CZ353698A3 - Monoklonální protilátka proti CEA, konjugáty, které ji obsahují, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje - Google Patents

Monoklonální protilátka proti CEA, konjugáty, které ji obsahují, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje Download PDF

Info

Publication number
CZ353698A3
CZ353698A3 CZ983536A CZ353698A CZ353698A3 CZ 353698 A3 CZ353698 A3 CZ 353698A3 CZ 983536 A CZ983536 A CZ 983536A CZ 353698 A CZ353698 A CZ 353698A CZ 353698 A3 CZ353698 A3 CZ 353698A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
seq
sequence
humanized
human
Prior art date
Application number
CZ983536A
Other languages
English (en)
Inventor
Clive Graham Copley
Michael Derek Edge
Stephen Charles Emery
Original Assignee
Zeneca Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9609405.7A external-priority patent/GB9609405D0/en
Priority claimed from GBGB9703103.3A external-priority patent/GB9703103D0/en
Application filed by Zeneca Limited filed Critical Zeneca Limited
Publication of CZ353698A3 publication Critical patent/CZ353698A3/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6899—Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy [ADEPT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nových protilátek proti CEA (anti-CEA protilátek nazvaných „protilátka 806.077 nebo zkráceně „806.077 Ab) vhodných pro diagnózu a léčení rakoviny.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že transformace normálních buněk v tkáni na buňky nádorové je spojena se změnou struktury na buněčném povrchu. Změněné struktury na buněčném povrchu mohou sloužit jako antigeny a modifikované nádorové struktury představují typ tzv. antigenu asociovaného s nádorem (viz např. Altered Glycosylation in Tumour Cells, eds. Reading, Hakamori and Marcus, 1988, Arthur Liss Publ.). Takové antigeny se mohou využít např. pro vytváření monospecifických protilátek pomocí hybridomové technologie, což je technika dnes všeobecně dobře zavedená a známá, poté co byla poprvé publikována (Kohler a Milstein, Nátuře 256, 495-497, 1975).
Jeden antigen asociovaný s nádorem je CEA („carcinomembrionic antigen, karcinoembryonální antigen), který poprvé popsali Gold a Freedman (J. Exp. Med. 121, 439, 1965). Tento antigen je přítomen na povrchu nádorových buněk a může být prokázán v krevním séru.
Pojetí využívající protilátky namířené proti antigenům asociovaným s nádorem v léčení rakoviny je již nějakou dobu oceňováno (Herlyn et al. 1980, Cancer Research 40: 717).
• · · ·
-2Protilátky se mohou užít k zasažení různých chemických a biologických agens v nádoru a takové konjugáty pak jsou zvláště užitečné jako základ pro mnohé způsoby diagnostiky jak in vitro tak in vivo. Použití imunokonjugátů v léčení rakoviny je také slibné (Lord et al. , 1985, Trends in Biotechnology 3, 175, Vitetta et al., 1987, Science 238, 1098) . Tento přístup je technicky mnohem náročnější než pouhé diagnostické využití a vyžaduje, aby antigeny asociované s nádorem, které jsou cílem protilátek při takové imunoterapii, byly vysoce nádorově specifické a nebyly exprimovány ve významné hladině ve vitálních lidských tkáních. Bez ohledu na teoretické požadavky a nádorově specifickou tkáňovou distribuci, v některých aplikacích je žádoucí, aby protilátka zůstala na povrchu buňky po navázání s antigenem místo toho, aby byla rychle internalizována. Tak např. v systému ADEPT („Antibody directed enzyme prodrug therapy, viz Patenty USA č. 4975278 a 5405990) se má zato, že je výhodné, když protilátka zůstává na povrchu buňky, kde konjugát „protilátka-enzym usnadňuje aktivaci předléku.
Konjugáty protilátek se mohou také využít v nádorové imunoterapii. V následujících odstavcích je popsán vědecká základ pro takové aplikace.
Aby mohly odpovídat na imunní stimuly, vyžadují T-buňky dva signály. Jeden takový signál poskytuje to, že receptor T-buňky (TCR) rozpoznává peptidy prezentované MHC. Bylo ale ukázáno, že samotná stimulace TCR vede k neodpovídavosti T-buněk nebo anergii a pro stimulaci specifické aktivace a proliferace T-buněk je třeba druhý nebo ko-stimulační signál (přehled viz Schwartz R.H., J. EXP. Med., 1996, 184, 1-8). Jestliže obdrží oba signály, výsledné cytotoxické T-buňky zprostředkují imunitní odpověď usmrcením cílové buňky. Bylo identifikováno množství potenciálně ko-3stimulačních molekul, např. B7, molekuly ICAM, LFA-1 a LFA3, CD40, CD70 a CD24 (viz přehled Galea-Lauri, J. et al. ,
Cancer Gene Therapy, 1996, 3, 202-213). Hlavní ko-stimulační funkci zřejmě mají příbuzné molekuly B7.1 (zvaná také CD80) a B7.2 (zvaná také CD86), které mohou současně reagovat se dvěma receptory CD28 a CTLA-4 (Hellstrom, K.E. et al. , Immunol. Rev., 1995, 145, 123-145, Lenschow, D.J. et al. ,
Ann. Rev. Immunol., 1996, 14, 233-258). B7.1 a B7.2 jsou exprimovány na buňkách prezentujících antigen (APC) jako jsou např. dendritové buňky, zatímco CD28 a CTLA-4 jsou přítomné na T-buňkách. B7.2 je konstitutivně exprimován na povrchu APC, ale po kontaktu s T-buňkou je zvýšena exprese B7.1. Obdobně na povrchu T-buněk je exprimován CD28, ale po aktivaci je jeho exprese utlumena a nahrazena expresí
CTLA-4. Stimulace CD28 a CTLA-4 pomocí B7.1 a B7.2 představuje složitý vzorec signalizace, která řídí nejen aktivaci T-buňky, ale také následnou proliferaci vedoucí k modulaci imunitní odpovědi (Greene J. et al. , J. Biol.
Chem., 1996, 271, 26762-26771). Tento jev vysvětluje někdy rozporné údaje popisované pracovníky, kteří studují tyto kostimulační molekuly.
Při rakovině byly identifikovány lymfocyty infiltrující nádor, ale nepřítomnost imunitní odpovědi na nádor může být způsobena anergii T-buněk. Nádorové buňky mohou prezentovat na svém povrchu specifické nebo selektivní antigeny, ale postrádají B7.1/B7.2, což jim umožňuje unikat imunologickému dozoru. A vskutku pokusy in vivo prokázaly, že nádorové buňky transfekované B7.1/B7.2 jsou méně tumorigenní než netransfekované buňky téže linie, a že transfekované buňky jsou schopny vyvolávat ochrannou imunitu proti opakované výzvě rodičovskými buňkami (Townsend, S.E. a Allison, J.P., 1993, Science, 259, 368-370). To ukazuje, že jakmile je • · · · • ·
-4jednou stimulována, imunitní odpověď se může stát nezávislou na B7.1/B7.2. Hellstrom navrhl, že exprese B7.1/B7.2 vnesená do nádorových buněk genovou terapií má potenciál stimulovat odpověď hostitele, která může omezit nebo i eliminovat nemoc. Gajewski (J. Immunol., 1996, 156, 465-472) a
Matulonis et al. (J. Immunol., 1996, 156, 1126-1131) publikovali, že B7.1 je nadřazena B7.2 v procesu aktivace T-buněk. Použití B7.1 v roztoku (ve formě konjugátu s konstantní doménou protilátky) poskytuje jen mírnou kostimulaci T-buněk, které dostávají stimulaci TCR z jiného nezávislého zdroje (Linsley P.S. et al., J. Exp. Med., 1991, 173, 721-730) .
Existuje stálá potřeba dalších a zlepšených protilátek proti CEA (anti-CEA protilátek) vhodných pro diagnostiku a léčení rakoviny.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález je založen na objevu nové protilátky proti CEA (anti-CEA protilátky) nazvané „protilátka 806.077.
Jeden aspekt předkládaného vynálezu poskytuje anti-CEA protilátku obsahující úseky určující komplementaritu (CDR), které mají následující sekvence:
a) těžký řetězec
CDR1 DNYMH (sekvence id. č. 29)
CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG (sekvence id. č. 31)
CDR3 LIYAGYLAMD Y (sekvence id. č. 32)
b) lehký řetězec
CDR1 SASSSVTYMH (sekvence id. č. 26)
CDR2 STSNLAS (sekvence id. č. 27)
CDR3 QQRSTYPLT (sekvence id. č. 28).
• · · ·
0 0
-5Úseky určující komplementaritu (CDR) jsou takové sekvence uvnitř hypervariabilních smyček ve variabilních doménách protilátky, které jsou rozhodující pro určení specifičnosti interakce antigen-protilátka (Kabat, E.A., Lu, T.T., ReiMiller, M., Perry, H.M. , Sequences of Proteins of and Gottesman, K.S., 1987,
Immunological Interest, 4th edition, Washington D.C. United States Dept. of Health and Human Services, zde také čtenář nalezne podrobnosti k číslování reziduí protilátek podle Kabata). Úseky CDR jsou zde definovány tak, že zahrnují i rezidua kostry (základní struktury) protilátky, pokud se podílejí na vazbě. Pro protilátku 806.077 byly úseky CDR stanoveny pomocí homologie s hypervariabilními úseky jiných myších protilátek. Termíny „VK a „VH zde znamenají variabilní úseky lehkého a těžkého řetězce protilátky. Anatomii molekul protilátek publikoval v přehledu Padlan, 1994 (Molecular Immunology 31, 160-217).
Úseky CDR lehkého řetězce jsou:
VK CDR1 rezidua 23 až 34 dle Kabata, včetně, SASSSVTYMH (sekvence id. č. 26),
VK CDR2 rezidua 50 až 56 dle Kabata, včetně, STSNLAS (sekvence id. č. 27),
VK CDR3 rezidua 8 9 až 97 dle Kabata, včetně, QQRSTYPLT (sekvence id. č. 28).
Úseky CDR těžkého řetězce jsou:
VH CDR1 rezidua 31 až 35B dle Kabata včetně, DNYMH (sekvence id. č. 29), výhodný je VH CDR1 rezidua 27 až 35B včetně, FNIKDNYMH (sekvence id. č. 30),
VH CDR2 rezidua 50 až 65 včetně dle Kabata, WIDPENGDTE
YAPKFRG (sekvence id . č. 31)
VH CDR3 rezidua 95 až 102 včetně dle Kabata, LIYAGYLAMDY
(sekvence id. č. 32) , výhodně VH CDR3 rezidua 93 až 103 dle
Kabata včetně, HVLIYAGYLAMDY (sekvence id. č. 33).
• · ··
6Výhodně je vazebná afinita pro antigen CEA alespoň
io'5 M, výhodněj ší je vazebná afinita pro antigen
ío'6 M, výhodněj ší je vazebná afinita pro antigen
ío'7 M, výhodněj ší je vazebná afinita pro antigen
ío'8 M, výhodněj ší je vazebná afinita pro antigen
ío'9 M, výhodněj ší je vazebná afinita pro antigen
io'10 M a zvláště výhodná j e vazebná afinita pro
alespoň 10'11 M.
Termín protilátka používaný zde obecně znamená molekulu imunoglobulinu (nebo konstrukt protilátky specifickou antigenní v podstatě zodpovědné nebo modifikovaný scFv zachovávající Úseky CDR j sou její fragment j ako např.
vazbu s CEA) za vazbu antigenu, proteinová sekvence mimo CDR je normálně odvozena z imunoglobulinu, ale může být odvozena z imunoglobulinové domény člena imunoglobulinové nadrodiny.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje CEA protilátku, která obsahuje následující, případně humanizované, struktury:
sekvence variabilního úseku těžkého řetězce (id. č. 11):
EVQLQQSGAE LVRSGASVKL SCTASGFNIK DNYMHWVKQR 40
PEQGLEWIAW IDPENGDTEY APKFRGKATL TADSSSNTAY 80
LHLSSLTSED TAVYYCHVLI YAGYLAMDYW GQGTSVAVSS 120 a sekvence variabilního úseku lehkého řetězce (id. č. 9) :
DIELTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVT YMHWFQQKPG 40
TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE 80
DAATYYCQQR STYPLTFGAG TKLELKRA 108.
nebo kterékoliv jejich konstrukty z následující skupiny: F(ab')2/ F(ab'), Fab, Fv, jednotlivý řetězec Fv a V-min.
• ·
Výhodné jsou konstrukty fragmentu F(ab')2. Patří sem také jakékoliv fragmenty protilátek uchovávající si vazebné charakteristiky protilátky 806.077. Příkladem je nedávno publikovaný fragment protilátky „L-F(ab)2, který popsal Zapata, 1995 (Protein Engineering, 8, 1057-1062) . Patří sem také fragmenty Fv svázané disulfidovými můstky. Případně protilátka tvoří část konjugátu, jak je popsáno v následujícím textu.
Výhodná humanizovaná protilátka obsahuje alespoň jednu z následujících sekvencí:
sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce, tj . sekvenci VH1 (sekvence id. č. 55), sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce, tj . sekvenci VK4 (sekvence id. č. 71), konstantní úsek CHI těžkého řetězce lidského IgG3, úsek CL lidského lehkého řetězce kappa, a kloubový úsek lidského IgG3, případně ve formě fragmentu F(ab')2.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje polynukleotidovou sekvenci schopnou kódovat variabilní úsek těžkého nebo lehkého řetězce CEA protilátky podle vynálezu. Výhodně je variabilní úsek těžkého nebo lehkého řetězce fúzován (výhodně prostřednictvím spojovací sekvence) s genem kódujícím proteinovou efektorovou skupinu (jako část konjugátu, viz následující text), výhodná je fúze prostřednictvím těžkého řetězce protilátky. Obecně může být fúzován jak N-konec tak i C-konec řetězce protilátky. Pro konjugáty s B7 je výhodná fúze s N-koncem řetězce protilátky.
CPB má na svém N-konci pro-doménu, která napomáhá správnému složení proteinu před tím, než je pro-doména odstraněna, aby se uvolnil aktivní enzym. Jestliže je • · « · ·
-8pro-CPB fúzována na C-konci s N-koncem řetězce protilátky, umožňuje to odstranění pro-domény (např. působením trypsinu) z N-konce fúzovaného konstruktu. Jestliže naopak pro-CPB byla připojen k C-konci řetězce protilátky, vzniká problém, jak odstranit pro-doménu ze středu konstruktu, aniž by se zničil celý fúzovaný protein. Řešením je exprimovat (koexprimovat) pro-doménu samostatně (trans). To má tu výhodu, že jakmile byla jednou buněčná linie vytvořena, není potřeba aktivace exprimovaného proteinu trypsinem k tomu, aby se odstranila pro-doména CPB. Konstrukty s pro-CPB fúzovanou svým C-koncem s N-koncem řetězce protilátky mají tu výhodu, že nevyžadují vytvoření ko-exprimujících buněčných linií, což vyžaduje vysokou úroveň exprese pro-domény společně s vysokou hladinou exprese dalších proteinů.
V tomto popisu se uvažují také konzervativní analogy aminokyselinových sekvencí které uchovávají vazebné vlastnosti CEA protilátky podle předkládaného vynálezu, ale liší se v sekvenci jednou nebo několika konzervativními substitucemi, delecemi nebo adicemi aminokyselin. Typické konzervativní substituce aminokyselin jsou uvedeny v následující tabulce.
Konzervativní substituce
původní aminokyselina příklad substituce výhodná substituce
Ala (A) Val, Leu, Ile Val
Arg (R) Lys, Gin, Asn Lys
Asn (N) Gin, His, Lys, Arg Gin
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gin (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
····
Gly (G) Pro Pro
His (H) Asn, Gin, Lys, Arg Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucin Leu
Leu (L) norleucin, Ile, Val, Met Ile
Lys (K) Arg, Gin, Asn Arg
Met (M) Leu, Phe, Ile Leu
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala Leu
Pro (P) Gly Gly
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala, norleucin Leu
V tomto popisu se uvažují také variace nukleových kyselin (delece, substituce a adice) specifických sekvencí nukleové kyseliny, které zachovávají schopnost hybridizovat za stringentních (přísných) podmínek s příslušnou specifickou sekvencí. Hybridizační test je v této přihlášce popsán v příkladu 9. Avšak výhodné jsou sekvence nukleové kyseliny zde výslovně vyjmenované. Má se za to, že nukleové kyseliny peptidů jsou přijatelným ekvivalentem polynukleotidových sekvencí, alespoň pro takové účely, které nevyžadují translaci do proteinu (Wittung, 1994, Nátuře, 368, 561).
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje protilátku nebo fragment protilátky, která je v humanizované formě.
Humanizovaná protilátka, příslušný fragment nebo struktura vážící protilátku, je polypeptid složený hlavně ze strukturní kostry sekvencí lidského imunoglobulinu, nesoucí aminokyselinové sekvence jiného než lidského původu ve vazebném místě pro antigen a v jeho okolí (tj. úseky
určující komplementaritu CDR, tato technika je známa jako „roubováni CDR a často zahrnuje i změny kostry protilátky, viz následující příklady). Vhodná metodologie byla popsána podrobně např. ve WO 91/09967, EP 0328404 a Queen et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 10029) a Montain a Adair, 1989 (Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 10,1, 1992), ačkoliv i jiné metody humanizace připadají v úvahu, jako je např. pokrývání povrchových reziduí protilátkou (viz EP 519596, Merck/NIH, Padlan et al.) . Výhodné humanizované protilátky jsou kterékoliv protilátky uvedené zde v příkladech 11 až 47 nebo 107 až 122. Výhodný humanizovaný variabilní úsek těžkého řetězce je VH1 (viz příklady). Výhodný humanizovaný variabilní úsek lehkého řetězce je VK4 případně zahrnující kteroukoliv z dodatečných změn popsanou v příkladech 107 až 109. Výhodný konstantní úsek lidského těžkého řetězce je IgG3.
Chimérické humanizované protilátky představují další aspekt předkládaného vynálezu. Příprava humanizovaných chimérických protilátkových fragmentů protilátky 806.077 je zde popsána v příkladu 8. Obecně se chimérické protilátky připravují kombinací variabilního úseku protilátky z jednoho druhu s konstantním úsekem jiné protilátky z odlišného druhu živočicha.
Termín „humanizovaný týkající se protilátky jak se zde užívá zahrnuje všechny způsoby humanizace jako je např. CDR roubování nebo přípravu chimérických protilátek nebo jakýchkoliv hybridů např. CDR štěp těžkého řetězce v kombinaci s chimérickým lehkým řetězcem (viz provedení v příkladu 110).
Konkrétně protilátky hlodavců po opakovaném podávání in vivo člověku, a to bud' samotné nebo jako konjugát, vyvolají imunitní odpověď příjemce proti těmto protilátkám hlodavců,
11tzv. odpověď HAMA („Human Anti Mouše Antibody). Odpověď HAMA může omezit účinnost léčiva, pokud se vyžaduje opakované podávání. Imunogeničnost protilátky se může snížit chemickou modifikací protilátky pomocí hydrofilního polymeru jako je např. polyetylenglykol nebo metodami genového inženýrství, kdy lze vytvořit vazebné struktury protilátky více podobné lidským. Tak např. genové sekvence pro variabilní domény protilátky hlodavce, které vážou CEA, mohou nahradit variabilní domény lidského myelomového proteinu, a tak se vytvoří chimérická rekombinantní protilátka. Takové postupy jsou podrobně popsány v patentových přihláškách EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 a WO 86/01533. Alternativně se mohou izolovat nebo syntetizovat genové sekvence CDR protilátky hlodavce vážící CEA a těmito sekvencemi se nahradí odpovídající úseky sekvencí v genu pro homologní lidskou protilátku, čímž vznikne lidská protilátka se specifičností původní protilátky hlodavce. Tyto postupy jsou popsány v přihláškách EP 023940, WO 90/07861 a WO 91/09967. Případně se může velké množství povrchových reziduí variabilní domény protilátky hlodavce změnit na taková rezidua, která se normálně nacházejí na homologní lidské protilátce, čímž se vytvoří protilátka hlodavce „obložená povrchovou vrstvou reziduí, která proto bude rozpoznávána v lidském těle jako vlastní. Tento přístup publikoval Padlan et al. , 1991 (Mol. Immunol. 28, 489).
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje hostitelskou buňku transformovanou polynukleotidovou sekvencí nebo transgenního živočicha (kromě člověka) nebo transgenní rostlinu, pocházející z hostitelské buňky, ve které polynukleotidová sekvence kóduje přinejmenším variabilní úsek těžkého řetězce nebo lehkého řetězce CEA • ·
-12protilátky podle předkládaného vynálezu, případně ve formě konjugátu jak se zde popisuje.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje hybridom 806.077, uložený v ECACC pod č. 96022936, a varianty této buněčné linie.
Hybridomová protilátka 806.077 byla uložena v „European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), v PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Velká Británie, 29. února 1996 pod č. 30 96022936, v souladu s Budapešťskou smlouvou.
Jiný aspekt vynálezu poskytuje plazmid pNG3-Vkss-HuCk uložený v NCIMB pod č. 40798.
Plazmid pNG3-Vkss-HuCk byl uložen v „The National Collections of Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Scotland, Velká Británie, 11. dubna 1996 pod č. NCIMB 40798 v souladu s Budapešťskou smlouvou.
Jiný aspekt vynálezu poskytuje plazmid pNG4-VHssHuIgG2CHl uložený v NCIMB pod č. 40797.
Plazmid pNG4-VHss-HuIgG2CHl byl uložen v „The National Collections of Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Scotland, Velká Británie, 11. dubna 1996 pod č. NCIMB 40797 v souladu s Budapešťskou smlouvou.
Jiný aspekt vynálezu poskytuje plazmid pNG3-Vkss-HuCkNEO uložený v NCIMB pod č. 40799.
Plazmid pNG3-Vkss-HuCk-NEO byl uložen v „The National Collections of Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Scotland, Velká Británie, 11. dubna 1996 pod č. NCIMB 40799 v souladu s Budapešťskou smlouvou.
-13Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob přípravy alespoň variabilního úseku těžkého nebo lehkého řetězce anti-CEA protilátky, který spočívá v tom, že se
a) transformuje hostitelská buňka polynukleotidovou sekvencí kódující alespoň variabilní úsek těžkého nebo lehkého řetězce anti-CEA protilátky a případně se transformované hostitelská buňka nechá vyvinout v transgenního savce kromě člověka nebo v transgenní rostlinu,
b) hostitelská buňka, transgenní savec kromě člověka nebo transgenní rostlina se vystaví takovým podmínkám, které vedou k expresi, případně sekreci, alespoň variabilního úseku, a případně
c) alespoň částečně purifikuje variabilní úsek.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob přípravy protilátky nebo konjugátu, který spočívá v tom, že se
a) hostitelská buňka, transgenní savec kromě člověka nebo transgenní rostlina, nebo hybridom 806.077 vystaví takovým podmínkám, které vedou k expresi, případně sekreci, protilátky nebo konjugátu, a případně
b) alespoň částečně purifikuje protilátka nebo konjugát.
Výhodně jsou variabilní úseky jak lehkého tak i těžkého řetězce exprimovány v jedné a téže buňce, čímž se složí a -vytvoří anti-CEA protilátku. Výhodně je variabilní úsek těžkého nebo lehkého řetězce fúzován (případně prostřednictvím spojovací sekvence) s genem kódujícím proteinovou efektorovou skupinu (jako část konjugátu, viz následující text), výhodně fúzován prostřednictvím těžkého řetězce protilátky. Obecně může být fúzován jak N-konec tak i C-konec řetězce protilátky. Pro konjugáty s B7 je výhodná fúze s N-koncem řetězce protilátky. CPB má na svém N-konci pro-doménu, která napomáhá správnému složení proteinu před • · · β · · • · ' • · · ·· · · • · 4 ·· »·
-14tím, než je pro-doména odstraněna, aby se uvolnil aktivní enzym. Jestliže je pro-CPB fúzován na C-konci s N-koncem řetězce protilátky, umožňuje to odstranění pro-domény (např. působením trypsinu) z N-konce fúzovaného konstruktu. Jestliže naopak pro-CPB byl připojen k C-konci řetězce protilátky, vzniká problém, jak odstranit pro-doménu ze středu konstruktu, aniž by se zničil celý fúzovaný protein. Řešením je exprimovat (ko-exprimovat) pro-doménu samostatně (v trans) . To má tu výhodu, že jakmile byla jednou buněčná linie vytvořena, není potřeba aktivace exprimovaného proteinu trypsinem k tomu, aby se odstranila pro-doména CPB. Konstrukty s pro-CPB fúzovaným svým C-koncem s N-koncem řetězce protilátky mají tu výhodu, že nevyžadují vytvoření ko-exprimujících buněčných linií, což vyžaduje vysokou úroveň exprese pro-domény společně s vysokou hladinou exprese dalších proteinů.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob přípravy monoklonální protilátky 806.077, který spočívá v tom, že se
a) kultivuje hybridom protilátky 806.077 uložený v ECACC pod č. 96022936 v médiu za podmínek vhodných pro expresi protilátky a
b) získá protilátka 806.077 z kultivačního média a případně
c) připraví protilátkový fragment F(ab')2 z protilátky 806.077 enzymatickým štěpením.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje konjugát, který obsahuje efektorovou skupinu a anti-CEA protilátku 806.077 podle vynálezu, jak je zde popsána.
skupina je skupina s takovým účinkem, že protilátce 806.077 v konjugátu ještě jinou aktivitu (např. enzymový, toxinový nebo radioaktivní ligand).
Efektorová propůjčuje • ft rfrfr* fr • · ·· ·· » · · «
I · ·· ftft · · * • · 1 «· frfr
-15V jednom provedení předkládaného vynálezu je výhodně efektorová skupina enzym vhodný pro použití v systému ADEPT. V Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, publikované 4. července 1996, jsme navrhli systém ADEPT „s obrácenou polaritou založený na mutantním lidském enzymu, který má výhodu nízké imunogeničnosti ve srovnání např. s bakteriálním enzymem. Konkrétní hostitelský enzym byla CPB z pankreatu (viz příklad 15 výše zmíněné přihlášky, lidská [D253K]CPB, a příklad 16, lidská[D253R]CPB) a předléky (viz příklady 18 a 19 výše zmíněné přihlášky) . Hostitelský enzym je mutován tak, aby se změnil způsob interakce mezi enzymem a předlékem ve smyslu rozpoznávání substrátu ve srovnání s nativním hostitelským enzymem. V následující Mezinárodní patentové přihlášce PCT/GB96/01975 (publikované 6. března 1997 jako WO 97/07796) je popsána další práce na mutované kombinaci enzym CPB/předlék pro systém ADEPT. Výhodným enzymem vhodným pro ADEPT je kterýkoliv z enzymů CPG2 nebo CPB s obrácenou polaritou, např. kterýkoliv z [D253K]HCPB, [G251T,D253K]HCPB nebo [A248S,G251T,D253K]HCPB.
Konjugáty protilátky 806.077 jsou využitelné v nádorové imunoterapii.
V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu efektorová skupina konjugátu je ko-stimulační molekula, výhodně je touto ko-stimulační molekulou B7, výhodněji lidská B7.1 nebo B7.2, a zvláště výhodně lidská B7.1. Výhodně je konjugát ve formě fúzního proteinu, výhodně takového, který je vytvořen spojením C-konce ko-stimulační molekuly a N-konce řetězce protilátky 806.077, výhodně prostřednictvím těžkého řetězce protilátky, výhodně tak, že protilátka 806.077 postrádá úsek Fc, výhodněji fragment F(ab')2 a nejvýhodněji je protilátka humanizovaná nebo • · • · ·
-16lidská. Zvláště výhodný konjugát je popsán v příkladu 104 v následujícím textu.
Předpokládá se, že použití protilátky k zacílení kostimulační molekuly na nádorové buňky propůjčí nádorovým buňkám funkci prezentace antigenu, takže T-buňky obdrží specifickou stimulaci TCR od samotných nádorových buněk a ko-stimulační signál od protilátkou zacílené molekuly. Použití lidských nebo humanizovaných protilátek je výhodné pro léčení lidských nádorů, neboř myší protilátky mohou vyvolat imunitní odpověď pokud se užijí u člověka, což může snížit účinnost opakovaného léčení. Použití fúzního proteinu kombinujícího úsek vážící nádorový antigen spojený s extracelulární částí ko-stimulační molekuly je nové. Hayden et al.(Tissue Antigens, 1996, 48, 242-254) popsali použití molekuly protilátky s dvojí specifitou, která anti-nádorového antigenu Zatímco tato molekula je relevantní údaje kombinuje vazebnou doménu s vazebnou doménou anti-CD28. schopna interakce s CD28 na T-buňkách, signál, který může předat, má tu nevýhodu, že je kvalitativně odlišný od signálu, který poskytují přirozené ligandy CD28, např. afinita vazby je vyšší než mezi B7.1 a CD28. Mezidruhová homologie mezi B7.1, B7.2 a CD28, CTLA-4 ukazuje evoluční konzervaci sekvencí vazebných úseků. V důsledku těchto fakt se má zato, že např. B7.1 z člověka může reagovat s CD28 z myši a může předat podobný ko-stimulační signál. Pro léčení nemocí člověka je výhodný lidský nebo humanizovaný protein. Avšak použití lidských nebo humanizovaných proteinů na zvířecím modelu by mohlo mít podobné účinky, jaké se očekávají u člověka, a tak zvířecí model by měl poskytnout o účinnosti
1idských/humani zovaných protilátkových fúzních proteinů s lidskými B7.1/B7.2 při léčení nemocí člověka.
• ·
-17Konjugace efektorové skupiny a protilátky lze dosáhnout jakoukoliv vhodnou metodou jako je např. chemická vazba prostřednictvím heterobifunkční spojky nebo technikami fúze rekombinantních genů. Obecně fúzní proteiny jsou výhodně konjugáty, zvláště konjugáty s HCPB nebo B7.
Výhodné konjugáty jsou takové, kde efektorová skupina je kterákoliv z následujících:
a) enzym vhodný pro použití v systému ADEPT,
b) CPG2,
c) [G251T,D253K]HCPB,
d) [A248S,G251T,D253K]HCPB,
e) ko-stimulační molekula,
f) extracelulární doména B7,
g) extracelulární doména lidské B7.1, a
h) extracelulární doména lidské B7.2 , případně ve formě fúzního proteinu.
Uznává se, že konjugát podle předkládaného vynálezu se nemusí nutně skládat z jedné efektorové molekuly a jedné molekuly protilátky. Konjugát může např. obsahovat více než jednu efektorovou molekulu na každou molekulu protilátky . Obecně protilátkové konjugáty s F(ab')2, které představují spojení mezi protilátkou a enzymem nebo extracelulární doménou B7, mají 2 mol enzymu nebo B7 na 1 mol protilátky.
Zvláště výhodné konjugáty jsou kterékoliv fúzní proteiny vybrané z následujících konjugátu (sekvence jsou uvedeny ve směru od N-konce k C-konci):
a) „humanizovaný 806.077 F(ab')2-{ [A248S,G251T,D253K]HCPB}2 fúzní protein obsahující:
protilátkový řetězec Fd' se strukturou VH1 (sekvence id. č. 55)/konstantní úsek CH1 z IgG3/ kloubový úsek z IgG3, přičemž Fd' řetězec byl fúzován svým C-koncem k N-konci [A248S,G251T,D253K]HCPB a • · · ·
-18lehký řetězec protilátky podle vzorce VK4 (sekvence id. č. 71)/úsek CL z lehkého řetězce kappa,
b) „ { [A248S,G251T,D253K] HCPB }2-humanizovaný 806.077 F(ab')2 fúzní protein obsahující:
[A248S,G251T,D253K]HCPB, přičemž HPCB je fúzován svým C-koncem prostřednictvím spojky (GGGS)3 k N-konci Fď řetězce protilátky se strukturou VH1 (sekvence id. č. 55)/konstantní úsek CH1 z IgG3/ kloubový úsek z IgG3,a lehký řetězec protilátky podle vzorce VK4 (sekvence id. č. 71)/úsek CL z lehkého řetězce kappa, a
c) „(lidská B7.1 extracelulární doména)2 - humanizovaný
806.077 F(ab')2 fúzní protein obsahující:
lidskou extracelulární doménu B7.1, přičemž B7.1 je fúzována svým C-koncem k N-konci Fď řetězce protilátky se strukturou VH1 (sekvence id. č. 55)/konstantní úsek CH1 z IgG3/ kloubový úsek z IgG3,a lehký řetězec protilátky podle vzorce VK4 (sekvence id. č. 71)/úsek CL z lehkého řetězce kappa.
V tomto popisu je kloubový úsek protilátky ve vztahu ke konjugátu definován podle principů, které stanovil Padlan (1994)v Molecular Immunology 31, 169-217 (viz zejména tab. 2 ve zmíněné publikaci). V těchto výhodných konjugátech jsou 2 mol enzymu nebo B7.1 na 1 mol F(ab')2. Symbol lomítka „/ je zde použit jako oddělovač, aby byly viditelné samostatné strukturní prvky spojené peptidovými vazbami, které tvoří složky konjugátu.
Humanizované sekvence variabilních úseků VH1 a/nebo VK4 mají tu výhodu, že si uchovávají dobré vazebné vlastnosti s minimálními dalšími změnami vyžadovanými na kostře lidské protilátky. Kloubový úsek IgG3 má výhodu, že poskytuje
-19dobrou produkční úroveň F(ab')2 a dostatečně homogenní produkt.
V dalším výhodném provedení vynálezu, které se týká zvláště výhodných konjugátů definovaných v předchozím textu, fúze je ovlivněna prostřednictvím lehkého řetězce protilátky. V dalším výhodném provedení vynálezu, které se týká zvláště výhodných konjugátů definovaných v předchozím textu, se může konstatní úsek CHI ze strukturního prvku IgG3/kloubový úsek IgG3 nahradit odpovídajícím prvkem IgG2 .
Pokud je efektorovou molekulou toxin, toxinová skupina obecně obsahuje složku, která má cytotoxické vlastnosti a je tudíž schopna po internalizaci buňky usmrtit.
Toxinová skupina a anti-CEA protilátka mohou být navzájem spojeny přímo nebo nepřímo. Toxinová skupina a anti-CEA protilátka jsou obecně spojeny tak, že geometrie konjugátu dovoluje, aby se anti-CEA protilátka navázala na svou cílovou buňku. Výhodně jsou toxinová skupina a antiCEA protilátka spojeny tak, že konjugát je extracelulárně stabilní a intracelulárně nestabilní, takže toxinová skupina a anti-CEA protilátka zůstávají spojeny pokud jsou mimo cílovou buňku, ale po internalizaci je toxinová skupina uvolněna. Takže výhodný konjugát obsahuje intracelulárně štěpítelné/extracelulárně stabilní místo.
Příklady konjugátů, kde je toxinová skupina přímo spojena s vazebnou skupinou pro cílovou buňku, zahrnují takové konjugáty, kde toxinová skupina a anti-CEA protilátka jsou spojeny disulfidovým můstkem vytvořeným mezi thiolovou skupinou toxinové skupiny a thiolovou skupinou anti-CEA protilátky. Podrobnosti přípravy a vlastností imunotoxinů a dalších konjugátů jsou popsány v Evropské patentové přihlášce EP 528527, na jejíž obsah se tímto odkazujeme.
•20Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje polynukleotidovou sekvenci shopnou kódovat polypeptid protilátky nebo konjugátů podle předkládaného vynálezu. Termín „schopná kódovat je užit zde tak, že zahrnuje i takové polynukleotidové sekvence, kde je nutno brát v úvahu degenerovanost genetického kódu, neboř některé aminokyseliny jsou kódovány více než jedním kodonem.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje vektor obsahující polynukleotid definovaný v předchozím textu.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje hostitelskou buňku transformovanou polynukleotidovou sekvencí definovanou v předchozím textu nebo transgenní zvíře kromě člověka nebo transgenní rostlinu, které se vyvinou z hostitelské buňky.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje farmaceutický přípravek obsahující konjugát podle vynálezu ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem, případně ve formě vhodné k intravenóznímu podávání.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje konjugát popsaný v předchozím textu pro použití jako léčivo.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje použití konjugátu podle vynálezu pro přípravu léčiva pro léčení neoplastických onemocnění.
Je zřejmé, že dávky a dávkový režim budou záviset na konkrétní efektorové skupině, která byla použita, na populaci cílových buněk a na anamnéze pacienta. Podávaná dávka konjugátu bude typicky v rozmezí od 0,1 do 1 mg/kg hmotnosti pacienta.
Konjugát podle předkládaného vynálezu se může normálně podávat ve formě léčivého přípravku. Takže předkládaný vynález poskytuje také farmaceutický přípravek obsahující konjugát ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem
-21nebo nosičem. Příklad takového přípravku je zde uveden v příkladu 10.
Farmaceutický přípravek podle předkládaného vynálezu muže být v různých lékových formách. Obecně konjugát podle předkládaného vynálezu je podáván parenterálně, výhodně intravenózně. Konkrétní parenterální farmaceutický přípravek je přípravek, jehož jednotková dávková forma je vhodná pro injekční podávání. Takže zvláště vhodný přípravek obsahuje roztok, emulzi nebo suspenzi imunotoxinu ve spojení s farmaceuticky přijatelným parenterálním ředidlem nebo nosičem. Mezi vhodné nosiče a rozpouštědla patří vodná vehikula, jako je voda nebo solný (fyziologický) roztok, nebo jiná vehikula bez vody, jako jsou fixované oleje nebo lipozómy. Přípravek může také obsahovat agens, které zvyšuje stabilitu konjugátu v přípravku. Např. přípravek může obsahovat pufr (tlumivý roztok). Koncentrace konjugátu bude různá, ale obecně konjugát bude v přípravku v koncentraci přibližně od 1 do 10 mg/ml.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje expresní vektor kódující anti-CEA protilátku podle vynálezu.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje expresní vektor kódující alespoň variabilní úsek těžkého nebo lehkého řetězce anti-CEA protilátky podle vynálezu.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje hostitelskou buňku transformovanou vektorem podle vynálezu, který je kompatibilní s expresí v této buňce.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje hostitelskou buňku transformovanou polynukleotidovou sekvencí podle vynálezu.
Savčí buňky (CHO, COS, myelomové buňky) byly použity jako hostitelské buňky pro ko-expresi cDNA lehkého (L) a těžkého (H) řetězce protilátky a jejich fragmentů, aby se • ·
-22vytvořila protilátka s požadovanou vazebnou aktivitou (Bebbington, C., 1991, Methods, Vol. 2, 136-145, Adair, J. ,
1992, Reviews, Vol.130). Pro expresi konstruktů pro přímou expresi aktivní CPB jsou výhodným buněčným expresním systémem buňky COS nebo CHO. cDNA se vloží do plazmidů a pak se integruje do chromozómové DNA v případě buněk CHO nebo se replikuje na velký počet kopií v případě buněk COS. Plazmidy obecně vyžadují nějaký selektovatelný markér pro udržování v transfekovaném hostiteli, účinný eukaryotický promotor, který umožní vysokou úroveň transkripce z cDNA, vhodná restrikční místa pro klonování a také polyadenylační a terminační signály transkripce pro dobrou stabilitu mRNA. V literatuře již bylo popsáno několik takových vektorů (Bebbington, C. et al. , 1992, Biotechnology, vol. 10, 169175, Wright, A., 1991, Methods, Vol. 2, 125-135), a navíc existují také komerčně dostupné vektory (jako např. pRc/CMV, Invitrogen Corp.), které jsou vhodné.
Exprese různých fragmentů protilátek v E. coli je dobře dokumentována (přehled viz Pluckthun, A.,
Reviews, 1992, vol. 130, 151-188, Skerra,
Opinion in immunology, 1993, vol. 5, 256-262) intracelulární exprese řetězců Fd a L (Cabilly, S.ř 1989, Gene, vol. 85, 553-557), ale ta vyžaduje nové složení molekuly in vitro a reasociaci řetězců (Buchner, J, Rudolph,R., 1991? Biotechnology , vol. 9, 157-162), aby byly schopné vazebné aktivity. Účinnější způsob, jak získat aktivní fragmenty protilátky je prostřednictvím periplazmatické sekrece (Better,M. et al. , 1988, Science
240, 1041-1043) . Jednotlivé složky, řetězce H a L, fragmentu protilátky jsou ko-exprimovány z jediného plazmidu. Každý řetězec protilátky je opatřen bakteriálním vedoucím peptidem, který směruje řetězec do periplazmy E. coli, kde
Immunological
A., Current Byla popsána • · • · · · ··
-23je vedoucí peptid odštěpen a volně řetězce asociovány, čímž vytvoří rozpustné a aktivní fragmenty protilátky. Věří se, že tento proces napodobuje přirozený proces v eukaryotické buňce, kde se exprimované řetězce protilátky dostávají do lumen endoplazmatického retikula před tím, než jsou asociovány v kompletních protilátkách. Tento proces vede často k tomu, že je vazebná aktivita přítomna i v supernatantu z buněčných kultur.
Některé expresní systémy zahrnují transformování hostitelské buňky vektorem, takové systémy jsou dobře známy např. v E. coli, kvasinkách a savčích hostitelích (viz Methods in Enzymology, 185, Academie Press, 1990). V úvahu přicházejí i jiné expresní systémy jako např. transgenní savci kromě člověka, kde je požadovaný gen výhodně vyříznut z vektoru a asociován se savčím promotorem z mléčné žlázy, aby se exprimovaný protein nasměroval do mléka, nebo je zaveden do pronukleu savčí zygoty (obvykle mikroinjekcí do jednoho ze dvou jader (obvykle samčího jádra) v pronukleu), která je pak implantována náhradní matce. Část zvířat z potomstva náhradní matky ponese a bude exprimovat zavedený gen, který se integroval do chromozómu. Obvykle je integrovaný gen přenášen na potomstvo konvenčním šlechtěním, což umožňuje rychlou expanzi kmene. Výhodně se požadovaný protein jednoduše sbírá z mléka samic transgenních zvířat. Odkazujeme čtenáře na následující publikace: Simons et al. , 1988, Biotechnology 6: 179-183, Wright et al. , 1991, Biotechnology 9: 830-834, patentové přihlášky US 4 873 191 a US 5 322 775. Manipulace myších embryí je popsána v Hogan et al. „Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986.
Technologie transgenních rostlin také přichází v úvahu, jak je popsána např. v následujících publikacích: Swain, • · • · · · • · · ·
-24W.F., 1991, TIBTECH 9, 107-109, Ma, J.K.C. et al. , 1994, Eur. J. Immunol. 24, 131-138, Hiatt A. et al. , 1992, FEBS Letters, 307, 71-75, Hein M.B. Et al. , Biotechnology Progress, 7, 455-561, Duering, K. , 1990, Plant Molecular Biology 15, 281-294.
Pokud je to žádoucí, geny hostitele mohou být inaktivovány nebo modifikovány pomocí standardních postupů, jak je přehledně a stručně uvedeno v následujícím textu a jak je podrobně popsáno např. v „Gene Targeting: A Practical Approach, IRL PREss, 1993. Cílový gen nebo jeho část je výhodně klonován do vektoru se selekčním markérem (jako je např. Neo) vloženým do genu tak, že narušuje jeho funkci. Vektor je linearizován a transformován (obvykle elektroporací) do embryonálních kmenových (ES) buněk (např. pocházejících z myšího kmene 129/Ola) a poté se v určité části kmenových buněk uskuteční homologní rekombinace. Kmenové buňka obsahující porušený gen jsou namnoženy a injikovány do blastocysty (např. z myši C57BL/6J), která je pak pro další vývoj vložena do náhradní matky. Chimérické potomstvo se identifikuje pomocí markéru pro barvu. Aby se zajistil příspěvek ES buněk k zárodečné linii, chiméry se dále šlechtí křížením s myšmi s genetickými markéry, což umožňuje odlišit gamety pocházející z ES a hostitelské blastocysty. Polovina gamet pocházejících z ES buněk ponese genovou modifikaci. Potomstvo se vyšetřuje (obvykle pomocí Southernova přenosu) na přítomnost porušeného genu (obvykle 50 % potomstva). Takto selektované potomstvo bude heterozygotní a proto se může křížit s jiným heterozygotním nebo homozygotním potomstvem selektovaným potom (přibližně 25 % potomstva). Transgenní zvířata s vyřazeným genem („gene knockout) se mohou křížit s transgenními zvířaty, která byla vytvořena známými technikami jako jsou např.
• ·
-25mikroinjekce DNA do pronukleu, fúze sferoplastů (Jakobovits et al., 1993, NAture, 362, 255-258) nebo lipidy zprostředkovaná transfekce (Lamb et al., 1993, Nátuře Genetics 5, 22-29) buněk ES, aby se vytvořila transgenní zvířata, kde je endogenní gen vyřazen a nahrazen cizím genem.
ES buňky obsahující porušený cílový gen mohou být dále modifikovány transformací sekvencí cílového genu obsahující specifické změny, která je výhodně klonována do vektoru a linearizována před transformací. Po homologní rekombinaci je změněný gen zaveden do genomu. Tyto embryonální buňky se pak mohou použít k vytvoření transgenního organismu.
Termín „hostitelská buňka znamená jakoukoliv prokaryotickou nebo eukaryotickou buňku vhodnou pro expresní technologii jako jsou např. bakterie, kvasinky, rostlinné buňky, zygoty savců kromě člověka, oocyty, blastocyty, embryonální kmenové buňky a jakékoliv další vhodné buňky pro transgenní technologii. Pokud to kontext dovoluje, termín „hostitelská buňka také zahrnuje transgenní rostlinu nebo savce kromě člověka, které se vyvinuly z transformovaných zygot savce kromě člověka, oocytú, blastocyst, embryonálních kmenových buněk, rostlinných buněk a jakýchkoliv dalších buněk vhodných pro transgenní technologii.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob léčení člověka nebo zvířete, které toto léčení potřebují, kde tento způsob spočívá v tom, že se podává člověku nebo zvířeti farmaceuticky účinné množství konjugátu podle vynálezu.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob cílení efektorové skupiny do buněk prezentujících CEA antigen u savců, kteří takové cílení vyžadují, kde tento ·
-26biosenzorů např.
způsob spočívá v tom, že podává farmaceuticky účinné množství konjugátu podle vynálezu.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje použití protilátky podle vynálezu v diagnostické metodě.
Jednou z diagnostických metod je imunotest. Imunotest pro in vitro testování založený na nové protilátce podle předkládaného vynálezu může být vytvořen v souladu s konvenčními imunologickými technikami známými v oboru, kde se protilátka podle vynálezu použije ve značené nebo neznačené formě a stanovuje se vytváření komplexu protilátky s CEA v testovaném vzorku. V jednom případě může být protilátka značena detekovatelnou značkou jako je značka radioaktivní, chemiluminiscenční, fluorescenční nebo enzymová. Alternativně je protilátka detekována prostřednictvím komplexu, který látkou nebo také způsoby bez založenou na se vytváří se značenou značení, např. metodou povrchové plazmonové rezonanci. Vzorkem může být např. tělní tekutina, jako sérum, nebo preparát tkáně (v případě histochemického testu).
Pro účely diagnostiky in vivo je protilátka podle vynálezu opatřena vhodnou vnější detekovatelnou značkou, jako je např. radioznačka nebo atom těžkého kovu, a je podána subjektu, načež je možné stanovit lokalizovanou akumulaci protilátky.
Pro diagnostiku rakoviny in vitro může být anti-CEA protilátka konjugována s enzymem, jako je např. křenová peroxidáza a bakteriální luciferáza, které mohou generovat měřitelný signál, nebo s fluorescenčními markéry nebo radioizotopy, které se mohou detekovat a kvantifikovat přímo. Ve standardním imunotestu takové konjugáty poskytují prostředek k měření přítomnosti nebo nepřítomnosti CEA • ·
-27v tělních tkáních a tudíž poskytují rychlý a pohodlný test pro diagnózu nádorové choroby. Základní popis metodologie enzymových imunotestů lze najít v „Enzyme Immunoassay, E.T.Maggio, CRC Press, a dále v patentových přihláškách
US 3 690 8334, US 3 791 932, US 3 817 837,
US 3 853 987, US 3 867 517, ' US 3 901 654,
US 3 984 533, US 3 996 345 a US 4 098 876.
Pro diagnostiku rakoviny in vivo, anti
může být konj ugována s izotopy prvků j ako j e
technecium nebo indium nebo s izotopy těžkých kovů, které je možné detekovat celotělovými snímacími kamerami (viz Larson, S.M., 1987, Radiology, 165, 297-304).
Pro léčení rakoviny výhodné provedení vynálezu obsahuje anti-CEA protilátku, která může být konjugována s efektorovou skupinou, která může přímo usmrtit nádorové buňky nebo prostřednictvím aktivace vhodného předléku v systému ADEPT. V systému ADEPT je selektivní usmrcování nádorových buněk dosaženo tím, že anti-CEA protilátka je konjugována s enzymem, který je schopen katalyzovat přeměnu netoxické dávky předléku na účinnou toxickou léčivou sloučeninu. Podání konjugátu vede k lokalizaci enzymové aktivity do místa nádoru. Následné podání předléku vede k místní tvorbě toxické sloučeniny a selektivnímu usmrcování buněk v místě nádoru. Tento přístup je popsán v patentových přihláškách WO 88/07378, US 4 975 278, US 5 405 990 a
Protilátka 806.077 se může také použít s ko-stimulační molekulou pro nádorovou imunoterapii, jak bylo již popsáno v předchozím textu.
Selektivní usmrcování nádorových buněk může být dosaženo konjugací anti-CEA protilátky buď přímo nebo chemickou derivatizací s makrocyklickými chelatačními činidly obsahujícími vysokoenergetické radioizotopy jako
WO 89/10140. konj ugovaná • · · · • ·
-28např. 90Y, 131I a 1:L1In. Anti-CEA protilátka slouží k lokalizaci izotopu do nádoru a radioaktivita emitovaná izotopem ničí DNA okolních buněk a usmrcuje nádor.
Selektivního usmrcováni nádorových buněk může být také dosaženo konjugací anti-CEA protilátky s cytotoxickým nebo cytostatickým léčivem jako je např. methotrexat, chlorambucil, adriamycin, daunorubicin a vincristin. Tyto látky jsou používány v klinice již mnoho let a léčení s jejich pomocí je často omezeno nespecifickou toxicitou. Konjugace těchto látek s CEA protilátkou umožňuje, aby se tyto látky lokalizovaly v místě nádoru, a tím se zvýšila dávka látky, která je dodána do nádoru bez nepřijatelných vedlejších účinků působením těchto látek na jiné tkáně jako je např. kostní dřeň nebo nervový sytém.
Účinnost protilátky je v mnoha aplikacích zlepšena snížením velikosti vazebné struktury protilátky, čímž se zvýší penetrace tkání a jiné farmakodynamické vlastnosti farmaceutického přípravku. Toho lze dosáhnout tím, že se odstraní úsek Fc z molekuly protilátky buďto enzymaticky nebo metodami genového inženýrství a vytvoří se rekombinantní fragment Fab' nebo F(ab')2.
Metody genového inženýrství se mohou využít také k dalšímu zmenšení velikosti anti-CEA protilátky. Úsek Fv obsahující úseky CDR může být upraven metodami genového inženýrství, izolovaně exprimován a pak chemicky zesítěn např. využitím disulfidových můstků. Nebo obě domény lehkého a těžkého řetězce vytvářející strukturu Fv se mohou exprimovat jako jeden polypetidový řetězec (SCFv) fúzí domén Fv se spojovací peptidovou sekvencí od přirozeného C-konce jedné domény k N-konci druhé domény (viz patentové přihlášky PCT/US/87/02208 a US 4 704 692). Nebo může být exprimována jediná izolovaná doména Fv vytvářející protilátku s jedinou ·· φ φ · · φ φφφφ
-29doménou neboli dAb, jak publikovali Ward et al. , Nátuře, 1989, 341, 544). Jiným typem anti-CEA protilátky připadajícím v úvahu je také V-min konstrukt, popsaný v Mezinárodní patentové přihlášce WO/12625 (původci Slater a Timms).
Seznam zkratek používaných v tomto textu:
ADEPT
APC
CDR
CEA
CL
CPB
CPG2
DAB
DEPC
DMEM
ECACC
EIA
ELISA
FCS
Fd
HAMA
HCPB terapie protilátkou řízeným enzymovým předlékem („antibody directed enzyme prodrug therapy) buňka prezentující antigen úsek(-y) určující komplementaritu karcinoembryonální antigen konstatní doména lehkého řetězce protilátky karboxypeptidáza B karboxypeptidáza G2
3,3'-diamnobenzidinterahydrochlorid dietylpyrokarbonát
Dulbeccem modifikované Eagleho médium
Evropská sbírka živočišných buněčných kultur („European Collection of Animal Cell Cultures) enzymový imunotest test s enzymem navázaným na imunosorbent fetální telecí sérum těžké řetězec Fab, Fab' nebo F(ab')2, případně obsahující i kloubový úsek lidská proti-myší protilátka lidská kaboxypeptidáza, výhodně z pankreatu
-30kloub IgG krátký peptid bohatý na prolin obsahující (kloubový úsek) cysteiny, které přemosťují 2 těžké řetězce HRPO křenová peroxidáza
NCA nespecifický křížově reagující antigen
NCIMB Národní sbírky průmyslových a mořských bakterií („National Collections of Industrial and Marině Bacteria)
PBS solný (fyziologický) roztok pufrovaný fosfátem
PCR polymerázová řetězová reakce preproCPB proCB
SDS-PAGE
TBS
VH
VK proCPB s N-koncovou vedoucí sekvencí
CPB s N-koncovou prodoménou elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným solný roztok pufrovaný Tris variabilní úsek těžkého řetězce protilátky variabilní úsek lehkého řetězce protilátky
Vynález je ilustrován pomocí příkladů (neomezujících) uvedených v následujícícm textu (včetně referenčních příkladů), kterých se týkají také obrázky 1 až 3.
Popis obrázků
Obr. 1 ukazuje protinádorovou aktivitu konjugátu „protilátka 806.077-CPG2 v modelovém systému ADEPT.
Obr. 2 ukazuje mapu plazmidu pCF009.
Obr. 3 ukazuje údaje ze zařízení BIAcore týkající se fúzního proteinu protilátka-B7.1 navázaného k imobilizovanému
9« ··<· 9 9 99 99 * 99 99 9999
999 9 9 9999
99 9 9999999
9999 9 9 999
99 9·9 999 99 99
-31CTLA4-Ig, kde plná čára představuje testovanou vazbu a tečkovaná čára je kontrola.
Pokud není uvedeno výslovně jinak, pro příklady platí následující údaje.
DNA byla izolována a purifikována pomocí soupravy GENECLEAN™ II (Stratech Scientific Ltd. nebo BiolOl lne.) Tato souprava obsahuje: 1) 6M jodid sodný, 2) koncetrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA pro přípravu promývacího roztoku sůl/etanol/voda, 3)Glassmilk, tj. 1,25 ml suspenze speciálně připravené křemičitanové matrix ve vodě v l,5ml ampulce. To je způsob purifikace DNA založený na metodě, kterou publikovali Vogelstein a Gillespie, 1979 (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615). Stručně, postup podle soupravy je následující. K jednomu dílu objemu proužku gelu se přidají 3 díly objemu roztoku jodidu sodného ze soupravy. Agaróza se rozpustí zahříváním směsi při 55 °C po 10 minut, pak se přidá „Glassmilk (5 až 10 ml), vše se dobře promíchá a ponechá se stát 10 minut při teplotě místnosti. „GLassmilk se stočí v centrifuze a promyje 3x roztokem NEW WASH (0,5 ml) ze soupravy. Promývací pufr se odstraní z „Glassmilk, a zbytek se ponechá na vzduchu uschnout. DNA se eluuje tím, že se „glassmilk inkubuje ve vodě (5 až 10 ml) při 55 °C po 10 minut. Centrifugací se získá vodný supernatant obsahující eluovanou DNA. Eluční kroky se mohou opakovat a supernatanty se pak sloučí.
Kompetentní buňky E. coli DH5a byly získány od firmy Life Technologies Ltd. (kompetentní buňky „MAX efficiency DH5oc„) .
Minipreparace dvouřetězcová plazmidové DNA byly provedeny pomocí preparační soupravy „RPM™ DNA Preparátion Kit od firmy Bio 101 lne. (katalog, č. 2070-400) nebo >· aaaa • aa a · · · ·» • a · a a a · ·· · a · • aaa a a aa· a· ·· aaa aaa · · aa
-32podobné soupravy, obsahující alkalický lyzovací roztok pro uvolnění plazmidové DNA z bakteriálních buněk a „glassmilk v centrifugačním filtru pro adsorpci uvolněné DNA, která se pak eluuje sterilní vodou nebo roztokem lOmM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 7,5.
Bylo použito médium bez séra OPTIMEM™ Reduced Sérum Medium od firmy Gibco BRL, katalog, č. 31985.
Činidlo LIPOFECTIN™ (Gibco BRL, katalog, č. 18292-011) je 1:1 (hmotnost/hmotnost) přípravek kationtového lipidu
N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-Ν,Ν,Ν-trimetylamonium-chloridu (DOTMA) a dioleoylfosfatidyletanolaminu (DOPE) ve vodě filtrované přes membránu. Spontánně se váže s DNA a vytváří komplexy lipid-DNA (viz Felgner et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7431).
G418 (sulfát) je GENETICIN™ (GibcoBRL katalog. č. 11811), což je aminoglykosidové antibiotikum příbuzné gentamicinu, které se užívá jako selekční agens v molekulárně genetických experimentech.
AMPLITAQ™ je termostabilní DNA polymeráza od firmy Perkin-Elmer Cetus.
Obecné postupy molekulární biologie byly prováděny podle postupů publikovaných v Sambrook, Fritsch and Maniatis: Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Objev a příprava hybridomové buněčné linie 806.077
Myši BALB/C staré 8 až 10 týdnů byly imunizovány subkutánně primární dávkou CEA (10 μ9) v PBS (0,1 ml) a Freundově úplném adjuvans. O dva týdny později a ještě • 0 ···· ·» ··
Β · · ·
Β · ·· ··· · · • · · ·♦ ··
-33znovu ο další dva týdny později byla zvířata stimulována dalšími dávkami CEA (10 gg) v PBS (0,1 ml) a Freundově nekompletním adjuvans. Po 32 týdnech byla zvířata naposledy imunizována intravenózně dávkou CEA (10 gg) v PBS, a po dalších třech dnech usmrcena. Byly vyjmuty sleziny, z nichž připravené buňky byly fúzovány s buňkami NSO (získanými z „European Collection of Animal Cell Cultures, č. 85110503) standardním způsobem (Kohler and Milstein, Nátuře, 1975, 256, 495) . Výsledné buňky byly vysety na 96jamkové kultivační misky a inkubovány po 2 týdny. Supernatanty z výsledných hybridomů byly testovány metodu EIA („enzyme immunoassay). Z celkového počtu 1824 jamek vzniklo 5 fúzí, 102 jamek bylo pozitivních proti nativnímu CEA. Ve fúzi 806 bylo zjištěno sedmnáct pozitivních jamek. Buňky z těchto jamek byly klonovány konečným ředěním a výsledné klony byly testovány EIA. Linie z původních jamek 10/17 se úspěšně klonovaly. Jedna linie, nazvaná 806.077, byla v „European Collection of Animal Cell Cultures
96022936. Následující tabulka uvádí přehledně uložena pod č. program generace protilátek, který vedl 806.077.
k vytvoření hybridomů
Antigen podmínky týdny v klidu počet fúzí počet testovaných j amek počet CEA* +ve metodou EIA počet nakonec vybraných
CEA bez úprav normální 8 až 20 28 13920 99 0
desialovaný CEA normální 8 až 12 14 5568 12 0
konjugovaný CEA normální 10 až 12 8 3168 1 0
CEA bez úprav izolátor více než 30 5 1824 102 3
* testovány proti CEA bez úprav, desialované imunizace vedly k mnoha +ve, když se testovaly proti imunogenu • ·
-34Příklad 2
Příprava protilátky 806.077 z uložené hybridomové linie ECACC č. 96022936.
2.1. Příprava z média obsahujícího sérum
Kryoprezervační ampule o objemu 1 ml byla vyjmuta z tekutého dusíku a rychle rozmražena ve vodní lázní s teplotou 37 °C. Obsah byl asepticky přenesen do sterilní
15ml centrifugační zkumavky. Buňky byly resuspendovány jemným mícháním a přidáváním 10 ml kultivačního média po kapkách, přičemž kultivačním médiem bylo Dulbeccem modifikované Eagleho médium (DMEM) obsahující 10 % (objem/objem) fetálního telecího séra (FCS). Suspenze byla odstředěna při 50xg po 10 minut a supernatant byl asepticky odstraněn a pelet resuspendován v 5 ml DMEM, 10% FCS a 1% L-glutaminu v 25ml kultivačních nádobách které byly předem propláchnuty a naplněny směsí 95% vzduchu a 5% oxidu uhličitého. Nádoby pak byly inkubovány ve tmě v 36,5 °C.
Po 3 dnech byla provedena subkultivace tím, že celý obsah lahve byl naředěn do 75ml lahve médiem DMEM s 10% FCS a 1% L-glutaminem (tak aby výsledná hustota byla 2 až 3 χ 105 buněk/ml). Podobným způsobem byla provedena další expanze do 162ml lahví.
Supernatanty z kultur pro purifikaci byly připraveny v 500ml rolerových kulturách v 850ml rolerových lahvích. Kultury byly vysety s hustotou 2 χ 105 živých buněk/lml do rolerových lahví předem naplněných vzduchem s 5% CO2, inkubace pak probíhala s rotací 3 rpm při teplotě 36,5°C. Kultury byly pěstovány do zralosti a sbírány typicky 500 až 800 hodin po inokulaci, když životnost buněk byla pod 10 % a koncentrace IgG dosáhla maxima.
• ·
-352.2. Ošetření kultur po sběru
Po sběru byly supernatanty z kultur pročištěny při 60xg po 30 minut. Pak byl přidán azid sodný (0,02% (hmotnost/objem)) jako konzervační látka a čistý supernatant byl uložen ve 4°C ve tmě až do purifikace.
2.3. Purifikace protilátky 806.077
Supernatant z hybridomu protilátky 806.077 (objem 3 1) byl upraven na hodnotu pH 7,5 pomocí zředěného roztoku hydroxidu sodného a pak filtrován přes 0,45 μτη filtr (MILLIDISK™, Millipore). Filtrovaný protilátkový supenatant byl nanesen na afinitní kolonu s proteinem-G (např. „Protein G Fast Flow Sepharose™, Pharmacia, kat. č. 17.0618.03, vnitřní průměr 5 cm x 6,5 cm = 130 ml), ekvilibrovaný pufrovaným solným (fyziologickým) roztokem (PBS, 8mM Na2HPO4, l,5mM KH2PO4, 150mM NaCl, 2,5mM KCl, pH 7,3., který je např. dostupný ve formě tablet pro přípravu roztoku od firmy Oxoid) při rychlosti průtoku 4 ml/min a teplotě 4°C. Kolona byla propláchnuta PBS (260 ml) se stejnou rychlostí průtoku a protilátky byly eluovány lOOmM citrátem sodným pH 2,6 tak, že se sbíraly frakce a sledovala absorpce v UV oblasti (280 nm) . Frakce absorbující v UV a obsahující protilátky byly sloučeny, pH bylo okamžitě upraveno na hodnotu pH 7 a ultrafiltrací koncentrovány na přibližně 2 mg/ml pomocí filtrační 30kDa „cut-off membrány (např. Amicon YM3 0). Výtěžek dialýzy pomocí porézní 6-8 kDa „cut-off membrány (např. SPECTRAPOR™ YM30) do pufru 50mM Tris-HCl pH 7,0 byl 110 mg protilátky 806.077 s čistotou lepší než 95% (stanoveno SDS-PAGE).
• ·
-36Příklad 3
Selektivita protilátky 806.077
Pro hodnocení selektivity byly testovány mnohé lidské normální i nádorové tkáně na reaktivitu s protilátkou
806.077, a to pomocí citlivého třístupňového imunohistologického testu na kryostatových zmražených řezech fixovaných acetonem.
Imunohistologie se prováděla na řezech z lidských tkání získaných bud' chirurgickým odstraněním orgánu nebo post mortem. Aby se uchovala optimální morfologie a antigeničnost, tkáně byly získávány co možná nej čerstvější a byly nařezány na malé kousky (asi 0,5 cm3) a bleskově zmraženy v tekutém dusíku před uložením v -80 °C. Tkáňové řezy (6 μπι) byly nařezány na kryostatu a umístěny na sklíčka potažená polylysinem (např. modrá TECHMATE™ sklíčka, Dako), fixovány ledovým acetonem po 2 minuty a pak byla zabaleny do fólie a uloženy při -80°C.
Sklíčka byla rozmražována při teplotě místnosti než byla rozbalena z fólie bezprostředně před použitím. Každý řez byl na sklíčku vyznačen diamantovým popisovačem a ke každému řezu se přidalo 100 μΐ protilátky 806.077 naředěné na 2 μg/ml ve fyziologickém roztoku pufrovaném Trisem (TBS), nebo 100 μΐ CEA/NCA reaktivní kontroly (protilátka A5B7) v koncentraci 2 μg/ml v TBS, nebo 100 μΐ MOPC izotypové kontroly (Sigma, St. v koncentraci 2 μg/ml kontroly jako je např.
katalog. č. 9269) relevantní pozitivní
Všechny následující
Louis, USA, v TBS, nebo LP34 (Dako) inkubace probíhaly při teplotě místnosti po 30 minut ve zvlhčované komůrce, všechny oplachovací kroky byly v TBS se dvěma výměnami. Po inkubaci byla sklíčka opláchnuta a ke každému řezu bylo přidáno 100 μΐ druhého protilátkového reagens, obsahujícího 1/50 králičího proti-myšího
-37imunoglobulinu konjugovaného s křenovou peroxidázou (Dako Patts) a 1/5 normálního lidského séra (Sigma) v TBS.
Sklíčka byla opět inkubována a opláchnuta TBS. Ke každému řezu byla přidána závěrečná detekční protilátka, tj. 100 μΐ prasečí proti-králičí imunoglobulin konjugovaný s křenovou peroxidázou (ředění 1/50 s 1/5 normálního lidského séra v TBS) , sklíčka byla opět inkubována a pak důkladně opláchnuta. Substrát DAB (3,3'-diaminobenzidinterahydrochlorid) byl připraven rozpuštěním 1 tablety DAB (Sigma) se 17 μΐ peroxidu vodíku v TBS (17 ml) a přidáváním po kapkách přes rychlý filtrační papír (Whatman Č. 4). Po 3minutové inkubaci byl přebytek DAB ze sklíček odstraněn a sklíčka byla opláchnuta TBS. Po obarvení hematoxylinem (např. Mayerův hematoxylin, Shandon) byla řezy odvodněny v alkoholu a xylénu, a upevněny na sklíčko syntetickou bezvodou montážní hmotou (např. E-Z Mountant, Shandon) než byly prohlíženy pod mikroskopem.
Místa navázání protilátky byla vizualizována hnědým zabarvení na řezu. Pro hodnocení vazby protilátky 806.077 na tkáně byl použit následující skórovací systém.
+++ (silná) = protilátka se váže k >75 % nádorových buněk ++ (střední) = protilátka se váže k 50 % až 75 % nádorových buněk + (slabá) = protilátka se váže k 25 % až 50 % nádorových buněk
1/- (minimální) = vazba protilátky na malé kousky povrchu nádorových buněk
- = žádné barvení.
Karcinoembryonální antigen (CEA) je člen genové superrodiny imunoglobulinů s jednou predikovanou oblastí podobnou variabilní doméně (N doménou, 108 aminokyselin)
-38a třemi sadami úseků podobných konstantní doméně A1B1, A2B2 a A3B3 (92 aminokyselin v doméně A, 86 aminokyselin v doméně B, Hefta et al. , Cancer Research 52, 5647-5655). Kromě toho CEA obsahuje dva signální peptidy, jeden na aminovém konci a jeden na karboxylovém konci. Oba jsou během posttranslačních úprav odstraněny, přičemž peptid na karboxylovém konci je nahrazen glykosylfosfatidylinositolovou (GPI) skupinou.
Bylo popsáno mnoho proteinů podobných CEA s různou mírou homologie s CEA (Thompson, 1991, J. of Clinical laboratory Analysis, 5, 344-366). K nim patří také nespecificky křížově reagující antigeny NCA 1 a 2. Tyto příbuzné proteiny jsou exprimovány v řadě normálních tkání včetně granulocytů a normálního plicního epitelu. Většina monoklonálních protilátek anti-CEA dosud připravených křížově reagovala s jedním z těchto proteinů a tudíž reagovala s řadou normálních tkání a často reagovala také silně s granulocyty nebo plicním epitelem.
Bylo zjištěno, že protilátka 806.077 je CEA selektivní, neprojevuje žádnou křížovou reaktivitu s granulocyty a pouze minimální barvení(4/14) testované normální plicní tkáně.
Protilátka 806.077 byla na počátku testována na nádorovou a NCA selektivitu v supernatantu tkáňové kultury. Testy byly prováděny použitím nezředěného supernatantu a ředěním 1:10 a ukazovaly shodnou vazbu protilátky k nádorům tlustého střeva jako A5B7, ale mnohem slabší vazbu k normální tkáni z plic a sleziny ve srovnání se stejnou protilátkou. Protilátka byla afinitně purifikována (jak je popsáno v příkladu 2) a screening byl opakován a rozšířen aby zahrnoval i další typy tkání a nádorů.
Protilátka byla titrována proti celému panelu řezů z kolorektálního nádoru a tento screening ukázal, že • · · · · · · ’ ·· «· ··· ··· ··
-39optimální koncentrace protilátky 806.077 pro testy je 2 pg/ml. Všechny následující testy byly prováděny s touto koncentrací protilátky.
Výsledky testů jsou uvedeny v následujícím přehledu. Reaktivita protilátky 806.077 byla srovnávána proti A5B7 (použité také v koncentraci 2 pg/ml) v následujících nádorových a normálních tkáních.
Reaktivita protilátky 806.077 ve tkáních z nádorů
Nádory tlustého střeva (n=17):
Mírná až silná reaktivita (++/+++ shodná s A5B7) pozorována u všech 17 testovaných nádorů.
Nádory prsu (n=6):
Střední až slabé barvení (+/++) 2/6 nádorů, minimální barvení (+/-) 2/6 nádorů.
Nádory NSCLC (n=6):
Silné barvení (+++) 1/2 nádorů, střední barvení (++) 1/6 a slabé barvení (+) 2/6 nádorů.
Nádory žaludku (n=2):
Silné barvení (+++) 1/2 nádorů a slabé barvení (+) 1/2 nádorů.
Nádory vaječníků (n=3) a prostaty (n=3):
Žádné barvení nebylo pozorováno u těchto nádorů, ve všech případech byla pozorována stejná reaktivita s A5B7.
Reaktivita v normálních tkáních
Plíce (reaktivita NCA)(n=14):
Slabé barvení (+) 4/14 tkání, žádné barvení (-) 10/14 tkání, protilátka A5B7 se vázala středně (++) v 1/14 plicních tkání, slabě (+) v 10/14 tkání a minimálně (+/-) v 1/14 tkání.
-40Slezina (reaktivita granulocyty/NCA)(n=6):
Nebylo pozorováno barvení žádné z testovaných tkání, protilátka A5B7 se vázala středně (++) v 1/6 tkání a slabě (+) v 5/6 tkání.
Normální tkáně post mortem (n=13):
Střední až slabá reaktivita (++/+) byla pozorována pouze ve tkáních jícnu, kůže, tlustého střeva a panktreatu (normální tkáně exprimuj ící CEA), podobná vazba byla pozorována s protilátkou A5B7. Kromě pozitivních tkání tlustého střeva, kůže, jícnu a pankreatu byly ostatní negativní tkáně z mozečku, středního mozku, mozku, hladkého svalstva, jater, ledvin, aorty, žaludku a srdce.
Příklad 4
Příprava fragmentu F(ab') protilátky 806.077
Ficin (10 mg) byl resuspendován v roztoku 50mM cysteinu (3 ml, BDH 37218) a 50mM Tris-HCl, pH 7,0, a inkubován 30 minut při 37°C. Přebytečný cystein byl odstraněn vytěsňovací chromatografií (kolona Sephadex™ G-25, 1,25 cm x 25 cm, Pharmacia) v pufru 50mM Tris-HCl, pH 7,0. Snížená koncentrace ficinu byla určena monitorováním absorbance v UV při 2 80 nm (za předpokladu že roztok o koncentraci 1 mg/ml má absorbanci 2 v 1 cm kyvetě) a byla stanovena na 1,65 mg/ml.
Roztok protilátky 806.077 (100 mg) v 50mM Tris-HCl, pH
7,0, (50 ml) a čerstvě redukovaný ficin (5 mg, 3 ml výše zmíněného roztoku) byl štěpen při 37 °C přes 20 hodin. Po štěpení byl roztok naředěn shodným objemem PBS a nanesen na afinitní kolonu s proteinem-G (Pharmacia SEPHAROSE™ Fast Flow, 5cm vnitřní průměr x 6,5 cm = 125 ml, před použitím ekvilibrován pufrem s 50mM Tris-HCl, pH 7,0, při 4°C) , konstantním průtokem 3 ml/min. Kolona byla propláchnuta 50mM • · · ·
-41acetátem sodným s pH 4,0 (250 ml), aby se odstranily nízkomolekulární fragmenty, pak byla propláchnuta 50mM citrátem sodným s pH 2,8 aby se eluovaly fragmenty F(ab'), přičemž se monitorovala UV aborbance při 280 nm. Eluát obsahující F(ab') byla nastaven na pH 7 a pufr byl vyměněn dialýzou do roztoku lOOmM fosfát sodný/lOOmM chlorid sodný/ lmM EDTA, pH 7,2, a koncentrován membránovou filtrací na 8 mg/ml pomocí 10 kDa „cut-off filtru (např. Amicon™ YM10), za předpokladu, že roztok o koncentraci 1 mg/ml má absorbanci 1,4 při 280 nm v lem kyvetě. Byl dosažen 65% výtěžek představující 42 mg F(ab')2 s 95% čistotou.
Příklad 5
Příprava konjugátu „F(ab')2 protilátky 806.077 karboxypeptidáza G2
Spojkou pro derivatizaci F(ab')2 protilátky 806.077 byl
ŠATA (N-hydroxysukcinylimidester glykolové, Sigma, kat. č. A 9043) karboxypeptidázy G2 (CPG2) byla SMPB (N-hydroxysukcinylimidester kyseliny 4-(p-maleinylimidofenyl)máselné, Sigma, kat. č. M6139).
kyseliny S-acetylthioSpojkou pro derivatizaci
5.1. Derivatizace F(ab')2
K roztoku fragmentu F(ab')2 (40 mg, připraven postupem popsaným v příkladu 4) ve lOOmM fosfát/lOOmM NaCl/lmM EDTA, pH 7,2 (pufr A, 5 ml) se přidal ŠATA (0,28 mg) v DMSO (28 μΐ) . Po 40 minutách v teplotě místnosti se výsledný roztok nanesl na odsolovací kolonu (SEPHADEX™ G-25, 1,5 cm vnitřní průměr x 50 cm = 100 ml, ekvilibrován v pufru A při 4°C) průtokem 1,2 ml/min, aby se odstranily přebytečné reagencie. Eluát byl monitorován UV absorpcí při 280 nm. F(ab')2 derivatizované ŠATA byly sloučeny a smíchány s 10% • · · · ·· ··
-42(objem/objem) 500mM hydroxylamin HCl/500mM fosfát sodný/30mM EDTA, pH 8,8, na 60 minut při teplotě místnosti, aby se deacetyloval derivátizovaný F(ab')2. Koncentrace proteinu byla stanovena měřením UV absoroce při 280 nm za předpokladu, že roztok o koncentraci 1 mg/ml má absorbanci 1,4 v lem kyvetě. Roztok byl naředěn na přibližně 1 mg/ml pufrem A. Množství spojovací sloučeniny bylo určeno SH zkouškou dle Ellmana a bylo stanoveno na 1,8 až 2 mol spojovací sloučeniny/mol F(ab)2.
5.2. Derivatizace CPG2
Purifikace CPG2 z Pseudomonas RS-16 ve velkém měřítku byla popsána v Sherwood et al. , 1985, Eur. J. Biochem. 148, 447-453. Příprava F(ab')2 a IgG protilátek konjugovaných s enzymem CPG může být ovlivněna známými prostředky a byla popsána např. v PCT/WO 89/10140. CPG lze získat z „Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Velká Británie. CPG2 lze také získat rekombinantní technikou. Nukleotidovou sekvenci pro CPG2 publikoval Minton, N.P., et al., Gene, 1984, 31, 31-38. Byla popsána exprese kódující sekvence CPG2 v E. coli (Chambers S.P. et al. , Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988,
29, 572-578) a v Saccharomyces cerevisiae (Clarke, L.E. et al., J. gen. Microbiol., 1985, 131, 897-904). Celkovou syntézu genů popsal Edwards M, Am. Biotech. Lab., 1987, 5,
38-44. Expresi heterologních proteinů v E. coli popsali v přehledu Marston F.A.O., DNA Cloning, Vol. III, Practical Approach Series, IRL Press (editor D.M.Glover), 1987, 5988. Eprese proteinů v kvasinkách je popsána v Methods in Enzymology, Vol. 194, Academie Press 1991, ed. C. Guthrie a G.R. Fink.
• ·
-43Enzym CPG je dostupný od firmy SIGMA Chemical Company, Fancy Road, Poole, Dorset, Velká Británie. ENzym CPG byl popsán v Goldman, P., Levý C.C., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 58: 1299-1306, 1967 a také v Levý, C.C. a Goldman, P.J., J.
Biol. Chem. 242: 2933-2938, 1967. Enzym karboxypeptidázu popsali Yasuda, N. et al. , Biosci. Biotech. Biochem. 56: 1536-1540, 1992. Enzym karboxypeptidáza G2 byl popsán v Evropské patentové přihlášce 121 352.
CPG2 (50 mg, rekombinantní enzym z E. coli) byl dialyzován do lOOmM fosfát sodný/lOOmM NaCl pH 7,2 (=pufr B) a naředěn na 8 mg/ml, za předpokladu, že roztok o koncentraci 1 mg/ml má absorbanci při 280 nm 0,6 v lem kyvetě.
SMPB (Sigma) se rozpustila v DMSO na koncentraci 10 mg/ml. CPG2 (50 mg v pufru B o koncentraci 8 mg/ml) se pak smíchalo s roztokem SMPB (0,108 ml, 1,08 g) a reagovala při teplotě místnosti po 120 minut. Výsledný roztok se nanesl na odsolovací kolonu (SEPHADEX™ G-25, 1,5 cm vnitřní průměr x 50 cm = 100 ml, ekvilibrován v pufru B při 4°C) průtokem 1,2 ml/ min, aby se odstranily přebytečné reagencie. Derivátizované CPG2 byly sloučeny a koncentrace byla stanovena měřením UV absorpce při 280 nm za předpokladu, že roztok o koncentraci 1 mg/ml má absorbanci 0,6 v lem kyvetě. Množství spojovací sloučeniny bylo určeno reverzní SH Ellmanovou zkouškou na nezreagované SH skupiny přidáním známého množství 2-merkaptoetanolu k maleinylimidoderivat i zované CPG2. Bylo stanoveno na 2 až 2,4 mol spojovací sloučeniny/mol CPG2.
5.3. Konjugace
Stejné hmotnosti deacetylovaného a derivátizovaného F(ab')2 a derivatizované CPG2 byly smíchány v atmosféře
-44dusíku a směs (asi 80 ml, celková koncentrace proteinu asi 1 mg/ml) byla ponechána reagovat při teplotě místnosti 20 hodin. Reakce byla zastavena přidáním 10% (objem/objem) vodného lOOmM glycinu. Směs hrubého konjugátu byla dialyzována do pufru s nízkým obsahem soli (50mM acetát sodný pH 6,0)a pak byla nanesena na afinitní kolonu s barvivém a ligandem (přičemž barvivo se váže na CPG2, např. ACL Mimetic Green 1,25 cm vnitřní průměr x 10 cm = 50 ml) ve 4°C ekvilibrovanou shodným pufrem, aby se odstranily nezreagované derivátizované F(ab')2- Konjugát a derivátizované CPG2 byly eluovány směsí 50mM acetát/500mM NaCI pH 6,0 při průtoku 2,0 ml/min a monitorování eluce v UV (280 nm).
Hrubý konjugát, stále ještě obsahující derivátizovanou CPG2, byl koncentrován pomocí ultrafiltračního zařízení s lOkDa „cut-off filtrem (např. Amicon YM10™) asi na objem 12 ml s koncentrací celkového proteinu 5 mg/ml a byl přidán 10% (objem/objem) lOmM síran zinečnatý ve vodě (Sigma Z0251) , aby se doplnila ztráta zinku v CPG2 v průběhu celé procedury. Následná chromatografie (např. SEPHACRYL S-300HR™ Pharmacia, 2,5 cm vnitřní průměr x 25 cm = 500 ml) ve 4°C v 50mM octan sodný/150mM NaCI pH 6,0 při průtoku 1 ml/min, sběr frakcí a monitorování v UV při 280 nm vedla k frakcionaci konjugátu a separaci nezreagované derivatizované CPG2, což bylo určeno SDS-PAGE elektroforézou frakcí z kolony. Frakce odpovídající vrcholu konjugátu (s poměrem F(ab')2:CPG2 1.2, 1:1 a 2:1) byly sloučeny a koncentrovány ultrafiltrací na 1,3 mg/ml, přičemž koncentrace proteinu byla stanovena monitorováním UV absorbance při 280 nm (za předpokladu, že 1 mg/ml má absorbanci 1,0). Čistota konjugátu byla stanovena SDS-PAGE a bylo zjištěno, že celkové množství konjugátu 12 mg mělo • 0
-45složení: 65% konjugátu s poměrem 1:1, 20% konjugátu s poměrem 1:2 nebo 2:1 a <5% volných derivátizovaných F(ab')2 a <5% volné derivatizované CPG2.
Příklad 6
Protinádorová aktivita konjugátu „F(ab')2 protilátky 806.077 - karboxypeptidáza G2 kombinovaného s předlékem
Protinádorová aktivita konjugátu „F(ab')2 protilátky 806.077 - karboxypeptidáza G2 připraveného postupem podle příkladu 5 byla hodnocena v kombinaci s předlékem N(4-[N,Nbis(2-chloetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinou (zkracovanou PGP v tomto příkladu, je popsána v příkladu 1 patentu US 5 405 990 a v Blakey et al. , Br. J. Cancer 72, 1038-1088, 1995) na modelu xenoštěpu lidského kolorektálního nádoru.
Skupiny 8 až 10 samic nahých bezthymových myší byly injikovány dávkou 1 x 107 buněk kolorektálního nádoru LoVo (ECACC č. 87060101) . Když byly nádory velikosti 4 až 5 mm v průměru, buďto konjugát „F(ab')2 protilátky 806.077 karboxypeptidáza G2 (250 U enzymatické aktivity CPG/kg) nebo PBS (solný roztok pufrovaný fosfátem, 170mM NaCI, 3,4mM KCl, 12mM Na2HPO4, l,8mM KH2PO4, pH 7,2) byly intravenózně injikovány. Po 72 hodinách byl i.p. injikován předlék PGP (3 dávky 40 mg/kg v lhodinových intervalech). Průměr nádoru ve dvou směrech se měřil třikrát týdně a byl vypočten objem nádoru podle vzorce:
objem = π/6 x D2 x d, kde D je větší průměr a d je menší průměr. Objem nádoru pak byl vyjádřen relativně k objemu nádoru na počátku terapie předlékem. Protinádorová aktivita byla srovnána s kontrolními skupinami, kterým byl podán PBS místo předléku nebo konjugátu. Protinádorová aktivita byla vyjádřena jako
-46zpoždění růstu definované jako čas, který je třeba k 4násobnému nárůstu objemu léčeného nádoru bez doby kterou k témuž potřebuje kontrolní nádor a také jako T/C hodnota, definovaná jako objem léčeného nádoru dělený objemem kontrolního nádoru 14 dní po podání předléku. Statistická významnost protinádorového působení byla hodnocena pomocí analýzy variance (jednostranné).
Protinádorová aktivita konjugátu „F(ab')2 protilátky 806.077 - karboxypeptidáza G2 kombinovaného s předlékem PGP je demonstrována na obr. 1. a údaje shrnující protinádorové působení jsou uvedeny v následující tabulce.
Konjugát Dávka (U/kg) T/C (%) zpoždění růstu (dny) významnost (p)
806.077F(ab')2 “ CPG2 250 16.5 14 <0,01
500 4.7 22 <0,01
Výsledky ukazují, že konjugát „F(ab')2 protilátky 806.077 - karboxypeptidáza G2 kombinovaný s předlékem PGP působí regresi nádoru a prodlužuje růstové zpoždění, přičemž tyto rozdíly jsou statisticky významné ve srovnání s kontrolními skupinami.
Příklad 7
Klonování a sekvencování variabilních úseků genů těžkého a lehkého řetězce protilátky 806.077
7.1. Příprava RNA z cytoplazmy
Existuje několik postupů pro izolaci polyA+mRNA z eukaryotických buněk (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold ·· » · · fl » · ·· • · · • · « • · · · ·· ·· ··
-47Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989, kapitola 8, str. 3) . V tomto konkrétním případě byla RNA z cytoplazmy připravena z peletů zamrazených hybridomových buněk obsahujících lxlO9 buněk uchovávaných při -80°C postupem, který popsali Favoloro et al. , Methods in Enzymology 65, 718-749.
Buňky byly resuspendovány v 5 ml ledově chladného lyzovacího pufru (140mM NaCI, l,5mM MgCl2, lOmM Tris-HCl, pH 8,6 a 0,5% NP40 (neiontový detergent polyglykoléter, nonylfenoxypolyetoxyetanol, Sigma, katalog, č. 127087-87-0)) obsahujícím 400 U inhibitoru ribonukleázy (RNAguard, Pharmacia, katalog, č. 27-0815-01) a 10 minut protřepány na vortexu. Tento roztok byly převrstven shodným objemem ledového lyzovacího pufru obsahujícího 24 % (hmotnost/objem) sacharózy a 1 % NP-4% a ochlazen 5 minut na ledu. Pak byl odstředěn 30 minut při 4000 rpm a 4°C ve stolní centrifuze (Sorval RT6000B), vrchní cytoplazamtická fáze byla odstraněna a přemístěna do shodného objemu pufru 2xPK (200mM Tris-HCl, pH 7,5, 25mM EDTA, 300mM NaCI a 2% (hmotnost/objem) SDS. Proteináza K (Sigma, katalog. č. P2308) byla přidána do konečné koncentrace 200 μg/ml a směs pak byla inkubována 30 minut při 37°C.
Preparát byl dále extrahován směsí stejného objemu fenolu a chloroformu, vodná fáze byla odstraněna, přidal se k ní 2,5xobjem etanolu a promíchala se. Tento roztok se uchoval přes noc v -20 °C. RNA pak byla získána odstředěním (4000 rpm, 30 minut, 4°C, stolní centrifuga, Sorval RT6000B), supernatant byl odstraněn a pelet byl vysušen ve vakuovém desikátoru a pak byl rozpuštěn ve 250 μΐ vody ošetřené dietylpyrokarbonátem
Sambrook, J., Fritsch, E.F.
(DEPC) připravené podle
Maniatis, T., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ·· ·· • · · • · ··
-48Press, Second Edition, 1989 . Obsah RNA byla stanoven a koncentrace byla vypočtena za předpokladu, že absorbance 1 ve 260 nm odpovídá koncentraci 40 μ9/ιη1.
7.2. Příprava prvního řetězce variabilního úseku cDNA
Řadu metod pro syntézu cDNA uvádí přehledně Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989 (kapitola 8). Oligonukleotidové primery byly převážně na základě těch, které navrhl Marks et al., Mol. Biol., 1991, 222, 581-597. cDNA byla v tomto konkrétním případě připravena následujícím postupem.
RNA (5mg) byla v mikrozkumavce smíchána s 10 μΐ 5x pufru pro reverzní transkriptázu (250mM Tris-HCl, pH 8,3, 40mM MgCl2 a 50mM DTT), 1 μΐ předního primeru (25 pM), 10 μΐ l,25mM směsi všech dNTP, 5 μΐ lOmM DTT, 0,5 μΐ RNAguard (Pharmacia) a doplněno vodou ošetřenou DEPC na celkový objem 50 μΐ. Reakční směs byla zahřáta na 10 minut na 70°C a pak pomalu chlazena na 37°C, pak bylo přidán 100 U (0,5 μΐ) reverzní transkriptázy M-MLV (Pharmacia, katalog, č. 270925-01) a reakční směs byla inkubována 1 hodinu při 37 °C. Přední primer použitý zde pro vytvoření cDNA lehkého řetězce byla oligonukleotid CK2FOR (sekvence id. č. 1), který je navržen tak, aby hybridizoval s konstantním úsekem CK genu pro lehký kappa řetězec myši. Pro cDNA těžkého řetězce byl použit přední primer CG1FOR (sekvence id. č. 2), který hybridizuje s konstantní doménou CH1 myšího IgGl.
7.3. Sekvencování aminokyselin
Těžký a lehký řetězec protilátky 806.077 byly izolovány pomocí SDS-PAGE a „westernovým přenosem a pak podrobeny N-koncovému aminokyselinovému sekvencování. Výsledky • ·
-49ukázaly, že N-konec lehkého řetězce byl chemicky blokován, avšak sekvenční údaje byly získány pro prvních 34 aminokyselinových reziduí N-konce těžkého řetězce (sekvence id. č. 3) . Na základě této sekvence aminokyselin byl navržen specifický zpětný DNA primer pro PCR variabilního úseku těžkého řetězce protilátky 806.077. Tento primer byl nazván SPlback (sekvence id. č. 7).
7.4. Izolace fragmentů genů protilátek metodou PCR
Izolace genů variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce protilátky 806.077 byla provedena pomocí cDNA, izolované jak bylo popsáno v předchozím textu, která byla použita jako templát. Obecně byly reakční podmínky takové, jak je uvedeno v následujícím odstavci.
K 5 μΐ reakční směsi cDNA bylo přidáno 5 μΐ směsi všech dNTP (2,5mM), 5 μΐ lOx enzymového pufru (500mM KCl, lOOmM Tris-HCl, pH 8,3, 15mM MgCl2 a 0,1% želatina), 1 μΐ zpětného primeru 25ρπιο1/μ1, 1 μΐ předního primeru 25ρπιο1/μ1, 0,5 μΐ termostabilní DNA polymerázy a objem byl doplněn na 50 μΐ vodou ošetřenou DEPC. Podmínky pro PCR byly: 25 cyklů 94°C, 90 s, 55°C, 60s, 72°C, 120 s a poslední cyklus byl ukončen další lOmin inkubací při 72°C.
Ve výše uvedených reakčních podmínkách byl pro přípravu cDNA lehkého řetězce použit oligonukleotid CK2FOR (sekvence id. č. 1) a pro cDNA těžkého řetězce oligonukleotid CG1FOR (sekvence id. č. 7). Bylo provedeno mnoho reakcí s různými zpětnými primery pro těžké i lehké řetězce, aby se získal specifický PCR produkt.
V případě lehkého řetězce protilátky 806.077 byly specifické produkty získány se zpětným primerem VKlback (sekvence id. č. 4) a VK4back (sekvence id. č. 5). Podobně pro řetězec byly specifické PCR produkty získány pomocí
-50primerů VHlback (sekvence id. č. 6) a SPlback (sekvence id. č. 7) . Reakční produkty byly analyzovány na 2% agarózovém gelu. Produkty očekávané délky byly vyříznuty a DNA byla purifikována.
7.5. Klonování PCR produktů do vektoru Bluescript KS +
Do každého fragmentu protilátky byla pomocí oligonukleotidů zavedena restrikčního místa, a to jak do 5'konce (zpětný primer) tak i do 3-konce (přední primer). Samostatné produkty PCR jak z VH tak i VK PCR je možné klonovat do vektoru Bluescript KS+ (Stratgene Clonig Systems) prostřednictvím vhodných restrikčních míst a užitím standardních metod pro manipulaci s DNA (např. PCR produkt VHlback/CGlFOR byl klonován prostřednictvím Pstl/HindlII a VK4back/CK2FOR prostřednictvím Sacl/HindlII). Ze získaných klonů byla připravena DNA a pro každý konstrukt byla sekvencována DNA alespoň z 12 klonů pomocí automatického fluorescenčního sekvencovacího zařízení (Applied Biosystems). Sekvence byly dále zpracovány a porovnávány pomocí vhodného počítačového softwaru. Byly získány souhlasné sekvence genů VH a VK a byly přeloženy do odpovídajících sekvencí aminokyselin.
Sekvence DNA a sekvence aminokyselin variabilního úseku lehkého řetězce (VK) protilátky 806.077 jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 8 a 9. Sekvence DNA a sekvence aminokyselin variabilního úseku těžkého řetězce (VH) protilátky 806.077 jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 10 a 11. Klon obsahující lehký řetězec byl označen VK4 a klon obsahující těžký řetězec byl označen VH14A.
·· · · ·
-51Příklad 8
Konstrukce chimérických genů lehkého řetězce a těžkého řetězce Fd
Geny těžkého a lehkého řetězce, které byly klonovány do vektoru Bluescript (VK4 a VH14A v příkladu 7) byly izolovány pomocí PCR s primery, které umožnily specifickou amplifikaci pouze variabilních úseku příslušných genů a přitom vnesly nová jedinečná restrikční místa. Tato restrikční místa umožnila, že fragmenty genů variabilních úseků byly klonovány ve čtecím rámci s fragmenty DNA kódujícími vhodné signální sekvence a sekvence lidských konstantních úseků. Signální sekvence a sekvence lidských konstantních úseků těžkého a lehkého řetězce Fd byly již dříve klonovány do pNG3 a pNG4, což jsou deriváty eukaryotického plazmidového expresního vektoru pSG5.
Vektor pNG3 byl připraven následujícím způsobem. Plazmid pSG5 (Stratagene, katalog, č. 216201) byla naštěpen Sáli a Xbal, aby se odstranily sekvence promotoru SV40 a polylinkeru (vícečetného klonovacího místa). Nový polylinker byl zaveden pomocí oligonukleotidů uvedených zde jako sekvence id. č. 34 a 35, které byly hybridizovány a klonovány do plazmidu pSG5 naštěpeného enzymy Sáli a Xbal, čímž vznikl plazmid pNGl. Plazmid pNGl byl štěpen BglI a Hindlll a promotorový BglI-HindiII fragment CMV z pcDNA3 (Invitrogen, katalog, č. V790-20) byl klonován do tohoto místa, čímž vznikl plazmid pNG2. Nakonec úsek polyA z pSG5 byl izolován pomoci PCR jak je popsáno v příkladu 7 (oddíl7.4) ale pomocí oligonukleotidu sekvence id. č. 36 a 37 a plazmidu pSG5. Produkt PCR byl štěpen Xmal a BamHI, purifikován elektroforézou na 2% agarózovém gelu a izolován (např. GENECLEAN, viz. příklad 7) a pak ligován do plazmidu pNG2 štěpeného Xmal-BamHI, čímž vznikl pNG3 .
• · · • · · · • · · · • · ·« · · ·* ·*··
-52Vektor pNG4 byl připraven následujícím způsobem. Vektor pNG3 byl dále modifikován tak, že restrikční místo Sací v klonovaném promotorovém fragmentu CMV bylo narušeno změnou DNA sekvence. Toho bylo dosaženo použitím dvoustupňové PCR mutageneze s vektorem pNG3 jako templátem. V PCR se užilo dvou komplementárních oligonukleotidových primerů (sekvence id. č. 38 a 39) aby se mutovala Sací rozpoznávací sekvence a dále dvou vnějších primerů (sekvence id. č. 4é a 41) pro vlastní amplifikací produktu. Dva páry primerů (sekvence id. č. 38 a 41 a sekvence id. č. 39 a 40) byla užity ve standardní PCR k získání 2 počátečních PCR produktů, které byly izolovány elektroforézou ve 2% agarózovém gelu. Ekvimolární množství každého produktu byla smíchána a byla provedena reamplifikace pomocí vnějších primerů (sekvence id. č. 40 a 41) za standardních podmínek PCR, aby se spojil a amplifikoval výsledný produkt PCR. Tento produkt byl pak štěpen restrikčními enzymy Ncol a HindlII a klonován do vhodně naštěpeného a připraveného vektoru pNG3, takže mutovaný fragment (minus Sací místo) nahradil původní NcolHindlII fragment (plus Sací místo) z pNG3. Tento nový vektor byl pojmenován pNG4.
Klon myšího lehkého řetězce protilátky 806.077 ve vektoru Bluescript KS+ (VK4) byl použit pro amplifikaci pomocí primerů 077VK-UP (sekvence id. č. 12) a 077VK-DOWN (sekvence id. č.
13'
Podobně klon těžkého řetězce protilátky 806.077 (VH14A) byl použit pro amplifikaci pomocí primerů 077VH-UP (sekvence id. ě. 14) a 077VH-DOWN (sekvence id. č. 15). PCR byla provedena následujícím způsobem; Ke 10 0 ng plazmidové DNA bylo přidáno 5 μΐ směsi všech dNTP (2,5mM), 5 μί lOx enzymového pufru (viz výše), 1 μί zpětného primerů 25ρπιο1/μ1, 1 μΐ předního primerů 25ρπιο1/μ1, 0,5 μΐ termostabilní DNA polymerázy a objem byl doplněn na 50 μΐ
9· 9999
99 » 9 9 9 • 99
9 9 9
9 9
99
53vodou ošetřenou DEPC. Podmínky pro PCR byly: 15 cyklů 94°C, 90 s, 55°C, 60s, 72°C, 120 s a poslední cyklus byla ukončen další lOmin inkubací při 72 °C. Produkty byly analyzovány elektroforézou na 2% agarózovém gelu. DNA byla purifikována a fragmenty DNA byly štěpeny odpovídajícími restrikčními enzymy a připraveny pro následné klonování.
Pro sekreci lehkého řetězce protilátky byla navržena kazeta dvoj řetězcové DNA obsahující jak Kozákovu rozpoznávací sekvenci tak i signální sekvenci lehkého řetězce. Kazeta obsahovala dva individuální oligonukleotidy (sekvence id. č. 42 a 43) , které byly hybridizovány a pak klonovány mezi restrikční místa HindiII a Sací plazmidu pNG3 (který byl vhodným způsobme naštěpen a izolován standardním způsobem), aby se vytvořil vektor pNG3-Vkss. Sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 46, která obsahuje sekvenci konstantního úseku lidského lehkého řetězce kappa, byla naštěpena Xmal a Xhol a vložena do pNG-Vkss naštěpeného Xhol a Xmal, čímž vznikl vektor pNG3-Vkss-HuCk (NCIMB č. 40798).
Dále byla do pNG3-Vkss-HuCk klonována genová expresní kazeta pro rezistenci k neomycinu (z vektoru pSG5-Neo, který je variantou pSG3, a byl získán od S. Greena, Zeneca Pharmaceuticals, alernativním zdrojem je např. pMCIneo, Stratagene, kat. č. 213201) . Genová expresní kazeta pro rezistenci k neomycinu byla klonována jako Xbal fragment do Xba I místa pNG3-Vkss-HuCk a orientace byla ověřena štěpením restrikčními enzymy. Tak vznikl plazmid pNG3-Vkss-HuCk-neo (NCIMB 40799).
Sekvence lehkého řecězce popsané v předchozím textu byly klonováním vloženy, ve shodě se čtecím rámcem, přímo mezi Sací a Xhol místa vektoru pNG3-Vkss-HuCk-neo. Fragment PCR získaný pro gen lehkého řetězce byl naštěpen restrikčními enzymy Sací a Xhol a klonován do obdobně ····
I · « • · » · «
I · · « • 9 *· ·· *·· «· ·· • · · · • 9 99
999 · · • · · ·· ··
-54naštěpeného expresního vektoru obsahujícího signální sekvenci VK a kódující sekvenci konstantního úseku HuCK. Vytvořená chimérická sekvence lehkého řetězce protilátky 806.077 je zde ukázána jako sekvence id. 16 a 17.
Podobně pro sekreci těžkého řetězce protilátky byla navržena kazeta dvoj řetězcové DNA obsahující jak Kozákovu rozpoznávací sekvenci tak i signální sekvenci těžkého řetězce. Kazeta obsahovala dva individuální oligonukleotidy (sekvence id. č. 44 a 45), které byly hybridizovány a pak klonovány mezi restrikční místa HindlII a EcoRI plazmídu pNG4 (který byl vhodným způsobme naštěpen a izolován standardním způsobem), aby se vytvořil vektor pNG4-VHss.
Sekvence genu těžkého řetězce pak byly klonováním přímo vloženy, ve shodě se čtecím rámcem, mezi EcoRI a Sací místa vektoru pNG4-VHss. Sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 47 obsahující kódující sekvenci konstantního úseku lidského těžkého řetězce IgG2CHl' (sekvence id. č. 22 a 23) byla naštěpena Sací a Xmal a klonována do pNG4-VHss štěpeného Sací a Xmal, čímž vznikl vektor pNG4-VHssKuIgG2CHl' (NCIMB č. 40797).
Fragment PCR získaný pro gen těžkého řetězce byl naštěpen restrikčními enzymy EcoRI a Sací a klonován do obdobně naštěpeného expresního vektoru pNG4-VHss-HuIgG2CHl' obsahujícího signální sekvenci VH a kódující sekvenci konstantního úseku HuIgG2CHl'. Vytvořená chimérická sekvence řetězce HuIgG2 Fd protilátky 806.077 je zde ukázána jako sekvence id. č. 18 a 19.
V některých případech může být výhodné použít jiné třídy chimérických konstruktů těžkého řetězce Fd. Pro tento účel byly vytvořeny varianty vektorů těžkého řetězce obsahující HulgGICHl' (sekvence id. č. 2é a 21) nebo • ·
• · · ·
-55HuIgG3CHl' (sekvence id. č. 24 a 25), které nahrazují gen HuIgG2CHl' (sekvence id. č. 22 a 23) .
Sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 46 a 47 byly získány různými metodami, k nimž patří postupy, které publikovali Edwards, 1987, Am. Biotech. Lab, 5, 38-44, Jayaraman et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 4084-4088, Foguet a Lubbert, 1992, Biotechniques, 13, 674675, a Pierce, 1994, Biotechniques 16, 703. Výhodně jsou sekvence id. č. 4 6 a 4 7 připraveny pomocí PCR podobné té, kterou popsali Jayaraman et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 4084-4088.
Jakmile byly zkonstruovány jednotlivé sekvence těžkého a lehkého řetězce, expresní kazeta těžkého řetězce Fd, včetně promotoru a genu, byla vystřižena jako BglII/SalI fragment a klonována mezi BglI a Sáli místa vektoru lehkého řetězce, aby se tak vytvořil ko-expresní vektorový konstrukt. Tento konstrukt byl transfekován do myelomových buněk NS0 (ECACC č. 85110503) standardním způsobem elektroporací a transfekované buňky pak byly selektovány na základě rezistence k G418, což je znak nesený plazmidovým konstruktem jako selektovatelný markér.
Alternativně se úplné geny těžkého řetězce Fd a lehkého řetězce mohou jednoduše vystřihnout z příslušných vektorů jako HindlII/Xmal fragmenty a pak klonovat do jiných expresních vektorových systémů.
Příklad 9
Hybridizační test variant specifických sekvencí nukleové kyseliny
-569.1. Hybridizační test
Způsob detekce variantních nukleových kyselin obsahujících sekvence příbuzné se specifickými sekvencemi protilátky 806.077 je popsán. Variantní nukleové kyseliny mohou byt přítomny v různých formách jako je DNA z bakteriálních kolonií nebo DNA/RNA z eukaryotických buněk fixovaných na membránu jak bylo popsané v předchozím textu týkajícím se screeningu cDNA knihovny nebo jako fragmenty purifikované nukleové kyseliny separované gelovou elektroforézou a přenesené na vhodnou membránu jak se používá v „northernovém hybridizačním přenosu (viz Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Seccnd Edition, 1989 , kapitola 7, str. 39) nebo Southernově hybridizačním přenosu (viz Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989 , kapitola 9, str. 31).
9
I
-579.2. Hybridizačni sonda
Hybridizačni sondy mohou být vytvořeny z jakéhokoliv fragmentu DNA nebo RNA kódujícího sekvenci specifickou pro protilátku 806.077, zejména z variabilního úseku, zvláště pak z úseku CDR3. Syntetický oligonukleotid nebo jeho komplementární sekvence se může použít jako specifická sonda pro kódující úsek CD3.
Hybridizační sonda se může vytvořit ze syntetického oligonukleotidů 5' adicí radioaktivní fosfátové skupiny z [y-3iP]ATP působením T4 polynukleotidylkinázy. 20 pmol oligonukleotidů se přidá do 20 μΐ reakce obsahující lOOmM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM MgCl2, 0,lmM spermidin, 20mM dithiotreitol (DTT) , 7,55 μΜ ATP, 55 μCi [γ-32Ρ]ΑΤΡ a 2,5 U T4 polynukleotidylkinázy (Pharmacia Biotechnology Ltd., Uppsala, Sweden) . Reakce se inkubuje 30 minut při 37 °C a pak 10 minut při 70 °C před tím, než se použije k hybridizaci. Způsoby přípravy hybridizační sondy z oligonukleotidů (kapitola 11) nebo z fragmentů DNA a RNA (kapitola 10) jsou popsány v publikaci Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989. Existuje také řada dostupných souprav speciálně vhodných pro tento účel.
9.3. Hybridizační podmínky
Filtry obsahující nukleovou kyselinu se pre-hybridizuj i ve 100 ml roztoku obsahujícím 6xSSC, 0,1% SDS a 0,25% sušené odstředěné mléko (Marvel™) při 65 °C po nejméně jednu hodinu ve vhodné uzavřené nádobě. Speciální hybridizační přístroj jako je např. model HB-1 (Techne Ltd.) poskytuje reprodukovatelné podmínky pro takový experiment.
• · ·« • · · • · ·
-58Pre-hybridizační roztok se pak nahradí 10 ml hybridizačniho roztoku se sondou obsahujícího 6 x SSC, 0,1% SDS, 0,25% sušené odstředěné mléko (Marvel™) a sondu, připravenou postupem popsaným v předchozím textu. Filtry se inkubují v tomto roztoku 5 minut při teplotě 65 °C a pak se nechá teplot a pomalu klesat na 3 0 °C. Roztok se sondou je pak odstraněn a filtry se 5 minut promýva j í ve 10 0 mi roztoku 6 x SSC, 0,1% SDS při teplotě místnosti. Další promývání se opakuje ve stejném roztoku při 3 0 °C a pak v rostoucí teplotě po 10°C až do 60 °C po 5 minutách.
Po promytí se filtry usuší a exponují se na rentgenové filmy jako je např. Hyperfilm™ MP (Amersham International) při -70 °C ve světlotěsné kazetě použitím zesilovacího wolframového stínítka k zesíleni fotografického obrazu. Film se exponuje po vhodnou dobu (obvykle přes noc) než se vyvolá, aby se projevil fotografický obraz radioaktivních oblasti na filtru. Příbuzné sekvence nukleové kyseliny se identifikují na základě přítomnosti fotografického otisku ve srovnání se zcela nepříbuznými sekvencemi, které nedávají žádný obraz. Obecně příbuzné sekvence budou pozitivní i při nejvyšší promývací teplotě (60°C). Avšak příbuzné sekvence se mohou ukázat jako pozitivní při nižších promývacích teplotách (50, 40 nebo 30°C).
Výsledky budou také závislé na druhu použité sondy. Sondy, které jsou tvořeny delšími fragmenty nukleové kyseliny vyžadují delší hybridizaci, ale zůstávají dobu a vyšší teplotu pro hybridizované s příbuznými sekvencemi při vyšší promývací teplotě a/nebo při nižší koncentraci solí. Kratší, smíšené nebo degenerované oligonukleotidové sondy vyžaduji méně stringentní (přísné) promývací podmínky jako je např. nižší teplota a/nebo vyšší koncentrace Na+. Diskuse týkající se předpokladů pro • · · · • 0 · · • 0 • 0 • 00 0
-59hybridizační postupy lze najít v publikaci Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989 (kapitola 11) .
Příklad 10
Farmaceutické přípravky
Následující příklad ilustruje reprezentativní farmaceutické lékové formy obsahující protilátku 806.077, které se mohou použít pro léčení v kombinaci s vhodným předlékem.
Roztok pro injekce pro systém ADEPT
Sterilní vodný roztok pro injekce obsahuje na 1 ml roztoku:
konjugát „protilátka 806.077-CPG2 1,0 mg trihydrát octanu sodného 6,8 mg chlorid sodný 7,2 mg
Tween 20 0,05 mg
Typická dávka konjugátu pro dospělého člověka je 30 mg následována po 3 dnech třemi lg dávkami předléku podávaného v hodinových intervalech. Vhodným konjugátem CPG2 je kterýkoliv z konjugátu popsaných v příkladech 105 a 106. Konjugáty HCPB mohou nahradit CPG2 konjugáty v tabulce. Vhodné HCPB konjugáty jsou kterékoliv z konjugátů popsaných v příkladech 48 až 101.
• · • · • · · ·
• · · • · · · • · · · • · · fr
-60-
Roztok pro injekce pro nádorovou imunoterapii
Sterilní vodný roztok pro inj ekce obsahuj e
roztoku:
konjugát „protilátka 806.077 -B7 1,0 mg
trihydrát octanu sodného 6,8 mg
chlorid sodný 7,2 mg
Tween 20 0,05 mg
Typická dávka konjugátu pro dospělého člověka je 30 mg. Vhodný konjugát je popsán v příkladu 104.
Příklad 11
Konstrukce počátečních genů těžkého a lehkého řetězce humanizované protilátky 806.077
V následujícím textu je nejdříve přehledně uvedena strategie humanizace protilátek. Cílem humanizace protilátek je zkombinovat vazebné místo protilátky jiné než lidské s podpůrnou kostrou (základní strukturou) lidské protilátky, přičemž se uchová vazebná afinita pro chararkteristický antigen původní protilátky. Proveditelnost takových úprav protilátek je důsledkem silné sekvenční a strukturní homologie imunoglobulinů různých druhů savců.
V základní podobě takový přístup zahrnuje přenos šesti hypervariabilních úseků nebo komplementaritu určujících úseků (CDR) z úseku Fv jedné protilátky do druhé protilátky, tak jak to poprvé popsali Jones et al. , Nátuře, 1986, 321,
522-525. Ale zkušenost ukázala, že kromě úseků CDR je často potřeba přenést aminokyseliny kostry protilátky, aby byl celý proces úspěšný, neboř tato rezidua kontaktují a ovlivňují konformaci smyček CDR.
V tomto případě z protilátky 806.077 byla vytvořena „počáteční humanizovaná verze protilátky obsahující 6
-61myších CDR a několik substituovaných reziduí z kostry protilátky. Tento konstrukt byl použit jako templát, ze kterého byly vytvořeny další varianty (viz příklady 12 až 47) tak, že se zavedly další substituce „myších reziduí. Další část tohoto příkladu popisuje podrobně počáteční humanizovaný konstrukt.
Variabilní úsek těžkého řetězce lidské protilátky NEWM (Poljak, R.J. et al . , 1974, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 71,
3440-3444) a variabilní úsek lehkého řetězce kappa REI (Palm, W. a Hilschmann, N.Z., 1975, Physiol. Chem., 356,
167-191) byly vybrány jako akceptorová kostra lidské protilátky. Četné příklady úspěšné humanizace použitím této Fv kostry byly popsány v literatuře a byly vyřešeny trojrozměrné struktury těchto dvou proteinových domén. Na základě srovnání proteinových sekvencí variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce myší 806.077 s nejblíže příbuznou podskupinou myších konsensuálních sekvencí dle Kabata (s jednotlivými členy) a lidskými proteinovým sekvencemi NEWM a REI, byly navrženy jednotlivé sekvence DNA kódující počáteční humanizovanou protilátku, které obsahují myší CDR a jakékoliv další substituce v kostře, které jsou považovány za důležité.
Sekvence CDR myší protilátky 806.077 jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 26, 27 a 28 pro variabilní úsek lehkého řetězce a nalézají se v polohách 23 až 34 (CDR1) , 50 až 56 (CDR2) a 89 až 97 (CDR3) . Sekvence CDR variabilního úseku těžkého řetězce jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 29, 30 a 31 a vyskytují se v polohách 31 až 35 (CDR1) , 50 až 65 (CDR2) a 95 až 102 (CDR3) (podle Rabatový nomenklatury) . Ve variabilním úseku těžkého řetězce byly provedeny ještě další změny v kostře NEWM, a sice V24A, S27F, T28N, F29I, S30K, • · • ·
62V71A, A92H, R93V (nomenklatura dle Kabata) , ve variabilním úseku lehkého řetězce nebyly provedeny žádné změny.
Jednotlivé syntetické sekvence DNA byly navrženy tak, aby kódovaly počáteční verzi variabilních úseků těžkého řetězce (306.077HuVHl) a lehkého řetězce (806.077HuVKl) humanizované protilátky 806.077, do kterých byly vloženy úseky CDR a další změny reziduí v kostře protilátky. Variabilní genové sekvence protilátky uvedené jako sekvence id. č. 4 8 a 53 se mohou připravit různými metodami, k nimž patří postupy, které publikovali Edwards, 1987, Am. Biotech. Lab, 5, 38-44, Jayaraman et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 4084-4088, Foguet a Lubbert, 1992, Biotechniques, 13, 674-675, a Pierce, 1994, Biotechniques 16, 708. Výhodně jsou sekvence id. č. 48 a 53 připraveny pomocí PCR podobné té, kterou popsali Jayaraman et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 4084-4088.
Variabilní genová sekvence lehkého řetězce (sekvence id. č. 49 a 50) humanizované protilátky 806.077 byla vložena, v souladu se čtecím rámcem, klonováním do expresního vektoru pNG3-Vkss-HuCK-Neo (NCIMB č. 40799) . Pro tento účel byl syntetický PCR fragment kódující humanizovaný gen lehkého řetězce (sekvence id. č. 48) naštěpen restrikčními enzymy Sací a Xhol a klonován do obdobně naštěpeného vektoru pNG3-Vkss-HuCK-Neo obsahujícího signální sekvenci VK a kódující sekvenci konstantního úseku HuCK. Sekvence DNA a proteinová sekvence vzniklého úplného humanizovaného lehkého řetězce 806.077 (806.077HuVKl-HuCK), společně s jeho signální sekvencí, jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 51 a 52 a vektor byl pojmenován pNG3-Vkss806.077HuVKl-HuCK-Neo.
Podobně se postupovalo s těžkým řetězcem humanizované protilátky, variabilní genová sekvence těžkého řetězce • · · • · • ·
-62V71A, A92H, R93V (nomenklatura dle Kabata), ve variabilním úseku lehkého řetězce nebyly provedeny žádné změny.
Jednotlivé syntetické sekvence DNA byly navrženy tak, aby kódovaly počáteční verzi variabilních úseku těžkého řetězce (806.077HuVHl) a lehkého řetězce (806.077HuVKl) humanizované protilátky 306.077, do kterých byly vloženy úseky CDR a další změny reziduí v kostře protilátky. Variabilní genové sekvence protilátky uvedené jako sekvence id. č. 48 a 53 se mohou připravit různými metodami, k nimž patří postupy, které publikovali Edwards, 1987, Am. Biotech. Lab, 5, 38-44, Jayaraman et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 4084-4088, Foguet a Lubbert, 1992, Biotechniques, 13, 674-675, a Pierce, 1994, Biotechniques 16, 708. Výhodně jsou sekvence id. č. 48 a 53 připraveny pomocí PCR podobné té, kterou popsali Jayaraman et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 4084-4088.
Variabilní ^genová sekvence lehkého řetězce (sekvence id. č. 49 a 50) humanizované protilátky 806.077 byla vložena, v souladu se čtecím rámcem, klonováním do expresního vektoru pNG3-Vkss-HuCK-Neo (NCIMB č. 40799). Pro tento účel byl syntetický PCR fragment kódující humanizovaný gen lehkého řetězce (sekvence id. č. 48) naštěpen restrikčními enzymy Sací a Xhol a klonován do obdobně naštěpeného vektoru pNG3-Vkss-HuCK-Neo obsahujícího signální sekvenci VK a kódující sekvenci konstantního úseku HuCK. Sekvence DNA a proteinová sekvence vzniklého úplného humanizovaného lehkého řetězce 806.077 (806.077HÚVK1-HuCK), společně s jeho signální sekvencí, jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 51 a 52 a vektor byl pojmenován pNG3-Vkss806.077HÚVK1-HuCK-Neo.
Podobně se postupovalo s těžkým řetězcem humanizované protilátky, variabilní genová sekvence těžkého řetězce •63(sekvence id. č. 54 a 55) humanizované protilátky 806.077 byla klonováním vložena, v souladu se čtecím rámcem, přímo do expresního vektoru pNG4-VHss-HuIgG2CHl' (NCIMB č. 40797). Pro tento účel byl syntetický PCR fragment humanizovaný gen těžkého řetězce (sekvence id naštěpen restrikčními enzymy EcoRI obdobně naštěpeného vektoru obsahujícího signální sekvenci VH kóduj ící č. 53) a Sací a klonován do pNG4-VHs s-HuIgG2 CH1' a kódující sekvenci
tak, že se zkonstruoval
oba geny pro variabilní i
1 a lehkého řetězce 806
konstantního úseku HuIgG2CHl'. Sekvence DNA a proteinová sekvence vzniklého úplného humanizovaného těžkého řetězce 806.077Fd (806.077HuVHl- HuIgG2Fd), společně s jeho signální sekvencí, jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 56 a 57 a vektor byl pojmenován pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHl'.
Počáteční konstrukt humanizované protilátky byl připraven tak, obsahující c 806.077HuVHl
Plazmidový vektor pNG3-Vkss-806.077HuVKl-HuCK-Neo obsahující variabilní úsek HuVKl (sekvence id. č. 4 9 a 50) humanizovaného lehkého řetězce byl naštěpen restrikčními enzymy BamHI a Sáli, pak byl rozdělen na 1% agarózovém gelu a vektorový pás byl vyříznut a purifikován. Plazmid pNG4VHss-806.077HuVHl- HuIgG2CHl' (obsahující variabilní úsek humanizovaného těžkého řetězce 806.077HuVHl, sekvence id. č. 56 a 57) byl štěpen restrikčními enzymy BglI a Sáli, reakční směs pak byla rozdělena elektroforézou na 2% agarózovém gelu a pás odpovídající fragmentu byl vyříznut a purifikován. Takto získaný fragment DNA byl pak ligován do připraveného vektoru pNG3-Vkss-806.077HuVKl-HuCK-Neo, čímž byly připraveny klony požadovaného ko-expresního vektoru HuVHl/HuVKl.
• 0 • 0
-64Tyto konstrukty byly transfekovány do myelomových buněk NSO (ECACC č. 85110503) standardními technikami elektroporace a transfekované buňky byly selektovány na rezistenci k antibiotiku G418. Získané klony byly testovány jak na expresi protilátky v testech ELISA s anti-lidskou Fd protilátkou a ELISA na vazbu s CEA, které jsou popsány v násleujícím textu.
Pro CEA-ELISA test bylo všech 96 jamek imunodestíčky (NUNC MAXISORB™) potaženo 50 ng CEA v 5 0mM karbonát/bikarbonátovém potahovacím pufru pH 9,6 (pufrové tablety Sigma C3041) a inkubovány ve 4 °C přes noc. Destičky pak byly opláchnuty třikrát v PBS + 0,05% Tween 2 0 a pak blokovány 150 μΐ 1% BSA v PBS + 0,05% Tween 20 v každé jamce 1 hodinu při 20 °C. Pak byly destičky opláchnuty stejně jako předtím a do každé jamky se přidalo 100 μΐ testovaného roztoku a destičky se inkubovaly 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se destičky opět třikrát opláchly v PBS + 0,05% Tween 20, a do každé jamky se přidalo 100 μΐ kozí anti-lidské kappa protilátky (Sigma A7164) značené HRPO v roztoku 1% BSA v PBS-Tween a destičky se inkubovaly při teplotě místnosti na houpací plošině alespoň 1 hodinu. Destičky byly opláchnuty jako předtím a pak ještě jednou PBS. Pro detekci vazby se přidalo 100 μΐ vyvíjecího roztoku do každé jamky (1 tableta fosfát-citrátovéo pufru Sigma P4922 rozpuštěná ve 100 ml H20 s přídavkem jedné 3 0 mg tablety dihydrochlorídu o-fenylen-diaminu Sigma P8412) a destičky se inkubovaly 15 minut. Reakce byla zastavena přidáním 75 μΐ 2M H2SO4 a pak se měřila absorbance při 490 nm.
V testu ELISA s anti-lidskou Fd protilátkou byla každá jamka 96jamkové imunodestičky potažena 1,2 μυ ovčí antilidské Fd protilátky (vazebné místo PC075) v 50mM • · * ’ - . · . · · · • · . · · · · ··· * * ·..··..· .:. .:. .· ..
-65karbonát/bikarbonátovém potahovacím pufru pH 9,6 (pufrove tablety Sigma C3041) a inkubovány ve 4 °C přes noc. Destičky pak byly opláchnuty třikrát v PBS + 0,05% Tween 20 a pak blokovány 150 μΐ 1% BSA v PBS + 0,05% Tween 20 v každé jamce 1 hodinu při 20 °C. Pak byly destičky opláchnuty stejně jako předtím a do každé jamky se přidalo 100 μΐ testovaného roztoku a destičky se inkubovaly 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se destičky opět třikrát opláchly v PBS + 0,05% Tween 20, a do každé jamky se přidalolOO μΐ kozí antilidské kappa protilátky (Sigma A7164) značené HRPO v roztoku 1% BSA v PBS-Tween a destičky se inkubovaly při teplotě místnosti na houpací plošině alespoň 1 hodinu. Destičky byly opláchnuty jako předtím a pak ještě jednou PBS. Pro detekci vazby se přidal vyvíjecí roztok a postupovalo se stejně jako je popsáno v předchozím textu pro CEA test.
Klony, které vykazovaly nej lepší úroveň exprese CEA byly selektovány pro další růst ve 24jamkových destičkách a znovu testovány. Nej lepší klon podle kritérií těchto testů byl vybrán a namnožen v llitrové produkční kultuře, která byla připravena ředěním 1:10 konfluentní kultury (t.j. 100 ml do 900 ml čerstvého kultivačního média) a pěstována dalších 14 dní. Fragment F(ab')2 lidské protilátky byl pak purifikován ze supernatantu této kultury postupem popsaným v příkladu 102.
Příklady 12 až 38
Další kombinace variant genů variabilních úseků humanizovaného těžkého a lehkého řetězce: Konstrukce variant variabilního úseku 806.077 humanizovaného těžkého a lehkého řetězce
Geny počátečního variabilního humanizovaného 806.077 úseku byly využity také pro následnou přípravu dalších • · • ΦΦΦ
ΦΦΦ φ φ · ·
-66genových konstruktů, které obsahovaly další rezidua kostry myší protilátky. Modifikace genových sekvencí byla provedena (ve většině případů) kazetovou mutagenezí. Tato technika spočívala v tom, že část původního genu se odstranila pomocí vhodných jedinečných restrikčních enzymů z původního úplného pl 3. zmidového vektoru a byla nahrazena kazetou dvouřetězcová DNA (obsahující dva komplementární oligonukleotidy navzájem hybridizované do fragmentu DNA s vhodnými kohezivními konci) metodou přímé iigace do připraveného plazmidu, čímž se rekonstituoval gen, ale nyní obsahující požadované změny v DNA. Další kombinace mutací ať už těžkého nebo lehkého řetězce může být vytvořena jednoduchou výměnou fragmentů DNA mezi vhodnými variantami využitím dostupných jedinečných míst pro restrikční enzymy.
Kromě původní sekvence HuVKl (sekvence id. č. 4 9 a 50) byly vytvořeny další varianty humanizovaného variabilního úseku lehkého řetězce, které byly nazvány HuVK2, HuVK3 a HuVKl. Variabilní úsek lehkého řetězce varianty HuVK2 je modifikací původní kódující sekvence HuVKl, která vede k aminokyselinové záměně M4L (dle Kabatovy nomenklatury) v důsledku kazetové mutageneze genu (sekvence id. č. 49) . Plazmid pNG3-Vkss-806.077HuVKl-HuCK-Neo (obsahující úplný humanizovaný lehký řetězec, sekvence id štěpen restrikčními enzymy Sací a Nhel byl rozdělen elektroforézou na 2%
č. 4 9 a 50) byl Naštěpený plazmid agarózovém gelu a vyštěpený fragment byl oddělen od zbytku vektoru. DNA vektoru byla vyříznuta z gelu, izolována a uchována při -20°C. Dva oligonukleotidy (obsahující požadovanou změnu) byly navrženy a syntetizovány (sekvence id. č. 58 a 59) . Tyto oligonukleotidy byly hybridizovány tak, že se přidalo 200 pmol každého oligonukleotidu do celkového objemu 30 μΐ H20, směs se zahřála na 95 °C a nechala pomalu chladnout na
0
-673 0 °C. 100 pmol výsledného spojeného produktu bylo přímo ligováno do předem připraveného vektoru. Tato kazetová výměna DNA vedla k vytvoření požadované DNA a proteinové sekvence HuVK2 (sekvence id. č. 60 a 61) umístěné již v expresním vektoru pNG3-Vkss-806.077HuVK2-HuCK-Neo.
Podobně byla vytvořena varianta HuVK3 se změnami aminokyselin D1Q, Q3V a M4L (nomenklatura dle Kabata) použitím syntetických oligonukleotidů (sekvence id. č. 62 a 63), která vedla k vytvoření požadované DNA a proteinové sekvence HuVK3 (sekvence id. č. 64 a 65) umístěné již v expresním vektoru pNG3-Vkss-806.077HuVK3-HuCK-Neo.
Varianta variabilního úseku lehkého řetězce HuVK4 byla vytvořena jiným způsobem, jelikož nebyla k dispozici vhodná jedinečná restrikční místa v blízkosti mutovaného místa. Varianta HuVK4 s aminokyselinovou záměnou L47W byla vytvořena PCR mutagenezí. Vektor pNG3-Vkss-806.077HuVKlHuCK-Neo byl použit jako templát ve dvou PCR reakcích (94 °C, 90 s, 55°C, 60 s, 72 °C, 120 s, 15 cyklů, pufry a ostatní podmínky shodné s předchozím popisem). V reakci A byly použity syntetické oligonukleotidové primery se sekvencemi id. č. 66 a67 a v reakci B byly použity syntetické oligonukleotidové primery se sekvencemi id. č. 68 a 69. Výsledkem těchto dvou PCR reakcí (A a B) byly fragmenty o délce 535 bp a 205 bp. Reakční produkty byly rozděleny elektroforézou na 2% agarózovém gelu a separovány od znečištujících produktů. Pásy očekávané délky byly vyříznuty z gelu a izolovány. Byly připraveny směsi různých množství produktů A a B a byla provedena PCR reakce se syntetickými oligonukleotidy sekvencí id. č. 66 a 68.
Výsledný produkt (asi 700 bp) byl naštěpen restrikčními
enzymy SacII a Xhol a štěpný produkt byl separován
elektroforézou na 2% agarózovém gelu. Pás očekávané
·· ····
68velikosti 310 bp byl vyříznut z gelu a izolován. Fragment byl pak ligován do vektoru pNG3-Vkss-806.077HuVKl-HuCK-Neo (který byl předtím štěpen restrikčními enzymy SacII/Xhol a izolován)a tak byla vytvořena požadovaná DNA a proteinová sekvence HuVK4 (sekvence id. č. 70 a 71) v expresním vektoru pNG3-Vkss-8 0 6.07 7HuVK4-HuCK-Neo.
Kromě původní sekvence KuVHl (sekvence id. č.54 a 55) bylo vytvořeno 6 dalších variant humanizovaného variabilního úseku těžkého řetězce, které byly nazvány HuVH2 až HuVH7. Variabilní úsek těžkého řetězce varianty HuVH2 byl modifikací původní kódující sekvence HuVHl, která vedla k aminokyselinové záměně G49A (dle Kabatovy nomenklatury) v důsledku kazetové mutageneze genu (sekvence id. č. 54) . Plazmid pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHl' (obsahující úplný humanizovaný těžký Fd řetězec IgG2, sekvence id. č. 56 a 57) byl štěpen restrikčními enzymy Stul a Notl. Naštěpený plazmid byl rozdělen elektroforézou na 2% agarózovém gelu a vyštěpený fragment byl oddělen od zbytku vektoru. DNA vektoru byla vyříznuta z gelu, izolována a uchována při -20°C. Dva oligonukleotidy byly navrženy a syntetizovány (sekvence id. č. 72 a 73), hybridizovány a produkt byl přímo ligován do předem připraveného vektoru. Tato kazetová výměna DNA vedla k vytvoření požadované DNA a proteinové sekvence HuVH2 (sekvence id. č. 74 a 75) umístěné již v expresním vektoru pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CHl'.
Podobně byla vytvořena varianta HuVH3 se změnami aminokyselin T73S a F78A (nomenklatura dle Kabata) použitím syntetických oligonukleotidů (sekvence id. č. 76 a 77), avšak v tomto případě byl vektor pNG4-VHss-8Q6.077HuVHlHuIgG2CHl' štěpen restrikčními enzymy Notl a SacII. Syntetická DNA kazeta byla přímo ligována do předem připraveného vektoru, což vedlo k vytvoření požadované DNA
4 4
69Nhel v 2%
Nhel a vektorový klony obsahovaly a proteinové sekvence HuVH3 (sekvence id. č. 78 a 79) v expresním vektoru pNG4-VHss-806.077HuVH3-HuIgG2CHl'.
HuVH4 s aminokyselinovými záměnami G49A, T37S a F78A (nomenklatura dle Kabata) kombinuje varianty HuVH2 (sekvence id. č. 74 a 75) a HuVH3 (sekvence id. č. 78 a 79) . Tato varianta byla získána naštěpením vektoru pNG4-VHss806.077HuVH3-HuIgG2CHl' restrikčními enzymy Notl a a izolováním fragmentu o velikosti asi 200 bp agarózovém gelu. Fragment byl izolován a pak ligován do vektoru pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CHl' (který byl předtím naštěpen restrikčními enzymy Notl a fragment byl izolován). Výsledné požadovanou DNA a proteinovou sekvenci HuVH4 (sekvence id. č. 80 a 81) v expresním vektoru pNG4-VHss-806.077HuVH4HuIgG2CHl'.
Varianta HuVH5 s aminokyselinovou záměnou V67A (nomenklatura dle Kabata) byla připravena použitím syntetických oligonukleotidú (sekvence id. č. 82 a 83). Opět vektor pNC-4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHl' byl naštěpen restrikčními enzymy Notl a SacII. Syntetická DNA kazeta byla ligována přímo do předem připraveného vektoru, čímž vznikl expresní vektor pNG4-VHss-806.077HuVH5-HuIgG2CHl' obsahující požadovanou DNA a proteinovou sekvenci HuVH5 (sekvence id. č. 84 a 85) .
Varianta HuVH6 s aminokyselinovými záměnami V67A, T73S a F78A (nomenklatura dle Kabata) byla připravena použitím syntetických oligonukleotidú (sekvence id. č. 86 a 87) . Pro tuto mutaci byl vektor pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHl' naštěpen restrikčními enzymy Notl a SacII. Syntetická DNA kazeta byla ligována přímo do předem připraveného vektoru, čímž vznikl expresní vektor pNG4-VHss-806.077HuVH6• · • · tt ··· ·
-70HuIgG2CHl' obsahující požadovanou DNA a proteinovou sekvenci HuVH6 (sekvence id. č. 88 a 89) .
Varianta HuVH7 s aminokyselinovými záměnami G49A, V69A a F78A (nomenklatura dle Kabata) ) kombinuje varianty HuVH2 (sekvence id. č. 74 a 75) a HuVH6 (sekvence id. č. 88 a 89). Tato varianta byla získána naštěpením vektoru pNG4-VHss806.077HuVH6-HuIgG2CHl' restrikčními enzymy Notl a Nhel a izolováním restrikčního fragmentu Notl/Nhel o velikosti asi 200 bp v 2% agarózovém gelu. Fragment byl izolován a pak ligován do vektoru pNG4-VHss-806.077KuVH2-HuIgG2CHl' (který byl předtím naštěpen restrikčními enzymy Notl a Nhel a vektorový fragment byl izolován). Výsledné klony obsahovaly požadovanou DNA a proteinovou sekvenci HuVH7 (sekvence id. č. 90 a 91) v expresním vektoru pNG4-VHss806.077HuVH7-HuIgG2CHl'.
Kombinace takových variant genu humanizovaných těžkých a lehkých řetězců bylo dosaženo vystřižením expresní kazety varianty těžkého řetězce Fd (včetně promotoru a genu vystřiženého jako BglII/SalI fragment) a klonováním tohoto fragmentu do míst BamHI/SalI vektoru nesoucího variantu lehkého řetězce, aby se vytvořil ko-expresní vektorový konstrukt. Seznam možných kombinací variant založených na variantách humanizovaného těžkého a lehkého řetězce popsaných v předchozím textu ukazuje následující tabulka.
• · • · · • · · · * ·· ·· • · · · • · * ·
-71Kombinace variant variabilních úseků humanizovaného těžkého a lehkého řetězce
Přík- lad č. variabilní úsek těžkého řetězce id. č . sevence variabilní úsek lekého řetězce id. č. sekvence ko-expresní plazmidový vektor
11 HuVHl 54 a 55 HuVKl 49 a 50 pNG 806HuVHl/HuVKl/HuIgG2
12 HuVHl 54 a 55 HuVK2 60 a 61 pNG 806HuVHl/HuVK2/HuIgG2
13 HuVHl 54 a 55 HuVK3 64 a 65 pNG 806HuVHl/HuVK3/HuIgG2
14 HuVHl 54 a 55 HuVK4 70 a 71 pNG 806HuVHl/HuVK4/HuIgG2
15 HuVH2 74 a 75 HuVKl 49 a 50 pNG 806HuVH2/HuVKl/HuIgG2
16 HuVH2 74 a 75 HuVK2 60 a 61 pNG 806HuVH2/HuVK2/HuIgG2
17 HuVH2 74 a 75 HuVK3 64 a 65 pNG 806HuVH2/HuVK3/HuIgG2
18 HuVH2 74 a 75 HUVK4 70 a 71 pNG 806HuVH2/HuVK4/HuIgG2
19 HuVH3 78 a 79 HuVKl 49 a 50 pNG 806HuVH3/HuVKl/HuIgG2
20 HuVH3 78 a 79 HUVK2 60 a 61 pNG 806HuVH3/HuVK2/HuIgG2
21 HuVH3 73 a 79 HuVK3 64 a 65 pNG 806HuVH3/HuVK3/HuIgG2
22 HuVH3 78 a 79 HuVK4 70 a 71 pNG 806HuVH3/HuVK4/HuIgG2
23 HuVH4 80 a 81 HuVKl 49 a 50 pNG 806HuVH4/HuVKl/HuIgG2
24 HuVH4 80 a 81 HUVK2 60 a 61 pNG 806HuVH4/HuVK2/HuIgG2
25 HuVH4 80 a 81 HuVK3 64 a 65 pNG 806HuVH4/HuVK3/HuIgG2
26 HuVH4 80 a 81 HuVK4 70 a 71 pNG 806HuVH4/HuVK4/HuIgG2
27 HuVH5 84 a 85 HuVKl 49 a 50 pNG 806HuVH5/HuVKl/HuigG2
28 HuVH5 84 a 85 HuVK2 60 a 61 pNG 806HuVH5/HuVK2/HuIgG2
29 HuVH5 84 a 85 HuVK3 64 a 65 pNG 806HuVH5/HuVK3/HuIgG2
30 HuVH5 84 a 85 HuVK4 70 a 71 pNG 806HuVH5/HuVK4/HuIgG2
31 HuVH6 88 a 89 HuVKl 49 a 50 pNG 806HuVH6/HuVKl/HuIgG2
32 HuVH6 88 a 89 HuVK2 60 a 61 pNG 806HuVH6/HuVK2/HuXgG2
33 HuVH6 88 a 89 HUVK3 64 a 65 pNG 806HuVH6/HuVK3/HuIgG2
34 HuVH6 88 a 89 HuVK4 70 a 71 pNG 806HuVH6/HuVK4/HuIgG2
35 HuVH7 90 a 91 HuVKl 49 a 50 pNG 806HuVH7/HuVKl/HuIgG2
36 HuVH7 90 a 91 HuVK2 60 a 61 pNG 806HuVH7/HuVK2/HuIgG2
37 HuVH7 90 a 91 HuVK3 64 a 65 pNG 806HuVH7/HuVK3/HuIgG2
38 HuVH7 90 a 91 HuVK4 70 a 71 pNG 806HuVH7/HuVK4/HuIgG2
·· «· ··»· ·» • · · · • · ·· • ···· · • · · »· ·» • · · ·· • · · · • · · · · • · · · · ·· ·· «»· ·
-72Obdobně jako v příkladu 11 byl konstrukt v příkladu 14 připraven tak, že se zkonstruoval ko-expresní plazmid obsahující oba protilátkové geny pro variabilní úseky těžkého řetězce 806.077HuVHl a lehkého řetězce 806.077HuVK4. V tomto případě byl plazmidový vektor pNG3-Vkss806.077HuVK4-HuCK-Neo obsahující variabilní úsek HuVK4 (sekvence id. č. 70 a 71) humanizovaného lehkého řetězce byl naštěpen restrikčními enzymy BamHI a Sáli, pak byl rozdělen na 1% agarózovém gelu a vektorový pás byl vyříznut a purifikován. Plazmid pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgC-2CHl' (obsahující variabilní úsek humanizovaného těžkého řetězce 806.077HuVHl, sekvence id. č. 56 a 57) byl štěpen restrikčními enzymy BglII a Sáli, reakční směs pak byla rozdělena elektroforézou na 2% agarózovém gelu a pás odpovídající fragmentu byl vyříznut a purifikován. Takto získaný fragment DNA byl pak ligován do připraveného vektoru pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo, čímž byly připraveny klony požadovaného ko-expresního vektoru HuVHl/HuVK4.
Stejně jako to bylo popsáno v příkladu 11 tyto konstrukty byly transfekovány do myelomových buněk NSO (ECACC č. 85110503) standardními technikami elektroporace a transfekované buňky byly selektovány na rezistenci k antibiotiku G418. Získané klony byly testovány jak na expresi protilátky v testech ELISA s anti-lidskou Fd protilátkou a ELISA na vazbu s CEA. Klony vykazující nej lepší expresi a nejvyšší úroveň vazby s CEA byly selektovány, namnoženy a produkt byl exprimován. Lidský protilátkový fragment F(ab')2 byl purifikován ze supernatantu kultury tak jak je popsáno v příkladu 102.
-73Příklady 39 až 47
Exprese humanizovaných fragmentů F(ab)2 s různými třídami konstantních úseků lidského těžkého řetězce
Další třídy konstruktů chimérického těžkého řetězce Fd se mohou použít. A sice byly připraveny další varianty vektorů těžkého řetězce obsahující buďto HulgGICHl' (sekvence id. č. 2 0 a 21) nebo HuIgG3CHl' (sekvence id. č. 24 a 115), jejichž konstantní úseky jsou náhradou za gen HuIgG2CHi' (sekvence id. č. 22 a 23). Vytvořené vektory jsou pNG4-VHss-HulgGICHl' a pNG4-VHss-HuIgG3CHl'. Požadovaný variabilní úsek těžkého řetězce protilátky se může vystřihnout z příslušného plazmidů pNG4-VHss-variabilní úsek VH-HuIgG2CHl' naštěpením restrikčními enzymy EcoRI a Sací a klonováním do obdobně naštěpeného vektoru pNG4VHss-HulgGICHl' nebo pNG4-VHss-HuIgG3CHl' se vytvoří úplná sekvence těžkého řetězce Fd. Jak již bylo popsáno v předchozím textu, jakmile jsou jednotlivé sekvence těžkého a lehkého řetězce připraveny, expresní kazeta genu těžkého řetězce Fd, obsahující promotor a gen, může být vystřižena štěpením restrikčními enzymy a získaný fragment pak klonován do vhodných míst vektoru s lehkým řetězcem, aby se vytvořil konečný ko-expresní vektor. Následující tabulka ukazuje příklady 39 až 47, ve kterých byly kombinovány různé variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce s mnoha různými třídami konstantního úseku lidského těžkého řetězce.
V příkladu 44 byl vektor pNG4-VHss-HulgGICHl' štěpen restrikčními enzymy EcoRI a Sací a vektorový fragment byl izolován, jak bylo popsané v předchozím textu. Variabilní úsek huVHl těžkého řetězce protilátky (sekvence id. č. 54 a 55) byl vystřižen z plazmidů pNG4-VHss-806.077HuVHlHuIgG2CHl' štěpením restrikčními enzymy EcoRI a Sací a fragment byl klonován do obdobně naštěpeného vektoru pNG4-
• · · · · · ι» · · » · ·
-74VHss-HuIgG3CHl' , čímž vznikla úplná sekvence humanizovaného těžkého Fd řetězce IgG3 (sekvence id. č. 94 a 95) v kompletním vektoru pNG4-VHss-806.077HuVHl-HuIgG3CHl'. Genová expresní kazeta těžkého řetězce Fd, zahrnující promotor a gen, byla vystřižena restrikčními enzymy a jako BglII/SalI fragment klonována do BamHI/SalI míst vektoru lehkého řetězce pNG3-Vkss-806.077HŮVK1-HuCK-Neo (který obsahuje humanizovaný lehký řetězec HuVKl-HuCK, sekvence id. č. 51 a 52), který byl naštěpen restrikčními enzymy BamHI a Sáli, rozdělen na 1% agarózovém gelu a purifikován jako vektorový pás. Tím byl vytvořen ko-expresní vektor pNG 806HuVHl/HuVK3/HuIgG3, z něhož může být exprimován humanizovaný protilátkový fragment 806.077HuVHl/HuVKlHuIgG3/Kappa Fd .
Př. humanizovaný id č. humanizo- id č. ko-expresní plazmidový
č. těžký sekven- váný lehký sekvenc vektor
řetězec ce řetězec e
39 HuVHl-HulgGI 92 a 93 HuVKl-HuCK 51 a 52 pNG 806HuVHl/HuVKl/HuIgGl
40 HuVHl-HuIgG2 56 a 57 HuVKl-HuCK 51 a 52 pNG 806HuVHl/HuVKl/HuIgG2
41 HuVHl-HuIgG3 94 a 95 HuVKl-HuCK 51 a 52 pNG 806HuVHl/HuVKl/HuIgG3
42 HuVHl-HulgGI 92 a 93 HuVK3-HuCK 96 a 97 pNG 806HuVHl/HuVK3/HuIgGl
43 HuVHl-HuIgG2 56 a 57 HuVK3-HuCK 96 a 97 pNG 806HuVHl/HuVK3/HuIgG2
44 HuVHl-HuIgG3 94 a 95 HuVK3-HuCK 96 a 97 pNG 806HuVHl/HuVK3/HuIgG3
45 HuVHl-HulgGI 92 a 93 HuVK4-HuCK 93 a 99 pNG 806HuVHl/HuVK4/HuXgGl
46 HuVHl-HuIgG2 56 a 57 HuVK4-HuCK 98 a 99 pNG 806HuVHl/HuVK4/HuIgG2
47 HuVHl-HuIgG3 94 a 95 HuVK4-HuCK 98 a 99 pNG 806HuVHl/HuVK4/HuIgG3
-75V příkladu 47 byl vektor pNG4-VHss-HuIgG3CHl' štěpen restríkčnimi enzymy EcoRI a Sací a vektorový fragment byl izolován. Variabilní úsek HuVHl těžkého řetězce protilátky (sekvence id. č. 54 a 55) byl vystřižen z plazmidů pNG4 VHss-806.077HuVHl-HuIgG2CHl' štěpením restríkčnimi enzymy EcoRI a Sací a fragment byl klonován do obdobně naštěpeného vektoru pNG4-VHss-HuIgG3CHl'. Tím vznikla úplná sekvence humanizovaného těžkého Fd řetězce IgG3 (sekvence id. č. 94 a 95) v kompletním vektoru pNG4-VHss-806.077HuVHiHuIgG3CHl'. Genová expresní kazeta těžkého řetězce Fd, zahrnující promotor a gen, byla vystřižena restríkčnimi enzymy jako BglII/SalI fragment a klonována do BamHI/SalI míst vektoru lehkého řetězce pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo (obsahujícího humanizovaný lehký řetězec HuVK4-HuCK, sekvence id. č. 98 a 99) , který byl naštěpen restríkčnimi enzymy BamHI a Sall, rozdělen na 1% agarózovém gelu a purifikován jako vektorový pás. Tím byl vytvořen koexpresní vektorový konstrukt pNG 806HuVHl/HuVK4/HuIgG3, z něhož může být exprimován humanizovaný protilátkový fragment HuVHl/HuVKl-HuIgG3/Kappa.Fd.
Další příklady ukázané v tabulce byly připraveny podobným způsobem jako popsané příklady 44 a 47. Avšak v případě konstruktů obsahujících lidský IgGl, konečný koexpresní vektorový konstrukt byl vytvořen klonováním genové expresní kazety těžkého řetězce Fd (obsahující promotor a gen) vystřižené jako BglII/BamHI fragment (protože není k dispozici vnitřní restrikční místo Sall v genu konstantního úseku HulgGICHl') a klonované do BamHI místa vhodně připraveného vektoru s lehkým řetězcem. V tomto případě se musela zkontrolovat orientace kazety s těžkým řetězcem. To bylo provedeno štěpením restríkčnimi enzymy (např. enzymem HindlII) a elektroforetickou analýzou • · • · · ·
-76výsledných fragmentů ve srovnání s fragmenty obdobně naštěpené verze HuIgG2 (viz příklady 11 až 38) . Pokud se vzorce fragmentů shodovaly pro oba konstrukty, je jisté, že kazeta těžkého řetězce byla zaklonována ve správné orientaci.
Stejně jako bylo popsáno v příkladu 11, tyto konstrukty byly transfekovány do myelomových buněk NSO (ECACC č. 85110503) standardními technikami elektroporace a transfekované buňky byly selektovány na rezistenci k antibiotiku G418. Získané klony byly testovány jak na expresi protilátky v testech ELISA s anti-lidskou Fd protilátkou a ELISA na vazbu s CEA, a klony vykazující nej lepší expresi a vazebnou úroveň CEA byly selektovány, namnoženy a kultivovány pro expresi. Podobně jako v předchozích případech lidský protilátkový fragment F(ab)2 byl izolován ze supernatantu příslušné kultury jak je popsáno v příkladu 102.
Příklad 48
Příprava fúzního proteinu „humanizovaný 806.077 F(ab')2 [A248S,G251T,D253K]HCPB
Tento příklad popisuje přípravu genu kódujícího fragment humanizovaného těžkého řetězce Fd 806.077 spojeného s [A248S,G251T,D253K]HCPB a jejich ko-expresi s genem kódujícím humanizovaný lehký řetězec 806.077 a genem kódujícím pro-doménu lidské karboxypeptidázy B, čímž vzniká protein F(ab')2 s molekulou [A248S,G251T,D253K]HCPB na C-konci každého fragmentu těžkého řetězce. Konstantní a kloubový úsek humanizovaného fragmentu těžkého řetězce Fd jsou odvozeny z izotypu lidské protilátky IgG3. Exprimovaný protein je také nazýván fúzním proteinem protilátka-enzym.
• ·
-77a) Příprava genu kódujícího fragment humanizovaného těžkého řetězce Fd 806.077 spojeného s [A248S,G251T,D253K]HCPB a jeho klonování do pEE6
Gen kódující humanizovaný 806.077 Fd spojený s [A248S, G251T, D253K]HCPB byl vytvořen pomocí PCR z pZEN1921 (viz příklad 2) .
První PCR byla připravena s templátem pZEN1921 (2 ng) a oligonukleotidy sekvence id. 100 a 101 (100 pmol každého) v pufru (100 μΐ) obsahujícím lOmM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM KCI, l,5mM MgCl2, 0,125mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP. Reakce byla inkubována 5 min při 94 °C, pak byla přidána termostabilní DNA polymeráza (2,5 U, 0,5 μΐ) a směs byla převrstvena minerálním olejem (100 μΐ) a pak byla reakční směs inkubována po 25 cyklů: 94 °C, 1 min, 53 °C, 1 min, 72°C, 2,5 min a nakonec ještě 10 min při 72°C. Produkt PCR velikosti 536 bp byl izolován elektroforézou v 1% agarózovém gelu (Agarose type I, Sigma katalog, č. A-6013)a pak byl vyříznut pás z gelu a fragment DNA izolován.
Druhá PCR byla připravena s templátem IgG3-pBSIIKS+ (8,7 ng, viz odkazy v příkladu 4) a oligonukleotidy sekvencí id. č. 102 a 103, výsledný fragment velikosti 954 bp byl izolován stejně jak je popsáno výše. Produkty z obou PCR (v koncentracích 0,2, 1,0 nebo 5,0 ng/ μΐ) byly smíchány v pufru pro PCR popsaném výše. Směs byly inkubována 5 min při 94 °C a pak v 10 cyklech 94OOOC, 1 min, 63 °C, 4 min. Oligonukleotidy sekvencí id. č. 102 a 103 (100 pmol každý)
PCR pufru (50 μΐ) byly přidány. Po inkubaci 3 min v 94 °C byla směs dále inkubována v 25 cyklech 94°C, 1 min, 53 °C, 2 min a 72 °C, 2 min a nakonec ještě 10 min při 72 °C. Tímto postupem byla báze G v poloze 508 sekvence id. č. 115 nahrazena baží A.
·»
-78PCR produkt velikosti 1434 bp byl izolován elektroforézou na 1% agarózovém gelu, purifikován a pak štěpen Nhel (20 U) a Xbal (80 U) (New England Biolabs, lne.) v celkovém objemu 100 μΐ obsahujícím lOmM Tris-HCl, pH 7,9, 50mM NaCl, lOmM MgCl2, lmM DTT a BSA (100 μg/μl) po 4 hodiny při 37 °C. Výsledný fragment byl znovu izolován elektroforézou na 1% agarózovém gelu a purifikován. V podobné štěpné reakci byl naštěpen vektor pNG4-VHss806.077huVHl-HuIgG2CHl' (10 μg, viz příklad 11) Nhel a Xbal a pak byla přidána telecí intestinální alkalická fosfatáza (1 μΐ , New England Biolabs, lne, 10 U/μΙ) k odstranění přesahujících 5'fosfátových skupin a reakce byla inkubována při 37 °C po 30 min. Fosfatázová aktivita byla ukončena inkubací v 70 °C po 10 minut. Plazmid naštěpený Nhel-Xbal byl purifikován z agarózového gelu. PCR produkt z výše popsané reakce (asi 500 ng) byl ligován do naštěpené plazmidové DNA (asi 200 ng) ve 20 μΐ reakci obsahující 50mM Tris-HCl, pH 7,8, lOmM MgCl2, lOmM DDT, lmMATP, 50 μg/ml BSA a 400 U T4 DNA ligázy (New England Biolabs, lne.) v 25 °C po 4 hodiny. 1 μΐ reakční směsi byl pak použit k transformaci 20 μΐ kompetentních buněk E. coli DH5a. Transformované buňky byly vysety na L-agar se 100 μg/ml ampicilinu. Potenciální klony obsahující humanizovaný 806.077Fd-[A248S,G251T,D253K] HCPB byly identifikovány PCR. Každý klon byl podroben PCR jak byla popsána v předchozím textu sekvencí id. č. 104 a 105. Vzorek (10 μ1) analyzován elektroforézou na 1% agarózovém gelu. obsahující požadovaný gen byly identifikovány přítomnosti produktu velikosti 512 bp. tyto klony s pásem velikosti 512 bp byly užity pro minipreparaci DNA. Vzorky DNA byly kontrolovány štěpením HindiII a Xbal, zda je přítomen fragment velikosti 3751 bp a 1862 bp. Klony s oligonukleotidy z PCR reakce byl Klony podle • · • · · ·
-79obsahující tyto fragmenty po naštěpení DNA HindlII a Xbal byly použity pro izolaci DNA ve větším měřítku a sekvence inzertů byla ověřena sekvencováním DNA. Sekvence očekávaného inzertu je uvedena jako sekvence id. č. 112. Ze všech ověřovaných klonů 2 klony obsahovaly očekávanou sekvenci, ale s mutací jedné baze. Klon 54 (nazvaný pMF195) měl bázi T v poloze 605 podle sekvence id. č. 112 místo báze A a klon 68 (nazvaný pMF198) měl bázi C v ploze 1825 místo baze T. Sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 112 byla připravena z pMF195 a pMF198 štěpením obou (10 gg každého) Xmal (10U) a Xbal (100 U)(New England Biolabs, lne.) v pufru obsahujícím 20mM Tris-acetát, pH 7,9, 50mM octan draselný, lOmM octan hořečnatý, lmM DTT a BSA (10 0 gg/ml) . Fragment velikosti 215 bp z pMF195 a vektorový fragment z pMF198 (po ošetření alkalickou fosfatázou) byl izolován z 1% agarózového gelu a fragmenty byly ligován navzájem, jak bylo popsané v předchozím textu. Ligační směs pak byla použita pro transformaci kompetentních DH5ct. Transformované buňky byly vysety na L-agar s ampicilinem a výsledky kolonie byly testovány štěpením Xmal a Xbal na přítomnost fragmentů velikosti 5400 bp a 215 bp. Pozitivní klony byly použity pro přípravu plazmidové DNA ve velkém měřítku a sekvence inzertu byla potvrzena sekvencováním DNA. Plazmid obsahující gen 806.077Fd-[A248S,G251T,D253K]HCPB z klonu 102 byl nazván pMF213. Fragment HindlII-Xbal z pMF213 byl klonován do pEE6 (což je derivát pEE6.hCMV, viz Stephens a Cockett, 1989, Nucl. Acid Res. 17, 7110, ve kterém místo HindlII „upstream od promotoru CMV bylo změněno na místo BglII) v DH5a (testovaných pak oligonukleotidy sekvencí id. č. 106 a 107 na inzert velikosti 2228 bp), čímž vznikl plazmid pMF221.
• · ♦ · · • · · * · · • · · · • · « ·
-sofa) Příprava ko-expresního vektoru pro expresi fúzního proteinu protilátka-enzym
Pro přípravu vektoru schopného exprimovat fúzní protein protilátka-enzym v eukaryotické buňce byl použit systém GS-System™ (Celltech Biologics, WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 a WO 89/10404). Postup vyžadoval klonování lehkého řetězce humanizované protilátky do úseku HindlIIXmal vektoru pEE14. Tento vektor je popsán v Bebbington, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1991, 2, 136145. Pro konstrukci expresního vektoru byly plazmidy pEE14 a pNG3-Vkss-306.077HuVK4-HuCK-Neo (viz příklad 14) naštěpeny HindlII a Xmal. Vhodný vektor (z pEE14) a inzert (fragment velikosti 732 bp z pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo) z každého štěpení byly izolovány z 1 % agarózového gelu a navzájem ligovány a pak použity pro transformaci DH5a. Transformované buňky byly vysety na L-agar s ampicilínem (100 μg/ml). Kolonie byly testovány restrikční analýzou izolované DNA enzymy HindlII a Xmal na přítomnost fragmentu velikosti 732 bp. Kolonie obsahující restrikční fragment velikosti 732 bp byly užity pro přípravu plazmidové DNA ve velkém měřítku a sekvence inzertu byly ověřena sekvencováním DNA. Plazmid obsahující sekvenci humanizovaného lehkého řetězce sekvence id. č. 70 v plazmidu pEE14 byl nazván pEE14-806.077HuVK4-HuCK.
Pro -vytvoření ko-expresního vektoru byl vektor pMF221 (10 μg) naštěpen BglII (20U) a Sáli (40U) v pufru (100 μΐ) obsahujícím lOmM Tris-HCl, pH 7,9, 150mM NaCI, 10 mM MgCl2, lmM DTT a BSA (100 μ9/ω1) a fragment velikosti 4560 bp byl izolován elektroforézou na agarózového gelu a purifikován. Podobně byl pEE14-806.077HuVK4-HuCK štěpen BamHI (40 U) a Sáli (40 U) a vektorový fragment velikosti 9,95 kb byl izolován a ligován s fragmentem BglII-Sáli z pMF221 a pak • · • · · · • · ♦ · «
-81klonován do DH5a. Kolonie byly testovány PCR se 2 sadami oligonukleotidových primerů (sekvence id. č. 104 a 105 a sekvence id. č. 108 a 109) . Klony poskytující produkt PCR velikosti 185 bp a 525 bp byly dále charakterizován sekvencováním DNA. Klon se správnou sekvencí představující ko-expresní vektor lehký řetězec/mutantní Fd HPCB v DH5a byl nazván pMF228. Humanizovaná sekvence Fd-mutantní HCPB je zde uvedena jako sekvence id. č. 113. Rezidua 1 až 19 představují signální sekvenci, rezidua 20 až 242 představují humanizovaný variabilní úsek CH1 z IgG3, rezidua 243 až 306 jsou kloubová oblast IgG3 a rezidua 307 až 613 představují mutovanou sekvenci HCPB se změnami ve srovnání s lidskou sekvencí HCPB v reziduích v polohách 248, 251 a 253. Změny v sekvenci HCPB jsou v sekvenci id. č. 113 v polohách 554 (Ser), 557 (Thr) a 559 (Lys).
dodatečným preproHCPB
c) Příprava vektoru pro expresi pro-domény z proHCPB
Druhý eukaryotický expresní plazmid pEE12 obsahující gen prepro-sekvence pro sekreci pro-domény s leucinovým reziduem na C-konci (zvaný pro-L) z byl připraven jak je popsáno v odkazech v příkladu 17 v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011. Plazmid pMF161 byl připraven pomoci PCR z pMF18 jak je popsáno pro nemodifikovanou prepro-sekvenci pomocí oligonukleotidů sekvencí id. č. 110 a 111. Fragment velikosti 3 59 bp byl klonován do pBluescript, čímž vznikl pMF141 a pak do pEE12, čímž vznikl pMF161. Proteinová sekvence pro-L je uvedena jako sekvence id. č. 114.
φ · · φ ΦΦΦ φφφφ φ φ φ φ φ · φ *
-82d) Exprese fúzniho proteinu protilátka-enzym v eukaryotických buňkách
Pro expresi v eukaryotických buňkách byly vektory obsahující geny schopné exprimovat fúzní protein protilátkaenzym (pMF228) a sekvence pro-L (pMF161) ko-transfekovány do buněk COS-7. Buňky COS jsou buňky buněčné linie CV-1 ledvinných buněk z afrických zelených opic transformovaných virem SV-40 s defektním replikačním počátkem a využívají se pro krátkodobou přechodnou expresi různých proteinů, neboť mají kapacitu replikovat kruhové plazmidy obsahující replikační počátek viru SV40 na vysoký počet kopií. Existuji dva dostupné klony buněk COS, a sice COS-1 a COS-7. Základní metody transfekce buněk COS popsal Bebbington v METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1991, 2,141. Pro expresi HCPB byly použity plazmidové vektory pMF48 a pMF67 (2 μg každého) ke ko-transfekci buněk COS-7 (2xl05) v 6jamkové kultivační misce ve 2 ml Dulbeccem modifikovaného Eagleho média (DMEM) s 10 % teplem inaktivovaného telecího fetálního séra (FCS) metodou tzv. lipofekce, tj. přenosem polynukleotidu zprostředkovaným kationtovým lipidem (Felgner et al. , METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1993,5, 67-75). Buňky byly inkubovány ve 37°C v C02inkubátoru po 20 hodin. Směs plazmidové DNA v médiu bez séra (200 μΐ) byla jemně smíchána s reagens LIPOFECTIN™ (12 μΐ) a inkubována při teplotě místnosti 15 minut. Buňky pak byly opláchnuty médiem bez séra (2 ml). Médium bez séra (600 μΐ) pak bylo přidáno ke směsi DNA/LIPOFECTIN™ a směsí byly převrstveny buňky, které byly nadále inkubovány v 37°C v inkubátoru s CO2 po 6 hodin. Médium obsahující DNA pak bylo nahrazeno normálním médiem DMEM obsahujícím 10 % FCS a buňky byly dalších 72 hodin inkubovány stejně jako předtím. Buněčné supernatanty (naředěné 1:10 0,025 Tris-HCl, pH 7,5, ·· ·· • · ··· ·
-83125 μΐ) byly analyzovány na aktivitu proti Hipp-Glu (5h test, v celkovém objemu 250 μΐ ) postupem popsaným v příkladu 103. Naředěny supernatant vedl k 18,4% hydrolýze substrátu Hipp-Glu.
Alternativně se může použít nemodifikovaná doména (z plazmidu pMF67, popsaná v odkazech z příkladu 17 Mezinárodní patentové přihlášky WO 96/20011) místo pro-L expresního plazmidu ve výše popsaném experimentu. Exprese proteinů ve velkém měřítku v buňkách COS je popsána v Ridder et al, 1995, Gene 166, 273-276 a v Blysey et al. , 1996, Cryotechnology 18, 183-192.
Pro stabilní expresi v buňkách CHO byly užity postupy které popsal Bebbington, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1991, 2, 136-145 s využitím selekce s 25μΜ GS a 50μΜ MSX. Případně může být pro transfekci buněk COS užita i lipofekce, popsaná v předchozím textu. Buňky se transfekují směsí plazmidu pMF228 a pMF161 nebo pMF228 a pMF67. Supernatanty z přežívájicích kolonií jsou testovány CEA.-ELISA (popsanou v příkladu 11) a „westernovým přenosem (který je popsán dále) na přítomnost pásu velikosti 170 kDa odpovídajícího velikosti požadovaného fúzního proteinu protilátka-enzym. Vhodně naředěné supernatanty jsou také testovány na enzymovou aktivitu jak je popsáno v příkladu 103. Kolonie exprimující požadovaný fúzní protein protilátka-enzym jsou pak kultivovány v potřebném měřítku (viz např. Reff, M.E., 1993, Current Opinion in Biotechnology 4, 573-576 a další práce v této práci citované) a fúzní protein je pak purifikován ze supernatantu buněčné kultury jednou nebo několika metodami popsanými dále v příkladu 102.
• ·
-84e) Analýza „westernovým přenosem
Analýza „westernovým přenosem byla provedena následujícím způsobem. Alikvotní díly (20 μΐ) supenatantu každého vzorku byly smíchány se stejným objemem vzorkového pufru (62,5mM Tris-HCl, pH 8,1, 1% SDS, 10% sacharóza a 0,05% bromfenolová modř) buď s reduktantem nebo bez něho. Vzorky pak byly inkubovány v 65 °C po 10 minut před tím, než byly rozděleny elektroforézou na 8-18% akrylamidovém gradientovém gelu (gelový systém EXCEL™ firmy Pharmacia Biotechnolcgy Products) v zařízení MULTIPHOR™ II (LKB Produkter AB) podle doporučení výrobců. Po elektroforéze byly separované proteiny přeneseny na membránu (HYBOND™ C-Super, Amersham International) pomocí zařízení NOVABLOT™ (LKB Produkter AB) podle protokolů poskytnutých výrobcem. Po přenesení byly membrána usušena.
Přítomnost protilátkových fragmentů byla detekována použitím anti-lidské protilátky kappa (Sigma A7164, konjugát lehkého řetězce kappa kozí anti-lidské protilátky s peroxidázou) použité v ředění 1:2500. Přítomnost lidských protilátkových fragmentů byla vizualizována pomocí chemiluminiscenčního systému (detekční systém ECL™, Amersham International) .
Příklady 49 až 74
Příprava dalších fúzních proteinů „humani zováný
806.077F (ab': )2 - mutovaná HCPB
Tento příklad popisuj e přípravu genů kóduj ících
humani zováný Fd fragment z protilátky 806.077 spojený
s mutovanou HPCB (D253K nebo G251T,D253K nebo
A248S,G251T, D253K) a jejich ko-expresi s genem kódujícím
humanizovaný lehký řetězec z protilátky 806.077 a genem
kódujícím pro-doménu lidské karboxypeptidázy B, čímž vzniká
·· ····
-85F(ab')2 protein s molekulou mutované HPCB na C-konci každého fragmentu těžkého řetězce. Konstantní a kloubové úseky humanizovaného těžkého Fd řetězce jsou odvozeny z izotypú lidských protilátek IgGl nebo IgG2 nebo IgG3. Exprimované proteiny jsou dále nazývány fúzními proteiny protilátkaenzym.
Postupy popsané v příkladu 48 se opakují s příslušnými vhodnými sekvencemi podle dále uvedené tabulky. Oligonukleotidy pro konstrukce pomocí PCR a testování klonů se lehce odvodí z vhodných sekvencí.
Aby se změnily sekvence mutované HPCB, templát PCR, a sice plazmid pZEN1921 z části A) příkladu 48, je nahrazen plazmidem pZEN1860 pro mutaci [G251T,D253K]HPCB (viz příklad 1) nebo pICI1713 pro mutaci [D253K]HPCB (viz Mezinárodní patentová přihláška WO 96/20011) .
Pro změnu konstantního úseku těžkého řetězce a kloubového úseku byl templát PCR, a sice vektor IgG3pBSIIKS+ z části a) příkladu 48 nahrazen vektorem pNG4-VHssHuIgGlCHl' (viz příklady 39-47) nebo pNG4-VHss-HuIgG2CHl' (NCIMB č. 40797).
Kvůli výměně sekvence humanizovaného lehkého řetězce protilátky byl vektor pEE14-806.077HuVK4-HuCK z části b) příkladu 48 nahrazen vektorem pEE14-806.077HuVKl-HuCK nebo pEE14-806.077HuVK3-HuCK. Vektory pEE14-806.077HuVKl-HuCK pEE14-806.077HuVK3-HuCK byly připraveny stejně jako je to popsáno pro vektor pEE14-806.077HuVK4-HuCK v části b) příkladu 48, ale využitím fragmentu HindlII-Xmal velikosti 732 bp z pNG4-VHss-806.077HuVKl-Neo, případně z pNG4-VHss806.077HuVK3-Neo (viz příklady 12-38) místo fragmentu HindlII-Xmal z pNG4-VHss-806.077HuVK4-Neo.
Varianty fúzních proteinů protilátka-enzym pro každý příklad jsou uvedeny v následující tabulce.
·· ····
Př. humanizovaný těžký řetězec humanizovaný lehký řetězec mutant HPCB
49 HuVHl-HuIgG3 HuVK4-HuCK [D253K]HCPB
50 HuVHl-HuIgG3 HuVK4-HuCK [G251T, D253K]HCPB
51 HuVHl-HuIgG3 HuVKl-HuCK [A248S, G251T, D253KJHCPB
52 HuVHl-HuIgG3 HuVKl-HuCK [D253K]HCPB
53 HuVHl-HuIgG3 HuVKl-HuCK [G251T, D253K]HCPB
54 HuVHl-HuIgG3 HuVK3-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
55 HuVHl-HuIgG3 HuVK3-HuCK [D253K] HCPB
56 HuVHl-HuIgG3 HuVK3-HuCK [G251T, D253K]HCPB
57 HuVHl-HulgGI HuVK4-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
58 HuVHl-HulgGI HuVK4-HuCK [D253K] HCPB
59 HuVHl-HulgGI HuVK4-HuCK [G251T, D253K]HCPB
60 HuVHl-HulgGI HuVKl-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
61 HuVHl-HulgGI HuVKl-HuCK [D253K] HCPB
62 HuVHl-HulgGI HuVKl-HuCK [G251T, D253K]HCPB
63 HuVHl-HulgGI HuVK3-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
64 HuVHl-HulgGI HuVK3-HuCK [D253K] HCPB
65 HuVHl-HulgGI HuVK3-HuCK [G251T, D253K]HCPB
66 HuVHl-HuIgG2 HuVK4-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
67 HuVHl-HuIgG2 HuVK4-HuCK [D253K] HCPB
68 HuVHl-HuIgG2 HuVK4-HuCK [G251T, D253K]HCPB
69 HuVHl-HuIgG2 HuVKl-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
70 HuVHl-HuIgG2 HuVKl-HuCK [D253K] HCPB
71 HuVHl-HuIgG2 HuVKl-HuCK [G251T, D253K]HCPB
72 HuVHl-HuIgG2 HuVK3-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
73 HuVHl-HuIgG2 HuVK3-HuCK [D253K]HCPB
74 HuVHl-HuIgG2 HuVK3-HuCK [G251T, D253K]HCPB
• · · ·· · • · « • · · • · · · « • · <
-87Příklad 75
Příprava fúzního proteinu „[A248S, G251T, D253K]HCPB humanizovaný 806.077 F(ab')2
Tento příklad popisuje přípravu genu kódujícího proenzym [A248S, G251T, D253K]HCPB spojený s humanizovaným (verze 1 VH z lidského ±gG3) Fd fragmentem těžkého řetězce protilátky 806.077 a jeho ko-epxpresi s genem kódujícím humanizovaný lehký řetězec (verze 4 VK z CK) protilátky 806.077. Tím vzniká protein F(ab)2 s molekulou pro[A248S,G251T,D253K]HCPB na každém fragmentu těžkého řetězce. Enzym se aktivuje enzymatickým odstraněním pro-domény pomocí trypsinu.
Standardní postupy molekulární biologie jako je štěpení restrikčními enzymy, ligace, kinázová reakce, defosforylační reakce, polymerázová řetězová reakce (PCR), transformace bakterií, gelová elektroforéza, příprava pufrů, izolace a purifikace DNA, byly prováděny postupy, jak je popisuje Sambrook, J. , Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989, případně se postupovalo podle doporučení výrobců specifických produktů. Enzymy byly ve většině případů od New England BioLabs, lze užít produkty i postupy jiných firem. Oligonukleotidy byly připraveny na syntetizátoru DNA Applied Biosystems 380A z fosfoamiditů (nukleosid-2-kyanoetyl-N,N'-diisopropylfosfoamiditú s baží chráněnou 5'-dimetoxytritylovou skupinou) navázaných na skleněný porézní nosič v měřítku 0,2 pmol podle protokolů dodaných výrobcem Applied Biosystems lne.
Mutanty HCPB, nativní HCPB a fúzní proteiny s HCPB byly testovány na schopnost konvertovat hipuryl-L-glutamovou kyselinu nebo hippuryl-L-arginin na hippurovou kyselinu pomocí testu užívajícího HPLC, který je popsán v příkladu
-88103 nebo v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 96/20011, příklad 20.
Techniky imunotestování byly prováděny podle metod, které popsal Tijssen, 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 15, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, nebo podle postupů doporučených výrobcem specifických produktu.
Pro vytvoření plazmidů schopných exprimovat fúzní protein protilátka-enzym v eukaryotických buňkách byl použit systém GS-System (Celltech Biologics, podrobně popsaný v Mezinárodních patentových přihláškách WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 a WO 89/10404) se dvěma plazmidy pEE6 (což je derivát pEE6.hCMV, viz Stephens a Cockett, 1989, Nucl. Acid Res. 17, 7110, ve kterém místo HindlII „upstream od promotoru hCMV bylo změněno na místo BglII) a pEE12 (což je derivát pSV2.GS s mnoha odstraněnými restrikčními místy (Bebbington et al. , 1992, Biotechnology, 10, 169) .
a) Klonování pre-pro-HCPB do restrikčního místa Xmal (poloha 1048 v sekvenci id. č. 124)
Dvoj řetězcová DNA z plazmidů pMF18 (popsaného v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, referenční příklad 19), konstrukt obsahující pre-pro-HCPB klonovaný do vektoru pBluescript II KS+ (Stratagene), byla připravena standardním postupem (souprava pro izolaci plazmidů Qiagen nebo podobně) a restrikční štěpení bylo provedeno velmi pečlivě, aby se zajistilo úplné štěpení. Restrikční enzym HindlII štěpí plazmid pMF18 právě před začátkem pre-sekvence genu HCPB a enzym Xmal štěpí v kodonu pro 240. aminokyselinu (prolin) maturovaného proteinu, a tento fragment od HindlII • · · · I • · <
·· ·· • · ··· ·
-89místa po Xmal místo je označován jako fragment pre-pro-HCB. DNA správné délky, obsahující fragment pre-pro-HCB (1061 bp), byla izolována.
Dvoj řetězcová DNA z plazmidového vektoru pUC19 (New England BioLabs) byla připravena, naštěpena restrikčními enzymy HindiII a Xmal a purifikována (2651 bp) podobným způsobem jako fragment pre-pro-HCB. Pro klonování genového fragmentu HCPB do vektoru pUC byly připraveny ligační směsi s poměrem 1 mol vektoru na 2,5 mol inzertu a celkovou koncentrací DNA asi 2,5 ng/μΐ , s T4 DNA ligázou, 1 mM ATP a enzymovým pufrem. Po uskutečnění ligační reakce byla směs DNA použita pro transformaci kmene E. coli DH5ct. Alikvotní díly buněk byly vysety na L-agar s živným médiem obsahující 100 μg/ml ampicilinu pro selekci plazmidového vektoru, a inkubovaly se v 37°C přes noc. Několik kolonií pak bylo sebráno a použito pro minipreparaci dvoj řetězcové plazmidové DNA. Tyto vzorky DNA byly analyzovány naštěpením restrikčními enzymy a tak byl identifikován konstrukt se správnou konfigurací. Tento plazmid obsahuje fragment prepro-HCPB nad Xmal místem v maturovaném genu a je označen pCF003.
b) Klonování [A248S, G251T, D253K]HCPB z polohy G241 + linker a 5 aminokyselin z VH
Pro oddělení HCPB od sekvence Fd byl v průběhu PCR do sekvence vložen neutrální peptidový linker (spojka) obsahující (glycin-glycin-glycin-serin)3. Aby byla vytvořena mutovaná sekvence [A248S,G251T,D253K]HCPB (jak je popsáno v referenčním příkladu 2) s přidaným peptidovým linkerem a prvními 5 aminokyselinami humanizované 806.077VH, byla připravena PCR se 100 pmol primerů CME00971 a CME00972 (sekvence id. č. 122 a 123) s přibližně 5 ng DNA pZEN1921,
-90všemi dNTP v 200μΜ koncentraci, reakčním pufrem pro Taq polymerázu a 2,5 U Taq polymerázy v celkovém reakčním objemu 100 μΐ. Směs byly zahřívána 10 minut při 94°C před přidáním Taq polymerázy, a pak bylo provedeno 30 cyklů PCR - 94 °C, 1,5 minuty, 5 5 °C, 2 minuty, 72 °C, 2 minuty - po kterých následovalalO minutová inkubace v 72 °C na ukončení reakce. Produkt PCR obsahující fragment [A248S,G251T,D253K]HCPB (asi 298 bp) byl analyzován elektroforézou na agarózového gelu na správnou velikost a bylo zjištěno, že obsahuje především pás správné velikosti. Zbytek produktu v reakční směsi byl purifikován od zbytku reagencií mikrokoncentrační kolonkou CENTRICON™ 100 (Amicon) a pak byla DNA izolována precipitací s etanolem a octanem sodným, centrifugací, vakuovým usušením a resuspendováním v destilované vodě. Izolovaná DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Xmal a EcoRI a pás správné velikosti (271 bp) byl purifikován.
Dvoj řetězcová DNA plazmidu pCF003 (popsaného výše) byla připravena standardním způsobem (plazmidová souprava Qiagen nebo podobná), naštěpena enzymy Xmal a EcoRI a pás správné velikosti (2696 bp) byl purifikován.
Pro klonování genového fragmentu mutované HCPB do vektoru byly připraveny ligační směsi s poměrem 1 mol vektoru (pCF003) na 2,5 mol inzertu (PCR fragment [A248S, G251T, D253K]HCPB) a celkovou koncentrací DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzymovým pufrem. Po uskutečnění ligační reakce byla směs DNA použita pro transformaci kmene E. coli DH5a. Alikvotní díly buněk byly vysety na L-agar s živným médiem obsahující 100 μg/ml ampicilinu pro selekci plazmidového vektoru, a inkubovaly se v 37°C přes noc. Asi 200 kolonií bylo přeneseno otiskem na dva sterilní nitrocelulózové filtry (Schleicher and Schuell) na misky s L-agarem a živným médiem se 100 μg/ml ampicilinu pro • ·· ·
-91selekci plazmidového vektoru, které pak byly inkubovány přes noc při 37°C. Duplikátní miska pak byla uložena při 4°C a sloužila jako zdroj živých buněk a druhá miska byla ošetřena tak, aby se denaturovala DNA z jednotlivých kolonií a fixovala na filtru. Nitrocelulózový filtr byl odstraněn z agarové misky a postupně pokládán na určitou dobu na nasáklý filtrační papír (Whatman): 1) na 2 minuty na papír nasáklý 10% SDS, 2) 7 minut 0,5M NaOH, 1,5M NaCI, 3) 4 minuty 0,5M NaOH, 1,5M NaCI, 4) 2 minuty 0,5M NaOH, 1,5M
NaCI, 5) 2 minuty 0,5M Tris-HCl, pH 7,4, 1,5M NaCI, 6) 2 minuty 2xSSC (standardní roztok soli a citrátu). Filtr byl pak umístěn na papír Whatman nasáklý lOxSSC a denaturovaná DNA navázaná na filtr byla fixována ultrafialovým zářením (Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker). Filtry pak byly usušeny při teplotě místnosti a pak prehybridizovány v 60°C jednu hodinu v roztoku 6XSSC za mírného třepání (např. v hybridizačním inkubátoru Techne HB-1D). Prehybridizace slouží k blokování nespecifických vazebných míst pro DNA na filtrech.
Aby se určilo, které kolonie obsahují požadovaný DNA inzert, byla DNA fixovaná na nitrocelulózový filtr hybridizována s radioaktivně značenou 32P-DNA sondou připravenou z purifikovaného PCR fragmentu [A248S, G251T,
D253K]HCPB (jak uvedeno výše) . Asi 50 ng DNA bylo značeno pomocí 50 μCi 32P-dCTP (>3000 Ci/mmol) a T7 DNA polymerázy v celkovém reakčním objemu 50 μΐ (souprava T7 Quickprime, Pharmacia), kdy reakce probíhala 15 minut při 37°C. Značená sonda byla zahřáta 2 minuty na 95 °C aby se denaturovala dvouřetězcová DNA, bezprostředně poté přidána k 10 ml 60°C roztoku 6xSSC, a tímto roztokem pak byl nahrazen prehybridizační roztok na filtrech. Inkubace za mírného třepání probíhala další 3 hodiny v 60°C. Potom byl ·· ·*♦·
-92hybridizační roztok slit a filtry byly dvakrát promyty při 60°C v roztoku 2xSSC pokaždé 15 minut. Filtry pak byly osušeny jemně filtračním papírem, zabaleny do přilnavé fólie (Saran™ nebo podobné) a exponovány na rentgenovém filmu (např. X-OMAT-ARS™, Kodak) přes noc při teplotě místnosti. Po vyvolání filmu byly kolonie obsahující požadovaný inzert identifikovány jako ty, které dávaly nej silnější signál (nej tmavší skvrna) na rentgenovém filmu. V této sérii experimentů asi 15 % kolonií poskytlo pozitivní signál.
Z nich bylo 12 vybráno pro další screening. Kolonie byly odebrány z duplikátního filtru a naneseny na L-agarové živné médium se 100 pg/ml ampicilinu a pak kultivovány v živném médiu LB se 100 pg/ml ampicilinu.
Vybrané kolonie se pak použily pro minipreparaci plazmidové DNA. Tyto vzorky DNA pak byly analyzovány štěpením restrikčními enzymy a konstrukty se správnou konfigurací, žádné změny v sekvenci DNA nebyly vneseny v průběhu PCR bylo několik kolonií se správnou restrikční mapou vybráno pro minipreparaci DNA standardním postupem (plazmidová souprava Qiagen nebo podobná) a inzerty byly sekvencovány pomocí několika samostatných oligonukleotidových primeru. Konstrukt se správnou konfigurací byl identifikován a tento plazmid obsahující gen „pre-pro-[A248S, G251T, D253K]HCPB-linkerhumanizovaný 806.077VH nad místem Pstl (v 5. aminokyselině, poloha 1301 v sekvenci id. č. 124) byl nazván pCF004.
byly identifikovány Aby se zajistilo, že
c) Klonování humanizovaného 806.077Fd
Dvoj řetězcová DNA plazmidu pNG4-VHss-HuVHl-806.077IgG3CHl', konstrukt obsahující humanizovanou verzi 806.077VH1 s lidskou IgG3 CH1 a kloubovým úsekem klonované do vektoru pNG4 (viz příklad 44) byla připravena standardním ·>· »···
-93postupem (plazmidová souprava Qiagen nebo podobná) a naštěpena enzymy Pstl a Xmal. DNA správné velikosti (854 bp) obsahující humanizovaný Fd 806.077 fragment byla purifikována. Dvoj řetězcová DNA z plazmidového vektoru pUC19 (New England BioLabs) byla připravena, naštěpena restrikčními enzymy Pstl a Xmal a purifikována (2659 bp) podobným způsobem jako humanizovaný Fd 806.077 fragment.
Byla kontrolována čistota alikvotů naštepené a purifikované DNA a byla stanovena koncentrace DNA elektroforézou na agarózovém gelu srovnáním se známými standardy.
Na základě těchto měření byly připraveny ligační směsi pro klonování genového fragmentu humanizovaného Fd 806.077 do vektoru pUC s poměrem 1 mol vektoru na 2,5 mol inzertu a celkovou koncentrací DNA asi 2,5 ng/μί, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzymovým pufrem.
Po uskutečnění ligační reakce byla směs DNA použita pro transformaci kmene E. coli DH5cc. Alikvotní díly buněk byly vysety na L-agar s živným médiem obsahující 100 μg/ml ampicilinu pro selekci plazmidového vektoru, a inkubovaly se v 37°C přes noc. Několik kolonií pak bylo sebráno a použito pro minipreparaci dvouřetězcové plazmidové DNA. Tyto vzorky DNA byly analyzovány naštěpením restrikčními enzymy a tak byl identifikován konstrukt se správnou konfigurací. Tento plazmid obsahuje humanizovaný 806.077 Fd fragment fragment mezi místem Pstl a místem Xmal a byl označen pCF005.
d) Klonování humanizovaného 806.077Fd do konstruktu „pre-pro [A248S,G25IT,D253K]HCPB-linker
Dvoj řetězcová DNA plazmidů pCF005 (popsaného v předchozím textu) byla připravena standardním postupem (plazmidová souprava Qiagen nebo podobná) a naštěpena enzymy ·· ·* • · · « • · ·· ··· « fl • · fl *· a* •β ♦··· • · > · · > · · · k · · · ·· ··
-94Pstl a EcoRI. DNA správné velikosti (854 bp) obsahující humanizovaný Fd 806.077 fragment (870 bp) byla purifikována. Dvoj řetězcová DNA z plazmidového vektoru pCF0 04 (popsaného v předchozím textu) byla připravena, naštěpena restrikčními enzymy Pstl a EcoRI a purifikována (3950 bp) podobným způsobem jako humanizovaný Fd 806.077 fragment.
Byly připraveny ligační směsi pro klonování genového fragmentu humanizovaného Fd 806.077 do vektoru pCF0004 s poměrem 1 mol vektoru na 2,5 mol inzertu a celkovou koncentrací DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzymovým pufrem.
Po uskutečnění ligační reakce byla směs DNA použita pro transformaci kmene E. coli DH5a. Alikvotní díly buněk byly vysety na L-agar s živným médiem obsahující 100 μ9/πι1 ampicilinu pro selekci plazmidového vektoru, a inkubovaly se v 37°C přes noc. Několik kolonií pak bylo sebráno a použito pro minipreparaci dvouřetězcové plazmidové DNA. Tyto vzorky DNA byly analyzovány naštěpením restrikčními enzymy a tak byl identifikován konstrukt se správnou konfigurací. Tento plazmid obsahující gen „pre-pro[A248S,G251T,D253K]HCPBlinker-humanizovaný 806.077 Fd v pUC19 byl označen pCF006.
e) Klonování „pre-pro[A248S,G251T,D253K] HCPB-linker(humanizovaný 806.077) Fd do vektoru pEE6 hCMV
Dvoj řetězcová DNA plazmidu pCF006 (popsaného v předchozím textu) byla připravena standardním postupem (plazmidová souprava Qiagen nebo podobná) a naštěpena enzymy HindlII a EcoRI. DNA správné velikosti (2185 bp) obsahující fúzní protein byla purifikována.
Dvoj řetězcová DNA z plazmidového vektoru pEE6 (popsaného v předchozím textu) byla připravena, naštěpena restrikčními enzymy HindlII a EcoRI a purifikována (4775 bp)
0 0 0
• · 0 0· ·
0 · · • · 0· ·
0 0 0 ·
00 000 ·
-95podobným způsobem jako fragment fúzního proteinu. Byly připraveny ligační směsi pro klonování humanizovaného Fd 806.077 fúzního proteinu do vektoru pEES s poměrem 1 mol vektoru na 2,5 mol inzertu a celkovou koncentrací DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzymovým pufrem. Po provedení ligační reakce byla směs DNA použita pro transformaci kmene E. coli DH5a. Alikvotní díly buněk byly vysety na L-agar s živným médiem obsahující 100 μg/ml ampicilinu pro selekci plazmidového vektoru, a inkubovaiy se v 37°C přes noc. Několik kolonií pak bylo sebráno a použito pro minipreparaci dvouřetězcová plazmidové DNA. Tyto vzorky DNA byly analyzovány naštěpením restrikčními enzymy a tak byl identifikován konstrukt se správnou konfigurací. Tento plazmid obsahující gen „pre-pro[A248S,G251T,D253K]HCPBlinker-humanizovaný 806.077 Fd v pEE6 byl označen pCF007.
f) Klonování humanizovaného lehkého řetězce 806.077 verze 4 do vektoru pEE12
Dvoj řetězcová DNA plazmidu pNG3-VKss-806.077-HuVK4HuCK-Neo, konstrukt obsahující humanizovanou verzi 806.077 HuVK4 s lidským CK klonovanou do vektoru pNG3 (viz příklady 12-38), byla připravena standardním postupem (plazmidové souprava Qiagen nebo podobná) a naštěpena enzymy HindlII a EcoRI. DNA správné velikosti (854 bp) obsahující humanizovaný 806.077 lehký řetězec (2022 bp) byla purifikována. Dvoj řetězcová DNA z plazmidového vektoru byla připravena, naštěpena restrikčními enzymy HindlII a EcoRI a purifikována (7085 bp) podobným způsobem jako humanizovaný 806.077 lehký řetězec. Byly připraveny ligační směsi pro humanizovaného lehkého řetězce 806.077 do vektoru pEE12 s poměrem 1 mol vektoru na 2,5 mol inzertu a celkovou koncentrací DNA asi 2,5 ng/μΐ, s T4 DNA ligázou, lmM ATP • · · ·
• · · · · · • · · • · ··
-96a enzymovým pufrem. Po uskutečnění ligační reakce byla směs DNA použita pro transformaci kmene E. coli DH5a. Alíkvotní díly buněk byly vysety na L-agar s živným médiem obsahující 100 gg/ml ampicilinu pro selekci plazmidového vektoru, a inkubovaly se v 37°C přes noc. Několik kolonií pak bylo sebráno a použito pro minipreparaci dvouřetězcové plazmidové DNA. Tyto vzorky DNA byly analyzovány naštěpením restrikčními enzymy a tak byl identifikován konstrukt se správnou konfigurací. Tento plazmid obsahující humanizovaný lehký řetězec 806.077 verze 4 byl označen pCF008/4.
g) Klonování „CMVp-pre-pro[A248S,G251T,D253K]HCPB-linker(humanizovaný 806.077)Fd do pCF008/4
Dvoj řetězcová DNA plazmidu pCF007 (popsaného v předchozím textu) byla připravena standardním postupem (plazmidová souprava Qiagen nebo podobná) a naštěpena enzymy BglII a Sáli. Restrikční enzym BglII štěpí plazmid pCF007 začátkem vedoucí sekvence CMV MIE, promotorem a genem fúzního proteinu. Restrikční enzym Sáli štěpí asi 520 bp za stop kodonem maturovaného proteinu. DNA správné velikosti (4844 bp) obsahující fúzní protein byla purifikována. Dvoj řetězcová DNA z plazmidového vektoru pCF008/4 byla připravena, naštěpena restrikčními enzymy BamHI a Sáli a purifikována (7436 bp) podobným způsobem jako fúzní protein. Byly připraveny ligační směsi pro klonování fúzního proteinu „[A248S,G251T,D253K]HCPB-linker-(humanizovaný
806.077)Fd do vektoru pCF008/4 s poměrem 1 mol vektoru na 2,5 mol inzertu a celkovou koncentrací DNA asi 2,5 ng/gl, s T4 DNA ligázou, lmM ATP a enzymovým pufrem. Po uskutečnění ligační reakce byla směs DNA použita pro transformaci kmene E. coli DH5a. Alíkvotní díly buněk byly vysety na L-agar s živným médiem obsahující 100 gg/ml ampicilinu pro selekci ·· · · ) · · · » · ··
-9Ίplazmidového vektoru, a inkubovaly se v 37 °C přes noc. Několik kolonií pak bylo sebráno a použito pro minipreparaci dvouřetězcové plazmidové DNA. Tyto vzorky DNA byly analyzovány nastěpením restrikčními enzymy a tak byl identifikován konstrukt se správnou konfigurací. Tento plazmid obsahující geny pro „pro[A248S,G251T,D253K]HCPBlinker-(Fab')2(humanizované protilátky 806.077) v GS expresním vektoru pEE12 byl nazván pCF009 a jeho plazmidová mapa je uvedena na obr. 2. DNA sekvence a aminokyselinová sekvence lehkého řetězce HuVK4 jsou uvedeny jako sekvence id. č. 70 a 71. Sekvence DNA genu „pre-pro[A248S,G251T, D253K] HCPB-linker-Fd(humanizovaný 806.077) je zde uvedena jako sekvence id. č. 124 a příslušná sekvence aminokyselin jako sekvence id. č. 125.
h) Exprese „pro [mutant] HCPB-linker- (Fab' ) 2 (humanizovaný 806.077) v myších myelomových buňkách
Následující metody byly použity pro expresi všech mutant ( [D253K] , [G251T, D253K] a [A248S, G251T, D253K] ) proHCPB fúzních proteinů.
Výhodná myší myelomová buněčná linie je NS0 (Galfre a Milstein, 1981, Methods in Enzymol. 73, 3-46) a je dostupná z ECACC, PHLS CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG (ECACC katalog, č. 85110503) . Tyto buňky byly kultivovány v Dulbeccem modifikovaném Eagleho médiu (DMEM, Gibco BRL) obsahujícícm 10% teplem inaktivované fetální telecí sérum (FCS).
Pro expresi „pro [mutant] HCPB-linker-(Fab') 2 (humanizovaný 806.077) byly použity plazmidy pCF009 (popsaný v předchozím textu) a pRc/RSV (Invitrogen katalog, č. V780-20) , který obsahuje gen rezistence k neomycinu pro selekci stabilních buněčných linií rezistentních ke G418.
• · · ·
-98Přibližně 5 μ9 každého plazmidu (v rozmezí od 0,5 do 10 μ9) bylo použito ke transfekci 8xlOs buněk NSO metodou lipofekce, tj . přenosem polynukleotidu do eukaryotické buňky zprostředkovaným kationtovým lipidem (Felgner et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1993,5, 6775). Buňky byly sklizeny odstředěním, opláchnuty médiem bez séra (3 0 ml) , resuspendovány v 8 00 μΐ média a udržovány v 37 °C v lahvi pro tkáňové kultury dokud nebyl přidána DNA. Médium bez séra (4 5 0 μΐ) bylo jemně smícháno s reagens LIPOFECTIN™ (50 μΐ) a inkubována při teplotě místnosti 30 až 45 minut. Tato směs byla přidána k 500 μΐ média obsahujícího plazmidovou DNA (v objemu menším než 100 μΐ) a ponechána při teplotě místnosti 15 minut. Médium bez séra (600 μΐ) pak bylo přidáno ke směsi DNA/LIPOFECTIN™ a směs byly přidána k buňkám, které byly nadále inkubovány v 37°C v inkubátoru s CO2 po 6 hodin. Médium obsahující DNA pak bylo nahrazeno normálním médiem DMEM (8 ml) obsahujícím 10 % FCS a buňky byly inkubovány přes noc. Pak bylo médium opět nahrazeno normálním DMEM médiem (8 ml) obsahujícím 10% FCS a buňky byly inkubovány stejně jako předtím dalších 24 hodin. Na konci této doby bylo médium opět nahrazeno normálním DMEM médiem obsahujícím 10% FCS a selekční G418 (1,5 mg/ml) a buňky byly naředěny (1 ku 4 až 1 ku 20) (přibližně 0,5 až 1,5χ10δ buněk na misku) stejným médiem do jamek mikrotitrační destičky (150 μΐ) na jamku, 2 nebo více destiček na každé ředění). Mikrotitrační destičky byly inkubovány alespoň dva týdny v 37°C v inkubátoru s CO2 a pravidelně kontrolovány, zda tvoří životaschopné klony. Médium z jamek obsahujících jednotlivé životaschopné klony bylo odebráno pro testování a nahrazeno čerstvým médiem (obsahujícím G418). Odebrané médium na vazbu protilátky CEA v ELISA testu (způsobem který je popsán v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 96/20011,
-99referenční příklad 5, část 1, kromě toho, že sekundární anti-myší protilátka byla zaměněna za anti-lidskou (kozí anti-lidský lehký řetězec kappa konjugovaný s peroxidázou, Sigma A7164) . Vzorky pozitivní v testu CEA ELISA byly také testovány na enzymovou aktivitu [A248S,G251T,D253K]HCPB (jak bylo již popsáno v předchozím textu) po aktivaci (tj . odstranění pro-domény z fúzního proteinu) trypsinem (700 gg/ml v 50mM Tris-HCl a 150mM NaCI pH 7,6 při 4°C po 1 hodinu, reakce byla zastavena přidáním pětinásobku inhibitoru trypsinu ze sóji). Bylo identifikováno několik klonů, které produkovaly médium pozitivní na 806.707 protilátku vázající CEA a enzymovou aktivitu [A248S,G251T,D253K]HCPB. Tyto klony byly dále testovány analýzou neredukujicím „westernovým přenosem (jak je popsáno v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 96/20011, referenční příklad 5, kromě toho, že anti-myší protilátka byla zaměněna za anti-lidskou (kozí anti-lidský lehký řetězec kappa konjugovaný s peroxidázou, Sigma A7164) pro identifikaci klonů, které produkují přednostně fúzní protein (Fab') 2806.077. Tyto klony byly namnoženy, testovány na stabilní tvorbu fúzního proteinu po několik generací a největší producenti pak byly spojeni a uchováni zamaraženi v kapalném dusíku standardním způsobem.
Namnožení, exprese vysoké úrovně a fermentace fúzních proteinů v myelomových buňkách NS0 byly provedeny podobným způsobem který popsali Bebbington et al. , 1992, Bio/Technology, 10, 169-175. Fúzní proteiny byly purifikovány a pro-sekvence byla odstraněna jak je popsáno v příkladu 102.
-100Příklady 76 až 101
Klonování a exprese dalších variant „proHCPB-linker(humanizovaný 806.077)Fd + (humanizovaný 806.077)lehký řetězec
Způsob vytváření fúzních proteinů s dalšími mutanty HCPB byl podobný tomu, který je podrobně popsán v předchozím příkladu 7, kromě části b) tohoto příkladu, a byly použity mutanty [D253K]HCPB nebo [G251T,D253K]HCPB místo [A248S, G251T,D253K] , a plazmidová DNA použitá v PCR byla z pICI1713 (viz Mezinárodní patentová přihláška WO 96/20011, příklad 15) nebo pZEN1860 (referenční příklad 1). Po klonování, identifikaci a potvrzení sekvencí byly výsledné plazmidy, obsahující „pre-pro [D253K]HCPB-linker nebo pre-pro[G251T, D253K]HCPB-linker a humanizovaný gen 806.077 nad místem Pstl (5. aminokyselina) ve vektoru pUC19 jakožto základu, použity místo plazmidů pCF004 pro následující klonování.
Způsob vytváření fúzních proteinů s dalšími doménami CH1 byl podobný tomu, který je podrobně popsán v předchozím příkladu 7, kromě části c) tohoto příkladu, a byly použity plazmidy obsahující buďto verzi 1 humanizovaného 806.077VH s lidským IgGl nebo IgG2 CH1 a kloubovými úseky místo 806.077-HuVHl-IgG3CHl' (sekvence id. č. 92 a 56) . Po klonování, identifikaci a potvzení sekvencí byly výsledné plazmidy, obsahující sekvence IgGl nebo IgG2 použity místo plazmidů pCF005 pro následující klonování.
Způsob vytváření fúzních proteinů s dalšími variantami humanizovaného lehkého řetězce 806.077 byl podobný tomu, který je podrobně popsán v předchozím příkladu 7, kromě části f) tohoto příkladu, a byly použity plazmidy obsahující buďto verzi 1 nebo verzi 3 humanizovaného 806.077LC místo 806.077-HuVK4-HuCK (sekvence id. č. 51 a 96). Po klonování, identifikaci a potvrzení sekvencí byly výsledné plazmidy, • · · · · • · · · · · * · ft • ftft
B ·
-101obsahující alternativní sekvence lehkých řetězců použity místo plazmidů pCF008/4 pro následující klonování. Varianty fúzních proteinů v každém jednotlivém případě (příklady 76 až 101) jsou uvedeny v následující tabulce.
Př. humani zovaný těžký řetězec humani zovaný lehký řetězec mutant enzymu HPCB
76 HuVHl-HuIgG3 HuVK4-HuCK [D253K] HCPB
77 HuVHl-HuIgG3 HuVK4-HuCK [G251T, D253K]HCPB
78 HuVHl-HuIgG3 HuVKl-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
79 HuVHl-HuIgG3 HuVKl-HuCK [D253K] HCPB
80 HuVHl-HuIgG3 HuVKl-HuCK [G251T, D253K]HCPB
81 HuVHl-HuIgG3 HuVK3-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
82 HuVHl-HuIgG3 HuVK3-HuCK [D253K] HCPB
83 HuVHl-HuIgG3 HuVK3-HuCK [G251T, D253K]HCPB
84 HuVHl-HulgGI HuVK4-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
85 HuVHl-HulgGI HuVK4-HuCK [D253K] HCPB
86 HuVHl-HulgGI HuVK4-HuCK [G251T, D253K]HCPB
87 HuVHl-HulgGI HuVKl-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
88 HuVHl-HulgGI HuVKl-HuCK [D253K] HCPB
89 HuVHl-HulgGI HuVKl-HuCK [G251T, D253K]HCPB
90 HuVHl-HulgGI HuVK3-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
91 HuVHl-HulgGI HuVK3-HuCK [D253K] HCPB
92 HuVHl-HulgGI HuVK3-HuCK [G251T, D253K]HCPB
93 HuVHl-HuIgG2 HuVK4-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
94 HuVHl-HuIgG2 HuVK4-HuCK [D253K] HCPB
-102-
95 HuVHl-HuIgG2 HuVK4-HuCK [G251T, D253K]HCPB
96 HuVHl-HuIgG2 HuVKl-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
97 HuVHl-HuIgG2 HuVKl-HuCK [D253K] HCPB
98 HuVHl-HuIgG2 HuVKl-HuCK [G251T, D253K]HCPB
99 HuVHl-HuIgG2 HuVK3-HuCK [A248S, G251T, D253K]HCPB
100 HuVHl-HuIgG2 HuVK3-HuCK [D253K] HCPB
101 HuVHl-HuIgG2 HuVK3-HuCK [G251T, D253K]HCPB
Příklad 102
Purifikace proteinů obsahujících sekvence protilátky 806.077 Purifikace rekombinantních F(ab')2 proteinů nebo fúzních proteinů protilátka-enzym ze supernatantů myelomových buněk, buněk CHO nebo buněk COS lze dosáhnout několika způsoby, a to použitými buď jednotlivě nebo společně. Purifikace myších 806.077 F(ab')2, chimérických konstruktů 806.077
F(ab')2 a plně humanizovaných konstruktů 806.077 F(ab')2 byla provedena jednou nebo několika z následujících metod: afinitní chromatografie, aniontová výměnná chromatografie nebo „protein-A/protein-G chromatografie. Tyto způsoby lze také použít pro purifikaci fúzních konstruktů „protilátka 806.077-B7 (viz příklad 104).
a) Afinitní chromatografie s antigenem
Karcionoebmryonický antigen (CEA), proti kterému byla připravena původní myší protilátka 806.077, byl imobilizován v chromatografické koloně (použitím produktů firmy Pharmacia). Ve stručnosti, antigen je imobilizován prostřednictvím stabilních esterových vazeb na prostředí
-103s médiem Sepharose™ High Performance, naplněné v kolonách (HiTrap™)a NHS-aktivované. Navázání CEA na aktivovanou matrix bylo provedeno podle standardních instrukcí výrobce.
Příprava lml afinitní kolony
Zásobní roztok CEA (8 mg/ml) byl nejdříve naředěn vazebným pufrem (0,2M hydrogenuhličitan sodný, 0,5M chlorid sodný, pH 8,3) na výslednou koncentraci 0,5 mg/ml. Nová kolona byla propláchnuta 6 ml vychlazené lmM HCl průtokem nepřesahujícím 1 ml/min. Bezprostředně poté byl ligand CEA (1 mi s koncentrací 0,5 mg/ml) injikován do kolony. Kolona byla uzavřena na obou koncích a ponechána 3 0 minut při teplotě místnosti. Přebytečné aktivní skupiny, které nenavázaly ligand, byly deaktivovány a všechny nespecificky navázané ligandy byly odstraněny propláchnutím kolony třikrát střídavě pufrem s vysokým a nízkým pH. Použité pufry byly 0,5M etanolamin, 0,5M chlorid sodný (pH 8,3) a 0, IM octan sodný, 0,5M chlorid sodný (pH 4,0). Při každém propláchnutí matrix bylo použito 6 ml každého pufru. Nakonec byla kolona propláchnuta skladovacím pufrem (0,05M Na2HPO4, 0,01% NaN-, pH 7,0).
Postup purifikace
Supernatant z buněčné kultury, obsahující požadované konstrukty F(ab')2 nebo fúzní konstrukty, tj. chimérické konstrukty 806.077 F(ab')2, humanizované konstrukty 806.077 F(ab')2 nebo fúzní proteiny protilátka-enzym, byl naředěn v poměru 1:1 PBS (pH 7,2) a aplikován na kolonu průtokem 1 ml/min. Kolona byla předtím ekvilibrována roztokem PBS (50mM fosforečnan sodný, 150mM chlorid sodný, pH 7,2). Kolona byla propláchnuta desetinásobkem objemu PBS poté, co jí prošel buněčný supernatant. Navázané F(ab')2 byly eluovány ·· ·· •104(pH 3,0) a byly byly detekovány
5násobkem objemu lOOmM citrátu sodného sbírány lml frakce. Eluované F(ab')2 „westernovou analýzou pomocí vhodného konjugátu protilátky a peroxidázy (anti-lidské lehké řetězce kappa Sigma A7164 v případě plně humanizovaných F(ab' která byla vizualizována peroxidem vodíku a 4-chloro-l-naftolem. Vhodné frakce byly sloučeny a pokud to bylo nutné koncentrovány pomocí centrifugace (Centricon™).
b) Aniontová výměnná chromatografie
Supernatant z buněčné kultury, obsahující požadované konstrukty F(ab')2 nebo fúzní konstrukty, tj. chimérické kontrukty 806.077 F(ab')2, humanizované konstrukty 806.077
F(ab')2 nebo fúzní diafiltrován do 50mM s cut-off membránou proteiny protiiátka-enzym, byl Tris (pomocí promíchávané kyvety s limitem filtrace molekulové hmotnosti 10 000) dokud iontová síla roztoku nebyla v rovnováze s ekvilibračním pufrem kolony. 40ml alikvotní část diafiltrovaného roztoku byla nanesena do vhodné kolony (Pharmacia Mono Q™ 10/10HR) rychlostí 2 ml/min. Kolona byla předtím ekvilibrována 50mM Tris (pH 8,0). Jakmile supernatant prošel kolonou, byla kolona propláchnuta opět ekvilibračním pufrem. Navázaný materiál byl pak eluován 15násobkem (objemu kolony) 0-50% pufru B (50mM Tris, 1M chlorid sodný, pH 8,0) . Eluované frakce se sbíraly (4 ml na frakci) a frakce obsahující F(ab')2 byly identifikovány „westernovou analýzou pomocí vhodného konjugátu protilátky a peroxidázy (anti-lidské lehké řetězce kappa Sigma A7164 v případě plně humanizovaných F(ab')2), která byla vizualizována peroxidem vodíku a 4-chloro-1-naftolem. Vhodné frakce byly sloučeny a pokud to bylo nutné koncentrovány pomocí centrifugace (Centricon™).
• ·· ·
-105c) Purifikace pomocí „protein-A/ protein-G
Supernatant z buněčné kultury, obsahující požadované konstrukty F(ab')2 nebo fúzní konstrukty (tj . 806.077
F(ab')2, chimérické konstrukty 806.077 IgGl nebo IgG2 nebo IgG3 , konstrukty pro-HCPB-linker-806.077 F(ab')2, konstrukty 8 0 6.077 F (ab')2-HCPB) , byl naředěn v poměru 1:1 PBS a pak nanesen na kolonu předtím ekvilibrovanou PBS (pH 7,2). Kolona byla propláchnuta PBS a navázané F(ab')2 nebo fúzní proteiny pak byly eluovány lOOmM citrátem sodným (pH 3,0) v případě F(ab')2 a 50mM glycinem + lOOmM chloridem sodným (pH 10,8) v případě fúzních proteinů. Eluované frakce byly sebrány a neutralizovány přidáním 125 μΐ 2M Tris na každý 1 ml eluátu. Frakce obsahující F(ab')2 byly spojeny a pokud to bylo třeba koncentrovány centrifugaci.
d) Štěpení pro-sekvence
Fúzní proteiny obsahující kovalentně spojené prosekvence (tj . Pro-HCPB-linker-806.077 F(ab')2) byly inkubovány s trypsinem, aby se odštěpila pro-sekvence. Tento postup v miligramovém měřítku (vzhledem k fúznímu proteinu) byl proveden následovně. Trypsin byl smíchán s fúzním proteinem v poměru 1:1000 (trypsin:fúzní protein). Směs byla inkubována 24 hodin při teplotě místnosti (přibližně 22°C), až bylo štěpení dokončeno. Fúzní protein byl pak separován od pro-sekvencí recirkulací směsi podle jednoho z původních postupů pro chromatografickou purifikaci nebo obohacení směsi.
··· · • ·
-106Příklad 103
Test aktivity fúzních proteinů protilátka-enzym obsahujících mutovanou lidskou CPB proti analogům předléku Hipp-Glu
Supernatanty buněčných kultur nebo purifikované fúzní proteiny protilátka-enzym obsahující mutanty lidské CPB ( [D253K] , [G2 5 IT, D2 53K] nebo [A248S,G251T,D253K], viz příklady 48 až 101) byly testovány na schopnost přeměňovat hippuryl-L-glutamovou kyselinu (Hipp-Glu, viz Mezinárodní patentová přihláška WO 96/20011, referenční příklad 9) na hippurovou kyselinu měřením na HPLC.
Reakční směs (250 μΐ) obsahovala bud' 4 μg purifikovaného fúzního proteinu nebo supernatantu buněčné kultury (buď v původním stavu nebo naředěného 0,025M TrisHCl, pH 7,5, 125 μί) a 0,5mM Hipp-Glu v 0,025M Tris-HCl, pH 7,5. Vzorky byly inkubovány 5 hodin při 37°C. reakce byla zastavena přidáním 250 μΐ 30% metanolu, 70% fosfátového pufru (50mM, pH 6,5), 0,2% trifluoroctové kyseliny, a hippurová kyselina, která se tvořila, byla kvantifikována pomocí HPLC (Hewlwtt Packard 1090 Series 11 s diodovým polem).
Vzorky (50 μΐ) byly injikovány do kolony (25 cm, HICHROM™ Hi-RPB) a separovány pomocí pohyblivé fáze z 15 % metanolu a 85 % fosfátového pufru (50mM, pH 6,5) při průtoku 1 ml/min. Množství vznikajícího produktu (hippurové kyseliny) bylo stanoveno pomocí kalibrační křivky připravené ze známých množství hippurové kyseliny (Sigma H6375). Výsledky jsou vyjádřeny jako procenta konverze substrátu na produkt při 37°C v časovém rozmezí od 30 minut do 24 hodin v závislosti na rychlosti konverze.
V případě fúzních proteinů protilátka-enzym s N-koncovou proCPB byla pro-doména nejdříve odstraněna naštěpenim trypsinem (700 pg/ml) v 50mM Tris-HCl, pH 7,6, 150mM NaCl po 1 hodinu při 4°C.
Příklad 104
Příprava fúzního proteinu lidská B7.1-humanizovaný 806.077 F(ab')2 (hB7-806)
Stejně jako v referenčním příkladu 3 byl fúzní protein, obsahující signální sekvenci a extracelulární doménu lidské B7.1 fúzované přímo k 5'-konci kódujícího úseku humanizovaného řetězce Fd protilátky 806.077, připraven pomocí PCR. Byl tak vytvořen fragment HindiII-Nhel obsahující přirozenou signální sekvenci a extracelulární doménu lidské B7.1 fúzované přímo k úseku VH humanizovaného těžkého řetězce protilátky 806.077. Ten byl klonován do vhodného vektoru např. pNG4-VHss-HuIgG2CHl' nebo pNG4-VHssHuIgG3CHl' (viz příklady 39 až 47) (a nahradil baze 1 až 423 v sekvenci id. č. 18), čímž vznikl fúzní gen „lidská B7.1humanizovný 806.077Fd. Ko-exprese tohoto fúzního genu s humanizovaným 806.077 L řetězcem (vhodný vektor, obsahující verzi VK4 humanizovaného 806.077 lehkého řetězce, je pCF008/4, viz příklad 75) je dosažena po konstrukci koexpresního vektoru pomocí expresních systémů zde popsaných. Takový vektor je pak použit k transfekci myelomových buněk NSO a kolonie se selektují na přítomnost CEA vazebné aktivity v supernatantu buněčných kultur. Další humanizované sekvence byly již popsány v příkladech 39 až 47.
Fúzní protein hB7-806 je exprimován ve vhodné buněčné linii a purifikován pomocí kolony s proteinem-A, jak je popsáno v referenčním příkladu 102. Je nutno poznamenat, že pro fragmenty humanizovaných protilátek 806.077 a jejich fúzní proteiny jsou výhodné jiné purifikační metody než kolony s proteinem-A. Fúzní proteiny se mohou testovat jak na vazbu • ·
-108antigenu tak receptoru a také ko-stimulační aktivitu T-buněk, když se naváži na buňky LS174T, pomocí testu popsaného v referenčním příkladu 3.
Příklad 105
Příprava chimérických a humanizovaných konjugátů 806.077 F(ab')2 - CPG2
Postup popsaný v příkladu 5 se opakoval s tím, že myší F(ab')2 byl nahrazen jednou z chimérických verzí popsaných v příkladu 8 nebo jednou z humanizovaných verzí popsaných v příkladech 39 až 47.
Příklad 106
Příprava fúzniho proteinu „ humanizovaný 806.077 Fab - enzym CPG2
Konstrukty fúzních proteinů humanizované protilátky 806.077 a bakteriálního enzymu CPG2 byly připraveny pomocí PCR podobně jako byly konstruovány HuVK4 v příkladech 12 až 38, kde byly použity speciálně navržené primery pro PCR reakce, aby amplifikovaly složky genů protilátky a enzymu (tak aby výsledné produkty DNA obsahovaly přesahující komplementární sekvence), které byly spojeny prostřednictvím speciální PCR reakce typu „sestřih/spojení, a tak se vytvořil úplný gen fúzniho proteinu protilátka-enzym. Fúzní protein je tedy vytvořen spojením 3'-konce genu humanizovaného těžkého řetězce 806.077 Fd s 5'-koncem strukturního kódujícího genu CPG2, čímž vznikne gen kódující fúzní protein Fab-CPG2. V takovém konstruktu může být složka humanizovaného těžkého řetězce protilátky 806.077 ukončena za reziduem K236 v případě těžkého řetězce HuVHl-HulgGI Fd (sekvence id. č. 93), za reziduem Val237 v případě těžkého řetězce HuVHl-HuIgG2 Fd (sekvence id. č. 57) anebo za ·· ··*·
-109s prvním reziduem těžkého řetězce Val237 v případě HuVHl-HuIgG3 Fd (sekvence id. č. 95)(v každém případě včetně jakékoliv sekvence patřící ke kloubovému úseku) a reziduem CPG2 na C-konci od může být spojena štěpícího místa signální sekvence (Minton et al. , 1984, GEne 31, 31-38). Avšak proto, aby se získaly optimální vazebné vlastnosti protilátky a optimální enzymové vlastnosti, doporučuje se vložit další rezidua do místa spojení mezi dvěma složkami.
Fúzní gen se potom klonuje do vhodného vektoru, např. pNG4-VHss-HuIgG2CHl' (NCIMB č. 40797), po příslušném štěpení restrikčními enzymy a izolaci vektoru a fúzního genu je připraven fragment DNA, který nahrazuje původní gen protilátky genem fúzního proteinu. Ko-exprese fúzního genu s humanizovaným lehkým řetězcem 806.077 je pak dosaženo zkonstruováním koexpresního vektoru stejně jak je popsáno v příkladu 11. Ko-expresní vektor se použije k transfekci myelomových buněk NSO a kolonie se pak selektují na své CEA vazebné a Fd vazebné vlastnosti ze supernatantu buněčných kultur jak bylo popsané v předchozím textu. Fúzní protein může být purifikován pomocí kolony s proteinem-A a standardními testy se prokáže, zda má požadované antigení a enzymatické vlastnosti.
Příklad 107
Další kombinace humanizovaných variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce na podkladu sekvence lehkého řetězce VK4
Postup popsaný v příkladech 12 až 38 se opakoval s tím, že variabilní sekvence humanizovaného lehkého řetězce VK4 (sekvence id. č. 71) byla nahrazena modifikovanou sekvencí, kde tyrosin (Tyr) v poloze 35 sekvence id. č. 71 byl nahrazen fenylalaninem (Phe).
• · · «
-110Příklad 108
Další kombinace humanizovaných variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce na podkladu sekvence lehkého řetězce VK4
Postup popsaný v příkladech 12 až 38 se opakoval s tím, že variabilní sekvence humanizovaného lehkého řetězce VK4 (sekvence id. č. 71) byla nahrazena modifikovanou sekvencí, kde fenylalanin (Phe v poloze 72 sekvence id. č. 71) byl nahrazen leucinem (Leu).
Příklad 109
Další kombinace humanizovaných variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce na podkladu sekvence lehkého řetězce VK4
Postup popsaný v příkladech 12 až 38 se opakoval s tím, že variabilní sekvence humanizovaného lehkého řetězce VK4 (sekvence id. č. 71) byla nahrazena modifikovanou sekvencí, kde tyrosin (Tyr) v poloze 35 sekvence id. č. 71 byl nahrazen fenylalaninem (Phe) a fenylalanin (Phe) v poloze 72 sekvence id. č. 71 byly nahrazen leucinem (Leu).
Příklad 110
Kombinace humanizovaných variabilních úseků těžkého řetězce a chimérických sekvencí lehkého řetězce
Postup popsaný v příkladech 12 až 38 se opakoval s tím, že variabilní sekvence humanizovaného lehkého řetězce byla nahrazena chimérickou sekvencí id. č. 17 popsanou zde v příkladu 8.
Příklady 111 až 113
Exprese humanizovaných fragmentů F(ab')2 s modifikovanou variabilní sekvencí lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladech 39 až 47 se opakovaly s tím, že variabilní sekvence popsaná v příkladu 107 byla • · ·
-111použita k nahrazení humanizované sekvence lehkého řetězce (sekvence id. č. 99), a že tyrosin (Tyr) v poloze 57 sekvence id. č. 99 byl nahrazen fenylalaninem (Phe).
Příklad 111 kombinuje HuVHl-HulgGI a modifikovanou sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 112 kombinuje HuVHl-HuIgG2 a modifikovanou sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 113 kombinuje HuVHl-HuIgG3 a modifikovanou sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
Příklady 114 až 116
Exprese humanizovaných fragmentů F(ab')2 s modifikovanou variabilní sekvencí lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladech 39 až 47 se opakovaly s tím, že variabilní sekvence popsaná v příkladu 108 byla použita k nahrazení humanizované sekvence lehkého řetězce (sekvence id. č. 99), a že fenylalanin (Phe) v poloze 94 sekvence id. č. 99 byly nahrazen leucinem (Leu).
Příklad 114 kombinuje HuVHl-HulgGI a modifikovanou sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 115 kombinuje HuVHl-HuIgG2 a modifikovanou sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 116 kombinuje HuVHl-HuIgG3 a modifikovanou sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
Příklady 117 až 119
Exprese humanizovaných fragmentů F(ab')2 s modifikovanou variabilní sekvencí lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladech 39 až 47 se opakovaly s tím, že variabilní sekvence popsaná v příkladu 109 byla použita k nahrazení humanizované sekvence lehkého řetězce (sekvence id. č. 99), a že tyrosin (Tyr) v poloze 57 ·· ····
-112sekvence id. č. 99 byl nahrazen fenylalaninem (Phe) a fenyialanin (Phe) v poloze 94 sekvence id. č. 99 byl nahrazen leucinem (Leu).
Příklad 117 kombinuje HuVHl-HulgGI a modifikovanou sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 118 kombinuje HuVHl-HuIgG2 a modifikovanou sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 119 kombinuje HuVHl-HuIgG3 a sekvenci id. č. 99 popsanou v úvodním odstavci.
modifikovanou
Příklady 120 až 122
Exprese humanizovaných fragmentů F(ab')2 s chimérickou sekvencí lehkého řetězce
Postupy popsané v příkladech 39 až 47 se opakovaly s tím, že chimérická sekvence lehkého řetězce popsaná v příkladu 110 nahradila sekvence humanizovaných lehkých řetězců použité v příkladech 39 až 47.
Příklad 120 kombinuje HuVHl-HulgGI a chimérickou sekvenci lehkého řetězce popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 121 kombinuje HuVHl-HuIgG2 a chimérickou sekvenci lehkého řetězce popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 122 kombinuje HuVHl-HuIgG3 a chimérickou sekvenci lehkého řetězce popsanou v úvodním odstavci.
Příklad 123
Příprava humanizovaného fúzního proteinu založeného na modifikované sekvenci lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladu 48 se opakovaly, ale s tím, že plazmid pEE14- 8 06.077HuVK4-HuCK byl nahrazen plazmidem obsahujícím modifikované sekvence VK4 uvedené v příkladech 107 a 111 až 113.
·· ····
-113Příklad 124
Příprava humanizovaného fúzního proteinu založeného na modifikované sekvenci lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladu 48 se opakovaly, ale s tím, že plazmid pEE14-806.077HuVK4-HuCK byl nahrazen plazmidem obsahujícím modifikované sekvence VK4 uvedené v příkladech
108 a 114 až 116.
Příklad 125
Příprava humanizovaného fúzního proteinu založeného na modifikované sekvenci lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladu 48 se opakovaly, ale s tím, že plazmid pEE14-806.077HuVK4-HuCK byl nahrazen plazmidem obsahujícím modifikované sekvence VK4 uvedené v příkladech
109 a 117 až 119.
Příklad 126
Příprava humanizovaného fúzního proteinu založeného na chiméricé sekvenci lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladu 48 se opakovaly, ale s tím, že plazmid pEE14-806.077HuVK4-HuCK byl nahrazen plazmidem obsahujícím chimérické sekvence lehkého řetězce uvedené v příkladech 110 a 120 až 122.
Příklad 127
Příprava humanizovaného fúzního proteinu založeného na modifikované sekvenci lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladu 75 se opakovaly, ale s tím, že plazmid pCF008/4 byl nahrazen plazmidem obsahujícím modifikované sekvence VK4 uvedené v příkladech 107 a 111 až
113 .
• · · · ·· • · · ··· · · • · · · · ··· ··· ·· »· ·· ··*· • · · • · · • · · • · · · t· ··
-114Příklad 128
Příprava humanizovaného fúzního proteinu založeného na modifikované sekvenci lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladu 75 se opakovaly, ale s tím, že plazmid pCF008/4byl nahrazen plazmidem obsahujícím modifikované sekvence VK4 uvedené v příkladech 108 a 114 až 116 .
Příklad 129
Příprava humanizovaného fúzního proteinu založeného na modifikované sekvenci lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladu 75 se opakovaly, ale s tím, že plazmid pCF008/4byl nahrazen plazmidem obsahujícím modifikované sekvence VK4 uvedené v příkladech 109 a 117 až 119 .
Příklad 130
Příprava humanizovaného fúzního proteinu založeného na chimérické sekvenci lehkého řetězce VK4
Postupy popsané v příkladu 75 se opakovaly, ale s tím, že plazmid pCF008/4byl nahrazen plazmidem obsahujícím chimérické sekvence lehkého řetězce uvedené v příkladech 110 a 120 až 122.
Referenční příklad 1
Příprava genové sekvence [G251T,D253K]HCPB
Způsob klonování [G251T,D253K]HCPB v E. coli byl velmi podobný způsobu popsanému v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, příklad 15. Plazmid pICI266 byl použit jako klonovací vektor, ale výchozím materiálem pro místně cílenou mutagenezi pomocí PCR byl gen [D253K]HCPB v plazmidu
• ·
-115pICI1713 (viz Mezinárodní patentová přihláška WO 96/20011, příklad 15). Avšak v tomto případě místně cílená mutageneze prostřednictvím PCR amplifikace genu byla užita k záměně kodonů aminokyseliny v poloze 251 maturovaného genu, tj . glycinu na threonin (GGC na ACT), tedy mutace G251T. Během generování této mutace vznikla také řada mutací ve stejném, místě tím, že se použila směs oligonukleotidů se záměnou kodonů v poloze G251. Jednotlivé mutované geny byly identifikovány po transformaci a hybridizaci sekvencováním příslušného mutovaného místa a pak byl sekvencován celý gen. V tomto případě je však uvažován pouze oligonukleotid pro vnesení mutace G251T. Byly připraveny dvě reakce PCR způsobem stejným jak je popsáno v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, příklad 15. V první reakci byly použity primery CAN00402 (sekvence id. č. 116) a CAN00734 (sekvence id. č. 117) . Ve druhé reakci byly použity primery CAN00284 (sekvence id. č. 118) a CAN01076 (sekvence id. č. 119). V obou případech výchozí DNA byl plazmid pICI1713.
Alikvoty z obou PCR byly analyzovány, zda obsahují DNA správné velikosti (750 a 250 bp) , byla změřena koncentrace elektroforézou na agarózového gelu, a zjistilo se, že obsahují převážně pásy odpovídající správné velikosti. Další PCR byla připravena s použitím primárních produktů z obou PCR s primery CAN00402 (sekvence id. č. 16) a CAN00284 (sekvence id. 4. 118) . Alikvot z PCR byl analyzován, zda obsahuje DNA správné velikosti (1000 bp), byla změřena koncentrace elektroforézou na agarózového gelu, a zjistilo se, že obsahuje převážně pás odpovídající správné velikosti. Zbytek PCR produktu z reakční směsi byl purifikován, izolovaná DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Ncol a EcoRI a pás správné velikosti (1000 bp) byl purifikován
I · · · · · • · · ·
-116stejně jak je popsáno v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, příklad 16.
Dvoj řetězcová DNA plazmidů pICI266 byla naštěpena enzymy Ncol a EcoRI a DNA správné velikosti (5600 bp) byla purifikována. Alikvoty naštěpeného a purifikovaného vektoru a inzertu DNA byly kontrolovány na čistotu a byla změřena koncentrace elektroforézou na agarózovém gelu srovnáním se známými standardy. Na základě těchto stanovení byly připraveny ligační směsi pro klonování genu HCPB do plazmidů pICI266 obdobným způsobem popsaným v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, příklad 16.
Po uskutečnění ligační reakce byla směs DNA použita pro transformaci kmene E. coli DH5a, kolonie byly testovány hybridizaci. několik kolonií bylo sebráno pro minipreparaci DNA a vzorky DNA byly sekvencovány v úseku mutace vnesené PCR, aby se identifikovaly klony s mutací G251T postupem popsaným v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, příklad 16. Na základě výsledků sekvencování byl vyselektován plazmid obsahující požadovaný gen [G251T, D253K]HCPB a byl nazván pZEN1860.
Referenční příklad 2
Příprava genové sekvence [A248S,G251T,D253K]HCPB
Způsob klonování [A248S,G251T,D253K]HCPB v E. coli byl velmi podobný způsobu popsanému v referenčním příkladu 1. Výchozím materiálem pro místně cílenou mutagenezi pomocí PCR byl gen [G251T,D253K]HCPB v plazmidů pZEN1860 (viz referenční příklad 1) . Avšak v tomto případě místně cílená mutageneze prostřednictvím PCR amplifikace genu byla užita k záměně kodonu aminokyseliny v poloze 248 maturovaného genu, tj. alaninu na serin (GCT na TTC), tedy mutace A248S.
• ·
-117Byly připraveny dvě reakce PCR způsobem stejným jak je popsáno v referenční příkladu 1. V první reakci byly použity primery CAN00402 (sekvence id. č. 116) a CAN00720 (sekvence id. č. 120) . Ve druhé reakci byly použity primery CAN00284 (sekvence id. č. 118) a CAN00726 (sekvence id. č. 121) . V obou případech výchozí DNA byl plazmid pZEN1860.
Způsoby PCR, klonování, exprese a identifikace byly stejné jako v referenčním příkladu 1. Na základě výsledků sekvencování byl vyselektován plazmid obsahující požadovaný gen [A248S,G251T,D253K]HCPB a byl nazván pZEN1921.
Referenční příklad 3
Příprava a charakterizace fúzního proteinu „lidská B7.1-myší A5B7 F(ab')2 (AB7)
Způsoby přípravy, purifikace a charakterizace F(ab')2 rekombinantní myší protilátky A5B7 byly publikovány (viz Mezinárodní patentová přihláška WO 96/20011, referenční příklad 5) . cDNA sekvence lidského antigenu B7.1 (zvaného také CD80) byla izolována a popsána (Freeman, G.J., Journal Of Immunology, 1989, 143, 2714-2722). V tomto příkladu „AB7 znamená fúzní protein „lidský B7.1 - myší A5B7 F(ab')2 a „A5B7 znamená anti-CEA protilátku zvanou A5B7.
Pomocí strategie založené na PCR byly izolovány přirozená signální sekvence a extracelulární doména lidského B7.1 (kódující aminokyseliny 1 až 242) z cDNA připravené z kultivovaných buněk Ráji (ATCC č. CCL 86) a přímo fúzovány „upstream s 5'-koncem maturované kódující sekvence myšího fragmentu Fd A5B7. To zahrnuje izolaci sekvence B7.1 pomocí PCR primerů 187/96 a 204/96 (sekvence id. č. 126 a 127) a izolaci částečné sekvence A5B7 Fd pomocí primerů 203/96 a 205/96 (sekvence id. č. 128 a 129). Po purifikaci byly PCR produkty smíchány přibližně v ekvimolárních množstvích • · • ·
-118a fúzovány prostřednictvím PCR s primery 187/96 a 205/96. Výsledný PCR produkt byl purifikován, naštěpen Hindlll a Bstl (New England BioLabs (UK) Ltd., Wilbury Way, Hitchin, SG4 OTY) a klonován do úseku Hindlll-Bstl plazmidu pAFl standardním postupem, aby vznikl fúzní gen „lidský B7.1-myší A5B7 Fd plné délky. Tento fúzní gen (sekvence id. č. 130 a 131) byl klonován jako fragment EcoRI-Hindlll do systému GS-System™ expresního vektoru pEE6 (Celltech Biologics, Bath Road, Slough, SL1, 4EN) podle protokolů popsaných v Mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, referenční příklad 5, aby se vytvořil vektor pAB7.1.
Fragment BglII-Sall obsahující expresní kazetu „37.1A5B7 Fd byl pak klonován do míst BglII a Sall vektoru pAF6 popsanému v předchozím textu, aby se vytvořil vektor pAB7.2 schopný ko-exprese fúzniho proteinu a lehkého řetězce A5B7. Vektor pAB7.2 byl pak použit k transformaci myelomových buněk NSO a kolonie byly selektovány na základě schopnosti růst bez přítomnosti glutaminu. Buněčné linie exprimující fúzní protein byly identifikovány stanovením CEA vazebné aktivity v supernatantu buněčné kultury pomocí ELISA testu popsaného v předchozím textu. Buněčná linie exprimující fúzní protein ve vhodné hladině (1D4) byla selektována pro purifikaci a charakterizaci fúzniho proteinu AB7.
Purifikace a charakterizace fúzniho proteinu AB7
Secernovaný rekombinantní materiál „B7.1(35-242)-A5B7 F(ab')2, AB7, byl purifikován ze supernatantu použitím agarózové matrix s proteinem-A jako je např. Protein-A Sepharose Fast Flow od firmy Pharmacia (Pharmacia Biotech, 23 Grosvenor Rd., St. Albans, Herts, AL1 3AW) . Matrix byla propláchnuta 2x8 objemem vazebného pufru (3M NaCl, 1,5M Glycin, pH 8,9). Supernatant obsahující AB7 byla naředěn 1:1
-119vazebným pufrem. Propláchnutá matrix byla přidána k naředěnému supernatantu (1 ml usazené matrix na 40 ml naředěného supernatantu) a inkubována za mírného třepání 2 hodiny ve 4°C. Matrix pak byla stočena centrifugací a asi 75 % supernatantu bylo slito. Matrix pak byla resuspendována ve zbylém supernatantu a výsledná směs byla naplněna do kolony. Kolona byla propláchnuta 5 až 6 objemy 150mM NaCl, lOmM NaH2PO4, pH 7,4. Pufr byl pak vyměněn za lOOmM citrát sodný, pH 2,8 eluované frakce se sbíraly. Frakce byly titrovány na přibližně pH 7,0 přidáním 2M Tris pufru pH 8,5. Eluované frakce byly analyzovány neredukující SDSPAGE a jako výsledný produkt zůstala frakce s vrcholem AB7.
N-koncové sekvencování
Vzorky AB7 byly rozděleny redukující SDS-PAGE elektroforézou a přeneseny na PVDF (polyvinylidendifluorid) membránu (zařízení, gely, přenosová membrána a postup - vše od firmy NOVEX, 4202 Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121, USA) . Proteinové pásy byly obarveny Coomassie modří a pás velikosti asi 70 kDa (tj . fúzní protein B7.1-Fd) byl N-koncově sekvencován (Applied Biosystems, 494 Protein Sequencer, Perkin Elmer, ABI Division, Kelvin Close, Birchwood Science Park North, Warington, WA3 7PB) . Získaná sekvence souhlasila s očekávanou sekvencí maturovaného B7 (tj . po odštěpení vedoucí sekvence od aminokyseliny 35 v sekvenci id. č. 131, Val-Ile-His-Val atd.).
Analýza „BIAcore
Produkt AB7 byl analyzován pomocí zařízení BIAcore pro povrchovou plazmonovou rezonanci firmy Biacore (23 Grosvenor Rd., St. Albans, Herts, AL1 3AW) metodou pro BIAcore analýzu převzatou z publikace Greene, J.L., Leytze G.M., Emswiler, • ·
-120J., Peach, R.O., Bajorath, J. , Cosand, W. a Linsley, P.S., 1996, J. Biol. Chem. 271, 26762-27771. Vzorky purifikovaného produktu AB7 byly injikovány na povrch CTLA4-Ig navázaný aminem a na prázdný kontrolní povrch navázaný aminem. Navázání AB7 se dalo zřetelně pozorovat na povrchu s CTLA-Ig ve srovnání s kontrolním povrchem (viz. obr. 3) . Bylo možné také ukázat vazbu mezi CTLA4-Ig a AB7, když se injikoval CTLA4-Ig na aminem navázaný povrch AB7.
Tyto údaje společně s údaji z anti-CEA ELISA testů potvrzují, že purifikovaný fúzní protein AB7 má biologické vlastnosti obou spojených částí, zejména vazebné aktivity pro receptor a antigen.
fluoresceinisothiokyanátu (Becton-Dickinson UK Ltd.
Ko-stimulační aktivita fúzního proteinu AB7
Schopnost fúzního proteinu AB7 poskytovat ko-stimulační signál pro T-buňky, když je navázán na tumorové buňky exprimující CEA, byla testována pomocí upraveného kostimulčního testu, který publikovali Jenkins et al. , 1991,
J. Immunol. 147, 2461. Buňky kolorektálního nádoru LS174 exprimující CEA (fixované 0,5% paraformaldehydem po 5 minut při teplotě místnosti) byly inkubovány s 10 μg/ml fúzního proteinu AB7 (2 hodiny rotování ve 4°C v médiu RPMI 1640 (Gibco Life Technologies, Paisley, Scotland) obsahujícím 0,5% lidské sérum (Sigma AB, Sigma Chemical Co., Dorset, UK) . Buňky byly před použitím dvakrát opláchnuty a navázání fúzního proteinu bylo potvrzeno použitím konjugátu (FITC) s kozím anti-myším Ig Oxford) v průtokové cytometrii (Facscan, Becton-Dickinson). Aby bylo možné použít v testu nepřipravené (tj . bez primeru) lidské T-buňky, stimul pro receptor T-buněk (TCR) byl poskytnut protilátkou proti receptoru T-buněk (protilátka anti-CD3, OKT-3 Orthoclinical • · • · · · · • · «
9· ··
-121Diagnostics, Amersham, UK) , kterou byly předtím potaženy jamky v 96jamkové destičce. OKT-3 byla imobilizována tak, že se purifikovaná protilátka inkubovala (2 pg/ml v bikarbonštovém potahovacím pufru, pH 9,6 (tablety Sigma)) přes noc při 4° C v 96jamkové mikrotitrační destičce s jamkami s rovným dnem (Costar Corporation, Cambridge, MA, USA), které pak byly opláchnuty třikrát až čtyřikrát PBS. T-buňky purifikované z dárcovské lidské krve (negativně vyčerpané (tj . vytlačením všech složek kromě T-buněk) pomocí magnetických perliček (Dynabeads, Dynal A.S., Oslo, Norway) se přidaly do jamek v množství 2X105 na jamku v 50 μΐ RPMI 1640 média obsahujícího 5% lidské sérum. Buňky LS174T vázající fúzní protein byly přidány v množství 5xlQ4 na jamku v 50 μΐ RPMI 1640 média obsahujícího 5% lidské sérum. Nakonec byl objem v každé jamce doplněn na 200 μΐ médiem RPMI 1640 obsahujícím 5% lidské sérum. Po 48 hodinách byly kultury označeny pulzem 1,25 pCi [3H] thymidinu (Amersham International) a o 16 hodin později byly sklizeny poloautomatickým sběračem buněk (TomTec Harvester, Wallac, UK) . Inkorporace [3H] thymidinu do DNA byla kvantifikována scintilačním počítačem (Betaplate Scint, Betaplate Counter, Wallac, UK). Typická data z ko-stimulačního testu jsou uvedena v následující tabulce.
ctCD3 (2 pg/ml) navázaná na jamky [cpm]
samotné T-buňky 3582
T-buňky + aCD28 28178
T-buňky + LS174T 12303
T-buňky + LS174T + aCD28 25759
T-buňky + LS174T/fúzní protein 41755
aCD3 = protilátka. anti-CD3,. aCD28 = protilátka anti-CD28 • ·
-122Nepřipravené T-buňky vyžadují jak signál pro receptor TCR tak i ko-stimulační signál. V tomto testu signál pro receptor T-buňky byl poskytnut protilátkou aCD3. Pokud je poskytnuta ko-stimulace prostřednictvím aCD28 (BectonDickinson, 0,6 gg/ml), příjem [3H] thymidinu je stimulován více než 8x ve srovnání se samotnou ccCD3. Přítomnost nádorových buněk nemá žádný významný vliv na tuto stimulaci, jestliže se ko-stimulační signál poskytne prostřednictvím fúzního proteinu AB7 navázaného na nádorové buňky, je příjem [3H]thymidinu stimulován více než 3x ve srovnání se samotnými nádorovými buňkami a je více než llx vyšší než lze pozorovat bez přítomností ko-stimulace. Zjevná stimulace, kterou poskytly samotné nádorové buňky, může být způsobena zbytkem pomocných buněk přítomných v purifikované populaci T-buněk. Zvýšení proliferace T-buněk bylo opakovaně pozorováno v jamkách obsahujících fúzní protein navázaný na nádorové buňky v každém z pěti testů, kdy se porovnávaly s jamkami obsahujícím samotné T-buňky nebo nenavázané nádorové buňky.
Referenční příklad 4
Příprava IgG3-pBSIIKS+
Tento příklad popisuje přípravu vektoru obsahujícího gen pro konstantní úsek těžkého řetězce a kloubový úsek lidského IgG3.
Gen obsahující sekvenci id. č. 115 (ta obsahuje sekvenci (rezidua 8 až 508) podobnou sekvenci id. č. 25, ale rezidua 312 a 501 sekvence id. č. 25 jsou změněna na C a G) byl připraven pomocí PCR způsobem podobným tomu, který popsali Jayaraman et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 4084-4088.
• ·· · • ·
-123Gen byl připraven, ve dvou částech známých jako IgG3A a IgG3B. Ty byly odděleně klonovány do míst Sací a Xmal v pBluescript KS+ (Stratagene Cloning System), čímž vznikly vektory IgG3A-pBSIIKS+klonA7 a IgG3B-pBSIIKS+klonB17. IgG3A byl připraven tak, že se prodloužil za restrikčním místem PmaCI (CACGTG v poloze 334 až 339 v sekvenci id. č. 115) . Podobně IgG3B byl připraven tak, že 5'-konec sekvence byl před restrikčním místem PmaCI. Vektorový fragment (2823 bp) z IgG3A-pBSIIKS+klonA7 a inzertový fragment (666 bp) z IgG3B-pBSIIKS+klonB17 byly izolovány elektroforézou na 1% agarózovém gelu a purifikovány. Fragmenty byly ligovány a ligační směsí pak byly transformovány bakterie E. coli DH5a. Klony obsahující požadovaný gen byly identifikovány restrikčním štěpením izolované DNA pomocí Sací a Xmal, které poskytovalo fragment 520 bp. Sekvence inzertu byla potvrzena sekvencováním DNA a klon F3 byl pojmenován IgG3PBSIIKS+.
124
SEZNAM SEKVENCI (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
GGAAGCTTGA AGATGGATAC AGTTGGTGCA GC 32 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
GGAAGCTTAG ACAGATGGGG GTGTCGTTTT G 31 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid •0 ·♦··
- 125 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
Glu 1 Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
20 25 30
Tyr Met
2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCA 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA
00
0 0
• 0
- 126 0 0 ··
0
0
0
000 0 0 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 41 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
ACTAGTGGAA TTCAGTGTGA GGTSCARCTG CAGCARTCWG G φφ φφ • φ φ φ φ φ ·· φφφφ · φ φ φ • Φ ·Φ
- 127 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 357 párů baží (3) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACC 60
ATAACCTGCA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTTCCAGCA GAAGCCAGGC 120
ACTTCTCCCA AACTCTGGAT TTATAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC 180
TTCAGTGGCA GTGGATCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCCGAAT GGAGGCTGAA 240
GATGCTGCGA CTTATTACTG CCAGCAAAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGTGCTGGG 300
ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT CAAGCTT
357 • ·
- 128 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 108 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid
(xi) POPIS SEKVENCE: SE KVENCE s IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9
As? Ile Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala
100
105
- 129 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
GAGGTGCAGC TGCAGCARTC WGGGGCAGAG CTTGTGAGGT CAGGGGCCTC AGTCAAGTTG 60
TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CAACATTAAA GACAACTATA TGCACTGGGT GAAGCAGAGG 120
CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GA7TGCATGG ATTGATCCTG AGAA. i GGTGA TACTGAATAT ISO
GCCCCGAAGT TCCGGGGCAA GGCCACTTTG ACTGCAGACT CATCCTCCAA CACAGCCTAC 240
ČTGCACCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCGTCT ATTACTGTCA TGTCCTGATC 300
TATGCTGGTT ATTTGGCTAT GGAC7ACTGG GďTCAAGGAA CCTCAGTCGC CGTCTCCTCA 360
2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11 :
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
• ·
- 130 Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Glv Thr Ser Val Ala Val Ser Ser 115 120
• 0 • 0
- 131 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
AAGCTTTCCC GCGGGGACAT TGAGCTCACC CAGTCTCCA 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
AAGCTTCTCG AGCTTGGTCC CAGCACCGAA to to
- 132(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: j ednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
AAGCTTGGAA TTCAGTGTGA GGTGCAGCTG CAGCAG 36 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
AAGCTTCGAG CTCACGGCGA CTGAGGTCC TTG 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 705 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
- 133' ATGGA7T77C AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC 60
CGCGGGGACA TTGAGCTCAC CCAGTCTCCA GCAATCATGT CTGCATCTCC AGGGGAGAAG 120
GTCACCATAA CCTGCAG7GC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTT CCAGCAGAAG 180
CCAGGCACTT CTCCCAAAC7 CTGGATTTAT AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT 240
GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG ATCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CCGAATGGAG 300
GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAAAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGT 360
GCTGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG 420
CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC 480
TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC 540
CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 600
ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 660
GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AG7GT 705 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 235 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
180
185
190 • · · · · ·
0 · • 0 · • · · • 0 0 · • 0 ·0 0 0 0 ·
0 ··
0 0 0 0 ·
- 135 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 765 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG 60
GTGCAGCTGC AGCAATCAGG GGCAGAGCTT GTGAGGTCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC 120
TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC AACTATATGC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT 1Θ0
GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGCATGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TGAATATGCC 240
CCGAAGTTCC GGGGCAAGGC CACTTTGACT GCAGACTCAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG 300
CACCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTCATGT CCTGATCTAT 360
GCTGGTTATT TGGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAACCT CAGTCGCCGT GAGCTCGGCT 420
• · • · ·
- 136 AGCACCAAGG GACCATCGGT CTTCCCCCTG GCCCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC
ACAGCCGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG
AACTCAGGCG CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA
CTCTACTCCC TCAGCAGCGT CGTGACGGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC CCAGACCTAC
ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGACAGT TGAGCGCAAA
TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCGGCG CCACCTGTGG CCGGC
480
540
600
660
720
765 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 255 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp ±le Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15
Ile Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30
Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
40 45
Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu 50 55 5o
Gly Asp Thr Glu Tyr Ala 15 80
Ala Asp Ser Ser Ser Asn
Ser Glu Asp Thr Ala Val
110
Tyr Leu Ala Met Asp Tyr
125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly
140
Arg Ser Thr Ser Glu Ser
155 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val
115
Ser Giy Val His Thr Phe
190
Ser Leu Ser Ser Val Val
205
Thr Tyr Thr Cys Asn Val
220
Lys Thr Val Glu Arg Lys 235 240
Pro Pro Val Ala Gly
- 137
Glu Trp Ile Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn 65 10
Pro Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr
90
Thr Ala Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr
100 105
Tyr Tyr Cys His Val Leu Ile Tyr Ala Gly 115 120
Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Ala Val Ser 130 135
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 145 150
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 165 170
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr ISO 135
Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin 210 215
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245
250
255 • ·
- 138
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 121 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 20
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 35 40
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 50 55
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 65 to
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Asn 85
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 100
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 10 15
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 45
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 75 80
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 90 95
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
105 no
Pro
115
120
- 139 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 369 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG 60
GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 120
TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 180
GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGG7GACT GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC 240
TACATCTGCA ACGTGAATCA CAACCCCAGC AACACCAAGG TCGACAAGAA AGTTGAGCCC 300
AAATCTTGTG ACAAGACGCA CACGTGCCCG CCGTGCCCGG CTCCGGAACT GCTGGGTGGC 360
CCGTAATAG
369 • 9
9 · · • · ·· «
- 140 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 116 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 19 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tvr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 30 75 go
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro .Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Pro Val Ala Gly
115 »*·· • ·
I frfr · • fr ··
- 141 • fr « · · • · • · · · « • · 1 • fr fr* (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 348 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
GCTAGCACCA AGGGACCATC GGTCTTCCCC CTGGCCCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG 60
AGCACAGCCG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 120
ŤGGAACTCAG GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 160
GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTCGTGACG GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC 240
TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC AGTTGAGCGC 300
AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCG GCGCCACCTG TGGCCGGC 348 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 167 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein • ·
- 142 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 io 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 30 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 200 105 HO
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 125 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 no
Pro Glu Pro lvs Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 142 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
165 • · • ·
- 143 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 501 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
GCTAGCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCTGGG 60
GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 120
TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 1Θ0
GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC 240
TACACCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAG AGTGGAGCTG 300
AAAACCCCAC TTGGTGACAC AACTCACACG TGCCCTAGGT GTCCTGAACC TAAATCTTGT 360
GACACACCTC CCCCGTGCCC ACGGTGCCCA GAGCCCAAAT CTTGCGACAC GCCCCCACCG 420
TGTCCCAGAT GTCCTGAACC AAAGAGCTGT GACACTCCAC CGCCCTGCCC GAGGTGCCCA 480
GCACCTGAAC TCCTGGGAGG A
501 • ·
- 144 • · · « (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met His 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA.: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:
Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr 1 5 • ·
- 145 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (3) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
Asp Asn Tyr Met His 1 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (3) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
Phe Asn Ile Lys Asp Asn Tyr Met His 1 5
2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys 15 10
Phe Arg Gly • ·
- 146 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 60 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:
TCGAGAGATC TAAGCTTCCG CGGGAATTCC TCGAGGAGCT CCCCGGGGGA 50 TCCGTCGACT 60 • · · · • · · ·
- 147 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 60 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
CTAGAGTCGA CGGATCCCCC GGGGAGCTCC TCGAGGAATT CCCGCGGAAG 50 CTTAGATCTC 6 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 29 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:
AAGCTTCCCG GGTATTAAAG CAGAACTTG 29 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 29 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:
ACTAGTGGAT CCCAGACATG ATAAGATAC
- 148 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:
GGTCTATATA AGCAGAGCTG TCTGGCTAAC TAGAGAACC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:
GGTTCTCTAG TTAGCCAGAC AGCTCTGCTT ATATAGACC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:
GGACTTTCCT ACTTGGCAG to to
- 149 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:
GGCAACTAGA AGGCACAGTC 2 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 77 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:
AGCTTGCCGC CACCATGGAT TTTCAAGTGC AGATTTTCAG CTTCCTGCTA 50 ATCAGTGCTT CAGTCATAAT GTCCCGC 77 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 71 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:
GGGACATTAT GACTGAAGCA CTGATTAGCA GGAAGCTGAA AATCTGCACT 50 TGAAAATCCA TGGTGGCGGC A 71 • · « ·
- 150 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 61 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA.: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:
AGCTTGCCGC CACCATGAAG TTGTGGCTGA ACTGGATTTT CCTTGTAACA 50 CTTTTAAATG 6 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 61 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:
AATTCCATTT AAAAGTGTTA CAAGGAAAAT CCAGTTCAGC CACAACTTCA 50 TGGTGGCGGC A 61 • ·
- 151 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 357 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:
AAGCTTCTCG AGATCAAACG GACTGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT CCCGCCATCT 60
GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC 120
AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG 180
AGTGTCACAG AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 240
AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG 300
AGTTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT AATAGCCCGG GACTAGT
357
- 152 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 381 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:
GGAAGCTTGA GCTCGGCTAG CACCAAGGGA CCATCGGTCT TCCCCCTGGC CCCCTGCTCC 60
AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA 120
CCGGIGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT 180
GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTCG TGACGGTGCC CTCCAGCAAC 240
TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC 300
AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT GCCCGGCGCC ACCTGTGGCC 360
GGCTAATAGC CCGGGACTAG T 381
2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 342 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina • 0· · • 0 ·· • 0
(xi) POPIS SEKVENCE: - 153 SEKVENCE 0 0·· * 0 0 · · 0 · · S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM
AAGCTTTCCC GCGGCGACAT CCAGATGACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCTAGCGTG 60
GGTGACAGAG TGACCATCAC GTGTAGTGCC AGCTCAAGTG TAACTTACAT GCACTGGTAC 120
CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC TCCAAAGCTG CTGATCTACA GCACATCCAA CCTGGCTTCT 180
GGTGTGCCAA GCAGATTCTC CGGAAGCGGT AGCGGCACCG ACTACACCTT CACCATCAGC 240
AGCCTCCAGC CAGAGGATAT CGCCACCTAC TACTGCCAGC AGAGGAGTAC TTACCCGCTC 300
ÁCGTTCGGCC AAGGGACCAA GCTCGAGATC AAACGGACTA GT 342
2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 321 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:
GACATCCAGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60
ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT 120
AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA 180
TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG 240
- 154 GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG 300
ACGAAGCTCG AGATCAAACG G 321 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:
As? Ile Gin MeC Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly - 5 io
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr MeC 20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 55 so
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 00 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
- 155 Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 705 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:
ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTG CTAAT CA GTGCTTCAGT CATAATGTCC SO
CGCGGCGACA TCCAGATGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA 120
GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG 180
CCAGGTAAGG CTCCAAAGCT GCTGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA 240
AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG 300
CCAGAGGATA TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC 350
CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG 420
CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC 480
TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC 540
CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 600
ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 660
GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT
705 • ·
- 156 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 235 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:
Met Asp Phe Gin Val Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 15 io 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 SO
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile 85 90 95
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg
100
105
110
- 157 -
Ser Thr Tyr 115 Pro Leu Thr Phe Gly 120 Gin Gly Thr Lys Leu 125 Glu Ile Lys
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
13 0 135 140
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
155 170 175
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser PVis Αεη Arg Gly Glu Cys
225 230 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 385 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:
·· • · • · * · • ·
120
180
240
300
360
385
- 158 GAAGCTTGGA ATTCAGTGTG AGGTGCAGCT GCAGCAGAGC GGTCCAGGTC TCGTACGGCC
TAGCCAGACC CTGAGCCTCA CGTGCACCGC ATCTGGCTTC AACATTAAGG ACAATTACAT
GCACTGGGTG AGACAGCCAC CTGGACGAGG CCTTGAGTGG ATTGGATGGA TTGACCCTGA
GAATGGTGAC ACTGAGTACG CACCTAAGTT TCGCGGCCGC GTGACAATGC TGGCAGACAC’
TAGTAAGAAC CAGTTCAGCC TGAGACTCAG CAGCGTGACA GCCGCCGACA CCGCGGTCTA
TTATTGTCAC GTCCTGATAT ACGCCGGGTA TCTGGCAATG GACTACTGGG GCCAAGGGAC
CCTCGTCACC GTGAGCTCGA CTAGT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:
GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC SO
ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120
CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 180
GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC 240
CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300 ·· ·»··
·· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · ·· ··
- 159 TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15
Tin Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Aso Asn 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 SS so
Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser θ5 70 75 Θ0
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys ·♦·· «· ·· • · · · > · ·· • ···· · • · · ·· ·» • · · , . · · • · · · ·· · ·
- 160 Kis Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 765 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:
ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTT C CTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG 60
GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG 120
TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT 180
GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA 240
CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG 300
AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC 360
GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT 420
AGCACCAAGG GACCATCGGT CTTCCCCCTG GCCCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC 480
ACAGCCGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG 540
0000 • · · · • · ·· ··· · · • · · ·· «r ·
0 0 e
0 0
00
- 161 AACTCAGGCG CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA
600
CTCTACTCCC TCAGCAGCGT CGTGACGGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC CCAGACCTAC
660
ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGACAGT TGAGCGCAAA
720
TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCGGCG CCACCTGTGG CCGGC
765 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 255 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 S 10 15
Ile Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40
Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 gg
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala
- 163 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:
GGCGACATCC AGCTGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 46 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:
CTAGCGCTCA GGCTGCTTGG GCTCTGGGTC AGCTGGATGT CGCCGC 46 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 321 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:
- 164 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60
ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT 120
AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA 180
TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG· 240
GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG 300
ACCAAGCTCG AGATCAAACG G 2 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 61:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 61:
Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 2° 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
-165 -
Ser Thr Ser Asn Leu 50 Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 30
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
35 30 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 62 :
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 62:
GGCCAGATCG TGCTGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 63:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 46 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 63:
CTAGCGCTCA GGCTGCTTGG GCTCTGGGTC AGCACGATCT GGCCGC
- 166 ·· ···· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 64:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 321 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 64:
CAGATCGTGC TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60
ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT 120
AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA 130
TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG 240
GATATCGCCA CCTACTACTG. CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG 300
ACCAAGCTCG AGATCAAACG G
321 • ·
- 167 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 65:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 65:
Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Mec
25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
70 75 S0
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100
105
168 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 66:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 66:
CGTATTAGTC ATCGCTATTA CC 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 67:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 67:
GTTGGATGTG CTGTAGATCC ACAGCTTTGG AGCCTTACC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 68:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (li) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 68:
TCCGTTTGAT CTCGAGCTTG G • · · ·
- 169 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 69:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 69:
GGTAAGGCTC CAAAGCTGTG GATCTACAGC ACATCCAAC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 70:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 321 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 70:
GACATCCAGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60
ATCACGTGTA GTGCCAGCTC AAGTGTAACT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGT 120
AAGGCTCCAA AGCTGTGGAT CTACAGCACA TCCAACCTGG CTTCTGGTGT GCCAAGCAGA 180
TTCTCCGGAA GCGGTAGCGG CACCGACTAC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG 240
GATATCGCCA CCTACTACTG CCAGCAGAGG AGTACTTACC CGCTCACGTT CGGCCAAGGG 300
ACCAAGCTCG AGATCAAACG G
321
- 170 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 71:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 71:
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 1S
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100
105
- 171 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 72:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 64 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 72:
CCTTGAGTGG ATTGCATGGA TTGACCCTGA GAATGGTGAC ACTGAGTACG 50 CACCTAAGTT TCGC cí (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 73:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 68 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 73:
GGCCGCGAAA CTTAGGTGCG TACTCAGTGT CACCATTCTC AGGGTCAATC 50 CATGCAATCC ACTCAAGG 68 • · • · ·
- 172 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 74:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 74:
GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC SO
ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120
CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGCATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 130
GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC 240
CTGAGACTCA gcagcgtgac AG^-CůjCcGAC accgcggtct ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300
TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 3S0
·· · · · • · · ·· ··
- 173 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 75:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 75:
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin '20 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn 20 25 30
Tyr Mec His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Mec Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 go 95
His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Mec Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
120
• · ·
- 174 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 76:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 80 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 76:
GGCCGCGTGA CAATGCTGGC AGACTCAAGT AAGAACCAGG CCAGCCTGAG 50 ACTCAGCAGC GTGACAGCCG CCGACACCGC 80 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 77:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 74 párů baží (3) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 77:
GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT CAGGCTGGCC TGGTTCTTAC 50 TTGAGTCTGC CAGCATTGTC ACGC 74 • · •fe ····
- 175 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 78:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 78:
GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60
ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120
CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 130
GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC 240
CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300
TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360
- 176 ·· ·«·· ·· · ··· ·
99 • · 9 ·
9 99
999 9 · • « · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 79:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 79:
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 1 5 10 ig
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn
25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 6o
Arg Gly Arg Val Thr Met: Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gin Ala Ser 55 70 75 qq
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 no
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
120 • ·
- 177 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 80:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 80:
GAGG7GCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60
ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120
CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGCATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 180
GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGTGACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC 240
CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAG ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300
TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360
v —
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 81:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
• ·
- 178 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 81:
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 5 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn 20 25
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Il<
Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Ph 50 55
Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gin Ala Ser 65 70
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 90 g5
His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glr 100 105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110
115
120 • ·
- 179 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 82:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 80 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 82:
GGCCGCGCCA CAATGCTGGC AGACACTAGT AAGAACCAGT TCAGCCTGAG 50 ACTCAGCAGC GTGACAGCCG CCGACACCGC 80 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 83:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 74 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 83:
GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT CAGGCTGAAC TGGTTCTTAC 50 TAGTGTCTGC CAGCATTGTG GCGC 74
2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 84:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 84:
• ·
- 180 -
GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60
ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120
CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 180
GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGCCACAATG CTGGCAGACA CTAGTAAGAA CCAGTTCAGC 240
CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGGCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300
TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 85:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 85:
Glu Va-1 Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 IQ 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn • · • · • · · · · • · ’ • · · • · · • · «
- 181 Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tm Ile 35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser S5 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9o
His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 no
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser US 120 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 86:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 80 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 86:
GGCCGCGCCA CAATGCTGGC AGACTCAAGT AAGAACCAGG CCAGCCTGAG 50 ACTCAGCAGC GTGACAGCCG CCGACACCGC 80 • · ·· · ·· ·
- 1-82 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 87:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 74 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 87:
GGTGTCGGCG GCTGTCACGC TGCTGAGTCT CAGGCTGGCC TGGTTCTTAC 50 TTGAGTCTGC CAGCATTGTG GCGC 74 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 88:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 88:
GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60
ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA
120
183
CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGGATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 180
GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGCCACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC 240
CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300
TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 89:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 89:
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gin Ala Ser • · ·· ···· • · · • · · • · · 1 • · ·· • · · · · ’
184
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 90:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 360 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 90:
GAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGTCCAGGT CTCGTACGGC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTC 60
ACGTGCACCG CATCTGGCTT CAACATTAAG GACAATTACA TGCACTGGGT GAGACAGCCA 120
CCTGGACGAG GCCTTGAGTG GATTGCATGG ATTGACCCTG AGAATGGTGA CACTGAGTAC 180
GCACCTAAGT TTCGCGGCCG CGCCACAATG CTGGCAGACT CAAGTAAGAA CCAGGCCAGC 240
CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTCT ATTATTGTCA CGTCCTGATA 300
TACGCCGGGT ATCTGGCAAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCCTCGTCAC CGTGAGCTCG 360
- 185 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 91:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 91:
Glu Val Glr. Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 1S
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Met Leu Ala Asp Ser Ser Lys Asn Gin Ala Ser
70 75 00
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
30 95
Kis Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
120
.··.···: ·· • · *· · : : ·..·*··* ··· ···
- 186 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 92:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 780 párů baží
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) TYP VLÁKNA: j ednoduché
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 92:
ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG 60
GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG 120
TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT 180
GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA 240
CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG 300
AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC 360
GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCC 420
TCCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCACCCTCCT CCAAGAGCAC CTCTGGGGGC 480
ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG 540
AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA 600
CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACTGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC 660
ATCTGCAACG TGAATCACAA CCCCAGCAAC ACCAAGGTCG ACAAGAAAGT TGAGCCCAAA 720
- 187 TCTTGTGACA AGACGCACAC GTGCCCGGCG TGCCCGGCTC CGGAACTGCT GGGTGGCCCG 730 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 93:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 260 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 93:
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 15 10 15
Ile Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45
Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80
Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 135 190
Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220
Asn His Asn Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro
260 »» fr · · ·
- 189 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 94:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 918 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 94:
ATGAAG77GT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG 60
GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG 120
TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT íao
GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA 240
CCTAAG7TTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG 300
AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC 360
GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT 420
AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCTGGGGGC 480
ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG 540
AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA 600
CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC 660
ACCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT GGAGCTGAAA 720
ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC CCTAGGTGTC CTGAACCTAA ATCTTGTGAC 780
ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG CCCAAATCTT GCGACACGCC CCCACCGTGT 840
·· ··»·
- 190 CCCAGATGTC CTGAACCAAA GAGCTGTGAC ACTCCACCGC CCTGCCCGAG GTGCCCAGCA 900
CCTGAACTCC TGGGAGGG 918 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 95:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 306 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 95:
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 io 15
He Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45
Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala 55 70 75 80
Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn ···· • · fr • · · • · frfr • · · · ·· ··
- 191 Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 no
Tyr Tyr Cys His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Mec Asp Tyr US 120 125
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 iso
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 i75
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190
Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 155 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val 810 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys 225 230 235 240
Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
245 250 255
Lys Ser Cys Asp Thr Pro·Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys 260 265 270
Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser ·· · · · · • · · ·» • . ··· · · • · · ·
... ·· ··
275
280
285
- 192 Cy3 Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
230 295 300
Gly Gly
305 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 96:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 705 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 96:
ATGGATTTTC AAGTGGAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC 60
CGCGGCCAGA TCGTGCTGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA 120
GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG 180
CCAGGTAAGG CTCCAAAGCT GCTGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA 240
AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG 300
CCAGAGGATA TCGCGACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC 360
CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG 420
CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC 480
TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC 540
- 193 CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT
ACAGCCTCAG CAGCACCCTG
ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG
CCTGCGAAGT CACCCATCAG
GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG
AGTGT
600
660
705 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 97:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 235 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 97:
Met Asp Phe Gin Val Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45
Ser Ser· Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 so
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro • · • · · * • · · • · · · • · · · e· ♦· ·
- 194 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile 85 90 95
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg 100 105 110
Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 ISO
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205
Lys Kis Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Giy Leu Ser Ser 210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 98:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 705 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
• · ·
- 195 -
(ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 98:
ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC 60
CGCGGCGACA TCCAGATGAC CCAGAGCCCA AGCAGCCTGA GCGCTAGCGT GGGTGACAGA 120
GTGACCATCA CGTGTAGTGC CAGCTCAAGT GTAACTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG ISO
CCAGGTAAGG CTCCAAAGC7 GTGGATCTAC AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGTGTGCCA 240
AGCAGATTCT CCGGAAGCGG TAGCGGCACC GACTACACCT TCACCATCAG CAGCCTCCAG 300
CCAGAGGATA TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGAGGAGTA CTTACCCGCT CACGTTCGGC 360
CAAGGGACCA AGCTCGAGAT CAAACGGACT GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG 420
CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC 480
TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC 540 25
CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 600
ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 660
GGCCTGAGTT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT 705 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 99:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 235 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ··· ·
- 196 (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 99:
Met Asp Phe Gin Val Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 15 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 SO
Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile
90 95
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg 100 105 110
Ser Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145
150
155
160 • · · · · · • · ·« β
• ·· • i · fe * · · • fefe · • · fefe
- 197 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 130 135 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 100:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 54 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 100:
CCCAGCACCT GAACTCCTGG GAGGAGCAAC AGGACACAGT TATGAGAGT 50 ACAA 54
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 101:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 101:
GGGGGTCTAG ATTATTAGTA CAGGTGTTCC AGGACGTAGC TGGCAACATA 50 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 102:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 46 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 102:
GGGGGAGCTC GGCTAGCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGC 46 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 103:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 55 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 103:
TTGTACTTCT CATAACTGTG TCCTGTTGCT CCTCCCAGGA GTTCAGGTGC 50 TGGGC 55 • · • •a ·
- 199 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 104:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 104:
GCCTGTGCTC AATATTGATG G 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 105:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 105:
GGAGAAAGCC ATATCTGCCT G 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 106:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP·, nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 106:
TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC • ·
- 200 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 107:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (3) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 107:
GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 108:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 108:
CACAACAGAG GCAGTTCC 18 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 109:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) TYP VLÁKNA: jednoduché
(D) TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 109:
CACCTTCACC ATCAGCAGCC
201 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 110:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 110:
GGACCTGCTG CAGAGTCTG 19 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 111:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA.: 4 7 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 111:
GGCTGCAGGA ATTCTTATTA TAGACGAACC CGGCTATCAA ACTGAGC 47 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 112:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1870 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina
202 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 112:
AAGCTTGCCG CCACCATGAA GTTGTGGCTG AACTGGATTT TCCTTGTAAC ACTTTTAAAT 60
GGAATTCAGT GTGAGGTGCA GCTGCAGCAG AGCGGTCCAG GTCTCGTACG GCCTAGCCAG 120
ACCCTGAGCC TCACGTGCAC CGCATCTGGC TTCAACATTA AGGACAATTA CATGCACTGG 180
GTGAGACAGC CACCTGGACG AGGCCTTGAG TGGAÍTGGAT GGATTGACCC TGAGAATGGT 240
GACACTGAGT ACGCACCTAA GTTTCGCGGC CGCGTGACAA TGCTGGCAGA CACTAGTAAG 300
AACCAGTTCA GCCTGAGACT CAGCAGCGTG ACAGCCGCCG ACACCGCGGT CTATTATTGT 360
CACGTCCTGA TATACGCCGG GTATCTGGCA ATGGACTACT GGGGCCAAGG GACCCTCGTC 420
ACCGTGAGCT CGGCTAGCAC CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG 480
AGCACCTCTG GGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG 540
GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC 600
CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG 660
GGCACCCAGA CCTACACCTG CAACGTGAAT CACAAGCCCA GCAACACCAA GGTGGACAAG 720
AGAGTGGAGC TGAAAACCCC ACTCGGTGAC ACAACTCACA CGTGCCCTAG GTGTCCTGAA 780
CCTAAATCTT GTGACACACC TCCCCCGTGC CCACGGTGCC CAGAGCCCAA ATCTTGCGAC 840
ACGCCCCCAC CGTGTCCCAG ATGTCCTGAA CCAAAGAGCT GTGACACTCC ACCGCCCTGC 900
CCGAGGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGA GGAGCAACAG GACACAGTTA TGAGAAGTAC 960
AACAAGTGGG AAACGATAGA GGCTTGGACT CAACAAGTCG CCACTGAGAA TCCAGCCCTC 1020
ATCTCTCGCA GTGTTATCGG AACCACATTT GAGGGACGCG CTATTTACCT CCTGAAGGTT 1080 • ·
- 203 -
GGCAAAGCTG GACAAAATAA GCCTGCCATT TTCATGGACT GTGGTTTCCA TGCCAGAGAG 1140
TGGATTTCTC CTGCATTCTG CCAGTGGTTT GTAAGAGAGG CTGTTCGTAC CTATGGACGT 1200
GAGATCCAAG TGACAGAGCT TCTCGACAAG TTAGACTTTT ATGTCCTGCC TGTGCTCAAT 1260
ATTGATGGCT ACATCTACAC CTGGACCAAG AGCCGATTTT GGAGAAAGAC TCGCTCCACC 1320
CATACTGGAT CTAGCTGCAT TGGCACAGAC CCCAACAGAA ATTTTGATGC TGGTTGGTGT 1380
GAAATTGGAG CCTCTCGAAA CCCCTGTGA? GAAACTTACT GTGGACCTGC CGCAGAGTCT 1440
GAAAAGGAGA CCAAGGCCCT GGCTGATTTC ATCCGCAACA AACTCTCTTC CATCAAGGCA 1500
TATCTGACAA TCCACTCGTA CTCCCAAATG ATGATCTACC CITACICATA TGCTTACAAA 1560
CTCGGTGAGA ACAATGCTGA GTTGAATGCC CTGGCTAAAG CTACTGTGAA AGAACTTGCC 1620
TCACTGCACG GCACCAAGTA CACATATGGC CCGGGAGCTA CAACAATCTA TCCTTCTGCT 1680
GGGACTTCTA AAGACTGGGC TTATGACCAA GGAATCAGAT ATTCCTTCAC CTTTGAACTT 1740
CGAGATACAG GCAGATATGG CTTTCTCCTT CCAGAATCCC AGATCCGGGC TACCTGCGAG 1300
GAGACCTTCC TGGCAATCAA GTATGTTGCC AGCTACGTCC TGGAACACCT GTACTAATAA 1860
TCTAGAGAGA 1870 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 113:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 613 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
- 204 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 113:
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly
10 15
Ile Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45
Lys Asp Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala
70 75 80
Pro Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn
90 95
Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys His Val Leu Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 115 120 125
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly . 130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180
185
190
HRB ·· 00 • ·· · • 0 ·· ·· ···· • · · • 0 0 • 0 0 • · 0 0
- 206 Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu Ile Gin Val Thr
385 390 395 400
Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Leu Asn Ile
405 410 415
Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe Trp Arg Lys Thr 420 425 430
Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr Asp Pro Asn Arg 435 440 445
Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser Arg Asn Pro Cys 450 455 460
Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys
465 470 475 430
Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser Ile Lys Ala Tyr
485 490 495
Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gin Met Met Ile Tyr Pro Tyr Ser Tyr 500 505 510
Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn Ala Leu Ala Lys 515 520 525
Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr 530 535 540
Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ser Ala Gly Thr Ser Lys Asp
545 550 555 560
Trp Ala Tyr Asp Gin Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg
565 570 575
Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gin Ile Arg Ala
530 535 59o
- 207 Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val Ala Ser Tyr Val 595 600 605
Leu Glu His Leu Tyr 610 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 114:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 114:
His His Gly Gly Glu His PhS Glu Gly Glu Lys Val Phe Arg Val Asn
1 5 10 15
Val Glu Asp Glu Asn His Ile Asn Ile Ile Arg Glu Leu Ala Ser Thr
20 25 30
Thr Gin Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Val Thr Gin Ile Lys Pro
35 40 45
His Ser Thr Val Asp Phe Arg Val Lys Ala Glu Asp Thr Val Thr Val
50 55 60
Glu Asn Val Leu Lys Gin Asn Glu Leu Gin Tyr Lys Val Leu Ile Ser
65 70 75 80
Asn Leu Arg Asn Val Val Glu Ala Gin Phe Asp Ser Arg Val Arg Leu
«· ···· ···
- 208 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 115:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 520 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 115:
GAGCTCGGCT AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC SO
CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC 120
GGTGTCGTGG AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA 130
GTCCTCAGGA CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC 240
CCAGACCTAC ACCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT 300
GGAGCTGAAA ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC CCTAGGTGTC CTGAACCTAA 360
ATCTTGTGAC ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG CCCAAATCTT GCGACACGCC 420
CCCACCGTGT CCCAGATGTC CTGAACCAAA GAGCTGTGAC ACTCCACCGC CCTGCCCGAG 480
GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGAGGGTA ATAGCCCGGG
520 • ··· · • · ·· ··
209 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 116:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 116:
GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC G 31 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 117:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 117:
GCAGCAGGAT AGATTGTTGT AGC 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 118:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 88 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 118:
CCGGAATTCT TATTAGTTCA GGTCCTCCTC AGAGATCAGC TTCTGCTCCT 50 CGAACTCATG GTGGTGATGG TGGTGGTACA GGTGTTCC 88
- 210 • fe · fefe · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 119:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 119:
CAATCTATCC TGCTGCTGGG ACTTCTAAAG 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 120:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 120:
GATTGTTGTA GCTCCCGGGC 2 0
2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 121:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 121:
GGAGCTACAA CAATCTATCC TTCTGCTGGG
- 211 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 122:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 122:
ACGGCACCAA GTACACATAT GG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 123:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 90 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 123:
ACGAGAATTC GACCGCTCTG CTGCAGCTGC ACCTCGGAAC CGCCACCGCT 50 GCCACCGCCA GAACCGCCAC CGTACAGGTG TTCCAGGACG 90 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 124:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2154 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 124:
ATGTTGGCAC TCTTGGTTCT GGTGACTGTG GCCCTGGCAT CTGCTCATCA TGGTGGTGAG 60
CACTTTGAAG GCGAGAAGGT GTTCCGTGTT AACGTTGAAG ATGAAAATCA CATTAACATA
120 ·· ···· • · · ·· fl • · · z • 9 · · ?
- 212 ATCCGCGAGT TGGCCAGCAC GACCCAGATT GACTTCTGGA AGCCAGATTC TGTCACACAA 180
ATCAAACCTC ACAGTACAGT TGACTTCCGT GTTAAAGCAG AAGATACTGT CACTGTGGAG 240
AATGTTCTAA AGCAGAATGA ACTACAATAC AAGGTACTGA TAAGCAACCT GAGAAATGTG 300
GTGGAGGCTC AGTTTGATAG CCGGGTTCGT GCAACAGGAC ACAGTTATGA GAAGTACAAC 360
AAGTGGGAAA CGATAGAGGC TTGGACTCAA CAAGTCGCCA CTGAGAATCC AGCCCTCATC 420
TCTCGCAGTG TTATCGGAAC CACATTTGAG GGACGCGCTA TTTACCTCCT GAAGGTTGGC 480
AAAGCTGGAC AAAATAAGCC TGCCATTTTC ATGGACTGTG GTTTCCATGC CAGAGAGTGG 540
ATTTCTCCTG CATTCTGCGA GTGGTTTGTA AGAGAGGCTG TTCGTACCTA TGGACGTGAG 600
ATCCAAGTGA CAGAGCTTCT CGACAAGTTA GACTTTTATG TCCTGCCTGT GCTCAATATT 660
GATGGCTACA TCTACACCTG GACCAAGAGC CGATTTTGGA GAAAGACTCG CTCCACCCAT 720
ACTGGATCTA GCTGCATTGG CACAGACCCC AACAGAAATT TTGATGCTGG TTGGTGTGAA 780
ATTGGAGCCT CTCGAAACCC CTGTGATGAA ACTTACTGTG GACCTGCCGC AGAGTCTGAA 840
AAGGAGACCA AGGCCCTGGC TGATTTCATC CGCAACAAAC TCTCTTCCAT CAAGGCATAT 900
CTGACAATCC ACTCGTACTC CCAAATGATG ATCTACCCTT ACTCATATGC TTACAAACTC 960
GGTGAGAACA ATGCTGAGTT GAATGCCCTG GCTAAAGCTA CTGTGAAAGA ACTTGCCTCA 1020
CTGCACGGCA CCAAGTACAC ATATGGCCCG GGAGCTACAA CAATCTATCC TTCTGCTGGG 1080
ACTTCTAAAG ACTGGGCTTA TGACCAAGGA ATCAGATATT CCTTCACCTT TGAACTTCGA 1140
GATACAGGCA GATATGGCTT TCTCCTTCCA GAATCCCAGA TCCGGGCTAC CTGCGAGGAG 1200
ACCTTCCTGG CAATCAAGTA TGTTGCCAGC TACGTCCTGG AACACCTGTA CGGTGGCGGT 1260 ·9 ι to · ’ > · ·· ··«· • · ·· ··
9999
- 213 TCTGGCGGTG GCAGCGGTGG CGGTTCCGAG GTGCAGCTGC AGCAGAGCGG TCCAGGTCTC 1320
GTACGGCCTA GCCAGACCCT GAGCCTCACG TGCACCGCAT CTGGCTTCAA CATTAAGGAC 1380
AATTACATGC ACTGGGTGAG ACAGCCACCT GGACGAGGCC TTGAGTGGAT TGGATGGATT 1440
GACCCTGAGA ATGGTGACAC TGAGTACGCA CCTAAGTTTC GCGGCCGCGT GACAATGCTG 1500
GCAGACACTA GTAAGAACCA GTTCAGCCTG AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC 1560
GCGGTCTATT ATTGTCACGT CCTGATATAC GCCGGGTATC TGGCAATGGA CTACTGGGGC 1620
CAAGGGACCC TCGTCACCGT GAGCTCGGCT AGCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG 1680
GCGCCCTGCT CCAGGAGGAC CTCTGGGGGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT GGTCAAGGAC 1740
TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG CCCTGACCAG CGGCGTGCAC 1800
ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG 1860
CCCTCCAGCA GCTTGGGCAC CCAGACCTAC ACCTGCAACG TGAATCACAA GCCCAGCAAC 1920
ACCAAGGTGG ACAAGAGAGT GGAGCTGAAA ACCCCACTCG GTGACACAAC TCACACGTGC 1980
CCTAGGTGTC CTGAACCTAA ATCTTGTGAC ACACCTCCCC CGTGCCCACG GTGCCCAGAG 2040
CCCAAATCTT GCGACACGCC CCCACCGTGT CCCAGATGTC CTGAACCAAA GAGCTGTGAC 2100
ACTCCACCGC CCTGCCCGAG GTGCCCAGCA CGTGAACTCC TGGGAGGGTA ATAG 2154 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 125:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 716 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein ·· fr··· ··
- 214 • · « • · · <
·· ··
9«· ··· ·· ·· fr · · · • · **B • ··· · · • · · ·· ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 125:
Met Leu Ala Leu Leu Val Leu Val Thr Val Ala Leu Ala Ser Ala His 15 iq is
His Gly Gly Glu His Phe Glu Gly Glu Lys Val Phe Arg Val Asn Val 20 25 30
Glu Asp Glu Asn His Ile Asn Ile Ile Arg Glu Leu Ala Ser Thr Thr 35 40 45
Gin Ile Asp Phe Tra Lys Pro Asp Ser Val Thr Gin Ile Lys Pro His 50 55 60
Ser Thr Val Asp Phe Arg Val Lys Ala Glu Asp Thr Val Thr Val Glu
70 75 ao
Asn val Leu Lys Gin Asn Glu Leu Gin Tyr Lys Val Leu Ile Ser Asn
30 95
Leu Arg Asn Val Val Glu Ala Gin Phe Asp Ser Arg Val Arg Ala Thr 100 io5 no
Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp 115 120 i25
Thr Gin Gin Val Ala Thr Glu Asn Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val 13° 135 140
11® Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly
160
145
150
155 • · • · · · a aaaa · a a · aa aa
- 215 Lys Ala Gly Gin Asn Lys Pro Ala Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His
165
170
175
Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gin Trp Phe Val Arg Glu ISO 185 190
Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu Ile Gin Val Thr Glu Leu Leu Asp 195 200 205
Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile 210 215 220
Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His 225 230 235 240
Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala 245 250 255
Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr 260 265 270
Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp 275 280 285
Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His 290 295 300
Ser Tyr Ser Gin Met Met Ile Tyr Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu 305 310 315 320
Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys
325 330 335
Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala 340 345 350
Thr Thr Ile Tyr Pro Ser Ala Gly Thr Ser Lys Asp Trp Ala Tyr Asp
355
360
365
- 216 -
Gin Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg 370 375 330
Tyr Gly Phe Leu Leu Pra Glu Ser Gin Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu
385 390 395 400
Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu
405 410 415
Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin 420 425 430
Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pra Ser Gin Thr Leu Ser 435 440 445
Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn Tyr Met His 450 455 460
Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile
4S5 470 475 480
Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Arg Gly Arg
485 490 495
Val Thr Met Leu Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu 500 505 510
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Leu 515 520 525
Ile Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 530 535 540
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
545
550
555
560
217
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
56S
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
580
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 595 600
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 610 615
Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys 625 630
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
645
Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro 660
Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 675 680
Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro 690 695
Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 570 575
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 585 590
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser
605
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
620
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
635 640
Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr 650 655
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro 665 670
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro
685
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro
700
Leu Leu Gly Gly
705
710
715
- 218 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 126:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 126:
TATATAAAGC TTGCCGCCAC CATGGGCCAC ACACGGAGGC AG 42 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 127:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 45 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 127:
ACTCCACCAG CTTCACCTCG TTATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGG 45 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 128:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 45 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 128:
AGAGCATTTT CCTGATAACG AGGTGAAGCT GGTGGAGTCT GGAGG • · » 4 • ·
- 219 5K?
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 129:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLAKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 129:
CCAGGCATCC CAGGGTCACC ATGGAGTTAG TTTGGGCAGC 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 130:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1446 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 16 . . .1435 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 130:
• · • · • ·
- 220 -
AAGC TTGC CG CCACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG GGA ACA TCA CCA TCC 51
Met Gly His Thr Arg Arg Gin Gly Thr Ser Pro Ser
1 5 10
AAG TGT CCA TAC CTC AAT TTC TTT CAG CTC TTG GTG CTG GCT GGT CTT 99
Lvs Cys Pro Tyr Leu Asn Phe Phe Gin Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu
15 20 25
TCT CAC TTC TGT TCA GGT GTT ATC CAC GTG ACC AAG GAA GTG AAA GAA 147
Ser His Phe Cys Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu
30 35 40
GTG Val 45 GCA ACG CTG TCC TGT GGT CAC AAT GTT TCT Ser 55 GTT GAA GAG CTG GCA Leu Ala 60 195
Ala Thr Leu Ser Cys 50 Gly His Asn Val Val Glu Glu
CAA ACT ATC TAC TGG CAA AAG GAG AAG AAA ATG GTG CTG ACT ATG 243
Gin Thr Arg Ile Tyr Trp Gin Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met
55 70 75
ATG TCT* GGG GAC ATG AAT ATA TGG CCC GAG TAC AAG AAC CGG ACC ATC 291
Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile
SO 85 90
TTT GAT ATC ACT AAT AAC CTC TCC ATT GTG ATC CTG GCT CTG CGC CCA 339
Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro
95 100 105
TCT GAC GAG GGC ACA TAC GAG TGT GTT GTT CTG AAG TAT GAA AAA GAC 387
Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp
110 115 120
GCT TTC AAG CGG GAA CAC CTG GCT GAA GTG ACG TTA TCA GTC AAA GCT 435
Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala
125
130
135
140 • · • · • · · ·
- 221 -
GAC TTC CCT ACA CCT AGT ATA TCT GAC TTT GAA ATT CCA ACT TCT AAT 483
Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn
145 150 155
ATT AGA AGG ATA ATT TGC TCA ACC TCT GGA GGT TTT CCA GAG CCT CAC 531
Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His
ISO 165 170
CTC TCC TGG TTG GAA AAT GGA GAA GAA TTA AAT GCC ATC AAC ACA ACA 579
Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr
175 180 185
GTT TCC CAA GAT CCT GAA ACT GAG CTC TAT GCT GTT AGC AGC AAA CTG S27
Val Ser Gin Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu
190 195 200
GAT TTC AAT ATG ACA ACC AAC CAC AGC TTC ATG TGT CTC ATC AAG TAT 675
Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr
205 210 215 220
GGA CAT TTA AGA GTG AAT CAG ACC TTC AAC TGG AAT ACA ACC AAG CAA 723
Gly His Leu Arg Val Asn Gin Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gin
225 230 235
GAG CAT TTT CCT GAT AAC GAG GTG AAG CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC 771
Glu His Phe Pro Asp Asn Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
240 245 250
TTG Leu GTA Val CAG Gin 255 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG 819
Pro Gly Gly Ser Leu Arg 260 Leu Ser Cys Ala 265 Thr Ser Gly
TTC ACC TTC ACT GAT TAC TAC ATG AAC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA 867
Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly
270 275 280
AAG GCA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT GGA AAC AAA GCT AAT GGT TAC 915
• · • ·
222 -
Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr
285 290 295 300
ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA
Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
305 310 315
GAC AAA TCC CAA AGC ATC CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCT
Asp Lys Ser Gin Ser Ile Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala
320 325 330
GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT ACA AGA GAT AGG GGG CTA CGG TTC
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe
335 340 345
963
1011
1059
TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCC 1107
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala
350 355 360
AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT GCT GCC 1155
Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala
365 370 375 380
CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC AAG GGC TAT TTC 1203
Gin Thr Asn Ser Mec Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
385 390 395
CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCT CTG TCC AGC GGT 1251
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly
400 405 410
GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TC’1’ GAC CTC TAC ACT CTG AGC 1299
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser
415 420 425
AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC GAG ACC GTC ACC 1347
Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr
430
435
440 • ·
- 223 -
TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG GAC AAG AAA ATT 1395
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile
445 450 455 460
GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG CCT TGC ATA TGT ACA T AGTAAGAATT 1445
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
465
470 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 131:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 473 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 131:
Met Glv His Thr Arg Arg Gin Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr 15 10 15
Leu Asn Phe Phe Gin Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys 20 25 30
Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu 35 40 45
Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gin Thr Arg Ile 50 55 60
Tyr Trp Gin Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp 65 70 75 80
- 224 Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr 85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly 100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg 115 120 125
Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr 130 135 140
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
145 150 155 160
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gin Asp 180 185 190
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205
Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg 210 215 220
Val Asn Gin Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gin Glu His Phe Pro
225 230 235 240
Asp Asn Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Protilátka anti-CEA („806.077 Ab) , která obsahuje úseky určující komplementaritu (úseky CDR) obsahující následující sekvence:
a) těžký řetězec
CDR1 DNYMH (sekvence id. č. 29)
CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG (sekvence id. č. 31)
CDR3 LIYAGYLAMD Y (sekvence id. č. 32)
b) lehký řetězec
CDR1 SASSSVTYMH (sekvence id. č. 26)
CDR2 STSNLAS (sekvence id. č. 27)
CDR3 QQRSTYPLT (sekvence id. č. 28).
2. Protilátka podle nároku 1, kde úseky CDR 1 a 3 jsou definovány jako:
CDR1 FNIKDNYMH (sekvence id. Č. 30) a CDR3 HVLIYAGYLA MDY (sekvence id. Č. 33) .
3. Protilátka podle nároku 1, která obsahuje následující, volitelně humanizované, struktury:
sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce (sekvence id. č. ll):
EVQLQQSGAE LVRSGASVKL SCTASGFNIK DNYMHWVKQR 40 PEQGLEWIAW IDPENGDTEY APKFRGKATL TADSSSNTAY 80 LHLSSLTSED TAVYYCHVLI YAGYLAMDYW GQGTSVAVSS 120
a sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce (sekvence id. č. 9):
DIELTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVT YMHWFQQKPG 40 TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE 80 DAATYYCQQR STYPLTFGAG TKLELKRA 108
• · • ·
• * · ·· • · · · • · · · · • · · · · ·· ·· ·· · -227- 4 . Humanizovaná protilátka podle nároku 3, která alespoň jednu z následujících sekvencí: sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce, VH1 (sekvence id. Č. 55), sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce, VK4 (sekvence id. Č. 71),
obsahuje která je která je konstantní úsek CH1 těžkého řetězce lidského IgG3, úsek CL lidského lehkého řetězce kappa a kloubový úsek lidského IgG3, volitelně ve formě fragmentu F(ab')2.
5. Konjugát obsahující protilátku podle kteréhokoliv z předchozích nároku 1 až 4 a efektorovou skupinu.
6. Konjugát podle nároku 5, kde efektorová skupina je vybrána z kterékoliv v následujícím souboru:
a) enzym vhodný pro použití v systému ADEPT,
b) CPG2,
c) [G251T,D253K]HCPB,
d) [A248S,G251T,D253K]HCPB,
e) ko-stimulační molekula,
f) extracelulární doména z B7,
g) extracelulární doména z lidské B7.1 a
h) extracelulární doména z lidské B7.2, volitelně ve formě fúzního proteinu.
7. Konjugát podle nároku 6, který je fúzní protein vybraný z kteréhokoliv konjugátu v následujícím souboru (sekvence jsou uvedeny ve směru od N-konce k C-konci):
a) humanizovaný 806.077 F(ab')2 - { [A248S,G251T,D253K]HCPB}2 obsahuj ící:
protilátkový řetězec Fď se strukturou VH1 (sekvence id. č. 55)/konstantní úsek CH1 z IgG3/kloubový úsek z IgG3, přičemž řetězec Fď je fúzován svým C-koncem k N-konci [A248S,G251T,D253K]HCPB, a lehký řetězec protilátky vzorce VK4 (sekvence id. č. 71)/úsek CL z lehkého řetězce kappa,
b) {[A248S,G251T,D253K]HCPB}2 - humanizovaný 806.077 F(ab')2 obsahuj ící:
[A248S,G251T,D253K]HCPB, přičemž HCPB je fúzována svým C-koncem prostřednictvím spojky-linkeru (GGGS)3 k N-konci protilátkového řetězce Fď struktury VH1 (sekvence id. Č. 55)/konstantní úsek CH1 z IgG3/kloubový úsek z IgG3, a lehký řetězec protilátky vzorce VK4 (sekvence id. č. 71)/úsek CL z lehkého řetězce kappa, a
c) (lidská B7.1 extracelulární doména)2 - humanizovaný 806.077 F(ab')2 obsahující:
lidskou extracelulární doménu B7.1, přičemž B7.1 je fúzována svým C-koncem k N-konci protilátkového řetězce struktury VH1 (sekvence id. č. 55)/ konstantní úsek CH1 z IgG3/kloubový úsek z IgG3, a lehký řetězec protilátky vzorce VK4 (sekvence id. č. 71)/úsek CL z lehkého řetězce kappa.
8. Polynukleotidová sekvence, která je schopná kódovat polypeptid protilátky nebo konjugátu podle kteréhokoliv z předchozích nároku 1 až 7.
9. Vektor, který obsahuje polynukleotid podle nároku 8.
10. Hostitelská buňka transformovaná polynukleotidovou sekvencí podle nároku 8, nebo transgenní živočich kromě • 9 9 9
I · · ( » · ··
99 9 9
9 9 I ·· ··
-229člověka nebo transgenní rostlina pocházející z hostitelské buňky.
11. Hybridom 806.077 uložený v ECACC pod č. 96022936.
12. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků ve spojení s farmakologicky přijatelným ředidlem nebo nosičem, volitelně ve formě vhodné pro intravenózní podávání.
13. Konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků pro použití jako lék.
14. Způsob přípravy protilátky nebo konjugátu podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačuj ící se t i m, že se
a) hostitelská buňka, transgenní savec kromě člověka nebo transgenní rostlina podle nároku 10 nebo hybridom podle nároku 11 vystaví takovým podmínkám, které vedou k expresi, a volitelně i sekreci, protilátky nebo konjugátu, a volitelně
b) protilátka nebo konjugát se částečně purifikují.
15. Způsob léčení člověka nebo zvířete, kteří takové léčení potřebují, vyznačující se tím, že se člověku nebo zvířeti podá farmaceuticky účinné množství konjugátu podle kteréhokoliv z předchozích nároků.
• · · · kontrola mopsu uraCqo juATrqejsH
Čas (dny) • ·
2/3
Restrikční enzymy štěpící jedenkrát + HindiII štěpí dvakrát + Xma I štěpí třikrát + Pstl štěpí šestkrát
CZ983536A 1996-05-04 1997-04-29 Monoklonální protilátka proti CEA, konjugáty, které ji obsahují, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje CZ353698A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9609405.7A GB9609405D0 (en) 1996-05-04 1996-05-04 Protein
GBGB9703103.3A GB9703103D0 (en) 1997-02-14 1997-02-14 Protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ353698A3 true CZ353698A3 (cs) 1999-02-17

Family

ID=26309272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ983536A CZ353698A3 (cs) 1996-05-04 1997-04-29 Monoklonální protilátka proti CEA, konjugáty, které ji obsahují, způsob jejich přípravy a farmaceutický přípravek, který je obsahuje

Country Status (19)

Country Link
US (2) US6277599B1 (cs)
EP (1) EP0896626B1 (cs)
JP (1) JP2000510692A (cs)
CN (1) CN1217750A (cs)
AT (1) ATE350478T1 (cs)
AU (1) AU719513B2 (cs)
BR (1) BR9708910A (cs)
CA (1) CA2250579A1 (cs)
CZ (1) CZ353698A3 (cs)
DE (1) DE69737188T2 (cs)
ES (1) ES2279539T3 (cs)
HU (1) HUP9901562A3 (cs)
IL (1) IL126772A0 (cs)
NO (1) NO985120L (cs)
NZ (1) NZ331978A (cs)
PL (1) PL329871A1 (cs)
SK (1) SK150298A3 (cs)
TR (1) TR199802227T2 (cs)
WO (1) WO1997042329A1 (cs)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL329871A1 (en) * 1996-05-04 1999-04-12 Zeneca Ltd Monoclonal antibody agains cea, coniugates incorporating that antibody and their therapeutic application in the adept system
AU6000698A (en) * 1997-02-14 1998-09-08 Zeneca Limited Proteins
GB9709421D0 (en) * 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
JP2002504372A (ja) * 1998-02-25 2002-02-12 ザ ダウ ケミカル カンパニー 高親和性ヒト型化抗−ｃｅａモノクロ−ナル抗体
WO2000029583A2 (en) * 1998-11-19 2000-05-25 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin superfamily proteins
JP2003515323A (ja) * 1999-11-18 2003-05-07 オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド 抗 体
GB2371803A (en) * 1999-11-18 2002-08-07 Oxford Biomedica Ltd Antibodies
AU2001262216A1 (en) * 2000-04-22 2001-11-07 Stefan Barth Apoptotic agents
GB0210783D0 (en) * 2002-05-10 2002-06-19 Polonelli Luciano Anti-microbial polypeptides
KR100604037B1 (ko) * 2002-08-02 2006-07-24 주식회사유한양행 항체 경쇄 카파 발현벡터
US20050008618A1 (en) * 2003-02-27 2005-01-13 Howard Kaufman Composition for delivering an agent to a target cell and uses thereof
AU2004217433A1 (en) * 2003-03-04 2004-09-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Vectors used to create hybrid constant regions
ATE517920T1 (de) * 2003-04-23 2011-08-15 Medarex Inc Humanisierte antikörper gegen interferon-alpha- rezeptor-1 (ifnar-1)
EP1691763A4 (en) * 2003-12-12 2008-03-12 Genencor Int CAB MOLECULES
JP4805848B2 (ja) * 2004-02-12 2011-11-02 モルフォテック、インク． 腫瘍抗原の生物活性を特異的に阻止するモノクローナル抗体
DE602005023138D1 (de) * 2004-04-15 2010-10-07 Genencor Int Anti-cea scfv-beta-lactamase konstrukte (cab moleküle) in adept
CA2585776A1 (en) 2004-10-29 2006-05-11 University Of Southern California Combination cancer immunotherapy with co-stimulatory molecules
US7592426B2 (en) 2005-03-10 2009-09-22 Morphotek, Inc. Anti-mesothelin antibodies
EP1879922A2 (en) 2005-04-22 2008-01-23 Morphotek, Inc. Antibodies with immune effector activity and that internalize in folate receptor alpha-positive cells
BRPI0616359B8 (pt) 2005-09-30 2022-08-30 Medimmune Ltd Composição farmacêutica, processo para purificação de um anticorpo de il-13 e uso de uma composição farmacêutica contendo um anticorpo
WO2008011157A2 (en) 2006-07-20 2008-01-24 The General Hospital Corporation Methods, compositions, and kits for the selective activation of protoxins through combinatorial targeting
US8043830B2 (en) * 2008-02-01 2011-10-25 The Regents Of The University Of California Biotin-ligase system for secretion of biotinylated protein
CN101607985B (zh) * 2008-12-24 2013-03-27 中国科学院生物物理研究所 抗人cea的单克隆抗体，包含其的组合物，及其用途
CN101704892B (zh) * 2009-12-09 2014-02-12 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗uPAR人源化抗体及其编码基因与应用
KR20130028055A (ko) 2010-01-28 2013-03-18 글락소 그룹 리미티드 Ｃｄ １２７ 결합 단백질
US8846042B2 (en) 2011-05-16 2014-09-30 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific FAB fusion proteins and methods of use
KR102037541B1 (ko) 2011-10-28 2019-10-29 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도
CN102526707B (zh) * 2012-01-13 2015-04-22 成都博发生物技术有限公司 共刺激因子及融合蛋白的新用途
RU2493166C1 (ru) * 2012-04-09 2013-09-20 Общество с ограниченной ответственностью "Технофарма" Наноантитело, специфически связывающее белок сеа, способ его использования для детекции этого белка
CN102838676A (zh) * 2012-09-26 2012-12-26 李彬 一种癌胚抗原单抗及包含该抗体的芯片以及应用
RS53818B1 (en) 2012-10-12 2015-06-30 Spirogen Sàrl PIROLOBENZODIAZEPINI I NJIHOVI conjugated
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
EA033115B1 (ru) 2013-04-29 2019-08-30 Тева Фармасьютикалз Острэйлиа Пти Лтд. АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD38 И СЛИТЫЕ БЕЛКИ С ОСЛАБЛЕННЫМ ИНТЕРФЕРОНОМ АЛЬФА-2b
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
IL251822B2 (en) 2014-10-29 2023-03-01 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Variants of interferon alpha-2-b
JP7034489B2 (ja) 2016-03-15 2022-03-14 アイタブメッド （エイチケイ） リミテッド 多重特異性Ｆａｂ融合タンパクおよびその使用
US11618784B2 (en) 2016-07-19 2023-04-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-CD47 combination therapy
WO2018069289A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Medimmune Limited Antibody-drug conjugates with immune-mediated therapy agents
CN106749667B (zh) * 2016-12-04 2020-07-14 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种抗癌胚抗原的纳米抗体及其应用
WO2019224275A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
US20210128617A1 (en) * 2019-08-27 2021-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania SYNTHETIC CARS TO TREAT IL13R-alpha-2 POSITIVE HUMAN AND CANINE TUMORS
WO2022079211A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8809616D0 (en) 1988-04-22 1988-05-25 Cancer Res Campaign Tech Further improvements relating to drug delivery systems
GB9014932D0 (en) * 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
CA2161351C (en) * 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9324807D0 (en) 1993-12-03 1994-01-19 Cancer Res Campaign Tech Tumour antibody
US5874540A (en) 1994-10-05 1999-02-23 Immunomedics, Inc. CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies
PL329871A1 (en) * 1996-05-04 1999-04-12 Zeneca Ltd Monoclonal antibody agains cea, coniugates incorporating that antibody and their therapeutic application in the adept system

Also Published As

Publication number Publication date
WO1997042329A1 (en) 1997-11-13
TR199802227T2 (xx) 2000-07-21
US6277599B1 (en) 2001-08-21
EP0896626B1 (en) 2007-01-03
US20020142359A1 (en) 2002-10-03
EP0896626A1 (en) 1999-02-17
IL126772A0 (en) 1999-08-17
NO985120D0 (no) 1998-11-03
CA2250579A1 (en) 1997-11-13
CN1217750A (zh) 1999-05-26
DE69737188D1 (de) 2007-02-15
HUP9901562A3 (en) 2000-06-28
AU719513B2 (en) 2000-05-11
PL329871A1 (en) 1999-04-12
DE69737188T2 (de) 2007-10-11
NZ331978A (en) 2000-05-26
AU2645597A (en) 1997-11-26
ATE350478T1 (de) 2007-01-15
ES2279539T3 (es) 2007-08-16
US6903203B2 (en) 2005-06-07
SK150298A3 (en) 1999-04-13
HUP9901562A2 (hu) 1999-08-30
BR9708910A (pt) 1999-08-03
NO985120L (no) 1998-12-29
JP2000510692A (ja) 2000-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU719513B2 (en) Monoclonal antibody to CEA, conjugates comprising said antibody, and their therapeutic use in an adept system
AU709503B2 (en) Delivery system using mAb 3E10 and mutants and/or functional fragments thereof
CA2019559C (en) Bispecific and oligospecific mono- and oligovalent receptors, the preparation and use thereof
US8858950B2 (en) Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
AU720223B2 (en) Serpin enzyme complex receptor-mediated gene transfer
JP2019524745A (ja) Ｆｃ結合能力を有する融合タンパク質を含む細胞外小胞
AU734915B2 (en) Chemical compounds
EP0731838B1 (en) Binding structures directed against the ca55.1 antigen
AU2004245038A1 (en) De-immunized anti-CD3 antibody
JP3805365B2 (ja) 化合物
Hoogenboom et al. Cloning and expression of a chimeric antibody directed against the human transferrin receptor.
JP2010536751A (ja) ＥｐｈＢ４に結合するヒト化抗体を利用する癌治療剤
KR20000010771A (ko) Cea에 대한 모노클로널 항체, 이 항체를 함유하는 접합체 및adept계에서의 치료적 용도
JPH0576385A (ja) キメラ抗体およびその用途
Wang Gene construction and expression of two single-chain antibodies for immunotherapy of human sarcoma
CZ396599A3 (cs) Genový konstrukt, který kóduje část zaměřující buňku a enzym aktivující proléčivo, pro použití jako léčivo

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic