CN1217750A - 抗cea的单克隆抗体,包括所述抗体的偶联物及其在adept系统中的治疗应用 - Google Patents

抗cea的单克隆抗体,包括所述抗体的偶联物及其在adept系统中的治疗应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鼠源的用于癌症诊断和治疗的抗－CEA单克隆抗体(命名为“806.077抗体”)。该抗体的互补性决定区(CDRs)具有下面的序列:重链:CDR1DNYMH、CDR2WIDPENGDTEYAPKFRG、CDR3LIYAGYLAMDY；和轻链；CDR1SASSSVTYMH、CDR2STSNLAS、CDR3QQRSTYPLT。描述了人源化的抗体。该抗体优选是与适于用于ADEPT系统的酶,特别是羧肽酶的偶联物形式或与共刺激分子如人B7.1细胞外区域的偶联物形式。

Description

抗CEA的单克隆抗体，包括所述抗体的 偶联物及其在ADEPT系统中的治疗应用
本发明涉及用于癌症诊断和治疗的新的抗-CEA单克隆抗体(本文命名为“806.077抗体”或“806.077Ab”)。
已确证正常组织细胞向癌细胞的转化与细胞表面的结构改变有关。改变的细胞表面可用作抗原并且肿瘤修饰的结构代表一种所谓的肿瘤相关抗原(见例如肿瘤细胞中改变的糖基化，编.Reading,Hakamori和Marcus 1988,Arthur R.Liss出版社)。这种抗原可，例如，通过用Kohler和Mrlstein首先描述(自然，256,495-497,1975)的现已得到公认的杂交瘤技术产生单特异性抗体而被利用。
一种肿瘤相关的抗原为CEA(癌胚抗原)，其由Gold和Freedman在实验医学杂志，121.439，1965中首先描述过。该抗原存在于肿瘤细胞表面并且也可存在于血清中。
在癌症治疗中用抗体靶向肿瘤相关抗原的概念已被认识了一段时间(Herlyn等.，(1980)癌症研究40,717)。抗体可用于将各种化学和生物药剂定向至肿瘤并且这种偶联物在形成体外和体内诊断的许多方法的基础中特别成功。在癌症治疗中免疫偶联物的使用也是令人满意的(Lord等(1985)生物技术趋势3,175；Vitetla等(1987)科学，238,1098)。该方法在技术上较诊断应用要求更高并且需要在这种免疫治疗方法中被定向的肿瘤相关抗原是高度肿瘤特异性的并且在致命的人组织中不以显著的水平表达。虽然不希望与理论方面以及具有特异性肿瘤相关组织分布的特性相结合，但对有些应用来说，抗原结合后抗体仍然保留于细胞表面而不迅速内化(internalised)是理想的。例如在ADEPT(抗体引导的酶前体药物治疗，见美国专利4975278和5405990)中，认为抗体保留了细胞表面以利于前体药物通过抗体-酶偶联物的激活。
抗体偶联物在肿瘤免疫治疗中也有应用。下面几段陈述此种应用的科学背景。为了对免疫刺激应答，T细胞需要2种信号。一种这样的信号由T-细胞受体(TCR)对MHC显示肽(displayed pepdides)的识别所提供。然而已证实仅仅TCR刺激没有导致T-细胞的反应性或导致无反应且需要第二种或共刺激信号(co-stimulatory signal)刺激特异性T-细胞激活和增殖(Schwartz R.H.综述，实验医学杂志，1996,184,1-8)。当接收到两种信号时，得到的细胞毒性T-细胞通过杀死靶细胞而介导免疫反应。已鉴定出许多潜在的共刺激分子(如B7、ICAMs、LFA-1和3、CD40、CD70和CD24,Galea-Lauri J等综述，癌症基因治疗，1996,3,202-213)。主要的共刺激功能似乎由可与两种受体CD28和CTLA-4相互作用的相关分子B7.1(也称为CD80)和B7.2(也称为CD86)提供(HellstromK.E.等，免疫学综述，1995,145,123-145和Lenschow D.J.等，免疫学年鉴，1996,14,233-258)。B7.1和B7.2在抗原呈递细胞(APC)如树突细胞中表达而CD28和CTLA-4存在于T-细胞。B7.2在APCs表面似乎是组成性表达但与T-细胞接触后，B7.1的表达受到上调。类似地，CD28在T-细胞中表面但激活后受到下调并且由CTLA-4的表达所替代。由B7.1和B7.2对CD28和CTLA-4的刺激代表了信号处理的复杂模式，其不仅控制T-细胞的激活，而且随后控制增殖以调节免疫反应(Greene J.等.，生物化学杂志，1996,271,26762-26771)。该现象可省时解释由研究这些共-刺激分子的研究人员所报导的相互矛盾的数据。
在癌症中，肿瘤浸润的淋巴细胞已被鉴定但对肿瘤免疫反应的缺乏可能是由于T-细胞的无反应性。肿瘤细胞在其表面可显示特异性或选择性的抗原但缺乏B7.1/B7.2使它们逃避了免疫监视。的确，体内实验已证实B7.1/B7.2转染的肿瘤细胞较相同细胞系未转染的细胞具有较少的致瘤性并且转染的细胞能够诱导对亲代细胞重新攻击的保护性免疫性(Townsend S.E.和Allison J.P.,1993，科学，259,368-370)。这证明一旦被刺激，免疫应答可变为是B7.1/B7.2非依赖性的。Hellstrom提议通过基因治疗在肿瘤细胞中表达B7.1/B7.2具有刺激可降低或排除疾病的宿主免疫应答的可能性。Gejewski(免疫学杂志，1996,156,465-472)和Matulonis等(免疫学杂志，1996,156,1126-1131)已报导B7.1在T-细胞激活中优于B7.2。已有报导在溶液中B7.1(与抗体恒定区融合)的使用仅对通过独立来源而接受TCR刺激的T-细胞提供较少的共-刺激(Linsley P.S.等实验医学杂志，1991,173,721-730)。
需要有进一步改善的用于癌症诊断和治疗的抗-CEA抗体。
本发明基于发现一种本文称为806.077抗体的新的抗-CEA抗体。
根据本发明的一个方面，提供了包括互补性决定区(CDRs)的抗-CEA抗体，其中的CDRs具有下面的序列：a)重链
CDR1 DNYMH(SEQ ID NO:29)
CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG(SEQ ID NO:31)
CDR3 LIYAGYLAMD Y(SEQ ID NO:32)；b)轻链
CDR1 SASSSVTYMH(SEQ ID NO:26)
CDR2 STSNLAS(SEQ ID NO:27)
CDR3 QQRSTYPLT(SEQ ID NO:28)。
CDRs或互补性决定区为认为在决定抗原抗体相互作用的特异性中至关重要的抗体可变区中高度可变环中的序列(Kabat,E.A.,Lu,T.T.,Reid-Miller,M.,Perry,H.M.和Gottesman,K.S.(1987)。免疫学感兴趣蛋白的序列。第4版。华盛顿特区：美国卫生和人类服务部；读者也可参考该文献中Kabat抗体残基编号的细节)。然而，本文所定义的CDRs包括其促进结合的框架残基。对于806.077抗体来说，通过与其它鼠抗体高度可变序列的类比而测定其CDRs。在该说明书中，术语“VK”和“VH”分别指抗体轻链和重链的可变区。抗体分子的解剖学已由Padlan(1994)在分子免疫学31,169-217中综述过。轻链CDRs为：VK CDR1 Kabat残基，包括位点第24-34:SASSSVTYMH(SEQID NO:26)；VK CDR2 Kabat残基，包括位点第50-56:STSNLAS(SEQ IDNO:27)；VK CDR3 Kabat残基，包括位点第89-97:QQRSTYPLT(SEQID NO:28)；重链CDRs为：VH CDR1 Kabat残基，包括位点第31-35B:DNYMH(SEQ IDNO:29)；优选的VH CDR1 kabat残基为包括位点第27-35B，FNIKDN YMH(SEQID NO:30)；VH CDR2 Kabat残基，包括位点第50-65:WIDPENGDTEYAPKFTG(SEQ ID NO:31)；VH CDR3 Kabat残基，包括位点第95-102:LIYAGYLAMD Y(SEQ ID NO:32)；并且优选的VH CDR3 kabat残基包括位点第93-102,HVLIYAGYLAMDY(SEQ ID NO:33)。
对CEA抗原优选的结合亲和性为至少10E-5M，对CEA更优选的结合亲和性至少为10E-6M，对CEA更优选的结合亲和性为至少10E-7M，对CEA的更优选的结合亲和性为至少10E-7M，对CEA的更为优选的结全亲和性为至少10E-9M，对CEA更为优选的结合亲和性为至少10E-10M且特别优选的对CEA的结合亲和性至少为10E-10M。
本文使用的术语“抗体”一般意为免疫球蛋白分子(或其片段或其修饰的抗体构建体如保持特异性CEA抗原结合的scFv)。CDRs主要负责抗原结合，虽然非-CDR蛋白序列一般源自免疫球蛋白但可源自免疫球蛋白超家族成员的免疫球蛋白区域。
根据本发明的另一方面，提供了包括下面结构任选人源化的CEA抗体：重链可变区序列(SEQ ID NO:11):EVQLQQSGAE LVRSGASVKL SCTASGFNIK DNYMHWVKQR  40PEQGLEWIAW IDPENGDTEY APKFRGKATL TADSSSNTAY  80LHLSSLTSED TAVYYCHVLI YAGYLAMDYW GQGTSVAVSS 120和；轻链可变区序列(SEQ ID NO:9):DIELTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVT YMHWFQQKPG  40TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE  80DAATYYCQQR STYPLTFGAG TKLELKRA  108；或其任何一种下面的构建体：F(ab′)2；F(ab′),Fab,Fv，单链Fv及V-min。
F(ab′)2片段是优选的。可以考虑保留有806.077抗体结合特征的任何合适的抗体片段。例如，最近描述的抗体片段为由Zapata(1995)在蛋白质工程，8,1057-1062中描述的“L-F(ab)2”。也可考虑二硫键结合的Fvs。任选地该抗体形成下述偶联物的一部分。
优选人源化的抗体包括至少一种下面的序列：重链可变区序列，VH1(SEQ ID NO:55)；轻链可变区序列，VK4(SEQ ID NO:71)；人CH1重链IgG3恒定区；人κ轻链CL区；和人IgG3铰链区；任选为F(ab′)2片段的形式。
根据本发明的另一方面提供了能够编码本发明CEA抗体重链或轻链可变区的多核苷酸序列。优选该重链或轻链可变区融合(任选通过一些连接序列)至编码蛋白效应部分(作为偶联物的一部分，见下文)的基因上，优选融合经过抗体重链。一般地，融合可以在抗体链的N或C末端进行。对于B7偶联物来说，在抗体链N-末端的融合是优选的。
CPB具有N-末端区域原(pro domain)，认为该区域原在被去除而释放活性酶之前可帮助纠正蛋白的折叠。如果前CPB在其C-末端融合至抗体链的N-末端上，那么这允许区域原从融合构建体的N-末端去除(如，通过胰蛋白酶处理)。或者，如果前CPB附着到抗体链的C-末端时，则产生了不得不从该构建体“中部”去除区域原而不破坏该融合蛋白的问题。解决方案是单独共表达该区域原(反向)。一旦细胞系已被建立时，这具有无需胰蛋白酶激活表达的融合蛋白以去除CPB区域原的优势。前CPB在其C-末端融合至抗体链N-末端的构建体具有无需构建其表达细胞系的优势，后者需要区域原与其它蛋白一起高水平的表达。
在该说明书中，考虑到了特异性氨基酸序列的保守氨基酸类似物，它们保留本发明CEA抗体的结合特性但序列中有一个或更多个保守氨基酸替代、缺失或添加的不同。然而特异性列出的氨基酸序列是优选的。典型的保守氨基酸替代列表如下：保守替代
原始的         典型替代              优选替代
Ala(A)       Val；Leu；Ile              Val
Arg(R)       Lys；Gln；Asn              Lys
Asn(N)       Gln；His；Lys；Arg         Gln
Asp(D)       Glu                        Glu
Cys(C)       Ser                        Ser
Gln(Q)       Asn                        Asn
Glu(E)       Asp                        Asp
Gly(G)       Pro                        Pro
His(H)       Asn；Gln；Lys；Arg         Arg
Ile(I)       Leu；Val；Met；Ala；Phe；  Leu
             正亮氨酸
Leu(L)       正亮氨酸；Ile；Val；Met；  Ile
             Ala；Phe
Lys(K)       Arg；Gln；Asn              Arg
Met(M)       Leu；Phe；Ile              Leu
Phe(F)       Leu；Val；Ile；Ala         Leu
Pro(P)       Gly                        Gly
Ser(S)       Thr                        Thr
Thr(T)       Ser                        Ser
Tyr(Y)       Trp；Phe；Thr；Ser         Phe
Val(V)       Ile；Leu；Met；Phe；Ala；  Leu
             正亮氨酸
在该说明书中考虑到了特异保留核酸序列的核酸变异(缺失、替代和添加)，该变异保留在严格的条件下与本文讨论的特定序列杂交的能力。杂交测试在后面的实施例9中列出。然而特异性列出的核酸序列是优选的。认为肽核酸可以是多核苷酸序列可接受的等价物，至少是为了无需翻译成蛋白的目的(Wittung(1994)自然368,561)。
根据本发明的另一方面提供了本文所述的特征在于人源化了的抗体或抗体片段。
人源化的抗体、相关的片段或抗体结合结构为主要由在抗原结合位点(互补决定区或CDRs；该技术称为CDR嫁接，其通常地包括一些框架改变，见下面的实施例)中或其周围支持非人源氨基酸序列的人源免疫球蛋白序列的结构框架所组成的多肽。虽然也考虑过其它的人源化方法如抗体的表面残基镶盖(antibody veneering)(EP519596,Meck/NIH,Padlan等)，但合适的方法学如下文献中有详细描述，例如WO91/09967,EP0328404和Queen等，美国自然科学院院报86,10029,Mountain和Adair(1989)生物技术和遗传工程综述10,1(1992)。优选人源化的806.077抗体为实施例11-47或107-22中任何一种抗体。优选人源化的重链可变区为VH1(见实施例)。优选的轻链可变区为任选掺入有任何一种实施例107-109中所述其它的变化的VK4。优选的人重链恒定区为IgG3。
嵌合的人源化抗体代表本发明的另一方面。抗体806.077抗体嵌合人源化抗体片段的制备描述于本文的实施例8中。嵌合抗体一般通过一物种的可变区与不同物种的另一种抗体的恒定区连接而构建。
本文使用的关于抗体的术语“人源化”(humanised)包括任何一种人源化方法例如CDR嫁接或嵌合抗体的制备或其任何一种杂合体例如嫁接CDR的重链与嵌合的轻链连接(见实施例110中合适的实施方案)。
特别地，在人体内单独或作为偶联物而重复施用的啮齿类抗体将导致受体中抗啮齿类抗体的免疫应答，所谓的HAMA应答(人抗小鼠抗体)。如果需要重复的剂量，HAMA应答可限制药物的有效性。通过用亲水聚合物如聚乙二醇对抗体进行化学修饰或通过用遗传工程的方法使抗体结合结构更象人类抗体的结构可降低抗体的免疫原性。例如，结合CEA啮齿类抗体可变区的基因序列可由人杂交瘤蛋白的可变区所替代，因而产生了重组的嵌合抗体。这些方法详细描述于EP194276、EP0120694、EP0125023、EP0171496、EP0173494和WO86/01533。或者可分离或合成结合CEA啮齿类抗体CDRs的基因序列并以同源的人抗体基因相应的序列替代，产生具有原始啮齿类抗体特异性的人抗体。这些方法描述于EP023940、WO09/07861和WO91/09967中。或者，啮齿类抗体可变区大量的表面残基可变成同源的人抗体中常见的残基，产生具有表面残基“镶盖”且将因此自身由人体所识别的啮齿类抗体。该方法已由Padlan等(1991)在分子免疫学，28,489中所证实。
根据本发明的另一方面提供了从多核苷酸序列转化的宿主细胞或从其中的多核苷酸序列编码本文所述任选偶联物形式的至少本发明CEA抗体重链或轻链可变区的宿主细胞形成的转基因非人动物或转基因植物。
根据本发明的另一方面，提供了杂交瘤806.077，保藏于ECACC，保藏号为96022936及其变异的细胞系。
杂交瘤806.077抗体已于1996年2月29日根据布达佩斯条约以登记号96022936保藏于欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，应用微生物和研究PHLS中心，Porton Down,Salisbury,Wiltshire SP40JG，英国。
根据本发明的另一方面，提供了保藏于NCIMB且保藏号为40798的质粒pNG3-Vkss-HuCk。
质粒pNG3-Vkss-HuCk已于1 996年4月11日根据布达佩斯条约以保藏参考号NCIMB 40798保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB),23 St Machar Drive,Aberdeen AB21RY，苏格兰，英国。
根据本发明的另一方面提供了保藏于NCIMB中且保藏号为40797的质粒pNG4-VHss-HuIgG2CH1′。
质粒pNG4-VHss-HuIgG2CH1′已于1996年4月11日根据布达佩斯条约以保藏参考号NCIMB 40797保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB),23 St Machar Drrve Aberdeen AB21RY，苏格兰，英国。
根据本发明的另一方面提供了保藏于NCIMB且保藏号为40799的质粒pNG3-Vkss-HuCk-NEO.
质粒pNG3-Vkss-HuCk-NEO已于1996年4月11日根据布达佩斯条约以保藏参考号NCIMB 40797保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB),23 St Machar Drrve Aberdeen AB21RY，苏格兰，英国。
根据本发明的另一方面提供了制备至少本文定义的抗-CEA抗体重链或轻链的可变区的方法，包括：a)以编码至少抗-CEA抗体重链或轻链可变区的多核苷酸序列转化宿主细胞并任选将转化的宿主细胞开发成转基因的非-人哺乳动物或植物；b)将宿主细胞、转基因非-人哺乳动物或转基因植物置于利于至少可变区表达且任选分泌的条件下并任选；c)至少部分可变区。
根据本发明的另一个方面，提供了制备本文定义的抗体或偶联物的方法，包括：a)将本文定义的宿主细胞、转基因非-人哺乳动物或转基因植物或806.077杂交瘤置于利于抗体或偶联物表达和任选分泌的条件下；并且任选地b)至少部分纯化抗体或偶联物。
优选地，重链和轻链可变区均在相同的细胞中表达和装配从而形成抗-CEA抗体。优选地，该重链和轻链可变区融合(任选地经过一些连接序列)至编码蛋白效应部分(作为偶联物的一部分，见下文)的基因上，优选融合是经过抗体重链。一般地，融合可以在抗体链的N或C末端进行。对于B7偶联物来说，在抗体链N-末端的融合是优选的。CPB具有N-末端区域原，该区域被认为在去除区域原以释放活性酶之前帮助校正蛋白的折叠。如果前体CPB在其C-末端融合至抗体链的N-末端，那么这允许从融合构建体的N-末端去除区域原(如通过胰蛋白酶处理)。或者，如果前体CPB附着到抗体链的C-末端，那么产生了不得不从该构建体“中部”去除区域原而不破坏融合蛋白的问题。解决方案是单独共表达区域原(反向)。一旦建立细胞系，这具有无需胰蛋白酶激活表达的融合蛋白以去除CPB区域原的优势。用前CPB在其C-末端融合至抗体链N-末端的构建体具有无需构建需要同时高水平表达区域原和其它蛋白的共表达细胞系的优势。
根据本发明的另一方面，提供了制备单克隆抗体806.077的方法，包括：a)在培养基中利于抗体在其中表达的条件下培养在ECACC中保藏号为96022936的杂交瘤806.077抗体和；b)从该培养基中获取抗体806.077抗体和任选地；c)通过酶消化制备抗体806.077的抗体F(ab′)2片段。
根据本发明的另一方面，提供了包括效应部分(effector moiety)的偶联物和本文所述的本发明抗CEA 806.077抗体。效应部分是这样的一个整体，即具有在形成偶联物中赋予806.077抗体另一种活性(如，酶、毒物或放射性配体)的效应的部分。
在一个实施方案中，优选地，该效应部分为适合用于ADEPT系统中的酶。在96年7月4日公开的国际专利申请WO96/20011中，我们提出了一种“反极性”(reversed polarity)的ADEPT系统，其基于与例如，细菌酶相比具有低免疫原性优势的突变的人的酶。特别的宿主酶为人胰CPB(见例如，实施例15〔D253K〕人CPB和其中的16〔D253R〕人CPB)和其前体药物(见其中的实施例18和19)。将宿主酶突变以得到在底物识方面与天然宿主酶相比在酶和前体药物相互作用的模式发生变化。在我们随后的国际专利申请No PCT/GB96/01975(97年3月6日公开为WO97/07796)中，描述了关于用于ADEPT突变的CPB酶/前体药物结合的工作。适于ADEPT的优选酶为任何一种CPG2或反极性CPB酶，例如〔D253K〕HCPB、〔G251T,D253K〕HCPB或〔A248S,G251T,D253K〕HCPB中的任何一种。
806.077抗体偶联物在肿瘤免疫治疗中也有应用。因此，在另一个优选的实施方案中，偶联物效应部分为共刺激分子，优选该共刺激分子为B7，更优选为B7.1或B7.2且特别优选为人B7.1。优选该偶联物为融合蛋白的形式，优选其中的融合蛋白经共刺激分子的C-末端与806.077抗体缺乏Fc抗体区域，更优选缺乏F(ab′)2抗体片段，更优选抗体为人源化或人的抗体。特别优选的偶联物描述于下面实施例104中。
预计使用抗体将共刺激分子定向运输至肿瘤细胞具有将抗原呈递给肿瘤细胞的功能从而使T-细胞接受肿瘤细胞本身的特异性TCT刺激和抗体定向运输分子的共-刺激信号。人或人源化抗体的使用优选用于治疗人类肿瘤因为当用于人时鼠抗体可诱发这样的免疫反应，即当重复治时其可导致反应性的下降。肿瘤抗原结合区域与共刺激分子细胞外部分连接的融合蛋白的使用是新奇的。Hayden等(组织抗原，1996,48,242-254)报导了抗-肿瘤抗原结合区与抗-CD28结合区相连接的双特异性抗体分子的使用。尽管该分子能够与T-细胞上的CD28相互作用，但其可运送信号具有与天然CD28配体提供的信号具有质的不同的劣势，例如，其结合亲和性大于B7.1和CD28之间的亲和性。B7.1、B7.2和CD28、CTLA-4之间的种间同源性表明结合区序列的进化保守性。因此，认为，例如人的B7.1可小鼠的CD28相互作用并可传导类似的共-刺激信号。对于人类疾病的治疗，人或人源化的蛋白是优选的。然而，在动物模型中人或人源化的蛋白的使用可产生与在人中预期的类似的效应，并且这种动物模型应该提供有关在人类疾病治疗中人/人源化抗体与人B7.1/B7.2融合蛋白效应的数据。
效应部分和抗体的结合可以是通过任何合适的方法，例如，通过异源双功能性(heterokifunctional)接头的化学键或重组基因融合技术。一般地，融合蛋白为优选的偶联物，特别是与HCPB或B7的偶联物。
优选的偶联物为其中的效应部分选自以下任何一种组分的偶联物：a)适合用于ADEPT系统的酶；b)CTG2；c)〔G251T,D253K〕HCPB；d)〔A248S,G251T,D253K〕HCPB；e)共刺激分子；f)B7的细胞外区域；g)人B7.1的细胞外区域；和h)人B7.2的细胞外区域；它们任选以融合蛋白的形式。
应该理解本发明的偶联物不一定由一个效应部分和一个抗体分子所组成。例如，此偶联物可包括每个抗体分子一个以上的效应分子。一般地，抗体与酶或B7细胞外区域融合的F(ab′)2抗体偶联物将具有每摩尔抗体2摩尔的酶或B7。
特别优选的偶联物为选自以下任何一种偶联物的融合蛋白(序列以从N末端向C末端方向列出)：a)人源化的806.077F(ab′)2-{〔A248S,G251T,D253K〕HCPB}2融合，包括：结构为VH1(SEQ ID NO:55)/IgG3 CH1恒定区/IgG3铰链区的抗体Fd′链；Fd′链经其C-末端融合至〔A248S,G251T,D253K〕HCPB的N-末端；和式VK4(SEQ ID NO:71)/κ轻链CL区域的抗体轻链；b){〔A248S,G251T,D253K〕HCPB}2-人源化的806.077F(ab′)2融合；包括：〔A248S,G251,D253K〕HCPB；HCPB在其C末端经(GGGS)3接头融合至结构为VH1(SEQ ID NO:55)/IgG3 CH1恒定区/IgG3铰链区的抗体Fd′链N末端；和式VK4(SEQ ID NO:71)/κ轻链CL区域的抗体轻链；和c)(人B7.1细胞外区域)2-人源化806.077F(ab′)2融合，包括：人B7.1细胞区域；在其C末端融合至结构为VH1(SEQ ID NO:55)/IgG3 CH1恒定区/IgG3铰链区的抗体Fd′链N末端的B7.1；和式VK4(SEQ ID NO:71)/κ轻链CL区域的抗体轻链。
在该说明书中有关偶联物中的抗体铰链区按Padlan(1994)在分子免疫学31,169-217中提出的原则来定义；特别见于表2中。在这些特别优选的偶联物中，每摩尔的F(ab′)2有2摩尔的酶或B7.1。正斜线(“/”)仅为分隔物以表示由偶联物各部分构成的肽键所连接的不同结构元件。
VH1和/或VK4可变区人源化序列具有保存良好的结合特性而只需要人框架中最少其它改变的优势。IgG3铰链区具有得到良好F(ab′)2产量水平和产物均一性的优势。
在有关特别优选上述偶联物的另一个优选的实施方案中，融合经抗体轻链完成，在有关特别优选上述偶联物的另一个优选的实施方案中，IgG3恒定区/IgG3铰链区的结构元件可由相应的IgG2元件所替代。
当效应成分为毒素时，该毒素成分一般包括具有细胞毒性特性并且因此能够在内化后杀死细胞的成分。
毒素成分和抗-CEA抗体可直接相互偶联或者它们可间接偶联。一般地，毒素部分和抗-CEA抗体偶联从而使该偶联物的几何结构允许抗-CEA抗体结合其靶细胞。优选地，该毒素成分和抗-CEA抗体偶联从而使偶联物在细胞外是稳定的，且在细胞内是不稳定的从而使该毒素部分和抗-CEA抗体在靶细胞外保持偶联，但内化后，将毒素部分释放。因此，优选地，该偶联物具有细胞内可切割/细胞外稳定的位点。
其中的毒素部分直接偶联至靶细胞结合部分的偶联物实例包括这样的偶联物，即其中的毒素部分与抗-CEA抗体通过毒素部分上的巯基与抗-CEA抗体上的巯基之间形成的二硫键加以偶联。免疫毒素和其它偶联物的制备和特性细节列于欧洲专利专利申请EP528527(公开号)中，在本文公开此内容仅供参考。
根据本发明的另一方面，提供了能够编码在前面任一权利要求中定义抗体或偶联物多肽的多核苷酸序列。术语“能够编码”欲包括考虑进遗传密码简并后的多核苷酸序列因为有些氨基酸由一个以上密码子所编码。
根据本发明的另一方面，提供了包括上述多核苷酸的载体。
根据本发明的另一方面，提供了以上述多核苷酸序列转化的宿主细胞或由该宿主细胞形成的转基因非-人动物或转基因植物。
根据本发明的另一方面，本发明提供了药物组合物，其中包括本文所述的本发明偶联物和药学上可接受的稀释剂或载体，任选适于静脉给药的形式。
根据本发明的另一方面，提供了本文所述的用作药剂的偶联物。
根据本发明的另一方面，提供了本文所述的偶联物在制备治疗肿瘤疾病药剂中的使用。
应该理解剂量和剂量制度将依赖于所用的特定效应部分、靶细胞群和病人的历史。施用偶联物的剂量将一般为0.1-1mg/kg病人体重。
本发明的偶联物将一般以药物组合物的形式施用。因此，根据本发明也提供了包括偶联物(本文所述)与药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。这种制剂的实例在此列于实施例10中。
本发明的药物组合物可以各种剂量形式配制。一般地，本发明的偶联物将通过肠道外、优选静脉内施用。特别的肠道外药物组合物为以单位剂量形式配制的适于注射施用的组合物。因此，特别合适的组合物包括免疫毒素的溶液、乳液或悬液与药物上可接受的肠道外载体或稀释剂。合适的载体或稀释剂包括水性载体，例如水或盐或非-水性载体，例如固定的油或脂质体。该组合物可包括增强组合物中偶联物稳定性的试剂。例如，该组合物可包括缓冲液。偶联物的浓度将会改变，但一般地，该偶联物将以约1-10mg/ml的浓度配制。
根据本发明的另一方面，提供了编码本文所述的本发明抗-CEA抗体的表达载体。
根据本发明的另一方面，提供了编码本文所述的至少抗-CEA抗体重链或轻链可变区的表达载体。
根据本发明的另一方面，提供了以本文所述的并且与在其中的表达相容的载体转化的宿主细胞。
根据本发明的另一方面，提供了以本文所述的多核苷酸序列转化的宿主细胞。
哺乳动物细胞(CHO、COS、骨髓瘤)用作共表达抗体H和L链cDNAs及其片段以制备具有特异结合活性的抗体(Bebbington,C.,1991，方法，第2卷，第136-145页，和Adair,J.,1992，免疫学综述，130卷)。对于导致直接表达活性CPB的构建体的表达，COS或CHO细胞系统是优选的。cDNAs可导入到质粒上并使其整合至特别是CHO细胞的染色体DNA上或使其尤其在COS细胞中以很高的拷贝数复制。该质粒一般需要用于维持于转染宿主中的可筛选标记、使高水平从cDNAs转录的有效的真核启动子，用于克隆和多聚腺苷酸化的方便的限制酶位点和用于信息稳定性的转录终止信号。文献中(Bebbington,C，等，1992生物/技术，10卷，169-175页，和Wright,A.,1991，方法，2卷，125-135页)描述了几种这样的载体并且有商业上可得到的合适载体，(如pRc/CMV,Invitrogen公司)。
抗体片段范围在大肠杆菌中的表达有很好的记录(Pluckthnn,A.综述，免疫学综述，1992,130卷，151-188页和Skerra,A.，当前免疫学观点，1993,5卷，p256-262)。Fd和L链的细胞内表达已有描述(Cabilly,S.,1989，基因，85卷，p553-557)但这需要该链的体外折叠和重新连接(Buchner,J和Rudolph,R.,1991，生物/技术，9卷，157-162页)以产生结合活性。获得活性抗体片段更为有效的途径是经周质分泌(Better,M.等，1988，科学，240卷，1041-1043页)。抗体片段的H和L链组分从单一质粒上共表达。提供的每种抗体链具有指导其进入大肠杆菌周质的细菌前导肽，在该周质中切除前导肽并且自由链连接以产生可溶和活性的抗体片段。该过程认为是模仿了真核细胞中的天然过程，在后者表达的抗体链在连接成完整的抗体之前进入内质网的管腔。该过程常导致了培养上清中结合活性的存在。
有些表达系统包括以载体转化宿主细胞；这种系统是众所周知的如在大肠杆菌、酵母和哺乳动物宿主中(见酶学方法，185，学术出版社，1990)。也考虑过其它的表达系统如转基因非-人的哺乳动物，其中的感兴趣基因(优选从载体中切下并且优选与哺乳动物启动子连接以指导表达的蛋白进入动物的乳汁中)导入哺乳动物分子的原核中(pronucleus)(通常通过显微注射到原核中两个核中的一个通常为雄性的核)中且之后移植到代孕母亲中。由代孕母亲产生的动物将带有和表达整合至染色体中的导入基因。通常整合的基因通过常规的育种传递给子代并且因此允许牲畜方便的扩增。优选地，感兴趣蛋白简单地从雌雄转基因动物的乳汁中收获。读者可参考下面的文献：Simons等(1988)，生物/技术6:179-183；Wright等(1991)生物/技术9:830-834；美国4,873,191和；美国5,322,775。小鼠胚胎的操作描述于Hogan等，“操作小鼠胚胎；实验指南”，冷泉港实验室1986。
也考虑到转基因植物技术，例如在下面的文献中所述：Swain W.F.(1991)TIBTECH 9:107-109；Ma J.K.C.等(1994)欧洲免疫学杂志24:131-138；Hiatt A.等(1992)FEBS通迅307:71-75；Hein M.B.等(1991)生物技术进展7:455-461；DueringK.(1990)植物分子生物学15:281-294。
如果必要，宿主基因可用下面简述的标准方法加以失活或修饰并且描述于如“基因靶向；实践方法”，IRL出版社1993。靶基因或其部分优选克隆入具有筛选标记(如新霉素(Neo))插入到该基中以破裂其功能的载体中。将该载体线性化然后转化(常通过电穿孔)入胚胎干(ES)细胞(例如源于小鼠129/Ola菌株的细胞)并且之后在一定比例的干细胞中发生同源重组。扩增含有破裂基因的干细胞并注射入胚泡(例如源自C57BL/6J的小鼠的胚泡)且移植入代孕母亲中发育。通过外表颜色标记可鉴定嵌合体的子代。繁殖嵌合体以通过将小鼠与能够区分ES来源和宿主胚泡来源配子的遗传标记匹配而确证是否ES细胞分布到精子系中。一半ES细胞来源的配子将带有基因修饰。筛选子代(如通过Southern印迹)以鉴定带有破裂基因的个体(约妊娠的50％)。这些筛选出的子代将是杂合的并且因此可与另一种杂合子交配且之后筛选出纯合的子代(约妊娠的25％)。具有基因敲除的转基因动物可与通过已知的技术如显微注射DNA至原核、原生质球融合(Jakobovits等(1993)自然362:255-258)或ES细胞脂质介导的转染(Lamb等.，(1993)自然遗传学5:22-29)而产生的转基因动物杂交以得到具有内源性基因敲除和外源性基因替代的转基因动物。
含有靶向破裂基因的ES细胞可通过从含有特异性改变的靶基因序列转化而进一步加以修饰，该靶基因序列优选克隆入载体中并在转化之前线性化。同源重组以后将改变的基因导入基因组中。这些胚胎干细胞可随后用于建立上述的转基因学(transgenics)。
术语“宿主细胞”包括适于表达技术的任何原核或真核细胞例如细菌、酵母、植物细胞和非-人的哺乳动物合子、卵母细胞、胚泡、胚胎干细胞和任何其它用于转基因技术的合适细胞。如果上下文允许，术语“宿主细胞”也包括从转化的非-人哺乳动物合子、卵母细胞、胚泡、胚胎干细胞、植物细胞和任何其它用于转基因技术的合适细胞而形成的转基因植物或非-人哺乳动物。
根据本发明的另一方面，提供了治疗需要下面的治疗的人或动物的方法，即该治疗包括给人或动物施用本文所述的药物上有效量的偶联物。
根据本发明的另一方面，提供了在需要下面的治疗的哺乳动物中定向运送效应部分于显示抗原CEA细胞的方法，即其中的治疗包括施用本文所述的药学上有效量的本发明偶联物。
根据本发明的另一方面，提供了前述抗体在诊断方法中的使用。
一种诊断方法为免疫测定。基于本发明新的抗体的用于体外测试免疫测定可根据本领域常规的免疫学技术来设计，该技术包括标记或未标记形式的根据本发明的抗体和测定该抗体与待测样品中CEA之间复合物的形成。在一种情况，抗体可用可检测的标记，如放射标记、化学发光物质、荧光物质或酶标记加以标记。通过与标记的物质形成复合物或通过非标记技术，如生物传感器方法如根据表面胞质基团共振来测定抗体。该样品可以是，例如体液的形式，如血清或组织制品(组织化学测定)。
为了体内诊断的目的，根据本发明的抗体以具有合适外部可检测到的标记，如放射标记或重金属原子的形式提供并施用至这样的受试者，即在其身体中检测到抗体可能的局部积累。
为了体外诊断癌症，抗-CEA抗体可交联至酶如辣根过氧化物酶上和可产生可被检测到信号的细菌荧光素酶上或可直接检测和定量的荧光标记或放射性同位素上。在标准的免疫测定系统中，这种偶联物提供了测定身体组织中CEA存在与否的方法并且随后提供了用于诊断肿瘤疾病的快速而方便的测试。见下面文献中的一般性描述，包括酶免疫测定中的方法学，E.T.Maggio，CRC出版社和美国36908334，美国3791932，美国3817837，美国3850578，美国3853987，美国3867517，美国3901654，美国3935074，美国3984533，美国3996345和美国4098876。
为了癌症的体内诊断，抗-CEA抗体可交联至可通过整个身体成像照片加以检测的同位素如，钇、锝或铟或重金属同位素上(见Larson,S.M.1987，放射学，165,297-304)。
对于癌症的治疗，优选的实施方案包括可交联至效应部分的抗-CEA抗体，该效应部分可直接杀死癌细胞或特别地在APEPT系统中经过适当前体药物的激活而杀死癌细胞。在ADEP中，肿瘤细胞的选择性杀死是通过交联抗-CEA抗体至酶上得以完成，其中的酶能够催化非-毒性剂量的前体药物向潜在的有毒药物化合物的转变。该偶联物的施用导致酶活性在肿瘤位点的集中(localization)。该前体药物随后的施用导致有毒药物局部的产生并在该肿瘤位点选择性杀死。此方法描述于WO85/07378、美国4,975,278，美国5,405,990和WO89/10140。抗体806.077也可交联至用于上述肿瘤免疫治疗的共-刺激分子上而加以使用。
肿瘤细胞的选择性杀死也可通过抗-CEA抗体直接或通过大环螯合试剂化学衍生而与含有高能放射性同位素如90Y、131I和111I的交联而完成。该抗-CEA抗体用于将同位素集中到肿瘤处并且由同位素发出的放射破坏周围细胞的DNA且杀死肿瘤。
选择性杀死肿瘤细胞也可通过抗-CEA抗体与细胞毒和细胞静止药物如氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、阿霉素、道诺红霉素和长春新碱的交联而完成。这些药已用于临床多年并且它们提供的治疗常受非特异性毒性的限制。这些药物与CEA抗体的交联使这些药物集中于肿瘤位点，并且因此增加可被运送至肿瘤的药物的剂量而不导致该药物对其它组织如骨髓或神经系统的不可接受的副作用。
抗体的效应在许多应用中通过降低抗体结合结构的大小且因此改善此药物组合物的组织穿透和其它药物动力学特性而得以改进。这可通过以酶去除抗体分子的Fc区域或通过遗传工程方法产生重组Fab′或F(ab＇)2片段加以完成。
遗传工程方法也可用于进一步减小抗-CEA抗体的大小。含有CDRs的Fv可经遗传工程操作并单独表达且通过如二硫桥的使用而化学交联。或者，构成Fv结构的轻链和重链区可通过用接头肽序列将Fv区从一个区域的天然C-末端融合至另一区域的N-末端而制备成单一的多肽链(SCFv)(见PCT/美国/87/02208和美国4704692)。或者，如Ward等自然(1989)341,544中所述，单一的Fv区可单独表达以形成单一区的抗体或dAb。另一种考虑到的抗-CEA抗体为由国际专利申请WO94/12625(发明者Slater和Trmms)中公开的V-min构建体。本文使用的简写包括：ADEPT            抗体介导的酶前体药物治疗APC              抗原呈递细胞CDRs             互补性决定区CEA              癌胚抗原CL               抗体轻链恒定区CPB              羧肽酶BCPG2             羧肽酶G2DAB              底物3,3＇-二氨基联苯胺四盐酸DEPC             焦碳酸二乙酯DMEM             Dulbecco改进的Eagle培养基ECACC            欧洲动物细胞保藏中心EIA              酶免疫测定ELISA            酶联免疫吸附测定FCS              胎牛血清Fd               Fab、Fab′或F(ab′)2重链，任选含有铰链HAMA             人抗小鼠抗体HCPB             人羧肽酶B，优选为胰来源(IgG)的铰链区    含有将2条重链交联在一起的半胱氨酸的短的富
             含脯氨酸的肽HRPO             辣根过氧化物酶NCA              非特异性交叉反应抗原NCIMB            国立工业和海洋微生物保藏有限公司PBS              磷酸缓冲盐液PCR                   聚合酶链式反应preproCPB             具有N-末端前导序列的前体CPB(proCPB)proCPB                具有其N-末端区域原的CPBSDS-PAGE              十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳TBS                   Tris缓冲盐溶液VH                    抗体重链的可变区VK                    抗体轻链的可变区本发明通过下面的非-限制性实施例(由实施例后的参考实施例所支持)加以说明，其中：图1显示在ADEPT模型中806.077抗体-CPG2偶联物的抗肿瘤活性；图2显示pCF009的质粒图谱；图3显示结合到固定CTLA4-Ig上的抗体-B7.1融合蛋白的BIAcore数据，如果没有特别说明，其中的实线代表测试结合且点线代表空白对照；
用GENECLEANTMⅡ试剂盒(Stratech科学公司或Brol 101公司)回收和纯化DNA。此试剂盒含有：1)6M碘化钠；2)浓缩的氯化钠溶液，用于制备氯化钠/乙醇/水洗液的Tris和EDTA；3)在水中含有1.25ml特别制备的硅基质(silica matrix)悬液的1.5ml-Glassmilk小瓶。这是基于美国自然科学院院报(1979)76卷，615页中发表的Vogelstein和Gillespie方法的DNA纯化技术。简言之，该试剂盒方法如下。向1体积的凝胶切片中加入试剂盒中3体积的碘化钠溶液。通过于55℃加热10分钟融化琼脂糖然后加入Glass milk(5-10ml)，充分混合并于室温静置10分钟。将Glass milk离心并以3体积试剂盒中的NEW WASH(0-5ml)洗3次。从Glass milk中去除洗用的缓冲液并空气中干燥。通过将干燥的Glass milk与水(5-10ml)于55℃孵育5-10分钟而洗脱DNA。通过离心回收含有洗脱DNA的水上清。可重复洗脱步骤并收集上清；
感受态大肠杆菌DH5α细胞获自生命技术公司(最大效率的DH5感受态细胞)；
用Bio 101公司的RPMTMDNA制备试剂盒(目录号2070-400)或类似的产品微量制备双链质粒DNA-该试剂盒含有碱性裂解液以从细菌细胞和Spinfilfer中的Glass milk中释放质粒DNA以吸附释放的DNA，然后以无菌水或10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH7.5洗脱该DNA。
无血清培养基为OPTIMEMTMⅠ减少血清的培养基，GibcoBRL目录号31985。
LIPOFECTINTM试剂(GibcoBRL目录号18292-011)为在膜过滤的水中阳离子型脂N-〔1-(2,3-二油酰氧基)丙基〕-n,n,n-氯化三甲胺(DOTMA)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1(w/w)脂质体制剂。其自发与DNA结合以形成脂质-DNA复合物-见Felgner等。美国自然科学院院报(1987)84,7431；
G418(硫酸盐)为GENETICINTM，GibcoBRL目录号11811，为一种与庆大霉素有关用作分子遗传实验中筛选试剂的氨基糖苷类抗生素。
可从Perkin-Elmer Cetus得到的AMPLITAQTM用作热稳定DNA聚合酶的来源；且
常规的分子生物学方法可遵从“分子克隆-实验指南”第二版，Sambrook,Fritsch和Maniatis(冷泉港实验室，1989)中描述的任何一种方法。实施例1杂交瘤细胞系806.077的发现和建立
将8-10周龄的BALB/c小鼠皮下以磷酸缓冲盐溶(0.1ml)和弗氏完全佐剂(0.1ml)中的初次剂量的CEA(10μg)免疫。2周后再过2周，将该动物以磷酸缓冲盐(0.1ml)混合以弗氏不完全佐剂(0.1ml)中进一步剂量的CEA(10μg)加强。32周后，给予该动物最后一次磷酸缓冲盐中的静脉内免疫CEA(10μg)并于3周后杀死。去除和制备胰脏并通过标准的方法(Kohler和Mrlstein，自然(1975)256,495)与NS40细胞(可从欧洲动物细胞保藏中心获得，登记号85110503)融合。将得到的细胞分散于96孔培养板中并孵育2周。通过EIA(酶免疫测定)筛选得到杂交瘤的上清中。总5个融合产生的总共1,824孔中，102孔为对天然CEA阳性的。在融合806中，发现17个孔为阳性的。通过有限稀释克隆在这些孔中含有的细胞，并通过EIA测定得到的克隆。10/17原初孔中的细胞系被成功克隆。一种名为806.077的细胞系已以许可号96022936保藏于欧洲动物细胞保藏中心。下表提供了导致806.077抗体杂交瘤发现的抗体产生程序的小结。
抗原 圈养 安静周数 融合数月  测试的孔数 EIA CEA*阳性数 最终筛选到的数目
未处理的CEA 正常    8-20     28     13.920     99     0
desialatedCEA 正常    8-12     14     5.568     12*     0
交联的CEA 正常    10-12     8     3.168     1     0
未处理的CEA 隔离    ＞30     5     1.824     102     3
*测试抗未处理的CEA，desialated免疫在以免疫原测试时产生
大量的阳性。实施例2从保藏的杂交瘤细胞系ECACC No.96022936中806.077抗体的制备2.1从含有培养基的血清中的制备
从液氮中取出1ml深低温保藏的安瓿并于37℃水浴中迅速融化。将内容物灭菌转移至无菌的15ml离心管中。通过逐滴加入含有10％(v/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)伴随以混合而重悬细胞。悬液以50×g离心10分钟，无菌去除上清并将沉淀物重悬于以95％空气5％CO2预冲气的25ml组织培养瓶中的5mlDMEM、10％FCS和1％谷氨酰胺中。培养瓶于36.5℃在黑暗中孵育。
3天后通过以DMEM、10％FCS和1％谷氨酰胺稀释该培养瓶而将其中的全部内容物转至更大的75ml培养瓶中而传代培养(最终存活密度=2-3×105细胞/ml)。以类似的方式进一步扩增至162ml的培养瓶中。
在850ml滚瓶中的500ml滚动培养物制备用于纯化的培养上清。在预冲气的滚瓶中以2×105个活细胞/ml接种培养物，以3rpm旋转并于36.5℃孵育。将培养物培养至成熟并且当细胞存活低于10％且IgG浓度达到最大时一般为接种后的500-800小时收获。2.2培养收获物的处理
收获后，通过以60×g30分钟离心澄清滚瓶培养上清。加入叠氮钠(0.02％w/v)作为防腐剂以澄清上清，并在黑暗处贮存于4℃直至纯化。2.3 806.077抗体的纯化
以稀释水溶性氢氧化钠将806.077抗体杂交瘤上清(31)调至pH7.5并经0.45μm滤膜过滤(Millipore MILLIDISKTM)。将过滤的抗体上清上样至G蛋白亲和柱(例如，G蛋白快速流SEPHAROSETM，发玛西亚产品，号为17.0618.03；5cm i.d×6.5cm=130ml；)该柱在4℃以4ml/分钟的流速以磷酸缓冲盐(“PBS”；8mM同Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,150mM NaCl,2.5mM KCl,pH7.3，例如可获自Oxford的片剂形式用于重新调制)平衡。以相同的流速用PBS(260ml)洗柱并以pH2.6的10mM柠檬酸钠洗脱抗体，收集馏份并通过紫外吸收(280nm)监测洗脱液。合并含有抗体的UV吸收馏份，并立即调至pH7并通过用30kDa截断膜(如，Amicon YM30)的超滤而浓缩至约2mg/ml。用6-8kDa孔隙度的截断膜(如SPECTRAPORTMl)透析至50mM pH7.0的Tris-HCl缓冲液中产生110mg 806.077抗体，通过SDS-PAGE检测，纯度大于95％。实施例3806.077抗体的选择性
为了分析选择性，用灵敏的三级间接免疫组织学在丙酮-固定的冷冻恒冷箱切片上筛选许多人正常和肿瘤组织与抗体806.077之间的反应性。
免疫组织学在通过切除手术或尸体中获得的人组织切片上进行。为了保持最佳的形态学和抗原性，组织尽可能新鲜获得，切成小块(约0.5cm3)并在-80℃贮藏前瞬时冷冻于液氮中。组织切片(6μm)在恒冷箱中进行，置于聚赖氨酸包被的载玻片上(如，蓝色的TECHMATETM载玻片，Dako)并于冰冷的丙酮中固定2分钟后包裹于箔片中并贮存于-80℃。
在使用前即刻从箔片中解包装之前将载玻片于室温中除霜。每张切片以金刚石标记(diamond marker)加以限定，并向每张切片加入在Tris-缓冲盐(TBS)中稀释至2μg/ml的100μl 806.077抗体，或TBS中2μg/ml的100μl CEA/NCA反应对照(A5B7抗体，或TBS中2μg/ml的100μl MOPC同型对照(西格玛化学公司，圣路易斯，美国，目录号M9269或相关的阳性对照如LP34(Dako)。所有随后的孵育在潮湿小室中室温进行30分钟：所有清洗步骤均在TBS中并2次换液。孵育后，清洗载玻片并向每张切片中加入100μl二级抗体试剂，其中包括TBS中交联至辣根过氧化酶上的1/50兔抗-小鼠免疫球蛋白(DakoPatts)和1/5的正常人血清(西格玛)。
将载玻片再次孵育并于TBS中清洗。向每张切片上加入最后的检测抗体，交联至辣根过氧化物酶上的100μl猪抗-兔免疫球蛋白(在TBS中以1/5的正常人血清进行1/50稀释)，孵育并彻底清洗。用TBS(17ml)中具有过氧化氢(17μl)的1DAB片剂(西格玛)制备DAB底物(3,3＇-二氨基联苯胺四盐酸盐)，并经快速滤纸(如，Whatman4号)逐滴加入。孵育3分钟后去除载玻片上过多的DAB并将其TBS中清洗。以苏木精(如Mayer’s苏木精，Shandon)负染后，将切片于乙醇和二甲苯中脱水，并在显微镜检查前置于非水性合成的浸片剂(如，E-Z浸片剂，Shandon)中。
抗体结合面积通过切片上的棕色染色而加以观察。使用计分系统评估806.077抗体与组织的结合程度：+++(强)      =抗体结合至＞75％肿瘤细胞++(适中)     =抗体结合至50％-75％的肿瘤细胞+(弱)        =抗体结合至25％-50％的肿瘤细胞+/-(最低)    =没有结合到小面积肿瘤细胞的集中抗体-            =没有染色
癌胚抗原(CEA)为免疫球蛋白基因超家族成员，具有一个预定的可变区(N区；108个氨基酸)和三套恒定区A1B1、A2B2和A3B3；A区92个氨基酸且B区86个氨基酸(Hefta,1992，癌症研究52:5647-5655。此外，CEA具有2个信号肽，一个在氨基末端且另一个在羧基末端。两者均在翻译后加工过程中被去除，羧基端的信号肽由糖基磷脂酰肌醇部分所替代。
已报导大量的具有与CEA各种同源性的CEA-相关蛋白(Thompson,1991，临床实验室分析杂志，5:344-366)。这些包括非-特异性的交叉反应抗原，NCA1和2。这些相关的蛋白在多种正常组织中表达，包括粒细胞和正常肺上皮细胞。到目前为止产生的大多数抗-CEA单克隆抗体与这些相关蛋白中的一种起交叉反应并且因此与多种正常组织起反应并且常与粒细胞或肺上皮细胞强烈反应。
抗-CEA抗体，806.077被鉴定为CEA选择性的，对粒细胞没有显示出交叉反应性且对测试的4/14正常肺组织仅具有最少的染色。
最初筛选806.077抗体用于肿瘤和组织培养上清的NCA选择性。筛选用清洁且以1∶10稀释的上清进行并与A5B7比较时，显示出抗体对结肠癌相当的结合，但与相同的抗体比较时，抗体对正常的肺和胰组织的结合大大下降。亲和纯化抗体(如实施例2中所述)并反复筛选和延伸以包括进一步的肿瘤和组织类型。
抗体在结肠-直肠肿瘤切片上进行滴定并且此筛选显示806.077抗体的最佳筛选浓度为2μg/ml。所有随后的筛选用此浓度的抗体完成。
这些筛选的结果如下。806.077抗体的反应性与抗下面肿瘤/正常组织的A5B7(也以2μg/ml筛选)作比较：806.077抗体肿瘤反应性：结肠癌(n=17)。在所有17个测试的肿瘤中见到适中至强的反应性(++/+++相当于A5B7)。乳腺癌(n=6)适中/微弱染色(+/++)，2/6肿瘤；最低染色(+/-)，2/6肿瘤。NSCLC癌(n=6)。强的染色(+++)，2/6肿瘤；适中染色(++)，1/6，和微弱染色(+)，2/6肿瘤。胃癌(n=2)。强染色(+++)，1/2肿瘤；弱染色(+)1/2肿瘤。卵巢癌(n=3)和前列腺癌(n=3)。在任何这类癌中没见到染色。在所有的情况中，均见到与A5B7相当的反应性。正常组织反应性：-肺(NCA反应性)(n=14)。弱染色(+)，4/14肺组织；没有染色(-)10/14组织。A5B7结合适中(++)，1/14肺组织；弱(+)，10/14组织且最低(+/-)，1/14组织。胰(粒细胞/NCA反应性)(n=6)。在任何一种测试的胰组织中没有见到染色。A5B7结合适中(++)，1/6组织和弱(+)，5/6组织。尸体正常组织(n=13)。适中/微弱的反应性(++/+)仅见于食管、皮肤、结肠和胰组织(CEA表达正常组织)。见到与A5B7类似的结合。除了阳性组织结肠、皮肤、食管和胰脏外，阴性组织有：小脑、中脑、大脑、平滑肌、肝脏、肾脏、主动脉、胃、心脏。实施例4806.077抗体F(ab′)2片段的产生
将无花果蛋白酶(10mg)悬浮于50mM半胱氨酸(3ml；BDH37218)和50mM tris-HCl pH7.0的溶液中并于37℃孵育30分钟。在50mM tris-HCl pH7.0缓冲液中通过大小排阻层析(SephadexTM G-25柱，1.5cm×25cm；发玛西亚)去除过多的半胱氨酸。通过在A280nm处监测UV吸收来测定降低的无花果蛋白酶浓度(1mg/ml溶液在1cm样品池中具有2的吸收读数)并发现其为1.05mg/ml。
于50mM tris-HCl缓冲液pH7.0(50ml)中的806.077抗体(100mg)溶液和新减少的无花果蛋白酶(5mg；3ml上述溶液)于37℃消化20小时。然后以等体积的PBS稀释消化产物并以3ml/分钟的恒定流速上样至G蛋白亲和柱(发玛西亚SEPHAROSETM FAST FloW5.0cm I.d×6.5cm=125ml；预先在4℃以pH7.0的50mMtris-HCl平衡)。以pH4.0的50mM的醋酸钠(250ml)洗柱以去除低分子量的片段，然后以50mM的柠檬酸钠pH2.8洗脱F(ab′)2，在A280nm处监测洗脱液的UV吸收。将含有洗脱液的F(ab′)2调至pH 7且通过透析将缓冲液更换为100mM磷酸钠/100mM氯化钠/1mM EDTA并且用10kDa截断的膜过滤(如AmiconTM YM10)将其浓缩至8mg/ml，认为在1cm样品池中280nm处的吸收读数为1.4。得到42mg 95％纯度F(ab′)2的65％产量。实施例5806.077抗体F(ab′)2-羧肽酶G2偶联物的制品
用于806.077抗体F(ab′)2衍生的接头为STAT(S-乙酰硫代羟基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimideester，西格玛，产品号A9043)。用于羧肽酶G2(CPG2)衍生的接头为SMPB〔4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，西格玛，产品号M6139〕。5.1 F(ab′)2的获得
向pH 7.2的100mM磷酸盐/100mM NaCl/1mM EDTA(缓冲液A；5ml)中的F(ab′)2片段(40mg，前面实施例4中制备)溶液中混合以DMSO(28μl)中的SATA(0.28mg)。室温中40分钟后，将得到的溶液以1.2ml/分钟的流速应用于脱盐柱(SEPHADEXTM G-25,1.5cm i.d×50cm=100ml；在缓冲液A中于4℃平衡)以去除过多的试剂。于A280nm处通过UV吸收监测洗脱液。合并SATA衍生的F(ab′)2。并在室温混合以pH 8.0的10％v/v的500mM羟胺盐酸/500mM磷酸钠/30mM pH 8.0的EDTA 60分钟从脱乙酰基衍生的F(ab′)2。蛋白浓度通过于280nm处的UV吸收加以监测，认为1mg/ml溶液具有在1cm样品池中1.4的吸收读数。以缓冲液A将该溶液稀释至约1mg/ml。通过Ellman’s-SH分析测定接头上样并发现为1.8-2.0接头/摩尔F(ab′)2。5.2 CPG2的获得：
从假单胞菌RS-16中CPG2的大规模纯化描述于Sherwood等，(1995)，欧洲生物化学杂志，148,447-453。F(ab′)2和偶联至CPG酶上的IgG抗体的制备通过已知方法完成并已描述于例如PCTWO89/10140中。CPG可获自应用微生物研究中心，Porton Down,Salisbury,Wrltshir SP4 OJG，英国。CPG2也可通过重组技术获得。CPG2的核苷酸编码序列已由Mrnton N.P.等，在基因，(1984)31,31-38中发表。已报导该编码序列在大肠杆菌(Chambers S.P.等，应用微生物学生物技术，(1988),29,572-578)和酿酒酵母(Clarke,L.E.等，基因微生物学杂志，(1985)131,897-904)中的表达。完整的基因合成已由M.Eclwards在美国生物技术实验室(1987),5,38-44中描述。异源蛋白在大肠杆菌中的表达已由F.A.O.Marston在DNA克隆第Ⅲ卷，实践方法系列，(IRL出版社(编者D.M.Glover),1987,59-88)中综述过。蛋白在酵母中的表达已在酶学方法，第194卷，(学术出版社，1991,C.Grothrie和G.R.Fink编)中综述过。
CPG酶可从西格玛化学公司，(Fancy Road,Pook,Dorset，英国)获得。CPG酶描述于：Golman,P.和Levy,C.C.,PNAS美国，58:1299-1306(1967)和Levy,C.C.和Goldman P.，生物化学杂志，242:2933-2938(1967)。羧肽酶G3酶已描述于Yasuda,N.等，生物科学、生物技术、生物化学，56:1536-1540(1992)。羧肽酶G2酶已描述于欧洲专利121 352。
将CPG2(50mg；来自大肠杆菌的重组酶)透析至100mM的磷酸钠/100mM氯化钠pH7.2(二缓冲液B)并稀释至8mg/ml，认为1mg/ml的溶液在1cm的样品池中280nm处具有0.6的吸收读数。
将SMPB(西格玛)以10mg/ml溶解于DMSO中。将CPG2(50mg以8mg/ml位于缓冲液中)与SMPB溶液混合(0.108ml；1.08mg)，并于室温反应120分钟。在脱盐柱(Sephadex G-25,1.5cm i.d×50cm=100ml；在4℃以缓冲液B平衡)上以1.2ml/分钟去除过多的试剂。合并得到的CPG2并通过UV A280nm测定其浓度，认为1mg/ml溶液在1cm样品池中于280nm处具有0.6吸收读数。将该溶液稀释至约1mg/ml的CPG2浓度。通过加入已知量的2-巯基乙醇至马来酰亚胺得到的CPG2并分析未反应的SH，通过“反相”Ellman分析测定接头上样。发现了2.0-2.4接头/摩尔CPG2的接头上样。5.3交联：
将相等重量的脱乙酰化得到的F(ab′)2和得到的CPG2在氮气中混合并将混合物(约80ml，总蛋白浓度约1mg/ml)置于室温中20小时。通过加入10％v/v 100mM的水中甘氨酸而终止反应。粗交联混合物为通过透析至低盐缓冲液(50mM醋酸钠pH6.0)中而交换的缓冲液并应用至于4℃以相同缓冲液平衡的染料-配体亲和柱(其中的染料结合至CPG2，如ACL Mimetic Green 1,2.5cm i.d×10cm=50ml)以去除未反应的得到的F(ab′)2。偶联物和得到的CPG2以pH6.0的50mM醋酸盐/500mM NaCl以2.0ml/分钟的流速洗脱，通过UV(A280nm)监测洗脱。
仍然含有得到CPG2的粗偶联物用10kDa的截断超滤装置(如，Amicon YM10TM)浓缩至约12ml,5mg/m1的总蛋白浓度且加入10％v/v 10mM水中的硫酸锌(西格玛Z 0251)以补充该过程中丢失至CPG2中的锌。进一步于4℃以1ml/分钟的流速在pH 6.0的50mM的醋酸钠/150mM氯化钠中进行大小排阻层析(如SEPHACRYL S-300HRTM发玛西亚，2.5cm i.d×25cm=500ml)，收集馏份并通过UV A280nm加以监测，通过对柱馏份的SDS-PAGE测定导致了偶联物的分级及其与未反应得到的CPG2的分离。
合并含有偶联物的洗脱峰(具有1∶2、1∶1和2∶1的F(ab′)2∶CPG2比例)并超滤浓缩至1.3mg/ml，通过于A280nm处监测UV吸收测定蛋白的浓度(认为1mg/ml具有1.0的吸收)。通过SDS PAGE测定该偶联物的纯度并发现含有总共12mg偶联物具有65％组成1∶1比例的偶联物，20％1∶20或2∶1比例的偶联物具有＜5％自由得到的F(ab′)2和＜5％自由得到的CPG2。实施例6
806.077抗体F(ab′)2-CPG2偶联物再加上前体药物的抗肿瘤活性。在人结肠直肠癌异体移植模型中与前体药物N(4-〔N,N-双(2-氯乙基)氨基〕-苯氧羰基)-L-谷氨酸(在该实施例中称为“PGP”在实施例1中描述于美国5,405,990和Blakey等，Br.J.Cancer72,1083-88,1995)一起评价实施例5中制备的806.077抗体F(ab′)2-CPG2偶联物的抗肿瘤活性。
将几组8-10号雌性麻醉的裸鼠皮下注射以1×107个LoVo结肠直肠癌细胞(ECACC no 87060101)。当肿瘤直径4-5mm时，静脉内(i.v)注射806.077抗体F(ab′)2-CPG2偶联物(每kg 250UCPG2酶活性)或磷酸盐缓冲液(170mM NaCl,3.4mM KCl,12mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,pH 7.2)。72小时后腹膜内(i.p)注射PGP前体药物(以1小时的间隔注射3剂量的40mg/kg)。每周3次测定肿瘤的直径且肿瘤体积用下面的公式计算：
体积=π/6×D2×d其中的D为较大的直径且d为较小的肿瘤直径。肿瘤体积表示为对以前体药物开始治疗时肿瘤体积的相对值。抗肿瘤活性与施以PBS而不是偶联物或前体药物的对照组作比较。抗肿瘤活性既表示为生长延缓，即治疗组的肿瘤体积增加4倍时花费的时间减去对照组肿瘤体积增加4倍所花费的时间，又定义为T/C值，即施用前体药物14天后治疗组肿瘤体积除以对照组肿瘤的体积。抗肿瘤效应的统计显著性用方差分析(单因素)检验加以判定。
806.077抗体F(ab＇)2-CPG2偶联物与PGP前体药物的抗肿瘤活性显示于图1中并且抗肿瘤数据总结如下。在LoVo肿瘤异体移植中806.077抗体F(ab＇)2-CPG2偶联物与PGP前体药物的抗肿瘤活性。
    偶联物  剂量(U/kg)    T/C(％)  生长延缓(天) 显著性(P)
806.077F(ab＇)2-CPG2   250500    16.54.7     1422 ＜0.01＜0.01
结果显示806.077抗体F(ab＇)2-CPG2偶联物与PGP前体药物一起与对照组相比较产生统计学显著的肿瘤抑制和延长的生长延缓。实施例7806.077抗体重链和轻链基因可变区的克隆和测序7.1细胞质RNA的制备
有几种从真核细胞中分离poly A+mRNA的方法(Sambrook J.,Fritsch E.F.,Maniatis T.，分子克隆：实验指南，冷泉港实验室出版社，第2版，1989，第8章，第3页，本文指“Maniatis”)。在本特定的情况中，按Favoloro等，酶学方法65，718-749中所述的方法从贮存于-80℃含有1×109个细胞的杂交瘤细胞沉淀中制备细胞质RNA。
将细胞重悬于含有400U核糖核酸酶抑制剂(RNAguard；发玛西亚，目录号.27-0815-01)的5ml冰冷的裂解液(140mM NaCl,1.5mM MgCl2,10mM pH8.6的Tris-HCl和0.5％的NP40(聚乙二醇醚非离子去污剂；壬基苯氧基聚氧乙基醇西格玛，目录号127087-87-01)中并旋转10秒。将此溶液以相等体积的含有24％(w/v)蔗糖和1％NP-40的冰冷裂解液体镶盖并保存于冰中5分钟。将该制品然后于4℃于台式离心机(Sorval RT6000B)中以4000rpm离心30分钟，然后将上层细胞质相移入等体积的2×PK缓冲液(200mMTris(pH7.5),25mM EDTA,300mM NaCl和2％(w/v)SDS)中。加入蛋白酶K(西格玛，目录号p2308)至200μg/ml的终浓度并将该混合物于37℃孵育30分钟。
以等体积的酚/氯仿抽提该制品，去除水相并加入2.5体积的乙醇并混合。然后将该溶液贮存于-20℃过夜。离心(台式离心机，SorvalRT6000B，中于4℃30分钟，4000rpm)收集RNA，弃上清并于真空干燥器中将沉淀干燥，然后将其溶解于250μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中(按上述的Maniatis描述的制备)。通过分光光度法测定RNA含量并且认为260nm处的吸收值1=40μg/ml来计算其浓度。7.2第一条链可变区cDNA的制备
许多用于cDNA合成的方法由Maniatis综述(第8章)。所用的寡核苷酸引物主要基于Marks等，分子生物学杂志(1991)222,581-597中提到的序列。本文的cDNA按如下制备。RNA在微量离心管中与以下成分混合，包括10μl 5×反转录酶缓冲液〔250mM Tris(pH8.3),40mM MgCl2和50mM DTT〕，1μl正向引物(25pM),10μl 1.25mM dNTPs,5μl 10mM DTT,0.5μlRNAguard(发玛西亚)，向其中加入DEPC处理的H2O以得到50μl的终体积。将反应混合物加热至70℃ 10分钟且然后缓慢冷却至37℃，然后加入100μ(0.5μl)M-MLV反转录酶(发玛西亚，目录号27-0925-01)并将反应物与37℃孵育1小时。用于产生轻链cDNA正向引物为设计与鼠κ轻链基因CK恒定区杂交的寡核苷酸CK2FOR(SEQ ID NO:1)。对于重链cDNA，使用了与鼠IgG1的CH1恒定区杂交的正向引物CG1FOR(SEQ ID NO:2)。7.3氨基酸测序
806.077抗体重链和轻链通过SDS-PAGE加以分离和Western印迹并用于N-末端氨基酸测序。结果显示轻链的N-末端被化学封闭，然而，获得了重链头34个N-末端残基的序列(SEQ ID NO:3)。根据此氨基酸序列设计用于806.077抗体重链可变区PCR的特异性DNA反向引物(back primer)，这些引物称为SP1 back(SEQ IDNO:7)。7.4通过PCR对抗体基因片段的分离
用按前述制备的cDNA为模板分离806.077重链和轻链可变区基因。一般反应条件如下。
向5μl的cDNA反应物中加入5μl dNTPs(2.5mM)、5μl 10×酶缓冲液(500mM KCl,100mM Tris(pH 8.3),15mMMgCl2和0.1％明胶)，1μl 25pM/μl的反向引物，1μl 25pM/μl的正向引物，0.5μl热稳定的DNA聚合酶和DEPC-处理的水以获得50μl的体积。PCR条件设定为25个循环，94℃90秒；55℃60秒；72℃120秒，以进一步的72℃10分钟孵育结果最后一个循环。
用常规的反应条件，用于产生轻链cDNA的正向引物为寡核苷酸CK2FOR(SEQ ID NO:1)且用于重链cDNA的为寡核苷酸CG1FOR(SEQ ID NO:2)。对重链和轻链进行用多种不同反向引物的多个反应以获得所需的特异性PCR产物。
在806.077轻链情况中，用反向引物VK1(SEQ ID NO:4)反向和VK4(SEQ ID NO:5)反向引物获得对特异性PCR产物的分析。同样地，用VH1(SEQ ID NO:6)反向引物和SP1反向引物(SEQ ID NO:7)获得重链的特异性PCR产物。反应产物于2％的琼脂糖凝胶上分析。切下预期大小的产物并纯化DNA。7.5 PCR产物向Bluescript KS+载体中的克隆
对于每种抗体片段，将5′区(反向引物)和3′区(正向引物)均导入限制性位点。VH和VK PCR反应的各自PCR产物因此能够用标准的DNA操作方法(如，PCR产物VH1back/CG1For通过PstI/Hind Ⅲ克隆且VK4back/CK2For通过SacⅠ/Hind Ⅲ克隆)通过适当的酶限制性位点克隆入Bluescript载体KS+(Stratagene克隆系统)中。从获得的克隆中制备DNA并用自动荧光测序仪(应用生物系统)对至少12个克隆的每个构建体进行精确的测序。用适当的计算机软件对序列进行评价，比较和对齐。获得了VH和VK基因的连续序列并随后翻译成其相应的氨基酸序列。
获得的806.077轻链可变区(VK)的DNA和氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中。获得的806.077重链可变区(VH)的DNA和氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:10和SEQID NO:11中。含有轻链序列的克隆命名为VK4，且含有重链序列的克隆命名为VH14A。实施例8嵌合轻链和重链Fd基因的构建
用能够不仅特异性扩增可变区适当基因而且导入新独特酶限制性位点的引物通过PCR分离克隆入Bluescript(实施例7中的VK4和VH14A)中的重链和轻链基因。这些限制性位点能够使可变区基因片段克隆入既编码适当的抗体信号序列又编码人恒定区的DNA片段框架中。轻链和重链Fd的信号和恒定区序列以前分别被克隆入真核质粒表达载体pSG5的衍生物pNG3和pNG4中。
载体pNG3如下制备。质粒pSG5(Stratagene，目录号216201)以SalⅠ和XbaⅠ消化以去除存在的SV 40启动子和多连接序列。通过使用能够杂交的寡核苷酸SEQ NOS:34和35将新的多连接导入并克隆入SalⅠ和XbaⅠcut pSG5质粒以得到质粒pNGl。将pNGl质粒以BglⅡ和HindⅢ切割并将pcDNA3(Invitrogen，目录号V790-20)的BglⅡ-HindⅢ CMV启动子片段克隆入此位点以得到质粒pNG2。最后，用寡核苷酸序列SEQ ID NOS:36和37及质粒pSG5通过实施例7 7.4节中所述的PCR从pSG5中分离polyA区域。PCR产物以XmaⅠ和Bam HⅠ切割，通过于2％琼脂糖凝胶上的电泳加以纯化，分离(如，用GENECLEAN，见实施例7)然后连接至XmaⅠ-Bam HⅠ cut pNG2质粒以得到pNG3。
pNG4载体按如下制备。将pNG3载体进一步修饰从而使克隆的CMV启动子片段中SacⅠ限制酶识别位点通过改变DNA序列加以破坏(corupted)。这通过使用pNG3载体作为模板的2步PCR诱变反应加以完成。该PCR用两条互补的寡核苷酸引物(SEQ ID NOS:38和39)以突变SacⅠ的识别序列和用于产物扩增的2个侧翼引物(SEQID NOS:40和41)。将2个引物对(SEQ ID NOS:38和41)和(SEQ ID NOS:39和40)用于标准的PCR反应(和实施例7，7.4节中所述)以获得起初的2个PCR产物，通过2％琼脂糖凝胶上的电泳将此产物分离。将等摩尔量的每种产物产物混合并用侧翼引物(SEQ ID NOS:40和41)在标准的PCR反应条件下重新扩增以一起剪接和扩增最终的PCR产物。该产物随后以限制酶NcoⅠ和HindⅢ消化并克隆入适当限制且制备的pNG3载体中，从而使突变的(SacⅠ位点负型)片段替代最初的pNG3 NcoⅠ-HindⅢ(Sac 位点+)片段。将此新的载体命名为pNG4。
取Bluescript KS+载体中的806.077鼠轻链的克隆(VK4)并用寡核苷酸引物077 VK-UP(SEQ ID NO:12)和077 VK-DOWN(SEQ ID NO:13)扩增。同样地，用077 VH-UP(SEQ ID NO:14)和077 VH-DOWN(SEQ ID NO:15)扩增806.077重链克隆(VH14A)。PCR按如下进行：向100ng质粒DNA中加入5μldNTPs(2.5mM),5μl 10×酶缓冲液(见上)，1μl 25pM/μl反向引物，1μl 25pM/μl正向引物，0.5μl热稳定的DNA聚合酶和DEPC-处理的水以得到50μl的体积。PCR条件设定为94℃90秒；55℃60秒；72℃120秒，15轮循环，以72℃进一步10分钟的孵育结束最后一轮循环。产物于2％琼脂糖凝胶上分析。纯化DNA且以有关的限制酶消化该DNA片段以备用于以后的载体克隆。
为了抗体轻链的分泌，设计既含有Kozak识别序列信息又含有轻链信号序列的双链DNA盒。该盒由两个单独的寡核苷酸(SEQ IDNOS:42和43)所组成，这两个寡核苷酸被杂交且随后克隆入质粒pNG3(已用标准的方法加以适当的限制和分离)中的HindⅢ和SacⅠ限制位点之间以产生载体pNG3-Vkss。含有人轻链κ恒定区序列的SEQID NO:46的DNA序列以XmaⅠ和XhoⅠ消化并插入到XhoⅠ和XmaⅠ切割的pNG-Vkss质粒以得到载体pNG3-Vkss-HuCK(NCIMBno.40798)。此外，将新霉素抗性基因表达盒克隆入pNG3-Vkss-HuCK(来自pSG5质粒变异体pSG5-Neo载体，获自S.Green,ZenecaPharmaceuticals，其它来源包括载体如pMClneo,Stratagene，目录号213201)。将新霉素抗性基因表达盒克隆为XbaⅠ片段并克隆入pNG3-Vkss-HuCk的XbaⅠ位点中且用限制酶消化检查方向。这得到了质粒pNG3-Vkss-HuCk-Neo(NCIMB 40799)。通过在pNG3VkssHuCk-neo载体的SacⅡ和XhoⅠ位点之间的直接克隆将上述轻链基因序列插入阅读框中。将获得的轻链基因的PCR片段用SacⅡ和XhoⅠ限制酶消化并克隆入含有VK信号序列和HuCK恒定区编码序列的类似限制的表达载体中。产生的嵌合的806.077轻链序列显示于SEQ IDNOS:16和17中。
同样地，对于抗体重链的分泌，设计既含有Kozak识别序列信息又含有重链信号序列的双链DNA盒。该盒由2个单独的寡核苷酸(SEQID NOS:44和45)所组成，将该寡核苷酸杂交并随后克隆入pNG4质粒(已用标准的方法进行适当的限制并分离)的HindⅢ和Eco RⅠ限制性位点之间以产生载体pNG4-VHss。因此，可通过在pNG4-VHss载体的Eco RⅠ和SacⅠ位点之间的直接克隆将重链基因序列插入框架中。含有人重链IgG2CH1′恒定区编码序列(SEQ ID NOS:22和23)的SEQ ID NO:47的DNA序列以SacⅠ和XmaⅠ消化并克隆入以SacⅠ和XmaⅠ切割的pNG4-VHss中(NCIMB no.40797)。获得的重链基因的PCR片段以Eco RⅠ和SacⅠ限制酶消化并克隆入含有VH信号序列和HuIgG2CH1′恒定区编码序列的类似限制的表达载体pNG4-VHss-HuIgG2CH1′中。产生的嵌合806.077 HuIgG2 Fd链序列显示于SEQ ID NOS:18和19中。
在有些场合，使用其它类的嵌合重链Fd构建体也许是优选的。到此，制备出含有替代HuIgG2CH1′(SEQ ID NOS:22和23)基因的HuIgG1′(SEQ ID NOS:20和21)或HuIgG2CH1′(SEQ IDNOS:24和25)的重链载体变异体。
通过多种方法制备显示于SEQ ID NOS:46和47中的序列，这些方法包括Edwards(1987)美国生物技术实验室，5,38-44,Jayaraman等(1991)美国自然科学院院报88,4084-4088,Foguet和Lubbert(1992)生物技术13,674-675和Pierce(1994)生物技术16,708中所述的方法。优选地，显示于SEQ ID NOS:46和47中的序列通过类似于由Jayaraman等(1991)在美国自然科学院院报88,4084-4088中所述的PCR方法加以制备。
一旦构建了单个的重链和轻链序列，将重链Fd基因表达盒(包括启动子和基因)切成BglⅡ/SalⅠ片段并克隆入轻链载体的Bam HⅠ/SalⅠ位点之间以制备其表达的载体构建体。将此构建体通过标准的电穿孔技术转染入NSO骨髓瘤细胞(ECACC No.85110503)中并筛选具有G418抗性的转染子，具有该特征作为表达质粒构建体上的可筛选标记。
或者，完整的重链Fd和轻链基因可简单地从其各自的载体中切成HindⅢ/XmaⅠ片段且随后克隆入其它的表达载体系统。实施例9特异性核酸序列变异的杂交测试9.1杂交测试
描述了用于测定含有与特异性806.077抗体序列有关序列的变异核酸的方法。这些变异的核酸可以多种形式存在如在cDNA文库筛选中固定于上述膜上的细菌菌落DNA或真核细胞DNA/RNA或通过凝胶电泳分离并然后转移至适当的膜上用于Northern(Maniatis等，第7章，p39)或Southern(Maniatis，第9章，p31)杂交技术的纯化核酸片段。9.2杂交探针
杂交探针可从编码特异性806.077抗体的目的核酸序列、更为特异地是从可变区，特别是编码该区域CDR3区域的任何DNA或RNA片段产生。合成的寡核苷酸或其互补序列可用作CDR3编码区的特异性探针。
通过T4多核苷酸激酶的作用加入〔γ-32p〕ATP的5′放射性磷酸基团而从合成的寡核苷酸中产生杂交探针。将20pmoles的寡核苷酸加入到20μl的反应物中，其中含有100mM Tris,pH7.5,10mMMgCl2,0.1mM精胺，20mM二硫苏糖醇(DTT),7.55μM的ATP,55μCi〔γ-32P〕ATP和2.5μ的T4多核苷酸激酶(发玛西亚生物技术公司，Uppsala，瑞典)。将反应于37℃孵育30分钟且用于杂交前于70℃孵育10分钟。用于从寡核苷酸(第11章)或DNA和RNA片段(第10章)产生杂交探针的方法列于Maniatis中。许多专用的试剂盒也可用于这些方法中。9.3杂交条件
含有此核酸的滤膜在适当密闭瓶中的100ml溶液中于65℃预杂交最少1小时，其中的溶液含有6×SSC、0.1％SDS和0.25％的干脱脂牛奶(MarvelTM)。专用的杂交仪如HB-1型(Techne公司)杂交仪提供用于该实验的可重复条件。
然后将预杂交液以含有6×SSC、0.1％SDS、0.25％的干脱脂牛奶(MarvelTM)和上面产生的寡核苷酸探针的10ml探针溶液替代。使温度逐渐降至30℃以下之前，将该滤膜于此溶液中在65℃孵育5分钟。然后丢弃探针溶液并将滤膜于室温中在100ml 6×SSC、0.1％SDS中洗5分钟。然后于30℃于新鲜各批的相同溶液中进一步洗膜且然后每次5分钟洗膜增加10℃直至60℃。
洗完后，将滤膜干燥并用于在轻度-固定的胶片盒中于-70℃用快速的钨酸盐增感屏以增强图象生成而暴露至X-射线胶片如HyperfilmTM MP(Amersham International)。在显影以显示滤膜上放射活性区图象生成之前将胶片曝光适当的时间(一般过夜)。通过与不应该产生图象的完全无关序列相比图象生成的存在而鉴定相关的核酸序列。一般地，在最高的洗膜温度(60℃)时相关的序列将出现阳性。然而，仅在较低的洗膜温度(50、40或30℃)时相关的序列可显示阳性。
这些结果也将依赖于所用探针的性质。较长核酸片段探针将需要在高温下杂交更长的时间但在较高的洗膜温度和/或较低的盐浓度下可保持与相关序列的结合。较短、混合或简并的寡核苷酸探针可需要较少严格的洗膜条件如较低的温度和/或更高的Na+浓度。杂交方法的讨论列于Maniatis中(第11章)。实施例10药物组合物
下面说明含有可与适当的前体药物一起用于治疗的806.077抗体的代表性药物剂量形式。用于ADEPT的可注射溶液
用于注射的无菌水溶液，每ml溶液含有：806.077抗体-CPG2偶联物    1.0mg三水醋酸钠                6.8mg氯化钠                    7.2mgTween20                   0.05mg用于成人的偶联物的典型剂量为30mg，3天后以1小时间隔施用3个1g的前体药物剂量。适当的CPG2偶联物为描述于实施例105和106中的任何一种偶联物。在表中具有HCPB的偶联物可替代CPG2偶联物。适当的HCPB偶联物为描述于实施例48-101中的任何一种偶联物。用于肿瘤免疫治疗的可注射溶液
用于注射的无菌水溶液，每ml溶液含有：806.077抗体-B7偶联物           1.0mg三水醋酸钠                     6.8mg氯化钠                         7.2mgTween20                        0.05mg用于成人的偶联物的典型剂量为30mg。适当的偶联物描述于实施例104中。实施例11起始806.077人源化抗体重链和轻链可变区基因的构建
首先在下文中提出人源化策略的概述。抗体人源化的目的是将非-人抗体的结合位点连接到人抗体的支持框架右而同时维持特征性的抗原结合亲和性和母本抗体的特异性。这种抗体工程的可行性是不同种哺乳动物免疫球蛋白密切相关的序列和结构同源性的结果。
在其最基本的形式中，如首先由Jones等在自然(1986)321,522-525中所述的，该方法包括将一种抗体Fv区的6个高度可变区或互补性决定区(CDRs)转移至另一种抗体上。然而，经验已显示除了CDRs之外，为了此过程成功，抗体框架中的氨基酸也需要转移常是必要的因为这样的残基有时似乎接触并影响CDR环的构型。
在806.077抗体中，制备包括6个鼠CDRs和多个框架残基替代的该抗体的“起始”人源化版本。此构建体用作模板，从中通过导入额外的“鼠”残基替代而进一步制备变异体(实施例12-47)。该实施例的其余部分详细描述了起始人源化的构建体。
挑选人抗体重链可变区NEWM(Poliak,R.J.等(1974)pNAS71,3440-3444)和轻链κ可变区REI(Palm,W.和Hrlschmann,N.Z.(1975)生理化学356,167-191)以形成受体人抗体的框架。用该Fv框架成功人源化的众多实施区描述于文献中且这2个蛋白区的3维结构已经解决。根据鼠806.077重链和轻链可变区蛋白序列与其最密切相关的Kabat鼠亚基连续序列(和单个序列成员)和人NEWM和REI蛋白序列的比较，设计编码起始人源化抗体的单个DNA序列，其中掺入有鼠CDRs和认为是重要的任何额外的框架替代。
掺入的鼠806.077 CDR序列对于轻链可变区描述于SEQ IDNOS:26；27和28中且分别发现于位点24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)。掺入到重链可变区的CDRs分别描述于SEQ ID NOS:29、31和32的位点31-35(CDR1)、50-65(CDR2)、95-102(CDR3)中(用Kabat命名法)。在重链可变区造成NEWM框架额外的改变V24A；S27F；T28N；F29I；S30K；V71A；A92H；R93V(Kabat命名法)且在轻链可变区中没有造成额外的框架改变。
设计编码806.077人源化抗体重链(806.077HuVH1)和轻链(806.077 HuVK1)可变区其中掺入有CDRs和任何额外框架残基改变的单个合成DNA序列。显示于SEQ ID NOS:48和53中的该抗体可变区基因序列可通过多种方法制备，包括由Edwaards(1987)美国生物技术实验室，5,38-44,Jayaraman等，(1991)美国自然科学院院报88,4084-4088,Foguet和Lubbert(1992)生物技术13,674-675和Pierce(1994)生物技术16,708所述的方法。优选地，显示于SEQ ID NOS:48和53中的DNA序列通过类似于由Jayaraman等，(1991)在美国自然科学院院报88,4084-4088中所述的PCR方法制备。
通过将克隆入pNG3-Vkss-HuCK-Neo(NCIMB no.40789)表达载体而将人源化的806.077抗体可变区轻链基因序列(SEQID NOS:49和50)插入框架中。为了完成此过程，编码人源化可变轻链基因(SEQ ID NO:48)的合成PCR DNA片段以SacⅡ和XhoⅠ限制酶消化并克隆入含有VK信号序列和HuCK恒定区编码序列的类似限制的pNG3-Vkss-HuCK-Neo载体中。制备的完全人源化的806.077轻链序列(806.077 HuVK1-HuCK)的DNA和蛋白序列与其信号序列一起分别显示于SEQ ID NOS:51和52中并将该载体命名为pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo。
类似地，对于人源化的抗体重链，通过直接克隆入pNG4-VHss-HuIgG2CH1′(NCIMB no.40794)表达载体中而将人源化可变区重链基因序列SEQ ID NOS:54和55插入到框架中。为了完成此过程，获得的用于人源化重链基因(SEQ ID NO:53)的合成PCR片段以Eco RⅠ和SacⅠ限制酶消化并克隆入含有VH信号序列和HuIgG2CH1′恒定区编码序列的类似限制的pNG4-VHss-HuIgG2CH1′载体中。制备的完全人源化的806.077Fd重链序列(806.077 HuVH1-HuIgG2Fd)的DNA和蛋白序列与其信号序列一起分别显示于SEQ IDNOS:56和57中并将该载体命名为pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′。
通过构建既含有806.077 HuVK1轻链又含有806.077 HuVH1重链可变区抗体基因的其表达质粒而制备起始的人源化抗体构建体。含有人源化轻链可变区HuVK1(SEQ ID NOS:49和50)的质粒pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo载体用限制酶Bam HⅠ和SalⅠ消化且将载体走1％的琼脂糖凝胶，切下并纯化载体带。质粒pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′(含有人源化的806.077HuVH1重链可变区(SEQ ID NOS:56和56))用限制酶BglⅡ和SalⅠ消化，反应于2％的琼脂糖上电泳并切下和纯化该片段。将回收的DNA片段随后连接至制备的pNG3-Vkss-806.077HuVKl-HuCK-Neo载体中以制备所需HuVH1/HuVK1共表达载体的克隆。
通过标准的电穿孔技术将这些构建体转染至NSO骨髓瘤细胞(ECACC No.85110503)中并筛选出具有G418抗生素抗性的转化子。在下述的抗-人抗体Fd ELISA和CEA结合ELISA分析中测定获得克隆2种抗体的表达。
对于CEA ELISA，将96孔免疫板(NUNC MAXISORBTM)的每只孔以pH9.6的碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液(缓冲液胶囊-西格玛C3041)中的50ng的CEA包被并于4℃孵育过夜。将该平板从PBS+0.05％Tween 20洗三次且然后于室温以每孔PBS+0.05％Tween 20中的150μl 1％BSA封闭1小时。按前述洗板，每孔加入100μl测试样品且于室温孵育2小时。再次以PBS+0.05％Tween 20洗板3次，每孔加入1％BSA PBS-Tween 20中的100μl 1/500稀释的HRPO标记的羊抗-人修饰抗体(西格玛A 7164)，并于室温于振摇的平台上孵育至少1小时。按前述洗板且然后再以PBS洗一次。为了测定结合，每孔加入100μl显影液(一个胶囊的磷酸-柠檬酸缓冲液-西格玛P4922-溶于100ml H2O中，向其中加入30mg的片剂O-次二苯基二胺二盐酸(O-phenylenediamine dihydrochloride-西格玛P8412)并孵育达15分钟。通过加入75μl 2M的H2SO4终止反应，并于490nm处读吸收值。
在抗-人抗体Fd ELISA中，96孔免疫板的每孔以pH 9.6的50mM碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液(缓冲液胶囊-西格玛C3041)中的1.2μg单抗-人Fd抗体(Binding Site PC 075)包被于4℃孵育过夜。以PBS+0.05％Tween 20洗板三次且然后以每孔150μl的PBS+0.05％Tween 20中的1％BSA在室温封闭1小时。按前述洗板，每孔加入100μl测试样品并于室温孵育2小时。再次以PBS+0.05％Tween20洗板3次，并每孔加入1％BSA PBS-Tween 20中100μl的HRPO-标记的羊抗-人κ抗体(西格玛A 7164)且于振摇的平台上室温孵育至少1小时。按前述洗板且然后再以PBS洗板一次。为了检测结合，按前述加入显影液等用于CEA结合分析。
筛选出发现显示出最佳表达和CEA结合水平的克隆用于进一步扩增至24孔板并重新测试。筛选并扩增根据这些分析标准的最佳克隆从而进行滴度制备并进一步培养14天，其中的滴度制备用1:10稀释的汇合生长培养物接种(即：100ml加入900ml的新鲜培养基)。然后按实施例102中所述从培养上清中纯化人F(ab′)2抗体片段。实施例12-38人源化重链和轻链可变区基因变异的进一步连接806.077人源化重链和轻链可变区变异体的构建
起始人源化806.077可变区基因也用于随后的含有额外鼠框架残基进一步基因构建体的构建。通过盒式诱变得到对该基因序列的修饰(在大多数情况下)。在此技术中，部分的原始基因通过以两种适当的特定酶切割从完整的质粒载体中去除且然后以双链DNA盒(由2个互补的寡核苷酸所组成，它们杂交到一起以与适当的粘性末端形成DNA片段)通过直接连接到该制备的质粒中而替代，因此重组了基因但现在含有所需的DNA变化。重链或轻链内突变的进一步连接也可通过利用可得到的独特限制酶位点以适当的变异体之间简单DNA片段的交换而制备。
除了原始的序列HuVK1(SEQ ID NOS:49和50)外进一步制备人源化轻链可变区的变异体且这些分别称为HuVK2、HuVK3和HuVK4。为了制备氨基酸改变M4L(Kabat命名)，轻链可变区变异体HuVK2为原始HuVK1编码序列的修饰，其中的基因(SEQ IDNO:49)通过盒式诱变加以突变。将质粒pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo(其含有完整酸的人源化轻链(SEQID NOS:49和50)用限制酶SacⅡ和NheⅠ消化。然后将消化产物上样至2％的琼脂糖凝胶上并切下从余下载体中分离出的片段。然后将载体从凝胶中切出，回收并贮存于-20℃直至需要。设计和合成2条寡核苷酸(含有所需的碱基改变)(SEQ ID NOS:58和59)。通过加入200pmol的每种寡核苷酸至总共30μl的H2O中，加热至95℃且使该溶液缓慢冷却至30℃而将这2条寡核苷酸杂交。然后将100pmol退火的DNA产物直接连接至前面制备的载体中。此DNA“盒”交换在表达载体pNG3-Vkss-806.077HuVK2-HuCK-Neo中的适当位点产生了所需的HuVK2 DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:60和61)。
同样地，用合成寡核苷酸(SEQ ID NOS:62和63)构建具有氨基酸改变DIQ；Q3V；M4L(Kabat命名法)的HuVK3以再次产生在表达载体pNG3-Vkss-806.077HuVK3-HuCK-Neo中的适当位点具有所需的HuVK3 DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:64和65)。
通过不同的技术制备轻链可变区变异体HuVK4，因为在靠近突变位点处没有独特的限制酶位点。通过PCR诱变技术制备具有氨基酸改变L47W的HuVK4。载体pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo用作2个PCR反应的模板(94℃，90秒；55℃，60秒；72℃，120秒，15个循环，所有缓冲液按前述)。反应A使用合成寡核苷酸序列引物SEQ ID NOS:66和67且反应B使用合成寡核苷酸序列引物SEQ ID NOS:68和69。这些PCR反应(A和B)的产物分别为535个碱基对和205个碱基对长度的片段。这些反应产物于2％的琼脂糖凝胶上电泳且与任何背景产物分离。从凝胶中切下预期大小的带并回收。制备产物A和B各种量的混合物并且用合成的寡核苷酸SEQ IDNO:66和58进行PCR反应。以限制酶SacⅡ和XhoⅠ消化得到的产物(Ca.700个碱基对)并于2％的琼脂糖凝胶上将切割产物分离。从凝胶中切下并回收预期310碱基对大小的条带。然后将此片段连接到载体pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuVK-Neo载体(以前以限制酶SacⅡ/XhoⅠ切割并随后分离)中且因此在表达载体pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo中产生所需的HuVK4 DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:70和71)。
除了原始的HuVH1序列(SEQ ID NOS:54和55)外，制备人源化重链可变区的6个其它变异体且这些分别称为HuVH2至HuVK7。为了产生氨基酸改变G49A(Kabat命名)，重链可变区变异体HuVH2为原始HuVH1编码序列的修饰，其中的基因(SEQ IDNO:54)由盒式诱变加以突变。质粒pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′(其中含有完整的人源化IgG2重链Fd(SEQ IDNOS:56和57))以限制酶StuⅠ和NotⅠ消化。然后将消化产物上样于2％琼脂糖凝胶中且从余下的载体中分离切出的片段。从凝胶中切下并回收载体DNA并贮存至-20℃直至需要使用。设计合成2条寡核苷酸(SEQ ID NOS:72和73)，杂交并将产物直接连接至以前制备的载体中。该DNA“盒”交换在表达载体pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′中的适当位点产生所需的HuVH2 DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:74和75)。
类似地，用合成的寡核苷酸(SEQ ID NOS:76和77)构建具有氨基酸改变T73S；F78A的HuVH3(Kabat命名)，然而，在此情况，载体pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′用限制酶NotⅠ和SacⅡ消化。将合成的DNA盒直接连接至前面制备的载体中以在表达载体pNG4-VHss-806.077HuVH3-HuIgG2CH1′中产生所需的HuVH3 DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:78和79)。
具有氨基酸改变G49A；T73S；和F78A(Kabat命名)的HuVH4连接了HuVH2(SEQ ID NOS:74和75)和HuVH3(SEQ IDNOS:78和79)的变异体。这通过以酶NotⅠ和NheⅠ消化pNG4-VHss-806.077HuVH3-HuIgG2CH1′载体且于2％的琼脂糖凝胶上分离后分离出ca.200碱基对的NotⅠ/NheⅠ限制性片段而完成。回收该片段并且随后连接至pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CH1′载体(以相同的NotⅠ和NheⅠ限制酶消化并纯化载体片段)中。得到的克隆在表达载体pNG4-VHss-806.077HuVH4-HuIgG2CH1′中含有所需的HuVH4 DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:80和81)。
用合成的寡核苷酸(SEQ ID NOS:82和83)构建具有氨基酸改变V67A(Kabat命名)的HuVH5。再次将载体pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′用限制酶NotⅠ和SacⅡ消化。将合成的DNA盒直接连接至前面制备的载体以在表达载体pNG4-VHss-806.077HuVH5-HuIgG2CH1′中产生所需的HuVH5 DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:84和85)。
用合成的寡核苷酸(SEQ ID NOS:86和87)构建具有酸改变V67A；T73S和F78A(Kabat命名)的HuVH6且对于该突变，将载体pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′用限制酶NotⅠ和SacⅡ消化。将合成的DNA盒直接连接至前面制备的载体中以在表达载体pNG4-VHss-806.077HuVH6-HuIgG2CH1′中产生所需的HuVH6DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:88和89)。
具有氨基酸改变G49A；V69A；T73S；和F78A(Kabat命名)的HuVH7连接HuVH2(SEQ ID NOS:74和75)和HuVH6(SEQID NOS:88和89)变异体。这通过以酶NotⅠ和NheⅠ消化pNG4-VHss-806.077HuVH6-HuIgG2CH1′载体并于2％的琼脂糖凝胶中分离后分离出ca.200个碱基对的NotⅠ/NheⅠ限制性片段而完成。回收该片段并连接至pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CH1′载体(以相同的NotⅠ和NheⅠ限制酶消化并纯化载体片段)。得到的克隆在表达载体pNG4-VHss-806.077HuVH7-HuIgG2CH1′中含有所需的HuVH7 DNA和蛋白序列(SEQ ID NOS:90和91)。
这种人源化重链和轻链可变区基因变异体的连接通过切下重链Fd基因变异体表达盒(既包括启动子又包括基因，切成BglⅡ/SalⅠ片段)并将该片段克隆入轻链变异载体的Bam HⅠ/SalⅠ位点以制备共表达载体构建体而完成。基于前述人源化重链和轻链变异体的各种可能连接条目列于下表中。
表  人源化重链和轻链可变区变异体的连接
实施例号 重链可变区  SEQ IDNOS： 轻链可变区  SEQ IDNOS： 共表达质粒载体
    11     HuVH1  54和55     HuVK1  49和50  pNG 806HuVH1/HuVK1/HuIgG2
    12     HuVH1  54和55     HuVK2  60和61  PNG 806HuVH1/HuVK2/HuIgG2
    13     HuVH1  54和55     HuVK3  64和65  pNG 806HuVH1/HuVK3/HuIgG2
    14     HuVH1  54和55     HuVK4  70和71  pNG 806HuVH1/HuVK4/HuIgG2
    15     HuVH2  74和75     HuVK1  49和50  pNG 806HuVH2/HuVK1/HuIgG2
    16     HuVH2  74和75     HuVK2  60和61  pNG 806HuVH2/HuVK2/HuIgG2
    17     HuVH2  74和75     HuVK3  64和65  PNG 806HuVH2/HuVK3/HuIgG2
    18     HuVH2  74和75     HuVK4  70和71  pNG 806HuVH2/HuVK4/HuIgG2
    19     HuVH3  78和79     HuVK1  49和50  PNG 806HuVH3/HuVK1/HuIgG2
    20     HuVH3  78和79     HuVK2  60和61  pNG 806HuVH3/HuVK2/HuIgG2
    21     HuVH3  78和79     HuVK3  64和65  pNG 806HuVH3/HuVK3/HuIgG2
    22     HuVH3  78和79     HuVK4  70和71  pNG 806HuVH3/HuVK4/HuIgG2
    23     HuVH4  80和81     HuVK1  49和50  pNG 806HuVH4/HuVK1/HuIgG2
    24     HuVH4  80和81     HuVK2  60和61  pNG 806HuVH4/HuVK2/HuIgG2
    25     HuVH4  80和81     HuVK3  64和65  pNG 806HuVH4/HuVK3/HuIgG2
    26     HuVH4  80和81     HuVK4  70和71  pNG 806HuVH4/HuVK4/HuIgG2
    27     HuVH5  84和85     HuVK1  49和50  pNG 806HuVH5/HuVK1/HuIgG2
    28     HuVH5  84和85     HuVK2  60和61  PNG 806HuVH5/HuVK2/HuIgG2
    29     HuVH5  84和85     HuVK3  64和65  pNG 806HuVH5/HuVK3/HuIgG2
    30     HuVH5  84和85     HuVK4  70和71  pNG 806HuVH5/HuVK4/HuIgG2
    31     HuVH6  88和89     HuVK1  49和50  pNG 806HuVH6/HuVK1/HuIgG2
    32     HuVH6  88和89     HuVK2  60和61  pNG 806HuVH6/HuVK2/HuIgG2
    33     HuVH6  88和89     HuVK3  64和65  PNG 806HuVH6/HuVK3/HuIgG2
    34     HuVH6  88和89     HuVK4  70和71  pNG 806HuVH6/HuVK4/HuIgG2
    35     HuVH7  90和91     HuVK1  49和50  PNG 806HuVH7/HuVK1/HuIgG2
    36     HuVH7  90和91     HuVK2  60和61  pNG 806HuVH7/HuVK2/HuIgG2
    37     HuVH7  90和91     HuVK3  64和65  pNG 806HuVH7/HuVK3/HuIgG2
    38     HuVH7  90和91     HuVK4  70和71  pNG 806HuVH7/HuVK4/HuIgG2
与实施例11类似，通过构建既含806.077HuVK4轻链又含有806.077HuVH1重链可变区抗体基因的共表达质粒完成实施例14。在此实施例中，含有人源化轻链可变区HuVK1(SEQ ID NOS:70和71)的质粒pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo载体用限制酶Bam HⅠ和SalⅠ消化并将载体于1％琼脂糖凝胶上电泳并纯化载体带。质粒pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CH1′(含有人源化的806.077HuVH1重链可变区(SEQ ID NOS:56和57))用限制酶BglⅡ和SalⅠ消化，反应产物与2％琼脂糖凝胶上电泳并切下和纯化该片段的条带。将回收的DNA片段连接至制备的pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo载体以制备所需HuVH1/HuVK4共表达载体的克隆。
如在实施例11中所述，通过标准的电穿孔技术将这些构建体转染入NSO骨髓瘤细胞(ECACC No.85110503)中并筛选具有G418抗性的转化子。在抗-人抗体中Fd ELISA和CEA结合ELISA分析中测定获得克隆2种抗体的表达。筛选和扩增发现是表现出最佳表达和CEA结合水平的克隆并进行产物表达。然后按实施例102中所述从培养上清中纯化人F(ab′)2抗体片段。实施例39-47具有各种类型人重链恒定区的人源化F(ab′)2片段的表达
可使用其它类型嵌合的重链Fd构建体。因此，制备含有HuIgGlCH1′(SEQ ID NOS:20和21)或HuIgG3CH1′(SEQ IDNOS:24和25)重链载体的其它变异体，其中的恒定区由HuIgG2CH1′基因(SEQ ID NOS:22和23)所替代。产生的载体分别为pNG4-VHss-HuIgGlCH1′和pNG4-VHss-HuIgG3CH1′。本文讨论的重链抗体可变区可通过从Eco RⅠ和SacⅠ限制酶消化而从适当的pNG4-VHss-“VH可变区”-HuIgG2CH1′质粒中切下并克隆入类似限制的pNG4-VHss-HuIgG1CH1′或pNG4-VHss-HuIgG3CH1′载体中且因此制备完整的重链Fd序列。如上述，一旦构建出单个的重链和轻链序列，重链Fd基因表达盒(既包括启动子又包括基因)可通过限制性消化切下并将该片段克隆入轻链载体的适当位点中以制备最终的共表达载体。下表描述了实施例33-47中各种重链和轻链可变区已与多种不同类型的人重链恒定区发生连接。
在实施例44中，载体pNG4-VHss-HuIgG3CH1′以限制酶Eco RⅠ和SacⅠ消化并按前述分离载体片段。通过以Eco RⅠ和SacⅠ限制酶消化从pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′质粒中切下HuVH1重链抗体可变区(SEQ ID NOS:54和55)并将该片段克隆入类似限制的pNG4-VHss-HuIgG3CH1′载体中以在完整的载体pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG3CH1′中制备完整的人源化IgG3重链Fd序列(SEQ ID NOS:94和95)。将重链Fd基因表达盒(既包括启动子又包括基因)切成BglⅡ/SacⅠ片段并克隆入轻链载体pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo(含有HuVK1-HuCK人源化轻链SEQ ID NOS:51和52)的Bam HⅠ/SalⅠ位点，其中的载体已用限制酶Bam HⅠ和SalⅠ消化，1％琼脂糖上电泳并纯化了该载体带。这便制备了可表达人源化806.077HuVH1/HuVK1-HuIgG3/Kappa.Fd抗体片段的共表达载体(pNG806HuVH1/HuVK3/HuIgG3)。
                                  表
实施例号 人源化重链   SEQIDNOS 人源化轻链 SEQ IDNOS 共表达质粒载体
    39  HuVH1-HuIgG1  92和93  HuVK1-HuCK  51和52  Png 806HuVH1/HuVK1/HuIgG1
    40  HuVH1-HuIgG2  56和57  HuVK1-HuCK  51和52  pNG 806HuVH1/HuVK1/HuIgG2
    41  HuVH1-HuIgG3  94和95  HuVK1-HuCK  51和52  pNG 806HuVH1/HuVK1/HuIgG3
    42  HuVH1-HuIgG1  92和93  HuVK3-HuCK  96和97  pNG 806HuVH1/HuVK3/HuIgG1
    43  HuVH1-HuIgG2  56和57  HuVK3-HuCK  96和97  pNG 806HuVH1/HuVK3/HuIgG2
    44  HuVH1-HuIgG3  94和95  HuVK3-HuCK  96和97  pNG 806HuVH1/HuVK3/HuIgG3
    45  HuVH1-HuIgG1  92和93  HuVK4-HuCK  98和99  pNG 806HuVH1/HuVK4/HuIgG1
    46  HuVH1-HuIgG2  56和57  HuVK4-HuCK  98和99  pNG 806HuVH1/HuVK4/HuIgG2
    47  HuVH1-HuIgG3  94和95  HuVK4-HuCK  98和99  pNG 806HuVH1/HuVK4/HuIgG3
在实施例47中，载体pNG4-VHss-HuIgG3CH1′以Eco RⅠ和SacⅠ限制酶消化并分离该载体片段。通过以Eco RⅠ和SacⅠ限制酶消化从pNG4-VHss-HuVH1-HuIgG2CH1′质粒中切下HuVH1重链抗体可变区(SEQ ID NOS:54和55)并将该片段克隆入类似限制的pNG4-VHss-HuIgG3CH1′载体中。这便在完整的载体pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG3CH1＇中产生了完整的人源化IgG3重链Fd(SEQ ID NOS:94和95)。将该重链Fd基因表达盒(包括启动子和基因)切成BglⅡ/SalⅠ片段并克隆入轻链载体pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo载体(含有HuVK4-HuCK人源化轻链SEQ ID NOS:98和99)的Bam HⅠ/SacⅠ位点中，其中的轻链载体已用限制酶Bam HⅠ和SalⅠ消化，1％琼脂糖上电泳且纯化载体带。这产生了可表达人源化HuVH1/HuVK1HuIgG3/Kappa.Fd抗体片段的共表达载体构建体pNG806HuVH1/HuVK4/HuIgG3。
列于上表中的其它实施例均以与实施例44和47中所述的类似方式加以制备。然而，在含有人IgG1的构建体实施例中，最终共表达载体的构建通过克隆切成BglⅡ/Bam HⅠ片段(因在HuIgGlCH1′恒定区基因中有一个内部的SalⅠ限制位点)的重链Fd基因表达盒(包括启动子和基因)并克隆入适当制备轻链载体的Bam HⅠ位点中加以完成。这通过限制性消化(如以限制酶HindⅢ)和琼脂糖凝胶电泳分析加以完成，在电泳中看到得到的片段与类似消化的HuIgG2版本(实施例11-38)基本一致。当比较2种构建体的带型时，我们可确定该重链盒的方向是正确的。
如在前面实施例11中所述，通过标准的电穿孔技术将这些构建体转染入NSO骨髓细胞(ECACC No.85110503)中并筛选具有G418抗性的转染子。在抗-人抗体Fd ELISA和CEA结合ELISA分析中测试获得克隆两种抗体的表达并筛选和扩增发现是表现出最佳表达和CEA结合水平的克隆并培养而用于基因表达。如前面一样，然后按实施例102中所述从培养上清中纯化人F(ab′)2抗体片段。实施例48人源化的806.077F(ab′)2-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB融合蛋白的制备
该实施例描述了编码连接到〔A248S,G251T,D253K〕HCPB上的人源化806.077 Fd重链片段基因的制备和其与编码人源化806.077轻链基因和编码人羧肽酶B前体区基因的共表达以得到在每个重链片段的C-末端具有〔A248S,G251T,D253K〕HCPB分子的F(ab′)2蛋白。人源化Fd重链片段的恒定区和铰链区来自人IgG3抗体的同型。表达的蛋白也称为抗体-酶融合蛋白。(a)编码连接到〔A248S,G251T,D253K〕HCPB人源化的806.077Fd重链片段基因的制备及其向pEE6中的克隆
编码连接到〔A248S,G251T,D253K〕HCPB上人源化806.077Fd的基因通过从pEEN1921(参考实施例2)的PCR产生。第一次PCR以模板pEEN1921(2ng)和寡核苷酸SEQ ID NO:100和SEQ IDNO:101(每种100pM)在含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、1.5mM MgCl2、0.125mM每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP的缓冲液中(100μl)进行。该反应物于94℃孵育5分钟且然后加入热稳定的DNA聚合酶(2.5μ,0.5μl)且将混合物镶盖以矿物油(100μl)且将反应混合物于94℃孵育1分钟，53℃孵育1分钟且72℃孵育2.5分钟25轮循环，再加上72℃孵育10分钟。通过于1％琼脂糖(琼脂糖Ⅰ型，西格玛A-6013)上的电泳分离536碱基对的PCR产物然后从凝胶中切下该条带并分离该DNA片段。
第二次PCR以模板IgG3-pBSIIKS+(8.7ng，描述于参考实施例4中)和寡核苷酸SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103进行并按上述分离954个碱基对的片段。合并上述2次PCR缓冲液中的PCR产物(以0.2、1.0或5.0ng/μl)。将混合物于94℃孵育5分钟，然后94℃1分钟和63℃4分钟进行10个循环。向PCR缓冲液中(50μl)加入寡核苷酸SEQ ID NOS:101和102(每种100pM)。94℃孵育3分钟后，将混合物进一步于94℃孵育1.5分钟，53℃孵育2分钟和72℃孵育2分钟进行25轮循环再于72℃孵育10分钟。在此过程中，SEQ ID NO:115中位点508处的G碱基变为A碱基。
将1434个碱基对的PCR产物通过于1％的琼脂糖凝胶上的电泳加以分离、纯化并于37℃在含有100mM Tris-HCl(pH7.9)、50mMNaCl、10mM MgCl2、1mM DTT和BSA(100μg/ml)的100μl总体积中以NheⅠ和XbaⅠ(80μ)(New England Biolabs Inc.)消化4小时。再次于1％琼脂糖凝胶上分离并纯化得到的片段。以类似的消化，将载体pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1′(10μg，实施例11)以NheⅠ和XbaⅠ切割然后加入牛小肠碱性磷酸酶(1μl；New England Biolabs,10μ/μl)以消化质粒从而去除5′磷酸基并于37℃继续孵育30分钟。通过于70℃孵育10分钟破坏磷酸酶活性。从琼脂糖凝胶中纯化NheⅠ-XbaⅠ切割的质粒。将上面的NheⅠ-XbaⅠ消化的PCR产物(约500ng)与上面切割过的质粒DNA(约200ng)在20μl溶液中于25℃连接4小时，其中的溶液含有50mMTris-HCl(pH 7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、50μg/ml BSA和400μT4 DNA连接酶(New England BiolabsInc.)将1μl的反应液用于转化20μl感受态的大肠杆菌DH5α细胞。转化的细胞铺板至具有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂上。通过PCR鉴定含有人源化806.077 Fd-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB基因的潜在克隆。按上述以寡核苷酸SEQ ID NOS:104和105对每个克隆进行PCR。通过于1％琼脂糖凝胶上的电泳分析PCR反应样品(10μl)。通过512个碱基对PCR产物的存在鉴定含有所需基因的克隆。产生512个碱基对条带的克隆用于DNA的小量制备。通过以HindⅢ和XbaⅠ消化后3751个碱基对和1862个碱基对片段的存在而确证(checked)该DNA样品。在DNA以HindⅢ和XbaⅠ消化后含有这些片段的克隆用于大规模的质粒DNA制备并通过DNA序列分析证实插入的序列。预期的插入序列显示于SEQ ID NO:112中。上面检测过的克隆中，2个含有预期的序列但具有单碱基突变。克隆54(也称为pMF 195)在SEQ ID NO:112中的605位点中以T碱基代替A碱基，而克隆68(也称为pMF 198)在位点1825中以C碱基代替预期的T碱基。通过在含有20mM Tris醋酸盐(pH7.9)、50mM醋酸钾、10mM醋酸镁、1mM DTT和BSA(100μg/ml)的缓冲液(100μl)中以(每种10μg)XmaⅠ(10μ)和XbaⅠ(100u)(NewEngland Biolabs)消化而从pMF 195和pMF 198中制备显示于SEQID NO:112中的序列。将来自pMF 195的25个碱基对的片段和来自pMF 198的载体片段(以碱性磷酸酶处理后)于1％的琼脂糖凝胶上分离并按前述连接到一起。将连续混合物用于转化感受态的DH5α细胞。将转化的细胞铺板于具有氨苄青霉素的L-琼脂上并通过以XmaⅠ和XbaⅠ消化后5400个碱基对和215个碱基对片段的存在而筛选得到的克隆。阳性克隆用于大规模质粒DNA的制备且插入的序列通过DNA序列分析加以确证。含有克隆号102的(806.077)Fd-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB基因的质粒命名为pMF213。将pMF213的HindⅢ-XbaⅠ片段克隆入DH5α中的pEE6中〔这是pEE6.hCMV的衍生物-Stephens和Cockett(1989)核酸研究17,7110-其中hCMV启动子上游的HindⅢ位点已转变为BglⅡ位点〕(通过PCR筛选具有寡核苷酸SEQ ID NOS:106和107的2228个碱基对的插入子)以得到pMF221。(b)用于抗体-酶融合蛋白表达的共表达载体的制备
为了产生能在真核细胞中表达抗体-酶融合蛋白的载体，使用了GS-SystemTM(Celltech Biologics)(WO87/04462,WO89/01036,WO86/05807和WO89/10404)。该方法需要将人源化抗体轻链基因克隆入载体pEE14的HindⅢ-XmaⅠ区域。此载体由Bebbington在方法：酶学方法的伴侣(companion)(1991)2,136-145中描述过。为了构建该表达，按上述将质粒pEE14和pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo(实施例14)以HindⅢ和XmaⅠ消化。每个消化产物的适当载体(来自pEE 14)和插入子(来自pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo)在1％的琼脂糖凝胶上分离并连接在一起且用于转化感受态的DH5α细胞。将转化的细胞铺板至具有氨苄青霉素(100μg/ml)的L-琼脂上。在以HindⅢ和XmaⅠ消化DNA后通过限制性分析分离DNA中732个碱基对片段的存在而筛选菌落。产生732个碱基对限制性片段的克隆用于大规模质粒DNA的制备且通过DNA序列分析确证插入子的序列。将含有pEE14中SEQID NO:70的人源化轻链序列的质粒命名为pEE14-806.077HuVK4-HuCK。
为了制备共表达载体，在含有10mM Tris-HCl(pH7.9)、150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT和BSA(100μg/ml)的缓冲液中以BglⅡ(20μ)和SalⅠ(40μ)切割pMF221(10μg)并且通过琼脂糖凝胶电泳分离和纯化4560个碱基对的片段。同样地，pEE14-806.077HuVK4-HuCK以Bam HⅠ(40μ)和SalⅠ(40μ)，切割且分离9.95kb的载体片段并连接至pMF221的BglⅡ-SalⅠ片段中且克隆入DH5α。通过以2套寡核苷酸(SEQ ID NOS:104和105，和SEQ ID NOS:108和109)的PCR筛选菌落。通过DNA测序对分别产生185个碱基对和525个碱基对的PCR产物的克隆进行特征分析。具有正确序列的克隆命名为pMF228-DH5α中轻链/Fd-突变体HCPB的共表达载体。人源化的Fd-突变HCPB序列显示于SEQID NO:113中。残基1至19为信号序列，残基20至242为人源化的可变区和IgG3 CH1区域，残基243至306为IgG3铰链区且残基307至613为在人HCPB序列的残基248、251和253处具有变化的突变HCPB序列。在HCPB序列中的改变分别发生于SEQ ID NO:113中的位点554(Ser)、557(Thr)和559(Lys)。(c)用于pro HCPB区域原表达载体的制备
按照参考实施例17中的国际专利申请号WO96/20011中所述制备第二种真核表达质粒，pEE12，其中含有用于在pre-proHCPB(preproHCPB)中具有额外的C-末端亮氨酸残基(称为pro-L)的区域原分泌的pre-pro(prepro)序列的基因。按对未修饰的pre-pro序列中所述但用寡核苷酸SEQ ID NOS:110和111从pMF18中通过PCR制备质粒pMF161。将359个碱基对的片段克隆入pBluescript以得到pMF141且随后克隆入pEE12以得到pMF161。pro-L的蛋白序列显示于SEQ ID N0:114。(d)抗体-酶融合蛋白在真核细胞中的表达
为了在真核细胞中表达，将含有能够表达抗体酶-融合蛋白的基因(pMF228)和pro-L序列(pMF161)的载体转染入COS-7细胞中。COS细胞为以起始点-缺失的SV40病毒转化的非洲绿猴肾细胞系CU-1并且由于其具有将含有SV40复制起点的环状质粒复制至很高拷贝数的能力而广泛用于各种蛋白短期暂时的表达。有2种广泛使用的COS细胞克隆，COS-1和COS-7。用于COS细胞转染的基本方法学由Bebbington在方法：酶学方法伴侣(1991),2,p141中描述过。为了HCPB的表达，通过已知的脂质体转染方法-阳离子脂-介导的多核苷酸运输〔Felgner等，在方法：酶学方法伴侣(1993)5,67-75〕在6-孔培养板中含有10％热灭活的胎牛血清(FCS)的2ml Dulbecco改进的Eagle培养基中，将质粒载体pMF48和pMF67(每种2μg)用于转染COS-7细胞(2×105)。将细胞于CO2培养箱中孵育20小时。无血清培养基(200μl)中质粒DNA的混合物与LIPOFECTINTM试剂(12μl)轻轻混合并于环境温度中孵育15分钟。从无血清培养基(2ml)洗细胞。将无血清培养基(600μl)加入到DNA/LIPOFECTINTM中并将混合物镶盖于细胞上面并于CO2培养箱中于37℃孵育6小时。含有培养基的DNA以含有10％FCS的正常DMEM替代并将细胞按前述孵育72小时。基本上按实施例103中所述分析细胞上清(以0.025M的Tris-HCl pH7.5 1∶10稀释；125μl)的抗Hipp-Glu活性(5小时分析，在250μl的总体积中)。稀释的上清导致Hipp-Glu底物18.4％的水解。
或者，在上面的实验中，未修饰的区域原(来自质粒pMF67，描述于参考实施例17中的国际专利申请号WO96/20011)可用于代替pro-L表达质粒。
COS细胞中蛋白的大规模表达由Ridder等(1995)在基因166,273-276中和由Blasey等(1996)在细胞技术18,183-192中描述过。
至于在CHO细胞中的稳定表达，使用了由Bebbington在方法：酶学方法伴侣(1991)2,136-145中所述的用通过25μM和50μMMSX的GS筛选的方法。或者，基本上按上面所述的用于COS细胞转染的脂质体转染也可用于转染CHO细胞。细胞以质粒pMF228和pMF161或pMF228和pMF67的混合物转染。通过CEA ELISA(描述于实施例11中)和Western分析(下述)相应所需抗体酶融合蛋白17kDa条带的存在而筛选存活克隆的上清。也按实施例103中所述筛选适当稀释的上清的酶活性。以所需的规模培养表达所需抗体酶融合蛋白的菌落(见例如由M.E.Reff(1993)在当前生物技术观点4,573-576中的文献及其中引用的文献)并通过实施例102中描述的一种或更多的方法从细胞培养上清中纯化融合的蛋白。(e)Western分析
按下述进行Westem印迹分析。(将20μl)的每种上清样品与具有和不具有还原剂的相同体积的样品缓冲液(62.5mM Tris,pH6.8,1％SDS，10％的蔗糖和0.05％的溴酚蓝)混合。样品于65℃孵育10分钟后，根据制造商的说明在MULTIPHORTMⅡ电泳仪中进行8-18％丙烯酰胺梯度胶(发玛西亚生物技术产品的EXCELTM凝胶系统)电泳。电泳后，根据制造商提供的方法用NOVABIOLTM仪(LKBProdukter AB)将分离的蛋白转移至膜(HYBONDTM C-Super,Amersham International)上。印迹后，将膜空气干燥。
通过用1∶2500稀释的抗-人κ抗体(西格玛A 7164，羊抗-人κ轻链过氧化物酶偶联物)检测抗体片段的存在。用化学发光系统(ECLTM检测系统，Amersham International)观察人抗体片段的存在。实施例49-74其它人源化806.077F(ab′)2-突变体HCPB融合蛋白的制备
这些实施例描述了编码连接到突变体HCPB(D253K；G251T,D253K；A248S,G251T,D253K)上的人源化806.077 Fd重链片段基因的制备和其与编码人源化806.077轻链基因的共表达以及编码人羧肽酶B区域原的基因从得到在每个重链片段的C-末端具有突变体HCPB分子的F(ab′)2蛋白。人源化Fd重链片段的恒定区和铰链区来自人IgG1或IgG2或IgG3抗体同型(isotype)。表达的蛋白也称为抗体-酶融合蛋白。
用显示于下表中的适当序列重复实施例48中描述的方法。用于PCR构建和克隆筛选的寡核苷酸容易地从这些适当的序列中得到。
为了改变突变体HCPB序列，实施例48中的(a)部分中的PCR模板、质粒pEEN1921以pEEN1860的〔G251T,D253K〕HCPB(描述于参考实施例1中)或pICI1713的〔D253K〕HCPB(描述于国际专利申请号WO96/20011)代替。
为了改变抗体重链的恒定区和铰链区，实施例48的(a)部分中的PCR模板、载体IgG3-pBSIIKS+以pNG4-VHss-HuIgG1CH′(描述于实施例39-47中)或pNG4-VHss-HuIgG2CH′(NCIMBNo.40797)代替。
为了改变人源化抗体轻链序列，实施例48中(b)部分中的载体pEE14-806.077HuVK4-HuCK以pEE14-806.077HuVK1-HuCK或pEE14-806.077HuVK3-HuCK代替。载体pEE14-806.077HuVK1-HuCK和pEE14-806.077HuVK3-HuCK按实施例48(b)部分中用于描述pEE14-806.077HuVK4-HuCK的方法制备但分别用pNG-VHss-806.077HuVK1-Neo和pNG-VHss-806.077HuVK3-Neo中的732个碱基对的HindⅢ-XmaⅠ片段替代pNG-VHss-806.077HuVK4-Neo中的HindⅢ-XmaⅠ片段。每个实施例抗体-酶融合蛋白变异体显示于下表中。
表
 实施例号     人源化重链     人源化轻链 突变的HCPB酶
    49  HuVH1-HuIgG3  HuVK4-HuCK [D253K]HCPB
    50  HuVH1-HuIgG3  HuVK4-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    51  HuVH1-HuIgG3  HuVK1-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    52  HuVH1-HuIgG3  HuVK1-HuCK [D253K]HCPB
    53  HuVH1-HuIgG3  HuVK1-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    54  HuVH1-HuIgG3  HuVK3-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    55  HuVH1-HuIgG3  HuVK3-HuCK [D253K]HCPB
    56  HuVH1-HuIgG3  HuVK3-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    57  HuVH1-HuIgG1  HuVK4-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    58  HuVH1-HuIgG1 HuVK4-HuCK [D253K]HCPB
    59  HuVH1-HuIgG1  HuVK4-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    60  HuVH1-HuIgG1  HuVK1-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    61  HuVH1-HuI9G1  HuVK1-HuCK [D253K]HCPB
    62  HuVH1-HuIgG1  HuVK1-HuCK [G251T,D253K]HCP8
    63  HuVH1-HuIgG1  HuVK3-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    64  HuVH1-HuIgG1  HuVK3-HuCK [D253K]HCPB
    65  HuVH1-HuIgG1  HuVK3-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    66  HuVH1-HuIgG2  HuVK4-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    67  HuVH1-HuIgG2  HuVK4-HuCK [D253K]HCPB
    68  HuVH1-HuIgG2  HuVK4-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    69  HuVH1-HuIgG2  HuVK1-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    70  HuVH1-HuIgG2  HuVK1-HuCK [D253K]HCPB
    71  HuVH1-HuIgG2  HuVK1-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    72  HuVH1-HuIgG2  HuVK3-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    73  HuVH1-HuIgG2  HuVK3-HuCK [D253K]HCPB
    74  HuVH1-HuIgG2  HuVK3-HuCK [G251T,D253K]HCPB
实施例75〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-(人源化806.077)F(ab′)2融合蛋白的制备
本实施例描述了编码连接于人源化的抗体806.077(具有人IgG3的版本1VH)Fd重链片段上的〔A248S,G251T,D253K〕HCPB基因的制备及其与编码人源化的806.077抗体轻链(具有CK的版本4VK)基因的共表达。这得到了在每个重链片段N-末端具有前-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB分子的F(ab′)2蛋白。该酶通过用胰蛋白酶去除区域原而得到。
标准的分子生物学技术，如限制酶消化、连接、激酶反应、去磷酸化、聚合酶链式反应(PCR)、细菌转化、凝胶电泳、缓冲液制备和DNA产生、纯化和分离按Maniati，等(1989)在分子克隆，实验指南；第二版：冷泉港实验室，冷泉港，纽约中所述进行或遵循特定产品制造商建议的方法进行。在大多数情况下，酶购自New EnglandBiolabs，但也可使用其它的供应商及相应的方法。根据应用生物系统提供的方法，在应用生物系统380A DNA合成仪上从用5′二甲氧三苯甲基进行碱基保护的核苷-2-氰乙基-N,N′-双-异丙基-亚磷酰胺制备寡核苷酸序列并将保护的核苷以0.2μmol的量连接到可控孔度玻璃支持物上。
按实施例103中或国际专利申请号WO 96/20011实施例20中所述用基于HPLC的分析测定HCPB突变体、天然HCPB及HCPB融合蛋白将马尿酰基(hippuryl)-L-谷氨酸或马尿酰基-L-精氨酸转变为马尿酸的能力。
用基于下面的方法进行免疫测定技术，包括Tijssen，(1985)酶免疫测定的实践和理论，生化和分子生物学实验技术，第15卷，Elserier科学出版社，Ameterdam，或遵循特定产品制造商建议的方法。
为了产生能在真核细胞中表达抗体-酶融合蛋白的质粒，使用了GS-系统(Celltech Biologics)(详述于国际专利申请号WO87/04462,WO89/01036,WO86/05807和WO89/10404)及两种质粒pEE6(pEE6.hCMV的衍生物，其中的hCMV启动子的上游的HindⅢ限制位点已变为BglⅡ位点{Stephens和Cockett,1989，核酸研究，17,7110})和pEE12(pSV2.GS衍生物，去除了其中的多个限制位点{Bebbington等，1992，生物/技术，10.169})。a)前-原-pre-pro-HCPB向限制酶XmaⅠ切割位点(SEQ IDNO:124中的位点1048)的克隆。
用标准的DNA技术(Qiagen质粒试剂盒或类似产品)制备质粒pMF18(在国际专利申请号WO 96/20011参考实施例19)的双链DNA、由克隆入载体pBluescriptⅡ KS+(Stratagene)中的pre-pro-HCPB所组成的构建体，并用HindⅢ和XmaⅠ酶进行限制性消化，操作时应谨慎以确保完全的消化。限制酶HindⅢ在HCPB基因前序列的起点之前处切割且XmaⅠ在成熟蛋白的氨基酸240(脯氨酸)密码子处切割，HindⅢ到XmaⅠ DNA的片段称为pre-pro-HCPB片段。纯化含有pre-pro-HCPB片段正确大小(约1061个碱基对)的DNA。
以类似pre-pro-HCPB片段的方式制备质粒载体pUC19(NewErgland Biolabs)的双链DNA，以HindⅢ和XmaⅠ限制性消化并纯化(约2651个碱基对)。用1载体对2.5插入子的摩尔比且约2.5ng/ml的终DNA浓度、在T4 DNA连接酶、1mM ATP和酶缓冲液的存在下制备连续混合物以将HCPB基因片段克隆入pUC19载体中。连接反应后，将此DNA混合物用于转化大肠杆菌DH5α菌株。将细胞等份铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素作为质粒载体筛选标记的L-琼脂营养培养基上，并于37℃孵育过夜。挑取多个菌落用于小量制备双链质粒DNA。通过限制酶消化分析这些DNA样品，并鉴定具有正确构型的构建体。在成熟基因中的XmaⅠ位点含有前-原-HCPB片段的质粒称为pCF003。b)从VH的位点G241+接头和5个氨基酸克隆〔A248S,G251T,D253K〕HCPB
为了从Fd序列中分离HPCB，将由(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-比氨酸)3所组成的中性接头在PCR过程中导入该序列。为了产生突变体〔A248S,G251T,D253K〕HCPB序列(参考实施例2中描述)的片段并添加肽接头和人源化806.077 VH的头5个氨基酸，PCR在下面的条件下建立，即用100pMol的引物CME 00971和CME 00972(SEQID NOS:122和123)在约5ng pZen1921 DNA、终浓度为200μM的dNTP、Taq聚合酶反应缓冲液和2.5U的Taq聚合酶存在下在100μl的终体积中。在加入Taq酶之前将此混合物于94℃加热10分钟，并且用30轮的循环的94℃1分钟、55℃2分钟和72℃2分钟进行PCR孵育，在最后一个反应中再于72℃孵育10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分析含有〔A248S,G251T,D253K〕HCPB片段的PCR产物(约298个碱基对)中正确大小的DNA并发现其含有正确大小的显著的带。用微量浓缩柱(CentriconTM 100,Amicon)从过多的试剂中从反应混合物中将产物的剩余物进行纯化和分离，然后通过乙醇/醋酸钠沉淀、离心而分离DNA、真空干燥且重悬于蒸馏水中。以酶XmaⅠ和Eco RⅠ限制性消化此分离的DNA，并纯化正确大小的条带(约271个碱基对)。
用标准的DNA技术(Qiagen质粒试剂盒或类似的产品)制备的质粒pCF003(上述)的双链DNA用XmaⅠ和Eco RⅠ酶限制性消化，并纯化具有正确大小的条带(约2696个碱基对)。
在T4 DNA连接酶、1mM ATP和酶缓冲液的存在下用约1载体对2.5插入子(1pCF003对2.5〔A248S,G251T,D253K〕HCPB片段PCR产物)的摩尔比且约2.5/μl的终DNA浓度制备连接混合物从而将突变体HCPB基因片段克隆入载体中。连接反应后，将此DNA混合物用于转化大肠杆菌DH5α菌株。将细胞等份铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素用于质粒载体筛选的L-琼脂营养培养基上并于37℃孵育过夜。挑取约200个菌落并铺板至2份无菌硝酸-纤维素膜(Schleicher和Schull)上，在含有100μg/ml氨苄青霉素用于质粒载体筛选的L-琼脂营养培养平板上预湿(pre-wet)，并于37℃孵育过夜。将一份复制平板贮存于4℃用于菌落的活细胞来源，将另一平板处理从而将单个菌落的DNA变性并固定至硝酸-纤维素上。从琼脂板上取出硝酸-纤维素膜并依次置于浸入下面物质的滤纸(Whatman)上：1．10％SDS 2分钟；2．0.5M NaOH；1.5M NaCl 7分钟；3．0.5MNaOH；1.5M NaCl 4分钟；4．0.5M NaOH；1.5M NaCl 2分钟；5．0.5M Tris pH 7.4,1.5M NaCl 2分钟；和6.2×SSC(标准的柠檬酸盐)2分钟。然后将此滤膜置于浸于10×SSC中的滤纸(Whatman)上并通过紫外光处理(Spectrolinker XL-1500 UV交联仪)将此变性的DNA交联至硝酸-纤维素上。让滤膜于室温干燥，且然后于6×SSC溶液中缓缓振摇而于60℃预杂交1小时(例如用Techne HB-1D杂交仪)。注意预杂交封闭了滤膜上非-特异性的DNA结合位点。
为了测定哪个菌落含有目的DNA插入子，将交联至硝酸-纤维素膜上的DNA与从〔A248S,G251T,D253K〕HCPB纯化的PCRDNA片段(见上)制备的放射-标记的32P-DNA探针杂交。在50μl的总体积中用T7 DNA聚合酶以50μCi的32P-dCTP(＞3000Ci/mMol)标记约50ng DNA(发玛西亚T7 Quickprime试剂盒)并让此反应在37℃进行15分钟。将标记的探针加热至95℃2分钟以变性双链DNA，立即加入60℃的10ml 6×SSC中并将此溶液用于代替滤膜上的预杂交液。继续于60℃轻轻振摇孵育约3小时。然后倾倒杂交液，并将该滤膜于60℃以2×SSC洗2次，每次15分钟。然后将滤膜轻轻印干，镶盖以粘附胶片(SaranTM wrap或类似产品)并于室温曝光至X-射线胶片(例如Kodak X-OMAT-ARSTM)过夜。胶卷显影后，在X-射线胶片上具有最强曝光(最黑的点)的菌落被鉴定为含有目的插入子的菌落。在该系列的实验中，约15％的菌落得到阳性杂交。挑选这12个菌落用于进一步的筛选。从复制的滤膜上挑取这些菌落，划盘并维持于含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂营养培养基上并于含有100μg/ml氨苄青霉素的L-B营养培养基中含有。
选出的菌落用于小量制备双链质粒DNA。通过限制酶消化分析这些DNA样品，并鉴定具有正确构型的构建体。为了确保不在PCR过程中导入变化到此DNA序列中，具有正确图谱的许多克隆被取出而用标准的技术(Qiagen质粒试剂盒或类似产物)进行DNA制备，且用几个单独的寡核苷酸引物对插入子测序。鉴定具有正确序列的构建体，并将该在PstⅠ位点(氨基酸5)(SEQ ID NO:124中位点1301)含有pre-pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-人源化806.077 VH基因的质粒命名为pCF004。c．克隆人源化的806.077 Fd
用标准的DNA技术(Qiagen质粒试剂盒或类似的产品)制备质粒pNG4-VHss-HuVH1-806.077-IgG3CH1′的双链DNA、具有克隆入载体pNG5中人IgG3CH1和铰链区(见实施例44)且由人源化的806.077版本1 VH所组成的构建体，并以PstⅠ和XmaⅠ酶限制性消化。纯化含有人源化806.077 Fd片段具有正确大小的DNA(约854个碱基对)。以与人源化806.077 Fd片段类似的方式制备质粒载体pUC19(New England Biolabs)的双链DNA，以PstⅠ和XmaⅠ限制性消化并纯化(约2659个碱基对)。
用琼脂糖凝胶电泳与已知的标准比较来检查限制且纯化DNA样品的纯度且进行浓度估计。根据这些估计，在T4 DNA连接酶、1mMATP及酶缓冲液存在下，用约1载体对2.5插入子的摩尔比及约2.5ng/ml的DNA终浓度制备连接混合物从而将人源化的806.077 Fd基因片段克隆入pUC19载体中。
连接反应后，将该DNA混合物用于转化大肠杆菌DH5α菌株。将细胞等份铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素用于质粒载体筛选的L-琼脂营养培养基中并于37℃孵育过夜。挑取多个菌落并用于双链质粒DNA的小量制备。通过限制酶消化分析这些DNA样品，并鉴定具有正确构型的构建体。在PstⅠ位点至XmaⅠ位点之间含有人源化806.077 Fd片段的质粒称为pCF005。d)将人源化的806.077 Fd克隆入pre-pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头构建体中
用标准的DNA技术(Qiagen质粒试剂盒或类似产品)制备质粒pCF005(上述)的双链DNA，并以PstⅠ和Eco RⅠ酶限制性消化。纯化含有人源化806.077 Fd片段的正确大小的DNA(约870个碱基对)。以与人源化806.077 Fd片段类似的方式制备质粒载体pCF004(如上述)的双链DNA，以PstⅠ和Eco RⅠ限制性消化及纯化(约3950个碱基对)。在T4 DNA连接酶、1mM ATP及酶缓冲液的存在下用约1载体对2.5插入子的摩尔比制备连接混合物以将人源化的806.077 Fd基因片段克隆和pCF004载体中。
连接反应后，将此DNA混合物用于转化大肠杆菌DH5α菌株。将细胞等份铺板于含100μg/ml氨苄青霉素用于质粒载体筛选的L-琼脂营养培养基中，并于37℃孵育过夜。挑取多个菌落并用于小量制备双链质粒DNA。通过限制酶消化分析这些DNA样品，并鉴定具有正确构型的构建体。在pUC19中含有pre-pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-Fd(人源化806.077)的质粒称为pCF006。e)将pre-pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-(人源化806.077)Fd克隆入pEE6 hCMV载体
用标准的技术(Qiagen质粒试剂盒或类似产品)制备质粒pCF006(上述)的双链DNA，并以HindⅢ和Eco RⅠ酶限制性消化。纯化含有该融合蛋白的正确大小的DNA(约2185个碱基对)。
以与融合蛋白类似的方式制备质粒载体pEE6(上述)的双链DNA，以HindⅢ和Eco RⅠ限制性消化并纯化(约4775个碱基对)。在T4 DNA连接酶、1mM ATP及酶缓冲液的存在下用1载体对2.5插入子的摩尔比及约2.5ng/μl的终DNA浓度制备连接混合物以将人源化的806.077融合蛋白克隆入pEE6载体中。连接反应后，将此DNA混合物用于转化大肠杆菌DH5α菌株。将细胞等份铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素用于质粒载体筛选的L-琼脂营养培养基上并于37℃孵育过夜。挑取多个克隆于小量制备双链质粒DNA。这些DNA样品通过限制酶消化分析并鉴定具有正确构型的构建体。在pEE6中含有pre-pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-Fd(人源化806.077)的质粒称为pCF007。f)将人源化的806.077轻链版本4克隆入pEE12载体
用标准的DNA技术(Qiagen质粒试剂盒或类似的产品)制备质粒pNG3-VKss-806.077-HuVK4-HuCK-Neo的双链DNA、由具有克隆入载体pNG3(见实施例12-38)的人CK的人源化806.077版本HuVK4所组成的构建体，并用HindⅢ和Eco RⅠ酶限制性消化。纯化含有人源化806.077轻链的正确大小的DNA(约2022个碱基对)。以与人源化806.077轻链类似的方式制备质粒载体pEE12的双链DNA、以HindⅢ和Eco RⅠ限制性消化并纯化(约7085个碱基对)。在T4 DNA连接酶、1mM ATP和酶缓冲液存在下，用约1载体对2.5插入子的摩尔比及约2.5ng/μl的终DNA浓度制备混合物从而将人源化的806.077轻链克隆入pEE12载体中。连接反应后，将该DNA混合物用于转化大肠杆菌DH5α菌株中。将细胞等份铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素用于质粒载体筛选的L-琼脂营养培养基上，并于37℃孵育过夜。挑取多个菌落用于小量制备双链质粒DNA。通过限制性酶消化分析这些DNA样品，且鉴定具有正确构型的构建体。含有人源化806.077轻链版本4的质粒称为pCF008/4。g)将CMVp-pre-pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-(人源化806.077)Fd克隆入pCF008/4
用标准的DNA技术(Qiagen质粒试剂盒或类似产品)制备质粒pCF007(上述)的双链DNA，并以BglⅡ和SalⅠ酶限制性消化。限制酶BglⅡ在CMV MIE异肽、融合蛋白的启动子和基因的起始点之前切割pCF007质粒，限制酶SalⅠ在成熟蛋白的终止密码子之后切下约520个碱基对。纯化含有该融合蛋白的正确大小的DNA(约4844个碱基对)。以与融合蛋白类似的方式制备质粒载体pCF008/4的双链DNA、以Bam HⅠ和SalⅠ限制性消化并纯化(约7436个碱基对)。在T4 DNA连接酶、1mM ATP和酶缓冲液的存在下用约1载体对2.5插入子的摩尔比，和约2.5ng/μl的DNA终浓度制备连接混合物从而将〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-(人源化806.077)Fd融合基因克隆入pCF008/4载体中。连接反应后，将DNA混合物用于转化大肠杆菌DH5α菌株。将细胞等份铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素用于质粒载体筛选的L-琼脂营养培养基上，并于37℃孵育过夜。挑取多个菌落并用于小量制备双链质粒DNA。通过限制酶消化分析这些DNA样品，且鉴定具有正确构型的构建体。在GS表达载体pEE12中含有pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-F(ab′)2(人源化806.077抗体)基因的质粒称为pCF009并将此质粒图谱显示于SEQ ID NOS:70和71中。pre-pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-Fd(人源化806.077)的DNA序列显示于SEQ ID NO:124中并且相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:125中。h)Pro-〔突变体〕HCPB-接头-F(ab′)2(人源化806.077)在小鼠骨髓瘤细胞中的表达
下面的方法已用于所有(D253K和G251T,D253K和A248S,G251T,D253K)突变体pro-HCPB酶融合蛋白在骨髓瘤中的表达，优选的小鼠骨髓瘤细胞系为NSO(Galfre和Milstein,1981，酶学方法，73,3-46)，且可获自欧洲动物细胞保藏中心，PHLSCAMR,Porton Down,Salisbury,Wiltshire,SP4 OJG(ECACC目录号85110503)。将这些细胞培养于含有10％热灭活胎牛血清(FCS)的Dulbeco改进的Eagle培养基(DMEM；Grbco/BRL)中。
对于pro-〔A248S,G251T,D253K〕HCPB-接头-F(ab′)2(人源化806.077)的表达，使用2种质粒pCF009(上述)及pRc/RSVC来自InVitrogen，目录号V780-20)，其中含有新霉素抗性基因用于筛选G418抗性稳定的细胞系。通过包括阳离子脂质介导的多核苷酸向真核细胞中的转动的脂质体转染方法(Felgner等，方法：酶学方法伴侣，1993,5,67-65)，将约5μg的每种质粒(0.5-10μg)用于转染约8×106个NSO细胞。离心收获细胞，以无血清培养基(30ml)洗，重悬于800μl的培养基中并于37℃保存于组织培养瓶中直至加入DNA。无血清培养基(450μl)与LIPOFECTINTM试剂(50μl)轻轻混合并于室温孵育30到45分钟。将此混合物加入到含有质粒DNA混合物(不到100μl)的500μl培养基中并于室温放置15分钟。将无血清培养基(600μl)加入到质粒DNA-LIPOFECTINTM混合物中，并将该混合物加入细胞中且于CO2培养箱中于37℃孵育约5小时。然后以含有10％FCS的正常DMEM培养基(8ml)代替含有培养基的DNA并将细胞孵育过夜。然后再次将培养基以含有10％FCS的正常DMEM培养基(8ml)代替并按前述没有筛选将细胞孵育24小时。此时段结束时将培养基换为含有10％FCS及G418筛选(1.5mg/ml)的DMEM，并以相同的培养基将细胞稀释(在1∶4至1∶20之间)(约每板0.5至1.5×106个细胞)至微滴定孔(150μl每孔；每次稀释2或更多板)中。将此微滴定板于CO2培养箱中于37℃孵育至少2周且然后有规则地检查存活克隆的形成。
取出含有单个存活克隆孔中的培养基用于测试并以新鲜培养基(含有G418)代替。在ELISA中测试取出培养基对CEA的抗体结合(除了二级抗体溶液从抗-小鼠更换为抗-人(羊抗-人κ轻链过氧化物酶偶联物，西格玛A7164)外，以与参考实施例5第1部分中国际专利申请号WO96/20011中描述的相同的方式)。也测定CEA ELISA阳性样品在以胰蛋白酶(在pH7.6 50mM Tris-HCl和150mM NaCl中700μg/ml于4℃孵育1小时，反应通过加入5倍过量的大豆胰蛋白酶抑制剂而终止)激活后(去除融合蛋白的区域原)的〔A248S,G251T,D253K〕HCPB酶活性均为阳性培养基的克隆。这些克隆通过非还原性Western印迹分析进一步加以测定(除了抗体溶液从抗-小鼠更换为抗-人(羊-抗-人κ轻链过氧化物酶偶联物，西格玛A7164外，以与参考实施例5第1部分的国际专利申请号WO96/20011中所述的相同的方式)以鉴定出显著产生F(ab′)2(806.077)融合蛋白的克隆。然后扩增这些克隆，测试经多代后融合蛋白的稳定产生，并收集(bulkup)最高产量的克隆且用标准的技术于液氮中冷冻保存。
融合蛋白在NSO骨髓瘤细胞中的扩增、高水平表达和发酵以与Bebbington等(1992)在生物/技术10,169-175中所述的类似的方式进行。按实施例102中所述纯化融合蛋白及去除前体序列。实施例76至101pro-HCPB-接头-(人源化806.077)Fd+(人源化的806.077)Fd+(人源化806.077)轻链其它变异体的克隆与表达
除了在实施例75的b部分中以〔D253K〕HCPB或〔G251T,D253K〕HCPB代替〔A248S,G251T,D253K〕HCPB外且用于PCR反应中的质粒DNA分别为pICI1713(描述于实施例15中的国际专利申请号WO96/20011中)或pZEN1860(参考实施例1)外，产生与其它HCPB突变体融合蛋白的方法类似于在实施例75(上面)中详述的方法。克隆、鉴定和序列确定后，将得到的含有pre-pro-〔D253K〕HCPB-接头或pre-pro-〔G251T,D253K〕HCPB-接头的质粒和pUC19载体背景中PstⅠ位点(氨基酸位点5处)中的人源化806.077 VH基因在随后的克隆反应中用于代替pCF004。
除了在实施例75的c部分中以人IgG1或IgG2 CH代替含有人源化806.077 VH版本1的质粒且从铰链区代替806.077-HuVH1-IgG3CH1′(分别为SEQ ID NOS:92和56)外，与其它CH1区域产生融合蛋白的方法类似于在实施例75(上面)中详述的方法。克隆、鉴定和序列确证后，得到的含有IgG1或IgG2序列的质粒在随后的克隆反应中用于代替pCF005。
除了在实施例75的f部分中以含有人源化806.077 Lc版本1或版本3代替806.077-HuVK4-HuVK(分别为SEQ ID NOS:51和96)外，产生与其它人源化806.077轻链变异体融合蛋白的方法类似于在实施例75(上面)中详述的方法。克隆、鉴定和序列确证后，得到的含有其它轻链序列的质粒在随后的克隆反应中用于代替pCF008/4中。每个实施例(76至101)融合蛋白变异体显示于下表中。表
 实施例号        人源化重链     人源化轻链 突变的HCPB酶
    76     HuVH1-HuIgG3     HuVK4-HuCK [D253K]HCPB
    77     HuVH1-HuIgG3     HuVK4-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    78     HuVH1-HuIgG3     HuVK1-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    79     HuVH1-HuIgG3     HuVK1-HuCK [D253K]HCPB
    80     HuVH1-HuIgG3     HuVK1-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    81     HuVH1-HuIgG3     HuVK3-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    82     HuVH1-HuIgG3     HuVK3-HuCK [D253K]HCPB
    83     HuVH1-HuIgG3     HuVK3-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    84     HuVH1-HuIgG1     HuVK4-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    85     HuVH1-HuIgG1     HuVK4-HuCK [D253K]HCPB
    86     HuVH1-HuIgG1     HuVK4-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    87     HuVH1-HuIgG1     HuVK1-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    88     HuVH1-HuI9G1     HuVK1-HuCK [D253K]HCPB
    89     HuVH1-HuIgG1     HuVK1-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    90     HuVH1-HuIgG1     HuVK3-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    91     HuVH1-HuI9G1     HuVK3-HuCK [D253K]HCPB
    92     HuVH1-HuIgG1     HuVK3-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    93     HuVH1-HuIgG2     HuVK4-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    94     HuVH1-HuIgG2     HuVK4-HuCK [D253K]HCPB
    95     HuVH1-HuIgG2     HuVK4-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    96     HuVH1-HuIgG2     HuVK1-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    97     HuVH1-HuIgG2     HuVK1-HuCK [D253K]HCPB
    98     HuVH1-HuIgG2     HuVK1-HuCK [G251T,D253K]HCPB
    99     HuVH1-HuIgG2     HuVK3-HuCK [A248S,G251T,D253K]HCPB
    100     HuVH1-HuIgG2     HuVK3-HuCK [D253K]HCPB
    101     HuVH1-HuIgG2     HuVK3-HuCK [G251T,D253K]HCPB
实施例102含有806.077抗体序列蛋白的纯化
重组F(ab′)2或抗体-酶融合蛋白的纯化或富集可通过几种方法单独使用或联合使用从骨髓瘤细胞、CHO细胞或COS细胞上清中完成。通过一种或更多种不同的方法；亲和层析或阴离子交换层析或蛋白A/蛋白G层析纯化鼠806.077F(ab′)2、嵌合806.077F(ab′)2构建体和完全人源化的806.077F(ab′)2构建体以及掺入到这些F(ab′)2构建体中的抗体-酶融合蛋白构建体。这些技术也可用于纯化806.077抗体-B7融合(见实施例104)。a)抗原亲和层析
将产生抗该蛋白的母本鼠806.077抗体的癌胚抗原(CEA)固定于柱上(用发玛西亚产品)。简言之，固定通过结合至SepharoseTM HighPerformance介质在柱中(HiTrapTM)以NHS-激活预装柱上的稳定酯；CEA向激活基质的偶联用该产品提供的标准说明书方法进行。1ml亲和柱柱的制备
将CEA贮备液(8mg/ml)以偶联缓冲液(0.2M碳酸氢钠、0.5M氯化钠；pH8.3)首先稀释至0.5mg/ml的终浓度。新柱以6ml冰冷的1mM HCl以不超过1ml/l分钟的流速洗。洗柱后即刻，将CEA配体(1mL以0.5mg/ml)注射至柱上。在两端封柱且于室温放置30分钟。将没有偶联至配体的过多活性基因失活且通过三轮交替的高和低pH清洗将任何非特异性结合的配体洗出柱外。所用的缓冲液为0.5M的乙醇胺，0.5M氯化钠(pH8.3)和0.1M醋酸钠、0.5M氯化钠(pH4.0)。在每轮清洗中，将6ml每种缓冲液洗出柱基质。最后，将柱清洗入贮备缓冲液(0.05M Na2HPO4,0.1％NaN3,pH7.0)。纯化方法
将含有所需F(ab′)2或融合构建体如嵌合的806.077F(ab′)2，人源化的806.077F(ab′)2或抗体-酶融合蛋白的细胞培养上清以磷酸缓冲盐(pH7.2) 1∶1稀释并以1ml/分钟的流速流经该1ml的亲和柱。该柱预先以磷酸缓冲盐(pH7.2；50mM磷酸钠、150mM氯化钠)加以平衡。细胞上清流完后将柱以10倍柱床体积的磷酸缓冲液洗。以5倍柱床体积的100mM柠檬酸钠(pH3.0)洗脱结合的F(ab′)2，收集1ml的洗脱馏份。通过用适当抗体过氧化物酶偶联物(在完全人源化F(ab′)2情况下抗-人κ轻链-过氧化物酶偶联物，西格玛A-7164)并以过氧化氢和4-氯-1-萘酚显色的Western印迹分析完成对洗脱F(ab′)2的检测。必要时，用离心式浓缩器(CentriconTM 30)合并和浓缩适当的馏份。b)阴离子交换层析
将含有所需的F(ab′)2或融合构建体如嵌合806.077F(ab′)2、人源化806.077F(ab′)2或抗体-酶融合蛋白的细胞培养上清渗滤至50mM Tris(用具有10,000分子量截断膜的搅拌细胞)中直至溶液的离子强度等于柱平衡缓冲液为止。将40ml渗滤上清的等份以2ml/分钟上样至适当的柱(发玛西亚Mono QTM 10/10HR)。该柱预先以50mM Tris(pH8.0)平衡。一旦上清流经该亲和柱，以平衡缓冲液将该柱洗回基线。然后以15倍柱床体积的0-50％缓冲液B(50mM Tris,1M氯化钠pH8.0)洗脱结合于柱上的物质。收集洗脱馏份(每馏份4ml)且通过用适当抗体过氧化物酶偶联物(在完全人源化的F(ab′)2情况下，抗-人κ轻链-过氧化物酶偶联物，西格玛A-7164)并以过氧化氢和4-氯-1-萘酚显色的Westem印迹分析鉴定含有F(ab′)2的馏份。必要时，用离心式浓缩器(CentriconTM 30)合并和浓缩适当的馏份。c)蛋白A和蛋白G纯化
在上样至预先以磷酸缓冲液(pH7.2)平衡的柱之前，将含有所需F(ab′)2或融合构建体(如806.077 F(ab′)2，嵌合806.077 IgGl或IgG2或IgG3；pro-HCPB-接头-806.077 F(ab′)2,806.077 F(ab′)2-HCPB)的细胞培养上清以磷酸缓冲液1∶1稀释。在F(ab′)2和50mM甘氨酸、100mM氯化钠(pH 10.8)在融合蛋白情况下以100mM柠檬酸钠(pH3.0)洗脱结合F(ab′)2或融合蛋白之前，以磷酸缓冲液洗柱。收集洗脱馏份并通过每1ml洗液体积添加125μl 2M Tris而将其中和。必要时，用离心式浓缩器合并和浓缩含有F(ab′)2的馏份。d)前(Pro)序列切割：
对于含有共价连接前(Pro)-序列的融合蛋白(如Pro-HCPB-接头-806.077 F(ab′)2)，前序列通过将融合体与胰蛋白酶共同孵育而切割。毫克级(融合体)的该方法包括如下步骤。将胰蛋白酶与融合蛋白以1∶1000的比例(胰蛋白酶∶融合蛋白)混合。将混合物于室温(约22℃)中孵育24小时，然后前序列的切割完成。通过在一个同类(generic)层析纯化或富集方法中再循环(recirculating)该混合物而将融合蛋白与前序列分离。实施例103抗Hipp-Glu前体药物类似物含有突变体人CPB抗体-酶融合蛋白活性的测定
用基于HPLC的分析测定细胞培养上清或含有人CPB突变体(D253K；G252T,D253K；A248S,G251T,D253K；实施例48-101)的纯化抗体-酶融合蛋白将马尿酰基-L-谷氨酸(Hipp-Glu)参考实施例9中国际专利申请号WO 96/20011))转变为马尿酸的能力。
该反应混合物(250μl)在pH 7.5的0.025M Tris-HCl中含有4μg纯化的融合蛋白或细胞培养上清(直接使用或以pH 7.5的0.025MTris-HCl稀释后使用；125μl)和0.5mM的Hipp-Glu。样品于37℃孵育5小时。反应通过加入250μl 30％甲醇、70％磷酸缓冲液(50mM；pH 6.5)、0.2％三氟乙酸加以终止且产生的马尿酸的量通过HPLC(用Hewlett Packard 1090 Series 11二级管排列系统(diode array system))加以定量。
将样品(50μl)注射至柱(25cm；HICHROMTMHi-RPB)并用流动相15％甲醇、85％磷酸缓冲液(50mM；pH 6.5)以1ml/分钟的流速加以分离。根据已知量马尿酸(西格玛-H6375)产生的校正曲线测定产生产物(马尿酸)的量。结果表示为37℃底物向产物的百分转换，依据转换速度时间为30分钟-24小时。
对于具有N-末端proCPB的抗体-酶融合蛋白区域原首先通过在50mM Tris-HCl(pH 7.6),150mM NaCl中于4℃以胰蛋白酶(700μg/ml)处理1小时而去除。实施例104人B7.1-人源化806.077F(ab′)2融合蛋白(hB7-806)的制备
如参考实施例3中一样，用PCR技术构建由信号序列和直接融合至人源化806.077抗体Fd链5′编码区人B7.1细胞外区域所组成的融合蛋白。产生含有天然信号序列和融合至人源化806.077抗体重链VH区域的人B7.1细胞外区域的HindⅢ-NheⅠ片段。将其克隆入适当的载体，例如，pNG4-VHss-HuIgG2CH1′或pNG4-VHss-HuIgG3CH1′(见实施例39-47)(在SEQ ID NO:18中代替1-423碱基)以产生人B7.1-人源化806.077 Fd融合基因。构建共表达载体后用表达系统如本文所述完成该融合体与人源化806.077 L链的其表达(含有人源化806.077轻链VK4版本的合适的载体为pCF008/4；见实施例75)。将这种载体用于转染NSO骨髓瘤细胞且筛选培养上清中具有CEA结合活性的菌落。其它人源化的序列描述于实施例39-47中。
按参考实施例3中所述或实施例102中所述的其中一种方法在合适的细胞系中表达hB7-806融合蛋白并用蛋白A柱加以纯化。应该注意非蛋白A柱的纯化方法对于人源化806.077抗体片段及其融合蛋白是优选的。当结合至LS174T细胞时用参考实施例3中所提出的分析方法可测定该融合蛋白的抗原及受体结合特性和T-细胞共刺激活性。实施例105嵌合和人源化806.077F(ab′)2-CPG2偶联物的制备
用描述于实施例8中的一个嵌合版本或描述于实施例39-47中的一个人源化版本代替鼠F(ab＇)2蛋白重复实施例5中描述的方法。实施例106人源化806.077 Fab-CPG2酶融合蛋白的制备
用类似于在实施例12-38中描述的用于HuVK4构建的PCR方法构建人源化806.077抗体和细菌CPG2酶融合蛋白构建体，其中特异性设计的引物用于PCR反应中以扩增出抗体和酶基因成分(从而得到的DNA产物含有重叠的互补序列)，然后将它们通过进一步“剪接/连接”PCR反应而连接以制备完全的抗体-酶融合基因。通过将Fd人源化806.077抗体重链基因的3′末端连接至CPG2结构编码基因的5′末端以产生Fab-CPG2融合蛋白编码基因而产生该融合蛋白。在此构建体中，人源化806.077抗体重链基因成分对于HuVH1-HuIgG1Fd重链(SEQ ID NO:93)可在残基K236后终止，对于HuVH1-HuIgG2Fd重链(SEQ ID NO:57)来说可在残基Val 237后终止，或者在HuVH1-HuIgG3 Fd重链(SEQ ID NO:95)中可在重链残基Val237后终止可连接到信号序列切割位点C-末端的第一个CPG2残基上(Minton等(1984)基因31,31-38)。然而，为了获得最佳的抗体结合和酶特性，但也应正视在两种成分连接处掺入其它的残基也许是必要的。
然后将融合基因克隆入适当的载体，例如pNG4-VHss-HuIgG2CH1′(NCIMB no.40797)，在此之前将载体以适当的限制酶消化、分离并制备融合基因DNA片段因而以融合蛋白基因代替原始的抗体基因。以类似于实施例11中所述的方式构建共表达载体后完成对与人源化806.077轻链融合蛋白的共表达。将此共表达载体用于转染NSO骨髓瘤细胞并按前述筛选在培养上清中具有CEA和Fd结合活性的菌落。该融合蛋白可用蛋白-A柱加以纯化且用标准的测试技术显示其既具有抗原特性又具有酶特性。实施例107
人源化重链和基于轻链序列VK4的轻链可变区的进一步组合
以改变的序列代替人源化轻链VK4可变区序列(SEQ ID NO:71)重复描述于实施例12-38中的方法，其中改变的序列中在SEQ IDNO:71位点35处的酪氨酸残基(Tyr)以苯丙氨酸残基(Phe)替代。实施例108人源化重链和基于轻链序列VK4的轻链可变区的进一步组合
以改变的序列代替人源化轻链VK4可变区序列(SEQ ID NO:71)重复描述于实施例12-38中的方法，其中改变的序列的苯丙氨酸残基(在SEQ ID NO:71的位点72处的Phe)由亮氨酸残基(Leu)所替代。实施例109人源化重链和基于轻链序列VK4的轻链可变区的进一步组合
以改变的序列代替人源化轻链VK4可变区序列(SEQ ID NO:71)重复描述于实施例12-38中的方法，其中的改变序列SEQ IDNO:71中的位点35的酪氨酸残基(Tyr)和位点72的苯丙氨酸残基(Phe)分别以苯丙氨酸残基(Phe)和亮氨酸残基(Leu)替代。实施例110人源化重链可变区和嵌合轻链序列的组合
以实施例8中描述的SEQ ID NO:17嵌合序列代替人轻链可变区序列而重复描述于实施例12-38中的方法。实施例111-113具有修饰的轻链VK4可变区序列的人源化F(ab′)2片段的表达
用描述于实施例107中的可变区轻链序列代替SEQ ID NO:99的人源化轻链序列重复描述于实施例39-47中的方法，其中SEQ IDNO:99的57位点的酪氨酸残基(Tyr)由苯丙氨酸残基(Phe)所替代。
实施例111为HuVH1-HuIgG1与上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。
实施例112为HuVH1-HuIgG2与上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。
实施例113为HuVH1-HuIgG3与上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。实施例114-116具有修饰的轻链VK4可变区序列的人源化F(ab′)2片段的表达
用描述于实施例108中的可变区轻链序列代替SEQ ID NO:99的人源化轻链序列而重复描述于实施例39-47中的方法，其中SEQID NO:99中位点94的苯丙氨酸残基(Phe)由亮氨酸残基(Leu)代替。
实施例114为HuVH1-HuIgG1和上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。
实施例115为HuVH1-HuIgG2与上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。
实施例116为HuVH1-HuIgG3与上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。实施例117-119具有修饰的轻链VK4可变区序列的人源化F(ab＇)2片段的表达
以描述于实施例109中的可变区轻链序列代替SEQ ID NO:99的人源化轻链序列而重复描述于实施例39-47中的方法，其中SEQID NO:99中的位点57的酪氨酸残基(Tyr)和位点94的苯丙氨酸残基(Phe)分别以苯丙氨酸残基(Phe)和亮氨酸残基(Leu)所替代。
实施例117为HuVH1-HuIgG1与上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。
实施例118为HuVH1-HuIgG2与上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。
实施例119为HuVH1-HuIgG3与上述修饰的SEQ ID NO:99的组合。实施例120-122具有嵌合轻链序列的人源化F(ab′)2片段的表达
以描述于实施例110中的嵌合轻链序列代替用于实施例39-47中的人源化轻链序列而重复描述于实施例39-47中的方法
实施例120为HuVH1-HuIgG1与上述嵌合的轻链序列的组合。
实施例121为HuVH1-HuIgG2与上述嵌合的轻链序列的组合。
实施例122为HuVH1-HuIgG3与上述嵌合的轻链序列的组合。实施例123基于修饰的轻链VK4序列的人源化融合蛋白的制备
以含有实施例107和111至113修饰的VK4序列的质粒代替pEE14-806.077HuVK4-HuCK质粒而重复描述于实施例48中的方法。实施例124基于修饰的轻链VK4序列的人源化融合蛋白的制备
以含有实施例108和114至116修饰的VK4序列的质粒代替质粒pEE14-806.077HuVK4-HuCK质粒而重复描述于实施例48中的方法。实施例125基于修饰的轻链VK4序列的人源化融合蛋白的制备
以含有实施例109和117至119中修饰的VK4序列的质粒代替质粒pEE14-806.077HuVK4-HuCK质粒而重复描述于实施例48中的方法。实施例126基于嵌合轻链VK4序列人源化融合蛋白的制备
以含有实施例110和120至122中嵌合轻链序列的质粒代替质粒pEE14-806.077HuVK4-HuCK质粒而重复描述于实施例48中的方法。实施例127基于修饰轻链VK4序列的人源化融合蛋白的制备
以含有实施例107和111至113中修饰的VK4序列的质粒代替质粒pCF008/4而重复描述于实施例75中的方法。实施例128基于修饰轻链VK4序列的人源化融合蛋白的制备
以含有实施例108和114至116中修饰的VK4序列的质粒代替质粒pCF008/4而重复描述于实施例75中的方法。实施例129基于修饰的轻链VK4序列的人源化融合蛋白的制备
以含有实施例109和117至119中修饰VK4序列的质粒代替质粒pCF008/4而重复描述于实施例75中的方法。实施例130基于嵌合轻链VK4序列人源化融合蛋白的制备
以含有实施例110和120至122嵌合轻链序列质粒代替质粒pCF008/4而重复描述于实施例75中的方法。参考实施例1〔G251T、D253K〕HCPB基因序列的制备
在大肠杆菌中克隆〔G251T、D253K〕HCPB的方法很类似于实施例15，国际专利申请号WO96/20011中所述的方法。又一以将pICI266用作克隆载体，但用于PCR定点诱变的起始原料为在质粒pICI1713中的〔D253K〕HCPB基因(如实施例15中国际专利申请号WO96/20011中所述)。然而在此实施例中，在PCR扩增基因过程中使用定点诱变以将成熟基因中氨基酸位点251处的密码子以甘氨酸变为苏氨酸(GGC至ACT)，G251T改变。同样在此突变产生过程中，通过使用具有G251密码子改善的寡核苷酸混合物在相同的(G251)位点产生许多其它的突变。在全基因测序之前经转化和横跨该突变点序列的杂交而鉴定单个的突变体基因。在此实施例中，仅考虑导入G251T突变的寡核苷酸。以与国际专利申请号WO96/20011实施例15中所述的类似方法制备2种PCR混合物。在第一种反应中引物为CAN00402(SEQID NO:116)和CAN00734(SEQ ID NO:117)。在第二种反应中引物为CAN00284(SEQ ID NO:118)和CAN01076(SEQID NO:119)。在2种反应中起始DNA为pICI1713。
通过琼脂糖凝胶电泳分析2种PCR产物等份中正确大小的DNA(约750和250个碱基对)并估计浓度，并发现显著含有具有正确大小的条带。用头2种PCR产物中的每一种和2个末端引物{CAN00402(SEQID NO:116)和CAN 00284(SEQ ID NO:118)}进行另一种PCR。通过琼脂糖凝胶电泳分析该PCR产物等份正确大小(约1000个碱基对)的DNA并发现显著含有正确大小的条带。纯化该反应混合物中的剩余产物，将分离的DNA以酶NcoⅠ和Eco RⅠ限制性消化且以与实施例16中国际专利申请号WO96/20011中所述的类似方式纯化此正确大小的(约1000个碱基对)的条带。
以NcoⅠ和Eco RⅠ酶限制性消化pICI266双链DNA，且纯化具有正确大小(约5600个碱基对)的DNA。用琼脂糖凝胶电泳，与已知的标准比较而检测限制性消化过且纯化过载体等份及插入DNA样品的纯度和浓度估计。根据这些估计，以与国际专利申请号WO96/20011实施例16中所述的类似方式制备连接混合物以将HCPB基因克隆入pICI266载体中。
连接反应后，将此DNA混合物用于转化大肠杆菌DH5α菌株，挑取菌落并通过杂交而测试。然后以与国际专利申请号WO96/20011实施例16中所述的类似方式取出多个克隆用于质粒DNA制备，且对PCR突变区进行测序以鉴定出具有G251T改变的克隆。从测试结果中筛选出。含有具有所需〔G251T:D253K〕HCPB基因序列质粒的克隆，并将此质粒称为pZEN1860。参考实施例2〔A248S、G251T、D253K〕HCPB基因序列的制备
在大肠杆菌中克隆〔A248S、G251T、D253K〕HCPB的方法很类似于参考实施例1描述的方法，用于PCR定点诱变的起始原料为质粒pZEN1860中的〔G251T,D253K〕HCPB基因(描述于参考实施例1中)代替pICI1713。然而，在此实施例中，在基因PCR扩增过程中用定点诱变从将成熟基因位点248氨基酸的密码子以丙氨酸变为丝氨酸(GCT至TTC)，A248S改变。以类似于参考实施例1中所述的方式制备2种PCR混合物。在第一种反应中引物为CAN00402(SEQID NO:116)和CAN00720(SEQ ID NO:120)。在第二种反应中引物为CAN00284(SEQ ID NO:118)和CAN00726(SEQID NO:121)。在2种反应中，起始DNA为pZEN1860。
PCR、克隆、表达和鉴定的方法与参考实施例1相同。根据测序结果，筛选出含有具有〔A248S,G251T,D253K〕HCPB基因序列的质粒的克隆并将此质粒称为pZEN1921。参考实施例3人B7.1-鼠A5B7 F(ab′)2融合蛋白(AB7)的制备和特征分析
用于重组鼠A5B7 F(ab′)2抗体制备，纯化和特征分析的方法已经公开(WO96/20011，参考实施例5)。人B7.1抗原(也称CD80)的cDNA序列已经分离和描述过(Frceman G.J等，免疫学杂志，1989,143,2714-2722)。在该实施例中“AB7”指人B7.1-鼠A5B7 F(ab′)2融合蛋白且“A5B7”指称为A5B7的抗-CEA抗体。
基于PCR的策略，我们从培养的Raji细胞(ATCC No.CCL80)的cDNA中分离了人B7.1的天然信号序列和细胞外区域(编码氨基酸1-242)并将其直接融合至鼠A5B7 Fd片段成熟5′编码序列的上游。这包括以PCR引物187/96和204/96(SEQ ID NOS:126和127)分离B7.1序列和以PCT引物203/96和205/96(SEQ ID NOS:128和129)分离部分的A5B7 Fd序列。PCR产物纯化后，将它们以大约等摩尔量混合并以引物187/96和205/96通过PCR加以融合。用标准的方法纯化得到的PCR产物，以HindⅢ和Bst EⅡ(New EnglandBiolabs(UK)Ltd.,Wilbury,Hitchin,SG4 OTY)消化并克隆入pAF1的HindⅢ-Bst EⅡ区域以产生全长的人B7.1-鼠A5B7 Fd融合。根据WO96/20011，参考实施例5中所述的方法将此Eco RⅠ-HindⅢ片段的融合基因(SEQ ID NOS:130-131)克隆入GS-系统TM表达载体pEE6(Celltech Biologics,Bath Road,Slough,SL14EN)中以产生载体pAB7.1。
然后将含有B7.1-A5B7 Fd表达盒的Bg1Ⅱ-SalⅠ片段克隆入前述pAF6载体的BglⅡ和SalⅠ位点之间以产生能够共表达融合蛋白和A5B7 L链的载体(pAB7.2)。然后将载体pAB7.2用于转化NSO骨髓瘤细胞并筛选出能够在无谷氨酰胺时生长的菌落。用上述的ELISA测定培养上清中CEA结合活性而鉴定出表达融合蛋白的细胞系。筛选出表达适当水平融合蛋白(1D4)的细胞系用AB7融合蛋白的纯化和特征分析。AB7融合蛋白的纯化和特征分析
用蛋白-A琼脂糖基质如发玛西亚生产的蛋白-A Sepharose 4fast flow(Pharmacia Biotech,23 Grosvenor Rd,St Albans,Hert,AL1 3AW)从培养上清中纯化分泌的重组B7.1(35-242)A5B7F(ab′)2,AB7，物质。以2×8基质体积的结合缓冲液(3M NaCl,1.5M甘氨酸，pH8.9)洗基质。含有AB7的培养上清以结合缓冲液1:1稀释。将洗过的基质加入稀释过的培养上清(每40ml稀释的上清1ml固定的基质体积)中并于4℃孵育2小时，同时轻轻振荡。将基质离心且小心倾倒约75％的上清。然后将此基质重悬于剩余的上清中并将得到混合物装柱。洗5-6倍柱床体积的150mM NaCl、10mMNaH2PO4(pH7.4)洗柱。然后将缓冲液换为100mM pH2.8的柠檬酸钠且收集洗脱馏份。通过添加pH8.5的2M Tris缓冲液将这些馏份滴定至约pH7.0。通过非-还原性SDS-PAGE分析洗脱馏份且将峰值AB7馏份保留为产物。N-末端测序
将AB7样品于还原性的SDS-PAGE上电泳并印迹至PCDF(聚偏二氟乙烯)膜(设备、凝胶、印迹膜及方法根据NOVEX,4202 SorrentoValley Blvd，圣地亚哥，CA92121，美国)上。将蛋白带以考马斯蓝染色并对约70kD的条带(即B7.1-Fd融合)进行N-末端测序(应用生物系统，494蛋白测序仪(Perkin Elmer,ABI division,kelvinclose,Birchwood Science Park North,Warrington WA3 7PB)。得到的序列与成熟B7的预期序列(即，SEQ ID NO:131中氨基酸35处切割的前导序列后，Val Ile His Val等)相一致。BIAcore分析
根据Greene JL,Leytze GMEmsutler J,Peach R,Bajorath J,Cosand W，和Linsley PS(1996)生物化学杂志，271,26762-26771中的CD80/CTLA-4相互作用的BIAcore分析方法，用Biacore(23 Grosvenor Rd,St,Albans,Herts.,AL1 3AW，美国)制造的BIAcore胞质基因组表面共振装置(surface plasmon resonanceequipment)分析AB7。将纯化的AB7产品样品注射于CTLA4-Ig胺偶联的表面和空白(对照)胺偶联的表面。CTLA4-Ig表面与对照表面相比可清楚地见到结合(见图3)。当CTLA4-Ig注射于胺偶联的AB7表面时也可见到CTLA4-Ig和AB7之间的结合。
结合抗-CEA ELISA中的数据，这些数据证实了此纯化的AB7融合蛋白具有两种组分，即抗原和受体结合活性的生物学特征。AB7融合蛋白的共-刺激活性
用前述的适当调整后的共刺激分析形式的适当(Jenkins等(1991)免疫学杂志147:2461)测定当结合至表达CEA的肿瘤细胞时AB7融合蛋白对T细胞提供共-刺激信号的能力。在含有0.5％人血清(西格玛AB，西格玛化学公司，Dorset，英国)的RPMI 1640培养基(Gibco，生命技术，Paisley，苏格兰)中于4℃将表达CEA的LS174T结肠-直肠癌细胞(在室温中用0.5％的多聚甲醛混合5分钟)与10μg/ml的AB7融合蛋白振荡孵育2小时。用前将细胞洗2次并用异硫氰酸荧光素(FITC)-交联的羊-抗-鼠Ig(Becton-DickinsonUK Ltd.,Oxford)和流式细胞术(Facscan,Becton-Dickinson)证实融合蛋白的结合。为了使在此分析中使用未引发(unprimed)的人T细胞，通过事先包装96孔板小孔的抗T-细胞受体抗体(抗-CD3抗体，OKT-3 Drthoclinicai Diagnostics,Amersham，英国)提供T细胞受体(TCR)刺激。通过在96孔平底的微滴定板(Costar公司，Cambridge MA，美国)中将纯化的抗体(以2μg/ml存在于pH9.6的于碳酸氢盐包被缓冲液(现成的胶囊，西格玛))于4℃孵育过夜而固定OKT-3，然后以PBS洗板三到四次。纯化的外周血T细胞(用磁珠(Dynabeads,Dynal A.S.,Oslo,Norway)从供体血中负去除尽(即排除非T细胞组分)而得到)以2×105/孔加入到小孔中，每孔中具有50μl含有5％人血清的RPMI 1640培养基。将结合融合蛋白的LS1747细胞以5×104/孔加入到具有50μl含有5％人血清RPMI 1640培养基的小孔中。最后用含5％2血清的RPMI 1640培养基将所有小孔的终体积调至200μl，48小时后将培养物以1.25μCi的[3H]胸腺嘧啶核苷(Amersham International)脉冲标记且16小时后用半自动细胞收获器(Tom Tec收获器(havvester),Wallac英国)收获。用液闪计数(Betaplate Scint和Betaplate计数器，Wallac英国)定量掺入到DNA中的[3H]胸腺嘧啶核苷。典型共刺激分析中的数据显示于下表中。表：共刺激数据
                      α CD3包被的孔@2μg/ml(cpm)仅为T细胞                            3582T细胞+αCD28                         28178T细胞+LS174T                         12303T细胞+LS174T+αCD28                  25759T细胞+LS174T/融合蛋白                41755αD3=抗-CD3抗体；αCD28=抗-CD28抗体
未引发的T-细胞既需要T-细胞受体又需要共刺激信号。在此分析中，T-细胞受体信号由αCD3抗体提供。当单独的αCD3相比，经αCD28(Becton-Dickinson以0.6μg/ml)提供的共刺激刺激[3H]胸腺嘧啶核苷的吸收比前者多8倍。肿瘤细胞的存在对该刺激没有显著的效应。由结合到肿瘤细胞AB7融合蛋白而提供的共刺激信号刺激[3H]胸腺嘧啶核苷的摄入较单独的肿瘤细胞多3倍且较无共刺激时高出11倍。仅由肿瘤细胞提供的明显刺激也许是源自纯化T-细胞种群中残余的辅助细胞。在5个分析中的每一个中在含有结合肿瘤细胞的融合蛋白的小孔中观察到的T细胞增殖的增加与含有T细胞和未结合肿瘤细胞的小孔相同。参考实施例4IgG3-pBSIIKS+的制备
该实施例描述了含有人IgG3重链恒定区和铰链区基因的载体的制备。
用与Jayaraman等(1991)美国自然科学院院报88,4084-4088中所述的类似方法通过PCR制备含有显示于SEQ ID NO:115中序列的基因〔其含有类似于SEQ ID NO:25的序列(残基8至508)，但SEQ ID NO:25中的残基312和501分别变为C和G〕。
该基因被制成2部分，称为IgG3和IgG3B。将它们分别克隆入pBluescript KS+(Stratagene Cloning System)的SacⅠ和XmaⅠ位点以分别得到载体IgG3A-pBSIIKS+克隆A7和IgG3B-pBSIIKS+克隆。制备IgG3A以延伸跨越PmaCⅠ限制位点(SEQ ID NO:115中的位点334-339的CACGTG)。同样地，制备IgG3B从而使该序列的5′末端位于PmaCⅠ限制位点的上游。为了获得所需的IgG3基因序列，将中间的IgG3A和IgG3B载体以AflⅢ和PmaCⅠ切割。通过1％琼脂糖凝胶中的电泳分离和纯化IgG3A-pBSIIKS+克隆A7的载体片段(2823bp)和IgG3B-pBSIIKS+克隆B17的插入片段(666bp)。将片段连接并用此连接混合物转化大肠杆菌DH5α菌株。通过以SacⅠ和XmaⅠ消化分离的DNA以得到520bp片段而鉴定含有所需基因的克隆。插入子的序列通过DNA序列分析加以确证并将克隆号F3命名为IgG3-pBSIIKS+。
                                  序列表(1)一般信息:
(ⅰ)申请人：
  (A)名字：ZENECA LIMIED
  (B)街道：15 STANHOPE GATE
  (C)城市：伦敦
  (E)国家：英国
  (F)邮编：WIY 6LN
  (G)电话：0171 304 5000
  (H)电传：0171 304 5151
  (I)电报：0171 834 2042
(ⅱ)发明题目：
(ⅲ)序列数目：13l
(ⅳ)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：专利发布#1.0,#1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：32个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1GGAAGCTTGA AGATGGATAC AGTTGGTGCA GC                      32(2)SEQ ID NO:2信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：31个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2GGAAGCTTAG ACAGATGGGG GTGTCGTTTT G                       31(2)SEQ ID NO:3信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：34个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3Glu Val Gln Leu Gln Gln ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala1               5                   10              15Ser val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  25              30Tyr Met(2)SEQ ID NO:4信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCA                               24(2)SEQ ID NO:5信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA                               24(2)SEQ ID NO:6信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG                                 22(2)SEQ ID NO:7信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：41个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7ACTAGTGSAA TTCAGTGTGA GGTSCARCTG CAGCARTCWG G            41(2)SEQ ID NO:8信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：357个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACC      60ATAACCTGCA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTTCCAGCA GAAGCCAGGC     120ACTTCTCCCA AACTCTGGAT TTATAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC     180TTCAGTGGCA GTGGATCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCCGAAT GGAGGCTGAA     240GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAAAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGTGCTGGG     300ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT CAAGCTT        357(2)SEQ ID NO:9信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：108氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1               5                   10                  15Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
        20                  25                  30His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
    35                  40                  45Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu65                  70                  75                  80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
            85                  90                  95Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala
        100                 105(2)SEQ ID NO:10信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：360个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10GAGGTGCAGC TGCAGCARTC WGGGGCAGAG CTTGTGAGGT CAGGGGCCTC AGTCAAGTTG     60TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CAACATTAAA GACAACTATA TGCACTGGGT GAAGCAGAGG    120CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GATTGCATGG ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTGAATAT    180GCCCCGAAGT TCCGGGGCAA GGCCACTTTG ACTGCAGACT CATCCTCCAA CACAGCCTAC    240CTGCACCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCGTCT ATTACTGTCA TGTCCTGATC    300TATGCTGGTT ATTTGGCTAT GGACTACTGG GGTCAAGGAA CCTCAGTCGC CGTCTCCTCA    360(2)SEQ ID NO:11信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：120氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala1               5                   10                  15Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  25                  30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO:12信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：39个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12AAGCTTTCCC GCGGGGACAT TGAGCTCACC CAGTCTCCA               39(2)SEQ ID NO:13信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13AAGCTTCTCG AGCTTGGTCC CAGCACCGAA                         30(2)SEQ ID NO:14信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：36个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5AAGCTTGGAA TTCAGTGTGA GGTGCAGCTG CAGCAG                  36(2)SEQ ID NO:15信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：33个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15AAGCTTCGAG CTCACGGCGA CTGAGGTTCC TTG                     33(2)SEQ ID NO:16信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：705个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC        60CGCGGGGACA TTGAGCTCAC CCAGTCTCCA GCAATCATGT CTGCATCTCC AGGGGAGAAG       120GTCACCATAA CCTGCAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTT CCAGCAGAAG       180CCAGGCACTT CTCCCAAACT CTGGATTTAT AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT       240GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG ATCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CCGAATGGAG       300GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAAAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGT       360GCTGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG       420CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC       480TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC       540CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG       600ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG       660GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT                       705(2)SEQ ID NO:17信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：235氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1               5                   10                  15Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
        20                  25                  30Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
    35                  40                  45Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser
50                  55                  60Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65                  70                  75                  80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
            85                  90                  95Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg
        100                 105                 110Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
    115                 120                 125Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130                 135                 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145                 150                 155                 160Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
            165                 170                 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
        180                 185                 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
    195                 200                 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210                 215                 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225                 230                 235(2)SEQ ID NO:18信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：765个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG     60GTGCAGCTGC AGCARTCAGG GGCAGAGCTT GTGAGGTCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC    120TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC AACTATATGC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT    180GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGCATGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TGAATATGCC    240CCGAAGTTCC GGGGCAAGGC CACTTTGACT GCAGACTCAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG    300CACCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTCATGT CCTGATCTAT    360GCTGGTTATT TGGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAACCT CAGTCGCCGT GAGCTCGGCT    420AGCACCAAGG GACCATCGGT CTTCCCCCTG GCCCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC    480ACAGCCGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG    540AACTCAGGCG CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA    600CTCTACTCCC TCAGCAGCGT CGTGACGGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC CCAGACCTAC    660ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGACAGT TGAGCGCAAA    720TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCGGCG CCACCTGTGG CCGGC                    765(2)SEQ ID NO:19信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：255氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly1               5                   10                  15Ile Gln Cys Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu val Arg
        20                  25                  30Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
    35                  40                  45Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50                  55                  60Glu Trp Ile Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala65                  70                  75                  80Pro Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn
            85                  90                  95Thr Ala Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
        100                 105                 110Tyr Tyr Cys His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr
    115                 120                 125Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130                 135                 140Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser145                 150                 155                 160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
            165                     170                 175Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
        180                     185                 190Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
    195                     200                 205Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210                     215                 220Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys225                     230                 235             240Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
                245                 250             255(2)SEQ ID NO:20信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：121氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1               5                   10                  15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
        20                  25                  30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser GLy Ala Leu Thr Ser
    35                  40                  45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65                  70                  75                  80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Asn Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
            85                  90                  95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
        100                 105                 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
    115                 120(2)SEQ ID NO:21信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：369个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG    60GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG   120TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA   180GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACT GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC   240TACATCTGCA ACGTGAATCA CAACCCCAGC AACACCAAGG TCGACAAGAA AGTTGAGCCC   300AAATCTTGTG ACAAGACGCA CACGTGCCCG CCGTGCCCGG CTCCGGAACT GCTGGGTGGC   360CCGTAATAG                                                           369(2)SEQ ID NO:22信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：116氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1               5                   10                  15Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
        20                  25                  30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
    35                  40                  45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr65                  70                  75                  80Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
            85                  90                  95Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
        100                 105                 110Pro Val Ala Gly
    115(2)SEQ ID NO:23信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：348个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:GCTAGCACCA AGGGACCATC GGTCTTCCCC CTGGCCCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG    60AGCACAGCCG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG   120TGGAACTCAG GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA   180GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTCGTGACG GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC   240TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC AGTTGAGCGC   300AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCG GCGCCACCTG TGGCCGGC                348(2)SEQ ID NO:24信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：167氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1               5                   10                  15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
        20                  25                  30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
    35                  40                  45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65                  70                  75                  80Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
            85                  90                  95Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
        100                 105                 110Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
    115                 120                 125Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130                 135                 140Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro145                 150                 155                 160Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
            165(2)SEQ ID NO:25信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：501个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:GCTAGCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCTGGG    60GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG   120TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA   180GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC   240TACACCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAG AGTGGAGCTG   300AAAACCCCAC TTGGTGACAC AACTCACACG TGCCCTAGGT GTCCTGAACC TAAATCTTGT   360GACACACCTC CCCCGTGCCC ACGGTGCCCA GAGCCCAAAT CTTGCGACAC GCCCCCACCG   420TGTCCCAGAT GTCCTGAACC AAAGAGCTGT GACACTCCAC CGCCCTGCCC GAGGTGCCCA   480GCACCTGAAC TCCTGGGAGG A                                             501(2)SEQ ID NO:26信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：10氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
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(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：7氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser1               5(2)SEQ ID NO:28信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：9氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28:Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr1               5(2)SEQ ID NO:29信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：5氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29:Asp Asn Tyr Met His1               5(2)SEQ ID NO:30信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：9氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:30:Phe Asn Ile Lys Asp Asn Tyr Met His1               5(2)SEQ ID NO:31信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：17氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31:Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Arg1               5                   10                  15Gly(2)SEQ ID NO:32信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：11氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr1               5                   10(2)SEQ ID NO:33信息:
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：13氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:33:His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr1               5                   10(2)SEQ ID NO:34信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：60个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:34:TCGAGAGATC TAAGCTTCCG CGGGAATTCC TCGAGGAGCT CCCCGGGGGA TCCGTCGACT   60(2)SEQ ID NO:35信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：60个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:35CTAGAGTCGA CGGATCCCCC GGGGAGCTCC TCGAGGAATT CCCGCGGAAG CTTAGATCTC   60(2)SEQ ID NO:36信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：29个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:36:AAGCTTCCCG GGTATTAAAG CAGAACTTG                                     29(2)SEQ ID NO:37信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：29个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:37:ACTAGTGGAT CCCAGACATG ATAAGATAC                          29(2)SEQ ID NO:38信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：39个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:38GGTCTATATA AGCAGAGCTG TCTGGCTAAC TAGAGAACC               39(2)SEQ ID NO:39信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：39个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:39GGTTCTCTAG TTAGCCAGAC AGCTCTGCTT ATATAGACC               39(2)SEQ ID NO:40信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：19个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:40GGACTTTCCT ACTTGGCAG                                                  19(2)SEQ ID NO:41信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:41:GGCAACTAGA AGGCACAGTC                                                 20(2)SEQ ID NO:42信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：77个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:42:AGCTTGCCGC CACCATGGAT TTTCAAGTGC AGATTTTCAG CTTCCTGCTA ATCAGTGCTT     60CAGTCATAAT GTCCCGC                                                    77(2)SEQ ID NO:43信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：71个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:43:GGGACATTAT GACTGAAGCA CTGATTAGCA GGAAGCTGAA AATCTGCACT TGAAAATCCA   60TGGTGGCGGC A                                                        71(2)SEQ ID NO:44信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：61个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:44:AGCTTGCCGC CACCATGAAG TTGTGGCTGA ACTGGATTTT CCTTGTAACA CTTTTAAATG   60G                                                                   61(2)SEQ ID NO:45信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：61个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:45:AATTCCATTT AAAAGTGTTA CAAGGAAAAT CCAGTTCAGC CACAACTTCA TGGTGGCGGC   60A                                                                   61(2)SEQ ID NO:46信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：357个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:46:AAGCTTCTCG AGATCAAACG GACTGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT CCCGCCATCT      60GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC     120AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG     180AGTGTCACAG AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG     240AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG     300AGTTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT AATAGCCCGG GACTAGT        357(2)SEQ ID NO:47信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：381个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:47:GGAAGCTTGA GCTCGGCTAG CACCAAGGGA CCATCGGTCT TCCCCCTGGC CCCCTGCTCC      60AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA     120CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT     180GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTCG TGACGGTGCC CTCCAGCAAC     240TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC     300AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT GCCCGGCGCC ACCTGTGGCC    360GGCTAATAGC CCGGGACTAG T                                              381(2)SEQ ID NO:48信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：342个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:48:AAGCTTTCCC GCGGCGACAT CCAGATGACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCTAGCGTG            60GGTGACAGAG TGACCATCAC GTGTAGTGCC AGCTCAAGTG TAACTTACAT GCACTGGTAC           120CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC TCCAAAGCTG CTGATCTACA GCACATCCAA CCTGGCTTCT           180GGTGTGCCAA GCAGATTCTC CGGAAGCGGT AGCGGCACCG ACTACACCTT CACCATCAGC           240AGCCTCCAGC CAGAGGATAT CGCCACCTAC TACTGCCAGC AGAGGAGTAC TTACCCGCTC           300ACGTTCGGCC AAGGGACCAA GCTCGAGATC AAACGGACTA GT                              342(2)SEQ ID NO:49信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：321个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:49:GACATCCAGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC     60ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT    120AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA    180TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG    240GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG    300ACCAAGCTCG AGATCAAACG G                                              321(2)SEQ ID NO:50信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：107氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:50:Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1               5                   10                  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
        20                  25                  30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lya Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
    35                  40                  45Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65                  70                  75                  80Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
            85                  90                  95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        100                 105(2)SEQ ID NO:51信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：705个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:51:ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC        60CGCGGCGACA TCCAGATGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA       120GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG       180CCAGGTAAGG CTCCAAAGCT GCTGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA       240AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG       300CCAGAGGATA TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC       360CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG       420CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC       480TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC       540CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG       600ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG       660GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT                       705(2)SEQ ID NO:52信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：235氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:52:Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1                   5               10                  15val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
            20              25                  30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
        35              40                  45Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
    50              55                  60Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65                  70                  75                  80Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile
            85                  90                  95Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg
        100                 105                 110Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
    115                 120                 125Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130                 135                 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145                 150                 155                 160Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
            165                 170                 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
        180                 185                 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
    195                 200                 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210                 215                 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225                 230                 235(2)SEQ ID NO:53信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：385个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:53:GAAGCTTGGA ATTCAGTGTG AGGTGCAGCT GCAGCAGAGC GGTCCAGGTC TCGTACGGCC     60TAGCCAGACC CTGAGCCTCA CGTGCACCGC ATCTGGCTTC AACATTAAGG ACAATTACAT    120GCACTGGGTG AGACAGCCAC CTGGACGAGG CCTTGAGTGG ATTGGATGGA TTGACCCTGA    180GAATGGTGAC ACTGAGTACG CACCTAAGTT TCGCGGCCGC GTGACAATGC TGGCAGACAC    240TAGTAAGAAC CAGTTCAGCC TGAGACTCAG CAGCGTGACA GCCGCCGACA CCGCGGTCTA    300TTATTGTCAC GTCCTGATAT ACGCCGGGTA TCTGGCAATG GACTACTGGG GCCAAGGGAC    360CCTCGTCACC GTGAGCTCGA CTAGT                                          385(2)SEQ ID NO:54信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：360个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:54:GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC     60ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA    120CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC    180GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC    240CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA    300TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG    360(2)SEQ ID NO:55信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：120氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:55:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1               5                   10                  15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  25                  30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Ash Gln Phe Ser65                  70                  75                  80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO:56信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：765个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:56:ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG      60GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG     120TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT     180GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA     240CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG     300AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC     360GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT    420AGCACCAAGG GACCATCGGT CTTCCCCCTG GCCCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC    480ACAGCCGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG    540AACTCAGGCG CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA    600CTCTACTCCC TCAGCAGCGT CGTGACGGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC CCAGACCTAC    660ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGACAGT TGAGCGCAAA    720TGTT3TGTCG AGTGCCCACC GTGCCCGGCG CCACCTGTGG CCGGC                    765(2)SEQ ID NO:57信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：255氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:57:Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly1               5                   10                  15Ile Gln Cys Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg
        20                  25                  30Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
    35                  40                  45Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu
50                  55                  60Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala65                  70                  7S                  80Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn
            85                  90                  95Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
        100                 105                 110Tyr Tyr Cys His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr
    115                 120                 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130                 135                 140Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser145                 150                 155                 160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
            165                 170                 175Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
        180                 185                 190Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
    195                 200                 205Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210                 215                 220Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys225                 230                 235                 240Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
            245                 250                 255(2)SEQ ID NO:58信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：40个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:58:GGCGACATCC AGCTGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG                                40(2)SEQID NO:59信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：46个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:59:CTAGCGCTCA GGCTGCTTGG GCTCTGGGTC AGCTGGATGT CGCCGC                          46(2)SEQ ID NO:60信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：321个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:60:GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC     60ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT    120AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA    180TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG    240GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG    300ACCAAGCTCG AGATCAAACG G                                              321(2)SEQ ID NO:61信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：107氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:61Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1               5                   10                  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
        20                  25                  30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
    35                  40                  45Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65                  70                  75                  80Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
            85                  90                  95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        100                 105(2)SEQ ID NO:62信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：40个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:62:GGCCAGATCG TGCTGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG                                  40(2)SEQ ID NO:63信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：46个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:63:CTAGCGCTCA GGCTGCTTGG GCTCTGGGTC AGCACGATCT GGCCGC                           46(2)SEQ ID NO:64信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：321个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:64:CAGATCGTGC TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC    60ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT   120AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA   180TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG   240GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG   300ACCAAGCTCG AGATCAAACG G                                             321(2)SEQ ID NO:65信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：107氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:65:Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1               5                   10                  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
        20                  25                  30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
    35                  40                  45Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65                  70                  75                  80Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
            85                  90                  95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        100                 105(2)SEQ ID NO:66信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:66:CGTATTAGTC ATCGCTATTA CC                                 22(2)SEQ ID NO:67信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：39个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:67GTTGGATGTG CTGTAGATCC ACAGCTTTGG AGCCTTACC               39(2)SEQ ID NO:68信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:68:TCCGTTTGAT CTCGAGCTTG G                                  21(2)SEQ ID NO:69信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：39个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:69:GGTAAGGCTC CAAAGCTGTG GATCTACAGC ACATCCAAC               39(2)SEQ ID NO:70信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：321个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:70:GACATCCAGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC    60ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT   120AAGGCTCCAA AGCTGTGGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA   180TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG   240GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG   300ACCAAGCTCG AGATCAAACG G                                             321(2)SEQ ID NO:71信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：107氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:71:Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1               5                   10                  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
        20                  25                  30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
    35                  40                  45Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65                  70                  75                  80Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
            85                  90                  95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        100                 105(2)SEQ ID NO:72信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：64个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:72:CCTTGAGTGG ATTGCATGGA TTGACCCTGA GAATGGTGAC ACTGAGTACG CACCTAAGTT     60TCGC                                                                  64(2)SEQ ID NO:73信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：68个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:73GGCCGCGAAA CTTAGGTGCG TACTCAGTGT CACCATTCTC AGGGTCAATC CATGCAATCC     60ACTCAAGG                                                              68(2)SEQ ID NO:74信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：360个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:74:GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC    60ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA   120CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGCATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC   180GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC   240CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA   300TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG   360(2)SEQ ID NO:75信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：120氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:75:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1               5                   10                  15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  25                  30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser65                  70                  75                  80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO:76信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：80个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:76:GGCCGCGTGA CAATGCTGGC AGACTCAAGT AAGAACCAGG CCAGCCTGAG ACTCAGCAGC  60GTGACAGCCG CCGACACCGC                                              80(2)SEQ ID NO:77信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：74个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:77:GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT CAGGCTGGCC TGGTTCTTAC TTGAGTCTGC   60CAGCATTGTC ACGC                                                     74(2)SEQ ID NO:78信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：360个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:78GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC   60ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA  120CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC  180GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC  240CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA  300TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG  360(2)SEQ ID NO:79信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：120氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:79:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1               5                   10                  15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  25                  30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gln Ala Ser65                  70                  75                  80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95Mis Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO:80信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：360个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:80GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC    60ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA   120CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGCATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC   180GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC   240CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA   300TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG   360(2)SEQ ID NO:81信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：120氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:81Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1               5                   10                  15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  25                  30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gln Ala Ser65                  70                  75                  80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO:82信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：80个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:82:GGCCGCGCCA CAATGCTGGC AGACACTAGT AAGAACCAGT TCAGCCTGAG ACTCAGCAGC  60GTGACAGCCG CCGACACCGC                                              80(2)SEQ ID NO:83信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：74个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:83:GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT CAGGCTGAAC TGGTTCTTAC TAGTGTCTGC  60CAGCATTGTG GCGC                                                    74(2)SEQ ID NO:84信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：360个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:84:GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC      60ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA     120CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC     180GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGCCACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC     240CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA     300TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG     360(2)SEQ ID NO:85信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：120氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:85:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1               5                   10                  15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  25                  30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser65                  70                  75                  80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO:86信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：80个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:86:GGCCGCGCCA CAATGCTGGC AGACTCAAGT AAGAACCAGG CCAGCCTGAG ACTCAGCAGC  60GTGACAGCCG CCGACACCGC                                              80(2)SEQ ID NO:87信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：74个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:87:GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT CAGGCTGGCC TGGTTCTTAC TTGAGTCTGC  60CAGCATTGTG GCGC                                                    74(2)SEQ ID NO:88信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：360个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:88:GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC     60ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA    120CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC    180GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGCCACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC    240CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA    300TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG    360(2)SEQ ID NO:89信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：120氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:89:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1               5                   10                  15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  15                  30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gln Ala Ser65                  70                  75                  80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO:90信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：360个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:90GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC     60ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA    120CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGCATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC    180GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGCCACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC    240CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA    300TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG    360(2)SEQ ID NO:91信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：120氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:91:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln1               5                   10                  15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
        20                  25                  30Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gln Ala Ser65                  70                  75                  80Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
        100                 105                 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
   115                  120(2)SEQ ID NO:92信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：780个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:92:ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG     60GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG    120TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT    180GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA    240CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG    300AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC    360GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCC    420TCCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCACCCTCCT CCAAGAGCAC CTCTGGGGGC    480ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG    540AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA    600CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACTGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC    660ATCTGCAACG TGAATCACAA CCCCAGCAAC ACCAAGGTCG ACAAGAAAGT TGAGCCCAAA    720TCTTGTGACA AGACGCACAC GTGCCCGCCG TGCCCGGCTC CGGAACTGCT GGGTGGCCCG    780(2)SEQ ID NO:93信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：260氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:93:Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly1               5                  10                   15Ile Gln Cys Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg
        20                  25                  30Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
    35                  40                  45Lys Asp Asn Tyr Met Mis Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu
50                  55                  60Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala65                  70                  75                  80Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn
            85                  90                  95Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
        100                 105                 110Tyr Tyr Cys His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr
    115                 120                 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130                 135                 140Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145                 150                155                  160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
            165                 170                 175Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
        180                 185                 190Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
    195                 200                 205Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210                 215                 220Asn His Asn Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys225                 230                 235                 240Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
            245                 250                 255Leu Gly Gly Pro
        260(2)SEQ ID NO:94信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：918个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:94:ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG   60GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG  120TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT  180GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA  240CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG  300AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC  368GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT  420AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCTGGGGGC  480ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG  540AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA   600CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC   660ACCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT GGAGCTGAAA   720ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC CCTAGGTGTC CTGAACCTAA ATCTTGTGAC   780ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG CCCAAATCTT GCGACACGCC CCCACCGTGT   840CCCAGATGTC CTGAACCAAA GAGCTGTGAC ACTCCACCGC CCTGCCCGAG GTGCCCAGCA   900CCTGAACTCC TGGGAGGG                                                 918(2)SEQ ID NO:95信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：306氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:95Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly1               5                   10                  15Ile Gln Cys Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg
        20                  25                  30Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
    35                  40                  45Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu
50                  55                  60Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala65                  70                  75                  80Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn
            85                  90                  95Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
        100                 105                 110Tyr Tyr Cys His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr
    115                 120                 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130                 135                 140Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly145                 150                 155                 160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
            165                 170                 175Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
        180                 185                 190Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
    195                 200                 205Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210                 215                 220Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys225                 230                 235                 240Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
            245                 250                 255Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys
        260                 265                 270Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser
    275                 280                 285Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
290                 295                 300Gly Gly305(2)SEQ ID NO:96信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：705个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:96:ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC      60CGCGGCCAGA TCGTGCTGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA     120GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG     180CCAGGTAAGG CTCCAAAGCT GCTGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA     240AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG     300CCAGAGGATA TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC     360CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG     420CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC     480TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC     540CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG     600ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG     660GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT                     705(2)SEQ ID NO:97信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：235氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:97:Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1               5                   10                  15Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser
        20                  25                  30Leu Ser Ala Ser val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
    35                  40                  45Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50                  55                  60Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65                  70                  75                  80Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile
            85                  90                  95Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg
        100                 105                 110Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
    115                 120                 125Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130                 135                 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145                 150                 155                 160Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
            165                 170                 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
        180                 185                 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
    195                 200                 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210                 215                 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225                 230                 235(2)SEQ ID NO:98信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：705个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:98:ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC      60CGCGGCGACA TCCAGATGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA     120GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG     180CCAGGTAAGG CTCCAAAGCT GTGGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA     240AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG     300CCAGAGGATA TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC     360CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG    420CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC    480TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC    540CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG    600ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG    660GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT                    705(2)SEQ ID NO:99信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：235氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:99:Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1               5                   10                  15Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
        20                  25                  30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
    35                  40                  45Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50                  55                  60Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65                  70                  75                  80Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile
            85                  90                  95Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
            165                 170                 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
        180                 185                 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
    195                 200                 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210                 215                 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225                 230                 235Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg
        100                 105                 110Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
    115                 120                 125Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130                 135                 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145                 150                 155                 160(2)SEQ ID NO:100信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：54个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:100CCCAGCACCT CAACTCCTGG GAGGAGCAAC AGGACACAGT TATGAGAAGT ACAA        54(2)SEQ ID NO:101信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：50个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:101:GGGGGTCTAG ATTATTAGTA CAGGTGTTCC AGGACGTAGC TGGCAACATA         50(2)SEQ ID NO:102信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：46个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:102:GGGGGAGCTC GGCTAGCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGC             46(2)SEQ ID NO:103信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：55个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:103:TTGTACTTCT CATAACTGTG TCCTGTTGCT CCTCCCAGGA CTTCAGGTGC TGGC    55(2)SEQ ID NO:104信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:104GCCTGTGCTC AATATTGATG G                                  21(2)SEQ ID NO:105信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:105:GGAGAAAGCC ATATCTGCCT G                                  21(2)SEQ ID NO:106信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:106:TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC                         30(2)SEQ ID NO:107信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：23个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:107:GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT                                23(2)SEQ ID NO:108信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:108CACAACAGAG GCAGTTCC                                      18(2)SEQ ID NO:109信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
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(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：19个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:110GGACCTGCTG CAGAGTCTG                                     19(2)SEQ ID NO:111信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：47个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:111:GGCTGCAGGA ATTCTTATTA TAGACGAACC CGGCTATCAA ACTGAGC                    47(2)SEQ ID NO:112信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1870个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:112:AAGCTTGCCG CCACCATGAA GTTGTGGCTG AACTGGATTT TCCTTGTAAC ACTTTTAAAT      60GGAATTCAGT GTGAGGTGCA GCTGCAGCAG AGCGGTCCAG GTCTCGTACG GCCTAGCCAG     120ACCCTGAGCC TCACGTGCAC CGCATCTGGC TTCAACATTA AGGACAATTA CATGCACTGG     180GTGAGACAGC CACCTGGACG AGGCCTTGAG TGGATTGGAT GGATTGACCC TGAGAATGGT     240GACACTGAGT ACGCACCTAA GTTTCGCGGC CGCGTGACAA TGCTGGCAGA CACTAGTAAG     300AACCAGTTCA GCCTGAGACT CAGCAGCGTG ACAGCCGCCG ACACCGCGGT CTATTATTGT     360CACGTCCTGA TATACGCCGG GTATCTGGCA ATGGACTACT GGGGCCAAGG GACCCTCGTC     420ACCGTGAGCT CGGCTAGCAC CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG     480AGCACCTCTG GGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG     540GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC     600CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG      660GGCACCCAGA CCTACACCTG CAACGTGAAT CACAAGCCCA GCAACACCAA GGTGGACAAG      720AGAGTGGAGC TGAAAACCCC ACTCGGTGAC ACAACTCACA CGTGCCCTAG GTGTCCTGAA      780CCTAAATCTT GTGACACACC TCCCCCGTGC CCACGGTGCC CAGAGCCCAA ATCTTGCGAC      840ACGCCCCCAC CGTGTCCCAG ATGTCCTGAA CCAAAGAGCT GTGACACTCC ACCGCCCTGC      900CCGAGGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGA GGAGCAACAG GACACAGTTA TGAGAAGTAC      960AACAAGTGGG AAACGATAGA GGCTTGGACT CAACAAGTCG CCACTGAGAA TCCAGCCCTC     1020ATCTCTCGCA GTGTTATCGG AACCACATTT GAGGGACGCG CTATTTACCT CCTGAAGGTT     1080GGCAAAGCTG GACAAAATAA GCCTGCCATT TTCATGGACT GTGGTTTCCA TGCCAGAGAG     1140TGGATTTCTC CTGCATTCTG CCAGTGGTTT GTAAGAGAGG CTGTTCGTAC CTATGGACGT     1200GAGATCCAAG TGACAGAGCT TCTCGACAAG TTAGACTTTT ATGTCCTGCC TGTGCTCAAT     1260ATTGATGGCT ACATCTACAC CTGGACCAAG AGCCGATTTT GGAGAAAGAC TCGCTCCACC     1320CATACTGGAT CTAGCTGCAT TGGCACAGAC CCCAACAGAA ATTTTGATGC TGGTTGGTGT     1380GAAATTGGAG CCTCTCGAAA CCCCTGTGAT GAAACTTACT GTGGACCTGC CGCAGAGTCT     1440GAAAAGGAGA CCAAGGCCCT GGCTGATTTC ATCCGCAACA AACTCTCTTC CATCAAGGCA     1500TATCTGACAA TCCACTCGTA CTCCCAAATG ATGATCTACC CTTACTCATA TGCTTACAAA     1560CTCGGTGAGA ACAATGCTGA GTTGAATGCC CTGGCTAAAG CTACTGTGAA AGAACTTGCC     1620TCACTGCACG GCACCAAGTA CACATATGGC CCGGGAGCTA CAACAATCTA TCCTTCTGCT     1680GGGACTTCTA AAGACTGGGC TTATGACCAA GGAATCAGAT ATTCCTTCAC CTTTGAACTT     1740CGAGATACAG GCAGATATGG CTTTCTCCTT CCAGAATCCC AGATCCGGGC TACCTGCGAG   1800GAGACCTTCC TGGCAATCAA GTATGTTGCC AGCTACGTCC TGGAACACCT GTACTAATAA   1860TCTAGAGAGA                                                          1870(2)SEQ ID NO:113信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：613氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:113:Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly1               5                   10                  15Ile Gln Cys Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg
        20                  25                  30Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
    35                  40                  45Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu
50                  55                  60Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala65                  70                  75                  80Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn
            85                  90                  95Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
        100                 105                 110Tyr Tyr Cys His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr
    115                 120                 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130                 135                 140Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly145                 150                 155                 160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
            165                 170                 175Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
        180                 185                 190Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
    195                 200                 205Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210                 215                 220Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys225                 230                 235                 240Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
            245                 250                 255Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys
        260                 265                 270Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser
    275                 280                 285Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
290                 295                 300Gly Gly Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn Lys Trp Glu Thr305                 310                 315                 320Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn Pro Ala Leu Ile
            325                 330                 335Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Ala Ile Tyr Leu
        340                 345                 350Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala Ile Phe Met Asp
    355                 360                 365Cys Gly Phe His Ala Ar9 Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp
370                 375                 380Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu Ile Gln Val Thr385                 390                 395                 400Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Leu Asn Ile
            405                 410                 415Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe Trp Arg Lys Thr
        420                 425                 430Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr Asp Pro Asn Arg
    435                 440                 445Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser Arg Asn Pro Cys
450                 455                 460Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys465                 470                 475                 480Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser Ile Lys Ala Tyr
            485                 490                 495Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr Pro Tyr Ser Tyr
        500                 505                 510Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn Ala Leu Ala Lys
    515                 520                 525Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr
530                 535                 540Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ser Ala Gly Thr Ser Lys Asp545                 550                 555                 560Trp Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg
            565                 570                 575Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Ala
        580                 585                 590Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val Ala Ser Tyr Val
    595                 600                 605Leu Glu His Leu Tyr
610(2)SEQ ID NO:114信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：96氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:114:His His Gly Gly Glu His Phe Glu Gly Glu Lys Val Phe Arg Val Asn1               5                   10                  15Val Glu Asp Glu Asn His Ile Asn Ile Ile Arg Glu Leu Ala Ser Thr
        20                  25                  30Thr Gln Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Val Thr Gln Ile Lys Pro
    35                  40                  45His Ser Thr Val Asp Phe Arg Val Lys Ala Glu Asp Thr Val Thr Val
50                  55                  60Glu Asn Val Leu Lys Gln Asn Glu Leu Gln Tyr Lys Val Leu Ile Ser65                  70                  75                  80Asn Leu Arg Asn Val Val Glu Ala Gln Phe Asp Ser Arg Val Arg Leu
            85                  90                  95(2)SEQ ID NO:115信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：520个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:115:GAGCTCGGCT AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC   60CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC  120GGTGTCGTGG AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA  180GTCCTCAGGA CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC  240CCAGACCTAC ACCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT  300GGAGCTGAAA ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC CCTAGGTGTC CTGAACCTAA  360ATCTTGTGAC ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG CCCAAATCTT GCGACACGCC  420CCCACCGTGT CCCAGATGTC CTGAACCAAA GAGCTGTGAC ACTCCACCGC CCTGCCCGAG  480GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGAGGGTA ATAGCCCGGG                        520(2)SEQ ID NO:116信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：31个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:116:GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC G                                 31(2)SEQ ID NO:117信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：23个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:117:GCAGCAGGAT AGATTGTTGT AGC                                          23(2)SEQ ID NO:118信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：88个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:118CCGGAATTCT TATTAGTTCA GGTCCTCCTC AGAGATCAGC TTCTGCTCCT CGAACTCATG  60GTGGTGATGG TGGTGGTACA GGTGTTCC                                     88(2)SEQ ID NO:119信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:119:CAATCTATCC TGCTGCTGGG ACTTCTAAAG                         30(2)SEQ ID NO:120信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:120:GATTGTTGTA GCTCCCGGGC                                    20(2)SEQ ID NO:121信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:121GGAGCTACAA CAATCTATCC TTCTGCTGGG                         30(2)SEQ ID NO:122信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:122:ACGGCACCAA GTACACATAT GG                                 22(2)SEQ ID NO:123信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：90个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:123ACGAGAATTC GACCGCTCTG CTGCAGCTGC ACCTCGGAAC CGCCACCGCT GCCACCGCCA   60GAACCGCCAC CGTACAGGTG TTCCAGGACG                                    90(2)SEQ ID NO:124信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：2154个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:124ATGTTGGCAC TCTTGGTTCT GGTGACTGTG GCCCTGGCAT CTGCTCATCA TGGTGGTGAG   60CACTTTGAAG GCGAGAAGGT GTTCCGTGTT AACGTTGAAG ATGAAAATCA CATTAACATA  120ATCCGCGAGT TGGCCAGCAC GACCCAGATT GACTTCTGGA AGCCAGATTC TGTCACACAA  180ATCAAACCTC ACAGTACAGT TGACTTCCGT GTTAAAGCAG AAGATACTGT CACTGTGGAG  240AATGTTCTAA AGCAGAATGA ACTACAATAC AAGGTACTGA TAAGCAACCT GAGAAATGTG  300GTGGAGGCTC AGTTTGATAG CCGGGTTCGT GCAACAGGAC ACAGTTATGA GAAGTACAAC  360AAGTGGGAAA CGATAGAGGC TTGGACTCAA CAAGTCGCCA CTGAGAATCC AGCCCTCATC  420TCTCGCAGTG TTATCGGAAC CACATTTGAG GGACGCGCTA TTTACCTCCT GAAGGTTGGC  480AAAGCTGGAC AAAATAAGCC TGCCATTTTC ATGGACTGTG GTTTCCATGC CAGAGACTGG  540ATTTCTCCTG CATTCTGCCA GTGGTTTGTA AGAGAGGCTG TTCGTACCTA TGGACGTGAG   600ATCCAAGTGA CAGAGCTTCT CGACAAGTTA GACTTTTATG TCCTGCCTGT GCTCAATATT   660GATGGCTACA TCTACACCTG GACCAAGAGC CGATTTTGGA GAAAGACTCG CTCCACCCAT   720ACTGGATCTA GCTGCATTGG CACAGACCCC AACAGAAATT TTGATGCTGG TTGGTGTGAA   780ATTGGAGCCT CTCGAAACCC CTGTGATGAA ACTTACTGTG GACCTGCCGC AGAGTCTGAA   840AAGGAGACCA AGGCCCTGGC TGATTTCATC CGCAACAAAC TCTCTTCCAT CAAGGCATAT   900CTGACAATCC ACTCGTACTC CCAAATGATG ATCTACCCTT ACTCATATGC TTACAAACTC   960GGTGAGAACA ATGCTGAGTT GAATGCCCTG GCTAAAGCTA CTGTGAAAGA ACTTGCCTCA  1020CTGCACGGCA CCAAGTACAC ATATGGCCCG GGAGCTACAA CAATCTATCC TTCTGCTGGG  1080ACTTCTAAAG ACTGGGCTTA TGACCAAGGA ATCAGATATT CCTTCACCTT TGAACTTCGA  1140GATACAGGCA GATATGGCTT TCTCCTTCCA GAATCCCAGA TCCGGGCTAC CTGCGAGGAG  1200ACCTTCCTGG CAATCAAGTA TGTTGCCAGC TACGTCCTGG AACACCTGTA CGGTGGCGGT  1260TCTGGCGGTG GCAGCGGTGG CGGTTCCGAG GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC  1320GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC  1380AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT  1440GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG  1500GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC  1560GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC  1620CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG  1680GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC  1740TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC  1800ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG  1860CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC ACCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC  1920ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT GGAGCTGAAA ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC  1980CCTAGGTGTC CTGAACCTAA ATCTTGTGAC ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG  2040CCCAAATCTT GCGACACGCC CCCACCGTGT CCCAGATGTC CTGAACCAAA GAGCTGTGAC  2100ACTCCACCGC CCTGCCCGAG GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGAGGGTA ATAG        2154(2)SEQ ID NO:125信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：716氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:125:Met Leu Ala Leu Leu Val Leu Val Thr Val Ala Leu Ala Ser Ala His1               5                   10                  15His Gly Gly Glu His Phe Glu Gly Glu Lys Val Phe Arg Val Asn Val
        20                  25                  30Glu Asp Glu Asn His Ile Asn Ile Ile Arg Glu Leu Ala Ser Thr Thr
    35                  40                  45Gln Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Val Thr Gln Ile Lys Pro His
50                  55                  60Ser Thr Val Asp Phe Arg Val Lys Ala Glu Asp Thr Val Thr Val Glu65                  70                  75                  80Asn Val Leu Lys Gln Asn Glu Leu Gln Tyr Lys Val Leu Ile Ser Asn
            85                  90                  95Leu Arg Asn Val Val Glu Ala Gln Phe Asp Ser Arg Val Arg Ala Thr
        100                 105                 110Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp
    115                 120                 125Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val
130                 135                 140Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly145                 150                 155                 160Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His
            165                 170                 175Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu
        180                 185                 190Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp
    195                 200                 205Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile
210                 215                 220Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His225                 230                 235                 240Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala
            245                 250                 255Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr
        260                 265                 270Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp
    275                 280                 285Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His
290                 295                 300Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu305                 310                 315                 320Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys
            325                 330                 335Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala
        340                 345                 350Thr Thr Ile Tyr Pro Ser Ala Gly Thr Ser Lys Asp Trp Ala Tyr Asp
    355                 360                 365Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg
370                 375                 380Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu385                 390                 395                 400Thr Phe Leu Ala Ile Lys TyT Val Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu
            405                 410                 415Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
        420                 425                 430Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser
    435                 440                 445Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn Tyr Met His
450                 455                 460Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile465                 470                 475                 480Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Arg Gly Arg
            485                 490                 495Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu
        500                 505                 510Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Leu
    515                 520                 525Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
530                 535                 540Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu545                 550                 555                 560Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
            565                 570                 575Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
        580                 585                 590Gly Ala Leu Thr Ser gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
    595                 600                 605Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
610                 615                 620Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn625                 630                 635                 640Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr
            645                 650                 655Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro
        660                 665                 670Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro
    675                 680                 685Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro
690                 695                 700Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly705                 710                 715(2)SEQ ID NO:126信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：42个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:126:TATATAAAGC TTGCCGCCAC CATGGGCCAC ACACGGAGGC AG           42(2)SEQ ID NO:127信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：45个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:127:ACTCCACCAG CTTCACCTCG TTATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGG        45(2)SEQ ID NO:128信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：45个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(xⅰ)序列描述：SEQ ID NO:128:AGAGCATTTT CCTGATAACG AGGTGAAGCT GGTGGAGTCT GGAGG                  45(2)SEQ ID NO:129信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：40个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(xⅰ)序列描述：SEQ ID NO:129:CCAGGCATCC CAGGGTCACC ATGGAGTTAG TTTGGGCAGC                        40(2)SEQ ID NO:130信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1446个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(ⅸ)
  (A)名称/关键词：COS
  (B)位点：16..1435
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:130AAGCTTGCCG CCACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG GGA ACA TCA CCA TCC   51
             Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser
               1               5                  10AAG TGT CCA TAC CTC AAT TTC TTT CAG CTC TTG GTG CTG GCT GGT CTT        99Lys Cys Pro Tyr Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu
     15                  20                  25TCT CAC TTC TGT TCA GGT GTT ATC CAC GTG ACC AAG GAA GTG AAA GAA       147Ser His Phe Cys Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu
 30                  35                  40GTG GCA ACG CTG TCC TGT GGT CAC AAT GTT TCT GTT GAA GAG CTG GCA       195Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala45                  50                  55                  60CAA ACT CGC ATC TAC TGG CAA AAG GAG AAG AAA ATG GTG CTG ACT ATG       243Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met
             65                  70                  75ATG TCT GGG GAC ATG AAT ATA TGG CCC GAG TAC AAG AAC CGG ACC ATC       291Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile
         80                  85                  90TTT GAT ATC ACT AAT AAC CTC TCC ATT GTG ATC CTG GCT CTG CGC CCA       339Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro
     95                 100                 105TCT GAC GAG GGC ACA TAC GAG TGT GTT GTT CTG AAG TAT GAA AAA GAC       387Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp
110                 115                 120GCT TTC AAG CGG GAA CAC CTG GCT GAA GTG ACG TTA TCA GTC AAA GCT       435Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala125                 130                 135                 140GAC TTC CCT ACA CCT AGT ATA TCT GAC TTT GAA ATT CCA ACT TCT AAT       483Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Sar Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn
            145                 150                 155ATT AGA AGG ATA ATT TGC TCA ACC TCT GGA GGT TTT CCA GAG CCT CAC       531Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His
        160                 165                 170CTC TCC TGG TTG GAA AAT GGA GAA GAA TTA AAT GCC ATC AAC ACA ACA      579Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr
    175                 180                 185GTT TCC CAA GAT CCT GAA ACT GAG CTC TAT GCT GTT AGC AGC AAA CTG      627Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu
190                 195                 200GAT TTC AAT ATG ACA ACC AAC CAC AGC TTC ATG TGT CTC ATC AAG TAT      675Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr205                 210                 215                 220GGA CAT TTA AGA GTG AAT CAG ACC TTC AAC TGG AAT ACA ACC AAG CAA      723Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln
            225                 230                 235GAG CAT TTT CCT GAT AAC GAG GTG AAG CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC      771Glu His Phe Pro Asp Asn Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
        240                 245                 250TTG GTA CAG CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG      819Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly
    255                 260                 265TTC ACC TTC ACT GAT TAC TAC ATG AAC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA      867Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly
270                 275                 280AAG GCA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT GGA AAC AAA GCT AAT GGT TAC      915Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr285                 290                 295                 300ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA      963Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
            305                 310                 315GAC AAA TCC CAA AGC ATC CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCT    1011Asp Lys Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala
        320                 325                 330GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT ACA AGA GAT AGG GGG CTA CGG TTC    1059Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe
    335                 340                 345TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCC    1107Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala
350                 355                 360AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT GCT GCC    1155Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala365                 370                 375                380CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC AAG GGC TAT TTC    1203Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
            385                 390                 395CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCT CTG TCC AGC GGT    1251Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly
        400                 405                 410GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GACCTC TAC ACT CTG AGC     1299Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser
    415                 420                 425AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC GAG ACC GTC ACC    1347Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr
430                 435                 440TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG GAC AAG AAA ATT    1395Cys Asn val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile445                 450                 455                 460GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG CCT TGC ATA TGT ACA T AGTAAGAATT   1445Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
            465                 470C                                                                  1446(2)SEQ ID NO:131信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：473氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:131:Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr1               5                  10                  15Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Set His Phe Cys
         20                  25                  30Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
     35                  40                  45Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Lau Ala Gln Thr Arg Ile
 50                  55                  60Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp65                  70                  75                  80Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
            85                  90                  95Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
        100                 105                 110Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
    115                 120                 125Glu His Leu A la Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr
130                  135                 140Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile145                 150                 155                 160Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
            165                 170                 175Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
        180                 185                 190Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
    195                 200                 205Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
210                 215                 220Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro225                 230                 235                 240Asp Asn Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
            245                 250                 255Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr
        260                 265                 270Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
    275                 280                 285Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala ASn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr
290                 295                 300Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln305                 310                 315                 320Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala
            325                 330                 335Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr
        340                 345                 350Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro
    355                 360                 365Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser
370                 375                 380Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val385                 390                 395                 400Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
            405                 410                 415Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr
        420                 425                 430Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala
    435                 440                 445His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
450                 455                 460Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr465                 470

Claims (15)

1．包括互补决定区(CDRs)的抗-CEA抗体(“806.077 Ab”)，其中的CDRs包括下面的序列：a)重链
CDR1 DNYMH(SEQ ID NO:29)
CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG(SEQ ID NO:31)
CDR3 LIYAGYLAMD Y(SEQ ID NO:32)；和b)轻链
CDR1 SASSSVTYMH(SEQ ID NO:26)
CDR2 STSNLAS(SEQ ID NO:27)
CDR3 QQRSTYPLT(SEQ ID NO:28)
2．根据权利要求1的抗体，其中的重链CDRs 1和3进一步定义为：
CDR1 FNIKDNYMH(SEQ ID NO:30)；和
CDR3 HVLIYAGYLAMDY(SEQ ID NO:33)。
3．根据权利要求1的抗体，其中包括下面的结构任选地为人源化的：重链可变区序列(SEQ ID NO:11):
EVQLQQSGAE LVRSGASVKL SCTASGFNIK DNYMHWVKQR    40
PEQGLEWIAW IDPENGDTEY APKFRGKATL TADSSSNTAY    80
LHLSSLTSED TAVYYCHVLI YAGYLAMDYW GQGTSVAVSS   120和，轻链可变区序列(SEQ ID NO:9):
DIELTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVT YMHWFQQKPG    40
TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE    80
DAATYYCQQR STYPLTFGAG TKLELKRA                108。
4．根据权利要求3的人源化抗体，包括至少一种下面的序列：重链可变区序列VH1(SEQ ID NO:55)；轻链可变区序列VK4(SEQ ID NO:71)；人CH1重链IgG3恒定区；人κ轻链CL区；和人IgG3铰链区；它们任选为F(ab′)2片段的形式。
5．包括根据前面任一权利要求的抗体和效应部分的偶联物。
6．根据权利要求5的偶联物，其中的效应部分选自下面任何一种成分：a)适用于ADEPT系统中的酶；b)CPG2；c)〔G251T,D253K〕HCPB；d)〔A248S,G251T,D253K〕HCPB；e)共刺激分子；f)B7的细胞外区域；g)人B7.1的细胞外区域；和h)人B7.2的细胞外区域；它们任选为融合蛋白的形式。
7．根据权利要求6的偶联物，其为选自下面任何一种偶联物的融合蛋白，(序列从N-末端到C-末端方向列出)：a)人源化的806.077 F(ab′)2-{〔A248S,G251T,D253K〕HCPB}2融合，包括：结构为VH1(SEQ ID NO:55)/IgG3 CH1恒定区/IgG3铰链区的抗体Fd′链；Fd′链通过其C-末端融合至〔A248S,G251T,D253K〕HCPB N-末端；和通式为VK4(SEQ ID NO:71)/κ轻链CL区的抗体轻链；b){〔A248S,G251 T,D253K〕HCPB}2-人源化806.077 F(ab′)2融合，包括：〔A248S,G251T,D253K〕HCPB；HCPB经其C-末端通过(GGGS)3接头融合至结构为VH1(SEQ IDNO:55)/IgG3 CH1恒定区/IgG3铰链区的抗体Fd′链N-末端上；和式VK4(SEQ ID NO:71)/κ轻链CL区域的抗体轻链；和c)(人B7.1细胞外区域)2-人源化806.077 F(ab′)2融合，包括：人B7.1细胞外区域；B7.1在其C-末端融合至结构为VH1(SEQ ID NO:55)/IgG3 CH1恒定区/IgG3铰链区的抗体Fd′链N-末端上；和式VK4(SEQ ID NO:71)/κ轻链CL区的抗体轻链。
8．能够编码在前面任一权利要求中定义的抗体多肽或偶联物的多核苷酸序列。
9．包括权利要求8中定义的多核苷酸的载体。
10．用权利要求8中定义的多核苷酸序列转化的宿主细胞或用该宿主细胞形成的转基因非-人动物或转基因植物。
11．以保藏号96022936保藏于ECACC的杂交瘤806.077。
12．药物组合物，包括在前面任一权利要求中定义的偶联物和药学上可接受的稀释剂或载体，任选适于静脉内用药。
13．在前面任一权利要求中描述的偶联物用作药剂。
14．制备在前面任一权利要求中定义的抗体或偶联物的方法，包括：a)将权利要求10中定义的宿主细胞，转基因非-人哺乳动物或转基因植物或权利要求11的杂交瘤置于有利于抗体或偶联物表达及任选有利于分泌的环境下；和任选地b)至少部分纯化该抗体或偶联物。
15．对有需要的人或动物的治疗方法，包括给人或动物施用药学上有效量的前面任一权利要求中定义的偶联物。
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