyselinových zbytků z jedné nebo dvou smyček Fc domény, je přeneseno na analogické pozice proti látkového fragmentu. Ještě výhodnější je, když je přeneseno tři nebo více zbytků z jedné nebo dvou smyček Fc domény. Ještě výhodnější je, když je epitop vzat z CH2 části Fc domény (například z IgG) a přenesen do CHI, CH3 nebo VH domény, nebo do více než jedné z těchto oblastí protilátky. Jinou možností je vzít epitop z CH2 domény Fc oblasti a přenést do C_L oblasti nebo V_L oblasti, nebo do obou těchto oblastí protilátkového fragmentu.

(xii) Jiné kovalentní modifikace protilátek

Kovalentní modifikace protilátek jsou zahrnuty v rámci obsahu tohoto vynálezu. Mohou být provedeny chemickou syntézou nebo enzymatickým či chemickým štěpením protilátky, pokud je použitelné. Jiné typy kovalentních modifikací protilátek jsou vneseny do molekuly pomocí reakcí cílových aminokyselinových zbytků v protilátce s organickým derivatizujícím činidlem, které je schopno reagovat s vybraným postranními řetězci nebo se zbytky na N-konci nebo C-konci.

Cysteinové zbytky nejčastěji reagují s α-halogenacetáty (a odpovídajícími aminy), jako jsou kyselina chloroctová nebo chloracetamin a výsledkem jsou karboxymethylové nebo karboxyaminomethylové deriváty. Cysteinové zbytky jsou také modifikovány reakcí s bromotrifluoroacetonem, a-bromo~p-(5-imidazoyl)-propionovou kyselinou, chloracetylfosfátem, N-alkylmaleinimidy, 3-nitro-2-pyridyl disulfidem, methyl 2-pyridyl disulfidem, p-chlormerkuriben30 zoátem, 2-ch loromerkuri-4-nitrofenolem nebo 7-nitrobenzo-2-oxa-l ,3-diazolem.

Histidinové zbytky jsou modifikovány reakcí s diethylpyrokarbonátem při pH 5,5 až 7,0, protože toto činidlo je relativně specifické pro postranní řetězce histidinu. Lze také použít para-bromofenylacyl bromid, reakce se s výhodou provádí v prostředí 0,1 M kakodylátu sodného při pH 6,0.

Lyzinové zbytky a zbytky aminovém konci mohou reagovat s anhydridem kyseliny jantarové nebo anhydridy jiných karboxylových kyselin. Reakce s těmito činidly má za následek obrácení náboje lyzinových zbytků. Jiná reakční činidla vhodná pro pozměnění zbytků, obsahujících α-aminoskupinu, jsou imidoestery jako je methyl pikolinimid, pyridoxal fosfát, pyridoxal, chloroborohydrid, kyselina trinitrobenzen sulfonová, O-methylizomočovina, 2,4-pentandion a transaminázou katalyzované reakce se solemi kyseliny glyoxalové.

Argíninové zbytky jsou modifikovány reakcí s jednou či více běžných chemikálií, mezi jiným fenylglyoxalem, 2,3-butandíonem, 1,2-cyklohexandionem a ninhydrinem. Reakce sarginino45 vými zbytky vyžaduje, aby probíhala za alkalických podmínek, kvůli vysoké pK₈ guanidinové funkční skupiny. Mimo to tato činidla mohou reagovat se skupinami lyzinovými a rovněž s ε-aminoskupinou argininu.

Může být provedena specifická modifikace tyrozinových zbytků, zvláště se může provést vnesení so spektrálních značkovačů do tyrozinových zbytků, zvláště se může provést vnesení spektrálních značkovačů do tyrozinových zbytků pomocí reakce s aromatickými diazoniovými sloučeninami nebo tetranitromethanem. Nejčastěji se používají N-acetylimidazol a tetranitromethan pro vznik

O-acety ltyrozinu, popřípadě 3-nitroderivátů tyrozinu. Tyrozinové zbytky se označují jódem ¹²⁵1 nebo ^BlI a připraví se tak označené proteiny, vhodné pro použití v radioimunotestu.

-39cz 300724 B6

Karboxylové postranní skupiny (asparagová nebo glutamová kyselina) jsou selektivně pozměněny pomocí reakce s karbodiimidy (R-N~C=C-R^ř), kde R a R' jsou různé alkylové skupiny, jako je l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyM-ethyl) karbodiimid nebo 1-ethyl—3-(25 azonium-4,4-dimethylpentyl) karbodiimid. Mimo to zbytky kyseliny asparagové nebo glutamové mohou být převedeny na zbytky asparaginu nebo glutaminu pomocí reakce s amonnými ionty.

Glutaminové a asparaginové zbytky jsou často deaminovány na odpovídající zbytky kyseliny io glutamové a asparagové. Tyto zbytky jsou deaminovány za neutrálních nebo zásaditých podmínek. Deaminované formy těchto zbytků spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Jinými modifikacemi jsou hydroxy láce prolinu a lyzinu, fosforylace hydroxylových skupin ve zbytcích serinu nebo threoninu, methylace α-aminoskupin lyzinových, argininových a histidino15 vých postranních řetězců (Τ. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman&Co., San Francisko, str. 79-86 (1986)), aeetylace N-koncové aminoskupiny a amidace C-koncové karboxylové skupiny.

Jiným typem kovalentní modifikace je chemické nebo enzymatické připojení cukerných zbytků k protilátce. Tyto postupy mají výhodu v tom, že nevyžadují vytváření protilátek v hostitelských buňkách, které mají schopnost N- nebo O-glykosylace. V závislosti na použitém způsobu připojení může být cukr (cukry) připojen k: (a) argininu a histidinu; (b) volným karboxylovým skupinám; (c) volným -SH skupinám, jako jsou v cysteinu; (d) volným hydroxylovým skupinám, jako jsou v šeřinu, threoninu nebo hydroxyprolinu; (e) aromatickým zbytkům, jako je fenylalanin, tyrozin nebo tryptofan; nebo (f) aminoskupině glutaminu. Tyto metody jsou popsány v WO 87/05330, publikovaném 11. září 1987 a v Aplin a Wriston, CRC Crit. Rev. Boichem., str. 259306(1981).

Odstranění kterýchkoli sacharidových složek, přítomných v protilátce, může být provedeno chemicky nebo enzymaticky. Chemické odstranění sacharidové složky vyžaduje působení trifluoromethansulfonové kyseliny nebo analogické chemikálie na danou sloučeninu. Takové působení má za následek odštěpení většiny nebo všech cukrů, kromě vázaných cukrů (N-acetylglukozamin nebo N-acetylgalaktozamin), zatímco zbytek protilátky není pozměněn. Chemické odstranění sacharidové složky je popsáno v Hakimuddin a kol., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) a vEdge a kol., anal. Biochem. 118: 131 (1981). Enzymatické štěpení sacharidových složek v protilátkách může být dosaženo pomocí různých endoglykozidáz a exoglykozidáz, jak je popsáno v Thotakura a kol., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).

Jiným typem kovalentní modifikace protilátky je připojení protilátky k některému z množství neproteinových polymerů, například polyethylenglykol., polypropylen gly kol nebo polyoxyalkyleny, způsobem popsaným v US patentech 4 640 835; 4 496 689; 4 301144; 4 670 417; 4 791 192 nebo 4 179 337.

B. Vektory, hostitelské buňky a metody rekombinace

Vynález také poskytuje nukleovou kyselinu, kódující mutované protilátky, jak je zde popsáno, vektory a hostitelské buňky, obsahující nukleovou kyselinu a rekombinační metody pro vytváření mutovaných protilátek.

Při vytváření mutovaných protilátek rekombinační metodou je nukleová kyselina, která ji kóduje, izolována a pro další klonování nebo expresi vložena do replikujícího se vektoru (amplifikace DNA). DNA kódující mutovanou monoklonální protilátku je snadno izolována a sekvenována pomocí běžných postupů (například pomocí oligonukleotidových sond, které jsou schopny se specificky vázat ke genům, kódujícím těžké a lehké řetězce mutovaných protilátek). K dispozici je mnoho vektorů. Složky vektoru všeobecně zahrnují, mimo jiné, jednu nebo více

CL JUU724 136 z následujících sekvencí: signální sekvence, počátek replikace, jeden nebo více značkovacích genů, element zesilující transkripci, promotor a sekvenci, kterou je zakončena transkripce.

(i) Signální sekvence

Mutovaná protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, může být vytvořena rekombinantně nejen přímo, ale i jako fuzní polypeptid s heterologním polypeptidem, přičemž je výhodné, když tímto polypeptidem je signální sekvence nebo jiný polypeptid, obsahující specifické štěpné místo na N-konci zralého proteinu nebo polypeptidu. Výhodně vybraná heterologní signální sekvence je taková, která je rozpoznána a zpracována (tj. rozštěpena signální peptidázou) hostitelské buňky. U prokaryotických buněk, které nerozpoznávají a nezpracovávají signální sekvenci zralé protilátky, je signální sekvence nahrazena vybranou prokaryotickou signální sekvencí, například vedoucích sekvencí ze skupin alkalických fosfatáz, penicilináz, Ipp nebo teplotně stabilních enterotoxinů. Aby byla dosaženo sekrece u kvasinek, zralá signální sekvence může být nahrazena například vedoucí sekvencí z kvasinkové invertázy, vedoucí sekvencí ζα-faktoru včetně vedoucích sekvencí, pocházejících ze Saccharomyces a Kluyveromyces) nebo vedoucí sekvencí zfosfatázy, vedoucí sekvencí z glukoamylázy C. albicans nebo signální sekvencí popsanou v WO 90/13646. Pro expresi v savčích buňkách jsou k dispozici savčí signální sekvence a rovněž virové vedoucí sekvence pro sekrei, například gD signální sekvence herpetického viru.

DNA pro takovéto prekurzorové oblasti je připojena ve čtecím rámci k DNA, kódující mutovanou protilátku.

(ii) Původ replikaČních složek

Jak expresní tak i klonovací vektory obsahují sekvence nukleové kyseliny, které umožňují vektoru replikovat se v jedné nebo více vybraných hostitelských buňkách. Obecně je v klonovacích vektorech obsažena sekvence, která umožňuje vektoru replikovat se nezávisle na hostitelské chromozomální DNA a obsahuje počátky replikace nebo autonomně se replikující sekvence. Takové sekvence jsou dobře známy pro různé bakterie, kvasinky a viry. Počátek replikace z plazmidu pBR322 je vhodný pro většinu gramnegativních bakterií, počátek replikace z plazmidu 2μ je vhodný pro kvasinky a různé virové počátky replikace (SV40, polyoma, adenovirus, VSV nebo BRV) jsou vhodné pro klonovací vektory v savčích buňkách. Obecně není počátek replikace pro savčí expresní vektory potřebný (počátek replikace SV40 může být použit pouze proto, protože obsahuje časný promotor).

(iii) Gen pro selekci

Expresní a klonovací vektory mohou obsahovat geny pro selekci, také nazývané selektovatelné znaky. Typický selekční gen kóduje protein, který (a) propůjčuje rezistenci k antibiotiku nebo jiným toxinům, například ampicilinu, neomycinu, methotrexatu nebo tetracyklinu, (b) kompenzuje auxotrofhí deficience, nebo (c) poskytuje kritické živiny, které se nenacházejí v komplexním médiu, například gen kódující racemázu D-alaninu u Baeilli.

Jeden příklad selekčního schématu používá jistou látku pro zamezení růstu hostitelských buněk. Ty buňky, které jsou úspěšně transformovány heterologním genem, produkují protein propůjčující resistenci ktéto látce a přežívají tak v selekčních podmínkách. Příklady takovýchto dominantních selekcí používají látky jako je neomycin, kyselina mykofenolová a hygromycin.

Jinými příklady vhodných selekčních znaků pro savčí buňky jsou takové, které umožňuji určení buněk kompetentních pro příjem nukleové kyseliny, kódující protilátku, jako je DHFR, thymidin kináza, metallothionein-1 a metallothionein-Π, s výhodou jsou používány metallothioneinové geny primátů, adenozin deamináza, omithin dekarboxyláza atd.

Například buňky transformované s DHFR selekčním genem jsou napřed určeny pomocí kultivace všech transformantů v kultivačním médiu, které obsahuje methotrexát (Mtx), kompetitivní

-41CZ 300724 B6 inhibitor DHFR. Vhodnými hostitelskými buňkami, když je použit standardní typ DHFR, je buněčná linie z vaječníku čínského křečka (Chinese hamster ovary (CHO)), která postrádá DHFR aktivitu.

Jinou možností je selektovat hostitelské buňky (zvláště standardní typ hostitelských buněk, které obsahuji vnitřní DHFR aktivitu) transformované nebo kontrasformované sekvencemi DNA, kódujícími protilátky, standardní typ DHFR proteinu a jiný selektovatelný znak, jako je aminoglykozid 3'-fosfotransferázu (APH) pomocí růstu buněk v médiu obsahujícím selekční látku pro selektovatelný znak, jako je aminoglykozidické antibiotikum, například kanamycin, neomycin io nebo G418. (US patent 4 965 199).

Vhodným selekčním genem pro použití v kvasinkách je gen trp 1, přítomný v kvasinkovém plazmidů Yrp7 (Stinchcomb a kol., Nátuře 2%l·. 39 (1979)), Gen trp 1 poskytuje selekční znak pro mutovaný kmen kvasinek, který postrádá schopnost růstu v přítomnosti tryptofanu, například

ATCC No. 44076 nebo PEP4-1. Jones, Genetics 85: 12 (1977). Přítomnost poškozeni trp 1 v genomu kvasinkových hostitelských buněk poskytuje účinné prostředí pro detekci transformace pomocí růstu v nepřítomnosti tryptofanu. Podobně Leu2-deficientní kvasinkové kmeny (ATCC 20,622 nebo 38,626) jsou komplementovány známými plazmidy, které nesou gen Leu2.

Navíc vektory odvozené z 1,6 pm kruhového plazmidů pKDl, mohou být použity pro transformování kvasinek Kluyveromyces. Jako jiná možnost byl popsán expresní systém u K lactis pro produkci rekombinantního telecího chymozinu ve velkém měřítku. Van den Berg Bio/Technology 8: 135 (1990). Také byly popsány stabilní expresní vektory s velkým počtem kopií, pro sekreci zralého rekombinantního lidského sérumalbuminu průmyslovými kmeny Kluyveromyces. Fleer a kol., Bio/Technology 9: 968-975 (1991).

(iv) Promotorova složka vektorů

Expresní a klonovací vektory obvykle obsahují promotor, který je rozpoznáván hostitelským organizmem aje operativně připojen knukleové kyselině, která kóduje protilátku. Promotory vhodné pro použití u prokaryotických hostitelů jsou promotor phoA, β-laktamázové a laktózové promotorové systémy, alkalická fosfatáza, tiyptofanový (trp) promotorový systém a hybridní promotory, jako je promotor tac. Jsou však vhodné i jiné známé bakteriální promotory. Promotory užívané v bakteriálních systémech budou také obsahovat Shine-Dalgamovu (S.D.) sekvenci, operativně připojenou k DNA, která kóduje protilátku.

Promotorové sekvence jsou známy i pro eukaryotické organizmy. Prakticky všechny eukaryotické geny mají oblast bohatou na AT, umístěnou přibližně 25 až 30 baží proti směru transkripce od místa, kde transkripce začíná. Jiná sekvence, nacházející se 70 až 80 baží proti směru transkripce od jejího počátku u mnoha genů je oblast CNCAAT, kde N může být kterýkoli nukleotid.

Na 3 konci mnoha eukaryotických genů je sekvence AATAAA, která může být signálem přidání póly A sekvence na 3'konec kódující sekvence. Všechny tyto sekvence jsou vhodně vloženy do eukaryotických expresních vektorů.

Příklady promotorových sekvencí vhodných pro použití u kvasinkových hostitelů jsou například promotory kinázy 3-fosfoglycerové kyseliny nebo jiných gly ko lyrických enzymů, jako je enoláza, dehydrogenáza giyceraldehyd-3-fosfátu, hexokináza, dekarboxyláza kyseliny pyrohroznové, fosfofruktokináza, izomeráza glukózo-6-fosfátu, mutáza 3-fosfoglycerové kyseliny, kináza kyseliny pyrohroznové, izomeráza triosofosfátu, fosfogíukózo izomeráza a glukokináza.

Jiné promotory kvasinek, které jsou indukovatelné a mají jako další výhodu kontrolu transkripce pomocí podmínek růstu, jsou promotorové oblasti pro alkoholdehydrogenázu 2, izocytochrom C, kyselou fosfatázu, degradační enzymy spojené s metabolizmem dusíku, metallothionein, dehydrogenáza glyceraldehyd-3-fosfátu a enzymy, odpovědné za využití maltózy a galaktózy. Vektory

a promotory vhodné pro použití u kvasinek jsou dále popsány v EP 73 657. Spolu s kvasinkovými promotory je také výhodné použít kvasinkové zesilovače transkripce.

Přepis protilátek z vektorů v savčích hostitelských buňkách je kontrolován například promotory získanými z genomů vírů, jako jsou polyoma virus, virus drůbežích neštovic, adenovirus (jako je např. adenovirus 2), hovězí papíloma virus, ptačí sarkoma virus, cytomegaíovirus, retrovirus, virus hepatitidy B a nejvýhodněji z opičího viru 40 (SV40), z heterologních savčích promotorů, například aktinový promotor nebo imunoglobulinový promotor, z promotorů heat-shock proteinů - za předpokladu, že takové promotory jsou kompatibilní s hostitelským buněčným io systémem.

Časné a pozdní promotory viru SV40 lze vhodně získat jako SV40 restrikční fragment, který též obsahuje počátek replikace viru SV40. Bezprostředně časný promotor lidského cytomegaloviru lze vhodně získat jako HindllI E restrikční fragment. Systém pro expres i DNA v savčích hosti15 telích za pomoci hovězího papíloma viru jako vektoru, je popsáno v US 4 601 978. Jako jinou možnost lze uvést, že cDNA lidského β-interferonu byla exprimována v myších buňkách pod kontrolou thymidin kinázového promotoru, získaného z viru herpes simplex. Další možností je použít jako promotor dlouhé koncové repetíce viru Rousova sarkomu.

(v) Zesilovače transkripce

Transkripce DNA kódující protilátku, která je předmětem tohoto vynálezu, u vyšších eukaryotických organizmů je často zvýšena vložením sekvence zesilovače transkripce do příslušného vektoru. V současné době je známo mnoho sekvencí zesilovačů transkripce ze savčích genů (globin, elastáza, albumin, α-fetoprotein a inzulín). Typicky se však používají zesilovače tran25 skřipce z virů eukaryotických buněk. Jako příklady lze uvést zesilovač transkripce SV40, nacházející se na pozdní straně počátku replikace (bázové páry 100 až 270), zesilovač transkripce Časného promotoru cytomegaloviru, zesilovač transkripce polyomavíru, nacházející se na pozdní straně počátku replikace a zesilovače transkripce adenoviru. Viz též Yaniv, Nátuře 297: 17-18 (1982), pojednávající o zesilovacích elementech pro aktivaci eukaryotických promotorů. Zesilo30 vač může být umístěn do vektoru vzhledem k sekvenci kódující protilátku buď ve směru 5' (proti směru přepisu) nebo ve směru 3' (ve směru přepisu), ale dává se přednost jeho umístění na straně 5' (proti směru přepisu) od promotoru.

(vi) Složky ukončující transkripci

Expresní vektory užívané v eukaryotických hostitelských buňkách (kvasinky, houby, hmyz, rostliny, živočichové, člověk nebo jaderné buňky z jiných mnohobuněčných organizmů), budou také obsahovat sekvence nezbytné pro ukončení transkripce a pro stabilizaci mRNA. Takové sekvence jsou obecně dostupné na 5' a případně 3' koncích nepřekládaných oblastí eukaryotických nebo virových DNA nebo cDNA. Tyto oblasti obsahují úseky nukleotidů přepsané jako polyadenylové fragmenty v nepřekládaných částech mRNA, kódující protilátku. Jednou z užitečných složek ukončujících transkripci je polyadenylační oblast hovězího růstového hormonu. Viz WO 94/11026 a tam popsaný expresní vektor.

(vii) Výběr a transformace hostitelských buněk

Vhodné hostitelské buňky pro klonování a expresi DNA ve vektorech jsou zde prokaryontní organizmy, kvasinky nebo vyšší eukaryontní buňky, popsané výše. Vhodnými prokaryonty pro tento účel jsou eubakterie, jako jsou gramnegativní nebo grampozitivní organizmy, například Enterobakteria jako jsou Escherichia, např. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Próteus, Salmonella, např. Salmonella typhymurium, Serratia, např. Serratia marcecens a Shigella, a rovněž Bacilli, jako je B. subtilis a B. Licheniformis (např. B. Licheniformis 41P popsaný v DD 266 710 publikováno 12. dubna 1989), Pseudomonas jako je Pseudomonas aeruginosa a Streptomyces, Jedním z výhodných hostitelů E. coli je E. coli 294 (ATCC 31 446), třebaže jsou .41 .

vhodné i jiné kmeny, jako jsou např. E. coli Β, E. coli Χ1ΊΊ6 )ATCC 31 537 a E. coli W3110 (ATCC 27 325). Tyto příklady jsou uvedeny pro ilustraci, nikoli jako omezení.

Vedle prokaryotů jsou jako hostitelé pro klonování nebo expresi vektorů, kódujících protilátky, vhodné eukaryotické mikroby, jako jsou vláknité houby nebo kvasinky. Saccharomyces cerevisiae neboli běžné pekařské kvasinky, jsou mezi nižšími eukaryotickými hostitelskými mikroorganizmy používané nejběžněji. Avšak i množství jiných rodů, druhů a kmenů je běžně dostupných a zde používaných, jako jsou Schizosaccharomyces pombe\ Kluyveromyces jako jsou například K. lactis, K.fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii io (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermololerans a K. marxianus; yaffowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, jakoje Schwanniomyces occidentalis a vláknité houby jako jsou například hostitelé Neurospora', Penicillium; Tolypocladium a

Aspergillus, jako jsou A. Nidulans a A. niger.

Vhodné hostitelské buňky pro expresi glykosylovaných protilátek jsou odvozeny z mnohobuněčných organizmů. Principiálně je použitelná jakákoli kultura vyšších eukaiyotických buněk, ať se jedná o kulturu z obratlovce nebo bezobratlého organizmu. Příkladem buněk z bezobratlých organizmů jsou rostlinné a hmyzí buňky, Luckow a kol., Bio/Technology 6: 47-55 (1988); Miller a kol., Genetic Engineering, vyd. Setlowa kol., sv. 8, str. 277-279 (Plenám publishing 1986); Mseda a kol., Aařwre315: 592-594 (1985). Je k dispozici množství bakulovirových kmenů, jejich variant a odpovídajících permisivních hostitelských hmyzích buněk, pocházejících z hostitelů jako jsou Spodoptera frugiperda (housenka), Aedes aegypti (komár), Aedes albopictus (komár), Drosophila melanogaster (ovocná muška) a Bombyx moři. Zvláště zajímavou buněčnou linií je hmyzí buněčná linie sf9. Pro transfekci je veřejně dostupné množství virových kmenů, například L-t varianta Autographa californica NVP a kmen Bm-5, pocházející z Bombyx moři NVP a tyto viry mohou být použity podle předloženého vynálezu, zvláště pro transfekci buněk, pocházejících ze Spodoptera frugiperda. Mimoto mohou být jako hostitelé použity též kultury rostlinných buněk, pocházejících z bavlnovníku, kukuřice, brambor, sojových bobů, petúnie, rajských jablíček a tabáku.

Avšak největší zájem je věnován buňkám, pocházejícím z obratlovců a množení buněk obratlovců v kulturách (tkáňové kultury) se stalo běžným postupem. Viz Tissue Culture, Academie Press, vyd. Kruše a Patterson, (1973). Příklady vhodných hostitelských savčích buněčných linií jsou linie CV1 z opičích ledvin, transformovaná SV40 (COS-7, ATCCCRL 1651); linie lidských embryonálních ledvin (293 nebo buňky 293 subklonované pro růst v suspenzní kultuře, Graham a kol., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977); buněčná linie z ledvin mláďat křečků (BHK, ATCC CCL 10); buněčná linie z vaječníků čínského křečka/-DHFR (CHO, Urlaub a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 77: 4 216 (1980)); myší Sertoliho buňky (TM4, Mather,

Biol. Reprod. 23: 243-251 (1981)); buněčná linie z opičích ledvin (CV1 ATCC CCL 70); buněčná linie z kočkodana zeleného - Afričan green monkey (VERO-76, ATCC CRL-1587); buněčná linie z lidského carcinomu děložního čípku (HELA, ATCC CCL 2); buněčná linie z psích ledvin (W138, ATCC CCL 75); buněčná linie z lidských jater (Hep G2, HB 8065); buněčná linie z myšího nádoru mléčné žlázy (MMT 060562, ATCC CCL51); buňky TRI (Mather a kol., Annals Ν. K Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); buňky MRC 5; buňky FS4 a buněčná linie z lidského hepatomu (Hep G2).

Hostitelské buňky jsou transformovány pomocí výše popsaných expresních nebo klon ovacích vektorů, určených pro produkci protilátky, kultivovány ve vhodném živném médiu, modifikovaném tak, aby bylo vhodné pro indukci promotorů, selekci transformovaných buněk nebo pomnožení genů, kódujících požadované sekvence.

(viii) Kultivace hostitelských buněk

Hostitelské buňky používané pro produkci mutovaných protilátek, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být kultivovány v řadě rozličných médiL Pro kultivaci hostitelských buněk jsou _ ΛΛ _ vhodná komerčně dostupná média, jako jsou Ham's F10 (Sigma), minimální médium - Minimal Essential Medium-(MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) a Eaglovo médium modifikované podle Dulbecca- Dulbeccos Modifíed Eagle's Medium - (DMEM, Sigma). Dále kterékoli z médií popsaných v Ham a kol., Meth. Enzymol. 58: 44 (1979), Bames a kot, Anal.

Biochem. 102: 255 (1980), US patenty 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; 4 560 655 nebo 5 122 469; WO 87/00195 nebo US patent Re. 30 985 může být použito jako kultivační médium pro hostitelské buňky. Kterékoli z těchto médií může být doplněno podle potřeby hormony anebo jinými růstovými faktory (jako jsou inzulín, transferrin nebo epidermální růstový faktor), solemi (jakojsou X-chloridy, kde Xje sodík, vápník, hořčík; a fosfáty), pufry (jakoje HEPES), nukleoio tidy (jako jsou adenozin a thymidin), antibiotiky (jako je lék GENTAMYCIN™), stopovými prvky (definované jako anorganické sloučeniny obvykle přítomné v konečných koncentracích v mikromolámích množstvích) a glukózou nebo srovnatelným zdrojem energie. Ve vhodných koncentracích mohou být též dodány jakékoli jiné nezbytné doplňky, které jsou známy osobám s běžnou zkušeností v tomto oboru. Kultivační podmínky, jako je teplota, pH a podobně jsou používány stejné jako u buněk vybraných pro expresi a budou zřejmé osobám s běžnou zkušeností v oboru.

(ix) Čištění protilátek

Při použití rekombinaěních technik může být mutovaná protilátka produkována intracelulámě, v periplazmatickém prostoru anebo může být vylučována přímo do média. Pokud je mutovaná protilátka produkována intracelulámě, pak je jako první krok odebrán buněčný debris, buď hostitelské buňky nebo lyžované fragmenty, například pomocí centriťugace nebo ultrafiltrace. Carter a kol., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) popisuje postup pro izolaci protilátek, které jsou vylučovány do periplazmatického prostoru E. coli. Krátce řečeno, buněčná hmota je rozmra25 žována za přítomnosti octanu sodného (pH 3,5), EDTA a fenylmethylsulfonyl fluoridu (PMSF) po dobu 30 minut. Zbytky buněk mohou pak být odstraněny centrifugaci. Když je mutovaná protilátka vylučována do média, jsou obecně supernatanty z takovýchto expresních systémů napřed koncentrovány pomocí komerčně dostupných filtrů pro koncentraci proteinů, například ultrafiltrační jednotky Amicon nebo Millipore Pellicon. Inhibitor proteáz, jako je PMSF může být přítomen v kterémkoli z předcházejících kroků, aby inhiboval proteolýzu a antibiotika mohou být přidána, aby se zabránilo růstu nahodilých kontaminujících organizmů.

Protiíátkový přípravek, získaný z buněk může být čištěn pomocí například chromatografie na hydroxylapatitu, gelové elektroforézy, díalýzy a afinitní chromatografie, přičemž preferovaným purifikačním postupem je afinitní chromatografie. Vhodnost použití proteinu A jako afinitního ligandů závisí na druhu a izotypu každé imunoglobulínové Fc domény, která je přítomna v mutované protilátce. Protein A může být použit pro purifikaci protilátek, které jsou založeny na lidských těžkých řetězcích γΐ, γ2 nebo γ4 (Lindmark a kol, J. immunol Meth. 62: 1-13 (1983)). Protein g je doporučován pro všechny myší izotypy a pro lidské γ3 (Gus a kol., EMBO J. 5:

1567-1575 (1986)). Základní hmota, ke které je afinitní ligand připojen, je nejčastěji agaróza, ale jsou dostupné i jiné. Mechanicky stabilní základní hmoty, jako je sklo s kontrolovanou velikostí pórů nebo poly(styrendivinyl)benzen umožňují větší rychlosti průtoku a tedy zkracují doby zpracování, než jaké mohou být dosaženy s agarózou. Když mutovaná protilátka obsahuje doménu CH3 je vhodné použít pro purifikaci pryskyřici Bakerbond ABXTM (J. T. Baker,

Phillipsburg, NJ). Jsou k dispozici i jiné techniky pro purifikaci proteinů, jako jsou frakcionace na sloupci iontoměniče, srážení etanolem, HPLC na reverzní fázi, chromatografie na kysličníku křemičitém, chromatografie na heparin SEPHAROSE™, chromatografie na anexových nebo katexových pryskyřicích (jako je sloupec s polyasparagovou kyselinou), chromatofokusace, SDS-PAGE a srážení síranem amonným, jejich použití závisí na druhu mutované protilátky, so která má být získána.

Po jakémkoli předběžném purifikačním kroku (krocích), může být směs obsahující požadovanou mutovanou protilátku podrobena při nízkém pH ehromatografii s hydrofobní interakcí, za použití

-45CZ 300724 B6 elučního pufru s pH mezi 2,2 až 4,5, která se přednostně provádí s použitím nízkých koncentrací soli (například v rozmezí 0 až 0,25 M sůl).

C. Farmaceutické přípravky

Léčebné přípravky z polypeptidů nebo protilátek jsou připravovány pro uložení jako lyofilizované přípravky nebo vodné roztoky smíšením polypeptidu, který má požadovaný stupeň čistoty se zvolenými „farmaceuticky přijatelnými“ nosiči, masťovými základy nebo stabilizátory, které se typicky v tomto oboru používají (všechny se nazývají vehikula - „excipients“). Například io pufrovaeí prostředky, stabilizační prostředky, konzervační prostředky, izotonizující prostředky, neiontové detergenty, antioxidanty a jiné přídavné látky, (viz Remington s Pharmaceutical

Sciences, 16. vydání, vyd. A. Osol (1980)). Takové přídavné látky musí být netoxické pro příjemce v rámci používaných dávek a koncentrací.

Pufrovaeí prostředky pomáhají udržovat pH v oblasti, která přibližně odpovídá fyziologickým podmínkám. Je výhodné, když jsou přítomny v koncentracích v rozmezí 2mM až 5mM. Pufrovací prostředky vhodné pro použití v předkládaném vynálezu jsou jak organické a anorganické kyseliny a jejich soli, jako jsou citrátové pufry (například směs sodné a dvojsodné soli kyseliny citrónové, směs kyseliny citrónové a její trojsodné soli, směs kyseliny citrónové a její sodné soli atd), jantaranové pufry (například směs kyseliny jantarové a její sodné soli, směs kyseliny jantarové a hydroxidu sodného, směs kyseliny jantarové a její dvojsodné soli atd), vínanové pufry (například směs kyseliny vinné a její sodné soli, směs kyseliny vinné a její draselné solí, směs kyseliny vinné a hydroxidu sodného atd), fumarátové pufry (například směs kyseliny fumarové a její sodné soli atd), fumarátové pufiy (například směs kyseliny fumarové a její sodné soli, směs kyseliny fumarové a její dvojsodné soli, směs sodné soli a dvojsodné soli kyseliny fumarové atd), glukonátové pufry (například směs kyseliny glukonové a její sodné soli, směs kyseliny glukonové a hydroxidu sodného, směs kyseliny glukonové a její draselné soli atd), šťavelanové pufry (například směs kyseliny šťavelové a její sodné soli, směs kyseliny šťavelové a hydroxidu sodného, směs kyseliny glukonové a její draselné soli atd), laktátové pufry (například směs kyseliny mléčné a její sodné soli, směs kyseliny mléčné a hydroxidu sodného, směs kyseliny mléčné a její draselné soli atd) a octanové pufry (například směs kyseliny octové a její sodné soli, směs kyseliny mléčné a hydroxidu sodného atd). Navíc je možno zmínit fosfátové pufry, histidinové pufry a trímethylaminové soli, jako je Tris.

Konzervační přípravky jsou přidávány, aby potlačily mikrobiální růst a jsou přidávány v množstvích v rozmezí od 0,2% až 1,0% (váha/objem). Konzervační přípravky vhodné pro použití v rámci tohoto vynálezu, jsou fenol, benzyl alkohol, metakresol, methylparaben, propylparaben, oktadecyldimetylbenzyl amoníumchlorid, halídy (např. chlorid, bromid, jodid) benzalkonia, chlorid hexamethonia, alkylparabeny jako jsou methylparaben nebo propylparaben, katechol, resorcinol, cyklohexanol a 3-pentanol.

Izotonizující prostředky známé jako „stabilizátory“ jsou přítomné, aby zajistily izotonicitu tekutých prostředků, které jsou připraveny podle tohoto vynálezu a patří mezi ně cukerné polyalkoholy, s výhodou trojmocné nebo vyšší cukerné polyalkoholy, jako jsou glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol a manitol. Polyalkoholy mohou být přítomny v množstvích mezi 0,1 až 25 váhových procent, s výhodou 1 až 5 %, pokud se vezmou v úvahu relativní množství ostatních doplňků.

Stabilizátory označují širokou kategorii základů, jejichž funkční rozsah může sahat od neutrál50 nich objemových příměsí až po příměsi, které pomáhají rozpouštět léčebný přípravek nebo zabraňují jeho denaturaci, popřípadě adhesi na stěny zásobníku. Typickými stabilizátory mohou být cukerné polyalkoholy (vypočítané výše); aminokyseliny jako jsou arginin, lysin, glyein, asparagin, histidin, alanin, ornitin, L-leucin, 2-feny lalanin, kyselina glutamová, threonin atd., organické cukry nebo cukerné alkoholy, jako jsou laktóza, trehalóza, stachyóza, manitol, sorbitol, xylitol, ribitol, myoinisitol, galaktitol, glycerol a podobné, včetně cyklitolů, jako jsou inozitol;

J z polyetylenglykol; polymery aminokyselin; redukující Činidla obsahující síru, jako jsou močovina, glutathion, kyselina thioctová, thioglykolát sodný, thioglycerol, α-monothioglycerol a thiosíran sodný; nízkomolekulámí polypeptidy (tj. méně než 10 zbytků); proteiny jako jsou lidský sérový albumin, hovězí sérový albumin, gelatin nebo imunoglobuliny; hydrofilní polymery jako jsou polyvinylpyrrolidon; monosacharidy jako jsou xylóza, mannóza, fhiktóza, glukóza; disacharidy jako jsou laktóza, maltóza, sacharóza a trisacharidy jako jsou rafinóza; polysacharidy jako je například dextran. Stabilizátory bývají přítomny v rozmezí od 0,1 až do 10,000 váhových dílů na váhový díl aktivního proteinu.

io Neiontové povrchově aktivní látky nebo detergenty (také známé jako „smáčedla“) jsou přítomna, aby pomohla rozpouštět léčebné přípravky a rovněž chránit léčebný protein proti agregaci, indukované mícháním; jejich přítomnost též umožňuje vystavit přípravek střižným silám bez toho, že by způsobily denaturaci proteinu. Vhodnými neiontovými, povrchově aktivními látkami jsou polysorbáty (20, 80 atd.), polyoxamery (184, 188 atd.), Pluronic® polyoly, polyoxyetylen sorbitan monoéteiy (Tween®-20, Tween®-80 atd.). Neiontové povrchově aktivní látky bývají přítomny v rozmezí od 0,05 mg/ml až do 1,0 mg/ml, s výhodou od 0,02 mg/ml do 0,2 mg/ml.

Mezi další přídavné látky patří neutrální objemové příměsi (např. škrob), chelační činidla (např. EDTA), antioxidanty (např. kyselina askorbová, metathion, vitamin E) a rozpustidla.

Léčivé přípravky zde uvedené mohou také obsahovat více než jednu aktivní složku, pokud jsou nezbytné pro léčení zvláštních případů, s výhodou takové, které mají doplňkové aktivity a které se navzájem záporně neovlivňují. Například může být žádoucí dále podávat imunosupresivní přípravek. Je vhodné, když jsou takové molekuly přítomny v dané směsi v množství, které je dostačující pro zamýšlený účel.

Aktivní příměsi mohou být též zachyceny v mikrokapslích, připravovaných například koacervační technikou nebo polymerizaci, například hydroxymethyl celulózové nebo gelatinové mikrokapsle a polymethylmethakrylátové mikrokapsle, v systémech podávání léku v koloidní formě (například lipozómy, albuminové mikrokulíčky, mikroemulze, nanočástice a nanokapsule) nebo v makroemulzích. Takové techniky jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, vyd. A Ošal (1080).

Přípravky, které se budou podávat in vivo musí být sterilní. Toho se snadno dosáhne, například filtrací přes sterilní filtrační membrány.

Mohou být připraveny přípravky s postupným uvolňováním aktivní látky. Vhodnými příklady takových přípravků s postupným uvolňováním aktivní látky jsou polopropustné základní hmoty zpěvných hydrofobních polymerů, obsahující mutované protilátky, tyto základní hmoty zaujímají určitou formu, například ve tvaru filmů nebo mikrokapsle. Příkladem základní hmoty s postupným uvolňováním aktivní látky jsou polyestery, hydrogely (například poly(2-hydroxyethylmethakrylát) nebo polyvinylalkohol), polyaktidy (US patent 3 773 919), kopolymery kyseliny L-glutamové a ethyl-L-glutamátu, nedegradovatelný ethylenvinylacetát, degradovatelné kopolymery kyseliny mléčné a kyseliny glykolové, jako jsou LUPRON DPOT™ (injekčně podávané mikrokulíčky, složené z kopolymerů kyseliny mléčné a kyseliny glykolové a octanu leuprolidu) a poly-D-(-}-3-hydroxymáselná kyselina. Zatímco polymery, jako jsou ethylenvinylacetát a kyselina mléčná-kyselina glykolová, umožňují uvolňování molekul po dobu delší než 100 dní, určité hydrogely uvolňují proteiny po kratší časové období. Pokud protilátky uzavřené v kapslích, zůstanou v těle po dlouhou dobu, mohou denaturovat nebo agregovat so následkem vystavení vlhkosti při teplotě 37 °C, což má za následek ztrátu biologické aktivity a možné změny imunogenicity. Lze vyvinout účinné postupy pro stabilizaci v závislosti na příčinných mechanizmech. Například pokud se zjistí, že mechanizmus agregace je podmíněn vytvářením mezimolekulámích S-S vazeb následkem thio—disulfidické výměny, může být dosaženo stability pomocí modifikace sulfhydrylových zbytků, lyofilizací z kyselých roztoků, .47 .

cz 300724 B6 kontrolou hladiny vlhkosti, použitím vhodných příměsí a vývojem specifických složení základ nich hmot.

Množství léčebného polypeptidu, protilátky nebo jejich fragmentu, které bude účinné při léčení určité poruchy nebo stavu, bude záviset na povaze poruchy nebo stavu a můžeme jej určit standardními klinickými technikami. Je pokud možno žádoucí stanovit křivku závislosti odpovědi na dávce léčebného prostředku, který je předmětem tohoto vynálezu, napřed in vitro a poté na vhodném modelovém živočišném systému, dříve než dojde k testování na lidech. Ale na základě obecných poznatků v tomto oboru je známo, že farmaceutické prostředky, podporující přežívání smyslových neuronů, mohou působit jako lokální léčebný prostředek při koncentracích mezi 5 až 20 ng/ml a výhodněji mezi 10 až 20 ng/ml. Při dalším specifickém provedení vynálezu, farmaceutické prostředky, podporující přežívání neuronů sítnice, mohou působit jako lokální léčebný prostředek při koncentracích mezi 10 až 100 ng/ml.

is Ve výhodném provedení je vodný roztok léčebného polypeptidu, protilátky nebo jejich fragmentu, podán pomocí subkutánní injekce. Každá jednotlivá dávka může být v rozmezí 0,5 pg až 50 pg na kilogram tělesné váhy, nebo výhodněji v rozmezí 3 pg až 30 pg na kilogram tělesné váhy.

Časový harmonogram dávek pro subkutánní podávání se může lišit od jednou týdně po denní podávání, v závislosti na řadě klinických faktorů, včetně typu nemoci, intenzity nemoci a citlivosti pacienta k léčebnému prostředku.

D. Neléčebné využití mutovaných protilátek

Mutované protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být využívány jako afinitní purifikační činidla. Při tomto postupu jsou protilátky i mobil izo vány na pevné fázi jako je Sephadexová pryskyřice nebo filtrační papír, pomocí v oboru dobře známých postupů. Imobilizovaná mutovaná protilátka je pak přivedena do styku se vzorkem obsahujícím antigen, který má být vyčištěn, poté je nosič promýt vhodným rozpouštědlem, které odstraní v podstatě veškeiý materiál ze vzorku kromě antigenu, který má být vyčištěn a který je vázán na imobilizovanou mutovanou protilátku. Nakonec je nosič promýt jiným vhodným rozpouštědlem, jako je glycinový pufr pH 5,0, který uvolní antigen z mutované protilátky.

Mutované protilátky mohou být také užitečné v diagnostických testech, například pro zjišťování exprese požadovaného antigenu ve specifických buňkách, tkáních nebo séru.

Pro diagnostické aplikace budou mutované protilátky označeny detekovatelnou součástí. Je dostupné množství značek a lze je rozdělit do následujících kategorií:

(a) Radioizotopy, jako jsou ³⁶S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H a ^,31I. Mutované protilátky mohou být například označeny radioizotopem pomocí postupů popsaných v Current Protocols in Immunology, sv. 1-2, vyd. Coligen a kol., Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991) a radioaktivita může být měřena pomocí scintilace.

(b) Fluorescenční značky, jako jsou eheláty vzácných zemin nebo fluorescein a jeho deriváty, rhodamin a jeho deriváty, dansyl, lissamin, phycoerythrin a Texaská červeň. Fluorescenční značky mohou být konjugovány k mutované protilátce pomocí technik popsaných například v Current Protocols in immunology, vyd. Coligen a kol., Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991). Fluorescenci lze kvantifikovat pomocí fluorimetru.

(c) Jsou k dispozici různé označovače typu enzym-substrát a US patent 4 275 149 poskytuje přehled některých z nich. Enzym obecně katalyzuje chemickou změnu chromogenního substrátu, která pak může být různými technikami měřena. Například enzym může katalyzovat takovou barevnou změnu v substrátu, která může být spektrofotometricky měřena. Jinou možností je, že /IQ enzym může změnit fluorescenci nebo chemiluminiscenci substrátu. Techniky pro kvantifikaci změn ve fluorescenci jsou popsány výše. Chemiluminiscentní substrát se chemickou reakcí dostává do excitovaného stavu a poté může emitovat světlo, které může být měřeno (například pomocí chemiluminometru) nebo předá energii fluoreskujícímu akceptorů. Příklady enzymatic5 kýeh značek jsou luciferázy (například luciferáza ze světlušek a bakteriální luciferáza; US patent 4 737 456), luciferin, 2,3-dihydroftaIazindiony, dehydrogenáza kyseliny jablečné, ureáza, peroxidáza jako je křenová peroxidáza (HRPO), alkalická fosfatáza, β-galaktozidáza, gíukoamyláza, lysozym, oxidázy cukrů (například oxidáza glukózy, oxidáza galaktózy a dehydrogenáza glukózo-6-fosfátu), oxidázy heterocyklických sloučenin (jako jsou urikáza a xanthin oxidáza), io taktoperoxidáza, mikroperoxidáza a podobně. Techniky pro konjugaci enzymů k protilátkám jsou popsány v 0'Sullivan a kol., Methods for the Preparatíon of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, v Methods in Enzym. (Vyd. J. Kantone&H. Van Vunakis),

Academie press, New York, 73: 147-166 (1981).

Příklady kombinací enzym-substrát jsou například:

(i) Křenová peroxidáza (HRPO) s peroxidem vodíku jako substrátem, kde peroxid vodíku oxiduje prekurzor barvičky (například orthofenylendiamin (OPD) nebo 3,3^ř,5,5'-tetrametylbenzidin hydrochloríd (TMB));

(ii) alkalická fosfatáza (AP) s chromogenním substrátem p-nitrofenyl fosfátem; a (iii) β-D-galaktozidáza (β-D-gal) s chromogenním substrátem (například p-nitrofenyl-(3-Dgalaktozidáza) nebo fluorogenním substrátem 4-methylumbelliferyl-p-D-galaktozidázou.

Pro osoby se zkušeností v oboru je k dispozici množství dalších kombinací enzym-substrát. Pro obecný přehled viz US patenty 4 275 149 a 4 318 980.

Někdy je značka konjugována s mutovanou protilátkou nepřímo. Zkušení pracovníci z tohoto oboru si budou vědomi rozličných postupů pro dosažení tohoto cíle. Například mutovaná protilátka může být konjugována s biotinem a kterákoli ze tří široce vymezených kategorií značek, zmíněných výše, může být konjugována s avidinem a naopak. Biotin se pak selektivně váže k avidinu a značka tedy může být tímto nepřímým způsobem konjugována s mutovanou protilátkou. Jiná možnost, jak dosáhnout nepřímé konjugace značky s mutovanou protilátkou je ta, že mutovaná protilátka je konjugována s malým haptenem (například digloxin) a některá z odlišných výše zmíněných typů značek je konjugována s mutovanou anti-haptenovou protilátkou (například protilátkou proti digloxinu). Tím lze dosáhnout nepřímé konjugace značky s mutovanou protilátkou.

Při jiném provedení vynálezu nemusí být mutovaná protilátka značena, a její přítomnost je potom možno detekovat pomocí značené protilátky, která se váže k mutované protilátce.

Protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být používány v kterékoli známé testovací metodě, jako jsou vazebně kompetiční testy, přímé a nepřímé sendvičové testy a imunoprecipitační testy. Zola, Monoklonal Antibodies\ A Manual of Techniques, str. 147-158 (CRC Press, lne. 1987).

Vazebně kompetiční testy jsou založeny na schopnosti značeného standardu kompotovat o vazbu v testovaném vzorku s omezeným množstvím mutované protilátky. Množství antigenu v testovaném vzorku je nepřímo úměrné množství standardu, který se naváže na protilátku. Aby se usnadnilo určování množství navázaného standardu, protilátky se obecně vysráží bud před nebo po kompetici. Výsledkem je, že standard a testovaný vzorek, které jsou vázány s protilátkou, mohou být vhodně odděleny od standardu a testovaného vzorku, které zůstaly nenavázány.

Sendvičové testy obsahují použití dvou protilátek, z nichž každá je schopna se vázat k jiné imunogenní části, epitopu nebo proteinu, který má být detekován. V sendvičovém testuje vzorek,

-40CZ 300724 B6 který má být analyzován, vázán na první protilátku, itnobilizovanou na pevné podložce, potom se k testovanému vzorku naváže druhá protilátka, čímž je vytvořen nerozpustný třídí lný komplex. Viz například US patent 4 376 110. Druhá protilátka sama může být označena detekovatelnou molekulou (přímé sendvičové testy) nebo může být měřena pomocí protilátky proti imunoglobu5 linu, která je označena detekovatelnou molekulou (nepřímý sendvičový test). Jedním typem sendvičového testuje například test ELISA, v jehož případě je detekovatelnou molekulou enzym.

Pro imunohistochemii může být vzorek nádoru čerstvý nebo zmražený, popřípadě může být zalit do parafinu a fixován konzervačním činidlem, jako je například formalín.

io

Protilátky se mohou též využívat v diagnostických testech in vivo. Obecně je mutovaná protilátka označena radioaktivním izotopem (jako jsou ^lT]In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ^l311,³H, ³²P nebo ³⁵S), takže nádor může být lokalizován pomocí imunoscintiografie.

E. Diagnostické soupravy

Pro pohodlné používání mohou být polypeptidy nebo protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, dodávány v podobě souprav, tj. balené spolu s reagenciemi v potřebných množstvích a s návodem na provedení diagnostického testu. Když je mutovaná protilátka označena enzymem, souprava bude obsahovat substráty a kofaktory vyžadované enzymem (například prekurzor substrátu, který poskytne detekovatelný chromofor nebo fluorofor). Navíc mohou být do soupravy přidány další látky, jako jsou stabi lizátoiy, pufry (například blokující pufr nebo lyzační pufr) a podobně. Se vzájemnými poměry různých reagencií je pak možno varírovat v širokém rozmezí, aby byla zajištěny takové koncentrace reakčních látek v roztoku, které optimalizují citlivost testu.

Reakční látky mohou být dodávány ve formě suchých prášků, obvykle lyofilizované, včetně vehikula, které po rozpuštění zabezpečí že reakční roztok bude mít vhodnou koncentraci.

F. Využití polypeptidů nebo protilátky in vivo

Předpokládá se, že polypeptid nebo protilátka, které jsou předmětem tohoto vynálezu, se mohou používat pro léčbu u savců. Při jednom způsobu provedení, je protilátka podána savci (jinému než člověku) za účelem získání například preklinických údajů. Příklady savců (jiných než člověk), kteří mohou být léčeni jsou primáti, psi, kočky, hlodavci a ostatní savci, na nichž jsou preklinická studia prováděna. Tito savci mohou sloužit jako živočišné modely pro nemoc léčenou protilátkou, nebo mohou být použiti pro studium toxicity příslušných protilátek. Při každém z těchto provedení by měla být studia zvyšování dávek provedena na savcích.

Protilátka nebo polypeptid je podáván některým z vhodných způsobů, jako jsou parenterální, subkutánní, intraperitoneální, intrapulmonámí, intranasální a pokud je žádoucí pro lokální imuno40 supresivní léčbu, je možno je podat i do poranění. Parenterální infúze zahrnují intramuskulární, intravenózní, intraarteriální, intraperitoneální nebo subkutánní podávání. Navíc je vhodným způsobem podávání mutované protilátky pulzní inťuze, zvláště se snižujícími se dávkami mutované protilátky. Přednostně jsou dávky podávány injekčně, nejvýhodněji intravenózními nebo subkutánními injekcemi, částečně v závislosti na tom, zda se jedná o podávání krátkodobé nebo dlouhodobé.

Pro prevenci nebo léčení nemoci bude vhodné dávkování protilátky nebo polypeptidů záviset na typu léčené nemoci, na závažnosti a průběhu nemoci, na tom zda se jedná o podávání mutované protilátky pro preventivní čí léčebné účely, na předchozím způsobu léčení, na klinické historii pacienta a na jeho reakci na mutovanou protilátku a na rozhodnutí ošetřujícího lékaře. Protilátku proti lidskému IgE je vhodné pacientovi podávat najednou nebo v sérii dávek.

V závislosti na druhu a závažnosti nemocí je navrhovanou počáteční dávkou, která se podává pacientovi 1 pg/kg až 150 mg/kg (například 0,1 až 20 mg/kg) protilátky nebo antigenu, ať se jedná například o jedno nebo více podání v sérii, nebo o souvislou infúzi. Typická denní dávka může být v rozsahu od 1 gg/kg do 100 mg/kg nebo více, v závislosti na faktorech uvedených výše. Při opakovaném podávání po dobu několika dní nebo déle, v závislosti na stavu, se v léčení pokračuje, dokud nenastane požadované potlačení příznaků nemoci. Mohu však být užitečné i jiné dávkové režimy. Příklad dávkového režimu pro protilátky anti-LFA-1 nebo anti-ÍCAM-1 je uvedeno v WO 94/04188.

Prostředky, obsahující mutované protilátky, budou vyráběny, dávkovány a podávány způsobem, který je v souladu se správnou lékařskou praxi. Faktory, které je nutno v této souvislosti uvažovat, jsou například nemoc, která je léčena, druh savce, který je léčen, klinický stav určitého i o pacienta, příčina nemoci, místo, kde má přípravek působit, způsob podání, Časový harmonogram podávání přípravku a jiné faktory, které jsou lékařským praktikům známé. Na základě těchto úvah bude stanovena „léčebně účinná dávka“ mutované protilátky, která bude podávána, a jedná se o minimální množství, které je nezbytné k zabránění, zlepšení stavu nebo vyléčení nemoci či poruchy. Mutovaná protilátka nemusí být, ale bývá spojena s jedním nebo více prostředky, které se běžně používají při předcházení nebo léčení dané poruchy. Účinná dávka těchto dalších prostředků závisí na množství protilidského IgE, přítomného v léčebném prostředku, na typu poruch nebo léčení a jiných faktorech, diskutovaných výše. Obecně se používají ve stejných dávkách a podávají se stejnými způsoby, jak je uvedeno výše nebo od 1 do 99% dříve používaných dávek.

G. Výrobky

Při jiném provedení vynálezu, jsou výsledkem výrobky, obsahující materiál vhodný pro léčení poruch, popsaných výše. Výrobek obsahuje nádobu a označení. Vhodnými nádobami jsou například láhve, ampulky, injekční stříkačky a zkumavky. Nádoby mohou být vyrobeny z různých materiálů, jako jsou například sklo nebo plasty. Nádoba obsahuje prostředek, který je účinný při léčení poruch a má mít možnost sterilního vstupu (například nádobou může být vak s intravenózním roztokem nebo lékovka se zátkou, kterou je možno propíchnout jehlou podkožní injekční stříkačky). Aktivní látkou v prostředku je mutovaná protilátka. Označení na nádobě, nebo s nádobou jinak spojené, označuje že prostředek je používán pro léčení vybraných stavů. Výrobky mohou dále obsahovat druhou nádobu, ve které je farmaceuticky přijatelný pufr, jako jsou fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, Ringerův roztok a roztok dextrózy. Dále může obsahovat jiné materiály, které jsou žádoucí z komerčního hlediska nebo z hlediska uživatele, včetně jiných pufrů, ředících roztoků, filtrů, jehel, injekčních stříkaček a letáků s návodem pro použití.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je porovnání VH a VL domén u myší protilátky MAE11, lidské konsenzuální sekvence těžkých řetězců podskupiny III (humlll), sekvence lidského lehkého řetězce k podskupiny I (humKl) a fragmentu F(ab)-2, modifikovaného fragmentu lidské protilátky s CDR zbytky a některými zbytky podpůrné oblasti zaměněnými za myší aminokyselinové zbytky.

Obrázek 2 je porovnáni sekvenčních odchylek mezi lehkým a těžkým řetězcem CDR domén u rhuMabe25, e426 a sekvencemi e26 a e27. Číslováni zbytků je zde postupné, na rozdíl od práce Kabat a kol. Také si povšimněte, že tyto sekvence jsou pouze fragmenty a nikoli skutečné celé délky těžkých a lehkých řetězců.

Obrázek 3 je graf testu typu FACS, ukazující schopnost testovaných protilátek inhibovat vazbu IgE konjugovaného s FITC na α-řetězec vysoceafinního FceRI reeeptoru, který je exprimován na buňkách CHO3D10. Je ukázáno procento inhibice myšími mABMaEll(a), zušlechtěnými mAb405 ()- negativní kontrola, F(ab}-2 (o), F(ab)-9(·), F(ab)-11(A), F(ab)-12(A). Vynesené hodnoty jsou průměry ze tří pokusů, mimo výsledků s mAb4D5, které jsou hodnotou _ ÍI z jednoho pokusu. Výsledky ukazují, že MaEl l a testované F(ab) blokují vazbu IgE konjugovaného s FITC na buňky CHO 3D10, které exprimují α-řetězec FceRI.

Obrázek 4 je graf testu typu FACS, měřícího vazbu testované protilátky k IgE, vy sycenému a-subjednotkou vysoceafinního reeeptorů FceRI, který je exprimován na buňkách CHO 3D10. Je ukázáno procento inhibiee myšími mAB MaEll (o), zušlechtěnou variantou 12 (A), pozitivní kontrolou - myší mAb MaEl (·), negativní kontrolní myší protilátkou MOPC21 (Δ) a negativní kontrolní zušlechtěnou mAb4D5 (□). Na aritmetické/lineámí stupnici byly průměrné hodnoty fluorescenčního kanálu při 0,1 pg/ml u MPOC21 7,3, MaEl 32,1, MaEl 16,4, hu4D5 4,7 a io huMaE114,6. Všechny tri myší monoklonální protilátky byly myšího izotypu IgGl a obě zušlechtěné monoklonální protilátky byly lidského izotypu IgGl. Vynesené hodnoty jsou průměry ze tří pokusů. Výsledky ukazují, že MaEll a F(ab>-12 se nevážou na IgE pokryté buňky

CHO 3D10, které exprimují α-retězec FceRI.

Obrázek 5 je graf molárního poměru anti-IgE vyneseného proti procentům inhibiee uvolňování histaminu, indukovanému alergeny ambrosie. Jsou ukázány E-25 (·) a e-26 (o). Výsledky ukazují, že F(ab) forma e26 výrazným způsobem inhibuje uvolňování histaminu, indukovanému alergeny ambrosie a to způsobem, který je úměrný podané dávce, přičemž molární poměr, při kterém dochází k polovině maximální inhibiee je 44:1 (anti-IgE:RSIgE).

Obrázek 6 je grafická reprezentace obohacení afmitními postupy po různých kolech afinitních selekcí, popsaných v části II příkladu 4. Je ukázán poměr vazebného obohacení pro každou šarži vzhledem k standardnímu typu (Emut/Ewt). Výsledky naznačují, že VL knihovny (představované „a“ & „b“) vykazují úspěšné relativní obohacení, které je až 1 Okřát větší než u standardního typu po 5 až 6 obohacovacích kolech. Mimo to VH knihovny „c“ a „d“) vykazují asi 3 až 5násobné vylepšení po asi 3 kolech. Je nutno si povšimnout že „a“ odpovídá Fab fágové knihovně, mutované na CDR-1 zbytcích 27, 28, 30 a 31, kdežto „b“ odpovídá mutacím na místech 30, 31, 32 & 34, zatímco „c“ a „d“ jsou nezávislé F(ab) knihovny s mutacemi na zbytcích 101, 102, 103, 105 & 107.

Obrázek 7 je graf pozorované optické hustoty vzhledem ke koncentraci kompetičních IgE protilátek ve kompetiční studii provedené pomocí fágového ELISA testu u výsledných variant z kombinací VLCDR1 mutací ve26 sVHCDR2 mutacemi v klonech 235-5.1, 235-5.2, 235-5,3 a 2235-5.4, přejmenovaných na e27, e695, e696 a e697, popsaných v části v příkladu 4,

Obrázek 8 je graf absorbance při 490 nm při různých úrovních koncentrace e25, e26 a e27 anti-IgE protilátky v testu na biotínové destičce, popsaném v části VI příkladu 4.

Obrázek 9 ukazuje zřetelnou vazebnou afinitu F(ab) e25, e26 a e27, jak byla naměřena systémem povrchové rezonance BIAcore TM-2000. Sériová l,5násobná ředění proti látkových F(ab) fragmentů byla ínjektována na IgE čip v pufru PBS/Tween (0,05% Tween 20 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem) při 25 °C při použití rychlosti průtoku 20 μΙ/min. Uvedené rovnovážné disociační konstanty (Kd) byly vypočteny z poměru pozorovaných kon/koff pro každou variantu F(ab).

Obrázek 10 je sekvence plazmidu p426, který byl použit jako matrice pro konstrukci stop matric specifických pro knihovnu v příkladu 4.

Obrázek 11. A. Schéma inzertu v plazmidu pDH188, který obsahuje DNA kódující lehký řetězec a těžký řetězec (variabilní a konstantní doména 1) F(ab) zušlechtěné protilátky namířené proti reeeptorů HER-2. VL a VH jsou variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce. Ck je konstantní oblast lidského lehkého kapa řetězce. CHIqi je první konstantní oblast lidského gama 1 řetězce. Obě kódující oblasti začínají bakteriální signální sekvencí stll.

B. Schematický diagram celého plazmidů pDH118, obsahujícího inzert popsaný v 11 A. Po transformaci buněk E. coli SRÍ01 tímto plazmidem a přidání helper fága, je plazmid zabalen do fágových Částic. Některé z těchto částic prezentují fúzní protein Fab-p III, (kde ρ III je protein kódovaný DNA genu III fága M13).

Obrázek 12 představuje celou délku lehkého a těžkého řetězce anti-IgE protilátek E25, E26 aE27.

Obrázek 13 představuje fragmenty F(ab) anti-IgE protilátek E25 a E26.

io

Obrázek 14 představuje fragmenty sFV anti-IgE protilátek E25 a E26.

Obrázek 15 představuje fragmenty F(ab)'2 anti-IgE protilátek E25 a E26.

SEQ ID NO: 1 představuje sekvenci expresního plazmidů e426 použitého v tomto vynálezu, také uvedenou v obr. 10.

SEQ ID NO: 2 představuje sekvenci variabilního těžkého řetězce MaEl 1 uvedenou v obr. 1.

SEQ ID NO: 3 představuje sekvenci variabilního těžkého řetězce F(ab)-2 uvedenou v obr. 1.

SEQ ID NO: 4 představuje sekvenci variabilního těžkého řetězce humlll uvedenou v obr. 1.

SEQ ID NO: 5 představuje sekvenci variabilního lehkého řetězce MaEl 1 uvedenou v obr. 1.

SEQ ID NO: 6 představuje sekvenci variabilního lehkého řetězce F(ab)-2 uvedenou v obr. 1.

SEQ ID NO: 7 představuje sekvenci variabilního lehkého řetězce humlll uvedenou v obr. 1.

SEQ ID NO: 8 představuje sekvenci variabilního lehkého řetězce e26 a e27 uvedenou v obr. 2.

SEQ ID NO: 9 představuje sekvenci variabilního lehkého řetězce e426 uvedenou v obr. 2.

SEQ ID NO: 10 představuje sekvenci variabilního lehkého řetězce e25 uvedenou v obr, 2.

SEQ ID NO: 11 představuje sekvenci variabilního těžkého řetězce e27 uvedenou v obr. 2.

SEQ ID NO: 12 představuje sekvenci variabilního těžkého řetězce e25, e26 a e426 uvedenou v obr. 2.

SEQ ID NO: 13 představuje celou délku sekvence variabilního lehkého řetězce e25 uvedenou v obr. 12.

SEQ ID NO: 14 představuje celou délku sekvence variabilního těžkého řetězce e25 uvedenou v obr. 12.

SEQ ID NO: 15 představuje celou délku sekvence variabilního lehkého řetězce e26 uvedenou v obr. 12.

SEQ ID NO: 16 představuje celou délku sekvence variabilního těžkého řetězce e26 uvedenou v obr. 12.

SEQ ID NO: 17 představuje celou délku sekvence variabilního lehkého řetězce e27 uvedenou v obr. 12.

SEQ ID NO: 18 představuje celou délku sekvence variabilního těžkého řetězce e27 uvedenou v obr. 12.

SEQ ID NO: 19 představuje variabilní lehký Fab fragment e26 a e27 uvedený v obr. 13.

SEQ ID NO: 20 představuje variabilní těžký řetězec Fab fragmentu e26 uvedený v obr. 13.

SEQ ID NO: 21 představuje variabilní těžký řetězec Fab fragmentu e27 uvedený v obr. 13.

SEQ ID NO: 22 představuje sFv fragment e26 uvedený v obr. 14.

- 43 _

SEQ ID NO: 23 představuje sFv fragment e27 uvedený v obr. 14.

SEQ ID NO: 24 představuje variabilní lehký řetězec F(ab)'2 fragmentu z e26 a e27 uvedený v obr. 15.

SEQ ID NO: 25 představuje variabilní těžký řetězec F(ab)'2 fragmentu z e26 uvedený v obr. 15.

SEQ ID NO: 26 představuje variabilní těžký řetězec F(ab)'2 fragmentu z e27 uvedený v obr. 15.

Následující příklady jsou uváděny pro ilustraci a nikoli aby omezily rozsah vynálezu.

io Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava monoklonálních protilátek proti IgE

Bylo připraveno osm monoklonálních protilátek (MAE10-MAE17), které mají schopnost zabránit vazbě IgE na FceRI. Monoklonální protilátky proti IgE byly připraveny ze supernatantu buněk U266B1 (ATCC TIB 196) pomocí afinitní ehromatografie na izolované anti-IgE protilátce (Genentech MAE11). Pro MAE12 bylo pět myších samic kmene BALB/c, starých šest týdnů, imunizováno do tlapek podáním 10 pg vyčištěného IgE v adjuvans podle Ribiho. Následující injekce byly provedeny stejným způsobem po jednom a po třech týdnech po počátečních imunizacích. Tři dny po závěrečné injekci byly odebrány tříselné a podkolenní lymfatické uzliny, ty byly spojeny a pomocí protlačení přes sterilní ocelovou vlnu byla připravena jednotná buněčná suspenze. Buňky byly fúzovány v poměru 4:1 s myšími myelomovými buňkami P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) v médiu s vysokým obsahem glukózy (DMEM), obsahujícím 50% (váha/objem) polyetylenglykolu 4000. Imunizace pří přípravě MAE14, MAE 15 a MAE 13 byla provedena podobným způsobem, výjimkou bylo že u MAE 13 bylo použito 30 pg IgE na injekci a jako posilovači dávka před fúzí byl testován IgE fragment 315-347 (Kabat); u MAE 10 a MAE11 bylo subkutánně injekčně aplikováno ve dvou dávkách 100 pg, pak závěrečná posilovači dávka 50 pg a pro fúzi byly použity slezinné buňky.

Fúzované buňky byly pak vysety v hustotě 2x10⁵ na jamku do 96-jamkové destičky pro tkáňové kultury. Po 24 hodinách bylo přidáno selekční médium HAT (hypoxanthin/aminopterin/thymidin, Sigma, #H0262). Buňky byly vysety do 1440 jamek a 365 z nich obsahovalo buňky rostoucí po selekci médiem HAT. Patnáct dní po fúzi byly supematanty testovány na přítomnost protilátek, specifických proti lidskému IgE pomocí testu ELIS A. Tento ELIS A test byl proveden způsobem, který je dále popsán, přičemž všechny inkubace byly provedeny při teplotě místnosti. Testovací destičky (Nunc Immunoplate) byly během dvouhodinové inkubace potáhnuty krysím anti-myším IgG (Boehringer Mannheim, #605-500) v koncentraci 1 pg/ml v 50 mM pufru uhličitanu sodného, pH 9,6, poté blokovány 0,5% hovězím sérumalbuminem ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem (PBS) po dobu 30 minut, potom čtyřikrát promyty PBS, obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST). Testované supematanty byly přidány a inkubovány 2 hodiny za třepání a potom čtyřikrát promyty PBST. Potom byl přidán lidský IgE (vyčištěný z buněk U266 výše popsaným postupem) v koncentraci 0,5 pg/ml a inkubován po dobu 1 hodiny za třepání a potom čtyřikrát promyt PBST. Dále byla přidána křenová peroxidáza, konjugovaná s kozím anti45 lidským IgE (Kirkegarrd & Perry Labs, #14-10-04, 0,5 mg/ml) ředěným 1:2 500 a inkubována po dobu 1 hodiny a potom čtyřikrát promyta PBST. Destičky byly vyvolány přidáním na jamku 100 pl roztoku, obsahujícího 10 mg o-fenylendiamin dihydrochloridu (Sigma, #P8287) a 10 pl 30% roztoku peroxidu vodíku v 25 ml pufru fosforečnanu a citronanu, pH 5,0, a inkubací po dobu 15 minut. Reakce byla zastavena přidáním 100 pl 2,5 M kyseliny sírové do jamky. Hodnoty byly získány odečtením na přístroji pro automatické odečítání ELISA destiček jako absorbance při 490 nm. Pro MAE 12 bylo testováno 365 supematantů a 100 z nich bylo specifických pro lidský IgE. Podobné frekvence IgE specifity byly získány při hromadném prohledávání pro jiné

protilátky. Všechny zde popsané monoklonální protilátky byly izotypu IgGl kromě mAE17, která byla IgG2b a MAE 14, která byla IgG2a.

Každá ze specifických IgE protilátek byla dále testována pomocí buněčných ELISA testů na 5 destičkách, aby byly vybrány protilátky, které se vážou k IgE takovým způsobem, že tím inhibují vazbu IgE k FceRI a které nejsou schopny vázat k IgE vázanému na FCEH. Výsledky těchto testů jsou uvedeny v tabulce I a tabulce 2, uvedených níže.

ío Tabulka 1

Souhrn charakteristik myších anti-HulgE mAb

mAb	Imunogen	Časový pián / dávka (g)	Zdroj B- buněk	izotyp	vazba Fc Rl· vázaného IgE	uvolnění PBL histamtnu3 (EC50)	množství btokujídciho FcRP* (EC50)
MaE1	PS IgE	3x50	lymfatická uzlina	lgG1	0,05 g/mf	1 g/ml	0.3 g
MaE10	U268 IgE	2x100, 1x50	slezina	IgGl	žádná vazba ph 10 g/ml	>100 g/ml	2.5 g
MaE11	U266 IgE	2x100, 1x50	slezina	lgG1	žádná vazba při 10 g/ml	>100 g/mi	0,6 g
MaE12	U266 IgE	3x30	lymfatická uzlina	lgG1	žádná vazba ph 10 g/mí	>100 g/ml	0,8 g
MaE13	U266lgE	3x30	lymfatická uzlina	IgGl	žádná vazba při 10 g/ml	>10 g/ml	0,6 g
MaE14	U266 IgE	5x50	lymfatická uzlina	lgG2a	Žádná vazba ph 10 g/ml	>100 g/ml	2,5 g
MaE15	U266 IgE	5x50	lymfatická uzlina	lgG1	žádná vazba při 10 g/ml	>100 g/ml	0,6 g
MaE16	rHIgE aa315-547	5x1	lymfatická uzlina	lgG1	žádná vazba při 10 g/ml	>100 g/ml	0.7 g
MaE17	rHIgE aa315-547	5x1	lymfatická uzlina	lgG2b	žádná vazba při 10 g/ml	>100 g/mi	>5,0 g

. CZ 300724 B6

Tabulka 2

Souhrn myších anti-HulgE (pokračování)

mAb	vazba k membránovému lgEnaU266Bi_ (ESO)*	vazba IgE na FceRII (CD23) IM9(EC50)’	množství btokujlcl vazbu 1 μθ IgE na FceRII (E50)’	inhibice in víro IgE syntézy	konstanta afinity pra lgE8 (Kd)
MaE1	0,4 pg/ml	0,05 pg/ml	> 100 pg	(-)	5,4x1 θ'®
MaE10	0,5 pg/ml	žádná vazba při 10 pg/ml	2,5 gg	(-)	7x1 θ'9
MaE11	0,15 Mg/ml	žádná vazba při 10 pg/ml	0,5 Mg	w	3x10-8
MaE12	> 10 pg/ml	1 pg/ml	5,0 pg	(-)	4x10'7
MaE13	1 pg/ml	žádná vazba pň 10 pg/ml	0,7 pg/ml	(++)	5x10®
MaE14	β pg/ml	žádná vazba pň 10 pg/ml	2,5 ng/ml	<±)	1,4x10®
MaE15	6 pg/ml	žádná vazba pn 10 pg/ml	0,6 pg/ml	<±)	7χΐσ®
MaE16	10g/ml	< 0,05 pg/ml	5 Mg	(+)	netestováno
MaE17	10 g/ml	Žádná vazba pň 10 pg/ml	5m0	(++)	netestováno

1. Testy FACS pro analýzu myších anti—lidských IgE monoklonálních protilátek. Hledání myší anti-lidské IgE monoklonální protilátky, která se váže na IgE na CHO 3D10 (FceRI alpha +).

a. Buňky CHO3D10 (stabilně transfekované řetězcem FceRI alpha, Hakimi a kol., J. Mol. Biol. 2$: 22079) v koncentrací 2x10⁵ buněk na vzorek, jsou inkubovány se standardním IgE U266 (šarže č. 13068-46) v koncentraci 10 pg/ml ve ΙΟΟμΙ pufru FACS (0,1% BSA, 10 mM io azid sodný v PBS, pH 7,4) po dobu 30 minut při teplotě 4 °C a poté následuje jedno promytí pufrem FACS. Množství vázaného IgE je určeno inkubací části buněk, které reagovaly s IgE, s polyklonálním králičím anti-lidským IgG, konjugovaným s FITC (Accurate Chem. Co.

AXL-475F, šarže č. 16) v koncentraci 50 pg/ml po dobu 30 minut při teplotě 4 °C a poté následují tři promytí pufrem FACS.

b. Buňky, které reagovaly s IgE, jsou inkubovány se 100 pl supematantu z myšího hybridomů, připravenému proti lidskému IgE (koncentrace myšího IgG se pohybuje v rozmezí od 1 do 20 pg/ml) po dobu 30 minut při teplotě 4 °C a poté následuje promytí pufrem FACS. Jako pozitivní kontrola pro vazbu je použita monoklonální protilátka od Genentech proti lidskému IgE (MaEl) v koncentraci 10 pg/ml, jako negativní kontrola je použita monoklonální protilátka od

Genentech, která nerozpoznává IgE (MAD 6P) v koncentraci 10 pg/ml.

c. Monoklonální protilátka, která se váže k lidskému IgE na buňkách CHO je detekována pomoci inkubace buněk safinitně purifikovaným F(ab')₂ z kozího anti-myšího IgG (Organon Teknica, #10711-0081), který je konjugován s FITC, v koncentraci 20 pg/ml, po dobu 30 minut pri teplotě 4 °C a poté jsou třikrát promyty pufrem FACS. Buňky jsou přidány do 400 μΐ pufru, obsahujícího 2 pg/ml propidium jodidu (Sigma, #P4170), aby došlo k obarvení mrtvých buněk.

d. Buňky jsou analyzovány na průtokovém cytometru FACSCAN od Becton Dickinson. Snímací štěrbina předního rozptýleného světla a boění štěrbina, snímací světlo rozptýlené v úhlu 90°, jsou nastaveny tak, aby analyzovaly homogenní populaci buněk. Mrtvé buňky, které jsou obarveny propidium jodidem, jsou z analýzy vyloučeny. Hybridomové supernatanty, které se ío nevážou k IgE na buňkách CHO 3D10, byly považovány za kandidáty pro další testování.

2. Uvolňování histaminu z bazofílních granulocytů z periferní krve. Heparinizovaná krev byla získána od normálních dárců a zředěna 1:4 v modifikovaném pufru Tyrodes (25 mM Tris, 150 mM NaCI, 10 mM CaCl₂, MgCl₂, 0,3 mg/ml HSA, pH 7,35), poté mkubována s 1 nm lidského IgE (ND) pri teplotě 4 ^CC po dobu 60 minut Buňky byly pak přidány k pufru Tyrodes, obsahujícím buď myší monoklonální protilátku proti IgE (10 mg/ml) nebo polyklonální anti—lidské antisérum jako pozitivní kontrolu a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Buňky byly centrifugovány, histamin v supematantech byl acetylován a obsah histaminu byl určen pomocí RIA soupravy (AMAC, lne. Westbrook, Main). Celkový obsah histaminu byl určen u buněk, které byly podrobeny několika cyklům zmražení a rozmražení.

3. Blokování vazby IgE, konjugovaného s Fitc, k řetězci FceRl alpha. Vliv protilátek na vazbu IgE byl studován pomocí preinkubace Fitc označeného IgE sráznými MaE protilátkami při teplotě 37 °C po dobu 30 minut v PBS, obsahujícím 0,1% BSA a 10 mM azid sodný pH 7,4, a poté inkubací komplexu s 5xlO⁵ buněk 3D10 při teplotě 4 ^ŮC po dobu 30 minut. Buňky byly poté třikrát promyty a byla měřena fluorescence hlavního kanálu při 475 nm. Jako kontrola byla použita myší monoklonální protilátka proti lidskému IgE (Mael), která neblokuje vazbu IgE k řetězci FceRl alpha.

4. Analýza vazby myšího protilidského IgE k membráně IgE pozitivních B buněk U266.

a. Buňky U266 Bl (membránový IgE +) jsou pěstovány v základním médiu doplněném 15 % tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra (Hyclone, #A-1111-L), penicilinem, streptomycinem (100 jednotek/ml) a L-glutaminem (2 mM).

b. Buňky (5xl0⁵/vzorek) jsou inkubovány v 100μ1 pufru FACS, obsahujícím myší mono35 klonální protilátky proti lidskému IgE v koncentracích 10, 5, 1, 0,5 a 0,1 μΙ/ml po dobu 30 minut na ledu v 96jamkových mikrotitračních destičkách s kulatým dnem, poté následují dvě promytí pufrem FACS. Jako pozitivní kontrola je použita monoklonální protilátka MAE1 od Genetech.

c. Buňky jsou inkubovány v 100 μΐ pufru FACS, obsahujícím 50 pg/ml (1:20 ředěný zásobní roztok) F(ab')₂ zafinitně čištěného kozího protímyšího IgE, (Organon Teknica, #10711-0081), který je konjugován s FITC, po dobu 30 minut na ledu, pak následují tři promytí pufrem FACS. Buňky jsou přidány ke 400 μΐ pufru FACS, obsahujícího 2 pg/ml propidium jodidu, aby došlo k obarvení mrtvých buněk.

5. Testy vazby k FceRII (CD23)+ B buňkám IM9, založené na FACS.

a. Linie 1M9 lidského B buněčného myelomu IM9 (ATCCCCL159, Ann. N. Γ. Acad Sci. 190: 221-234 (1972) bylo udržována v základním médiu GIF s 10% tepelně inaktivovaného fetálního hovězího séra, penicilinem, streptomycinem (100 jednotek/ml) a L-glutaminem (2 mM).

b. Buňky (vzorek 5x10⁵) jsou inkubovány v 100 μΐ pufru FACS, obsahujícím standardní IgE

U266 v koncentraci 2 pg/ml po dobu 30 minut pri teplotě 4 °C v 96jamkových mikrotitračních destičkách, poté následují dvě promytí pufrem FACS. Jako kontrola byly buňky inkubovány

v pufru samotném nebo v pufru, obsahujícím 2 pg/ml lidského IgGl (Behring Diagnostics, kat. č. 400112, šarže Č. 801 024).

c. Poté byly buňky inkubovány na ledu s myšími monoklonálními protilátkami proti lidskému IgE v koncentracích 0,1 až 10 pg/ml po dobu 30 minut. Jako pozitivní kontrola byla použita monoklonální protilátka MAE1 od Genentech.

d. Buňky jsou potom inkubovány v 100 pl pufru FACS, obsahujícím 50 pg/ml F(ab')₂ kozího protimyšího IgG, (Organon Teknica, #10711-0084), který je konjugován s FITC, po dobu 30 minut při teplotě 4 °C, pak následují tři promytí pufrem FACS.

e. Buňky jsou potom přidány ke 400 pl pufru, obsahujícího 2 pg/ml propidium jodidu, aby io došlo k obarvení mrtvých buněk.

f. Buňky jsou analyzovány na průtokovém cytometru FACSCAN od Becton Dickinson. Snímací štěrbina předního rozptýleného světla a boční štěrbina, snímací světlo rozptýlené v úhlu 90°, jsou nastaveny tak, aby analyzovaly homogenní populaci buněk. Mrtvé buňky, které jsou obarveny propidium jodidem, byly z analýzy vyloučeny. Buňky pozitivní na FITC (vazba IgE) byly analyzovány a srovnávány $ buňkami, barvenými samotným králičím protilidským IgE, konjugovaným s FITC.

g. Aby bylo možno určit hladinu CD23 na povrchu buněk IM9 v každém pokusu, tak byl jako pozitivní kontrola obarven podíl buněk pomocí myší monoklonální protilátky Leu 20 (antí-CD23) od Becton Dickinson, v koncentraci 10 pg/ml po dobu 30 minut při teplotě 4 °C a poté následovala 2 promytí. Buňky byly dále inkubovány s F(ab')₂ z afmitně purifikovaného kozího protimyšího IgG v koncentraci 50 pg/ml.

6. Protilátka blokující vazbu IgE konjugovaného s FITC k nízkoafinnímu receptoru pro k IgE.

Vazba 40 np IgE značeného FITC k nízkoafinnímu receptoru pro IgE (CD23 z FceRI), exprimovanému na B lymfoblastických buňkách 1M-9, byla analyzována pomocí průtokové cytometrie na průtokovém cytometru FACSCAN. Vliv protilátek na vazbu IgE konjugovaného s FITC byla pomocí preinkubace IgE konjugovaného s FITC s myšími protilidskými protilátkami v koncentraci od 0,1 do 10 pg/ml při teplotě 37 °C po dobu 30 minut v PBS, obsahujícím 0,1% BSA a

10 mM azid sodný pH 7,4, a poté inkubací komplexu s 5x10⁵ buněk při teplotě 4 °C po dobu minut. Buňky byly poté třikrát promyty a byla měřena fluorescence hlavního kanálu při 475 nM.

7. Protokol in vitro IgE testu

a. Z periferní krve normálních dárců byly odděleny mononukleámí buňky.

b. Buňky byly důkladně promývány PBS, aby se pokud možno odstranily krevní destičky,

c. Mononukleámí buňky byly spočítány a resuspendovány v médiu na koncentraci lxlO⁶ buněk/ml. Médium byla směs DMEM s penicilinem a streptomycinem, 15% koňské sérum, IL-2 (25 jednotek/ml) a IL-4 (20 ng/ml).

d. Protilátky byly přidány ve vhodných koncentracích v nultém, 5. a 8. dni.

e. Kultury byly inkubovány v 24jamkových destičkách pro tkáňové kultury od Falcon po dobu 14 dní.

f. Čtrnáctý den byly odebrány supematanty a testována koncentrace IgE pomocí ELISA postupu specifického pro IgE.

8. Afinitní konstanty (kd) myších monoklonálních protilátek k lidskému IgE byly určeny metody vazebné rovnováhy (Scatchard).

a. IgE (allotypy ND a PS byly jódovány metodou pomocí chloraminu T a odděleny od volného jodidu sodného (Na¹²⁵I) na sloupci PD10 Sephadexu G25 (Pharmacia, #17-0851^01)) v pufru

RIA: PBS, 0,5% hovězí sérumalbumin (Sigma, #A-7888), 0,05% Tween 20 (Sigma, #P-1379), 0,01% thiomersol (Sigma, #T-5125), pH 7,4. Přibližně 78 až 95% radioaktivních impulzů ze sloupce bylo sraženo pomocí 50% kyseliny trichloroctové a specifická aktivita jódovaného preparátu IgE se pohybovala v rozsahu od 1,6 až 13 pCi/pg za předpokladu 70% účinnosti měření.

b. Stejné koncentrace ¹²⁵I (přibližně 5xl0⁴cpm) byly přidány k různým koncentracím neznačeného IgE (1 až 200 nM) v konečném objemu 0,1 ml pufru RIA v 12x75 mm polypropylenových zkumavkách. Pak byla v 0,1 ml RIA pufru přidána myší monoklonální protilátka proti lidskému IgE (konečná koncentrace 20 mM) do konečného objemu 0,2 ml.

io c. Vzorky byly inkubovány za stálého míchání 16 až 18 hodin při teplotě 25 °C.

d. Vázaný a volný ¹²⁵I byl oddělen přidáním 0,3 ml směsi obsahující afinitně purifikovaný kozí protimyší IgG (Boehringer Mannheim, #605-208), vázaný k Sepharose 4B, aktivované CNBr ((Pharmacia, #17—0430—01) a nosič protein A sepharose (Repligen, #IPA300) v pufru RIA a inkubováno 1 až 2 hodiny při teplotě 25 °C za stálého míchání. Potom byl přidán RIA pufr (1 ml) a zkumavky byly centrifugovány 5 minut při 400 g. U vzorků bylo potom změřeno celkové množství impulzů. Pak byly supematanty odsáty pomocí jemně vytažených Pasteurových pipet, u vzorků byla opět změřeno množství impulzů a spočítán poměr mezi vázanými a volnými impulzy.

e. Scatchard analýza byla provedena pomocí Fortranového programu (scanplot), založeného na programu Ligand, který byl napsán P. Munsonem z NIH. Scatplot používá rovnici, která vyhodnocuje vazbu jako funkci celku, přičemž používá regresní analýzu podle Rodbarta.

Příklad 2: Příprava zušlechtěných MaEl 1

Úvod:

Následující příklad popisuje různé způsoby přípravy zušlechtěných MaEll, ve kterých byly zbytky modifikovány pomocí cílené mutageneze, a bylo získáno 12MaEll variant proti IgE [F(ab)l-12]. Jako matrice pro vytvoření rhuMaE25 nebo E25, vysoce účinné protilátky proti IgE, popsané v přihlášce PCT/US92/06860 podané 14. srpna 1992, byly použity zbytky F(ab) 12. Metody:

Myší monoklonální protilátka proti lidskému IgE, ukázaná na obrázku č. 1, byla modifikována cílenou mutagenezí (Kunkel, T. A, (1985), Proč. Acad, Sci. USA 82: 488) matrice obsahující deoxyuridin; tato matrice obsahuje lidský lehký řetězec k-podskupiny I a lidský těžký řetězec podskupiny III (VH-CH1) v plazmidu založeném na pUCl 19, pAK2 (Carter a kol., Proč. Natí Acad, Sci. USA $9 : 4 285); aby byla získána varianta F(ab)-1. F(ab>2 byla konstruována z matrice F(ab)-1 a všechny další zušlechtěné varianty F(ab) byly konstruovány z matrice F(ab)-2. Plazmidy byly pro přípravu dvoj vláknové a jednovláknové DNA transformovány do kmene E. coli JM101 (Messing, 1(1979), Recomb. DNA Tech. Bulí 2: 43; Ausuble a kol., Current Protocols in Molecular Biology část 1 (1977)). Zbytky jak lehkého tak těžkého řetězce byly kompletně sekvenovány pomocí dideoxynukleotidové metody. DNA, kódující lehký a těžký řetězec, byla pak subklonována do odvozeného plazmidu E. coli, exprimujicího F(ab)-pAK19 (Carter a kol. (1992), Biotechnology \Q: 163). Odvozený plazmid postrádá cysteiny v otočné oblasti, které vytvářejí disulfidické vazby mezi těžkými řetězci v F(ab')₂ fragmentech. Fragmenty F(ab), na rozdíl od IgG protilátek o plné délce, usnadňují analýzu průměrně velkého množství variant, neboť lze použít spíše exprese v E. coli než techniky kultivace savčích buněk. Tyto jednotlivé varianty jsou popsány v přihlášce WO 93/04173, uveřejněné 4. března 1993. Jakmile je určena nejlepší varianta, je následně subklonována do plazmidu, kódujícího celou délku lidského IgGl (viz níže).

Expresní plazmidy byly transformovány do kmene E. coli MM294 (Meselon, Ma R. Yuan (1968), Nátuře 217: 1 110) a jednotlivé kolonie byly pomnoženy v 5 ml média 2YT s carbenicilinem (100 μ/ml) po dobu 5 až 8 hodin při teplotě 37 °C. Kultura (5 ml) byla pak přidána do 100 ml média APS s karbenici línem (100 μ/ml) a ponechány růst po dobu 16 hodin v 500 ml třepací láhvi při teplotě 37 °C. Kultury byly centrifugovány při 4 000 g a supematant byl odstraněn. Po jednohodinovém zmražení byl sediment resuspendován v 5 ml vychlazeného 10 mM Tris, 1 mM EDTA a 50 μΐ 0,1 M benzimidinu (Sigma, St. Louis), poslední složka je přidána, aby inhibovala proteolýzu. Po mírném míchání na ledu po dobu 1 hodiny, byl vzorek centrifugován při lOOOOg po dobu 15 minut. Supematant byl nanesen na sloupec Sepharosy CL-4B s proteinem A (Pharmacia) (objem částic 0,5 ml), kteiý byl potom promyt 10 ml roztoku 3M chloridu draselného/] 00 ml Tris, pH8,0, následovalo vymytí pomocí 100 mM kyseliny octové (2,5 ml), pH 2,8 do 1 M Tris, pH 8,0 (0,5 ml).

Potom byl pufr F(ab) zaměněn za PBS pomocí Centricon-30 (Amicon) a koncentrován do konečného objemu 0,5 ml. U každého F(ab) fragmentu byla provedena SDS-PAGE elektroforéza, aby byla ověřena jeho čistota. Koncentrace F(ab) fragmentů byla určována pomocí předpokladu, že 0,1% ε₂δο odpovídá 1,0. Extinkční koeficient byl určen pomocí koncentrací proteinů z aminokyselinové analýzy čištěných F(ab)-2 a A₂₈₀ z téhož vzorku.

Vybrané fragmenty F(ab) byly analyzovány přímo kapalnou chromatografií nebo hmotovou spektrometrií, aby byla potvrzena jejich molekulová hmotnost. Vzorky byly nastříknuty do systému kapilární kapalné chromatografie (Henzel, W. J, a kol., (1980), Anal, Biochem. 187: 228) a přímo analyzovány pomocí hmotového spektrometru Sciex API 3. Pro kalibraci byly použity vyšší nabité stavy lidského růstového hormonu (molekulová hmotnost 22 256,2), dosažené pomocí týchž přístrojových parametrů, jaké byly užity pro testované vzorky.

Pro vytváření plně dlouhých lidských IgGl verzí zušlechtěného MaEll, byly lehký a těžký řetězec odděleně klonovány do dříve popsaných plazmidů pRK (Gorman, C. M. a kol., (1990), DNA Protein Eng. Tech. 2: 3). Plazmidy, obsahující vhodné lehké a těžké řetězce (v závislosti na požadované změně (změnách) sekvence), byly společně transfekovány do adenovirem transformovaných buněk linie lidských embryonálních ledvin, známých jako 293 (Graham, F. L. a kol., (1977), J. Gen. Virol. 36: 59), pomocí vysoce efektivního postupu (Graham, F. L. a kol., (1977), J Gen. Virol. 36: 59 & Gorman, C. M., Science 221: 551). Medium bylo zaměněno ze médium bez séra a bylo odebíráno denně po dobu až pět dní. Protilátky byly vyčištěny ze spojených supernatantú pomocí na Sepharose CJA1B s proteinem A (Pharmacia). U vymytých protilátek byl pomocí filtrace na gelu G25 vyměněn pufr za PBS, protilátky byly koncentrovány ultrafiltrací na Centricon-30 nebo Centricon-100 (Millipore) a uloženy při teplotě 4 °C. Koncentrace protilátky byla zjišťována pomocí testu ELISA, při němž je vázán veškerý IgG. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Test pro rozpustný receptor:

Na testovacích destičkách s 96 jamkami (Nunc) byl zakotven inkubací s 0,05 ml chimemí receptor pro FceRI α-řetězec IgG v zakotvovacím pufru (50 mM uhličitan, kyselý uhličitan, pH9,6) po dobu 12 hodin při teplotě 4 až 8°C. Tekutina z jamek byla odsáta, bylo přidáno 250 μΐ blokovacího pufru (PBS, 1% BSA, pH 7,2) a inkubováno 1 hodinu při teplotě 4 °C. Na jiné testovací destičce byly titrovány vzorky a referenční myší MaEl 1 od 200 po 0,001 pg/ml při 4násobných ředěních v testovacím pufru (0,5% BSA a 0,05% Tween 20, PBS, pH 7,2), k tomu byl přidán stejný objem 10 ng/ml biotinylovaného IgE (O-Shannessy, D. J., a kol., (1984), Immunol. Let. 8: 273) a následovala inkubace destičky 2 až 3 hodiny při teplotě 25 °C. Jamky se zakotveným FceRI byly 3krát promyty PBS a 0,05% Tween 20 (Sigma), bylo do nich přeneseno 50 μΐ z jamek se vzorky a inkubováno s třepáním 30 minut při teplotě 25 °C. Poté bylo přidáno do každé jamky 50 μΐ roztoku Streptavidin-HRP (500pg/ml, Sigma), zředěného 1:5000 v testovacím pufru a následovala inkubace destičky s třepáním a promytím, jak bylo popsáno dříve. Do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ Microwell Peroxidase Substráte (Kírgaard & Perry Laboratories) a barva se ponechala vyvíjet 30 minut. Reakce byla zastavena přidáním stejného objemu 1 N HCI a byla měřena absorbance při 430 nm. Koncentrace při 50% inhibici byla spočtena pomocí vynesení procenta inhibice oproti koncentraci blokující protilátky pomocí nelineární čtyřparametrové křivky při použití Kaleidagraph analýzy (Synergy Software). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Vazba protilátek na IgE, který je připojený k FceRI:

io Vázání protilátek k lidskému IgE spojenému s α-podjednotkou FcsRI, exprimovanou na buňkách CHO 3D10 s 10 pg/ml lidského IgE po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Buňky byly 3x promyty, pak následovala inkubace 30 minut s různými koncentracemi buď myší monoklonální protilátkou proti lidskému IgE MaEl nebo MaEl 1 nebo zušlechtěnou variantou monoklonální protilátkou 12 [F(ab)12]. Jako kontrola pro myší monoklonální protilátku byla použita MOPC21 (myši IgGl), zatímco pro F(ab)12 byla jako kontrola použita zušlechtěná monoklonální protilátka 4D5 (Carter a kol., Proč, Nati Acad, Sci. USA 89: 4 285 (1992), lidský IgGl). Vazba myší monoklonální protilátky byla detekována pomocí sFITC konjugovaného F(ab')2 z kozího protimyšího IgE (10 pg/ml). Vazba /ušlechtěné monoklonální protilátky byla detekována pomocí s FITC konjugovaného F(ab'h z kozího protilidského IgG (50 pg/ml), který byl čištěn afinitní purifikaci na sloupci IgE, aby se minimalizovalo zkřížené reagování s IgE. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4.

Počítačové grafické modely myších a zušlechtěných F(ab):

Sekvence VL a VH domén F(ab) z obrázku 1 byly použity pro konstrukci počítačových grafických modelů VL-VH domén myší MaEll. Model byl poté použit pro určení, které podpůrné zbytky mají být zabudovány do /ušlechtěné protilátky, aby výsledkem bylo vytvoření F(ab)-2, Byly též konstruovány modely zušlechtěných variant, aby se ověřil správný výběr zbytků myší podpůrné oblasti. Konstrukce modelů byla prováděna tak, jak je popsáno v Carter a kol., (1992),

Proč. Natí Acad, Sci. USA 89:4 285; Eigenbrot, C. a kol., J. Mol. Biol. 229:969.

Výsledky:

Navrhování zušlechtěných protilátek MaEl 1:

Současná studie zušlechtěných protilátek používala lidskou konsensuální sekvenci. Toto je v kontrastu s jinými zušlechťovacími technikami, které používaly lidské sekvence, které jsou nejbližší myšímu Ig, o který se jedná. Shearman, C. W. a kol., (1991), J. lmmunol. 147: 4 366; Kettlenborough, C.A a kol., (1991), Protein Eng. 4: 773; Tempest, P. R. a kol., (1991),

Biotechnology 9: 266; Co, M. S, a kol., Proč. Nati Acad, Sci. USA 88: 2869; Routledge, E. G. (1991), Eur. J. lmmunol. 21: 2717. Tato lidská konsensuální sekvence se skládá z podpůrné oblasti, založené na lidské VH podskupině III a VLk podskupině 1, jak je definováno v Kabat a kol., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ed., National Institute of Health, Bethesda, MO. F(ab)-1 byl vytvořen připojením šestí CDR, jak jsou definovány v Kabat a kok, (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 ed., National Institute of Health, Bethesda, MD, k lidské podpůrné oblasti IgGl. Všechny zbytky podpůrné oblasti byly ponechány lidské. Tato varianta může být nejlépe popsána jako přímá „výměna CDR“. F(ab)~l nevykazují detekovatelnou inhibici vazby IgE k reeeptorů (tabulka 3), Zrušení schopnosti takových variant typu „výměna CDR“ vázat se ke svému antigenu byla dříve popsána. Carter a kol., viz výše; Tempest a kok, viz výše. Povšimněte si, že přesná sekvence F(ab)-1 není v tabulce 3 uvedena, nicméně tato sekvence může být odvozena zaměněním MaEl 1 myších CDR zbytků dle Kabata (označených v závorkách), za odpovídající lidské zbytky. V obrázku 1 jsou CDR dle Kabata označeny pravými a levými závorkami, zatímco CDR dle Chothii jsou označeny podtržením,

Aby se usnadnila interpretace a zamezilo nejasnostem, lidské aminokyselinové zbytky jsou psány normálním typem písma, kdežto myší aminokyselinové zbytky jsou psány italikou. Kde jsou vyznačeny substituce, první zbytek je ten, který byl zaměněn, druhý uvedený je ten, kterým byl zaměněn a číslo je uvedeno podle nativní sekvence dle Kabata.

Varianta F(ab)-2 byla založena na molekulárním modelování. V této molekule bylo několik zbytků z myší podpůrné oblasti vneseno do lidské podpůrné oblasti. VF(ab}-2 byly použity definice CDR podle Kabat a kol., viz výše (které jsou založeny na mezidruhové sekvenční io variabilitě), výjimku tvořily CDR-H1 a CDR-H2,

Definice CDR-H1, založené na sekvenční variabilitě (Kabat a kol., viz výše) se významně odlišují od definic, založených na krystalografických studiích komplexů antigen-protilátka (Chothia, C, a kol., (1989), Nátuře 342: 877) - viz obrázek 1. Proto byla CDR-H1 předefinována tak, aby zahrnovala obě definice, tj. 1 idské zbytky 26 až 35.

Definice CDR-H2, založená na sekvenční variabilitě (Kabat a kol.) obsahuje více zbytků než ta, která je založena na krystalografických studiích komplexů antigen-protilátka (Chothia, C, a kol.) [viz obrázek 1; CDR dle Kabata jsou definovány závorkami, dle Chothii podtržením]. Protože nebyla objevena krystalická struktura, ukazující kontakty protilátka-antigen pro proti látkové lidské zbytky 60 až 65, CDR-H2 byla modifikována, aby obsahovala hybrid obou definicí, tj. lidské zbytky 50 až 58. Výsledkem je, že v F(ab)-2 byla ve srovnání s F(ab)-1 použita kratší verze CDR-H2.

Výsledkem je, že F(ab)-2 byla vytvořena s minimálním množstvím změn lidských zbytků za myší, o kterých se mělo za to, že jsou vyžadovány pro udržení vazby. Bylo vytvořeno dalších 10 variant, aby byly testovány vlivy zanořených zbytků na prostorové uspořádání CDR a rovněž hodnotit možnosti předpovědi vlivů významných zbytků podpůrné oblasti při molekulárním modelování a vyzkoušet jiné zajímavé zbytky.

Aby byly testovány vlivy zanořených zbytků na prostorové uspořádáni CDR, byly konstruovány F(ab)-3 a F(abp4, u nichž byly myší zbytky zaměněny zpět za zbytky lidské. Jak je ukázáno v tabulce 4 (u F(ab)-3 & F(ab)-4), postranní řetězce v VL4 a VL33 mají minimální vliv na vazbu a pravděpodobně i prostorové uspořádání CDR-L1 v zušlechtěné protilátce.

Modelování naznačuje, že zbytky podpůrné oblasti VH 24 může ovlivňovat prostorové uspořádání CDR-L1 a VH 37 může ovlivňovat oblast styku VL-VH. Avšak záměna lidského zbytku v VH 24 [F(ab)-5] nebo VH37 [F(ab)-7] vykázala minimální snížení vazby. Naopak záměna myšího Phe v pozici VH 78 v podpůrné oblasti za Leu [F(ab)-6] způsobil značné snížení vazebné schopnosti. Modely naznačují, že tento zbytek ovlivňuje prostorové uspořádání CDR-H1 anebo CDR-H2.

Na F(ab)-9 až F(ab)-12 byly testovány záměny lidských zbytků za myší zbytky. Všechny tyto čtyři varianty vykazovaly podstatné zdokonalení vazebné schopnosti ve srovnání s F(ab)-2 (Viz tabulky 3, 4 a obrázek 3). V F(ab)-9, která vykazuje dvojnásobné zdokonalení vazebné schopnosti oproti F(ab)™2, byly zaměněny dva zbytky v CDR-H2 (podle definice Kabat a kol., viz výše) za myší aminokyselinové zbytky: Ala VH 60 a Asp H61 Pro. Substituce Pro by mohla změnit prostorové uspořádání anebo pevnost CDR-H2 a pro Asn H60 se předpokládá že je zanořen v oblasti styku VL-VH, je možné že interaguje s Asp VLL

F(ab)-10, který vykazoval podstatné zdokonalení vazebné schopnosti ve srovnání s F(ab)-2, byl variantou, kde všechny zanořené zbytky (definované jako zbytky, jejichž přístupný povrch je menší než 5 % přístupného povrchu volné aminokyseliny) jak v VL tak v VH doménách byly myší zbytky z MaEl 1. V podstatě lze F(ab)-10 považovat za myší MaEl 1, v níž pouze expono55 váné zbytky v VL a VH, které nespadají do CDR, byly zaměněny zbytky lidskými.

Aby bylo možno určit, zda zdokonalení vazebné schopnosti F(ab)-10 bylo způsobeno jedním nebo několika zbytky, byly vytvořeny varianty F(ab)-11 a F(ab}-12. Namísto F(ab)-2 byla jako základní matrice pro přípravu těchto variant použita F(ab)-9, protože vykazovala 5násobné zvýšení vazebné schopnosti. Modelování naznačuje, že postranní řetězce v VH 63 a VH67 by mohly ovlivnit prostorové uspořádání CDR-H2. VH 63 je považována podle definice v Kabat a kol, viz výše, za součást CHR-H2, podle definice Chothia a kol., viz výše, však nikoli. VH 67 je podle obou definic považována za zbytek v podpůrné oblasti. V F(ab)-ll, byly v pozicích VH 63 a VH 67 myší zbytky Leu a Ile. V F(ab)~ 12 byl pouze VH 67 zaměněn za myší Ile.

io

V obou druzích testů - test s rozpustným receptorem (tabulka 4) a buněčný test (tabulka 4, obrázek 3), obě varianty F(ab)-11 a F(ab)-12 vykazovaly vazbu, která byla nejméně taková jako u F(ab)-10 a lepší než u F(ab>-9. To naznačuje, že vylepšení vazebné schopnosti u F(ab)-10 nebylo způsobeno změnou prostorového uspořádání vnitřku VL domény s myšími zbytky, ale bylo způsobeno vlivem pouze jediného aminokyselinového zbytku, tj. VH 67.

F(ab)-8 byla konstruována záměnou lidského VL 55 zbytku Glu za myší Gly a rovněž podobnou substitucí na místě VL 57, a to Gly za Glu. V F(ab)-2 jsou použity lidské zbytky, kdežto F(ab)-8 je má na těchto pozicích zaměněné za zbytky myší. Jak může být snadno zjištěno z tabulky 3, záměny těchto zbytků neměly žádný dopad na vazbu k receptorů.

Tabulka 3

Zušlechtěné varianty MaEl 1

Varianta	Změny vzhledem k Ftab}^	Koncentrace pň 50% inhibiei (ng/ml) průměr, stodch,^	F(ab>X F(abF2	F(ab)-X Mae11
VL	VH
F(abFl	Leu 4 Met Arg 24 Lys Glu 55 Gly Gly 57 Glu	Va/24Ala //e 37 Val Thr 57 Ser MaGQAsn Val 63 Leu GtyGSAsn Phe 78 Leu	>100 000	M6.'ÓW	>560
F(ab>2	-	-	6083,1279	1.0	34
F(ab>3	Leu 4 Met Met 33 Leu	-	9439, 508	1.6	53
F(ab>4	Leu 4 Met	-	6770,349	1.1	3,8
F(ab)-5	-	Val 24 Ala	9387, 733	1.6	52
F(abý6	-	Phe 78 Leu	17 537,4372	2,9	24
F(ab>7	-	Ile 37 Val	8622,107	1Λ	48
F(ab>8	Glu 55 Gly Gly 57 Glu	-	5799, 523	1.0	32
F(ab>9	-	Ala 60 Asn Asp 61 Pro	1224,102	0,20	6,8
F(ab>10	Ala 13 Vol Val 49 Ala Val 58 Ile Leu 78 Val Val 104 Leu	Valte Met Na 49 Gly Ala 60 Asn Val Θ3 Leu Phe 67 Ile ile 69 Val Met 82 Leu Leu 82c Ala	842,130	0,14	4,7
F(ab)-11		Ala 60 Asn Asp 61 Pro Val 63 Leu Phe 87//e	416,66	0,07	23
F(ab)-12		Ala 60 Asn Asp 61 Pro Phe 67 Ile	501,84	0,08	2,8
Mae11	-	-	179,63	0,03	1.0

^(a) myší aminokyselinové zbytky jsou psány italikou; číslování zbytků podle Kabat a kol.

^(b) průměr a standardní odchylka ze třech pokusů s rozpustným receptorem ^(c) poměr F(ab)X/F(ab)-2 > 16 znamená, že tato varianta nevykazuje vazbu ani při nejvyšší použité koncentraci io

Varianty F(ab), u kterých bylo zjištěno, že mají vazebnou schopnost nejblíže k myší MaEll, jmenovitě F(ab}-2, F(ab)-9, F(ab)—10 a F(ab)-12 byly použity pro vytvoření molekul IgGl o plné délce. Vazba těchto molekul vzhledem k variantě F(ab)-2 nebo MaEll byla srovnatelná s vazbou, kterou vykazují fragmenty F(ab). Tyto výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Zušlechtěné varianty MaEll IgGl

varianta o plné délce	Koncentrace pň 50% inhibici (ng/mi) průměr, stand. odch.w	Varianta X lgG1-2®	Varianta X MaE11
lgG1~2	7569,1042	1,0	16,9
IgG 1-9	3493,1264	0,46	7,8
IgGMO	1118,172	0,15	2,5
lgG1-12	1449,226	0,19	3,2
MaE11	449,53	0,06	1,0

Vazba MaEl 1 na IgE, který je připojený k FceRI;

Myší MaEll zabraňuje vazbě volného IgE na FceRI na žímých buňkách, ale nespouští uvolňování histaminu vazbou na IgE, který je připojený k FceRI. Jak je ukázáno na obrázku 4, jak myší ic MaEl 1, tak zušlechtěné varianta 12 (IgG 1—12) a rovněž kontrolní protilátka negativního izotypu

MOPC21 a kontrolní zušlechtěné protilátka negativního izotypu 4D5 (Carter a kol., viz výše) se nevážou na IgE připojený k FceRI na buňkách CHO 3D10. Naopak myší protilátka MaEl, která se váže na IgE, ale nebrání vazbě IgE na FceRI, se váže k IgE připojenému k FceRI. Na rozdíl od toho, lidský kontrolní IgGl (zušlechtěný 4D5), myší izotyp IgGl (reprezentovaný MOPC21) vykazují nespecifické pozadí vazbou na přibližně 10 % těchto buněk. MaEl 1 nevykazuje barvení vyšší než kontrolní MOPC21 a zušlechtěná varianta 12 nevykazuje barvení vyšší než zušlechtěné kontrola 4D5 (obrázek 4).

Částečné určení (pomocí záměny alaninem) těch zbytků v CDR, které jsou důležité pro vazbu

IgE:

Sekvence CDR MaEll ukazují převahu nabitých zbytků (obrázek 1). CDR-L1 obsahuje tri zbytky Asp, zatímco CDR-L3 má His, Glu a Asp. CDR-H3 má tři zbytky His. Modely myší a zušlechtěné MaEll ukazuje prostorovou blízkost všech těchto nabitých zbytků (neukázáno). Naopak osamocený Asp 54 v CDR-H2 je prostorově oddělen od ostatních nabitých zbytků.

Každý z těchto nabitých zbytků byl pomocí místně cílené mutageneze (Kunkel, T. A. (1985), Proč. Nati. Acacž, Sci. USA 82: 488) zaměněn alaninem a vytvořeny tak varianty. V CDR-L1 změna jednoho ze tří Asp zbytků, Asp VL32b, účinně zrušila vazbu IgE [F(ab)-16; tabulka 5], zatímco záměna ostatních Asp zbytků měla minimální vliv [F(ab)-14; F(abý-15]. Podobná záměna Glu VL93 a Asp VL94 za alanin vCDR-L3 [F(ab)-17; tabulka 5], také snížila vazbu

IgE, ačkoli ne v takovém rozsahu, jako způsobila záměna na VL32b. Jednotlivé záměny tří zbytků His vCDR-H3 za Ala měly za výsledek slabě zdokonalenou vazebnou schopnost [F(ab)-21] nebo trojnásobné snížení vazby [F(ab)-20 & F(ab)-22]. Avšak současná změna všech tri zbytků His vazbu zrušilo [F(ab}-19]. Třebaže není snadno určitelné zda se nabité zbytky podílí na přímé vazbě na IgE nebo poskytují nějakou stabilitu prostorového uspořádání svým

CDR, varianty F(ab)—13 až F(ab)-22 ukazují, že CDR-L1 a CDR-H3 jsou důležitými určujícími faktory při vazbě IgE.

Tabulka 5

Zušlechtěné varianty MaEl 1 F(ab) CDR

Varianta	Změny vzhledem k F(ab)-2W	Koncentrace pří 50% inhibici (ng/ml) průměr, st.odch/b^	F(ab)-X F(ab)-2
VL	VH
F(ab)-2	-	***	6083,1279	1,0
F(ab)-13	Asp 30 Ala Asp 32 Ala Asp 32b Ala		>100 000	>16,0M
F(ab)14	Asp 30 Ala	—	3452,183	0,57
F(ab)-15	Asp 32 Ala	—	6384, 367	1,0
F(ab)-16	Asp 32b Ala	—	> 100 000	>16,0
F(ab)-17	Glu 93 Ala Asp 94 Ala	—	17456, 7115	2,9
F(ab)-18	—	Asp 54 Ala	2066,174	0,34
F(ab)-19		His 97 Ala His 100a Ala His 100c Ala	>100 000	>16,0
F(ab)-20	—	His 97 Ala	19427,8360	3,2
F(ab)-21	—	His 100a Ala	2713,174	0,45
F(ab)-22	—	His 100c Ala	15 846, 8128	2,6

^(a) myší aminokyselinové zbytky jsou psány italikou', číslování zbytků podle Kabat a kol.

^(b) průměr a standardní odchylka ze tří pokusů s rozpustným receptorem ^(c) poměr F(ab)X/F(ab)-2 > 16 znamená, že tato varianta nevykazuje vazbu ani při nejvyšší použité koncentraci io Souhrn a závěry

Tvorba funkčních, zušlechtěných myších protilátek proti IgE z MaEl 1 obsahuje záměnu několika zbytků z myší podpůrné oblasti do lidské podpůrné oblasti. Navíc mapování nabitých zbytků v CDR naznačuje, že některé z nich jsou důležité při interakci protilátka-IgE,

V souhlase s předchozími studiemi (Carter a kol., viz výše; Shearman, C. W. a kol., (1991), J. Immunol. 147: 4 366; Kettlenborough, C. A. a kol., Protein Eng. 4: 773; Tempest, P. R. (1991), Biotechnology 9: 266), varianty F(ab)—I až F(ab)-12 naznačují, že zbytky podpůrné oblasti mohou mít významný vliv na funkci protilátky. Toto se zvláště důrazně projeví, když vezmeme v úvahu F(ab)-1, která vznikla pouhou přímou záměnou CDR a v níž bylo transplantováno pouhých šest myších CDR za lidské zbytky v podpůrné oblasti. Možné vysvětlení pro to obsahuje CDR-H2. Zanořené hydrofobní zbytky na pozicích VH63 a VH67 mohou ovlivnit prostorové uspořádání CDR-H2. Byly vytvořeny varianty, obsahující na pozicích VH63 a VH67 čtyři kombinace, ij. myší Leu m Ile [MaEll a F(ab)-ll], Val a Phe [F(ab)~2], Leu a Phe [F(ab)-1] a Val a Ile [F(ab)-12]. Jasný závěr z vazebných údajů od těchto čtyř variant ukazuje, že důležitým zbytkem je VH67, který musí být myší Ile, aby poskytl afinitu srovnatelnou s myší MaEl 1. V F(ab)-1 je tímto zbytkem lidský Phe.

Z 12 zbytků v F(ab)-1, které byly ponechány jako lidské [porovnáno s F(ab)-2], osm bylo jednotlivě zaměněno v ostatních variantách za myší zbytky. Tři záměny neměly na vazbu vliv: VL4 [F(ab>4]; VL55 a VL 57 [F(ab)_8]. Dvě záměny zbytků: VH60 a VH 61 [F(ab)-9], vazbu vylepšily, zatímco tri vazbu snížily: VH24 [F(ab)-5]; VH37 [F(ab)-7] a VH78 [F(ab)-6].

Varianta F(ab)-10 byla vytvořena podle hypotézy navržené Padlanem (Padlan, E. A. (1991), Mol Immunol 28: 489), který předpokládal, že imunogenicita myší protilátky může být snížena změnou pouze exponovaných zbytků v podpůrné oblasti. V této variantě byla hydrofobní vnitřní io část jak VL tak VH domén, jinými slovy, varianta byla myší MaEl 1, v níž byly pouze exponované zbytky v podpůrných oblastech ve VL a VH zaměněny za lidskou sekvenci. Třebaže

F(ab)-10 vykazovala vazbu blízkou myší MaEll, změna v jedné aminokyselinové doméně, VH67 z lidské na myší, měla za následek stejné vylepšení vazby [F(ab)-12, IgG 1-12].

Zušlechtěná varianta, vykazující vazbu porovnatelnou smyší MaEll, která také vyžadovala nejméně změn, byla [F(ab)-12]. U této varianty bylo zaměněno pouze 5 lidských zbytků podpůrné oblasti za myší (VL4, VH24, VH37, VH67 a VH78. Čtyři z těchto zbytků byly určeny molekulárním modelováním. Pátý, VH67, a rovněž CDR-H2 zbytky VH60 a VH61, byly zahrnuty při použití molekulárních modelů ve snaze zdokonalit vazbu původní varianty F(ab)-2.

Příklad 3: Testování uvolňování histaminu

Úvod:

Jedná se o histaminový test na krysích žímých buňkách (RMCHA), který kvantitativně měří biologickou aktivitu rekombinantní, zušlechtěné, monoklonální protilátky proti IgE, a který je založen na schopnosti protilátky zabránit uvolnění histaminu buněk RBL 48, sensibilizovaných alergenem. Mimo to, toto testování se provádí za fyziologických podmínek podobných těm, které jsou v lidském těle. Buněčná linie RBL 48 byla odvozena z rodičovské linie krysích žímých buněk RBL 2H3, která byla následně transferována α-podjednotkou lidského vysoceafmního receptorů pro IgE (FceRI). Gilfillan A. M. a kol., J. Immunol 149(7): 2 445-2 451 (1992). Metody:

Buňky RBL 48 (Gilfillan A. M. a kok, J. Immunol. 149(7): 2 445-2 451 (1992)) jsou pěstovány v sIMDM, Dulbeccově médiu modifikovaném podle Iscova, doplněném 10 % fetálního telecího séra, 2mM glutaminem a 500 pg/ml aktivního geneticinu (Gibco, #860-1811) v láhvi pro tkáňové kultury T175 (Falcon, #3028) při teplotě 37 °C ve vlhkém 5% CO₂ v inkubátoru (Fischer, model #610). Buňky byly uvolněny působením 4 ml roztoku PBS/0,05% trypsin/0,53 mM EDTA po dobu 2 minut při teplotě 37 °C, následovala centrifugace (400 g, 10 minut) a resuspendování do Čerstvého sIMDM. Buňky v suspenzi byly spočteny pomocí hemocytometru (Reichert-Jung) ajejich hustota byla upravena na 0,4 χ 10⁶ buněk/ml. Buňky byly potom vysety v množství 100 μΙ/jamku (40 000 buněk na jamku) do vnitřních 60 jamek v 96jamkové destičce pro tkáňové kultivace se dnem ve tvaru „U“ (Linbro) a kultivovány po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C ve vlhkém 5 % CO₂ v inkubátoru. Po jednom promytí 200 μΙ/jamku sIMDM (pomocí odsátí), byly buňky preinkubovány po dobu 10 minut s 90 μΙ/jamku ředícího roztoku (sIMDM, 3 U/ml Na-heparin) s IgE specifickým proti alergenům ambrosie (RSIgE, 10 ng/ml, 23,48 ng/ml celkového IgE, 1,43% lidská plazma specifická pro alergeny ambrosie, North American Biological, šarže #42-365054).

so Po preinkubační periodě bylo k buňkám přidáno 10 μΙ/jamku buď protilátky proti IgE (zředěné ve ředícím roztoku, 0,06 až 39,4 pg/ml) nebo ředícího roztoku (pro zjištění celkově uvolněného histaminu, pozadí a kontroly alergenů ambrosie) a destička byla inkubována po dobu 24 hodin v5% CO₂ při teplotě 37°C v inkubátoru. Po inkubaci byly buňky odsáty a 3x promyty

200 μΙ/jamku sIMDM. Po promytí byly buňky inkubovány se 100 μΙ/jamku buď (1) 0,5% roztok tritonu (pro zjištění celkově uvolněného histaminu), (2) pufr pro uvolnění histaminu (HRB, 50% D₂O, 0,8% NaCI, 1,3 mM CaCl₂, sIMDM) nebo (3) antigen ambrosie (NIH #A-601-903A-l 85, 0,1 pg/ml v HRB) při teplotě 37 °C po dobu 30 minut a reakce byla ukončena umístěním na led.

(100% D₂O = 100% D₂0,0,8% NaCI, 1,3 mM CaCl₂).

Destička byla centrifugována po dobu 5 minut při 900 g (2 400 rpm) při teplotě 4 °C a supematanty byly odebrány a zředěny 1/80 v PBS (1/1000 v PBS pro kontrolní zjištění celkově uvolněného histaminu) pro určení histaminu pomocí soupravy Hístamine Enzyme Immunoassay io (Immunotech #1153). Supematanty (100 μΙ/jamku) byly přeneseny do acylačních zkumavek, obsahujících acylační prášek (součást soupravy) a reagovaly s 50 μΐ acylačního pufru (součást soupravy) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Acylovaný histamin (50 μΙ/jamku) byl potom přenesen na konjugační destičku (součást soupravy) a inkubován s 200 μΙ/jamku konjugátu histamin-acetylcholinesteráza (součást soupravy) po dobu 18 hodin při teplotě 4 °C.

Po této inkubaci byly jamky vysáty a 4krát opláchnuty promývacím pufrem 300 μΙ/jamku, aby se odstranil nenavázaný konjugát (Immunotech kit, #1153). Poté byl přidán chromatogenní substrát (acetylthiocholin, dithionitrobenzoát, 200 μΙ/jamku, součást soupravy) a inkubováno v temnotě při teplotě místností po dobu 30 minut. Reakce byla ukončena přidáním stop roztoku (50 μΙ/jamku, součást soupravy) a byla změřena absorbance při 405 nm s referencí při 620 nm na odeěítacím přístroji pro destičky SLT 340 ATTC. Intenzita absorbance je nepřímo úměrná koncentraci histaminu (vyjádřena v nm), která je určena z histaminové standardní křivky (ze soupravy Enzyme Immunoassay kit, AMAC). Procento z celkového uvolnění histaminu bylo spočteno z údajů o koncentraci histaminu a procento inhibiee bylo spočteno jako 100%25 celkové uvolnění histaminu. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 5.

Souhrn a závěry

Graf molámího poměru anti-IgE proti procentu inhibiee uvolňování histaminu, indukovaného alergeny ambrosie naznačuje, že F(ab) forma protilátky e26 má lepší vlastnosti pří alergeny ambrosie indukovaném uvolňování histaminu, než F(ab) forma protilátky e25. E26 inhibuje alergeny ambrosie indukované uvolňování histaminu způsobem, který je závislý na dávce, přičemž polovina maximální inhibiee je dosažena při molámím poměru 44:1 (anti-IgE;RSIgE). Naproti tomu e25 inhibuje alergeny ambrosie indukované uvolňování histaminu při velmi vysokém molámím poměru (mezi 200:1 až 1 550:1 anti-IgE:RSlgE). Molární poměr, při kterém je dosažena polovina maximální inhibiee pro křivku e25, může být stanoven mezi 400:1 až 500:1. Proto na základě údajů o molámím poměru, při kterém je dosažena polovina maximální inhibiee, což je míra vazebné afinity molekuly, lze říci, že molekula e26 se váže na RSIgE přibližně lOx lépe než molekula e25.

Příklad 4: Prezentace na fágové částici Úvod:

Tento příklad popisuje specifické anti-IgE protilátky se zdokonalenou afinitou, vytvářené pomocí prezentace na fágové částicí a výběru monovalentních fragmentů F(ab), odvozených ze zušlechtěné anti-IgE protilátky E25 (Přesta a kol., J, Immunol. 151: 2 623 (1993).

Metody:

1. Konstrukce fágových knihoven monovalentních F(ab)

Bylo konstruováno několik F(ab) knihoven. Jako výchozí vektor byla varianta e25, obsahující VL substituci D32E (kvůli eliminaci IsoAsp izomerizace), fúzována k C~koncové doméně bakteriofága M13g3p pomocí známých technik, viz například Bass a kol., Proteins 8: 309 (1990).

Tento plazmid, který byl znám jako p426 je uveden na obrázku 10. Zaprvé „standardní typ“ F(ab)-fága, p426 byl použít jako matrice pro konstrukci pro knihovnu specifických „stop“ matric. Zavedením stop kodonů (TAA nebo TG A) se původní molekula stane neaktivní, čímž je sníženo pozadí a specifické hybrídizace matrice v jednotlivých krocích mutageneze při konstrukci knihovny (Lowman & Wells, Methods: Comp. Methods Enzymoí 204: 125 (1991). Matrice byly konstruovány pomocí řízené mutageneze na jednovláknové matrici (Kunkel a kol,, Methods Enzymoí 204: 125 (1991)) za použití oligonukleotidů, uvedených v tabulce 10.

Poté byly tyto stop-matrice použity ve druhém kole mutageneze, kdy byly použity oligonukleoio tidy, uvedené v tabulce 11, pro vytvoření knihoven pro každou z označených oblasti CDR.

Degenerované kodony NNS byly použity k získání všech 20 aminokyselin v každé z označených oblastí CDR. (Nukleotidové báze jsou označovány pomocí jednopísmenné nomenklatury IUPAC; N = A, G, C nebo T; s - G nebo C). Degenerované kodony NNS byly použity k získání všech 20 aminokyselin na každé náhodné pozici, za použití 32 různých možných kodonů. Stop kodon amber (TAG) kóduje ve zde použitém supresorovém systému Gin; tj. supE supresorový kmen XL-1 Bíue; Bullock a kol., Biotechniques 5: 376 (1987). Přítomnost kodonů amber mezi doménou těžkého řetězce protilátky a g3p doménou fága umožňuje expresi na fágu prezentovaného fůzního proteinu pouze v amber supresorových kmenech E. coli, zatímco rozpustné proteiny F(ab) mohou být získány pomocí téhož konstruktu v nesupresorových kmenech E. coli. (Lowman a kol., Biochemistry 30: 10 832 (1991); Lowman a Wells, Methods Comp. Methods. Enzymoí 3: 205 (1991); Hoogenboom a kol., Nucleic Acids Res. 19: 4 133 (1991). Avšak i jiné stop kodony pro použití v jiných E.coli fágových expresních systémech jsou zřejmé osobám s běžnou zkušeností v tomto oboru.

Produkty náhodné mutagenizační reakce byly transformovány do buněk E. coli (Stratagene, XL-1 Blue) pomocí elektroporace a pomnoženy během růstu přes noc při teplotě 37 °C v přítomnosti pomocného fága M13K07 (Vierra a Messing, Methods Enzymoí 153: (1987)).

Tabulka 10

Oligonukleotidy se stop kodony pro první kolo mutageneze

Sekvence úfigonukleotfdu č.	Oblast	Sekvence
HL-208	VL1	ACC TGC CGT GCC ΑΘΤ TAA TAA GTC TAA TAA GAA GGŤ GATAGCTAC
HL-209	VH3	GCC AGT CAG AGC GTC TAA TAA TAA GGT TGA AGC TACCTGAACTGGT
HL-210	VH3	TGT GCT CGA GGC AGC TAA TAA TAA GGT TAA TGG TAA TTCGCCGTGTGGGG
HL-220	VL2	G AAA CTA CTG ATT TAC TAA TAA TAA TAA CTG GAG TCTGGAGTC
HL-221	VL3	CT TAT TAC TGT CAG CAA AGT TAA TAA TAA CCG TAA ACATTTGGACAGGGT
HL-222	VH1	G TOC TGT GCA GTT TCT TAA TAA TAA TAA TAA TCC GGA TAC AGC TGG
HL-223	VH1	GCC TAC TCC ATC ACC TAA TAA TAA AGC TGA AAC TGG ATCCGTCAG
HL-224	VH2	GG GTT GCA TCG ATT TAA TAA TAA GGA TAA ACT TAA TATAACCCTAGCCTC
HL-225	VLt	AAG CCG GTC GAC AGG TAA TAA GAT TAA TAC TAA AAC TGG TAT CAA CAG

Tabulka 11

Pro knihovnu specifické degenerované oligonukleotidy pro druhé kolo mutageneze

Sekvence oligonuWeotidu č.	Oblast	Sekvence
HL-212	VL1	ACC TGC CGT GCC AGT NNS NNS GTC NNS NNS GAA GGTGATAGCTAC
HL-213	VH3	GCC AGT CAG AGC GTC NNS NNS NNS GGT NNS AGC TACCTGAACTGG
HL-214	VH3	TGT GCT CGA GGC AGC NNS NNS NNS GGT NNS ŤGG NNS TTC GCC GTG TGG GG
HL-231	VL2	G AAA CTA ČTG ATT ŤAC NNS NNS NNS NNS CTG GAG TCTGGAGTC
HL-232	VL3	CT TAT TAC TGT CAG CAA AGT NNS NNS NNS CCG NNS ACA ΤΓΤ GGA CAG GGT ACC
HL-233	VH1	G TCC TGT GCA GTT TCT NNS NNS NNS NNS NNS TCC GGA TAC AGC TGG
HL-234	VH1	GTT TCT GGC TAC TCC ATC ACC NNS NNS NNS AGC NNS AACTGGATCCGTCAG
HL-235	VH1	GG GTT GCA TCG ATT NNS NNS NNS GGA NNS ACT NNS TAT AAC CCT AGC GTC AAG
HL-236	VL1	AAGCCG GTCGAC AGGNNS NNSGAT NNSTAC NNS AAC TGG TAT CAA CAG

II. Selekce fágů pomocí vazby

Pro afinitní selekci fágových částic, prezentujících varianty F(ab), byly fágy připraveny ze supernatantů kultur E. coli pomocí precipitace směsí chlorid sodný-polyethy lenglykol (NaCl/PEG). io Fágy byly suspendovány v pufru PBS, poté zředěny koňským sérem (katalogové č. A-3311-D,

Hyclone, Logan UT), obsahujícím 0,05% Tween-20, jako kontrola byly rovněž připraveny neprezentující fágy. Jako pozitivní kontrola byl „standardní typ“ fága e426 F(ab) smíchán s neprezentujícím fágem a podrobeny selekci.

Na plastových destičkách s 96 jamkami Maxisorb (Nunc) byl zakotven 2 pg/ml IgE (lidský IgE;

Genentech šarže #9957-36) v 50 mM pufru uhličitanu sodného, pH 9,6, přes noc při teplotě 4 °C.

Potom byl roztok IgE odstraněn a destičky byly inkubovány s blokujícím roztokem koňského séra (bez Tween™-20) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti.

Blokující roztok byl odstraněn a na destičkách byl inkubován roztok fága po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pak byl roztok fága odstraněn a destičky byly 1 Okřát promyty pufrem PBS/Tween™-20 (0,05%). Jamky byly naplněny PBS/Tween, ponechány inkubovat dalších 10 minut a poté byly destičky znovu 1 Okřát promyty.

Fágy s F(ab), které zůstaly navázané na destičku, byly vymyty pomocí 20 mM HCI, neutralizované Tris-HCl, Ph 8 a pomnoženy v přítomnosti pomocného tága, jak bylo popsáno výše. Vzorek fága byl sériově naředěn, smíchán s čerstvými buňkami XL-1 Blue, vyset na vhodné plotny s antibiotiky a spočten počet CFU (colony-forming unit, jednotek vytvářejících kolonie) fága prezentujícího F(ab) (rezistentní ke karbenícilinu; CFUa) nebo fága neprezentujícího F(ab) (rezistentní ke chloramfenikolu; CFUc). Obohacení (Emut) fága prezentujícího F(ab) oproti fágu neprezentujícímu F(ab) v každém kole čištění bylo spočteno jako (CFUa/CFUc) pro eluát a děleno (CFUa/CFUc) pro výchozí materiál. Obohacení pro kontrolního fága standardního typu (Ewt) bylo spočteno stejným způsobem.

Následující kola afinitních selekcí byla provedena jak je výše popsáno, kromě toho, že inkubační doba, následující po prvních lOpromytích, se v každém kole prodlužovala. Aby bylo možno porovnat efektivitu selekce fága kolo po kole při zvyšující se přísnosti podmínek, faktor obohacení, spočtený pro každé kolo, byl normalizován k faktoru obohacení kontrolního standardního typu fága. Poměr obohacení každé frakce vzhledem k standardnímu typu (Emut/Ewt) je ukázán na obrázku 6. Protože při rovnováze by měla být k IgE na destičce vázána větší frakce vysoceafinních variant než nízkoafinních variant, vysoceafinní varianty by měly být získávány účinněji a proto ukazovat větší relativní obohaceni. Opravdu knihovny VL1 ukazovaly postupně se zlepšující relativní obohacení, až asi 1 Okřát vyšší relativní obohacení než standardní typ po 5 až ío 6 selekcích. Podle tohoto způsobu měření ukázaly knihovny VL1 větší vylepšení v afinitě než standardní typ, který vytvořil knihovny VH3. Rozdílnost výsledků mezi dvěma soubory CDR knihoven může odrážet větší energetický příspěvek VL1 na vazbu antigenu. Jinou možností je, že VH3 CDR ze25 může být více optimalizována pro vazbu klgE než VL1 CDR, což tedy dovoluje větší relativní zdokonalování vazebných interakci VL1, toto zdokonalování se realizuje is záměnami postranních řetězců.

Sekvenování DNA ukázalo, že většina variant F(ab)-fága z první VL CDR1 knihovny (na pozicích 27, 28, 39 a 31 byly vygenerovány náhodné kombinace aminokyselin) měla konzervovaný zbytek D30 standardního typu a přednostně mutovaný Y31G (tabulka 15, kde klony z kola 3 jsou označeny 212-3.X a klony z kola 6 jsou označeny 212-6.x). Ačkoli byly pozorovány různé záměny na pozicích Q27 a S28, po 6. kole selekce převládal ve fágovém materiálu jeden klon, který obsahoval Q27K. a S28P. Tento klon též obsahoval výhodné zbytky D30 a G31, což naznačuje, že tato kombinace postranních řetězců může být optimální pro vazbu k IgE.

Ve druhé VL CDR1 knihovně (na pozicích 30, 31, 32 a 34 byly vygenerovány náhodné kombinace aminokyselin) většina selektovaných variant si zachovávala standardní typ zbytků D30 a E22; a mezi sekvenovanými klony byl pozorován pouze standardní typ D34. V této knihovně bylo pozorováno množství různých zbytků na pozici Y31. Dále byly ve dvou klonech, 213-6.7 a 213-6.8, pozorovány nepravé mutace G33S (tabulka 15).

Sekvenační analýza klonů z knihovny VH CDR3 po třech kolech selekce ukázala, že knihovna v podstatě konvergovala do jednoho klonu, tj. 214-3.1, který má standardní typ zbytků na pozicích 101 až 103 a substituce H105T a H107Y (tabulka 15).

IV. Fágové ELISA testy selektovaných F(ab) klonů

Aby bylo možno vyhodnotit selekci fágu pomocí vazby, fág byl transfekován do buněk E. coli XL-1 Blue a pomnožován v tekuté kultuře nebo byl vyset na plotny, obsahující antibiotikum. Klony byly z těchto ploten náhodně vypíchnuty pro sekvenování a vazebnou analýzu pomocí kompetitivního fágového ELISA testu. (Cunninghem a kol., EMBO J. 2 508 (1994); Lowman, kapitola 24, v Methods in Molecular Biology, sv. 87, S. Cabilly (vyd.), Humana Press Inc., Ottawa, NJ (1997).

Aby bylo možno vyhodnotit relativní afinity IgE vazeb, fág byl titrován na destičce se zakotve45 ným IgE, jak bylo popsáno výše, aby bylo možno normalizovat koncentrace prezentovaných F(ab). Fág byl předem smíchán se sériovými ředěními IgE, přidán na destičku se zakotveným IgE a inkubován po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Destičky byly potom 1 Okřát promyty s PBS/Tween a byl přidán roztok králičí protilátky proti fágu smíchané s kozím, protikráliČím konjugátem s křenovou peroxidázou. Po hodinové inkubaci při teplotě místnosti byly destičky vybarveny pomocí chromogenního substrátu o-fenylendiaminu (Sigma). Reakce byla zastavena přidáním 1/2 objemu 2,5 M H₂SO₄. Na spektrofotometru pro odečítání destiček byla měřena optická hustota při 490 nm. Pro každou variantu byla určena IC50 pomocí 4-parametrické křivky pro každý soubor údajů (Lowman, Methods in Molecular Biology, sv. 87, S. Cabilly (vyd.), Humana Press Inc., Totawa, NJ (1997). Relativní vazebná afinita každé klonované fágové varianty byla určena jako poměr její IC50 k IC50 výchozího fága, e426 (tabulky 15 a 16).

V některých případech byly z daných kol selekce testovány hromadně směsi fágů, aby byla získána hodnota průměrné relativní afinity populace [IC5O(wt)/IC50(mutanty)] pro IgE. Například knihovna VL CDR1, zbytky 32, 33, 35 & 37 ukazovaly pouze 3,6násobné vylepšení afinity oproti e426 po pěti kolech selekce, i když rodičovská varianta této knihovny (e26) se zdála mít 25násobné vylepšení afinity. Proto s knihovnou VL-CDR1 těchto určitých zbytků nebylo dále pokračováno. Na druhé straně směs fágů z knihovny VH CDR2 ukázala 6,2násobné vylepšení afinity oproti jejímu rodičovskému fágu e426.

io Fágové knihovny byly také vytvořeny pro CDR domény VL CDR2, zbytky 54 až 57 a VL CDR3, zbytky 96 až 98, 99 & 100. Avšak substituce aminokyselin na těchto pozicích nevykazovaly jakékoli vylepšení oproti e426. Fágové knihovny vytvořené pro VH CDR1, zbytky 26 až 30 také nevykazovaly jakékoli vylepšení oproti e26 a bylo zjištěno, že v nich převládl kontaminující fág e26. To naznačuje, že v počátečních knihovnách nebyly přítomné žádné varianty s vyšší afinitou nežmáe26.

Fágové knihovny CDR domén VLCDR1, zbytky 27, 28, 30, 31, 32, 34 a rovněž VHCDR1, zbytky 101, 102, 103, 105 & 107 jsou uvedeny v tabulce 15, zatímco VHCDR2 je uvedena v tabulce 16. V tabulkách 15 a 16 nebylo dále pracováno s knihovnami klonů, které nevykazovaly afinitu zřetelně vyšší než e26 a faktor zdokonalení vazby u nich nebyl dále určován.

Tabulka 15

Klony fágů s F(ab) po selekci vazbou na IgE

fágový klon	VLCDR1 zbytky	VHCDR3 zbytky	vylepšení vazebné schopnosti (tógový ELISA test)
27	28	30	31	32	34	101	102	103	105	107
©426	Q	S	D	Y	E	D	H	Y	F	H	H	-1-
212-3.1 <x2)	M	R	Y	G	-	-	-		-	-	-	netestováno
212-3.2	A	Y	N	G								3,3x
212-3,3	G	G	Y	G	—	—	—	—	-	-	-	-6.SW—
212-3.5	M	G	E	A	«	—	—	—	-	-	-	netestováno
212-0.1	E	Q	D	V		—	—	—		-	-	23x
212-6.2	E	R	E	s		—	—	-	-	-	-	netestováno
212-6.4	E	H	D	w	—		—	—	—	-		23x
212-6,5	S	N	S	G								netestováno
212-6.6	K	E	D	S	—	—	—	-	—	-	-	netestováno
212-6,7 (X8) (©26)	K	P	D	G	-	-	-	-	-	-	-	25x
212-6.15	R	P	0	T			—	—	-	-	-	netestováno
212-616	R	s	D	G								netestováno
212-6.17	V	T	H	S	—	—	-	-	-	-	-	netestováno
213-3.1			D	D	C	D	—	—	-	-	-	netestováno
213-3.2			H	0	S	0	—	—	-		-	netestováno
213-3.3			D	w	Q	0	—	—	-	-	-	8,8x
213-3.4		—	G	D	H	D	—	—		-	-	3,7x
213-6.1	—	_	E	R	W	D	—	—	—	-	-
213-6.3 <x2)	-	-	0	T	E	D	-	-	-		-	14x
213-6.4		T—	D	w	E	D	—	-	-	-	-	20x
213-6.7 G33S	-	-	H	N	E	0	-	—	-	-	-	netestováno
213-6.8 G33S	-	—	Y	S	N	D	-	—	-	-	-	14X
213-6.9			W	G	E	D	—	-	-	-	-	netestováno
213-6.11		—	Y	S	E	D	-	—	-	-	-	netestováno
213-6.12			E	R	D	D	—	—	-	-	-	netestováno
213-6,13			H	E	E	D	—	-	-	-	-	netestováno
213-6,14			D	K	K	o-	—	-	-	-	-	netestováno
213-6.15		—	D	R	Q	D		—	-			15X
214-3.1 (xS)	-	-		-	-	-	H	Y	F	T	Y	2,7x
21445.6	—	-		-	-	-	H	Y	F	s	R	netestováno

Tabulka 16

Klony fágů VH CDR2

fágový klon	VHCDR2 zbytky	vylepšení vazebná schopnoetí (fágový ELISA test)
53	54	55	57	59
©426	T	Y	D	S	N	-1-
235-5.1	K	Y	S	E	K	netestováno*
235-5.2	K	W	H	E	M	netestováno*
235-6.3	K	W	W	E	A	netestováno*
23M.4	H	Y	A	R	K	netestováno*
23M.5	K	Y	H	G	A	netestováno*

* Poznámka: Průměrná relativní fágová afinita byla stanovena jako 6,2násobné vylepšení oproti e426

V. Kombinované mutace nalezené během hromadných prohledávání io Vlivy mutací na různých místech v proteinu se často sčítají ve svém vlivu na určitou funkci proteinu (Wells, Biochemistry 29: 8 509 (1990). Proto bylo několik mutací z počátečních, výše popsaných fágových knihoven spojeno, aby se dosáhlo zdokonalení vazby na IgE.

Aby byla snížena pravděpodobnost zvýšení imunogenicity anti-IgE protilátek musí být minima15 lizován rozsah mutačních odchylek od E-25. Výsledkem bylo, že byly použity pouze mutace z těch fágových variant, které ukázaly největší vylepšení afinity, když byly jednotlivě testovány. Navíc frekvence, s níž byl daný fágový klon pozorován, může být úměrná úrovni exprese anebo proteolytícké stabilitě (Lowman & Wells, 1991, viz výše). Byl vybrán určitý klon z knihovny VL1, 212-6.1 - přejmenovaný e26, protože vykazoval ve fágových ELISA testech 25x zvýšenou afinitu oproti e426 (tabulka 17).

Knihovna VH CDR2 také ukazovala vylepšení afinity oproti e426, ačkoli u tohoto vylepšení byla naměřena hodnota pouze 6,2x a to pro spojenou populaci fágů. Spojená populace fágů ukázala vylepšení vazebné afinity, přinejmenším pro některé členy této populace, bez toho, že by bylo nutno měřit afinitu všech jednotlivých členů. Použití spojených fágů také umožňuje určit, jakého zvýšení afinity bylo dosaženo po daném kole a zda se má v afinitní selekci pokračovat či nikoli (tj, když jednou afinita spojené populace fágů dosáhla maximum, je nepravděpodobné, že následující kola přispějí k dalšímu obohacení). Jako takové, je použití údajů o afinitě spojené populace fágů vysoce užitečným nástrojem při prohledávání.

Bylo zřejmé, že mutace v oblasti VH CDR2 může fungovat aditivně s mutacemi v VLCDR1, neboť smyčka VH CDR2 je vzdálená od smyčky VL CDR1 jak v krystalové struktuře, tak i na molekulových modelech. Avšak protože některé kombinace těchto mutant by mohly být nicméně neslučitelné, byly testovány čtyři různé kombinace mutant: e26 v kombinaci s mutacemi, nachá35 zejícími se v klonech 235-5.1, 235-5.2, 235-5,3 a 235-5.4 (tabulka 17). Tyto konstrukty byly připraveny pomocí mutageneze podle Kunkela (Kunkel a kol., Methods Enzymol. 204; 125 (1991)), pomocí e26 F(ab) fága jako matrice a s mutačními oligonukleotidy, kódujícími mutace ve VH2.

CZ 300724 Bó

Fágové ELISA testy (Lowman, Methods in Moleeular Biology, sv. 87, vyd, Cabilly, Humana Press lne., Totawa, NJ (1991)) byly použity pro porovnání výsledných variant kombinací mutaci VLCDR1 ve26 s mutacemi VHCDR2, nacházejícími se v klonech 235-5.1, 235-5,2, 235-5.3 a 235-5.4. Byly též připraveny rozpustné proteiny F(ab) a porovnány na testovací destičce s biotinylovaným IgE, výsledek je ukázán níže v tabulce 17 a na obrázku 7.

Tabulka 17

F(ab) fragment	lC50(nm)	relativní afinita (násobek zlepšení)
e426	1,5	-1-
e26	0,17	8.9
927 (©26 + 235-5.1)	0,040	36
©695 (©26 * 235-5.2)	0,050	31
θ696(β26 +235-5.3)	0,063	24
e697 (©26 + 235-5.4)	0,066	23

VI. Test na biotinylované destičce (kompetiční test chiméry FceRI-IgE)

Úvod: Účelem tohoto příkladu je porovnat, jak odlišné anti-IgE F(ab) kompetují s mobilizovanou, vysoceafinní chimérou IgE reeeptorů s IgG o vazbu k biotinylovanému lidskému IgE v roztoku, když anti-IgE F(ab) a biotinylované IgE jsou přidány současně na destičku, se zakotvenou chimérou reeeptorů IgE. Jak se zvyšuje koncentrace anti-IgE F(ab), tak se snižuje množství biotinylovaného IgE, které se může vázat k reeeptorů na destičce, což má za následek snížení hodnoty optické hustoty, měřené pomocí spektrofotometru.

Na destičkách Nunc maxisorb (katalogové číslo F96) byl zakotven FceRI-IgG v množství lOOng/jamku (Haak-Frendsho a kol, J. Immunol. 151: 352 (1993), (Genentech, šarže #2148-74 (6,4 mg/ml)) po rozplnění po 100 μΐ zásobního roztoku 1 pg/ml v50nm pufru uhličitanu sodného (pH9,6) po dobu 24 hodin pri teplotě 4°C. Destičky byly 3x promyty promývacím pufrem ELISA (0,05% polysorbate 20 (Sigma) v PBS (PH 7,4)) a blokovány pomocí 200 μΐ testovacího pufru ELISA (fyziologický roztok pufrovaný Tris, pH 4,45 s 0,5% hovězím sérovým albuminem v čistotě pro RIA test, Sigma; 0,05% polysorbate 20 a 4mM EDTA) po dobu 60 minut. Po třech promytích promývacím pufrem bylo na ELISA destičku přidáno ve třech paralelách 100 μΐ sériových dvojnásobných ředění anti-IgE F(ab) v testovacím pufru, přičemž počáteční koncentrace byla 200nM. Ředění byla provedena multikanálovou pipetou Titertek*.

Pak byl do všech jamek přidán biotinylovaný IgE v testovacím pufru (100 μΐ, 1/500 ředění zásobního roztoku 0,5 mg/ml) a směs byla inkubována na třepačce (Bellco) po dobu 60 minut pri teplotě 25 °C. IgE byl čištěn afinitní purifíkaci ze supernatantu kultury myelomu U266B1 (ATCCTIB196) a biotinylován pomocí biocytin hydrazinu (0'Shannessya kol., Immunol. Lett. 8: 273 (1984); Pierce Chemical). Vzorky byly 5x promyty promývacím pufrem a vázaný

IgE byl detekován pomocí 100 μΐ streptavidinu kojugovaného s peroxidázou (Zymed) v ředění 1:3000 po dobu 90 minut. Vzorky byly poté znovu 6x promyty promývacím pufrem a následovalo přidání 100 μΐ roztoku substrátu (400 μΙ/ml o-fenylendiamín dihydrochloridu a 4 mM H₂O₂ v PBS) a inkubováno 6 minut. Reakce byla zastavena přidáním 4,5M H₂SO₄ (100 μΐ) a byla změřena absorbance pri 490 nm na čtecím zařízení pro destičky LJvmax (Molecular Devices). Absorbanee při různých koncentracích F(ab) e25, e26 a e27 F(ab) protilátkových fragmentů je vynesena na obrázku 8.

Závěry; Vynesené údaje na obrázku 8 naznačují, že jak E26 tak i E27 mají větší afinitu než E25 pro vysoceafinní receptor a E27 vykázala afinitu nejvyšší.

VII. BIAcore testy rozpustných F(ab) proteinů.

Afinity vazby k receptoru pro několik fragmentů F(ab) byly spočteny (Kotas & Johnson, J. Chem. Soc. Commun. 21: 1526-1 528 1(1990)) z asociačních a disociačních rychlostních konstant, měřených pomocí systému povrchové rezonance BIAcoreTM-2000 (BlAcoreTM-2000 surface plasmon resonance systém) (BIAcore, Inc.). Biosenzorický čip byl aktivován kovalentním navázáním IgE pomocí N-ethy]-N'-(3~dirnethylarninopropyl)-karbodíimid hydroehloridu (EDC) a N-hydroxysuccinimidu (NHS) podle návodu výrobce (BIAcore). IgE byl zředěn v 10 nM pufru oetanu sodného (pH4,5) a dále naředěn na koncentraci přibližně 30 pg/ml a injikován na Čip, až byl získán signál 800 až 1 200 jednotek odezvy (RU - response unit) od (mobilizovaného materiálu. Protože signál, vyjádřený v RU je úměrný hmotností imobilizovaného materiálu, představuje rozsah hustot imobilizovaného IgE na matrici asi 0,4 až 6,5 pmol/cm². Nakonec byl jako blokující činidlo injikován 1 M ethanolamin. Regenerace byla provedena pomocí 4,5 M MgCl₂.

Pro kinetická měření bylo injikováno na IgE čip l,5násobná sériová ředění fragmentů F(ab) v pufru PBS/Tween (0,05% Tween-20 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem) při teplotě 25 °C a průtokové rychlosti 20 μΙ/min. [obrázek 9].

Disociační hodnoty byly upraveny pro „one-site“ model, aby byla získána kord+/-s.d. (standardní odchylka měření). Pro každou asociační křivku byla spočítána rychlostní konstanta pseudoprvého řádu (ks) a vynesena jako funkce koncentrace proteinu, aby byla získána kon +/s.e. (standardní chyba přiblížení). Rovnovážné disociační konstanty pro vazbu Fab:IgE, Kd, byly spočítány z měření SPR jako kord/kon. Pokud nenastanou v průběhu pokusů artefakty, jako je například opakované vázání disociovaných F(ab), pozorovaná off-rychlost (off-rate) je nezávislá na koncentraci F(ab). Tedy, protože je rovnovážná disociační konstanta Kd nepřímo úměrná koff, odhad zlepšení afinity lze udělat za předpokladu, že asociační rychlost (kon) je konstantní pro všechny varianty. Off-rychlosti (off-rates) spolu s vypočteným poločasem disocíace, jsou uvedeny v tabulce 18.

Tabulka 18

Kinetické konstanty disocíace

F(ab)	K«x 1 θ'* (sec’)	t«>(min)	zlepšení (násobek)
625	22 ±4	5,3	-1-
e26	3,6 ± 0,2	41	7.7
e27 (e26 + 235-5.1)	0,98	118	22
e695 (e26 + 235-5.2)	0,94	122	23
e696(e26 + 235-5 3)	1.4	83	16
e697 (e26 + 235-5.4)	1,5	77	15

VIII. Exprese a Čištění F(ab)

Anti-IgE F(ab) E-25 (Presta a kol., J Immunol. 151: 2 623-2 632 (1993)) a varianty ve fágemidech, odvozených zp426 (obrázek 10) byly exprimovány v E. coli, kmen 34B8. Kultury vypíchaně párátkem (10 mí) do média 2YT s 50 pg/ml karbenicilinu, byly inkubovány po dobu 8 hodin při teplotě 37 °C a potom přeneseny do 1 litru modifikovaného média AP-S, obsahujícího 50 pg/ml karbenicilinu a inkubovány po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C. Kultury byly centrifugovány v 500 ml lahvích při 7 000 ot./min. po dobu 15 minut při teplotě 4 °C. Sediment byl zmražen alespoň 3 hodiny při -20 °C. Sediment v každých 500 ml kultury byl pri 4 °C io resuspendován do 12,5 ml chladné 25% sacharózy v50mM Tris pH8,0, obsahujícím 1 mM benzamidin (Sigma). Suspenze byla rozpuštěna pomocí míchání při teplotě 4 °C po dobu 3 hodin. Suspenze byla centrifugována pri 18 000 ot./min. po dobu 15 minut pri teplotě 4 °C a fragmenty F(ab), exprimované v supernatantu, byly čištěny pomocí afinitní chromatografie na proteinu G (Pharmacia). Sloupec byl promyt roztokem 10 mM Tris (pH 7,6) a 1 mM EDTA (pH 8,0) a F(ab) byly ze sloupce vymyty 2,5násobkem objemu sloupce 100 mM kyseliny octové (pH 3,0) a pH bylo okamžitě navráceno na neutrální pH pomocí polovičního objemu l M Tris pH 8,0. Eluáty byly koncentrovány a pufr byl vyměněn za PBS pomocí mikrokoncentrátorů centricon30 (Amicon). Koncentrace proteinu byla určena pomocí absorbance při 280 nm na spektrofotometru (Beckman DU 64) a čistota vzorku byla hodnocena pomocí gelu 4 až 20% SDS PAGE (Novex) za redukujících podmínek s 5% (β-merkaptoethanolem.

IX. Výsledky a závěry

Výsledky kompetičních pokusů, provedených fágovýtn ELISA testem ukazují, že zatímco e26

F(ab)-fág měl oproti e426 9krát zvýšenou afinitu, kombinace variant e695, e696 a e697 ji měly 20 až 40krát zvýšenou oproti fágu c426. Další kombinace mutací z odvozených fágů mohou dát vznik variantám protilátek s podobně vylepšenými afinitami.

Když byly testovány rozpustné proteiny F (ab) pomocí testu na destičce s bíotinylovaným IgE, e26 F(ab) a e27 F(ab) byly, pokud se týká inhibice vazby IgE na FceRI-IgE, 1 Okřát a 30krát lepší oproti e25. Určení off-rychlosti (off-rate) pomocí BIAcore analýzy je ve shodě s těmito relativními afinitami. Zvláště e26 a e27 vykázaly 7,7krát a 22krát nižší off-rychlosti (off-rates) než e25. Delší poločasy dovozují, že IgE je „obsazeno“ neboje způsobeno, zeje neschopné po dlouhou dobu vazby k vysoceafinnímu receptoru a to má za následek zvýšenou léčebnou anti-IgE schopnost.

Tedy jak rovnovážné i kinetické vazebné údaje podporují závěr, že e26 a e27 F(ab) se vážou na IgE 1 Okřát a 3Okřát pevněji, než e25. Očekává se, že protilátky o plné délce molekuly (IgG), obsahující odpovídající mutace F(ab), budou vykazovat podobné relativní afinity vzhledem k e25

IgG.

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález se týká způsobu úpravy afinity polypeptidu k cílové molekule tím, že jsou nahrazeny zbytky asparagové kyseliny, které jsou náchylné k izomerizaci, alternativními aminokyselinovými zbytky. Pomocí hromadného testování jsou selektovány výsledné mutace s vylepšenou afinitou k cílové molekule. Postup popsaný ve vynálezu lze použít pro přípravu protilátek proti IgE, které mají zvýšenou afinitu k IgE.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Genentech, lne.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Vylepšené anti-IgE protilátky a způsob zdokonalení póly peptidů io (iii) POČET SEKVENCÍ: 26 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADDRESA: Genentechjnc.

(B) ULICE: 1 DNA Way is (C) MĚSTO: Jižní San Francisko (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 94080 (v) POČÍTAČOVÉ VYBAVENÍ:

(A) TYP MÉDIA: 3.5 palcová disketa, 1.44 Mb (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WinPatin (Genentech) (vi) ÚDAJE O PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: PTCZUS98Z13410 (B) DATUM PODÁNÍ: 30. června 1998 (C) KLASIFIKACE:

(viii) ÚDAJE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Svoboda, Craig G.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 39,044 (C) REFERENČNÍ ČÍSLO: Pl 123PCT-A (íx) INFORMACE O SPOJENÍ:

(A) TELEFON: 650/225-1489 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMACE K SEKVENCI ě: 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6127 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvouvláknový (D) TOPOLOGIE: kruhový (ix) Základní rysy (A) JMENO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-6127 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: expresní plazmid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE c: 1:

GAATTCAACT TCATTGCTGA	TCTCCATACT STTGTTATTT	TTGGATAAGG AAGCTTGCCC	AAATACAGAC AAAAAGAAGA	ATGAAAAATC 50
AGAGTCGAAT	100
GAACTGTGTG <	CGCAGGTAGA	AGCTTTGGAG	ATTATCGTCA	CTGCAATGCT	150
TCGCAATATG i	GCGCAAAATG	ACCAACAGCG	GTTGATTGAT	CAGGTAGAGG	200
GGGCGCTGTA	CGAGGTAAAG	CCCGATGCCA	GCATTCCTGA	CGACGATACG	250
GAGCTGCTGC	GCGATTACGT	AAAGAAGTTA	TTGAAGCATC	CTCGTCAGTA	30Q
AAAAGTTAAT	CTTTTCAACA	GCTGTCATAA	AGTTGTCACG	GCCGAGACTT	350
ATAGTCGCTT	TGTTTTTATT	TTTTAATGTA	TTTGTAACTA	GAATTCGAGC	400
TCGGTACCCG	GGGATCCTCT	CGAGGTTGAG	GTGATTTTAT	GAAAAAGAAT	450
ATCGCATTTC	TTCTTGCATC	TATGTTCGTT	TTTTCTATTG	CTACAAACGC	500
GTACGCTGAT	ATCCAGCTGA	CCCAGTCCCC	gagctccctg	TCCGCCTCTG	550
TGGGCGATAG	GGTCACCATC	ACCTGCCGTG	CCAGTCAGAG	CGTCGATTAC	600
GAAGGTGATA	GCTACCTGAA	CTGGTATCAA	CAGAAACCAG	GAAAAGCTCC	650
GAAACTACTG	ATTTACGCGG	CCTCGTACCT	GGAGTCTGGA	GTCCCTTCTC	700
GCTTCTCTGG	ATCCGGTTCT	GGGACGGATT	TCACTCTGAC	CATCAGCAGT	750
CTGCAGCCAG	AAGACTTCGC	AACTTATTAC	TGTCAGCAAA	GTCACGAGGA	800
TCCGTACACA	tttggacagg	GTACCAAGGT	GGAGATCAAA	CGAACTGTGG	850
CTGCACCATC	TGTCTTCATC	TTCCCGCCAT	CTGATGAGCA	GTTGAAATCT	900
GGAACTGCTT	CTGTTGTGTG	CCTGCTGAAT	AACTTCTATC	CCAGAGAGGC	950
CAAAGTACAG	TGGAAGGTGG	ATAACGCCCT	CCAATCGGGT	AACTCCCAGG	1000
AGAGTGTCAC	AGAGCAGGAC	AGCAAGGACA	GCACCTACAG	CCTCAGCAGC	1050
ACCCTGACGC	TGAGCAAAGC	AGACTACGAG	AAACACAAAG	TCTACGCCTG	1100
CGAAGTCACC	CATCAGGGCC	TGAGCTCGCC	CGTCACAAAG	AGCTTCAACA	1150
GGGGAGAGTG	TTAAGCTGAT	CCTCTACGCC	GGACGCATCG	TGGCCCTAGT	1200
ACGCAAGTTC	ACGTAAAAAG	GGTATCTAGA	GGTTGAGGTG	ATTTTATGAA	1250
AAAGAATATC	GCATTTCTTC	TTGCATCTAT	GTTCGTTTTT	TCTATTGCTA	1300
CAAACGCGTA	CGCTGAGGTT	CAGCTGGTGG	AGTCTGGCGG	TGGCCTGGTG	1350
CAGCCAGGGG	GCTCACTCCG	TTTGTCCTGT	GCAGTTTCTG	GCTACTCCAT	1400
CACCTCCGGA	TACAGCTGGA	ACTGGATCCG	TCAGGCCCCG	GGTAAGGGCC	1450
TGGAATGGGT	TGCATCGATT	ACGTATGACG	GATCGACTAA	CTATAACCCT	1500
AGCGTCAAGG	GCCGTATCAC	TATAAGTCGC	GACGATTCCA	AAAACACATT	1550
CTACCTGCAG	ATGAACAGCC	TGCGTGCTGA	GGACACTGCC	GTCTATTATT	1600
GTGCTCGAGG	CAGCCACTAT	TTCGGTCACT	GGCACTTCGC	CGTGTGGGGT	1650
CAAGGAACCC	TGGTCACCGT	CTCCTCGGCC	TCCACCAAGG	GCCCATCGGT	1700
CTTCCCCCTA	GCACCCTCCT	CCAAGAGCAC	CTCTGGGGGC	ACAGCGGCCC	1750
TGGGCTGCCT	GGTCAAGGAC	tacttccccg	AACCGGTGAC	GGTGTCGTGG	1800

AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA 1850
GTCCTCAGGA	CTCTACTCCC	TCAGCAGCGT	GGTGACCGTG	CCCTCCAGCA	1900
GCTTGGGCAC	CCAGACCTAC	ATCTGCAACG	TGAATCACAA	GCCCAGCAAC	1950
ACCAAGGTGG	ACAAGAAAGT	TGAGCCCAAA	TCTTGTGACA	AAACTCACAC	2000
CTAGAGTGGC	GGTGGCTCTG	GTTCCGGTGA	TTTTGATTAT	GAAAAGATGG	2050
CAAACGCTAA	TAAGGGGGCT	atgaccgaaa	ATGCCGATGA	AAACGCGCTA	2100
CAGTCTGACG	CTAAAGGCAA ACTTGATTCT	GTCGCTACTG	ATTACGGTGC	2150
TGCTATCGAT	GGTTTCATTG	GTGACGTTTC	CGGCCTTGCT	AATGGTAATG	2200
GTGCTACTGG	TGATTTTGCT	GGCTCTAATT	CCCAAATGGC	TCAAGTCGGT	2250
GACGGTGATA	ATTCACCTTT	AATGAATAAT	TTCCGTCAAT	ATTTACCTTC	2300
CCTCCCTCAA	TCGGTTGAAT	GTCGCCCTTT	TGTCTTTAGC	GCTGGTAAAC	2350
CATATGAATT	TTCTATTGAT	TGTGACAAAA	TAAACTTATT	CCGTGGTGTC	2400
TTTGCGTTTC	TTTTATATGT	TGCCACCTTT	atgtatgtat	TTTCTACGTT	2450
TGCTAACATA	CTGCGTAATA	AGGAGTCTTA	ATCATGCCAG	TTCTTTTGGC	2500
TAGCGCCGCC	CTATACCTTG	TCTGCCTCCC	CGCGTTGCGT	CGCGGTGCAT	2550
GGAGCCGGGC	CACCTCGACC	TGAATGGAAG	CCGGCGGCAC	CTCGCTAACG	2600
GATTCACCAC	TCCAAGAATT	GGAGCCAATC	AATTCTTGCG	GAGAACTGTG	2650
AATGCGCAAA	CCAACCCTTG	GCAGAACATA	TCCATCGCGT	CCGCCATCTC	2700
CAGCAGCCGC	ACGCGGCGCA	TCTCGGGCAG	CGTTGGGTCC	TGGCCACGGG	2750
TGCGCATGAT	CGTGCTCCTG	TCGTTGAGGA	CCCGGCTAGG	CTGGCGGGGT	2800
TGCCTTACTG	GTTAGCAGAA	TGAATCACCG	ATACGCGAGC	GAACGTGAAG	2850
CGACTGCTGC	TGCAAAACGT	CTGCGACCTG	AGCAACAACA	TGAATGGTCT	2900
TCGGTTTCCG	TGTTTCGTAA	AGTCTGGAAA	CGCGGAAGTC	AGCGCCCTGC	2950
ACCATTATGT	TCCGGATCTG	CATCGCAGGA	TGCTGCTGGC	TACCCTGTGG	3000
AACACCTACA	TCTGTATTAA	CGAAGCGCTG	GCATTGACCC	TGAGTGATTT	3050
TTCTCTGGTC	CCGCCGCATC	CATACCGCCA	GTTGTTTACC	CTCACAACGT	3100
TCCAGTAACC	GGGCATGTTC	ATCATCAGTA	ACCCGTATCG	TGAGCATCCT	3150
CTCTCGTTTC	ATCGGTATCA	TTACCCCCAT	GAACAGAAAT	TCCCCCTTAC	3200
ACGGAGGCAT	CAAGTGACCA	AACAGGAAAA	AACCGCCCTT	AACATGGCCC	3250
GCTTTATCAG	AAGCCAGACA	TTAACGCTTC	TGGAGAAACT	CAACGAGCTG	3300
GACGCGGATG	AACAGGCAGA	CATCTGTGAA	TÚGCTTCACG	ACCACGCTGA	3350

TGAGCTTTAC CGCAGGATCC GGAAATTGTA AACGTTAATA TTTTGTTAAň 3400

ATTCGCGTTA	AATTTTTGTT	AAATCAGCTC	ATTTTTTAAC	CAATAGGCCG	3450
AAATCGGCAA	AATCCCTTAT	AAATCAAAAG	AATAGACCGA	GATAGGGTTG	3500
AGTGTTGTTC	CAGTTTGGAA	CAAGAGTCCA	CTATTAAAGA	ACGTGGACTC	3550
CAACGTCAAA	GGGCGAAAAA	CCGTCTATCA	GGGCTATGGC	CCACTACGTG	3600
AACCATCACC	CTAATCAAGT	TTTTTGGGGT	CGAGGTGCCG	TAAAGCACTA	3650
AATCGGAACC	CTAAAGGGAG	CCCCCGATTT	AGAGCTTGAC	GGGGAAAGCC	3700
GGCGAACGTG	GCGAGAAAGG	AAGGGAAGAA	AGCGAAAGGA	GCGGGCGCTA	3750
GGGCGCTGGC	AAGTGTAGCG	GTCACGCTGC	GCGTAACCAC	CACACCCGCC	3800
GCGCTTAATG	CGCCGCTACA	GGGCGCGTCC	GGATCCTGCC	TCGCGCGTTT	3850
CGGTGATGAC	GGTGAAAACC	TCTGACACAT	GCAGCTCCCG	GAGACGGTCA	3900
CAGCTTGTCT	GTAAGCGGAT	GCCGGGAGCA	GACAAGCCCG	TCAGGGCGCG	3950
TCAGCGGGTG	TTGGCGGGTG	TCGGGGCGCA	GCGATGACCC	AGTCACGTAG	4000
CGATAGCGGA	GTGTATACTG	GCTTAACTAT	GCCGCATCAG	AGCAGATTGT	4050
ACTGAGAGTG	CACCATATGC	GGTGTGAAAT	ACCGCACAGA	TGCGTAAGGA	4100
GAAAATACCG	CATCAGGCGC	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TGACTCGCTG	4150
CGCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGAGCGGTA	TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT	4200
AATACGGTTA	TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG	AACATGTGAG	4250
CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	AGGAACCGTA AAAAGGCCGC	GTTGCTGGCG	4300
TTTTTCCATA	GGCTCCGCCC	CCCTGACGAG	CATCACAAAA	ATCGACGCTC	4350
AAGTCAGAGG	TGGCGAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	CAGGCGTTTC	4400
CCCCTGGAAG	CTCCCTCGTG	CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT	GCCGCTTACC	4450
GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CCCTTCGGGA	AGCGTGGCGC	TTTCTCATAG	4 500
CTCACGCTGT	AGGTATCTCA	GTTCGGTGTA	GGTCGTTCGC	TCCAAGCTGG	4550
GCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	GTTCAGCCCG	ACCGCTGCGC	CTTATCCGGT	4600
AACTATCGTC	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	CACGACTTAT	CGCCACTGGC	4650
AGCAGCCACT	GGTAACAGGA	TTAGCAGAGC	GAGGTATGTA	GGCGGTGCTA	4700
CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AAGGACAGTA	4750
TTTGGTATCT	GCGCTCTGCT	GAAGCCAGTT	ACCTTCGGAA	AAAGAGTTGG	4800
TAGCTCTTGA	TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGGTAGCGGT	GGTTTTTTTG	4850
TTTGCAAGCA	GCAGATTACG	CGCAGAAAAA	AAGGATCTCA	AGAAGATCCT	4900
TTGATCTTTT	CTACGGGGTC	TGACGCTCAG	TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	4 950
AGGGATTTTG	GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	GATCTTCACC	TAGATCCTTT	5000

η 1

TAAATTAAAA	ATGAAGTTTT	AAATCAATCT	AAAGTATATA	TGAGTAAACT	5050
TGGTCTGACA	GTTACCAATG	CTTAATCAGT	GAGGCACCTA	TCTCAGCGAT	5100
CTGTCTATTT	CGTTCATCCA	TAGTTGCCTG	ACTCCCCGTC	GTGTAGATAA	5150
CTACGATACG	GGAGGGCTTA	CCATCTGGCC	CCAGTGCTGC	AATGATACCG	5200
CGAGACCCAC	GCTCACCGGC	TCCAGATTTA	TCAGCAATAA	ACCAGCCAGC	5250
CGGAAGGGCC	GAGCGCAGAA	GTGGTCCTGC	AACTTTATCC	GCCTCCATCC	5300
AGTCTATTAA	TTGTTGCCGG	GAAGCTAGAG	TAAGTAGTTC	GCCAGTTAAT	5350
AGTTTGCGCA	ACGTTGTTGC	CATTGCTGCA	GGCATCGTGG	TGTCACGCTC	5400
GTCGTTTGGT	ATGGCTTCAT	TCAGCTCCGG	TTCCCAACGA	TCAAGGCGAG	5450
TTACATGATC	CCCCATGTTG	TGCAAAAAAG	CGGTTAGCTC	CTTCGGTCCT	5500
CCGATCGTTG	TCAGAAGTAA	GTTGGCCGCA	GTGTTATCAC	TCATGGTTAT	5550
GGCAGCACTG	CATAATTCTC	TTACTGTCAT	GCCATCCGTA	AGATGCTTTT	5600
CTGTGACTGG	TGAGTACTCA	ACCAAGTCAT	TCTGAGAATA	GTGTATGCGG	5650
CGACCGAGTT	GCTCTTGCCC	GGCGTCAACA	CGGGATAATA	CCGCGCCACA	5700
TAGCAGAACT	TTAAAAGTGC	TCATCATTGG	AAAACGTTCT	TCGGGGCGAA	5750
AACTCTCAAG	GATCTTACCG	CTGTTGAGAT	CCAGTTCGAT	GTAACCCACT	5800
CGTGCACCCA	ACTGATCTTC	AGCATCTTTT	ACTTTCACCA	GCGTTTCTGG	5850
GTGAGCAAAA	ACAGGAAGGC	AAAATGCCGC	AAAAAAGGGA	ATAAGGGCGA	5900
CACGGAAATG	TTGAATACTC	ATACTCTTCC	TTTTTCAATA	TTATTGAAGC	5950
ATTTATCAGG	GTTATTGTCT	CATGAGCGGA	TACATATTTG	AATGTATTTA	6000
GAAAAATAAA	CAAATAGGGG	TTCCGCGCAC	ATTTCCCCGA	AAAGTGCCAC	6050
CTGACGTCTA	AGAAACCATT	ATTATCATGA	CATTAACCTA	taaaaatagg	6100
CGTATCACGA	GGCCCTTTCG	TCTTCAA 6127

(2) INFORMACE K SEKVENCI č:2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 121 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č.2

Asp Val 1

Gin Leu

Gin Glu Ser Gly Pro Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser 15

5

10

Gin

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Cys

Ser

Val

Thr

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys 35 40 45

Leu Glu Trp Met Gly Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Ser Asn Tyr
	50	55	60
Asn Pro Ser	Leu Lys Asn Arg 65	Ile Ser Val Thr 70	Arg Asp Thr Ser 75
Gin Asn Gin	Phe Phe Leu Lys 80	Leu Asn Ser Ala 85	Thr Ala Glu Asp 90
Thr Ala Thr	Tyr Tyr Cys Ala 95	Arg Gly Ser His 100	Tyr Phe Gly His 105
Trp His Phe	Ala Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr	Val Thr Val Ser

110 115 12ΰ

Ser

121 (2) INFORMACE K SEKVENCI č:3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 121 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

i o (A) JMÉNO/KLÍČ: U měle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-121 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence F(ab) odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:3:

Glu Val 1	Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
5	10	15
Gly Ser	Leu Arg Leu 20	Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile 25	Thr 30
Ser Gly Tyr Ser Trp 35	Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys 40	Gly 45
Leu Glu	Trp Val Ala 50	Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn 55	Tyr 60
Ala Asp	Ser Val Lys 65	Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp 70	Ser 75
Lys Asn	Thr Phe Tyr 80	Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 85	Asp 90
Thr Ala	Val Tyr Tyr 95	Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly 100	His 105
Trp His	Phe Ala Val 110	Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val 115	Ser 120

Ser

121

Ol (2) INFORMACE K SEKVENCI č:4:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 121 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:4:

Glu 1

val

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Xaa

20

25

30

Sex

Asp Tyr

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

val

Ala

Val

Ile

Ser

Asn

Gly

Ser

Asp

Thr

Tyr Tyr

50

55

60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr Tyr Cys Ala

Arg Asp

Ser

Arg

Phe

Phe

Xaa

Xaa

95

100

105

Xaa

Xaa

Xaa

Asp Val Trp Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

121

io (2) INFORMACE K SEKVENCI Č:5:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 i aminokyselin (B) TYP: aminokyselina t5 (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:5:

Asp 1

ile Gin Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu

Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Gin Arg Ala

Thr 20

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Ser

val

Asp 30

Tyr

Asp Gly Asp

Ser 35

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

Gin

Pro Pro Ile

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Tyr

Leu

Gly

Ser 60

Glu

Ile Pro Ala

Arg 65

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Thr

Leu Asn Ile

His 80

Pro

Val

Glu

Glu

Glu 85

Asp

Ala

Ala

Thr

Phe 90

Tyr

Cys Gin Gin

Ser 95

His

Glu

Asp

Pro

Tyr 100

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly 105

Thr Lys Leu Glu Ile Lys 110 111 (2) INFORMACE K SEKVENCI ě:6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 111 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-111 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence lehkého řetězce F(ab) odvozená z MAE 11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE Č.6:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser

Pro Ser

Ser Leu Ser Ala Ser Val

1

5

10

15

Gly Asp Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

20

25

30

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

ASp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pra

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

110 111

Q<

(2) INFORMACE K SEKVENCI č:7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 111 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE; SEKVENCE č:7:

Asp 1

Ile Gin

Met

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

5

10

15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

20

25

30

Ile

Ser

Xaa

Xaa

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

ψγΓ

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Sex

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Asn

Ser

Leu

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

val

Glu

Ile

Lys

110

lll

(2) INFORMACE K SEKVENCI č:8:.

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 114 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (D) TOPOLOGIE; lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-114 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence lehkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:8:

Asp 1

lle Gin

Leu

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

5

10

15

Gly Asp

Arg

Val

Thr

lle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Pro

Val

Asp

20

25

30

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

LyS

Leu

Leu

lle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

lle

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cy$

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

lle

Lys

Arg

Thr

val

110

114

(2) INFORMACE K SEKVENCI č:9:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 114 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-114 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence lehkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE Č.9:

Asp 1

lle Gin

Leu

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

5

10

15

Gly Asp Arg

Val

Thr

lle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

val

Asp

20

25

30

Tyr

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

lle

ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

lle

Lys

Arg

Thr

Val

110

114

OT (2) INFORMACE K SEKVENCI č: 10:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 114 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence io (B) UMÍSTĚNÍ: 1-114 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence lehkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č: 10:

Asp 1

Ile Gin

Leu

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

5

10

15

Gly Asp

Arg Val

Thr

ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

20

25

30

Tyr Asp

Gly Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

110

114

(2) INFORMACE K SEKVENCI č: 11:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 114 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-114 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č: 11:

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

GlU

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tvr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

110

114

(2) INFORMACE K SEKVENCI č: 12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 114 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-114 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce odvozená z MAE11 15 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č.l2 ort

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser	Gly	Gly Gly 10	Leu Val	Gin Pro Gly 15
1	5
Gly	Ser Leu Arg Leu Ser Cys 20	Ala	Val Ser 25	Gly Tyr	Ser Ile Thr 30
Ser	Gly Tyr Ser Trp Asn Trp 35	Ile	Arg Gin 40	Ala Pro	Gly Lys Gly 45
Leu	Glu Trp Val Ala Ser Ile 50	Thr	Tyr Asp Gly Ser 55	Thr Asn Tyr 60
Asn	Pro Ser Val Lys Gly Arg 65	Ile	Thr Ile 70	Ser Arg	Asp Asp Ser 75
Lys	Asn Thr Phe Tyr Leu Gin 80	Met	Asn Ser 85	Leu Arg	Ala Glu Asp 90
Thr Trp	Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser 95 100 His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly	His Tyr	Phe Gly His 105

110 114 (2) INFORMACE K SEKVENCI č:13:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 218 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-218 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence lehkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č: 13:

Asp Ile Gin Leu Thr	Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1	5	10	15
Gly Asp Arg	Val Thr	Ile Thr Cys Arg Ala Ser	Gin Ser Val Asp
	20	25	30
Tyr Asp Gly	Asp Ser	Tyr Met Asn Trp Tyr Gin	Gin Lys Pro Gly
	35	40	45
Lys Ala Pro	Lys Leu	Leu Ile Tyr Ala Ala Ser	Tyr Leu Glu Ser
	50	55	60
Gly Val Pro	Ser Arg	Phe Ser Gly Ser Gly Ser	Gly Thr Asp Phe
	65	70	75
Thr Leu Thr	ile ser	Ser Leu Gin Pro Glu Asp	Phe Ala Thr Tyr
	B0	85	90
Tyr Cys Gin	Gin ser	His Glu Asp Pro Tyr Thr	Phe Gly Gin Gly
	95	100	105
Thr Lys Val	Glu Ile	Lys Arg Thr Val Ala Ala	Pro Ser Val Phe
	110	115	120
11« Phe Pro	Pro Ser	Asp Glu Gin Leu Lys Ser	Gly Thr Ala Ser
	125	130	135
Val val Cys	Leu Leu	Asn Asn Phe Tyr Pro Arg	Glu Ala Lys Val
	140	145	150
Gin Trp Lys	Val Asp	Asn Ala Leu Gin Ser Gly	Asn Ser Gin Glu
	155	160	165
Ser Val Thr	Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser Thr	Tyr Ser Leu Ser
	170	175	180
Ser Thr Leu	Thr Leu	Ser Lys Ala Asp Tyr Glu	Lys His Lys Val
	185	190	195
Tyr Ala Cys	Glu Val	Thr His Gin Gly Leu Ser	Ser Pro Val Thr
	200	205	210
Lys Ser Phe	Asn Arg Gly Glu Cys
	215	218

(2) INFORMACE K SEKVENCI č; 14:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 451 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: M51 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce odvozená z MAE11 15 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č: 14:

ni

Glu 1	Val Gin Leu	Val 5	Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
10	15
Gly	Ser Leu Arg	Leu	Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile	Thr
		20	25	30
Ser	Gly Tyr Ser	Trp	Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys	Gly
		35	40	45
Leu	Glu Trp Val	Ala	Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asii Tyr
		50	55	60
Asn	Pro Ser Val	Lys	Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp	Ser
		65	70	75
Lys	Asn Thr Phe	Tyr	Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu	Asp
		80	85	90
Thr	Ala Val Tyr	Tyr	Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly	His
		95	100	105
Trp	His Phe Ala	Val	Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val	Ser
		110	115	120
Ser	Ala Ser Thr	Lys	Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro	Ser
		125	130	135
Ser	Lys Ser Thr	Ser	Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu	Val
		140	145	150
Lys	Asp Tyr Phe	Pro	Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser	Gly
		155	160	165

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser

170 175 190

Ser	Gly Leu	Tyr	Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
185	190	195
Ser	Leu Gly	Thr	Gin Thr Tyr	Ile Cys Asn Val	Asn His Lys Pro
			200	205	210
Ser	Asn Thr	Lys	Val Asp Lys	Lys Val Glu Pro	Lys Ser Cys Asp
			215	220	225
Lys	Thr His	Thr	Cys Pro Pro	Cys Pro Ala Pro	Glu Leu Leu Gly
			230	235	240
Gly	Pro Ser	Val	Phe Leu Phe	Pro Pro Lys Pro	Lys Asp Thr Leu
			245	250	255
Met	Ile Ser	Arg	Thr Pro Glu	Val Thr Cys Val	Val Val Asp Val
			260	265	270
Ser	His Glu	Asp	Pro Glu Val	Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
			275	290	285
Val	Glu Val	His	Asn Ala Lys	Thr Lys Pro Arg	Glu Glu Gin Tyr
			290	295	300
Asn	Ser Thr	Tyr	Arg Val Val	Ser Val Leu Thr	Val Leu His Gin
			305	310	315
Asp Trp Leu	Asn	Gly Lys Glu	Tyr Lys Cys Lys	Val Ser Asn Lys
			320	325	330
Ala	Leu Pro	Ala	Pro Ile Glu	Lys Thr Ile Ser	Lys Ala Lys Gly
			335	340	345
Gin	Pro Arg	Glu	Pro Gin val	Tyr Thr Leu Pro	Pro Ser Arg Glu
			350	355	360
Glu	Met Thr	Lys	Asn Gin Val	Ser Leu Thr Cys	Leu Val Lys Gly
			365	370	375
Phe	Tyr Pro	Ser	Asp Ile Ala	Val Glu Trp Glu	Ser Asn Gly Gin
			380	385	390
Pro	Glu Asn	Asn	Tyr Lys Thr	Thr Pro Pro Val	Leu Asp Ser Asp
			395	400	405
Gly	Ser Phe	Phe	Leu Tyr Ser	Lys Leu Thr Val	Asp Lys Ser Arg
			410	415	420
Trp	Gin Gin	Gly	Asn Val Phe	Ser Cys Ser Val	Met His Glu Ala
			425	430	435
Leu	His Asn	His	Tyr Thr Gin	Lys Ser Leu Ser	Leu Ser Pro Gly

440 445 450

Lys

451 m

(2) INFORMACE K SEKVENCI č: 15:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 218 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence ίο (B) UMÍSTĚNÍ: 1-218 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence lehkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č: 15:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1	5	10	15
Gly Asp Arg Val Thr	Ile Thr Cys Arg Ala	Ser Lys Pro Val Asp
	20	25	30
Gly Glu Gly Asp Ser	Tyr Leu Asn Trp Tyr	Gin Gin Lys Pro Gly
	35	40	45
Lys Ala Pro Lys Leu	Leu Ile Tyr Ala Ala	Ser Tyr Leu Glu Ser
	50	55	60
Gly Val Pro Ser Arg	Phe Ser Gly Ser Gly	Ser Gly Thr Asp Phe
	65	70	75
Thr	Leu Thr Ile Ser	Ser Leu Gin Pro Glu	Asp Phe Ala Thr Tyr
	80	85	90
Tyr Cys Gin Gin Ser	His Glu Asp Pro Tyr	Thr Phe Gly Gin Gly
	95	100	105
Thr	Lys Val Glu Ile	Lys Arg Thr Val Ala	Ala Pro Ser Val Phe
	110	115	120
Ile	Phe Pro Pro Ser	Asp Glu Gin Leu Lys	Ser Gly Thr Ala Ser
	125	130	135
val	Val Cys Leu Leu	Asn Asn Phe Tyr Pro	Arg Glu Ala Lys Val
	140	145	150
Gin	Trp Lys Val Asp	Asn Ala Leu Gin Ser	Gly Asn Ser Gin Glu
	155	160	165
Ser	Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser	Thr Tyr Ser Leu Ser
	170	175	180
Ser	Thr Leu Thr Leu	Ser Lys Ala Asp Tyr	Glu Lys His Lys Val
	185	190	195
Tyr	Ala Cys Glu Val	Thr His Gin Gly Leu	Ser Ser Pro Val Thr
	200	205	210

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 218 (2) INFORMACE K SEKVENCI č: 16:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 451 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence ίο (B) UMÍSTĚNÍ: M51 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č: 16:

Glu 1	Val Gin Leu Val 5	Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
10	15
Gly	Ser Leu Arg Leu	Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile	Thr
	20	25	30
Ser	Gly Tyr Ser Trp	Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys	Gly
	35	40	45
Leu	Glu Trp Val Ala	Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn	Tyr
	50	55	60
Asn	Pro Sér Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp	Ser
	65	70	75
Lys	Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu	ASp
	80	85	90
Thr	Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly	His
	95	100	105
Trp	His Phe Ala Val	Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val	Ser
	110	115	120
Ser	Ala ser Thr Lys	Gly Prů Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro	Ser
	125	130	135
Ser	Lys Ser Thr Ser	Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu	Val
	140	145	150
Lys	Asp Tyr Phe Pro	Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser	Gly
	155	160	165
Ala	Leu Thr Ser Gly	Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin	Ser
	170	175	180
Ser	Gly Leu Tyr Ser	Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser	Ser
	185	190	195
Ser	Leu Gly Thr Gin	Thr Tyr ile Cys Asn Val Asn His Lys	Pro
	200	205	210
Ser	Asn Thr Lys Val	Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys	Asp
	215	220	225

nc

Lys

Thr

His

Thr

Cys 230

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala 235

Pro

Glu

Leu

Leu

cly 240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 255

Met

ile

Ser

Arg

Thr 260

Pro

Glu

Val

Thr

Cys 265

val

Val

Val

Asp

Val 270

Ser

His

Glu

Asp

Pro 275

Glu

Val

Lys

Phe

Asn 280

Trp

Tyr

Val

Asp Gly 285

Val

Glu

Val

His

Asn 290

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro 295

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr 300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg 305

Val

val

Ser

Val

Leu 310

Thr

Val

Leu

His

Gin 315

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly 320

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys 325

Lys

Val

Ser

Asn

Lys 330

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro 335

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile 340

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly 345

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 350

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser Leu

Thr 370

Cys

Leu

Val

Lys

Gly 375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 390

Ile

Ala

Val

Glu

Trp 385

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin 390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr 395

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro 400

Val

Leu

Asp

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr 415

Val

Asp

Lys

Ser

Arg 420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His

Glu

Ala 435

Leu

His

Asn

His

Tyr 440

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu 445

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly 450

Lys

451 (2) INFORMACE K SEKVENCI č: 17:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 218 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-218 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE; Sekvence lehkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č: 17:

Asp Ile Gin Leu Thr

Gin Ser

Pro

Ser

Ser Leu Ser Ala Ser Val

1

5

10

15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Pro

Val

Asp

20

25

30

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

GLn

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glú

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

110

115

120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

125

130

135

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

140

145

150

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyt

Ser

Leu

Ser

170

175

180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

185

190

195

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

200

205

210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

215

218

(2) INFORMACE K SEKVENCI č: 18:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 451 aminokyselin ίο (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineám!

(ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence is (B) UMÍSTĚNÍ: 1-451 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č: 18:

m

Glu 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Glu Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser Cys

Ala

val

Ser 25

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr 30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp 35

Asn Trp

Ile

Arg

Gin 40

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly 45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala 50

Ser Ile

Lys

Tyr

Ser 55

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr 60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys 65

Gly Arg

Ile

Thr

ile 70

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr 80

Leu Gin

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys Ala

Arg

Gly

Ser 100

His

Tyr

Phe

Gly

His 105

Trp

His

Phe

Ala

Val 110

Trp Gly

Gin

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly Pro

Ser

Val

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser 140

Gly Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly Cys

Leu

Val 150

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165

CZ 300724 Bó

Ala	Leu Thr Ser	Gly 170	Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser
175	180
Ser	Gly Leu Tyr	Ser 185	Leu Ser Ser val Val Thr 190	Val Pro Ser Ser 195
Ser	Leu Gly Thr	Gin 200	Thr Tyr Ile Cys Asn Val 205	Asn His Lys Pro 210
Ser	Asn Thr Lys	Val 215	Asp Lys Lys Val Glu Pro 220	Lys Ser Cys Asp 225
Lys	Thr His Thr	Cys 230	Pro Pro Cys Pro Ala Pro 235	Glu Leu Leu Gly 240
Gly	Pro Ser Val	Phe 245	Leu Phe Pro Pro Lys Pro 250	Lys Asp Thr Leu 255
Met	Ile Ser Arg	Thr 260	Pro Glu Val Thr Cys Val 265	Val val Asp val 270
Ser	His Glu Asp	Pro 275	Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 280 285
Val	Glu Val His	Asn 290	Ala Lys Thr Lys Pro Arg 295	GlU Glu Gin Tyr 300
Asn	Ser Thr Tyr Arg 305	val val ser Val Leu Thr 310	Val Leu His Gin 315
Asp	Trp Leu Asn	Gly 320	Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325	Val Ser Asn Lys 330
Ala	Leu Pro Ala	Pro 335	Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340	Lys Ala Lys Gly 345
Gin	Pro Arg Glu	Pro 350	Gin Val Tyr Thr Leu Pro 355	Pro Ser Arg Glu 360
Glu	Met Thr Lys	Asn 365	Gin Val Ser Leu Thr Cys 370	Leu Val Lys Gly 375
Phe	Tyr Pro Ser	Asp 380	Ile Ala Val Glu Trp Glu 385	Ser Asn Gly Gin 390
Pro	Glu Asn Asn	Tyr 395	Lys Thr Thr Pro Pro Val 400	Leu Asp Ser Asp 405
Gly	Ser Phe Phe	Leu 410	Tyr Ser Lys Leu Thr Val 415	Asp Lys Ser Arg 420
Trp	Gin Gin Gly	Asn 425	Val Phe Ser Cys Ser Val 430	Met His Glu Ala 435
Leu	His Asn His	Tyr 440	Thr Gin Lys Ser Leu Ser 445	Leu Ser Pro Gly 450

Lys

451 nn (2) INFORMACE K SEKVENCI č: 19:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 218 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (íx) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence ίο (B) UMÍSTĚNÍ: 1-218 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence lehkého řetězce F(ab) odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ě: 19:

Asp lle Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1	5	10	15
Gly Asp Arg Val Thr	lle Thr Cys Arg Ala	Ser Lys Pro Val Asp
	20	25	30
Gly	Glu Gly Asp Ser	Tyr Leu Asn Trp Tyr	Gin Gin Lys Pro Gly
	35	40	45
Lys	Ala Pro Lys Leu	Leu lle Tyr Ala Ala	Ser Tyr Leu Glu Ser
	50	55	60
Gly	Val Pro Ser Arg	Phe Ser Gly Ser Gly	Ser Gly Thr Asp Phe
	65	70	75
Thr	Leu Thr lle Ser	Ser Leu Gin Pro Glu	Asp Phe Ala Thr Tyr
	80	85	90
Tyr	Cys Gin Gin Ser	His Glu Asp Pro Tyr	Thr Phe Gly Gin Gly
	95	100	105
Thr	Lys Val Glu lle	Lys Arg Thr Val Ala	Ala Pro Ser Val Phe
	110	115	120
lle	Phe Pro Pro Ser	Asp Glu Gin Leu Lys	Ser Gly Thr Ala Ser
	125	130	135
Val	Val Cys Leu Leu	Asn Asn Phe Tyr Pro	Arg Glu Ala Lys Val
	140	145	150
Gin	Trp Lys val Asp	Asn Ala Leu Gin Ser	Gly Asn Ser Gin Glu
	155	160	165
Ser	Val Thr Glu Gin	Asp Ser Lys Asp Ser	Thr Tyr Ser Leu Ser
	170	175	180
Ser	Thr Leu Thr Leu	Ser Lys Ala Asp Tyr	Glu Lys His Lys Val
	185	190	195
Tyr	Ala Cys Glu Val	Thr His Gin Gly Leu	Ser Ser Pro Val Thr
	200	205	210

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 218 (2) INFORMACE K SEKVENCI ě:20:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 229 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineám!

(ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence ιο (B) UMÍSTĚNÍ: 1-229 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce F(ab) odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ě:20:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30

Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45

Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60

Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105

Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pra Leu Ala Pro Ser 125 130 135

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165 ₁₅ Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser

170 175 180

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225

Lys Thr His Thr 229 ini _ (2) INFORMACE K SEKVENCI č:21:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 229 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence io (B) UMÍSTĚNÍ: 1-229 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce F(ab) odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ě:21:

Glu 1

Val Gin Leu Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Tle

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

uo

115

120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

140

145

150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys Thr His Thr 229 (2) INFORMACE K SEKVENCI č:22:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: (A) DÉLKA: 248 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-248 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence sFv odvozená z MAE11

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:22:
Glu Val 1	Gin	Leu	Val Glu Ser 5	Gly Gly Gly 10	Leu	val	Gin	Pro
Gly Ser	Leu	Arg	Leu Ser Cys 20	Ala Val Ser 25	Gly	Tyr	Ser	Ile
Ser Gly	Tyr	Ser	Trp Asn Trp 35	Ile Arg Gin 40	Ala	Pro	Gly	Lys
Leu Glu	Trp	Val	Ala Ser Ile 50	Thr Tyr Asp 55	Gly	Ser	Thr	Ash
Asn Pro	Ser	Val	Lys Gly Arg 65	Ile Thr Ile 70	Ser	Arg	Asp	Asp
Lys Asn	Thr	Phe	Tyr Leu Gin 80	Met Asn Ser 85	Leu	Arg	Ala	Glu
Thr Ala	Val	Tyr	Tyr Cys Ala 95	Arg Gly Ser 100	His	Tyr	Phe	Gly
Trp His	Phe	Ala	Val Trp Gly 110	Gin Gly Thr 115	Leu	Val	Thr	Val
Ser Glu	Gly	Gly	Gly Ser Glu 125	Gly Gly Gly 130	Ser	Glu	Gly	Gly
Ser Asp	Ile	Gin	Leu Thr Gin 140	Ser Pro Ser 145	Ser	Leu	Ser	Ala
Val Gly	Asp	Arg	Val Thr Ile 155	Thr Cys Arg 160	Ala	Ser	Lys	Pro
Asp Gly	Glu	Gly	Asp Ser Tyr 170	Leu Asn Trp 175	Tyr	Gin	Gin	Lys
Gly Lys	Ala	Pro	Lys Leu Leu 185	Ile Tyr Ala 190	Ala	Ser	Tyr	Leu
Ser Gly	Val	Pro	Ser Arg Phe 200	Ser Gly Ser 205	Gly	Ser	Gly	Thr
Phe Thr	Leu	Thr	Ile Ser Ser 215	Leu Gin Pro 220	Glu	Asp	Phe	Ala
Tyr Tyr	Cys	Gin	Gin Ser His 230	Glu Asp Pro 235	Tyr	Thr	Phe	Gly

Gly

Thr

Gly

Tyr

Ser

Asp

His

105

Ser

120

Gly

135

Ser

150 val

165

Pro

180

Glu

195

Asp

210

Thr

225

Gin

240

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 245 248

1Λ1 _ (2) INFORMACE K SEKVENCI č:23:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 248 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLIČ: Uměle připravená sekvence io (B) UMÍSTĚNÍ: 1-248 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence sFv odvozená z MAE11

(xi) PO1

PIS Si

EKVENCE: SEKVENCE č

:23:

Glu

val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Cly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Lea

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Sér

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Gly

Gly

Gly

125

130

135

ser

Asp

Ile

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

140

145

150

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val

155

160

165

Asp

Gly

Glu

Gly Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

170

175

180

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

185

190

195

Ser

Giy

val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

200

205

210

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

215

220

225

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

230

235

240

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

245

248

(2) INFORMACE K SEKVENCI č:24;

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 218 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) Základní rysy:

io (A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-218 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence lehkého řetězce F(ab)'2 odvozená z MAE11

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:24:

Asp

Ile

Gin

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

val

1

5

10

15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Pro

val

Asp

20

25

30

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

35

40

45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

110

115

120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

125

130

135

. ins

Val

Val Cys Leu

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val

140

145

150

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

155

160

165

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

170

175

180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

185

190

195

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

200

205

210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

215

218

(2) INFORMACE K SEKVENCI ě:25:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 233 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-233 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce F(ab)'2 odvozená z MAE11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:25:

Glu Val 1

Gin

Leu

Val 5

Glu Ser

Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

10

15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150

Lys

Asp Tyr

Phe

Pro 155

Glu Pro

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

230

233

(2) INFORMACE K SEKVENCI č:26:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 233 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (ix) Základní rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Uměle připravená sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 1-233 (C) IDENTIFIKAČNÍ METODA:

(D) JINÉ INFORMACE: Sekvence těžkého řetězce F(ab)'2 odvozená z MAE11 15 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE č:26:

Glu Val 1

Gin Leu

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

Gin Pro Gly 15

5

10

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ile

Thr

20

25

30

Ser

Gly

Tyr

Ser

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

35

40

45

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Tyr

Ser

Gly

Glu

Thr

Lys

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Val

Lys

Gly Arg

Ile

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asp

Ser

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Phe

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

Phe

Gly

His

95

100

105

Trp

His

Phe

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

125

130

135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

140

145

150

1Π7 _

Lys Asp Tyr Phe Pro

Glu

Pro Val

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

155

160

165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

170

175

180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

185

190

195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

200

205

210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

215

220

225

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

230 233

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy modifikovaného polypeptidů, kterým je anti-IgE protilátka, která nevykazuje deaktivací v důsledku izomerace aspartylu, a která má afinitu k cílové molekule, kterou je IgE, která je rovná nebo větší, než u nemodifikovaného polypeptidů, vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje kroky:

   a) identifikace aspartylových zbytků, které jsou náchylné k izomeraci.

   b) substituce alternativních zbytků a prozkoumání výsledných mutantů z hlediska afinity vůči cílové molekule afinitním dozráváním za použití fágového displeje, přičemž tento způsob dále zahrnuje (i) substituci, deleci nebo inzerci jednoho nebo více kodonů v genu kódujícím polypeptid, což vede ke změně aminokyselinové sekvence polypeptidů, a k přípravě knihovny strukturně příbuzných polypeptidů fúzovaných s krycím proteinem fágu, (ii) vystavení jediné kopie každého příbuzného polypeptidů na povrchu fágemidové částice obsahující DNA kódující tento polypeptid a

   c) výběr upravených polypeptidů, ve kterých byl aspartylový zbytek změněn a které mají afinitu k cílové molekule, která je rovna nebo větší než u nemodifikovaného polypeptidů.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nemodifikovaná protilátka má lehký řetězec „E25“ sekvence SEQ ID 13 a sekvenci těžkého řetězce SEQ ID 14 uvedenou na obrázku 12.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že nahrazené zbytky jsou zbytky CDR1 lehkého řetězce Asp32Glu, Gln27Lys a Ser28Pro.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že další nahrazené zbytky jsou zbytky těžkého řetězce CDR2 Thr53Lys, Asp55Ser, Ser57Glu a Asn59Lys.
5. 5. Způsob zlepšení inhibičních vlastností uvolňování histaminu indukovaného alergeny ambrózie u protilátky ve farmaceutickém prostředku, vyznačující se tím, že je proveden způsobem podle nároku 1.
6. 6. Molekula protilátky anti-IgE, která má sekvenci lehkého řetězce a sekvenci těžkého řetězce, které mají alespoň 85% sekvenční identitu se sekvencemi SEQ ID č. 19 a 20 lehkého a těžkého řetězce protilátky „e26“ z obrázku 13 a které zahrnují zbytky proměnného CDR1 lehkého řetězce 32Glu, 27Lysa28Pro.
7. 7. Fragment protilátky anti-IgE podle nároku 6 obsahující sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z: fragmentu F(ab) (SEQ ID č. 19 až 20), fragmentu sFv (SEQ ID č. 22) nebo F(ab')₂ (SEQ ID č. 24 až 25).
8. 8. Molekula protilátky anti-IgE, která má sekvenci lehkého řetězce a sekvenci těžkého řetězce, které mají alespoň 85% sekvenční identitu se sekvencemi SEQ ID č, 19 a 21 lehkého a těžkého řetězce z protilátky „e27^w z obrázku 13 a které zahrnují zbytky CDR1 lehkého řetězce 32Glu, 27Lys a 28Pro.
9. 9. Fragment protilátky anti-IgE podle nároku 8, obsahující sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z: fragmentu F(ab) (SEQ ID č. 19 a 21), fragmentu sFv (SEQ ID Č. 23) nebo F(ab')₂ (SEQ ID č. 24 a 26).
10. 10. Molekula nukieové kyseliny kódující protilátku podle nároku 6.
11. 11. Molekula nukieové kyseliny kódující protilátku podle nároku 7.
12. 12. Nukleová kyselina kódující protilátku podle nároku 8.
13. 13. Molekula nukieové kyseliny kódující protilátku podle nároku 9.
14. 14. Farmaceutický prostředek pro snížení nebo prevenci produkce histaminu zprostředkované pomocí IgE nebo potíže zprostředkované IgE, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný excipíent(y) ve směsi s molekulou protilátky podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9.
15. 15. Použití prostředku obsahujícího terapeuticky účinné množství protilátky podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9 pro přípravu léku pro snížení nebo prevenci produkce histaminu zprostředkované pomocí IgE u savců.
16. 16. Použití prostředku obsahujícího terapeuticky účinné množství protilátky podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9 pro přípravu léku pro léčení poruchy zprostředkované pomocí IgE.