JPH07501806A - ヒトｐｄｇｆベータ・レセプタに対する阻害性免疫グロブリン・ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＰＤＧＦベータ・レセプタに対する阻害性免疫グロブリン・ポリペプチド 発明の分野 本発明は、一般的に、ヒト型ベータ血小板誘導成長因子レセプタ表示細胞のＰＤ ＧＦ−仲介増殖を阻害する免疫グロブリン・ポリペプチドの製造及び使用に関す る。

発明の背景 血小板誘導成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａ ｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ））は、間充織（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）起源の細胞にお ける有効な増殖剤である（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、　Ｈ，Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　 （１９７９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６ ：　１８０９−１８１３＋　Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ、　Ｄ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｒｏ ｓｓ、　Ｒ，（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５７：５１６７−５１７１：　Ｈｅ１ｄｉｎ、　Ｃ−Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　（１ ９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８＋　１００５４−１００５９ （これを、引用により本明細書中に取り込む。））。ＰＤＧＦ（分子量３０ｋＤ ａ）は、Ａ又はＢという２つの相同績から成るジ細書中に取り込む。））。この 鎖は、同−又は異なる型の鎖と組み合わされ、相同形態（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）　 ＡＡ　、　ＢＢ又はＡＢをもたらす（Ｈｅｌｄｉｎ。

Ｃ−Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３１９二５１１−５１４ 　（これを、引用により本明細書中に取り込む。））。この有糸分裂促進物質（ ｍｉ　ｔｏｇｅｎ）ＰＤＧＦは、最初の同定され（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、　Ｈ ，Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

明細書中に取り込む。）、そしてヒト血小板から精製された（ＲａｉｎｅＳ、前 掲畜牛）、但し、その後の研究は、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、マクロファ ージ及び繊維芽細胞さえも含む幾つかの細胞がＰＤＧＦを合成することを、示し た（Ｒｏｓｓ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｃｅ１ｌ　４６：１５５− １６９　（これを、引用により本明細書中に取り込む。））。

ＰＤＧＦの相同形態のすべてにより誘導される細胞増殖は、ＰＤＧＦレセプタへ のリガンド結合により仲介される（Ｈｅｌｄｉｎ、　Ｃ−Ｈ，（１９８３）前掲 本明細書中に取り込む。））。ＰＤＧＦレセプタ（分子量１８０ｋＤａ）は、チ ロシン・キナーゼ・ファミリーに属し、そしてＡ型（又はα型）（れらの両方を 、引用により本明細書中に取り込む。））及びＢ型（又引用により本明細書中に 取り込む。））という２つのレセプタ・サブタイプから成る。

ＰＤＧＦのレセプタへの高いアフィニティー結合が、レセプタ・ダイ５−８９１ ２）及び自動リン酸化（Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、前掲畜牛）の後 に起こり、そしてＤＮＡ合成における最高点に達する一連の複雑な細胞間シグナ ル事件（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｅｖｅｎｔｓ）をもたらす。マウス及びヒトＰ ＤＧＦベータ・レセプタ並びにＰＤＧＦアルファ・レセプタ遺伝子が、クローン 化されている（Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ、前掲畜牛、　Ｃ１ａｅｓｓｏｎ−Ｗ ｅｌｓｈ　ｅｔａｌ、前掲畜牛、　Ｙａｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、前掲畜牛、及び Ｅｓｃｏｂｅｄｏ　ｅｔ　ａｌ、前掲畜牛）。本明細書中でＰＤＧＦレセプタに ついていうとき、Ａ型とアルファ型とを、同様に、Ｂ型とベータ型とを、交換で きるものとして使用する。

２つのタイプの相同形態は、それらの釦著に異なるリガンド結合の特性により、 区別されることができる。ＰＤＧＦベータ・レセプタは、Ｂ−Ｍ　（相同形態Ｂ Ｂ及びＡＢ）のみに結合し、一方、ＰＤＧＦアルファ・レセプタは、ＰＤＧＰの すべての形態（Ａ及び／又はＢ鎖を含む形ｔＪ（Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｔ、前 掲畜牛、　Ｃ１ａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ　ｅｔ　ａｌ、前掲畜牛、及び５ｅｉ ｆｅｒｔ、　Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　２６４：８７７１−８７７８））に結合することができる。ＰＤＧＦレ セプタは、マクロファージ−コロニー刺激因子レセプタ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ、　 Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２０：２７７−２８０） 及びｃ−ｋｉｔプロトオンコジーン（ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）生成物（Ｙ ａｒｄｅｎ、　ｅｔａｌ、、前掲畜牛）に対する高い程度の構造相同性を示す。

ＰＤＧＦレセプタは、それらのβ−シート豊富構造に基づ（５つのｔｇ一様ドメ イン（ドメイン１−５）中にはっきり分けられることができる細胞外ドメインを 特徴とする。約１００アミノ酸のこれらのｔｇ反復は、（第４反復を除き）それ ぞれ、規則的に間隔をあけて配置されたシスティン残基をもつ。このレセプタは 、単一のトランスメンブラン・ドメイン及び細胞質チロシン・キナーゼ・ドメイ ンをもつ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｌ、　Ｔ、　（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２４３：　１５６４−１５７０（これを、引用により本明細書中に取り込む。） ）。

ＰＤＧＦは、正常な生理学的過程、例えば、組織修復及び胚形成（ｅｍｂｒｙｏ ｇｅｎｅｓ　ｉｓ）において重要な役割を演じている（Ｒｏｓｓ、　Ｒ，ｅｔ　 ａｌ、前掲畜牛）。しかしながら、目下、研究は、病因学的増殖失調における及 び特定の肉腫の発達におけるこの有効な有糸分裂促進物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）に 係わっている（Ｒｏｓｓ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、前掲畜牛）　、　ＰＤＧＦ　Ａｌ 及びＰＤＧＦベータ・レセプタの発現は、その場のハイブリダイゼーションによ るヒト・アテローム性動脈硬化症プラークにおいて検出されたするポリクロナー ル抗体が無胸腺の（ａｔｈｙｍｉｃ）ヌード・ラットにおける脱内皮化頚動脈（ ｄｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｓｅｄ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｉｅｓ）に おける脈管内膜の（ｉｎｔｉｍａｌ）病変の形成を有意に減少させることを、報 告した。ＰＤＧＦは、間充織起源の細胞における増殖疾患の病因論におり込む。

））。Ｇｏｌｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、は、ＰＤＧＦ　Ａ鎖メツセージが、血管移植 のためのヒヒ・モデルにおける脈管内膜の過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）の 領域内において増加されたことを報告した（（１９９０）　Ｊ、　Ｖａｓｃ、　 Ｓｕｒｇ。

１１：　５８０−５８５）　。また、ＰＤＧＦは、平滑筋のために化学走性（ｃ ｈｅｍｏｔａおける平滑筋細胞の転移及び増殖であって重症な狭窄症（ｓｔｅｎ ｏｓｉｓ）をもたらすもの、のための原因となる剤となることができる。

他の増殖因子及びそれらのレセプタの研究は、レセプタに対する抗体の発明によ り、援助された。例えば、表皮成長因子レセプタを認識する抗体は、レセプタ活 性化の機構の評価における強力な道具り込む。））。インターロイキン−２（Ｉ Ｌ−２）のためのレセプタに対する抗体は、ｒＬ−２の内面化（ｉｎｔｅｒｎａ ｌｉｓａｔｉｏｎ）を阻害し、そしてこれ故、応答性細胞の増殖のその後の導入 を阻害する（Ｄｕｐｒｅｚ、　Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１４９７−１５０１（これを、引用により本明細書中に取 り込む。））。同様に、表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプタに対するモノクロナー ル抗体は、ヒト哺乳動物腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞系ＭＣＦ− ７のエストロゲン−刺激成長を阻害する（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ、　Ｄ、Ａ。

（１９８９）　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１４１：　４２０−４３ ０　（これを、引用により本明細書中に取り込む。））。このような抗体は、成 長因子−仲介疾患の治療において非常に治療的な価値を有することができる。

幾つかのグループは、ＰＤＧＦレセプタに対する抗体を単離したが、これらの抗 体は、用途を限定されていた（例えば、Ｋａｗａｈａｒａ、　Ｒ，Ｓ。

ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、 　Ｃｏｍｍｕｎ、　１４７：８３９−８４５　（これを、引用により本明細書中 に取り込む。）を参照のこと。）。

追加のモノクロナール抗体が、ブタの子宮（ｐｏｒｃｉｎｅ　ｕｔｅｒｕｓ）か らのＰＤＧＦの細胞外ＰＤＧＦ−結合ドメインに対して作られたが（Ｒｏｎｎｅ ｓｔｒａｎｄ。

Ｌ、　ａｎｄ　ｔｅｒｒａｃｉｏ、　Ｌ、　（１９８８）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、　２６３：１０４２９−１０４３５（これを、引用により本明細書中 に取り込む。））、これらの抗体は、Ｉ！Ｓ　（−標識ＰＤＧＦの、ヒト繊維芽 細胞への結合を阻害しなかった。

また、ＰＤＧＦ活性を阻害しないＰＤＧＦレセプタに対する多数の抗体が、Ｋａ ｎａｋａｒａｊ、　Ｐ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　３０：　１７６１−１７６７；　ＣＩＫｕｍｊｉａｎ、　Ｄ、　Ａ、 　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８６：８２３２−８２３６：　Ｂ１５ｈａｙｅｅ、　Ｓ、　ｅｔ　 ａｌ、　（１９８８）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８：　３−９７８ ４：　Ｋｅａｔｉｎｇ、　Ｍ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｌ、　Ｔ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ 　（１９８７）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２ニア９３２−７９３７ ；　Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ａ、　Ｃｏｐｐｅｒ　（１ ９９０）　ＥＭＢＯＪ、　９：３２７９−３２８６：　（これらの全てを、引用 により本明細書中に取り込む。）により、報告されている。

このように、ヒト・レセプタの活性化を特異的に阻害、及び／又はヒト・ベータ 型ＰＤＧＦレセプタを表示する細胞の増殖を、可能にする免疫グロブリン及び他 の剤の必要性が在る。このような剤は、そのレセプタの異なる機能的ドメインの マツピングにおいて、そして正常及び疾患状態におけるＰＤＧＦ及びそのレセプ タの役割を吟味することにおいて、有用であろう。さらに、このような剤は、Ｐ ＤＧＦ−仲介増殖性疾患、そしてまた、ＰＤＧＦ−仲介化学定性及び転移の治療 における治療的価値をもつであろう。このような疾患は：ａ）再狭窄（ｒｅｓｔ ｅｎｏｓｉｓ）であって、血管形成（ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）　、ａｔｈｅｒ ｅｃｔｏｍｙ　、又はプラーク（ｐｌａｑｕｅ）除去の他の侵入方法後の冠状動 脈再狭窄（ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）　、並びに同一手順の後 の腎臓（ｒｅｎａり又は末梢（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）の動脈再狭窄を含むもの ；ｂ）血管増殖現象及び繊維症（ｆ　１ｂｒｏｓｉｓ）であって急性損傷の他の 形態と関連のあるもの、例えば：成人呼吸困難症候群関連肺繊維症、腎炎（ｎｅ ｐｈｒｉｔｉｓ）関連腎臓繊維症、カワサキ病関連冠状狭窄、及び他の動脈炎（ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）　、例えば、タカヤス病関連血管狭窄（ｖａｓｃｕｆａｒ 　ｎａｒｒｏｗｉｎｇ）： Ｃ）静脈移植における狭窄の防止： ｄ）移植臓器における加速された平滑筋細胞の転移及び増殖を原因とする狭窄の 防止： ｅ）他の繊維症の（ｆ　１ｂｒｏｔ　ｉｃ）過程、例えば、他の硬皮症（ａｃｌ ｅｒｏｄｅｒｍａ）　、筋繊維症（ｍｙｏｆ　１ｂｒｏｓｉｓ）　；及び、ｆ） ＰＤＧＦにより仲介される腫瘍細胞増殖の阻害、を含む。

本発明は、これらの及び他の必要性を実現する。

発明の要約 本発明は、ヒト型ベータ血小板誘導成長因子レセプタ（βＰＤＧＰ−Ｒ）に特異 的に結合する免疫グロブリン・ポリペプチドであって、その免疫グロブリン・ポ リペプチドの、ヒトβＰＤＧＦ−Ｒの第５１ｇ一様ドメインへの結合が、以下の 効果の１以上をもつものを提供する：ｌ）レセプタへのＰＤＧＦ　ＢＢ結合の阻 害：１ｉ）ＰＤＧＦ−誘導βＰＤＧＦ−Ｒリン酸化の阻害；１ｉｉ）ＰＤＧＦ− 誘導βＰＤＧＦ−Ｒダイマー化の阻害：１ｖ）ヒトβＰＤＧＦ−Ｒ表示細胞のＰ ＤＧＦ−誘導有糸分裂誘発の阻害；及びＶ）βＰＤＧＦ−Ｒ表示細胞のＰＤＧＦ −誘導化学走性及び転移。本発明の好ましい態様は、モノクロナール抗体、例え ば、モノクロナール抗体２ＡＩＢ２であってＩｇＧ、イソタイプを有するもので ある。

上記の性質をもつ免疫グロブリン・ポリペプチドの全部又は部分をコードしてい るものに実質的に同じ配列をもつ単離核酸も、本発明に包含される。これらの核 酸によりトランスフェクト、形質転換、又は感染された細胞系は、請求の核酸を 含む細胞系を培養しそしてその免疫グロブリン・ポリペプチド又は断片を収穫す ることによりその免疫グロブリン・ポリペプチド又はそれらの断片を製造する方 法と同様に、本発明の他の態様である。

本発明の免疫グロブリン・ポリペプチドは、診断及び治療の用途をもつ。例えば 、本発明のさらなる態様は、平滑筋細胞の増殖に関連するＰＤＧＦ−仲介疾患を もつヒトを治療する方法であって、患者に、本発明の免疫グロブリン・ポリペプ チドの治療的有効投与量を投与することを含んで成る方法を含む。

図面の簡単な説明 図１．　組換えヒト・ベータ・レセプタ細胞外ドメイン構築物。完全長のＰＤＧ Ｆベータ・レセプタの欠失突然変異誘発を、方法中に記載するように行った。Ｐ Δｌは、第５ドメイン細胞外ＰＤＧＦベータ・レセプタ（アミノ酸１−４９９） であって、ＰＤＧＦベータ型レセプしｃＤＮＡからアミノ酸残基５００−１０７ ４のコドンをオリゴヌクレオチドＧＴＧ　ＴＧＡ　ＧＧＡＡＣＧ　ＧＧＡ　ＡＡ Ｔ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＣＣＣＣＧＡＣ（配列番号ｌ）を使 用して欠失させることにより作られたものをいう。ＰΔ２は、第４ドメイン細胞 外ＰＤＧＦレセプタ（ａａｌ−３８４）であって、上記ｃＤＮＡからアミノ酸残 基３８５−１０７４のコドンをオリゴヌクレオチドＧＧＡ　ＡＧＧ　ＴＣＧ　Ａ ＴＧＴＣＴ　ＡＧＴ　ＴＡＡ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＣＣＣＣＧＡＣ（ 配列番号２）を使用して欠失させることにより作られたものをいう。仮定の１ｇ ドメインを、以下のように示す：Ｄ１（ａａ　１−９１）、Ｄ２（ａａ　９２− １８１）　、Ｄ３（ａａ１８２−２８２）、　Ｄ４（ａａ２８３−３８４）及び Ｄ５（ａａ３８５−４９９）　、ポリクロナール抗血清１−３−５のペプチド決 定基は、先に示したＤｌである。

図２．Ａ０分泌された第５ドメイン細胞外ＰＤＧＦベータ・レセプタｐΔ１−５ のウェスタン・プロット。還元された（レーン１−３）及び非還元（レーン４− ６）のＰＤＧＦベータ・レセプタの分泌細胞外ドメイン（ｐΔ１−５　、５μｇ ／レーン）を、７％Ｌａｅｍｍｌｉゲル上で電気泳動にかけ、その後、方法中に 記載するようにウェスタン転移をおこなった。ニトロセルロースを、２％ミルク を含むリン酸塩−バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中でブロックし、ストリップ に切断し、そしてＭＡｂ　２ＡＩＥ２（レーンｌ及び４）、他のＰＤＧＦベータ ・レセプタ・モノクロナール抗体（ＩＣ７Ｄ５）　（レーン２及び５）、又は非 特異的モノクロナール抗体（レーン３及び６）のいずれかの６０μｇ／ｍｌと共 に、４℃において一夜インキユベートした。このニトロセルロース・ストリップ を、０．５％ミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳにより洗浄し、 室温において２時間１２＄！−標識プロチインＡと共にインキュベートし、そし てＸ−線フィルムに露出させた。矢印は、ｐΔ１−５の位置を示している。

Ｂ、　分泌された第４ドメイン細胞外ＰＤＧＦベータ・レセプタｐΔ２−７の免 疫沈降。分泌された第４ドメイン細胞外ＰＤＧＦベータ・レセプタｐΔ２−７（ ２，６μｇ）を、ＭＡｂ　２ＡＩＥ２（レーン２．５μｇ）、ＩＣ７Ｄ５（レー ン３．５μｇ）又は非特異的ＭＡｂ（レーン４．５μｇ）のいずれかと共に［、 Ｐ、バッファー中の最終容量５００μｍ中で４°Ｃにおいて３時間インキュベー トした。プロティンＡセファロースＣＬ４ＢニブロチインＧセファロースＣＬ４ Ｂ（１：１）を、それぞれのチューブに添加しく６０μＩの５０％スラリー）、 そしてインキュベーションを、４℃において２時間続けた。ビーズを、分離し、 Ｌ　Ｐ、バッファー中で５回洗浄し、そしてｌＯ％Ｌａｅｍｍｌｉゲル上で電気 泳動にかけた。このゲルを、ニトロセルロースに移し、そして５％ミルクを含む ＰＢＳ中でブロックした。

このプロットを、０．５％ミルクを含むＰＢＳ中のウサギ・ポリクロナール抗− ＰＤＧＦベータ・レセプタＡｂ（１−３−５）の１　：　１００希釈物と共にイ ンキュベートした。−夜のインキュベーション後、このプロットを、洗浄し、Ｉ ｔｓ　［−プロティンＡと共にインキュベートし、洗浄し、モしてＸ−線フィル ムに露出させた。レーンｌは、免疫沈降をもたないｐΔ２−７の探準を示してい る。矢印は、ｐΔ２−７の位置を示している。

Ｃ，ＭＡｂ　２ＡＩＥ２による分泌細胞外ＰＤＧＦベータ・レセプタの免疫沈降 。細胞外ヒトＰＤＧＦベータ・レセプタ（ｐΔ１−５．５μｇ）を、非特異的Ｍ Ａｂ（レーン２）、ＭＡｂ　２ＡＩＢ２（レーン３）、又はＩＣ７Ｄ５（レーン ４）のいずれかの５μｇと共に、パネルＡについて記載したように、免疫沈降さ せた。このサンプルを、加工し、そしてそのプロットを、ウサギ・ポリクロナー ル抗−ＰＤＧＦベータ・レセプタ！−３−５（１：１００希釈物）及び１２ｓ１ −プロティンＡと共に、パネルＢについての凡例中に記載したように、インキュ ベートした。

図３．　ＨＲ５細胞への＋２’　［−ＰＤＧＦ　ＢＢ結合の阻害。Ａ）　ＨＲ５ 細胞を、方法中に記載したように、様々な濃度のＭＡｂ　２ＡＩＢ２又は対照Ｍ Ａｂｓ（２００ｎＭ抗−［１ｂ／ｌ１ｌａ又は２００ｎＭ　４Ｃ５Ｃ８）と共に インキュベートした。次に、この細胞を、”’　Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢとインキュ ベートし、そして結合された放射能を先に記載したように測定した。非特異的結 合は、１００倍過剰の非標識ＰＤＧＦ　ＢＢの存在中で結合した”’　ｒ−ＰＤ ＧＦ　ＢＢの量といして決定する。Ｂ）　ＨＲ５細胞を、様々な濃度の完全長Ｍ Ａｂ　２ＡＩＥ２　、ＭＡｂ　２ＡＩＥ２−Ｆ（ａｂ’）２　、又はＭＡｂ　２ ＡＩＥ２−Ｆａｂ　、及び方法中に記載するような１１００ｎ完全長抗−［［ｂ ／Ｉｌ［ａと共にインキュベートした。ＭＡｂｓ及びそれらの誘導体の存在及び 非存在中の細胞への”’　Ｉ−ＰＤＧＦ　Ｂｅの全結合を測定した。１００倍過 剰の非標識ＰＤＧＦ　ＢＢの存在中で結合した”’　Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢの量は 、非特異的結合を表している。

図４．　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２によるＨＲ５細胞のリン酸化の阻害。６−ｗｅ　ｌ 　１皿中のＨＲ５細胞の集密単層を、様々なＭＡｂｓと２で前インキュベートし 、その後、方法中に記載するようにリガンドＰＤＧＦ　ＢＢとインキュベートし た。細胞を、可溶化し、そして１つの６−ｗｅ　ｌ　１皿の当量を、７％Ｌａｅ ｍｍｌｉゲル上て電気泳動し、そしてニトロセルロースに移した。ウェスタン・ プロットをブロックし、そして次に１２５１−プロティンＡと共にインキュベー トし、そしてオートラジオグラフを行った。レーン３−７は、０．１３　ｎＭ　 ＭＡｂ　２ＡＩＥ２（レーン３）、１．３ＨＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＢ２（レーン４ ）、１３．３ＨＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２（レーン５）、０．１３ＨＭ　Ｍａｂ　 ２ＡＩＥ２（レーン６）又は０．５３μＭ　２ＡＩＥ２（レーン７）のいずれか と前インキュベートされ、その後１１００ｎ／ｍｌ　ＰＤＧＦ　ＢＢとインキュ ベートされたｗｅｌｌｓを表している。

レーン２は、その細胞が０．５３μＭの非特異的ＭＡｂと第−前インキュベート されたときの＋００ｎｇ／ｍｌ　ＰＤＧＦ　ＢＢの存在中のリン酸化の程度を示 しており、そしてレーン８は、その細胞が０．５３μＭのＰＤＧＦベータ・レセ プタＭＡｂ　４Ｃ５Ｃ８と前インキュベートされたときのＰＤＧＦ　’　ＢＢ− 誘導体リン酸化を示している。矢印は、完全長のヒトＰＤＧＦベータ・レセプタ の位置を示している。

図５．　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２によるＰＤＧＦレセプタのＰＤＧＦ　ＢＢ−仲介ダ イマー化の阻害。ＨＲ５細胞を、０．１３　ｎＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２（レーン ３）、０．１３ＨＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２（レーン４）、又は１．３ＨＭ　ＭＡ ｂ　２ＡＩＢ２（レーン５）のいずれかと、その後、１１００ｎ／ｍｌ　ＰＤＧ Ｆ　ＢＢとインキュベートし、そして架橋を、方法中に記載するように行った。

レーン６は、ダイマー化に対する０、１ＨＭの抗−１１ｂ／［［ｒａ　ＭＡｂの 効果を表している。レーンｌは、添加された架橋剤の非存在中のダイマーの相対 量を示しており、そしてレーン２は、抗体の非存在中のダイマー化ＰＤＧＦレセ プタの量を示している。

図６．　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２によるＡＧ０１５２３Ｂ細胞における有糸分裂誘発 の阻害。

細胞を、集密まで増殖させ、そおして方法中に記載したように、様々な濃度の、 ＭＡｂ　２ＡＩＥ２（白丸）又は非阻害的対照ＰＤＧＦベータ・レセプタＭＡｂ 　４Ｃ５Ｃ８（黒四角）のいずれかと共に、５０μｇ／ｍｌのＰＤＧＦ　ＢＢの 存在中でインキュベートした。′Ｈ−チミジンの取り込みを、記載するように測 定した。

図７．　ヒヒ平滑筋細胞におけるＭＡｂ　２ＡＩＢ２によるリン酸化の阻害。

ヒヒ平滑筋細胞を、ＰＤＧＦ　ＢＢ無しくレーンｌ）、又は１１００ｎ／ｍｌ　 ＰＤＧＰＢＢと共に、ＭＡｂの非存在中（レーン２）、又は２ＨＭ　ＭＡｂ　２ ＡＩＥ２　（レーン３）、２００　ｎＭ　ＭＡｂ　２Ａ］Ｅ２（レーン４）又は ２０μＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＢ２（レーン５）の存在中、インキュベートした。リ ガンド誘導リン酸化を、方法中に記載したようにウェスタン分析により測定した 。

図８．　ＭＡｂ　２ＡＩＢ２によるヒヒ平滑筋細胞における有糸分裂誘発の阻害 。集密ヒヒ平滑筋細胞を、様々な濃度のＰＤＧＦ　ＢＢの存在で、１ＨＭ　、５ ＨＭ　、　２５μＭ、　２５０　ｎＭ、又は１　ｔｌＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＢ２と インキュベートした。３Ｈ−チミジン取り込みを、方法中に記載したように測定 した。

データは、ＭＡｂの非存在中の飽和リガンド濃度（１０μｇ／ｍｌ）における最 大３Ｈ−チミジン取り込み（約３０−５００００　ｃｐｍ）のパーセントとして 、表されている。ＰＤＧＦ　ＢＢの非存在中の３Ｈ−チミジン取り込みは、５− ８０００　ｃｐｍである。このグラフは、４つの別々の実験の平均を表している 。

好ましい態様の説明 本発明は、ヒト型ベータＰＤＧＦレセプタに特異的に結合する免疫グロブリン・ ポリペプチドを提供する。この抗体は、その細胞表面上にヒト・ベータｆｆ１Ｐ ＤＧＦレセプタを表示する細胞のＰＤＧＦ−誘導有糸分裂誘発を阻害することが できる。本発明は、診断用途において、並びに、ヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセプ タを表示する細胞の、ＰＤＧＰ−仲介増殖、転移及び化学定性に関連する疾患の 治療のためにも、有用であろう。

用語′ペプチド”、”ポリペプチド”又は“蛋白“は、本明細書中で互換可能に 使用される。用語′実質的同一性′は、ポリブチドについていうとき、問題のポ リペプチド又は蛋白が天然蛋白の全体又はそれらの部分に少なくとも約３０％同 じであり、普通には少なくとも約７０％同じてあり、そして好ましくは少なくと も約９５％同じであることを示している。

本明細書中で使用するとき、用語”単離された”、”実質的に純粋な”及び′実 質的に均一な”は、互換可能に使用され、そして蛋白に天然に同伴する成分から 分離された蛋白について記載している。

典型的には、モノマー蛋白が、サンプルの少なくとも約６０〜７５％が１本鎖ポ リペプチド骨格を示すとき、実質的に純粋である。僅がな変異体又は化学修飾は 、典型的には、同じポリペプチド配列を占めている。実質的に純粋な蛋白は、典 型的には、蛋白サンプルの約８５〜９０％超えるもの、より普通には約９５％を 含んで成るであろうし、そして好ましくは約９９％を超えるものであろう。蛋白 の純度又は同質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉ　ｔｙ）は、本分野においてよく知られ た多数の手段、例えば、蛋白サンプルのポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、そ の後の、染色の間のポリアクリルアミド・ゲル上の単一ポリペプチド・バンドの 可視化により、示されることができる。特定の目的のためには、高分解能が必要 であろうし、モしてＨＰＬＣ又は精製用途のための類似の手段が必要であろう。

ポリペプチドは、それがその天然の状態においてそれを同伴する生来の汚染物か ら分離されるとき、天然関連成分を実質的に含まない。したがって、化学的に合 成される又はそれが天然に生じる細胞と異なる細胞系内で合成されるポリペプチ ドは、その天然関連成分を実質的に含まないであろう。

蛋白は、硫酸アンモニウムのような物質による選択的沈降、カラム・クロマトグ ラフィー、免疫精製法、及びその他を含む本分野においてよく知られた標準的な 技術により、実質的な同質性まで精製されることができる。例えば、Ｒ，５ｃｏ ｐｅｓ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ 　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ　（１９８２）（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照 のこと。

ｂ）核酸 本明細書中で使用するとき、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。核 酸についていいうとき、用語”実質的同一性“は、２つの核酸配列、又はそれら の設計された部分が、場合により並べられそして比較されたとき、適当なヌクレ オチドの挿入又は欠失を伴って、そのヌクレオチドの少なくとも約８０％におい て、そのヌクレオチドの、普通には少なくとも約９０％〜９５％、そしてより好 ましくは少なくとも約９８〜９９．５％において、同一であることを、示してい る。

あるいは、実質的な核酸配列の同一性は、核酸セグメントが選択的ハイブリダイ ゼーション条件下、他の核酸ストランドとハイブリダイズするであろうときに、 存在する。

”実質的に相補的な“は、同様に、ある核酸が他の核酸と同一であり、又はそれ に選択的にハイブリダイズするということを、意味している。典型的には、選択 的ハイブリダイゼーションは、少なくとも１４−２５ヌクレオチドのストレッチ にわたり少なくとも約５５％の同一性が、好ましくは少なくとも約６５％の同一 性が、より好ましくは少なくとも約７５％の、そして最も好ましくは少なくとも 約９０％の同一性が、在るときに、起こる。Ｍ、　Ｋａｎｅｈｉｓａ　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１２：２０３　（１９８４）（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を 参照のこと。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満の 、より普通には約５００ｍＭ未満の、そして好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃 度を含むであろう。温度条件は、典型的には、２２°Ｃよりも高く、より典型的 には約３０°Ｃよりも高く、そして好ましくは約３７°Ｃを超えるであろう。そ の相補的ストランドの塩基組成及びサイズ、有機溶媒の存在及び塩基非適合の程 度を含む他の要素が、劇的にハイブリダイゼーションのストリンジエンシーに影 響を与えることができるので、パラメーターの組み合わせが、いずれか１つの単 独の絶対的な測定よりも、より重要である。

”単離された“又は“実質的に純粋な”は、核酸についていうとき、アルカリ／ ＳＤＳ処理、ＣｓＣ１結合、カラム・クロマトグラフィー。

そして本分野においてよく知られているその他を含む標準的な技術により、他の 細胞成分又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又はＷｉｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓ ｃｉｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８７）　（これを、引用により本明 細書中に取り込む。）を参照のこと。

核酸は、それが他の核酸配列との機能的関係に中に置かれてるとき、”作用可能 な状態で結合されて（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）”いる。例えば、プロ モーター又はエンハンサ−は、それが配列の転写に影響を与える場合に、コーデ ィング配列に作用可能な状態で結合されている。一般的には、作用可能な結合は 、結合されている核酸配列が連続しており、２つの蛋白コーディング領域を連結 させる必要がある場合には、連続しており、そして読み取り枠内にある。

核酸操作のための技術、例えば、ポリペプチドをエンコードしている核酸配列の 、発現ベクターへのサブクローニング、プローブの標識付け、ＤＮＡハイブリダ イゼーション、等は、一般的に、例えば、Ａｕ５ｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄ 、　（１９８７）前掲書中、（これらの両方を、引用により本明細書中に取り込 む。）の中に記載されている。

“発現ベクター”、”クローニング・ベクター“又は”ベクター”は、しばしば 、プラスミド又は他の核酸分子であって選ばれた宿主内で複製することができる ものである。発現ベクターは、自己複製可能であり、又はそれらは、本分野にお いてよく知られた方法により、宿主細胞のゲノム内に挿入されることにより、複 製することができる。自己複製したベクターは、選ばれた宿主細胞内において機 能的な複製起点又は自己複製配列（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉ ｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＲＳ））をもつであろう。しばしば、ベクターが、 １以上の宿主細胞内において、例えば、クローニング及び構築のための大腸菌（ Ｅ、ｃｏｌｉ）内において、並びに発現のための哺乳類細胞内において、使用可 能であることが必要である。

哺乳類細胞系は、しばしば、真核生物から得られるポリペプチドの発現のための 宿主細胞として使用される。培養における哺乳類細胞の増殖（Ｐｒｏｐａｇａｔ ｉｏｎ）は、それ自体よく知られている。Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　 ｅｄ、　（１９７３）　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照 のこと。また、細胞、又は昆虫細胞、のような生物を含む。

゛形質転換”は、よく知られた方法により、問題の核酸を含むベクターを直接に 宿主に導入することをいう。宿主のタイプに依存する形質転換の方法は、エレク トロポレーション：塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥ ＡＥ−デキストラン、又は他の物質を使用するトランスフエフシコン；マイクロ プロジェクタイル・ボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｂｏ ｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リポフエクション：感染（ベクターが感染性剤の場合） ：及び他の方法を含む。

一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）前掲書中、及び Ａｕ５ｂｅｌ　ｅｔａｌ、　（ｅｄ、）、　（１９８７）前掲書中２を参照のこ と。また、先に記載した核酸が導入されている細胞への言及は、そのような細胞 の子孫を含むことを意味している。

Ｃ）抗体 本明細書中で使用するとき、“免疫グロブリン・ポリペプチド”は、特異的な免 疫反応活性をもつ分子をいう。抗体は、典型的んいは、免疫グロブリン・ポリペ プチドのテトラマーである。本明細書中で使用するとき、用語“抗体゛は、免疫 グロブリン遺伝子により実質的にエンコードされている１以上のポリペプチドか ら成る蛋白をいう。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ又はラムダ型を有すること ができる軽鎖をコードしているもの、及び重鎮をコードしているものを含み、重 鎮の型は、アルファ、ガンマ、デルタ、ニブシロン及びミューである。免疫グロ ブリン重鎮及び軽鎖のカルボキシ末端部分は、定常領域であり、一方、そのアミ ノ末端部分は、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子によりエンコードされて“ いる。免疫グロブリンの可変領域は、抗原認識特異性を提供する部分である。特 に、その特異性は、その免疫グロブリンの、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅ ｎｔｅｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ））であって 超可変領域としても知られているものの内に在る。免疫グロブリンは、例えば、 Ｆｖ、Ｐａｂ　、及びＦ（ａｂ）　２　、を含む様々な形態において、並びに１ 本鎖において、存在することができる（例えば、Ｈｏ５ｔｏｎ、　ｅｔ　ａｔ、 、　Ｐｒｏｃ。

り込む。））。（一般的には、Ｈｏｏｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　”Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ”、　Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｎ、Ｙ、、　２ｎｄ　ｅｄ、　（１９８４） 、　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。重鎮及 び軽鎖のための遺伝子が１重鎖コーディング配列内で組み合わされているところ の１本鎖抗体を、使用することもてきる。

”モノクロナール抗体”は、当業者に馴染みのある様々な技術により得られるこ とができる。簡単に言えば、所望の抗原により免疫化された動物からの牌臓細胞 を、一般的には骨髄腫細胞との融合により、不朽化する（Ｋｏｈｎｅｒ　ａｎｄ 　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　６：５１１−５１ ９（１９７６））　、不朽化の他の方法は、Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒウィルス 、オンコジーン、又はレトロウィルスによる形質転換、あるいは、本分野におい てよく知られた他の方法を含む。単一の不朽化細胞から生じたコロニーは、所望 の特異性及び抗原についてのアフィニティーを有する抗体を作り出すためにスク リーニングされ、そしてこのような細胞により作られたモノクロナール抗体の収 率は、を椎動物宿主の腹膜腔（ｐｅｒｔｏｎｅａｌ　ｃａｖｉｔｙ）中への注射 を含む様々な技術により、増強されることができる。

また、モノ特異的免疫グロブリンが、原核生物又は真核生物宿主細胞における組 換え技術により、作られることができる。

′キメラ゛抗体は、その軽鎖及び重鎮の遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリ ン遺伝子セグメントから成るように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によ りエンコードされている。例えば、マウス・モノクロナール抗体からの遺伝子の 可変（Ｖ）セグメントを、ヒト定常（Ｃ）セグメントに結合することができる。

このようなキメラ抗体は、マウス定常領域並びにマウス可変領域をもつ抗体より もヒトに対してより少ない抗原性をもつようである。

本明細書中で使用するとき、また、用語キメラ抗体は、ヒト一様の枠組み（ｆｒ ａｍｅｗｏｒｋ）をもち、そしてその中で、存在するいずれかの定常領域がヒト 免疫グロブリン定常領域に少なくとも約８５−９０％、そして好ましくは約９５ ％同じポリペプチド配列をもつような免疫グロブリン、所謂°ヒト化“免疫グロ ブリンをいう（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０１０７８６１、（これを、引用 により本明細書中に取り込む。

）を参照のこと。）。これ故に、このような”ヒト化”免疫グロブリンの全ての 部分は、ひょっとしたら相補性決定領域（ＣＤＲ’　ｓ）を除いて、１以上の生 来のヒト免疫グロブリン配列の対応部分に実質的に同一である。

用語”フレームワーク領域”は、本明細書中で使用するとき、Ｋａｔｅｒｅｓｔ 、　４ｔｈ　Ｅｄ、、　ＵＳ　Ｄｅｐｔ、　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ 　５ｅｒｖｉｃｅｓ、　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）により 定められるような、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎮の可変領域の部分であって単 一種内の異なる免疫グロブリンの中の比較的保存されているような（すなわち、 ＣＤＲ’　ｓ以外の）ものをいう。本明細書中で使用されるとき、“ヒト一様フ レームワーク領域”は、それぞれの現存鎖内に、ヒト免疫グロブリン内のものと 同じ、少なくとも約７０％以上のアミノ酸残基、典型的には７５〜８５以上の残 基を含んで成るフレームワーク領域である。

ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、よく知られた手順に従って、様々なヒト細胞から単 離されることができるが、好ましくは、不朽化Ｂ−細胞から単離されることがて きる。本発明のキメラ免疫グロブリンを作るための可変領域又はＣＤＲ５は、ヒ ト・ベータ盟ＰＤＧＦレセプタに結合することができるモノクロナール抗体から 、同様に得られるであろうし、そしてマウス、ラット、ウサギ、又はよく知られ た方法により抗体を作ることができる他のを椎動物を含むいずれかの慣用の哺乳 類源内で作られるであろう。

好適な、ＤＮＡ配列のための源細胞及び免疫グロブリン発現及び分泌のための宿 主細胞は、多数の源、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 ＣｏｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＣＣａｔａｌｏ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａ ｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、’　Ｆｉｆｔｈｅｄｉｔｉｏｎ　（１９８５）　 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、（これを、引用に より本明細書中に取り込む。）から得られることができる。

本明細書中に特に記載するキメラ及び′ヒト化”免疫グロブリンに加えて、他の 実質的に同一な修飾された免疫グロブリンを、当業者によく知られた様々な組換 えＤＮＡ技術を使用して容易に設計及び製造することができる。一般的に、遺伝 子の修飾は、様々なよ（知られた技術、例えば、部位特異的突然変異誘発により 容易に行われ用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。

あるいは、−次免疫グロブリン構造の一部のみを含んで成るポリペプチド断片を 作ることができる。例えば、抗原認識に加えて、又はそれ以外の、１以上の免疫 グロブリン活性（例えば、補体固定）を有する免疫グロブリン・ポリペプチド断 片を作ることが要求されることができる。

また、免疫グロブリン遺伝子は、全体として又は部分において、他の遺伝子から の機能的領域（例えば、酵素）と、又は他の分子、例えば、新たな性質をもつ融 合蛋白（例えば、″免疫毒（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ）”）を作るための毒素 又は標識と、組み合わされることができる。

遺伝子融合のこれらの場合においては、２つの成分が、同一ポリペプチド鎖内に 存在する。あるいは、免疫グロブリン又はそれらの断片が、様々なよく知られた 化学的手順のいずれかにより、毒素又は標識に化学的に結合されることができる 。例えば、標識又は細胞毒性剤か蛋白であり、そして第２成分が無傷の免疫グロ ブリンであるとき、その結合は、ヘテロ２官能価の架橋剤、例えば、５ＰＤＰ、 カルボジイミド、グルタルアルデヒド、等の方法によるものであることができる 。

好適な標識は、例えば、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化 学発光剤、磁気粒子を含む。このような標識の使用を教示している特許の例は、 以下のものである：米国特許第３．８１７゜８３７号；第３．８５０．７５２号 ；第３．９３９．３５０号；第３．９９６．３４５号；第４゜２７７、４３７号 ；第４．２７５．１４９号；及び第４．３６６、２４１号、（これらの全てを、 引用により本明細書中に取り込む。）。

また、１本鎖分子を含む免疫毒は、組換え手段により、製造されることができる 。様々な免疫毒の製造は、本分野によく知られておｃｉｅｎｃｅ　（１９８７） 　２３８：　１０９８−１１０４；及びＧ、　Ｗｉｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｃ，Ｍｉ ｌｓｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９９１）　３４９：２９３−２９９；　（すべてを、引用に より本明細書中に取り込む。）中に見られることができる。

様々な細胞毒剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ａｇｅｎｔ）が、免疫毒における使用に 好適である。細胞毒剤は、放射性核種、例えば、インジウム−１３１、イツトリ ウム−９０、レンニウムー１８８、及びビスマス−２１２：多数の化学療法医薬 、例えば、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）　、メトトレキサート、アドリア マイシン、及びシスブラチナム（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）　；及び細胞毒性蛋 白、例えば、リポソーム阻害蛋白様ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルス 蛋白、シュードモナス外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｅｘｏｔｏｘｉｎ　 Ａ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）　、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、等、又は細胞表 面において活性な剤、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ ）を、含むことができる（一般的に、”Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｔｏｘｉｎｓ、”０ １ｓｎｅｓ　ａｎｄ　Ｐｈ１１．　Ｐｈａｒｍａｃ、　Ｔｈｅｒ、、　１５：３ ５５−３８１　（１９８１）　、及び”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ 、”　ｅｄｓ。

Ｂａｌｄｗｉｎ　ａｎｄ　Ｂｙｅｒｓ、　ｐｐ、　１５９−１７９．２２４−２ ６６、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８５）、　（これらの両方を、 引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。

発明の説明 本発明の免疫グロブリン・ポリペプチドは、治療における並びに診断及び他の用 途における使用を見つけられるであろう。これらの分野において有用な様々な技 術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　 Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）　（すべての目的のために、引用によ り本明細書中に取り込む。）中に記載されており：免疫グロブリンを作るための 動物の免疫化：モノクロナール抗体の生産；プローブとしての使用のための免疫 グロブリンの標識付け：免疫アフィニティー精製；及び免疫検定を含む。

本発明の免疫グロブリン・ポリペプチドの例は、以下に記載するようなモノクロ ナール抗体２ＡＩＥ２であって、ベータ型ヒトＰＤＧＦレセプタに特異的に結合 するものである。モノクロナール抗体２ＡＩＥ２であってＩｇＧ　＋イソタイプ を有するものは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋ　Ｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０２３１（ＡＴＣＣｎｏ、　ＨＢＩ０９３８）に、 この出願の出願日に先立って、寄託されている。

本発明の抗−ＰＤＧＰレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドを、ヒト・ベータ 型ＰＤＧＦレセプタの精製された又は部分的に精製された細胞外ドメインにより 動物を免疫化することにより、調製することができる。免疫化された動物は、ヒ ト・ベータ型ＰＤＧＦレセプタ細胞外ドメインに特徴的なエピトープを免疫学的 に認識することができる様々な種、例えば、ネズミ、ウサギ（ｌａｇｏｍｏｒｐ ｈ）　、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）等の中のいずれか１っである。

本発明のモノクロナール抗体は、ヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセプタ細胞外ドメイ ンに特徴的な抗原決定基に特異的に結合する免疫グロブリン・ポリペプチド又は それらの部分をエンコードしている核酸配列を免疫化することにより、調製され ることができる。不朽化過程を、ハイブリドーマ融合技術により、抗体−産生リ ンパ球のウィルス形質転換、組換えＤＮＡ技術により、又は細胞融合、ウィルス 形質転換及び／又は組換えＤＮＡ方法論を組み合わせることにより、行うことが できる。

本発明の１つの態様に従って、ヒト抗−ＰＤＧＦレセプタ・モノクロナール抗体 産生細胞を、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）形質転換技 術を使用して、不朽化する。例えば、患者の、末梢血液、骨髄、リンパ節、扁桃 （ｔｏｎｓｉｌｓ）等、好ましくは、ＰＤＧＦレセプタ又はそれらの部分により 免疫化されたものを、米国特許第４．４６４．４６５号及びＣｈａｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　１３６：１０６　（１９８６）　（これを、 引用により本明細書中に取り込む。）に従ってＥＢＶを使用して、不朽化する。

また、ヒト抗−ＰＤＧＦレセプタ・モノクロナール抗体を、様々な他の方法によ り、例えば、ＥＢＶ又は他のウィルス形質転換とハイブリドーマ融合技術との組 み合わせを使用して、調製することができる。

例えば、ハイブリドーマを、ＰＤＧＦレセプタ又はそれらの部分により免疫化さ れた個体から得られた刺激されたＢ細胞を、マウス／ヒト・ヘテロハイブリット 融合パートナ−と、融合することにより、創出することができ、これらの様々な ものが、記載されている。例えば、米国特許第４．６２４．９２１号及びＪａｍ ｅｓ　ａｎｄ　Ｂｅ１ｌ、　Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｓ、　１００： ５−４０　（１９８７）（これを、引用により本明細書中に取り込む。

）を、参照のこと。マウス／ヒト融合パートナ−は、ＥＢＶにより刺激され又は 形質転換されたヒト・リンパ球を、容易に入手可能なマウス骨髄腫系、例えば、 Ｎ５−１又はＰ３Ｎ５−１と、例えば、ポリエチレン・グリコールの存在中で、 融合することにより、構築されることができる。このハイブリッドは、好適に医 薬−マークされるべきであり、これは、そのハイブリッドを、所望の医薬、例え ば、６−チオグアニン、オウバイン（ｏｕｂａｉｎ）、又はネオマイシン（ｎｅ ｏｍｙｃｉｎ）の増加濃度において培養することにより、達成されることができ る。

問題の抗体を分泌するマイブリドーマ又はリンパ芽球様細胞（ｌｙｍｐｈｏｂｌ ａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ）は、ベータ型ＰＤＧＦレセプタに結合する抗体につ いて培養上澄液をスクリーニングすることにより同定されることができる。より 好ましくは、スクリーニング検定は、例えば、ＰＤＧＦ−仲介有糸分裂誘発を阻 害する抗体を検出するために使用されることができる。所望の活性を有する細胞 を、慣用の技術に従ってクローン化及びサブクローン化し、そして問題の抗−Ｐ ＤＧＦレセプタ・モノクロナール抗体を産生ずる安定な、不朽化された系が同定 されるまで、監視する。モノクロナール抗体は、異なる抗原結合特異性をもつ抗 体を産生ずる細胞から分離されたクローンの、不朽化された細胞系により作られ た抗体を、意味する。したがって、このような抗体は、他のモノクロナール抗体 から単離されて作られ、そして、従って、（他の抗体と比べて）実質的に純粋な 形態であり、そしてＢ細胞源として役立つ動物種からの血清中に正常に生じるよ りも一般的に高い濃度にある。

あるいは、ある者は、Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１ ２７５−１２８１（１９８９）（これを、引用により本明細書中に取り込む。） により概説されるような一般的な手順に従ってヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングし、そして次に所望の特異性を有する抗−ＰＤＧＦレセプタ 抗体（又は結合断片）をエンコードしている配列をクローニング及び増幅するこ とにより、ＰＤＧＦレセプタの細胞外ドメインに特異的に結合するヒト抗−ＰＤ ＧＦレセプタ免疫・ポリペプチド又はそれらの部分をエンコードしているＤＮＡ 配列を単離することができる。

免疫グロブリンを、次に、適当な免疫グロブリン遺伝子、又はそれらの部分を含 む発現ベクターを、適当な宿主細胞に導入することにいより、作ることができる 。この宿主細胞を、次に、免疫グロブリン・ヌクレオチド配列の高レベル発現に 好適な条件下で、維持し、そして必要なときに、軽鎖、重鎖、軽／重鎖ダイマー 又は無傷抗体、結合断片、又は他の免疫グロブリン形態の回収及び精製が、続く ことができる。

好適な宿主細胞は、微生物を含むが、哺乳類又は昆虫の組繊細胞培養物が、本発 明のモノクロナール抗体の生産に好まれることができる（Ｅ、　Ｗｉｎｎａｃｋ ｅｒ、　”Ｆｒｏｍ　Ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　Ｃ１ｏｎｅｓ、＋ＶＣＨＰｕｂｌｉｓ ｈｅｒｓ、　Ｎ。

Ｙ、、　Ｎ、Ｙ、　（１９８７）　（これを、引用により本明細書中に取り込む 。）を参照のこと。）。無傷の免疫グロブリンを分泌することができる多数の好 適な宿主細胞系が、本分野において開発されており、そしてこれは、チャイニー ズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を含むが、好ましくは、形質転換されたＢ −細胞又はハイブリドーマが使用されるであろう。

一旦発現されれば、本発明の、抗体全体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重 鎮、又は他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティー・ カラム、カラム・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等を含む、本分野の標準 的技術に従って精製することができる（一般的には、Ｒ，５ｃｏｐｅｓ、　Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、 　Ｎ、Ｙ、　（１９８２）　（引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこ と。）。少なくとも約９０〜９８％同質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）を存する 実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、そして医薬用途のためには、９８〜 ９９％以上の同質性を有するものが最も好ましい。一旦、部分的に又は同質性ま で精製されれば、そのポリペプチドを、次に、（体外を含み）治療的に、又は検 定手順、免疫蛍光染色、等の開発及び実施において、使用することができる。（ 一般的に、１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｖｏｌｓ、　Ｉ　 ａｎｄ　ＩＩ、　Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ　ａｎｄ　Ｐｅｒｎｉｓ、　ｅｄｓ、、　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、　（１９７９ ａｎｄ　１９８１）（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこ と。）本発明に従って作られた免疫グロブリン・ポリペプチドは、ＩｇＧ、Ｉｇ Ｍ　、　ｒｇＡ又は［ｇＤイソタイプを有することができ、そしてさらに、それ らの適当なサブクラス、例えば、［ｇＧ　＋　、ＩｇＧ　２　、［ｇＧ　ｓ、又 はＩｇＧ　ａの中のいずれかであることができる。組換えＤＮＡ技術を使用して 、単離された免疫グロブリン・ポリペプチドの“クラス−スイッチング（ｃｌａ ｓｓ−ｓｗｉ　ｔｃｈｉｎｇ）”を、容易に行うことができる。この方法におい ては、問題の免疫グロブリン分子のイソタイプを決定する定常領域をエンコード している遺伝子が、欧州特許出願第ＥＰＩ３１４、１６１号（引用により本明細 書中に取り込む。）中に一般的に記載されるように、所望のイソタイプ又はサブ クラスをエンコードしている遺伝子により、置き換えられる。また、クラス−ス イッチされた免疫グロブリンは、本分野において知られた選択方法を使用して自 発的スイッチングを経験した細胞を選択することにより、単離されることもてき る。

実質的に非−ヒトである免疫グロブリン・ポリペプチドのヒトへの投与は、抗− 抗体応答を穎現させることができる。したがって、実質的にヒトである本発明の 抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドを調製することが必要であ ることができる。゛実質的にヒト“とは、特に、確立されたＰＤＧＦ−仲介細胞 増殖失調を治療するために必要であることができる長い期間にわたる反復投与の ための、起源において少なくとも約５０％、より好ましくは約７０〜８０％以上 、そして最も好ましくは約９５〜９９％以上であるアミノ酸配列から成る抗体又 はそれらの結合断片を、意味する。本明細書中で使用するとき、ヒト抗体は、そ の文脈が特にことわらない限り、完全にヒト起源の抗体並びに実質的にヒトであ るものを含むことを、意味する。

ヒト抗−ＰＤＧＦレセプタ・モノクロナール抗体の生産が慣用の不朽化技術によ っては困難であることができるので、まず、非−ヒト抗体を作り、そして次に組 換えＤＮＡ技術を介して、非−ヒト抗体の抗原結合領域、例えば、Ｆａｂ　、相 補性決定領域（ＣＤＲｓ）又は超可変領域を、実質的なヒト分子を作るために適 用なヒト定常領域（Ｆｃ）又はフレームワーク領域に、移すことが、必要である ことができる。このような方法は、本分野において一般的に知られており、そし て、例えば、米国特許第４．８１６．３９７号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０１０７ ８６１、及び欧州特許出願第１７３４９４号及び２３９４００号（これらのそれ ぞれを、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されている。

ヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセプタに特異的に結合し、そしてこれ故、そのレセプ タへのＰＤＧＦの結合を阻害する、得られたキメラ抗体及びキメラ免疫グロブリ ン・ポリペプチドも、本発明の範囲内にある。

典型的な治療的キメラ抗体は、ヒトＰＤＧＦベータ型レセプタ抗原決定基に特異 的なマウス免疫グロブリンからの可変（Ｖ）又は抗原結合ドメイン、及びヒト免 疫グロブリンからの定常（Ｃ）又はエフェクター・ドメインから成るハイブリッ ド蛋白であるであろう。但し、他の哺乳類種からのドメインを、可変及び定常ド メインの両方のために使用することができる。本明細書中で使用するとき、また 、用語”キメラ抗体“は、相補性決定領域（ＣＤＲ’　ｓ）だけがその抗原決定 基を特異的に認識する免疫グロブリンから移されており、その免疫グロブリン遺 伝子の残りがヒト（又は所望により他の哺乳類）の免疫グロブリン遺伝子から得 られているような、免疫グロブリン遺伝子により、コードされている抗体をいう 。このタイプのキメラ抗体は、”ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）”（ヒト免疫グ ロブリン遺伝子が使用される場合）抗体といわれる。

抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドの可変ドメインの超可変領 域は、本発明の関連態様を含んで成る。この超可変領域又はＣＤＲ５は、フレー ムワーク領域（単一種内の異なる免疫グロブリンの中で比較的保存されている免 疫グロブリンの軽鎖及び重鎮の可変領域の部分）と共に、抗−ＰＤＧＦレセプタ 免疫グロブリン・ポリペプチドがヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセプタを認識し且つ それ故それに結合することを、可能にする。この超可変領域を、クローン化し、 そして配列決定することができる。一旦、同定されれば、ＰＤＧＦレセプタの特 異的認識を与えるこれらの領域は、次に、他の免疫グロブリン分子の一部として 又は融合蛋白、例えば、そのクローン化イディオタイプの免疫原性を強化する働 きをもつ担体分子として、宿主内での発現のために、ベクター内にクローン化さ れることができる。

本発明の抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドは、一般的に無傷 で、又は免疫原性断片、例えば、Ｆ　、　、Ｆａｂ　、又はＦ（ａｂ゛）２断片 として、使用されるであろう。この断片を、慣用の技術により、例えば、ペプシ ン又はパパインのようなものを使用した抗体の蛋白分解消化により、又は所望の 断片をエンコードしている遺伝子又はそれらの部分がクローン化又は合成され、 そして様々な宿主内で発現されてるような組換えＤＮＡ技術により、抗体から得 ることができる。

当業者は、゛抗−イディオタイプ抗体を標準的な技術に従って免疫原として特異 的免疫グロブリンを使用することにより作ることができることを認めるであろう 。例えば、ＰＤＧＦレセプタ・ポリペプチド、又はそれらの断片による感染又は 免疫化は、そのＦａｂ可変領域結合部位の上に、その特定の免疫グロブリン、例 えば、イディオタイプに対しユニークなＰＤＧＦレセプタ・ポリペプチドのイメ ージをもつ中和免疫グロブリンを、誘導する。このような抗−ＰＤＧＰ−Ｒ免疫 グロブリンによる免疫化は、抗−イディオタイプ抗体であって元のＰＤＧＦ−Ｒ 抗原の構造を真似たその結合部位において立体配置をもつものを、誘導する。こ れらの抗−イディオタイプ抗体は、それ故に、ＰＤＧＦ−仲介疾患を治療するた めにＰＤＧＦ−Ｒ抗原の代わりに、使用されることができる（例えば、Ｎ１５ｏ ｎｏｆｆ　（１９９１）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４７：２４２９−２４３ ８　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。

本発明の抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドは、治療及び診断 方法並びに組成物における用途を見いだしている。治療用途のためには、抗−Ｐ ＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドを、ヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセ プタのための可溶性リガンドとして使用され、そのレセプタマスキングし又はそ の他にそのレセプタへの結合からＰＤＧＦ分子を阻害し、そしてそれにより不所 望の細胞の転移及び増殖を阻害する。

医薬組成物のためには、本明細書中に記載するような本発明の抗−ＰＤＧＦレセ プタ免疫グロブリン・ポリペプチドを、ＰＤＧＦ−仲介細胞増殖失調をもつ個体 に投与する。治療用途においては、組成物を、細胞レセプタを有効にブロックす るのに充分な量で患者に投与し、そしてそれによりその細胞増殖及びその徴候及 び／又は合併症を少なくとも部分的に休止させる。これを達成するのに適当な量 は、”治療的有効投与量”として定められる。この使用のため・に有効な量は、 例えば、抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチド組成物の性質、投 与のやり方、治療される疾患の段階及び重症度、患者の体重及び健康の総合状態 、及び処方内科医の判断に依存するであろうが、一般的には、１日当たり約ｏ、 　０１ｍｇ／ｋｇから約ｔｏｏ、　Ｏｍｇ／ｋｇ体重までの範囲にあるであろう し、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０．　Ｏｏ＋ｇ／ｋｇ体重までの投 与量が、より一般的に使用される。抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリ ペプチド及びそれから得られたペプチド組成物が、重症な疾患状態、すなわち、 致死的又は潜在的に致死的な状態において使用されることができるということに 留意しなければならない。このような場合には、実質的に過剰のこれらの組成物 を投与することが、可能であり、そしてそその処方内科医により必要と思われる ことができる。したがって、本発明の、ヒト抗−ＰＤＧＦレセプタ・モノクロナ ール抗体又は実質的ヒト抗−ＰＤＧＦレセプタ・モノクロナール抗体が、これら の情況の下では最も好ましい。

本組成物の単−又は複数の投与を、その処方内科医により選ばれた投与レベル及 びパターンにより、行うことができる。いずれの事件においても、医薬配合物は 、患者を有効に治療するのに充分な本発明の抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリ ン・ポリペプチドの量を提供すべきである。投与は、不所望の細胞増殖の第一指 標において又は診断直後に開始され、そして徴候が実質的に軽減され、そしてそ の後の期間にわたり、続けられるべきである。よく確立された病気の場合におい ては、負荷投与量その後の維持投与量が、必要であろう。

治療処置のための医薬組成物は、非経口的、局所的、経口的又は居所投与につい て意図されている。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈中に 、皮下内に、皮膚内に、又は筋肉内に、投与される。したがって、本発明は、許 容される担体、好ましくは水性担体中に溶解され又は懸濁される抗−ＰＤＧＦレ セプタ免疫グロブリン・ポリペプチドの溶液を含んで成る非経口投与のための組 成物を提供する。様々な水性担体、例えば、水、バッファー水、０．４％生理食 塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、等を、使用することがてきる。これら の組成物は、慣用の、よく知られた滅菌技術により、滅菌され、又は滅菌濾過さ れることができる。得られた水溶液を、それ自体としての使用のために包装し、 又は凍結乾燥することができる。投与に先立ちその凍結乾燥調製物が無菌溶液と 組み合わされる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要な、医薬と して許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整及び緩衝化剤、浸透圧調整剤、水和 剤、等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリ ウム、塩化カルシウム、ソルビタン・モノラウレート、トリエタノールアミン・ オレエート、等を含むことができる。

医薬配合品中の本発明の抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドの 濃度は、広く、すなわち、約１％未満、普通には約１０−１５％において又は少 なくとも約１０−１５％においてから、５０重量％以上と同じ程度まで、変動す ることができ、そして選ばれた投与の特定の態様に従って、主に、液体の容量、 粘度等により、選ばれることができるであろう。

したがって、静脈中の注入のための典型的な医薬組成物は、２５０ｍ１の滅菌Ｒ ｉｎｇｅｒ’　ｓ溶液、及び１．００ｍｇの抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリ ン・ポリペプチドを含むように調製されることができる。非経口的に投与するこ とができる化合物を製造するための実際の方法は、当業者に知られ又は明らかに なるであろうし、そして例えば、セμ−ｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　１７ｔｈ　ｅｄ、、　Ｍｅｒｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｉｎｇ　Ｃ。

ｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８５）（これを、引用により本明 細書中に取り込む。）中により詳細に記載されている。

また、抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチド及びそれらの断片は 、リポソームを介して投与されることもできる。この抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫 グロブリン・ポリペプチドは、そのリポソームを、ヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセ プタを表示する特定の組織又は細胞に、標的化することに役立つことができる。

リポソームは、エマルジョン、泡、ミセル、不溶性単層、脂質結晶、リン脂質分 散体、ラメラ層、等を含む。これらの調製物においては、配達されるべき免疫グ ロブリン・ポリペプチド又は断片は、リポソームの一部として、単独で又は例え ば、その標的細胞に対して毒性である分子と共に、取り込まれる。免疫グロブリ ン・ポリペプチドを含むリポソーム懸濁液は、静脈内に、局部的に、局所的に、 等に、とりわけ、投与のやり方、配達されるペプチド、及び治療される疾患の段 階に従って変動する投与量において、投与されることができる。

本発明の抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドの固体組成物のた めに、慣用の非毒性固体担体であって、例えば、医薬グレードのマニトール、ラ クトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、タルク 、セルロース、グルコース、シュクロース、炭酸マグネシウム等を含むものを、 使用することができる。経口投与のためには、医薬として許容される非毒性組成 物を、正常に使用される賦形剤、例えば、先に列記したような担体、一般的に１ ０−９５％の活性成分、すなわち、１以上の抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリ ン・ポリペプチドのいずれかを、そしてより好ましくは２５％−７５％の濃度に おいて、取り込むことにより配合する。

診断目的のためには、抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドを、 標識又は非標識のいずれかを行うことができる。標識は、本分野においてよく知 られ且つ報告されている様々な技術の中のいずれかにより検出することができる シグナルを提供する物質である。あるいは、本発明内に含まれる非標識抗体を、 標識され、そして本発明の抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチド を認識する他の抗体（第二抗体）と共に、使用することがてきる。例えば、抗− ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドの定常領域に特異的な標識抗体 を、サンプルに結合した免疫グロブリン・ポリペプチドを検出するために使用す ることができる。

多種多様の標識、例えば、放射性核種、ホタル石（ｆｌυ０「Ｓ）、酵素、酵素 基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド（特にハブテン）、等を、使用するこ とができる。多くのタイプの免疫検定が利用でき、そして当業者によく知られて いる。

本発明の、抗−ＰＤＧＦレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチド、及びそれらの 断片は、生理学的試料中のＰＤＧＦレセプタの検出のための様々な免疫検定にお いて使用されることができる。このような免疫検定は、液相イムノアッセイ及び ウェスタン・プロット検定、競合的及び非競合的蛋白結合検定、酵素−結合イム ノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）　、一般的に使用され、そして科学的及び特許 の刊行物において広く記載されている他のもの、並びに商業的に使用される多く のものを、含むことができる。

このような免疫グロブリン及びペプチドは、同様に、本分野においてよく知られ た方法により、免疫組織化学的染色技術において、使用されることができる。

以下の例を、限定ではなく、例示により、提供する。

実施例 材料 ＰＤＧＦ　ＢＢをＡｍｇｅｎから購入した。抗−ホスホチロシン・モノクロナー ル抗体（ＭＡｂ）　ＰＹ２０を、［Ｃ［から購入した。ＤＭＥＭ、　ＲＰＭ［１ ６４０、Ｆ１２、ウシ血清、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、Ｇ４１８− ネオマイシン、２００ｍＭグルタミン、ＩＭ　ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウ ム（ｌ１ｍｇ／ｍｌ）　、及びリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）を、Ｇ ｒＢＣＯから入手した。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びモノクロナール抗体サブタ イピング・キットは、Ｈｙｃｌｏｎｅからのものであった。Ｔｒｉｓ、リン酸ナ トリウム、硼酸ナトリウム、酢酸、ピロリン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、 ジチオトレオトール（ＤＤＴ）　、エチレン・ジアミン・テトラ酢酸（ＥＤＴＡ ）、ＥＧＴＡ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、ナトリウム・オルトバナ デート、塩化ナトリウム（ＮａＣ１）、クエン酸、フェニル・メチル・スルホニ ル・フルオリド（ＰＭＳＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、Ｔｒｉｔｏｎ 　Ｘ１００　、　Ｔｗｅｅｎ　２０．２．２’アジノーｂｉｓ（３−−１−チル ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、及び過酸化水素は、Ｓｉｇ ｍａからのものであった。ヤギ抗−マウス・ペルオキシダーゼ及びヒボキサンチ ン−チアミン（ＨＴ）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍがらのもの であった。ゼラチン、非染色蛋白分子量マーカー及びニトロセルロースは、Ｂｉ ｏＲａｄからのものであった。前染色高分子量蛋白マーカーは、ＢＲＬからのも のであった。プロティンＡセファロースＣＬ４Ｂ、プロティンＧセファ０−スＣ Ｌ４Ｂ、　［ｍｍｕｎｏｐｕｒｅＴＭ結合バッファー、Ｆ（ａｂｏ）を及びＦａ ｂ調製キットは、Ｐｉｅｒｃｅからのものであった。前包装ＰＤＩＯカラムは、 Ｐｈａｒｍａｃｉａからのものであった。１２５Ｉ−プロティンＡ及び１４Ｃ− 分子量マーカーは、Ａｍｅｒｓｈａｍからのものであった。Ｉｔｓ　ｌ−ショー ト−Ｂａｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ ａｒがらのものであった。メタノールは、Ｂｕｒｄｉｃｋ−Ｊａｃｋｓｏｎがら のものであった。組織培養供給物は、Ｃｏ５ｔａｒからのものてあった。ＡＧ０ １５２３Ｂ細胞は、ＡＴＣＣから得た。ＨＲ５細胞は、Ｊ、　Ａ、ε５ｃｏｂｅ ｄｏ（ＵＣＳＦ）により好意的に提供された。初期のヒヒ腕動脈平滑筋細胞は、 Ｊ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＳ、　）ｔａｎｓｏｎ　（Ｅｍｏｒｙ　ｔｌｎｉｖ 、）により、親切に提供された。

互迭 細胞培養。ＮｒＨ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎児血清、ＩＸペニシリン−ストレ プトマイシン、２ｍＭグルタミン、及びピルビン酸ナトリウム（０，１１ｍｇ／ ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中で、定例的に維持した。細胞外ドメイン（ＰΔ１−５） 又は完全長ＰＤＧＦベータ・レセプタ（ＨＲ５）を表示するＣＨＯ細胞を、１０ ％ＦＣ３、ＩＸペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、ピルビン 酸ナトリウム（０，１１ｍｇ／ｍｌ）及びＧ４１８（２００μｇ／ｍｌ）を含む ＲＰＭＩ中で培養した。ヒト包皮繊維芽細胞（ＡＧ０１５２３Ｂ）を、１ｏ％Ｐ ＣＳ　ＳＩＸペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、及びピルビ ン酸ナトリウム（０，ｌ１ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。モノクロ ナール・ハイブリドーマ細胞を、２ｏ％ＦＣ３、ＩＸペニシリン−ストレプトマ イシン、２ｍＭグルタミン、ピルビン酸ナトリウム（０，１ｍｇ／ｍｌ）、ＩＸ 　ＨＴ　、及び１０％マクロ７フージーならし培地を含む５０：５０　ＤＭＥ： ＲＰＭＩ中で維持した。

切り詰められたヒトＰＤＧＦベータ・レセプター発現細胞系の構築。

ヒトＰＤＧＦベータ・レセプタｃＤＮＡの切り詰めを、オリゴヌクレオチド−特 異的欠失突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　 ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、行った。オリゴヌクレオ チド−特異的インビトロ突然変異誘発は、Ｋｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８７）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５４：３６７−３８２（これを、引 用により本明細書中に取り込む。）の修飾された方法に従って行われた。最初に 、ヒトＰＤＧＦベータ・レセプタのコーディング領域全体の３．９ｋｂ　Ｅｃｏ Ｒｒ−Ｈｉｎｄｒｒ［ｃＤＮＡ断片（残基−３２〜４９９）を、ｍ１３ｍｐ１８ 産生ベクターｍｐ１８ＰＲのＥｃｏＲＥとＨｉｎｄｌＩＩ　との中ｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　（これを、引用により本明細書中に取り込 む。））。

オリゴヌクレオチドを、アミノ酸４９９−１０７４（ＰＲΔ１：　ＧＴＧ　ＴＧ Ａ　ＧＧＡＡＣＧ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＣ ＣＣＣＧＡＣ）、又はアミノ酸３８４−＋０７４（ＰＲΔ２；　ＧＧＡ　ＡＧＧ 　ＴＣＧ　ＡＴＧ　ＴＣＴ　ＡＧＴ　ＴＡＡ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＣ ＣＣＣＧＡＣ）をコードしているヒトＰＤＧＦベータ・レセプタｃＤＮＡの部分 を欠失させるために設計した（図１）。終止コドンを、残基４９９（ＰＲΔｌ） 又は残基３８４（ＰＲΔ２）の後に導入した。サブクローニングの正当化を、制 限酵素消化分析及びジデオキシ連鎖終止配列決定により行った（Ｓａｎｇｅｒ、 　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４：５４６３−５４６７、　（これを、引用により本明 細書中に取り込む。））。

修飾されたＰＤＧＦベータ・レセプタ・ポリペプチドを、発現ベクターＰＢＪＩ 　（Ｌｉｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｔ、　（１９９０）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９： 　６７７−６７９．（これを、引用により本明細書中に取り込む。））のＥｃｏ ＲＥとＨｉｎｄ［ＩＩとの中にサブクローン化し、ベクターｐＳＶ２Ｎｅｏ（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ。

Ｐ、　（１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　１：３２７−３ ４１　（これを、引用により本明細書中に取り込む。））と共に、１：１０の比 において、Ｃ）１０−Ｋｌ細胞中に、リポフエクチン試薬取り込み（ｌｉｐｏｆ ｅｃｔｉｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｕｐｔａｋｅ））により、共同トランスフェクト した。トランスフェクトされた細胞を、Ｇ４１８−ネオマイシン耐性について選 択し、そして個々のクローンを、単離し、そして血清不含培地中の細胞外ＰＤＧ Ｆベータ・レセプタの高レベル発現のための等しい細胞密度において、スクリー ニングした。修飾された細胞外ＰＤＧＦベータ・レセプタ蛋白の発現を、ヒトＰ ＤＧＦレセプタ残基５１−６８　ｉ：基づく合成ペプチド（ＳＶＬＴＬＴＮＬＴ ＧＬＤＴＧＥＹＦＣ配列番号３）に対して作られたウサギ・ポリクロナール血清 （Ａｂ　ｌ−３−５、図１を参照のこと。）を使用して、ウェスタン・プロット 検定により、測定した。組換えクローンｐΔ１−５（完全長細胞外ＰＤＧＦレセ プタを発現するもの）及びｐΔ２−７（細胞外ＰＤＧＦレセプタのドメイン１− ４を発現するもの）を、その後の蛋白製造のために使用した。

ヒトＰＤＧＦベータ・レセプタに対するＭＡｂｓの調製。抗体を、Ｈａｒ　ｌｏ ｗａｎｄ　Ｌａｎｅ　（１９８８）、［ｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、（こ れを、引用により本明細書中に取り込む。）により記載されているように、開発 した。マウスを、ＰＤＧＦベータ・レセプタ（ｐΔ１−５）の部分的に精製され た細胞外ドメインにより、５０−１００μｇ／免疫注射を使用して、免疫化した 。免疫化マウス中の抗体の力価を、以下のように、酵素−結合イムノソルベント 検定（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。９６−ｗｅｔｌｌ　１ｍｍｕｎｏｌｏ ｎ　ｒ［？イクロタイター・プレートを、ＰＤＧＦベータ・レセプタの部分精製 （１０−，１５％）細胞外ドメイン（２００−３００μｇ／ｗｅｌｌ）＋：より 、４度において一夜被覆した。残りの操作を、室温において行った。

このｗｅｌｌを、１００ｍＭ　ＮａＣ１及び０．５％ゼラチンを含む０．０５Ｍ 　’ｒｒｉｓ、　ｐＨ７により、１時間ブロッックした。プレートを、各種希釈 のマウス血清により２時間インキュベートし、洗浄バッファー（０，０５Ｍ　Ｔ ｒｉｓ、　ｐＨ７、１００ｍＭ　ＮａＣ１及び０．３％ゼラチン）により５回洗 浄し、ヤギ抗−マウス・ペルオキシダーゼ（洗浄バッファー中１＋１０００）と 共に１時間インキュベートした。プレートを、先に記載したように洗浄し、そし て過酸化水素（最終濃度０．００３％）を含む、０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍリ ン酸ナトリウム２塩基、ｐＨ４中の２．２−アジノーｂｉｓ（３エチルベンズチ アゾリン）６−スルホン酸（ＡＢＴＳ　、　１ｍｇ／ｍｌ）により、顕色させた 。６５０μｍにおける吸光度を測定し、そしてその値を、ｐＢＪベクター単独に よりトランスフェクトされたＣ）（Ｏ細胞からのならし培地から類似の程度まで 精製された蛋白により得られた値と比較した。

高い反応性を示すマウスを、殺し、そしてその牌臓を単離した。

牌臓細胞を取り出し、そして先に記載したような骨髄腫細胞と融合した（ｈａｒ ｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、前掲畜牛）。ハイブリドーマを、同−ＥＬ［ＳＡを 使用してスクリーニングし、そして陽性ハイブリドーマを、クローン化し、そし て再スクリリーニングした。陽性モノクロナール抗体細胞を、培養し、そして腹 水（ａｓｃｉ　ｔｅｓ）を、記載されたＢａ１ｂ／Ｃマウス中で調製した（Ｈａ ｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、前掲畜牛）。組織培養基を、製造者による指示に 従ってＨｙＣＩｏｎｅからのサブタイピング・キットを使用してそのＭＡｂｓを サブ−タイプ（ｓｕｂ−ｔｙｐｅ）するために使用した。

抗体の精製。抗体を、以下のようにプロティンＡ　ＣＬＪＢ上で精製した。腹水 液を、［ｍｍｕｎｏｐｕｒｅ”結合バッファ　−（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１＝５希 釈し、そして同一バッファー中で平衡にしたプロティンＡ　ＣＬ４Ｂカラム上で クロマトグラフィーにかけた。通過物を、回収し、そしてそのカラムを、［ｍｍ ｕｎｏｐｕｒｅ結合バッファー（１０カラム容量）により洗浄した。この結合１ ｇＧ５を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２，８により溶出させ、そして中和剤として ２　Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨＩｔ（４０μｇ／ｍｌ）を入れたチューブ内に回収し た。ピーク蛋白画分を、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより検出し 、プールし、そしてＰＢＳ中で透析した（それぞれ４Ｌの２回交換）。

ＩＪＡｂ　２ＡＩＥ２　Ｆ（ａｂ’　Ｌ及びＦａｂ蛋自分解断片の調製。ＭＡｂ 　２ＡＩＥ２のＦ（ａｂ’）を断片を、製造者の指示に従ってＩｍｍｕｎｏｐｕ ｒｅ　Ｆ（ａｂ’）　！調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して無傷ＭＡｂから 調製した。モノクロナール抗体２ＡＩＥ２を、ｐＨ４，２において３７°Ｃにお いて４時間、固定化ペプシンと共にインキュベートし、そして非解裂１ｇＧ及び Ｆｃ断片を、プロティンＡセファロースＣＬ４Ｂを使用してＦ（ａｂ’）　２　 断片から分離した。

Ｆａｂ断片を、同様に、Ｐｉｅｒｃｅ　［ｍｍｕｎｏｐｕｒｅ　Ｆａｂ調製キッ トを使用して調製した。このＩｇＧを、３７°ＣにおいてｐＨ７で５時間、固定 化パパインと共にインキュベートし、そして未消化１ｇＧ及びＦｃ断片を、プロ ティンＡを使用して除去した。サンプルを、酵素消化後５Ｏ３−ＰＡＧＥにより 分析し、そしてＰＤＧＦベータ・レセプタＥＬＩＳＡを、たとえあるにしでも、 抗原認識の損失について測定するために使用した。

免疫沈降検定。免疫沈降検定を、Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｓ、Ｗ、　（１９８１）、　 Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７３：　４４２−４７１　（これを、引用によ り本明細書中に取り込む。

）の手順の修正により行った。精製ｐΔｌ−５又はｐΔ２−７を使用するとき、 蛋白を、室温において２時間か又は４°Ｃにおいて１２時間かのいずれかで、免 疫沈降（ＩＰ）バッフｙ−（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，１００＋ｎＭＮａ Ｃ１，ｌ０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ＩｍＭ　ＥＧＴＡ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１０ ０）中で、ＭＡｂとインキュベートした。完全長レセプタを免疫沈降させる場合 、その時、ＰＤＧＦベータ・レセプタ表現細胞は、ｌμＭナトリウム・オルトバ ナデート及び１ｍＭ　ＰＭＳＦを含むＩＰバッファー中で可溶化され、そして４ °Ｃにおいて８−１２時間、ＭＡｂとインキュベートされた。次に、サンプルを 、プロティンＡ−セファロースＣＬ４ＢとプロティンＧ−セファロースＣＬ４Ｂ と（７）に１混合物（７）５０％スラリー（５０−１００μｌ　／サンプル）と 共にインキュベートした。４℃において１−２時間後、樹脂を、３サイクルの遠 心分離により洗浄し、そしいてＩＰバッファー中に再懸濁させ、そして最終的に 、その樹脂を、Ｌａｅｍｍｌ　ｉサンプル可溶化バラ−中で煮沸した（５０−１ ００　ｕ　ｌ　／サンプルＸ１９７０．　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８ ５（これを、引用により本明細書中に取り込む。）。サンプルを、７％又は１０ ％Ｌａｅｍｍｌ　ｉゲル上て５ＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして次に、ニトロセル ロースに移した。ウェスタン・プロットを、ブロッキング・バッファー（０，５ ％ＮａＣｌ及び４％ＢＳＡを含む０．０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８）中でブロ ックし、そして４°Ｃにおいて１２時間、−次抗体と共にインキュベートした。

このニトロセルロースを、ブロッキング・バッファーにより洗浄し、そして＋１ １８１−プロティンＡ（０，４ｍＣ１／ｍｌ）と、室温において１−２時間イン キュベートし、そしてＸ−線に露出させた。

込む。））により記載されているようなりｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ手順の修正 によりヨウ素化した。簡単に言えば、１２６１−ショートＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎ ｔｅｒ試薬（１ｍＣ１）を、窒素下で乾燥させた。次に、ＰＤＧＦ　ＢＢ（２， ５ｕｇ）を、１０μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８，５）中４°Ｃにお いて１５分間、１２′！−ショートＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬に添加した 。この試薬混合物を、５００μｌの０．１Ｍホウ酸すトリウム、０．２Ｍグリシ ン、ｐＨ８，５により、４°Ｃにおいて１０分間、クエンチした。この材料を、 １ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含む０．３Ｍ酢酸により前もって平衡としたＰＤＩＯカ ラム上のゲル濾過クロマトグラフィーに供した。ピーク放射標識蛋白画分を、ガ ンマ・カウンターを使用して検出した。典型的には、ヨウ素化ＰＤＧＦ　ＢＢの 比活性は、５００００カウント／ｎｇであった。

無傷ＨＲ５細胞への”’　１−ＰＤＧＰ　ＢＢの結合。ＨＲ５細胞を、２ｍＭ　 ＥＤＴＡを含むＰＢＳにより、３７°Ｃにおいて２０分間、収穫した。洗浄ＨＲ ５細胞（１ｘ　１０　＠細胞／１００μりを、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の ＭＡｂ（又はＦ（ａｂ’）を又はＦａｂ断片）の各種濃度をもつ懸濁液中で、３ 連て、３０分間室温においてインキュベートした。ＨＲ５細胞を、１００倍過剰 の非標識ＰＤＧＦ　ＢＢ及び担体蛋白（血小板貧弱血漿、５０μｌ）の非存在中 （全結合）又は存在中（非特異的結合）において”’　１−ＰＤＧＦ　ＢＢ（約 １ｎｇ／チューブ）と、室温において４５分間、インキュベートした。

インキュベーションの最終容量は、５００μｌてあった。このインキュベーショ ン混合物（４００μｌ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（７００μＩ　）上に層 化し、そして遠心分離した。その上澄液を、除去し、そして細胞ペレット中の放 射能を測定した。

リン酸化検定。ＨＲ５細胞を、６−ｗｅｌ１皿内で集密まで増殖させ、そして− 次細胞を、１００ｍｍ皿内で培養した。細胞を、冷血清不含ＤＭＥＭにより２回 洗浄し、そして１０分間氷上でインキュベートした。細胞を、回転振とう機上で 氷上で３０−４５分間、ＭＡｂ　２ＡＩＥ２と２連で、前インキュベートし、そ して次に、リガンドＰＤＧＰ　ＢＢを、そのｗｅｌｌに添加し、そしてインキュ ベーションを、１．５−２時間続けた。細胞を冷ＰＢＳにより２回洗浄し、そし て溶菌バッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８、３０ｍＭビロリン酸ナト リウム、５０ｍＭ　フッ化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＥＧＴＡ、　 Ｉ％ＳＤＳ、　ｌ００ｍＭ　ＤＴＴ）、又はＩＰバッファーであって両者が１ｍ Ｍ　ＰＭＳＦ及びｌμＭオルトバナデートを含むもののいずれかにおいて、可溶 化した。次に、サンプルを、電気泳動に先立ってさらに加工した。

ヒト包皮繊維芽ＡＧ０１５２３Ｂ細胞及びヒヒ平滑筋細胞における有糸分裂誘発 。ヒト包皮繊維芽ＡＧ０１５２３Ｂ細胞及びヒヒ平滑筋細胞を、９６−Ｗｅｌ１ 皿内で集密まで増殖させた。ヒヒ平滑筋細胞を、０．５％ウシ血清を含むＤＭＥ Ｍと一夜インキユベートすることにより、静止させた。次に、細胞を、ＰＤＧＦ 　ＢＢの存在中３７°Ｃにおいて１８時間、その後３７℃において５時間、２μ Ｃｉ／ｗｅｌｌの８Ｈ−チミジンと共に、様々な濃度のＭＡｂ　２ＡＩ２２と共 に３連てインキュベートした。対照ヒヒ初期平滑筋細胞を、非特異的ＭＡｂと共 に並行してインキュベートし、そして対照ＡＧ０１５２３Ｂ細胞を、非阻害性抗 −ＰＤＧＦベータ・レセプタＭＡｂ（４Ｃ５Ｃ８）と共にインキュベートした。

次に、Ｗｅｌｌを、氷冷５％ＴＣＡ（２ｘ　２５０μｌ）により洗浄し、そして ０゜２５　Ｎ　ＮａＯＨ（２ｘ　Ｉ００μｌ　）により可溶化した。この可溶化 サンプルを、シンチレーション・バイアルに移し、そして放射能を測定した。

ダイマー化検定。集密ＨＲ５細胞を、１００ｍｍ皿内で先に記載したように培養 した。細胞を、冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＢＳＡ（１，５ｍｇ／ｍｌ）及 び２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含むＰＢＳ中の各種濃度のＭＡｂ　２ＡＩＥ２と共に ４°Ｃにおいて１時間、インキュベートした。ＰＤＧＦ　ＢＢを、細胞に添加し 、そしてインキュベーションを、４°Ｃにおいて２時間続けた。細胞を、冷ＰＢ Ｓ中で２回洗浄し、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含むＰＢＳ中の架橋剤ＢＳ”　（０ ，７５ｍｇ／プレート）と共に４℃において３０分間、インキュベートした。こ の反応を、クエンチ・バッファー（１５０ｍμＮａＣ１を含む０．０２５　Ｍ　 Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４：　１０ｍ１／プレート）中の希釈により終了させた。

細胞を、１ｍ１Ｊ　ＰＩＪＳＦ及び１００μＭナトリウム・オルトバナデートを 含むＩＰバッファー（０，５ｍｌ／プレート）中で４°Ｃにおいて２０分間、抽 出した。細胞溶解物を、ポリクロナール抗ヒト・ベータ・レセプタＡｂ（ＡＢ８ ８　、１：５００希釈）を使用して４°Ｃにおいて一夜免疫沈降させた。

次に、プロティンＡ　Ｃ１４Ｂ（６０μｍの５０％スラリー）を、それぞれのサ ンプルに添加した。４°Ｃにおいて１時間後、ビーズを、逐次、０゜５％ＮＰ４ ００を含むＰＢＳ　、０．５％ＮＰ４０を含む０．５Ｍ塩化リチウム、０．５Ｍ 塩化リチウム、そして最後に、水により、洗浄した。サンプルを、Ｌａｅｍｍｌ 　ｉサンモル可溶化バッファーにより可溶化し、そして３％−８％グラジェント ・ゲル上のＳＯ３−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、その後の、ニトロセル ロースへのウェスタン転移に供した。ウェスタン・プロットを、抗ホスホチロシ ンＭＡｂ（１：１０００）又はＡｂ８８（１：５００希釈）のいずれかと、４° Ｃにおいて一夜、その後、Ｉｔｓ　ｌ−プロティンＡ（０，１５μＣｉ／ｍｌ） と、室温において２時間、インキュベートした。

次に、ウェスタン・プロットをＸ−線フィルムに露出させた。

結果 ＭＡｂ　２ＡＩＥ２の性質。ＭＡｂ　２ＡＩＥ２は、ＩｇＧ　＋モノクロナール 抗体である。ウェスタン分析は、ＭＡｂ　２ＡＩＥ２が、非−還元ヒトＰＤＧＦ ベータ・レセプタ（図２、パネルＡ、レーン４）を認識するが、還元蛋白（図２ 、パネルＡル−ン１）を認識しないことを示している。ＭＡｂ　２Ａ１１１ｉ２ は、溶液から完全長の細胞外レセプタ（ｐΔｌ−５；残基１−４９９）を免疫沈 降させる（図２、パネルＣ、レーン３）。しかしながら、精製Δ２−７（ドメイ ン５を除く：残基１−３８４）が抗原であるとき、反応性は全くない（図２、パ ネルＢ、レーン２）。このデータは、ＭＡｂ　２Ａ１ε２により認識されるエピ トープが第５　（ｇ一様ドメイン内に、すなわち、ヒトＰＤＧＦベータ・レセプ タの残基３８５−４９９間にあることを示している。

ＭＡｂ　２ＡＩＢ２によるＨＲ５細胞への”　Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢ結合の投与量 −依存性阻害。ＨＲ５細胞（完全長ヒトＰＤＧＦベータ・レセプタを発現するＣ ｌ０−に細胞）が最初にＭＡｂ　２ＡＩＥ２と、その後”’　Ｉ−ＰＤＧＦ　Ｂ Ｂとインキュベートされるとき、有意（４８，１％）な阻害が、ＭＡｂ　２ＡＩ Ｅ２により処理されていない細胞と比べて、０．１ＨＭ　ＭＡｂと同程度に低い 濃度にあることが観察される。１ＨＭ以上の濃度のＭＡｂ　２ＡＩＥ２を使用す るとき、その細胞上の完全長ＰＤＧＰベータ・レセプタへのリガンド結合の１０ ０％阻害が在る（図３、パネルＡ）。ＰＤＧＦベータ・レセプタに対する２００ ｎＭの異なる、非阻害性ＭＡｂ（４Ｃ５Ｃ８）を前インキュベーションにおいて 使用するとき、阻害の量は、はんの３６．１％である。これは、２゜ＯｎＭの非 関連ＭＡｂ（抗−１１ｂ／ＩＩ［ａ）の効果に匹敵する（１９．１８％阻害）。

ｌｎＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２の存在中の”’　１−ＰＤＧＰ　ＢＢ結合の量は、 非標識ＰＤＧＦＢＢの１５００倍過剰の存在中に見られるリガンド結合の量に（ 図３、パネルＡ）、又はヒトＰＤＧＦレセプタを発現しない非トランスフェクト ＣＨＯ細胞へのリガンドの結合量に（データを示さず。）、等しい。

ＭＡｂ　２ＡＩＥ２により見られる阻害が立体障害によるものであるがどうかを 決定するために、我々は、ＭＡｂのＦ（ａｂ’）＊及びＦａｂ断片を調製した。

この抗体のこれらの蛋白分解断片は、εＬＩＳＡにおけるＰＤＧＦベータ・レセ プタを未だに認識する（データを示さず。）。但し、それらの活性は、僅かに減 少されていた。これを、放射標識リガンド結合検定において使用するとき、我々 は、その抗体断片が、濃度に依存してＨＲ５細胞上の完全長ＰＤＧＦベータ・レ セプタへの”’　Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢの結合を未だ阻害することを見つけた（図 ３、パネルＢ）。しかしながら、完全な阻害が、１０ｎＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２ のＦ（ａｂ’）　！又はＦａｂ断片により見られ、一方、１ＨＭ無傷抗体は、完 全に、結合を阻害した。ＩｎＭ　Ｆ（ａｂ’）　ｔ　断片の存在中のリガンドの 結合は、６４．５％程阻害され、１ＨＭ　Ｆａｂ断片の存在中の結合は、５０％ ０％程阻害た。

ＭＡｂ　２ＡＩＥ２によるリン酸化の阻害。図４中に示すように、ＭＡｂ　２Ａ ＩＥ２は、濃度に依存して、ＨＲ５細胞におけるＰＤＧＦ誘導リン酸化を特異的 に阻害し、約５０％の阻害が１．３ＨＭの濃度において生じ（レーン４）、そし て１００％の阻害が１３．３　ｎＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２において生じている（ レーン５）。対照の非関連ＭＡｂ（抗−１１ｂ／ｌ１ｌａ）は、効果な無く（レ ーン３）、そしてＭＡｂ　４Ｃ５Ｃ８であってこれもヒトＰＤＧＦベータ・レセ プタに対して開発されたが異なるエピトープを認識するものは、リガンド−誘導 リン酸化に対する効果を全くもっていなかった（レーン８）。

ヒトＰＤＧＰベータ・レセプタのＰＤＧＦ　ＢＢ誘導ダイマー化に対するＭＡｂ 　２ＡＩＥ２の効果。ＰＤＧＦ　ＢＢによるＨＲ５細胞の処理は、ＰＤＧＦベー タ・レセプタの、リガンド−仲介リン酸化（図５、レーン１−６中の１８０ＫＤ ａ）及びダイマー化（図５、レーン２及び６中の３９０ＫＤａ）をもたらした。

ＨＲ５細胞を、ＭＡｂ　２ＡＩＥ２と最初の前インキュベートし、そして次に、 ＰＤＧＦ　ＢＢとインキュベートするとき、ダイマー化は、テスト濃度のすへて において阻害された（図５、レーン３．４及び５）。

このデータは、レセプタ上のＭＡｂ　２ＡＩＥ２の結合かりガント結合及びレセ プタ・ダイマー化を排除することを示している。

ＭＡｂ　２ＡＩＥ２による有糸分裂誘発の阻害。図６中に示すように、ＭＡｂ　 ２ＡＩＥ２は、濃度に依存して、ヒト包皮繊維芽ＡＧ０１５２３Ｂ細胞における ＰＤＧＦ　ＢＢ−誘導有糸分裂誘発を阻害し、最大阻害（６９，５５％）は、１ ．３μＭの濃度において生じる。非−阻害性ＭＡｂ　、４Ｃ５Ｃ８を使用したと き、我々は、有糸分裂誘発の存意な阻害を検出しなかった。ＭＡｂ　２ＡＩＥ２ の濃度の増加は、阻害の程度を改善しなかった。主な理由は、これらの細胞が、 ２ＡＩＥ２により結合又は阻害されないＰＤＧＦアルファ・レセプタ（データを 示さず。）をも発現するからである。

また、我々は、ヒヒ動脈からの初期平滑筋細胞に対する様々な濃度のＭＡｂ　２ ＡＩＥ２の効果について測定した。ヒヒ平滑筋細胞におけるＰＤＧＦ　８Ｂ−仲 介ＰＤＧＦレセプタ・リン酸化は、２００ｎＭ及び２０ｎＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ ２により阻害された（それぞれ、図７中、レーン４及び５）。

図８中に見られるように、１ＨＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２は、１１−２ｎ／ｍｌの ＰＤＧＦの存在中の１Ｈ−チミジンの取り込みを、９０％程、阻害し、そして２ ５ｎＭＭＡｂは、１１−１Ｏｎ／ｍｌからのリガンドの濃度範囲において、８０ ％程、有糸分裂誘発を阻害する。２５０ｎＭを超える濃度のＭＡｂ　２ＡＩＥ２ は、リガンドのすべてのテスト濃度において９０％程、有糸分裂誘発を阻害する 。非関連ＭＡｂｓを使用するとき、ヒヒ平滑筋細胞における有糸分裂誘発の有意 な効果は全くなかった。

要約すると、我々は、ヒトＰＤＧＦベータ・レセプタに高く特異的であるモノク ロナール抗体、ＭＡｂ　２Ａ１ε２を開示した。ＭＡｂ　２ＡＩＥ２は、ナノモ ル濃度においてヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセプタへのＰＤＧＦの結合を阻害し、 そしてそれ故、リガンド−仲介リン酸化及びダイマー化の阻害により示されるよ うなレセプタの活性化を阻害する。この抗体は、マイクロモルの濃度においてイ ンビトロにおける有糸分裂誘発を阻害する。本ＭＡｂの蛋白分解断片は、”’　 ｒ−ＰＤＧＦ　ＢＢ結合の阻害により測定されるように、阻害作用を保持してい る（図３Ａ）。ＭＡｂ　２ＡＩＥ２は、ＰＤＧＦベータ・レセプタの第５１ｇ一 様ドメイン内のエピトープを認識するよってあり（図２）、そしてこのドメイン への結合は、このレセプタのダイマー化を防ぐようである（図５）。１．３ｎＭ ＭＡｂ　２ＡＩＥ２と同程度に低い濃度において、ＰＤＧＦベータ・レセプタの りガント−誘導自動リン酸化の特異的且つ有意な阻害が在る（図４）。

結果として、我々は、０．１ｇＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２においてＨＲ５細胞にお けるＰＤＧＦ誘導有糸分裂誘発の完全な阻害を見つけ（データを示さず。

）、そしてヒト包皮繊維芽細胞（ＡＧＯ１５２３Ｂ）において、７０％阻害が、 ｌμＭ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２濃度において達成される。

また、ＭＡｂ　２ＡＩＥ２を、ヒヒ腕動脈からの平滑筋細胞との交差反応につい てテストした。ＰＤＧＦ　ＢＢ−誘導リン酸化（図７）及び有糸分裂誘発（図８ ）は、２２０−２５ｎ　ＭＡｂ　２ＡＩＥ２により８０％まで阻害された。モノ クロナール抗体２ＡＩＥ２は、イヌ、ウサギ、マウス、又はブタからあのＰＤＧ Ｆレセプタと交差反応せず、そしてまた、ヒト・アルファ型ＰＤＧＦレセプタと 交差反応しない（データを示さず。）。

特に興味のあるのは、我々が、ＭＡｂ　２ＡＩＥ２がＰＤＧＦベータ型レセプタ の第５１ｇ一様ドメインに結合し、そしてそれ故、ＰＤＧＦ−仲介活性を阻害す るということを証明したと同時に、ＰＤＧＦが第３１ｇ一様ドメインに結合する ということである。

これまでの記載は、例示的なものであって、限定的なものではないことを理解す べきである。先の記載をレビューする間、多くの態様が当業者にとって明らかと なるであろう。それ故、本発明の範囲は、先の記載を参照により決定されるへき てはなく、代わりに、添付の請求の範囲を参照して、このような請求の範囲が権 利をもつ等価な範囲の全体を伴って、決定されるへきである。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：　Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ、　ＶａｎｉｔｈａＥｓｃｏｂｅｄ ｏ、　Ｍａｒｉａ　Ａ。

Ｆｒｅｔｔｏ、　Ｌａｒｒｙ　Ｊ。

（ｉｉ）発明の名称：ヒトＰＤＧＦベータ・レセプタに対する阻害性免疫グロブ リン・ポリペプチド （ｉｉｉ）配列数：３ （ｉｖ）通信先： （Ａ）番地：　Ｔｏｗｎｓｅｎｄ　ａｎｄ　Ｔｏｗｎｓｅｎｄ（Ｂ）ストリート ：　Ｏｎｅ　Ｍａｒｋｅｔ　Ｐｌａｚａ、　５ｔｅｕａｒｔ　Ｔｏｗｅｒ、５ｕ ｉｔｅ（Ｃ）市：　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃ。

（Ｄ）州：　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ （Ｅ）国：　ＵＳＡ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　＋９４１０５（Ｖ）コンピューター読込媒体： （Ａ）媒体形式：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換性（Ｃ）オペレーティングシステム：Ｐ Ｃ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔｒｎ　Ｒｅ１ｅ ａｓｅ　＃１．Ｏ，ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２（ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願データ： （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝３６塩基対 ＣＢ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号２： ＧＧＡＡＧＧＴＣＧＡ　ＴＧＴＣＴＡＧＴＴＡ　ＡＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣ ＣＣ（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８アミノ酸 （Ｂ）配列の盟二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号３： ３６　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇ１１　５　１０　１！ Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ ＦＩＧ　２Ａ。

ＦＩＧ　３Ａ。

ＦＩＧ　４ ＦＩＧ　５ ＭＡｂＪ度（ｕＭ） ＦＩＧ、６ ＰＤＧＦ　ＢＢ　（ｎｇ／ｍＬ） ＦＩＧ　Ｂ。

６戦　７ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　９２８２−４Ｂ２１１０８　９１６１−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、ＮＩＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。

、　ＮＺ、ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＡ、　ＵＳＩ （７２）発明者　エスコベド、マリア　ニー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１１７゜サンフランシスコ、＃３．アッ パーテラス（７２）発明者　フレット、ラリ−ジェイ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４００２゜ベルモント、ニスコンデイド　 ウェイ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト・ベータ型血小板誘導成長因子レセプタ（βＰＤＧＦ−Ｒ）の第５Ｉｇ −様ドメインに特異的に結合する実質的に精製された免疫グロブリン・ポリペプ チドであって、そのポリペプチドの結合が、以下の効果： ｉ）βＰＤＧＦ−ＲへのＰＤＧＦＢＢ又はＡＢ結合の阻害；ｉｉ）ＰＤＧＦ−誘 導βＰＤＧＦ−Ｒリン酸化の阻害；ｉｉｉ）βＰＤＧＦ−ＲのＰＤＧＦ−誘導ダ イマー化の阻害；ｉｖ）ヒトβＰＤＧＦ−Ｒ表示細胞のＰＤＧＦ−誘導有糸分裂 誘発の阻害；及び、 ｖ）βＰＤＧＦ−Ｒ表示細胞のＰＤＧＦ−誘導化学走性及び転移の阻害、の中の １以上をもつようなポリペプチド。
2. ２．ポリペプチドがモノクロナール抗体である、請求項１に記載の免疫グロブリ ン・ポリペプチド。
3. ３．モノクロナール抗体が２ＡｌＥ２抗体である、請求項２に記載の免疫グロブ リン・ポリペプチド。
4. ４．請求項１に記載の免疫グロブリン・ポリペプチドの相補性決定領域の配列に 実質的に同じアミノ酸配列をもつ実質的に精製されたポリペプチド。
5. ５．ポリペプチドが検出可能な標識に結合している、請求項１に記載の免疫グロ ブリン・ポリペプチド。
6. ６．ポリペプチドがキメラである、請求項１に記載の免疫グロブリン・ポリペプ チド。
7. ７．ヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセプタのアミノ酸残基３８５−４９９の間に横た わるエピトープを特異的に認識する実質的に精製された免疫グロブリン・ポリペ プチド。
8. ８．ヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセプタに結合するモノクロナール抗体又はそれら の結合断片であってそのレセプタヘのＰＤＧＦＢＢ又はＡＢのインビボにおける 結合を阻害するような抗体又は断片を含んで成る組成物。
9. ９．免疫グロブリン・ポリペプチド又はそれらの結合断片をコードしている核酸 に実質的に同じ配列をもつ単離された核酸であって、そのヒト・ベータ型血小板 −誘導成長因子レセプタ（βＰＤＧＦ−Ｒ）の第５Ｉｇ−様ドメインヘのそのポ リペプチド又は断片の結合が、以下の効果： ｉ）そのレセプタヘのＰＤＧＦＢＢ又はＡＢ結合の阻害：ｉｉ）ＰＤＧＦ−誘導 βＰＤＧＦ−Ｒリン酸化の阻害：ｉｉｉ）βＰＤＧＦ−ＲのＰＤＧＦ−誘導ダイ マー化の阻害；ｉｖ）ヒトβＰＤＧＦ−Ｒ表示細胞のＰＤＧＦ−誘導有糸分裂誘 発の阻害；及び、 ｖ）ＰＤＧＦ−誘導化学走性及び転移の阻害、の中の１以上をもつような核酸。
10. １０．核酸がプロモーターに作用可能な状態で結合されている、請求項９に記載 の核酸。
11. １１．プロモーター及び核酸が発現ベクター内に含まれている、請求項１０に記 載の核酸。
12. １２．請求項９に記載の核酸によりトランスフェクト、形質転換、又は感染され た、細胞系。
13. １３．ヒト・ベータ型ＰＤＧＦレセプタ（βＰＤＧＦ−Ｒ）の第５Ｉｇ−様ドメ インに特異的に結合する、実質的の精製された免疫グロブリン・ポリペプチド又 はそれらの結合断片の製造方法であって、そのβＰＤＧＦ−Ｒへのその免疫グロ ブリン・ポリペプチドの結合が、以下の群：そのレセプタヘのＰＤＧＦＢＢ又は ＡＢ結合の阻害；ＰＤＧＦ−誘導βＰＤＧＦ−Ｒリン酸化の阻害；ＰＤＧＦ−誘 導βＰＤＧＦ−Ｒダイマー化の阻害；及び、ヒトβＰＤＧＦ−Ｒ表示細胞のＰＤ ＧＦ−誘導有糸分裂誘発の阻害；並びに、ヒトβＰＤＧＦ表示細胞のＰＤＧＦ− 誘導化学走性及び転移の阻害、から選ばれた１以上の効果をもち；以下の： ｉ）その免疫グロブリン・ポリペプチドをエンコードしている核酸を含んで成る 細胞系を増殖させ； ｉｉ）その免疫グロブリン・ポリペプチドを収穫すること、を含んで成るような 方法。
14. １４．細胞系がハイブリドーマである、請求項１３に記載の方法。
15. １５．ハイブロドーマがＡＴＣＣ番号ＨＢ１０９３８である、請求項１４に記載 の方法。
16. １６．免疫グロブリン・ポリペプチドがモノクロナール抗体である、請求項１３ に記載の方法。
17. １７．平滑筋細胞の増殖、転移又は化学走性に関連するＰＤＧＦ−仲介疾患をも つヒトの治療法であって、請求項１、７、及び８の中のいずれか１項から選ばれ た少なくとも１の免疫グロブリン・ポリペプチド、又はその免疫グロブリン・ポ リペプチドの断片の治療的有効投与量、並びに医薬として許容される担体を、そ の患者に投与することを含んで成るような治療法。
18. １８．ＡＴＣＣ番号ＨＢ１０９３８と命名された単離細胞。