CN1639185A - 癌相关表位 - Google Patents

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CN1639185A CNA038051486A CN03805148A CN1639185A CN 1639185 A CN1639185 A CN 1639185A CN A038051486 A CNA038051486 A CN A038051486A CN 03805148 A CN03805148 A CN 03805148A CN 1639185 A CN1639185 A CN 1639185A
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Abstract

本发明提供了两种多肽组成的癌相关表位，其中，第一种多肽来自细胞角蛋白K8，而第二种多肽来自细胞角蛋白K18。所述癌相关表位在恶性转化期间，特别是在结肠，乳腺，卵巢，肾脏，肺和睾丸组织的恶性转化期间变得暴露。所述癌相关表位的暴露，是通过裂解并且除去细胞角蛋白K8和K18的N－末端肽产生的。本发明还提供了在癌组织中高达10M－1的癌相关表位，比正常组织中细胞角蛋白K8/K18复合物高出100倍。本发明提供了癌相关表位，结合实体，抗体以及使用所述表位，结合实体和抗体检测和治疗癌症的方法。

Description

癌相关表位
                      发明领域
本发明涉及癌相关表位，针对所述表位的抗体和多肽结合实体。本发明还涉及包括所述表位，抗体或结合实体的诊断试剂，并且涉及将所述表位，抗体或结合实体用于多种诊断或治疗目的的用途。本发明还涉及药用组合物，所述组合物包括表位，抗体或结合实体。
                      发明背景
恶性肿瘤有时候会表达特有的抗原或“标记”，这种抗原或“标记”提供了用于检测，以及可能地治疗所述癌症的手段。例如，可以纯化和制备所述肿瘤所特有的抗原，并用于制备抗体。由所述抗原产生的抗体可用作监测宿主体内肿瘤标记水平的检测工具，以便跟踪疾病的进程或治疗效果。将抗体与毒素连接，并且用于治疗癌症。在某些场合下，可以将所述抗原用作疫苗，以便刺激癌症患者体内的抗体反应和细胞免疫反应，并因此抑制所述癌的生长和扩散。
腺上皮细胞包括中间丝的网络，它主要由细胞角蛋白8(K8)和细胞角蛋白18(K18)的复合物组成。所述中间丝通过形成与桥粒型的特殊细胞-细胞接触连接的稳定网络，提供了对机械应力的弹性(1)。可以将中间丝分成小组，它在高等真核生物中是以组织特异性和细胞类型限制形式表达的(2)。在上皮细胞中，中间丝由化学计量上相等量的I型(较小的，酸性)和II型(较大的，中性或碱性)细胞角蛋白多肽组成，由它们形成有力的相互作用的异源二聚体(3-5)。
每一种细胞角蛋白多肽由中央的300-350个氨基酸的α-螺旋杆状结构域组成，其旁侧为具有各种长度和组成的非螺旋头部(N-末端)和尾部(C-末端)结构域。还可以将所述杆状结构域进一步细分成四个亚结构域(1A，1B，2A和2B)，在它们中间插有短的非螺旋接头(L1，L12，L2)。类似地，可以将所述头部结构域细分成三个结构域：末端结构域(E1)，可变结构域(V1)，和与最接近所述杆状结构域具有序列同源性的区(H1)(6)。
所述中间丝的组装似乎涉及若干相关的步骤，这些步骤取决于不同结构域之间的相互作用。一般来说，I型和II型细胞角蛋白多肽是平行排列的，以便产生卷曲螺旋型异源二聚体(7，8)。然后，通过两个二聚体的反向平行，交错，并排聚合，形成了四聚体。所述四聚体头对头的聚合，以便形成原丝，然后，由8个原丝组合产生最终的10纳米的丝(9)。
所述组装的杆由2个卷曲螺旋型亚基形成了原丝主链结构。不过，所述头部和尾部结构域不会被认为是所述丝状主链的一部分。相反，所述头部和尾部结构域似乎是横向突出的，并且导致了原丝和中间丝包装。所述头部和尾部结构域，还可能导致了中间丝与其他细胞成分的相互作用(10-12)。因此，缺乏所述头部和尾部结构域的细胞角蛋白，通常能够产生卷曲螺旋型和较高级别的横向相互作用。不过，缺乏丝的伸长性(13)。
I型细胞角蛋白8(K8)和II型细胞角蛋白18(K18)是诸如肠道，肝脏和乳腺管的上皮层的简单的或单层上皮的中间丝的主要成分(4)。这两种细胞角蛋白形成了异原二聚体和纤丝。对K8和K18细胞角蛋白进行的缺失研究业已证实了所述头部结构域在形成异源二聚体和纤丝方面发挥关键作用。共转染头部缺失的K8和头部缺失的K18，导致了分散的非纤维形状的形成，而共转染一个无头的和一个完整的细胞角蛋白的组合，导致了细胞质颗粒或原纤维的形成(12)。更详细的分析表明，在通过缺失每一种细胞角蛋白的前66个氨基酸对K8和K18进行N-末端截短时，仅仅产生了短的和不规则的中间丝(13)。完整的，或几乎完整的所述头部结构域的H1区，是产生所述短丝所必需的。在进一步去掉H1结构域的主要部分，以便在截短的K8(75-483号氨基酸)和K截短的18(67-385号氨基酸)之间形成复合物时，只形成了四聚体。H1区的重要性，显然与它参与两种异源二聚体的排列相关，并且与所形成的异源四聚体复合物的稳定化相关。
K8和K18的确切功能在很大程度上尚属未知，不过，最新的资料表明，这两种细胞角蛋白在天然发育中是重要的。以显性性状在转基因小鼠中表达的K18的突变体(arg89cys)，导致了肝脏和胰腺中间丝网络的明显破坏，导致了肝细胞不稳定性，以及相关的肝脏炎症和坏死(14，15)。K8或K19剔除小鼠的表型，包括完全或部分妊娠中期胚胎致死，这取决于存活动物的遗传学背景，雌性不育性以及成体结肠直肠增生(16-18)。其他资料业已表明，K8/K18丝在多种药物抗性中发挥作用(19-21)。
在细胞转化和肿瘤发育期间，K8和K18的细胞类型特异性得到保留，使得可以将它们用作组织类型鉴定的临床组织病理学标记(22-24)。假设K8和K18的细胞类型特异性在细胞转化和肿瘤发育期间是保守的，人们不能期望K8和K18细胞角蛋白能在癌细胞中表现出新的抗原性表位。
                      发明概述
本发明提供了包括两种独立多肽的分离的癌相关表位。第一种多肽可以具有细胞角蛋白8的SEQ ID NO：3，而第二种多肽可以具有细胞角蛋白18的SEQ ID NO：4。另外，第一种多肽可以具有细胞角蛋白8的SEQ ID NO：5，而第二种多肽可以具有细胞角蛋白18的SEQ IDNO：6。另外，第一种多肽可以具有细胞角蛋白8的SEQ ID NO：3，而第二种多肽可以具有细胞角蛋白18的SEQ ID NO：6。第一种多肽还可以具有细胞角蛋白8的SEQ ID NO：5，而第二种多肽可以具有细胞角蛋白18的SEQ ID NO：4。
所述分离的表位可以在腺癌细胞的丝状细胞质结构中检测到，不过，在正常细胞中基本不能检测到。可以检测到所述表位的腺癌的例子包括结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原细胞瘤睾丸癌细胞。可以将所述表位用于制备癌特异性抗体，并且用于通过检测癌症患者的血液，血清，粪便或尿液中的所述抗原表位或针对所述表位的抗体诊断癌症。因此，在一种实施方案中，所述表位是在试剂盒中提供的。
在另一种实施方案中，本发明提供了能够结合本发明的任何癌相关表位的抗体或其他结合实体。在一种实施方案中，所述抗体或结合实体，可以包括含有SEQ ID NO：7-35中任意一个的多肽。优选的抗体或结合实体，包括含有SEQ ID NO：21-35中任意一个的或它们的组合的多肽。在另一种实施方案中，本发明涉及含有SEQ ID NO：7-33的任意组合的多肽，其中，所述多肽可以结合本发明的表位。所述抗体或结合实体，能够由含有SEQ ID NO：36-39中任意一项的核酸编码。所述结合实体或抗体能够检测结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原细胞瘤睾丸癌细胞中的丝状细胞质结构中的癌相关表位。所述抗体或结合实体可以具有与它连接的标记或诊断显像制剂，本发明还提供了含有所述结合实体或抗体的组合物和试剂盒。在使用抗体时，所述抗体优选不是COU-1单克隆抗体。
本发明还提供了检测腺癌的方法，包括让本发明的抗体或结合实体与测试样品接触，并且检测所述抗体或结合实体是否与癌相关表位结合。所述抗体和结合实体可以具有与它连接的标记或诊断显像试剂。
本发明还提供了通过施用能够与所述癌相关表位结合的治疗有效量的本发明的抗体或结合实体治疗哺乳动物癌症的方法。所述抗体或结合实体，可以具有与它连接的可用于治疗的试剂。
本发明还提供了治疗哺乳动物癌症的方法，包括施用治疗有效量的本发明的癌相关表位。
本发明还提供了治疗哺乳动物癌症的方法，包括施用治疗有效量的蛋白酶抑制剂，它能通过抑制裂解细胞角蛋白8和细胞角蛋白18的蛋白酶，抑制本发明癌相关表位的形成。在一种实施方案中，所述蛋白酶是胰蛋白酶样蛋白酶，而所述抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂或胰蛋白酶抑制剂。
本发明还提供了鉴定突变型抗体的方法，包括将编码具有SEQ IDNO：7-35中任意一个的多肽的核酸与编码噬菌体外被蛋白的核酸融合，以便制备编码融合蛋白的重组核酸；使编码所述融合蛋白的重组核酸突变，以便制备编码所述突变型融合蛋白的突变核酸；在噬菌体表面上表达所述突变型融合蛋白，并且，选择与本发明的癌相关表位结合的噬菌体。
                    附图的说明
图1表示从结肠癌组织中纯化细胞角蛋白。
图1A提供了细胞角蛋白富集材料的洗脱曲线(OD280，实线)，将所述材料加样到装有含有SDS缓冲液的QFF阴离子交换柱(100-ml床体积)上，并且，用高达1M NaCl的线性梯度洗脱(短划线)。在所述盐梯度的第一个和第二个峰中，观察到了含有COU-1反应性的级份。
图1B提供了图1A所示洗脱曲线的一部分的放大示意图。该放大的曲线提供了各个级份(30-53)的OD280吸收(实线)，盐梯度(短划线)和COU-1反应性(点线)的比较。将所述级份包衣到ELISA孔上，并且与COU-1抗体起反应。
图1C提供了来自级份41-50，原始匀浆物(H)和加样到QFF阴离子交换柱(S)上的级份的电泳分离的蛋白的考马斯染色印迹。包括结肠癌细胞系Colon137(C137)的提取物作为对照。
图1D提供了来自级份41-50，原始匀浆物(H)和加样到QFF阴离子交换柱(S)上的材料的电泳分离的蛋白的Western印迹(用COU-1染色)。包括结肠癌细胞系Colon137(C137)的提取物作为对照。该印迹说明了通过QFF柱获得的细胞角蛋白的纯度，以及COU-1抗体与分子量为42-46kDa的3个条带的反应性。
图2提供了由结肠癌组织纯化的或在相同条件下由正常结肠上皮纯化的细胞角蛋白制剂的Western印迹分析。以10倍的稀释比例(1∶1，1∶10，1∶100)将匀浆物(homog)和阴离子交换层析纯化的材料(QFF)加样到SDS-PAGE凝胶上。将所述蛋白转移到PVDF膜上，并且，用COU-1或鼠抗-K18 Mab染色。尽管抗-K18抗体能对来自正常和恶性肿瘤结肠上皮的细胞角蛋白制剂强烈染色，但COU-1只能对来自癌组织的细胞角蛋白强烈染色(大约42-46kDa的三条带)，而不能对来自正常上皮的细胞角蛋白染色。
图3表示从结肠癌组织中纯化的细胞角蛋白的SDS-PAGE分离和N-末端测序，并且进一步说明了N-末端-截短的K8，K18和K19细胞角蛋白在结肠癌组织中的存在。
图3A是SDS-PAGE-分离的纯化细胞角蛋白的PVDF膜印迹。该膜的区域(a)是用考马斯染色的。所述膜的条还用COU-1抗体(b区)，小鼠抗-K8抗体(c区)和小鼠抗-K18抗体(d区)染色。以上数据表明，可以检测到10条不同的蛋白带(1-10)。分别对这10条带进行N-末端测序。
图3B提供了从结肠癌组织中分离的细胞角蛋白的氨基酸序列，该序列是通过N-末端测序测定的(SEQ ID NOs：54-61)。另外，示出了具有一组K8/K18抗体的不同的分离的细胞角蛋白的反应性。
图4提供了K8和K18细胞角蛋白的结构域的图谱(中央)。所述细胞角蛋白多肽的二级结构结构域，是通过氨基酸序列鉴定的。示出了中央杆状结构域，其旁侧为非螺旋N-末端头部结构域和非-螺旋C末端尾部结构域。结构域1A，1B，2A和2B是由接头L1，L12和L2间隔的杆的α螺旋亚结构域。该附图还提供了K8和K18 N-末端和C-末端缺失蛋白的示意性说明。缺失蛋白名称提供了所述缺失蛋白的起始和终止氨基酸残基编号。所有缺失蛋白是以GST融合蛋白形式表达的。在括号中示出了在与互补的角蛋白温育之后，缺失蛋白片段与COU-1的阳性(+)和阴性(-)反应性。
图5提供了一组C-末端缺失的K18片段的Western印迹分析。含有以GST融合蛋白形式表达的一组C-末端缺失的K18片段的SDS-PAGE凝胶进行平行电泳，转移到PVDF膜上，用山羊抗-GST抗体(A)，COU-1(B)或小鼠抗-K18抗体(CY-90)(D)染色。
图5A是以GST融合蛋白形式表达的一组电泳分离的C-末端缺失的K18蛋白片段的Western印迹，它是用山羊抗-GST抗体染色的。在顶部提供了不同K18蛋白片段的身份，其中，数字表示在不同的K18蛋白片段中存在哪些氨基酸。将GST蛋白制剂用作GST抗体染色的阳性对照。将MCF7癌细胞裂解物用作细胞角蛋白表位的阳性对照(看不到染色，因为在所述裂解物中不存在GST蛋白)。所述GST抗体染色表明，所有K18片段表达良好，并且，以大致相同的水平表达。
图5B是在图5A中提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K18片段的Western印迹的复制件，它是用COU-1抗体染色的。在该印迹上，COU-1只能与用作阳性对照的MCF7癌细胞裂解物起反应。没有观察到COU-1与每一种K18片段的明显结合。
图5C是在图5A中提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K18片段的Western印迹的复制件。不过，在对COU-1染色之前将该印迹与纯化的完整的K8一起温育。在与K8复合之后，COU-1能有效结合某些K18片段。
图5D是图5A中提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K18片段的Western印迹的复制件，它是用小鼠抗-K18抗体(CY-90)染色的。所述CY-90抗体能与相当于非复合的K18的C-末端部分的340-390号残基的表位起反应。
图6提供了一组C-末端缺失的K18片段的SDS-PAGE和Western印迹分析。SDS-PAGE凝胶含有一组以GST融合蛋白形式表达的C-末端缺失的K8片段，这些凝胶是平行电泳的，并且用考马斯蓝染色(A)，或者转移到PVDF膜上，并且用COU-1染色(B)，或在染色HMab COU-1之前，与纯化的完整K18一起温育(C)。
图6A是用考马斯蓝染色的一组电泳分离的C-末端缺失的K18片段的SDS-PAGE凝胶。在顶部提供了不同K8蛋白片段的身份，其中，数字表示存在于不同K18蛋白片段上的氨基酸的范围。考马斯蓝染色证实了所有片段是以大致相同的良好水平表达的。
图6B是图6A中所提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K8片段的Western印迹的复制件，它是用COU-1抗体染色的。没有观察到COU-1与单独的K8片段的结合。在该印迹上，COU-1只能与所述阳性对照-MCF7癌细胞裂解物起反应。
图6C是图6A中所提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K8片段的Western印迹的复制件，在对HMab COU-1染色之前，与纯化的完整K18一起温育。COU-1能有效结合K8片段，因为此时它们业已与K18形成了复合物。
图7提供了在用COU-1染色前通过电泳分离的，并且转移到PVDF膜上的，然后与不同的纯化的C-末端缺失的K8或K18片段一起温育以便形成K8/K18复合物的一组C-末端缺失的K8或K18片段的Western印迹分析。
图7A提供了通过电泳分离的，并且转移到PVDF膜上的一组C-末端缺失的K18(1-72)，K18(1-124)，K18(1-187)和完整K18蛋白片段的Western印迹。然后将所述膜与纯化的C-末端缺失的K8(1-129)片段一起温育，并且用COU-1染色，所述COU-1抗体能强有力地结合K18(1-124)/K8(1-129)复合物。
图7B是图7A中所提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K18片段的Western印迹，将该印迹与纯化的C-末端缺失的K8(1-233)片段一起温育，并且用COU-1染色。对于K18(1-187)/K8(1-233)复合物来说，缺少COU-1染色，或者只能看到微弱的染色。
图7C是在图7A中提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K18片段的Western印迹的复制件，将它与纯化的完整K8一起温育，并且用COU-1染色。对于K18(1-187)/完整的K8复合物来说，缺少COU-1染色，或只能观察到微弱的染色。
图7D提供了通过电泳分离，并且转移到PVDF膜上的一组C-末端缺失的K18(1-85)，K8(1-129)，K8(1-233)和完整的K8多肽的Western印迹。然后将所述膜与纯化的K8(1-124)一起温育，并且用COU-1染色。COU-1抗体能识别与K18(1-124)复合的K8(1-129)，以及与K18(1-124)复合的K8(1-233)。对于含有K8(1-85)的复合物来说，没有观察到COU-1结合。
图7E是在图7D中提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K8片段的Western印迹的复制件，将它与纯化的K18(1-187)一起温育，并且用COU-1染色。所述COU-1抗体能识别与K18(1-187)复合的K8(1-129)，以及与K18(1-187)复合的K8(1-233)。对于任何含有K8(1-85)的所有复合物来说，都没有观察到COU-1结合。
图7F是在图7D中提供的一组通过电泳分离的C-末端缺失的K8片段的复制件，将它与纯化的K18(1-213)一起温育，并且用COU-1染色。所述COU-1抗体能识别与K8(1-129)复合的K18(1-213)，以及与K8(1-233)K18(1-187)复合的K18(1-213)。对于所有含有K8(1-85)的复合物来说，都没有观察到COU-1结合。
图8提供了K8/K18异型复合物的N-末端头部结构域和相邻的杆状结构域的示意图。
图8A确定了K8(SEQ ID NO：62)和K18(SEQ ID NO：63)被蛋白裂解的位点(箭头)。对于细胞角蛋白K8来说，裂解是在Arg-22之后，在Arg-39之后，在Val-65之后，以及在Leu-75之后。对于细胞角蛋白K18来说，裂解是在Arg-49之后，以及在Ile-67之后。还示出了翻译后磷酸化(PO4，P)或糖基化(GlcNac，G)残基的位置。
图8B是说明如何裂解K8和K18细胞角蛋白的N-末端头部结构域能够导致构像变化，以便使得COU-1抗体能够接触所述表位的示意图。该示意图与在体内在癌细胞中进行的观察，以及对重组K8/K18复合物的形成进行的观察吻合。该示意图还说明了如何体外缺失两种细胞角蛋白之一的C-末端结构域的主要部分也能够人工暴露COU-1表位。该示意图还与对一组重组K8/K18缺失蛋白进行的复合物形成研究吻合。
图9表示COU-1优先与含有N-末端缺失的K8片段的异型的复合物结合。该附图提供了SDS-PAGE-分离的K8和K18蛋白的PVDF膜印迹。A区具有在用COU-1染色前通过电泳分离，然后与纯化的K18(50-430)起反应的完整的K8或K8(66-483)蛋白。B区具有在用COU-1染色之前，与纯化的完整的K18一起温育的完整的K8或K8(66-483)蛋白。C区具有在用COU-1染色之前通过电泳分离的，与纯化的K8(66-483)一起温育的K18(50-430)和完整的K18。在含有K8(66-483)/K18(50-430)和K8(66-483)/完整的K18的泳道中，观察到了COU-1强有力染色的大约75kDa的带(K8/K18蛋白+GST融合蛋白)。D区具有在用COU-1染色之前，通过电泳分离的，并且与纯化的完整K8一起温育的K18(50-430)和完整的K18蛋白。对于完整的K8/K18(50-430)和完整的K8/完整的K18来说，只观察到了微弱的染色。
图10表示通过ELISA测定的COU-1能优先结合截短形式的重组异型K8/K18复合物。异型的复合物，是通过将纯化的重组K8(1-129)或完整的K8与纯化的重组K18(1-124)或完整的K18以相等的摩尔比组合制备的。将该复合物的5μg/ml溶液用于对ELISA平板进行包衣。以系列稀释的形式，将ELISA平板与COU-1一起温育。检测结合的COU-1，并且通过AP-标记的二级抗人κ抗体和对硝基苯磷酸观察。如图所示，K8(1-129)/完整的K18复合物(菱形符号)和K8/K18(1-124)(圆形)，能比完整的K8/完整的K18复合物结合更多的COU-1抗体。
图11表示N-末端-截短的K8/K18复合物(A和E)和K18(B和F)在乳腺癌细胞中的分布。将乙醇固定的MCF7乳腺癌细胞分别与COU-1抗体(A和E)和CY90单克隆抗体(B和F)一起温育，所述抗体能结合完整的K18。用FITC-山羊抗人γ-链抗体检测结合的COU-1(绿色)，并且用德克萨斯红-山羊抗-小鼠IgG抗体检测结合的CY90(红色)。包括DIC图象(D和H)，以便观察所述细胞的组成。在两种抗体之间观察到了部分共同定位，它是通过融合的图象中的黄色所表现的(C和G)，不过，N末端截短的K8/K18复合物，主要存在于新形成的增殖的癌细胞中(箭头)，而K18结构等同地存在于所有细胞中(箭头端头)。
图12表示由COU-1识别的N-末端截短的K8/K18复合物(A和E)以及由Mab CY-90识别的K18(B和F)在乳腺癌细胞中的细胞分布。按图11所述对MCF7乳腺癌细胞进行处理和染色。包括DIC图象(D和H)，以便显示所述细胞的组成。尽管整个中间丝是由Mab CY-90染色的(箭头端头)，COU-1(箭头)只能对短的原纤维和球状结构染色。观察到了两种抗体的共同定位，正如通过融合的图象中的黄色所表现的(C和G)。
图13提供了人单克隆抗体COU-1的可变重链和轻链的氨基酸序列，与最密切相关的种系序列进行比较(SEQ ID NOs：7-20)。
                    发明详述
根据本发明，独立的K8细胞角蛋白多肽能与K18细胞角蛋白多肽结合，以便形成仅存在于癌细胞中，而不存在于正常细胞中的抗原表位。所述肿瘤表位，是通过对癌细胞中的K8/K18复合物的特异性蛋白裂解产生的。将出现在癌细胞中的所述新的表位用于制备抗体或结合实体，可将它用于诊断癌症，并且用于治疗癌症患者。
定义
术语“抗体”是以最广义的含义使用的，并且具体涵盖单克隆抗体(包括完整长度的单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如，Fab，F(ab′)2和Fv)，只要它们具有需要的生物学活性就行。
本文所使用的术语“结合实体”，是能结合通过本发明鉴定的表位的多肽。例如，本发明的结合实体是能结合包括两种独立的多肽，细胞角蛋白8多肽和细胞角蛋白18多肽的表位的多肽，其中，细胞角蛋白8多肽包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5，而细胞角蛋白18多肽包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。
术语“癌”或“癌的”表示或描述哺乳动物的生理学状态，它通常以失控的细胞生长为特征。所述癌的例子包括，但不局限于癌肿，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤和白血病。所述癌症的更具体的例子包括结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原细胞瘤睾丸癌组织。
所述COU-1抗体是通过人杂交瘤细胞系B9165(ECACC 87040201)生产的单克隆抗体。它能够与癌相关抗原结合，所述癌相关抗原表观分子量为大约43,000，而等电点在大约5.4-6.2的范围内。
短语“控制序列”表示在特定宿主生物中可操作地连接的编码序列表达所必需的DNA序列。例如，所述适用于原核生物的所述控制序列包括启动子，任选地包括操纵子序列，以及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，聚腺苷酸化信号和增强子。
参考抗原表位，抗体，核酸，蛋白，多肽或肽的“衍生物”具有相关的，但是不同于各自相应的参考抗原表位，抗体，核酸，蛋白，多肽或肽的序列或化学结构。所述衍生的抗原表位，抗体，核酸，蛋白，多肽或肽，通常是专门制备的，以便增强或整合在所述参考抗原性表位，抗体，核酸，蛋白，多肽或肽中不存在或只能微弱存在的某些化学，物理学或功能特性。衍生的核酸的核苷酸序列与参考核酸不同，而衍生的抗原表位，抗体，核酸，蛋白，多肽或肽分别与参考抗原表位，抗体，核酸，蛋白，多肽或肽的氨基酸序列不同。所述序列差异包括一种或多种取代，插入，添加，缺失，融合和截短，所述差异能够以任何组合形式存在。差异可能微小(例如一个核苷酸或氨基酸的差异)，或更明显，涉及到若干个或多个核苷酸或氨基酸。不过，所述衍生物的序列与所述参考序列没有这么大的差异，以至本领域技术人员不会认为所述衍生物和参照物在结构和/或功能方面相关。一般来说，差异是有限的，因此，所述参照物和衍生物在总体上是非常类似的，并且在很多区域是相同的。“变体”与“衍生的”核酸，蛋白，多肽或肽的差别在于，所述变体可以具有沉默的结构差异，所述差异不会明显改变所述参考核酸，蛋白，多肽或肽的化学，物理学或功能特性。相反，参照物和衍生的核酸，蛋白，多肽或肽之间的差别是为了改善所述参考核酸，蛋白，多肽或肽的一种或多种化学，物理学或功能特性而有意引入的改变。
术语“相同性”或“同源性”应当被理解成在对所述序列进行比对，并且在必要时引入缺口以便获得完整序列的最大百分相同性，并且没有将任何保守性取代视为所述序列相同性的一部分之后，表示候选序列上的氨基酸残基与比对的相应序列的残基的相同的百分比。N-或C-末端延伸或插入，都不被认为会降低相同性或同源性。用于比对的方法和计算机程序为本领域所熟知。序列相同性可以用序列分析软件测定(例如，序列分析软件包，Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 UniversityAve.，Madison，Wis.53705)。该软件通过确定各种取代，缺失和其他修饰的同源性程度，使类似的序列匹配。
“脂质体”是用于给哺乳动物输送药物(如本文所披露的抗原性表位和抗体突变体，以及任选地化疗制剂)的由各种类型脂类，磷脂，和/或表面活性剂组成的小泡。脂质体的成分通常是以双层形式排列的，类似于生物学膜的脂类排列。
“哺乳动物”表示被划分为哺乳动物的任何动物，包括人，家畜和农畜，非人灵长类，和动物园动物，体育动物或宠物，如狗，马，猫，牛等。
当核酸与另一种核酸序列形成功能性关系时，它就是“可操作地连接的”。它可以是以这种方式连接的基因和调控序列，使得当合适的分子(例如，转录激活蛋白)与所述调控序列结合时，可以进行基因表达。例如，编码前导序列或分泌前导序列的DNA可操作地与编码多肽的DNA连接，如果所述多肽是以参与所述多肽分泌的前蛋白形式表达的话；启动子或增强子可操作地与编码序列连接，如果它影响所述序列的转录的话；或核糖体结合位点可操作地与编码序列连接，如果它影响所述序列的转录的话；或核糖体结合位点可操作地与编码序列连接，如果它的定位有利于翻译的话。一般来说，“可操作地连接”表示被连接的DNA序列是连续的，对于分泌前导序列来说是连续的并且在阅读相。不过，增强子不一定是连续的。连接是通过在常见的限制位点上连接实现的。如果不存在所述位点的话，所述合成的寡核苷酸连接物或接头是按照常规操作使用的。
术语“蛋白”，“多肽”和“肽”是被交换使用的。它们表示通过肽或酰胺键连接在一起的两个(2)或两个以上氨基酸的链，与翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)无关。抗原，表位和抗体被专门用于本定义的范围内。本发明的多肽可以包括一个以上亚基，其中，每一个亚基是由独立的DNA序列编码的。
与抗原，抗体或结合实体多肽序列相关的短语“大体上相同的”，应当被理解成与参考多肽序列具有至少70％，优选75％，更优选80％，更优选85％，更优选90％，更优选95％，特别优选97％或98％的序列相同性的多肽。对于多肽来说，所述比对序列的长度，通常至少为25个氨基酸。对于核酸来说，所述长度通常为至少75个核苷酸。
参考抗原性表位，抗体片段，结合实体，核酸，蛋白，多肽或肽的“变体”分别是具有与相应的参考抗原性表位，抗体片段，结合实体，核酸，蛋白，多肽或肽相关，但是不同的序列的抗原性表位，抗体片段，结合实体，核酸，蛋白，多肽或肽。变体和参考抗原性表位，抗体片段，结合实体，核酸，蛋白，多肽或肽之间的差异是沉默的或保守性差异。变体核酸在核苷酸序列上与参考核酸不同，而变体抗原性表位，抗体片段，结合实体，蛋白，多肽或肽在氨基酸序列上分别与所述参考抗原性表位，抗体片段，结合实体，蛋白，多肽或肽不同。变体和参考抗原性表位，抗体片段，结合实体，核酸，蛋白，多肽或肽可能在序列上存在一个或多个取代，插入，添加，缺失，融合和截短的差异，这些差异能够以任何组合形式出现。差异可能微小(例如，一个核苷酸或氨基酸的差异)，或更明显。不过，所述变体的结构和功能与所述参照物的差别，没有大到使本领域技术人员不会认为所述变体和参照物在结构和/或功能方面是相关的程度。一般来说，差异是有限的，以便所述参照物和变体总体上非常类似的，并且在很多区域是相同的。
表位
根据本发明，通过对细胞角蛋白K8和细胞角蛋白K18蛋白的特异性蛋白水解裂解，在多种腺癌细胞中产生了一种或多种可以免疫学识别的新型表位，正常的，非癌细胞不具有所述新型表位。细胞角蛋白K8和细胞角蛋白K18蛋白是不同的蛋白。不过，它们能形成细胞角蛋白K8/细胞角蛋白K18复合物。所述可以免疫学识别的新型表位，包括来自细胞角蛋白K8和细胞角蛋白K18蛋白的氨基酸。
本发明的表位基本上不存在于正常组织中。不过，所述表位在结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原细胞瘤睾丸癌组织中会变得暴露。在增殖期间，本发明的表位主要存在于所述细胞类型的丝状细胞质结构中。测试表明，所述表位在某些肉瘤，恶性黑素瘤，B-淋巴瘤或胸腺瘤中检测不到。
下面提供了人细胞角蛋白K8的序列(SEQ ID NO：1)。
  1 SIRVTQKSYK VSTSGPRAFS SRSYTSGPGS RISSSSFSRV
 41 GSSNFRGGLG GGYGGASGMG GITAVTVNQS LLSPLSLEVD
 81 PNIQAVRTQE KEQIKTLNNK FASFIDKVRF LEQQNKMLET
121 KWSLLQQQKT ARSNMDNMFE SYINNLRRQL ETLGQEKLKL
161 EAELGNMQGL VEDFKNKYED EINKRTEMEN EFVLIKKDVD
201 EAYMNKVELE SRLEGLTDEI NFLRQLYEEE IRELQSQISD
241 TSVVLSMDNS RSLDMESIIA EVKAQYEDIA NRSRAEAESM
281 YQIKYEELQS LAGKHGDDLR RTKTEISEMN RNISRLQAEI
321 EGLKGQRASL EAAIADAEQR GELAIKDANA KLSELEAALQ
361 RAKQDMARQL REYQELMNVK LALDIDIATY RKLLEGEESP
401 LESGMQNMSI HTKTTGGYAG GLSSAYGDLT DPGLSYSLGS
441 SFGSGAGSSS FSRTSSSRAV VVKKIETRDG KLVSESSDVL
481 PK
下面提供了人细胞角蛋白K8的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)。
   1 TTCGGCAATT CCTACCTCCA CTCCTGCCTC CACCATGTCC
  41 ATCAGGGTGA CCCAGAAGTC CTACAAGGTG TCCACCTCTG
  81 GCCCCCGGGC CTTCAGCAGC CGCTCCTACA CGAGTGGGCC
 121 CGGTTCCCGC ATCAGCTCCT CGAGCTTCTC CCGAGTGGGC
 161 AGCAGCAACT TTCGCGGTGG CCTGGGCGGC GGCTATGGTG
 201 GGGCCAGCGG CATGGGAGGC ATCACCGCAG TTACGGTCAA
 241 CCAGAGCCTG CTGAGCCCCT TGTCCCTGGA GGTGGACCCC
 281 AACATCCAGG CCGTGCGCAC CCAGGAGAAG GAGCAGATCA
 321 AGACCCTGAA CAACAAGTTT GCCTCCTTCA TAGACAAGGT
 361 ACGGTTCCTG GAGCAGCAGA ACAAGATGCT GGAGACCAAG
 401 TGGAGCCTCC TGCAGCAGCA GAAGACGGCT CGAAGCAACA
 441 TGGACAACAT GTTCGAGAGC TACATCAACA ACCTTAGGCG
 481 GCAGCTGGAG ACTCTGGGCC AGGAGAAGCT GAAGCTGGAG
 521 GCGGAGCTTG GCAACATGCA GGGGCTGGTG GAGGACTTCA
 541 AGAACAAGTA TGAGGATGAG ATCAATAAGC GTACAGAGAT
 601 GGAGAACGAA TTTGTCCTCA TCAAGAAGGA TGTGGATGAA
 641 GCATACATGA ACAAGGTAGA GCTGGAGTCT CGCCTGGAAG
 681 GGCTGACCGA CGAGATCAAC TTCCTCAGGC AGCTGTATGA
 721 AGAGGAGATC CGGGAGCTGC AGTCCCAGAT CTCGGACACA
 761 TCTGTGGTGC TGTCCATGGA CAACAGCCGC TCCCTGGACA
 801 TGGAGAGCAT CATTGCTGAG GTCAAGGCAC AGTACGAGGA
 841 TATTGCCAAC CGCAGCCGGG CTGAGGCTGA GAGCATGTAC
 881 CAGATCAAGT ATGAGGAGCT GCAGAGCCTG GCTGGGAAGC
 921 ACGGGGATGA CCTGCGGCGC ACAAAGACTG AGATCTCAGA
 961 GATGAACCGG AACATCAGCC GGCTCCAGGC TGAGATTGAG
1001 GGCCTCAAAG GCCAGAGGGC TTCCCTGGAG GCCGCCATTG
1041 CAGATGCCGA GCAGCGTGGA GAGCTGGCCA TTAAGGATGC
1081 CAACGCCAAG TTGTCCGAGC TGGAGGCCGC CCTGCAGCGG
1121 GCCAAGCAGG ACATGGCCCG GCAGCTGCGT GAGTACCAGG
1161 AGCTGATGAA CGTCAAGCTG GCCCTGGACA TCGACATCGC
1201 CACCTACAGG AAGCTGCTGG AGGGCGAGGA GAGCCCGCTG
1241 GAGTCTGGGA TGCAGAACAT GAGTATTCAT ACGAAGACCA
1281 CCGGCGGCTA TGCGGGTGGT TTGAGCTCGG CCTATGGGGA
1321 CCTCACAGAC CCCGGCCTCA GCTACAGCCT GGGCTCCAGC
1361 TTTGGCTCTG GCGCGGGCTC CAGCTCCTTC AGCCGCACCA
1401 GCTCCTCCAG GGCCGTGGTT GTGAAGAAGA TCGAGACACG
1441 TGATGGGAAG CTGGTGTCTG AGTCCTCTGA CGTCCTGCCC
1481 AAGTGAACAG CTGCGGCAGC CCCTCCCAGC CTACCCCTCC
1521 TGCGCTGCCC CAGAGCCTGG GAAGGAGGCC GCTATGCAGG
1561 GTAGCACTGG GAACAGGAGA CCCACCTGAG GCTCAGCCCT
1601 AGCCCTCAGC CCACCTGGGG AGTTTACTAC CTGGGGACCC
1641 CCCTTGCCCA TGCCTCCAGC TACAAAACAA TTCAATTGCT
1681 TTTTTTTTTT TTGGTCCCAA AATAAAACCT CAGCTAGCTC
1721 TGCC
下面提供了人细胞角蛋白K18的序列(SEQ ID NO：2)。
  1 SFTTRSTFST NYRSLGSVQA PSYGARPVSS AASVYAGAGG
 41 SGSRISVSRS TSFRGGMGSG GLATGIAGGL AGMGGIQNEK
 81 ETMQSLNDRL ASYLDRVRSL ETENRRLESK IREHLEKKGP
121 QVRDWSHYFK IIEDLRAQIF ANTVDNARIV LQIDNARLAA
161 DDFRVKYETE LAMRQSVEND IHGLRKVIDD TNITRLQLET
201 EIEALKEELL FMKKNHEEEV KGLQAQIASS GLTVEVDAPK
241 SQDLAKIMAD IRAQYDELAR KNREELDKYW SQQIEESTTV
281 VTTQSAEVGA AETTLTELRR TVQSLEIDLD SMRNLKASLE
321 NSLREVEARY ALQMEQLNGI LLHLESELAQ TRAEGQRQAQ
361 EYEALLNIKV KLEAEIATYR RLLEDGEDFN LGDALDSSNS
401 MQTIQKTTTR RIVDGKVVSE TNDTKVLRH
下面提供了人细胞角蛋白K18的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。
  1 CGGGGTCGTC CGCAAAGCCT GAGTCCTGTC CTTTCTCTCT
 41 CCCCGGACAG CATGAGCTTC ACCACTCGCT CCACCTTCTC
 81 CACCAACTAC CGGTCCCTGG GCTCTGTCCA GGCGCCCAGC
121 TACGGCGCCC GGCCGGTCAG CAGCGCGGCC AGCGTCTATG
161 CAGGCGCTGG GGGCTCTGGT TCCCGGATCT CCGTGTCCCG
201 CTCCACCAGC TTCAGGGGCG GCATGGGGTC CGGGGGCCTG
241 GCCACCGGGA TAGCCGGGGG TCTGGCAGGA ATGGGAGGCA
281 TCCAGAACGA GAAGGAGACC ATGCAAAGCC TGAACGACCG
321 CCTGGCCTCT TACCTGGACA GAGTGAGGAG CCTGGAGACC
361 GAGAACCGGA GGCTGGAGAG CAAAATCCGG GAGCACTTGG
401 AGAAGAAGGG ACCCCAGGTC AGAGACTGGA GCCATTACTT
 441 CAAGATCATC GAGGACCTGA GGGCTCAGAT CTTCGCAAAT
 481 ACTGTGGACA ATGCCCGCAT CGTTCTGCAG ATTGACAATG
 521 CCCGTCTTGC TGCTGATGAC TTTAGAGTCA AGTATGAGAC
 561 AGAGCTGGCC ATGCGCCAGT CTGTGGAGAA CGACATCCAT
 601 GGGCTCCGCA AGGTCATTGA TGACACCAAT ATCACACGAC
 641 TGCAGCTGGA GACAGAGATC GAGGCTCTCA AGGAGGAGCT
 681 GCTCTTCATG AAGAAGAACC ACGAAGAGGA AGTAAAAGGC
 721 CTACAAGCCC AGATTGCCAG CTCTGGGTTG ACCGTGGAGG
 761 TAGATGCCCC CAAATCTCAG GACCTCGCCA AGATCATGGC
 801 AGACATCCGG GCCCAATATG ACGAGCTGGC TCGGAAGAAC
 841 CGAGAGGAGC TAGACAAGTA CTGGTCTCAG CAGATTGAGG
 881 AGAGCACCAC AGTGGTCACC ACACAGTCTG CTGAGGTTGG
 921 AGCTGCTGAG ACGACGCTCA CAGAGCTGAG ACGTACAGTC
 961 CAGTCCTTGG AGATCGACCT GGACTCCATG AGAAATCTGA
1001 AGGCCAGCTT GGAGAACAGC CTGAGGGAGG TGGAGGCCCG
1041 CTACGCCCTA CAGATGGAGC AGCTCAACGG GATCCTGCTG
1081 CACCTTGAGT CAGAGCTGGC ACAGACCCGG GCAGAGGGAC
1121 AGCGCCAGGC CCAGGAGTAT GAGGCCCTGC TGAACATCAA
1161 GGTCAAGCTG GAGGCTGAGA TCGCCACCTA CCGCCGCCTG
1201 CTGGAAGATG GCGAGGACTT TAATCTTGGT GATGCCTTGG
1241 ACAGCAGCAA CTCCATGCAA ACCATCCAAA AGACCACCAC
1281 CCGCCGGATA GTGGATGGCA AAGTGGTGTC TGAGACCAAT
1321 GACACCAAAG TTCTGAGGCA TTAAGCCAGC AGAAGCAGGG
1361 TACCCTTTGG GGAGCAGGAG GCCAATAAAA AGTTCAGAGT
1401 TCATTGGATG TC
本发明的表位由两种多肽组成，细胞角蛋白K8多肽和细胞角蛋白K18多肽。不过，所述细胞角蛋白K8多肽比具有482个氨基酸的完整长度的细胞角蛋白K8多肽短。另外，所述细胞角蛋白K18多肽比具有429个氨基酸的完整长度的细胞角蛋白K18多肽短。在某些实施方案中，所述细胞角蛋白K8多肽短于大约475个氨基酸，或短于大约450个氨基酸，或短于大约425个氨基酸，或短于大约400个氨基酸。在某些实施方案中，所述细胞角蛋白K18多肽短于大约425个氨基酸，或短于大约415个氨基酸，或短于大约400个氨基酸，或短于大约375个氨基酸。
本发明表位的一种例子构成两种独立蛋白的肽区，即细胞角蛋白K8(SEQ ID NO：3)和细胞角蛋白K18(SEQ ID NO：3)。下面提供了被命名为SEQ ID NO：3包括细胞角蛋白8序列的85-129号氨基酸的表位。
 1 AVRTQEKEQI KTLNNKFASF IDKVRFLEQQ NKMLETKWSL
41 LQQQ
下面提供了被命名为SEQ ID NO：4的还包括细胞角蛋白18的72-124号氨基酸的表位。
 1 AGMGGIQNEK ETMQSLNDRL ASYLDRVRSL ETENRRLESK
41 IREHLEKKGP QVR
在某些例子中，可能需要允许细胞角蛋白K8和细胞角蛋白K18多肽之间相互作用的合适的三维结构，以便获得最佳免疫反应性。因此可以将较长的细胞角蛋白多肽用作抗原。例如，可以将具有SEQ IDNO：5的细胞角蛋白K8多肽与合适的细胞角蛋白K18多肽一起使用，以便制备抗体。SEQ ID NO：5如下。
 84                           AVRTQE KEQIKTLNNK
101 FASFIDKVRF LEQQNKMLET KWSLLQQQKT ARSNMDNMFE
141 SYINNLRRQL ETLGQEKLKL EAELGNMQGL VEDFKNKYED
181 EINKRTEMEN EFVLIKKDVD EAYMNKVELE SRLEGLTDEI
221 NFLRQLYEEE IRELQSQISD TSVVLSMDNS RSLDMESIIA
261 EVKAQYEDIA NRSRAEAESM YQIKYEELQS LAGKHGDDLR
301 RTKTEISEMN RNISRLQAEI EGLKGQRASL EAAIADAEQR
341 GELAIKDANA KLSELEAALQ RAKODMARQL REYQELMNVK
381 LALDIDIATY RKLLEGEESP LESGMQNMSI HTKTTGGYAG
421 GLSSAYGDLT DPGLSYSLGS SFGSGAGSSS FSRTSSSRAV
461 VVKKIETRDG KLVSESSDVL PK
类似地，具有SEQ ID NO：6的细胞角蛋白K18多肽可以与合适的细胞角蛋白K8一起使用，以便制备抗体。SEQ ID NO：6如下。
 71            AGMGGIQNEK ETMQSLNDRL ASYLDRVRSL
101 ETENRRLESK IREHLEKKGP QVRDWSHYFK IIEDLRAQIF
141 ANTVDNARIV LQIDNARLAA DDFRVKYETE LAMRQSVEND
181 IHGLRKVIDD TNITRLQLET EIEALKEELL FMKKNHEEEV
221 KGLQAQIASS GLTVEVDAPK SQDLAKIMAD IRAQYDELAR
261 KNREELDKYW SQQIEESTTV VTTQSAEVGA AETTLTELRR
301 TVQSLEIDLD SMRNLKASLE NSLREVEARY ALQMEQLNGI
341 LLHLESELAQ TRAEGQRQAQ EYEALLNIKV KLEAEIATYR
381 RLLEDGEDFN LGDALDSSNS MQTIQKTTTR RIVDGKVVSE
421 TNDTKVLRH
本发明还预期抗原表位“片段”。所述片段不包括完整长度的细胞角蛋白，不过，确实编码相对SEQ ID NO：3-6的抗原性表位而言，具有类似或改善了的免疫学特性的抗原。因此，诸如SEQ ID NO：3-6的抗原性表位片段可以小到大约6个氨基酸，大约9个氨基酸，大约12个氨基酸，大约15个氨基酸，大约17个氨基酸，大约18个氨基酸，大约20个氨基酸，大约25个氨基酸，大约30个氨基酸，或更多个氨基酸。一般，本发明的片段抗原性表位可以具有任何大小的上限，只要它相对于通过SEQ ID NO：3-6中任意一个的组合所形成的表位具有相似的或改进的免疫学特性就行。
本发明还预期包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4肽组合的融合蛋白。所述融合蛋白将两种肽连接在一起，以便所述肽能够更容易地形成本发明的癌相关表位。
融合多肽通常可以使用标准技术制备，包括化学缀合。融合多肽还能够以重组多肽形式表达，在表达系统中能够相对非融合多肽以更高的水平生产。简单地讲，可以分别组装编码所述多肽成分的DNA序列，并且连接到合适的表达载体上。用或不用肽接头将编码一种多肽成分的DNA序列的3’末端与编码第二种多肽成分的DNA序列的5’末端连接，以便所述序列的读框同相。这样能够翻译成一种融合多肽，它保留了两种多肽成分的生物学活性。
可以将接头序列用于隔离第一种和第二种多肽成分为足以确保每一种多肽折叠成它的二级和三级结构的距离。所述接头可以是肽，多肽，烷基链或其他合适的间隔分子。
使用本领域所熟知的标准技术，将肽或肽接头序列整合入融合多肽。合适的肽接头序列可以根据以下因素选择：(1)它们采用灵活延伸的构象的能力；(2)它们不采用可以与第一和第二种肽上的功能性表位相互作用的二级结构的能力；和(3)缺乏有可能与所述多肽功能性表位起反应的疏水性或带电荷的残基。在某些实施方案中，所述肽接头序列包括Gly，Asn和Ser残基。诸如Thr和Ala的其他接近中性的氨基酸，也可用于所述接头序列中。可以用作接头的氨基酸序列包括披露于以下文献中的序列：Maratea等，Gene 40：39-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258-8262，1986；美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180。所述接头序列的长度一般为1-大约50个氨基酸。当所述第一和第二种多肽具有非必需N-末端氨基酸区域时，接头序列通常是不必要的，所述区域可以用于隔离功能性结构域，并且阻止空间干扰。
所述融合多肽可以包括本文所披露的多肽表位(例如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4肽)以及不相关的免疫原性蛋白，如能够诱导记忆反应的免疫原性蛋白。所述蛋白的例子包括破伤风，结核和肝炎蛋白(例如，参见Stoute等New Engl.J Med.，336：86-91，1997)。
在一种实施方案中，将能够促进针对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4肽表位的免疫反应发展的肽或多肽用作所述接头。所述免疫学融合配偶体可以源于分枝杆菌属(Mycobacterium)。例如，所述免疫学融合配偶体可以是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberduosis)产生的Ra12片段。Ra12组合物以及将其用于增强异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的方法，披露于美国专利申请流水号60/158,585中，该文献的内容被以全文形式收作本文参考。简单地讲，Ra12表示一种多核苷酸区，它是结核分枝杆菌MTB32A核酸的亚序列。MTB32A是由结核分枝杆菌的有毒和无毒菌株中的基因编码的分子量为32KD的丝氨酸蛋白酶。业已披露了MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列(例如，美国专利申请流水号60/158,585；还可参见Skeiky等，Infection and Immun.(1999)67：3998-4007，被收作本文参考)。MTB32A编码序列的C-末端片段能以高水平表达，并且在整个纯化过程中保持可溶性多肽的形式。另外，Ra12能够增强与它融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。一种有用的Ra12融合多肽包括相当于MTB32A的192-323号氨基酸残基的14KD C-末端片段。其他有用的Ra12多核苷酸，通常包括至少大约15个连续的核苷酸，至少大约30个核苷酸，至少大约60个核苷酸，至少大约100个核苷酸，至少大约200个核苷酸，或至少大约300个核苷酸，它能编码Ra12多肽的一部分。
Ra12多核苷酸可以包括天然序列(即编码Ra12多肽或它的一部分的内源序列)，或者可以包括所述序列的变体。Ra12多核苷酸变体可以包括一个或多个取代，添加，缺失和/或插入，以便相对于包括天然Ra12多肽的融合多肽而言，它所编码的融合多肽的生物学活性不会明显减弱。变体优选与编码天然Ra12多肽或它的一部分的多核苷酸序列具有至少大约70％的相同性，更优选至少大约80％的相同性，最优选至少大约90％的相同性。
在另一种实施方案中，免疫学融合配偶体源于蛋白D，它是格兰氏阴性细菌流感嗜血菌(Haemophilus influenza)B的表面蛋白(WO91/18926)。蛋白D的有用部分，大体上包括该蛋白的前1/3(例如，N-末端的前100-110个氨基酸)。另外，所述蛋白D融合配偶体可以是脂肪酸化(lipidated)的。在某些优选实施方案中，脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包含在N-末端，以便提供具有额外外源T-细胞表位的多肽，并且提高在大肠杆菌(E.coli)中的表达水平(因此发挥表达增强子的作用)。所述脂类尾巴能确保所述抗原呈递到抗原呈递细胞的最佳呈递作用。其他融合配偶体包括源于流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。通常，使用N-末端81个氨基酸，尽管可以使用包括T-辅助表位的不同的片段。
在另一种实施方案中，所述免疫性融合配偶体是被称为LYTA的蛋白或它的一部分(优选C-末端部分)。LYTA源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，它能合成被称为酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；Gene 43：265-292，1986)。LYTA是自溶素，它能特异性地降解肽聚糖主链上的某些键。LYTA蛋白的C-末端结构域，决定对胆碱的亲和力，或对某些胆碱类似物，如DEAE的亲和力。业已将这种特性用于开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。业已描述了在氨基末端包括C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化(参见Biotechnology 10：795-798，1992)。在一种优选实施方案中，可以将LYTA的重复部分整合到融合多肽中。重复部分存在于始于178号残基的C-末端区。特别优选的重复部分整合了188-305号残基。
另一种说明性实施方案涉及融合多肽，以及编码它们的多核苷酸，其中，所述融合配偶体包括能够将一种多肽引导到内体/溶酶体区室的导向信号，正如在美国专利号5,633,234中所描述的。本发明的免疫原性多肽在与该导向信号融合时，能够更有效地与II型MHC分子结合，以便提供所述多肽的CD4+T-细胞特异性的体内刺激的增强。
本发明的多肽和融合蛋白是用多种已知合成和/或重组技术中的任意一种制备的。少于大约150个氨基酸的多肽和融合蛋白可以通过合成方法制备，使用本领域普通技术人员所熟知的技术。在一种说明性例子中，所述多肽是用任何可以通过商业渠道获得的固相技术合成的，如Merrifield固相合成方法，其中，氨基酸是依次添加到生长的氨基酸链上的。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963。用于多肽自动合成的设备可以从诸如PerkinElmer/Applied BioSystems Division(Foster City，Calif.)的供应商那里购买，并且可以按照生产商的说明操作。
本发明的小的和大的融合蛋白和多肽表位，可以通过本领域技术人员可以获得的任何其他方法生产。例如，所述融合蛋白和多肽表位，可以通过使用多种方法中的任意一种向表达载体中插入编码选择的融合蛋白或多肽表位的核酸而以重组方式制备。一般来说，使用本领域已知的技术将编码所需蛋白或多肽的核酸插入合适的限制性内切酶位点。一般，参见Sambrook等，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition(January 15，2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN：0879695765；Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishing Associates and WileyInterscience，NY(1989))。采用本领域技术人员所公知的标准连接技术构建含有融合蛋白或多肽表位的表达载体。
将所述连接的核酸序列可操作地与合适的转录或翻译调控元件连接，所述元件有利于本发明融合蛋白和多肽表位的表达。决定蛋白表达的调控元件仅位于所述多肽的编码区的5’末端。类似地，结束翻译的终止密码子和转录终止信号，仅存在于编码所述融合蛋白或多肽表位的核酸序列的3’末端。在构建了具有可操作地连接的调控元件的编码感兴趣的多肽的核酸之后，可以将该表达盒导入宿主细胞，并且可以表达所编码的多肽。
一般，本发明的多肽组合物(包括融合多肽)是分离的。“分离的”多肽是从它的原始环境中取出的多肽。例如，天然存在的蛋白或多肽如果是与它的天然系统中的某些或所有共同存在的材料分离的话，它就是分离的。所述多肽还可以是纯化的，例如，所述多肽表位和融合蛋白的纯度可以至少为大约90％，或至少大约95％，或至少大约99％。
抗体和结合实体
本发明的细胞角蛋白表位是以均匀的小斑点形式分布在活的癌和腺癌细胞表面上的。免疫组织学研究业已证实，本发明的与癌相关的表位与正常的细胞角蛋白8和18不同，可用于区分恶性肿瘤和正常结肠上皮，以及区分肝脏中的结肠癌转移，以及周围的正常肝细胞。另外，本发明的癌相关表位与活体检查的恶性肿瘤部位内的增殖细胞的膜结合，而静息细胞在进行所述表位的染色时具有丝状形式。
本发明提供了针对本发明表位的抗体制剂和结合实体，例如，抗体或结合实体能够结合来自细胞角蛋白K8的至少一种肽和来自细胞角蛋白K18的至少一种肽的抗原混合物。来自细胞角蛋白K8的肽的例子包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5。来自细胞角蛋白K18的肽的例子包括SEQ ID NO：4和S EQ ID NO：6。
在一种实施方案中，所述抗体或结合实体可以包括含有SEQ IDNO：7-35，47-49中任意一个的多肽。在某些实施方案中，抗体和结合实体包括基本由SEQ ID NO：21-35，47-49中任意一个组成的多肽。在其他实施方案中，抗体和结合实体包括基本由SEQ ID NO：8，10，12，15，17，19，22，24，27，29或32中任意一个组成的多肽。在另一种实施方案中，本发明涉及含有SEQ ID NO：7-33，47-49中的任意组合的结合实体多肽，其中，所述多肽能够结合本发明的表位。
本发明还提供了编码本发明的抗体样多肽的核酸。在一种实施方案中，所述核酸编码含有SEQ ID NO：7-35，47-49中任意一个的多肽，其中，所述核酸编码能够结合本发明表位的多肽。在另一种实施方案中，所述核酸编码SEQ ID NO：7-33，47-49中两个或两个以上的组合，其中，所述核酸编码能够结合本发明表位的结合实体多肽。优选的核酸编码基本由SEQ ID NO：21-33中任意一个或SEQ ID NO：8，10，12，15，17，19，22，24，27，29或32中任意一个的多肽组成。本发明的其他核酸包括核苷酸序列SEQ ID NO：36-39。
本发明还提供了通过现有方法制备的能够结合本发明表位的抗体。
属于血浆蛋白家族的抗体分子被称为免疫球蛋白，它的基本结构模块，免疫球蛋白折叠或结构域被以各种形式用于免疫系统的很多分子中，以及用于其他生物学识别系统的很多分子中。标准抗体是四聚体结构，它由两个相同的免疫球蛋白重链和两个相同的轻链组成，并且分子量为大约150,000道尔顿。
抗体的重链和轻链由不同的结构域组成。每一个轻链具有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，而每一个重链具有一个可变结构域(VH)和三或四个恒定结构域(CH)。例如，参见Alzari，P.N.，Lascombe，M.-B.&Poljak，R.J.(1988)Three-dimensionalstructure of antibodies。Annu.Rev.Immunol.6，555-580。将由大约110个氨基酸残基组成的每一个结构域折叠成特有的β-夹心结构，它是由两个β-折叠，即免疫球蛋白折叠彼此相互包装形成的。VH和VL结构域各自具有三个互补决定区(CDR1-3)，它们是环，或转角，在所述结构域的一端连接β-链。轻链和重链的可变区通常导致了抗原特异性，尽管不同的链对特异性的作用并不总是相同的。抗体分子业已进化，以便通过使用六个随机的环(CDRs)，结合大量的分子。
根据其重链的恒定区的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白划分成不同的类型。存在至少五种主要类型的免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且可以将其中的若干种进一步划分成亚型(同种型)，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。相当于不同类型免疫球蛋白的重链恒定区结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。根据其恒定区的氨基酸序列，可以将抗体的轻链划分成被称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维结构是众所周知的。
术语“可变的”在用于表示抗体的可变结构域时，是指可变结构域的某些部分在不同抗体的序列之间明显不同的事实。所述可变结构域是用于结合的，并且决定每一种特定抗体对它的特定抗原的特异性。不过，所述可变性在抗体的可变结构域中不是均匀分布的。它集中在被称为互补决定区(CDRs)的三个片段，所述片段在轻链和重链可变结构域中又被称为超变区。
可变结构域的更高度保守的部分被称为构架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个FR区，主要采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，它能形成环状连接，并且，在某些场合下形成所述β折叠结构的一部分。每一条链上的CDRs通过FR区保持在紧密相邻的距离内，且与来自其他链的CDRs保持在紧密相邻的距离内，导致抗体的抗原结合位点的形成。所述恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，但是，具有各种效应子功能，如在抗体依赖型细胞毒性中参与所述抗体。
因此，可用于本发明中的抗体可以是多种形式中的任意一种，包括完整的免疫球蛋白，抗体片段，如Fv，Fab，以及类似的片段，包括可变结构域互补决定区(CDR)的单链抗体，以及类似形式，所有形式都属于本文所使用的广义的术语“抗体”的范围。本发明预期多克隆或单克隆抗体的任何特异的使用，并且，不局限于能识别并且与特殊抗原发生免疫反应的抗体。在优选实施方案中，在下文所描述的治疗和筛选方法的场合下，使用抗体或它的片段，它对本发明的抗原或表位来说是免疫特异性的。在某些实施方案中，所述抗体不是COU-1抗体。
术语“抗体片段”表示完整长度抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。对抗体的木瓜蛋白酶消化，产生了两种相同的抗原结合片段，被称为Fab片段，它们各自具有一个抗原结合位点，和残余的″Fc″片段，这样的称谓是因为它的便于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了F(ab′)2片段，它具有能够交联抗原的两个抗原结合片段，以及残余的其他片段(该片段被称为PFc′)。其他片段可以包括双功能抗体(diabodies)，线性抗体，单链抗体分子，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。正如在本文中所使用的，与抗体相关的“功能性片段”表示Fv，F(ab)和F(ab′)2片段。
因此，本发明所预期的抗体片段是不完整长度的抗体，不过，相对于诸如COU-1抗体的抗体而言，确实具有类似的或改进的免疫学特性。因此，本发明预期COU-1抗体片段和/或具有SEQ ID NO：7-35抗体中的任意一个的多肽的片段。所述抗体片段可以小到大约4个氨基酸，5个氨基酸，6个氨基酸，7个氨基酸，9个氨基酸，大约12个氨基酸，大约15个氨基酸，大约17个氨基酸，大约18个氨基酸，大约20个氨基酸，大约25个氨基酸，大约30个氨基酸或更多。
一般，本发明的抗体片段可以具有任意的大小上限，只要它具有与能够以特异性结合通过SEQ ID NO：3-6中任意一个的组合形成的表位的抗体具有相似的或相同的免疫学特性就行。所述参考抗体可以是COU-1抗体。例如，结合实体和轻链抗体片段可以具有少于大约200个氨基酸，少于大约175个氨基酸，少于大约150个氨基酸，或少于大约120个氨基酸，如果所述抗体片段与轻链抗体亚基相关的话。另外，结合实体和重链抗体片段，可以具有少于大约425个氨基酸，少于大约400个氨基酸，少于大约375个氨基酸，少于大约350个氨基酸，少于大约325个氨基酸，或少于大约300个氨基酸，如果所述抗体片段与重链抗体亚基相关的话。
抗体片段保留了选择性地与它的抗原，表位或受体结合的某些能力。某些抗体片段的类型是按以下方式定义的：
(1)Fab是包括抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可以通过用木瓜蛋白酶消化完整的抗体产生，以便得到完整的轻链和重链的一部分。
(2)Fab′是抗体分子的片段，可以通过用胃蛋白酶处理完整的抗体，然后进行还原，以便产生完整的轻链和重链的一部分而获得。用每个抗体分子获得了两个Fab′片段。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1结构域的羧基末端增加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
(3)(Fab′)2是抗体的片段，它可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体而不进行随后的还原而获得。F(ab′)2是通过两个二硫键维持在一起的两个Fab′片段的二聚体。
(4)Fv是包括完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区由具有紧密的，非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每一个可变结构域的三个CDRs相互作用，以便在VH-VL二聚体的表面上形成抗原结合位点。总之，这六个CDRs产生了所述抗体的抗原结合特异性。不过，即使是一个可变结构域(或仅包括对抗原特异的三个CDRs的Fv的一半)，也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力比完整结合位点要低。
(5)单链抗体(″SCA″)，被定义为包括通过合适的多肽接头连接的轻链可变区，重链可变区的基因工程产生的分子，如遗传学融合的单链分子。所述单链抗体还被称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。一般，Fv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头，它使得sFv能够形成抗原结合所需要的结构。有关sFv的综述，可以参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，N.Y.，pp.269-315(1994)。
术语“双功能抗体”表示具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包括与相同的多肽链(VH-VL)上的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用不是太短的接头，使得以上两个结构域能够在相同的链上配对，强制所述结构域与另一条链上的互补结构域配对，以便产生两个抗原结合位点。例如，双功能抗体更详细地描述于以下文献中：EP 404,097；WO 93/11161，和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
本领域技术人员可以获得用于制备多克隆抗体的方法。例如，参见Green等，Production of Polyclonal Antisera，in：Immunochemical Protocols(Manson，ed.)，pages 1-5(HumanaPress)；Coligan等，Production of Polyclonal Antisera inRabbits，Rats Mice and Hamsters，in：Current Protocols inImmunology，section 2.4.1(1992)，这些文献被收作本文参考。
单克隆抗体的制备同样是常规的。例如，参见Kohler &Milstein，Nature，256：495(1975)；Coligan等，sections 2.5.1-2.6.7；和Harlow等，in：Antibodies：A Laboratory Manual，page 726(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，以上文献被收作本文参考。可以通过多种业已完善的技术，从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。所述分离技术包括用A蛋白琼脂糖进行的亲和层析，大小排阻层析，和离子交换层析。例如，参见Coligan等，sections 2.7.1-2.7.12和sections 2.9.1-2.9.3；Barnes等，Purification of lmmunoglobulin G(IgG)，in：Methods inMolecular Biology，Vol.10，pages 79-104(Humana Press(1992)。
体外和体内操作单克隆抗体的方法，为本领域技术人员所熟知。例如，用于本发明的单克隆抗体，可以通过杂交瘤方法制备，该方法最初是由Kohler和Milstein，Nature 256，495(1975)描述的，或者可以通过重组方法制备，例如，在美国专利号4,816,567中所描述的。本发明所使用的单克隆抗体，还可以利用描述于以下文献中的技术从噬菌体抗体文库中分离：Clackson等Nature 352：624-628(1991)，以及Marks等，J.Mol Biol.222：581-597(1991)。另一种方法涉及通过重组方式使单克隆抗体人源化，以便制备含有人类特异性和可识别的序列的抗体。有关综述参见Holmes等，J.Immunol.，158：2192-2201(1997)和Vaswani等，AnnalsAllergy，Asthma & Immunol.，81：105-115(1998)。
本文所使用的术语“单克隆抗体”表示从一群大体上均匀的抗体中获得的抗体，即构成所述群体的每一种抗体是相同的，可能天然发生的突变除外，这些突变可能以很少的数量存在。单克隆抗体是高度特异的，针对一个抗原位点的。另外，与常规多克隆抗体制剂不同，所述抗体通常包括针对不同决定簇(表位)的不同的抗体，每一种单克隆抗体是针对所述抗原上的一个决定簇的。除了它们的特异性之外，所述单克隆抗体的优点在于，它们是通过杂交瘤培养物合成的，没有受到其他免疫球蛋白的污染。修饰词“单克隆”表示抗体的特征，表明所述抗体的特征是从大体上均匀的抗体群体获得的，并且不被理解成通过任何特性方法生产所述抗体。
本发明的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，以及所述抗体的片段，只要它们具有需要的生物学活性就行，其中，重链和/或轻链的一部分与源于特定物种的抗体的相应的序列相同或同源，或属于特定的抗体类型或亚型，而所述链的其他部分与源于另一种物种的相应的序列相同或同源，或属于另一种抗体类型或亚型(美国专利号4,816,567)；Morrison等Proc.Natl.AcadSci.81，6851-6855(1984)。
制备抗体片段的方法也是本领域所公知的(例如参见Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York，(1988)，被收作本文参考)。本发明的抗体片段可以通过对所述抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌中表达所述片段的DNA而制备。抗体片段可以通过用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体的常规方法获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶对抗体进行酶促裂解产生，以便提供被称为F(ab′)2的5S片段。可以用硫醇还原制剂进一步裂解该片段，并且通过对二硫键的裂解任选地产生了巯基的封闭基团，以便产生3.5S Fab′单价片段。另外，使用胃蛋白酶的酶促裂解，直接产生了两个单价Fab′片段和一个Fc片段。例如，所述方法描述于以下文献中：美国专利号4,036,945和4,331,647，以及其中所包含的参考文献。以上专利被以全文形式收作本文参考。
还可以使用裂解抗体的其他方法，如分离重链，以便形成单价轻链片段，进一步裂解片段，或其他酶促，化学，或遗传学技术。只要所述片段能够结合由完整的抗体识别的抗原就行。例如，Fv片段包括VH和VL链的结合。这种结合可以是非共价的，或所述可变链可以通过分子间二硫键结合或通过诸如戊二醛的化学物质交联。Fv片段优选包括通过肽接头连接的VH和VL链。所述单链抗原结合蛋白(sFv)是通过构建包括通过寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因而制备的。将所述结构基因插入表达载体，然后将所述载体导入诸如大肠杆菌的宿主细胞。所述重组宿主细胞合成了一条多肽链，通过接头肽连接两个V结构域。例如，用于生产sFvs的方法描述于以下文献中：Whitlow等，Methods：a Companion toMethods in Enzymology.Vol.2，page 97(1991)；Bird等，Science242：423-426(1988)；Ladner等，美国专利号4,946,778；和Pack等，Bio/Technology 11：1271-77(1993)。
另一种形式的抗体片段是编码一个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最低识别单位”)通常参与抗原识别和结合。CDR肽可以通过克隆或构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因而获得。例如，所述基因是通过聚合酶链反应，由抗体生产性细胞的RNA合成所述可变区而制备的。例如，参见Larrick等，Methods：a Companion toMethods in Enzymology.Vol.2，page 106(1991)。
本发明涉及人和人源化形式的非人(例如鼠)抗体。所述人源化抗体是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或它的片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其他抗原结合序列)，它包括源于非人免疫球蛋白的最低序列。对于大部分来说，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，来自所述受体的互补决定区(CDR)的残基被来自诸如小鼠，大鼠或兔子的非人物种的具有需要的特异性，亲和力和能力的CDR(供体抗体)的残基所取代。
在某些例子中，所述人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基所取代。另外，人源化抗体可以包括在所述受体抗体或输入的CDR或构架序列中都不存在的残基。进行上述修饰，是为了进一步调整和优化抗体性能。一般，人源化抗体大体上包括至少一种，通常两种可变结构域中的全部，其中，全部或基本上全部CDR区相当于非人免疫球蛋白的CDR区，且FR区的全部或基本上全部，是人免疫球蛋白共有序列的结构域。所述人源化抗体最好还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。有关细节可以参见：Jones等，Nature 321，522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332，323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2，593-596(1992)；Holmes，等，J.Immunol.，158：2192-2201(1997)；和Vaswani，等，Annals Allergy，Asthma &Immunol.，81：105-115(1998)。
尽管可以获得制备抗体的标准化方法，抗体大小，抗体的多链结构以及存在于抗体上的六个结合环的复杂性，构成了对改进和生产大量抗体的障碍。因此，本发明还预期使用结合实体，它包括能够识别并且结合本发明表位的多肽。
因此，本发明还涉及能够结合本发明的癌相关表位的抗体和其他结合实体。在某些实施方案中，所述抗体和结合实体具有SEQ ID NO：7-33。下面提供了SEQ ID NO：7-33的序列。
SEQ ID NO：      序列                         Ab区
SEQ ID NO：7     GAEVKKPGASVKVSCKASDYTFS      VH FR1
SEQ ID NO：8     SYYMH                        VH CDR1
SEQ ID NO：9     WVRQAPGQGLEWMG               VH FR2
SEQ ID NO：10    IINPSGGSTSYAQKFQG            VH CDR2
SEQ ID NO：11    RVTMTRDTSTNTVYMELSSLRSE      VH FR3
                 DTAVYYCAR
SEQ ID NO：12    DQVVVAATLSNYGMDV             VH CDR3
SEQ ID NO：13    WGQGTTVTVSSAST               VH FR4
SEQ ID NO：14    ELTQSPGTLSLSPGERATLSC        VL FR1
SEQ ID NO：15    RASQSVSSSYLA                 VL CDR1
SEQ ID NO：16    WYQQKPGQAPRLLIY              VL FR2
SEQ ID NO：17    DASNRAT                      VL CDR2
SEQ ID NO：18    GIPARFSGSGSGTDFTLTISS        VL FR3
                 LEPEDFAVYYC
SEQ ID NO：19    QQGTNWGIA                    VL CDR3
SEQ ID NO：20    FGQGTRLDIKR                  VL FR4
SEQ ID NO：21    TQSPGTLSLSPGERATLSC          VL FR1
SEQ ID NO：22    GASSRAT                      VL CDR2
SEQ ID NO：23    GIPDRFSGSGSGTDFTLTI          VL FR3
                 SRLEPEDFAAYYC
SEQ ID NO：24    QQYGNSPPYT                   VL CDR3
SEQ ID NO：25    FGQGTKLEI                    VL FR4
SEQ ID NO：26    TQSPDSLAVSLGERATINC          VL FR1
SEQ ID NO：27    KSSQSLLYSSNNKNYTA            VL CDR1
SEQ ID NO：28    WYQQKPGQPPKLLIY              VL FR2
SEQ ID NO：29    WASTRES                      VL CDR2
SEQ ID NO：30    GVPDRFSGSGSGT                VL FR3
SEQ ID NO：31    DFTLTISSLQAEDVAGYYC          VL FR3
SEQ ID NO：32    QQYYSTPPM                    VL CDR3
SEQ ID NO：33    FGQGTKVEI                    VL FR4
从能分泌COU-1抗体的细胞中，分离编码肽SEQ ID NO：7-33的核酸。尽管不是所有的通过这种筛选方法分离的核酸编码的多肽都能结合癌相关表位，业已通过噬菌体展示和其他实验证实肽SEQ ID NO：7-33在结合方面发挥作用。另外，在不同抗体片段克隆的类似区域，发现了若干种差异。例如，分离的可变轻链CDR1片段具有RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：15)以及KSSQSLLYSSNNKNYLA(SEQ ID NO：27)。类似地，分离的可变轻链CDR2片段具有DASNRAT(SEQ ID NO：17)，GASSRAT(SEQ ID NO：22)或WASTRES(SEQ ID NO：29)。另外，分离的可变轻链CDR3片段具有QQYGNSPPYT(SEQ ID NO：24)或QQYYSTPPM(SEQ ID NO：32)。因此，并不是所有的克隆都相同。
有多种蛋白可以起着蛋白支架的作用，结合结构域(例如，SEQ IDNO：7-33，47-49肽的任意一种或它的变体)可以与它连接。所述结合结构域能够结合或与本发明的癌相关表位相互作用，而所述蛋白构架只能保持和稳定所述结合结构域，以便它们能够结合。可以使用多种蛋白构架。例如，可以使用噬菌体衣壳蛋白，综述参见Clackson &Wells，Trends Biotechnol.12：173-184(1994)。实际上，按本文所描述的方法使用所述噬菌体衣壳蛋白，以便筛选SEQ ID NO：7-33肽(参见实施例)。另外，业已将噬菌体衣壳蛋白用作支架用于展示随机肽序列，包括牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(Roberts等，PNAS 89：2429-2433(1992))，人生长激素(Lowman等，Biochemistry 30：10832-10838(1991))，Venturini等，Protein Peptide Letters1：70-75(1994))，和链球菌属的IgG结合结构域(O′Neil等，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb，L，.ed.)pp.517-524，Academic Press，San Diego(1994))。所述支架业已展示了一种随机化的环或区域，可以对它进行修饰，以便包括本文所提供的结合结构域(例如SEQ ID NO：7-33，47-49)。
研究人员业已将小的74个氨基酸的α-淀粉酶抑制剂Tendamistat用作丝状噬菌体M13的呈递构架。McConnell，S.J.，& Hoess，R.H.，J.Mol.Biol.250：460-470(1995)。Tendamistat是来自唐德链霉菌(Streptomyces tendae)的β-折叠蛋白。它具有多种特征，使得它成为用于结合肽的有吸引力的支架，这些特征包括它的小的尺寸，稳定性，以及高分辨NMR和X-射线结构数据的可利用性。Tendamistat的总体拓扑结构，类似于免疫球蛋白结构域的拓扑结构，通过一系列的环将两个β折叠连接在一起。与免疫球蛋白结构域不同，Tendamistat的β折叠通过两个，而不是一个二硫键保持在一起，产生了所述蛋白的明显的稳定性。通过与存在于免疫球蛋白中的CDR环的类比，Tendamistat的环可以发挥类似的功能，并且能够通过体外诱变方便地随机化。不过，Tendamistat源于唐德链霉菌，并且在人体内可以具有免疫原性。不过，它的小的尺寸，可能降低或抑制它的免疫原性。
另外，业已将III型纤连蛋白结构域用作蛋白构架，结合实体可以与它连接。例如，将所述III型纤连蛋白结构域用作结合实体(例如CDR肽)的蛋白构架的序列，载体和克隆方法披露于美国专利申请号20020019517中。纤连蛋白是一种大型蛋白，它在细胞外基质的形成和细胞-细胞相互作用方面发挥重要作用。纤连蛋白由三种类型(I，II和III)的小的结构域的很多重复组成。Baron，M.，Norman，D.G.& Campbell，I.D.(1991)Protein modules Trends Biochem.Sci.16，13-17。III型纤连蛋白是免疫球蛋白超家族的大的亚家族(Fn3家族或s-型Ig家族)的一部分。Fn3家族包括细胞粘附分子，细胞表面激素和细胞因子受体，侣伴蛋白，和碳水化合物结合结构域。有关综述，参见Bork，P.& Doolittle，R.F.(1992)Proposedacquisition of an animal protein domain by bacteria.Proc.Nati.Acad.Sci.USA 89，8990-8994；Jones，E.Y.(1993)Theimmunoglobulin superfamily Curr.Opinion Struct.Biol.3，846-852；Bork，P.，Hom，L.& Sander，C.(1994)Theimmunoglobulin fold.Structural classification，sequencepatterns and common core.J.Mol.Biol.242，309-320；Campbell，I.D.& Spitzfaden，C.(1994)Building proteins withfibronectin type III modules Structure 2，233-337；Harpez，Y.& Chothia，C.(1994)Many of the immunoglobulin superfailydomains in cell adhesion molecules and surface receptorsbelong to a new structural set wllich is close to thatcoutaining variable domains J.Mol.Diol.238，528-539。
在所述免疫系统中，选择特异性抗体，并且用大型文库扩增(亲和力成熟)。在所述免疫细胞中采用的组合技术，可以通过诱变和制备结合实体的组合文库而模拟。因此，结合实体，抗体片段和抗体可以通过展示类型技术制备，包括，但不局限于噬菌体展示，逆转录病毒展示，核糖体展示和其他使用本领域众所周知的技术的技术，并且，所得到的分子可以进行其他成熟，如亲和力成熟，因为所述技术是本领域所熟知的。Wright和Harris，同上。Hanes和Plucthau PNAS USA94：4937-4942(1997)(核糖体展示)，Parmley和Smith Gene 73：305-318(1988)(噬菌体展示)，Scott TIBS 17：241-245(1992)，Cwirla等PNAS USA 87：6378-6382(1990)，Russel等Nucl.AcidsResearch 21：1081-1085(1993)，Hoganboom等Immunol.Reviews130：43-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH 10：80-84(1992)，以及美国专利号5,733,743。
因此，本发明还提供了使抗体突变以便优化它们的亲和力，选择性，结合强度和/或其他理想特性的方法。突变型抗体表示一种抗体的氨基酸序列变体。一般，所述突变抗体上的一个或多个氨基酸残基与存在于参考抗体上的相应残基不同。所述突变抗体与所述参考氨基酸必须具有少于100％的序列相同性或相似性。一般，突变抗体与参考抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％的氨基酸序列相同性或相似性。突变抗体与参考抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列优选具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的氨基酸序列相同性或相似性。突变抗体的一种方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。
例如，可以将使用噬菌体展示的亲和力成熟用作制备突变抗体的一种方法。使用噬菌体展示的亲和力成熟表示描述于以下文献中的方法：Lowman等，Biochemistry 30(45)：10832-10838(1991)，还可参见Hawkins等，J.Mol Biol.254：889-896(1992)。尽管对以下说明没有更多限制，可以将该方法简单地描述为涉及若干抗体超变区在多个不同位点的突变，其目标是在每一个位点产生所有可能的氨基酸取代。因此，所产生的抗体突变体，是以单价形式作为融合蛋白由丝状噬菌体颗粒表达的。通常对M13的基因III产物进行融合。各种突变体的噬菌体表达，可以通过对感兴趣的性状的若干轮选择进行循环，例如，结合亲和力或选择性。分离感兴趣的突变体并且测序。所述方法更详细地描述于以下文献中：美国专利5,750,373，美国专利6,290,957和Cunningham，B.C.等，EMBO J.13(11)，2508-2515(1994)。
在一种实施方案中，本发明提供了如下方法，即操纵抗体多肽或抗体编码性核酸，制备能识别与COU-1抗体相同的表位的具有改善了的结合特性的抗体和抗体片段。
突变COU-1抗体的部分的所述方法包括将编码具有SEQ ID NO：7-35中的任意一个或SEQ ID NO：8，10，12，15，17，19，22，24，27，29，32，47，48或49中任意一个的多肽的核酸融合在编码噬菌体外被蛋白的核酸上，以便制备编码融合蛋白的重组核酸，使编码所述融合蛋白的重组核酸突变，以便制备编码突变融合蛋白的突变核酸，在噬菌体的表面上表达所述突变融合蛋白，并且选择与本发明表位结合的噬菌体。
在一种实施方案中，所述方法包括将具有SEQ ID NO：7-35的任意组合或SEQ ID NO：8，10，12，15，17，19，22，24，27，29，32，47，48或49的任意组合的多肽的核酸与编码噬菌体外被蛋白的核酸融合，以便制备编码融合蛋白的重组核酸，使编码所述融合蛋白的重组核酸突变，以便制备编码突变融合蛋白的突变核酸，在噬菌体表面上表达所述突变融合蛋白，并且选择能结合本发明表位的噬菌体。
在另一种实施方案中，所述方法包括将编码SEQ ID NO：26，15，27，22，23，24和25中的每一个的多肽的核酸与编码噬菌体外被蛋白的核酸融合，以便制备编码融合蛋白的重组核酸，使编码所述融合蛋白的重组核酸突变，以便制备编码突变融合蛋白的突变核酸，在噬菌体表面上表达所述突变融合蛋白，并且选择能结合本发明表位的噬菌体。
在另一种实施方案中，所述方法包括将编码具有SEQ ID NO：26，27，28，29，30，31，32和33中的每一个的多肽的核酸与编码噬菌体外被蛋白的核酸融合，以便制备编码融合蛋白的重组核酸，使编码所述融合蛋白的重组核酸突变，以便制备编码突变融合蛋白的突变核酸，在噬菌体表面上表达所述突变融合蛋白，并且选择能结合本发明表位的噬菌体。
在另一种实施方案中，所述方法涉及将编码具有SEQ ID NO：SEQID NO：34或SEQ ID NO：35的多肽的核酸与编码噬菌体外被蛋白的核酸融合，以便制备编码融合蛋白的重组核酸，使编码所述融合蛋白的重组核酸突变，以便制备编码突变融合蛋白的突变核酸，在噬菌体表面上表达所述突变融合蛋白，并且选择能结合本发明表位的噬菌体。SEQ ID NO：34和35编码可以结合本发明表位的有用的可变轻链。下面提供了SEQ ID NO：34。
TQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAT
GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAAYYCQQYGNSPPYTFGQGTKLEI
下面提供了SEQ ID NO：35。
TQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIY
WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAGYYCQQYYSTPPM
FGQGTKVEI
所述方法还涉及将包括与COU-1相关的可变重链和轻链(例如SEQID NO：36-39中的任意一个)的核酸与编码噬菌体外被蛋白的核酸融合，以便制备编码融合蛋白的重组核酸，使编码所述融合蛋白的重组核酸突变，以便制备编码突变融合蛋白的突变核酸，让所述突变融合蛋白在噬菌体表面上表达，并且选择能结合本发明表位的噬菌体。
因此，本发明涉及编码与COU-1相关的可变重链的核酸，例如，下面提供的SEQ ID NO：36。
GGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCGTCAGTGAAGGTTTCCTGCAA
GGCATCTGGATACACCTTCAGCAGCTACTATATGCACTGGGTGCGAC
AGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTAGT
GGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCAT
GACCAGGGACACGTCCACGAACACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGC
CTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGT
GGTGGTAGCTGCTACTTTGTCCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCC
AAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
在另一种实施方案中，本发明涉及编码与COU-1相关的可变轻链的核酸，例如，下面提供的SEQ ID NO：37。
GAGCTCACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGA
GCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGTAGCAGCTACTTA
GCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT
GATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAG
TGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGA
AGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGGGTACCAACTGGGGGATCGC
CTTCGGCCAAGGGACACGACTGGATATTAAACGA
在另一种实施方案中，本发明涉及编码与COU-1相关的可变轻链的核酸，例如，下面提供的SEQ ID NO：38(又被称为L8)。
ACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC
CTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGG
TACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCA
TCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTC
AGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTT
TGCAGCGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAACTCACCTCCGTACACTTTT
GGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCA
在另一种实施方案中，本发明涉及编码与COU-1相关的可变轻链，例如，SEQ ID NO：39(又被称为T5)。
ACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACC
ATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTCTTTTATACAGCTCCAACAATAAG
AACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGTTG
CTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTC
AGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTG
CAGGCTGAAGATGTGGCAGGTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACT
CCTCCGATGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATC
所述方法还包括构建含有编码本发明多肽的核酸的可复制的表达载体，例如，包括SEQ ID NO：7-35中任意一个的多肽，或包括SEQ IDNO：36-39中任意一个的核酸。所述核酸还可以编码包括本发明多肽(例如SEQ ID NO：7-35中任意一个)和天然或野生型噬菌体外被蛋白的至少一部分的融合蛋白。所述表达载体还可以具有可操作地与编码所述融合蛋白的核酸连接的转录调控元件。在编码所述抗体多肽的核酸内的一个或多个特定位点上对所述载体进行突变，以便形成含有相关的核酸的质粒的家族或“文库”，它们各自编码略微不同的抗体多肽。用所述质粒家族转化合适的宿主细胞。用具有编码所述噬菌体外被蛋白的基因的辅助噬菌体感染所述转化过的宿主细胞，并且，在适合形成重组噬菌粒颗粒的条件下培养转化过的，感染过的宿主细胞。每一种重组噬菌粒在噬菌粒颗粒表面上具有大致一个拷贝的融合蛋白。为了筛选所述噬菌粒，让所述噬菌粒颗粒接触本发明的表位或抗原。将能结合所述表位或抗原的噬菌粒颗粒与不能结合所述表位或抗原的噬菌粒颗粒分离。另外，优选通过分别克隆具有可接受的结合特性的噬菌粒并再次测试它们的亲和力一次或多次进行其他轮次的选择。还可以将能适当结合所述表位或抗原的噬菌粒颗粒中的所述质粒分离，克隆，甚至再次突变，以便进一步选择所述需要的抗体特性，例如，具有良好的结合亲和力。
所述方法可应用于由一种以上亚基多肽组成的多肽复合物。在这种情况下，将编码每一种感兴趣的亚基的核酸分别融合在噬菌体外被蛋白上，并且分别分析它们的结合特性。
本领域技术人员所使用的任何克隆方法，都可用于制备表达载体，用于所述亲和力成熟/噬菌体展示方法中。例如，本领域技术人员可以方便地采用已知的克隆方法，将编码抗体超变区的核酸融合在编码噬菌体外被蛋白的核酸上。例如，参见Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989；Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，2001。
因此，本发明涉及选择具有所需特性的抗体和/或抗体片段或多肽的方法。所述理想的特性可以包括对本发明表位的增强了的结合亲和力或选择性。
本发明的抗体和抗体片段，是分离的抗体和抗体片段。分离的抗体是业已鉴定的并且从生产它的环境的成分中分离和/或回收的抗体。其生产环境的污染成分，是会干扰所述抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可能包括酶，激素，和其他蛋白类或非蛋白类溶质。术语“分离的抗体”还包括重组细胞内的抗体，因为将不存在所述抗体的天然环境中的至少一种成分。不过，一般来说，分离的抗体可以通过至少一个纯化步骤制备。
如果需要的话，本发明的抗体可以通过任何可利用的方法纯化。例如，所述抗体可以通过将抗体制剂结合在固体支持物上进行亲和纯化，将用于制备所述抗体的抗原结合在所述支持物上。在洗去污染物之后，可以通过已知方法洗脱所述抗体。本领域技术人员可以了解免疫学技术领域的多种常见技术，这些技术被用于纯化和/或浓缩多克隆抗体，以及单克隆抗体(例如，参见Coligan等，Unit 9，CurrentProtocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，被收作本文参考)。
在优选实施方案中，所述抗体通过至少三种不同的方法衡量是纯化的：1)通过Lowry方法测定超过抗体重量95％，最优选超过抗体重量的99％；2)通过使用转杯式测序仪可以达到足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或3)在还原或非还原条件下，使用考马斯蓝或优选使用银染料，通过SDS-PAGE能达到均匀性。
抗原，结合实体和抗体变体和衍生物
本发明还提供了本发明所鉴定的抗原性表位，结合实体和抗体片段的变体和衍生物。例如，SEQ ID NO：3，4，5或6抗原性表位的任何衍生物或变体，都被认为属于本发明的范围，特别是当所述变体或衍生物在作为疫苗用于预防或治疗腺癌时，保留了或具有改善的特异性，或者是用于检测腺癌的改进的标记。类似地，本发明预期SEQ ID NO：7-35抗体多肽的任何衍生物或变体，特别是当所述变体或衍生的抗体多肽对本发明的抗原性表位具有改善了的特异性或结合亲和力时，例如，具有SEQ ID NO：3，4，5或6的抗原性表位。
本发明的衍生物和变体抗原性表位和抗体片段是通过在参考抗原表位和抗体片段的N-末端和/或C-末端缺失或添加一个或多个氨基酸；在所述参考抗原表位和抗体片段内的一个和多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或在所述参考抗原表位和抗体片段内的一个和多个位点取代一个或多个氨基酸而由所述参考抗原表位和抗体产生的。因此，本发明的抗原表位和抗体片段能够以多种方式改变，包括氨基酸取代，缺失，截短和插入。
例如，所述变体和衍生的抗原表位和抗体片段，可能是通过人类操作产生的。例如，使用上文所描述的噬菌体展示的亲和力成熟技术，可用于制备具有本发明的抗原表位和抗体片段的变体和衍生物。用于突变或改变多肽序列的其他方法，在本领域中通常是可以获得的。例如，抗原表位和抗体片段的氨基酸序列可以通过在编码所述抗原表位和抗体片段上的DNA的突变制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中也是可以获得的。例如，参见Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154，367(1987)；美国专利号4,873,192；Walker and Gaastra，eds.，Techniques in Molecular Biology，MacMillan PublishingCompany，New York(1983)，以及这些文章中所引用的参考文献。不会对感兴趣的肽的结构完整性和/或生物学活性产生负面影响的合适的氨基酸取代的指南，可以从Dayhoff等的模型中查阅到(Atlas ofProtein Sequence and Structure)，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D.(1978))，被收作本文参考。
本发明的抗原表位和抗体片段的衍生物和变体与SEQ ID NO：3-35中任意一个的氨基酸位置具有至少大约90％，91％，92％，93％或94％的相同性，并且通常具有相对具有SEQ ID NO：3-35中任意一个的抗原表位和抗体片段的类似的或改善了的免疫学特性。在理想的实施方案中，抗原表位和抗体片段的衍生物和变体与SEQ ID NO：3-35中任意一个的氨基酸位置具有至少大约95％或96％的相同性，并且，通常具有类似于和好于具有SEQ ID NO：3-35的抗体片段的抗原表位的免疫学特性。在更优选的实施方案中，所述抗原表位和抗体片段衍生物以及变体与SEQ ID NO：3-35中任意一个的氨基酸位置具有至少大约97％或98％的相同性，并且通常具有相对具有SEQ ID NO：3-35的抗原表位和抗体片段的类似的或改善了的免疫学特性。
“类似的或改善了的免疫学特性”表示SEQ ID NO：3，4，5或6抗原表位的衍生物保留了或具有改善了的作为疫苗用于预防或治疗腺癌的活性，或是用于检测腺癌的改善了的标记。类似地，SEQ ID NO：7-35抗体多肽的衍生物或变体当它们具有对本发明的抗原表位，例如具有SEQ ID NO：3，4，5或6的抗原表位的改善了的特异性或结合亲和力时，就具有“类似的或改善了的免疫学特性”。
所述抗原表位，结合实体和抗体片段以及它的衍生物和变体的氨基酸残基，可以是遗传学编码的L-氨基酸，天然存在的非遗传学编码的L-氨基酸，合成的L-氨基酸或上述任意一种的D-对映体。在本发明中用于二十种遗传学编码的L-氨基酸和常见非编码氨基酸的氨基酸符号是常规的，并且如表1所示。
                                                              表1
氨基酸 单-字母符号  通用缩写
丙氨酸 A  Ala
精氨酸 R  Arg
天冬酰胺 N  Asn
天冬氨酸 D  Asp
半胱氨酸 C  Cys
谷氨酰胺 Q  Gln
谷氨酸 E  Glu
甘氨酸 G  Gly
组氨酸 H  His
异亮氨酸 I  Ile
亮氨酸 L  Leu
赖氨酸 K  Lys
甲硫氨酸 M  Met
苯丙氨酸 F  Phe
脯氨酸 P  Pro
丝氨酸 S  Ser
苏氨酸 T  Thr
色氨酸 W  Trp
酪氨酸 Y Tyr
缬氨酸 V Val
β-丙氨酸 Bala
2，3-二氨基丙酸 Dpr
α-氨基异丁酸 Aib
N-甲基甘氨酸(肌氨酸) MeGly
鸟氨酸 Orn
瓜氨酸 Cit
叔-丁基丙氨酸 t-BuA
叔-丁基甘氨酸 t-BuG
N-甲基异亮氨酸 MeIle
苯基甘氨酸 Phg
环己基丙氨酸 Cha
正亮氨酸 Nle
萘基丙氨酸 Nal
吡啶基丙氨酸
3-苯并噻吩丙氨酸
4-氯苯丙氨酸 Phe(4-Cl)
2-氟苯丙氨酸 Phe(2-F)
3-氟苯丙氨酸 Phe(3-F)
4-氟苯丙氨酸 Phe(4-F)
表霉胺 Pen
1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸 Tic
β-2-噻吩丙氨酸 Thi
甲硫氨酸亚砜 MSO
高精氨酸 Harg
N-乙酰赖氨酸 AcLys
2，4-二氨基丁酸 Dbu
ρ-氨基苯丙氨酸 Phe(pNH2)
N-甲基缬氨酸 MeVal
高半胱氨酸 Hcys
高丝氨酸 Hser
ε-氨基己酸 Aha
δ-氨基戊酸 Ava
2，3-二氨基丁酸 Dab
本发明范围内的本发明抗原表位和抗体片段的变体，可以具有用类似化学和/或物理学特性的一种氨基酸取代的一个或多个氨基酸，只要所述变体肽的主链部分具有相对于具有SEQ ID NO：3-35中任意一个的抗原表位和抗体片段的类似的或改善了的免疫学特性就行。衍生的抗原表位和抗体片段可以具有其他肽或化学部分，以及用具有不同化学和/或物理特性的氨基酸取代过的一个或多个氨基酸，只要所述衍生的抗原表位和抗体片段具有相对于具有SEQ ID NO：3-35中任意一个的抗原表位和抗体片段的类似的或改善了的免疫学特性就行。
可以相互取代以便形成本发明的变体抗原表位和抗体片段的氨基酸通常属于类似的类型或亚型。正如本领域技术人员所公知的，可以将氨基酸划分成三种主要类型：亲水性氨基酸，疏水性氨基酸和半胱氨酸样氨基酸，这主要取决于所述氨基酸侧链的特征。这些主要类型可以进一步划分成亚型。亲水性氨基酸包括具有酸性，碱性或极性侧链的氨基酸，而疏水性氨基酸包括具有芳族或非极性侧链的氨基酸。非极性氨基酸可以进一步细分成包括脂族氨基酸。本文所使用的氨基酸类型的定义如下：
“疏水性氨基酸”表示具有在生理学pH条件下不带电荷的侧链的氨基酸，并且它是被水溶液排斥的。遗传学编码的疏水性氨基酸的例子包括Ile，Leu和Val。非遗传学编码的疏水性氨基酸的例子包括t-BuA。
“芳族氨基酸”表示具有包括至少一个具有共轭的π-电子系统的环的侧链(芳族基团)的疏水性氨基酸。芳族基团还可以用诸如烷基，烯基，炔基，羟基，磺酰基，硝基和氨基，以及其他基团的取代基取代。遗传学编码的芳族氨基酸的例子包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。常见的非遗传学编码的芳族氨基酸包括苯基甘氨酸，2-萘基丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，和4-氟苯丙氨酸。
“非极性氨基酸”表示具有在生理学pH下通常是不带电荷的并且是无极性的侧链的疏水性氨基酸。遗传学编码的非极性氨基酸的例子包括甘氨酸，脯氨酸，和甲硫氨酸。非编码的无极性氨基酸的例子包括Cha。
“脂族氨基酸”表示具有饱和的或不饱和的直链，支链或环状烃侧链的非极性氨基酸。遗传学编码的脂族氨基酸的例子包括Ala，Leu，Val和Ile。非编码的脂族氨基酸的例子包括NIe。
“亲水性氨基酸”表示具有由水溶液吸引的侧链的氨基酸。遗传学编码的亲水性氨基酸的例子包括Ser和Lys。非编码的亲水性氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”表示具有pK值小于7的侧链的亲水性氨基酸。酸性氨基酸通常具有在生理学pH下带负电荷的侧链，这是由于丧失了氢离子。遗传学编码的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸和谷氨酸。
“碱性氨基酸”表示具有pK值大于7的侧链的亲水性氨基酸。碱性氨基酸通常具有在生理学pH下带正电荷的侧链，这是由于与水合氢离子的结合产生的。遗传学编码的碱性氨基酸的例子包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。非遗传学编码的碱性氨基酸的例子包括非环状氨基酸鸟氨酸，2，3-二氨基丙酸，2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“非极性氨基酸”表示具有在生理学pH下不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，不过，它具有如下键，其中由两个原子所共同拥有的电子对由所述原子之一更紧密地保持。遗传学编码的极性氨基酸的例子包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遗传学编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸，N-乙酰赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
“半胱氨酸样氨基酸”表示具有能够与另一个氨基酸残基的侧链形成共价键的侧链的氨基酸，如二硫键。通常，半胱氨酸样氨基酸一般具有包括至少一个硫醇(SH)基团的侧链。遗传学编码的半胱氨酸样氨基酸的例子包括半胱氨酸。非遗传学编码的半胱氨酸样氨基酸的例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
正如本领域技术人员所能够理解的，上述分类不是绝对的。若干种氨基酸具有一种以上特有的特征，并且因此能够包括在一种以上类型中。例如，酪氨酸同时具有芳族环和极性羟基。因此，酪氨酸具有双重特性，并且能够包含在芳族和极性类型中。类似地，除了能够形成二硫键之外，半胱氨酸还具有非极性特征。因此，尽管不能严格划分为疏水性或非极性氨基酸，在很多场合下，可将半胱氨酸用于赋予多肽的疏水性。
在本发明的变体多肽上存在的或取代它上面的氨基酸的某些通常会遇到的不是遗传学编码的氨基酸包括，但不局限于β-丙氨酸(b-Ala)和其他ω-氨基酸，如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔-丁基丙氨酸(t-BuA)；叔-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；对-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高丝氨酸(hSer)。所述氨基酸同样属于上面所定义的类型。
上述遗传学编码的和非编码的氨基酸的分类归纳在下面的表2中。应当理解的是，表2仅仅是用于说明目的的，而不是要穷举可以包括本文所描述的变体和衍生的抗原表位和抗体片段的氨基酸残基。可用于制备本文所描述的变体和衍生的多肽的其他氨基酸残基可以从以下文献中查阅到，例如，Fasman，1989，CRC Practical Handbookof Biochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.，以及它所引用的参考文献。没有在这里专门提到的氨基酸，可以根据已知的行为和/或它们的特征性化学和/或物理学特征方便地划分成上述类型，在划分时与专门指定的氨基酸进行比较。
                                                          表2
分类 遗传学编码的 遗传学非编码的
疏水性 F，L，I，V
芳族 F，Y，W Phg，Nal，Thi，Tic，Phe(4-Cl)，Phe(2-F)，Phe(3-F)，Phe(4-F)，吡啶基Ala，苯并噻吩Ala
非极性 M，G，P
脂族 A，V，L，I t-BuA，t-BuG，MeIle，Nle，MeVal，Cha，bAla，MeGly，Aib
亲水性 S，K Cit，hCys
酸性 D，E
碱性 H，K，R Dpr，Orn，hArg，Phe(p-NH2)，DBU，A2 BU
极性 Q，N，S，T，Y Cit，AcLys，MSO，hSer
半胱氨酸样 C Pen，hCys，β-甲基Cys
本发明的抗原表位和抗体片段可以具有通过任何类似的分类的氨基酸取代的任何氨基酸，以便产生变体抗原表位或变体抗体片段，只要所述变体具有与具有SEQ ID NO：3-35中任意一个的抗原表位和抗体片段的特征相似或改善了的免疫学特性就行。
因此，本发明还涉及具有与按照本发明方法分离的可变轻链或重链CDR片段相关的结合结构域的结合实体和抗体。例如，可变轻链CDR1片段可以排列如下：
RASQS V-SSS ----Y LA(SEQ ID NO：15)
KSSQS LLYSS NNKNY LA(SEQ ID NO：27)
相关的可变轻链CDR1片段和结合实体具有以下结构式(SEQ ID NO：47)。
Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-
Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27
其中：
Xaa11是碱性氨基酸；
Xaa12是脂族氨基酸或极性氨基酸；
Xaa13，Xaa15，Xaa19，和Xaa20分别是丝氨基酸；
Xaa14是谷氨酰胺；
Xaa16，Xaa26，和Xaa27分别是脂族氨基酸；
Xaa17是脂族氨基酸或不是氨基酸；
Xaa18和Xaa25分别是极性氨基酸；
Xaa21，Xaa22，和Xaa24分别是极性氨基酸或不是氨基酸；和
Xaa23是碱性氨基酸或不是氨基酸。
在某些实施方案中，Xaa21，Xaa22，和Xaa24是天冬酰胺或不是氨基酸。在其他实施方案中，Xaa25是酪氨酸。
所述可变轻链CDR2片段可以排列如下：
DASNRAT(SEQ ID NO：17)
GASSRAT(SEQ ID NO：22)和
WASTRES(SEQ ID NO：29)。
相关的可变轻链CDR2片段和结合实体具有以下结构式(SEQ ID NO：48)。
Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
其中：
Xaa31是酸性氨基酸，非极性或芳族氨基酸；
Xaa32是丙氨酸；
Xaa33是丝氨酸；
Xaa34和Xaa37分别是极性氨基酸；
Xaa35是碱性氨基酸；
而Xaa36是酸性或脂族氨基酸。
所述可变轻链CDR3片段可以排列如下：
QQYGNSPPYT(SEQ ID NO：24)和
QQYYSTPPM(SEQ ID NO：32)。
相关的可变轻链CDR3片段和结合实体具有以下结构式(SEQ ID NO：49)。
Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50
其中：
Xaa41和Xaa42分别是谷氨酰胺；
Xaa43是酪氨酸；
Xaa44和Xaa49分别是非极性，极性或芳族氨基酸；
Xaa45和Xaa46分别是极性氨基酸；
Xaa47和Xaa48分别是脯氨酸；
而Xaa50是极性氨基酸或不是氨基酸。
检测癌相关表位
本发明还提供了在生物学检测样品中检测本发明的癌相关表位的方法。本领域技术人员所公知的任何免疫测定或体内成像方法，都可用于检测生物学测试样品中的本发明的癌相关表位。例如，本发明的癌相关表位可以通过免疫化学，免疫组织学，ELISA，放射免疫测定，核磁共振，磁共振成像，表面等离子体共振和相关的方法检测。
所述方法可以包括让测试样品与能够结合本发明的癌相关表位的抗体或结合实体接触的步骤，以及检测所述抗体或结合实体是否与所述样品的成分结合的步骤。所述方法还包括从被怀疑患有癌症的患者体内获得生物学样品(例如，细胞，血液，血浆，组织等)的步骤，让所述样品与对本发明的癌相关表位特异的标记过的抗体或标记过的结合实体接触的步骤，以及利用标准免疫测定和/或诊断成像技术检测所述表位的步骤。所述抗体或结合实体与所述生物学样品的结合，表明了所述样品含有所述表位。
在另一种实施方案中，可以将所述癌相关表位用于检测患有癌症的哺乳动物的血液，血清，或组织中的抗体。当所述癌相关表位在恶性转化期间变得暴露时，所述抗体可以在哺乳动物体内自然产生。
因此，本发明提供了检测哺乳动物体内的癌的方法，包括让检测样品与本发明的癌相关表位接触，并且检测来自所述测试样品的抗体是否业已与所述癌相关表位结合。
能与本发明的癌相关表位和/或包括本发明的癌相关表位的多肽起反应的抗体或结合实体可以进行标记，或与诊断成像试剂结合，以便有利于癌的检测。
术语“标记”和诊断成像剂，表示直接和间接与抗体，抗原或表位缀合的可检测的化合物或组合物。所述标记本身是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者对于酶标记来说，能够催化可以检测的底物化合物或组合物的化学改变。
所述标记或诊断成像剂，可用于对能表达所述癌相关表位的细胞和组织成像。所述标记还可以与本发明的癌相关表位一起用于标准免疫测定中。标记和诊断成像剂包括，但不局限于硫酸钡，碘醋胺酸，碘番酸，碘泊酸钙，泛影酸钠，泛影葡胺，甲泛葡胺，丁酰碘番酸钠和放射性诊断制剂，包括正电子发射剂，如氟-18和碳-11；γ射线发射剂，如碘-123，锝-99m，碘-131和铟-111；用于核磁共振的核素，如氟和钆。
用于体内诊断目的的顺磁同位素也可根据本发明的方法应用。存在多种可用于磁共振成像的元素的例子。例如，有关体内核磁共振成像的讨论可以参见Schaefer等，(1989)JACC 14，472-480；Shreve等，(1986)Magn.Reson.Med.3，336-340；Wolf，G.L.，(1984)Physiol.Chem.Phys.Med.NMR 16，93-95；Wesbey等，(1984)Physiol.Chem.Phys.Med.NMR 16，145-155；Runge等，(1984)Invest.Radiol.19，408-415。合适的荧光标记的例子包括荧光素标记，异硫氰酸盐标记，罗丹明标记，藻红蛋白标记，藻蓝蛋白标记，别藻蓝蛋白标记，邻苯二醛标记，荧光胺标记等。化学发光标记的例子包括鲁米那标记，异鲁米那标记，芳族吖啶酯标记，咪唑标记，吖啶盐标记，草酸酯标记，荧光素标记，荧光素酶标记，水母发光蛋白标记等。本领域普通技术人员可以了解可以根据本发明使用的其他合适的标记。
所述标记与抗体或它的片段的结合，可以用本领域技术人员所公知的标准技术实现。典型的技术描述于以下文献中：Kennedy等，(1976)Clin.Chim.Acta 70，1-31；和Schurs等，(1977)Clin.Chim.Acta 81，1-40。在后面所提到的结合技术是戊二醛方法，高碘酸方法，二马来酰亚胺方法，间马来酰苄基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯方法。上述所有方法都被收作本文参考。
可以将固相或固体支持物与本发明的抗体，结合实体，抗原或表位组合应用。所述固相或固体支持物表示无水基质，所述抗体，结合实体，抗原或表位可以与它连接。在本发明中固相和固体支持物的例子包括部分或完全由玻璃(例如，控制孔度玻璃)，多糖(例如琼脂糖)，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇和硅氧烷形成的固相和固体支持物。在某些实施方案中，根据具体场合，所述固相或支持物可以包括测定平板的孔；在其他场合下，它是纯化柱(例如，亲和层析柱)。该术语还包括分离的颗粒的不连续的固相，如在美国专利号4,275,149所描述的。治疗
根据本发明，本发明的抗原表位，针对所述表位的抗体或结合实体，以及能抑制本发明表位形成的蛋白酶抑制剂，可用于癌症的预防和/或治疗。可以将本发明的抗原表位用作疫苗，用于刺激哺乳动物的免疫反应，所述反应是针对具有癌相关表位的细胞的。针对本发明抗原表位的抗体或结合实体能够对抗或预防腺癌。另外，本发明预期施用能抑制细胞角蛋白8和/或细胞角蛋白18的裂解的蛋白酶抑制剂，以便预防和治疗腺癌。
在一种实施方案中，本发明提供了预防或治疗哺乳动物腺癌的方法，包括给所述哺乳动物施用足以刺激针对所述抗原表位的免疫学反应的量的包括SEQ ID NO：3-6中任意一个的抗原表位。可以将两种或两种以上包括SEQ ID NO：3-6的多肽组合在治疗组合物中，并且分若干个剂量，用一定时间施用，以便优化所述哺乳动物的免疫学反应。所述免疫学反应可以通过观察在所述哺乳动物的血流中是否存在针对本发明表位的抗体进行检测和监控。
本发明制备的能选择性地与本发明的癌相关表位反应的抗体和结合实体还可用于癌症治疗。因此，本发明提供了预防或治疗哺乳动物腺癌的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的能够结合包括SEQID NO：3-6中任意一个的抗原表位的抗体或结合实体。
所述抗体或结合实体可以单独使用，或与可用于治疗的制剂结合或组合使用。抗体和/或结合实体可以给患有具有本发明抗原相关表位的任何癌症的哺乳动物施用。所述施用可以同时提供治疗性处理，和预防或防御性措施。例如，本发明的治疗方法可用于阻止癌的扩散，并且导致癌的缓解。
在本文中，“可用于治疗的制剂”包括任何能够有利地靶定表达本文所描述的癌表位的细胞的任何治疗分子，包括抗肿瘤剂，放射性碘化化合物，毒素，化疗制剂，细胞抑制的或细胞裂解药物。
例如，所述可用于治疗的制剂包括adrimycin，氨鲁米特，氨基喋呤，硫唑嘌呤，硫酸博来霉素，白消安，卡波铂，洋红霉素，卡氮芥，苯丁酸氮芥，顺铂，环磷酰胺，环孢菌素，cytarabidine，胞嘧啶阿拉伯糖苷，细胞毒素氮烯咪胺，放线菌素D，道诺霉素，正定霉素，阿霉素，esperamicins(参见美国专利号4,675,187)，足叶乙甙，氟尿嘧啶，异环磷酰胺，干扰素-α，环己亚硝脲，美法仑，巯基嘌呤，氨甲蝶呤，丝裂霉素C，米托坦，米托蒽醌，盐酸甲基苄肼，紫杉酚，多西他塞(docetaxel)，替尼泊甙，硫鸟嘌呤，噻替哌，硫酸长春碱，硫酸长春新碱和长春烯碱。其他制剂包括披露于以下文献中的制剂：第52章，抗肿瘤剂(Paul Calabresi and Bruce A.Chabner)，以及对它的介绍，pp.1202-1263，of Goodman and Gilman′s″ThePharmacological Basis of Therapeutics″，Eighth Edition，1990，McGraw-Hill，Inc.(Health Professions Division)。毒素可以是蛋白，例如，美洲商陆抗病毒蛋白，霍乱毒素，百日咳毒素，蓖麻毒蛋白，gelonin，相思豆毒素，白喉外毒素或假单胞菌外毒素。毒素部分还可以是高能发射放射核素，如钴-60，I-131，I-125，Y-90和Re-186，以及源于细菌，真菌，植物或动物的酶促活性毒素或它的片段。
根据本发明，可以将所述化疗制剂用于减弱能表达本发明肿瘤相关表位的癌细胞和肿瘤的生长或扩散。可以用本发明的化疗制剂治疗的动物包括人，非人灵长类，母牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫，和啮齿类动物等。在所有实施方案中，人类肿瘤抗原和人类对象是优选的。
本发明还预期将物种依赖型抗体用于本发明的治疗方法中。所述物种依赖型抗体具有与所选择的物种大体上是非免疫学反应性的恒定区。所述物种依赖型抗体特别适用于治疗，因为它大体上不会产生免疫学反应。所述物种依赖型抗体可以是上文所定义的多种类型抗体中的任意一种，不过优选是哺乳动物的，更优选是人源化的或人类抗体。
可以将可用于治疗的制剂制备成具有本发明抗体的组合物，并且没有必要直接连接在本发明的抗体上。不过，在某些实施方案中，使用本领域技术人员可以获得的方法，将可用于治疗的制剂连接在本发明的抗体上，例如，使用标准结合方法。
本发明还提供了预防或治疗哺乳动物腺癌的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的能抑制包括SEQ ID NO：3-6中任意一个的抗原表位形成的蛋白酶抑制剂。根据本发明，所述蛋白酶裂解的位点位于细胞角蛋白K8的22和40号氨基酸上。以及细胞角蛋白K18的50号氨基酸上，它们都包括共有序列Xaa1SR↓Xaa4(SEQ ID NO：40)，其中Xaa1是丝氨酸，苯丙氨酸或缬氨酸，而Xaa4是丝氨酸或缬氨酸。所述裂解位点的结构表明，决定所述裂解的所述酶是胰蛋白酶样蛋白酶。本领域技术人员可以获得胰蛋白酶抑制剂。例如，参见美国专利6,239,106；美国专利6,159,938；美国专利5,962,266。所述胰蛋白酶抑制剂包括可用于诸如丝氨酸蛋白酶的抑制剂，如激肽释放酶，胰凝乳蛋白酶A和B，胰蛋白酶，弹性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，凝血剂和前凝血剂，特别是活性形式的，包括凝固因子，如因子VIIa，IXa，Xa，XIa，和XIIa，纤溶酶，凝血酶；蛋白酶-3，肠激酶，顶体蛋白，组织蛋白酶，尿激酶和组织纤溶酶原激活物。
根据本发明，能够抑制可以裂解Xaa1SR↓Xaa4(SEQ ID NO：40)的蛋白酶的任何抑制剂都可用于预防或治疗腺癌。例如，与Xaa1SR↓Xaa4(SEQ ID NO：40)具有同源性，但是不能够裂解的肽可以用作本发明治疗方法的抑制剂。例如，可以使用的抑制剂的其他例子包括大豆胰蛋白酶抑制剂(或STI，购自Sigma Chemical Co.)，α-2-巨球蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，抑蛋白酶肽，胰分泌型胰蛋白酶抑制剂(PSTI)，玉米和西葫芦胰蛋白酶抑制剂(Wen等，Protein Exp.&Purif.4：215(1993)；Pedersen等，J.Mol.Biol.236：385(1994))，等等。来源于人类的一种有用的抑制剂候选物是以人淀粉样β-蛋白前体(APPI)的循环同种型形式存在的，又被称为蛋白酶连接蛋白-2。APPI包括被称为KPI(Kunitz蛋白酶抑制剂)的Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂。参见Ponte等，Nature，331：525(1988)；Tanzi等，Nature331：528(1988)；Johnstone等，Biochem.Biophys.Res.Commun.163：1248(1989)；Oltersdorf等，Nature 341：144(1989)。人KPI与抑蛋白酶肽具有大约45％的氨基酸序列相同性。业已通过重组表达在多种系统中制备了分离的KPI结构域，并且业已证实是有活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。例如，参见Sinha等，J.Biol.Chem.265：8983(1990)。
腺癌的发展和/或化疗的治疗效力，可以通过本领域现有的方法测定。例如，特定化疗制剂的效力，可以通过测定正在发生细胞死亡的腺癌细胞释放的癌相关表位的数量确定。由细胞释放的抗原表位(例如，具有SEQ ID NO：3-6中任意一个的多肽，或所述多肽的组合)的浓度可以与来自健康的，未治疗过的患者的标准进行比较，以便评估在患者体内是否存在提高了的本发明表位的水平。可以在治疗期间以独立的间隔采集流体样品，并且与标准进行比较。预计，本发明的与癌症相关的抗原表位水平的改变，能够指示治疗的效力(即癌细胞死亡的速度)。预计癌相关抗原表位的释放，可以在很多测试样品中测定，包括血液，血浆，血清，粪便，尿液，唾液，阴道分泌物，精液，精子和任何组织样品。
当所述测定方法被用于监测腺癌的组织生活力或发展时，以一定间隔重复测定感兴趣的样品中抗原表位的存在和丰度的步骤，并且对这些值进行比较，检测浓度的改变体现了所述组织状态的改变。例如，腺癌相关表位的含量的提高，可能与腺癌的发展相关。在将所述测定方法用于评估治疗的效力时，所述监测步骤是在施用所述治疗剂或进行治疗方法之后进行的(例如，在施用化疗制剂之后或在放射治疗之后)。类似地，本发明的腺癌癌相关表位的水平的降低，可能与腺癌的抑制相关。
因此，可以通过本文所提供的癌相关抗原表位的存在鉴定腺癌。一旦鉴定了腺癌，就可以用抗体和能够减弱细胞角蛋白8和18裂解的蛋白酶抑制剂处理所述腺癌。另外，本文所提供的方法可用于监测疾病的发展和/或治疗所述疾病。
组合物
本发明还涉及含有本发明抗体，结合实体，抗原表位或胰蛋白酶样蛋白酶抑制剂的组合物。所述组合物可用于检测本发明的抗原表位，并且用于涉及与本发明的抗原表位的存在相关的癌症的预防和治疗相关的治疗方法。
本发明的抗体，结合实体，抗原表位和蛋白酶抑制剂可以制备成可以药用的组合物，并且以适应所选择的施用途径的多种形式给诸如人类患者的哺乳动物宿主施用。例如，施用途径包括静脉内，动脉内，皮下，肌内，腹膜内和本领域技术人员所选择的其他途径。
本发明的抗体，结合实体，抗原表位和蛋白酶抑制剂的溶液可以用水或盐水制备，并且任选地与无毒表面活性剂混合。用于静脉内或动脉内施用的制剂可以包括无菌水溶液，它还可以包括缓冲物，脂质体，稀释剂和其他合适的添加剂。
适合注射或输液的药用剂型，可以包括含有所述活性成分的无菌水溶液或分散液，所述无菌水溶液或分散液适合通过胶囊化在脂质体中施用。在所有场合下，最终的剂型必须是无菌的流体，并且在生产和储存条件下是稳定的。
无菌注射溶液是通过以需要的用量将抗体，结合实体，抗原表位和蛋白酶抑制剂根据需要与上面所列举的各种其他成分一起整合在合适的溶剂中，然后进行过滤消毒而制备的。
抗体，结合实体，抗原表位和蛋白酶抑制剂的有用剂量，可以通过观察它们的体内活性以及在动物模型中的体内活性而确定。在小鼠和其他动物上推断人类的有效剂量的方法为本领域所公知；例如参见美国专利号4,938,949。
一般，抗体，结合实体，抗原表位和蛋白酶抑制剂的合适剂量，在大约1-大约2000μg/kg范围内，例如，大约2.0-大约1500μg/kg体重/每次治疗。优选的剂量在每次治疗受体的每千克体重大约3-大约500μg范围内，更优选在大约10-大约300μg/kg/治疗范围内，最优选在大约20-大约200μg/kg/治疗范围内。
所述抗体，结合实体，抗原表位和蛋白酶抑制剂，适宜以单位剂量形式施用，例如，每单位剂量形式含有5-1000μg，适宜的为10-750μg，最适宜的是50-500μg活性成分。
理想的是，应当施用所述抗体，结合实体，抗原表位和蛋白酶抑制剂，以便获得大约0.1-大约10nM的高峰血浆浓度，优选大约0.2-10nM，最优选大约0.5-大约5nM。例如，这一目的可以通过静脉内注射0.05-25％的抗体溶液，任选地在盐水中注射而实现。可以通过连续输液维持理想的血液水平，以便提供大约0.01-10.0μg/kg/小时，或通过间接输液含有大约0.4-50μg/kg的抗体。
理想的剂量适宜以单一剂量形式存在，或划分成若干剂量，以适当的间隔施用，例如，作为每天施用的两个，三个，四个或更多个小剂量。所述小剂量本身还可以进一步细分，例如，划分成多个独立的松散间隔的施用；如多次静脉内剂量。例如，需要通过连续输液或以独立的剂量通过静脉内途径长时间地施用本发明的组合物。
试剂盒
本发明还提供了用于检测本发明的抗原表位，并且用于治疗腺癌的试剂盒。
用于检测本发明的抗原表位的试剂盒，可以包括装有能够结合本发明的抗原表位的抗体或结合实体的容器。可以对所述抗体或结合实体进行标记，以便于检测。可以对独立的试剂盒进行改良，以便实施本发明的一种或多种方法。
所述目标试剂盒还可以任选地包括至少一种实施所述方法所需要的其他制剂，所述方法是用所述试剂盒实施的。所述其他制剂的例子包括：标记，标准物，对照，缓冲物，用于稀释测试样品的溶液，或有利于所述标记检测的制剂。本发明试剂盒中所包含的试剂能够以预先测定的单位形式提供，以便提供较高的准确性和精确性。通常，将试剂盒制剂和其他成分放置并且包装在独立的容器中。在所述试剂盒中还可以包括反应容器，试管，微孔托盘，微量滴定平皿或其他容器。可以将不同的标记用在不同的制剂上，以便可以将每一种制剂彼此区分开来。
本发明的另一方面涉及用于治疗腺癌的试剂盒，包括本发明的药用组合物和说明材料。所述试剂盒可以包括装有本发明的抗原表位，抗体，结合实体或抑制剂的容器。所述抗原表位能够起着疫苗的作用，用于抑制转移性腺癌的形成。所述抗体或结合实体是针对本发明的抗原表位的，并且可用于施用以治疗或预防腺癌的扩散。细胞角蛋白8或12裂解的抑制剂还能够抑制腺癌的形成和扩散。可以将所述抗原表位，抗体，结合实体或抑制剂的任意一种包含在所述试剂盒的合适的容器中。另外，可以在所述试剂盒的合适的容器中装有抗原表位，抗体，结合实体或抑制剂的组合。
在本文中，“说明材料”包括出版物，记录，图表，或任何其他表达媒介，它被用于与本发明药用组合物的用途联系，用于抑制细胞角蛋白8或18的裂解或用于刺激所述免疫系统，以便在哺乳动物或患者体内识别本发明的表位。例如，所述说明材料还可以说明本发明药用组合物的合适剂量。例如，本发明的试剂盒的说明材料可以粘贴在装有本发明药用组合物的容器上，或者与装有所述药用组合物的容器一起运输。另外，所述说明材料可以与本发明的容器分开运输，以便所述说明材料和药用组合物可以由接受者配合使用。
本发明还包括含有本发明药用组合物的试剂盒和用于将所述组合物输送到哺乳动物，例如患有腺癌的人类患者体内的输送装置。举例来说，所述输送装置可以是可挤压的喷雾瓶，计量剂量喷雾瓶，气溶胶喷雾装置，喷雾器，干粉输送装置，自推进溶剂/粉末分配装置，注射器，针头，止血棉球或剂量测定容器。
将结合以下详细例子对本发明作进一步说明，提供这些例子是为了说明本发明的，而不是为了限制本发明。
                   实施例1：癌相关表位表征
COU-1单克隆抗体的分离
IgM HMab，COU-1是由杂交瘤细胞系B9165分泌的，所述细胞系是通过将人的类淋巴母细胞细胞系WI-L2-729-HF2与从结肠癌患者的肠系膜淋巴结中获得的淋巴细胞融合而产生的(35)。在无菌条件下，切碎来自直肠结肠癌患者的肿瘤部位的肠系膜淋巴结。通过棉纱过滤除去碎片，并且通过在Ficoll-Isopaque(Boehringer-Mannheim，德意老联邦共和国)上离心，纯化淋巴细胞。
按照披露于以下文献中的方法，将所述淋巴细胞与人融合细胞系W1-L2-729-HF2(称之为HF2)(来自Tecniclone Int.，Santa Ana，Calif.，美国)融合：Kohler，Immunological Methods Vol.II，Academic Press，1981，pp.285-298。HF2和淋巴细胞(107)之间的比例为1∶2。
在RPMI-1640培养基中一起洗涤HF2和所述淋巴细胞，并且通过离心收集所述细胞之后，将所述细胞沉淀物重新悬浮在0.5ml的50％聚乙二醇(PEG)6000中，稳定摇晃1分钟时间。在用RPMI-1640稀释所述PEG之前，再将所述细胞温育2分钟。洗涤所得到的融合产物，并且重新悬浮在溶液培养基中[RPMI-1640，10％FCS(胎牛血清)，补充了HAT(2×10-4M次黄嘌呤，4×10-7M氨基喋呤，3.2×10-6M胸苷)]。将所述细胞铺平板在96孔微量滴定板上，每孔使用含有2×105细胞的200μl体积。将细胞在选择培养基上维持2周。在RPMI-1640中进一步培养，使用补充了次黄嘌呤和胸苷的10％FCS。在融合之后10天-4周，出现了生长的杂合体。在没有饲养细胞的条件下，通过限制稀释进行克隆。
通过ELISA，分析来自具有生长的克隆的孔的上清液的免疫球蛋白生产，使用用兔抗人Ig(H和L链)包衣的微量滴定平板(Dakopatts，Copenhagen，丹麦)，所述免抗人Ig用pH9.6的0.1M碳酸氢盐，以1∶10,000的比例稀释。用PBS-Tween(磷酸缓冲的盐溶液--0.05％Tween 20)洗涤包衣过的孔，并且在室温下与在PBS-Tween中以1∶10的比例稀释的上清液一起温育2小时。用对以1∶3000的比例在PBS-Tween中稀释的IgM，IgA或IgG(Dakopatts，Copenhagen)特异的碱性磷酸酶(AP)-结合的抗体进行显影。在室温下温育1小时之后，添加底物对-磷酸硝基苯酯(PNPP)，1mg/ml 10％二乙醇胺，1mM MgCl2，pH9.6。在37℃下温育1小时之后，在405nm的波长下测定光学密度。通过稀释IgM(Cappel)或IgG(Kabi AB，Stockholm，瑞典)建立用于定量的标准曲线。通过转移到24孔大型平板(Nunc A/S，丹麦)上繁殖通过ELISA测定的产生免疫球蛋白(Ig)的杂合体。通过所述方法选择的杂交瘤细胞系B9165(ECACC87040201)，分泌了下文所述的COU-1抗体，并且通过ELISA证实，在不改变培养基的条件下，使得它们生长2周时间，能产生1-5μg/IgM/ml。
所述杂交瘤细胞系B9165是由欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保存的，CAMR，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，英国，保藏号ECACC87040201。
通过免疫细胞化学分析进一步分析COU-1杂交瘤上清液与肿瘤细胞的反应，或通过免疫组织化学分析，分析与肿瘤组织的反应，正如下文所披露的。
COU-1抗体的免疫细胞化学分析
对来自不同的人类肿瘤细胞系和来自外周人类血白细胞制备的细胞涂片进行免疫细胞化学分析。通过用甲醛-丙酮(9.5％甲醛，43％丙酮，溶解在86mM磷酸缓冲液中，pH7.2)处理，将细胞固定在载玻片上。将大约50μl的COU-1上清液(来自杂交瘤B9165；ECACC87040201)放置在固定细胞的涂片上，并且在4℃下，在潮湿的培养箱中培养过夜，然后漂洗，并且在室温下，与用PBS-Tween以1∶80的比例稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-标记过的兔抗-人IgM(Dakopatts)一起温育1小时。最后，添加过氧化物酶底物(0.01％H2O2和二氨基联苯胺在PBS中配制成0.6μg/ml的浓度)。用苏木精对所述涂片进行轻微的对染，并且封固。表3示出了通过分析各种细胞涂片上的COU-1获得的结果。
                         表3
          通过免疫细胞化学测定的COU-1的反应性
细胞类型              名称                  反应
1.结肠腺癌            Colon137              阳性
2.结肠腺癌            COLO 201              阳性
3.黑素瘤              HU373                 阴性
4.乳腺癌              MCF-7                 阳性
5.十二指肠腺癌        HUTU 80               阴性
6.伯基特淋巴瘤        EB-2                  阴性
7.人外周血白细胞      PBL                   阴性
与结肠和乳腺腺癌的选择性反应是明显的。
在4℃下将活的COLO 201细胞(结肠腺癌细胞)与COU-1抗体一起温育，然后与酶标记过的抗-Ig抗体一起温育。然后将所述细胞涂抹在载玻片上，用戊二醛(0.17％，溶解在PBS中)固定，并且与底物一起温育。用COU-1对COLO 201细胞进行染色，而对照细胞不染色(数据未发表)。
免疫组织化学分析
对在丙酮中固定的冷冻组织切片进行初步免疫组织化学分析。在与COU-1抗体(0.5μg/ml)一起温育之前，通过与抗-μ-链抗体的Fab′片段(从Dakopatts，Copenhagen，丹麦购买)温育，抑制内源IgM。所述抗-μ-链抗体Fab′片段是按照以下文献中的方法制备的：B.Nielsen等，Hybridoma 6(1)，1987，pp.103-109)。尽管用COU-1抗体观察到了癌组织的明确的特异性，但是在某些组织类型中(例如乳腺管)观察到了某些非特异性结合。
采用改进了的固定方法，它能大体上消除与某些组织类型的非特异性交叉反应，包括乳腺导管和乳腺管。组织样品是从进行手术切除的结肠直肠癌患者体内获得的。正常结肠组织取自距肿瘤部位大约15厘米处的切除物。在4℃下，在96％的乙醇中固定组织6小时。然后，对组织进行石蜡包埋，并且切割成5微米的切片。在二甲苯中对切片进行脱石蜡，通过梯度乙醇进行再水合，并且用PBS-Tween洗涤。在室温下，在潮湿培养箱中将切片与浓度均为0.5-10μg/ml的100μl的鼠单克隆抗体，人单克隆IgM抗体活正常多克隆人IgM抗体一起温育2小时。洗涤所述载玻片，并且与AP-标记过的兔抗-人IgM(Dako，Glostrup，丹麦)，辣根过氧化物酶(HRP)标记过的兔抗-人IgM(Dako)或HRP-标记过的兔抗-小鼠IgG(Dako)一起温育，所述抗体是用含有10％(w/v)牛血清清蛋白的PBS稀释过的，温育在室温下进行1小时。在洗涤之后，通过用生色底物(0.6mg二氨基联苯胺/ml PBS，含有0.01％H2O2)和具有0.2mg萘酚-AS-Mx磷酸(Sigma)的AP，1mg固红TR盐(Sigma)，20μg二甲基甲酰胺/ml 0.1M Tris/HCl，1M左旋咪唑，pH8.2显影观察HRP。用Mayer′s苏木精对所述切片进行对染，在二甲苯中进行脱水，并且封固在Aquamount(Gurr，Poole，英国)中。
按上文所述进行免疫细胞化学分析的方法观察结合的抗体。只有结肠腺癌切片中的肿瘤细胞能够用COU-1染色。在扁桃腺组织中没有观察到染色。表4A和4B归纳了COU-1抗体与各种组织的反应，其中，恶性肿瘤组织在表4A中提供，而非恶性肿瘤组织的反应的缺乏在表4B中提供。
                     表4A
      COU-1抗体反应性与恶性肿瘤人组织
组织                                结果a
结肠腺癌                            19/21
卵巢腺癌                            2/2
肾脏腺癌                            1/2
乳腺癌                              7/9
肺腺癌                              7/7
非精原细胞瘤睾丸癌                  1/1
肉瘤                                0/3
恶性黑素瘤                          0/7
B-淋巴瘤                            0/1
胸腺瘤                              0/1
a)阳性数量/检测数量。
           表4B
COU-1抗体反应性与正常人组织
组织 结果
卵巢基质 阴性
卵巢上皮 阴性
肾小球 阴性
肾小管 阴性
肺泡 阴性
支气管上皮 阴性
睾丸 阴性
上皮 阴性
扁桃腺淋巴组织 阴性
扁桃腺上皮 阴性
平滑肌 阴性
血管 阴性
前列腺上皮 阳性
正常结肠上皮表现出所有分析过的人IgM，单克隆抗体，骨髓瘤IgM以及正常多克隆人IgM的结合。因此，IgM与正常结肠上皮的一般结合被判断为非特异性的。
            实施例2：癌相关表位作图
材料和方法
抗体
如上文所述，IgM HMab，COU-1，是由杂交瘤细胞系B9165分泌的，该细胞系是通过将人的类淋巴母细胞细胞系WI-L2-729-HF2与从结肠癌患者的肠系膜淋巴结中获得的淋巴细胞融合产生的。将杂交瘤细胞系B9165交由欧洲细胞培养物保藏中心保藏(ECACC)，CAMR，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，英国，保藏号ECACC 87040201。有关ECACC的更多信息，可以在ecacc.org网站上查阅到。
所述人-人杂交瘤细胞系，是在无蛋白培养基中生长的：补充了SSR3血清替代物(Medicult，Copenhagen，丹麦)的RPMI1640培养基(Gibco，Grand Island，NY)。HMab COU-1是通过在琼脂糖-结合的鼠抗-人μ-链单克隆抗体(Mab)上亲和层析从细胞培养物上清液中纯化的(HB57，ATCC，Rockville，MD)。用pH10.5的0.1M二乙胺洗脱所述抗体，然后通过FPLC分离。将从正常人血清中纯化的IgM(Cappel，Cochranville，PA)用作对照。抗正常K8的鼠Mabs，M20以及抗正常K18的CY-90，是从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得的。
ELISA
在4℃下，用存在于pH7.4的PBS中的来自细胞角蛋白纯化方法的级份或不同的重组K8/K18复合物(5μg/ml)，对ELISA孔(Costar，Cambridge，MA)进行包衣过夜。用PBS洗涤所述孔2次，在37℃下，用由PBS配制的3％的BSA封闭1小时，并且，在37℃下，与HMab COU-1抗体一起温育2小时。用PBS-0.05％Tween 20洗涤平板10次，并且用在PBS中稀释1000倍的碱性磷酸酶(AP)-标记过的山羊抗-人κ链(Sigma)检测结合的抗体。用对-磷酸硝基苯酯(Sigma)(1mg/ml 1mM MgCl2，10％(w/v)二乙醇胺，pH9.6)观察结合的抗体，并且在405nm波长下读数。
细胞培养物
在补充了10％FCS，非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，1mM HEPES缓冲液，100U青霉素/ml，100mg链霉素/ml和mM L-谷氨酰胺的Eagle′sMEM(Gibco)中，维持人乳腺腺癌细胞系MCF7(ATCC)。在补充了上述FCS，青霉素，链霉素，和L-谷氨酰胺的RPMI1640(Gibco)中，保持人结肠腺癌细胞系Colon137(由Ebbesen博士馈赠，AarhusUniversity，丹麦)。
从正常和恶性肿瘤组织中纯化细胞角蛋白
细胞角蛋白是用新鲜的，手术取出的，结肠癌组织或正常结肠上皮制备的。用刀片切碎组织样品(1-5g)，并且用刀片转子(Euro TurraxT20b basic，IKA Labortechnik，Staufen，德国)以27,000rpm的速度，在冰上在10-30ml含有1％(v/v)Emulphogene(Sigma)的Tris-缓冲的盐溶液(TBS)(10mM Tris，0.14M NaCl，15mM NaN3，pH7.6)中匀浆3×5秒。酶抑制剂：在匀浆超声波处理，并且进行离子交换层析期间，在每毫升缓冲液中含有5m碘乙酰胺，10mM PMSF，5mM EDTA(均购自Sigma)，5mM Cyclocapron(KABI，Stockholm，瑞典)，和10U抑蛋白酶肽(Bayer，Leverkusen，德国)/ml。通过在4℃下以10,000g的速度离心10分钟，使悬浮液沉淀，用含有1％Emulphogene的TBS洗涤2次，并且重新悬浮在缓冲液A(10mM TrispH8.6，含有0.1％SDS(w/v)和0.05％Emulphogene)中。在冰上对悬浮液进行超声波处理3×15秒，并且在4℃下以12,000g的速度离心10分钟。将上清液加样到用缓冲液A预平衡的阴离子交换柱(20ml Q-Sepharose Fast Flow column，QFF，(Pharmacia Upjohn，Uppsala，瑞典))上。在用10倍柱体积的缓冲液A洗涤所述柱之后，结合的蛋白被用缓冲液A配制的高达1M的NaCl的线性梯度洗脱。收集1ml的级份，并且通过SDS-PAGE/Western印迹和ELISA进一步分析。对于ELISA来说，将10μl每一种级份添加到装有10μl包含在100μl TBS中的SM2珠(BioRad)的孔中，然后按上述方法与COU-1一起温育。所述珠能结合洗涤剂，因此能够对所述级份中的蛋白直接进行包衣。
SDS-PAGE和Western印迹分析
在不连续的缓冲液系统中，在8cm 4-20％或10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以便分析，并且在15cm 14％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以便进行N-末端测序(36)。将样品与2×样品缓冲液(4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，溶解在100mM Tris缓冲的盐溶液中)混合，煮沸5分钟，并且在变性和还原(100mM DTT)条件下分解。用考马斯亮蓝观察蛋白带。在冰中，在100伏电压下，用1小时时间将分离的蛋白电印迹到聚偏二氟乙烯膜上(PVDF，Immobilon P，Millipore，Bedford，MA)，使用转移缓冲液(10％(v/v)乙醇，25mM Tris，200mM甘氨酸)。在转移之前，在乙醇中预浸泡所述膜2分钟，并且在转移缓冲液中温育所述膜和凝胶10分钟。在转移之后，在Western印迹缓冲液(50mM Tris，350mM NaCl，15mM NaN3，0.1％Tween-20)中封闭所述膜2小时，用Western印迹缓冲液洗涤3次，并且与COU-1抗体(5μg/ml)，小鼠抗-K8抗体(以1/2000的比例稀释)，小鼠抗K-18抗体(以1/2000的比例稀释)或山羊-抗-GST抗体(以1/1000的比例稀释，Pharmacia Upjohn)在室温下温育过夜。用Western印迹缓冲液洗涤所述膜，并且与AP-缀合的兔-抗-山羊IgG抗体(以1/1000的比例稀释，Sigma)，或AP-缀合的-兔-抗-人IgM抗体(以1/500的比例稀释，DAKO，Glostrup，丹麦)一起，在室温下温育2小时。在用PBS洗涤3次之后，用在PBS中配制的0.2％的戊二醛在室温下固定所述膜15分钟，并且最终在PBS中洗涤。通过NBT/BCIP(Bio-Rad，Hercules，CA)观察结合的AP缀合物。将悬浮在SDS样品缓冲液中，并且进行过超声波处理的MCF7或Colon137细胞用作抗原对照。将低范围蛋白标记(Bio-Rad)用于指示片段的分子量。
氨基酸测序和氨基酸分析
将以前描述的方法(37)用于氨基酸测序和氨基酸分析。对于N-末端测序来说，在SDS-PAGE上对纯化的细胞角蛋白进行电泳，并且电印迹到PVDF膜上，然后用考马斯检测。将不同的带从所述印迹上切除，并且用Applied Biosystems 470A蛋白测序仪(ABI，Forster City，CA)测序。使用BLAST程序在GenBank/EBI/DDBI/PDB数据库中寻找与细胞角蛋白类似的序列。
重组K8和K18蛋白的表达和纯化
分析获得了编码一组K8和K18蛋白的质粒的大肠杆菌DH5a。所述一组蛋白由完整长度的和若干种N-末端和C-末端缺失的K8和K18片段组成，以GST融合蛋白形式克隆到修饰过的pGEX-2T载体上(38)。在37℃下，在补充了20mM MgCl2和50mg羧苄青霉素/ml的SuperBroth培养基中生长所述大肠杆菌培养物，直到OD600达到0.6。然后用1mM IPTG(Sigma)和4μM cAMP诱导蛋白表达，并且让所述培养物在30℃下再生长3小时。在4℃下，以4,000g的速度使所述细菌沉淀15分钟。为了进行SDS-PAGE，将所述沉淀重新悬浮在样品缓冲液中，并且进行超声波处理5×10秒，然后进行电泳。为了纯化重组K8或K18蛋白，将按上述方法生长和处理过的400ml培养物的沉淀重新悬浮在50ml含有1mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，5mM β-巯基乙醇，pH8.0)中，并且在4℃下温育30分钟。对所述悬浮液进行3×20秒的超声波处理，并且在4℃下以20,000g的速度沉淀。在高盐缓冲液(50mM Tris-HCl，2M NaCl，10mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇，1％NP40，pH8.0)中洗涤所述沉淀2次，并且用裂解缓冲液洗涤1次。然后用含有2M尿素的裂解缓冲液洗涤所述沉淀2次，并且在4℃下保存在含有8M尿素的裂解缓冲液中。
异型结合测定
按上述方法通过SDS-PAGE分离不同的C-或N-末端缺失的或完整的K8和K18蛋白组，并且转移到PVDF膜上。在封闭之后，在4℃下将所述膜与存在于PBS，2％BSA和4M尿素中的100μg/ml纯化的K8或K18蛋白一起温育16小时；如果将K8蛋白转移到所述膜上的话，然后，与纯化的K18蛋白一起温育所述膜，反之亦然(38)。然后用PBS洗涤所述膜，在室温下与存在于含有10％FCS的Western印迹缓冲液中的COU-1(5μg/ml)一起温育，并且按上述方法进行结合检测。
表面等离子体共振
使用BIAcore仪器(Pharmacia)，通过表面等离子体共振测定与重组完整的K8或K18(以及它的片段)的异型复合物结合的HMab COU-1的动力学。激活传感器芯片，以便用N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N′-(3-二乙基氨基丙基)碳二亚胺固定。通过注射50μl的50μg/ml的样品，将所述异型细胞角蛋白复合物结合在所述表面上。用pH8.5的30μl 1M的乙醇胺对过度激活的酯进行猝灭。通常固定了3000个共振单位。通过以5μl/分钟的流速注射一定浓度范围(0.5-80μg/ml)的COU-1，研究COU-1与固定化异型细胞角蛋白复合物的结合。以每单位时间共振单位的增加形式监测所述结合。在所述解离期结束之后，以20μl/分钟的流速获得了解离测定。用10mM HCl，1M NaCI，pH2.0再生了所述结合表面，并且使所述表面对10次测定维持活性。按照以前描述的方法(39)，通过一系列的测定，确定结合和解离速度常数kon和koff。使用Bioevaluation程序3.1版(Pharmacia)根据动力学数据推测结合和解离常数。
聚焦激光扫描显微术
将细胞接种在Lab Tek腔室载玻片(Nalge Nunc，Naperville，IL)上，并且在37℃下，在5％CO2中，让它生长48小时并且贴壁在玻璃载玻片上。用冰冷96％乙醇固定细胞5分钟，用PBS洗涤3次，并且在室温下，用存在于PBS中的10％正常山羊血清封闭1小时。在4℃下，将COU-1(5μg/ml)与小鼠抗-K8抗体(1/1000)或小鼠抗K-18抗体(1/1000)一起温育过夜。在用PBS洗涤之后，在室温下，将所述细胞与FITC-标记过的山羊-抗-人γ-链和德克萨斯红-标记过的山羊抗-小鼠IgG抗体(稀释比例1/200，均购自Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)一起遮光温育1小时。用PBS洗涤所述细胞3×5分钟，并且用存在于PBS/甘油中的抗退色制剂Slow FadeTM(MolecularProbes，Eugene，OR)封固所述载玻片。用与Zeiss Anyvert100TV连接的MRC-1024聚焦激光扫描显微镜(Bio-Rad)分析结果。作为对照，所有实验另外以去掉所述一级抗体或添加所述物种和同种型匹配的对照抗体取代所述一级抗体形式再次进行。另外，获得了分析的细胞的微分干涉相差(DIC)图象。
结果
从结肠癌和正常结肠上皮中纯化细胞角蛋白
通过利用细胞角蛋白和其他细胞骨架蛋白是以不可溶的丝状结构形式存在于生理学盐浓度下的缓冲液中这一事实，分别将新鲜的，手术取出的结肠癌组织和正常结肠上皮用于提取细胞角蛋白K8和K18。将非离子洗涤剂添加到所述缓冲液中，以便改善匀浆，部分是通过破碎细胞膜。通过离心沉淀不溶性中间丝蛋白，然后溶解在含有SDS的缓冲液中，并且使用线性盐梯度通过QFF阴离子交换层析分离。图1A表示来自QFF阴离子交换柱的洗脱曲线。含有COU-1反应性的级份存在于所述梯度的第一和第二个峰中(级份41-48)。通过将所述级份中的蛋白包衣在ELISA孔上，随后通过与COU-1一起温育检测COU-1反应性(图1B)。Western印迹分析证实了COU-1与存在于同一级份的三条主要带的反应性(图1D)。这三条带上的蛋白只代表存在于所述级份中的分子量为41-46kDa的蛋白的一部分，正如通过对SDS分离的凝胶进行考马斯染色所揭示的(图1C)。
对从四位不同患者的结肠癌中纯化的细胞角蛋白进行的Western印迹分析和考马斯染色揭示了HMab COU-1反应性和非反应性的蛋白带的相似形式。还从使用相同的纯化方法从三个个体中获得的正常结肠上皮中分离了细胞角蛋白，以便对结肠癌和正常结肠组织中的K8/K18的性质进行比较。使用一组抗-K8和抗-K18抗体，通过Western印迹分析，检查来自两种来源的组织匀浆物和纯化的细胞角蛋白制剂(QFF洗脱物)。在分析来自癌和正常上皮的大致相同数量的细胞角蛋白时，在用抗-K18抗体，CYK-90染色之后观察到了相同强度的蛋白带(在42-46kDa范围内)，所述抗体能识别K18的C-末端部分的线性表位(图2)。相反，在用COU-1对相同的制剂进行染色时，在来自结肠癌组织的细胞角蛋白制剂中，有分子量42-46kDa的三条带能染色，但是，来自正常结肠上皮的细胞角蛋白不能染色(图2)。
为了确定存在于结肠癌组织中的不同的K8/K18-样蛋白的性质，使用了纯化的细胞角蛋白制剂的每一条蛋白带的改进了的分离。因此，来自不同结肠癌组织的纯化的细胞角蛋白制剂分别是在大的14％的SDS-PAGE凝胶上分离的，将所述蛋白印迹到滤膜上，并且进行考马斯染色。将所述印迹条与抗-K8抗体M20，抗-K18抗体CY-90，或COU-1一起温育。图3A表示结肠癌组织样品的典型的印迹，通过考马斯染色观察到了大约10条不同的带。在这种增强的分离中，5条带表现出明确的COU-1反应性。不能被COU-1染色的其他的带用抗-K8抗体，抗-K18抗体或这两种抗体染色(图3A)。
对所有的10条带进行N-末端测序。如图3B所示，所述带相当于不同形式的K8，K18和K19，只有一条带是作为迁移抑制因子相关的蛋白8(MRP8，又被称为钙视网膜蛋白)鉴定的，它是一种钙结合蛋白，能够与细胞角蛋白结合(40)。正如通过始于23号残基至76号残基，而不是始于预期的1号残基的鉴定的氨基酸序列所证实的，大部分带是N-末端截短的K8或K18。
K8的氨基末端截短相当于23，40，66和76号残基，而K18的截短相当于50和68号残基。显然，K8和K18截短存在于三种不同结肠癌的相同残基上，表明所述截短是由特殊的蛋白酶导致的。
对所述裂解位点周围的序列分析提示，至少有两种不同的蛋白酶负责所述裂解，这两种蛋白酶中包括一种胰蛋白酶样蛋白酶。由COU-1识别的带是N-末端截短的K8和K18。不过，有趣的是，并不是所有N-末端截短的K8和K18蛋白都能由COU-1识别。例如，在缺少了前22个氨基酸的N-末端截短的K8蛋白上，没有观察到COU-1结合，也没有观察到抗体与完整的K8或K18的反应。后两种观察是通过分别用抗K8和抗K18抗体染色进行的(图3A中的1号和3号带)，而不是通过N-末端测序观察的，因为所述蛋白是N-末端封闭的(K18包括位于它的N-末端乙酰化丝氨酸)。
用重组K8和K18片段对COU-1表位作图
为了详细研究由COU-1识别的表位性质，用一组重组N-或C-末端缺失的K8和K18片段或以GST-融合蛋白形式表达的完整K8和K18对该表位进行作图。所述片段的性质如图4所示。
首先，通过SDS-PAGE分离上述组的K8和K18片段，并且印迹到PVDF膜上。随后对所述Western印迹进行的分析惊人地证实了所述COU-1抗体不能结合任何独立的K8或K18片段。所述COU-1抗体也不能结合完整的K8或K18分子(图5B和6B)。
在每一种实验中，都包括MCF7细胞裂解物作为正对照，在42-46kDa的分子量上提供了阳性反应带。为了确保所述K8和K18片段的均匀表达，对含有所述片段组的凝胶进行平行电泳，并且对用于Western印迹的所述凝胶用考马斯蓝进行染色(图6A)。另外，用抗GST抗体对SDS-PAGE-分离的K8/GST或K18/GST融合蛋白的印迹进行染色(图5A)。所述结果证实了不同融合蛋白的大致均匀的表达，并且COU-1的信号的缺乏，不是由于细胞角蛋白片段的低的表达水平或蛋白的不完全转移。
另外，分别测试了K8和K18的Mabs对所述组的K8或K18片段的结合。如图5D所示，抗K18 Mab能与K18(1-356)，K18(1-385)和完整的K18强烈起反应，但是不能与K18(1-312)起反应，这表明它的表位位于312-356区。然后，检测细胞角蛋白K8和K18复合物，验证所述复合物是否能由COU-1识别。在用COU-1染色之前，使成组的K18片段的Western印迹与完整的纯化的K8一起温育，并洗掉未结合的K8。COU-1能强烈地结合由完整的K8和K18片段K18(1-213)-K18(1-385)之间形成的复合物。相反，COU-1只能微弱的结合完整的K8/K18(1-187)和完整的K8/完整的K18，并且，没有发现与完整的K8/K18(1-65)和完整的K8/K18(1-124)的结合(图5C)。
同样，将含有所述组的K8片段的印迹与完整的K18一起温育，然后用COU-1染色。COU-1能强烈地结合在完整的K18和K8片段K8(1-213)-K8(1-385)之间形成的复合物。相反，COU-1只能微弱地结合完整的K8/完整的K18，而没有发现与K8(1-65)/完整的K18复合物结合(图6C)。
N-末端测序表明，来自结肠癌患者的K8和K18蛋白都是截短的。进行实验，以便鉴定由COU-1结合的K8/K18异型表位。同时，制备了含有COU-1表位周围的C-末端缺失的片段，K18(1-72)，K18(1-124)，K18(1-187)和完整的K18的Western印迹。然后，将所述印迹与COU-1表位周围的K8片段之一，K8(1-85)，K8(1-129)或K8(1-233)，或完整的K8蛋白一起温育。在允许K8-K18复合物形成之后，将所述印迹与COU-1抗体一起温育。
如图7(A-C)所示，在K18(1-124)/完整的K8或K18(1-124)/K8(1-233)复合物上，由COU-1识别的表位不是暴露的，或者仅仅是很少暴露的。相反，观察到了COU-1对K18(1-124)/K8(1-129)复合物的强烈结合。没有观察到COU-1与含有K8(1-85)或K18(1-72)的任何异型复合物的结合。
综上所述，以上结果证实了由COU-1识别的表位涉及K8区85-129和K18区72-124。如图4和8所示，该区包括N-末端头部结构域的C-末端部分，以及第一个螺旋结构域的N-末端部分，即K8和K18的α螺旋杆状结构域的1A。
所述结果还证实了该表位在完整的K8和K18的异型复合物上只能是较差的暴露的，即使在完整的K8与K18(1-124)复合时也是如此。当所述α螺旋杆的第一个结构域A1不是处在它的正常卷曲螺旋结构状态时，发现了COU-1表位。这种现象可能是通过截短引起的，这种截短除去了现有结合的重要的接触点，留下处在非折叠状态的K8/K18复合物的COU-1结合区。
颠倒上述组合，以便K8(1-85)，K8(1-129)，K8(1-233)和完整的K8的C-末端缺失的片段的Western印迹与COU-1表位周围的K18片段K18(1-72)，K18(1-124)，K18(1-187)和完整的K18一起温育。然后将所述印迹与COU-1抗体一起温育。如图7(D-F)所示，当K8(1-129)与K18(1-72)，K18(1-124)，和K18(1-187)或完整的K18复合时，由COU-1识别的表位是以相同的程度暴露的。同样，在含有K8(1-85)的任何异型复合物上都没有观察到COU-1结合。
用由一组与完整的K8和K18组合的N-末端缺失的K8和K18组成的异型复合物检测COU-1结合，使用异型Western印迹测定。该片段缺少了前129个氨基酸或更多个氨基酸，正如在图4中详细示出的。不过，在上述任何N-末端缺失异型K8/K18复合物上都没有观察到COU-1结合，这表明COU-1表位位于N-末端129个氨基酸内(数据未发表)。所述对照表明，N-末端缺失的片段能够由鼠抗K8和抗K18 Mabs很好地识别。
所述N-末端测序数据和重组作图数据表明，在K8的前65个氨基酸和K18的前49个氨基酸缺失时，COU-1表位是很好地暴露的。
作为GST融合蛋白，制备了两种其他的N-末端缺失的片段，K8(66-483)和K18(50-430)。图9表示与K18(50-430)(A)或完整的K18(B)一起温育的完整的K8和K8(66-483)的印迹。图9还表明与K8(66-483)(C)或完整的K8一起温育的K18(50-430)和完整的K18的印迹。与完整的K8/K18(50-430)或完整的K8/完整的K18复合物相比，对于K8(66-483)/K18(50-430)和K8(66-483)/完整的K18复合物来说，观察到了明显更强的COU-1结合。
进行了其他研究，以便确定在癌细胞中观察到的K8和K18的N-末端裂解是否可能是由腺病毒(adenovirus)感染引起的。腺病毒L3 23-kDa蛋白酶能促进K18的N-末端结构域的裂解，而在腺病毒感染的HeLa细胞中，K8保持完整(41，42)。这种裂解导致了K18的头部结构域的1-73区的消除，以及将细胞角蛋白网络解离成球状小体。进行实验，以便检查由腺病毒感染导致的所述分解，是否会导致能允许COU-1结合的构象的改变。
以前的数据表明，COU-1抗体不能结合来自HeLa细胞的K8/K18。通过SDS-PAGE纯化并且分离来自用腺病毒感染的HeLa细胞的细胞角蛋白，证实了分子量为41kDa的一条带，与以前的报导吻合。使COU-1与腺病毒感染的HeLa细胞的Western印迹温育，没有导致染色(数据未发表)，这表明存在于腺癌中的细胞角蛋白片段不是腺病毒感染的结果。
似乎明确的是，COU-1表位只在形成异型K8/K18复合物时存在。所述表位不存在于独立的K8和K18分子上。不过，剩下的问题是，为什么与SDS-分离的癌细胞裂解物的Western印迹结合的COU-1会在K8/K18复合物业已解离的情况下出现。一种可能的解释是，在所述培养步骤期间，不同细胞角蛋白的一部分与所述膜解离，并且随后仍然和所述膜结合的它的互补细胞角蛋白形成高亲和力的异型复合物。
为了检验这种假设，将结肠癌细胞系colon137的裂解物的Western印迹分成两份。其中的一半在与抗体温育之前用乙醇固定，而另一半在不固定的情况下按常规方法处理。在固定的和未固定的印迹上用抗-K18抗体(CY-90)观察到了染色，而与COU-1的染色仅出现在未固定过的印迹上。
早先的免疫组织化学研究业已表明，组织切片的乙醇固定对COU-1抗原没有作用。检测了癌裂解物的斑点印迹，以便在固定或不固定的情况下检测癌相关表位。在进行和不进行固定的情况下都观察到了用COU-1的染色，证实了COU-1表位不受乙醇处理的影响。总之，所述初步假设似乎是正确的，即细胞角蛋白的异源二聚体形成是在Western印迹显影期间发生的，并且由部分截短的细胞角蛋白导致的异源二聚体的形成是COU-1表位的形成所必需的。
还通过ELISA测定了COU-1与不同重组异型K8/K18复合物的结合。将K8或完整的K8的纯化的重组片段与纯化的K18或完整的K18的重组片段以1∶1的摩尔比混合，以便在尿素中制备异型复合物。然后用PBS透析所述样品，以便形成所述异型复合物，并且以5μg/ml的浓度在ELISA平板上包衣。将完整的K8与K18(1-124)，K18(1-187)，K18(1-213)，和完整的K18组合。另外，将完整的K18与K8(1-65)，K8(1-85)，K8(1-129)，和K8(1-233)组合。
在该ELISA测定中，COU-1以各种强度与所有的复合物结合，K8(1-65)/完整的K18和完整的K8(1-85)/完整的K18复合物除外。以上数据与来自Western印迹分析的结果吻合。图10表示COU-1在三种异型复合物上的滴定，证实了比完整的K8/K18复合物明显更强的与片段K8/K18的结合。
同时实时生物特异性相互作用分析(BIAcore)测定COU-1与不同的重组异型K8/K18复合物结合的动力学参数。COU-1表现出与K8(1-124)/完整的K18和K8(1-124)/K18(1-124)的异型复合物的高亲和力结合。K8(1-124)/完整的K18的动力学参数为kon＝1.7×105M-1s-1，koff＝1.2×10-4s-1，推导的结合常数(Ka)和解离常数为(Kd)为1.4×109M-1和7.1×10-1M。COU-1与K8(1-124)/K18(1-124)的结合稍低一些，kon＝2.8×105M-1s-1，koff＝3×10-4s-1，推导的Ka为9.5×108M-1，而Kd为1.5×10-9M。相反，COU-1表现出与完整的K8/完整的K18的结合低大约100倍，kon＝9.1×103M-1s-1，koff＝5.0×10-5s-1，Ka和Kd分别为1.8×107M-1和5.5×10-8M。
截短的异型K8/K18复合物的细胞分布
为了评估与截短的K8/K18异型复合物相比，正常K8和K18的细胞分布，用COU-1和Mab M20(抗-K8)或Mab CY-90(抗-K18)对乳腺和结肠癌细胞系MCF-7和BrCa01进行共同染色，并且通过高分辨聚焦显微术分析(图11和12)。Mabs M20和CY-90都能对形成复杂的相互连接网络的中间丝的长纤维染色。所述纤维来自核周环，从这里，所述长丝似乎与细胞核表面连接，并且延伸通过细胞质，止于细胞质膜。相反，COU-1表现出斑点状式样，通过对短纤维片段和杆状颗粒的染色，表明了分解的中间丝。
检查细胞簇内的MCF7细胞的染色形式，只有外周的，新形成的繁殖细胞对COU-1是强阳性的，而所有细胞是由抗-K18和抗-K8Mabs染色的(图11)。在所述细胞簇的增殖细胞内，COU-1染色必须在朝向远离所述细胞簇的细胞外表面上是明显的。相反，Mabs M20和CY-90能对整个细胞中的中间丝网络染色。通过重叠用COU-1和Mab M20或Mab CY-90染色的图象确定，所述斑点状COU-1染色，似乎与完整的中间丝网络密切相关(图12)。
因此，仅在癌上皮中鉴定了N-末端截短形式的K8/K18复合物，而完整的K8/K18复合物出现在正常的和癌简单腺上皮中。细胞角蛋白K8和细胞角蛋白K18在不同癌症患者的相同部位的裂解，表明了有特异性蛋白酶起作用。所述裂解位点位于K8的22和40号氨基酸，而在K18上位于50号氨基酸，它们都包括(S/F/V)XSR↓X(S/V)(SEQ ID NO：50)共有序列，这提示决定所述裂解的酶是胰蛋白样蛋白酶(图8)。对所述裂解位点附近的氨基酸序列分析，发现了位于K8上的另一个位点，它具有相同的通用序列(氨基酸32，GSR↓I(SEQID NO：64))，但是没有裂解。这提示位于所述底物的P3或P1′位置上的氨基酸也能影响通过这种蛋白酶的识别。
共有序列在K8和K18的三个其余的裂解位点上是不明显的(TAV↓T(SEQ ID NO：51)，SPL↓V(SEQ ID NO：52)，TGI↓A(SEQ IDNO：53))。需要更不严格的识别条件的蛋白酶或若干不同的蛋白酶可能决定所述裂解。一种这样的蛋白酶可能是弹性蛋白酶型蛋白酶，它在P1位置上能接受缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
细胞角蛋白K8和K18片段的裂解，不大可能出现在出于若干种原因从组织样品中纯化细胞角蛋白期间。首先，所有时间都存在五种酶抑制剂的混合物。其次，在使用相同的纯化条件从正常结肠上皮中纯化细胞角蛋白之后，没有观察到细胞角蛋白片段。第三，只能识别截短形式的K8/K18的HMab COU-1在对组织样品进行基本处理和马上固定时，能够在癌上皮中检测它的表位，而不能在正常上皮中检测。
与以前的观点相反，细胞角蛋白网络在上皮细胞中的维持是一种动态过程，它涉及通过组装和解散中间维管束经常进行重建(45)。生物素标记的细胞角蛋白的显微注射或用荧光标记过的细胞角蛋白进行的转染，业已证实了扩散材料在细胞外周的向内的流动，它是以斑点形式和细的长丝形式朝向细胞质深处移动的，其中，它与其他长丝和长丝维管束结合(46)。尽管这一过程同时发生在正常和恶性肿瘤上皮细胞中，由本发明提供的结果表明了第二种降解途径在癌细胞中的特异性存在。
同样根据本发明，由结肠癌患者的具肿瘤淋巴结克隆的人类抗体COU-1能特异性地识别N-末端截短形式的K8和K18，此时，以上两种细胞角蛋白形成了异型复合物。以前对COU-1的分析表明了COU-1与K18的选择性反应(35，48)，或与修饰过的K18的特异性反应(31，32，49)。业已报导了与细胞程序死亡相关的K18的蛋白水解裂解(56)，不过，细胞程序死亡蛋白酶天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3，-6和-7的裂解位点位于保守的L1-2接头和C-末端尾部结构域上，并且相当远离N-末端裂解位点，正如我们在有生活力的肿瘤组织中业已研究的(56)。最近，报导了抗体(M30)能识别仅在细胞程序死亡癌细胞中暴露而不在有生活力的或坏死细胞中暴露的肿瘤表位(57)。在所述C-末端尾部结构域通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3，-6或-7裂解成26，22和19kDa的片段之后而释放时，所述新表位就变得暴露。在结肠癌细胞中出现的裂解位点同样不同于报导过的有关腺病毒感染的HeLa细胞中的裂解位点，其中，除去了K18的N-末端73个氨基酸(41，42)。令人吃惊的是，没有发现COU-1与来自感染过的HeLa细胞的裂解过的K8/K18异型复合物的结合，而COU-1能结合K8/K18复合物，其中，除去了K18的最靠N-末端的67个氨基酸。这提示尽管所述裂解位点似乎是紧密的，另外除去6个氨基酸有可能导致构象改变，这种改变能抑制COU-1的结合。
某些证据表明了，K8/K18是与细胞迁移和入侵紧密相关的。K8/K18的N-末端裂解可能影响所述过程。另外，缺少的K8/K18的N-末端头部结构域包括若干重要的磷酸化位点，包括K18上的ser52，它与丝重构和区室定位相关，并且与对于14-3-3蛋白的结合来说重要的第二个磷酸化位点相关(58，59)。在K8中，磷酸化位点ser23业已与促分裂原活化相关(60)。
本文所使用的缩略语包括：K8，细胞角蛋白8；K18，细胞角蛋白18；IF，中间丝；HMab，人单克隆抗体；FCS，胎牛血清；AP，碱性磷酸酶；QFF，Q-Sepharose fast flow；ELISA，酶联免疫吸附测定；PBS，磷酸缓冲的盐溶液；TBS，Tris-缓冲的盐溶液；PVDF，聚偏二氟乙烯膜；FITC，荧光素异硫氰酸酯。
       实施例3：克隆能结合癌相关表位的抗体片段
为了进一步开发可用于检测癌症的抗体，克隆了编码部分抗体的核酸，并且通过噬菌体展示选择筛选与本发明的癌相关表位的结合。所述核酸编码人Fab和其他片段。
材料和方法
抗体。
所述人单克隆IgM抗体COU-1，是由杂交瘤细胞系B9165分泌的，它是通过将人的类淋巴母细胞细胞系WI-L2-729-HF2和从患者结肠癌的患者的肠系膜淋巴结中获得的淋巴细胞融合而产生的，如上文所述。还可参见Borup-Christensen，P.，Erb，K.，Jensenius，J.C.，Nielsen，B.& Svehag，S.-E.(1986)Int.J.Cancer 37，683-688。所述人-人杂交瘤细胞系，是在无蛋白培养基中生长的：补充了SSR3血清替代物(Medicult，Copenhagen，丹麦)的RPMI1640培养基(GIBCO，Grand Island，N.Y.)。COU-1抗体是在琼脂糖-结合的鼠单克隆抗-人μ链抗体(HB57，美国典型保藏物保藏中心，Rockville，MD)上，通过亲和层析从细胞培养物上清液中纯化的。用pH10.5的0.1M二乙胺洗脱所述抗体，然后通过FPLC分级分离。将从正常人血清中纯化的IgM(Cappel，Cochranville，PA)用作对照。
所述人单克隆IgM抗体16.88是从R.McCabe博士那里获得的。参见Haspel等，(1985)Cancer Res.45，3951-3961。业已将这种抗体成功地用于人类的肿瘤成像。参见Steis等(1990)J.Clin.Oncol.8，476-490；Boven等(1991)Eur.J.Cancer 27，1430-1436；Rosenblum等(1994)Cancer Immunol.Immunother.39，397-400)。两种鼠单克隆抗体，直接抗正常细胞角蛋白8的M20和直接抗正常细胞角蛋白18的CY-90是从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得的。
可变重链和轻链的PCR扩增和克隆
通过胍盐方法用B9165杂交瘤细胞系制备总RNA。在逆转录之后，通过聚合酶链反应(PCR)，使用一组家族特异性引物扩增μ(Fd区)和κ链，使用描述于以下文献中的方法：Persson等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2432-2436。用限制酶SacI和XbaI裂解扩增的轻链DNA，并且与用SacI/XbaI-线性化的pComb3载体连接3小时时间，如在以下中所描述6的：Burton等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，10134-10137，和Barbas等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982。纯化连接的材料，并且通过电穿孔转化入200μl大肠杆菌XL1-Blue细胞。在转化之后，让所述细胞生长过夜，并且制备噬菌粒DNA。
然后，用限制酶SpeI和XhoI消化PCR扩增的重链和分离的含有所述轻链的噬菌粒DNA。连接所述重链噬菌粒片段，并且用于转化XL1-Blue。在37℃下，让Fab文库在SOC培养基中生长1小时，然后添加含有羧苄青霉素(50μg/ml)和四环素(10μg/ml)的SB培养基。3小时之后，添加辅助噬菌体VCS-M13(1012噬斑形成单位)，并且再摇晃所述培养物2小时之间。添加卡那霉素(70μg/ml)，并且在30℃下温育所述培养物过夜。通过在4℃下离心(4000×g，20分钟)使所述上清液清晰。添加5％聚乙二醇和0.15M NaCl，并且在冰上温育30分钟。然后通过第二轮离心，使噬菌体沉淀。将噬菌体沉淀物重新悬浮在含有1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)的pH7.4的磷酸缓冲的盐溶液(PBS)中，并且以10,000×g的速度离心3分钟，以便使碎片沉淀。
通过淘选富集抗原结合性噬菌体。B9165抗体文库的淘选，是用描述于以下文献中的方法进行的：Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，10134-10137。简单地讲，在4℃下，用超声波处理过的存在于pH8.6的0.1M碳酸氢盐缓冲液中的结肠癌细胞系(colo137)的裂解物，对微量滴定孔进行包衣过夜。参见Ditzel等(1992)Eur.J.Nucl.Med.19，409-417。在37℃下，用含有3％BSA的PBS封闭1小时之后，将存在于PBS中的50μl噬菌体悬浮液添加到每一个孔中，并且温育2小时。通过用含有0.05％(w/v)Tween 20(PBS-Tween)(Merck，Darmstadt，FRG)的PBS剧烈洗涤10次，除去未结合的噬菌体。用pH2.2的0.2M甘氨酸/HCl洗脱富集了所述抗原结合性Fabs的结合噬菌体。通过感染大肠杆菌，扩增洗脱的噬菌体，并且通过用VCS-M13辅助噬菌体超感染回收。将所述淘选方法进行两次。从最后一轮淘选中分离噬菌粒DNA，用NheI和SpeI裂解，并且重新连接。该步骤切除了cpIII基因，得到了能产生可溶性Fab片段的载体。
B9165 Fab和完整的抗体的ELISA分析。通过冷冻-解冻方法，以细菌上清液形式制备Fabs，使用披露于以下文献中的方法：Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，10134-10137；和Barbas等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982。
为了评估特异性，在ELISA系统中筛选上清液和纯化的Fabs对结肠癌细胞(Colon137)，BSA(Sigma)，卵清蛋白(Sigma)，重组HIV-1gp120(EB)(Intracel，Issaquah，WA)和人胎盘DNA(Sigma)的超声处理物的结合。在4℃下，用存在于pH8.6的0.1M碳酸氢盐缓冲液中的50μl抗原(1-10μg/ml)，对ELISA孔(Costar)进行包衣过夜。在37℃下，让PBS中的DNA在ELISA孔上干燥。用PBS洗涤所述孔2次，通过在37℃下用存在于PBS中的3％的BSA填充所述孔进行封闭1小时，并且在37℃下与人Fab样品或完整的人IgM抗体一起温育2小时。用PBS-Tween和结合的Fab洗涤平板10次，并且用在PBS中稀释500倍的碱性磷酸酶(AP)标记过的山羊抗-人IgG F(ab′)2(Pierce Chemical Co，Rockford，IL)检测结合的Fab，或者用在PBS中稀释1000倍的碱性磷酸酶-标记过的兔抗-人κ-链(Sigma)检测结合的Fab。用对-磷酸硝基苯酯(Sigma)(1mg/ml，1mM MgCl2，10％(w/v)二乙醇胺，pH9.6)观察结合的抗体，并且在405nm波长下读数。
Fab的纯化。用作过某些改进的描述于以下文献中的方法纯化重组B9165 Fab：Ditzel等(1995)J.ImmunoL.154，895-908。简单地讲，将含有合适的克隆的大肠杆菌接种到含有羧苄青霉素(50μg/ml)，四环素(10μg/ml)和MgCl2(20mM)的超级营养液的1L培养物中，并且在37℃下摇晃生长6小时。然后用2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白表达，并且在30℃下继续生长过夜。通过亲和层析，从细菌上清液中纯化可溶性Fab，使用与蛋白Gγ结合基质(Pharmacia)交联的抗人IgG F(ab′)2(Pierce)的山羊抗体。用PBS洗涤所述柱，并且用0.2M甘氨酸/HCl，pH2.2洗脱结合的Fab，并且马上用1M Tris/HCl，pH9.0中和。
核苷酸测序。测序是在373A自动DNA测序仪(ABI，FosterCity，Ca)上进行的，使用Taq荧光双脱氧终止循环测序试剂盒(ABI)。用于阐明轻链序列的引物是SEQKb引物(5′-ATAGAAGTTGTTCAGCAGGCA-3′，SEQ ID NO：41)，它能与(+)链杂交，以及KEF引物(5′-GAATTCTAAACTAGCTAGTTCG-3′，SEQ ID NO：42)，它能与(-)链杂交。对于重链来说，使用了与(-)链结合的CMHD引物(5′-CAAGGGCTTGAGTGGATGGGA-3′，SEQ ID NO：43)和T3引物(5′-ATTAACCCTCACTAAAG-3′，SEQ ID NO：44)。
通过聚焦激光扫描显微术分析。在含有10％FBS的Iscove′s改进的Dulbecco′s培养基中生长人结肠癌细胞系(H3619和colo137)，以及乳腺癌细胞系(MCF-7和H3396)，并且让它在37℃下，在5％CO2中与有腔室的盖玻片(Nunc，Kamstrup，丹麦)贴壁48小时，以便形成单层。如下文所述，使用一级COU-1抗体，B9165Fab，鼠抗-细胞角蛋白8，鼠抗-细胞角蛋白18，和HuMab 16.88进行实验。除了B9165 Fab(30μg/ml)之外，所有抗体都是在10μg/ml的浓度下检测的。
1)细胞内染色。在-20℃下，用甲醇透化H3619和colo137细胞5分钟，用正常山羊血清封闭，然后在室温下与一级抗体一起温育1小时。然后用培养基洗涤所述细胞3次，并且在室温下分别用由PBS稀释1∶100和1∶50倍的FITC-标记过的山羊抗-人κ-链抗体(Southern biotech)或FITC-标记过的山羊抗-小鼠IgG(BioSource)一起温育1小时。
2)表面染色。在4℃下将活的H3619细胞与COU-1抗体一起温育2小时，用冰冷培养基洗涤3次，并且在4℃下与二级FITC-标记过的抗体一起温育1小时。
3)内在化。在37℃下将活的H3619和colo137细胞与COU-1抗体或B9165 Fab一起培养6小时，然后洗涤3次，并且用甲醇在-20℃下透化5分钟。用正常的山羊血清封闭细胞，并且在室温下与二级FITC-标记过的抗体一起温育1小时。对于所有实验来说，在一级和二级抗体温育之后，洗涤所述细胞，在室温下用PBS配制的2％的低聚甲醛固定15分钟，洗涤2次，并且封固在抗退色制剂(30mM二硫赤藓糖醇∶PBS∶甘油，2∶9∶1)中。通过聚焦激光扫描显微术评估细胞染色。作为对照，所有实验都在去掉所述一级抗体的情况下进行。
免疫组织化学分析。组织样本是从进行手术切除的结肠直肠癌患者体内获得的。正常的结肠组织是从离开肿瘤部位大约15厘米的切除物上采集的。在4℃下，在96％的醇中固定组织6小时。然后，对组织进行石蜡包埋，并且切割成5微米的切片。在二甲苯中对切片进行脱石蜡，通过分级的醇进行再水合，并且用PBS-Tween洗涤。在室温下，在潮湿培养箱中，将切片与100μl浓度均为0.5-10μg/ml的鼠单克隆抗体，人单克隆IgM抗体或正常多克隆人IgM一起温育2小时。洗涤载玻片，并且在室温下与在含有10％(w/v)牛血清清蛋白的PBS中稀释过的AP-标记过的兔抗-人IgM(Dako，Glostrup，丹麦)，辣根过氧化物酶(HRP)标记过的兔抗-人IgM(Dako)或HRP-标记过的兔抗-小鼠IgG(Dako)一起温育1小时。在洗涤之后，通过用生色底物(0.6mg二氨基联苯胺/ml PBS，含有0.01％H2O2)和具有0.2mg萘酚-AS-Mx磷酸(Sigma)，1mg固红TR盐(Sigma)，20μg二甲基甲酰胺/ml 0.1M Tris/HCl，1M左旋咪唑，pH8.2显影观察HRP。用Mayer′s苏木精对所述切片进行对染，在二甲苯中脱水，并且封固在Aquamount中(Gurr，Poole，英国)。染色强度划分成以下等级：(-)不染色，(+)弱染色，(++)中等染色，(+++)强染色。
结果
能够结合癌相关表位的HuMab的噬菌体展示表达和测序。RNA是从B9165细胞系中提取的，并且通过PCR使用3′家族特异性引物和5′恒定引物扩增来自相应的cDNA的重(μ，Fd区)链和轻(κ链)基因。然后将所述轻链和重链产物依次克隆到M13噬菌体表面表达载体pComb3上，以便制备具有2×106个成员的文库。在COU-1抗原阳性结肠癌细胞系(colon137)的超声处理物上选择所述噬菌体文库2次。将来自最后一轮选择的洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌XLI-blue细胞。用所述细胞制备DNA，并且通过NheI/SpeI消化除去基因III片段，并且连接。利用重建的噬菌粒转化XLI-Blue，以便产生能分泌可溶性Fab片段的克隆。检测过的80个独立Fab表达克隆中的三个的上清液，在ELISA中表现出与colon 137裂解物的结合，并且不能与卵清蛋白结合。
鉴定了这三种克隆的序列。序列分析表明，B9165杂交瘤细胞轻链属于VKIII家族，并且它与作为最接近的种系(图13)的L6具有97％(269/276)的核苷酸同源性。B9165轻链包括相当于30号密码子插入的额外的丝氨酸。轻链J片段表现出与种系JK5片段具有95％(36/38)的核苷酸同源性。另外，序列分析表明，所述重链属于VHI家族，与重链种系DP-7具有98％的核苷酸同源性。重链J片段表现出与种系JH6b片段具有96％(53/55)核苷酸同源性。COU-1的D片段表现出与D2种系D片段具有最密切的同源性，具有一个具有完全同源性的16个核苷酸的片段。
在ELISA测定中，用完整的COU-1抗体和正常的多克隆IgM同时检测了纯化的B9165Fab对结肠癌细胞的裂解物(colo137)和不相关的抗原的结合。B9165 Fab和COU-1表现出与colon137裂解物的强的结合，但是对包括BSA，卵清蛋白，人DNA和HIV-1gp120在内的一组其他抗原不能结合(数据未发表)。相反，正常的人IgM不能结合任何抗原。对于B9165 Fab来说，饱和所需要的浓度(20μg/ml)明显高于完整抗体的(1μg/ml)，并且类似于以前用化学衍生的半单聚体片段测定的结果，它的Ka为2×106M-1(Ditzel，H.，Erb，K.，Leslie，G.& Jensenius，J.C.(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4，86-93)。
COU-1能优先结合恶性癌细胞。使用间接免疫过氧化物酶和碱性磷酸酶技术研究了在结肠和直肠腺癌的组织活体检查中的COU-1识别的抗原的亚细胞定位。在较高的放大倍数下，观察到了COU-1对中间丝的独特的纤维状染色。在小细胞团或单个细胞中，在外周部分观察到了强的染色，它可能与细胞表面结合。另外，观察到了与相邻细胞之间的连接区结合的增强的染色。在八种结肠或直肠癌中的五个中的相邻的正常结肠隐蔽的上皮细胞中没有观察到染色。在其他三种癌症中，除了癌组织的强染色之外，在相邻的形态学正常的结肠组织的地方，观察到了由阴性细胞包围的少数独立细胞弱的染色。尽管这些结肠上皮在形态学上看上去是正常的，但这可能不是事实。鼠抗细胞角蛋白8抗体和抗细胞角蛋白18抗体(未示出)能够对相邻的正常结肠上皮和结肠癌组织产生强的染色。不过，COU-1只能与恶性肿瘤细胞起反应，而不能与正常上皮起反应。在表3中提供了COU-1，鼠抗细胞角蛋白8和18，以及16.88的染色水平的比较。16.88抗体表现出对结肠癌细胞的强染色，弱染色仅仅出现在正常结肠上皮的某些区域，不过，另外可染色平滑肌纤维，还观察到了肌上皮衍生的结缔组织(表5)。
                          表5
乙醇固定的恶性肿瘤组织和正常组织的抗体反应性的比较。
组织/抗体 HuMabCOU-1 HuMab16.88 正常人IgM Mab抗-K8 Mab抗-K18
结肠癌 +++ +++ - +++ +++
正常上皮 - + - +++ +++
结缔组织 - - - -
平滑肌 - ++ - - -
肝细胞 - - - +++ +++
胆管 +++ +++ - +++ +++
比较了所述抗体对肝脏中的结肠转移瘤和周围正常肝脏组织的染色。COU-1能够对转移瘤产生强的染色，而没有观察到大部分肝细胞的染色。位于门管周区域的一些肝细胞是弱阳性的。类似地，所述16.88抗体不能对所述肝细胞的大部分染色。不过，肌上皮结缔组织能被16.88染色，但是不能被COU-1染色。这两种人抗体都能对胆管染色。鼠抗细胞角蛋白8和18(未示出)抗体，能够以相同的强度对转移瘤和正常肝细胞强烈染色。所述染色朝向小叶中心区减弱。发现了鼠Mabs对与肝细胞的细胞膜结合的特别强的染色。
因此，将噬菌体展示和细菌表达用于克隆，并且进一步表征来自能表达人单克隆抗体COU-1的杂交瘤细胞系的Fab和其他抗体片段。克隆的B9165 Fab的结合特征与以前有关半单聚体片段的报导非常类似，所述片段是通过化学还原和烷基化产生的(Ditzel，H.，Erb，K.，Leslie，G.& Jensenius，J.C.(1993)Hum.Antibod.Hybridomas4，86-93)。序列分析表明，重链和轻链可变区具有最低的体细胞突变，与密切相关的种系V基因分别具有98％和97％的核苷酸同源性。这一结果与COU-1是IgM抗体这一事实吻合，并且表明了通过定点诱变进行明显的亲和力成熟是可行的。
包括所述测定实施方案和实施例的以上说明，是用于说明本发明的，而不是被作为限定。在不超出本发明的真实构思和范围的前提下，可以进行多种其他的改变和改进。
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55.Godfroid，E.，Geuskens，M.，Dupressoir，T.，Parent，I.，and Szpirer，C.Cytokeratins are exposed on the outer surface of established humanmammary carcinoma cells.J.Cell Science，99：595-607，1991.
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                        序列表
<110>The Scripps Research Institute
     Ditzel，Henrik
     Jensenius，Jens
<120>癌相关表位
<130>1361.017WO1
<150>US60/345,208
<151>2002-01-03
<160>64
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>482
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Ser Ile Arg Val Thr Gln Lys Ser Tyr Lys Val Ser Thr Ser Gly Pro
1               5                   10                  15
Arg Ala Phe Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Ser Gly Pro Gly Ser Arg Ile
            20                  25                  30
Ser Ser Ser Ser Phe Ser Arg Val Gly Ser Ser Asn Phe Arg Gly Gly
        35                  40                  45
Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Ala Ser Gly Met Gly Gly Ile Thr Ala
    50                  55                  60
Val Thr Val Asn Gln Ser Leu Leu Ser Pro Leu Ser Leu Glu Val Asp
65                  70                  75                  80
Pro Asn Ile Gln Ala Val Arg Thr Gln Glu Lys Glu Gln Ile Lys Thr
                85                  90                  95
Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu
            100                 105                 110
Gln Gln Asn Lys Met Leu Glu Thr Lys Trp Ser Leu Leu Gln Gln Gln
        115                 120                 125
Lys Thr Ala Arg Ser Asn Met Asp Asn Met Phe Glu Ser Tyr Ile Asn
    130                 135                 140
Asn Leu Arg Arg Gln Leu Glu Thr Leu Gly Gln Glu Lys Leu Lys Leu
145                 150                 155                 160
Glu Ala Glu Leu Gly Asn Met Gln Gly Leu Val Glu Asp Phe Lys Asn
                165                 170                 175
Lys Tyr Glu Asp Glu Ile Asn Lys Arg Thr Glu Met Glu Asn Glu Phe
            180                 185                 190
Val Leu Ile Lys Lys Asp Val Asp Glu Ala Tyr Met Asn Lys Val Glu
        195                 200                 205
Leu Glu Ser Arg Leu Glu Gly Leu Thr Asp Glu Ile Asn Phe Leu Arg
    210                 215                 220
Gln Leu Tyr Glu Glu Glu Ile Arg Glu Leu Gln Ser Gln Ile Ser Asp
225                 230                 235                 240
Thr Ser Val Val Leu Ser Met Asp Asn Ser Arg Ssr Leu Asp Met Glu
                245                 250                 255
Ser Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Asp Ile Ala Asn Arg
            260                 265                 270
Ser Arg Ala Glu Ala Glu Ser Met Tyr Gln Ile Lys Tyr Glu Glu Leu
        275                 280                 285
Gln Ser Leu Ala Gly Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Arg Thr Lys Thr
    290                 295                 300
Glu Ile Ser Glu Met Asn Arg Asn Ile Ser Arg Leu Gln Ala Glu Ile
305                 310                 315                 320
Glu Gly Leu Lys Gly Gln Arg Ala Ser Leu Glu Ala Ala Ile Ala Asp
                325                 330                 335
Ala Glu Gln Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Asp Ala Asn Ala Lys Leu
            340                 345                 350
Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp Met Ala Arg
        355                 360                 365
Gln Leu Arg Glu Tyr Gln Glu Leu Met Asn Val Lys Leu Ala Leu Asp
    370                 375                 380
Ile Asp Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Pro
385                 390                 395                 400
Leu Glu Ser Gly Met Gln Asn Met Ser Ile His Thr Lys Thr Thr Gly
                405                 410                 415
Gly Tyr Ala Gly Gly Leu Ser Ser Ala Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Pro
            420                 425                 430
Gly Leu Ser Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gly Ser
        435                 440                 445
Ser Ser Phe Ser Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Val Lys Lys
    450                 455                 460
Ile Glu Thr Arg Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val Leu
465                 470                 475                 480
Pro Lys
<210>2
<211>429
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Ser Phe Thr Thr Arg Ser Thr Phe Ser Thr Asn Tyr Arg Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Ser Val Gln Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Arg Pro Val Ser Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Ser Val Tyr Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Arg Ile Ser Val Ser
        35                  40                  45
Arg Ser Thr Ser Phe Arg Gly Gly Met Gly Ser Gly Gly Leu Ala Thr
    50                  55                  60
Gly Ile Ala Gly Gly Leu Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys
65                  70                  75                  80
Glu Thr Met Gln Ser Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Arg
                85                  90                  95
Val Arg Ser Leu Glu Thr Glu Asn Arg Arg Leu Glu Ser Lys Ile Arg
            100                 105                 110
Glu His Leu Glu Lys Lys Gly Pro Gln Val Arg Asp Trp Ser His Tyr
        115                 120                 125
Phe Lys Ile Ile Glu Asp Leu Arg Ala Gln Ile Phe Ala Asn Thr Val
    130                 135                 140
Asp Asn Ala Arg Ile Val Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu Ala Ala
145                 150                 155                 160
Asp Asp Phe Arg Val Lys Tyr Glu Thr Glu Leu Ala Met Arg Gln Ser
                165                 170                 175
Val Glu Asn Asp Ile His Gly Leu Arg Lys Val Ile Asp Asp Thr Asn
            180                 185                 190
Ile Thr Arg Leu Gln Leu Glu Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Glu Glu
        195                 200                 205
Leu Leu Phe Met Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Val Lys Gly Leu Gln
    210                 215                 220
Ala Gln Ile Ala Ser Ser Gly Leu Thr Val Glu Val Asp Ala Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Gln Asp Leu Ala Lys Ile Met Ala Asp Ile Arg Ala Gln Tyr Asp
                245                 250                 255
Glu Leu Ala Arg Lys Asn Arg Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Trp Ser Gln
            260                 265                 270
Gln Ile Glu Glu Ser Thr Thr Val Val Thr Thr Gln Ser Ala Glu Val
        275                 280                 285
Gly Ala Ala Glu Thr Thr Leu Thr Glu Leu Arg Arg Thr Val Gln Ser
    290                 295                 300
Leu Glu Ile Asp Leu Asp Ser Met Arg Asn Leu Lys Ala Ser Leu Glu
305                 310                 315                 320
Asn Ser Leu Arg Glu Val Glu Ala Arg Tyr Ala Leu Gln Met Glu Gln
                325                 330                 335
Leu Asn Gly Ile Leu Leu His Leu Glu Ser Glu Leu Ala Gln Thr Arg
            340                 345                 350
Ala Glu Gly Gln Arg Gln Ala Gln Glu Tyr Glu Ala Leu Leu Asn Ile
        355                 360                 365
Lys Val Lys Leu Glu Ala Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Leu Glu
    370                 375                 380
Asp Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asn Ser
385                 390                 395                 400
Met Gln Thr Ile Gln Lys Thr Thr Thr Arg Arg Ile Val Asp Gly Lys
                405                 410                 415
Val Val Ser Glu Thr Asn Asp Thr Lys Val Leu Arg His
            420                 425
<210>3
<211>44
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Ala Val Arg Thr Gln Glu Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Asn Asn Lys
1               5                   10                  15
Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys
            20                  25                  30
Met Leu Glu Thr Lys Trp Ser Leu Leu Gln Gln Gln
        35                  40
<210>4
<211>53
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys Glu Thr Met Gln Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Arg Val Arg Ser Leu Glu Thr
            20                  25                  30
Glu Asn Arg Arg Leu Glu Ser Lys Ile Arg Glu His Leu Glu Lys Lys
        35                  40                  45
Gly Pro Gln Val Arg
    50
<210>5
<211>398
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Ala Val Arg Thr Gln Glu Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Asn Asn Lys
1               5                   10                  15
Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys
            20                  25                  30
Met Leu Glu Thr Lys Trp Ser Leu Leu Gln Gln Gln Lys Thr Ala Arg
        35                  40                  45
Ser Asn Met Asp Asn Met Phe Glu Ser Tyr Ile Asn Asn Leu Arg Arg
    50                  55                  60
Gln Leu Glu Thr Leu Gly Gln Glu Lys Leu Lys Leu Glu Ala Glu Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asn Met Gln Gly Leu Val Glu Asp Phe Lys Asn Lys Tyr Glu Asp
                85                  90                  95
Glu Ile Asn Lys Arg Thr Glu Met Glu Asn Glu Phe Val Leu Ile Lys
            100                 105                 110
Lys Asp Val Asp Glu Ala Tyr Met Asn Lys Val Glu Leu Glu Ser Arg
        115                 120                 125
Leu Glu Gly Leu Thr Asp Glu Ile Asn Phe Leu Arg Gln Leu Tyr Glu
    130                 135                 140
Glu Glu Ile Arg Glu Leu Gln Ser Gln Ile Ser Asp Thr Ser Val Val
145                 150                 155                 160
Leu Ser Met Asp Asn Ser Arg Ser Leu Asp Met Glu Ser Ile Ile Ala
                165                 170                 175
Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Asp Ile Ala Asn Arg Ser Arg Ala Glu
            180                 185                 190
Ala Glu Ser Met Tyr Gln Ile Lys Tyr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ala
        195                 200                 205
Gly Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Arg Thr Lys Thr Glu Ile Ser Glu
    210                 215                 220
Met Asn Arg Asn Ile Ser Arg Leu Gln Ala Glu Ile Glu Gly Leu Lys
225                 230                 235                 240
Gly Gln Arg Ala Ser Leu Glu Ala Ala Ile Ala Asp Ala Glu Gln Arg
                245                 250                 255
Gly Glu Leu Ala Ile Lys Asp Ala Asn Ala Lys Leu Ser Glu Leu Glu
            260                 265                 270
Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp Met Ala Arg Gln Leu Arg Glu
        275                 280                 285
Tyr Gln Glu Leu Met Asn Val Lys Leu Ala Leu Asp Ile Asp Ile Ala
    290                 295                 300
Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Pro Leu Glu Ser Gly
305                 310                 315                 320
Met Gln Asn Met Ser Ile His Thr Lys Thr Thr Gly Gly Tyr Ala Gly
                325                 330                 335
Gly Leu Ser Ser Ala Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Pro Gly Leu Ser Tyr
            340                 345                 350
Ser Leu Gly Ser Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gly Ser Ser Ser Phe Ser
        355                 360                 365
Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Val Lys Lys Ile Glu Thr Arg
    370                 375                 380
Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val Leu Pro Lys
385                 390                 395
<210>6
<211>359
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys Glu Thr Met Gln Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Arg Val Arg Ser Leu Glu Thr
            20                  25                  30
Glu Asn Arg Arg Leu Glu Ser Lys Ile Arg Glu His Leu Glu Lys Lys
        35                  40                  45
Gly Pro Gln Val Arg Asp Trp Ser His Tyr Phe Lys Ile Ile Glu Asp
    50                  55                  60
Leu Arg Ala Gln Ile Phe Ala Asn Thr Val Asp Asn Ala Arg Ile Val
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Val Lys
                85                  90                  95
Tyr Glu Thr Glu Leu Ala Met Arg Gln Ser Val Glu Asn Asp Ile His
            100                 105                 110
Gly Leu Arg Lys Val Ile Asp Asp Thr Asn Ile Thr Arg Leu Gln Leu
        115                 120                 125
Glu Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Glu Glu Leu Leu Phe Met Lys Lys
    130                 135                 140
Asn His Glu Glu Glu Val Lys Gly Leu Gln Ala Gln Ile Ala Ser Ser
145                 150                 155                 160
Gly Leu Thr Val Glu Val Asp Ala Pro Lys Ser Gln Asp Leu Ala Lys
                165                 170                 175
Ile Met Ala Asp Ile Arg Ala Gln Tyr Asp Glu Leu Ala Arg Lys Asn
            180                 185                 190
Arg Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Trp Ser Gln Gln Ile Glu Glu Ser Thr
        195                 200                 205
Thr Val Val Thr Thr Gln Ser Ala Glu Val Gly Ala Ala Glu Thr Thr
    210                 215                 220
Leu Thr Glu Leu Arg Arg Thr Val Gln Ser Leu Glu Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ser Met Arg Asn Leu Lys Ala Ser Leu Glu Asn Ser Leu Arg Glu Val
                245                 250                 255
Glu Ala Arg Tyr Ala Leu Gln Met Glu Gln Leu Asn Gly Ile Leu Leu
            260                 265                 270
His Leu Glu Ser Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ala Glu Gly Gln Arg Gln
        275                 280                 285
Ala Gln Glu Tyr Glu Ala Leu Leu Asn Ile Lys Val Lys Leu Glu Ala
    290                 295                 300
Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Leu Glu Asp Gly Glu Asp Phe Asn
305                 310                 315                 320
Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asn Ser Met Gln Thr Ile Gln Lys
                325                 330                 335
Thr Thr Thr Arg Arg Ile Val Asp Gly Lys Val Val Ser Glu Thr Asn
            340                 345                 350
Asp Thr Lys Val Leu Arg His
        355
<210>7
<211>23
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
1               5                   10                  15
Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Ser
            20
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Ser Tyr Tyr Met His
1               5
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>9
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>10
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>11
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>12
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Asp Gln Val Val Val Ala Ala Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>13
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>13
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
1               5                   10
<210>14
<211>21
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Glu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
1               5                   10                  15
Ala Thr Leu Ser Cys
            20
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>15
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>17
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
<210>18
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>18
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Gln Gln Gly Thr Asn Trp Gly Ile Ala
1               5
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys Arg
1               5                   10
<210>21
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<400>21
Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
1               5                   10                  15
Leu Ser Cys
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>23
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>23
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>24
Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>25
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
1               5
<210>26
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<400>26
Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr
1               5                   10                  15
Ile Asn Cys
<210>27
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>27
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>28
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>29
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210>30
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>30
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
1               5                   10
<210>31
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Gly
1               5                   10                  15
Tyr Tyr Cys
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met
1               5
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
1               5
<210>34
<211>104
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
1               5                   10                  15
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp
            20                  25                  30
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala
        35                  40                  45
Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe
65                  70                  75                  80
Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Pro Tyr Thr Phe
                85                  90                  95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100
<210>35
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>35
Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr
1               5                   10                  15
Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Val Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Pro Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105
<210>36
<211>354
<212>DNA
<213>智人
<400>36
ggggctgagg tgaagaagcc tggggcgtca gtgaaggttt cctgcaaggc atctggatac     60
accttcagca gctactatat gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg    120
atgggaataa tcaaccctag tggtggtagc acaagctacg cacagaagtt ccagggcaga    180
gtcaccatga ccagggacac gtccacgaac acagtctaca tggagctgag cagcctgaga    240
tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg agagatcagg tggtggtagc tgctactttg    300
tccaactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca          354
<210>37
<211>321
<212>DNA
<213>智人
<400>37
gagctcaccc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc     60
tgcagggcca gtcagagtgt tagtagcagc tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc    120
caggctccca ggctcctcat ctatgatgca tccaacaggg ccactggcat cccagccagg    180
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa    240
gattttgcag tttattactg tcagcagggt accaactggg ggatcgcctt cggccaaggg    300
acacgactgg atattaaacg a                                              321
<210>38
<211>313
<212>DNA
<213>智人
<400>38
acgcagtctc caggcaccct gtctttgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgtagg    60
gccagtcaga gtgttagcag cagctactta gcctggtacc agcagaaacc tggccaggct    120
cccaggctcc tcatctatgg tgcatccagc agggccactg gcatcccaga caggttcagt    180
ggcagtgggt cagggacaga cttcactctc accatcagca gactggagcc tgaagatttt    240
gcagcgtatt actgtcagca gtatggtaac tcacctccgt acacttttgg ccaggggacc    300
aagctggaga tca                                                       313
<210>39
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>39
acccagtctc cagactccct ggctgtgtct ctgggcgaga gggccaccat caactgcaag     60
tccagccaga gtcttttata cagctccaac aataagaact acttagcttg gtaccagcag    120
aaaccaggac agcctcctaa gttgctcatt tactgggcat ctacccggga atccggggtc    180
cctgaccgat tcagtggcag cgggtctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg    240
caggctgaag atgtggcagg ttattactgt cagcaatatt atagtactcc tccgatgttc    300
ggccaaggga ccaaggtgga aatc                                           324
<210>40
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<221>SITE
<222>1，4
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>40
Xaa Ser Arg Xaa
1
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
atagaagttg ttcagcaggc a                                      21
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
gaattctaaa ctagctagtt cg                                     22
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
caagggcttg agtggatggg a                                      21
<210>44
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
attaaccctc actaaag                                           17
<210>45
<211>1724
<212>DNA
<213>智人
<400>45
ttcggcaatt cctacctcca ctcctgcctc caccatgtcc atcagggtga cccagaagtc      60
ctacaaggtg tccacctctg gcccccgggc cttcagcagc cgctcctaca cgagtgggcc     120
cggttcccgc atcagctcct cgagcttctc ccgagtgggc agcagcaact ttcgcggtgg     180
cctgggcggc ggctatggtg gggccagcgg catgggaggc atcaccgcag ttacggtcaa     240
ccagagcctg ctgagcccct tgtccctgga ggtggacccc aacatccagg ccgtgcgcac     300
ccaggagaag gagcagatca agaccctgaa caacaagttt gcctccttca tagacaaggt     360
acggttcctg gagcagcaga acaagatgct ggagaccaag tggagcctcc tgcagcagca     420
gaagacggct cgaagcaaca tggacaacat gttcgagagc tacatcaaca accttaggcg     480
gcagctggag actctgggcc aggagaagct gaagctggag gcggagcttg gcaacatgca     540
ggggctggtg gaggacttca agaacaagta tgaggatgag atcaataagc gtacagagat     600
ggagaacgaa tttgtcctca tcaagaagga tgtggatgaa gcatacatga acaaggtaga     660
gctggagtct cgcctggaag ggctgaccga cgagatcaac ttcctcaggc agctgtatga     720
agaggagatc cgggagctgc agtcccagat ctcggacaca tctgtggtgc tgtccatgga     780
caacagccgc tccctggaca tggagagcat cattgctgag gtcaaggcac agtacgagga     840
tattgccaac cgcagccggg ctgaggctga gagcatgtac cagatcaagt atgaggagct     900
gcagagcctg gctgggaagc acggggatga cctgcggcgc acaaagactg agatctcaga     960
gatgaaccgg aacatcagcc ggctccaggc tgagattgag ggcctcaaag gccagagggc    1020
ttccctggag gccgccattg cagatgccga gcagcgtgga gagctggcca ttaaggatgc    1080
caacgccaag ttgtccgagc tggaggccgc cctgcagcgg gccaagcagg acatggcccg    1140
gcagctgcgt gagtaccagg agctgatgaa cgtcaagctg gccctggaca tcgacatcgc    1200
cacctacagg aagctgctgg agggcgagga gagcccgctg gagtctggga tgcagaacat    1260
gagtattcat acgaagacca ccggcggcta tgcgggtggt ttgagctcgg cctatgggga    1320
cctcacagac cccggcctca gctacagcct gggctccagc tttggctctg gcgcgggctc    1380
cagctccttc agccgcacca gctcctccag ggccgtggtt gtgaagaaga tcgagacacg    1440
tgatgggaag ctggtgtctg agtcctctga cgtcctgccc aagtgaacag ctgcggcagc    1500
ccctcccagc ctacccctcc tgcgctgccc cagagcctgg gaaggaggcc gctatgcagg    1560
gtagcactgg gaacaggaga cccacctgag gctcagccct agccctcagc ccacctgggg    1620
agtttactac ctggggaccc cccttgccca tgcctccagc tacaaaacaa ttcaattgct    1680
tttttttttt ttggtcccaa aataaaacct cagctagctc tgcc                     1724
<210>46
<211>1412
<212>DNA
<213>智人
<400>46
cggggtcgtc cgcaaagcct gagtcctgtc ctttctctct ccccggacag catgagcttc     60
accactcgct ccaccttctc caccaactac cggtccctgg gctctgtcca ggcgcccagc    120
tacggcgccc ggccggtcag cagcgcggcc agcgtctatg caggcgctgg gggctctggt    180
tcccggatct ccgtgtcccg ctccaccagc ttcaggggcg gcatggggtc cgggggcctg    240
gccaccggga tagccggggg tctggcagga atgggaggca tccagaacga gaaggagacc    300
atgcaaagcc tgaacgaccg cctggcctct tacctggaca gagtgaggag cctggagacc     360
gagaaccgga ggctggagag caaaatccgg gagcacttgg agaagaaggg accccaggtc     420
agagactgga gccattactt caagatcatc gaggacctga gggctcagat cttcgcaaat     480
actgtggaca atgcccgcat cgttctgcag attgacaatg cccgtcttgc tgctgatgac     540
tttagagtca agtatgagac agagctggcc atgcgccagt ctgtggagaa cgacatccat     600
gggctccgca aggtcattga tgacaccaat atcacacgac tgcagctgga gacagagatc     660
gaggctctca aggaggagct gctcttcatg aagaagaacc acgaagagga agtaaaaggc     720
ctacaagccc agattgccag ctctgggttg accgtggagg tagatgcccc caaatctcag     780
gacctcgcca agatcatggc agacatccgg gcccaatatg acgagctggc tcggaagaac     840
cgagaggagc tagacaagta ctggtctcag cagattgagg agagcaccac agtggtcacc     900
acacagtctg ctgaggttgg agctgctgag acgacgctca cagagctgag acgtacagtc     960
cagtccttgg agatcgacct ggactccatg agaaatctga aggccagctt ggagaacagc    1020
ctgagggagg tggaggcccg ctacgcccta cagatggagc agctcaacgg gatcctgctg    1080
caccttgagt cagagctggc acagacccgg gcagagggac agcgccaggc ccaggagtat    1140
gaggccctgc tgaacatcaa ggtcaagctg gaggctgaga tcgccaccta ccgccgcctg    1200
ctggaagatg gcgaggactt taatcttggt gatgccttgg acagcagcaa ctccatgcaa    1260
accatccaaa agaccaccac ccgccggata gtggatggca aagtggtgtc tgagaccaat    1320
gacaccaaag ttctgaggca ttaagccagc agaagcaggg taccctttgg ggagcaggag    1380
gccaataaaa agttcagagt tcattggatg tc                                  1412
<210>47
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>相关可变轻链CDR1片段和结合实体的结构式
<221>SITE
<222>1
<223>Xaa＝任何碱性氨基酸
<221>SITE
<222>2
<223>Xaa＝任何脂族或极性氨基酸
<221>SITE
<222>3，5，9，10
<223>Xaa＝丝氨酸
<221>SITE
<222>6，16，17
<223>Xaa＝任何脂族氨基酸
<221>SITE
<222>8，15
<223>Xaa＝任何极性氨基酸
<221>SITE
<222>(4)...(4)
<223>Xaa＝谷氨酰胺
<221>SITE
<222>(7)...(7)
<223>Xaa＝任何脂族氨基酸或无氨基酸
<221>SITE
<222>(11)...(11)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸或无氨基酸
<221>SITE
<222>(12)...(12)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸或无氨基酸
<221>SITE
<222>(14)...(14)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸或无氨基酸
<221>SITE
<222>(13)...(13)
<223>Xaa＝任何碱性氨基酸或无氨基酸
<400>47
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa
<210>48
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>相关的可变轻链CDRR片段和结合实体的结构式
<221>SITE
<222>1
<223>Xaa＝任何酸性、非极性、或芳族氨基酸
<221>SITE
<222>2
<223>Xaa＝丙氨酸
<221>SITE
<222>3
<223>Xaa＝丝氨酸
<221>SITE
<222>4，7
<223>Xaa＝任何极性氨基酸
<221>SITE
<222>5
<223>Xaa＝任何碱性氨基酸
<221>SITE
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝任何酸性或脂族氨基酸
<400>48
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>相关的可变轻链CDR3片段和结合实体的结构式
<221>SITE
<222>1，2
<223>Xaa＝谷氨酰胺
<221>SITE
<222>3
<223>Xaa＝酪氨酸
<221>SITE
<222>4，9
<223>Xaa＝任何非极性、极性、或芳族氨基酸
<221>SITE
<222>5，6
<223>Xaa＝任何极性氨基酸
<221>SITE
<222>7，8
<223>Xaa＝脯氨酸
<221>SITE
<222>(10)...(10)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸或无氨基酸
<400>49
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>50
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<221>SITE
<222>1
<223>Xaa＝丝氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸
<221>SITE
<222>2，5
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>SITE
<222>6
<223>Xaa＝丝氨酸或缬氨酸
<400>50
Xaa Xaa Ser Arg Xaa Xaa
1               5
<210>51
<211>4
<212>PRT
<213>智人
<400>51
Thr Ala Val Thr
1
<210>52
<211>4
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Ser Pro Leu Val
1
<210>53
<211>4
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Thr Gly Ile Ala
1
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>54
Ser Tyr Thr Ser Gly Pro Gly Ser Arg Ile
1               5                   10
<210>55
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>55
Val Gly Ser Ser Asn Phe Arg Gly Gly Leu
1               5                   10
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>56
Thr Val Asn Gln Ser Leu Leu Ser Pro Leu
1               5                   10
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>57
Val Leu Glu Val Asp Pro Asn Ile Gln Ala
1               5                   10
<210>58
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>58
Ser Thr Ser Phe Arg Gly Gly Met Gly Ser Gly Gly Leu Ala Thr
1               5                   10                  15
<210>59
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>59
Ala Gly Gly Leu Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys Glu Thr
1               5                   10                  15
Met Gln Ser Leu
            20
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>60
Phe Gly Pro Gly Val Ala Phe Arg Ala Pro
1               5                   10
<210>61
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>61
Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala
1               5
<210>62
<211>105
<212>PRT
<213>智人
<400>62
Ser Ile Arg Val Thr Gln Lys Ser Tyr Lys Val Ser Thr Ser Gly Pro
1               5                   10                  15
Arg Ala Phe Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Ser Gly Pro Gly Ser Arg Ile
            20                  25                  30
Ser Ser Ser Ser Phe Ser Arg Val Gly Ser Ser Asn Phe Arg Gly Gly
        35                  40                  45
Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Ala Ser Gly Met Gly Gly Ile Thr Ala
    50                  55                  60
Val Thr Val Asn Gln Ser Leu Leu Ser Pro Leu Val Leu Glu Val Asp
65                  70                  75                  80
Pro Asn Ile Gln Ala Val Arg Thr Gln Glu Lys Glu Gln Ile Lys Thr
                85                  90                  95
Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile
            100                 105
<210>63
<211>94
<212>PRT
<213>智人
<400>63
Ser Phe Thr Thr Arg Ser Thr Phe Ser Thr Asn Tyr Arg Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Ser Val Gln Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Arg Pro Val Ser Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Ser Val Tyr Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Arg Ile Ser Val Ser
        35                  40                  45
Arg Ser Thr Ser Phe Arg Gly Gly Met Gly Ser Gly Gly Leu Ala Thr
    50                  55                  60
Gly Ile Ala Gly Gly Leu Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys
65                  70                  75                  80
Glu Thr Met Gln Ser Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu
                85                  90
<210>64
<211>4
<212>PRT
<213>智人
<400>64
Gly Ser Arg Ile
1

Claims (69)

1.分离的癌相关表位，包括两种独立的多肽，细胞角蛋白8多肽，和细胞角蛋白18多肽，其中，所述细胞角蛋白8多肽基本由SEQID NO：3或SEQ ID NO：5组成，而所述细胞角蛋白18多肽基本由SEQID NO：4或SEQ ID NO：6组成。
2.如权利要求1的分离的多肽，其中，所述细胞角蛋白8多肽短于大约475个氨基酸，而所述细胞角蛋白18多肽短于大约425个氨基酸。
3.如权利要求1的分离的表位，其中，所述癌相关表位是在腺癌细胞的丝状细胞质结构中检测的，不过在正常细胞中基本上检测不到。
4.如权利要求1的分离的表位，其中，所述癌相关表位是在结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原细胞瘤睾丸癌细胞的丝状细胞质结构中检测的。
5.一种用于预防或治疗腺癌的疫苗组合物，含有癌相关表位，所述表位包括两种独立的多肽，细胞角蛋白8多肽和细胞角蛋白18多肽，其中，所述细胞角蛋白8多肽基本由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5组成，而所述细胞角蛋白18多肽基本由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6组成。
6.如权利要求5的疫苗组合物，其中，所述细胞角蛋白8多肽短于大约475个氨基酸，而所述细胞角蛋白18多肽短于大约425个氨基酸。
7.如权利要求5的疫苗组合物，其中，所述腺癌是结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌或非精原细胞瘤睾丸癌。
8.一种分离的结合实体多肽，它能够结合癌相关表位，所述表位包括两种独立的多肽，细胞角蛋白8多肽和细胞角蛋白18多肽，其中，所述细胞角蛋白8多肽基本由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5组成，而所述细胞角蛋白18多肽基本由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6组成。
9.如权利要求8的分离的结合实体多肽，其中，所述细胞角蛋白8多肽短于大约475个氨基酸，而所述细胞角蛋白18多肽短于大约425个氨基酸。
10.如权利要求8的分离的结合实体多肽，其中，所述结合实体多肽短于大约425个氨基酸。
11.如权利要求8的分离的结合实体多肽，其中，所述结合实体多肽短于大约200个氨基酸。
12.如权利要求8的分离的结合实体多肽，其中，所述结合实体多肽是抗体。
13.如权利要求8的分离的结合实体多肽，其中，所述结合实体多肽能够检测腺癌细胞中丝状细胞质结构中的癌相关表位，但是基本上不能在正常细胞的丝状结构中检测。
14.如权利要求8的结合实体，其中，所述结合实体多肽能够在结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原细胞瘤睾丸癌细胞的丝状细胞质结构中检测癌相关表位。
15.如权利要求8的结合实体，其中，所述结合实体多肽基本由其氨基酸序列与SEQ ID NO：7-35中任意一个至少具有98％同源性的多肽组成。
16.如权利要求8的结合实体，其中，所述结合实体基本由具有SEQ ID NO：7-35或SEQ ID NO：47-49中任意一个的多肽组成。
17.如权利要求8的结合实体，其中，所述结合实体是由包括SEQID NO：36-39中任意一个的核酸编码的。
18.一种用于检测癌症的试剂盒，包括装有能结合癌相关表位的结合实体多肽的容器，其中，所述癌相关表位包括两种独立的多肽，细胞角蛋白8多肽和细胞角蛋白18多肽，并且，其中，所述细胞角蛋白8多肽基本由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5组成，而所述细胞角蛋白18多肽基本由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6组成。
19.如权利要求18的试剂盒，其中，所述细胞角蛋白8多肽短于大约475个氨基酸，而所述细胞角蛋白18多肽短于大约425个氨基酸。
20.如权利要求18的试剂盒，其中，所述结合实体多肽短于大约425个氨基酸。
21.如权利要求18的试剂盒，其中，所述结合实体多肽短于大约200个氨基酸。
22.如权利要求18的试剂盒，其中，所述结合实体多肽是抗体。
23.如权利要求18的试剂盒，其中，所述癌是腺癌。
24.如权利要求18的试剂盒，其中，所述癌是结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌或非精原细胞瘤睾丸癌。
25.如权利要求18的试剂盒，其中，所述结合实体多肽还包括一种标记或诊断成像剂。
26.如权利要求18的试剂盒，其中，所述结合实体多肽还包括硫酸钡，碘醋胺酸，碘番酸，碘泊酸钙，泛影酸钠，泛影葡胺，甲泛葡胺，丁酰碘番酸钠，氟-18，碳-11，碘-123，锝-99m，碘-131，铟-111，氟，钆，荧光素，异硫氰酸盐，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二醛，荧光胺，鲁米那，异鲁米那，荧光素，荧光素酶或水母发光蛋白。
27.如权利要求18的试剂盒，其中，所述结合实体基本由其氨基酸序列与SEQ ID NO：7-35中任意一个至少具有98％同源性的多肽组成。
28.如权利要求18的试剂盒，其中，所述结合实体基本由具有SEQID NO：7-35或SEQ ID NO：47-49中任意一个的多肽组成。
29.如权利要求18的试剂盒，其中，所述结合实体是由包括SEQID NO：36-39中任意一个的核酸编码的。
30.一种治疗组合物，包括结合实体多肽和可以药用的载体，其中，所述结合实体多肽能够结合癌相关表位，所述表位包括两种独立的多肽，细胞角蛋白8多肽和细胞角蛋白18多肽，其中，所述细胞角蛋白8多肽包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5，而所述细胞角蛋白18多肽包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。
31.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述细胞角蛋白8多肽短于大约475个氨基酸，而所述细胞角蛋白18多肽短于大约425个氨基酸。
32.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述结合实体多肽短于大约425个氨基酸。
33.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述结合实体多肽短于大约200个氨基酸。
34.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述结合实体多肽是抗体。
35.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述结合实体能够结合腺癌细胞的丝状细胞质结构中的癌相关表位，但基本上不能结合正常细胞的丝状结构中的表位。
36.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述结合实体能够结合结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌和非精原细胞瘤睾丸癌细胞的丝状细胞质结构中的癌相关表位。
37.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述结合实体基本由其氨基酸序列与SEQ ID NO：7-35中任意一个具有至少98％同源性的多肽组成。
38.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述结合实体基本由具有SEQ ID NO：7-35或SEQ ID NO：47-49中任意一个的多肽组成。
39.如权利要求30的治疗组合物，其中，所述结合实体是由包括SEQ ID NO：36-39中任意一个的核酸编码的。
40.一种用于治疗腺癌的组合物，包括能裂解Xaa1SR↓Xaa4(SEQID NO：40)的蛋白酶的抑制剂，以及可以药用的载体，其中，Xaa1是丝氨酸，苯丙氨酸或缬氨酸，而Xaa4是丝氨酸或缬氨酸。
41.如权利要求40的治疗组合物，其中，所述蛋白酶是胰蛋白酶-样蛋白酶。
42.如权利要求40的治疗组合物，其中，所述抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂，α-2-巨球蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，抑蛋白酶肽，胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，玉米胰蛋白酶抑制剂，西葫芦胰蛋白酶抑制剂或人淀粉样β-蛋白前体抑制剂。
43.如权利要求40的治疗组合物，其中，所述腺癌是结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌或非精原细胞瘤睾丸癌。
44.一种检测腺癌的方法，包括让结合实体多肽与检测样品接触，并且检测所述结合实体多肽是否与包括两种独立多肽，细胞角蛋白8多肽和细胞角蛋白18多肽的表位结合，其中，所述细胞角蛋白8多肽基本由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5组成，而所述细胞角蛋白18多肽基本由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6组成。
45.如权利要求44的方法，其中，所述细胞角蛋白8多肽短于大约475个氨基酸，而所述细胞角蛋白18多肽短于大约425个氨基酸。
46.如权利要求44的方法，其中，所述结合实体多肽短于大约425个氨基酸。
47.如权利要求44的方法，其中，所述结合实体多肽短于大约200个氨基酸。
48.如权利要求44的方法，其中，所述结合实体多肽是抗体。
49.如权利要求44的方法，其中，所述结合实体基本由其氨基酸序列与SEQ ID NO：7-35中任意一个具有至少98％同源性的多肽组成。
50.如权利要求44的方法，其中，所述结合实体基本由具有SEQID NO：7-35或SEQ ID NO：47-49中任意一个的多肽组成。
51.如权利要求44的方法，其中，所述结合实体是由包括SEQ IDNO：36-39中任意一个的核酸编码的。
52.如权利要求44的方法，其中，所述腺癌是结肠腺癌，卵巢腺癌，肾脏腺癌，乳腺腺癌，肺腺癌，胰腺腺癌或非精原细胞瘤睾丸癌。
53.如权利要求44的方法，其中，所述结合实体还包括一种标记或诊断成像剂。
54.如权利要求44的方法，其中，所述结合实体还包括硫酸钡，碘醋胺酸，碘番酸，碘泊酸钙，泛影酸钠，泛影葡胺，甲泛葡胺，丁酰碘番酸钠，氟-18，碳-11，碘-123，锝-99m，碘-131，铟-111，氟，钆，荧光素，异硫氰酸盐，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二醛，荧光胺，鲁米那，异鲁米那，荧光素，荧光素酶或水母发光蛋白。
55.一种治疗或预防哺乳动物癌症的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的与抗肿瘤剂偶联的结合实体多肽；其中结合实体多肽能结合包括两种独立的多肽的癌相关表位，所述独立的多肽为细胞角蛋白8多肽，和细胞角蛋白18多肽；并且，其中，所述细胞角蛋白8多肽包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5，而所述细胞角蛋白18多肽包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。
56.如权利要求55的方法，其中，所述细胞角蛋白8多肽短于大约475个氨基酸，而所述细胞角蛋白18多肽短于大约425个氨基酸。
57.如权利要求55的方法，其中，所述结合实体多肽短于大约425个氨基酸。
58.如权利要求55的方法，其中，所述结合实体多肽短于大约200个氨基酸。
59.如权利要求55的方法，其中，所述结合实体多肽是抗体。
60.如权利要求55的方法，其中，所述抗-肿瘤制剂是放射性碘酸化化合物，毒素，细胞抑制药物或细胞裂解药物。
61.如权利要求55的方法，其中，所述抗-肿瘤制剂是氨鲁米特，硫唑嘌呤，硫酸博来霉素，白消安，卡氮芥，苯丁酸氮芥，顺铂，环磷酰胺，环孢菌素，cytarabidine，氮烯咪胺，放线菌素D，正定霉素，阿霉素，紫杉酚，足叶乙甙，氟尿嘧啶，干扰素-α，环己亚硝脲，巯基嘌呤，氨甲蝶呤，米托坦，盐酸甲基苄肼，硫鸟嘌呤，硫酸长春碱，硫酸长春新碱，美洲商陆抗-病毒蛋白，霍乱毒素，百日咳毒素，蓖麻毒蛋白，gelonin，相思豆毒素，白喉外毒素，假单胞菌外毒素或钴-60。
62.如权利要求55的方法，其中，所述结合实体包括其氨基酸序列与SEQ ID NO：20-35中任意一个具有至少98％同源性的多肽。
63.如权利要求55的方法，其中，所述结合实体包括具有SEQ IDNO：7-35或SEQ ID NO：47-49中任意一个的多肽。
64.如权利要求55的方法，其中，所述结合实体是由包括SEQ IDNO：36-39中任意一个的核酸编码的。
65.一种鉴定突变型结合实体的方法，包括：
将编码具有SEQ ID NO：20-35中任意一个的多肽的核酸与编码展示蛋白的核酸融合，以便制备编码融合蛋白的重组核酸；
对编码所述融合蛋白的重组核酸进行诱变，以便制备编码突变融合蛋白的突变核酸；
表达所述突变融合蛋白；和
选择能结合包括两种独立多肽的癌相关表位的突变融合蛋白，第一种多肽包括细胞角蛋白8的SEQ ID NO：3，第二种多肽包括细胞角蛋白18的SEQ ID NO：4。
66.如权利要求65的方法其中，所述结合实体是CDR或Fab片段。
67.如权利要求65的方法，其中，所述展示蛋白是噬菌体展示蛋白，逆转录病毒展示蛋白，或核糖体展示蛋白。
68.将如权利要求30的治疗组合物用于制备用来治疗和/或预防哺乳动物癌症的药物的用途。
69.将如权利要求40的治疗组合物用于制备用来治疗和/或预防哺乳动物癌症的药物的用途。
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