KR20160114716A - 악성 신생물 질환의 검출을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

악성 신생물 질환의 검출을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 두 개의 표적화제를 포함하는 조성물을 제공하는데, 적어도 하나의 제1 표적화제는 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하고, 적어도 하나의 제2 표적화제는 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식한다. 상기 제1 및 제2 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 및 동시에 결합할 수 있다. 본 발명의 조성물은 치료의 효능을 진단 및/또는 예상, 예측하거나, 대상체에서 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암, 및 난소암의 재발을 평가하는 치료의 결과를 평가하는 방법에 사용될 수도 있다.

Description

악성 신생물 질환의 검출을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR DETECTING MALIGNANT NEOPLASTIC DISEASE}
본 발명은 악성 신생물 질환의 분야에 관한 것이다. 특히, 그것은 악성 신생물 질환의 개선된 검출을 위한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 그것의 진단적 및/또는 예후적 사용에 관한 것이다.
환자의 치료 결정 및 관리를 돕기 위해서, 악성 질환의 진단을 도울 수 있는, 단순하고, 정확하며 비용 효율적인 방법이 엄청나게 필요하다. 현재 이용 가능한 종양 마커는, 몇 가지를 제외하고는, 민감도 및 특이성의 결핍으로 인해 치료 모니터링으로 축소되었다. 근본적으로 모든 종양 마커는 단일 마커로서 만족스럽지 못하며 확립된 마커를 새롭고 더 특이적인 마커로 보충할 필요가 있다. 특히 종양 특이성의 결핍, 즉, 다양한 양성 질병, 예를 들어, 간경화증(liver cirrhosis), 신부전(kidney failure) 및 다양한 조직의 일반적인 염증에서 증가된 마커 값은 현재 이용 가능한 종양 마커의 핵심적인 문제이다.
아폽토시스성(apoptotic) 또는 괴사성 종양 및 비-종양 세포로부터 방출된, 혈청에서 순환하는 케라틴 또는 이것의 단편은 여러 암에서 질환 진행을 모니터링하기 위한 종양 마커로 사용되었다. 상피 세포-특이적 방식에서 다수의 케라틴의 발현 및 케라틴 발현 프로파일이 신생세포 형질전환(neoplastic transformation) 중에 비교적 안정하게 유지된다는 사실은 왜 케라틴이 흔히 사용되는 종양 마커인지를 설명한다.
가장 흔하게 사용되는 케라틴 종양 마커는 조직 폴리펩타이드 항원 (TPA; 케라틴 8 (K8), 케라틴 18 (K18), 및 케라틴 19 (K19)의 혼합물), 조직 폴리펩타이드-특이적 항원 (TPS; K18로부터 유래됨), 시토케라틴 단편 21-1 (CYFRA 21-1; K19로부터 유래됨)이다. TPA는 유방, 대장, 폐, 및 방광을 수반하는 것들을 포함하는, 다양한 상피 세포-관련 암종에 걸린 개체를 확인하기 위한 잠재적 혈청 마커로서 사용되었다. TPS는 임상적으로 유방, 난소, 전립선의 암에 걸린 개체의 관리에 사용되었고 CYFRA 21-1는 폐암에 걸린 개체의 관리에 사용되었다. TPA, TPS, 및 CYFRA 21-1의 주요 잠재적인 임상적 사용은 치료 반응 및 종양 재발을 모니터링하고 예후적 정보를 제공하기 위한 것이다. 종양 마커로서 일상적인 사용의 권장을 위해서, 이 마커들은 기관 특이성의 결핍 및 비악성 질환에서 높아진 혈청 수준으로 인해 임상적 유용성을 제한하였다. 높은 TPS 및 TPA 수준은 여러 간 질환 및 다양한 염증성 질환의 맥락에서 발견된다. CYFRA 21-1은 가장 특이적인 케라틴 마커이고 광범위하게 용인된다. 하지만, CYFRA 수준은 간질성 폐 섬유증(interstitial pulmonary fibrosis) 및 신부전(renal failure)을 동반한다. 또한 심부전(cardiac heart failure)에서 CYFRA 수준은 위양성(false positive) 결과로 이어진다.
상기 언급된 바와 같이 현재 사용되는 종양 마커, CYFRA 21-1, 뿐만 아니라, 예를 들어, 암 태아성 항원 (CEA), 암 항원 125 (CA125), 암 항원 19-9 (CA 19-9), 암 항원 15-3 (CA15-3), 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE), 편평상피 암종 (SCC)는 몇 가지를 언급하기 위해 위양성 결과의 문제를 제공한다.
따라서 단순하고 믿을 만한 방식으로 악성 신생물 질환을 진단하고 예상할 때 더 나은 진단적 및 예후적 마커, 수단 및 방법, 뿐만 아니라 악성 신생물 질환을 검출하기 위해 정확하고 덜 편향된 방법 또는 검정을 수행하기 위한 수단을 찾는 것이 절실하게 필요하다. 따라서, 악성 신생물 질환을 진단하거나 예상할 때 일상적인 테스트를 위한 단순하고 효율적인 방식으로, 정확하고 덜 편향된 진단적 검정을 수행하기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
이 목적은 적어도 두 개의 표적화제를 포함하는 조성물을 제공함으로써 달성될 수도 있는데, 적어도 하나의 제1 표적화제는 케라틴 7 (K7) 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하고, 적어도 하나의 제2 표적화제는 케라틴 19 (K19) 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식한다. 상기 제1 및 제2 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 및 동시에 결합할 수 있다.
제1 및/또는 제2 표적화제는 표적화된 펩타이드 또는 이것의 단편(들)을 인식하고 이것에 결합하는 어떤 종류의 분자도 될 수 있다. 제1 표적화제는 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식한다. 케라틴 7 (K7)은 인간에서 KRT7 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 케라틴 7은 II형 케라틴이고 내부 기관의 공동을 라이닝하는(lining) 단순 상피에서 및 선 분비관(gland duct) 및 혈관에서 특이적으로 발현된다. K7은 51 kDa 단백질이고, 469개의 아미노산 길이이다.
제2 표적화제는 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식한다. 케라틴 19 (K19)는 인간에서 KRT19 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. K19는 주피, 발달 표피를 덮고 있는 일시적 표면층에서 특이적으로 발견되는 I형 케라틴이다. K19는 44 kDa 단백질이고, 400개의 아미노산 길이이다.
제1 및/또는 제2 표적화제는 리간드, 억제자, 펩티드 유사 화합물, 펩타이드, 단백질, 항체, 항체의 항원-결합 단편(들), 및/또는 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 유리하게 선택된다. 제1 및 제2 표적화제 둘 다는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 및 동시에 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체"는 전장 케라틴 7 및 전장 케라틴 19 사이의 평행한 및 인 레지스터(in register) 다이머, 및 이것의 단편으로부터 기원한 분자적 실체물을 의미하기 위한 것이다. 용어는 케라틴 7 및 케라틴 19 사이에서 역평행 테트라머를 형성하는, 케라틴 7 및 케라틴 19 사이의 중첩 다이머, 및 이것의 단편을 더 포함한다. 그것은 이 테트라머들로부터 조립된 올리고머, 프로토필라멘트(protofilament) 및 필라멘트(filament)를 더 포함한다.
케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체에는, 끊김 없는 서열에서, 이형 복합체의 케라틴 7 모이어티로부터 유래된, 최소한 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개 또는 적어도 30개, 하지만 더 바람직하게는 40개 이상의 아미노산이 있어야 하고, 끊김 없는 서열에서, 이형 복합체의 케라틴 19 모이어티로부터 유래된, 최소한 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개 또는 적어도 30개, 하지만 더 바람직하게는 40개 이상의 아미노산이 있어야 한다. 상기 아미노산은 각각 케라틴 7 또는 케라틴 19에 고유한 것이어야 한다.
유리하게는, 끊김 없는 서열에서, 상기 최소한 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개 또는 적어도 30개, 하지만 더 바람직하게는 40개 이상의 아미노산은 케라틴 7에서 256-412 아미노산 서열의 것이다. 더 바람직하게는 끊김 없는 서열은 케라틴 7에서 300-380 아미노산 서열의 것이다. 유리하게는, 끊김 없는 서열에서, 상기 최소한 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개 또는 적어도 30개, 하지만 더 바람직하게는 40개 이상의 아미노산은 케라틴 19에서 244-400 아미노산 서열의 것이다. 더 바람직하게는 끊김 없는 서열은 케라틴 19에서 311-375 아미노산 서열의 것이다. 제1 및 제2 표적화제가 상기 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 및 동시에 결합할 때, 그것들은 둘 다 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 결합되어 상기 제1 및 제2 표적화제 및 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하는 트리플렉스(triplex)를 형성할 것이다. 상기 제1 및 제2 표적화제는 트리플렉스가 본원에서 기술된 어떤 수단 또는 방법에 의해, 또는 그 밖에 당업자에게 공지된 수단 또는 방법에 의해 검출되기에 충분히 긴 기간 동안 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)으로 상기 트리플렉스를 형성할 것이다.
한 이로운 구체예에서 제1 또는 제2 표적화제 중 적어도 하나는 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합이다. 유리하게는 제1 및 제2 표적화제 둘 다는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하고 이것에 결합하여, 항원-항체 트리플렉스를 형성하는 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합이다. 따라서 고체 항원-항체 트리플렉스는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하며, 제1 및 제2 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합이 이것에 결합된다. 제1 항체, 이것들의 항원 단편(들) 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 케라틴 7-펩타이드 모이어티에 결합되고, 제2 항체, 항원 단편(들) 또는 이것들의 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 케라틴 19-펩타이드 모이어티에 결합된다.
제1 및 제2 표적화제가 항체, 항원 단편(들) 또는 이것들의 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합일 때, 그것들은 유리하게 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 다른 항원성 부위에 결합할 것이다. 전형적으로 제1 항체, 이것들의 항원 단편(들) 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 케라틴 7 모이어티 상에 위치한 항원성 부위를 인식하고 이것에 특이적으로 결합한다. 제2 항체, 이것들의 항원 단편(들) 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 케라틴 19 모이어티 상에 위치한 항원성 부위를 인식하고 이것에 특이적으로 결합한다.
상기 제1 및 제2 표적화제는 어떤 순서로도 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 결합하여, 이것들과 함께 트리플렉스를 형성할 수도 있다. 이것은 한 구체예에서 제1 표적화제가 먼저 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 케라틴 7 모이어티에 결합하여, 듀플렉스(duplex)를 형성한다는 것을 의미한다. 그 이후 제2 표적화제는 상기 듀플렉스의 케라틴 19 모이어티에 결합하여 트리플렉스를 형성할 것이다.
또 다른 구체예에서는 제2 표적화제가 먼저 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 케라틴 19-모이어티에 결합하여 듀플렉스를 형성한다. 그 이후 제1 표적화제는 트리플렉스를 형성하기 위해 상기 듀플렉스의 케라틴 7-모이어티에 결합할 것이다. 추가의 구체예에서, 제1 및 제2 표적화제 둘 다는 실질적으로 동시에 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 결합할 것이다.
한 유리한 구체예에서 제1 및/또는 제2 표적화제는 1차 항체, 및 또는 이것의 단편(들)이고, 추가의 유리한 구체예에서 상기 제1 및/또는 제2 표적화제는 단클론성 또는 재조합 항체, 및 또는 이것의 단편(들)이다.
제1 표적화제가 항체일 때, 그것은 유리하게 항체 C-35, C-62, C-68, C18, C35, KS 7.18, LDS-68, LP1K, 및 RCK105 또는 이것들의 항체 단편(들), 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 이것들은 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하고, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 결합하는 능력을 가지고 있다. 유리하게는 제1 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 7 모이어티 상에 위치한 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 7개, 또는 10개 이상의 아미노산의 서열을 인식하고, 이것들은 케라틴 7 단백질 서열에 고유하다. 유리하게는 상기 제1 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 7 모이어티에서 256-412 아미노산 서열 내에 위치한 서열을 인식한다. 더 바람직하게는 상기 서열은 케라틴 7 모이어티에서 300-380 아미노산 서열의 것이다.
유리하게는 케라틴 7 펩타이드 또는 이것의 단편을 인식하는 항체는 Progen Biotechnik, GmBH, Germany로부터 이용 가능한 클론 Ks 7.18에 의해 생산된 Ks 7.18 단클론성 항체이다. 단클론성 항체 KS 7.18은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 또는 이것의 단편(들)의 K7 모이어티의 아미노산 300-350에 특이적으로 결합한다.
대안으로 케라틴 7 펩타이드 또는 이것의 단편을 인식하는 항체는 Acris Antibodies Gmbh로부터 이용 가능한 클론 RCK105에 의해 생산된 RCK105 단클론성 항체이다.
제2 표적화제가 항체일 때, 그것은 유리하게 항체 A53-B/A2.26 aka, Ks19.1, BM-19.21, CCD003, CCD004, CKS04, CKS06, CKS14, K19.2, KM 4.62, LP2K, SA 21, 및 SA45 또는 이것들의 항체 단편(들) 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 이것들은 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하고, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 결합하는 능력을 가지고 있다. 유리하게는 제2 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 19 모이어티 상에 위치한 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산의 서열을 인식하고, 이것들은 케라틴 19 단백질 서열에 고유하다. 유리하게는 상기 서열은 케라틴 19에서 244-400 아미노산 서열 내에 위치한다. 더 바람직하게는 서열은 케라틴 19에서 311-375 아미노산 서열의 것이다.
유리하게는 케라틴 19 펩타이드 또는 이것의 단편(들)을 인식하는 항체는 Roche Diagnostics로부터 이용 가능한 클론 BM-19.21에 의해 생산된 BM-19.21 단클론성 항체이다. BM 19.21은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 K19 모이어티의 아미노산 346-367에 특이적으로 결합한다.
대안으로 케라틴 19 펩타이드 또는 이것의 단편(들)을 인식하는 항체는 Progen Biotechnik, GmBH로부터 이용 가능한 Ks 19.2 단클론성 항체이다. Ks 19.2는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 K19 모이어티의 아미노산 352-368에 특이적으로 결합한다.
대안으로 케라틴 19 펩타이드 또는 이것의 단편(들)을 인식하는 항체는 클론 Ks 19.1 aka A53-B/A2에 의해 생산된 Ks 19.1 단클론성 항체이다. Ks 19.1은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 K19 모이어티의 아미노산 311-335에 특이적으로 결합한다.
유리하게는 제1 표적화제는 Ks 7.18 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 BM-19.21 단클론성 항체이다.
대안으로 제1 표적화제는 Ks 7.18 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 Ks 19.2 단클론성 항체이다.
대안으로 제1 표적화제는 RCK105 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 Ks 19.1 단클론성 항체이다.
본 발명의 추가의 양태는 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
a) 상기 생물학적 샘플을 본원에서 기술된 조성물과 접촉시키는 단계; 또는 대안으로
b) 상기 생물학적 샘플을 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 생물학적 샘플을 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
d) 상기 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하는 단계
를 포함하며; 단계 b) 및 c)는 어떤 순서로도, 또는 동시에 수행될 수 있다.
방법의 유리한 구체예에서, 본원에서 개시된 조성물은 적합한 조건 하에서 생물학적 샘플을 접촉시키는데 사용된다. 상기 조성물 및 생물학적 샘플이 접촉되는 적합한 조건의 예는 하기 본원의 다른 곳에서도 기술된다. 그 후에 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)은 본원에서 또한 기술된 어떤 적합한 방법에 의해서도 검출된다.
대안으로 제1 및 제2 표적화제는 별도로 제공되지만 조성물로서는 아니다. 하지만, 생물학적 샘플은 어떤 순서로도 상기 제1 및 제2 표적화제와 접촉될 수 있다. 그러므로, 한 구체예에서는 생물학적 샘플이 먼저 생물학적 샘플에 존재하는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 케라틴 7 모이어티에 결합하는 제1 표적화제를 접촉시키고, 제1 표적화제 및 이형 복합체 사이에서 듀플렉스를 형성한다. 그 후에 제1 표적화제 및 이형 복합체 사이에서 이와 같이 형성된 상기 듀플렉스는 상기 형성된 듀플렉스의 케라틴 19 모이어티에 결합하는 제2 표적화제와 접촉되고 이로 인해 이형 복합체에 결합된 제1 및 제2 표적화제를 포함하는 트리플렉스를 형성할 것이다.
또 다른 구체예에서 생물학적 샘플은 먼저 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 케라틴 19 모이어티에 결합하는 제2 표적화제를 접촉시키고 제2 표적화제 및 이형 복합체 사이에서 듀플렉스를 형성할 것이다. 그 후에 이와 같이 형성된, 제2 표적화제 및 이형 복합체를 포함하는 상기 듀플렉스는 상기 듀플렉스의 케라틴 7 모이어티에 결합하는 제1 표적화제와 접촉되고 이로 인해 제1 및 제2 표적화제 및 이형 복합체를 포함하는 트리플렉스를 형성할 것이다.
추가의 구체예에서, 제1 및 제2 표적화제 둘 다는 실질적으로 동시에 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 결합할 것이다.
그 후에 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)은 하기 기술된 바와 같이 어떤 적합한 방법에 의해서도 검출된다.
시험관 내 방법에서 사용된 제1 및 제2 표적화제는 유리하게는 상기 기술된 바와 같다.
생물학적 샘플은 고체 조직 샘플, 예를 들어, 생검 시료, 조직 배양물 또는 그것들로부터 유래된 세포, 및 그것들의 자손, 임상 샘플, 배양 중인 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 또는 체액으로 구성된 군으로부터 선택된 어떤 샘플도 될 수 있다. 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)은 생물학적 샘플에서 발현될 수도 있거나 그렇지 않을 수도 있다.
유리하게는 방법은 생물학적 유체 샘플, 예를 들어, 혈청, 혈장, 림프, 삼출물, 배설물, 위산, 위액, 림프, 점액, 심막액, 복막액, 흉수, 고름, 타액, 가래, 관절 낭액, 눈물, 땀, 질 분비물, 토사물 및 소변에 사용된다. 특히 유리한 구체예에서 방법은 혈액, 혈장 및 또는 혈청 샘플에 사용된다.
유리한 구체예에서 방법은 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현을 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하는 추가의 단계를 포함하는데, 양성 대조군은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하고, 음성 대조군은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하지 않는다.
유리한 구체예에서 상기 양성 대조군은 악성 신생물 질환으로 고통받고 있는 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플이고, 상기 음성 대조군은 악성 질환으로 고통받고 있지 않은 건강한 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플이다.
추가의 구체예에서 방법은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양을 스코어링(scoring)하는 단계를 포함할 수도 있다. 스코어링 단계는 업계에 공지되거나 본원에서 기술된 표준 스코어링 시스템에 따라 검출된 표적화제 복합체에 의해 실시될 수도 있다.
유리하게는 방법은 자동화된 판독 장치 상에서 수행되거나 검출은 수동으로 수행된다.
본 발명의 한 추가의 양태는
i) 대상체에서 악성 신생물 질환의 진단 및/또는 예상, 및/또는
ii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능의 예측, 및/또는
iii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과의 평가, 및/또는
iv) 대상체에서 악성 신생물 질환의 재발의 평가
를 위한 시험관 내 방법인데
대상체는 악성 신생물 질환에 걸린, 또는 걸린 것으로 의심되는 포유동물이다.
대상체는 인간, 비인간 영장류, 예를 들어, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종, 가축, 예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말, 애완용 포유동물, 예를 들어, 개 및 고양이, 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트 및 기니피그를 포함하는 실험동물로 구성된 군의 포유동물이다. 유리하게는 대상체는 인간 및 비-인간 포유동물을 포함하는 포유동물이다. 가장 유리한 구체예에서, 대상체는 인간이다.
악성 신생물 질환은 담관암 (bile duct cancer; 간 외), 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 불명 암종 (원발 부위), 자궁경부암(cervical cancer), 결장암(colon cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 식도암(esophageal cancer), 쓸개암(gallbladder cancer), 위장암(gastric cancer) (위암(stomach cancer)), 두경부암(head and neck cancer), 간세포암(hepatocellular cancer) (간암 (liver cancer)), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 신장암(kidney cancer), 후두암(laryngeal cancer), 간암 (일차성), 폐암 (비-소세포), 폐암 (소세포), 중피종(mesothelioma), 비-소세포 폐암, 난소암(ovarian cancer), 상피성 난소암 (표면 상피-간질성 종양(surface epithelial-stromal tumor)), 난소 생식세포 종양(ovarian germ cell tumor), 저악성 잠재성 난소 종양(ovarian low malignant potential tumor), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 직장암(rectal cancer), 신세포 암종 (renal cell carcinoma; 신장암), 침샘암(salivary gland cancer), 소세포 폐암, 소장암(small intestine cancer), 위암, 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 신우 및 요관의 이행세포암(transitional cell cancer), 또는 자궁암(uterine cancer) (자궁 내막)으로 구성된 군 중 하나일 수도 있다.
유리하게는 악성 신생물 질환은 폐암, 방광암, 식도암(esophagus cancer), 간세포암, 췌장암, 위암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 방법은 악성 신생물 질환이 폐암, 방광암, 식도암, 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택될 때 특히 유리하다.
대상체에서 악성 신생물 질환을 진단 및/또는 예상할 때, 방법은
a) 주어진 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계
b) 상기 생물학적 샘플을 본원에서 기술된 조성물과 접촉시키는 단계; 또는 대안으로
c) 상기 생물학적 샘플을 시토케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
d) 상기 생물학적 샘플을 시토케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
e) 상기 시토케라틴 7과 시토케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하는 단계; 및
f) 검출된 시토케라틴 7과 시토케라틴19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양을 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하고, 이로 인해 대상체에서 악성 신생물 질환을 진단 및/또는 예상하는 단계
를 포함하며, 단계 c) 및 d)는 어떤 순서로도, 또는 동시에 수행될 수 있다.
선택적으로, 업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 표준 스코어링 시스템에 따라 검출된 항원-항체 복합체의 스코어링이 실시될 수도 있다.
샘플은 아마도 악성 신생물 질환을 포함하는 어떤 샘플도 될 수 있다. 추가의 구체예는 양성 대조군이 악성 신생물 질환으로 고통받고 있는 대상체의 세포를 포함한다는 것이다. 추가의 구체예는 음성 대조군이 악성 신생물 질환으로 고통받고 있지 않은 건강한 대상체의 세포를 포함한다는 것이다.
악성 신생물 질환으로 고통받고 있는 대상체에서 치료 결과를 예측할 때, 방법은
a) 악성 신생물 질환으로 고통받고 있는 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계
b) 상기 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 발현을 검출하는 단계; 및
c) 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 발현을 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하고, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편의 검출된 발현에 기초하여 상기 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과를 예측하는 단계를 포함한다.
악성 신생물 질환이 치료되고 있는 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능을 평가할 때, 방법은
a) 악성 신생물 질환에 대한 치료를 거친 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 발현을 검출하는 단계;
c) 악성 신생물 질환에 대한 상기 대상체의 치료 중에 하나 이상의 시점에서 a) 및 b)를 반복하는 단계
를 포함하는데, 시간이 흐름에 따른 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 상대적 발현의 변화는 치료의 효능을 나타낸다.
따라서, 효율적 치료의 징후는 방법을 반복하는 단계에서 분석된 이전의 샘플에 비해 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 발현 감소의 상대적인 변화이다.
선택적으로, 업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 표준 스코어링 시스템에 따라 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 스코어링이 실시될 수도 있다.
샘플은 아마도 악성 신생물 질환을 포함하는 어떤 샘플, 바람직하게는 악성 신생물 질환에 걸린 대상체의 생물학적 샘플도 될 수 있으며, 상기 대상체는 치료될 예정이거나, 치료 중간에 있거나 또는 현재 치료 중이다.
악성 신생물 질환의 재발을 평가할 때, 방법은
a) 이전에 악성 신생물 질환에 걸린 적이 있는 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계,
b) 상기 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 발현을 검출하는 단계,
c) 악성 신생물 질환에 대한 상기 대상체의 치료 중에 하나 이상의 시점에서 a) 및 b)를 반복하는 단계
를 포함하는데, 시간이 흐름에 따른 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 상대적 발현의 변화는 악성 신생물 질환의 재발을 나타낼 수도 있다.
따라서, 재발의 징후는 방법을 반복하는 단계에서 분석된 이전의 샘플에 비해 악성 신생물 질환을 확인하는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 양의 증가의 상대적인 변화, 즉, 케라틴 7과 케라틴 19의 단백질 마커 이형 복합체의 발현의 시간이 흐름에 따른 증가이다.
추가의 양태에서 본 발명은 다음을 위한 시험관 내 방법의 사용을 제공한다:
i) 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및 또는 이것의 단편(들)의 검출, 및/또는
ii) 악성 신생물 질환의 검출; 및/또는
iii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 진단 또는 예상, 및/또는
iv) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과의 예측, 및/또는
v) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능의 평가, 및/또는
vi) 대상체에서 악성 신생물 질환의 재발의 평가.
추가의 양태에서 본 발명은
i) 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 검출; 및/또는
ii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 검출; 및/또는
iii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 진단 또는 예상; 및/또는
iv) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과의 예측; 및/또는
v) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능의 평가; 및/또는
vi) 대상체에서 악성 신생물 질환의 재발의 평가
를 위한 키트를 제공하며,
키트는 다음을 포함한다:
a) 본원에서 기술된 조성물; 또는 대안으로
b) 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
c) 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기; 및
d) 선택적으로 본원에서 기술된 방법을 수행하기 위한 설명서.
도 1은 케라틴 단백질 구조 및 필라멘트 조립체를 나타낸다.
도 2는 K7/19 검정에 대한 전형적인 보정 곡선을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 검정된 양성 질환에 대한 민감도 대 95% 특이성을 나타낸다.
도 4는 난소암에서 다른 종양 마커, CA125, HE4, K7/19 및 CYFRA를 비교하는 ROC-곡선을 나타낸다.
도 5는 조합 CA125EIA & HE4 EIA를 조합 CA125EIA & K7/19 검정과 비교하는 ROC-곡선을 나타낸다.
본 발명이 기술되기 전에, 본 발명은, 방법, 장치, 및 제형이 물론 달라질 수도 있기 때문에, 기술된 특정 구체예에 제한되지 않는 것으로 생각되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술하기 위한 목적을 위한 것이며, 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아닌 것으로 생각되어야 한다. 본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 달리 분명하게 나타나지 않으면 복수의 지시대상을 포함하고, 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 지시대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다.
본 발명에서 사용된 용어는, 일반적으로, 분자 생물학의 당업자에 의해 일반적으로 용인되는 표준 정의를 따르는 것으로 예상된다. 몇몇 예외는, 하기 나열된 바와 같이, 본 발명의 범위 내에서 더 한정되었다.
"적어도 하나"는 본원에서 사용된 바와 같이 하나 이상, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등을 의미한다.
"검출", "검출하다", "검출하는"은 본원에서 사용된 바와 같이 대조군을 참조하거나 참조하지 않는 정성적 및/또는 정량적 검출 (측정하는 수준)을 포함하고, 주어진 단백질, 구체적으로 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재, 부재, 또는 양의 확인을 더 말한다.
"진단"은 본원에서 사용된 바와 같이 질환의 특성의 확인을 포함한다.
"예후"는 본원에서 사용된 바와 같이 질환의 예상 결과에 관한 예측, 질환으로부터의 회복에 관한 전망을 포함하며 질환의 특성 및 증상에 의해 나타난 바와 같다.
"진양성(true positive)"은 국소화된 또는 전이된 악성 신생물을 가진 상기 대상체를 말한다.
"위음성(false negative)"은 국소화된 또는 전이된 악성 신생물을 가진 상기 대상체를 말하며 진단적 검정에 의해서는 이와 같이 분류되지 않는다.
"진음성(true negative)"은 국소화된 또는 전이된 악성 신생물을 갖고 있지 않고 진단적 검정에 의해 이와 같이 분류되는 상기 대상체를 말한다.
"위양성"은 국소화된 또는 전이된 악성 신생물을 갖고 있지 않지만 통상적인 진단적 검정에 의해 국소화된 또는 전이된 악성 신생물을 가진 것으로 분류되는 상기 대상체를 말한다. 상황에 따라, 용어 "위양성"은 또한 악성 신생물을 갖고 있지 않지만 진단적 검정에 의해 악성 신생물 또는 비-악성 질환을 가진 것으로 분류되는 상기 대상체를 말한다.
"민감도"는, 진단적 검정에 그것의 적용의 맥락으로 본원에서 사용된 바와 같이, 이와 같이 정확하게 확인된 국소화된 또는 전이된 악성 신생물을 가진 모든 대상체의 비율 (즉, 진양성 및 위음성의 수의 합계로 나누어진 진양성의 수)을 말한다.
진단적 검정의 "특이성"은, 진단적 검정에서 그것의 적용의 맥락으로 본원에서 사용된 바와 같이, 이와 같이 정확하게 확인된 국소화된 또는 전이된 악성 신생물을 갖지 않은 모든 대상체의 비율 (즉, 진음성 및 위양성의 수의 합계로 나누어진 진음성의 수)을 말한다.
용어 "신생물" 또는 "종양"은 교체 가능하게 사용될 수도 있으며 비정상적인 조직 덩어리를 말하는데 덩어리의 성장은 정상 조직의 성장을 능가하고 정상 조직의 성장과 조화를 이루지 않는다. 신생물 또는 종양은 다음 특성에 따라 "양성" 또는 "악성"으로 한정될 수도 있다: 형태 및 기능성을 포함하는 세포 분화의 정도, 성장 속도, 국소적 침범 및 전이. "양성" 신생물은 일반적으로 잘 분화되고, 특성상 악성 신생물보다 더 느리게 성장하며 기원의 부위에 국소화된 채로 남아있다. 이에 더하여 양성 신생물은 멀리 떨어져 있는 부위로 침투하거나, 침범하거나 전이하는 능력을 갖고 있지 않다.
"악성" 신생물은 일반적으로 불량하게 분화되고 (퇴화), 특성상 주위 조직의 점진적 침투, 침범, 및 파괴를 동반하여 신속하게 성장한다. 게다가, 악성 신생물은 멀리 떨어져 있는 부위로 전이하는 능력을 가지고 있다. 용어 "전이"는 1차 (원래의) 종양에서 또 다른 기관 또는 조직으로 암세포의 확산 또는 이동을 말하며, 전형적으로 2차 (전이성) 종양이 위치하는 기관 또는 조직이 아니라 1차 (원래의) 종양의 조직 유형의 "2차 종양" 또는 "2차 세포 덩어리"의 존재에 의해 확인 가능하다. 예를 들어, 뼈로 이동한 폐의 암종은 전이된 폐암이라고 하며, 뼈 조직에서 성장하는 상피성 폐 세포로부터 기원한 암세포로 구성된다.
"건강한"은 양호한 건강상태를 보유하고 있는 대상체를 말한다. 이러한 대상체는 어떠한 악성 또는 비-악성 질환의 부재를 입증한다. 본 출원의 맥락에서, "건강한 개체"는 단지 그것들에게 어떠한 악성 또는 비-악성 질환도 없다는 점에서 건강하다; "건강한 개체"는 보통 "건강한" 것으로 간주되지 않는 다른 질환 또는 질병을 가질 수도 있다.
"대상체"는 본원에서 사용된 바와 같이 인간, 비인간 영장류, 예를 들어, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종, 가축, 예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말, 애완용 포유동물, 예를 들어, 개 및 고양이, 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트 및 기니피그를 포함하는 실험동물 등을 포함한다. 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 남성이든 여성이든, 성체 및 새로 태어난 대상체, 뿐만 아니라 태아가 커버되는 것으로 의도된다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 포유동물이며, 인간 및 비-인간 포유동물을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 대상체는 인간이다.
"단클론성 항체" 또는 "mAb"는 본원에서 사용된 바와 같이 단일 아미노산 조성물의 항체를 말하며, 이것은 특이적 항원에 대하여 유도되고 B 세포 또는 하이브리도마(hybridoma)의 단일 클론에 의해 생성된다.
"다클론성 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이 다른 B-세포주로부터 유래된 특이적 항원에 대하여 유도되는 항체를 말한다.
"Fab"는 본원에서 사용된 바와 같이 약 50,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 가진 항체 단편을 말하며, 이것에서, IgG에 프로테아제, 파파인을 처리함으로써 얻어진 단편들 중에서, H 사슬의 N-말단 측면의 약 절반 및 전체 L 사슬이 이황화 결합을 통해 함께 결합된다.
"F(ab')2"는 본원에서 사용된 바와 같이 약 100,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 가진 항체 단편을 말하며, 이것은, IgG에 프로테아제, 펩신을 처리함으로써 얻어진 단편들 중에서, 힌지(hinge) 영역의 이황화 결합을 통해 결합된 Fab보다 약간 더 크다.
"Fab1"은 본원에서 사용된 바와 같이 약 50,000 Da의 분자량 및 항원 결합 활성을 가진 항체 단편을 말하며, 이것은 F(ab')2의 힌지 영역의 이황화 결합을 자름으로써 얻어진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단일 사슬 Fv ("scFv") 폴리펩타이드는 공유 결합에 의해 결합된 VH::VL 헤테로다이머이며, 이것은 보통 펩타이드-암호화 링커에 의해 결합된 VH 및 VL 암호화 유전자를 포함하는 유전자 융합체로부터 발현된다. 본 발명의 인간 scFv 단편은 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 사용함으로써, 적절한 구조로 유지되는 CDR을 포함한다.
"하이브리도마"는 본원에서 사용된 바와 같이 비-인간 포유동물을 항원으로 면역화함으로써 제조된 B 세포를 항원 특이성을 가진 원하는 단클론성 항체를 생산하는 마우스 등으로부터 유래된 골수종(myeloma) 세포와 세포 융합함으로써 얻어진 세포를 나타낸다.
용어 "폴리펩타이드", "단백질", 및 "펩타이드"는 본원에서 교체 가능하게 사용되어 아미노산 잔기가 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산 사슬을 나타낸다. 아미노산 사슬은 두 개 이상의 아미노산의 어떠한 길이도 될 수 있다. 달리 명시되지 않으면, 용어 "폴리펩타이드", "단백질", 및 "펩타이드"는 또한 이것들의 다양한 변형된 형태를 포함한다. 이러한 변형된 형태는 자연적으로 발생한 변형된 형태 또는 화학적으로 변형된 형태일 수도 있다. 변형된 형태의 예는 글리코실화된 형태, 인산화된 형태, 미리스토일화된 형태, 팔미토일화된 형태, 리보실화된 형태, 아세틸화된 형태, 유비퀴틴화된 형태, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 변형은 또한 다양한 모이어티, 예를 들어, 지질, 플라빈, 비오틴, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이것들의 유도체, 등과의 분자 간 교차결합 및 이것들로의 공유 결합에 의한 부착을 포함한다. 이에 더하여, 변형은 또한 환화(cyclization), 분지 및 교차결합을 포함할 수도 있다. 또한, 유전자에 의해 암호화되는 통상적인 20개의 아미노산 이외의 아미노산이 또한 폴리펩타이드에 포함될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "생물학적 샘플"은 악성 신생물을 가지고 있거나 가지고 있지 않은 어떠한 대상체로부터 얻어진 다양한 샘플 유형을 포함한다. 전형적인 대상체는 인간이다; 하지만, 암으로 발달할 수도 있는 악성 신생물을 가진 어떠한 포유동물도 개시된 방법에 유용한 생물학적 샘플의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 개시된 방법에 유용한 예시의 생물학적 샘플은 고체 조직 샘플, 예를 들어, 생검 시료, 조직 배양물 또는 그것들로부터 유래된 세포, 및 그것들의 자손, 임상 샘플, 배양 중인 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 체액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 악성 신생물을 가진 것으로 의심되는 개체로부터 수거된 조직 또는 유체로부터 얻어진 샘플을 포함한다.
생물학적 유체 샘플의 예는 혈청, 혈장, 림프, 삼출물, 배설물, 위산, 위액, 림프, 점액, 심막액, 복막액, 흉수, 고름, 타액, 가래, 관절 낭액, 눈물, 땀, 질 분비물, 토사물 및 소변을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가의 예는 생검 및/또는 미세바늘 흡인물이다. 샘플은 신선한 것이거나 수거 후 가공될 수도 있다 (예를 들어, 목적을 달성하기 위해). 일부 예에서, 가공된 샘플은 고정 (예를 들어, 포르말린-고정)되고 및/또는 왁스- (예를 들어, 파라핀-) 임베딩 (embedded)될 수도 있다. 마운팅된(mounted) 세포 및 조직 제조를 위한 고정액은 업계에 잘 공지되어 있으며, 제한 없이, 95% 알콜 함유 부앙 고정액(Bouin's fixative); 95% 알콜 고정액; B5 고정액, 부앙 고정액, 포르말린 고정액, 카르노프스키 고정액 (Karnovsky's fixative; 글루타르알데하이드), 하트먼 고정액(Hartman's fixative), 올랑드 고정액(Hollande's fixative), 오르트 용액(Orth's solution) (중크롬산염 고정액), 및 젠커 고정액(Zenker's fixative)을 포함한다 (예를 들어, Carson, Histotechology: A Self-Instructional Text, Chicago: ASCP Press, 1997 참조). 일부 예에서, 샘플 (또는 이것의 분획)은 고체 지지물 위에 존재한다.
개시된 방법에 유용한 고체 지지물은 단지 생물학적 샘플을 지탱하기만 하면 되고, 선택적으로, 하지만 유리하게는 샘플에서 원하는 단백질의 편리한 검출을 허용한다. 예시의 지지물은 현미경용 슬라이드 (에를 들어, 유리 현미경용 슬라이드 또는 플라스틱 현미경용 슬라이드), 커버슬립(coverslip) (예를 들어, 유리 커버슬립 또는 플라스틱 커버슬립), 조직 배양 접시, 다중-웰 플레이트, 막 (예를 들어, 나이트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)) 또는 BIACORE®; 칩을 포함한다.
"치료"는 본원에서 사용된 바와 같이 의학적 또는 수술적 수단을 통한 환자의 관리로 한정된다. 치료는 의학적 질병 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하거나 완화하고 치유를 제공하는데 필요하다. 용어 "치료 결과" 또는 "치료의 결과"는 본원에서 사용된 바와 같이 치료 중인 환자에 대한 물리적 효과이다.
용어 "알고리즘"은 본원에서 사용된 바와 같이 두 개 이상의 양 사이의 관계를 제공하는 수식을 말한다. 이러한 식은 선형, 또는 비-선형일 수도 있고, 컴퓨터 메모리에서 다양한 수치적 가중 인자(weighting factor)로서 존재할 수도 있다.
"폐암"은 주어진 대상체 내에서 폐의 신생물, 예를 들어, 악성 신생물을 말하는데, 신생물은 폐의 상피 기원, 즉, 암종이다. 폐 암종은 악성 세포의 크기 및 외관에 의해 분류되고 용어 "폐암"은 비-소세포 폐암 (NSCLC) 및 소세포 폐암 (SCLC) 둘 다를 포함한다. 용어 "폐암"은, 조건 없이 사용될 때, 국소화된 및 전이된 폐암 둘 다를 포함한다. 용어 "폐암"은 다른 유형의 종양들과 구별하기 위해 용어 "국소화된" 또는 "전이된"에 의해 규정될 수 있으며, "국소화된"이 원래의 모체 종양을 말하고, 종양으로 전이된 것은 원래의 모체 종양으로부터 확산된 것을 말한다.
TNM 시스템 (종양, 절(node), 전이)은 초기 평가에서 NSCLC를 단계화하는데 사용될 수도 있다. TNM 기술어를 사용하여, 군은 잠재암으로부터, 병기(stage) 0, IA (1-A), IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB 및 IV (4)까지 할당된다. 이 병기 군은 치료의 선택 및 예후의 추정을 돕는다.
소세포 폐 암종은 전통적으로 '제한 병기(limited stage)' (흉부의 절반에 및 단일 허용 가능한 방사선 치료 분야의 범위 내로 국한됨) 또는 "진행 병기(extensive stage)" (더 광범위한 질환)로 분류되었다. 하지만, TNM 분류 및 군화는 예후를 추정하는데 있어서 유용하다.
NSCLC 및 SCLC 둘 다에 대하여, 두 가지 일반적인 유형의 병기 결정 평가(staging evaluation)는 임상적 병기 결정 및 수술적 병기 결정이다. 임상적 병기 결정은 최종 수술 전에 수행된다. 그것은 이미지화 연구 (예를 들어, CT 스캔 및 PET 스캔)의 결과 및 생검 결과에 기초한다. 수술적 병기 결정은 수술 중에 또는 그 후에 평가되고, 흉부 림프절의 수술 샘플링을 포함하는, 수술적 및 임상적 결론의 통합된 결과에 기초한다.
"난소암"은 주어진 여성 대상체 내에서 난소의 신생물, 예를 들어, 악성 신생물을 말하며, 신생물은 상피 기원이다.
용어 "난소암"은, 조건 없이 사용될 때, 국소화된 및 전이된 난소암 둘 다를 포함한다. 용어 "난소암"은 다른 유형의 종양들과 구별하기 위해 용어 "국소화된" 또는 "전이된"에 의해 규정될 수 있으며, "국소화된"이 원래의 모체 종양을 말하고, 종양으로 전이된 것은 원래의 모체 종양으로부터 확산된 것을 말한다.
난소암은 AJCC/TNM 시스템에 따라 단계화될 수 있다. 이것은 1차 종양의 규모 (T), 근처의 림프절로의 전이의 부재 또는 존재 (N), 및 먼 거리 전이의 부재 또는 존재 (M)를 기술한다. 1차 종양의 규모는 세 개의 하위 범주 T1, T2, T3을 함유한다. 이것은 FIGO 시스템이라 불리는, 대부분의 부인과 종양학자에 의해 실제로 사용되는 시스템과 매우 유사하다. 둘 다 실제 병기에 대한 수술 결과에 의존한다. FIGO 시스템에서 종양 병기는 종양이 얼마나 멀리까지 확산되는지에 따라 I-IV로 분류된다. 병기 IV가 최악인 경우에는 종양이 그것의 추정 한계까지 확산되었다는 것을 의미한다. 병기 I-III은 하위 범주 A, B 및 C를 함유한다.
"식도암"은 주어진 대상체 내에서 식도의 신생물, 예를 들어, 악성 신생물을 말하며, 신생물은 식도의 상피 기원, 즉, 암종이다. 이 암종은 두 가지 부류, 선암종(adenocarcinoma) 또는 편평세포 암종으로 나누어진다.
식도암을 단계화하는데 사용되는 가장 일반적인 시스템은 미국 암 연합 위원회 (American Joint Committee on Cancer; AJCC)의 TNM 시스템이다. TNM 시스템은 정보의 여러 중요한 조각들을 기반으로 한다: T는 1차 종양이 식도의 벽 및 근처의 기관으로 얼마나 멀리까지 성장하는지를 말한다. N은 근처의 림프절로 확산된 암을 말한다. M은 암이 전이되었는지 (먼 거리 기관으로 확산되었는지) 여부를 나타낸다. G는 암의 등급을 기술하는데, 이것은 암세포의 패턴이 현미경 하에서 어떻게 보이는지를 기반으로 한다. 단계화는 또한 암의 세포 유형 (편평세포 암종 또는 선암종)을 고려한다. 편평세포암에 대하여, 종양의 위치는 또한 단계화의 인자가 될 수 있다.
"방광암"은 주어진 대상체 내에서 방광의 신생물, 예를 들어, 악성 신생물을 말하며, 신생물은 요로상피 또는 이행상피로부터 기원한다. 따라서 방광암은 이행세포 (요로상피) 암종을 말하지만, 그것은 또한 방광의 선암종을 말한다.
방광암에 가장 자주 사용되는 단계화 시스템은 미국 암 연합 위원회 (AJCC)의 것이다. 이것은 또한 TNM 시스템이라 불린다. 종양을 기술하는 T 범주는 하위 범주, T0, Ta, Tis, T1, T2a, T2b, T3a, T3b, T4를 함유한다.
면역조직화학법 (IHC) 및 면역세포화학법 (ICC)과 같은 면역검정
본원에서 사용된 바와 같이 "면역검정"은 물질의 복합적 혼합물을 빈번하게 함유하는 샘플에서 물질의 존재 또는 농도를 측정하는 생화학적 테스트이다. 이러한 검정은 분자 또는 항원 중 하나 또는 이것들의 극히 제한된 군에 높은 특이성으로 결합하는 항체의 독특한 능력을 기반으로 한다. 면역조직화학법 (IHC) 및 면역세포화학법 (ICC)은 개시된 방법 및 사용에서 항원 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하는데 유용한 두 개의 예시의 면역검정 기술이다.
면역세포화학법 (ICC)은 세포에서 특이적 에피토프를 통해 특이적 펩타이드 또는 단백질 항원을 표적화하는 항체를 사용하는 일반적인 실험실 기술이다. 그 다음에 이 결합된 항체는 여러 다른 방법을 사용하여 검출될 수 있다. ICC는 연구원들이 특정 샘플에서 세포가 문제의 항원을 발현하는지 아닌지를 평가하게 한다. 면역양성 신호가 발견되는 경우에, ICC는 또한 연구원들이 세포 이하 구획이 항원을 발현하고 있는지를 결정하게 한다.
면역조직화학법 (IHC)에서, 샘플은 생물학적 조직의 절편이며, 각 세포는 조직 구조에 의해 둘러싸여 있고 다른 세포들은 온전한 조직에서 정상적으로 발견된다. 면역세포화학법은 세포 (배양된 세포, 세포 현탁액)에서 특이적 항체의 사용에 의해 특이적 단백질 또는 항원의 존재를 평가하는데 사용되는 기술이며, 특이적 항체는 특이적 단백질 또는 항원에 결합하고, 이로 인해 현미경 하에서 가시화 및 검사를 허용한다. 그것은 개개의 세포의 세포 내용물의 결정을 위한 귀중한 도구이다. 분석될 수 있는 샘플은 혈액 도말 표본(blood smear), 흡인물, 스웝(swab), 배양된 세포, 및 세포 현탁액을 포함한다.
효소-결합 면역흡착 검정 (Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 및 샌드위치(sandwich) ELISA는 본원에서 개시된 방법에 유리하게 사용되는 면역검정이다. (직접) ELISA에서 알려지지 않은 양의 항원이 표면에 부착되고, 그 다음에 특이적 항체가 항원에 결합할 수 있도록 표면 위에 도포된다. 이 항체는 효소에 결합되고, 최종 단계에서, 효소가 어떤 검출 가능한 신호, 가장 흔하게는 화학적 기질의 색 변화로 전환될 수 있는 물질이 첨가된다. 샌드위치 ELISA에서는 항원에 결합할 수 있는 캡쳐 항체가 표면에 부착된다. 다른 단계는 ELISA와 동일하다.
샌드위치 ELISA와 유사한 효소 면역 검정 (Enzyme Immuno Assay; EIA)에서는, 스트렙타비딘이 표면에 부착되고 그 다음에 캡쳐 항체가 비오티닐화되며, 그 밖에는 다른 단계들은 ELISA와 동일하게 수행된다. EIA 면역검정은 본원에서 개시된 방법에서 유리하게 사용된다.
웨스턴 블롯(Western Blot) (때로는 단백질 면역블롯이라고 불림)은 조직 균질액 또는 추출물의 주어진 샘플에서 특이적 단백질을 검출하는데 사용되는, 널리 사용되는 분석 기술이다. 그것은 폴리펩타이드의 길이 (변성 조건) 또는 단백질의 3-D 구조 (고유한/비-변성 조건)에 의해 고유한 또는 변성된 단백질을 분리하기 위해 겔 전기영동을 사용한다. 그 다음에 단백질은 막 (전형적으로 나이트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 옮겨지며, 그것들은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 탐침 (검출)된다.
케라틴 7 및 케라틴 19 및/또는 이것들의 단편에 특이적인 표적화제, 예를 들어, 항체, 항원-결합 단편, 또는 변이체, 융합체 또는 유도체가 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현을 검출하기 위해 사용된다. 본 발명의 표적화제는 유리하게는 조성물로서 제공되지만 또한 별도로 하지만 서로의 이후에 제공될 수도 있다. 따라서 본 발명의 방법은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 결합하는 항체 항원-결합 단편, 또는 변이체, 융합체 또는 유도체를 제공한다. 항체는, 본원에서 더 기술된 바와 같이, 예를 들어, 방사성 라벨, 형광 라벨, 합텐 라벨, 예를 들어, 비오틴, 또는 효소, 예들 들어, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제로 항체 그 자체의 직접적 라벨링에 의해 검출될 수 있다. 대안으로, 간접 라벨링이 사용되는데, 라벨링되지 않은 1차 항체가 라벨링된 2차 항체, 예를 들어, 1차 항체에 특이적인 항혈청, 다클론성 항혈청 또는 단클론성 항체와 함께 사용된다. IHC 및 ICC 프로토콜이 업계에 잘 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능하며, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY 1988) 및 Current Protocols in Immunology, 및 Current Protocols in Molecular Biology (둘 다 John Wiley and Sons, Inc., N. Y.)를 참고하면 된다.
상기 나타난 바와 같이, 본 발명은 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 및/또는 난소암의 진단 및/또는 예후의 민감도 및 특이성을 개선하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 더 구체적으로는, 본 발명은
ELISA 및 EIA에서, 뿐만 아니라 IHC 및 ICC에서 악성 신생물 단백질 마커의 검출을 개선하기 위해 악성 신생물 질환의 검출을 위한 더 나은 민감도를 제공하고, 이로 인해 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 및/또는 난소암에 걸린 환자의 진단 및/또는 예상을 수행할 때 더 일정하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공한다.
또한, 본 발명에 따르는 방법은 이용 가능한 방법과 비교하여 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 및/또는 난소암의 확인을 개선할 것이다.
따라서 본원의 방법에서 사용된 표적화제는 다른 공지된 방법, 예를 들어, CYFRA 21-1과 비교할 때 다양한 악성 신생물 질환의 개선된 검출을 나타낸다 (본원에서 제공된 실시예 참조).
실시예 2-5는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 및/또는 난소암이 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현에 의해 확인된다는 것을 나타낸다.
방법은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 결합하는 항체로 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 및/또는 난소암을 검출한다.
단백질
본 발명의 방법은 적어도 두 개의 표적화제, 예를 들어, 두 개의 1차 항체, 항원-결합 단편, 이것들의 변이체, 융합체, 유도체 또는 단편의 사용을 포함한다. 적어도 하나의 제1 1차 항체는 케라틴 7 또는 이것의 단편에 특이적으로 결합하고 적어도 하나의 제2 1차 항체는 케라틴 19 또는 이것의 단편에 특이적으로 결합한다. 상기 제1 및 제2 1차 항체 둘 다는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들) 및/또는 이것의 단편에 특이적으로 및 동시에 결합할 수 있다.
시토케라틴 7 (CK7) 또는 사콜렉틴 (SCL)으로도 공지되어 있는 케라틴 7 (K7) (NCBI 참조 서열: NP_005547.3, NCBI 유전자 ID: 3855)은 인간에서 KRT7 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 케라틴 7은 II형 케라틴이고 II형 케라틴을 암호화하는 다른 유전자와 함께 염색체 12q12-q13의 영역에서 군집화된다. K7은 469개의 아미노산 길이이고 도 1에서 나타난 바와 같이 일반적인 구조를 가진 52 kDa 단백질이다. 대안의 스플라이싱(splicing)은 여러 전사 변이체를 초래할 수도 있다. 그것은 내부 기관의 공동을 라이닝하는 단순 상피에서 및 선 분비관 및 혈관에서 특이적으로 발현된다.
케라틴 19 (K19) (NCBI 참조 서열: NP_002267.2, NCBI 유전자 ID: 3880)는 시토케라틴 19 (CK19)로도 공지되어 있고 주피, 발달 표피를 덮고 있는 일시적 표면층에서 특이적으로 발견되는 I형 케라틴이다. K19는 44 kDa 단백질이며 이것은 400개의 아미노산 길이이고 도 1에서 보이는 바와 같은 일반적인 구조를 가진다. K19는 인간에서 KRT19 유전자에 의해 암호화되고 염색체 17q12-q21 유전자의 영역에 위치한다.
생체 내 케라틴은 헤테로폴리머, 즉, I형 및 II형 단백질 형태 헤테로다이머로서 조립되며, 이것은 차례로 조립되어 테트라머를 형성한다. 두 개의 모노머는 그것들의 α-나선형 막대를 또꼬인나선(coiled coil)으로 감아서, 인 레지스터 및 같은 방향으로 배향된, 평행한 다이머를 형성하고, 그 다음에 두 개의 다이머는 엇갈린 역평행 방향으로 나란히 결합하여 양방향 테트라머를 형성한다 (도 1 참조). 케라틴 K7 및 K19가 헤테로다이머 및 테트라머로 조립될 때 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체가 형성된다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체"는 전장 케라틴 7 및 전장 케라틴 19 사이에서 평행 및 인 레지스터 다이머로부터 기원한 분자적 실체물 및 이것의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 그것은 케라틴 7 및 케라틴 19 사이의 역평행 테트라머로 중첩되는 케라틴 7 및 케라틴 19 사이의 다이머 및 이것의 단편를 더 포함한다. 그것은 이 테트라머로부터 조립된 올리고머, 프로토필라멘트 및 필라멘트 및 이것들의 어떠한 단편도 더 포함한다. 케라틴의 이형 복합체의 일반적인 구조에 대해서는 도 1을 참고하면 된다.
케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체에서 유리하게는, 끊김 없는 서열에서, 이형 복합체의 케라틴 7 모이어티로부터 유래된, 최소한 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개 또는 적어도 30개, 하지만 더 바람직하게는 40개 이상의 아미노산이 있고, 끊김 없는 서열에서, 이형 복합체의 케라틴 19 모이어티로부터 유래된, 최소한 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개 또는 적어도 30개, 하지만 더 바람직하게는 40개 이상의 아미노산이 있어야 한다. 상기 아미노산은 각각 케라틴 7 또는 케라틴 19에 고유한 것이어야 한다.
유리하게는 끊김 없는 서열에서 상기 최소한 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개 또는 적어도 30개하지만 더 바람직하게는 40개 이상의 아미노산은 케라틴 7 단백질의 256-412 아미노산 서열의 것이다. 더 바람직하게는 끊김 없는 서열은 케라틴 7의 300-380 아미노산 서열의 것이다.
유리하게는 끊김 없는 서열에서 상기 최소한 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개 또는 적어도 30개하지만 더 바람직하게는 40개 이상의 아미노산은 케라틴 19 단백질의 244-400 아미노산 서열의 것이다. 더 바람직하게는 끊김 없는 서열은 케라틴 19의 311-375 아미노산 서열의 것이다.
항체
한 양태에서 본 발명은 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재를 검출하기 위해 적어도 두 개의 표적화제, 예를 들어, 두 개의 1차 항체, 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체의 사용을 포함하는 방법을 제공하는데, 제1 1차 항체, 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체는 이형 복합체의 케라틴 7 또는 이것의 단편에 특이적으로 결합하고, 제2 1차 항체, 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체는 이형 복합체의 케라틴 19 또는 이것의 단편에 특이적으로 결합한다. 유리하게는, 적어도 두 개의 항체, 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체는 사용자에 의해 사용할 준비가 된 포맷으로 또는 때때로 스톡(stock) 용액으로 불리는, 사용 전에 희석이 필요한 농축된 용액으로 항체 칵테일에 함께 존재한다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 적어도 하나의 제1 1차 항체, 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체, 및 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 적어도 하나의 제2 1차 항체, 항원-결합 단편 또는 이것들의 변이체 융합체 또는 유도체를 포함하는 조성물을 포함하는데, 제1 및 제2 1차 항체 둘 다는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 및 동시에 결합할 수 있다.
"~에 특이적으로 결합하는" 또는 "~와 특이적으로 반응하는"은 본원에서 사용된 바와 같이 "선택적으로 결합할 수 있는" 또는 "~에 특이적으로 결합하는"과 같은 것으로 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같이 발현은 어떠한 항체 유래 결합 모이어티를 포함하여, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체를 의미하는 것으로 의도되며, 이것들은 분자의 항원에 결합할 수 있고 추가로 또 다른 단백질보다 적어도 10배 더 강하게, 예를 들어, 적어도 50배 더 강하게 또는 적어도 100배 더 강하게 단백질에 결합한다. 결합 모이어티는 생리학적 조건 하에서, 예를 들어, 생체 내에서 선택적으로 단백질에 결합할 수도 있다. 상대적인 결합 강도를 측정하는데 적합한 방법은, 예를 들어, 결합 모이어티가 항체인 경우에, 면역 검정을 포함한다. 대안으로, 결합은 경쟁적 검정을 사용하여 또는 Biacore(R) 분석 (Biacore International AB, Sweden)을 사용하여 평가될 수도 있다.
용어 "~에 특이적으로 및 동시에 결합하는"은 본원에서 사용된 바와 같이 제1 및 제2 표적화제가 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 및 동시에 결합하고, 상기 제1 및 제2 표적화제 및 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하는 트리플렉스를 형성한다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 상기 제1 및 제2 표적화제는 본원에서 기술된 어떠한 수단 또는 방법에 의해, 또는 그 밖에 당업자에게 공지되어 있는 수단 또는 방법에 의해 복합체가 검출되기에 충분히 긴 기간 동안 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)으로 상기 트리플렉스를 형성할 것이다.
한 양태 구체예에서, 제1 및 제2 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체 각각은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 별도의 항원성 부위에 결합한다. 전형적으로 제1 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 K7 모이어티에 존재하는 항원성 부위와 특이적으로 반응하고, 제2 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 K19 모이어티에 존재하는 항원성 부위와 특이적으로 반응한다.
케라틴 7 및 케라틴 19 사이의 이형 복합체의 두 개의 모노머 케라틴 7 및 케라틴 19가 나선 구조와 평행하게 및 인 레지스터 정렬되기 때문에, 각각 케라틴 7 및 케라틴 19 상에서 나선 1A에서 시작하여 나선 2B까지에 해당하는 위치에 결합하는 어떠한 두 개의 항체도 동시에 결합하지 않을 것이다 (도 1 참조). 이것은 케라틴 7이 케라틴 19 주위에 감겨있는 경우에, 해당하는 노출된 위치는 입체 구조의 이유로 두 개의 항체의 동시 결합을 허용하지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 예를 들어, 케라틴 19 상의 아미노산 271- 291가 또꼬인나선에서 케라틴 7 상의 아미노산 283-303과 짝을 지을 때 추가로 예시된다. 케라틴 7에 대한 항체가 케라틴 7 상의 서열 283-303 내에서 결합하는 경우, 케라틴 19에 대한 항체는 이형 복합체에서 입체 구조의 방해로 인해 케라틴 19 상의 아미노산 271-291에 동시에 결합할 수 없을 것이다.
케라틴 7에 특이적으로 결합하는 많은 이용 가능한 항체, 예를 들어, C-35, C-62, C-68, C18, C35, KS 7.18, LDS-68, LP1K, RCK105가 본원에서 제공된 방법에서 사용될 수도 있다. 하지만 본원에서 제공된 방법에서 유리하게 사용되는 한 항체는 Progen Biotechnik, GmBH, Germany로부터 이용 가능한 클론 Ks 7.18에 의해 생산된 케라틴 7 단클론성 항체이다. 단클론성 항체 KS 7.18은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 K7 모이어티의 아미노산 300-350에 특이적으로 결합한다.
케라틴 19에 특이적으로 결합하는 이용 가능한 항체의 예는 A53-B/A2.26 aka Ks19.1, BM-19.21, CCD003, CCD004,CKS04, CKS06, SA 21, SA 45, Ks19.2, LP2K이다. 하지만 본 방법에서 유리하게 사용되는 한 항체는 Progen Biotechnik, GmBH로부터 이용 가능한 Ks 19.2 단클론성 항체이며 Roche Diagnostics로부터 이용 가능한 클론 BM-19.21에 의해 생산된 BM-19.21 단클론성 항체로도 공지되어 있다. BM-19.21은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 K19 모이어티의 아미노산 346-367에 특이적으로 결합한다. 케라틴 19에 대한 여러 항체는 Epitope Specificity of 30 Monoklonal Antibodies against Cytokeratin Antigens: The ISOBM TD-1 workshop, Tumor Biol 1998;19:132-152에 기술되어 있다.
유리하게는, 제1 및 제2 1차 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체 각각은 항체 칵테일로서 조성물로, 수성 형태로 또는 동결 건조된 분말 형태로 제공된다. 후자에 대하여, 사용 가능한 액체 형태의 항체를 넣기 위해서는 사용 전에 재수화 단계가 필요하다.
대안으로 본원에서 제공된 방법에서 사용될 때 제1 및 제2 1차 항체는 별도로 제공된다, 즉, 하나의 1차 항체가 다른 항체 이전에 제공된다. 한 구체예에서 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 함유하는 샘플에 제공된다. 제1 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 K7 모이어티 상에 존재하는 항원성 부위에 결합하여 항원 - K7-항체 복합체를 형성할 것이다. 그 후에, 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 1차 항체가 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 - K7-항체를 함유하는 샘플에 제공된다. 상기 제2 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 K19 모이어티 상에 존재하는 항원성 부위에 결합하여 K19-항체 - 항원 - K7-항체 복합체를 형성할 것이다.
대안의 구체예에서, 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 1차 항체가 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 함유하는 샘플에 제공된다. 제2 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 K19 모이어티 상에 존재하는 항원성 부위에 결합하여 항원 - K19-항체 복합체를 형성할 것이다. 그 후에, 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 1차 항체가 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 - K19-항체를 함유하는 샘플에 제공된다. 상기 제1 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 K7 모이어티 상에 존재하는 항원성 부위에 결합하여 K7-항체 - 항원 - K19-항체 복합체를 형성할 것이다.
항체는 그것들이 시험관 내에서 원하는 단백질에 결합할 수 있는 한 전체 항체 또는 이것의 단편, 예를 들어, 항원-결합 단편, 또는 변이체, 융합체 또는 유도체일 수도 있다. 이러한 결합 특이성은 모든 서브 유닛 또는 이것들의 헤테로다이머를 발현하는 트랜스펙션된 세포를 사용하는 업계에 공지된 방법, 예를 들어, ELISA, EIA, 면역조직화학법, 면역침강법, 웨스턴 블롯, 크로마토그래피 및 유동 세포 분석법에 의해 결정될 수도 있다 (실시예 참조).
용어 "항체"는 어느 종, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 쥐, 래트, 기니피그, 또는 비-설치류, 예를 들어, 토끼, 염소, 양, 개, 돼지, 낙타, 단봉 낙타, 당나귀, 말 또는 닭의 실질적으로 온전한 항체 분자, 뿐만 아니라 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 (자연 발생한 인간 항체에 관하여 적어도 하나의 아미노산이 돌연변이됨), 단일 사슬 항체, 이중 특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 호모다이머 및 헤테로다이머, 및 항원 결합 단편 및 이것의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 항체는 단클론성 항체일 수도 있다.
항원 특이성은 가변 도메인에 의해 부여되고 불변 도메인에 독립적이며, 항체 단편의 박테리아 발현을 수반하는 실험으로부터 공지된 바와 같고, 모두 하나 이상의 가변 도메인을 함유한다. 이 분자들은 Fab-유사 분자; Fv 분자; 단일-사슬 Fv (ScFv) 분자 (V H 및 V L 파트너 도메인은 플렉시블 올리고펩타이드를 통해 결합된다); 및 분리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체 (dAb)를 포함한다. 특이적 결합 부위를 보유한 항체 단편의 합성에 수반된 기술의 일반적인 리뷰는 Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293- 299에서 찾을 수 있다.
따라서, "항원-결합 단편"은 단백질 K7 또는 K19 또는 이것의 단편, 및 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들) 중 어느 것에도 결합할 수 있는 항체의 기능적 단편을 의미한다. 예시의 항원-결합 단편은 Fv 단편 (예를 들어, 단일 사슬 Fv 및 이황화 결합된 Fv), Fab-유사 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab) 2 단편), 단일 항체 사슬 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄), 단일 가변 도메인 (예를 들어, VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체 (dAb, 단일 및 이중 포맷, 즉, dAb-링커-dAb 포함)로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다.
따라서, 한 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체는 온전한 항체를 포함하거나 이것으로 구성된다. 한 구체예에서, 항체는 단클론성 항체이다
예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체는 근본적으로 온전한 항체로 구성될 수도 있다. "근본적으로 ~로 구성된"은 항체 또는 항원-결합 단편, 이것들의 변이체, 융합체 또는 유도체가 두 개의 다른 단백질 K7 및 K19 중 어느 것 또는 이것의 단편에 대한 결합 특이성을 보유하기에 충분한 온전한 항체의 일부로 구성된다는 것을 의미한다. 추가의 구체예에서, 두 개의 다른 단백질 K7 및 K19는 인간 기원의 것이다.
용어 '항체'는 또한 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함하는 모든 부류의 항체를 포함한다. 한 구체예에서, 하지만, 항체는 IgG 분자, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자이다. 한 구체예에서, 항체는 IgG1 분자이다. 추가의 구체예에서, 항체는 카파 경쇄를 가진 IgG1 분자이다.
추가의 구체예에서, 항체는 비자연적으로 발생한 항체일 수도 있다. 물론, 항체가 자연 발생한 항체인 경우에, 그것은 단리된 형태 (즉, 그것이 자연에서 발견된 것과는 별개)로 제공된다.
또한 변형된, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 폴리머의 공유 결합에 의한 부착에 의해 변형된 버전의 항체 및 이것의 항원-결합 단편, 및 이것의 사용이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
항체 및 항체 단편을 생성하는 방법은 업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 항체는 항체 분자의 생체 내 생산 유도, 면역글로불린 라이브러리의 스크리닝 또는 배양 중인 세포주에 의한 단클론성 항체 분자의 생성을 이용하는 여러 방법 중 어느 하나를 통해서 생성될 수도 있다. 이것들은 하이브리도마 기술, the 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus; EBV)- 하이브리도마 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, K7, 또는 K19에 대한 단클론성 또는 다클론성 항체의 생성은 항체 반응을 생성하기 위해 전체 단백질 또는 이것의 적합한 단편이 비-인간 포유동물 (예를 들어, 마우스 또는 토끼)로 주사된 후 이어서, 촉진 주사(boost injection)될 수 있는 면역화에 의해 실시될 수도 있다. 면역화된 동물로부터 분리된 혈청이 그 안에 함유된 다클론성 항체를 위해서 분리될 수도 있거나, 또는 면역화된 동물의 비장이 하이브리도마 및 단클론성 항체의 생산을 위해 사용될 수도 있다.
한 예에서, 단백질 중 하나에 대한 단클론성 항체는 Kohler 및 Milstein의 고전적인 방법 (Nature, 256:495, 1975) 또는 이것의 유도 방법에 따라 쥐 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 간략히 말하면, 마우스 (예를 들어, Balb/c)는 몇 주의 기간 동안 선택된 단백질 또는 이것의 펩타이드 단편 또는 이것의 적합한 담체 컨쥬게이트 몇 마이크로그램으로 반복적으로 접종된다. 그 다음에 마우스가 희생되고, 비장의 항체-생산 세포가 분리된다. 비장 세포는 폴리에틸렌 글리콜에 의해 마우스 골수종 세포와 융합되고, 과도한 비융합 세포는 아미노프테린을 포함하는 선택적 배지 (HAT 배지)에서 시스템의 성장에 의해 파괴된다. 성공적으로 융합된 세포가 희석되고 희석물의 앨리쿼트는 배양물의 성장이 계속되는 미세적정 플레이트의 웰에 배치된다. 항체-생산 클론은 웰의 상층액에서 Engvall (Enzymol., 70:419, 1980)에 의해 원래 기술된 면역검정 과정, 예를 들어, ELISA, 및 이것의 유도 방법에 의한 항체의 검출에 의해 확인된다.
선택된 양성 클론은 확장될 수 있으며 그것들의 단클론성 항체 생성물은 사용을 위해 수확된다.
항체의 상업적 공급원은 DAKO A/S, Abeam, Lab Vision, BioCare Medical, Cell Marque Corp. Abnova, Acris, Progen, Santa cruz biotech 등을 포함한다.
다클론성 항체-생산 동물은 면역화된 동물의 채혈 및 이것의 적합한 다클론성 항체-역가를 가진 적절한 동물의 선택에 의해 확인된다.
일부 구체예에서, 항체는 사용 전에 정제된다. 항체의 정제는 업계에서 이용 가능한 및 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 실시된다.
항체 K7 및 K19의 생성은 업계에 기술되어 있고 본원에서 기술된 상업적 공급원으로부터 이용 가능하거나, 또는 본원에 개시되고 따라서 본원에 참고로 포함된 참고문헌을 사용하는 숙련자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 이용 가능하다.
항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체는 또한 재조합 수단에 의해 생산될 수도 있다. 선택된 항원 및 단백질에 대한 적합한 단클론성 항체는 숙련자에게 공지되어 있는 기술에 의해 제조될 수도 있다. 항체 단편은 또한 업계에 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 항체의 단백질 가수분해에 의해 또는 대장균(E. coli) 또는 포유류 세포 (예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포 배양 또는 다른 단백질 발현 시스템)에서 단편을 암호화하는 DNA의 발현에 의해 제조될 수도 있다. 대안으로, 항체 단편은 통상적인 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있다.
따라서, 한 구체예에서 본원에서 제공된 방법에서 사용된 1차 항체 중 적어도 하나는 단클론성 항체이다. 추가의 구체예에서 본원의 방법에서 사용된 1차 항체 중 적어도 하나는 재조합 항체이다.
대안으로, 복합체 형성은 듀오링크(duolink) (O-link bioscience)를 사용하여 검출될 수도 있다. 통상적인 면역형광법은 개개의 단백질의 존재를 나타낼 수 있지만, 다른 단백질 사이에서 헤테로다이머의 형성을 나타낼 수는 없다. 듀오링크를 사용하여, 헤테로다이머화가 일어나는 위치를 정확히 찾아내고 상호작용의 상대적인 규모를 정량화하는 것이 가능할 것이다. 따라서, 듀오링크 기술을 사용하여 케라틴 7에 특이적인 하나의 항체 및 케라틴 19에 특이적인 하나의 항체를 사용함으로써 케라틴 7 및 케라틴 19 사이에서 이형 복합체의 위치를 찾아내고 이것을 정량화하는 것이 가능할 것이며, 두 항체는 케라틴 7 및 케라틴 19 사이에서 이형 복합체에 동시에 결합한다.
본원에서 기술된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체, 또는 상기 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체를 포함하는 조성물은 저장을 위해 동결건조될 수도 있고 사용 전에 적합한 담체에서 복원될 수도 있다. 어떤 적합한 동결건조 방법 (예를 들어, 분무 건조, 케이크 건조(cake drying)) 및/또는 복원 기술도 이용될 수 있다. 동결건조 및 복원은 다양한 정도의 항체 활성 손실로 이어질 수 있고 (예를 들어, 통상적인 면역글로불린으로, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 가지는 경향이 있음) 보충하기 위해 사용 수준이 상향 조정되어야 할 수도 있는 것으로 당업자에 의해 인정될 것이다. 한 구체예에서, 동결건조된 (냉동 건조된) 조성물은 재수화될 때 그것의 활성 (동결건조 이전)의 약 20% 이하, 또는 약 25% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 45% 이하, 또는 약 50% 이하를 상실한다. 본원에서 기술된 항체 및 이것의 항원-결합 단편, 변이체, 융합체 및 유도체가 모노머 형태로 또는 이것들의 호모- 또는 헤테로-멀티머 (예를 들어, 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머, 등)의 형태로 존재할 수도 있는 것으로 당업자에 의해 추가로 인정될 것이다.
1차 항체 또는 이것의 단편은 검출 가능 모이어티로 직접적으로 또는 간접적으로 라벨링될 수도 있다는 것이 본원에서 추가로 제공된다. 직접적으로 라벨링된다는 것은 검출 가능 모이어티가 항체에 부착된다는 것을 의미한다. 간접적으로 라벨링된다는 것은 검출 가능 모이어티가 링커, 예를 들어, 2차 또는 3차 항체에 부착된다는 것을 의미한다. 검출 가능 모이어티는 당업자에게 공지된, 또는 본원에서 기술된 어떤 모이어티 또는 마커, 및 부착되는 분자의 직접적인 또는 간접적인 정량적 또는 상대적 측정을 허용하는 신호를 발생시킬 수 있는 모이어티도 될 수 있다.
다양한 검출 가능 모이어티, 또는 라벨, 및 컨쥬게이션 기술은 과학 및 특허 문헌 둘 다에서 광범위하게 공지 및 보고되어 있다. 적합한 라벨은 당업자에게 잘 공지되어 있는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조 인자, 억제자, 형광발광제, 화학발광제, 자기 입자 등을 포함한다. 검출 가능 모이어티는 검출 가능한 종의 생산에 직접적으로 또는 간접적으로 수반되는 단일 원자 또는 분자일 수도 있다. 선택적으로, 검출 가능 모이어티는 형광 모이어티, 효소 결합된 모이어티, 비오티닐화된 모이어티 및 방사성 라벨링된 모이어티로 구성된 군으로부터 선택되며, 본원에서, 예를 들어, 하기 추가로 기술된 바와 같다. "라벨", "검출 가능 모이어티"는 원하는 분자에 직접적으로 (예를 들어, 폴리펩타이드에 통합된 형광 분자) 또는 간접적으로 (예를 들어, 통합된 형광 분자를 가진 2차, 3차 이상의 항체와 함께 1차 항체에 결합하는 방식으로) 부착될 수 있는 어떠한 검출 가능한 태그를 의미한다. 따라서, 라벨, 마커 또는 검출 가능 모이어티는, 예를 들어, 이미지화 방법으로 가시화될 수 있는 어떤 태그도 된다.
"검출 가능 모이어티"는 본 발명의 조성물을 생물학적 샘플, 예를 들어, 조직 샘플, 또는 생물학적 유체 샘플에 제공한 후 표적 부위에 위치할 때 모이어티가 시험관 내에서 검출될 수도 있다는 의미를 더 포함한다. 상기는 검출 가능 모이어티가 신호를 발생시키고 그것이 더 편리하다는 것을 포함하며 따라서 검출 가능 모이어티가 검출될 수도 있고 모이어티의 상대적인 양 및/또는 위치 (예를 들어, 조직 샘플 상의 위치)가 결정될 수도 있는 경우 추가의 구체예에 포함된다. 검출 가능한 모이어티는 업계에 잘 공지되어 있다.
따라서, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체, 또는 이러한 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체를 포함하는 조성물은 방법 및 사용에 의해 본원에서 추가로 예시된 방법에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 검출, 시험관 내에서 생물학적 샘플의 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 및 난소암의 진단 또는 예후에 유용하다. 추가의 구체예에서, 사용된 면역화학적 방법이 본원에서 예시된다.
적합한 검출 가능한 모이어티는 업계에 잘 공지되어 있고 폴리펩타이드 및 단백질에 이 모이어티의 부착 또는 결합이 추가로 업계에 잘 공지되어 있다. 검출 가능한 모이어티의 추가의 예는 효소; 효소 기질; 효소 억제자; 보조효소; 효소 전구체; 아포 효소(apoenzyme); 형광 물질; 색소; 화학발광 화합물; 발광 물질; 착색 물질; 자성체; 또는 금속 입자, 예를 들어, 금 콜로이드; 방사성 물질, 예를 들어, 125I, 131I, 32P, 3H, 35S, 또는 14C; 인산화된 페놀 유도체, 예를 들어, 나이트로페닐 포스페이트, 루시페린 유도체, 또는 디옥세탄 유도체; 등이다. 효소는 데하이드로게나제; 옥시도리덕타제, 예를 들어, 리덕타제 또는 옥시다제; 작용기, 예를 들어, 아미노, 카르복실, 메틸, 아실, 또는 포스페이트 기의 전이를 촉진하는 트랜스퍼라제; 결합, 예를 들어, 에스터, 글리코시드, 에테르, 또는 펩타이드 결합을 가수분해할 수도 있는 하이드로라제; 리아제; 아이소머라제; 또는 리가제일 수도 있다. 효소는 또한 또 다른 효소에 컨쥬게이션될 수도 있다. 효소는 효소적 순환(enzymatic cycling)에 의해 검출될 수도 있다. 예를 들어, 검출 가능한 라벨이 알칼린 포스파타제일 때, 측정은 적합한 기질, 예를 들어, 엄벨리페론 유도체로부터 생성된 형광 또는 발광을 관찰함으로써 이루어질 수도 있다. 엄벨리페론 유도체는 4-메틸-엄벨리페릴 포스페이트를 포함할 수도 있다. 형광 또는 화학발광 라벨은 플루오레세인 아이소티오시아네이트; 로다민 유도체, 예를 들어, 로다민 B 아이소티오시아네이트 또는 테트라메틸 로다민 아이소티오시아네이트; 단실 클로라이드 (5-(디메틸아미노)-1-나프탈렌설포닐 클로라이드); 단실 플루오라이드; 플루오레사민 (4-페닐스피로[푸란-2(3H);ly-(3yH)-아이소벤조푸란]-3;3y-디온); 피코빌리단백질, 예를 들어, 피코시아닌 또는 피코에리트린; 아크리디늄 염; 루미놀 화합물, 예를 들어, 루시페린, 루시퍼라제, 또는 에쿼린; 이미다졸; 옥살산 에스터; 희토류 원소, 예를 들어, 유로퓸 (Eu), 테르븀 (Tb) 또는 사마륨 (Sm)의 킬레이트 화합물; 또는 쿠마린 유도체, 예를 들어, 7-아미노-4-메틸쿠마린일 수도 있다. 라벨은 또한 합텐, 예를 들어, 아다만틴, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 또는 카바졸일 수도 있다. 합텐은 다원자가 항체 또는 스트렙타비딘 함유 모이어티와 접촉될 때 응집체의 형성을 허용할 수도 있다. 검출 가능한 모이어티의 추가의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 방사성 동위원소 (예를 들어, 3H, 14C, 35S, 123I, 125I, 131I, 99Tc, 111 In, 90Y, 188Re), 방사성 핵종 (예를 들어, 11C, 18F, 64Cu), 형광 라벨 (예를 들어, FITC, 로다민, 란탄 계열 원소 인광체, 카보시아닌), 효소적 라벨 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, [베타]-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제), 화학발광, 비오티닐 기 및 2차 결합 실체물 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequence), 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 또는 단백질 태그, 탄수화물)에 의해 인식되는 사전 결정된 폴리펩타이드 에피토프. 일부 구체예에서, 라벨은 잠재적인 입체적 장해를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암(spacer arm)에 의해 부착된다.
간접적 라벨링에서, 추가적인 분자 또는 모이어티는 1차 항체와 그것이 결합하는 단백질 사이에서 항체-항원 복합체, 즉, 면역-복합체와 접촉하게 되거나, 또는 이것의 부위에서 생성된다. 예를 들어, 검출 가능 모이어티, 예를 들어, 효소는 본원에서 예시된 검출 항체 또는 검출 분자에 부착되거나 이것과 회합될 수 있다. 그 다음에 신호-발생 분자는 면역-복합체의 부위에서 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 효소는, 적합한 기질이 공급될 때, 면역-복합체의 부위에서 가시적인 또는 검출 가능한 생성물을 생산할 수 있다.
간접적 라벨링의 또 다른 예로서, 원하는 분자 또는 원하는 항체 (1차 항체)에 결합할 수 있는 추가적인 분자 (이것은 결합제로도 불릴 수 있음), 예를 들어, 1차 항체에 대한 2차 항체는 면역 복합체와 접촉될 수 있다. 추가적인 분자는 신호-발생 분자 또는 검출 가능 모이어티를 가질 수 있다.
추가적인 분자는 따라서 2차, 3차 이상의 항체로 불릴 수도 있는 항체일 수도 있다. 1차 항체로의 2차 항체의 결합은 첫 번째 (또는 1차) 항체 및 원하는 분자와의 소위 샌드위치를 형성할 수 있다. 면역 복합체는 2차 면역 복합체의 형성을 허용하는데 효율적인 조건 하에 및 이에 충분한 기간 동안 라벨링된, 2차 항체와 접촉될 수 있다. 그 다음에 2차 면역 복합체는 일반적으로 어떠한 비-특이적으로 결합된 라벨링된 2차 항체를 제거하기 위해 세척될 수 있고, 이어서 2차 면역 복합체에서 잔류 라벨이 검출될 수 있다. 추가적인 분자는 또한 서로 결합할 수 있는 분자 또는 모이어티의 쌍, 예를 들어, 비오틴/아비딘 분자 중 하나일 수 있거나 또는 이것을 포함할 수 있고, 그때 검출 항체 또는 검출 분자는 쌍의 다른 구성원을 포함해야 한다.
간접적 라벨링의 추가의 예는 2단계 접근법에 의한 1차 항체-항원 (면역 복합체)의 검출을 포함한다. 예를 들어, 1차 항체-항원 복합체 사이에서 1차 면역 복합체에 대한 결합 친화도를 가지는 분자 (제1 결합제로 불릴 수 있음), 예를 들어, 항체는 2차 복합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 세척 후, 2차 복합체는, 다시 3차 복합체의 형성을 허용하는데 효과적인 조건 하에 및 이에 충분한 기간 동안, 제1 결합제에 대한 결합 친화도를 가진 또 다른 추가의 분자 (제2 결합제로 불릴 수 있음)와 접촉될 수 있다. 이 예에서 제2 결합제는 검출 가능 모이어티에 결합될 수도 있으며, 이와 같이 형성된 3차 복합체의 검출을 허용한다. 이 시스템은 신호 증폭을 제공하기 위한 수단을 더 포함할 수도 있다.
신호 증폭을 위한 수단을 가지고 있는 1차, 2차 또는 추가의 결합제의 다른 예는 컨쥬게이션된 항-면역글로불린, 예를 들어, 비오티닐화된 항체 (예를 들어, 아비딘/ 스트렙타비딘과 컨쥬게이션됨) 또는 포도상구균 단백질 A (IgG에 결합함), 단백질 G, 덱스트란, 압타머, 단백질, 펩타이드, 작은 유기 분자, 천연 화합물 (예를 들어, 스테로이드), 비-펩타이드 폴리머, 또는 검출 가능 모이어티에 컨쥬게이션되든 컨쥬게이션되지 않는 다른 분자에 특이적으로 및 효율적으로 결합하는 어떤 다른 분자이다. 한 추가의 구체예에서, 2차, 3차 이상의 결합제는 항체, 예를 들어, 항-마우스 컨쥬게이트, 예를 들어, 돼지 항-마우스 항체이다. 컨쥬게이트는 상기 기술된 바와 같이 덱스트란, HRP, 비오틴, 알칼리 포스파타제, 등에 컨쥬게이션될 수도 있다.
한 구체예에서 검출 가능 모이어티는 덱스트란 및 HRP와 컨쥬게이션된 돼지 항-마우스 항체이다.
추가의 구체예에서 2차, 3차 이상의 결합제는 항체, 예를 들어, 항-토끼 컨쥬게이트, 예를 들어, 염소 항-토끼 컨쥬게이트이다. 컨쥬게이트는 상기 기술된 덱스트란, HRP, 비오틴, 등으로의 컨쥬게이트일 수도 있다.
한 구체예에서, 검출 가능 모이어티는 덱스트란과 컨쥬게이션된 염소 항-토끼이다.
추가의 구체예에서 2차, 3차 이상의 결합제는 항체, 예를 들어, 항-염소 컨쥬게이트, 예를 들어, 토끼 항-염소 컨쥬게이트이다. 컨쥬게이트는 상기 기술된 덱스트란, HRP1 비오틴, 등으로의 컨쥬게이트일 수도 있다.
한 구체예에서 검출 가능 모이어티는 덱스트란 및 알칼린 포스파타제, AP와 컨쥬게이션된 토끼 항-염소이다.
추가의 구체예에서, 본원에서 제공된 조성물은 버퍼를 더 포함한다. 버퍼의 예는 Tris-버퍼, 예를 들어, Tris-HCl, 및 PBS-버퍼이다. 적합한 버퍼는 업계에서 이용 가능하거나 공지되어 있다.
버퍼로의 추가의 첨가제는, 예를 들어, Tween®20, BSA, 나트륨 아지드, 글리세롤, 및 물일 수도 있고, 약 5.5 내지 약 8.0, 예를 들어, 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0의 pH일 수도 있다.
항체 조성물은 액체 형태일 때 "사용할 준비가 된(ready-to-use)" 형태 또는 사용시 어느 적절한 버퍼 시스템, 예를 들어, 본원에서 제공되고 및/또는 당업자에게 명백할 수도 있는 버퍼 시스템에서 사용 전에, 예를 들어, 적어도 1x10, 1x20, 1x30, 1x40, 1x50, 1x60, 1x70, 1x80, 1x90, 1x100, 1x1000, 1x10000 및 그 사이의 모든 범위 및 값으로 희석될 수도 있는 농축된 형태로 제공될 수도 있다.
한 유리한 구체예에서 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 1차 항체 단클론성 항체 Ks 7.18은 비오틴에 컨쥬게이션되고, 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 1차 항체 BM 19.21은 퍼옥시다제 (호스 래디쉬 퍼옥시다제 (horse radish perosidase; HRP))에 컨쥬게이션된다. 비오틴 또는 HRP의 컨쥬게이션은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따르는 조성물은 또한 단독으로 또는, 또 다른 종양 마커, 예를 들어, CA125, HE4, CA 19-9, CEA, CYFRA 21-1, SCC, ProGRP, CA242, PSA의 검출 및 측정 수단 또는 진단 수단, 예를 들어, 초음파, CT-스캔, 흉부 방사선 사진술 및/또는 IHC 마커, 예를 들어, K5,K20,TTF-1, CDX2, MUC 2, p63, 베타-카테닌, p53, 34-베타-E12, ER, CD56, NCAM, K6, K7, K19를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 악성 신생물을 검출하기 위한 다른 수단과 조합하여 사용될 수도 있다.
조성물의 방법 및 사용
본원에서 기술된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체, 또는 이러한 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체를 포함하는 조성물은 다양한 면역-방법, 예를 들어, 면역조직화학적 (IHC) 및 면역화학적 방법에 사용될 수도 있다. 이러한 면역-방법, 특히 면역조직화학법에 대한 일반적인 프로토콜은 업계에 공지되어 있다. 이에 더하여, 본 발명의 방법 및 사용은 차등적 진단의 결과를 개선하기 위한 다른 진단 방법과 조합될 수도 있다.
악성 신생물의 존재 또는 부재를 정확하게 결정하는 것의 중요성은 분명하다. 환자 및 헬스 케어 시스템 둘 다에 대한 영향은 또한 더욱 더 분명하다. 따라서, 방법 및 사용의 일부 구체예는 주어진 생물학적 샘플 내에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하는 단계를 제공한다. 방법 및 사용은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플을 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체, 또는 두 가지 단백질 K7 및 K19에 특이적인, 본원에서 개시된 이러한 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이것들의 유도체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계, 상기 항체 및 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 또는 이것의 단편(들) 사이의 상호작용을 검출하는 단계를 포함하며, 상호작용의 검출은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재 또는 부재를 나타내고, 이로 인해, 예를 들어, 본원에서 개시된 방법들 중 어느 것에 따라, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 검출, 생물학적 샘플에서 악성 신생물 질환의 검출, 진단, 예후 등을 허용하며, 이것의 결과는 대상체가 건강한지, 또는 악성 신생물 질환에 걸렸는지 결정할 수도 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 악성 신생물 질환이 담관암 (간 외), 방광암, 유방암, 불명 암종 (원발 부위), 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 쓸개암, 위장암 (위암), 두경부암, 간세포암 (간암), 하인두암, 신장암, 후두암, 간암 (일차성), 폐암 (비-소세포), 폐암 (소세포), 중피종, 비-소세포 폐암, 난소암, 상피성 난소암 (표면 상피-간질성 종양), 난소 생식세포 종양, 저악성 잠재성 난소 종양, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신세포 암종 (신장암), 침샘암, 소세포 폐암, 소장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행세포암, 또는 자궁암 (자궁 내막)일 때 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 악성 신생물 질환이 폐암, 방광암, 식도암, 간세포암, 췌장암, 위암 및 난소암일 때 적합하다.
본 발명의 조성물 및 방법은 악성 신생물 질환이 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암 중 하나일 때 특히 적합하다.
양성 질환은 이 개체들에 대한 종양 마커 값들이 건강한 개체에 비해 다소 높은 경향이 있다. 마커 농도가 높아지는 전형적인 양성 질환은 담도, 간 및 신장의 질환이다. 이 높아진 값들로 인해 경계선 구역 또는 "그레이 존(gray zone)"이 대부분의 마커에 빈번하게 사용되고 이 그레이 존은 또한 마커를 진단적 목적에 부적합하게 만든다. 경계선 구역의 종양 마커 값은 매우 불확실하고 종양 또는 양성 질환으로서 분류될 수 없다. 이 그레이 존 내에 있는 대상체는 거짓으로 암에 걸리거나 걸리지 않은 것으로 의심될 수도 있다. 이 그레이 존 내에 있는 대상체는 본원에서 제공된 방법으로부터 이익을 얻을 것이다. 개시된 방법 및 사용 내에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)은 특정 임상적 상태의 (예를 들어, 건강하거나 또는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린) 대상체로부터 채취한 샘플 내에서 증가한 수준으로, 감소한 수준으로 존재하거나, 완전히 없을 수도 있다.
따라서, 주어진 생물학적 샘플에서 발견된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 차등적 존재는 테스트되는 대상체가 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 및 난소암에 걸리거나 또는 건강할 가능성에 관하여 유용한 정보를 제공한다. 테스트되는 대상체가 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 및 난소암에 걸리거나 건강할 가능성은 상기 대상체로부터 채취한 테스트 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양이 건강한 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양 또는 건강한 대상체에 존재하는 것으로 공지된 대조군 수준으로부터 통계적으로 유의한지에 따른다.
주어진 생물학적 샘플에서 발견된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 차이는 또한 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린 것으로 공지된 대상체가 투여되는 치료적 처치에 반응하고 있는지를 결정하는데 사용될 수도 있다. 치료시 채취한 샘플에서 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양은 치료의 투여 전에 채취한 샘플에서 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양과 비교된다. 이에 더하여, 치료시 채취한 샘플에서 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양은 건강한 대상체를 나타내는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 지시대상과 비교된다. 비교에 기초하여, 상기 대상체가 치료적 처치에 반응하고 있는지, 및 반응은 어느 정도인지 결정할 수 있다.
게다가, 주어진 생물학적 샘플에서 발견된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재의 차이는 또한 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린 것으로 공지된 대상체가 주어진 치료적 처치에 반응할 것인지를 결정하는데 사용될 수도 있다. 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린 것으로 진단된 대상체로부터 채취한 샘플에서 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양은 유사하게 진단된, 다른 치료 형태를 거친 대상체로부터 채취한 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 참조 패널과 비교된다. 주어진 치료에 노출된 대상체로부터 채취한 샘플로부터 발생된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 참조 패널로서, 상기 치료는 긍정적인 결과를 초래하였으며, 상기 참조 패널은 주어진 치료가 대상체에 대하여 긍정적인 효과를 갖는다는 것을 나타내는 것으로 간주되고 그러므로 성공적인 것으로 생각될 것이다. 주어진 치료에 노출된 대상체로부터 채취한 샘플로부터 발생된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 참조 패널로서, 상기 치료는 중립의 결과를 초래하였으며, 상기 참조 패널은 대상체에 대하여 치료적 효과가 없다는 것을 나타내는 것으로 간주되고 그러므로 성공적이지 않은 것으로 생각될 것이다. 주어진 치료에 노출된 대상체로부터 채취한 샘플로부터 발생된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 참조 패널로서, 상기 치료는 부정적인 결과를 초래하였으며, 상기 참조 패널은 대상체에 대하여 치료 효과가 없다는 것을 나타내는 것으로 그러므로 성공적이지 않은 것으로 생각될 것이다. 비교에 기초하여, 당업자는 상기 대상체에 대한 최선의 치료 방식을 투여할 수 있을 것이다.
추가적으로, 주어진 생물학적 샘플에서 발견된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 차등적 존재는 또한 대상체에서 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 병기를 결정하는데 사용될 수도 있다.
악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린 것으로 진단된 대상체로부터 채취한 샘플에서 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 양은 특정 병기 또는 등급의 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린 것으로 공지된 대상체로부터 채취한 참조 바이어마커 패널과 비교된다. 비교에 기초하여, 상기 대상체 내에서 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 병기 또는 등급을 결정할 수 있을 것이다.
케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)은 특정 임상적 상태의 (예를 들어, 건강하거나 또는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린) 대상체로부터 채취한 샘플 내에서 증가한 수준, 감소한 수준으로 존재하거나, 또는 완전히 없을 수도 있다.
따라서, 주어진 생물학적 샘플에서 발견된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 어떠한 존재도 테스트되는 대상체가 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸리거나 또는 건강할 가능성에 관한 유용한 정보를 제공한다. 테스트되는 대상체가 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸리거나 건강할 가능성은 상기 대상체로부터 채취한 테스트 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양이 건강한 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양 또는 건강한 대상체에 존재하는 것으로 공지된 대조군 수준으로부터 통계적으로 유의한지에 따른다.
악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸렸다고 하는 대상체는 그것들의 조직이 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암으로 특성화될 수 있도록 조직의 형태학적, 생화학적, 및 기능적 변화를 보유한다. 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암이 진행하는 병기는 현재 이용 가능한 및 본원에서 제공된 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재 또는 부재를 분석하기 위한 데이터 분석은 검출된 바이오마커의 신호 강도 (예를 들어, 피크의 강도)를 결정하고 "이상치(outlier)" (사전 결정된 통계적 분포로부터 벗어난 데이터)를 제거하는 단계를 포함할 수도 있다. 예는 피크의 표준화, 일부 참조에 관하여 각각의 피크의 강도가 계산되는 공정이다. 예를 들어, 참조는 기구 및/또는 화학물질 (예를 들어, 에너지 흡수 분자)에 의해 발생한 백그라운드 노이즈(background noise)일 수 있으며, 이것은 규모가 0으로 설정된다. 그 다음에 각각의 단백질에 대하여 검출된 신호 강도가 원하는 규모 (예를 들어, 100)에서 상대적인 강도의 형태로 나타날 수 있다. 구체예에서, 주어진 피크에 대하여 관찰된 신호는 명시된 질량 대 전하 비율 범위에서 피크 및 백그라운드 노이즈에 대하여 관찰된 전체 신호의 합계에 대한 상기 피크의 강도의 비율로서 표현될 수 있다. 구체예에서, 표준은 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 대하여 관찰된 신호의 상대적인 강도를 관찰하기 위한 참조로서 사용될 수 있도록 샘플로 인정될 수도 있다.
결과로 얻은 데이터는 전형적으로 컴퓨터 알고리즘의 사용을 통해, 디스플레이를 위한 다양한 포맷으로 변형될 수 있다. 상기 디스플레이 포맷 중 어느 것을 사용해서도, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)이 샘플에서 검출되는지가 신호 디스플레이로부터 쉽게 결정될 수 있다.
예시적 방법은 본원에서 더 기술된 바와 같이, 예를 들어, 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 병기를 진단, 예상하고, 치료 결과를 예측하고, 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암 재발의 가능성을 예측하는데 사용될 수도 있다.
재발은 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암이 초기 (또는 차후) 치료(들) 이후 되살아난다는 것을 의미한다. 대표적인 초기 치료는 방사선 치료, 화학요법, 항-호르몬 치료 및/또는 수술을 포함한다.
본원에서 개시된 몇몇 방법은 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 예후에 유용하다. 예후는 질환의 유망한 결과이다 (전형적으로 치료와 관계 없음).
본원에서 개시된 방법은 질환의 유망한 결과, 예를 들어, 재발 이전에 샘플 수거된 웰에서의 재발을 예상, 즉, 예측하는데 사용될 수도 있다. 불량한 (또는 더 불량한) 예후는 더 공격성 암에 걸린 대상체에 대한 가능성이 더 높다. 일부 방법 구체예에서, 불량한 예후는 신생물 질환의 초기 진단 후 환자의 5년 미만의 생존 (예를 들어, 1년 미만의 생존 또는 2년 미만의 생존)이다. 일부 방법 구체예에서, 양호한 예후는 신생물 질환의 초기 진단 후 환자의 2년 초과의 생존 (예를 들어, 3년 초과 생존, 5년 초과 생존, 또는 7년 초과 생존)이다.
또 다른 방법 구체예는 환자에서 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 치료 결과를 예측하고, 암 환자에 대한 치료 양식을 지시하는데 (예를 들어, 유용한 치료 양식을 선택하는데) 유용하다. 본 명세서의 다른 곳에서도 논의된 바와 같이, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현은 치료 (예를 들어, 면역요법, 온열요법, 레이저 요법, 수술, 방사선 요법, 화학요법)가 실패할 가능성이 높다 (예를 들어, 질환이 재발할 것이다)는 것을 예측한다. 이런 이유로, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)은 간병인에 의해 치료 (예를 들어, 면역요법, 레이저 요법, 수술, 온열요법, 방사선 요법, 화학요법)의 성공에 관해서 암 환자를 상담하는데 사용될 수 있다. 특정 대상체의 병력의 맥락에서 취해지면, 환자 및 간병인은 치료 (예를 들어, 수술의 수행)를 할지 여부 및/또는 대안의 치료 (예를 들어, 외부 빔(beam) 방사선 치료, 근접요법(brachytherapy), 화학요법, 또는 감시 대기(watchful waiting))를 제공할지 여부의 더 현명한 결정을 할 수 있다.
따라서 본 발명은 주어진 대상체의 생물학적 샘플 내에서 발현된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 검출에 의한 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 진단 및 예상 방법에 관한 것이며, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재 또는 부재는 대상체가 건강하거나 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린 것으로 진단 또는 예후를 허용한다. 한 구체예에서, 방법은 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재를 검출하는데 마커는 건강하고, 질환에 걸리지 않은 개체에서는 발현되지 않는다. 관련된 구체예에서, 본 발명의 방법은 정상이고, 건강한 개체와 비교하여 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암에 걸린 개체의 샘플에서 더 높은 수준으로 존재하는, 증가한 수준의 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출한다.
본 발명의 한 양태는 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하기 위한 시험관 내 방법이며, 방법은
a) 상기 생물학적 샘플을 적어도 제1 및 제2 표적화제 또는 이것의 단편을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 또는
b) 상기 생물학적 샘플을 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 생물학적 샘플을 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
d) 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하는 단계를 포함하며, 단계 b) 및 c)는 어떤 순서로도, 또는 동시에 수행될 수 있다.
예를 들어, 한 구체예에서 생물학적 샘플은 적어도 두 개의 표적화제를 포함하는 조성물과 접촉되는데, 적어도 하나의 제1 표적화제는 케라틴 7-펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하고, 적어도 하나의 제2 표적화제는 케라틴 19-펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식한다. 상기 제1 및 제2 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 및 동시에 결합할 수 있다. 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)로의 상기 제1 및 제2 표적화제의 특이적 및 동시 결합은 그 후에 당업자에게 잘 공지된 어떤 방법에 의해, 또는 대안으로 본원에서 기술된 유리한 방법에 의해 검출된다.
대안의 구체예에서 생물학적 샘플은 조성물의 일부로서 제1 및 제2 1차 항체와 접촉되는 것이 아니라 제1 및 제2 1차 항체는 별도로 제공되며, 즉, 하나의 1차 항체는 다른 것 이전에 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 1차 항체는 생물학적 샘플과 접촉된다. 제1 1차 항체는 상기 생물학적 샘플에 존재하는, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 또는 이것의 단편(들)의 K7 모이어티 상에 존재하는 항원성 부위에 결합할 것이다. 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들) 및 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 항체 사이의 복합체가 형성될 것이다. 그 후에, 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 1차 항체가 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 1차 항체에 결합된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 함유하는 생물학적 샘플에 제공된다. 상기 제2 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 K19 모이어티 상에 존재하는 항원성 부위에 결합하여 K19-항체 - 항원 - K7-항체 복합체, 즉, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들) 및 각각 케라틴 7 및 케라틴 19 펩타이드, 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 두 개의 1차 항체를 포함하는 삼중 복합체를 형성할 것이다.
대안의 구체예에서, 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 1차 항체가 생물학적 샘플에 제공된다. 제2 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들) 상의 K19 모이어티 상에 존재하는 항원성 부위에 결합하여 항원 - K19-항체 복합체를 형성할 것이다. 그 후에, 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 1차 항체가 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들) - K19-항체를 함유하는 샘플에 제공된다. 상기 제1 1차 항체는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 K7 모이어티 상에 존재하는 항원성 부위에 결합하여 K7-항체 - 항원 - K19-항체 복합체, 즉, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들) 및 각각 케라틴 7 및 케라틴 19 펩타이드, 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 두 개의 1차 항체를 포함하는 삼중 복합체를 형성할 것이다.
추가의 단계에서, 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양은 양성 및/또는 음성 대조군과 비교될 수도 있는데, 양성 대조군은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하고 음성 대조군은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서, 양성 대조군은 악성 신생물 질환으로 진단된 대상체로부터 얻은 조직 또는 체액을 포함하고, 음성 대조군은 악성 질환으로 고통받고 있지 않은 건강한 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플이다.
선택적으로, 업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 표준 스코어링 시스템에 따라 검출된 항원-항체 복합체의 스코어링이 실시될 수도 있다.
물론, 샘플은 아마도 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 포함할 수 있는 어떤 생물학적 샘플도 될 수 있다. 이러한 생물학적 샘플의 예는 인간, 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 또는 염소, 양, 돼지, 낙타, 개, 고양이, 및 심지어 토끼의 조직 샘플, 체액 샘플 또는 세포 샘플 또는 그렇지 않으면 본원에서 개시된 바와 같다. 한 구체예에서, 샘플은 인간의 것이다. 추가의 구체예에서, 샘플은 조직 샘플 또는 인간 체액 샘플, 예를 들어, 혈청, 혈장, 림프, 삼출물, 배설물, 위산, 위액, 림프, 점액, 심막액, 복막액, 흉수, 고름, 타액, 가래, 관절 낭액, 눈물, 땀, 질 분비물, 토사물 및 소변이다. 생물학적 샘플은 작업을 하기 위해 제조될 필요가 있을 수도 있고, 샘플의 전처리는 당업자에게 공지된 방법에 따라 실시될 수도 있다.
생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하기 위한 시험관 내 방법은 본원에서 제공된 바와 같이 유리하게는
i) 대상체에서 악성 신생물 질환의 진단 및/또는 예상, 또는
ii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능의 예측, 또는
iii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과의 평가, 또는
iv) 대상체에서 악성 신생물 질환의 재발의 평가
에 사용될 수도 있으며, 상기 대상체는 악성 신생물 질환에 걸린, 또는 걸린 것으로 의심되는 포유동물이다.
악성 신생물 질환은 담관암 (간 외), 방광암, 유방암, 불명 암종 (원발 부위), 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 쓸개암, 위장암 (위암), 두경부암, 간세포암 (간암), 하인두암, 신장암, 후두암, 간암 (일차성), 폐암 (비-소세포), 폐암 (소세포), 중피종, 비-소세포 폐암, 난소암, 상피성 난소암 (표면 상피-간질성 종양), 난소 생식세포 종양, 저악성 잠재성 난소 종양, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신세포 암종 (신장암), 침샘암, 소세포 폐암, 소장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행세포암, 자궁암 (자궁 내막) 중 어느 하나일 수도 있다.
하지만, 본원에서 개시된 방법은
i) 대상체에서 악성 신생물 질환의 진단 및/또는 예상, 또는
ii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능의 예측, 또는
iii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과의 평가, 또는
iv) 대상체에서 악성 신생물 질환의 재발의 평가
에 유용하며, 상기 대상체는 폐암, 방광암, 식도암, 간세포암, 췌장암, 위암 및 난소암에 걸린, 또는 걸린 것으로 의심되는 포유동물이다. 본원에서 개시된 방법은 대상체가 폐암, 방광암, 식도암, 및 난소암에 걸린, 또는 걸린 것으로 의심되는 포유동물일 때 특히 유용하다.
예를 들어, 본 발명의 한 양태는 생물학적 샘플에서 악성 신생물 질환의 시험관 내 검출 방법이다. 샘플은 아마도 악성 신생물 질환을 포함하는 어떤 생물학적 샘플도 될 수 있으며, 상기 방법은
a) 상기 생물학적 샘플을 본원에서 기술된 조성물과 접촉시키는 단계; 또는
b) 상기 생물학적 샘플을 시토케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 생물학적 샘플을 시토케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
d) 시토케라틴 7과 시토케라틴 19의 상기 이형 복합체를 검출하는 단계
를 포함하며, 단계 b) 및 c)는 어떤 순서로도, 또는 동시에 수행될 수 있다.
케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)로의 상기 제1 및 제2 표적화제의 특이적 및 동시 결합은 당업자에게 잘 공지된 어떤 방법에 의해서도, 또는 대안으로 본원에서 기술된 유리한 방법에 의해서 검출될 수 있고, 이로 인해 생물학적 샘플에서 악성 신생물 질환을 검출한다.
추가의 단계에서 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양은 양성 및/또는 음성 대조군에 비교될 수도 있는데, 양성 대조군은 악성 신생물 질환으로 고통받고 있는 대상체의 세포를 포함하고, 음성 대조군은 악성 신생물 질환으로 고통받고 있지 않은 건강한 대상체의 세포를 포함한다.
선택적으로, 업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 표준 스코어링 시스템에 따라 검출된 항원-항체 복합체의 스코어링이 실시될 수도 있다.
추가의 양태는 생물학적 샘플에서 악성 신생물 질환의 시험관 내 진단 및/또는 예상 방법이며, 방법은
a) 상기 생물학적 샘플을 본원에서 한정된 조성물과 접촉시키는 단계; 또는
b) 상기 생물학적 샘플을 시토케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 생물학적 샘플을 시토케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
d) 시토케라틴 7과 시토케라틴 19의 이형 복합체를 검출하는 단계; 및
e) 검출된 시토케라틴 7과 시토케라틴19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양을 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하고, 이로 인해 악성 신생물 질환을 진단 및/또는 예상하는 단계
를 포함하며, 단계 b) 및 c)는 어떤 순서로도, 또는 동시에 수행될 수 있다
선택적으로, 업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 표준 스코어링 시스템에 따라 검출된 항원-항체 복합체의 스코어링이 실시될 수도 있다.
샘플은 아마도 악성 신생물 질환을 포함하는 어떤 샘플도 될 수 있다.
추가의 구체예는 양성 대조군이 악성 신생물 질환으로 고통받고 있는 대상체의 세포를 포함한다는 것이다. 추가의 구체예는 음성 대조군이 악성 신생물 질환으로 고통받고 있지 않은 건강한 대상체의 세포를 포함한다는 것이다.
따라서, 주어진 대상체의 생물학적 샘플 내에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현 여부의 검출에 의한 악성 신생물 질환의 진단 또는 예상 방법은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재 또는 부재는 대상체가 건강하거나 악성 신생물 질환에 걸린 것으로 진단 또는 예후를 허용한다는 것일 수도 있다. 한 구체예에서, 방법은 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재를 검출하는데 마커는 건강하고, 질환에 걸리지 않은 개체에서는 발현되지 않는다. 관련된 구체예에서, 본 발명의 방법은 정상이고, 건강한 개체와 비교하여 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암, 간세포암, 췌장암, 위암 및 난소암 에 걸린 개체의 샘플에서 더 높은 수준으로 존재하는, 증가한 수준의 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출한다. 이것은 본원에서 개시된 실시예에서 추가로 가시화된다.
한 구체예에서, 악성 신생물 질환의 진단 또는 예후 방법은 주어진 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계, 특이적 결합 조건 하에서 상기 샘플을 본원에서 개시된 조성물과 접촉시키는 단계, 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들) 및 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)에 결합하는 항체를 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 결합하게 하는 단계, 샘플 내에서 상기 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현의 프로파일을 생성하는 검출 방법을 사용하여 항체를 검출하는 단계, 생성된 프로파일을 컴퓨터로 판독 가능한 형태로 변환하는 단계, 및 상기 샘플의 프로파일을 악성 신생물 질환에 걸린 건강한 대상체에 특이적인 비슷한 샘플의 프로파일을 함유하는 데이터베이스와 비교하는 단계를 포함한다. 상기 비교의 결과는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 존재, 부재 또는 비슷한 양을 기반으로 하여 생물학적 샘플이 얻어진 대상체가 건강한지 또는 악성 신생물 질환에 걸렸는지 여부의 결정을 허용한다.
추가의 구체예에서, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 검출은 대상체를 건강한 또는 악성 신생물 질환에 걸린 것으로 진단하기 위해 또 다른 진단 도구와 조합으로 사용될 수도 있다. 예를 들어, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 검출은 폐암, 방광암, 식도암, 및 난소암 검출에 특이적인 다른 진단 도구, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 자격증을 가진 임상의에 의한 생검 평가, 방사선 촬영 및 징후학적 평가와 조합으로 사용될 수도 있다.
의사는 일상적으로 폐암에 대하여 환자를 진단하기 위해 흉부 방사선 사진 및 컴퓨터 단층촬영을 사용한다. 방광암은 방광경 검사를 사용하여 진단되고 NMP 22와 같은 소변 결합된 마커가 또한 진단에 도움을 줄 수도 있으며, 식도암은 보통 위 내시경 (esophagogastroduodenoscopy; EGD), 또는 아마도 바륨 조영 검사(barium swallow)에 의해 진단된다. 난소암은 골반 내진(pelvic examination), 초음파 및 CA125를 사용하여 진단된다. 진단은 수수로 확인되어야 한다.
테스트 중 어느 것도 비정상인 경우 의사는 그것들의 발견을 확인하기 위한 생검을 지시할 것이다. 생검 조직은 이어서 병리학자에 의해 검사되고 추가적인 테스트, 예를 들어, CT-스캔 또는 조합 CT 및 PET 스캔 또는 자기 공명 영상법 (magnetic resonance imaging; MRI) 및 언급된 암의 임상적 실시에 있어서 공지된 다른 방법이 또한 사용될 수도 있다.
케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 조성물은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 결합하는 항체가 악성 신생물 질환에 걸린 대상체만을 검출하고 불명확한 경우에는 마이너스로 점수를 계산하기 때문에 불명확한 병소를 검출하는데 유용하다.
샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양은 업계에 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여 결정될 수도 있다. 생물학적 샘플에서 상기 단백질 (또는 항원) 수준의 검정에 적합한 방법은 항체-기반 기술을 포함한다. 예를 들어, 조직에서 상기 단백질의 단백질 발현은 고전적인 면역화학적 및/또는 면역조직학적 방법으로 연구될 수 있다. 이것들에서, 특이적 인식은 본 발명에 따르는 조성물에서 1차 항체 (다클론성 또는 단클론성)에 의해 제공된다. 2차 검출 시스템은 형광, 효소, 또는 다른 컨쥬게이션된 2차 항체를 활용할 수 있으며, 본원에서 논의된 바와 같다.
한 구체예에서, 테스트되는 생물학적 샘플은 상응하는 정상적인 건강한 세포와 비교하여 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들) 수준의 상향- 또는 하향-조절에 의해 악성 신생물 질환과 관련된 샘플로서 확인된다. "상향 조절된"은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)이 정상적인 (건강한) 세포에서 단백질의 발현과 비교하여 적어도 10%만큼 증가된다는 것을 의미한다. 유사하게, "하향 조절된"은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 양이 정상적인 (건강한) 세포에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현과 비교하여 적어도 10%만큼 감소된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 수준은 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 심지어 100% 또는 그 이상만큼 증가될 수도 있다. 샘플에서 항원의 수준을 측정하는 수단은 본원에서 개시되고 업계에 추가로 공지된다.
화합물 또는 항체의 검출은 임상 이미지화의 업계에서 잘 공지된 방법 및 본원에서 및 업계에서 추가로 기술된 진단법을 사용하여 달성될 수 있다. 필요한 특이적 방법은 본 발명에 따르는 조성물의 항체에 부착된 검출 가능한 라벨의 유형에 의존적일 것이다.
추가의 양태는 악성 신생물 질환 환자의 대상체에서 치료 결과의 시험관 내 예측 방법이며, 방법은
a) 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현을 검출하는 단계
b) 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현을 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하고, 이로 인해 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 검출된 발현에 기초하여 상기 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과를 예측하는 단계
를 포함한다.
선택적으로, 업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 표준 스코어링 시스템에 따라 검출된 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 스코어링이 실시될 수도 있다.
생물학적 샘플은 아마도 악성 신생물 질환을 포함하는 어떠한 샘플, 바람직하게는 악성 신생물 질환에 걸린 대상체의 생물학적 샘플일 수도 있다.
추가의 양태는 악성 신생물 질환의 치료 효능의 시험관 내 평가 방법이며, 방법은
a) 악성 신생물 질환에 걸린 대상체의 생물학적 샘플을 제공하는 단계,
b) 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하는 단계
c) 악성 신생물 질환에 대한 상기 대상체의 치료 중에 하나 이상의 시점에서 a) 및 b)를 반복하는 단계
를 포함하는데, 시간이 흐름에 따른 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 상대적인 발현의 변화는 효율적인 치료를 나타낸다.
따라서, 효율적인 치료의 징후는 방법을 반복하는 단계에서 분석된 제 시간의 이전 샘플과 비교하여 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 감소하는 발현의 상대적인 변화이다.
선택적으로, 업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 표준 스코어링 시스템에 따라 검출된 항원-항체 복합체의 스코어링이 실시될 수도 있다.
샘플은 아마도 악성 신생물 질환을 포함하는 어떠한 샘플, 바람직하게는 악성 신생물 질환에 걸린 대상체의 생물학적 샘플도 될 수 있고, 상기 대상체는 치료될 예정이거나, 치료 중간에 있거나 또는 현재 치료 중이다.
추가의 양태는 악성 신생물 질환의 재발의 시험관 내 평가 방법이며, 방법은
a) 이전에 악성 신생물 질환에 걸린 적이 있는 대상체의 생물학적 샘플을 제공하는 단계,
b) 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하는 단계,
c) 악성 신생물 질환에 대한 상기 대상체의 치료 중에 하나 이상의 시점에서 a) 및 b)를 반복하는 단계
를 포함하는데, 시간이 흐름에 따른 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 상대적인 발현의 변화는 악성 신생물 질환의 재발을 나타낸다.
따라서, 재발의 징후는 방법을 반복하는 단계에서 분석된 제 시간의 이전 샘플과 비교하여 악성 신생물 질환, 즉, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 발현의 시간이 흐름에 따른 증가를 확인하는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 증가하는 양의 상대적인 변화이다.
본원에서 제공된 방법은 수동으로, 또는, 바람직하게는, 자동화된 판독 디바이스 상에서 수행될 수도 있다. 따라서, 한 구체예에서 방법은 수동으로 수행된다. 추가의 구체예에서, 방법은 자동화된 판독 디바이스 상에서 수행된다.
조성물의 사용
본 발명의 추가의 양태는 본원에서 제공된 방법 및 조성물의 사용을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하기 위한 본원에서 제공된 방법의 사용이다.
본 발명의 추가의 양태는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암을 검출하기 위한 본원에서 제공된 방법의 사용이다.
본 발명의 추가의 양태는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암을 진단 또는 예상하는 방법의 사용이다.
본 발명의 추가의 양태는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 치료 결과를 예측하는 방법의 사용이다.
본 발명의 추가의 양태는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암 치료의 효능을 평가하는 방법의 사용이다.
본 발명의 추가의 양태는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 재발을 평가하는 방법의 사용이다.
키트
본 발명은 또한 면역검정, 예를 들어, 면역조직화학법용 키트를 제공한다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는
a) 본원에서 제공된 본 발명의 조성물; 또는
b) 본원에서 한정된 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
c) 본원에서 한정된 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기; 및
d) 선택적으로 본원에서 한정된 방법을 수행하기 위한 설명서
를 포함하는 면역검정용 키트를 제공한다.
추가의 구체예는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 결합하는 조성물을 검출할 수 있도록 가시화 시약을 포함한다. 가시화 및 검출 시약의 예는 업계에 공지되어 있다. 일부 키트 구체예에서, 1차 항체 또는 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 직접적으로 라벨링될 수 있다.
다른 키트 구체예는 본원에서 기술된 바와 같이 2차 항체 (예를 들어, 염소 항-토끼 항체, 토끼 항-마우스 항체, 항-합텐 항체) 또는 비-항체 합텐-결합 분자 (예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘)의 2차적인 또는 추가의 검출을 포함할 것이다. 이러한 키트에서, 2차 또는 추가의 검출 수단은 검출 가능 모이어티로 직접적으로 라벨링될 수도 있다. 다른 경우에는, 2차 (또는 추가의) 항체 또는 결합제는 합텐 (예를 들어, 비오틴, DNP, 및/또는 FITC)에 컨쥬게이션될 것이며, 이것은 검출 가능하게 라벨링된 동족 합텐 결합 분자 (예를 들어, 스트렙타비딘 (SA) 호스래디쉬 퍼옥시다제, SA 알칼린 포스파타제)에 의해 검출 가능하다. 일부 키트 구체예는 이러한 비색분석 시약의 개발을 위해 효소로 라벨링된 1차 또는 2차 (또는 더 고차의) 검출 수단 (예를 들어, 항체 또는 결합 실체물)과 협력하여 사용되는데 적합한 용기에서 비색분석 시약 (예를 들어, DAB, 및/또는 AEC)을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 키트는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)을 발현하거나 또는 발현하지 않는 것으로 공지된 양성 또는 음성 대조군 샘플, 예를 들어, 세포주, 조직 또는 체액을 포함한다. 대조군 샘플의 예는 치료 후 (예를 들어, 치료 후 적어도 5년 또는 적어도 10년) 악성 신생물 질환이 재발하지 않거나 재발한 적이 없는 것으로 공지된 대상체의 정상적인 (예를 들어, 비-암성) 세포 또는 조직, 악성 신생물 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 키트는, 예를 들어, 조성물 또는 추가의 결합 실체물의 사용 수단 또는 검출 수단, 예를 들어, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 특정 시약의 사용 수단을 개시하는 교육용 재료를 포함한다. 교육용 재료는 전자적 형태 (예를 들어, 컴퓨터 디스켓 또는 컴팩트 디스크)로 쓰여질 수도 있거나 시각적일 수도 있다 (예를 들어, 비디오 파일). 키트는 또한 키트가 디자인된 특정 용도를 용이하게 하는 추가적인 구성요소를 포함할 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 키트는 버퍼 및 개시된 특정 방법의 실시에 일상적으로 사용되는 다른 시약을 포함할 수 있다. 이러한 키트 및 적절한 내용물은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
키트는, 적어도 1회 검정에 충분한 양으로, 별도로 포장된 시약으로서 본 발명에 따르는 조성물을 더 포함할 수도 있다.
포장된 시약의 사용을 위한 설명서가 또한 전형적으로 포함된다. 이러한 설명서는 전형적으로 시약 농도 및/또는 적어도 하나의 검정 방법 파라미터, 예를 들어, 혼합되는 시약 및 샘플의 상대적인 양, 시약/샘플 혼합물의 유지 시간, 온도, 버퍼 조건 등을 기술하는 실질적 표현을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 시험관 내 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체, 및/또는 이것의 단편(들)의 검출용 키트를 제공하며, 키트는
a) 본원에서 제공된 본 발명의 조성물; 또는
b) 본원에서 한정된 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
c) 본원에서 한정된 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기, 및
d) 선택적으로 선택적으로 본원에서 한정된 방법을 수행하기 위한 설명서
를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 시험관 내 생물학적 샘플에서 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 검출용 키트를 제공하며, 키트는
a) 본원에서 제공된 본 발명의 조성물; 또는
b) 본원에서 한정된 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
c) 본원에서 한정된 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기, 및
d) 선택적으로 선택적으로 본원에서 한정된 방법을 수행하기 위한 설명서
를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 시험관 내 생물학적 샘플에서 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 진단 및/또는 예상용 키트를 제공하며, 키트는
a) 본원에서 제공된 본 발명의 조성물; 또는
b) 본원에서 한정된 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
c) 본원에서 한정된 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기, 및
d) 선택적으로 선택적으로 본원에서 한정된 방법을 수행하기 위한 설명서
를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 악성 신생물 질환의 대상체, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암 환자의 치료 결과 예측용 키트를 제공하며, 키트는
a) 본원에서 제공된 본 발명의 조성물; 또는
b) 본원에서 한정된 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
c) 본원에서 한정된 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기, 및
d) 선택적으로 선택적으로 본원에서 한정된 방법을 수행하기 위한 설명서
를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 치료 효능의 평가용 키트를 제공하며, 키트는
a) 본원에서 제공된 본 발명의 조성물; 또는
b) 본원에서 한정된 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
c) 본원에서 한정된 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기, 및
d) 선택적으로 선택적으로 본원에서 한정된 방법을 수행하기 위한 설명서
를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암 또는 난소암의 재발의 평가용 키트를 제공하며, 키트는
a) 본원에서 제공된 본 발명의 조성물; 또는
b) 본원에서 한정된 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
c) 본원에서 한정된 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기, 및
d) 선택적으로 선택적으로 본원에서 한정된 방법을 수행하기 위한 설명서
를 포함한다.
특정 키트 구체예는 운송 수단, 예를 들어, 박스, 가방, 새첼(satchel), 플라스틱 곽 (예를 들어, 몰딩된(moulded) 플라스틱 또는 다른 투명한 포장재), 포장지 (예를 들어, 밀봉된 또는 밀봉 가능한 플라스틱, 종이, 또는 금속 포장지), 또는 다른 용기를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 키트 구성요소는 단일 포장 유닛, 예를 들어, 박스 또는 다른 용기에 동봉될 것이며, 이 포장 유닛은 키트의 하나 이상의 구성요소가 배치될 수 있는 구획을 가질 수도 있다. 다른 예에서, 키트는, 예를 들어, 테스트되는 하나 이상의 생물학적 샘플을 보유할 수 있는 하나 이상의 용기, 예를 들어, 바이알, 튜브, 등을 포함한다.
키트 구체예는, 예를 들어, 주사기, 면봉, 또는 라텍스 장갑을 포함하며, 이것은 생물학적 샘플의 핸들링, 수거 및/또는 가공에 유용할 수도 있다. 키트는 또한 선택적으로 생물학적 샘플을 한 위치에서 다른 곳으로 이동시키는데 유용한 기구를 함유할 수도 있으며, 예를 들어, 점적기(dropper), 주사기, 등을 포함한다. 또 다른 키트 구체예는 사용된 또는 더 이상 필요하지 않은 아이템 (예를 들어, 대상체 샘플, 등)을 폐기하기 위한 처리 수단을 포함할 수도 있다. 이러한 처리 수단은, 제한 없이, 폐기된 재료의 누출물을 함유할 수 있는 용기, 예를 들어, 플라스틱, 금속 또는 다른 불투수성 가방, 박스 또는 용기를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양태를 구현하는 비-제한 실시예가 이제 기술될 것이다.
실시예 1
체액에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 결정을 위한 검정
목적은 임상 평가에 적합한 검정을 생성하는 것이었다.
케라틴 7에 특이적인 단클론성 항체 Ks 7.18을 비오틴에 컨쥬게이션하였고 케라틴 19에 특이적인 단클론성 항체 BM 19.21을 "Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRP) to antibodies" (M Barbara Wilson and Paul K. Nakane, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1978)에서 기술된 방법에 따라 퍼옥시다제에 컨쥬게이션하였다.
샌드위치 효소-면역검정을 수행하여 악성 신생물 질환으로 진단된 환자로부터 얻거나, 또는 비-악성 질환으로 진단된 환자 또는 건강한 것으로 간주되는 개체로부터 얻은 체액에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 또는 이것의 단편의 존재를 결정하였다. 이 과정에서 두 개의 단클론성 항체, 비오틴 컨쥬게이션된 Ks 7.18 (1μg/ml) 및 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 BM 19.21 (2 μg/ml)을 함유하는 BSA Tris 버퍼 pH 7.2 중 항체 용액 100 μl를 마이크로플레이트의 스트렙타비딘-코팅된 웰에서 실온에서 한 시간 동안 흔들면서 50 μl 혈청 샘플 또는 칼리브레이터(calibrator), 즉, 공지된 농도의 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 또는 이것의 단편을 가진 샘플과 함께 배양하였다. 배양 후 웰을 0.05% Tween/PBS로 여섯 번 세척하여 초과량의 항체를 제거하였다. 그 이후 100 μl 완충된 TMB 기질 (과산화수소 및 3, 3', 5, 5' 테트라메틸벤지딘)을 웰에 첨가하여 효소 반응을 실온에서 30분 동안 진행하였다. 효소 반응 중에 항원, 즉, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 또는 이것의 단편이 혈청 샘플에 존재하면 웰에서 파란색이 발달하였다. 색 강도를 마이크로플레이트 리더에서 620 nm에서 결정하였다. 흡광도 값 대 각 칼리브레이터에 대한 농도를 플로팅함으로써 각 검정에 대한 보정 곡선을 구성하였다. 환자의 샘플에 존재하는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 또는 이것의 단편의 농도를 보정 곡선으로부터 결정하였다. 이 실시예에서 기술된 검정은 하기에서 "K7/K19 검정"으로 불린다. 도 2는 전형적인 보정 곡선을 나타낸다.
실시예 2
다른 형태의 암에 대한 K7/K19의 민감도
다양한 형태의 암으로 고통받고 있는 환자의 총 398개의 혈청을 실시예 1에서 기술된 바와 같이 K7/19 검정을 사용하여 테스트하였다. 결과는 표 1에서 요약된다.
결론으로서 K7/K19 검정은 연구된 다른 암과 비교하여 방광암, 난소암, 폐암 및 식도암(oesophagus cancer)에 대하여 가장 높은 임상적 민감도를 나타냈고, 특히 폐암, 방광암 및 난소암 환자의 샘플이 고농도의 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 (또는 이것의 단편(들))를 가지고 있다. 그에 반해 K7/K19 검정은 자궁경부, 및 유방의 편평세포 암종, 뿐만 아니라 두경부암 및 위장관의 암에 대하여 10% 이하만큼 낮은 민감도를 나타냈다. 이 후자의 암 환자에 대한 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 (또는 이것의 단편(들))의 농도 값은 표 2에서 대조군 (건강하고 양성임)과 같은 범위에 있었다. 따라서 K7/K19 검정은 일반적으로 낮은 민감도 때문에 이 유형의 암에 적합하지 않다. 하지만, 두 명의 유방암 환자 및 한 명의 GI 관 암 환자는 양성 질환 군에서의 샘플의 최고값보다 더 높은 값을 갖는다. 이 높은 값들은 공격적인 암 또는 불량한 예후를 나타낼 수도 있다. 다시 말해서, 검정은 일반적으로 일부 암에는 적합하지 않지만, 검정이 실제로 높은 값을 제공하는 소수의 경우는 임상적 가치가 있을 수도 있다.
다양한 암에 대한 민감도 대 96% 특이성
암 군 샘플의 수 상위 95번째 백분위수
(U/mL) 		평균
(U/mL) 		1.1　U/mL의 컷-오프(cut-off)에서 양성의 수 양성 테스트 ( % )
폐 119 38,1 8,0 43 36,1
난소 40 13,3 2,38 15 37,5
식도 (SCC) 40 4,3 1,30 18 45
방광 38 47,0 8,16 19 50
GI 관 40 1,9 0,39 3 7,5
자궁경부 (SCC) 40 1,8 0,35 4 10
유방 40 4,9 0,65 3 7,5
두경부 40 1,2 0,07 2 5
실시예 3:
건강한 개체에 대한 참고 범위의 확립
명백하게 건강한 개체의 백 열 두 개 (112)의 혈청을 악성 신생물 질환의 명백한 징후가 없는 개체에 대한 참고 범위를 확립하기 위해 실시예 1에서 기술된 바와 같이 K7/K19 검정에 따라 테스트하였다. 개체 중 95%는 1.01 U/mL 미만인 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 또는 이것의 단편(들)의 농도를 갖거나, 또는 95.5%는 1.09 U/mL 이하의 값을 갖고 있었다. 112명의 건강한 개체 중 다섯 명 (5) (즉, 4.5%)은 1.1 U/mL보다 높은 농도를 갖고 있었다. 테스트된 개체에 대한 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 또는 이것의 단편(들)의 평균 농도는 0.15 U/mL였다 (표 2 참조).
실시예 4:
양성 (비- 암성 ) 신생물 질환에 걸린 개체에 대한 참고 범위의 확립.
일반적으로 높아진 종양 마커 값을 제공하는 것으로 공지되어 있는, 질환으로 고통받고 있는 환자의 총 239개의 혈청을 실시예 1에 따르는 K7/19 검정으로 테스트하였다. 결과는 하기 표 2에서 나타난다.
결론으로서 95번째 백분위수 값은 건강한 혈액 기증자보다 양성 질환에 대하여 더 높지 않았다. 모든 군은 1.09　U/mL의 절삭값(cut value)을 사용하여 5% 이하의 양성 샘플을 제공하였고 양숭 군의 샘플 중 99%는 1.8 U/mL보다 낮은 값을 갖고 있었다 (미도시).
건강한 혈액 기증자 및 양성 질환 각각에 대한 기준값 및 % 양성 샘플
군 샘플의 수 상위 95번째 백분위수
(U/mL) 		평균
(U/mL) 		1.1　U/mL의 컷-오프에서 양성의 수 양성 테스트 ( % )
건강한 혈액 기증자 112 1,01 0,15 5 4,5
양성 질환 　 　 　 　 　
폐 75 1,08 0,36 2 2,7
부인과 45 1,40 0,16 2 4,4
간 39 1,44 0,19 2 5,1
신장 40 1,52 0,55 2 5
CHF 40 0,85 0,25 1 2,5
모든 양성 239 1,03 0,31 9 3,8
실시예 5A:
케라틴 8과 케라틴 19의 이형 복합체 또는 케라틴 19와의 가능한 교차반응성의 테스트
케라틴 8과 케라틴 19의 이형 복합체를 함유하는 칼리브레이터, 즉, CYFRA 21-1 EIA 키트 (Fujirebio Diagnostics Inc.)에 의해 결정된 바와 같이 50 μg/L의 케라틴 19 농도를 가진 CYFRA 21-1 키트 칼리브레이터 (Lung cancer-associated keratin 19 fragments: development and biochemical characterisation of the new serum assay Enzymun-Test CYFRA 21-1. Bodenmuller H, Ofenloch-Hahnle B, Lane EB, Dessauer A, Bottger V, Donie F, Int J Biol Markers. 1994 Apr-Jun; 9(2):75-81에서 기술됨)를, 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 혈액 기증자 샘플, K7/K19 검정에서 칼리브레이터 0 (이것은 케라틴 7/19가 없는 칼리브레이터 매트릭스로 구성됨) 및 난소암 환자의 혈청으로 구성된 양성 대조군과 함께 검정하였다.
Figure pct00001
결론: 검정에서 유의한 신호가 검출되지 않았거나, 또는 검출된 농도는 CYFRA 21-1 칼리브레이터 50 μg/L에 대하여 K19 또는 케라틴 8과 케라틴 19의 이형 복합체에 대한 어떠한 교차 반응성이 임상 성능에 영향을 미칠 정도로 충분히 낮았다. 이것은 CYFRA 키트 (50μg/L)에서 가장 높은 칼리브레이터가 K7/19 검정에 대한 검출 한계 근처에 있고 동시에 또한 혈액 기증자 혈청보다 더 낮고 난소암 혈청으로 구성된 양성 대조군보다 훨씬 더 낮기 때문에 분명하다.
실시예 5B
Ks 19.2 및 BM 19.21 클론 간의 비교
검정을 구성하여 실시예 1에서와 같이 실행하였지만, 클론 BM 19.21 대신에 케라틴 19 단클론성 항체 클론 Ks 19.2를 사용하였다. 이 검정을 케라틴 19 단클론성 항체 클론 BM 19.21를 가진 검정과 비교하였다. 검정을 같은 샘플에 대하여 실행하였다. 암 (폐암, 식도암, 방광암 또는 난소암)으로 고통받고 있는 개체의 열 다섯 개 (15)개의 혈청 및 양성 질환 (간-, 신장-, 폐-, 또는 CHF)로 고통받고 있는 환자의 13개의 혈청을 실시예 1에서 기술된 바와 같이 K7/K19 검정에 따라 테스트하였다.
결과:
검정들 간에 높은 상관관계가 있으며 (r=0.97) 양성 샘플의 수는 다음과 같았다:
양성 암 양성 양성(Positive benign)
Ks 7.18/BM 19.21 14/15 2/13
Ks 7.18/Ks 19.2 12/15 0/13
결론: 두 검정들 간에 유의한 차이가 없었다. "BM 19.21 유사" 단클론성 항체 중 어느 것도 본 발명을 입증하는데 사용될 수 있다.
실시예 6
확립된 케라틴 19 마커 CYFRA 21- 1와의 비교
실시예 3 및 4에서 검정된 같은 샘플을 포함된 사용 설명서 (Fujirebio Diagnostics Inc.)에 따라 CYFRA 21-1 효소 면역 계측 검정 (EIA)으로 테스트하였다. CYFRA 21-1 EIA는 인간 혈청에서 가용성 케라틴 19 단편의 정량적 결정을 제공하며, 종종 폐암 환자에서 질환 및 치료의 과정 중에 질환 진행을 모니터링하는데 도움이 된다. 2.42 μg/L의 상위 95번째 백분위수 기준 한계를 양성 질환에 기초한 CYFRA 21-1 EIA에 대하여 계산하였으며, 신장 질환은 제외하였다 (n=199). 결과는 도 3에서 그래프로 나타난다. 도 3은 양성 질환에 대한 민감도 vs 95% 특이성을 나타낸다 (신장 질환은 제외됨). 컷-오프 값은 CYFRA 21-1 EIA에 대하여 2.42 μg/L이고 K7/19 검정에 대하여 1.1 U/mL이다.
결론: K7/19 검정은 CYFRA 21-1 EIA와 비교하여 우수한 특이성을 나타낸다. 도 3으로부터 종양 마커 CYFRA 12-1 (케라틴 19)의 수준은 신장 질환으로 고통받고 있는 환자, 뿐만 아니라 심부전에 걸린 환자에서도 높아지는 것으로 나타난다. K7/19 검정은 또한 더 조직 제한적이지만, 난소암, 식도암 (SCC) 및 방광암에서 비슷한 민감도를 갖는다. 폐암, 모든 히스토타입(histotype)에서 민감도는 CYFRA 21-1보다 더 낮다.
실시예 7
난소암에 대한 K7/K19 검정의 평가 및 확립된 마커와의 비교 .
하복부 또는 골반부 (골반 질량)의 비정상적인 성장에 대하여 병원을 방문하는 여성의 혈청 샘플을 다음 검정에서 실행하였다: CA 125 EIA, HE4 EIA, CYFRA 21-1 EIA (이것들 모두는 Fujirebio Diagnostics Inc.로부터 상업적으로 이용 가능하다) 및 실시예 1에 따르는 K7/19 검정. CA 125 EIA는 CA125 항원에 특이적이고 HE4 EIA는 HE4 항원에 특이적이다. 두 테스트는 부인과 악성 종양, 예를 들어, 상피성 난소암에 걸린 환자를 모니터링하는데 종종 사용된다. 잘 특성화된 샘플은 하기 표 3에서 기술된다. 이 샘플 세트에서 21명의 환자가 난소암에 걸렸고 60명의 환자가 양성 질환에 걸렸다는 것이 나타났다. 수신자 조작 특성 (Receiver operating characteristic; ROC) 곡선을 네 가지 검정에 대한 민감도 대 특이성 프로파일을 비교하여 생성하였다: 도 4에서 나타난 바와 같이 난소암에서 CA 125 EIA, HE4 EIA, CYFRA 21-1 EIA.
CA125 EIA 및 K7/19 검정이 95% 특이성에서 가장 높은 민감도, 52% 및 가장 큰 곡선 아래 면적을 제공하였으며, 따라서 HE4 EIA 또는 CYFRA 21-1 EIA와 비교하여 난소암과 양성 골반 질량을 구별하는 더 높은 능력을 입증하였다.
난소암 연구를 위한 환자 재료
진단 병리학적 측면 샘플의 수
상피성 난소암 장액성 14
상피성 난소암 자궁내막 모양 2
암 - 비-상피성 난소암 과립막, 미숙기형종(immature teratoma) 2
상피성 난소암 점액성 3
　 21
양성 선섬유종(adenofibroma) 2
양성 단순 낭종(simple cyst) 6
양성 낭선종(cystadenoma) 7
양성 유피 낭종(dermoid) 3
양성 자궁내막증(endometriosis) 2
양성 자궁내막종(endometrioma) 3
양성 섬유종(fibroma) 2
양성 수란관 수종(hydrosalpinx) 2
양성 평활근종(leiomyomata) 1
양성 성숙 양성낭기형종(mature cystic teratoma) 2
양성 점액성 낭종(mucinous cystadenoma) 3
양성 근종(myoma) 2
양성 출혈성 모낭을 가진 정상 난소 1
양성 난소 난포(ovarian cyst) 1
양성 부난관 낭종(paratubal cyst) 1
양성 근종 2
양성 장액성 낭종(serous cyst) 4
양성 장액성 낭선섬유종(serous cystadenofibroma) 2
양성 장액성 낭선종(serous cystadenoma) 7
양성 기형종(teratoma) 2
양성 명시되지 않음 5
60
실시예 8
실시예 7의 바이오마커의 조합
도 5는 조합 CA125 EIA & HE4 EIA와 조합 CA125 EIA & K7/19 검정을 비교하는 ROC-곡선을 나타낸다. CA125 EIA가 K7/19 검정과 결합되면, 진단적 민감도는 CA 125 EIA 또는 K7/19 검정이 단독으로 사용될 때와 비교하여 증가된다.
CA125 EIA & K7/19 검정 조합에 대한 민감도는 95% 특이성에서 62%이고 70%의 특이성에서 100%의 민감도에 도달한다.
결론: 실시예 7 및 8은 난소암 환자의 관리에 있어서 임상적으로 사용될 수도 있다는 것을 입증한다. K7/19 검정의 상대적으로 높은 암 특이성으로 인해 악성 신생물 질환, 예를 들어, 폐암, 방광암, 식도암, 및 난소암에 대한 마커로서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 사용은 특이성을 감소시키지 않으면서 민감도를 증가시킬 수 있다.
실시예 9
폐암: NSCLC 및 SCLC 간의 감별 진단
소세포 폐암 환자의 스물 아홉 (29)개의 혈청을 실시예 1에서 기술된 바와 같이 K7/K19 검정에 따라 테스트하였다. 스물여덟 개의 샘플은 1.1 U/mL보다 낮은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 (또는 이것의 단편(들))의 농도를 갖고 있었다. 즉, 샘플 중 단 하나만이 K7/19 검정에서 양성이었다. 샘플을 또한 ProGRP에 대하여 이전에 분석하였고 29개의 샘플 중 17개는 200 pg/mL보다 높은 ProGRP 농도를 가지며 샘플이 활성 SCLC에 걸린 개체로부터 채취된다는 것을 입증한다.
K7/K19 검정은 비-소세포 폐암 (NSCLC)과 소세포 폐암 (SCLC)을 구별할 수 있다. 이것은 K7/19 검정의 높은 특이성과 결합하여 K7/K19 검정을 소세포 및 비-소세포 폐암 간의 감별 진단을 지원하기 위한 도구로서 적합하게 만든다. 소세포 폐암에 대하여 높은 민감도 및 특이성을 가진 검정인 ProGRP와 결합한 K7/K19 검정이 특히 유용할 것이다 (Tang Jian-hua, et. al. Meta analysis, Diagnostic value of tumours marker pro-gastrin-releasing peptide in patients with small cell lung cancer: a systematic review, Chinese Medical Journal 2011;124(10): 1563-1568.). CYFRA 21-1은 또한 SCLC를 검출하고 그러므로 이러한 용도에는 유용하지 않다.
또한 ProGRP 및 K7/19의 결합된 측정은 SCLC와 결합된 SCLC (c-SCLC) 및 대세포 신경내분비 암종 (Large cell Neuroendocrine carcinoma; LC-NET)과 SCLC를 구분하기 위한 값이 될 수 있다고 예상될 수 있다.
실시예 10
폐암에서 K7/K19 검정의 진단적 가능성
양성 질환에 사용된 컷-오프 값의 네 배의 컷-오프 값을 사용하여 실시예 3 (건강한 개체의 112개의 샘플), 실시예 4 (양성 질환의 239개의 샘플), 및 실시예 5 (악성 신생물 질환의 398개의 샘플)의 데이터를 이용하였으며 (이 검정을 불신하지 않기 위해 신장 질환은 CYFRA 21-1 EIA에서 제외되었다), 다음과 같은 컷-오프 값을 제공한다: K7/19 검정에 대하여 4.4　U/mL 및 CYFRA 21-1 EIA에 대하여 9.7 μg/L. 이러한 제한으로, 양성 폐암 샘플, 다른 양성 암 샘플 (즉, 폐암 샘플은 아님) 및 양성 질환으로 고통받고 있는 환자의 양성 샘플의 수를 표 5에서 요약한다.
진단적 컷- 오프 값을 사용하는 K7/19 검정 및 CYFRA 21-1 EIA에서의 양성 샘플
검정 총 119개 중 양성 폐암 샘플의 수 총 280개 중 다른 양성 암 샘플의 수 총 240개 중 양성 양성 질환의 수 PPV 폐암
K7/19 26 (22%) 22 (8%) 0 54%
CYFRA 21-1 23 (19%) 28 (10%) 1 45%
PPV 폐암 = 폐암에 대한 양성 예측치 (즉, 양성 폐암 샘플/모든 양성 샘플)
결론: 양성인 샘플의 퍼센트가 매우 낮지만, 양성인 샘플은 높은 확률로 암이다. K7/K19 검정의 경우에 4.4 U/mL보다 높은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 (또는 이것의 단편(들))에 대한 값을 가진 샘플이 폐암일 확률은 50%보다 높다. CYFRA 21-1 EIA에 대하여 이 확률은 더 낮으며 신부전의 확률 또한 배제될 수 없다 (양성 양성 샘플). 이 예비 데이터 세트에서 폐암의 조직학적 유형은 공지되지 않았다.
실시예 11
담도암에서 K7/K19 검정의 가능성
확인된 진행된 담도의 상피암 또는 확인된 진행된 위암에 걸린 환자의 혈청을 실시예 1에서 기술된 바와 같이 K7/19 검정에서 실행하였다.
Figure pct00002
결론: K7/K19 검정은 상기 언급된 상피암으로 고통받고 있는 환자의 관리에서 또한 임상적 가치가 있을 수도 있다.
실시예 12 Nytt
혈청에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 결정을 위한 대체 검정
목적은 실시예 1에서 기술된 Ks7.18/BM 19.21 검정과 비교된 항체에 대하여 주요 다른 에피토프 위치를 가진 임상 평가에 적합한 검정을 비교하는 것이다.
케라틴 19에 특이적인 항체 Ks.19.1은 케라틴 19 상에서 아미노산 서열 311-335에 결합하고 (Bottger et al. Eur. J. Biochem. 231, 475-485, 1995) 단클론성 항체 RCK 105는 케라틴 7에 특이적이다 (Ramaekers et al. Exp Cell Res. 170(1):235-49, 1987).
"Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRP) to antibodies"에서 기술된 방법에 따라 단클론성 항체 RCK105를 비오틴에 컨쥬게이션하였고 단클론성 항체 BM Ks 19.1을 퍼옥시다제에 컨쥬게이션하였다 (M Barbara Wilson and Paul K. Nakane, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1978).
샌드위치 효소-면역검정을 수행하였고, 실시예 1에서와 같이, 악성 신생물 질환으로 진단된 환자로부터 얻어진 혈청에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 또는 이것의 단편의 존재를 결정하였다. 두 가지 검정을 같은 19 암 샘플에 대하여 비교하였다.
검정들 간에 높은 상관관계가 있으며 r=0.98, n=19 샘플, 하기 표에서 보이는 바와 같이 주요 임상적 차이는 입증될 수 없다.
결과는 하기 표에서 요약된다.
Figure pct00003
결론: 케라틴 7/19에 대한 대체 검정은 RCK 105와 짝을 지어 케라틴 19 상의 아미노산 311-331에 결합하며, 항체 Ks 7.18 외에 케라틴 7의 또 다른 부분에 위치한 그것의 에피토프를 가진 케라틴 19 항체를 사용하여 구성될 수도 있다.
실시예 13
케라틴 7 상에서 항체 Ks 7.18에 대한 에피토프 위치는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체에 대한 검정에서 Ks 19.1 케라틴 19 항체에 의한 완전한 억제에 의해 확립될 수 있다.
검정을 실시예 1에서와 같이, 하지만 BM 19.21 mab 대신에 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 Ks 19.1 mab로 구성하였다. Ks 7.18 항체와 결합한 두 개의 다른 케라틴 19 항체에 대한 결과는 한정된 샘플에 대한 하기 표에서 나타난다.
Figure pct00004
결론:
케라틴 7 및 케라틴 19 사이에서 이형 복합체가 나선 구조와 평행하게 및 인 레지스터(in register) 정렬되기 때문에 각각 케라틴 7 및 케라틴 19 상에서, 나선 1A에서 시작하여 나선 2B까지의, 해당하는 노출된 위치에 결합하는 어떠한 두 개의 항체도 동시에 결합하지 않을 것이다. 즉, 케라틴 7이 케라틴 19 주위에 감겨 있는 경우 상기 해당하는 위치는 입체 구조의 이유로 동시 결합을 허용하지 않을 것이다. 이것은, 예를 들어, 케라틴 19 상의 아미노산 271- 291가 또꼬인나선에서 케라틴 7 상의 아미노산 283-303과 짝을 지을 때 추가로 예시된다.
BM 19.21에 대한 에피토프는 케라틴 19 상의 아미노산 서열 352-368 상에 위치한다.
케라틴 19 상에서 Ks 19.1 항체에 대한 에피토프는 아미노산 서열 311-335에 위치되어 있다. 케라틴 7 상에서 해당하는 서열은 323-347이다.
Ks 7.18에 대한 에피토프는 케라틴 7 상에서 300-350의 아미노산 서열 상에 위치하는 것으로 결론 내려질 수 있다.

Claims (54)

  1. 적어도 두 개의 표적화제를 포함하는 조성물로서, 적어도 하나의 제1 표적화제는 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하고, 적어도 하나의 제2 표적화제는 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하며, 상기 제1 및 제2 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)에 특이적으로 및 동시에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 표적화제는 리간드, 억제자, 펩티드 유사 화합물, 펩타이드, 단백질, 항체, 항체의 항원-결합 단편(들), 및/또는 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2 항에 있어서, 제1 또는 제2 표적화제 중 적어도 하나는 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2 항에 있어서, 제1 및 제2 표적화제 둘 다는 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제3 항 및 제4 항에 있어서, 제1 또는 제2 표적화제 중 적어도 하나는 1차 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5 항에 있어서, 1차 항체는 단클론성 또는 재조합 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 항체 C-35, C-62, C-68, C18, C35, KS 7.18, LDS-68, LP1K 및 RCK105 또는 이것들의 항원-결합 단편(들) 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 7 모이어티 상에 위치하는 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산의 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 7 모이어티에서 256-412 아미노산 서열 내, 또는 더 바람직하게는 300-380 아미노산 서열 내에 위치하는 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제7 항 또는 제8 항에 있어서, 제1 표적화제는 Progen Biotechnik, GmBH, Germany로부터 이용 가능한 클론 Ks 7.18에 의해 생산된 Ks 7.18 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제7 항 또는 제8 항에 있어서, 제1 표적화제는 Acris Antibodies Gmbh, Germany로부터 이용 가능한 클론 RCK105에 의해 생산된 RCK105 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적화제는 항체 A53-B/A2.26 aka Ks19.1, BM-19.21, CCD003, CCD004, CKS04, CKS06, Ks19.2, KM 4.62, LP2K, SA 21, SA 45, 또는 이것들의 항원-결합 단편(들) 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 19 모이어티 상에 위치하는 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산의 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1 항 내지 제7 항 및 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 19 모이어티에서 244-400 아미노산 서열 내, 또는 더 바람직하게는 311-375 아미노산 서열 내에 위치하는 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제11 항 또는 제12 항에 있어서, 제2 표적화제는 Roche Diagnostics로부터 이용 가능한 클론 BM-19.21에 의해 생산된 BM 19.21 단클론성 항체이고 케라틴 19의 아미노산 서열 346-367에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제11 항 또는 제12 항에 있어서, 제2 표적화제는 Progen Biotechnik, GmBH, Germany로부터 이용 가능한 클론 Ks 19.2에 의해 생산된 Ks 19.2 단클론성 항체이고 케라틴 19의 아미노산 서열 352-368에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제11 항 또는 제12 항에 있어서, 제2 표적화제는 케라틴 19 상의 아미노산 서열 311-335에 결합하는 Ks19.1 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 Ks 7.18 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 BM-19.21 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 Ks 7.18 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 Ks 19.2 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 RCK105 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 Ks 19.1 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)의 시험관 내 검출 방법으로서, 상기 방법은
    a) 상기 생물학적 샘플을 제1 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에서 한정된 조성물과 접촉시키는 단계; 또는 대안으로
    b) 상기 생물학적 샘플을 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제와 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 생물학적 샘플을 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제2 표적화제와 접촉시키는 단계: 및
    d) 상기 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하는 단계
    를 포함하며, 단계 b) 및 c)는 어떤 순서로도, 또는 동시에 수행될 수 있는 방법.
  20. 제19 항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈청, 혈장, 림프, 삼출물, 배설물, 위산, 위액, 림프, 점액, 심막액, 복막액, 흉수, 고름, 타액, 가래, 관절 낭액, 눈물, 땀, 질 분비물, 토사물 및 소변으로 구성된 군의 생물학적 유체 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20 항에 있어서, 생물학적 유체 샘플은 혈액, 혈청, 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제19 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 표적화제는 리간드, 억제자, 펩티드 유사 화합물, 펩타이드, 단백질, 항체, 항체의 항원-결합 단편(들), 및/또는 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22 항에 있어서, 제1 또는 제2 표적화제 중 적어도 하나는 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23 항에 있어서, 제1 및 제2 표적화제 둘 다는 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23 항 및 제24 항에 있어서, 제1 또는 제2 표적화제 중 적어도 하나는 1차 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25 항에 있어서, 1차 항체는 단클론성 또는 이것의 재조합 항체, 항원-결합 단편(들), 또는 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제19 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 항체 C-35, C-62, C-68, C18, C35, KS 7.18, LDS-68, LP1K 및 RCK105 또는 이것들의 항원-결합 단편(들) 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 7 모이어티 상에 위치하는 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산의 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제19 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 19 모이어티에서 244-400 아미노산 서열 내, 또는 더 바람직하게는 311-375 아미노산 서열 내에 위치하는 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28 항에 있어서, 제1 표적화제는 Progen Biotechnik, GmBH, Germany로부터 이용 가능한 클론 Ks 7.18에 의해 생산된 Ks 7.18 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제28 항에 있어서, 제1 표적화제는 Acris Antibodies Gmbh, Germany로부터 이용 가능한 클론 RCK05에 의해 생산된 RCK105 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제19 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적화제는 항체 A53-B/A2.26 aka Ks19.1, BM-19.21, CCD003, CCD004, CKS04, CKS06, Ks19.2, KM 4.62, LP2K, SA 21, SA 45, 또는 이것들의 항체 단편(들) 변이체, 융합체, 유도체 또는 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 19 모이어티 상에 위치하는 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 10개 이상의 아미노산의 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제19 항 내지 제26 항 및 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적화제는 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체의 케라틴 19 모이어티에서 244-400 아미노산 서열 내, 또는 더 바람직하게는 311-375 아미노산 서열 내에 위치하는 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제31 항 또는 제32 항에 있어서, 제2 표적화제는 Roche Diagnostics로부터 이용 가능한 클론 BM-19.21에 의해 생산된 BM 19.21 단클론성 항체이고 케라틴 19 상의 아미노산 서열 346-367에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제31 항 또는 제32 항에 있어서, 제2 표적화제는 케라틴 19 상의 아미노산 서열 311-335에 결합하는 Ks19.1 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제19 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 Ks 7.18 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 BM-19.21 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제19 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 Ks 7.18 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 Ks 19.2 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제19 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적화제는 RCK105 단클론성 항체이고 제2 표적화제는 Ks 19.1 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제19 항 내지 제37 항 중 어느 한 항에 있어서, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)과 양성 및/또는 음성 대조군의 발현을 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38 항에 있어서, 양성 대조군은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39 항에 있어서, 양성 대조군은 악성 신생물 질환으로 고통받고 있는 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제38 항에 있어서, 음성 대조군은 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41 항에 있어서, 음성 대조군은 악성 질환으로 고통받고 있지 않은 건강한 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제19 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)의 양을 스코어링하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제19 항 내지 제43 항 중 어느 한 항에 있어서, 이것은 자동화된 판독 디바이스 상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제19 항 내지 제43 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출은 수동으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제19 항 내지 제45 항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관 내에서
    i) 대상체에서 악성 신생물 질환의 진단 및/또는 예상, 및/또는
    ii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능의 예측, 및/또는
    iii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과의 평가, 및/또는
    iv) 대상체에서 악성 신생물 질환의 재발의 평가
    를 위한 방법으로서
    대상체는 악성 신생물 질환에 걸렸거나, 또는 걸린 것으로 의심되는 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제46 항에 있어서, 악성 신생물 질환은 담관암 (간 외), 방광암, 유방암, 불명 암종 (원발 부위), 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 쓸개암, 위장암 (위암), 두경부암, 간세포암 (간암), 하인두암, 신장암, 후두암, 간암 (일차성), 폐암 (비-소세포), 폐암 (소세포), 중피종, 비-소세포 폐암, 난소암, 상피성 난소암 (표면 상피-간질성 종양), 난소 생식세포 종양, 저악성 잠재성 난소 종양, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신세포 암종 (신장암), 침샘암, 소세포 폐암, 소장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행세포암, 자궁암 (자궁 내막)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제47 항에 있어서, 악성 신생물 질환은 폐암, 방광암, 식도암, 간세포암, 췌장암, 고환암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48 항에 있어서, 악성 신생물 질환은 폐암, 방광암, 식도암, 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. i) 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)을 검출하거나, 또는
    ii) 생물학적 샘플에서 악성 신생물 질환을 검출하거나; 또는
    iii) 대상체에서 악성 신생물 질환을 진단하거나 또는 예상하거나, 또는
    iv) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과를 예측하거나, 또는
    v) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능을 평가하거나, 또는
    vi) 대상체에서 악성 신생물 질환의 재발을 평가하기 위한,
    제19 항 내지 제49 항 중 어느 한 항에 따르는 시험관 내 방법의 사용.
  51. 제50 항에 있어서, 악성 신생물 질환은 담관암 (간 외), 방광암, 유방암, 불명 암종 (원발 부위), 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 쓸개암, 위장암 (위암), 두경부암, 간세포암 (간암), 하인두암, 신장암, 후두암, 간암 (일차성), 폐암 (비-소세포), 폐암 (소세포), 중피종, 비-소세포 폐암, 난소암, 상피성 난소암 (표면 상피-간질성 종양), 난소 생식세포 종양, 저악성 잠재성 난소 종양, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신세포 암종 (신장암), 침샘암, 소세포 폐암, 소장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행세포암, 자궁암 (자궁 내막)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  52. 제51 항에 있어서, 악성 신생물 질환은 폐암, 방광암, 식도암, 간세포암, 췌장암, 고환암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  53. 제52 항에 있어서, 악성 신생물 질환은 폐암, 방광암, 식도암, 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  54. i) 생물학적 샘플에서 케라틴 7과 케라틴 19의 이형 복합체 및/또는 이것의 단편(들)의 검출; 또는
    ii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 검출; 또는
    iii) 대상체에서 악성 신생물 질환의 진단 또는 예상; 또는
    iv) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 결과의 예측; 또는
    v) 대상체에서 악성 신생물 질환의 치료 효능의 평가; 또는
    vi) 대상체에서 악성 신생물 질환의 재발의 평가
    를 위한 키트로서,
    a) 제1 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에서 한정된 조성물; 또는 대안으로
    b) 케라틴 7 펩타이드 및/또는 이것의 단편(들)을 인식하는 제1 표적화제를 포함하는 제1 용기; 및
    c) 케라틴 19 펩타이드 및/또는 이것의 단편을 인식하는 제2 표적화제를 포함하는 제2 용기, 및
    d) 선택적으로 제18 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에서 한정된 방법을 수행하기 위한 설명서
    를 포함하는 키트.
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