KR100628818B1 - 인테그린 길항제를 사용하여 다발성 골수종 및 골수종에의한 골흡수를 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

알파4 인테그린/알파4 인테그린 리간드 부착의 길항제는 상기 부착의 생물학적 효과를 저해하는 것으로 설명되고, 이것의 용도를 위한 방법이 설명되었다. 상기 길항제는 다발성 경화증과 관련된 골흡수를 억제하는 데 사용된다. 다발성 경화증을 가진 환자에서 골파괴를 야기하는 다발성 경화증 세포의 골수로의 회귀 및 골흡수 인자의 알파4 인테그린-의존성 방출을 저해한다.

Description

인테그린 길항제를 사용하여 다발성 골수종 및 골수종에 의한 골흡수를 치료하는 방법{METHODS OF TREATING MULTIPLE MYELOMA AND MYELOMA-INDUCED BONE RESORPTION USING INTEGRIN ANTAGONISTS}

본 발명은 인간에서 골수종의 주요 부작용인 심각한 골손상을 야기하는 골수종 세포에 의한 골흡수 인자의 방출 및 다발성 골수종을 위한 치료에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 다발성 골수종 환자에서 골파괴를 야기하는 다발성 골수종 세포의 골수로의 회귀; 이들의 인테그린-의존성 생존; 및 골흡수 인자의 인테그린-의존성 방출과 관련된 상기 부착의 생물학적 효과를 저해하는 인테그린 길항제, 예컨대 알파4 함유 인테그린의 길항제에 관한 것이다.

다발성 골수종은 두번째로 일반적인 혈액 종양으로써, 매년 15,000종의 신규 사례가 진단되고 미국에서 매년 30,000 내지 40,000 골수종 환자가 존재한다(Mundy and Bertolini 1986). 환자의 80%는 파골세포(OCL) 형성 및 활성의 증가에 의한 파괴적인 용골성(osteolytic) 골파괴로 고통받는다(Mundy and Bertolini 1986). 상기 골파괴는 몹시 괴로운 뼈의 통증, 병리학적 골절, 골수 압박 및 생명을 위협하는 과칼슘혈증을 일으킬 수 있다. 다발성 골수종이 표준 화학요법 또는 간세포 이식에 의하여 치유될 수 없기 때문에(Attal et al, 1996), 또한 골수종 골질환과 관련된 심각한 이환율(morbidity) 및 치사가능성 때문에, 골수종 성장 자체 및 특히 상기 환자에서 발생하는 용골성 골파괴를 통제하는 치료 방법은 매우 중요하다.

그러나, 다발성 골수종의 환자에서 파골세포 활성의 증가를 야기하는 병리학적 메카니즘은 알려지지 않았다(Mundy, 1998). 골손상은 여러 유형으로 일어난다. 종종, 환자는 단독 형질구종과 관련된 분리된 용골성 손상을 발전시킨다. 일부 환자는 골다공증의 외관과 유사한 분산된 골감소증을 가지며, 이것은 골격 축을 통하여 분산되게 흩어져 있는 골수종 세포에 기인한다. 대부분의 환자에서, 골수종 세포의 집단 주변에서 발생하는 다발성의 불연속 용해성 손상이 존재한다. 과칼슘혈증은 질병이 진행된 환자의 약 3분의 1에서 골파괴의 결과로서 발생한다. 희귀하게도, 골수종 환자는 골손실 또는 용해성 손상을 갖지 않지만, 골수종 세포 주위의 신생 뼈의 형성이 증가한다. 이 드문 현상은 골경화성 골수종으로서 알려졌다.

용골성 골손상은 골수종 환자에서 가장 공통적으로 나타나는 골격 징후이다(Mundy, 1998). 정확한 분자 메카니즘이 불명료하지만, 15년 동안의 관찰을 통해 1) 골수종에서 뼈가 파괴되는 메카니즘은 파골세포, 정상 골흡수 세포에 의한다; 2)파골세포는 골수종 세포의 집합 주위의 골수종에서 골흡수 표면 상에 축적되며, 이는 파골세포가 골수종에서 자극되는 메카니즘이 국소적이라는 것을 나타낸다; 3) 시험관내 인간 골수종 세포의 배양은 파골세포 활성화 인자, 예를 들면, 림포톡신-알파(LT-α), 인터루킨-1(IL-1), 부갑상선 호르몬 관련된 단백질(PTHrP) 및 인터루킨-6(IL-6)을 생산하는 것으로 수년간 알려졌다; 4) 골수종 환자의 약 3분의 1에서 질병의 진행 중 일시적으로 과칼슘혈증이 발생한다. 과칼슘혈증은 현저 한 골흡수 증가와 항상 관련되며, 집괴 여과시 손상과 종종 관련된다.

용골성 골질환의 다른 유형의 환자와는 달리, 혈청내 알카리 포스파타제 활성이 감소되거나 또는 정상 범위이고, 방사핵종 검사는 흡수 증가의 증거를 보여주지 않으며, 이는 골흡수의 증가에 대한 손상된 파골세포 반응을 나타낸다.

상술된 다양한 매개자가 다발성 골수종의 환자에서 파골세포 활성의 자극에 관여되어 있지만, 골수종 세포에 의하여 생성된 인자의 보고가 일관성이 없고, 일부 연구는 다발성 골수종 세포 집단에서 간질 세포 및 대식세포를 비롯한 기타 오염성 세포 유형의 존재로 인하여 결정적이지 않았다. IL-6은 환자에서 분리된 신선한 골수종 세포 및 일부 골수종 세포주의 성장을 향상시키는 주요 골수종 성장 인자이다(Bataille et al., 1989). IL-6 생성은 PCR에 의하여 신선하게 분리된 골수종 세포의 약 40%에서 검출될 수 있으며, 연구된 150명의 환자 중 1명이 면역세포화학 또는 ELISA 분석에 의하여 검출가능한 IL-6 생성을 나타낸다(Epstein 1992). IL-6 수용기는 다발성 골수종 환자에서 유래한 13개의 표본 중 6개에서만 검출되었다(Bataille et al., 1992). 게다가, 성숙한 골수종 세포는 IL-6에 최소 증식성 반응을 하는 것으로 보고되었다. 인터루킨-11(IL-11)은 형질구종에서 IL-6 유사 활성을 갖지만, 지금까지 골수종 세포가 IL-11을 생성함을 누구도 증명하지 못하였다. Bataille 및 협력자들은(1995) 5명의 난치 골수종 환자를 IL-6에 대한 항체로 관류시켜 상기 환자 중 단지 2명에서 골수종 세포 다발의 크기가 감소함을 보여주었다. IL-1은 신부전증이 없는 동물 모델에서 과칼슘혈증을 유도하는 특히 잠재적인 골흡수제이다(Boyce et al., 1989). 반대로, 과칼슘혈증은 신부전증 없는 골수종 환자 에서 드물게 발생한다. 매우 정제된 골수종 세포에서, IL-1이 검출되지 않고 희귀한 TNF-a 생성만이 검출될 수 있다는 것은 매우 중요하며, 이는 대식세포와 같은 기타 오염성 세포 유형이 IL-1 및 TNF-a의 원료일 수 있음을 시사한다(Epstein, 1992). 유사하게는, LT-a는 대부분의 인간 골수종 세포주에 의하여 생성되지만(Bataille et al., 1995), 생체내 골수종 세포에 의하여 생성되는 것처럼 보이지 않는다(Alsina et al., 1996). IL-1, TNF-a, LT-a, 및 IL-6 뿐만 아니라, 골수세포는 생물학적으로 활성인 M-CSF의 절단된 형태를 생성할 수 있으나, M-CSF는 그 자체로 인간 골수 배양에서 과칼슘혈증을 일으키거나 파골세포 형성을 유도하지 않는다(MacDonald et al., 1986).

따라서, 골수종 환자의 용골성 골질환에서 상기 임의의 인자의 역할은 생체내에서 명확하게 제시되지 않았으므로, 공지된 시토킨은 상기 환자에서 관찰된 골흡수를 명확히 전체적으로 설명하지 못한다.

골수종 골질환에서 부착 분자 상호작용의 역할

Anderson 및 협력자들은 골수종 세포의 성장 및 용골성 골질환의 발달 모두에서 골수 미세환경내 세포 및 골수종 세포 간에 부착성 상호작용의 중요성을 보여준 제1 그룹이었다. 다발성 골수종 세포는 세포 표면 부착 분자, CD29(VLA-4), LFA-1, 및 CD44를 발현시킨다(Chauhan et al., 1995). 상기 연구가들은 골수종 세포가 세포외 기질 단백질 및 골수 간질 세포간에 특이적 부착 상호작용을 통하여 골수에 위치함을 제안하였다. 이들은 나아가 간질 세포에 다발성 골수종 세포의 부착이 정상 및 다발성 골수종 골수 유도된 간질 세포 모두에 의하여 IL-6 분비를 유 도하고 IL-6 매개된 종양 세포 성장을 증가시킴을 보여주었다. 그러나, CD29, LFA-1 또는 CD44의 항체는 골수종 세포에 대한 반응으로 골수 간질 세포에 의한 IL-6 생성을 감소시키지 않으며, 이는 또다른 리간드-수용기 상호작용이 골수종 세포에 결합하는 골수 간질 세포에 의하여 IL-6 분비를 자극하는 것을 시사하였다. 가능한 부착 경로의 단순한 동정은 경로가 중요함을 반드시 의미하는 것은 아니다. 이 경우에 연관된 어느 경로의 어느 것도 IL-6 생성에 작용하지 않는다.

Vanderkerken et al(1997)은 또한 뮤린 골수종의 모델에서 뮤린 5T2 세포 및 5T33 골수종 세포의 표현형 부착 개요를 조사하였다. 상기 조사자들은 상기 세포주가 VLA-4, VLA-5, LFA-1 및 CD44를 발현시킴을 보여주었고, 상기 부착성 상호작용은 골수 간질 세포에 결합하는 골수종 세포에서 중요할 것임을 시사하였다.

그렇지만, 많은 실험실의 발전에도 불구하고, 생체내 골수종에서 골경화성 골파괴에 기반이 되는 기초 메카니즘이 충분히 알려지지 않고 있다. 이것은 시험관내에서 얻어진 부착성 상호작용에 대한 데이터가 생체내 환경으로 용이하게 해석되기 어렵다는 것을 반영한다. 예를 들면, 다수의 시험관내 연구는 골수 간질에 조혈 간세포의 부착에서 인테그린 VLA-4 및 인테그린 LFA-1 모두를 연관시켰다(Papayannopoulou and Nakamoto에서 리뷰, 1993). 시험관내 데이타에서 이들은 한 경로가 생체내에서 차단되면 골수에서 말초 혈액으로 조혈 간세포가 말초화될 것을 예측한다. 그러나, 영장류 연구에서, VLA-4에 대한 모노클로날 항체(mAb)는 간세포를 효과적으로 말초화시키지만, LFA-1의 베타2 인테그린 쇄에 대한 모노클로날 항체는 호중구 수를 증가시켜 mAb의 효능을 보여줌에도 불구하고 효과가 없다(Papayannopoulou and Nakamoto, 1993). 상기 데이타는 시험관내 결과가 실제로 생체내 관련성을 정확히 예측할 수 없음을 보여준다.

인테그린 VLA-4의 역할이 상반된 결과를 갖는, 림프종과 같은 백혈병을 비롯한 다발성 종양의 전이에서 연구되었음을 주목해야 한다. 따라서, 차이니즈 햄스터 오버리(CHO) 세포로의 인간 알파4 쇄의 형질전환은 VLA-4를 발현시키고, 상기 세포가 생체내 골수로 이동가능하게 하여, mAb에 의한 VLA-4에 대한 현상이 저해된다(Matsuura et al., 1996). 반대로, VLA-4로 림프종 세포를 형질전환시키면 간, 폐 및 신장으로의 전이를 저해하고 골수에서 회귀 및 증식에 영향을 미치지 못한다(Gosslar et al., 1996). 또한, 고도의 전이성 뮤린 골수종 세포상 VLA-4의 발현은 생체내 폐 전이의 형성을 강하게 저해하여(Qian et al., 1994), 골수종이 골수로 쉽게 전이하지 못하게 한다.

요약하면, 시험관내 연구를 기초로 부착 경로의 생체내 관련성을 확실히 예측하는 방법은 불명확하다. 게다가, 생체내 연구가 수행된 경우라도, 생성된 데이타는 일치하지 않는다. 다발성 골수종의 분야에서 곤란스런 불일치에 대한 주원인은 최근 이용가능한 동물 모델이 인간 질환에 좋은 예측물이 아니라는 점이다. 다발성 골수종의 경우에, 시험관에서 드물게 자랄 수 있는 인간 및 뮤린 골수종 세포주는 생체내 골 파괴와 관련되어 있다(Mundy 1998).

이러한 골 흡수 인자의 생성을 억제하여, 진행성 골 파괴를 중지시키고 골수종 환자의 삶의 질을 향상시키는 화합물 또는 길항제를 동정하는 것이 매우 바람직하다.

발명의 요약

본 발명자는 인간 질병의 모든 징후를 갖는 심각한 골용해를 갖는, 최근에 발달된 다발성 골수종 뮤린 모델을 사용하였다(Garrett 1997). 이러한 세포주 및 동물 모델을 사용하여 본 발명자는 알파4 리간드/알파4 인테그린 리간드의 생체내 경로의 차단이 다발성 골수종 세포의 증식 및/또는 생존 능력을 감소시키도록 유도한다는 것을 확립하였다. 본 발명자는 시험관내 골 미세환경에서 파골세포의 골흡수를 자극하는 활성의 생성 증가를 위하여 VLA-4/VCAM-1 상호작용을 통한 골수종 세포와 골수 간질 세포간의 세포-세포 부착이 요구됨을 보여준다.

본 발명자는 상기 상호작용이 골수 구획으로 골수종 세포의 회귀, 이들의 연이은 생존 및 성장, 궁극적으로 골수종-유도된 골용해의 진행에 중요함을 제안한다. 본 발명자는 동물 모델에서 이것을 시험하여 생체내 알파4 서브유니트를 포함한 인테그린 VLA-4의 길항제가 IgG2 하위유형의 항체 생성을 강하게 억제함을 발견하였다. 상기 이소형은 5TGM1 세포주에 의하여 생성되는 것과 동일하고, 어느때나 골수 구획에서 골수종 세포의 수에 대하여 정확한 대용물이다. 따라서, VLA-4 경로의 차단은 IgG2 생성을 강하게 억제하며, 암시적으로 골수종 다발의 수준을 억제한다.

본 발명의 한 양태는 알파4 서브유니트(예, VLA-4)을 갖는 인테그린과 이 인테그린에 대한 리간드(예, VCAM-1) 간의 상호작용의 길항제를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 다발성 골수종을 치료하는 방법이다. 상기 길항제는 알파4 인테그린 결합제 또는 알파4 인테그린 리간드 결합제일 수 있다. 바람직한 제제는 항-VLA4 또는 항-알파4베타7 항체 상동체(인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이들의 단편); 항-VCAM-1 항체 상동체(인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이들의 단편); 및 알파4 서브유니트를 포함한 인테그린과 이들 리간드의 상호작용을 저해하는 소형 분자일 수 있다. 조성물은 약 0.1 내지 약 20 mg/kg체중을 제공하기 위한 용량으로 투여될 수 있다. 특히, 바람직한 제제는 a) VLA-4 및 알파4베타7 모두와 이들 각각의 알파4리간드와의 집합적; b) VLA-4와 이것의 알파4 리간드만의; 또는 c) 알파4베타7과 알파4 리간드만의; 상호작용을 길항할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는 골수 종양과 관련된 골흡수를 저해하는 방법으로서, 상기 종양을 가진 포유동물에 VLA-4과 같은 알파4 서브유니트를 함유한 인테그린과 VCAM-1과 같은 상기 알파4 서브유니트를 함유한 인테그린에 대한 리간드의 상호작용의 길항제를 골흡수를 저해하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 길항제는 VLA-4 결합제와 같은 알파4 인테그린 결합제 또는 VCAM-1 결합제와 같은 알파4 인테그린 리간드 결합제일 수 있다. 바람직한 제제는 항-VLA4 또는 항 알파4베타7 항체 상동체(인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이들의 단편); 항-VCAM-1 항체 상동체(인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이들의 단편); 및 알파4 서브유니트를 함유한 인테그린과 이들 각각의 알파4 인테그린 리간드의 상호작용(예, VCAM-1/VLA-4 상호작용)을 저해하는 소형 분자이다. 길항제는 약 0.1 내지 약 20 mg/kg체중을 제공하기 위한 용량으로 투여될 수 있다.

그러나, 본 발명의 또다른 양태는 파골세포생성의 존재를 특징으로 하는 질병을 보유한 피검체를 치료하는 방법으로서, 알파4 서브유니트를 보유한 인테그린과 알파4 서브유니트를 보유한 인테그린에 대한 리간드간의 상호작용의 길항제를 파골세포형성과정을 억제하기에 충분한 양으로 피검체에 투여하는 단계를 포함한다. 유사하게, 길항제는 알파4 결합제 또는 알파4 리간드 결합제일 수 있다. 바람직한 제제는 항-VLA4 또는 항-알파4베타7 항체 상동체(인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이들의 단편); 항-VCAM-1 항체 상동체(인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이들의 단편); 및 알파4 서브유니트를 포함한 인테그린과 이들 각 알파4 인테그린 리간드의 상호작용(예, VCAM-1/VLA-4의 상호작용)을 저해하는 소형 분자이다. 조성물은 약 0.1 내지 약 20 mg/kg체중을 제공하기 위한 용량으로 투여될 수 있다. 다른 고려가 없다면, 모든 문헌은 본원에서 참고 문헌으로 인용된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 다발성 골수종을 예방하는 치료법에 관한 것이다. 특히 자세하게는, 본 발명의 방법은 다발성 골수종의 치료에서 알파4 서브유니트를 포함하는 인테그린 및 상기 인테그린에 대한 리간드 간의 상호작용의 길항제의 용도에 관한 것이다. 용어 "다발성 골수종"은 환자에서 환자로 혈장 세포 일족의 다른 단계의 신생 클론을 제시하는 세포와 함께 혈장세포의 신생 질병을 보유한 개체의 의학적 질병을 의미한다(Mundy, 1998).

알파4베타1 인테그린은 VCAM-1, 피브로넥틴 및, 알파4베타1 인테그린과 결합하거나 또는 상호작용이 가능한 기타 분자를 위한 세포-표면 수용체이다. 이런 관점에서, 알파4베타1 서브유니트를 함유하는 인테그린과 결합하거나 또는 상호작용하는 상기 분자는 개별적으로 또는 집합적으로 "알파4 리간드(들)"로 언급된다. 따라서, 본원에서 용어 a4b1 인테그린(상호교환하여 사용되는, "VLA-4" 또는 "a4b1" 또는 "a4b1 인테그린")은 VLA-4에 대한 기타 리간드가 존재할 것이고 통상적 방법을 사용하여 분석될 수 있음이 당업자에 의하여 평가될 수 있지만, VCAM-1과 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 세포외 매트릭스 단백질의 일원, 특히 피브로넥틴, 또는 이들의 상동체 또는 단편으로 언급된다.

그렇지만, 알파4 서브유니트는 베타1 이외의 기타 베타 서브유니트와 연관된 것으로 알려졌기 때문에 본 출원인은 알파4 서브유니트가 베타 서브유니트의 하나 또는 또하나와 연관된 인테그린을 알파4 인테그린으로 정의할 것이다. "알파4"의 추가적 예는 알파4베타7이다(R.Lobb and M Hemler, 1994). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알파4 인테그린"은 베타1, 베타7 또는 기타 베타 서브유니트를 함유하는 인테그린 및 VLA-4를 의미한다.

본원에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용된 길항제는 분자의 구조 또는 특정 형태에 제한되는 것이 아니므로, 본 발명의 목적을 위하여, VLA-4(또는 알파4베타7) 또는 VCAM-1(또는 MadCAM)(즉, "알파4 인테그린 결합제" 및 "알파4 인테그린 리간드 결합체" 각각)를 효과적으로 차단하거나 피복하는, VLA-4 보유 세포의 표면위의 VLA-4와 같은 알파4서브유니트를 함유하는 임의의 인테그린 및/또는 알파4베타7 보유 세포의 표면위의 알파4베타7 인테그린에 결합할 수 있는 제제[참조 Lobb and Hemler, J.Clin.Inrest., 94; 1722-1728 (1994)] 및/또는 VCAM-1 및 MadCAM 보유 세포의 표면 상의 각각 VCAM-1 및 MadCAM과 같은 각 알파4 리간드에 각각 결합할 수 있는 제제가 본원의 실시예에 사용된 길항제의 균등물로 생각된다.

인테그린 "길항제"는 알파4 인테그린(들)이 알파4 인테그린 리간드 및/또는 수용기와 결합하는 것을 저해하는 임의의 화합물을 포함한다. 항-인테그린 항체 또는 항체 상동체-함유 단백질(하기에서 설명) 및 기타 분자, 예를 들면 인테그린을 위한 리간드 단백질의 가용성 형태가 유용한다. 알파4 인테그린을 위한 리간드 단백질의 가용성 형태는 가용성 VCAM-1 또는 콜라겐 펩티드, VCAM-1 융합 단백질 또는 이작용성 VCAM-1/Ig 융합 단백질을 포함한다. 예를 들면, 알파4 인테그린 리간드의 가용성 형태 또는 이들의 단편은 인테그린에 결합하도록 투여될 수 있고, 바람직하게는 세포상의 인테그린 결합 부위에 대하여 경쟁하고, 이에 따라 항-알파4 인테그린과 같은 길항제(예, 알파4베타7 항체 및/또는 VLA-4 항체)의 투여에 유사한 효과를 야기한다. 특히, 알파4 인테그린 리간드에 결합하지만 인테그린-의존성 신호를 유도하지 않는 가용성 알파4 인테그린 돌연변이체가 본 발명의 범위내에 포함된다. 이러한 돌연변이체는 야생형 인테그린 단백질의 경쟁적 저해제로서 작용할 수 있으며 "길항제"로 생각된다. 본 발명의 방법에 사용되는 기타 길항제는 하기에 설명되는 바와 같이, "소형 분자"이다.

본 발명은 단일 소형 분자와 같은 1 이상의 알파4 인테그린의 작용을 길항하는 제제 또는 VLA-4 및 알파4베타7, 수개의 알파4 인테그린 또는 알파4 인테그린의 기타 조합을 길항하는 항제 상동체를 사용하는 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 기타 분자의 조합을 사용하여 조합된 활성이 1 이상의 알파4 인테그린의 작용을 길 항하는 방법, 예를 들면 알파4 인테그린 VLA-4 및 알파4 베타7 또는 인테그린의 기타 조합을 길항하는 수개의 소형 분자 또는 항체 상동체를 사용하는 방법을 포함한다.

본원에서 설명된 바와 같이, 특정 인테그린 길항제는 융합될 수 있거나, 아니면 면역글로블린과 같은 항체 상동체 또는 이들의 단편에 접합될 수 있으며, 인테그린 또는 리간드 또는 기타 분자의 구조 또는 특정 유형에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 융합 단백질(하기에 설명)을 형성할 수 있고 알파4 인테그린 리간드에 결합할 수 있으며 알파4 베타7 및/또는 VLA-4 인테그린을 효과적으로 차단하거나 피복하는 임의의 제제가 본원에 실시예에서 사용된 길항제의 균등물로 생각된다.

본 발명의 목적을 위하여, "알파4 인테그린 리간드/알파4 인테그린 상호작용의 길항제"는 폴리펩티드 또는 기타 분자와 같은 제제를 의미하며, 이는 알파4 리간드(예, VCAM-1) 및/또는 알파4 인테그린(예, 알파4베타7 또는 VLA-4)-매개된 결합을 저해하거나 차단할 수 있거나, 아니면 알파4-리간드 매개된 알파4 인테그린 신호 전달 또는 알파4 리간드-매개된 알파4 리간드 신호 전달을 저해하거나 또는 차단함으로써 알파4 리간드 및/또는 알파4 인테그린 기능을 조절할 수 있으며, 바람직하게는 항-알파4 인테그린 항체와 동일한 방식으로 다발성 골수종의 치료에 효과적이다.

자세히 설명하자면, VCAM-1/VLA-4 상호작용의 길항제는 다음의 성질을 1 이상 갖는 제제이다:(1) VLA-4리간드/VLA-4 상호작용(예, 골 간질 세포와 골수종 세 포간의 VCAM-1/VLA-4 상호작용)을 저해하는데 충분한 특이성을 가지고 VLA-4를 보유한 세포(예, 골수종 세포) 표면위의 VLA-4에 결합하거나 피복하는 성질; (2) VLA-4-매개된 신호(예,VLA-4/VCAM-1 매개된 신호)의 전달을 조절하고, 바람직하게는 저해하는데 충분한 특이성을 가지고 VLA-4를 보유한 세포(예, 골수종 세포)의 표면위의 VLA-4에 결합하거나 피복하는 성질; (3) VLA-4리간드/VCAM 상호작용을 저해하는데 충분한 특이성을 가지고 골 간질 세포 상의 VLA-4 리간드(예, VCAM-1)에 결합하거나 피복하는 성질; (4) VLA-4-리간드 매개된 VLA-4 신호(예, VCAM-1 매개된 신호)의 전달을 조절, 바람직하게는 저해하기에 충분한 특이성을 가지고 골 간질 세포 상의 VLA-4 리간드(예, VCAM-1)에 결합하거나 피복하는 성질. 바람직한 구체예에서 길항제는 성질 1 및 2의 한쪽 또는 양쪽을 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서 길항제는 성질 3 및 4의 한쪽 또는 양쪽을 갖는다. 또한, 1 이상의 길항제, 예를 들면 VLA-4에 결합하는 제제가 VCAM-1에 결합하는 제제와 배합될 수 있는 방식으로 환자에게 투여될 수 있다.

예를 들면, 항체 또는 항체 상동체(하기에 설명) 및 VLA-4 및 VCAM-1에 대한 천연 결합 단백질의 가용성 형태가 유용하다. VLA-4에 대한 천연 결합 단백질의 가용성 형태는 가용성 VCAM-1 펩티드, VCAM-1 융합 단백질, 이작용성 VCAM-1/Ig 융합 단백질, 피브로넥틴, 택일적 스플라이스된 비-유형 III 연결성 분절을 갖는 피브로넥틴, 및 아미노산 서열 EILDV 또는 보존적으로 치환된 유사한 아미노산 서열을 함유하는 피브로넥틴 펩티드를 포함한다. VCAM-1에 대한 천연 결합 단백질의 가용성 형태는 가용성 VLA-4 펩티드, VLA-4 융합 단백질, 이작용성 VLA-4/Ig 융합 단백질 등을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "가용성 VLA-4 펩티드" 또는 "가용성 VCAM-1 펩티드"는 막에서 그 자체로 고정할 수 없는 VLA-4 또는 VCAM-1 폴리펩티드이다. 이러한 가용성 폴리펩티드는 폴리펩티드를 고정하기 위한 막 통과 영역의 충분한 부분이 부족하거나 변형되어 막 통과 영역이 기능하지 못하는, 예를 들면 VLA-4 및 VCAM 폴리펩티드를 포함한다. 상기 결합제는 VLA-4에 대한 세포-표면 결합 단백질과 경쟁함으로써 또는 VLA-4 기능을 변화시킴으로써 작용할 수 있다. 예를 들면, VCAM-1의 가용성 형태(참조, 예, Osborn et al., 1989, Cell, 59: 1203-1211) 또는 이들의 단편이 투여되어 VLA-4에 결합할 수 있고, 바람직하게는 골수종 세포 상의 VLA-4 결합 부위에 대하여 경쟁하여, 이로써 소형 분자 또는 항-VLA-4 항체와 같은 길항제의 투여에 유사한 효과를 야기한다.

또다른 실시예에서, VLA-4를 보유하는 골수종 세포 표면위의 VLA-4에 결합할 수 있는 VCAM-1 또는 이것의 단편, 예컨대 VCAM-1의 2개의 N-말단 영역을 함유하는 단편이 VCAM-1 부분의 생체내 생존 시간 또는 가용성을 증가시키는 펩티드와 같은 제2 펩티드에 융합될 수 있다. 제2 펩티드는 가용성 펩티드의 단편, 바람직하게는 인간 펩티드, 가장 바람직하게는 혈장 펩티드 또는 면역글로블린 수퍼족의 일원일 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서 제2 펩티드는 IgG 또는 이것의 단편, 예를 들면 인간 IgG1 중쇄 불변부이고, 적어도 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.

본 발명에 유용한 기타 길항제는 세포 표면위 VCAM-1 수용기에 결합함으로써 VCAM-1을 차단하거나 또는 세포 표면위 VLA-4 수용기에 결합함으로써 VLA-4를 차단하여 알파4 인테그린/알파4 인테그린 리간드 상호작용을 파괴할 수 있는 펩티드의 작용을 의태하는 제제("소형 분자"로 불리는 유기 분자)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 "소형 분자"는 그 자체로 소형 펩티드 또는 대형 펩티드를 함유 유기 화합물 또는 비-펩티드 유기 화합물일 것이다. 본원에서 정의된 바와 같이, "소형 분자"는 항체 또는 항체 상동체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 이러한 "소형 분자"의 분자량은 일반적으로 2000 이상이지만, 본 발명자들은 분자량의 절대 상한으로서 상기 수치를 적용하려고 하지 않는다.

예를 들면, VLA-4 리간드의 결합 영역을 의태하고 VLA-4의 수용기 영역에 맞는 올리고다당류와 같은 소형 분자가 사용될 수 있다[참조: J.J.Devlin et al., 1990, Science 249: 400-406 (1990), J.K.Scott and G.P.Smith, 1990, Science 249: 386-390, 및 U. S. Patent 4,833,092 (Geysen), 모두 본원에서 참고로 인용됨]. 역으로, VCAM-1 리간드의 결합 영역을 의태하고 VCAM-1의 수용기 영역에 맞는 소형 분자가 사용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 기타 소형 분자의 실시예는 Komoriya 등의 문헌["피브로넥틴의 택일적 스플라이스된 타입III 연결성 분절 영역내 주요 세포 유형-특이적 부착 부위(CS1)에 대한 최소 필수 서열이 류신-아스파르트산-발린임", J.Biol. Chem., 266 (23), pp.15075-79 (1991)]에서 발견할 수 있다. 이들은 VLA-4 결합에 필요한 최소 활성 아미노산 서열을 동정하고 피브로넥틴의 특정 종의 CS-1 부분(VLA-4 결합 영역)의 아미노산 서열에 기초한 다양한 중복 펩티드를 합성하였다. 이들은 피브로넥틴에 의존하는 세포 부착에 대하여 저해 활성을 진행시키는 8개의 아미노산 펩티드, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr 및 2개의 소형 중복 펜타 펩티드, Glu-Ile-Leu-Asp-Val 및 Leu-Asp-Val-Pro-Ser을 동정하였다. 이어서 LDV 서열을 함유하는 특정의 대형 펩티드는 생체내에서 활성으로 나타났다[문헌: T.A. Ferguson et al., "2개의 인테그린 결합 펩티드는 생체내 T-세포 매개성 면역 반응을 정지시킴", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 8072-76 (1991); 및 S.M.Wahl et al., "합성 피브로넥틴 펩티드가 백혈구 부착 및 회수를 저해함으로써 뮤린의 관절염을 억제함", J. Clin. Invest., 94, pp. 655-62 (1994)]. 피브로넥틴에 VLA-4 및 VLA-5의 부착을 저해할 수 있는 환형 펜타펩티드, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys(여기서, TPro는 4-티오프롤린을 나타냄)가 또한 설명되어 있다[참조: D. M. Nowlin et al., "신규한 환형 펜타펩티드가 알파4 베타1 인테그린-매개된 세포 부착을 저해함", J. Biol. Chem., 268 (27), pp. 20352-59(1993); 및 PCT 공개공보 PCT/US91/04862]. 상기 펜타펩티드는 수개의 세포외-매트릭스 단백질에 대한 인식 부위에서 공통 모티프로서 알려진 FN에서 유래된 트리펩티드 서열 Arg-Gly-Asp에 기초하였다.

기타 소형 분자 VLA-4 저해제의 실시예가 예를 들면, 세포 부착 저해 활성을 갖는 베타-아미노산을 함유하는 선형 펩티드 화합물을 설명하는 Adams등의 문헌["세포부착 저해제", PCT US97/13013]에 보고되었다. 국제 특허 출원 WO 94/15958 및 WO 92/00995는 세포 부착 저해 활성을 갖는 환형 펩티드 및 펩티드 의태성 화합물을 설명한다. 국제 특허 출원 WO 93/08823 및 WO 92/08464는 구아니디닐-, 우레아- 및 티오우레아-함유 세포 부착 저해 화합물을 설명한다. 미국 특허 제5,260,277호는 구아니디닐 세포 부착 분자 화합물을 설명한다.

이러한 소형 분자 의태제는 펩티드, 세미-펩티드 화합물 또는 비-펩티드, 유기 화합물의 다수를 합성한 후 알파4 인테그린/알파4 인테그린 리간드 상호작용을 저해하는 능력에 대하여 화합물을 검색함으로써 제조될 수 있다[참조: 미국 특허 제4,833,092gh, Scott and Smith, "에피토프 라이브러리로 펩티드 리간드를 검색", Science, 249, pp. 386-90 (1990), 및 Devlin et al., "무작위 펩티드 라이브러리: 특이적 단백질 결합 분자의 원료", Science, 249, pp. 40407 (1990)].

기타 바람직한 구체예에서, 세포-표면 알파4 인테그린 및/또는 알파4 인테그린 리간드를 차단, 피복 및 결합하는 본 발명의 방법에 사용된 제제는 항-VLA-4 및/또는 항-알파4 베타7 모노클로날 항체 또는 항체 상동체이다. 치료, 특히 인간 치료를 위한 바람직한 항체 및 상동체는 인간 항체 상동체, 인간화된 항체 상동체, 키메라 항체 상동체, Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v) 항체 단편 및 항체 중쇄 또는 경쇄의 단량체 또는 이량체 또는 이들의 혼합물을 포함한다. VLA-4에 대한 모노클로날 항체는 본 발명의 방법에서 바람직한 결합제이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 상동체"는 이황화 결합에 의하여 연결된 면역글로블린 경쇄 및 중쇄로 구성된 고유의 항체를 포함한다. 용어 "항체 상동체"는 또한 면역글로블린 경쇄, 면역글로블린 중쇄 및 1 또는 2 항원에 결합할 수 있는 이것의 항원-결합성 단편에서 선택된 1 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 1 이상의 폴리펩티드로 구성된 항체 상동체의 성분 폴리펩티드는 선택적으로 이황화 결합되거나 또는 공유결합될 수 있다.

따라서, "항체 상동체"는 유형 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM(및 이것의 하위형 태)의 고유 면역글로블린을 포함하며, 여기서 면역글로블린의 경쇄가 카파 또는 람다 유형일 수 있다.

"항체 상동체"는 또한 항체-결합 특이성을 보유하는 고유 항체의 일부, 예를 들면 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, F(v) 단편, 중쇄 단량체 또는 이량체, 경쇄 단량체 또는 이량체, 1 중쇄 및 1 경쇄로 구성된 이량체 등을 포함한다. 따라서, 상술된 항체에서 유래한 항체-결합 단편 및 전장 이량체의 또는 삼량체의 폴리펩티드는 그 자체로 유용하다.

본원에서 사용된 바와 같이, "인간화된 항체 상동체"는 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된 항체 상동체로서, 여기서 항체 결합에 필요하지 않는 인간 면역글로블린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산의 일부 또는 전부가 인간을 제외한 포유동물 면역글로블린 경쇄 또는 중쇄로부터 유래한 상응하는 아미노산에 대하여 치환되었다.

본원에서 사용된 바와 같이, "키메라 항체 상동체"는 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된 항체 상동체로서, 여기서 면역글로블린 경쇄 또는 중쇄 또는 양쪽 모두의 불변부 및 힌지의 전부 또는 일부가 또다른 면역글로블린 경쇄 또는 중쇄의 상응하는 영역에 대하여 치환되었다. 본 발명의 또다른 양태로서, 본 발명의 특징은 다음을 포함하는 키메라 분자의 변이체를 특징으로 한다: (1) VLA-4 표적 부분, 예, VLA-4을 보유하는 골수종 세포의 표면위에 항원(즉, VLA-4)과 결합할 수 있는 VCAM-1 부분; (2) 선택적으로, 제2 펩티드, 예, VLA-4 표적 부분의 생체내 생존 시간 또는 가용성을 증가시키는 것, 예, 면역글로블린 수퍼족 또는 단편의 일원 또는 이들의 일부, 예, IgG의 일부 또는 단편, 예, 인간 IgG2 중쇄 불변부, 예, CH2 및 CH3 힌지 영역; 및 독성 부분. VLA-4 표적 부분은 임의의 천연 발생하는 VLA-4 리간드 또는 이것의 단편, 예를 들면 VCAM-1 펩티드 또는 보존적으로 치환된 유사한 아미노산 서열일 수 있다. 바람직한 표적 부분은 가용성 VCAM-1 단편, 예를 들면 VCAM-1 분자의 N-말단 영역 1 및 2이다. 키메라 분자는 VLA-4, 바람직하게는 활성화된 VLA-4를 보유한 골수종 세포의 존재를 특징으로 하는 다발성 골수종과 같은 위험한 질병에서 인간과 같은 피검체를 치료하는 데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "인간 항체 상동체"는 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된 항체 상동체로서, 여기서 면역글로블린 경쇄 또는 중쇄의 모든 아미노산이 인간원에서 유래된다.

항- VLA -4 항체 상동체를 제조하는 방법

모노클로날 항체 상동체를 제조하는 기법은 공지되었다. 간단하게 말하면, 불사 세포주(통상 골수종 세포)는 주어진 항원(예, VLA-4)을 발현시키는 전체 세포로 면역화된 포유동물에서 유래한 백혈구(통상 비장세포)와 융합되고, 생성된 혼성 세포의 배양 상층액을 항원에 대한 항체에 대하여 검색한다[참조, Kohler et al., 1975, Nature, 254:295-297].

면역화는 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 단위 용량 및 면역화 방법은 면역화된 포유동물의 종, 이것의 면역 상태, 포유동물의 체중 등에 따라 달라진다. 통상, 면역화된 포유동물을 채혈하고 각 혈액 표본의 혈청을 적절한 검색 분석을 사용하여 특정 항체에 대하여 분석한다. 예를 들면, 항-VLA-4 항체는 VLA-4-발현 세포로부터 125I-표지된 세포 용해물의 면역침전에 의하여 동정될 수 있다[참 조: Sanchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 및 Hemler et al., 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485]. 항-VLA-4 항체는 또한 유동 시토메트리, 예를 들면, VLA-4를 인식하는 것으로 여겨지는 항체와 항온배양된 라모스(Ramos) 세포의 형광 염색을 측정함으로써 동정될 수 있다[참조: Elices et al., 1990 Cell, 60:577-584]. 혼성 세포의 제조에 사용되는 림프구는 통상 이러한 검색 분석을 사용하여 항-VLA-4 항체의 존재에 대하여 혈청이 이미 양성으로 시험된 면역화된 포유 동물에서 분리된다.

통상, 불사 세포주(예, 골수종 세포주)는 림프구와 동일한 포유동물 종에서 유래된다. 바람직한 불사 세포주는 히포잔틴, 아르니노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 포함하는 배양 배지에 민감한 마우스 골수종 세포주이다. 통상, HAT-민감성 마우스 골수종 세포는 1500 분자량 폴리에틸렌 글리콜("PEG 1500")을 사용하여 마우스 비장세포에 융합된다. 융합으로 생성된 혼합 세포는 비융합된 세포 및 비생산적인 융합된 골수종 세포를 죽이는(비융합된 비장 세포는 형질전환되지 않았기 때문에 수일 후 죽는다) HAT 배지를 사용하여 선택된다. 원하는 항체를 생성하는 혼성 세포는 혼성 세포 배양 상층액을 스크린함으로써 검색된다. 예를 들면, 항-VLA-4 항체를 생성하기 위하여 제조된 혼성 세포는 재조합 알파4-서브유니트-발현 세포주에 결합하는 능력을 갖는 분비된 항체에 대하여 혼성 세포 배양 상층액을 시험함으로써 검색될 수 있다(참조, Elices et al., supra).

고유의 면역글로블린인 항-VLA-4 항체 상동체를 제조하기 위하여 상기 검색 분석에서 양성 시험된 혼성 세포가 조건하에서 충분한 시간동안 영양 배지에서 배양되어 혼성 세포가 배양 배지내로 모노클로날 항체를 분비하도록 한다. 혼성 세포에 적합한 조직 배양 기술 및 배양 배지는 공지되었다. 조건화된 혼성 배양 상층액은 수집될 수 있고, 항-VLA-4 항체는 공지된 방법에 의하여 선택적으로 추가 정제된다.

대안으로, 원하는 항체는 비면역화된 마우스의 복강내로 혼성 세포를 주입함으로써 제조될 수 있다. 혼성 세포는 복강에서 증식하고, 복수로서 축적되는 항체를 분비한다. 항체는 주사기로 복강에서 복수를 추출함으로써 회수할 수 있다.

수개의 마우스 항-VLA-4 모노클로날 항체는 이전에 설명되었다[참조: Sanchez-Madrid et al., 1986, supra; Hemler et al., 1987, supra; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245]. VLA-4의 P 쇄를 인식할 수 있는 HP 1/2 및 기타 항-VLA-4 항체(예, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9)와 같은 상기 항-VLA-4 모노클로날 항체는 본 발명에 따른 치료 방법에 유용할 것이다. VCAM-1 및 피브로넥틴 리간드와의 결합에 관여하는 VLA-4 알파4 쇄 에피토프를 인식할 수 있는 항 VLA-4 항체(즉, 리간드 인식, 피브로넥틴 결합 및 VCAM-1 차단에 관여하는 부위에서 VLA-4에 결합할 수 있는 항체)가 바람직하다. 상기 항체는 B 에피토프-특이적 항체(B1 또는 B2)로서 정의되었으며(Pulido et al., 1991, supra), 또한 본 발명에 따른 항-VLA-4 항체이다.

VLA-4에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체 상동체는 본 발명의 방법에서 VLA-4 항원을 차단하거나 피복할 수 있는 또다른 바람직한 결합제이다. 고유의 형태로서, 이것들은 문헌[Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95]에 의하여 설명된 바와 같이, 시험관내-개시된 인간 비장세포를 사용하여 제조될 수 있다.

대안으로, 이들은 인간 B 세포로부터 인간 모노클로날 항체의 제조를 설명하는 문헌[Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 또는 Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. U.S. Patent 5,798,230 (Aug. 25, 1998, "인간 모노클로날 항체의 제조 방법 및 이들의 용도")]에 의하여 설명되는 총 클로닝에 의하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따라, 인간 항체-제조 B 세포는 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 핵 항원 2(EBNA2)를 발현시키는 엡스테인-바르 바이러스 또는 이것의 유도체로 감염되어 불사화된다. 불사화에 필요한 EBNA2 기능은 이어서 차단되며, 이것은 항체 생성의 증가를 야기한다.

그러나 또다른 완전한 인간 항체의 제조 방법에서, 미국 특허 제5,789,650호(Aug. 4, 1998, "이종 항체를 제조하기 위한 인간을 제외한 트랜스 유전자 동물")는 불활성화된 내인성 면역글로블린 유전자를 보유한 인간을 제외한 트랜스유전자 동물 및 이종 항체를 제조할 수 있는 인간을 제외한 트랜스유전자 동물을 설명하고 있다. 내인성 면역글로블린 유전자는 내인성 면역글로블린에 대하여 지시된 직접적 항혈청에 의하여 및/또는 안티센스 폴리뉴클레오티드에 의하여 억제된다. 이종 항체는 인간을 제외한 동물 종의 유전자에서 통상 발견되지 않는 면역글로블린 유전자에 의하여 암호화된다. 재배치되지 않은 이종 이간 면역글로블린 중쇄의 서열을 포함하는 1 이상의 트랜스유전자는 인간을 제외한 동물내로 도입되며, 이로써 트랜스유전자 면역글로블린 서열을 기능적으로 재배치할 수 있는 트랜스유전자의 동물을 형성하고, 인간 면역글로블린 유전자에 의하여 암호화되는 다양 한 이소형의 총 항체를 제조한다. 상기 이종의 인간 항체는 B-세포에서 제조되어, 이후 예컨대, 골수종과 같은 불사화된 세포주와 융합함으로써 또는 기타 방법에 의하여 상기 B-세포를 조작함으로써 불사화시켜, 모노클론의 이종성인 완전한 인간 항체 상동체를 제조할 수 있는 세포주를 불사화시킨다.

대형의 비면역화된 인간 파지 표현 라이브러리는 표준 파지 기술을 사용하여 인간 치료법으로서 개발될 수 있는 고도의 친화성 항체를 분리하는데 사용될 수 있다(Vaughan et al., 1996). 그러나 본 발명의 방법에서 VLA-4 항원을 차단 또는 피복할 수 있는 또다른 바람직한 결합제는 항-VLA-4-특이성을 보유한 인간화된 재조합 항체 상동체이다. 키메라 항체의 제조를 위한 초기 방법 이후에, 신규한 접근법이 EP 0239400(Winter 등)에서 설명되고, 이로써 항체는 한 종의 상보성 결정 부위(CDR)을 다른 종의 것으로 치환함으로써 변경된다. 상기 방법은 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 Ig 가변부 영역의 CDR을 뮤린 가변부 영역의 대안적 CDR로 치환하는 데 사용될 수 있다. 상기 변경된 Ig 가변 영역은 인간 Ig 불변부와 결합되어 조성물에서 치환된 뮤린 CDR을 제외한 완전히 인간인 항체를 제조할 수 있다. CDR-치환된 항체는 상당히 약한 비인간 성분을 포함하기 때문에, 상기 CDR-치환된 항체는 키메라 항체에 비하여 인간에서 면역 반응을 덜 유도할 것으로 예측될 것이다. CDR "이식"에 의한 모노클로날 항체를 인간화하는 방법은 "재형성"이라고 명명하였다[문헌: Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536].

통상, CDR(항체 중쇄 중 3개, 경쇄 중 3개)이 특정 항원에 결합하는 마우스 항체의 영역이기 때문에 뮤린 항체의 상보성 결정 영역(CDR)이 인간 항체에서 상응하는 영역으로 이식된다. CDR의 이식은 CDR DNA 서열이 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변부(v) 유전자 분절의 클로닝에 의하여 결정되고 이어서 위치 지정된 돌연변이유발법에 의하여 상응하는 인간 V 영역으로 이전되는 유전 공학 기술에 의하여 달성된다. 방법의 마지막 단계에서, 원하는 이소형(통상 CL에 대하여 카파 및 CH에 대하여 감마 I)의 인간 불변부 유전자 분절이 첨가되고 인간화된 중쇄 및 경쇄 유전자가 포유동물 세포에서 함께 발현되어 가용성 인간화된 항체를 생성한다.

상기 CDR의 인간 항체로의 전이는 상기 항체에 고유의 뮤린 항체의 항체 결합 성질을 부여한다. 뮤린 항체에서 6개의 CDR은 V 영역 "골격"부에서 구조적으로 쌓인다. CDR-이식이 성공하는 이유는 마우스와 인간 항체 간의 골격부가 CDR에 대하여 유사한 부착 지점을 갖는 매우 유사한 3-D 구조를 가질 수 있으므로, CDR이 상호교환될 수 있기 때문이다. 상기 인간화된 항체 상동체는 문헌[Jones et al., 1986, Nature. 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; and Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833]에 예시된 바와 같이, 제조될 수 있다.

그러나, 골격부내의 특정 아미노산은 CDR과 상호작용하여 전체 항원 결합 친화성에 영향을 주는 것으로 생각된다. 인간 V 영역 골격부의 임의의 변형없이 재조합 인간화된 항체를 제조하기 위하여 뮤린 항체에서 CDR의 직접 이전은 종종 결합 친화성의 부분 또는 전부 손실을 야기한다. 다수의 경우에서, 결합 활성을 획득하기 위하여 수용기 항체의 골격부내 잔기를 변경하는 것이 중요한 것 같다.

문헌[Queen et al., 1989 (supra) 및 WO 90/07861 (Protein Design Labs)]은 인간 면역글로블린 골격부 및 불변부와 뮤린 MAb(항-Tac)의 CDR을 결합시킴으로써 수용기 항체의 골격부에서 변형된 잔기를 포함하는 인간화된 항체의 제조를 설명하였다. 이것은 인간 V 영역 골격 잔기의 임의의 변형없이 직접 CDR 전이로부터 종종 생기는 결합 친화성의 손실 문제에 대한 하나의 해결책을 제시해준다. 이 해결책은 2개의 핵심 단계를 포함한다. 제1단계, 인간 V 골격부가 컴퓨터 분석에 의하여 고유 뮤린 항체의 V 영역 골격부, 이 경우 항-Tac Mab에 대한 최적 단백질 서열 상동체에 대하여 선택된다. 제2 단계, 뮤린 V 영역의 3차 구조가 컴퓨터에 의하여 모형화되어, 뮤린 CDR과 상호작용하는 아미노산 잔기를 시각화하여 상동성 인간 골격위에 놓는다. 참조: 프로틴 디자인 랩, 미국 특허 5,693,762.

다른 접근법[Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271]을 사용하여, 마우스 잔기의 근원적 도입없이 CDR-이식을 위하여 NEWM 및 REI 중쇄 및 경쇄 각각에서 유도된 V 영역 골격부를 표준으로 이용한다. NEWM 및 REI 기초한 인간화된 항체를 제작하는 Tempest et al의 접근법을 사용하는 이점은 NEWM 및 REI 가변부의 3차 구조가 x-선 결정학에서 알려졌으며 CDR과 V 영역 골격 잔기간의 특이적 상호작용이 모형화될 수 있다.

접근법과는 상관없이, 데이타에서 준비된 초기 인간화된 항체 상동체의 실시예는 직접 방법이 아님을 보여주었다. 그러나, 상기 골격 변화가 필요할 수 있다는 인식에도 불구하고, 이용가능한 선행 기술에 기초하여 골격 잔기가 원하는 특이성의 기능적 인간화된 재조합 항체를 획득하기 위하여 변경될 필요가 있는지 예측하 는 것이 불가능하다. 따라서 결과는 특이성 및/또는 친화성을 보존하는 데 필요한 변화가 대부분 다른 항체의 인간화에 기초하여 예측될 수 없고 주어진 항체에 독특하다는 것을 시사한다.

본 발명에 사용하는 바람직한 길항제는 이미 제조된 B 에피토프 특이성을 갖는 키메라 재조합 및 인간화된 재조합 항체 상동체(즉, 고유의 면역글로블린 및 이것의 일부)를 포함하며, 1993, 1, 12일에 출원된 공출원중인 미국 특허 출원 08/004,798, 1994년 1월 7일에 출원된 PCT 공보 US94/002666에서 설명된다. 키메라(마우스 V- 인간 C) 및 인간화된 항-VLA-4 항체 상동체의 제조를 위한 출발 물질은 상술된 뮤린 모노클로날 항-VLA-4-항체, 시판되는 모노클로날 항-VLA-4 항체(예, HP2/1, 아메 인터내셔널 인크., 웨스트브룩, 메인) 또는 본원의 교시에 따라 제조된 모노클로날 항-VLA-4 항체일 수 있다. 예를 들면, 항-VLA-4 항체 HP½의 중쇄 및 경쇄의 가변부가 클론되고 서열결정된 후, 인간 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 불변부와 배합하여 함께 발현되었다. 이러한 HP½항체는 특이성 및 잠재성에서 뮤린 HP½항체와 유사하고, 본 발명에 따른 치료방법에서 유용하다.

기타 바람직한 인간화된 항-VLA-4 항체 상동체는 아테나 뉴로사이언스, 인크.에 의하여 PCT/US95/01219 (1995. 7. 27)에서 설명된다. 상기 인간화된 항-VLA-4 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 인간화된 경쇄는 마우스 21-6 면역글로블린 경쇄의 상응하는 상보성 결정 영역으로부터의 아미노산 서열을 보유하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2, CDR3)을 포함하고, 적어도 아미노산 위치를 제외한 인간 카파 경쇄 가변부 골격 서열에서 가변부 골격은 마우스 21.6 면역글로블린 경쇄 가변부 골격의 균등 위치에 존재하는 동일한 아미노산에 의하여 점유된다. 인간화된 중쇄는 마우스 21.6 면역글로블린 중쇄의 상응하는 상보성 결정 영역으로부터의 아미노산 서열을 보유하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 적어도 한 위치에서 아미노산 위치를 제외한 인간 중쇄 가변부 골격에서 가변부 골격이 마우스 21.6 면역글로블린 중쇄 가변부 골격의 동등 위치에 존재하는 동일한 아미노산에 의하여 점유된다.

치료 용법

본 발명의 제1 양태에 따른 방법에서, VLA-4 결합제, 특히, VCAM 융합 및 항-VLA-4 항체 상동체는 비경구적으로 투여하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 포막내, 간내, 상처내 및 두개골내 주사 또는 주입 기법을 포함한다.

VLA-4 결합제는 물, 식염수, 인산 완충된 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 또는 이들의 배합과 같은 다수의 공지된 담체중의 하나일 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 살균 약학 조성물로서 투여되는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물은 무기 또는 유기 산 및 염기에서 유래된 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 산염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 디글루코네이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설포네이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드 로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로이오다이드, 2-히드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐-프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 언데카노에이트를 포함한다. 염기염은 암모늄 염, 알칼리 금속 염(예, 나트륨 및 칼륨 염), 알칼리 토금속 염(예, 칼슘 및 마그네슘 염) 유기 염기 염(예, 디시클로헥실아민 염, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민) 및 아미노산 염(아르기닌, 라이신 등)을 포함한다. 또한, 염기 질소를 함유한 군은 저차 알킬 할로겐화물(예, 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 염화물, 브롬화물 및 요도드화물); 디알킬 설페이트(예, 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트), 장쇄 할로겐화물(예, 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 염화물, 브롬화물 및 요오도화물), 아르알킬 염화물(예, 벤질 및 펜틸 브롬화물 등)과 같은 제제로 4차화될 수 있다. 이에 의하여 수성 또는 유성 또는 분산성 생산물이 획득된다.

본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 임의의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 유도체, 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함한다. 본원에 사용된 용어 "담체"는 허용가능한 보조제 및 매체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 렉틴, 혈청 단백질, 예를 들면 인간 혈청 알부민, 완충액 물질, 예를 들면 인산, 글리신, 소르빅산, 칼륨 소르베이트, 포화된 야채 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들면 프로타민 설페이트, 디소디움 수소 인산염, 칼륨 수소 인산염, 나트륨 염화물, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피르롤리돈, 셀룰로스-기초한 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시에틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 포함한나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따라, 약학 조성물은 살균 주사 제제의 형태로, 예컨대, 살균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 상기 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지 기술에 따라 제형화될 수 있다. 또한, 살균 주사 제제는 또한 비독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매, 예를 들면, 1,3-부탄디올용액과 같은 살균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 담체 및 용매 중에는 물, 링거 용액 및 등장 나크륨 염화물 용액이 있다. 또한, 살균, 고정된 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁성 배지로서 사용된다. 본 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 디- 글리세라이드를 포함하는 임의의 혼합 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방산, 예를 들면 올레산 및 이것의 글리세라이드 유도체는 특히 이것의 폴리옥시에틸레이트화 형태에서 올리브유 또는 피마자유와 같은 천연의 약학적으로 허용가능한 오일처럼 주사용 제제에서 유용하다. 상기 오일 용액 또는 현탁액은 또한 Ph.Helv 또는 유사한 알코올과 같은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제를 포함할 것이다.

본 발명의 약학 조성물, 특히 VLA-4/VCAM-1 상호작용의 소형 분자 길항제는 비경구적으로 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 경구적으로 투여되면, 이것은 임의 의 경구적으로 허용가능한 투여 형태, 예를 들면 캐슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 경구 용도를 위한 정제의 경우에, 통상 사용되는 담체는 락토스와 콘 전분이다. 또한 윤활제, 예를 들면 마그네슘 스테아레이트가 통상 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위하여, 유용한 희석제는 락코스 및 건조 콘 전분을 포함한다. 수성 현탁액이 경구 용도를 위하여 요구되는 경우, 유효 성분은 에멀션화제 및 현탁제와 혼합된다. 필요하다면, 특정 감화제, 향미료 또는 착색제를 첨가할 수 있다. 또한, 국소적으로 피부 통과 패치가 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 분무기, 건분말 흡입기 또는 계량기 용량 흡입기의 사용을 통한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의하여 투여될 수 있다. 상기 조성물은 약학 제제의 당업계 기술에 따라 제조되고 식염수 용액으로, 벤질 알코올 또는 기타 적절한 보존제, 생체이용성을 향상시키는 흡수 촉진제, 형광 탄소 및/또는 기타 통상 용해 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다.

또다른 구체예에 따라 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은 코르티코스테로이드, 소염제, 면역억제제, 항대사제 및 면역조절제로 구성된 군에서 선택되는 첨가제를 포함할 것이다. 각 상기 부류 중에서 특정 화합물은 본원에서 참고로 인용된 문헌["종합 의화학", Pergamon Press, Oxford, England, pp. 970-986 (1990)]에서 적절한 군의 제목하에 목록화된 것에서 선택될 수 있다. 또한 본 그룹에 테오필린, 설파살라진 및 아미노살리실레이트(소염제); 시클로스포린, FK-506 및 라파마이신(면역억제제); 시클로스포스파미드 및 메토트렉세이트(항대사제); 스테로이드(흡입, 경구 또는 국소) 및 인터페론(면역조절제)와 같은 화합물이 본 군에 속한다.

단일 용량 형태를 생산하기 위하여 담체 물질과 배합될 수 있는 유효 성분의 양은 처리된 숙주, 특정 투여 방법에 따라 달라질 것이다. 그러나, 임의의 특정 환자에 대하여 특정 용량 및 치료방법은 사용된 특정 화합물, 연령, 체중, 일반적 건강 상테, 성별, 식이요법, 투여 시간, 분비 속도, 약물 배합 및 주치의의 판단 및 치료되는 특정 질병의 심각성을 비롯한 다양한 인자에 따라 좌우될 것이다. 또한 유효 성분의 양은 성분이 함께 투여된다면, 치료제 또는 예방제에 따라 달라질 수 있다.

세포 부착을 예방, 억제 또는 저해하는데 효과적인 본 발명 화합물의 용량 및 투여 속도는 저해제의 성질, 환자의 몸집, 처리 목적, 처리되는 병인의 성질, 사용된 특정 약학 조성물 및 주치의의 판단과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 유효 성분 화합물의 일일당 약 0.001 내지 약 100 mg/kg체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 50 mg/kg체중의 용량 수준이 사용된다. 매우 바람직하게는, 항체 또는 항체 유도체라면, VLA-4 결합제가 약 0.1 mg/kg체중/일 내지 약 20mg/kg체중/일의 범위의 용량으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 약 0.1 mg/kg체중/일 내지 약 10mg/kg체중/일의 범위로 1일 내지 14일의 간격으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 비항체 또는 소형 분자 결합제에 대하여 용량 범위는 항체의 상기 양과 동등한 분자량 내이어야 한다. 바람직하게는, 항체 조성물은 적어도 1mg/ml의 항체의 혈장 수준을 제공하는데 효과적인 양으로 투여된다. 최적 용량은 결합제의 투여에 의하여 측정되며, 이후 생체내 주어진 용량으로 투여된 후 시간의 경과에 따라 제제에 의하여 VLA-양성 세포의 피복이 측정될 수 있다.

개체의 말초 혈액(또는 골수 세포)의 표본에 함유된 골수종 세포는 투여된 제제를 검출하기 위한 제2 제제를 사용하여 시험관내(또는 생체외) 제제의 존재에 대하여 검출되어야 한다. 예를 들면, 이것은 투여된 제제에 대하여 특이적인 플루오로크롬으로 표지된 항체이고, 이어서 표준 FACS(형광 활성화된 세포 분리기) 분석에 의하여 측정된다. 대안으로, 투여된 제제의 존재는 그 자체가 표지된(예, 플루오로크롬에 의하여) 동일한 제제에 결합하는 개체의 세포의 능력 감소 또는 불능에 의하여 시험관내(또는 생체외)에서 검출될 수 있다. 바람직한 용량은 거의 대부분의 검출가능하게 피복된 VLA-4 양성 세포를 생산해야 한다. 바람직하게는, 항체 상동체의 경우에 1 내지 14일의 기간동안 피복이 유지되어야 한다.

동물 모델:

동물 모델은 상세하게 설명되었다(Garrett 1997). 간단히 설명하자면, Radl et al(1988)은 나이든 C57BL/KaLwRij 뮤린에서 자연발생하는 골수종의 뮤린 모델을 설명한다. 상기 질병은 동물이 나이가 들면서 200 마리 중 약 1마리에서 발생하고, 인간 질병의 일부 특성을 갖는 모노클로날 감마글로블린 장애를 일으킨다. 더 양호하고 재생가능한 동물 모델을 개발하기 위하여, 본 출원인은 5TGM1이라고 명명하는 상기 뮤린 골수종으로부터 세포주를 확립하여 서브클론하였고, 이것은 마우스에서 심각한 골용해 및 간과 신장을 포함하는 비-골기관과의 관련같은 인간 골수종의 특성을 야기한다는 사실을 발견하였다(Garrett 1997). 배양된 세포로 접종된 마우스는 높은 예측가능성 및 재생가능한 방식으로 모노클로날 감마글로블린 장애 및 방사능성 골 손상의 형성을 포함하는 질병을 발생시킨다. 또한, 일부의 마우스는 과칼슘혈이 되고, 골손상은 파골세포 활성 증가를 특징으로 한다. 따라서, 5TGM1-보유하는 마우스에서 질병에 걸린 기관의 조직학적 조사 및 IgG2b의 혈청 수준 증가에 기초하여, 5TGM1이 인간의 질병을 정확히 증명하는 뮤린 골수종으로서 정의된다.

다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 특정 구체예를 추가로 예시하기 위한 것이고 본 발명의 본질을 한정하기 위한 것이 아니다. 다음 실시예에서, 필요한 제한 효소, 플라스미드 및 기타 제제 및 물질은 시판되는 원료로부터 획득될 수 있고, 클로닝, 연결 및 기타 재조합 DNA 방법은 당업계의 공지 방법에 의하여 수행될 수 있다.

도1

중화 항체가 5 TGM 1 세포 및 골수 세포의 공배양액에서 TRAP-양성 다핵화된 OC-유사 세포 형성에 미치는 효과

현탁액중의 5TGM1 세포(1e3) 및 골수 세포(1e6)의 혼합물이 48-웰 배양 플레이트에 플레이트되고, 10 ug/ml 항-VCAM-1 항체(VCAM-1 Ab), 항-알파4베타1 항체(α4β11Ab), 항-ICAM-1 항체(ICAM-1 Ab) 또는 대조구로서 래트 IgG를 포함하거나 포함하지 않고 배양한다. 배양 6일 후에, 배양액을 고정하고 TRAP-양성 다핵화된 OC-유사 세포(TRAP(+) MNC)의 수를 측정하였다. VCAM-1 Ab 및 알파4베타1 Ab 모두가 TRAP(+) MNC 형성을 저해하지만, ICAM-1 Ab는 아무 효과도 없었다. 데이터는 평 균값±S.E.(n=3)으로 표현된다. ^*=IgG 대조구와 상당히 다름.

도2

5 TGM 1 및 ST2 조정 배지가 태아 래트 장골의 기관 배양에서 골흡수에 미치는 영향

ST2 단독, 5TGM1 단독, 및 ST2 및 5TGM1의 공배양에서 획득된 조건화된 배지(48시간)를 ⁴⁵칼슘으로 표지된 태아 래트 장골의 기관 배양에서 골흡수 활성에 대하여 분석하였다. 표지된 태아 래트 장골을 조건화된 배지(40% v/v) 또는 대조구 배지의 존재에서 120시간 동안 배양하였다. 데이터는 대조구 배지에서 칼슘 방출의 증가를 백분율로서 표현된다. ST2 간질 세포의 조건화된 배지에서의 방출은 열린 막대로 표시된다. 5TGM에서의 방출은 점선 막대로 표시된다. 5TGM1 및 ST2의 공배지로부터 회수된 조건화된 배지에서의 방출은 닫힌 막대로 표시된다. 데이터는 평균치±S.E.(n=4)로서 표현된다. ^*= ST2 단독과 상당히 다름. ^***= 5TGM1 단독과 상당히 다름.

도3

재조합 가용성 VCAM -1( sVCAM -1)이 5 TGM 1 세포에 의한 파골세포형성 활성의 생성에 미치는 효과

조건화된 배지는 sVCAM-1(1×10^-8 내지 1×10^-7)의 존재 또는 부재시 24시간동안 배양된 5TGM1 세포로부터 수확되었다. 이러한 조건화된 배지의 파골세포형성 활성을 마우스 골수 배양액에서 분석하였다. 골수 세포(1e6/웰)가 48-웰 플레이트에 플레이트되었고, 동일한 농도의 sVCAM-1(열린 막대)를 포함하는 조건화된 배지(점선 막대) 또는 대조구 배지(IMDM)의 존재에서 배양되었다. 6일 후에, 배양액을 고정하고 TRAP-양성 다핵화된 OC-유사 세포(TRAP+MNC)의 수를 측정하였다. 1×10^-7 M sVCAM-1로 처리된 5TGM1 세포로부터의 조건화된 배지는 TRAP(+)MNC 형성을 증가시킨다. 데이타는 평균치±S.E.(n=3)으로 표현된다. ^*= 대조구와 상당히 다름.

도4

VLA -4에 대한 mAb PS2가 5 TGM 1-보유한 마우스에서 혈청 IgG 2b 상승에 미치는 효과

골수를 콜로니화할 수 있는 1e5 5TGM1 세포로 마우스를 주사한다. 마우스는 3마리의 2군으로 분리하여, 한군은 대조군으로, 다른 군은 8, 11, 14, 17, 및 20일에 80 ug mAb PS/2(-4 mg/kg)으로 처리한다. 5TGM1 골수종 세포에 의하여 생성된 항체 이소형인 IgG2b의 수준, 은 1 내지 6주 동안 매주마다 측정되었다. Mab 처리는 생체내 골수종 세포 생존 및 성장의 저해를 시사하면서 IgG2b 생성을 강하게 저해한다.

도5

VCAM -1에 대한 mAb M/K-2.7 가 5 TGM -1을 보유하는 마우스에서 혈청 IgG 2b 상승에 미치는 효과

도4에서 설명된 바와 같이 골수를 콜로니화할 수 있는 5TGM1 세포를 마우스 에 주사하였다. 마우스는 4 또는 5개의 군으로 분리하여, 1군은 대조군으로(열린 사각형), 2/3 군은 80ug(열린 다이아몬드) 및 160 ug mAb(열린 원)(~4 내지 8 mg/kg)에서 예방적으로 처리되고, 4군은 160 ug mAb (삼각형)에서 예방적으로 처리되어 측정되었다. 5TGM1 골수종 세포에 의하여 생성된 항체 이소형인 IgG2b의 수준을 측정하였다. Mab 처리는 생체내 골수종 세포 생존 및 성장의 저해를 나타내면서 IgG2b 생성을 강하게 저해한다.

도6

항-알파4 인테그린 항체가 다발성 골수종을 보유하는 마우스의 생존에 미치는 영향

실시예 1: 재료 및 방법

5 TGM 1 골수종 세포

5TGM1 골수종 세포는 나이든 C57BL/KaLwRij 뮤린에서 자연발생하는 골수종에서 최초로 유래되었다(Garrett 1997, Vanderkerken 1997). 세포는 37℃ 5% CO2 대기에서 10% 태아 소 혈청(FBS, Summit, FOrt Collins, CO) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(GIBCO, Grand Island, NY)으로 보충된 이소코브스 변형된 둘베코스 배지(IMDM, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)에서 성장하였다. 하기에 설명된 시험관내 실험에 있어서, 25 내지 30 계대 사이의 5TGM1세포가 사용되었다.

항체, 가용성 VCAM -1

뮤린 VCAM-1(M/K-2.7), 인테그린 VLA-4(PS/2) 및 세포내 부착 분자-1(ICAM-1, YN1/1.7)에 대한 중화 항체는 Dr. Kensuke Miyake(일본 사가의 사가 의과 대학)에 의하여 선물받았다. 인간 VCAM-1의 7개 세포외 영역을 포함하는 재조합 가용성 VCAM-1(Lobb et al, 1991)은 메사추세츠 캠브리지의 Dr.Roy Lobb, Biogen, Inc.에서 받았다.

역전사 - 폴리머라제 연쇄 반응( RT - PCR )

RT-PCR을 사용하여, 본 출원인은 골수 간질 세포 및 5TGM1 각각에 VCAM-1 및 인테그린 알파4의 발현을 확인하였다. 총 RNA는 TRIzol 시약(GIBCO)을 사용하여 단일 단계 RNA 분리 방법에 의하여 골수 간질 세포 및 ST2 골수 간질 세포주의 일차 배양액, 5TGM1에서 제조되었다. RNA 3 ug을 70℃에서 10분간 무작위 헥사머의 50 ng과 함께 항온배양하고 얼음에서 냉각시킨 후, 제조 방법에 따라 역전사효소(뉴저지 브란츠버그의 퍼킨-엘머)를 사용하여 제1 쇄 cDNA로 전환하였다. PCR을 위한 프라이머는 다음과 같았다: 뮤린 VCAM-1 5'-프라이머; 5'-OH-GCTGCGCGTCACCATTGTTCTC-3'-OH[서열번호:1]; 뮤린 VCAM-1 3'-프라이머; 5'-OH-ACCACCCTCTTGAAGCCTTGTG-3'-OH[서열번호:2]; 뮤린 인테그린 알파4 5'-프라이머; 5'-OH-CCCCTCAACACGAACAGATAGG-3'-OH[서열번호:3]; 뮤린 인테그린 알파4 3'-프라이머; 5'-OH-GCCTTGTCCTTAGCAACACTGC-3'-OH[서열번호:4].

PCR은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 구성된 30 사이클로 수행되었다. PCR 반응 혼합물(총 50ul)은 10 마이크로리터를 포함한다. 제1 쇄 cDNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH8.3), 2 mM MgCl₂, 디옥시-NTP 혼합(0.2 mM 각 각), 프라이머의 쌍(0.15 마이크로몰 각각) 및 2U Taq DNA 폴리머라제(뉴저지 브란츠버그의 퍼킨-엘머). PCR 생성물을 에티듐 브로마이드를 포함하는 2.5% 아가로스 겔에서 분리하여 자외선하에서 가시화하였다. 단편의 크기는 분자량 마커를 참조하여 결정되었다.

골수 간질 세포에 5 TGM 1 세포의 부착

이형 세포-세포 부착 분석에 있어서, ST2 세포(5e4/웰)는 48-웰 배양 플레이트에서 종균되고(메사추세스, 캠브리지, 코르타르) 밀집될때까지 10% FBS로 보충된 알파MEM에서 48시간동안 배양되었다. 5TGM1 세포(5e6)는 배양 배지에서 37℃에 24시간동안 10 마이크로 Ci[메틸-3H]티미딘(뉴잉글랜드 뉴클리어)으로 항온배양함으로써 표지되었다. ST2 단일층을 형성한 후에, 1시간동안 혈청이 없는 알파MEM에서 1% 소 혈청 알부민(미주리 세이트루이스의 시그마 BSA)으로 항온배양되었고, 트리튬으로 표지된 5TGM1 세포를 단일층 위에 플레이트하였다. 시스템을 1시간동안 37℃에서 알파4베타1 인테그린 또는 VCAM-1에 대한 항체의 존재 또는 부재에서 항온배양하였다. 비부착 세포는 5% 트리클로로아세트산으로 2회 및 PBS으로 2회 세척하여 제거하고, 부착 세포를 0.25 mM NaOH의 300 밀리리터에 용해시키고, 0.25 mM HCl의 동일한 부피로 중화시킨 후 액정 신틸레이션 계수관에서 방사능을 측정하였다.

5 TGM 1 및 마우스 골수 세포의 공배양에서 파골세포 형성 분석

마우스 골수 세포는 상술한 바와 같은 5주된 수컷 C57BL 마우스에서 획득하였다(Yoneda 1993). 대퇴골 및 경골을 살균성 해부하고 양끝을 절단한다. 골수 세 포를 한꺼번에 세척하고, 회수하여 37℃에서 2시간동안 100 mm-배양 접시에서(메사추세츠 베드포드, 베콘 디킨슨 랩웨어) 10% FBS(유타주 로간의 하이클론) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 알파MEM에서 항온배양시킨다. 조혈성 파골세포 전구체 및 간질 세포를 포함하는 비부착 세포를 회수하였다. 배양 배지 300밀리리터 중의 골수세포(1e6) 및 5TGM1 세포(1e3)를 48-웰 배양 배지위에 플레이트시켰다(0일). 2일째에 300 밀리리터의 신선한 배양 배지를 각 웰에 부드럽게 첨가하고, 4일째에 300 밀리리터의 사용된 배지를 동일한 부피의 신선한 배지로 교환하였다. 6일째에 배양액을 고정하고 시판되는 키트(시그마)를 사용하여 타트레이트-저항성 산 포스파타제(TRAP)에 대하여 염색하였다. 3개 이상의 핵을 가진 TRAP-양성 다핵화된 세포를 파골세포-유사(OC-유사) 세포로서 정의하고 현미경하에서 손으로 세었다. 상기 OC-유사 세포가 뼈를 재흡수하는 성능을 보유한다는 것을 확인하기 위하여, 5TGM1 세포 및 골수 세포를 5×5 mm 고래 상아질의 슬라이스 위에서 동일한 조건으로 함께 배양하고, 상기 상아질 슬라이스 위에 형성된 재흡수 구멍을 설명된 바와 같이 스캐닝 전자 현미경에 의하여 조사하였다(Yoneda 1992).

몇몇 실험에서, 5TGM1 골수종 세포 및 골수 세포의 공배양은 상기 2 유형의 세포(2e6, 24-웰 플레이트, 코스타르) 간의 직접 접촉을 예방하기 위하여 트랜스웰 삽입체(벡콘 디킨슨 랩웨어)를 사용하여 수행되었다. 골수 세포를 하부 방에서 플레이트하고, 이어서 5TGM1 골수 세포(2e3)을 하부 방(직접 접촉) 또는 상부 방(무접촉)에서 플레이트하였다.

45Ca- 표지된 태아 래트 장골의 기관 배양

5TGM1 배양액에서 회수된 조건화된 배지를 상술된 바와 같은 45Ca-표지된 태아 래트 장골의 기관 배양에 의하여 골흡수 활성에 대하여 분석하였다(Mbalaviele 1995). 임신한 래트에 임신기간의 18일째에 250 uCi의 45Ca(New England Nuclear)로 주사하였다. 요골 및 척골 축을 미세해부에 의하여 19-일된 태아에서 획득하고, 티없는 그물 격자 위의 공기 및 액체-상 사이에 0.1 % BSA로 보충된 BGJ 배지(시그마)에서 24시간동안 예비배양시켰다. 이어서 뼈를 조건화된 배지(50% v/v)의 존재 또는 대조구 배지에서 120 시간동안 배양하였다. 배지를 48시간에 한번 교환하였다. 배양의 말기에 뼈를 2시간동안 얼음-냉각된 5% 트리클로아세트산에서 항온배양하고, 뼈에 45Ca 방사능활성 처리한 후 배지를 액체 신틸레이션 계수로 측정하였다. 뼈 흡수는 (배지에서 45Ca 계수)/(배지 및 뼈에서 45Ca 계수)×100에 의하여 계산되어 뼈에서 배지로 방출된 45Ca의 백분율로 정량하였다.

마우스 간질 세포주 ST2 세포와 5 TGM 1 골수종 세포의 공배양

ST2 세포(0.5e6) 및 5TGM1(4e6) 세포를 10% FBS-보충된 IMDM에서 60-mm 배양 접시(벡콘 디킨슨) 위에 함께 플레이트하고 밤새 배양한 후, 혈청이 없는 IMDM으로 2회 세척하여 혈청이 없는 IMDM 5ml로 항온배양하였다. 48시간 후에, 조건화된 배지를 회수하여 사용할 때까지 -70℃에서 저장하였다.

5 TGM 1-보유하는 마우스에서 혈청 IgG 2b 상승에 미치는 VLA -2에 대한 mAb PS2의 영향

골수를 콜로니화하게 만드는 1e5 5TGM1로 마우스를 주사한다. 마우스는 3 마리의 2개 군으로 분리하고 한 군은 대조군으로 다른 군은 8일째에 시작하여 2주마 다 80ug mAb PS/2(4 mg/kg)으로 처리하였다. 5TGM1 골수종 세포에 의하여 제조된 항체 이소형, IgG2b의 수준은 1 내지 6 동안 매주 측정되었다.

결과

ST2 단일층에의 5 TGM 1 부착에 대한 VCAM -1 및 VLA -4에 대한 항체의 효과 및 VCAM-1, VLA -4의 발현

RT-PCR을 사용하여, 본 발명자는 골수 간질 세포 및 골수종 세포에서 각각 VCAM-1 및 인테그린 VLA-4의 발현을 확인하였다. 예측한 바와 같이, ST2 간질 세포주 및 일차 골수 간질 세포 모두는 VCAM-1을 발현하지만, 5TGM1은 발현하지 않는다. 반대로, 5TGM1 골수종 세포는 인테그린 VLA-4를 발현하나 간질 세포는 발현하지 않는다(데이타가 제시되지 않음). 게다가, 항-VCAM-1 항체(10 ug/ml) 및 VLA-4 항체(10 ug/ml) 모두가 ST2 단일층에 5TGM1 세포의 부착을 부분적으로(50-80%) 저해하여, 상기 세포에서 발현되는 VCAM-1 및 VLA-4 인테그린이 생물학적으로 기능성이고 상기 항체가 중화 활성을 갖음을 보여주었다(데이타가 제시되지 않음).

마우스 골수 세포와 5 TGM 1 골수 세포의 공배양에서 OC -유사 세포 형성

마우스 골수 세포와 5TGM1 세포의 공배양 6일째에, 다수의 TRAP-양성 다핵화된 파골세포-유사(OC-유사) 세포가 형성되었다. 상기 OC-유사 세포는 상아질 슬라이스 위에 재흡수 구멍의 형성을 보여주었고, 이는 상기 세포가 뼈를 재흡수할 수 있으며 파골세포적 표현형을 보유함을 시사한다. 트랜스웰 삽입체를 사용한 실험에서, OC-유사 세포의 형성이 5TGM1 세포가 골수 세포와 직접 접촉하여 배양되는 경우 관찰되었다. 반대로, 5TGM1 세포가 트랜스웰 막에 의하여 골수 세포로부터 분리 되는 경우 형성된 OC-유사 세포는 한계 수만이 존재하였다. 따라서, 5TGM1 세포는 혼합된 골수 배양에서 파골세포 형성을 유도하고 이러한 유도는 세포-세포의 직접 접촉을 필요로 한다.

골수 세포와 5 TGM 1의 공배양에서 VCAM -1 및 인테그린 VLA 4에 대한 항체가 OC-유사 세포 형성에 미치는 영향

항-VCAM-1 항체(VCAM-1 Ab, 10 ug/ml) 및 항 VLA-4 인테그린 항체(알파4베타1 Ab, 10 ug/ml) 모두가 OC-유사 세포 형성을 상당히 저해하였다. 반대로 간질/골수종 상호작용에 관여하는 골수 간질 세포상의 또다른 부착 세포, ICAM-1에 대한 mAb가 OC-유사 세포 형성에 영향을 미치지 않는다(도1).

VCAM-1 및 VLA-4 mAb에 의한 상기 저해가 5TGM1-유도된 OC-유사 세포 형성에 특이적이고 세포독성에 기인하지 않는지 결정하기 위하여, 상기 항체의 효과를 마우스 골수세포 배양에서 파골세포 생성의 자극제로 널리 사용되는 1,25(OH)₂D₃에 의하여 유도되는 OC-유사 세포 형성에서 조사하였다(Takahashi 1988). VCAM-1 Ab 및 VLA-4 mAb는 그 자체로 간질 세포에서 VCAM-1 발현에 영향을 미치는 비타민 D3에 의하여 유도되는 OC-유사 세포 형성을 저해하지 않는다(데이타가 제시되지 않음).

5 TGM 1 및 ST2의 공배양에서 회수된 조건화된 배지가 골흡수에 미치는 영향

5TGM1 및 ST2 세포의 공배양에서 회수된 조건화된 배지는 태아 래트 장골 분석에서 골흡수의 현저한 증가를 보여주었으나(도2), 5TGM1의 조건화된 배지는 대조 배지에 비하면 한계 증가만을 야기했다. ST2 세포에서 유래된 조건화된 배지는 골흡수에서 증가를 보이지 않는다. 따라서 VCAM-1 및 VLA-4 양자에 의한 세포-세포의 직접 접촉은 파골세포-유사 세포 및 시험관내 골흡수 인자의 생성를 유도한다.

재조합 가용성 VCAM -1( sVCAM -1)이 5 TGM 1 세포에 의한 골흡수 및 파골세포 생성에 미치는 영향

VCAM-1(sVCAM-1)의 가용성 재조합 형으로 처리된 5TGM1의 조건화된 배지는 용량에 의존하는 방식으로 태아 래트 장골에서 골흡수를 증가시키지만, 비처리된 5TGM1에서 획득된 조건화된 배지는 재흡수를 한계적으로 증가시켰다. 가용성 VCAM-1 그자체는 골흡수에 영향을 끼치지 않았다(데이타가 제시되지 않음). 마우스 골수 배양계에서, sVCAM-1로 처리된 5TGM1 세포에서 회수된 조건화된 배지는 OC-유사 세포 형성의 활성 증가를 나타내지만, 비처리된 5TGM1의 조건화된 배지는 OC-유사 세포 형성의 한계 활성만을 나타내었다(도3).

뮤린 골수종 세포의 존재 및 부재시 배양된 골수 간질 세포(ST2)에서 랑크리간드 mRNA 의 발현

랑크(Rank) 리간드가 OCL 형성의 중요한 매개체로 보이고 OCL 생성에서 파골세포생성 시토킨의 영향에 대한 제1 공통 경로일 수 있기 때문에, 본 발명자는 5TGM1 및 ST2 세포 각각 및 공배양 모두에서 랑크 리간드의 발현을 조사하였다. 본 출원인은 5TGM1 및 ST2 세포의 공배양이 ST2 세포에서 랑크 리간드 mRNA를 유도함을 발견한다. 또한, 5TGM1 세포는 랑크 리간드를 발현하지 않지만, sVCAM-1로 처리되는 경우 발현한다(제시되지 않음). 결국, sVCAM-1로 처리된 5TGM1 세포에서 조건화된 배지는 ST2 세포에서 랑크 리간드 mRNA을 유도하며, 이것은 VCAM-1/VLA-4 경로가 골수 간질 세포에 의한 랑크 리간드 발현을 향상시키는 골수종 세포에서 시토 킨을 생성함을 시사한다(데이터가 제시되지 않음).

요약하자면, 본 출원인은 5TGM1 세포 단독이 OC-유사 세포 형성 및 골흡수를 자극하는 활성의 한계량을 생성함을 보여준다. 그러나, 5TGM1 골수종 세포가 조혈 파골세포 전구체 및 간질 세포를 포함하는 골수종 세포와 함께 배양되는 경우, 이것은 간질 세포에 강하게 부착되고 OC-유사 세포 형성을 증가시켰다. 5TGM1 세포의 간질 세포와의 접촉이 방지되는 공배양에서도 OC-유사 세포는 형성되지 않았다. 게다가, 태아 래트 장골의 기관 배양에서 5TGM1 골수종 세포 및 ST2 골수 간질 세포의 공배양에서 회수된 조건화된 배지는 ST2 또는 5TGM1 단독의 조건화된 배지와 비교하여 골흡수 활성을 증가시킨다. 상기 데이타는 골수 간질 세포와 5TGM1 세포의 세포-세포 직접 접촉이 파골세포 자극 및 골흡수 활성의 생성에 요구된다는 생각과 일치한다. 이어서 본 출원인은 어떤 세포 부착 분자가 파골세포 형성 활성의 생성에 필요한 5TGM1 세포 및 골수 간질 세포 간의 세포-세포 직접 상호작용에 관련되는지를 결정하였다. 데이타는 VCAM-1 및 VLA-4 인테그린 분자에 대한 중화 항체가 공배양에서 OC-유사 세포 형성을 상당히 감소시키기 때문에 상기 2개의 부착 분자가 상기 세포-세포 상호작용에서 작용함을 나타낸다. VCAM-1/VLA-4 인테그린 상호작용은 골수 간질 세포 및 5TGM1 골수종 세포 간의 세포-세포 신호전달을 야기하므로 파골세포생성 및 골흡수 활성의 생성 증가를 유도한다. 결국, 상기 골흡수의 활성은 부분적으로 랑크 리간드의 유도에 기인한다.

실시예 2: 생체내 실험

본 시험관내 실험은 골수종 세포상의 VLA-4와 골수 간질 세포상의 VCAM-1 사 이의 상호작용이 골수종에 의한 골흡수의 유도에 중요한 작용을 할 수 있음을 시사한다. 본 출원인은 인간 질병을 정확하게 반영하는 동물 모델의 상체내에서 상기 가설을 시험하는 중요한 단계를 채택하였다.

A. 본 실험에서 골수를 콜로니화할 수 있는 1e5 5TGM1 골수종 세포로 마우스를 주사하였다. 마우스는 3마리의 2개 군으로 분리하고, 1군은 대조군으로, 2군은 8일째에 시작하여 2주마다 mAb PS/2로 처리하였다. 5TGM1 골수종 세포에 의하여 생성된 항체 이소형, IgG2의 수준은 1 내지 6주에 매주 측정되었다. 2주마다 주사당(~4 mg/kg) 80ug의 용량으로 mAb의 처리는 생체내 골수종 세포 생존 및 성장의 상당한 저해를 시사하면서 IgG2b 생성을 강하게 저해하였다(도4). 또한, 처리된 마우스는 양측하지 마비의 발생을 감소시켰다(총 3마리의 비처리된 동물은 42일째에 양측하지 마비를 나타내지만, 처리된 동물은 단 한마리만 양측하지 마비를 나타낸다). 양측하지마비가 없는 2마리의 비처리된 동물은 종양 적재와 상관관련있는 비장 및 간 중량의 감소를 나타내었다. 결국, 처리된 동물은 경골 및 대퇴골에서 조직학적으로 종양 부위의 감소(약 6.71+/- 1.74 내지 0.05 +/- 0.08 평방밀리터)를 나타내었다. 처리는 혈청 칼슘 수준에 어떠한 효과도 없었다(데이타가 제시되지 않음).

B. 평행 실험에서, 2주마다 40 ug PS/2로 처리는 IgG2b 수준에 영향을 미치지 않는다(제시되지 않음). 상기 데이타는 VLA-4에 대한 mAb PS/2이 수립된 골수종 세포의 성장을 용량-의존적인 방식으로 강하게 저해함을 보여주었다.

C. 또다른 생체내 실험에서, 18SCID 마우스는 0일째에 5TGM1 골수종 세포로 주사하였다. 4마리 마우스는 PBS로 처리하였다; 4마리 마우스는 예방적 프로토콜에서 1일째 시작하여 매3일마다(즉, 1, 2, 5, 8, 및 11일) 80ug(-4mg/kg)의 용량으로 마우스 VCAM1에 대하여 반응하는 mAb M/K-2.7로 처리하였다. 동일한 프로토콜을 사용한 평행 실험에서, 5마리 마우스를 160 ug의 mAb M/K-2.7을 사용하여 처리하였다. 또한, 5마리 마우스를 치료적 프로토콜에서 8일째에 시작하여(즉, 8, 11, 14, 17 및 20일) 160 ug mAb M/K-2.7으로 처리하였다. 혈청을 21, 28 및 35일에 마우스에서 채취하고, 동물은 35일째 X-레이를 찍은 후, 조직학을 위하여 치사되었다. 3마리 처리군 모두는 IgG2b 혈청 수준의 감소를 나타내며, 골수종 세포 적재의 감소를 보여주었다(도5). 대조군에 비하여 저용량 예방적 프로토콜에서 비장 중량에서 상당한 효과를 관찰하였다(대조군에 대한 0.23+/-0.14 g 대 처리군에 대한 0.08+/-0.04). 예방학적 고용량군에서 5마리 동물중 4마리는 비장 중량의 명백한 감소를 보여주었으나, 비장 중량이 큰 동물때문에 전체값은 상당하지 않았다.(데이타가 제시되지 않음).

D. 본 발명자는 알파4 인테그린 길항체의 최초 고용량의 환괴 및 이후 유지 용량이 효능을 향상시키는지 조사하였다. 골수 구획에서 골수종 세포는 이미 수립되고, VCAM-1과 이것의 강한 VLA-4 의존성 상호작용이 저해되어야 한다. 또한 수립된 골수종 세포의 수가 많을수록 말초 순환으로 세포를 흘려버리는데 필요한 최초 용량이 더 커진다.

따라서, 항-VLA-4 항체 PS/2의 대형 연구를 수행하였다. 28 SCID 마우스를 0일째 5TGM1 골수종 세포로 주사하였다. 9마리 마우스는 처리하지 않고, 9마리는 이 소형-부합된 대조 IgG mAb를 투여하였으며, 10마리 마우스는 mAb PS/2 알파4인테그린으로 처리하였다. 다른 치료 방법을 사용하여 마우스에 4, 5 및 6일째에 mAb(200 ug)의 고용량을 투여하여 8일째부터 3일마다 계속 80 ug(-4mg/kg)의 유지 용량을 투여하였다.

처리군을 처리되지 않은 군 또는 3 및 4주에 IgG 처리된 대조군에 비교한 경우, 통계적으로 혈청 IgG2b의 상당한 감소가 있었다. 중요하게는, 처리군이 처리되지 않은 군 또는 IgG-처리된 대조군에 비교한 경우, 생존에 미치는 명백한 효과가 있었다(도6).

실시예 3: 기타 생체내 실험

처음에 본원에서 제시된 정보에 기초하여, 당업자는 설명된 뮤린 동물 모델을 사용하여 다발성 골수종에서 알파4 인테그린 및 이것의 리간드의 중요성을 용이하게 확인할 수 있고 확장할 수 있다.

다음 일련의 실험들은 본 개시에 기초하여 당업자의 수준에 포함되지만 본 발명의 유형을 단순히 예시하는 것이며 이에 한정되는 것은 아니다.

1) 적절한 2주마다의 유지 용량을 결정하기 위한 mAb PS/2에 대한 용량 반응. 80 ug는 양호한 효능을 나타내지만, 40 ug은 효과가 없었다. 최적 용량을 결정하기 위하여 20 mg/kg 이하의 고용량으로 매주 2회 또는 3회 조사한다.

2) 종양 적재 증가와 연관된 다양한 단계의 심각한 질병을 가진 환자. 질병의 확립 후 다양한 시간에 투여한 mAb PS/2의 효능을 조사한다. 즉 접종 후에 2, 3, 4, 및 5주 후 시작하는 치료와 8일째 시작하는 치료를 비교하여, mAb가 증상의 완화를 제공하기위하여 걸리는 시간을 측정한다.

3) 뮤린 VCAM-1에 대한 mAb MK-2의 효능 조사를 하고 VLA-4에 대한 mAb에 대하여 상기 개요된 동일한 매개변수를 조사한다. 유사한 용량 수준이 효능을 보기 위하여 요구될 것으로 예상된다.

4) 조직형태학에 의한 골격의 방사선 사진 분석에 의한 골손상의 정량, 골수 및 연수외 부위에서 종양 적재; 혈장에서 콜라겐 가교결합의 측정에 의한 골흡수 속도의 측정; 혈장에서 모노클로날 단백질 생성의 측정; 고칼슘혈증의 존재 위치; 및 사망률을 비롯한 골수종 진행의 추가적 마커를 조사한다.

5) 다발성 골수종은 최근 표준 화학치료법으로 불충분하게 치료된다. mAb의 추가적 또는 상승적 효과는 저절한 화학치료법으로 투여 이전 또는 이후에 배합되어 측정된다.

6) mAb의 효과를 의태하거나 골수종 진행을 차단하기 위하여, 한번에 하나의 특정 알파4 인테그린에 선택적이거나 또는 수개의 알파4 인테그린에 선택적인 소형 분자 알파4 인테그린 저해제의 능력 또는 상기 저해제의 배합 능력을 상술된 프로토골 및 결과를 사용하여 조사한다. 소형 분자 저해제는 매주 2회 또는 3회, 매일 1회 또는 2회, 0.1 내지 30 mg/kg의 용량 범위로 비경구 또는 경구로 전달된다.

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Claims (29)

1. 다발성 골수종 치료용 조성물로서, 상기 조성물은

   a) 항-VLA-4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편;

   b) 항-알파4/베타7 인테그린 항체 또는 이의 항원-결합성 단편; 및

   c) 항-VCAM-1 항체 또는 이의 항원-결합성 단편

   으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합성 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이의 항원-결합성 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
2. 골수 종양과 관련된 골흡수 저해용 조성물로서, 상기 조성물은

   a) 항-VLA-4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편;

   b) 항-알파4/베타7 인테그린 항체 또는 이의 항원-결합성 단편; 및

   c) 항-VCAM-1 항체 또는 이의 항원-결합성 단편

   으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합성 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이의 항원-결합성 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
3. 파골세포생성의 존재를 특징으로 하는 질병 치료용 조성물로서, 상기 조성물은

   a) 항-VLA-4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편;

   b) 항-알파4/베타7 인테그린 항체 또는 이의 항원-결합성 단편; 및

   c) 항-VCAM-1 항체 또는 이의 항원-결합성 단편

   으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합성 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 이의 항원-결합성 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
4. 다발성 골수종 치료용 조성물로서, VLA-4/VCAM-1 상호작용을 길항하는 가용성 VLA-4 또는 VCAM-1 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
5. 골수 종양과 관련된 골흡수 저해용 조성물로서, VLA-4/VCAM-1 상호작용을 길항하는 가용성 VLA-4 또는 VCAM-1 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
6. 파골세포생성의 존재를 특징으로 하는 질병 치료용 조성물로서, VLA-4/VCAM-1 상호작용을 길항하는 가용성 VLA-4 또는 VCAM-1 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 HP1/2 항체 또는 이의 항원-결합성 단편, HP2/1 항체 또는 이의 항원-결합성 단편, HP2/4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편, L25 항체 또는 이의 항원-결합성 단편, P4C2 항체 또는 이의 항원-결합성 단편, 및 P4G9 항체 또는 이의 항원-결합성 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된 항-VLA-4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편인 것인 조성물.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 각각 뮤린 21.6 항-VLA-4 항체 유래의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 인간화된 경쇄 및 인간화된 중쇄를 포함하는 인간화된 항-VLA-4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편인 것인 조성물.
9. 제8항에 있어서,

   (a) 인간화된 경쇄는 인간 카파 경쇄 가변 영역 골격 서열로부터의 가변 영역 골격을 포함하고, 상기 골격 영역의 하나 이상의 아미노산 위치는 뮤린 21.6 면역글로불린 경쇄 가변 영역 골격의 균등 위치에 존재하는 아미노산에 의해 점유되고;

   (b) 인간화된 중쇄는 인간 중쇄 가변 영역 골격 서열로부터의 가변 영역 골격을 포함하고, 상기 골격 영역의 하나 이상의 아미노산 위치는 뮤린 21.6 면역글로불린 중쇄 가변 영역 골격의 균등 위치에 존재하는 아미노산에 의해 점유되는 것인 조성물.
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 인간화된 21.6 항체인 것인 조성물.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합성 단편 또는 폴리펩티드는 비경구 투여할 수 있는 것인 조성물.
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 코르티코스테로이드, 소염제, 면역억제제, 항대사제 또는 면역조절제를 더 포함하는 조성물.
13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합성 단편인 것인 조성물.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-VLA-4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 VLA-4의 알파쇄에 결합하는 것인 조성물.
15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-VLA-4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 B 에피토프 특이적 항-VLA-4 항체 또는 이의 항원-결합성 단편인 것인 조성물.
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