JP2005523888A - 癌関連エピトープ - Google Patents

癌関連エピトープ Download PDF

Info

Publication number
JP2005523888A
JP2005523888A JP2003557527A JP2003557527A JP2005523888A JP 2005523888 A JP2005523888 A JP 2005523888A JP 2003557527 A JP2003557527 A JP 2003557527A JP 2003557527 A JP2003557527 A JP 2003557527A JP 2005523888 A JP2005523888 A JP 2005523888A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
seq
cytokeratin
binding entity
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003557527A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2005523888A5 (ja
Inventor
ヘンリク ディッツェル，
イェンス シー． イェンセニウス，
Original Assignee
ザ スクリプス リサーチ インスティテュート
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ スクリプス リサーチ インスティテュート filed Critical ザ スクリプス リサーチ インスティテュート
Publication of JP2005523888A publication Critical patent/JP2005523888A/ja
Publication of JP2005523888A5 publication Critical patent/JP2005523888A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本発明は、２つのポリペプチドから構成される癌関連エピトープを提供し、ここで、第１のポリペプチドは、サイトケラチンＫ８由来であり、そして第２のポリペプチドは、サイトケラチンＫ１８由来である。癌関連エピトープは、悪性転換の間、特に、結腸組織、乳房組織、卵巣組織、腎臓組織、肺組織おおび精巣組織の悪性転換の間に露出される。癌関連エピトープの露出は、サイトケラチンＫ８およびＫ１８からのＮ末端ポリペプチドの切断および除去による。本発明はまた、癌組織において約１０Ｍ−１程度に高くあり得る（正常組織におけるサイトケラチンＫ８／Ｋ１８複合体についてよりも１００倍高くあり得る）癌関連エピトープを提供する。本発明は、癌関連エピトープ、結合実体、抗体ならびに癌の検出および処置のためのこのようなエピトープ、結合実体および抗体を使用する方法を提供する。

Description

（発明の分野）
本発明は、癌関連エピトープ、抗体およびこのようなエピトープに対して指向されたポリペプチド結合実体（ｅｎｔｉｔｙ）に関する。本発明はまた、このエピトープ、抗体または結合実体を含む診断剤、および種々の診断目的または治療目的のためのこれらのエピトープ、抗体または結合実体の使用に関する。これらのエピトープ、抗体または結合実体を含む薬学的組成物もまた、本発明に従って企図される。
（発明の背景）
悪性腫瘍は、しばしばこれらの腫瘍の検出および潜在的な処置のための手段を提供する特有の抗原または「マーカー」を発現する。例えば、腫瘍に特有の抗原は、精製され、処方され、そして抗体産生に使用される。これらの抗原によって惹起された抗体は、宿主における腫瘍マーカーのレベルをモニターする検出ツールとして使用され、疾患の過程または処置の有効性を追跡し得る。抗体はまた、毒素と結合され、癌を処置するために投与される。ある場合において、これらの抗原は、ワクチンとして使用され得、癌患者における抗体応答および細胞性免疫応答を刺激し、それによって癌の成長および拡大を阻止する。
腺上皮細胞は、主にサイトケラチン８（Ｋ８）およびサイトケラチン１８（Ｋ１８）の複合体からなる中間径フィラメントのネットワークを有する。これらのフィラメントは、デスモソーム型の特定の細胞−細胞接触に付着される安定なネットワークを形成することによって、機械的ストレスに対して弾性を提供する（１）。中間径フィラメントは、群に分類され得、より高度な真核生物の群において、組織特異的パターンおよび細胞型限定パターンで発現される（２）。上皮細胞において、中間径フィラメントは、化学量論的に等量のＩ型（より小さい、酸性の）サイトケラチンポリペプチドおよびＩＩ型（より大きい、中性または塩基性の）サイトケラチンポリペプチドからなり、これらは強く相互作用して、ヘテロ二量体を形成する（３−５）。
各サイトケラチンポリペプチドは、種々の長さおよび組成の非ヘリックスヘッド（Ｎ末端）ドメインおよびテイル（Ｃ末端）ドメインに挟まれる中央の３００〜３５０アミノ酸αヘリックスロッドドメインからなる。このロッドドメインはさらに、４つのサブドメイン（１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ）に細分され得、これらのサブドメインは、短い非ヘリックスリンカー（Ｌ１、Ｌ１２、Ｌ２）によって間隔を置かれる。同様に、ヘッドドメインは、以下の３つのドメインに細分され得る（６）：末端ドメイン（Ｅｌ）、可変ドメイン（Ｖ１）およびロッドドメインに最近接の配列相同性の領域（Ｈ１）。
中間径フィラメントの構築は、異なるドメイン間の相互作用に依存するいくつかの会合工程を包含するようである。通常は、Ｉ型およびＩＩ型サイトケラチンポリペプチドは、平行に整列してコイルドコイルヘテロ二量体を生じる（７，８）。続いて、２つの二量体の逆平行凝集（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、ねじれ型凝集（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、隣り合う凝集（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）によって、四量体が形成される。これらの四量体は、末端相互間の重合化によってプロトフィラメントを形成し、次いで８つのプロトフィラメントが結合して、最終的な１０ｎｍのフィラメントを生成する（９）。
これらの構築されたロッドは、２つのコイルドコイルサブユニットから、プロトフィラメント骨格構造を形成する。しかし、ヘッドドメインおよびテールドメインは、フィラメント骨格の一部と考えられない。代わりに、ヘッドドメインおよびテールドメインは、側方に突出して、プロトフィラメントおよび中間径フィラメントのパッケージングに寄与するようである。これらのヘッドドメインおよびテールドメインはまた、中間径フィラメントの、他の細胞構成要素との相互作用に寄与し得る（１０〜１２）。従って、これらのヘッドドメインおよびテールドメインを欠失したサイトケラチンは、通常、コイルドコイルおよびより高次の側方相互作用は可能であるが、フィラメント伸長に欠ける（１３）。
サイトケラチン８（Ｋ８）Ｉ型およびサイトケラチン１８（Ｋ１８）ＩＩ型は、単層上皮（ｓｉｍｐｌｅ ｌａｙｅｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ）または単層上皮（ｓｉｎｇｌｅ ｌａｙｅｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ）（例えば、腸、肝臓および胸部の管の単層上皮）の中間径フィラメントの主要な構成要素である（４）。これらの２つのサイトケラチンは、ヘテロ二量体およびフィラメントを形成する。Ｋ８およびＫ１８サイトケラチンの欠失研究により、ヘッドドメインが、ヘテロ二量体およびフィラメントの形成に重要な役割を演じることが示された。ヘッド欠失型Ｋ８およびヘッド欠失型Ｋ１８の同時トランスフェクションの結果、分散型非繊維状パターン（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｎｏｎ−ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ）を形成し、一方、１つの頭部のないサイトケラチンと１つのインタクトなサイトケラチンを組み合わせた同時トランスフェクションの結果、細胞質顆粒または細胞質原線維を形成した（１２）。さらに詳細な分析により、Ｋ８およびＫ１８が、各々のサイトケラチンの最初の６６アミノ酸を欠失することによりＮ末端が短縮される場合、短くかつ異常な中間径フィラメントのみが生成されることが示された（１３）。完全かまたはほぼ完全な、ヘッドドメインのＨ１領域は、これらの短いフィラメントの生成に必要であった。Ｈ１ドメインの主要な部分がさらに除去されて、短縮型Ｋ８（アミノ酸７５〜４８３）と短縮型Ｋ１８（アミノ酸６７〜３８５）との間で複合体を形成する場合、四量体のみが生成された（１３）。ＨＩ領域の重要性は、これらの２つのヘテロ二量体の整列へのＨＩ領域の関与、および形成されたヘテロ四量体複合体の形成の安定化に、明らかに関連する。
両方のサイトケラチンが天然の発生（ｎａｔｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）に重要であることが最近のデータによって示されるにも関わらず、Ｋ８およびＫ１８の正確な機能は、ほとんど不明なままである。Ｋ１８の変異体（ａｒｇ８９ ｃｙｓ）は、トランスジェニックマウスにおいて優勢な特徴として発現され、肝臓および膵臓の中間径フィラメントネットワークの顕著な崩壊を生じ、肝細胞不安定性および関連する肝臓の炎症および壊死を引き起こす（１４，１５）。Ｋ８またはＫ１９のノックアウトマウスの表現型として、生存動物における遺伝的背景、女性不妊症および成体結腸直腸過形成に依存する完全または部分的な妊娠中期の胚死亡率（ｍｉｄｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）が含まれた（１６〜１８）。他のデータによって、Ｋ８／Ｋ１８フィラメントが、多剤耐性において役割を果たすことが示唆されている（１９〜２１）。
細胞形質転換および腫瘍発達の間、Ｋ８およびＫ１８の細胞型特異性は保存され、組織型の同定のための臨床的組織病理学的マーカーとして有用となる（２２〜２４）。Ｋ８およびＫ１８の細胞型特異性が、細胞の形質転換および腫瘍の発達の間保存されると仮定すると、Ｋ８およびＫ１８サイトケラチンが、癌細胞における新規の抗原性エピトープを提示することは、予測されなかった。
（発明の概要）
本発明は、２つの別個のポリペプチドを含む単離された癌関連エピトープを提供する。第１のポリペプチドは、配列番号３のサイトケラチン８を有し得、そして第２のポリペプチドは、配列番号４のサイトケラチン１８を有し得る。あるいは、第１のポリペプチドは、配列番号５のサイトケラチン８を有し得、そして第２のポリペプチドは、配列番号６のサイトケラチン１８を有し得る。さらに、第１のポリペプチドは、配列番号３のサイトケラチン８を有し得、そして第２のポリペプチドは、配列番号６のサイトケラチン１８を有し得る。第１のポリペプチドはまた、配列番号５のサイトケラチン８を有し得、そして第２のポリペプチドは、配列番号４のサイトケラチン１８を有し得る。
このような単離されたエピトープは、腺癌細胞の線維状細胞質構築物中に検出され得るが、正常細胞において、実質的に検出されない。これらのエピトープが検出され得る腺癌の例としては、結腸腺癌細胞、卵巣腺癌細胞、腎臓腺癌細胞、乳腺癌細胞、肺腺癌細胞、膵臓腺癌細胞および非セミノーマ精巣癌細胞が挙げられる。これらのエピトープは、癌特異的抗体の作製に有用であり、そして抗原性エピトープまたは癌患者の血液、血清、便または尿中のこれらのエピトープに特異的な抗体のいずれかを検出することによって癌を診断するのに有用である。従って１つの実施形態において、これらのエピトープは、キットにおいて提供される。
別の実施形態において、本発明は、本発明の任意の癌関連エピトープに結合し得る抗体または他の結合実体を提供する。１つの実施形態において、抗体または結合実体は、配列番号７〜３５のうちのいずれかを含むポリペプチドを含み得る。好ましい抗体または結合実体は、配列番号２１〜３５のうちいずれか１つまたはそれらの組み合わせを含むペプチドを含む。別の実施形態において、本発明は、配列番号７〜３３の任意の組み合わせを含むポリペプチドに指向され、このポリペプチドは、本発明のエピトープに結合し得る。この抗体または結合実体は、配列番号３６〜３９のうちいずれか１つを含む核酸によってコードされ得る。このような結合実体または抗体は、結腸腺癌細胞、卵巣腺癌細胞、腎臓腺癌細胞、乳腺癌細胞、肺腺癌細胞、膵臓腺癌細胞および非セミノーマ精巣癌細胞の線維状細胞質構築物中の癌関連エピトープを検出し得る。この抗体または結合実体は、これに付着する標識または診断画像化薬剤を有し得る。本発明はまた、結合実体または抗体を含むこのような組成物およびキットを提供する。好ましくは、抗体が使用される場合、この抗体は、ＣＯＵ−１モノクローナル抗体ではない。
本発明は、本発明の抗体または結合実体を試験サンプルと接触させ、そしてこの抗体または結合実体が癌関連エピトープに結合するか否かを検出することによって、腺癌を検出する方法をさらに提供する。これらの抗体および結合実体は、標識または診断画像化薬剤を付着して有し得る。
本発明はまた、癌関連エピトープに結合し得る、治療的有効量の本発明の抗体または結合実体を投与することによって、哺乳動物の癌を処置する方法を提供する。このような抗体または結合実体は、治療的に有効な薬剤を付着して有し得る。
本発明はさらに、哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、この方法は、治療的有効量の、本発明の癌関連エピトープを投与する工程を包含する。
本発明はまた、哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、この方法は、サイトケラチン８およびサイトケラチン１８を切断するプロテアーゼを阻害することによって本発明の癌関連エピトープの形成を阻害し得る、治療的有効量のプロテアーゼインヒビターを投与する工程を包含する。１つの実施形態において、このプロテアーゼは、トリプシン様プロテアーゼであり、そしてこのインヒビターは、セリンプロテアーゼインヒビターまたはトリプシンインヒビターである。
本発明はまた、変異体抗体を同定する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：配列番号７〜３５のうちいずれか１つを有するポリペプチドをコードする核酸を、ファージコートタンパク質をコードする核酸に融合させて、融合タンパク質をコードする組換え核酸を生成する工程；この融合タンパク質をコードする組換え核酸を変異させて、変異体融合タンパク質をコードする変異体核酸を生成する工程；ファージの表面に変異体融合タンパク質を発現させる工程；および本発明の癌関連エピトープに結合するファージを選択する工程。
（発明の詳細な説明）
本発明によると、別個のＫ８サイトケラチンポリペプチドが、Ｋ１８サイトケラチンポリペプチドと結合して、癌性細胞においてのみ可視的であり正常細胞においては不可視である、抗原性エピトープを形成する。そのような新規エピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）は、癌腫細胞におけるＫ８／Ｋ１８複合体の特異的タンパク質分解切断によって、作製される。癌細胞において可視的なこの新規エピトープは、癌の診断剤でありかつ癌患者の処置のために有用である、抗体または結合実体を作製するために使用される。
（定義）
用語「抗体」とは、最も広い意味で使用され、詳細には、所望される生物学的活性を示す限りは、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ）を網羅する。
「結合実体」とは、本明細書中で使用される場合、本発明により同定されるエピトープに結合し得るポリペプチドである。例えば、本発明の結合実体は、２つの別個のポリペプチド（サイトケラチン８ポリペプチドおよびサイトケラチン１８ポリペプチド）を含むエピトープに結合し得る、ポリペプチドである。このサイトケラチン８ポリペプチドは、配列番号３または配列番号５を含み、このサイトケラチン１８ポリペプチドは、配列番号４または配列番号６を含む。
用語「癌」および「癌性」とは、調節されていない細胞増殖により代表的には特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたはそれを記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより特定の例としては、結腸腺癌、卵巣腺癌、腎腺癌、乳腺癌、肺腺癌、膵腺癌、および非セミノーマ精巣癌組織が挙げられる。
ＣＯＵ−１抗体は、ヒトハイブリドーマ細胞株Ｂ９１６５（ＥＣＡＣＣ ８７０４０２０１）により生成されるモノクローナル抗体である。この抗体は、癌腫関連抗原に結合し得、平均分子量約４３，０００および約５．４〜６．２の範囲内の等電点を有する。
表現「制御配列」とは、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物のために適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
参照抗原性エピトープ、参照抗体、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドの、「誘導体」は、個々の参照抗原性エピトープ、参照抗体、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドと関連はするが異なる配列もしくは化学構造を有する。そのような誘導体抗原性エピトープ、誘導体抗体、誘導体核酸、誘導体タンパク質、誘導体ポリペプチド、または誘導体ペプチドは、一般的には、参照抗原性エピトープ、参照抗体、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチド中に存在しないかもしくは弱くしか存在しないいくらかの化学特性、物理特性、もしくは機能特性を増強するかもしくは組み込むために、意図的に作製される。誘導体核酸は、参照核酸とはヌクレオチド配列が異なり、誘導体抗原性エピトープ、誘導体抗体、誘導体タンパク質、誘導体ポリペプチド、または誘導体ペプチドは、それぞれ、参照抗原性エピトープ、参照抗体、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドとは、アミノ酸配列が異なる。そのような配列の差異は、１つ以上の置換、挿入、付加、欠失、融合、および短縮を包含し、これらは、任意の組み合わせで存在し得る。差異は、微量（例えば、１ヌクレオチドの差異もしくは１アミノ酸の差異）であっても、より実質的（いくつかもしくは多くの、ヌクレオチドもしくはアミノ酸に関する）であってもよい。しかし、その誘導体の配列は、その誘導体と参照物とが構造および／または機能が関連していると当業者が認識しない程度には、参照物とは異ならない。一般には、差異は限定されており、その参照物とその誘導体とは、全体的に密接に類似しており、多くの領域にて同一である。「改変体」は、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドもしくは参照ペプチドの化学特性、物理特性、もしくは機能特性を実質的には変更しないサイレントな構造的差異を有し得る点で、「誘導体」核酸、「誘導体」タンパク質、「誘導体」ポリペプチド、もしくは「誘導体」ペプチドとは異なる。対照的に、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドもしくは参照ペプチドと、誘導体核酸、誘導体タンパク質、誘導体ポリペプチド、もしくは誘導体ペプチドとの間の差異は、その参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドもしくは参照ペプチドの１つ以上の化学特性、物理特性、もしくは機能特性を改善するようになされた意図的変化である。
用語「同一性」または「相同性」とは、候補配列と対応配列とを整列し、必要な場合には配列全体についての最大の同一性パーセントを得るためにギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、比較される対応配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味すると解釈される。Ｎ末端もしくはＣ末端の伸長も挿入も、同一性または相同性を減少するとは考慮されない。アライメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。配列同一性は、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅ．，Ｍａｄｉｓｏｎ．Ｗｉｓ．５３７０５）を使用して、測定され得る。このソフトウェアは、種々の置換物、欠失物、および他の改変物に対する相同性の程度を割当てることによって、類似する配列を一致させる。
「リポソーム」とは、哺乳動物への薬物（例えば、本明細書中に開示される抗原性エピトープおよび抗体変異体、および必要に応じて、化学療法剤）の送達のために有用である、種々の型の脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成された小胞である。このリポソームの構成成分は、生体膜の脂質配置と類似する、二重層形成して一般的に配置される。
「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類されるあらゆる動物（ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌおよびｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、非ヒト霊長類、および動物園動物、運動用（ｓｐｏｒｔｓ）動物、もしくは愛玩動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）を包含する）を指す。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係になるように配置されている場合に、「作動可能に連結されている」。これは、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が調節配列に結合している場合に遺伝子発現を可能にする様式で結合されている、遺伝子および調節配列であり得る。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質としてそれが発現される場合に、そのポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響する場合に、そのコード配列に作動可能に連結されている。あるいはリボソーム結合部位は、コード配列の転写にそれが影響を与える場合に、そのコード配列に作動可能に連結されているか、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するようにそれが配置されている場合に、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が、連続していることを意味し、分泌リーダーの場合には、連続して読み取り枠にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、簡便な制限部位での連結反応によって、達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実施に従って使用される。
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換可能に使用される。これらは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、ペプチド結合またはアミド結合によって一緒に連結されている、２つ以上のアミノ酸の鎖を指す。抗原、エピトープ、および抗体は、この定義の範囲内にあることが特に意図される。本発明のポリペプチドは、１つより多くのサブユニットを含み得、各サブユニットは、別のＤＮＡ配列によりコードされる。
抗原に関する句「実質的に同一」とは、抗体ポリペプチド配列または結合実体ポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、なおより好ましくは９０％、なおより好ましくは９５％、そして特に好ましくは９７％もしくは９８％の配列同一性を示すポリペプチドとして解釈される。ポリペプチドに関して、比較配列の長さは、一般的には、少なくとも２５アミノ酸である。核酸に関して、その長さは、一般的には、少なくとも７５ヌクレオチドである。
参照抗原性エピトープ、抗体セグメント、結合要素、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「改変体」は、それぞれ、参照抗原性エピトープ、抗体セグメント、結合要素、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと関連するが異なる配列を有する抗原性エピトープ、抗体セグメント、結合要素、核酸、タンパク質またはペプチドである。改変体と参照抗原性エピトープ、抗体セグメント、結合要素、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとの間の差異は、サイレントであるか、または保存的差異である。改変体核酸は、参照核酸とヌクレオチド配列において異なるが、改変体抗原性エピトープ、抗体セグメント、結合要素、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、それぞれ、参照抗原性エピトープ、抗体セグメント、結合要素、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと、アミノ酸配列において異なる。改変体および参照抗原性エピトープ、抗体セグメント、結合要素、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、１つ以上の置換、挿入、付加、欠失、融合および短縮によって配列が異なり、これは任意の組み合わせで存在し得る。差異は、微量（例えば、１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の差異）であるか、またはより実質的である。しかし、改変体の構造および機能は、当業者が、改変体および参照が構造および／または機能において関連することを認識しない参照とそれほど異ならない。一般的に、差異は限定され、その結果参照および改変体は、全体と密接に類似し、そして多くの領域において同一である。
（エピトープ）
本発明に従って、免疫学的に認識可能な１以上の新規のネオエピトープが、サイトケラチンＫ８タンパク質およびサイトケラチンＫ１８タンパク質の特異的タンパク質分解性切断を介して種々の腺癌細胞で生成される。正常な、非癌性細胞は、このようなネオエピトープを提示しない。サイトケラチンＫ８タンパク質およびサイトケラチンＫ１８タンパク質は、別個のタンパク質である。しかし、これらは、サイトケラチンＫ８／サイトケラチンＫ１８複合体を形成する。免疫学的に認識可能なネオエピトープは、サイトケラチンＫ８タンパク質およびサイトケラチンＫ１８タンパク質の両方に由来するアミノ酸を含む。
本発明のエピトープは、正常組織において実質的には存在しない。しかし、このエピトープは、結腸腺癌、卵巣腺癌、腎臓腺癌、乳腺腺癌、肺腺癌、膵臓腺癌および非セミノーマ精巣癌腫瘍組織において露出するようになる。本発明のエピトープは、増殖の間にこれらの型の細胞の糸状の細胞質構造において優勢に存在する。試験によって、このエピトープが特定の肉腫、悪性黒色腫、Ｂリンパ腫または胸腺腫において検出されないことが示めされる。
ヒトサイトケラチンＫ８に対する配列は、以下に提供される（配列番号１）：
Figure 2005523888
 。
ヒトサイトケラチンＫ８に関するヌクレオチド配列は、以下に提供される（配列番号４５）。
Figure 2005523888
 ヒトサイトケラチンＫ１８に関する配列は、以下に提供される（配列番号２）。
Figure 2005523888
 ヒトサイトケラチンＫ１８に関するヌクレオチド配列は、以下に提供される（配列番号 ４６）。
Figure 2005523888
 本発明のエピトープは、２つのポリヌクレオチド、すなわち、サイトケラチンＫ８ポリペプチドおよびサイトケラチンＫ１８ポリペプチドからなる。しかし、サイトケラチンＫ８ポリペプチドは、４８２アミノ酸を有する全長サイトケラチンＫ８ポリペプチドよりも短い。さらに、このサイトケラチンＫ１８ポリペプチドは、４２９アミノ酸を有する全長サイトケラチンＫ１８ポリペプチドよりも短い。いくつかの実施形態において、このサイトケラチンＫポリペプチドは、約４７５アミノ酸よりも短いか、または約４５０アミノ酸よりも短いか、または約４２５アミノ酸よりも短いか、または約４００アミノ酸よりも短い。いくつかの実施形態において、そのサイトケラチンＫ１８ポリペプチドは、約４２５アミノ酸よりも短いか、約４１５アミノ酸よりも短いか、約４００アミノ酸よりも短いか、または約３７５アミノ酸よりも短い。
本発明のエピトープの１つの例は、２つの別個のタンパク質、すなわち、サイトケラチンＫ（配列番号３）およびサイトケラチンＫ１８（配列番号３）の２つのペプチジル領域を構成する。このエピトープは、配列番号３として示され、そして以下のように提供される、サイトケラチン８配列の８５〜１２９アミノ酸を含む。
Figure 2005523888
 このエピトープは、配列番号４として示され、以下に提供されるような、サイトケラチン１８のアミノ酸７２〜１２４にさらに含む。
Figure 2005523888
 いつかの例において、サイトケラチンＫ８ポリペプチドとサイトケラチンＫ１８ポリペプチドとの間の相互作用を可能にする適切な３次元構造が、最適な免疫反応性を取得するためには必要であり得る。したがって、より長いサイトケラチンポリペプチドは、抗原として使用され得る。例えば、配列番号５を有するサイトケラチンＫ８ポリペプチドは、抗体を生成するために適切なサイトケラチンＫ１８ポリペプチドと共に使用され得る。配列番号５は、以下である：
Figure 2005523888
 同様に、配列番号６を有するサイトケラチンＫ１８ポリペプチドは、抗体を生成するために適切なサイトケラチンＫ８ポリペプチドと共に使用され得る。配列番号６は、以下である。
Figure 2005523888
 抗原性エピトープ「フラグメント」がまた、本発明によって企図される。このようなフラグメントは、全長サイトケラチンを含まないが、配列番号３〜６を有する抗原性エピトープに類似しているかまたはそれらに対して改善された免疫学的特性を有する抗原をコードしている。従って、配列番号３〜６のような抗原性エピトープのフラグメントは、約６アミノ酸、約９アミノ酸、約１２アミノ酸、約１５アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸またはそれ以上ほどの短さであり得る。一般的に、本発明のフラグメント抗原性エピトープは、そのエピトープが配列番号３〜６のいずれか１つの組み合わせによって形成されるエピトープと類似しているか、または免疫学的な特性を有している限り、任意に上限サイズを有する。
本発明はまた、配列番号３のペプチドおよび配列番号４のペプチドの組み合わせを含む融合タンパク質を企図する。このような融合タンパク質がその２つのペプチドを一緒して結合すると、その結果、そのペプチドは、本発明の癌関連エピトープをより容易に形成し得る。
融合ポリペプチドは、標準的な技術（化学結合体化を含む）を使用して一般的に調製され得る。融合ポリペプチドはまた、組換えポリペプチドとして発現され得、ある発現系における、非融合ポリペプチドと比較して、増大したレベルの産生を可能とし得る。簡潔には、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別個にアセンブリされ得、そして、適切な発現ベクターとして連結され得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてかまたはそれを用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結され、その結果、その配列のリーディングフレームの、フェーズ（相）は一致する。このことによって、成分ペプチドの両方の生物学的活性を保持する単一の融合ペプチドへと翻訳されることが可能となる。
十分な距離で第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを隔てるために、リンカー配列が使用され得、ポリペプチドの各々が、その２次構造および３次構造にフォールドすることが確実となる。このようなリンカーは、ペプチド、ポリペプチド、アルキル鎖または他の従来型スペーサー分子であり得る。
ポリペプチドリンカー配列またはペプチドリンカー配列は、当該分野において周知の標準技術を使用して、融合ポリペプチドに組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下のような要因に基づいて選択され得る：（１）可撓性の伸延したコンフォメーションを採用するそれらの能力；（２）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド上の機能エピトープと相互作用し得る二次構造をそれらが採用することができないこと；および（３）ポリペプチド機能エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電した残基の欠如。いくつの実施形態において、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。他の中性付近のアミノ酸（例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ）はまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして通常使用され得るアミノ酸配列としては、以下に開示されるアミノ酸配列が挙げられる：Ｍａｒａｔｅａら，Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３ ：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号。このリンカー配列は、一般的に、１〜約５０アミノ酸の長さであり得る。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、機能ドメインを分離し、空間的な干渉を防ぐように使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合には、リンカー配列は、一般的に必要とされない。
この融合ポリペプチドは、関連しない免疫原性タンパク質（例えば、リコール応答（ｒｅｃａｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を惹起することができる免疫原性タンパク質）と共に本明細書に記載されるようなポリペプチドエピトープ（例えば、配列番号３および配列番号４のペプチド）を含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質、および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．，３３６：８６−９１，１９９７を参照のこと）。
１実施形態において、配列番号３および配列番号４のペプチドエピトープに対する免疫応答の進展を容易にし得るペプチドおよびポリペプチドがリンカーとして使用され得る。このような免疫原性融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．に由来し得る。例えば、この免疫原性融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来Ｒａ１２フラグメントであり得る。Ｒａ１２組成物および、異種のポリヌクレオチド配列／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増強するためのＲａ１２組成物の使用の方法は、米国特許出願番号６０／１５８，５８５号（この開示は、本明細書において参考として全体が援用される）に記載されている。簡潔にいうと、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性株または非病原性株における遺伝子によってコードされる分子量３２ＫＤのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、記載されている（例えば、米国特許出願番号６０／１５８，５８５；また、Ｓｋｅｉｋｙら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８−４００７を参照のこと。本明細書中においてこれらは参考として援用される）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは、高レベルで発現し、そして、精製プロセスの全体に亘って、可溶性ポリペプチドとして維持される。さらに、Ｒａ１２は、Ｒａ１２が融合している異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの有用なＲａ１２融合ポリペプチドは、１４ＫＤのＣ末端フラグメント（ＭＴＢ３２の１９２〜３２３のアミノ酸残基に対応する）を含む。他の有用なＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする、少なくとも約１５の連続したヌクレオチド、少なくとも約３０の連続したヌクレオチド、少なくとも約６０の連続したヌクレオチド、少なくとも約１００の連続したヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチドまたは少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。
Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部分をコードする内因性配列）を含み得るか、または、このような配列の改変体を含み得る。ネイティブＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較してそのコードされる融合ポリペプチドの生物学的活性が実質的に消失しないように、Ｒａ１２ ポリヌクレオチド改変体は、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。改変体は、好ましくは、ネイティブのＲａ１２ポリペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、および最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を提示する。
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、プロテインＤ、つまり、グラム陰性細菌のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂの表面タンパク質（ＷＯ９１／１８９２６）に由来する。プロテインＤの有用部分は、そのタンパク質のおよそ３分の１（例えば、第１のＮ末端の１００〜１１０のアミノ酸）を含む。さらに、このようなプロテインＤ融合パートナーは、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポプロテインＤ融合パートナーのはじめの１０９残基がＮ末端に含まれて、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供して、そして、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるその発現レベルを増大する（従って、発現エンハンサーとして機能する）。その脂質テイルは、抗原提示細胞に対する抗原の最適な提示を確実にする。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルスＮＳ１（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）に由来する非構造タンパク質を含む。代表的には、Ｎ末端の８１アミノ酸が使用されるが、Ｔヘルパーエピトープを含む様々なフラグメントが使用され得る。
別の実施形態において、この免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質またはその一部（好ましくは、Ｃ末端部分）である。ＬＹＴＡは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来であり、これは、（ＬｙｔＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ ４３：２６５−２９２，１９８６）によってコードされる）アミダーゼＬＹＴＡとして公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性の要因である。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｃ−ＬＹＴＡの開発のために利用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９５−７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分が融合ポリペプチド中に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８において開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチドおよびこの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、この融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載されるように、ポリペプチドをエンドソーム／リソソーム区画に指向し得る、標的化シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的化シグナルと融合される場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子とより効率的に結合し、それによってポリペプチドに特異的なＣＤ４．ｓｕｐ．＋Ｔ細胞のインビボでの増強された刺激を提供する。
本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、種々の周知の合成技術および／または組換え技術のいずれかを使用して調製される。約１５０未満のアミノ酸であるポリペプチドおよび融合タンパク質は、当業者に周知の技術を使用して、合成手順によって作製され得る。１つの例において、このようなポリペプチドは、商業的に利用可能な固相技術（例えば、アミノ酸が、成長しているアミノ酸鎖に連続的に加えられる、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと））のいずれかを使用して合成される。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）のような業者から市販されており、そして製造業者の指示書に従って操作され得る。
本発明の小さい融合タンパク質および大きい融合タンパク質ならびにポリペプチドエピトープは、当業者に利用可能な任意の他の方法によって生成され得る。例えば、融合タンパク質およびポリペプチドエピトープは、選択された融合タンパク質またはポリペプチドエピトープをコードする核酸を、任意の種々の手順を使用して、発現ベクター中に挿入することによって、組換え的に作製され得る。一般的に、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版（２００１年１月１５日）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８７９６９５７６５；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（１９８９））を参照のこと。融合タンパク質またはポリペプチドエピトープを含有する適切な発現ベクターの構築は、当業者に公知の標準的なライゲーション技術を使用する。
結合された核酸配列は、本発明の融合タンパク質およびポリペプチドエピトープの発現を容易にする、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。タンパク質の発現の要因である調節エレメントは、ポリペプチドのコード領域の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳を終了させるのに必要とされる終止コドンおよび転写終結シグナルは、融合タンパク質またはポリペプチドエピトープをコードする核酸配列の３’側にのみ存在する。作動可能に連結された調節エレメントを有する目的のポリペプチドをコードする核酸の構築後、この発現カセットは、宿主細胞中に導入され得、そしてコードされたポリペプチドが発現され得る。
一般的に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元々の環境から除去されるポリペプチドである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドが天然の系に同時に存在する物質のいくらかまたは全てから分離される場合、このタンパク質またはポリペプチドは、単離される。このようなポリペプチドはまた、精製され得る。例えば、ポリペプチドエピトープおよび融合タンパク質は、少なくとも約９０％純粋であるかまたは少なくとも約９５％純粋であるかまたは少なくとも約９９％純粋であり得る。
（抗体および結合実体）
本発明のサイトケラチンエピトープは、生存可能な癌細胞および腺癌細胞の表面上に均一な点状パターンで表示される。免疫組織学研究は、本発明の癌関連エピトープが、正常なサイトカイン８および１８とは対照的に、悪性結腸上皮と正常結腸上皮との間、および肝臓における結腸癌転移とまわりを取り囲む正常肝細胞との間を区別するのに使用され得ることを示す。さらに、本発明の癌関連エピトープは、生検の悪性領域内の増殖細胞の膜と結合するが、休止細胞は、エピトープ用に染色された場合、糸状のパターンを有した。
本発明は抗体調製物および本発明のエピトープに対して指向される結合実体（例えば、サイトケラチンＫ８由来の少なくとも１つのペプチドとサイトケラチンｋ１８由来の少なくとも１つのペプチドとの抗原混合物に結合し得る、抗体または結合実体）を提供する。サイトカインＫ８由来のペプチドの例としては、配列番号３および配列番号５が挙げられる。サイトケラチンＫ１８由来のペプチドの例としては、配列番号４および配列番号６が挙げられる。
１つの実施形態において、抗体または結合実体は、配列番号７〜３５、４７〜４９のうちのいずれか１つを含むポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、抗体および結合実体は、配列番号２１〜３５、４７〜４９のうちのいずれか１つから本質的になるポリペプチドを含む。他の実施形態において、抗体および結合実体は、配列番号８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、２７、２９または３２のいずれか１つから本質的になるポリペプチドを含む。別の実施形態において、本発明は、配列番号７〜３３、４７〜４９の任意の組み合わせを含む結合実体ポリペプチドに関し、ここで、このポリペプチドは、本発明のエピトープに結合し得る。
本発明はまた、本発明の抗体様ポリペプチドをコードする核酸を提供する。１つの実施形態において、この核酸は、配列番号７〜３５、４７〜４９のうちのいずれか１つを含むポリペプチドをコードし、ここで、このような核酸は、本発明のエピトープに結合し得るポリペプチドをコードする。別の実施形態において、この核酸は、配列番号７〜３３、４７〜４９の２つ以上の組み合わせをコードし、ここで、このような核酸は、本発明のエピトープに結合し得る結合実体ポリペプチドをコードする。好ましい核酸は、配列番号２１〜３３のいずれか１つまたは配列番号８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、２７、２９または３２のいずれか１つから本質的になるポリペプチドをコードする。本発明の他の核酸は、ヌクレオチド配列（配列番号３６〜３９）を含む。
本発明はまた、利用可能な手順によって作製される抗体を提供し、この抗体は、本発明のエピトープに結合し得る。
抗体分子は、免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質のファミリーに属し、これらの基本構造ブロックである免疫グロブリンフォールドまたは免疫グロブリンドメインは、免疫系および他の生物学的な認識系の多くの分子中で種々の形態で使用される。標準的な抗体は、２つの同一な免疫グロブリン重鎖および２つの同一な軽鎖からなる四量体構造であり、かつ約１５０，０００ダルトンの分子量を有している。
抗体の重鎖および軽鎖は、異なるドメインからなる。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）を有し、一方各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ）を有している。例えば、Ａｌｚａｒｉ，Ｐ．Ｎ．，Ｌａｓｃｏｍｂｅ，Ｍ．−Ｂ．＆Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．（１９８８）Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５５５−５８０を参照のこと。約１１０のアミノ酸残基からなる各ドメインは、互いに対してパックされた（ｐａｃｋ）２つのβシートから形成される特徴的なβサンドイッチ構造に折り畳まれる（免疫グロブリングロブリンフォールド）。このＶＨドメインおよびＶＬドメインは、それぞれ、ドメインの１つの末端でβストランドを接続するループ、またはターンである、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１−３）を有する。軽鎖および重鎖両方の可変領域は、一般的には抗原特異性に寄与するが、個々の鎖の特異性に対する寄与は、常に等しいわけではない。抗体分子は、６つの無作為に選ばれたループ（ＣＤＲ）を使用することによって多くの分子に結合するように進化された。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンが、異なるクラスに割り当てられ得る。少なくとも５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかが、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）にさらに分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する、重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２つの明らかに別々の型の１つに割り当てられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は、周知である。
抗体の可変ドメインの脈絡における用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間の配列中で広範に異なるという事実をいう。この可変ドメインは、結合のためおよび各特定抗体の、その特定の抗原に対する特異性を決定するためのものである。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布されない。可変性は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の超可変領域としても公知である、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントにおいて濃縮される。
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、そのほとんどがβシート構成を採用し、３つのＣＤＲによって接続されており、βシート構造と接続し、かついくつかの場合においてβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって共に近位に保持され、そして他の鎖由来のＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与のような種々のエフェクター機能を示す。
従って、本発明における使用が企図される抗体は、任意の種々の形態であり得、この形態としては、Ｆｖ、Ｆａｂおよび同様のフラグメントのような抗体フラグメント、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一本鎖抗体、ならびに同様の形態が挙げられ、これらの全ては、本明細書中で使用される場合、広義の用語「抗体」とされる。本発明は、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）の任意の特異性の使用を企図し、そしてこの抗体は、特異的抗原を認識し、そして特異的抗原と免疫反応する抗体に限定されない。好ましい実施形態において、以下に記載される治療法とスクリーニング法の両方の脈絡において、本発明の抗原またはエピトープに免疫特異的である抗体またはそのフラグメントが、使用される。いくつかの実施形態において、この抗体は、ＣＯＵ−１抗体ではない。
用語「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部のことをいい、一般的には、抗原結合領域または可変領域をいう。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを生成し、その各々は、単一の抗原結合部位および残りの「Ｆｃ」フラグメント（その結晶化を容易にする能力のためにそう呼ばれる）を有している。ペプシン処理は、２つの抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、これは、抗原および残りの他のフラグメント（これは、ｐＦｃ’と称される）を架橋し得る。さらなるフラグメントとしては、ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、線形抗体、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が挙げられる。本明細書中で使用される場合、抗体に関する「機能的フラグメント」は、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントをいう。
従って、本発明によって企図される抗体フラグメントは、全長抗体ではなく、ＣＯＵ−１抗体のような抗体に対して、類似の免疫学的特性または改善された免疫学的特性を有する。従って、ＣＯＵ−１抗体のフラグメントおよび／または配列番号７〜３５の抗体のいずれか１つを有するポリペプチドのフラグメントが、本発明によって企図される。このような抗体フラグメントは、約４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、９アミノ酸、約１２アミノ酸、約１５アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸程度の小ささまたはそれ以上であり得る。
一般に、本発明の抗体フラグメントは、このフラグメントが、配列番号３〜６のいずれか１つの組み合わせによって形成されるエピトープと特異的に結合する抗体に対して類似の特性または免疫学的特性を有する限り、任意の上限サイズを有し得る。このような参照配列は、ＣＯＵ−１抗体であり得る。例えば、結合実体および軽鎖抗体フラグメントは、この抗体フラグメントが軽鎖抗体サブユニットに関連する場合、約２００アミノ酸未満、約１７５アミノ酸未満、約１５０アミノ酸未満、または約１２０アミノ酸未満を有し得る。さらに、結合実体および重鎖抗体フラグメントは、この抗体フラグメントが重鎖抗体サブユニットに関連する場合、約４２５アミノ酸未満、約４００アミノ酸未満、約３７５アミノ酸未満、約３５０アミノ酸未満、約３２５アミノ酸未満、または約３００アミノ酸未満を有し得る。
抗体フラグメントは、その抗原、エピトープまたはレセプターと選択的に結合するいくつかの能力を保持する。抗体フラグメントの数種の型は、以下の（１）〜（５）のように規定される。：
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、抗体全体を酵素パパインで消化することによって産生され、インタクトな軽鎖、および１つの重鎖の一部を生じ得る。
（２）Ｆａｂ’は、抗体全体をペプシンで処理し、続いて還元することによって得られ、インタクトな軽鎖、および重鎖の一部を生じ得る、抗体分子のフラグメントである。２つのＦａｂ’フラグメントは、抗体分子によって得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、その重鎖ＣＨ１ドメイン（抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む）のカルボキシル末端におけるわずかな残基の付加だけ、Ｆａｂフラグメントとは異なる。
（３）（Ｆａｂ’）２は、その後に還元することなく、抗体全体を酵素ペプシンで処理することによって得られ得る抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である。
（４）Ｆｖは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む、最小抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有結合した、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは、このＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するように相互作用する。集合的に、６つのＣＤＲが、この抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえもが、結合部位全体よりも低い親和性にもかかわらず、抗原を認識しかつ抗原に結合する能力を有する。
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子として定義され、遺伝学的に融合された一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結される。このような一本鎖抗体はまた、「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントとも称される。一般に、このＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このポリペプチドリンカーにより、ｓＦｖは、抗原結合のための所望の構造を形成することができる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．、２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
用語「ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において、軽鎖可変ドメインに連結された（ＶＬ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成され、２つの抗原結合部位が作製される。ジアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）において、より完全に記載される。
ポリクローナル抗体の調製のための方法は、当業者に利用可能である。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編）１−５頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２．４．１節（１９９２）（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
同様に、モノクローナル抗体の調製は、従来式である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｃｏｌｉｇａｎら、２．５．１−２．６．７節；およびＨａｒｌｏｗら：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、７２６頁（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ．（１９８８））（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技術によって、ハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。このような単離技術としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用するアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、２．７．１−２．７．１２節および２．９．１−２．９．３節；Ｂａｒｎｅｓら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第１０巻、７９−１０４頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））を参照のこと。
モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボでの操作方法は、当業者に周知である。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得るか、または例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組み換え方法によって作製され得る。本発明とともに使用するためのモノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）、およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。別の方法は、組換え手段によってモノクローナル抗体をヒト化して、ヒト特異的配列およびヒト認識可能配列を含む抗体を作製する工程を包含する。総説については、Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２１９２−２２０１（１９９７）およびＶａｓｗａｎｉら、Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１０５−１１５（１９９８）を参照のこと。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、実質的に同種の抗体（すなわち、少量で存在し得る潜在的に天然に存在する変異を除いては同一である集団を含む、個々の抗体）の集団から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、１つの抗原部位に対して指向される。さらに、種々の決定因子（エピトープ）に対して指向される種々の抗体を代表的に含む、従来型のポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定因子に対して指向される。これらの特異性に加えて、これらのモノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されないハイブリドーマ培養物によって合成されるという点で有益である。「モノクローナル」モディファイヤー（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）は、その抗体の特徴が、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体の特徴を示すことを示し、任意の特定の方法による抗体集団を必要とするとはみなされない。
本明細書中のモノクローナル抗体は、特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、その重鎖および／または軽鎖の一部は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の、対応する配列と同一であるかまたはそれらの配列に相同であり、一方、その鎖の残部は、別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびこれらの抗体のフラグメントの、対応する配列と同一であるかまたはそれらの配列に相同である（米国特許第４，８１６，５６７号）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．８１，６８５１−６８５５（１９８４）。
抗体フラグメントを作製する方法はまた、当該分野で公知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。本発明の抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解性加水分解によってか、またはこのフラグメントをコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉにおける発現によって、調製され得る。抗体フラグメントは、従来方法によって抗体全体をペプシン消化またはパパイン消化することによって得られ得る。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンでの抗体の酵素学的切断によって作製され、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓフラグメントが提供され得る。このフラグメントは、チオール還元剤、および必要に応じて、ジスルフィド結合の切断を生じるスルフヒドリル基に対するブロッキング基を使用してさらに切断され、３．５Ｓ Ｆａｂ’の一価のフラグメントが作製され得る。あるいは、ペプシンを使用する酵素学的切断は、２つの一価のＦａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接生じる。これらの方法は、例えば、米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号、ならびにこれらに含まれる参考文献に記載されている。これらの特許は、それら全体が本明細書中で参考として援用される。
このフラグメントがインタクトな抗体によって認識可能である抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法（例えば、重鎖を分離して、一価の軽鎖フラグメントを形成する方法）、フラグメントのさらなる切断方法、または他の酵素学的技術、化学的技術、もしくは遺伝学的技術もまた、使用される。例えば、Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖とＶＬ鎖との結合を含む。この結合は、非共有結合であり得るか、またはその可変鎖は、分子間ジスルフィド結合もしくは化学物質（例えば、グルタルアルデヒド）による架橋によって、連結され得る。好ましくは、このＦｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されるＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって、調製される。この構造遺伝子は、発現ベクターに挿入され、続いて、Ｅ．ｃｏｌｉのような宿主細胞に導入される。その組み換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する一本鎖ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを作製するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２巻、９７頁（１９９１）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；およびＰａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１−７７（１９９３）によって記載されている。
抗体フラグメントの別の形態は、１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小領域単位」）は、しばしば、抗原認識および抗原結合に関与する。ＣＤＲペプチドは、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子をクローニングまたは構築することによって得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって、調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２巻、１０６頁（１９９１）を参照のこと。
本発明は、ヒト抗体および非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態を企図する。このようなヒト化抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、それらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合配列）である。大部分は、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。このヒト化免疫グロブリンでは、レシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、非ヒト種（例えば、所望の特異性、親和性および受容能力を有するマウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する残基により置換されている。
いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、さらに洗練かつ最適な抗体性能にさせる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変領域の全てを実質的に含む。ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲと対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列である。ヒト化抗体はまた、必要に応じて免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的に、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，５９３−５９６（１９９２）；Ｈｏｌｍｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２１９２−２２０１（１９９７）およびＶａｓｗａｎｉら，Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１０５−１１５（１９９８）を参照のこと。
標準化手順は、抗体生成に有用であるが、抗体のサイズ、抗体の複鎖構造および抗体内に存在する６つの結合ループの複雑性は、大量の抗体の改良および生産に対して障害物となる。従って、本発明はさらに、本発明のエピトープを認識し、結合し得るポリペプチドを含む、結合実体の使用も企図する。
従って、本発明は、本発明の癌関連エピトープに結合し得る抗体および他の結合実体に関連する。いくつかの実施形態において、抗体および結合実体は、配列番号７〜配列番号３３を有する。配列番号７〜配列番号３３の配列は、以下に提供される。
Figure 2005523888
Figure 2005523888
 ペプチド配列番号７〜配列番号３３をコードする核酸は、ＣＯＵ−１抗体を分泌する細胞から単離された。本スクリーニングにおいて単離された核酸によりコードされる全てのポリペプチドが、癌関連エピトープに結合し得るわけではなく、配列番号７〜配列番号３３のペプチドが、ファージディスプレイおよび他の実験により結合において役割を果たすことが示された。さらに、異なる抗体フラグメントクローンの類似の領域において、いくつかの差異が見出された。例えば、単離された可変軽鎖ＣＤＲ１フラグメントは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１５）並びにＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ（配列番号２７）を有した。同様に、単離された可変軽鎖ＣＤＲ２フラグメントは、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号１７）、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２２）またはＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）を有した。さらに、単離された可変軽鎖ＣＤＲ３フラグメントは、ＱＱＹＧＮＳＰＰＹＴ（配列番号２４）またはＱＱＹＹＳＴＰＰＭ（配列番号３２）を有した。従って、全てのクローンが同一であるわけではない。
多くのタンパク質が、結合ドメイン（例えば、任意の配列番号７〜３３、４７〜４９のペプチド、またはそれらの変異体）が付着し得るためのタンパク質の骨組としての役割を果たし得る。結合ドメインは、本発明の癌関連エピトープに結合するかまたは相互作用するが、タンパク質骨組は、結合ドメインが結合し得るように結合ドメインを維持しそして安定化させるにすぎない。多くのタンパク質骨組が使用され得る。例えば、ファージカプシドタンパク質が使用され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ＆ Ｗｅｌｌｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１７３−１８４（１９９４）において概説される。実際、このようなファージカプシドタンパク質は、本明細書に記載されるように使用され、配列番号７〜配列番号３３のペプチドをスクリーニングした（実施例を参照のこと）。ファージカプシドタンパク質はまた、ランダムペプチド配列（ウシ膵臓トリプシンインヒビター（Ｒｏｂｅｒｔｓら，ＰＮＡＳ ８９：２４２９−２４３３（１９９２））、ヒト成長ホルモン（Ｌｏｗｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１）、Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １：７０−７５（１９９４））、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩｇＧ結合ドメイン（Ｏ’Ｎｅｉｌら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖ（Ｃｒａｂｂ，Ｌ，編)ｐｐ．５１７−５２４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４））が挙げられる）を示す骨組としても使用され得る。これらの骨組は、本明細書で提供される結合ドメインを含むように改変され得る、単一のランダム化ループまたは領域を示す（例えば、配列番号７〜３３、４７〜４９）。
研究者らはまた、小さな７４アミノ酸αアミラーゼインヒビターＴｅｎｄａｍｉｓｔａｔを、糸状ファージＭ１３の提示骨組として使用した。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．，およびＨｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−４７０（１９９５）。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅに由来するβシートタンパク質である。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、結合ペプチドに対する魅力的な骨組としての多くの特徴を有し、その特徴としては、小さなサイズ、安定性、および高解像度のＮＭＲおよびＸ線構造データの有用性が挙げられる。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔの全体的なトポロジーは、一連のループにより結合される、２つのβシートを有する免疫グロブリンドメインのトポロジーと類似している。免疫グロブリンドメインと対照的に、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔのβシートは、１つのジスルフィド結合ではなく、むしろ２つのジスルフィド結合で一緒に維持され、タンパク質の多くの安定性の原因となる。免疫グロブリンで見出されるＣＤＲループから類推して、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔのループは、類似の機能を果たし得、そしてインビトロ突然変異誘発により容易にランダム化され得る。しかし、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅに由来し、ヒトにおいて抗原性であり得る。しかし、その小さなサイズは、その抗原性を減少し得るか、または阻害し得る。
フィブロネクチンＩＩＩ型領域はまた、付着され得る結合実体のためのタンパク質骨組として使用され得る。結合実体（例えば、ＣＤＲペプチド）のタンパク質骨組として、ドメイン中で、このようなフィブロネクチンタイプを使用するための配列、ベクターおよびクローニング手順が提供される（例えば、米国特許出願公開２００２００１９５１７）。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスおよび細胞−細胞相互作用の形成において必須な役割を果たす大きなタンパク質である。フィブロネクチンは、小さなドメインの３つのタイプ（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）の多くの反復からなる。Ｂａｒｏｎ，Ｍ．，Ｎｏｒｍａｎ，Ｄ．Ｇ．およびＣａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌｅｓ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６，１３−１７。フィブロネクチンＩＩＩ型は、免疫グロブリンスーパーファミリーの大きなサブファミリー（Ｆｎ３ファミリーまたはｓ型Ｉｇファミリー）の一部である。Ｆｎ３ファミリーとしては、細胞接着分子、細胞表面ホルモンおよびサイトカインレセプター、シャペロニン、ならびに炭水化物結合ドメインが挙げられる。概説として、Ｂｏｒｋ，Ｐ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．（１９９２）Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，８９９０−８９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．（１９９３）Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，８４６−８５２；Ｂｏｒｋ，Ｐ．，Ｈｏｍ，Ｌ．およびＳａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９９４）Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｌｄ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｒｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｄ．およびＳｐｉｔｚｆａｄｅｎ，Ｃ．（１９９４）Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｍｏｄｕｌｅｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２，２３３−３３７；Ｈａｒｐｅｚ，Ｙ．および Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．（１９９４）Ｍａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ａ ｎｅｗ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｅｔ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８，５２８−５３９を参照のこと。
免疫系において、特異的な抗体をラージライブラリーから選択し、そして増幅する（親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ））。免疫細胞において使用されたコンビナトリアル技術は、突然変異誘発および結合実体のコンビナトリアルライブラリーの生成により、模倣され得る。従って、結合実体、抗体フラグメントおよび抗体は、ディスプレイ型技術（ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、および当該分野で周知の技術を使用する他の技術が挙げられるが、これらに限定されない）により生成され得、生じた分子は、さらなる成熟（例えば、親和性成熟（例えば、当該分野で周知である技術））に供され得る。ＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｒｉｓ、上述、ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｔｈａｕ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：４９３７−４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ）、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）， Ｓｃｏｔｔ ＴＩＢＳ １７：２４１−２４５（１９９２），Ｃｗｉｒｌａら ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２（１９９０），ＲｕｓｓｅｌらＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１０８１−１０８５（１９９３），Ｈｏｇａｎｂｏｏｍら．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３０：４３−６８（１９９２），ＣｈｉｓｗｅｌｌおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ＴＩＢＴＥＣＨ １０：８０−８４（１９９２），ならびに米国特許第５，７３３，７４３号。
従って、本発明はまた、抗体を最適なそれらの親和性、選択性、結合強度および／または他の所望の特性に変異する方法を提供する。変異抗体とは、抗体のアミノ酸配列変異体を言う。一般的に、変異抗体中の１以上のアミノ酸残基は、参考の抗体に存在するアミノ酸残基と異なる。このような変異抗体は、参照アミノ酸配列と１００％未満の配列同一性または類似性を必然的に有する。一般的に、変異抗体は、参照抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有する。変異抗体は、参考の抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおさらに好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有する。抗体を変異する１つの方法としては、ファージディスプレイを用いる親和性成熟が挙げられる。
例えば、ファージディスプレイを用いる親和性成熟は、変異抗体を生成する１つの方法として利用され得る。ファージディスプレイを用いる親和性成熟とは、Ｌｏｗｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（４５）：１０８３２−１０８３８（１９９１）に記載されるプロセスを言う。Ｈａｗｋｉｎｓら，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２５４：８８９−８９６（１９９２）もまた参考のこと。以下の記載に厳密に制限されないが、このプロセスは、お互いの部位で全ての可能なアミノ酸置換を生成する目的を有する多くの異なる部位において、いくつかの抗体超可変領域の変異を含むとして簡単に記載され得る。このように、生成された抗体変異は、融合タンパク質として、糸状ファージ粒子から一価様式で示される。融合は、一般的にＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に成される。様々な変異を発現するファージは、目的の特質（例えば、結合親和性または選択性）のための数回の選択が繰り返され得る。目的の変異は、単離されそして配列決定される。このような方法は、米国特許第５，７５０，３７３号、同第６，２９０，９７５号およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．１３（１１），２５０８−２５１５（１９９４）においてより詳細に記載される。
一つの実施形態において、本発明は、抗体ポリペプチドまたは抗体コード核酸を操作し、ＣＯＵ−１抗体と同じエピトープを認識する、改良された結合特性有する抗体または抗体フラグメントを生成する方法を提供する。
ＣＯＵ−１抗体の一部を変異するこのような方法としては、配列番号７〜３５の任意の１つ、または配列番号８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、２７、２９、３２、４７、４８または４９の任意の１つを有するポリペプチドをコードする核酸をファージコートタンパク質をコードする核酸と融合し、融合タンパク質をコードする組換え核酸を生成する工程、融合タンパク質をコードする組換え核酸を変異し、変異融合タンパク質をコードする変異核酸を生成する工程、ファージの表面上で変異融合タンパク質を発現する工程および本発明のエピトープに結合するファージを選択する工程を包含する。
一つの実施形態において、この方法は、配列番号７〜３５の任意の組み合わせまたは配列番号８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、２４、２７、２９、３２、４７、４８または４９の任意の組み合わせを有するポリペプチドをコードする核酸をファージコートタンパク質をコードする核酸と融合し、融合タンパク質をコードする組換え核酸を生成する工程、融合タンパク質をコードする組換え核酸を変異し、変異融合タンパク質をコードする変異核酸を生成する工程、ファージの表面上で変異融合タンパク質を発現する工程および本発明のエピトープに結合するファージを選択する工程を包含する。
別の実施形態において、この方法は、配列番号２６、１５、２７、２２、２３、２４および２５の各々１つを有するポリペプチドをコードする核酸をファージコートタンパク質をコードする核酸と融合し、融合タンパク質をコードする組換え核酸を生成する工程、融合タンパク質をコードする組換え核酸を変異し、変異融合タンパク質をコードする変異核酸を生成する工程、ファージの表面上で変異融合タンパク質を発現する工程および本発明のエピトープに結合するファージを選択する工程を包含する。
別の実施形態において、この方法は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３の各々１つを有するポリペプチドをコードする核酸をファージコートタンパク質をコードする核酸と融合し、融合タンパク質をコードする組換え核酸を生成する工程、融合タンパク質をコードする組換え核酸を変異し、変異融合タンパク質をコードする変異核酸を生成する工程、ファージの表面上で変異融合タンパク質を発現する工程および本発明のエピトープに結合するファージを選択する工程を包含する。
別の実施形態において、この方法は、配列番号３４または配列番号３５を有するポリペプチドをコードする核酸を、ファージコートタンパク質をコードする核酸に融合して、融合タンパク質をコードする組み換え核酸を作製する工程、この融合タンパク質をコードする組み換え核酸を変異させて、変異体融合タンパク質をコードする変異体核酸を作製する工程、この変異体融合タンパク質を、ファージの表面上に発現させる工程、および本発明のエピトープに結合するファージを選択する工程を包含する。配列番号３４および３５は、本発明のエピトープに結合し得る有用な可変軽鎖をコードする。配列番号３４は、以下に提供される。
Figure 2005523888
 配列番号３５は、以下に提供される。
Figure 2005523888
 この方法はまた、ＣＯＵ−１に関連する可変重鎖または軽鎖（例えば、配列番号３６〜３９のいずれか１つ）を含む核酸を、ファージコートタンパク質をコードする核酸に融合させて、融合タンパク質をコードする組み換え核酸を作製する工程、この融合タンパク質をコードする組み換え核酸を変異させて、変異体融合タンパク質をコードする変異体核酸を作製する工程、この変異体融合タンパク質をファージの表面上に発現する工程、および本発明のエピトープに結合するファージを選択する工程を包含し得る。
それ故、本発明は、ＣＯＵ−１に関連する可変重鎖をコードする核酸（例えば、以下に提供される配列番号３６）に関する。
Figure 2005523888
 別の実施形態において、本発明は、ＣＯＵ−１に関連する可変軽鎖をコードする核酸（例えば、以下に提供される配列番号３７）に関する。
Figure 2005523888
 別の実施形態において、本発明は、ＣＯＵ−１に関連する可変軽鎖をコードする核酸（例えば、以下に提供される配列番号３８（Ｌ８とも呼ばれる））に関する。
Figure 2005523888
 別の実施形態において、本発明は、ＣＯＵ−１に関連する可変軽鎖をコードする核酸（例えば、配列番号３９（Ｔ５とも呼ばれる））に関する。
Figure 2005523888
 このような方法は、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号７〜３５のいずれか１つを含むポリペプチド）をコードする核酸、または配列番号３６〜３９のいずれか１つを含む核酸を含む複製可能な発現ベクターを構築する工程をさらに包含し得る。この核酸はまた、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号７〜３５のいずれか）を含む融合タンパク質、および天然もしくは野生型のファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質をコードし得る。この発現ベクターはまた、融合タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された転写調節エレメントを有し得る。このベクターは、抗体ポリペプチドをコードする核酸内の１つ以上の選択された位置において変異されて、関連核酸（それぞれわずかに異なる抗体ポリペプチドをコードする）を含むプラスミドのファミリーまたは「ライブラリー」を形成する。適切な宿主細胞は、プラスミドのファミリーで形質転換される。形質転換された宿主細胞を、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで感染し、そしてこの形質転換された感染した宿主細胞を、組み換えファージミド粒子を形成するために適切な条件下で培養する。各組み換えファージミドは、このファージミド粒子の表面上に融合タンパク質の約１つのコピーを提示する。これらのファージミドをスクリーニングするために、ファージミド粒子を、本発明のエピトープまたは抗原と接触させる。結合するファージミド粒子は、エピトープにも抗原にも結合しないファージミド粒子と分離される。受容可能な結合特性を有するファージミドを別々にクローニングし、そしてそれらの結合親和性を１回以上再試験することにより、好ましくは、さらなる回数の選択を行う。エピトープまたは抗原に適切に結合するファージミド粒子由来のファージミドをまた、所望の、例えば、良好な結合親和性を有する抗体の特性についてさらに選択するために、単離し、クローン化し、そして再び変異さえし得る。
この方法は、１つより多くのサブユニットポリペプチドから構成されるポリペプチド複合体に適用可能である。この場合、目的の各サブユニットのそれぞれをコードする核酸は、ファージコートタンパク質に別々に融合され、そしてその結合特性について別々に分析される。
当業者により使用される任意のクローニング手順を使用して、このような親和性成熟／ファージディスプレイ手順において使用される発現ベクターを作製し得る。例えば、当業者は、公知のクローニング手順を容易に使用して、抗体超可変領域をコードする核酸を、ファージコートタンパク質をコードする核酸に融合し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．２００１を参照のこと。
従って、本発明は、所望の特性を有する抗体および／もしくは抗体フラグメントまたはポリペプチドを選択する方法に関する。このような所望の特性は、本発明のエピトープに関する増加した結合親和性または選択性を含み得る。
本発明の抗体および抗体フラグメントは、単離された抗体および抗体フラグメントである。単離された抗体は、同定され、そしてそれが産生された環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その産生環境の混入成分は、その抗体の診断的使用および治療的使用に干渉する物質であり、そしてこれらとしては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。用語「単離された抗体」はまた、組み換え細胞内の抗体を含む。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は、存在しないからである。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製される。
所望の場合、本発明の抗体は、任意の利用可能な手順により精製され得る。例えば、抗体は、抗体を惹起するために使用される抗原が結合される固体支持体に抗体調製物を結合することによりアフィニティー精製され得る。混入物質を洗い流した後、抗体を、公知の手順により溶出され得る。当業者は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および／または濃度についての免疫学的技術において一般的な種々の技術を知っている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｕｎｉｔ９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１（参考として援用される）を参照のこと）。
好ましい実施形態において、抗体を、少なくとも３つの異なる方法により測定可能な程度に精製する：１）Ｌｏｗｒｙ法により決定される場合に９５重量％の抗体より高くまで、そして最も好ましくは、９９重量％より高くまで；２）スピニングカップシーケンテイター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎｔａｔｏｒ）の使用によりＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度；または３）クマシーブルー染色または、好ましくは銀染色を使用する還元条件または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同種性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）まで。
（抗原、結合実体および抗体の改変体および誘導体）
本発明はまた、本明細書中で同定された抗原性エピトープ、結合実体および抗体セグメントの改変体および誘導体を提供する。例えば、配列番号３、４、５または６の抗原性エピトープの任意の誘導体または改変体は、本発明の範囲内である場合、特にこの改変体または誘導体が、腺癌を予防または処置するためのワクチンとしての特性を保持するか、もしくは改善された特異性を有するか、あるいは腺癌を検出するための改善されたマーカーである場合に、企図される。同様に、配列番号７〜３５の抗体ポリペプチドの任意の誘導体または改変体は、特に、この改変体または誘導体抗体ポリペプチドが、本発明の抗原性エピトープ（例えば、配列番号３、４、５または６を有する抗原性エピトープ）に対して改善された特異性または結合親和性を有する場合、本発明により企図される。
本発明の誘導体および改変体の抗原性エピトープおよび抗体セグメントは、参照抗原性エピトープおよび抗体セグメントのＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失または付加により；この参照抗原性エピトープおよび抗体セグメント内の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失または付加により；あるいは参照抗原性エピトープおよび抗体セグメント内の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換により、この参照抗原性エピトープおよび抗体セグメントから誘導される。従って、本発明の抗原性エピトープおよび抗体セグメントは、アミノ酸の置換、欠失、短縮、および挿入を含む種々の様式で変更され得る。
このような改変体および誘導体抗原性エピトープおよび抗体セグメントは、例えば、人の操作から生じ得る。例えば、上記のファージディスプレイを使用する親和性成熟技術を使用して、本発明の抗原性エピトープおよび抗体セグメントの両方の改変体および誘導体を生成し得る。ポリペプチドの配列を変異するかまたは変更するための他の方法は、当該分野において一般的に利用可能である。例えば、抗原性エピトープおよび抗体セグメントのアミノ酸配列改変体は、これらの抗原性エピトープおよび抗体セグメントをコードするＤＮＡにおける変異により調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法もまた当該分野で利用可能である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７）；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）ならびにこれらに引用される参考文献を参照のこと。目的のペプチドの構造的完全性および／または生物学的活性に不利に影響しない、適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｄ．（１９７８）（本明細書中に参考として援用される）のモデルに見出され得る。
本発明の抗原性エピトープおよび抗体セグメントの誘導体および改変体は、配列番号３〜３５のいずれか１つのアミノ酸位置の少なくとも約９０％、９１％、９１％、９３％または９４％との同一性を有し、そして一般的には配列番号３〜３５のいずれか１つを有する抗原性エピトープおよび抗体セグメントの免疫学的特性に対して、同様かまたは改善された免疫学的特性を有する。所望の実施形態において、抗原性エピトープおよび抗体セグメントの誘導体および改変体は、配列番号３〜３５のいずれか１つのアミノ酸位置の少なくとも約９５％または９６％との同一性を有し、そして一般的には、配列番号３〜３５を有する抗原性エピトープおよび抗体セグメントと同様かまたはより良好な免疫学的特性を有する。より所望の実施形態において、抗原性エピトープおよび抗体セグメントの誘導体および改変体は、配列番号３〜３５のいずれか１つのアミノ酸位置の少なくとも約９７％または９８％との同一性を有し、そして一般的に、配列番号３〜３５を有する抗原性エピトープおよび抗体セグメントの免疫学的特性と比較して同様かまたは改善された免疫学的特性を有する。
「同様かまたは改善された免疫学的特性」により、配列番号３、４、５または６の抗原性エピトープの誘導体または改変体が、腺癌を予防または処置するためのワクチンとしての活性を保持するか、または改善された活性を有するか、あるいは、腺癌を検出するための改善されたマーカーであることを意味する。同様に、配列番号７〜３５の抗体ポリペプチドの誘導体または改変体は、それらが本発明の抗原性エピトープ（例えば、配列番号３、４、５または６を有する抗原性エピトープ）に対して改善された特異性または結合親和性を有する場合、「同様かまたは改善された免疫学的特性」を有する。
抗原性エピトープ、結合実体および抗体セグメントのアミノ酸残基、ならびにその誘導体および改変体のアミノ酸残基は、遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、天然に存在し遺伝的にコードされないＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸または上記のいずれかのＤ−エナンチオマーであり得る。２０種の遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸および一般的な非コードアミノ酸について本明細書中で使用されるアミノ酸の表記は、従来のものであり、表１に示されるとおりである。
Figure 2005523888
Figure 2005523888
本発明の範囲内に含まれる、本抗原性エピトープの改変体および抗体セグメントの改変体は、これらの改変体ペプチドの骨格部分が、配列番号３〜３５のいずれか１つを有する抗原性エピトープおよび抗体セグメントに対して類似または改善された免疫学的特性を有する限り、類似の化学特性および／または物理特性のアミノ酸との１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。誘導体の抗原性エピトープおよび抗体セグメントは、これらの誘導体の抗原性エピトープおよび抗体セグメントが、配列番号３〜３５のいずれか１つを有する抗原性エピトープおよび抗体セグメントに対して類似のまたは改善された免疫学的特性を有する限り、異なる化学的特性および／または物理的特性を有するアミノ酸で置換された１つ以上のアミノ酸に加えて、付加的なペプチドまたは化学的部分を有し得る。
本発明の改変抗原性エピトープおよび抗体セグメントを形成するために互いに置換可能であるアミノ酸は、一般的に、類似のクラスまたはサブクラスの中にある。当業者に公知であるように、アミノ酸は、アミノ酸側鎖の特性に主に依存して、３つの主要クラス：親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、およびシステイン様アミノ酸中に配置される。これらの主要クラスは、さらにサブクラスに分けられ得る。親水性アミノ酸は、酸性側鎖、塩基性側鎖または極性側鎖を有するアミノ酸を含み、そして疎水性アミノ酸は、芳香族の側鎖または無極性の側鎖を有するアミノ酸を含む。無極性アミノ酸は、さらに細分割され、例えば、脂肪族アミノ酸が挙げられる。本明細書で使用される場合、アミノ酸のクラスの定義は、以下の通りである：
「疎水性アミノ酸」は、生理的ｐＨで帯電しておらず、かつ水溶液によって反発される側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸の例としては、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌが挙げられる。遺伝的にコードされない疎水性アミノ酸の例としては、ｔ−ＢｕＡが挙げられる。
「芳香族アミノ酸」は、結合したπ−電子系を有する少なくとも１つの環（芳香族基）を含む側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。芳香族基は、他と同じように、置換基（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル基、スルホニル基、ニトロ基およびアミノ基）でさらに置換され得る。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。一般に遭遇される遺伝的にコードされない芳香族アミノ酸の例としては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
「無極性アミノ酸」は、一般に、生理的ｐＨで帯電しておらず、かつ極性でない側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされた無極性アミノ酸の例としては、グリシン、プロリンおよびメチオニンが挙げられる。コードされない無極性アミノ酸の例としては、Ｃｈａが挙げられる。
「脂肪族アミノ酸」は、飽和または不飽和の直鎖、分枝もしくは環状の炭化水素側鎖を有する無極性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸の例としては、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅが挙げられる。コードされない脂肪族アミノ酸の例としては、Ｎｌｅが挙げられる。
「親水性アミノ酸」は、水溶液によって誘引される側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされた親水性アミノ酸の例としては、ＳｅｒおよびＬｙｓが挙げられる。コードされない親水性アミノ酸の例としては、ＣｉｔおよびｈＣｙｓが挙げられる。
「酸性アミノ酸」は、ｐＫ値が７未満の側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。典型的には、酸性アミノ酸は、水素イオンを欠失しているために、生理的ｐＨで負に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸の例としては、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）（アスパルテート（ａｓｐａｒｔａｔｅ））およびグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）（グルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ））が挙げられる。
「塩基性アミノ酸」は、ｐＫ値が７より大きい側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。典型的には、塩基性アミノ酸は、ヒドロニウムイオンが付加されているために、生理的ｐＨで正に帯電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。遺伝的にコードされない塩基性アミノ酸の例としては、非環状アミノ酸のオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが挙げられる。
「極性アミノ酸」は、生理的ｐＨで帯電していないが、通常は２つの原子によって共有される電子対が、それらの原子の一方によってより密に保持されている結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされた極性アミノ酸の例としては、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。遺伝的にコードされない極性アミノ酸の例としては、シトルリン、Ｎ−アセチルリジンおよびメチオニンスルホキシドが挙げられる。
「システイン様アミノ酸」は、別のアミノ酸残基の側鎖と共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成することができる側鎖を有するアミノ酸をいう。代表的に、システイン様アミノ酸は、一般的に、少なくとも１つのチオール（ＳＨ）基を含む側鎖を有する。遺伝的にコードされたシステイン様アミノ酸の例としては、システインが挙げられる。遺伝的にコードされないシステイン様アミノ酸の例としては、ホモシステインおよびペニシラミンが挙げられる。
当業者によって理解されるように、上記の分類は、絶対的なものではない。いくつかのアミノ酸は、１を超える特徴的な特性を示し、従って、１を超えるカテゴリの中に含まれ得る。例えば、チロシンは、芳香族環および極性ヒドロキシル基の両方を有する。従って、チロシンは二重の特性を有し、芳香族カテゴリおよび極性カテゴリの両方に含まれ得る。同様に、ジスルフィド結合を形成できることに加えて、システインはまた、無極性の特徴も有する。従って、疎水性アミノ酸または無極性アミノ酸として厳密に分類されない一方、多くの例において、システインは、ポリペプチドに疎水性を与えるために使用され得る。
遺伝的にコードされず、そして本発明の改変体ポリペプチドにおいて存在し得るか、またはアミノ酸に代わって置換され得る、特定の一般に遭遇されるアミノ酸としては、β−アラニン（ｂ−Ａｌａ）および、３−アミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸などの他のω−アミノ酸；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロへキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアミノ酸もまた、上記で規定したカテゴリに分類される。
上記に記載の遺伝的にコードされたアミノ酸およびコードされないアミノ酸の分類を、以下の表２にまとめる。表２は、例証的な目的のみであり、そして本明細書中に記載の改変体および誘導体の抗原性エピトープおよび抗体セグメントを構成し得るアミノ酸残基の網羅的なリストとすることを意図しない。本明細書中に記載の改変体および誘導体のポリペプチドを作製するのに有用な他のアミノ酸残基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．およびその中に引用される参考文献で見出され得る。本明細書中で具体的に言及していないアミノ酸は、具体的に同定したアミノ酸と比較して公知の性質および／またはそれらの特徴的な化学的特性および／または物理的特性に基づいて、上記のカテゴリに好都合に分類され得る。
Figure 2005523888
 本発明の抗原性エピトープおよび抗体セグメントは、改変体抗原性エピトープまたは改変体抗体セグメントを作製するために、その改変体が、配列番号３〜３５のいずれか１つを有する抗原性エピトープまたは抗体セグメントに対して類似または改善された免疫学的特性を有する限り、任意のアミノ酸が任意の同様に分類されたアミノ酸によって置換されており得る。
従って、本発明はまた、本発明に従って単離された可変軽鎖または重鎖ＣＤＲフラグメントに関連した結合ドメインを有する結合実体および抗体に関する。例えば、可変軽鎖ＣＤＲ１フラグメントは、以下のように並べられ得る：
ＲＡＳＱＳ Ｖ−ＳＳＳ −−−−Ｙ ＬＡ（配列番号１５）
ＫＳＳＱＳ ＬＬＹＳＳ ＮＮＫＮＹ ＬＡ（配列番号２７）
関連した可変軽鎖ＣＤＲ１フラグメントおよび結合実体は、以下の式（配列番号４７）である。
Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７
ここで、
Ｘａａ１１は、塩基性アミノ酸であり；
Ｘａａ１２は、脂肪族アミノ酸または極性アミノ酸であり；
Ｘａａ１３、Ｘａａ１５、Ｘａａ１９およびＸａａ２０は別々に、各々がセリンであり；
Ｘａａ１４は、グルタミンであり；
Ｘａａ１６、Ｘａａ２６およびＸａａ２７は別々に、各々が脂肪族アミノ酸であり；
Ｘａａ１７は、脂肪族アミノ酸であるか、またはアミノ酸が存在せず；
Ｘａａ１８およびＸａａ２５は別々に、各々が極性アミノ酸であり；
Ｘａａ２１、Ｘａａ２２およびＸａａ２４は別々に、各々が極性アミノ酸であるか、またはアミノ酸が存在せず；
そして、Ｘａａ２３は、塩基性アミノ酸であるか、またはアミノ酸が存在しない。
いくつかの実施形態において、Ｘａａ２１、Ｘａａ２２およびＸａａ２４は、アスパラギンであるか、またはアミノ酸が存在しない。他の実施形態において、Ｘａａ２５はチロシンである。
可変軽鎖ＣＤＲ２フラグメントは、以下のように並べられ得る：
ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号１７）、
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２２）および
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号２９）。
関連する可変軽鎖ＣＤＲ２フラグメントおよび結合実体は、以下の式（配列番号４８）である。
Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
ここで、
Ｘａａ３１は、酸性アミノ酸、無極性アミノ酸または芳香族アミノ酸であり；
Ｘａａ３２は、アラニンであり；
Ｘａａ３３は、セリンであり；
Ｘａａ３４およびＸａａ３７は別々に、各々が極性アミノ酸であり；
Ｘａａ３５は、塩基性アミノ酸であり；そして
Ｘａａ３６は、酸性アミノ酸または脂肪族アミノ酸である。
可変軽鎖ＣＤＲ３フラグメントは、以下のように並べられ得る：
ＱＱＹＧＮＳＰＰＹＴ（配列番号２４）および
ＱＱＹＹＳＴＰＰＭ （配列番号３２）。
関連する可変軽鎖ＣＤＲ３フラグメントおよび結合実体は、以下の式（配列番号４９）である。
Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５−Ｘａａ４６−Ｘａａ４７−Ｘａａ４８−Ｘａａ４９−Ｘａａ５０
ここで、
Ｘａａ４１およびＸａａ４２は別々に、各々がグルタミンであり；
Ｘａａ４３は、チロシンであり；
Ｘａａ４４およびＸａａ４９は別々に、各々が無極性アミノ酸、極性アミノ酸または芳香族アミノ酸であり；
Ｘａａ４５およびＸａａ４６は別々に、各々が極性アミノ酸であり；
Ｘａａ４７およびＸａａ４８は別々に、各々がプロリンであり；そして
Ｘａａ５０は、極性アミノ酸であるか、またはアミノ酸が存在しない。
（癌関連エピトープの検出）
本発明はまた、生物学的試験サンプルにおける本発明の癌関連エピトープの検出方法を提供する。当業者に公知の任意の免疫アッセイまたはインビボ画像化の手順が、生物学的試験サンプルにおける本発明の癌関連エピトープを検出するために使用され得る。例えば、本発明の癌関連エピトープは、免疫化学的、免疫組織学的、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、核磁気共鳴、磁気共鳴画像化、表面プラスモン共鳴および関連した手順によって検出され得る。
このような方法は、試験サンプルを本発明の癌関連エピトープに結合し得る抗体または結合実体と接触させる工程、および当該抗体または結合実体が当該サンプルの成分に結合するか否かを決定する工程を包含し得る。これらの方法はまた、癌を有する疑いのある患者から生物学的サンプル（例えば、細胞、血液、血漿、組織など）を得る工程、当該サンプルを本発明の癌関連エピトープに特異的である標識化された抗体または標識化された結合実体と接触させる工程、ならびに標準的な免疫アッセイおよび／または診断画像化技術を用いて当該エピトープを検出する工程を包含し得る。生物学的サンプルへの抗体または結合実体の結合は、サンプルがエピトープを含むことを示す。
別の実施形態では、癌関連エピトープは、癌を有する哺乳動物の血液、血清、または組織中の抗体を検出するために使用され得る。このような抗体は、癌関連エピトープが悪性形質転換の間に露出される場合に哺乳動物内で天然に生じ得る。
従って、本発明は、試験サンプルを本発明の癌関連エピトープと接触させ、そして当該試験サンプル由来の抗体がこの癌関連エピトープに結合したか否かを検出することにより、哺乳動物中の癌を検出する方法を提供する。
本発明の癌関連エピトープおよび／または本発明の癌関連エピトープを含むポリペプチドと反応性である抗体または結合実体は、標識され得るか、または癌の好都合な検出のための診断造影剤にカップリングされ得る。
用語「標識」および診断造影剤は、抗体または抗原またはエピトープに直接または間接的に結合体化される検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体検出可能であり得るか（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
このような標識または診断造影剤は、癌関連エピトープを発現する細胞および組織の画像化のために有用である。このような標識はまた、標準的な免疫アッセイにおいて、本発明の癌関連エピトープと共に使用され得る。標識および診断造影剤としては、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、ヨーパン酸、イポダートカルシウム、ジアトリゾエートナトリウム、ジアトリゾエートメグルミン（ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ）、メトリザマイド、チロパノエートナトリウム、および放射性診断剤（陽電子放出剤（例えば、フッ素−１８および炭素−１１）、γ放出剤（例えば、ヨウ素−１２３、テクニチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１、およびインジウム−１１１）、核磁気共鳴のための核種（例えば、フッ素およびガドリニウム）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
インビボ診断の目的のための常磁性同位体が、本発明の方法に従って使用され得る。磁気共鳴画像化に有用な元素の多数の例がある。インビボでの核磁気共鳴画像化に関する考察のために、例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒら、（１９８９）ＪＡＣＣ １４、４７２−４８０；Ｓｈｒｅｖｅら、（１９８６）Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．３，３３６−３４０；Ｗｏｌｆ，Ｇ．Ｌ．，（１９８４）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．ＮＭＲ １６，９３−９５；Ｗｅｓｂｅｙら、（１９８４）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．ＮＭＲ １６，１４５−１５５；Ｒｕｎｇｅら、（１９８４）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．１９，４０８−４１５を参照のこと。適切な蛍光標識の例としては、フルオレセイン標識、イソチオシアレート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、オフタルアルデヒド標識、フルオレサミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）標識などが挙げられる。化学発光標識の例としては、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、アエクリン標識などが挙げられる。当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切な標識について認識している。
抗体またはそれらのフラグメントへのこれらの標識の付着は、当業者に一般的に知られる標準的な技術を用いて達成され得る。代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら、（１９７６）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０，１−３１；およびＳｃｈｕｒｓら、（１９７７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１，１−４０によって記載される。後者で言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、ヨウ化法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル法である。これらの方法は、全て、本明細書中に参考として援用される。
固相または固体支持体が、本発明の抗体、結合実体、抗原またはエピトープと共に使用され得る。このような固相または固体支持体は、抗体、結合実体、抗原またはエピトープが担持し得る非水性のマトリクスをいう。本明細書中に包含される固相および支持体の例は、ガラス（例えば、制御孔ガラス）、ポリサッカリド（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンで部分的または全体的に形成されたものが挙げられる。特定の実施形態では、含有物に依存して、固相または支持体は、アッセイプレートのウェルを含み得る；他では、それは、精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、個別の複数の粒子でなる不連続な固相を包含する（例えば、
1088747764046_0
号に記載される）。
（治療）
本発明に従って、本発明の抗原性エピトープ、このようなエピトープに対して指向される抗体または結合実体、および本発明のエピトープの形成を阻害するプロテアーゼインヒビターが、癌防止および／または治療のために使用され得る。本発明の抗原性エピトープは、癌関連エピトープを有する細胞に対して指向される、哺乳動物における免疫学的応答を刺激するために、ワクチンとして使用され得る。本発明の抗原性エピトープに対して指向される抗体または結合実体は、腺癌と戦い得るか、または防ぎ得る。さらに、本発明は腺癌を防止または処置するために、サイトケラチン８および／またはサイトケラチン１８の切断を阻害するプロテアーゼインヒビターを投与することを意図する。
１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物において腺癌を防止または処置する方法であって、その哺乳動物に、配列番号３〜６のいずれか１つを含む抗原性エピトープを、その抗原性エピトープに対する免疫学的応答を刺激するに十分な量で投与することによる、方法を提供する。配列番号３〜６を含む２つ以上のポリペプチドが、治療組成物中で組み合わされ得、そして哺乳動物の免疫学的応答を最適化する期間にわたって、数用量で、投与され得る。このような免疫学的応答は、本発明のエピトープに対して指向される抗体が哺乳動物の血流中に存在するか否かを観察することによって、検出およびモニタリングされ得る。
本発明の癌関連エピトープと選択的に反応する、本明細書中で提供されるように生成された抗体および結合実体もまた、癌治療のために使用され得る。従って、本発明は、哺乳動物において腺癌を防止または処置する方法であって、その哺乳動物に、配列番号３〜６のいずれか１つを含む抗原性エピトープを結合し得る治療有効量の抗体または結合実体を投与することによる、方法を提供する。
このような抗体または結合実体は、単独で使用され得るか、または治療的に有用な薬剤にカップリングされ得るか、またはこれと組み合わされ得る。抗体および／または結合実体は、本発明の癌関連エピトープを提示する任意の癌に罹患した哺乳動物に投与され得る。このような投与は、治療的処置、および予防的または防止的手段の両方を提供し得る。例えば、本発明の治療方法は、癌の蔓延を阻止し、そしてその寛解に至らせるために使用され得る。
本明細書中で使用される場合、「治療的に有用な薬剤」とは、本明細書中で開示される癌エピトープを発現する細胞に有利に標的化され得る任意の治療分子を包含し、このような薬剤としては、抗新生物剤、放射ヨウ素標識化合物、毒素、化学療法剤、細胞増殖抑制薬もしくは細胞溶解薬が挙げられる。
このような治療的に有用な薬剤としては、例えば、アドリアマイシン（ａｄｒｉｍｙｃｉｎ）、アミノグルテチミド、アミノプテリン、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン（ｂｕｌｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｄｉｎｅ）、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、サイトキシンダカルバジン（ｃｙｔｏｘｉｎ ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、エトポシド、フルオロウラシル、イフォスファミド、インターフェロン−α、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトザントロン、プロカルバジンＨＣｌ、タキソール、タキソテル（ｔａｘｏｔｅｒｅ）（ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ））、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられる。さらなる薬剤としては、Ｃｈａｐｔｅｒ ５２， Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ Ａ． Ｃｈａｂｎｅｒ）およびそれに対する導入部、ｐｐ．１２０２−１２６３， Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，第８版、１９９０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）に開示されたものが挙げられる。毒素は、例えば、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アブリン、ジフテリア外毒素、もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素のようなタンパク質であり得る。毒素部分はまた、高エネルギー放出放射性核種（例えば、コバルト−６０、Ｉ−１３１、Ｉ−１２５、Ｙ−９０およびＲｅ−１８６）および細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素またはそれらのフラグメントでもあり得る。
本発明に従って、このような化学療法剤は、本発明の腫瘍関連エピトープを発現する癌細胞および腫瘍の増殖または広がりを減少するために使用され得る。本発明の化学療法剤により処置され得る動物としては、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類などが挙げられる。全ての実施形態において、ヒト腫瘍抗原およびヒト被験体が好ましい。
本発明はまた、本発明の治療方法において使用するための種依存性抗体の使用を意図する。このような種依存性抗体は、選択された種と実質的に免疫学的に反応しない定常領域を有する。このような種依存性抗体は、これが、免疫学的反応を実質的に生じない限り、治療のために特に有用である。種依存性抗体は、上記の抗体の種々のタイプのいずれかであり得るが、好ましくは、哺乳動物の抗体であり、そしてより好ましくは、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
治療的に有用な薬剤は、本発明の抗体と共に組成物中に処方され得、それは、本発明の抗体に直接的に付着される必要はない。しかし、いくつかの実施形態では、治療的に有用な薬剤は、当業者に利用可能な方法（例えば、標準的なカップリング技術）を用いて、本発明の抗体に付着され得る。
本発明はさらに、哺乳動物において腺癌を防止または処置する方法であって、この哺乳動物に、配列番号３〜６のいずれかを含む抗原性エピトープの形成を防止する治療有効量のプロテアーゼインヒビターを投与することによる、方法を提供する。本発明に従って、サイトケラチンＫ８におけるアミノ酸２２および４０ならびにサイトケラチンＫ１８におけるアミノ酸５０でのプロテアーゼ切断の部位は、全て、コンセンサス配列Ｘａａ１ＳＲ↓Ｘａａ４（配列番号４０）（ここでＸａａ１はセリン、フェニルアラニン、またはバリンであり、そしてＸａａ４はセリンまたはバリンである）を含んだ。これらの切断部位の構造は、これらの切断を担う酵素がトリプシン様プロテアーゼであることを示す。トリプシンインヒビターは、当業者に入手可能である。例えば、米国特許第６，２３９，１０６号；米国特許第６，１５９，９３８号；米国特許第５，９６２，２６６号を参照のこと。このようなトリプシンインヒビターとしては、カリクレイン、キモトリプシンＡおよびＢ、トリプシン、エラスターゼ、サブチリシン、凝固剤およびプロ凝固剤（特に、活性形態のもの、凝固因子（例えば、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、および第ＸＩＩａ因子、プラスミン、トロンビン）を含む）；プロテイナーゼ−３、エンテロキナーゼ、アクロシン、カテプシン、ウロキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベーターのようなセリンプロテアーゼについて有用なプロテアーゼが挙げられる。
本発明に従って、Ｘａａ１ＳＲ↓Ｘａａ４（配列番号４０）を切断し得るプロテアーゼを阻害可能な任意のインヒビターが使用され、腺癌を阻害し得るか、または処置し得る。例えば、Ｘａａ１ＳＲ↓Ｘａａ４（配列番号４０）に相同性を有するが、切断され得ないペプチドは、本治療方法において、インヒビターとして使用され得る。使用され得るインヒビターの他の例としては、例えば、ダイズトリプシンインヒビター（すなわち、ＳＴＩ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）、α−２−マクログロブリン、α−１−抗トリプシン、アプロチニン、膵臓分泌トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ）、トウモロコシおよびカボチャトリプシンインヒビター（Ｗｅｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．＆ Ｐｕｒｉｆ．４：２１５（１９９３）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３６：３８５（１９９４））などが挙げられる。ヒト起源の有用なインヒビターに関する１つの候補は、ヒトアミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰＩ）（プロテアーゼｎｅｘｉｎ−２としても知られる）の循環アイソフォームにおいて見出される。ＡＰＰＩは、ＫＰＩ（Ｋｕｎｉｔｚプロテアーゼインヒビター）として公知のＫｕｎｉｔｚセリンプロテアーゼインヒビタードメインを含む。Ｐｏｎｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５２５（１９８８）；Ｔａｎｚｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２８（１９８８）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３：１２４８（１９８９）；Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１４４（１９８９）を参照のこと。ヒトＫＰＩは、アプロチニンと約４５％のアミノ酸配列同一性を共有する。単離されたＫＰＩドメインは、様々なシステムにおける組換え発現によって調製され、そして活性セリンプロテアーゼインヒビターであることが示された。例えば、Ｓｉｎｈａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８９８３（１９９０）を参照のこと。
腺癌の進行および／または化学療法の治療効力は、当該分野で利用可能な手順を使用して測定され得る。例えば、特定の化学療法剤の効力は、細胞死を起こしている腺癌細胞から放出された癌関連エピトープの量を測定することで決定され得る。細胞から放出された抗原性エピトープ（例えば、配列番号３〜６のいずれか１つを有するポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの組み合わせ）の濃度は、健康で、処置を受けていない患者からの基準と比較され、本エピトープの強められたレベルが、患者に存在するか否かを評価され得る。流体サンプルは、処置の間の別々の間隔で回収され得、そして基準と比較され得る。本発明の癌関連抗原性エピトープのレベルにおける変化が、処置の効力（すなわち、癌細胞死の割合）を示すということが企図される。癌関連抗原性エピトープの放出が、多くの試験サンプル（血液、血漿、血清、糞便、尿、痰、膣分泌液、精漿、精液および任意の組織サンプルが挙げられる）において測定され得ることが企図される。
アッセイを使用し、組織生存可能性または腺癌の進行をモニタリングする場合、目的のサンプル中の抗原性エピトープの存在または存在量を検出する工程が、間を置いて反復され、次いで、これらの値が比較され、この検出された濃度における変化が、組織の状態における変化を反映する。例えば、腺癌関連エピトープのレベルにおける増加は、腺癌の進行と相関し得る。アッセイを使用して、治療の効力を評価する場合、モニタリングする工程は、治療薬または治療手順の投与後（例えば、化学療法剤の投与後または放射線処置後）に起こる。同様に、本発明の腺癌相関エピトープのレベルにおける減少は、腺癌の後退と関連し得る。
従って、腺癌は、本明細書中に提供されるような癌関連抗原性エピトープの存在により同定され得る。一度同定されると、腺癌は、抗体およびサイトケラチン８およびサイトケラチン１８の切断を減少するプロテアーゼインヒビターを用いて処置され得る。さらに、本明細書中に提供される方法は、疾患の進行および／または疾患の処置をモニタリングするために使用され得る。
（組成物）
本発明はさらに、本抗体、結合実体、抗原性エピトープまたはトリプシン様プロテアーゼインヒビターを含む組成物に関連する。このような組成物は、本発明の抗原性エピトープの検出、ならびに本発明の抗原性エピトープの存在と関連する、癌の予防および処置を包含する治療方法に有用である。
本発明の抗体、結合実体、抗原性エピトープおよびプロテアーゼインヒビターは、薬学的組成物として処方され得、そして哺乳動物宿主（例えば、ヒトの患者）に、選択された投与経路に適応する様々な形態で、投与され得る。投与の経路としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内および当業者により選択された他の経路が挙げられる。
本発明の抗体、結合実体、抗原性エピトープおよびプロテアーゼインヒビターの溶液は、水または生理食塩水中で調製され得、そして必要に応じて無毒性界面活性剤と混合され得る。静脈内投与または動脈内投与の処方物としては、緩衝液、リポゾーム、希釈剤および他の適切な添加剤をまた含有し得る滅菌水溶液が挙げられる。
注射または注入に適した薬学的投薬形態としては、リポソーム内のカプセル化による投与に適した、活性成分を含む滅菌水溶液または分散物が挙げられ得る。全ての場合において、最終的な投薬形態は、滅菌され、流体でありかつ製造および保存の条件下で安定であるべきである。
滅菌注射溶液は、抗体、結合実体、抗原性エピトープおよびプロテアーゼインヒビターを、所望の量で、上に列挙された様々な他の成分（必要な場合、フィルター滅菌後）を有する適切な溶媒中に、取りこむことにより調製される。
抗体、結合実体、抗原性エピトープおよびプロテアーゼインヒビターの有用投薬量は、それらのインビトロ活性、および動物モデル中のインビボ活性を観察することにより決定され得る。マウスおよび他の動物、ヒトに対する有効投薬量の推定方法は当該分野に公知である；例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照のこと。
一般的に、抗体、結合実体、抗原性エピトープおよびプロテアーゼインヒビターの適切な用量は、約１〜約２０００μｇ／ｋｇ、例えば、１回の処置につき、体重の１ｋｇあたり約２．０〜約１５００μｇ／ｋｇの範囲である。好ましい用量は、１回の処置につき、レシピエントの体重１ｋｇあたり、約３〜約５００μｇの範囲であり、より好ましくは、１回の処置あたり約１０〜約３００μｇ／ｋｇの範囲であり、最も好ましくは、１回の処置あたり約２０〜約２００μｇ／ｋｇの範囲である。
抗体、結合実体、抗原性エピトープおよびプロテアーゼインヒビターは、単位投薬形態（例えば、単位投薬形態あたり、５〜１０００μｇ、簡便には１０〜７５０μｇ、最も簡便には、５０〜５００μｇの活性成分を含む）で簡便に投与される。
理想的には、抗体、結合実体、抗原性エピトープおよびプロテアーゼインヒビターは、約０．１〜約１０ｎＭ、好ましくは約０．２〜約１０ｎＭ、最も好ましくは約０．５〜約５ｎＭのピーク血漿濃度を達成するように、投与され得るべきである。これは、例えば、抗体（必要に応じて、生理食塩水中の）の０．０５〜２５％溶液の静脈内注射により達成され得る。所望の血液レベルは、約０．０１〜１０．０μｇ／ｋｇ／ｈｒを提供するための持続的な注入によるか、約０．４〜５０μｇ／ｋｇの抗体を含む断続的な注入により維持され得る。
所望の用量は、単一用量で、または適切な間隔で投与された、分配された用量として（例えば、１日あたりの２、３、４またはそれ以上のサブ用量として）、簡便に示され得る。サブ用量自体、例えば、いくつか別々に大まかに分配された投与（例えば、複数の静脈内投薬）に、さらに分配され得る。例えば、本組成物を、延長された期間中、持続的な注入によるか、または分けた投薬のいずれかで静脈内に投与することが望ましい。
（キット）
本発明は、本発明の抗原性エピトープの検出および腺癌処置のためのキットをさらに提供する。
本発明の抗原性エピトープの検出のためのキットは、本発明の抗原性エピトープに結合可能である抗体または結合実体を含む容器を含み得る。このような抗体または結合実体は、容易な検出のために標識され得る。個々のキットは、本発明の１つ以上の方法を実施するために適合され得る。
必要に応じ、対象のキットは、このキットを実施に適応させる方法を実施するために必要とされる、少なくとも１つの他の試薬をさらに含み得る。このようなさらなる試薬の例としては、以下が挙げられる；標識、基準、コントロール、緩衝液、試験サンプルを希釈するための溶液、または標識の検出を促進する試薬。本発明のキットに含まれる試薬は、より大きな精度および正確度を提供するため、予め測定された単位で供給され得る。代表的に、キット試薬および他の成分は、別の容器に配置され、そして含まれ得る。反応容器、試験管、マイクロウェルトレイ、マイクロタイターディッシュまたは他のコンテナがまた、キットに含まれ得る。各試薬を別の試薬から区別し得るように、異なる標識が異なる試薬について使用され得る。
本発明のさらなる局面は、腺癌治療のための、本発明の薬学的組成物および教材（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）を含むキットに関連する。このようなキットは、本発明の抗原性エピトープ、抗体、結合実体またはインヒビターを有する容器を含み得る。抗原性エピトープは、転移性腺癌の形成を妨げるためのワクチンとして働き得る。抗体または結合実体は、本発明の抗原性エピトープに対して指向され、そして腺癌の蔓延を処置または阻害するために投与され得る。サイトケラチン８またはサイトケラチン１８切断のインヒビターはまた、腺癌の形成および蔓延を阻害し得る。これらの抗原性エピトープ、抗体、結合実体またはインヒビターのいずれか１つは、キットの適切な容器内に含まれ得る。あるいは、抗原性エピトープ、抗体、結合実体またはインヒビターの組み合わせが、キットの適切な容器内に含まれ得る。
本明細書中で使用される場合、「教材」としては、出版物、記録、図表、または他の表現媒体が挙げられ、この表現媒体は、サイトケラチン８またはサイトケラチン１８の切断を阻害することに関し、あるいは哺乳動物または患者において、本発明のエピトープを認識するために免疫系を刺激することに関し、本発明の薬学的組成物の有用性を伝えるために使用される。教材はまた、例えば、本発明の薬学的組成物の適切な用量を記載し得る。本発明のキットの教材はまた、例えば、本発明の薬学的組成物を含む容器に添付され得るか、または薬学的組成物を含む容器と共に出荷される。あるいは、レシピエントによって教材および薬学的組成物が協同的に使用され得るという意図で、この教材は、容器と別々に出荷され得る。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含むキットおよび哺乳動物（例えば、腺癌を有し得るヒト患者）にこの組成物を送達するための送達デバイスを含む。一例として、送達デバイスは、絞ることが可能なスプレー缶、定量スプレー缶、エアロゾルスプレーデバイス、噴霧器、乾燥粉末送達デバイス、自力推進溶媒／粉末調剤デバイス、シリンジ、針、タンポン、または投薬量測定容器であり得る。
本発明は、以下の詳細な実施例の参照によりさらに記載され、この実施例は、本発明の説明のために示され、それらの制限を意図するものではない。
（実施例１：癌関連エピトープの特徴づけ）
（ＣＯＵ−１モノクローナル抗体の単離）
ＩｇＭ ＨＭａｂ、ＣＯＵ−１を、ハイブリドーマ細胞株Ｂ９１６５を用いて選択した。このハイブリドーマ細胞株Ｂ９１６５は、ヒトリンパ芽球腫細胞株ＷＩ−Ｌ２−７２９−ＨＦ２を結腸癌患者に由来する腸間膜リンパ節から得られたリンパ球と融合することにより誘導された（３５）。結腸直腸癌を有する患者において腫瘍領域から流れ出る腸間膜リンパ節を、滅菌条件下で刻んだ。細片を脱脂綿を用いたろ過により除去し、そしてリンパ球をＦｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ）で、遠心分離により精製した。
このリンパ球を、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ第ＩＩ巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８１，２８５−２９８頁に従って、ヒト融合細胞株Ｗ１−Ｌ２−７２９−ＨＦ２（ＨＦ２といわれる）（Ｔｅｃｎｉｃｌｏｎｅ Ｉｎｔ．，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから）と融合させた。ＨＦ２とリンパ球（１０７）との比は、１：２であった。
ＲＰＭＩ−１６４０培地中でＨＦ２およびリンパ球を一緒に洗浄し、そして遠心分離によって細胞を収集した後、細胞ペレットを、０．５ｍｌの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００中に、一定に振盪しながら、１分間にわたって再懸濁した。ＲＰＭＩ−１６４０を用いたＰＥＧの希釈前に、これらの細胞をさらに２分間インキュベートした。得られた融合産物を洗浄し、そして溶液培地［ＨＡＴ（２×１０−４Ｍヒポキサンチン、４×１０−７Ｍアミノプテリン、３．２×１０−６Ｍチミジン）を補充した、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）］中に再懸濁した。これらの細胞を、１ウェルあたり２×１０５細胞を含む２００μｌを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート中にプレーティングした。細胞を、選択培地中に２週間にわたって維持した。ヒポキサンチンおよびチミジンを補充した、１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で、さらなる培養を実施した。増殖するハイブリッドは、融合１０日後〜４週間後に出現した。クローニングを、フィーダー細胞を用いず、限界希釈によって実施した。
増殖するクローンを含む細胞からの上清を、０．１Ｍバイカーボネート（ｐＨ９．６）中に１０，０００：１希釈したウサギ抗ヒトＩｇ（Ｈ鎖およびＬ鎖）（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡによって免疫グロブリン産生について分析した。コーティングしたウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝化生理食塩水−−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１０：１希釈した上清とともに室温で２時間インキュベートした。発色を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に３０００：１希釈した、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＧに特異的なアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）を用いて実施した。室温にて１時間のインキュベーション後、基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、１ｍｇ／ｍｌ １０％ジエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ９．６を添加した。光学密度を、３７℃で１時間のインキュベーション後、４０５ｎｍにて測定した。定量のための標準曲線を、ＩｇＭ（Ｃａｐｐｅｌ）またはＩｇＧ（Ｋａｂｉ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）の希釈を用いて構築した。ＥＬＩＳＡによってアッセイされた免疫グロブリン（Ｉｇ）を産生するハイブリッドを、２４ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に移植することによって増殖させた。この方法によって選択されたハイブリドーマ細胞株Ｂ９１６５（ＥＣＡＣＣ ８７０４０２０１）は、以下に記載のＣＯＵ−１抗体を分泌し、そしてＥＬＩＳＡによって、培地を交換せずに２週間にわたって増殖させた場合に１ｍｌあたり１μｇと５μｇとの間のＩｇＭを産生することが示された。
ハイブリドーマ細胞株Ｂ９１６５を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），ＣＡＭＲ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＳＰ４ ＯＪＧ，ＵＫに受託番号ＥＣＡＣＣ ８７０４０２０１で寄託した。
ＣＯＵ−１ハイブリドーマ上清を、以下のように、腫瘍細胞との反応についての免疫細胞化学分析によって、または腫瘍組織との反応についての免疫組織化学的分析によって、さらに分析した。
（ＣＯＵ−１抗体の免疫細胞化学分析）
免疫細胞化学分析を、種々のヒト腫瘍細胞株から調製した細胞塗沫標本およびヒト末梢血白血球から調製した細胞塗沫標本について実施した。細胞を、ホルモル−アセトン（８６ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の９．５％ホルムアルデヒド、４３％アセトン）を用いた処理によってスライドに固定した。約５０μｌのＣＯＵ−１上清（ハイブリドーマＢ９１６５；ＥＣＡＣＣ ８７０４０２０１由来）を固定した細胞の塗沫標本上に配置し、そして加湿チャンバ中で４℃にて一晩インキュベートし、その後、リンスし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に８０：１希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）とともに室温にて１時間インキュベーションした。最後に、ペルオキシダーゼの基質（ＰＢＳ中０．０１％ Ｈ２Ｏ２および０．６μｇ／ｍｌのジアミノベンジジン）を添加した。これらの塗沫標本をヘマトキシリンで軽く対比染色し、そして載せた。表３は、種々の細胞の塗沫標本上のＣＯＵ−１の分析によって得られた結果を示す。
Figure 2005523888
 結腸腺癌および乳腺癌との選択的反応性は明らかであった。
生きたＣＯＬＯ ２０１細胞（結腸腺癌細胞）を、４℃にてＣＯＵ−１抗体と共にインキュベートし、続いて酵素標識した抗Ｉｇ抗体と共にインキュベートした。次いで、これらの細胞をスライド上に塗沫し、グルタルアルデヒド（ＰＢＳ中０．１７％）を用いて固定し、そして基質と共にインキュベートした。ＣＯＬＯ ２０１細胞はＣＯＵ−１で染まり、一方、コントロール細胞は染まらなかった（データは示さず）。
（免疫組織化学的分析）
予備的な免疫組織化学的分析を、アセトン中で固定した凍結組織切片について行った。内因性ＩｇＭを、抗μ鎖抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋから購入）のＦａｂ’フラグメントを用いたインキュベーションによってブロックし、その後、ＣＯＵ−１抗体（０．５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。抗μ鎖抗体Ｆａｂ’フラグメントを、Ｂ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６（１），１９８７，１０３−１０９頁に従って調製した。癌組織についての明確な特異性はＣＯＵ−１抗体を用いて観察されたが、いくつかの非特異的結合は、特定の組織型（例えば、乳房の細管）において観察された。
特定の組織型（乳房の小管および細管が挙げられる）との非特異的交叉反応性を実質的に除去する改善された固定手順を用いた。組織標本を、外科的切除を受けた結腸直腸癌患者から得た。正常結腸組織を、腫瘍部位から約１５ｃｍ離れた切除物（ｒｅｓｅｃｔａｔｅ）から採取した。組織を、９６％アルコール中で４℃にて６時間固定した。その後、組織をパラフィン包埋し、そして５μｍ切片に切断した。切片をキシロール中で脱パラフィン処理し、段階的なアルコールを通して再水和し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄した。切片を、全て０．５〜１０μｇ／ｍｌの、１００μｌのマウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体または正常ポリクローナルヒトＩｇＭとともに、加湿チャンバ中で室温にて２時間インキュベートした。これらのスライドを洗浄し、そして１０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中に希釈したＡＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ（Ｄａｋｏ）またはＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ）とともに室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰを、色素形成性基質（０．０１％ Ｈ２Ｏ２を含む１ｍｌのＰＢＳあたり０．６ｍｇジアミノベンジジン）および０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１Ｍレバミゾール（ｐＨ８．２）１ｍｌあたり０．２ｍｇナフトール−ＡＳ−Ｍｘホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ Ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇジメチルホルムアミドを含むＡＰを用いた発色によって可視化した。これらの切片を、Ｍａｙｅｒ’ヘマトキシリンを用いて対比染色し、キシレン中で脱水し、そしてＡｑｕａｍｏｕｎｔ（Ｇｕｒｒ，Ｐｏｏｌｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中に載せた。
結合した抗体を、免疫細胞化学分析について上記に記載したとおりに可視化した。結腸腺癌の切片中の腫瘍細胞のみが、ＣＯＵ−１で染色された。染色は扁桃（ｔｏｎｓｉｌｌａｒ）組織においては観察されなかった。表４Ａおよび表４Ｂは、種々の組織とのＣＯＵ−１抗体の反応性をまとめる。ここで、悪性組織の反応性を、表４Ａに提供し、そして非悪性組織の反応性が欠如していることをを表４Ｂに提供する。
Figure 2005523888
Figure 2005523888
 正常結腸上皮は、分析した全てのヒトＩｇＭ、モノクローナル抗体、骨髄腫ＩｇＭ、ならびに正常ポリクローナルヒトＩｇＭの結合を示した。従って、正常結腸上皮に対するＩｇＭのこの一般的結合は、非特異的であると判断された。
（実施例２：癌関連エピトープマッピング材料および方法）
（抗体）
ＩｇＭ ＨＭａｂ、ＣＯＵ−１は、上記のように、ヒトリンパ芽球腫細胞株ＷＩ−Ｌ２−７２９−ＨＦ２と、結腸癌患者由来の腸間膜リンパ節から得られたリンパ球とを融合させることによって誘導されたハイブリドーマ細胞株Ｂ９１６５によって分泌される。このハイブリドーマ細胞株Ｂ９１６５を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ＯＪＧ、ＵＫ寄託番号ＥＣＡＣＣ ８７０４０２０１で寄託した。ＥＣＡＣＣについてのさらなる情報は、ｅｃａｃｃ．ｏｒｇにウェブサイトにおいて得られ得る。
ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞株を、無タンパク質培地：ＳＳＲ３血清置換物（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）において増殖させた。ＨＭａｂ ＣＯＵ−１を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−結合マウス抗ヒトμ−鎖モノクローナル抗体（Ｍａｂ）（ＨＢ５７，ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製した。抗体を、０．１Ｍ ジエチルアミン（ｐＨ１０．５）で溶出し、続いて、ＦＰＬＣによって分画した。正常ヒト血清（Ｃａｐｐｅｌ，Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）から精製されたＩｇＭを、コントロールとして使用した。マウスＭａｂ、正常Ｋ８に対して指向するＭ２０および正常Ｋ１８に対して指向するＣＹ−９０を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡウェル（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）において、サイトケラチン精製手順からの画分を用いて、または異なる組換えＫ８／Ｋ１８複合体（５μｇ／ｍｌ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡで１時間、３７℃でブロックし、そしてＨＭａｂ ＣＯＵ−１抗体とともに２時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を用いて１０×洗浄し、そして結合した抗体を、ＰＢＳ中に１０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗ヒトκ鎖（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。結合した抗体を、パラ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）（１ｍｇ／ｍｌ １ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％（ｗ／ｖ）ジエタノールアミン、ｐＨ９．６）を用いて可視化し、４０５ｎｍで読んだ。
（細胞培養物）
ヒト乳房腺癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１００Ｕペニシリン／ｍｌ、１００ｍｇストレプトマイシン／ｍｌ、および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したイーグルＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において維持した。ヒト結腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏｎ１３７（Ｄｒ．Ｅｂｂｅｓｅｎ，Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄｅｎｍａｒｋによって親切にも提供された）を、上記のようなＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）において維持した。
（正常組織および悪性組織由来のサイトケラチンの精製）
サイトケラチンを、新鮮な外科的に除去された結腸癌組織または正常結腸上皮から調製した。組織サンプル（１〜５ｇ）を、剪断して細かく刻み、そして氷上で、２７．０００ｒｐｍで３×５秒間、ブレードローター（Ｅｕｒｏ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２０ｂ ｂａｓｉｃ，ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１％（ｖ／ｖ）Ｅｍｕｌｐｈｏｇｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を含む１０〜３０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ７．６）中でホモジナイズさせた。酵素インヒビター：１ｍｌ当たり、５ｍＭヨードアセトアミド、１０ｍＭ ＰＭＳＦ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（すべて、Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭ Ｃｙｃｌｏｃａｐｒｏｎ（ＫＡＢＩ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）、および１０Ｕ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（Ｂａｙｅｒ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ホモジナイゼーション、超音波処理およびイオン交換クロマトグラフィーの間、緩衝液中でインキュベートした。懸濁液を、４℃で１０分間、１０．０００ｇで遠心分離によってペレット化し、１％Ｅｍｕｌｐｈｏｈｇｅｎｅを含むＴＢＳ中で２回洗浄し、そして緩衝液Ａ（０．１％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および０．０５％ Ｅｍｕｌｐｈｏｇｅｎｅを含む１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．６）中に再懸濁させた。懸濁液を３×１５秒間、氷上で超音波処理し、４℃で１０分間、１２．０００ｇで遠心分離した。上清を、緩衝液Ａで予め平衡化された、アニオン交換カラム（２０ｍｌ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム、ＱＦＦ、（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））に適用した。１０カラム容量の緩衝液Ａを用いてカラムを洗浄した後に、結合タンパク質を、緩衝液Ａ中の１Ｍ ＮａＣｌに線形勾配で溶出した。１ｍｌの画分を収集し、そしてさらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによって分析した。ＥＬＩＳＡについて、１０μｌの各画分を、１００μｌ ＴＢＳ中のＳＭ２ビーズ（ＢｉｏＲａｄ）を含むウェルに添加し、続いて、上記のように、ＣＯＵ−１とともにインキュベートした。ビーズは、洗浄剤と結合し、従って、画分中のタンパク質の直接的なコーティングが可能になる。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析）
分析のための８ｃｍの４〜２０％または１０％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲル、およびＮ末端配列決定のための１５ｃｍの１４％ポリアクリルアミドゲルでの不連続緩衝系において、電気泳動を実施した（３６）。サンプルを、２×サンプル緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の４％ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）と混合し、５分間沸騰させ、そして変性および還元（１００ｍＭ ＤＴＴ）条件下で分離させた。タンパク質バンドを、クーマシーブリリアントブルーで可視化した。分離されたタンパク質をまた、移動緩衝液（１０％（ｖ／ｖ）エタノール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ グリシン）を使用して、氷において１時間１００ボルトで、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＰＶＤＦ，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上にエレクトロブロットした。移動の前に、膜を、エタノール中に２分間予め浸し、そして膜およびゲルを、１０分間、移動緩衝液中でインキュベートさせた。移動に続いて、膜を２時間、ウェスタンブロット緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＮａＮ３、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中でブロックし、ウェスタンブロット緩衝液で３回洗浄し、そしてＣＯＵ−１抗体（５μｇ／ｍｌ）、マウス抗Ｋ８抗体（１／２０００に希釈）、マウス抗Ｋ−１８抗体（１／２０００に希釈）、またはヤギ抗ＧＳＴ抗体（１／１０００に希釈、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ）とともに、室温で一晩、インキュベートした。膜をウェスタンブロット緩衝液で洗浄し、そしてＡＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（１／１０００に希釈、Ｓｉｇｍａ）、またはＡＰ結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体（１／５００に希釈、ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに、２時間室温でインキュベートした。ＰＢＳ中での３回の洗浄後、膜を１５分間、室温で、０．２％グルタルアルデヒドを用いて固定し、そして最終的に、ＰＢＳで洗浄した。結合したＡＰ結合体を、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって可視化した。ＭＣＦ７またはＣｏｌｏｎ １３７細胞（ＳＤＳサンプル緩衝液中に再懸濁し、そして超音波処理した）を、抗原コントロールとして使用した。低い範囲のタンパク質マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、フラグメントの分子量を示した。
（アミノ酸配列決定およびアミノ酸分析）
先に記載された手順（３７）を、アミノ酸配列決定およびアミノ酸分析に使用した。Ｎ末端配列決定のために、精製サイトケラチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、そしてクーマシーでの検出の前に、ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットした。ブロットから異なるバンドを切り出し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａタンパク質シーケンサー（ＡＢＩ，Ｆｏｒｓｔｅｒ，ＣＡ）において配列決定した。サイトケラチンに類似の配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＢＩ／ＤＤＢＩ／ＰＤＢデータベースにおいて検索した。
（組換えＫ８タンパク質およびＫ１８タンパク質の発現および精製）
Ｋ８タンパク質およびＫ１８タンパク質のパネルをコードするＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ保有プラスミドを分析した。パネルは、全長およびＫ８およびＫ１８のいくつかのＮ末端およびＣ末端欠失フラグメントからなり、ＧＳＴ融合タンパク質として、改変ｐＧＥＸ−２Ｔベクターにクローニングした（３８）。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、ＯＤ６００が０．６に達するまで、３７℃で、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０ｍｇカルベニシリン／ｍｌを補充したＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地で増殖させた。次いで、タンパク質発現を、１ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）および４μＭ ｃＡＭＰを用いて誘導し、そして培養物をさらに３時間、３０℃で増殖させた。細菌を４．０００ｇで１５分間４℃でペレット化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、ペレットをサンプル緩衝液中に再懸濁させ、そして電気泳動の前に５×１０秒間、超音波処理した。組換えＫ８またはＫ１８タンパク質の精製のために、上記のように増殖させ、そして処理した４００ｍｌ培養物のペレットを、１ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む５０ｍｌ溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、ｐＨ ８．０）中に再懸濁させ、そして３０分間、４℃でインキュベートさせた。懸濁液を３×２０秒間、超音波処理し、そして４℃で２０．０００ｇでペレット化させた。ペレットを２回、高塩緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％ ＮＰ４０、ｐＨ ８．０）中で２回洗浄し、溶解緩衝液において１回洗浄した。続いて、ペレットを、２Ｍ尿素を含む溶解緩衝液において２回洗浄し、そして８Ｍ尿素を含む溶解緩衝液において４℃で保存した。
（ヘテロタイプ会合アッセイ）
異なるＣ末端欠失もしくはＮ末端欠失またはインタクトなＫ８タンパク質およびＫ１８タンパク質のパネルを、上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＰＶＤＦ膜に移した。ブロッキング後、膜を、ＰＢＳ、２％ＢＳＡおよび４Ｍ尿素中の１００μｇ／ｍｌの精製Ｋ８タンパク質またはＫ１８タンパク質とともに１６時間４℃でインキュベートした；Ｋ８タンパク質が膜に移された場合、膜を、精製Ｋ１８タンパク質とともにインキュベートし、その逆も同様である（３８）。次いで、膜をＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＣＳを含むウェスタンブロット緩衝液中で、ＣＯＵ−１（５μｇ／ｍｌ）とともに２時間、室温でインキュベートし、上記のように、結合を検出した。
（表面プラズモン共鳴）
組換えインタクトＫ８またはＫ１８（およびそのフラグメント）のヘテロタイプ複合体に結合するＨＭａｂ ＣＯＵ−１の動力学を、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、表面プラズモン共鳴測定によって決定した。センサーチップを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いて免疫化のために活性化した。ヘテロタイプサイトケラチン複合体を、５０μｌの５０μｇ／ｍｌサンプルの注入によって、表面に結合させた。過剰の活性化エステルを、３０μｌ １Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を用いてクエンチした。代表的に、３０００共鳴単位を固定した。固定ヘテロタイプサイトケラチン複合体に対するＣＯＵ−１の結合を、ＣＯＵ−１を、ある範囲の濃度（０．５〜８０μｇ／ｍｌ）で、５μｌ／分の流速で注入することによって、研究した。会合を、単位時間当たりの共鳴単位の増加としてモニターした。解離測定を、２０μｌ／分の流速で、会合相の最後に続いて得た。結合表面を、１０ｍＭ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．０）で再生し、そして１０の測定の間、活性を維持した。会合速度定数ｋｏｎおよび解離速度定数ｋｏｆｆを、以前に記載されるように、一連の測定から決定した（３９）。会合定数および解離定数は、Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、動力学的データから推定した。
（共焦点レーザー走査顕微鏡）
細胞を、Ｌａｂ Ｔｅｋチャンバスライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）内に播種し、４８時間、３７℃で、５％ＣＯ２で、増殖させて、ガラススライドに接着させた。細胞を、氷冷９６％エタノールで５分間固定し、ＰＢＳで３×洗浄し、そしてＰＢＳ中で１時間、室温で、１０％正常ヤギ血清を用いてブロックした。マウス抗Ｋ８抗体（１／１０００）またはマウス抗Ｋ１８抗体（１／１０００）のいずれかと一緒に、ＣＯＵ−１（５μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトγ−鎖およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１／２００に希釈、ともに、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ由来）とともに、１時間、室温暗所でインキュベートした。細胞をＰＢＳで３×５分間洗浄し、そしてスライドに、ＰＢＳ／グリセロール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）中の抗退色試薬Ｓｌｏｗ ＦａｄｅＴＭを載せた。結果を、ＭＲＣ−１０２４共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析し、Ｚｅｉｓｓ Ａｎｙｖｅｒｔ １００ＴＶに付着させた。コントロールとして、一次抗体を除外するかまたは一次抗体の代わりに種およびアイソタイプを一致させたコントロール抗体を含む、全ての実験もまた実施した。さらに、分析される細胞の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を得た。
（結果）
（結腸癌および正常な結腸上皮からのサイトケラチンの精製）
新たな外科的に取り出した結腸癌組織および正常な結腸上皮を使用して、サイトケラチンおよび他の細胞骨格タンパク質が、生理学的塩濃度の緩衝液中で不溶性繊維状構造として存在するという事実を利用することによって、サイトケラチンＫ８およびＫ１８を別々に抽出した。非イオン性界面活性剤をこの緩衝液に添加して、細胞膜を部分的に破壊することによって、ホモジナイゼーションを改善した。不溶性中間体のフィラメントタンパク質を、遠心分離によって沈殿させ、続いてＳＤＳ含有緩衝液中で可溶化し、そして線形塩勾配を使用して、ＱＦＦ陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した。
図１Ａは、ＱＦＦ陰イオン交換カラムからの溶出プロファイルを示す。ＣＯＵ−１反応性を含む画分は、この勾配の第１のピークおよび第２のピーク（画分４１〜４８）において見出された。ＣＯＵ−１反応性を、これらの画分中のタンパク質をＥＬＩＳＡウェル上にコーティングし、続いてＣＯＵ−１と共にインキュベートすることによって検出した（図１Ｂ）。ウエスタンブロット分析は、同じ画分中の３つの主要なバンドとのＣＯＵ−１の反応性を証明した（図１Ｄ）。これら３つのバンドにおけるタンパク質は、ＳＤＳ分離ゲルのクーマシー染色によって示されるように、これらの画分において見出される４１〜４６ｋＤａの範囲の分子量を有するタンパク質の部分のみを示した（図１Ｃ）。
４人の異なる患者の結腸癌から精製されたサイトケラチンのウエスタンブロット分析およびクーマシー染色は、ＨＭａｂ ＣＯＵ−１と反応性および非反応性のタンパク質バンドの類似のパターンを示した。サイトケラチンをまた、同じ精製手順を使用して、３人の個体から得られた正常な結腸上皮から単離して、結腸癌 対 正常な結腸組織におけるＫ８／Ｋ１８の性質を比較した。２種の供給源由来の組織ホモジネートおよび精製サイトケラチン調製物（ＱＦＦ溶出物）を、抗Ｋ８抗体および抗Ｋ１８抗体のパネルを使用して、ウエスタンブロットにより試験した。癌および正常な上皮由来の、ほぼ等しい量のサイトケラチンを分析し、同じ強度のタンパク質バンド（４２〜４６ｋＤａの範囲）を、抗Ｋ１８抗体、ＣＹＫ−９０（これはＫ１８のＣ末端部分における線形エピトープを認識する）で染色した後に観察した（図２）。対照的に、同じ調製物をＣＯＵ−１で染色した場合、４２〜４６ｋＤａの分子量における３つのバンドが、結腸癌組織由来のサイトケラチン調製物において染色されたが、正常な結腸上皮由来のサイトケラチン調製物は染色されなかった（図２）。
結腸癌組織において見出される異なるＫ８／Ｋ１８様タンパク質の性質を決定するために、精製サイトケラチン調製物の個々のタンパク質バンドの改善された分離を使用した。従って、異なる結腸眼組織由来の精製サイトケラチン調製物を、ラージ１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで別々に分離し、これらのタンパク質を、フィルターにブロッティングし、そしてクーマシー染色した。このブロットの小片を、抗Ｋ８抗体Ｍ２０、抗Ｋ１８抗体ＣＹ−９０またはＣＯＵ−１のいずれかと共にインキュベートした。図３Ａは、結腸癌組織サンプルの典型的なブロットを示し、クーマシー染色により可視化された約１０個の異なるバンドを示す。この増加された分離において、５個のバンドは、明瞭なＣＯＵ−１活性を示した。ＣＯＵ−１で染色されていないさらなるバンドを、抗Ｋ８抗体もしくは抗Ｋ１８抗体のいずれか、またはその両方で染色した（図３Ａ）。
１０個全てのバンドを、Ｎ末端配列決定した。図３Ｂに示されるように、これらのバンドは、移動阻止因子関連タンパク質８（ＭＲＰ８、カルレチニンとしても公知）（サイトケラチンに結合し得るカルシウム結合タンパク質）として同定された１つのバンド以外は、Ｋ８、Ｋ１８およびＫ１９の異なる形態に対応する（４０）。これらのバンドのほとんどは、推定残基１以外は、残基２３〜７６から始まる同定されたアミノ酸配列によって証明されるように、Ｎ末端短縮型Ｋ８またはＫ１８であった。
Ｋ８のアミノ酸末端短縮型Ｋ８は、前記２３、４０、６６および７６に対応し、一方、Ｋ１８の切断は、残基５０および６８に対応した。有意に、Ｋ８およびＫ１８の切断が、３つの異なる結腸癌における同じ残基において見出され、このことは、これらの切断が特定のプロテアーゼによって引き起こされたことを示す。
切断部位の周りの配列の分析は、少なくとも２つの異なるプロテアーゼ（１つのトリプシン様プロテアーゼを含む）が、切断を担うことを示唆した。ＣＯＵ−１によって認識されるバンドは、Ｎ末端短縮型Ｋ８およびＫ１８であった。しかし、興味深いことに、全てのＮ末端短縮型Ｋ８およびＫ１８タンパク質が、ＣＯＵ−１によって認識されるわけではなかった。例えば、ＣＯＵ−１結合は、最初の２２アミノ酸を欠いているＮ末端短縮型Ｋ８タンパク質では観察されず、この抗体は、インタクトなＫ８ともＫ１８とも反応しなかった。それぞれ、抗Ｋ８抗体および抗Ｋ１８抗体で染色することによって（図３Ａのバンド１および３）、後に２回の観察を行ったが、Ｎ末端配列決定によっては行わなかった。なぜなら、これらのタンパク質は、Ｎ末端をブロックされているからである（Ｋ１８は、そのＮ末端にアセチル化セリンを含む）。
（組換えＫ８およびＫ１８フラグメントを使用するＣＯＵ−１エピトープのマッピング）
ＣＯＵ−１によって認識されるエピトープの性質を詳述するために、このエピトープを、組換えＮまたはＣ末端欠失のＫ８およびＫ１８フラグメント、またはＧＳＴ融合タンパク質として発現されるインタクトなＫ８およびＫ１８のパネルを使用して、マッピングした。これらのフラグメントの性質を、図４に示す。
最初に、Ｋ８およびＫ１８フラグメントのパネルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＰＶＤＦ膜にブロッティングした。これらのウエスタンブロットの配列分析は、驚くべきことに、ＣＯＵ−１抗体が、個々のＫ８またはＫ１８フラグメントのいずれにも結合しなかったことを示した。ＣＯＵ−１抗体は、インタクトなＫ８分子にもＫ１８分子にも結合しなかった（図５Ｂおよび６Ｂ）。
各実験において、ＭＣＦ７細胞溶解物を、ポジティブコントロールとして含め、４２〜４６ｋＤａの分子量のポジティブに反応するバンドを提供した。Ｋ８およびＫ１８フラグメントが均一に発現されることを保証するために、フラグメントパネルを含むゲルを、並行して泳動させ、そしてウエスタンブロットのためのゲルを、クーマシーブルーで染色した（図６Ａ）。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＫ８／ＧＳＴまたはＫ１８／ＧＳＴ融合タンパク質のブロットを、抗ＧＳＴ抗体で染色した（図５Ａ）。これらの結果は、異なる融合タンパク質のほぼ均一な発現を証明し、そしてＣＯＵ１を有するシグナルがないことが、サイトケラチンフラグメントの低い発現レベルにも、タンパク質の不完全な移動にも起因しないことを証明した。
さらに、Ｋ８およびＫ１８に対するＭａｂを、それぞれ、Ｋ８またはＫ１８フラグメントのパネルへの結合について試験した。図５Ｄに示されるように、抗Ｋ１８Ｍａｂは、Ｋ１８（１−３５６）、Ｋ１８（１−３８５）およびインタクトなＫ１８と強力に反応したが、Ｋ１８（１−３１２）とは反応しなかった。このことは、そのエピトープが、領域３１２−３５６に位置することを示す。次いで、サイトケラチンＫ８およびＫ１８複合体を、これらの複合体がＣＯＵ−１により認識されるか否かを観察するために試験した。Ｋ１８フラグメントのパネルのウエスタンブロットを、インタクトな精製Ｋ８と共にインキュベートし、そして未結合のＫ８を洗い流し、その後ＣＯＵ−１で染色した（図５Ｃ）。ＣＯＵ−１は、Ｋ１８（１−３８５）を介してインタクトなＫ８とＫ１８フラグメントＫ１８（１−２１３）との間に形成された複合体に強力に結合した。対照的に、ＣＯＵ−１は、インタクトなＫ８／Ｋ１８（１−１８７）およびインタクトなＫ８／インタクトなＫ１８とは弱くしか結合せず、そしてインタクトなＫ８／Ｋ１８（１−６５）およびインタクトなＫ８／Ｋ１８（１−１２４）への結合は観察されなかった（図５Ｃ）。
同様に、Ｋ８フラグメントのパネルを含むブロットを、インタクトな１８と共にインキュベートし、その後、ＣＯＵ−１で染色した。ＣＯＵ−１は、Ｋ８（１−３８５）を介してインタクトなＫ１８とＫ８フラグメントＫ８（１−２１３）との間に形成された複合体に強力に結合した。対照的に、ＣＯＵ−１は、インタクトなＫ８／インタクトなＫ１８に弱く結合し、そして結合は、Ｋ８（１−６５）／インタクトなＫ１８複合体について観察されなかった（図６Ｃ）。
Ｎ末端配列決定は、結腸癌患者由来のＫ８およびＫ１８タンパク質の両方が、切断されたことを証明した。ＣＯＵ−１によって結合されたＫ８／Ｋ１８異型エピトープを同定するための実験を行った。並行して、ＣＯＵ−１エピトープの周りのＣ末端欠失フラグメント、Ｋ１８（１−７２）、Ｋ１８（１−１２４）、Ｋ１８（１−１８７）およびインタクトなＫ８タンパク質を含むウエスタンブロットを作製した。次いで、これらのＵｂロットを、ＣＯＵ−１エピトープの周りのＣ末端欠失フラグメント、Ｋ１８（１−８５）、Ｋ１８（１−１２９）、Ｋ１８（１−２３３）またはインタクトなＫ８タンパク質のうち１つと共にインキュベートした。Ｋ８−Ｋ１８複合体形成を可能にした後、これらのブロットを、ＣＯＵ−１抗体と共にインキュベートした。
図７（Ａ〜Ｃ）に示されるように、ＣＯＵ−１により認識されるエピトープは、Ｋ１８（１−１２４）／インタクトなＫ８またはＫ１８（１−１２４）／Ｋ８（１−２３３）複合体上で、露出されないか、または最小限にしか露出されない。対照的に、ＣＯＵ−１の強力な結合が、Ｋ１８（１−１２４）／Ｋ８（１−１２９）複合体について観察された。ＣＯＵ−１の結合は、Ｋ８（１−８５）またはＫ１８（１−７２）を含む異型複合体のいずれについても観察されなかった。
まとめると、これらの結果は、ＣＯＵ−１によって認識されるエピトープが、Ｋ８領域８５−１２９およびＫ１８領域７２−１２４を含むことを確認する。図４および８に示されるように、この領域は、Ｋ８およびＫ１８の両方のαへリックスロッドドメインの、Ｎ末端ヘッドドメインのＣ末端部分、および第１のへリックスドメインＡ１のＮ末端部分を含む。
これらの結果は、このエピトープが、インタクトなＫ８がＫ１８（１−１２４）と複合体化する場合でさえ、インタクトな８およびＫ１８の異型複合体上でほとんど露出されないことをさらに証明する。ＣＯＵ−１エピトープは、αへリックスロッドの第１のドメインＡ１が通常のコイル−コイル構造に存在しない場合に示される。このことは、切断によって引き起こされ、この切断によって、Ｋ８／Ｋ１８複合体のＣＯＵ−１結合領域をａｎフォールド状態にしたままにする現存の会合にとって必須の接触点が除去される。
上記の組合せは、逆にされ、その結果、Ｋ１８（１−８５）、Ｋ１８（１−１２９）、Ｋ１８（１−２３３）またはインタクトなＫ８のＣ末端欠失フラグメントのウエスタンブロットを、ＣＯＵ−１エピトープの周りのＣ末端欠失フラグメントである、Ｋ１８（１−７２）、Ｋ１８（１−１２４）、Ｋ１８（１−１８７）およびインタクトなＫ８と共にインキュベートした。これらのブロットを、次いで、ＣＯＵ−１抗体と共にインキュベートした。図７（Ｄ〜Ｆ）に示されるように、ＣＯＵ−１によって認識されるエピトープは、Ｋ８（１−１２９）がＫ１８（１−７２）、Ｋ１８（１−１２４）、Ｋ１８（１−１８７）およびインタクトなＫ８と複合体化した場合に、等しく露出された。また、ＣＯＵ−１の結合は、Ｋ８（１−８５）を含むいずれの異型複合体を用いた場合にも観察されなかった。
ＣＯＵ−１の結合を、異型ウエスタンブロットアッセイを使用して、インタクトなＫ８およびＫ１８と組み合わせたＮ末端欠失のＫ８およびＫ１８から構成される異型複合体のパネルを使用して試験した。これらのフラグメントは、図４に示されるように、初めの１２９アミノ酸またはそれ以上を欠いている。しかし、ＣＯＵ−１の結合は、これらのＮ末端欠失異型Ｋ８／Ｋ１８複合体のいずれについても観察されず、このことは、ＣＯＵ−１エピトープが、Ｎ末端１２９アミノ酸内に位置していることを示す（データは示さず）。コントロールは、Ｎ末端欠失フラグメントが、マウスの抗Ｋ８Ｍａｂおよび抗Ｋ１８Ｍａｂによって十分に認識されることを示した。
Ｎ末端配列決定データおよび組換えマッピングデータは、ＣＯＵ−１エピトープが、Ｋ８の初めの６５アミノ酸およびＫ１８の初めの４９アミノ酸が欠失している場合、十分に露出されることを示した。
２つのさらなるＮ末端欠失フラグメントである、Ｋ８（６６−４８３）およびＫ１８（５０−４３０）を、ＧＳＴ融合タンパク質として作製した。図９は、Ｋ１８（５０−４３０）（Ａ）またはインタクトなＫ１８（Ｂ）と共にインキュベートしたインタクトなＫ８およびＫ８（６６−４８３）のブロットを示す。図９はまた、Ｋ８（６６−４８３）（Ｃ）またはインタクトなＫ８と共にインキュベートしたＫ１８（５０−４３０）およびインタクトなＫ１８のブロットを示す。インタクトなＫ８／Ｋ１８（５０−４３０）またはインタクトなＫ８／インタクトなＫ１８複合体よりも有意により強力なＣＯＵ−１結合が、Ｋ８６６−４８３）／Ｋ１８（５０−４３０）およびＫ８（６６−４８３）／インタクトなＫ１８複合体について観察された。
さらなる研究を行って、癌細胞において観察されるＫ８およびＫ１８のＮ末端切断が、アデノウイルス感染によって引き起こされ得るか否かを決定した。アデノウイルスＬ３ ２３ｋＤａプロテアーゼは、Ｋ１８のＮ末端ドメインの特異的切断を促進し、同時に、Ｋ８を、ＨｅＬａ細胞のアデノウイルス感染においてインタクトなままにする（４１、４２）。この切断は、Ｋ１８のヘッドドメインの領域１−７３の除去、およびサイトケラチンネットワークの球状小球（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｇｌｏｂｕｌｅ）への分解を生じる。試験を実施して、アデノウイルス感染によって引き起こされる断片化が、ＣＯＵ−１結合を可能にするコンフォメーション変化を生じるか否かを評価した。
以前までのデータによって、ＣＯＵ−１抗体は、ＨｅＬａ細胞由来のＫ８／Ｋ１８に結合しないことが示された。アデノウイルスに感染したＨｅＬａ細胞に由来するサイトケラチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製および分離して、以前の報告に従う４１ｋＤａの分子量のバンドを実証した。アデノウイルス感染ＨｅＬａ細胞のウェスタンブロットとＣＯＵ−１とのインキュベーションによって、染色は生じず（データ示さず）、腺癌腫において見出されるサイトケラチンフラグメントはアデノウイルス感染の結果でないことを示唆した。
ヘテロ型のＫ８／Ｋ１８複合体が形成されたときには、ＣＯＵ−１エピトープが存在するのみであるのは明確なようである。このエピトープは、Ｋ８分子およびＫ１８分子の個々の上には存在しない。しかし、Ｋ８／Ｋ１８複合体が解離したはずの場合においても、ＳＤＳ分離した癌細胞溶解物のウェスタンブロットに対するＣＯＵ−１結合がなぜ観察されたかということに関する問題が依然として残っていた。可能な説明は、インキュベーション工程間に、様々なサイトケラチンの部分がその膜から解離し、その後、その膜にまだ結合している相補的なサイトケラチンに付着し、そして、高い親和性のヘテロ型複合体を形成するというものであった。
この仮説を調べるために、結腸癌細胞株（ｃｏｌｏｎ１３７）の溶解物のウェスタンブロットを、半分に分離した。半分をエタノールで固定し、その後、抗体とインキュベートしつつ、他方で、残りの半分を、固定することなしに通常どおりの処理を加えた。固定したブロットおよび固定なかったブロットの両方において抗Ｋ１８抗体（ＣＹ−９０）での染色は観察されたが、ＣＯＵ−１での染色は、固定していないブロットにおいて観察されるのみであった。
以前の免疫組織化学的研究によって、組織切片のエタノール固定は、ＣＯＵ−１抗原に対して影響を与えないと示されてきた。癌溶解物のドットプロットを、固定ありまたは固定なしで、癌関連エピトープの検出に対して試験した。ＣＯＵ−１での染色を、固定のある場合と固定のない場合の両方において観察し、このＣＯＵ−１エピトープがエタノール処理によって影響を受けていないことを確認した。結論として、最初の仮説は正しいようであり、すなわち、サイトケラチンのヘテロダイマー形成は、ウェスタンブロットの現像の間に生じ、そして、部分的に短縮されたサイトケラチンによるこのようなヘテロダイマー形成が、ＣＯＵ−１エピトープの形成にとって必要とされるようである。
様々な組換えヘテロ型Ｋ８／Ｋ１８複合体に対するＣＯＵ−１の結合がまた、ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｋ８またはインタクトＫ８の精製した組換えフラグメントを、インタクトＫ１８またはＫ１８の精製組換えフラグメントと１：１のモル比で組み合わせて、尿素中でヘテロ型の複合体を生成した。次いで、これらのサンプルを、ＰＢＳに対して透析し、ヘテロ型の複合体の形成を可能し、そして、５μｌ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。インタクトＫ８を、Ｋ１８（１−１２４）、Ｋ１８（１−１８７）、Ｋ１８（１−２１３）およびインタクトＫ１８と組み合わせた。さらに、インタクトＫ１８を、Ｋ８（１−６５）、Ｋ８（１−８５）、Ｋ８（１−１２９）およびＫ８（１−２３３）と組み合わせた。
ＣＯＵ−１は、このＥＬＩＳＡにおける全ての複合体に対して様々な強度で結合するが、但し、Ｋ８（１−６５）／インタクトＫ１８複合体およびインタクトＫ８（１−８５）／インタクトＫ１８複合体に対する結合はのぞく。これらのデータは、ウェスタンブロット分析からの結果と一致する。図１０は、ヘテロ型の複合体の３つに対するＣＯＵ−１の滴定を示し、インタクトＫ８／Ｋ１８複合体に対してよりもフラグメント化したＫ８／Ｋ１８に対して有意に強い結合を示している。
様々な組換えへテロ型Ｋ８／Ｋ１８複合体に対するＣＯＵ−１の結合に関する速度論的パラメーターは、実時間生体特異的相互作用分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって測定した。ＣＯＵ−１は、Ｋ８（１−１２４）／インタクトＫ１８およびＫ８（１−１２４）／Ｋ１８（１−１２４）のヘテロ型複合体に対する高親和性の結合を提示した。Ｋ８（１−１２４）／インタクトＫ１８に関する速度論的パラメーターは、ｋｏｎ＝１．７×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝１．２×１０−４ｓ−１であって、誘導された結合定数（Ｋａ）および解離定数（Ｋｂ）は、１．４×１０９Ｍ−１および７．１×１０−１０Ｍであった。Ｋ８（１−１２４）／Ｋ１８（１−１２４）に対するＣＯＵ−１の結合は、僅かに低く、ｋｏｎ＝２．８×１０５Ｍ−ｌｓ−１、ｋｏｆｆ＝３×１０−４ｓ−ｌであって、誘導されたＫａは、９．５×１０８Ｍ−１であって、そしてＫｄは１．５×１０−９Ｍであった。対照的に、ＣＯＵ−１は、インタクトＫ８／インタクトＫ１８に対しておよそ１００分の１の結合を提示し、ｋｏｎ＝９．１×１０３Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝５．０×１０−５ｓ−１であって、そして、ＫａおよびＫｄは、それぞれ、１．８×１０７Ｍ−１および５．５×１０−８Ｍであった。
（短縮へテロ型Ｋ８／Ｋ１８複合体の細胞分布）
短縮Ｋ８／Ｋ１８ヘテロ型複合体と比較して通常のＫ８およびＫ１８の細胞分布を評価するために、乳癌細胞株および結腸癌細胞株である、ＭＣＦ−７およびＢｒＣａＯｌをＣＯＵ−１およびＭａｂ Ｍ２０（抗Ｋ８）またはＭａｂ ＣＹ−９０ （抗Ｋ１８）のいずれかを用いて共染色して、高分解能共焦点顕微鏡によって分析した（図１１および図１２）。Ｍａｂ Ｍ２０およびＭａｂ ＣＹ−９０の両方とも、中間フィラメントの長い線維を染色し、複合体の相互結合ネットワークを形成した。これらの線維は、核周辺リング（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｎｇ）から広がり、この核周辺リングからそのフィラメントは核表面に結合するようであり、そして、細胞質全体に延び、原形質膜で終結する。対照的に、ＣＯＵ−１は、斑点パターンを提示し、短いフィラメントフラグメントおよび桿状様粒子の染色を伴い、これは断片化された中間フィラメントを示す。
細胞クラスター中のＭＣＦ７細胞の染色パターンを調べるときに、周辺の、新規に形成された増殖細胞のみが、ＣＯＵ−１について強く陽性であり、他方、全ての細胞が、抗Ｋ１８ Ｍａｂおよび抗Ｋ８ Ｍａｂで染色された。（図１１）。クラスターの増殖細胞内で、ＣＯＵ−１染色は、クラスターから離れて面している細胞の外側表面において最も顕著であった。対照的に、Ｍａｂ Ｍ２０およびＭａｂ ＣＹ−９０は、その細胞全体にわたって中間フィラメントネットワークを染色した。斑点パターンのＣＯＵ−１染色が、インタクトな中間フィラメントネットワークに緊密に結合して見受けられ、これは、ＣＯＵ−１およびＭａｂ Ｍ２０またはＭａｂ ＣＹ−９０で染色された画像の重ね合わせ（図１２）によって決定づけた。
したがって、Ｋ８／Ｋ１８複合体のＮ末端短縮型形態は、癌上皮においてのみ同定され、他方、インタクトＫ８／Ｋ１８複合体は、正常および癌化した単純な腺上皮の両方に観測された。様々な癌患者の同一の部位でのサイトケラチンＫ８およびサイトケラチンＫ１８の両方の切断は、特異的なプロテアーゼが関与していることを示している。Ｋ８の上のアミノ酸２２および４０での切断部位、ならびにＫ１８上のアミノ酸５０での切断部位は、全て、（Ｓ／Ｆ／Ｖ）ＸＳＲ↓Ｘ（Ｓ／Ｖ）コンセンサス配列（配列番号５０）を含み、これは、これらの切断を担う酵素が、トリプシン様プロテアーゼである（図８）ことを示唆した。切断部位の近傍にあるアミノ酸配列の解析によって、同一の一般的な配列（アミノ酸３２：ＧＳＲ↓Ｉ（配列番号６４））を有したＫ８上の１つ他の部位が切断されなかった明らかとなった。これは、その基質のＰ３位またはＰ１’位でのアミノ酸もまた、このプロテアーゼによる認識に影響を与えることを示唆する。
コンセンサス配列は、Ｋ８およびＫ１８における以下の３つの残る切断部位において明確ではなった：（ＴＡＶ↓Ｔ（配列番号５１）、ＳＰＬ↓Ｖ（配列番号５２）、ＴＧ↓Ａ（配列番号５３））。より厳密でない認識条件を必要とするプロテアーゼ、または数個の異なるプロテアーゼは、これらの切断を担い得る。１つのこのようなプロテアーゼは、バリン、ロイシン、およびイソロイシンをＰ１位で許容するエラスターゼ型プロテアーゼであり得る。
幾つかの理由により、サイトケラチンＫ８フラグメントおよびＫ１８フラグメントの切断が組織サンプルからのサイトケラチンの精製の間に起こる可能性はひくい。第１に、５つの酵素インヒビターのカクテルは、全ての時間において存在した。第２に、サイトケラチンフラグメントは同一の精製条件を使用する正常な結腸上皮からのサイトケラチンの精製の後で観察されなかった。第３に、組織サンプルが最小限に操作され、そして直ちに固定された場合に、このＨＭａｂ ＣＯＵ−１（これは、Ｋ８／Ｋ１８の短縮形態を認識するのみである）は、癌上皮におけるそのエピトープを検出し得るが、正常な上皮において検出し得ない。
初期の外観とは対照的に、上皮細胞におけるサイトケラチンネットワークの維持は、中間束のアセンブリおよび分解による定常再構築に関与する動的プロセスである（４５）。ビオチン標識化サイトケラチンのマイクロインジェクションまたは蛍光標識化サイトケラチンによるトランスフェクションは、より深部の細胞質に向かう点および細いフィラメントの形態で細胞の末梢に移動する拡散物質の内部方向の流れを示し、ここで、それは、他のフィラメントおよびフィラメント束と合体する（４６）。このプロセスは、正常上皮細胞および悪性上皮細胞の両方において生じるが、本発明によって提供される結果は、癌細胞において特異的な二次分解経路の存在を示す。
また、本発明にしたがって、結腸癌患者の腫瘍排出リンパ節からクローニングされたヒト抗体であるＣＯＵ−１は、２つのサイトケラチンが、異型複合体を形成した場合、Ｋ８およびＫ１８のＮ末端短縮型形態を特異的に認識する。ＣＯＵ−１の以前の分析は、ＣＯＵ−１とＫ１８（３５、４８）または改変されたＫ１８（３１、３２、４９）との選択的反応を示した。アポトーシスに関連するＫ１８のタンパク質分解切断が、報告されている（５６）。しかし、アポトーシス性プロテアーゼであるカスパーゼ−３、カスパーゼ−６およびカスパーゼ−７についての切断部位は、本発明者らが生存腫瘍組織において研究したように（５６）、保存されたＬ１−２リンカーおよびＣ末端テイルドメインに位置し、そしてＮ末端切断部位に対してかなりの距離に位置する。最近、抗体（Ｍ３０）が、生存細胞でも壊死細胞でもなく、アポトーシス性癌細胞のみにおいて曝されるネオエピトープを認識することが、報告された（５７）。Ｃ末端テイルドメインが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６およびカスパーゼ−７によって２６ｋＤａ、２２ｋＤａおよび１９ｋＤａのフラグメントへと切断された後に、遊離された場合、ネオエピトープは、曝される。結腸癌細胞において観察された切断部位はまた、アデノウイルス感染ＨｅＬａ細胞（Ｋ１８のＮ末端の７３個のアミノ酸は除去されていた（４１、４２））について報告された切断部位とは異なった。驚くべきことに、感染したＨｅＬａ細胞由来の、切断されたＫ８／Ｋ１８異型複合体へのＣＯＵ−１の結合は観察されず、一方、ＣＯＵ−１は、Ｋ１８の最もＮ末端の６７個のアミノ酸は除去されている結合Ｋ８／Ｋ１８複合体に結合した。このことは、切断部位は閉じられているように見えるが、６アミノ酸のさらなる除去が、ＣＯＵ−１の結合を防止する立体配置変化を引き起こし得ることを示唆する。
幾つかの証拠は、Ｋ８／Ｋ１８が、細胞移動および細胞侵襲性に密に関連することを示す。Ｋ８／Ｋ１８のＮ末端切断は、これらのプロセスに影響し得る。さらに、Ｋ８／Ｋ１８の失われたＮ末端ヘッドドメインは、幾つかの重要なリン酸化部位（Ｋ１８上のｓｅｒ５２を含む）を含み、これは、フィラメント再統合およびコンパートメント限局化ならびに１４−３−３タンパク質への結合に重要な第２のリン酸化部位に関連する（５８、５９）。Ｋ８においてリン酸化部位であるｓｅｒ２３は、マイトジェン活性化に関連する（６０）。
本明細書で使用される略号は、以下の通りである：Ｋ８、サイトケラチン８；Ｋ１８、サイトケラチン１８；ＩＦ、中間フィラメント；ＨＭａｂ、ヒトモノクローナル抗体；ＦＣＳ、ウシ胎仔血清；ＡＰ、アルカリホスファターゼ；ＱＦＥ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速流；ＥＬＩＳＡ、酵素結合イムノソルベントアッセイ；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食塩水；ＴＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水；ＰＶＤＦ、ポリビニリデンジフルオライドメンブレン；ＦＩＴＣ、フルオレセインイソチオシアネート。
（実施例３：癌関連エピトープに結合する抗体フラグメントのクローニング）
癌の検出のために有用な抗体をさらに開発するために、抗体の一部をコードする核酸をクローニングし、そしてファージディスプレイ選択によって、本発明の癌関連エピトープへの結合についてスクリーニングした。これらの核酸は、ヒトＦａｂフラグメントおよび他のフラグメントをコードする。
（材料および方法）
（抗体）
ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体のＣＯＵ−１は、ハイブリドーマ細胞株Ｂ９１６５（これは、上記のように、ヒトリンパ芽球細胞株ＷＩ−Ｌ２−７２９−ＨＦ２と、結腸癌を有する患者由来の腸間膜リンパ節から得られたリンパ球との融合によって誘導された）によって分泌される。Ｂｏｒｕｐ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．，Ｅｒｂ，Ｋ．，Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂ．およびＳｖｅｈａｇ，Ｓ．−Ｅ．（１９８６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３７，６８３−６８８もまた参照のこと。ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞株を、ＳＳＲ３血清補充物（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を補充した無タンパク質培地（ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．））中で増殖させた。ＣＯＵ−１抗体を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合マウスモノクローナル抗ヒトμ鎖抗体（ＨＢ５７，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）でのアフィニティクロマトグラフィーによって、細胞培養物上清から精製した。抗体を、０．１Ｍジエチルアミン（ｐＨ１０．５）で溶出し、その後、ＦＰＬＣで分画した。正常ヒト血清から精製したＩｇＭ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を、コントロールとして使用した。
ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の１６．８８を、Ｄｒ．Ｒ．ＭｃＣａｂｅから得た。Ｈａｓｐｅｌら、（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５，３９５１−３９６１を参照のこと。この抗体は、ヒトにおける腫瘍画像化について、首尾よく使用されている。Ｓｔｅｉｓら、（１９９０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８，４７６−４９０；Ｂｏｖｅｎら、（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２７，１４３０−１４３６；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３９，３９７−４００）を参照のこと。２種のマウスモノクローナル抗体（正常サイトケラチン８に対するＭ２０および正常サイトケラチン１８に対するＣＹ−９０）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
（可変重鎖遺伝子および可変軽鎖遺伝子のＰＣＲ増幅およびクローニング）
総ＲＮＡを、グアニジニウム法によって、Ｂ９１６５ハイブリドーマ細胞株から調製した。逆転写後、μ鎖（Ｆｄ領域）およびκ鎖を、ファミリー特異的プライマーセットを使用して、Ｐｅｒｓｓｏｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４３２−２４３６に記載される方法を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。増幅した軽鎖ＤＮＡを、Ｂｕｒｔｏｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１０１３４−１０１３７およびＢａｒｂａｓら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，７９７８−７９８２に記載されるように、制限酵素ＳｃａＩおよびＸｂａＩで切断し、ＳａｃＩ／ＸｂａＩで線状化したｐＣｏｍｂ３ベクターと、３時間連結した。連結した材料を精製し、そしてエレクトロポレーションによって、２００μｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞中に形質転換した。形質転換後、細胞を一晩増殖させ、そしてファージミドＤＮＡを調製した。
続いて、ＰＣＲ増幅した重鎖、および軽鎖を含む単離されたファージミドＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。重鎖ファージミドフラグメントを連結し、そしてＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換するために使用した。Ｆａｂライブラリーを、ＳＯＣ培地中で３７℃で１時間増殖させ、その後、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＳＢ培地を添加した。３時間後、ヘルパーファージＶＣＳ−Ｍ１３（１０１２プラーク形成単位）を添加し、そしてこの培養物を、さらに２時間振とうした。カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を添加し、そしてこの培養物を、一晩３０℃でインキュベートした。上清を、４℃での遠心分離（４０００×ｇで２０分間）によって清浄化した。ファージを、５％ポリエチレングリコールおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌの添加、ならびに氷上で３０分間のインキュベーション後、二回目の遠心分離によって沈殿させた。ファージペレットを、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）中に再懸濁し、そして１０，０００×ｇで３分間遠心分離して、破片をペレット化した。
（パニングによる、抗原結合ファージの富化）
Ｂ９１６５抗体ライブラリーのパニングを、Ｂｕｒｔｏｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１０１３４−１０１３７に記載される方法を使用して実施した。簡潔には、マイクロタイターウェルを、０．１Ｍビカルボネート緩衝液（ｐＨ８．６）中で４℃にて、超音波処理した結腸癌細胞株（ｃｏｌｏ １３７）の溶解物を用いて一晩コーティングした。Ｄｉｔｚｅｌら、（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９，４０９−４１７を参照のこと。３％ ＢＳＡを含むＰＢＳでの３７℃で１時間のブロッキング後、５０μｌのＰＢＳ中ファージ懸濁物を各ウェルに添加し、そして２時間インキュベートした。未結合のファージを、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＦＲＧ）を含むＰＢＳで１０回激しく洗浄して除去した。抗原結合Ｆａｂを有するものについて富化された、結合したファージを、０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出した。溶出したファージを、Ｅ．ｃｏｌｉの感染によって増幅し、そしてＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージでの重複感染によって回収した。パニング手順を、２回実施した。ファージミドＤＮＡを、最後の回のパニングから単離し、ＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで切断し、そして再び連結した。この工程は、ｃｐＩＩＩ遺伝子を切り出し、可溶性Ｆａｂフラグメントを産生するベクターを得た。
（Ｂ９１６５ Ｆａｂおよびインタクトな抗体のＥＬＩＳＡ分析）
Ｆａｂを、Ｂｕｒｔｏｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１０１３４−１０１３７およびＢａｒｂａｓら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，７９７８−７９８２によって報告された方法を使用して、凍結−解凍手順によって、細菌上清として調製した。
特異性を評価するために、上清および精製Ｆａｂを、結腸癌細胞（Ｃｏｌｏｎ １３７）の超音波処理物、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ）、組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）（Ｉｎｔｒａｃｅｌ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）およびヒト胎盤ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）への結合について、ＥＬＩＳＡシステムでスクリーニングした。ＥＬＩＳＡウェル（Ｃｏｓｔａｒ）を、０．１Ｍビカルボネート緩衝液（ｐＨ８．６）中の抗原（１〜１０μｇ／ｍｌ）５０μｌで、４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中のＤＮＡを、ＥＬＩＳＡウェル上で３７℃で乾燥させた。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、ウェルをＰＢＳ中３％のＢＳＡで３７℃で１時間満たすことによってブロッキングし、そしてヒトＦａｂサンプルまたはインタクトなヒトＩｇＭ抗体と共に、３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０回洗浄し、そして結合したＦａｂを、ＰＢＳ中に５００倍希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）またはＰＢＳ中に１０００倍希釈したアルカリホスファターゼ標識化ウサギ抗ヒトκ鎖（Ｓｉｇｍａ）を用いて、検出した。結合した抗体を、パラ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）（１ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ ＭｇＣ１２、１０％（ｗ／ｖ）ジエタノールアミン（ｐＨ９．６））で可視化し、４０５ｎｍで読み取った。
（Ｆａｂの精製）
組換えＢ９１６５ Ｆａｂを、いくらかの改変を加えて、Ｄｉｔｚｅｌら、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，８９５−９０８に記載される方法を使用して精製した。簡潔には、適切なクローンを含むＥ．ｃｏｌｉを、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびＭｇＣ１２（２０ｍＭ）を含むスーパーブロスの１リットルの培養物中に接種し、振とうしながら６時間、３７℃で増殖させた。次いで、タンパク質発現を、２ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導し、そして３０℃で一晩増殖を続けた。可溶性Ｆａｂを、プロテインＧγ結合マトリクス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に架橋された、ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２に対するヤギ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用するアフィニティクロマトグラフィーによって細菌上清から精製した。このカラムを、ＰＢＳで洗浄し、そして結合したＦａｂを、０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出し、直ぐに１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。
（ヌクレオチド配列決定）
配列決定を、３７３Ａ自動化ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ）で、Ｔａｑ蛍光ジデオキシターミネーターサイクル配列決定キット（ＡＢＩ）を使用して実施した。軽鎖配列の解明のためのプライマーは、（＋）鎖にハイブリダイズするＳＥＱＫｂプライマー（５’−ＡＴＡＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡ−３’、配列番号４１）、および（−）鎖にハイブリダイズするＫＥＦプライマー（５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＣＧ−３’、配列番号４２）であった。重鎖について、ＣＭＨＤプライマー（５’−ＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡ−３’、配列番号４３）および（−）鎖に結合するＴ３プライマー（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’、配列番号４４）を使用した。
（共焦点レーザー走査顕微鏡による分析）
ヒト結腸癌細胞株（Ｈ３６１９およびｃｏｌｏ １３７）、ならびに乳癌細胞株（ＭＣＦ−７およびＨ３３９６）を、１０％ ＦＢＳを含むＩｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地中で増殖させ、そして単層を形成するために、チャンバになったカバーガラス（Ｎｕｎｃ，Ｋａｍｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に、３７℃、５％ＣＯ２にて、４８時間接着させた。実験を、一次ＣＯＵ−１抗体、Ｂ９１６５ Ｆａｂ、マウス抗サイトケラチン８、マウス抗サイトケラチン１８およびＨｕＭａｂ １６．８８を使用して、以下に示されるように実施した。全ての抗体を、Ｂ９１６５ Ｆａｂ（３０μｇ／ｍｌ）以外、１０μｇ／ｍｌで試験した。
１）細胞内染色。Ｈ３６１９細胞およびｃｏｌｏ １３７細胞を、−２０℃で５分間、メタノールによって透過化し、正常ヤギ血清でブロッキングし、その後、一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞を培養培地で３回洗浄し、そしてそれぞれ、ＰＢＳ中に１：１００および１：５０で希釈した、ＦＩＴＣ標識化ヤギ抗ヒトκ鎖抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＦＩＴＣ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）と共に、室温で１時間インキュベートした。
２）表面染色。生きたＨ３６１９細胞を、ＣＯＵ−１抗体と共に、４℃で２時間インキュベートし、冷培養培地で３回洗浄し、そして二次ＦＩＴＣ標識化抗体と共に、４℃で１時間インキュベートした。
３）内在化。生きたＨ３６１９細胞およびｃｏｌｏ １３７細胞を、ＣＯＵ−１抗体またはＢ９１６５ Ｆａｂと共に、３７℃で６時間インキュベートし、その後、３回洗浄し、そして−２０℃で５分間、メタノールによって透過化した。細胞を、正常ヤギ血清でブロッキングし、そして二次ＦＩＴＣ標識化抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。全ての実験について、一次抗体および二次抗体のインキュベーション後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定し、２回洗浄し、そして抗退色試薬（３０ｍＭ ジチオエリスリトール：ＰＢＳ：グリセロール、２：９：１）中に配置した。細胞の染色を、共焦点レーザー走査顕微鏡によって評価した。コントロールとして、全ての実験を、一次抗体を省いて実施した。
（免疫組織化学的分析）
組織試料を、外科的切除を受けた結腸直腸癌患者より得た。正常な結腸組織を、腫瘍の部位から約１５ｃｍ離れた切除片から取った。組織を９６％のアルコール中、６時間、４℃で固定した。その後、組織をパラフィン包埋し、そして５μｍの切片に切断した。切片をキシロール中で脱パラフィン処理し、段階的なアルコールで再水和し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄した。切片を、２時間、室温で、加湿器中で、１００μｌのマウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体または正常ポリクローナルヒトＩｇＭ（全て０．５〜１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。スライドを洗浄し、そして１０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを有するＰＢＳ中で希釈した、ＡＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ（Ｄａｋｏ）またはＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ）とともに１時間室温でインキュベートした。洗浄後、ＨＲＰを発色体基質（０．０１％Ｈ２Ｏ２を有するＰＢＳ１ｍｌあたり０．６ｍｇジアミノベンジジン）および０．２ｍｇナフトール−ＡＳ−Ｍｘリン酸（Ｓｉｇｍａ）を含むＡＰ、１ｍｇ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ Ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ １ｍｌあたり２０μｇジメチルホルムアミド、１Ｍレバミゾール、ｐＨ ８．２での顕色により可視化する。切片を、Ｍａｙｅｒ’ｓ ヘマトキシリンで対比染色し、キシレン中で脱水し、Ａｑｕａｍｏｕｎｔ（Ｇｕｒｒ，Ｐｏｏｌｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中で標本にした。染色強度を、以下のようにランク付けした：（−）染色なし、（＋）弱い染色、（＋＋）中程度の染色、（＋＋＋）強い染色。
（結果）
（ファージディスプレイ発現および癌関連エピトープと結合し得るＨｕＭａｂの配列決定）
ＲＮＡをＢ９１６５細胞株から抽出し、対応するｃＤＮＡに由来する重鎖（μ、Ｆｄ領域）および軽鎖（κ）遺伝子を、３’ファミリー特異的プライマーおよび５’定常プライマーを使用するＰＣＲで増幅した。次いで、軽鎖産物および重鎖産物を続いてＭ１３ファージ表面発現ベクターｐＣｏｍｂ３にクローン化し、２×１０６メンバーのライブラリーを生成する。ファージライブラリーをＣＯＵ−１抗原陽性結腸癌細胞株（ｃｏｌｏｎ １３７）の超音波処理で２回選択した。選択の最後の回に由来する、溶出したファージを使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬＩ−ｂｌｕｅ細胞に感染させる。ＤＮＡをこれらの細胞から調製し、そして遺伝子ＩＩＩフラグメントをＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化およびライゲーションにより取り除いた。再構築したファージミドを使用し、ＸＬＩ−ｂｌｕｅを形質転換し、可溶性Ｆａｂフラグメントを分泌するクローンを作製した。ＥＬＩＳＡにおいて、試験した８０個の単一Ｆａｂ発現クローンのうち３個の上清は、ｃｏｌｏｎ １３７溶解液に結合し、そしてオボアルブミンと結合しないことを示した。
これら３個のクローンの配列を同定した。配列分析は、Ｂ９１６５ハイブリドーマ細胞軽鎖がＶＫＩＩＩファミリーに属し、そして最も近い生殖系列であるＬ６に対し、９７％（２６９／２７６）のヌクレオチド相同性を示すことを示した（図１３）。Ｂ９１６５軽鎖は、挿入されたｃｏｄｏｎ ３０に一致する付加的なセリンを含んだ。軽鎖Ｊセグメントは、生殖系列ＪＫ５セグメントに対し、９５％（３６／３８）ヌクレオチド相同性を示した。さらに、配列分析は、重鎖がＶＨＩファミリーに属し、そして重鎖生殖系列ＤＰ−７に対し、９８％のヌクレオチド相同性を示すことを示した。重鎖Ｊセグメントは、生殖系列ＪＨ６ｂセグメントに対し、９６％（５３／５５）のヌクレオチド相同性を示した。ＣＯＵ−１のＤセグメントは、完全相同性の１６ヌクレオチド伸展（ｓｔｒｅｃｈ）を有するＤ２生殖系列Ｄセグメントに対し、最も近い相同性を示した。
精製した組換えＢ９１６５ Ｆａｂを、同時に、インタクトなＣＯＵ−１抗体および正常ポリクローナルＩｇＭで、結腸癌細胞（ｃｏｌｏｎ １３７）の溶解液および無関係な抗原への結合に関し、ＥＬＩＳＡにおいて試験した。Ｂ９１６５ ＦａｂおよびＣＯＵ−１は、ｃｏｌｏｎ １３７溶解液に強く結合するが、他の抗原のパネル（ＢＳＡ、オボアルブミン、ヒトＤＮＡおよびＨＩＶ−１ ｇｐ１２０を含む）に結合しないことを示した（データ示さず）。対照的に、正常ヒトＩｇＭは、どの抗原にも結合しなかった。飽和に必要な濃度は、インタクトな抗体（１μｇ／ｍｌ）に対してよりも、Ｂ９１６５ Ｆａｂ（２０μｇ／ｍｌ）に対しての方が有意に高く、そして化学生成の半単量体フラグメント（２×１０６Ｍ−１のＫａを示す（Ｄｉｔｚｅｌ，Ｈ．，Ｅｒｂ，Ｋ．，Ｌｅｓｌｉｅ，Ｇ．＆Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ，Ｊ．Ｃ．（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４， ８６−９３））に対し以前測定された濃度と同じであった。
（ＣＯＵ−１は、悪性の癌細胞に優先的に結合する。）
結腸腺癌および直腸腺癌の組織生検においてＣＯＵ−１により認識される抗原の細胞下局在を、間接的な免疫ペルオキシダーゼ法およびアルカリホスファターゼ法を用いて研究した。高い倍率で、ＣＯＵ−１による中間径フィラメントの明確な原線維染色を観察した。小さな細胞培養物または個々の細胞において、強い染色を、おそらく細胞表面に関連する周辺で認めた。加えて、隣接した細胞間の接合域に関連した、増強された染色を認めた。８つの結腸癌または直腸癌のうち５つにおいて、隣接した正常結腸陰窩上皮細胞中の染色がないことを、観察した。他の３つの癌において、癌組織の強い染色に加え、陰性細胞に囲まれたいくつかの個々の細胞の弱い染色を、隣接した形態学的に正常な結腸組織中で観察した。これらの結腸上皮は形態学的に正常と見られるが、これはそうではないかもしれない。マウス抗サイトケラチン８抗体および抗サイトケラチン１８抗体（示さず）は、隣接した正常な結腸上皮ならびに結腸癌組織の強い染色を生じた。しかし、ＣＯＵ−１は、悪性細胞とのみ反応し、正常な上皮とは反応しなかった。ＣＯＵ−１、マウス抗サイトケラチン８および１８、ならびに１６．８８の染色レベルの比較を、表３に示す。１６．８８抗体は、結腸癌細胞の強い染色、正常の結腸上皮のいくつかの領域のみにおける弱い染色を示したが、しかしさらに染色された平滑筋線維および染色された結合組織に由来する筋上皮を観察した（表５）。
Figure 2005523888
 結腸転移した肝臓の染色対周囲の正常肝組織の染色に関し、抗体を比較した。ＣＯＵ−１は、転移の強い染色を示したのに対し、大部分の肝細胞で染色がないことを観察した。門脈周辺域におけるいくつかの肝細胞は、弱い陽性であった。同様に、１６．８８抗体は、大部分の肝細胞を染色しなかった。しかし、筋上皮性結合組織は、１６．８８により染色されたが、ＣＯＵ−１では染色されなかった。両方のヒト抗体は、胆管を染色した。マウス抗サイトケラチン８および１８（示さず）抗体は、転移を染色し、ならびに正常癌細胞を同じ強度で強く染色した。染色は、小葉中心域に向かって減少した。特定の強い染色は、マウスＭａｂを有する肝細胞の細胞メンバーに関連すると認められた。
従って、ファージディスプレイおよび細菌発現を使用して、Ｆａｂおよびヒトモノクローナル抗体ＣＯＵ−１を発現するハイブリドーマ細胞株に由来する他の抗体をクローン化し、そしてさらに特徴付けた。クローン化されたＢ９１６５Ｆａｂの結合特性は、化学的還元およびアルキル化により生成された半単量体フラグメントに関する以前の報告と非常に類似していた（Ｄｉｔｚｅｌ，Ｈ．，Ｅｒｂ，Ｋ．，Ｌｅｓｌｉｅ，Ｇ．＆Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ，Ｊ．Ｃ．（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４，８６−９３）。配列分析は、重鎖および軽鎖の可変領域が、最も近い生殖系列Ｖ遺伝子に対し、それぞれ９８％および９７％のヌクレオチド相同性の最小の体細胞変異を有することを示した。このことは、ＣＯＵ−１がＩｇＭ抗体であることに基づき、そして部位定方向変異誘発による実質的な親和性成熟が可能であることを示す。
前記の明細書は、特定の実施形態および実施例を包含し、本発明の説明となることを意図し、制限として理解されない。多くの他の変化および改変は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく達成され得る。
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中に示された事項に対する系統として、模範的な手順または他の詳細補充を提供する程度まで、本明細書中に参考として具体的に援用される。
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
図１は、結腸癌組織からのサイトケラチンの精製を示す。図１Ａは、ＳＤＳ含有緩衝液中のＱＦＦアニオン交換カラム（床容積１００ｍｌ）に適用され、１Ｍ ＮａＣｌまでの直線勾配（破線）を用いて溶出されたサイトケラチン濃縮物質の溶出プロフィール（ＯＤ２８０、実線）を提供する。ＣＯＵ−１に対する反応性を有する画分は、塩勾配の第１ピークおよび第２ピークにおいて観察された。図１Ｂは、図１Ａにおいて示した溶出プロフィールの領域の拡大図を提供する。この拡大されたプロフィールは、画分（３０〜５３）についての、ＯＤ２８０吸収（実線）、塩勾配（破線）およびＣＯＵ−１反応性（点線）の比較を提供する。これらの画分由来のタンパク質を、ＥＬＩＳＡウェル上にコートし、そしてＣＯＵ−１抗体と反応させた。 図１は、結腸癌組織からのサイトケラチンの精製を示す。図１Ｃは、画分４１〜５０、未加工のホモジネート（Ｈ）、およびＱＦＦアニオン交換カラムに適応した物質（Ｓ）から電気泳動で分離されたタンパク質のクマシー染色したブロットを提供する。結腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ１３７（Ｃ１３７）の抽出物を、コントロールとして含めた。図１Ｄは、画分４１〜５０、未加工のホモジネート（Ｈ）、およびＱＦＦアニオンカラムに適用した物質（Ｓ）から電気泳動で分離されたタンパク質のウエスタンブロット（ＣＯＵ−１で染色した）を提供する。結腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ１３７（Ｃ１３７）の抽出物を、コントロールとして含めた。このブロットは、ＱＦＦカラムから得られたサイトケラチンの純度およびＣＯＵ−１抗体の反応性（４２〜４６ｋＤａの分子量で３つのバンドを有する）を示す。 図２は、結腸癌組織または正常結腸上皮から同一条件下で精製されたサイトケラチン調製物のウェスタンブロット分析を提供する。ホモジネート（ｈｏｍｏｇ）およびアニオン−交換クロマトグラフィーで精製した物質（ＱＦＦ）を、１０倍希釈（１：１、１：１０、１：１００）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した。これらのタンパク質を、ＰＶＤＦ膜に転写し、ＣＯＵ−１またはマウス抗Ｋ１８Ｍａｂで染色した。抗Ｋ１８抗体は、正常結腸上皮および悪性結腸上皮からのサイトケラチン調製物を強く染色したが、ＣＯＵ−１は、癌組織からのサイトケラチンタンパク質のみを強く染色（約４２〜４６ｋＤａの３つのバンド）し、正常上皮からのサイトケラチンタンパク質を染色しなかった。 図３は、結腸癌組織から精製されたサイトケラチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびＮ末端配列決定を示し、さらにこれらの結腸癌組織における、Ｎ末端短縮型Ｋ８サイトケラチン、Ｋ１８サイトケラチンおよびＫ１９サイトケラチンの存在を示す。図３Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した精製サイトケラチンのＰＶＤＦ膜ブロットである。この膜の領域（ａ）を、クマシーで染色した。この膜の片はまた、ＣＯＵ−１抗体（領域ｂ）、マウス抗Ｋ８抗体（領域ｃ）およびマウス抗Ｋ１８抗体（領域ｄ）で染色された。これらのデータは、１０個の異なるタンパク質バンド（１〜１０）が検出され得ることを示す。これらの１０個のバンドを、各々、Ｎ末端配列決定した。 図３は、結腸癌組織から精製されたサイトケラチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびＮ末端配列決定を示し、さらにこれらの結腸癌組織における、Ｎ末端短縮型Ｋ８サイトケラチン、Ｋ１８サイトケラチンおよびＫ１９サイトケラチンの存在を示す。図３Ｂは、Ｎ末端配列決定によって決定された、結腸癌組織から単離したサイトケラチンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５４〜６１）を提供する。さらに、Ｋ８／Ｋ１８抗体の群との、種々の単離されたサイトケラチンタンパク質の反応性を示す。 図４は、Ｋ８サイトケラチンおよびＫ１８サイトケラチンの構造ドメインのマップ（中央）を提供する。サイトケラチンポリペプチドの２次構造ドメインを、アミノ酸配列から同定した。中央のロッドドメイン（ｒｏｄ ｄｏｍａｉｎ）は、非らせん状のＮ末端ヘッドドメインおよび非らせん状のＣ末端テールドメインに隣接することが示される。ドメイン１Ａ、ドメイン１Ｂ、ドメイン２Ａおよびドメイン２Ｂは、リンカーＬ１、リンカーＬ１２およびリンカーＬ２によって間隔を空けられたロッドαヘリックスサブドメインである。この図面はまた、Ｋ８およびＫ１８のＮ末端欠失タンパク質およびＣ末端欠失タンパク質の模式図を提供する。欠失タンパク質の名称は、その欠失タンパク質の開始アミノ酸残基番号および終結アミノ酸残基番号を提供する。全ての欠失タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質として発現された。補完的ケラチン（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｋｅｒａｔｉｎ）との１時間のインキュベーション後、これらの欠失タンパク質フラグメントとＣＯＵ−１とのポジティブ（＋）およびネガティブ（−）な反応性を括弧内に示す。 図５は、一群のＣ末端欠失型Ｋ１８フラグメントの、ウェスタンブロット分析を提供する。ＧＳＴ融合タンパク質として発現されたＣ末端欠失型Ｋ１８フラグメントを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを並行して泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてヤギ抗ＧＳＴ抗体（Ａ）、ＣＯＵ−１（Ｂ）またはマウス抗Ｋ１８抗体（ＣＶ−９０）（Ｄ）のいずれかで染色した。図５Ａは、ヤギ抗ＧＳＴ抗体で染色した、ＧＳＴ融合タンパク質として発現された電気泳動で分離された一群のＣ末端欠失型Ｋ１８タンパク質フラグメントの、ウェスタンブロットである。種々のＫ１８タンパク質フラグメントの正体を上部に提供する。ここで、数は、どのアミノ酸が種々のＫ１８タンパク質フラグメントに存在するかを示す。ＧＳＴタンパク質調製物を、ＧＳＴ抗体染色についてのポジティブコントロールとして使用した。ＭＣＦ７癌細胞溶解物を、サイトケラチンエピトープについてのポジティブコントロールとして使用した（この染色は可視的ではない。なぜなら、ＧＳＴタンパク質はこの溶解物中に存在しないからである）。ＧＳＴ抗体染色は、全Ｋ１８フラグメントが十分に発現し、そしてほぼ同じレベルであったことを実証した。図５Ｂは、ＣＯＵ−１抗体で染色した、図５Ａに提供される電気泳動で分離された一群のＣ末端欠失型Ｋ１８フラグメントの、ウェスタンブロットのレプリカである。このブロットにおいて、ＣＯＵ−１は、ポジティブコントロールとして使用したＭＣＦ７癌細胞溶解物のみと反応した。個々のＫ１８フラグメントへのＣＯＵ−１の実質的な結合は観察されなかった。図５Ｃは、電気泳動で分離された一群の図５Ａに提供されるＣ末端欠失型Ｋ１８フラグメントの、ウェスタンブロットのレプリカである。しかし、このブロットは、精製したインタクトなＫ８とともにインキュベートした後にＣＯＵ−１を染色した。Ｋ８と複合体を形成した場合、Ｋ１８フラグメントのいくつかはＣＯＵ−１に強く結合した。図５Ｄは、マウス抗Ｋ１８抗体（ＣＹ−９０）で染色した、電気泳動で分離された一群の図５Ａに提供されるＣ末端欠失型Ｋ１８フラグメントの、ウェスタンブロットのレプリカである。ＣＹ−９０抗体は、Ｋ１８と複合体を形成していないＣ末端部分の残基３４０〜３９０に対応するエピトープと反応した。 図６は、一群のＣ末端欠失型Ｋ８フラグメントの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を提供する。ＧＳＴ融合タンパク質として発現されたＣ末端欠失型Ｋ８フラグメントを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを並行して泳動し、クマシーブルー（Ａ）で染色するか、あるいはＰＶＤＦ膜に転写して、ＣＯＵ−１（Ｂ）で染色するか、あるいは精製したインタクトなＫ１８と共にインキュベートした後、ＨＭａｂ ＣＯＵ−１（Ｃ）で染色した。図６Ａは、クマシーブルーで染色した、電気泳動で分離された一群のＣ末端欠失型Ｋ８フラグメントの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。異なるＫ８タンパク質フラグメントの正体を上部に提供する。この数は、種々のＫ１８タンパク質フラグメントに存在するアミノ酸の範囲を示す。クマシーブルー染色は、全フラグメントがほぼ等しく十分に発現されたことを実証した。図６Ｂは、ＣＯＵ−１抗体で染色された、電気泳動で分離された一群の図６Ａに提供されるＣ末端欠失型Ｋ８フラグメントの、ウェスタンブロットのレプリカである。個々のＫ８フラグメントへのＣＯＵ−１の結合は観察されなかった。このブロットに関して、ＣＯＵ−１は、ポジティブコントロールであるＭＣＦ７癌細胞溶解物のみと反応した。図６Ｃは、精製したインタクトなＫ１８とともにインキュベートした後にＨ Ｍａｂ ＣＯＵ−１を染色した、電気泳動で分離された一群の図６Ａに提供されるＣ末端欠失型Ｋ８フラグメントの、ウェスタンブロットのレプリカである。Ｋ１８と複合体を形成した場合、ＣＯＵ−１は、Ｋ８フラグメントのいくつかと強く結合した。 図７は、一群のＣ末端欠失型のＫ８フラグメントまたはＫ１８フラグメントのウェスタンブロット分析を提供する。この分析では、これらのフラグメントを、電気泳動で分離し、そしてＰＶＤＦ膜に転写し、次いで種々の精製Ｃ末端欠失型のＫ８フラグメントまたはＫ１８フラグメントと共にインキュベートしてＫ８／Ｋ１８複合体を形成させた後に、ＣＯＵ−１で染色した。図７Ａは、Ｃ末端欠失型のＫ１８（１〜７２）タンパク質フラグメント、Ｋ１８（１〜１２４）タンパク質フラグメント、Ｋ１８（１〜１８７）タンパク質フラグメントおよびインタクトなＫ１８タンパク質フラグメントの一群のウェスタンブロット分析を提供する。この分析では、これらのフラグメントを電気泳動で分離し、そしてＰＶＤＦ膜に転写した。次いで、この膜を精製Ｃ末端欠失型Ｋ８（１〜１２９）フラグメントと共にインキュベートし、そしてＣＯＵ−１で染色した。ＣＯＵ−１抗体は、Ｋ１８（１〜１２４）／Ｋ８（１〜１２９）複合体に強く結合した。図７Ｂは、精製Ｃ末端欠失型Ｋ８（１〜２３３）フラグメントと共にインキュベートし、そしてＣＯＵ−１で染色した、図７Ａに提供されるＣ末端欠失型Ｋ１８フラグメントの、電気泳動で分離された一群のウェスタンブロットのレプリカである。ＣＯＵ−１染色は、Ｋ１８（１〜１８７）／Ｋ８（１〜２３３）複合体について存在しないか、または最小限に観察されるのみであった。図７Ｃは、精製されたインタクトなＫ８と共にインキュベートし、ＣＯＵ−１で染色した、図７Ａに提供されるＣ末端型欠失Ｋ１８フラグメントの、電気泳動で分離された一群のウェスタンブロットのレプリカである。ＣＯＵ−１染色は、Ｋ１８（１〜１８７）／インタクトＫ８複合体について存在しないか、または最小限に観察されるのみであった。図７Ｄは、電気泳動で分離し、そしてＰＶＤＦ膜に転写した、Ｃ末端欠失型のＫ８（１〜８５）、Ｋ８（１〜１２９）、Ｋ８（１〜２３３）およびインタクトなＫ８ポリペプチドの一群のウェスタンブロット分析を提供する。次いで、この膜を精製したＫ１８（１〜１２４）とともにインキュベートし、そしてＣＯＵ−１で染色した。ＣＯＵ−１抗体は、Ｋ１８（１〜１２４）と複合体化したＫ８（１〜１２９）、およびＫ１８（１〜１２４）と複合体化したＫ８（１〜２３３）を認識した。ＣＯＵ−１結合は、Ｋ８（１〜８５）を含む複合体で観察されなった。図７Ｅは、精製されたＫ１８（１〜１８７）と共にインキュベートし、そしてＣＯＵ−１で染色した、図７Ｄに提供されるＣ末端欠失型Ｋ８フラグメントの電気泳動で分離された一群のウェスタンブロットのレプリカである。ＣＯＵ−１抗体は、Ｋ１８（１〜１８７）と複合体化したＫ８（１〜１２９）、およびＫ１８（１〜１８７）と複合体化したＫ８（１〜２３３）を認識した。ＣＯＵ−１結合は、Ｋ８（１〜８５）を含むいずれの複合体でも観察されなった。図７Ｆは、精製されたＫ１８（１〜２１３）と共にインキュベートし、そしてＣＯＵ−１で染色した、図７Ｄに提供されるＣ末端欠失型Ｋ８フラグメントの電気泳動で分離された一群のウェスタンブロットのレプリカである。ＣＯＵ−１抗体は、Ｋ１８（１〜１２９）と複合体化したＫ１８（１〜２１３）、およびＫ１８（１〜２３３）Ｋ１８（１〜１８７）と複合体化したＫ８（１〜２１３）を認識した。ＣＯＵ−１結合は、Ｋ８（１〜８５）を含むいずれの複合体でも観察されなった。 図８は、Ｋ８／Ｋ１８ヘテロタイプ複合体のＮ末端ヘッドドメインおよび隣接するロッドドメインの模式図を提供する。図８Ａは、Ｋ８（配列番号６２）およびＫ１８（配列番号６３）がタンパク質分解性に切断される部位（矢印）を同定する。サイトケラチンＫ８について、切断は、Ａｒｇ−２２の後、Ａｒｇ−３９の後、Ｖａｌ−６５の後およびＬｅｕ−７５の後である。Ｋ１８サイトケラチンについて、切断は、Ａｒｇ−４９の後およびＩｌｅ−６７の後である。翻訳後にリン酸化される残基の位置（ＰＯ４、Ｐ）またはグリコシル化される残基の位置（ＧｌｃＮａｃ、Ｇ）もまた同定される。 図８は、Ｋ８／Ｋ１８ヘテロタイプ複合体のＮ末端ヘッドドメインおよび隣接するロッドドメインの模式図を提供する。図８Ｂは、Ｋ８サイトケラチンおよびＫ１８サイトケラチンのＮ末端ヘッドドメインの切断が、ＣＯＵ−１をエピトープに接近させる立体構造変化をどのように生じさせ得るのかを示す模式図である。この図は、インビボで癌細胞にてなされ、組換えＫ８／Ｋ１８複合体の形成についてなされた観察と一致する。この図はさらに、２つのサイトケラチンタンパク質のうちの１つのＣ末端ドメインの主要部分のインビボでの欠失がまた、どのようにしてＣＯＵ−１エピトープを人為的に露出し得るのかを説明する。この図はまた、組換えＫ８／Ｋ１８欠失タンパク質の一群に関する複合体形成研究と一致する。 図９は、ＣＯＵ−１が、Ｎ末端欠失型Ｋ８フラグメントを含むヘテロタイプ複合体に優先的に結合することを示す。この図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＫ８タンパク質およびＫ１８タンパク質のＰＶＤＦ膜ブロットを提供する。領域Ａは、電気泳動で分離し、次いで精製したＫ１８（５０〜４３０）と反応させた後、ＣＯＵ−１で染色した、インタクトなＫ８タンパク質またはＫ８（６６〜４８３）タンパク質を有する。領域Ｂは、精製したインタクトなＫ１８と共にインキュベートした後、ＣＯＵ−１で染色した、インタクトなＫ８タンパク質またはＫ８（６６〜４８３）タンパク質を有する。領域Ｃは、電気泳動で分離し、次いで精製したＫ８（６６−４８３）と共にインキュベートした後、ＣＯＵ−１で染色した、Ｋ１８（５０〜４３０）およびインタクトなＫ１８を有する。ＣＯＵ−１を用いて、約７５ｋＤａのバンド（Ｋ８／Ｋ１８タンパク質＋ＧＳＴ融合タンパク質）の強い染色が、Ｋ８（６６〜４８３）／Ｋ１８（５０〜４３０）およびＫ８（６６〜４８３）／インタクトなＫ１８を含むレーンにおいて観察された。領域Ｄは、電気泳動で分離し、次いで精製したインタクトなＫ８と共にインキュベートした後、ＣＯＵ−１で染色した、Ｋ１８（５０〜４３０）タンパク質およびインタクトなＫ１８タンパク質を有する。弱い染色しか、インタクトなＫ８／Ｋ１８（５０〜４３０）およびインタクトなＫ８／Ｋ１８において観察されなかった。 図１０は、ＥＬＩＳＡにより測定された短縮形態の組換えヘテロタイプＫ８／Ｋ１８複合体に、ＣＯＵ−１が優先的に結合することを示す。ヘテロタイプ複合体は、精製組換えＫ１８（１−１２９）またはインタクトなＫ１８を、精製組換えＫ８（１−１２４）またはインタクトなＫ８と等モル比であわせることによって、作製した。これらの複合体の５μｇ／ｍｌ溶液を、ＥＬＩＳＡプレートをコートするために使用した。このＥＬＩＳＡプレートを、連続希釈物中のＣＯＵ−１とともにインキュベートした。結合したＣＯＵ−１を、ＡＰ標識二次抗ヒトκ抗体およびｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて検出し可視化した。示されるように、Ｋ８（１−１２９）／インタクトなＫ１８複合体（菱型記号）およびＫ８／Ｋ１８（１−１２４）（丸）は、インタクトなＫ８／インタクトなＫ１８複合体よりも多くＣＯＵ−１抗体に結合した。 図１１は、乳癌細胞におけるＮ末端短縮型Ｋ８／Ｋ１８複合体（ＡおよびＥ）ならびにＫ１８（ＢおよびＦ）の分布を示す。エタノール固定ＭＣＦ７乳癌細胞を、ＣＯＵ−１抗体（ＡおよびＥ）ならびにＣＹ９０モノクローナル抗体（ＢおよびＦ）とともに別個にインキュベートした。ＣＹ９０モノクローナル抗体は、インタクトなＫ１８に結合する。結合したＣＯＵ−１を、ＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトγ鎖抗体（緑色）を用いて検出し、結合したＣＹ９０を、テキサスレッド−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（赤色）を用いて検出した。ＤＩＣ画像（ＤおよびＨ）を含めて、これらの細胞の組成を可視化した。合わせた画像（ＣおよびＧ）において黄色により可視化される部分的同時局在化が、この２つの抗体間で観察された。しかし、Ｎ末端短縮型Ｋ８／Ｋ１８複合体が、新たに形成された増殖中の癌細胞（矢印）において優先的に見出され、一方Ｋ１８構築物は、すべての細胞（鏃）において等しく存在した。 図１２は、乳癌細胞において、ＣＯＵ−１により認識されるＮ末端短縮型Ｋ８／Ｋ１８複合体の細胞分布（ＡおよびＥ）ならびにＭａｂ ＣＹ−９０により認識されるＫ１８の細胞分布（ＢおよびＦ）を示す。ＭＣＦ７乳癌細胞を、図１１に記載されるように処理し染色した。ＤＩＣ画像（ＤおよびＨ）を含めて、これらの細胞の組成を可視化した。中間フィラメント全体を、Ｍａｂ ＣＹ−９０（鏃）で染色した一方、ＣＯＵ−１（矢印）は、短い原線維および球状構造のみを染色した。合わせた画像（ＣおよびＧ）において黄色により可視化される２つの抗体のいくらかの同時局在化が、観察された。 図１３は、最も密接であることが公知である生殖系列配列（配列番号７〜２０）と比較した、ヒトモノクローナル抗体ＣＯＵ−１の可変重鎖および可変軽鎖についてのアミノ酸配列を提供する。
【配列表】
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888
Figure 2005523888

Claims (69)

  1. ２つの別々のポリペプチド、サイトケラチン８ポリぺプチドおよびサイトケラチン１８ポリペプチドを含む単離された癌関連エピトープであって、該サイトケラチン８ポリペプチドが、配列番号３または配列番号５から本質的になり、そして該サイトケラチン１８ポリペプチドが、配列番号４または配列番号６から本質的になる、単離された癌関連エピトープ。
  2. 請求項１に記載の単離されたエピトープであって、前記サイトケラチン８ポリペプチドが、約４７５アミノ酸よりも短く、そして前記サイトケラチン１８ポリペプチドが、約４２５アミノ酸よりも短い、単離されたエピトープ。
  3. 請求項１に記載の単離されたエピトープであって、前記癌関連エピトープが、腺癌細胞の線維状細胞質構造において検出されるが、正常細胞において実質的に検出されない、単離されたエピトープ。
  4. 請求項１に記載の単離されたエピトープであって、前記癌関連エピトープが、結腸腺癌細胞、卵巣腺癌細胞、腎腺癌細胞、乳腺癌細胞、肺腺癌細胞、膵臓腺癌細胞および非セミノーマ精巣癌細胞の線維状細胞質構造において検出される、単離されたエピトープ。
  5. ２つの別々のポリペプチド、サイトケラチン８ポリぺプチドおよびサイトケラチン１８ポリペプチドを含む癌関連エピトープを含む腺癌を予防または処置するためのワクチン組成物であって、該サイトケラチン８ポリぺプチドが、配列番号３または配列番号５から本質的になり、そしてサイトケラチン１８ポリペプチドが、配列番号４または配列番号６から本質的になる、ワクチン組成物。
  6. 請求項５に記載のワクチン組成物であって、前記サイトケラチン８ポリペプチドが、約４７５アミノ酸よりも短く、そして前記サイトケラチン１８ポリペプチドが、約４２５アミノ酸よりも短い、ワクチン組成物。
  7. 請求項５に記載のワクチン組成物であって、前記腺癌が、結腸腺癌、卵巣腺癌、腎腺癌、乳腺癌、肺腺癌、膵臓腺癌または非セミノーマ精巣癌である、ワクチン組成物。
  8. ２つの別々のポリペプチド、サイトケラチン８ポリぺプチドおよびサイトケラチン１８ポリペプチドを含む癌関連エピトープに結合し得る単離された結合実体ポリペプチドであって、該サイトケラチン８ポリペプチドが、配列番号３または配列番号５から本質的になり、そして該サイトケラチン１８ポリペプチドが、配列番号４または配列番号６から本質的になる、単離された結合実体ポリペプチド。
  9. 請求項８に記載の単離された結合実体ポリペプチドであって、前記サイトケラチン８ポリペプチドが、約４７５アミノ酸よりも短く、そして前記サイトケラチン１８ポリペプチドが、約４２５アミノ酸よりも短い、単離された結合実体ポリペプチド。
  10. 請求項８に記載の単離された結合実体ポリペプチドであって、該結合実体ポリペプチドが、約４２５アミノ酸よりも短い、単離された結合実体ポリペプチド。
  11. 請求項８に記載の単離された結合実体ポリペプチドであって、該結合実体ポリペプチドが、約２００アミノ酸よりも短い、単離された結合実体ポリペプチド。
  12. 請求項８に記載の単離された結合実体ポリペプチドであって、該結合実体ポリペプチドが、抗体である、単離された結合実体ポリペプチド。
  13. 請求項８に記載の単離された結合実体ポリペプチドであって、該結合実体ポリペプチドが、腺癌細胞の線維状細胞質構造において癌関連エピトープを検出し得るが、正常細胞の線維状構造において実質的に検出し得ない、単離された結合実体ポリペプチド。
  14. 請求項８に記載の結合実体であって、該結合実体ポリペプチドが、結腸腺癌細胞、卵巣腺癌細胞、腎腺癌細胞、乳腺癌細胞、肺腺癌細胞、膵臓腺癌細胞および非セミノーマ精巣癌細胞の線維状細胞質構造において癌関連を検出し得る、結合実体。
  15. 請求項８に記載の結合実体であって、該結合実体ポリペプチドが、配列番号７〜３５のいずれか１つに少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドから本質的になる、結合実体。
  16. 請求項８に記載の結合実体であって、該結合実体が、配列番号７〜３５または配列番号４７〜４９のいずれか１つを有するポリペプチドから本質的になる、結合実体。
  17. 請求項８に記載の結合実体であって、該結合実体が、配列番号３６〜３９のいずれか１つを含む核酸によってコードされる、結合実体。
  18. 癌を検出するためのキットであって、該キットは、癌関連エピトープに結合し得る結合実体ポリペプチドを含む容器を備え、該癌関連エピトープが、２つの別々のポリペプチド、サイトケラチン８ポリぺプチドおよびサイトケラチン１８ポリペプチドを含み、該サイトケラチン８ポリペプチドが、配列番号３または配列番号５から本質的になり、そして該サイトケラチン１８ポリペプチドが、配列番号４または配列番号６から本質的になる、キット。
  19. 請求項１８に記載のキットであって、前記サイトケラチン８ポリペプチドが、約４７５アミノ酸よりも短く、そして前記サイトケラチン１８ポリペプチドが、約４２５アミノ酸よりも短い、キット。
  20. 請求項１８に記載のキットであって、前記結合実体ポリペプチドが、約４２５アミノ酸よりも短い、キット。
  21. 請求項１８に記載のキットであって、前記結合実体ポリペプチドが、約２００アミノ酸よりも短い、キット。
  22. 請求項１８に記載のキットであって、前記結合実体ポリペプチドが、抗体である、キット。
  23. 請求項１８に記載のキットであって、前記癌が、腺癌である、キット。
  24. 請求項１８に記載のキットであって、前記癌が、結腸腺癌、卵巣腺癌、腎腺癌、乳腺癌、肺腺癌、膵臓腺癌または非セミノーマ精巣癌である、キット。
  25. 請求項１８に記載のキットであって、前記結合実体ポリペプチドが、標識または診断画像化剤をさらに含む、キット。
  26. 請求項１８に記載のキットであって、前記結合実体ポリペプチドが、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、ヨーパン酸、イポデートカルシウム、ジアトリゾエートナトリウム、ジアトリゾエートメグルミン、メトリザマイド、チロパノエートナトリウム、フッ素−１８、炭素−１１、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素、ガドリニウム、フルオレセイン、イソチオシアレート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オプトアルデヒド、フルオレサミン、ルミナル、イソルミナル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、またはエクオリンをさらに含む、キット。
  27. 請求項１８に記載のキットであって、前記結合実体が、配列番号７〜３５のいずれか１つに少なくとも９８％相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドから本質的になる、キット。
  28. 請求項１８に記載のキットであって、前記結合実体が、配列番号７〜３５または配列番号４７〜４９のいずれか１つを有するポリペプチドから本質的になる、キット。
  29. 請求項１８に記載のキットであって、前記結合実体が、配列番号３６〜３９のいずれか１つを含む核酸によってコードされる、キット。
  30. 結合実体ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する治療組成物であって、該結合実体ポリペプチドが、２つの別々のポリペプチド、サイトケラチン８ポリぺプチドおよびサイトケラチン１８ポリペプチドを含む癌関連エピトープに結合し得、該サイトケラチン８ポリペプチドが、配列番号３または配列番号５を含み、そして該サイトケラチン１８ポリペプチドが、配列番号４または配列番号６を含む、治療組成物。
  31. 請求項３０に記載の治療組成物であって、前記サイトケラチン８ポリペプチドが、約４７５アミノ酸よりも短く、そして前記サイトケラチン１８ポリペプチドが、約４２５アミノ酸よりも短い、治療組成物。
  32. 請求項３０に記載の治療組成物であって、前記結合実体ポリペプチドが、約４２５アミノ酸よりも短い、治療組成物。
  33. 請求項３０に記載の治療組成物であって、前記結合実体ポリペプチドが、約２００アミノ酸よりも短い、治療組成物。
  34. 請求項３０に記載の治療組成物であって、前記結合実体ポリペプチドが、抗体である、治療組成物。
  35. 請求項３０に記載の治療組成物であって、前記結合実体が、腺癌細胞の線維状細胞質構造において前記癌関連エピトープに結合し得るが、正常細胞の線維状構造において実質的に結合し得ない、治療組成物。
  36. 請求項３０に記載の治療組成物であって、前記結合実体が、結腸腺癌細胞、卵巣腺癌細胞、腎腺癌細胞、乳腺癌細胞、肺腺癌細胞、膵臓腺癌細胞および非セミノーマ精巣癌細胞の線維状細胞質構造において、前記癌関連エピトープに結合し得る、治療組成物。
  37. 請求項３０に記載の治療組成物であって、ここで、前記結合実体が、配列番号７〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドから本質的になる、治療組成物。
  38. 請求項３０に記載の治療組成物であって、ここで、前記結合実体が、配列番号７〜３５または配列番号４７〜４９のいずれか１つを有するポリペプチドから本質的になる、治療組成物。
  39. 請求項３０に記載の治療組成物であって、ここで、前記結合実体が、配列番号３６〜３９のいずれか１つを含む核酸によってコードされる、治療組成物。
  40. 腺癌を処置するための治療組成物であって、該組成物は、Ｘａａ１ＳＲ↓Ｘａａ４（配列番号４０）を切断するプロテアーゼのインヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有し、ここで、Ｘａａ１は、セリン、フェニルアラニンまたはバリンであり、そしてＸａａ４は、セリンまたはバリンである、治療組成物。
  41. 請求項４０に記載の治療組成物であって、ここで、前記プロテアーゼは、トリプシン様プロテアーゼである、治療組成物。
  42. 請求項４０に記載の治療組成物であって、ここで、前記インヒビターは、ダイズトリプシンインヒビター、α−２−マクログロブリン、α−１−アンチトリプシン、アプロチニン、膵分泌性トリプシンインヒビター、コーントリプシンインヒビター、カボチャトリプシンインヒビターまたはヒトアミロイドβ−タンパク質前駆体インヒビターである、治療組成物。
  43. 請求項４０に記載の治療組成物であって、ここで、前記腺癌が、結腸腺癌、卵巣腺癌、直腸腺癌、乳腺癌、肺腺癌、膵臓腺癌または非セミノーマ精巣癌である、治療組成物。
  44. 腺癌を検出する方法であって、該方法は、
    試験サンプルと結合実体ポリペプチドを接触させる工程、および
    該結合実体ポリペプチドが、サイトケラチン８ポリペプチドおよびサイトケラチン１８ポリペプチドの２つの別々のポリペプチドを含むエピトープに結合するかどうかを検出する工程
    を包含し、ここで、該サイトケラチン８ポリペプチドは、配列番号３または配列番号５から本質的になり、そして該サイトケラチン１８ポリペプチドは、配列番号４または配列番号６から本質的になる、方法。
  45. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記サイトケラチン８ポリペプチドが、約４７５アミノ酸より短く、そして前記サイトケラチン１８ポリペプチドが、約４２５アミノ酸より短い、方法。
  46. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記結合実体ポリペプチドが、約４２５アミノ酸より短い、方法。
  47. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記結合実体ポリペプチドが、約２００アミノ酸より短い、方法。
  48. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記結合実体ポリペプチドが、抗体である、方法。
  49. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、配列番号７〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドから本質的になる、方法。
  50. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、配列番号７〜３５または配列番号４７〜４９のいずれか１つを有するポリペプチドから本質的になる、方法。
  51. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、配列番号３６〜３９のいずれか１つを含む核酸によってコードされる、方法。
  52. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記腺癌が、結腸腺癌、卵巣腺癌、直腸腺癌、乳腺癌、肺腺癌、膵臓腺癌または非セミノーマ精巣癌である、方法。
  53. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、標識薬剤または診断画像化剤をさらに含む、方法。
  54. 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、ヨーパン酸、イポデートカルシウム、ジアトリゾエートナトリウム、メグルミンジアトリゾエート、メトリザマイド、チロパノエートナトリウム、フッ素−１８、炭素−１１、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素、ガドリニウム、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、オプトアルデヒド、フルオレスカミン、ルミナル、イソルミナル、ルシフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリンをさらに含む、方法。
  55. 哺乳動物において癌を処置または予防するための方法であって、該方法が、抗新生物形成剤に連結された治療有効量の結合実体ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、結合実体ポリペプチドが、サイトケラチン８ポリペプチドおよびサイトケラチン１８ポリペプチドの２つの別個のポリペプチドを含む癌関連エピトープに結合し得、そしてここで、該サイトケラチン８ポリペプチドが、配列番号３または配列番号５を含み、そして該サイトケラチン１８ポリペプチドが、配列番号４または配列番号６を含む、方法。
  56. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記サイトケラチン８ポリペプチドが、約４７５アミノ酸より短く、そして前記サイトケラチン１８ポリペプチドが、約４２５アミノ酸より短い、方法。
  57. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記結合実体ポリペプチドが、約４２５アミノ酸より短い、方法。
  58. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記結合実体ポリペプチドが、約２００アミノ酸より短い、方法。
  59. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記結合実体ポリペプチドが、抗体である、方法。
  60. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記抗新生物薬剤が、放射性ヨウ素化化合物、毒素、細胞増殖抑制性薬物、または細胞分解性薬物である、方法。
  61. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記抗新生物薬剤が、アミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトーテン、プロカルバジンＨＣｌ、チオグアニン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素、シュードモナス外毒素またはコバルト６０である、方法。
  62. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、配列番号２０〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、方法。
  63. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、配列番号７〜３５または配列番号４７〜４９のいずれか１つを有するポリペプチドを含む、方法。
  64. 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、配列番号３６〜３９のいずれか１つを含む核酸によってコードされる、方法。
  65. 変異体結合実体を同定するための方法であって、該方法は、
    配列番号７〜３５のいずれか１つを有するポリペプチドをコードする核酸を、提示タンパク質をコードする核酸に融合し、融合タンパク質をコードする組換え核酸を生成する工程；
    該融合タンパク質をコードする組換え核酸を変異させ、変異融合タンパク質をコードする変異核酸を生成する工程；
    該変異融合タンパク質を発現する工程；および
    ２つの別個のポリペプチドを含む癌関連エピトープに結合し得る変異融合タンパク質を選択する工程であって、該２つの別個のポリペプチドが、配列番号３のサイトケラチン８を含む第１のポリペプチドおよび配列番号４のサイトケラチン１８を含む第２のポリペプチドを含む、工程、
    を包含する、方法。
  66. 請求項６５に記載の方法であって、ここで、前記結合実体が、ＣＤＲフラグメントまたはＦａｂフラグメントである、方法。
  67. 請求項６５に記載の方法であって、ここで、前記提示タンパク質が、ファージ提示タンパク質、レトロウイルス提示タンパク質、またはリボソーム提示タンパク質である、方法。
  68. 哺乳動物において癌を処置および／または予防する医薬の調製のための請求項３０の治療組成物の使用。
  69. 哺乳動物において癌を処置および／または予防する医薬の調製のための請求項４０の治療組成物の使用。
JP2003557527A 2002-01-03 2003-01-03 癌関連エピトープ Pending JP2005523888A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34520802P 2002-01-03 2002-01-03
PCT/US2003/000297 WO2003057168A2 (en) 2002-01-03 2003-01-03 Cancer-associated epitope

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2005523888A true JP2005523888A (ja) 2005-08-11
JP2005523888A5 JP2005523888A5 (ja) 2005-12-22

Family

ID=23354043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003557527A Pending JP2005523888A (ja) 2002-01-03 2003-01-03 癌関連エピトープ

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20050048070A1 (ja)
EP (1) EP1461001A4 (ja)
JP (1) JP2005523888A (ja)
CN (1) CN1639185A (ja)
AU (1) AU2003207459A1 (ja)
WO (1) WO2003057168A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160114716A (ko) * 2014-02-05 2016-10-05 후지레비오 디아그노스틱스 에이비 악성 신생물 질환의 검출을 위한 조성물 및 방법

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003086456A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Arius Research, Inc. Anti-ck18 monoclonal antibody and therapeutic and diagnostic uses thereof in cancer
JPWO2005043166A1 (ja) * 2003-10-30 2007-11-29 シスメックス株式会社 子宮腺癌の診断薬及び腺癌細胞の検出方法
WO2005074968A2 (en) * 2004-02-10 2005-08-18 Universiteit Maastricht Medical use of basic peptides
FR2869909B1 (fr) 2004-05-04 2007-12-21 Univ Angers Peptide capable d'inhiber la polymerisation de la tubuline et son utilisation pour inhiber la proliferation cellulaire
JPWO2006030602A1 (ja) * 2004-09-16 2008-05-08 田辺三菱製薬株式会社 卵巣癌の診断および／または治療薬
EP1870458B1 (en) 2005-03-31 2018-05-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha sc(Fv)2 STRUCTURAL ISOMERS
CN101262885B (zh) 2005-06-10 2015-04-01 中外制药株式会社 含有sc(Fv)2的药物组合物
KR101367544B1 (ko) 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
WO2009003489A1 (en) * 2007-07-02 2009-01-08 Natimmune A/S CaOU-1 EPITOPE BINDING POLYPEPTIDES
FR2945952B1 (fr) * 2009-05-27 2013-10-04 Univ Claude Bernard Lyon Anticorps anti-ck8 pour utilisation comme medicament.
US9255142B2 (en) 2010-09-09 2016-02-09 Beijing Cotimes Biotech Co., Ltd. Blood markers for diagnosing epithelium derived cancers and monoclonal antibodies thereof
GB201214007D0 (en) * 2012-08-07 2012-09-19 Scancell Ltd Anti-tumour immune responses to modified self-epitopes
KR20240096798A (ko) 2012-10-24 2024-06-26 인리젠 신장 세포 모집단 및 이의 용도
US20190099475A1 (en) * 2015-04-08 2019-04-04 Nantomics, Llc Cancer neoepitopes
CA3172682A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Nantomics, Llc Cancer neoepitopes
JP2018532736A (ja) 2015-10-12 2018-11-08 ナントミクス，エルエルシー チェックポイント阻害物質への感受性を予測するｍｓｉおよびネオエピトープの探索のための系、組成物、および方法
CN110117323B (zh) * 2018-02-07 2023-01-10 海默斯（重庆）医学生物技术有限公司 一种可溶性人源角蛋白及其应用
CN109134647B (zh) * 2018-08-28 2020-08-04 东莞市朋志生物科技有限公司 Ns1蛋白的结合蛋白
JP7440509B2 (ja) * 2018-11-09 2024-02-28 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター Ｃｄｃｐ１－標的化療法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) * 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4275149A (en) * 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4331647A (en) * 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
DK169987D0 (da) * 1987-04-03 1987-04-03 Jens Christian Jensenius Human tumor-associated antigen, ca-ou1
US5338832A (en) * 1987-07-02 1994-08-16 Akzo N.V. Antigen recognized by MCA 16-88
EP0340356A1 (en) * 1988-05-05 1989-11-08 Kabushiki Kaisha Akita A block-formed basidiomycete and a method of cultivation for the same
SE470273B (sv) * 1990-09-24 1993-12-20 Idl Immunodeveloplab Ab Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer
DK0564531T3 (da) * 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
CA2293632C (en) * 1997-06-12 2011-11-29 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
US5994511A (en) * 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
US20030125245A1 (en) * 1999-06-30 2003-07-03 Tongtong Wang Compositions and methods for therapy and diagnosis of lung cancer

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6008049591, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ, 1997, Ｖｏｌ． ９４, ｐ． ８１１０−８１１５ *
JPN6008049594, Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, 1993, Ｖｏｌ． ５３, ｐ． ５９２０−５９２８ *
JPN6008049595, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, 1991, Ｖｏｌ． ３０, ｐ． １０８３２−１０８３８ *
JPN6008049598, Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ, 1992, Ｖｏｌ． １１, ｐ． １２１−１３４ *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160114716A (ko) * 2014-02-05 2016-10-05 후지레비오 디아그노스틱스 에이비 악성 신생물 질환의 검출을 위한 조성물 및 방법
JP2017506338A (ja) * 2014-02-05 2017-03-02 フジレビオ・ダイアグノスティックス・アーベー 悪性腫瘍性疾患を検出するための組成物および方法
KR102280473B1 (ko) 2014-02-05 2021-07-22 후지레비오 디아그노스틱스 에이비 악성 신생물 질환의 검출을 위한 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20050048070A1 (en) 2005-03-03
WO2003057168A2 (en) 2003-07-17
CN1639185A (zh) 2005-07-13
EP1461001A2 (en) 2004-09-29
WO2003057168A3 (en) 2003-12-04
EP1461001A4 (en) 2010-03-31
AU2003207459A8 (en) 2003-07-24
AU2003207459A1 (en) 2003-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2005523888A (ja) 癌関連エピトープ
JP7003036B2 (ja) グリコシル化ｐｄ－１に対して特異的な抗体およびその使用方法
RU2661772C2 (ru) Антитела против клаудина 18.2 для диагностики рака
JP5328155B2 (ja) Ａｄａｍ−９モジュレータ
CN111777681B (zh) 一种结合紧密连接蛋白-18.2的抗体及其用途
JP2021006582A (ja) 血漿カリクレイン結合タンパク質
JP4727992B2 (ja) 癌転移および癌転移に伴なう骨量減少を予防および処置するための方法
JP2021087432A (ja) トランスサイレチン（ｔｔｒ）アミロイドーシスに対する抗体療法及びそのためのヒト由来抗体
JP4124486B2 (ja) ガン細胞を特異的に検出する抗原結合フラグメント、このフラグメントをコードするヌクレオチド、ならびにガンの予防および検出のためのその使用
JP3492373B2 (ja) モノクローナル抗体
US7183384B2 (en) Monoclonal antibody 7H11 reactive with human cancer
DK2457928T3 (en) Monoclonal human tumor-specific antibody
CN107098970B (zh) 结合细胞内prl-1多肽或prl-3多肽的抗体
CN114106099A (zh) 蛋白裂解酶和u型纤溶酶原激活物的底物和其它可裂解部分及其使用方法
CN108064243B (zh) 对lox1具有特异性的结合蛋白及其用途
JP2002515235A (ja) 坑アミロイド抗体を用いるアミロイドの除去方法
NZ276745A (en) Antibodies recognising a tumour related antigen ca55.1 its production and use
JP2018510613A (ja) 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）抗体およびその派生使用
JPH07501806A (ja) ヒトｐｄｇｆベータ・レセプタに対する阻害性免疫グロブリン・ポリペプチド
US8629247B2 (en) Antibodies against prostate specific membrane antigen
JP2005503756A (ja) 硫酸化部分を含むエピトープを含む単離分子、当該エピトープに対する抗体、及びその使用
US7132510B2 (en) Specific human antibodies for selective cancer therapy
JP2005503756A5 (ja)
US8835608B2 (en) Anti-MRP3 antibodies and methods of use
WO2018142323A1 (en) Anti-psma antibodies and uses thereof for diagnostic and therapeutic applications

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20051207

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080930

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081222

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090106

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090130

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20090130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20091028

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100319