DE69737188T2

DE69737188T2 - Monoklonaler antikoerper gegen cea, konjugate die dieses antikoerper enthalten und deren therapeutische verwendung in einem adept-system

Info

Publication number: DE69737188T2
Application number: DE69737188T
Authority: DE
Inventors: Graham Clive Macclesfield COPLEY; Derek Michael Macclesfield EDGE; Charles Stephen Macclesfield EMERY
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1996-05-04
Filing date: 1997-04-29
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2017-04-30
Also published as: WO1997042329A1; NO985120L; HUP9901562A2; PL329871A1; CA2250579A1; TR199802227T2; CZ353698A3; AU2645597A; AU719513B2; EP0896626B1; ES2279539T3; EP0896626A1; US6903203B2; BR9708910A; ATE350478T1; NZ331978A; DE69737188D1; NO985120D0; JP2000510692A; US6277599B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen monoklonalen Anti-CEA-Antikörper (im vorliegenden Schriftstück als "Antikörper 806.077" oder "806.077 Ab" bezeichnet), welcher für die Diagnose und Therapie von Krebs von Nutzen ist.
Es ist allgemein anerkannt, dass die Transformation normaler Gewebezellen in Tumorzellen mit einer Veränderung der Struktur der Zelloberfläche verbunden ist. Veränderte Zelloberflächenstrukturen können als Antigene dienen, und die tumormodifizierten Strukturen stellen eine Art eines so genannten tumorassozierten Antigens dar (siehe zum Beispiel "Altered Glycosylation in Tumour Cells", Hrsg. Reading, Hakamori und Marcus 1988, Arthur R. Liss publ.). Solche Antigene können zum Beispiel dazu genutzt werden, unter Verwendung der Hybridomtechnik monospezifische Antikörper herzustellen, wie gegenwärtig allgemein bekannt ist, nachdem dies zuerst von Kohler und Milstein (Nature, 256, 495–497, 1975) beschrieben wurde.
Eines dieser tumorassoziierten Antigene ist CEA (Carcinoembryonisches Antigen), wie erstmals von Gold und Freedman, J Exp Med, 121, 439, 1965 beschrieben wurde. Dieses Antigen ist auf der Tumorzelloberfläche vorhanden und kann auch im Blutserum nachgewiesen werden.
Das Konzept, bei der Behandlung von Krebs Antikörper gezielt auf tumorassoziierte Antigene anzusetzen, wird seit geraumer Zeit geschätzt (Herlyn et al. (1980) Cancer Research 40, 717). Antikörper können verwendet werde, um verschiedenartige chemische und biologische Mittel gezielt zum Tumor zu bringen, und derartige Konjugate haben in besonders erfolgreicher Weise die Grundlage für viele Verfahren der in vitro und in vivo Diagnose bildet. Die Verwendung von Immunokonjugaten in der Krebstherapie ist ebenfalls vielversprechend (Lord et al.(1985) Trends in Biotechnology 3, 175; Vitetta et al (1987) Science 238, 1098). Diese Herangehensweise stellt eine größere technische Herausforderung dar als diagnostische Anwendungen und macht es erforderlich, dass die tumorassoziierten Antigene, die bei einem solchen immunotherapeutischen Zugriff das Ziel bilden, hochgradig tumorspezifisch sind und in lebenswichtigen menschlichen Geweben nicht in bedeutendem Ausmaße exprimiert werden. Wiewohl auf die theoretischen Erwägungen nicht näher eingegangen werden soll, sei darauf hingewiesen, dass es für einige Anwendungen erstrebenswert ist, dass der Antikörper, zusätzlich zu der Eigenschaft, eine spezifische tumorassoziierte Verteilung im Gewebe aufzuweisen, nach dem Binden an das Antigen an der Zelloberfläche verbleibt, anstatt rasch ins Innere einzudringen. Bei ADEPT-Anwendungen (antibody directed enzyme prodrug therapy, siehe US-Patentschriften 4975278 und 5405990) wird beispielsweise angenommen, dass der Antikörper an der Zelloberfläche verbleibt, um die Aktivierung der unwirksamen Arzneimittelvorstufe (Prodrug) durch das Antikörper-Enzym-Konjugat zu erleichtern.
Antikörperkonjugate finden auch in der Tumorimmunotherapie Anwendung. In den folgenden Absätzen ist der wissenschaftliche Hintergrund dieser Anwendung dargelegt. Um auf einen Immunstimulus antworten zu können, benötigen T-Zellen zwei Signale. Eines dieser Signale wird geliefert, indem Peptide, die von MHC angezeigt werden, durch den T-Zellrezeptor (TCR) erkannt werden. Es ist gezeigt indes worden, dass die T-Zellen bei alleiniger TCR-Stimulierung keine Antwort zeigen und sich unempfindlich gegenüber dem Reiz zeigen und dass co-stimulierendes Signal erforderlich ist, um die Aktivierung und Proliferation der T-Zellen auszulösen (Übersichtsartikel von Schwartz R.H. J.Exp.Med., 1996, 184, 1–8). Nach Empfang der beiden Signale vermitteln die entstandenen zytotoxischen T-Zellen die Immunantwort, indem die Zielzellen getötet werden. Ein Reihe von möglichen co-stimulierenden Molekülen sind identifiziert werden (z.B. B7, ICAMs, LFA-1 und 3, CD40, CD70 und CD24, Übersichtsartikel von Galea-Lauri J. et al Cancer Gene Therapy, 1996, 3, 202–213). Die co-stimulierende Wirkung scheint hauptsächlich von den verwandten Molekülen B7.1 (auch CD80 genannt) und B7.2 (auch CD86 genannt) auszugehen, welches mit zwei Rezeptoren, CD28 und CTLA-4 in Wechselwirkung treten können (Hellstrom K.E. et al Immunol. Rev., 1995, 145, 123–145 und Lenschow D.J. et al Ann.Rev.Immunol., 1996, 14, 233–258). B7.1 und B7.2 werden auf antigenpräsentierenden Zellen (APC) wie etwa dentritischen Zellen exprimiert, während CD28 und CTLA-4 auf T-Zellen vorhanden sind. B7.2 scheint an der Oberfläche der APCs konstitutiv exprimiert zu werder, doch nach Kontakt mit einer T-Zelle wird die Expression von B7.1 hochgeregelt. Analog dazu wird CD28 auf T-Zellen exprimiert, wobei die Expression nach der Aktivierung jedoch heruntergefahren wird, und stattdessen CTLA-4 zu exprimieren. Die Stimulierung von CD28 und CTLA-4 mit Hilfe von B7.1 und B7.2 stellt ein komplexes Signalgabemuster dar, welches nicht nur die Aktivierung der T-Zelle steuert, sondern auch die anschließende Proliferation zur Anpassung der Immunantwort (Greene J. et al J.Biol.Chem., 1996, 271, 26762–26771). Dieses Phänomen könnte die erklären, dass sich die veröffentlichten Daten von Forschern, welche diese co-stimulierenden Moleküle untersuchen, manchmal nicht in Einklang zu bringen sind.
Im Hinblick auf Krebs wurden Lymphozyten identifiziert, die zwar in den Tumor eindringen, aber eine mangelnde Immunantwort zeigen, was auf die Unempfindlichkeit von T-Zellen zurückzuführen sein könnte. Tumorzellen können auf ihrer Oberfläche spezifische oder selektive Antigene zeigen, aber es fehlt ihnen B7.1/B7.2, wodurch es ihnen möglich wird, der Wachsamkeit des Immunsystems zu entkommen. In der Tat ist in in vivo Versuchen gezeigt worden, dass Tumorzellen, die mit B7.1/B7.2 transfiziert wurden, weniger tumorerzeugend als nicht transfizierte Zellen aus der gleichen Linie sind und dass die transfizierten Zellen dazu befähigt sind, bei parentalen Zellen eine schützende Immunität bei einer erneuten Herausforderung (Rechallenge) zu induzieren (Townsend S.E. und Allison J.P., 1993, Science, 259, 368–370). Die zeigt, dass die Immunantwort nach einmal erfolgter Stimulierung unabhängig von B7.1/B7.2 werden kann. Hellstrom kann vorgeschlagen, dass die Expression von B7.1/B7.2 in Tumorzellen mit Hilfe von Gentherapie das Potenzial hat, die Antwort des Wirtes zu stimulieren, wodurch die Krankheit gelindert oder beseitigt werden kann. Gajewski (J.Immunol., 1996, 156, 465–472) und Matulonis et al (J.Immunol., 1996, 156, 1126–1131) haben berichtet, dass B7.1 hinsichtlich der Aktivierung von T-Zellen B7.2 überlegen ist. Es wird berichtet, dass B7.1 in Lösung (nach Verschmelzung mit konstanten Antikörperdomänen) nur eine mäßige co-Stimulierung von T-Zellen, die eine TCR-Stimulierung durch eine unabhängige Quelle erfahren, bewirkt. (Linsley P.S. et al J.Exp.Med., 1991, 173, 721–730).
Es besteht ein Bedarf an weiteren und verbesserten Anti-CEA-Antikörpern, die zur Diagnose und Therapie von Krebs von Nutzen sind.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung eines neuartigen Anti-CEA-Antikörpers, der im vorliegenden Schriftstück als Antikörper 806.077 bezeichnet wird.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Anti-CEA-Antikörper bereitgestellt, welcher "Complementarity determining regions" (CDRs) umfasst, wobei die CDRs folgende Sequenzen aufweisen:

a) schwere Kette CDR1 DNYMH (SEQ ID Nr: 29) CDR2 WIDPENGDTE YRPKFRG (SEQ ID Nr: 31) CDR3 LIYAGYLAMD Y (SEQ ID Nr: 32);
b) leichte Kette CDR1 SASSSVTYMH (SEQ ID Nr: 26) CDR2 STSNLAS (SEQ ID Nr: 27) CDR3 QQRSTYPLT (SEQ ID Nr: 28).

Bei den CDRs oder "Complementarity determining regions" handelt es sich um Sequenzen der hypervariablen Schleifen von variablen Antikörperdomänen, von denen angenommen wird, die sich eine kritische Rolle bei der Festlegung der Spezifizität der Antigen-Antikörper-Wechselwirkung spielen (Kabat, E.A., Lu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. & Gottesman, K.S. (1987). Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4te Ausgabe. Washington D.C.: United States Dept. of Health and Human Services; auch für Einzelheiten zur Nummerierung der Antikörperreste nach Kabat sei auf diese Literaturstelle verwiesen). Nach der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück umfassen CDRs indes rahmenbildende Reststücke, wenn diese zur Bildung beitragen. Für den Antikörper 806.077 werden die CDRs durch Homologie bestimmt mit den hypervariablen Sequenzen anderer Mausantikörper bestimmt. In dieser Spezifikation bezeichnen die Begriffe "VK" und "VH" variable Regionen der leichten beziehungsweise schweren Antikörperkette. Die Anatomie des Antikörpermoleküls ist in einem Übersichtsartikel von Padlan (1994) in Molecular Immunology 31, 169–217 behandelt worden.
Die CDRs der leichten Kette sind:
VK CDR1 Reste 24 bis 34 einschließlich nach Kabat, SASSSVTYMH (SEQ ID Nr: 26);
VK CDR2 Reste 50 bis 56 einschließlich nach Kabat, STSNLAS (SEQ ID Nr: 27);
VK CDR3 Reste 89 bis 97 einschließlich nach Kabat, QQRSTYPLT (SEQ ID Nr: 28);
Die CDRs der schweren Kette sind:
VH CDR1 Reste 31 bis 35B einschließlich nach Kabat, DNYMH (SEQ ID Nr: 29); die bevorzugten VH CDR1-Reste nach Kabat sind Nr. 27 bis 35B einschließlich, FNIKDNYMH (SEQ ID Nr: 30);
VH CDR2 Reste 50 bis 65 einschließlich nach Kabat, WIDPENGDTE YAPKFRG (SEQ ID Nr: 31) VH CDR3 Reste 95 bis 102 einschließlich nach Kabat, LIYAGYLAMD Y (SEQ ID Nr: 32); die bevorzugten VH CDR3-Reste nach Kabat sind Nr. 93 bis 102 einschließlich, HVLIYAGYLA MDY (SEQ ID Nr: 33).
Vorzugsweise beträgt die Bindungsaffinität zum CEA-Antigen mindestens 10E-5M, mit noch größerem Vorzug beträgt die Bindungsaffinität zum CEA-Antigen mindestens 10E-6M, mit noch größerem Vorzug beträgt die Bindungsaffinität zum CEA-Antigen mindestens 10E-7M, mit noch größerem Vorzug beträgt die Bindungsaffinität zum CEA-Antigen mindestens 10E-8M, mit noch größerem Vorzug beträgt die Bindungsaffinität zum CEA-Antigen mindestens 10E-9M, mit noch größerem Vorzug beträgt die Bindungsaffinität zum CEA-Antigen mindestens 10E-10M und insbesondere beträgt die Bindungsaffinität zum CEA-Antigen mindestens 10E-11M.
Der Begriff Antikörper bezeichnet gemäß seiner Verwendung im vorliegenden Schriftstück ein Immunglobulinmolekül (oder ein Fragment desselben oder ein modifiziertes Antikörperkonstrukt wie etwa scFv, welche spezifische CEA-Antigen-Bindungseigenschaften behält). In erster Linie sind die CDRs für die Antigenbindung verantwortlich, wobei die nicht-CDR-Proteinsequenz sich normalerweise von einem Immunglobulin ableitet, aber auch von einer Immunglobulindomäne eines Mitglieds einer Immunglobulin-Superfamilie abgeleitet sein kann.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein CEA-Antikörper bereitgestellt, der die folgende, wahlweise humanisierte, Struktur umfasst:
eine variable Region der schweren Kette mit der Sequenz (SEQ ID Nr: 11)
und;
eine variable Region der leichten Kette mit der Sequenz (SEQ ID Nr: 9):
oder ein beliebiges der im Folgenden genannten Konstrukte daraus:
F(ab')₂; F(ab'), Fab, Fv, Einzelketten-Fv & V-min.
Fragmentkonstrukte des Typs F(ab')₂ sind bevorzugt. Es ist ein beliebiges geeignetes Antikörperfragment denkbar, welches die kennzeichnenden Bindungseigenschaften des Antikörpers 806.077 behält. Ein Beispiel für ein in jüngerer Zeit beschriebenen Antikörperfragment ist "L-F(ab)₂" gemäß der Beschreibung von Zapata (1995) in Protein Engineering, 8, 1057–1062. Disulfidgebundene Fvs sind ebenfalls denkbar. Wahlweise stellt der Antikörper einen Teil eines Konjugats gemäß der untenstehenden Beschreibung dar.
Ein bevorzugter humanisierter Antikörper umfasst mindestens eine der folgenden Sequenzen:
eine variable Region der schweren Kette mit der Sequenz VH1 (SEQ ID Nr: 55);
eine variable Region der leichten Kette mit der Sequenz VK4 (SEQ ID Nr: 71);
eine konstante Region CH1 der schweren Kette des humanen IgG3;
eine Region CL der humanen leichten Kappa-Kette; und
eine humane IgG3-Hinge-Region;
wahlweise in Form eines F(ab')₂-Fragments.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Polynukleotidsequenz bereitgestellt, die dazu befähigt ist, für die variable Region der schweren oder leichten Kette eines CEA-Antikörpers der Erfindung zu codieren. Vorzugsweise ist die variable Region der schweren oder leichten Kette an ein Gen kondensiert (wahlweise über eine verbindende Sequenz), welches für ein Protein als Effektorgruppe codiert (als Teil eines Konjugats, siehe untenstehenden Text), wobei die Fusion vorzugsweise über die schwere Antikörperkette erfolgt. Im Allgemeinen kann die Fusion entweder am N- oder am C-Terminus der Antikörperkette erfolgt sein. Für B7-Konjugate wird eine Fusion am N-Terminus der Antikörperkette bevorzugt.
CPB weist eine N-terminale Prodomäne auf, von der angenommen wird, dass sie an der korrekten Auffaltung des Proteins beteiligt ist, bevor die Prodomäne entfernt wird, um aktives Enzym freizusetzen. Wenn proCPB mit ihrem C-Terminus an den N-Terminus einer Antikörperkette kondensiert wird, so ermöglicht dies die Entfernung der Prodomäne (z.B. durch Trypsinbehandlung) vom N-Terminus des Fusionskonstruktes. Alternativ dazu stellt sich das Problem, die Prodomäne ohne Zerstörung des Fusionsproteins aus der "Mitte" des Konstruktes entfernen zu müssen, wenn proCPB an den C-Terminus der Antikörperkette angegliedert wurde. Die Lösung besteht darin, die Prodomäne separat zu co-exprimieren (in trans). Dies hat den Vorteil, dass es nach der Konstruktion der Zelllinien nicht erforderlich ist, das exprimierte Fusionsprotein mit Trypsin zu aktivieren, um die CPB-Prodomäne zu entfernen. Konstrukte, bei denen proCPB mit seinem C-Terminus an den N-Terminus der Antikörperkette kondensiert wurde, weisen den Vorteil auf, dass sie nicht die Konstruktion von co-Expressionszelllinien erfordern, welche neben einem hohem Expressionsniveau anderer Proteine auch ein hohes Expressionsniveau der Prodomäne benötigen.
In dieser Spezifikation ist an konservative Aminosäureanaloga von spezifischen Aminosäuresequenzen gedacht, welche die Bindungseigenschaften des CEA-Antikörpers der Erfindung behalten, sich aber in der Sequenz durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder Additionen unterscheiden. Die spezifisch aufgeführten Aminosäuresequenzen werden indes bevorzugt. Typische konservative Aminosäuresubstitutionen sind unten aufgelistet. Konservative Substitutionen
In dieser Spezifikation ist an Nukleinsäureabwandlungen (Deletionen, Substitutionen und Additionen) von spezifischen Nukleinsäuren gedacht, welche die Fähigkeit behalten, unter stringenten Bedingungen zur fraglichen spezifischen Sequenz zu hybridisieren. Im nachstehenden Beispiel 9 ist ein Hybridisierungstest dargelegt. Die spezifisch aufgeführten Nukleinsäuresequenzen werden indes bevorzugt. Es ist denkbar, dass peptidische Nukleinsäure ein annehmbares Äquivalent zu Polynukleotidsequenzen dargestellt, zumindest für Zwecke, bei denen eine Translation zum Protein nicht erforderlich ist (Wittung (1994) Nature 368, 561).
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß der vorliegenden Beschreibung bereitgestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass er/es humanisiert ist.
Bei einem humanisierten Antikörper, einem entsprechenden Fragment oder einer solchen Antikörperbindungsstruktur handelt es sich um ein Polypeptid, das überwiegend aus einer Rahmenstruktur aus Immunglobulinsequenzen, die sich vom Menschen ableiten, besteht, wobei diese Struktur an der Antigenbindungsstelle und um diese herum Aminosäuresequenzen trägt, die sich nicht vom Menschen ableiten ("complementarity determining regions" oder CDRs; diese Technik ist als CDR-Pfropfen bekannt, wobei es oftmals auch zu Veränderungen in der Rahmenstruktur kommt, siehe Beispiele unten). Eine geeignete Methodologie ist zum Beispiel ausführlich in WO 91/09967, EP 0328404 and Queen et al. Proc Natl Acad Sci 86, 10029, Mountain and Adair (1989) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1 (1992) beschrieben, obgleich alternative Verfahren der Humanisierung ebenfalls denkbar sind, wie etwa die oberflächliche Belegung von Resten mit Antikörpern ( EP 519596 , Merck/NIH, Padlan et al). Die bevorzugten humanisierten Antikörper 806.077 sind diejenigen der Beispiele 11 bis 47 oder 107 bis 122. Eine bevorzugte humanisierte variable Region der schweren Kette ist VH1 (siehe Beispiele). Eine bevorzugte variable Region der leichten Kette ist VK4, welche wahlweise beliebige der zusätzlichen Änderungen, die in den Beispielen 107 bis 109 beschrieben sind, aufweist. Eine bevorzugte menschliche konstante Region der schweren Kette ist IgG3.
Chimärische humanisierte Antikörper stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar. Die Herstellung von chimärischen humanisierten Antikörperfragmenten des Antikörpers 806.077 ist im vorliegenden Schriftstück in Beispiel 8 beschrieben. Chimärische Antikörper werden im Allgemeinen konstruiert, indem die variable Region aus einer Spezies mit einer konstanten Region aus einem anderen Antikörper von einer verschiedenartigen Spezies kombiniert wird.
Der Begriff "humanisiert" wie er im vorliegenden Schriftstück mit Bezug auf Antikörper gebraucht wird, umfasst beliebige Verfahren zur Humanisierung wie beispielsweise das CDR-Pfropfen oder die Herstellung chimärischer Antikörper oder Hybride daraus wie beispielsweise eine CDR-gepfropfte schwere Kette in Kombination mit einer chimärisierten leichten Kette (siehe Beispiel 110 für eine geeignete Ausführungsform).
Insbesondere wird ein Antikörper eines Nagetiers, wenn er dem Menschen entweder allein oder als Konjugat wiederholt in vivo verabreicht wird, bei dem Empfänger eine Immunantwort gegen den Nagetierantikörper hervorrufen; die so genannte HAMA-Antwort (Human Anti Mouse Antibody). Die HAMA-Antwort kann die Wirksamkeit des pharmazeutischen Mittels einschränken, wenn eine wiederholte Dosierung erforderlich ist. Die immunogene Wirkung des Antikörpers kann durch chemische Modifizierung des Antikörpers mit einem hydrophilen Polymer wie etwa Polyethylenglykol verringert werden, oder aber durch Anwendung gentechnischer Verfahren, die dazu dienen, die Antikörperbindungsstruktur menschenähnlicher zu machen. Zum Beispiel können die Gensequenzen für die variablen Domänen des Nagetierantikörpers, welche an CEA binden, durch die variablen Domänen eines menschlichen Myelomproteins ersetzt werden, wodurch ein rekombinanter chimärischer Antikörper entsteht. Diese Verfahren werden in EP 194276 , EP 0120694 , EP 0125023 , EP 0171496 , EP 0173494 und WO 86/01533 ausführlich dargelegt. Alternativ dazu können die Gensequenzen der CDRs des CEA-bindenden Nagetierantikörpers isoliert oder synthetisiert werden, um die entsprechenden Sequenzregionen eines homologen menschlichen Antikörpergens zu ersetzen, wodurch ein menschlicher Antikörper mit der Spezifizität des ursprünglichen Nagetierantikörper entsteht. Diese Verfahren sind in EP 023940 , WO 90/07861 und WO 91/09967 beschrieben. Alternativ dazu kann eine große Anzahl an Oberflächenresten der variablen Domäne des Nagetierantikörpers zu denjenigen Resten verändert werden, die sich normalerweise auf einem homologen menschlichen Antikörper befinden, wodurch ein Nagetierantikörper entsteht, der eine oberflächliche "Belegung" mit Resten aufweist und daher vom menschlichen Körper als eigen erkannt wird. Diese Herangehensweise wird von Padlan et.al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489 gezeigt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit einer Polynukleotidsequenz transformiert wurde, oder aber ein transgenes nicht-menschliches Tier oder eine transgene Pflanze, das/die aus der Wirtszelle entwickelt wurde, wobei die Polynukleotidsequenz mindestens für eine variable Region der schweren Kette oder der leichten Kette eines CEA-Antikörpers der Erfindung codiert, welcher wahlweise in Form eines Konjugats gemäß der Beschreibung im vorliegenden Schriftstück vorliegt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Hybridom 806.077 bereitgestellt, welches unter der ECACC-Registrierungs-Nr. 96022936 eingereicht wurde sowie Zelllinienvarianten davon.
Der Antikörper Hybridom 806.077 wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Vereinigtes Königreich am 29. Februar 1996 unter der Registrierungs-Nr. 96022936 gemäß dem Budapester Vertrag eingereicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Plasmid pNG3-Vkss-HuCk bereitgestellt, welches unter der NCIMB-Registrierungs-Nr. 40798 eingereicht wurde.
Das Plasmid pNG3-Vkss-HuCk wurde bei The National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, Vereinigtes Königreich am 11. April 1996 unter der Registrierungsnummer NCIMB 40798 gemäß dem Budapester Vertrag eingereicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Plasmid pNG4-VHss-HuIgG2CH1' bereitgestellt, welches unter der NCIMB-Registrierungs-Nr. 40797 eingereicht wurde.
Das Plasmid pNG4-VHss-HuIgG2CH1' wurde bei The National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, Vereinigtes Königreich am 11. April 1996 unter der Registrierungsnummer NCIMB 40797 gemäß dem Budapester Vertrag eingereicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Plasmid pNG3-Vkss-HuCk-NEO bereitgestellt, welches unter der NCIMB-Registrierungs-Nr. 40799 eingereicht wurde.
Das Plasmid pNG3-Vkss-HuCk-NEO wurde bei The National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, Vereinigtes Königreich am 11. April 1996 unter der Registrierungsnummer NCIMB 40799 gemäß dem Budapester Vertrag eingereicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung mindestens einer variablen Region einer schweren oder leichten Kette eines Anti-CEA-Antikörpers gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück bereitgestellt, welches folgendes umfasst:

a) Transformieren einer Wirtszelle mit einer Polynukleotidsequenz, die mindestens für die variable Region der schweren oder leichten Kette der Anti-CEA-Antikörpers codiert, sowie wahlweise Entwickeln der transformierten Wirtszelle zu einer transgenen nicht-menschlichen Säugetier oder einer transgenen Pflanze;
b) Anwenden von Bedingungen, die zur Expression, und wahlweise zur Sekretion, mindestens einer variablen Region führen, auf die Wirtszelle, das transgene nicht-menschliche Säugetier oder die transgene Pflanze und wahlweise;
c) mindestens teilweises Auf reinigen der variablen Region

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines Konjugats gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück bereitgestellt, welches folgendes umfasst:

a) Anwenden von Bedingungen, die zur Expression, und wahlweise zur Sekretion, des Antikörpers oder des Konjugats führen, auf eine Wirtszelle, ein transgenes nicht-menschliches Säugetier oder eine transgene Pflanze gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück, oder auf das Hybridom 806.077; und wahlweise;
b) mindestens teilweises Aufreinigen des Antikörpers oder Konjugats.

Vorzugsweise werden die variablen Regionen sowohl der schweren als auch der leichten Kette in derselben Zelle exprimiert und somit zusammengesetzt, um den Anti-CEA-Antikörper zu bilden. Vorzugsweise ist die variable Region der schweren oder leichten Kette an ein Gen kondensiert (wahlweise über eine verbindende Sequenz), welches für ein Protein als Effektorgruppe codiert (als Teil eines Konjugats, siehe untenstehenden Text), wobei die Fusion vorzugsweise über die schwere Antikörperkette erfolgt. Im Allgemeinen kann die Fusion entweder am N- oder am C-Terminus der Antikörperkette erfolgt sein. Für B7-Konjugate wird eine Fusion am N-Terminus der Antikörperkette bevorzugt. CPB weist eine N-terminale Prodomäne auf, von der angenommen wird, dass sie an der korrekten Auffaltung des Proteins beteiligt ist, bevor die Prodomäne entfernt wird, um aktives Enzym freizusetzen. Wenn proCPB mit ihrem C-Terminus an den N-Terminus einer Antikörperkette kondensiert wird, so ermöglicht dies die Entfernung der Prodomäne (z.B. durch Trypsinbehandlung) vom N-Terminus des Fusionskonstruktes. Alternativ dazu stellt sich das Problem, die Prodomäne ohne Zerstörung des Fusionsproteins aus der "Mitte" des Konstruktes entfernen zu müssen, wenn proCPB an den C-Terminus der Antikörperkette angegliedert wurde. Die Lösung besteht darin, die Prodomäne separat zu co-exprimieren (in trans). Dies hat den Vorteil, dass es nach der Konstruktion der Zelllinien nicht erforderlich ist, das exprimierte Fusionsprotein mit Trypsin zu aktivieren, um die CPB-Prodomäne zu entfernen. Konstrukte, bei denen proCPB mit seinem C-Terminus an den N-Terminus der Antikörperkette kondensiert wurde, weisen den Vorteil auf, dass sie nicht die Konstruktion von co-Expressionszelllinien erfordern, welche neben einem hohem Expressionsniveau anderer Proteine auch ein hohes Expressionsniveau der Prodomäne benötigen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers 806.077 bereitgestellt, welches folgendes umfasst:

a) Anzüchten des Antikörpers Hybridom 806.077, der unter der ECACC-Registrierungs-Nr. 96022936 eingereicht wurde, in einem Medium unter Bedingungen, die zur Expression des Antikörpers daraus führen, und;
b) Erhalten des Antikörpers Antikörper 806.077 aus dem Kulturmedium und wahlweise;
c) Herstellen eines F(ab')₂-Fragments des Antikörpers Antikörper 806.077 durch enzymatische Verdauung.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat bereitgestellt, welches eine Effektorgruppe sowie einen Anti-CEA-Antikörper 806.077 der Erfindung gemäß der Beschreibung im vorliegenden Schriftstück umfasst. Eine Effektorgruppe ist eine Einheit, welche die Auswirkung hat, dem Antikörper 806.077 durch Bildung des Konjugats eine weitere Aktivität zu verleihen (z.B. ein Enzym, ein Toxin oder ein radioaktiver Ligand).
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Effektorgruppe vorzugsweise um ein Enzym, welches zur Verwendung in einem ADEPT-System geeignet ist. In der internationalen Patentanmeldung WO 96/20011, veröffentlicht am 4 Juli 96, haben wir ein ADEPT-System mit "umgekehrter Polarität" vorgeschlagen, welches auf mutierten menschlichen Enzymen beruht, die den Vorteil haben, verglichen beispielsweise mit bakteriellen Enzymen, eine geringe immunogene Wirkung auszuüben. Insbesondere wurden menschliches pankreatisches CPB (siehe, zum Beispiel, Beispiel 15 [D253K]menschliches CPB & 16 [D253R]menschliches CPB) und dessen Prodrugs (siehe Beispiele 18 & 19) als Wirtsenzym eingesetzt. Das Wirtsenzym ist mutiert, um die Art der Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Prodrug gegenüber dem nativen Wirtsenzym zu verändern, und zwar hinsichtlich der Erkennung des Substrats. In unserer anschließend erfolgten internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB96/01975 (veröffentlicht am 6. März 97 als WO 97/07796) sind weitere Arbeiten an Kombinationen aus mutiertem CPB-Enzym/Prodrug für ADEPT beschrieben. Als Enzyme, die für ADEPT geeignet sind, werden bevorzugt beliebige der CPG2-Enzyme oder ein CPB-Enzym mit umgekehrter Polarität eingesetzt, zum Beispiel ein beliebiges der Enzyme [D253K], HCPB, [G251T,D253K]HCPB und [A248S,G251T,D253K]HCPB.
Konjugate des Antikörpers 806.077 kommen auch in der Immunotherapie von Tumoren zur Anwendung. Dementsprechend handelt es sich, in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, bei der Effektorgruppe des Konjugats um ein co-stimulierendes Molekül, vorzugsweise um das co-stimulierende Molekül B7 und insbesondere um menschliches B7.1 oder B7.2, ganz besonderes um menschliches B7.1. Vorzugsweise liegt das Konjugat in Form eines Fusionsproteins vor, wobei das Fusionsprotein vorzugsweise gebildet wird, indem ein C-Terminus des co-stimulierenden Moleküln mit einem N-Terminus der Kette des Antikörpers 806.077 verknüpft wird, vorzugsweise über die schwere Kette des Antikörpers, wobei dem Antikörper 806.077 vorzugsweise eine Fc-Antikörperregion fehlt, insbesondere ein F(ab')₂-Antikörperfragment und wobei es sich insbesondere um einen humanisierten oder menschlichen Antikörper handelt. Ein besonders bevorzugtes Konjugat ist im untenstehenden Beispiel 104 beschrieben.
Die Verwendung des Antikörpers, um den Tumorzellen gezielt ein co-stimulierendes Molekül zuzuführen, sollte erwartungsgemäß den Tumorzellen Antigenfunktion verleihen, und zwar indem T-Zellen die spezifische TCR-Stimulierung von der Tumorzelle selbst erhalten, das co-stimulierende Signal jedoch von dem Molekül, welches mit dem Antikörper gezielt zugeführt wird. Die Verwendung von menschlichen oder humanisierten Antikörpern wird für die Behandlung von menschlichen Tumoren bevorzugt, denn Maus-Antikörper können bei Verwendung im Menschen eine Immunreaktion verursachen, die zu einer verringerten Wirksamkeit der Therapie im Wiederholungsfall führen könnte. Die Verwendung eines Fusionsproteins, in welchem eine Region, die an ein Tumorantigen bindet, mit dem extrazellulären Abschnitt eines co-stimulierenden Moleküls kombiniert ist, ist neu. Hayden et al. (Tissue Antigens, 1996, 48, 242–254) haben von der Verwendung eines bi-spezifischen Antikörpermoleküls berichtet, in welchem eine Antitumor-Domäne, die an ein Antigen bindet, mit einer Anti-CD28-bindenden Domäne kombiniert ist. Obgleich dieses Molekül dazu befähigt ist, mit CD28 auf T-Zellen in Wechselwirkung zu treten, weist das Signal, das dadurch erzeugt werden kann, den. Nachteil auf, sich qualitativ von demjenigen zu unterscheiden, das von natürlichen CD28-Liganden erzeugt wird, so ist zum Beispiel die Bindungsaffinität größer als diejenige zwischen B7.1 und CD28. Die artenübergreifende Homologie zwischen B7.1, B7.2 und CD28,CTLA-4 deutet auf eine Erhaltung der Sequenzen der Bindungsregionen im Evolutionsprozess hin. Folglich wird angenommen, dass beispielsweise B7.1 vom Menschen mit CD28 der Maus in Wechselwirkung treten und ein ähnliches co-stimulierendes Signal erzeugen kann. Für die Behandlung menschlicher Krankheiten ist ein menschliches oder humanisiertes Protein zu bevorzugen. Die Verwendung eines menschlichen oder humanisierten Proteins in Tiermodellen könnte indes zu Wirkungen führen, welche den beim Mensch erwarteten ähnlich sind, und solche Tiermodelle sollten aussagekräftige Daten über die Wirksamkeit eines menschlichen/humanisierten Antikörper-Fusionsproteins mit menschlichem B7.1/B7.2 in der Behandlung von menschlichen Krankheiten liefern.
Die Konjugation der Effektorgruppe mit dem Antikörper kann mittels eines beliebigen geeigneten Verfahrens erfolgen, wie beispielsweise durch chemische Verknüpfung mit heterobifunktionellen Linkern oder durch rekombinante Genfusionstechniken. Als Konjugate werden im Allgemeinen Fusionsproteine bevorzugt, insbesondere bei Konjugaten mit HCPB oder B7.
Es werden solche Konjugate bevorzugt, bei denen die Effektorgruppe aus den im Folgenden genannten gewählt ist:

a) ein Enzym, das zur Verwendung in einem ADEPT-System geeignet ist;
b) CPG2;
c) [G251T,D253K]HCPB;
d) [A248S,G251T,D253K]HCPB;
e) ein co-stimulierendes Molekül;
f) die extrazelluläre Domäne von B7;
g) die extrazelluläre Domäne von menschlichem B7.1; und
g) die extrazelluläre Domäne von menschlichem B7.2;

Es versteht sich, dass das Konjugat der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise nur aus einem Effektormolekül und einem Antikörpermolekül besteht. Zum Beispiel kann das Konjugat mehr als nur ein Effektormolekül pro Antikörpermolekül umfassen. Im Allgemeinen weisen F(ab')₂-Antikörperkonjugate, die Fusionen aus dem Antikörper und einem Enzym oder einer extrazellulären Domäne von B7 darstellen, 2 Mol an Enzym oder B7 pro Mol Antikörper auf.
Insbesondere werden Konjugate bevorzugt, bei denen es sich um ein Fusionsprotein handelt, das aus den folgenden Konjugaten gewählt ist (wobei die Sequenzen in der Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus aufgeführt sind)

a) eine Fusion aus einem humanisierten F(ab')₂ 806.077 – {[A248S,G251T,D253K]HCPB}₂, welche folgendes umfasst: eine Fd'-Antikörperkette mit der Struktur VH1 (SEQ ID Nr: 55)/CH1 konstante Region aus der IgG3/Hinge-Region von IgG3; wobei die Fd'-Kette über ihren C-Terminus an den N-Terminus von [A2485,G251T,D253K]HCPB kondensiert ist; und eine leichte Antikörperkette mit der Formel VK4(SEQ ID Nr: 71/CL-Region aus der leichten Kappakette;
b) eine Fusion aus {[A248S,G251T,D253K]HCPB}₂-humanisiertem 806.077 F(ab')₂, welche folgendes umfasst: [A248S,G251T,D253K]HCPB; wobei das HCPB an seinem C-Terminus, über einen (GGGS)₃-Linker, an den N-Terminus einer Fd'-Antikörperkette mit der Struktur VH1(SEQ ID Nr: 55)/CH1 konstante Region aus der IgG3/Hinge-Region von IgG3 kondensiert ist; und eine leichte Antikörperkette mit der Formel VK4(SEQ ID Nr: 71/CL-Region aus der leichten Kappakette; und
c) eine Fusion aus (extrazelluläre Domäne des menschlichen B7.1)₂ – humanisiertem F(ab')₂ 806.077, welche folgendes umfasst: die extrazelluläre Domäne des menschlichen B7.1; wobei das B7.1 an seinem C-Terminus an den N-Terminus einer Fd'-Antikörperkette mit der Struktur VH1(SEQ ID Nr: 55)/CH1 konstante Region aus der IgG3/Hinge-Region von IgG3 kondensiert ist; und eine leichte Antikörperkette mit der Struktur VK4 (SEQ ID Nr: 71/CL-Region aus der leichten Kappakette.

In dieser Spezifikation entspricht die Hinge-Region des Antikörpers mit Bezug auf die Konjugate den prinzipiellen Begriffsbestimmungen, die von Padlan (1994) in Molecular Immunology 31, 169–217 dargelegt wurden; siehe insbesondere die dortige Tabelle 2. In diesen besonders bevorzugten Konjugaten kommen 2 Mol an Enzym oder B7.1 auf ein Mol an F(ab')₂. Der nach vorn geneigte Schrägstrich ("/") stellt lediglich eine Abgrenzung dar, um die einzelnen strukturellen Elemente anzuzeigen, die über Peptidbindungen aneinandergefügt wurden und Teile des Konjugats darstellen.
Die humanisierten Sequenzen der variablen Regionen VH1 und/oder VK4 haben den Vorteil, gute Bindungseigenschaften zu behalten, da die humane Rahmenstruktur nur minimale zusätzliche Veränderungen erfahren muss. Die Hinge-Region des IgG3 weist den Vorteil auf, zu einem guten Produktionsniveau an F(ab')₂ zu führen, wobei das Produkt sich durch eine gute Homogenität auszeichnet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, die sich auf die besonders bevorzugten Konjugate gemäß der obigen Begriffsbestimmung bezieht, erfolgt die Fusion über die leichte Antikörperkette. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, die sich auf die besonders bevorzugten Konjugate gemäß der obigen Begriffsbestimmung bezieht, kann die konstante CH1-Region aus der IgG3/Hinge-Region des IgG3-Baugliedes durch das entsprechende IgG2-Element ersetzt werden.
Wenn es sich bei dem Effektormolekül um ein Toxin handelt, umfasst diese Toxingruppe im Allgemeinen einen Bestandteil, der zytotoxische Eigenschaften aufweist und daher dazu befähigt, Zellen zu töten, nachdem er in ihr Inneres gelangt ist.
Die Toxingruppe und der Anti-CEA-Antikörper können direkt miteinander verknüpft sein, oder sie können auf indirekte Weise verknüpft sein. Die Toxingruppe und der Anti-CEA-Antikörper sind im Allgemeinen derart miteinander verknüpft, dass die Geometrie des Konjugates es ermöglicht, dass der Anti-CEA-Antikörper an die Zielzelle bindet. Vorteilhafterweise sind die Toxingruppe und der Anti-CEA-Antikörper derart miteinander verknüpft, dass das Konjugat extrazellulär stabil ist und intrazellulär instabil, sodass die Toxingruppe und der Anti-CEA-Antikörper außerhalb der Zielzelle verknüpft bleiben, die Toxingruppe aber nach dem Erreichen des Zellinneren freigesetzt wird. Daher weist das Konjugat vorteilhafterweise eine intrazellulär spaltbare/extrazellulär stabile Stelle auf.
Zu den Beispielen für Konjugate, bei denen die Toxingruppe direkt mit der Gruppe, die an die Zielzelle bindet, verknüpft ist, gehören solche, bei denen die Toxingruppe und der Anti-CEA-Antikörper über eine Disulfidbrücke, die zwischen einer Thiolgruppe an der Toxingruppe und einer Thiolgruppe am Anti-CEA-Antikörper gebildet wird, miteinander verknüpft sind. Einzelheiten zur Herstellung und zu den Eigenschaften von Immunotoxinen und anderen Konjugaten sind in der Europäischen Patentanmeldung EP 528 527 (Veröffentlichungs-Nr.) angegeben, auf deren Inhalt hiermit zu den Referenzen des vorliegenden Schriftstücks gezählt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Polynukleotidsequenz bereitgestellt, die dazu befähigt ist, für ein Polypeptid eines Antikörpers oder eines Konjugats gemäß einer beliebigen der vorstehend beanspruchten Begriffsbestimmungen zu codieren. Der Begriff "befähigt, für ... zu codieren" ist derart aufzufassen, dass er Polynukleotidsequenzen unter Berücksichtigung des degenerierten Charakters des genetischen Codes miteinschließt, bei welchem einige Aminosäuren von mehr als nur einem Codon codiert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der ein Polynukleotid nach der obigen Begriffsbestimmung umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit einer Polynukleotidsequenz nach der obigen Begriffsbestimmung transformiert wurde, oder ein transgenes nicht-menschliches Tier oder eine transgene Pflanze, das/die aus der Wirtszelle entwickelt wurde.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, welche ein Konjugat der Erfindung gemäß der Beschreibung im vorliegenden Schriftstück umfasst, und zwar in Verbindung mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel oder Trägerstoff, wahlweise in einer Form, die zur intravenösen Verabreichung geeignet ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat gemäß der Beschreibung im vorliegenden Schriftstück bereitgestellt, welches zur Verwendung als Arzneimittel bestimmt ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat gemäß der Beschreibung im vorliegenden Schriftstück bereitgestellt, welches dazu verwendet wird, ein Arzneimittel herzustellen, das der Behandlung neoplastischer Krankheiten dient.
Es versteht sich, dass die Dosis und die Dosierungsvorschriften von der jeweils eingesetzten Effektorgruppe, von dem Bestand an Zielzellen und von der Patientengeschichte abhängen. von dem Konjugat wird typischerweise eine Dosis verabreicht, die im Bereich von 0,1 bis 1 mg/kg Gewicht des Patienten liegt.
Die Konjugate der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht. Somit wird gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, welche ein Konjugat (gemäß der Begriffbestimmung im vorliegenden Schriftstück) in Verbindung mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel oder Trägerstoff umfasst. Ein Beispiel für eine solche Formulierung ist im vorliegenden Schriftstück in Beispiel 10 gegeben.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Dosierungsformen formuliert werden. Im Allgemeinen werdend die Konjugate der vorliegenden Erfindung parenteral, vorzugsweise intravenös, verabreicht. Eine besondere parenterale pharmazeutische Zusammensetzung ist in Form einer Dosiereinheit formuliert, welche sich für eine Verabreichung durch Injektion eignet. Somit gehören eine Lösung, eine Emulsion oder eine Suspension des Immunotoxins in Verbindung mit einem pharmazeutisch unbedenklichen parenteralen Trägerstoff oder Verdünnungsmittel zu den besonders geeigneten Zusammensetzungen. Zu den geeigneten Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln gehören wässrige Vehikel, zum Beispiel Wasser oder Kochsalzlösung, und nicht-wässrige Vehikel, zum Beispiel nicht-flüchtige Öle oder Liposomen. Die Zusammensetzungen können Mittel umfassen, welche die Stabilität des Konjugats in den Zusammensetzungen verbessern. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung einen Puffer umfassen. Die Konzentration des Konjugats wird variieren, aber im Allgemeinen wird derart formuliert, dass dessen Konzentration zwischen ungefähr 1 und 10 mg/ml beträgt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, der für einen Anti-CEA-Antikörper der Erfindung gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück codiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, der mindestens für eine variable Region einer schweren oder leichten Kette eines Anti-CEA-Antikörpers gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück codiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit einem Vektor gemäß der Beschreibung im vorliegenden Schriftstück transformiert ist, welcher mit der darin enthaltenen Expression kompatibel ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit einer Polynukleotidsequenz gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück transformiert ist.
Säugetierzellen (CHO, COS, Myelom) sind als Wirtszellen für die co-Expression der H- und L-cDNA-Ketten von Antikörpern und deren Fragmenten verwendet worden, um Antikörper mit der spezifizierten Bindungsaktivität herzustellen (Bebbington, C., 1991, Methods, vol 2, 5.136 bis 145, und Adair, J., 1992, Immunological Reviews, vol 130). Für die Expression von Konstrukten, die zur direkten Expression von aktivem CPB führen, werden COS- oder CHO-Zellexpressionssysteme bevorzugt. Die cDNAs können auf Plasmiden eingeführt werden um dort entweder, insbesondere für CHO-Zellen, in die chromosomale DNA integriert zu werden oder, insbesondere bei COS-Zellen, sich in sehr hoher Anzahl zu replizieren. Die Plasmide benötigen im Allgemeinen einen selektierbaren Marker für die Fortbestand in transfizierten Wirtszellen, einen wirksamen eukaryotischen Promotor, um ein hohes Transkriptionsniveau von den cDNAs zu erreichen, zweckmäßige Restriktionsenzymstellen zum Klonieren and für die Polyadenylierung sowie Transkriptionsendsignale für die Stabilität der Nachricht. Mehrere solche Vektoren sind in der Literatur beschrieben worden (Bebbington, C. et al, 1992, Bio/Technology, vol 10, 5.169 bis 175, und Wright, A., 1991, Methods, vol 2, 5.125 bis 135), und es gibt gewerblich erhältliche Vektoren (wie etwa pRc/CMV, Invitrogen Corp.), die geeignet sind.
Die Expression einer Reihe von Antikörperfragmenten in E.Coli ist gut dokumentiert (Übersichtsartikel von Pluckthun, A., Immunological Reviews, 1992, vol 130, S.151 bis 188 und Skerra, A., Current Opinion in Immunology, 1993, vol 5, S.256 bis 262). Die intrazelluläre Expression von Fd- and L-Ketten ist beschrieben worden (Cabilly, S., 1989, Gene, vol 85, 5.553 bis 557), aber es kann eine in vitro Neufaltung und Wiederverbindung der Ketten erforderlich sein (Buchner, J und Rudolph, R., 1991, Bio/Technology, vol 9, S.157 bis 162), um Bindungsaktivität herzustellen. Die periplasmatische Sekretion ist eine wirksamere Vorgehensweise, um aktive Antikörperfragment zu erhalten (Better, M. et al, 1988, Science, vol 240, S.1041 bis 1043). Die H- und L-Kettenbestandteile des Antikörperfragments werden von einem einzigen Plasmid co-exprimiert. Jede der Antikörperketten ist mit einem bakteriellen Führungspeptid versehen, welches deren Übergang in das Periplasma von E.Coli bewirkt, wo das Führungselement abgespalten wird und die freien Ketten sich verbinden, um lösliche und aktive Antikörperfragmente zu produzieren. Von diesem Vorgang wird angenommen, dass er den natürlichen Vorgang in eukaryotischen Zellen imitiert, bei welchem exprimierte Antikörperketten in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums gelangen, bevor sie sich zu ganzen Antikörpern verbinden. Dieser Vorgang führt oftmals dazu, dass der Überstand des Kulturansatzes Bindungsaktivität aufweist.
Bei einigen Expressionssystemen wird eine Wirtszelle mit einem Vektor transformiert; derartige Systeme sind wohlbekannt, wie beispielsweise in E.Coli, Hefe und Säugetierwirtszellen (siehe Methods in Enzymology 185, Academic Press 1990). Es sind auch andere Expressionssysteme denkbar, wie beispielsweise transgene nicht-menschliche Säugetiere, bei denen das fragliche Gen, welches vorzugsweise aus einem Vektor ausgeschnitten wurde und vorzugsweise in Verbindung mit einem Milchdrüsenpromotor eingesetzt wird, um das exprimierte Protein in die Milch des Tieres gelangen zu lassen, in den Pronukleus einer Säugetierzygote eingeführt wird (üblicherweise durch Mikroinjektion in einen der beiden Kerne (üblicherweise den männlichen Kern) des Pronukleus), woraufhin eine Einpflanzung in ein Leihmuttertier erfolgt. Ein Teil der Tiere, die von der Leihmutter geboren werden, wird das eingeführte Gen, welches in ein Chromosom integriert wurde, tragen und exprimieren. Üblicherweise wird das integrierte Gen durch herkömmliche Züchtung an die Nachkommen weitergegeben, wodurch der Bestand ausgedehnt werden kann. Vorzugsweise wird das fragliche Protein einfach aus der Milch des weiblichen transgenen Tieres gewonnen. Der Leser sei auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen: Simons et al. (1988), Bio/Technology 6:179–183; Wright et al. (1991), Bio/Technology 9:830–834; US 4,873,191 und; US 5.322,775 . Die Manipulation von Mausembryonen ist bei Hogan et al, "Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory 1986 beschrieben.
Es ist auch an transgene Pflanzentechnologie zu denken, wie sie beispielsweise in der folgenden Veröffentlichung beschrieben ist: Swain W.F. (1991) TIBTECH 9: 107–109; Ma J.K.C. et al (1994) Eur. J. Immunology 24: 131–138; Hiatt A. et al (1992) FEBS Letters 307: 71–75; Hein M.B. et al (1991) Biotechnology Progress 7: 455–461; Duering K. (1990) Plant Molecular Biology 15: 281–294.
Wenn dies gewünscht wird, können die Gene des Wirtsorganismus unter Verwendung von Standardverfahren inaktiviert oder modifiziert werden, wie unten kurz dargelegt wird und wie zum Beispiel in "Gene Targeting; A Practical Approach", IRL Press 1993 beschrieben ist. Das Zielgen oder ein Teil desselben wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, wobei Selektionsmarker (wie etwa NEO) in das Gen eingefügt wird, um dessen Funktion auszuschalten. Der Vektor wird linearisiert und anschließend (üblicherweise durch Elektroporation) in embryonale Stammzellen (ES)(die sich z.B. vom 129/Ola-Strang der Maus ableiten) transformiert, woraufhin eine homologe Rekombination in einem Teil der Stammzellen stattfindet. Der Bestand an Stammzellen, welche die Genabschaltung aufweisen, wird ausgedehnt und in eine Blastozyste (wie beispielsweise diejenige aus einem C57BL/6J Maus) injiziert und dann zur weiteren Entwicklung einem Leihmuttertier eingepflanzt. Chimärische Nachkommen könnte mittels eines Fellfärbungsmarkers identifiziert werden. Die chimärischen Tiere werden gezüchtet, um die Verteilung der ES-Zellen auf die Keimbahn sicherzustellen, wobei Mäuse gepaart werden, die genetische Marker aufweisen, die es ermöglichen, zwischen ES-abgeleiteten Gameten und solchen, die sich von Blastozyten des Wirts ableiten, zu unterscheiden. Die Hälfte der Gameten, die sich von ES-Zellen ableiten, wird die Genmodifizierung tragen. Die Nachkommen werden gescreent (z.B. mit Hilfe von Southern Blots), um diejenigen zu identifizieren, die eine Genabschaltung aufweisen (ungefähr 50% der Nachkommenschaft). Diese selektierten Nachkommen sind heterozygotisch und können daher mit einem weiteren Heterozygoten vermehrt werden, sowie mit homozygotischen Nachkommen, die im Folgenden selektiert werden (ungefähr 25 % der Nachkommenschaft). Transgene Tiere mit einem Gen-Knockout können mit transgenen Tieren, die mit Hilfe bekannter Techniken wie etwa der Mikroinjektion von DNA in Pronuklei, der Sphäroblastenfusion (Jakobovits et al. (1993) Nature 362: 255–258) oder der lipidvermittelten Transfektion (Lamb et al. (1993) Nature Genetics 5 22–29) von ES-Zellen erzeugt wurden, gekreuzt werden, um transgene Tiere mit einem endogenen Gen-Knockout und Fremdgenersatz zu erhalten.
ES-Zellen, welche die gewünschte Genabschaltung aufweisen, können weiter modifiziert werden, indem sie mit der Zielgensequenz, die eine spezifische Veränderung enthält, transformiert werden, wobei diese vorzugsweise in einen Vektor kloniert und vor der Transformation linearisiert wird. Nach homologer Rekombination ist das veränderte Gen in das Genom eingeführt. Diese embryonischen Stammzellen können anschlieflend dazu verwendet werden, wie oben beschrieben, transgene Organismen zu schaffen.
Der Begriff "Wirtszelle" umfasst beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zellen, die für die Expressionstechnik geeignet sind, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen und nicht-menschliche Säugetierzygoten, -oozyten, -blastozyten, embryonische Stammzellen sowie beliebige andere Zellen, die für die transgene Technik geeignet sind. Wenn die Umstände es zulassen, umfasst der Begriff "Wirtszelle" ebenfalls eine transgene Pflanze oder ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, die/das aus transformierten nicht-menschlichen Säugetierzygoten, -oozyten, -blastozyten, embryonischen Stammzellen, Pflanzenzellen sowie beliebigen anderen Zellen, die für die transgene Technik geeignet sind, entwickelt wurde.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Behandlungsverfahren für einen Menschen oder ein Tier bereitgestellt, der/das eine solche Behandlung benötigt, wobei das Verfahren das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Konjugats gemäß der Beschreibung im vorliegenden Schriftstück an einen Menschen oder ein Tier umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das dazu dient, Zellen, welche das Antigen CEA aufweisen, gezielt eine Effektorgruppe zuzuführen, und zwar in einem Säugetier, das einer solchen gezielten Zuführung bedarf, wobei das Verfahren das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Konjugats der Erfindung gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, der dazu bestimmt ist, gemäß der Beschreibung im vorliegenden Schriftstück bei einem diagnostischen Verfahren eingesetzt zu werden.
Eines dieser diagnostischen Verfahren ist der Immunoassay. Ein Immunoassay für in vitro-Tests, der auf dem neuartigen Antikörper gemäß der Erfindung beruht, kann nach herkömmlichen immunologischen Techniken des Fachgebietes erstellt werden, wobei der Antikörper gemäß der Erfindung in markierter oder unmarkierter Form zum Einsatz kommt und festgestellt wird, ob sich in der zu untersuchenden Probe ein Komplex aus dem Antikörper und CEA bildet. In einem der Fälle kann der Antikörper mit einem nachweisbaren Marker wie etwa einem Radiomarker, einem Chemilumineszenzmarker, einem Fluoreszenzmarker oder einem Enzymmarker versehen werden. Alternativ dazu wird der Antikörper über einen Komplex, den er mit einer markierten Substanz bildet, oder mittels einer Technik ohne Markierung nachgewiesen, wie etwa mit Hilfe von Biosensor-Verfahren, die z.B. auf der Oberflächenplasmonresonanz beruhen. Die Probe kann, zum Beispiel, in Form einer Körperflüssigkeit wie etwa Serum, oder aber als Gewebepräparat (histochemischer Assay) vorliegen.
Für Zwecke der in vivo-Diagnose wird der Antikörper gemäß der Erfindung mit einem geeigneten extern nachweisbaren Marker wie etwa einem Radiomarker oder einem Schwermetallatom versehen und dem Patienten verabreicht, woraufhin festgestellt wird, ob es zu einer möglichen lokalen Anreicherung des Antikörper im Körper kommt.
Für die in vitro-Diagnose von Krebs kann der Anti-CEA-Antikörper entweder mit Enzymen wie etwa Meerrettichperoxidase und bakterieller Luciferase, welche ein messbares Signal erzeugen, oder mit fluoreszierenden Markern oder Radioisotopen, welche direkt nachgewiesen und quantifiziert werden können, konjugiert werden. In einem Standard-Immunoassaysystem stellen derartige Konjugate ein Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von CEA in Körpergewebe dar und liefern somit ein schnelles und leicht anzuwendendes Testverfahren bei der Diagnose von Tumorkrankheiten. Es sei auf die allgemeinen Beschreibungen der Methodologie, die beim Enzymimmunoassay eingesetzt wird, verwiesen, E.T. Maggio, CRC Press und US 3690 8334 , US 3791 932 , US 3817 837 , US 3850 578 , US 3853 987 , US 3867 517 , US 3901 654 , US 3935 074 , US 3984 533 , US 3996 345 und US 4098 876 .
Für die in vivo-Diagnose von Krebs kann der Anti-CER-Antikörper mit Isotopen von Elementen wie etwa Yttrium, Technetium oder Indium oder aber mit Schwermetallisotopen, welche mit Kameras zur Ganzkörperbildgebung nachgewiesen werden können, konjugiert werden (siehe Larson, S.M., 1987, Radiology, 165, 297–304.
Für die Krebstherapie kommt bei bevorzugten Ausführungsformen ein Anti-CEA-Antikörper zum Einsatz, der mit einer Effektorgruppe konjugiert sein kann, welche Krebszellen direkt töten kann oder aber über die Aktivierung eines geeigneten Prodrugs in einem ADEPT-System. Im Rahmen von ADEPT wird das selektive Abtöten von Tumorzellen erreicht, indem der Anti-CEA-Antikörper mit einem Enzym konjugiert wird, was dazu befähigt ist, die Umwandlung einer nicht-toxischen Dosis eines Prodrugs in eine wirksame toxische Arzneimittelverbindung zu katalysieren. Die Verabreichung des Konjugats für dazu, dass die Enzymaktivität sich lokal an der Tumorstelle entfaltet. Die anschließende Verabreichung des Prodrugs führt zu einer lokalen Produktion des toxischen Arzneimittels und zu einer selektiven Tötung an der Tumorstelle. Diese Herangehensweise ist in WO 88/07378, US 4,975,278 , US 5,405,990 und WO 89/10140 beschrieben. Der Antikörper 806.077 kann auch, wie oben beschrieben, mit einem co-stimulierenden Molekül für die Tumor-Immunotherapie konjugiert werden.
Das selektive Töten von Tumorzellen kann auch erreicht werden, indem der Anti-CEA-Antikörper entweder direkt oder durch chemische Derivatisierung mit makrozyklischen Chelatbildnern konjugiert wird, welche hochenergetische Radioisotope wie etwa ⁹⁰Y, ¹³¹I und ¹¹¹In enthalten. Der Anti-CEA-Antikörper dient dazu, das Isotop örtlich beschränkt dem Tumor zuzuführen, und die Strahlung, die von dem Isotop ausgesendet wird, zerstört die DNA der umgebenden Zellen und töten den Tumor.
Das selektive Töten von Tumorzellen kann ebenfalls erreicht werden, indem der Anti-CEA-Antikörper mit zytotoxischen und zytostatischen Arzneimitteln wie etwa Methotrexat, Chlorambucil, Adriamycin, Daunorubicin and Vincristin konjugiert wird. Diese Arzneimittel finden seit Jahren klinische Anwendung, wobei ihr therapeutischer Nutzen oft durch ihre unspezifische Toxizität eingeschränkt wird. Die Konjugation dieser Arzneimittel mit dem CEA-Antikörper ermöglicht es diesen Arzneimitteln, örtlich beschränkt an der Tumorstelle zu wirken und so die Dosis des Arzneimittels, die zum Tumor gelangt, zu erhöhen, ohne es zu unannehmbaren Nebenwirkungen kommt, welche derartige Arzneimittel auf andere Gewebe wie etwa das Knochenmark oder das Nervensystem ausüben.
Die Wirksamkeit des Antikörpers wird bei vielen Anwendungen verbessert, indem die Größe der antikörperbindenden Struktur verringert wird, wodurch die Gewebedurchdringung sowie weitere pharmakodynamische Eigenschaften der pharmazeutischen Zusammensetzung verbessert werden. Dies kann erreicht werden, indem die Fc-Region des Antikörpermoleküls entweder enzymatisch oder mit Hilfe von gentechnischen Verfahren entfernt wird, um ein rekombinantes Fab'- oder F(ab')₂-Fragment herzustellen.
Um die Größe des Anti-CEA-Antikörpers weiter zu verringern, können ebenfalls gentechnische Verfahren angewendet werden. Die Fv, welche. die CDRs enthalten, können isoliert technisch bearbeitet und exprimiert werden, um beispielsweise durch Verwendung von Disulfidbrücken chemisch vernetzt zu werden. Alternativ dazu können die Domänen sowohl der leichten als auch der schweren Ketten, aus denen die Fv-Struktur besteht, als eine einzelne Polypeptidkette (SCFv) hergestellt werden, indem die Fv-Domänen mit einer Linker-Peptidsequenz zwischen dem natürlichen C-Terminus einer Domäne und dem N-Terminus einer anderen Domäne kondensiert werden (siehe PCT/US/87/02208 und US 4704692 ). Alternativ dazu kann eine einzelne Fv-Domäne isoliert exprimiert werden und einen Einzeldomainenantikörper oder dAb bilden, wie bei Ward et al Nature (1989) 341, 544 beschrieben ist. Eine weitere denkbare Art von Anti-CEA-Antikörper ist ein V-min-Konstrukt, wie es in der internationalen Patentanmeldung WO 94/12625 (Erfinder Slater & Timms) offenbart wird. Zu den Abkürzungen, die im vorliegenden Schriftstück gebraucht werden, gehören:

ADEPT: antibody directed enzyme prodrug therapy (Antikörpergesteuerte Enzym-Prodrugtherapie)
APC: antigen presenting Cell (antigenpräsentierende Zelle)
CDRs: complementarity determining regions
CER: Carcinoma Embryonic Antigen (embryonisches Antigen von Karzinomen)
CL: constant domain of antibody light chain (konstante Domäne der leichten Antikörperkette)
CPB: Carboxypeptidase B
CPG2: Carboxypeptidase G2
DAB: 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Substrat
DEPC: Diethylpyrocarbonat
DMEM: Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium
ECACC: European Collection of Animal Cell Cultures
EIA: Enzym-Immunoassay
ELISA: enzyme linked immunosorbent assay (enzymgekoppelter Immunadsorptionstest)
FCS: foetal calf serum (fötales Kälberserum)
Fd: Schwere Kette von Fab, Fab' oder F(ab')₂, wahlweise ein Hinge enthaltend
HAMA: Humaner Anti-Maus Antikörper
HCPB: Humane Carboxypeptidase B, vorzugsweise aus der Bauchspeicheldrüse
Hinge: (eines IgG) ein kurzes, prolinreiches Peptid, das Cysteinbausteine enthält, welche die beiden schweren Ketten brückenartig verknüpfen
HRPO: horse radish peroxidase (Meerrettichperoxidase)
NCA: non-specific cross reacting antigen (unspezifisches kreuzreagierendes Antigen)
NCIMB: National Collections of Industrial and Marine Bacteria
PBS: phosphate buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PCR: polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
präproCPB: proCPB mit einer N-terminalen Führungssequenz
proCPB: CPB mit seiner N-terminalen Prodomäne
SDS-PAGE: sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis (Natriumlaurylsulfat – Polyacrylamidgelelektrophorese)
TBS: Tris-buffered Saline (Kochsalzlösung mit TRIS-Puffer)
VH: variable Region der schweren Antikörperkette
VK: variable Region der leichten Antikörperkette

Die Erfindung wird durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele (sowie durch Vergleichsbeispiele, die den Beispielen folgen) erläutert, wobei:
1 die Antitumor-Aktivität des Antikörper 806.077-CPG2-Konjugats in einem ADEPT-Modell zeigt;
2 eine Plasmid-Kartierung von pCF009 zeigt;
3 BIAcore-Daten dargestellt sind, welche das Antikörper-B7.1-Fusionsprotein zeigen, das an immobilisiertes CTLA4-Ig bindet, wobei die durchgezogene Linie für die Bindung im Test steht und die gepunktete Linie eine Blindkontrolle ist; und soweit keine anderslautenden Angaben gemacht werden;
Die DNA unter Verwendung eines GENECLEAN^TM II Kits (Stratech Scientific Ltd. oder Bio 101 Inc.) gewonnen und auf gereinigt. Das Kit enthält: 1) Natriumiodid 6M; 2) eine konzentrierte Natriumchloridlösung, TRIS and EDTA zur Herstellung einer Natriumchlorid/Ethanol/Wasser-Spüllösung; 3) "Glassmilk" – ein 1,5-ml-Probenfläschchen, welches 1,25 ml einer Suspension einer speziell formulierten Siliziumdioxidmatrix in Wasser enthält. Es handelt sich hierbei um eine DNA-Aufreinigungstechnik, die auf dem Verfahren von Vogelstein und Gillespie beruht, welches in den Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1979) Vol 76, S.615. veröffentlicht wurde. Kurz gesagt, läuft das Kit-Verfahren wie folgt ab. Zu 1 Volumen des Gelabschnitts wurden 3 Volumina an Natriumiodidlösung aus dem Kit gegeben. Die Agarose wurde geschmolzen, indem die Mischung 10 min. lang auf 55°C erwärmt wurde, woraufhin "Glassmilk" (5 bis 10 ml) hinzugefügt gut gemischt wurde, um den Ansatz dann 10 min. lang bei Umgebungstemperatur ruhen zu lassen. Die "Glassmilk" wird abzentrifugiert und 3mal mit NEW WASH (0,5 ml) aus dem Kit gewaschen. Der Waschpuffer wird aus der "Glassmilk" entfernt, welche an der Luft getrocknet wird. Die DNA wird eluiert, indem die getrocknete "Glassmilk" 5 bis 10 min. lang bei 55°C mit Wasser (5–10 ml) inkubiert wird. Der wässrige Überstand, der die eluierte DNA enthält, wird durch Zentrifugation gewonnen. Der Elutionsschritt kann wiederholt und die Überstände vereinigt werden.
Kompetente E.Coli DH5α-Zellen wurden von Life Technologies Ltd (MAX efficiency DH5α competent cells) bezogen;
Kleine Ansätze von Doppelstrang-Plasmid-DNA wurden unter Verwendung des RPM^TM DNA-Präparationskits von Bio 101 Inc. (Kat.-Nr. 2070-400) oder mit einem ähnlichen Produkt hergestellt – das Kit enthält eine alkalische Lyse-Lösung zur Freisetzung von Plasmid-DNA aus den bakteriellen Zellen sowie "Glassmilk" in einem Spinfilter zur Adsorption der freigesetzten DNA, welche anschließend mit sterilem Wasser oder 10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,5, eluiert wird;
Bei dem serumfreien Medium handelt es sich um das serumreduzierte Medium OPTIMEM^TM von GibcoBRL Kat.-Nr. 31985;
Bei dem LIPOFECTIN^TM Reagenz (GibcoBRL Kat.- Nr. 18292-011) handelt es sich um eine 1:1 (w/w) Liposomformulierung des kationischen Lipids N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und von Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) in membrangefiltertem Wasser. Es bindet spontan an DNA, um einen Lipid-DNA-Komplex zu bilden – siehe Felgner et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 7431;
Bei G418 (Sulfat) handelt es sich um GENETICIN^TM, GibcoBRL Kat.- Nr. 11811, ein Aminoglycosid-Antibiotikum, welches mit Gentamicin verwandt ist und als Selektionsmittel in molekulargenetischen Versuchen verwendet wird.
AMPLITAQ^TM, erhältlich bei Perkin-Elmer Cetus, wird als Quelle für thermostabile DNA-Polymerase verwendet; und
Zum Nachvollziehen allgemeiner molekularbiologischer Vorgehensweisen sei auf die Verfahren verweisen, die in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschrieben sind.
Beispiel 1
Entdeckung und Etablierung der Hybridom-Zelllinie 806.077
BALB/C-Mäuse, die 8 bis 10 Wochen alt waren, wurden subkutan mit einer Primärdosis an CEA (10 μg) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,1 ml) sowie Freund'schem kompletten Adjuvans immunisiert. Zwei Wochen später und dann wieder 2 Wochen später wurden den Tieren zur Verstärkung der Wirkung weitere Dosen an CEA (10 μg) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,1 ml), gemischt mit Freund'schem inkompletten Adjuvans (0,1 ml), verabreicht. Zweiunddreißig Wochen später erhielten die Tiere eine letzte intravenöse Immunisierung mit CEA (10 μg) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung und wurden drei Tage später getötet. Die Milzen wurden entnommen, präpariert und NS0-Zellen (erhältlich bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Registierungs-Nr. 85110503) unter Anwendung von Standardverfahren (Kohler und Milstein, Nature (1975) 256, 495) fusioniert. Die erhaltenen Zellen wurden auf Kulturplatten mit 96 Kavitäten verteilt und 2 Wochen lang inkubiert. Die Überstände aus der erhaltenen Hybridomen wurden mittels EIA (Enzym-Immunoassay) gescreent. Von einer Gesamtzahl von 1.824 Kavitäten, die auf 5 Fusionen beruhten, waren 102 Kavitäten positiv gegenüber nativem CEA. Im Fusionsansatz 806 wurden siebzehn Kavitäten für positiv befunden. Die Zellen, die in diesen Kavitäten enthalten waren, wurden durch limitierende Verdünnung kloniert und die erhaltenen Klone wurden mit EIA untersucht. Bei den Linien aus den Originalkavitäten 10/17 war das Klonieren erfolgreich. Eine Linie, die als 806.077 bezeichnet wurde, ist bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Registierungs-Nr. 96022936 eingereicht worden. Die untenstehende Tabelle gibt einen Überblick über das Versuchsprogramm zur Erzeugung von Antikörpern, das zur Entdeckung des Hybridom-Antikörpers 806.077 geführt hat.
Beispiel 2
Herstellung des Antikörpers 806.077 aus der eingereichten Hybridom-Zelllinie ECACC Nr. 96022936
2.1 Herstellung aus serumhaltigem Medium
Eine kryokonserviert gelagerte 1-ml-Ampulle wurde aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und rasch in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut. Der Inhalt wurde aseptisch in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt Die Zellen wurde durch tropfenweises Hinzufügen von 10 ml an Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), welches 10 % (v/v) an fötalem Kälberserum (FCS) enthielt, wieder in Suspension gebracht, wobei vorsichtig durchmischt wurde. Die Suspension wurde 10 min. lang bei 50 × g zentrifugiert, der Überstand aseptisch entfernt und das Pellet in 5 ml DMEM, 10 % FCS und 1 % L-Glutamin wieder in Suspension gebracht, und zwar in einem 25-ml-Gewebekulturkolben, welcher zuvor mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid begast wurde. Der Kolben wurde in der Dunkelheit bei 36,5°C inkubiert.
Nach 3 Tagen wurde weiterkultiviert, indem der gesamte Inhalt des Kolbens in einen größeren 75-ml-Kolben überführt wurde, wobei mit DMEM, 10 % FCS und 1 L-Glutamin verdünnt wurde (erreichte Dichte an lebensfähigen Zellen: 2–3 × 10⁵). Eine erneute Erweiterung auf 162-ml-Kolben wurde in ähnlicher Art und Weise durchgeführt.
Zur Aufreinigung wurden die Überstände der Kulturen in 850-ml-Schüttelkolben mit 500 ml Inhalt weiterkultiviert. Die Kulturansätze in zuvor begasten Schüttelkolben wurden mit 2 × 10⁵ lebensfähigen Zellen/ml beimpft, mit 3 U/min. bewegt und bei 36,5°C inkubiert. Die Kulturen wurden bis zur Reife weitergeführt und typischerweise 500 bis 800 Stunden nach dem Beimpfen entnommen, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen bei weniger als 10 % lag und die IgG-Konzentration ihr Maximum erreicht hatte.
2.2 Behandlung der entnommenen Kultur
Nach der Entnahme wurden die Kulturüberstände aus den Schüttelkolben durch 30minütige Zentrifugation bei 60 × g geklärt. Den geklärten Überstanden wurde Natriumazid (0,02 % w/v) aus Konservierungsstoff zugesetzt, und sie wurden bis zur Aufreinigung bei 4°C in der Dunkelheit gelagert.
2.3 Aufreinigung des Antikörpers 806.077
Der Überstand mit dem Hybridom-Antikörper 806.077 (31) wurde mit verdünntem wässrigem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und durch ein 0,45-μm-Filter (Millipore MILLIDISK^TM) filtriert. Der filtrierte Antikörper-Überstand wurde auf eine Affinitätssäule des Proteins G gegeben (zum Beispiel des Typs Protein G Fast Flow SEPHAROSE^TM, Pharmacia Produktkennzahl 17.0618.03; 5 cm i.d × 6.5 cm = 130 ml;), wobei mit in phosphatgepufferter Kochsalzlösung konditioniert wurde ("PBS"; 8 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, pH 7,3, erhältlich zum Beispiel in Tablettenform zur Rekonstitution bei Oxoid) und eine Flussrate von 4 ml/min. bei 4°C zur Anwendung kam. Die Säule wurde mit PBS (260 ml) gewaschen, und zwar mit der gleichen Flussrate, und der Antikörper wurde mit 100 mM Natriumcitrat (pH-Wert 2,6) eluiert, wobei die Fraktionen aufgefangen und das Eluat durch UV-Absorption (280 nm) kontrolliert wurde. Die UVabsorbierenden Fraktionen, die den Antikörper enthielten, wurden vereinigt, sofort auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer 30-kDa-Ausschlussmembran (z.B. Amicon YM30) auf ungefähr 2 mg/ml konzentriert. Bei der Dialyse, unter Verwendung einer Porositätsmembran mit einer Ausschlussgrenze von 6 bis 8 kDa (z.B. SPECTRAPORTM 1) und mit einer Vorlage aus einem 50 mM TRIS-HCl Puffer (pH = 7), wurden 110 mg an Antikörper 806.077 erhalten, Reinheitsgrad > 95 % nach SDS-PAGE.
Beispiel 3
Selektivität des Antikörpers 806.077
Um die Selektivität zu bewerten, ist eine Vielzahl von menschliche Normal- und Tumorgeweben auf ihre Reaktivität gegenüber dem Antikörper 806.077 untersucht worden, wobei die hochempfindliche dreistufige Immunohistologie zur Anwendung kann, und zwar an acetonfixierte, gefrorenen Cryostat-Abschnitten.
Die Immunohistologie wurde an menschlichen Gewebeabschnitten vorgenommen, die entweder durch Resektionschirurgie oder post mortem erhalten wurden. Um eine optimale Morphologie und antigene Wirkung aufrecht zu erhalten, wurden die Gewebe zu frisch wie möglich entnommen, in kleine Stücke geschnitten (ungefähr 0,5 cm³) und in flüssigem Stickstoff schockgefroren, um dann bei –80°C gelagert zu werden. An einer Cryostat-Anlage wurden die Gewebe in Scheiben (6μ) zerschnitten, auf polylysinbeschichtete Trägerplatten aufgebracht (z.B. blaue TECHMATE^TM Träger, Dako) und 2 Minuten lang mit eiskaltem Aceton fixiert, um dann in Folie eingewickelt und bei –80°C gelagert zu werden.
Die Trägerplatten wurden bei Raumtemperatur auftauen gelassen, und unmittelbar vor der Verwendung wurde die Folie entfernt. Jeder Abschnitt wurde mit einem Diamantmarker umrissen, und zu jedem Abschnitt wurden entweder 100 μl Antikörper 806.077, der mit TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) auf 2 μg/ml verdünnt wurde, oder 100 μl an reaktiver CEA/NCA-Kontrolllösung (Antikörper A5B7) mit einer Konzentration von 2 μg/ml in TBS oder 100 μl MOPC Isotypenkontrolle (Sigma Chemical Company, St. Louis, U.S.A., Kat.- Nr. M 9269) mit einer Konzentration von 2 μl/ml in TBS oder aber eine aussagekräftige Positivkontrolle wie etwa LP34 (Dako) gegeben. Sämtliche der nachfolgenden Inkubationen wurde bei Raumtemperatur für eine Dauer von 30 Minuten in einer befeuchteten Kammer durchgeführt: Sämtliche Waschschritte erfolgten in TBS mit 2maligem Wechsel. Nach der Inkubation wurden die Trägerplatten gewaschen, und zu jedem Abschnitt wurden 100 μl eines zweiten Antikörperreagenzes gegeben, das 1/50 Anti-Maus-Immunglobulin vom Kaninchen, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Dako Patts), sowie 1/5 normales menschliches Serum (Sigma) in TBS umfasste.
Die Trägerplatten wurde erneut inkubiert und in TBS gewaschen. Zu jedem Abschnitt wurde ein letzter Antikörper zum Nachweis gegeben, und zwar 100 μl Anti-Kaninchen-Immunglobulin vom Schwein, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Verdünnung 1/50 mit 1/5 normalem menschlichen Serum in TBS), woraufhin inkubiert und gründlich gewaschen wurde. Ein DAB-Substrat (3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid wurde hergestellt, und zwar unter Verwendung einer DAB-Tablette (Sigma) mit Wasserstoffperoxid (17 μl) in TBS (17 ml), und tropfenweise durch ein Schnellfilterpapier (z.B. Whatman Nummer 4) hinzugefügt. Nach 3 Minuten Inkubation wurde der DAB-Überschuss von den Trägerplatten abgeschüttelt und die Trägerplatten mit TBS gewaschen. Nach Gegenfärbung mit Hämatoxylin (z.B. Mayer's Hämatoxylin, Shandon) wurden die Abschnitte in Alkohol und Xylol dehydratisiert und in einem nichtwässrigen synthetischen Trägerstoff (z.B. E-Z mountant, Shandon) aufgenommen, bevor sie unter einem Mikroskop untersucht wurden.
Die Bereiche der Antikörperbindung zeigten sich durch eine Braunfärbung auf dem Abschnitt. Um den Grad der Bindung des Antikörpers 806.077 an die Gewebe zu beurteilen, wurde ein Bewertungssystem verwendet:

+++ (stark): = Antikörper bindet an > 75 % der Tumorzellen
++ (mäßig): = Antikörper bindet an 50 % bis 75 % der Tumorzellen
+ (schwach): = Antikörper bindet an 25 % bis 50 % der Tumorzellen
+/– (geringfügig): = diffuse Antikörperbindung an einen kleinen Bereich von Tumorzellen
–: = keine Färbung

Das carcinoembryonische Antigen (CEA) ist ein Mitglied der Gen-Superfamilie der Immunglobuline mit einer vorhergesagte Domänenregion, die einer variablen Region ähnlich ist (N-Domäne, 108 Aminosäuren) und drei Sätzen von Regionen, die konstanten Domänen ähnlich sind, und als A1B1, A2B2 und A3B3 bezeichnet werden; die A-Domänen weisen 92 Aminosäuren auf und die B-Domänen 86 Aminosäuren (Hefta, 1992, Cancer Research 52:5647-5655). Zusätzlich dazu besitzt CEA zwei Signalpeptide, eines am Aminoende und eines am Carboxylende. Beide werden während der Verarbeitung nach der Translation entfernt, wobei dasjenige am Carboxyende durch eine Glycosylphosphatidylinosit(GPI)-Gruppe ersetzt wird.
Eine große Anzahl von CEA-verwandten Proteinen wird mit wechselndem Homologiegrad gegenüber CEA sind bekannt (Thompson, 1991, J. of Clinical Laboratory Analysis, 5: 344–366). Dazu gehören unspezifisch kreuzreagierende Antigene, NCA 1 und 2. Diese verwandten Proteine werden in einer Reihe von normalen Geweben einschließlich Granulozyten und normalem Lungenepithel exprimiert. Die Mehrheit der bislang hergestellten monoklonalen Anti-CEA-Antikörper zeigen eine Kreuzreaktion mit einem dieser verwandten Proteine und reagieren daher mit einer Reihe von normalen Geweben, wobei die Reaktion entweder mit Granulozyten oder mit Lungenepithel oftmals stark ausfählt.
Der Anti-CEA-Antikörper 806.077 wurde als CEA-selektiv identifiziert und zeigt keinerlei Kreuzreaktion mit Granulozyten und nur geringfügige Färbung mit den untersuchten normalen 4/14-Lungengeweben
Der Antikörper 806.077 wurde ursprünglich hinsichtlich der Selektivität für Tumoren und NCA gescreent, wobei es sich um den Überstand der Gewebekultur 5 handelte. Die Untersuchungen wurden an reinem und an 1:10-verdünntem Überstand vorgenommen und zeigten eine Bindung des Antikörpers an Dickdarmtumoren, die verglichen mit A5B7 gleichwertig war, während die Bindung an normale Lungen- und Milzgewebe, im Vergleich mit dem gleichen Antikörper, viel geringer ausfiel. Der Antikörper wurde mit dem Affinitätsverfahren aufgereinigt (wie in Beispiel 2 beschrieben) und das Screening wurde wiederholt und auf weitere Tumoren und Gewebearten ausgedehnt.
Der Antikörper quantitativ mit einem Satz von kolorektalen Tumorabschnitten bewertet und diese Untersuchung zeigte, dass die die optimale Konzentration des Antikörpers 806.077 bei 2 μg/ml lag. Sämtliche der anschließenden Untersuchungen wurden unter Verwendung der Antikörper in dieser Konzentration durchgeführt. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erhalten. Die Reaktivität des Antikörpers 806.077 betrug, verglichen mit A5B7 (ebenfalls bei 2 μg/ml untersucht), gegenüber den folgenden Tumoren/normalen Geweben:
Tumorreaktivität des Antikörpers 806.077
Dickdarmtumoren (n = 17).
Bei allen 17 untersuchten Tumoren wurde eine mäßige bis starke Reaktivität (++/+++ gleichwertig mit A5B7) beobachtet.
Brusttumoren (n = 6)
Mäßige/schwache Färbung (+/++), 2/6 Tumoren; geringfügige Färbung (+/–), 2/6 Tumoren.
NSCLC-Tumoren (n = 6).
Starke Färbung (+++), 2/6 Tumoren; mäßige Färbung (++), 1/6 und schwache Färbung (+), 2/6 Tumoren.
Magentumoren (n = 2)
Starke Färbung (+++), 1/2 Tumoren; schwache Färbung (+) 1/2 Tumoren.
Eierstocktumoren (n = 3) und Prostatatumoren (n = 3)
Bei keinem dieser Tumoren wurde eine Färbung beobachtet.
In sämtlichen dieser Fälle wurde eine Reaktivität beobachtet, die gleichwertig mit A5B7 war.
Reaktivität gegenüber normalem Gewebe:
Lunge (NCA-Reaktivität) (n = 14).
Schwache Färbung (+), 4/14 Lungengeweben, keine Färbung (–) 10/14 Geweben.
Die Bindung von A5B7 war mäßig (++) 1/14 Lungengeweben; schwach (+) 10/14 Geweben und geringfügig (+/–), 1/14 Geweben.
Milz (Granylozyten/NCA-Reaktivität) (n = 6).
Bei keinem der untersuchten Milzgewebe wurde eine Färbung beobachtet.
Die Bindung von A5B7 war mäßig (++), 1/6 Geweben und schwach (+) 5/6 Geweben
Normale Gewebe post mortem (n = 13)
Lediglich bei Geweben der Speiseröhre, Haut, Dickdarm und Bauchspeicheldrüse (normale CEA-exprimierende Gewebe) wurde eine mäßige/schwache Reaktivität (++/+) beobachtet. Eine ähnliche Bindung wurde mit A5B7 beobachtet. Zusätzlich zu den positiven Geweben Dickdarm, Haut, Speiseröhre und Bauchspeicheldrüse, wurden folgende Gewebe negativ getestet: Kleinhirn, Mittelhirn, Großhirn, glatte Muskulatur, Leber, Niere, Aorta, Magen, Herz.
Beispiel 4
Herstellung des F(ab')-Fragments des Antikörpers 806.077
Ficin (10 mg) wurde in einer Lösung von 50 mM Cystein (3 ml; BDH 37218) und 50 mM TRIS-HCl (pH 7,0) in Suspension gebracht und 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Überschüssiges Cystein wurde durch Größenausschlusschromatographie (Sephadex^TM G-25 Säule, 1,5 cm × 25 cm; Pharmacia) in 50 mM TRIS-HCl Puffer (pH = 7.0) entfernt. Die verringerte Ficinkonzentration wurde bestimmt, indem die UV-Absorption bei A280nm verfolgt wurde (in der Annahme, dass eine Lösung mit 1 mg/ml in einer 1-cm-Zelle zu einem abgelesenen Wert von 2 führt), wobei ein Wert von 1,65 mg/ml festgestellt wurde.
Eine Lösung des Antikörpers 806.077 (100 mg) in 50 mM TRIS-HCl-Puffer (pH = 7,0) (50 ml) sowie frisch in seiner Konzentration verringertes Ficin (5 mg, 3 ml der obigen Lösung) wurden bei 37°C 20 Stunden lang verdaut. Die verdaute Lösung wurde anschließend mit dem gleichen Volumen an PBS verdünnt und auf eine Protein G Affinitätssäule (Pharmacia SEPHAROSE^TM Fast Flow, 5,0 i.d × 6.5 cm = 125 ml; zuvor bei 4°C mit 50 mM TRIS-HCl Puffer (pH = 7.0) konditioniert) gegeben, bei einer konstanten Flussrate von 3 ml/min. Die Säule wurde mit 50 mM Natriumacetat (pH = 4,0) (250 ml) gewaschen, um niedermolekulare Fragmente zu entfernen, woraufhin mit 50 mM Natriumcitrat (pH = 2,8) aufgegeben wurde, um das F(ab')₂ zu eluieren, wobei die UV-Absorption des Eluats bei A280nm beobachtet wurde. Das F(ab')₂-haltige Eluat wurde auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und der Puffer mittels Dialyse durch 100 mM Natriumphosphat/100mM Natriumchlorid/1 mM EDTA (pH = 7,2) ersetzt, woraufhin unter Verwendung einer 10-kDa-Ausschlussvorrichtung (z.B. Amicon^TM YM10) durch Membranfiltration auf 8 mg/ml aufkonzentriert wurde, wobei die Annahme zugrunde liegt, das eine Lösung von 1 mg/ml in einer 1-cm-Zelle zu einem abgelesenen Adsorptionswert von 1,4 führt. ES wurden 42 mg an F(ab')₂ mit einem Reinheitsgrad von 95 % erhalten, was einer Ausbeute von 65 % entspricht.
Beispiel 5
Herstellung eines Konjugats aus Antikörper 806.077 F(ab')₂ – Carboxypepdidase G2
Für die Derivatisierung des Antikörpers 806.077 F(ab')₂ wurde SATA (S-Acetylthioglycolsäure-N-hydroxysuccinimidester, Sigma, Produktnummer A 9043) als Linker eingesetzt. Für die Derivatisierung der Carboxypepdidase G2 (CPG2) wurde SMPB [4-(p-Maleimidophenyl)buttersäure-N-hydroxysuccinimidester, Sigma, Produktnummer M6139] als Linker eingesetzt.
5.1 F(ab')₂-Derivatisierung:
Eine Lösung von des F(ab')₂-Fragments (40 mg, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben) in 100 mM Phosphat/100mM NaCl/1 mM EDTA (pH = 7,2) (Puffer A, 5 ml) wurde mit SATA (0,28 mg) in DMSO (28 μl) gemischt. Nach 40 Minuten bei Raumtemperatur wurde die erhaltene Lösung auf eine Entsalzungssäule (SEPHADEX^TM G-25, 1,5 cm i.d × 50 cm = 100 ml; konditioniert mit Puffer A bei 4°C), um bei einer Flussrate von 1,2 ml/min. überschüssige Reagentien zu entfernen. Das Eluat wurde mit Hilfe von UV-Absorption bei A280nm beobachtet. Das SATA-derivatisierte F(ab')₂ wurde vereinigt und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 % v/v an 500 mM Hydroxylamin HCl/500mM Natriumphosphat/30 nm EDTA (pH = 8,0) gemischt, um das derivatisierte F(ab')₂ zu deacetylieren. Die Proteinkonzentration wurde durch UV-Absorption bei 280 nm bestimmt, in der Annahme, dass eine Lösung mit 1 mg/ml in einer 1-cm-Zelle zu einem abgelesenen Wert von 1,4 führt. Die Lösung wurde mit Puffer A auf ungefähr 1 mg/ml verdünnt. Die Belegung mit Linkern wurde mittels Ellman's SH-Assay bestimmt, wobei ein Wert von 1,8 bis 2,0 Linkern/mol F(ab')₂ erhalten wurde.
5.2 CPG2-Derivatisierung:
Die Aufreinigung in großem Maßstab von CPG2 aus Pseudomonas RS-16 ist bei Sherwood et al. (1985), Eur, J. Biochem., 148, 447–453 beschrieben. Die Herstellung von F(ab')₂- und IgG-Antikörpern, die an das CPB-Enzym gekoppelt sind, kann mit bekannten Mitteln erfolgen und ist zum Beispiel in PCT WO 89/10140 beschrieben. CPB ist beim Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Vereinigtes Königreich erhältlich. CPG2 kann ebenfalls durch rekombinante Techniken erhalten werden. Die Nukleotidsequenz, die für CPG2 codiert, ist von Minton, N.P. et al., Gene, (1984) 31, 31–38 veröffentlicht worden. Die Expression der codierenden Sequenz in E.Coli ist bekannt (Chambers, S.P. et al., Appl. Microbiol, Biotechnol. (1988), 29, 572–578), ebenso wie die in Saccharomyces cerevisiae (Clarke, L. E. et al., J. Gen Microbiol, (1985) 131, 897–904). Die Synthese des gesamten Gens ist von M. Edwards in Am. Biotech. Lab (1987), 5, 38–44 beschrieben worden. Von der Expression heterologer Proteine in E.Coli berichtet ein Übersichtsartikel von F.A.O. Marston in DNA Cloning Vol. III, Practical Approach Series, IRL Press (Herausgeber D M Glover), 1987, 59–88. Die Expression von Proteinen in Hefe in Gegenstand eines Übersichtsartikels in Methods in Enzymology Volume 194, Academic Press 1991, herausgegeben von C. Guthrie und G R Fink.
Das CPB-Enzym ist erhältlich bei Sigma Chemical Company, Fancy Road, Poole, Dorset, U.K. Das CPB-Enzym ist beschrieben in: Goldman, P. und Levy, C.C., PNAS USA, 58: 1299–1306 (1967) und in: Levy, C.C. und Goldman P., J. Biol. Chem., 242: 2933–2938 (1967). Das Enzym Carboxypepdidase G3 ist in Yasuda, N. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56: 1536–1540 (1992) beschrieben worden. Das Enzym Carboxypepdidase G2 ist in dem Europäischen Patent 121 352 beschrieben.
CPG2 (50 mg; rekombinantes Enzym aus E. coli) wurde in eine Vorlage aus 100 mM Natriumphosphat/100 mM Natriumchlorid (pH = 7,2) (= Puffer B) dialysiert und auf 8 mg/ml verdünnt, in der Annahme, dass eine Lösung mit 1 mg/ml in einer 1-cm-Zelle bei 280 nm zu einem abgelesenen Wert von 0,6 führt.
SMPB (Sigma) wurde mit 10 mg/ml in DMSO gelöst. CPG2 (50 mg in Puffer B bei 8 mg/ml) wurde mit der SMPB-Lösung (0,108 ml; 1,08 mg) gemischt und bei Raumtemperatur 120 Minuten lang umgesetzt. Überschüssige Reagentien wurden auf einer Entsalzungssäule (Sephadex G-25, 1,5 cm i.d × 50 cm = 100 ml; konditioniert mit Puffer B bei 4°C) bei 1,2 ml/min. entfernt. Das derivatisierte CPG2 wurde vereinigt und die Konzentration mittels UV A280nm bestimmt, wobei die Annahme zugrunde liegt, das eine Lösung von 1 mg/ml in einer 1-cm-Zelle zu einem abgelesenen Adsorptionswert von 0,6 führt. Die Lösung wurde bis zu einer CPG2-Konzentration von ungefähr 1 mg/ml verdünnt. Die Belegung mit Linkern wurde mittels eines 'umgekehrten' Ellman's Assay bestimmt, indem eine bekannte Menge an 2-Mercaptoethanol zu dem maleimidoderivatisierten CPG2 gegeben und das nicht umgesetzte -SH dem Assay unterzogen wurde. Es wurde eine Linkerbelegung von 2,0 bis 2,4 Linkern/mol CPG2 festgestellt.
5.3 Konjugation:
Gleiche Gewichtsmaße an deacetyliertem derivatisiertem F(ab')₂ sowie an derivatisiertem CPG2 wurden Unter Stickstoffatmosphäre gemischt und die Mischung (ungefähr 80 ml, bei einer Gesamtproteinkonzentration von ungefähr 1 mg/ml) wurde bei Raumtemperatur 20 Std. lang stehengelassen. Die Reaktion wurde beendet, indem 10 % v/v an 100 mM wässrigem Glycin hinzugefügt wurde. Die rohe Konjugationsmischung wurde einem Pufferaustausch durch Dialyse unterzogen, wobei sie in einem Puffer mit geringem Salzgehalt (50 mM Natriumacetat, pH-Wert 6,0) aufgenommen und bei 4°C auf eine Farbliganden-Affinitätssäule (bei welcher der Farbstoff an CPG2 bindet, z.B. ACL Mimetic Green 1, 2,5 cm i.d × 10 cm = 50 ml), die mit dem gleichen Puffer konditioniert wurde, gegeben, um nicht umgesetztes derivatisiertes F(ab')₂ zu entfernen. Das Konjugat und derivatisiertes CPG2 wurden mit 50 mM Acetat/500 mM NaCl (pH = 6,0) bei einer Flussrate von 2,0 ml/min. eluiert, wobei die Elution mittels UV (A280nm) verfolgt wurde.
Das rohe Konjugat, welches noch derivatisiertes CPG2 enthält, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung mit Ausschluss bei 10 kDa (z.B. Amicon YM10^TM) auf ungefähr 12 ml aufkonzentriert, bei einer Gesamtproteinkonzentration von 5 mg/ml, woraufhin 10 % v/v 10 mM Zinksulfat (Sigma Z 0251) in Wasser hinzugefügt wurden, um die Zinkverluste des CPG2 im Laufe des Verfahrens auszugleichen. Es folgte einer weiterer Chromatographieschritt mit Größenausschluss (z.B. SEPHACRYL 5-300HR^TM Pharmacia, 2,5 cm i.d × 25 cm = 500 ml) bei 4°C in 50 mM Natriumacetat/150 mM Natriumchlorid (pH = 6,0) bei einer Flussrate 1 ml/min., woraufhin die Fraktionen aufgefangen und mittels W A280nm fortlaufend beobachtet wurden, sodass eine Fraktionierung des Konjugats und dessen Abtrennung von nicht umgesetztem derivatisierten CPG2 erzielt wurde, wie mittels SDS-PAGE der Säulenfraktionen festgestellt wurde.
Der Peak, der das Konjugat enthielt (mit Mengenverhältnissen von F(ab')₂:CPG2 von 1:2, 1:1 und 2:1) wurde vereinigt und mittels Ultrafiltration auf 1,3 mg/ml aufkonzentriert, wobei die Proteinkonzentration durch Beobachten der UV-Absorption bei A280nm bestimmt wurde (unter der Annahme, dass 1 mg/ml eine Absorption von 1,0 hat). Die Reinheit des Konjugats wurde mittels SDS-PAGE bestimmt, wobei festgestellt wurde, dass der Gesamtgehalt von Konjugat 12 mg beträgt, mit der Zusammensetzung 65% an Verhältnis 1:1, 20% an Verhältnis 1:2 oder 2:1 und < 5 freiem derivatisierten F(ab')₂ und < 5 % freiem derivatisierten CPG2.
Beispiel 6
Antitumoraktivität des Konjugats aus Antikörper 806.077 F(ab')₂-CPG2 in Kombination mit einem Prodrug.
Die Antitumoraktivität des Konjugats aus Antikörper 806.077 F(ab')₂-CPG2, welches wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt wurde, wurde in Kombination mit dem Prodrug N(4-[N,N-bis(2-Chlorethyl)amino]phenoxycarbonyl)-L-glutaminsäure (in diesem Beispiel "PGP" genannt, beschrieben in Beispiel 1 in US 5,405,990 und von Blakey et al., Br. J. Cancer 72, 1083–88, 1995) ausgewertet, und zwar in einem Xenograft-Modell eines menschlichen kolorektalen Tumors.
Gruppen von 8 bis 10 weiblichen athymischen Nachtmäusen erhielten eine Injektion mit 1 × 10⁷ LoVo kolorektalen Tumorzellen (ECACC-Nr. 87060101). Als die Tumoren einen Durchmesser von 4 bis 5 mm erreicht hatten, wurde entweder das Konjugat aus Antikörper 806.077 F(ab')₂-CPG2 (250 U CPG2-Enzymaktivität Kg^–1) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (170 mM NaCl 3,4 mM KCl, 12 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH = 7,2) intravenös (i.v.) injiziert. Zweiundsiebzig Stunden später wurde der Prodrug PGP i.p. injiziert (3 Dosen von 40 mg/Kg in Intervallen von 1 Std.). Anschließend wurde dreimal pro Woche die Länge der Tumor in zwei Richtungen gemessen und das Tumorvolumen unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Volumen = π/6 × D2 × dwobei D der größere Durchmesser und d der kleinere Durchmesser des Tumors sind. Das Tumorvolumen wurde im Verhältnis zum Tumorvolumen zum Zeitpunkt des Beginns des Prodrug-Einsatzes in der Therapie ausgedrückt. Die Antitumoraktivität wurde mit Kontrollgruppen verglichen, die PBS erhielten, und zwar anstelle von entweder dem Konjugat oder dem Prodrug. Die Antitumoraktivität wurde sowohl als Wachstumsverzögerung, definiert als Zeit, welche die behandelten Tumoren benötigen, um ihr Volumen zu vervierfachen, abzüglich der Zeit, welche die Kontrolltumoren benötigen, um ihr Volumen zu vervierfachen, ausgedrückt, als auch als T/C-Wert, definiert als Volumen des behandelten Tumors geteilt durch das Volumen des Kontrolltumors 14 Tage nach der Verabreichung des Prodrugs. Die statistische Signifikanz der Antitumorwirkungen wurde unter Anwendung der Varianzanalyse (einseitiges Testverfahren) beurteilt.
Die Antitumoraktivität des Konjugats aus Antikörpers 806.077 F(ab')₂-CPG2 in Kombination mit dem Prodrug PGP ist in 1 dargestellt und die Antitumordaten sind unten zusammenfassend dargestellt. Antitumoraktivität des Konjugats aus Antikörper 806.077 F(ab')₂-CPG2 in Kombination mit einem Prodrug PGP in LoVo Tumor Xenograft-Versuchsansätzen.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Konjugat aus Antikörper 806.077 F(ab')₂-CPG2 in Kombination mit einem Prodrug PGP zu einer Tumorregression und zu verlängerten Wachstumsfristen führt, die verglichen mit Kontrollgruppen statistisch signifikant waren.
Beispiel 7
Klonieren von Sequenzieren der variablen Regionen der Gene der schweren und leichten Ketten des Antikörpers 806.077
7.1 Herstellung der cytoplasmatischen RNA
Es gibt mehrere Vorgehensweisen bei der Isolierung von polyA+ mRNA aus eukaryotischen Zellen (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Zweite Ausgabe, 1989, Kapitel 8, S.3, im vorliegenden Schriftstück als "Maniatis" bezeichnet). In diesem besonderen Fall wurde die cytoplasmatische RNA gemäß der Beschreibung von Favoloro et al., Methods in Enzymology 65, 718–749, aus einem gefrorenen Hybridomzellenpellet, welches 1 × 10⁹ Zellen enthielt und bei –80°C gelagert wurde, hergestellt.
Die Zellen wurde in 5 ml eiskaltem Lyse-Puffer (140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM TRIS-HCl (pH = 8,6) und 0,5 % NP40 (ein nichtionisches Reinigungsmittel auf Polyglukoletherbasis; Nonylphenoxypolyethoxyethanol, Sigma Kat.- Nr. 127087-87-0)), welches 400 u eines Ribonukleasehemmers (RNAguard; Pharmacia Kat.- Nr. 27-0815-01) enthielt, wieder in Suspension gebracht und 10 sec. lang durchgemischt. Ein gleiches Volumen an eiskaltem Lyse-Puffer, welches 24 % (w/v) an Saccharose und 1 % NP-40 enthielt, wurde mit dieser Lösung überschichtet und 5 min. lang auf Eis gelagert. Anschließend wurde die Zubereitung bei 4°C mit 4.000 U/min. 30 min. lang in einer Tischzentrifuge (Sorval RT6000B) zentrifugiert, woraufhin die obere cytoplasmatische Phase entfernt und in einem gleichen Volumen an 2 × PK-Puffer (200 mM TRIS (pH = 7,5), 25 mM EDTA, 300 mM NaCl und 2 % (w/v) SDS) aufgenommen wurde. Es wurde Proteinase K (Sigma, Kat.-Nr. P2308) bis zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml hinzugefügt und die Mischung dann 30 min. lang bei 37°C inkubiert.
Die Zubereitung wurde mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform extrahiert, die wässrige Phase entfernt und 2,5 vol. hinzugefügt und gemischt. Diese Lösung wurde anschließend über Nacht bei –20°C gelagert. Die RNA wurde durch Zentrifugation (4.000 U/min., 30 min. bei 4°C in einer Tischzentrifuge, Sorval RT6000B) gewonnen, wobei der Überstand dekantiert und das Pellet in einem Vakuum-Exsikkator getrocknet wurde, woraufhin letzteres in 250 μl diethylpyrocarbonat(DEPC)-behandeltem Wasser (hergestellt wie bei Maniatis beschrieben, Literaturverweis siehe oben) gelöst wurde. Der RNA-Gehalt wurde mittels Spektrophotometrie gemessen und die Konzentration berechnet, und zwar unter der Annahme, dass ein Absorptionswert von 1 bei 260 nm = 40 μg/ml ist.
7.2 Herstellung der cDNA der variablen Region des ersten Stranges
In der Übersicht von Maniatis (Kapitel 8) finden sich eine Reihe von Verfahren zur Synthese von cDNA. Die verwendeten Oligonukleotid-Primer beruhen hauptsächlich auf denen, die von Marks et al. J. Mol. Biol (1991) 222, 581–597 vorgeschlagen werden. In diesem Fall wurde die cDNA wie unten beschrieben hergestellt. RNA (5 mg) wurde in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 μl 5 × reversem Transkriptasepuffer [250 mM TRIS (pH = 8,3), 40 mM MgCl₂ und 50 mM DTT], 1 μl Vorwärtsprimer (25 pM), 10 μl 1,25 mM dNTPs, 5 μl 10 mM DTT, 0,5 μl RNAguard (Pharmacia) gemischt, wobei DEPC-behandeltes H₂O hinzugefügt wurde, um ein Volumen von 50 μl zu erhalten. Die Reaktionsmischung wurde 10 min. lang auf 70°C erhitzt und anschließend langsam auf 37°C abgekühlt, woraufhin 100 u (0,5 μl) M-MLV reverse Transkriptase (Pharmacia Kat.- Nr. 27-0925-01) hinzugefügt wurden und der Reaktionsansatz 1 Std. lang bei 37°C inkubiert wurde. Bei dem Vorwärtsprimer, der zur Herstellung der cDNA der leichten Kette verwendet wurde, handelte es sich um CK2FOR (SEQ ID Nr: 1), welcher erstellt wurde, um sich an die konstante CK-Region von leichten kappa-Ketten von Mausgenen anzulagern. Für die cDNA der schweren Kette wurde der Vorwärtsprimer CGIFOR (SEQ ID Nr: 2) eingesetzt, welcher sich an die konstante CH1-Domäne von IgG1 der Maus anlagert.
7.3 Aminosäuresequenzierung
Die schweren und die leichten Ketten des Antikörpers 806.077 wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot isoliert und einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass der N-Terminus der leichten Kette chemisch blockiert war, für die ersten 34 N-terminalen Reste der schweren Kette wurden indes Sequenzierungsdaten erhalten (SEQ ID Nr: 3). Auf der Grundlage dieser Aminosäuresequenz wurde ein spezifischer DNA-Rückwärtsprimer für die PCR der variablen Region der schweren Kette von 806.077 erstellt. Dieser Primer wurde SP1back genannt (SEQ ID Nr: 7).
7.4 Isolierung des Antikörper-Genfragments mittels PCR
Die Isolierung des Gens der variablen Region der schweren und leichten Kette von 806.077 erfolgte unter Verwendung der wie oben beschrieben hergestellten cDNA als Template. Die allgemeinen Reaktionsbedingungen waren die folgenden.
Zu 5 μl des cDNR-Reaktionsansatzes wurden 5 μl dNTPs (2,5 mM), 5 μl 10 × Enzympuffer (500 mM KCl, 100 mM TRIS (pH 8,3), 15 mM MgCl₂ und 0,1% Gelatine), 1 μl des 25 pM/μl Rückwärtsprimers, 1 μl des 25 pM/μl Vorwärtsprimers, 0,5 μl thermostabile DNA-Polymerase hinzugefügt, sowie DEPC-behandeltes Wasser, um ein Volumen von 50 μl zu erhalten. Die PCR-Bedingungen wurden auf 25 Zyklen von 94°C für 90 sec; 55°C für 60 sec; 72°C für 120 sec eingestellt, wobei der letzte Zyklus mit einer 10minütigen Inkubation bei 72°C endet.
Bei dem Vorwärtsprimer, der unter Anwendung der allgemeinen Reaktionsbedingungen zur Herstellung der cDNA der leichten Kette verwendet wurde, handelte es sich um das Oligonukleotid CK2FOR (SEQ ID Nr: 1) und bei demjenigen für die cDNA der schweren Kette um das Oligonukleotid CGIFOR (SEQ ID Nr: 2). Sowohl für die schwere als auch für die leichte Kette wurden eine Reihe von Reaktionen unter Einsatz mehrerer verschiedener Rückwärtsprimer durchgeführt, um die gewünschten spezifischen PCR-Produkte zu erhalten.
Im Falle der leichten Kette von 806.077 ergab die Analyse, dass ein spezifisches PCR-Produkt erhalten wurde, und zwar unter Einsatz der Rückwärtsprimer VK1back (SEQ ID Nr: 4) und VK4back (SEQ ID Nr: 5). Ähnlich spezifische PCR-Produkte wurden für die schwere Kette erhalten, und zwar unter Einsatz von der Primer VH1back (SEQ ID Nr: 6) und SPlback (SEQ ID Nr: 7). Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 2 %igen Agarosegel analysiert. Die Produkte, welche die erwartete Größe aufwiesen, wurden ausgeschnitten und die DNA auf gereinigt.
7.5 Klonieren der PCR-Produkte in den Vektor Bluescript KS+
Für jedes der Antikörperfragmente wurden sowohl in der 5'-Oligonukleotidregion (Rückwärtsprimer) als auch in der 3'-Region (Vorwärtsprimer) Restriktionsstellen eingeführt. Die herausgetrennten PCR-Produkte sowohl der VH- als auch der VK-PCR-Reaktionen konnten somit in den Vektor Bluescript KS+ (Stratagene Cloning Systems) kloniert werden, und zwar über die geeigneten Enzym-Restriktionsstellen unter Anwendung von Standardverfahren zur DNA-Manipulation (z.B. wurden die PCR-Produkte VH1back/CG1For über PstI/HindIII sowie VK4back/CK2For über SacI/HindIII kloniert). Aus den erhaltenen Klonen wurde die DNA präpariert, und von jedem Konstrukt wurden mindestens 12 Klone durchgehend sequenziert, wobei eine automatisierte Vorrichtung zur Fluoreszenz-Sequenzierung (Applied Biosystems) zum Einsatz kam. Die Sequenzen wurden überprüft, verglichen und unter Verwendung einer geeigneten Computersoftware aliniert. Sowohl für das VH- als auch für das VK-Gen wurden Konsenssequenzen erhalten und anschließend in ihre entsprechenden Aminosäuresequenzen translatiert.
Die DNA- und Aminosäuresequenzen, die für die variable Region (VK) der leichten Kette von 806.077 erhalten wurden, sind in SEQ ID Nr: 8 beziehungsweise in SEQ ID Nr: 9 beschrieben. Die DNA- und Aminosäuresequenzen, die für die variable Region (VH) der schweren Kette von 806.077 erhalten wurden, sind in SEQ ID Nr: 10 beziehungsweise in SEQ ID Nr: 11 beschrieben. Ein Klon, der die leichte Kette enthielt, wurde als VK4 bezeichnet, und ein Klon, der die Sequenz der schweren Kette enthielt, wurde als VH14A bezeichnet.
Beispiel 8
Konstruktion von chimärischen Fd-Genen der leichten und der schweren Kette
Die Gene der schweren und der leichten Kette, welche in das Bluescript kloniert wurden (VK4 und VH14A in Beispiel 7) wurden mittels PCR isoliert, und zwar unter Verwendung von Primern, die es ermöglichten, nur die variable Region der geeigneten Gene spezifisch zu vervielfältigen, die aber auch neue, einzigartige, Enzym-Restriktionsstellen einführten. Dank dieser Restriktionsstellen konnten die Genfragmente der variablen Region in einen Rahmen mit DNA-Fragmenten kloniert werden, die sowohl für die geeigneten Signalsequenzen des Antikörpers als auch für menschliche konstante Regionen codieren. Die Sequenzen der Signal- und der konstanten Region für das Fd der leichten und der schweren Kette waren jeweils zuvor in pNG3 und 0 pNG4, Derivate des eukaryotischen plasmidischen Expressionsvektors pSG5, kloniert worden.
Der Vektor pNG3 wurde wie folgt hergestellt. Das Plasmid pSG5 (Stratagene, Kat.- Nr. 216201) wurde mit SaII und XbaI verdaut, um den existierenden Promotor SV40 und die Polylinkersequenz zu entfernen. Unter Einsatz der Oligonukleotide mit den SEQ Nummern: 34 und 35 wurde ein neuer Polylinker eingeführt, und zwar indem die diese Oligonukleotide hybridisiert und in das Plasmid pSG5, welches mit SaII und XbaI aufgeschnitten wurde, kloniert wurden, um das Plasmid pNG1 zu erhalten. Das Plasmid pNG1 wurde mit BgIII und HindIII aufgeschnitten, um das BgIII–HindIII CMV Promoterfragment aus pcDNA3 (Invitrogen, Kat.- Nr. V790-20) an die Stelle zu klonieren, wodurch das Plasmid pNG2 erhalten wurde. Schließlich wurde die polyA-Region aus pSG5 wie in Beispiel 7, Abschnitt 7.4, beschrieben mittels PCR isoliert, wobei indes die Oligonukleotidsequenzen SEQ ID Nr: 36 und 37 mit dem Plasmid pSG5 zum Einsatz kamen. Das PCR-Produkt wurde mit XmaI und BamHI ausgeschnitten, mittels Elektrophorese auf 2 %igem Agarosegel aufgereinigt, isoliert (z.B. mit GENECLEAN, siehe Beispiel 7) und dann in das Plasmid pNG2, welches mit XmaI–BamHI aufgeschnitten wurde ligiert, um pNG3 zu erhalten.
Der Vektor pNG4 wurde wie folgt hergestellt. Der Vektor pNG3 wurde dahingehend weiter modifiziert, dass die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym SacI, die sich in dem klonierten CMV Promotorfragment befindet, funktionsunfähig gemacht wurde, indem die DNA-Sequenz geändert wurde. Diese wurde erreicht, indem eine zweistufige PCR-Mutagenesereaktion zur Anwendung kam, wobei der Vektor pNG3 als Template diente. Bei der PCR wurden zwei komplementäre Oligonukleotidprimer (SEQ ID Nr: 38 und 39) verwendet, um die Erkennungssequenz für SacI zur Mutation zu bringen sowie 2 flankierende Primer (SEQ ID Nr: 40 und 41) für die Vervielfältigung des Produkts. Zwei Primerpaare (SEQ ID Nr: 38 und 41) und (SEQ ID Nr: 39 und 40) wurden in einer Standard-PCR-Reaktion (wie in Beispiel 7, Abschnitt 7.4 beschrieben) verwendet, um die ursprünglichen 2 PCR-Produkte zu erhalten, welche mittels Elektrophorese auf 2 %igen Agarosegelen isoliert wurden. Äquimolare Mengen von jedem der Produkte wurden gemischt und unter Verwendung der flankierenden Primer (SEQ ID Nr: 40 und 41) erneut vervielfältigt, und zwar unter Standard-PCR-Reaktionsbedingungen, um das PCR-Endprodukt zusammenzuspleißen und zu vervielfältigen. Dieses Produkt wurde anschließend mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII verdaut und derart in einen Vektor pNG3, der zuvor in geeigneter Weise aufgeschnittenen und vorbereitet wurde, kloniert, dass das mutierte (der SacI-Stelle beraubte) Fragment das ursprüngliche NcoI-HindIII-Fragment von pNG3 (mit SacI-Stelle) ersetzt. Dieser neue Vektor wurde als pNG4 bezeichnet.
Ein Klon der leichten Kette des 806.077 der Maus, welcher sich in einem Bluescript KS+ Vektor (VK4) befindet, wurde vorgelegt und unter Verwendung der Oligonukleotidprimer 077VK-UP (SEQ ID Nr: 12) und 077VK-DOWN (SEQ ID Nr: 13) vervielfältigt. In ähnlicher Weise wurde ein Klon (VH14A) des schweren Kette von 806.077 unter Verwendung von 077VH-UP (SEQ ID Nr: 14) und 077VH-DOWN (SEQ ID Nr: 15) vervielfältigt. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: Zu 100 ng an plasmidischer DNA wurden 5 μl dNTPs (2,5 mM), 5 μl 10 × Enzympuffer (siehe oben), 1 μl des 25 pM/μl Rückwärtsprimers, 1 μl des 25 pM/μl Vorwärtsprimers, 0,5 μl thermostabile DNA-Polymerase hinzugefügt, sowie DEPC-behandeltes Wasser, um ein Volumen von 50 μl zu erhalten. Die PCR-Bedingungen wurden auf 15 Zyklen von 94°C für 90 sec; 55°C für 60 sec; 72°C für 120 sec eingestellt, wobei der letzte Zyklus mit einer 10minütigen Inkubation bei 72°C endet. Die Produkte wurden auf einem 2 %igen Agarosegel analysiert. Die DNA wurde aufgereinigt und die DNA-Fragmente zur Vorbereitung auf das anschließende Klonieren in Vektoren mit den betreffenden Restriktionsenzymen verdaut.
Für die Sekretion der leichten Kette des Antikörpers wurde eine doppelsträngige DNA-Kassette erstellt, welche sowohl die Information für eine Kozak-Erkennungssequenz als auch eine Signalsequenz für die leichte Kette enthielt. Die Kassette bestand aus zwei einzelnen Oligonukleotiden (SEQ ID Nr: 42 und 43), die hybridisiert und anschließend zwischen die HindIII- und die SacII-Restriktionsstellen des Plasmids pNG3 (welches in geeigneter weise aufgeschnitten und unter Anwendung von Standardverfahren isoliert wurde) kloniert, um den Vektor pNG3-Vkss zu schaffen. Die DNA-Sequenz entsprechend SEQ ID Nr: 46, welche die Sequenz für die konstante Region der menschlichen leichten kappa-Kette enthält, wurde mit XmaI und XhoI verdaut und zwischen die Schnittstellen von XhoI und XmaI in das Plasmid pNG-Vkss eingefügt, um den Vektor pNG3-Vkss-HuCk (NCIMB-Nr. 40798) zu erhalten. Darüber hinaus wurde eine Expressionskassette für ein Neomycin-Resistenzgen in pNG3-Vkss-HuCk kloniert (aus dem Vektor pSG5-Neo, der eine Variante des Plasmids pSG5 darstellt, erhältlich bei S.Green, Zeneca Pharmaceuticals, zu den alternativen Quellen gehören Vektoren wie etwa pMC1neo, Stratagene Kat.-Nr. 213201). Die Expressionskassette für ein Neomycin-Resistenzgen wurde als XbaI-Fragment kloniert, und sie wurde an die XbaI-Stelle von pNG3-Vkss-HuCk kloniert, wobei die Ausrichtung unter Anwendung der Restriktionsenzymverdauung überprüft wurde. Dadurch entstand das Plasmid pNG3-Vkss-HuCk-Neo (NCIMB 40799). Die Gensequenz der leichten Kette, die oben beschrieben ist, wurde innerhalb des Rahmens eingefügt, indem sie direkt zwischen die SacII- und XhoI-Stellen des Vektors pNG3-Vkss-HuCk-neo kloniert wurde. Das PCR-Fragment, welches für das Gen der leichten Kette erhalten wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen SacII und XhoI verdaut und in den Expressionsvektor kloniert, der in ähnlicher Weise aufgeschnitten wurde und die Sequenzen enthielt, die für die Regionen des VK-Signal und der konstanten Region HuCK codieren. Die chimärische Sequenz der leichten Kette von 806.077, die erstellt wurde, ist in SEQ ID Nr: 16 und 17 dargestellt.
Für die Sekretion der schweren Kette des Antikörpers wurde in ähnlicher weise eine doppelsträngige DNA-Kassette erstellt, welche sowohl die Information für eine Kozak-Erkennungssequenz als auch eine Signalsequenz für die schwere Kette enthielt. Die Kassette bestand aus zwei einzelnen Oligonukleotiden (SEQ ID Nr: 44 und 45), die hybridisiert und anschließend zwischen die HindIII- und die EcoRI-Restriktionsstellen des Plasmids pNG4 (welches in geeigneter Weise aufgeschnitten und unter Anwendung von Standardverfahren isoliert wurde) kloniert, um den Vektor pNG4-VHss zu schaffen. Die Gensequenz der schweren Kette konnte auf diese Weise innerhalb des Rahmens eingefügt werden, indem sie direkt zwischen die EcoRI- und SacI-Stellen des Vektors pNG4-Vkss kloniert wurde. Die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr: 47, welche die Sequenz enthält, die für die konstante Region der schweren Kette von menschlichem IgG2CH1' (SEQ ID Nr: 22 und 23) codiert, wurde mit SacI und XmaI verdaut und in pNG4-VHss kloniert, wobei letzteres mit SacI und XmaI aufgeschnitten wurde, um den Vektor pNG4-VHss-HuIgG2CH1' (NCIMB-Nr. 40797) zu erhalten. Das PCR-Fragment, welches für das Gen der schweren Kette erhalten wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SacI verdaut und in den Expressionsvektor pNG4-VHss-HuIgG2CH1' kloniert, der in ähnlicher Weise aufgeschnitten wurde und die Sequenzen enthielt, die für die Regionen des VH-Signal und der konstanten Region HuIgG2CH1' codieren. Die chimärische Sequenz der HuIgG2 Fd-Kette von 806.077, die erstellt wurde, ist in SEQ ID Nr: 18 und 19 dargestellt.
In einigen Fällen kann es vorzuziehen sein, andere Klassen von chimärischen Konstrukten der schweren Fd-Kette zu verwenden. Zu diesem Zwecke werden Varianten des Vektors der schweren Kette hergestellt, die HulgG1CH1' (SEQ ID Nr: 20 und 21) oder HuIgG3CH1' (SEQ ID Nr: 24 und 25) enthalten, welche das HuIgG2CH1'-Gen (SEQ ID Nr: 22 und 23) ersetzen.
Die Sequenzen, die in den SEQ ID Nr: 46 und 47 dargestellt sind, können mit mehreren Verfahren hergestellt werden, einschließlich derer, die von Edwards (1987) Am. Biotech. Lab. 5, 38–44, Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084–4088, Foguet und Lubbert (1992) Biotechniques 13, 674–675 und Pierce (1994) Biotechniques 16, 708 beschrieben werden. Vorzugsweise werden die Sequenzen, die in den SEQ ID Nr: 46 und 47 dargestellt sind, mittels eines PCR-Verfahren hergestellt, das demjenigen ähnlich ist, das von Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084–4088 beschrieben wurde.
Sobald die einzelnen Sequenzen der schweren und der leichten Kette erstellt waren, wurde eine Genexpressionskassette für die schwere Fd-Kette (einschließlich beider Promotoren und Gene) als BgIII/SaII-Fragment ausgeschnitten und zwischen die BamHI/SaII-Stellen des Vektors der leichten Kette kloniert, um ein co-Expressionsvektorkonstrukt zu erstellen. Dieses Konstrukt wurde in NS0-Myelomzellen (ECACC-Nr. 85110503) transfiziert, und zwar mit Standardtechniken der Elektroporation sowie mit Transfektanten, die hinsichtlich der Eigenschaften der G418-Resistenz selektiert wurden, ein Wesenszug, der aus selektierbarer Marker von dem Expressionsplasmidkonstrukt getragen wird.
Alternativ dazu können die gesamten Gene der schweren Fd-Kette und der leichten Kette einfach aus ihren jeweiligen Vektoren als HindIII/XmaI-Fragment ausgeschnitten und anschließend in andere, frei wählbare, Expressionsvektorsysteme kloniert werden.
Beispiel 9
Hybridisierungstest bei Nukleinsäureänderungen an spezifischen Nukleinsäuresequenzen
9.1 Hybridisierungstest
Es wird ein Verfahren zum Nachweis von Sequenzen, die abgeänderte Nukleinsäuren enthalten, mit Bezug auf spezifische Sequenzen des Antikörpers 806.077 beschrieben. Diese abgeänderten Nukleinsäuren können in verschiedenen Formen auftreten wie etwa als DNA aus Bakterienkolonien oder als DNA/RNA aus eukaryotischen Zellen, die wie oben beschrieben beim Screening einer cDNA-Datenbank auf einer Membran fixiert sind oder als Fragmente auf gereinigter Nukleinsäuren, die durch Gelelektrophorese getrennt und dann auf eine geeignete Membran übertragen werden, wie dies etwa für Techniken der Northern- (Maniatis et al, Kapitel 7, S.39) oder Southern- (Maniatis, Kapitel 9, S.31) hybridisierung der Fall ist.
9.2 Hybridisierungssonde
Hybridisierungssonden können aus beliebigen DNA- oder RNA-Fragmenten hergestellt werden, die für spezifische Nukleinsequenzen des Antikörpers 806.077 codieren, die von Interesse sind, genauer gesagt aus der variablen Region und insbesondere der Region, die für das CDR3 dieser Region codiert. Ein synthetisches Oligonukleotid oder dessen komplementäre Sequenz kann als eine spezifische Sonde für die Region, die für CDR3 codiert, eingesetzt werden.
Eine Hybridisierungssonde kann aus einem synthetischen Oligonukleotid hergestellt werden, indem eine radioaktive 5'-Phosphatgruppe aus [γ-³²P]ATP durch Einwirken von T4-Polynukleotidkinase angefügt wird. 20 pmol des Oligonukleotids werden zu 20 μl eines Reaktionsansatz, der 100mM TRIS (pH = 7,5), 10 mM MgCl₂, 0,1 mM Spermidin, 20 mM Dithiothreitol (DTT), 7,55 μM ATP, 55 μCi [γ-³²P]ATP und 2,5 u an T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia Biotechnology Ltd, Uppsala, Schweden) enthält, hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wird 30 Minuten lang bei 37°C bebrütet und sowie anschließend 10 Minuten lang bei 70°C, bevor er für die Hybridisierung eingesetzt wird. Bei Maniatis sind Verfahren zur Herstellung von Hybridisierungssonden aus Oligonukleotiden (Kapitel 11) oder aus DNA- und RNA-Fragments (Kapitel 10) dargelegt. Eine Reihe von gewerbsrechtlich geschützten Kits für diese Verfahren sind ebenfalls erhältlich.
9.3 Hybridisierungsbedingungen
Filter, welche die Nukleinsäure enthalten, werden in 100 ml einer Lösung, die 6 × SSC, 0,1 % SDS und 0,25 % Magermilchpulver (Marvel^TM) enthält, bei 65°C mindestens 1 Stunde lang in einem geeigneten geschlossenen Behälter vorhybridisiert. Eine gewerbsrechtlich geschützte Hybridisierungsvorrichtung wie etwa das Modell HB-1 (Techne Ltd) sorgt für reproduzierbare Bedingungen bei diesem Versuch.
Die Vorhybridisierungslösung wird anschließend durch 10 ml einer Sondenlösung, die 6 × SSC, 0,1 % SDS, 0,25 % Magermilchpulver (z.B. Marvel^TM) sowie die oben hergestellte Oligonukleotidsonde enthält, ersetzt. Die Filter werden in dieser Lösung 5 Minuten lang bei 65°C inkubiert, bevor die Temperatur allmählich wieder auf unter 30°C absinken gelassen wird. Die Sondenlösung wird anschließend verworfen und die Filter 5 Minuten lang in 100 ml 6 × SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend folgen weitere Waschschritte mit frischen Chargen der gleichen Lösung, zunächst bei 30°C und dann in 10°C-Stufen ansteigend bei maximal 60°C, wobei jeder der Waschschritte 5 Minuten dauert.
Nach dem Waschen werden die Filter getrocknet und dienen dann zum Bestrahlen eines Röntgenfilms wie etwa Hyperfilm^TM MP (Amersham International), wobei dieser Vorgang bei –70°C in einer vollkommen lichtundurchlässigen Filmkassette erfolgt und die photographische Bildgebung durch Verwendung eines schnellen Wolframatverstärkungsschirms verbessert wird. Der Film wird der Strahlung während einer geeigneten Dauer (normalerweise über Nacht) ausgesetzt, bevor er entwickelt wird, um das photographische Abbild der radioaktiven Bereiche auf den Filtern zu zeigen. Verwandte Nukleinsäuresequenzen werden durch das Vorhandensein eines photographischen Abbildes identifiziert, während Sequenzen ohne jede Verwandtheit im Vergleich dazu kein Abbild erzeugen sollten. Im Allgemeinen werden verwandte Sequenzen bei der höchsten Waschtemperatur (60°C) als Positivbild erscheinen. Verwandte Sequenzen können sich indes auch nur bei geringeren Waschtemperaturen (50, 40 oder 30°C positiv zeigen.
Diese Ergebnisse werden auch von der Beschaffenheit der eingesetzten Sonde abhängen. Sonden aus längeren Nukleinsäurefragmenten benötigen längere Hybridisierungszeiten bei hohen Temperaturen, bleiben dann aber bei höheren Waschtemperaturen und/oder geringeren Salzkonzentration an die verwandten Sequenzen gebunden. Bei kürzeren, gemischten oder degenerierten Oligonukleotidsonden können weniger scharfe Waschbedingungen wie etwa geringere Temperaturen und/oder höhere Na⁺-Konzentrationen erforderlich sein. Die Überlegungen, die hinsichtlich der Vorgehensweise bei der Hybridisierung anzustellen sind, werden bei Maniatis (Kapitel 11) diskutiert.
Beispiel 10
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die folgenden Ausführungen dienen der Erläuterung typischer pharmazeutischer Dosierungsformen, die den Antikörper 806.077 enthalten und in Kombination mit einem geeigneten Prodrug zur Therapie eingesetzt werden können.
Lösungen zur Injektion für das ADEPT-Verfahren
Eine sterile wässrige Lösung, die zur Injektion bestimmt ist und pro ml Lösung folgendes enthält:

Konjugat aus Antikörper 806.077 – CPG2 1,0 mg

Natriumacetat-Trihydrat 6,8 mg

Natriumchlorid 7,2 mg

Tween 20 0,05 mg
Eine typische Dosis des Konjugat liegt für Erwachsene bei 30 mg, woraufhin 3 Tage später 3 Dosen von 1 g des Prodrugs in stündlichen Intervallen verabreicht werden. Als CPG2-Konjugate eignen sich beliebige der Konjugate, die in Beispiele 105 und 106 beschrieben sind. Anstelle der CPG2-Konjugate in der Tabelle können auch Konjugate mit HCPB verwendet werden. Als HCPB-Konjugate eignen sich beliebige der Konjugate, die in den Beispielen 48 bis 101 beschrieben sind.
Lösungen zur Injektion für die Tumorimmunotherapie
Eine sterile wässrige Lösung, die zur Injektion bestimmt ist und pro ml Lösung folgendes enthält:

Konjugat aus Antikörper 806.077 – B7 1,0 mg

Natriumacetat-Trihydrat 6,8 mg

Natriumchlorid 7,2 mg

Tween 20 0,05 mg
Für Erwachsene liegt die typische Dosis des Konjugats bei 30 mg. Ein geeignetes Konjugat ist in Beispiel 104 beschrieben.
Beispiel 11
Konstruktion der Gene der variablen Regionen der schweren und der leichten Kette des ursprünglichen humanisierten Antikörpers 806.077
Im Folgenden wird zunächst ein Überblick über die Humanisierungsstrategie gegeben. Die Humanisierung des Antikörpers dient dazu, die Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers in die tragende Rahmenstruktur eines menschlichen Antikörper zu integrieren, wobei die kennzeichnenden Eigenschaften des parentalen Antikörpers hinsichtlich seiner Antigen-Bindungsaffinität und seiner Spezifizität erhalten bleiben. Die Machbarkeit einer solchen Antikörperveränderungtechnik beruht auf der weitgehenden Homologie der Sequenzen und Strukturen bei Immunglobulinen verschiedener Säugetierarten.
Bei der einfachsten Herangehensweise werden sechs hypervariable Regionen oder "complementarity determining regions" (CDRs) von der Fv-Region eines Antikörpers in diejenige eines anderen übertragen, wie erstmals von Jones et al., Nature (1986) 321 522–525 beschrieben wurde. Die Erfahrung zeigt jedoch, dass es oftmals erforderlich ist, zusätzlich zu den CDRs auch Aminosäuren, die sich in der Rahmenstruktur des Antikörpers befinden, zu übertragen, damit das Verfahren Erfolg hat, was darauf zurückzuführen ist, dass solche Reste offenbar manchmal mit CDR-Schleifen in Kontakt treten und deren Bildung zu beeinflussen scheinen.
Im Falle des Antikörpers 806.077 wurde eine "ursprüngliche" humanisierte Version des Antikörpers hergestellt, welche sechs CDRs der Maus sowie eine Reihe von Substitutionen im Rest 5 der Rahmenstruktur umfasst. Dieses Konstrukt wurde als Template verwendet, von welchem weitere Varianten (Beispiele 12 bis 47) erstellt wurden, indem zusätzliche Substitutionen von "Maus"-Resten durchgeführt wurden. Die übrigen Ausführungen in diesem Beispiel beschreiben im Einzelnen das ursprüngliche humanisierte Konstrukt.
Die variable Region NEWM der schweren Kette des menschlichen Antikörpers (Poljak, R.J et al (1974) PNAS 71 3440–3444) und die variable Region REI der leichten kappa-Kette (Palm, W und Hilschmann, N. Z. (1975) Physiol. Chem. 356 167–191) wurden gewählt, um die aufnehmende Rahmenstruktur des menschlichen Antikörpers zu bilden. Zahlreiche Beispiele für erfolgreiche Humanisierungen, bei denen diese Fv-Rahmenstruktur verwendet wurde, sind in der Literatur beschrieben, und die dreidimensionale Struktur dieser beiden Proteindomänen ist aufgeklärt worden. Auf der Grundlage eines Vergleichs der Proteinsequenzen der variablen Regionen der schweren und der leichten Ketten vom 806.077 der Maus mit den am engsten verwandten Konsenssequenzen (und den einzelnen Baugliedern der Sequenzen) der Maus-Untergruppe nach Kabat sowie mit den Proteinsequenzen von menschlichem NEWM und REI wurden individuelle DNA-Sequenzen erstellt, die für den ursprünglichen humanisierten Antikörper codieren, welcher die Maus-CDRs sowie beliebige weitere für wichtig erachtete Substitutionen in der Rahmenstruktur umfasst.
Die eingebauten CDR-Sequenzen vom 806.077 der Maus sind, für die variable Region der leichten Kette, in den SEQ ID Nr: 26; 27 und 28 beschrieben und befinden sich an den Positionen 24 bis 34 (CDR1), 50 bis 56 (CDR2) beziehungsweise 89 bis 97 (CDR3). Für die variable Region der schweren Kette sind die eingebauten CDRs in den SEQ ID Nr: 29, 31 und 32 beschrieben und befinden sich an den Positionen 31 bis 35 (CDR1), 50 bis 65 (CDR2) beziehungsweise 95–102 (CDR3)(bei Verwendung der Nomenklatur nach Kabat). In der variablen Region der schweren Kette wurde die zusätzlichen Änderungen V24A; S27F; T28N; F29I; 530K; V71A; A92H; R93V (Nomenklatur nach Kabat) an der Rahmenstruktur des NEWM vorgenommen, während in der variablen Region der leichten Kette keinerlei zusätzliche Änderungen in der Rahmenstruktur erfolgten.
Es wurde individuelle synthetische DNA-Sequenzen erstellt, welche für die variablen Regionen der schweren Kette (806.077HuVH1) und der leichten Kette (806.077HuVK1) der ursprünglichen Version des humanisierten Antikörpers 806.077 codieren, bei welchen die CDRs sowie beliebige weitere Änderungen von Resten in der Rahmenstruktur eingebaut sind. Die variablen Gensequenzen des Antikörpers sind in den SEQ ID Nr: 48 und 53 dargestellt und können mit Hilfe verschiedener Verfahren einschließlich derer, die von Edwards (1987) Am. Biotech. Lab. 5, 38–44, Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084–4088, Foguet und Lubbert (1992) Biotechniques 13, 674–675 und Pierce (1994) Biotechniques 16, 708 beschrieben werden, hergestellt werden. Vorzugsweise werden die DNA-Sequenzen, die in den SEQ ID Nr: 48 und 53 dargestellt sind, mit einem PCR-Verfahren hergestellt, welches demjenigen ähnlich ist, das von Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084–4088 beschrieben wird.
Die variable Gensequenz der leichten Kette des humanisierten Antikörpers 806.077 (SEQ ID Nr: 49 und 50) wurde, innerhalb des Rahmens, durch Klonieren in den Expressionsvektor pNG3-Vkss-HuCK-Neo (NCIMB-Nr. 40799) eingefügt. Um dies zu erreichen, wurde das synthetische PCR DNA-Fragment, das für das Gen der variablen humanisierten leichten Kette codiert (SEQ ID Nr: 48), mit den Restriktionsenzymen SacII und XhoI verdaut und in den Vektor pNG3-Vkss-HuCK-Neo kloniert, welcher in ähnlicher Weise aufgeschnitten wurde und die VK-Signalsequenz sowie die Sequenzen, die für die konstante Region HuCK codieren, enthielt. Die DNA sowie die Proteinsequenz der hergestellten vollständig humanisierten Sequenz der leichten Kette von 806.077 (806.077HuVK1-HuCK) sind, gemeinsam mit deren Signalsequenz, in den SEQ ID Nr: 51 beziehungsweise 52 dargestellt, sowie der Vektor, der als pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo bezeichnet wird.
Für die schwere Kette des humanisierten Antikörpers wurde in ähnlicher Weise vorgegangen, wobei die variable Gensequenz der humanisierten schweren Kette mit den SEQ ID Nr: 54 und 55, innerhalb des Rahmens, durch direktes Klonieren in den Expressionsvektor pNG4-VHss-HuIgG2CH1' (NCIMB-Nr. 40797) eingefügt wurde. Um dies zu erreichen, wurde das synthetische PCR-Fragment, welches für das Gen der humanisierten schweren Kette erhalten wurde (SEQ ID Nr: 53), mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SacI verdaut und in den Vektor pNG4-VHss-HuIgG2CH1' kloniert, welcher in ähnlicher Weise aufgeschnitten wurde und die VH-Signalsequenz sowie die Sequenzen, die für die konstante Region HuIgG2 CH1' codieren, enthielt. Die DNA sowie die Proteinsequenz der hergestellten vollständig humanisierten Sequenz der schweren Kette von 806.077 (806.077HuVH1-HuIgG2 Fd) sind, gemeinsam mit deren Signalsequenz, in den SEQ ID Nr: 56 beziehungsweise 57 dargestellt, sowie der Vektor, der als pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2 CH1' bezeichnet wird.
Das Konstrukt des ursprünglichen humanisierten Antikörpers wurde erstellt, indem ein co-Expressionsplasmid, welches sowohl das Gen sowohl der variablen Region 806.077 HuVK1 der leichten Kette als auch der variablen Region 806.077 HuVH1 der schweren Kette des Antikörpers enthielt, konstruiert wurde. Der plasmidische Vektor pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo, der die variable Region HuVK1 (SEQ ID Nr: 49 und 50) der humanisierten leichten Kette enthielt, wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und SaII verdaut, woraufhin der Vektor auf 1 %igem Agarosegel laufen gelassen und die Vektorbande ausgeschnitten und auf gereinigt wurde. Der plasmidische Vektor pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1' (der die variable Region 806.077HuVHl (SEQ ID Nr: 56 und 57) der humanisierten schweren Kette enthielt) wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme BgIII und SaII verdaut, woraufhin der Reaktionsansatz auf 2 %igem Agarosegel laufen gelassen und die Fragmentbande ausgeschnitten und auf gereinigt wurde. Das erhaltene DNA-Fragment wurde anschließend in einen präparierten Vektor pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo ligiert, um Klone das gewünschten co-Expressionsvektors HuVH1/HuVK1 zu produzieren.
Diese Konstrukte wurde mit Hilfe von Standard-Elektroporationstechniken in NS0-Myelomzellen (ECACC-Nr. 85110503) transfiziert und die Transfektanten hinsichtlich der Eigenschaft der G418-Antibiotikaresistenz selektiert. In einem Anti-Mensch-Antikörper ELISA Assay und einem CEA-bindenden ELISA-Assay, welche unten beschrieben sind, wurden die erhaltenen Klone auf die Expression beider Antikörper untersucht.
Für den CEA-ELISA wurden je 50 ng CEA in 50 mM Carbonat/Hydrogencarbonat-Belegungspuffer mit pH9,6 (Pufferkapseln – Sigma C3041) in sämtliche Kavitäten einer Immunoplatte (NUNC MAXISORB^TM) mit 96 Kavitäten gegeben, woraufhin bei 4°C über Nacht inkubiert wird. Die Platte wurde dreimal mit PBS + 0,05 % Tween 20 gewaschen und dann blockiert, indem pro Kavität 150 μl an 1 % BSA in PBS + 0,05 % Tween 20 zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur einwirken gelassen wurden. Die Platte wurde gemäß der obigen Beschreibung gewaschen, woraufhin pro Kavität 100 μl der zu untersuchenden Probe hinzugefügt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Platte wurde erneut dreimal mit PBS + 0,05 % Tween 20 gewaschen, woraufhin pro Kavität 100 μl einer 1/500-Verdünnung von HRPO- markiertem Anti-Mensch-kappa-Antikörper der Ziege (Sigma A 7164) in 1 % BSA in PBS-Tween 20 zugegeben und mindestens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einen Rütteltisch inkubiert wurde. Die Platte wurde wie oben gewaschen und dann ein weiteres Mal mit PBS. Um die Bindung nachzuweisen, wurden pro Kavität 100 μl Entwicklungslösung (eine Kapsel Phosphat-Citrat-Puffer – Sigma P4922 – gelöst in 100 ml H₂O, dem ein 30-mg-Tablette o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid – Sigma P8412 – zugesetzt wurde) hinzugefügt und bis zu 15 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 75 μl 2M H₂SO₄ gestoppt, und die Absorption wurde bei 490 nm gemessen.
Für den Anti-Mensch-Antikörper Fd-ELISA wurden je 1,2 μg des Anti-Mensch-Antikörpers Fd vom Schaf (Bindungsstelle PC075) in 50 mM Carbonat/Hydrogencarbonat-Belegungspuffer mit pH9,6 (Pufferkapseln – Sigma C3041) in sämtliche Kavitäten einer Immunoplatte mit 96 Kavitäten gegeben und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit PBS + 0,05 % Tween 20 gewaschen und dann blockiert, indem pro Kavität 150 μl an 1 % BSA in PBS + 0,05 Tween 20 zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur einwirken gelassen wurden. Die Platte wurde gemäß der obigen Beschreibung gewaschen, woraufhin pro Kavität 100 μl der zu untersuchenden Probe hinzugefügt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Platte wurde erneut dreimal mit PBS + 0,05 % Tween 20 gewaschen, woraufhin pro Kavität 100 μl an HRPO-markiertem Anti-Mensch-kappa-Antikörper der Ziege (Sigma A 7164) in 1 % BSA in PBS-Tween 20 zugegeben und mindestens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einen Rütteltisch inkubiert wurde. Die Platte wurde zuvor gewaschen und dann ein weiteres Mal mit PBS. Um die Bindung nachzuweisen, wurden die Entwicklungslösung usw. wie oben für den CEA.-Bindungsassay beschrieben hinzugefügt.
Diejenigen Klone, bei denen die beste Expression und die besten Niveaus der CEA-Bindung festgestellt wurden, wurde für die weitere Vermehrung selektiert, in eine Platte mit 24 Kavitäten überführt und erneut untersucht. Derjenige Klon, der nach diesen Untersuchungskriterien der Beste war, wurde selektiert und soweit vermehrt, dass ein Liter erhalten wurde, woraufhin dieser Ansatz zum Beimpfen mit einer konfluent gezüchteten Kultur unter Anwendung des 1:10-Verdünnungsschrittes eingesetzt wurde (d.h. 100 ml in 900 ml an frischen Kulturmedium), woraufhin 14 Tage lang weitergezüchtet wurde. Das Fragment F(ab')₂ des menschlichen Antikörpers wurde daraufhin, wie in Beispiel 102 beschrieben, aus dem Kulturüberstand durch Aufreinigung gewonnen.
Beispiele 12 bis 38
Weitere Kombination von Genvarianten der variablen Regionen der humanisierten schweren und leichten Kette: Konstruktion von Varianten der humanisierten schweren und leichten variablen Regionen des 806.077.
Die Gene der variablen Region des ursprünglichen humanisierten 806.077 wurden weiterhin zur anschließenden Konstruktion weiterer Genkonstrukte, die zusätzliche Rahmenstrukturreste der Maus enthalten, verwendet. Die Modifizierungen der Gensequenzen wurden (in der überwiegenden Anzahl der Fälle) durch Kassettenmutagenese erreicht. Bei dieser Technik wird ein Teil des ursprünglichen Gens durch Restriktion mit zwei geeigneten einzigartigen Enzymen aus dem vollständigen Plasmidvektor entfernt und dann durch eine doppelsträngige DNA-Kassette (bestehend aus zwei komplementären Oligonukleotiden, die hybridisiert sind, um ein DNA-Fragment mit geeigneten kohäsiven Enden zu bilden) ersetzt, wobei dieser Vorgang durch direkte Ligation in das präparierte Plasmid erfolgt, wodurch das Gen zwar wiederhergestellt wird, nun aber die gewünschten DNA-Änderungen enthält. Weitere Kombinationen von Mutationen in der schweren und in der leichten Kette könnten auch durch einfachen Austausch von DNA-Fragmenten zwischen geeigneten Varianten erzielt werden, wobei verfügbare einzigartige Enzym-Restriktionsstellen genutzt werden.
Drei weitere Varianten der variablen Region der humanisierten leichten Kette wurden zusätzlich zu der ursprünglichen Sequenz HuVK1 (SEQ ID Nr: 49 und 50) hergestellt und als HuVK2, HuVK3 beziehungsweise HuVK4 bezeichnet. Die Variante der variablen Region der leichten Kette HuVK2 stellte eine Modifizierung ursprünglichen Sequenz, die für HuVK1 codiert, dar und erfolgte mit dem Ziel, die Aminosäureänderung M4L (Nomenklatur nach Kabat) hervorzurufen, wobei das Gen (SEQ ID Nr: 49) durch Kassettenmutagenese mutiert wird. Das Plasmid pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo (welches die vollständige humanisierte leichte Kette enthält (SEQ ID Nr: 49 und 50)) wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme SacII und NheI verdaut. Das Verdauungsprodukt wurde anschließend auf 2 %iges Agarosegel gegeben und das ausgeschnittene Fragment von dem verbleibenden Vektor abgetrennt. Die Vektor-DNA wurde daraufhin aus dem Gel ausgeschnitten, entnommen und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert. Es wurden zwei Oligonukleotide (welche die gewünschten Basenänderungen enthalten) erstellt und synthetisiert (SEQ ID Nr: 58 und 59). Diese beiden Oligonukleotide wurden hybridisiert, indem 200 pmol von jedem der Oligonukleotide in ein Gesamtvolumen von 30 μl H₂O gegeben wurden, woraufhin auf 95°C erwärmt wurde, um schließlich die Lösung langsam wieder auf 30°C abkühlen zu lassen. 100 pmol des zusammengefügten DNA-Produktes wurden anschließend direkt in den zuvor präparierten Vektor ligiert. Dieser DNA-"Kassetten"-Austausch führte zur Bildung der gewünschten DNA- und Proteinsequenzen (SEQ ID Nr: 60 und 61) des HuVK2, die im Expressionsvektor pNG3-Vkss-806.077HuVK2-HuCK-Neo bereits vorliegen.
In ähnlicher Weise wurde HuVK3 mit den Aminosäureänderungen D1Q; Q3V; M4L (Nomenklatur nach Kabat) konstruiert, wobei die synthetischen Oligonukleotide (SEQ ID Nr: 62 und 63) verwendet wurden, um die gewünschten DNA-und Proteinsequenzen (SEQ ID Nr: 64 und 65) des HuVK3 herzustellen, die im Expressionsvektor pNG3-Vkss-806.077HuVK3-HuCK-Neo wiederum bereits vorliegen.
Die Variante HuVK4 der variablen Region der leichten Kette wurde mittels einer anderen Technik hergestellt, da hier keinerlei einzigartige Restriktionsstellen für Enzyme in der Nähe der Mutationsstelle vorhanden waren. HuVK4, welches die Aminosäureänderung L47W aufweist, wurde mit Hilfe einer PCR-Mutagenesetechnik hergestellt. Der Vektor pNG3-806.077HuVK1-HuVK-Neo wurde als Template für zwei PCR-Reaktionen (94°C, 90 sec; 55°C, 60 sec; 72°C, 120 sec, mit 15 Zyklen, sämtliche Puffer usw. gemäß der obigen Beschreibung) eingesetzt. Bei der Reaktion A wurden die synthetischen Oligonukleotidsequenz-Primer SEQ ID Nr: 66 und 67 verwendet, und bei der Reaktion B wurden die synthetischen Oligonukleotidsequenz-Primer SEQ ID Nr: 68 und 69 verwendet. Bei den Produkten dieser PCR-Reaktionen (A und B) handelte es sich um Fragmente mit einer Länge von 535 Basenpaaren beziehungsweise 205 Basenpaaren. Diese Reaktionsprodukte wurden auf 2 %igem Agarosegel laufen gelassen, wobei beliebige Matrixprodukte abgetrennt wurden. Die Banden mit der erwarteten Größe wurden aus dem Gel ausgeschnitten und entnommen. Es wurden Mischungen aus variierenden Mengen der Produkte A und B hergestellt und PCR-Reaktionen unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide SEQ ID Nr: 66 und 68 durchgeführt. Das erhaltene Produkt (ungefähr 700 Basenpaare) wurde mit den Restriktionsenzymen SacII und XhoI verdaut und die Spaltprodukte wurden auf 2 %igem Agarosegel aufgetrennt. Die Bande mit der erwarteten Größe von 310 Basenpaaren wurde aus dem Gel ausgeschnitten und entnommen. Dieses Fragment wurde anschließend in den Vektor pNG3-806.077HuVK1-HuVK-Neo ligiert (welcher zuvor mit den Restriktionsenzymen SacII/XhoI aufgeschnitten und anschließend isoliert worden war), wodurch die gewünschte DNA- und Proteinsequenz (SEQ ID Nr: 70 und 71) des HuVK4 geschaffen wurde, und zwar innerhalb des Expressionsvektor pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo.
Sechs weitere Varianten der variablen Region der humanisierten schweren Kette wurden zusätzlich zu der ursprünglichen Sequenz HuVH1 (SEQ ID Nr: 54 und 55) hergestellt und als jeweils als HuVH2 bis HuVK7 bezeichnet. Die Variante HuVH2 der variablen Region der leichten Kette stellte eine Modifizierung ursprünglichen Sequenz, die für HuVH1 codiert, dar und erfolgte mit dem Ziel, die Aminosäureänderung G49A (Nomenklatur nach Kabat) hervorzurufen, wobei das Gen (SEQ ID Nr: 54) durch Kassettenmutagenese mutiert wird. Das Plasmid pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1' (welches die vollständige humanisierte schwere Kette Fd des IgG2 enthält (SEQ ID Nr: 56 und 57)) wurde, unter Verwendung der Restriktionsenzyme StuI und NotI verdaut. Das Verdauungsprodukt wurde anschließend auf 2 %iges Agarosegel gegeben und das ausgeschnittene Fragment von dem verbleibenden Vektor abgetrennt. Die Vektor-DNA wurde daraufhin aus dem Gel ausgeschnitten, entnommen und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert. Es wurden zwei Oligonukleotide erstellt, synthetisiert (SEQ ID Nr: 72 und 73), hybridisiert und das Produkt direkt in den zuvor präparierten Vektor ligiert. Dieser DNA-"Kassetten"-Austausch führte zur Bildung der gewünschten DNA-und Proteinsequenzen (SEQ ID Nr: 74 und 75) des HuVH2, die im Expressionsvektor pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CH1' bereits vorliegen.
In ähnlicher Weise wurde HuVH3 mit den Aminosäureänderungen T73S; F78A (Nomenklatur nach Kabat) konstruiert, wobei die synthetischen Oligonukleotide (SEQ ID Nr: 76 und 77) verwendet wurde, wobei in diesem Fall jedoch der Vektor pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1' unter Verwendung der Restriktionsenzyme NotI und SacII verdaut wurde. Die synthetische DNA-Kassette wurde direkt in den zuvor präparierten Vektor ligiert, um die gewünschte DNA- und Proteinsequenz (SEQ ID Nr: 78 und 79) des HuVH3 innerhalb des Expressionsvektors pNG4-VHss-806.077HuVH3-HuIgG2 CH1' herzustellen.
HuVH4, welches die Aminosäureänderungen G49A; T73S; und F78A aufweist (Nomenklatur nach Kabat), stellt ein Kombination aus den Varianten HuVH2 (SEQ ID Nr: 74 und 75) und HuVH3 (SEQ ID Nr: 78 und 79) dar. Dies wird erreicht, indem der Vektor pNG4-VHss-806.077HuVH3-HulgG2CH1' mit den Enzymen NotI und NheI verdaut und dann ein ungefähr 200 Basenpaare umfassendes NotI/NheI-Restriktionsfragment nach Auftrennung auf 2 %igem Agarosegel isoliert wird. Das Fragment wurde entnommen und anschließend in den Vektor pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CH1' ligiert (welcher mit den gleichen Restriktionsenzymen NotI and NheI verdaut worden war, wobei das Vektorfragment aufgereinigt worden war). Die erhaltenen Klone enthielten die gewünschte DNA- und Proteinsequenz (SEQ ID Nr: 80 und 81) des HuVH4 innerhalb des Expressionsvektors pNG4-VHss-806.077HuVH4-HuIgG2CH1'.
HuVH5 mit den Aminosäureänderungen V67A (Nomenklatur nach Kabat) wurde konstruiert, wobei die synthetischen Oligonukleotide (SEQ ID Nr: 82 und 83) verwendet wurden. Wiederum wurde der Vektor pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1' unter Verwendung der Restriktionsenzyme NotI und SacII verdaut. Die synthetische DNA-Kassette wurde direkt in den zuvor präparierten Vektor ligiert, um die gewünschte DNA- und Proteinsequenz (SEQ ID Nr: 84 und 85) des HuVH5 innerhalb des Expressionsvektors pNG4-VHss-806.077HuVH5-HuIgG2CH1' herzustellen.
HuVH6 mit den Aminosäureänderungen V67A; T73S und F78A (Nomenklatur nach Kabat) wurde konstruiert, wobei die synthetischen Oligonukleotide (SEQ ID Nr: 86 und 87) verwendet wurden und für diesen Mutanten der Vektor pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1' unter Verwendung der Restriktionsenzyme NotI und SacII verdaut wurde. Die synthetische DNA-Kassette wurde direkt in den zuvor präparierten Vektor ligiert, um die gewünschte DNA- und Proteinsequenz (SEQ ID Nr: 88 und 89) des HuVH6 innerhalb des Expressionsvektors pNG4-VHss-806.077HuVH6-HuIgG2CH1' herzustellen.
HuVH7, welches die Aminosäureänderungen G49A; V69A; T73S; und F78A aufweist (Nomenklatur nach Kabat), stellt ein Kombination aus den Varianten HuVH2 (SEQ ID Nr: 74 und 75) und HuVH6 (SEQ ID Nr: 88 und 89) dar. Dies wird erreicht, indem der Vektor pNG4-VHss-806.077HuVH6-HuIgG2CH1' mit den Enzymen NotI und NheI verdaut und dann ein ungefähr 200 Basenpaare umfassendes NotI/NheI-Restriktionsfragment nach Auftrennung auf einem 2 % igen Agarosegel isoliert wird. Das Fragment wurde entnommen und anschließend in den Vektor pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2CH1' ligiert (welcher mit den gleichen Restriktionsenzymen NotI and NheI verdaut worden war, wobei das Vektorfragment auf gereinigt worden war). Die erhaltenen Klone enthielten die gewünschte DNA- und Proteinsequenz (SEQ ID Nr: 90 und 91) des HuVH7 innerhalb des Expressionsvektors pNG4-VHss-806.077HuVI-I7-HulgG2CH1'.
Es wurden Kombinationen aus solchen Varianten variabler Gen der humanisierten schweren und leichten Ketten hergestellt, indem die Expressionskassette für die Genvariante der schweren Fd-Kette (einschließlich beider Promotoren und des Gens, welches als BgIII/SaII-Fragment ausgeschnitten wurde) ausgeschnitten und dieses Fragment zwischen die BamHI/SaII-Stellen der Vektorvariante der leichten Kette kloniert wurde, um ein co-Expressionsvektorkonstrukt zu erstellen. Die untenstehende Tabelle zeigte eine Auflistung möglicher Variantenkombinationen aus den vorstehend beschriebenen Varianten der humanisierten schweren und leichten Ketten. Tabelle – Variantenkombinationen aus den variablen Regionen der huminisierten schweren und leichten Ketten
In Analogie zu Beispiel 11 wurde Beispiel 14 hergestellt, indem ein co-Expressionsplasmid konstruiert wurde, welches die Antikörpergene der variablen Regionen sowohl der leichten Kette von HuVK4 als auch der schweren Kette von 806.077 HuVH1 enthält. In diesem Fall wurde der plasmidische Vektor pNG3-Vkss- 806.077HuVK4-HuCK-Neo, welcher die variable Region HuVK1 (SEQ ID Nr: 70 und 71) der humanisierten leichten Kette enthält, unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und SaII verdaut, und der Vektor wurde auf 1 %igem Agarosegel laufen gelassen, woraufhin die Vektorbande aufgereinigt wurde. Das Plasmid pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1' (welches die variable Region 806.077 HuVH1 (SEQ ID Nr: 56 und 57) der humanisierten schweren Kette enthält) wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme BgIII und SaII verdaut, und der Reaktionsansatz wurde auf 2 %igem Agarosegel laufen gelassen, woraufhin die Fragmentbande ausgeschnitten und aufgereinigt wurde. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in den präparierten Vektor pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo ligiert, um Klone des gewünschten co-Expressionsvektors für HuVH1/HuVK4 zu produzieren.
Gemäß den Beschreibungen in Beispiel 11 wurden diese Konstrukte mit Hilfe von Standardtechniken der Elektroporation in NS0-Myelomzellen (ECACC-Nr. 85110503) transfiziert, woraufhin die Transfektanten hinsichtlich der Eigenschaft der G418-Resistenz selektiert wurden. In einem Anti-Mensch-Antikörper Fd ELISA Assay und einem CEA-bindenden ELISA-Assay wurden die erhaltenen Klone auf die Expression beider Antikörper untersucht. Diejenigen Klone, welche die beste Expression und die höchsten Niveaus an CEA-Bindung zeigten, wurden selektiert, vermehrt und ihr Produkt exprimiert. Anschließend wurde das menschliche Antikörperfragment F(ab')₂ wie in Beispiel 102 beschrieben aus dem Kulturüberstand aufgereinigt.
Beispiel 39 bis 47
Expression des humanisierten Fragments F(ab')₂ mit verschiedenen Klassen von menschlichen konstanten Regionen der schweren Kette Es können weiteren Klassen chimärischer Fd- Konstrukte der schweren Kette verwendet werden. Dementsprechend wurden zusätzliche Varianten der Vektoren der schweren Kette hergestellt, die entweder HuIgG1CH1' (SEQ ID Nr: 20 und 21) oder HuIgG3CH1' (SEQ ID Nr: 24 und 115) enthalten, wobei deren konstante Regionen das Gen HuIgG2CH1' (SEQ ID Nr: 22 und 23) ersetzen. Bei den erstellten Vektoren handelt es sich um pNG4-VHss-HuIgG1CH1' beziehungsweise um pNG4-VHss-HuIgG3CH1'. Die fraglichen variablen Antikörperregionen der schweren Kette können aus dem geeigneten Plasmid pNG4-VHss-"VH variable Region"-HuIgG2CH1' durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SacI ausgeschnitten aus in die Vektoren pNG4-VHss-HuIgG1CH1' oder pNG4-VHss-HuIgG3CH1', die in ähnlicher Weise aufgeschnitten wurden, kloniert werden, um auf diese Weise eine vervollständigte Sequenz der schweren Kette Fd zu erhalten. Wie oben beschrieben wurde, kann nach der Konstruktion der einzelnen Sequenzen der schweren und leichten Kette eine Genexpressionkassette für die schwere Kette Fd (einschließlich beider Promotoren und des Gens) mit Hilfe von Restriktionsverdauung ausgeschnitten und das Fragment zwischen die geeigneten stellen im Vektor der leichten Kette kloniert werden, um schließlich der co-Expressionsvektor zu erhalten. Die untenstehende Tabelle beschreibt die Beispiele 39 bis 47, bei denen verschiedene variable Regionen der schweren und leichten Kette mit einer Reihe von verschiedenartigen Klassen menschlicher konstanter Regionen der schweren Kette kombiniert wurden.
Im Beispiel 44 wurde der Vektor pNG4-VHss-HuIgG3CH1' mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SacI verdaut und das Vektorfragment gemäß der obigen Beschreibung isoliert. Die variable Region HuVH1 (SEQ ID Nr: 54 und 55) der schweren Kette wurde aus dem Plasmid pNG4-VHss-806.077HuVHI-HuIgG2CH1' durch Verdauung den Restriktionsenzymen mit EcoRI und SacI ausgeschnitten, und das Fragment wurde in den Vektor pNG4-VHss-HuIgG3CH1', der in ähnlicher Weise aufgeschnitten wurde, kloniert, um eine vervollständigte Sequenz (SEQ ID Nr: 94 und 95) der schweren Kette Fd des menschlichen IgG3 innerhalb des vervollständigten Vektors pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG3CH1' zu erhalten. Die Genexpressionskassette für die schwere Kette Fd (einschließlich beider Promotoren und des Gens) wurde als ein BgIII/SaII-Fragment ausgeschnitten und in die BamHI/SaII-Stellen des Vektors der leichten Kette pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo (welcher die humanisierte leichte Kette HuVK1-HuCK SEQ ID Nr: 51 und 52) enthält), kloniert, wobei letzterer unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und SaII verdaut worden war, mit Trennlauf auf 1 % iger Agarose und Aufreinigung der Vektorbande. Auf diese weise wurde ein co-Expressionsvektor (pNG 806HuVH1/HuVK3/HuIgG3) erhalten, aus welchem das humanisierte Antikörperfragment 806.077HuVH1/HuVK1-HuIgG3/Kappa.Fd exprimiert werden konnte. Tabelle
Im Beispiel 47 wurde der Vektor pNG4-VHss-HuIgG3CH1' mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SacI verdaut, und das Vektorfragment wurde isoliert. Die variable Region HuVH1 (SEQ ID Nr: 54 und 55) der schweren Kette des Antikörpers wurde zwischen durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SacI aus dem Plasmid pNG4-VHss-HuVH1-HuIgG2CH1' ausgeschnitten, und das Fragment in den Vektor pNG4-VHss-HuIgG3CH1', der in ähnlicher Weise aufgeschnitten wurde, kloniert. Hierdurch wird eine vervollständigte Sequenz (SEQ ID Nr: 94 und 95) der schweren Kette Fd des humanisierten IgG3 erhalten, die sich innerhalb des vervollständigten Vektors pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG3CH1' befindet. Die Genexpressionskassette für die schwere Kette Fd (einschließlich beider Promotoren und des Gens) wurde als ein BgIII/SaII-Fragment ausgeschnitten und in die BamHI/SaII-Stellen des Vektors der leichten Kette pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo (welcher die humanisierte leichte Kette HuVK4-HuCK SEQ ID Nr 98 und 99 enthält), kloniert, wobei letzterer unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und SaII verdaut worden war, mit Trennlauf auf 1 % iger Agarose und Aufreinigung der Vektorbande. Auf diese Weise wurde ein co-Expressionsvektorkonstrukt pNG 806HuVH1/HuVK4/HuIgG3 erhalten, aus welchem das humanisierte Antikörperfragment HuVH1/HuVK1-HuIgG3/Kappa.Fd exprimiert werden konnte.
Die übrigen Beispiele, die in der obigen Tabelle aufgeführt sind, wurden alle in einer Weise hergestellt, die derjenigen ähnlich ist, die in den Beispielen 44 und 47 beschrieben ist. Im Falle des Konstrukts, welches das menschliche IgG1 enthält erfolgte die abschließende Konstruktion des co- Expressionsvektors indes indem die Genexpressionskassette für die schwere Fd-Kette (einschließlich beider Promotoren und Gene) als BgIII/BamHI-Fragment ausgeschnitten wurde (da es eine interne SaII-Restriktionsstelle im Gen der konstanten Region HuIgG1CH1' gibt), um dieses dann in die BamHI-Stelle des Vektors der leichten Kette zu klonieren, welcher in geeigneter Weise präpariert wurde. In diesem Fall muss die Ausrichtung der Kassette der schweren Kette überprüft werden. Dies wurde mittels Restriktionsverdauung (z.B. mit dem Restriktionsenzym HindIII) und Untersuchung durch Elektrophorese auf Agarosegel erreicht, wobei die erhaltenen Fragmentgrößen mit Bezug auf vergleichbare Fragmente aus einer HuIgG2-Version, die in ähnlicher weise verdaut wurde, in Augenschein genommen wurden (Beispiele 11–38). Wenn die Fragmentierungsmuster für beide Konstrukte übereinstimmten, war dies ein sicheres Anzeichen dafür, dass die Kassette der schweren Kette richtig ausgerichtet war.
Gemäß der obigen Beschreibung in Beispiel 11 wurden diese Konstrukte mit Hilfe von Standardtechniken der Elektroporation in NS0-Myelomzellen (ECACC-Nr. 85110503) transfiziert, woraufhin die Transfektanten hinsichtlich der Eigenschaft der G418-Resistenz selektiert wurden. In einem – Anti-Mensch-Antikörper ELISA Assay und einem CEA-bindenden ELISA-Assay wurden die erhaltenen Klone auf die Expression beider Antikörper untersucht, und diejenigen Klone, bei denen die beste Expression und die besten Niveaus der CEA-Bindung festgestellt wurden, wurden selektiert, vermehrt und für die Genexpression gezüchtet. Das Fragment F(ab')₂ des menschlichen Antikörpers wurde daraufhin wiederum, wie in Beispiel 102 beschrieben, aus dem Kulturüberstand durch Aufreinigung gewonnen.
Beispiel 48
Herstellung des humanisierten Fusionsproteins 806.077 F(ab')₂-[A248S,G251T,D253K] HCPB
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Gens, welches für ein humanisiertes Fragment der schweren Kette Fd von 806.077, das mit [A248S,G251T,D253K]HCPB verknüpft ist, codiert, sowie dessen co-Expression mit einem Gen, welches für eine humanisierte leichte Kette des 806.077 codiert, und einem Gen, das für die Prodomäne der menschlichen Carboxypepdidase B codiert, mit dem Ziel, das Protein F(ab')₂ zu erhalten, wobei dieses an C-Terminus jedes Fragmente der schweren Kette ein Molekül [A248S, G251T,D253K]HCPB aufweist. Die konstante Region und die Hinge-Region, des humanisierten Fragments der schweren Kette Fd leiten sich von dem menschlichen IgG3-Antikörperisotyp ab. Das exprimierte Protein wird auch als Antikörper-Enzym-Fusionsprotein bezeichnet.
(a) Herstellung eines Gens, welches für ein humanisiertes Fragment der schweren Kette Fd von 806.077, das mit [A248S,G251T,D253K]HCPB verknüpft ist, codiert, sowie dessen Klonierung in pEE6
Ein Gen, welches für humanisiertes Fd von 806.077, das mit [A248S,G251T,D253K]HCPB verknüpft ist, codiert, wurde mittels PCR aus pZEN 1921 hergestellt (Vergleichsbeispiel 2). Zur Durchführung einer ersten PCR wurde ein Template pZEN1921 (2 ng) sowie Oligonukleotide SEQ ID Nr: 100 und SEQ ID Nr: 101 (100 pM von jedem) in einem Puffer (100 μl) vorgelegt, der 10 mM TRIS-HCl (pH = 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ und je 0,125 mM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP enthielt. Der Reaktionsansatz wurde bei 94°C 5 min. lang inkubiert, woraufhin thermostabile DNA-Polymerase (2,5 u, 0,5 μl hinzugefügt und die Mischung mit Mineralöl (100 μl) überschichtet wurde, um dann für 25 Zyklen 1 min. bei 94°C, 1 min. bei 53°C und 1 min. bei 72°C inkubiert zu werden, sowie zusätzlich 10 min. bei 72°C. Das PCR- Produkt von 536 Basenpaaren wurde durch Elektrophorese auf 1 %igem Agarosegel (Agarose Typ I, Sigma A-6013) isoliert, woraufhin die Bande aus dem Gel ausgeschnitten und das DNA-Fragment isoliert wurde.
Zur Durchführung einer zweiten PCR wurde ein Template IgG3-pBSIIKS+ (8,7 ng, beschrieben im Vergleichsbeispiel 4) sowie die Oligonukleotide SEQ ID Nr: 102 und SEQ ID Nr: 103 sowie das Fragment mit 954 Basenpaaren, das wie oben beschrieben isoliert wurde, vorgelegt. Die Produkte der beiden PCRs wurden kombiniert (entweder mit 0,2, 1,0 oder mit 5,0 ng/μl), und zwar in PCR-Puffer gemäß der obigen Beschreibung. Die Mischung wurde 5 min. lang bei 94°C inkubiert, dann folgten 10 Zyklen bei 94°C für 1 min. und 63°C für 4 min. Die Oligos SEQ ID Nr: 101 und 102 (100 pM von jedem) in PCR-Puffer (50 μl) wurden hinzugefügt. Nach 3minütiger Inkubation bei 94°C wurde die Mischung weiter inkubiert, und zwar in 25 Zyklen von 1,5 min. bei 94°C, 2 min. bei 53°C und 2 min. bei 72°C, sowie zusätzlich für 10 min. bei 72°C. Im Laufe dieses Vorganges wurde aus der Base G an Position 508 in der SEQ ID Nr: 115 eine Base A.
Das PCR-Produkt mit 1434 Basenpaaren wurde durch Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel isoliert, auf gereinigt und mit NheI (20 u) und XbaI (80 u) (New England Biolabs Inc.) 4 Std. lang bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 100 μl verdaut, wobei letzteres 10 mM TRIS-HCl (pH = 7,9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT sowie BSA (100 μg/ml) enthielt. Das erhaltene Fragment wurde erneut mittels Elektrophorese auf einem 1 Agarosegel isoliert und auf gereinigt. In einem ähnlichen Verdauungsansatz wurde der Vektor pNG4-VHss-806.077huVH1-HuIgG2CH1' (10 μg; Beispiel 11) mit NheI und XbaI aufgeschnitten, woraufhin dem verdauten Plasmid alkalische Phosphatase aus dem Kalbsdarm (1 μl; New England Biolabs, 10 u/μl) zugesetzt wurde, um 5'-Phosphatgruppen zu entfernen, um schließlich die Inkubation für weitere 30 Minuten bei 37°C fortzusetzen. Die Phosphataseaktivität wurde durch 10-minütige Inkubation bei 70°C gestoppt. Das Plasmid, welches mit NheI-XbaI aufgeschnitten wurde, wurde aus einem Agarosegel auf gereinigt. Das oben erhaltene PCR-Produkt, welches mit NheI-XbaI verdaut wurde, (ungefähr 500 ng) wurde mit der obigen, aufgeschnittenen plasmidischen DNA (ungefähr 200 ng) ligiert, und zwar 4 Std. lang bei 25°C in 20 μl einer Lösung, die 50 mM TRIS-HCl (pH = 7,8), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 μg/ml BSA und 400 u T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Inc) enthielt. Ein 1-μl-Aliquot des Reaktionsansatzes wurde eingesetzt, um 20 μl kompetente E.coli DH5α-Zellen zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf einer L-Agarplatte, die 100 μg/ml an Ampicillin enthielt, kultiviert. Potentielle Klone, die das Gen für humanisiertes 806.077 Fd-[A248S,G251T,D253K]HCPB enthielten, wurden mittels PCR identifiziert. Jeder der Klone wurde wie oben beschrieben einer PCR mit den Oligonukleotiden SEQ ID Nr: 104 und 105 unterzogen. Eine Probe (10 μl) des PCR-Reaktionsansatzes wurde mittels Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel analysiert. Diejenigen Klone, welche das erforderliche Gen enthielten, wurden anhand des Vorhandenseins eines PCR-Produktes mit 512 Basenpaaren identifiziert. Die Klone, welche die Bande mit 512 Basenpaaren produzierten, dienten zur Herstellung von DNA-Minipräparaten. Die DNA-Proben wurden durch Verdauung mit HindIII und XbaI auf die Anwesenheit von Fragmenten mit 3751 Basenpaaren und 1862 Basenpaaren überprüft. Diejenigen Klone, welche diese Fragmente nach Verdauung der DNA mit HindIII und XbaI enthielten, wurden dazu verwendet, in großem Maßstab, plasmidische DNA herzustellen, und die Sequenz des Inserts wurde mittels DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Die Sequenz des erwarteten Inserts ist in SEQ ID Nr: 112 dargestellt. Von den oben untersuchten Klonen enthielten 2 die erwartete Sequenz, welche indes eine Einzelbasenmutation aufwies. Der Klon 54 (auch als pMF195 bezeichnet) hatte eine Base T an der Position 605 in SEQ ID Nr: 112 anstelle einer Base A, während der Klon 68 (auch als pMF198 bezeichnet) eine Base C an Position 1825 anstelle der erwarteten Base T hatte. Die Sequenz, die in SEQ ID Nr: 112 dargestellt ist, wurde aus pMF195 und pMF198 hergestellt, indem beide (10 μg von jedem) mit XmaI (10 u) und XbaI (100 u) (New England Biolabs) verdaut wurden, und zwar in Puffer (100 μl), welcher 20 mM TRIS-acetat (pH = 7,9), 50 mM Kaliumacetat, 10 mM Mg-acetat, 1 mM DTT sowie BSA (100 μg/ml) enthielt. Das Fragment mit 215 Basenpaaren aus pMF195 sowie das Vektorfragment zwischen pMF198 wurden (nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase) aus einen 1 %igen Agarosegel isoliert und wie zuvor beschrieben zu einer gemeinsamen Struktur ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente DH5α-Zellen zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf L-Agarplatten, die zusätzlich Ampicillin enthielten, kultiviert und die erhaltenen Kolonien wurden durch Verdauung der DNA mit XmaI und XbaI auf die Anwesenheit von Fragmenten mit 5400 Basenpaaren und 215 Basenpaaren gescreent. Positiv getestete Klone wurden dazu verwendet, in großem Maßstab plasmidische DNA herzustellen, und die Sequenz des Inserts wurde mittels DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Das Plasmid, welches das Gen 806.077 Fd-[A248S,G251T,D253K]HCPB aus dem Klon Nummer 102 enthielt, wurde pMF213 genannt. Das HindIII-XbaI-Fragment aus pMF213 wurde in pEE6 kloniert [es handelt sich um ein Derivat von pEE6.hCMV – Stephens und Cockett (1989) Nucleic Acids Research 17, 7110 – in welchem die HindIII-Stelle strangaufwärts des hCMV-Promotors in eine BgIII-Stelle umgewandelt wurde], welches sich in DH5α (mittels PCR mit den Oligonukleotiden SEQ ID Nr: 106 und 107 auf einen Insert mit 2228 Basenpaaren gescreent), befand, um pMF221 zu erhalten.
b) Herstellung eines co-Expressionsvektors zur Expression des Antikörper-Enzym-Fusionsproteins
Zur Herstellung von Vektoren, die dazu befähigt sind, das Antikörper-Enzym-Fusionsprotein in eukaryotischen Zellen zu exprimieren, wurde das GS-System^TM (Celltech Biologics)(WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 und WO 89/10404) verwendet. Bei dem Verfahren wird das Gen der leichten Kette des humanisierten Antikörpers in die HindIII-XmaI-Region des Vektors pEE14 kloniert. Dieser Vektor ist in METHODS: A Companion to methods in Enzymology (1991) 2, 136–145 beschrieben. Um den Expressionsvektor zu konstruieren, wurden die Plasmide pEE14 und pNG3-VKss-806.077HuVK4-HuCK-Neo (Beispiel 14) wie oben beschrieben mit HindIII und XmaI verdaut. Der geeignete Vektor (aus pEE14) sowie das Insert (732 Basenpaare aus pNG3-VKss806.077HuVK4-HuCK-Neo), die bei den jeweiligen Verdauungsvorgängen erhalten wurden, wurden aus 1 %igem Agarosegel isoliert, zu einer gemeinsamen Struktur ligiert und dazu verwendet, kompetente DH5α-Zellen zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf L-Agarplatten, die zusätzlich Ampicillin (100 μg/ml) enthielten, kultiviert. Mittels Restriktionsanalyse der isolierten DNA wurden die Kolonien auf die Anwesenheit eines Fragments mit 732 Basenpaaren nach Verdauung der DNA mit HindIII und XmaI gescreent. Diejenigen Klone, die ein Restriktionsfragment mit 732 Basenpaaren produzierten, wurden dazu verwendet, in großem Maßstab plasmidische DNA herzustellen, und die Sequenz des Inserts wurde mittels DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Das Plasmid, welches die Sequenz der humanisierten leichten Kette mit der SEQ ID Nr: 70 in pEE14 enthielt, wurde als pEE14-806.077HuVK4-HuCK bezeichnet.
Zur Herstellung des co-Expressionsvektors wurde pMF221 (10 μg) mit BgIII (20 u) und SaII (40 U) aufgeschnitten, und zwar in einem Puffer (100 μl), der 10mM TRIS-HCl (pH 7,9), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT sowie BSA (100 μg/ml) enthielt, und das Fragment mit 4560 Basenpaaren wurde mittels Agarosegel- Elektrophorese isoliert und auf gereinigt. In ähnlicher Weise wurde pEE14-806.077HuVK4-HuCK mit BamHI (40 u) und SaII (40 u) aufgeschnitten, woraufhin das Vektorfragment mit 9,95 kb isoliert, mit dem BgIII-SaII-Fragment aus pMF221 ligiert und in DH5α kloniert wurde. Die Kolonien wurde mittels PCR mit 2 Sätzen von Oligonukleotiden (SEQ ID Nr: 104 und 105 sowie SEQ ID Nr: 108 und 109) gescreent. Ein Klon mit der korrekten Sequenz wurde als pMF228 – leichte Kette/Fd-Mutant HCPB co-Expressionsvektor in DH5α bezeichnet. Die Sequenz des humanisierten Fd-Mutant HCPB ist in SEQ ID Nr: 113 dargestellt. Die Reste 1 bis 19 stellen die Signalsequenz dar, die Reste 20 bis 242 stellen die humanisierte variable Region sowie die IgG3CH1-Region dar, die Reste 243 bis 306 stellen die IgG3-Hinge-Region dar, und die Reste 307 bis 613 stellen die Sequenz des mutierten HCPB dar, wobei letzteres Änderungen bei den Reste 248, 251 und 253 aus der menschlichen HCPB-Sequenz aufweist. Die Änderungen in der HCPB-Sequenz treten in SEQ ID Nr: 113 an den Positionen 554 (Ser), 557 (Thr) beziehungsweise 559 (Lys) auf.
(c) Herstellung eines Vektors für die Expression der Prodomäne von proHCPB
Ein zweites eukaryotisches Expressionsplasmid namens pEE12, welches ein Gen für die Präpro-Sequenz enthält, wurde gemäß der Beschreibung im Vergleichsbeispiel 17 der internationalen Patentanmeldung mit der Nummer WO 96/20011 hergestellt, um die Prodomäne von präproHCPB, welche einen zusätzlichen C-terminalen Leucinrest enthält (endständiges pro-L), zu sekretieren. Das Plasmid pMFl61 wurde mittels PCR aus pMFl8 gemäß der Beschreibung für die unmodifizierte präpro-Sequenz hergestellt, wobei jedoch die Oligonukleotide SEQ ID Nr: 110 und 111 verwendet wurden. Das Fragment mit 359 Basenpaaren wurde in pBluescript kloniert, um pMF141 zu erhalten, und anschließend in pEE12, um pMF161 zu erhalten. Die Proteinsequenz von pro-L ist in SEQ ID Nr: 114 dargestellt.
(d) Expression des Antikörper-Enzym-Fusionsproteins in eukaryotischen Zellen
Für die Expression in eukaryotischen Zellen wurden Vektoren, die Gene enthielten, die dazu befähigt sind, das Antikörper-Enzym-Fusionsprotein (pMF228) zu exprimieren, sowie die pro-L Sequenz (pMF161) in COS-7-Zellen cotransfiziert. Bei COS-Zellen handelt es sich um eine Zelllinie, CV-1, aus der Niere der grünen Meerkatze, wobei die Zelllinie mit einem "origin-defective" SV40-Virus transformiert worden ist. Diese Zellen haben weitverbreitete Anwendung zur kurzfristigen und vorübergehenden Expression einer Vielzahl von Proteinen gefunden, da sie dazu befähigt sind, kreisförmige Plasmide, die einen SV40-Replikationsursprung enthalten, in sehr großer Anzahl zu replizieren. Es gibt zwei weitverbreitet erhältliche COS-Zellkloie, COS-1 und COS-7. Die grundlegende Methodologie für die Transfektion von COS-Zelle, ist bei Bebbington in Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 2, S. 141 beschrieben. Zur Expression von HCPB wurden die Plasmidvektoren pMF48 und pMF67 (2 μg von jedem) verwendet, um die COS-7-Zellen (2 × 10⁵) auf Kulturplatten mit sechs Kavitäten zu transfizieren, und zwar in 2 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), welches 10 % an hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) enthielt, und mittels eines Verfahrens, das als Lipofektion – kationische lipidvermittelte Zuführung von Polynukleotiden [Felgner et al. in Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1993) 5, 67–75] bekannt ist. Die Zellen in einem CO₂-Inkubator 20 Std. lang bei 37°C inkubiert. Die Mischung aus plasmidischer DNA in einem serumfreien Medium (200 μl) wurde vorsichtig mit LIPOFECTIN^TM-Reagenz (12 μl) gemischt und 15 min. lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit serumfreiem Medium (2 ml) gewaschen. Serumfreies Medium (600 μl) wurde der DNA/LIPOFECTIN^TM zugesetzt, und die Mischung wurde zum Überschichten von Zellen eingesetzt, welche daraufhin 6 Std. lang in einem CO₂-Inkubator bei 37°C inkubiert wurden. Das DNA-haltige Medium wurde durch normales DMEM, welches 10 % FCS enthielt, ersetzt, und die Zellen wurden wie zuvor 72 Std. lang inkubiert. Die Zellkulturüberstände (1:10 mit 0,025 M TRIS-HCl TRIS-HCl (pH = 7,5); 125 μl verdünnt) wurde hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber Hipp-Glu untersucht (5 Std. Assay, in einem Gesamtvolumen von 250 μl), und zwar im Wesentlichen wie in Beispiel 103 beschrieben. Der verdünnte Überstand führte zu einer 18,4 %igen Hydrolyse des Hipp-Glu-Substrats.
Alternativ dazu kann im obigen Versuch die unmodifizierte Prodomäne (aus dem Plasmid pMF67, das im Vergleichsbeispiel 17 der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011 beschrieben ist) anstelle des pro-L-Expressionsplasmids verwendet werden.
Die Expression von Proteinen aus COS-Zellen in großem Maßstab ist bei Ridder et al. (1995) in GENE 166, 273–276 und bei Blasey et al. (1996) in CRYOTECHNOLOGY 18, 183–192 beschrieben.
Die stabile Expression in CHO-Zellen erfolgt gemäß der Vorgehensweise, die bei Bebbington in METHODS: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 2, 136–145 beschrieben ist, wobei eine GS-Selektion mit 25 μM und 50 μM MSX zur Anwendung kommt. Alternativ dazu kann auch die Lipofektion, die im Wesentlichen gemäß der obigen Beschreibung für die Transfektion von COS-Zellen durchgeführt wird, zur Anwendung kommen, um CHO-Zellen zu transfizieren. Die Zellen werden mit einer Mischung der Plasmide pMF228 und pMF161 oder der Plasmide pMF228 und pMF67 transfiziert. Die Überstände aus den überlebenden Kolonien werden mittels CEA-ELISA (beschrieben in Beispiel 11) sowie mittels Western-Analyse (unten beschrieben) auf die Anwesenheit einer 170-kDa-Bande gescreent, welche dem benötigten Antikörper-Enzym-Fusionsprotein entspricht. In geeigneter Verdünnung werden die Überstände weiterhin, wie in Beispiel 103 beschrieben, hinsichtlich der Enzymaktivität gescreent. Diejenigen Kolonien, welche das gewünschte Antikörper-Enzym-Fusionsprotein exprimieren, werden im erforderlichen Maßstab kultiviert (siehe zum Beispiel die Veröffentlichung von M E Reff (1993) in Current Opinion in Biotechnology 4, 573–576 sowie die darin zitierten Literaturstellen), und das Fusionsprotein wird aus der Zellkulturüberstand mittels eines oder mehrerer der Verfahren, die in Beispiel 102 beschrieben sind, auf gereinigt.
(e) Western-Analyse
Die Untersuchung mittels des Western-Blots wurde gemäß der folgenden Beschreibung durchgeführt. Aliquote (20 μl) von jeder Überstandsprobe wurden mit einem gleichen Volumen an Probenpuffer (62,5 mM TRIS, pH = 6,8, 1 % SDS, 10 % Saccharose und 0,05 % Bromphenol blau) gemischt, und zwar mit und ohne Reduktionsmittel. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert und anschließend einer Elektrophorese auf einem 8 bis 18 %igem Acrylamidgradientgel (EXCEL Gelsystem von Pharmacia Biotechnology Products) unterzogen, welches gemäß den Anweisungen des Herstellers an einem MULTIPHOR^TM II-Gerät (LKB Produkter AB) durchgeführt wurde. Nach der Elektrophorese wurde die aufgetrennten Proteine gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines NOVABLOT^TM-Geräts (LKB Produkter AB) auf eine Membran (HYBOND^TM C-Super, Amersham International) übertragen. Nach dem Blotten wurde die Membran an der Luft getrocknet.
Die Anwesenheit von Antikörperfragmenten wurde durch Einsatz eines Anti-Mensch-kappa-Antikörpers (Sigma A7164, Konjugat aus der leichten Anti-Mensch kappa-Kette von der Ziege und Peroxidase) nachgewiesen, wobei 1:2.500 verdünnt wurde. Die Anwesenheit von menschlichen Antikörper-Fragmenten wurde sichtbar gemacht, indem ein Chemilumineszenzsystem (ECL^TM Detektionssystem, Amersham International) eingesetzt wurde.
Beispiele 49 bis 74
Herstellung von weiteren Fusionssproteinen aus humanisiertem 806.077 F(ab')₂-mutiertem HCPB
Diese Beispiele beschreiben die Herstellung von Genen, die für humanisierte Fragmente der schweren Kette Fd von 806.077, mit mutiertem HCPB (D253K; G251T,D253K; A248S,G251T,D253K) verknüpft sind, codieren sowie deren co-Expression mit einem Gen, das für eine humanisierte leichte Kette von 806.077 codiert, und einem Gen, das für die Prodomäne der menschlichen Carboxypepdidase B codiert, um ein F(ab')₂-Protein zu erhalten, welches am C-Terminus jedes seiner Fragmente der schweren Kette ein Molekül mutiertes HCPB aufweist. Die konstanten Regionen und die Hinge-Regionen des humanisierten Fragments der schweren Kette Fd leiten sich von menschlichen IgG1- oder IgG2- oder IgG3-Antikörperiosptypen ab. Die exprimierten Proteine werden auch als Antikörper-Enzym-Fusionsproteine bezeichnet.
Die Vorgehensweise, die in Beispiel 48 beschrieben ist, wird mit geeigneten Sequenzen, die sich aus der untenstehenden Tabelle ableiten, wiederholt. Die Oligonukleotide für die PCR-Konstruktionen und für das Screenen der Klone lassen sich auf einfache Weise aus den geeigneten Sequenzen anleiten.
Um die mutierte HCPB-Sequenz, die als PCR-Template dient, zu ändern, wird das Plasmid pZEN1921 aus Teil a) des Beispiels 48 durch pZEN1860 ersetzt, um [G251T,D253K]HCPB (beschrieben im Vergleichsbeispiel 1) zu erhalten, oder durch pICI1713, um [D253K]HCPB (beschrieben in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011) zu erhalten.
Um die konstante Region und die Hinge-Region der schweren Kette des Antikörpers, welche als PCR-Template dienen, zu ändern, wird der Vektor IgG3-pBSIIKS+ aus Teil (a) des Beispiels 48 durch pNG4-VHss-HuIgG1CH1' (beschrieben in den Beispielen 39 bis 47) oder durch pNG4-VHss-HuIgG2CH1' (NCIMB-Nr. 40797) ersetzt.
Um die Sequenz der humanisierten leichten Kette des Antikörpers zu ändern, wird der Vektor pEE14-806.077HuVK4-HuCK aus Teil (b) des Beispiels 48 durch pEE14-806.077HuVK1-HuCK oder pEE14-806.077HuVK3-HuCK ersetzt. Die Vektoren pEE14-806.077HuVK1-HuCK und pEE14-806.077HuVK3-HuCK werden gemäß der Beschreibung für pEE14-806.077HuVK4-HuCK in Teil (b) des Beispiels 48 hergestellt, wobei jedoch anstelle des HindIII-XmaI-Fragments aus pNG-VHss-806.077HuVK4-Neo das HindIII-XmaI-Fragment aus pNG-VHss-806.077HuVK1-Neo beziehungsweise aus pNG-VHss-806.077HuVK3-Neo mit 732 Basenpaaren (beschrieben in den Beispielen 12 bis 38) verwendet werden.
Für jedes Beispiel sind Varianten des Antikörper-Enzym-Fusionsproteins in der untenstehenden Tabelle aufgeführt. Tabelle
Beispiel 75
Herstellung des Fusionsproteins [A248S,G251T,D253K]HCPB-(humanisiertes 806.077)F(ab')₂
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Gens, welches für pro-[A248S,G251T,D253K]HCPB, das mit einem humanisierten (Version 1 VH mit menschlichem IgG3) schweren Fragment Fd des Antikörpers 806.077 verknüpft ist, codiert, sowie dessen co-Expression mit einen Gen, welches für eine humanisierte leichte Kette (Version 4 VK mit CK) des Antikörpers 806.077 codiert. Hierbei wird das F(ab')₂-Protein erhalten, welches am N-Terminus jedes seiner Fragmente der schweren Kette ein Molekül pro-[A248S,G251T,D253K]HCPB aufweist. Das Enzym wird aktiviert, indem die Prodomäne unter Verwendung von Trypsin enzymatisch entfernt wird.
Es kamen Standardtechniken der Molekularbiologie wie etwa die Verdauung mit Restriktionsenzymen, die Ligation, Kinasereaktionen, Dephosphorylierungen, Polymerasekettenreaktion (PCR), bakterielle Transformationen, Gelelektrophorese, Pufferherstellung und DNA-Erzeugung, Aufreinigung und Isolierung, wobei diese gemäß den Beschreibungen von Maniatis et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual; zweite Ausgabe: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, durchgeführt wurde, oder aber gemäß den Empfehlungen der Hersteller der jeweiligen Produkte. In den meisten Fällen stammten die Enzyme von New England BioLabs, wobei aber auch andere Anbieter und gleichwertige Verfahren geeignet sind. Die Oligonukleotidsequenzen wurden in einem Applied Biosystems 380A DNA-Synthesegerät aus Nucleosid-2-cyanoethyl-N,N'-di-isopropyl-phosphoramiditen, deren Basen eine 5'-Dimethoxytritylschutzgruppe aufwiesen sowie aus geschützten Nukleosiden, die mit Glasträgersubstanzen mit kontrollierten Poreneigenschaften verknüpft waren, im Maßstab von 0,2 μmol hergestellt, und zwar gemäß den mitgelieferten Verfahrensanleitungen von Applied Biosystems Inc.
Mutanten von HCPB, natives HCPB sowie HCPB-Fusionsproteine wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Hippuryl-L-Glutaminsäure oder Hippuryl-L-Argininsäure zu Hippursäure umzuwandeln, einem Assay unterzogen, und zwar unter Verwendung eines Assays auf Basis von HPLC gemäß der Beschreibung in Beispiel 103 oder in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011, Beispiel 20.
Die Immunoassaytechniken wurden unter Anwendung von Verfahren durchgeführt, die auf denjenigen beruhen, die von Tijssen, (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Volume 15, Elsevier Science Publishers, Amsterdam beschrieben wurde, oder gemäß der Vorgehensweise, die von den Herstellern der jeweiligen Produkte empfohlen werden.
Zur Herstellung von Plasmiden, die dazu befähigt waren, die Antikörper-Enzym-Fusionsproteine in eukaryotischen Zellen zu exprimieren, wurde das GS-System (Celltech Biologics) benutzt (Einzelheiten in den internationalen Patentanmeldungen mit den Nummern WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 und WO 89/10404), und zwar mit den beiden Plasmiden pEE6 (ein Derivat von pEE6.hCMV, in welchem die HindIII-Restriktionsstelle, die strangaufwärts des hCMV-Promotors liegt, in eine BgIII-Stelle umgewandelt wurde {Stephens and Cockett, 1989, Nucleic Acids Research, 17, 7110}) und pEE12 (ein Derivat von pSV2.GS, bei welchem ein Reihe von Restriktionsstellen entfernt wurden {Bebbington et al, 1992, Bio/Technology, 10. 169}).
a) Klonieren von präpro-HCPB bis zur Angriffsstelle des Restriktionsenzyms XmaI (Position 1048 in SEQ ID Nr: 124)
Eine doppelsträngige DNA des Plasmids pMF18 (gemäß der Beschreibung in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011, Vergleichsbeispiel 19), ein Konstrukt, welches aus präpro-HCPB, das in den Vektor pBluescript II KS+ (Stratagene) kloniert wurde, besteht, wurde unter Verwendung von Standard-DNA-technologie (Qiagen Plasmid-Kit oder ähnliches) hergestellt und mit den Restriktionsenzymen HindIII und XmaI verdaut, wobei sorgfältig auf eine vollständige Verdauung zu achten ist. Das Restriktionsenzym HindIII schneidet das Plasmid pMF18 genau vor dem Start der prä-Sequenz des HCPB-Gens auf, und XmaI schneidet beim Codon für die Aminosäure 240 (Prolin) des ausgereiften Proteins, wobei das DNA-Stück von HindIII bis XmaI als präpro-HCPB-Fragment bezeichnet wird. Die DNA mit der richtigen Größe, welche das präpro-HCPB-Fragment (ungefähr 1061 Basenpaare) enthielt, wurde auf gereinigt.
Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmidvektors pUC19 (New England BioLabs) hergestellt und in ähnlicher Weise wie das präpro-HCPB-Fragment mit den Restriktionsenzymen HindIII und XmaI verdaut und auf gereinigt (ungefähr 2651 Basenpaare). Es wurden Ligationsmischungen hergestellt, um das HCPB-Genfragment in den Vektor pUC19 zu klonieren, wobei das Molverhältnis ungefähr 1 Vektor auf 2,5 Inserts betrug, die DNA-Konzentration am Ende bei ungefähr 2,5 ng/μl lag und der Vorgang in Gegenwart von T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und Enzympuffer durchgeführt wurde. Nach der Ligationsreaktion wurde die DNA-Mischung verwendet, um den E.coli Stamm DH5α zu transformieren. Aliquote der Zellen wurden auf einem L-Agar Nährmedium kultiviert, welches 100 μg/ml an Ampicillin as Selektionsmittel für den Plasmidvektor enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine Reihe von Kolonien wurden entnommen und zur Herstellung von Doppelstrang-Plasmid-DNA in kleinem Maßstab verwendet. Diese DNA-Proben wurden durch Verdauung mit Restriktionsenzymen analysiert, und es wurde ein Konstrukt mit der richtigen Konfiguration identifiziert. Dieses Plasmid, welches das präpro-HCPB-Fragment bis zur XmaI-Stelle im ausgereiften Gen enthält, ist unter der Bezeichnung pCF003 bekannt.
b) Klonieren von [A248S,G251T,D253K]HCPB aus Position G241 + Linker und 5 Aminosäuren des VH
Um das HCPB von der Fd-Sequenz zu trennen, wurde ein neutraler Peptidlinker, der aus (Glycin-Glycin-Glycin-Serin)₃ bestand, während der PCR in die Sequenz eingeführt. Um das Fragment der mutierten Sequenz [A248S, G251T,D253K]HCPB (siehe Ausführungen in Vergleichsbeispiel 2) herzustellen und um den Peptidlinker und die ersten 5 Aminosäuren des humanisierten VH von 806.077 anzufügen, wurde ein PCR-Ansatz vorbereitet, um zwar mit 100 pmol der Primer CME 00971 und CME 00972 (SEQ ID Nr: 122 und 123) in Gegenwart von näherungsweise 5 ng pZen1921-DNA, dNTPs bis zu einer Endkonzentration von 200 μM, Taq-Polymerasereaktionspuffer und 2,5 U an Taq-Polymerase in einem Endvolumen von 100 μl. Die Mischung wurde 10 Minuten lang auf 94°C erwärmt, um dann das Taq-Enzym hinzufügen und die PCR-Inkubation über 30 Zyklen von 1,5 Minuten bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C durchzuführen, woraufhin am Ende der Reaktion eine einmalige Inkubation von 10 Minuten bei 72°C folgte. Das PCR-Produkt, welches das Fragment [A248S,G251T,D253K]HCPB (ungefähr 298 Basenpaare) enthielt, wurde mittels Agarosegelelektrophorese auf DNA mit der richtigen Größe untersucht, und es wurde festgestellt, dass hauptsächlich eine Bande von der richtigen Größe enthält. Das restliche Produkt aus der Reaktionsmischung wurde auf gereinigt und unter Verwendung einer Mikrokonzentrationssäule (Centricon^TM 100, Amicon) von überschüssigen Reagentien getrennt, woraufhin die DNA mittels Ethanol/Natriumacetat-Fällung, Zentrifugation, Vakuumtrocknung und erneuter Suspension in destilliertem Wasser isoliert wurde. Die isolierte DNA wurde mit den Restriktionsenzymen XmaI und EcoRI verdaut, und eine Bande mit der richtigen Größe (ungefähr 271 Basenpaare) wurde aufgereinigt.
Doppelsträngige DNA des Plasmids pCF003 (oben beschrieben), die unter Verwendung von Standard-DNA-Technologie (Qiagen Plasmid-Kits oder ähnliches) hergestellt wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen XmaI und EcoRI verdaut, und eine Bande der richtigen Größe (ungefähr 2696 Basenpaare) wurde aufgereinigt.
Es wurden Ligationsmischungen hergestellt, um die mutierten Fragmente des HCPB-Gens in den Vektor zu klonieren, wobei das Molverhältnis ungefähr 1 Vektor auf 2,5 Inserts (1 pCF003 auf 2,5 des PCR-Produktes [A248S,G251T,D253K]HCPB-Fragment) betrug, die DNA-Konzentration am Ende bei ungefähr 2,5 ng/μl lag und der Vorgang in Gegenwart von T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und Enzympuffer durchgeführt wurde. Nach der Ligationsreaktion wurde die DNA-Mischung verwendet, um den E.coli Stamm DH5α zu transformieren. Aliquote der Zellen wurden auf einem L-Agar Nährmedium kultiviert, welches 100 μg/ml an Ampicillin as Selektionsmittel für den Plasmidvektor enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Es wurden ungefähr 200 Kolonien entnommen und in einem Doppelansatz auf sterilen Nitrocellulosefiltern (Schleicher und Schüll) kultiviert, die vorbefeuchtet und auf ein L-Agar Nährmedium, welches 100 μg/ml an Ampicillin as Selektionsmittel für den Plasmidvektor enthielt, gegeben wurden, woraufhin über Nacht bei 37°C inkubiert wurde. Eine der Platten des Doppelansatzes wurde bei 4°C gelagert und diente als Quelle für lebende Zellen für die Kolonien, während die andere Platte derart behandelt wurde, dass die DNA aus den einzelnen Kolonien denaturiert und auf der Nitrocellulose fixiert wurde. Der Nitrocellulosefilter wurde von der Agarplatte entfernt und anschließend auf Filterpapiere (Whatman) gegeben, die mit Folgendem durchtränkt wurden: 1. 10% SDS für 2 Minuten; 2. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl für 7 Minuten; 3. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl für 4 Minuten, 4. 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl für 2 Minuten; 5. 0,5 M TRIS (pH = 7,4), 1,5 M NaCl für 2 Minuten; und 6. 2 × SSC (Standard Kochsalz/Citrat-Lösung) für 2 Minuten. Anschließend wurden die Filter auf ein Filterpapier (Whatman) gegeben, das mit 10 × SSC durchtränkt war, und die denaturierte DNA wurde mit der Nitrocellulose mittels einer Behandlung mit ultraviolettem Licht quervernetzt (Spectrolinker XL-1500 UV crosslinker). Die Filter wurden bei Raumtemperatur an der Luft trocknen gelassen und wurden anschließend bei 60°C eine Stunde lang in einer Lösung von 6 × SSC vorhybridisiert, wobei vorsichtig geschüttelt wurde (zum Beispiel unter Verwendung einer "Techne HB-1D hybridizer"-Vorrichtung). Auf den Filtern sind Vorhybridisierungsblöcke unspezifischer DNA-Bindungsstellen zu vermerken.
Um festzustellen, welche Kolonien die DNA-Inserts, die von Interesse sind, enthalten, wurde die DNA, die mit dem Nitrocellulosefilter quervernetzt war, mit einer radiomarkierten ³²P-DNA-Sonde, die aus dem aufgereinigten PCR-DNA-Fragment [A248S,G251T,D253K]HCPB hergestellt wurde (siehe oben), hybridisiert. Ungefähr 50 ng der DNA wurde unter Verwendung der T7-DNA-Polymerase mit 50 μCi an ³²P-dCTP (> 3000Ci/mmol) markiert, wobei das Gesamtvolumen 50 μl betrug (Pharmacia T7 Quickprime kit) und die Reaktion bei 37°C für eine Dauer von 15 Minuten ablaufen lassen wurde. Die markierte Sonde wurde 2 Minuten lang auf 95°C erwärmt, um die doppelsträngige DNA au denaturieren, woraufhin der Ansatz unverzüglich in 10 ml 6 × SSC mit einer Temperatur von 60°C gegeben wurde, und diese Lösung wurde eingesetzt, um die Vorhybridisierungslösung auf den Filtern zu ersetzen. Unter vorsichtigem Schütteln wurde die Inkubation ungefähr 3 Stunden lang bei 60°C fortgesetzt. Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Hybridisierungslösung ablaufen lassen, und die Filter wurden zweimal je 15 Minuten lang bei 60°C in 2 × SSC gewaschen. Anschließend wurden die Filter vorsichtig trockengetupft, mit Abdichtungsfolie (Saran wrap oder Ähnliches) bedeckt und dann über Nacht bei Raumtemperatur zum Bestrahlen eines Röntgenfilms (zum Beispiel Kodak X-OMAT-RRS^TM) eingesetzt. Nach der Entwicklung des Films konnten diejenigen Kolonien, welche die fraglichen Inserts enthielten, anhand der am besten ausgeprägten Signale (der dunkelsten Flecken) auf dem Röntgenfilm identifiziert werden. In dieser Versuchsreihe zeigten ungefähr 15 % der Kolonien eine positive Hybridisierung. Diese 12 Kolonien wurden für ein weitergehendes Screening ausgewählt. Diese Kolonien wurden aus dem Filter des Doppelansatzes entnommen, zur Weiterkultur auf ein L-Agar-Nährmedium, welches 100 μg/ml an Ampicillin enthielt, gestrichen und dann in einem Nährmedium aus L-Brühe mit einem Ampicillingehalt von 100 μg/ml gezüchtet.
Die ausgewählten Kolonien wurden zur Herstellung von Doppelstrang-Plasmid-DNA in kleinem Maßstab verwendet. Diese DNA-Proben wurden mittels Verdauung mit Restriktionsenzymen untersucht, und Konstrukte mit der richtigen Konfiguration wurden identifiziert. Um sicherzustellen, dass während der PCR keine Änderungen in der DNA-Sequenz erfolgt sind, wurden eine Reihe von Klonen mit dem richtigen Restriktionsschema zur DNA-Herstellung eingesetzt, wobei Standardtechnologie(Qiagen Plasmid-Kits oder Ähnliches) zum Einsatz kam, und die Inserts wurden unter Verwendung mehrerer getrennt voneinander wirkenden Oligonukleotidprimer sequenziert. Es wurde ein Konstrukt mit der richtigen Sequenz identifiziert, und dieses Plasmid, welches das Gen für präpro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker-humanisiertes 806.077 VH bis zur PstI-Stelle (bei Aminosäure 5) (Position 1301 in SEQ ID Nr: 124) enthält, wird als pCF004 bezeichnet.
c. Klonieren des humanisierten 806.077 Fd
Doppelsträngige DNA des Plasmids pNG4-VHss-HuVH1-806.077-IgG3CH1', eines Konstrukts, das aus der humanisierten Version 1 des VK von 806.077 mit menschlichen IgG3Ch1- und Hinge-Regionen, welche in den Vektor pNG4 kloniert wurde (siehe Beispiel 44), besteht, wurde unter Verwendung von Standard-DNA-Technologien (Qiagen Plasmid-Kit oder Ähnliches) hergestellt und mit den Restriktionsenzymen PstI und XmaI verdaut. Die DNA mit der richtigen Größe, welche das humanisierte Fragment 806.077 Fd (ungefähr 854 Basenpaare) enthielt, wurde auf gereinigt. Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmidvektors pUC19 (New England BioLabs) hergestellt und in ähnlicher Weise wie das humanisierte Fragment 806.077 Fd mit den Restriktionsenzymen PstI und XmaI verdaut und aufgereinigt (ungefähr 2659 Basenpaare).
Sowohl nach der Restriktion als auch nach der Aufreinigung wurden Aliquote der DNA unter Anwendung der Gelelektrophorese einer Reinheitsprüfung und einer Konzentrationsabschätzung unterzogen, wobei mit bekannten Standards verglichen wurde. Auf Grundlage dieser Schätzungen wurden Ligationsmischungen hergestellt, um das humanisierte Genfragment 806.077 Fd in den Vektor pUC19 zu klonieren, wobei das Molverhältnis ungefähr 1 Vektor auf 2,5 Inserts betrug, die DNA-Konzentration am Ende bei ungefähr 2,5 ng/μl lag und der Vorgang in Gegenwart von T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und Enzympuffer durchgeführt wurde.
Nach der Ligationsreaktion wurde die DNA-Mischung verwendet, um den E.coli Stamm DH5α zu transformieren. Aliquote der Zellen wurden auf einem L-Agar Nährmedium kultiviert, welches 100 μg/ml an Ampicillin as Selektionsmittel für den Plasmidvektor enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine Reihe von Kolonien wurden entnommen und zur Herstellung von Doppelstrang-Plasmid-DNA in kleinem Maßstab verwendet. Diese DNA-Proben wurden durch Verdauung mit Restriktionsenzymen analysiert, und es wurde ein Konstrukt mit der richtigen Konfiguration identifiziert. Dieses Plasmid, welches das humanisierte Fragment 806.077 Fd von der PstI-Stelle bis zur XmaI-Stelle enthält, ist als pCF005 bekannt.
d) Klonieren des humanisierten 806.077 Fd in das präpro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker-Konstrukt
Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmids pCF005 (siehe Ausführungen oben) unter Verwendung von Standard-DNA-Technologie (Qiagen Plasmid-Kit oder Ähnliches) hergestellt und mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI verdaut. Die DNA mit der richtigen Größe, welche das humanisierte Fragment 806.077 Fd (ungefähr 870 Basenpaare) enthielt, wurde auf gereinigt. Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmidvektors pCF004 (siehe Ausführungen oben) hergestellt und in ähnlicher Weise wie das humanisierte Fragment 806.077 Fd mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI verdaut und auf gereinigt (ungefähr 3950 Basenpaare). Es wurden Ligationsmischungen hergestellt, um das humanisierte Genfragment 806.077 Fd in den Vektor pCF004 zu klonieren, wobei das Molverhältnis ungefähr 1 Vektor auf 2,5 Inserts betrug, die DNA-Konzentration am Ende bei ungefähr 2,5 ng/μl lag und der Vorgang in Gegenwart von T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und Enzympuffer durchgeführt wurde.
Nach der Ligationsreaktion wurde die DNA-Mischung verwendet, um den E.coli Stamm DH5α zu transformieren. Aliquote der Zellen wurden auf einem L-Agar Nährmedium kultiviert, welches 100 μg/ml an Ampicillin as Selektionsmittel für den Plasmidvektor enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine Reihe von Kolonien wurden entnommen und zur Herstellung von Doppelstrang-Plasmid-DNA in kleinem Maßstab verwendet. Diese DNA-Proben wurden durch Verdauung mit Restriktionsenzymen analysiert, und es wurde ein Konstrukt mit der richtigen Konfiguration identifiziert. Dieses Plasmid, welches das präpro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker-Fd(humanisiertes 806.077) in pUC19 enthält, ist unter der Bezeichnung pCF006 bekannt.
e) Klonieren von präpro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker(humanisiertes 806. 077) Fd in den Vektor pEE6 hCMV
Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmids pCF006 (siehe Ausführungen oben) unter Verwendung von Standard-DNA-Technologie (Qiagen Plasmid-Kit oder Ähnliches) hergestellt und mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI verdaut. Die DNA mit der richtigen Größe, welche das Fusionsprotein (ungefähr 2185 Basenpaare) enthielt, wurde auf gereinigt.
Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmidvektors pEE6 (siehe Ausführungen oben) hergestellt und in ähnlicher Weise wie das Fusionsprotein mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI verdaut und auf gereinigt (ungefähr 4775 Basenpaare). Es wurden Ligationsmischungen hergestellt, um das humanisierte Fusionsprotein 806.077 Fd in den Vektor pEE6 zu klonieren, wobei das Molverhältnis ungefähr 1 Vektor auf 2,5 Inserts betrug, die DNA-Konzentration am Ende bei ungefähr 2,5 ng/μl lag und der Vorgang in Gegenwart von T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und Enzympuffer durchgeführt wurde. Nach der Ligationsreaktion wurde die DNA-Mischung verwendet, um den E.coli Stamm DH5α zu transformieren. Aliquote der Zellen wurden auf einem L-Agar Nährmedium kultiviert, welches 100 μg/ml an Ampicillin as Selektionsmittel für den Plasmidvektor enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine Reihe von Kolonien wurden entnommen und zur Herstellung von Doppelstrang-Plasmid-DNR in kleinem Maßstab verwendet. Diese DNR-Proben wurden durch Verdauung mit Restriktionsenzymen analysiert, und es wurde ein Konstrukt mit der richtigen Konfiguration identifiziert. Dieses Plasmid, welches das präpro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker-Fd(humanisiertes 806.077) in pEE6 enthält, ist unter der Bezeichnung pCF007 bekannt.
f) Klonieren des humanisierten Version 4 der leichten Kette von 806.077 in den Vektor pEE12
Doppelsträngige DNA des Plasmids pNG3-VKss-806.077-HuVK4-HuCK-Neo, eines Konstrukts, das aus der humanisierten Version HuVK4 von 806.077 mit menschlichen CK, welche in den Vektor pNG3 kloniert wurde (siehe Beispiele 12 bis 38), besteht, wurde unter Verwendung von Standard-DNA-Technologien (Qiagen Plasmid-Kit oder Ähnliches) hergestellt und mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI verdaut. Die DNA mit der richtigen Größe, welche die humanisierte leichte Kette von 806.077 (ungefähr 2022 Basenpaare) enthielt, wurde aufgereinigt. Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmidvektors pEE12 hergestellt und in ähnlicher Weise wie die humanisierte leichte Kette 5 von 806.077 mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI verdaut und aufgereinigt (ungefähr 7085 Basenpaare). Es wurden Ligationsmischungen hergestellt, um die humanisierte leichte Kette von 806.077 in den Vektor pEE12 zu klonieren, wobei das Molverhältnis ungefähr 1 Vektor auf 2,5 Inserts betrug, die DNA-Konzentration am Ende bei ungefähr 2,5 ng/μl lag und der Vorgang in Gegenwart von T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und Enzympuffer durchgeführt wurde. Nach der Ligationsreaktion wurde die DNA-Mischung verwendet, um den E.coli Stamm DH5α zu transformieren. Aliquote der Zellen wurden auf einem L-Agar Nährmedium kultiviert, welches 100 μg/ml an Ampicillin as Selektionsmittel für den Plasmidvektor enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine Reihe von Kolonien wurden entnommen und zur Herstellung von Doppelstrang-Plasmid-DNA in kleinem Maßstab verwendet. Diese DNA-Proben wurden durch Verdauung mit Restriktionsenzymen analysiert, und es wurde ein Konstrukt mit der richtigen Konfiguration identifiziert. Dieses Plasmid, welches die humanisierte Version 4 der leichten Kette von 806.077 enthält, ist unter der Bezeichnung pCF008/4 bekannt.
g) Klonieren von CNNp-präpro[A2485,G251T,D253KJHCPB-Linker- (humanisiertes 806. 077) Fd in pCF008/4.
Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmids pCF007 (siehe Ausführungen oben) unter Verwendung von Standard-DNA-Technologie (Qiagen Plasmid-Kit oder Ähnliches) hergestellt und mit den Restriktionsenzymen BgIII und SaII verdaut. Das Restriktionsenzym BgIII schneidet das Plasmid pCF007 vor dem Start des CMV MIE Führungsabschnitts, des Promotors und des Gens für das Fusionsprotein. Das Restriktionsenzym SaII schneidet ungefähr 520 Basenpaare nach dem Stopcodon des ausgereiften Proteins. Die DNA mit der richtigen Größe, welche das Fusionsprotein (ungefähr 4844 Basenpaare) enthielt, wurde auf gereinigt. Es wurde doppelsträngige DNA des Plasmidvektors pCF008/4 hergestellt und in ähnlicher Weise wie das Fusionsprotein mit den Restriktionsenzymen BamHI und SaII verdaut und auf gereinigt (ungefähr 7436 Basenpaare). Es wurden Ligationsmischungen hergestellt, um das Fusionsgen aus [A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker-(humanisiertes 806.077)Fd in den Vektor pCF008/4 zu klonieren, wobei das Molverhältnis ungefähr 1 Vektor auf 2,5 Inserts betrug, die DNA-Konzentration am Ende bei ungefähr 2,5 ng/μl lag und der Vorgang in Gegenwart von T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP und Enzympuffer durchgeführt wurde. Nach der Ligationsreaktion wurde die DNA-Mischung verwendet, um den E.coli Stamm DH5α zu transformieren. Aliquote der Zellen wurden auf einem L-Agar Nährmedium kultiviert, welches 100 μg/ml an Ampicillin as Selektionsmittel für den Plasmidvektor enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Eine Reihe von Kolonien wurden entnommen und zur Herstellung von Doppelstrang-Plasmid-DNA in kleinem Maßstab verwendet. Diese DNA-Proben wurden durch Verdauung mit Restriktionsenzymen analysiert, und es wurde ein Konstrukt mit der richtigen Konfiguration identifiziert. Dieses Plasmid, welches die Gene für pro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker-F(ab')₂(humanisierter Antikörper 806.077) in dem GS-Expressionsvektor pEE12 enthält, ist als pCF009 bekannt, und eine Plasmidkartierung ist in 2 dargestellt. Die DNA- und Aminosäuresequenzen der leichten Kette HuVK4 sind in SEQ ID Nr: 70 und 71 dargestellt. Die DNA-Sequenz des präpro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker-Fd(humanisiertes 806.077) ist in der SEQ ID Nr: 124 dargestellt, wobei die entsprechende Aminosäuresequenz in der SEQ ID Nr: 125 dargestellt ist.
h) Expression von Pro-[mutiertes]HCPB-Linker-F(ab')₂(humanisiertes 806.077) aus Myelomzellen der Maus
Das folgende Verfahren ist für die Myelomexpression sämtlicher (D253K und G251T,D253K und A248S,G251T,D253K) Fusionsproteine mit mutiertem pro-HCPB-Enzym angewendet worden. Bei der bevorzugten Myelom-Zelllinie der Maus handelt es sich um NS0 (Galfre and Milstein, 1981, Methods in Enzymol., 73, 3–46), welche bei der European Collection of Animal Cell Cultures, PHLS CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG (ECACC Katalognummer 85110503) erhältlich ist. Diese Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM; Gibco/BRL) gezüchtet, welches 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) enthielt.
Für die Expression von pro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Linker-F(ab')₂(humanisiertes 806.077) wurden zwei Plasmide verwendet, nämlich pCF009 (oben beschrieben) und pRc/RSV (von Invitrogen, Kat.-Nr: V780-20), welche das Neomycin-Resistenzgen für die Selektion der G418-resistenten stabilen Zelllinie enthalten. Ungefähr S μg von jedem Plasmid (zwischen 0,5 und 10 μg) werden eingesetzt, um näherungsweise 8 × 10⁶ NS0-Zellen mittels des Verfahrens der Lipofektion (Felgner et al., in Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1993, 5, 67–75) zu transfizieren, wobei es zur kationischen lipidvermittelten Zuführung von Polynukleotiden in die eukaryotische Zellen kommt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, mit serumfreiem Medium (30 ml) gewaschen und in 800 μl Medium wieder in Suspension gebracht, um dann bei 37°C in einem Gewebekulturkolben bis zur Zugabe der DNA aufbewahrt zu werden. Serumfreies Medium (450 μl) wurde vorsichtig mit LIPOFECTIN^TM-Reagenz (50 μl) gemischt und 30 bis 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mischung wurde in eine Vorlage aus 500 μl Medium, welches die Mischung mit plasmidischer DNA (in weniger als 100 μl) enthält, und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Serumfreies Medium (600 μl) wurde der Mischung aus plasmidischer DNA mit LIPOFECTIN^TM zugesetzt, woraufhin der Komplex zu den Zellen hinzugefügt wurde, welche ungefähr 5 Stunden lang bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert wurden. Das DNA-haltige Medium wurde anschließend durch normales DMEM-Medium (8 ml), welches 10 % FCS enthielt, ersetzt, und die Zellen wurden über Nacht inkubiert. Das Medium wurde anschließend erneut durch normales DMEM-Medium (8 ml), welches 10 % FCS enthielt, ersetzt, und die Zellen wurden ohne Selektion wie zuvor 24 Stunden lang inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Medium durch DMEM ersetzt, welches 10% FCS und ein G418-Selektionsmittel (1,5 mg/l) enthielt, woraufhin die Zellen in dem gleichen Medium verdünnt (zwischen 1 zu 4 und 1 zu 20)(näherungsweise 0,5 bis 1,5 × 10⁶ Zellen pro Platte) und in Mikrotiterplatten gegeben wurden (150 μl pro Kavität; 2 oder mehr Platte pro Verdünnung). Die Mikrotiterplatten wurden mindestens zwei Wochen lang bei 37°C in einem CO₂-Inkubator bebrütet und anschließend regelmäßig auf die Bildung lebensfähiger Klone überprüft.
Aus den Kavitäten, welche einzelne lebensfähige Klone enthielten, wurde das Medium zur Untersuchung entnommen und durch frisches Medium (G418 enthaltend) ersetzt. Das entnommene Medium wurde in einem ELISA-Ansatz auf Antikörperbindung an CEA getestet (in der gleichen Art und Weise wie in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011, Vergleichsbeispiel 5 Teil 1 beschrieben ist, mit dem Unterschied, dass die zweite Antikörperlösung dahingehend geändert wurde, dass Anti-Mensch (Konjugat aus Anti-Mensch leichte kappa-Kette und Peroxidase, von der Ziege, Sigma A7164) anstelle von Anti-Maus verwendet wurde. Die Proben mit einem Positiven Ergebnis bei dem CEA-ELISA-Test wurden nach Aktivierung (Entfernung der Prodomäne von den Fusionsprotein) mit Trypsin (700 μg/ml in 50 mM TRIS-HCl and und 150 mM NaCl bei pH = 7,6 und 4°C für 1 Stunde, wobei die Reaktion durch Zugabe eines fünffachen Überschusses an Soja-Trypsinhemmer abgebrochen wurde) ebenfalls auf [A248S,G251T,D253K]HCPB-Enzymaktivität untersucht. Es wurde eine Reihe von Klonen identifiziert, welche ein Medium produzierten, das sowohl für die Bindung des Antikörpers 806.077 an CEA als auch für die [A248S,G251T,D253K]HCPB-Enzymaktivität positiv getestet wurde. Diese wurden mittels eines nicht-reduzierenden Western-Blots weitergehend untersucht (in der gleichen Weise, wie es in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011, Vergleichsbeispiel 5 Teil j beschrieben ist, mit dem Unterschied, dass die Antikörperlösung dahingehend geändert wurde, dass Anti-Mensch (Konjugat aus Anti-Mensch leichte kappa-Kette und Peroxidase, von der Ziege, Sigma A7164) anstelle von Anti-Maus verwendet wurde, um Klone zu identifizieren, welche hauptsächlich das Fusionsprotein F(ab')₂ (806.077) produzierten. Diese Klone wurden anschlieflend vermehrt und auf die stabile Erzeugung des Fusionsproteins über mehrere Generationen hinweg getestet, woraufhin die besten Produzenten vereinigt und unter Verwendung von Standardtechnologie in flüssigem Stickstoff gelagert wurden.
Die Vervielfältigung, Expression auf hohem Niveau und Fermentation von Fusionsproteinen aus NS0-Myelomzellen erfolgte in ähnlicher Weise wie bei Bebbington et al. (1992) in Bio/Technology 10, 169–175 beschrieben ist. Das Fusionsprotein wurde aufgereinigt, und die pro-Sequenz wurde wie in Beispiel 102 beschrieben entfernt.
Beispiele 76 bis 101
Klonierung und Expression weiterer Varianten von pro-HCPB-Linker-(humanisiertes 806.077)Fd + (humanisiertes 806.077) leichte Kette
Das Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen mit weiteren Mutanten von HCPB ähnelte demjenigen, das in Beispiel 75 (oben) ausgeführt ist, mit der Ausnahme, dass in Teil b des Beispiels 75 [A248S,G251T,D253K]HCPB durch [D253K]HCPB oder durch [G251T, D253K]HCPB ersetzt wurde und dass es sich bei dem Plasmid, welches in der PCR-Reaktion zum Einsatz kam, um pICI1713 (wie in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011, Beispiel 15, beschrieben) beziehungsweise um pZEN1860 (Vergleichsbeispiel 1) handelte. Nach dem Klonieren, der Identifizierung und der Bestätigung der Sequenz wurde das erhaltene Plasmid, welches präpro-[D253K] HCPB-Linker oder präpro-[G251T,D253K]HCPB-Linker sowie das Gen für humanisiertes 806.077 VH bis zur PstI-Stelle (bei Aminosäure 5) im Gerüst des Vektors pUC 19 enthielt, in den nachfolgenden Klonierungsreaktionen anstelle von pCF004 eingesetzt.
Das Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteine mit anderen CH1-Domänen ähnelte demjenigen, das in Beispiel 75 (oben) ausgeführt ist, mit der Ausnahme, dass in Teil c. des Beispiels 75 anstelle von 806.077-HuVH1-IgG3CH1' (SEQ ID Nr: 92 beziehungsweise 56) Plasmide eingesetzt wurden, die entweder die Version 1 des humanisierten 806.077 VH mit menschlichem IgG1 oder aber IgG2CH1 und Hinge-Regionen enthielten. Nach dem Klonieren, der Identifizierung und der Bestätigung der Sequenz wurde das erhaltene Plasmid, welches die IgG1- oder IgG2-Sequenz enthielt, in den nachfolgenden Klonierungsreaktionen anstelle von pCF005 eingesetzt.
Das Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteine mit anderen Varianten der humanisierten leichten Kette von 806.077 ähnelte demjenigen, das in Beispiel 75 (oben) ausgeführt ist, mit der Ausnahme, dass in Teil f. des Beispiels 75 anstelle von 806.077-HuVK4-HuCK (SEQ ID Nr: 51 beziehungsweise 96) Plasmide eingesetzt wurden, die entweder die Version 1 des humanisierten 806.077 Lc oder dessen Version 3 enthielten. Nach dem Klonieren, der Identifizierung und der Bestätigung der Sequenz wurde das erhaltene Plasmid, welches die alternative Sequenz der leichten Kette enthielt, in den nachfolgenden Klonierungsreaktionen anstelle von pCF008/4 eingesetzt. Die Varianten der Fusionsproteine für jedes der Beispiele (76 bis 101) sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Tabelle
Beispiel 102
Aufreinigung von Proteinen, welche die Sequenzen des Antikörpers 806.077 enthalten
Die Aufreinigung oder Anreicherung von rekombinantem F(ab')₂ oder Antikörper-Enzym-Fusionsproteinen aus den Zellkulturüberständen von Myelomzellen, CHO-Zellen oder COS-Zellen kann mittels mehrerer Verfahren erfolgen, welche einzeln oder zusammen angewendet werden können. Die Aufreinigung von 806.077 F(ab')₂ der Maus, chimärischen 806.077 F(ab')₂-Konstrukten und vollständig humanisierten 806.077 F(ab')₂-Konstrukten sowie von Antikörper-Enzym-Fusionsproteinkonstrukten, welche diese Konstrukte umfassen erfolgte mittels eines oder mehrerer unterschiedlicher Verfahren der Affinitätschromatographie oder Anionenaustauschchromatographie oder Protein A/Protein G-Chromatographie. Diese Techniken im Falle von Fusionen aus Antikörper 806.077 – B7 ebenfalls zur Aufreinigung angewendet werden (siehe Beispiel 104).
a) Antigen-Affinitätschromatographie
Das carcinoembryonische Antigen (CEA), welches als Entwicklungsgrundlage des parentalen Antikörpers 806.077 der Maus diente, wurde (unter Verwendung von Pharmacia Produkten) auf einer Säule immobilisiert. Zusammenfassend gesagt, erfolgte die Immobilisierung über eine stabile Esterbindung an ein Sepharose^TM Hochleistungsmedium, welches NHS-aktiviert und in Säulen (HiTrap^TM) vorgepackt war; Die Kupplung des CEA an die aktivierte Matrix wurde gemäß den Standardanweisungen, die dem Produkt beiliegen, durchgeführt.
Herstellung einer 1-ml-Affinitätssäule
Die CEA-Stammlösung (8 mg/ml) wurde zunächst mit Kupplungspuffer (0,2 M Natriumhydrogencarbonat, 0,5 M Natriumchlorid; pH = 8,3) verdünnt, und zwar bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml. Ein unbenutzte Säule wurde mit 6 ml eiskalter HCl (1 mM) mit einer Flussrate, die 1 ml/min. nicht übersteigt, gewaschen. Unmittelbar nach wurde der CEA-Ligand (1 ml mit 0,5 mg/ml) auf die Säule gegeben. Die Säule wurde an beiden Enden fest verschlossen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Überschüssige aktive Gruppen, die keine Verknüpfung mit dem Ligand eingegangen sind, wurden deaktiviert, und jegliche unspezifisch gebundene Liganden wurden in drei Waschschritten mit jeweils abwechselnd hohem und niedrigem pH-Wert ausgespült. Bei den verwendeten Puffern handelte es sich um 0,5 M Ethanolamin, 0,5 M Natriumchlorid (pH = 8,3) und um 0,1 M Natriumacetat, 0,5 M Natriumchlorid (pH = 4,0). Bei jedem Waschschritt wurden von jedem der Puffer 6 ml auf die Säulenmatrix gegeben. Zum Abschluss wurde die Säule mit Lagerungspuff er (0,05 M Na₂HPO₄, 0,1 % NaN₃, pH = 7,0) gewaschen.
Aufreinigungsverfahren
Der Zellkulturüberstand, welcher das gewünschte F(ab')₂ oder die gewünschten Fusionskonstrukte z.B. chimärisches 806.077 F(ab')₂, humanisiertes 806.077 F(ab')₂ oder Antikörper-Enzym-Fusionsprotein enthielt, wurde 1:1 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,2) verdünnt und mit einer Flussrate von 1 ml/min. auf eine 1-ml-Affinitätssäule gegeben. Die Säule war zuvor mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,2; 50 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid) konditioniert worden. Nach dem Durchlauf des Zellkulturüberstandes Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina an phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Gebundenes F(ab')₂ wurde mit 5 Säulenvolumina an 100 mM Natriumcitrat (pH 3,0) eluiert, wobei 1-ml-Fraktionen des Eluenten aufgefangen wurden. Der Nachweis des eluierten F(ab')₂ erfolgte durch Untersuchung mit Western Blot, wobei ein geeignetes Konjugat aus Antikörper und Peroxidase (im Falle des vollständig humanisierten F(ab')₂ handelte es sich um ein Konjugat aus Anti-Mensch leichter kappa-Kette und Peroxidase, Sigma A-7164) zum Einsatz kam und mit Wasserstoffperoxid und 4-Chlor-1-Naphthol entwickelt wurde. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und aufkonzentriert, wobei, wenn erforderlich, ein Zentrifugalkonzentrator (Centricon^TM 30) benutzt wurde.
b) Anionenaustauschchromatographie
Der Zellkulturüberstand, welcher das gewünschte F(ab')₂ oder die gewünschten Fusionskonstrukte z.B. chimärisches 806.077 F(ab')₂, humanisiertes 806.077 F(ab')₂ oder Antikörper-Enzym-Fusionsprotein enthielt, wurde (unter Verwendung eines Behälters mit Rührvorrichtung und Ausschlussmembran für ein Molekulargewicht von 10.000) in 50 mM TRIS diafiltriert, bis die Ionenstärke der Lösung derjenigen des Puffers für die Konditionierung der Säule entsprach. Ein Aliquot von 40 ml des diafiltrierten Überstandes wurde mit 2 ml/min. auf eine geeignete Säule (Pharmacia Mono Q^TM 10/10 HR) gegeben. Die Säule war zuvor mit 50 mM TRIS (pH = 8,0) konditioniert worden. Nachdem Durchlauf des Überstandes wurde die Säule mit Konditionierungspuffer gewaschen, bis die Grundlinie wieder erreicht wurde. Die auf der Säule gebundenen Substanzen wurden anschließend mit 0 bis 50% Puffer B (50 mM TRIS, 1 M Natriumchlorid, pH = 8,0) unter Einsatz von 15 Säulenvolumina eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden aufgefangen (4 ml pro Fraktion), und diejenigen, welche F(ab')₂ enthielten, wurden mittels Western Blot identifiziert, wobei ein geeignetes Konjugat aus Antikörper und Peroxidase (im Falle des vollständig humanisierten F(ab')2 handelte es sich um ein Konjugat aus Anti-Mensch leichter kappa-Kette und Peroxidase, Sigma A-7164) zum Einsatz kam und mit Wasserstoffperoxid und 4-Chlor-1-Naphthol entwickelt wurde. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und aufkonzentriert, wobei, wenn erforderlich, ein Zentrifugalkonzentrator (Centricon^TM 30) benutzt wurde.
c) Protein A- und Protein G-Aufreinigung
Der Zellkulturüberstand, welcher das gewünschte F(ab')₂ oder das gewünschte Fusionskonstrukt (z.B. 806.077 F(ab')₂, chimärisches 806.077 IgG₁ oder IgG₂ oder IgG₃; pro-HCPB-Linker-806.077 F(ab')₂, 806.077 F(ab')₂-HCPB)enthielt, wurde 1:1 mit phosphatgepufferte Kochsalzlösung verdünnt, bevor er auf ein Säule gegeben wurde, die zuvor mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,2) konditioniert worden war. Die Säule wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, bis zum erneuten Erreichen der Grundlinie, bevor das gebundene F(ab')₂ oder Fusionsprotein eluiert wurde, und zwar mit 100 mM Natriumcitrat (pH = 3,0) im Falle von F(ab')₂ sowie mit 50 mM Glycin, 100 mM Natriumchlorid (pH = 10,8) im Falle der Fusionsproteine. Die Elutionsfraktionen wurden aufgefangen und durch Zugabe von 125 μl an 2M TRIS pro 1 ml Elutionsvolumen neutralisiert. Diejenigen Fraktionen, welche das F(ab')₂ enthielten, wurden vereinigt und aufkonzentriert, wobei, wenn erforderlich, ein Zentrifugalkonzentrator benutzt wurde.
d) Abspaltung der pro-Sequenz:
Bei Fusionsproteinen, die eine kovalent gebundene pro-Sequenz z.B. (pro-HCPB-Linker-806.077 F(ab')₂) enthielten, wurde die pro-Sequenz durch Inkubation des Fusionsproduktes mit Trypsin abgespalten. Dieses Verfahren wurde im Maßstab von einigen Milligramm (des Fusionsproduktes) durchgeführt und umfasste Folgendes. Trypsin wurde mit dem Fusionsprotein in einem Verhältnis von 1:1.000 (Trypsin:Fusionprodukt) gemischt. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur (ungefähr 22°C) inkubiert, woraufhin die pro-Sequenz vollständig abgespalten war. Das Fusionsprotein wurde von der pro-Sequenz abgetrennt, indem die Mischung erneut einem der allgemeinen Verfahrensabläufe zur chromatographischen Aufreinigung oder Anreicherung unterzogen wurde.
Beispiel 103
Assay zur Untersuchung der Aktivität von Antikörper-Enzym-Fusionsproteinen, die mutiertes menschliches CPB enthalten, gegenüber Analoga des Hipp-Glu-Prodrugs
Zellkulturüberstände oder aufgereinigte Antikörper-Enzym-Fusionsproteine, die Mutanten des menschliches CPB enthalten (D253K; G252T,D253K; A248S,G251T,D253K: Beispiele 48 bis 101) werden unter Verwendung eines HPLC-basierten Assays auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Hippuryl-L-Glutaminsäure (Hipp-Glu; Vergleichsbeispiel 9 in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011) in Hippursäure umzuwandeln.
Die Reaktionsmischung (250 μl) enthält entweder 4 μl des aufgereinigten Fusionsproteins oder aber Zellkulturüberstand (entweder unverändert oder mit 0,025 M TRIS-HCl (pH = 7,5) verdünnt eingesetzt; 125 μl) sowie 0,5 mM Hipp-Glu in 0,025 M TRIS-HCl, wobei Proben mit einem pH-Wert von 7,5 bei 37°C 5 Stunden lang inkubiert wurden. Die Reaktionen wurden beendet, indem 250 μl an 30 % Methanol, 70 % Phosphatpuffer (50 mM; pH 6,5), 0,2 % Trifluoressigsäure hinzufügt wurden, woraufhin die Menge der gebildeten Hippursäure mittels HPLC bestimmt wird (unter Verwendung eines Hewlett Packard 1090 Series 11 mit Diodenarraysystem).
Die Proben (50 μl) werden auf eine Säule gegeben (25 cm; HICHROM^TM Hi-RPB) und unter Verwendung einer mobilen Phase aus 15 % Methanol und 85 % Phosphatpuffer (50 mM; pH = 6,5) mit einer Flussrate von 1 ml/min. aufgetrennt. Die Menge an gebildetem Produkt (Hippursäure) wird anhand von Kalibrierkurven bestimmt, welche mit bekannten Mengen an Hippursäure (Sigma-H6375) erstellt wurden. Die Ergebnisse werden als prozentuale Umwandlung des Substrats in das Produkt bei 37°C ausgedrückt, wobei die Bestimmung, in Abhängigkeit von Umwandlungsrate, zu verschiedenen Zeitpunkten im Bereich von 30 min. bis 24 Std. erfolgt.
Bei Antikörper-Enzym-Fusionsproteinen mit N-terminalem proCPB wird zunächst die Prodomäne durch 1stündige Behandlung mit Trypsin (700 μg/ml) in 50 mM TRIS-HCl (pH = 7,6), 150 mM NaCl bei 4°C entfernt.
Beispiel 104
Herstellung eines Fusionsproteins (hB7-806) aus menschlichem B7,1-humanisiertem 806.077 F(ab')₂
Wie im Vergleichsbeispiel 3 wird unter Einsatz von PCR-Techniken ein Fusionsprotein konstruiert, das aus der Signalsequenz und der extrazellulären Domäne von menschlichem B7.1, welche direkt an die 5'-codierende Region der humanisierten Kette Fd des Antikörpers 806.077 kondensiert sind, besteht. Es wird ein HindIII-NheI-Fragment erstellt, das die natürliche Signalsequenz und die extrazelluläre Domäne des menschlichen B7.1, welche an die V_H-Region der humanisierten schweren Kette des Antikörpers 806.077 kondensiert sind, enthält. Dieses wird in einen geeigneten Vektor, zum Beispiel in pNG4-V_Hss-HuIgG2CH1' oder pNG4-V_Hss-HuIgG3CH1' (siehe Beispiele 39 bis 47) kloniert (wobei die Basen 1 bis 423 in Seq.ID Nr: 18 ersetzt werden), um ein Fusionsgen aus menschlichem B7.1-humanisiertem 806.077 Fd zu schaffen. Die co-Expression dieses Fusionsprodukts mit einer humanisierten L Kette von 806.077 (als Vektor für die Version VK4 der humanisierten leichten Kette von 806.077 eignet sich pCF008/4, siehe Beispiel 75) erfolgt anschließend, nach Konstruktion eines co-Expressionsvektors unter Verwendung von Expressionssystemen wie denen, die im vorliegenden Schriftstück beschrieben sind. Ein solcher Vektor wird für die Transfektion von NS0-Myelomzellen und Kolonien verwendet, wobei letztere in dem Kulturüberstand hinsichtlich des Vorhandenseins von CEA-Bindungsaktivität selektiert wurden. Weitere humanisierte Sequenzen sind in den Beispielen 39 bis 47 beschrieben.
Das Fusionsprotein hB7-806 wird aus einer geeigneten Zelllinie exprimiert und unter Verwendung einer Protein-A-Säule aufgereinigt, und zwar gemäß der Beschreibung im Vergleichsbeispiel 3 oder einem der Verfahren, die in Beispiel 102 beschrieben sind. Es sei darauf hingewiesen, dass für humanisierte Fragmente des Antikörpers 806.077 und daraus hergestellte Fusionsproteine andere Verfahren als Protein-A-Säulen bevorzugt werden. Wenn die Fusionsproteine an LS174T-Zellen gebunden sind, können sie sowohl auf ihre Antigen- und Rezeptorbindungseigenschaften als auch auf ihre co-stimulierende Wirkung auf T-Zellen untersucht werden, und zwar unter Verwendung der Assays, die im Vergleichsbeispiel 3 beschrieben sind.
Beispiel 105
Herstellung von Konjugaten aus chimärischem and humanisiertem 806.077 F(ab')₂-CPG2
Die Vorgehensweise, die in Beispiel 5 beschrieben ist, wurde wiederholt, wobei das F(ab')₂-Protein der Maus durch eine der chimärischen Versionen, die in Beispiel 8 beschrieben sind, oder eine der humanisierten Versionen, die in den Beispielen 39 bis 47 beschrieben sind, ersetzt wird.
Beispiel 106
Herstellung eines Fusionsproteins aus humanisiertem 806.077 Fab-CPG2
Fusionsproteinkonstrukte aus humanisiertem Antikörper 806.077 und bakteriellem CPG2-Enzym werden unter Verwendung von PCR-Verfahren konstruiert, welche denjenigen ähnlich sind, die für die Konstruktion von HuVK4 in den Beispielen 12 bis 38 beschrieben wurden, wobei spezifisch erstellte Primer in einer PCR-Reaktion zum Einsatz kommen, um die Genkomponenten des Antikörpers und des Enzyms zu vervielfältigen (und zwar derart, dass die erhaltenen DNA-Produkte überlappende komplementären Sequenzen aufweisen), welche anschließend über eine weitere PCR-Reaktion des Typs "Spleißen/Verbinden" aneinandergefügt werden, um das vollständige Antikörper-Enzym-Fusionsgen herzustellen. Das Fusionsprotein wird hergestellt, indem das 3'-Ende des Gens des humanisiertes schweren Kette Fd des Antikörpers 806.077 an das 5'-Ende des Gens, welches für die CPG2-Struktur codiert, angefügt wird, um ein Gen zu schaffen, welches für ein Fab-CPG2-Fusionsprotein codiert. In einem solchen Konstrukt kann die Genkomponente des humanisierten schweren Kette des Antikörpers 806.077 nach dem Rest K236 beendet werden, um die schwere Kette Fd HuVH1-HulgG1 (SEQ ID Nr: 93) zu erhalten, oder nach dem Rest Val 237, um die schwere Kette Fd HuVH1-HuIgG2 (SEQ ID Nr: 57) zu erhalten, oder nach dem Rest Val 237 der schweren Kette in der schweren Kette Fd HuVH1-HuIgG3 (SEQ ID Nr: 95) (sodass, in jedem der Fälle, jegliche Sequenz, welche die Hinge-Region betreffen, ausgeschlossen werden), und sie kann an den ersten CPG2-Rest, der sich, mit Bezug auf die Spaltungsstelle der Signalsequenz (Minton et al (1984) Gene 31, 31–38), in C-terminaler Position befindet, angefügt werden. Um optimale Enzymeigenschaften und Antikörperbindungseigenschaften zu erzielen, ist indes vorstellbar, dass es erstrebenswert wäre, zusätzliche Reste in die Verbindungsstelle zwischen den beiden Bestandteilen, aus denen sich das Konstrukt zusammensetzt, einzufügen.
Anschließend wird das Fusionsgen in einen geeigneten Vektor kloniert, zum Beispiel in pNG4-VHss-HuIgG2CH1' (NCIMB-Nr. 40797), nachdem eine geeignete Verdauung mit Restriktionsenzymen stattgefunden hat und der Vektor sowie das DNA-Fragment des Fusionsgens isoliert worden sind, sodass das ursprüngliche Antikörpergen durch das Gen des Fusionsproteins ersetzt werden kann. Anschließend erfolgt die co-Expression des Fusionsproduktes mit einer humanisierten leichten Kette von 806.077, nachdem ein co-Expressionsvektor in einer Weise konstruiert worden ist, die analog zu derjenigen ist, die in Beispiel 11 beschrieben ist. Der co-Expressionsvektor wird dazu verwendet, NS0-Myelomzellen und Kolonien wie oben beschrieben zu transfizieren, wobei letztere anhand des Vorhandensein von CEA- und Fd-Bindungsaktivität im Kulturüberstand selektiert wurden. Das Fusionsprotein kann unter Verwendung einer Protein-A-Säule aufgereinigt werden, und das Vorhandensein sowohl der Antigen- als auch der enzymatischen Eigenschaften kann unter Anwendung von Standardtestverfahren aufgezeigt werden.
Beispiel 107
Weitere Kombinationen der variablen Regionen der humanisierten schweren und leichten Kette, wobei die Sequenz VK4 der leichten Kette als Grundlage dient.
Die Vorgehensweise, die in den Beispielen 12 bis 38 beschrieben ist, wird wiederholt, wobei die variable Sequenz VK4 (SEQ ID Nr: 71) der humanisierten leichten Kette durch die modifizierte Sequenz, in welcher sich anstelle des Tyrosinrestes (Tyr) an Position 35 von SEQ ID Nr: 71 ein Phenylalaninrest (Phe) befindet, ersetzt wird.
Beispiel 108
Weitere Kombinationen der variablen Regionen der humanisierten schweren und leichten Kette, wobei die Sequenz VK4 der leichten Kette als Grundlage dient.
Die Vorgehensweise, die in den Beispielen 12 bis 38 beschrieben ist, wird wiederholt, wobei die variable Sequenz VK4 (SEQ ID Nr: 71) der humanisierten leichten Kette durch die modifizierte Sequenz, in welcher sich anstelle des Phenylalaninrestes (Phe) an Position 72 von SEQ ID Nr: 71 ein Leucinrest (Leu) befindet, ersetzt wird.
Beispiel 109
Weitere Kombinationen der variablen Regionen der humanisierten schweren und leichten Kette, wobei die Sequenz VK4 der leichten Kette als Grundlage dient.
Die Vorgehensweise, die in den Beispielen 12 bis 38 beschrieben ist, wird wiederholt, wobei die variable Sequenz VK4 (SEQ ID Nr: 71) der humanisierten leichten Kette durch die modifizierte Sequenz, in welcher sich anstelle des Tyrosinrestes (Tyr) an Position 35 und des Phenylalaninrestes (Phe) an Position 72 von SEQ ID Nr: 71 ein Phenylalaninrest (Phe) beziehungsweise ein Leucinrest (Leu) befinden, ersetzt wird.
Beispiel 110
Kombination der variablen Regionen der humanisierten schweren Kette und einer chimärischen Sequenz der leichten Kette
Die Vorgehensweise, die in den Beispielen 12 bis 38 beschrieben ist, wird wiederholt, wobei die variable Sequenz der humanisierten leichten Kette durch die chimärische Sequenz mit der SEQ ID Nr: 17, die in Beispiel 8 beschrieben ist, ersetzt wird.
Beispiel 111 bis 113
Expression des humanisierten F(ab')₂-Fragments mit einer modifizierten variablen Sequenz VK4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in den Beispielen 39 bis 47 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei die variable Sequenz der leichten Kette, die in Beispiel 107 beschrieben ist, eingesetzt wird, um die humanisierte Sequenz SEQ ID Nr: 99 der leichten Kette, in welcher sich anstelle des Tyrosinrestes (Tyr) an Position 57 von SEQ ID Nr: 99 ein Phenylalaninrest (Phe) befindet, zu ersetzen.
Bei Beispiel 111 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG1 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Bei Beispiel 112 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG2 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Bei Beispiel 113 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG3 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Beispiel 114 bis 116
Expression des humanisierten F(ab')₂-Fragments mit einer modifizierten variablen Sequenz VK4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in den Beispielen 39 bis 47 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei die variable Sequenz der leichten Kette, die in Beispiel 108 beschrieben ist, eingesetzt wird, um die humanisierte Sequenz SEQ ID Nr: 99 der leichten Kette, in welcher sich anstelle des Phenylalaninrestes (Phe) an Position 94 von SEQ ID Nr: 99 ein Leucinrest (Leu) befindet, zu ersetzen.
Bei Beispiel 114 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG1 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Bei Beispiel 115 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG2 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Bei Beispiel 116 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG3 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Beispiel 117 bis 119
Expression des humanisierten F(ab')₂-Fragments mit einer modifizierten variablen Sequenz VK4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in den Beispielen 39 bis 47 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei die variable Sequenz der leichten Kette, die in Beispiel 109 beschrieben ist, eingesetzt wird, um die humanisierte Sequenz SEQ ID Nr: 99 der leichten Kette, in welcher sich anstelle des Tyrosinrestes (Tyr) an Position 57 und des Phenylalaninrestes (Phe) an Position 94 von SEQ ID Nr: 99 ein Phenylalaninrest (Phe) beziehungsweise ein Leucinrest (Leu) befindet, zu ersetzen.
Bei Beispiel 117 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG1 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Bei Beispiel 118 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG2 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Bei Beispiel 119 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG3 und der oben beschriebenen modifizierten SEQ ID Nr: 99.
Beispiel 120 bis 122
Expression des humanisierten F(ab')2-Fragments mit einer chimärischen Sequenz der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in den Beispielen 39 bis 47 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei die chimärische Sequenz der leichten Kette, die in Beispiel 110 beschrieben ist, die humanisierten Sequenzen, die in den Beispielen 39 bis 47 verwendet werden, ersetzt.
Bei Beispiel 120 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG1 und der oben beschriebenen chimärischen Sequenz der leichten Kette.
Bei Beispiel 121 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG2 und der oben beschriebenen chimärischen Sequenz der leichten Kette.
Bei Beispiel 122 handelt es sich um die Kombination von HuVH1-HuIgG3 und der oben beschriebenen chimärischen Sequenz der leichten Kette.
Beispiel 123
Herstellung eines humanisierten Fusionsproteins auf Grundlage der modifizierten Sequenz VK 4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in Beispiel 48 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei jedoch das Plasmid pEE14-806.077HuVK4-HuCK durch ein Plasmid ersetzt wird, welches die modifizierte Sequenz VK4 der Beispiele 107 und 111 bis 113 enthält.
Beispiel 124
Herstellung eines humanisierten Fusionsproteins auf Grundlage der modifizierten Sequenz VK 4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in Beispiel 48 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei jedoch das Plasmid pEE14-806.077HuVK4-HuCK durch ein Plasmid ersetzt wird, welches die modifizierte Sequenz VK4 der Beispiele 108 und 114 bis 116 enthält.
Beispiel 125
Herstellung eines humanisierten Fusionsproteins auf Grundlage der modifizierten Sequenz VK 4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in Beispiel 48 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei jedoch das Plasmid pEE14-806.077HuVK4-HuCK durch ein Plasmid ersetzt wird, welches die modifizierte Sequenz VK4 der Beispiele 109 und 117 bis 119 enthält.
Beispiel 126
Herstellung eines humanisierten Fusionsproteins auf Grundlage einer chimärischen Sequenz VK 4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in Beispiel 48 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei jedoch das Plasmid pEE14-806.077HuVK4-HuCK durch ein Plasmid ersetzt wird, welches eine chimärische Sequenz der Beispiele 110 und 120 bis 122 enthält.
Beispiel 127
Herstellung eines humanisierten Fusionsproteins auf Grundlage der modifizierten Sequenz VK 4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in Beispiel 75 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei jedoch das Plasmid pCF008/4 durch ein Plasmid ersetzt wird, welches die modifizierte Sequenz VK4 der Beispiele 107 und 111 bis 113 enthält.
Beispiel 128
Herstellung eines humanisierten Fusionsproteins auf Grundlage der modifizierten Sequenz VK 4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in Beispiel 75 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei jedoch das Plasmid pCF008/4 durch ein Plasmid ersetzt wird, welches die modifizierte Sequenz VK4 der Beispiele 108 und 114 bis 116 enthält.
Beispiel 129
Herstellung eines humanisierten Fusionsproteins auf Grundlage der modifizierten Sequenz VK 4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in Beispiel 75 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei jedoch das Plasmid pCF008/4 durch ein Plasmid ersetzt wird, welches die modifizierte Sequenz VK4 der Beispiele 109 und 117 bis 119 enthält.
Beispiel 130
Herstellung eines humanisiertes Fusionsproteins auf Grundlage einer chimärischen Sequenz VK 4 der leichten Kette
Die Vorgehensweisen, die in Beispiel 75 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei jedoch das Plasmid pCF008/4 durch ein Plasmid ersetzt wird, welches die chimärische Sequenz der Beispiele 110 und 120 bis 122 enthält.
Vergleichsbeispiel 1
Herstellung der Gensequenz für [G251T,D253K]HCPB
Das Verfahren zum Klonieren von [G251T,D253K]HCPB in E.coli war demjenigen Verfahren sehr ähnlich, das in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011, Beispiel 15 beschrieben ist. Es wurde wiederum pICI266 als Klonierungsvektor verwendet, wobei es sich bei dem Ausgangsmaterial, welches für die PCR-stellengesteuerte Mutagenese eingesetzt wurde, jedoch um das Gen [D253K]HCPB im Plasmid pICI1713 handelte (wie in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011, Beispiel 15 beschrieben ist). In diesem Fall wurde die stellengesteuerte Mutagenese indes während der PCR-Vervielfältigung des Gens angewendet, um das Codon der Aminosäureposition 251 im ausgereiften Gen von Glycin in Threonin (GGC zu ACT) umzuändern, d.h. eine G251T-Änderung vorzunehmen. Weiterhin wurden, während diese Mutation vorgenommen wurde, eine Reihe anderer Mutationen an der gleichen Stelle (G251) bewirkt, indem eine Mischung aus Oligonukleotiden mit Codonänderungen bei G251 eingesetzt wurde. Die jeweiligen mutierten Gene wurden nach Transformation und Hybridisierung mittels einer Sequenzierung an der Mutationsstelle, welche vor der vollständigen Gensequenzierung vorgenommen wurde, identifiziert. In diesem Beispiel werden ausschließlich diejenigen Oligonukleotid, welche der Einführung der G251T-Mutation dienen, betrachtet. Auf ähnliche Weise wie es in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011, Beispiel 15 beschrieben ist, wurden zwei PCR-Mischungen hergestellt. In der ersten handelte es sich bei den Reaktionsprimern um CAN 00402 (SEQ ID Nr: 116) und CAN 00734 SEQ ID Nr: 117). In der zweiten handelte es sich bei den Reaktionsprimern um CAN 00284 (SEQ ID Nr: 118) und CAN 01076 SEQ ID Nr: 119). In beiden Reaktionen wurde pICIl713 als Start-DNA eingesetzt.
Aliquote der beiden PCR-Reaktionen wurden mittels Agarosegelelektrophorese unter Abschätzung der Konzentration auf DNA mit den richtigen Größen (ungefähr 750 und 250 Basenpaare) untersucht, wobei festgestellt wurde, dass hauptsächlich Banden der richtigen Größe enthalten waren. Anschließend wurde eine weitere PCR vorbereitet, bei welcher die ersten beiden PCR-Produkte sowie die beiden Endprimer {CAN 00402 (SEQ ID Nr: 116) und CAN 00284 (SEQ ID Nr: 118)} eingesetzt wurden. Ein Aliquot des PCR-Produktes wurde mittels Agarosegelelektrophorese auf DNA mit der richtigen Größe (ungefähr 1.000 Basenpaare) untersucht, wobei festgestellt wurde, dass hauptsächlich eine Bande der richtigen Größe enthalten waren. Das übrige Produkt aus der Reaktionsmischung wurde aufgereinigt, die isolierte DNA mit den Restriktionsenzymen NcoI und EcoRI verdaut und eine Bande mit der richtigen Größe (ungefähr 1.000 Basenpaare) ähnlicher Weise wie es in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011 Beispiel 16 beschrieben ist aufgereinigt.
Die doppelsträngige DNA von pICI266 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und EcoRI verdaut, und die DNA mit der richtigen Größe (ungefähr 5.600 Basenpaare) wurde auf gereinigt. Sowohl nach der Restriktion als auch nach der Aufreinigung wurden Aliquote von DNA-Proben des Vektors und des Inserts unter Anwendung der Gelelektrophorese einer Reinheitsprüfung und einer Konzentrationsabschätzung unterzogen, wobei mit bekannten Standards verglichen wurde. Auf Grundlage dieser Schätzungen wurden Ligationsmischungen hergestellt, um das HCPB-Gen in den Vektor pICI266 zu klonieren, um zwar auf ähnliche Weise wie es in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011 Beispiel 16 beschrieben ist.
Nach dem Ligationsreaktion wurde die DNA-Mischung verwendet, um den Kolonien des E.coli Stamms DH5α zu transformieren. Die Kolonien wurden entnommen und mittels Hybridisierung getestet. Eine Reihe von Klonen wurde zur Herstellung von plasmidischer DNA eingesetzt, woraufhin die Region der PCR-Mutation sequenziert wurde, um Klone mit der G251T-Änderung zu identifizieren, und zwar auf ähnliche Weise wie es in der internationalen Patentanmeldung Nummer WO 96/20011 Beispiel 16 beschrieben ist. Auf der Grundlage der Ergebnisse der Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, der ein Plasmid mit der erforderliche Gensequenz [G251T:D253K]HCPB enthält, und dieses Plasmid wurde als pZEN1860 bezeichnet.
Vergleichsbeispiel 2
Herstellung der Gensequenz für [A248S,G251T,D253K]HCPB
Das Verfahren zum Klonieren von [A248S,G251T,D253K]HCPB in E.coli war demjenigen Verfahren sehr ähnlich, das im Vergleichsbeispiel 1 beschrieben ist. Bei dem Ausgangsmaterial, welches für die PCR-stellengesteuerte Mutagenese eingesetzt wurde, handelte es sich um das Gen [G251T,D253K]HCPB, das sich im Plasmid pZEN1860 (beschrieben in Vergleichsbeispiel 1) anstelle des Plasmids pICI1713 befand. In diesem Fall wurde die stellengesteuerte Mutagenese indes während der PCR-Vervielfältigung des Gens angewendet, um das Codon der Aminosäureposition 248 im ausgereiften Gen von Alanin in Serin (GCT zu TTC) umzuändern, d.h. eine A248S-Änderung vorzunehmen. Auf ähnliche Weise wie es im Vergleichsbeispiel 1 beschrieben ist, wurden zwei PCR-Mischungen hergestellt. In der ersten handelte es sich bei den Reaktionsprimern um CAN 00402 (SEQ ID Nr: 116) und CAN 00720 (SEQ ID Nr: 120). In der zweiten handelte es sich bei den Reaktionsprimern um CAN 00284 (SEQ ID Nr: 118) und CAN 00726 SEQ ID Nr: 121). In beiden Reaktionen wurde pZEN1860 als Start-DNA eingesetzt.
Die Verfahren, die zur PCR, zum Klonieren, zur Expression und zur Identifizierung angewendet wurden, waren die gleichen wie für das Vergleichsbeispiel 1. Auf der Grundlage der Sequenzierungsergebnisse wurde ein Klon ausgewählt, der ein Plasmid mit der erforderlichen Gensequenz [A248S,G251T,D253K]HCPB enthält, und dieses Plasmid wurde als pZEN1921 bezeichnet.
Vergleichsbeispiel 3
Herstellung und Charakterisierung eines Fusionsproteins (AB7) aus menschlichem B7.1-A5B7 F(ab')₂ der Maus
Die Verfahren zur Herstellung, Aufreinigung und Charakterisierung des rekombinanten Antikörpers A5B7 F(ab')₂ der Maus sind veröffentlicht worden (WO 96/20011, Vergleichsbeispiel 5). Die cDNA-Sequenz für das menschliche B7.1-Antigen (auch CD80 genannt) ist isoliert und beschrieben worden (Freeman G.J et al, Journal of Immunology, 1989, 143, 2714–2722). In diesem Beispiel bezieht sich "AB7" auf das Fusionsprotein aus menschlichem B7.1-A5B7 F(ab')₂ der Maus, und "A5B7" bezieht sich auf den Anti-CEA-Antikörper, der als A5B7 bezeichnet wird.
Unter Anwendung einer Strategie, die auf PCR beruhte, haben wir die natürliche Signalsequenz und die extrazelluläre Domäne des menschlichen B7.1 (welche für die Aminosäuren 1 bis 242 codiert) aus der cDNA, die aus kultivierten 5-Raji-Zellen (ATCC-Nr. CCL 86) präpariert wurde, isoliert und direkt strangaufwärts der ausgereiften 5'-codierenden Sequenz des Fragments A5B7 Fd der Maus angefügt. Dabei wurde die B7.1-Sequenz mit den PCR-Primern 187/96 und 204/96 (SEQ ID Nr: 126 und 127) sowie ein Teil der A5B7 Fd Sequenz mit den PCR-Primern 203/96 und 205/96 (SEQ ID Nr: 128 und 129) isoliert. Nach der Aufreinigung der PCR-Produkte wurden diese in näherungsweise äquimolaren Mengen gemischt mittels PCR unter Verwendung der Primer 187/96 und 205/96 kondensiert. Das erhaltene PCR-Produkt wurde gereinigt, mit HindIII und BstEII (New England Biolabs (UK) Ltd., Wilbury Way, Hitchin, SG4 OTY) verdaut und unter Anwendung von Standardverfahren in die HindIII-BstEII-Region von pAF1 kloniert, um das Fusionsprodukt aus menschlichem B7.1-A5B7 Fd der Maus in voller Länge zu erhalten. Dieses Fusionsgen (SEQ ID Nr: 130 bis 131) wurde gemäß den Verfahrensanleitungen, die in WO 96/20011, Vergleichsbeispiel 5 beschrieben sind, als EcoRI-HindIII-Fragment in den GS-System^TM Expressionsvektor pEE6 (Celltech Biologics, Bath Road, Slough, SL1 4EN) kloniert, um den Vektor pAB7.1 herzustellen.
Anschließend wurde ein BgIII-SaII-Fragment, welches die B7.1-A5B7 Fd Expressionskassette enthielt, zwischen die BgIII- und SaII-Stellen des vorstehend beschriebenen Vektors pAF6 kloniert, um einen Vektor (pAB7.2) herzustellen, der dazu befähigt ist, das Fusionsprotein und die A5B7 L Kette zu co-exprimieren. Der Vektor pAB7.2 wurde daraufhin dazu verwendet, die NS0-Myelomzellen und Kolonien zu transformieren, welche hinsichtlich ihrer Fähigkeit, bei Abwesenheit von Glutamin zu wachsen, selektiert wurden. Zelllinien, welche das Fusionsprotein exprimieren, wurden identifiziert, indem im Kulturüberstand die CEA-Bindungsaktivität unter Verwendung des beschriebenen ELISA bestimmt wurde. Eine Zelllinie, welche das Fusionsprotein (1D4) in geeignetem Ausmaße exprimierte, wurde zur Aufreinigung und Charakterisierung des Fusionsproteins AB7 ausgewählt.
Aufreinigung und Charakterisierung des Fusionsproteins AB7
Das sekretierte rekombinante Material, nämlich B7.1(35-242)-ASB7 F(ab)₂, AB7, wurde unter Verwendung einer Protein-A-Agarosematrix wie beispielsweise Protein-A-Sepharose 4 "fast flow" des Herstellers Pharmacia (Pharmacia Biotech, 23 Grosvenor Rd, St Albans, Herts, AL1 3AW) aus dem Kulturüberstand auf gereinigt. Die Matrix wurde mit 2 × 8 Matrixvolumina an Bindungspuffer (3 M NaCl, 1,5 M Glycin, pH = 8,9) gewaschen. Der Kulturüberstand, der AB7 enthielt, wurde 1:1 mit dem Bindungspuffer verdünnt. Die gewaschene Matrix wurde zu dem verdünnten Kulturüberstand gegeben (1 ml Rüttelvolumen an Matrix auf 40 ml verdünnten Überstand) und 2 Std. lang unter mäßigem Schütteln bei 4°C inkubiert. Die Matrix abzentrifugiert, und näherungsweise 75 % des Überstandes wurde vorsichtig abgegossen. Anschließend wurde die Matrix in dem verbleibenden Überstand wieder in Suspension gebracht und die erhaltene Aufschlämmung in eine Säule gegeben. Die Säule wurde mit 5 bis 6 Säulenvolumina an 150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ (pH = 7,4) gewaschen. Anschließend wurde der Puffer durch 100 mM Na-Citrat (pH = 2,8) ersetzt und die Elutionsfraktionen aufgefangen. Diese Fraktionen wurde bis zu einem pH-Wert von näherungsweise 7,0 titriert, und zwar durch Zugabe von 2M TRIS-Puffer (pH = 8,5). Die Elutionsfraktionen wurden mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE untersucht und die Peaks der AB7-Fraktion(en) als das Produkt gewonnen.
N-Terminale Sequenzierung
Eine Probe von AB7 wird einer Untersuchung mittels reduzierender SDS-PAGE unterzogen und auf einer PVDF(Polyvinylidendifluorid)-Membran geblottet (Geräte, Gele, Blotting-Membran und Verfahrensanleitungen von NOVEX, 4202 Sorrento Valley Blvd, San Diego, CA 92121, USA.) Die Proteinbanden wurden mit Coomassie-Blau angefärbt und die Bande bei näherungsweise 70 kDa (d.h. das Fusionsprodukt B7.1-Fd) wurde N-terminal sequenziert (Applied Biosystems, 494 Protein Sequencer (Perkin Elmer, ABI division, Kelvin close, Birchwood Science Park North, Warrington, WA3 7PB.) Die erhaltene Sequenz stimmte mit der erwarteten Sequenz für ausgereiftes B7 (d.h. nach Abspaltung der Führungssequenz ab Aminosäure 35 in SEQ.ID Nr: 131, Val Ile His Val usw.) überein.
BIAcore-Analyse
AB7 wurde unter Verwendung eines BIAcore Oberflächenplasmonresonanz-Gerätes hergestellt von BIAcore (23 Grosvenor Rd, St. Albans, Herts., AL1 3AW, UK.) untersucht, und zwar gemäß den Verfahren für die BIAcore-Analyse der CD80/CTLA-4-Wechselwirkung, die aus Greene JL, Leytze GM, Emswiler J, Peach R, Bajorath J, Cosand W, und Linsley PS. (1996) J. Biol. Chem. 271, 6762–26771 übernommen wurden. Proben des aufgereinigten AB7-Produktes wurden sowohl auf eine Fläche mit CTLA4-Ig-Aminkupplung als auch, in einem Blind-(Kontroll)ansatz auf eine Fläche mit Aminkupplung gegeben. Verglichen mit der Kontrollfläche zeigte sich eindeutig eine Bindung an die CTLA4-Ig-Fläche (siehe 3). Wenn CTLA4-Ig auf Fläche mit Amin-AB7-Kupplung gegeben wurde, konnte ebenfalls eine Bindung zwischen dem CTLA4-Ig und AB7 aufgezeigt werden.
In Kombination mit den Ergebnissen des Anti-CEA-ELISA bestätigen diese Ergebnisse, dass das aufgereinigte Fusionsprotein AB7 die biologischen Eigenschaften seiner beiden Bestandteile aufweist, insbesondere die Antigen- und Rezeptorbindungsaktivitäten.
Co-stimulierende Aktivität des Fusionsproteins AB7
Die Fähigkeit des Fusionsproteins AB7, bei Bindung an CEA-exprimierende Tumorzellen ein co-stimulierendes Signal für T-Zellen zu liefern, wurde unter Verwendung eines angepassten co-Stimulationsassayformats, welches bereits vorstehend beschrieben wurde (Jenkins et al. (1991) J. Immunol. 147:2461) untersucht. CEA-exprimierende kolorektale Tumorzellen LS174T (fixiert durch 5minütige Anwendung von 0,5 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur) wurden mit 10 μg/ml des Fusionsproteins AB7 inkubiert (2 Stunden lang mit Drehbewegung bei 4°C in RPMI 1640 Medium (Gibco. Life Technologies, Paisley, Scotland), welches 0,5 % menschliches Serum (Sigma AB, Sigma Chemical Co, Dorset, UK.) enthielt. Die Zellen wurde vor der Verwendung zweimal gewaschen, und die Bindung des Fusionsproteins wurde unter Verwendung von fluorosceinisothiocyanat(FITC)-konjugiertem Anti-Maus-Ig der Ziege (Becton-Dickinson UK Ltd, Oxford) und Fließzytometrie (Facscan, Becton Dickinson) bestätigt. Um die Verwendung nicht voraktivierter menschlicher T-Zellen in dem Assay zu ermöglichen, wurde der T-Zellrezeptor(TCR)-Stimulus durch einen Anti-T-Zellenrezeptor-Antikörper (Anti-CD3-Antikörper, OKT-3 Orthoclinical Diagnostics, Amersham, UK) geliefert, mit welchem die Kavitäten der Platte mit 96 Kavitäten zuvor belegt worden waren. OKT-3 wurde immobilisiert, indem der aufgereinigte Antikörper (2 μg/ml in Hydrogencarbonat-Belegungspuffer, pH = 9,6 (vorgefertigte Kapsel, Sigma) über Nacht bei 4°C in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten mit flachem Boden (Costar Corporation, Cambridge, MA, USA) inkubiert wurde, woraufhin die Platten drei- bis viermal mit PBS gewaschen wurden. Es wurden auf gereinigte periphere T-Zellen (die unter Verwendung von Magnetperlen Dynabeads, Dynal A.S, Oslo, Norwegen) negativ ausgelaugt worden waren (d.h. es wurden alle anderen Bestandteile als T-Zellen entzogen) und aus menschlichem Spenderblut stammten) in die Kavitäten gegeben, und zwar in einer Menge von 2 × 10⁵/Kavität in 50 μl RPMI 1640 Medium, welches 5 % menschliches Serum enthielt. Das Fusionsprotein, welches an LS174T-Zellen gebunden war, wurde in die Kavitäten gegeben, und zwar in einer Menge von 5 × 10⁴/Kavität in 50 μl RPMI 1640 Medium, dem 5 % menschliches Serum zugesetzt worden war. Schließlich wurden sämtliche Kavitäten mit RPMI 1640 Medium, dem 5 % menschliches Serum zugesetzt worden war, auf 200 μl aufgefüllt. Nach 48 Stunden wurden die Kulturen mit 1,25 μCi an [³H]-Thymidin (Amersham International) gepulst und 16 Stunden später mit einem halbautomatischem Zellentnahmegerät (TomTec harvester, Wallac UK.) gewonnen. Der Einbau von [³H]-Thymidin in die DNA wurde unter Verwendung einer Flüssigkeits-Szintillationszählers (Betaplate Scint und Betaplate counter, Wallac UK.) quantifiziert. Die Ergebnisse eines typischen co-Stimulationsassays sind in der untenstehenden Tabelle aufgeführt. Tabelle: co-Stimulationsergebnisse

αCD3 = Anti-CD3-Antikörper; αCD28 = Anti-CD28- Antikörper

Nicht voraktivierte T-Zellen benötigen sowohl den T-Zellrezeptor als auch co-stimulierende Signale. In dem Assay wird das T-Zellrezeptorsignal von dem αCD3-Antikörper geliefert. Bei Lieferung einer co-Stimulierung über αCD28 (Becton-Dickinson, eingesetzt mit 0.6 μg/ml) wird die Aufnahme von [³H]-Thymidin verglichen mit dem alleinigen Einsatz von αCD3 8mal stärker stimuliert. Die Gegenwart von Tumorzellen hat keine signifikante Auswirkung auf diese Stimulierung. Wenn das co-stimulierende Signal von dem Fusionsprotein AB7, welches an Tumorzellen gebunden ist, geliefert wird, erfährt die Aufnahme von [³H]-Thymidin eine 3fache Steigerung gegenüber dem Vorhandensein von Tumorzellen allein und eine 11fache Steigerung gegenüber der Aufnahme, die ohne co-Stimulation beobachtet wird. Die offensichtliche Stimulierung, die durch das alleinige Vorhandensein von Tumorzellen geliefert wird, könnte auf restliche antigenpräsentierende Zellen in der aufgereinigten T-Zell-Population zurückzuführen sein. In sämtlichen der 5 durchgeführten Assays wurden in übereinstimmender Weise ähnliche Anstiegsraten der T-Zellenproliferation in denjenigen Kavitäten, die tumorzellengebundenes Fusionsprotein enthielten beobachtet, und zwar im Vergleich mit denjenigen Kavitäten, die T-Zellen und ungebundene Tumorzellen enthielten.
Vergleichsbeispiel 4
Herstellung von IgG3-pBSIIKS+
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Vektors, der ein Gen für die konstante Region und die Hinge-Region der schweren Kette des menschlichen IgG3 enthält.
Ein Gen, welches die Sequenz enthält, die in SEQ ID Nr: 115 [die ihrerseits eine Sequenz (Reste 8 bis 508) enthält, die der SEQ ID Nr: 25 ähnlich ist, aber bei welcher die Reste 312 und 501 der SEQ 5 ID Nr: 25 zu C beziehungsweise G geändert sind] dargestellt ist, wurde mittels PCR unter Anwendung eines Verfahrens, das demjenigen ähnlich ist, das von Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 4084–4088 beschrieben wurde, hergestellt.
Das Gen wurde in zwei Teilen hergestellt, die als IgG3A und IgG3B bekannt sind. Diese wurden getrennt voneinander in die SacI- und XmaI-Stellen von pBluescript KS+ (Stratagene Cloning Systems) kloniert, um die Vektoren IgG3A-pBSIIKS+ Klon A7 beziehungsweise IgG3B-pBSIIKS+ Klon B17 zu erhalten. IgG3A wurde derart hergestellt, dass es sich bis hinter die PmaCI-Restriktionsstelle (CACGTG an den Positionen 334–339 in SEQ ID Nr: 115) erstreckt. In ähnlicher Weise wurde IgG3B derart hergestellt, dass sich das 5'-Ende der Sequenz strangaufwärts der PmaCI-Restriktionsstelle befand. Um die gewünschte IgG3-Gensequenz zu erhalten, wurden die IgG3A- und IgG3B-Zwischenvektoren mit AflIII und PmaCI aufgeschnitten. Das Vektorfragment (2.823 bp) aus dem IgG3A-pBSIIKS+ Klon A7 sowie das Insertfragment aus dem IgG3B-pBSIIKS+ Klon B17 (666 bp) wurden mittels Elektrophorese in einem 1 %igen Agarosegel isoliert und aufgereinigt. Die Fragment wurden ligiert, und die Ligationsmischung wurde dazu verwendet, den E.coli-Stamm DH5α zu transformieren. Diejenigen Klone, die das erforderliche Gen enthielten, wurden durch Verdauung der isolierten DNA mit SacI und XmaI zum Erhalt eines 520 bp Fragment identifiziert. Die Sequenz des Inserts wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt, und der Klon Nummer F3 wurde als IgG3-pBSIIKS+ bezeichnet. SEQUENZLISTE

Claims

Anti-CEA-Antikörper, enthaltend komplementaritätsbestimmende Regionen (Complementary determining regions, CDRs), bei dem die CDRs die folgenden Sequenzen umfassen: a) schwere Kette CDR1 DNYMH (SEQ ID NR: 29) CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG (SEQ ID NR: 31) CDR3 LIYAGYLAMD Y (SEQ ID NR: 32); und b) leichte Kette CDR1 SASSSVTYMH (SEQ ID NR: 26) CDR2 STSNLAS (SEQ ID NR: 27) CDR3 QQRSTYPLT (SEQ ID NR: 28).
Antikörper nach Anspruch 1, bei dem die CDRs 1 und 3 der schweren Kette weiter definiert sind als: CDR1 FNIKDNYMH (SEQ ID NR: 30); und CDR3 HVLIYAGYLA MDY (SEQ ID NR: 33).
Antikörper nach Anspruch 1, enthaltend die folgende, gegebenenfalls humanisierte, Struktur: eine variable Region der schweren Kette mit der Sequenz (SEQ ID NR: 11) EVQLQQSGAE LVRSGASVKL SCTASGFNIK DNYMHWVKQR 40 PEQGLEWIAW IDPENGDTEY APKFRGKATL TADSSSNTAY 80 LHLSSLTSED TAVYYCHVLI YAGYLAMDYW GQGTSVAVSS 120 und eine variable Region der leichten Kette mit der Sequenz (SEQ ID NR: 9): DIELTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVT YMHWFQQKPG 40 TSPKLWIYST SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE 80 DAATYYCQQR STYPLTFGAG TKLELKRA 108.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 3, enthaltend wenigstens eine der folgenden Sequenzen: eine variable Region der schweren Kette mit der Sequenz VH1 (SEQ ID NR: 55); eine variable Region der leichten Kette mit der Sequenz VK4 (SEQ ID NR: 71); eine konstante Region CH1 der schweren Kette des humanen IgG3; eine Region CL der humanen leichten Kappa-Kette; und eine humane IgG3-Hinge-Region; gegebenenfalls in Form eines F(ab')₂-Fragments.
Konjugat, enthaltend einen Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche und eine Effektorgruppe.
Konjugat nach Anspruch 5, wobei die Effektorgruppe unter den folgenden ausgewählt ist: a) einem für eine Verwendung in einem ADEPT-System geeigneten Enzym; b) CPG2; c) [G251T,D253K]HCPB; d) [A248S,G251T,D253K]HCPB; e) einem co-stimulierenden Molekül; f) einer extrazellulären Domäne von B7; g) einer extrazellulären Domäne von humanem B7.1; und h) einer extrazellulären Domäne von humanem B7.2; gegebenenfalls in Form eines Fusionsproteins.
Konjugat nach Anspruch 6, bei dem es sich um ein aus den folgenden Konjugaten ausgewähltes Fusionsprotein handelt (die Sequenzen sind in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus aufgeführt): a) eine humanisierte 806.077 F(ab')₂-{[A248S,G251T,D253K]HCPB}₂-Fusion umfassend: eine Antikörper-Fd'-Kette der Struktur VH1 (SEQ ID NR: 55)/CH1 der konstanten Region der IgG3/Hinge-Region von IgG3; wobei die Fd'-Kette über ihren C-Terminus an den N-Terminus von [A248S,G251T,D253K]HCPB kondensiert ist; und eine leichte Antikörperkette der Formel VK4 (SEQ ID NR: 71)/CL-Region der leichten Kappa-Kette; b) {[A248S,G251T,D253K]HCPB}₂-humanisierte 806.077 F(ab')₂-Fusion umfassend: [A248S,G251T,D253K]HCPB; wobei HCPH an seinem C-Terminus über einen (GGGS)₃-Linker an den N-Terminus einer Antikörper-Fd'-Kette der Struktur VH1 (SEQ ID NR: 55)/CH1 konstanter Region der IgG3/Hinge-Region von IgG3 kondensiert ist; und eine leichte Antikörperkette der Formel VK4 (SEQ ID NR: 71)/CL-Region der leichten Kappa-Kette; und c) eine (humane B7.1 extrazelluläre Domäne)₂-humanisiertes 806.077 F(ab')₂-Fusion, umfassend: eine extrazelluläre Domäne von humanem B7.1; wobei das B7.1 an seinem C-Terminus mit dem N-Terminus der Antikörper Fd'-Kette der Struktur VH1 (SEQ ID NR: 55)/CH1 konstanter Region der IgG3/Hinge-Region von IgG3 kondensiert ist; und eine leichte Antikörperkette der Struktur VK4 (SEQ ID NR: 71)/CL der leichten Kappa-Kette.
Polynukleotidsequenz, die dazu fähig ist, für ein Polypeptid eines wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definierten Antikörpers bzw. eines wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definierten Konjugats zu codieren.
Vektor, enthaltend ein wie in Anspruch 8 definiertes Polynukleotid.
Wirtszelle, transformiert mit einer wie in Anspruch 8 definierten Polynukleotidsequenz oder ein transgenes nicht-menschliches Tier oder eine transgene Pflanze, das/die aus der Wirtszelle entwickelt wurde.
Hybridom 806.077, hinterlegt als ECACC-Deposit Nr. 96022936.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiertes Konjugat in Assoziation mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger, gegebenenfalls in einer für die intravenöse Verabreichung geeigneten Form.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung als Medikament.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines Konjugats nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem man: a) eine Wirtszelle, ein transgenes nicht-menschliches Säugetier oder eine transgene Pflanze nach Anspruch 10 oder das Hybridom nach Anspruch 11 Bedingungen aussetzt, die der Expression und gegebenenfalls Sekretion des Antikörpers bzw. Konjugats zuträglich sind; und gegebenenfalls b) den Antikörper bzw. das Konjugat wenigstens teilweise aufreinigt.