JP2006520610A

JP2006520610A - ハイブリッド不変領域を産生するのに用いるベクター

Info

Publication number: JP2006520610A
Application number: JP2006509121A
Authority: JP
Inventors: エス．ボーディッシュキャサリン; フレデリクソンシャナ; マルヤマトシアキ
Original assignee: アレクシオンファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2004-03-04
Publication date: 2006-09-14
Also published as: US20070009957A1; EP1606387A4; EP1606387A2; CA2517519A1; WO2004078937A3; WO2004078937A2; AU2004217433A1

Abstract

所望のクローニングサイトを維持しつつヒトの不変領域で置き換かえられたマウスの不変領域の部分を有する、マウスＦａｂライブラリーの発現及び個々のクローンの発現に用いられる発現ベクター。

Description

関連出願
本願は２００３年３月４日付けの米国仮出願第６０／４５１，８２０号の優先権を主張し、その開示を本明細書に援用する。
本開示はハイブリッド不変領域を有する抗体をコードする発現ベクターに関する。

プラスミドは宿主内で自律的増殖のできる染色体外の遺伝要素である。細菌のプラスミドは大きさが１Ｋｂ〜２００Ｋｂ又はそれを超え、種々の有用な特性をコードする。プラスミドによってコードされた特性には抗生物質に対する耐性、抗生物質の産生、複雑な有機分子の分解、コリシンのようなバクテリオシンの産生、腸毒素の産生、及びＤＮＡの制限及び修飾酵素が包含される。プラスミドはそれ自体として、とりわけ増殖、遺伝性、構造及び進化の観点で長年研究されてきたが、遺伝子工学技術の到来によりプラスミド研究の焦点は外来遺伝情報のクローニング及び発現のためのベクターとしてのプラスミドの使用へと移行した。

発現ベクターは挿入された外来遺伝情報を増殖する能力だけでなく、ｍＲＮＡへの該遺伝情報の転写及びそれに続くタンパク質への翻訳を促進する能力に特徴付けられる。発現には、必ずしも限定的ではないが、プロモーター、オペレーター、転写ターミネーター、リボソーム結合部位並びにタンパク質合成開始及び終止コドンを含む種々の調整遺伝子の配列が必要となる。上記の発現要素は外来ＤＮＡ断片の部分として外来ＤＮＡ断片と一緒に供給されることができ、或いは上記の発現要素は制限部位に隣接する領域でベクター内に組み込まれることができる（そのため外来ＤＮＡ断片がベクター内に導入されるとその外来ＤＮＡ断片は今や化学的に結合した上記要素の制御下に置かれる。）。

発現ベクターは該ベクターによってコードされる任意のタンパク質を比較的大量に産生するのに利用することができる。このために、発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする。当業者には理解できるだろうが、タンパク質の発現レベルは、限定的ではないが、宿主細胞とタンパク質の給源との適合性を含む多数の要因に左右される。例えば、大腸菌（通常使用される宿主の一つ）中でのマウス抗体の発現は、例えば類似のヒト由来の抗体の発現レベルに比べて相対的に低い。抗体ライブラリーのスクリーニングが行われるときには発現レベルはとりわけ重要である。相対的に少量で発現するライブラリーの構成要素はパニング過程において同定しづらい。従って、ライブラリーの潜在的に重要又は有用な構成要素が低い発現レベルのために看過される場合がある。

抗体ライブラリーのより多くの構成要素に対してより高いレベルの発現を引き起こす発現ベクターを提供することは有利であろう。

マウスＦａｂライブラリー及び個々のクローンの発現に用いられる発現ベクターは典型的にはマウスの抗体遺伝子を直接クローニングするための固有の制限酵素部位と共にマウスのカッパＬ鎖及びＨ鎖の不変領域を有する。しかしながら、大腸菌においてこれらのＦａｂ断片の発現レベルは至適とまでは行かない。所望のクローニングサイトを維持しつつ本開示に従ってマウスの不変領域をヒトの不変領域に置き換えることによってマウスＦａｂの発現が大きく増加する。特に有用な実施形態においては、マウスＦａｂベクターは部分的なヒトＨ鎖不変領域のＣＨ１ドメインに加えて部分的なヒトヒンジ領域又は部分的なヒトカッパ鎖不変領域又はその両者を含有する。

別の一側面において、ハイブリッド不変領域をコードする発現ベクターによって抗体がコードされる抗体発現の改善方法が提供される。

別の一側面において、ハイブリッド不変領域を含む抗体が記載される。

更に別の一側面において、ハイブリッド不変領域をコードする発現ベクターを用いて産生された抗体ライブラリーが記載される。

更に別の一側面において、抗体ライブラリーがハイブリッド不変領域をコードする発現ベクターを用いて作製される抗体ライブラリーのスクリーニング方法が記載される。

マウスＦａｂライブラリー及び個々のクローンの発現のために用いられる発現ベクターは、所望のクローニングサイトを維持しつつヒト不変領域と共にマウス不変領域を含むハイブリッド抗体の不変領域をコードする。上記発現ベクターの使用により、完全にマウス不変領域を含むマウスＦａｂの発現に比較してマウスＦａｂの発現が著しく増加する。ヒト不変領域と置き換えられるマウス不変領域の量は該ベクターによってコードされる抗体の発現を増加させるのに充分な量である。ヒト不変領域と置き換えられるマウス不変領域は重鎖（Ｈ鎖）の不変領域内、軽鎖（Ｌ鎖）の不変領域内、又はその両方とすることができる。特に有用な実施形態では、マウスＦａｂベクターは部分的なヒトＨ鎖不変領域のＣＨ１ドメインに加えて部分的なヒトヒンジ領域又は部分的なヒトカッパ鎖不変領域、或いはその両者を含有する。

ハイブリッド不変領域を有する抗体はベクターが宿主細胞内にトランスフェクトされると産生される。トランスフェクションのための技術は当業者の認識範囲内である。特に有用な実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。

本明細書に記載のベクターは、ライブラリーの各要素がハイブリッド不変領域を含む抗体ライブラリーの作製にも使用することができる。本開示に係るハイブリッド不変領域をコードする発現ベクターを用いて作製された抗体ライブラリーは、例えば結合親和性のような所望の特性を有する抗体を同定するための当業者に知られた技術を用いてスクリーニングすることができる。

以下の実施例には、ハイブリッド抗体の不変領域をコードする発現ベクターを産生し、そして特定の抗体の発現にその発現ベクターを使用するための一連の特定工程が記載されるが、本開示はこの特定の工程順序又は産生される特定の抗体に限定されるものではないことは当然に理解される。当業者であれば本開示に係る発現ベクターを製造するためのその他のスキームを容易に構想するだろう。また、当業者であれば以下に具体的に例示される抗体以外の抗体がここで記載された発現ベクターの中に連結され得ることを容易に理解するだろう。そのための技術は当業者の認識範囲内である。

実施例１
ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧの構築
ＰＡＸ１３１（２００２年１１月７日付け国際公開ＷＯ０２／０８８３１５Ａ２に記載のファージミドベクターであり、本開示を本明細書に援用する。）からＰＡＸ２４３ｈＧＫを調製した。ＰＡＸ１３１をＮｏｔＩ（ＮＥＢ社）でまず消化し、クレノウ酵素（ＮＥＢ社製）をフィルインした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼで平滑末端ライゲーションを行い、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞へ電気穿孔法により導入した。個々のクローンをＮｏｔＩで消化してＮｏｔＩサイトの不在を確認した。次に、ＥｃｏＳｐｅオリゴ（５’ＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＧＡＴＴＧＣＧＡＴＴＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡ３’−ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１）及びＳｐｅＥｃｏオリゴ（５’ＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＡＡＴＣＧＣＡＡＴＣＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＡＴＴＡＡＣＴＣＣＴＴＧ３’− ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２）をハイブリダイズし、上で得られたＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩで消化したＰＡＸ１３１ＮｏｔＩ（−）ベクターに連結した。挿入したＥｃｏＳｐｅ二重鎖オリゴは後のクローニング目的のためにＮｏｔＩサイトを含有する。次いで、カッパＬ鎖の不変領域をＰＣＲ増幅によって増幅した。ＣＫＸｂａＩプライマー（５’ＧＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣ３’−ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：３）及びＣＫＮｏｔＩプライマー（５’ＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣ３’− ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：４）を使用した。この増幅産物及びＰＡＸ１３１ＮｏｔＩ（−）ベクターをＸｂａＩ／ＮｏｔＩで消化して連結した。この連結産物をＴＯＰ１０Ｆ’細胞へ電気穿孔法により導入し、個々のクローンの配列を決定した。更なる修飾に対してはＰＣＲエラーのないクローン（ＰＡＸ１３１Ｋ）を選択した。

より良いＦａｂの発現のために、短縮された遺伝子ＩＩＩをＰＡＸ１３１ＫからＰＣＲ増幅によって増幅した。Ｔｇ３ＳｐｅＳｆｉプライマー（５’ＴＣＴＧＧＴＡＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧ３’−ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：５）及びｔｇ３Ｎｄｅプライマー（５’ＣＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＧ３’−ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：６）を使用した。この増幅産物及びＰＡＸ１３１ＫをＸｂａＩ／ＮｄｅＩで消化して連結した。この連結産物をＴＯＰ１０Ｆ’細胞へ電気穿孔法により導入し、個々のクローンの配列を決定した。更なる修飾に対してはＰＣＲエラーのないクローン（ＰＡＸ２４３Ｋ）を選択した。Ａｐｔａｇｅｎ社からヒトＩｇＧＣＨ１及び部分的なヒンジ領域遺伝子を取り寄せた。この遺伝子断片及びＰＡＸ２４３ＫベクターをＸｈｏＩ／ＳｐｅＩで消化して連結した。この連結産物をＴＯＰ１０Ｆ’細胞へ電気穿孔法により導入し、個々のクローンについて該断片の挿入を確認した。得られたベクターをＰＡＸ２４３ｈＧＫ−ｉｎｔと命名した。最後にクローニング効率のために、８１５ｂｐスタッファー断片をＸｈｏＩ／ＡｐａＩの消化及びライゲーションによってＰＡＸ２４３ｈＧＫ−ｉｎｔベクターに挿入した。最終的なベクターをＰＡＸ２４３ｈＧＫと命名した。

部分的なヒトＨ鎖（ヒトの不変領域ＣＨ１）に加えて部分的なヒトヒンジ領域をもつマウスＦａｂベクターの構築のために、マウスＨ鎖不変領域内のＢｌｎＩサイトに対応する部分からヒトＦａｂベクターＰＡＸ２４３ｈＧＫ（図１Ａ〜Ｅ）内のＳｐｅＩサイトをもつ部分的なヒンジ領域へ達する末端部分までの断片を得るためにＰＣＲ増幅を行った。使用したプライマーは：
ＢｌｎｌｈＣＨ１５’ＧＧＣＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣ３’ （ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：７）；及び
ＳｐｅｌｈＣＨ１５’ＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣ３’ （ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：８）
である。

ＰＣＲ増幅をＡｄｖａｎｔａｇｅＨＦｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｍｉｘｋｉｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて３０サイクル行った。マウスＦａｂベクター内のそれぞれのクローニング部位でクローニングするためにＢｌｎｈＣＨ１はＢｌｎＩサイトを含有し、ＳｐｅｌｈＣＨ１はＳｐｅＩサイトを含有する。増幅産物を１％アガロースゲル（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）上に流して、２６４ｂｐの断片を収集し、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを使用して精製した。精製産物を次いでＢｌｎＩ及びＳｐｅＩで消化した。２４４ｂｐの断片を１％アガロースゲルから収集し、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製した。マウスＦａｂベクターＰＡＸ２４３ｍＧＩＫ（図２）もＢｌｎＩ及びＳｐｅＩで消化した。４８２４ｂｐの断片を０．６％アガロースゲル上で収集し、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製した。これらの断片を連結し、反応産物をＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌細胞へ電気穿孔法により導入した。

単一のコロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する１ｍＬのＳＢ培地中で成長させ、ＱＩＡＧＥＮ社のミニプレップカラムでプラスミドＤＮＡを調製した。元（オリジナル）のマウスＨ鎖内に存在しないヒトＨ鎖不変領域内のＡｇｅＩ（ＰｉｎＡＩ）サイトの新たな存在によってヒトＨ鎖不変領域の挿入を確認した。ＰＣＲエラーの存在を検査するためにポジティブＤＮＡクローンをＤＮＡ配列分析（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州サンジエゴ）のために送った。ＰＣＲエラーのなかったＤＮＡの１０ナノグラムをＴＯＰ１０Ｆ’細胞中で再び形質転換させて単一コロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する１０ｍＬのＳＢ培地中で６時間ほど成長させた。次いでこの培養物を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する５００ｍＬのＳＢ培地に移して２５０ｒｐｍとしたシェーカー（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｈａｋｅｒ）内で３７℃で一晩成長させた。この培養物をスピンダウンしてＨｉＳｐｅｅｄＭａｘｉＰｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを調製した。

実施例２
ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＫの構築
ヒトカッパＬ鎖をもつマウスＦａｂベクターの構築のために、マウスカッパＬ鎖不変領域内のＢｓｐＥＩサイトに対応する部分からヒトＦａｂベクターＰＡＸ２４３ｈＧＫ（図１Ａ〜Ｅ）内のヒト抗体クローンの一つにあるＮｏｔＩサイトをもつ末端部分までの断片を得るためにＰＣＲ増幅を行った。使用したプライマーは：
ＢｓｐＥｌｈＣＫ５’ＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧ３’（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：９）；及び
ＮｏｔｌｈＣＫ−ｒｅｖ５’ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴＡＴＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣ３’（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１０）
である。

ＰＣＲ増幅をＡｄｖａｎｔａｇｅＨＦｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｍｉｘｋｉｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて３０サイクル行った。マウスＦａｂベクター内のそれぞれのクローニング部位でクローニングするためにＢｓｐＥｌｈＣＫはＢｓｐＥＩサイトを含有し、ＮｏｔｌｈＣＫ−ｒｅｖはＮｏｔＩサイトを含有する。増幅産物を１％アガロースゲル（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）上に流して、２９９ｂｐの断片を収集し、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを使用して精製した。精製産物を次いでＢｓｐＥＩ及びＮｏｔＩで消化した。２７２ｂｐの断片を１％アガロースゲルから収集し、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製した。マウスＦａｂベクターＰＡＸ２４３ｍＧ１Ｋ（図２Ａ〜Ｇ）もＢｓｐＥＩ及びＮｏｔＩで消化した。この消化によって、４７９１ｂｐの断片が０．６％アガロースゲル上に収集され、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製した。これらの断片を連結し、反応産物をＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌細胞へ電気穿孔法により導入した。

単一のコロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する１ｍＬのＳＢ培地中で成長させた。ＱＩＡＧＥＮ社のミニプレップカラムでプラスミドＤＮＡを調製した。元（オリジナル）のマウスカッパＬ鎖内に存在しないヒトカッパＬ鎖不変領域内の付加的なＳａｃＩサイトによってヒトカッパＬ鎖不変領域の挿入を確認した。ＰＣＲエラーの存在を検査するためにポジティブＤＮＡクローンをＤＮＡ配列分析（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ社）のために送った。次いで、ＰＣＲエラーのなかったＤＮＡの１０ナノグラムをＴＯＰ１０Ｆ’細胞中で再び形質転換させた。単一コロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する１０ｍＬのＳＢ培地中で６時間ほど成長させた。次いでこの培養物を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する５００ｍＬのＳＢ培地に移して２５０ｒｐｍとしたシェーカー（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｈａｋｅｒ）内で３７℃で一晩成長させた。この培養物をスピンダウンしてＨｉＳｐｅｅｄＭａｘｉＰｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを調製した。

実施例３
ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫの構築
部分的なヒトＨ鎖ヒト不変領域ＣＨ１に加えて部分的なヒトヒンジ領域及びヒトカッパＬ鎖をもつマウスＦａｂベクターの構築のために、ヒトカッパＬ鎖不変領域をＰＡＸ３１３ｍ／ｈＫ（図３Ａ〜Ｄ）ベクターからＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧ（図４Ａ〜Ｄ）ベクターへＢｓｐＥＩ及びＮｏｔＩで両ベクターＤＮＡを消化することによって移行した。ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧ（図４Ａ〜Ｄ）から４７９６ｂｐの断片を、ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＫ（図３）から２７２ｂｐの断片を収集し、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを使用してアガロースゲルから精製した。これらの断片を連結し、反応産物をＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌細胞へ電気穿孔法により導入した。

単一のコロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する１ｍＬのＳＢ培地中で成長させた。ＱＩＡＧＥＮ社のミニプレップカラムでプラスミドＤＮＡを調製した。ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧ（図４Ａ〜Ｄ）ベクターにおける元（オリジナル）のマウスカッパＬ鎖内に存在しないヒトカッパＬ鎖不変領域内の付加的なＳａｃＩサイトによってヒトカッパＬ鎖不変領域がＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧ（図４Ａ〜Ｄ）へ挿入されたことを確認した。ＰＣＲエラーのなかったＤＮＡの１０ナノグラムをＴＯＰ１０Ｆ’細胞中で再び形質転換させた。単一コロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する１０ｍＬのＳＢ培地中で６時間ほど成長させた。次いでこの培養物を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有する５００ｍＬのＳＢ培地に移して２５０ｒｐｍとしたシェーカー（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｈａｋｅｒ）内で３７℃で一晩成長させた。この培養物をスピンダウンしてＨｉＳｐｅｅｄＭａｘｉＰｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを調製した。

実施例４
マウス／ヒトのハイブリッドベクターにおけるＦａｂ発現及び／又は結合の比較
上記の種々のマウス／ヒトハイブリッド構築物におけるマウスＦａｂの発現を確認するために、公知のマウスＦａｂを上記ベクター内で発現させた。次いで、Ｆａｂ発現及び／又は元の抗原への結合を比較した。最初に、良好に発現するとして知られている、ヒトＩｇＥに特異的なマウスＩｇＧ１カッパＦａｂを比較に用いた。Ｌ鎖及びＨ鎖の双方の断片が対応するクローニングサイトで消化され、各ベクター内へ順次クローニングした。最終的な構築がなされた後に、Ｆａｂ発現ＥＬＩＳＡを実施した。各ハイブリッドベクター中のＦａｂを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンが存在する１ｍＬのＳＢ培地中で成長させた。１ｍＭのＩＰＴＧ及びＭ１３ＶＣＳヘルパーファージでＦａｂ発現を３０℃で一晩誘発した。培養物をスピンダウンしてＦａｂを含有する上澄みをＥＬＩＳＡ実験に用いた。４℃で一晩かけてヤギの抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）₂若しくはウサギの抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）₂の何れか又は両者の混合物（Ｐｉｅｒｃｅ社）（ＰＢＳ中の４μｇ／ｍＬ）でマイクロタイターのウェルをコートした。

ウェルをＰＢＳで洗浄し、３７℃で１時間、１％のＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。該ブロッカーをはじき飛ばした。Ｆａｂ含有上澄みを加えて１．５時間ほどインキュベートした。該ウェルを洗浄し、アルカリホスファターゼ結合のヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）₂又はヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）₂抗体（１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：５００）（Ｐｉｅｒｃｅ社）の何れかで結合Ｆａｂを検出した。

元（オリジナル）のマウスＦａｂベクターＰＡＸ２４３ｍＧ１ＫにおけるＦａｂと比較して、ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧ及びＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫ（図５Ａ〜Ｆ参照）は同一又はずっと良好なＦａｂ発現を示した（図６参照）。ウェスタンブロットによる分析も同様の結果を示した。図７ａはウェスタンブロット分析によるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）によって検出された各ベクターを示す。ヤギの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は特に、元（オリジナル）のＰＡＸ２４３ｍＧ１Ｋベクター及びＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧハイブリッドベクターにおけるＦａｂのマウスカッパＬ鎖を検出する。ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧベクターにおけるＦａｂの発現はＰＡＸ２４３ｍＧ１Ｋよりも優れていた。上記データはマウスカッパＬ鎖不変領域はマウス／ヒトＩｇＧ１のＨ鎖不変領域ハイブリッドとペアになるときにより良く発現されることを示唆するものである。図７ｂはウェスタンブロット分析によるヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）によって検出される各ベクターにおけるＦａｂを示す。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）はＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫハイブリッドベクター及びＰＡＸ３１３ｍ／ｈＫハイブリッドベクターにおけるＦａｂのヒトカッパＬ鎖を特に検出する。ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫベクターにおけるＦａｂの発現はＰＡＸ３１３ｍ／ｈＫベクターよりも優れていた。上記データはマウス／ヒトカッパＬ鎖不変領域ハイブリッドはマウスＩｇＧ１Ｈ鎖不変領域とペアになるとあまり良く発現しないが、更にマウス／ヒトＩｇＧ１Ｈ鎖不変領域ハイブリッドとペアになると非常に良く発現することを示唆する。

次の比較について、発現に乏しいことが知られている、ヒトＰＤＧＦに特有のマウスＦａｂを比較に用いた。該クローンは我々のＰＡＸベクターとは異なるクローニングサイトを有しているため、Ｌ鎖及びＨ鎖における正しいクローニングサイトを作り出すようにプライマーを設計した。カッパＬ鎖及びＨ鎖のＰＣＲ増幅の後に、断片をＸｂａＩ／ＢｓｐＥＩ及びＸｈｏＩ／ＢｌｎＩサイトでそれぞれ消化して精製した。

断片を１％のアガロースゲルで精製し、３９１ｂｐの断片（カッパＬ鎖）及び４３８ｂｐの断片（Ｈ鎖）をＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製した。これらの断片を順次ＰＡＸ２４３ｍＧ１Ｋベクターへクローニングした。特定の抗原への結合を以下のように実施した。抗原のヒトＰＤＧＦをｐＨ８．６で４℃で一晩かけて０．１ＭのＮａＨＣＯ₃中４μｇ／ｍＬでコートした。プレートをＰＢＳで洗浄して１％のＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。上述したように、発現した上澄みを抗原と共に３７℃で１．５時間ほどインキュベートした。該ウェルをＰＢＳで洗浄し、アルカリホスファターゼ結合のヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）₂抗体（１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：５００）（Ｐｉｅｒｃｅ社）で結合Ｆａｂを検出した。最も強い結合を示したクローンをＰＣＲエラーの検査のためにＤＮＡ配列分析に出した。ＰＣＲエラーのなかったクローンからのカッパＬ鎖及びＨ鎖を選択してマウス／ヒトのハイブリッドＦａｂの構築に用いた。カッパＬ鎖及びＨ鎖をＸｂａＩ／ＢｓｐＥＩ及びＸｈｏＩ／ＢｌｎＩでそれぞれ消化して、対応するサイトで各マウス／ヒトのハイブリッドベクターへ順次クローニングした。

各ハイブリッドベクター及びＰＡＸ２４３ｍＧ１Ｋにおけるファブを上述したようにＦａｂ発現及び元（オリジナル）の抗原への結合について比較した。結果はＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧ又はＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫにおけるＦａｂの発現が元（オリジナル）のＰＡＸ２４３ｍＧ１Ｋにおけるものよりも少なくとも２〜４倍優れていたことを示している（図８参照）。この傾向は特定の抗原に対する結合に関しても同じであった（図９参照）。

本マウス／ヒトハイブリッドベクター構築物はマウス抗体ライブラリーのｄｅｎｏｖｏ構築に使用することができ、同様に発現上の問題がある既存のマウス抗体ライブラリー又はＦａｂの改善に使用することができる。３’末端クローニングはカッパ及びＨ鎖不変領域内に固有のマウス制限部位を利用するので、これは抗体断片の５’末端のクローニングサイトを調和させることにより達成することができる。

実施例５
マウス／ヒトハイブリッドベクターにおけるＦａｂライブラリーの構築
国際公開ＷＯ０３／０２５２０２Ａ２に記載の方法に従って、ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧベクターにおけるＦＬＪ３２０２８ペプチドで免疫したマウスの脾臓サンプルからＦａｂライブラリーを作製した。簡単に言うと、全ＲＮＡを脾臓サンプルから抽出してメッセンジャーＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘキット（ＱＩＡＧＥＮ社、カリフォルニア州バレンシア)を用いて精製した。製造者のプロトコルに従ってＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成した。第一鎖ｃＤＮＡをカッパＬ鎖に対してはＨｐａＩで、ＩｇＧ１のＨ鎖に対してはＸｃｍＩで、そしてＩｇＧ２ａのＨ鎖に対してはＢｓａＪＩで消化した。第二鎖ｃＤＮＡを各遺伝子断片のフレームワーク１領域にアニールするプライマーを用いて合成し、各遺伝子断片の不変領域にハイブリダイズするオリゴを用いて伸長反応を実施した。単一プライマーの増幅後に、各断片をＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製して、ベクターにクローニングするための適切な酵素で消化した。カッパＬ鎖をＸｂａＩ／ＢｓｐＥＩで消化したＰＡＸ３１３ｍｈ／Ｇベクター内に結合させた。形質転換をＴＯＰ１０Ｆ’細胞（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内で実施した。ライブラリーサイズは１．３×１０⁸であった。ＰＡＸ３１３ｍｈ／ＧベクターにおけるカッパＬ鎖ライブラリーをＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ断片の挿入に用いた。各断片をＸｈｏＩ／ＢｌｎＩで消化したカッパＬ鎖ライブラリーへ連結した。形質転換をＴＯＰ１０Ｆ’細胞内で実施した。ライブラリーサイズの滴定は形質転換株をグルコース含有ＬＢカルベニシリンのプレート上で培養することで測定した。ライブラリーサイズはＩｇＧ１カッパライブラリーについて２．５×１０⁹であり、ＩｇＧ２ａカッパライブラリーについて１×１０⁹であった。得られたコロニーを用いてＥＬＩＳＡにより断片の挿入及びＦａｂ発現を確認した。滴定プレートから１６個の単一コロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＳＢ培地に接種し、３７℃で６時間ほど成長させた。培養物の一部を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２０ｍＭのグルコースを含有するＳＢ培地内で１：１００に希釈し、ＭｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ精製のために３７℃で一晩成長させた。Ｍ１３ＶＣＳヘルパーファージ及び１ｍＭのＩＰＴＧを残りの培養物に加えて３７℃で２時間成長させた。カナマイシンを７０μｇ／ｍＬで培養物に加えてＦａｂのファージ上での発現を３０℃で一晩かけて誘発させた。実施例４に記載の通りにＦａｂ発現（ＥＬＩＳＡ）を実施した。この実験の結果を図１０に示す。１６個のＩｇＧ１カッパライブラリークローンのうち１５個がＨ鎖及びカッパＬ鎖両方の挿入を含有し、１６個のＩｇＧ２ａカッパライブラリークローンのうち１５個がＨ鎖及びＬ鎖の挿入を含有していた。このライブラリーを当業者に知られた方法（Maruyama T et al., J Virol 73 : 6024-6030,1999）を使用してマイクロタイターウェル上にコートしたＦＬＪ３２０２８ペプチド上でパニングした。図１１は４回のパニングの結果を示す。実施例４に記載のようにウサギの抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）₂でコートしたウェルを用いてＦａｂ発現を確認した。ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃ及びマウスＩｇＧＦｃへの結合も比較した。実施例４に記載のように、アルカリホスファターゼ結合のヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）₂抗体（１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：５００）（Ｐｉｅｒｃｅ社）によって結合Ｆａｂを検出した。大部分のクローンは非常に良く発現し（４８のクローンのうち３５は３０分で３．０を超えるＯＤ４０５値を示した。）、ＦＬＪ３２０２８抗原への結合は非常に強固であり（４８のクローンのうち２０が３０分で２．０を超えるＯＤ４０５値を示した。）、そして特異的であった（対照抗原マウスＩｇＧＦｃへの最小限の結合）。

本発明の好ましい実施形態及びその他の実施形態について記載したが、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲から逸脱することなく当業者であれば更なる実施形態を理解することができる。

ベクターｐＡＸ２４３ｈｇＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１１）及びこれによるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１２−１６）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｈｇＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１１）及びこれによるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１２−１６）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｈｇＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１１）及びこれによるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１２−１６）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｈｇＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１１）及びこれによるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１２−１６）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｈｇＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１１）及びこれによるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１２−１６）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｍＧ１Ｋの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１７）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１８−２２）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｍＧ１Ｋの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１７）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１８−２２）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｍＧ１Ｋの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１７）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１８−２２）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｍＧ１Ｋの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１７）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１８−２２）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｍＧ１Ｋの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１７）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１８−２２）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｍＧ１Ｋの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１７）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１８−２２）を示す。ベクターｐＡＸ２４３ｍＧ１Ｋの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１７）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：１８−２２）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２３）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：２４−２８）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２３）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：２４−２８）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２３）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：２４−２８）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２３）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：２４−２８）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２９）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３０−３４）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２９）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３０−３４）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２９）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３０−３４）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：２９）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３０−３４）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：３５）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３６−４０）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：３５）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３６−４０）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：３５）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３６−４０）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：３５）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３６−４０）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：３５）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３６−４０）を示す。ベクターｐＡＸ３１３ｍ／ｈＧＫの核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：３５）及びこれによってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤＮＯＳ：３６−４０）を示す。本開示に係るハイブリッドベクターにおけるマウスＦａｂの発現を比較するものである。７ａ及び７ｂは本開示に係るハイブリッドベクターにおけるマウスＦａｂの発現を確認するために使用した免疫ブロット法の結果を示す。本開示に係るハイブリッドベクターにおけるマウス抗ＰＤＧＦのＦａｂの発現を比較するものである。本開示に係るハイブリッドベクターにおけるマウス抗ＰＤＧＦのＦａｂの結合を比較するものである。パニング前のＰＡＸ１３３ｍ／ｈＧベクター内で作製されたライブラリーのＦａｂ発現を示す。ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃ上で４回パニングした後の、ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧベクターにおけるＩｇＧ１カッパクローンのＦＬＪ３２０２８−Ｆｃ及びマウスＩｇＧＦｃへ結合するＦａｂ発現を示す。

Claims

抗体Ｌ鎖領域及び抗体Ｈ鎖領域（前記抗体Ｌ鎖領域又は前記抗体Ｈ鎖領域の少なくとも一方は少なくとも部分的にマウスでかつ少なくとも部分的にヒトのハイブリッド領域である。）を少なくともコードする核酸とマウス抗体の遺伝子をベクター内へ直接クローニングするための制限部位とを含む発現ベクター。
抗体Ｌ鎖不変領域がヒトカッパＬ鎖不変領域の少なくとも一部を含む請求項１に記載の発現ベクター内のハイブリッドＬ鎖。
Ｈ鎖不変領域がヒトＨ鎖不変領域ＣＨ１ドメインの少なくとも一部を含む請求項１に記載の発現ベクター。
Ｈ鎖不変領域がヒトＨ鎖不変領域のヒンジ領域の少なくとも一部を含む請求項１に記載の発現ベクター。
抗体Ｌ鎖領域及び抗体Ｈ鎖領域の両方が、少なくとも部分的にマウスでかつ少なくとも部分的にヒトのハイブリッド領域である請求項１に記載の発現ベクター。
抗体Ｌ鎖領域及び抗体Ｈ鎖領域（前記抗体Ｌ鎖領域又は前記抗体Ｈ鎖領域の少なくとも一方は少なくとも部分的にマウスでかつ少なくとも部分的にヒトのハイブリッド領域である。）を少なくともコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることを含む、純粋にマウス不変領域を有する同一のベクターと比較してＦａｂ発現が増加するＦａｂ発現の方法。
少なくとも部分的にマウスでかつ少なくとも部分的にヒトのハイブリッド不変領域を含む抗体。
前記ハイブリッド不変領域がＨ鎖不変領域である請求項７に記載の抗体。
前記ハイブリッド不変領域がＬ鎖不変領域である請求項７に記載の抗体。
Ｌ鎖不変領域及びＨ鎖不変領域の両方がハイブリッド領域である請求項７に記載の抗体。
前記ハイブリッド不変領域がヒトＨ鎖不変領域ＣＨ１ドメインの少なくとも一部を含む請求項７に記載の抗体。
前記ハイブリッド不変領域がヒトＨ鎖不変領域のヒンジ領域の少なくとも一部を含む請求項７に記載の抗体。
前記ハイブリッド不変領域がヒトカッパＬ鎖不変領域の少なくとも一部を含む請求項７に記載の抗体。
請求項１に記載の発現ベクターを用いて作製した抗体ライブラリー。
請求項１４に記載の抗体ライブラリー提供することと、前記ライブラリーから所望の特性を有する抗体を選択することとを含む抗体ライブラリーのスクリーニング方法。
宿主細胞がマウスＨ鎖可変領域の少なくとも一部及びマウスＨ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸を含有する発現ベクターでトランスフェクトされるＦａｂ発現の方法における、マウスＨ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸の一部をヒトＨ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸に置換することを含む改良（ここで、発現したＦａｂはハイブリッドＨ鎖不変領域を含有する。）。
宿主細胞がマウスＬ鎖可変領域の少なくとも一部及びマウスＬ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸を含有する発現ベクターでトランスフェクトされるＦａｂ発現の方法における、マウスＬ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸の一部をヒトＬ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸に置換することを含む改良（ここで、発現したＦａｂはハイブリッドＬ鎖不変領域を含有する。）。
宿主細胞がマウスＬ鎖可変領域の少なくとも一部及びマウスＬ鎖不変領域の少なくとも一部をコード化する核酸を含有する発現ベクターでトランスフェクトされるＦａｂ発現の方法における、マウスＬ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸の一部をヒトＬ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸に置換することと、マウスＨ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸の一部をヒトＨ鎖不変領域の少なくとも一部をコードする核酸に置換することとを含む改良（ここで、発現したＦａｂはハイブリッドＬ鎖不変領域及びハイブリッドＨ鎖不変領域を含有する。）。