KR20140043795A

KR20140043795A - 가용성 인테그린 α4 변이체

Info

Publication number: KR20140043795A
Application number: KR1020147001816A
Authority: KR
Inventors: 쓰토무 세이토; 시게유키 곤
Original assignee: 가부시키가이샤 멘에키세이부츠 켄큐죠; 가부시키가이샤 진 테크노 사이언스
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-28
Publication date: 2014-04-10
Also published as: JPWO2013001819A1; AU2012277185A1; US20140135483A1; EP2727937A4; WO2013001819A1; EP2727937A1; CA2840577A1; CN103619874A

Abstract

본 발명은, 인테그린 α4의 다양한 기능을 저해할 수 있는 신규 물질을 제공하는 것, 및/또는, 인테그린 α4 및 인테그린 α9의 양쪽을 저해할 수 있는 신규 물질을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은, 인간 인테그린 α4의 세포외 영역의 일부를 가지는 인테그린 α4 변이체 펩티드 등을 제공하는 것이며, 구체적으로는, 서열 번호 4∼9의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 등 및 이들 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

가용성 인테그린 α4 변이체{SOLUBLE INTEGRIN α4 MUTANT}

본 발명은, 인테그린 α4 및 인테그린 α9가 관여하는 질환의 치료 또는 예방 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 가용성 인테그린 α4 변이체에 의한, 인테그린 α4 및 인테그린 α9가 관여하는 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

인테그린(이하, "ITG"라고 함)은 α쇄와 β쇄가 1:1인 헤테로 2량체를 형성하는 세포막 관통 수용체 단백질이다. 인테그린 α4(이하, "ITG-α4"라고 함)는 주로 임파구나 종양 세포 상에 발현하고, 혈관 세포 접착 분자 1(VCAM1), 피브로넥틴(Fn), 접합부 접착 분자 2(JAM2), 점막 아드레신 세포 접착 분자 1(MAdCAM1), 인간 임파구 발현 메탈로프로테이나제 유사 디스인테그린 유사 시스테인 풍부 단백질 패밀리 멤버(MDC-L; 디스인테그린 및 메탈로인프로테이나제 28(ADAM28), 폰빌레브란트 인자(pp-vWF)나 오스테오폰틴(OPN) 등의 리간드와 접착하는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2). ITG-α4는 이들 리간드와 결합하고, 세포 접착, 이동(예를 들면, 임파구, 단구(單球), 호산구(好酸球)의 염증 부위로의 이동 등), 임파구의 호밍(homing) 등의 다양한 기능을 발휘하는 것으로 여겨지고 있다. 지금까지, ITG-α4가 암전이(비특허 문헌 3), 다발성 골수종(특허 문헌 1)이나 관절 류머티즘, 기관지염, 염증성 장질환, 크론병, 다발성 경화증 등의 염증성 질환(비특허 문헌 4), 급성 중추신경계 손상(특허 문헌 2), HIV(특허 문헌 3)에 관여하는 것으로 알려져 있고, 항ITG-α4 항체가 실험적 알레르기성 뇌척수염, 과민증, I형 당뇨병 등의 T세포 의존성 자가면역 질환 모델에서 일정한 효과를 얻을 수 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 마찬가지로, 항ITG-α4 항체가 알레르기성 폐렴, 면역 복합체 개재 폐장애, 급성 신독성 신염, 지연성 과민증에서 피부 경화와 피브린의 침착의 억제에 효과가 있어, 혈관 부착 심장(vascularized heart)의 동종 이식의 거부 반응을 억제하는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 1).

이와 같이 ITG-α4가 질환에 관여하므로, ITG-α4의 저해제를 의약으로서 이용하는 것에 대하여 기대되고 있다. 실제로, ITG-α4의 기능을 저해하는 물질로서, 항ITG-α4 항체, ITG-α4 안타고니스트(특허 문헌 4 등), ITG-α4 수용체 안타고니스트(특허 문헌 5 등)가 검토되고 있고, 항ITG-α4 항체인 Tysabri는, 이미 다발성 경화증이나 크론병의 치료약으로서 승인되어 있다. 또한, ITG-α4의 세포질 내 도메인에서 기능 모티프를 표적으로 한 치료 방법(특허 문헌 6)이 보고되어 있다.

항체를 의약품으로서 이용하는 경우, 에피토프에 의해 그 효과가 좌우된다. α4β1ITG는, ITG-α5β1이 결합하는 RGD 서열(서열 번호 1)과는 상이한 서열[LDV 서열(서열 번호 2)이나 QIDSPL 서열(서열 번호 3)]을 통하여 그 리간드와 강하게 결합하는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2). 그러나, 예를 들면, ITG-α4에서의 Fn과의 결합 부위와 VCAM1과의 결합 부위는 서로 오버랩함에도 불구하고, ITG-α4와 VCAM1과의 결합에는 칼슘 이온에 의한 도움이 필요한 것에 비해, Fn과의 결합에는 칼슘 이온은 불필요하며, 일부 항체는 ITG-α4와 Fn과의 결합만을 저해하는 등, ITG-α4와 그 리간드와의 결합은 상이한 특성을 가지는 것으로 알려져 있었다. 또한, 항ITG-α4 항체의 주요한 에피토프로서 오버랩하지 않는 3종류의 에피토프가 존재하는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 1).

한편, ITG-α4와 공통의 리간드를 가지는 ITG로서, 인테그린 α9(이하, "ITG-α9"라고 함)가 존재한다. ITG-α9는 다발성 경화증의 마우스 모델인 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 악화에도 관여하는 것으로 보고되어 있다(비특허 문헌 5). 본 발명자들은, 지금까지 ITG-α9에 대한 항체를 제조하고, 관절 류머티즘 치료 효과를 발견하였다(비특허 문헌 6, 특허 문헌 7).

ITG-α9는, ITG-α4와 공통되는 리간드를 가지므로, ITG-α4와 유사한 기능을 가지는 것으로 여겨지고 있다. 또한 ITG-α9 아미노산 서열은, ITG-α4의 아미노산 서열과 39%의 상동성을 가지며, ITG 중 가장 상동성이 높은 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 7).

지금까지 본원의 발명자는, ITG-α9의 세포외 영역의 일부 및 새로운 C 말단 아미노산만으로 구성되는 선택적 스플라이싱 변이체(Alternative splicing variant)인 α9 변이체(SFα9)가 생체 내에 존재하는 것을 발견하고, SFα9의 구조 및 기능에 대하여 해석을 행하여 보고해 왔다(비특허 문헌 8). ITG-α4의 변이체에 대해서는, ITG-α4의 다형에 대한 보고(특허 문헌 8)는 있지만, 선택적 스플라이싱 변이체에 대한 보고는 없었다.

국제 공개 공보 WO00/15247 국제 공개 공보 WO01/43774 국제 공개 공보 WO2008/140602 국제 공개 공보 2010/126914 국제 공개 공보 2006/0969807 국제 공개 공보 WO2006/112738 국제 공개 공보 WO2008/007804 국제 공개 공보 WO00/17394

Roy R. Lobb. , et al. (1994) J. Clin. Invest., 94: 1722-1728 Roberto Gonzalez-Amaro, e tal. (2005) I㎜unology, 116: 289-296 Holzmann, B., et al. (1998) Curr. Top. Microbiol. I㎜unol., 231: 125-141 Jackson, D. Y. (2002) Curr. Pharm. Des., 8: 1229-1253 Kanayama, M., e tal. (2009) J. I㎜unol., 182: 8015-8025 Palmer, E. L., et al. (1993) J. Cell. Biol., 123: 1289-1297 International I㎜unology Meeting, PP-038-31 Kon, S., et al. (2011) Exp. Cell. Res. 317: 1774-84

ITG-α4와 ITG-α9는 공통되는 리간드를 가지고, EAE 등의 동일한 질환 발증에 관여하는 것으로 여겨지므로, ITG-α4와 ITG-α9를 동시에 저해할 수 있는 물질은, ITG-α4와 ITG-α9가 관여하는 질환에 대한 효과적인 치료약이 될 수 있을 것으로 기대되고 있다. 또한, 멜라노마 등의 암 세포는, ITG-α4와 ITG-α9의 양쪽을 발현하고 있는 것으로 알려져 있다(J Cell Physiol. (2007)212: 368-74.; Exp Cell Res. (2009)315: 3312-24.). 암의 전이에는, 혈관 내에서 롤링, 접착, 혈관외 이동과 같은 스텝이 있는 것으로 알려져 있지만, 이 접착 시에 ITG가 중요한 기능을 담당하고 있는 것으로 여겨지고 있다. 혈관 내피 세포 상에 ITG-α4와 ITG-α9에 공통되는 리간드가 발현하고 있는 경우, 항체 등에 의하여, 한쪽 인테그린과 상기 리간드와의 결합을 저해하는 것만으로는 전이를 블로킹하지 못하고 ITG-α4와 ITG-α9의 양쪽에 대한 항체가 필요한 것으로 여겨지고 있다. 실제로, ITG-α4와 ITG-α9에 공통되는 리간드인 폰빌레브란트 인자(vWF)는 혈관 내피 세포로부터 생산되는 것으로 보고되어 있다(J Clin Invest. 1978 Jun, 61(6): 1498-507.). 임파관에서는 ITG-α4와 ITG-α9의 양쪽이 발현하고 있는 것으로 보고되어 있다(Nat Rev Cancer. (2008)8: 604-17.). 따라서, ITG-α4와 ITG-α9를 동시에 저해할 수 있는 물질은, 효과적인 암전이 억제제가 될 것으로 여겨지고 있다. 또한, ITG-α4 저해나 ITG-α9 저해에 의한, 임파관 신생·기능에 대한 영향이 보고되어 있고(Cancer Res. (2010)70: 3042-51., EMBO J. (2005)24: 2885-95.), ITG-α4와 ITG-α9를 동시에 저해함으로써 지금까지 존재하지 않았던 효율적인 임파관 신생 억제제를 제공할 것으로 기대되고 있다.

본 발명자들은, ITG-α4의 효과적인 저해제를 탐색하기 위하여, ITG-α4의 신규 선택적 스플라이싱 변이체의 동정(同定)을 시도했다. 그 결과, 6종의 신규 선택적 스플라이싱 변이체를 동정하는 것에 성공하였다(도 1∼3 및 서열 번호 4∼9). 본 발명자들은, 얻어진 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체의 구조를 해석한 결과, 놀랍게도 6 종류 중 5종류의 선택적 스플라이싱 변이체는, C 말단 측에 인간 ITG-α4(서열 번호 10) 유래가 아닌 신규하면서 고유의 인트론 유래의 아미노산 서열을 가지고 있었다(각각의 ITG-α4 선택적 스플라이싱 변이체의 C 말단 측의 신규 아미노산 서열을 도 3에 나타냄).

본 발명자들은, 얻어진 ITG-α4 선택적 스플라이싱 변이체의 기능을 해석한 결과, 이들 선택적 스플라이싱 변이체가 ITG-α4과 복수의 상이한 리간드와의 결합을 저해할 수 있는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은, 얻어진 ITG-α4 선택적 스플라이싱 변이체가, ITG-α4와 그 리간드와의 결합을 저해할뿐만 아니라, ITG-α9와 그 리간드와의 결합도 저해하는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명은, ITG-α4의 다양한 기능을 저해할 수 있는 신규 물질을 제공하는 것, 및/또는, ITG-α4 및 ITG-α9의 양쪽을 저해할 수 있는 신규 물질을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, ITG-α4의 신규 선택적 스플라이싱 변이체를 발견한 것에 기초한 것이다.

구체적으로는, 본 발명은, 이하의 (1)∼(15)에 기재된 발명에 관한 것이다.

(1) 인간 인테그린 α4(서열 번호 10)의 세포외 영역의 일부를 가지는 인테그린 α4 변이체.

(2) 인간 인테그린 α4(서열 번호 10)의 세포외 영역이, 인간 인테그린 α4(서열 번호 10)의 β-프로펠러(propellor) 도메인 유래의 아미노산 서열을 포함하고 있는 (1)에 기재된 펩티드.

(3) 인간 인테그린 α4(서열 번호 10)의 세포외 영역이, 서열 번호 9 및 서열 번호 11∼14로부터 선택되는 하나의 서열인, (1)에 기재된 펩티드.

(4) 서열 번호 15∼19로부터 선택되는 하나의 서열이 인간 인테그린 α4(서열 번호 10)의 세포외 영역의 C 말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.

(5) 서열 번호 4∼9로부터 선택되는 하나의 서열을 가지는 펩티드.

(6) 인테그린 α4의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 (1)∼(5) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.

(7) 인테그린 α4의 리간드가, VCAM1, Fn, JAM2, MAdCAM1, MDC-L(ADAM28), pp-vWF 및 OPN으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 물질인 (6)에 기재된 펩티드.

(8) 인테그린 α4의 리간드가 pp-vWF 또는 OPN인 (6)에 기재된 펩티드.

(9) 인테그린 α4의 리간드가 서열 번호 20 또는 21의 아미노산 서열을 가지는 펩티드인 (6)에 기재된 펩티드.

(10) 인테그린 α9의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α9와 그 리간드와의 결합을 저해하는 (1)∼(9) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.

(11) 인테그린 α9의 리간드가, VCAM1, Fn, JAM2, MAdCAM1, MDC-L(ADAM28), pp-vWF 및 OPN으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 물질인 (10)에 기재된 펩티드.

(12) 인테그린 α9의 리간드가 pp-vWF 또는 OPN인 (10)에 기재된 펩티드.

(13) 인테그린 α9의 리간드가 서열 번호 20 또는 21의 아미노산 서열을 가지는 펩티드인 (10)에 기재된 펩티드.

(14) 가용성 펩티드인, (1)∼(13) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.

(15) (1)∼(14) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물.

(16) (1)∼(14) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 특이적으로 인식(또는 결합)하는 항체.

(17) 인테그린 α4를 인식하지 않는(또는 인테그린 α4와 결합하지 않는), (16)에 기재된 항체.

본 발명의 ITG-α4 변이체는, ITG-α4의 다양한 기능을 저해할 수 있으므로, ITG-α4가 발증 또는 악화에 관여하는 다양한 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 특히, 본 발명의 ITG-α4 변이체는, ITG-α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 것에 더하여 및 ITG-α9와 그 리간드와의 결합을 저해할 수 있으므로, ITG-α4 및 ITG-α9가 발증 또는 악화에 관여하는 다양한 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

도 1은, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체인, 1-2-1 변이체, 1-1-2 변이체, 7-3-2 변이체, 및 10-7-3 변이체의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체인, 10-7-2 변이체, 및 9-5-4 변이체의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 3은, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체의 서열의 모식도이다.
도 4는, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체의 크로모솜 2에서의 유전자 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는, 6종의 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체(1-1-2 변이체, 1-2-1 변이체, 7-3-2 변이체, 10-7-3 변이체, 10-7-2 변이체, 9-5-4 변이체)를 강제 발현시킨 COS 세포의 배양 상청 중의 각 변이체의 발현을 웨스턴블로팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은, 배양 상청 중의 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 인테그린 α4의 리간드인 인간 OPN RAA Nhalf 단백질(Kon, S., et al., (2002) J. Cell. Biochem., 84: 420-432) 또는 네가티브 컨트롤(소 혈청 알부민: BSA)과의 결합을 리간드 고상(固相) ELISA로 검토한 결과를 나타낸다. 세로축은, 리간드에 결합한 인테그린 α4 변이체의 양의 지표가 되는 표지 항체의 450 ㎚에서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 사용한 각 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체를 나타낸다. 검은색 그래프는 각 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 인간 OPN RAA Nhalf 단백질과의 결합을 나타내고, 회색 그래프는 각 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 BSA와의 결합을 나타낸다.
도 7은, 내재적 1-2-1 변이체의 발현을 웨스턴블로팅에 의해 해석한 결과를 나타낸다. 좌측의 수치는 단백질의 분자량(kDa)을 나타낸다. 사진 상부의 "1-2-1/COSposi-con"은, 1-2-1 변이체를 강제 발현시킨 COS1 세포의 배양 상청을 나타내고, "Jurkat sup"는, Jurkat 세포의 배양 상청을 나타내고, "Rec-1 sup"는, Rec-1 세포의 배양 상청을 나타낸다.
도 8은, 1-2-1 변이체의 인테그린 α4, 인테그린 α9를 개재시킨 세포 접착 저해 기능을 측정한 결과를 나타낸다. 세로축은, 리간드에 결합한 세포수의 지표가 되는 595 ㎚에서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 사용한 각 리간드를 나타낸다. "mα4/CHO"는, 마우스 인테그린 α4를 발현하는 CHO 세포를 사용한 것을 의미하고, "mα9/CHO"는, 마우스 인테그린 α9를 발현하는 CHO 세포를 사용한 것을 의미한다. 그래프 중에서 흰색은 1-2-1 변이체 미첨가(-)를, 검은색은 1-2-1 변이체를 6.25μg/mL 첨가한 것을, 점으로 표시된 것은 12.5μg/mL 첨가를, 사선은 25μg/mL 첨가를 의미한다.
도 9는, 1-2-1 변이체/GST 단백질에 의한 EAE의 영향을 검토한 스케줄을 나타낸 도면이다.
도 10은, 1-2-1 변이체 단백질에 의한 EAE 억제 효과를 검토한 결과를 나타낸 도면이다. 세로축은 EAE 스코어를 나타내고, 가로축은 1-2-1 변이체 투여 후의 경과일수를 나타낸다.

본 발명에 있어서, "인테그린 α4 변이체"와 "ITG-α4 변이체"는 동의어이며, ITG-α4 게놈으로부터 유래하는 ITG-α4와는 상이한 스플라이싱에 의해 생산되는 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체 펩티드 또는 상기 펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 의미한다. 본 명세서에 있어서의 "인테그린 α4 변이체"는, 인간 ITG-α4의 세포외 영역(서열 번호 10의 1∼977 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 부분)의 일부를 가지며, 막 관통 영역 및 세포내 영역은 포함하지 않는다. ITG-α4로 도메인과의 관련에 대해서는, 인테그린 αv의 입체 구조 해석의 결과[Science(2001), 294.339-345]로부터, ITG-α4 아미노산 서열과의 상동성 분석에 의해 유추한 것에 대하여 보고되어 있다(Proc Natl Acad Sci USA. (1997)94: 65-72). 구체적으로는, 세포외 영역에, 시그널 서열(서열 번호 10에서의 1번째∼33번째의 아미노산 서열로 이루어지는 부분), β-propellor(서열 번호 10에서의 34번째∼465번째의 아미노산 서열로 이루어지는 부분), Thigh(서열 번호 10에서의 466번째∼618번째의 아미노산 서열로 이루어지는 부분), Genu(서열 번호 10에서의 619번째∼626번째의 아미노산 서열로 이루어지는 부분), Calf1(서열 번호 10에서의 627번째∼770번째의 아미노산 서열로 이루어지는 부분), 및 Calf2(서열 번호 10에서의 771번째∼977번째의 아미노산 서열로 이루어지는 부분)로 불리는 도메인을 가지는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 있어서의 인간 ITG-α4의 세포외 영역의 일부로서, β-propellor 도메인 및/또는 Thigh 도메인이 바람직하다. 예를 들면, 본 명세서에 있어서의 인간 ITG-α4의 세포외 영역의 일부는, 인간 ITG-α4의 β-propellor 도메인 유래의 아미노산 서열을 가진다. 여기서, β-propellor 도메인 유래의 아미노산 서열이란, ITG-α4의 N 말단에 위치하는 β-propellor 도메인을 구성하는 아미노산 서열의 일부이면, 어느 부위의 서열이라도 된다. 인간 ITG-α4의 세포외 영역의 일부는, 예를 들면, 50 아미노산 이상, 100 아미노산 이상, 150 아미노산 이상, 180 아미노산 이상, 또는 185 아미노산 이상의 β-propellor 도메인(432 아미노산으로 이루어짐)을 구성하는 아미노산 서열로부터 유래하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 인간 ITG-α4의 β-propellor 도메인 유래의 아미노산 서열은, 바람직하게는 서열 번호 10에서의 34번째의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 인간 ITG-α4의 β-propellor 도메인 유래의 아미노산 서열을 가지는 인간 ITG-α4의 세포외 영역의 일부는, β-propellor 도메인 유래의 아미노산 서열만으로 이루어질 수도 있고, β-propellor 도메인 유래의 아미노산 서열뿐만 아니라 β-propellor 도메인 이외의 인간 ITG-α4의 세포외 영역 유래의 아미노산 서열을 가질 수도 있다. 보다 구체적으로는, 본 명세서에 있어서의 인간 ITG-α4의 세포외 영역의 일부는, 서열 번호 11∼14에 기재된 아미노산 서열(또는, 상기 아미노산 서열에서, 1번째∼33번째의 아미노산 서열로 이루어지는 시그널 서열이 결여된 아미노산 서열), 또는 서열 번호 10의 1∼185 번째, 1∼384 번째, 1∼513 번째, 또는 1∼640 번째(또는, 서열 번호 10의 34∼185 번째, 34∼384 번째, 34∼513 번째, 또는 34∼640 번째)의 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, "인테그린 α4 변이체"는, ITG-α4로부터 유래하지 않는 아미노산 서열(이하, "ITG-α4 변이체 특이적 아미노산 서열"이라고 함)을 구비할 수 있다. 바람직하게는, "ITG-α4 변이체 특이적 아미노산 서열"은 ITG-α4의 인트론 유래의 서열이며, 구체적으로는, 본 명세서에 있어서의 ITG-α4 변이체 특이적 아미노산 서열은, 서열 번호 15∼19에 기재된 아미노산 서열이라도 된다.

즉, 하나의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서의 "인테그린 α4 변이체"는, 상기 인간 ITG-α4의 세포외 영역의 일부만으로 이루어지거나, 또는 상기 인간 ITG-α4의 세포외 영역의 일부와 ITG-α4 변이체 특이적 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드(이하, 총칭하여 "ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체"라고 함)를 포함한다. 구체적으로는, 본 명세서에 있어서의 ITG-α4 변이체는, 서열 번호 4∼9(각각 차례대로, "1-2-1 변이체"(서열 번호 4), "1-1-2 변이체"(서열 번호 5), "7-3-2 변이체"(서열 번호 6), "10-7-3 변이체"(서열 번호 7), "10-7-2 변이체"(서열 번호 8), 및 "9-5-4 변이체"(서열 번호 9)라고 함]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드라도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서의 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체는, ITG-α4의 리간드와 결합하고, 또한/또는, ITG-α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성, 및/또는, ITG-α9의 리간드와 결합하고, 또한/또는, ITG-α9와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성을 가진다.

또한, 다른 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서의 "인간 인테그린 α4의 세포외 영역의 일부를 가지는 인테그린 α4 변이체"는, 상기 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 실질적으로 동일한 펩티드를 포함한다. 여기서, 실질적으로 동일한 펩티드란, 상기 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와, 아미노산 서열에서의 상동성이 높고, 상기 펩티드를 코딩하는 DNA와 스트린젠트한 조건에서 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되고, 및/또는, 소수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 펩티드로서, 또한 본 명세서에 있어서의 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 동등한 생물학적 활성을 가지는 펩티드를 의미한다.

본 명세서에 있어서, 아미노산 서열의 상동성이 높다는 것은, 상기 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 아미노산 서열에서의 상동성이 높은 펩티드는, 서열 번호 4∼9의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것일 수도 있다. 여기서, 아미노산 서열의 상동성은, 예를 들면, BLAST, FASTA 등의 공지의 프로그램을 사용하여 당업자가 통상적으로 사용하는 방법에 의해 결정할 수 있다.

본 명세서에 있어서, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체를 코딩하는 DNA와 스트린젠트한 조건에서 혼성화하는 DNA에 의해 코딩된다는 것은, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체를 코딩하는 DNA와 당업자가 통상적으로 사용되는 혼성화 조건에서 혼성화하는 것을 의미한다. 예를 들면, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체를 코딩하는 DNA와 스트린젠트한 조건에서 혼성화하는 DNA는, 서열 번호 4∼9의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA와 스트린젠트한 조건에서 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는 펩티드라도 된다. 스트린젠트한 조건에서의 혼성화인지의 여부는, Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)에 기재된 방법에 의해 혼성화의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 스트린젠트한 혼성화의 조건은, 6×SSC(0.9M NaCl, 0.09M 시트르산3나트륨) 또는 6×SSPE(3M NaCl, 0.2M NaH₂PO₄, 20mM EDTA·2Na, pH 7.4) 중에서 42℃에서 혼성화시키고, 그 후 42℃에서 0.5×SSC로 세정하는 조건일 수도 있다.

본 명세서에 있어서, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체에 소수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 펩티드란, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체를 구성하는 아미노산 서열의 일부 아미노산이 다른 아미노산과 치환되고 및/또는 결실한 펩티드, 및/또는, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체를 구성하는 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 다른 아미노산 서열이 부가된 펩티드, 및/또는, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체를 구성하는 아미노산 서열 내에 다른 아미노산이 삽입된 펩티드를 의미한다. 예를 들면, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체에 소수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 펩티드로서는, 서열 번호 4∼9의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 소수의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 펩티드를 들 수 있다. 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되는 아미노산의 수는, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 수이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 1∼10개, 1∼5개, 1∼4개, 또는 1∼3개로 할 수 있다.

전술한 바와 같이, 상기 ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 실질적으로 동일한 펩티드는, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 동등한 생물학적 활성을 가진다. 여기서, "ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 동등한 생물학적 활성"이란, ITG-α4의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성을 의미한다. 여기서, ITG-α4의 리간드는, ITG-α4의 리간드로서 이미 알려져 있는 단백질 또는 펩티드이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, VCAM1, Fn[특히, 피브로넥틴 EIIIA(Fn-EIIIA)], JAM2, MAdCAM1, MDC-L(ADAM28), pp-vWF 또는 OPN이며, 보다 바람직하게는, Fn-EIIIA, pp-vWF 또는 OPN이며, 더욱 바람직하게는, 서열 번호 20 또는 21의 아미노산 서열을 가지는 펩티드이다. ITG-α4의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α9와 그 리간드와의 결합을 저해하는 경우의 리간드의 종류는, 이들 리간드 모두일 필요는 없으며, 예를 들면, 전술한 것 중에서 일부 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α4와 전술한 것 중에서 일부 리간드와의 결합을 저해할 수도 있다. 바람직하게는, 2개 또는 그 이상의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α4와 그 리간드와의 결합을 저해하고, 상기 2개 또는 그 이상의 리간드는, 바람직하게는, Fn-EIIIA, pp-vWF 및 OPN를 포함하고, 더욱 바람직하게는, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함한다.

바람직하게는, "ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 동등한 생물학적 활성"은, ITG-α4의 리간드와 결합하고, 또한/또는, ITG-α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성에 더하여, ITG-α9의 리간드와 결합하고, 또한/또는, ITG-α9와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성을 의미한다. 여기서, ITG-α9의 리간드는, ITG-α9의 리간드로서 이미 알려져 있는 단백질 또는 펩티드이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, VCAM1, Fn[특히, 피브로넥틴 EIIIA(Fn-EIIIA)], JAM2, MDC-L(ADAM28), pp-vWF 또는 OPN이며, 보다 바람직하게는, Fn-EIIIA, pp-vWF 또는 OPN이며, 더욱 바람직하게는, 서열 번호 20 또는 21의 아미노산 서열을 가지는 펩티드이다. ITG-α9의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 경우에, 리간드의 종류는, 이들 리간드 모두일 필요는 없고, 예를 들면, 전술한 것 중 일부 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α9와 전술한 것 중 일부 리간드와의 결합을 저해할 수도 있다. 바람직하게는, 2개 또는 그 이상의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α9와 그 리간드와의 결합을 저해하고, 상기 2개 또는 그 이상의 리간드는, 바람직하게는, Fn-EIIIA, pp-vWF 및 OPN를 포함하고, 더욱 바람직하게는, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함한다.

본 명세서에 있어서, ITG-α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성, 및 ITG-α9와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성은, 각각, ITG-α4를 발현하는 세포와 ITG-α4 리간드와의 결합(ITG-α4를 발현하는 세포의 ITG-α4 리간드로의 세포 접착)을 저해하는 활성, 및 ITG-α9를 발현하는 세포와 ITG-α9 리간드와의 결합(ITG-α9를 발현하는 세포의 ITG-α9 리간드로의 세포 접착)을 저해하는 활성으로 대체할 수도 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 ITG-α4 변이체는, ITG-α4의 리간드와 결합하고, 또한/또는, ITG-α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성, 및/또는, ITG-α9의 리간드와 결합하고, 또한/또는, ITG-α9와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성을 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 ITG-α4 변이체는, ITG-α4의 리간드와 결합하고, 또한/또는, ITG-α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성, 및 ITG-α9의 리간드와 결합하고, 또한/또는, ITG-α9와 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성을 가진다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 ITG-α4 변이체는, ITG-α4와 ITG-α9의 양쪽이 결합하는 공통의 리간드와 결합하거나, 또는 ITG-α4와 ITG-α9의 양쪽이 결합하는 공통의 리간드와 ITG-α4와의 결합, 및 ITG-α4와 ITG-α9의 양쪽이 결합하는 공통의 리간드와 ITG-α9와의 결합을 저해한다. ITG-α4와 ITG-α9의 양쪽이 결합하는 공통의 리간드로서는, Fn-EIIIA, pp-vWF 및 OPN을 예로 들 수 있다.

또한, 바람직하게는, "ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 동등한 생물학적 활성"은, 이상의 활성에 더하여, 가용성인 것을 포함할 수도 있다. 대상으로 되는 펩티드가 가용성인지의 여부는, 예를 들면, FLAG 등으로 표지된 상기 펩티드를 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 도입한 후, 상기 세포를 배양한 후, 배양 상청 중의 상기 펩티드의 존재를 항FLAG 항체 등을 사용하여 확인함으로써 조사할 수 있다. 배양 상청 중에 상기 펩티드가 방출되어 있는 경우에는, 가용성인 것으로 판정할 수 있다. 본 명세서에 있어서, "가용성"이란, 생산된 펩티드의 대부분(과반수)이 세포내 또는 세포 표면에 머물지 않고 배양액 중에 방출되는 것을 의미하고, 생산된 모든 펩티드가 배양액 중에 방출될 필요는 없다.

본 명세서에 있어서, "ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체와 동등한 생물학적 활성"이란, 원칙으로서는 정성적(定性的)인 성질을 의미하고, 전술한 활성을 가지는 한 그것의 크고 작음에 구애받지 않지만, ITG-α4의 선택적 스플라이싱 변이체(바람직하게는, 서열 번호 4∼9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드)와 같은 정도(예를 들면, 활성 값이 ±25%, ±20%, ±15%, 또는 ±10%의 범위 내)인 것이 바람직하다.

또한, 본 명세서에 있어서의 "인테그린 α4 변이체"는, 필요에 따라 구성하는 아미노산이 적절하게 화학적 수식을 받고 있어도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서의 "인테그린 α4 변이체"는, RGD 서열(서열 번호 1)과 결합하지 않는 펩티드, 및/또는 RDG 서열(서열 번호 1)과 ITG(특히, ITG-α4, 및/또는 ITG-α9)와의 결합을 저해하지 않는 펩티드라도 된다.

또한, 다른 태양에 있어서, 본 발명은, ITG-α4 변이체를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체일 수도 있고, 단일 클론 항체일 수도 있지만, 바람직하게는, 단일 클론 항체이다. 본 발명에 있어서, "단일 클론 항체"는, 항원에 대하여 고도로 특이적이고, 단일 항원을 인식하는 것이다. 또한, 본 발명의 항체는, 비인간 동물의 항체, 비인간 동물의 항체의 아미노산 서열과 인간 유래의 항체의 아미노산 서열을 가지는 항체, 및 인간 항체를 포함한다. 비인간 동물의 항체로서는, 예를 들면, 마우스, 랫, 햄스터, 몰모트, 래빗, 개, 원숭이, 양, 염소, 닭, 집오리 등의 항체가 있으며, 바람직하게는, 하이브리도마를 제조할 수 있는 동물의 항체이며, 더욱 바람직하게는 마우스의 항체이다. 비인간 동물의 항체의 아미노산 서열과 인간 유래의 항체의 아미노산 서열을 가지는 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체를 예로 들 수 있다. 상기에 있어서, "키메라 항체"란, 비인간 동물 유래로서 ITG-α4 변이체와 특이적으로 결합하는 항체의 불변 영역을 인간의 항체와 같은 불변 영역을 가지도록 유전자 공학적으로 변형한 항체이며, 바람직하게는, 인간·마우스·키메라 항체(유럽 특허 공개 공보 EP0125023 참조)이다. "인간화 항체"란, 비인간 동물 유래이며, ITG-α4 변이체와 특이적으로 결합하는 항체의 H쇄와 L쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 1차 구조를 인간의 항체에 대응하는 1차 구조로 유전자 공학적으로 변형한 항체이다. 여기서, CDR이란, Kabat et al(“Sequences of Proteins of I㎜unological Interest”, Kabat, E. et al, U.S. Department of Health and Human Services, 1983) 또는 Chothia et al(Chothia＆Lesk(1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917)의 어떤 정의에 의한 것이라도 된다. "인간 항체"란, 완전하게 인간 유래의 항체 유전자의 발현 산물인 인간 항체이며, 예를 들면, 인간의 항체 생산에 관여하는 유전자를 도입한 형질전환(transgenic) 동물을 사용하여 제조한 단일 클론 항체(유럽 특허 공개 공보 EP0546073 참조) 등이 있다.

[발명을 실시하기 위한 형태]

(ITG-α4 변이체)

본 발명의 ITG-α4 변이체는, ITG-α4의 구조(도 3) 및 서열(서열 번호 10)을 참조하면서 당업자 주지의 방법을 채용하면서 본 명세서의 기재를 참작함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, ITG-α4를 발현하는 것으로 알려져 있는 세포(예를 들면, Jurkat 세포 등의 T 세포, Rec-1 세포 등)의 cDNA를 사용하여 3'-race법을 행함으로써 ITG-α4 변이체를 얻을 수 있다. 예를 들면, ITG-α4는, 장, T 세포, IgA 생산 B 세포, (단핵) 백혈구 등에서 발현하고 있는 것으로 보고되어 있다. 구체적으로는, ITG-α4를 발현하는 것으로 알려져 있는 세포로부터의 총 RNA를, QIAGEN RNeasy 키트(QIAGEN)를 사용하여 추출한다. 총 RNA로부터 3'-race용 cDNA 합성은, Firststrand cDNA 합성 키트(로슈)를 사용하여 행할 수 있다. 구체적으로는, 역전사에 사용하는 프라이머로서 3'-race용의 QT 프라이머(예를 들면, 서열 번호 22)를 사용하여, 3'-race용의 cDNA를 합성한다. 얻어진 cDNA를 템플레이트로 하여 Q0 프라이머(예를 들면, 서열 번호 23)와 다음에 나타내는 ITG-α4의 각종 영역의 프라이머(예를 들면, 인간 ITG-α4의 경우, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26 등)를 사용하여 1st PCR을 행한다. 얻어진 PCR 산물을 20배로 희석하고, 그 중의 1μL를 템플레이트로서 이용하여, Q1 프라이머(예를 들면, 서열 번호 27)와 ITG-α4 프라이머(예를 들면, 인간 ITG-α4의 경우, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 28 등)를 사용하여 2nd PCR을 행한다. 얻어진 밴드를, 겔 추출에 의해 정제하고, 클로닝을 행함으로써 ITG-α4 변이체를 얻을 수 있다.

또는, 본 발명의 ITG-α4 변이체는, 1-2-1 변이체, 1-1-2 변이체, 7-3-2 변이체, 10-7-3 변이체, 10-7-2 변이체, 및 9-5-4 변이체를 그대로 또는 적절하게 변형함으로써 얻을 수 있다. ITG-α4 변이체로서 1-2-1 변이체, 1-1-2 변이체, 7-3-2 변이체, 10-7-3 변이체, 10-7-2 변이체, 및 9-5-4 변이체를 그대로 사용하는 경우에는, 본 명세서의 실시예 2의 방법에 준해 제작할 수 있다. 또한, 변형은, 단백질 공학의 분야에서 통상 사용되는 기술을 이용하여, 아미노산의 치환, 결실, 부가, 및 또는 삽입을 행하는 것 외에, 아미노산을 적절하게 변경함으로써 행할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 ITG-α4 변이체는, 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 변이체를 얻은 세포 cDNA를 템플레이트로서 사용하고, 목적으로 하는 변이체를 코딩하는 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머를 적절하게 설계하고, PCR을 행한다. PCR 산물을 적절하게 설정한 제한 효소로 소화한 후, 발현 벡터에 삽입(integration)하고, 숙주 세포에 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 등을 사용하여 제작한 발현 벡터를 도입하고, 배양 상청을 필요에 따라 정제한다. 또는, 당업자 주지의 방법을 이용하여, 아미노산 서열로부터 DNA 서열을 설계하고, 상기 DNA를 합성에 의해 제작하여 발현 벡터로의 삽입에 사용할 수도 있다. 또는, 1-2-1 변이체와 같은 짧은 변이체는, 직접 펩티드 합성에 의해 제작할 수도 있다.

(결합 활성 측정 방법)

ITG-α4 변이체가, ITG-α4 또는 ITG-α9의 리간드와 결합능을 가지고 있는지의 여부는, 당업자 주지의 방법을 채용하면서 본 명세서의 기재를 참작함으로써 결정할 수 있다. 구체적으로는, 리간드 고상 ELISA를 사용하여 이하의 방법에 의해 행할 수 있다. ITG-α4 또는 ITG-α9의 리간드를 고상하고, BSA/PBS로 블로킹한 후, FLAG로 표지한 피험 ITG-α4 변이체를 함유하는 용액을 첨가한다. 1시간 4℃에서 반응한 후, 항FLAG 항체와 항마우스 IgG 혼합물을 첨가한 후, 4℃에서 30분간 반응시켜, 세정 후에 TMB액으로 발색시켜 결합능을 해석할 수 있다.

(결합 저해 활성 측정 방법)

ITG-α4 변이체가, ITG-α4와 그 리간드 또는 ITG-α9와 그 리간드와 결합을 저해하는 활성을 가지고 있는지의 여부는, ITG-α4 변이체가 ITG-α4 또는 ITG-α9를 발현하는 세포와 이들 리간드와의 결합(세포 접착)을 저해하는지의 여부에 의해 결정할 수 있다. 구체적으로는, ITG-α4의 리간드 또는 ITG-α9의 리간드에 BSA를 커플링시켜, 4℃에서 하룻밤 방치해 고상한다. BSA를 포함하는 DMEM 배지에서 1시간 블로킹한 후, 인테그린 α4, 또는 인테그린 α9를 발현하는 세포(예를 들면, CHO 세포)와 GST 융합 피험 ITG-α4 변이체의 혼합물을 첨가하고 CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃에서, 1시간 배양한다. PBS로 비접착 세포를 제거하고, 0.5%의 크리스탈 바이올렛을 포함하는 20% 메탄올로 접착 세포를 고정하고, 염색시킨다. 20% 아세트산으로 용해 전이하여 세포 접착 저해 효과를 595 ㎚의 흡광도에서 측정하고, 정량할 수 있다.

(의약 조성물)

본 발명의 ITG-α4 변이체는, 단백질 의약 분야에서 당업자가 통상 사용하는 지식에 기초하여, 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 따라서, 하나의 태양에 있어서 본 발명은, 본 발명의 ITG-α4 변이체를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명의 의약 조성물은, 암, 암전이, 다발성 골수종이나 관절 류머티즘, 기관지염, 염증성 장질환, 크론병, 다발성 경화증 등의 염증성 질환 또는 자가면역 질환, 급성 중추신경계 손상, HIV 등의 면역 부전, 알레르기성 뇌척수염, 과민증, I형 당뇨병 등의 T 세포 의존성 자가면역 질환, 알레르기성 폐렴, 면역 복합체 개재 폐장애, 급성 신독성 신염, 지연성 과민증(피부 경화와 피브린의 침착 등), 동맥 경화, 심근경색의 치료약 또는 예방약, 또는 혈관 부착 심장의 동종 이식의 거부 반응 억제 등의 이식 시의 거부 반응의 억제제로 할 수 있다.

본 발명의 ITG-α4 변이체를 의약 조성물로서 사용하는 경우, 투여 부위로서는, 예를 들면, 경구 투여, 구강내 투여, 기도내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 혈관내(정맥내) 투여, 경피 투여 등이 있다. 또한, 의약 조성물은, 예를 들면, 주사제, 캡슐제, 정제, 시럽제, 과립제, 연고 등의 도포제의 제제로 만들 수 있다. 본 발명의 변이체는, 단독으로 투여할 수도 있고, 약리학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수도 있다.

(항체)

본 발명의 항체는, 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 먼저, 본 발명의 항체의 제작에 사용하는 면역원은, ITG-α4 변이체의 전부 또는 그 일부를 가지는 폴리펩티드(바람직하게는, ITG-α4에 존재하지 않는 ITG-α4 변이체 특이적 아미노산 서열, 예를 들면, 서열 번호 15∼19)를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터[예를 들면, pGEX(대장균용), pcDNA3.1(동물세포 발현용) 등]를 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등에 형질 전환하고, 형질 전환된 대장균 등의 숙주 미생물·배양 세포를 적절한 배지(예를 들면, LB 배지 등)에서 배양하고 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 또한, 상기 서열을 가지는 펩티드를 화학적으로 합성한 것을 사용하는 것도 가능하다.

상기 항원을 사용한 동물의 면역은, 상기 항원을 인산 나트륨 완충액(PBS)에 용해시키고, 필요에 따라 면역 활성화제[예를 들면, 광유 또는 알루미늄 침전물과 가열 사균 또는 리포 다당체, 프로인트(Freund)의 완전 아쥬반트(adjuvant), 또는 프로인트의 불완전 아쥬반트 등]와 함께, 비인간 포유동물 또는 조류에 면역함으로써 행해진다. 동물에 대한 면역원의 투여는, 예를 들면, 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사 또는 족척(足蹠) 주사에 의해 행할 수 있다. 사용하는 면역원의 양은, 항체를 생산할 수 있는 양이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 0.1∼1000 μg이며, 보다 바람직하게는, 1∼500 μg이며, 더욱 바람직하게는, 10∼100 μg이다. 면역은, 1회 또는 적절한 간격을 두고 수회 행할 수 있다. 바람직하게는, 1∼5 주에 1회의 면역을 복수회(바람직하게는, 합계 2∼5 회) 행할 수 있다. 폴리클로날 항체는, 충분한 항체가를 나타낸 동물의 혈청으로부터 정제함으로써 얻을 수 있다.

단일 클론 항체를 작성하는 경우, 전술한 방법에 의해 면역된 면역 감작 동물의 비장 등으로부터 얻은 항체 생산 세포와, 골수종계 세포(골수종 세포)를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마를 배양함으로써 얻을 수 있다. 상기 융합 방법으로서는, 예를 들면, 밀스테인 등의 방법(Galfre, G. ＆ Milstein, C. , Methods Enzymol.73: 3-46, 1981)이 있다. 항체는, 하이브리도마를 in vitro에서 배양하고, 배양액을 정제함으로써 얻을 수 있다.

(인간형 키메라 항체 제작)

본 발명의 항체가 인간형 키메라 항체의 경우, ITG-α4 변이체와 결합하는 비인간 동물 단일 클론 항체의 VH 및 VL를 코딩하는 DNA를 조제하고, 이것을 인간 면역 글로불린의 불변 영역 cDNA와 결합하여 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포에 상기 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다(Morrison, S. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984).

(인간화 항체의 제작)

본 발명의 항체가 인간화 항체의 경우에는, ITG-α4 변이체와 결합하는 비인간 동물 단일 클론 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 V 영역을 코딩하는 DNA를 구축하고, 구축한 DNA를 인간 유래 면역 글로불린의 불변 영역 cDNA와 결합하여 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포에 상기 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다(L. Rieohmann et al., Nature, 332, 323, 1988: Kettleborough, C. A. et al., Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., I㎜unol. Today., 21, 397-402, 2000 참조). 비인간 동물 단일 클론 항체의 CDR은, 전술한 방법에 의해 얻어진 비인간 동물 단일 클론 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 DNA 서열로부터 예측되는 아미노산 서열과, 기존의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 비교하여 얻을 수 있다. 기존의 항체의 아미노산 서열은, 예를 들면, 프로테인·데이터·뱅크 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 항체의 아미노산 서열로부터 얻을 수 있다. 또한, 인간화 항체의 FR로서는, 이식 후의 항체가 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 것이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 인간화 항체의 가변 영역(이하, "V 영역"이라고 함)이 CDR이 유래하는 비인간 동물 단일 클론 항체의 V 영역과 유사한 입체 구조가 되는 인간 항체의 FR, 또는 사용하는 비인간 동물 단일 클론 항체의 FR의 아미노산 서열과 상동성이 높은 인간 항체 FR이다. 사용하는 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA 서열은, 비인간 동물 단일 클론 항체의 CDR의 아미노산 서열과 인간 항체의 FR의 아미노산 서열을 결합한 아미노산 서열에 대응하는 DNA 서열로서 설계한다. 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA는, 설계한 DNA 서열을 바탕으로, 당업자 주지의 방법에 의해 제작할 수 있다.

(인간 항체)

인간 항체는, 예를 들면, 인간 항체 살균 바이러스 라이브러리 또는 인간 항체 생산 형질전환(transgenic) 마우스를 이용함으로써 얻을 수 있다(도미즈카 외, Nature Genet., 15, 146-156(1997)). 인간 항체 살균 바이러스 라이브러리를 이용하는 경우, 예를 들면, ITG-α4 변이체 또는 본 발명의 항체가 인식하는 에피토프 서열을 가지는 펩티드를 고상으로 고정화하고, 살균 바이러스 항체 라이브러리를 반응시켜, 비결합 살균 바이러스를 세정 제거한 후, 결합한 살균 바이러스를 회수함으로써, 원하는 클론을 얻을 수 있다(패닝). 또한, 얻어진 살균 바이러스를 증폭시키고, 증폭시킨 라이브러리에 대하여 패닝을 더욱 반복하여 행함으로써, 얻어진 클론의 정밀도를 높일 수 있다. 얻어진 클론의 VH 유전자 및 VL 유전자를 해석함으로써, 이들 유전자 서열을 가지는 완전한 인간 항체를 제작할 수도 있다.

인간 항체 생산 형질전환(transgenic) 마우스는, 내인성 면역 글로불린(Ig) 유전자를 녹아웃한 마우스에 인간 항체의 Ig 유전자를 도입한 마우스이다. 인간 항체 생산 형질전환(transgenic) 마우스는, 예를 들면, 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 인간-마우스 하이브리드 세포를 48시간 콜세미드(방추사 형성 저해제) 처리함으로써, 1개 내지 수개의 염색체가 핵막에 싸인 구조체인 마이크로 셀을 형성한다. 사이토칼라신 B 존재 하에서 단리된 마이크로 셀을 염색체 수용 세포(마우스 ES 세포)와 폴리에틸렌글리콜에 의해 융합하여, 마이크로 셀 하이브리드 ES 세포를 제작하고, 마우스 배아에 주입한다. 인간 항체 생산 형질전환(transgenic) 마우스를 면역 동물로 하여, 전술한 항ITG-α4 변이체 항체 제작 방법에 준하여 항원(바람직하게는, 본 발명의 항체가 인식하는 에피토프 서열을 가지는 펩티드)을 면역함으로써, 항ITG-α4 변이체 인간 항체를 얻을 수 있다.

(항체 단편의 제작)

F(ab')₂ 단편(분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편)은, 본 발명의 IgG 항체를 펩신으로 처리함으로써, H쇄의 234번째의 아미노산 잔기에서 절단하여 얻을 수 있다. Fab' 단편은, 전술한 방법에 의해 얻어진 F(ab')₂를 디티오트레이톨 처리하여 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 Fab' 단편은, 본 발명의 항체의 Fab'를 코딩하는 DNA로부터 얻을 수 있다. Fab 단편(H쇄의 N 말단 측의 대략 절반의 영역과 L쇄의 전체 영역이 디술피드 결합에 의해 결합된 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편)은, 본 발명의 항체를 파파인으로 처리함으로써, H쇄의 224번째의 아미노산 잔기에서 절단하여 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 Fab 단편은, 본 발명의 항체의 Fab를 코딩하는 DNA로부터 얻을 수 있다. scFv는, 본 발명의 항체의 VH 및 VL를 코딩하는 cDNA의 사이에 링커 서열을 코딩하는 DNA를 삽입하여, scFv를 코딩하는 DNA를 구축함으로써 얻을 수 있다. 링커의 길이는, VH와 VL이 회합할 수 있는 길이이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 10∼20 잔기이며, 더욱 바람직하게는 15잔기이다. 또한, 링커의 서열은, VH와 VL의 2개의 도메인의 폴리펩티드쇄의 접힘(folded)을 저해하지 않는 것이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신 및/또는 세린으로 이루어지는 링커이며, 더욱 바람직하게는, GGGGS(G: 글리신, S: 세린) 또는 그것의 반복 서열이다. dsFv는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환하고, 상기 시스테인 잔기 사이를 디술피드 결합에 의해 결합시킴으로써 얻을 수 있다. Diabody는, 전술한 scFv를 코딩하는 DNA에서, 링커의 아미노산 서열이 8잔기 이하(바람직하게는 5잔기)가 되도록 구축함으로써 얻을 수 있다. 이중특이성(bispecific) 디아바디(diabody)는, 상이한 2종류의 scFv의 VH 및 VL의 DNA를 조합하여 scFv를 제작함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 CDR을 포함하는 펩티드는, 본 발명의 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 가지는 펩티드로서 설계함으로써 얻을 수 있다.

이하에서, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다. 그리고, 본원 전체를 통해 인용되는 전체 문헌은 참조에 의해 그대로 본원에 원용된다.

(실시예 1) 인테그린 α4 변이체의 동정

신규 인간 α4 인테그린 변이체의 동정은, Jurkat 세포, Rec-1 세포 cDNA를 사용한 3'-race법을 이용하여 행하였다. 인간 T 세포 세포주 Jurkat 세포(ATCC, TIB-152)와 인간 맨틀 세포 임파종 세포주 Rec-1 세포(ATCC, CRL-3004)로부터의 총 RNA를, QIAGEN RNeasy 키트(QIAGEN)를 사용하여 추출했다. 구체적으로는, 역전사에 사용하는 프라이머를 3'-race용의 프라이머 QT 프라이머(5'-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3': 서열 번호 22)를 이용하여 3'-race용 cDNA 합성을 행하였다. 얻어진 cDNA를 템플레이트로 하여, Q0 프라이머(5'-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3': 서열 번호 23)와 다음에 나타내는 인간 인테그린 α4의 각종 영역의 3종의 프라이머(α4-N: 5'-TGTCTCGAGTGGCCGTTTAGTGTTGAATGT-3': 서열 번호 24; α4-1246: 5'-ACTGGTGGTTGCTATGGAGTA-3': 서열 번호 25; α4-2118: 5'-CTTTTCGGTCTGATTCTGCTG-3': 서열 번호 26)를 사용하여 1st PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 20배로 희석하고, 그 중의 1μL를 템플레이트로서 이용하여 2nd PCR을 행하였다. 2nd PCR용의 프라이머 세트로서, Q1 프라이머(5'-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3': 서열 번호 27)와 3종의 인간 인테그린 α4 프라이머(α4-1246: 5'-ACTGGTGGTTGCTATGGAGTA-3': 서열 번호 25; α4-2118: 5'-CTTTTCGGTCTGATTCTGCTG-3': 서열 번호 26; α4-2556: 5'-CACTTCAGCCAATTCTTCAGC-3': 서열 번호 28)를 이용하였다. 얻어진 복수의 밴드는, 겔 추출에 의해 정제하고, TOPO 클로닝 키트(Invitrogen)에 의해 클로닝을 행하고, 시퀀싱에 의한 염기 서열을 결정했다.

그 결과, 6종의 신규 인테그린 α4 변이체를 동정하는 것에 성공하였다. 동정된 신규 변이체를, 각각, 1-1-2 변이체, 1-2-1 변이체, 7-3-2 변이체, 10-7-3 변이체, 10-7-2 변이체, 9-5-4 변이체로 명명했다. 동정된 6종의 인테그린 α4 변이체, 1-2-1 변이체, 1-1-2 변이체, 7-3-2 변이체, 10-7-3 변이체, 10-7-2 변이체, 및 9-5-4 변이체의 아미노산 서열을 도 1 및 도 2에 나타내었다. 또한, 이들 변이체의 서열의 모식도를 도 3에 나타내고, 크로모솜 2에서의 각 인테그린 α4 변이체의 유전자 구조를 도 4에 나타낸다.

(실시예 2) 인테그린 α4 변이체의 발현

얻어진 모든 인테그린 α4 변이체는, 인테그린 α4 세포외 영역으로만 이루어져 있으므로, 이들은 분비성 단백질인 것으로 추측되었다. 이에, 각각의 변이체를 배양 세포에 발현시키기 위해, C 말단 측에 FLAG 태그를 부가시킨 플라스미드를 구축하였다. 6종의 인테그린 α4 변이체(1-1-2 변이체, 1-2-1 변이체, 7-3-2 변이체, 10-7-3 변이체, 10-7-2 변이체, 9-5-4 변이체)의 발현 벡터 구축은 이하와 같이 행하였다. Jurkat 세포(ATCC, TIB-152)와 Rec-1 세포(ATCC, CRL-3004) cDNA를 템플레이트로서 사용하고, α4-N 프라이머와 각 변이체에 특이적인 3' 말단의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하였다. 사용한 3' 말단 프라이머를 이하에 나타낸다. 각각의 프라이머에는, 발현 해석을 위한 FLAG 태그 서열을 부가하였다.

ha4-1-1-2-FLAG-RV 프라이머: 5'-TTACTCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCATTACCTTCAAAGCCATCATT-3'(서열 번호 29);

ha4-1-2-1-FLAG-RV 프라이머: 5'-TCGTTCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCTGTCCTAGCTCTGTACTTGCT-3'(서열 번호 30);

ha4-7-3-2-FLAG-RV 프라이머: 5'-CCACTCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCATATTGTAGGGCATACCCACC-3'(서열 번호 31);

ha4-10-6-3-FLAG-RV 프라이머: 5'-TTGATCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCTGAGGAAAAGCTGAGAGAGTT-3'(서열 번호 32);

ha4-10-7-2-FLAG-RV 프라이머: 5'-CCCATCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCGAGACAACACTTCAAAAACCC-3'(서열 번호 33);

ha4-9-5-4-FLAG-RV 프라이머: 5'-CGTTTCTAGACTATTTATCGTCATCATCTTTGTAGTCCTTCAAAAACCCAATCTTTGC-3'(서열 번호 34). PCR 산물을 제한 효소 XhoI, XbaI로 소화한 후, pcDNA3.1 발현 벡터(Invitrogen)에 삽입하고, 시퀀싱에 의해 서열을 확인하였다.

COS1 세포(ATCC, CRL-1650)에 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 작성한 발현 벡터를 도입하고, 2일 후의 배양 상청을 Vivaspin(GE)에 의해 10배로 농축한 샘플을 사용하여, 항FLAG 항체(와코)에 의해 웨스턴블로팅을 행하였다.

웨스턴블로팅의 결과를 도 5에 나타낸다. 도면에 나타낸 바와 같이, 각 인테그린 α4 변이체는 배양 상청 중에 분비되는 것을 알았다.

(실시예 3) 인테그린 α4 변이체의 인테그린 α4 리간드에 대한 결합능

상청 중의 인테그린 α4 변이체가 인테그린 α4의 리간드와 결합능을 가지고 있는지에 대해서 리간드 고상 ELISA에 의해 검토했다. 인테그린 α4의 리간드인 인간 OPN RAA Nhalf 단백질(Kon, S., et al., (2002) J. Cell. Biochem., 84: 420-432) 또는 컨트롤로서 BSA를 10μg/mL로 4℃에서 하룻밤 고상하고, 1%의 BSA/PBS로 블로킹한 후, 실시예 2에서 사용한 것과 같이 10배로 농축한 배양 상청을 첨가했다. 1시간 4℃에서 반응한 후, 항FLAG 항체(와코)와 항마우스 IgG(가부시키가이샤 면역 생물 연구소) 혼합물을 첨가한 후, 4℃에서 30분간 반응시켰다. 세정 후, TMB액(DAKO)으로 발색시켜 결합능을 해석했다.

결과를 도 6에 나타내었다. 9-5-4를 제외한 모든 변이체가 인테그린 α4의 리간드인 인간 OPN RAA Nhalf 단백질과의 결합능을 가지고 있었다. 웨스턴블로팅의 결과로부터, 9-5-4 변이체는 결합능이 없는 것이 아니라, 배양 상청중으로의 분비량이 적은 것이 원인으로 추측된다.

(실시예 4) 내재적 1-2-1 변이체의 발현 해석

(1) 항1-2-1 변이체 항체의 제작

1-2-1 변이체 특이적 아미노산 서열인 GSISKYRART(서열 번호 15)를 항원으로하여 토끼 폴리클로날 항체를 제작하고, 내재적인 1-2-1 변이체의 발현 해석을 행하였다. 구체적으로는, 1-2-1 변이체 특이적 아미노산 서열인 GSISKYRART 서열(서열 번호 15)에 소 티로글로불린을 캐리어 도입하고, 토끼에 면역했다. 항혈청을 GSISKYRART 펩티드(서열 번호 15)를 결합시킨 티올세파로즈비즈(GE)를 사용하여 정제하여, 항1-2-1 변이체 항체를 얻었다.

(2) 배양 상청의 조제

COS1 세포(ATCC, CRL-1650)에서의 일과성의 α4 인테그린 변이체(1-2-1 변이체)의 과잉 발현은, Lipofectamine2000(Invitrogen)을 사용하여 실시예 2에서 작성한 1-2-1 변이체의 발현 벡터를 COS1 세포(ATCC, CRL-1650)에 도입함으로써 행하였다. DMEM(혈청 없음)에서 2일간 배양을 계속하고, 배양 상청과 세포를 회수했다. 배양 상청은, Vivaspin(GE)에 의해 10배로 농축하고, 웨스턴블로팅에 사용하였다. 또한 Jurkat 세포(ATCC, TIB-152)와 Rec-1 세포(ATCC, CRL-3004)를 TIL 배지(가부시키가이샤 면역 생물 연구소)에서 무혈청 배양하고, 3일 후의 배양 상청을 Vivaspin으로 20배로 농축하고, 웨스턴블로팅에 사용하였다.

(3) 웨스턴블로팅에 의한 발현 확인

웨스턴블롯은, SDS-PAGE 후, i㎜obilon-P 멤브레인(밀리포어)에 전사하였다. 모든 α4 변이체에는 FLAG 태그가 부착되어 있으므로, COS 세포에서의 인테그린 α4 변이체(1-2-1 변이체)의 발현은 항FLAG 항체(와코)에서 블로팅했다. 또한, 내재성 인테그린 α4 변이체(1-2-1 변이체)의 발현은 상기 방법에 의해 제작한 항1-2-1 변이체 항체에 의해 블로팅했다. 발광·검출은 ECL-plus(퍼킨엘머)를 사용하였다.

웨스턴블로팅의 결과로부터, Rec-1 세포(ATCC, CRL-3004)에서, 1-2-1 변이체를 도입한 COS 세포의 배양 상청과 같은 위치에 밴드가 확인되었다(도 7). 즉, Rec-1 세포에는 내재적으로 1-2-1 변이체가 단백질 레벨로 발현 및 분비하고 있는 것으로 나타났다.

(실시예 5) 1-2-1 변이체의 인테그린 α4, 인테그린 α9를 개재시키는 세포 접착 저해 기능

(1) GST 융합 1-2-1 변이체 단백질의 제작

1-2-1 변이체의 기능을 해석하기 위하여, GST 융합 단백질로서 대장균에 발현시키고, 글루타티온세파로오스를 사용한 통상적인 방법에 의해 정제를 행하였다. 인테그린 α4 변이체(1-2-1 변이체) 단백질을 대장균에 의해 제작하기 위하여, pGEX6P-1(GE)에 1-2-1 변이체를 재조합하였다. 1-2-1의 N 말단의 시그널 서열을 결손시키도록 설계한 5' 말단 프라이머(5'-GAGGAATTCTACAACGTGGACACTGAGAG-3': 서열 번호 35)와 3' 말단 프라이머(5'-CGTCTCGAGTTATGTCCTAGCTCTGTACTTGC-3': 서열 번호 36)를 사용하여, 1-2-1 변이체 발현 벡터를 템플레이트에 PCR을 행하였다. PCR 산물을 EcoRI와 XhoI 제한 효소로 소화한 후, pGEX6P-1 벡터에 프레임이 GST부와 합치하도록 삽입하였다. 서열은 시퀀싱에 의해 확인하였다. 본 플라스미드를 대장균에 형질 전환하고, 암피실린을 함유하는 LB 배지중, 37℃에서 증식시켜, 대수 증식기에 20℃에서 1시간 배양한 후, 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도 0.3 mM이 되도록 첨가하고, 20℃에서 하룻밤 후 배양했다. 대장균을 회수하고, NETN150(20mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5%(v/v) NP-40)으로 현탁한 후, 초음파 파쇄기로 대장균을 소니케이션(sonication)했다. 원심분리 후 상청에, 글루타티온 비즈(GE)를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 회전시켰다. 원심분리에 의해 비즈를 회수하고 NETN100(20mM Tris-HCl(pH 8.0), 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5%(v/v) NP-40)으로 3회 세정한 후, 용출액(20mM 환원형 글루타티온(Sigma), 100mM Tris-HCl(pH 8.8))으로 용출시켰다. 얻어진 GST 융합 1-2-1 변이체 단백질은 PBS에 대하여 투석한 후, 프로테인 어세이 키트(BioRad)에 의해 정량했다.

(2) 인테그린 α4, 또는 인테그린 α9를 발현하는 CHO 세포(각각 "mα4/CHO", 또는 "mα9/CHO"라고 함)의 제작법

마우스 α4 인테그린(본 명세서에 있어서 "mα4"라고 함) 발현 벡터는, mα4-Fw 프라이머(5'-CGAGGATCCTGAATGTTCTCCACCAAGAGC-3': 서열 번호 37)와 mα4-RV 프라이머(5'-TTACTCGAGACGGGTCTTCTGAACAGGATT-3': 서열 번호 38)를 사용하고, 마우스 멜라노마 세포주 B16-F10(ATCC, CRL-6475)를 템플레이트로 하여 PCR을 행하고, PCR 산물을 제한 효소 BamHI과 XhoI으로 절단한 후, pcDNA3.1 벡터(Invitrogen)에 클로닝을 행하여 제작하였다.

마우스 α9 인테그린(본 명세서에 있어서 "mα9"라고 함) 발현 벡터는, 이하의 방법에 의해 구축하였다. mα9-Fw 프라이머(5'-GCTAAGCTTCTCTCGACTGTAGCCCATCG-3': 서열 번호 39)와 mα9-RV 프라이머(5'-CCATCTAGAGCAACTGCTGAGAGGAAACC-3': 서열 번호 40)를 사용하여, 마우스 태반으로부터 제작한 cDNA를 템플레이트로 하여 PCR을 행하고, TOPO 클로닝 키트(Invitrogen)에 의해 먼저 클로닝을 행하였다(mα9/TOPO). 시퀀싱에 의해 마우스α9 인테그린 서열을 확인한 후, FLAG 태그를 부가시킨 mα9 인테그린 발현 벡터를 제작하기 위하여, mα9-Fw프라이머와 mα9-FLAG-RV 프라이머(5'-CTGTCTAGATTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCCTGGTTTTTCTGGACCCAGTC-3': 서열 번호 41)를 사용하여 mα9/TOPO를 템플레이트로 하여 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 제한 효소 HindIII와 XbaI으로 절단한 후, pcDNA3.1 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 제작하였다.

마우스 α4 인테그린과 α9 인테그린 각각에 대하여 구축된 벡터는 시퀀싱법에 의해 서열 확인을 행하였다. CHO-K1 세포(ATCC, CCL-61)에 lipofectamine2000(Invitrogen)을 사용하여 각각의 유전자 도입을 행하였고, 항생 물질로서 1 mg/mL G418(PAA)을 포함한 DMEM, 10% FCS에 의해 셀렉션한 후, 한외 희석을 행하여 싱글 콜로니 중의 마우스 α4 인테그린, 마우스 α9 인테그린의 발현을 확인하였다. 마우스 α4 인테그린의 발현은, 항마우스 α4 인테그린 항체(R1-2)(Biolegend)에 의한 플로사이토메트리(flow cytometry) 해석에 의해 행하였고, 마우스 α9 인테그린의 발현은, 항FLAG 항체(와코)를 사용한 웨스턴블로팅에 의해 행하였고, 가장 고발현의 클론을 세포 접착 저해 활성 시험에 사용하였다.

(3) 세포 접착 저해 활성 시험

얻어진 정제 GST 융합 1-2-1 변이체 단백질(1-2-1/GST)을 사용하여, 세포 접착 저해 시험을 행하였다. 세포 접착 시험 시에는, 각종 세포외 매트릭스 단백질의 기능 부위 펩티드, 구체적으로는 하기 펩티드를 BSA에 결합시킨 것을 각종 인테그린 리간드로서 사용하였다: 5μg/mL의 GRGDS(서열 번호 42) 펩티드(αv 인테그린 등의 RGD 의존성 인테그린을 통한 세포 접착용 펩티드: 네가티브 컨트롤), 10μg/mL의 SVVYGLR(서열 번호 20) 펩티드(OPN의 기능 펩티드이며, 인테그린 α4, 인테그린 α9와 결합함으로써 세포 접착능을 나타냄), 10μg/mL의 QDHSFSIVIETVQ(서열 번호 21) 펩티드(pp-vWF의 기능 펩티드이며, 인테그린 α4, 인테그린 α9와 결합함으로써 세포 접착능를 나타냄).

BSA를 커플링시킨 세포외 매트릭스 단백질의 기능 부위 펩티드를 4℃에서 하룻밤 방치하여 고상했다. 0.5% BSA를 포함하는 DMEM 배지에서 1시간 블로킹한 후, α4 인테그린, α9 인테그린을 발현하는 CHO 세포와, 1-2-1/GST 단백질(각각, 최종 농도, 6.25μg/mL, 12.5μg/mL, 및 25μg/mL)의 혼합물을 첨가하고 CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃에서, 1시간 배양했다. PBS로 비접착 세포를 제거하고, 0.5%의 크리스탈 바이올렛을 포함하는 20% 메탄올로 접착 세포를 고정하고, 염색하였다. 20%의 아세트산으로 용해 전이하고 595 ㎚의 흡광도를 이뮤노리더(immuno-reader)로 측정함으로써 세포 접착 저해 효과를 검토했다.

(4) 결과

1-2-1/GST 단백질은, RGD 의존성 세포 접착에는 저해능을 전혀 가지지 않지만, 인테그린 α4, 인테그린 α9와 결합능을 가지는 SVVYGLR(서열 번호 20) 펩티드나 QDHSFSIVIETVQ(서열 번호 21) 펩티드 의존성의 세포 접착을 농도 의존적으로 저해하는 것을 알았다(도 8). 즉, 1-2-1/GST 단백질은, 인테그린 α4, 인테그린 α9를 개재시키는 세포 접착을 동시에 저해하는 기능을 가지는 것을 알았다. 또한, 마찬가지로 피브로넥틴 EIIIA에 대하여 접착 저해 활성을 측정한 결과, 1-2-1/GST 단백질은, 인테그린 α4, 인테그린 α9를 개재시키는 세포 접착을 동시에 저해하는 기능을 가지고 있었다(도시하지 않음). OPN은 동맥 경화, 심근경색, 암전이, 및 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 ITG-α4 변이체는, OPN과 인테그린 α4 및 인테그린 α9의 양쪽을 개재한 접착을 저해할 수 있으므로, 이들 질환의 보다 효과적인 치료약이 될 수 있는 것을 나타낸다. 또한, pp-vWF는, 혈전, 혈소판 기능, 염증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 ITGα4 변이체는, pp-vWF와 인테그린 α4 및 인테그린 α9의 양쪽을 개재시키는 접착을 저해할 수 있으므로, 보다 효과적인 염증성 질환(일본 특허출원 공개번호 2005-298336) 등의 치료제가 될 수 있는 것을 나타낸다. 나아가서는, 피브로넥틴 EIIIA(별명 EDA)는, 암(Clin. Chim. Acta. (2006) 372: 83-93)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 ITGα4 변이체는, 피브로넥틴 EIIIA와 인테그린 α4 및 인테그린 α9의 양쪽을 개재시키는 접착을 저해할 수 있으므로, 보다 효과적인 암의 치료약 또는 암전이 억제제가 될 수 있는 것을 나타낸다.

(실시예 6) 인테그린 α4 변이체 1-2-1 단백질에 의한 EAE 억제 효과

EAE 모델을 사용하여, 1-2-1/GST 단백질에 의한 질환 악화 억제 효과에 대하여 검토를 행하였다. EAE 모델은, PLP139-151 펩티드(서열: HSLGKWLGHPDKF: 서열 번호 43) 200μg과 CFA의 emulsion을 SJL/J마우스(일본 찰즈 리버)의 미근부(尾根部)에 피하 투여하고, 같은 날에 백일해 독소(ListBiological Laboratories)(400 ng)를 정맥내 주사하고, 또한 2일 후에도 백일해 독소(400 ng)를 정맥내 주사함으로써 발증시켰다. 1-2-1/GST 단백질 또는 GST 단백질(네가티브 컨트롤) 50μg을, PLP139-151 펩티드를 투여하기 전날에 복강 내에 투여했다. EAE의 임상 스코어는 다음과 같이 하여 채점하였다. 0. 증상 없음, 1. 꼬리 마비, 2. 운동 실조, 3. 후지(後肢)의 가벼운 마비, 4. 후지의 마비, 5. 사지 마비 및 요실금, 6. 빈사, 7. 사망. 1-2-1/GST 단백질에 의한 EAE의 영향에 대한 검토 스케줄을 도 9에 나타내었다.

본 검토를 행한 결과, 1-2-1/GST 단백질은, 발증일(onset)의 지연, 또한 EAE 스코어의 극적인 억제를 나타낸 것이 발견되었다(도 9). EAE 모델은, 다발성 경화증의 모델이므로, 본 실험의 결과로부터 본 발명의 ITG-α4 변이체가, 다발성 경화증의 치료약 또는 예방약이 되는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> IMMUNO-BIOLOGICAL LABOLATORIES CO., LTD <120> Soluble alpha 4 integrin mutant <130> PW12014IB <150> JP2011-146164 <151> 2011-06-30 <160> 43 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> integrin binding sequence <400> 1 Arg Gly Asp 1 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> integring binding sequence <400> 2 Leu Asp Val 1 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> integrin binding sequence <400> 3 Gln Ile Asp Ser Pro Leu 1 5 <210> 4 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Trp Glu Ala Arg Arg Glu Pro Gly Pro Arg Arg Ala Ala Val 1 5 10 15 Arg Glu Thr Val Met Leu Leu Leu Cys Leu Gly Val Pro Thr Gly Arg 20 25 30 Pro Tyr Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His 35 40 45 Asn Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn 50 55 60 Arg Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala 65 70 75 80 Ser Val Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys 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His Thr Thr Glu Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 Pro Gln His Glu Gln Ile Gly Lys Ala Tyr Ile Phe Ser Ile Asp Glu 275 280 285 Lys Glu Leu Asn Ile Leu His Glu Met Lys Gly Lys Lys Leu Gly Ser 290 295 300 Tyr Phe Gly Ala Ser Val Cys Ala Val Asp Leu Asn Ala Asp Gly Phe 305 310 315 320 Ser Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn 340 345 350 Ala Met Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe 355 360 365 Gly Glu Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu 370 375 380 Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gln Glu Asp Asp Leu Gln Gly Ala Ile 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Asn Gly Arg Ala Asp Gly Ile Ser Ser Thr Phe Ser Gln 405 410 415 Arg Ile Glu Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ser Leu Ser Met Phe Gly Gln 420 425 430 Ser Ile Ser Gly Gln Ile Asp Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Val Asp Val 435 440 445 Ala Val Gly Ala Phe Arg Ser Asp Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Arg 450 455 460 Pro Val Val Ile Val Asp Ala Ser Leu Ser His Pro Glu Ser Val Asn 465 470 475 480 Arg Thr Lys Phe Asp Cys Val Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Cys Ile 485 490 495 Asp Leu Thr Leu Cys Phe Ser Tyr Lys Gly Lys Glu Val Pro Gly Tyr 500 505 510 Ile Val Leu Phe Tyr Asn Met Ser Leu Asp Val Asn Arg Lys Ala Glu 515 520 525 Ser Pro Pro Arg Phe Tyr Phe Ser Ser Asn Gly Thr Ser Asp Val Ile 530 535 540 Thr Gly Ser Ile Gln Val Ser Ser Arg Glu Ala Asn Cys Arg Thr His 545 550 555 560 Gln Ala Phe Met Arg Lys Asp Val Arg Asp Ile Leu Thr Pro Ile Gln 565 570 575 Ile Glu Ala Ala Tyr His Leu Gly Pro His Val Ile Ser Lys Arg Ser 580 585 590 Thr Glu Glu Phe Pro Pro Leu Gln Pro Ile Leu Gln Gln Lys Lys Glu 595 600 605 Lys Asp Ile Met Lys Lys Thr Ile Asn Phe Ala Arg Phe Cys Ala His 610 615 620 Glu Asn Cys Ser Ala Asp Leu Gln Val Ser Ala Lys Ile Gly Phe Leu 625 630 635 640 Lys Pro His Glu Asn Lys Thr Tyr Leu Ala Val Gly Ser Met Lys Thr 645 650 655 Leu Met Leu Asn Val Ser Leu Phe Asn Ala Gly Asp Asp Ala Tyr Glu 660 665 670 Thr Thr Leu His Val Lys Leu Pro 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Tyr Cys Ile Lys Ala Asp Pro His 885 890 895 Cys Leu Asn Phe Leu Cys Asn Phe Gly Lys Met Glu Ser Gly Lys Glu 900 905 910 Ala Ser Val His Ile Gln Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ile Leu Glu Met 915 920 925 Asp Glu Thr Ser Ala Leu Lys Phe Glu Ile Arg Ala Thr Gly Phe Pro 930 935 940 Glu Pro Asn Pro Arg Val Ile Glu Leu Asn Lys Asp Glu Asn Val Ala 945 950 955 960 His Val Leu Leu Glu Gly Leu His His Gln Arg Pro Lys Arg Tyr Phe 965 970 975 Thr Ile Val Ile Ile Ser Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Ile Val Leu 980 985 990 Leu Leu Ile Ser Tyr Val Met Trp Lys Ala Gly Phe Phe Lys Arg Gln 995 1000 1005 Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Glu Asn Arg Arg Asp Ser Trp Ser 1010 1015 1020 Tyr Ile Asn Ser Lys Ser Asn Asp Asp 1025 1030 <210> 11 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Trp Glu Ala Arg Arg Glu Pro Gly Pro Arg Arg Ala Ala Val 1 5 10 15 Arg Glu Thr Val Met Leu Leu Leu Cys Leu Gly Val Pro Thr Gly Arg 20 25 30 Pro Tyr Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His 35 40 45 Asn Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn 50 55 60 Arg Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala 65 70 75 80 Ser Val Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys Asn 85 90 95 Pro Gly Gln Thr Cys Glu Gln Leu Gln Leu Gly Ser Pro Asn Gly Glu 100 105 110 Pro Cys Gly Lys Thr Cys Leu Glu Glu Arg Asp Asn Gln Trp Leu Gly 115 120 125 Val Thr Leu Ser Arg Gln Pro Gly Glu Asn Gly Ser Ile Val Thr Cys 130 135 140 Gly His Arg Trp Lys Asn Ile Phe Tyr Ile Lys Asn Glu Asn Lys Leu 145 150 155 160 Pro Thr Gly Gly Cys Tyr Gly Val Pro Pro Asp Leu Arg Thr Glu Leu 165 170 175 Ser Lys Arg Ile Ala Pro Cys Tyr Gln 180 185 <210> 12 <211> 384 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Trp Glu Ala Arg Arg Glu Pro Gly Pro Arg Arg Ala Ala Val 1 5 10 15 Arg Glu Thr Val Met Leu Leu Leu Cys Leu Gly Val Pro Thr Gly Arg 20 25 30 Pro Tyr Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His 35 40 45 Asn Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn 50 55 60 Arg Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala 65 70 75 80 Ser Val Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys Asn 85 90 95 Pro Gly Gln Thr Cys Glu Gln Leu Gln Leu Gly Ser Pro Asn Gly Glu 100 105 110 Pro Cys Gly Lys Thr Cys Leu Glu Glu Arg Asp Asn Gln Trp Leu Gly 115 120 125 Val Thr Leu Ser Arg Gln Pro Gly Glu Asn Gly Ser Ile Val Thr Cys 130 135 140 Gly His Arg Trp Lys Asn Ile Phe Tyr Ile Lys Asn Glu Asn Lys Leu 145 150 155 160 Pro Thr Gly Gly Cys Tyr Gly Val Pro Pro Asp Leu Arg Thr Glu Leu 165 170 175 Ser Lys Arg Ile Ala Pro Cys Tyr Gln Asp Tyr Val Lys Lys Phe Gly 180 185 190 Glu Asn Phe Ala Ser Cys Gln Ala Gly Ile Ser Ser Phe Tyr Thr Lys 195 200 205 Asp Leu Ile Val Met Gly Ala Pro Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Gly Ser 210 215 220 Leu Phe Val Tyr Asn Ile Thr Thr Asn Lys Tyr Lys Ala Phe Leu Asp 225 230 235 240 Lys Gln Asn Gln Val Lys Phe Gly Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val Gly 245 250 255 Ala Gly His Phe Arg Ser Gln His Thr Thr Glu Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 Pro Gln His Glu Gln Ile Gly Lys Ala Tyr Ile Phe Ser Ile Asp Glu 275 280 285 Lys Glu Leu Asn Ile Leu His Glu Met Lys Gly Lys Lys Leu Gly Ser 290 295 300 Tyr Phe Gly Ala Ser Val Cys Ala Val Asp Leu Asn Ala Asp Gly Phe 305 310 315 320 Ser Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn 340 345 350 Ala Met Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe 355 360 365 Gly Glu Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu 370 375 380 <210> 13 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ala Trp Glu Ala Arg Arg Glu Pro Gly Pro Arg Arg Ala Ala Val 1 5 10 15 Arg Glu Thr Val Met Leu Leu Leu Cys Leu Gly Val Pro Thr Gly Arg 20 25 30 Pro Tyr Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His 35 40 45 Asn Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn 50 55 60 Arg Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala 65 70 75 80 Ser Val Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys Asn 85 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300 Tyr Phe Gly Ala Ser Val Cys Ala Val Asp Leu Asn Ala Asp Gly Phe 305 310 315 320 Ser Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn 340 345 350 Ala Met Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe 355 360 365 Gly Glu Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu 370 375 380 Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gln Glu Asp Asp Leu Gln Gly Ala Ile 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Asn Gly Arg Ala Asp Gly Ile Ser Ser Thr Phe Ser Gln 405 410 415 Arg Ile Glu Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ser Leu Ser Met Phe Gly Gln 420 425 430 Ser Ile Ser Gly Gln Ile Asp Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Val Asp Val 435 440 445 Ala Val Gly Ala Phe Arg Ser Asp Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Arg 450 455 460 Pro Val Val Ile Val Asp Ala Ser Leu Ser His Pro Glu Ser Val Asn 465 470 475 480 Arg Thr Lys Phe Asp Cys Val Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Cys Ile 485 490 495 Asp Leu Thr Leu Cys Phe Ser Tyr Lys Gly Lys Glu Val Pro Gly Tyr 500 505 510 Ile <210> 14 <211> 640 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Trp Glu Ala Arg Arg Glu Pro Gly Pro Arg Arg Ala Ala Val 1 5 10 15 Arg Glu Thr Val Met Leu Leu Leu Cys Leu Gly Val Pro Thr Gly Arg 20 25 30 Pro Tyr Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His 35 40 45 Asn Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn 50 55 60 Arg Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala 65 70 75 80 Ser Val Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys Asn 85 90 95 Pro Gly Gln Thr Cys Glu Gln Leu Gln Leu Gly Ser Pro Asn Gly Glu 100 105 110 Pro Cys Gly Lys Thr Cys Leu Glu Glu Arg Asp Asn Gln Trp Leu Gly 115 120 125 Val Thr Leu Ser Arg Gln Pro Gly Glu Asn Gly Ser Ile Val Thr Cys 130 135 140 Gly His Arg Trp Lys Asn Ile Phe Tyr Ile Lys Asn Glu Asn Lys Leu 145 150 155 160 Pro Thr Gly Gly Cys Tyr Gly Val Pro Pro Asp Leu Arg Thr Glu Leu 165 170 175 Ser Lys Arg Ile Ala Pro Cys Tyr Gln Asp Tyr Val Lys Lys Phe Gly 180 185 190 Glu Asn Phe Ala Ser Cys Gln Ala Gly Ile Ser Ser Phe Tyr Thr Lys 195 200 205 Asp Leu Ile Val Met Gly Ala Pro Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Gly Ser 210 215 220 Leu Phe Val Tyr Asn Ile Thr Thr Asn Lys Tyr Lys Ala Phe Leu Asp 225 230 235 240 Lys Gln Asn Gln Val Lys Phe Gly Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val Gly 245 250 255 Ala Gly His Phe Arg Ser Gln His Thr Thr Glu Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 Pro Gln His Glu Gln Ile Gly Lys Ala Tyr Ile Phe Ser Ile Asp Glu 275 280 285 Lys Glu Leu Asn Ile Leu His Glu Met Lys Gly Lys Lys Leu Gly Ser 290 295 300 Tyr Phe Gly Ala Ser Val Cys Ala Val Asp Leu Asn Ala Asp Gly Phe 305 310 315 320 Ser Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn 340 345 350 Ala Met Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe 355 360 365 Gly Glu Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu 370 375 380 Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gln Glu Asp Asp Leu Gln Gly Ala Ile 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Asn Gly Arg Ala Asp Gly Ile Ser Ser Thr Phe Ser Gln 405 410 415 Arg Ile Glu Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ser Leu Ser Met Phe Gly Gln 420 425 430 Ser Ile Ser Gly Gln Ile Asp Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Val Asp Val 435 440 445 Ala Val Gly Ala Phe Arg Ser Asp Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Arg 450 455 460 Pro Val Val Ile Val Asp Ala Ser Leu Ser His Pro Glu Ser Val Asn 465 470 475 480 Arg Thr Lys Phe Asp Cys Val Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Cys Ile 485 490 495 Asp Leu Thr Leu Cys Phe Ser Tyr Lys Gly Lys Glu Val Pro Gly Tyr 500 505 510 Ile Val Leu Phe Tyr Asn Met Ser Leu Asp Val Asn Arg Lys Ala Glu 515 520 525 Ser Pro Pro Arg Phe Tyr Phe Ser Ser Asn Gly Thr Ser Asp Val Ile 530 535 540 Thr Gly Ser Ile Gln Val Ser Ser Arg Glu Ala Asn Cys Arg Thr His 545 550 555 560 Gln Ala Phe Met Arg Lys Asp Val Arg Asp Ile Leu Thr Pro Ile Gln 565 570 575 Ile Glu Ala Ala Tyr His Leu Gly Pro His Val Ile Ser Lys Arg Ser 580 585 590 Thr Glu Glu Phe Pro Pro Leu Gln Pro Ile Leu Gln Gln Lys Lys Glu 595 600 605 Lys Asp Ile Met Lys Lys Thr Ile Asn Phe Ala Arg Phe Cys Ala His 610 615 620 Glu Asn Cys Ser Ala Asp Leu Gln Val Ser Ala Lys Ile Gly Phe Leu 625 630 635 640 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Ser Ile Ser Lys Tyr Arg Ala Arg Thr 1 5 10 <210> 16 <211> 2 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Asn 1 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Gly Tyr Ala Leu Gln Tyr 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asn Ser Leu Ser Phe Ser Ser 1 5 <210> 19 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Cys Cys Leu 1 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence involved in cell adhesion <400> 20 Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence involved in cell adhesion <400> 21 Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln 1 5 10 <210> 22 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> QT primer for 3'-race <400> 22 ccagtgagca gagtgacgag gactcgagct caagcttttt tttttttttt tt 52 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Q0 primer for 3'-race <400> 23 ccagtgagca gagtgacg 18 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin <400> 24 tgtctcgagt ggccgtttag tgttgaatgt 30 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin <400> 25 actggtggtt gctatggagt a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin <400> 26 cttttcggtc tgattctgct g 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 gaggactcga gctcaagc 18 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 cacttcagcc aattcttcag c 21 <210> 29 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin mutant 1-1-2 <400> 29 ttactctaga ctatttatcg tcatcatctt tgtagtcatt accttcaaag ccatcatt 58 <210> 30 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin mutant 1-2-1 <400> 30 tcgttctaga ctatttatcg tcatcatctt tgtagtctgt cctagctctg tacttgct 58 <210> 31 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin mutant 7-3-2 <400> 31 ccactctaga ctatttatcg tcatcatctt tgtagtcata ttgtagggca tacccacc 58 <210> 32 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin mutant 10-6-3 <400> 32 ttgatctaga ctatttatcg tcatcatctt tgtagtctga ggaaaagctg agagagtt 58 <210> 33 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin mutant 10-7-2 <400> 33 cccatctaga ctatttatcg tcatcatctt tgtagtcgag acaacacttc aaaaaccc 58 <210> 34 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for human alpha 4 integrin mutant 9-5-4 <400> 34 cgtttctaga ctatttatcg tcatcatctt tgtagtcctt caaaaaccca atctttgc 58 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5' primer for N-terminal signal sequence lacked alpha 4 integrin mutant 1-2-1 <400> 35 gaggaattct acaacgtgga cactgagag 29 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3' primer for N-terminal signal sequence lacked alpha 4 integrin mutant 1-2-1 <400> 36 cgtctcgagt tatgtcctag ctctgtactt gc 32 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR <400> 37 cgaggatcct gaatgttctc caccaagagc 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR <400> 38 ttactcgaga cgggtcttct gaacaggatt 30 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR <400> 39 gctaagcttc tctcgactgt agcccatcg 29 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR <400> 40 ccatctagag caactgctga gaggaaacc 29 <210> 41 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR <400> 41 ctgtctagat tacttgtcat cgtcatcctt gtagtcctgg tttttctgga cccagtc 57 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence involved in cell adhesion <400> 42 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide used to develop EAE model mouse <400> 43 His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe 1 5 10

Claims

인간 인테그린 α4의 세포외 영역의 일부를 가지는 인테그린 α4 변이체.
제1항에 있어서,
인간 인테그린 α4의 세포외 영역이, 인간 인테그린 α4의 β-프로펠러(propellor) 도메인 유래의 아미노산 서열을 포함하고 있는, 펩티드.
제1항에 있어서,
인간 인테그린 α4의 세포외 영역이, 서열 번호 9 및 서열 번호 11∼14로부터 선택되는 하나의 서열인, 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 15∼19로부터 선택되는 하나의 서열이 인간 인테그린 α4(서열 번호 10)의 세포외 영역의 C 말단에 결합되어 있는, 펩티드.
서열 번호 4∼9로부터 선택되는 하나의 서열을 가지는 펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
인테그린 α4의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α4와 그 리간드와의 결합을 저해하는 펩티드.
제6항에 있어서,
인테그린 α4의 리간드가, 혈관 세포 접착 분자 1, 피브로넥틴, 접합부 접착 분자 2, 점막 아드레신 세포 접착 분자 1, 인간 임파구 발현 메탈로프로테이나제 유사 디스인테그린 유사 시스테인 풍부 단백질 패밀리 멤버 L, 폰빌레브란트 인자(von willebrand factor) 및 오스테오폰틴(osteopontin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 물질인 펩티드.
제6항에 있어서,
인테그린 α4의 리간드가 폰빌레브란트 인자 또는 오스테오폰틴(OPN)인, 펩티드.
제6항에 있어서,
인테그린 α4의 리간드가 서열 번호 20 또는 21의 아미노산 서열을 가지는, 펩티드.
제1한 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
인테그린 α9의 리간드와 결합하고, 또한/또는, 인테그린 α9와 그 리간드와의 결합을 저해하는 펩티드.
제10항에 있어서,
인테그린 α9의 리간드가, 혈관 세포 접착 분자 1, 피브로넥틴, 접합부 접착 분자 2, 점막 아드레신 세포 접착 분자 1, 인간 임파구 발현 메탈로프로테이나제 유사 디스인테그린 유사 시스테인 풍부 단백질 패밀리 멤버 L, 폰 빌레브란트 인자 및 오스테오폰틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 물질인, 펩티드.
제10항에 있어서,
인테그린 α9의 리간드가 폰빌레브란트 인자 또는 OPN인, 펩티드.
제10항에 있어서,
인테그린 α9의 리간드가 서열 번호 20 또는 21의 아미노산 서열을 가지는 펩티드인, 펩티드.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
가용성 펩티드인, 펩티드.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체.
제16항에 있어서,
인테그린 α4를 인식하지 않는 항체.