CN106061998B - 用于检测恶性赘生性疾病的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含至少两种靶向试剂的组合物，其中至少一种第一靶向试剂识别角蛋白7肽和/或其片段，且至少一种第二靶向试剂识别角蛋白19肽和/或其片段。所述第一和第二靶向试剂能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。本发明的组合物可用于诊断和/或预后、预测受试者中的恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌的治疗效力、评价其治疗结果或评价其复发的方法中。

Description

用于检测恶性赘生性疾病的组合物和方法

技术领域

本发明涉及恶性赘生性疾病的领域。具体地，其涉及用于改进检测恶性赘生性疾病的组合物和方法以及其诊断和/或预后用途。

发明背景

极大地需要可以帮助诊断恶性疾病的简单、准确和节约成本的方法，以辅助患者的治疗决策和管理。目前可用的肿瘤标志物(存在少数例外)已经由于缺乏灵敏度和特异性而减少至治疗监测。基本上所有肿瘤标志物作为单一标志物都是无法令人满意的，并且需要新的且更特定的标志物补充建立的标志物。特别地，缺乏肿瘤特异性，即各种组织中的各种良性病况诸如肝硬化、肾衰竭和一般炎症中的标志物值增加，是当前可用的肿瘤标志物的一个基本问题。

从凋亡或坏死的肿瘤和非肿瘤细胞释放的在血清中循环的角蛋白或其片段已经用作用于监测几种癌症中的疾病进展的肿瘤标志物。多个角蛋白的上皮细胞特异性的方式的表达和角蛋白表达概况在赘生性转化过程中保持相对稳定的事实解释了为什么角蛋白通常用于肿瘤标志物。

最常用的角蛋白肿瘤标志物是组织多肽抗原(TPA；角蛋白8(K8)、角蛋白18(K18)和角蛋白19(K19)的混合物)，组织多肽特异性抗原(TPS；源自K18)，细胞角蛋白片段21-1(CYFRA 21-1；源自K19)。TPA已经用作潜在的血清标志物以鉴定具有各种上皮细胞相关的癌、包括涉及乳腺、结肠直肠、肺癌和膀胱的那些的个体。TPS已经临床应用于护理具有乳腺、卵巢、前列腺的癌症的个体，且CYFRA 21-1已经临床应用于护理具有肺癌的个体。TPA、TPS和CYFRA 21-1的主要潜在的临床用途是监测治疗响应和肿瘤复发和提供预测信息。对于推荐作为肿瘤标志物的常规用途，这些标志物因为它们在非恶性疾病中缺乏器官特异性和升高的血清水平而具有有限的临床效用。在几种肝脏疾病和各种炎性疾病的背景下发现高TPS和TPA水平。CYFRA 21-1是角蛋白标志物中最特异性的，并且已经获得广泛的接受度。然而，高CYFRA水平伴随间质性肺纤维化和肾衰竭。此外，在心脏衰竭中，CYFRA水平导致假阳性结果。

如上所提到，目前使用的肿瘤标志物，不仅CYFRA 21-1，给出假阳性结果的问题，而且例如癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原19-9(CA 19-9)、癌抗原15-3(CA15-3)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、鳞状细胞癌(SCC)也提到一些。

因此，迫切需要发现当以简单和可靠的方式诊断和预后恶性赘生性疾病时更好的诊断和预后标志物、方式和方法，以及进行精确和更少偏倚的用于检测恶性赘生性疾病的方法或测定法的方式。因此，本发明的一个目标是提供当诊断或预后恶性赘生性疾病时以简单和有效的常规测试方式进行精确和更少偏倚的诊断测定法的方式和方法。

发明概述

该目的可以通过以下实现：提供包含至少两种靶向试剂的组合物，其中至少一种第一靶向试剂识别角蛋白7(K7)肽和/或其片段，且至少一种第二靶向试剂识别角蛋白19(K19)肽和/或其片段。所述第一和第二靶向试剂能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

第一和/或第二靶向试剂可以是任何种类的分子，其识别和结合至被靶向肽或其片段。第一靶向试剂识别角蛋白7肽和/或其片段。角蛋白7(K7)是在人中由KRT7基因编码的蛋白。角蛋白7是II型角蛋白，并且在内部器官腔内层的简单上皮中和腺导管和血管中特异性表达。K7是51kDa蛋白，并且是469个氨基酸长。

第二靶向试剂识别角蛋白19肽和/或其片段。角蛋白19(K19)是在人中由KRT19基因编码的蛋白。K19是在角皮(包围正在发育的表皮的浅表层)中特异性存在的I型角蛋白。K19是44kDa蛋白，并且是400个氨基酸长。

第一和/或第二靶向试剂有利地选自配体、抑制剂、拟肽化合物、肽、蛋白、抗体、抗体的抗原结合片段和/或其组合。第一和第二靶向试剂两者均能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

如本文所使用的术语“角蛋白7与角蛋白19的异型复合物”意指源自全长角蛋白7和全长角蛋白19及其片段之间的平行和对齐二聚体的分子实体。该术语进一步包括角蛋白7和角蛋白19之间的重叠二聚体，其在角蛋白7和角蛋白19及其片段之间形成反平行四聚体。其进一步包括由这些四聚体及其任何片段组装的寡聚物、原丝和细丝。

在角蛋白7与角蛋白19的异型复合物中，在源自异型复合物的角蛋白7部分的不间断序列中必须存在最少至少3个、优选至少5个或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个、但更优选多于40个氨基酸，并且在源自异型复合物的角蛋白19部分的不间断序列中必须存在最少至少3个、优选至少5个或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个、但更优选多于40个氨基酸。所述氨基酸必须分别对于角蛋白7或角蛋白19是独特的。

有利地，所述不间断序列中的最少至少3个、优选至少5个或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个、但更优选多于40个氨基酸来自角蛋白7中的256-412氨基酸序列。更优选地，所述不间断序列来自角蛋白7中的300-380氨基酸序列。有利地，所述不间断序列中的最少至少3个、优选至少5个或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个、但更优选多于40个氨基酸来自角蛋白19中的244-400氨基酸序列。更优选地，所述不间断序列来自角蛋白19中的311-375氨基酸序列。当第一和第二靶向试剂特异性和同时结合至所述角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段时，它们都将结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，且形成包含所述第一和第二靶向试剂和角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的三联体。在足够长使得通过本文所述的任何方式或方法或者另外通过本领域技术人员已知的方式或方法检测三联体的时间段过程中，所述第一和第二靶向试剂将和角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段形成所述三联体。

在一个有利的实施方案中，所述第一或第二靶向试剂中的至少一种是抗体、其抗原结合片段、或变体、融合体、衍生物或其组合。有利地，第一和第二靶向试剂两者均为抗体、其抗原结合片段、或变体、融合体、衍生物或其组合，其将识别并结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，并形成抗原-抗体三联体。所述抗原-抗体三联体因此包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，第一和第二抗体、其抗原结合片段、或变体、融合体、衍生物或其组合均与之结合。第一抗体、其抗原片段、变体、融合体、衍生物或其组合结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7-肽部分，且第二抗体、其抗原片段或变体、融合体、衍生物或其组合结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19-肽部分。

当第一和第二靶向试剂是抗体、其抗原片段或变体、融合体、衍生物或其组合时，它们将有利地结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的不同的抗原性位点。通常，第一抗体、其抗原片段、变体、融合体、衍生物或其组合特异性识别并结合至位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分的抗原性位点。第二抗体、其抗原片段、变体、融合体、衍生物或其组合特异性识别并结合至位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分的抗原性位点。

所述第一和第二靶向试剂可以结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，且以任何顺序与其形成三联体。这意味着，在一个实施方案中，第一靶向试剂将首先结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分，且形成双联体。其后，第二靶向试剂将结合至所述双联体的角蛋白19部分，且形成三联体。

在另一个实施方案中，第二靶向试剂将首先结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分，且形成双联体。其后，第一靶向试剂将结合至所述双联体的角蛋白7部分以形成三联体。在一个进一步实施方案中，第一和第二靶向试剂两者将基本上同时结合角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

在一个有利的实施方案中，第一和/或第二靶向试剂是一抗，和或其片段，并且在另一个有利的实施方案中，所述第一和/或第二靶向试剂是单克隆或重组抗体，和或其片段。

当第一靶向试剂是抗体时，其有利地选自抗体C-35、C-62、C-68、C18、C35、KS7.18、LDS-68、LP1K和RCK105或其抗体片段变体、融合体、衍生物或其组合，其识别角蛋白7肽和/或其片段，且具有特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的能力。有利地，第一靶向试剂识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的角蛋白7部分上的至少3个、或至少5个、或至少7个、或10个或更多个氨基酸的序列，并且其对于角蛋白7蛋白序列是独特的。有利地，所述第一靶向试剂识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的角蛋白7部分中的256-412氨基酸序列内的序列。更优选地，所述序列来自角蛋白7部分中的300-380氨基酸序列。

有利地，识别角蛋白7肽或其片段的抗体是由得自Progen Biotechnik,GmBH,德国的克隆Ks 7.18产生的Ks 7.18单克隆抗体。单克隆抗体KS 7.18特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物或其片段的K7部分的氨基酸300-350。

或者，识别角蛋白7肽或其片段的抗体是由得自Acris Antibodies Gmbh的克隆RCK105产生的RCK105单克隆抗体。

当第二靶向试剂是抗体时，其有利地选自抗体A53-B/A2.26aka、Ks 19.1、BM-19.21、CCD003、CCD004、CKS04、CKS06、CKS14、K19.2、KM 4.62、LP2K、SA 21、和SA45或其抗体片段、变体、融合体、衍生物或其组合，其识别角蛋白19肽和/或其片段，且具有特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的能力。有利地，第二靶向试剂识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的角蛋白19部分上的至少3个、或至少5个、或至少7个、或10个或更多个氨基酸的序列，并且其对于角蛋白19蛋白序列是独特的。有利地，所述序列位于角蛋白19中的244-400氨基酸序列内。更优选地，所述序列来自角蛋白19中的311-375氨基酸序列。

有利地，识别角蛋白19肽或其片段的抗体是由得自Roche Diagnostics的克隆BM-19.21产生的BM-19.21单克隆抗体。BM 19.21特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的K19部分的氨基酸346-367。

或者，识别角蛋白19肽或其片段的抗体是得自Progen Biotechnik,GmBH的Ks19.2单克隆抗体。Ks 19.2特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的K19部分的氨基酸352-368。

或者，识别角蛋白19肽或其片段的抗体是由克隆Ks 19.1aka A53-B/A2产生的Ks19.1单克隆抗体。Ks 19.1特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的K19部分的氨基酸311-335。

有利地，第一靶向试剂是Ks 7.18单克隆抗体，且第二靶向试剂是BM-19.21单克隆抗体。

或者，第一靶向试剂是Ks 7.18单克隆抗体，且第二靶向试剂是Ks 19.2单克隆抗体。

或者，第一靶向试剂是RCK105单克隆抗体，且第二靶向试剂是Ks 19.1单克隆抗体。

本发明的一个进一步方面涉及用于检测生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)使所述生物样品与如本文所述的组合物接触；或者可替代地

b)使所述生物样品与识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂接触；和

c)使所述生物样品与识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂接触；和

检测所述角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段；其中步骤b)和c)可以以任何顺序或同时进行。

在该方法的一个有利的实施方案中，如本文公开的组合物用于在合适条件下接触生物样品。下文在别处描述所述组合物和生物样品接触的合适条件的实例。其后，通过也如本文所述的任何合适的方法检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

或者，第一和第二靶向试剂分开且不作为组合物提供。然而，可以将生物样品与所述第一和第二靶向试剂以任何顺序接触。因此，在一个实施方案中，生物样品将首先与将结合至生物样品中存在的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分的第一靶向试剂接触，并且在第一靶向试剂和异型复合物之间形成双联体。其后，所述第一靶向试剂和因此形成的异型复合物之间的所述双联体将与将结合至所述形成的双联体的角蛋白19部分的第二靶向试剂接触，并且由此形成包含结合至异型复合物的第一和第二靶向试剂的三联体。

在另一个实施方案中，生物样品将首先与将首先结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分的第二靶向试剂接触，并且在第二靶向试剂和异型复合物之间形成双联体。其后，包含第二靶向试剂和因此形成的异型复合物的所述双联体将与将结合至所述形成的双联体的角蛋白7部分的第一靶向试剂接触，并且由此形成包含第一和第二靶向试剂和异型复合物的三联体。

在一个又进一步实施方案中，第一和第二靶向试剂两者将基本上同时结合角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

其后，通过如下面所述的任何合适的方法检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

体外方法中使用的第一和第二靶向试剂有利地如上所述。

生物样品可以是选自固体组织样品诸如例如活检样本、组织培养物或源自其的细胞及其后代、临床样品、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物或体液的任何样品。生物样品中可以表达或可以不表达角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

有利地，所述方法用于生物流体样品，诸如例如血清、血浆、淋巴液、渗出液、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、唾液、痰液、滑液、泪液、汗液、阴道分泌物、呕吐物和尿液。在一个特别有利的实施方案中，所述方法用于血液、血浆和或血清样品。

在一个有利的实施方案中，所述方法包括将生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达与阳性和/或阴性对照进行比较的进一步步骤，其中所述阳性对照包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，且所述阴性对照不包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

在一个有利的实施方案中，所述阳性对照是获得自患有恶性赘生性疾病的受试者的生物样品，并且所述阴性对照是获得自未患有恶性疾病的健康受试者的生物样品。

在一个进一步实施方案中，所述方法可以包括对角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量评分的步骤。所述评分可以根据本领域已知或本文所述的标准评分系统通过检测的靶向试剂复合物的方式来完成。

有利地，在自动化读取装置上进行所述方法或手动进行所述检测。

本发明的一个进一步方面是用于以下的体外方法

i)诊断和/或预后受试者中的恶性赘生性疾病，和/或

ii)预测受试者中的恶性赘生性疾病的治疗效力，和/或

iii)评价受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果，和/或

iv)评价受试者中的恶性赘生性疾病的复发

其中所述受试者是具有或怀疑具有恶性赘生性疾病的哺乳动物。

所述受试者是选自人，非人灵长类诸如黑猩猩和其它猿类和猴类，农场动物诸如牛、绵羊、猪、山羊和马，家养哺乳动物诸如狗和猫，实验动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠的哺乳动物。有利地，所述受试者是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。在最有利的实施方案中，所述受试者是人。

所述恶性赘生性疾病可以是选自胆管癌(肝外)、膀胱癌、乳腺癌、未知(原发性)的癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、胃部(胃)癌、头颈癌、肝细胞(肝)癌、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞)、肺癌(小细胞)、间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、唾液腺癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌或子宫癌(子宫内膜)。

有利地，所述恶性赘生性疾病选自肺癌、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、胃癌和卵巢癌。当所述恶性赘生性疾病选自肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌时，所述方法是特别有利的。

当诊断和/或预后受试者中的恶性赘生性疾病时，所述方法包括以下步骤

a)从给定受试者获得生物样品

b)使所述生物样品与如本文所述的组合物接触；或者可替代地

c)使所述生物样品与识别细胞角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂接触；和

d)使所述生物样品与识别细胞角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂接触；和

e)检测所述细胞角蛋白7与细胞角蛋白19的异型复合物和/或其片段；

其中步骤c)和d)可以以任何顺序或同时进行；和

f)将检测的细胞角蛋白7与细胞角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与阳性和/或阴性对照进行比较，由此诊断和/或预后受试者中的恶性赘生性疾病。

任选地，可以根据本领域已知或本文所述的标准评分系统完成检测的抗原-抗体复合物的评分。

所述样品可以是可能包含恶性赘生性疾病的任何样品。

进一步实施方案是其中所述阳性对照包含来自患有恶性赘生性疾病的受试者的细胞。甚至进一步实施方案是其中所述阴性对照包含来自未患有恶性赘生性疾病的健康受试者的细胞。

当预测患有恶性赘生性疾病的受试者中的治疗结果时，所述方法包括以下步骤

a)从患有恶性赘生性疾病的受试者获得生物样品

b)检测所述生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的表达

c)将角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的表达与阳性和/或阴性对照进行比较，由此基于检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达预测所述受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果。

当评价正在针对恶性赘生性疾病进行治疗的受试者中的恶性赘生性疾病的治疗效力时，所述方法包括以下步骤

a)从正在经历针对恶性赘生性疾病的治疗的受试者获得生物样品

b)检测所述生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的表达

c)在针对恶性赘生性疾病治疗所述受试者过程中的一个或多个时间点重复步骤a)和b)，并且其中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的相对表达随时间的变化指示治疗效力。

因此，有效治疗的指示是角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的渐降表达相对于重复所述方法的步骤中分析的先前样品的相对变化。

任选地，可以根据本领域已知或本文所述的标准评分系统完成检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的评分。

所述样品可以是可能包含恶性赘生性疾病的任何样品，优选来自具有恶性赘生性疾病的受试者的生物样品，并且该受试者将在两者之间或目前正在治疗。

当评价恶性赘生性疾病的复发时，所述方法包括以下步骤

a)从先前已经具有恶性赘生性疾病的受试者获得生物样品，

b)检测所述生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的表达，

c)在针对恶性赘生性疾病治疗所述受试者后的一个或多个时间点重复步骤a)和b)，并且其中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的相对表达随时间的变化可指示恶性赘生性疾病的复发。

因此，复发的指示是鉴定恶性赘生性疾病的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的渐增量(即，蛋白标志物角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的表达的随时间增加)相对于重复所述方法的步骤中分析的先前样品的相对变化。

在一个进一步方面，本发明提供体外方法用于以下的用途

i)检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和或其片段，和/或

ii)检测恶性赘生性疾病；和/或

iii)诊断或预后受试者中的恶性赘生性疾病，和/或

iv)预测受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果，和/或

v)评价受试者中的恶性赘生性疾病的治疗效力，和/或

vi)评价受试者中的恶性赘生性疾病的复发。

在一个进一步方面，本发明提供试剂盒，其用于

i)检测生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段；和/或

ii)检测受试者中的恶性赘生性疾病；和/或

iii)诊断或预后受试者中的恶性赘生性疾病；和/或

iv)预测受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果；和/或

v)评价受试者中的恶性赘生性疾病的治疗效力；和/或

vi)评价受试者中的恶性赘生性疾病的复发；

所述试剂盒包含：

a)如本文所述的组合物；或者可替代地

b)第一容器，其包含识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂；和

c)第二容器，其包含识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂，和

d)任选地用于进行如本文所述的方法的说明书。

附图简述

图1显示角蛋白结构和细丝组装。

图2显示K7/19测定的典型校准曲线。

图3显示如通过本发明的方法测定的对于良性疾病的灵敏度vs95％特异性。

图4显示比较卵巢癌中的不同肿瘤标志物CA125、HE4、K7/19和CYFRA的ROC-曲线。

图5显示比较组合CA125EIA&HE4EIA与组合CA125EIA&K7/19测定法的ROC-曲线。

发明详述

在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体实施方案，因此方法、装置和制剂当然可以变化。也应当理解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意欲限制本发明的范围，其将仅由所附权利要求限定。必须指出的是，如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a)、(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另有明确指出，并且包括提及本领域技术人员已知的等同步骤和方法。

通常预期本发明中使用的术语符合分子生物学领域的普通技术人员公认的标准定义。如下所列的少数例外已经进一步定义于本发明的范围内。

如本文所使的“至少一个/种”意指一个/种或多个/种，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个/种等。

如本文所使用的“检测(detection)、(detect)、(detecting)”包括在参考或不参考对照的情况下的定性和/或定量检测(测量水平)，并且进一步是指鉴定给蛋白、特别是角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在、不存在或量。

如本文所使用的“诊断”包括疾病性质的鉴定。

如本文所使用的“预后”包括关于疾病的可能结果的预测，关于通过由疾病的性质和症状所表明的从疾病恢复的希望。

“真阳性者”是指具有局部或转移的恶性赘生物的那些受试者。

“假阴性者”是指具有局部或转移的恶性赘生物且没有通过诊断测定法归类为这样的那些受试者。

“真阴性者”是指不具有局部或转移的恶性赘生物且通过诊断测定法归类为这样的那些受试者。

“假阳性者”是指不具有局部或转移的恶性赘生物、但通过常规诊断测定法归类为具有局部或转移的恶性赘生物的那些受试者。

根据上下文，术语“假阳性者”也可以是指不具有恶性赘生物、但通过诊断测定法归类为具有恶性赘生物或非恶性疾病的那些受试者。

如其应用于诊断测定法的上下文中本文所使用的“灵敏度”是指被正确鉴定为这样的具有局部或转移的恶性赘生物的受试者的比例(即，真阳性者的数目除以真阳性者和假阴性者的数目的总和)。

如其应用于诊断测定法的上下文中本文所使用的诊断测定法的“特异性”是指被正确鉴定为这样的没有局部和转移的恶性赘生物的所有受试者的比例(即，真阴性者的数目除以真阴性者和假阳性者的数目的总和)。

术语“赘生物”或“肿瘤”可互换使用，并且是指组织的异常肿块，其中肿块的生长超过正常组织的生长，且不与正常组织的生长协调。赘生物或肿瘤可被定义为“良性”或“恶性”，其取决于以下特征：细胞分化的程度，包括形态和功能，生长的速率，局部侵袭和转移。“良性”赘生物通常是分化良好的，具有比恶性赘生物特征性更慢的生长，并且保持定位至来源部位。此外，良性肿瘤不具有渗透、侵袭或转移至远端部位的能力。

“恶性”赘生物通常是低分化的(退行发育)，具有特征性快速生长，伴随周围组织的进行性渗透、侵袭和破坏。此外，恶性赘生物具有转移至远端部位的能力。术语“转移”是指癌性细胞从原发性(初始)肿瘤扩散或迁移另一器官或组织，且典型地可通过原发性(初始)肿瘤的组织类型的“继发性肿瘤”或“次级细胞块”的存在，而不是定位次级(转移性)肿瘤的器官或组织的“继发性肿瘤”或“次级细胞块”的存在。例如已经迁移至骨的肺癌被认为是转移的肺癌，并且由源自骨组织中生长的上皮肺细胞的癌细胞组成。

“健康”是指具有良好健康的受试者。这样的受试者表明不存在任何恶性或非恶性的疾病。在本申请的上下文中，“健康个体”只有当他们不存在任何恶性或非恶性疾病才是健康的；“健康个体”可以具有通常不被视为“健康”的其它疾病或病况。

如本文所使用的“受试者”包括人，非人灵长类诸如黑猩猩和其它猿类和猴类，农场动物诸如牛、绵羊、猪、山羊和马，家养哺乳动物诸如狗和猫，实验动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语并不表明特定的年龄或性别。因此，意欲覆盖成年和新生的受试者以及胎儿，不论是雄性还是雌性。在优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。在最优选的实施方案中，所述受试者是人。

如本文所使用的“单克隆抗体”或“mAb”是指具有单一氨基酸组成的抗体，其针对特定抗原，并且由B细胞或杂交瘤的单克隆产生。

如本文所使用的“多克隆抗体”是指源自不同的B细胞系的针对特定抗原的抗体。

如本文所使用的“Fab”是指具有约50,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段之中，约一半的H链的N端侧和完整的L链通过二硫键结合在一起。

如本文所使用的“F(ab')2”是指在通过用蛋白酶胃蛋白酶处理IgG获得的片段之中，具有约100,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，所述抗体片段通过铰链区的二硫键结合，稍大于Fab。

如本文所使用的“Fab¹”是指具有约50,000Da的分子量和抗原结合活性的抗体片段，所述抗体片段通过切割F(ab')2的铰链区的二硫键获得。如本文所使用的单链Fv("scFv")多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，所述异源二聚体通常表达自包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因的融合基因。本发明的人scFv片段包括以适当构象保持的CDR，其优选通过使用基因重组技术。

如本文所使用的“杂交瘤”表示通过将用抗原免疫非人哺乳动物制备的B细胞经受与源自小鼠等的骨髓瘤细胞的细胞融合而获得的细胞，其产生具有抗原特异性的期望的单克隆抗体。

术语“多肽”、“蛋白”和“肽”在本文中可互换用于指其中氨基酸残基通过肽键或修饰的肽键连接的氨基酸链。氨基酸链可以是多于两个氨基酸的任何长度。除非另有指明，术语“多肽”、“蛋白”和“肽”也包括其各种修饰形式。这样的修饰形式可以是天然存在的修饰形式或化学修饰形式。修饰形式的实例包括，但不限于，糖基化形式、磷酸化形式、肉豆蔻酰化形式、棕榈酰化形式、核糖基化形式、乙酰化形式、泛素化形式等。修饰还包括分子内交联和与各个部分诸如脂质、黄素、生物素、聚乙二醇或其衍生物的共价附接等。此外，修饰也可以包括环化、支化和交联。进一步，多肽中也可以包括除了由基因编码的常规二十种氨基酸以外的氨基酸。

如本文所使用的“生物样品”包括获得自具有或不具有恶性赘生物的任何受试者的各种样品类型。典型的受试者是人；然而，具有可能发展癌症的恶性赘生物的任何哺乳动物可以充当可用于公开的方法中的生物样品的来源。可用于公开的方法中的示例性生物样品包括但不限于固体组织样品诸如例如活检样本、组织培养物或源自其的细胞及其后代、临床样品、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、体液。例如，生物样品包括获得自从怀疑具有恶性赘生物的个体采集的组织或体液的样品。

生物流体样品的实例包括但不限于血清、血浆、淋巴液、渗出液、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、唾液、痰液、滑液、泪液、汗液、阴道分泌物、呕吐物和尿液。

进一步的实例是活检样品和/或细针抽吸物。样品可以是新鲜的或收集后处理的(例如，用于存档目的)。在一些实例中，处理的样品可以是固定的(例如福尔马林固定的)和/或蜡(例如，石蜡)包埋的。用于封固的细胞和组织制备物的固定剂是本领域中众所周知的，并且包括但不限于：95％乙醇Bouin氏固定剂；95％乙醇固定剂；B5固定剂、Bouin氏固定剂、福尔马林固定剂、Karnovsky氏固定剂(戊二醛)、Hartman氏固定剂、Hollande氏固定剂、Orth氏溶液(重铬酸盐固定剂)和Zenker氏固定剂(参见，例如，Carson,Histotechology:ASelf-Instructional Text,Chicago:ASCP Press,1997)。在一些实例中，所述样品(或其部分)存在于固体支持物上。

公开的方法中使用的固体支持物仅需要承受生物样品，并且任选地、但有利地允许方便地检测样品中目标蛋白。示例性支持物包括显微镜载片(例如玻璃显微镜载片或塑料显微镜载片)、盖片(例如，玻璃盖片或塑料盖片)、组织培养皿、多孔板、膜(例如，硝化纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF))或

芯片。

如本文所使用的“治疗”被定义为通过内科或外科的方式处置患者。所述治疗改善或减轻医学病况或疾病的至少一种症状，并且被要求提供治愈。如本文所使用的术语“治疗结果”或“治疗的结果”是所述治疗对患者的身体影响。

如本文所使用的术语“算法”是指提供两个或更多个量之间的关系的数学公式。这样的公式可以是线性的或非线性的，并且可作为计算机存储器中的多种数字加权因子而存在。

“肺癌”是指给定受试者内的肺的赘生物，例如，恶性赘生物，其中所述赘生物是上皮来源的，即肺癌。肺癌通过恶性细胞的大小和外观进行归类，且术语“肺癌”包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两者。当不限定使用时，术语“肺癌”包括局部和转移的肺癌两者。术语“肺癌”可以通过术语“局部的”或“转移的”来定性以区分不同类型的肿瘤，其中“局部的”是指初始母肿瘤，转移的是指已经从初始母肿瘤扩散的肿瘤。

TNM系统(肿瘤、结节、转移)可用于在初始评估中对NSCLC分期。使用TNM描述符，分配组，范围为隐匿性癌症，至阶段0、IA(一-A)、IB、IIA、IIB、IIIA、IIIB和IV(4)。该阶段组辅助治疗的选择和预后的估计。

小细胞肺癌已经常规地被归类为“受限阶段”(限于胸部的一半和单个可耐受放疗域的范围内)或“扩展阶段”(更广泛的疾病)。然而，TNM分类和分组可用于估计预后。

对于NSCLC和SCLC两者，两种一般类型的分期评估是临床分期和手术分期。临床分期在确定性手术之前进行。其基于成像研究(诸如CT扫描和PET扫描)的结果和活检结果。手术分期在手术过程中或之后评估，并且基于手术和临床发现(包括胸部淋巴结的外科采样)的组合结果。

“卵巢癌”是指给定雌性受试者内的卵巢的赘生物，例如，恶性赘生物，其中所述赘生物是上皮来源的。

当不限定使用时，术语“卵巢癌”包括局部和转移的卵巢癌两者。术语“卵巢癌”可以通过术语“局部的”或“转移的”来定性以区分不同类型的肿瘤，其中“局部的”是指初始母肿瘤，转移的是指已经从初始母肿瘤扩散的肿瘤。

卵巢癌可以根据AJCC/TNM系统进行分期。这描述了原发性肿瘤(T)的程度，不存在或存在转移至附近的淋巴结(N)，以及不存在或存在远端转移(M)。原发性肿瘤的程度含有三种子类别T1、T2、T3。这非常类似于大多数妇科肿瘤学家实际使用的系统，称为FIGO系统。两者都依赖于手术对于实际阶段的结果。在FIGO系统中，肿瘤分期根据肿瘤已经扩散多远而分类为I-IV。其中阶段IV是最差的，意指肿瘤已经扩散至其估计极限。阶段I-III含有子类型A、B和C。

“食道癌”是指给定受试者内的食道的赘生物，例如，恶性赘生物，其中所述赘生物是上皮来源的，即食道癌。这些癌分为两类：腺癌或鳞状细胞癌。

用于对食道癌分期的最常见的系统是美国癌症联合委员会(American JointCommittee on Cancer,AJCC)的TNM系统。TNM分期系统基于几个关键的信息片段：T是指原发性肿瘤已经生长入食道壁和附近器官多远。N是指扩散至附近淋巴结的癌症。M表示癌症是否已经扩散(扩散至远端器官)。G描述了癌症的等级，其基于如何在显微镜下看癌细胞的模式。分期还考虑癌症的细胞类型(鳞状细胞癌或腺癌)。对于鳞状细胞癌，肿瘤的位置也可以是分期中的因素。

“膀胱癌”是指给定受试者内的泌尿膀胱的赘生物，例如，恶性赘生物，其中所述赘生物源自尿路上皮或移行上皮。膀胱癌因此是指移行细胞(上皮)癌，但其也是指膀胱的腺癌。

最常用于膀胱癌的分期系统是美国癌症联合委员会(American Joint Committeeon Cancer,AJCC)的分期系统。这也称为TNM系统。描述肿瘤的T类型含有子类型：T0、Ta、Tis、T1、T2a、T2b、T3a、T3b、T4。

免疫测定，诸如免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学(ICC)

如本文中所使用的“免疫测定”是测量经常含有物质的复杂混合物的样品中的物质的存在或浓度的生化测试。这样的测定基于抗体以高特异性结合至一种或非常有限组的分子或抗原的独特能力。免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学(ICC)是公开的方法和用途中可用于检测角蛋白7与角蛋白19的抗原异型复合物和/或其片段的两种示例性免疫测定技术。

免疫细胞化学(ICC)是一种常见的实验室技术，其使用经由特异性表位靶向细胞中的特异性肽或蛋白抗原的抗体。然后可使用几种不同的方法检测这些结合的抗体。ICC允许研究人员评估特定样品中的细胞是否表达考虑的抗原。在发现免疫阳性信号的情况下，ICC还允许研究人员确定哪些亚细胞隔室表达所述抗原。

在免疫组织化学(IHC)中，样品是生物组织，其中各细胞由组织结构完整组织中通常发现的其它细胞所包围。免疫细胞化学是用于通过使用与之结合的特异性抗体评价细胞(培养的细胞，细胞悬浮液)中的特定蛋白或抗原的存在、由此允许在显微镜下显现和检查的技术。其为用于测定来自单个细胞的细胞内容物的有价值的工具。可分析的样品包括血液涂片、抽吸物、拭子、培养的细胞和细胞悬浮液。

酶联免疫吸附测定(ELISA)和夹心ELISA是有利地用于本文公开的方法中的免疫测定。在(直接)ELISA中，将未知量的抗原固定至表面，然后将特异性抗体应用至表面上，使得其可以结合至抗原。该抗体连接至酶，并且在最后步骤中，添加物质，使得所述酶能够转化为一些可检测的信号，最通常为化学底物的颜色变化。在夹心ELISA中，将可以结合至抗原的捕获抗体固定至表面。其它步骤等同于ELISA。

在类似于夹心ELISA的酶免疫测定(EIA)中，将链霉抗生物素蛋白固定至表面，然后将捕获抗体生物素化，否则与ELISA相同地进行其它步骤。本文公开的方法中有利地使用EIA免疫测定。

Western印迹(有时称为蛋白免疫印迹)是用于检测组织匀浆或提取物的给定样品中的特定蛋白的广泛使用的分析技术。其使用凝胶电泳以通过多肽的长度(变性条件)或通过蛋白3-D结构(天然/非变性条件)分离天然或变性的蛋白。然后将蛋白转移至膜(通常为硝化纤维素或PVDF)，在膜上，使用对于目标蛋白特异性的抗体探测(检测)它们。

靶向试剂诸如例如，对于角蛋白7和角蛋白19和/或它们的片段特异性的抗体、抗原结合片段或变体、融合体或衍生物可用于检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达。本发明的靶向试剂被有利地提供为组合物，但也可以分开、但在彼此之后提供。本发明的方法因此提供了结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的抗体、抗原结合片段或变体、融合体或衍生物。可以，如本文进一步描述，通过例如用放射性标记、荧光标记、半抗原标记诸如生物素或酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶直接标记抗体本身，检测抗体。或者，使用间接标记，其中未标记的一抗与标记的二抗结合使用，所述标记的二抗包含例如对于一抗特异性的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。IHC和ICC方案是本领域中众所周知的并且可商购，参见例如Antibodies:A Laboratory Manual,Harlowand Lane(Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,NY 1988)和Current Protocols in Immunology,and Current Protocols in Molecular Biology,both John Wiley and Sons,Inc.,N.Y.)，其通过引用并入本文。

如上所揭示，本发明提供了改进恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和/或卵巢癌的诊断和/或预后的灵敏度和特异性的方式和方法。更具体地，本发明提供了这样的组合物，其对于恶性赘生性疾病的检测给出更好的灵敏度，以便改进ELISA和EIA中以及IHC和ICC中的恶性赘生性蛋白标志物的检测，由此当进行具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和/或卵巢癌的患者的诊断和/或预后时给出更一致和可靠的结果。

进一步，根据本发明的方法将与可用方法相比改进恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和/或卵巢癌的鉴定。

本文方法中使用的靶向试剂因此显示当与其它已知方法诸如例如CYFRA 21-1相比时各种恶性赘生性疾病的改进检测(参见本文给出的实施例)。

实施例2-5显示，通过角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达鉴定恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和/或卵巢癌。

所述方法用特异性结合至角蛋白7与角蛋白19和/或其片段的异型复合物的抗体检测恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和/或卵巢癌。

蛋白

本发明的方法包括使用至少两种靶向试剂诸如例如两种一抗、抗原结合片段、变体、融合体、衍生物或其片段。至少一种第一一抗特异性结合至角蛋白7或其片段，且至少一种第二一抗特异性结合至角蛋白19或其片段。所述第一和第二一抗两者均能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19和/或它们的片段的异型复合物和/或其片段。

也称为细胞角蛋白7(CK7)或肌凝集素(SCL)的角蛋白7(K7)(NCBI参考序列:NP_005547.3,NCBI基因ID:3855)是在人中由KRT7基因编码的蛋白。角蛋白7是II型角蛋白，且与编码II型角蛋白的其它基因在染色体12q12-q13的区域中聚集在一起。K7是469个氨基酸长的51kDa蛋白，并且具有如图1中所见的一般结构。替代剪接可以导致几种转录变体。其在内部器官腔内层的简单上皮中和腺导管和血管中特异性表达)。

角蛋白19(K19)(NCBI参考序列:NP_002267.2,NCBI基因ID:3880)也称为细胞角蛋白19(CK19)，并且是在角皮(围绕正在发育的表皮的浅表层)中特异性发现的I型角蛋白。K19是400个氨基酸长的44kDa蛋白，并且具有如图1中所见的一般结构。K19在人中由KRT19基因编码且位于染色体17q12-q21基因的区域中。

体内角蛋白组装为异源聚合物，即I型和II型蛋白形式异源二聚体，其进而组装以形成四聚体。两个单体通过将它们的α螺旋杆卷绕成呈对齐和相同方向取向的卷曲螺旋而形成平行二聚体，然后两个二聚体以交错反平行取向并行接合以形成双向四聚体(参见图1)。当角蛋白K7和K19组装成异源二聚体和四聚体时，形成角蛋白7与角蛋白19的异型复合物。

如本文所使用的术语“角蛋白7与角蛋白19的异型复合物”意欲包括源自全长角蛋白7和全长角蛋白19及其片段之间的平行和对齐二聚体的分子实体。其进一步包括角蛋白7和角蛋白19之间的二聚体重叠成角蛋白7和角蛋白19及其片段之间的反平行四聚体。其进一步包括由这些四聚体及其任何片段组装的寡聚物、原丝和细丝。对于角蛋白的异型复合物的总体结构，参见图1。

在角蛋白7与角蛋白19的异型复合物中，在源自异型复合物的角蛋白7部分的不间断序列中有利地存在最少至少3个、优选至少5个或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个、但更优选多于40个氨基酸，并且在源自异型复合物的角蛋白19部分的不间断序列中必须存在最少至少3个、优选至少5个或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个、但更优选多于40个氨基酸。所述氨基酸必须分别对于角蛋白7或角蛋白19是独特的。

有利地，所述不间断序列中的最少至少3个、优选至少5个或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个、但更优选多于40个氨基酸来自角蛋白7蛋白中的256-412氨基酸序列。更优选地，所述不间断序列来自角蛋白7中的300-380氨基酸序列。

有利地，所述不间断序列中的最少至少3个、优选至少5个或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个、但更优选多于40个氨基酸来自角蛋白19蛋白中的244-400氨基酸序列。更优选地，所述不间断序列来自角蛋白19中的311-375氨基酸序列。

抗体

在一个方面，本发明提供了包括使用至少两种靶向试剂，诸如例如两种一抗、抗原结合片段、或其变体、融合体或衍生物以检测生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在的方法，其中第一一抗、抗原结合片段、或其变体、融合体或衍生物特异性结合至所述异型复合物的角蛋白7或其片段，且第二一抗、抗原结合片段、或其变体、融合体或衍生物特异性结合至所述异型复合物的角蛋白19或其片段。有利地，所述至少两种抗体、抗原结合片段、或其变体、融合体或衍生物一起存在于抗体混合物中，其呈使用者即用的形式，或需要在其使用前稀释的浓缩溶液，有时称为储备溶液。

因此，本发明的一个方面包括包含识别角蛋白7肽和/或其片段的至少一种第一一抗、抗原结合片段或其变体、融合体或衍生物和识别角蛋白19肽和/或其片段的至少一种第二一抗、抗原结合片段或其变体、融合体或衍生物的组合物，其中第一和第二一抗能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

如本文所使用的“特异性结合至”或“与...特异性反应”意欲等于“能够选择性结合”或“特异性结合至”。如本文所使用的该表述意指，抗体或其抗原结合片段或变体、融合体或衍生物，包括任何抗体衍生的结合部分，其能够结合至分子的抗原，并且进一步与另一种蛋白相比更强至少10倍、例如更强至少50倍或更强至少100倍结合。所述结合部分能够在生理条件下(例如在体内)选择性结合至所述蛋白。用于测量相对结合强度的合适的方法包括免疫测定，例如其中所述结合部分是抗体。或者，结合可以使用竞争性测定或使用Biacore(R)分析(Biacore International AB,瑞典)进行评价。

如本文所使用的术语“特异性且同时结合至”意指第一和第二靶向试剂特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，且形成包含所述第一和第二靶向试剂和角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的三联体。在足够长使得通过本文所述的任何方式或方法或者另外通过本领域技术人员已知的方式或方法检测复合物的时间段过程中，所述第一和第二靶向试剂将和角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段形成所述三联体。

在一个方面实施方案中，所述第一和第二抗体或抗原结合片段或其变体、融合体或衍生物各自结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的分开抗原位点。典型地，所述第一一抗与角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的K7部分上存在的抗原性位点特异性反应，且所述第二一抗与角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的K19部分上存在的抗原性位点特异性反应。

因为与螺旋结构平行且对齐比对角蛋白7和角蛋白19之间的异型复合物的两个单体角蛋白7和角蛋白19，所以分别结合至角蛋白7和角蛋白19上从螺旋1A开始至螺旋2B的对应位置(参见图1)的任何两种抗体将不同时结合。这意味着，在角蛋白7卷绕角蛋白19的情况下，对应的暴露位置由于空间原因将不允许两种抗体的同时结合。这进一步例举为，例如，角蛋白19上的氨基酸271-291与角蛋白7上的氨基酸283-303在卷曲螺旋中配对起来。如果针对角蛋白7的抗体在角蛋白7上的283-303的序列内结合，则针对角蛋白19的抗体将因为空间位阻而不能同时结合至异型复合物中的角蛋白19上的氨基酸271-291。

特异性结合至角蛋白7的许多可用抗体可以用于本文呈现的方法中，诸如例如C-35、C-62、C-68、C18、C35、KS 7.18、LDS-68、LP1K、RCK105。然而，一种有利地用于本文呈现的方法中的抗体是由得自Progen Biotechnik,GmBH,德国的克隆Ks 7.18产生的角蛋白7单克隆抗体。单克隆抗体KS 7.18特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的K7部分的氨基酸300-350。

将特异性结合至角蛋白19的可用抗体的实例是A53-B/A2.26aka Ks19.1、BM-19.21、CCD003、CCD004、CKS04、CKS06、SA 21、SA 45、Ks 19.2、LP2K。然而，一种有利地用于本文呈现的方法中的抗体是由得自Roche Diagnostics的克隆BM-19.21产生的也称为BM-19.21单克隆抗体的得自Progen Biotechnik,GmBH的Ks 19.2单克隆抗体。BM-19.21特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的K19部分的氨基酸346-367。几种针对角蛋白19的抗体描述于:Epitope Specificity of 30Monoklonal Antibodies againstCytokeratin Antigens:The ISOBM TD-1workshop,Tumor Biol 1998；19:132-152。

有利地，所述第一和第二一抗或抗原结合片段或其变体、融合体或衍生物各自作为含水形式或冷冻干燥的粉末形式的抗体混合物提供于组合物中。对于后者，在使用前需要再水合步骤以便将抗体置于可用液体形式中。

或者，分开提供所述第一和第二一抗，即，当在本文呈现的方法中使用时，一种抗体在另一种之前提供。在一个实施方案中，将识别角蛋白7肽和/或其片段的第一一抗提供给含有角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的样品。第一一抗将结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的K7部分上存在的抗原性位点，且形成抗原-K7-抗体复合物。其后，将识别角蛋白19肽和/或其片段的第二一抗提供给含有角蛋白7与角蛋白19的异型复合物–K7-抗体的样品。所述第二一抗将结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的K19部分上存在的抗原性位点，且形成K19-抗体-抗原-K7-抗体复合物。

在一个替代实施方案中，将识别角蛋白19肽和/或其片段的第二一抗提供给含有角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的样品。所述第二一抗将结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的K19部分上存在的抗原性位点，且形成抗原-K19-抗体复合物。其后，将识别角蛋白7肽和/或其片段的第一一抗提供给含有角蛋白7与角蛋白19的异型复合物–K19-抗体的样品。所述第一一抗将结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的K7部分上存在的抗原性位点，且形成K7-抗体-抗原-K19-抗体复合物。

所述抗体可以是完整的抗体或其片段，例如，抗原结合片段，或其变体、融合体或衍生物，只要其能够在体外结合至期望的蛋白。这样的结合特异性可以通过本领域中众所周知的方法来确定，诸如例如，ELISA、EIA、免疫组织化学、免疫沉淀、Western印迹、色谱法和使用表达所有亚基或其异源二聚体的经转染的细胞的流式细胞术(参见实施例)。

“抗体”包括任何物种诸如啮齿类动物例如小鼠、大鼠、豚鼠或非啮齿类动物诸如兔、山羊、绵羊、狗、猪、骆驼、单峰骆驼、驴、马或鸡的实质上完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(其中相对于天然存在的人抗体突变至少一个氨基酸)、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体，以及其抗原结合片段和衍生物。例如，所述抗体可以是单克隆抗体。

抗原特异性由可变结构域赋予，并且不依赖于恒定结构域，如从涉及都包含一个或多个可变结构域的抗体片段的细菌表达的实验所知。这些分子包括Fab样分子；Fv分子；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL伴侣结构域经由柔性的寡肽连接；和包含分离的V结构域的单结构域抗体(dAb)。参与合成保留其特异性结合位点的抗体片段的技术的一般综述可见于Winter&Milstein(1991)Nature 349,293-299。

因此，“抗原结合片段”意指能够结合至蛋白K7或K19或其片段和角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段中任一种的抗体的功能片段。示例性抗原结合片段可以选自Fv片段(例如，单链Fv和二硫键键合的Fv)，Fab样片段(例如，Fab片段，Fab'片段和F(ab)2片段)，单抗体链(例如，重链或轻链)，单可变结构域(例如，VH和VL结构域)和结构域抗体(dAb，包括单和双形式；即dAb-接头-dAb)。

因此，在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段或其变体、融合体或衍生物包含完整抗体或由其组成。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

例如，所述抗体或抗原结合片段或其变体、融合体或衍生物基本上由完整抗体组成。“基本上由…组成”意指所述抗体或抗原结合片段、其变体、融合或衍生物由足以保留对于两种不同的蛋白K7和K19或其片段中任一种的结合特异性的完整抗体的部分组成。在进一步实施方案中，两种不同的蛋白K7和K19是人来源的。

术语“抗体”还包括所有类型的抗体，包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。然而，在一个实施方案中，所述抗体是IgG分子，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子。在一个实施方案中，所述抗体是IgG1分子。在一个进一步实施方案中，所述抗体是具有κ轻链的IgG1分子。

在一个进一步实施方案中，所述抗体可以是非天然存在的抗体。当然，当所述抗体是天然存在的抗体时，其以分离的形式(即，不同于其在自然界中发现的形式)提供。

本发明的范围内还包括抗体及其抗原结合片段的修饰版本，例如通过聚乙二醇或其它合适的聚合物的共价连接修饰，及其用途。

生成抗体和抗体片段的方法是本领域中众所周知的。例如，抗体可以经由以下几种方法的任一种来生成，所述方法采用诱导抗体分子的体内产生，筛选免疫球蛋白文库，或通过培养的细胞系生成单克隆抗体分子。这些包括但不限于，杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EB病毒(EBV)-杂交瘤技术。

例如，生成针对K7或K19的单克隆或多克隆抗体可以通过免疫来进行，在所述免疫中，可以将完整蛋白或其合适的片段注入非人哺乳动物(诸如小鼠或兔)，随后加强注射，以产生抗体反应。可以针对其中含有的多克隆抗体分离从被免疫的动物分离的血清，或者可以使用来自被免疫动物的脾脏用于产生杂交瘤和单克隆抗体。

在一个实例中，针对一种蛋白的单克隆抗体可以根据Kohler和Milstein{Nature,256:495,1975)的经典方法或其衍生方法从鼠杂交瘤制备。简言之，小鼠(诸如Balb/c)在几周的时间段内被重复地接种几微克选择的蛋白或其肽片段，或其合适的载体缀合物。然后将小鼠处死，并且分离脾脏的抗体产生细胞。借助聚乙二醇将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，并且通过将该体系在包含氨基蝶呤的选择性培养基(HAT培养基)上生长而破坏过量的未融合细胞。将成功融合的细胞稀释，并且将稀释物的各等分试样置于微量滴定板的各孔中，在所述微量滴定板的各孔中继续培养物的生长。

通过经由免疫测定程序和其衍生方法检测各孔的上清液中的抗体而鉴定抗体产生克隆，所述免疫测定程序诸如ELISA，如最初由Engvall(Enzymol.,70:419,1980)所述。

可以扩增选择的阳性克隆，并且收获其单克隆抗体产物用于使用。

抗体的商业来源包括DAKO A/S、Abeam、Lab Vision、BioCare Medical、CellMarque Corp.Abnova、Acris、Progen、Santa cruz biotech等。

通过对免疫动物采血和用合适的多克隆抗体-其滴度选择适当的动物而鉴定产生多克隆抗体的动物。

在一些实施方案中，在使用前纯化抗体。使用本领域中可用且技术人员已知的技术完成抗体的纯化。

抗体K7和K19的生成描述于本领域中且可得自如本文所述的商业来源，或者使用技术人员已知的技术使用本文所附且因此通过引用并入本文的参考文献可得。

抗体或其抗原结合片段或衍生物也可以通过重组的方式产生。针对选择的抗原和蛋白的合适的单克隆抗体可以通过技术人员已知的技术制备。抗体片段也可以使用本领域中众所周知的方法来获得。例如，抗体片段可以通过抗体的蛋白酶水解，或者通过在大肠杆菌中或哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。或者，抗体片段可以通过经由常规方法胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化完整抗体而获得。

因此，在一个实施方案中，如本文呈现的方法中使用的一抗中的至少一种是单克隆抗体。在一个进一步实施方案中，本发明的方法中使用的一抗中的至少一种是重组抗体。

或者，可以使用duolink(O-link bioscience)检测复合物形成。常规免疫荧光可以揭示个体蛋白的存在，但无法揭示不同蛋白之间的异源二聚体的形成。使用Duolink，将可能恰好定位异源二聚化发生且定量相互作用的相对程度的位置。因此，可能使用duolink技术来使用一种针对角蛋白7的抗体和一种针对角蛋白19的抗体定位和定量角蛋白7和角蛋白19之间的异型复合物，其中两种抗体同时结合至角蛋白7和角蛋白19之间是异型复合物。

本文描述的抗体或其抗原结合片段或衍生物，或包含所述抗体或其抗原结合片段或衍生物的组合物可以冻干用于储存且在使用前重构于合适的载体中。可以利用任何合适的冻干方法(例如喷雾干燥、结块干燥(cake drying))和/或重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可导致不同程度的抗体活性损失，(例如，用常规免疫球蛋白，IgM抗体趋于具有比IgG抗体更大的活性)，并且使用水平可能不得不向上调节来补偿。在一个实施方案中，冻干(冷冻干燥)的组合物损失当重新水合时其活性(在冻干之前)的不超过约20％，或不超过约25％，或不超过约30％，或不超过约35％，或不超过约40％，或不超过约45％，或不超过约50％。本领域技术人员将进一步理解的是，本文描述的抗体及其抗原结合片段、变体、融合体和衍生物可以以单体形式或其同源或异源多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等)的形式存在。

本文进一步提供了所述一抗或其片段可以用可检测部分直接或间接标记。直接标记意指可检测部分附接至所述抗体。间接标记意指可检测部分附接至接头，诸如例如二抗或三抗。所述可检测部分可以是本领域技术人员已知的任何部分或标志物，或者如本文所述，并且作为能够生成允许其所附接的分子的直接或间接定量或相对测量的这样的部分。

多种多样的可检测部分或标记和缀合技术是已知的，并且深入报道于科学和专利文献中。合适的标记包括技术人员众所周知的放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂、磁性颗粒等。所述可检测部分可以是单一原子或分子，其直接或间接参与可检测物质的产生。任选地，所述可检测部分选自：荧光部分、酶连接部分、生物素化部分和放射性标记部分，例如，如以下本文中进一步描述。“标记”、“可检测部分”意指可直接(例如，整合入多肽的荧光分子)或间接(例如，借助用具有整合的荧光分子的二级、三级或进一步试剂结合至一抗)附接至目标分子的任何可检测的标签。因此，标记、标志物或可检测部分是可以例如用成像方法显现的任何标签。

“可检测部分”进一步包括以下含义：该部分是当将本发明的组合物提供给生物样品诸如组织样品或生物流体样品之后位于目标部位时可在体外检测的部分。其包括，可检测部分是生成信号的且如果该可检测部分可被检测并且可确定该部分的相对量和/或位置(例如，组织样品上的位置)，则该可检测部分是更方便的且因此被包括在进一步实施方案中。可检测部分是本领域中众所周知的。

因此，抗体或其抗原结合片段或衍生物或包含所述抗体或其抗原结合片段或衍生物的组合物可用于这样的方法中，所述方法在本文进一步例举为用于检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段、诊断或预后体外生物样品的恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌的方法和用途。在进一步实施方案中，本文例举所用的免疫化学方法。

合适的可检测部分是本领域中众所周知的，并且将这些部分附接或连接至多肽和蛋白是本领域中进一步众所周知的。可检测部分的进一步实例是酶；酶底物；酶抑制剂；辅酶；酶前体；酶蛋白；荧光物质；色素；化学发光化合物；发光物质；显色物质；磁性物质；或金属颗粒诸如金胶体；放射性物质诸如¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³H、³⁵S或¹⁴C；磷酸化的酚衍生物诸如硝基苯磷酸酯、荧光素衍生物或二氧杂环丁烷(dioxetane)衍生物；或类似物。所述酶可以是脱氢酶；氧化还原酶诸如还原酶或氧化酶；催化官能团诸如氨基、羧基、甲基、酰基或磷酸酯基的转移的转移酶；可水解键诸如酯键、糖苷键、醚键或肽键的水解酶；裂解酶；异构酶；或连接酶。所述酶还可以缀合至另一酶。所述酶可通过酶促循环来检测。例如，当可检测标记是碱性磷酸酶时，可通过观察由合适的底物诸如伞形酮衍生物生成的荧光或发光来进行测量。伞形酮衍生物可包含4-甲基-伞形酮磷酸酯(4-methyl-umbellipheryl phosphate)。荧光或化学发光标记可以是荧光素异硫氰酸酯；若丹明衍生物诸如若丹明B异硫氰酸酯或四甲基若丹明异硫氰酸酯；丹磺酰氯(5-(二甲基氨基)-1-萘磺酰氯)；丹磺酰氟；荧光胺(4-苯基螺[呋喃-2(3H)；基-(3yH)-异苯并呋喃]-3；3y-二酮)；藻胆蛋白诸如藻蓝蛋白或藻红蛋白；吖啶鎓盐(acridinium salt)；鲁米诺化合物诸如荧光素、荧光素酶或水母发光蛋白；咪唑类；草酸酯；稀土元素诸如铕(Eu)、铽(Tb)或钐(Sm)的螯合化合物；或香豆素衍生物诸如7-氨基-4-甲基香豆素。所述标记也可以是半抗原，诸如金刚硼(adamantine)、荧光素异硫氰酸酯或咔唑。当与含有部分的多价抗体或(链霉抗生物素蛋白接触时，所述半抗原可允许形成聚集体。可检测部分的进一步实例包括但不限于以下：放射性同位素，例如³H、¹⁴C、³⁵S、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、⁹⁹Tc、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁸Re)，放射性核素(例如11C、18F、64Cu)，荧光标记，(例如FITC、若丹明、镧系元素荧光粉(lanthanide phosphor)、羰花青)；酶促标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光的生物素基团和由二级结合实体识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，二抗的结合位点，金属结合结构域、表位或蛋白标签、碳水化合物类)。在一些实施方案中，将标记通过各种长度的间隔臂附接以减少可能的空间位阻。

在间接标记中，使额外的分子或部分与抗体-抗原复合物(即一抗和其结合的蛋白之间的免疫复合物)接触，或者在抗体-抗原复合物(即一抗和其结合的蛋白之间的免疫复合物)的位点生成。例如，可检测部分诸如酶可被附接至如本文例举的检测抗体或检测分子或者与如本文例举的检测抗体或检测分子缔合。然后，信号生成分子可在免疫复合物的位点生成可检测的信号。例如，当提供有合适的底物时，酶可在免疫复合物的位点生成可见的或可检测的产物。

作为间接标记的另一个实例，可以结合至目标分子或目标抗体(一抗)的额外分子(其可以称为结合剂)，诸如针对一抗的二抗，可以与免疫复合物接触。所述额外分子可以具有信号生成分子或可检测部分。

所述额外分子可以是抗体，其因此可以被称为二抗、三抗或进一步抗体。二抗与一抗的结合可以第一抗体(或一抗)和目标分子形成所谓的夹心。可以在有效且足以允许形成二级免疫复合物的条件和时间段下使免疫复合物与标记的二抗接触。然后通常可以洗涤二级免疫复合物以去除任何非特异性结合的标记的二抗，并且然后可以检测二级免疫复合物中剩余的标记。所述额外分子还可以是或包括可以结合至彼此的分子或部分对(诸如生物素/抗生物素蛋白分子)之一，并且所述检测抗体或检测分子然后应当包括所述对的另一个成员。

间接标记的进一步实例包括通过两步法检测一抗-抗原(免疫复合物)。例如，对于一抗-抗原复合物之间的一级免疫复合物具有结合亲和力的分子(其可以被称为第一结合剂)，诸如抗体，可以用于形成二级复合物。洗涤之后，可以再次在有效且足以允许形成三级复合物的条件和时间段下使二级复合物与对于第一结合剂具有结合亲和力的另一种进一步分子(其可以称为第二结合剂)接触。在该实例中，所述第二结合剂可以连接至可检测的部分，允许检测由此形成的三级复合物。该系统可以进一步包含提供信号扩增的方式。

具有用于信号扩增的方式的一级、二级或进一步结合剂的实例是缀合的抗免疫球蛋白诸如生物素化的抗体(例如，与抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白缀合)或葡萄球菌蛋白A(结合IgG)、蛋白G、葡聚糖、适配子、蛋白、肽、小有机分子、天然化合物(例如类固醇)、非肽聚合物，或特异性且有效结合至与可检测部分缀合的不是可检测部分的其它分子的任何其它分子。在一个进一步实施方案中，二级、三级或进一步结合剂是抗体，诸如抗小鼠缀合物，例如猪抗小鼠抗体。所述缀合物可以是如上文所述的葡聚糖、HRP生物素、碱性磷酸酶等。

在一个实施方案中，所述可检测的部分是与葡聚糖和HRP缀合的猪抗小鼠抗体。

在一个进一步实施方案中，二级、三级或进一步结合剂是抗体，诸如抗兔缀合物，例如山羊抗兔缀合物。所述缀合物可以是与如上文所述的葡聚糖、HRP、生物素等的缀合物。

在一个实施方案中，所述可检测的部分是与葡聚糖缀合的山羊抗兔。

在一个进一步实施方案中，二级、三级或进一步结合剂是抗体，诸如抗山羊缀合物，诸如例如兔抗山羊缀合物。所述缀合物可以是与如上文所述的葡聚糖、HRP、生物素等的缀合物。

在一个实施方案中，所述可检测的部分是与葡聚糖和碱性磷酸酶AP缀合的兔抗山羊。

在又一个进一步实施方案中，本文提供的组合物进一步包含缓冲液。

缓冲液的实例是Tris-缓冲液诸如Tris-HCI，和PBS-缓冲液。合适的缓冲液是本领域中可得且已知的。

缓冲液的进一步添加剂可以是例如

20、BSA、叠氮化钠、甘油和水，以及约5.5至约8.0、诸如约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH。

当抗体组合物呈液体形式时，其可被提供为“即用”形式或浓缩形式，所述浓缩形式可在使用之前在任何合适的缓冲系统中稀释，诸如在例如本文提供的缓冲系统中或本领域技术人员可以明显的任何中在使用后稀释例如至少1x10、1x20、1x30、1x40、1x50、1x60、1x70、1x80、1x90、1x100、1x1000、1x10000和其之间所有范围和值。

在一个有利的实施方案中，将识别角蛋白7肽和/或其片段的第一一抗单克隆抗体Ks 7.18缀合至生物素，并且将识别角蛋白19肽和/或其片段的第二一抗BM 19.21缀合至过氧化物酶(辣根过氧化物酶(HRP))。生物素或HRP的缀合是本领域技术人员已知的。

根据本发明的组合物也可以单独使用或与用于检测恶性肿瘤的其它方式组合使用，所述其它方式包括，但不限于用于检测和测量另一种肿瘤标志物诸如：CA125、HE4、CA19-9、CEA、CYFRA 21-1、SCC、ProGRP、CA242、PSA的方式或诊断方式诸如超声、CT-扫描、胸部放射成像和/或IHC标志物诸如K5、K20、TTF-1、CDX2、MUC 2、p63、β-联蛋白、p53、34-β-E12、ER、CD56、NCAM、K6、K7、K19。

方法和组合物的用途

本文描述的抗体或抗原结合片段或其衍生物，或包含这样的抗体或抗原结合片段或其衍生物的组合物可以用于各种免疫方法诸如免疫组织化学(IHC)和免疫化学方法中。用于这样的免疫方法、特别是免疫组织化学方法的一般方案是本领域中已知的。此外，本发明的方法和用途可以与其它诊断方法组合以改善差异诊断的结果。

准确确定恶性赘生物的存在或不存在的重要性是显而易见的。对患者和健康护理系统两者的影响也是进一步显而易见的。因此，所述方法和用途的一些实施方案提供给定生物样品内的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的检测。所述方法和用途包括

从受试者获得生物样品，

使所述样品与本文公开的对于两种蛋白K7和K19特异性的抗体或抗原结合片段或其衍生物，或包含这样的抗体或抗原结合片段或其衍生物的组合物接触，

检测所述抗体和角蛋白7与角蛋白19的异型复合物或其片段之间的相互作用，

其中相互作用的检测指示角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在或不存在，由此允许例如检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，检测生物样品中的恶性赘生性疾病，根据本文公开的任何方法的诊断，预后等，其结果之一可以确定受试者是否是健康的，或者是否具有恶性赘生性疾病。

当所述恶性赘生性疾病是胆管癌(肝外)、膀胱癌、乳腺癌、未知(原发性)的癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、胃部(胃)癌、头颈癌、肝细胞(肝)癌、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞)、肺癌(小细胞)、间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、唾液腺癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌或子宫癌(子宫内膜)时，可以使用本发明的组合物和方法。

当所述恶性赘生性疾病是肺癌、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、胃癌和卵巢癌时，本发明的组合物和方法是合适的。

当所述恶性赘生性疾病是肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌之一时，本发明的组合物和方法是特别合适的。

相对于健康个体，对于这些个体，良性疾病趋于提高一点肿瘤标志物值。升高标志物浓度的典型良性疾病是胆道、肝脏和肾脏的疾病。由于这些升高的值，边界线区或“灰色区域”经常用于大多数标志物，且该灰色区域也使得所述标志物不适合于诊断目的。边界线区中的肿瘤标志物值是非常不确定的，并且不能被归类为肿瘤或良性疾病。落入该灰色区域内的受试者可能被错误地怀疑为具有或不具有癌症。落入该灰色区域内的受试者将得益于本文提供的方法。在公开的方法和用途内，角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段可以升高水平、以降低水平存在，或完全不存在于取自特定临床状态(例如，健康或具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌)的受试者的样品内。

因此，给定生物样品中发现的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的差异存在提供关于所测试的受试者是否具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌或是健康的概率的有用信息。所测试的受试者具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌或是健康的概率取决于取自所述受试者的测试样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与取自健康受试者的生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量或已知存在于健康受试者中的对照水平是否是统计学显著的。

给定生物样品中发现的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的差异也可用于确定已知具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的受试者是否响应于所施用的治疗性处理。将治疗时所取的样品中检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与施用治疗前所取的样品中检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量进行比较。此外，将治疗时所取的样品中检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与表明健康受试者的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的参考进行比较。基于比较，可以确定所述受试者是否响应于治疗性处理，和响应的程度。

此外，给定生物样品中发现的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在的差异也可用于确定已知具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的受试者是否将响应于给定治疗性处理。将取自被诊断为具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的受试者的样品中检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与取自已经经历不同形式的治疗的具有类似诊断的受试者的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的参考实验对象组进行比较。由取自暴露于给定治疗(其中所述治疗导致阳性结果)的受试者的样品生成的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的参考实验对象组被认为表明给定治疗对所述受试者具有积极作用，且因此被认为是成功的。由取自暴露于给定治疗(其中所述治疗导致中性结果)的受试者的样品生成的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的参考实验对象组被认为表明给定治疗对所述受试者不具有治疗作用，且因此被认为是不成功的。由取自暴露于给定治疗(其中所述治疗导致阴性结果)的受试者的样品生成的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的参考实验对象组被认为表明给定治疗对所述受试者不具有治疗作用，且被认为是不成功的。基于比较，本领域技术人员将能够为所述受试者施用最佳治疗模式。

此外，给定生物样品中发现的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的差异存在也可用于确定受试者中的恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌的阶段。

将取自被诊断为具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的受试者的样品中检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的量与取自已经具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的特定阶段或分期的受试者的参考实验对象组进行比较。基于比较，将能够确定所述受试者内的恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的阶段或分期。

角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段可以升高水平、以降低水平存在，或完全不存在于取自特定临床状态(例如，健康或具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌)的受试者的样品内。

因此，给定生物样品中发现的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的任何存在提供关于所测试的受试者是否具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌或者是健康的概率的有用信息。所测试的受试者具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌或是健康的概率取决于取自所述受试者的测试样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与取自健康受试者的生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量或已知存在于健康受试者中的对照水平是否是统计学显著的。

被称为具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的受试者具有其组织的形态学、生物化学和功能改变，使得所述组织可被表征为恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌。恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌已经进展的阶段可以使用目前可用和本文呈现的已知方法来确定。

分析角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在或不存在的数据分析可包括以下步骤：测定监测的生物标志物的信号强度(例如，峰的强度)，除去“异常值”(偏离预定统计分布的数据)。实例是峰的标准化，这是计算每个峰相对于特定参考的强度的过程。例如，参考可以是由仪器生成的背景噪声和/或化学物质(例如，能量吸收分子)，其在标度中被设置为零。然后，对各蛋白检测的信号强度可以以在期望标度(例如，100)中的相对强度的形式显示。在一个实施方案中，观察到的给定峰的信号可表示为该峰的强度与在指定的质荷比范围内观察到的峰和背景噪声的全部信号的总和的比率。在一个实施方案中，标准品可被样品接纳，使得来自该标准品的峰可用作参考以计算对于检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段所观察到的信号的相对强度。

可以通常通过使用计算机算法将所得数据转化成各种显示形式。使用任何上述显示形式，可以从信号显示容易地确定在样品中是否检测到角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

示例性方法可以用于例如诊断、预后、分期恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌，预测治疗结果，预测恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌复发的可能性等，如本文进一步所述。

复发意指恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌在初始(或后续)治疗之后已经回复。代表性初始治疗包括放射治疗、化学疗法、抗激素治疗和/或外科手术。

本文公开的一些方法可用于预后恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌。预后是疾病的可能结果(通常不依赖于治疗)。

本文公开的方法可用于预后，即，预测疾病的可能结果，诸如例如完全在这样的复发前收集的样品中的复发。对于具有侵袭性更强的癌症的受试者，不良(或较差)预后是可能的。在一些方法实施方案中，不良预后是赘生性疾病的初始诊断之后患者的少于5年存活(诸如少于1年存活或少于2年存活)。在一些方法实施方案中，良好预后是赘生性疾病的初始诊断之后患者的大于2年存活(诸如大于3年存活、大于5年存活或大于7年存活)。

还有其它方法实施方案预测患者中的恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的治疗结果，并且可用于为癌症患者指导(例如，选择有用的)治疗方式。如本说明书中别处所讨论，角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达预测治疗(例如免疫疗法、热疗法、激光疗法、外科手术、放射疗法、化学疗法)可能失败(例如，疾病将复发)。因此，护理者可以使用角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段以便就治疗(例如免疫疗法、激光疗法、外科手术、热疗法、放射疗法、化学疗法)的可能成功建议癌症患者。考虑具体受试者的病史的情形，患者和护理者可以更好地明智决策是否治疗(例如，进行外科手术)和/或是否提供替代治疗(诸如，外部束放射疗法、近距离放射疗法、化学疗法或观察等待)。

因此，本发明涉及用于通过检测特定受试者的生物样品内表达的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段而诊断和预后恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的方法，其中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在或不存在允许将受试者诊断或预后为健康的或具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌。在一个实施方案中，所述方法检测样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在，其中健康、无病的个体中不表达所述标志物。在相关实施方案中，本发明的方法检测与正常、健康的个体相比在来自具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的个体的样品中以更高水平存在的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的升高水平。

本发明的一个方面是用于检测生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的体外方法，所述方法包括以下步骤

a)使所述生物样品与包含至少第一和第二靶向试剂或其片段的组合物接触；或

b)使所述生物样品与识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂接触；和

c)使所述生物样品与识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂接触；和

d)检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段；其中步骤b)和c)可以以任何顺序或同时进行。

例如，在一个实施方案中，将生物样品与包含至少两种靶向试剂的组合物接触，其中至少一种第一靶向试剂识别角蛋白7-肽和/或其片段，且至少一种第二靶向试剂识别角蛋白19-肽和/或其片段。所述第一和第二靶向试剂能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。其后借助本领域技术人员众所周知的任何方法或者可替代地通过如本文所述的有利方法检测所述第一和第二靶向试剂与角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的特异性和同时结合。

在一个替代实施方案中，所述生物样品不与作为组合物的部分的第一和第二一抗接触，但分开提供第一和第二一抗，即一种一抗在另一种之前提供。例如，在一个实施方案中，将识别角蛋白7肽和/或其片段的第一一抗与生物样品接触。第一一抗将结合至所述生物样品中存在的角蛋白7与角蛋白19或其片段的异型复合物的K7部分上存在的抗原性位点。角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段和识别角蛋白7肽和/或其片段的抗体之间的复合物将形成。其后，将识别角蛋白19肽和/或其片段的第二一抗提供给含有结合至识别角蛋白7肽和/或其片段的第一一抗的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的生物样品。所述第二一抗将结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的K19部分上存在的抗原性位点，且形成K19抗体-抗原-K7-抗体复合物，即包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段和分别识别角蛋白7和角蛋白19肽和/或它们的片段的两种一抗的三重复合物。

在一个替代实施方案中，将识别角蛋白19肽和/或其片段的第二一抗提供给生物样品。第二一抗将结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的K19部分上存在的抗原性位点，且形成抗原-K19-抗体复合物。其后，将识别角蛋白7肽和/或其片段的第一一抗提供给含有角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段–K19-抗体的样品。所述第一一抗将结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的K7部分上存在的抗原性位点，且形成K7-抗体-抗原–K19-抗体复合物，即包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段和分别识别角蛋白7和角蛋白19肽和/或它们的片段的两种一抗的三重复合物。

在一个进一步步骤中，可以将所检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与阳性和/或阴性对照进行比较，其中所述阳性对照包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，且所述阴性对照不包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。在一个进一步实施方案中，所述阳性对照包含获得自被诊断具有恶性赘生性疾病的受试者的组织或体液，且所述阴性对照是获得自未患有恶性疾病的健康受试者的生物样品。

任选地，可以根据本领域已知或本文所述的标准评分系统完成检测的抗原-抗体复合物的评分。

所述样品当然可以是可能包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的任何生物样品。这样的生物样品的实例是来自人，啮齿类动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠，或来自山羊、绵羊、猪、骆驼、狗、猫和甚至兔或另外如本文公开的组织样品、体液样品或细胞样品。在一个实施方案中，所述样品来自人。在又一个进一步实施方案中，所述样品是组织样品或人体液样品，诸如例如血清、血浆、淋巴液、渗出液、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、唾液、痰液、滑液、泪液、汗液、阴道分泌物、呕吐物和尿液。所述生物样品可能需要为了工作而进行准备，且可以根据本领域技术人员已知的方法来完成样品的预处理。

如本文呈现的用于检测生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的体外复发可以有利地用于

i)诊断和/或预后受试者中的恶性赘生性疾病，或

ii)预测受试者中的恶性赘生性疾病的治疗效力，或

iii)评价受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果，或

iv)评价受试者中的恶性赘生性疾病的复发，其中所述受试者是具有或怀疑具有恶性赘生性疾病的哺乳动物。

所述恶性赘生性疾病可以是以下中的任一种：胆管癌(肝外)、膀胱癌、乳腺癌、未知(原发性)的癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、胃部(胃)癌、头颈癌、肝细胞(肝)癌、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞)、肺癌(小细胞)、间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、唾液腺癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、子宫癌(子宫内膜)。

然而，当所述受试者是具有或怀疑具有肺癌、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、胃癌和卵巢癌的哺乳动物时，如本文公开的方法可用于

i)诊断和/或预后受试者中的恶性赘生性疾病，或

ii)预测受试者中的恶性赘生性疾病的治疗效力，或

iii)评价受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果，或

iv)评价受试者中的恶性赘生性疾病的复发。

当所述受试者是具有或怀疑具有肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌的哺乳动物时，本文公开的方法是特别有用的。

例如，本发明的一个方面是用于体外检测生物样品中的恶性赘生性疾病的方法。所述样品可以是可能包含恶性赘生性疾病的任何生物样品，所述方法包括以下步骤

a)使所述生物样品与如本文所述的组合物接触；或

b)使所述生物样品与识别细胞角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂接触；和

c)使所述生物样品与识别细胞角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂接触；和

d)检测所述细胞角蛋白7与细胞角蛋白19的异型复合物；

其中步骤b)和c)可以以任何顺序或同时进行。

可以借助本领域技术人员众所周知的任何方法或者可替代地通过如本文所述的有利方法检测所述第一和第二靶向试剂与角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的特异性和同时结合，由此检测生物样品中的恶性赘生性疾病。

在一个进一步步骤中，可以将所检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与阳性和/或阴性对照进行比较，其中所述阳性对照包含来自患有恶性赘生性疾病的受试者的细胞，且所述阴性对照包含未患有恶性赘生性疾病的健康受试者的细胞。

任选地，可以根据本领域已知或本文所述的标准评分系统完成检测的抗原-抗体复合物的评分。

一个进一步方面是用于体外诊断和/或预后生物样品中的恶性赘生性疾病的方法，所述方法包括以下步骤

a)使所述生物样品与如本文定义的组合物接触；或

b)使所述生物样品与识别细胞细胞角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂接触；和

c)使所述生物样品与识别细胞细胞角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂接触；和

d)检测细胞角蛋白7与细胞角蛋白19的异型复合物；

其中步骤b)和c)可以以任何顺序或同时进行；和

e)将检测的细胞角蛋白7与细胞角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与阳性和/或阴性对照进行比较，由此诊断和/或预后恶性赘生性疾病。

任选地，可以根据本领域已知或本文所述的标准评分系统完成检测的抗原-抗体复合物的评分。

所述样品可以是可能包含恶性赘生性疾病的任何样品。

进一步实施方案是其中所述阳性对照包含来自患有恶性赘生性疾病的受试者的细胞。甚至进一步实施方案是其中所述阴性对照包含来自未患有恶性赘生性疾病的健康受试者的细胞。

因此，通过检测特定受试者的生物样品内的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达或不表达而诊断或预后恶性赘生性疾病的方法可以是，其中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在或不存在允许将受试者诊断或预后为健康的或具有恶性赘生性疾病。在一个实施方案中，所述方法检测样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在，其中健康、无病的个体中不表达所述标志物。在相关实施方案中，本发明的方法检测与正常、健康的个体相比在来自具有恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、胃癌和卵巢癌的个体的样品中以更高水平存在的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的升高水平。本文公开的实施例进一步显现了这一点。

在一个实施方案中，诊断或预后恶性赘生性疾病的方法包括：从给定受试者获得生物样品

在特异性结合条件下使所述样品与本文公开的组合物接触，

使结合至角蛋白7肽和/或其片段和角蛋白19肽和/或其片段的抗体结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，

使用检测方法检测所述抗体，其中所述检测方法生成所述样品内的所述角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达概况，

将生成的概况转化为计算机可读形式，和

将所述样品的概况与含有来自对于健康受试者、具有恶性赘生性疾病的受试者特异性的相当样品的概况的数据库进行比较。所述比较的结果将允许基于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的存在、不存在或比较量确定由其获得生物样品的受试者是否健康或具有恶性赘生性疾病。

在进一步实施方案中，角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的检测可以与将受试者诊断为是健康或具有恶性赘生性疾病的另一种诊断工具组合使用。例如，角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的检测可以与对于肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌检测特异性的其它诊断工具(诸如、但不限于通过合格临床医师的活检评估、放射成像和症候学评估)组合使用。

医师通常使用胸部放射成像和计算机断层扫描来诊断患者的肺癌。使用膀胱镜检查诊断膀胱癌，且尿结合的标志物如NMP 22也可辅助诊断，通常通过食管胃十二指肠镜检(EGD)或者可能吞钡诊断食道癌。使用骨盆检查、超声波和CA125诊断卵巢癌。必须用外科手术证实所述诊断。

如果任何测试是异常的，则医生将预定活检以证实他们的发现。然后由病理学家检查活检组织。也可以使用额外测试，诸如CT-扫描或组合的CT和PET扫描或磁共振成像(MRI)和所提及癌症的临床实践中已知的其它方法。

本发明的包含特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的抗体的组合物可用于检测模棱不清的病变，因为结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的抗体将仅检测具有恶性赘生性疾病的受试者，并且将在模棱不清的情况下评分为负。

可以使用本领域中众所周知的方法确定样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量。用于测定生物样品中的所述蛋白(或抗原)水平的合适方法包括基于抗体的技术。例如，可以用经典的免疫化学和/或免疫组织学方法来研究组织中的所述蛋白的蛋白表达。在这些中，根据本发明的组合物中的一抗(多克隆或单克隆)提供特异性识别。二级检测系统可以利用如本文讨论的荧光、酶或其它缀合的二抗。

在一个实施方案中，通过与相应的正常健康细胞相比角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的上调或下调来将待测试的生物样品鉴定为与恶性赘生性疾病相联的样品。“上调”意味着角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段与正常(健康)细胞中的所述蛋白的表达相比增加至少10％。类似地，“下调”意味着角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量与正常(健康)细胞中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达相比减少至少10％。例如，角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的水平可以增加至少20％、30％、40％、50％或甚至100％或更多。本文公开且本领域中进一步已知测量样品中的抗原水平的方式。

可以使用本文和本领域中进一步描述的本领域中众所周知的临床成像和诊断的方法实现检测化合物或抗体。

所需具体方法将取决于附接至根据本发明的组合物的抗体的可检测标记的类型。

一个进一步方面是用于预测恶性赘生性疾病患者的受试者中的治疗结果的体外方法，所述方法包括以下步骤

a)检测获得自所述受试者的生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达，

b)将角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达与阳性和/或阴性对照进行比较，且由此基于检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达预测所述受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果。

任选地，可以根据本领域已知或本文所述的标准评分系统完成检测的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的评分。

所述生物样品可以是可能包含恶性赘生性疾病的任何样品，优选来自具有恶性赘生性疾病的受试者的生物样品。

一个进一步方面是评价恶性赘生性疾病的治疗效力的体外方法，所述方法包括以下步骤

a)提供来自具有恶性赘生性疾病的受试者的生物样品，

b)检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，

c)在针对恶性赘生性疾病治疗所述受试者过程中的一个或多个时间点重复步骤a)和b)，并且其中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的相对表达随时间的变化指示有效治疗。

因此，有效治疗的指示是角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的渐降表达相对于重复所述方法的步骤中分析的先前时间样品的相对变化。

任选地，可以根据本领域已知或本文所述的标准评分系统完成检测的抗原-抗体复合物的评分。

所述样品可以是可能包含恶性赘生性疾病的任何样品，优选来自具有恶性赘生性疾病的受试者的生物样品，并且该受试者将在两者之间或目前正在治疗。

一个进一步方面是评价恶性赘生性疾病的复发的体外方法，所述方法包括以下步骤：a)提供来自先前已经具有恶性赘生性疾病的受试者获得生物样品，

b)检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，

c)在针对恶性赘生性疾病治疗所述受试者过程中的一个或多个时间点重复步骤a)和b)，并且其中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的相对表达随时间的变化指示恶性赘生性疾病的复发。

因此，复发的指示是鉴定恶性赘生性疾病的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的渐增量(即，角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达的随时间增加)相对于重复所述方法的步骤中分析的先前时间样品的相对变化。

本文提供的方法可以手动或优选在自动阅读装置上进行。因此，在一个实施方案中，手动进行所述方法。在进一步实施方案中，在自动阅读装置上进行所述方法。

组合物的用途

本发明的进一步方面包括本文提供的方法和组合物的用途。

本发明的一个进一步方面是本文提供的方法用于检测角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的用途。

本发明的一个进一步方面是本文提供的方法用于检测恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的用途。

本发明的一个进一步方面是所述方法用于诊断或预后恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的用途。

本发明的一个进一步方面是所述方法用于预测恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的治疗结果的用途。

本发明的一个进一步方面是所述方法用于评价恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的治疗效力的用途。

本发明的一个进一步方面是所述方法用于评价恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的复发的用途。

试剂盒

本发明还提供用于免疫测定诸如免疫组织化学的试剂盒。因此，本发明的一个进一步方面提供用于免疫测定的试剂盒，其包含

a)本文提供的本发明的组合物；或

b)第一容器，其包含如本文定义的识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂；和

c)第二容器，其包含如本文定义的识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂，和

d)任选地用于进行如本文定义的方法的说明书。

进一步实施方案包括能够检测特异性结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的组合物的显现试剂。显现和检测试剂的实例是本领域中已知的。

在一些试剂盒实施方案中，一种或多种一抗可以如本文所述直接标记。

其它试剂盒实施方案将包括二级或进一步检测，诸如如本文所述的二抗(例如，山羊抗兔抗体、兔抗小鼠抗体、抗半抗原抗体)或非抗体半抗原-结合分子(例如，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)。在这样的试剂盒中，所述二级或进一步检测方式可以用可检测部分直接标记。在其它情况下，二级(或进一步)抗体或结合剂将被缀合至半抗原(诸如生物素、DNP和/或FITC)，其可通过可检测标记的同源半抗原结合分子(例如，链霉抗生物素蛋白(SA)辣根过氧化物酶、SA碱性磷酸酶)检测。一些试剂盒实施方案可以在合适容器中包括比色试剂(例如，DAB和/或AEC)以用于与一级或二级(或更高阶)检测方式(例如，抗体或结合实体)接触，所述一级或二级(或更高阶)检测方式(例如，抗体或结合实体)以用于这样的比色试剂的显色的酶标记。

在一些实施方案中，试剂盒包括阳性或阴性对照样品，诸如已知表达或不表达角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的细胞系、组织或体液。对照样品的实例包括但不限于正常(例如，非癌性)细胞或组织，来自已知不具有或具有治疗之后(例如，治疗之后至少5年或至少10年)的恶性赘生性疾病的任何复发的受试者的恶性赘生性样品。

在一些实施方案中，试剂盒包括说明性材料，其公开，例如，使用所述组合物的方式或进一步结合实体或检测方式，例如特异性结合角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的抗体，或使用特定试剂的方式。所述说明性材料可以以电子形式书写(例如计算机软盘或光盘)，或者可以是可视的(例如，视频文件)。所述试剂盒还可包括额外的组分以便于试剂盒为此设计的特定应用。因此，例如，所述试剂盒可包括惯例地用于特定公开方法的实施的缓冲液和其它试剂。这样的试剂盒和适当的内容物是本领域技术人员众所周知的。

所述试剂盒可以进一步包含作为分开包装的试剂的足以用于至少一次测定的量的根据本发明的组合物。

通常还包括用于使用包装试剂的说明书。这样的说明书通常包括描述试剂浓度和/或至少一种测定方法参数诸如待混合的试剂与样品的相对量、试剂/样品混合物的维持时间段、温度、缓冲液条件等的有形表述。

本发明的一个进一步方面提供用于检测体外生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的试剂盒，所述试剂盒包含

a)本文提供的本发明的组合物；或

b)第一容器，其包含如本文定义的识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂；和

c)第二容器，其包含如本文定义的识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂，和

d)任选地用于进行如本文定义的方法的说明书。

本发明的一个进一步方面提供用于检测体外生物样品中的恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的试剂盒，所述试剂盒包含

a)本文提供的本发明的组合物；或

b)第一容器，其包含如本文定义的识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂；和

c)第二容器，其包含如本文定义的识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂，和

d)任选地用于进行如本文定义的方法的说明书。

本发明的一个进一步方面提供用于诊断和/或预后体外生物样品中的恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的试剂盒，所述试剂盒包含

a)本文提供的本发明的组合物；或

b)第一容器，其包含如本文定义的识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂；和

c)第二容器，其包含如本文定义的识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂，和

d)任选地用于进行如本文定义的方法的说明书。

本发明的一个进一步方面提供用于预测受试者中恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌患者的治疗结果的试剂盒，所述试剂盒包含

a)本文提供的本发明的组合物；或

b)第一容器，其包含如本文定义的识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂；和

c)第二容器，其包含如本文定义的识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂，和

d)任选地用于进行如本文定义的方法的说明书。

本发明的一个进一步方面提供用于评价恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的治疗效力的试剂盒，所述试剂盒包含

a)本文提供的本发明的组合物；或

b)第一容器，其包含如本文定义的识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂；和

c)第二容器，其包含如本文定义的识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂，和

d)任选地用于进行如本文定义的方法的说明书。

本发明的一个进一步方面提供用于评价恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌或卵巢癌的复发的试剂盒，所述试剂盒包含

a)本文提供的本发明的组合物；或

b)第一容器，其包含如本文定义的识别角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向试剂；和

c)第二容器，其包含如本文定义的识别角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向试剂，和

d)任选地用于进行如本文定义的方法的说明书。

某些试剂盒实施方案可包括载体装置，诸如盒、袋、包、塑料箱(诸如成型塑料或其它透明包装)、包装材料(诸如，密封的或可密封的塑料、纸或金属包装材料)，或其它容器。

在一些实例中，试剂盒组分将被装入单一包装单元诸如盒或其它容器中，所述包装单元可具有隔室，在所述隔室中可放置所述试剂盒的一种或多种组分。在其它实例中，试剂盒包括可保留例如一种或多种待测试的生物样品的一个或多个容器，比如小瓶、管等。

所述试剂盒实施方案包括，例如，注射器、棉拭子或乳胶手套，其可用于处理、收集和/或处理生物样品。试剂盒还可任选地包含可用于将生物样品从一个位置移动至另一个位置的器具，包括例如滴管、注射器等。还有其它试剂盒实施方案可包括用于丢弃用过的或不再需要的物品(诸如受试者样品，等)的处理装置。这样的处理装置可包括、但不限于：能够含有从丢弃材料的泄漏物的容器，诸如塑料的、金属的或其它不可渗透的袋、盒或容器。

现在将描述体现本发明的某些方面的非限制性实施例。

实施例1

用于测定体液中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的测定法

目的是生成适合于临床评估的测定法。

根据“Recent development in the periodate method of conjugatinghorseradish peroxidase(HRP)to antibodies”(M Barbara Wilson和Paul K.Nakane,Elsevier/North-Holland Biomedical Press,1978)中描述的方法，将对于角蛋白7特异性的单克隆抗体Ks 7.18缀合至生物素，并将对于角蛋白19特异性的单克隆抗体BM 19.21缀合至过氧化物酶。

实施夹心酶-免疫测定，以确定获得自被诊断具有恶性赘生性疾病的患者或获得自被诊断具有非恶性疾病的患者或被认为健康的个体的体液中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物或其片段的存在。在该程序中，将含有两种单克隆抗体(生物素缀合的Ks 7.18(1μg/ml)和过氧化物酶缀合的BM 19.21(2μg/ml))的BSA Tris缓冲液pH 7.2中的100μl抗体溶液与50μl血清样品或校准物(即，具有已知浓度的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物或其片段的样品)在微孔板的链霉抗生物素蛋白包被的孔中一起孵育，其在室温振摇一小时。孵育之后，将各孔用0.05％Tween/PBS洗涤6次以去除过量抗体。随后，将100μl缓冲的TMB底物(过氧化氢和3,3’,5,5’四甲基联苯胺)添加至各孔，使酶反应在室温进行30分钟。在酶反应过程中，如果抗原，即，角蛋白7与角蛋白19的异型复合物或其片段存在于血清样品中，则孔中显蓝色。在酶标仪中在620nm处测定颜色强度。通过将各校准物的吸光度值相对于浓度绘图而对于各测定构建校准曲线。从该校准曲线测定患者样品中存在的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物或其片段的浓度。如本实施例中描述的测定法在下文被称为“K7/K19测定法”。图2显示典型的校准曲线。

实施例2

K7/K19测定法对于不同形式的癌症的灵敏度

使用实施例1中描述的K7/19测定法测试来自患有各种形式的癌症的患者的总共398份血清。结果概述于表1中。

总之，K7/K19测定法显示与研究的其它癌症相比对于膀胱癌、卵巢癌、肺癌和食道癌的最高临床灵敏度，并且尤其来自肺癌、膀胱癌和卵巢癌患者的样品具有高浓度的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物(或其片段)。相反，K7/K19测定法对于宫颈的鳞状细胞癌和乳腺癌以及头颈癌和胃肠道癌症显示低至10％或更低的灵敏度。这些后者癌症患者的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物(或其片段)的浓度值在与表2中的对照组(健康和良性)的那些相同的范围内。K7/K19测定法因此通常因为低灵敏度而不适合于这些类型的癌症。然而，两个乳腺癌患者和一个胃肠道癌症患者具有比来自良性疾病组中的样品的最高值更高的值。这些高值可表明侵袭性癌症或较差预后。也就是说，尽管该测定法通常不适合于一些癌症，但其中该测定法确实给出高值的少数情况可具有临床价值。

表1：对于各种癌症的灵敏度相比96％特异性。

实施例3:

健康个体的参考范围的建立。

根据如实施例1中所述的K7/K19测定法测试来自明显健康个体的一百一十二(112)份血清，以便为不具有恶性赘生性疾病的明显体征的个体建立参考范围。95％的个体具有小于1.01U/mL的角蛋白7与角蛋白19的异型复合体或其片段的浓度，或95.5％具有1.09U/mL或更小的值。112个健康个体中的五(5)个(即4.5％)具有高于1.1U/mL的浓度。测试个体的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物或其片段的平均浓度为0.15U/mL(参见表2)。

实施例4:

具有良性(非癌性)赘生性疾病的个体的参考范围的建立。

根据实施例1在K7/19测定中测试来自患有已知通常给出升高肿瘤标志物值的患者的总共239份血清。结果显示于下表2中。

总之，95百分位数值对于良性疾病不比健康血液供体更高。所有组使用1.09U/mL的截止值得到5％或更少的阳性样品，且99％的来自良性组的样品具有低于1.8U/mL的值(未显示)。

表2：健康血液供体和良性疾病各自的参考值和％阳性样品

实施例5A：

与角蛋白8与角蛋白19的异型复合物或角蛋白19的可能交叉反应性的测试

如实施例1中所述，测定如通过CYFRA 21-1EIA试剂盒(Fujirebio DiagnosticsInc.)所测定具有50μg/L的角蛋白19浓度的含有角蛋白8与角蛋白19的异型复合物的校准物，即CYFRA 21-1试剂盒校准物(描述于：Lung cancer-associated keratin19fragments:development and biochemical characterisation of the new serumassay Enzymun-Test CYFRA 21-1.Bodenmüller H,Ofenloch-

B,Lane EB,Dessauer A,

V,DoniéF,Int J Biol Markers.1994Apr-Jun；9(2):75-81)，连同血液供体样品，K7/K19测定中的校准物0(其由不含角蛋白7/19的校准物基质组成)和由来自卵巢癌患者的血清组成的阳性对照。

表3：K7/19测定中的样品的结果

结论：该测定中未检测到显著信号，或者检测到的浓度对于CYFRA 21-1校准物50μg/L足够低，即与K19或角蛋白8与角蛋白19的异型复合物的任何交叉反应性会影响临床表现。这是显而易见的，因为来自CYFRA试剂盒(50μg/L)的最高校准物在K7/19测定法的检出限值附近，并且同时也低于血液供体血清，并且比由卵巢癌血清组成的阳性对照低得多。

实施例5B

Ks 19.2和BM 19.21克隆之间的比较

如实施例1中构建和运行测定法，但使用角蛋白19单克隆抗体克隆Ks 19.2代替克隆BM 19.21。将该测定法与具有角蛋白19单克隆抗体克隆BM 19.21的测定法进行比较。在相同样品上运行测定法。根据如实施例1中所述的K7/K19测定法测试来自患有癌症(肺癌、食道癌、膀胱癌或卵巢癌)的个体的十五(15)份血清和来自患有良性疾病(肝脏-、肾脏-、肺-或CHF)的患者的13份血清。

结果：

测定法之间存在高相关性(r＝0.97)，并且阳性样品数为：

结论：两种测定法之间没有显著差异。任何的“BM 19.21样”单克隆抗体可用于证明本发明。

实施例6

与建立的角蛋白19标志物CYFRA 21-1的比较

用CYFRA 21-1酶免疫定量测定法(EIA)根据如包括的使用说明(FujirebioDiagnostics Inc.)测试实施例3和4中测定的相同样品。CYFRA 21-1EIA提供人血清中的可溶性角蛋白19片段的定量测定，并且经常用作肺癌患者的疾病和治疗进程过程中监测疾病进展的辅助手段。基于良性疾病(其中排除肾脏疾病)(n＝199)针对CYFRA 21-1EIA计算2.42μg/L的95百分位数参考上限。结果图示显示于图3中。图3显示对于良性疾病(排除肾脏疾病)的灵敏度vs 95％特异性。CYFRA 21-1EIA的截止值为2.42μg/L，且K7/19测定法的截止值为1.1U/mL。

结论：K7/19测定法显示与CYFRA 21-1EIA相比优异的特异性。从图3看到，不仅在患有肾脏疾病的患者中，而且在具有心脏衰竭的患者中，肿瘤标志物CYFRA 12-1(角蛋白19)的水平升高。K7/19测定法也更加组织受限，但在卵巢癌、食道癌(SCC)和膀胱癌中具有相当的灵敏度。肺癌(所有组织型)中的灵敏度比CYFRA 21-1中更低。

实施例7

K7/K19测定法用于卵巢癌的评估和与建立的标志物的比较。

在以下测定中运行来自由于下腹部或骨盆区域(骨盆肿块)的异常生长而就医的妇女的血清样品：CA 125EIA、HE4EIA、CYFRA 21-1EIA(其中所有都购自FujirebioDiagnostics Inc.)和根据实施例1的K7/19测定法。CA 125EIA对于CA125抗原是特异性的，且HE4EIA对于HE4抗原是特异性的。两种测试经常用于监测具有妇科恶性肿瘤诸如上皮卵巢癌的患者。充分表征的样品描述于下表3中。发现在该样品集合中，21个患者具有卵巢癌，且60个患者具有良性疾病。生成比较四种测定法的灵敏度vs.特异性概况的接受者操作特性(Receiver operating characteristic)(ROC)曲线：卵巢癌中的CA 125EIA、HE4EIA、CYFRA 21-1EIA，如图4中所见。

CA125EIA和K7/19测定得到在95％特异性的最高灵敏度，52％，和最大曲线下面积，因此表明与HE4EIA或CYFRA 21-1EIA相比区分卵巢癌和良性骨盆肿块的较高能力。

表4用于卵巢癌研究的患者材料

实施例8

来自实施例7的生物标志物的组合。

图5显示比较组合CA125EIA&HE4EIA与组合CA125EIA&K7/19测定法的ROC曲线。如果将CA125EIA与K7/19测定法比较，诊断灵敏度与当单独使用CA 125EIA或K7/19测定法时相比增加。

CA125EIA&K7/19测定法的灵敏度在95％特异性时为62％，并且在70％的特异性时达到100％的灵敏度。

结论：实施例7和8表明，K7/19测定法可临床用于控制卵巢癌患者。由于K7/19测定法的相对高的癌症特异性，使用角蛋白7与角蛋白19的异型复合物作为恶性赘生性疾病诸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌作为标志物可以增加灵敏度，而不降低特异性。

实施例9

肺癌：NSCLC和SCLC之间的差异诊断

根据如实施例1中所述的K7/K19测定法测试来自小细胞肺癌患者的二十九(29)份血清。二十八个样品具有低于1.1U/mL的角蛋白7与角蛋白19的异型复合体(或其片段)的浓度，即只有一个样品在K7/19测定法中是阳性的。所述样品先前也针对ProGRP进行分析，并且29个样品中的17个具有高于200pg/mL的ProGRP浓度，表明所述样品取自具有活跃SCLC的个体。

K7/K19测定法能够区分非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。这与K7/19测定法的高特异性组合，使得K7/K19测定法适合作为辅助小细胞和非小细胞肺癌之间的差异诊断的工具。K7/K19测定法将特别可用于与ProGRP(具有对于小细胞肺癌的高灵敏度和特异性)组合(Tang Jian-hua,等人.Meta analysis,Diagnostic value of tumours markerpro-gastrin-releasing peptide in patients with small cell lung cancer:asystematic review,Chinese Medical Journal 2011；124(10):1563-1568.)。CYFRA 21-1还检测SCLC，因此不可用于这样的应用。

也可以预期，ProGRP和K7/19的组合测量对于区分SCLC和组合型SCLC(c-SCLC)以及大细胞神经内分泌癌(LC-NET)和SCLC是有价值的。

实施例10

K7/K19测定法在肺癌中的诊断潜能。

使用四倍于用于良性疾病的截止值的截止值利用来自实施例3(来自健康个体的112个样品)、实施例4(良性疾病的239个样品)和实施例5(恶性赘生性疾病的398个样品)的数据(在CYFRA 21-1EIA中排除肾脏疾病以不使该测定法失信)，得到截止值：对于K7/19测定法为4.4U/mL，且对于CYFRA 21-1EIA为9.7μg/L。用这些限值，阳性肺癌样品、其它阳性癌症样品(即，不是肺癌样品)和来自患有良性疾病的患者的阳性样品的数目概述于表5中。

表5使用诊断截止值的K7/19测定法和CYFRA 21-1EIA中的阳性样品

PPV肺癌＝对于肺癌的阳性预测值(即，阳性肺癌样品/所有阳性样品)

结论：尽管阳性样品的百分比相当低，但阳性样品高概率是癌症。在K7/K19测定法的情况下，具有高于4.4U/mL的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物(或其片段)的值的样品是肺癌症的概率大于50％。对于CYFRA 21-1EIA，该概率较低，并且也不能排除肾衰竭的可能性(阳性良性样品)。在该初步数据集中，肺癌的组织学类型是未知的。

实施例11

K7/K19测定法在胆道癌中的潜能

在如实施例1中所述的K7/19测定法中运行来自具有晚期证实的胆道上皮癌或证实的晚期胃癌的患者的血清。

恶性疾病	评估的血清数目	K7/K19中的阳性血清
			胰腺癌	4	3
胆囊癌	2	2
			原发性肝细胞癌	1	1
胃癌	4	3

结论：K7/K19测定法在控制患有上述上皮癌的患者中也可具有临床价值。

实施例12Nytt

用于测定血清中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的替代测定法。

目的是比较与实施例1中描述的Ks7.18/BM 19.21测定法相比的适合于具有对于抗体的主要不同表位位置的临床评估的测定法。

对于角蛋白19特异性的抗体Ks.19.1结合至角蛋白19上的氨基酸序列311-335(

等人.Eur.J.Biochem.231,475-485,1995)，且单克隆抗体RCK 105对于角蛋白7是特异性的(Ramaekers等人.Exp Cell Res.170(1):235-49,1987)。

根据“Recent development in the periodate method of conjugatinghorseradish peroxidase(HRP)to antibodies”(M Barbara Wilson和Paul K.Nakane,Elsevier/North-Holland Biomedical Press,1978)中描述的方法，将单克隆抗体RCK105缀合至生物素，并将单克隆抗体BM Ks 19.1缀合至过氧化物酶。

如实施例1中实施夹心酶-免疫测定，以确定获得自被诊断具有恶性赘生性疾病的患者的血清中角蛋白7与角蛋白19的异型复合物或其片段的存在。针对相同的19个癌症样品比较两种测定。

在测定之间存在高相关性，r＝0.98，n＝19个样品，并且可以证明没有重大临床差异，如下表所见。

结果概述于下表中。

结论：可以通过使用结合至角蛋白19上的氨基酸311-331与RCK105(其表位定位至不同于抗体Ks 7.18的角蛋白7的另一部分)的配对而构建角蛋白7/19的替代测定法。

实施例13

可以通过测定中Ks 19.1角蛋白19抗体对角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的完全抑制而建立角蛋白7上的抗体Ks 7.18的表位位置。

如实施例1中构建测定法，但用与过氧化物酶缀合的Ks 19.1mab替代BM19.21mab。对于定义样品，与Ks 7.18抗体组合的两种不同的角蛋白19抗体的结果概述于下表中。

结论：

因为与螺旋结构平行且对齐比对角蛋白7和角蛋白19之间的异型复合物，所以分别结合至角蛋白7和角蛋白19上的对应的暴露位置(从螺旋1A开始至螺旋2B)的任何两种抗体将不同时结合，即，其中角蛋白7在角蛋白19周围卷曲，那些相应位置由于空间原因而不会允许同时结合。这进一步例举为，例如，角蛋白19上的氨基酸271-291与角蛋白7上的氨基酸283-303在卷曲螺旋中配对起来。

BM 19.21的表位位于角蛋白19上的氨基酸序列352-368。

角蛋白19上的Ks 19.1抗体的表位已经被定位至氨基酸序列311-335。角蛋白7上的相应序列是323-347。

可以得出结论，Ks 7.18的表位定位至角蛋白7上的300-350的氨基酸序列。

Claims (72)

1.包含至少两种抗体、抗原结合片段或其组合的组合物，其中至少一种第一抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分中的256-412氨基酸序列内的序列，且至少一种第二抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分中的244-400氨基酸序列内的序列，其特征在于所述第一和第二抗体、抗原结合片段或其组合能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分中的300-380氨基酸序列内的序列。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分中的311-375氨基酸序列内的序列。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一或第二抗体中的至少一种为一抗、抗原结合片段或其组合。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述一抗是单克隆或重组抗体、抗原结合片段或其组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述第一抗体选自抗体KS 7.18和RCK105或抗原结合片段或其组合，且识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分上的至少3个或至少5个或至少7个或10个或更多个氨基酸的序列。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述第一抗体是由得自Progen Biotechnik,GmBH,德国的克隆Ks 7.18产生的Ks 7.18单克隆抗体。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述第一抗体是由得自Acris AntibodiesGmbh,德国的克隆RCK105产生的RCK105单克隆抗体。

9.根据权利要求6所述的组合物，其中所述第二抗体选自抗体Ks19.1、BM-19.21和Ks19.2或其抗原结合片段或其组合，且识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的角蛋白19部分上的至少3个或至少5个或至少7个或10个或更多个氨基酸的序列。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述第二抗体是由得自Roche Diagnostics的克隆BM-19.21产生的BM 19.21单克隆抗体，且特异性结合至角蛋白19的氨基酸序列346-367。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述第二抗体是由得自Progen Biotechnik,GmBH,德国的克隆Ks 19.2产生的Ks 19.2单克隆抗体，且特异性结合至角蛋白19的氨基酸序列352-368。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述第二抗体是结合至角蛋白19上的氨基酸序列311-335的Ks 19.1单克隆抗体。

13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述第一抗体是Ks 7.18单克隆抗体，且所述第二抗体是BM-19.21单克隆抗体。

14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述第一抗体是Ks 7.18单克隆抗体，且所述第二抗体是Ks 19.2单克隆抗体。

15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述第一抗体是RCK105单克隆抗体，且所述第二抗体是Ks 19.1单克隆抗体。

16.包含至少两种抗体、抗原结合片段或其组合的组合物在制备用于检测生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的药剂中的用途，其中，检测包括以下步骤：

a)使所述生物样品与包含至少两种抗体、抗原结合片段或其组合的组合物接触，其中至少一种第一抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分中的256-412氨基酸序列内的序列，且至少一种第二抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分中的244-400氨基酸序列内的序列，所述第一和第二抗体、抗原结合片段或其组合能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段；或者可替代地

b)使所述生物样品与第一抗体、抗原结合片段或其组合接触，所述第一抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分中的256-412氨基酸序列内的序列；和

c)使所述生物样品与第二抗体、抗原结合片段或其组合接触，所述第二抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分中的244-400氨基酸序列内的序列；和

d)检测所述角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段；

其中步骤b)和c)可以以任何顺序或同时进行。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述第一抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分中的300-380氨基酸序列内的序列。

18.根据权利要求16所述的用途，其中所述第二抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分中的311-375氨基酸序列内的序列。

19.根据权利要求16所述的用途，其中所述生物样品是生物流体样品，其选自血清、血浆、淋巴液、渗出液、排泄物、胃酸、胃液、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、唾液、痰液、滑液、泪液、汗液、阴道分泌物、呕吐物和尿液。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述生物流体样品选自血液、血清和血浆。

21.根据权利要求16所述的用途，其中所述第一或第二抗体中的至少一种是一抗、抗原结合片段或其组合。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述一抗是单克隆或重组抗体、抗原结合片段或其组合。

23.根据权利要求16-22中任一项所述的用途，其中所述第一抗体选自抗体KS 7.18和RCK105或其抗原结合片段变体、融合体、衍生物或其组合，且识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的角蛋白7部分上的至少3个或至少5个或至少7个或10个或更多个氨基酸的序列。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述第一抗体是由得自Progen Biotechnik,GmBH,德国的克隆Ks 7.18产生的Ks 7.18单克隆抗体。

25.根据权利要求23所述的用途，其中所述第一抗体是由得自Acris AntibodiesGmbh,德国的克隆RCK105产生的RCK105单克隆抗体。

26.根据权利要求23所述的用途，其中所述第二抗体选自抗体Ks19.1、BM-19.21和Ks19.2或其抗体片段或其组合，且识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的角蛋白19部分上的至少3个或至少5个或至少7个或10个或更多个氨基酸的序列。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述第二抗体是由得自Roche Diagnostics的克隆BM-19.21产生的BM 19.21单克隆抗体，且特异性结合至角蛋白19上的氨基酸序列346-367。

28.根据权利要求26所述的用途，其中所述第二抗体是由得自Progen Biotechnik,GmBH,德国的克隆Ks 19.2产生的Ks 19.2单克隆抗体，且特异性结合至角蛋白19的氨基酸序列352-368。

29.根据权利要求26所述的用途，其中所述第二抗体是结合至角蛋白19上的氨基酸序列311-335的Ks19.1单克隆抗体。

30.根据权利要求27所述的用途，其中所述第一抗体是Ks 7.18单克隆抗体，且所述第二抗体是BM-19.21单克隆抗体。

31.根据权利要求28所述的用途，其中所述第一抗体是Ks 7.18单克隆抗体，且所述第二抗体是Ks 19.2单克隆抗体。

32.根据权利要求29所述的用途，其中所述第一抗体是RCK105单克隆抗体，且所述第二抗体是Ks 19.1单克隆抗体。

33.根据权利要求28所述的用途，其进一步包括将角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达与阳性和/或阴性对照比较的步骤。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述阳性对照包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

35.根据权利要求34所述的用途，其中所述阳性对照是获得自患有恶性赘生性疾病的受试者的生物样品。

36.根据权利要求33所述的用途，其中所述阴性对照不含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

37.根据权利要求36所述的用途，其中所述阴性对照是获得自未患有恶性疾病的健康受试者的生物样品。

38.根据权利要求33所述的用途，其进一步包括对角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量评分的步骤。

39.根据权利要求38所述的用途，其在自动阅读装置上进行。

40.根据权利要求38所述的用途，其中所述对角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量的检测手动进行。

41.至少两种抗体、抗原结合片段或其组合在制备药物中的用途，其中至少一种第一抗体、抗原结合片段或其组合识别生物样品中的位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分中的256-412氨基酸序列内的序列，且至少一种第二抗体、抗原结合片段或其组合识别生物样品中的位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分中的244-400氨基酸序列内的序列，所述第一和第二抗体、抗原结合片段或其组合能够特异性且同时结合至角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段，所述药物用于

i)诊断和/或预后受试者中的恶性赘生性疾病，和/或

ii)预测受试者中的恶性赘生性疾病的治疗效力，和/或

iii)评价受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果，和/或

iv)评价受试者中的恶性赘生性疾病的复发，

其中所述受试者是具有或怀疑具有恶性赘生性疾病的哺乳动物，所述恶性赘生性疾病为食道癌、胆囊癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤和/或胰腺癌，其中包括以下步骤：

1)使所述生物样品与第一抗体、抗原结合片段或其组合接触，所述第一抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分中的256-412氨基酸序列内的序列；和

2)使所述生物样品与第二抗体、抗原结合片段或其组合接触，所述第二抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分中的244-400氨基酸序列内的序列；和

3)检测所述角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段；

其中步骤1)和2)可以以任何顺序或同时进行。

42.根据权利要求41所述的用途，其中所述第一抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白7部分中的300-380氨基酸序列内的序列。

43.根据权利要求41所述的用途，其中所述第二抗体、抗原结合片段或其组合识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的角蛋白19部分中的311-375氨基酸序列内的序列。

44.根据权利要求41所述的用途，其中所述恶性赘生性疾病选自肺癌、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、睾丸癌和卵巢癌。

45.根据权利要求41所述的用途，其中所述恶性赘生性疾病选自肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌。

46.根据权利要求41所述的用途，其中所述恶性赘生性疾病选自胰腺癌、胆囊癌、原发性肝癌和胃癌。

47.根据权利要求41所述的用途，其中所述肝细胞癌为原发性肝癌。

48.根据权利要求41所述的用途，其中所述肺癌为非小细胞肺癌、小细胞肺癌和/或间皮瘤。

49.根据权利要求41所述的用途，其中所述卵巢癌为卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤和/或卵巢低恶性潜能肿瘤。

50.根据权利要求41所述的用途，其中所述生物样品是生物流体样品，其选自血清、血浆、淋巴液、渗出液、排泄物、胃酸、胃液、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、唾液、痰液、滑液、泪液、汗液、阴道分泌物、呕吐物和尿液。

51.根据权利要求50所述的用途，其中所述生物流体样品选自血液、血清和血浆。

52.根据权利要求41和50-51中任一项所述的用途，其中所述第一或第二抗体中的至少一种是一抗、抗原结合片段或其组合。

53.根据权利要求52所述的用途，其中所述一抗是单克隆或重组抗体、抗原结合片段或其组合。

54.根据权利要求41和50-51和53中任一项所述的用途，其中所述第一抗体选自抗体KS7.18和RCK105或其抗原结合片段或其组合，且识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的角蛋白7部分上的至少3个或至少5个或至少7个或10个或更多个氨基酸的序列。

55.根据权利要求54所述的用途，其中所述第一抗体是由得自Progen Biotechnik,GmBH,德国的克隆Ks 7.18产生的Ks 7.18单克隆抗体。

56.根据权利要求54所述的用途，其中所述第一抗体是由得自Acris AntibodiesGmbh,德国的克隆RCK105产生的RCK105单克隆抗体。

57.根据权利要求41所述的用途，其中所述第二抗体选自抗体Ks19.1、BM-19.21和Ks19.2或其抗体片段或其组合，且识别位于角蛋白7与角蛋白19的异型复合物的角蛋白19部分上的至少3个或至少5个或至少7个或10个或更多个氨基酸的序列。

58.根据权利要求57所述的用途，其中所述第二抗体是由得自Roche Diagnostics的克隆BM-19.21产生的BM 19.21单克隆抗体，且特异性结合至角蛋白19上的氨基酸序列346-367。

59.根据权利要求57所述的用途，其中所述第二抗体是由得自Progen Biotechnik,GmBH,德国的克隆Ks 19.2产生的Ks 19.2单克隆抗体，且特异性结合至角蛋白19的氨基酸序列352-368。

60.根据权利要求57所述的用途，其中所述第二抗体是结合至角蛋白19上的氨基酸序列311-335的Ks19.1单克隆抗体。

61.根据权利要求41和57中任一项所述的用途，其中所述第一抗体是Ks 7.18单克隆抗体，且所述第二抗体是BM-19.21单克隆抗体。

62.根据权利要求41和57中任一项所述的用途，其中所述第一抗体是Ks 7.18单克隆抗体，且所述第二抗体是Ks 19.2单克隆抗体。

63.根据权利要求41和57中任一项所述的用途，其中所述第一抗体是RCK105单克隆抗体，且所述第二抗体是Ks 19.1单克隆抗体。

64.根据权利要求41和50-51、53、55-60中任一项所述的用途，其进一步包括将角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的表达与阳性和/或阴性对照比较的步骤。

65.根据权利要求64所述的用途，其中所述阳性对照包含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

66.根据权利要求65所述的用途，其中所述阳性对照是获得自患有恶性赘生性疾病的受试者的生物样品。

67.根据权利要求64所述的用途，其中所述阴性对照不含角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段。

68.根据权利要求67所述的用途，其中所述阴性对照是获得自未患有恶性疾病的健康受试者的生物样品。

69.根据权利要求41和50-51、53、55-60、65-68中任一项所述的用途，其进一步包括对角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量评分的步骤。

70.根据权利要求41和50-51、53、55-60、65-68中任一项所述的用途，其在自动阅读装置上进行。

71.根据权利要求41和50-51、53、55-60、65-68中任一项所述的用途，其中对角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段的量的检测手动进行。

72.试剂盒，其用于：

i)检测生物样品中的角蛋白7与角蛋白19的异型复合物和/或其片段；或

ii)检测受试者中的恶性赘生性疾病；或

iii)诊断或预后受试者中的恶性赘生性疾病；或

iv)预测受试者中的恶性赘生性疾病的治疗结果；或

v)评价受试者中的恶性赘生性疾病的治疗效力；或

vi)评价受试者中的恶性赘生性疾病的复发；

其中所述恶性赘生性疾病为食道癌、胆囊癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤和/或胰腺癌，

所述试剂盒包含：

a)如权利要求1-15中任一项中所定义的组合物；或者可替代地

b)第一容器，其包含识别角蛋白7肽和/或其片段的第一抗体、抗原结合片段或其组合；和

c)第二容器，其包含识别角蛋白19肽和/或其片段的第二抗体、抗原结合片段或其组合，和

d)任选地用于进行如权利要求41-71中所定义的步骤的说明书。

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