JP2022548509A

JP2022548509A - ＩＬ１３Ｒα２陽性ヒト腫瘍およびイヌ腫瘍を処置するための合成ＣＡＲ

Info

Publication number: JP2022548509A
Application number: JP2022513446A
Authority: JP
Inventors: ドナルドエムオルーク; イボイン; ローラジョンソン; ゼブビンダー; ラディカソカラ
Original assignee: ザトラスティーズオブザユニバーシティオブペンシルバニア
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2022-11-21
Also published as: WO2021041725A1; US20210128617A1; CA3149543A1; EP4021464A4; EP4021464A1

Abstract

本開示は、ヒトIL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞（例えばT細胞）を提供する。二重特異性CAR、パラレルCAR、タンデムCAR、BiTE、BiTE/CAR、およびBiTE/BiTEも提供される。組成物および処置の方法もまた、提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）の下、2019年8月27日付で出願された米国仮特許出願第62/892,114号への優先権を有しており、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

発明の背景
膠芽腫（GBM）とも呼ばれる、グレードIV神経膠腫を含む悪性神経膠腫は、最もよく見られる原発性悪性脳腫瘍であり、高い罹患率および死亡率と関連する。中枢神経系（CNS）内での神経膠腫細胞の浸潤性成長のアグレッシブな性質は、全切除を達成不可能にする。外科的切除、放射線療法、化学療法および腫瘍治療電場を含む、利用可能な最善の治療法にかかわらず、生存期間中央値は、GBMを有する患者についてわずか12～17ヶ月であり、グレードIII神経膠腫を有する患者について2～5年である。

再方向づけされたT細胞による養子免疫療法は、これらの悪性腫瘍を処置するための実行可能な戦略である。難治性慢性リンパ性白血病を有する患者において、CD19標的指向キメラ抗原受容体改変自家T（CAR T）細胞による処置後に長期の無病生存期間が達成され、再発急性リンパ芽球性白血病（ALL）を有する患者の90％において、この戦略により完全寛解が達成された。しかし今日まで、固形腫瘍におけるCAR T細胞の抗腫瘍活性は、ずっと控えめであった。以前に、ヒト化抗EGFRバリアントIII（EGFRvIII）CAR T細胞（2173BBz）が、再発性GBMを有する10人の患者の第I相臨床試験（NCT02209376）に利用された。CAR T細胞の注入後に、CAR T細胞輸送と関連するEGFRvIII標的抗原の低減およびインサイチューの機能的活性化を含む、腫瘍微小環境に明らかな変化があった。しかし、この試験に臨床応答を決定する検出力はなかった（全生存期間の中央値は251日であった）。最近の報告は、再発性多巣性GBMを有する1人の患者における、T細胞シグナル伝達ドメインと融合されたIL13ゼータカイン、変異型IL13サイトカインを発現している再方向づけされたT細胞の腫瘍内および髄腔内への繰り返し注入の使用を説明したが、この注入は、7.5ヶ月間で腫瘍の完全退縮につながった。

インターロイキン13受容体α2（IL13Rα2）は、異なるヒト腫瘍型に発現されるが、成人の精巣を除き、正常ヒト組織に発現が見られない（図7B）。IL13Rα2を経由するIL13シグナル伝達は、細胞の遊走および侵襲に重要な役割を演じる。以前の研究は、GBM症例の82％がIL13Rα2を発現したことを見出した。IL13Rα2を標的とする中和抗体および薬物コンジュゲート型抗体は、異種移植マウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害した。IL13Rα2ベースの腫瘍ワクチンは、小児神経膠腫患者にも有益であった。IL13ゼータカインで再方向づけされたT細胞はIL13Rα2と結合し、限られた臨床応答を誘導したものの、それらのT細胞は、いくつかの正常ヒト組織に発現されるIL13Rα1とも結合し（図7A）、有害なオフターゲット効果を実証した。

悪性神経膠腫の腫瘍微小環境は免疫抑制性であり、これは、CAR T細胞の注入後に示された。免疫チェックポイント受容体（例えば、PD-1、CTLA-4、TIM-3およびLAG-3）は、活性化T細胞の刺激を異なる時空間的プロファイルでダウンレギュレーションしてT細胞機能を調節する一連の分子である。チェックポイント阻害剤は、免疫抑制性の腫瘍微小環境内でT細胞阻害に打ち勝ち、標的腫瘍細胞にT細胞レパートリーを動員するために、がん療法に適用されている。今日まで、大部分の組み合わせ研究は、抗PD-1チェックポイント遮断を腫瘍抗原に対する内在性T細胞応答と一緒に使用しており、選ばれた少数の報告が操作T細胞に関するものである。

IL13Rα2陽性腫瘍を処置するための組成物および方法の必要性が、当技術分野に存在する。本発明は、この必要性に対処し、応えるものである。

一局面では、本発明は、ヒトIL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（CAR）を提供する。抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、完全長抗体またはその抗原結合断片、Fab、一本鎖可変断片（scFv）、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）である。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（CAR）を提供する。抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：21または22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）である。

ある特定の態様では、CARは、IL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、CARは、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、CARは、イヌIL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、CARは、ヒトIL13Rα2およびイヌIL13Rα2と結合することが可能である。

ある特定の態様では、膜貫通ドメインは、人工疎水性配列、ならびにI型膜貫通タンパク質、T細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40（CD134）、4-1BB（CD137）、およびCD154の膜貫通ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する膜貫通ドメインからなる群より選択される。ある特定の態様では、膜貫通ドメインは、CD8の膜貫通ドメインを含む。ある特定の態様では、CD8の膜貫通ドメインは、CD8アルファの膜貫通ドメインである。

ある特定の態様では、細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の態様では、細胞内ドメインは、TNFRスーパーファミリー内のタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらのバリアントからなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する細胞内ドメインを含む。ある特定の態様では、細胞内ドメインは、4-1BBの共刺激ドメインを含む。ある特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を担持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらのバリアントの細胞質シグナル伝達ドメインからなる群より選択される細胞内ドメインを含む。ある特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζの細胞内ドメインを含む。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を提供する。抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を提供し、その際、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：24またはSEQ ID NO：55またはSEQ ID NO：56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を提供する。

別の局面では、本発明は、本明細書において企図されているCARのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：138または133と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：134または135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である。

ある特定の態様では、膜貫通ドメインは、CD8アルファの膜貫通ドメインを含む。ある特定の態様では、細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBの共刺激ドメインを含む。ある特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζの細胞内ドメインを含む。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、その際、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、その際、第1のCARおよび第2のCARは、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを各々含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：138または133と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：134または135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である。

ある特定の態様では、第1のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む。

ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：33または141と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である。

ある特定の態様では、第2のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：35またはSEQ ID NO：196と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む。

ある特定の態様では、第1のCARおよび／または第2のCARの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列、ならびにI型膜貫通タンパク質、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40（CD134）、4-1BB（CD137）、およびCD154の膜貫通ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する膜貫通ドメインからなる群より選択される。ある特定の態様では、第1のCARおよび／または第2のCARの膜貫通ドメインは、CD8アルファの膜貫通ドメインを含む。

ある特定の態様では、第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の態様では、第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインは、TNFRスーパーファミリー内のタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらのバリアントからなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する細胞内ドメインを含む。ある特定の態様では、第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインは、4-1BBの共刺激ドメインを含む。

ある特定の態様では、第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を担持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらのバリアントの細胞質シグナル伝達ドメインからなる群より選択される細胞内ドメインを含む。ある特定の態様では、第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζの細胞内ドメインを含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。第1のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。第2のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCARをコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のCARをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。第1のCARは、SEQ ID NO：57または67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61または71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。第2のCARは、SEQ ID NO：139または194と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：140または195と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。第1のCARは、SEQ ID NO：133、134、135、または138と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：33または141と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、その際、第1のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含み；第2のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：35またはSEQ ID NO：196と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および免疫チェックポイント阻害剤をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

ある特定の態様では、免疫チェックポイントは、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は抗CTLA-4抗体である。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

ある特定の態様では、第2のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：53または54をコードする配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む。

ある特定の態様では、BiTEは、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である。ある特定の態様では、BiTEは、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である。

ある特定の態様では、第1のポリヌクレオチド配列と第2のポリヌクレオチド配列とは、リンカーにより隔てられている。ある特定の態様では、リンカーは、配列内リボソーム進入部位（IRES）または自家切断型ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、自己切断型ペプチドは2Aペプチドである。ある特定の態様では、2Aペプチドは、ブタテッショウウイルス-1 2A（P2A）、ゾセアアシグナ（Thoseaasigna）ウイルス2A（T2A）、ウマ鼻炎Aウイルス2A（E2A）、および口蹄疫ウイルス2A（F2A）からなる群より選択される。ある特定の態様では、2AペプチドはT2Aである。ある特定の態様では、リンカーは、フューリン切断部位をさらに含む。

ある特定の態様では、核酸は、5'から3'の方向へ、第1のポリヌクレオチド配列と、リンカーと、第2のポリヌクレオチド配列とを含む。ある特定の態様では、核酸は、5'から3'の方向へ、第2のポリヌクレオチド配列と、リンカーと、第1のポリヌクレオチド配列とを含む。

ある特定の態様では、核酸は、誘導性プロモーターをさらに含み、その際、誘導性プロモーターは、SEQ ID NO：161、162、または198のいずれか1つと85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％、または100％同一であるヌクレオチド配列を含む。

別の局面では、本発明は、本明細書において企図されている核酸のいずれかを含むベクターを提供する。

ある特定の態様では、ベクターは発現ベクターである。ある特定の態様では、ベクターは、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される。ある特定の態様では、ベクターは、EF-1aプロモーターをさらに含む。ある特定の態様では、ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）をさらに含む。ある特定の態様では、ベクターは、rev応答エレメント（RRE）をさらに含む。ある特定の態様では、ベクターは、cPPT配列をさらに含む。ある特定の態様では、ベクターは自己不活性化ベクターである。

別の局面では、本発明は、本明細書において企図されているCARのいずれか、本明細書において企図されている核酸のいずれか、または本明細書において企図されているベクターのいずれかを含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供する。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供する。CARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供し、その際、CARは、SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供し、その際、CARは、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供し、その際、CARは、SEQ ID NO：21または22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

ある特定の態様では、CARは、IL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、CARは、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である。

ある特定の態様では、改変細胞は、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含み、その際、改変細胞は、免疫チェックポイント阻害剤を分泌する。ある特定の態様では、免疫チェックポイントは、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される。

ある特定の態様では、改変細胞は、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）をさらに含み、その際、改変細胞はBiTEを分泌する。ある特定の態様では、誘導性BiTEは、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、BiTEは、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である。ある特定の態様では、BiTEは、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1の抗原結合ドメインを含む第1のCAR；および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2の抗原結合ドメインを含む第2のCARを含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供する。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供する。第1のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および、3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。第2のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCAR、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のCARを含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供する。第1のCARは、SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。第2のCARは、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供し、その際、第1のCARは、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：34と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供し、その際、第1のCARは、SEQ ID NO：23または24と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：36または197と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

ある特定の態様では、CARは、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である。

改変細胞のある特定の態様では、第2のCARは、野生型EGFR（wtEGFR）、変異型EGFR、EGFR^A289V、EGFR^A289D、EGFR^A289T、EGFR^A289T、EGFR^R108K、EGFR^R108G、EGFR^G598V、EGFR^D126Y、EGFR^C628F、EGFR^R108K/A289V、EGFR^R108K/D126Y、EGFR^A289V/G598V、EGFR^A289V/C628F、およびEGFRバリアントIIからなる群より選択されるEGFRアイソフォーム、またはそれらの任意の組み合わせと結合することが可能である。

ある特定の態様では、改変細胞は改変免疫細胞である。ある特定の態様では、改変細胞は改変T細胞である。ある特定の態様では、改変細胞は自家細胞である。ある特定の態様では、改変細胞は、ヒト対象から得られた自家細胞である。

別の局面では、本発明は、本明細書において企図されている改変細胞のいずれかの治療有効量を含む薬学的組成物を提供する。

別の局面では、本発明は、その必要のある対象において疾患を処置する方法を提供する。方法は、本明細書において企図されている改変細胞のいずれか、または本明細書において企図されている薬学的組成物のいずれかの有効量を対象に投与する段階を含む。

ある特定の態様では、疾患はがんである。ある特定の態様では、がんは神経膠腫である。ある特定の態様では、がんは星状細胞腫である。ある特定の態様では、がんは高悪性度星状細胞腫である。ある特定の態様では、がんは膠芽腫である。

別の局面では、本発明は、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。方法は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む。CARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供し、その際、CARは、SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供し、その際、CARは、SEQ ID NO：10またはSEQ ID NO：11またはSEQ ID NO：21またはSEQ ID NO：22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供し、その際、CARは、SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：24またはSEQ ID NO：55またはSEQ ID NO：56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

ある特定の態様では、方法は、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、その際、改変細胞は、免疫チェックポイント阻害剤を分泌する。ある特定の態様では、免疫チェックポイントは、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、改変T細胞と同時投与される。

ある特定の態様では、方法は、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）を投与する段階をさらに含み、その際、改変細胞はBiTEを分泌する。

ある特定の態様では、誘導性BiTEは、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、BiTEは、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である。ある特定の態様では、BiTEは、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である。ある特定の態様では、BiTEは、改変T細胞と同時投与される。

ある特定の態様では、方法は、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）、および免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、その際、改変細胞は、BiTEおよび免疫チェックポイント阻害剤を分泌する。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、改変T細胞と同時投与される。

別の局面では、本発明は、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。方法は、IL13Rα2と結合することが可能な第1の抗原結合ドメインを含む第1のキメラ抗原受容体（CAR）；および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2の抗原結合ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。第1のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。第2のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。第1のCARは、SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。第2のCARは、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。第1のCARは、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：34と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。第1のCARは、SEQ ID NO：23または24と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：36または197と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

ある特定の態様では、方法は、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、その際、改変細胞は、免疫チェックポイント阻害剤を分泌する。ある特定の態様では、免疫チェックポイントは、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、改変細胞と同時投与される。

別の局面では、本発明は、第1の抗原結合ドメインと、第2の抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、その際、第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインとは、リンカーにより隔てられている。ある特定の態様では、リンカーは、5個、10個、15個、または20個のアミノ酸を含む。ある特定の態様では、第1の抗原結合ドメインは、IL13Rα2と結合することが可能であり、第2の抗原結合ドメインは、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能である。ある特定の態様では、CARは、SEQ ID NO：163、165、167、または169のいずれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、CARは、SEQ ID NO：164、166、168、または170のいずれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。

別の局面では、本発明は、パラレルCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、その際、パラレルCARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを各々含む第1のCARおよび第2のCARを含み、第1のCARと第2のCARとは、切断可能なリンカーにより隔てられている。ある特定の態様では、パラレルCARは、SEQ ID NO：171と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／またはSEQ ID NO：172と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。

別の局面では、本発明は、BiTEおよびCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ある特定の態様では、BiTEは、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含み、CARは、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様では、BiTEは、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインを含み、CARは、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様では、ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：176またはSEQ ID NO：178と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である。ある特定の態様では、ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：175またはSEQ ID NO：177と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列によってコードされる。

別の局面では、本発明は、第1のBiTEおよび第2のBiTEをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ある特定の態様では、第1のBiTEおよび／または第2のBiTEは、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメイン、および／またはEGFRもしくはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様では、ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：180と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である。ある特定の態様では、ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：179と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列をコードする。

本発明の前述および他の特徴および利点は、添付の図面と共になされる例示的な態様の以下の詳細な説明から、より良く理解されるであろう。

図1A～1Fは、IL13Rα2を標的とするヒト化CAR T細胞を図示する。図1Aは、マウスscFvおよびヒト化scFv（07および08）ベースのCAR構築物のmRNAをエレクトロポレーションした後のヒトT細胞によるCAR発現の、ウサギ抗マウスIgG抗体またはウサギ抗ヒトIgG抗体を使用したフローサイトメトリー検出を示す。図1Bは、試験した抗IL13Rα2 CAR設計のベクターマップを、各成分のサイズベースで示す。図1Cは、共培養実験に使用されたヒト化IL13Rα2 CAR形質導入T細胞のCAR発現染色を図示する。図1Dは、ヒト腫瘍細胞株（Sup-T1、Jurkat、A549、U87、U251およびD270）に関するIL13Rα1およびIL13Rα2の発現分析を示す。図1Eは、図1Dにおけるヒト腫瘍細胞株と共培養されたヒト化IL13Rα2 CAR T細胞のフローベースの細胞内サイトカイン（IFNγ）染色を、非形質導入T細胞（UTD）を対照として示す。ヒトCD8を染色して、x軸に沿ってCD4陽性T細胞亜集団とCD8陽性T細胞亜集団とを識別した。図1Fは、図1Dにおける腫瘍細胞株と、異なるエフェクター／標的（E:T）比（1：1、3：1、10：1および30：1）で共培養したヒト化IL13Rα2 CAR T細胞のクロム放出アッセイからの結果を非形質導入T細胞（UTD）と、一元配置分散分析（ANOVA）の事後Tukey検定で比較したものを示す。**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。図1Aの説明を参照。図1Aの説明を参照。図1Aの説明を参照。図1Aの説明を参照。図1Aの説明を参照。図2A～2Eは、IL13Rα2 CAR T細胞が腫瘍の成長をインビボで制御するという知見を図示する。図2Aは、対照抗体を対照として、D270腫瘍細胞株上のフローベースのEGFRvIIIおよびIL13Rα2の発現を示す。図2Bは、D270腫瘍細胞株と共培養したEGFRvIII標的指向（2173BBz）CAR T細胞およびIL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞を図示する。FITCコンジュゲート型抗CD69抗体の染色によりT細胞の刺激を図示し、24時間または48時間の共培養後に、非形質導入T細胞を対照としてCD4 CAR陽性T細胞およびCD8 CAR陽性T細胞に関する蛍光強度の中央値（MFI）を定量した。事後Tukey検定を伴う一元配置ANOVAによって統計的な有意差を計算した。図2Cは、等しい数の非形質導入T細胞、EGFRvIII標的指向（2173BBz）CAR T細胞またはIL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞をi.v.移入した11日後に、D270を注射したNSGマウスの脾臓（n＝3）中で計数されたヒトT細胞を図示する。図2Dは、D270を皮下に植え込んだNSGマウスモデル（n＝10／群）において、腫瘍植え込みの7日後での500万個のCAR陽性EGFRvIII標的指向（2173BBz）CAR T細胞またはCAR陽性IL13Rα2標的指向（Hu07BBzおよびHu08BBz）CAR T細胞または同じ数の非形質導入T細胞のi.v.注入後を図示する。腫瘍体積の測定（左のパネル）および生物発光イメージング（中央のパネル）を行って、腫瘍の成長を評価した。線形回帰を用いて、実験群間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること（hunch）、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（Prismソフトウェア）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。図2Eは、腫瘍の注射の8日後に、D270腫瘍を同所性に植え込んだNSGマウス（n＝8／群）において、80万個のIL13Rα2標的指向CAR陽性（Hu08BBz）CAR T細胞または同じ数の非形質導入T細胞がi.v.注入により与えられたことを図示する。生物発光イメージングを3～4日毎に繰り返して、腫瘍の成長を評価した。エンドポイントを予め定義し、図2Dに記載されるように統計的有意差を決定した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。図2Aの説明を参照。図2Aの説明を参照。図2Aの説明を参照。図2Aの説明を参照。図3A～3Dは、チェックポイントの遮断がCAR T細胞の機能を選択的に増強するという知見を図示する。図3Aは、EGFRvIII（2173BBz）標的指向CAR T細胞およびIL13Rα2（Hu08BBz）標的指向CAR T細胞のみならず、非形質導入T細胞対照を、標的陽性D270腫瘍細胞株および標的陰性A549腫瘍細胞株と共培養したことを図示する。T細胞上でのチェックポイント受容体の発現を、フローサイトメトリー、蛍光色素コンジュゲート型抗チェックポイント受容体抗体による染色によって決定し；24時間または48時間の共培養後にCD4 CAR陽性T細胞およびCD8 CAR陽性T細胞に関する蛍光強度の中央値（MFI）を定量した。事後Tukey検定を伴う一元配置ANOVAによって統計的有意差を計算した。図3Bは、腫瘍の植え込みの7日後に、D270を皮下に植え込んだマウスモデル（n＝5／群）に非形質導入（UTD）ヒトT細胞をi.v.注入したことを図示する。6日目から4日毎に、PBSまたは同じ体積のチェックポイント遮断抗体（抗PD-1、抗CTLA-4および抗TIM-3）200μgを腹腔内注射した。腫瘍サイズを測定し、UTD＋PBS群とUTD＋チェックポイント遮断群との間で比較した。図3Cは、（図3B）に記載するように注入し、チェックポイント遮断と組み合わせた同じ数のEGFRvIII標的指向（2173BBz）CAR T細胞およびIL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞を図示する。チェックポイント遮断の組み合わせ療法群の腫瘍体積を、PBSと組み合わせたCAR T細胞対照群（n＝5／群）と比較した。図3Dは、EGFRvIII標的指向（2173BBz）CAR T細胞群およびIL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞群において、マウスの腫瘍サイズをベースに、異なるチェックポイント遮断の組み合わせ療法を比較したものを図示する。これらの2つのCAR T細胞群で生存曲線も比較した。実験群間の腫瘍成長の統計的有意差を線形回帰により決定し、生存曲線の統計的有意差を決定するためにログランク検定を用いた。ns、有意でない；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。図3Aの説明を参照。図3Aの説明を参照。図3Aの説明を参照。図4A～4Eは、IL13Rα2 CAR T細胞が、インサイチューで分泌された抗CTLA-4チェックポイント遮断によって選択的に増強されるという知見を図示する。図4Aは、ミニボディー分泌の抗IL13Rα2 CARの設計の、各成分のサイズベースのベクターマップである。ミニボディーは、ヒトIgG1スペーサーおよびCH3ドメインとつながったPD-1標的指向scFv、CTLA-4標的指向scFvおよびTIM-3標的指向scFvとして単純化されたものである。自己切断配列（P2A）を使用して、同じオープンリーディングフレーム中にミニボディーを抗IL13Rα2 CARと共に発現させた。図4Bは、CARの発現がミニボディー分泌IL13Rα2標的指向CAR T細胞上のみならず、ミニボディー非分泌IL13Rα2標的指向CAR T細胞上で検出されたことを図示する。図4Cは、抗PD-1ミニボディー分泌IL13Rα2標的指向CAR T細胞および抗CTLA-4ミニボディー分泌IL13Rα2標的指向CAR T細胞の上清を収集し、別々に濃縮したことを図示する。標準的な直接ELISAを実行して、CAR T細胞によって分泌された抗PD-1ミニボディーおよび抗CTLA-4ミニボディーが組み換えhPD-1および組み換えhCTLA-4と結合する能力を評価した。対応のないt検定によって統計的有意差を計算した。図4Dは、非形質導入T細胞、IL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞およびミニボディー分泌Hu08BBz CAR T細胞をD270腫瘍細胞株と共培養したことを図示する。24時間または48時間の共培養後のCAR陽性T細胞のCD4亜集団およびCD8亜集団へのBV605コンジュゲート型抗TIM-3抗体染色によって蛍光強度の中央値（MFI）を定量した。事後Tukey検定を伴う一元配置ANOVAによって統計的有意差を計算した。図4Eは、D270を皮下に植え込んだ8日後（n＝8）に、80万個のIL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞およびミニボディー分泌Hu08BBz CAR T細胞または同じ数の非形質導入T細胞をi.v.注射したことを図示する。腫瘍サイズをノギスで測り、各群の間で比較した。腫瘍成長の統計的有意差を線形回帰によって決定した。ns、有意でない；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。図4-1の説明を参照。図4-1の説明を参照。図5A～5Dは、IL13Rα2 CAR T細胞がイヌ腫瘍に応答するという知見を図示する。図5Aは、患者由来の神経膠腫幹細胞株（5077、5430、4860、5377、5560、4806および4892）に関するIL13Rα2発現分析を示す。図5Bは、mRNAをエレクトロポレーションしたIL13Rα2標的指向ヒトCAR T細胞（Hu07BBzおよびHu08BBz）上にCARの発現が検出されたことを図示する。ウシ血清アルブミン（BSA）を対照として、これらのCAR T細胞をヒトIL13Rα2タンパク質およびイヌIL13Rα2タンパク質と共培養した後に細胞内サイトカイン（IFNγ）染色を実行した。CD8染色を用いて、x軸上にCD4陽性T細胞群とCD8陽性T細胞群とを識別した。図5Cは、様々なイヌ腫瘍細胞株（Camac2、CLBL-1、GL-1、Cacal3、Cacal5、BW-KOSA、CS-KOSA、MC-KOSAおよびSK-KOSA）に関するイヌIL13Rα1 mRNAおよびIL13Rα2 mRNAの発現が、イヌGAPDHを対照として逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により検出されたことを図示する。mRNAをエレクトロポレーションしたIL13Rα2標的指向（Hu07BBzおよびHu08BBz）ヒトCAR T細胞および非形質導入T細胞を前述のイヌ腫瘍細胞株と共培養後、CD4陽性T細胞亜集団およびCD8陽性T細胞亜集団に占めるサイトカイン（IFNγ、IL2およびTNFα）陽性T細胞のパーセンテージを分析した。図5Dは、500万個のMC-KOSAを皮下に植え込んだ（n＝5／群）7日後に、200万個のHu08BBz形質導入ヒトCAR陽性T細胞をi.v.注射したことを図示する。腫瘍サイズをノギスで測り、同量の非形質導入T細胞の対照群と比較した。腫瘍成長の統計的有意差を線形回帰によって決定した。****P<0.0001。図5Aの説明を参照。図5Aの説明を参照。図5Aの説明を参照。図6A～6Eは、イヌIL13Rα2 CAR T細胞がイヌの腫瘍成長を制御するという知見を図示する。図6Aは、mRNAをエレクトロポレーションしたHu08BBzイヌCAR T細胞をイヌ腫瘍細胞株（Camac2、CLBL-1、GL-1、Cacal3、Cacal5、BW-KOSA、CS-KOSA、MC-KOSA、SK-KPSAおよびJ3T）と共培養したことを図示する。イヌIFNγの分泌をELISAにより検出し、非形質導入イヌT細胞による刺激と比較した。図6Bは、抗IL13Rα2ヒトHu08BBz CAR構造（Hu08HuBBz）およびイヌHu08BBz CAR構造（Hu08CaBBz）のベクターマップを示す。図6Cは、mRNAをエレクトロポレーションしたHu07HuBBz、Hu08HuBBzおよびHu08CaBBzイヌCAR T細胞をCLBL1およびJ3T腫瘍細胞株と共培養したものを図示する。イヌIFNγの分泌をELISAにより検出した。対応のないt検定を用いて、J3T神経膠腫細胞と共培養したHu08HuBBzとHu08CaBBzとの間でIFNγ分泌の統計的有意差を決定した。図6Dは、NSGマウス脳に同所性に植え込んだJ3Tイヌ神経膠腫細胞株を図示する。腫瘍の植え込みの7、10、13日後に、エレクトロポレーションしたHu08HuBBz、Hu08CaBBzまたは非形質導入イヌT細胞1200万個をマウスモデル（n＝4／群）にi.v.注射した。腫瘍成長を3～4日毎に生物発光イメージングによって評価した。腫瘍成長の統計的有意差を線形回帰によって決定した。図6Eは、10日目の2回目の注射で使用したイヌT細胞を、J3T腫瘍細胞株と共培養後にCAR発現およびイヌIFNγの分泌について分析したことを図示する。イヌCD4を染色して、x軸に沿ってイヌCD4陽性亜集団とCD8陽性亜集団とを識別した。ns、有意でない；**P<0.01、****P<0.0001。図6Aの説明を参照。図6Aの説明を参照。図6Aの説明を参照。図6Aの説明を参照。図7A～7Cは、ヒト正常組織または腫瘍組織におけるIL13Rα1発現パネルおよびIL13Rα2発現パネルを図示する。図7A～7Bは、Human Protein Atlas（HPA）（www.proteinatlas.org）のRNA-seqデータに基づくヒト正常組織におけるIL13Rα1およびIL13Rα2の発現を平均TPM（転写物100万分率）として報告したものを示す。図7Cは、cBioPortalで入手可能ながんゲノムアトラス（TCGA）データをベースとする発現の中央値として記載した、ヒト腫瘍におけるIL13Rα2の発現を示す。図7Aの説明を参照。図7Aの説明を参照。図8A～8Dは、マウスscFvベースのIL13Rα2標的指向CAR T細胞を図示する。図8Aは、試験されたマウスscFvベースの抗IL13Rα2 CARの設計のベクターマップを示す。図8Bは、エレクトロポレーションしたヒトT細胞上でのマウスscFv（07および08）ベースのIL13Rα2標的指向CAR構築物の発現を図示する。図8Cは、ヒト腫瘍細胞株（Sup-T1、Jurkat、U87、U251およびD270）に関するIL13Rα1およびIL13Rα2の発現分析を図示する。図8Dは、非形質導入T細胞（UTD）を対照とする、図8Cにおけるヒト腫瘍細胞株と共培養したマウスscFvベースのIL13Rα2 CAR T細胞（Mu07BBzおよびMu08BBz）のフローベースの細胞内サイトカイン（IFNγ）染色を図示する。ヒトCD8を染色して、x軸に沿ってT細胞のCD4陽性亜集団とCD8陽性亜集団とを識別した。図8Aの説明を参照。図8Aの説明を参照。図8Aの説明を参照。図9A～9Cは、ヒト正常細胞型と共培養したヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞を図示する。図9Aは、共培養実験に使用したヒト化IL13Rα2 CAR形質導入T細胞のフローベースのCAR発現染色を図示する。図9Bは、ヒト正常細胞（CD34陽性骨髄細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト末梢気道上皮細胞、ヒト腎上皮細胞、ヒト角化細胞、ヒト神経前駆細胞、ヒト大動脈平滑筋細胞およびヒト肺動脈平滑筋細胞）に関するIL13Rα1およびIL13Rα2の発現分析のフローサイトメトリーを図示する。図9Cは、非形質導入T細胞（UTD）を対照として、図9Bにおけるヒト正常細胞と共培養したヒト化IL13Rα2 CAR T細胞のフローベースの細胞内サイトカイン（IFNγ）の染色を図示する。ヒトCD3およびCD8を染色して、x軸に沿ってT細胞のCD4陽性亜集団とCD8陽性亜集団とを識別した。図9Aの説明を参照。図9Aの説明を参照。図10A～10Eは、インビトロで共培養したIL13Rα2標的指向CAR T細胞の刺激および拡大増殖を図示する。図10A～10Cは、ヒト腫瘍細胞株と共培養したマウスIL13Rα2 CAR T細胞（図10A）、ヒト腫瘍細胞株と共培養したヒト化IL13Rα2 CAR T細胞（図10B）およびヒト正常細胞と共培養したヒト化IL13Rα2 CAR T細胞（図10C）のフローベースの細胞内サイトカイン（IFNγ、IL2およびTNFα）染色を図示する。CD4陽性亜集団およびCD8陽性亜集団に占めるサイトカイン陽性T細胞のパーセンテージを図示した。図10Dは、対照抗体を対照として、インビトロ培養した0、1、2、3、5および7日目のD270腫瘍細胞株に関するフローベースのEGFRvIIIおよびIL13Rα2の発現を図示する。図10Eは、A549細胞株を対照として、D270細胞株と共培養した3、5および8日目のUTD T細胞、2173BBz CAR陽性T細胞およびHu08BBz CAR陽性T細胞に対して実行したCFSE染色による、フローサイトメトリーで決定されたT細胞増殖アッセイを図示する。図10-1の説明を参照。図11A～11Bは、インビトロで共培養したCAR T細胞に関する表面マーカー染色を図示する。図11Aは、D270細胞株と48時間共培養したUTD T細胞、2173BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞の試料を用いて図示した代表的なゲーティングスキームを示す。生きたCD45+、CD3+リンパ球をゲーティングし、T細胞表面マーカーの発現を分析し、CAR+ T細胞とUTD T細胞との間で比較した。図11Bは、24時間または48時間の共培養後に、蛍光色素とコンジュゲーションした対応する抗体を用いた染色によって、フローサイトメトリーによって決定したCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞上のCD69、PD-1、CTLA-4およびTIM-3の発現を図示する。D270細胞株と共培養したUTD T細胞およびCAR+ T細胞における代表的な発現結果を図示した。図11Aの説明を参照。図12A～12Cは、CAR T細胞のインビボ活性に関与するチェックポイント受容体およびリガンドの発現を図示する。図12Aは、抗CD3ビーズおよび抗CD28ビーズを用いたT細胞のインビトロ拡大増殖中の0、3、7および13日目のCD4陽性T細胞亜集団およびCD8陽性T細胞亜集団におけるチェックポイント受容体（PD-1、CTLA-4およびTIM-3）およびそれらのリガンド（PD-L1、CD80、CD86およびガレクチン-9）のフローベースの検出を図示する。図12Bは、D270神経膠腫細胞株に関するチェックポイント受容体リガンド（PD-L1、CD80、CD86およびガレクチン-9）の発現分析のフローベースの検出を図示する。図12Cは、D270を皮下に植え込んだNSGマウスモデルにおける抗PD-1チェックポイント遮断と組み合わせた2173BBz CAR T細胞の注入後のエクスビボのマウス脾臓中のヒトCD3⁺ T細胞に関するヒトPD-1、CD69、CD4およびCD8の染色を図示する。陽性細胞のパーセンテージとしてデータを示す。対応のないt検定によって統計的有意差を計算した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図12Aの説明を参照。図12Aの説明を参照。図13A～13Cは、ミニボディー分泌T細胞（MiST）を標的細胞と共培養し、インビトロ分析したことを図示する。図13Aは、非形質導入T細胞、IL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞およびミニボディー分泌Hu08BBz CAR T細胞（抗PD1および抗CTLA4 MiST）をD270腫瘍細胞株と共培養したことを図示する。24時間または48時間共培養後にCAR陽性T細胞のCD4亜集団およびCD8亜集団に関するBV711コンジュゲート型抗PD1抗体およびPEコンジュゲート型抗CTLA-4抗体の染色によって蛍光強度の中央値（MFI）を定量した。図13Bは、D270腫瘍細胞株と共培養後に評価したIL13Rα2（Hu08BBz）標的指向CAR T細胞およびミニボディー分泌細胞の刺激を図示する。蛍光強度の中央値（MFI）を、24時間または48時間共培養後のCAR陽性T細胞のCD4亜集団およびCD8亜集団上のFITCコンジュゲート型抗CD69抗体染色によって定量した。図13Cは、CD4陽性T細胞亜集団およびCD8陽性T細胞亜集団に占めるサイトカイン（IFNγ、IL2およびTNFα）染色陽性T細胞のパーセンテージを、D270標的腫瘍細胞株と共培養後のIL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞およびミニボディー分泌細胞について分析したことを図示する。事後Tukey検定を伴う一元配置ANOVAによって統計的有意差を計算した。ns、有意でない；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。図14A～14Bは、IL13Rα2のアミノ酸配列およびイヌ骨肉腫マウスモデルを図示する。図14Aは、Geneiousソフトウェアを用いてヒトおよびイヌIL13Rα2のアミノ酸配列を比較したものを図示する。図14Bは、イヌ骨肉腫腫瘍細胞株（BW-KOSA、CS-KOSA、MC-KOSAおよびSK-KOSA）をNSGマウスの右側腹部に異なる用量で皮下に植え込んだことを図示する。生物発光イメージングを繰り返し実行して、各群における腫瘍成長を評価した。図14Aの説明を参照。図15A～15Bは、本明細書に開示される誘導性プロモーターのヌクレオチド配列を図示する。図15A：T細胞活性化後に発現を促進することができる誘導性プロモーターについてのDNA配列。この配列を部分的に繰り返して、T細胞の発現レベルを増強することができる。このプロモーターによりT細胞／CAR T細胞を改変して、設計されたRNAまたはアミノ酸を発現させることができる。図15B：活性を増強させるために繰り返された配列（SEQ ID NO：198）を下線付きで示す。図16A～16Bは、誘導性プロモーターの機能的活性を図示する。図16Aは、蛍光発現のためのTDTomato遺伝子を含む、誘導性プロモーターを含有する構築物の模式図である。図16Bは、PMA／イオノマイシンで刺激されたJurkat細胞（T細胞腫瘍株）におけるTD-Tomatoの発現を示す。細胞をPMA／イオノマイシンで刺激した場合、TD-Tomatoの発現をフローサイトメトリーにより検出し、プロモーターの活性化を実証した。タンデム（上）およびパラレル（下）二重特異性CARを図示する。タンデム二重特異性CARは、EGFR抗原結合ドメイン（806）と連結したIL13Rα2抗原結合ドメイン（Hu08）を含む。タンデムCARにおけるリンカーは、5、10、15、または20アミノ酸（5AA/10AA/15AA/20AA）長であることができる。パラレルCARは、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCAR、およびEGFRと結合することが可能な第2のCARを含む。自己切断配列（P2A）は、抗IL13Rα2 CARと抗EGFR CARとを同じオープンリーディングフレーム中に連結する。図18A～18Eは、5AAリンカー（（G₄S）；図18A）を有するタンデムCAR、10AAリンカー（2（G₄S）；図18B）を有するタンデムCAR、15AAリンカー（3（G₄S）；図18C）を有するタンデムCAR、20AAリンカー（4（G₄S）；図18D）を有するタンデムCAR、およびパラレルCAR（図18E）についてのアミノ酸配列および核酸配列を示す。図18Aの説明を参照。図18Aの説明を参照。図18Aの説明を参照。図18Aの説明を参照。フローサイトメトリーによって決定された場合のCAR構築物の発現定量を示す。T細胞にHu08BBz CAR、806BBz CAR、Hu08/806_(G4S)二重特異性CAR、Hu08/806_2(G4S)二重特異性CAR、Hu08/806_3(G4S)二重特異性CAR、Hu08/806_4(G4S)二重特異性CAR、およびHu08BBz_P2A_806BBzパラレルCARを形質導入した。ビオチン標識化プロテインL、およびストレプトアビジンコンジュゲート型PE、またはストレプトアビジンコンジュゲート型PE単独のいずれかによりCARの発現を検出した。 Hu08BBz CARおよび806BBz CAR、Hu08/806二重特異性CAR、およびHu08BBz_P2A_806BBzパラレルCARを含むT細胞の刺激を図示する。各CAR T細胞集団を、標的を過剰発現している5077神経膠腫幹細胞株と共培養した。CAR1（Hu08BBz）およびCAR2（806BBz）は単一のCAR構築物であり、5AA、10AA、15AA、および20AAは、様々な長さのタンデム二重特異性CAR構築物（Hu08/806_(G4S)、Hu08/806_2(G4S)、Hu08/806_3(G4S)、Hu08/806_4(G4S)）であり、2Aはパラレル二重特異性CAR構築物（Hu08BBz_P2A_806BBz）であった。T細胞の刺激をAPCコンジュゲート型抗CD69抗体の染色によって図示し、24時間共培養後に、非形質導入T細胞を対照としてCD4+（図20、上）CAR陽性T細胞およびCD8+（図20、下）CAR陽性T細胞に関して蛍光強度の中央値（MFI）を定量した。事後Tukey検定を伴う一元配置ANOVAによって統計的有意差を計算した。*p＜0.05、***p＜0.001、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。図21A～21Fは、標的を過剰発現している5077神経膠腫幹細胞株と共培養した図18～20の各タンデム二重特異性CAR T細胞およびパラレルCAR T細胞のフローベースの細胞内サイトカイン[IFNγ（図21Aおよび21D）、IL2（図21Bおよび21E）、およびTNFα（図21Cおよび21F）]染色を図示する。CD4+（図21A～21C）T細胞亜集団およびCD8+（図21D～21F）T細胞亜集団に占めるサイトカイン陽性T細胞のパーセンテージを実証した。一元配置ANOVAの事後のTukey検定。**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。図21-1の説明を参照。図22A～22Dは、EGFRvIIIおよびIL13Rα2を発現していない標的5077細胞株（5077_Rα2-_vIII-）、またはIL13Rα2だけを過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2+_vIII-）、EGFRvIIIだけを過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2-_vIII+）、もしくはEGFRvIIIおよびIL13Rα2を過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2+_vIII+）、ならびに対照の非形質導入T細胞（UTD）と共培養した場合の、806/Hu08タンデム二重特異性CAR T細胞の殺滅能を試験するために行った生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを図示する。図2Aは、Hu08/806_(G4S)二重特異性CARの生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを図示する。2つのscFvの間のリンカーはGGGGS（SEQ ID NO：157）である。データを平均±SEMとして提示する。図22Bは、Hu08/806_2(G4S)二重特異性CARの生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを図示する。2つのscFvの間のリンカーはGGGGSx2（SEQ ID NO：181）である。データを平均±SEMとして提示する。図22Cは、Hu08/806_3(G4S)二重特異性CARの生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを図示する。2つのscFvの間のリンカーはGGGGSx3（SEQ ID NO：158）である。データを平均±SEMとして提示する。図22Dは、Hu08/806_4（G4S）二重特異性CARの生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを図示する。2つのscFvの間のリンカーはGGGGSx4（SEQ ID NO：160）である。データを平均±SEMとして提示する。図22Aの説明を参照。図22Aの説明を参照。図22Aの説明を参照。図23A～23Dは、パラレル二重特異性CAR構築物（Hu08BBz_P2A_806BBz）のインビトロ殺滅を図示する。生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを行って、IL13Rα2だけを過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2+_vIII-）、EGFRvIIIだけを過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2-_vIII+）、またはEGFRvIIIおよびIL13Rα2を過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2+_vIII+）ならびにEGFRvIIIおよびIL13Rα2を過剰発現しているD270神経膠腫細胞株（D270_Rα2+_vIII+）、ならびに対照の非形質導入T細胞（UTD）と共培養した場合の806BBz/Hu08BBz（Hu08BBz_P2A_806BBz）パラレル二重特異性CAR T細胞の殺滅能を試験した。データを平均±SEMとして提示する。 806BBz/Hu08BBz（Hu08BBz_P2A_806BBz）パラレル二重特異性CAR T細胞が腫瘍成長を低減し、動物の生存期間を向上させたことを図示する。D270を皮下に植え込んだNSGマウス（n＝8／群）に806BBz/Hu08BBz二重特異性CAR T細胞または同じ数の非形質導入T細胞（UTD）をi.v.注入した。腫瘍体積の測定（図24、上）を行って、腫瘍の成長を評価した。線形回帰を用いて、実験群間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（図24、下、Prismソフトウェア）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。図25A～25Dは、IL13Rα2陽性細胞において抗IL13Rα2/CD3二重特異性T細胞エンゲージャー（Hu07BiTE）によって誘導されるT細胞活性化を図示する。新鮮培地（図25A）、ならびに非形質導入（UTD）T細胞（図25B）、Hu08BBz CAR形質導入T細胞（図25C）、およびHu07BiTE形質導入T細胞（図25D）からの馴化培地を収集し、5077細胞株（上、IL13Rα2-）または4892細胞株（下、IL13Rα2+）との共培養に使用した。CD69を染色してT細胞活性化を実証した。ヒトCD8を染色して、x軸に沿ってT細胞のCD4陽性亜集団とCD8陽性亜集団とを識別した。抗IL13Rα2/CD3（Hu08OKT3）二重特異性T細胞エンゲージャーのIL13Rα2とのインビトロ結合を図示する。293T細胞にプラスミドpTRPE CFP（蛍光遺伝子）またはpTRPE Hu08BiTEをトランスフェクションした。2日後に上清を収集した。直接ELISAを実行して、組み換えタンパク質IL13Rα2とのHu08OKT3 BiTEの結合を検出した。 2つの抗EGFR/CD3（C225BiTEおよび806BiTE）二重特異性T細胞エンゲージャーのEGFRとのインビトロ結合を図示する。T細胞にpTRPE Hu08BBz、pTRPE C225BiTE、またはpTRPE 806BiTEを形質導入し、非形質導入T細胞（UTD）およびHu8BBz CARを対照とした。7日後に上清を収集した。直接ELISAを実行して、BiTEと、組み換えタンパク質、EGFR野生型またはEGFRvIIIとの結合を検出した。図28A～28Bは、野生型5077細胞に及ぼす2つの抗EGFR/CD3（C225BiTEおよび806BiTE）二重特異性T細胞エンゲージャーの効果の差を図示する。さらに、神経膠腫幹細胞株5077は、低レベルのEGFRを発現するが、IL13Rα2を発現しない。806BiTEおよびC225BiTE形質導入T細胞を、野生型を発現している5077細胞またはEGFRvIIIを過剰発現している5077細胞と共培養し、殺滅アッセイ（図28A）およびサイトカイン分泌定量アッセイ（図28B）を実行した。図28Aは、806BiTE形質導入T細胞がEGFRvIII過剰発現5077細胞だけを殺滅したのに対し、C225BiTE形質導入T細胞は、5077野生型およびEGFRvIII過剰発現5077細胞を殺滅したことを図示する。図28Bは、806BiTE形質導入T細胞をEGFRvIII過剰発現5077細胞と共培養した場合だけ、806BiTEがINFγ、IL-2、およびTNFの分泌を誘導したのに対し、C225BiTE形質導入T細胞が、EGFRvIIIバリアントの非存在下および存在下でINFγ、IL-2、およびTNFの分泌を刺激したことを図示する。標的細胞の非存在下でサイトカインの産生は観察されなかった。図28Aの説明を参照。 IL13Rα2陽性細胞およびEGFRvIII陽性細胞において抗IL13Rα2/CD3（Hu08/KT3-T2A-mCherry）および抗EGFRvIII/CD3（80/KT3-T2A-mCherry）二重特異性T細胞エンゲージャーによって誘導されるT細胞活性化を図示する。非形質導入T細胞（UTD）、806BBz CAR T細胞、806BiTE T細胞、Hu08BBz CAR T細胞およびHu08BiTE T細胞の上清を収集し、非形質導入T細胞と、標的過剰発現5077 GSC株およびD270神経膠腫細胞株との共培養に使用した。CD69を染色してT細胞活性化を実証した。ヒトCD8を染色して、x軸に沿ってT細胞のCD4陽性亜集団とCD8陽性亜集団とを識別した。図30A～30Dは、BiTE/CARの実験に使用した二重特異性構築物の模式図を図示する。図30Aは、Hu08BBz CARをコードする第1のヌクレオチド配列、806BBz CARをコードする第2のヌクレオチド配列、および蛍光マーカーをコードする第3のヌクレオチドを含むパラレル二重特異性ポリヌクレオチド配列（806BBz/Hu08BBz二重特異性構築物）の模式図を示す。図30Bは、抗EGFRvIII/CD3二重特異性T細胞エンゲージャーをコードする第1のヌクレオチド配列、Hu08CARをコードする第2のヌクレオチド、および蛍光マーカーをコードする第3のヌクレオチドを含む模式的ポリヌクレオチド配列（806BiTE/Hu08CAR二重特異性構築物）を示す。図30Cは、抗IL13Rα2/CD3二重特異性T細胞エンゲージャーをコードする第1のヌクレオチド配列、806CARをコードする第2のヌクレオチド、および蛍光マーカーをコードする第3のヌクレオチドを含む模式的ポリヌクレオチド配列（Hu08BiTE/806CAR二重特異性構築物）を示す。図30Dは、抗EGFRvIII/CD3二重特異性T細胞エンゲージャーをコードする第1のヌクレオチド配列、抗IL13Rα2/CD3二重特異性T細胞エンゲージャーをコードする第2のヌクレオチド、および蛍光マーカーをコードする第3のヌクレオチドを含む模式的ポリヌクレオチド配列（806BiTE/Hu08BiTE二重特異性構築物）を示す。自己切断配列（P2Aおよび／またはT2A）は、CAR、二重特異性T細胞エンゲージャー、および蛍光マーカーを同じオープンリーディングフレーム中に連結する。図31A～31Dは、SEQ ID No：173～174として記載される806BBz/Hu08BBz（図31A）、SEQ ID No：175～176として記載される806BiTE/Hu08BBz（図31B）、SEQ ID No：177～178として記載されるHu08BiTE/806BBz（図31C）、およびSEQ ID No：179～180として記載される806BiTE/Hu08BiTE（図31D）についてのアミノ酸配列および核酸配列を示す。図31Aの説明を参照。図31Aの説明を参照。図31Aの説明を参照。図32A～32Dは、非形質導入T細胞（UTD）を対照として、標的を過剰発現する（EGFRvIII/IL13Rα2）細胞株と共培養した場合の806BiTE/Hu08BBz二重特異性T細胞の殺滅能を試験するために行った生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを図示する。データを平均±SEMとして提示する。図32Aは、EGFRvIIIだけを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2-_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図32Bは、IL13Rα2だけを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2+_vIII-）における細胞傷害効果を示す。図32Cは、IL13Rα2およびEGFRvIIIを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2+_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図32Dは、IL13Rα2およびEGFRvIIIを過剰発現しているD270細胞株（D270_Rα2+_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図33A～33Bは、806BiTE/Hu08BBz二重特異性T細胞が腫瘍成長を低減し、動物の生存期間を向上させたことを示す。806BiTE/Hu08BBz二重特異性T細胞または同じ数の非形質導入T細胞（UTD）を、D270を皮下に植え込んだNSGマウス（n＝8／群）にi.v.注入した。図33Aは、806BiTE/Hu08BBz二重特異性T細胞により処置された動物において低減した腫瘍サイズを示す。腫瘍体積の測定を行って、腫瘍成長を評価した。線形回帰を用いて、実験群の間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。図33Bは、806BiTE/Hu08BBz二重特異性T細胞により処置された動物における向上した生存期間を示す。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（Prismソフトウェア）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。***p＜0.001、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。図34A～34Dは、非形質導入T細胞（UTD）を対照として、標的を過剰発現する（EGFRvIII/IL13Rα2）5077細胞株およびD270神経膠腫細胞株と共培養した場合の、Hu08BiTE/806BBz二重特異性T細胞の殺滅能を試験するために実行した生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを図示する。データを平均±SEMとして提示する。図34Aは、EGFRvIIIだけを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2-_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図34Bは、IL13Rα2だけを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2+_vIII-）における細胞傷害効果を示す。図34Cは、IL13Rα2およびEGFRvIIIを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2+_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図34Dは、IL13Rα2およびEGFRvIIIを過剰発現しているD270細胞株（D270_Rα2+_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図35A～35Bは、Hu08BiTE/806BBz二重特異性T細胞が腫瘍成長を低減し、動物の生存期間を向上させたことを示す。Hu08BiTE/806BBz二重特異性T細胞または同じ数の非形質導入T細胞（UTD）を、D270を皮下に植え込んだNSGマウス（n＝8／群）にi.v.注入した。図35Aは、Hu08BiTE/806BBz二重特異性T細胞で処置された動物における低減した腫瘍サイズを示す。腫瘍体積の測定を実行して、腫瘍成長を評価した。線形回帰を用いて、実験群間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。図35Bは、Hu08BiTE/806BBz二重特異性T細胞により処置された動物における向上した生存期間を示す。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（Prismソフトウェア）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。**p＜0.01、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。図36A～36Dは、非形質導入T細胞（UTD）を対照として、標的を過剰発現する（EGFRvIII/IL13Rα2）5077細胞株およびD270神経膠腫細胞株と共培養した場合の806BiTE/Hu08BiTE二重特異性T細胞の殺滅能を試験するために行った生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを図示する。データを平均±SEMとして提示する。図36Aは、EGFRvIIIだけを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2-_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図36Bは、IL13Rα2だけを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2+_vIII-）における細胞傷害効果を示す。図36Cは、IL13Rα2およびEGFRvIIIを過剰発現している5077細胞株（5077_Rα2+_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図36Dは、IL13Rα2およびEGFRvIIIを過剰発現しているD270細胞株（D270_Rα2+_vIII+）における細胞傷害効果を示す。図37A～37Bは、806BiTE/Hu08BiTE二重特異性T細胞が腫瘍成長を低減し、動物の生存期間を向上させたことを示す。806BiTE/Hu08BiTE二重特異性T細胞または同じ数の非形質導入T細胞（UTD）を、D270を皮下に植え込んだNSGマウス（n＝8／群）にi.v.注入した。図37Aは、806BiTE/Hu08BiTE二重特異性T細胞により処置された動物における低減した腫瘍サイズを示す。腫瘍体積の測定を実行して、腫瘍成長を評価した。線形回帰を用いて、実験群間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。図37Bは、806BiTE/Hu08BiTE二重特異性T細胞により処置された動物における向上した生存期間を示す。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（Prismソフトウェア）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。***p＜0.001、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。腫瘍内注射の実現可能性を示すための、他方の脳室への脳室内注射に続く対側性脳室への治療薬の拡散を図示する。トリパンブルー5uLをブレグマの右1～2mm、0.3mm前方、深さ3.0mmの右脳室内に注射した。注射から15分以内に動物を安楽死させ、対側性脳室へのトリパンブルーの拡散について脳を調査した。両方の脳室で見られた青色の染色は、治療薬を右脳室内に注射できること、および左の対側性脳室への治療薬の拡散が得られることの両方を示す。

詳細な説明
本発明は、ヒトIL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞（例えば改変T細胞）のための組成物および方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCAR、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞のための組成物および方法を提供する。提供される組成物および方法は、がん（例えば、神経膠腫、高悪性度星状細胞腫、および膠芽腫）を処置するために有用である。

本開示に記載される方法は、本明細書において開示される特定の方法および／または実験条件が変動し得るので、そのような方法および条件に限定されないことを理解されたい。また、本明細書において使用される用語法は、特定の態様だけを説明することを目的とし、限定的であることは意図しないことも理解されたい。

さらに、本明細書に記載される実験は、特に示さないかぎり、当業者の技能の範囲内で従来の分子細胞生物学的および免疫学的技法を使用する。そのような技法は、熟練の作業者に周知であり、文献に十分に説明されている。例えば、すべての補遺を含むAusubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008）、MR GreenおよびJ. SambrookによるMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)ならびにHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition）を参照されたい。

A. 定義
特に定義されないかぎり、本明細書において用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって広く理解されている意味を有する。何らかの潜在的意味不確定が発生した場合、本明細書において提供される定義が、任意の辞書または外部の定義よりも優先される。状況により特に必要とされないかぎり、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。特に述べないかぎり、「または」の使用は「および／または」を意味する。「含んでいる（including）」という用語ならびに「含む（includes）」および「含んだ（included）」などの他の形態の使用は、非限定的である。

一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は周知であり、当技術分野において広く使用される。本明細書において提供される方法および技法は、特に示さないかぎり一般的に当技術分野において周知の従来法に従って、本明細書全体にわたり引用され、論じられる様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されるように行われる。酵素反応および精製技法は、当技術分野において広く成し遂げられる、または本明細書に記載されるように製造業者の規格に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医薬化学に関連して使用される命名法ならびにその検査手技および技法は、周知であり、当技術分野において広く使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達ならびに患者の処置のために標準的な技法が使用される。

本開示がより容易に理解され得るように、選ばれた用語を以下に定義する。

「1つの（a）」および「1つの（an）」という冠詞は、本明細書においてその冠詞の文法的対象物の1つまたは1つよりも多く（すなわち、少なくとも1つ）をいうように用いられる。例として、「1つの（an）要素」は、1つの要素または1つよりも多い要素を意味する。

量、時間的持続期間などのような測定可能な値をいう場合に本明細書において用いられる「約」は、特定された値から±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、なおより好ましくは±0.1％のばらつきを包含するものとするが、これはそのようなばらつきが、開示された方法を実施する上で妥当なためである。

本明細書において用いられる「活性化」とは、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態のことを指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能に関連することができる。「活性化T細胞」という用語は、特に、細胞分裂を起こしているT細胞のことを指す。

本明細書において使用される場合、疾患を「緩和する」は、疾患の1つまたは複数の症状の重症度を低減することを意味する。

本明細書において用いられる「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれ得る。当業者は、事実上、すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働くことができることを理解するであろう。

さらに、抗原は、組み換えDNAまたはゲノムDNAに由来することができる。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それゆえ、本明細書においてその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、1つよりも多い遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されるわけではないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは、容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要はまったくないことを理解するであろう。抗原が生物学的試料から生成、合成または由来することができることは、容易に明らかである。そのような生物学的試料は、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液を含むことができるが、それに限定されるわけではない。

本明細書において用いられる場合、「自己」という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料をいうよう意図される。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、非限定的に増殖などのT細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体が含まれるが、それに限定されるわけではない。

「共刺激シグナル」は、本明細書において使用される場合、TCR/CD3の連結などの一次シグナルとの組み合わせで、T細胞増殖および／または鍵となる分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを導くシグナルを指す。

「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、その動物が恒常性を維持できるが、その動物の健康状態が障害のない場合よりも好ましくない健康状態である。未処置のまま放置されても、障害が必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。

用語「ダウンレギュレーション」は、本明細書において使用される場合、1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の減少または消失を指す。

「有効量」または「治療的有効量」は、本明細書において互換的に用いられ、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、または治療的もしくは予防的利益をもたらす、本明細書において記述される化合物、製剤、材料または組成物の量のことを指す。そのような結果には、哺乳動物に投与した場合に、本発明の組成物の非存在下で検出される免疫応答と比較して検出可能なレベルの免疫抑制または耐容性を引き起こす量が含まれ得るが、それに限定されるわけではない。免疫応答は、おびただしい数の当技術分野において認識されている方法によって容易に評価することができる。当業者は、本明細書において投与される組成物の量が、変動すること、そして、処置されている疾患または状態、処置されている哺乳動物の齢および健康および身体の状態、疾患の重症度、投与されている特定の化合物などの多数の要因に基づいてこれを容易に決定できることを理解するであろう。

「コードする」とは、定義されたヌクレオチド（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的過程において他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAのようなポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性ならびにそれに起因する生物学的特性をいう。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。mRNA配列と同一であり通常は配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖も、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖も共に、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードするということができる。

本明細書において用いられる場合、「内因性」とは、生物、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはそれらの内部で産生される、任意の材料をいう。

用語「エピトープ」は、本明細書において使用される場合、免疫応答を誘発し、B細胞応答および／またはT細胞応答を誘導することができる、抗原上の小化学分子として定義される。抗原は、1つまたは複数のエピトープを有することができる。ほとんどの抗原は、多くのエピトープを有する；すなわち、これらは多価である。一般に、エピトープは、おおよそ約10アミノ酸および／または糖のサイズである。好ましくは、エピトープは、約4～18アミノ酸、より好ましくは約5～16アミノ酸、さらにより最も好ましくは6～14アミノ酸、より好ましくは約7～12、そして、最も好ましくは約8～10アミノ酸である。一般には、分子の特定の直鎖状配列よりも全体の三次元構造が抗原の特異性の主な基準であること、それゆえ、これによってあるエピトープが別のエピトープと区別されることを、当業者は理解する。本開示に基づいて、本発明で用いられるペプチドは、エピトープであることができる。

本明細書において用いられる場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される、任意の材料をいう。

本明細書において用いられる「増大する」という用語は、T細胞の数の増加のように、数が増加することをいう。一態様では、エクスビボで増大したT細胞は、培養物中に当初存在している数と比べて数が増加する。別の態様では、エクスビボで増大したT細胞は、培養物中の他の細胞型と比べて数が増加する。本明細書において用いられる「エクスビボ」という用語は、生物（例えば、ヒト）から取り出され、生物の外側で（例えば、培養皿、試験管、またはバイオリアクタ中で）繁殖させた細胞をいう。

本明細書において用いられる「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。

「発現ベクター」とは、発現されるべきヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されることができる。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み入れたコスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの）ならびにウイルス（例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、当技術分野において公知のすべてのものが含まれる。

本明細書において用いられる「同一性」とは、2つのポリマー分子間の、特に2つのポリペプチド分子間のような2つのアミノ酸分子間のサブユニット配列の同一性をいう。2つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合；例えば、2つのポリペプチド分子の各々における位置がアルギニンによって占有されているなら、それらはその位置で同一である。2つのアミノ酸配列がアライメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する同一性または程度は、百分率として表現されることが多い。2つのアミノ酸配列間の同一性は、一致しているまたは同一である位置の数の一次関数である；例えば、2つの配列における位置の半分（例えば、10アミノ酸長のポリマーにおける5つの位置）が同一であるなら、2つの配列は50％同一であり；位置の90％（例えば、10中9）が一致しているまたは同一であるなら、2つのアミノ酸配列は90％同一である。

本明細書において用いられる「免疫応答」という用語は、リンパ球が抗原分子を異物と同定し、抗体の形成を誘導し、かつ／またはリンパ球を活性化して抗原を除去する場合に起きる、抗原に対する細胞応答と定義される。

「免疫抑制」という用語は、本明細書において免疫応答全体を低減することを指すために使用される。

「単離された」とは、天然の状態から変えられたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在することができる。

本明細書において用いられる「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科（Retroviridae）ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でも独特である；それらはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNA中に送達することができるため、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIVおよびFIVはすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移入を達成するための手段を与える。

本明細書において用いられる用語「改変された」とは、本発明の分子または細胞の変化した状態または構造を意味する。分子は化学的に、構造的に、および機能的になど、多くの方法で改変され得る。細胞は、核酸の導入によって改変され得る。

本明細書において用いられる用語「モジュレートする」とは、処置もしくは化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較して、および／または他の点では同一であるが処置を受けていない対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、対象、好ましくはヒトにおいて、天然のシグナルもしくは応答を撹乱させ、かつ／またはそれに影響を与え、それにより有益な治療応答を媒介することを包含する。

本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基に関する以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンをいい、「C」はシトシンをいい、「G」はグアノシンをいい、「T」はチミジンをいい、そして「U」はウリジンをいう。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的に、短いポリヌクレオチドを意味する。ヌクレオチド配列がDNA配列（すなわち、A、T、C、G）により表される場合、「T」が「U」に置き換えられるRNA配列（すなわち、A、U、C、G）もまた含まれることを理解されたい。

特別の定めのないかぎり、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型である、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、型によってはイントロンを含み得るかぎり、イントロンを含み得る。

免疫原性組成物の「経口」投与には、例えば、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）、もしくは胸骨内注射、または注入技術が含まれる。

本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書において用いられる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらは単量体「ヌクレオチド」に加水分解することができるという一般知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書において用いられる場合、ポリヌクレオチドには、非限定的に、組み換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCRなどを用いた組み換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野において利用可能な任意の手段により、ならびに合成手段により得られるすべての核酸配列が含まれるが、それに限定されるわけではない。

本明細書において用いられる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互につなぎ合わされた2つまたはそれよりも多いアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において用いられる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともいわれる短鎖と、当技術分野において一般にタンパク質といわれる長鎖の両方をいい、その中には多くのタイプがある。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。

抗体に関して本明細書において用いられる用語「特異的に結合する」とは、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識またはそれと結合しない抗体を意味する。例えば、1つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体が、1つまたは複数の種由来のその抗原にも結合する場合がある。しかし、そのような異種間反応性はそれ自体で、特異的としての抗体の分類を変化させることはない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体が、その抗原の異なる対立遺伝子型にも結合する場合がある。しかし、そのような交差反応性はそれ自体で、特異的としての抗体の分類を変化させることはない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関連して用いて、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味することができる；例えば、抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的であるなら、標識された「A」およびその抗体を含む反応物中にエピトープAを含む分子（または遊離した、標識されていないA）が存在することにより、その抗体に結合した標識されたAの量が低減するであろう。

「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、TCR/CD3複合体）がその同族リガンドと結合し、それによって、非限定的に、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達のような、シグナル伝達事象を媒介することにより誘導される一次応答を意味する。刺激は、TGF-ベータのダウンレギュレーション、および／または細胞骨格構造の再編成などのような、ある特定の分子の発現の変化を媒介することができる。

「刺激分子」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合する、T細胞上の分子を意味する。

本明細書において用いられる「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など）に存在する場合、T細胞上の同族結合パートナー（本明細書において「刺激分子」といわれる）と特異的に結合でき、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むが、それに限定されるわけではない、T細胞による一次応答を媒介するリガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体、およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。

「対象」という用語は、免疫応答を誘発することができる生物（例えば、哺乳動物）を含むよう意図される。本明細書において用いられる「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物には、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびマウス哺乳動物のような、家畜およびペットが含まれる。好ましくは、対象はヒトである。

「標的部位」または「標的配列」とは、結合が起きるのに十分な条件の下で結合分子が特異的に結合し得る核酸の一部分を規定する核酸配列をいう。いくつかの態様では、標的配列は、結合が起こるために十分な条件の下で結合分子が特異的に結合しうる核酸の一部分を規定するゲノム核酸配列を指す。

本明細書において用いられる「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、抗原の提示に応答するT細胞の活性化に関与する膜タンパク質複合体を指す。TCRは、主要組織適合複合体分子に結合した抗原を認識することを担う。TCRは、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖とのヘテロ二量体から構成されるが、いくつかの細胞では、TCRは、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。TCRは、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタ形態で存在する場合があり、これらの形態は、構造的に類似しているが、別個の解剖学的位置および機能を有する。各鎖は、2つの細胞外ドメイン、可変ドメインおよび定常ドメインから構成される。いくつかの態様では、TCRは、例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、およびガンマデルタT細胞を含む、TCRを含む任意の細胞上で改変されうる。

本明細書において用いられる「治療的」という用語は、処置および／または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。

「移植片」は、移植されることになる生体適合性の格子またはドナーの組織、臓器または細胞のことをいう。移植片の例には、皮膚細胞または組織、骨髄ならびに心臓、膵臓、腎臓、肺および肝臓などの実質臓器が含まれ得るが、それに限定されるわけではない。移植片はまた、宿主に投与されることになる任意の材料を指すことができる。例えば、移植片は、核酸またはタンパク質を指すことができる。

本明細書において用いられる「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクションされた、形質転換された、または形質導入されたものである。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。

疾患を「処置する」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。

「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる材料の組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結びついたポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、それに限定されるわけではない、多数のベクターが当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリシン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、それに限定されるわけではない。

範囲：本開示の全体を通じて、本発明の様々な局面を範囲の形式で提示することができる。範囲の形式の記述は、単に便宜および簡略化のためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、可能なすべての部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1～6のような範囲の記述は、1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6などのような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

B. キメラ抗原受容体
本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を提供する。ある特定の態様では、CARは、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む。CARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞、例えば、改変T細胞のための組成物および方法もまた、提供される。したがって、いくつかの態様では、免疫細胞は、CARを発現するように遺伝的に改変されている。前記CARをコードする核酸、前記核酸をコードするベクター、および前記CAR、ベクター、または核酸を含む改変細胞（例えば改変T細胞）もまた、提供される。

本発明の対象CARは、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む。本発明の対象CARは、任意で、ヒンジドメインを含みうる。したがって、本発明の対象CARは、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む。

抗原結合ドメインは、細胞における発現のために、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメイン（両方とも本明細書の他の箇所に記載される）などのCARの別のドメインと機能的に連結されうる。一態様では、抗原結合ドメインをコードする第1の核酸配列は、膜貫通ドメインをコードする第2の核酸と機能的に連結され、細胞内ドメインをコードする第3の核酸配列とさらに機能的に連結される。

本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される膜貫通ドメインのいずれか、本明細書において記載される細胞内ドメインもしくは細胞質ドメインのいずれか、または本発明のCARに含まれうる、本明細書において記載される他のドメインのいずれかと組み合わせることができる。本発明の対象CARはまた、本明細書において記載されるヒンジドメインを含みうる。本発明の対象CARはまた、本明細書において記載されるスペーサードメインを含みうる。いくつかの態様では、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインの各々は、リンカーにより隔てられている。

ある特定の態様では、CARは、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、CARは、イヌIL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、CARは、イヌIL13Rα2およびヒトIL13Rα2と結合することが可能である。

一局面では、本発明は、ヒトIL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む単離された抗原受容体（CAR）を含む。抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む単離されたCARを含み、その際、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。

CAR配列の耐容される変動は、当業者に公知であろう。例えばいくつかの態様では、CARは、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、12、13、14、15、16、17、または18に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能な単離されたCARを含み、その際、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能な単離されたCARを含み、その際、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の局面では、本発明は、SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：24またはSEQ ID NO：55またはSEQ ID NO：56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、IL13Rα2と結合することが可能な単離されたCARを含む。

別の局面では、本発明は、SEQ ID NO：92またはSEQ ID NO：94またはSEQ ID NO：111またはSEQ ID NO：113と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、IL13Rα2と結合することが可能な単離されたCARを含む。

ある特定の態様では、CARは、GBM幹細胞と結合することが可能である。

抗原結合ドメイン
CARの抗原結合ドメインは、タンパク質、糖質、および糖脂質を含む特異的標的抗原に結合するためのCARの細胞外領域である。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、IL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、イヌIL13Rα2と結合することが可能である。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、ヒトIL13Rα2およびイヌIL13Rα2と結合することが可能である。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：20のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がSEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含み、HCDR2がSEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含み、HCDR3がSEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がSEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含み、LCDR2がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含み、LCDR3がSEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がSEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含み、HCDR2がSEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含み、HCDR3がSEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がSEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含み、LCDR2がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含み、LCDR3がSEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がSEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含み、HCDR2がSEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含み、HCDR3がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がSEQ ID NO：16のアミノ酸配列を含み、LCDR2がSEQ ID NO：17のアミノ酸配列を含み、LCDR3がSEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がSEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含み、HCDR2がSEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含み、HCDR3がSEQ ID NO：15のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がSEQ ID NO：16のアミノ酸配列を含み、LCDR2がSEQ ID NO：17のアミノ酸配列を含み、LCDR3がSEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、完全長抗体またはその抗原結合断片、Fab、一本鎖可変断片（scFv）、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、IL13Rα2と結合することが可能なscFvを含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：21のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：22のアミノ酸配列を含む。

ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、完全長抗体またはその抗原結合断片、Fab、一本鎖可変断片（scFv）、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、IL13Rα2と結合することが可能なscFvを含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：125のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：127のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：129のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：131のアミノ酸配列を含む。

抗原結合ドメイン配列の耐容される変動は、当業者に公知であろう。例えばいくつかの態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

抗原結合ドメイン配列の耐容される変動は、当業者に公知であろう。例えばいくつかの態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

抗原結合ドメイン配列の耐容される変動は、当業者に公知であろう。例えばいくつかの態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：2、77、79、82、84、86、88、90、127、または129に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

抗原結合ドメイン配列の耐容される変動は、当業者に公知であろう。例えばいくつかの態様では、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：96、98、99、100、103、105、107、109、129、または131に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインを含むことができ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、およびそれらの任意の断片を含みうるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様では、抗原結合ドメインの部分は、哺乳動物抗体またはその断片を含む。抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面に存在する抗原の種類および数に依存しうる。

いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、抗体、抗原結合断片（Fab）、および一本鎖可変断片（scFv）からなる群より選択される。いくつかの態様では、本発明のIL13Rα2結合ドメインは、IL13Rα2特異的抗体、IL13Rα2特異的Fab、およびIL13Rα2特異的scFvからなる群より選択される。一態様では、IL13Rα2結合ドメインは、IL13Rα2特異的抗体である。一態様では、IL13Rα2結合ドメインはIL13Rα2特異的Fabである。一態様では、IL13Rα2結合ドメインはIL13Rα2特異的scFvである。

本明細書において用いられる「一本鎖可変断片」または「scFv」という用語は、免疫グロブリン（例えば、マウスまたはヒト）の重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）とが共有結合的に連結してVH::VLヘテロ二量体を形成した融合タンパク質である。重鎖（VH）と軽鎖（VL）とは、直接つながっているか、またはリンカーをコードするペプチドによってつながっており、このリンカーは、VHのN末端をVLのC末端と、またはVHのC末端をVLのN末端と接続する。いくつかの態様では、抗原結合ドメイン（例えば、IL13Rα2結合ドメイン）は、N末端からC末端へと、VH－リンカー－VLの配置を有するscFvを含む。いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、N末端からC末端へと、VL－リンカー－VHの配置を有するscFvを含む。当業者は、本発明における使用に適した配置を選択することができるであろう。

リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが、さらには可溶性のためにセリンまたはトレオニンが豊富である。リンカーは、細胞外抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することができる。リンカーの非限定的な例は、Shen et al., Anal. Chem. 80(6):1910-1917 (2008) および国際公開公報第2014/087010号に開示されており、それらの内容は、それらの全体で参照により本明細書に組み入れられる。グリシンセリン（GS）リンカー、例えば(GS)_n、(GSGGS)_n（SEQ ID NO：148）、(GGGS)_n（SEQ ID NO：149）、および(GGGGS)_n（SEQ ID NO：150）（配列中、nは少なくとも1の整数を表す）を含むが、それに限定されるわけではない様々なリンカー配列が当技術分野において公知である。例示的なリンカー配列は、GGSG（SEQ ID NO：151）、GGSGG（SEQ ID NO：152）、GSGSG（SEQ ID NO：153）、GSGGG（SEQ ID NO：154）、GGGSG（SEQ ID NO：155）、GSSSG（SEQ ID NO：156）、GGGGS（SEQ ID NO：157）、GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO：158）などを含むが、それに限定されるわけではないアミノ酸配列を含むことができる。当業者は、本発明における使用に適したリンカー配列を選択することができるであろう。一態様では、本発明の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含み、その際、VHとVLとは、核酸配列

によってコードされうるアミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO：158）を有するリンカー配列により隔てられている。

定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、scFvタンパク質は、本来の免疫グロブリンの特異性を保持する。一本鎖Fvポリペプチド抗体は、Hustonら（Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988）によって記載されるようなVHおよびVLコード配列を含む核酸から発現させることができる。米国特許第5,091,513号、同第5,132,405号および同第4,956,778号；ならびに米国特許出願公開第20050196754号および同第20050196754号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニスト性scFvが、記載されている（例えば、Zhao et al., Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51; Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12; Shieh et al., J Imunol 2009 183(4):2277-85; Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63; Fife eta., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61; Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84; Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40を参照されたい）。刺激活性を有するアゴニスト性scFvが記載されている（例えば、Peter et al., J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7; Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71; Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55; Ho et al., BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66を参照されたい）。

本明細書に用いられる「Fab」は、抗原に結合するが、一価であってFc部分を有しない抗体構造のフラグメントを指し、例えば、酵素パパインによって消化された抗体は、2つのFabフラグメントおよび1つのFcフラグメント（例えば、重（H）鎖定常領域；抗原に結合しないFc領域）をもたらす。

本明細書に用いられる「F(ab')2」は、IgG抗体全体のペプシン消化によって生成される抗体フラグメントを指し、その際、このフラグメントは2つの抗原結合(ab')（二価）領域を有し、各(ab')領域は、抗原との結合のためのH鎖の一部および軽（L）鎖という2つの別々のアミノ酸鎖がS-S結合によって連結されたものを含み、残ったH鎖部分は一緒に連結している。「F(ab')2」フラグメントは、2つの個別のFab'フラグメントに分割することができる。

いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、CARが最終的に使用される種と同じ種に由来する場合がある。例えば、ヒトにおける使用のために、CARの抗原結合ドメインは、ヒト抗体またはそのフラグメントを含む場合がある。いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、CARが最終的に使用されるであろう種と異なる種に由来しうる。例えば、ヒトでの使用のために、CARの抗原結合ドメインは、マウス抗体またはその断片を含みうる。

いくつかの態様では、本開示のCARは、1つまたは複数の標的細胞上の1つまたは複数の標的抗原に対して親和性を有しうる。いくつかの態様では、CARは、標的細胞上の1つまたは複数の標的抗原に対して親和性を有しうる。そのような態様では、CARは、二重特異性CAR、または多重特異性CARである。いくつかの態様では、CARは、1つまたは複数の標的抗原に対する親和性を付与する1つまたは複数の標的特異的結合ドメインを含む。いくつかの態様では、CARは、同じ標的抗原に対する親和性を付与する1つまたは複数の標的特異的結合ドメインを含む。例えば、同じ標的抗原に対する親和性を有する1つまたは複数の標的特異的結合ドメインを含むCARは、標的抗原の別個のエピトープと結合することもできる。複数の標的特異的結合ドメインがCARに存在する場合、これらの結合ドメインは、タンデムに配置される場合があり、リンカーペプチドにより隔てられている場合がある。例えば、2つの標的特異的結合ドメインを含むCARにおいて、結合ドメインは、オリゴペプチドリンカーもしくはポリペプチドリンカー、Fcヒンジ領域、または膜ヒンジ領域を経由して単一のポリペプチド鎖上に相互に共有結合的につながれている。

膜貫通ドメイン
本発明のCARは、CARの抗原結合ドメインをCARの細胞内ドメインと接続する膜貫通ドメインを含み得る。対象のCARの膜貫通ドメインは、細胞（例えば、免疫細胞またはその前駆細胞）の形質膜を貫通することが可能な領域である。膜貫通ドメインは、細胞膜、例えば、真核生物細胞膜内への挿入のためのものである。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、CARの抗原結合ドメインと細胞内ドメインとの間にはさまれている。

いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、CARにおけるドメインの1つまたは複数に自然に関連している。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、このようなドメインと、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を回避するように、選択または1つもしくは複数のアミノ酸置換によって修飾して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。

膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来する場合がある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質、例えば、I型膜貫通タンパク質に由来し得る。供給源が合成である場合、膜貫通ドメインは、細胞膜へのCARの挿入を容易にする任意の人工配列、例えば、人工疎水性配列であり得る。本発明における特定の使用の膜貫通ドメインの例は、非限定的に、T細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134（OX-40）、CD137（4-1BB）、CD154（CD40L）、Toll様受容体1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8およびTLR9に由来する（すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む）膜貫通ドメイン、またはキラー細胞免疫グロブリン様ドメイン（KIR）に由来する膜貫通ドメインを含む。一態様では、膜貫通ドメインはCD8の膜貫通ドメインを含む。一態様では、CD8の膜貫通ドメインは、CD8αの膜貫通ドメインを含む。

いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、合成であり得るが、この場合、それは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含むであろう。好ましくは、合成膜貫通ドメインの各末端で、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの3つ組が見出されるであろう。

本明細書に記載の膜貫通ドメインを、本明細書に記載の抗原結合ドメインのいずれか、本明細書に記載の細胞内ドメインのいずれか、または対象のCARに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わせることができる。

いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、ヒンジ領域をさらに含む。本発明の対象のCARはまた、ヒンジ領域も含み得る。CARのヒンジ領域は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する親水性領域である。いくつかの態様では、このドメインは、CARにふさわしいタンパク質フォールディングを容易にする。ヒンジ領域は、CARの任意の成分である。ヒンジ領域は、抗体のFcフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工的なヒンジ配列またはそれらの組み合わせより選択されるドメインを含み得る。ヒンジ領域の例は、非限定的に、CD8aヒンジ、3つのグリシン（Gly）ほどの小ささであり得るポリペプチドから構成される人工的なヒンジ、ならびにIgG（ヒトIgG4など）のCH1ドメインおよびCH3ドメインを含む。

いくつかの態様では、本開示の対象のCARは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続してこれを次いで細胞内ドメインに接続する、ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、好ましくは、抗原結合ドメインが標的細胞上の標的抗原を認識してこれに結合することを支援することが可能である（例えば、Hudecek et al., Cancer Immunol. Res. (2015） 3(2): 125-135を参照されたい）。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、可動性ドメインであり、その結果、抗原結合ドメインが、腫瘍細胞などの細胞上の標的抗原の特異的な構造および密度を最適に認識する構造を有することが可能となる（Hudecekら、上記）。そのヒンジ領域の可動性は、ヒンジ領域が多くの異なる立体配座をとることを許容する。

いくつかの態様では、ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、受容体に由来するヒンジ領域ポリペプチド（例えば、CD8由来ヒンジ領域）である。

ヒンジ領域は、約4アミノ酸～約50アミノ酸、例えば、約4aa～約10aa、約10aa～約15aa、約15aa～約20aa、約20aa～約25aa、約25aa～約30aa、約30aa～約40aa、または約40aa～約50aaの長さを有することができる。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、5aa超、10aa超、15aa超、20aa超、25aa超、30aa超、35aa超、40aa超、45aa超、50aa超、55aa超、またはそれ以上の長さを有することができる。

適切なヒンジ領域を、容易に選択することができ、いくつかの適切な長さ、例えば、4アミノ酸～10アミノ酸、5アミノ酸～9アミノ酸、6アミノ酸～8アミノ酸、または7アミノ酸～8アミノ酸を含む、1アミノ酸（例えば、Gly）～20アミノ酸、2アミノ酸～15アミノ酸、3アミノ酸～12アミノ酸のいずれかであることができ、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸であることができる。適切なヒンジ領域は、20アミノ酸長（例えば、30個、40個、50個、60個、またはそれ以上のアミノ酸）の長さを有することができる。

例えば、ヒンジ領域は、グリシンポリマー(G)_n、グリシン-セリンポリマー（例えば、(GS)_n、(GSGGS)_n（SEQ ID NO：148)および(GGGS)_n（SEQ ID NO：149）を含み、その際、nは少なくとも1の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当技術分野において公知の他の可動性リンカーを含む。グリシンポリマーおよびグリシン－セリンポリマーを使用することができる；GlyおよびSerの両方は、相対的に構造不定であり、したがって、成分間の中性のつなぎ鎖（tether）として役立つことができる。グリシンポリマーを使用することができる；グリシンは、アラニンより有意に多くφ-ψ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限を受けない（例えば、Scheraga, Rev. Computational. Chem. (1992) 2: 73-142を参照されたい)。例示的なヒンジ領域は、非限定的に

などを含むアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの態様では、ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列は、当技術分野において公知である；例えば、Tan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87(1):162-166；およびHuck et al., Nucleic Acids Res. (1986) 14(4): 1779-1789を参照されたい。非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列：

などのうちの1つを含むことができる。

ヒンジ領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4ヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。一態様では、ヒンジ領域は、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換および／または挿入および／または欠失を含むことができる。例えば、ヒトIgG1ヒンジのHis229は、Tyrにより置換することができ、それによって、ヒンジ領域は、配列EPKSCDKTYTCPPCP（SEQ ID NO：85）を含む；例えば、Yan et al., J. Biol. Chem. (2012) 287: 5891-5897を参照されたい。一態様では、ヒンジ領域は、ヒトCD8に由来するアミノ酸配列またはそのバリアントを含むことができる。

細胞内ドメイン
本発明の対象のCARはまた、細胞内ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。CARの細胞内ドメインは、CARが発現される細胞（例えば、免疫細胞）のエフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担っている。細胞内ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞（例えば、免疫細胞）がその特殊な機能、例えば、標的細胞の損傷および／または破壊を遂行するように指示する。

本発明において使用するための細胞内ドメインの例は、表面受容体の細胞質部分、共刺激分子、およびT細胞においてシグナル伝達を開始するように協力して作用する任意の分子、ならびにこれらのエレメントの任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含むが、それに限定されるわけではない。

細胞内ドメインの例は、非限定的に、T細胞受容体複合体のζ鎖またはそのホモログのいずれか、例えば、η鎖、FcsRIγおよびβ鎖、MB 1（Iga）鎖、B29（Ig）鎖など、ヒトCD3ゼータ鎖、CD3ポリペプチド（Δ、δおよびε）、sykファミリーチロシンキナーゼ（Syk、ZAP 70など）、srcファミリーチロシンキナーゼ（Lck、Fyn、Lynなど）、ならびに、CD2、CD5およびCD28などのT細胞形質導入に関与する他の分子を含む。一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖、FcyRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）保有細胞質受容体、およびそれらの組み合わせであり得る。

ある特定の態様では、CARの細胞内ドメインは、1つまたは複数の共刺激分子の任意の部分、例えば、CD2、CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1からの少なくとも1つのシグナル伝達ドメイン、それらの任意の誘導体またはバリアント、同じ機能的能力を有するそれらの任意の合成配列、およびそれらの任意の組み合わせを含む。細胞内ドメインは、TNFRスーパーファミリー内のタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらのバリアントからなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する細胞内ドメインを含む。ある特定の態様では、細胞内ドメインは、4-1BBの共刺激ドメインを含む。

細胞内ドメインの他の例には、TCR、CD3ゼータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD86、共通FcRガンマ、FcRベータ（FcイプシロンRIb）、CD79a、CD79b、FcガンマRlla、DAP10、DAP12、T細胞受容体（TCR）、CD8、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIRファミリータンパク質、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM（LIGHTR）、SLAMF7、NKp80 （KLRF1）、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CDlib、ITGAX、CD11c、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRT AM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll様受容体1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本明細書に記載される他の共刺激分子、それらの任意の誘導体、バリアント、またはフラグメント、同じ機能的能力を有する共刺激分子の任意の合成配列、およびそれらの任意の組み合わせを含むが、それに限定されるわけではない1つまたは複数の分子または受容体に由来するフラグメントまたはドメインが含まれる。

細胞内ドメインの追加的な例には、非限定的に、CD3、B7ファミリー共刺激受容体および腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリー受容体を含む第1、第2および第3世代のT細胞シグナル伝達タンパク質を非限定的に含む、数種類の様々な他の免疫シグナル伝達受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる（例えば、Park and Brentjens, J. Clin. Oncol. (2015) 33(6): 651-653を参照されたい）。追加的に、細胞内シグナル伝達ドメインは、NK細胞およびNKT細胞によって使用されるシグナル伝達ドメイン（例えば、Hermanson and Kaufman, Front. Immunol. (2015) 6: 195を参照されたい）、例えば、NKp30（B7-H6）（例えば、Zhang et al., J. Immunol. (2012) 189(5): 2290-2299を参照されたい）、およびDAP12（例えば、Topfer et al., J. Immunol. (2015) 194(7): 3201-3212を参照されたい）、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10、およびCD3zのシグナル伝達ドメインを含み得る。

ある特定の態様では、細胞内ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を担持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらのバリアントの細胞質シグナル伝達ドメインからなる群より選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の態様では、細胞内ドメインは、CD3ζの細胞内ドメインを含む。

本発明の対象のCARにおいて使用するために適した細胞内ドメインは、CARの活性化（すなわち、抗原および二量体化剤によって活性化される）に反応して別個のかつ検出可能なシグナル（例えば、細胞による1つまたは複数のサイトカインの産生の増加；標的遺伝子の転写の変化；タンパク質の活性の変化；細胞挙動の変化、例えば、細胞死；細胞増殖；細胞分化；細胞生存；細胞シグナル伝達応答のモジュレーションなど）を提供する任意の所望のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内ドメインは、以下に記載のような少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つなど）のITAMモチーフを含む。いくつかの態様では、細胞内ドメインは、DAP10/CD28型シグナル伝達鎖を含む。いくつかの態様では、細胞内ドメインは、膜結合CARに共有結合することなく、代わりに細胞質中に拡散される。

本発明の対象のCARにおいて使用するために適した細胞内ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、ITAMモチーフは、細胞内ドメイン内で二度反復され、そこで、ITAMモチーフの第1および第2の例は、6～8アミノ酸により互いに隔てられている。一態様では、対象のCARの細胞内ドメインは、3つのITAMモチーフを含む。

いくつかの態様では、細胞内ドメインは、非限定的に、FcガンマRI、FcガンマRIIA、FcガンマRIIC、FcガンマRIIIA、FcRL5などの、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含有するヒト免疫グロブリン受容体のシグナル伝達ドメインを含む（例えば、Gillis et al., Front. Immunol. (2014) 5:254を参照されたい）。

適切な細胞内ドメインは、ITAMモチーフを含有するポリペプチドに由来する、ITAMモチーフ含有部分であることができる。例えば、適切な細胞内ドメインは、任意のITAMモチーフ含有タンパク質由来のITAMモチーフ含有ドメインであることができる。したがって、適切な細胞内ドメインは、それが由来するタンパク質全体の配列全体を含有する必要はない。適切なITAMモチーフ含有ポリペプチドの例は、DAP12、FCER1G（Fcイプシロン受容体Iガンマ鎖）、CD3D（CD3デルタ）、CD3E（CD3イプシロン）、CD3G（CD3ガンマ）、CD3Z（CD3ゼータ）、およびCD79A（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）を含むが、それに限定されるわけではない。

一態様では、細胞内ドメインは、DAP12（TYROBP；TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；KARAP；PLOSL；DNAX活性化タンパク質12；KAR関連タンパク質；TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質などとしても知られている）に由来する。一態様では、細胞内ドメインは、FCER1G（FCRG；Fcイプシロン受容体Iガンマ鎖；Fc受容体ガンマ鎖；fc-イプシロンRI-ガンマ；fcRガンマ；fceRlガンマ；高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ；免疫グロブリンE受容体、高親和性ガンマ鎖などとしても知られている）に由来する。一態様では、細胞内ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3デルタ鎖（CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原、デルタサブユニット；CD3デルタ；CD3d抗原、デルタポリペプチド（TiT3複合体）；OKT3、デルタ鎖；T細胞受容体T3デルタ鎖；T細胞表面糖タンパク質CD3デルタ鎖などとしても知られている）に由来する。一態様では、細胞内ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3イプシロン鎖（CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4イプシロン鎖、T細胞表面糖タンパク質CD3イプシロン鎖、AI504783、CD3、CD3イプシロン、T3eなどとしても知られている）に由来する。一態様では、細胞内ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3ガンマ鎖（CD3G、T細胞受容体T3ガンマ鎖、CD3-GAMMA、T3G、ガンマポリペプチド（TiT3複合体）などとしても知られている）に由来する。一態様では、細胞内ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖（CD3Z、T細胞受容体T3ゼータ鎖、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZなどとしても知られている）に由来する。一態様では、細胞内ドメインは、CD79A（B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖；CD79a抗原（免疫グロブリン関連アルファ）；MB-1膜糖タンパク質；ig-アルファ；膜結合免疫グロブリン関連タンパク質；表面IgM関連タンパク質などとしても知られている）に由来する。一態様では、本開示のFN3 CARにおいて使用するために適した細胞内ドメインは、DAP10/CD28型シグナル伝達鎖を含む。一態様では、本開示のFN3 CARにおいて使用するために適した細胞内ドメインは、ZAP70ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、細胞内ドメインは、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79bまたはCD66dの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一態様では、CAR中の細胞内ドメインは、ヒトCD3ゼータの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。

通常、細胞内ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、必ずしも鎖全体を使用する必要はない。細胞内ドメインの切断型部分が使用される範囲内で、そのような切断型部分は、エフェクター機能シグナルを伝達するかぎり、無傷の鎖の代わりに使用され得る。細胞内ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の切断型部分を含む。

本明細書に記載の細胞内ドメインを、本明細書に記載の抗原結合ドメインのいずれか、本明細書に記載の膜貫通ドメインのいずれか、またはCARに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わせることができる。

（表１）本発明で使用された配列

C. タンデム二重特異性CARおよびパラレル二重特異性CAR
タンデムCAR、タンデムCARを含む細胞（例えばT細胞）、タンデムCARを含むアミノ酸配列、およびタンデムCARをコードする核酸もまた、本明細書において提供される。タンデムCARは、リンカーにより隔てられている2つの抗原結合ドメインを含み、これらのドメインは、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（例えば、4-1BBおよび／またはCD3ζ）と連結される（図17）。一局面では、タンデムCARは、第1の抗原結合ドメイン（例えば第1のscFv）が第2の抗原結合ドメイン（例えば第2のscFv）とリンカーにより隔てられたものに続き、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（例えば、4-1BBおよび／またはCD3ζ）を含む（図17）。第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、2つの異なる抗原と結合することができる。例えば、例示的なタンデムCARは、IL13Rα2と結合することが可能なscFvを含む第1の抗原結合ドメイン、およびEGFRと結合することが可能なscFvを含む第2の抗原結合ドメインを含む。

第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインとを連結するタンデムCAR内のリンカーは、様々なサイズ、例えば、任意の数のアミノ酸長であることができる（図18A～18D）。例えば、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25アミノ酸長であることができる。ある特定の態様では、タンデムCARは、5アミノ酸長であるリンカーを含む。ある特定の態様では、タンデムCARは、SEQ ID NO：163のアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO：164のヌクレオチド配列によってコードされうる。ある特定の態様では、タンデムCARは、10アミノ酸長であるリンカーを含む。ある特定の態様では、タンデムCARは、SEQ ID NO：165のアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO：166のヌクレオチド配列によってコードされうる。ある特定の態様では、タンデムCARは、15アミノ酸長であるリンカーを含む。ある特定の態様では、タンデムCARは、SEQ ID NO：167のアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO：168のヌクレオチド配列によってコードされうる。

パラレルCAR、パラレルCARを含む細胞（例えばT細胞）、パラレルCARを含むアミノ酸配列、およびパラレルCARをコードする核酸もまた、本明細書において提供される。パラレルCARは、切断可能なリンカー（例えば2Aリンカー）によって連結された2つの別々のCARを含む。例えば、例示的なパラレルCARは、第1の膜貫通ドメインおよび第1の細胞内ドメインと連結された第1の抗原結合ドメイン（例えばscFv）と、切断可能なリンカー（例えば2Aリンカー）と、第2の膜貫通ドメインおよび第2の細胞内ドメインと連結された第2の抗原結合ドメイン（例えばscFv）とを含む。核酸が細胞内で発現された場合、リンカー（例えば2Aリンカー）は切断され、2つの別々のCARが細胞表面に発現される。ある特定の態様では、パラレルCARは、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCARおよびEGFRと結合することが可能な第2のCARを含む。ある特定の態様では、パラレルCARは、SEQ ID NO：171のアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO：172のヌクレオチド配列によってコードされうる。

D. BiTE、BiTE/BiTE、およびBiTE/CARの組み合わせ
二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）およびBiTE/CAR組み合わせが、本明細書において提供される。BiTEは、第1の抗原結合ドメイン（例えば、第1のscFv）および第2の抗原結合ドメイン（例えば、第2のscFv）を含み、その際、第1のscFvは、標的細胞（例えば腫瘍細胞）上の抗原と結合することが可能であり、第2のscFvは、活性化T細胞上の抗原（例えば、CD3、CD4、CD8、またはTCR）と結合することが可能である。

一局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能なBiTEを含む。一局面では、本発明は、CD3およびIL13Rα2と結合することが可能なBiTEを含む。ある特定の態様では、BiTEは、IL13Rα2と結合することが可能な、本明細書に開示される抗原結合ドメインのいずれかを含む。ある特定の態様では、BiTEは、SEQ ID NO：1～22のいずれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む。

一局面では、本発明は、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォーム（例えば、野生型EGFR（wtEGFR）またはEGFRバリアントIII（EGFRvIII））と結合することが可能なBiTEを含む。一局面では、本発明は、CD3およびEGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能なBiTEを含む。ある特定の態様では、BiTEは、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な、本明細書に開示される抗原結合ドメインのいずれかを含む。ある特定の態様では、BiTEは、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

ある特定の態様では、BiTEは誘導性である（例えば、誘導性プロモーターを含む／それによって駆動される）。

第1のCARおよび第2のCAR（CAR/CAR、例えば図30Aを参照されたい）、BiTEおよびCAR（BiTE/CAR、例えば図30B～30Cを参照されたい）、または第1のBiTEおよび第2のBiTE（BiTE/BiTE、例えば図30Dを参照されたい）を含む二重特異性構築物もまた、本明細書に提供される。

CAR/CARは、本明細書に開示されるCARのいずれかの任意の組み合わせを含むことができる。ある特定の態様では、CAR/CARは、SEQ ID NO：174と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされうる、SEQ ID NO：173と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

BiTE/CARは、本明細書に開示されるBiTEのいずれか、本明細書に開示されるCARのいずれか、およびそれらの任意の組み合わせを含むことができる。ある特定の態様では、BiTE/CARは、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能なBiTE、およびIL13Rα2と結合することが可能なCARを含む。ある特定の態様では、BiTE/CARは、SEQ ID NO：176と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされうる、SEQ ID NO：175と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、BiTE/CARは、IL13Rα2と結合することが可能なBiTE、およびEGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能なCARを含む。ある特定の態様では、BiTE/CARは、SEQ ID NO：178と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされうる、SEQ ID NO：177と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

BiTE/BiTEは、本明細書に開示されるBiTEのいずれかをそれらの任意の組み合わせで含むことができる。ある特定の態様では、BiTE/BiTEは、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な第1のBiTE、およびIL13Rα2と結合することが可能な第2のBiTEを含む。ある特定の態様では、BiTE/BiTEは、SEQ ID NO：180と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされうる、SEQ ID NO：179と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

E. 核酸および発現ベクター
本開示は、CARをコードする核酸を提供する。本開示の核酸は、本明細書に開示されるCAR、BiTE、BiTE/CAR、またはBiTE/BiTEのいずれか1つをコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。

一態様では、本開示の核酸は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含み、その際、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列G VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域を含む。

一態様では、核酸は、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含むCARをコードする。

一態様では、核酸は、SEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含むCARをコードする。

一態様では、核酸は、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域および／またはSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含むCARをコードする。

一態様では、核酸は、抗原結合ドメインがSEQ ID NO：133または138と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）であるCARをコードする。

抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供され、その際、抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。

一態様では、核酸は、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含むCARをコードする。

一態様では、核酸は、SEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含むCARをコードする。

一態様では、核酸は、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含むCARをコードする。

一態様では、核酸は、抗原結合ドメインがSEQ ID NO：134または135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）であるCARをコードする。

別の局面では、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、その際、抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

IL13Rα2と結合することが可能な第1のCARをコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のCARをコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供され、その際、第1のCARおよび第2のCARは、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを各々含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）またはGVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および／またはSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および／またはSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第1のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：138またはSEQ ID NO：133またはSEQ ID NO：134またはSEQ ID NO：135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である。

ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGINLDD（SEQ ID NO：143）またはHGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／またはSEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：144と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／またはSEQ ID NO：146と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：145と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／またはSEQ ID NO：147と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：42と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／またはSEQ ID NO：43と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：33またはSEQ ID NO：141またはSEQ ID NO：41と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である。ある特定の態様では、第2のCARの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO：34またはSEQ ID NO：142またはSEQ ID NO：44と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）である。

ある特定の態様では、第2のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：35またはSEQ ID NO：37またはSEQ ID NO：196と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む。ある特定の態様では、第2のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：36またはSEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：197と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列をコードする。

IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供され、その際、第1のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および、3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含み；第2のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGINLDD（SEQ ID NO：143）またはHGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域を含む。

IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供され、その際、第1のCARは、SEQ ID NO：57、または67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61、または71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：139、または194と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、およびSEQ ID NO：140、または195と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。

IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供され、その際、第1のCARは、SEQ ID NO：138、133、134、または135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：33または141と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）を含む。

IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供され、その際、第1のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：65または66または75または76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含み；第2のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：35または196と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む。

本発明はまた、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCARをコードする第1のポリヌクレオチド配列、および免疫チェックポイント阻害剤をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。ある特定の態様では、免疫チェックポイントは、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は抗CTLA-4抗体である。

IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む核酸もまた、提供される。ある特定の態様では、第2のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：53または54をコードする配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む。ある特定の態様では、BiTEは、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である。ある特定の態様では、BiTEは、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である。

いくつかの態様では、本開示の核酸は、例えば哺乳動物細胞における、本明細書において記載されるCARの産生のために提供される。いくつかの態様では、本開示の核酸は、CARをコードする核酸の増幅を提供する。

いくつかの態様では、本開示の核酸は、第1のポリヌクレオチド配列および第2のポリヌクレオチド配列を含む。第1のポリヌクレオチド配列と第2のポリヌクレオチド配列とは、リンカーにより隔てられている場合がある。本開示に使用するためのリンカーは、複数のタンパク質が同じ核酸配列（例えば、多シストロン性配列または2シストロン性配列）によってコードされることを可能にし、それらは、解離して別々のタンパク質成分になるポリタンパク質として翻訳される。例えば、IL13Rα2 CARのコード配列およびEGFR CARのコード配列を含む、本開示の核酸に使用するためのリンカーは、IL13Rα2CARおよびEGFR CARが、解離して別々のCARになるポリタンパク質として翻訳されることを可能にする。ある特定の態様では、核酸は、5'から3'の方向へ、第1のポリヌクレオチド配列と、リンカーと、第2のポリヌクレオチド配列とを含む。ある特定の態様では、核酸は、5'から3'の方向へ、第2のポリヌクレオチド配列と、リンカーと、第1のポリヌクレオチド配列とを含む。

いくつかの態様では、リンカーは、配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする核酸配列を含む。本明細書に用いられる「配列内リボソーム進入部位」または「IRES」は、タンパク質コード領域のATGなどの開始コドンへの直接の配列内リボソーム進入を促進するエレメントであって、それにより、遺伝子のcap非依存的翻訳をもたらすエレメントを指す。非限定的に、ウイルスまたは細胞mRNA供給源から入手可能なIRES、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（BiP）；血管内皮増殖因子（VEGF）；線維芽細胞増殖因子2；インスリン様増殖因子；翻訳開始因子eIF4G；酵母転写因子TFIIDおよびHAP4；ならびに例えば、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、HCV、フレンドマウス白血病ウイルス（FrMLV）、およびモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）から入手可能なIRESを含む、様々な配列内リボソーム進入部位が、当業者に公知である。当業者は、本発明において使用するために適したIRESを選択することが可能であろう。

いくつかの態様では、リンカーは、自己切断型ペプチドをコードする核酸配列を含む。本明細書に用いられる「自己切断型ペプチド」または「2Aペプチド」は、翻訳されると成分タンパク質に解離するポリタンパク質として複数のタンパク質をコードできるようにするオリゴペプチドを指す。「自己切断型」という用語の使用は、タンパク質分解切断反応を意味することが意図されない。ピコルナウイルス科（Picornaviridae）ウイルスファミリーのメンバー、例えば、口蹄疫ウイルス（FMDV）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV0、ゾセアアシグナウイルス（TaV）、およびブタテッショウウイルス-1（PTV-1）；ならびにタイロウイルスおよび脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルスに見出されるものを非限定的に含む様々な自己切断型ペプチドまたは2Aペプチドが、当業者に公知である。FMDV、ERAV、PTV-1、およびTaVに由来する2Aペプチドは、本明細書においてそれぞれ「F2A」、「E2A」、「P2A」、および「T2A」と称される。当業者は、本発明において使用するために適した自己切断型ペプチドを選択することが可能であろう。

いくつかの態様では、リンカーは、フューリン切断部位をコードする核酸配列をさらに含む。フューリンは、トランスゴルジ中に存在し、かつタンパク質前駆体をそれらの分泌の前にプロセシングする、遍在的に発現されるプロテアーゼである。フューリンは、そのコンセンサス認識配列のCOOH-末端で切断する。非限定的に、Arg-Gln-Lys-Arg（SEQ ID NO：121）などの、Arg-X-Lys-Arg（SEQ ID NO：117）またはArg-X-Arg-Arg（SEQ ID NO：118）、X2-Arg-X1-X3-Arg（SEQ ID NO：119）およびArg-X1-X1-Arg（SEQ ID NO：120）（配列中、X1は、任意の天然アミノ酸であり、X2はLysまたはArgであり、X3はLysまたはArgである）を含む、様々なフューリンコンセンサス認識配列（または「フューリン切断部位」）が、当業者に公知である。当業者は、本発明において使用するために適したフューリン切断部位を選択することが可能であろう。

いくつかの態様では、リンカーは、フューリン切断部位と2Aペプチドとの組み合わせをコードする核酸配列を含む。例には、フューリンおよびF2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリンおよびE2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリンおよびP2Aをコードする核酸配列を含むリンカー、フューリンおよびT2Aをコードする核酸配列を含むリンカーが含まれるが、それに限定されるわけではない。当業者は、本発明において使用するために適した組み合わせを選択することが可能であろう。そのような態様では、リンカーは、フューリンと2Aペプチドとの間にスペーサー配列をさらに含み得る。非限定的に、(GS)n、(GSGGS)n（SEQ ID NO：148）および(GGGS)n（SEQ ID NO：149）（配列中、nは少なくとも1の整数を表す）などのグリシンセリン（GS）スペーサーを含む、様々なスペーサー配列が当技術分野において公知である。例示的なスペーサー配列は、非限定的に、

などを含むアミノ酸配列を含むことができる。当業者は、本発明において使用するために適したスペーサー配列を選択することが可能であろう。

いくつかの態様では、本開示の核酸は、転写制御エレメント、例えば、プロモーター、およびエンハンサーなどに機能的に連結される場合がある。適切なプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、当業者に公知である。

いくつかの態様では、外部CARをコードする核酸は、プロモーターに機能的に連結した状態にある。いくつかの態様では、プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1（PGK）プロモーターである。

細菌細胞における発現に適したプロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPおよびtrcが含まれるが、それに限定されるわけではない。真核細胞における発現に適したプロモーターには、軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーターおよびエンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期および後期SV40プロモーター；レトロウイルス由来の長鎖末端反復配列に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン-Iプロモーター；ならびに当技術分野において公知の様々な組織特異的プロモーターが含まれるが、それに限定されるわけではない。可逆誘導性プロモーターを含む、適切な可逆プロモーターは、当技術分野において公知である。そのような可逆プロモーターは、多数の生物、例えば、真核生物および原核生物から単離され、それに由来する場合がある。第2の生物における使用のために第1の生物に由来する可逆プロモーターの改変（例えば、第1の原核生物および第2の真核生物、第1の真核生物および第2の原核生物など）は、当技術分野において周知である。そのような可逆プロモーター、およびそのような可逆プロモーターに基づくが、追加的な制御タンパク質も含むシステムには、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼI（alcA）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質（A1cR）応答プロモーターなど）、テトラサイクリン調節プロモーター、（例えば、TetActivator、TetON、TetOFFなどを含むプロモーターシステム）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステムなど）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターシステムなど）、病原性関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節プロモーターなど）、温度調節プロモーター（例えば、熱ショック誘導プロモーター（例えば、HSP-70、HSP-90、ダイズ熱ショックプロモーターなど）、光調節プロモーター、合成誘導プロモーターなどが含まれるが、それに限定されるわけではない。

いくつかの態様では、プロモーターは、CD8細胞特異的プロモーター、CD4細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、またはNK特異的プロモーターである。例えば、CD4遺伝子プロモーターを使用することができる；例えば、Salmon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90：7739；およびMarodon et al. (2003) Blood 101:3416を参照されたい。別の例として、CD8遺伝子プロモーターを使用することができる。NK細胞特異的発現は、NcrI（p46）プロモーターの使用により達成することができる；例えば、Eckelhart et al. Blood (2011) 117:1565を参照されたい。

酵母細胞における発現に適したプロモーターは、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1プロモーターなどのような構成的プロモーター；またはGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PHOSプロモーター、CUP1プロモーター、GALTプロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモーター、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、LEU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーター、およびAOX1（例えば、ピキア（Pichia）における使用のため）のような調節可能なプロモーターである。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。原核生物宿主細胞における使用に適したプロモーターには、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター；trpプロモーター；lacオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えば、lac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター；trcプロモーター；tacプロモーターなど；araBADプロモーター；ssaGプロモーターなどのインビボ調節プロモーターまたは関連プロモーター（例えば、米国特許出願公開第20040131637号を参照されたい）、pagCプロモーター(Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1): 86-93；Alpuche-Aranda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89(21): 10079-83）、nirBプロモーター(Harborne et al. Mol. Micro. (1992) 6:2805-2813）など(例えば, Dunstan et al., Infect. Immun. (1999) 67:5133-5141；McKelvie et al., Vaccine (2004) 22:3243-3255；およびChatfield et al., Biotechnol. (1992) 10:888-892を参照されたい）；sigma70プロモーター、例えば、コンセンサスsigma70プロモーター（例えば、GenBankアクセッション番号AX798980、AX798961、およびAX798183を参照されたい）；静止期プロモーター、例えば、dpsプロモーター、spvプロモーターなど；病原性アイランドSPI-2に由来するプロモーター（例えば、WO96/17951を参照されたい）；actAプロモーター（例えば、Shetron-Rama et al., Infect. Immun. (2002) 70:1087-1096を参照されたい）；rpsMプロモーター（例えば, Valdivia and Falkow Mol. Microbiol. (1996). 22:367を参照されたい）；tetプロモーター（例えば、Hillen, W. and Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein--Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162を参照されたい）；SP6プロモーター（例えば, Melton et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12:7035を参照されたい）などが含まれるが、それに限定されるわけではない。大腸菌（Escherichia coli）などの原核生物における使用に適した強力なプロモーターには、Trc、Tac、T5、T7、およびPラムダが含まれるが、それに限定されるわけではない。細菌宿主細胞における使用のためのオペレーターの非限定的な例には、ラクトースプロモーターオペレーター（LacIリプレッサータンパク質は、ラクトースと接触した場合に立体配座を変化させ、それにより、Ladリプレッサータンパク質がオペレーターに結合するのを阻止する）、トリプトファンプロモーターオペレーター（トリプトファンと複合体化した場合、TrpRリプレッサータンパク質は、オペレーターと結合する立体配座を有し；トリプトファンの非存在下で、TrpRリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体配座を有する）、およびtacプロモーターオペレーターが含まれる（例えば、deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25を参照されたい）。

適切なプロモーターの他の例には、前初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列が含まれる。このプロモーター配列は、それに機能的に連結される任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を推進することが可能な、強力な構成的プロモーター配列である。サルウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（MMTV）またはヒト免疫不全ウイルス（HIV）長鎖末端反復配列（LTR）プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、EF-1アルファプロモーター、ならびに非限定的にアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含むが、それに限定されるわけではない他の構成的プロモーター配列も使用される場合がある。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導プロモーターもまた、本発明の一部として企図されている。誘導プロモーターの使用は、それが機能的に連結されるポリヌクレオチド配列の発現が望ましい場合に、そのような発現をオンにすること、または発現が望ましくない場合に発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導プロモーターの例には、メタロチオニン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、それに限定されるわけではない。ある特定の態様では、本発明は、誘導性プロモーターを含む、CAR（例えば、二重特異性CAR、BiTE、タンデムCAR、パラレルCAR、およびその他）をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある特定の態様では、誘導性プロモーターは、T細胞活性化後に機能的に連結された配列（例えばCAR）の発現を促進する。設計されたRNAまたはアミノ酸を発現するように、T細胞（例えばCAR T細胞）をこのプロモーターで改変することができる。ある特定の態様では、誘導性プロモーターは、SEQ ID NO：161と85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、誘導性プロモーターは、SEQ ID NO：198と85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、SEQ ID NO：198を含む配列は、T細胞の発現レベルを増強するように反復される。例えば、ある特定の態様では、誘導性プロモーターは、SEQ ID NO：162と85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。

いくつかの態様では、適切なプロモーターを含有する遺伝子座または構築物または導入遺伝子は、誘導システムの誘導を経由して不可逆的にスイッチされる。不可逆スイッチの誘導に適したシステムは、当技術分野において周知であり、例えば、不可逆スイッチの誘導は、Cre-lox媒介組み換えを利用する場合がある（例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Fuhrmann-Benzakein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 28:e99を参照されたい）。当技術分野において公知であるリコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組み換え部位などの任意の適切な組み合わせが、不可逆的にスイッチ可能なプロモーターを生成するために使用される場合がある。本明細書の他の箇所に記載される部位特異的組み換えを行うための方法、メカニズム、および要件が、不可逆的にスイッチされたプロモーターの生成に用いられ、当技術分野において周知である。例えば、その開示が、参照により本明細書に組み入れられる、Grindley et al. Annual Review of Biochemistry (2006) 567-605；およびTropp, Molecular Biology (2012) (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, Mass.）を参照されたい。

いくつかの態様では、本開示の核酸は、CAR誘導発現カセットをコードする核酸配列をさらに含む。一態様では、CAR誘導発現カセットは、CARシグナル伝達の際に放出されるトランスジェニックポリペプチド産物の産生のためである。例えば、Chmielewski and Abken, Expert Opin. Biol. Ther. (2015) 15(8): 1145-1154；およびAbken, Immunotherapy (2015) 7(5): 535-544を参照されたい。いくつかの態様では、本開示の核酸は、T細胞活性化応答プロモーターに機能的に連結されるサイトカインをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの態様では、T細胞活性化応答プロモーターに機能的に連結されるサイトカインは、別々の核酸配列上に存在する。一態様では、サイトカインはIL-12である。

本開示の核酸は、発現ベクターおよび／またはクローニングベクター内に存在し得る。発現ベクターは、選択マーカー、複製起点、ならびにベクターの複製および／または維持を提供する他の特徴を含むことができる。適切な発現ベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが含まれる。多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり；対象の組み換え構築物を生成するために多くが市販されている。以下のベクターが例として提供されるが、これらは、いかようにも限定として解釈されるべきではない：細菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene, La Jolla, Calif., USA）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、およびpRIT5（Pharmacia, Uppsala, Sweden）。原核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmacia）。

発現ベクターは、一般的に、プロモーター配列近くに位置する好都合な制限部位を有して、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現宿主において作動する選択マーカーが存在する場合がある。適切な発現ベクターには、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2543-2549；Borras et al., Gene Ther. (1999) 6: 515-524；Li and Davidson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7700-7704；Sakamoto et al., H. Gene Ther. (1999) 5: 1088-1097；国際公開公報第94/12649号、同第93/03769号；同第93/19191号；同第94/28938号；同第95/11984号および同第95/00655号を参照されたい）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum. Gene Ther. (1998) 9: 81-86, Flannery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 6916-6921；Bennett et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1997) 38: 2857-2863；Jomary et al., Gene Ther. (1997) 4:683 690, Rolling et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10: 641-648；Ali et al., Hum. Mol. Genet. (1996) 5: 591-594；国際公開公報第93/09239号におけるSrivastava、Samulski et al., J. Vir. (1989) 63: 3822-3828；Mendelson et al., Virol. (1988) 166: 154-165；およびFlotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 10613-10617を参照されたい）；SV40；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 10319-23；Takahashi et al., J. Virol. (1999) 73: 7812-7816を参照されたい）に基づくウイルスベクター；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）などが含まれるが、それに限定されるわけではない。

使用に適した追加的な発現ベクターは、例えば、非限定的に、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、操作ハイブリッドウイルスベクター、トランスポゾン媒介ベクターなどである。ウイルスベクター技法は、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY）ならびに他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、それに限定されるわけではない。

一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能性の複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択マーカーを含有する（例えば、国際公開公報第01/96584号；同第01/29058号；および米国特許第6,326,193号）。

いくつかの態様では、免疫細胞またはその前駆細胞（例えば、T細胞）中にCARを導入するために、発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）が使用される場合がある。したがって、本発明の発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、CARをコードする核酸を含む場合がある。いくつかの態様では、発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、その中にコードされるCARの機能的発現を助ける追加的なエレメントを含むであろう。いくつかの態様では、CARをコードする核酸を含む発現ベクターは、哺乳動物プロモーターをさらに含む。一態様では、ベクターは、伸長因子-1-アルファプロモーター（EF-1αプロモーター）をさらに含む。EF-1αプロモーターの使用は、下流の導入遺伝子（例えば、CARをコードする核酸配列）の発現における効率を上げる場合がある。生理的プロモーター（例えば、EF-1αプロモーター）は、組み込み媒介遺伝毒性を誘導する可能性が低い場合があり、レトロウイルスベクターが幹細胞を形質転換する能力を打ち消す場合がある。ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）における使用に適した他の生理的プロモーターは、当業者に公知であり、本発明のベクターに組み込まれる場合がある。いくつかの態様では、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、力価および遺伝子発現を改善する場合がある、必須ではないシス作用配列をさらに含む。必須ではないシス作用配列の非限定的な一例は、効率的な逆転写および核内輸送に重要なセントラルポリプリントラクトおよびセントラルターミネーション配列（cPPT/CTS）である。他の必須ではないシス作用配列は、当業者に公知であり、本発明のベクター（例えば、レンチウイルスベクター）に組み込まれる場合がある。いくつかの態様では、ベクターは、転写後調節エレメントをさらに含む。転写後調節エレメントは、RNAの翻訳を改善し、導入遺伝子の発現を改善し、RNA転写物を安定化する場合がある。転写後調節エレメントの一例は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）である。したがって、いくつかの態様では、本発明のためのベクターは、WPRE配列をさらに含む。様々な転写後調節因子エレメントは、当業者に公知であり、本発明のベクター（例えば、レンチウイルスベクター）に組み込まれる場合がある。本発明のベクターは、RNAの輸送のためのrev応答エレメント（RRE）、パッケージング配列、ならびに5'および3'長鎖末端反復配列（LTR）などの追加的なエレメントをさらに含む場合がある。「長鎖末端反復配列」または「LTR」という用語は、U3、RおよびU5領域を含むレトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインを指す。LTRは、一般的にレトロウイルス遺伝子の発現（例えば、プロモーション、イニシエーションおよび遺伝子転写物のポリアデニル化）およびウイルス複製に必要な機能を提供する。一態様では、本発明のベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、3' U3欠失LTRを含む。したがって、本発明のベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、本明細書に記載されるエレメントの任意の組み合わせを含んで、導入遺伝子の機能的発現の効率を高める場合がある。例えば、本発明のベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、CARをコードする核酸に加えてWPRE配列、cPPT配列、RRE配列、5'LTR、3' U3欠失LTR'を含む場合がある。

本発明のベクターは、自己不活化ベクターであり得る。本明細書に用いられる「自己不活化ベクター」という用語は、3' LTRエンハンサープロモーター領域（U3領域）が改変されている（例えば、欠失または置換により）、ベクターを指す。自己不活化ベクターは、ウイルス複製の第1ラウンドを超えたウイルス転写を防止し得る。結果として、自己不活化ベクターは、感染して、次いで宿主ゲノム（例えば、哺乳動物ゲノム）中に1回だけ組み込まれることができ得るが、さらに継代され得ない。したがって、自己不活化ベクターは、複製適格ウイルスを生み出すリスクを大きく低減し得る。

いくつかの態様では、本発明の核酸は、RNA、例えば、インビトロ合成されたRNAであり得る。RNAのインビトロ合成のための方法は、当業者に公知であり；任意の公知の方法を使用して、本開示のCARをコードする配列を含むRNAを合成することができる。宿主細胞内にRNAを導入するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Zhao et al. Cancer Res. (2010) 15: 9053を参照されたい。本開示のCARをコードするヌクレオチド配列を含むRNAを宿主細胞中に導入することは、インビトロまたはエクスビボまたはインビボで実施することができる。例えば、宿主細胞（例えば、NK細胞、細胞傷害性Tリンパ球など）に、本開示のCARをコードするヌクレオチド配列を含むRNAをインビトロまたはエクスビボでエレクトロポレーションすることができる。

ポリペプチドまたはその部分の発現を評価するために、細胞内に導入されるべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターによりトランスフェクションまたは感染させようとする細胞集団から発現している細胞の特定および選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の一方または両方を含有する場合がある。いくつかの態様では、選択マーカーは、別々のDNA片上に保有され、共トランスフェクション手順に使用される場合がある。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にするために適切な調節配列に隣接する場合がある。有用な選択マーカーには抗生物質耐性遺伝子が含まれるが、それに限定されるわけではない。

トランスフェクションされた可能性のある細胞を特定するためおよび調節配列の機能性を評価するために、レポーター遺伝子が使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織中に存在することもそれによって発現されることもない遺伝子であって、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によってその発現が明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞内に導入された後の適切な時間に評価される。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれる場合があるが、それに限定されるわけではない（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。

F. 改変免疫細胞
本発明は、IL13Rα2（例えば、ヒトIL13Rα2またはイヌIL13Rα2）と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞（例えばT細胞）を提供する。BiTE、BiTE/BiTE、またはBiTE/CARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞もまた、提供される。本発明はまた、本明細書に開示される核酸のいずれかまたは本明細書に開示されるベクターのいずれかを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を含む。

本発明の一局面は、IL13Rα2と結合することが可能なCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を提供し、その際、CARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域を含む。HCDR1は、アミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2は、アミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3は、アミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む。CARはまた、3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域を含む。LCDR1は、アミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2は、アミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3は、アミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む。

本発明の別の局面は、IL13Rα2と結合することが可能なCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を含み、その際、CARは、SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

IL13Rα2と結合することが可能なCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞もまた提供され、その際、CARは、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む。

本発明の別の局面は、IL13Rα2と結合することが可能な第1の抗原結合ドメインを含む第1のキメラ抗原受容体（CAR）；および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2の抗原結合ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を含む。

本発明のさらに別の局面は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCAR、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を含み、その際、第1のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域を含む。HCDR1は、アミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2は、アミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3は、アミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む。第1のCARはまた、3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域を含む。LCDR1は、アミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2は、アミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3は、アミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む。第2のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域を含む。HCDR1は、アミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2は、アミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3は、アミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む。第2のCARはまた、3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域を含む。LCDR1は、アミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2は、アミノ酸配列HGINLDD（SEQ ID NO：143）またはHGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3は、アミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む。

本発明のなお別の局面は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCAR、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のCARを含む改変免疫細胞またはその前駆細胞を含み、その際、第1のCARは、SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびSEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。第2のCARは、SEQ ID NO：31またはSEQ ID NO：42またはSEQ ID NO：144またはSEQ ID NO：145と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびSEQ ID NO：32またはSEQ ID NO：43またはSEQ ID NO：146またはSEQ ID NO：147と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞もまた提供され、その際、第1のCARは、SEQ ID NO：10またはSEQ ID NO：11またはSEQ ID NO：21またはSEQ ID NO：22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：34またはSEQ ID NO：44と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む。

ある特定の態様では、第2のCARは、野生型EGFR（wtEGFR）、変異型EGFR、EGFR^A289V、EGFR^A289D、EGFR^A289T、EGFR^A289T、EGFR^R108K、EGFR^R108G、EGFR^G598V、EGFR^D126Y、EGFR^C628F、EGFR^R108K/A289V、EGFR^R108K/D126Y、EGFR^A289V/G598V、EGFR^A289V/C628F、およびEGFRバリアントIIからなる群より選択されるEGFRアイソフォーム、またはそれらの任意の組み合わせと結合することが可能である。

改変細胞は、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含むことができ、その際、改変細胞は、免疫チェックポイント阻害剤を分泌する。免疫チェックポイントは、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3を含むが、それに限定されるわけではない。免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体を含むが、それに限定されるわけではない。

改変細胞は、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）をさらに含むことができる。改変細胞は、BiTEを分泌する。ある特定の態様では、誘導性BiTEは、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、BiTEは、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である。ある特定の態様では、BiTEは、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である。

G. 免疫細胞の供給源
いくつかの態様では、エクスビボ操作のために免疫細胞（例えば、T細胞）の供給源が対象から得られる。エクスビボ操作のための標的細胞の供給源はまた、例えば、自己または異種のドナー血、臍帯血、または骨髄も含む場合がある。例えば、免疫細胞の供給源は、本発明の改変された免疫細胞により処置されるべき対象に由来する場合があり、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄であり得る。対象の非限定的な例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。好ましくは、対象はヒトである。

免疫細胞は、血液、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、リンパ液、またはリンパ器官を含むいくつかの供給源から得ることができる。免疫細胞は、免疫系の細胞、例えば自然免疫または適応免疫の細胞、例えば、リンパ球、典型的にはT細胞および／またはNK細胞を含む骨髄系細胞またはリンパ球系細胞である。他の例示的な細胞には、人工多能性幹細胞（iPSC）を含む、複能性および多能性幹細胞などの幹細胞が含まれる。いくつかの局面では、細胞はヒト細胞である。処置されるべき対象に関して、細胞は、同種および／または自己であり得る。細胞は、典型的には、初代細胞、例えば、対象から直接単離され、かつ／または対象から単離され凍結された初代細胞である。

ある特定の態様では、免疫細胞は、T細胞、例えば、CD8+ T細胞（例えば、CD8+ ナイーブT細胞、中枢性メモリーT細胞、またはエフェクターメモリーT細胞）、CD4+ T細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、制御性T細胞（Treg）、幹細胞メモリーT細胞、リンパ球系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）または樹状細胞である。いくつかの態様では、細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄系細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、および／または好塩基球である。ある態様では、標的細胞は、人工多能性幹（iPS）細胞またはiPS細胞に由来する細胞、例えば、対象から生成され、1つまたは複数の標的遺伝子の発現を変化させる（例えばそれに変異を誘導する）または操作するように操作され、例えば、T細胞、例えば、CD8+ T細胞（例えば、CD8+ ナイーブT細胞、中枢性メモリーT細胞、またはエフェクターメモリーT細胞）、CD4+ T細胞、幹細胞メモリーT細胞、リンパ球系前駆細胞または造血幹細胞に分化したiPS細胞である。

いくつかの態様では、細胞は、T細胞または他の細胞型の1つまたは複数のサブセット、例えばT細胞集団全体、CD4+細胞、CD8+細胞、およびその部分集団、例えば機能、活性化状態、成熟、分化能、増大、再循環、局在、および／もしくは持続能、抗原特異性、抗原受容体の種類、特定の器官もしくは区画における存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル、および／または分化の度合いにより定義されるものを含む。T細胞ならびに／またはCD4+および／もしくはCD8+ T細胞のサブタイプおよび部分集団は中でも、ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞およびそれらのサブタイプ、例えば幹細胞メモリーT（TSCM）、中枢性メモリーT（TCM）、エフェクターメモリーT（TEM）、または最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、自然および適応制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、アルファ／ベータT細胞、およびデルタ／ガンマT細胞である。ある特定の態様では、当技術分野において入手可能ないくつものT細胞系が、使用される場合がある。

いくつかの態様では、方法は、対象から免疫細胞を単離する段階、それらを調製、処理、培養、および／または操作する段階を含む。いくつかの態様では、操作された細胞の調製は、1つまたは複数の培養および／または調製段階を含む。記載のように操作するための細胞は、生物学的試料などの試料、例えば対象から得られたまたは対象に由来する試料から単離される場合がある。いくつかの態様では、細胞が単離される対象は、疾患もしくは状態を有する対象、または細胞療法を必要とする、もしくは細胞療法が投与されるであろう対象である。対象は、いくつかの態様では、そのために細胞が単離、処理、および／または操作される、養子細胞療法などの特定の治療的介入の必要のあるヒトである。したがって、細胞は、いくつかの態様では、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料には、対象から直接採取された組織、液体、および他の試料、ならびに分離、遠心分離、遺伝子操作（例えばウイルスベクターによる形質導入）、洗浄、および／またはインキュベーションなどの1つまたは複数の処理段階の結果として生じる試料が含まれる。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られる試料または処理された試料であることができる。生物学的試料には、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液、組織、ならびに器官試料が、それらに由来する処理された試料を含めて含まれるが、それに限定されるわけではない。

いくつかの局面では、細胞が由来または単離される試料は、血液もしくは血液由来試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物である、もしくはそれに由来する。例示的な試料には、全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸、精巣、卵巣、扁桃、もしくは他の器官、および／またはそれらに由来する細胞が含まれる。試料は、細胞療法、例えば、養子細胞療法に関連して、自己および同種供給源からの試料を含む。

いくつかの態様では、細胞は、細胞株、例えば、T細胞株に由来する。細胞は、いくつかの態様では、異種供給源から、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタから得られる。いくつかの態様では、細胞の単離は、1つまたは複数の調製段階および／または親和性に基づかない細胞分離段階を含む。いくつかの例では、細胞が、洗浄、遠心分離、および／または1つもしくは複数の試薬の存在下でインキュベートされて、例えば、望まれない成分が除去され、所望の成分が濃縮され、特定の試薬に感受性の細胞が溶解または除去される。いくつかの例では、細胞は、密度、接着特性、サイズ、特定の成分に対する感受性および/または耐性などの1つまたは複数の特性に基づき分離される。

いくつかの例では、対象の循環血からの細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスにより得られる。試料は、いくつかの局面では、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および／または血小板を含有し、いくつかの局面では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。いくつかの態様では、対象から収集された血液細胞は、洗浄されて、例えば、血漿画分を除去し、その後の処理段階に適した緩衝液または媒質中に細胞を入れる。いくつかの態様では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄される。いくつかの局面では、洗浄段階は、タンジェント流濾過（TFF）により、製造業者の説明に従って成し遂げられる。いくつかの態様では、細胞は洗浄後に多様な生体適合性緩衝液中に再懸濁される。ある特定の態様では、血液細胞試料の成分が除去され、細胞が培地中に直接再懸濁される。いくつかの態様では、方法は、赤血球を溶解し、PercollまたはFicoll勾配による遠心分離を行うことによる末梢血からの白血球の調製などの、密度に基づく細胞分離方法を含む。

一態様では、免疫は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られた個体の循環血から得られた細胞である。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有する。血漿画分を除去するため、および適切な緩衝液もしくは媒質、例えばリン酸緩衝食塩水（PBS）中に細胞を入れるために、アフェレーシスによって収集された細胞が洗浄される場合があり、または洗浄溶液は、その後の処理段階のためにカルシウムを欠如し、かつマグネシウムを欠如する場合があり、もしくはすべてとはいわないまでも多くの二価陽イオンを欠如する場合がある。洗浄後、細胞は、多様な生体適合性緩衝液、例えば、Ca不含、Mg不含PBSなどの中に再懸濁される場合がある。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分が、除去され、細胞が培地中に直接再懸濁される場合がある。

いくつかの態様では、単離方法は、1種または複数種の特異的分子、例えば表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸の細胞中の発現または存在に基づく、異なる細胞型の分離を含む。いくつかの態様では、そのようなマーカーに基づく分離のために、任意の公知の方法が使用される場合がある。いくつかの態様では、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、分離は、いくつかの局面では、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーと一緒のインキュベーション、一般的にそれに続く洗浄段階、および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーと結合した細胞の分離による、1つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離を含む。

そのような分離段階は、試薬と結合した細胞がさらなる使用のために保持される正の選択、および／または抗体もしくは結合パートナーに結合していない細胞が保持される負の選択に基づくことができる。いくつかの例では、両方の画分がさらなる使用のために保持される。いくつかの局面では、所望の集団以外の細胞により発現されるマーカーに基づいて分離が最も良好に行われるように、不均一な集団中の細胞型を特異的に特定する抗体が利用不能な場合に、負の選択は特に有用であることができる。分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現している細胞の100％の濃縮または除去を生じる必要はない。例えば、特定の種類の細胞、例えばマーカーを発現している細胞の正の選択または濃縮は、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現していない細胞の完全な非存在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現している細胞などの特定の種類の細胞の負の選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、そのような細胞のすべての完全な除去をもたらす必要はない。

いくつかの例では、複数ラウンドの分離段階が実施され、その際、1つの段階から正または負の選択をされた画分が、後続の正または負の選択などの別の分離段階に供される。いくつかの例では、それぞれが負の選択のための標的とされるマーカーに特異的な複数の抗体または結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることなどによって、複数のマーカーを同時発現している細胞を単一の分離段階で枯渇させることができる。同様に、複数の抗体または様々な細胞型に発現される結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞型に同時に正の選択を行うことができる。

いくつかの態様では、T細胞集団の1つまたは複数は、1つまたは複数の特定のマーカー、例えば表面マーカーについて陽性（マーカー+）である、もしくはそれを高レベル発現する（マーカー^high）細胞、または1つもしくは複数のマーカーについて陰性である（マーカー^-）もしくはそれを比較的低レベルを発現する（マーカー^low）細胞が濃縮または枯渇されている。例えば、いくつかの局面では、T細胞の特定の部分集団、例えば、1つまたは複数の表面マーカー、例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、および／またはCD45RO+ T細胞について陽性またはそれを高レベル発現している細胞は、正または負の選択技法により単離される。場合によっては、そのようなマーカーは、T細胞のある特定の集団（非メモリー細胞など）に存在しない、または比較的低レベルで発現されるが、T細胞のある特定の他の集団（メモリー細胞など）に存在する、または比較的高レベル発現されるマーカーである。一態様では、細胞（CD8+細胞、またはT細胞、例えばCD3+細胞など）は、CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127、および／もしくはCD62Lについて陽性である、もしくはその高い表面レベルを発現する細胞が濃縮されている（すなわち、正の選択をされている）、かつ／またはCD45RAについて陽性である、もしくはその高い表面レベルを発現する細胞が枯渇されている（例えば、それについて負の選択をされている）。いくつかの態様では、細胞は、CD122、CD95、CD25、CD27、および／またはIL7-Ra（CD127）について陽性であるまたはその高い表面レベルを発現している細胞が濃縮されているまたはそれを枯渇している。いくつかの例では、CD8+ T細胞は、CD45ROについて陽性（またはCD45RAについて陰性）およびCD62Lについて陽性の細胞が濃縮されている。例えば、CD3+、CD28+ T細胞は、CD3/CD28コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を使用して正の選択を行うことができる。

いくつかの態様では、T細胞は、B細胞、単球、または他の白血球などの非T細胞に発現されるマーカー、例えばCD14の負の選択によってPBMC試料から分離される。いくつかの局面では、CD4+またはCD8+選択段階は、CD4+ヘルパーT細胞およびCD8+細胞傷害性T細胞を分離するために使用される。そのようなCD4+集団およびCD8+集団は、1つまたは複数のナイーブ、メモリー、および／またはエフェクターT細胞部分集団上に発現されるまたは比較的高い度合いで発現されるマーカーについて正の選択または負の選択により部分集団にさらに選別することができる。いくつかの態様では、CD8+細胞は、例えば、それぞれの部分集団に関連する表面抗原に基づく正の選択または負の選択により、ナイーブ、中枢性メモリー、エフェクターメモリー、および／または中枢性メモリー幹細胞についてさらに濃縮または枯渇される。いくつかの態様では、中枢性メモリーT（TCM）細胞についての濃縮は、有効性を増加させるために、例えば、投与後に長期生存、増大、および／または生着を改善するために実施され、それは、いくつかの局面ではそのような部分集団において特に堅固である。いくつかの態様では、TCMが濃縮されたCD8+ T細胞およびCD4+ T細胞を組み合わせることで、有効性がさらに高まる。

いくつかの態様では、メモリーT細胞は、CD8+末梢血リンパ球のCD62L+およびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体などを使用して、CD62L-CD8+および／またはCD62L+CD8+画分について濃縮されているまたはそれを枯渇していることができる。いくつかの態様では、CD4+ T細胞集団およびCD8+ T細胞部分集団、例えば、中枢性メモリー（TCM）細胞について濃縮された部分集団である。いくつかの態様では、中枢性メモリーT（TCM）細胞についての濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および／またはCD127について陽性またはその高い表面発現に基づく；いくつかの局面では、それは、CD45RAおよび／またはグランザイムBを発現しているまたは高度に発現している細胞についての負の選択に基づく。いくつかの局面では、TCM細胞が濃縮されたCD8+集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現している細胞の枯渇、およびCD62Lを発現している細胞についての正の選択または濃縮により実施される。一局面では、中枢性メモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD4の発現に基づき選択される細胞の負の画分から開始して実施され、それが、CD14およびCD45RAの発現に基づく負の選択、ならびにCD62Lに基づく正の選択に供される。そのような選択は、いくつかの局面では、同時に実施され、他の局面では、どちらかの順序で順次に実施される。いくつかの局面では、CD8+細胞集団または部分集団を調製するのに使用されるCD4発現に基づく同じ選択段階はまた、CD4+細胞集団または部分集団を生成するために使用され、それにより、CD4に基づく分離からの正の画分および負の画分の両方が、任意で1つまたは複数のさらなる正または負の選択段階に続いて、方法のその後の段階において保持および使用される。

CD4+ Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することにより、ナイーブ、中枢性メモリー、およびエフェクター細胞に選別される。CD4+ リンパ球は、標準的な方法により得ることができる。いくつかの態様では、ナイーブCD4+ Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T細胞である。いくつかの態様では、中枢性メモリーCD4+細胞は、CD62L+およびCD45RO+である。いくつかの態様では、エフェクターCD4+細胞は、CD62L-およびCD45ROである。一例では、負の選択によりCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様では、抗体または結合パートナーは、正および／または負の選択のための細胞の分離を可能にするために磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合される。

いくつかの態様では、細胞は、遺伝子操作の前またはそれに関連してインキュベートおよび／または培養される。インキュベーション段階は、培養（culture）、培養（cultivation）、刺激、活性化、および／または繁殖を含むことができる。いくつかの態様では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激物質の存在下でインキュベートされる。そのような条件には、集団中の細胞の増殖、増大、活性化、および／もしくは生存を誘導するために、抗原曝露を模倣するために、ならびに／または遺伝子操作、例えば組み換え抗原受容体の導入のために細胞をプライミングするために設計された条件が含まれる。条件は、特定の媒質、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組み換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質のうちの1つまたは複数を含むことができる。いくつかの態様では、刺激条件または刺激物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な1つまたは複数の作用物質、例えば、リガンドを含む。いくつかの局面では、作用物質は、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを始動する、または開始する。そのような作用物質は、例えば、ビーズなどの固体支持体に結合した抗体、例えば、TCR成分および／もしくは共刺激受容体に特異的な抗体、例えば、抗CD3、抗CD28、ならびに／または1つもしくは複数のサイトカインを含むことができる。任意で、増大方法は、培地に抗CD3および／または抗CD28抗体を（例えば、少なくとも約0.5ng/mlの濃度で）添加する段階をさらに含む場合がある。いくつかの態様では、刺激物質は、IL-2および／またはIL-15、例えば、少なくとも約10ユニット/mLのIL-2濃度を含む。

別の態様では、T細胞は、赤血球を溶解することおよび単球を枯渇させることによって、例えば、PERCOLL（商標）勾配による遠心分離により、末梢血から単離される。あるいは、T細胞は、臍帯から単離することができる。任意の事象では、T細胞の特定の部分集団を正または負の選択技法によりさらに単離することができる。

そのように単離された臍帯血単核細胞は、非限定的にCD34、CD8、CD14、CD19、およびCD56を含む、ある特定の抗原を発現している細胞を枯渇していることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、抗体を含む生物学的試料、例えば腹水、物理的支持体に結合した抗体、細胞と結合した抗体を使用して成し遂げることができる。

負の選択によるT細胞集団の濃縮は、負の選択をされた細胞に独特な表面マーカーに対する抗体の組み合わせを使用して成し遂げることができる。好ましい方法は、負の選択をされた細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着（negative magnetic immunoadherence）またはフローサイトメトリーを介する細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によりCD4⁺細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。

正または負の選択により細胞の所望の集団を単離するために、細胞濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変化させることができる。ある特定の態様では、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を顕著に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増加させて）、細胞とビーズとの最大の接触を保証することが望ましい場合がある。例えば、一態様では、20億個/mlの細胞濃度が使用される。一態様では、10億個/mlの細胞濃度が使用される。さらなる態様では、細胞1億個/ml超が使用される。さらなる態様では、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、または5000万個/mlの細胞濃度が使用される。なお別の態様では、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、または1億個/mlの細胞濃度が使用される。さらなる態様では、1億2500万または1億5000万個/mlの細胞濃度を使用することができる。高濃度を使用することは、増加した細胞収量、細胞活性化、および細胞増大をもたらすことができる。

T細胞はまた、単球の除去段階を必要としない洗浄段階の後に凍結することができる。理論に縛られることを望むわけではないが、凍結およびその後の解凍段階は、細胞集団中の顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄段階の後で、細胞が凍結溶液中に懸濁される場合がある。多数の凍結溶液およびパラメーターが当技術分野において公知であり、この状況で有用であろうものの、非限定的な例では、1つの方法は、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または他の適切な細胞凍結媒を使用することを伴う。次いで細胞は、1℃／分の速度で-80℃に凍結され、液体窒素保存タンクの気相中で保管される。制御凍結の他の方法および-20℃または液体窒素中での即時の非制御凍結が使用される場合もある。

一態様では、T細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、T細胞の精製集団、およびT細胞株などの細胞の集団中に含まれる。別の態様では、末梢血単核細胞は、T細胞集団を含む。なお別の態様では、精製T細胞は、T細胞集団を含む。

ある特定の態様では、制御性T細胞（Treg）は、試料から単離することができる。試料は、臍帯血または末梢血を含むことができるが、それに限定されるわけではない。ある特定の態様では、Tregは、フローサイトメトリー選別によって単離される。試料は、当技術分野において公知の任意の手段により単離前にTregが濃縮されることができる。単離されたTregを、凍結保存し、かつ／または使用前に増大させることができる。Tregを単離するための方法は、米国特許第7,754,482号、同第8,722,400号、および同第9,555,105号、ならびに米国特許出願第13/639,927号に記載されており、それらの内容は、その全体で本明細書に組み入れられる。

H. 処置方法
本明細書に記載される改変された免疫細胞（例えば、T細胞）は、免疫療法のための組成物中に含まれる場合がある。組成物は、薬学的組成物を含み、薬学的に許容される担体をさらに含む場合がある。改変されたT細胞を含む薬学的組成物の治療有効量が、投与される場合がある。

一局面では、本発明は、対象における疾患または状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に本発明の改変されたT細胞の有効量を投与する段階を含む方法を含む。別の局面では、本発明は、対象における疾患または状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に本発明の改変されたT細胞の集団の有効量を含む薬学的組成物を投与する段階を含む方法を含む。別の局面では、本発明は、養子細胞移入療法のための方法であって、それを必要とする対象に本発明の改変されたT細胞の有効量を投与する段階を含む方法を含む。

養子細胞療法のための免疫細胞の投与のための方法は、公知であり、提供される方法および組成物と共に使用される場合がある。例えば、養子T細胞療法は、例えば、Gruenbergらの米国特許出願公開第2003/0170238号；Rosenbergの米国特許第4,690,915号；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)に記載されている。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933；Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照されたい。いくつかの態様では、細胞療法、例えば、養子T細胞療法は、細胞療法を受けることになる対象もしくはそのような対象に由来する試料から細胞が単離され、かつ／またはその他の方法で調製される、自己移入によって実施される。したがって、いくつかの局面では、細胞は、処置を必要とする対象、例えば、患者に由来し、細胞は、単離および処理の後に同じ対象に投与される。

いくつかの態様では、細胞療法、例えば、養子T細胞療法は、細胞が、細胞療法を受けることになる、または最終的に受ける対象、例えば、第1の対象以外の対象から単離され、かつ／またはその他の方法で調製される、同種移入によって実施される。そのような態様では、次いで細胞は、同じ種の異なる対象、例えば、第2の対象に投与される。いくつかの態様では、第1および第2の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの態様では、第1および第2の対象は、遺伝的に類似である。いくつかの態様では、第2の対象は、第1の対象と同じHLAクラスまたは上位タイプを発現する。

いくつかの態様では、対象は、細胞または細胞を含有する組成物の投与前に疾患または状態、例えば、腫瘍を標的とする治療剤により処置されている。いくつかの局面では、対象は、他の治療剤に対して抗療性または非応答性である。いくつかの態様では、対象は、例えば、化学療法、放射線、および／または造血幹細胞移植（HSCT）、例えば、同種HSCTを含む別の治療的介入による処置の後に持続性疾患または再発性疾患を有する。いくつかの態様では、投与は、対象が別の治療法に抵抗性になったにもかかわらず、対象を効果的に処置する。

いくつかの態様では、対象は、他の治療剤に応答性であり、治療剤による処置は、疾病負荷を低減する。いくつかの局面では、対象は、最初は治療剤に応答性であるが、時間が経つにつれて疾患または状態の再発を示す。いくつかの態様では、対象は再発していない。いくつかのそのような態様では、対象は、再発の危険性がある、例えば再発の高い危険性があると決定され、したがって細胞は、例えば、再発の可能性を低減するまたは再発を防止するために、予防的に投与される。いくつかの局面では、対象は、別の治療剤による事前の処置を受けたことがない。

いくつかの態様では、対象は、例えば、化学療法、放射線、および／または造血幹細胞移植（HSCT）、例えば、同種HSCTを含む別の治療的介入による処置の後で、持続性疾患または再発性疾患を有する。いくつかの態様では、投与は、対象が別の治療法に抵抗性になったにもかかわらず、対象を効果的に処置する。

本発明の改変された免疫細胞を、動物、好ましくは哺乳動物、なおより好ましくはヒトに投与して、がんを処置することができる。加えて、本発明の細胞は、疾患を処置または軽減することが望ましい場合に、がんに関係する任意の状態の処置、特に腫瘍細胞に対する細胞媒介免疫応答のために使用することができる。本発明の改変された細胞または薬学的組成物により処置されるべきがんの種類には、がん腫、芽腫、および肉腫、ならびにある特定の白血病またはリンパ系腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば、肉腫、がん腫、および黒色腫が含まれる。他の例示的ながんには、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、甲状腺がんなどが含まれるが、それに限定されるわけではない。がんは、非固形腫瘍（血液腫瘍など）または固形腫瘍であり得る。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんもまた含まれる。一態様では、がんは、固形腫瘍または血液学的腫瘍である。一態様では、がんは癌種である。一態様では、がんは肉腫である。一態様では、がんは白血病である。一態様では、がんは固形腫瘍である。

固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない組織の異常塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であることができる。異なる種類の固形腫瘍が、それら（肉腫、がん腫、およびリンパ腫など）を形成する細胞の種類にちなんで名付けられる。肉腫およびがん腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、乳頭様甲状腺がん、褐色細胞腫、脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱がん、黒色腫、およびCNS腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合性神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、CNSリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移など）が含まれる。いくつかの態様では、がんは星状細胞腫である。いくつかの態様では、がんは高悪性度星状細胞腫である。

本明細書に開示される方法による治療の対象となるがん腫には、食道がん、肝細胞がん、基底細胞がん（皮膚がんの一形態）、扁平上皮がん（様々な組織）、移行上皮がん（膀胱の悪性新生物）を含む膀胱がん、気管支原性がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、副腎皮質がん、甲状腺がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、腎細胞がん、非浸潤性乳管がんまたは胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、骨原性がん、上皮がん、および上咽頭がんが含まれるが、それに限定されるわけではない。

本明細書に開示の方法による治療の対象となる肉腫には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、および他の軟組織肉腫が含まれるが、それに限定されるわけではない。

ある特定の例示的な態様では、本発明の改変免疫細胞は、骨髄腫、または骨髄腫に関係する状態を処置するために使用される。骨髄腫またはそれに関係する状態の例は、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（MGUS）、形質細胞腫（例えば、孤立性、多発性、髄外性形質細胞腫）、アミロイドーシス、および多発性骨髄腫を含むが、それに限定されるわけではない。一態様では、本開示の方法は、多発性骨髄腫を処置するために使用される。一態様では、本開示の方法は、難治性骨髄腫を処置するために使用される。一態様では、本開示の方法は、再発性骨髄腫を処置するために使用される。

ある特定の例示的な態様では、本発明の改変免疫細胞は、黒色腫、または黒色腫に関係する状態を処置するために使用される。黒色腫またはそれに関係する状態の例は、表在性拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、または皮膚の黒色腫（例えば、皮膚、眼、外陰部、膣、直腸黒色腫）を含むが、それに限定されるわけではない。一態様では、本開示の方法は、皮膚黒色腫を処置するために使用される。一態様では、本開示の方法は、難治性黒色腫を処置するために使用される。一態様では、本開示の方法は、再発性黒色腫を処置するために使用される。

なお他の例示的な態様では、本発明の改変免疫細胞は、肉腫、または肉腫に関係する状態を処置するために使用される。肉腫またはそれに関係する状態の例は、血管肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫、骨肉腫、多形肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫を含むが、それに限定されるわけではない。一態様では、本開示の方法は、滑膜肉腫を処置するために使用される。一態様では、本開示の方法は、脂肪肉腫、例えば粘液性／円形細胞脂肪肉腫、分化型／脱分化型脂肪肉腫、および多形性脂肪肉腫を処置するために使用される。一態様では、本開示の方法は、粘液性／円形細胞脂肪肉腫を処置するために使用される。一態様では、本開示の方法は、難治性肉腫を処置するために使用される。一態様では、本開示の方法は、再発性肉腫を処置するために使用される。

投与されるべき本発明の細胞は、治療を受けている対象に対して自己であり得る。

本発明の細胞の投与は、当業者に公知の任意の好都合な方法で実施される場合がある。本発明の細胞は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、埋め込みまたは移植により対象に投与される場合がある。本明細書に記載される組成物は、患者に経動脈的、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内に、静脈内（i.v.）注射により、または腹腔内に投与される場合がある。他の例では、本発明の細胞は、対象における炎症部位、対象における局所疾患部位、リンパ節、器官、腫瘍などに直接注射される。

いくつかの態様では、細胞は、所望の投薬量で投与され、投薬量は、いくつかの局面では、細胞もしくは細胞型の所望の用量もしくは数および／または細胞型の所望の比を含む。したがって、細胞の投薬量は、いくつかの態様では細胞の合計数（またはkg体重あたりの数）およびCD4+対CD8+の比のように個別の集団またはサブタイプの所望の比に基づく。いくつかの態様では、細胞の投薬量は、個別の集団における、または個別の細胞型の細胞の所望の合計数（またはkg体重あたりの数）に基づく。いくつかの態様では、投薬量は、所望の総細胞数、所望の比、および個別の集団中の所望の細胞合計数などの、そのような特徴の組み合わせに基づく。

いくつかの態様では、CD8⁺ T細胞およびCD4⁺ T細胞などの細胞の集団またはサブタイプは、所望の用量の総細胞、例えば所望の用量のT細胞の許容される差異でまたは差異内で投与される。いくつかの局面では、所望の用量は、所望の細胞数、または細胞が投与される対象の単位体重あたりの所望の細胞数、例えば、個/kgである。いくつかの局面では、所望の用量は、最小細胞数または単位体重あたりの最小細胞数である、またはそれを超える。いくつかの局面では、所望の用量で投与される総細胞の中で、個別の集団またはサブタイプは、所望のアウトプット比（CD4⁺対CD8⁺の比など）でまたはそれ近くで、例えば、そのような比のある特定の許容される差異または誤差内で存在する。

いくつかの態様では、細胞は、細胞の個別の集団またはサブタイプのうち1つまたは複数の所望の用量、例えば、CD4+細胞の所望の用量および／またはCD8+細胞の所望の用量の許容される差異でまたは差異内で投与される。いくつかの局面では、所望の用量は、サブタイプもしくは集団の所望の細胞数、または細胞が投与される対象の単位体重あたりのそのような細胞の所望の数、例えば、個/kgである。いくつかの局面では、所望の用量は、集団もしくはサブタイプの最小細胞数、または単位体重あたりの集団もしくはサブタイプの最小細胞数である、またはそれを超える。したがって、いくつかの態様では、投薬量は、総細胞の所望の固定用量および所望の比に基づき、かつ／または個別のサブタイプもしくは部分集団の1つもしくは複数、例えば、それぞれの所望の固定用量に基づく。したがって、いくつかの態様では、投薬量は、T細胞の所望の固定用量もしくは最小用量およびCD4⁺細胞対CD8⁺細胞の所望の比に基づき、かつ／またはCD4⁺細胞および／もしくはCD8⁺細胞の所望の固定用量もしくは最小用量に基づく。

ある特定の態様では、細胞、または細胞のサブタイプの個別の集団は、対象に、約100万～約1000億個の細胞の範囲で、例えば、100万～約500億個の細胞（例えば、約500万個の細胞、約2500万個の細胞、約5億個の細胞、約10億個の細胞、約50億個の細胞、約200億個の細胞、約300億個の細胞、約400億個の細胞、または前記値の任意の2つにより定義される範囲）、例えば約1000万～約1000億個の細胞（例えば、約2000万個の細胞、約3000万個の細胞、約4000万個の細胞、約6000万個の細胞、約7000万個の細胞、約8000万個の細胞、約9000万個の細胞、約100億個の細胞、約250億個の細胞、約500億個の細胞、約750億個の細胞、約900億個の細胞、または前記値の任意の2つにより定義される範囲）で、場合によっては約1億個の細胞～約500億個の細胞（例えば、約1億2000万個の細胞、約2億5000万個の細胞、約3億5000万個の細胞、約4億5000万個の細胞、約6億5000万個の細胞、約8億個の細胞、約9億個の細胞、約30億個の細胞、約300億個の細胞、約450億個の細胞）またはこれらの範囲の間の任意の値で投与される。

いくつかの態様では、総細胞の用量および／または細胞の個別の部分集団の用量は、細胞1×10⁵個または約1×10⁵個/kg～約1×10¹¹個/kg、細胞10⁴個～10¹¹個または約10¹¹個/キログラム（kg）体重、例えば、細胞10⁵～10⁶個/kg体重の範囲内であり、例えば、細胞1×10⁵個または約1×10⁵個/kg、細胞1.5×10⁵個/kg、細胞2×10⁵個/kg、または細胞1×10⁶個/kg体重である。例えば、いくつかの態様では、細胞は、T細胞10⁴個または約10⁴個～10⁹個または約10⁹個/キログラム（kg）体重、例えば、T細胞10⁵個～10⁶個/kg体重で、またはその誤差のある特定の範囲内で、例えば、T細胞1×10⁵個もしくは約1×10⁵個/kg、T細胞1.5×10⁵個/kg、T細胞2×10⁵個/kg、またはT細胞1×10⁶個/kg体重で投与される。他の例示的な態様では、本開示の方法に使用するために適した、改変された細胞の投薬量範囲は、細胞約1×10⁵個/kg～細胞約1×10⁶個/kg、細胞約1×10⁶個/kg～細胞約1×10⁷個/kg、細胞約1×10⁷個/kg～細胞約1×10⁸個/kg、細胞約1×10⁸個/kg～細胞約1×10⁹個/kg、細胞約1×10⁹個/kg～細胞約1×10¹⁰個/kg、細胞約1×10¹⁰個/kg～細胞約1×10¹¹個/kgを含むが、それに限定されるわけではない。例示的な態様では、本開示の方法に使用するために適した投薬量は、細胞約1×10⁸個/kgである。例示的な態様では、本開示の方法に使用するために適した投薬量は、細胞約1×10⁷個/kgである。他の態様では、適切な投薬量は、総細胞約1×10⁷個～総細胞約5×10⁷個である。いくつかの態様では、適切な投薬量は、総細胞約1×10⁸個～総細胞約5×10⁸個である。いくつかの態様では、適切な投薬量は、総細胞約1.4×10⁷個～総細胞約1.1×10⁹個である。例示的な態様では、本開示の方法に使用するために適した投薬量は、総細胞約7×10⁹個である。

いくつかの態様では、細胞は、10⁴または約10⁴～10⁹または約10⁹個/キログラム（kg）体重のCD4⁺および／またはCD8⁺細胞、例えば、10⁵～10⁶個/kg体重のCD4⁺および／またはCD8⁺細胞で、またはその誤差のある特定の範囲内で、例えば、1×10⁵もしくは約1×10⁵個/kgのCD4⁺および／もしくはCD8⁺細胞、1.5×10⁵個/kgのCD4⁺および／もしくはCD8⁺細胞、2×10⁵個/kgのCD4⁺および／もしくはCD8⁺細胞、または1×10⁶個/kg体重のCD4⁺および／もしくはCD8⁺細胞で投与される。いくつかの態様では、細胞は、約1×10⁶個、約2.5×10⁶個、約5×10⁶個、約7.5×10⁶個、もしくは約9×10⁶個を超える、もしくは少なくとも約1×10⁶個、約2.5×10⁶個、約5×10⁶個、約7.5×10⁶個、もしくは約9×10⁶個のCD4⁺細胞、および／または少なくとも約1×10⁶個、約2.5×10⁶個、約5×10⁶個、約7.5×10⁶個、もしくは約9×10⁶個のCD8⁺細胞、および／または少なくとも約1×10⁶個、約2.5×10⁶個、約5×10⁶個、約7.5×10⁶個、もしくは約9×10⁶個のT細胞で、またはその誤差のある特定の範囲内で投与される。いくつかの態様では、細胞は、約10⁸個～10¹²個もしくは約10¹⁰個～10¹¹個のT細胞、約10⁸個～10¹²個もしくは約10¹⁰個～10¹¹個のCD4⁺細胞、および／または約10⁸個～10¹²個もしくは約10¹⁰個～10¹¹個のCD8⁺細胞で、またはその誤差のある特定の範囲内で投与される。

いくつかの態様では、細胞は、CD4+およびCD8+細胞またはサブタイプなどの、複数の細胞集団またはサブタイプの所望のアウトプット比で、またはその耐容される範囲内で投与される。いくつかの局面では、所望の比は、特定の比であることができる、または比の範囲であることができ、例えば、いくつかの態様では、所望の比（例えば、CD4⁺細胞対CD8⁺細胞の比）は、5：1もしくは約5：1～5：1もしくは約5：1（または約1：5よりも大きく、約5：1よりも小さい）、または1：3もしくは約1：3～3：1もしくは約3：1（または約1：3よりも大きく、約3：1よりも小さい）、例えば、2：1もしくは約2：1～1：5もしくは約1：5（または約1：5よりも大きく、約2：1よりも小さい、例えば、5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、もしくは1：5、または約5：1、約4.5：1、約4：1、約3.5：1、約3：1、約2.5：1、約2：1、約1.9：1、約1.8：1、約1.7：1、約1.6：1、約1.5：1、約1.4：1、約1.3：1、約1.2：1、約1.1：1、約1：1、約1：1.1、約1：1.2、約1：1.3、約1：1.4、約1：1.5、約1：1.6、約1：1.7、約1：1.8、約1：1.9、約1：2、約1：2.5、約1：3、約1：3.5、約1：4、約1：4.5、もしくは約1：5である。いくつかの局面では、耐容される差は、所望の比の約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％以内であり、これらの範囲の間の任意の値を含む。

いくつかの態様では、改変された細胞の用量は、それを必要とする対象に単回用量または複数回用量で投与される。いくつかの態様では、改変された細胞の用量は、複数回用量で、例えば、週1回または7日毎、2週1回または14日毎、3週1回または21日毎、4週1回または28日毎に投与される。例示的な態様では、改変された細胞の単回用量が、それを必要とする対象に投与される。例示的な態様では、改変された細胞の単回用量は、急速静脈内注入によりそれを必要とする対象に投与される。

疾患の予防または治療に適した投薬量は、処置されるべき疾患の種類、細胞もしくは組み換え受容体の種類、疾患の重症度および経過、細胞が予防目的それとも治療目的で投与されるか、事前の療法、対象の臨床歴および細胞に対する応答、ならびに担当医師の判断に依存する場合がある。組成物および細胞は、いくつかの態様では、対象に1回でまたは一連の処置にわたり適宜投与される。

いくつかの態様では、細胞は、組み合わせ処置の部分として、例えば、別の治療的介入、例えば、抗体または操作された細胞または受容体または作用物質、例えば細胞傷害剤もしくは治療剤と同時にまたは任意の順序で順次に投与される。細胞は、いくつかの態様では、1つまたは複数の追加的な治療剤と共に、または別の治療的介入に関連して、同時にまたは任意の順序で順次に共投与される。いくつかの状況では、細胞は、細胞集団が1つまたは複数の追加的な治療剤の効果を高めるように十分に近い時間で別の療法と共に、またはその逆で共投与される。いくつかの態様では、細胞は、1つまたは複数の追加的な治療剤の前に投与される。いくつかの態様では、細胞は、1つまたは複数の追加的な治療剤の後に投与される。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加的な作用物質は、例えば持続性を高めるための、IL-2などのサイトカインを含む。いくつかの態様では、この方法は、化学療法剤の投与を含む。

ある特定の態様では、本発明の改変細胞（例えば、CARを含む改変細胞）は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて対象に投与される場合がある。免疫チェックポイントの例は、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3を含むが、それに限定されるわけではない。抗体は、免疫チェックポイントを阻害するために使用される場合がある（例えば、抗PD1抗体、抗CTLA-4抗体、または抗TIM-3抗体）。例えば、改変細胞は、例えば、PD-1（プログラム死1タンパク質）を標的とする抗体または抗体断片と組み合わせて投与されうる。抗PD-1抗体の例は、ペムブロリズマブ（KEYTRUDA（登録商標）、以前のランブロリズマブ、MK-3475としても知られる）、およびニボルマブ（BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、OPDIVA（登録商標））またはそれらの抗原結合断片を含むが、それに限定されるわけではない。ある特定の態様では、改変細胞は、抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与されうる。抗PD-L1抗体の例は、BMS-936559、MPDL3280A（TECENTRIQ（登録商標）、アテゾリズマブ）、およびMEDI4736（デュルバルマブ、イミフィンジ）を含むが、それに限定されるわけではない。ある特定の態様では、改変細胞は、抗CTLA-4抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与されうる。抗CTLA-4抗体の例は、イピリムマブ（商品名Yervoy）を含むが、それに限定されるわけではない。小分子、siRNA、miRNA、およびCRISPRシステムを含むが、それに限定されるわけではない他の種類の免疫チェックポイントモジュレーターもまた使用されうる。免疫チェックポイントモジュレーターは、CARを含む改変細胞の前、後、またはそれと同時に投与されうる。ある特定の態様では、免疫チェックポイントモジュレーターを含む組み合わせ処置は、本発明の改変細胞を含む治療法の治療有効性を増大させる場合がある。

細胞の投与に続き、操作された細胞集団の生物学的活性は、いくつかの態様では、例えば、いくつかの公知の方法のいずれかにより測定される。評価のためのパラメーターは、例えばイメージングによるインビボでの、または例えばELISAもしくはフローサイトメトリーによるエクスビボでの、操作されたまたは天然のT細胞または他の免疫細胞の抗原への特異的結合を含む。ある特定の態様では、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力は、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)、およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載される細胞傷害性アッセイなどの、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。ある特定の態様では、細胞の生物学的活性は、1つまたは複数のサイトカイン、例えばCD107a、IFNy、IL-2、およびTNFの発現および／または分泌をアッセイすることにより測定される。いくつかの局面では、生物学的活性は、腫瘍負荷または腫瘍量の低減などの臨床的成果を評価することにより測定される。

ある特定の態様では、対象に二次処置が提供される。二次処置は、化学療法、放射線、外科手術、および投薬を含むが、それに限定されるわけではない。

いくつかの態様では、CAR T細胞療法の前に、対象に条件づけ療法を投与することができる。いくつかの態様では、条件づけ療法は、対象にシクロホスファミドの有効量を投与することを含む。いくつかの態様では、条件づけ療法は、対象にフルダラビンの有効量を投与することを含む。好ましい態様では、条件づけ療法は、対象にシクロホスファミドとフルダラビンとの組み合わせの有効量を投与することを含む。CAR T細胞療法の前の条件づけ療法の投与は、CAR T細胞療法の有効性を増大させる場合がある。T細胞療法のために患者を条件づける方法は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる米国特許第9,855,298号に記載されている。

いくつかの態様では、本開示の特異的投薬レジメンは、改変されたT細胞の投与前のリンパ球枯渇段階を含む。例示的な態様では、リンパ球枯渇段階は、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビンの投与を含む。

いくつかの態様では、リンパ球枯渇段階は、約200mg/m²/日～約2000mg/m²/日（例えば、200mg/m²/日、300mg/m²/日、または500mg/m²/日）の用量でのシクロホスファミドの投与を含む。例示的な態様では、シクロホスファミドの用量は、約300mg/m²/日である。いくつかの態様では、リンパ球枯渇段階は、約20mg/m²/日～約900mg/m²/日（例えば、20mg/m²/日、25mg/m²/日、30mg/m²/日、または60mg/m²/日）の用量でのフルダラビンの投与を含む。例示的な態様では、フルダラビンの用量は約30mg/m²/日である。

ある態様では、リンパ球枯渇段階は、約200mg/m²/日～約2000mg/m²/日（例えば、200mg/m²/日、300mg/m²/日、または500mg/m²/日）の用量のシクロホスファミド、および約20mg/m²/日～約900mg/m²/日（例えば、20mg/m²/日、25mg/m²/日、30mg/m²/日、または60mg/m²/日）の用量のフルダラビンの投与を含む。例示的な態様では、リンパ球枯渇段階は、約300mg/m²/日の用量のシクロホスファミド、および約30mg/m²/日の用量のフルダラビンの投与を含む。

例示的な態様では、シクロホスファミドの投薬は、300mg/m²/日を3日間であり、フルダラビンの投薬は、30mg/m²/日を3日間である。

リンパ球枯渇化学療法の投薬は、0日目のT細胞（例えば、CAR-T、TCR-T、改変T細胞など）の注入に対して-6～-4日目（-1日の時間枠を設ける、すなわち、-7～-5日目に投薬）に予定されうる。

例示的な態様では、がんを有する対象について、対象は、改変されたT細胞の投与の3日前に、静脈内注入により300mg/m²のシクロホスファミドを含むリンパ球枯渇化学療法を受ける。例示的な態様では、がんを有する対象について、対象は、改変されたT細胞の投与前に3日間、静脈内注入により300mg/m²のシクロホスファミドを含むリンパ球枯渇化学療法を受ける。

例示的な態様では、がんを有する対象について、対象は、約20mg/m²/日～約900mg/m²/日（例えば、20mg/m²/日、25mg/m²/日、30mg/m²/日、または60mg/m²/日）の用量のフルダラビンを含むリンパ球枯渇化学療法を受ける。例示的な態様では、がんを有する対象について、対象は、30mg/m²の用量のフルダラビンを含むリンパ球枯渇化学療法を3日間受ける。

例示的な態様では、がんを有する対象について、対象は、約200mg/m²/日～約2000mg/m²/日（例えば、200mg/m²/日、300mg/m²/日、または500mg/m²/日）の用量のシクロホスファミド、および約20mg/m²/日～約900mg/m²/日（例えば、20mg/m²/日、25mg/m²/日、30mg/m²/日、または60mg/m²/日）の用量のフルダラビンを含むリンパ球枯渇化学療法を受ける。例示的な態様では、がんを有する対象について、対象は、約300mg/m²/日の用量のシクロホスファミド、および30mg/m²の用量のフルダラビンを含むリンパ球枯渇化学療法を3日間受ける。

本発明の細胞は、適切な前臨床および臨床実験および試験において決定されるべき投薬量および経路および回数で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与される場合がある。本発明の細胞の投与は、当業者により決定される、所望の疾患または状態を処置するために有用な他の方法と組み合わせられる場合がある。

CAR T細胞の注入後の有害作用の1つが、サイトカイン放出症候群（CRS）として知られる免疫活性化の開始であることが、当技術分野において公知である。CRSは、炎症性サイトカインの上昇を招く免疫活性化である。CRSは、公知のオンターゲット毒性であり、CRSの発生は有効性に関連すると考えられる。臨床尺度および検査尺度は、軽度のCRS（全身症状および／またはグレード2の臓器毒性）から重度のCRS（sCRS；グレード≧3の臓器毒性、積極的な臨床介入、および／または場合によっては生死にかかわる）の範囲である。臨床特徴には、高熱、倦怠感、疲労、筋肉痛、悪心、食欲不振、頻脈/低血圧、毛細血管漏出、心機能不全、腎機能障害、肝不全、および播種性血管内凝固が含まれる。インターフェロン-ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、IL-10、およびIL-6を含むサイトカインの劇的な上昇が、CAR T細胞注入の後に示されている。1つのCRSシグネチャーは、IL-6（重度の上昇）、IFN-ガンマ、TNF-アルファ（中等度）、およびIL-2（軽度）を含むサイトカインの上昇である。フェリチンおよびC反応性タンパク質（CRP）を含む、臨床的に利用可能な炎症マーカーにおける上昇もまた、CRS症候群と相関関係にあることが観察されている。CRSの存在は、一般的に、養子移入された細胞の増大および進行性免疫活性化と相関する。高い腫瘍量を有する患者は、より大きいsCRSを経験するので、CRSの重症度は注入時の疾病負荷により決まることが実証されている。

したがって、本発明は、CRSの診断後に、操作された細胞（例えば、CAR T細胞）の抗腫瘍有効性を弱めずに、制御されない炎症の生理的症状を緩和するために適したCRS管理戦略を提供する。CRS管理戦略は、当技術分野において公知である。例えば、全身コルチコステロイドは、最初の抗腫瘍応答を損なわずに、sCRS（例えば、グレード3のCRS）の症状を急速に後退させるために投与される場合がある。

いくつかの態様では、抗IL-6R抗体が投与される場合がある。抗IL-6R抗体の例は、米国食品医薬品局に承認された、アトリズマブとしても知られるモノクローナル抗体トシリズマブである（ActemraまたはRoActemraとして市販されている）。トシリズマブは、インターロイキン-6受容体（IL-6R）に対するヒト化モノクローナル抗体である。トシリズマブの投与は、CRSのほぼ即時の後退を実証した。

CRSは、一般的に、観察される症候群の重症度に基づき管理され、介入はそのように個別化される。CRSの管理の決定は、単に臨床検査値だけではなく、臨床徴候および症状ならびに介入に対する応答に基づき得る。

軽症例～中等症例は、一般的に、症状の十分な緩和のために必要に応じて輸液療法、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）および抗ヒスタミン薬を用いた症状管理で処置される。より重症の例は、任意の程度の血行動態不安定を有する患者を含み；任意の血行動態不安定では、トシリズマブの投与が推奨される。CRSの第一選択管理は、いくつかの実施形態では、表示用量8mg/kg（800mg/回を超えない）の60分間にわたるIVのトシリズマブであり得；トシリズマブは反復Q8時間であることができる。トシリズマブの初回用量に対する応答が最適以下である場合、トシリズマブの追加的な用量が考慮される場合がある。トシリズマブは、単独で、またはコルチコステロイド療法と組み合わせて投与することができる。トシリズマブに対して12～18時間で不十分な臨床改善または応答不良の、継続性または進行性のCRS症状を有する患者は、高用量コルチコステロイド療法、一般的にヒドロコルチゾン100mg IVまたはメチルプレドニゾロン1～2mg/kgで処置される場合がある。より重症の血行動態不安定またはより重症の呼吸器症状を有する患者では、患者は、CRSのクールの初期に高用量コルチコステロイド療法が投与される場合がある。CRS管理のガイダンスは、公表された基準に基づき得る（Lee et al. (2019) Biol Blood Marrow Transplant, doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758; Neelapu et al. (2018) Nat Rev Clin Oncology, 15:47; Teachey et al. (2016) Cancer Discov, 6(6):664-679）。

CRSの臨床徴候と同時発生的に、マクロファージ活性化症候群（MAS）または血球貪食性リンパ組織球症（HLH）に一致する特徴が、CAR-T療法で処置された患者で観察されている（Henter, 2007）。MASは、CRSから起こる免疫活性化に対する反応のように見え、したがって、CRSの徴候とみなすべきである。MASは、HLH（同じく免疫刺激に対する反応）と類似している。MASの臨床的症候群は、高グレードの非弛張性の発熱、3系統のうち少なくとも2つを冒す血球減少、および肝脾腫によって特徴づけられる。これは、高い血清フェリチン、可溶性インターロイキン-2受容体、およびトリグリセリド、ならびに循環ナチュラルキラー（NK）活性の減少に関連する。

本発明のCARを含む改変免疫細胞は、本明細書において記載される処置方法に使用されうる。一局面では、本発明は、本明細書に開示される改変免疫細胞または前駆細胞のいずれか1つを対象に投与する段階を含む、その必要のある対象においてがんを処置する方法を含む。本発明のさらに別の局面は、本明細書に開示される方法のいずれか1つによって生成される改変免疫細胞または前駆細胞を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象においてがんを処置する方法を含む。

本発明の一局面は、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。該方法は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む。CARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域を含む。

本発明の別の局面は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供し、その際、CARは、SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

本発明のさらに別の局面は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を含み、その際、CARは、SEQ ID NO：10またはSEQ ID NO：11またはSEQ ID NO：21またはSEQ ID NO：22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む。

本発明の別の局面は、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供し、その際、CARは、SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：24またはSEQ ID NO：55またはSEQ ID NO：56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書に開示される方法のいずれかは、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）を投与する段階をさらに含むことができ、その際、改変細胞はBiTEを分泌する。ある特定の態様では、誘導性BiTEは、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、BiTEは、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である。ある特定の態様では、BiTEは、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である。ある特定の態様では、BiTEは、改変T細胞と同時投与される。ある特定の態様では、方法は、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性BiTE、および免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、その際、改変細胞は、BiTEおよび免疫チェックポイント阻害剤を分泌する。ある特定の態様では、BiTEおよび免疫チェックポイント阻害剤は、改変T細胞と同時投与される。

IL13Rα2と結合することが可能な第1の抗原結合ドメインを含む第1のCAR；およびEGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な第2の抗原結合ドメインを含む第2のCARを含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法もまた、提供される。

別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のCAR、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。第1のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域を含む。HCDR1は、アミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2は、アミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3は、アミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む。LCDR1は、アミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2は、アミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3は、アミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む。第2のCARは、3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域および3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域を含む。HCDR1は、アミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2は、アミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3は、アミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む。LCDR1は、アミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2は、アミノ酸配列HGINLDD（SEQ ID NO：143）またはHGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3は、アミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む。

さらに別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供する。第1のCARは、SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。第2のCARは、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、第2のCARは、SEQ ID NO：144またはSEQ ID NO：145と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：146またはSEQ ID NO：147と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

なお別の局面では、本発明は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を含み、その際、第1のCARは、SEQ ID NO：10または11または21または22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：34、44、または142と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む。

本発明の別の局面は、IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法を提供し、その際、第1のCARは、SEQ ID NO：23または24または55または56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含み；第2のCARは、SEQ ID NO：36または38または197と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。

I. 免疫細胞の拡大増殖
CARを発現させるための細胞の改変の前であろうと後であろうと、細胞を、例えば米国特許第6,352,694号；同第6,534,055号；同第6,905,680号；同第6,692,964号；同第5,858,358号；同第6,887,466号；同第6,905,681号；同第7,144,575号；同第7,067,318号；同第7,172,869号；同第7,232,566号；同第7,175,843号；同第5,883,223号；同第6,905,874号；同第6,797,514号；同第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載される方法を使用して、活性化させ、その数を拡大増殖させることができる。例えば、本発明のT細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびT細胞表面の共刺激分子を刺激するリガンドが結びついている表面と接触することにより、拡大増殖する場合がある。特に、T細胞集団は、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片または抗CD2抗体との接触により、あるいはカルシウムイオノフォアと一緒にプロテインキナーゼC活性化因子（例えばブリオスタチン）と接触することにより、刺激されうる。T細胞表面のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞を、抗CD3抗体および抗CD28抗体と、T細胞の増殖を刺激するために適した条件下で接触させることができる。抗CD28抗体の例は、9.3、B-T3、XR-CD28（Diaclone, Besancon, France）を含み、これらを本発明に使用することができ、同様に、当技術分野において公知の他の方法および試薬も使用することができる（例えば、ten Berge et al., Transplant Proc. (1998) 30(8): 3975-3977；Haanen et al., J. Exp. Med. (1999) 190(9): 1319-1328；およびGarland et al., J. Immunol. Methods (1999) 227(1-2): 53-63を参照されたい）。

本明細書に開示される方法によってT細胞を拡大増殖させることは、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、もしくはそれより大きく、ならびにそれらの間のあらゆるすべての整数（whole integer）倍または部分整数（partial integer）倍にすることができる。一態様では、T細胞は、約20倍～約50倍の範囲で拡大増殖する。

培養に続き、培養装置中の細胞培地中で、細胞が集密または高い細胞密度に達する期間、または達するまで、細胞を別の培養装置に植え継ぐ前に最適な植え継ぎのために、T細胞をインキュベートすることができる。培養装置は、細胞をインビトロ培養するために通常使用される任意の培養装置であることができる。好ましくは、細胞を別の培養装置に植え継ぐ前の集密レベルは70％以上である。より好ましくは、集密のレベルは90％以上である。期間は、細胞のインビトロ培養に適した任意の時間であることができる。T細胞培地は、T細胞の培養中の、任意の時間に取り替えられる場合がある。好ましくは、T細胞培地は、約2～3日毎に取り替えられる。次いでT細胞が、培養装置から回収され、それから、T細胞を直ちに使用することができ、またはその後の使用のために凍結保存して保管することができる。一態様では、本発明は、拡大増殖したT細胞を凍結保存することを含む。T細胞に核酸を導入する前に、凍結保存されたT細胞は解凍される。

別の態様では、方法は、T細胞を単離する段階およびT細胞を拡大増殖する段階を含む。別の態様では、本発明は、拡大増殖の前にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様では、凍結保存されたT細胞は、キメラ膜タンパク質をコードするRNAをエレクトロポレーションするために解凍される。

細胞をエクスビボ拡大増殖するための別の手順は、米国特許第5,199,942号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。拡大増殖、例えば米国特許第5,199,942号に記載されているものは、本明細書において記載される他の拡大増殖方法に代替的または追加的であることができる。簡潔には、T細胞のエクスビボ培養および拡大増殖は、米国特許第5,199,942号に記載されているものなどの細胞増殖因子、またはflt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドなどの他の因子の添加を含む。一態様では、T細胞を拡大増殖することは、T細胞を、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子と共に培養することを含む。

本明細書において記載される培養する段階（本明細書において記載される作用物質との接触またはエレクトロポレーションの後）は、非常に短い、例えば、24時間未満、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23時間であることができる。本明細書においてさらに記載される培養する段階（本明細書において記載される作用物質との接触）は、より長い、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日、またはそれ以上であることができる。

培養細胞を記載するために様々な用語が使用される。細胞培養物は、一般的に、生きた生物から取得され、制御された条件下で成長された細胞を指す。初代細胞培養物は、生物から直接取得された、最初の継代培養前の細胞、組織または器官の培養物である。細胞は、細胞の成長および／または分裂を容易にする条件下で成長培地中に入れられると、培養で拡大増殖され、結果としてより大きな細胞集団をもたらす。細胞が培養で拡大増殖されると、細胞の増殖速度は、典型的には、別途に倍加時間として知られる、細胞数が倍増するために要する時間によって測定される。

継代培養の各ラウンドは、植え継ぎと称される。細胞が継代培養されると、それらは、植え継がれたと称される。細胞、または細胞株の特定集団は、時に、それが植え継がれた回数により称される、または特徴づけられる。例えば、10回植え継がれた培養細胞集団は、P10培養物と称される場合がある。初代培養物、すなわち、組織から細胞を単離後の最初の培養物は、P0と称される。最初の継代後、細胞は二次培養物（P1または植え継ぎ1回目）と記載される。2回目の継代後、細胞は三次培養物（P2または植え継ぎ2回目）になる、などである。植え継ぎ期間に多数の集団倍加があり得ることが、当業者によって理解されるであろう。したがって、培養物の集団倍加数は、植え継ぎ回数よりも大きい。植え継ぎにはさまれた期間の細胞の拡大増殖（すなわち、集団倍加数）は、播種密度、基質、培地、および植え継ぎにはさまれた時間を含むが、それに限定されるわけではない多数の要因に依存する。

一態様では、細胞は、数時間（約3時間）～約14日またはその間の任意の時間整数値だけ培養されうる。T細胞培養に適した条件は、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-ガンマ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-ベータ、およびTNF-α、または当業者に公知の、細胞成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および生存能力に必要な因子を含有しうる適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640、またはX-vivo 15、（Lonza））を含む。細胞の成長のための他の添加物は、界面活性剤、プラズマネート（plasmanate）、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、それに限定されるわけではない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加された、無血清か、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは規定のセットのホルモン、および／またはT細胞の成長および拡大増殖に十分な量のサイトカインが補充されたかのいずれかの、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerを含むことができる。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物中にのみ含まれ、対象に注入されることになる細胞の培養物中には含まれない。標的細胞は、成長を支援するために必要な条件下で、例えば適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気+5％ CO₂）で維持される。

T細胞を培養するために使用される培地は、T細胞を共刺激することができる作用物質を含みうる。例えば、CD3を刺激することができる作用物質は、CD3に対する抗体であり、CD28を使用することができる作用物質は、CD28に対する抗体である。本明細書に開示される方法によって単離される細胞は、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれより大きく拡大増殖することができる。一態様では、T細胞は、約20倍～約50倍、またはそれ以上の範囲で拡大増殖する。一態様では、ヒト制御性T細胞は、抗CD3抗体をコーティングしたKT64.86人工抗原提示細胞（aAPC）を介して拡大増殖される。T細胞を拡大増殖および活性化するための方法は、米国特許第7,754,482号、同第8,722,400号、および同第9,555,105号に見出すことができ、これらの内容は、それらの全体で本明細書に組み入れられる。

一態様では、T細胞を拡大増殖する方法は、拡大増殖されたT細胞をさらなる適用のために単離することをさらに含むことができる。別の態様では、拡大増殖する方法は、拡大増殖されたT細胞のその後のエレクトロポレーションに続いて培養することをさらに含むことができる。その後のエレクトロポレーションは、作用物質をコードする核酸を、拡大増殖されたT細胞集団中に導入すること、例えば核酸を、拡大増殖されたT細胞に形質導入すること、拡大増殖されたT細胞にトランスフェクトすること、または拡大増殖されたT細胞にエレクトロポレーションすることを含む場合があり、その際、作用物質は、T細胞をさらに刺激する。作用物質は、さらなる拡大増殖、エフェクター機能、または別のT細胞機能を刺激することなどによって、T細胞を刺激しうる。

J. 遺伝子改変免疫細胞を産生する方法
本開示は、腫瘍免疫療法、例えば養子免疫療法のために本発明の改変免疫細胞またはその前駆細胞（例えばT細胞）を産生または生成するための方法を提供する。

いくつかの態様では、CARは、発現ベクターにより細胞に導入される。本発明のCARをコードする核酸配列を含む発現ベクターが、本明細書に提供される。適切な発現ベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、操作ハイブリッドウイルス、Sleeping Beauty、Piggybakなどのトランスポゾン媒介ベクター、およびPhi31などのインテグラーゼを含むが、それに限定されるわけではないネイキッドDNAを含む。いくつかの他の適切な発現ベクターは、単純ヘルペスウイルス（HSV）およびレトロウイルス発現ベクターを含む。

ある特定の態様では、CARをコードする核酸は、ウイルス形質導入を介して細胞に導入される。ある特定の態様では、ウイルス形質導入は、免疫細胞または前駆細胞を、CARをコードする核酸を含むウイルスベクターと接触させることを含む。ある特定の態様では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。ある特定の態様では、AAVベクターは、AAV6に由来する5'ITRおよび3'ITRを含む。ある特定の態様では、AAVベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）を含む。ある特定の態様では、AAVベクターは、ポリアデニル化（ポリA）配列を含む。ある特定の態様では、ポリA配列は、ウシ成長ホルモン（BGH）のポリA配列である。

アデノウイルス発現ベクターは、ゲノムDNAへの組み込み能が低いが、宿主細胞のトランスフェクト効率が高いアデノウイルスをベースとする。アデノウイルス発現ベクターは、（a）発現ベクターのパッケージングを支援し、（b）最終的に宿主細胞においてCARを発現するために十分なアデノウイルス配列を含有する。いくつかの態様では、アデノウイルスゲノムは、本発明の発現ベクターを製造するために、外来DNA配列（例えば、CARをコードする核酸）が挿入されて、アデノウイルスDNAの大きな片を置換する場合がある、36kbの直鎖二本鎖DNAである（例えば、Danthinne and Imperiale, Gene Therapy (2000) 7(20): 1707-1714を参照されたい）。

別の発現ベクターは、アデノウイルス共役系を利用するアデノ随伴ウイルス（AAV）をベースとする。このAAV発現ベクターは、宿主ゲノムへの高い組み込み頻度を有する。AAV発現ベクターは、非分裂細胞に感染することができ、したがって、これによりAAV発現ベクターは、例えば組織培養またはインビボで遺伝子を哺乳動物細胞内に送達するために有用になる。AAVベクターは、感染性について広い宿主範囲を有する。AAVベクターの生成および使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号および同第4,797,368号に記載されている。

レトロウイルス発現ベクターは、宿主ゲノム中に組み込むこと、大量の外来遺伝物質を送達すること、広域スペクトルの種および細胞型に感染すること、ならびに特別な細胞株にパッケージングされることが可能である。レトロウイルスベクターは、複製欠損ウイルスを産生するためにある特定の位置で核酸（例えば、CARをコードする核酸）をウイルスゲノム中に挿入することによって構築される。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染することが可能であるが、CARの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を要する。

レンチウイルスベクターは、通常のレトロウイルス遺伝子gag、pol、およびenvに加えて、調節機能または構造機能を有する他の遺伝子を含有する複合レトロウイルスであるレンチウイルスに由来する（例えば、米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照されたい）。レンチウイルスのいくつかの例は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1、HIV-2）およびサル免疫不全ウイルス（SIV）を含む。レンチウイルスベクターは、HIV病原遺伝子を多重に弱毒化することによって生成されており、例えば、遺伝子env、vif、vpr、vpuおよびnefが欠失され、ベクターを生物学的に安全にする。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することが可能であり、例えば、CARをコードする核酸のインビボおよびエクスビボの両方の遺伝子導入および発現のために使用することができる（例えば米国特許第5,994,136号を参照されたい）。

本開示の核酸を含む発現ベクターを、当業者に公知の任意の手段によって宿主細胞に導入することができる。発現ベクターは、所望により、トランスフェクションのためのウイルス配列を含みうる。あるいは、発現ベクターは、融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクション、またはその他によって導入されうる。宿主細胞は、発現ベクターの導入前に培養で成長および拡大増殖され、続いてベクターの導入および組み込みに適した処理を受ける場合がある。次いで、宿主細胞が拡大増殖され、ベクター中に存在するマーカーによりスクリーニングされる場合がある。使用されうる様々なマーカーは、当技術分野において公知であり、hprt、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシン耐性などを含みうる。本明細書において用いられる、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という用語は、互換的に使用されうる。いくつかの態様では、宿主細胞は、免疫細胞またはその前駆細胞、例えば、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である。

本発明はまた、本開示のCARを含み、それを安定的に発現する遺伝子操作された細胞を提供する。いくつかの態様では、遺伝子操作された細胞は、遺伝子操作されたTリンパ球（T細胞）、ナイーブT細胞（TN）、メモリーT細胞（例えば、中枢性メモリーT細胞（TCM）、エフェクターメモリー細胞（TEM））、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）、および治療的に関連する子孫をもたらすことが可能なマクロファージである。ある特定の態様では、遺伝子操作された細胞は自家細胞である。ある特定の態様では、改変細胞は、T細胞の消耗に耐性である。

改変細胞（例えば、CARを含む）は、宿主細胞に、本開示の核酸を含む発現ベクターを安定的にトランスフェクトすることによって産生されうる。本開示の改変細胞を生成するための追加的な方法は、化学的変換方法（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソームおよび／もしくは陽イオン性ポリマーを使用する）、非化学的変換方法（例えば、エレクトロポレーション、光学的変換、遺伝子電気泳動転写および／もしくは流体力学的送達）ならびに／または粒子ベースの方法（例えば、インペールフェクション（impalefection）、遺伝子銃および／もしくはマグネトフェクションを使用する）を含むが、それに限定されるわけではない。本開示のCARを発現している、トランスフェクトされた細胞は、エクスビボで拡大増殖されうる。

発現ベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、微量注入、エレクトロポレーション、およびその他を含む。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照されたい。発現ベクターを宿主細胞に導入するための化学的方法は、巨大分子複合体などのコロイド分散系、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベース系を含む。

使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）は、Sigma（St. Louis, MO）から得ることができ；リン酸ジセチル（「DCP」）は、K & K Laboratories（Plainview, NY）から得ることができ；コレステロール（「Choi」）は、Calbiochem-Behringから得ることができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.（Birmingham, AL）から得られる場合がある。脂質のクロロホルムまたはクロロホルム／メタノール保存溶液は、約-20℃で貯蔵することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用されうる。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集物の生成によって形成される多様な単一膜および多重膜脂質媒体を包含する一般名称である。リポソームは、リン脂質二重膜および内部の水性媒質を有する小胞構造を有すると特徴づけることができる。多重膜リポソームは、水性媒質により隔てられている複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は、閉鎖構造を形成する前に自己再編成を受け、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を封入する（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。通常の小胞構造と異なる構造を溶液中に有する組成物もまた包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を想定する場合があり、または単に脂質分子の不均一凝集物として存在する場合がある。リポフェクタミン-核酸複合体も企図されている。

宿主細胞内の核酸の存在を確認するために、外因性核酸を宿主細胞に導入する、またはその他の方法で細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用される方法にかかわらず、多様なアッセイが行われる場合がある。そのようなアッセイは、例えば、当業者に周知の分子生物学アッセイ、例えばサザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、RT-PCRおよびPCR；生化学アッセイ、例えば、免疫学的手段（ELISAおよびウエスタンブロット）によってまたは本明細書において記載されるアッセイによって、例えば特定のペプチドの存在または非存在を検出して本発明の範囲内に含まれる作用物質を同定することを含む。

一態様では、宿主細胞に導入される核酸はRNAである。別の態様では、RNAは、インビトロ転写されたRNAまたは合成RNAを含むmRNAである。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で生成されたテンプレートを使用するインビトロ転写によって産生されうる。適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを使用するインビトロmRNA合成のために、任意の供給源からの関心対象のDNAをPCRによりテンプレートに直接変換することができる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列または任意の他の適切なDNA供給源であり得る。

PCRは、mRNAのインビトロ転写のためのテンプレートを生成するために使用される場合があり、それが次いで細胞に導入される。PCRを実行するための方法は、当技術分野において周知である。PCRに使用するためのプライマーは、PCRのためのテンプレートとして使用されることになるDNAの領域と実質的に相補的な領域を有するように設計される。本明細書において用いられる「実質的に相補的な」は、プライマー配列における塩基の大部分またはすべてが相補的なヌクレオチド配列を指す。実質的に相補的な配列は、PCRのために使用されるアニーリング条件下で意図されるDNA標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、DNAテンプレートの任意の部分と実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーを、5' UTRおよび3' UTRを含む、細胞において通常転写される遺伝子部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。プライマーはまた、関心対象の特定のドメインをコードする遺伝子部分を増幅するように設計されうる。一態様では、プライマーは、5' UTRおよび3' UTRのすべてまたは部分を含む、ヒトcDNAのコード領域を増幅するように設計される。PCRに有用なプライマーは、当技術分野において周知の合成方法によって生成される。「フォワードプライマー」は、増幅されることになるDNA配列の上流であるDNAテンプレート上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチド領域を含有するプライマーである。「上流」は、コード鎖に関して、増幅されることになるDNA配列に対して5'の位置を指すために本明細書において使用される。「リバースプライマー」は、増幅されることになるDNA配列の下流である二本鎖DNAテンプレートと実質的に相補的であるヌクレオチド領域を含有するプライマーである。「下流」は、コード鎖に関して、増幅されることになるDNA配列に対して3'の位置を指すために本明細書において使用される。

RNAの安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造もまた、使用されうる。RNAは、好ましくは、5' UTRおよび3' UTRを有する。一態様では、5' UTRは、0～3000ヌクレオチド長である。コード領域に付加されることになる5' UTR配列および3' UTR配列の長さを、UTRの異なる領域とアニールするPCR用のプライマーを設計することを含むが、それに限定されるわけではない異なる方法によって変更することができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクションに続いて最適な翻訳効率を達成するために必要な5' UTRおよび3' UTRの長さを改変することができる。

5' UTRおよび3' UTRは、関心対象の遺伝子についての天然に存在する内在性5' UTRおよび3' UTRであることができる。あるいは、フォワードプライマーおよびリバースプライマー中にUTR配列を組み込むことによって、またはテンプレートの任意の他の改変によって、関心対象の遺伝子に内在しないUTR配列を付加することができる。関心対象の遺伝子に内在しないUTR配列の使用は、RNAの安定性および／または翻訳効率を改変するために有用であることができる。例えば、3' UTR配列中のAUリッチエレメントがmRNAの安定性を低下できることが公知である。したがって、当技術分野において周知であるUTRの性質をベースとして、転写されたRNAの安定性を増大させるように、3' UTRを選択または設計することができる。

一態様では、5' UTRは、内在遺伝子のKozak配列を含有することができる。あるいは、関心対象の遺伝子に内在しない5' UTRが上記のPCRによって付加される場合、5' UTR配列を付加することによってコンセンサスKozak配列を再設計することができる。Kozak配列は、いくつかのRNA転写物の翻訳効率を増大させることができるが、効率的な翻訳を可能にするためにすべてのRNAが必要なわけではないように見える。多くのmRNAへのKozak配列の必要は、当技術分野において公知である。他の態様では、5' UTRは、そのRNAゲノムが細胞内で安定なRNAウイルスに由来することができる。他の態様では、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために、様々なヌクレオチド類似体を3' UTRまたは5' UTR中に使用することができる。

遺伝子クローニングの必要なしにDNAテンプレートからのRNA合成を可能にするために、転写されることになる配列上流のDNAテンプレートに転写プロモーターを結びつけるべきである。RNAポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5'末端に付加される場合、RNAポリメラーゼプロモーターは、PCR産物中の、転写されることになるオープンリーディングフレームの上流に組み込まれるようになる。一態様では、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載されるT7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、T3およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含むが、それに限定されるわけではない。T7、T3およびSP6プロモーターについてのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。

一態様では、mRNAは、細胞におけるリボソームの結合、翻訳開始およびmRNAの安定性を決定する5'末端のキャップと、3'ポリ（A）尾部との両方を有する。RNAポリメラーゼは、環状DNAテンプレート、例えば、プラスミドDNAに対して、真核細胞における発現に適さない長鎖コンカテマー産物を産生する。3' UTRの末端で直鎖化されたプラスミドDNAの転写の結果として、たとえ転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物のトランスフェクションに有効でない通常サイズのmRNAがもたらされる。

直鎖DNAテンプレート上で、ファージT7 RNAポリメラーゼは、転写物の3'末端をテンプレートの最終塩基を超えて伸ばすことができる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)）。

100T尾部などのポリT尾部（サイズは50～5000Tであることができる）を含有するリバースプライマーを使用することによるPCRの間に、またはDNAライゲーションもしくはインビトロ組み換えを含むが、それに限定されるわけではない任意の他の方法によるPCRの後に、転写DNAテンプレートのポリA/Tセグメントを産生することができる。ポリ（A）尾部はまた、RNAに安定性を提供し、それらの分解を低減する。一般的に、ポリ（A）尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関関係にある。一態様では、ポリ（A）尾部は、100～5000アデノシンである。

RNAのポリ（A）尾部を、大腸菌（E. coli）ポリAポリメラーゼ（E-PAP）などのポリ（A）ポリメラーゼを使用するインビトロ転写後にさらに伸長することができる。一態様では、100ヌクレオチドから300～400ヌクレオチドへのポリ（A）尾部の長さを増大させる結果として、RNAの翻訳効率に約2倍の増大をもたらす。追加的に、3'末端への異なる化学基の結びつきは、mRNAの安定性を増大させることができる。そのような結びつきは、改変／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含有することができる。例えば、ATP類似体を、ポリ（A）ポリメラーゼを使用してポリ（A）尾部に組み込むことができる。ATP類似体は、RNAの安定性をさらに増大させることができる。

5'キャップはまた、RNA分子に安定性を提供する。好ましい態様では、本明細書に開示される方法によって産生されるRNAは、5'キャップを含む。5'キャップは、当技術分野において公知の技法および本明細書において記載される技法を用いて提供される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 （2001）；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。

いくつかの態様では、インビトロ転写されたRNAなどのRNAは、細胞内にエレクトロポレーションされる。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、および界面活性剤などの、細胞の透過性および生存度を促進する因子を含有することができる、細胞のエレクトロポレーションに適した任意の溶質が含まれることができる。

いくつかの態様では、本開示のCARをコードする核酸は、RNA、例えば、インビトロ合成されたRNAであろう。RNAのインビトロ合成のための方法は、当技術分野において公知であり；任意の公知の方法を使用して、CARをコードする配列を含むRNAを合成することができる。宿主細胞にRNAを導入するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Zhao et al. Cancer Res. (2010) 15: 9053を参照されたい。CARをコードするヌクレオチド配列を含むRNAを宿主細胞に導入することは、インビトロ、エクスビボまたはインビボで行うことができる。例えば、宿主細胞（例えば、NK細胞、細胞傷害性Tリンパ球など）に、CARをコードするヌクレオチド配列を含むRNAをインビトロまたはエクスビボでエレクトロポレーションすることができる。

本開示の方法は、遺伝的に改変されたT細胞が標的がん細胞を殺滅する能力の評価を含み、がん、幹細胞、急性および慢性感染、ならびに自己免疫疾患の分野での基礎研究および治療法におけるT細胞活性のモジュレーションに適用することができる。

方法はまた、例えば、プロモーターまたはインプットRNAの量を変化させることによって発現レベルを広範囲にわたり制御する能力を提供し、発現レベルを個別に調節することを可能にする。さらに、mRNA産生のPCRベース技法は、それらのドメインの異なる構造および組み合わせを有するmRNAの設計を大きく促進する。

本発明のRNAトランスフェクション方法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過性であり、ベクターを含まないことである。RNA導入遺伝子は、リンパ球に送達し、短時間のインビトロ細胞活性化後にその中で、任意の追加的なウイルス配列の必要なしに最小発現性のカセットとして発現させることができる。これらの条件下で、宿主細胞ゲノム中への導入遺伝子の組み込みは起こりそうにない。RNAのトランスフェクションの効率およびそれがリンパ球集団全体を均一に改変する能力のため、細胞のクローニングは必要ない。

インビトロ転写されたRNA（IVT-RNA）によるT細胞の遺伝的改変は、どちらも様々な動物モデルにおいて連続的に試験された2つの異なる戦略を利用する。細胞に、インビトロ転写されたRNAがリポフェクションまたはエレクトロポレーションによりトランスフェクトされる。移入されたIVT-RNAの長期発現を達成するために、様々な改変を用いてIVT-RNAを安定化することが望ましい。

インビトロ転写のためのテンプレートとして標準化された方法で利用され、安定化されたRNA転写物が産生されるように遺伝的に改変されている、いくつかのIVTベクターが、文献から公知である。現在、当技術分野において使用されるプロトコールは、以下の構造を有するプラスミドベクターをベースとする：RNA転写を可能にする5'RNAポリメラーゼプロモーター、それに続く関心対象の遺伝子、その3'および／または5'に隣接する非翻訳領域（UTR）、ならびに50～70Aヌクレオチドを含有する3'ポリアデニルカセット。インビトロ転写前に、環状プラスミドは、II型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）によってポリアデニルカセットの下流で直鎖化される。したがって、ポリアデニルカセットは、転写物中でその後のポリ（A）配列に対応する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドは、直鎖化後に酵素切断部位の一部として残り、ポリ（A）配列を3'末端で伸長またはマスクする。この非生理学的オーバーハングが、そのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響するかどうかは明らかでない。

別の局面では、RNA構築物は、エレクトロポレーションによって細胞内に送達される。例えば、US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1に教示されるような、核酸構築物の製剤および哺乳動物細胞内へのエレクトロポレーションの方法論を参照されたい。任意の公知の細胞型のエレクトロポレーションに必要とされる電場強度を含む様々なパラメーターは、一般的に、関連する研究文献のみならず、当技術分野における多数の特許および出願から公知である。例えば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号、および米国特許第7,173,116号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療適用のための装置、例えば、MedPulser（商標）DNA Electroporation Therapy System（Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.）は、市販されており、米国特許第6,567,694号；米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号、および米国特許第6,233,482号などの特許に記載されている；エレクトロポレーションはまた、例えばUS20070128708A1に記載されるように細胞のインビトロトランスフェクションのために使用されうる。エレクトロポレーションはまた、核酸を細胞内にインビトロ送達するために利用されうる。したがって、当業者に公知の多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用した、発現構築物を含む核酸の細胞内へのエレクトロポレーション媒介投与は、関心対象のRNAを標的細胞に送達するための刺激的な新手段を提示する。

K. 薬学的組成物および製剤
また、本発明の免疫細胞集団、そのような細胞を含有するおよび／またはそのような細胞が濃縮された組成物、例えば、CARを発現する細胞が、組成物中の総細胞またはT細胞もしくはCD8+細胞もしくはCD4+細胞などのある特定の種類の細胞に対して、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ超を占める、組成物も提供される。組成物は中でも、養子細胞療法のためなどの、投与のための薬学的組成物および製剤である。また、細胞および組成物を、対象、例えば、患者に投与するための治療法も提供される。

また、薬学的組成物および製剤を含めた投与のための細胞を含む組成物、例えば、所与の用量またはその画分での投与のための細胞数を含む単位用量形態組成物も提供される。薬学的組成物および製剤は、一般には、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。いくつかの態様では、組成物は、少なくとも1つの追加の治療剤を含む。

用語「薬学的製剤」は、それに含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせるような形態の調製物であって、製剤が投与されるであろう対象に対して許容できないほど有毒な追加の成分を含有しない、調製物を指す。「薬学的に許容される担体」は、対象に対して無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、緩衝液、賦形剤、安定剤または保存料を含むが、それに限定されるわけではない。いくつかの局面では、担体の選択は、一部には、特定の細胞によっておよび／または投与方法によって決定される。したがって、多種多様な適切な製剤がある。例えば、薬学的組成物は、保存料を含有することができる。適切な保存料は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウムおよび塩化ベンザルコニウムを含み得る。いくつかの局面では、2つまたはそれよりも多い保存料の混合物が使用される。保存料またはその混合物は、典型的には、全組成物の重量に対して約0.0001％～約2％の量で存在する。担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)により記載されている。薬学的に許容される担体は、一般には、採用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤を含むが、それに限定されるわけではない。

いくつかの局面では、緩衝剤が組成物中に含まれる。適切な緩衝剤は、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウムならびに様々な他の酸および塩を含む。いくつかの局面では、2種またはそれより多くの緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、全組成物の重量に対して約0.001％～約4％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)に、より詳細に記載されている。

製剤は、水溶液を含むことができる。製剤または組成物はまた、細胞により処置される特定の適応症、疾患、または状態に有用な1つよりも多い活性成分、好ましくは細胞を補完する活性であって、それぞれが、互いに悪影響を及ぼさない活性を有するもの、を含有し得る。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に効果的な量で組み合わされて存在する。したがって、いくつかの態様では、薬学的組成物は、他の薬学的に活性な作用物質または薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチンおよび／またはビンクリスチンをさらに含む。薬学的組成物は、いくつかの態様では、疾患または状態を治療または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で細胞を含有する。治療有効性または予防有効性は、いくつかの態様では、処置される対象を定期的に評価することによってモニタリングされる。細胞の単回ボーラス投与によって、細胞の複数回ボーラス投与によって、または細胞の連続注入投与によって、所望の投与量を送達することができる。

製剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺内、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔、舌下または坐剤投与のための製剤を含む。いくつかの態様では、細胞集団は、非経口投与される。用語「非経口」は、本明細書において使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内および腹腔内投与を含む。いくつかの態様では、細胞は、静脈内、腹腔内または皮下注射による末梢全身送達を使用して対象に投与される。組成物は、いくつかの態様では、無菌の液体調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液または粘性組成物として提供され、これらは、いくつかの局面では、選択されたpHに緩衝化され得る。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物よりも調製しやすい。追加的に、液体組成物が、投与に、とりわけ、注射による投与にいくらか便利である。他方で、粘性組成物を、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすのに適した粘性範囲内で製剤化することができる。液体組成物または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる、担体を含むことができる。

無菌注射液は、溶媒中に、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤または賦形剤と混合された溶媒中に細胞を取り入れることによって、調製することができる。組成物は、所望の投与経路および調製に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化もしくは粘性増強添加物、保存料、着香剤および／または着色剤などの補助物質を含有することができる。いくつかの局面では、適切な調製物を調製するために標準的な教科書に助言を求めてよい。

抗菌保存料、酸化防止剤、キレート剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールおよびソルビン酸によって保証することができる。注射用薬学的剤形の長期吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらすことができる。

インビボ投与に使用されるべき製剤は、一般に無菌のものである。無菌は、例えば滅菌濾過膜で濾過することによって、容易に達成され得る。

本明細書において言及または引用される論文、特許および特許出願、ならびにすべての他の文書および電子的に入手可能な情報の内容は、それぞれの個々の刊行物が参照によって組み入れられることが具体的かつ個々に示されているかのように、参照によってそれらの全体が同程度に本明細書に組み入れられる。出願人等は、そのような任意の論文、特許、特許出願または他の物理的および電子的文書からのあらゆる資料および情報を本出願中に物理的に組み入れる権利を有する。

本発明は、その具体的な態様を参照しながら記載されてきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱しなければ、様々な変更を行っても等価物に置換してもよいことが、当業者によって理解されるべきである。本明細書に開示の態様の範囲から逸脱しなければ、適切な等価物を使用して本明細書に記載の方法の他の適切な改変および適合を行ってよいことが、当業者には容易に明らかとなろう。加えて、多くの改変を行って、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、1つまたは複数のプロセス段階を本発明の目的、精神および範囲に適合させてもよい。そのような改変はすべて、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。ここでは特定の態様を詳細に記載してきたが、同じものが以下の実施例を参照することによってより明確に理解され、以下の実施例は、例証を目的としてのみ含まれるものであって、限定を意図するものではない。

実験的実施例
以下の実施例を参照して本発明をこれから説明する。これらの実施例は、例証だけの目的で提供されるものであって、本発明は、これらの実施例に限定されるわけではなく、本明細書において提供される教示の結果として明白であるすべての変形を包含する。

材料および方法
研究デザイン：本研究の目的は、完全ヒト化IL13Rα2特異的標的指向CAR T細胞を設計し、悪性神経膠腫などのIL13Rα2発現腫瘍を有する患者における治療剤としての潜在的使用のための、全身送達および局所送達による異なるチェックポイント遮断による組み合わせ療法の可能性を試験することであった。IL13Rα2を発現しているイヌ悪性腫瘍を処置するために、イヌIL13Rα2標的指向CAR T細胞もまた生成した。本研究において、2つのマウスIL13Rα2標的指向scFvおよびそれらのヒト化scFvs CAR T細胞をクローニングし、インビトロで腫瘍細胞株またはヒト正常細胞株と共培養することによって試験した。ヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞の機能もまた、皮下または同所性異種移植神経膠腫マウスモデルへの静脈内注入によって試験した。チェックポイント受容体の発現を、T細胞のインビトロ刺激後に検出した。腫瘍サイズをノギスにより測定し、神経膠腫マウスモデルにおいてチェックポイント遮断（抗PD-1、抗CTLA-4および抗TIM-3）と組み合わせたIL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞群またはEGFRvIII標的指向（2173BBz）CAR T細胞群の間で比較した。IL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞を改変して、これらの異なるチェックポイント遮断ミニボディーを発現させて、この戦略による組み合わせ療法の実現可能性をインビトロおよびインビボでさらに調査した。イヌIL13Rα2タンパク質と共培養することによってイヌIL13Rα2標的指向CAR T細胞を選別し、異なるイヌ腫瘍細胞株と共培養することによって確認した。ヒトおよびイヌタンパク質成分ベースのイヌIL13RA2標的指向CAR T細胞を樹立し、イヌ神経膠腫同所性異種移植マウスモデルにおいて試験した。様々な正常ドナーに由来するT細胞を用いて、各実験を複数回実行した。

細胞株および培養：GlutaMAX-1、HEPES、ピルビン酸塩およびペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）を加えたRPMI-1640に10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したもの（R10培地）の中で、ヒト腫瘍細胞株（Sup-T1、JurkatクローンE6-1、A549および293T細胞）およびイヌ腫瘍細胞株（CLBL-1およびGL-1）を維持した。U87をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入し、上述の成分を有するMEM（Richter変法）中で維持した。ヒト神経膠腫細胞株、U251は、Jay Dorsey博士（Department of Radiation Oncology, University of Pennsylvania）によって提供されたものであった。イヌ神経膠腫細胞株、J3Tは、Michael Berens（Cancer and Cell Biology Division, Tgen）によって提供されたものであった。イヌ腫瘍細胞株、Camac2、Cacal3、Cacal5、BW-KOSA、CS-KOSA、MC-KOSAおよびSK-KOSAはすべて、ペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）および10％ FBSを有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で培養した。患者から切除された腫瘍組織からヒト神経膠腫幹細胞株（5077、5430、4860、5377、5560、4806および4892）を単離し（Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine）、ペニシリン／ストレプトマイシン、GlutaMAX-1、B27、上皮増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子（Corning）を有するDMEM/F12中で維持した。D270神経膠腫細胞を成長させ、NSGマウスの右側腹部に植え継いで、それらの神経膠腫のインビボ特徴を保った。J3T細胞株を除き、イヌ腫瘍細胞株は、Nicola Mason（School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania）によって提供されたものであり、インビボ研究のためにEF-1αプロモーターの制御下でコメツキムシ緑色ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するようにレンチウイルスで形質導入されていた。イヌ神経膠腫細胞株、J3Tを、本発明者らの研究室で同じ手順により改変し、同所性異種移植イヌ神経膠腫マウスモデルに使用した。ヒト初代細胞、CD34⁺骨髄細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト末梢気道上皮細胞、ヒト腎上皮細胞、ヒト角化細胞、ヒト神経前駆細胞、ヒト大動脈平滑筋細胞およびヒト肺動脈平滑筋細胞をPromoCell GmbHから購入し、販売業者によって指示された培地中で3～7回の植え継ぎにわたり培養して維持した。

ベクター構築物：ヒトCD8αのリーダー配列、ヒンジおよび膜貫通配列ならびにヒト4-1BBの刺激ドメインおよびCD3ζの配列を有する、pGEMベクター中の第二世代CAR構造は、Jesse Rodriguez（Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania）によって提供されたものであった。マウスIL13Rα2標的指向scFv（07/08）およびヒト化バージョン（WO2014/072888）のアミノ酸配列を、コドン最適化された核酸配列に逆翻訳し、リーダーとヒンジドメインとの間のBamHIおよびBspEI部位にライゲートした。ヒト化07/08 BBz CAR配列を、pGEMベクターからXbaIおよびSalIを用いて消化し、同じ酵素部位を有するpTRPEベクターにライゲートした。ヒト化EGFRvIII標的指向scFvをHu08BBz CAR構造内のBamHIとBspEIとの間にライゲートして、ヒト化IL13Rα2標的指向scFvを置き換えて、ヒト化IL13Rα2 CARと同じ構造を有するヒト化EGFRvIII標的指向CARを構築した。ミニボディー（抗PD-1/CTLA-4/TIM-3 scFv、IgG1のCH3ドメインおよびStrep-tag）の核酸配列をP2Aリボソームスキップ配列と共にpTRPEベクター内のHu08BBz CAR構造の5'にライゲートすることによってミニボディー分泌CAR構造を樹立した（J. H. Kim, et al. PLoS One 6, e18556 (2011)）。ヒト化08（Hu08）scFv配列を、Nicola Mason（School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania）によって提供されたイヌCD8αのリーダー配列、ヒンジおよび膜貫通配列ならびにイヌ4-1BBの共刺激ドメインおよびCD3ζの配列と共にpGEM CD20イヌBBzのBamHIおよびBspEI部位内にライゲートすることによって、イヌIL13Rα2 CAR構築物を生成した。

ヒトT細胞の形質導入およびインビトロ培養：ヒトT細胞の形質導入および培養を、以前に記載されたように実行した（L. A. Johnson, et al. Sci Transl Med 7, 275ra222 (2015)）。簡潔には、単離されたT細胞は、施設内審査委員会により承認されたプロトコールにより非特定化された健康ドナーを使用して、ペンシルバニア大学のヒト免疫学コア（Human Immunology Core）から得られた白血球アフェレーシス産物に由来するものであった。T細胞を、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Life Technologies）をビーズ対細胞比3：1として用いて刺激した。24時間刺激後、レンチウイルスを培養培地に添加し、徹底的に混合して、安定形質導入されたCAR T細胞を産生した。拡大増殖しているヒトT細胞の濃度をCoulter Multisizer（Beckman Coulter）で計算し、30IU/mL 組み換えヒトIL2（rhIL2; Proleukin, Chiron）を補充したR10培地中で1.0～2.0×10⁶/mLに維持した。インビボ研究に使用した、安定形質導入されたヒトCAR T細胞を、移植前に30％ CAR+に正規化した。

イヌT細胞の培養およびインビトロ拡大増殖：ペンシルバニア大学獣医学部で、施設内動物管理使用委員会（IACUC）の承認を受けて、健康な研究用イヌの末梢血から得た白血球アフェレーシス産物からイヌT細胞を収集した。細胞を培養し、前記のように細胞ベースの人工APC（aAPC）を用いて拡大増殖させた（M. K. Panjwani, et al. Mol Ther 24, 1602-1614 (2016)）。簡潔には、ヒトFcγRII（CD32）およびイヌCD86を安定発現するようにレンチウイルスベクターを形質導入したヒト赤白血病細胞株K562を人工APCとして使用したが、これは、Nicola Mason（School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania）によって提供されたものであった。イヌT細胞を拡大増殖させる前に、aAPCに10,000ラド照射し、R10培地で洗浄した。イヌT細胞をaAPCと共に2：1の比で培養して、30IU/mL rhIL2を有するR10培地中に0.5μg/mL マウス抗イヌCD3（Bio-Rad）を有するもの1mLあたり1×10⁶個のイヌT細胞および5×10⁵個のaAPCの終濃度にした。拡大増殖しているイヌT細胞の濃度をCoulter Multisizer（Beckman Coulter）で計算し、rhIL2を有するR10培地1mLあたり1.0～2.0×10⁶個に維持した。

mRNAのインビトロ転写およびエレクトロポレーション：RNAを合成し、以前に記載されたようにエレクトロポレーションした（M. K. Panjwani, et al. Mol Ther 24, 1602-1614 (2016)）。簡潔には、SpeIを用いた消化によってpGEMプラスミドを直鎖化した。T7 mScript Standard mRNA産生システム（CellScript）を製造業者の説明書に従って使用して、mRNAのインビトロ転写を実行して、キャップ側mRNAおよび尾側mRNAを得た。産物を小分けし、使用まで-80℃で保存した。拡大増殖されたT細胞を、Opti-MEM培地（Gibco）で3回洗浄し細胞を1×10⁸個/mLで再懸濁した。10mgのmRNAを1×10⁷個のT細胞と混合し、エレクトロポレーションのためにキュベットに移した。500Vで700μsの間エレクトロポレーションした後、rhIL2を有するR10培地中にT細胞を回収した。

フローサイトメトリー：CARの検出のために、細胞をビオチン化プロテインL（GenScript）、ヤギ抗マウスIgGおよびウサギ抗マウス／ヒトIgG（Jackson ImmunoResearch）で染色し、ストレプトアビジンカップリングPE/FITC（BD Biosciences）の添加によって二次検出を行った。各染色の前および後に、2％ウシ胎児血清を含有するPBS（FACS緩衝液）で細胞を3回洗浄した。APCコンジュゲート型抗IL13Rα1（R&D Systems）、PEコンジュゲート型抗IL13Rα2（BioLegend）をそれらのアイソタイプと共に、および非コンジュゲート型抗EGFRvIII抗体（Novartis）をPEコンジュゲート型抗ウサギIgG（BioLegend）二次染色と共に、これらの標的を検出するために使用した。細胞増殖アッセイを除き、フローサイトメトリーに使用した共培養実験の設定は、96ウェルプレート中、12日拡大増殖されたT細胞を用いて1：1のエフェクター／標的（E：T）比で24または48時間共培養した後であった。CFSEの染色（Thermo Fisher）を製造業者の説明書に従って実行し、T細胞との共培養前に標的細胞に10,000ラド照射した。8日の共培養のために、75％大きく照射された標的細胞を2日目に添加した。脾臓を細切し、細胞ストレーナー（40μm, Falcon）を通して単一細胞懸濁液を洗浄し、赤血球を塩化アンモニウム-カリウム（ACK）溶解緩衝液（Lonza）で溶解した。PBSで洗浄後、細胞のサイズおよび濃度をCoulter Multisizer（Beckman Coulter）で測定した。脾臓および腫瘍の共培養実験においてヒトCD4⁺ T細胞およびCD8⁺ T細胞を生／死生存度染色（Thermo Fisher Scientific）に続くヒトCD45、CD3およびCD8（BioLegend）染色で識別した（図11A）。FITCコンジュゲート型抗ヒトCD69（BioLegend）を使用してT細胞刺激を検出した。BV711コンジュゲート型抗ヒトPD-1、PEコンジュゲート型抗ヒトCTLA-4、BV605コンジュゲート型抗ヒトTIM-3、BV605/PEコンジュゲート型抗ヒトPD-L1、PEコンジュゲート型抗ヒトCD80、BV711/PEコンジュゲート型抗ヒトCD86、FITC/PEコンジュゲート型抗ヒトガレクチン9およびアイソタイプ（BioLegend）を使用して、チェックポイントおよびそれらのリガンドの発現を検出した。BD LSR IIフローサイトメーターを使用して蛍光を評価し、FlowJoソフトウェアでデータを分析した。

細胞内サイトカイン分析：96ウェル丸底組織培養プレート中、CAR形質導入T細胞または非形質導入T細胞（2×10⁶個/mL）を標的細胞（腫瘍、細胞株またはヒト初代細胞）と1：1の比で、ゴルジ阻害剤モネンシンおよびブレフェルジンA（BD Bioscience）の存在下、R10培地に入れて37℃、5％ CO₂で16時間共培養した。T細胞を刺激するためにタンパク質を使用した場合、ヒトIL13Rα2（R&D System）／イヌIL13Rα2（SinoBiological Inc.）またはウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）を、T細胞刺激前に16時間、24ウェル平底組織培養プレート上にコーティングした。細胞を洗浄し、生／死生存度染色で染色し、続いてヒトCD3およびCD8（BioLegend）またはイヌCD3およびCD4（Bio-Rad）について表面染色し、次いで固定および透過処理し、ヒトIFNγ、IL2およびTNFαまたはイヌIFNγについて細胞内染色した。細胞をフローサイトメトリー（BD LSR II）によって分析し、生きた単一細胞のリンパ球およびCD3陽性リンパ球をゲーティングした。

クロム放出アッセイ：CAR発現T細胞の細胞傷害性を、L. A. Johnson, et al. Sci Transl Med 7, 275ra222 (2015) に記載されるように4時間の⁵¹Cr放出アッセイで試験した。1×10⁶個の標的細胞を放射性⁵¹Cr（50μCi）で37℃で1時間標識した。標識後、細胞を非フェノールレッドRPMI培地+5％ FBS 10mLで2回洗浄し、1×10⁶個/mLで再懸濁した。5000個（100μl）の標識標的細胞を96ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。体積100μl中、エフェクター細胞を異なるE：T比（1：1、3：1、10：1および30：1）で添加した。エフェクターおよび標的を37℃で4時間一緒にインキュベートした。各ウェルからの上清を収集し、LumaPlateのフィルター上に移した。フィルターを一晩乾燥させた。β線の放出を読み取る液体シンチレーションカウンターを使用して培養培地中に放出された放射能を測定した。特異的溶解のパーセンテージを以下のように計算した：（試料のカウント-自然カウント）／（最大カウント-自然カウント）×100。

マウスモデル：施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコールに従って、L. A. Johnson, et al. Sci Transl Med 7, 275ra222 (2015) に記載されるようにすべてのマウス実験を行った。同所性モデルについて、2×10⁴個のD270細胞またはJ3T細胞を6～8週齢雌性NSGマウス（JAX）の頭蓋内に植え込んだ。腫瘍細胞をブレグマの右2mmおよび0.1mm後方および脳内深さ3mmに植え込む定位外科的設定を用いて外科的植え込みを行った。術前および術後3日間、マウスを鎮痛薬で処置し、IACUCに従って有害症状についてモニタリングした。皮下モデルにおいて、0日目にNSGマウスにPBS 100μl中の5×10⁵個のD270腫瘍を皮下注射した。1週間後に、PBS 100μl中のCAR T細胞を、尾静脈を介して静脈内注射した。実験の期間中、ノギスを用いてL×Wの2方向で腫瘍サイズを測定した。製造業者の指示（GoldBio）に従ってD-ルシフェリンの腹腔内注射後にXenogen IVISスペクトルでの発光によって腫瘍の進行も評価した。他の研究に適用された投薬量をベースに、腫瘍の植え込みの6日後から4日毎に抗PD-1、抗CTLA-4および抗TIM-3チェックポイント遮断剤（BioLegend）を200μg／マウスで腹腔内注射した（S. F. Ngiow, et al. Cancer Res 71, 3540-3551 (2011)；K. Sakuishi, et al. J Exp Med 207, 2187-2194 (2010)；E. K. Moon, et al. Clin Cancer Res 22, 436-447 (2016)；K. D. Lute, et al. Blood 106, 3127-3133 (2005)。所定のIACUC承認済みエンドポイントに達するまで生存期間を経時的に追跡した。

逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）：抽出されたRNAから逆転写キットを用いてイヌ腫瘍細胞株のcDNAを合成した。Phusionポリメラーゼ（NEB）を使用して、DNA断片を増幅させた。PhusionポリメラーゼのためのPCRプロトコールに示されるように反応を設定した。実験のために設計したプライマーは、

である。35サイクルの反応後、PCR産物を1％アガロースゲル上で泳動させ、ゲルドキュメンテーションシステム（GDS touch, ENDURO）で視覚化した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）：抗PD-1および抗CTLA-4ミニボディーを検出するために、上記のようにT細胞に形質導入し、1.0～2.0×10⁶個/mLで維持した。11日目のT細胞のインビトロ拡大増殖からの上清70mLを収集し、Centricon Plus-70を用いて製造業者の説明書に従って濃縮した。DuoSet Ancillary Reagent Kit 2（R&D systems）を用いて標準的直接ELISAを実行した。組み換えヒトPD-1およびCTLA-4タンパク質（Abcam）をコーティング後、96ウェルプレートに、濃縮上清に続いてペルオキシダーゼヤギ抗ヒトIgG（Jackson ImmunoResearch）検出抗体を負荷した。イヌIFNγを検出するために、1：1比で16時間共培養後のイヌT細胞および標的細胞から上清を収集した。導入が示されたとき、イヌIFN-ガンマDuoSet ELISAキット（R&D Systems）を用いて検出を実行した。

2光子顕微鏡法：マウスに麻酔し、核心温度37℃に維持した。以前に記載されたように菲薄化頭蓋（thinned-skull）手術を実行した（G. Yang, et al. Nat Protoc 5, 201-208 (2010)）。前記のエクスビボイメージングのために（C. Konradt, et al. Nat Microbiol 1, 16001 (2016)）、Cell Trace Violet（Life Technologies）およびTRITC（Thermo）で標識されたCAR T細胞を静脈内移植し、4時間後に、マウスを安楽死させ、脾臓を直ちに取り出し、加温チャンバー中に入れ、そこで標本を加温（37℃）酸素添加培地（10％ FBSを補充した、フェノールレッドを含まないRPMI 1640, Gibco）で常に灌流した。発熱体を使用してイメージングチャンバー内の温度を37℃に維持し、温度制御プローブ（Fine Science Tools）を使用してモニタリングした。ピコ秒またはフェムト秒レーザ（Coherent）を備えるLeica SP5 2光子顕微鏡システム（Leica Microsystems）を用いてイメージングを実行した。20倍の水浸レンズを使用して画像を取得した。結果としてもたらされた動画をVolocityソフトウェア（PerkinElmer）で解析した。

統計解析：データを平均±SEMとして提示する。細胞傷害性アッセイ、細胞内サイトカイン分析およびフローサイトメトリーの蛍光強度の中央値の結果を、事後Tukey検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）で分析して、各群における差を比較した。対応のないt検定を、マウス脾臓のエクスビボ染色およびイヌIFNγ分泌のELISAおよびミニボディー検出に使用した。インビボ腫瘍研究のために、線形回帰を用いて、腫瘍サイズのノギス測定および生物発光イメージングにおける有意差について検定した。Kaplan-Meierを用いて生存曲線を分析した（ログランク検定）。Prismソフトウェアバージョン7.0（GraphPad）を用いてすべての統計解析を実行した。

実施例1：ヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞
ヒトタンパク質アトラスは、IL13Rα1が正常ヒト組織に広く発現されるのに対し（図7A）、IL13Rα2の発現が精巣に限られることを図示している（図7B）。対照的に、がんゲノムアトラスは、IL13Rα2が異なる組織起源の複数の異なる腫瘍試料中に発現されたことを実証している。IL13Rα2の非常に高い発現がGBM中に見い出された（図7C）。IL13Rα2標的指向CAR T細胞を製造するために、ヒトCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインがヒト4-1BBおよびCD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインと連結したものを有する第二世代CAR構築物を使用した。ヒトIL13Rα2標的指向マウスscFv配列、Mu07およびMu08（WO2014/072888）を、pGEMベクター内のCARバックボーン中にクローニングした（図8A）。pGEMテンプレートを用いてIL13Rα2 CARをコードするmRNAをインビトロで製造した。ヒトT細胞へのmRNAのエレクトロポレーション後に、2つのCAR構造、Mu07BBzおよびMu08BBzをT細胞表面から検出した（図8B）。3つの神経膠腫細胞株（U87、U251およびD270）および2つのT細胞がん株、Sup-T1およびJurkatを、マウスscFvベースのIL13Rα2 CAR T細胞の特異性および機能をインビトロで試験するための標的細胞として選択した。3つの神経膠腫細胞株のすべてでIL13Rα2が検出されたが、Sup-T1およびJurkat T細胞がん株では検出されず、それらが陰性対照の状態であることを確認した（図8C）。抗原特異的なCAR T細胞の活性化を決定するために、エレクトロポレーションされたマウスscFvベースのIL13Rα2 CAR T細胞を標的腫瘍細胞と共培養した。IFNγの産生は、IL13Rα2陽性腫瘍細胞株と共培養したCAR T細胞内でのみ検出されたが（図8D）、陰性対照細胞株と共培養したCAR T細胞内では検出されなかった。IL2およびTNFαの産生はまた、IFNγ産生と同じパターンを示した（図10A）。

HAMA応答およびアナフィラキシーを回避するために、ヒト化07（Hu07）および08（Hu08）scFv（WO2014/072888）を利用して、ヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞を生成した。フレームの復帰変異を伴うCDRグラフティングによってHu07 scFvおよびHu08 scFvを調製した。DP-54およびDPK9をヒトアクセプターフレームワークとして利用した。以前に記載されたヒト化scFvの結合活性および熱安定性をベースに（WO2014/072888）、pGEMベクター内の第二世代CAR構築物中にクローニングされることになるHu07配列およびHu08配列を選択した（図1B）。ヒトT細胞mRNAのエレクトロポレーション後、抗マウスIgG抗体または抗ヒトIgG抗体を用いてT細胞表面のMu07/08 scFvおよびHu07/08 scFvを検出した（図1A）。抗マウスIgGによって4つの構造をすべて検出したが、ヒト化CARだけが抗ヒトIgGによって認識された（図1A）。ヒトT細胞表面にIL13Rα2 CARを安定的に発現させるために、Hu07BBzおよびHu08BBz CAR構築物を、レンチウイルス産生に使用される移行プラスミドであるpTRPEベクター内にクローニングした（図1B）。形質導入されたT細胞の細胞表面のCARの発現を検出した（図1C）。両方のIL13Rα2 CARの特異性を決定するために、形質導入IL13Rα2 CAR T細胞を、IL13Rα1もIL13Rα2も発現しなかった標的細胞株（supT1およびJurkat細胞）；IL13Rα1のみを発現した標的細胞株（肺がん細胞株A549）、IL13Rα2のみを発現した標的細胞株（D270）またはIL13Rα1とIL13Rα2との両方を発現した標的細胞株（U87およびU251）と共培養した（図1D）。両方のヒト化07/08BBz CAR構築物は、IL13Rα2陽性標的細胞と共培養した場合、IFNγを産生した（図1E）。追加的に、ヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞は、A549と共培養した場合のIFNγ産生の欠如によって証明されるように、IL13Rα1と交差反応しなかった。IL2およびTNFαの産生もまた、IFNγの産生と対応した（図10B）。これらの共培養の結果は、マウスscFvベースのCARの結果と一致する（図8D）。ヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞が抗原特異的細胞傷害性を媒介する能力を決定するために、クロム放出アッセイを、ヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞と標的腫瘍細胞との異なるエフェクター／標的（E：T）比（1：1、3：1、10：1、30：1）で実行した。ヒト化CAR T細胞は、より低いE：T比であっても4時間の共培養の間にIL13Rα2陽性標的細胞（U87、U251、D270）を特異的に殺滅した（図1F）。陰性対照群ではバックグラウンドを上回る殺滅活性は検出されなかった。Hu07BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞（図9A）もまた正常ヒト初代細胞と共培養した。いくつかの種類のヒト初代細胞上に（図9B）、具体的にはヒト末梢気道上皮細胞、ヒト腎上皮細胞およびヒト角化細胞上に、異なるレベルのIL13Rα1発現が検出された。これらの標的のいずれかと共培養したヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞において、細胞内サイトカイン（IFNγ、IL2およびTNFα）染色により刺激は見出されなかった（図9C、図10C）。IL13Rα2発現もまた、共培養したヒト大動脈平滑筋細胞および肺動脈平滑筋細胞上に、IL13Rα2抗体（クローン47）により検出されたが（図9B）、これはまた、I型サイトカイン（IFNγ、IL2およびTNFα）の産生として説明される両方のCAR T細胞（Hu07BBzおよびHu08BBz）の刺激を誘導した（図9C、図10C）。まとめると、IL13Rα2は、膠芽腫における実行可能な標的を表し、Hu07BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞は、この受容体を高度な特異性で標的とする。

実施例2：IL13Rα2 CAR T細胞は腫瘍の成長をインビボで制御する
2つのヒト化IL13Rα2 CAR T細胞の機能をインビボでさらに試験するために、NSGマウスにおいて皮下および同所性神経膠腫異種移植モデルを開発した。インビボ作業のためにD270神経膠腫細胞株を選択した。これは、ヒト原発性神経膠腫の浸潤パターンおよび侵襲性成長パターンと密接にマッチする病態生理学的特徴をベースとした。NSGマウスモデルにおいて同所性に植え込んだD270神経膠腫細胞の状況を、頭蓋菲薄化後に2光子顕微鏡を使用してモニタリングした。

D270細胞株は、IL13Rα2を内在性発現しただけでなく、EGFRvIIIも発現した（図2A）。両方の標的の発現を、D270のインビトロ培養の0、1、2、3、5、7日目に検出した（図10D）。これにより、以前に記載された2173BBz CAR T細胞をこの実験に含めることが可能になった（L. A. Johnson, et al. Sci Transl Med 7, 275ra222 (2015)；D. M. O'Rourke, et al. Sci Transl Med 9, (2017)）。2173BBzは、Hu07/08BBzと同じCARバックボーンを有するヒト化EGFRvIII標的指向CARである。EGFRvIII標的指向（2173BBz）CAR T細胞およびIL13Rα2標的指向（Hu08BBz）CAR T細胞をD270神経膠腫細胞と1：1の比で共培養し、CD69染色の蛍光強度の中央値（MFI）をフローサイトメトリーによって評価することによってCAR T細胞の活性化を決定した（図11A～11B）。2173BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞のMFIは、非形質導入（UTD）T細胞よりも有意に高かったが、これは、標的細胞の存在下のCAR媒介活性化を実証している（図2B）。24時間（P<0.0001およびP＝0.0021）および48時間の共培養（P＝0.0008およびP＝0.0038）後のCAR T細胞のCD4⁺亜集団およびCD8⁺亜集団に関して、Hu08BBzのCD69 MFIもまた、2173BBzのCD69 MFIよりも有意に高かったが（図2B）、これは、Hu08BBz CAR T細胞が2173BBz CAR T細胞と比較して標的細胞に応答してより大きく活性化されたことを示唆している。

抗原特異的増殖を決定するために、CFSE標識UTD T細胞、2173BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞を、D270細胞株のみならず、標的陰性細胞株A549と共培養した。UTD T細胞およびCAR陽性T細胞（2173BBzおよびHu08BBz）に関するCFSEシグナル伝達の強度をフローサイトメトリーによって決定した（図10E）。D270細胞株との3、5および8日の共培養の間に、両方のCAR T集団のMFIは、段階的にUTD T細胞よりも低くなったが（P<0.0001）、これは、UTD T細胞と比較して増殖が増大していることを示している。重要なリンパ器官としての脾臓は、大量のリンパ球のリザーバーである。脾臓中のCAR T細胞の状況は、それらのインビボ機能と対応することが実証されている。CellTrace VioletおよびTRITC標識CAR T細胞を、同所性に植え込んだ神経膠腫NSGマウスモデルに静脈内移植し、そこで2光子顕微鏡を用いてマウス脾臓中のCAR T細胞を視覚化した。T細胞のCAR媒介インビボ拡大増殖を決定するために、NSGマウスへのD270の皮下植え込みの7日後に、2×10⁶個のヒトCAR T細胞（2173BBzおよびHu08BBz）またはUTD T細胞もまたマウスに静脈内注入した。T細胞移入の11日後に、マウス3匹／群の脾臓中のヒトT細胞を計数した。UTD T細胞（n＝1×10⁵個）で処置されたマウスよりも2173BBz（n＝7.3×10⁵個）で処置されたマウスでは7倍多いヒトT細胞が存在したのに対し、UTD群よりもHu08BBz（n＝3×10⁶個）群では30倍多いヒトT細胞が存在した（図2C）。しかし、一元配置分散分析（ANOVA）により各群の間に統計的な差は検出されなかった。

CAR T細胞が腫瘍成長も制御できるかどうかを決定するために、D270細胞を皮下に植え込み、7日後に、5×10⁶個のCAR T細胞（2173BBz/Hu07BBz/Hu08BBz）または同じ数のUTD T細胞を静脈内経路を介して投与した。UTD細胞と比較して、試験した3種のCAR T細胞のすべて（2173BBz/Hu07BBz/Hu08BBz）は、ノギス測定によって決定される腫瘍の成長を有意に阻害し（P<0.0001）、インビボイメージングシステム（IVIS）によって検出される生物発光シグナル（P<0.0001）および代表的な腫瘍サイズを減少させた（図2D）。ヒト化IL13Rα2 CAR T細胞（Hu07BBzおよびHu08BBz）で処置したマウスについて、静脈内（i.v.）T細胞植え込みの16日後に腫瘍は触知不可能であった。ヒト化IL13Rα2 CAR T群では、IVISを介してバックグラウンドシグナルだけ（2×10³p/s/cm²/sr）が捕捉された。さらに、側腹部の繰り返し触知および生物発光イメージング（BLI）をベースに、43日にわたり2つの群（Hu07BBzおよびHu08BBz）のいずれにも腫瘍の再発は観察されず、これらの群は、このマウスモデルにおいてEGFRvIII（2173BBz）CAR T細胞群よりも有意に良好な腫瘍根絶（P<0.0001）および全生存期間（P＝0.0012）であった（図2D）。次に、ヒト化IL13Rα2 CAR T細胞（Hu08BBz）の効果を同所性神経膠腫モデルで評価した。D270神経膠腫細胞を頭蓋内に植え込み、8日後に8×10⁵個のCAR T細胞（Hu08BBz）または対照UTD T細胞を静脈内投与した。腫瘍の植え込みの17～20日後までにUTD群のすべてのマウスは、背中を丸めるようになり、症候性になり、所定のIACUC承認エンドポイントをベースに安楽死された。Hu08BBz群のマウスの25％が同じ期間（20日目）に安楽死されたが、その処置群の他のマウスのどれも、D270腫瘍細胞からの生物発光シグナルは検出されず（P<0.0001）、Hu08BBzで処置されたマウスは、UTD T細胞で処置されたマウス（対照群）よりも明らかな生存期間の利点を示した（P＝0.0027）（図2E）。これらの結果は、Hu07 BBzおよびHu08BBzが強力なインビボ抗腫瘍活性を有することを示唆している。

実施例3：免疫チェックポイントの遮断は、CAR T細胞の機能を選択的に増強する
免疫チェックポイント受容体は、T細胞表面に発現される。3つの最も頻繁に研究されている免疫チェックポイント受容体（PD-1、CTLA-4およびTIM-3）がCAR T細胞の機能に及ぼす効果を評価して、免疫チェックポイントの遮断がCAR T細胞の機能を強化することもできるかどうかを決定した。

最初に、インビトロ拡大増殖の間の0、3、7および13日目にヒトT細胞上のPD-1、CTLA-4およびTIM-3の発現を評価した（図12A）。T細胞活性化は、インビトロ培養の3日目にピークとなったCD69の発現によって説明された。CD4 T細胞亜集団およびCD8 T細胞亜集団の両方において、チェックポイント受容体（PD-1、CTLA-4およびTIM-3）陽性T細胞のパーセンテージもまた、初期の刺激の間に増大し、次いで減少した。PD-1のリガンド（PD-L1）、CTLA-4のリガンド（CD80およびCD86）およびTIM-3のリガンド（ガレクチン-9）もまたT細胞の表面で検出された。リガンド陽性T細胞のパーセンテージも同様に、T細胞刺激後に時間と共に増減した（図12A）。D270神経膠腫細胞株の調査により、PD-L1およびガレクチン-9の発現が明らかとなり（図12B）、これにより、チェックポイント遮断がCAR T細胞に及ぼす効果を研究することは、適切な腫瘍標的になる。

T細胞の拡大増殖の12日後に、CARの標的会合がチェックポイント分子の経時的発現に及ぼす効果を決定するために、ヒト化EGFRvIII標的指向CAR T細胞（2173BBz）およびヒト化IL13Rα2標的指向CAR T細胞（Hu08BBz）をD270腫瘍細胞（EGFRvIIIおよびIL13Rα2+）またはA549腫瘍細胞（EGFRvIIIおよびIL13Rα2-、IL13Rα1+；陰性対照）のいずれかとインビトロで24時間または48時間共培養した（図11Aおよび11B）。A549細胞の共培養群またはUTD T細胞の群と比較して、D270細胞と共培養された2173BBzおよびHu08BBz CAR T細胞上のPD-1、CTLA-4およびTIM-3の発現は両時点で増大した（図3A）。興味深いことに、これらのチェックポイント受容体の発現レベルは、2173BBz CAR T細胞とHu08BBz CAR T細胞との間で異なった（図3A）。CTLA-4の発現は、CD4（P＝0.0003およびP＝0.0010）T細胞サブセットおよびCD8（P＝0.0006およびP＝0.0050）T細胞サブセットの両方において24時間および48時間の共培養の間、2173BBz CAR T細胞よりもHu08BBz CAR T細胞上の方が高かった。これは、D270細胞株と共培養した場合のCD69の発現レベルと対応した（図2B）。PD-1の発現は、2173BBz CAR T細胞とHu08BBz CAR T細胞との間で24時間の共培養後に統計的には異ならなかったが、48時間の共培養後にHu08BBz CAR T細胞上よりもCD4陽性2173BBz CAR T細胞およびCD8陽性2173BBz CAR T細胞上の方が有意に高かった（P＝0.0021およびP＝0.0456）。最終的に、TIM-3の発現は、共培養の持続時間にも、CD4サブセットおよびCD8サブセットにも依存せずに、Hu08BBz CAR T細胞よりも2173BBz CAR T細胞の方が高かった（24時間の共培養についてP＝0.0371およびP＝0.0026；48時間の共培養についてP＝0.0002およびP＝0.0004）。

免疫チェックポイント受容体の遮断がCAR T細胞の腫瘍殺滅活性を増強したかをさらに研究するために、D270腫瘍を頭蓋内に植え込んだNSGマウスにおいて、2173BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞処置をチェックポイント阻害剤（抗PD-1、抗CTLA-4および抗TIM-3）の腹腔内（i.p.）投与と組み合わせた。大多数のマウスについて、後期の時点でバックグラウンドシグナルだけが検出可能であり、チェックポイント遮断の組み合わせのいかなる利益も示すことを困難にした。したがって、チェックポイントの遮断がCAR T細胞療法の抗腫瘍効果を増強したかどうかを決定するために、投与したCAR T細胞の数を減らし、CAR T細胞とチェックポイント遮断との組み合わせが、D270神経膠腫細胞を皮下に植え込んだマウスに及ぼす効果を研究した。このマウスモデルにおいて、マウスにUTD T細胞を注射したとき、腫瘍が同じ速度で成長したので、チェックポイント阻害剤（抗PD-1、抗CTLA-4および抗TIM-3）の腹腔内送達は、腫瘍サイズの低減にいかなる効果も有しなかった（P＝0.1600、0.1194および0.4565）（図3B）。2173BBz CAR T細胞またはHu08BBz CAR T細胞のいずれかを抗PD-1および抗TIM-3と組み合わせたとき、腫瘍成長の有意な阻害が見られた（2173BBz群についてP<0.0001およびP<0.0001；ならびにHu08BBz群についてP＝0.0325、およびP＝0.0032）。加えて、Hu08BBz CAR T細胞はまた、抗CTLA-4と組み合わせて使用したときに、増強した抗腫瘍効果を示したが、一方で、2173BBz CAR T細胞は、CTLA-4チェックポイントの遮断から利益を受けなかった（2173BBz群についてP＝0.5817；およびHu08BBz群についてP<0.0001）（図3C）。

次に、2173BBz CAR T細胞またはHu08BBz CAR T細胞のいずれかで処置したマウスにおいて異なるチェックポイント阻害剤が腫瘍成長に及ぼす効果を比較した（図3D）。抗CTLA-4よりも、抗PD-1または抗TIM-3のいずれかとの併用療法は、2173BBz CAR T細胞でより大きな抗腫瘍効果を産生し（P<0.0001）、抗PD-1の組み合わせが最も大きな効果を有した（抗TIM-3群と比較してP＝0.0185）。Hu08BBz CAR T細胞について、CTLA-4の遮断は、最も優れた組み合わせ療法を提示した（P＝0.0010およびP<0.0001）。これらの結果は、D270腫瘍細胞とのインビトロ共培養の間の、2173BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞上のチェックポイント受容体の発現レベルと対応した（図3A）。2173BBz CAR T細胞処置群において、抗PD-1との組み合わせ療法だけが生存期間を延長したが（P＝0.0135）、一方で、Hu08BBz CAR T細胞処置群では抗CTLA-4が生存期間を延長した（P＝0.0135）。マウス脾臓におけるヒトT細胞の数および活性化状況も、2173BBz CAR T細胞群と2173BBz CAR T細胞+抗PD-1群との間で比較した（図12C）。組み合わせ抗PD-1群においてPD-1の発現は効率的に遮断され（それぞれP＝0.0034および0.0037）、2173BBz CAR T細胞のみで処置された細胞と比較して、この群においてCD69⁺ヒトT細胞のパーセンテージはより高く（P＝0.0006および0.0340）、CD8⁺ヒトT細胞のパーセンテージはより大きかった（P＝0.0177および0.0022）。したがって、チェックポイント遮断は、異なるCARに特異的な有効性を有してCAR T細胞の機能を増強した。

実施例4：IL13Rα2 CAR T細胞は、インサイチューで分泌された抗CTLA-4チェックポイント遮断によって選択的に増強される
全身チェックポイント遮断が2173BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞の両方の抗腫瘍効果を増強したという知見から考えて、チェックポイント阻害剤を分泌するようにCAR T細胞を改変することによってインサイチューのチェックポイント遮断の効果を評価した。局所チェックポイント阻害がCAR T細胞の活性を増強し、全身チェックポイント遮断によって誘導される有害作用を低減することが合理的に説明された。Hu08BBz CARとチェックポイント阻害剤分子との同時発現を可能にするリボソームスキップ配列（P2A）を介して抗PD-1構築物、抗CTLA-4構築物および抗TIM-3構築物と連結したHu08BBz CAR 構築物を含有するpTRPEベクターをT細胞に形質導入した。分子分泌のT細胞負荷を減少させるために、チェックポイント阻害剤のscFvをヒトIgG1分子のCH3ドメインと直接連結してミニボディーを生成することによってチェックポイント阻害剤のサイズを低減した（図4A）。これらをミニボディー分泌T細胞（MiST）と称する。

Hu08BBz CAR T細胞およびミニボディーを分泌しているHu08BBz CAR T細胞上のHu08BBz CARの表面発現をフローサイトメトリーによって確認した（図4B）。CAR T細胞からの馴化培地を収集し、濃縮し、標準的な直接ELISAに使用して、CAR T細胞からの抗PD-1ミニボディーおよび抗CTLA-4ミニボディーの分泌ならびに組み換えhPD-1およびhCTLA-4との結合を確認した（P＝0.0017および0.0075）（図4C）。Hu08BBz CAR T細胞から分泌された抗TIM-3ミニボディーの特異性を評価するために、Hu08BBz CAR T細胞をミニボディーの存在下または非存在下でD270腫瘍細胞株と24時間または48時間共培養し、蛍光色素コンジュゲート型抗TIM-3抗体を用いた競合阻害実験を実行した。MFIによって決定された蛍光色素コンジュゲート型抗TIM-3抗体の結合は、抗TIM-3ミニボディー分泌CAR T細胞群において有意に低かったが、これは、TIM-3ミニボディーによる効果的な分泌および遮断を示唆している（図4D）。さらに、48時間でのCD4陽性抗TIM-3分泌CAR T細胞を除き、これらの共培養において、抗TIM-3分泌CAR T細胞とUTD T細胞との間にTIM-3発現の統計的な差はなかった（24時間の共培養についてCD4：P＝0.6642およびCD8：P＝0.8771；48時間の共培養についてCD4：P＝0.0014およびCD8：P＝0.4578）。D270細胞と共培養した場合、MFIによって決定された蛍光色素コンジュゲート型抗PD-1抗体および抗CTLA-4抗体の結合はまた、非ミニボディー分泌CAR T細胞（Hu08BBz）よりも抗PD-1／抗CTLA-4 MiST上の方が低かったが、これは、MiSTによって分泌された抗PD-1／抗CTLA-4ミニボディーによる競合結合を実証している（抗PD-1 MiSTおよびHu08BBzの24時間の共培養についてCD4：P＝0.0678およびCD8：P＝0.0140；48時間共培養についてCD4：P<0.0001およびCD8：P＝0.0012；抗CTLA-4 MiSTおよびHu08BBzの24時間共培養についてCD4：P<0.0001およびCD8：P<0.0001；48時間の共培養についてCD4：P＝0.0002およびCD8：P＝0.0006）（図13A）。まとめると、このデータは、Hu08BBz MiSTが分泌している抗PD-1ミニボディー、抗CTLA-4ミニボディーおよび抗TIM-3ミニボディーがうまく生成されたことを示唆している。

次に、ミニボディーの分泌がHu08BBz CAR T細胞の活性化に及ぼす効果を、活性化のマーカーとしてCD69の発現を用いて、D270標的細胞によりインビトロで48時間評価した。24時間または48時間の共培養において、ミニボディーを分泌していないHu08BBz CAR T細胞の刺激は、ミニボディー分泌細胞よりも高かったが、CD8陽性T細胞亜集団の抗CTLA-4ミニボディー分泌Hu08BBz CAR T細胞と統計的な差は見られなかった（P＝0.0614および0.4561）（図13B）。ミニボディー分泌群のうち、抗PD-1 Hu08BBz CAR T細胞の刺激は、CD4陽性T細胞の24時間の共培養（P<0.0001）および48時間の共培養（P＝0.0008および0.0010）におけるその他の2つの群よりも有意に低かった。抗CTLA-4分泌Hu08BBz CAR T細胞および抗TIM-3分泌Hu08BBz CAR T細胞について、24時間でのCD4⁺ CAR T細胞における抗CTLA-4分泌の刺激は、抗TIM-3分泌よりも高かったのに対し（P<0.0001）、その他の亜集団では差が見られなかった（図13B）。D270腫瘍細胞株と共培養した場合のこれらのCAR T細胞のサイトカイン分泌（IFNγ、IL2およびTNFα）もまた比較した。他のHu08BBz CAR T細胞群と比較して、抗PD-1ミニボディー分泌群は、各亜集団において有意に低いパーセンテージがサイトカインを分泌した（図13B）。より大きなパーセンテージの抗CTLA-4分泌群および抗TIM-3分泌群が、ミニボディー非分泌群と比較してIFNγおよびTNFαを産生した。IL2の産生は、抗CTLA-4分泌群において抗TIM-3分泌群と比べて1.5倍高頻度であり、CD4⁺亜集団において有意に高かった（P＝0.0001）（図13C）。

CAR T細胞からのミニボディー分泌を介したチェックポイント遮断の効果を決定するために、D270細胞を皮下に植え込んだ8日後に、治療用量以下のHu08BBz CAR T細胞（8×10⁵個／マウス）、同量のMiSTまたはUTD T細胞をNSGマウスに静脈内投与した。この低用量にもかかわらず、Hu08BBz CAR T細胞は、22日目まで一過性の腫瘍退縮を媒介したが、この時点の後に腫瘍は進行した（図4E）。ミニボディー分泌CAR T細胞群のうち、抗CTLA-4ミニボディー分泌CAR T細胞だけがHu08BBz CAR T細胞の機能を延長し、腫瘍の成長をさらに阻害した（p＝0.0195）（図4E）、これは、インビトロ結果および全身チェックポイント遮断を用いたインビボの結果と一致した。これらの結果は、MiSTの実現可能性を実証しただけでなく、CAR T細胞がチェックポイント遮断から受ける利益の特異性を確認するものであった。

実施例5：IL13Rα2 CAR T細胞はイヌIL13Rα2+腫瘍に対する強力な抗腫瘍活性を示す
D270神経膠腫細胞株を生成することに加え、神経膠腫組織もまた外科的切除から回収して神経膠腫幹細胞株を生成した。これらの株の多くからIL13Rα2の発現が検出された（図5A）。標的陽性細胞のパーセンテージおよび標的発現レベルによって実証されるように、発現は不均一であった。チェックポイント遮断による腫瘍ではなく標的に対する毒性の潜在性および特異的な利益をさらに考慮すると、ヒト膠芽腫患者にそれらを使用する前に、ヒト疾患の臨床的に関連する自然発生大型動物モデルにおいてIL13Rα2 CAR T細胞を評価するべきである。

この目的のために、家畜イヌは、ヒト疾患の生物学的特徴および臨床経過を模倣する高悪性度膠芽腫を発生し、膠芽腫についての前臨床モードとして示唆されている。したがって、Hu07BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞がイヌIL13Rα2のエピトープを認識するかどうかを決定した。最初に、ヒトIL13Rα2およびイヌIL13Rα2のアミノ酸配列を比較し、71.6％の配列相同性を共有することが見出された（図14A）。次に、ヒトT細胞にHu07BBz mRNAおよびHu08BBz mRNAをエレクトロポレーションし、両方のCARの発現をT細胞表面から確認した（図5B）。次いで、エレクトロポレーションしたHu07BBzヒトCAR T細胞およびHu08BBzヒトCAR T細胞をヒトIL13Rα2タンパク質およびイヌIL13Rα2タンパク質とインビトロで共培養し、IFNγ産生により活性化を評価した。Hu07BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞の両方は、ヒトIL13Rα2タンパク質に応答してIFNγを産生した。驚くことに、Hu08BBz CAR T細胞だけがイヌIL13Rα2によって活性化された。Hu07BBz CAR T細胞もHu08BBz CAR T細胞もウシ血清アルブミン（BSA）（陰性対照）によって活性化されなかった（図5B）。多様なイヌ腫瘍細胞株においてイヌIL13Rα1およびIL13Rα2のmRNAレベルの発現を調査した。4つのイヌ骨肉腫細胞株（BW-KOSA、CS-KOSA、MC-KOSAおよびSK-KOSA）はすべて、イヌIL13Rα2を発現した（図5C）。低レベルのIL13Rα2 mRNAの発現がまた、イヌ白血病細胞株（GL-1）および肺がん細胞株（Cacal3およびCacal5）から検出されたが、イヌ乳がん細胞株（Camac2）からもリンパ腫細胞株（CLBL-1）からも検出されなかった。イヌIL13Rα1の発現は、GL-1および潜在的にCLBL-1を除き、被験イヌ腫瘍細胞株のすべてから検出された（図5C）。

Hu08BBz CAR T細胞が、腫瘍細胞の表面に発現されたイヌIL13Rα2によって活性化できたかどうかを決定するために、mRNAをエレクトロポレーションしたヒトHu07BBz CAR T細胞およびHu08BBz CAR T細胞またはUTD T細胞をイヌ細胞株と共培養し、フローサイトメトリーを使用してCD4およびCD8 CAR T細胞亜集団によるサイトカイン産生（IFNγ、IL2およびTNFα）を評価した。驚くことに、CD4 Hu08BBz CAR T細胞およびCD8 Hu08BBz CAR T細胞の両方は、骨肉腫細胞株（BW-KOSA、CS-KOSA、MC-KOSAおよびSK-KOSA）と共培養した場合、IFNγ、IL2およびTNFαを産生したのに対し、GL-1、Cacal3およびCacal5腫瘍細胞株に応答してより低いパーセンテージのCD4 Hu08BBz CAR T細胞およびCD8 Hu08BBz CAR T細胞が、これらのサイトカインを産生した（図5C）。サイトカイン産生は、これらの腫瘍細胞株におけるイヌIL13Rα2の発現レベルと対応した。Camac2はイヌIL13Rα1を発現したが、これらの細胞と共培養したCAR T細胞のいずれもサイトカインを産生しなかった。これは、IL13Rα2 CAR T細胞とイヌIL13Rα1との交差反応性の欠如を実証している。さらに、非形質導入T細胞群およびHu07BBz CAR T細胞群からサイトカイン陽性T細胞は検出されなかった（図5C）。

IL13Rα2＋腫瘍に対するHu08BBz CAR T細胞の抗腫瘍活性を試験する前に、NSGマウスにおいてイヌ骨肉腫モデルを樹立した。3つの異なる用量のイヌ骨肉腫腫瘍細胞をNSGマウスの右側腹部に皮下に植え込み、生物発光イメージングを用いて腫瘍の成長を評価した。MC-KOSA腫瘍細胞株を有するイヌ骨肉腫マウスモデルの平均放射輝度は、1×10⁷p/s/cm²/srに達し、時間と共に増大した。その他のイヌ骨肉腫細胞株における平均放射輝度は、ずっと低く、一貫して増大したわけではなかった（図14B）。5×10⁶個のMC-KOSA腫瘍細胞を植え込んだNSGマウスは、その他の腫瘍細胞群と比較して放射輝度に有意差を示した（P<0.0001）。MC-KOSAの最高耐容量（5×10⁶個）を選択して、NSGマウスにIL13Ra2+骨肉腫瘍を樹立し、植え込みの7日後に、2×10⁶個のHu08BBz CAR形質導入ヒトT細胞を静脈内投与した。UTD T細胞処置群と比較してCAR T細胞処置群において腫瘍の成長は有意に阻害された（図5D）。これらの結果は、イヌIL13Rα2陽性腫瘍を標的とするためにイヌCAR T細胞を生成することの潜在性を強調するものであった。

実施例6：イヌIL13Rα2 CAR T細胞はイヌ腫瘍の成長を制御する
自然発生膠芽腫を有するイヌにおいてIL13Rα2 CAR T細胞を評価することに向けた次の段階では、イヌIL13Rα2 CAR T細胞を生成し、それらの抗原特異的機能をインビトロおよびインビボで評価した。初代イヌT細胞にHu08BBz CAR mRNAをエレクトロポレーションし、これらのT細胞の活性化を試験するために異なるイヌ腫瘍細胞株と共培養した。IL13Ra2発現腫瘍細胞（すべての骨肉腫細胞株＋Cacal5）と共培養したとき、イヌIFNγはHu08BBzイヌCAR T細胞によって分泌されたが、UTDイヌT細胞によって分泌されなかった。イヌIFNγは、IL13Ra2陰性イヌ細胞株（Camac2およびCLBL-1）に応答して分泌されなかった。興味深いことに、イヌ神経膠腫細胞株、J3Tは、イヌHu08BBz CAR T細胞により、このアッセイにおける検出上限に達する最大量のIFNγを誘導した（1.26×10⁴pg/mL）（図6A）。

イヌT細胞の生理的発現および刺激状況を模倣するために、ヒトCD8αドメインならびにヒト4-1BBおよびCD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインをイヌCD8αならびにイヌ4-1BBおよびCD3ζによりスイッチングすることによって第二世代イヌIL13Rα2 CARを樹立した（図6B）。イヌ腫瘍細胞株（CLBL-1およびJ3T）と共培養したときのイヌIFNγの分泌を、Hu08-ヒト-BBz(Hu08HuBBz)イヌCAR T細胞とHu08-イヌ-BBz(Hu08CaBBz)イヌCAR T細胞との間で比較した。Hu07-ヒト-BBz(Hu07HuBBz)CAR T細胞を陰性対照として含めた。Hu08HuBBz CARまたはHu08CaBBz CARのいずれかを発現しているイヌT細胞は、CLBL-1細胞株ではなく、J3T腫瘍細胞株に応答してIFNγを産生したが、これら2つのCAR構築物の間でIFNγ産生に有意差は検出されなかった（P＝0.2736）（図6C）。

次に、J3T神経膠腫細胞をマウスに同所性注射して、これらのCAR T細胞の機能をインビボでさらに評価した。インビボイメージングシステムで視覚化するために、J3T腫瘍細胞株にコメツキムシ緑色ルシフェラーゼ遺伝子を形質導入した。J3Tの植え込み後、7、10および13日目に、mRNAをエレクトロポレーションした1.2×10⁷個のHu08HuBBzイヌCAR T細胞、Hu08CaBBzイヌCAR T細胞またはUTDイヌT細胞をマウス尾静脈により静脈内注射した。腫瘍の植え込みの41日後まで生物発光イメージングを実行した。Hu08HuBBz CAR T細胞およびHu08CaBBz CAR T細胞の両方は、UTD T細胞と比較して、腫瘍成長の長期阻害を媒介した（p<0.0001；p＝0.0015）（図6D）。2回目の植え込みに使用したイヌT細胞をインビトロで分析した。Hu08HuBBz CAR構築物およびHu08CaBBz CAR構築物がイヌT細胞の表面から検出された（図6E左パネル）が、イヌCAR構築物の発現の方が少なかった。イヌIFNγの産生もまた、J3Tと共培養したイヌCAR T細胞から検出された（図6E右パネル）。したがって、翻訳研究のためにイヌIL13Rα2標的指向CAR T細胞がうまく生成された。

実施例7：誘導性CAR構築物
T細胞活性化後に発現を促進することができる誘導性プロモーターを生成し、本明細書において試験した（図15A～15B）。図15Bに示したプロモーター配列の下線部分を部分的に繰り返してT細胞の発現レベルを増強することができる。T細胞／CAR T細胞をこのプロモーターにより改変して、設計されたRNAまたはアミノ酸を発現させる。このプロモーターを使用する構築物を生成したが（図16A）、それは、蛍光発現のためのTDTomato遺伝子を含んでいた。Jurkat細胞（T細胞腫瘍株）をPMA／イオノマイシンで刺激した場合、TD-Tomatoの発現をフローサイトメトリーにより検出し、プロモーターの活性化を実証した（図16B）。

実施例8：タンデムおよびパラレル二重特異性CAR
806およびHu08から構成されるタンデム（図17上）二重特異性CARおよびパラレル（図17下）二重特異性CARを生成し、本明細書において試験した。タンデムCARは、5アミノ酸長（5AA）、10アミノ酸長（10AA）、15アミノ酸長（15AA）、または20アミノ酸長（20AA）のいずれかであったリンカーを含有した。5AAリンカーを有するタンデムCAR（図18A）、10AAリンカーを有するタンデムCAR（図18B）、15AAリンカーを有するタンデムCAR（図18C）、20AAリンカーを有するタンデムCAR（図18D）、およびパラレルCAR（図18E）についてのアミノ酸配列および核酸配列を例示する。5AAのアミノ酸配列はGGGGS（(G4S)；SEQ ID NO：157）である。10AAのアミノ酸配列はGGGGSGGGGS（2(G4S)；SEQ ID NO：181）である。15AAのアミノ酸配列はGGGGSGGGGSGGGGS（3(G4S)；SEQ ID NO：158）である。20AAのアミノ酸配列はGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（4(G4S)；SEQ ID NO：160）である。

各CAR構築物の発現をフローサイトメトリーによって定量した（図19）。T細胞に、Hu08BBz CAR、806BBz CAR、Hu08/806_(G4S)二重特異性CAR、Hu08/806_2(G4S)二重特異性CAR、Hu08/806_3(G4S)二重特異性CAR、Hu08/806_4(G4S)二重特異性CAR、およびHu08BBz_P2A_806BBzパラレルCARを形質導入した。ビオチン標識プロテインLおよびストレプトアビジンコンジュゲート型PE、またはストレプトアビジンコンジュゲート型PEのみのいずれかを用いてCARの発現を検出した。

CD69ベースのT細胞刺激データを図20に示す。各CAR T細胞集団を標的過剰発現5077神経膠腫幹細胞株と共培養した。CAR1（Hu08BBz）およびCAR2（806BBz）は単一のCAR構築物であり、5AA、10AA、15AA、および20AAは、様々な長さで連結された二重特異性CAR構築物（（Hu08/806_(G4S)、Hu08/806_2(G4S)、Hu08/806_3(G4S)、Hu08/806_4(G4S)）であり、2Aは、パラレル二重特異性CAR構築物（Hu08BBz_P2A_806BBz）であった。T細胞の刺激は、APC-コンジュゲート型抗CD69抗体染色によって説明され、共培養の24時間後に、非形質導入T細胞を対照として、CD4+（図20、上）CAR陽性T細胞およびCD8+（図20、下）CAR陽性T細胞上の蛍光強度の中央値（MFI）を定量した。事後Tukey検定を伴う一元配置ANOVAによって統計的有意差を計算した。*p＜0.05、***p＜0.001、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。

標的過剰発現5077神経膠腫幹細胞株と共培養した各々のタンデム二重特異性CAR T細胞およびパラレルCAR T細胞について、フローベースの細胞内サイトカイン（IFNγ（図21Aおよび21D）、IL2（図21Bおよび21E）、およびTNFα（図21Cおよび21F））の染色を測定した。CD4+（図21A～21C）およびCD8+（図21D～21F）T細胞亜集団に占めるサイトカイン陽性T細胞のパーセンテージを実証した。事後Tukey検定を伴う一元配置ANOVAを実行した。**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。

生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを実行して、EGFRvIIIおよびIL13Rα2を発現していない標的5077細胞株（5077_Rα2-_vIII-）、またはIL13Rα2のみを過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2+_vIII-）、EGFRvIIIのみを過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2-_vIII+）、もしくはEGFRvIIIおよびIL13Rα2を過剰発現している標的5077細胞株（5077_Rα2+_vIII+）と共培養した場合の非形質導入T細胞（UTD）を対照とする806/Hu08タンデム二重特異性CAR T細胞の殺滅能を試験した（図22A～D）。2つのscFvの間のリンカーはGGGGS（SEQ ID NO：157）である。データを平均±SEMとして提示する。生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを実行して、標的過剰発現（EGFRvIII/IL13Rα2）5077細胞株と共培養した場合の非形質導入T細胞（UTD）を対照とする806/Hu08タンデム二重特異性CAR T細胞の殺滅能を試験した（図22B）。2つのscFvの間のリンカーはGGGGSx2（SEQ ID NO：181）である。データを平均±SEMとして提示する。図22C：生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを実行して、標的過剰発現（EGFRvIII/IL13Rα2）5077細胞株と共培養した場合の非形質導入T細胞（UTD）を対照とする806&Hu08タンデム二重特異性CAR T細胞の殺滅能を試験した。2つのscFvの間のリンカーはGGGGSx3（SEQ ID NO：158）である。データを平均±SEMとして提示する。図22D、生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを実行して、標的過剰発現（EGFRvIII/IL13Rα2）5077細胞株と共培養した場合の非形質導入T細胞（UTD）を対照とする806&Hu08タンデム二重特異性CAR T細胞の殺滅能を試験した。2つのscFvの間のリンカーはGGGGSx4（SEQ ID NO：160）である。データを平均±SEMとして提示する。

パラレル二重特異性CAR構築物を用いてインビトロ殺滅を実証した（図23A～23D）。生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを実行して、標的過剰発現（EGFRvIII/IL13Rα2）5077細胞株およびD270神経膠腫細胞株と共培養した場合の非形質導入T細胞（UTD）を対照とする806BBz/Hu08BBz（Hu08BBz_P2A_806BBz）パラレル二重特異性CAR T細胞の殺滅能を試験した。データを平均±SEMとして提示する。

D270を皮下に植え込んだNSGマウス（n＝8／群）に、806BBz/Hu08BBz（Hu08BBz_P2A_806BBz）パラレル二重特異性CAR T細胞または同じ数の非形質導入T細胞（UTD）をi.v.注入した（図24）。腫瘍体積の測定（図24、上）を実行して、腫瘍の成長を評価した。線形回帰を用いて、実験群間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（（図24、下、Prismソフトウェア）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する（図24）。

実施例9：BiTE（登録商標）
BiTEを設計して、CD3とEGFRアイソフォームまたはIL13Rα2とを標的とし、したがって、ナイーブT細胞のみならず、腫瘍細胞と結合させた。特に、抗EGFR/CD3、抗IL13Rα2/CD3二重特異性T細胞エンゲージャーを生成した。これは、次にCARを腫瘍細胞に近接させるように機能する。新鮮T細胞（図25A）、非形質導入（UTD）T細胞（図25B）、Hu08BBz CAR（図25C）T細胞、およびHu07BiTE（図25D）形質導入T細胞から馴化培地を収集し、新鮮培地を対照として、非形質導入T細胞と5077細胞株（図25A～25D上、IL13Rα2-）または4892細胞株（図25A～25D下、IL13Rα2+）との共培養に使用した。CD69を染色してT細胞の活性化を実証した。ヒトCD8を染色し、x軸に沿ってT細胞のCD4陽性亜集団とCD8陽性亜集団とを識別した。（図25A～25D）。

293T細胞にプラスミドpTRPE CFP（蛍光遺伝子）またはpTRPE Hu08BiTE（図26）をトランスフェクトした。2日後に上清を収集した。直接ELISAを実行して、組み換えタンパク質IL13Rα2とのHu08OKT3 BiTEの結合を検出した。非形質導入T細胞（UTD）を対照とし、T細胞にpTRPE Hu08BBz、pTRPE C225BiTE、またはpTRPE 806BiTEを形質導入した（図27）。7日後に上清を収集した。直接ELISAを実行して、組み換えタンパク質EGFR野生型またはEGFRvIIIとのBiTEの結合を検出した。結果は、BiTEがそれらの意図される標的と特異的に結合することを実証した（図26～27）。

神経膠腫幹細胞株5077は、低レベルのEGFRを発現することが実証された（図28A～28B）：806BiTE形質導入T細胞およびC225BiTE形質導入T細胞を5077野生型または標的形質導入細胞と共培養し、殺滅アッセイおよびサイトカイン分泌定量アッセイを実行した。806BiTE分泌T細胞は、EGFRvIII過剰発現5077だけに応答する。C225BiTE分泌T細胞は、5077野生型に応答する（図28A～28B）。

非形質導入T細胞（UTD）、806BBz CAR T細胞、806BiTE T細胞、Hu08BBz CAR T細胞およびHu08BiTE T細胞の上清を収集し、非形質導入T細胞と、標的過剰発現5077 GSC株およびD270神経膠腫細胞株との共培養に使用した（図29）。CD69を染色してT細胞活性化を実証した。ヒトCD8を染色して、x軸に沿ってT細胞のCD4陽性亜集団とCD8陽性亜集団とを識別した（図29）。

実施例10：BiTE/CARの組み合わせ
二重特異性構築物を生成し、BiTE/CAR実験に使用した（図30A～30D）。図30Aは、CAR/CAR二重特異性構築物を示し、図30Bは806BiTE/Hu08BBz二重特異性構築物を示し、図30CはHu08BiTE/806BBz二重特異性構築物を示し、図30Dは806BiTE/Hu08BiTE二重特異性構築物を示す。806BBz/Hu08BBz（図31A）、806BiTE/Hu08BBz（図31B）、Hu08BiTE/806BBz（図31C）、および806BiTE/Hu08BiTE（図31D）についてアミノ酸配列および核酸配列を示す。

生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを実行して、標的過剰発現（EGFRvIII/IL13Rα2）細胞株と共培養した場合の非形質導入T細胞（UTD）を対照とする806BiTE/Hu08BBz二重特異性T細胞の殺滅能を試験した（図32A～32D）。データを平均±SEMとして提示する。図32Aは、EGFRvIII+ GSC 5077を示し、図32Bは、IL13Rα2+ GSC 5077を示し、図32Cは、二重陽性GSC 5077を示し、図32Dは、二重陽性D270を示す。結果は、BiTEがインビトロ殺滅することが可能であったことを実証した。

D270を皮下に植え込んだNSGマウス（n＝8／群）に、806BiTE/Hu08BBz二重特異性T細胞または同じ数の非形質導入T細胞（UTD）をi.v.注入した（図33A～33B）。腫瘍体積の測定を実行して、腫瘍の成長を評価した（図33A）。線形回帰を用いて、実験群間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（Prismソフトウェア）（図33B）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。***p＜0.001、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。結果は、BiTEがインビボ殺滅可能であったことを実証した。

生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを実行して、標的過剰発現（EGFRvIII/IL13Rα2）5077細胞株およびD270神経膠腫細胞株と共培養した場合の非形質導入T細胞（UTD）を対照とするHu08BiTE/806BBz二重特異性T細胞の殺滅能を試験した（図34A～34D）。データを平均±SEMとして提示する。図34Aは、EGFRvIII+ GSC 5077を示し、図34Bは、IL13Rα2+ GSC 5077を示し、図34Cは、二重陽性GSC 5077を示し、図34Dは、二重陽性D270を示す。

D270を皮下に植え込んだNSGマウスモデル（n＝8／群）に、Hu08BiTE/806BBz二重特異性T細胞または同じ数の非形質導入T細胞（UTD）をi.v.注入した（図35A～35B）。腫瘍体積の測定を実行して、腫瘍の成長を評価した（図35A）。線形回帰を用いて、実験群間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（Prismソフトウェア）（図35B）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。**p＜0.01、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。

生物発光ベースの細胞傷害性アッセイを実行して、標的過剰発現（EGFRvIII/IL13Rα2）5077細胞株およびD270神経膠腫細胞株と共培養した場合の非形質導入T細胞（UTD）を対照とする806BiTE/Hu08BiTE二重特異性T細胞の殺滅能を試験した（図36A～36D）。データを平均±SEMとして提示する。図36Aは、EGFRvIII+ GSC 5077を示し、図36Bは、IL13Rα2+ GSC 5077を示し、図36Cは、二重陽性GSC 5077を示し、図36Dは、二重陽性D270を示す。

D270を皮下に植え込んだNSGマウス（n＝8／群）に、806BiTE/Hu08BiTE二重特異性T細胞または同じ数の非形質導入T細胞（UTD）をi.v.注入した（図37A～37B）。腫瘍体積の測定を実行して、腫瘍の成長を評価した（図37A）。線形回帰を用いて、実験群間の有意差について検定した。所定のIACUC承認済み病的状態エンドポイントとして、マウスが背中を丸めること、歩行できないこと、または腫瘍が任意の方向で2cmに達することによってエンドポイントを予め定義した。Kaplan-Meier曲線を用いてエンドポイントまでの時間をベースに生存期間をプロットした（Prismソフトウェア）（図37B）。ログランク検定を用いて統計的有意差を決定した。***p＜0.001、****p＜0.0001。データを平均±SEMとして提示する。

実施例11：脳室内注射
トリパンブルー（5uL）をマウスのブレグマの右1～2mm、0.3mm前方、深さ3.0mmの右脳室内に注射した。注射の15分以内に動物を安楽死させ、対側性脳室へのトリパンブルーの拡散について脳を調べた。両方の脳室内で青色染色が見られたことは、右脳室に治療薬を注射できること、および左の、対側性脳室への治療薬の拡散が得られることの両方を実証した。

他の態様
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの記述は、任意の単一の要素または列記された要素の組み合わせ（もしくは部分的組み合わせ）としての、その変数の定義を含む。本明細書における態様の記述は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部分と組み合わせられた、その態様を含む。

本明細書において引用されるあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は具体的な態様に関連して開示されているが、本発明の他の態様および変形は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、他の当業者によって考案されうることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および同等の変形を含むように解釈されることが意図される。

別の局面では、本発明は、第1のBiTEおよび第2のBiTEをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ある特定の態様では、第1のBiTEおよび／または第2のBiTEは、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメイン、および／またはEGFRもしくはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様では、ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：180と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である。ある特定の態様では、ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：179と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列をコードする。
[本発明1001]
ヒトIL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（CAR）であって、
抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域
を含む、CAR。
[本発明1002]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、本発明1001のCAR。
[本発明1003]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、本発明1001または1002のCAR。
[本発明1004]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記本発明のいずれかのCAR。
[本発明1005]
抗原結合ドメインが、完全長抗体またはその抗原結合断片、Fab、一本鎖可変断片（scFv）、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される、前記本発明のいずれかのCAR。
[本発明1006]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）である、前記本発明のいずれかのCAR。
[本発明1007]
IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（CAR）であって、
抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、CAR。
[本発明1008]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、本発明1007のCAR。
[本発明1009]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、本発明1007または1008のCAR。
[本発明1010]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、本発明1007～1009のいずれかのCAR。
[本発明1011]
抗原結合ドメインが、完全長抗体またはその抗原結合断片、Fab、一本鎖可変断片（scFv）、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される、本発明1007～1010のいずれかのCAR。
[本発明1012]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：21または22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）である、本発明1007～1011のいずれかのCAR。
[本発明1013]
IL13Rα2と結合することが可能である、本発明1001～1012のいずれかのCAR。
[本発明1014]
ヒトIL13Rα2と結合することが可能である、本発明1001～1013のいずれかのCAR。
[本発明1015]
イヌIL13Rα2と結合することが可能である、本発明1001～1014のいずれかのCAR。
[本発明1016]
ヒトIL13Rα2およびイヌIL13Rα2と結合することが可能である、本発明1001～1015のいずれかのCAR。
[本発明1017]
膜貫通ドメインが、人工疎水性配列、ならびにI型膜貫通タンパク質、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40（CD134）、4-1BB（CD137）、およびCD154の膜貫通ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する膜貫通ドメインからなる群より選択される、本発明1001～1016のいずれかのCAR。
[本発明1018]
膜貫通ドメインが、CD8の膜貫通ドメインを含む、本発明1001～1017のいずれかのCAR。
[本発明1019]
CD8の膜貫通ドメインが、CD8アルファの膜貫通ドメインである、本発明1018のCAR。
[本発明1020]
細胞内ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明1001～1019のいずれかのCAR。
[本発明1021]
細胞内ドメインが、TNFRスーパーファミリー内のタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらのバリアントからなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する細胞内ドメインを含む、本発明1001～1020のいずれかのCAR。
[本発明1022]
細胞内ドメインが、4-1BBの共刺激ドメインを含む、本発明1021のCAR。
[本発明1023]
細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を担持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらのバリアントの細胞質シグナル伝達ドメインからなる群より選択される細胞内ドメインを含む、本発明1020～1022いずれかのCAR。
[本発明1024]
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ζの細胞内ドメインを含む、本発明1020～1023のいずれかのCAR。
[本発明1025]
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）であって、
抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、CAR。
[本発明1026]
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）であって、
抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、CAR。
[本発明1027]
SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：24またはSEQ ID NO：55またはSEQ ID NO：56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）。
[本発明1028]
本発明1001～1028のいずれかのCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1029]
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、
抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域
を含む、核酸。
[本発明1030]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む、本発明1029の核酸。
[本発明1031]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、本発明1029または1030の核酸。
[本発明1032]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、本発明1029～1031のいずれかの核酸。
[本発明1033]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：138または133と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、本発明1029～1032のいずれかの核酸。
[本発明1034]
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、
抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、核酸。
[本発明1035]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む、本発明1034の核酸。
[本発明1036]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、本発明1034または1035の核酸。
[本発明1037]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、本発明1034～1036のいずれかの核酸。
[本発明1038]
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：134または135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、本発明1034～1037のいずれかの核酸。
[本発明1039]
膜貫通ドメインが、CD8アルファの膜貫通ドメインを含む、本発明1029～1038のいずれかの核酸。
[本発明1040]
細胞内ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明1029～1039のいずれかの核酸。
[本発明1041]
共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBの共刺激ドメインを含む、本発明1040の核酸。
[本発明1042]
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ζの細胞内ドメインを含む、本発明1040または1041の核酸。
[本発明1043]
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、
抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域
を含む、核酸。
[本発明1044]
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、
抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域
を含む、核酸。
[本発明1045]
SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1046]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、第1のCARおよび第2のCARが、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを各々含む、核酸。
[本発明1047]
第1のCARの抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域
を含む、本発明1046の核酸。
[本発明1048]
第1のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、本発明1046または1047の核酸。
[本発明1049]
第1のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：138または133と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、本発明1046～1048のいずれかの核酸。
[本発明1050]
第1のCARの抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、本発明1046の核酸。
[本発明1051]
第1のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、本発明1050の核酸。
[本発明1052]
第1のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：134または135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、本発明1050または1051の核酸。
[本発明1053]
第1のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む、本発明1046～1053のいずれかの核酸。
[本発明1054]
第2のCARの抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域
を含む、本発明1046～1053のいずれかの核酸。
[本発明1055]
第2のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、本発明1054の核酸。
[本発明1056]
第2のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、本発明1054または1055の核酸。
[本発明1057]
第2のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、本発明1054～1056のいずれかの核酸。
[本発明1058]
第2のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：33または141と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、本発明1054～1057のいずれかの核酸。
[本発明1059]
第2のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：35またはSEQ ID NO：196と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む、本発明1046～1058のいずれかの核酸。
[本発明1060]
第1のCARおよび／または第2のCARの膜貫通ドメインが、人工疎水性配列、ならびにI型膜貫通タンパク質、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40（CD134）、4-1BB（CD137）、およびCD154の膜貫通ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する膜貫通ドメインからなる群より選択される、本発明1046～1059のいずれかの核酸。
[本発明1061]
第1のCARおよび／または第2のCARの膜貫通ドメインが、CD8アルファの膜貫通ドメインを含む、本発明1046～1060のいずれかの核酸。
[本発明1062]
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明1046～1061のいずれかの核酸。
[本発明1063]
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインが、TNFRスーパーファミリー内のタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらのバリアントからなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する細胞内ドメインを含む、本発明1046～1062のいずれかの核酸。
[本発明1064]
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインが、4-1BBの共刺激ドメインを含む、本発明1046～1063のいずれかの核酸。
[本発明1065]
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を担持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらのバリアントの細胞質シグナル伝達ドメインからなる群より選択される細胞内ドメインを含む、本発明1046～1064のいずれかの核酸。
[本発明1066]
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ζの細胞内ドメインを含む、本発明1046～1065のいずれかの核酸。
[本発明1067]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、
第1のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域
を含む、核酸。
[本発明1068]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、
第1のCARが、
SEQ ID NO：57または67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：61または71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
SEQ ID NO：139または194と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：140または195と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域
を含む、核酸。
[本発明1069]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：133、134、135、または138と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：33または141と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）を含む、
核酸。
[本発明1070]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、
第1のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含み；
第2のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：35またはSEQ ID NO：196と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む、
核酸。
[本発明1071]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および免疫チェックポイント阻害剤をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1072]
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、本発明1071の核酸。
[本発明1073]
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、本発明1071または1072の核酸。
[本発明1074]
免疫チェックポイント阻害剤が抗CTLA-4抗体である、本発明1071～1073のいずれかの核酸。
[本発明1075]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む、核酸。
[本発明1076]
第2のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：53または54をコードする配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む、本発明1075の核酸。
[本発明1077]
BiTEが、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である、本発明1075または1076の核酸。
[本発明1078]
BiTEが、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である、本発明1075または1076の核酸。
[本発明1079]
第1のポリヌクレオチド配列と第2のポリヌクレオチド配列とが、リンカーにより隔てられている、本発明1046～1078のいずれかの核酸。
[本発明1080]
リンカーが、配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断型ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本発明1079の核酸。
[本発明1081]
自己切断型ペプチドが2Aペプチドである、本発明1080の核酸。
[本発明1082]
2Aペプチドが、ブタテッショウウイルス-1 2A（P2A）、ゾセアアシグナ（Thoseaasigna）ウイルス2A（T2A）、ウマ鼻炎Aウイルス2A（E2A）、および口蹄疫ウイルス2A（F2A）からなる群より選択される、本発明1081の核酸。
[本発明1083]
2AペプチドがT2Aである、本発明1081または1082の核酸。
[本発明1084]
リンカーが、フューリン切断部位をさらに含む、本発明1079～1083のいずれかの核酸。
[本発明1085]
5'から3'の方向へ、第1のポリヌクレオチド配列と、リンカーと、第2のポリヌクレオチド配列とを含む、本発明1079～1084のいずれかの核酸。
[本発明1086]
5'から3'の方向へ、第2のポリヌクレオチド配列と、リンカーと、第1のポリヌクレオチド配列とを含む、本発明1079～1084のいずれかの核酸。
[本発明1087]
本発明1029～1086のいずれかの核酸を含む、ベクター。
[本発明1088]
発現ベクターである、本発明1087のベクター。
[本発明1089]
DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される、本発明1087または1088のベクター。
[本発明1090]
EF-1aプロモーターをさらに含む、本発明1087～1089のいずれかのベクター。
[本発明1091]
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）をさらに含む、本発明1087～1090のいずれかのベクター。
[本発明1092]
rev応答エレメント（RRE）をさらに含む、本発明1087～1091のいずれかのベクター。
[本発明1093]
cPPT配列をさらに含む、本発明1087～1092のいずれかのベクター。
[本発明1094]
自己不活性化ベクターである、本発明1087～1093のいずれかのベクター。
[本発明1095]
本発明1001～1027のいずれかのCAR、本発明1029～1086いずれかの核酸、または本発明1087～1093のいずれかのベクターを含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1096]
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
CARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1097]
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
CARが、
SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1098]
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、CARが、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1099]
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、CARが、SEQ ID NO：21または22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1100]
CARが、IL13Rα2と結合することが可能である、本発明1096～1099のいずれかの改変細胞。
[本発明1101]
CARが、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である、本発明1096～1100のいずれかの改変細胞。
[本発明1102]
免疫チェックポイント阻害剤をさらに含み、免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、本発明1096～1101のいずれかの改変細胞。
[本発明1103]
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、本発明1102の改変細胞。
[本発明1104]
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、本発明1102または1103の改変細胞。
[本発明1105]
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）をさらに含み、BiTEを分泌する、本発明1096～1104のいずれかの改変細胞。
[本発明1106]
誘導性BiTEが、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1105の改変細胞。
[本発明1107]
BiTEが、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である、本発明1105または1106の改変細胞。
[本発明1108]
BiTEが、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である、本発明1105または1106の改変細胞。
[本発明1109]
IL13Rα2と結合することが可能な第1の抗原結合ドメインを含む、第1のキメラ抗原受容体（CAR）；および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2の抗原結合ドメインを含む、第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1110]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
第1のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1111]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
第1のCARが、
SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1112]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：34と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む、
改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1113]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：23または24と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：36または197と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、
改変免疫細胞またはその前駆細胞。
[本発明1114]
免疫チェックポイント阻害剤をさらに含み、免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、本発明1109～1113のいずれかの改変細胞。
[本発明1115]
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、本発明1114の改変細胞。
[本発明1116]
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、本発明1114または1115の改変細胞。
[本発明1115]
CARが、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である、本発明1096～1116のいずれかの改変細胞。
[本発明1116]
第2のCARが、野生型EGFR（wtEGFR）、変異型EGFR、EGFR ^A289V 、EGFR ^A289D 、EGFR ^A289T 、EGFR ^A289T 、EGFR ^R108K 、EGFR ^R108G 、EGFR ^G598V 、EGFR ^D126Y 、EGFR ^C628F 、EGFR ^R108K/A289V 、EGFR ^R108K/D126Y 、EGFR ^A289V/G598V 、EGFR ^A289V/C628F 、およびEGFRバリアントIIからなる群より選択されるEGFRアイソフォーム、またはそれらの任意の組み合わせと結合することが可能である、本発明1109～1115のいずれかの改変細胞。
[本発明1117]
改変免疫細胞である、本発明1096～1116のいずれかの改変細胞。
[本発明1118]
改変T細胞である、本発明1096～1117のいずれかの改変細胞。
[本発明1119]
自家細胞である、本発明1096～1118のいずれかの改変細胞。
[本発明1120]
ヒト対象から得られた自家細胞である、本発明1096～1119のいずれかの改変細胞。
[本発明1121]
本発明1096～1120のいずれかの改変細胞の治療有効量を含む、薬学的組成物。
[本発明1122]
本発明1096～1120のいずれかの改変細胞、または本発明1121の薬学的組成物の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において疾患を処置する方法。
[本発明1123]
疾患ががんである、本発明1122の方法。
[本発明1124]
がんが神経膠腫である、本発明1123の方法。
[本発明1125]
がんが星状細胞腫である、本発明1123または1124の方法。
[本発明1126]
がんが高悪性度星状細胞腫である、本発明1123～1125のいずれかの方法。
[本発明1127]
がんが膠芽腫である、本発明1123～1126のいずれかの方法。
[本発明1128]
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
CARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、方法。
[本発明1129]
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
CARが、
SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、方法。
[本発明1130]
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、CARが、SEQ ID NO：10またはSEQ ID NO：11またはSEQ ID NO：21またはSEQ ID NO：22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む、方法。
[本発明1131]
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、CARが、SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：24またはSEQ ID NO：55またはSEQ ID NO：56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
[本発明1132]
方法が、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、改変細胞が免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、本発明1128～1131のいずれかの方法。
[本発明1133]
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、本発明1132の方法。
[本発明1134]
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、本発明1132または1133の方法。
[本発明1135]
免疫チェックポイント阻害剤が、改変T細胞と同時投与される、本発明1132～1134のいずれかの方法。
[本発明1136]
方法が、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）を投与する段階をさらに含み、改変細胞がBiTEを分泌する、本発明1128～1135のいずれかの方法。
[本発明1137]
誘導性BiTEが、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1136の方法。
[本発明1138]
BiTEが、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である、本発明1136または1137の方法。
[本発明1139]
BiTEが、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である、本発明1136または1137の方法。
[本発明1140]
BiTEが、改変T細胞と同時投与される、本発明1136～1139のいずれかの方法。
[本発明1141]
方法が、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）、および免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、改変細胞が、BiTEおよび免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、本発明1128～1131のいずれかの方法。
[本発明1142]
BiTEおよび免疫チェックポイント阻害剤が、改変T細胞と同時投与される、本発明1141の方法。
[本発明1143]
IL13Rα2と結合することが可能な第1の抗原結合ドメインを含む第1のキメラ抗原受容体（CAR）；および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2の抗原結合ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法。
[本発明1144]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
第1のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域
を含む、方法。
[本発明1145]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
第1のCARが、
SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、方法。
[本発明1146]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：34と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む、
方法。
[本発明1147]
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：23または24と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：36または197と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、
方法。
[本発明1148]
方法が、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、改変細胞が免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、本発明1143～1147のいずれかの方法。
[本発明1149]
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、本発明1148の方法。
[本発明1150]
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、本発明1148または1149の方法。
[本発明1151]
免疫チェックポイント阻害剤が、改変T細胞と同時投与される、本発明1148～1150のいずれかの方法。
[本発明1152]
核酸が、誘導性プロモーターをさらに含み、誘導性プロモーターが、SEQ ID NO：161、162、または198のいずれか1つと85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列を含む、本発明1028～1086のいずれかの核酸。
[本発明1153]
第1の抗原結合ドメインと、第2の抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインとが、リンカーにより隔てられている、核酸。
[本発明1154]
リンカーが、5個、10個、15個、または20個のアミノ酸を含む、本発明1153の核酸。
[本発明1155]
第1の抗原結合ドメインが、IL13Rα2と結合することが可能であり、第2の抗原結合ドメインが、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能である、本発明1153の核酸。
[本発明1156]
CARが、SEQ ID NO：163、165、167、もしくは169のいずれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／またはSEQ ID NO：164、166、168、もしくは170のいずれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、本発明1155の核酸。
[本発明1157]
パラレルCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、パラレルCARが、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを各々含む第1のCARおよび第2のCARを含み、第1のCARと第2のCARとが、切断可能なリンカーにより隔てられている、核酸。
[本発明1158]
パラレルCARが、SEQ ID NO：171と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／またはSEQ ID NO：172と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、本発明1157の核酸。
[本発明1159]
BiTEおよびCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1160]
BiTEが、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含み、CARが、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインを含む、本発明1159の核酸。
[本発明1161]
BiTEが、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインを含み、CARが、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含む、本発明1159の核酸。
[本発明1162]
ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：176またはSEQ ID NO：178と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である、本発明1159の核酸。
[本発明1163]
ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：175またはSEQ ID NO：177と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列によってコードされる、本発明1159の核酸。
[本発明1164]
第1のBiTEおよび第2のBiTEをコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1165]
第1のBiTEおよび／または第2のBiTEが、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメイン、および／またはEGFRもしくはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含む、本発明1164の核酸。
[本発明1166]
ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：180と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である、本発明1164の核酸。
[本発明1167]
ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：179と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列をコードする、本発明1164の核酸。

Claims

ヒトIL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（CAR）であって、
抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域
を含む、CAR。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項1記載のCAR。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1または2記載のCAR。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のCAR。
抗原結合ドメインが、完全長抗体またはその抗原結合断片、Fab、一本鎖可変断片（scFv）、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載のCAR。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）である、前記請求項のいずれか一項記載のCAR。
IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（CAR）であって、
抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、CAR。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項7記載のCAR。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項7または8記載のCAR。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項7～9のいずれか一項記載のCAR。
抗原結合ドメインが、完全長抗体またはその抗原結合断片、Fab、一本鎖可変断片（scFv）、もしくは単一ドメイン抗体からなる群より選択される、請求項7～10のいずれか一項記載のCAR。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：21または22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）である、請求項7～11のいずれか一項記載のCAR。
IL13Rα2と結合することが可能である、請求項1～12のいずれか一項記載のCAR。
ヒトIL13Rα2と結合することが可能である、請求項1～13のいずれか一項記載のCAR。
イヌIL13Rα2と結合することが可能である、請求項1～14のいずれか一項記載のCAR。
ヒトIL13Rα2およびイヌIL13Rα2と結合することが可能である、請求項1～15のいずれか一項記載のCAR。
膜貫通ドメインが、人工疎水性配列、ならびにI型膜貫通タンパク質、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40（CD134）、4-1BB（CD137）、およびCD154の膜貫通ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する膜貫通ドメインからなる群より選択される、請求項1～16のいずれか一項記載のCAR。
膜貫通ドメインが、CD8の膜貫通ドメインを含む、請求項1～17のいずれか一項記載のCAR。
CD8の膜貫通ドメインが、CD8アルファの膜貫通ドメインである、請求項18記載のCAR。
細胞内ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1～19のいずれか一項記載のCAR。
細胞内ドメインが、TNFRスーパーファミリー内のタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらのバリアントからなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する細胞内ドメインを含む、請求項1～20のいずれか一項記載のCAR。
細胞内ドメインが、4-1BBの共刺激ドメインを含む、請求項21記載のCAR。
細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を担持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらのバリアントの細胞質シグナル伝達ドメインからなる群より選択される細胞内ドメインを含む、請求項20～22いずれか一項記載のCAR。
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ζの細胞内ドメインを含む、請求項20～23のいずれか一項記載のCAR。
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）であって、
抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO：8と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、CAR。
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）であって、
抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO：19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、CAR。
SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：24またはSEQ ID NO：55またはSEQ ID NO：56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）。
請求項1～28のいずれか一項記載のCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、
抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域
を含む、核酸。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む、請求項29記載の核酸。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項29または30記載の核酸。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項29～31のいずれか一項記載の核酸。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：138または133と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、請求項29～32のいずれか一項記載の核酸。
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、
抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、核酸。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む、請求項34記載の核酸。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項34または35記載の核酸。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項34～36のいずれか一項記載の核酸。
抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：134または135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、請求項34～37のいずれか一項記載の核酸。
膜貫通ドメインが、CD8アルファの膜貫通ドメインを含む、請求項29～38のいずれか一項記載の核酸。
細胞内ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項29～39のいずれか一項記載の核酸。
共刺激シグナル伝達ドメインが、4-1BBの共刺激ドメインを含む、請求項40記載の核酸。
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ζの細胞内ドメインを含む、請求項40または41記載の核酸。
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、
抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域
を含む、核酸。
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、
抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域
を含む、核酸。
SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、第1のCARおよび第2のCARが、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを各々含む、核酸。
第1のCARの抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）を含み、HCDR2がアミノ酸配列VKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：2）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）を含む、軽鎖可変領域
を含む、請求項46記載の核酸。
第1のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：57と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：61と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項46または47記載の核酸。
第1のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：138または133と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、請求項46～48のいずれか一項記載の核酸。
第1のCARの抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列SRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列TVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列QGTTALATRFFD（SEQ ID NO：14）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列KASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列SASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列QHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、請求項46記載の核酸。
第1のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項50記載の核酸。
第1のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：134または135と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、請求項50または51記載の核酸。
第1のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む、請求項46～53のいずれか一項記載の核酸。
第2のCARの抗原結合ドメインが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域
を含む、請求項46～53のいずれか一項記載の核酸。
第2のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項54記載の核酸。
第2のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項54または55記載の核酸。
第2のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびSEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項54～56のいずれか一項記載の核酸。
第2のCARの抗原結合ドメインが、SEQ ID NO：33または141と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）である、請求項54～57のいずれか一項記載の核酸。
第2のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：35またはSEQ ID NO：196と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む、請求項46～58のいずれか一項記載の核酸。
第1のCARおよび／または第2のCARの膜貫通ドメインが、人工疎水性配列、ならびにI型膜貫通タンパク質、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40（CD134）、4-1BB（CD137）、およびCD154の膜貫通ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する膜貫通ドメインからなる群より選択される、請求項46～59のいずれか一項記載の核酸。
第1のCARおよび／または第2のCARの膜貫通ドメインが、CD8アルファの膜貫通ドメインを含む、請求項46～60のいずれか一項記載の核酸。
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項46～61のいずれか一項記載の核酸。
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインが、TNFRスーパーファミリー内のタンパク質、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、およびB7-H3（CD276）、もしくはそれらのバリアントからなる群より選択されるタンパク質の共刺激ドメイン、またはキラー免疫グロブリン様受容体（KIR）に由来する細胞内ドメインを含む、請求項46～62のいずれか一項記載の核酸。
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内ドメインが、4-1BBの共刺激ドメインを含む、請求項46～63のいずれか一項記載の核酸。
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトCD3ゼータ鎖（CD3ζ）、FcγRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質尾部、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を担持する細胞質受容体、TCRゼータ、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66d、またはそれらのバリアントの細胞質シグナル伝達ドメインからなる群より選択される細胞内ドメインを含む、請求項46～64のいずれか一項記載の核酸。
第1のCARおよび／または第2のCARの細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ζの細胞内ドメインを含む、請求項46～65のいずれか一項記載の核酸。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、
第1のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域
を含む、核酸。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、
第1のCARが、
SEQ ID NO：57または67と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：61または71と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
SEQ ID NO：139または194と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：140または195と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域
を含む、核酸。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：133、134、135、または138と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：33または141と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖可変断片（scFv）を含む、
核酸。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む核酸であって、
第1のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：65またはSEQ ID NO：66またはSEQ ID NO：75またはSEQ ID NO：76と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含み；
第2のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：35またはSEQ ID NO：196と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む、
核酸。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および免疫チェックポイント阻害剤をコードする第2のポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、請求項71記載の核酸。
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、請求項71または72記載の核酸。
免疫チェックポイント阻害剤が抗CTLA-4抗体である、請求項71～73のいずれか一項記載の核酸。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体（CAR）をコードする第1のポリヌクレオチド配列、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）をコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む、核酸。
第2のポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：53または54をコードする配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む、請求項75記載の核酸。
BiTEが、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である、請求項75または76記載の核酸。
BiTEが、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である、請求項75または76記載の核酸。
第1のポリヌクレオチド配列と第2のポリヌクレオチド配列とが、リンカーにより隔てられている、請求項46～78のいずれか一項記載の核酸。
リンカーが、配列内リボソーム進入部位（IRES）または自己切断型ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項79記載の核酸。
自己切断型ペプチドが2Aペプチドである、請求項80記載の核酸。
2Aペプチドが、ブタテッショウウイルス-1 2A（P2A）、ゾセアアシグナ（Thoseaasigna）ウイルス2A（T2A）、ウマ鼻炎Aウイルス2A（E2A）、および口蹄疫ウイルス2A（F2A）からなる群より選択される、請求項81記載の核酸。
2AペプチドがT2Aである、請求項81または82記載の核酸。
リンカーが、フューリン切断部位をさらに含む、請求項79～83のいずれか一項記載の核酸。
5'から3'の方向へ、第1のポリヌクレオチド配列と、リンカーと、第2のポリヌクレオチド配列とを含む、請求項79～84のいずれか一項記載の核酸。
5'から3'の方向へ、第2のポリヌクレオチド配列と、リンカーと、第1のポリヌクレオチド配列とを含む、請求項79～84のいずれか一項記載の核酸。
請求項29～86のいずれか一項記載の核酸を含む、ベクター。
発現ベクターである、請求項87記載のベクター。
DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される、請求項87または88記載のベクター。
EF-1aプロモーターをさらに含む、請求項87～89のいずれか一項記載のベクター。
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）をさらに含む、請求項87～90のいずれか一項記載のベクター。
rev応答エレメント（RRE）をさらに含む、請求項87～91のいずれか一項記載のベクター。
cPPT配列をさらに含む、請求項87～92のいずれか一項記載のベクター。
自己不活性化ベクターである、請求項87～93のいずれか一項記載のベクター。
請求項1～27のいずれか一項記載のCAR、請求項29～86いずれか一項記載の核酸、または請求項87～93のいずれか一項記載のベクターを含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
CARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
CARが、
SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、CARが、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、CARが、SEQ ID NO：21または22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
CARが、IL13Rα2と結合することが可能である、請求項96～99のいずれか一項記載の改変細胞。
CARが、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である、請求項96～100のいずれか一項記載の改変細胞。
免疫チェックポイント阻害剤をさらに含み、免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、請求項96～101のいずれか一項記載の改変細胞。
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、請求項102記載の改変細胞。
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、請求項102または103記載の改変細胞。
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）をさらに含み、BiTEを分泌する、請求項96～104のいずれか一項記載の改変細胞。
誘導性BiTEが、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項105記載の改変細胞。
BiTEが、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である、請求項105または106記載の改変細胞。
BiTEが、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である、請求項105または106記載の改変細胞。
IL13Rα2と結合することが可能な第1の抗原結合ドメインを含む、第1のキメラ抗原受容体（CAR）；および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2の抗原結合ドメインを含む、第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
第1のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
第1のCARが、
SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：34と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む、
改変免疫細胞またはその前駆細胞。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む、改変免疫細胞またはその前駆細胞であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：23または24と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：36または197と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、
改変免疫細胞またはその前駆細胞。
免疫チェックポイント阻害剤をさらに含み、免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、請求項109～113のいずれか一項記載の改変細胞。
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、請求項114記載の改変細胞。
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、請求項114または115記載の改変細胞。
CARが、ヒトIL13Rα2と結合することが可能である、請求項96～116のいずれか一項記載の改変細胞。
第2のCARが、野生型EGFR（wtEGFR）、変異型EGFR、EGFR^A289V、EGFR^A289D、EGFR^A289T、EGFR^A289T、EGFR^R108K、EGFR^R108G、EGFR^G598V、EGFR^D126Y、EGFR^C628F、EGFR^R108K/A289V、EGFR^R108K/D126Y、EGFR^A289V/G598V、EGFR^A289V/C628F、およびEGFRバリアントIIからなる群より選択されるEGFRアイソフォーム、またはそれらの任意の組み合わせと結合することが可能である、請求項109～115のいずれか一項記載の改変細胞。
改変免疫細胞である、請求項96～116のいずれか一項記載の改変細胞。
改変T細胞である、請求項96～117のいずれか一項記載の改変細胞。
自家細胞である、請求項96～118のいずれか一項記載の改変細胞。
ヒト対象から得られた自家細胞である、請求項96～119のいずれか一項記載の改変細胞。
請求項96～120のいずれか一項記載の改変細胞の治療有効量を含む、薬学的組成物。
請求項96～120のいずれか一項記載の改変細胞、または請求項121記載の薬学的組成物の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において疾患を処置する方法。
疾患ががんである、請求項122記載の方法。
がんが神経膠腫である、請求項123記載の方法。
がんが星状細胞腫である、請求項123または124記載の方法。
がんが高悪性度星状細胞腫である、請求項123～125のいずれか一項記載の方法。
がんが膠芽腫である、請求項123～126のいずれか一項記載の方法。
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
CARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含む、方法。
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
CARが、
SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、方法。
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、CARが、SEQ ID NO：10またはSEQ ID NO：11またはSEQ ID NO：21またはSEQ ID NO：22と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む、方法。
IL13Rα2と結合することが可能なキメラ抗原受容体（CAR）を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、CARが、SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：24またはSEQ ID NO：55またはSEQ ID NO：56と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
方法が、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、改変細胞が免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、請求項128～131のいずれか一項記載の方法。
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、請求項132記載の方法。
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、請求項132または133記載の方法。
免疫チェックポイント阻害剤が、改変T細胞と同時投与される、請求項132～134のいずれか一項記載の方法。
方法が、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）を投与する段階をさらに含み、改変細胞がBiTEを分泌する、請求項128～135のいずれか一項記載の方法。
誘導性BiTEが、SEQ ID NO：53または54と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項136記載の方法。
BiTEが、野生型EGFR（wtEGFR）と結合することが可能である、請求項136または137記載の方法。
BiTEが、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）と結合することが可能である、請求項136または137記載の方法。
BiTEが、改変T細胞と同時投与される、請求項136～139のいずれか一項記載の方法。
方法が、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な誘導性二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）、および免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、改変細胞が、BiTEおよび免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、請求項128～131のいずれか一項記載の方法。
BiTEおよび免疫チェックポイント阻害剤が、改変T細胞と同時投与される、請求項141記載の方法。
IL13Rα2と結合することが可能な第1の抗原結合ドメインを含む第1のキメラ抗原受容体（CAR）；および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2の抗原結合ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
第1のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列TKYGVH（SEQ ID NO：1）またはSRNGMS（SEQ ID NO：12）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GVKWAGGSTDYNSALMS（SEQ ID NO：3）またはTVSSGGSYIYYADSVKG（SEQ ID NO：13）を含み、HCDR3がアミノ酸配列DHRDAMDY（SEQ ID NO：4）またはQGTTALATRFFDV（SEQ ID NO：15）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列TASLSVSSTYLH（SEQ ID NO：5）またはKASQDVGTAVA（SEQ ID NO：16）を含み、LCDR2がアミノ酸配列STSNLAS（SEQ ID NO：6）またはSASYRST（SEQ ID NO：17）を含み、LCDR3がアミノ酸配列HQYHRSPLT（SEQ ID NO：7）またはQHHYSAPWT（SEQ ID NO：18）を含む、軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
3つの重鎖相補性決定領域（HCDR）を含む重鎖可変領域であって、HCDR1がアミノ酸配列GYSITSDFAWN（SEQ ID NO：25）を含み、HCDR2がアミノ酸配列GYISYSGNTRYNPSLK（SEQ ID NO：26）を含み、HCDR3がアミノ酸配列VTAGRGFPYW（SEQ ID NO：27）を含む、重鎖可変領域；および
3つの軽鎖相補性決定領域（LCDR）を含む軽鎖可変領域であって、LCDR1がアミノ酸配列HSSQDINSNIG（SEQ ID NO：28）を含み、LCDR2がアミノ酸配列HGTNLDD（SEQ ID NO：29）を含み、LCDR3がアミノ酸配列VQYAQFPWT（SEQ ID NO：30）を含む、軽鎖可変領域
を含む、方法。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
第1のCARが、
SEQ ID NO：8または19と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：9または20と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み；
第2のCARが、
SEQ ID NO：31と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
SEQ ID NO：32と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、方法。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：10または11と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：34と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む一本鎖可変断片（scFv）を含む、
方法。
IL13Rα2と結合することが可能な第1のキメラ抗原受容体、および
上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能な第2のキメラ抗原受容体（CAR）
を含む改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象において膠芽腫を処置する方法であって、
第1のCARが、SEQ ID NO：23または24と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含み；
第2のCARが、SEQ ID NO：36または197と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、
方法。
方法が、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含み、改変細胞が免疫チェックポイント阻害剤を分泌する、請求項143～147のいずれか一項記載の方法。
免疫チェックポイントが、CTLA-4、PD-1、およびTIM-3からなる群より選択される、請求項148記載の方法。
免疫チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、および抗TIM-3抗体からなる群より選択される、請求項148または149記載の方法。
免疫チェックポイント阻害剤が、改変T細胞と同時投与される、請求項148～150のいずれか一項記載の方法。
核酸が、誘導性プロモーターをさらに含み、誘導性プロモーターが、SEQ ID NO：161、162、または198のいずれか1つと85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項28～86のいずれか一項記載の核酸。
第1の抗原結合ドメインと、第2の抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインとが、リンカーにより隔てられている、核酸。
リンカーが、5個、10個、15個、または20個のアミノ酸を含む、請求項153記載の核酸。
第1の抗原結合ドメインが、IL13Rα2と結合することが可能であり、第2の抗原結合ドメインが、上皮増殖因子受容体（EGFR）またはそのアイソフォームと結合することが可能である、請求項153記載の核酸。
CARが、SEQ ID NO：163、165、167、もしくは169のいずれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／またはSEQ ID NO：164、166、168、もしくは170のいずれか1つと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項155記載の核酸。
パラレルCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、パラレルCARが、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを各々含む第1のCARおよび第2のCARを含み、第1のCARと第2のCARとが、切断可能なリンカーにより隔てられている、核酸。
パラレルCARが、SEQ ID NO：171と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ／またはSEQ ID NO：172と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項157記載の核酸。
BiTEおよびCARをコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
BiTEが、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含み、CARが、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインを含む、請求項159記載の核酸。
BiTEが、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメインを含み、CARが、EGFRまたはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含む、請求項159記載の核酸。
ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：176またはSEQ ID NO：178と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である、請求項159記載の核酸。
ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：175またはSEQ ID NO：177と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列によってコードされる、請求項159記載の核酸。
第1のBiTEおよび第2のBiTEをコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸。
第1のBiTEおよび／または第2のBiTEが、IL13Rα2と結合することが可能な抗原結合ドメイン、および／またはEGFRもしくはそのアイソフォームと結合することが可能な抗原結合ドメインを含む、請求項164記載の核酸。
ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：180と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である、請求項164記載の核酸。
ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO：179と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一であるアミノ酸配列をコードする、請求項164記載の核酸。