CZ396599A3 - Genový konstrukt, který kóduje část zaměřující buňku a enzym aktivující proléčivo, pro použití jako léčivo - Google Patents
Genový konstrukt, který kóduje část zaměřující buňku a enzym aktivující proléčivo, pro použití jako léčivo Download PDFInfo
- Publication number
- CZ396599A3 CZ396599A3 CZ19993965A CZ396599A CZ396599A3 CZ 396599 A3 CZ396599 A3 CZ 396599A3 CZ 19993965 A CZ19993965 A CZ 19993965A CZ 396599 A CZ396599 A CZ 396599A CZ 396599 A3 CZ396599 A3 CZ 396599A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cpg2
- antibody
- cell
- enzyme
- cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Genový konstrukt, kteiý kóduje část zaměřující buňku a
heterologní enzymaktivizující proléčivo pro použitíjako léčivo u
savce, přičemž genový konstruktje schopen exprimovat část
zaměřující buňku a heterologní enzymjako konjugát uvnitř cílové
buňky v savčímhostiteli aje řízen tak, že po expresi opustí buňku
a selektivně se lokalizuje na antigen nabuněčnémpovrchu, který
je rozpoznáván částí zaměřující buňku.
Description
Genový konstrukt, který kóduje část zaměřující buňku a enzym aktivující pčediék, pro použití jako léčivo
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká genem řízené enzymové předlékové terapie (GDEPT), která využívá tvorbu protilátek in sítu, aby byla zvýšena selektivita léčby, zvláště při použití k léčení rakoviny.
Dosavadní stav techniky
K dosud známým léčebným postupům užívajícím předlék (prodrug), které jsou založeny na genové terapii, patří virem řízená enzymová předléková terapie (VDEPT) a genem řízená'' enzymová předléková terapie (GDEPTj, přičemž druhá metoda zahrnuje jak VDEPT tak i jiné než virové systémy přenosu genů. Metoda VDEPT zahrnuje zamíření nádorových buněk virovým vektorem, který nese gen kódující' enzym, který je schopen aktivovat předlék. Virový vektor vstoupí do nádorové buňky a z genu je uvnitř buňky exprimován enzym. V metodě GDEPT se pro přenos genu kódujícího enzym užívají alternativní přístupy jako jsou mikroinjekce, přenos liposomy, ' příjem, DNA zprostředkovaný receptory, ale také přenos pomocí virů.
Jak při VDEPT tak i GDEPT může být gen pro enzym transkripčně regulován sekvencemi DNA, které jsou schopny selektivní aktivace v savčích buňkách, např. specificky v nádorových buňkách (EP 415 731, Welcome, Huber et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 8039-8043, 1991). I přes • · · · · · · · · · • · ··· · · · · ··· ··· určitý stupeň selektivity se genová exprese může objevit i v jiných buňkách než jenom cílových buňkách, což je jasně nežádoucí, pokud se tento postup užívá k aktivaci předléku na silně účinné cytotoxické agens. Kromě toho tyto regulační sekvence obecně vedou ke snížení exprese enzymu ve srovnání s virovými promotory a tudíž ke snížené schopnosti konvertovat předlék v cílové tkáni.
Exprese a lokalizace enzymu aktivujícího předlék uvnitř buňky je nevýhodná. Návrh předléku je tím značně omezen, neboť předlék musí být schopen průchodu buněčnou membránou, přitom nesmí být toxický, dokud není konvertován na lék aktivujícím enzymem uvnitř buňky. U většiny předléků se užívá hydrofilních skupin k tomu, aby se zabránilo vstupu do buňky a tím snížila cytotoxicita. Aktivace předléku aktivujícím enzymem vede ke vzniku méně hydrofilního léku, který vstupuje do buňky a projevuje protirakovinný účinek. Ale tento přístup nelze využít, pokud je aktivující' enzym exprimován uvnitř buňky. Další nevýhodou je, že cílové buňky, které postrádají intracelulární aktivující enzym, budou jen těžko terapií zasaženy, neboť nejsou schopny generovat aktivní lék. Aby bylo možné dosáhnout žádoucí aktivity působící na sousední buňky (bystander nebo neighbouring cell kill aktivita), aktivní lék musí být schopen difundovat z buňky obsahující aktivující enzym, aby vnikl i do cílové buňky, která postrádá expresi aktivujícího enzymu. Mnoho aktivních léků, když jsou produkovány uvnitř buňky, není schopno úniku z buňky, aby bylo dosaženo výše zmíněného účinku na sousední buňky.
Modifikace GDEPT pokročily tak, že překonaly některé z výše popsaných problémů. Tak za prvé byly popsány vektory, které exprimují aktivující enzym na povrchu' cílových buněk (WO 96/03515), neboť k aktivujícímu enzymu byl připojen signální peptid a transmembránová doména. Tento přístup,
k tomu, že (WO 96/16179·) pokud by byl životaschopný, odstraní problém, že aktivující enzym je uvnitř · buňky, ale stále je třeba spoléhat na transkripční regulační sekvence schopné selektivní exprese v cílových buňkách, aby byla exprese omezena pouze na cílové buňky. Ale jak bylo již zmíněno výše, užití takových sekvencí má nevýhody. Za ..druhé, byly popsány vektory, které vedou enzym je secernován z cílových· buněk
Dle tohoto přístupu je enzym schopen difundovat z místa vzniku, neboť- je extracelulární a není přichycen k buněčnému , povrchu. Enzym schopný difundovat z místa vzniku je schopen aktivovat předlék i v jiných než jen cílových buňkách, což však vede k nežádoucí' toxicitě. Pro dosažení určité selektivity bylo navrženo, aby byl užit takový enzymový prekurzor, který je štěpen -proteázami, které se vyskytují jen při daném patologickém stavu, a vytváří tak aktivní enzym. Tímto způsobem lze dosáhnout jisté míry selektivity, ale je málo pravděpodobné, že k aktivaci dojde pouze v cílových buňkách. Kromě toho, jakmile je jednou aktivován, enzym bude volně difundovat z cílového místa, tudíž se projeví stejné nevýhody, jak byl již dříve popsány.
Při postupu GDEPT existují tři úrovně selektivity. První je selektivita ve stadiu infekce' buňky, to znamená, že jen specifický buněčný typ je zasažen. Takovéto buněčné selektivity lze např. dosáhnout užitím určitého systému Příklad tohoto druhu selektivity je patentové přihlášce WO 95/26412 (UAB Research Foundation), která popisuje použití modifikovaných vláknitých proteinů adenovirů obsahujících buněčně specifické lígandy. K jiným příkladům buněčně specifického zaměování genů patří genový přenos ex vívo do specifické buněčné populace jako jsou např. iymfocyty a nebo přímá injekce DNA do svalové tkáně.
přenosu genu per se. popsán v mezinárodní • · • ·· · ·· · · · · · · · ··· · · · · · · • · ··· · · · · ··· ··· • · · · · · · ·· ·· ··· ··· ·· ·· .
Druhou úrovní selektivity je řízení genové exprese po infekci buňky např. použitím buněčně nebo tkáňově, specifických promotorů. Pokud se gen přenáší do buňky selektivním způsobem, je důležité, . aby byl vybrán takový promotor, který je kompatibilní s aktivitou v daném buněčném typu.
Za třetí úroveň selektivity lze považovat selektivitu exprimováného genového konstruktu. Selektivitě tohoto typu se dosud věnovala jen skrovná pozornost. V mezinárodní patentové přihlášce WO 96/16179 (Welcome Foundation) bylo navrženo, abv byl užit takový enzymový prekurzor, který je odštěpen z prekurzoru proteázami, které se vyskytují jen při daném patologickém stavu, a vytváří tak aktivní enzym. Tímto způsobem lze dosáhnout jisté míry selektivity, ale- je málo pravděpodobné, že k aktivaci dojde pouze v cílových buňkách. Kromě toho, jakmile je jednou aktivován, enzym bude volně difundovat z cílového místa, takže je zde stejná nevýhoda aktivace předléku v jiných než ' cílových místech, což vede' k něžádoucí cytotoxicitě.
Existuje tedy potřeba systémů ADEPT s vyšší selektivitou, kde by se snížily nežádoucí účinky na normální tkáně, které jsou důsledkem nesprávné aktivace předléku.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález je založen na zjištění, že genový konstrukt protilátka-heterologní enzym může být exprimován intracelulárně a použit v systému ADEPT (nebo jiných systémech jako je AMIRACS - viz dále) pro buněčné zaměřování založené na specifičnosti protilátek, a sice k selektivnímu podávání enzymu dostupného na povrchu buňky. Tento přístup • · ·· ·· lze případě využít v kombinaci s jakoukoliv jinou technikou zvyšující specifičnost jako je např. cílená buněčná infekce a/nebo tkáňově specifická exprese.
První aspekt předkládaného vynálezu poskytuje genový konstrukt který kóduje protilátku zaměřující buňku a heterologní enzym aktivující předlék pro použití jako léčivo u savce, přičemž genový konstrukt je schopen exprimovat protilátku a heterologní enzym, jako konjugát uvnitř cí.lové buňky v savčím hostiteli, a konjugát opustí buňku a selektivně se lokalizuje na antigen na buněčném povrchu, který je rozpoznáván protilátkou zaměřující buňku.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje genový konstrukt který kóduje část zaměřující buňku a heterologní enzym aktivující předlék pro ' použití jako léčivo u savce, přičemž- genový konstrukt je schopen exprimovat část zaměřující buňku a heterologní enzym jako konjugát uvnitř cílové buňky v savčím hostiteli a je řízen tak, že po expresi opustí buňku a selektivně se lokalizuje na antigen na buněčném povrchu, který je rozpoznáván částí zaměřující buňku.
Část zaměřující buňku je definována jako jakýkoliv polypeptid nebo fragment polypeptidu, který se selektivně váže na určitý- buněčný typ v hostiteli tím, že rozpoznává antigen na buněčném povrchu. Výhodně je částí zaměřující buňku protilátka. Části zaměřující buňku jiné než protilátkyjsou např. ligandy, jak byly popsány pro použiti v ligandem řízené enzymové předlékové terapii v mezinárodní patentové přihlášce WO 97/26918 (Cancěr Research Campaign Technology Limited), epidermální růstový faktor, heregulin, c-erbB2 a výhodně vaskulární endoteliový růstový faktor.
Protilátka zaměřující buňku je definována j a-ko jakákoliv protilátka nebo 'fragment protilátky, která se • · * ·
selektivně váže na určitý, buněčný typ v hostiteli tím, že rozpoznává antigen na buněčném povrchu. Výhodné protilátky zaměřující buňku jsou např. protilátky specifické pro solidní nádory, výhodněji pro kolorektální nádory, nej výhodněji je to protilátka anti-CEA, A5B7 nebo ještě výhodněji 806.077. Hybridom 806.077 produkující protilátku byl v souladu s Budapešťskou smlouvou uložen 29. února 1996 v European Collection of Animal cell cultures (ECACC), PHLS Center for Applied Microbioogy, Porton Down, Salisbury, Wiltshire- SP4 OJG, UK, jako položka č. 96022936.
Protilátka A5B7 se váže na lidský karcinoembryonální antigen (CEA) a je zvláště vhodná k zaměření na kolorektální karcinom. A5B7 je možné získat od firmy DAKO Ltd., 16 Manor Courtyard, Hughenden Avenue, High Wycombe, Bucks HP13 5RE, Anglie. Obecně konjugát protilátky (nebo jejího -fragmentu) s enzymem by měl být alespoň divalentní, tzn. jinými slovy měl by být schopen vázat se alespoň ke dvěma antigenům asociovaným s nádorem (mohou být shodné nebo rozdílné). Molekula protilátky může být humanizována známými způsoby jako je např. „CDR roubování, které bylo popsáno v dokumentu EP 239400 nebo roubováním -celých variabilních úseků např. z myší protilátky do lidských konstantních úseků (čímž vznikají „chimérické protilátky), což bylo popsáno v patentu US 4816567. Humanizované protilátky mohou být užitečné ke snížení imunogeničnosti protilátky (nebo jejího fragmentu). Humanizovaná verze protilátky A5B7 byla popsána v patentové přihlášce WO 92(01059 (Celltech).
Hybridom produkující monoklonální protilátku A5B7 byl 14. července 1993 v souladu s Budapešťskou smlouvou uložen v European Collection of Animal cell cultures (ECACC) , PHLS Center for Applied Microbioogy, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK,, jako položka č. 93071411. Protilátku ·· '99 • · · 9
9 9 9
9 999 9
9 9 9
9 9 9
999 999
A5B7 lze z uloženého hybridomu získat užitím standardních postupů odborníkovi známých, jak je popsáno např. v Fenge, C., Fraune, E., Schuegerl, Κ.,ίη: Production of Biologicals from Animla Cell in Culture, Spier, R.E., Griffith, J.R.
Meignier, B eds. , Butterworth-Heinemánn, 1991, 262-265,
Anderson, B.L., Gruenberg, M.L. in Commercial Production of Monoclonal Antibodies, Seaver, S. ed., Marc.el dekker, 1987, 175-195. Buňky mohou vyžadovat občasné reklonováhí limitním ředěním, aby se udržela dobrá hladina produkce protilátek.
' „Heterologní enzym je definován jako enzym, který působí na· substrát, který byl podán hostitelské buňce, přičemž tento enzym není normálně v. přírodě přítomen v odpovídajícím kompartmentu hostitele.. Enzym může být cizorodý pro savčího hostitele (např. to může být bakteriální enzym jako CPG2) nebo to může být -enzym, který se přirozeně nevyskytuje v daném relevantním kompartmentu hostitele (např. použití lysosymu jako enzymu pro ADEPT, viz dále, neboť lysosym se normálně nevyskytuje v krevním, oběhu, viz také patent US 5433955, Akzo NV) . Relevantní kompartment hostitele, je ta část savčího hostitele, ve které je distribuován substrát. Výhodné enzymy jsou enzymy vhodné pro ADEPT nebo AMIRACS (antimetabolit s inaktivací pomocného činidla v místech rakoviny, viz Bagshawe, 1994, Cell Biophys. 24/25,
83-91), ale výhodné jsou· ADEPT enzymy. Protilátkami řízená enzymová předléková terapie (ADEPT)
ADEPT využívá konjugovanou s enzymem. Konjugát je podáván (zpravidla intravenózně) a ponechá se, aby se lokalizoval do místa nádoru a současně vymizel z. křevního oběhu a ostatních normálních tkání. Pak se- pacientovi podá předlék, který je enzymem (lokal izovaným ‘ v místě nádoru) konvertován na cytotoxický lék, 'který usmrtí nádorové buňky.
je známým přístupem nádorově selektivní v léčení rakoviny, protilátku pacientovi • · ·· ·· ·· • · · ·
·· • ·
V mezinárodní patentové přihlášce WO 96/20011, publikované 4.července 1996, jsme navrhli systém ADEPT s „obrácenou polaritou', založený na mutovaných lidských enzymech, které měly výhodu nízké imunogeničnosti ve srovnání např. s bakteriálním enzymy. Konkrétní hostitelovým enzymem byla lidská CPB (viz příklad 1.5, [D253K] lidská CPB a příklad 16, [D253R] lidská CPB a vhodný předlék (vi.z příklady 18 a 19) . Hostitelský enzym byl mutován/ aby se ve·' srovnání s nativním enzymem změnil způsob interakce mezi enzymem a předlékem ve smyslu rozpoznávání substrátu. V naší následné mezinárodní patentové přihlášce PCT/GB96/01975, publikované 6. března 1997 jako WO 97/07796 byl popsán další postup práce na kombinaci mutanty enzymu CPB/předléku pro ADEPT. Výhodné enzymy vhodné pro ADEPT jsou kterékoliv CPG2 nebo enzymy CPB s obrácenou polaritou, např. kterýkoliv z enzymů [D253K]HCPB, [G251T,D253K]HCPB nebo [A248S,G251T,D253K]HCPB. Výhodná forma CPG2 je forma, kde bylo mutováno jedno glykosylační místo, aby se odstranila nebo snížila glykosylace při expresi v savčích buňkách (viz WO 96/03515, Cancer Research Campaign Technology), což zlepšuje enzymovou aktivitu. Další úvahy se týkaly enzymů jako je např. CPB, která vyžaduje prodoménu, aby se umožnilo správně sestavení struktury, prodoména se může buďto exprimovat separátně (v trans) nebo jako součást fúzního proteinu a následně se odstraní.
Purifikaci CPG2 z Pseudomonas RS-16 ve velkém měřítku popsali Sherwood et al., 1985, Eur. J. Biochem, 148, 447-453 . CPG2 je možné získat z Center for Applied Microbiology, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. CPG2 je také možné získat rekombinantním způsobem. Nukleotidová kódující sekvence pro CPG2 byla popsána v Minton et al., Gene 31, 1984, 31-38. Byla popsána exprese této kódující sekvence v E. coli (Chambers
S.P.
et al., Appl. Microbiol i
• 0 00 0 • · · · 0 0 · • 0 0 · 0 • · 000 0 · • · · · • 0 00 000 · • 0 00 • 0 0 · • 0 0 0 •00 000 • 0 • 0 00
Biotechnol., 1988, 29, 572-578) a v Saccharomyces cerevisíae (Clarke, L.E. et al., J. Gen. Microbiol., 1985, 131, 897904). Celková syntéza genu byly popsána v M. Edwards, Biotech. Lab., 1987, 5, 38-44. Exprese heterologních proteinů v E. coli byla přehledně popsána v F.A.O. Manrston, DNA Cloning, Vol. III, Practical Approach Series, IRL Press, D.M.Glover, ed., 1987, 59-88. Exprese proteinů v kvasinkách byla přehledně popsána v Methods in Enzymology, Vol. 194, Academie Press, 1991, C. Guthrie, G.R. Fink, eds.
Výhodnou oblastí využití vynálezu je oblast léčení rakoviny, ale vynález lze využít' i v jiných terapeutických oblastech, jakmile lze vybrat cílový antigen a připravit vhodnou kombinaci enzym/předlék. Tak například zánětlivé nemoci jako je revmatoidní artritida lze léčit např. pomocí protilátky selektivní pro synoviální buňky fúzované s enzymem schopným konvertovat protizánětlivý lék z formy předléku do formy protizánětlivého léku. Použití protilátek cíleně proti revmatoidní artritidě bylo popsáno v Blakey et al., 1988,
Scand. J. Rheumatology, Suppl. 76, 279-287.
„Konjugát protilátky a enzymu může být fúzní protein (jde o kovalentní vazbu) nebo to může být konjugát vytvořený nekovalentní vazbou mezi protilátkou a enzymem in sítu. Výhodně je konjugát ve formě fúzního proteinu, výhodněji je protilátková složka· takové ' fúze alespoň divalentní (pro zlepšení vazebné avidity ve srovnání s monovalentní protilátkou. Protilátkové konstrukty postrádající úsek Fc jsou výhodné, zejména pak fragmenty Fab nebo F(ab')2. Pro fúze CPG2 (nebo fůze s jakýmkoliv jiným než monomerním enzymem) platí zvláštní' úvahy, neboť CPG2 je dimerický enzym a protilátka je výhodně divalentní, takže zde existuje potenciál pro nežádoucí kompetující dimerizaci mezi molekulami dvou druhů. Proto výhodná fúze CPG2 je taková, kde ·· *· • e · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· • 9 99.
• · · c • · · ·
9·· 999
9.
• 9 99 fúzní protein je vytvořen spojením C-konce protilátkového těžkého řetězce Fab (postrádajícího kloubovou oblast) k N-konci molekuly CPG2, dvě takové -Fab-CPG2 molekuly dimeřizují prostřednictvím dimerizační domény CPG2 a vytvoří se konjugát (Fab-CPG2)2. Pro protilátkové konstrukty s monomerními enzymy jsou výhodné fragmenty F(ab')2, zejména fragmenty F(ab')2 mající kloubový úsek z lidského IgG3. Fúze protilátky a enzymu lze případně . získat prostřednictvím krátké peptidové spojky (linkeru) jako je např. (G,-S)3..
Výhodné' fúzní konstrukty jsou takové, kde- je enzym fúzován k C-konci protilátky prostřednictvím jejího těžkého nebo lehkého řetězce, přičemž výhodná je fúze s těžkým řetězcem protilátky. Tudíž výhodným genovým konstruktem podle předkládaného vynálezu je genový konstrukt pro použití jako léčivo, kde konjugát protilátka-enzym CPG2 je fúzní protein, kde enzym je fúzován k C-konci protilátky' prostřednictvím jejího těžkého nebo lehkého řetězce, přičemž když je kódovaný konjugát exprimován, dojde k dimerizaci prostřednictvím dimerizační domény CPG2.' Výhodnějším genovým .konstruktem podle předkládaného vynálezu je genovýkonstrukt pro použití jako léčivo, kde fúzní protein Fab-CPG2 je vytvořen prostřednictvím vazby C-konce těžkého řetězce protilátkového Fab k N-konci molekuly CPG2, přičemž dvě molekuly Fab-CPG2, když jsou exprimovány, dimeřizují prostřednictvím CPG2 a vytvoří konjugát (Fab-CPG2)2. V jiném provedení vynálezu jevýhodný genový konstrukt pro použití jako léčivo konstrukt, kde karboxypeptidáza je vybrána z [D253K]HCPB, [G251T,D253K] HCPB nebo [A248S,G251T,D253K]HCPB.
Uvažuje se o tom, že pokud by. bylo možné získat přirozeně multimerní enzym v monomerní formě, přičemž si uchová podstatně enzymovou aktivitu, pak monomerní forma enzymu- by se mohla užít k’ přípravě konjugátu podle • · předkládaného vynálezu. Podobně lze uvažovat o tom, že pokud by bylo možné získat přirozeně monomerní enzym v multimerní formě, přičemž by si uchoval podstatnou enzymovou aktivitu, pak by se taková multimerní forma enzymu mohla užít k .přípravě konjugátu podle předkládaného vynálezu .
Konjugát je nasměrován k tomu, aby opustil buňku po expresi, a sice tím, že se užije sekreční vedoucí sekvence, která je odštěpena, když konjugát prochází buněčnou membránou. Výhodně je sekreční vedoucí sekvence taková vedoucí sekvence, která se vyskytuje přirozeně s protilátkou.
Další aspekt předkládaného' vynálezu poskytuje, použití genového konstruktu kódujícího protilátku zaměřující buňku a heterologní enzym pro přípravu léku vhodného pro terapii rakoviny v savčím hostiteli', kde genový konstrukt je schopen exprimovat protilátku a enzym jako konjugát v cílové buňce v savčím hostiteli, přičemž konjugát může poté opustit buňku pro selektivní lokalizaci na antigenu buněčného povrchu, rozpoznaném protilátkou.
Pro přenos genového konstruktu podle předkládaného vynálezu je možné užít jakýkoliv systém vhodný k přenosu, včetně virových a nevirových systémů. K virovým systémům patří retrovirové vektory, adenovirové vektory,. adenoasociované vektory, virus vakcínie, virus Herpes simplex, HIV, leukemický virus myši, virus hepatitidy B a virus chřipky. K nevirovým systémům patří čistá, nekomplexovaná DNA, DNA-liposové komplexy, DNA-proteinové komplexy a DNA pokryté částečky zlata.
Retrovirové vektory postrádají imunogenní proteiny a neexistuje žádná předem vzniklá imunita hostitele, ale infekce je omezena na dělící se buňky. Retroviry byly již použity v klinických pokusech (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 1990, 323, 570-578). Retroviry.jsou tvořeny genomem RNA, • ·'
999 999 který je zabalen v obálce pocházejíc z buněčné membrány hostitelské buňky a virových proteinů.Pro expresi svých genů musí nejdříve reverzně transkribovat svůj pozitivní řetězec RNA do dvojitého řetězce DNA, který se pak integruje do DNA hostitele za 'pomoci reverzní, transkriptázy a integrázy, což jsou proteiny obsažené ve virové částici. Integrovaný provirus je pak schopen užít buněčného mechanismu hostitelské buňky k expresi' svých genů.
Myší leukemický virus je široce využíván (Miller et al., Methods Enzymol. 1993, 217: 581-599). Retrovirové vektory jsou konstruovány tak, že se odstraní - geny gag, pol a env, aby se·· tak vytvořil prostor pro odpovídající vložený „náklad aby se odstranila replikativní schopnost viru. Virem kódované mRNA se eliminují a to odstraňuje také jakoukoliv potenciální imunitní reakci na transdukovanou buňku · Často jsou jako selekční prostředky vloženy geny kódující rezistenci k antibiotikům. Lze také vložit, promotorovou ,a zesilovací (enhancerovou) funkci, např. pro dosažení tkáňově specifické exprese po podání in vivo. Promotorové a zesilovací funkce obsažené v dlouhé terminální repetic retroviru se také mohou užít.
Tyto viry se mohou produkovat pouze ve sbalovacích („pakážovacích)' buněčných liniích. Sbalovací linie se může zkonstruovat tak, že se deletované virové geny (gag, pol, env) stabilně inzeruj i do buněk, a to tak, že j sou umí stěny na různých chromosomech, aby . se zabránilo rekombinaci. Sbalovací linie, se užije k přípravě produkční' linie, . která tvoří replikačně defektní retrovirus obsahující relevantní vložený gen tím, že se do ní vnese rekombinantní provirová DNA. Plazmidová DNA, která obsahuje sekvence dlouhé terminální repetice obklopující ' malý úsek genu gag obsahujícího enkapsidační sekvenci a požadovaný gen (geny) se • '· • · · · ·· · ··· • · • « · · transfekuje do sbalovací linie standardním způsobem pro přenos DNA (elektroporace, kalciová precipitace apod.).' Varianty tohoto přístupu byly užity, aby se snížila pravděpodobnost vzniku replikačně kompetentního viru (Jolly,. D., ' Cancer Gene - Therapy, 1994, 1, 51-64). Spektrum hostitelských buněk viru je určeno genem obalového proteinu (env) a je možné užít substituce genu env s různou buněčnou specifičností. Pro zaměřování lze také využít inkorporace vhodných ligadnů do obalového proteinu.
' Podávání lze provádět jakoukoliv, dostupnou technikou, např. exprese in vivo transdukcí buněk pacienta, přímou injekcí viru do tkáně, a nebo podáváním buněk produkujících retrovirus.
Přístup exprese in vivo má nevýhodu, že vyžaduje izolaci a udržování pacientových buněk ve tkáňové kultuře, ale má také výhodu, že je možné snadno kvantifikovat rozsah genového přenosu a je možné zaměřit specifickou populaci buněk. Kromě toho je možné dosáhnou vysokého poměru virových částic a cílových buněk, a tak zlepšit účinnost transdukce (Anderson et al., Hum. Gene Ther., 1990, 1: 331-341; Rosehberg et al., N. Engl. J. Med., 1990, 323: 570-578; Culver- et al. z Hum. Gene Ther·., 1991, 2: 107-109, Nienhuis et ai.z Cancer, 1991,. 67: 2700-2704, Anderson et al. , . Hum. Gene Ther., 1990, 1: 331-341, Grossman et al. , Nat. Genet. , 1994, 6.: 335-341, Lotze et al. , Hum. Gene Ther., 1992, 3: 167-177; Lotze, M.T., Cell Transplant., 1993, 2: 33—47; Lotze' et al . , Hum. Gene Ther., 1994, 5: 41-55 a patent US 5399346 (Anderson)). V některých případech je nezbytné přímé vložení viru in vivo. Retroviry byly užity k léčení, mozkových nádorů, kde schopnost retrovirů infikovat pouze dělicí se buňky (tj. nádorové) je zvláště výhodná.
···
Pro zvýšení účinnosti Oldfield et al. (Hum. Gene Ther.,' 1993, 4: 39-69) navrhli podávání retrovirové produkční linie přímo do mozkového nádoru pacienta. Myší produkční buňky by přežily v nádoru mozku po dobu několika dnů a secernovaly by retrovirus schopný transdukovat okolní buňky mozkového nádoru. Virus nesoucí gen thymidinkinázy z herpetického viru poskytuje buňky, které lze pak usmrtit ganciclovirem, který je thymidinkinázou metabolizován na toxickou sloučeninu. Retrovirů se týkají patentové dokumenty EP 334301, WO 91/02805 a WO 92/05266 (Viagene) a US 4650764 (University of Wisconsin).
V odborné literatuře byly popsány- lidské adenovirové infekce (viz Horwitz, M.S., In Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp. 1723-1740) . Většina dospělé populace byla exponována adenoviru a má proto antiadenovirové protilátky. Adenoviry obsahují- genom z dvouřetězcové .DNA a replikují se nezávisle na buněčném dělení hostitele.
Adenovirové vektory mají výhodné 'vlastnosti. Jsou schopné transdukovat buňky z širokého, spektra lidských tkání a lze jimi dosáhnout vysoké hladiny exprese jak v dělících se tak i v nedělících buňkách. Lze užít různé cesty podávání včetně - intravenózní, intrabiliární, intraperitoneální, intravesikulární, intrakraniální · a intrethekální injekce, a také přímé injekce do cílového, orgánu. Zaměřování založené na anatomických hranicích je tedy možné.
Adenovirový genom kóduje 15 proteinů, infekce se účastní vláknitý protein, který se váže na receptor na povrchu - buňky. Pehtonová základna virové kapsidy se váže na .integrinove receptorové domény (α3β3 nebo α3β5)' na buněčném povrchu, což vede k internalizaci viru.. Virová' DNA vstupuje do jádra a nezávisle na buněčném dělení- zahajuje transkripci. Exprese a replikace jsou kontrolovány geny E1A a E1B (viz Horwitz, • 9
9999 99 99 9999
9999 9 9 9999
999999 9 9 9 999999
9 9 9 9 9 9 • 9 99 999 999 99 99 15
M.Si, In Virology,· 2nd ed.,. 1990, pp. 1723-1740). Odstranění genu El vede k replikačně nekompetentnímu viru. Exprese adenovirových· proteinů vede k vyvolání imunitní reakce, která může ovlivnit zvláště účinnost při opakovaném podání. Avšak současné přístupy, kdy je také z virového genomu odstraněn další adenovirový gen, jako např. E2a (který kontroluje expresi jednoho z obalových proteinů a řady dalších virových proteinů), může odstranit nebo alespoň značně snížit expresi mnoha těchto virových proteinů v cílových buňkách.
Pro konstrukci vektorů byly . často užívány sérotypy 2 a 5. Bett et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1994, 91: 88028806 užili vektorový systém ~z adenoviru typu 5 s delecemi genů El a E3. Buněčná linie „293 lidských embryonálních ledvinných buněk byly genově upravena tak, aby exprimovala protein El a mohla tak transkomplementovat virový genom deficitní v El. Z média buněk 293 pak může být izolován virus a purifikuje se z plaků postupem limitního ředění (Graham, F.L. and Prevek, L. Ih Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press 1991, pp. 109-128) .
Rekombinantní virus může být pěstován v buňkách v buněčných, kulturách linie 293 a izolován lyží infikovaných buněk a purifikací pomocí centrifugace na hustotním gradientu chloridu· česného. Jeden problém užití buněk 293 pro přípravu .rekombinantního adenoviru je to, že díky dodatečným krajním .úsekům genů El může vzniknout replikačně kompetentní virus (RCA) během produkce virových částic. Ačkoliv je tento materiál pouze' adenovirus divokého typu a nikoliv replikačně kompetentní rekombinantní virus, může významně ovlivnit případný výtěžek požadovaného adenovirového materiálu, zvyšuje náklady· na přípravu a komplikuje kontrolu kvality jednotlivých výrobních cyklů a připuštění jednotlivých várek neautonomní nedělící se pro. klinické použiti. Byly vyvinuty· alternativní buněčné linie, např. PER.C6, které mají lépe definovanou integraci El než buňky 293 (neobsahují okolní virové sekvence),, a které neumožňují rekombinační událost, kterou vznikají RCA, a mají tudíž potenciál překonat výše zmíněné problémy produkce viru.
Adenovirové vektory mají nevýhodu relativně krátké doby trvání exprese transgenu díky clearanci imunitního systému a díky ' ztrátám „ředěním při dělení cílových buněk, ale lze očekávat zlepšení adenovirových vektorů. Patentové dokumenty týkající se adenovirů jsou WO 96/03517 (Boehringer), WO 96/13596 (Rhone Poplenc Rorer), WO 95/29993 (University of Michigan) a WO 96/34969 (Canji). Současné pokroky v adenovirových vektorech pro použití v genové terapii nádorů zahrnují vývoj strategií ke snížení imunogeničnosti, chimérické vektory adenovirus/retrovirus a podmíněně (omezeně) replikativní rekombinantní adenovirové systémy, jak uvádějí v přehledu Bilbao et al., Exp. Opin. Ther.' Patents, 1997,. 7(12): 1427-1446.
Adeno-asociované viry (AAV) (Kotin, R.M., Hum. Gene Ther., 1994, 5: 793-801) obsahující jednořetězcovou DNA, jsou parvoviry schopné integrovat se do genomu buňky s širokým hostitelským spektrem. Nebylo prokázáno, že· by AAV byly spojeny s jakoukoliv lidskou nemocí a je známo, že nevyvolávají žádnou imunitní odpověď.
AAV mají v životním cyklu dvě zřetelně odlišné fáze. Virus divokého typu infikuje hostitelskou buňku, integruje se a zůstává latentní. V přítomnosti· adenovir.u se indukuje lytická fáze životního cyklu adenovirů, která je závislá na expresi časných adenovirovývh genů, replikaci viru. Genom AAV je tvořen čtecích rámců (zvaných rep a aktivní a vede 1 ze dvou otevřených cap) obklopených sekvencemi invertované terminální repetice' (ITR). Úsek rep kóduje čtyři ··· ··· proteiny, které zprostředkovávají replikaci AAV, transkripci virové DNA a mají endonukleázovou funkci, nutnou k integraci do' hostitelského genomu. Geny rep jsou jediné geny ze sekvence AAV nutné pro virovou replikaci. Sekvence cap kóduje strukturní proteiny, které tvoří virovou kapsidu. Sekvence ITR obsahují virový replikační počátek, poskytují enkapsidační, signály a podílí-se na integraci virové DNA. Rekombinantní replikačně defektní viry, které byly vyvinuty pro genovou terapii, postrádají sekvence rep a cap. Replikačně defektní AAV se mohou produkovat kotransfekcí separovaných elementů nezbytných pro replikaci AAV do permisivních buněk linie 293. K patentovým dokumentům týkajícím se AAV patří WO 94/13788 (University of Pittsburgh) a US 4797368 (US Department of Health).
Vektory pro genovou terapii odvozené z pox viru', (virus neštovic) byly také popsány (Moss, B., Flexner, C. , Annu. Rev. Immunol. 1987, 5: 305-324, Moss, B., Virology, 1990, 2079-21111) . Virus vakcínie je velký DNA virus s obalem, který se replikuje v cytoplazmě infikovaných buněk. Infikuje dělící se i nedělící buňky mnoha tkání a lze pozorovat genovou expresi z neintegrovaného virového genomu. Rekombinantní virus může být připraven tak, že se transgen vloží do vektoru odvozeného z viru vakcínie a -tato DNA. se transfekuje do buněk'infikovaných vakcínií, kde pak homologní rekombinace vede k produkci viru. Významnou nevýhodou je, že virus vyvolává imunitní reakci hostitele na - 150 až 200 virem kódovaných proteinů, což značně komplikuje opakované podávání.
Virus herpes simplex je velký virus obsáhující dvouřtězcovou DNA, který se replikuje v jádře infikovaných buněk, a který je vhodný k přenosu genů (viz Kennedy, P.G.E., Steiner, I., Q. J. Méd. 1993, 86: 697-702)·. K výhodám patří • 9 • · • · ··· ·
• · 9 9
9 9 9
999 999 značný hostitelský rozsah, infekce jak dělicích se tak i nedělících buněk, a možnost vložit rozsáhlou' sekvenci cizí DNA do virového genomu prostřednictvím homologní rekombinace. Nevýhodou je obtížné získání virového preparátu bez replikačně kompetentního viru a také silná imunitní odezva. Delece virového genu pro .thymidinkinázu vede k replikačně defektním viru v buňkách s nízkou hladinou thymidinkinázy. Buňky, které se intenzivně dělí (právě např. nádorové buňky) mají dostatečnou thymidinkinázovou aktivitu,' aby umožnila replikaci. Byla publikována patentová přihláška týkající se herptického viru (WO 92/05263, Cantab Pharmaceuticals).
.Uvažovalo se také o řadě jiných virů, např., HIV, leukemických virech myší, viru hepatitidy B a chřipkovém viru, jako možných vektorech pro přenos genů (viz Jolly, D., Cancer Gene Therapy, 1994, 1: 51-64).
Bylo také navrženo použití atenuovaných bakterií Salmonella typhimurium, která se specificky zaměřuje a replikuje se v hypoxíckém prostředí (jaké se vyskytuje v nekrotických centrech nádoru), jako vektoru pro přenos genů v terapii založené na enzymu- jako předléku, TAPET™ (Tumor Amplified Prodrug Enzyme Therapy) firmy . Vion Pharmnaceuticals. Tento systém nabízí v přenosu genů další alternativu k dříve uvedeným virovým a nevirovým způsobům přenosu genů.
Lze také užít strategie nevirového přenosu DNA. Takové přenosové systémy užívají čistou nekomplexovanou DNA, DNAliposomové komplexy, DNA-proteinové komplexy a zlaté mikročástice pokryté DNA.
Purifikovaná nukleová kyselina může být injikována přímo do tkáně a vede k přechodné genové expresi např. ve svalové tkáni, což je zvláště účinné v regenerujícím se svalstvu (Wolff et al. , Science, 1990, 247: 1465-1468). Davis et • 9 • 999 · ·· ·· » · ♦ · > · · ·
999 999 . 9 9
9 9 '19 al.(Hum. Gene Ther., 1993, 4: 733-740) publikovali informaci o přímé injekci do zralého svalu. Obecně jsou výhodné kosterní svaly a srdeční sval. Odpovídající .patentové dokumenty jsou WO 90/1 1092:, US 5589466 (Vicalj a WO 97/05185 (biodegradovatelné hydrogely impregnované DNA pro injekci, Focal).
Pazmidová DNA na zlatých mikročásticích může být „vstřelena do buněk (např. epidermis nebo- melanomu) pomocí tzv. genového děla. DNA se koprecipituje na' částice zlata a pak je vystřelena pomocí elektrického výboje nebo stlačeného plynu jako propelentu (Fynan et al, , Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90: 1'1478-1 1482). Byla užita také elektroporace k usnadnění přenosu DNA ' do solidních nádorů užitím eletroporační sondy užívající mnohajehlového uspořádání a pulzního rotujícího elektrického pole (Nishi et al., Cancer Res., 1996, 56:1050-1055). Bylo tak dosaženo vysoce účinného genového přenosu do podkožních nádorů s významným zvýšením transfe-kce buněk a lepšími distribučními chrakteristikami než při intratumorové injkeční aplikaci.
Liposomy účinkují tak, že obklopují hydrofilní molekulu hydrofobními molekulami, a tím usnadňují vstup do buňky. Liposomy jsou jednovrstevné (unilamelární) nebo vícevrstevné (multilamelární) sféry (váčky) vytvořené z lipidů. Složení lipidů a způsob přípravy ovlivňují strukturu liposomů. Do lipidových membrán mohou být inkorporovány i jiné molekuly. Liposomy mohou být buďto kationotové nebo aniontové. Nicolau et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1983, 80: 1068-1072) publikovali expresi insulinu z aniontových liposomů injikovaných do krys. Aniontové lipososmy hlavně zaměřují retikuloendotelové buňky jater, pokud nejsou specificky zamířeny jiným způsobem. Na povrch liposomů mohou být inkorporovány jiné molekuly, aby změnily chování liposomů, • · ·· ·· • · » · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· ·· • · · · • · · · • ·· · ··· • · ·· ··
20' např. buněčnou specifitu přenosu (Wu G.Y. and Wu, C.H., J. Bio'1. Chem., 1987, 262: 4429-4432).
Felgner et al. (Proč. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1987, 84: 7413-7417) popsali kationtové liposomy a ukázaly, - že váží nukleové kyseliny elektrostatickými interakcemi a vstupují do buňky. Intravenózní ' injekce kationtových liposomů vedla k expresi transgenu ve. většině orgánů, když byla injekce aplikována do' aferentni cévy orgánu. Kationtové liposomy mohou být podány také ve formě aerosolu pokud je cílem plicní epitel (Brigham et al . , ' Am. J. Med. Sci., 1989, 298: 27 8281). Patentové dokumenty. týkající se liposomů jsou WO 90/11092, WO 91/17424, WO 91/16024, WO 93/ 14788 (Vical) a WO 90/01543 (Intracel) .
Studie in vivo s přenosem genů pomocí kationtových liposomů publikovali Nabel et al., Rev. Gene Hum. Ther. 1994, 5: 79-92, Hyde et al·., Nátuře, 1993, 362: 250-255, a C.onary et al., J. Clin. Invest. 1994, 93: 1834-1840).
Mikročástice byly také zkoumány jakožto systémy vhodné k přenosu DNA do fagocytujících buněk. Tento přístup užila firma Pangea Pharmaceuticals v systému ENDOSPHERE™, což. je mikrkapsulační přenosový systém DNA, který byl užit ke zvýšení transdukce u fagocytujících buněk jako jsou makrofágy, které pohltí mikrosféry. Mikrosféry obalí plazmidovou DNA, která kóduje potenciálně imunogenní peptidy, které po expresi vedou k prezentaci peptidů prostřednictvím molekul MHC na povrchu buněk, což může stimulovat imunitní odpověď proti takovým peptidům a proteinovým sekvencím, které obsahují stejný epitop. Tento přístup se dnes užívá se. zaměřením na vývoj protinádorových vakcín' a vakcín proti patogenům, ačkoliv může mít i možné využití v genové terapii.
Stejně jako byly užity syntetické polymery k zabalení DNA, tak byly užity i přírodní obalové proteiny virů, které ·· ·· · · ·· ·· ···· · · · · · · · · ···· · · · · · · • · · · ·· · * · · · · ·· · • · · · · . · · »· ·· ··· ··· ·· ·'· jsou schopny homogenního samosestavení do částic podobných virů (VLP). Hlavní strukturní obalový protein VP1 lidského polyomaviru může být exprimován jako rekombinantní protein a je schopen zabalit plazmidovou DNA během samosestavení do VLP. Výsledné částice se pak mohou užit k transdukci různých buněčných linií, přičemž předběžné imunologické studie ukázaly jen slabou imunogenní reakci na VLP založené na VP1. Takové systémy nabízejí atraktivní mezistupeň mezi syntetickými polymerními nevirovými vektory a -alternativním virovým přenosovým systémem, neboť kombinují výhody, tj. jednoduchost přípravy a vysokou účinnost transdukce.
Aby se zlepšila specifičnost přenosu genů a exprese u terapeutických genů, zkoumalo se vložení zaměřovačích prvků do přenosových vektorů a použití regulačních prvků exprese, jak samostatně tak i v kombinaci v mnoha přenosových systémech popsaných dříve.
Bylo také dosaženo zlepšení DNA vektorů a .lze ho také využít u všech nevirových přenosových systémů, nadšroubovicových minikruhových molekul minici.rcle) , které publikovala· firma RPR molekuly nejsou bakteriálního původu a neobsahují replikační počátek ani geny rezistence k antibiotiku, a tak jsou bezpečnější, neboť projevují značnou míru biologického omezení), epizomálních expresních vektorů vyvinutých firmou Copernicus Gene Systems lne. (replikující se episomální expresní systém, kde se plazmid amplifikuje sice uvnitř jádra, ale mimo chromosom, a tudíž se eliminuje integrace do genomu) a systémy T7 vyvinuté firmou Progenitor (striktně cytoplazmatický expresní vektor, kde vektor sám exprimuje T7 RNA polymerázu z fága T7 a terapeutický gen je řízen druhým promotorem T7, užívajíc polymerázy generované prvním promotorem). K dalším, obecnějším zlepšením technologie DNA
Jde o použití („supercoiled Gencell (tyto • · ♦ ·· · · • · · · • · ··· · • · · • · · · · ·· ·· • · · · • · · · • ··· ··> • · ·· »· vektorů patří použití cis-púsobících prvků k dosažení vysoké hladiny exprese (Vical), použití sekvencí odvozených z alfa-repeatu DNA k poskytnutí regulace- replikace „jednou za .buněčný cyklus a použití jaderných zaměřovačích sekvencí (z genu EBNA-1, Calos ve Stanfordu, a Megabios), časného promotoru SV4 O/enhanceru nebo- peptido.vých sekvencí připojených k DNA.
Zaměřovači systém založený . na rozpoznávání buněčných receptorů ligandem připojeným k DNA byl popsán v práci Michael, S.I a Curiel, D.T., Gene Therapy, 1994, 1: 223-232.
Pomocí ligandu, který je rozpoznáván takovým receptorem, se DNA selektivně váže na cílovou buňku, a pak .je jí internalizována (Wu, G, . Y and Wu, C.H.', J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429-4432) Polykationt poly-L-lysin (PLL) byl užit ke spojení řady proteinových ligandů'k DNA metodou 'chemického zesítění. DNA se elektrostaticky váže na molekuly ligandu PLL. Zaměřovači systém s využitím transferinového receptorů publikovali Zenke et al (Proč. Nať. Acad. Sci. U.S.A., 1990,
87: 3655-3659), Wu, G.Y. and Wu, C.H. (J. Biol. Chem., 1987. 262: 4429-4432) užili asialoorosomukoidový receptor a Batra et al. (Gene Therapy, 1994, 1: 255-260) užili sacharidy na buněčném povrchu. Činidla jako chlorokin nebo kolokalizované' adenoviry se mohou užít ke snížení degradace DNA v lysosomech (viz Fischer, K.J, and Wilson, J.M., Biochem. J., 1994, 299,
49-58) . Cristiano et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 199.3, 90: 11548-11552) zkonstruovali komplex adenovirus-DNA-ligand. Patentové dokumenty týkající se receptory zprostředkované endocytózy jsou WO 92/05250 (asialoglykoproteiny, University of Connecticut) a US 5354844 (transferinový receptor, Boehringer) .
DNA a ligand mohou být naneseny na povrch adenoviru a může tak vniknout tzv. potažený adenovirus (Fischer, K.J.
999
99
II · 9 <
» 9 999 · ► 9 9 • 9 99 » 9 9
I 9 9
999
9
99 and Wilson, J.M., Biochem. J., 1994, 299, 49-58) . Avšak přítomnost dvou receptorovýh drah pro vstup DNA (receptor pro ligand a receptor pro adenovirus) snižuje specifičnost tohoto přenosového systému, ale adenovirovou dráhu je možné eliminovat užitím protilátky proti vláknitému proteinu adenoviru, který je'pojítkem s DNA (Michael, Sil. and Curiel, D.T., Gene Therapy, 1994, 1: 223-232) . Použití purifikovaných endosomalytických proteinů místo intaktních virových částic je další možností (Seth, P. J. Virol., 1994, 68: 1204-1206).
• Exprese genového konstruktu podle předkládaného vynálezu v jeho cílovém místě je výhodně- řízena transkripční regulační sekvencí (TRS). TRS je promotor případně kombinovaný s enhancerem a/nebo kontrolním prvkem jako je např. genetický přepínač, který bude popsán dále.
Jedním příkladem TRS je genetický přepínač, který je možné využít ke kontrole exprese genového konstruktu .podle předkládaného vynálezu, jakmile byl jednou vnesen do cílové buňky. Kontrola genové exprese v buňkách vyšších eukaryot prokaryotickými regulačními prvky (které jsou výhodné podle vynálezu) byla popsána v přehledu Gossen et al., TIBS, 18. prosince, 1993, 471-475. Vhodný systém zahrnuje lac operon z E. coli a zvláště výhodně operon tetracyklinové rezistence z E. coli. K publikacím o tetracyklinové rezistenci patří Gossen et al. (1995) Science 268, 1766; Damke et al (1995) Methods in Enzymology 257, Academie Press; Yin et al (1996)
Anal. Biochém. 235, 19S patenty US 5464758, US 5589362, patentová Zeneca).
Connaught
WO 96/01313 and WO 94/29442 (Bujard). Další možností je přepínač založený na přihláška PCT/GB96/01195,
Ještě další možnosti ekdysonu (mezinárodní publikace WO 96/37609, jsou uvedeny dále.
Laboratories (WO 93/20218) popsali syntetický indukovatelný eukaryotický promotor obsahující alespoň dvě odlišné třídy ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· *· ·· · • · ·· · ·· ·· • · • · • · · ·· indukovatelných prvků. Rhone Pouleno Rorer (WO 96/30512) popsali systém podmíněné genové exprese založený na tetracyklinu. Ariad (WO 94/18317) popsali systém ^založený na dimerizaci proteinů, jehož aktivita byla prokázána in vivo. Bert O'Malley z Byalor College of Medicine (WO 93/2.3431 a US 5364791) popisuje molekulární přepínač založený na použití modifikovaných steroidnich receptorů. Whitehead Insitute publikoval indukovatelný genový expresní systém založený na· NF-KB ,(W0 88/05083). Batelle Memoriál popsali stresem indukovatelný promotor (evropský patent EP 263908) .
K příkladům TRS, který není závislý na typu buněk, patří následující prvky : cytomegalovirový promotor/enhancer, SV40 promotor/enhancer, a promotor/enhancer z dlouhé terminální repetice retroviru. K příkladů TRS,' který je závislý na typu buněk (což dodává další stupeň k zaměřování) patří následující: .karcionoembryonální antigen (CEA) · pro zaměřování buněk tlustého střeva a konečníku, plic a prsu, alfa-fetoprotein (AFP) pro zaměřování transformovaných hepatocytů, tyrosinhydroxyláza, cholinacetyltransferáza nebo neuronově specifická enoláza pro zaměřování neuroblastomů, insulin pro zaměřování pankreasu a gliový kyselý fibroprotein pro zaměřování glibblastomů. Mohou být také užity některé onkogeny, které jsou selektivně exprimovány . v některých nádorech, např. HER-2/neu nebo c-erbB2 v nádoru prsu nebo N-myc v neuroblastomech.
Tudíž' výhodný genový konstrukt pro použití jako léčivo je konstrukt, který obsahuje transkripční regulační sekvenci obsahující promotor a kontrolní prvek, kterým je genetický vypínač, který řídí expresi genového konstruktu. Výhodný regulační prvek s genetickým vypínačem je regulován přítomností tetracyklinu . nebo ékdysonu. Výhodný promotor je závislý na buněčném typu a je vybrán z následujících
9 999 9
9 9
99
9 9 9
9 9 9
promotorů: promotor karcionoembryonálního antigenu (CEA), alfa-fetoproteinu (AFP), tyrosinhydroxylázy, cholinacetyltransferázy, neuronově specifické enolázy insulinu a gliového kyselého fibroproteinu, HER-2/neu, c-erbB2 a N-myc. Výhodně genový konstrukt pro použití jako léčivo.pro podávání savčímu hostiteli je podle předkládaného vynálezu sbalen uvnitř adenoviru. - Obecný přehled o cílené genové terapii podali Douglas et al.,, Tumor Targetting, 1995, 1:
67-84.
Protilátka kódovaná genovým konstruktem podle vynálezu může být ve formě protilátkového konstruktu jako' je napřu F(ab')2, F(ab'), Fab, Fv, jednořetězcový Fv a V-min. Spadá sem jakýkoliv protilátkový konstrukt, jako např. nedávno popsaný protilátkový fragment L-F/abH dle Zapata, 1995., Protein Engeneering, 8, 1057-1062. Lze uvažovat- také o Fvs s disulfidickými vazbami. Pro konstrukty založené na enzymu CPG2 je výhodná dimerizace Fab fragmentů konstruktu prostřednictvím enzymové dimerizace. Protilátky jiné než lidské mohou být humanizovány pro použití u člověka, aby se snížila' imunitní reakce hostitele. Humanizovaná protilátka, příbuzný fragment nebo protilátková vazebná struktura je polypeptid složený z větší části strukturního rámce sekvencí odvozených z lidského imunoglobulinu, který nese aminokyselinové sekvence; jiné než lidské ve vazebném místě pro antigen a jeho okolí (komplementaritu určující úseky, CDR) . Vhodná metodologie byla popsána podrobně' např. v dokumemtech WO 91/09967, EP 0328404, Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029, Mountain a Adair, 1989,
Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 10, 1, 1992,' ale lze uvažovat i o dalších alternativních způsobech humanizace, jako je např. tzv. obkládání povrchových zbytků (viz EP 519596, Merck/NIH, Padlan et al.).
• · ·
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje párový dvousložkový systém pro použití v savčím hostiteli, kde složky tvoří: I) první složku, která obsahuje genový konstrukt kódující protilátku zaměřující buňku a heterologní enzym aktivující předlék, kde genový konstrukt je schopen exprimovat protilátku a enzym jako- konjugát uvnitř cílové buňky v savčím hostiteli, a kde konjugát může poté opustit cílovou buňku pro selektivní lokalizaci na antigenu buněčného povrchu rozpoznávaném protilátkou, a II) druhou složku, která obsahuje předlék, který může být, konvertován enzymem na aktivní lék.
Protilátkou řízená enzymová předléková terapie (ADEPT) je známým způsobem v léčení rakoviny. ADEPT užívá nádorově selektivní protilátky konjugované s enzymem. Konjugát je podáván pacientovi (obvykle intravenózně) a ponechá se, aby se lokalizoval do místa (míst) nádoru a odstranil z krevního oběhu a normálních tkání. Pak se podá pacientovi předlék, který je konvertován enzymem (lokalizovaným v místě nádoru) na cytotoxický lék, který zabíjí nádorové buňky.
Předkládaný vynález lze užít v jakémkoliv systému ADEPT. K vhodným příkladům systému ADEPT patří takové, založené na některém z následujících enzymů: karboxypeptidáza G2; karboxypeptidáza A; aminopeptidáza; alkalická fosfatáza; glykosidáza; β-glukuronidáza,· penicilinamidáza; β-laktamáza; cytosindeamináza; nitroreduktáza; nebo na mutovaných hostitelských enzymech jako je karboxypeptidáza B a ribonukleáza. popsali např. Melton RG, 1996, J.
88, 1 ; , Niculescu-Duvaz, I.,
Chemistry 2, 687; Knox RJ, 1995, Clin. Immunother. 3, 136; WO 88/07378 (CRCT) ;. Blakey et al, Cancer Res. 56, 3287-92, 1996; US 5587161 (CRCT a Zeneca); WO 97/07769 (Zeneca);
karboxypeptidáza A, Vhodné systémy ADEPT National Cancer Institute 1995, Current Medicinal • « • © ···· ·· ·· · · · « • · · · · · 9 · · · • · ©·· · · · · ··· ··· • · · · · · · ·© ·· ··· *·· ·· ·· a WO 95/13095 (Wellcome). Heterologní enzym může být ve formě katalytické protilátky, viz např. EP 745673 (Zeneca).
K dalším přehledným článkům o. systémech ADEPT patří Hay a Denny, 1996> Drugs of the Future, 21 (9), 917-931 a Blakey,
1997, Exp. Opin. Ther. Patents, 7(9), 965-977.·
Výhodný přizpůsobený dvousložkový systém podle předkládaného vynálezu je takový, kde:
. První složka obsahuje gen kó.dující heterologní enzym CPG2; a předlék druhé složky je vybrán ze skupiny obsahující N-(4-[Ν,Ν-bis(2-iodoetyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu, γ-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-(4-[N,N-bis(2chloroetyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové a N-{4-[N,Nbis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu nebo jejich f arrrtaceuticky přijatelné soli. 'Výhodné předléky pro použití s CPG2 jsou popsány v následujících patentech ' , firmy .Zeneca Limited a Cancer Research Campaign Technology Limited: US 5714148, US 5405990, 5587161 a 5660829.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob podání cytotoxického léku na požadované místo, kterýžto, způsob obsahuje krok, kdy se hostiteli podá první složka, která obsahuje genový konstrukt podle vynálezu, a pak následuje podání druhé složky, která obsahuje předlék, který může být konvertován na cytotoxický lék heterologním enzymem kódovaným první složkou. Výhodný způsob podání cytotoxického léku ne místo podle předkládaného vynálezu je takový způsob, kde první složka obsahuje gen kódující heterologní enzym CPG2 a předlék druhé složky je vybrán ze skupiny obsahující N-(4[N,N-bis(2-iodoetyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu, γ-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-(4-[N,N-bis.(2-chloroetyl) amino] fenoxykarbonyl)-L-glutamové a N- { 4-[N,N-bis (2- ..
chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli. .
• · · 9 9 9 · · · 9 9 · • · · · · 9 9 9 9 9 • 9 999 9 9 9« 999 999 • · . · 9 · · · «1 9 9 9 9·· 99 99
Zkratky
AAV
ADEPT
AFP
AMIRACS
APS
b.p.
BPB
CDR
CEA
CL
CPB
CPG2
CPG2 R6
DAB
DEPC
DMEM
ECACC
EIA
ELISA
FAS
FCS
Fd
GDEPT
HAMA
HCPB použité v popisu vynálezu
Adeno-asociovaný virus antilátkou řízená enzymová předléková terapie alfa-fetoprotein ,
Antimetabolit s inaktivací pomocného činidla v místě nádoru peroxodvojsíran amonný pár baží bromfenolová modř úsek'(-y) určující komplementaritu karcionembryonální antigen konstantní doména lehkého řetězce protilátky karboxypeptidáza B karboxypeptidáza G2
Karboxypeptidáza G2 mutovaná tak, aby se zabránilo glykosylaci po expresi v eukaryotické buňce, viz příklad 1 d substrát 3,3'-diaminobenzidinetetrahydrochlorid dietylpyrokarbonát
Dulbeccovo médium modifikované Eaglem Evropská sbírka buněčných kultur živočichů enzymový imunotest tes.t s enzymem vázaným na imunosorbent médium s přídavkem folinové kyseliny telecí fetální sérum těžký řetězec Fab, Fab' nebo F(ab')2 případně obsahující kloubovou.oblast genem řízená enzymové předléková terapie lidská anti-myší protilátka 1 lidská karboxypeptidáza B, výhodně pankreatická • · ·· * 9 99.99 • 9 · » , · · · 9 9 99 9
9999 9 9 9 99 9
9 999 99 99 999 999
9 9.9 9 9 9
99 999 999 99 99
Kloubové oblast (IgG) krátký peptid bohatý na proldn,který obsahuje cysteiny vytvářející můstky spojující 2 těžké řetězce
HRPO'nebo
IRES
MTX
NCA
NCIMB
OPD
PBS
PCR
PGP preproCPB proCPB scFv
SDS-PAGE
SSC '
TBS
Temed
TFA
TRS
VDEPT
VH
VK
HRP křenová proxidáza vnitřní ribozomové vstupní místo methotrexat nespecifický křížově reagující antigen
Národní sbírka průmyslových a mořských bakterií ortho-fenylendiamin fosfátem pufrovaný solný (fyziologický) roztok polymerázová řetězová reakce
N-(4-[N,N-bis(2-chloroethyl)aminofenoxykarbonyl)-L-glutamová kyselina proCPB s N-koncovou vedoucí sekvencí
CPB s N-koncovou prodoménou jednořetězcový Fv elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným roztok soli s citrátem sodným
Trisem pufrovaný solný roztok
N,N,Ν',Ν'-tetrametyletylenediamin trifluorooctová kyselina trans.kripční regulační sekvence virem řízená enzymová předléková terapie variabilní úsek těžkého řetězce protilátky variabilní úsek lehkého řetězce protilátky
V popisu předkládaného vynálezu se uvažuje také o konzervativních náhradách ve specifických sekvencích aminokyselin, které si uchovávají relevantní biologické vlastnosti složky předkládaného vynálezu, ale liší se v sekvenci jednou nebo několika konzervativními substitucemi, • · · € · • · · · 4 · · · • · · · · · • · · » * «« · delecemí nebo adicemi aminokyselin. Výhodné jsou zde konkrétně uvedené aminokyselinové . sekvence. Typické konzervativní aminokyselinové substituce jsou uvedeny v následující tabulce.
Původní aminokyselina
Příklady substitucí
Výhodná substituce
Ala | (A) | Val; | Leu; Ile | Va-1 |
Arg | (R) | Lys : | Gin; Asn | Lys |
Asn | (N) | Gin; | His; Lys; Arg | Gin |
Asp | (D) | Glu | Glu | |
Cys | (C) - | Ser | Ser | |
Gin | (Q) | Asn | Asn | |
Glu | (E) | Asp | Asp | |
Gly | (G) | Pro | Pro | |
His | (H) | Asn; | Gin; Lys; Arg | Arg |
Ile | (I) | Leu; | Val; Met; Ala; Phe;. | Leu |
Norleucin
Leu | (L) | Norleucin; Ile; | Val; | Ile |
Met; Ala; Phe | ||||
Lys | (K) | Arg; Gin; Asn | Arg | |
Met | (M) | Leu; Phe; Ile | Leu | |
Phe | (F) | Leu; Val; Ile; | Ala | Leu |
Pro | (P) | Gly | • Gly | |
Ser | (S) | Thr | Thr | |
Thr | (T) | Ser | Ser | |
Trp | (W) | Tyr | Tyr | |
Tyr | (Y) | Trp; Phe; Thr; | Ser | Phe |
Val | (V) ' | Ile; Leu; Met; | Phe; | Leu |
Ala; Norleucin |
Nomenklatura aminokyselin je
Alanin Ala Arginin Arg Asparagin Asn Asparagová kyselina Asp Cystein Cys Glutamová kyselina Glu Glutamin Gin Glycin Gly Histidin His Isoleucin Ile
Leucin Leu Lysin Lys Methionin Met Fenylalanin Phe Prolin· ' Pro Serin Ser Threonin Thr Tryptofan , Trp Tyrosin Tyr Valin Val libovolná aminokyselina Xaa ♦ · ·· • · · e • · · · • · 9 · » • · - ♦
99 · · ··
9. 9 9 9 9
9 9 9 ·
9 999 999 9 9 9
999 9 9 99 uvedena v následující tabulce
A .
R
N
D
C
E
Q
G
H
I
L
K
M
F
P ' S
T w
Y v
X
V popisu předkládaného vynálezu se uvažují variace nukleových kyselin (delece, substituce a adice) specifických sekvencí, které uchovávají jejich schopnost hybridizovat za stringentních· podmínek se specifickou sekvencí podle vynálezu. Přitom stringentní podmínky jsou zde definovány jako 6 x SSC, 0,1 % SDS a 60 °C po 5 minut. Avšak výhodné jsou specifické sekvence uvedené v seznamu sekvencí. Chemické analogy přirozených nukleových kyselin jako jsou např.
»· · · · · ·· • · · · * » ♦ · · ·· · • · · · · · « « · · • * ··· ·> · * · ··· ··· ♦ · · · 9 '9 9 ·· ·» ··» ··· «Jí «» „peptidové nukleové kyseliny (PNA)· považujeme za přijatelné ekvivalenty, zvláště pro účely, kdy se nevyžaduje translace do proteinu (Wittung, 1994, Nátuře 368, 561) .
Předkládaný vynález bude dále ilustrován pomoci následujících, vynález nijak neomezujících, příkladů a obrázku. Údaje o teplotě j,sou uváděny ve stupních Celsia:
Seznam obrázků
Obr. 1 představuje .reprezentativní konstrukt fúzního genu obsahující fragment Fd těžkého řetězce protilátky A5B7 spojený na svém C-konci prostřednictvím flexibilního peptidového linkeru (G4S)3 s N-koncem polypetidu CPG2. SS reprezentuje signální sekvenci, L reprezentuje sekvenci linkeru (spojky). CPG2/R6 reprezentuje CPG2 se zrušeným glykosylačním místem díky mutaci, jak je podrobněji vysvětleno v textu.
Obr. 2a ukazuje fúzní ' protein (Fab-CPG2)2 s dimerizací uskutečněnou prostřednictvím nekovalentních vazeb mezi dvěma molekulami CPG2.
Obr. 2b ukazuje protilátkový· fragment F(ab-)2·
Obr. 3 Ukazuje test ELISA založený na- buňkami secernovaném fúzním proteinu: Pouze linie pozitivní na CEA zvýšila hladinu vazby se zvyšujícím se množstvím přidaného fúzního proteinu, zatímco buněčné linie negativní na CEA měly stále konstantní základní hladinu vazby. Vertikální osa reprezentuje hodnoty optické hustoty měřené při 490 nm a horizontální osa představuje množství přidaného fúzního proteinu vyjádřené • · a « » · · « » · · · » ····<· ► · · • · 9 · • · 9 9 » « · 9 » » · 9
9 99 9
9
9-9 <9 v ng' proteinu. Graf ukazuje hodnoty získané v pokuse, kde byla řada buněčných linií spolu s negativní kontrolou (bez buněk) inkubována s rostoucím množstvím fúzního proteinu pomocí buněčného testu popsaného v příkladu 6.. Výsledky ukazují, že pouze .buňky LoVo (CEA pozitivní) projevily zvýšení OD4;q odpovídající zvýšenému množství přidaného fúzního proteinu. Všechny ostatní buněčné linie (CEA negativní) a kontrola (bez buněk) . vykazovaly pouze základní hladinu ODyjo, která se nezvyšovala po přidání fúzního proteinu. Tyto výsledky skýtají důkaz, že fúzní protein se váže specificky na CEA pozitivní buněčnou linii způsobem závislým na dávce a naopak se neváže na buňky negativní na CEA. ' Obr. 4 ukazuje retenci (zadržení) secernovaného fúzního proteinu na rekombinantních nádorových buňkách LoVo. Vertikální osa reprezentuje optickou hustotu měřenou, při 490 nm a horizontální osa množství přidané protilátky antiCEA (IIE6) vyjádřené v ng/ml proteinu. Pokus byl proveden jak je popsáno v příkladu 7 s užitím 3 různých buněčných linií, rekombinantní linie LoVo a Colo320DM (které sami secernují fúzní protein) a nesecernuje fúzní a opláchnuty, aby kontrolní rodičovské LoVo linie, která protein. Nejdříve byly buňky fixovány 3. všechen se odstranil supernatant ε nenavázaný materiál a pak se přidávala rostoucí koncentrace protilátky anti-CEA (IIE6) k fixovaným buňkám. Test se vyvolal jak je popsáno v textu, aby se stanovila hladina retence secernovaného meteriálu a aby se stanovilo, zda další přidání protilátky zvyšuje signál. Výsledky ukázaly, že bez přidání protilátky anti-CEA kontrolní rodičovská linie LoVo vykazovala pouze základní hladinu hustoty při 490 nm (jak se očekávalo), zatímco rekombinantní linie LoVo dávala velmi ' 44 4 • 4 4 » 99 • 444 4
4 4444 4
4 4 4
4 44 . '4 4 4
44 4 4
4 44 4
4 4 4 4
4 444 444
4 4
4 4 4* 4 4 signál OD při 490' niti, což ukazovalo, že materiál fúzniho proteinu byl zadržen na CEA pozitivních LoVo buňkách. CEAnegativní rekombinantní 'buky Colo320DM dávaly mnohem slabší signál než LoVo buňky, ale přitom byl signál silnější než základní pozadí (pravděpodobně díky nezafixování secernované protilátky na počátku testu). Zvyšování ' koncentrace protilátky anti-CEA (IIE6) přidávané k fixovaným buňkám ukázalo odpověď závislou na dávce v případě rodičovských buněk LoVo, což ukazuje, že' jsou C.EA pozitivní a že mohou vázat materiál vážící sena CEA (jako je např. fúzní protein, pokud je přidán) . Rekombinantní Colo320DM a LoVo buňky ukázaly jen malé zvýšení signálu OD490 se zvyšujícím se množstvím přidané protilátky s výjimkou buněk LoVo, které vykazovaly slabou odpověď při .nejvyšší dávce' protilátky. Jelikož rekombinantní buňky Colo320DM jsou CEA: neg-ativni, žádné zvýšení signálu díky anti-CEA protilátce se nedalo očekávat. V případě rekombinantních buněk LoVo je zvýšení signálu díky zvýšenému množství protilátky nesnadno hodnotitelné, kromě nejvyšší hodnoty protilátky, díky relativně vysokému počátečnímu signálu.
Obr. 5 ukazuje retenci secernovaného fúzniho proteinu na rekombinantních nádorových buňkách LoVo. Vertikální osa reprezentuje medián objemu nádoru (cm3) a horizontální osa představuje čas ve dnech po podání dávky předléku. Pokus byl proveden jak je popsáno v příkladu 12 užitím dávky předléku 60 mg/kg. Výsledky ukázaly, že kontrolní nádory GAD(c) (bez předléku) se zvětšily na 6násobekpůvodní velikosti do 11 -dnů (dny po dávce/, kdy byly nádory odebrány. Nádory ošetřené předlékem GAD(d) jevily významně pomalejší růst a do 16. dne (dny po dávce) dosáhly pouze 3násobku počáteční velikosti.
* · · · 0 .· ·· · · • · « · r 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99-9 9 9 9 9 999 999
9 9 9 9 9 9
99 «·· ··· ·> «·
Tato data ukazují alespoň na 11 denní zpoždění v růstu nádoru.
Příklady provedení vynálezu
V následujících příkladech, pokud nebude uvedeno jinak, bylo použito následujících metod a materiálů.
DNA byla izolována a purifikována pomocí soupravy GENECLEAN™ II (Stratech Scientific Ltd.Nebd Bio 101 lne.). Souprava obsahovala: 1)6M jodid sodný, 2) koncentrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA pro přípravu promývacího roztoku chlorid sodný/etanol/voda, 3) Glassmilk, což je
1,5 ml lahvička obsahující speciálně formulovanou matrix oxidu křemičitého ve vodě. Toto je technika izolace DNA založená na způsobu, který popsali Vogelstein a Gillespie v Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1979) Vol S 76, p 61 S. Stručně shrnuto, postup se soupravou vypadá takto: k jednomu objemu vyříznutého gelu se přidá 3 násobek roztoku jodidu sodného ze soupravy. Agaróza ' se rozpustí zahřátím na 55 °C po 10 minut a pak se přidá suspenze Glassmilk (5 až 10 ml) , vše se dobře promíchá a nechá stát při teplotě místnosti 10 minut. Glassmilk se pak stočí a 3x propláchne roztokem NEW WASH™ (0,5 ml) ze soupravy, promývací pufr se pak odstraní a DNA se eluuje tak, že se Glassmilk inkubujes vodou (5 až 10 ml) při 55 °C po 10 minut. Vodný supernatant obsahuje DNA, která... se pak získá centrifugací. Eluční krok je množné opakovat a supernatanty pak sloučit.
Kompetentní buňky E. coli DH5a byly získány od firmy Life Technologies Ltd. (kompetentní buňky DH5a MAX™efficiency). «00
0· ·· • · · · ' • 0 · ·
0 000 0
0 0
0 0 0 « 0 0 0 0 0 0 « 000 0-0 0 000 000 00 00
Minipreparace 'dvouřetězcové plazmidové DNA se prováděly pomocí soupravy pro izolaci DNA. RPMT™ DNA preparation kit nebo jiné podobné lýzovací roztok firmy Bio 101 lne. (katalog, č. 2070-400) soupravy. Souprava obsahuje alkalický k uvolnění plazmidové DNA z bakteriálních buněk a Glassmilk ve speciálním filtru pro centrifugační mikrozkumavky, ' který obsorbuje' uvolněnou DNA, která se pak eluuje, sterilní vodou nebo lOmM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 7,5.
Standardní polymerázová řetězová reakce (PCR) obsahovala 100 ng plazmidové DNA (pokud není uvedeno jinak) , 5 μΐ dNTP (2,5 mM) , 5 μΐ lOx Enzymový pufr (500 mM KC1, 100 mM Tris μΐ základního termostabilní DNA pH 8,3), 15mM . MgCl2 a, 0,1% želatina), ρΜ/μΙ roztoku každého primeru, 0,5 μΐ polymerázy a vodu do celkového objemu 50 μΐ. Standardní podmínky cyklování PCR byly: 15 cyklů PCR 94° - 90 s, 55 °C - 60 s, 72°C - 120 s, poslední cyklus končil . další inkubací v 72 °C po 10 minut.
Byla použita termostabilní DNA polymeráza AMPLITAQ™ od firmy Perkin-Elmer Cetus.
Obecné postupy molekulární biologie, které byly použity, jsou popsány v příručce Molecular Cloning - A Laboratory Manual Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 198'9) .
Použité médium bez séra bylo médium. OPTIMEM™ I Reduced Sérum Medium od firmy GibcoBRL (katalog, č. 31985) . To je modifikované médium Eagle's Minimum Essential Medium pufrované Hepes a hydrogenuhličitanem. sodným, doplněné hypoxantinem, thymidinem, pyruvátem sodným, L-glutaminem stopovými prvky a růstovým faktory.
Činidlo LIPOFECTIN™ (GibcoBRL, katalog, č. 18292-011) je liposomový přípravek 1:1 (hm./hm.) kationtového·lipidu N-[l(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimetylamoniumchloridu (DOTMA) • · · · • · » · • · · · • · ·Β· Β • · · • · * · • ·· · a dioleoylfosfatidyletanolaminu (DOPE) ve filtrované vodě. Spontánně se váže s DNA a vytváří DNA-lipidové komplexy, viz Felgner et al. in Proč. Nati. Acad. Sci.' USA ( 1987) 84,
7431 .
G418 č. 11811), gentamycinu, (sulfát) což je které je GENETICIN™, aminoglykosidové
GibcoBRL (katalog, antibiotikum příbuzné jako selekční činidlo každá jamka 96jamkové potažena 50 ng CEA se používá v molekulárně genetických pokusech V testech CEA .ELISA byla mikrodestičky (NUNC MAXISORBT™) v potahovacím uhličitan/hydrogenuhličitanovém pufru pH 9, 6 (pufrové tobolky Sigma C3041) a destička se inkubovala ve 4°C přes noc. Pak se destička 3x opláchla PBS-TWEEN™ (PBS + .0,05% TWEEN™ 20) a pak blokovala 150' μΐ 1% BSA v PBS-TWEEN™ do každé jamky po 1 hodinu při.teplotě místnosti. Destička se pak opět 3x opláchla PBS-TWEEN™, přidalo - se do každé jamky 100 μΐ testovaného vzorku a destička se inkubovala ' 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se opět 3x opláchla PBS-TWEEN™ a přidalo se do každé jamky 100 μΐ ředění 1/500 kozí antihumánní kappa protilátky značené HRPO (Sigma A 7164) v 1% BSA v PBS-TWEEN™ a destička se inkubovala při teplotě místnosti na kývající se plošině alespoň 1 hodinu. Pak se destička 3x opláchla PBS-TWEEN™ a nakonec ještě jednou v PBS. Pro detekci vazby se přidalo do každé jamky 100 μΐ vyvíjecího roztoku (jedna tobolky fosfát-citrátového pufru Sigma P4922 rozpuštěná ve 100 ml ‘vody, s přídavkem jedné 30mg tablety o-fenylendiamindihydrochloridu Sigma P4812) a destička se dále inkubovala 15 minut. Reakce byla zastavena přidáním 75 μΐ 2M H_S04 a byla odečtena obsorbance při 490 nm.
Test CEA ELISA užívající anti.-CPG2 reportérovou protilátku byl v podstatě shodný s výše popsaným, ale místo kozí- anti-humánní kappa protilátky značené HRPO se užila ·· *· • · · · • · · · • · »·» • · * ι· · ·· ·· «· » · · · > · « « ♦ ♦· · ·· * · ·· ·· králičí anti-CPG2 polyklonální sérum ředěné 1/1000 v 1% BSA v PBS-TWEEN™ a destička se inkubovala při. teplotě místnosti na kývající se plošině po 2 hodiny. Pak se destička 3x opláchla PBS-TWEEN™, přidala se kozí .anti-králičí protilátka značená HRPO (Sigma A-6154) a destička se inkubovala při teplotě místnosti na kývající se plošině po 1 hodinu a pak destička 3x opláchla PBS-TWEEN™ a nakonec ještě jednou v PBS. Pro detekci vazby te přidalo do každé jamky 100 μΐ vyvíjecího roztoku (jedna tobolky fosfát-citrátového pufru Sigma P4922 rozpuštěná ve 100 ml vody, s přídavkem jedné 30mg tablety o-fenylendiamindihydrochloridu Sigma P4812) a destička se dále inkubovala 15 minut. Reakce byla zastavena přidáním 75 μΐ 2M H2S04 a byla odečtena absorbance při 490 nm.
Analýza westernových blotů transfekčních supernatantů se prováděla následujícím způsobem.
10% minigely pro analýzu transfekce fúzním proteinem byly připraveny - pomocí vhodného systému pro minigely (HOEFER MIGHTY SMALL™). 10% rozdělovači gel (running gel) má složení: 20 ml akrylamid, 6 ml 10 x pufr pro rozdělovači gel, 34 ml H20;' 300 ml 20 % SDS;' 600 μΐ APS, 30 μΐ Temed. lOx, pufr pro rozdělovači gel je 3,75M Tris pH 8,6. 6% srovnávací gel (stacking gel) má složení: 9 ml akrylamid, 4,5 ml lOx pufr pro srovnávací gel, 31,5 ml H20, 225 μΐ 20% SDS, 450 μΐ 10% APS, 24 μΐ Temed). lOx pufr pro srovnávací gel je 1,25M Tris pH 6,8. 5x elektroforetický pufr pro SDS/PAGE byl 249mM (hmotnost/objem) SDS (pH nebylo
2x Laemmliho buffer je 0,125M Tris; 4%
Tris, | 7 99mM | glycin, | 0, 6 |
upraveno). | |||
Příprava | vzorků: | 2x | |
SDS, | 30% glycerol; | 4M |
urea; 0,002% BPB β-merkaptoetanol.
Supernatanty: 25 μΐ naneseno 40 μΐ.
případně 5% vzorku + 25 μΐ 2x LAemmliho pufru,
ΦΦ ΦΦ · • φ · · · φ • ΦΦΦ * φ φ ΦΦΦ « φ
9 9 <
ΦΦ ΦΦ ···
ΦΦ ΦΦ • ♦ · 9 9 · • Φ Φ Φ Φ
Φ -· ΦΦΦ ΦΦΦ Φ Φ Φ • ΦΦ ΦΦ ΦΦ
Standardy F(ab'); a CPG2: : 2 μΐ 10 ng/ml standardu; 8 μΐ FFO; 10 . μΐ 2x Laemmliho pufru (-merkaptoetanol); naneseno 20 μΐ.
Markéry (standardy) molekulové- hmotnosti: byl užit komerční markér RAINBOW™ firmy Amersham, 8 μΐ vzorku, 8 μΐ 2x Laemmliho pufru (+mercaptoetanol); naneseno 16 μΐ.
Podmínky elektroforézy: 1 30 miliampér dokud barva nedosáhla spodního okraje gelu (přibližně 1 hodinu).
Přenos na membránu (blotting): pomocí polosuchého přenosového zařízení firmy LKB na nitrocelulózovou membránu, miliampéry = 0,7 x cm, po 45 minut.
Blokování membrány: 5% sušené odstředěné mléko v PBS-TWEEN™ po 40 minut.
Detekce F(ab’)2: ' pomocí lehkého řetězce kozí antihumánní kappa protilátky značené HRPO, ředěné 1/2500 v 0,5% sušeném odstředěném mléku v PBS-TWEEN™, inkubováno přes noc.
Detekce CPG2: -myší anti-CPG2 monoklonální protilátka (ředění_1/2000 v 0,51 sušeném odstředěném mléku v PBS-TWEEN™, inkubováno přes noc),, kozí anti-myší kappa protilátka značená HRPO, Sigma 674301, ředěná 1./10000 v 0,5% sušeném .odstředěném mléku v PBS-TWEEN™, inkubováno alespoň 2 hodiny. 1 Vyvíjení blotů (přenesených membrán): Chemiluminiscenční detekce HRPO založená na luminolu jako' substrátu v přítomnosti zesilovače (Pierce SUPERSIGNAL™ Substráte). Pracovní roztok substrátu byl připraven následovně: doporučený objem 0,125 ml/cm2 povrchu membrány. Smíchal se stejný objem -roztoku luminolu/zesilovače a stabilního peroxidu, membrána se inkubovala 5 až 10 minut v pracovním roztoku, roztok se odstranil a membrána se umístila do chrániče a exponovala na autoradiografický film (obvykle 30 s až 5 minut).
φ · • φ • · • · * φφ φφ ··· · * φφφ • Φ • φ • · φφφ • φ φ* φφ • · ···
Uložení mikroorganismů: Plazmid pNG3-Vkss-HuCk ' byl v souladu s Budapěšťskou smlouvou uložen 11. dubna 1996 v Národní sbírce průmyslových a mořských bakterií (National Collections of Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Scotland, United Kingdom) jako položka č. NCIMB '40798. Plazmid pNG4-VHss-HuIgG2CHl' byl taktéž uložen v NCIMB 11. dubna 1996 jako položka č. . NCIMB 40797. Plazmid pNG3-Vkss-HuCk-NEO .byl taktéž uložen v NCIMB
11. dubna 1996 jako položka č. NCIMB 40799. Plazmid pICI266 byl uložen v NCIMB (23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Scotland, United Kingdom) 11. října 1993 jako položka č. NCIMB 40589.
Trypsinizace: Trypsin EDTA (Gibco BRL, katalog, č. 45300-019) a Hanksův vyvážený solný roztok (HBSS; Gibco BRL, katalog, č. 14170-088) byly předehřátý na 37 °C ve vodní lázni. Stávající média z kultur se odstranila a nahradila objemem HBSS, který byl polovinou původního objemu média, a'vrstva buněk byla opatrně promyta tím, že se miska nebo kultivační: láhev, jemně kývala, aby se odstranily všechny zbytky média obsahujícího sérum. HBSS se odstranilo a byl přidán objem trypsinového roztoku (čtvrtina objemu původního média) a láhev se jemně - kývala, aby se zajistilo úplné pokrytí celé vrstvy buněk a ponechalo se stát 5 minut. Trypsin byl inaktivován přidáním normálního kultivačního média (2 x objem trypsinového roztoku). Získaná buněčná suspenze se pak buď kvantifikovala co do počtu buněk nebo se ředila pro další kultivaci, v závislosti na zamýšlených dalších krocích. Tepelná inaktivace fetálního telecího séra (FCS): FCS (Viralex A15-651, akreditovaná várka neevropského původu)bylo uskladněno při -20 °C. Před použitím bylo ponecháno přes noc ve 4°C úplně roztát. Následující den se inkubovalo ve vodní lázni 37 °C 15 minut a pak se přeneslo do vodní lázně 56 ° C na 5 minut. Pak se sérum vyjmulo a ponechalo chladnout na teplotu místnosti, poté bylo rozděleno do 50 ml alikvotních částí a uskladněno v -20 °C.
Normální DMEM médium (s užitím složek firmy Gibco BRL): K 500 ml DMEM (katalog, č. 41966086) se přidalo 12,5 ml Hepes (15630-056); 5 ml NEAA (11140-035); 5 ml pen/strep (10378016) a 50 ml tepelně inaktivovaného FCS..
FAS média (s užitím složek firmy Gibco BRL, pokud není uvedeno jinak): 490 ml DMEM (41966-086); 12,5 ml Hepes (156.30-056); 5 ml: neesenciální ch aminokyselin (11140-035); 5 ml pen/strep (10378-016); 5 ml vitaminů (I 1120-037); 5 ml bazálních aminokyselin (51051-019); folinová kyselina (Sigma F8259) ve finální koncentraci v médiu 10 pg/ml, 50 ml tepelně inaktivovaného FCS; 5 ml směsi dNTP a G418 (50 mg/ml zásobní roztok pro přípravu vhodné selekční koncentrace).
Směs dNTP: 35 mg G (Sigma G6264), 35 mg C (Sigma C4654), 35 mg A (Sigma-A4036), 35 mg U (Sigma U3003), 125 mg Τ' (Sigma T1895)' byly rozpuštěny ve 100 ml vody, sterilizovány filtrací a uschovány v -20 °C.
Selekce: G418: Selekce buněk LoVo (ATCC CCL 229) se prováděla v koncentraci 1,25 mg/ml, buněk HCT 116 (ATCC CCL 247) a buněk - Colo320DM (ATCC CCL 220) : v koncentraci
1,5 mg/ml, pokud není uvedeno jinak.
Vektory BLUESCRIPT™ byly získány od firmy Stratagene Cloning Systems.
Expresní vektory s genem Tet-On byly získány od firmy Clontech (Palo Alto, California), položka s katalog, č. K1621-1.
Pokud není uvedeno jinak a nebo není zřejmé ze souvislosti, fúzní konstrukt protilátka-CPG2, o kterém se
99 9 99· 99 • · 9 · ·· 99 9 · 9 9 ··9 9 9 999 9
9 999 9 9 9 9 999 999
9 9 9 9 9 9
99 999 999 99 99 píše v příkladech, užívá mutovanou formu CPG2, aby se zabránilo glykosylaci.
Příklad 1
Konstrukce fúzního. proteinů (A5B7. Fab-CPG2)2
Konstrukce fúzního enzymu (A5B7 .Fab-CPG2)2 byla plánována s cílem získat bivalentní molekulu vázající lidský karcinoembryonální antigen (CEA), která má současně enzymovou aktivitu CPG2.' S tímto cílem byl navržen počáteční konstrukt, který obsahoval Fd fragment těžkého řetězce protilátky A5B7 navázaný svým C-koncem prostřednictvím flexibilní peptidové spojky (G4S)3 k N-konci polypeptidu CPG2 (obr. 1).
Protilátka A5B7 se váže na karcinoembryonální antigen (CEA) a je zvláště vhodná k zaměření kolorektálního karcinomu nebo jiných buněk nesoucích CEA antigen (význma CEA jakožto antigenu asociovaného s rakovinou popsali přehledně Shively, J.E. a Beatty, J.D., CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, vol 2, p355-399, 1994).
Enzym CPG2 je přirozený dimer, obsahuje asociované dvě identické polypeptidové podjednotky. Každá podjednotka tohoto dimeru obsahuje velkou katalytickou doménu a' druhou menší doménu, která zprostředkovává dimerizaci.
Obecně řečeno, konjugát protilátka-enzym (nebo protilátkový fragment-enzym) nebo fúzní protein by měl být alespoň divalentní, jinými slovy měl by být schopen vázat, alespoň 2 antigeny asociované s nádory (které mohou být shodné nebo různé). V případě fúzního proteinu (A5B7 FabCRG2)2 dochází po expresi k .dimerizaci složek stejně jako u nativního enzymu, takže vznikne enzymová molekula
9« .9»
9 «
9
9
9
9
999 9
9 9 9 9
9 9
99 99
9 9 9 9
9 9 9 9
9 999 999
9 9
999 99 99 obsahující dva protilátkové fragmenty Fab (a je tudíž bivalentní z hlediska protilátkových vazebných míst) a dvě molekuly CPG2 (obr. 2a).
a) Klonování'genů pro protilátku A5B7
Způsoby přípravy, izolace a charakterizace rekombinantní myší protilátky A5B7 F(ab’)2 byly publikovány (mezinárodní patentová přihláška Zeneca Limited, WO 96/20011, příklad 5). V příkladu 5 výše uvedené reference, v oddíle f, byly gen pro protilátku A5B7 klonovány do vektorů GS-SYSTÉM™ (Celletch), viz patentové dokumenty WO 87/04462, WO 89/01036-, WO 86/05807 a WO 89/10404, kde Fd protilátky A5B7 byl klonován do pEE6 a lehký řetězec do pEE12. Tyto vektory byly zdrojem'genů protilátky A5B7 pro konstrukci fúzního proteinu A5B7 Fab-CPG2.
bj Konstrukce chimérického vektoru A5B7
Variabilní úseky myší protilátky byly pomocí PCR amplifikovány z plazmidových vektorů pEE6 a‘ pEE12 užitím vhodných primerů, které obsahují nezbytná restrikční místa pro přímé klonování variabilních' úseků těžkého a lehkého řetězce do čtecího rámce vektorů pNG4-VHss-HuIgG2CHl' (NCIMB č. 40797) a pNG3-Vkss-HuCk-NEO (NCIMB deposit no. 40799) respectively. Výsledné vektory byly pojmenovány pNG4/A5B7VHIgG2CHl' (A5B7 chimérický těžký řetězec Fd'·) a pNG3/ASB7VKHuCK-NEO (A5B7 chimérický lehký řetězec).
c) Klonování genu CPG2
Gen kódující CPG2 je možné získat z Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom. CPG2 také může být získán rekombinantním způsobem. Nukleotidová sekvence kódující CPG2 • · .9 · * · 99 99 9 9 9 9 • · 9 · 9 .· · 9 9 9 9 • 9 999 99 9·· 9··
9 9 9 9 9 9 •9 9· 999 999 99 99
4 byla publikována Minton, N.P. et.al., Gene, (1984) 31, 31-38.
Exprese kódující sekvence byla popsána v E. coli (Chambers ·
S. P. et al. , Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, 29: 572-578'' a v Saccharomyces cerevisíae (Clarke, L.E. et al., Gen Microbiol, 1985, 131, 897-904) . Kromě toho gen CPG2 může být připraven jako syntetický DNA konstrukt různými metodami a použit jako výchozí materiál pro další pokusy. Úplná genová syntéza byla popsána v M. Edwards, Am. Biotech Lab., 1987, 5,
38-44, Jayaraman et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88,.
4084-4088, Foguet a Lubbert, 1992, Biotechniques 13, 674-675 a Pierce, 1994, Biotechnique.s 16, 708.
Jako příprava na klonování genu CPG2 byl konstruován vektor pNG3-Vkss, což je derivát plazmidu pNG3-Vkss-HuCk-Neo (NCIMB č. 40799) . Tento vektor byl . konstruován tak, že se odstranil neomycinový gen (neboť obsahuje místo pro restrikční enzym EcoRI) štěpením restrikčním enzymem Xbal,· pak byl izolován fragment a znovu ligován, čímž vytvořil plazmid pNG3/Vkss-HuCk. Tento meziprodukt byl štěpen enzymy S.acI a EcoRI, které vystřihly genový fragment HuCk. Naštěpená DNA pak byla nanesena na 1% agarózový gel a vystřižený fragment oddělený od zbývající části vektoru byl vyříznut z gelu a purifikován. Dva oligonukleotidy CME00261 a CME00262 (sekvence id. č. 1' a 2) byly navrženy a syntetizovány. Oligonukleotidy byly hybridizovány přidáním 200 pmol každého oligonukleotidu doo celkového objemu 30 μΐ H2O, zahřátý na 90 °G a ponechány pomalu chladnout na 30 °C. 100 pmol produktu, tj . spojené DNA, bylo ligováno přímo do předtím připraveného vektoru a ligační směs pak byla transformována do E. coli. V takto získaném klonu vnesená kazeta DNA vytvořila nový polylinker (vícečetné klonovací' místo) pro následné klonování genu CPG2 při tvorbě vektor pNG3-Vkss.
• · · ·♦ ·· • · · · • · ·· · • · · ·· · · '· • · » · • · ··· • · · ··· ·· ··
Strukturní gen CPG2 kódující aminokyselinové zbytky Q26 až K415 včetně byl amplifikován pomocí PCR z příslušné DNA pomocí oligonukleotidových primerů za standardních reakčních podmínek PCR. Výsledný produkt PCR byl analyzován na 1% agarózovém gelu, pás očekávané velikosti (přibližně 1200 b.p.) byl vyříznut, purifikován a DNA byla eluována do 20 μΐ H?O. Tento materiál byl pak štěpen SacII, pak byla reakce opět analyzována na 1% agarózovém gelu a pás očekávané velikosti (přibližně 250' b.p.) byl’ vyříznuta purifikován. tento fragment byl ligován do plazmidového vektoru pNG3Vkss, který byl předtím štěpen SacII, defosforylován a rozdělen-na 1% agarózovém gelu, pás s linearizovaným vektorem byl vyříznut a purifikován, a 'ligační směs pak byla transformována do E. coli. Výsledné- klony byly analyzovány na přítomnost a orientaci fragmentu CPG2 SacII restrikční analýzou s enzymy BglII a Fsel. Klony-, které měly fragment správné velikosti a orientace byly ještě potvrzeny sekvencováním DNA. Tento plazmidový meziprodukt byl nazván pNG3-Vkss-SacIICPG2frag. .Tento plazmid byl dále štěpen restrikčními enzymy Agel a EcoRI, defosforylován a vektorový fragment byl pak izolován. Původní PCR produkt genu CPG2 byl také štěpen enzymy Agel a EcoRI, fragment velikosti asi 1000 b.p. byl izolován, ligován a transformován do E. coli. Výsledné klony byly analyzován na přítomnost plné délky genu CPG2 , (asi1 1200 b.p.). pomocí restrikčních enzymů HindlII a EcoRI, klony správné velikosti byly pro potvrzení identity sekvencovány. nakonec byl tento plazmid (pNG3-Vkss-CPG2) štěpen Xbal, defosofrylován, vektorový fragment byl izolován a Xbal fragment neomycinového genu (přibližně 1000 b.p., který byl izolován v dřívějších stadiích) vložen do plazmidu a transformován do E. coli. výsledné klony byly testovány na • ·
6
• | • | ||
• · · · | • | • | • · · |
• · ··· · | • | • | • ·· · |
• · · | • | • | • |
·· ·· | • ♦ · | ··· | • · |
··· *
• · přítomnost a orientaci neomycinového genu štěpením enzymy Xbal a EcoRI. Výsledný vektor byl označen pNG3-Vkss-CPG2-NEO.
d) Konstrukce varianty CPG2 R6
Plazmid pNG3-Vkss-CPG2-NEO byl užit jako templát pro PCR mutagenezi genui CPG2, aby byla mutovány 3 potenciální glykosylační místa, která byla identifikována v sekvenci bakteriální enzymu divokého typu. Potenciální glykosylační místa (N-X-T/S) byly nalezena v poziciích 222(N-I-T), 264 (N-W-T) a 272 (N-V-S), publikace Mi-nton, N.P. Asparaginový zbytek mutován na glutamin (N) číslování pozic je dle Gene, 1984, 31, 31-38.
glykosylačních míst byl pncemz. et al., všech.. ;3 (Q), takže glykosylační místa byla zrušena, čímž' bylo zabráněno jakékoliv glykosylační události, která by mohla ovlivnit expresi CPG2 nebo enzymovou aktivitu CPG2 .
Pro vytvoření varianty CPG2 R6 byla . použita taková technika PCR mutageneze, kdy byly mutována všechna 3 místa v jediné reakci. Plazmid pNG3-Vkss-CPG2-NEO byl užit jako templát pro počáteční tři PCR. V reakci R1 byly užity syntetické oligonukleotidové primery CME 00395 a CME 00397 (sekvence id. č. 3 a 4),. v reakci R2 byly oligonukleotidové promery sekvencí CME 00395 a užity CME 00399 (sekvence id. č. 3 a 5) a v reakci R3 byly užity syntetické oligonukleotidové primery sekvencí CME 00396
CME 00400 (sekvence id.
7) 'Produkty PCR reakce R1( a R2 obsahovaly mutovaná místa 222 a 264 + 272 (v uvedeném pořadí), a R3 produkt jbyl kopií C-koncového segmentu genu CPG2. Produkty R2 a R3 (R2 je přibližně 750. b.p., R3 je přibližně 360 b.p.), po separaci na agaróze a purifikaci, byly spojeny v další PCR reakci. Byly připraveny směsi různých množství produktů R2 a R3 a provedeny další PCR se
syntetickými oligonukleotidy, CME 00395 a CME' 00396 (sekvence id. č. 3a 6) . Výsledný produkt R4 (přibližně velikosti 1200 b.p.) byl opět amplifikován pomocí PCR s oligonukleotidy CME 00398 a CME 00396 (sekvence id. č. 8 a 6) . Výsledný produkt R5 (přibližně velikosti 600 b.p.) byl spojen s produktem R1 (přibližně velikost 620 b.p.) v poslední PCR reakci provedené s oligonukleotidy CME 00395 a CME 00396 (sekvence id. č. 3 a 6). Výsledný produkt.R6 (přibližná velikost 1200 bp) , který nyní obsahoval všechna tři mutovaná glykosylační místa, mohl být' klonován do (po .naštěpení restrikčriími enzymy Agel a BsrGI a izolaci výsledného fragmentu) do vektoru pNG3/VkssCPG2-Neo (který- byl předtím- štěpen restrikčními enzymy Agel a BsrGI a poté izolován). Tak byla připravena požadovaná DNA (sekvence id.· č._ 9) kódující proteinovou sekvebcni CPG2/R6 (sekvence id. č. 10) v expresním vektoru pNG3/Vkss-CPG2R6Neo .
e) Konstrukce genu fúzního proteinu „Fd těžkého řetězce A5B7CPG2
Geny pro fragment těžkého řetězce protilátky a enzymu CPG2 byly získány pomocí PCR amplifikace plazmidového templátu. Plazmid pNG4/A5B'7VH-IgG2CHl' . byl s primery CME 00966 (sekvence, id. č. 11) amplifikován a CME 00969 (sekvence id. č. 12), aby se získala· složka A5B7 Fd (přibližně velikosti 300 b.p.) a plazmid pNG3/Vkss-CPG2R6-Neo se amplifikoval s primery CME 00967' (sekvence, id. č. 13) a CME 00968 (sekvence, id. č. 14) pro získání enzymové složky (přibližně velikosti 1350 b.p.). V každém případě byl reakční. produkt PCR nanesen antigen 1% agarózový gel, pás správné velikosti byl vyříznut,- purifikován a DNA byla eluována do 20 μΐ H;-0.
*·· .··
9 9 9 • · 9 9
9 99 9
9 9
9 9 9
9 9
9 9
999 » «
···
9
9
9 9
9
Další PCR byla provedena, aby se spojily dva reakční produkty dohromady. PCR byla provedena za standardních podmínek s různým množstvím (mezi 0., 5 'až 2 μΐ) každého z PCR produktů v 25 cyklech (místo obvyklých 15 cyklů). Reakční produkt byl analyzován na 1% agarózovém gelu a pás očekávané velikosti (přibližně 1650 b.p.) byl , vyříznut, purifikován a eluován do 20 μΐ H20. Tento materiál byl pak štěpen restrikčními enzymy Nhel a BamHI, pak byl pás očekávané velikosti (přibližně 1600 b.p.) izolován a purifikován. Vektor pNG4/A5B7VH-IgG2CHl' byl připraven štěpením Nhel a BamHI pro přijetí výše uvedeného produktu PCR, DNA vektoru byla po štěpení defosforylována a větší pás vektorové DNA byl separován od menšího Nhel/BamHI fragmentu. Vektorový pás byl izolován a purifikován a pak byl podobně naštěpený PCR produkt ligován do připraveného vektoru a ligační směs transformována do £. colí. Ze získaných klonů byla připravena DNA . a sekvencováním bylo ověřeno, zda obsahují sekvenci fúzního, genu. Byla nalezena řada správných klonů a jeden z nich (označený R2.8) byl přejmenován na pNG4/A5B7VHIgG2CHl/CPG2R6 (sekvence id. č. 15 a 16).
f) Kotransfekce a transientní (přechodná) exprese
Plazmid pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 (kódující fúzní protein protilátkový chiméricky Fd - CPG2) a pNG3/A5B7VKHuCK-NEO (kódující protilátkový- chimérický lehký řetězec, sekvence id. 4. 17 a 18) byly kotransfekovány (společně transfekovány) postupem s využitím činidla LIPOFECTIN™ do COS-7 buněk, jak bude popsáno dále. Buňky COS-7 byly vysety na 6jamkové kultivační destičky po 2 x 105 buněk/2ml/jamku ze subkonf luentní kultury a inkubovány přes noc v 37 °C a 5% CO2. Médium bez séra obsahující LIPOFECTIN ™ bylo připraveno následujícím postupem: 12 ml LIPOFECTINU™ a200 ml média bez • · 999
9 9 9 9 9 99
9 999 9 9 * * 999
9 9· 99 9 9
99 999 «99 99 99 49 séra se inkubovalo 30 minut při teplotě místnosti. Směs DNA a média bez séra · se připravila následovně: 4 mg DNA (2 .mg každého kontruktu) do 200 ml média bez séra. 200 ml směsi LIPOFECTIN™ a média bez séra se přidalo ke směsi s · DNA a inkubovalo při teplotě místnosti 15 minut. Ke každému vzorku se pak přidalo 600 ml média bez séra. Buňky byly opláchnuty jednou 2 ml média bez séra a pak byl k buňkám přidán 1 . ml směsi LIPOFECTIN™/DNA a ..buňky se inkubovaly 5 hodin ve 37 °C a 5 % CO2. Směs LIPOFECTIN™/DNA se odstranila a bylo přidáno normální kultivační médium, ve kterém pák byly buňky inkubovány 72 hodin ve 37 °C a 5% CO2.
Buněčný supernatant pak byl sklizen.
g) Analýza fúzního proteinu protilátka-enzym
Supernatant byl analyzován na přítomnost · fúzního proteinu pomocí CEA vazebného ELISA testu s užitím lidského kappa lehkého řetězce jakožto reportérové protilátky (pro. přítomnost protilátky), ELISA testu s užitím anti-CPG2 reportérové protilátky, (pro přítomnost. CPG2 fúzního proteinu vázaného ne CEA), HPLC testu CPG2 enzymové aktivity (ke změření specifické aktivity CPG2) a SDS(PAGE s westernovým přenosem (užitím- jak lidského kappa lehkého řetězce tak i anti-CPG2 jakožto reportérové protilátky) k detekci exprimovaného materiálu.
HPLC test enzymové aktivity jasně prokázal, že je přítomna CPG2 enzymová aktivita v buněčném supernatantu a' oba vazebné testy CEA-ELISA ukázaly vazbu proteinu ve shodě s bivalentní molekulou protilátky A5B7. Skutečnost, že antiCEA ELISA detekovaná s anti-CPG2 reportérovou protilátkou jasně vykázala vazbu CEA, prokázala, že nejen protilátka, ale i fúzní protein protilátka-CPG2 váže CEA.
• · • · · · • · · · • · · · · · · · · • 9 · ·
Westernový přenos (western blot) s oběma., reportérovými protilátkami jasně ukázal podjednotky fúzního proteinu v očekávané velikosti 90 kDa· bez pozorovatelné degradace na menši produkty (jako je' samostatný Fab nebo enzym) .
Jelikož CPG2 je známa tím, že vykazuje enzymatickou aktivitu pouze jako dimer a jelikož byl přítomen pouze -fúzní protein protilátka-enzym, bylo zřejmé, že fúzní protein velikosti 90 kDa (dle SDS/PAGE) dimerizuje prostřednictvím přirozeného dimerizačního mechanismu CPG2 a tvoří molekulu dimerního fúzního proteinu protilátka-enzym velikosti 180 kDa (obr. 2a) v „nativních podmínkách pufru. Tato molekula vykazuje jak enzymatickou aktivitu CPG2 tak i vazebné vlastnosti k CEA antigenu, které se nijak významně' neliší mezi fúzním proteinem a samostatným enzymem a protilátkou.
h) Použití exprimovaného fúzního proteinu a CPG2 předléku v testu cýtotoxicity in vitro
Byl proveden test buněčné toxicity in vitro, ve kterém se porovnal fúzní protein (A5B7-CPG2R6)2 s „konvenčním konjugátem A5B7F(ab')2-CPG2 vytvořeným spojením A5B7 F(ab')2 s CPG2 chemickým ‘heterobifunkčním činidlem. V každém případě se materiál vykazující stejnou hladinu CPG2 enzymové aktivity inkuboval s buňkami LoVo, což jsou nádorové buňky nesoucí CEA. Buňky pak byly opláchnuty, aby se odstranil nenavázaný materiál a pak byly resuspendovány v médiu obsahujícím CPG2 fenolový předlék (PGP, viz příklad 2) po dobu 1 hodiny, pak byly buňky opět opláchnuty, resuspendovány v čerstvém médiu a ponechány volně se dělit po 4. dny. Nakonec byly buňky ošetřeny barvivém SRB a byl stanoven jejich počet. '
Získané výsledky jasně ukázaly, že fúzní protein (A5B7CPG2R6)2 společně s předlékem působil přinejmenším stejné uhynutí buněk a vedl k nižšímu počtu buněk na konci testu než
stejné množství konjugátu A5B7F(ab')2-CPG2 (se stejným předlékem). Odumírání buněk (vyšší než bazální hladina kontroly) se objevovalo' pouze když byl předlék konvertován na aktivní lék enzymem CPG2 (a jelikož buňky byly opláchnuty, aby se odstranil nenavázaný protein, pouze enzym vázaný na buňky zůstal ve stádiu, kdy byl přidán předlék). Takže pokus jasně ukázal, že přinejmenším stejně tak fúzniho proteinu A5B7-CPG2R6 zůstalo navázáno jako konvenčního konjugátu A5B7F(ab')2-CPG2, když dochází k vyššímu stupni odumření buněk (pravděpodobně díky vyšší míře konverze předléku na lék).
ij Konstrukce koexpresního vektoru fúzniho proteinu pro použití v tranzientní a trvalé expresi v buněčných liniích
Pro jednoduší způsob transfekce a přímé spojení obou expresních kazet s jedním selekčním markérem byl zkonstruován koexpresní vektor pro expresi fúzniho proteinu z existujících (kódujícícho fúzní pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO Plazmid pNG4/A5B7VHrestrikčním enzymem gel , a pás purifikován.
vektorů pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 . protein protilátkový Fd-CPG2) a (kódujícího lehký protilátkový řetězec)
IgG2CHl/CPG2R6 byl nejdříve naštěpen
Seal, reakce nanesena na 1% agarózový s linearizovaným vektorem byl vyříznut a Vektorová DNA pak byla štěpena restrikčními enzymy BglII a BamHI, reakce nanesena na 1% agarózový gel a požadovaný pás '(přibližně 2700 b.p. ) byl vyříznut a purifikován. Plazmid pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO byl štěpen restrikčním enzymem BamHI a pak byl vektor vyříznut z gelu a purifikován. Fragment expresní kazety těžkého řetězce byl pak ligován do připraveného vektoru ,a ligační směs byla transf ekována do E. colí. orientace byla ověřena Štěpením různými restrikčními enzymy a byly vybrány klony s kazetou těžkého řetězce ve • · stejné orientaci jako kazeta pro leh.ký řetězce. Tyto plazmidy byly nazvána pNG3-A5B7VK-CPG2/R6-coexp-NEO.
j) Genové vypínače pro expresi proteinů
Lze předvídat, · že exprese in vitro CPG2 a fúzního proteinu s CPG2 povede· k degradaci folátů v médiu, což může vést ke zpomalení růstu buněk nebo k buněčné smrti. Vysoká aktivita enzymu CPG2 pravděpodobně způsobí tákový deficit folátu, který je obtížné překonat doplněním folátu do média. Avšak máme za ' to, že v případě exprese CPG2 nebo fúzního proteinu s CPG2 v savčích buňkách in vivo je nepravděpodobné, že nastanou takové problémy, neboť buňky jsou normálně zásobovány všemi látkami potřebnými pro růst normálními oběhovými a buněčnými mechanismy.
Byla .zvažována řada možností, jak in vitro zabránit možnému vyčerpání kyseliny listové. Jedno z možností bylo užití přísně kontrolovaného vypínacího systému jako jsou např. TET vypínače TET on nebo TET off (viz Grossen et al·., 1995, Science 268: 1766-1769) nebo vypínač, ekdyson/muristeron A (No, D. et al. , 1996, Proč. Nati. .Acad.
Sci. USA '93: 3346-3351). Takové systémy umožňují přesně' kontrolovat expresi požadovaného genu a umožňují trvalou transformaci savčích buněk geny, které kódují toxické nebo potenciálně škodlivé expresní : produkty. Genový vypínač umožní, že se stabilní rekombinantní buněčné linie obsahující fúzní geny CPG2 snáze založí, budou udržovat a rozmnožovat pro využití k' expresi proteinu a jako očkovací kultury pro další pokusy in vivo.
• · φ φφ φφ ·· » Φ Φ 4 » · Φ 4
ΦΦΦ ΦΦ4
Φ « * β I ·
Příklad 2
Nádorové buňky HCT116 exprimující fúzní protein protilátka-enzym jsou in vitro selektivně ničeny předlékem
HCT116 buňky kolorektálního nádoru (ATCC CCL 247) transfekované genem fúzního proteinu protilátka-enzym podle příkladu 1 mohou být selektivně zabíjeny předlékem, který je konvertován enzymem na aktivní lék.
Aby se toto prokázalo, byly kontrolní netransfekované buňky HCT116 a buňky HCT116 transfekované genem fúzního proteinu protilátka-enzym inkubovány -buďto s předlékem, 4-[N,N-bis(2-chloroetyl)amino)-fenxykarbonyl-L-glutamovou kyselinou (PGP, Blakey et al., Br. J. Cancěr 72: 1083, 1995) nebo odpovídajícím lékem uvolňovaným CPG2, 4-[N,N-bis(2chloroetyi)amino]-fenolem. Předlék PGP a lék v koncentracích 5 x 10-4 až 5 x 10‘8 M byly přidány na dobu 1 hodiny ve 37 °C na 96jamkové mikródestičky obsahující 1000 až 2500 buněk HCT116 na jamku. Buňky pak byly opláchnuty a inkubovány ve 37 °C po další tři dny. Po opláchnutí, kterým se odstranily odumřelé buňky, se přidala TCA amnožství buněčného proteinu adherujícího k destičkám se stanovilo pomocí barvení SR-B, jak popsali Skehan et al. (J. Nati. Cancěr Inst., 1107, 1990).
Síla léku a předléku se hodnotily podle koncentrace, potřebné k dosažení 50%' inhibice růstu buněk (IC50) .
Působení léku na netransfekované nebo transfekované buňky HCT116 vedlo k hodnotě IC5o asi 1 μΜ. Naproti tomu předlék PGP měl hodnotu IC5o 200 μΜ u netransfekovaných a 1 μΜ u transfekovaných buněk. Tyto výsledky ukazují, že transfekované buňky, které exprimovaly fúzní protein protilátka-CPG2, konvertovaly předlék PGP na mnohem účinnější aktivní lék, zatímco netransfekované buňky HCT116 nebyly • ♦ • ·
··· 0 « » • · · · • «· · ··· • · schopny konvertovat předlék. Tudíž transfekované buňky HCT116 byly více než lOOx citlivější k PGP předléku z hlediska odumírání buněk ve srovnání s netransfekovanými buňkami HCT116 (viz příklad 1j) týkající se možného'vyčerpání folátu v buňkách). .
Tato studie ukazuje, že transfekce nádorových buněk genem pro fúzní protein protilátka-enzym může' vést k selektivnímu zabití nádorových buněk.
Příklad 3
Protinádorová · aktivita předléku PGP v nádorových buňkách HCT116 exprimujících fúzní protein protilátka-CPG2
Protinádorová aktivita ín vivo předléku PGP v nádorových buňkách HCT116 exprimujících fúzní protein protilátka-CPG2 byla demonstrována následujícím způsobem. Kontrolní netransfekované buňky HCT116 a buňky HCT116 transfekované genem, fúzního proteinu protilátka-enzym byly injikovány do nahých bezthymových myší ( v dávce .1 x 107 buněk na myš) . Když byly nádory velikosti 5 až 7 mm v průměru, byl i.p. injikován předlék PGP (3 dávky po 5' až 25 mg/kg v lhodinových intervalech). Protinádorový účinek se posuzoval podle velikosti nádoru měřením průměru ve dvou ' směrech a' vypočteným objemem podle vzorce objem = π/6 x D2 x d, kde D je větší průměr a d je menší průměr.
Objem nádoru pak byl vyjádřen relativně k objemu nádoru na počátku terapie předlékem. Protinádorová aktivita byla srovnána s kontrolními skupinami, kterým b.yl podán PBS (solný ti· « «9 9 9 roztok pufrovaný fosfátem, 170mM NaCl, 3,4mM KC1, 12mM Na„;HPCk, l,8mM KH2PO4, pH 7,2) místo'PGP předléku.
Podávání PGP do nádorů HCT116 vzniklých z transfekovaných buněk HCT116 mělo významný protinádorový účinek, jak se dalo soudit podle zmenšující se velikosti nádorů léčených PGP ve srovnání s nádory, které dostávaly PBS, a také podle toho, že nádory léčené PGP ve srovnání s' nádory léčenými PBS potřebovaly delší čas k dosažení čtyřnásobku počáteční velikosti.' Naproti tomu podávání PGP do nádorů vzniklých z netransfekovaných buněk HCT116' nevedlo k žádnému významnému protinádorovému účinku.
Podobné studie je možné užít k prokázání toho, že gen protilátka-enzym vnesený pomocí vhodného vektoru do nádoru vzniklého z netransfekovaných buněk HCT116, pokud je užit v kombinaci s PGP předlékem, vede k významně protinádorové aktivitě. Netransfekované buňky HCT116 byly injikovány do nahých bezthymových myší (v dávce 1 x 107 buněk na . myš) . Když byly nádory velikosti 5 až 7 mm v průměru, byl injikován do nádoru vektor obsahující gen fúzního proteinu protilátka-enzym. Po 1 až 3 dnech, které se ponechaly pro expresi a navázání fúzního proteinu protilátka-enzym na nádorové buňky HCT116, byl podán PGP předlék stejně 'jak bylo. popsáno výše.. To vedlo k významné protinádorové aktivitě ve srovnání s' kontrolními myšmi, které dostávaly PBS místo PGP předléku.
Příklad 4
Zlepšená transfekce adherujících buněk užitím doplněného média FAS a/nebo „feeder buněk V-79
Lze předvídat, že exprese in vítro CPG2 a fúzního proteinu s CPG2 povede k degradaci folátů v médiu, což může vést ke zpomalení růstu buněk nebo k buněčné smrti. Médium FAS (doplněné kyselinou folinovou) zde popsané bylo vyvinuto právě pro buněčné linie exprimující CPG2 nebo fúzní protein s CPG2, aby lépe podporovalo'růst takových linií.
Při přípravě na transfekci se adherentní buněčné linie kultivovaly v normálním médiu DMEM a pasážovaly se nejméně třikrát, před transfekci. Buňky V-79 .. (fibroblasty z plic křečka, získané z MRC radiobiology Unit, Harwell, Oxford, United Kingdom) byly, kultivovány v normálním médiu DMEM a pasážovány třikrát před použitím. Přeď transfekci byly spočteny v adherentních buňkách živé buňky (pomocí, hemocytometru a barvení t.rypanovou modří) a byly vysety na 6jamkové destičky (Costar 3516) v množství 2 x 10s buněk na jamku a ponechány 18 až 24 hodin, aby se buňky znovu adherovaly.'
Pro každou jednotlivou transfekci se přidalo 20 μΐ LIPOFECTINU™ k 80 μΐ média bez séra a ponechalo se inkuboval-o 30 minut při teplotě místnosti. Plazmidová' DNA (2 pg) se přidala do 100 μΐ média bez séra, pak se přidala- směs LIPOFECTINU™ a ponechala se při teplotě místnosti 15 minut. Jednotlivé 6jamkové destičky byly opláchnuty 2 ml média bez séra v každé jamce., aby se .odstranilo všechno sérum, a pak bylo médium nahrazeno 800 μΐ čerstvého média bez séra. 200 μΐ směsi LIPOFECTIN™/DNA/médium bez séra, která byla předem připravena, se přidalo do každé jamky s buňkami. Destičky se ·57 pak inkubovaly 5 hodin ve 37 °C, směs LIPOFECTIN™/DNA se odstranila a byly přidány 2 ml čerstvého·' normálního kultivační médium, ve kterém pak byly buňky inkubovány dalších 48 hodin. Transfekováné buňky v' 6jamkových destičkách byly seškrábnutím uvolněny, buněčná suspenze odsáta a centrifugována. Všechen supernatant byl odstraněn a -buněčný pelet byl resuspendován ve 20 ml vhodného kultivačního média (tj. média FAS) obsahujícího vhodné selekční -činidlo pro transfekovanou. DNA (např. G418) Alikvoty (200 μΐ) byly vysety na 96 jamkovou destičku (1,25 x 104 buněk/jamka).
Aby se zvýšila klonální. expanze je' možné přidat k transf©kovaným buňkám krmné („feeder) fibroblastové buňky. Semikónfluentní krmné buňky V-79 byly trypsinizovány a byly spočteny živé buňky. Buňky pak -byly res.uspendovány ve sterilní ,skleněné nádobě na 1 x 106 buněk/ml a ozářeny cesiovým- zdrojem dávkou '5000 rad za 12 minut. Buňky pak bviy uloženy na 24 až ,48 hodin ve 4°C (ozářené buňky jsou metabolicky aktivní ale- nedělí se, takže mohou působit jako krmné buňky pro ostatní buňky, aniž by kontaminovaly kulturu). Krmné buňky se vysely na 96 jamkovou destičku, x 1Ό4 buněk/jamka, aby vytvořily konfluentní vrstvu pro vznikající rekombinantní klony. Krmné buňky zpočátku také adherují k destičce, ale po-stupně se uvolňují a vznášejí se v médiu, v jamce zůstávají adherovány pouze rekombinantní klony. Výměna média (200 μΐ) se prováděla dvakrát týdně, aby se odstranily uvolněné buňky a doplnilo médium.· Kolonie byly ponechány vyvíjet se 10 až 14 dnů, pak byl supernatant testován na sekreci fúzního proteinu standardním testem ELISA. ’ '
Pro změření rychlosti - exprese v případě genového konstruktu fúzního proteinu (A5B7-CPG2)2 byly rekombinantní buňky vysety v množství 1 x 106 do 10 ml čerstvého normálního ·* • · • · « © · · · ·· * • · · · » · • · · ·····« © · ' © · ©© * * ·· ·* · · kultivačního média a kultivovány přesně 24 hodin. Supernatant byl pak sklizen, centrifugován, aby se odstranily zbytky buněk a pak testován na enzymovou aktivitu testem ELISA a pomocí HPLC jak bylo popsáno výše. Výsledky pro řadu rekombinantních buněčných.linií fúzního proteinu (A5B7-CPG2)2 jsou ukázány v následující tabulce.
Buněčná linie | Klon | ng/10° buněk/24 hodin |
HCT116 | ' F7 | 6550 |
C12 | 3210 | |
F6 | 15560 | |
Cl | 6151 | |
B3 | 4502 | |
A8 | 4 650 | |
. D5 | 630 | |
H9 | 610 | |
Gll | 2081 | |
H4 | 238 0 | |
A4 | 1634 | |
LoVo | B9 | 8370 |
Cl | 7350 | |
F12 | 2983 | |
C7 | 10770 | |
G10 | 4140 | |
Colo320DM | B3 | 10540 |
G4 | 4 72 0 | |
B9 | 885 | |
BIO | 3090 | |
F12 | 35660 |
9 • 9 · 9 99 • 9 9 · · • 9 9 · 9 · * • 9 9 9 . 99 99 9·9 • 9 · 9
9 9 9 • 999 999 ·
9 9 9 9
Příklad 5
Konstrukce nádorové buněčné linie se ^stabilní indukovatelnou expresí fúzního proteinu (A5B7 Fab-CPG2)2
a) Konstrukce indukovatelného expresního vektoru fúzního proteinu
Aby se usnadnila exprese z jednoho indukovatelného savčího promotoru, byla zkonstruována verze fúzního proteinu (A5B7 Fab-CPG2)2 obsahující IRES - (vnitřní ribozomové vstupní místo, viz Sugimoto et a., Biotechnology, 1994, 12, 694-8). Konstruktz pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (chimérickýřetězec A5B7, viz příklad 1) byl použit jako' templát pro amplifikaci genu lehkého řetězce, gen byla amplifikován pomocí oligonukleotidů. CME 3153 a CME 3231 (sekvence id. č. 19 a 20) . Produkt PCR očekávané velikosti (přibližně 700 b.p.) byl purifikován. Tento produkt byl pak štěpen restrikčními enzymy EcoRI a BamHI a pak purifikován. vektoru pBleuescript™ KS+ restrikčními
Získaný fragment byl klonován do (připraveného naštěpením stejnými pak enzymy,' aby mohl přijmout fragment, a defosforylací a purifikací většího pásu). Ligační směs pak byla transformována do E. coli. Z klonů byla připravena DNA a analyzována restrikcemi na přítomnost vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony byly sekvencovány pro ověření sekvence. Byla získána řada klonů se správnou sekvencí a jeden z těchto klonů byl nazván A5B7Bleuescript. . -
Podobným způsobem byl amplifikován chimérický těžký řetězec pomocí PCR z plazmidu pNG4/A5B7VH~IgG2CHl/CPG2R6 a oligonukleotidů CME- 3151 a CME 3152 21 a 22) . Produkt PCR očekávané velikosti (přibližně 1800 b.p.) byl purifikován. Tento produkt byl pak štěpen restrikčními enzymy BamHI a Xbal a pak purifikován.
(viz příklad 1) (sekvence id. č.
• .9 ·· » «9 · » 9 * 9
999 999
Získaný fragment byl klonován do vektoru pBleuescript™ KS+ (připraveného naštěpením stejnými restrikčními enzymy, aby mohl přijmout fragment, a pak defosforylací a · purifikací většího pásu). Ligační směs pak byla transformována do E. coli. Z klonů byla připravena DNA a analyzována restrikcemi na přítomnost vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony byly sekvencovány pro ověření sekvence. Byla získána řada klonů se správnou sekvencí a jeden z těchto klonů byl nazván BleuescriptFd-CPG2R6.
Sekvence IRES použitá zde pocházela z plazmidu pSXLC (popsaného v Y. Sugimoto et al., Biotechnology, ' 1994, 12,
694-8, plazmid byl získán od těchto autorů). Sekvence IRES byla vystřižena restrikčními enzymy .BamHI a Ncol. Pás očekávané velikosti (přibližně 500 b.p.) byl purifikován a ligován do vektoru Bleuescript™ Fd-CPG2R6 (připraveného naštěpením stejnými' restrikčními enzymy). Ligační směs pak byla transformována do E. coli. Z klonů byla připravena DNA a analyzována restrikcemi na přítomnost vloženého fragmentu a vhodné klony byly sekvencovány pro ověření sekvence. Byla získána řada klonů se správnou sekvencí a' jeden z těchto klonů byl nazván Bleuescripť”IRES Fd-CPG2R6.
Pro usnadnění dalších klonovacích kroků bylo nutné odstranit místo Xbal, které bylo přeneseno ve fragmentu IRES. To bylo provedeno mutagenezí PCR s oligonukleoťidovými primery CME 3322 a CME 330 6 .(sekvence id, . č. 23 a- 24) a plazmidem Bleuescript™IRES ,Fd-CPG2R6 jakožto templátovou DNA. Produkt PCR očekávané velikosti (přibližně 500 b.p.) byl purifikován, štěpen restrikčními enzymy BamHI a Ncol a pak ligován do vektoru Bleuescript™IRES Fd-CPG2R6 (připraveného naštěpením stejnými restrikčními enzymy). Ligační směs pak byla transformována do E. coli. Z klonů byla připravena DNA a analyzována restrikcemi na přítomnost • 9
99 • 9 9 9
9 9 · • 99 9 999 ·
9« 99 vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony byly sekvencovány pro ověřeni genové sekvence. Byla získána řada klonů se správnou sekvencí a jeden z těchto klonů byl nazván Bluescript™lRES Fd-CPG2R6-Xba del.
Fragment chimérického lehkého řetězce , A5B7 byl vystřižen z plazmidu A5B7Bluescript™ restrikčními enzymy EcoRI a BamHI. Pás očekávané velikosti (přibližně 700 b.p.) byl purifikován a pak ligován do vhodně připraveného vektoru Bluescript™IRES Fd-CPG2R6-Xbadel a ligační směs pak byla transformována do E. coli. Z klonů byla připravena DNA a analyzována restrikcemi na přítomnost vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony byly sekvencovány pro ověření genové sekvence. Byla získána řada klonů se správnou sekvencí a jeden z těchto klonů byl nazván Bluescript™A5B7IRES Fd-CPG2R6-Xba del. Úplná sekvence chimérického fúzního proteinu A5B7 s IRES je zde uvedena jako sekvence id. č. 52.
Gen chimérického fúzního proteinu A.5B7 s IRES byl pak přenesen do expresního vektoru regulovaného tetracyklinem. vektory s expresním systémem TET on byly získány od firmy Clontech. Tetracyklinový vypínatelný expresní vektor pTRE (jinak známý jako pHUD10-3, viz Gossen et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 5547-51) byl připraven pro přijatí fragmentu naštěpením restrikčními enzymy EcoRI a· Xbal, defosforylován a velký pás vektoru byl purifikován. Genová kazeta IRES byla vystřižena z plazmidu Bluescript™A5B7IRES Fd-CPG2R6-Xba del pomocí stejných enzymů. Získaný fragment přibližné velikosti .3000 b.p. byl ligován do předem připraveného vektoru a ligační směs pak byla transformována do E. coli. Z klonů byla připravena DNA a analyzována restrikcemi na přítomnost vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony byly sekvencovány pro ověření genové sekvence. Byla
9 99 99
9 9 9 99 9
9 9 9 9 9
9 9 999999
9 9 9
999 999 9 9 9 9 • 9 « 9 * 9 9 9
99« <
9 9 •9 ·· získána řada klonů se správnou sekvencí a. jeden z těchto klonů byl nazván pHUD10-3/A5B7lRES Fd-CPG2R6. '
b) Konstrukce buněčné linie se szabilní indukovatelnou expresí fúzního proteinu
Pro přípravu rekombinantní linie nádorových buněk HCT116 byl- použit standardní způsob transfekce s lipofectinovým činidlem (jak bylo popsáno výše, avšak bez krmných buněk). Byla provedena kotransfekce 1 μρ plazmidu -pHUD10-3/A5B7IRES Fd-CPG2R6 a 1 μρ transaktivátorového expresního plazmidu pTet-On (ze soupravy firmy Clontech) a pozitivní klony se selektovaly pomocí FAS média obsahujícího 750 μg G418 /ml.
c) Indukční studie rekombinantních indukovatelných linií
HCT116 · Získané klony byly rozděleny v duplikátu na 48jamkové misky, 1 x . 106 buněk na jamku. Buňky byly kultivovány 48 hodin s tím, že jedna miska byla indukována 2 - μμ/ml doxycyklinu a druhá byla neindukovaná ’ kontrol. Expres fúzního proteinu (A5B7 Fab-CPG2)2 se testovala v buněčném supernatantu testem ELISA a westernovým přenosem, jak bylo popsáno v příkladu lg. Výsledky jasně demonstrovaly, že indukci fúzního proteinu z indukovatelné buněčné linie pomocí doxycilinu, tak např. pro jeden' ze získaných klonů, Fll, indukované buňky produkovaly 120 ng/ml fúzního proteinu v supernatantu, zatímco neindukované buňky produkovaly pouze základní hladinu fúzního proteinu odpovídající pozadí (pod 1 ng/ml).
• 9 • 9 • 9 9 9
• 9 ·
9·· 9·· • ·
9« 9«
Příklad 6
Buněčný test ELISA na secernovaný fúzní protein buňky byly vysety na 96 jamkové potažené destičky (Becton Dickinson Biocoat™ poly-D-lysinz katalog, č. 35-6461) v hustotě 1 x 104 buněk/jamka ve 100 pil normálního média a byly- ponechány 40 hodin ve 37 °C. 100 μΐ 6% formaldehydu bylo naředěno DMEM a ponecháno 1 hodinu při 4°C. Destičky byly odstředěny a 3 x opláchnuty ponořením v PBS obsahujícím 0,05% Tween™ (první dvě mytí po 2 minutách a poslední 5 minut).
100 μΐ z dvojkového ředění supernatantu buněčné kultury obsahujícího fúzní protein nebo chimérickou A5B7 anti-CEA bylo přidáno do každé jamky a destičky byly inkubovány přes noc ve 4°C. destičky pak byly opláchnuty, jak bylo popsáno výše,' ,a v případě chimérického fúzního proteinu se přidalo 100 μΐ kozí anti-humánní kappa protilátky značené HRPO (Sigma A 7164) a destička se inkubovala 2 hodiny při teplotě místnosti (detekce pomocí anti-CPG2 byla užita v případě myšího fúzního proteinu scFv). Destičky byly opláchnuty jak bylo popsáno výše a HRP se detekovala pomocí substrátu OPD (Sigma P-8412) . Zabarvení se vyvíjelo 5 minut a pak bylo vyvíjení zastaveno 75 μΐ 2M H2SO4 a odečtena hodnota OD při 4 9 0 nm.
V případě fúzního proteinu (A5B7 Fab-CPG2)2, materiál byl produkován z rekombinantních nádorových buněk Colo320DM (CEA-ve). Obsah fúzního proteinu byl měřen pomocí testu CEA ELISA jak .byl popsán výše. Zvyšující se .množství fúzního proteinu se přidávalo k řadě buněčných linií negativních na' CEA a k CEA pozitivní parentální linii L0V0. Výsledky uvedené na obr. 3 jasně ukazují, že pouze CEA pozitivní linie • · · • ··· · • · ·· ··
vykázaly zvýšenou úroveň vazby s rostoucím množstvím přidaného fúzního proteinu, zatímco CEA negativní buňky jevily pouze vazbu odpovídající základní úrovni pozadí. To jasně ukazuje, že se fúzní protein specificky váže a udržuje se na CEA pozitivních LoVo buňkách.
Příklad 7 ·
Rekombinantní nádorové buňky LoVo exprimující fúzní protein protilátka-enzym vykazují retenci fúzního proteinu na buněčném povrchu
Bylo ukázáno, že buňky kolorektálního nádoru LoVo transfekovaně genem- fúzního proteinu (A5B7 Fab-CPG2)2 jednak' secernují a také zadržují fúzní protein na svém povrchu.
To bylo demonstrováno srovnáním parentálních Lovo buněk a LoVo buněk secernujících : fúzní protein v podmínkách vhodných pro buněčný. test ELISA secernovaného fúzního .proteinu (viz obr. 4) . Podle vývoje zabarvení lze pozorovat, že rekombinantní LoVo buňky zadržují exprimovaný fúzní protein (což se ukazuje jako vysoká míra zabarvení). V kontrolním pokusu s buňkami Colo320DM exprimujícími fúzní protein test ukázal jistou nízkou retenci exprimováného fúzního proteinu (pravděpodobně nespecifickou) a parentální LoVo buňky měly jen základní aktivitu. Pozitivní kontroly, kde byly protilátky vázající CEA -přidány k testovaným buňkám exprimujícím fúzní protein a k parentálním LoVo buňkám, vedly k pozitivnímu signálu u parentálních LoVo buněk (což demonstruje, že CEA je přítomen.na parentálních buňkách),'ale žádný zvýšený signál nebyl· pozorován u buněk Col320DM (které jsou CEA negativní) . Rekombinantní LoVo buňky dávaly tak ·· ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· · • ' · ·* «· silný signál, že přidání protilátky způsobilo tak malý rozdíl vzhledem- k celkovému signálu, který byl podstatně vyšší než v kterémkoliv z kontrolních pokusů. Takže se zdá, že fúzní protein anti-CEA protilátka-enzym CPG2 secernovaný - CEA pozitivními nádorovými buňkami se váže na povrchu buněk (prostřednictvím CEA), zatímco tentýž protein exprimovaný CEA negativními 'nádorovými buňkami nevykazuje žádnou takovou vazbu.
Příklad 8
Rekombinantní nádorové buňky LoVo exprimující fúzní protein protilátka-enzym jsou ín vitro selektivně ničeny předlékem
Nádorové buňky HCT116 exprimující fúzní protein protilátka-enzym jsou in vitro selektivně ničeny předlékem, který je konvertován enzymem na aktivní lék.
Aby se toto. prokázalo, byly kontrolní netransfekované buňky LoVo a buňky LoVo transfekované genem fúzního proteinu protilátka-enzym CPG2 inkubovány buďto s předlékem, 4-[N,Nbis (2-chloroetyl) aminoj -f.enxykarbonyl-L-glutamovou kyselinou (PGP, Blakey et al.., Br. J. Cancer 72: 1083, 1995) . nebo odpovídajícím lékem uvolňovaným CPG2, 4-[N,N-bis(2chloroetyl)amino]-fenolem, stejně jak bylo popsáno v příkladu 2 pro buňky HCT116.
Transfekované buňky, které exprimovaly fúzní protein protilátka-CPG2, konvertovaly předlék PGP na mnohem účinnější, aktivní lék, zatímco netransfekované buňky LoVo nebyly schopny konvertovat předlék.
6 ·· ·· » · · · » · · · »·· *«* • · ·· · ·
Tato studie ukázala, že transfekce nádorových buněk genem pro fúzní protein protilátka-enzym může vést k selektivnímu zabití nádorových buněk předlékem.
Příklad 9 . .
Založení xenoštěpů nádorů LoVo exprimujicích fúzní protein u bezhymových myší
Nádorové rekombinantní buňky LoVo exprimující fúzní protein (A5B7 Fab-CPG2)2 nebo směs rekombinantních a parentálních buněk LoVo byly injikovány subkutánně do athymových nahých myší (107 buněk na myš) . Rychlosti růstu nádorů jak pro 100 %rekombinantní tak pro směs 20 % : 80 % rekombinantní:parentální buňky LoVo byly porovnány s nádory pouze z parentálních buněk. Nepozorovaly se žádné významné rozdíly v růstových křivkách jednotlivých buněčných linií, takže se nemusely provádět žádné korekce při srovnávání těchto buněčných linií, pozorované rychlosti růstu nádorů ukázaly, že v každém případě trvalo 12 dnů než xenoštěpový nádor dosáhl velikosti 10 x'10 mm.
Příklad 10 '
Stanovení enzymové aktivity ve vzorcích nádorových xenoštěpů
Tiby byla k dispozici jako standard pro testy, byla připravena standardní křivka enzymu CPG2 ve 20% homogenátu z normálního nádoru (nádorové parentální buňky). Bylo • 0 provedeno následné
ředění vzorků 20% homogenátu z normálního nádoru.
Vyříznutá nádorová tkáň byla vyjmuta z -80 °C, kde byla uskladněna (předtím byla bleskově zmražena v tekutém dusíku) a ponechána roztát. Byly odstraněny všechny zbytky kůže a nádor byl pak skalpelem rozřezán na malé kousky. Pak byla nádorová tkáň přenesena · do ' předem zvážené zkumavky a . určena hmotnost nádorové tkáně. Ke vzorku byl přidán 0,2mM ZnC12 tak., aby vznikla 20% (hm./obj.) směs, ta se pak homogenizovala a uložila na led. Pak bylo připraveno ředění vzorků nádoru (20% homogenátu), tj. řada neředěný, 1/10, 1/20 a 1/40.
Pro standardní křivku- byl ředěn enzym CPG2 na následující· koncentrace ve výsledném objemu 400 ,μΐ. Podobně bylo připraveno 400 μΐ z každého vzorku rekombinantního nádoru. Po vyrovnání teplot na 30 °C bylo přidáno k vzorkům 4 μΐ lOmM methotrexatu (MTX). Reakce byla zastavena po přesně 10 minutách přidáním 600 μΐ ledového' metanolu 40,2%TFA, centrifugována a supernatant byl odebrán. Substrát a produkt v supernatantu byly separovány-pomocí HPLC (užitím katexové kolony HICROM™ S5SCX-100A, mobilní fáze =60% metanol, 40% 60mM mravenčnan amonný/0,1% ’TFA, detekce, při 300 nm) ., Pro výpočet enzymové aktivity v nádorové tkáni, byla vynesena standardní křivka v jednotkách plochy methotrexatového metabolitu (standardní je, že pouze 20 až 30 % substrátu je metabolizováno, aby se zajistilo, že rychlost není limitována substrátem). Testované vzorky byly analyzovány srovnáním jednotkové plochy metabolitu' se standardní křivkou a pak vynásobením ředicím faktorem. Nakonce přijetím pracovního předpokladu, že 1 ml = 1 g byly výsledky vynásobeny 5 (neboť původní naředění vzorků bylo na. 20% homogenát) . .
Φ Φ Φ Φ φ · ·· ΦΦ • · φ · ·· ·· φ · φ · · • ΦΦΦ · φ φ · φ · φ φ ΦΦΦ φ φ φ φ ΦΦΦ ΦΦΦ φ φ Φ Φ φ φ φ φ» ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ
Výsledky získané se směsí 20 % : 80 % rekombinantní:parentální buňky LoVo exprimující fúzní protein (A5B7 Fab-CPG2)j ukázaly následující: Nádory odebrané 5. den vykazovaly průměrnou enzymovou aktivitu 0,26 U/g (rozmezí 0,18 až 0,36 U/g)- a nádory odebrané 12. den měly průměrnou enzymovou aktivitu 0,65 U/g (rozmezí 0,19 až 1,1 U/g).
Příklad 11
Stanovení enzymové aktivity ve vzorcích plazmy
Aby byla k dispozici jako standard pro testy, byla připravena standardní křivka enzymu CPG2 ve 20% normální plazmě s následujícími koncentracemi: 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 a 1,0 U/ml. Podobně všechny testované vzorky byly naředěny na 20 % plazmu, další ředění těchto vzorků, tj. 1/10, 1/20 1/50, byla provedena užitím normálního 20% séra. 200 μΐ alikvoty každého CPG2 standardu a příslušného ředění testovaného vzorku byly ekvilibrovány na 30 °C. 2 μΐ 10 mM MTX byly přidány ke každému vzorku a dobře promíchány. Reakce, byla zastavena přesně po 10 minutách /aby sě zvýšila citlivost testu inkubační doba může být prodloužena na 30 minut) přidáním 500 μΐ ledového metanolu + 0,2% TFA a produkt byl detekován pomocí HPLC, jak bylo popsáno v příkladu 10.
‘V plazmě nebyla patrná žádná aktivita, kromě řídkých případů, kdy hladina enzymové aktivity v nádoru přesáhla 2,0 U/g, přičemž v takovém případě byla plazmatická hladina enzymu detekována v rozmezí 0,013 až 0,045 U/ml.
• 4 44
4 4 4
4 4 4
4 444 • 4 4 • * 4 4 • 4 »
44 4 4» 4
4 4 4 4 4 · 4 4 >44 444 • 4 4 4
444 444 44 44 v LoVo nádorech exprimující fúzní rekombinantních
Příklad 12
Protinádorová aktivita PGP předléku exprimujících fúzní protein protilátka-CPG2
Rekombinantní nádorové buňky LoVo protein (A5B7 Fab-CPG2)2 nebo směs a parentálních buněk LoVo byly injikovány ' do nahých bezthymových myší jak bylo popsáno v příkladu 9.
Když byly nádory velikosti 5 až 7 mm v průměru, byl i.p, injikován předlék PGP (3 dávky, v DMSO/O,15M hydrogenuhličitanový pufr, po 40 až 80 mg/kg v lhodinových intervalech). .
Protinádoróvý účinek se posuzoval podle velikosti nádoru měřením průměru ve dvou směrech a výpočtem objemu nádoru podle vzorce objem = π/6 x D2 x d, kde D je větší průměr a d je menší průměr.
Objem nádoru pak byl vyjádřen relativně k objemu nádoru na počátku, kdy byl podán předlék, nebo lze alternativně počítat medián objemu nádoru. Protinádorová aktivita byla srovnána s kontrolními skupinami · s transfekovanými nebo netransfekovanými buňkami, kterým byl podán pufr bez PGP předléku.
Podávání PGP do nádorů LoVo vzniklých z rekombinantních LoVo buněk nebo směsi rekombinantních a parentálních LoVo buněk mělo významný protinádorový účinek, jak se dalo soudit podle zmenšující'se velikosti nádorů léčených PGP ve srovnání s kontrolami, a také podle toho,, že nádory léčené, PGP ve srovnání s nádory léčenými PBS potřebovaly delší čas k dosažení čtyřnásobku počáteční velikosti (obr. 5).
m* ·» 99
4 4 4 4 • 4 4 4
4 444 4
4 4
44 4
444
44
4 4 4
4 4 4
444 44«
4
44
ΊΟ
Naproti tomu podávání PGP do LoVo nádorů vzniklých z netransfekovaných buněk nevedlo k žádnému významnému protinádorovému účinku.
Podobné studie je možné užít k prokázání toho, že gen protilátka-enzym vnesený pomocí vhodného vektoru do LoVo nádoru vzniklého z netransfekovaných parentálních LoVo buněk, pokud je užit v kombinaci s PGP předlékem, vede k významně protinádorové aktivitě. Netransfekované buňky LoVo byly injikovány do nahých bezthymových myší ( v dávce 1 x 107 buněk na myš). Když byly nádory velikosti 5 až 7 mm v průměru, byl injikován do nádoru vektor obsahující gen fúzniho proteinu protilátka-enzym. Po 1 až 3 dnech, které se ponechaly pro expresi a navázání' fúzniho proteinu protilátkaenzym na nádorové LoVo buňky, byl podán PGP předlék stejně jak bylo popsáno výše. To vedlo k významné protinádorové aktivitě ve srovnání s kontrolami.
Příklad 13 .
Konstrukce fúzniho proteinu (806.077 Fab-CPG2)2
Konstrukce enzymové fúze . (806.077 Fab-CPG2)2 byla plánována s cílem získat bivalentní molekulu vázající lidský karcinoembryonální antigen (CEA), která má současně enzymovou aktivitu CPG2. S tímto cílem byl navržen počáteční konstrukt, který obsahoval Fd fragment těžkého řetězce protilátky 806.077 navázaný svým C-koncem prostřednictvím flexibilní peptidové spojky (G4S)3 k N-konci polypeptidu CPG2 (obr. 1, ale A5B7 je nahrazena 806.077).
Protilátka 806.077 (popsaná v mezinárodní patentové' přihlášce WO 97/42329, Zeneca Ltd.) se váže na lidský • ·
• · • · ·
karcinoembryonální antigen (CEA) s velmi vysokou specifičností. Takže protilátka 806.077 je zvláště vhodná k zaměření kolorektálního karcinomu nebo jiných buněk nesoucích CEA antigen.
Obecně řečeno, konjugát proti/Látka-enzym (nebo protilátkový fragment-enzym) nebo fúzní protein by měl být alespoň divalentní, jinými slovy měl by být schopen vázat alespoň 2 antigeny asociované s nádory (které mohou být shodné nebo .různé). V případě fúzního proteinu (806.077 Fab-CPG2)2 dochází po expresi k dimerizaci složek stejně jako u nativního enzymu, takže vznikne enzymová molekula obsahující dva protilátkové fragmenty Fab (a je tudíž bivalentní z hlediska protilátkových vazebných .míst) a dvě molekuly CPG2 (obr.' 2a) .
b) Klonování genů pro protilátku 806.077
Způsoby přípravy, izolace a charakterizace rekombinantní myší protilátky 806.077F(ab')2 byly publikovány (mezinárodní patentová přihláška WO 97/42329, příklad 7) . V příkladu 7.5 výše uvedené reference se popisuje klonování genu pro variabilní úsek protilátky 806.077 do vektorů pBluescript™ KS+. Tyto vektory pak byly zdrojem genů variabilního úseku protilátky 806.077 pro konstrukci genů chimérického těžkého a lehkého řetězce Fd.
b) Konstrukce vektorů chimérické 806.077 protilátky
Mezinárodní patentová přihláška WO 97/42329 v příkladu 8 popisuje klonování genů chimér těžkého a lehkého·řetězce Fd protilátky' .806.077 do vektorů pNG3-Vkss-HuCk-NEO (NCIMB deposit č. 4,0799) a pNG4-VHss-HuIgG2CHl' (NCIMB č. 40797). Výsledné vektory byly pojmenovány pNG4/VHss 806.077VHIgG2CHl' ( 806.077 chimérický těžký řetězec Fd') a pNG3/VKss • · ·
806.077VK-HuCK-NEO (806.077 chimérický lehký řetězec). Tyto vektory byly zdrojem genů protilátky 806.077 pro konstrukci fúzního proteinu 806.077Fab-CPG2 ..
c)Konstrukce genu fúzního proteinu těžký . řetězec 806.077 Fd-CPG2
Klonování a konstrukce genu CPG2 byly popsány v příkladu 1, v části c a d. Podobně konstrukce· vektoru pNG4/A5B7VHIgG2CHl/CPG2R6, který byl použit pro konstrukci těžký řetězec 806.077 Fd-CPG2, byla popsána v příkladu 1, části e·. Gen pro variabilní úsek těžkého řetězce 806.077 byl vyjmut z vektoru pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl' štěpením restrikčními enzymy HindlII a · Nhel a, pas očekávané velikosti (přibližně 300 b.p.) obsahující variabilní genový úsek byl vyříznut, purifikován. Stejné restrikčními enzymy byly užity ke štěpení vektoru pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6, aby se variabilní úsek protilátky A5B7 nahradil 806.077. Po štěpení byla DNA defosforylována a větší vektorový pás byl izolován a purifikován. Podobně naštěpené fragmenty variabilních genových úseků pak byly ligovány do tohoto připraveného vektoru a ligační směs pak byla transformována do E. coli. Ze získaných klonů byla izolována. DNA a klony byly analyzovány restrikčními enzymy na přítomnost a orientaci fragmentu a pak byl ještě gen pro fúzní protein'potvrzen sekvencováním DNA. Byla nalezena řada odpovídajících klonů a jeden z nich, nazvaný pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl/CPG2 byl vybrán pro další práci. Sekvence fúzního proteinu těžký řetězec 806.077 Fd-CPG2, která byla takto vtvořena, je uvedena jako sekvence id. č.·25 a 26.
‘SS^íšu··:· ·
• · · « • · - · · • · · · • · · · • · · · · · • ·
d) Kotransfekce, tranzientní exprese a analýza fúzního proteinu
Plazmid pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl/CPG2R6 (kódující fúzní protein protilátkový chimérický Fd - CPG2) a pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (kódující protilátkový chimérický lehký řetězec byly kotransfékovány postupem s využitím činidla LIPOFECTIN™ do COS-7 buněk, jak bylo popsáno v příkladu 1. Analýza fúzního proteinu protilátka-enzym byla provedena také stejně jako v příkladu 1.
HPLC test .enzymové · aktivity jasně prokázal, že je přítomna CPG2 enzymová aktivita v buněčném supernatantu a oba vazebné testy CEA-ELISA ukázaly vazbu proteinu ve shodě s bivalentní molekulou protilátky 806.077. Skutečnost, že anti-CEA ELISA detekovaná s anti-CPG2 reportérovou protilá-tkou jasně vykáazal vazbu CEA, což ukázalo, že nejen protilátka, ale i fúzní protein protilátka-CPG2 váže CEA.
Westernový přenos (western blot) s oběma reportérovými protilátkami jasně ukázal podjednotky fúzního proteinu (806.077Fab-CPG2)2 v očekávané velikosti 90 kDa pouze s malým stupněm degradace na menší produkty (jako je samostatný Fab nebo enzym).
Jelikož . CPG2 je znám tim, že vykazuje enzymatickou aktivitu pouze jako dimer a jelikož byl přítomen pouze fúzní protein protilátka-enzym, bylo zřejmé, ze fúzní protein velikosti 90 kDa (dle SDS/PAGE) dimerizuje prostřednictvím přirozeného dimerizačního mechanismu CPG2' a tvoří molekulu dimerního fúzního proteinu protilátka-enzym velikosti 180 kDa (obr. 2a) v „nativních podmínkách pufru, Tato molekula vykazuje jak enzymatickou aktivitu CPG2 tak i vazebné vlastnosti k CEA antigenu, které se nijak významně neliší mezi fúzním proteinem a samostatným enzymem a protilátkou.
• ·
ΊΑ
9 999 9
9 9
9 9 9
e) Konstrukce koexpresního vektoru fúzního proteinu (806.077Fab-CPG2)2 pro použití k tranzientní a stabilní expresi v buněčných liniích
Pro jednoduší způsob transfekce a přímé spojení obou expresních kazet s jedním selekčním markérem byl zkonstruován koexpresní, vektor pro expresi fúzního proteinu, z existujících vektorů pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl/CPG2R6 (kódujícího fúzní protein protilátkový Fd-CPG2) a pNG3/VKss 806.077VK-HuCK-NEO (kódujícího . lehký protilátkový řetězec) . Plazmid pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl/CPG2R6 byl nejdříve naštěpen restrikčním enzymem Seal a pás s linearizovaným vektorem byl vyříznut a purifikován. Vektorová DNA pak byla- štěpena restrikčními enzymy BglII a BamHI a požadovaný pás (přibližně 2700 b.p.) byl vyříznut a purifikován. Plazmid pNG3/VKss 806.077VK-HuCK-NEO byl štěpen restrikčním enzymem BamHI a pak byla DNA defosforylována a vektorový pás byl purifikován. Fragment expresní kazety těžkého řetězce byl pak ligován do připraveného vektoru a ligační směs byla transfekována do E. coli. Orientace byla ověřena štěpením různými restrikčními enzymy a byly vybrány klony s kazetou těžkého řetězce ve stejné orientaci jako lehký řetězec,. Tento pla.zmid byl nazván pNG3- 806.077-CPG2/R6-coexp-NEO.
Příklad 14
Konstrukce fúzního proteinu (55.lscFv-CPG2)2
Protilátka 55.1 popsaná v Patentu US 5665357 rozpoznává antigen asociovaný s nádorem CA55.1, který je exprimován ve většině kolorektálních nádorů a v normální tkáni tlustého střeva buďto vůbec není nebo je exppimován jen velmi slabě.
• · · • ··· * ·· ·· ► · * · ► · · · ·· · ··· • · • · « ·
Stanovení sekvence cDNA těžkého .a lehkého řetězce protilátky 55.1 bylo popsáno v příkladu 3 výše uvedeného patentu. Plazmidový expresní vektor, který dovoluje sekreci uziva^íci v:souladu v Národní proti látkových fragmentů do periplazmy E. coli vedoucí sekvence pelB (pICI266) byl uložen s Budapešťskou smlouvou uložen 11. října 1993 sbírce průmyslových a mořských bakterií (National Collectionsof Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), 23 St Machar
Drive, Aberdeen AB2 IRY, Scotland, United Kingdom) jako položka č. NCIMB 40589. Tento vektor byl modifikován, jak je popsáno v Patentu US 5665357, a byl vytvořen pICI1646> a· tento plazmid byl užit pro klonování různých fragmentů protilátky 55.1, jak bylo. dále popsáno ve výše zmíněném příkladu 3, včetně přípravy konstruktu 55.1scFv, který byl označen pICI1657.
Konstrukt pICI1657 jinak známý jako pICI-55.IscFv) byl použit jako výchozí materiál pro kontrukci fúzního proteinu (55.lscFv-CPG2)2. Gen 55.1scFv byla amplifikován pomocí oligonukleotidů CME 3270 a CME 3272 (sekvence id. č. 27 a 28)z plazmidu pICI1657 jako templátu. Produkt PCR očekávané velikosti (přibližně 790 b.p.) byl purifikován.
Podobným způsobem byl amplifikován gén CPG2 ve standardní PCR z plazmidu pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 (viz příklad 1) a oligonukleotidů ' CME 3274 a CME 3275 (sekvence id. č. 29 a 30) . Produkt PCR očekávané velikosti (přibližně 1200 b.p.) byl purifikován.
Další reakce PCR byla provedena, ' aby se spojily dva purifikované PCR produkty. PCR byla provedena za standardních podmínek s různým množstvím (mezi 0,5 až 2 μΐ) každého z PCR produktů v 25 cyklech (místo obvyklých 15 cyklů) s oligonukleotidy CME3270 a CME3275 (sekvence id. č. 27 a 30) . Reakční produkt očekávané velikosti (přibližně 2000 • · • 9 • · · · 9 -9 • 9 999 9 · · • ♦ · · 9
9··· »99 999
6 bp) byl byl vyříznut, purifikován a eluován do 20 ,μΐ H20. Tento materiál byl pak štěpen restrikčním enzymem EcoRI a pak byl purifikován. Vektor pNG4/VHss806.077VH-IgG2.GHl/CPG2 byl připraven štěpením EcoRI pro přijetí výše uvedeného produktu PCR, DNA vektoru byla po štěpení defosforylována a větší· pás vektorové DNA byl separován od menšího fragmentu. Vektorový pás byl izolován a purifikován a pak byl podobně naštěpený PCR produkt ligován do připraveného vektoru a ligační směs transformována do E. coli. Zezískaných klonů byla připravena DNA analyzována na správnou orientaci restrikčními enzymy HindlII/Notl a sekvencováním bylo ověřeno, zda obsahují sekvenci fúzního genu,. Byla nalezena řada klonů se správnou sekvencí a jeden z nich byl označen pNG4/55.lscFv/CPG2R6. DNA a aminokyselinová sekvence tohoto fúzního proteinu jsou zde ukázány jako sekvence id. č. 31 a 32. ,
Příklad 15
Modifikace plazmidu pŇG4/55.lscFv/CPG2R6 pro usnadnění výměny scFv
9
9 9
9 9
9 9 9
Během konstrukce plazmidu pNG4/55.lscFv/CPG2R6 bylo vnesenp jedinečné místo BspEI (isoschizomer Ac.cIIl) do sekvence linkeru (G3S)3, který je mezi genem pro protilátku a CPG2. Pro usnadnění klonování alternativních scFv konstruktů bylo odstraněno EcoRI místo na 3'konci genu CPG2 v plazmidu pNG4/55.lscFv/CPG2R6, aby se usnadnilo vkládání alternativních genů scFv protilátky ve shodě s čtecím rámcem, jak za plazmidovou signální sekvenci tak na 5'konec CPG2 genu, prostřednictvím klonováni fragmentu EcoRI/BspEI. Této modifikace bylo dosaženo PCR mutagenezí, kde nejdříve byl • ·· · .· · 9 9 9 9
9 999 9 9 99 999 999 ,· ♦ · · · · 9 • · ·· ··· 9·· · «· 99 amplifikován pNG4/55.lscFv/CPG2R6 s oligonukleotidy CME 3903 a CME 3906 (sekvence id. č. 33 a 34). Pak byl pNG4/55.lscFv/CPG2R6 zase amplifikován, ale s oligonukleotidy CME 4040 a CME 3905 (sekvence id. č. 35 a 36). První PCR pás očekávané velikosti 420 b.p. byl purifikován. Druhá reakce byla provedena podobně 'a očekávaný PCR produkt 450 b.p. byl purifikován.
Další reakce PCR byla provedena, aby se spojily dva purifikované PCR produkty. PCR byla provedena za standardních podmínek v 15 až 25 cyklech s oligonukleotidy CME 3905 a CME 3906 (sekvence id. č. 36 a 34) . Reakční produkt očekávané velikosti (přibližně 840 bp) byl purifikován a pak štěpen restrikčními enzymy Notl a Xbal a fragment očekávané velikosti asi 460 b.p. byl purifikován.
Vektor pNG4/55.lscFv/CPG2R6 byl připraven štěpením restrikčními enzymy Notl a Xbal pro přijetí výše uvedeného produktu PCR, DNA vektoru byla po štěpení defosforylována a větší pás vektorové DNA byl separován od menšího fragmentu. Vektorový pás byl izolován a purifikován a pak byl podobně naštěpený PCR produkt ligován do připraveného vektoru a ligační směs transformována do E. coli. Ze získaných klonů byla' připravena DNA analyzována ' na správnou ' orientaci restrikčním enzymem EcoRI a sekvencováním bylo ověřeno, zda obsahují sekvenci modifikovaného fragmentu fúzního genu. Byla nalezena řada klonů se správnou sekvencí a jeden z nich byl označen pNG4/55.lscFv/CPG2R6/delEcoRI. Tato mutace odstranila místo EcoRI, které bylo na 3'konci genu CPG2 a současně vnesla další stop kodon. DNA sekvence genu fúzního protein až po, a včetně obou stop kodonů, je ukázána jako sekvence id. č. 37.
• · · · • · · » • · » · * · · · · · · • · • · · ·
Příklad 16
Konstrukce genu protilátky 806.077scFv
806.077scFv byl vytvořen pomocí vektorů pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl' a pNG3/VKss806.077VK-HUCK-NEO, které byly zdroji genů variabilních úseků 806.077 VH a VK. Gen 806.077VH byl· amplifikován z pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl' za standardních podmínek PCR s oligonukleotidy CME 3260 a CME 3266 (sekvence id. č.’ 39 a 40) . 806.077VK byl amplifikován z pNG3/VKss806.077VK-HuCK-NEO s oligonukleotidy CME 3262 a CME 32 67 (sekvence id. č. 41 a 42) . PCR produkty VH a VK byly purifikovány.
Další reakce PCR byla provedena, aby se spojily dva purifikované PCR produkty. PCR byla provedena za standardních podmínek s různým množstvím (mezi 0,5 až 2 μΐ) každého z PCR produktů v 15 až 25 cyklech (místo obvyklých 15 ' cyklů) s oligonukleotidy CME3260 a CME3262 (sekvence id. č. 39 a 41). Reakční produkt očekávané velikosti (přibližně 730 bp) byl vyříznut, purifikován a štěpen restrikčními enzymy Ncol a Xhol a pak byl pás s fragmentem očekávané velikosti 720 b.p. purifikován.
Plazmid pICI1657 (jinak známý jako pICI-55.lscFvj byl dále modifikován vložením dvouřetězcové DNA kazety vytvořené ze dvou oligonukleotidů CME 3143 a 3145 (sekvence id. č. 45 a 46) mezi existující restrikční místa Xhol a EcoRI standardním klonovacím postupem, čímž se vytvořil vektor plCI26655.lscFvtag/his (DNA sekvence výsledného genu 55.lscFvtag/his je uvedena jako sekvence id. č. 47) . Vektor byl připraven štěpením restrikčními enzymy Ncol a Xhol pro přijetí výše uvedeného produktu PCR, DNA vektoru byla po štěpení de„fosforylována a větší pás vektorové DNA byl separován od
I • · ·
9 9
999 9
999 999
9
99 menšího fragmentu. Vektorový pás byl izolován a purifikován a pak byl podobně naštěpený PCR produkt ligován do připraveného vektoru a ligační směs transformována do E. coli. Ze získaných klonů byla připravena DNA analyzována restrikčním enzymem EcoRI, zda obsahují vložený modifikovaný fragment a vhodné klony pak- byly sekvencovány, aby byly ověřeny sekvenční změny. Byla nalezena řada klonů se správnou sekvencí a ' jeden z nich byl označen pICI266/ 806.077scFvtag/his (alternativně . známý jako pICI266806.077VH/VLscFvtag/his) . DNA a proteinová sekvence genu 806.077scFvtag/his jsou uvedeny jako sekvence id. č.,25 a 26.
Příklad 17
Konstrukce fúzního proteinu (806.077scFv-CPG2)2
Plazmid pICI266/ 806.077scFvtag/his byl použit jako zdroj 806scFv. Gen byl amplifikován pomocí oligonukleotidů CME 3907 a CME 3908 (sekvence id. č. 48 a 49) a pás očekávané velikosti byl purifikován. Fragment byl naštěpen' restrikčními enzymy EcoRI a BspEI a pak byl pás očekávané velikosti 760 b.p. purifikován.
Plazmid pNG4/55.lscFv/CPG2R6/delEcoRI byl připraven štěpením restrikčními'enzymy EcoRI a BspEI pro přijetí výše uvedeného produktu PCR, DNA vektoru byla po štěpení defosforylována a větší pás vektorové DNA byl separován od menšího fragmentu. Vektorový pás byl izolován a purifikován a pak' byl podobně naštěpený PCR produkt ligován do připraveného vektoru a ligační směs transformována do E. coli. Ze získaných klonů byla připravena DNA analyzována restrikčním enzymem EcoRI, zda obsahují vložený modifikovaný ·· ·♦ • · · · • · ♦ · · ·«9 · • ♦ · ·· 99 .
fragment. Vhodné klony pak byly sekvencovány, aby byly ověřeny genové sekvence. Byla nalezena řada klonů se správnou sekvencí a jeden z nich byl označen pNG4/806IscFv/CPG2R6/delEcoRI. DNA a proteinová sekvence genu fúzního proteinu 806IscFvtag/CPG2R6 jsou uvedeny jako sekvence id. č. 50 a 51.
Příklad 18
Kotransfekce ' a tranzientni exprese fúzních proteinů protilátka-CPG2
Jak bylo již popsáno v příkladu 1, plazmidy kódující jiné fúzní proteiny mohou být transfekovány standardním způsobem, aby se získala tranzientni exprese kódovaného fúzního proteinu v buňkách COS-7. V případě fúzních proteinů (Fab-CPG2)2 je možné užít jak kotrasnfekci vhodných plazmidů nebo ' transfekci koexprimujících proteinů. Podobně samotné expresní plazmidy fúzních proteinů (scFv-CPG2)2 mohou být transfekovány stejným způsobem. V každém případě pro jednotlivou transfekci bylo třeba užít 4 mg příslušné DNA.
Příklad 19
Genový vypínač proteinové exprese
Jak bylo již popsáno v příkladu 1, pro expresi fúzních proteinů je možné užít přísně, kontrolovaného ale indukovatelného vypínacího systému jako jsou např. TET on” nebo TET off (viz Grossen etal. , 1995, Science 268: 1766-
·· φφ • φ φ · • · · · φ φ φφφ φ φ φ φφ φφ
Φ· φφ φ φ φ · φ · · · φ φφφ φφφ φ φ φ φφ φφ
1769) nebo vypínač ekdyson/muristeron A (No, D. et al., .1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 3346-3351) . Vhodné způsoby a klonovací strategie popsané v příkladu 5 je možné použít pro fúze protilátkový Fab-enzym -vyžadující pro expresi sekvenci IRES. Vložení vhodné genové kazety do vypína.telného expresního -vektoru je možné použít, jestliže je produktem fúze jediný polypeptidový řetězec jako je. tomu např. v konstruktech scFv-enzym.
Příklad 20 ·
Stanovení vlastností fúzních proteinů protilátka-enzym vylučovaných buňkami COS7
Supernatant buněk COS7 může být analyzován na přítomnost protilátkových fúznídh proteinů postupem, který byl popsán v příkladu lg. Podobně lze užít . exprimóvaný fúzní protein a CPG2 předlék v in vitro testu cytotoxicity, jak bylo popsáno v příkladu lh.
' HPLC- test enzymové aktivity CPG2 jasně prokáže, zda je přítomna CPG2 enzymová aktivita v buněčném supernatantu a oba vazebné testy CEA-ELISA ; s anti-CPG2 reportérovou protilátkou potvrdí vazbu proteinu ve shodě s bivalentní molekulou protilátky A5B7 a ukáží, že fúzní protein protilátka-CPG2 (nejen samotná protilátková složka) váže CEA.
Westernový přenos (western blot) s oběma reprtérovými protilátkami jasně ukáže podjednotky fúzního proteinu v očekávané velikosti. Jelikož CPG2 je znám tím, že vykazuje enzymatickou aktivitu pouze jako dimer a jelikož je přítomen pouze fúzní protein protilátka-enzym, je zřejmé, že fúzní protein dimerizuje prostřednictvím přirozeného dimerizačního ·· 99 • · · · · • · · 9 • · 999 9
9 9 • 9 99 *
9« 99
9 9 9
9 9 9
999 999 ·« mechanismu CPG2 a tvoří molekulu dimerního fúzního proteinu v „nativních podmínkách pufru. Navíc pak molekula vykazuje jak enzymatickou aktivitu CPG2 tak i vazebné vlastnosti k CEA antigenu, které se nijak významně neliší mezi fúzním proteinem a samostatným enzymem a protilátkou. Výsledky' získané v testu cytotoxicity· mohou prokázat', že fúzní. protein společně s předlékem působil přinejmenším stejné uhynutí buněk a vedl k nižšímu počtu buněk na konci testu než stejné množství konjugátu A5B7F(ab')2-CPG2 (se stejným předlékem). Odumírání buněk (vyšší než bazální hladina 'kontroly) se objevuje pouze když je předlék konvertován na aktivní lék enzymem CPG2 (a jelikož buňky byly opláchnuty, aby se odstranil nenavázaný protein, pouze enzym vázaný na buňky zůstal ve stádiu, kdy byl přidán předlék). Takže takový test jasně ukazuje, že' přinejmenším stejně tak fúzního proteinu (A5B7-CPG2R6)2 zůstává navázáno jako konvenčního konjugátu A5B7F(ab')2-CPG2, když dochází k vyššímu stupni odumření buněk (pravděpodobně díky vyšší míře konverze' předléku na lék) . ·
Příklad 21
Stanovení in vitro a in vivo vlastností fúzních proteinů protilátka-enzym exprimovanýeh rekomb-inantními nádorovými buňkami ;
Přípravu linií nádorových buněk exprimujících fúzní proteiny je možné provést tak jak byla popsána v příkladu 4.
Retence (zadržení) fúzního proteinu na povrchu rekombinantních nádorových buněk LoVo exprimujících fúzní protein protilátka-enzym se dá prokázat způsoby popsanými v příkladu 7. Selektivní zabíjení nádorových buněk LoVo • 9 99 • 9 9 9 • 9 9 9
9 999 •9 9
99
99 99 ·· 9999
9 9 9 9
9 999 999 • 9 9
9·9 99 99
Založení protein
Stanovení transfekovaných fúzním proteinem protilátka-enzym CPG2 předlékem, který je konvertován enzymem na aktivní lék, lze demonstrovat postupem popsaným v příkladu 8.
xenoštěpů nádorů LoVo exprimujicích fúzní u bezthymových myší lze provést podle příkladu 9.
enzymové aktivity ve vzorcích nádorových xenoštěpů je možné provést-jak je popsáno v příkladu 10.
Stanovení enzymové aktivity ve vzorcích plazmy se provádí postupem popsaným' v příkladu 11. Protinádorová aktivita PGP předléku v LoVo nádorech exprimujících fúzní protein protilátka-CPG2 se může hodnotit postupem podle příkladu 12.
Výsledky z těchto experimentů slouží k průkazu toho, že fúzní protein anti-CEA protilátka-enzym CPG2 secernovaný CEA pozitvními nádorovými buňkami' se váže na povrchu buněk (prostřednictvím CEA), zatímco tentýž protein exprimovaný CEA negativními nádorovými buňkami nevykazuje žádnou takovou vazbu.
Výsledky také prokazují, -že transfekovaně buňky, které exprimovaly fúzní protein protilátka-CPG2, konvertovaly předlék PGP na mnohem účinnější aktivní lék, zatímco netransfekované buňky LoVo nebyly schopny konvertovat předlék. Tudíž transfekovaně LoVo buňky jsou více než lOOx Citlivější k PGP předléku ve smyslu usmrcení, buněk než bnetransfekované buňky LoVo, což ukazuje, že transfekce nádorových -buněk genem pro fúzní protein protilátka-enzym může vést k selektivnímu zabití nádorových buněk předlékem.
Podání PGP do LoVo nádorů založených z. rekombinantní ch LoVo buněk nebo směsi rekombinantních LoVo beněk s parentálními LoVo buňkami může vést k významnému protinádorovému působení, jak lze soudit podle zmenšující se velikosti nádorů léčených PGP ve, srovnání s nádory, do
Λ.»-*0' < -· V. ·.
• ·' · · · • · · · · · · • · · · · * · *·· · · • · · « ·» ·· ··· « ·· · kterých se podával samotný pufr, a významně delšího času, který potřebují nádory léčené PGP k dosažení 4násobku své původní velikosti. Naproti tomu podání PGP do LoVo nádorů vytvořených z netransformovaných buněk nevede k žádnému protinádorovému účinku.
Podobné studie lze provádět k demonstraci toho, že gen protilátka-enzym vnesený prostřednictvím vhodného vektoru do nádoru LoVo vyvinutého z netransformovaných parentálních buněk, pokud se užije v .kombinaci s PGP předlékem, vede k významné protinádorové aktivitě. Takže netransfekované LoVo buňky se injikují do bezthymových nahých myší (1 x 107 buněk na myš) a jakmile nádor dosáhne velikosti 5 až 7 mm v průměru, injikuje se do nádoru vektor obsahující gen fúzního .proteinu protilátka-enzym. Po 1 až 7 dnech, které jsou potřebné k tomu, aby se fúzní protein protilátka-enzym exprimoval .a navázal na nádorové. LoVo buňky, podá se PGP předlék, jak bylo již popsáno. To vede k významnému protinádorovému účinku ve srovnání s kontrolními myšmi, které dostaly pouze pufr místo PGP předlé.ku.
Příklad 22
Příprava fúzního proteinu (myší A5B7Fab-CPG2)2
Myší fúzního proteinu (myší A5B7Fab-CPG2)2 byl exprimován z buněk COS-7 .a CHO v podstatě shodně s tím, jak to bylo poúsáno v části D) příkladu 48 mezinárodní patentové přihlášky WO 97/42329 (Zeneca Ltd., publikována 13. listopdu 1997) tak, že se klonovaly geny pro lehký řetězec A5B7 a Fd A5B7 spojené přes svůj C-konec prostřednictvím spojky (G4S)3_ k CPG2 v koexpresním vektoru pEEÍ4.
·· ·· • · · · • · · · ··· ··· • · ·· ··
Myší lehký řetězec Α5Β7 byl izolován- z pAF8 (popsáno v části g) příkladu 5 Mezinárodní patentové přihlášky WO 96/20011, Zeneca Ltd.). Plazmid pAF8 byl štěpen EcoRI a výsledný fragment velikosti 732 b.p-. byl izolován elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Tento fragment byl klonován do pEE14 (popsal Bebbington v Methods: Companion to Methods in Enzymology, 1991, 2, 136-145) podobně ,naštěpeného
EcoRI a výsledným plazmidem byly transformovány buňky E. colí DH5a. Transformované buňky byly vysety na misky s L agarem μg/ml). Klon obsahující plazmid se správnou orientací fragmentu byl ještě a ampicilenem (100 správnou sekvencí a potvrzen sekvencováním DNA (sekvence id. č. 57) a tento plazmid byl nazván pEE14/A5B7muVkmuCk. Aminokyselinová sekvence kódované signální sekvence (aminokyselinové zbytky 1 až 22) a myší lehký řetězec (aminokyselinové zbytky 23 až 235) jsou uvedeny jako sekvence id. č. 58.
Myší gen Fd-CPG2 byl připraven z varianty R6 genu CPG2 (popsáno v příkladu 1 této přihlášky) a myší A5B7Fd sekvence z pAFl (popsáno v části d) příkladu 5 mezinárodní patentové přihlášky WO 96/20011, Zeneca Ltd.). PCR reakce s oligonukleotidy sekvence id. Č. 53 a 54 na PpAFl poskytla, fragment velikosti 247 b.p. Ten byl štěpen HindlIIa BamHI a byl .klonován do stejně naštěpeného pUC-19. Výsledným plazmidem ' byly transformovány buňky E. coli DH5cc. Transformované buňky byly vysety na misky s L agarem a ampicilinem (100 pg/ml). Klon obsahující plazmid se správnou sekvencí byl nazván pUC19/muCHl/NcoI-AccIII(Fd). -Druhá PCR s oligonukleotidy selvence id. č. 55 a 56 na plazmidu pNG/VKss/CPG2/R6-neo (viz příklad 1) vedla ke vzniku fragmentu velikosti 265 b.p., který byl štěpen HindlIIa EcoRI a klonován do stejně- naštěpeného pUC'19, čímž vznikl plazmid p'UC19/muCHl-spo,j ka-CPG2/AccIII-SacII.
• 9
9
·· ··
9 9 9
9 9 9 • 999 999 ·
Plazmid pUC19/muCHl/NcoI-AccIII(Fd)byl naštěpen HindlII a AccII a výsledný fragment velikosti 258 b.p. byl izolován elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Tento fragment byl klonován do plazmidu pÚC19/muCHl-spojka-CPG2/AccIII-SacII naštěpeného HindlIIa AccIII čímž vznikl plazmid pUC19/muCHlspojka-CPG2/NcoI-SacII. Fragment velikosti 956 b.p. byl izolován z pNG/VkSS/CPG2/R6-neo štěpením Sací a EcoRI. Ten byl pak klonován do stejně naštěpeného pUC19/muCHl-spojkaCPG2/NcoI-SacII, čímž vznikl- plazmid pUC19/muCHl-spojkaRC/CPG2(R6). Úplný genový konstrukt byl připraven izolací fragmentu HindlII-NcoI velikosti 498 b.p. z pAFl a .klonováním do HindlII a Ncol naštěpeného pUC19/muCHl-spojka-RC/CPG2(R6) . Výsledný plazmid byl transformován do buněk E. coli DH5a.' Transformované buňky byly vysety na misky s L agarem a ampcilenem (100 ^ig/ml) . Klon obsahující plazmid se správnou sekvencí a správnou orientací fragmentu byl ještě potvrzen sekvencováním DNA (sekvence id. č. 59) a tento plazmid byl nazván pUCl9/muA5B7RC/CPG2(R6). Aminokyselinová sekvence kódované signální sekvence (aminokyselinové zbytky 1 až 19) a myší :Fd~spojka-CPG2 (aminokyselinové zbytky 20 až 647) jsou zde ukázány- jako sekvence id. č. 60. Alternativně může .být sekvence CPG2 popsaná v příkladu 1 získána úplnou syntézoů genu a konvertována na variantu R6 způsobem popsaným v části d) příkladu 1 této přihlášky. V takovém případě ze baze C v poloze 933 v sekvenci id.. č. 59 změní na G, přitom aminokyselinová sekvence id. č. 60 zůstane nezměněna.
Pro expresi ve vektoru úpEE14 se gen nejdříve klonuje do pEE6 (to je derivát pEE6.hCMV- viz Stephens a Cockett, 1989, Nuc-leic Acids Resrearch 17, 7110, kde místo HindlI proti směru transkripce od CMV promotoru bylo změněno na místo BglII). Plazmid pUCl9/muA5B7RC/CPG2(R6)byl štěpen HindlII a EcoRI a výsledný fragmnet velikosti 1974 „b.p. byl izolován
00 ·· 00 • 0 0 0
0 0 ·
000 000 0 0
00 elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Tento fragment byl pak klonován do HindlII a EcoRI naštěpeného pEE6 a transformován do buněk E. coli DH5ct, čímž vznikl plazmid pEE6/muA5B7RC/CPG2(R6). tak, že se nejdříve a BamHI a fragment
Koexprení vektor pEE14 byl připraven štěpil pEE6/muA5B7RC/CPG2 (R6)' BglII velikosti 4320 b.p. byl izolován elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Tento fragment byl pak klonován do BglII a BamHI naštěpeného pEE14/A5B7muVkmuCk.
Výsledný plazmid byl transformován do buněk čímž vznikl plazmid pEE6/muA5B7RC/CPG2(R6).
vysety na misky s L agarem
E. coli DH5a, Transformované a ampicilenem buňky byly (100 ng/ml). a správnou
Klon obsahující plazmid se správnou sekvencí ještě potvrzen tento plazmid byl orientací fragmentu byl sekvencováním DNA (sekvence id. č. 59) a nazván pEE14/muA5B7-RC/CPG2(R6).
Pro expresi (myší A5B7Fab-CPG2)2 byl užit plazmid pEE14/muA5B7-RC/CPG2(R6) k transfekci buněk COS-7 a CHO, jak bylo popsáno v příkladu 48 mezinárodní patentové přihlášky WO 97/42329 (Zeneca Ltd., ' publikována 13. .listopdu 199'7) . Supernatanty z kultivovaných buněk COS-7 a CHO- byly testovány na aktivitu jak bylo popsáno v příkladu 1 této přihlášky a jevily vazebnou aktivitu CEA a enzymovou aktivitu CPG2. '
Příklad 23
Farmaceutický přípravek
Následující příklad ilustruje výhodnou farmaceutickou lékovou formu obsahující genový konstrukt podle předkládaného • · ·© © · • · • · • © ·· ' ©© • © • · ··· ·· ·© ·© • © · · • · · · • ··· ·*· vynálezu, kterou lze užít k terapii v kombinaci s vhodným předlékem.
Jedná se o sterilní vodný roztok, pro parenterální injekci nebo přímou injekci do nádorové tkáně, obsahující 107 až 10u adenovirových částic, které obsahují genový konstrukt popsaný v příkladu 1. Po 3 až .7 dnech se podají tři dávky předléku po 1 g ve 'formě sterilního roztoku v hodinových intervalech. Předlék je - vybrán ze. skupiny obsahující N-(4-[N,N-bis(2-iodoetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu, gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-(4-[N, Nbis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutamové a N- { 4[N,N-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (XÍ) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
GGGAATTCCT CGAGGAGCTC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(Ay DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) . TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
CCGGGGAGCT CCTCGAGGAA TTCCCGC 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) 'CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů -baží (B) TYP: nukleová kyselina .(C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
CAGAAGCGCG ACAACGTG • · ···· · · · · · · • · · ·· · · · · ······ • · · · · · · • · ·· ··· · · · · · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) . CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: . nukleová kyselina (C) · TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
CGAGGCCTTG CCGGTGATCT GGACCTGCAC GTAGGCGAT· 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
'(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 63 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) . TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
GGGGATGATG TTCGAGACCT GGCCGGCCTT GGCGATGGTC CACTGGAAGC ' 50
GCAGGTTCTT CGC 63 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová· kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (Xi) POPIS SEKVENCE : . SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
CTTGCCGGCG CCCAGATC • · · · • · · · · · • · · • · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (Dj TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
GTCTCGAACA TCATCCCC 18 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná.nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8: ATCACCGGCA AGGCCTCG lg (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1236 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC 60 CGCGGGCAGA AGCGCGACAA CGTGCTGTTC CAGGCAGCTA CCGACGAGCA GCCGGCCGTG 120 ATCAAGACGC TGGAGAAGCT GGTCAACATC GAGACCGGCA CCGGTGACGC CGAGGGCATC 180 GCCGCTGCGG GCAACTTCCT CGAGGCCGAG CTCAAGAACC TCGGCTTCAC GGTCACGCGA 240 AGCAAGTCGG CCGGCCTGGT.GGTGGGCGAC AACATCGTGG GCAAGATCAA GGGCCGCGGC 300 GGCAAGAACC TGCTGCTGAT GTCGCACATG GACACCGTCT ACCTCAAGGG CATTCTCGCG 360 AAGGCCCCGT TCCGCGTCGA AGGCGACAAG GCCTACGGCC CGGGCATCGC CGACGACAAG 420 GGCGGCAACG CGGTCATCCT GCACACGCTC AAGCTGCTGA AGGAATACGG CGTGCGCGAC 480 TACGGCACCA TCACCGTGCT GTTCAACACC GACGAGGAAA AGGGTTCCTT CGGCTCGCGC 540 • ·
GACCTGATCC AGGAAGAAGC CAAGCTGGCC GACTACGTGC TCTCCTTCGA GCCCACCAGC 600 GCAGGCGACG AAAAACTCTC GCTGGGCACC TCGGGCATCG CCTACGTGCA GGTCCAGATC 660 ACCGGCAAGG CCTCGCATGC CGGCGCCGCG CCCGAGCTGG GCGTGAACGC GCTGGTCGAG 720 GCTTCCGACC TCGTGCTGCG CACGATGAAC ATCGACGACA AGGCGAAGAA CCTGCGCTTC 780 CAGTGGACCA TCGCCAAGGC CGGCCAGGTC TCGAACATCA TCCCCGCCAG CGCCACGCTG 840 AACGCCGACG TGCGCTACGC GCGCAACGAG GACTTCGACG CCGCCATGAA GACGCTGGAA 900 GAGCGCGCGC AGCAGAAGAA GCTGCCCGAG GCCGACGTGA AGGTGATCGT CACGCGCGGC 960 CGCCCGGCCT TCAATGCCGG CGAAGGCGGC AAGAAGCTGG TCGACAAGGC GGTGGCCTAC 1020 TACAAGGAAG CCGGCGGCAC GCTGGGCGTG GAAGAGCGCA CCGGCGGCGG CACCGACGCG 1080 GCCTACGCCG CGCTCTCAGG CAAGCCAGTG ATCGAGAGCC TGGGCCTGCC GGGCTTCGGC 1140 TACCACAGCG ACAAGGCCGA GTACGTGGAC ATCAGCGCGA TTCCGCGCCG CCTGTACATG 1200 GCTGCGCGCC TGATCATGGA TCTGGGCGCC GGCAAG 1236 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: · (A) DÉLKA: 412 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
Met | Asp | Phe | Gin | Val | Gin | Ile | Phe | Ser | Phe | Leu | Leu | Ile | Ser | Ala | Ser |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Val | Ile | Met | Ser | Arg | Gly | Gin | Lys | Arg | Asp | Asn | Val | Leu | Phe | Gin | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ala | Thr | Asp | Glu | Gin | Pro | Ala | Val | Ile | Lys | Thr | Leu | Glu | Lys | Leu | Val |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Asn | Ile | Glu | Thr | Gly | Thr | Gly | Asp | Ala | Glu | Gly | Ile | Ala | Ala | Ala | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asn | Phe | Leu | Glu | Ala | Glu | Leu | Lys | Asn | Leu | Gly | Phe | Thr | Val | Thr | Arg |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ser | Lys | Ser | Ala | Gly | Leu | Val | Val | Gly | Asp | Asn | Ile | Val | Gly | Lys | Ile |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Lys | Gly | Arg | Gly | Gly | Lys | Asn | Leu | Leu | Leu | Met | Ser | His | Met | Asp | Thr |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Val | Tyr | Leu | Lys | Gly | Ile | Leu | Ala | Lys | Ala | Pro | Phe | Arg | Val | Glu | Gly |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Asp | Lys | Ala | Tyr | Gly | Pro | Gly | Ile | Ala | Asp | Asp | Lys | Gly | Gly | Asn | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Val | Ile | Leu | His | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Lys | Glu | Tyr | Gly | Val | Arg | Asp |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Tyr | Gly | Thr | Ile | Thr | Val | Leu | Phe | Asn | Thr | Asp | Glu | Glu | Lys | Gly | Ser |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Phe | Gly | Ser | Arg | Asp | Leu | Ile | Gin | Glu | Glu | Ala | Lys | Leu | Ala | Asp | Tyr |
180 | 185 | 190 |
99 9 9 99 99 • 99 9 99 99 9 99 9
9999 9 9 9999
9 9999 9 9 9 999 999
9 9 9 9 9 9
99 999 999 99 99
Val | Leu | Ser 195 | Phe | Glu Pro Thr | Ser Ala Gly Asp Glu Lys Leu Ser | Leu | |||||||||
200 | 205 | ||||||||||||||
Gly | Thr | Ser | Gly | Ile | Ala | Tyr | Val | Gin | Val | Gin | Ile | Thr | Gly | Lys | Ala |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ser | His | Ala | Gly | Ala | Ala | Pro | Glu | Leu | Gly | Val | Asn | Ala | Leu | Val | Glu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ala | Ser | Asp | Leu | Val | Leu | Arg | Thr | Met | Asn | Ile | Asp | Asp | Lys | Ala | Lys |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Asn | Leu | Arg | Phe | Gin | Trp | Thr | Ile | Ala | Lys | Ala | Gly Gin | Val | Ser | Asn | |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ile | Ile | Pro | Ala | Ser | A.la | Thr | Leu | Asn | Ala | Asp | Val | Arg | Tyr | Ala | Arg |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Asn | Glu | Asp | Phe | Asp | Ala | Ala | Met | Lys | Thr | Leu | Glu | Glu | Arg | Ala | Gin |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Gin | Lys | Lys | Leu | Pro | Glu | Ala | Asp | Val | Lys | Val | Ile | Val | Thr | Arg | Gly |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Arg | Pro | Ala | Phe | Asn | Ala | Gly | Glu | Gly | Gly | Lys | Lys | Leu | Val | Asp | Lys |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ala | Val | Ala | Tyr | Tyr | Lys | Glu | Ala | Gly | Gly | Thr | Leu | Gly | Val | Glu | Glu |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Arg | Thr | Gly | Gly | Gly | Thr | Asp | Ala | Ala | Tyr | Ala | Ala | Leu | Ser | Gly | Lys |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Pro | Val | Ile | Glu | Ser | Leu | Gly | Leu | Pro | Gly | Phe | Gly | Tyr | His | Ser | Asp |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Lys | Ala | Glu | Tyr | Val | Asp | Ile | Ser | Ala | Ile | Pro | Arg | Arg | Leu | Tyr | Met |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ala | Ala | Arg | Leu | Ile | Met | Asp | Leu | Gly | Ala | Gly | Lys | ||||
405 | 410 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
CCACTCTCAC AGTGAGCTCG G 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 55 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina ·· . ·· φφφ · φ • φ φ · φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
ACCGCTACCG CCACCACCAG AGCCACCACC GCCAACTGTC TTGTCCACCT TGGTG 55 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
ACCCCCTCTA GAGTCGAC 18 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 54 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
TCTGGTGGTG GCGGTAGCGG TGGCGGGGGT TCCCAGAAGC GCGACAACGT GCTG 54 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1929 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina . (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
ATGGAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAÁTGGTAT CCAGTGTGAG 60 GTGAAGCTGG TGGAGTCTGG AGGAGGCTTG GTACAGCCTG GGGGTTCTCT GAGACTCTCC 120 TGTGCAACTT CTGGGTTCAC CTTCACTGAT TACTACATGA ACTGGGTCCG CCAGCCTCCA 180 GGAAAGGCAC TTGAGTGGTT GGGTTTTATT GGAAACAAAG CTAATGGTTA CACAACAGAG 240 TACAGTGCAT CTGTGAAGGG TCGGTTCACC ATCTCCAGAG ATAAATCCCA AAGCATCCTC 300 TATCTTCAAA TGAACACCCT GAGAGCTGAG GACAGTGCCA CTTATTACTG TACAAGAGAT 360 AGGGGGCTAC GGTTCTACTT TGACTACTGG GGCCAAGGCA CCACTCTCAC AGTGAGCTCG 420 GCTAGCACCA AGGGACCATC GGTCTTCCCC CTGGCCCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG 480 AGCACAGCCG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 540 TGGAACTCAG GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 600 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTCGTGACG GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC 660 TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC AGTTGGCGGT 720 • 99 99
9 99 9
9 9 ··
9 999 999
9 9
999 99 ··
GGTGGCTCTG GTGGTGGCGG TAGCGGTGGC GGGGGTTCCC AGAAGCGCGA CAACGTGCTG | 780 |
TTCCAGGCAG CTACCGACGA GCAGCCGGCC GTGATCAAGA CGCTGGAGAA GCTGGTCAAC | 840 |
ATCGAGACCG GCACCGGTGA CGCGGAGGGC ATCGCCGCTG CGGGCAACTT CCTCGAGGCC | 900 |
GAGCTCAAGA ACCTCGGCTT CACGGTCACG CGAAGCAAGT CGGCCGGCCT GGTGGTGGGC | 960 |
GACAACATCG TGGGCAAGAT CAAGGGCCGC GGCGGCAAGA ACCTGCTGCT GATGTCGCAC | 1020 |
ATGGACACCG TCTACCŤCAA GGGCATTCTC GCGAAGGCCC CGTTCCGCGT CGAAGGCGAC | 1080 |
AAGGCCTACG GCCCGGGCAT CGCCGACGAC AAGGGCGGCA ACGCGGTCAT CCTGCACACG | 1140 |
CTCAAGCTGC TGAAGGAATA CGGCGTGCGC GACTACGGCA CCATCACCGT GCTGTTCAAC | 1200 |
ACCGACGAGG AAAAGGGTTC CTTCGGCTCG CGCGACCTGA TCCAGGAAGA AGCCAAGCTG | 1260 |
G.CCGACTACG TGCTCTCCTT CGAGCCCACC AGCGCAGGCG ACGAAAAACT CTCGCTGGGC | 1320 |
ACCTCGGGCA TCGCCTACGT GCAGGTCCAG ATCACCGGCA AGGCCTCGCA TGCCGGCGCC | 1380 |
GCGCCCGAGC TGGGCGTGAA CGCGCTGGTC GAGGCTTCCG ACCTCGTGCT GCGCACGATG | 1440 |
AACATCGACG ACAAGGCGAA GAACCTGCGC TTCCAGTGGA CCATCGCCAA GGCCGGCCAG | 1500 |
GTCTCGAACA TCATCCCCGC CAGCGCCACG CTGAACGCCG ACGTGCGCTA CGCGCGCAAC | 1.560 |
GAGGACTTCG ACGCCGCCAT GAAGACGCTG GAAGAGCGCG CGCAGCAGAA GAAGCTGCCC | 1620 |
GAGGCCGACG TGAAGGTGAT CGTCACGCGC GGCCGCCCGG CCTTCAATGC CGGCGAAGGC | 1680 |
GGCAAGAAGC TGGTCGACAA GGCGGTGGCC TACTACAAGG AAGCCGGCGG CACGCTGGGC | 1740 |
GTGGAAGAGC GCACCGGCGG CGGCACCGAC GCGGCCTACG CCGCGCTCTC AGGCAAGCCA | 1800 |
GTGATCGAGA GCCTGGGCCT GCCGGGCTTC GGCTACCACA GCGACAAGGC CGAGTACGTG | 1850 |
GACATCAGCG CGATTCCGCG CCGCCTGTAC ATGGCTGCGC GCCTGATCAT GGATCTGGGC | 1920 |
GCCGGCAAG | 1929 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI.S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM | 16: |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 643 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
Met | Glu | Leu | Trp | Leu | Asn | Trp | Ile | Phe | Leu | Val | Thr | Leu | Leu | Asn | Gly |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Ile | Gin | Cys | Glu | Val | Lys | Leu | Val | Glu | Ser | Gly | Gly | Gly | Leu | Val | Gin |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Gly | Gly | Ser | Leu | Arg | Leu | Ser | Cys | Ala | Thr | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Thr | Asp | Tyr | Tyr | Met | Asn | Trp | Val | Arg | Gin | Pro | Pro | Gly | Lys | Ala | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Glu | Trp | Leu | Gly | Phe | Ile | Gly | Asn | Lys | Ala | Asn | Gly | Tyr | Thr | Thr | Glu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Tyr | Ser | Ala | Ser | Val | Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile | Ser | Arg | Asp | Lys | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Gin | Ser | Ile- | Leu | Tyr | Leu | Gin | Met | Asn | Thr | Leu | Arg | Ala | Glu | Asp | Ser |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ala | Thr | Tyr | Tyr | Cys | Thr | Arg | Asp | Arg | Gly | Leu | Arg | Phe | Tyr | Phe | Asp |
115 | 120 | 125 |
• 99 ·· • 9 9 9 9
9 9 9 9
9 999 999
9 9
Tyr | Trp Gly Gin 130 | Gly | Thr Thr 135 | Leu Thr Val | Ser | Ser 140 | Ala | Ser | Thr | Lys | |||||
Gly | Pro | Ser | Val | Phe | Pro | Leu | Ala | Pro | Cys | Ser | Arg | Ser | Thr | Ser | Glu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ser | Thr | Ala | Ala | Leu | Gly | Cys | Leu | Val | Lys | Asp | Tyr | Phe | Pro | Glu | Pro |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Val | Thr | Val | Ser | Trp | Asn | Ser | Gly | Ala | Leu | Thr | Ser | Gly | Val | His | Thr |
180 | 185 | • | 190 | ||||||||||||
Phe | Pro | Ala | Val | Leu | Gin | Ser | Ser | Gly | Leu | Tyr | Ser | Leu | Ser | Ser | Val |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Val | Thr | Val | Pro | Ser | Ser | Asn | Phe | Gly | Thr | Gin | Thr | Tyr | Thr | Cys | Asn |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Val | Asp | His | Lys | Pro | Ser | Asn | Thr | Lys | Val | Asp | Lys | Thr | Val | Gly | Gly |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gin | Lys | Arg |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Asp | Asn | Val | Leu | Phe | Gin | Al a | Al a | Thr | Asp | Glu | Gin | Pro | Ala | Val | Xle |
2 60 | 265 | 270 | |||||||||||||
Lys | Thr | Leu | Glu | Lys | Leu | Val | Asn | Ile | Glu | Thr | Gly | Thr | Gly | Asp | Ala |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Glu | Gly | Ile | Ala | Ala | Ala | Gly | Asn | Phe | Leu | Glu | Ala | Glu | Leu | Lys | Asn |
290 | 2 95 | 300 | |||||||||||||
Leu | Gly | Phe | Thr | Val | Thr | Arg | Ser | Lys | Ser | Ala | Gly | Leu | Val | Val | Gly. |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Asp | Asn | Ile | Val | Gly | Lys | Ile | Lys | Gly | Arg | Gly | Gly | Lys | Asn | Leu | Leu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Leu | Met | Ser | His | Met | Asp | Thr | Val | Tyr | Leu | Lys | Gly | Ile | Leu | Ala | Lys |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ala | Pro | Phe | Arg | Val | Glu | Gly | Asp | Lys | Ala | Tyr | Gly | Pro | Gly | Ile | Ala |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asp | Asp | Lys | Gly | Gly | Asn | Ala | Val | Ile | Leu | His | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Lys | Glu | Tyr | Gly | Val | Arg | Asp | Tyr | Gly | Thr | Xle | Thr | Val | Leu | Phe | Asn |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Thr | Asp | Glu | Glu | L-ys | Gly | Ser | Phe | Gly | Ser | Arg | Asp | Leu | Ile | Gin | Glu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Glu | Ala | Lys | Leu | Ala | Asp | Tyr | Val | Leu | Ser | Phe | Glu | Pro | Thr | Ser | Ala |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Gly | Asp | Glu | Lys | Leu | Ser | Leu | Gly | Thr | Ser | Gly | Ile | Ala | Tyr | Val | Gin |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Val | Gin | Ile | Thr | Gly | Lys | Ala | Ser | His | Ala | Gly | Ala | Ala | Pro | Glu | Leu |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Gly | Val | Asn | Ala | Leu | Val | Glu | Ala | Ser | Asp | Leu | Val | Leu | Arg | Thr | Met |
465 | 470- | 475 | 480 | ||||||||||||
Asn | Ile | Asp | Asp | Lys | Ala | Lys | Asn | Leu | Arg | Phe | Gin | Trp | Thr | Ile | Ala |
485 | 4 90 | 495 | |||||||||||||
Lys | Ala | Gly' | Gin | Vál | Ser | Asn | Ile | Ile | Pro | Ala | Ser | Ala | Thr | Leu | Asn |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Ala | Asp | Val | Arg | Tyr | Ala | Arg | Asn | Glu | Asp | Phe | Asp | Ala | Ala | Met | Lys |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Thr | Leu | Glu | Glu | Arg | Ala | Gin | Gin | Lys | Lys | Leu | Pro | Glu | Ala | Asp | Val |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Lys | Val | Ile | Val | Thr | Arg | Gly | Arg | Pro | Ala | Phe | Asn | Ala | Gly | Glu | Gly |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Gly | Lys | Lys | Leu | Val | Asp | Lys | Ala | Val | Ala | Tyr | Tyr | Lys | Glu | Ala | Gly |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Gly | Thr | Leu | Gly | Val | Glu | Glu | Arg | Thr | Gly | Gly | Gly | Thr | Asp | Ala | Ala |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Tyr | Ala | Ala | Leu | Ser | Gly | Lys | Pro | Val | Ile | Glu | Ser | Leu | Gly | Leu | Pro |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gly | Phe | Gly | Tyr | His | Ser | Asp | Lys | Ala | Glu | Tyr | Val | Asp | Ile | Ser | Ala |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ile | Pro | Arg | Arg | Leu | Tyr | Met | Ala | Ala | Arg | Leu | Ile | Met | Asp | Leu | Gly |
625 | 630 | 635 | 640 |
Ala Gly Lys (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 705 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP.MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
ATGGATTTTC | AAGTGCAGAT | TTTCAGCTTC | CTGCTAATCA | GTGCTTCAGT | CATAATGTCC | 60 |
AGAGGACAAA | CTGTTCTCTC | CCAGTCTCCA | GCAATCCTGT | CTGCATCTCC | AGGGGAGAAG | 120 |
GTCACAATGA | CTTGCAGGGC | CAGCTCAAGT | GTAACTTACA | TTCACTGGTA | CCAGCAGAAG | 180 |
CCAGGTTCCT | CCCCCAAATC | CTGGATTTAT | GCCACATCCA | ACCTGGCTTC | TGGAGTCCCT | 240 |
GCTCGCTTCA | GTGGCAGTGG | GTCTGGGACC | TCTTACTCTC | TCACAATCAG | CAGAGTGGAG | 300 |
GCTGAAGATG | CTGCCACTTA | TTACTGCCAA | CATTGGAGTA | GTAAACCACC | GACGTTCGGT | 360 |
GGAGGCACCA | AGCTCGAGAT | CAAACGGACT | GTGGCTGCAC | CATCTGTCTT | CATCTTCCCG | 420 |
CCATCTGATG | AGCAGTTGAA | ATCTGGAACT | GCCTCTGTTG | TGTGCCTGCT | GAATAACTTC | 480 |
TATCCCAGAG | AGGCCAAAGT | ACAGTGGAAG | GTGGATAACG | CCCTCCAATC | GGGTAACTCC | 540 |
CAGGAGAGTG | TCACAGAGCA | GGACAGCAAG | GACAGCACCT | ACAGCCTCAG | CAGCACCCTG | 600 |
ACGCTGAGCA | AAGCAGACTA | CGAGAAACAC | AAAGTCTACG | CCTGCGAAGT | CACCCATCAG | 660 |
GGCCTGAGTT | CGCCCGTCAC | AAAGAGCTTC | AACAGGGGAG | AGTGT | 705 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 235 aminokyselin (B) . TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché '(D) TOPOLOGIE: lineární • 9 99 • · · · 9 '9 9 9 9
9 999 9 · 9
99
9 9 9
9 9 9
999 999 ' 9
99 (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
Met | Asp | Phe | Gin | Val | Gin | Ile | Phe | Ser | Phe | Leu | Leu | Ile | Ser | Ala | Ser |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Val | Ile | Met | Ser | Arg | Gly | Gin | Thr | Val | Leu | Ser | Gin | Ser | Pro | Ala | Ile |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Ser | Ala | Ser | Pro | Gly | Glu | Lys | Val | Thr | Met | Thr | Cys | Arg | Ala | Ser |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ser | Ser | Val | Thr | Tyr | Ile | His | Trp | Tyr | Gin | Gin | Lys | Pro | Gly | Ser | Ser |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Pro | Lys | Ser | Trp | Ile | Tyr | Ala | Thr | Ser | Asn | Leu | Ala | Ser | Gly | Val | Pro |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ala | Arg | Phe | Ser | Gly | Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Ser | Tyr | Ser | Leu | Thr. | Ile |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Arg | Val | Glu | Ala | Glu | Asp | Ala | Ala | Thr | Tyr | Tyr | Cys | Gin | His | Trp |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ser | Ser | Lys | Pro | Pro | Thr | Phe | Gly | Gly | Gly | Thr | Lys | Leu | Glu | Ile | Lys |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Arg | Thr | Val | Ala | Ala | Pro | Ser | Val | Phe | Ile | Phe | Pro | Pro | Ser | Asp | Glu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gin | Leu | Lys | Ser | Gly | Thr | Ala | Ser | Val | Val | Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Phe |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Tyr | Pro | Arg | Glu | Ala | Lys | Val | Gin | Trp | Lys | Val | Asp | Asn | Ala | Leu | 'Gin |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ser | Gly | Asn | Ser | Gin | Glu | Ser | Val | Thr | Glu | Gin | Asp | Ser | Lys | Asp | Ser |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Thr | Tyr | Ser | Leu | Ser | Ser | Thr | Leu | Thr | Leu | Ser | Lys | Ala | Asp | Tyr | Glu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Lys | His | Lys | Val | Tyr | Ala | Cys | Glu | Val | Thr | His | Gin | Gly | Leu | Ser | Ser |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Pro | Val | Thr | Lys | Ser | Phe | Asn | Arg | Gly | Glu | Cys | |||||
225 | '230 | 235 |
(2) INFORMACE PRO .SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina .
(C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
AAGCTTGAAT TCGCCGCCAC TATGGATTTT CAAGTGCAG ·» ·· • · · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· · • ·· ·· ·· · · « · • · · · · • · ··· ··· • · · ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM' 20:
TTAATTGGAT CCGAGCTCCT ATTAACACTC TCCCCTGTTG AAGC 44 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21: AAGCTTCCGG ATCCCTGCAG CCATGGAGTT GTGGCTGAAC TGGATTTTCC 50 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22: AAGCTTAGTC TAGATTATCA CTTGCCGGCG CCCAGATC 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 46 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
CGGGGGATCC AGATCTGAGC TCCTGTAGAC GTCGACATTA ATTCCG 46 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží ' (B) TYP: nukleová kyselina
9
99 9 9 9 9 99
9··999 9 99999
9 9 9 9 9
99 999 ·99 99
100 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární.
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
; GGAAAATCCA GTTCAGCCAC AACTCCATGG 30 (2) INFORMACE.PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1926 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
ATGAAGTTGT | GGCTGAACTG | GATTTTCCTT | GTAACACTTT | TAAATGGAAT | TCAGTGTGAG | 60 |
GTGCAGCTGC | AGCAGTCTGG | GGCAGAGCTT | GTGAGGTCAG | GGGCCTCAGT | CAAGTTGTCC | 120 |
TGCACAGCTT | CTGGCTTCAA | CATTAAAGAC | AACTATATGC | ACTGGGTGAA | GCAGAGGCCT | 180 |
GAACAGGGCC | TGGAGTGGAT | TGCATGGATT | GATCCTGAGA | ATGGTGATAC | TGAATATGCC | 240 |
CCGAÁGTTCC | GGGGCAAGGC | CACTTTGACT | GCAGACTCAT | CCTCCAACAC | AGCCTACCTG | 300 |
CACCTCAGCA | GCCTGACATC | TGAGGACACT | GCCGTCTATT | ACTGTCATGT | CCTGATCTAT | 360 |
GCTGGTTATT | TGGCTATGGA | CTACTGGGGT | CAAGGAACCT | CAGTCGCCGT | GAGCTCGGCT | 420 |
AGCACCAAGG | GACCATCGGT | CTTCCCCCTG | GCCCCCTGCT | CCAGGAGCAC | CTCCGAGAGC | 480 |
ACAGCCGCCC | TGGGCTGCCT | GGTCAAGGAC | TACTTCCCCG | AACCGGTGAC | GGTGTCGTGG | 540 |
AACTCAGGCG | CTCTGACCAG | CGGCGTGCAC | ACCTTCCCGG | CTGTCCTACA | GTCCTCAGGA | 600 |
CTCTACTCCC | TCAGCAGCGT | CGTGACGGTG | CCCTCCAGCA | ACTTCGGCAC | CCAGACCTAC | 660 |
ACCTGCAACG | TAGATCACAA | GCCCAGCAAC | ACCAAGGTGG | ACAAGACAGT | TGGCGGTGGT | 720 |
GGCTCTGGTG | GTGGCGGTAG | CGGTGGCGGG | GGTTCCCAGA | AGCGCGACAA | CGTGCTGTTC | 780 |
CAGGCAGCTA | CCGACGAGCA | GCCGGCCGTG | ATCAAGACGC | TGGAGAAGCT | GGTCAACATC | 840 |
GAGACCGGCA | CCGGTGACGC | CGAGGGCATC | GCCGCTGCGG | GCAACTTCCT | CGAGGCCGAG | 900 |
CTCAAGAACC | TCGGCTTCAC | GGTCACGCGA | AGCAAGTCGG | CCGGCCTGGT | GGTGGGCGAC | 960 |
AACATCGTGG | GCAAGATCAA | GGGCCGCGGC | GGCAAGAACC | TGCTGCTGAT | GTCGCACATG | 1020 |
GACACCGTCT | ACCTCAAGGG | CATTCTCGCG | aaggccccgt | TCCGCGTCGA | AGGCGACAAG | 1080 |
GCCTACGGCC | CGGGCATCGC | CGACGACAAG | GGCGGCAACG | CGGTCATCCT | GCACACGCTC | 1140 |
AAGCTGCTGA | AGGAATACGG | CGTGCGCGAC | TACGGCACCA | TCACCGTGCT | GTTCAACACC | 1200 |
GACGAGGAAA | AGGGTTCCTT | CGGCTCGCGC | GACCTGATCC | AGGAAGAAGC | CAAGCTGGCC | 1260 |
GACTACGTGC | TCTCCTTCGA | GCCCACCAGC | GCAGGCGACG | AAAAACTCTC | GCTGGGCACC | 1320 |
TCGGGCATCG | CCTACGTGCA | GGTCCAGATC | ACCGGCAAGG | CCTCGCATGC | CGGCGCCGCG | 13 80 |
CCCGAGCTGG | GCGTGAACGC | GCTGGTCGAG | GCTTCCGACC | TCGTGCTGCG | CACGATGAAC | 1440 |
ATCGACGACA | AGGCGAAGAA | CCTGCGCTTC | CAGTGGACCA | TCGCCAAGGC | CGGCCAGGTC | 1500 |
TCGAACATCA | TCCCCGCCAG | CGCCACGCTG | AACGCCGACG | TGCGCTACGC | GCGCAACGAG | 1560 |
GACTTCGACG | CCGCCATGAA | GACGCTGGAA | GAGCGCGCGC | AGCAGAAGAA | GCTGCCCGAG | 1620 |
GCCGACGTGA | AGGTGATCGT | CACGCGCGGC | CGCCCGGCCT | TCAATGCCGG | CGAAGGCGGC | 1680 |
0
00 0 00 00 0 ·0 · • 000 0 · 0000 0 0 000 00 00 000 000 • 0 0 0 0 0.0
101
AAGAAGCTGG TCGACAAGGC GGTGGCCTAC TACAAGGAAG CCGGCGGCAC GCTGGGCGTG 1740 GAAGAGCGCA CCGGCGGCGG CACCGACGCG GCCTACGCCG CGCTCTCAGG CAAGCCAGTG 1800 ATCGAGAGCC TGGGCCTGCC GGGCTTCGGC TACCACAGCG ACAAGGCCGA GTACGTGGAC 1860 ATCAGCGCGA TTCCGCGCCG CCTGTACATG GCTGCGCGCC TGATCATGGA TCTGGGCGCC 1920 GGCAAG 1926 (2) INFORMACE·PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 642 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly | |||||||||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Ile | Gin | Cys | Glu | Val | Gin | Leu | Gin | Gin | Ser | Gly | Ala | Glu | Leu | Val | Arg |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ser | Gly | Ala | Ser | Val | Lys | Leu | Ser | Cys | Thr | Ala | Ser | Gly | Phe | Asn | Ile |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Lys | Asp | Asn | Tyr | Met | His | Trp | Val | Lys | Gin | Arg | Pro | Glu | Gin | Gly | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Glu | Trp | Ile | Ala | Trp | Ile | Asp | Pro | Glu | Asn | Gly | Asp | Thr | Glu | Tyr | .Ala |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Pro | Lys | Phe | Arg | Gly | Lys | Ala | Thr | Leu | Thr | Ala | Asp | Ser | Ser | Ser | Asn |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Ala | Tyr | Leu | His | Leu | Ser | Ser | Leu | Thr | Ser | Glu | Asp | Thr | Ala | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Tyr | Tyr | Cys | His | Val | Leu | Ile | Tyr | Ala | Gly | Tyr | Leu | Ala | Met | Asp | Tyr |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Ser | Val | Ala | Val | Ser | Ser | Ala | Ser | Thr | Lys | Gly |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Pro | Ser | Val | Phe | Pro | Leu | Ala | Pro | Cys | Ser | Arg | Ser | Thr | Ser | Glu | Ser |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Thr | Ala | Ala | Leu | Gly | Cys | Leu | Val | Lys | Asp | Tyr | Phe | Pro | Glu | Pro | Val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Thr | Val | Ser | Trp | Asn | Ser | Gly | Ala | Leu | Thr | Ser | Gly | Val | His | Thr | Phe |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Pro | Ala | Val | Leu | Gin | Ser | Ser | Gly | Leu | Tyr | Ser | Leu | Ser | Ser | Val | Val |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Thr | Val | Pro | Ser | Ser | Asn | Phe | Gly | Thr | Gin | Thr | Tyr | Thr | Cys | Asn | Val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Asp | His | Lys | Pro | Ser | Asn | Thr | Lys | Val | Asp | Lys | Thr | Val | Gly | Gly | Gly |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gin | Lys | Arg | Asp |
245 | 250 | 255 |
• ·· · · · ·· · · · . · • · · · · · ···· • ····· · · · · · · ··· • · · · · · · • · · * · · · · ·· ·· ··
102
As η | Val | Leu | Phe 260 | Gin Ala | Ala | Thr Asp Glu 265 | Gin | Pro | Ala | Val 270 | Ile | • Lys | |||
Thr | Leu | Glu | Lys | Leu | Val | Asn | Ile | Glu | Thr | Gly | Thr | Gly | Asp | Ala | Glu |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Gly | Ile | Ala | Ala | Ala | Gly | Asn | Phe | Leu | Glu | Ala | Glu | Leu | Lys | Asn | Leu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Gly | Phe | Thr | Val | Thr | Arg | Ser | Lys | Ser | Ala | Gly | Leu | Val | Val | Gly | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Asn | Ile | Val | Gly | Lys | Ile | Lys | Gly | Arg | Gly | Gly | Lys | Asn | Leu | Leu | Leu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Met | Ser | His | Met | Asp | Thr | Val | Tyr | Leu | Lys | Gly | Ile | Leu | Ala | Lys | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Pro | Phe | Arg | Val | Glu | Gly | Asp | Lys | Ala | Tyr | Gly | Pro | Gly | Ile | Ala | Asp |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asp | Lys | Gly | Gly | Asn | Ala | Val | Ile | Leu | His | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Lys |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Glu | Tyr | Gly | Val | Arg | Asp | Tyr | Gly | Thr | Ile | Thr | Val | Leu | Pne | Asn | Thr |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Asp | Glu | Glu | Lys | Gly | Ser | Phe | Gly | Ser | Arg | Asp | Leu | Ile | Gin | Glu | Glu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Ala | Lys | Leu | Ala | Asp | Tyr | Val | Leu | Ser | Phe | Glu | Pro | Thr | Ser | Ala | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Asp | Glu | Lys | Leu | Ser | Leu | Gly | Thr | Ser | Gly | Ile | Ala | Tyr | Val | Gin | Val |
435 | 440 | 445 | •ď ' | ||||||||||||
Gin | Ile | Thr | Gly | Lys | Ala | Ser | His | Ala | Gly | Ala | Ala | Pro | Glu | Leu | Gly |
450 | 455 | 4 60 | |||||||||||||
Val | Asn | Ala | Leu | Val | Glu | Ala | Ser | Asp | Leu | Val | Leu | Arg | Thr | Met | Asn |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Ile | Asp | Asp | Lys | Ala | Lys | Asn | Leu | Arg | Phe | Gin | Trp | Thr | Ile | Ala | Lys |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Ala | Gly | Gin | Val | Ser | Asn | Ile | Ile | Pro | Ala | Ser | Ala | Thr | Leu, | Asn | Ala |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Asp | Val | Arg | Tyr | Ala | Arg | Asn | Glu | Asp | Phe | Asp | Ala | Ala | Met | Lys | Thr |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Leu | Glu | Glu | Arg | Ala | Gin | Gin | Lys | Lys | Leu | Pro | Glu | Ala | Asp | Val | Lys |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Val | Ile | Val | Thr | Arg | Gly | Arg | Pro | Ala | Phe | Asn | Ala | Gly | Glu | Gly/ Gly | |
545 | 550 | 1 | 555 | 560 | |||||||||||
Lys | Lys | Leu | Val | Asp | Lys | Ala | Val | Ala | Tyr | Tyr | Lys | Glu | Ala | Gly | Gly |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Thr | Leu | Gly | Val | Glu | Glu | Arg | Thr | Gly | Gly | Gly | Thr | Asp | Ala | Ala | Tyr |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Ala | Ala | Leu | Ser | Gly | Lys | Pro | Val | Ile | Glu | Ser | Leu | Gly | Leu | Pro | Gly |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Phe | Gly | Tyr | His | Ser | Asp | Lys | Ala | Glu | Tyr | Va.l | Asp | Ile | Ser | Ala | Ile |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Pro | Arg | Arg | Leu | Tyr | Met | Ala | Ala | Arg | Leu | Ile | Met | Asp | Leu* | Gly | Ala |
103
625
Gly Lys
630
635
640 (2). INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
AAGCTTGGAA TTCAGTGTCA GGTCCAACTG CAGCAGCCT 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28: .
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 54 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28: GCTACCGCCA CCTCCGGAGC CACCACCGCC CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TGCC 54 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 58 párů baží.
(B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29: TCCGGAGGTG GCGGTAGCGG TGGCGGGGGT TCCCAGAAGC GCGACAACGT GCTGTTCC 58 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:
CCTCGAGGAA TTCTTTCACT TGCC
104 ·· ·· · * • · · · · · · · • · · · · · • · ··· · · · • · · · · ·· ·· ·· · ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:. 2019 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:, jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:
ATGAAGTTGT | GGCTGAACTG | GATTTTCCTT | GTAACACTTT | TAAATGGAAT | TCAGTGTCAG | 60 |
GTCCAACTGC | AGCAGCCTGG | GGCTGAACTG | GTGAAGCCTG | GGGCTTCAGT | GCAGCTGTCC | 120 |
TGCAAGGCTT | CTGGCTACAC | CTTCACCGGC | TACTGGATAC | ACTGGGTGAA | GCAGAGGCCT | 180 |
GGACAAGGCC | TTGAGTGGAT | TGGAGAGGTT | AATCCTAGTA | CCGGTCGTTC | TGACTACAAT | 240 |
GAGAAGTTCA | AGAACAAGGC | CACACTGACT | GTAGACAAAT | CCTCCACCAC | AGCCTACATG | 300 |
CAACTCAGCA | GCCTGACATC | TGAGGACTCT | GCGGTCTATT | ACTGTGCAAG | AGAGAGGGCC | 360 |
TATGGTTACG | ACGATGCTAT | GGACTACTGG | GGCCAAGGGA | CCACGGTCAC | CGTCTCCTCA | 420 |
GGTGGCGGTG | GCTCGGGCGG | TGGTGGGTCG | GGTGGCGGCG | GATCTGACAT | TGAGCTCTCA | 480 |
CAGTCTCCAT | CCTCCCTGGC | TGTGTCAGCA | GGAGAGAAGG | TCACCATGAG | CTGCAAATCC | 540 |
AGTCAGAGTC | TCCTCAACAG | TAGAACCCGA | AAGAACŤACT | TGGCTTGGTA | CCAGCAGAGA | 600 |
CCAGGGCAGT | CTCCTAAACT | GCTGATCTAT | TGGGCATCCA | CTAGGACATC | TGGGGTCCCT | 660 |
GATCGCTTCA | CAGGCAGTGG | ATCTGGGACA | GATTTCACTC | TCACCATCAG | CAGTGTGCAG | 720 |
GCTGAAGACC | TGGCAATTTA | TTACTGCAAG | CAATCTTATA | CTCTTCGGAC | GTTCGGTGGA | 780 |
GGCACCAAGC | TCGAGATCAA | ACGioGGCGGT | GGTGGCTCCG | GAGGTGGCGG | TAGCGGTGGC | 840 |
GGGGGTTCCC | AGAAGCGCGA | CAACGTGCTG | TTCCAGGCAG | CTACCGACGA | GCAGCCGGCC | 900 |
GTGATCAAGA | CGCTGGAGAA | GCTGGTCAAC | ATCGAGACCG | GCACCGGTGA | CGCCGAGGGC | 960 |
ATCGCCGCTG | CGGGCAACTT | CCTCGAGGCC | GAGCTCAAGA | ACCTCGGCTT | CACGGTCACG | 1020 |
CGAAGCAAGT | CGGCCGGCCT. | GGTGGTGGGC | GACAACATCG | TGGGCAAGAT | CAAGGGCCGC | 1080 |
GGCGGCAAGA | ACCTGCTGCT | GATGTCGCAC | ATGGACACCG | TCTACCTCAA | GGGCATTCTC | 1140 |
GCGAAGGCCC | CGTTCCGCGT | CGAAGGCGAC | AAGGCCTACG | GCCCGGGCAT | CGCCGACGAC | 1200 |
AAGGGCGGCA | ACGCGGTCAT | CCTGCACACG | CTCAAGCTGC | TGAAGGAATA | CGGCGTGCGC | 1260 |
GACTACGGCA | CCATCACCGT | GCTGTTCAAC | ACCGACGAGG | AAAAGGGTTC | CTTCGGCTCG | 1320 |
CGCGACCTGA | TCCAGGAAGA | AGCCAAGCTG | GCCGACTACG | TGCTCTCCTT | CGAGCCCACC | 1380 |
AGCGCAGGCG | ACGAAAAACT | CTCGCTGGGC | ACCTCGGGCA | TCGCCTACGT | GCAGGTCCAG | 1440 |
ATCACCGGCA | AGGCCTCGCA | TGCCGGCGCC | GCGCCCGAGC | TGGGCGTGAA | CGCGCTGGTC | 1500 |
GAGGCTTCCG | ACCTCGTGCT | GCGCACGATG | AACATCGACG | ACAAGGCGAA | GAACCTGCGC | 1560 |
TTCCAGTGGA | CCATCGCCAA | GGCCGGCCAG | GTCTCGAACA | TCATCCCCGC | CAGCGCCACG | 1620 |
CTGAACGCCG | ACGTGCGCTA | CGCGCGCAAC | GAGGACTTCG | ACGCCGCCAT | GAAGACGCTG | 1680 |
GAAGAGCGCG | CGCAGCAGAA | GAAGCTGCCC | GAGGCCGACG | TGAAGGTGAT | CGTCACGCGC | 1740 |
GGCCGCCCGG | CCTTCAATGC | CGGCGAAGGC | GGCAAGAAGC | TGGTCGACAA | GGCGGTGGCC | 1800 |
TACTACAAGG | AAGCCGGCGG | CACGCTGGGC | GTGGAAGAGC | GCACCGGCGG | CGGCACCGAC | ' 1860 |
GCGGCCTACG | CCGCGCTCTC | AGGCAAGCCA | GTGATCGAGA | GCCTGGGCCT | GCCGGGCTTC | 1920 |
GGCTACCACA | GCGACAAGGC | CGAGTACGTG | GACATCAGCG | CGATTCCGCG | CCGCCTGTAC | 1980 |
ATGGCTGCGC | GCCTGATCAT | GGATCTGGGC | GCCGGCAAG | 2019 |
·· • · • φ · · φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ ΦΦΦ φ φ φ φ <φ· ΦΦΦ /Λ r ΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ
105 ·· ·· ··· ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 673 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:
Met | Lys | Leu | Trp | Leu | Asn | Trp | Ile | Phe | Leu | Val | Thr | Leu | Leu | Asn | Gly |
1 | 5 | 10 | 1 | 15 | |||||||||||
Ile | Gin | Cys | Gin | Val | Gin | Leu | Gin | Gin | Pro | Gly | Ala | Glu | Leu | Val | Lys |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Gly | Ala | Ser | Val | Gin | Leu | Ser | Cys | Lys | Ala | Ser | Gly | Tyr | Thr | Phe |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Thr | Gly | Tyr | Trp | Ile | His | Trp | Val | Lys | Gin | Arg | Pro | Gly | Gin | Gly | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Glu | Trp | Ile | Gly | Glu | Val | Asn | Pro | Ser | Thr | Gly | Arg | Ser | Asp | Tyr | Asn |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Glu | Lys | Phe | Lys | Asn | Lys | Ala | Thr | Leu | Thr | Val | Asp | Lys | Ser | Ser | Thr |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Ala | Tyr | Met | Gin | Leu | Ser | Ser | Leu | Thr | Ser | Glu | Asp | Ser | Ala | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Tyr | Tyr | Cys | Ala | Arg | Glu | Arg | Ala | Tyr | Gly | Tyr | Asp | Asp | Ala | Met | Asp |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Tyr | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Thr | Val | Thr | Val | Ser | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Asp | Ile | Glu | Leu | Ser |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Gin | Ser | Pro | Ser | Ser | Leu | Ala | Val | Ser | Ala | Gly | Glu | Lys | Val | Thr | Met |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ser | Cys | Lys | Ser | Ser | Gin | Ser | Leu | Leu | Asn | Ser | Arg | Thr | Arg | Lys | Ash |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Tyr | Leu | Ala | Trp | Tyr | Gin | Gin | Arg | Pro | Gly | Gin | Ser | Pro | Lys | Leu | Leu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ile | Tyr | Trp | Ala | Ser | Thr | Arg | Thr | Ser | Gly | Val | Pro | Asp | Arg | Phe | Thr |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Gly | Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp | Phe | Thr | Leu | Thr | Ile | Ser | Ser | Val | Gin |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ala | Glu | Asp | Leu | Ala | Ile | Tyr | Tyr | Cys | Lys | Gin | Ser | Tyr | Thr | Leu | Arg |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Thr | Phe | Gly | Gly | Gly | Thr | Lys | Leu | Glu | Ile | Lys | Arg | Gly Gly | Gly | Gly | |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gin | Lys | Arg | Asp | Asn |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Val | Leu | Phe | Gin | Ala | Ala | Thr | Asp | Glu | Gin | Pro | Ala | Val | Ile | Lys | Thr |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Leu | Glu | Lys | Leu | Val | Asn | Ile | Glu | Thr | Gly | Thr | Gly | Asp | Ala | Glu | Gly |
305 | 310 | 315 | 320 |
106
44 · · 4· 44 ♦ 4 · · 4 4 4 4 4 φ 4 ·
444 4 4 4 4444
4 444 44 44 444 444
4 4 4 4 4 4
44 444 444 44 44
Ile Ala Ala Ala | Gly Asn 325 | Phe | Leu Glu Ala Glu 330 | Leu | lys | Asn | Leu 335 | Gly | |||||||
Phe | Thr | Val | Thr | Arg | Ser | Lys | Ser | Ala | Gly | Leu | Val | Val | Gly | Asp | Asn |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ile | Val | Gly | Lys | Ile | Lys | Gly | Arg | Gly | Gly | Lys | Asn | Leu | Leu | Leu | Met |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Ser | His | Met | Asp | Thr | Val | Tyr | Leu | Lys | Gly | Ile | Leu | Ala | Lys | Ala | Pro |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Phe | Arg | Val | Glu | Gly | Asp | Lys | Ala | Tyr | Gly | Pro | Gly | Ile | Ala | Asp | Asp |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Lys | Gly | Gly | Asn | Ala | Val | Ile | Leu | His | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Lys | Glu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Tyr | Gly | Val | Arg | Asp | Tyr | Gly | Thr | Ile | Thr | Val | Leu | Phe | Asn | Thr | Asp |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Glu | Glu | Lys | Gly | Ser | Phe | Gly | Ser | Arg | Asp | Leu | Ile | Gin | Glu | Glu | Ala |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Lys | Leu | Ala | Asp | Tyr | Val | Leu | Ser | Phe | Glu | Pro | Thr | Ser | Ala | Gly | Asp |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Glu | Lys | Leu | Ser | Leu | Gly | Thr | Ser | Gly | Ile | Ala | Tyr | Val | Gin | Val | Gin |
4 65 | 470. | 475 | 480 | ||||||||||||
Ile | Thr | Gly | Lys | Ala | Ser | His | Ala | Gly | Ala | Ala | Pro | Glu | Leu | Gly | Val |
485 | 490 | 4 95 | |||||||||||||
Asn | Ala | Leu | Val | Glu | Ala | Ser | Asp | Leu | Val | Leu | Arg | Thr | Met | Asn | Ile |
500 | 505 | .510 | |||||||||||||
Asp | Asp | Lys | Ala | Lys | Asn | Leu | Arg | Phe | Gin | Trp | Thr | Ile | Ala | Lys | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gly | Gin | Val | Ser | Asn | Ile | Ile | Pro | Ala | Ser | Ala | Thr | Leu | Asn | Ala | Asp |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Val | Arg | Tyr | Ala | Arg | Asn | Glu | Asp | Phe | Asp | Ala | Ala | Met | Lys | Thr | Leu |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Glu | Glu | Arg | Ala | Gin | Gin | Lys | Lys | Leu | Pro | Glu | Ala | Asp | Val | Lys | Val |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ile | Val | Thr | Arg | Gly | Arg | Pro | Ala | Phe | Asn | Ala | Gly | Glu | Gly | Gly | Lys |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Lys | Leu | Val | Asp | Lys | Ala | Val' | Ala | Tyr | Tyr | Lys | Glu | Ala | Gly | Gly | Thr |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Leu | Gly | Val | Glu | Glu | Arg | Thr | Gly | Gly | Gly | Thr | Asp | Ala | Ala | Tyr | Ala |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ala | Leu | Ser | Gly | Lys | Pro | Val | Ile | Glu | Ser | Leu | Gly | Leu | Pro | Gly | Phe |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Gly | Tyr | His | Ser | Asp | Lys | Ala | Glu | Tyr | Val | Asp | Ile | Ser | Ala | Ile | Pro |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Arg | Arg | Leu | Tyr | Met | Ala | Ala | Arg | Leu | Ile | Met | Asp | Leu | Gly | Ala | Gly |
660 | 665 | 670 |
Lys
107 • · · . · • · 000 0
0 0
00 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33 GGGCGCCGGC AAGTGATAAA ATTCCTCGAG GAGCTCC 37 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM·ČÍSLEM 34:
(i) CHARAKTERISTIKA.SEKVENCE:
(A) ' DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34
CGCCACCTCT GACTTGAGC 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE' S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35 GGAGCTCCTG GAGGAATTTT ATCACTTGCC GGCGCCC 37 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová. kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36
GCTGAACGCC GACGTGCGC 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:
- (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2025 párů baží • 999 99 ·· · · 9
999 · 9 999
9 999 99 99 999
9 9 9 9 9
99 999 999 99
108 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS. SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:
ATGAAGTTGT | GGCTGAACTG | GATTTTCCTT | GTAACACTTT | TAAAŤGGAAT | TCAGTGTCAG | 60 |
GTCCAACTGC | AGCAGCCTGG | GGCTGAACTG | GTGAAGCCTG | GGGCTTCAGT | GCAGCTGTCC | , 120 |
TGCAAGGCTT | CTGGCTACAC | CTTCACCGGC | TACTGGATAC | ACTGGGTGAA | GCAGAGGCCT | 180 |
GGACAAGGCC | TTGAGTGGAT | TGGAGAGGTT | AATCCTAGTA | CCGGTCGTTC | TGACTACAAT | 240 |
GAGAAGTTCA | AGAACAAGGC | CACACTGACT | GTAGACAAAT | CČTCCACCAC | AGCCTACATG | 300 |
CAACTCAGCA | GCCTGACATC | TGAGGACTCT | GCGGTCTATT | ACTGTGCAAG | AGAGAGGGCC | 360 |
TATGGTTACG | ACGATGCTAT | GGACTACTGG | GGCCAAGGGA | CCACGGTCAC | CGTCTCCTCA | 420 |
GGTGGCGGTG | GCTCGGGCGG | TGGTGGGTCG | GGTGGCGGCG | GATCTGACAT | TGAGCTCTCA ' | 480 |
CAGTCTCCAT | CCTCCCTGGC | TGTGTCAGCA | GGAGAGAAGG | TCACCATGAG | CTGCAAATCC | 540 |
AGTCAGAGTC | TCCTCAACAG | TAGAACCCGA | AAGAACTACT | TGGCTTGGTA | CCAGCAGAGA | 600 |
CCAGGGCAGT | CTCCTAAACT | GCTGATCTAT | TGGGCATCCA | CTAGGACATC | TGGGGTCCCT | 660 |
GATCGCTTCA | CAGGCAGTGG | ATCTGGGACA | GATTTCACTC | TCACCATCAG | CAGTGTGCAG | 720 |
GCTGAAGACC | TGGCAATTTA | TTACTGCAAG | CAATCTTATA | CTCTTCGGAC | GTTCGGTGGA | .780 |
GGCACCAAGC | TCGAGATCAA | ACGGGGCGGT | GGTGGCTCCG | GAGGTGGCGG | TAGCGGTGGC | 840 |
GGGGGTTCCC | AGAAGCGCGA | CAACGTGCTG | TTCCAGGCAG | CTACCGACGA | GCAGCCGGCC | 900 |
GTGATCAAGA | CGCTGGAGAA | GCTGGTCAAC | atcgagaccg | GCACCGGTGA | CGCCGAGGGC | 960' |
ATCGCCGCTG | CGGGCAACTT | CCTCGAGGCC | GAGCTCAAGA | ACCTCGGCTT | CACGGTCACG | 1020 |
CGAAGCAAGT | CGGCCGGCCT | GGTGGTGGGC | GACAACATCG | TGGGCAAGAT | CAAGGGCCGC | 1080 |
GGCGGCAAGA | ACCTGCTGCT | GATGTCGCAC | ATGGACACCG | TCTACCTCAA | GGGCATTCTC | 1140 |
gcgaaggccc | CGTTCCGCGT | CGAAGGCGAC | AAGGCCTACG | GCCCGGGCAT | CGCCGACGAC | 1200 |
AAGGGCGGCA | ACGCGGTCAT | CCTGCACACG | CTCAAGCTGC | TGAAGGAATA | CGGCGTGCGC | 1260 |
GACTACGGCA | CCATCACCGT | GCTGTTCAAC | ACCGACGAGG | AAAAGGGTTC | CTTCGGČTCG | 1320 |
CGCGACCTGA | TCCAGGAÁGA | AGCCAAGCTG | GCCGACTACG | TGCTCTCCTT | CGAGCCCACC | 1380 |
AGCGCAGGCG | .ACGAAAAACT | CTCGCTGGGC | ACCTCGGGCA | TCGCCTACGT | GCAGGTCCAG | 1440 |
ATCACCGGCA | AGGCCTCGCA | TGCCGGCGCC | GCGCCCGAGC | TGGGCGTGAA | CGCGCTGGTC | 1500 |
GAGGCTTCCG | ACCTCGTGCT | GCGCACGATG | AACATCGACG | ACAAGGCGAA | GAACCTGCGC | 1560 |
TTCCAGTGGA | CCATCGCCAA | GGCCGGCCAG | GTCTCGAACA | TCATCCCCGC | CAGCGCCACG | 1620 |
CTGAACGCCG | ACGTGCGCTÁ | CGCGCGCAAC | GAGGACTTCG | ACGCCGCCAT | GAAGACGCTG | 1680 |
GAAGAGCGCG | CGCAGCAGAA | GAAGCTGCCC | GAGGCCGACG | TGAAGGTGAT | CGTCACGCGC | 1740 |
GGCCGCCCGG | CCTTCAATGC | CGGCGAAGGC | GGCAAGAAGC | TGGTCGACAA | GGCGGTGGCC | 1800 |
TACTACAAGG | AAGCCGGCGG | CACGCTGGGC | GTGGAAGAGC | GCACCGGCGG | CGGCACCGAC | 1860 |
GCGGCCTACG | CCGCGCTCTC | AGGCAAGCCA | GTGATCGAGA | GCCTGGGCCT | GCCGGGCTTC | 1920 |
GGCTACCACA | GCGACAAGGC | CGAGTACGTG | GACATCAGCG | CGATTCCGCG | CCGCCTGTAC | 1980 |
ATGGCTGCGC | GCCTGATCAT | GGATCTGGGC | GCCGGCAAGT | GATAA | 2025 | |
(2) INFORMACE PRO | SEKVENCI | S IDENTIFIKAČNÍM | : ČÍSLEM 38 |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 288 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:
.· · • · · · · · ·· · · · · • · · · * · . * · · · • · ··· · · · · ··· ··· • · · · · · ·
109 ·· ·· ..........
Met | Lys | Tyr | Leu | Leu | Pro | Thr | Ala | Ala | Ala | Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Ala | Gin | Pro | Ala | Met | Ala | Gin | Val | Gin | Leu | Gin | Gin | Pro | Gly | Ala | Glu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Val | Lys | Pro | Gly | Ala | Ser | Val | Gin | Leu | Ser | Cys | Lys | Ala | Ser | Gly |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Tyr | Thr | Phe | Thr | Gly | Tyr | Trp | Ile | His | Trp | Val | Lys | Gin | Arg | Pro | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gin | Gly | Leu | Glu | Trp | Ile | Gly | Glu | Val | Asn | Pro | Ser | Thr | Gly | Arg | Ser |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Asp | Tyr | Asn | Glu | Lys | Phe | Lys | Asn | Lys | Ala | Thr | Leu | Thr | Val | Asp | Lys |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Ser | Thr | Thr | Ala | Tyr | Met | Gin | Leu | Ser | Ser | Leu | Thr | Ser | Glu | Asp |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ser | Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys | Ala | Arg | Glu | Arg | Ala | Tyr | Gly | Tyr | Asp | Asp |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ala | Met | Asp | Tyr | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Thr | Val | Thr | Val | Ser | Ser | Gly |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Asp | Ile |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Glu | Leu | Ser | Gin | Ser | Pro | Ser | Ser | Leu | Ala | Val | Ser | Ala | Gly | Glu | Lys |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Val | Thr | Met | Ser | Cys | Lys | Ser | Ser | Gin | Ser | Leu | Leu | Asn | Ser | Arg | Thr |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Arg | Lys | Asn | Tyr | Leu | Ala | Trp | Tyr | Gin | Gin | Arg | Pro | Gly | Gin | Ser | Pro |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Lys | Leu | Leu | Ile | Tyr | Trp | Ala | Ser | Thr | Arg | Thr | Ser | Gly | Val | Pro | Asp |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Arg | Phe | Thr | Gly | Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp | Phe | Thr | Leu | Thr | Ile | Ser |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ser | Val | Gin | Ala | Glu | Asp | Leu | Ala | Ile | Tyr | Tyr | Cys | Lys | Gin | Ser | Tyr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Thr | Leu | Arg | Thr | Phe | Gly | Gly | Gly | Thr | Lys | Leu | Glu | Ile | Lys | Arg | Glu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Gin | Lys | Leu | Ile | Ser | Glu | Glu | Asp | Leu | Asn | His | His | His | His | His | His |
275 | 280 | 285 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
110 ·· ·* • · · · · • · ♦ · • · ··· · • · · »· · · · • ♦ · ·· ·· · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · ··· ·« ·* (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:
GCCCAACCAG CCATGGCCGA GGTGCAGCTG CAGCAG 36 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM '40:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 54 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina ; (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:
CGACCCACCA CCGCCCGAGC CACCGCCACC CGAGCTCACG GCGACTGAGG TTCC 54 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(Aj DÉLKA: 54 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:
TCGGGCGGTG GTGGGTCGGG TGGCGGCGGA TCTCAGATTG TGCTCACCCA GTCT 54 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:
(i) . CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:
CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TCCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 843 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:
ATGÁAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCTGC CCAACCAGCC
111
4 • 4
444
4
44 44
4 444
4 4 4 4
444 444
4 4 «44 44 44
ATGGCCGAGG | TGCAGCTGCA | GCAGTCTGGG | GCAGAGCTTG | TGAGGTCAGG | GGCCTCAGTC | 120 |
AAGTTGTCCT | GCACAGCTTC | TGGCTTCAAC | ATTAAAGACA | ACTATATGCA | CTGGGTGAAG | 180 |
CAGAGGCCTG | AACAGGGCCT | GGAGTGGATT | GCATGGATTG | ATCCTGAGAA | TGGTGATACT ' | 240 |
GAATATGCCC | CGAAGTTCCG | GGGCAAGGCC | ACTTTGACTG | CAGACTCATC | CTCCAACACA | 300 |
GCCTACCTGC | ACCTCAGCAG | CCTGACATCT | GAGGACACTG | CCGTCTATTA | CTGTCATGTC | 360 |
CTGATCTATG | CTGGTTATTT | GGCTATGGAC | TACTGGGGTC | AAGGAACCTC | AGTCGCCGTG | 420 |
AGCTCGGGTG | GCGGTGGCTC | GGGCGGTGGT | GGGTCGGGTG | GCGGCGGATC | TCAGATTGTG | 480 |
ctcacccagt' | CTCCAGCAAT | CATGTCTGCA | TCTCCAGGGG | AGAAGGTCAC | CATAACCTGC | 540 |
AGTGCCAGCT | CAAGTGTAAC | TTACATGCAC | TGGTTCCAGC | AGAAGCCAGG | CACTTCTCCC | 600 |
AAACTCTGGA | TTTATAGCAC | ATCCAACCTG | GCTTCTGGAG | TCCCTGCTCG | CTTCAGTGGC | 660 |
AGTGGATCTG | GGACCTCTTA | CTCTCTCACA | ATCAGCCGAA | TGGAGGCTGA | AGATGCTGCG | 720 |
ACTTATTACT | GCCAGCAAAG | GAGTACTTAC | CCGCTCACGT | TCGGTGCTGG | GACCAAGCTG | 780 |
GAGATCAAAC | GGGAACAAAA | ACTCATCTCA | GAAGAAGATC | TGAATCACCA | CCATCACCAC | 840 |
CAT | 843 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 281 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina 1 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ' (ii) TYP MOLEKULY: protein (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:
Met | Lys | Tyr | Leu | Leu | Pro | Thr | Ala | Ala | Ala | Gly | Leu | Leu | Leu | Leu | Ala |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Ala | Gin | Pro | Ala | Met | Ala | Glu | Val | Gin | Leu | Gin | Gin | Ser | Gly | Ala | Glu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Val | Arg | Ser | Gly | Ala | Ser | Val | Lys | Leu | Ser | Cys | Thr | Ala | Ser | Gly |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Phe | Asn | Ile | Lys | Asp | Asn | Tyr | Met | His | Trp | Val | Lys | Gin | Arg | Pro | Glu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gin | Gly | Leu | Glu | Trp | Ile | Ala | Trp | Ile | Asp | Pro | Glu | Asn | Gly | Asp | Thr |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Glu | Tyr | Ala | Pro | Lys | Phe | Arg | Gly | Lys | Ala | Thr | Leu | Thr | Ala | Asp | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Ser | Asn | Thr | Ala | Tyr | Leu | His | Leu | Ser | Ser | Leu | Thr | Ser | Glu | Asp |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Thr | Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys | His | Val | Leu | Ile | Tyr | Ala | Gly | Tyr | Leu | Ala |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Met | Asp | Tyr | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Ser | Val | Ala | Val | Ser | Ser | Gly | Gly |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gin | Ile | Val |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Leu | Thr | Gin | Ser | Pro | Ala | Ile | Met | Ser | Ala | Ser | Pro | Gly | Glu | Lys | Val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Thr | Xle | Thr | Cys | Ser | Ala | Ser | Ser | Ser | Val | Thr | Tyr | Met | His | Trp | Phe |
112
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Gin | Gin | Lys | Pro | Gly | Thr | Ser | Pro | Lys | Leu | Trp | Ile | Tyr | Ser | Thr | Ser |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Asn | Leu | Ala | Ser | Gly | Val | Pro | Ala | Arg | Phe | Ser | Gly | Ser | Gly | Ser | Gly |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Thr | Ser | Tyr | Ser | Leu | Thr | Ile | Ser | Arg | Met | Glu | Ala | Glu | Asp | Ala | Ala |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Thr | Tyr | Tyr | Cys | Gin | Gin | Arg | Ser | Thr | Tyr | Pro | Leu | Thr | Phe | Gly | Ala |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Gly | Thr | Lys | Leu | Glu | Ile | Lys | Arg | Glu | Gin | Lys | Leu | Ile | Ser | Glu | Glu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Asp | Leu | Asn | His | His | His | His | His | His |
275
280 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLPA: 72 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:
TCGAGATCAA ACGGGAACAA AAACTCATCT CAGAAGAAGA TCTGAATCAC CACCATCACC 60
ACCATTAATG AG .72 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 72 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:
AATTCTCATT AATGGTGGTG ATGGTGGŤGA TTCAGATCTT CTTCTGAGAT GAGTTTTTGT TCCCGTTTGA TC '2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47 (ii (Xi
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 846 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47
113 » ·· · · · · · • · · · · · • · · · · · · · · • · · · · «' · · · · · · · · ·
ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCTGC CCAACCAGCC 60 ATGGCCCAGG TCCAACTGCA GCAGCCTGGG GCTGAACTGG TGAAGCCTGG GGCTTCAGTG 120 CAGCTGTCCT GCAAGGCTTC TGGCTACACC TTCACCGGCT ACTGGATACA CTGGGTGAAG 180 CAGAGGCCTG GACAAGGCCT TGAGTGGATT GGAGAGGTTA ATCCTAGTAC CGGTCGTTCT 240 GACTACAATG AGAAGTTCAA GAACAAGGCC ACACTGACTG TAGACAAATC CTCCACCACA 300 GCCTACATGC AACTCAGCAG CCTGACATCT GAGGACTCTG CGGTCTATTA CTGTGCAAGA 360 GAGAGGGCCT ATGGTTACGA CGATGCTATG GACTACTGGG GCCAAGGGAC CACGGTCACC 420 GTCTCCTCAG GTGGCGGTGG CTCGGGCGGT GGTGGGTCGG GTGGCGGCGG ATCTGACATT 480 GAGCTCTCAC AGTCTCCATC CTCCCTGGCT GTGTCAGCAG GAGAGAAGGT CACCATGAGC 540 TGCAAATCCA GTCAGAGTCT CCTCAACAGT AGAACCCGAA AGAACTACTT GGCTTGGTAC 600 CAGCAGAGAC CAGGGCAGTC TCCTAAACTG CTGATCTATT GGGCATCCAC TAGGACATCT 660 GGGGTCCCTG ATCGCTTCAC AGGCAGTGGA TCTGGGACAG ATTTCACTCT CACCATCAGC 720 AGTGTGCAGG CTGAAGACCT GGCAATTTAT TACTGCAAGC AATCTTATAC TCTTCGGACG 780 TTCGGTGGAG GCACCAAGCT CGAGATCAAA CGGGAACAAA AACTCATCTC AGAAGAAGAT 840 CTGAATCACC ACCATCACCA CCAT 864 (2)
INFORMACE PRO SEKVENCI
S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) .TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48: AAGCTTGGAA TTCAGTGTGA GGTGCAGCTG CAGC 34 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 45 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:
CGCCACCTCC GGAGCCACCA CCGCCCCGTT TGATCTCGAG CTTGG 45 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1998 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární , (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS-SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:
114 | • · · · » · · · • · «· · * • · · « « · · | • · • • • • · · | ||||
ATGAAGTTGT | GGCTGAACTG | GATTTTCCTT | GTAACACTTT | TAAATGGAAT | TCAGTGTGAG | 60 |
GTGCAGCTGC | AGCAGTCTGG | GGCAGAGCTT | GTGAGGTCAG | GGGCCTCAGT | CAAGTTGTCC | 120 |
TGCACAGCTT | CTGGCTTCAA | CATTAAAGAC | AACTATATGC | ACTGGGTGAA | GCAGAGGCCT | 180 |
GAACAGGGCC | TGGAGTGGAT | TGCATGGATT | GATCCTGAGA | ATGGTGATAC | TGAATATGCC | 240 |
CCGAAGTTCC | GGGGCAAGGC | CACTTTGACT | GCAGACTCAT | CCTCCAACAC | AGCCTACCTG | 300 |
CACCTCAGCA | GCCTGACATC | TGAGGACACT | GCCGTCTATT | ACTGTCATGT | CCTGATCTAT | 360 |
GCTGGTTATT | TGGCTATGGA | CTACTGGGGT | CAAGGAACCT | CAGTCGCCGT | GAGCTCGGGT | 420 |
GGCGGTGGCT | CGGGCGGTGG | TGGGTCGGGT | GGCGGCGGAT | CTCAGATTGT | GCTCACCCAG | 480 |
TCTCCAGCAA | TCATGTCTGC | ATCTCCAGGG | GAGAAGGTCA | CCATAACCTG | CAGTGCCAGC | 540 |
TCAAGTGTAA | CTTACATGCA | CTGGTTCCAG | CAGAAGCCAG | GCACTTCTCC | CAAACTCTGG | 600 |
ATTTATAGCA | CATCCAACCT | GGCTTCTGGA | GTCCCTGCTC | GCTTCAGTGG | CAGTGGATCT | 660 |
GGGACCTCTT | ACTCTCTCAC | AATCAGCCGA | ATGGAGGCTG | AAGATGCTGC | CACTTATTAC | 720 |
TGCCAGCAAA | GGAGTACTTA | CCCGCTCACG | TTCGGTGCTG | GGACCAAGCT | CGAGATCAAA | 780 |
CGGGGCGGTG | GTGGCTCCGG | AGGTGGCGGT | AGCGGTGGCG | GGGGTTCCCA | GAAGCGCGAC | 840 |
AACGTGCTGT | TCCAGGCAGC | TACCGACGAG | CAGCCGGCCG | TGATCAAGAC | GCTGGAGAAG | 900 |
CTGGTCAACA | TCGAGACCGG | CACCGGTGAC | GCCGAGGGCA | TCGCCGCTGC | GGGCAACTTC | 960 |
CTCGAGGCCG | AGCTCAAGAA | CCTCGGCTTC | ACGGTCACGC | GAAGCAAGTC | GGCCGGCCTG | .1020 |
GTGGTGGGCG | ACAACATCGT | GGGCAAGATC | AAGGGCCGCG | GCGGCAAGAA | CCTGCTGCTG | 1080 |
ATGTCGCACA | TGGACACCGT | CTACCTCAAG | GGCATTCTCG | CGAAGGCCCC | GTTCCGCGTC | 1140 |
GAAGGCGACA | AGGCCTACGG | CCCGGGCATC | GCCGACGACA | AGGGCGGCAA | CGCGGTCATC | 1200 |
CTGCACACGC | TCAAGCTGCT | GAAGGAATAC | GGCGTGCGCG | ACTACGGCAC | CATCACCGTG | 1260 |
CTGTTCAACA | CCGACGAGGA | AAAGGGTTCC | TTCGGCTCGC | GCGACCTGAT | CCAGGAAGAA | 1320 |
GCCAAGCTGG | CCGACTACGT | GCTCTCCTTC | GAGCCCACCA | GCGCAGGCGA | CGAAAAACTC | 1380 |
TCGCTGGGCA | CCTCGGGCAT | CGCCTACGTG | CAGGTCCAGA | TCACCGGCAA | GGCCTCGCAT | 1440 |
GCCGGCGCCG | CGCCCGAGCT | GGGCGTGAAC | GCGCTGGTCG | AGGCTTCCGA | CCTCGTGCTG | 1500 |
CGCACGATGA | ACATCGACGA | CAAGGCGAAG | AACCTGCGCT | TCCAGTGGAC | CATCGCCAAG | 1560 |
GCCGGCCAGG | TCTCGAACAT | CATCCCCGCC | AGCGCCACGC | TGAACGCCGA | CGTGCGCTAC | 1620 |
GCGCGCAACG | AGGACTTCGA | CGCCGCCATG | AAGACGCTGG | AAGAGCGCGC | GCAGCAGAAG | 1680 |
AAGCTGCCCG | AGGCCGACGT | GAAGGTGATC | GTCACGCGCG | GCCGCCCGGC | CTTCAATGCC | 1740 |
GGCGAAGGCG | GCAAGAAGCT | GGTCGACAAG | GCGGTGGCCT | ACTACAAGGA | AGCCGGCGGC | 1800 |
ACGCTGGGCG | TGGAAGAGCG | CACCGGCGGC | GGCACCGACG | CGGCCTACGC | CGCGCTCTCA | 1860 |
GGCAAGCCAG | TGATCGAGAG | CCTGGGCCTG | CCGGGCTTCG | GCTACCACAG | CGACAAGGCC | 1920 |
GAGTACGTGG GATCTGGGCG | ACATCAGCGC CCGGCAAG | GATTCCGCGC | CGCCTGTACA | TGGCTGCGCG | CCTGATCATG | 1980 1998 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
. (A) DÉLKA: 666 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly
5 10 15
Ile Gin Cys Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
115
9« · · · 9 9 · · 9 · · · • 9 9 · 9 ' · · · · · • · 99 9 9 9 9 9 9 · 9 « 9 9
9 9 9 9 · »
99 999 999 9« 99
25 30
Ser Gly | Ala 35 | Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala 40 | Ser | Gly 45 | Phe | Asn | Ile | ||||||||
Lys | Asp | Asn | Tyr | Met | His | Trp | Val | Lys | Gin | Arg | Pro | Glu | Gin | Gly | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Glu | Trp | Ile | Ala | Trp | Ile | Asp | Pro | Glu | Asn | Gly | Asp | Thr | Glu | Tyr | Ala |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Pro | Lys | Phe | Arg | Gly | Lys | Ala | Thr | Leu | Thr | Ala | Asp | Ser | Ser | Ser | Asn |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Ala | Tyr | Leu | His | Leu | Ser | Ser | Leu | Thr | Ser | Glu | Asp | Thr | Ala | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Tyr | Tyr | Cys | His | Val | Leu | Ile | Tyr | Ala | Gly | Tyr | Leu | Ala | Met | Asp | Tyr |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Ser | Val | Ala | Val | Ser | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gin | Ile | Val | Leu | Thr | Gin |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ser | Pro | Ala | Ile | Met | Ser | Ala | Ser | Pro | Gly | Glu | Lys | Val | Thr | Ile | Thr |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Cys | Ser | Ala | Ser | Ser | Ser | Val | Thr | Tyr | Met | H.is | Trp | Phe | Gin | Gin | Lys |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Pro | Gly | Thr | Ser | Pro | Lys | Leu | Trp | Ile | Tyr | Ser | Thr | Ser | .Asn | Leu | Ala |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ser | Gly | Val | Pro | Ala | Arg | Phe | Ser | Gly | Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Ser | Tyr |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ser | Leu | Thr | Ile | Ser | Arg | Met | Glu | Ala | Glu | Ásp | Ala | Ala | Thr | Tyr | Tyr |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Cys | Gin | Gin | Arg | Ser | Thr | Tyr | Pro | Leu | Thr | Phe | Gly | Ala | Gly | Thr | Lys |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Leu | Glu | Ile | Lys | Arg | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Ser | Gin | Lys | Arg | Asp. | Asn | Val | Leu | Phe | Gin | Ala | Ala | Thr |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Asp | Glu | Gin | Pro | Ala | Val | Ile | Lys | Thr | Leu | Glu | Lys | Leu | Val | Asn | Ile |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Glu | Thr | Gly | Thr | Gly | Asp | Ala | Glu | Gly | Ile | Ala | Ala | Ala | Gly | Asn | Phe |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Leu | Glu | Ala | Glu | Leu | Lys | Asn | Leu | Gly | Phe | Thr | Val | Thr | Arg | Ser | Lys |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ser | Ala | Gly | Leu | Val | Val | Gly | Asp | Asn | Ile | Val | Gly | Lys | Ile | Lys | Gly |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Arg | Gly | Gly | Lys | Asn | Leu | Leu | Leu | Met | Ser | His | Met | Asp | Thr | Val | Tyr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Leu | Lys | Gly | Ile | Leu | Ala | Lys | Ala | Pro | Phe | Arg | Val | Glu | Gly | Asp | Lys |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ala | Tyr | Gly | Pro | Gly | Ile | Ala | Asp | Asp | Lys | Gly | Gly | Asn | Ala | Val | Ile |
385 | 390 | 395 | 400 |
• · · «
116
Leu His Thr Leu Lys | Leu | Leu Lys Glu Tyr Gly Val Arg Asp Tyr Gly | |||||||||||||
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Thr | Ile | Thr | Val | Leu | Phe | Asn | Thr | Asp | Glu | Glu | Lys | Gly | Ser | Phe | Gly |
420 | 425 | 4 30 | |||||||||||||
Ser | Arg | Asp | Leu | Ile | Gin | Glu | Glu | Ala | Lys | Leu | Ala | Asp | Tyr | Val | Leu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Ser | Phe | Glu | Pro | Thr | Ser | Ala | Gly | Ásp | Glu | Lys | Leu | Ser | Leu | Gly | Thr |
450 | 455 | 4 60 | |||||||||||||
Ser | Gly | Ile | Ala | Tyr | Val | Gin | Val | Gin | Ile | Thr | Gly | Lys | Ala | Ser | His |
4 65 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Ala | Gly | Ala | Ala | Pro | Glu | Leu | Gly | Val | Asn | Ala | Leu | Val | Glu | Ala | Ser |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Asp | Leu | Val | Leu | Arg | Thr | Met | Asn | Ile | Asp | Asp | Lys | Ala | Lys | Asn | Leu |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Arg | Phe | Gin | Trp | Thr | Ile | Ala | Lys | Ala | Gly | Gin | Val | Ser | Asn | Ile | Ile |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Pro | Ala | Ser | Ala | Thr | Leu | Asn | Ala | Asp | Val | Arg | Tyr | Ala | Arg | Asn | Glu |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Asp | Phe | Asp | Ala | Ala | Met | Lys | Thr | Leu | Glu | Glu | Arg | Ala | Gin | Gin | Lys |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Lys | Leu | Pro | Glu | Ala | Asp | Val | Lys | Val | Ile | Val | Thr | Arg | Gly | Arg | Pro |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ala | Phe | Asn | Ala | Gly | Glu | Gly | Gly | Lys | Lys | Leu | Val | Asp | Lys | Ala | Val |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Ala | Tyr | Tyr | Lys | Glu | Ala | Gly | Gly | Thr | Leu | Gly | Val | Glu | Glu | Arg | Thr |
5S5 | 600 | 605 | |||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Thr | Asp | Ala | Ala | Tyr | Ala | Ala | Leu | Ser | Gly | Lys | Pro | Val |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ile | Glu | Ser | Leu | Gly | Leu | Pro | Gly | Phe | Gly | Tyr | His | Ser | Asp | Lys | Ala |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Glu | Tyr | Val | Asp | Ile | Ser | Ala | Ile | Pro | Arg | Arg | Leu | Tyr | Met | Ala | Ala |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Arg | Leu | Ile | Met | Asp | Leu | Gly | Ala | Gly | Lys |
660 665 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3217 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:
GAATTCGCCG CCACTATGGA TTTTCAAGTG TCAGTCATAA TGTCCAGAGG ACAAACTGTT TCTCCAGGGG AGAAGGTCAC AATGACTTGC
CAGATTTTCA GCTTCCTGCT AATCAGTGCT CTCTCCCAGT CTCCAGCAAT CCTGTCTGCA AGGGCCAGCT CAAGTGTAAC TTACATTCAC
120
180
0 0 0 0 • 0
117 »00 0 0 0
TGGTACCAGC | AGAAGCCAGG | TTCCTCCCCC | AAATCCTGGA | TTTATGCCAC | ATCCAACCTG | 240 |
GCTTCTGGAG | TCCCTGCTCG | CTTCAGTGGC | AGTGGGTCTG | GGACCTCTTA | CTCTCTCACA | 300 |
ATCAGCAGAG | TGGAGGCTGA | AGATGCTGCC | ACTTATTACT | GCCAACATTG | GAGTAGTAAA | 360 |
CCACCGACGT | TCGGTGGAGG | CACCAAGCTC | GAGATCAAAC | GGACTGTGGC | TGCACCATCT | 420 |
GTCTTCATCT | TCCCGCCATC | TGATGAGCAG | TTGAAATCTG | GAACTGCCTC | TGTTGTGTGC | 480 |
CTGCTGAATA | ACTTCTATCC | CAGAGAGGCC | AAAGTACAGT | GGAAGGTGGA | TAACGCCCTC | 540 |
CAATCGGGTA | ACTCCCAGGA | GAGTGTCACA | GAGCAGGACA | GCAAGGACAG | CACCTACAGC | 600 |
CTCAGCAGCA | CCCTGACGCT | GAGCAAAGCA | GACTACGAGA | AACACAAAGT | CTACGCCTGC | 660 |
GAAGTCACCC | ATCAGGGCCT | GAGTTCGCCC | GTCAGAAAGA | GCTTCAACAG | GGGAGAGTGT | 720 |
TAATAGGAGC | TCGGATCCAG | ATCTGAGCTC | CTGTAGACGT | CGACATTAAT | TCCGGTTATT | 780 |
TTCCACCATA | TTGCCGTCTT | TTGGCAATGT | GAGGGCCCGG | AAACCTGGCC | CTGTCTTCTT | 840 |
GACGAGCATT | CCTAGGGGTC | TTTCCCCTCT | CGCCAAAGGA | ATGCAAGGTC | TGTTGAATGT | 900 |
CGTGAAGGAA | GCAGTTCCTC | TGGAAGCTTC | TTGAAGACAA | ACAACGTCTG | TAGCGACCCT | 960 |
TTGCAGGCAG. | CGGAACCCCC | CACCTGGCGA | CAGGTGCCTC | TGCGGCCAAA | AGCCACGTGT | 1020 |
ATAAGATACA | CCTGCAAAGG | CGGCACAACC | CCAGTGCCAC | GTTGTGAGTT | GGATAGTTGT | 10.80 |
GGAAAGAGTC | AAATGGCTCT | CCTCAAGCGT | ATTCAACAAG | GGGCTGAAGG | ATGCCCAGÁA | 1140 |
GGTACCCCAT | TGTATGGGAT | CTGATCTGGG | GCCTCGGTGC | ACATGCTTTA | CATGTGTTTA | 1200 |
GTCGAGGTTA | AAAAACGTCT. | AGGCCCCCCG | AACCACGGGG | ACGTGGTTTJ | CCTTTGAAAA | 1260 |
acacgatgat | AATACCATGG | AGTTGTGGCT | GAACTGGATT | TTCCTTGTAA | CACTTTTAAA | 1320 |
TGGTATCCAG | TGTGAGGTGA | AGCTGGTGGA | GTCTGGAGGA | GGCTTGGTAC | AGCCTGGGGG ' | 1380 |
TTCTCTGAGA | CTCTCCTGTG | CAACTTCTGG | GTTCACCTTC | ACTGATTACT | ACATGAACTG | 1.4 40 |
GGTCCGCCAG | CCTCCAGGAA | AGGCACTTGA | GTGGTTGGGT | TTTATTGGAA | ACAAAGCTAA | 1500 |
TGGTTACACA | ACAGAGTACA | GTGCATCTGT | GAAGGGTCGG | TTCACCATCT | CCAGAGATAA | 1560 |
ATCCCAAAGC | ATCCTCTATC | TTCAAATGAA | CACCCTGAGA | GCTGAGGACA | GTGCCACTTA | 1620 |
TTACTGTACA | AGAGATAGGG | GGCTACGGTT | CTACTTTGAC | TACTGGGGCC | AAGGCACCAC | 1680 |
TCTCACAGTG | AGCTCGGCTA | GCACCAAGGG | ACCATCGGTC | TTCCCCCTGG | CCCCCTGCTC | 1740 |
CAGGAGCACC | TCCGAGAGCA | CAGCCGCCCT | GGGCTGCCTG | GTCAAGGACT | ACTTCCCCGA | 1800 |
ACCGGTGACG | GTGTCGTGGA | ACTCAGGCGC | TCTGACCAGC | GGCGTGCACA | CCTTCCCGGC | 1860 |
TGTCCTACAG | TCCTCAGGAC | TCTACTCCCT | CAGCAGCGTC | GTGACGGTGC | CCTCCAGCAA | 1920 |
CTTCGGCACC | CAGACCTACA | CCTGCAACGT | AGATCACAAG | CCCAGCAACA | CCAAGGTGGA | 1980 |
CAAGACAGTT | GGCGGTGGTG | GCTCTGGTGG | TGGCGGTAGC | GGTGGCGGGG | GTTCCCAGAA | 2040 |
GCGCGACAAC | GTGCTGTTCC | AGGCAGCTAC | CGACGAGCAG | CCGGCCGTGA | TCAAGACGCT | 2100 |
GGAGAAGCTG | GTCAACATCG | AGACCGGCAC | cggtGacgcc | GAGGGCATCG | CCGCTGCGGG | 2160 |
CAACTTCCTC | GAGGCCGAGC | TCAAGAACCT | CGGCTTCACG | GTCACGCGAA | GCAAGTCGGC | 2220 |
CGGCCTGGTG | GTGGGCGACA | ACATCGTGGG | CAAGATCAAG | GGCCGCGGCG | GCAAGAACCT | 2280 |
GCTGCTGATG | TCGCACATGG | ACACCGTCTA | CCTCAAGGGC | ATTCTCGCGA | AGGCCCCGTT | 2340 |
CCGCGTCGAA | GGCGACAAGG | CCTACGGCCC | GGGCATCGCC | GACGACAAGG | gcgGcaacgc | 2400 |
GGTCATCCTG | CACACGCTCA | AGCTGCTGAA | GGAATACGGC | GTGCGCGACT | ACGGCACCAT | 2460 |
CACCGTGCTG | TTCAACACCG | ACGAGGAAAA | GGGTTCCTTC | GGCTCGCGCG | ACCTGATCCA | 2520 |
GGAAGAAGCC | AAGCTGGCCG | ACTACGTGCT | CTCCTTCGAG | CCCACCAGCG | CAGGCGACGA | 2580 |
AAAACTCTCG | CTGGGCACCT | CGGGCATCGC | CTACGTGCAG | GTCCAGATCA | CCGGCAAGGC | 2640 |
CTCGCATGCC | GGCGCCGCGC | CCGAGCTGGG | CGTGAACGCG | CTGGTCGAGG | CTTCCGACCT | 2700 |
• CGTGCTGCGC | ACGATGAACA | TCGACGACAA | GGCGAAGAAC | CTGCGCTTCC | AGTGGACCAT | 2760 |
CGCCAAGGCC | GGCCAGGTCT | CGAACATCAT | CCCCGCCAGC | GCCACGCTGA | ACGCCGACGT | 2820 |
GCGCTACGCG | CGCAACGAGG | ACTTCGACGC | CGCCATGAAG | ACGCTGGAAG | AGCGCGCGCA | 2880 |
GCAGAAGAAG | CTGCCCGAGG | CCGACGTGAA | GGTGATCGTC | ACGCGCGGCC | GCCCGGCCTT | 2940 |
- CAATGCCGGC | GAAGGCGGCA | AGAAGCTGGT | CGACAAGGCG | GTGGCCTACT | ACAAGGAAGC | 3000 |
• ♦ » · · · · · * · • · ··· « · » · ··· ··· • · · · 9 ' · 9 '9
99 999 999 99 99
118
CGGCGGCACG CTGGGCGTGG AAGAGCGCAC CGGCGGCGGC ACCGACGCGG CCTACGCCGC 3060
GCTCTCAGGC AAGCCAGTGA TCGAGAGCCT GGGCCTGCCG GGCTTCGGCT ACCACAGCGA 3120 . CAAGGCCGAG TACGTGGACA TCAGCGCGAT TCCGCGCCGC CTGTACATGG CTGCGCGCCT 3180
GATCATGGAT CTGGGCGCCG GCAAGTGATA ATCTAGA 3217 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:
TGGATCTGAA GCTTAAACTA ACTCCATGGT GACCC 35 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM-54:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 61 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (Dj TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:
GCCACGGATC CCGCCACCTC CGGAGCCACC ACCGCCACAA TCCCTGGGCA CAATTTTCTT 60
G 61 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 94 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:
GCCCAGGAAG CTTGGCGGTG GTGGCTCCGG AGGTGGCGGT AGCGGTGGCG GGGGTTCCCA 60
GAAGCGCGAC AACGTGCTGT TCCAGGCAGC TACC 94 (2.) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 51 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
119 • ·' • * · β « · » • · · ·♦· ··♦ • · ·* ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S’ IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:
.ATGTGCGAAT TCAGCAGCAG GTTCTTGCCG CCGCGGCCCT TGATCTTGCC C 51 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) 'DÉLKA: 732 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (ix) ZNAKY:
(A) . JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 16...720 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:
GAATTCGCCG CCACC ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA 51
Met Asp Phe Gin Val Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu
5 .10
ATC | AGT | GCT | TCA | GTC | ATA ATG | TCC | AGA | GGA | CAA | ACT | GTT | CTC | TCC | CAG | 99 |
Ile | Ser | Ala | Ser | Val | Ile Met | Ser | Arg | Gly | Gin | Thr | Val | Leu | Ser | Gin | |
15 | 20 | 25 | |||||||||||||
TCT | CCA | GCA | ATC | CTG | TCT GCA | TCT | CCA | GGG | GAG | AAG | GTC | ACA | ATG | ACT | 147 |
Ser | Pro | Ala | Ile | Leu | Ser Ala | Ser | Pro | Gly | Glu | Lys | Val | Thr | Met. | Thr | |
30 | 35 | 40 | |||||||||||||
TGC | AGG | GCC | AGC | TCA | AGT GTA | ACT | TAC | ATT | CAC | TGG | TAC | CAG | CAG | AAG | 195 |
Cys | Arg | Ala | Ser | Ser | Ser Val | Thr | Tyr | Ile | His | Trp | Tyr | Gin | Gin | Lys | |
45 | 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
CCA | GGT | TCC | TCC | ccd | AAA TCC | TGG | ATT | TAT | GCC | ACA | TCC | AAC | CTG | GCT | 243 |
Pro | Gly | Ser | Ser | Pro | Lys Ser | Trp | Ile | Tyr | Ala | Thr | Ser | Asn | Leu | Ala | |
65 | 70 | 75 | |||||||||||||
TCT | GGA | GTC | CCT | GCT | CGC TTC | AGT | GGC | AGT | GGG | TCT | GGG | ACC | TCT | TAC | 291 |
Ser | Gly | Val | Pro | Ala | Arg Phe | Ser | Gly | Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Ser | Tyr | |
80 | 85 | 90 | |||||||||||||
TCT | CTC | ACA | ATC | AGC | AGA GTG | GAG | GCT | GAA | GAT | GCT | GCC | ACT | TAT | TAC | 339 |
Ser | Leu | Thr | Ile | Ser | Arg Val | Glu | Ala | Glu | Asp | Ala | Ala | Thr | Tyr | Tyr | |
95 | 100 | 105 | |||||||||||||
TGC | CAA | CAT | TGG | AGT | AGT AAA | CCA | CCG | ACG | TTC | GGT | GGA | GGC | ACC | AAG | 387 |
Cys | Gin | His | Trp | Ser | Ser Lys | Pro | Pro | Thr | Phe | Gly | Gly | Gly | Thr | Lys | |
110 | 115 | 1 | 120 | ||||||||||||
CTG | GAA | ATC | AAA | CGG | GCT GAT | GCT | GCA | CCA | ACT | GTA | TCC | ATC | TTC | CCA | 435 |
Leu | Glu | Ile | Lys | Arg | Ala Asp | Ala | Ala | Pro | Thr | Val | Ser | Ile | Phe | Pro | |
125 | 130 | 135 | 140 | ||||||||||||
CCA | TCC | AGT | GAG | CAG | TTA ACA | TCT | GGA | GGT | GCC | TCA | GTC | GTG | TGC | TTC | 483 |
Pro | Ser | Ser | Glu | Gin | Leu Thr | Ser | Gly | Gly | Ala | Ser | Val | Val | Cys | Phe | |
145 | 150 | 155 | |||||||||||||
TTG | AAC | AAC | TTC | TAC | CCC AAA | GAC | ATC | AAT | GTC | AAG | TGG | AAG | ATT | GAT | 531 |
120
• 0 • 00
0 • 0 00 0 0 •0 00 0·00
0 0 0 0 0 0 0 0 000 000 0 0 0 0
000 000 0· 00
i.
h
Leu Asn Asn Phe | Tyr | Pro | Lys Asp Ile Asn Val 165 | Lys Trp | Lys 170 | Ile | Asp | |||||||||
160 | ||||||||||||||||
GGC | AGT | GAA | CGA | CAA | AAT | GGC | GTC | CTG | AAC | AGT | TGG | ACT | GAT | CAG | GAC | 579 |
Gly | Ser | Glu | Arg | Gin | Asn | Gly | Val | Leu | Asn | Ser | Trp | Thr | Asp | Gin | Asp | |
175 | 180 | 185 | ||||||||||||||
AGC | AAA | GAC | AGC | ACC | TAC | AGC | ATG | AGC | AGC | ACC | CTC | ACG | TTG | ACC | AAG | 627 |
Ser | Lys | Asp | Ser | Thr | Tyr | Ser | Met | Ser | Ser | Thr | Leu | Thr | Leu | Thr | Lys | |
190 | 195 | 200 | ||||||||||||||
GAC | GAG | TAT | GAA | CGA | CAT | AAC | AGC | TAT | ACC | TGT | GAG | GCC | ACT | CAC | AAG | 675 |
Asp | Glu | Tyr | Glu | Arg | His | Asn | Ser | Tyr | Thr | Cys | Glu | Ala | Thr | His | Lys | |
205 | 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
ACA | TCA | ACT | TCA | CCC | ATT | GTC | AAG | AGC | TTC | AAC | AGG | AAT | GAG | TGT | 720 | |
Thr | Ser | Thr | Set | Pro | Ile | Val | Lys | Ser | Phe | Asn | Arg | Asn | Glu | Cys |
225 . 230 235
2) | INFORMACE | PR( | 0 SEKVENCI S | IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58: |
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 235. aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM | ||||
Met | Asp Phe Gin | Val | Gin Ile Phe Ser | Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser |
1 Val | Ile Met Ser | 5 Arg | Gly Gin Thr Val | 10 15 Leu Ser Gin Ser Pro Ala Ile |
Leu | 20 Ser Ala Ser | Pro | 25 Gly Glu Lys Val | 30 Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser |
Ser | 35 Ser Val Thr | Tyr | 40 Ile His Trp Tyr | .45 ' Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser |
Pro | 50 Lys Ser Trp | Ile | 55 Tyr Ala Thr Ser | 60 Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro |
65 Ala | Arg Phe Ser | Gly | 70 Ser Gly Ser Gly | 75 .80 Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile |
Ser | Arg Val Glu | 85 Ala | Glu Asp Ala Ala | 90 95 Thr Tyr Tyr Cys Gin His Trp |
Ser | 100 Ser Lys Pro | Pro | 105 Thr Phe Gly Gly | 110 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys |
Arg | 115 Ala Asp Ala | Ala | 120 Pro Thr Val Ser | 125 Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu |
Gin | 130 Leu Thr Ser | Gly | 135 Gly Ala Ser Val | 140 Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe |
145 Tyr | Pro Lys Asp | Ile | 150 Asn Val Lys Trp | 155 160 Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg |
Gin | Asn Gly Val | 165 Leu | Asn Ser Trp Thr | 170 175 Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser |
·· ·· · · ·· • · · · « · · · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 999 9 9 9 ' 9 99 9
9 9 9 9 .9 9
99 999 999 99 99
121
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Thr | Tyr | Ser | Met | Ser | Ser | Thr | Leu | Thr | Leu | Thr | Lys | Asp | Glu | Tyr | Glu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Arg | His | Asn | Ser | Tyr | Thr | Cys | Glu | Ala | Thr | His | Lys | Thr | Ser | Thr | Ser |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Pro | Ile | Val | Lys | Ser | Phe | Asn | Arg | Asn | Glu | Cys | |||||
225 | 230 | 235 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: .
(A) DÉLKA: 1974 párů baží (B) TYP: nukléová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) 'TYP MOLEKULY: jiná nukléová kyselina (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 16...1956 (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:
AAGCTTGCCG CCACC ATG AAG TTG TGG CTG AAC TGG ATT TTC CTT GTA ACA 51
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr
10
CTT | TTA | AAT | GGT, | ATC | CAG | TGT | GAG | GTG | AAG | CTG | GTG | GAG | TCT | GGA. | GGA | 99 |
Leu | Leu | Asn | Gly | Ile | Gin | Cys | Glu | Val | Lys | Leu | Val | Glu | Ser | Gly | Gly | |
15 | 20 | 25 | ||||||||||||||
GGC | TTG | GTA | CAG | CCT | GGG | GGT | TCT | CTG | AGA | CTC | TCC | TGT | GCA | ACT | TCT | 147 |
Gly | Leu | Val | Gin | Pro | Gly | Gly | Ser | Leu | Arg | Leu | Ser | Cys | Ala | Thr | Ser | |
30 | 35 | 40 | ||||||||||||||
GGG | TTC | ACC | TTC | ACT | GAT | TAC | TAC | ATG | AAC | TGG | GTC | CGC | CAG | CCT | CCA | 195 |
Gly | Phe | Thr | Phe | Thr | Asp | Tyr | Tyr | Met | Asn | Trp | Val | Arg | Gin | Pro | Pro | |
45 | 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
GGA | AAG | GCA | CTT | GAG | TGG | TTG | GGT | TTT | ATT | GGA | AAC | AAA | GCT | AAT | GGT | 243 |
Gly | Lys | Ala | Leu | Glu' | Trp | Leu | Gly | Phe | Ile | Gly | Asn | Lys | Ala | Asn | Gly | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
TAC | ACA | ACA | GAG | TAC | AGT | GCA | TCT | GTG | AAG | GGT | CGG | TTC | ACC | ATC | TCC | 291 |
Tyr | Thr | Thr | Glu | Tyr | Ser | Alá | Ser | Val | Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile | Ser | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
AGA | GAT | AAA | TCC | CAA | AGC | ATC | CTC | TAT | CTT | CAA | ATG | AAC | ACC | CTG | AGA | 339 |
Arg | Asp | Lys | Ser | Gin | Ser | Ile | Leu | Tyr | Leu | Gin | Met | Asn | Thr | Leu | Arg | |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||||
GCT | GAG | GAC | AGT | GCC | ACT | TAT | TAC | TGT | ACA | AGA | GAT | AGG | GGG | CTA | CGG | 387 |
Ala | Glu | Asp | Ser | Ala | Thr | Tyr | Tyr | Cys | Thr | Arg | Asp | Arg | Gly | Leu | Arg | |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||||
TTC | TAC | TTT | GAC | TAC | TGG | GGC | CAA | GGC | ACC | ACT | CTC | ACA | GTC | TCC | TCA | 435 |
Phe | Tyr | Phe | Asp | Tyr | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Thr | Leu | Thr | Val | Ser | Ser | |
125 | 130 | 135 | 140 |
122 • * · « • · · · • · « · ♦ · · · · ♦ · · ·· . ·· • · *· ·· • * · · · « · « • · · · · « 9 * · «····« • · · · ··· ··· ·* ··
GCC AAA ACG | ACA | CCC CCA TCT GTC | TAT | CCA | CTG | GCC | CCT | GGA | TCT | GCT | 483 | |||||
Ala | Lys | Thr | Thr | Pro | Pro | Ser | Val | Tyr | Pro | Leu | Ala | Pro | Gly | Ser | Ala | |
145 | 150 | •155 | ||||||||||||||
GCC | CAA | ACT | AAC | TCC | ATG | GTG | ACC | CTG | GGA | TGC | CTG | GTC | AAG | GGC | TAT | 531 |
Ala | Gin | Thr | Asn | Ser | Met | Val | Thr | Leu | Gly | Cys | Leu | Val | Lys | Gly | Tyr | |
160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
TTC | CCT | GAG | CCA | GTG | ACA | GTG | ACC | TGG | AAC | TCT | GGA | TCT | CTG | TCC | AGC | 579 |
Phe | Pro | Glu | Pro | Val | Thr | Val | Thr | Trp | Asn | Ser | Gly | Ser | Leu | Ser | Ser | |
175 | 180 | 185 | ||||||||||||||
GGT | GTG | CAC | ACC | TTC | CCA | GCT | GTC | CTG | CAG | TCT | GAC | CTC | TAC | ACT | CTG | 627 |
Gly | Val | His | Thr | Phe | Pro | Ala | Val | Leu | Gin | Ser | Asp | Leu | Tyr | Thr | Leu | |
190 | 195 | 200 | ||||||||||||||
AGC | AGC | TCA | GTG | ACT | GTC | CCC | TCC | AGC | ACC | TGG | CCC | AGC | GAG | ACC | GTC | ' 675 |
Ser | Ser | Ser | Val | Thr | Val | Pro | Ser | Ser | Thr | Trp | Pro | Ser | Glu | Thr | Val | |
205 | 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
ACC | TGC | AAC | GTT | GCC | CAC | CCG | GCC | AGC | AGC | ACC | AAG | GTG | GAC | AAG | AAA · | 723 |
Thr | Cys | Asn | Val | Ala | HiS | Pro | Ala | Ser | Ser | Thr | Lys | Val | Asp | Lys | Lys | |
225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
ATT | GTG | CCC | AGG | GAT | TGT | GGC | GGT | GGT | GGC | TCC | GGA | GGT | GGC | GGT | AGC | 771 |
Ile | Val | Pro | Arg | Asp | Cys | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | |
240 | 245 | 250 | ||||||||||||||
GGT | GGC | GGG | GGT | TCC | CAG | AAG | CGC | GAC | AAC | GTG | CTG | TTC | CAG | GCA | GCT | 819 |
Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gin | Lys | Arg | Asp | Asn | Val | Leu | Phe | Gin | Ala | Ala | |
255 | 260 | 265 | ||||||||||||||
ACC | GAC | GAG | CAG | CCG | GCC | GTG | ATC | AAG | ACG | CTG | GAG | AAG | CTG | GTC | AAC | 8 67 |
Thr | Asp | Glu | Gin | Pro | Ala | Val | Ile | Lys | Thr | Leu | Glu | Lys | Leu | Val | Asn | |
270 | 27S | 280 | ||||||||||||||
ATC | GAG | ACC | GGC | ACC | GGT | GAC | GCC | GAG | GGC | ATC | GCC | GCT | GCG | GGC | AAC | 915 |
Ile | Glu | Thr | Gly | Thr | Gly | Asp | Ala | Glu | Gly | Ile | Ala | Ala | Ala | Gly | Asn | |
285 | 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
TTC | CTC | GAG | GCC | GAG | CTC | AAG | AAC | CTC | GGC | TTC | ACG | GTC | ACG | CGA | AGC | 963 |
Phe | Leu | Glu | Ala | Glu | Leu | Lys | Asn | Leu | Gly | Phe | Thr | Val | Thr | Arg | Ser | |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
AAG | TCG | GCC | GGC | CTG | GTG | GTG | GGC | GAC | AAC | ATC | GTG | GGC | AAG | ATC | AAG | 1011 |
Lys | Ser | Ala | Gly | Leu | Val | Val | Gly | Asp | Asn | Ile | Val | Gly | Lys | Ile | Lys | |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||||
GGC | CGC | GGC | GGC | AAG | AAC | CTG | CTG | CTG | ATG | TCG | CAC | ATG | GAC | ACC | GTC | 1059 |
Gly | Arg | Gly | Gly | Lys | Asn | Leu | Leu | Leu | Met | Ser | His | Met | Asp | Thr | Val | |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
TAC | CTC | AAG | GGC | ATT | CTC | GCG | AAG | GCC | CCG | TTC | CGC | GTC | GAA | GGC | GAC | 1107 |
Tyr | Leu | Lys | Gly | Ile | Leu | Ala | Lys | Ala | Pro | Phe | Arg | Val | Glu | Gly | Asp | |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||||
AAG | GCC | TAC | GGC | CCG | GGC | ATC | GCC | GAC | GAC | AAG | GGC | GGC | AAC | GCG | GTC | 1155 |
Lys | Ala | Tyr | Gly | Pro | Gly | Ile | Ala | Asp | Asp | Lys | Gly | Gly | Asn | Ala | Val | |
365 | 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
ATC | CTG | CAC | ACG | CTC | AAG | CTG | CTG | AAG | GAA | TAC | GGC | GTG | CGC | GAC | TAC | 1203 |
Ile | Leu | His | Thr | Leu | Lys | Leu | Leu | Lys | Glu | Tyr | Gly | Val | Arg | Asp ' | 'Tyr |
·' 9
1251 • 9 9 9 ' 9 9 9
9 9 9 • 9 «99
9 9
99
123
, | 385 | 390 | 395 |
GGC ACC ATC | ACC GTG CTG TTC AAC | ACC GAC GAG GAA AAG GGT | TCC TTC |
Gly Thr Ile | Thr Val Leu Phe Asn | Thr Asp Glu Glu Lys Gly | Ser Phe |
400 | 405 410 | ||
GGC TCG CGC | GAC CTG ATC CAG GAA | GAA GCC AAG CTG GCC GAC | TAC GTG |
Gly Ser Arg | Asp Leu Ile Gin Glu | Glu Ala Lys Leu Ala Asp | Tyr Val |
415 | 420 | 425 | |
CTC TCC TTC | GAG CCC ACC AGC GCA | GGC GAC GAA AAA CTC TCG | CTG GGC |
Leu Ser Phe | Glu Pro Thr Ser Ala | Gly Asp Glu Lys Leu Ser | Leu Gly |
430 | 435 | 440 | |
ACC TCG GGC | ATC GCC TAC GTG CAG | GTC AAC ATC ACC GGC AAG | GCC TCG |
Thr Ser Gly | Ile Ala Tyr Val Gin | Val Asn Ile Thr Gly Lys | Ala Ser |
445 | 450 | 4 55 | 4.60 |
CAT GCC GGC | GCC GCG CCC GAG CTG | GGC GTG AAC GCG CTG GTC | GAG GCT |
His Ala Gly | Ala Ala Pro Glu Leu | Gly Val Asn Ala Leu Val | Glu Ala |
465 | 470 | 475 | |
TCC GAC CTC | GTG CTG CGC ACG ATG | AAC ATC GAC GAC AAG GCG | AAG AAC |
Ser Asp Leu | Val L®u Arg Thr Met | Asn Ile Asp Asp Lys Ala | Lys Asn |
480 | 485 490 | ||
CTG CGC TTC | AAC TGG ACC ATC GCC | AAG GCC GGC AAC GTC TCG | AAC ATC |
Leu Arg Phe | Asn Trp Thr Ile Ala | Lys Ala Gly Asn Val Ser | Asn Ile |
495 | 500 | 505 | |
ATC CCC GCC | AGC GCC ACG CTG AAC | GCC GAC GTG CGC TAC GCG | CGC AAC |
Ile Pro Ala | Ser Ala Thr Leu Asn | Ala Asp Val Arg Tyr Ala | Arg Asn |
510 | 515 | 520 | |
GAG GAC TTC | GAC GCC GCC ATG AAG | ACG CTG GAA GAG CGC GCG | CAG CAG |
Glu Asp Phe | Asp Ala Ala Met Lys | Thr Leu Glu Glu Arg Ala | Gin Gin |
525 | ,530 | 535 , | 540 |
AAG AAG CTG | CCC GAG GCC GAC GTG | AAG GTG ATC GTC ACG CGC | GGC CGC |
Lys Lys Leu | Pro Glu Ala Asp Val | Lys Val Ile Val Thr Arg | Gly Arg |
545 | 550 | 555 | |
CCG GCC TTC | AAT GCC GGC GAA GGC | GGC AAG AAG CTG GTC GAC | AAG GCG |
Pro Ala Phe | Asn Ala Gly Glu Gly | Gly Lys Lys Leu Val Asp | Lys Ala |
560 | 565 570 | ||
GTG GCC TAC | TAC AAG GAA GCC GGC | GGC ACG CTG GGC GTG GAA | GAG CGC |
Val Ala Tyr | Tyr Lys Glu Ala Gly | Gly Thr Leu Gly Val Glu | Glu Arg |
575 | 580 | 585 | |
ACC GGC GGC | GGC ACC GAC GCG GCC | TAC GCC GCG CTC TCA GGC | AAG CCA |
Thr Gly Gly | Gly Thr Asp Ala Ala | Tyr Ala Ala Leu Ser Gly | Lys Pro |
590 | 595 | 600 | |
GTG ATC GAG | AGC CTG GGC CTG CCG | GGC TTC GGC TAC CAC AGC | GAC AAG |
Val Ile Glu | Ser Leu Gly Leu Pro | Gly Phe Gly Tyr His Ser | Asp Lys |
605 | 610 | 615 | 620 |
GCC GAG TAC | GTG GAC ATC AGC GCG | ATT CCG CGC CGC CTG TAC | ATG GCT |
Ala Glu Tyr | Val Asp Ile Ser Ala | Ile Pro Arg Arg Leu Tyr | Met Ala |
625 | 630 | 635 | |
GCG CGC CTG | ATC ATG GAT CTG GGC | GCC GGC AAG TGATAAGAAT TCCTCGAG |
1299
1347
1395
1443
1491
1539
1587
1635 .
1683
1731
177 9
1827
1875
1923
1974
124
444 4
4 »44 4 » 4 4 4
444 444
4
44 ,
Ala Arg Leu Ile Met Asp Leu Gly Ala Gly Lys (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 647 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) ·TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60
Met | Lys | Leu | Trp | Leu | Asn | Trp | Ile | Phe | Leu | Val | Thr | Leu | Leu | Asn | Gly |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Ile | Gin | Cys | Glu | Val | Lys | Leu | Val | Glu | Ser | Gly | Gly | Gly | Leu | Val | Gin |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Gly | Gly | Ser | Leu | Arg | Leu | Ser | Cys | Ala | Thr | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe |
35 | 40 | 4 5 | |||||||||||||
Thr | Asp | Tyr | Tyr | Met | Asn | Trp | Val | Arg | Gin | Pro | Pro | Gly | Lys | Ala | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Glu | Trp | Leu | Gly | Phe | Ile | Gly | Asn | Lys | Ala | Asn | Gly | Tyr | Thr | Thr | Glu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Tyr | Ser | Ala | Ser | Val | Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile | Ser | Arg | Asp | Lys | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Gin | Ser | Ile | Leu | Tyr | Leu | Gin | Met | Asn | Thr | Leu | Arg | Ala | Glu | Asp | Ser |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ala | Thr | Tyr | Tyr | Cys | Thr | Arg | Asp | Arg | Gly | Leu | Arg | Phe | Tyr | Phe | Asp |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Tyr | Trp | Gly | Gin | Gly | Thr | Thr | Leu | Thr | Val | Sér | Ser | Ala | Lys | Thr | Thr |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Pro | Pro | Ser | Val | Tyr | Pro | Leu | Ala | Pro | Gly | Ser | Ala | Ala | Gin | Thr | Asn |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ser | Met | Val | Thr | Leu | Gly | Cys | Leu | Val | Lys | Gly | Tyr | Phe | Pro | Glu | Pro |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Val | Thr | Val | Thr | Trp | Asn | Ser | Gly | Ser | Leu | Ser | Ser | Gly | Val | His | Thr |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Phe | Pro | Ala | Val | Leu | Gin | Ser | Asp | Leu | Tyr | Thr | Leu | Ser | Ser | Ser | Val |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Thr | Val | Pro | Ser | Ser | Thr | Trp | Pro | Ser | Glu | Thr | Val | Thr | Cys | Asn | Val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ala | His | Pro | Ala | Ser | Ser | Thr | Lys | Val | Asp | Lys | Lys | Ile | Val | Pro | Arg |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Asp | Cys | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gly | Gly |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ser | Gin | Lys | Arg | Asp | Asn | Val | Leu | Phe | Gin | Ala | Ala | Thr | Asp | Glu | Gin |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Pro | Ala | Val | Ile | Lys | Thr | Leu | Glu | Lys | Leu | Val | Asn | Ile | Glu | Thr | Gly |
275
280
285
125 .-9 9 • 9 · • 9 9 • · • 9 9
9 9 9
9
9 • ·
9 9
999 9
Thr Gly | Asp Ala Glu | Gly Ile Ala Ala Ala Gly Asn Phe Leu Glu | Ala | ||||||||||||
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Glu | Leu | Lys | Asn | Leu | Gly | Phe | Thr | Val | Thr | Arg | Ser | Lys | Ser | •Ala | Gly |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Leu | Val | Val | Gly | Asp | Asn | Ile | Val | Gly | Lys | Ile | Lys | Gly | Arg | Gly | Gly |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Lys | Asn | Leu | Leu | Leu | Met | Ser | His | Met | Asp | Thr | Val | Tyr | Leu | Lys | Gly |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ile | Leu | Ala | Lys | Ala | Pro | Phe | Arg | Val | Glu | Gly | Asp | Lys | Ala | Tyr | Gly |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Pro | Gly | Ile | Ala | Asp | Asp | Lys | Gly | Gly | Asn | Ala | Val | Ile | Leu | His | Thr |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Leu | Lys | Leu | Leu | Lys | Glu | Tyr | Gly | Val | Arg | Asp | Tyr | Gly | Thr | Ile | Thr |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Val | Leu | Phe | Asn | Thr | Asp | Glu | Glu | Lys | Gly | Ser | Phe | Gly | Ser | Arg | Asp |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Leu | Ile | Gin | Glu | Glu | Ala | Lys | Leu | Ala | Asp | Tyr | Val | Leu | Ser | Phe | Glu |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Pro | Thr | Ser | Ala | Gly | Asp | Glu | Lys | Leu | Ser | Leu | Gly | Thr | Ser | Gly. | Ile |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Ala | Tyr | Val | Gin | Val | Asn | Ile | Thr | Gly | Lys | Ala | Ser | His | Ala | Gly | Ala |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Ala | Pro | Glu | Leu | Gly | Val | Ašn | Ala | Leu | Val | Glu | Ala | Ser | Asp | Leu | Val |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Leu | Arg | Thr | Met | Asn | Ile | Asp | Asp | Lys | Ala | Lys | Asn | Leu | Arg | Phe | Asn |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Trp | Thr | Ile | Ala | Lys | Ala | Gly | Asn | Val | Ser | Asn | Ile | Ile | Pro | Ala | Ser |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Ala | Thr | Leu | Asn | Ala | Asp | Val | Arg | Tyr | Ala | Arg | Asn | Glu. | Asp | Phe | Asp |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Ala | Ala | Met | Lys | Thr | Leu | Glu | Glu | Arg | Ala | Gin | Gin | Lys | Lys | Leu | Pro |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Glu | Ala | Asp | Val | Lys | Val | Ile | Val | Thr | Arg | Gly | Arg | Pro | Ala | Phe | Asn |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ala | Gly | Glu | Gly | Gly | Lys | Lys | Leu | Val | Asp | Lys | Ala | Val | Ala | Tyr | Tyr |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Lys | Glu | Ala | Gly | Gly | Thr | Leu | Gly | Val | Glu | Glu | Arg | Thr | Gly | Gly | Gly |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Thr | Asp | Ala | Ala | Tyr | Ala | Ala ' | Leu | Ser | Gly | Lys | Pro | Val | Ile | Glu | Ser |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Leu | Gly | Leu | Pro | Gly | Phe | Gly | Tyr | His | Ser | Asp | Lys | Ala | Glu | Tyr | Val |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Asp | Ile | Ser | Ala | Ile | Pro | Arg | Arg | Leu- | Tyr | Met | Ala | Ala | Arg | Leu | Ile |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Met | Asp | Leu | Gly | Ala | Gly | Lys |
645
Claims (18)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Genový konstrukt, který' kóduje část zaměřující buňku a heterologní enzym aktivující předlék, pro použití jako léčivo v savčím hostiteli, přičemž genový konstrukt je schopen exprimovat část zaměřující buňku a heterologní enzym aktivující předlék jako konjugát' uvnitř buňky, přičemž konjugát je nasměrován tak, že pak opustí buňku, a je elektivně lokalizován na antígenu - buněčného povrchu, který je rozpoznáván částí zaměřující buňku.
- 2. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle nároku 1, , kde část zaměřující buňku je protilátka.
- 3. Genový konstrukt pro použití jako léčivo, podle nároku 2, kde protilátka je anti-CEA protilátka vybraná z protilátek A5B7 a 806.077.
- 4. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde heterologní enzym aktivující předlék je karboxypeptidáza.
- 5. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle nároku 4, kde karboxypeptidáza je CPG2 .
- 6. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle nároku 5, kde CPG2 má mutovanaá polypeptidová glykosylační místa, aby se odstranila nebo snížila glykosylace po· expresi v savčí buňce.• · · · • · · · • ··· ··· • · ·· ··127
- 7,. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle kteréhokoliv z nároků 5 až 6, kde konjugát protilátkaenzym CPG2 je fúzní protein, ve kterém je enzym fúzován k C-konci protilátky prostřednictvím těžkého nebo lehkého řetězce protilátky, přičemž dimerizace kódovaného konjugátu po expresi se uskuteční prostřednictvím dimeřizační domény CPG2.
- 8. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle nároku 7, kde fúzní protein je vytvořen navázáním C-konce protilátkového těžkého, řetězce Fab k N-konci molekuly CPG2, čímž vytvoří Fab-CPG2, přičemž dvě molekuly Fab-CPG2 po expresi dimerizují prostřednictvím CPG2, takže vytvoří konjugát · (Fab-CPG2)2.
- 9. Genový konstrukt!pro použití jako léčivo podle nároku 4, kde karboxypeptidáza je vybrána z enzymů [D253K]HCPB, [G251T, D253K] HCPB nebo. [A248S,G251T,D253K]HCPB.
- 10. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který obsahuje transkripční regulační sekvenci, kterážto sekvence obsahuje promotor a řídicí prvek, přičemž , tento prvek obsahuje genetický vypínač pro řízení exprese genového konstruktu.
- 11. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle nároku 10, kde transkripční regulační sekvence obsahuje jako. řídící prvek genetický vypínač, který je regulován přítomností tetracyklinu nebo ekdysonu.9 9 9 99 9 9 9 • 9 9 9 ·· 99 99 9 9 9 9
- 12θ12. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle nároku 10 nebo 11, kde promotor je závislý na buněčném typu a je vybrán z následujících promotorů: karcinoémbryonální antigen (CEA) , alfa-fetoprotein (AFP) , tyrosinhydroxyláza,· cholinacetyltransferáza, neuronově specifická enoláza, insulin, gliový kyselý fibroprotein, HER-2/neu, c-erbB2 a N-myc. '
- 13. Genový konstrukt pro použití jako léčivo podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který je vložen v adenoviru pro přenos do savčího hostitele.
- 14. Použití genového konstruktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 k výrobě léčiva pro léčení rakoviny u savců.
- 15. Uspořádaný dvousložkový systém pro použití na savčím hostiteli vyznačující se tím, že složky obsahuj iI) první složka obsahuje genový konstrukt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, aII) druhá složka obsahuje předlék, který může být konvertován na cytotoxický lék heterologním enzymem kódovaným první složkou.
- 16. Uspořádaný dvousložkový systém podle nároku 15, vyznačující se tím, že první složka obsahuje gen kódující heterologní enzym CPG2, a předlék ve druhé složce je vybrán ze skupiny obsahující N-(4-[N,Nbis(2-iodoetyl)aminol-fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu, gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-(4-[N,Nbis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutamové « »129 ·* tt • · · · · • - · » · • · ··· · • · · ·· ·· *999 a N- {4-[N,N-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbony1)-Lglutamovou kyselinu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.
- 17'. Způsob podávání cytotoxického léčiva na určené místo vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se podá hostiteli první složka, která obsahuje genový konstrukt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, pak následuje podání druhé složky, která obsahuje předlék, který může být konvertován na cytotoxický lék heterologním enzymem kódovaným první složkou.
- 18. Způsob podle· nároku ' 17 vyznačující se tím, že první složka obsahuje gen kódující heterologní enzym GPG2 a předlék ve druhé složce je vybrán ze skupiny obsahující N-(4-[N,N-bis(2-iodoetyl)amino]-fenoxy-karbonyl)-L-glutamovou kyselinu, gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-(4-(N,N-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutamové a N-{4-[N,N-bis(2-chloroetyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ19993965A CZ396599A3 (cs) | 1998-05-05 | 1998-05-05 | Genový konstrukt, který kóduje část zaměřující buňku a enzym aktivující proléčivo, pro použití jako léčivo |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ19993965A CZ396599A3 (cs) | 1998-05-05 | 1998-05-05 | Genový konstrukt, který kóduje část zaměřující buňku a enzym aktivující proléčivo, pro použití jako léčivo |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ396599A3 true CZ396599A3 (cs) | 2000-02-16 |
Family
ID=5467499
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19993965A CZ396599A3 (cs) | 1998-05-05 | 1998-05-05 | Genový konstrukt, který kóduje část zaměřující buňku a enzym aktivující proléčivo, pro použití jako léčivo |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ396599A3 (cs) |
-
1998
- 1998-05-05 CZ CZ19993965A patent/CZ396599A3/cs unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6339070B1 (en) | Gene construct encoding a heterologous prodrug-activating enzyme and a cell targeting moiety | |
AU719513B2 (en) | Monoclonal antibody to CEA, conjugates comprising said antibody, and their therapeutic use in an adept system | |
JP3786695B2 (ja) | 修飾した抗原性免疾グロブリンによるt細胞の活性化 | |
US7348419B2 (en) | Humanization of an anti-carcinoembryonic antigen anti-idiotype antibody as a tumor vaccine and for targeting applications | |
JP2000502562A (ja) | 細胞活性化プロセスおよびそのための試薬 | |
CA2000913C (en) | Family of high affinity antibodies for cancer treatment | |
US20170137484A1 (en) | Methods and compositions for cancer therapy using mutant light molecules with increased affinity to receptors | |
US7638619B2 (en) | Variable region gene of heavy/light chain of anti-human hepatoma monoclonal antibody HAb 18 and use thereof | |
JP3805365B2 (ja) | 化合物 | |
US5993813A (en) | Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment | |
Hardman et al. | Generation of a recombinant mouse‐human chimaeric monoclonal antibody directed against human carcinoembryonic antigen | |
US6051225A (en) | Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment | |
Yarnold et al. | Chimerization of antitumor antibodies via homologous recombination conversion vectors | |
CZ396599A3 (cs) | Genový konstrukt, který kóduje část zaměřující buňku a enzym aktivující proléčivo, pro použití jako léčivo | |
MXPA99010224A (en) | Chemical compounds | |
JP2004508035A (ja) | エンドグリン特異的ポリペプチド、その製造及び使用 | |
US6641999B1 (en) | Probing method for identifying antibodies specific for selected antigens | |
KR20000010771A (ko) | Cea에 대한 모노클로널 항체, 이 항체를 함유하는 접합체 및adept계에서의 치료적 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |