NO327855B1

NO327855B1 - Anvendelse av integrin-antagonister for fremstilling av et medikament til behandling av multippelt myelom samt myelom-indusert benresorpsjon

Info

Publication number: NO327855B1
Application number: NO20011244A
Authority: NO
Inventors: Toshiyuki Yoneda; Gregory R Mundy
Original assignee: Univ Texas
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2009-10-05
Also published as: SK287601B6; HUP0103630A3; KR100628818B1; NO20011244D0; EE05558B1; IS5856A; CZ2001916A3; NO20011283D0; CA2343579C; EP2065050A1; CZ302997B6; CN1236815C; CA2343579A1; SI1113810T1; CY1109413T1; ZA200102032B; EP1113810A2; IL141877A0; EA004270B1; PL347128A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse som angitt i krav 1 og krav 9 for fremstilling av medikamenter til behandling av multippelt myelom samt frigjøringen av benresorberende faktorer av myelomceller, noe som resulterer i alvorlig bentap som er den viktigste bi-effekt av myelom hos mennesker. Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse anvendelse av en antagonist for interaksjonen mellom alfa alfa-4-subenhet inneholdende integriner og en ligand for et alfa-4-subenhet-bærende integrin for fremstilling av et slikt medikament som inhiberer de biologiske effekter av slik adhesjon som er assosiert med målretting av multippel myelomceller til benmarg; deres påfølgende integrin-avhengige overlevelse og deres integrin-avhengige frigjøring av ben-resorberende faktorer, noe som leder til bendestruksjon hos pasienter med multippelt myelom.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Multippelt myelom er den nest vanligste hematologiske sykdom med 15.000 nye tilfeller hvert år og 30.000 til 40.000 myelompasienter i Amerika årlig (Mundy og Bertolini 1986). Åtti prosent av pasientene lider av ødeleggende osteolytisk bendestruksjon forårsaket av øket osteoklast (OCL)-dannelse og aktivitet (Mundy og Bertolini 1986) . Denne bendestruksjon kan forårsake utrolig bensmerte, patologiske brudd, sammenpressing av ryggsøylen og livstruende hyperkalsemi. Fordi multippelt myelom ikke kan bli helbredet med standard kjemoterapi eller stamcelle-transplantasjon (Attal et al, 1996) og på grunn av den alvorlige morbiditet og potensielle dødelighet assosiert med myelomatisk bensykdom, er behandlingsmetoder som kontrollerer myelomvekst-en i seg selv, og spesielt den osteolytiske bendestruksjon som opptrer i disse pasienter, av avgjørende viktighet.

Imidlertid er de patologiske mekanismer som er ansvarlige for den økede osteoklast-aktivitet hos pasienter med multippelt myelom, ukjent (Mundy, 1998). Benlesjonene opptrer i flere mønstre. Enkelte ganger utvikler pasienter enkelt-stående osteolytiske lesjoner som er assosiert med enkelt-stående plasmacytomer. Enkelte pasienter har diffus osteo-penia, som etteraper utseende av osteoporose og er basert på at myelomcellene er spredt diffust gjennom det aksielle skjelett. Hos de fleste pasienter er det multiple enkelt-stående lytiske lesjoner som opptrer ved siden av reder av myelomceller. Hyperkalsemi opptrer som en følge av bendestruksjon i omkring en tredjedel av pasienter med langt fremskreden sykdom. Sjeldent har pasienter med myelom ikke lytiske lesjoner eller bentap, men har i stedet en økning i dannelsen av nytt ben omkring myelomceller. Denne sjeldne situasjon er kjent som osteosklerotisk myelom.

Osteolytiske benlesjoner er overlegent de vanligste skele-tale manifestasjoner hos pasienter med myelom (Mundy, 1998). Selv om de nøyaktige molekylære mekanismer er uklare, har observasjoner over 15 år vist at: 1) mekanismen hvorved ben blir ødelagt i myelom er via osteoklasten, som er den normale ben-resorberende celle; 2) osteoklaster akkumulerer på ben-resorberende overflater i myelomer som ligger ved siden av samlinger av myelomceller og det synes som om mekanismen hvorved osteoklaster blir stimulert hos myelom, er lokal; 3) det har vært kjent i mange år at kulturer av humane myelomceller in vitro danner flere osteoklast-aktiverende faktorer innbefattende lymfotoksin-alfa (LT-a), interleukin-1 (IL-1), paratyroid-hormon-relatert protein (PTHrP) og interleukin-6 (IL-6); 4) hyperkalsemi opptrer i omkring en tredjedel av pasientene med myelom en eller annen gang i løpet av sykdommen. Hyperkalsemi er alltid assosiert med markert øket benresorpsjon og ofte med skade på glomerulær filtrering; 5) økningen i osteoklastisk benresorpsjon ved myelom er vanligvis assosiert med en markant svekkelse i osteoblast-funksjon. Alkalisk fosfatase-aktivitet i serumet er minsket eller i det normale område, ulikt pasienter med andre typer osteolytisk bensykdom, og radionuklid-undersøkelser viser ikke tegn på øket opptak, noe som indikerer svekkede osteoblast-responser på økningen i benresorpsjon.

Selv om forskjellige mediatorer opplistet ovenfor har vært implisert i stimuleringen av osteoklast-aktivitet hos pasienter med multippelt myelom, har rapporter av faktorer dannet av myelomceller ikke vært konsistente og enkelte studier har vært ubestemte grunnet tilstedeværelsen av andre forurensende celletyper innbefattende stromalceller og makrofager i den multiple myelomcelle-populasjon. IL-6 er en myelomvekst hovedfaktor som øker veksten av flere myelomcellelinjer samt ferskt isolerte myelomceller fra pasienter Bataille et al., 1989). IL-6-produksjon kan bli påvist i omkring 40% av ferskt isolerte myelomceller med PCR, men kun 1 av 50 pasienter som var studert, viste påvisbar IL-6-produksjon med immunocytokjemi eller ELISA-assays (Epstein, 1992). IL-6-reseptorene ble kun påvist i 6 av 13 prøver fra pasienter med multippelt myelom (Bataille et al, 1992). Videre har ferdigutviklede myelomceller blitt rapportert å ha en minimal proliferativ respons overfor IL-6. Interleukin-11 (IL-11) har en IL-6-liknende aktivitet på plasmacytomer, men til nå har ingen vist at myelomceller danner IL-11. Bataille og medarbeidere (1995) har vist at perfusjon av 5 pasienter med refraktorisk myelom med et antistoff mot IL-6 minsket størrelsen av myelomcelle-mengden i kun 2 av disse pasienter. IL-1 er et ekstremt kraf-tig ben-resorberende middel som induserer hyperkalsemi i dyremodeller ved fravær av nyresvikt (Boyce et al, 1989).

I motsetning til dette opptrer hyperkalsemi sjelden hos myelompasienter uten nyresvikt. Viktigere er det at i høyt rensede myelomcellelinjer kan ingen IL-1 og kun sjeldent TNF-a-produksjon bli påvist, noe som antyder at andre forurensende celletyper så som makrofager, kan være kilden for IL-1 og TNF-a (Epstein 1992). På liknende måte blir LT-a dannet av de fleste humane myelomcellelinjer (Bataille et al, 1995), men synes ikke å bli produsert av myelomceller in vivo (Alsina et al, 1996). I tillegg til IL-1, TNF-a, LT-a og IL-6, danner myelomceller en avkortet form av M-CSF som er biologisk aktiv, men M-CSF forårsaker ikke hyperkalsemi eller induserer osteoklast-dannelse av seg selv i humane marg-kulturer (MacDonald et al, 1986) .

Således har rollen til noen av disse faktorer i osteolytisk bensykdom hos pasienter med myelom ikke blitt klart vist in vivo, slik at kjente cytokiner klart ikke fullstendig er ansvarlige for benresorpsjonen som observeres hos disse pasienter .

Rolle av adhesjonsmolekyl- interaksjoner i

myelomatisk bensykdom

Anderson og medarbeidere var den første gruppen til å vise viktigheten av adhesive interaksjoner mellom myelomceller og celler i mikromiljøet hos benmarg, både ved veksten av myelomceller og utviklingen av osteolytisk bensykdom. Multippel myelomceller uttrykker celleoverflate adhesjons-molekyler, CD29 (VLA-4), LFA-1 og CD44 (Chauhan et al, 1995). Disse forskere foreslo at myelomceller plasserte seg til margen via spesifikke adhesjons-interaksjoner mellom ekstracellulære matriseproteiner og stromale benmargsceller. De viste videre at adhesjon av multiple myelomceller til stromalceller satte i gang IL-6-sekresjon hos både normale og multiple myelom benmargsavledede stromalceller og øket IL-6-mediert tumorcellevekst. Imidlertid minsker ikke antistoff mot CD29, LFA-1 eller CD44 IL-6-produksjon hos stromale benmargsceller som reaksjon på myelomceller, noe som antyder at en annen ligand-reseptor-interaksjon satte i gang IL-6-sekresjonen ved at stromale benmargsceller binder seg til myelomceller. Identifikasjon av en mulig adhe-sjonsvei alene betyr ikke nødvendigvis at veien er viktig. I dette tilfelle spiller ingen av de impliserte veier en rolle ved IL-6-produksjon.

Vanderkerken et al (1997) undersøkte også den fenotypiske adhesjonsprofil av murine 5T2-celler og 5T33 myelomceller i en modell for murint myelom. Disse forskere viste at disse cellelinjer uttrykte VLA-4, VLA-5, LFA-1 og CD44, og foreslo at disse adhesive interaksjoner munne være viktige for myelomceller til å binde seg til stromale margceller.

Ikke desto mindre, til tross for mange laboratoriefrem-skritt forblir de fundamentale mekanismer som ligger til grunn for øket osteoklastisk benødeleggelse ved myelom in vivo dårlig forstått. Dette blir reflektert ved at det ikke er mulig lett å overføre data angående adhesive interaksjoner in vitro til in vivo-forhold. For eksempel impli-serer mange in vitro-studier både integrin VLA-4 og integrin LFA-1 ved adhesjonen av hematopoietiske stamceller til benmargs-stroma (oversikt i Papayannopoulou og Nakamoto, 1993). Disse in vitro-data ville forutsi at hver vei, om blokkert in vivo, ville resultere i periferalisering av hematopoietiske stamceller fra marg til perifert blod. Like-vel, i et primat-studium, selv om et monoklonalt antistoff (mAb) mot VLA-4 effektivt periferialiserte stamceller, var et monoklonalt antistoff mot beta2 integrinkjeden av LFA-1 uten effekt til tross for økende neutrofiltall, noe som således viser effektiviteten av mAb'et (Papayannopoulou og Nakamoto, 1993). Disse data viser at in vitro-resultatene faktisk var ute av stand til nøyaktig å forutsi in vivo-relevans.

Det bør bemerkes at rollen av integrin VLA-4 har blitt studert i metastaser av multiple tumorer innbefattende leuke-mier og lymfom, med motstridende resultater. Således re-sulterte transfeksjon av den humane alfa-4-kjede i kinesisk hamster ovarieceller (CHO) i VLA-4-ekspresjon og gjorde disse i stand til å migrere til benmarg in vivo, et fenomen som inhiberes av mAbs mot VLA-4 (Matsuura et al, 1996). I motsetning til dette inhiberer transfeksjon av lymfomceller med VLA-4 sterkt metastaser til lever, lunge og nyre, og var uten effekt på plassering og proliferasjon i marg (Gosslar et al., 1996). I tillegg inhiberte ekspresjon av VLA-4 på høyt metastatiske murine melanomceller sterkt dannelsen av pulmonare metastaser in vivo (Qian et al., 1994) og predisponerte ikke melanom til benmargsmetastaser.

Fra Journal of Bone & Mineral Research, vol. 13, nr. 8, 1998 er det vist at inhibering av a4 VCAMI-interaksjon mellom hamsterceller transfektert med human- a4 cDNA (a-human-a4) og mus-benmargceller (VCAM-l-reseptor) hemmet økning/økt aktivitet av osteoklaster a-human-ou og a-mus-VCAM-1 antistoffer ble anvendt som antagonister for nevnte cellereseptor.

Fra Cancer Research, 57, 1997, side 930-936 er det vist at 50-80% av CD19<+> myelomceller adherte til benmargceller mot kun mindre enn 10% celleadhesjon for CD19<+> ikke-myelomceller. Denne celle-celle-kontakten ble hemmet av a-VLA4, a-(3 7 integrin og a-CD44 antistoffer.

Fra Cancer, 1997, oktober, 80. 8 suppl., side 1557-1563 er det foreslått at VLA4, VLA5, MCP-1, 1CAM1, CD21, CD44, LFA-1 og LFA-2 kan være aktuelle kandidater som cellereseptorer mellom benmargceller og myelomceller. En slik interaksjon mellom nevnte celler øker utskillelse av visse cytokiner så som IL-6.

Oppsummeringsvis er det ikke klart på basis av in vitro studier, hvordan pålitelig å forutsi in vivo relevans av adhesjonsveier. Videre, selv når in vivo studier har blitt utført er resultatene inkonsistente. En hovedgrunn for de overraskende inkonsistenser innenfor området multippelt myelom, er at for tiden tilgjengelige dyremodeller ikke er gode til å forutsi human sykdom. I tilfelle med multippelt myelom er humane og murine myelomcellelinjer som kan bli dyrket in vitro, sjelden assosiert med bendestruksjon in vivo (Mundy 1998).

Det ville være sterkt ønskelig å identifisere forbindelser eller antagonister som inhiberer dannelsen av disse ben-resorberende faktorer, for således å stanse progressiv ben-ødeleggelse og forbedre livskvaliteten hos pasienter med myelom.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Søker har benyttet en nylig utviklet murin-modell av multippelt myelom hvor musene utvikler alvorlig osteolyse med alle tegn tilsvarende den humane sykdommen (Garrett 1997). Ved å bruke denne cellelinje og dyremodell har søker etablert at inhibering av alfa-4-integrin/alfa-4-integrinli-gand-veien in vivo fører til redusert kapasitet for multippelt myelomceller å proliferere og/eller overleve. Søker viser at celle-celle-festing mellom myelomceller og stromale margceller via VLA-4/VCAM-l-interaksjonen er nød-vendig for en økning i produksjonen av en aktivitet som stimulerer osteoklastisk benresorpsjon i ben-mikromiljøet in vitro.

Søker antar at denne interaksjonen er kritisk for stedsbin-dingen av myelomceller til benmargsrommet, for deres etter-følgende overlevelse og vekst og til slutt for progresjonen av myelom-indusert osteolyse. Søker undersøkte dette i dyremodellen og fant at in vivo inhiberer en antagonist av det alfa-4-subenhet-inneholdende integrin VLA-4 sterkt produksjonen av antistoff av IgG2b-subtypen. Denne isotype er den samme som den dannet av 5TGM1 cellelinjen og er et nøy-aktig surrogat for antallet myelomceller i benmargsrommet ved enhver tid. Således inhiberer blokkering av VLA-4-veien sterkt IgG2b-produksjonen, og derved implisitt nivået av myelombelastning.

Et aspekt av oppfinnelsen er anvendelse av en antagonist for interaksjonen mellom et a-4-subenhet-bærende integrin og en ligand for et a-4-subenhet-bærende integrin for fremstilling av et medikament til behandling av multippelt myelom. Denne antagonist kan være et alfa-4 integrinbindende middel eller et alfa-4 integrin-ligandbindende middel. Foretrukne midler er anti-VLA4-eller anti.alfa4beta7-antistoff-homologer (humant antistoff, et chimerisk antistoff, et humanisert antistoff samt fragmenter derav); anti-VCAM-l-antistoffhomologer (et humant antistoff, et chimerisk antistoff, et humanisert antistoff samt fragmenter derav); og en småmolekylær inhibitor for interaksjoner mellom alfa-4-subenhet-inneholdende integriner og deres ligander. Sammensetningen kan bli administrert ved en dose for å fremskaffe fra omkring 0,1 til omkring 20 mg/kg kroppsvekt. Spesielt kan de foretrukne midler antagonisere en interaksjon: a) av både VLA-4 og alfa-4-betaa-7 kollektivt med deres respektive alfa-4-ligander; eller b) barre VLA-4 med dens alfa-4-ligand; eller c) bare alfa-4-beta-7 med dens alfa-4-ligand.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er anvendelse av en antagonist for interaksjonen mellom et a-4-subenhet-bærende integrin og en ligand for et a-4-subenhet-bærende integrin for fremstilling av et medikament for å inhibere benresorpsjon assosiert med tumorer av benmarg. Foretrukne midler er anti-VLA-4- eller anti-alfa-4-beta-7-antistoffhomologer (et humant antistoff, et chimerisk antistoff, et humanisert antistoff eller fragmenter derav); samt en småmolekylær inhibitor for interaksjonen mellom alfa-4-subenhet-inneholdnede integriner med deres respektive alfa-4-integrinligander (for eksempel VCAM-l/VLA-4-interaksjonen). Antagonisten kan bli administrert ved en dose for å gi fra omkring 0,1 til omkring 20 mg/kg kroppsvekt.

Det aktuelle medikament kan være egnet til å behandle et individ som har en lidelse som er særpreget ved tilstedeværelsen av osteoklastogenese, hvor slik osteoklastogenese blir hemmet. På liknende måte kan antagonisten være et alfa-4-bindende middel eller et alfa-4-ligand-bindende middel. Foretrukne midler er anti-VLA-4-eller anti-alfa-4-beta-7-antistoffhomologer (humant antistoff, chimerisk antistoff, et humanisert antistoff samt fragmenter derav); anti-VCAM-l-antistoffhomologer (et humant antistoff, et chimerisk antistoff, et humanisert antistoff samt fragmenter derav) og en småmolekylær inhibitor for interaksjonen mellom alfa-4-subenhetinneholdende integriner med deres respektive alfa-4-integrinligander (for eksempel VCAM-1/VLA-4-interaksjonen). Sammensetningen kan bli administrert ved en dose for å gi fra omkring 0,1 til omkring 20 mg/kg kroppsvekt.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1.

Effekt av nøytraliserende antistoff på TRAP-positive multinukleerte OC-liknende celledannelse i ko-kulturene av 5TGMl-celler og benmargsceller.

En blanding av 5TGMl-celler (1 e 3) og benmargsceller (1 e 6) i suspensjon ble sådd ut i 48 brønners kulturplater og ble dyrket med eller uten 10 ^g/ml anti-VCAM-l-antistoff (VCAM-1 Ab) , anti-alfa-4-beta-ll-antistoff (<x4pilAb) , anti-ICAM-l-antistoff (ICAM-1 Ab) eller rotte-IgG som en kontroll. Etter 6 dager i kultur ble kulturene fiksert og antallet TRAP-positive multinukleerte OC-liknende celler (TRAP(+) MNC) bestemt. Både VCAM-1 Ab og alfa-4-beta-ll Ab inhiberte TRAP(+) MNC-dannelse, mens ICAM-1 Ab ikke hadde noen effekt. Data er uttrykt som gjennomsnitt + S.E.

(n=3). <*> = Signifikant forskjellig fra IgG-kontroll.

Figur 2.

Effekt av 5TGM1- og ST2-kondisjonerte medier på benresorpsjon i organkulturer av føtale lange rotteben.

Kondisjonerte medier (48 timer) oppnådd fra ST2 alene,

5TGM1 alene og i samkulturer av ST2 og 5TGM1, ble undersøkt for benresorberende aktivitet i organkulturer av <45>kalsium-merkede føtale lange rotteben. Merkede føtale lange rotteben ble dyrket ved nærvær av kondisjonert medium (40% v/v)

eller kontrollmedium i 120 timer. Data er uttrykt som pro-sentvis økning av kalsiumfrigjøring i forhold til kontroll-

mediet. Frigjøring fra kondisjonert medium av ST2 stromale celler er vist som en åpen søyle. Frigjøring fra 5TGM1 er den skraverte søyle. Frigjøring fra kondisjonert medium innhøstet fra ko-kultur av 5TGM1 og ST2 er den lukkede søyle. Data er uttrykt som gjennomsnitt + S.E.

(n = 4). <*> = signifikant forskjellig fra ST2 alene.

= signifikant forskjellig fra 5TGM1 alene.

Figur 3.

Effekt av rekombinant oppløselig VCAM-1 (sVCAM-1) på produksjon av osteoklastogenetisk aktivitet hos 5TGMl-celler.

Kondisjonert medium ble innhøstet fra STGMl-celler dyrket ved nærvær eller fravær av sVCAM-1 (1 x IO<-8> til 1 x IO<-7 >molar) i 24 timer. Osteoklastogenetisk aktivitet av disse kondisjonerte medier ble undersøkt i musemargkulturer. Benmargceller (le6/brønn) ble sådd ut i 48 brønners plater og dyrket ved nærvær av kondisjonert medium (skraverte søy-ler) eller kontrollmedium (IMDM) inneholdende samme konsen-trasjoner av sVCAM-1 (åpne søyler). Etter 6 dager ble kulturene fiksert og det samme antall TRAP-positive multinukleerte OC-liknende celler (TRAP + MNC) ble bestemt. Kondisjonert medium fra 5TGMl-celler behandlet med 1 x IO<-7> M sVCAM-1 øket TRAP(+)MNC-dannelsen. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. (n = 3). <*> = signifikant forskjellig fra kontroller.

Fi gur 4.

Effekt av mAb PS2 til VLA-4 på serum IgG2b-økning i 5T6M1-bærende mus.

Mus ble injisert med le5 5TGMl-celler som ble tillatt å kolonisere benmargen. Mus ble delt opp i to grupper på tre hvor en virket som en kontrollgruppe og den andre behandlet på dag 8, 11, 14, 17 og 20 med 80 ^g mAb PS/2 (~ 4 mg/kg). Nivå av IgG2b som er antistoff-isotypen danne av 5TGM1 myelomceller, ble målt ukentlig fra uke 1 til 6. Mab-behandling inhiberte sterkt IgG2b-dannelse, noe som indikerer inhibering av myelomcelle-overlevelse og vekst in vivo.

Fi gur 5.

Effekt av mAb M/K-2.7 på VCAM-1 på serum IgG2b-økning i 5TGM1-bærende mus.

Mus ble injisert med 5TGMl-celler som beskrevet i Figur 4, og som ble tillatt å kolonisere benmargen. Mus ble delt opp i grupper på fire eller fem, hvor en gruppe virket som kontroll (åpen firkant), de andre/tredje grupper behandlet profylaktisk ved 80 ^g (åpne ruter) og 160 ^g mAb (åpne sirkler) (~ 4 til 8 mg/kg), den fjerde gruppe behandlet terapeutisk ved 160 ^g mAb (trekanter). Nivå av IgG2b, som er antistoff-isotyper dannet av 5TGM1 myelomceller, ble målt. Mab-behandling inhiberte sterkt IgG2b-produksjonen, noe som indikerer inhibering av myelomcelle-overlevelse og vekst in vivo.

Figur 6.

Effekt av anti-alfa4 integrin-antistoff på overlevelse av multippelt myelom-bærende mus.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen angår fremstilling av medikamenter til, blant annet, forebygging av multippelt myelom. Mer spesielt angår oppfinnelsen anvendelsen av antagonister for en interaksjon mellom et integrin inneholdende an alfa-4-subenhet og en ligand for dette integrin til fremstilling av et medikament til behandling av multippelt myelom. Uttrykket "multippelt myelom" er ment å bety en medisinsk tilstand hos et individ som har en neoplastisk sykdom hos plasmaceller, hvor den neoplastiske klon representerer celler ved forskjellige stadier i plasmacellelinjen fra pasient til pasient (Mundy, 1998).

Alfa-4-beta-l-integrin er en celleoverflate-reseptor for VCAM-1, fibronektin og trolig andre molekyler som binder til, eller på annen måte reagerer med, alfa-4-beta-l-integrin. I denne forbindelse blir slike molekyler som binder til, eller på annen måte reagerer med, alfa-4-subenhet-inneholdende integrin, individuelt og kollektivt referert til som "alfa-4-ligand(er)". Uttrykket a4bl-integrin ("VLA-4" eller "a4bl" eller a4bl-integrin" benyttet om hverandre) heri refererer således til polypeptider som er i stand til å binde til VCAM-1 og medlemmer av de ekstracellulære matriseproteiner, mest spesielt fibronektin, eller homologer eller fragmenter derav, selv om det vil bli forstått av den vanlige fagperson at andre ligander for VLA-4 kan eksistere og kan bli analysert ved å bruke konvensjonelle metoder.

Ikke desto mindre er det kjent at alfa-4-subenheten vil as-sosiere med andre beta-subenheter ved siden av beta-1 slik at det er mulig å definere uttrykket "alfa-4-integrin" til å være de integriner hvis alfa-4-subenhet assosierer med en eller annen av beta-subenhetene. Et ytterligere eksempel på et "alfa-4"-integrin er alfa4btea7 (R. Lobb og M. Hemler, 1994). Som benytter heri betyr uttrykket "alfa 4 integrin(er)" VLA-4 så vel som integriner som inneholder beta 1, beta-7 eller enhver annen beta-subenhet.

Som beskrevet heri er antagonistene benyttet i anvendelsen ifølge oppfinnelsen ikke begrenset til en spesiell type eller struktur av molekyl slik at, for formålene med foreliggende oppfinnelse, er ethvert middel som er i stand til å binde ethvert integrin inneholdende en alfa-4-subenhet så som VLA-4 på overflaten av VLA-4-bærende celler og/eller alfa4beta7-integrin på overflaten av alfa4beta7-bærende celler [se Hobb og Hemler, J. Clin. Invest., 94:1722-1728 (1994)] og/eller til deres respektive alfa4-ligander så som henholdsvis VCAM-1 og MadCAM, på overflaten av VCAM-1- og MadCAM-bærende celler, og som effektivt blokkerer eller belegger VLA-4 (eller alfa4beta7) eller VCAM-1 (eller MadCAM) (d.v.s. henholdsvis "et alfa4 integrin-bindende middel" og "alfa4 integrin ligand-bindende middel") betraktet som å være en ekvivalent av antagonistene benyttet i eksemplene heri.

En integrin-"antagonist" innbefatter enhver forbindelse som inhiberer an alfa4-integrin(er) fra binding med en alfa-4-integrin ligand og/eller reseptor. Anti-integrin antistoff eller antistoff-homolog-inneholdende proteiner (som beskrevet nedenfor) så vel som andre molekyler så som oppløselige former av ligandproteinene for integriner, er anvendelige. Oppløselige former av ligand-proteinene for alfa4-integriner innbefatter oppløselig VCAM-1 eller kollagen-peptider, VCAM-1 fusjonsproteiner eller bifunksjonelle VCAM-l/Ig fusjonsproteiner. For eksempel kan en oppløselig form av en alfa4 integrin-ligand eller et fragment derav bli administrert til å binde til integrin, og fortrinnsvis konkurrere for et integrin-bindende sete på celler for derved å føre til effekter liknende administrasjonen av antagonister så som anti-alfa4-integrin (for eksempel alfa4beta7-antistoff og/eller VLA-4-antistoff). Spesielt er anvendelse av oppløselige alfa4 integrinmutanter som binder alfa-4-integrinligand, men ikke fremskaffer integrin-avhengig signalisering, innbefattet innenfor omfanget av oppfinnelsen. Slike mutanter kan virke som konkurrerende inhibitorer av villtype integrin-protein og er betraktet som "antagonister". Andre antagonister benyttet i oppfinnelsen er "små molekyler" som definert nedenfor.

Ifølge oppfinnelsen kand det anvendes et middel som antagoniserer virkningen av mer enn et alfa-4-integrin så som et enkelt lite molekyl eller antistoff-homolog som antagoniserer flere alfa-4-integriner så som VLA-4 og alfa4beta7 eller andre kombinasjoner av alfa-4-integriner. Det kan også anvendes en kombinasjon av forskjellige molekyler slik at den totale aktivitet antagoniserer virkningen av mer en et alfa4-integrin så som flere små molekyler aller antistoff-homologer som i kombinasjon antagoniserer alfa-4-integrinene VLA-4 og alfa4beta7 eller andre kombinasjoner av integriner.

Som beskrevet heri kan visse integrin-antagonister bli fusert eller på annen måte konjugert til for eksempel en antistoffhomolog så som et immunoglobulin eller fragment derav og er ikke begrenset til en spesiell type eller struktur av et integrin eller ligand eller annet molekyl. Således, for formål med oppfinnelsen, er ethvert middel som er i stand til å danne et fusjonsprotein (som definert nedenfor) og som er i stand til å binde til alfa4integrin-ligander og som effektivt blokkerer eller belegger alfa4-beta7 og/eller VLA-4-integrin, betraktet som å være en ekvivalent av antagonistene benyttet i eksemplene heri.

For formålene med oppfinnelsen refererer en "antagonist av alfa-4-integrin-ligand/alfa4 integrin-interaksjon" til et middel, for eksempel polypeptid eller annet molekyl, som kan inhibere eller blokkere alfa-4-ligandd (for eksempel VCAM-1) og/eller alfa-4-integrin (for eksempel alfa4beta7 eller VLA-4)-mediert binding eller som på annen måte kan modulere alfa4 ligand og/eller alfa4 integrin-funksjon, for eksempel ved å inhibere eller blokkere alfa4 ligand-mediert alfa-4 integrin signal-transduksjon eller alfa4 ligand-mediert alfa4 signaltransduksjon og som er effektiv ved behandlingen av multippelt myelom, fortrinnsvis på samme måte som anti-alfa4 integrin-antistoffene.

Spesielt er en antagonist for VCAM-l/VLA-4-interaksjonen et middel som har en eller flere av de følgende egenskaper: (1) det belegger, eller binder til, VLA-4 på overflaten av VLA-4-bærende celler (for eksempel en myelomcelle) med tilstrekkelig spesifisitet til å inhibere en VLA-4-ligand/VLA-4-interaksjon, for eksempel VCAM/VLA-4-interaksjonen mellom stromale benceller og myelomceller; (2) det belegger, eller binder til, VLA-4 på overflaten av VLA-4-bærende celler (d.v.s. en myelomcelle) med tilstrekkelig spesifisitet til å modifisere, og fortrinnsvis inhibere, transduksjon av et VLA-4-mediert signal for eksempel VLA-4/VCAM-1-mediert signalisering; (3) det belegger, eller binder til, en VLA-4-ligand (for eksempel VCAM-1) på stromale benceller med tilstrekkelig spesifisitet til å inhibere VLA-4/VCAM-interaksjonen; (4) det belegger, eller binder til, en VLA-4-ligand (for eksempel VCAM-1) på stromale benceller med tilstrekkelig spesifisitet til å modifisere, og fortrinnsvis inhibere, transduksjon av VLA-4-ligand-mediert VLA-4-signalisering, for eksempel VCAM-l-mediert VLA-4-signalisering. I foretrukne utførelsesformer har antagonisten en eller begge egenskaper 1 og 2. I andre foretrukne utførelsesformer har antagonisten en eller begge egenskapene 3 og 4. Videre kan mer enn en antagonist bli administrert til en pasient, for eksempel kan et middel som binder til VLA-4, bli kombinert med et middel som binder til VCAM-1.

For eksempel er antistoff eller antistoffhomologer (beskrevet nedenfor) så vel som oppløselige former av de naturlige bindende proteiner for VLA-4 og VCAM-1 anvendelige. Oppløselige former av de naturlige bindende proteiner for VLA-4 innbefatter oppløselige VCAM-l-peptider, VCAM-1 fusjonsproteiner, bifunksjonelle VCAM-l/Ig fusjonsproteiner, fibronektin, fibronektin som har et alternativt spleiset ikke-type III forbindende segment og fibronektin-peptider inneholdende aminosyresekvensen EILDV eller en liknende konservativt substituert aminosyresekvens. Oppløselige former av de naturlig bindende proteiner for VCAM-1 innbefatter oppløselig VLA-4-peptider, VLA-4 fusjonsproteiner, bifunksjonelle VLA-4/Ig fusjonsproteiner og liknende. Som benyttet heri er et "oppløselig VLA-4-peptid" eller et "oppløselig VCAM-l-peptid" et VLA-4 eller VCAM-l-polypeptid som er ute av stand til å forankre seg selv i en membran. Slike oppløselige polypeptider innbefatter for eksempel VLA-4 og VCAM polypeptider som mangler en tilstrekkelig del av sitt membran-spennende domene til å forankre polypep-tidet eller er modifisert på en slik måte at det membran-spennende domene er ufunksjonelt. Disse bindende midler kan virke ved å konkurrere med det celle-overfate-bindende protein for VLA-4 eller på annen måte å endre VLA-4-funksjon. For eksempel kan en oppløselig form av VCAm-1 (se for eksempel Osborn et al. 1989, Cell, 59: 1203-1211) eller et fragment derav bli administrert for å bide til VLA-4 og fortrinnsvis konkurrere for et VLA-4-bindende sete på myelomceller for derved å føre til effekter som likner administrasjonen av antagonister så som små molekyler eller anti-VLA-4-antistoff.

I et annet eksempel kan VCAM-1 eller et fragment derav som er i stand til å binde til VLA-4 på overflaten av VLA-4-bærende myelomceller, for eksempel et fragment inneholdende to N-terminale domener av VCAM-1, bli fusert til et andre peptid, for eksempel et peptid som øker oppløseligheten eller in vivo levetiden av VCAM-l-enheten. Det andre peptid kan være et fragment av et oppløselig peptid, fortrinnsvis et humant peptid, mer foretrukket et plasmapro-tein eller et medlem av immunoglobulin superfamilien. I spesielt foretrukne utførelsesformer er det andre peptid IgG eller en del eller et fragment derav, for eksempel det humane IgG konstante tungkjedeområde og innbefatter minst hengsel-, CH2- og CH3-domenene.

Andre antagonister som er anvendelige i de aktuelle medikamenter innbefatter, men er ikke begrenset til midler som etteraper virkningen av peptider (organiske molekyler kalt "små molekyler") som er i stand til å forstyrre alfa4-integrin/alfa4-integrinligand-interaksjonen ved for eksempel å blokkere VLA-4 ved å binde VLA-4-reseptorer på overflaten av celler eller å blokkere CAM-1 ved å binde VCAM-l-reseptorer på overflaten av celler. Disse "små molekyler" kan i seg selv være små peptider eller større peptid-inneholdende organiske forbindelser eller ikke-peptidiske organiske forbindelser. Et "lite molekyl" som definert heri, er ikke ment å omfatte et antistoff eller en antistoffhomolog. Selv om molekylvekten av slike "små molekyler" generelt er mindre enn 2000 er det ikke ment å benytte dette tall som en absolutt øvre grense angående molekylvekt.

For eksempel kan små molekyler så som oligosakkarider som etteraper bindingsdomenet av en VLA-4-ligand og passer reseptor-domenet av VLA-4, bli benyttet. (Se J.J.Devlin et al., 1990, Science 249: 400-406 (1990), J.K.Scott og G.P.Smith, 1990, Science 249,: 386-390 og U.S. Patent 4.833.093 /Geysen.) Motsatt kan små molekyler som etteraper bindingsdomenet av en VCAM-l-ligand og passer reseptor-domenet av VCAM-1, bli benyttet.

Eksempler på andre små molekyler som er anvendelige i oppfinnelsen kan bli funnet i Komoriya et al. ("The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), s. 15075-79 (1991)). De identifiserte den minste aktive aminosyresekvens som var nødvendig for å binde VLA-4 og syntetiserte en mengde overlappende peptider basert på aminosyresekvensen av CS-l-området (det VLA-4-bindende domene) av en spesiell type fibronektin. De identifiserte et 8-aminosyrers peptid, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr så vel som to mindre overlappende pentapeptider, Glu-Ile-Leu-Asp-Val og Leu-Asp-Val-Pro-Ser som hadde inhibitorisk aktivitet mot fibronektin-avhengig celleadhesjon. Visse større peptider inneholdende LDV-sekvensen ble deretter vist å være aktive in vivo (T.A. Ferguson et al., "Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, s. 8072-76 (1991); og S.M. Wahl et al., "Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, s. 655-62 (1994)). Et cyklisk pentapeptid, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (hvor TPro beteg-ner 4-tioprolin), som kan inhibere både VLA-4- og VLA-5-adhesjon til fibronektin, har også blitt beskrevet. (Se for eksempel D.M. Nowlin et al., "A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Betal Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268(27), s. 20352-59 (1993); og PCT publikasjon PCT/US91/04862). Dette pentapeptid var basert på tripeptidsekvensen Arg-Gly-Asp fra FN som hadde vært kjent som et felles motiv i gjenkjennelsessetet for flere ekstracellulære matriseproteiner.

Eksempler på andre små molekylære VLA-4-inhibitorer har blitt rapportert, for eksempel i Adams et al., "Cell Adhesion Inhibitors", PCT/US97/13013 som beskriver lineære peptidyl-forbindelser inneholdende beta-aminosyrer som har celleadhesjons-inhiberende aktivitet. Internasjonale pa-tentsøknader WO 94/15958 og WO 92/00995 beskriver cykliske peptid- og peptidomimetiske forbindelser med celleadhesjons-inhiberende aktivitet. Internasjonale patentsøknader WO 93/08823 og WO 92/08464 beskriver guanidinyl-, urea- og tiourea-inneholdende celleadhesjons-inhiberende forbindelser. Amerikansk patent nr. 5.260.277 beskriver guanidinyl celleadhesjonsmodulerende forbindelser.

Slike småmolekylære etterapende forbindelser kan bli fremstilt ved å syntetisere et antall peptider, semipeptidiske forbindelser eller ikke-peptidiske, organiske forbindelser og så undersøke disse forbindelser for deres egenskap å inhibere alfa4-integrin/alfa4 integrin-ligand-interaksjonen. Se generelt US patent nr. 4.833.092, Scott og Smith, "Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, s. 386-90 (1990) og Devlin et al., "Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249, s. 40407 (1990).

I andre foretrukne utførelsesformer er middelet som blir brukt til å binde til, innbefattende blokkere eller belegge, celleoverflate alfa4-integrin og/eller alfa4 integrin-ligand, et anti-VLA-4 og/eller anti-alfa4bea7 monoklonalt antistoff eller antistoffhomolog. Foretrukne antistoffer og homologer til behandling, spesielt behandling av mennesker, innbefatter humane antistoff-homologer, humaniserte antistoffhomologer, chimeriske antistoffhomologer, Fab, Fab', F(ab')2 og F(v) antistoff-fragmenter samt monomere og dimere av antistoff tunge eller letter kjeder eller blandinger derav. Monoklonale antistoffer mot VLA-4 er et foretrukket bindingsmiddel.

Som benyttet heri innbefatter "antistoffhomolog" intakte antistoffer bestående av immunoglobulin tunge og lette kjeder bundet sammen via disulfidbindinger. Uttrykket "anti-stof fhomolog" er også ment å omfatte et protein bestående av en eller flere polypeptider valgt fra immunoglobulin lette kjeder, immunoglobulin tunge kjeder og antigen-bindende fragmenter derav som er i stand til å bind til et eller flere antigener. De enkelte polypeptid-deler av en antistoffhomolog bestående av mer enn et polypeptid kan eventuelt være disulfidbundet eller på annen måte kovalent kryssbundet.

Følgelig innbefatter derfor "antistoffhomologer" intakte immunoglobuliner av typene IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (så vel som subtyper derav) hvor de lette kjeder av immunoglobu-linet kan være av typer kappa eller lambda.

"Antistoffhomologer" innbefatter også deler av intakte antistoff som har antigen-bindende spesifisitet, for eksempel Fab-fragmenter, Fab'-fragmenter, F(ab)2-fragmenter, F(v)-fragmenter, monomere eller dimere av tung kjede, monomere eller dimere av lett kjede, dimere bestående av en tung kjede og en lett kjede og liknende. Således er antigenbindende fragmenter så vel som dimere eller trimere polypeptider av full lengde avledet fra de ovenfor beskrevne antistoff i seg selv anvendelige.

Som benyttet heri er en "humanisert antistoffhomolog" en antistoffhomolog dannet ved rekombinant DNA-teknologi hvor noen eller alle av aminosyrene av et humant immunoglobulin lett eller tung kjede, som ikke er nødvendige for antigen-binding, har blitt skiftet ut med de tilsvarende aminosyrer fra et ikke-humant pattedyr-immunoglobulin lett eller tung kjede.

Som benyttet heri er en "chimerisk antistoff-homolog" en antistoffhomolog fremstilt ved rekombinant NNA-teknologi

hvor alt eller deler av hengsel- og konstant-regioner av en immunoglobulin lett kjede, tung kjede eller begge deler har blitt skiftet ut med de tilsvarende områder fra en anen immunoglobulin lett kjede eller tung kjede. I et annet aspekt kan det benyttes en variant av et chimerisk molekyl som innbefatter: (1) en VLA-4-målrettende enhet for eksempel en VCAM-l-enhet som er i stand til å binde til et antigen (d.v.s. VLA-4) på overflaten av VLA-4-bærende myelomceller; (2) eventuelt et andre peptid, for eksempel et som øker oppløseligheten eller in vivo levetiden av den VLA-4-målrettende enhet, for eksempel et medlem av immunoglobulin superfamilien eller fragment eller del derav, for eksempel en del eller et fragment av IgG for eksempel det humane IgGl konstante område av tung kjede, for eksempel CH2 og CH3 hengselsområder og en toksin-enhet. Den VLA-4-målrettende enhet kan være enhver naturlig forekommende VLA-4-ligand eller fragment derav, for eksempel et VCAM-l-peptid eller en liknende konservativt substituert aminosyresekvens. En foretrukket målrettende enhet er et oppløselig VCAM-l-fragment, for eksempel de N-terminale domener 1 og 2 av VCAM-l-molekylet. Det chimeriske molekyl kan bli benyttet for å behandle et individ, for eksempel et menneske, som har risiko for å få en lidelse, for eksempel multippelt myelom som er særpreget ved tilstedeværelsen av myelomceller som bærer VLA-4 og fortrinnsvis aktivert VLA-4.

Som benyttet heri er en "human antistoffhomolog" en antistoffhomolog som er dannet ved rekombinant DNA-teknologi hvor ale av aminosyrene av en immunoglobulin lett eller tung kjede som er avledet fra en human kilde.

Fremgangsmåter for å fremstille Anti- VLA- 4- antistoffhomologer

Teknologien for å fremstille monoklonale antistoffhomologer er velkjent. Kort angitt blir en udødelig cellelinje (typisk myelomceller) fusert til lymfocytter (typisk splenocytter) fra et pattedyr immunisert med hele celler som uttrykker et gitt antigen for eksempel VLA-4, og kultursuper-natantene fra de resulterende hybridomceller blir undersøkt for antistoff mot antigenet. Se generelt Kohler et al., 1995, Nature, 265: 295-297.

Immunisering kan bli utført ved å bruke standard fremgangsmåter. Enhetsdose- og immuniseringsregimet avhenger av ar-ten av dyr som immuniseres, dets immunstatus, kroppsvekten av pattedyret etc. Typisk blir de immuniserte dyr tappet for blod og serumet fra hver blodprøve blir undersøkt for spesielle antistoff ved å bruke passende utvelgelsesassays. For eksempel kan anti-VLA-4-antistoff bli identifisert ved immunoutfelling av 1251-merkede cellelysater fra VLA-4-ut-trykkende celler. (Se Sanchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 og Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). Anti-VLA-4-antistoff kan også bli identifisert ved strømningscytometri, for eksempel ved å måle fluorescent farging av Ramos-celler inkubert med et antistoff som er antatt å gjenkjenne VLA-4 (se Elices et al., 1990 Cell, 60: 577-584). Lymfocyttene som benyttes ved fremstillingen av hybridomceller blir typisk isolert fra immuniserte dyr hvis sera allerede har blitt bestemt positivt for tilstedeværelsen an anti-VLA-4-antistoff ved å bruke utvelgelsesassays.

Typisk er den udødelige cellelinje (for eksempel en myelom-cellelinje) avledet fra samme pattedyrart som lymfocyttene. Foretrukne udødelige cellelinjer er musemyelomcellelinjer som er følsomme overfor dyrkningsmedium inneholdende hypox-antin, aminopterin og tymidin ("HAT-medium"). Typisk blir HAT-sensitive musemyelomceller fusert til musesplenocytter ved å bruke 1500 molekylvekts polyetylenglykol ("PEG 1500"). Hybridomceller som stammer fra fusjonen blir så selektert ved å bruke HAT-medium som dreper ufuserte og uproduktivt fuserte myelomceller (ufuserte splenocytter dør etter flere dager fordi de ikke er transformert). Hybridomer som produserer et ønsket antistoff blir påvist ved å undersøke hybridomkultur-supernatantene. For eksempel kan hybridomer fremstilt for å danne anti-VLA-4-antistoff bli valgt ut ved å undersøke hybridomkultur-supernatanten for utskilte antistoff som har egenskapen å binde til en rekombinant alfa-4-subenhet-uttrykkende cellelinje (se Elices et al., supra).

For å danne anti-VLA-4-antistoff-homologer som er intakte immunoglobuliner, ble hybridomceller som var positive i slike utvelgelsesassays dyrket i et næringsmedium under forhold og over en tid som er tilstrekkelig ti å tillate hybridomceller å skille ut monoklonale antistoff i kulturmediet. Vevskulturteknikker og dyrkningsmedier som er egnet for hybridomceller, er velkjent. Den kondisjonerte hy-bridomkultursupernatant kan bli samlet opp og anti-VLA-4-antistoffene eventuelt ytterligere bli renset ved velkjente metoder.

Alternativt kan det ønskede antistoff bli fremstilt ved å injisere hybridomcellene i peritoneal-hulrommet hos en ikke-immunisert mus. Hybridomcellene prolifererer i kroppshulen og skiller ut antistoff som akkumulerer i bukvæsken. Antistoffet kan bli samlet opp ved å trekke ut bukvæsken fra bukhulen med en sprøyte.

Flere anti-VLA-4-monoklonale museantistoff har tidligere blitt beskrevet. Se for eksempel Sanchez-Madrid et al., 1986, supra; Hemler et al., 1987, supra; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245). Disse anti-VLA-4-monoklonale antistoff så som HP ^ og andre anti-VLA-4-antistoff (for eksempel HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9) som er i stand til å gjenkjenne P-kjeden av VLA-4, vil være nyttige i medikamentene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Anti-VLA-4-antistoff som vil gjenkjenne VLA-4 alfa-4-kjede-epitopene involvert i binding til VCAM-1 og fibronektin-ligander (d.v.s. antistoff som kan blinde til VLA-4 ved et sete som er involvert i lignadgjenkjennelse og blokkere VCAM-1- og fibronektin-binding), er foretrukket. Slike antistoff har blitt definert som B-epitop-spesifikke antistoff (Bl eller B2) (Pulido et al., 1991, supra) og er også anti-VLA-4-antistoff.

Fullstendig humane monoklonale antistoffhomologer mot VLA-4 er et annet foretrukket bindingsmiddel som kan blokkere eller belegge VLA-4-antigener. I sin intakte form kan disse bli fremstilt ved å bruke in vitro-aktiverte humane splenocytter som beskrevet av Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Alternativt kan de bli fremstilt ved repertoar-kloning som beskrevet av Persson et al., 1991, Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 88: 2432-2436 eller av Huang og Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. US patent 5.798.230 (25. aug. 1998, "Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use") som beskriver fremstilling av humane monoklonale antistoff fra humane B-celler. Ifølge denne fremgangsmåte blir humane antistoff-produserende celler immortalisert ved infeksjon med et Epstein-Barr-virus eller et derivat derav som uttrykker Epstein-Barr-virus kjerneantigen 2 (EBNA2). EBNA2-funksjon, som er nødvendig for immortalisering, blir deretter avslått, noe som resulterer i en økning av antistoffproduksjon.

I enda en annen metode for å danne fullstendig humane antistoff beskriver US patent 5.789.650 (4. aug. 1998, "Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies") transgene ikke-humane dyr som har inaktiverte endogene immunoglobulin-gener. Endogene immunoglobulin-gener blir undertrykt av antisens-polynukleotider og/eller av antiserum rettet mot endogene immunoglobuliner. Heterologe antistoff er kodet av immunoglobulin-gener som ikke normalt finnes i genomet til denne art av ikke-humant dyr. En eller flere transgener som inneholder sekvenser av ikke rea-rangerte heterologe humane immunoglobulin tunge kjeder, blir innført i et ikke-humant dyr for derved å danne et transgent dyr som er i stand til funksjonelt å rearangere transgene immunoglobulin-sekvenser og danne et repertoar av antistoff av forskjellige isotyper kodet av humane immunoglobulin-gener. Slike heterologe humane antistoff blir dannet i B-celler som deretter blir immortalisert for eksempel ved fusjon med en immortaliserende cellelinje så som et myelom eller ved å manipulere slike B-celler med andre teknikker for å perpetuere en cellelinje som er i stand til å danne en monoklonal heterolog, fullstendig human anti-stof f -homolog .

Store ikke-immuniserte humane fagoppvisningsbibliotek kan også bli brukt til å isolere høyaffinitets-antistoff som kan bli utviklet som humane terapeutika ved å bruke standard fag-teknologi (Vaughan et al, 1996). Enda et annet foretrukket bindingsmiddel som kan blokkere eller belegge VLA-4-antigener, er en humanisert rekombinant antistoffhomolog som har anti-VLA-4-spesifisitet. Ved å følge de tidlige metoder for fremstilling av chimeriske antistoff ble en ny metode beskrevet i EP 0239400 (Winter et al.) hvorved antistoff blir endret ved substitusjon av deres komplementære bestemmende områder (CDR) for en art med dem fra en annen. Denne prosess kan for eksempel bli brukt til å substituere CDR fra human tung og lett kjede lg variable områdedomener med andre CDR fra murine variable region-domener. Disse endrede lg variable områder kan etterfølgende bli kombinert med humane lg konstante områder for å danne antistoff som er fullstendig humane i sammensetning bortsett fra for de substituerte muring CDR. Slike CDR-substituerte antistoff inneholder vesentlig mindre ikke-humane komponenter. Fremgangsmåten for å humanisere monoklonale antistoff via CDR-"poding" har blitt betegnet "gjenforming (Reichmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). Typisk blir komplementaritets-bestemmende områder (CDR) av et murint antistoff transplantert på de tilsvarende områder i et humant antistoff siden det er CDR (tre i antistoff tunge kjeder, tre i lette kjeder) som er områdene av muse-antistoffet som binder til et spesifikt antigen. Transplantasjon av CDR blir oppnådd ved genetisk manipulering hvorved CDR DNA-sekvenser blir bestemt ved å klone murine tunge og lette kjede variable (v) område gensegmenter, og blir så overført til tilsvarende humane V-områder ved sete-rettet mutagenese. I slutt-trinnet i prosessen blir humane konstant-område gen-segmenter av den ønskede isotype (vanligvis gamma I for CH og kappa for CL) tilsatt de humaniserte tunge og lette kjedegener og samtidig uttrykt i pat-tedyrceller for å danne oppløselig humanisert antistoff.

Overføringen av disse CDR til et humant antistoff gir til dette antistoff de antigen-bindende egenskaper av det opprinnelige murine antistoff. De seks CDR i det murine antistoff er montert strukturelt på et V-område "rammeverk"-område. Grunnen til at CDR-poding kan lykkes er at rammeverk-områdene mellom muse og humane antistoff kan ha meget like 3-D-strukturer med liknende bindingspunkter for CDR slik at CDR kan bli byttet mellom dem. Slike humaniserte antistoff-homologer kan bli fremstilt som eksemplifisert i Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Reichmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86, 10029; og Orlandi et al., 1989, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86, 3833.

Ikke desto mindre er visse aminosyrer innenfor rammeverk-områdene antatt å reagere med CDR og å påvirke den totale antigenbindende affinitet. Den direkte overføring av CDR fra et murint antistoff for å danne et rekombinant humanisert antistoff uten noen modifikasjoner av det humane V-område rammeverk resulterer ofte i et delvis eller fullstendig tap av bindingsaffinitet. I et antall tilfeller synes det å være kritisk å endre residuer i rammeverk-områdene av akseptor-antistoffet for å oppnå bindingsaktivitet.

Queen et al., 1989 (supra) og WO 90/07861 (Protein Design Labs) har beskrevet fremstillingen av et humanisert antistoff ved å kombinere CDR fra et murint MAb (anti-Tac) med humant immunoglobulin rammeverk og konstante områder. De har vist en løsning på problemet med tap av bindingsaffinitet som ofte stammer fra direkte CDR-overføring uten noen modifikasjoner av de humane V-område rammeverk-residuer idet deres løsning involverer to nøkkeltrinn. Først blir de humane V-rammeverkområder valgt ut fra computer-analyse for optimal proteinsekvens-homologi med V-område rammeverket av det opprinnelige murine antistoff, i dette tilfelle anti-Tac MAb. I det andre trinn blir tertiær-strukturen av det murine V-område modellert av en computer for å visuali-sere rammeverk aminosyreresiduer som er sannsynlige å sam-virke med murine CDR, og disse murine aminosyreresiduer blir så lagt over på det homologe humane rammeverk. Se også Protein Design Labs, US patent 5.639.762.

Det er mulig å anvende en forskjellig metode (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271) og anvende, som standard, V-område rammeverk avledet fra henholdsvis NEWM og REI tunge og lette kjeder for CDR-poding uten radikal in-troduksjon av muse-residuer. En fordel ved å bruke Tempest et al.-metoden for å konstruere NEWM- og REI-baserte humaniserte antistoff er at de 3-dimensjonale strukturer av NEWM og REI variable områder er kjent fra røntgenstråle-krystallografi og således kan spesifikke interaksjoner mellom CDR og V-område rammeverk-residuer bli modellert.

Uavhengig av den benyttede fremgangsmåte har eksemplene av de initiale humaniserte antistoffhomologer fremstilt til i dag vist at det ikke er noen enkel prosess. Imidlertid, selv ved å godta at slike rammeverk-endringer kan være nød-vendige, er det ikke mulig å forutsi, på basis av den tilgjengelige tidligere teknikk, hvilke, om noen, rammeverkre-siduer som vil måtte endres for å oppnå funksjonelle humaniserte rekombinante antistoff med den ønskede spesifisitet. Resultater har til nå indikert at endringer som er nødvendige for å preservere spesifisitet og/eller affinitet, er for det meste enestående for et gitt antistoff og kan ikke bli forutsagt basert på humanisering av et forskjellig antistoff.

Foretrukne antagonister som er anvendelige i foreliggende oppfinnelse innbefatter chimeriske rekombinante og humaniserte rekombinante antistoffhomologer (d.v.s. intakte immunoglobuliner og deler derav) med B-epitop-spesifisitet som har blitt fremstilt og er beskrevet i samtidig US patent-søknad serienummer 08/004,798 innlevert 12. januar 1993, PCT publikasjon US94/00266 innlevert 7. januar 1994. Ut-gangsmaterialet for fremstillingen av chimeriske (muse V - human C) og humaniserte anti-VLA-4 antistoffhomologer kan være et murint monoklonalt anti-VLA-4-antistoff som tidligere beskrevet, et monoklonalt anti-VLA-4-antistoff som er kommersielt tilgjengelig (for eksempel HP2/1, Amae Interna-tional, Inc., Westbrook, Maine) eller et monoklonalt anti-VLA-4-antistoff fremstilt i samsvar med beskrivelsen heri. For eksempel har de variable områder av de tunge og lette kjeder av anti-VLA-4-antistoffet HP1/2 blitt klonet, se-kvensert og uttrykt i kombinasjon med konstante områder av humane immunoglobulin tunge og lette kjeder. Slikt HP1/2 antistoff er likt i spesifisitet og effekt med det murine HP1/2 antistoff og kan være anvendelig i foreliggende oppfinnelse. Andre foretrukne humaniserte anti-VLA-4-antistoffhomologer er beskrevet av Athena Neurosciences, Inc. i PCT/US95/01219 (27. juli 1995). Disse humaniserte anti-VLA-4-antistoff omfatter en humanisert lett kjede og en humanisert tung kjede. Den humaniserte lette kjede omfatter tre komplementaritets-bestemmende områder (CDR1, CDR2 og CDR3) med aminosyresekvenser fra de tilsvarende komplementaritets-bestemmende områder av en muse 21-6 immunoglobulin lett kjede og et variabelt område rammeverk fra en human kappa lett kjede område rammeverksekvens bortsett fra i minst en posisjon hvor aminosyreposisjonen er opptatt av samme aminosyre som er til stede i den tilsvarende posisjon av muse 21.6 immunoglobulin lett kjede variabelt område rammeverket. Den humaniserte tunge kjede omfatter tre komplementaritetsbestemmende områder (CDR1, CDR2 og CDR3) som har aminosyresekvenser fra de tilsvarende komplementaritetsbestemmende områder av muse 21-6 immunoglobulin tung kjede, og et variabelt område rammeverk fra en human tung kjede variabelt område rammeverksekvens bortsett fra i minst en posisjon hvor aminosyreposisjonen er opptatt av samme aminosyre som er til stede i den tilsvarende posisjon av muse 21-6 immunoglobulin tung kjede variabelt område rammeverket.

Terapeutiske anvendelser:

I henhold til første aspekt av oppfinnelsen blir VLA-4-bindende midler, spesielt VCAM-fusjoner og anti-VLA-4-antistoffhomolgoer fortrinnsvis anvendt i det aktuelle medikament som kan tilpasses for å administreres parenterelt. Uttrykket "parenteralt" som benyttet heri, innbefatter subkutane, intravenøse, intramuskulære, intra-artikulære, intra-synoviale, intrasternale, intratekale, intrahepatiske, intralesjonale og intrakraniale injeksjons-eller infusjons-teknikker.

De VLA-4-bindende midler blir fortrinnsvis administrert som en steril farmasøytisk sammensetning inneholdende et farma-søytisk akseptabelt bæremiddel som kan være enhver av et antall velkjente bæremidler så som vann, fysiologisk saltvann, fosfatbufret saltvann, dekstrose, glycerol, etanol og liknende eller kombinasjoner derav. Forbindelsene som anvendes i de aktuelle medikamentene kan bli brukt i form av farmasøytisk akseptable salter avledet fra uorganiske eller organiske syrer og baser. Innbefattet blant slike syresalter er de følgende, acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butyrat, citrat, kamforat, kamforsulfonat, cyklopentanpropionat, digluconat, dodecylsulfat, etansulfonat, kamforsulfonat, cyklopentanpropionat, diglukonat, dodecylsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glycerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hydroklorid, hydrobromid, hydroiodid, 2.hydroksyetansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, pivalat, propionat, succinat, tartrat, tiocyanat, tosylat og undecanoat. Basesalter innbefatter ammoniumsalter, alkalimetallsalter så som natrium- og kalium-salter, jordalkalimetallsalter så som kalsium- og magnesiumsalter, salter med organiske baser så som dicykloheksylamin-salter, N-metyl-D-glukamin, tris(hydroksymetyl)metylamin og salter med aminosyrer så som arginin, lysin og så videre. I tillegg kan de basiske nitrogen-inneholdende grupper være kvaternisert med slike midler som lavere alkylhalider så som metyl-, etyl-, propyl- og butyl-klorid, bromider og iodider; dialkylsulfater så som dimetyl-, dietyl-, dibutyl-og diamyl-sulfater, langkjedede halider så som decyl-, lauryl-, myristyl- g stearyl-klorider, bromider og iodider, aralkyl-halider så som benzyl- og fenetyl-bromider og andre. Vann- eller olje-oppløselige eller dispergerbare produkter blir derved oppnådd.

De aktuelle medikamenter omfatter enhver av de angitte forbindelsene eller farmasøytisk akseptable derivater derav sammen med ethvert farmasøytisk akseptabelt bæremiddel. Uttrykket "bæremiddel" som benyttet heri, innbefatter akseptable adjuvanter og vehikler. Farmasøytisk akseptable bæremidler som kan bli brukt i de farmasøytiske sammensetninger innbefatter, men er ikke begrenset til ionebyttere, alumina, aluminiumstearat, lekitin, serum-proteiner så som human serum albumin, buffersubstanser så som fosfater, glycin, sorbinsyre, kaliumsorbat, delvise glyserid-blandinger av mettede vegetabilske fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter så som protaminsulfat, dinatriumhydrogenfosfat, kaliumhydrogenfosfat, natriumklorid, sinksalter, kolloidalt silika, magnesiumtri-silikat, polyvinylpyrrolidon, cellulose-baserte substanser, polyetylenglykol, natriumkarboksymetylcellulose, polyakry-later, vokser, polyetylen-polyoksypropylen blokkpolymere, polyetylenglykol og ullfett.

De farmasøytiske sammensetninger kan foreligge i form av et sterilt injiserbart preparat, for eksempel en steril injiserbar vandig eller oleaginøs suspensjon. Denne suspensjon kan bli formulert i henhold til teknikker som er kjent innen faget ved å bruke passende dispergerende eller fuktende midler og suspenderende midler. Det sterile injiserbare preparat kan også være en injiserbar steril oppløsning eller suspensjon i et ikke-toksisk parenteralt akseptabelt fortynningsmiddel eller oppløsningsmiddel for eksempel som en oppløsning i 1,3-butandiol. Blant de akseptable vehikler og oppløsningsmidler som kan bli benyttet er vann, Ringers oppløsning og isoton natriumklorid-oppløsning. I tillegg blir sterile faste oljer konvensjonelt brukt som et oppløsende eller suspenderende medium. For dette formål kan enhver vanlig fast olje bli benyttet innbefattende syntetiske mono- og di-glyserider. Fettsyrer så som oleinsyre og dets glyse-rid-derivater er anvendelige ved fremstilling av injiserbare materialer og tilsvarende er naturlige farmasøytisk akseptable oljer så som olivenolje eller lakserolje, spesielt i deres polyoksyetylerte former. Disse oljeoppløsnin-ger eller -suspensjoner kan også inneholde en langkjedet alkohol fortynningsmiddel eller dispergeringsmiddel så som Ph. Heiv eller liknende alkohol.

De farmasøytiske sammensetninger, spesielt små-molekylære antagonister av VLA-4/VCAM-l-interaksjonen, kan bli gitt parenteralt eller oralt. Dersom de blir gitt oralt, kan de bli administrert i enhver oralt akseptabel doseringsform innbefattende, men ikke begrenset til kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller oppløsninger. I tilfellet med tabletter for oralt bruk innbefatter bæremidler som blir vanlig brukt laktose og maisstivelse. Smøremidler så som magnesiumstearat blir også typisk tilsatt. For oral bruk i kapselform innbefatter anvendelige fortynningsmidler laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner er nødvendige for oralt bruk, blir den aktive bestanddel kombinert med emulgerende og suspenderende midler. Om

ønsket kan visse søtende, smaksgivende eller fargende midler også bli tilsatt. Topiske transdermale plastere kan også bli brukt. De farmasøytiske sammensetninger kan også bli administrert ved nasal aerosol eller inhalering ved bruk av en nebulisator, en tørrpulver-inhalator eller en tilmålt dose-inhalator. Slike sammensetninger blir fremstilt i henhold til teknikker som er velkjent innen faget farmasøytiske formuleringer og kan bli fremstilt som oppløsninger i fysiologisk saltvann ved å bruke benzyl-alkohol eller andre passende preservativer, absorpsjons-fremmende midler for å øke biotilgjengelighet, fluorokarbo-ner og/eller andre konvensjonelle solubiliserende eller dispergerende midler.

Ifølge en annen utførelsesform kan de aktuelle sammensetninger også omfatte et ytterligere middel valgt fra gruppen bestående av kortikosteroider, antiinflammatoriske midler, immunosuppressanter, antimetabolitter og immunomodulatorer. Spesielle forbindelser innen hver av disse klasser kan bli valgt fra dem opplistet under den passende gruppeoverskrift i Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, England, s. 970-986 (1990). Også innbefattet innen denne gruppe er forbindelser så som teofyllin, sulfasalazin og aminosalicylater (antiinflammatoriske midler), cyklosporin, FK-506 og rapamycin (immunoundertrykkende middel); cyklo-fosfamid og metotrexat (antimetaboitter); steroider (inha-lert, oral eller topisk) og interferoner (immunomodulatorer) .

Mengden av aktiv bestanddel som kan bli kombinert med bæ-rermaterialene for å danne en enkeltdoseform vil variere avhengig av den behandlede vertsorganisme og den spesielle tilføringsmetode. Det bør imidlertid bli forstått at et spesiell doserings- og behandlingsregime for enhver spesiell pasient vil avhenge av en mengde faktorer innbefattende aktiviteten av den spesielle forbindelse som benyttes, al-der, kroppsvekt, generell helse, kjønn, diett, administra-sjonstid, ekskresjonshastighet, medikamnet-kombinasjon og vurderingen fra den behandlende lege samt alvorligheten av den spesielle sykdom som blir behandlet. Mengden av aktiv bestanddel kan også avhenge av det terapeutiske eller profylaktiske middel, om noen, hvormed bestanddelen blir administrert samtidig.

Dosen og doseringshastigheten av de aktuelle forbindelsene som er effektive til å forebygge, undertrykke eller inhibere celleadhesjon, vil avhenge av en mengde faktorer så som naturen av inhibitoren, størrelsen av pasienten, målet for behandlingen, naturen av den sykdom som blir behandlet, den spesielle farmasøytiske sammensetning som benyttes og vurderingen hos den behandlende lege. Dosenivåer på mellom omkring 0,001 og omkring 100 mg/kg kroppsvekt per dag, fortrinnsvis mellom omkring 0,1 og omkring 50 mg/kg kroppsvekt per dag av den aktive bestand-delsforbindelse er anvendelige. Mest foretrukket vil den VLA-4-bindende, dersom den er et antistoff eller et anti-stof fderivat, bli administrert ved en dose i området mellom omkring 0,1 mg/kg kroppsvekt/dag og omkring 20 mg/kg kroppsvekt/dag, fortrinnsvis i området mellom omkring 0,1 mg/kg kroppsvekt/dag og omkring 10 mg/kg kroppsvekt/dag og ved intervaller på hver 1-14 dager. For ikke-antistoff eller småmolekylære bindingsmidler bør doseområdet fortrinnsvis være mellom molare ekvivalente mengder til disse mengder av antistoff. Foretrukket blir en antistoffsammenset-ning administrert i en mengde som er effektiv til å gi et plasmanivå av antistoff på minst 1 mg/ml. Optimalisering av doser kan bli bestemt ved administrering av bindingsmid-lene fulgt av bestemmelse av de beleggende VLA-4-positive celler ved middelet over tid etter administrering ved en gitt dose in vivo.

Myelomceller inneholdt i en prøve av individets perifere blod (eller benmargsceller) bør bli undersøkt for tilstedeværelse av middelet in vitro (eller ex vivo) ved å bruke et andre reagens for å påvise det administrerte middel. For eksempel kan dette et fluorokrom-merket antistoff som er spesifikt for det administrerte middel og som så blir målt ved standard FACS (fluorescent-aktivert celle-sorterer) - analyse. Alternativt kan tilstedeværelse av det administrerte middel bli påvist in vitro (eller ex vivo) ved den manglende egenskap eller svekkede egenskap hos individets celler å binde til samme middel som i seg selv har blitt merket (for eksempel av en fluorokrom). Den foretrukne dose bør gi påviselig belegg av den største hoveddelen av VLA-4-positive celler. Foretrukket blir belegging opprett-holdt i tilfellet med en antistoffhomolog over en 1 - 14 dagers periode.

Dyremodeller

Dyremodellen har blitt beskrevet i detalj (Garrett, 1997) . Kort angitt hadde Radl et al. (1988) beskrevet en murin-modell av myelom som opptrådte spontant i eldre C57BL/KaLwRij-mus. Denne tilstand inntraff i omtrentlig 1 av 200 dyr etter som de ble eldre og førte til en monoklonal gammopati med enkelte av trekkene av human sykdom (Radl, 1988). For å utvikle en bedre og er reproduserbar dyremodell, har det blitt etablert og subklonet en cellelinje fra denne murine myelom kalt 5TGM1, og det ble funnet at den forårsaker lesjoner hos mus som er karakteristiske for humant myelom så som alvorlig osteolyse og involveringen av ikke-ben-organer innbefattende lever og nyre (Garrett, 1997). Mus inokulert med dyrkede celler utvikler sykdom på ene høyst forutsigbar og reproduserbar måte, og som innbefatter dannelse av en monoklonal gammopati og radiologiske benlesjoner. Videre ble enkelte av musene hyperkalsemiske, og benlesjonene er karakterisert ved øket osteoklast-aktivitet. Således, basert på histologisk undersøkelse av påvirkede organer i 5TGM1-bærende mus og økede serumnivåer av IgG2b, blir 5TGM1 definert som en murin myelom som oppviser nøyaktig kjennetegnene til human sykdom.

De følgende eksempler er ment å ytterligere illustrere visse foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, og er ikke ment å være begrensende av natur. I de følgende eksempler kan de nødvendige restriksjonsenzymer, plasmider og andre reagenser og materialer bli oppnådd fra kommersielle kilder og kloning, ligering og andre rekombinante DNA-teknikker som kan bli utført ved fremgangsmåter som er velkjent innen faget.

Eksempel 1: MATERIALER OG METODER

5TGM1 Myelomceller

5TGM1 myelomceller ble opprinnelig avledet fra en myelom som oppstod spontant hos eldre C57BL/KaLwRij-mus (Garrett 1997, Vanderkerken 1997). Celler ble dyrket i Iscove's Modifisert Dulbecco's Medium (IMDM, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Summit, Fort Collins, CO) og 1% pennicillin-streptomycin-oppløsning (GIBCO, Grand Island, NY) ved 37°C 8 5% C02-atmosfære. For in vitro forsøk beskrevet nedenfor, ble 5TGMl-celler mellom passasje 25 og 30 brukt.

Antistoff, oppløselig VCAM-1

Nøytraliserende antistoff mot murin VCAM-1 (M/K-2.7), integrin VLA-4 (PS/2) og Intercellulært Adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1, YN1/1.7) ble vennlig gitt bort av Dr. Kensuke Miyake (Saga Medical University, Saga, Japan). Rekombinant oppløselig VCAM-1 (Lobb et al., 1991) inneholdende de 7 ekstracellulære domener av human VCAM-1 var en gave fra Dr. Roy Lobb, Biogen Inc., Cambridge, MA.

Revers transkripsjon-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)

Ved å bruke RT-PCR ble ekspresjon av VCAM-1 og integrin alfa4 i henholdsvis stromale benmargsceller og 5TGM1 påvist. Totalt RNA ble fremstilt fra 5TGM1 som er en primær-kultur av stromale benmargsceller og en ST2 stromal ben-margscellelinje (RIKEN Cell Bank, Tsukuba, Japan) ved en-kelttrinns RNA isolasjonsmetode ved å bruke TRIzol-reagens (GIBCO). Tre ^g av RNA ble inkubert med 50 ng tilfeldig heksamer ved 70°C i 10 min. og avkjølt på is og så konver-tert til første kjede cDNA ved å bruke revers transkriptase (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) ifølge forhandlers instruk-sjoner. Primerne brukt for PCR var som følger: murin VCAM-1 5'-primer; 5'-OH-GCTGCGCGTCACCATTGTTCTC-3'-OH [SEQ ID NO:l]; murin VCAM-1 3'-primer; 5'-OH-ACCACCCTCTTGAAGCCTTGTG-3'-OH [SEQ ID NO:2]; murin integrin alfa4 5'-primer; 5'-OH-CCCCTCAACACGAACAGATAGG-3'-OH [SEQ ID NO:3]; murin integrin alfa4 3'-primer; 5'-OH-GCCTTGTCCTTAGCAACACTGC-3'-OH [SEQ ID NO:4].

PCR ble utført i 30 runder bestående av 1 min. ved 94°C, 1 min. ved 55°C og 2 min. ved 72°C. PCR reaksjonsblanding (totalt 50 ^1) inneholdt 10 mikroliter. Første kjede cDNA, 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 mM MgCl2, deoksy-NTP-blanding (0,2 mM hver) primerparene (0,15 mikromolar hver) og 2 U Taq DNA polymerase (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). PCR-produktene ble separert på 2,5% agarosegeler inneholdende etidiumbromid og gjort synlige under ultrafiolett lys. Størrelsen av fragmentene ble bekreftet ved referanse til molekylvektsmarkører.

Festing av 5TGMl-celler til stromale benmargsceller

For heterotypisk celle-celle adhesjonsassays ble ST2-celler (5 e 4/brønn) sådd ut i 48-brønners kulturplater (Costar, Cambridge, MA) og dyrket i 4 8 timer i alfaMEM supplementert med 10% FBS inntil konfluens. 5TGMl-celler (5 e 6) ble merket ved inkubering med 10 mikroCi [metyl-3H]tymidin (New England Nuclear) i 24 timer ved 37°C i kulturmediet. Etter at ST2 monolaget var dannet, ble det inkubert med 1% bovin serum albumin (BSA, Sigma, St. Louis, MO) i serum-fritt alfaMEM i 1 time og tritium-merkete 5TGMl-celler ble sådd ut på monolaget. Systemet ble inkubert ved fravær eller nærvær av antistoff mot VCAM-1 eller alfa4betal-integrin ved 37°C i 1 time. Ikke-adherente celler ble fjernet ved vask med 5% trikloreddiksyre to ganger og to ganger med PBS, og adherente celler ble solubilisert i 300 mikroliter av 0,25 mM NaOH, nøytralisert med det samme volum av 0,25 mM HC1 og radioaktiviteten ble bestemt i en væske-scintillasjonstel-ler.

Osteoklast danneIsesassay i ko-kulturen av 5TGM1 og benmargs museceller

Benmargsceller fra mus ble isolert fra 5 uker gamle C57BL hannnmus som tidligere beskrevet (Yoneda, 1993) . Lårben og tibia ble dissekert aseptisk og begge ender skåret av. Benmargsceller ble vasket ut, samlet opp og inkubert i alfaMEM supplementert med 10% FBS (Hyclone, Logan, UT) og 1% pennicillin-streptomycin i 100 mm kulturskåler (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) ved 37°C i 2 timer. Ikke-adherente celler inneholdende hemopoietiske osteoklast-for-løpere og stromalceller ble høstet inn. Benmargsceller (1 e 6) og 5TGMl-celler (1 e 3) i 300 mikroliter dyrkningsmedium ble sådd ut på 48-brønners kulturplater (dag 0). På dag 2 ble 300 mikroliter av ferskt kulturmedium forsiktig tilsatt hver brønn og på dag 4 ble 300 mikroliter brukt medium erstattet med det samme volum av ferskt medium. På dag 6 ble kulturene fiksert og farget for tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP) ved å bruke kommersielle sett (Sigma). TRAP-positive multinukleerte celler med mer enn 3 kjerner ble definert som osteoklast-liknende (OC-liknende) celler og opptalt manuelt under mikroskop. For å bekrefte at disse OC-liknende har egenskaper å resorbere ben, ble 5TGMl-celler og benmargsceller samdyrket på 5x5 mm hval-tannskiver i samme tilstand, og resorpsjonsgroper som dannet seg på disse tannskiver, ble undersøkt med scannende elektronmikroskopi som beskrevet (Yoneda, 1992).

I enkelte forsøk ble ko-kulturer av 5TGM1 myelomceller og benmargsceller utført ved å bruke mellombrønnsinnskudd

(Becton Dickinson Labware) for å forhindre direkte kontakt mellom disse to typer celler. (2 e 6, 24 brønners plater, Costar). Margceller ble sådd ut i de lavere kammere og 5TGM1 myelomceller (2 e 3) ble så sådd ut i hver av de lavere (direkte kontakt) eller øvre (ingen kontakt) kammere.

Organ-kulturer av 45Ca-merket lange føtale rotteben

Kondisjonert medium innhøstet fra 5TGMl-kulturer ble under-søkt for ben-resorberende aktivitet med organkulturer av 45Ca-merkede føtale lange rotteben som beskrevet tidligere (Mbalaviele, 1995). Gravide rotter ble injisert med 250 ^Ci av 4 5Ca (New England Nuclear) på 18.de dag av gravidi-teten. Radius og ulna benpiper ble oppnådd fra 19 dager gamle fostre ved mikrodisseksjon, og fordyrket i 24 timer i BGJ-medium (Sigma) supplementert med 0,1% BSA mellom luft og flytende fase på nett av rustfritt stål. Ben ble så dyrket ved nærvær av kondisjonert medium (50% v/v) eller i kontrollmedium i 120 timer. Mediene ble skiftet en gang ved 48 timer. Mot slutten av dyrkningen ble ben inkubert i iskald 5% trikloreddiksyre i 2 timer, og 45Ca radioaktivi-tet i ben og medium bestemt i en væske scintillasjonstel-ler. Benresorpsjon ble mengdebestemt som prosentdelen av 45Ca frigjort i mediet fra ben som utregnet ved: (45Ca-tall i medium)/45Ca-tall i medium og ben) x 100.

Samdyrking av 5TGM1 myelomceller med stromal musecellelinje ST2-celler

ST2-celler (0,5 e 6) og 5TGM1 (4 e 6) -celler ble sådd ut sammen på 60 mm dyrkningsskåler (Becton Dickinson) i 10% FBA-supplementert IMDM og dyrket over natten, vasket med serum-fritt IMDM to ganger og inkubert i 5 ml serum-fritt IMDM. Etter 48 timer ble kondisjonert medium høstet inn og lagret ved -70°C inntil bruk.

Effekt av mAb PS2 mot VLA-4 på serum IgG2b-økning i 5TGM1-bærende mus

Mus ble injisert med 1 e 5 5TGMl-celler som ble tillatt å kolonisere benmargen. Mus ble delt opp i to grupper på tre, hvor en virket som kontrollgruppe og den andre ble behandlet hver 14. dag ved å starte på dag 8 med 80 ^g mAb PS/2 (4 mg/kg). Nivåer av IgG2b som er antistoff-isotypen dannet av 5TGM1 myelomceller, ble målt ukentlig fra uke 1 til 6.

RESULTATER

Ekspresjon av VCAM-1, VLA-4 og effekt av antistoff mot VCAM-1 og VLA-4 på 5TGMl-festing til ST2-monolag

Ved å bruke RT-PCR ble det bekreftet ekspresjon av VCAM-1 og integrin VLA-4 i henholdsvis benmarg stromalceller og myelomceller. Som ventet uttrykte både ST2 stromalcelle-linjen og de primære stromale benmargsceller VCAM-1, mens 5TGM1 ikke gjorde dette. I motsetning til dette uttrykte 5TGM1 myelomcellene integrin VLA-4, mens stromalceller ikke gjorde dette (data ikke vist). I tillegg inhiberte både anti-VCAM-1 antistoff (10 ug/ml) og VLA-4-antistoff (10 Hg/ml) delvis (50-80%) festingen av 5TGMl-celler til ST2 monolag, noe som viser at VCAM-1 og VLA-4-integrin uttrykt på disse celler, er biologisk funksjonelle og at disse antistoff har nøytraliserende aktivitet (data ikke vist).

OC-liknende celledannelse i kokulturen av 5TGM1 myelomceller med musebenmargsceller.

På dag 6 av kokulturen av 5TGMl-celler og musebenmargsceller var mange TRAP-positive multinukleerte osteoklast-liknende (OC-liknende)celler dannet. Disse OC-liknende celler oppviste resorpsjon grop-dannelse på tannskiver, noe som viser at disse celler var i stand til å resorbere ben og har en osteoklastisk fenotype. I forsøk som brukte trans-brønn-innskudd ble dannelsen av OC-liknende celler observert når 5TGMl-celler ble dyrket i direkte kontakt med benmargsceller. I motsetning til dette var det kun et margi-nalt antall av OC-liknende celler dannet når 5TGMl-celler var adskilt fra margceller av transbrønn-membranen. Således induserer 5TGMl-celler osteoklast-dannelse i blandede marg-kulturer, og denne induksjon krever direkte celle-celle-kontakt.

Effekt av antistoff mot VCAM-1 og antegrin VLA4 på OC-liknende celledannelse ved ko-kultur av 5T6M1 og margceller

Både anti-VCAM-l-antistoff (VCAM-1 Ab, 10 ug/ml) og anti-VLA-4-integrin-antistoff (alfa4betal Ab, 10 ^g/ml) inhiberte dramatisk OC-liknende celledannelse. I motsetning til dette hadde mAb mot ICAM-1, som er et annet adhesjonsmolekyl på stromale margceller implisert i stromal/myelom-interaksjoner, ingen effekt på OC-liknende celledannelse (Figur 1).

For å bestemme hvorvidt denne inhibering av VCAM-1 og VLA-4 mAb var spesifikk for 5TGMl-indusert OC-liknende celledannelse og ikkevar grunnet cytotoksisitet, ble effektene av disse antistoff undersøkt på OC-liknende celledannelse indusert av 1,25 (OH)2D3 som er en meget brukt stimulator av ostgeoklastogenese i musebenmargs cellekulturer (Takahashi, 1988). Verken VCAM-1 Ab eller VLA-4 Mab inhiberte OC-liknende celledannelse indusert av vitamin D3, som i seg selv ikke hadde noen effekt på VCAM-l-ekspresjon i stromalceller (data ikke vist).

Effekt av kondisjonert medium innhøstet fra ko-kultur av 5T6M-1 og ST2 på benresorpsjon

Kondisjonert medium fra ko-kulturen av 5TGM-l-celler og ST2-celler viste en markert økning i benresorpsjon i det føtale lange rotteben-assay (Figur 2), mens kondisjonert medium av 5TGM1 forårsaket kun marginal økning sammenliknet med kontrollmedium. Kondisjonert medium fra ST2-celelr viste ingen økning i benresorpsjon. Således induserer direkte celle-celle-kontakt via VCAM-1 og VLA-4 begge osteoklast-liknende celler og produksjon av ben-resorberende faktorer in vitro.

Effekt av rekombinant oppløselig VCAM-1 (sVCAM-1) på produksjonen av benresorberende og osteoklastogenisk aktivitet av 5TGM1-celler

Kondisjonert medium av 5TGM1 behandlet med en oppløselig rekombinant form av VCAM-1 (sVCAM-1) øket benresorpsjon i føtale lange rotteben på en doseavhengig måte, mens kondisjonert medium dannet fra ubehandlede 5TGM-1 øket kun mar-ginalt benresorpsjon. Oppløselig VCAM-1 hadde i seg selv ingen effekt på benresorpsjon (data ikke vist). I musemarg dyrkningssystemet viste kondisjonert medium innhøstet fra 5TGMl-cedller behandlet med sVCAM-1 øket aktivitet av OC-liknende celledannelse, mens kondisjonert medium av ube-handlet 5TGM1 viste kun marginal aktivitet av OC-liknende celledannelse (Figur 3).

Ekspresjon av rank-ligand mRNA i stromale margceller (ST2) dyrket ved nærvær og fravær av murine myelomceller

Fordi Rank-ligand synes å være en viktig mediator for OCL-dannelse og kan være den endelige felles vei for effektene av osteoklastogenetiske cytokiner på OCL-dannelse, ble eks-presjonen av Rank-ligand i 5TGM1- og ST2-celler undersøkt både individuelt og når samdyrket. Det ble funnet at ko-kultur av 5TGM1- og ST2-celler induserer Rank-ligand mRNA i ST2-cellene. Videre, mens 5TGMl-celler ikke uttrykker Rank-ligand, så gjør de dette når de behandles med sVCAM-1 (ikke vist). Endelig induserte det kondisjonerte medium fra 5TGMl-celler behandlet med sVCAM-1, Rank-ligand mRNA i ST2-celler, noe som antyder at VCAM-l/VLA-4-veien produserer et cytokin i myelomceller som øker Rank-ligand-ekspresjon av stromale margceller (data ikke vist). Oppsummeringsvis ble det vist at 5TGMl-celler alene danner en marginal mengde aktivitet som stimulerer OC-liknende celledannelse og benresorpsjon. Imidlertid når 5TGM1 myelomceller ble samdyrket med benmargsceller inneholdende hemopoietiske osteoklast-prekursorer og stromalceller, fes-tet de seg sterkt til stromalcellene og øket OC-liknende celledannelse. Det ble ikke dannet OC-liknende celler i ko-kulturene hvor 5TGMl-celler var forhindret fra å kon-takte stromalceller. Videre, i organkulturer av føtale lange rotteben hadde det kondisjonerte medium innhøstet fra ko-kulturene av 5TGM1 myelomceller og ST2 stromale benmargsceller øket benresorberende aktivitet sammenliknet med kondisjonert medium av enten ST2 eller 5TGM1 alene. Disse data er konsistente med antakelsen at direkte celle-celle-kontakt av STGMl-celler med stromale benmargsceller er nødvendig for produksjonen av osteoklast-stimulerende og benresorberende aktivitet. Det ble så bestemt hvilke cel-leadhes j onsmolekyler som var involvert i den direkte celle-celle-interaksjon mellom 5TGMl-celler og stromale benmargsceller som er nødvendig for produksjonen av osteklastoge-netisk aktivitet. Foreliggende data indikerer at VCAM-1 og VLA-4 integrin spiller en rolle i denne celle-celle-interaksjon siden nøytraliserende antistoff til disse to adhe-sjonsmolekyler dyptgripende minsket OC-liknende celledannelse i ko-kulturene. VCAM-l/VLA-4 integrin-interaksjonen er ansvarlig for celle-celle-kommunikasjonen mellom stromale margceller og 5TGM1 myelomceller, noe som fører til øket produksjon av en osteoklastogenetisk og ben-resorberende aktivitet. Endelig er denne ben-resorberende aktivitet delvis grunnet induksjonen av Rank-ligand.

Eksempel 2; IN VIVO FORSØK

Søkers in vitro studier antyder at interaksjonen mellom VLA-4 på myelomceller med VCAM-1 på stromale margceller kan spille en nøkkelrolle ved induksjonen av ben-resorberende aktivitet hos myelom. Søker har tatt det viktige steg å undersøke denne hypotese in vivo med en dyremodell som nøy-aktig reflekterer human sykdom.

A. I dette forsøk ble mus injisert med 1 e 5 5TGM1 myelomceller som ble tillatt å kolonisere benmargen. Mus ble delt opp i to grupper på tre, hvor en virket som en kontrollgruppe, og den andre ble behandlet hver fjortende dag ved å starte på dag 8, med mAb PS/2. Nivåer av IgG2b, som er antistoff-isotypen dannet av 5TGM1 myelomceller, ble målt ukentlig fra uke 1 til 6. Behandling med mAb ved en dose på 80 ^g per injeksjon (~4 mg/kg/ hver fjortende dag, inhiberte sterkt IgG2b-produksjon, noe som indikerte signifikant inhibering av myelomcelle-overlevelse og vekst in vivo (Figur 4). Videre vist de behandlede mus redusert hyppighet av paraplegia (alle 3 ubehandlede dyr vist paraplegia på dag 42, mens kun et av de behandlede dyr viste paraplegia). De to behandlede dyr uten paraplegia viste også en reduksjon i milt- og levervekter, noe som også kor-relerer med svulstbyrde. Endelig viste de behandlede dyr en reduksjon i svulstareale ved histologi (fra 6,71 +/-1,74 til 0,05 +/- 0,08 kvadratmillimeter) i tibia og lårben. Det var ingen effekter av behandlingen på kalsium-nivå i serum (data ikke vist).

B. I et parallelt forsøk hadde behandling med 40 ^g PS/2 hver fjortende dag ingen effekt på IgG2b-nivåer (ikke vist). Disse data viser at mAb PS/2 mot VLA-4 sterkt inhiberer veksten av etablerte myelomceller på en dose-avhengig måte. C. I et annet in vivo forsøk ble 18 SCID-mus injisert med 5TGM1 myelomceller på dag 0. Fire mus ble behandlet med PBS; 4 mus ble behandlet på en profylaktisk måte med mAb M/K-2.7 som er reaktiv overfor muse-VCAMl ved en dose på 80 Hg (~4 mg/kg/ hver 3. dag ved å starte på dag -1 (d.v.s. dager -1, 2, 5, 8 og 11). I et parallelt forsøk ved å bruke samme metode, ble fem mus behandlet med 160 ^g mAb M/2-2.7. I tillegg ble fem mus behandlet med 160 ^g mAb M/K-2.7 ved å starte på dag 8 (d.v.s. dager 8, 11, 14, 17 og 20) i en terapeutisk prosedyre. Serum ble tatt fra alle mus på dager 21, 28 og 35, og dyr ble røntgenstgråle-foto-grafert og så avlivet for histologi på dag 35. Alle tre behandlingsgrupper vist en reduksjon i serum IgG2b-nivåer, noe som indikerer redusert myelomcelle-belastning (Figur 5). En signifikant effekt ble også observert på milt-vek-ter ved den profylaktiske lave dosebehandling i forhold til kontroll (0,23 +/- 0,14 g for kontroll mot 0,08 +/- 0,04 for behandlet). I den profylaktiske høye dose-gruppe vist 4 av 5 dyr en klar reduksjon i milt-vekt, men den totale verdi var ikke signifikant på grunn av ett dyr med en stor milt-vekt (data ikke vist). D. Det er mulig å undersøke hvorvidt en initial høy bolus-dose av alfa4 integrin-antagonist, fulgt av en opprettholdelsesdose, forbedrer effektiviteten. Myelomcellene er allerede etablert i marg-rommet og nære VLA-4-avhengige interaksjon med VCAM-1 må også bli hemmet. Videre, antakelig jo større antallet etablerte myelomceller er, desto høyere er den initiale dose som er nødvendig for å spyle ut celler i den perifere sirkulasjon.

Et større studium med anti-VLA-4-antistoffet PS/2 ble føl-gelig utført. Åtteogtyve SCID-mus ble injisert med 5TGM1 myelomceller på dag 0. Ni mus mottok ingen behandling; 9 mus mottok et isotype-tilsvarende kontroll IgG mAb; 10 mus ble behandlet med mAb PS/2 mot alfa-4-integrin. En forskjellig terapeutisk behandling ble gitt hvor mus ble gitt en høy dose av mAb (200 ^g) på dag 4, 5 og 6, og så en opp-rettholdelses-dose på 80 ^g (~4 mg/kg) hver 3. dag ved å starte på dag 8.

Det fantes en statistisk signifikant reduksjon i serum IgG2b når den behandlede gruppe ble sammenlignet med enten den ubehandlede eller den IgG-behandlede gruppe ved uke 3 og 4 (data ikke vist). Det er viktig at når den behandlede gruppe ble sammenlignet med enten den ubehandlede eller den kontoll-IgG-behandlede gruppe, så fantes det en klar effekt på overlevelse (Figur 6).

Eksempel 3: ANDRE IN VIVO FORSØK

Basert på informasjonen presentert heri for første gang, kan den vanlige fagpersonen lett bekrefte og utvide viktigheten av alfa-4-integrinene og deres ligander i multippelt myelom ved å bruke den beskrevne murine dyremodell.

Den følgende serie forsøk ligger godt innenfor fagpersonens kompetanse basert på foreliggende beskrivelse, men virker kun for å eksemplifisere, og ikke begrense, typene arbeid. 1) Doserespons overfor mAb PS/2 for å bestemme den opti-male fjortendaglige opprettholdelsesdose. 80 ^g viser god effekt, men 40 ^g var uten effekt. Man undersøker høyere doser opp til 20 mg/kg to eller tre ganger ukentlig for å bestemme optimal dosering. 2) Pasienter som har sykdom ved forskjellige alvorlighetsgrader forbundet til øket svulstbelastning. Man undersøker effektiviteten av mAb PS/2 gitt ved forskjellige tidspunkter etter etablering av sykdommen, d.v.s. man sammenligner behandlingsstart på dag 8 (se for eksempel Figur 4) med oppstart etter to, tre, fire og fem uker etter inokulering for å se hvordan sen mAb kan bli gitt for å gi noe symptomlettelse. 3) Effektene av mAb MK-2 overfor murin VACM-1 undersøkes ved å følge de samme parametere som er skissert ovenfor (dosering, doseringstidspunkt) for mAb overfor VLA-4. Det er forventet at liknende doseringsnivåer vil være nødvendige for å observere effektivitet. 4) Ytterligere markører for myelom-progresjon blir under-søkt innbefattende tumorbelastning i benmarg og ekstramedullære områder; mengdebestemmelse av benlesjoner ved radiografisk analyse av skjelettet ved histomorfometri; målinger av hastigheter av benresorpsjon ved å vurdere kollagen-fornetting i plasma; målinger av monoklonal proteinproduksjon i plasma; hyperkalsemi hvor tilstede samt mortalitet. 5) Multippelt myelom blir for tiden behandlet ineffektivt med standard kjemoterapeutiske metoder. De additive synergistiske effekter av mAb ved optimal dosering i forbindelse med, eller enten før eller etter, dosering med passende kjemoterapeutiske regimer, undersøkes. 6) Egenskapen av en småmolekylær alfa-4-integrin-inhibitor som er selektiv for et spesielt alfa-4-integrin eller er selektiv for flere alfa-4-integriner på en gang eller egenskapen til flere slike inhibitorer til å etterape effektene av mAb som blokkerer myelom-progresjon, undersøkes ved å bruke metoder og resultater som er beskrevet ovenfor. Små-molekylære inhibitorer blir tilført parenteralt eller oralt i doseområdet 0,1 til 30 mg/kg en eller to

ganger daglig, eller to eller tre ganger ukentlig.

Ytterligere referanser:

Alsina M, Boyce B, Devlin R, Anderson JL, Craig F, Mundy GR, Roodman GD. Development of an in vivo model of human multiple myeloma bone disease. Blood 87: 1495-1501, 1996.

Attal M, Harousseau JL, Stoppa AM, Sotto JJ, Fuzibet JG, Rossi JF, Casassus P, Maisonneuve H, Facon T, Ifrah N, Payen C, Bataille R. A prospective, randomized trial of autologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma. lntergroupe Francais du Myelome. N Engl J Med 335: 91-97, 1996.

Bataille R, Jourdan M, Zhang XG, Klein B. Serum levels of interleukin-6, a potent myeloma cell growth factor, as a reflection of disease severity in plasma cell dyscrasias. J Clin Invest 84: 2008,1989.

Bataille R, Chappard D, Klein B. Mechanisms of bone lesions in multiple myeloma. Hem One Clin NA 6: 285-295,1992.

Bataille R, Barlogie B, Lu ZY, Rossi JF, Lavabre-Bertrand T, Beck TT Wijdenes J, Brochier J, Klein B. Biologic effects of anti-interleukin-6 murine monoclonal antibody in advanced multiple myeloma. Blood 86: 685-691,1995.

Boyce BF, Yates AJP, Mundy GR. Bolus injections of recombinant human interleukin-1 cause transient hypocalcemia in normal mice. Endocrinology 125: 2780-2783,1989.

Chauhan D, Uchiyama H, Urashima M, Yamamoto K, Anderson KC. Regulation of interleukin-6 in multiple myeloma and bone marrow stromal cells. Stem Cells 13: 35-39,1995.

Epstein J. Myeloma phenotype: Clues to disease origin and manifestation. Hem One Clin NA 6: 249-256, 1992.

Garrett IR, Dallas S, Radl J, Mundy GR: A murine model of human myeloma bone disease. Bone 20: 515-520, 1997.

Gosslar U, Jonas P, Luz A, Lifka A, Naor D, Hamann A, Holzmann B. Predominant role of alpha 4 integrins for distinct steps of lymphoma metastasis. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 93: 4821-4826, 1996.

Lacey DL, Timms E, Tan HL, Kelley MJ, Dunstan CR, Burgess T, Elliott R,

Colombero A, Elliott G, Scully S, Hsu H, Sullivan J, Hawkins N, Davy E, Capparelli C, Eli A, Qian YX, Kaufman S, Sarosi 1, Shalhoub V, Senaldi G, Guo J, Delaney J, Boyle WJ. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 93: 165-176, 1998.

Lobb R, Chi-Rosso G, Leone D, Rosa M, Newman B, Luhowskyj S, Osborn L, Schiffer S, Benjamin C, Dougas I, Hession C, Chow P. Expression and functional characterisation of a soluble form of vascular cell adhesion molecule 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178: 1498-1504, 1991.

Lobb, R. and Hemler, M. The Pathophysiologic Role of alpha4 Integrins In Vivo. J.

Clin. Invest., 94: 1722-1728 (1994).

MacDonald BR, Mundy GR, Clark S, Wang EA, Kuehl TJ, Stanley ER, Roodman GD.

Effects of human recombinant CSF-GM and highly purified CSF-1 on the formation of multinucleated cells with osteoclast characteristics in long-term bone marrow cultures.

J Bone Min Res 1: 227-233, 1986.

Mbalaviele G, Chen H, Boyce BF, Mundy GR, Yoneda T: The role of cadherin in the generation of multinucleated osteoclasts from mononuclear precursors in murine marrow. J Clin Invest 95: 2757-2765, 1995.

Matsuura N, Puzon-McLaughlin W, Irie A, Morikawa Y, Kakudo K, Takada Y.

Induction of experimental bone metastasis in mice by transfection of integrin alpha 4

beta 1 into tumor cells. Am J Pathol 148: 55-61, 1996.

Matsuzaki K, Udagawa N, Takahashi N, Yamaguchi K, Yasuda H, Shima N, Morinaga Tf Toyama Y, Yabe Y, Higashio K, Suda T. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochem Biophys Res Commun 246: 199-204, 1998.

Mundy GR, Bertolini DR. Bone destruction and hypercalcemia in plasma cell myeloma. Seminar Oncol 3: 291,1986.

Mundy GR. Myeloma bone disease. Eur. J. Cancer 34: 246-251, 1998.

Papayannopoulou T, Nakamoto B. Peripheralization of hemopoietic progenitors in primates treated with anti-VLA4 integrin. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90: 9374-9378,

1993.

Qian F, V aux DL, Weissman IL. Expression of the integrin a4bl on melanoma cells can inhibit the invasive stage of metastasis formation. Cell, 77: 335-347, 1994.

Radl J, Croese JW, Zurcher C, van den Enden-Vieveen MM, de Leuuw AM. Animal model of human disease. Am. J. Pathol. 132; 593-597, 1988.

Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR, Kelley M, Chang MS, Luthy R, Nguyen HQ,

Wooden S, Bennett L, Boone T, Shimamoto G, DeRose M, Elliott R, Colombero A, Tan HL, Trail G, Sullivan J, Davy E, Bucay N, Renshaw-Gegg L, Hughes TM, Hill D,

Pattison W, Campbell P, Boyle WJ, et al. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 309-319, 1997.

Takahashi N, Yamana H, Yoshiki S, Roodman GD, Mundy GR, Jones SH, Boyde A, Suda T: Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology 122: 1373-1382, 1988.

Vanderkerken K, De Raeve H, Goes E, Van Meirvenne S, Radl J, Van Riet 1,

Thielemans K, Van Camp B. Organ involvement and phenotypic adhesion profile of 5T2 and 5T33 myeloma cells in the C57BL/KaLwRij mouse. Brit J Cancer 76: 451-460, 1997.

Vaughan T, Williams AJ, Pritchard K, Osbourn JK, Pope AR, Eamshaw JC, et al. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nature Biotechnology. 14: 309-314, 1996.

Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Mochizuki S, Tomoyasu A, Yano K, Goto M, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashio K, Udagawa N, Takahashi N, Suda T. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RankL. Proe Nati Acad Sei USA 95: 3597-3602, 1998.

Yoneda T, Alsina MM, Garcia JL, Mundy GR: Differentiation of HL-60 Cells into cells with the osteoclast phenotype. Endocrinology 129: 683-689, 1992.

Yoneda T, Lowe C, Lee CH, Gutierrez G, Niewolna M, Williams P, lzbicka E, Uehara Y, Mundy GR: Herbimycin A, a pp60<c>"<sre> tyrosine kinase inhibitor, inhibits osteoclastic bone resorption in vitro and hypercalcemia in vivo. J Clin Invest 91: 2791-2795, 1993.

Claims

1. Anvendelse av en sammensetning omfattende en antagonist for interaksjonen mellom et alfa-4-subenhet-bærende integrin og en ligand for et alfa-4-subenhet-bærende integrin ved fremstilling av et medikament som er egnet til behandling av multippelt myelom.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antagonisten er et alfa-4-integrin-bindende middel.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antagonisten er et alfa-4-integrinligand-bindende middel.

4. Anvendelse ifølge krav 2, hvor det alfa-4-integrin-bindende middel er valgt fra gruppen omfattende: a) en anti-alfa-4 antistoffhomolog som antagoniserer interaksjonen av både VLA-4 og alfa4beta7 med deres respektive alfa-4-ligander; b) en anti-VLA-4 antistoffhomolog som antagoniserer interaksjonen av VLA-4 med dens alfa4-ligand; og c) en anti-alfa4beta7 antistoffhomolog som antagoniserer interaksjonen mellom alfa4bet7 og dent alfa4-ligand.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor antistoffhomologen er valgt fra gruppen omfattende et humant antistoff, et chimerisk antistoff, et humanisert antistoff samt alfa4-bindende fragmenter derav.

6. Anvendelse ifølge krav 3, hvor det alfa4-integrinli-gand-bindende middel en anti-VCAM-l-antistoffhomolog.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor antistoffhomologen er valgt fra gruppen omfattende et humant antistoff, et chimerisk antistoff, et humanisert antistoff samt VCAMl-bindende fragmenter derav.

8. Anvendelse ifølge krav 1, hvor sammensetningen er egnet til å bli administrert ved en dose for å gi fra omkring 0,1 til omkring 20 mg/kg kroppsvekt av antagonisten.

9. Anvendelse av en antagonist for interaksjon mellom et alfa4-subenhetbærende integrin og en ligand for et alfa4-subenhetbærende integrin ved fremstilling av et medikament til inhibering av benresorpsjon assosiert med tumorer i benmargen, hvor medikamentet er formulert for å gi fra omkring 0,1 til omkring 20 mg antagonist per kg kroppsvekt per dose.

10. Anvendelse ifølge krav 10, hvor antagonisten er et alfa4-integrinbindende middel.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor antagonisten er et alfa4-integrinligand-bindende middel.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor det alfa4-integrin-bindende middel er en anti-VLA4-antistoffhomolog eller alfa4beta7-antistoffhomolg.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor antistoffhomologen er valgt fra gruppen omfattende et humant antistoff, et chimerisk antistoff, et humanisert antistoff samt alfa4-bibndende fragmenter derav.

14. Anvendelse ifølge krav 11, hvor det alfa4-integrin-ligand-bindende middel er en anti-VCAM-1 antistoffhomolog.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor antistoffhomologen er valgt fra gruppen omfattende et humant antistoff, et chimerisk antistoff, et humanisert antistoff samt VCAM1-bindende fragmenter derav.

16. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antagonisten er et anti-VLA-4-antistoff.

17. Anvendelse ifølge krav 9, hvor antagonisten er et anti-VLA-4-antistoff.

18. Anvendelse ifølge krav 9, hvor antagonisten er valgt fra gruppen bestående av: a) en anti-alfa4 antistoffhomolog som antagoniserer interaksjonen av både VLA-4 og alfa4beta7 med sine respektive alfa4-ligander; b) en anti-VLA-4 antistoffhomolog som antagoniserer interaksjonen av VLA-4 med sin alfa4-ligand; og c) en anti-alfa4beta7 antistoffhomolog som antagoniserer interaksjonen av alfa4beta7 med sin alfa4-ligand.