CZ302997B6

CZ302997B6 - Použití protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen pro výrobu farmaceutického prípravku

Info

Publication number: CZ302997B6
Application number: CZ20010916A
Authority: CZ
Inventors: R. Mundy@Gregory; Yoneda@Toshiyuki
Original assignee: Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2012-02-15
Also published as: EP1113810A2; SK287601B6; SK6052001A3; CN1321091A; CA2343579A1; CA2343579C; JP2013241441A; EP1113810B1; NO20011244D0; CN1236815C; EA200100362A1; HU229038B1; EP2065050A1; ATE418999T1; KR100628818B1; PL203114B1; NO20011283D0; BR9913705A; US20020022028A1; DK1113810T3

Abstract

Použití protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen pro výrobu farmaceutického prípravku k lécení mnohocetného myelomu nebo k inhibici resorpce kosti spojené s nádory kostní drene, pricemž protilátka nebo její fragment vázající antigen jsou vybrány ze skupiny, kterou tvorí: a) anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen, b) anti-alfa4beta7 integrin protilátka nebo její fragment vázající antigen a c) anti-VCAM-1 protilátka nebo její fragment vázající antigen.

Description

(57) Anotace:

Použití protilátky nebo j ejího fragmentu vázajícího antigen pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení mnohočetného myelomu nebo k inhibici resurpce kosti spojenés nádory kostní dfeně, přičemž protilátka nebo její fragment vázající antigen jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: a) anti-VLA4 protilátka nebo její fragment vázající antigen. b) antialťa4beta7 integrin protilátka nebo jej i fragment vázající antigen a c) anti-VCAM-l protilátka nebo jej í fragment vázající antigen,

Použití protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen pro výrobu farmaceutického přípravku

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití antagonisty interakce mezi alfa4 podjednotku nesoucím integrinem a jeho ligandem pro výrobu léku pro léčení mnohočetného myelomu a myelomem indukované resorpce kosti, tedy uvolňování faktorů resorbujících kost z myelomových buněk, to Vynález se zejména týká antagonistů integrinu, např. antagonistů integrinu obsahujících alfa4, kteří inhibují biologické účinky adheze, asociované s osídlením kostní dřeně myelomovými buňkami, jejich další přežívání závislé na integrinu a také na integrinu závislé uvolňování faktorů resorbujících kost, které vede k destrukci kostí pacienta s mnohočetným myelomem.

Dosavadní stav techniky

Mnohočetný myelom je druhá nejčetnější hematologická maligní nemoc s 15 000 nově diagnostikovanými případy každý rok a 30 000 až 40 000 pacienty ročně v USA (Mundy a Bertolini,

1986). 80 % pacientů trpí devastující osteolytickou destrukcí kostí způsobenou zvýšenou tvorbou a aktivitou osteoklastů (OCL) (Mundy a Bertolini, 1986). Tato destrukce kostí způsobuje nesnesitelnou bolest kostí, patologické fraktury, kompresi pátere a život ohrožující hyperkalcémii. Jelikož mnohočetný myelom nemůže být léčen standardní chemoterapií nebo transplantací kmenových buněk (Attal et al„ 1996) aje spojen s vysokou nemocností a potenciální mortalitou, jsou životně důležité takové léčebné strategie, které brání růstu samotných myelomů a zejména osteolytické destrukci kostí, ke které u těchto pacientů dochází.

Avšak patologické mechanismy, které jsou zodpovědné za zvýšenou aktivitu osteoklastů u pacientů s mnohočetným myelomem, jsou dosud neznámé (Mundy, 1998). Objevují se různé profily kostních lézí. Někdy se u pacientů vyvinou diskrétní osteolytické leze, které jsou spojeny se solitérními plasmacytomy. Někteří pacienti mají difúzní osteopenii, která maskuje výskyt osteoporózy, aje způsobena tím, že myelomové buňky se difuzně rozšířily páteří. U většiny pacientů se objevují četné diskrétní lytické léze v sousedství hnízd myelomových buněk.

Hyperkalcémie se objevuje jako důsledek destrukce kosti asi u jedné třetiny pacientů s pokročilou nemocí. Zřídka pacienti s myelomem nemívají lytické léze nebo ztráty kosti, a spíše u nich dochází ke zvýšení tvorby nové kosti v okolí hnízd myelomových buněk. Tato vzácná situace se nazývá osteosklerotický myelom.

Osteolytické kostní léze jsou zdaleka nej rozšířenějším kosterním projevem u pacientů s myelomem (Mundy 1998). Ačkoliv přesný molekulární mechanismus zůstává nejasný, pozorování za posledních 15 let vedly k závěrům, že:

1) Mechanismus, kterým u myelomu dochází k destrukci kosti, je zprostředkován osteoklasty, což j sou normální buňky resorbující kost.

2) Osteoklasty se akumulují na kost resorbujících površích přilehlých k shluku myelomových buněk a zdá se, že mechanismus, kterým j sou stimulovány osteoklasty v myelomu, je lokální mechanismus.

3) Již mnoho let je známo, že kultury lidských myelomových buněk in vitro produkují několik faktorů stimulujících osteoklasty, jako jsou např. lymfotoxin-alfa (LT-a), interleukin-1 (IL1), protein příbuzný parathormonu (PTHrP) a interleukin-6 (IL- 6).

-1 CZ 302997 B6

4) Hyperkalcémie se objevuje asi u jedné třetiny pacientů někdy v průběhu nemoci, a je vždy spojena s výrazným zvýšením resorpce kosti a velmi často také s výrazným poškozením glomerulámí filtrace.

5) Zvýšení resorpce kosti osteoklasty v myelomu je často spojeno se zvýšeným poškozením funkce osteoblastů. Aktivita alkalické fosfatázy v séru je snížena neboje normální, na rozdíl od pacientů s jinými typy osteolytického onemocnění kosti, a radionuklidové vyšetření nevykazuje známky zvýšeného příjmu, což ukazuje na narušenou reakci osteoblastů na zvýšení resorpce kosti.

Ačkoliv různé mediátory, zmíněné výše, se účastní stimulace aktivity osteoklastů u pacientů s mnohočetným myelomem, dosavadní publikace o faktorech produkovaných myelomovým i buňkami nebyly konzistentní, a některé studie nebyly průkazné vzhledem k přítomnosti jiných kontaminujících typů buněk, včetně stromatálních buněk a makrofágů, v populaci myelomových buněk. Hlavním myelomovým růstovým faktorem je IL-6, který podporuje růst několika myelomových buněčných linií a myelomových buněk čerstvě izolovaných z pacienta (Bataille et al., 1989). Produkce IL-6 může být detekována u asi 40 % čerstvě izolovaných myelomových buněk užitím metody PCR, ale pouze 1 ze 150 vyšetřovaných pacientů měl produkci IL-6 detekovatelnou imunocytochemickým testem nebo testem ELISA (Epstein 1992). IL-6 receptory byly detekovány pouze u 6 ze 13 vzorků z pacientů s mnohočetným myelomem (Bataille et al., 1992). Navíc zralé myelomové buňky mají podle publikací minimální proliferační reakci na 1L 6. Interleukin-l 1 (IL—11) má na plastocytomy účinky podobné IL-6, avšak dosud nikdo neprokázal, že myelomové buňky produkují interleukin-l 1. Bataille a spolupracovníci (1995) ukázali, že perfuze 5 pacientů s refraktomím myelomem protilátkou proti IL-6 snížily počet myelomových buněk pouze u 2 z těchto pacientů. IL— 1 je extrémně účinné činidlo resorpce kosti, které způsobuje hyperkalcémii na zvířecích modelech bez selhání ledvin (Boyce et al., 1989). Naproti tomu hyperkalcémie se vyskytuje zřídka u pacientů s myelomem bez selhání ledvin. Důležitější však je, že u vysoce purifikovaných myelomových buněk nebyla detekována žádná produkce IL-1 a jen vzácná produkce TNF-a, což vedlo k domněnce, že jiné kontaminující buňky, jako např. makrofágy, by mohly být zdrojem IL— I a TNF-a (Epstein 1992). Podobně LT-a je produkován většinou lidských myelomových buněčných linií (Bataille et al., 1995), ale není produkován myelomovými buňkami invivo (Alsina et al., 1996). Kromě IL—1, TNF-a, LT-a a IL-6 myelomové buňky produkují zkrácenou formu M-CSF, který je biologicky aktivní, avšak samotný M-CSF nezpůsobuje hyperkalcémii ani neindikuje tvorbu osteoklastů v kulturách lidské kostní dřeně (MacDonald et al., 1986).

Takže role žádného z těchto faktorů v osteolytické nemoci kosti u pacientů s myelomem nebyla dosud prokázána in vivo, takže známé cytokiny zjevně nejsou zodpovědné samy za celkovou resorpci kosti pozorovanou u těchto pacientů.

Role interakcí adhezivních molekul při myelomové nemoci kosti

Andersen a spolupracovníci byli první skupinou, která prokázala důležitost adhezivních interakcí mezi myelomovými buňkami a buňkami v mikroprostředí dřeně, jak pro růst myelomových buněk, tak pro rozvoj osteolytické nemoci kosti.

Buňky mnohočetného myelomu exprimují na svém povrchu adhezní molekuly, CD29 (VLA-4), LFA-1 aCD44 (Chauhan et al., 1995). Tito pracovníci předpokládali, že myelomové buňky jsou lokalizovány v dřeni prostřednictvím specifických adhezních interakcí mezi proteiny extracelulární matrix a stromatálními buňkami dřeně. Dále ukázali, že adheze buněk mnohočetného myelomu k stromálním buňkám spouštěla sekreci IL-6 jak u normální buněk stromatu, tak buněk myelomových a zvyšovala růst nádorových buněk zprostředkovaný IL-6. Avšak protilátky proti CD29, LFA-1 nebo CD44 nesnížily produkci IL-6 stromatálními buňkami dřeně v reakci na myelomové buňky, což předpokládalo, že jiná interakce ligand-receptor spouští sekreci IL-6 stromatálních buněk dřeně navázaných na myelomové buňky. Pouhá identifikace možné adhezní

-2CZ 302997 Β6 metabolické dráhy neznamená, že tato dráha je důležitá. V tomto případě se ukázalo, že žádná z domnělých drah nehrála roli v produkci IL-6.

Vanderkerken et al. (1997) vyšetřil také fenotypový adhezní profil myších buněk 5T2 a 5T33 myelomových buněk na modelu myšího myelomu. Tyto výzkumy ukázaly, že tyto buněčné linie exprimovaly VLA-4, VLA-5, LFA-1 a CD44, a vedly k předpokladu, že tyto faktory jsou důležité k tomu, aby se myelomové buňky navázaly na stromatální buňky dřeně.

Nicméně i přes značné pokroky v laboratorním zkoumání, základní mechanismy zvýšené osteoklastické destrukce kosti při myelomu zůstaly nevyjasněny. To odráží také nesnadnou situaci při interpretaci údajů o adhezívních interakcích získaných in vitro pro situaci in vivo. Tak např. mnohé studie in vitro ukazovaly na účast jak integrinu VLA-4, tak integrinu LFA-1 při adhezi hematopoetických kmenových buněk na stromatální buňky dřeně (přehled viz Papayannaopoulou a Nakamoto, 1993). Tyto in vitro údaje by vedly k predikci toho, že obě metabolické dráhy, pokud by byly blokovány in vivo, by vedly k periferalizaci hematopoetických kmenových buněk z dřeně do periferní krve. Nyní na studii s primáty se ukázalo, že zatímco monoklonální protilátka (mAb) proti VLA-4 skutečně účinně periferalizovala kmenové buňky, monoklonální protilátka proti beta2-integr i novému řetězci LFA-1 byla bez účinku, t přes zvýšený počet neutrofilů, ukazující aktivitu protilátky (Papayannaopoulou a Nakamoto, 1993). Tyto údaje mj. také ukázaly, že na základě výsledků získaných in vitro se nedala předvídat situace in vivo.

Je třeba poznamenat, že role integrinu VI. A—4 byla studována v metastázách mnohých nádorů, včetně leukémií jako je lymfom, s rozdílnými výsledky. Transfekce lidského alfa-^4 řetězce do buněk ovarií čínského křečka (CHO) vedla k expresi VLA-4, a poskytla těmto buňkám schopnost migrovat do kostní dřeně in vivo, přičemž tento jev byl inhibován protilátkami proti VLA-4 (Matsuura et al., 1996). Naproti tomu transfekce lymfomových buněk VLA-4 vedla k silné inhibici metastáz v játrech, plících a ledvinách, a byla bez účinku na osidlování a proliferací kostní dřeně (Gosslar et al., 1996). Navíc exprese VLA—4 na silně metastazujících buňkách myšího melanomu inhibovala vytváření plicních metastáz in vivo (Qian et al., 1994) a nepredisponovala melanom k metastázám v kostní dřeni.

Lze tedy shrnout, že na základě studií adhezívních drah in vitro není jasné, jaká je relevance predikce pro situaci in vivo. Dokonce ani ze studií in vitro nejsou konzistentní údaje. Hlavním důvodem překvapivé nekonzistence údajů je zřejmě to, že současně dostupné zvířecí modely myelomu nejsou dostatečně dobré pro predikci nemoci u lidí. V případě mnohočetného myelomu, lidské a myší myelomové buněčné linie, které mohou být kultivovány in vitro, jsou jen velmi zřídka spojeny s destrukcí kosti in vivo (Mundy 1998).

Je tedy velmi potřebné identifikovat sloučeniny nebo antagonisty, kteří inhibuj í produkci těchto faktorů resorpce kosti, a tím mohou zastavit destrukci kosti a zlepšit kvalitu života pacientů trpících my e lomem.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení mnohočetného myelomu, přičemž protilátka nebo její fragment vázající antigen jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: a) anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen, b) anti-alfa4beta7 integrin protilátka nebo její fragment vázající antigen a c) anti-VCAM-1 protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen anti-alfa4beta7 protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen anti-VCAM-1 protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně jsou protilátka nebo její fragment vázající antigen vybrány ze skupiny, kterou tvoří lidská protilátka, chimé-3 CZ 302997 B6 rická protilátka, humanizovaná protilátka ajejich fragmenty vázající antigen. Výhodně je farmaceutický přípravek podáván v takové dávce, která poskytuje dávku protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. Výhodně je farmaceutický přípravek podáván v takové dávce, která poskytuje dávku protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen OJ až 50 mg/kg tělesné hmotnosti.

Předmětem vynálezu je rovněž použití protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen pro výrobu farmaceutického přípravku k inhibici resorpce kosti spojené s nádory kostní dřeně, přičemž protilátka nebo její fragment vázající antigen jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: a) antiVLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen, b) anti-alfa4beta7 integrin protilátka nebo její fragment vázající antigen a c) anti-VCAM-1 protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen anti-VLA^4 protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen anti-VCAM-1 protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen anti-alfa4beta7 protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně jsou protilátka nebo její fragment vázající antigen vybrány ze skupiny, kterou tvoří lidská protilátka, chimérická protilátka, humanizovaná protilátka ajejich fragmenty vázající antigen. Výhodně je farmaceutický přípravek podáván v takové dávce, která poskytuje dávku protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen OJ až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. Výhodně je farmaceutický přípravek podáván v takové dávce, která poskytuje dávku protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen 0,1 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti.

Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen, které jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: protilátka HP1/2 nebo její fragment vázající antigen, protilátka HP2/1 nebo její fragment vázající antigen, protilátka HP2/4 nebo její fragment vázající antigen, protilátka L25 nebo její fragment vázající antigen, protilátka P4C2 nebo její fragment vázající antigen a protilátka P4G9 nebo její fragment vázající antigen.

Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigenhumanizovaná VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen obsahující humanizovaný lehký řetězec a humanizovaný těžký řetězec, kde jak lehký, tak těžký řetězec obsahuje komplementaritu určující úseky CDR1, CDR2 a CDR3 z myší anti-VLA-4 protilátky 21.6. Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen humanizovaná VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen, přičemž

a) humanizovaný lehký řetězec obsahuje rámec variabilního úseku ze sekvence rámce variabilního úseku lidského lehkého řetězce kappa, kde alespoň jedna pozice rámce je obsazena stejnou aminokyselinou, jaká je přítomná v ekvivalentní pozici rámce variabilního úseku lehkého řetězce myšího imunoglobulinu 21.6, a

b) humanizovaný těžký řetězec obsahuje rámec variabilního úseku ze sekvence rámce variabilního úseku těžkého řetězce, kde alespoň jedna aminokyselinová pozice rámce je obsazena stejnou aminokyselinou, jaká je přítomna v ekvivalentní pozici rámce variabilního úseku těžkého řetězce myšího imunoglobulinu 21.6. Výhodně je farmaceutický přípravek určen pro parenterální podávání. Výhodně je farmaceutický prostředek určen pro podávání v kombinaci s jedním nebo více z následujících činidel: kortikosteroid, protizánětlivé činidlo, imunosupresivum, anti metabolit a imunomodulátor a/nebo v kombinaci s chemoterapeutickým režimem. Výhodně je protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen monoklonální protilátka nebo její fragment vázající antigen. Výhodně se anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen váže na alfa4 řetězec VLA-4. Výhodně jsou anti-VLA—4 protilátkou nebo jejím fragmentem vázajícím antigen anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen specifické pro B epitop.

Výhodně je pacientem člověk.

-4CZ 302997 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1

Účinek neutralizačních protilátek na vytváření TRAP-pozitivních multinukleámích buněk podobných OC ve společných kulturách (ko-kulturách) buněk 5TGM1 a buněk kostní dřeně

Směs buněk 5TGM1 (le3) a buněk kostní dřeně (te6) v suspenzi byla vyseta na 48jamkové kultivační destičky a kultivována buďto bez, a nebo s přídavkem 10 pg/ml protilátky anti-VCAM-l (VCAM-1 Ab), protilátky anti-alfa4betal (α4β lAb), protilátky anti-ICAMl (ICAM-1 Ab) nebo IgG potkana jakožto kontrolní protilátky. Po ódenní kultivaci byly kultury fixovány a bylo stanovené množství multinukleámích buněk podobných OC pozitivních na TRAP (TRAP(+)MNC). jak protilátky VCAM-1 Ab, tak anti-alfa4betal inhibovaly vytváření buněk TRAP(+)MNC, zatímco protilátka ICAM-1 Ab byla bez účinku. Údaje jsou uvedeny jako průměrné hodnoty ± směrodatná odchylka (S.E.) pro n = 3. * označuje statisticky významný rozdíl ve srovnání s IgG kontrolou.

Obr. 2

Účinek 5TGM1 a ST2 kondiciovaného média na resorpci kosti v orgánové kultuře dlouhých kostí z fétu potkana

Kondiciovaná média (48 hodin) získaná ze samotné kultury ST2, samotné kultury 5TGM1 a společné kultury ST2 a 5TGM1 byla restována na kost resorbujíct aktivitu v orgánových kulturách dlouhých kostí z fétu potkana značených ⁴⁵Ca. Dlouhé kosti z fétu potkana značené ⁴⁵Ca byly kultivovány v přítomnosti kondiciovaného (40 % objem.) nebo kontrolního média po dobu 120 hodin. Hodnoty jsou uvedeny jako procenta zvýšení uvolňování kalcia ve srovnání s kontrolním médiem. Úvolňování z kondiciovaného média stromatických buněk ST2 je ukázáno jako prázdný (bílý) sloupec, uvolňování z kondiciovaného média 5TGM1 je znázorněno řídce šrafovaným sloupečkem. Uvolňování z kondiciovaného média ze společné kultury 5TGM1 a ST2 je znázorněno hustě šrafovaným sloupcem. Data jsou uvedena jako průměr ± S.E. (střední chyba) pro n = 4. * znamená statisticky významně odlišnou hodnotu od samotné ST2, ** znamená statisticky významně odlišnou hodnotu od samotné 5TGM1.

Obr. 3

Účinek rekombinantního rozpustného VCAM-1 (sVCAM-1) na produkci osteoklastogenní aktivity u buněk 5TGM1

Kondiciované médium bylo sklizeno z buněčných kultur 5TGMI v přítomnosti či absenci sVCAM-1 (1 x 10 ⁸ až 1 x 10 ⁷ mol/1) po 24 hodin. Osteoklastogenní aktivita těchto kondicionovaných médií byla testována na kulturách buněk z kostní dřeně myší. Buňky kostní dřeně (1 e6/jamka) byly naneseny na 48jamkové destičky a kultivovány v přítomnosti kondiciovaného média (šrafované sloupce) nebo kontrolního média (IMDM) obsahujícího stejnou koncentraci sVCAM-1 (prázdné sloupce). Po 6 dnech byly kultury fixovány a byl stanoven počet TRAPpozitivních mnohojademých buněk podobných OC (TRAP+MNC), Kondiciované médium z buněk 5TGM1 ošetřené 1 x 10^-7 M sVCAM-l zvýšilo tvorbu TRAP(+)MNC. Data jsou uvedena jako průměr± S.E. (střední chyba) pro n = 3. * znamená statisticky významně odlišnou hodnotu od kontroly.

Obr. 4

Účinek monoklonální protilátky (mAb) PS2 proti VLA-4 na zvýšení IgG2b v séru myši nesoucí 5TGM1

-5CZ 302997 B6

Myším bylo ínjikováno le5 buněk 5TGM1, aby osídlily kostní dřeň. Pak byly myši rozděleny do dvou skupin po třech, kdy první skupina sloužila jako kontrola a druhá skupina byla 8., 11., 14.,

17. a 20. den ošetřena 80 gg mAb PS/2 (přibližně 4 mg/kg). Týdně od 1. do 6. týdne byly měřeny hladiny IgG2b, isotypové protilátky produkované myelomovými buňkami 5TGML Ošetření protilátkami významně inhibovalo tvorbu lgG2b, což ukazuje na to, že došlo k inhibicí přežívání a růstu myelomových buněk in vivo.

Obr. 5

Účinek monoklonální protilátky (mAb) M/K-27 proti VCAM-1 na hladinu IgG2 v séru myši nesoucí 5 TG Ml

Myším byly injikovány buňky 5TGM1 stejně jak bylo popsáno u obr. 4, aby osídlily kostní dřeň. Pak byly myši rozděleny do skupin po čtyřech nebo pěti, kdy první skupina sloužila jako kontrola (prázdné čtverečky) a druhá/třetí skupina byla profylakticky ošetřena 80 gg (prázdné kosočtverečky) a 160 gg mAb (4 a 8 mg/kg) a čtvrtá skupina byla ošetřena terapeuticky 160 gg mAb (trojúhelníčky). Byly měřeny hladiny IgG2b, isotypové protilátky produkované myelomovými buňkami 5TGM1. Ošetření protilátkami významně inhibovalo tvorbu lgG2b, což ukazuje na to, žc došlo k inhibicí přežívání a růstu myelomových buněk in vivo.

Obr. 6

Účinek protilátky proti alfa4-integrinu přežívání myší nesoucích mnohočetných myelom

Předkládaný vynález se týká také léčení a prevence mnohočetného myelomu. Zvláště se týká použití antagonistů interakce mezi integrinem obsahujícím podjednotku alfa4 a ligandem tohoto integrinu pro léčení mnohočetného myelomu. Termín „mnohočetný myelom“ v tomto popisu označuje nemoc, kterou trpí jedinec s neoplázií plazmatických buněk, kdy neoplazický kmen je tvořen buňkami plazmatické buněčné řady, a sice v různém stadiu vývoje u různých pacientů (Mundy 1998).

Alfa4betal integrin je receptor, lokalizovaný na buněčném povrchu, pro VCAM-1, fíbronektin a možná i jiné molekuly, které se na něj váží nebo s ním jinak interagují. V tomto ohledu molekuly, které se váží na integrin obsahující podjednotku alfa4 nebo s ním jinak interagují, jsou obecně označovány „alfa4 ligandy“. Termín a4bl integrin (a také zaměnitelně užívaná označení VLA-4 nebo a4bl) označuje polypeptid, který je schopen vázat VCAM-1 a některé proteiny extracelulámí matrix, zejména fíbronektin, nebo jeho homology a fragmenty, ačkoliv odborníkovi je známo, že mohou existovat i jiné ligandy VLA-4 a lze je analyzovat konvenčními metodami.

Nicméně je známo, že podjednotka alfa4 asociuje kromě podjednotky betal ještě s jinými podjednotkami beta, takže termín „alfa4 integrin“ může být definován tak, že zahrnuje takové integriny, jejich podjednotka alfa4 asociuje s podjednotkou beta jednoho Či druhého typu. Dalším příkladem „alfa4 integrinu“ je alfa4beta7 (R. Lobb a M. Hemler, 1994). Termín „alfa4 integrin(y)“ užívaný v předkládaném popisu označuje tedy VLA-4 a také integriny, které obsahují podjednotku betal, beta7 nebo jakoukoliv jinou beta jednotku.

Antagonisté použití ve vynálezu nejsou nijak omezení na určitý typ nebo struktury molekuly, takže podle vynálezu lze užít jakékoliv činidlo, které je schopné vázat se na integrin obsahující podjednotku alfa4 jako je např. VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA^l a/nebo integrin alfa4beta7 na povrchu buněk nesoucích integrin alfa4beta7 (viz Lobb a Hemler, J. Clin. Invest. 94: 1722 až 1728, 1994) a/nebo případně na jejich ligandy jako je např. VCAM-1 nebo MadCAM na povrchu buněk nesoucích VCAM-1 a MadCAM, a které účinně blokuje nebo pokrývá VLA-4 (nebo alfa4beta7) nebo VCAM-1 (nebo MadCAM) (tj. „činidlo vázající alfa4

-6CZ 302997 Β6 integrin“ nebo „činidlo vázající ligand alfa4 integrinu“) a které je považováno za ekvivalent antagonistů použitých v příkladech.

Antagonista integrinu zahrnuje tedy jakoukoliv sloučeninu, která zabraňuje tomu, aby se alfa4 integriny navázaly s ligandy a/nebo receptory alfa4 integrinu. V tomto smyslu jsou užitečné protilátky proti integrinu nebo proteiny obsahující homology protilátek (diskutovány dále) a další molekuly jako např. rozpustné proteinové ligandy integrinu. K rozpustným formám proteinových tigandů alfa4 integrinu patří VCAM-1, kolagenové peptidy, fúzní proteiny sVCAM-1 nebo bifunkční fúzní protein nebo bifunkční fuzní proteiny VCAM-l/Ig. Tak např. může být podávána rozpustná forma ligandu pro alfa4 integrin nebo její fragment, aby vázala integrin a zejména kompetovala o vazebná místa pro integrin na povrchu buněk, což vede k podobnému účinku jako podání antagonisty jako je např. anti-alfa4 integrin (tj. protilátky alfa4beta7 kompetovala o vazebná místa pro integrin na povrchu buněk, což vede k podobnému účinku jako podání antagonisty jako je např. anti-alfa4 integrin (tj. protilátky alfa4beta7 nebo VLA-4). Zejména rozpustné mutanty alfa4 integrinu, které váží ligandy alfa4 integrinu, ale přitom nevyvolávají na integrinu závislou signalizaci, jsou předmětem předkládaného vynálezu. Takové mutanty působí jako kompetitivní inhibitory integrinových proteinů divokého typu a jsou tedy považovány za „antagonisty“. Další antagonisté použití ve vynálezu jsou „malé molekuly“ jak budou definovány dále.

Předkládaný vynález zahrnuje také činidla, která antagonizují působení více než jednoho alfa4 integrinu, jako je např. malá molekula nebo homolog protilátky, které jsou antagonisty několika alfa4 integrinu jako je např. VLA-4 a alfa4beta7 nebo jiné kombinace alfa4 integrinů. Vynález zahrnuje také použití kombinací různých molekul jako je např. kombinace antagonizující působení více než jednoho alfa4 integrinu, kdy se užívá několik malých molekul nebo homologů protilátek, které v kombinaci antagonizují alfa4 integriny VLA—4 a alfa4beta7 nebo jinou kombinaci integrinů.

Někteří antagonisté integrinů mohou být fúzováni nebo jiným způsobem konjugováni např. s homology protilátek jako je např. imunoglobulin nebo jeho fragment, a nejsou nijak omezeny určitou strukturou integrinu nebo jeho ligandu nebo jiné molekuly. Tudíž podle vynálezu je za ekvivalent antagonistů použitých v příkladech považováno jakékoliv činidlo schopné vytvářet fúzní protein (definován dále) a schopné vázat se na ligandy alfa4 integrinu a účinně blokovat nebo potáhnout alfa4beta7 integrin nebo VLA^L

Termín „antagonista interakce ligandu alfa4 integrinu/alfa4 integrinu“ podle vynálezu označuje činidlo, tj. polypeptid nebo jinou molekulu, které může inhibovat nebo blokovat alfa4 ligand (např. VCAM-1) a/nebo alfa4 integrin (např. alfa4beta7 nebo VLA-4) zprostředkovanou vazbu nebo jiným způsobem modulovat funkci alfa4 integrinu a/nebo alfa4 ligandu, např. inhibovat nebo blokovat signální transdukci alfa4 integrinu zprostředkovanou alfa4 ligandem nebo signální transdukci alfa4 ligandu zprostředkovanou alfa4 ligandem, a které je schopno účinně léčit mnohočetný myelom, výhodně stejným způsobem jako protilátky anti-alfa4 integrin.

Specificky antagonistou interakce VCAM-l/VLA-4 je činidlo, které má jednu nebo více z následujících vlastností:

1) potahuje nebo se váže na VLA—4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4 (např. myelomových buněk) s dostatečnou specificitou k tomu, aby došlo k inhibici interakce VLA-4 lígand/VLA—4, např. interakce VCAM-l/VLA-4 mezi buňkami stromatu kosti a myelomovými buňkami,

2) potahuje nebo se váže na VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4 (např. mye lomových buněk) s dostatečnou specificitou k tomu, aby došlo k modifikaci, výhodně inhibici, signální transdukce zprostředkované VLA-4, např. signální transdukce zprostředkované VLA4( VCAM-1,

-7CZ 302997 B6

3) potahuje nebo se váže na VLA-4-ligand (např. VCAM-1) na buňkách stromatu kosti s dostatečnou specifickou k tomu, aby došlo k inhibici interakce VCAM-1/VLA-4 a

4) potahuje nebo se váže na VLA—4-ligand (např. VCAM-1) na buňkách stromatu kosti s dostatečnou specifickou k tomu, aby došlo k modifikaci, výhodně inhibici, signální transdukce zprostředkované VLA—4, např. signální transdukce zprostředkované VLA-4/VCAM-1.

Ve výhodném provedení má antagonista jednu nebo obě vlastnosti z výše uvedených bodů 1 a 2.

V jiném výhodném provedení má antagonista jednu nebo obě vlastnosti z bodu 3 a 4. Kromě toho může být pacientovi podáván více než jeden antagonista, např. činidlo vázající VLA^t může být kombinováno s činidlem vázajícím VCAM-1.

Tak např. protilátky nebo homology protilátek (budou ještě popsány dále) jsou užitečné podle vynálezu, a také rozpustné formy přírodních vazebných pro VLA-4 a VCAM-1. Rozpustné formy přírodních vazebných proteinů pro VLA—4 zahrnují peptidy VCAM-1, fúzní proteiny s VCAM-1, bifunkční fúzní proteiny VCAM-I/Ig, fibronektin, fibronektin s alternativně sestřiženým spojovacím fragmentem jiného typu nežje typ III, a fibronektinové peptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci EILDV nebo podobnou konzervativně substituovanou aminokyselinovou sekvenci. Rozpustné formy přírodních vazebných proteinů pro VCAM-1 zahrnují peptidy VLA-4, fúzní proteiny s VLA—4, bifunkční fúzní proteiny VLA-4/Ig a další. Termíny „rozpustné peptidy VLA-4“ a „rozpustné peptidy VCAM-1“ označují polypeptidy, které nejsou schopny samy ukotvení v membráně. K takovým rozpustným polypeptidum patří např. polypeptidy VCAM-1 nebo VLA-4 postrádající dostatečnou část transmembránové domény k ukotvení polypeptidů nebojsou modifikovány tak, že transmembránová doména je nefunkční. Tato vazebná činidla působí tak, že kompetují s vazebnými proteiny na povrchu buněk pro VLA-4 nebo jiným způsobem mění funkci VLA-4. Např. rozpustná forma VCAM-1 (viz Osbom et al., 1989, Cell 59: 1203 až 1211) nebo její fragment se mohou podávat, aby vázaly VLA-4 a výhodně kompetovaly o VLA^t vazebné místo na myelomových buňkách, což vede k účinku podobnému podávání antagonistů jako jsou malé molekuly nebo protilátky VLA-4.

V jiném příkladu je VCAM-1 nebo jeho fragment, schopná vázat se na VLA-4 na povrchu myelomových buněk nesoucích VLA-4, např. tedy fragment dvě N-koncové domény VCAM-1 může být fúzován s druhým peptidem, např. s peptidem, který zvyšuje rozpustnost nebo in vivo poločas části VCAM-1 fúzního peptidu. Druhý peptid může být fragment rozpustného peptidu, výhodně lidského peptidu, nej výhodněji plazmatického proteinu, nebo člen superrodiny imunoglobulinů. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je druhý peptid IgG nebo jeho část nebo fragment, např. konstantní úsek těžkého řetězce lidského IgG, a obsahuje alespoň kloubový úsek, a CH2 a CH3 domény.

Dalšími antagonisty užitečnými podle vynálezu (bez omezení) jsou činidla, která napodobují působení peptidů (tj. jsou to organické molekuly nazývané „malé molekuly“) a jsou schopná narušit interakci alfa4 integrinu/alfa4 ligand např. blokováním VLA-4 vazbou na VLA-4 receptory na povrchu buněk nebo blokováním VCAM-1 vazbou na VCAM-1 receptory na povrchu buněk. Tyto „malé molekuly“ jsou samotné malé peptidy nebojsou to větší organické sloučeniny obsahující peptid nebo jsou organické sloučeniny jiné než peptidy. Termín „malá molekula“ v předkládaném popisu nezahrnuje protilátku nebo homolog protilátky. Ačkoliv molekulová hmotnost „malých molekul“ je obvykle menší než 2000, tato hodnota ve vynálezu nepředstavuje žádný horní limit molekulové hmotnosti malých molekul.

Tak např. mohou být užity malé molekuly jako jsou oligosacharidy, které napodobují vazebnou doménu ligandu VLA-4 a „pasují“ k receptorové doméně VLA-4 (viz J.J. Devlin et al„ Science 249: 400 až 406, 1990, J.K. Scott, G.P, Smith, Science 249; 386 až 390, 1990 a patent US 4 833 092 (Geysen), které jsou vloženy formou odkazu). Také mohou být užity malé molekuly, které napodobují vazebnou doménu ligandu VCAM-1 a „pasují“ k receptorové doméně VCAM-1.

-8CZ 302997 B6

Příklady dalších molekul užitečných podle vynálezu lze najít v publikaci Komoriya et ak, („The Minimal Essential Sequence for Major Cell type-Specific Adhesion Site (CS1) within the Alternatively Spliced type III Connecting Segment Domain of Fibronectín is Leucine - Aspartic Acid - Val i ne“, J. Biol. Chem. 266/23): 15075 až 79, 1981). Byla identifikována minimální aktivní aminokyselinová sekvence nezbytná k vazbě VLA-4 a na základě aminokyselinové sekvence úseku CS-1 (vazebná doména VLA^t) byla syntetizována řada překrývajících se peptidů z určitého druhu fibronektinu. Byl identifikován peptid obsahující 8 aminokyselin, Glu-Ile-LeuAsp-Val-Pro-Ser-Thr a také dva menší překrývající se pentapeptidy GIu-lte-Leu-Asp-Val a Leu-Asp-Val-Pro-Ser, které mají inhibiční vlastnosti vzhledem k buněčné adhezi závislé na fibronektinu. Později bylo ukázáno, že určité větší peptidy obsahující sekvenci LDV byly aktivní in vivo (T.A. Ferguson, „Two Integrin Binding Peptides Abrogate Τ-Cell Mediated lmmune Response in vivo“, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8072 až 76, 1991, S.M. Wahl et ak, „Synthetic Fibronectín Peptides Supress Arthritis in Rats by ínterrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment“, J. Clin. Invest. 94: 655 až 62, 1994). Byl také popsán cyklický pentapeptid Arg-CysAsp-TPro-Cys (kde TPro je thíoprolin), který inhibuje adhezi jak VLA-4 tak VLA-5 k fibronektinu (viz např. D.M. Nowlin et ak, „A Novel cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Betal Integrin Mediated Cell Adhesion“, J. Biol. Chem. 268 (27): 20352 až 59, 1993 a mezinárodní patentová přihláška PCT/US91/04862). Tento pentapeptid byl založen na sekvenci tripeptidu Arg-Gly-Asp z FN, který je znám jako obecný motiv v rozpoznávacím místu pro několik proteinů z extracelulární matrix.

Příklady dalších malých molekul inhibujících VLA-4 byly popsány např. v Adams et ak, „Cell Adhesion Inhibitors“, PCT/US97/13013, kde jsou popsány lineární peptidylové sloučeniny obsahující beta aminokyseliny s inhibiční aktivitou pro buněčnou adhezi. Mezinárodní patentové přihlášky WO 94/15 958 a WO 92/00 995 popsaly cyklický peptid a peptidomimetické sloučeniny, které mají inhibiční aktivitu pro buněčnou adhezi. Mezinárodní patentové přihlášky WO 93/08 823 a WO 92/08 464 popsaly sloučeniny inhibující buněčnou adhezi, které obsahují guanidinyt, močovinu nebo thiomočovinu. Patent US 5 260 277 popsal guanidylovou sloučeninu modulující buněčnou adhezi.

Malé molekuly působící jako mimetická činidla mohou být připraveny tak, že se syntetizuje mnoho peptidů, semipeptidových sloučenin nebo organických sloučenin jiné než peptidové povahy, a pak se provede screening těchto sloučenin na jejich schopnost inhibovat interakci alfa4 integrin/ligand alfa4 integrinu. Obecně viz patent US 4 833 092, Scottand Smith, „Searching for peptide Ligands with an Epitope Libraiy“, Science 249, 386 až 90, 1990, a Devlin et ak, Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules, Science 249: 4040 až 7, 1990).

V jiném výhodném provedení je činidlo použité podle vynálezu, aby vázalo, blokovalo nebo potáhlo, alfa4 integrin a/nebo ligand alfa4 integrinu monoklonální protilátka anti-VLA-4 a/nebo anti-alfa4beta7 nebo její homolog. Výhodné protilátky a jejich homology, vhodné k léčení, zejména k léčení lidí, jsou analogy lidských protilátek, homology humanizovaných protilátek, homology chimérických protilátek, Fab, Fab’, F(ab’)2 a F(v) fragmenty protilátek a monomery nebo dimery lehkých a těžkých řetězců protilátek nebo jejich směsi. Monoklonální protilátky proti VLA—4 jsou výhodná vazebná činidla podle vynálezu.

Termín „homolog protilátky“ podle vynálezu zahrnuje intaktní protilátky složené z těžkého řetězce a lehkého řetězce imunoglobulinu, kteréjsou spojeny disulfídickými vazbami. Termín „homolog protilátky“ zahrnuje také proteiny obsahující jeden nebo více polypeptidů vybraných ze skupiny obsahující lehké řetězce imunoglobulinu, těžké řetězce imunoglobulinu a jejich fragmenty vázající antigen, kteréjsou schopné vázat jeden nebo více antigenů. Složené polypeptidy homologů protilátky obsahující více než jeden polypeptid jsou případně vázány disulfídickými vazbami nebo kovalentně zesítěný.

-9CZ 302997 B6

Tudíž k „homologům protilátky“ patří intaktní imunoglobulin typů IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (včetně jejich subtypů), kde jsou lehké imunoglobulinové řetězce typu kappa nebo lambda.

K „homologům protilátky“ patří i části intaktních protilátek, které si uchovávají vazebnou speci5 fitu pro antigen, např. fragmenty Fab, Fab’, F(ab’)2 a F(v), dále monomery nebo dimery těžkého řetězce, monomery nebo dimery lehkého řetězce, dimeiy složené z jednoho těžkého řetězce a jednoho lehkého řetězce apod. Takže podle vynálezu jsou užitečné fragmenty vázající antigen stejně tak jako dimemí nebo trimemí polypeptidy plné délky odvozené z výše popsaných protilátek.

to

Termín „homo log humanizované protilátky“ označuje homo log protilátky připravené technologií rekombinantní DNA, kde buďto jen některé, nebo všechny aminokyseliny, které nejsou nezbytné pro vazbu antigenů, z těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu savce jiného než člověk byly nahrazeny odpovídajícími aminokyselinami těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobu15 linu.

Termín „homolog humanizované protilátky“ označuje homolog protilátky připravené technologií rekombinantní DNA, kde buďto celá, nebo část kloubové oblasti a konstantních úseků těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu nebo obou řetězců byly nahrazeny odpovídajícími úseky těžkého nebo lehkého řetězce jiného imunoglobulinu.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je varianta chimérické molekuly, která obsahuje: 1) VLA-4 zaměřovači část, např. část VCAM-1 schopnou vázat se na antigen (tj. VLA-4) na povrchu myelomové buňky nesoucí VLA-4 a 2) případně druhý peptid, např. takový, který zvy25 suje rozpustnost nebo biologický poločas in vivo, např. člen superrodiny imunoglobulinů nebo jeho fragment, např. část nebo fragment imunoglobulinu G, např. konstantní úsek těžkého řetězce lidského IgGl, např. kloubové úseky CH2 a CH3, a dále toxinovou část. VLA—4 zaměřovači část je přirozeně se vyskytující VLA-4 ligand nebo jeho fragment, např. peptid VCAM-1 nebo podobná konzervativně substituovaná sekvence aminokyselin. Výhodná zaměřovači část je roz30 pustný fragment VCAM-1, např. N-koncové domény 1 a 2 molekuly VCAM-1. Chimérická molekula může být užita k léčení subjektu, např. člověka, u něhož je riziko nemoci, např. mnohočetného myelomu, charakterizované přítomností myelomových buněk nesoucích VLA-4 a výhodně VLA-4.

Termín „homolog lidské protilátky“ je homolog protilátky připravený technologií rekombinantní DNA, kde všechny aminokyseliny těžkého řetězce i lehkého řetězce imunoglobulinu pocházejí z lidského zdroje.

Způsoby přípravy homologů protilátky anti-VLA-4

Techniky přípravy homologů monoklonálních protilátek jsou odborníkům dobře známy. Stručně shrnuto, nesmrtelná buněčná linie (typicky myelomové buňky) jsou fúzovány s lymfocyty (typicky splenocyty) ze savce imunizovaného celými buňkami exprimuj ícími daný antigen, např. VLA-4, a supematant z kultury výsledných hybridomových buněk se pak testuje na přítomnost protilátek proti antigenů. Viz Kohler et al., 1975, Nátuře 265: 295 až 297.

Imunizace se provádí standardním postupem. Jednotkové dávky a imunizační režim jsou závislé na druhu imunizovaného savce, jeho imunitním stavu, tělesné hmotnosti apod. Typicky se imunizovanému savci odebere krev a sérum z každého krevního vzorku se testuje pomocí příslušného testu na přítomnost určitých protilátek. Tak např. protilátky anti-VLA-4 mohou být identifikovány pomocí imunoprecipitace ¹²⁵I-značených buněčných lyzátů buněk exprimuj ících VLA-4 (viz např. Sanchez-Madrid et al., 1996, Eur. J. Immunol. 16: 1343 až 1349, Hemler et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 11478 až 11485). Protilátky antt-VLA—4 mohou být identifikovány také pomocí průtokové cytometrie, např. měřením fluorescenčního barvení Kámošových buněk inku55 bovaných s protilátkou, která rozpoznává VLA-4 (Elices et al., 1990, Cell 60: 577 až 584). Lym- 10CZ 302997 B6 focyty použité pro přípravu hybridomových buněk se typicky izolují z imunizovaných savců, jejichž sérum bylo v testu na přítomnost protilátek anti-VLA-4 pozitivní.

Typicky nesmrtelná buněčná linie (např. myelomové buňky) pocházejí ze stejného druhu savce jako lymfocyty. Výhodné nesmrtelné buněčné linie jsou myší myelomové buněčné linie, které jsou citlivé na kulturní médium obsahující hypoxatin, aminopterin a thymidin (médium „HAT“). HAT-senzitivní myší myelomové buňky jsou fúzovány s myšími splenocyty pomocí polyethylenglykolu s molekulovou hmotností 1500 (PEG 1500). Vzniklé hybridomové buňky jsou pak selektovány pomocí média HAT, které usmrtí nefúzované a nebo neproduktivně fúzované io buňky (nefúzované splenocyty odumřou po několika dnech, protože nejsou transformované). Hybridomy produkující požadovanou protilátku se detekují pomocí testu supernatantu z kultury buněk. Tak např. hybridomy připravené, aby produkovaly protilátky anti-VLA-4 se podrobí screeningu, kdy se testuje supematant z hybridomové kultury na přítomnost secemovaných protilátek, které mají schopnost vázat se na rekombinantní buněčnou linii exprimující alfa4 podjed15 notku (viz např. Elices, výše).

Pro přípravu homologů protilátek anti-VLA—4, které jsou intaktní imunoglobuliny, se hybridomové buňky, které byly ve výše popsaných testech pozitivní, kultivují v živném médiu v takových podmínkách a po takovou dobu, které jsou dostatečné k tomu. aby hybridomové buňky secernovaly monoklonální protilátky do média. Techniky tkáňových kultur a živná média vhodná pro hybridomové buňky jsou známy. Kondicionovaný supematant z hybridomové kultury se odebere a požadované protilátky anti-VLA—4 se mohou dále purifikovat známými metodami, pokud je to potřeba.

Alternativně se požadované protilátky produkují injekcí hybridomových buněk do peritoneální dutiny myši premedikované přistáném. Hybridomové buňky pak proliferují v peritoneální dutině a secemují protilátky, které se akumulují v ascitu. Protilátky se pak izolují odebráním tekutiny z ascitu pomocí injekční stříkačky.

Několik myších monoklonálních protilátek anti-VLA-4 bylo již dříve popsáno (viz např. Sanchez-Madrid et al., 1986, Hemler et al, 1987, Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem. 266(16): 10241 až 10245). Tyto monoklonální protilátky anti-VLA-4 jako je např. HP 1/2 a další (např. HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9) schopné rozpoznávat P řetězec VLA—4 jsou užitečné podle vynálezu. Výhodné jsou takové protilátky anti-VLA—4, které rozpoznávají alfa4 epitop VLA—4, který se účastní vazby k ligandům VCAM-1 a fibronektinu (tj. protilátky, které se mohou vázat na VLA-4 v místě podílejícím se na rozpoznání ligandu a tudíž blokovat vazbu VCAM-1 a fibronektinu). Takové protilátky byly definovány jako protilátky specifické pro epitop B (Bl nebo B2) (Pulido et al., 1991, viz výše) a jsou také anti-VLA-4 protilátkami ve smyslu předkládaného vynálezu.

Homology plně lidských protilátek proti VLA-4 jsou dalším výhodným činidlem podle vynálezu, které blokuje nebo potahuje VLA-4 antigeny. Takové protilátky v jejich intaktní formě mohou být připraveny z lidských splenocytů stimulovaných in vitro, jako popsali Boemer et al., 1991, J. Immunol. 147: 86 až 95. Alternativně mohou být připraveny repertoárovým klonováním jak popsali Persson et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 2432 až 2436 nebo Huang a Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227 až 236 a patent US 5 798 230 (25. srpen 1998, „Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use“) pro přípravu lidských monoklonálních protilátek z lidských B buněk. Tímto postupem se lidské B buňky produkující protilátku imortalizující tak, že se infikují virem Epstein-Barrové nebo jeho derivátem, který exprímuje

EBV jaderný antigen 2 (EBNA2). Funkce EBNA2, která je nutná pro imortalizaci, je poté vyřazena z činnosti, což vede ke zvýšení tvorby protilátek.

V další metodě produkce plně lidských protilátek (patent US 5 789 650 ze 4. srpna 1998 „Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies“) je popsáno použití transgenních zvířat s výjimkou člověka schopných produkovat heterologní protilátky a transgen- 11 CZ 302997 B6 nich zvířat, která mají inaktivované endogenní imunolgobulinové geny. Endogenní imunolgobulinové geny jsou potlačeny užitím antisense oligonukleotidů a/nebo antísérem namířený proti endogenním imunoglobulinům. Heterologní protilátky jsou kódovány imunoglobulinovými geny, které se normálně v genomu daného biologického druhu nevyskytují. Jeden nebo více transgenů obsahujících sekvence těžkého řetězce heterologního lidského imunoglobulinu, které jsou v původním uspořádání, se vnesou do zvířete jiného než člověka, čímž se vytvoří transgenní zvíře schopné funkčně přeorganizovat transgenní imunoglobulínové sekvence a produkovat tak repertoár protilátek různých isotypů, které jsou kódovány lidskými imunoglobulinovými geny. Takové heterologní lidské protilátky jsou produkovány B buňkami, které jsou potom imortal izovány, např. fúzí s imortalizovanou buněčnou linií jako je např myelom, nebo úpravou těchto B-buněk jiným postupem, aby poskytly permanentní buněčnou linii produkující homology monoklonální heterologní plně lidské protilátky.

Velké neimunizované knihovny užívající fágové expozice mohou být užity pro izolaci protilátek s vysokou afinitou, které mohou pak dále být zpracovány jako léky konvenční technikou s využitím fágů (Vaughan et al., 1996).

Další výhodné vazebné činidlo, které může blokovat nebo potahovat VLA-4 antigeny podle vynálezu je homolog humanizované rekombinantní protilátky mající specifitu anti-VLA-4. Po původních metodách přípravy chimérických protilátek byl popsán nový způsob v dokumentu EP 0 239 400 (Winter et al.), kde byly protilátky změněny substitucí jejich původních komplementaritu určujících úseků (CDR) úseky z jiného biologického druhu. Tento způsob je možné použít např. k nahrazení CDR z domén variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce lidského lg alternativními CDR z domén variabilních úseků Ig myší. Tyto alterované variabilní úseky Ig pak mohou být kombinovány s konstantními úseky lidského Ig, čímž se vytvoří protilátky, které jsou svým složením plně lidské, až na substituované myší CDR. Lze předpokládat, že takové substituované protilátky budou s mnohem menší pravděpodobností vyvolávat imunitní reakci u lidí ve srovnání např. s chimérickými protilátkami, neboť CDR-substituované protilátky obsahují významně méně složek, které nejsou lidského původu. Proces „humanizace“ protilátek metodou tzv, „roubování“ CDR byl nazván „přetvařování“ protilátek (Riechmann et ab, 1988, Nátuře 332, 323 až 327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534 až 1536).

Typicky se komplementaritu určující úseky (CDR) z myší protilátky transplantují do odpovídajících úseků lidské protilátky, neboť jsou to právě CDR (tri v těžkých řetězcích a tři v lehkých řetězcích protilátky) úseky, které se v myší protilátce váží na specifický antigen. Transplantace CDR se provede metodami genového inženýrství, kdy se sekvence cDNA pro CDR určí klonováním genových segmentů pro variabilní úseky (V) lehkého a těžkého řetězce a pak se přenesou do odpovídajících úseků místně cílenou mutagenezi. V poslední fázi tohoto postupu se segmenty genu lidského konstantního úseku požadovaného isotypu (obvykle gama I pro CH a kappa pro CL) přidají a geny pro humanizované lehké a těžké řetězce se společně exprimují (ko-exprimují) v savčích buňkách a produkují rozpustné humanizované protilátky.

Přesun těchto CDR do lidských protilátek dává lidským protilátkám antigenně-vazebné vlastnosti původní myší protilátky. Šest úseků CDR z myší protilátky je vneseno do „rámcového“ úseku V. Důvod úspěšného roubování CDR je ten, že rámcové úseky myších a lidských protilátek mají velmi podobnou 3-D strukturu s podobnými body navázání CDR, takže CDR se mohou zaměňovat. Takové homology humanizovaných protilátek se mohou připravovat postupy, které např. popsali Jones et ab, 1986, Nátuře 321, 522 až 525; Riechmann, 1988, Nátuře 332, 323 až 327; Queen et al., 1989, Proč. Natb Acad. Sci. USA 86, 10029; a Orlandi et ab, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86,3833.

Avšak má se za to, že některé aminokyseliny v rámcové oblasti protilátky interagují s CDR a ovlivňují celkovou vazebnou schopnost protilátky. Přímý přenos CDR z myší protilátky na rekombinantní lidskou protilátku bez jakékoliv modifikace lidského rámcového V úseku často

- 12CZ 302997 B6 vede k částečné nebo úplné ztrátě vazebné afinity. V mnoha případech je zřejmě kritická záměna zbytků v rámcovém úseku akceptorové protilátky, aby bylo dosaženo vazebné aktivity.

V dokumentech Queen et al., (1989, viz výše) a WO 90/07 861 (Protein Design Labs) byla pop5 sána příprava humanizovaných protilátek, které obsahují modifikovaná rezidua v rámcové oblasti akceptorové protilátky tím, že byly kombinovány CDR z myší monoklonální protilátky (MAb) anti-Tac s rámcovým a konstantním úsekem lidského imunoglobulinu. Takto bylo tedy ukázáno jedno řešení problému ztráty vazebné afinity, která je Často důsledkem přímého přenosu CDR, aniž by byly modifikovány zbytky lidské V rámcové oblasti. Toto řešení obsahuje dva rozhodujíio cí kroky: první je výběr lidské V rámcové oblasti pomocí počítačové analýzy pro optimální homologii proteinových sekvencí s V rámcovou oblastí původní myší protilátky, v daném případě anti-Tac MAb. V druhém kroku je modelována terciární struktura myšího V úseku pomocí počítačového programu, aby bylo možné vizualizovat aminokyselinové zbytky v rámcové oblasti, které pravděpodobně interagují s myšími CDR a tyto aminokyselinové zbytky jsou pak přeneseny na homologní lidský rámcový úsek (viz také patent US 5 693 762, Protein Design Labs).

Je možné užít také jiný přístup (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266271) a využít jako standard úseky V rámce odvozené z NEWM a REl těžkého a lehkého řetězce pro roubování CDR bez radikálního vnášení aminokyselinových zbytků myši. Výhodou výše zmíněného postupu podle Tempest et al., pri konstrukci humanizovaných protilátek založených na NEWM a RE1 je to, že 3D struktury variabilních úseků NEWM a REI jsou známy ze zkoumání rentgenovou krystalografií a tudíž lze modelovat specifické interakce mezi CDR a aminokyselinovými zbytky

V rámcového úseku.

Bez ohledu na způsob přípravy, příklady počátečních homologů humanizovaných protilátek ukazují, že to není jednoduchý proces. I když je uznáváno, že změny v rámcovém úseku jsou nutné, není možné na základě dosavadního stavu techniky předpovědět, které aminokyselinové zbytky bude třeba změnit, aby se získala funkční humanizovaná rekombinantní protilátka s požadovanou specifitou. Dosavadní výsledky ukazují, že změny nutné k uchování specifity a/nebo afinity jsou z větší části jedinečné pro danou protilátku a nelze je předpovědět na základě humanizace jiné protilátky.

K výhodným antagonistům užitečným podle vynálezu patří homology chimérické rekombinantní a humanizované protilátky (tj. intaktní imunoglobuliny a jejich části) se specifitou k B epitopu, které byly připraveny způsobem popsaným v současně projednávané přihlášce vynálezu US 08/004 798, podané 7. ledna 1993, publikované jako PCT/US94/00266) - WO 94/16 094. Výchozím materiálem pro přípravu homologů chimérické (myší V - lidský C) protilátky a humanizované protilátky anti-VLA-1 je myší monoklonální protilátka anti-VLA-4, která je komerčně dostupná (např. protilátka HP2/1, Amae International, lne., Westbrook, Maine) nebo monoklo40 nální protilátka anti-VLA-4 připravená postupem podle předkládaného vynálezu. Tak např. variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce anti-VLA-4 protilátky HP 1/2 byly klonovány, sekvencovány a exprimovány v kombinaci s konstantními úseky těžkého a lehkého řetězce lidského imunoglobulinu. Takové protilátky HP 1/2 jsou specifitou a účinkem podobné myší protilátce HP 1/2 a lze je využít jako léčiva podle vynálezu.

Další výhodné homology humanizované protilátky byly popsány v přihlášce PCT/US 95/01219 WO 95/19 790 (podané 27. července 1995, Athéna Neuroseiences, lne.). Tyto humanizované protilátky anti-VLA-4 obsahují humanizovaný lehký řetězec a humanizovaný těžký řetězec. Humanizovaný lehký řetězec obsahuje tři komplementaritu určující úseky (CDR1, CDR2 aCDR3) mající aminokyselinovou sekvenci zodpovídajících komplementaritu určujících úseků myšího 21.6 imunoglobulinového lehkého řetězce a sekvenci rámce variabilního úseku ze sekvence rámce variabilního úseku lidského lehkého řetězce kappa s výjimkou, že alespoň v jedné pozici je aminokyselinová pozice obsazena stejnou aminokyselinou jaká je přítomna v ekvivalentní pozici rámce variabilního úseku lehkého řetězce myšího imunolgobulinu 21,6. Humanizo55 váný těžký řetězec obsahuje tři komplementaritu určující úseky (CDR1, CDR2 aCDR3) mající

- 13CZ 302997 Β6 aminokyselinovou sekvenci zodpovídajících komplementaritu určujících úseků myšího 21.6 imunoglobulinového těžkého řetězce a sekvenci rámce variabilního úseku z rámce variabilního úseku lidského těžkého řetězce s výjimkou, že alespoň v jedné pozici je aminokyselinová pozice obsazená stejnou aminokyselinou jaká je přítomna v ekvivalentní pozici rámce variabilního úseku lehkého řetězce myšího imunoglobulinu 21.6.

Terapeutické přípravky

Přípravky podle vynálezu, tj. VLA-4 vazebná činidla, zejména homology fúze VCAM-1 a antiVLA-4 protilátky, jsou výhodně podávány parenterálně.

Termín „parenterálně“ podle vynálezu znamená podávání subkutánní, intravenózní, intramuskulární, intra-artikulámí, intrasynoviální, intrastemální, intrathekálni, intrahepatickou, intrakraniální injekcí nebo infúzí nebo podávání přímo do léze.

VLA^4 vazebná činidla podle vynálezu jsou výhodně podávány jako sterilní farmaceutické přípravky obsahující farmaceuticky přijatelný nosič, což může být jakýkoliv z mnoha v oboru známých nosičů jako je např. voda, solný roztok, pufrovaný solný roztok, dextróza, glycerol, ethanol apod. nebo směsi těchto látek. Sloučeniny podle vynálezu mohou být ve formě farmaceuticky přijatelných solí organických nebo anorganických kyselin a bází. K takovým solím patří např. acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzensulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, kamforát, kamforsulfonát, cyklopentanpropionát, diglukonát, dodecyslulfát, ethansulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerolfosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyethansulfonát, laktát, maleát, methansulfonát, 2-naftalensulfonát, nikotinát, oxalát, palmoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartarát, thiokyanát, tosylát a undekanoát. K bazickým solím patří soli amonia, soli alkalických kovů jako jsou sodné a draselné soli, soli kovů alkalických zemin jako jsou soli vápníku a hořčíku, soli s organickými bázemi, jako jsou např. dicyklohexylaminové, N-methyl-D-glukaiminové a tris(hydroxymethyl)methylaminové soli a soli s aminokyselinami jako jsou arginin, lysin atd. Také bazické skupiny obsahující dusík mohou být kvarterizovány činidly, např. hal idy nižších alkylů jako jsou methyl-, ethyl-, propyl- butylchloridy, bromidy ajodidy; dialkyslulfáty jako jsou dimethyl-diethyl-dibutyl- a diamyl sul fáty, halidy s dlouhým řetězcem jako jsou decyl-, laurylmyristyl- a stearylchloridy, -bromidy a -jodidy, aralkylhalidy jako jsou benzyl- a fenethylbromidy a další. Takto se získají produkty, které jsou rozpustné nebo dispergovatelné ve vodě nebo v oleji.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují jakoukoliv sloučeninu podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelný derivát, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem. Termín „nosič“ podle vynálezu zahrnuje také přijatelná adjuvans a vehikula. K farmaceuticky přijatelným nosičům, které lze využít v předkládaném vynálezu patří (aniž by však tento výčet byl omezující): iontoměniěe, oxid hlinitý, aluminiurnstearát, lecitin, sérové proteiny jako je lidský sérový albumin, pufrované sloučeniny jako jsou fosfáty, glycin, kyselina sorbová, sorbát draselný, směsi parciálních glyceridů rostlinných saturovaných mastných kyselin, voda, soli nebo elektrolyty jako je např. protaminsulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, soli zinku, koloidní oxid křemičitý, křemičitan hořečnatý, polyvinylpyrrolidon, látky odvozené z celulózy, polyethylenglykol, sodná sůl karboxymethylcelulózy, polyakryláty, vosky, blokové polymery polyethylen-polyoxypropylenu, polyethylenglykol a tuky z ovčí vlny.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být ve formě sterilního injikovatelného přípravku, např. sterilní injikovatelné suspenze ve vodě nebo voleji. Taková suspenze je formulována obvyklými technikami, které jsou odborníkovi známé, pomocí vhodných disperguj ících, suspendujících a zvlhčovačích činidel. Sterilní injikovatelné přípravky mohou být také sterilní injikovatelné roztoky nebo suspenze v netoxických parenterálně přijatelných rozpouštědlech nebo ředidlech, např. jako roztok v 1,3-butandiolu. Jako přijatelná vehikula a rozpouštědla se mohou užít také voda, Ringerův roztok a isotonický roztok chloridu sodného. Kromě toho sterilní upravené

- 14CZ 302997 B6 oleje se užívají obvykle jako rozpouštědla nebo suspendační médium. Pro tento účel může být užit jakýkoliv nedráždivý upravený olej včetně syntetických mono- nebo diglyceridů. Mastné kyseliny, jako je kyselina olejová, a její glyceridové deriváty jsou užitečné pro přípravu injikovatelných přípravků, stejně tak jako přírodní farmaceuticky přijatelné oleje jako je olivový olej, ricinový olej, obzvláště jejich polyoxyethylované verze. Tyto olejové roztoky nebo suspenze mohou také obsahovat alkoholové ředidlo nebo dispergující činidlo s dlouhým řetězcem, například podle Ph. Helv. (Švýcarského lékopisu) nebo podobný alkohol.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu, zejména antagonistické malé molekuly interakce VLA-4/VCAM-1, mohou být podávány parenterálně nebo perorálně. Jestliže jsou podávány perorálně, mohou být podávány v každé perorálně přijatelné dávkové formě včetně, a bez omezení, tobolek, tablet, vodných suspenzí nebo roztoků. V případě tablet pro perorální použití obvykle používané nosiče zahrnují laktózu a kukuřičný škrob. Jsou také typicky přidávány lubrikanty, jako například stearát hořečnatý. Po perorální podávání ve formě tobolek zahrnují použitelná ředidla laktózu a usušený kukuřičný škrob. Když je pro perorální použití vyžadována vodná suspenze, aktivní složka je spojena s emulgátory a suspendujícími činidly. Je-li žádoucí, mohou být také přidány určitá sladidla, příchutě nebo barviva. Mohou být také použity topické transdermální náplasti. Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být také podávány nazálním aerosolem nebo inhalací s použitím nebulizéru, inhalátoru suchého prášku nebo inhalátoru s měřenými dávkami. Tyto přípravky jsou připraveny podle technik dobře známých v oboru farmaceutických formulací a mohou být připraveny jako roztoky ve fyziologickém roztoku, používat benzylalkohol nebo další vhodné konzervační prostředky, činidla podporující absorpci pro zvýšení biologické dostupnosti, fluorované uhlovodíky a/nebo další obvyklá solubilizační nebo dispergující činidla.

Podle dalšího provedení přípravky obsahující sloučeninu podle tohoto vynálezu mohou také obsahovat další činidlo vybrané ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, protizánětlivá činidla, imunosupresiva, antimetabolity a imunomodulátory. Specifické sloučeniny v každé z těchto skupin mohou být vybrány z jakýchkoliv sloučenin uvedených v příslušném záhlaví v „Comprehensive Medicinal Chemistry“ (Pergamon Press, Oxford, England, ss. 970 až 986, 1990), jejichž popis je zahrnut formou odkazu. V této skupině jsou také zahrnuty sloučeniny, jako například theofylin, sulfasalazin a aminosalicyláty (protizánětlivé látky); cyklosporin, FK-506, a rapamycin (imunosupresiva); cyklofosfamid a metotrexát (antimetabolity); steroidy (inhalační, perorální nebo topické) a interferony (imunomodulátory).

Množství aktivní složky, které může být spojeno s materiálem nosiče, aby vznikla jednotková léková forma, závisí na léčeném hostiteli a konkrétním způsobu podávání. Ale je nutné rozumět, že specifické dávkování a léčebný režim pro každého konkrétního pacienta závisí na celé řadě faktorů, včetně aktivity specifické použité sloučeniny, věku, tělesné hmotnosti, obecném zdraví, pohlaví, dietě, času podávání, rychlosti vylučování, kombinaci léků a úsudku ošetřujícího lékaře a vážnosti konkrétní léčené nemoci. Množství aktivní složky může také záviset na eventuálním terapeutickém nebo profylaktickém přípravku, se kterým je složka podávána společně.

Dávkování a dávkovači režim sloučenin podle tohoto vynálezu účinný pro prevenci, supresi nebo inhibici buněčné adheze závisí na celé řadě faktorů, jako je povaha inhibitoru, velikost pacienta, cíl léčby, povaha léčené patologie, specifickém použitém farmaceutickém přípravku a úsudku ošetřujícího lékaře. Hladina dávek mezi přibližně 0,001 a přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně, výhodně mezi přibližně 0,1 a přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti denně aktivní složky sloučeniny jsou použitelné. Nejvýhodněji, VLA-4 vázající činidlo, když jde o protilátku nebo její derivát, je podáváno v dávce 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti/den až 20 mg/kg tělesné hmotnosti/den, výhodně 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti/den v intervalech 1 až 14 dnů. V případě činidel, která jsou malé molekuly nebo jsou jiné povahy než protilátky, dávky jsou molámími ekvivalenty dávek protilátek. Výhodně je protilátkový přípravek podáván v množství, které poskytuje účinnou hladinu protilátky v plazmě alespoň l mg/ml. Optimalizaci dávek lze určit na

- 15CZ 302997 B6 základě podávání vazebného činidla a následného vyhodnocení potažení buněk pozitivních na

VLA—4 činidlem v průběhu času po podání dané dávky in vivo.

Myelomové buňky obsažené ve vzorku periferní krve odebrané pacientovi (nebo vzorku kostní dřeně) je třeba testovat na přítomnost činidla in vitro (nebo ex vivo) pomocí druhého činidla, kterým se detekuje podávané činidlo. To může být např. fluorochromem značená protilátka specifická pro podávané činidlo, která se pak stanovuje standardním postupem užitím průtokové cytometrie FACS („fluorescence activated cell sorter“). Alternativně přítomnost podávaného činidla může být detekována in vitro (nebo ex vivo) pomocí neschopností nebo sníženou schopností jednotlivých buněk vázat stejné činidlo, které bylo samo označeno (např. fluorochromem). Výhodné dávkování by mělo vést k detekovatelnému potažení převážné většiny buněk pozitivních na VLA-4. Výhodně by toto potažení mělo přetrvávat v případě homologu protilátky 1 až 14 dnů.

Zvířecí modely

Zvířecí modely byly podrobně popsány v práci Garretta 1997. Stručně shrnuto, Radí et al. (1988) popsali myší model myelomu, který vzniká spontánně u stárnoucích myší CS7BL/KaLwRij. Tato nemoc vzniká při stárnutí přibližně u jednoho z 200 zvířat a vede k monoklonální gamapatii s některými rysy nemoci u lidí (Radí 1988). Pro vývoj lepšího modelu s vyšší reprodukovatelností původci připravili a subklonovali buněčnou linii z myšího myelomu nazvanou STGMI a zjistili, že způsobuje léze u myší charakteristické pro lidský myelom, jako je např. silná osteolýza, a postihuje i jiné orgány než kosti, např. ledviny a játra (Garrett 1997). U myší inokulovaných kultivovanými buňkami se vyvíjí nemoc, a sice vysoce predikovatelným a reprodukovatelným způsobem, která zahrnuje vznik monklonální gamapatie a radiologické kostní léze. Kromě toho se některé myši stávají hyperkalcemické, a kostní léze jsou charakteristické zvýšenou aktivitou osteoklastů. Tudíž na základě histologického vyšetření postižených orgánů myší nesoucích STGM] a zvýšené sérové hladiny IgG2b, byl STGMI definován jako myší myelom, který přesně reprodukuje významné znaky onemocnění u lidí.

Následující příklady podrobně ilustrují výhodná provedení vynálezu a nijak neomezují předmět vynálezu.

Restrikční enzymy, plazmidy a další reagencie a materiály lze získat z komerčních zdrojů a postupy klonování a dalších metod genového inženýrství (technologie rekombinantní DNA) jsou odborníkům známy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Materiál a metody

Myelomové buňky 5TGM1

Myelomové buňky 5TGM1 původně pocházejí z myelomu, který vznikl spontánně u starých myší C57BL/KaLwRij (Garrett 1997, Vanderkerken 1997). Buňky byly pěstovány v Dulbeccově médiu modifikované podle Isocova (IMDM, Life Technologies lne., Gaithersburg, MD) doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS, Summit, Fort Collins, CO) a 1% roztokem pencilínstreptomycinu (GIBCO, Grand Island, NY) ve 37 °C v 5% CO₂ atmosféře. Pro in vitro pokusy popsané níže byly použity buňky 5TGM1 mezi 25. a 30. pasáží.

- 16CZ 302997 B6

Protilátky, rozpustná VCAM-1

Neutralizační protilátky proti myší VCAM-l (M/K-2.7), integrinu VLA-4 (PS/2) a intracelulámí adhezivní molekule-l (ICAM-1, YN1/1.7) byly laskavý dar od dr. Kensuke Miyake (Saga Medical University, Saga, Japan). Rekombinantní rozpustná VCAM-1 (Lobb et al., 1991) obsahující 7 extracelulamích domén lidské VCAM—1 byl dar od dr. Roy Lobb, Biogen lne., Cambridge, MA.

Reverzní transkripce spražená s polymerázovou řetězcovou reakcí (RT-PCR)

S použitím RT-PCR potvrdili původci expresi VCAM-1 a integrinu alfa4 v buňkách stromatu kostní dřeně a 5TGM1, vdaném pořadí. Celková RNA byla izolována z5TGMl, z primární kultury buněk stromatu kostní dřeně a buněčné linie ST2 stromatu kostní dřeně (RIKEN Cell Bank, Tsukuba, Japan) pomocí jednokrokové metody izolace RNA s použitím reagencie TRIzol (GIBCO). Tri gg RNA byly inkubovány s 50 ng náhodného hexameru v70°C po 10 min a ochlazeny na ledu, pak konvertovány na první vlákno cDNA s použitím reverzní transkriptázy (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) podle instrukcí výrobce. Primery použité pro PCR byly následující: myší VCAM-1 5’-primer, 5’-OH-GCTGCGCGTCACCATTGTTCTC-3’-OH (sekvence id. č. 1), myší VCAM-1 3-primer, 5’-OH-ACCACCCTCTTGAAGCCTTGTG-3’-OH (sekvence id. č. 2), myší integrin alfa4 5’-primer, 5’-OH-CCCCTCAACACGAACAGATAGG3’-OH (sekvence id. ě. 3), myší integrin alfa4 3’-primer, 5’4DH-GCCTTGTCCTTAGCAACACTGC-3’-OH (sekvence id. č. 4).

PCR byla prováděna 30 cyklů skládajících se z 1 min v 94 °C, 1 min v 55 °C a 2 min v 72 °C. PCR reakční směs (celkem 50 gl) obsahovala 10 gl. První vlákno cDNA, 50mM KCI, lOmM Tris-HCl (pH 8,3), 2mM MgCl₂, deoxy-NTP mix (0,2mM každý), pár primerů (0,15 gM každý) a 2 UTaq DNA polymerázy (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Produkty PCR byly separovány na 2,5% agarózových gelech obsahujících ethidiumbromid a vizualizovány pod ultrafialovým světlem. Velikost fragmentů byla potvrzena vztahem ke standardům molekulové hmotnosti.

Připojení buněk 5TGM1 k buňkám stromatu kostní dřeně

Pro provádění heterotypových testů adheze buněk byly buňky ST2 (5e4/jamka) nasazeny na 48jamkové kultivační destičky (Costar, Cambridge, MA) a pěstovány 48 hodin v médiu alfaMEM doplněném 10% FBS do konfluence. Buňky 5TGMI (5 a 6) byly značeny inkubací s 10 gCi (3,7.10⁵ Bq) [methyI-3H] thymidinu (New England Nuclear) po 24 hodin v 37 °C v kultivačním médiu. Poté, co se vytvořila monovrstva ST2, byly inkubovány s 1% bovinním sérovým albuminem (BSA, Sigma, St Louis, MO) v médiu alfaMEM bez séra po 1 hodinu a na monovsrtvu byly naneseny buňky 5TGM1 značené tritiem. Systém byl inkubován v přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek proti VCAM-1 neb integrinu alfa4betal v 37 °C po 1 hodinu. Neadherované buňky byly odstraněny promytím s 5% kyselinou trichloroctovou, dvakrát, a s PBS, dvakrát, a adherované buňky byly solubilizovány ve 300 gl 0,25mM NaOH, 0,25mM HCl neutralizovány se stejným objemem a radioaktivita byla určována počítačem scintilace v kapalinách.

Test tvorby osteoklastů ve společné kultuře buněk 5TGM1 a buněk kostní dřeně myší

Buňky kostní dřeně myší byly získány od samců myší C57BL starých 5 týdnů, jak popsáno dříve (Yoneda 1993). Femury a tibie byly asepticky vyňaty a oba konce odseknuty. Buňky kostní dřeně byly vypláchnuty, sesbírány a inkubovány v médiu alfMEM doplněném 10% FBS (Hyclone, Logan, UT) a 1% pěnic i lin-streptomy činem na kultivačních miskách o průměru 100 mm (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) v 37 °C po 2 hodiny, Neadherované buňky obsahující hemopoetické prekurzory osteoklastů a buněk stromatu byly sklizeny. Buňky kostní dřeně (le6) buňky 5TGM1 (le3) ve 300 gl kultivačního média byly nasazeny na 48-jamkové kultivační destičky (den 0). V den 2 bylo do každé jamky jemně přidáno 300 gl čerstvého kultivačního média a v den

- 17CZ 302997 Β6 bylo 300 μΙ vyčerpaného média nahrazeno stejným objemem čerstvého média. V den 6 byly kultury fixovány a obarveny kyselou fosfatázou rezistentní na tartarát (TRAP) s použitím komerčního kitu (Sigma). TRAP-pozitivní monojaderné buňky s více než 3 jádry byly definovány jako buňky podobné osteoklastům (podobné OC) a ručně počítány pod mikroskopem. Aby se potvrdilo, že tyto buňky OC mají schopnost resorbovat kost, byly buňky 5TGM1 a buňky dřeně společně pěstovány na řezech velrybího dentinu o velikosti 5x5 mm za stejných podmínek a resorpční otvory vytvořené na těchto dentinových řezech byly vyšetřovány rastrovacím elektronovým mikroskopem, jak popsáno (Yoneda, 1992).

V některých pokusech byly prováděny společné kultivace myelomových buněk 5TGM1 a buněk kostní dřeně s použitím jamkových přepážek (Becton Dickinson Labware), aby se zabránilo přímému kontaktu mezi těmito dvěma typy buněk (2e6, 24-jamkové destičky, Costar). Buňky dřeně byly nasazeny do spodních komůrek a myelomové buňky 5TGM1 (2e3) pak byly nasazeny buď do spodních (přímý kontakt), nebo do horních (bez kontaktu) komůrek.

Orgánové kultury kosti fétu laboratorního potkana značené ^4SCa

Kondiciovaná média sklizená z kultur 5TGM1 byla testována na aktivitu resorpce kosti prostřednictvím orgánové kultury dlouhých kostí fétu laboratorního potkana značené ⁴⁵Ca, jak popsáno dříve (Mbalaviele 1995). Březím samicím laboratorního potkana byly podávány injekce 250 pCÍ (9,25.10^{5 6} Bq) ⁴⁵Ca (New England Nuclear) 18. den březosti. Diafyzy radia a ulny byly získány od fétů starých 19 dnů pomocí mikrodisekce a předběžně pěstovány 24 hodin v médiu BGJ (Sigma) doplněném 0,1% BSA na rozhraní vzdušné a tekuté fáze na mřížkách z nerezové oceli. Kostí byly pěstovány v kondiciovaných médiích (50 % objem/objem) nebo v kontrolním médiu po 120 hodin. Média byla měněna jednou za 48 hodin. Na konci kultivace byly kosti inkubovány v ledově chladné 5% kyselině trichloroctové po 2 hodiny a radioaktivita ⁴⁵Ca v kostech a médiích byla určována počítačem v kapalinách. Resorpce kosti byla kvantifikována jako procento ⁴⁵Ca uvolněné do média z kostí, jak vypočítáno: (počet impulsů ⁴⁵Ca v médiu a kosti) x 100.

Společná kultivace myelomových buněk 5TGM1 s buňkami stromatu z myší buněčné linie ST2

Buňky ST2 (0, 5e 6) a buňky 5TGM1 (4 e 6) byly nasazeny společně na kultivační misky o průměru 60 mm (Beckton Dickinson) v IMDM doplněném 10% FBS a pěstovány přes noc, dvakrát promyty s IMDM bez séra a inkubovány v 5 ml IMDM bez séra. Po 48 hodinách byla kondiciovaná média sklizena a uskladněna v -70 °C až do použití.

Účinek mAb PS2 na elevaci IgG2b v séru u myší nesoucích 5TGM1

Myším byla podána injekce le5 buněk 5TGM1, kterým bylo umožněno kolonizovat kostní dřeň. Myši byly rozděleny na dvě skupiny po třech, jedna sloužila jako kontrolní skupina, a druhá byla ošetřena dvakrát týdně počínaje 8. dnem 80 pg mAb PS/2 (4 mg/kg). Hladiny IgG2b, protilátkového isotypu produkovaného myelomovými buňkami 5TGMI, byly měřeny v týdenních intervalech od 1. do 6. týdne.

Výsledky

Exprese VCAM-1, VLA—4 a účinek protilátek proti VCAM-1 a VLA-4 na připojení 5TGMI na monovrstvy ST2 použitím RT-PCR potvrdili původci expresi VCAM-I a integrinů VLA^t v buňkách stromatu kostní dřeně a myelomových buňkách, v daném pořadí. Jak lze očekávat, jak buněčná linie stromatu ST2, tak primární buňky stromatu kostní dřeně exprimovaly VCAM-1, zatímco 5TGM1 neexprimovaly. Na rozdíl od toho myelomové buňky 5TGM1 exprimovaly integrin VLA-4, zatímco buňky stromatu neexprimovaly (data neukázána). Kromě toho jak protilátka antiVCAM-1 (10 pg/ml) tak protilátka VLA-4 (10 pg/ml) částečně (50 až 80 %) inhibovaly připoje- 18CZ 302997 B6 ní buněk 5TGM1 k monovrstvě ST2, což ukazovalo, že VCAM-1 a integrin VLA-4 exprimovaný na těchto buňkách jsou biologicky funkční a že tyto protilátky mají neutralizační aktivitu (data neukázána).

Vznik buněk podobných OC ve společné kultuře myelomových buněk 5TGM1 s buňkami kostní dřeně myší

6. den společné kultury buněk 5TGM1 a buněk kostní dřeně myší vznikaly četné TRAP-pozitivní mnohojademé buňky podobné osteoklastům (podobné OC). Tyto buňky podobné OC vytvářely na dentinových řezech resorpční otvory, což prokazovalo, že tyto buňky byly schopné resorbovat kost a mají osteoklastický fenotyp. V pokusech používajících přepážky v jamkách, byl pozorován vznik buněk podobných OC, když byly buňky 5TGM1 pěstovány v přímém kontaktu s buňkami kostní dřeně. Na rozdíl od toho se buňky podobné OC, které vznikly při oddělení buněk 5TGM1 od buněk dřeně membránou v jamce, vyskytovaly pouze v malém počtu. Buňky 5TGM1 tedy indukují vznik osteoklastů ve smíšených kulturách kostní dřeně a tato indukce vyžaduje přímý kontakt buněk.

Účinek protilátek proti VCAM-l a integrinu VLA-4 na vznik buněk podobných C ve společné kultuře buněk 5TGM1 a buněk dřeně

Jak protilátka anti-VCAM-1 (VCAM-1 Ab, 10 pg/ml), tak protilátka VLA 4-integrin (alfa4betal Ab, 10 pg/ml) pozoruhodně inhibovaly vznik buněk podobných OC. Na rozdíl od toho mAb proti ICAM-1, jiné adhezivní molekule buněk stromatu kostní dřeně zapojené do interakcí stroma/myelom, neměla na vznik buněk podobných OC žádný účinek (obrázek 1). Aby se určilo, zda tato inhibice prostřednictvím VCAM-1 a VLA-^t mAbs byla specifická pro vznik buněk podobných OC indukovaný 5TGM1 a nebyla způsobená cytotoxicitou, byl účinek těchto protilátek vyšetřován na vzniku buněk podobných OC indukovaným 1,25(OH)₂D₃, široce používaným stimulátorem osteoklastogeneze v myších buněčných kulturách kostní dřeně (Takahashi 1988). Ani VCAM-l Ab nebo VLA-4 mAb neinhibovaly vznik buněk podobných OC indukovaný vitaminem D3, který samotný nemá žádný účinek na expresi VCAM-1 na buňkách stromatu (data neuvedena).

Účinek kondiciovaných médií sklizených ze společné kultury 5TGM1 ST2 na resorpci kostí

Kondiciované médium pro společnou kulturu buněk 5TGM1 a ST2 vykazovalo výrazné zvýšení resorpce kosti v testu na dlouhých kostech fétu laboratorního potkana (obrázek 2), zatímco kondicionované médium z 5TGMI způsobilo pouze malé zvýšení ve srovnání s kontrolním médiem. Kondiciované médium z buněk ST2 nevykázalo žádné zvýšení resorpce kostí. Tudíž přímý kontakt buněk prostřednictvím obou VCAM-1 a VLA-4 indukuje buňky podobné osteoklastům a in vitro produkci faktorů resorbujících kost.

Účinek rekombinantní rozpustné VCAM-1 (sVCAM-1) na aktivitu resorbující kost a osteoklastogenní aktivitu buněk 5TGM1

Kondicionované médium z 5TGM1 ošetřených rozpustnou rekombinantní formou VCAM-1 (sVCAM-1) zvyšovalo resorpci kosti na dlouhých kostech fétu laboratorního potkana způsobem závislým na dávce, zatímco kondiciované médium získané z neošetřených 5TGM1 zvyšovalo resorpci kostí pouze omezeně. Rozpustná VCAM-1 samotná neměla žádný účinek na resorpci kostí (data neukázána). V systému tkáňové kultury myší kostní dřeně kondiciované médium sklizené z buněk 5TGM1 ošetřených VCAM-1 vykázalo zvýšenou aktivitu, co se týče vzniku buněk podobných OC, zatímco kondiciované médium získané z neošetřených 5TGM1 projevovalo pouze omezenou aktivitu na vznik buněk podobných OC (obrázek 3).

Exprese mRNA ligandu Rank v buňkách stromatu kostní dřeně (ST2) pěstovaných v přítomnosti a nepřítomnosti myších myelomových buněk

-19CZ 302997 B6

Protože se zdá, že ligand Rank je důležitý mediátor tvorby OCL a může být konečnou společnou metabolickou drahou pro působení oosteoklastogenních cytokinů na tvorbu OCL, zkoumali původci expresi ligandu Rank v buňkách 5TGM1 a ST2 individuálně a při společné kultivaci. Původci zjistili, že společná kultivace buněk 5TGM1 a ST2 indukuje mRNA ligandu Rank v buňkách ST2. Navíc, i když buňky 5TGM1 neexprimují ligand Rank, učiní tak při ošetření s VCAM-1 (neukázáno). Konečně kondiciované médium z buněk 5TGMI ošetřených VCAM-1 indukovalo mRNA ligandu v buňkách ST2, což svědčilo pro to, že metabolická dráha VCAM1/VLA4 produkuje v myelomových buňkách cytokin, který zvyšuje expresi ligandu Rank buňkami stromatu kostní dřeně (data neukázána).

Souhrnem, původci prokázali, že buňky 5TGM1 samotné produkují omezené množství aktivity, která stimuluje vznik buněk podobných OC a resorpci kosti. Ale když byly myelomové buňky 5TGM1 společně pěstovány s buňkami kostní dřeně obsahujícími hemopoetické prekurzory osteoklastů a buňky stromatu, adherovaly silně k buňkám stromatu a zvyšovaly vznik buněk podobných OC. Ve společných kulturách, kdy bylo buňkám 5TGM1 zabráněno v kontaktu s buňkami stromatu, nevznikaly žádné buňky podobné OC. Navíc v orgánových kulturách dlouhých kostí fétu laboratorního potkana zvyšovalo kondicionované médium sklizené ze společných kultur myelomových buněk 5TGM1 a buněk stromatu kostní dřeně ST2 aktivitu resorbující kost ve srovnání s kondiciovaným médiem ze samotných ST2 nebo 5TGML Tato data jsou konzistentní s teorií, že přímý mezibuněčný kontakt buněk 5TGMI s buňkami stromatu kostní dřeně je vyžadován pro produkci aktivity stimulující osteoklasty a resorpci kostí. Původci tedy zjistili, které buněčné adhezivní molekuly byly zapojeny do přímých buněčných interakcí mezi buňkami 5TGM1 a buňkami stromatu kostní dřeně, které jsou nutné pro vytvoření osteoklastogenní aktivity·

Data původců ukazují, že VCAM-1 a integrin VLA-4 mají úlohu v těchto buněčných interakcích protože neutralizační protilátky k těmto dvěma adhezivním molekulám vážně snížily vznik buněk podobných OC ve společných kulturách. Interakce VCAM-1/integrin VLA-4 je zodpovědná za buněčnou komunikaci mezi buňkami stromatu kostní dřeně a myelomovými buňkami 5TGM1, která vede ke zvýšenému vytvoření osteoklastogenní aktivity a aktivity resorbující kost. Konečně, tato aktivita resorbující kost je částečně způsobena indukcí ligandu Rank.

Příklad 2

Pokusy in vivo

In vivo studie původců svědčí pro to, že interakce mezi VLA-4 na myelomových buňkách s VCAM-1 na buňkách stromatu kostní dřeně může mít klíčovou úlohu v indukci aktivity myelomu resorbující kost. Původci podnikli klíčové kroky testování této hypotézy in vivo na zvířecím modelu, který přesně odráží lidské onemocnění.

A. V tomto pokuse byla myším podávána injekce s le5 myelomových buněk 5TGM1, které byly ponechány kolonizovat kostní dřeň. Myši byly rozděleny do dvou skupin po třech, jedna sloužila jako kontrolní skupina a druhá byla ošetřována dvakrát týdně počínaje 8. den s mAb PS/2, Hladiny IgG2b, proti látkového isotypu produkovaného myelomovými buňkami 5TGM1, byly měřeny každý týden od 1. do 6 týdne. Ošetření s mAb v dávce 80 pg na injekci (~ 4 mg/kg) dvakrát týdně silně inhibovalo tvorbu IgG2b, udávající významnou inhibici přežívání myelomových buněk a růstu in vivo (obrázek 4). Dále ošetřené myši vykazovaly snížený výskyt paraplegie (všechna 3 neošetřená zvířata vykazovala paraplegíi 42. den, zatímco pouze jedno z ošetřených zvířat vykazovalo paraplegii. Dvě ošetřená zvířata bez paraplegie také vykazovala redukci hmotnosti sleziny a jater, což také korelovalo s výskytem nádorů. Konečně, ošetřená zvířata vykazovala redukci rozsahu nádoru při histologickém vyšetření (od 6,71 ± 1,74 do 0,05 ± 0,08 mm³) tibií a femurů. Na sérové hladiny kalcia ošetření nemělo žádný vliv (data neukázána).

-20CZ 302997 B6

Β. V paralelně probíhajícím pokuse nemělo ošetření se 40 pg /S/2 dvakrát týdně žádný účinek na hladiny IgG2b (neukázáno). Tato data ukazují, že mAb PS/2 proti VLA-45 silně inhíbuje růst usazených myelomových buněk způsobem závislým na dávce.

C. V dalším invivo pokuse byla myším 18 SCID podána injekce s myelomovými buňkami 5TGM1 v den 0. Čtyři myši byly ošetřeny s PBS, 4 myši byly ošetřeny podle profylaktického protokolu s mAb M/K-2.7 reaktivní proti myší VCAM-l v dávce 80 pg (4 mg/kg) každé 3 dny počínaje v den -l (tj. dny -1, 2, 5, 8, a 11). V paralelním pokuse používajícím stejný protokol bylo pět myší ošetřeno se 160 pg mAb M/K-2.7. Kromě toho bylo pět myší ošetřeno se 160 pg mAb M/K-2.7 počínaje 8. den /tj. dny 8, 11, 14, 17 a 20) terapeutického protokolu. Všem myším bylo odebráno sérum ve dnech 21, 28 a 35 a zvířatům bylo provedeno rentgenové vyšetření, a pak byla utracena, aby se provedlo histologické vyšetření v 35. den. Všechny tri ošetřené skupiny vykazovaly snížení sérových hladin IgG2b, udávající snížený výskyt myelomových buněk (obrázek 5). Relativně ke kontrolám byl také pozorován významný účinek na hmotnost sleziny při použití profylaktického protokolu s nízkými dávkami (0,23 ±0,14 g u kontrol versus 0,08 ±0,04 u ošetřených). V profylaktické skupině s vysokými dávkami 4 z 5 zvířat vykázala jasnou redukci hmotnosti sleziny, ale celková hodnota nebyla významná díky jednomu zvířeti s velkou hmotností sleziny (data neukázána).

D. Je také možné zkoumat, zda počáteční vysoká dávka jako bolus antagonisty alfa4 integrinu, následovaná udržovací dávkou, zlepší účinnost. Myelomové buňky jsou již usazené v kompartmentu kostní dřeně a jejich těsná interakce sVCAM-1 závislá na VLA-4 musí být inhibována. Navíc lze předpokládat, že čím je počet usazených myelomových buněk větší, tím je vyžadována vyšší počáteční dávka pro vyplavení buněk do periferní cirkulace.

Byla tedy provedena větší studie s anti—VLA—4 protilátkou PS/2. Dvaceti osmi myším SCID byla podána injekce s myelomovými buňkami 5TGM1 v den 0. Devět myší nedostalo žádné ošetření, 9 dostalo izotypově souhlasnou kontrolní IgG mAb, 10 myší bylo ošetřeno smAb PS/2 proti alfa4 integrinu. Byl podáván odlišný terapeutický režim, ve kterém byla myším podána vysoká dávka 80 pg (4 mg/kg) každé 3 dny počínaje 8. dnem.

Byla nalezena statisticky významná redukce sérového IgG2b, když byla ošetřená skupina srovnána buď s neošetřenou skupinou, nebo skupinou ošetřenou kontrolním IgG ve 3. a 4. týdnu (data neuvedena). Je důležité, že když byla ošetřená skupina srovnána buď s neošetřenou skupinou, nebo skupinou ošetřenou kontrolním IgG, byl zřetelný vliv na přežití (obrázek 6).

Příklad 3

Další pokusy in vivo

Na základě informací zde uvedených poprvé, mohou odborníci snadno potvrdit a rozšířit důležitost alfa4 integrinů a jejich ligandu u mnohočetného mye lomu při použití popsaného zvířecího modelu myší.

Následující série pokusů je v kompetenci odborníka na základě předkládaného popisu, slouží tedy pouze jako příklad a vynález nijak neomezuje.

1) Odpověď na dávku mAb PS/2 pro stanovení optimální udržovací dávky podávané dvakrát týdně. 80 gg ukazovalo dobrou účinnost, ale 40 gg bylo bez účinku. Lze vyšetřit vyšší dávky až do 20 mg/kg dvakrát nebo třikrát týdně pro určení optimálního dávkování.

2) Pacienti s nemocí v různých stupních závažnosti, spojeni se zvýšeným výskytem nádorů. Lze vyšetřit účinnost mAb PS/2 podávané v různých časech po stanovení nemoci, tj. lze

-21 CZ 302997 Β6 srovnávat zahájení ošetření v 8 dnech (viz například obrázek 4) se zahájením po dvou, třech, čtyřech a pěti týdnech po inokulaci, aby bylo možné vidět, jak pozdě může být mAb podávána, aby poskytla určitou úlevu od příznaků.

3) Lze vyšetřit účinek mAb MK-2 proti myší VCAM-1 při následování stejných parametrů navržených výše (dávkování, časování dávkování) pro mAb proti VLA-4. Očekává se, že pro pozorování účinnosti budou nezbytné podobné hladiny dávek.

4) Jsou vyšetřovány další markéry progrese myelomu, včetně výskytu nádorů v kostní dřeni a na místech mimo dřeň, kvantifikace kostních lézí pomocí rentgenografické analýzy skeletu prostřednictvím histomorfometrie, měření rychlosti resorpce kosti vyhodnocením zesítění kolagenu v plazmě, měření tvorby monoklonálního proteinu v plazmě, výskyt hyperkalcémiea úmrtnost.

5) Mnohočetný myelom je v současností neúčinně léčen podle standardních chemoterapeutických režimů. Lze zkoumat aditivní nebo synergický účinek mAbs v optimálním dávkování ve spojení s dávkováním podle příslušného chemoterapeutického režimu, ať už před tímto režimem nebo po něm.

6) Lze zkoumat schopnost malé molekuly inhibitoru alfa4 integrinu, který je selektivní typ pro jeden konkrétní alfa4 integrin neboje selektivní pro několik alfa4 integrinu najednou nebo schopnost kombinace těchto inhibitorů, napodobovat účinek mAbs a blokovat progresi myelomu s použitím protokolů a výsledků popsaných výše. Inhibitory s malou molekulou jsou podávány parenterálně nebo perorálně, v rozmezí dávek od 0,1 do 30 mg/kg, jednou nebo dvakrát denně nebo dvakrát nebo třikrát týdně.

Přehled citované literatury

Alsína M, Boyce B, Devlin R, Anderson JL, Craig F, Mundy GR, Roodman GD. Development of an in vivo model oh human multiple myeloma bone disease. Blood 87: 1495 až 1501, 1996.

Attal M, Harousseau JL, Stoppa AM, Sotto JJ, Fuzibet JG, Rossi JF, Casassus P, Maisonneuve H, Facon T, Ifrah N, Payen C, Bataille R. A prospective, randomized trial of autologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma. Intergroupe Francais du Myelome. N Engl J Med 335, 91 až 97, 1996.

Bataille R, Jourdan M, Zhang XG, Klein B. Sérum levels of interleukin-6, a potent myeloma cell growth factor, as a reflection of disease severity in plasma cell dyscrasias. J Clin Invest 84: 2008, 1989.

Bataille R, Chappard D, Klein B. Mechanisms of bone lesions in multiple myeloma. Hem One Clin NA 6: 285 až 295, 1992.

Bataille R, Barlogíe B, Lu ZY, Rossi JF, Lavabre-Bertrand T, Beck T, Wijdenes J, Brochier J, Klein B. Biologie effects of anti-interleukin-6 murine monoclonal antibody in advanced multiple myeloma. Blood 86: 685 až 691, 1995.

Boyce BF, Yates AJP, Mundy GR. Bolus injections of recombinant human interleukin-1 cause transient hypocalcemia in normál mice. Endocrinology 125: 2780 až 2783, 1989.

Chauhan D, Uchiyma H, Urashima M, Yamamoto K, Anderson KC. Regulation of interleukin-6 in multiple myeloma and bone marrow stromal cells. Stem Cells 13: 35 až 39, 1995.

Epstein J. Myeloma phenotype: Clues to disease origin and manifestation. Hem One Clin NA 6: 249 až 256, 1992.

Garrett IR, Dallas S, Radí J, Mundy GR: A murine model of human myeloma bone disease. Bone 20: 515 až 520, 1997.

-22CZ 302997 Β6

Gosslar U, Jonas P, Luz A, Lifka A, Naor D, Hamann A, Holzmann B. Predominant role of alpha 4 integrins for distinct steps of lymphoma metastasis. Proč, Nati. Acad. Sci. USA 93: 4821 až 4826, 1996.

Lacey DL, Timms E, Tan HL, Kelley MJ, Dunstan CR, Burgess T, Elliott R, Colombero A, Elliott G, Scully S, Hsu H, Sul li van J, Hawkins N, Davy E, Capparelli C, Eli A, Qian YX, Kaufman S, Sarosi I, Shalhoub V, Senaldi G, Guo J, Delaney J, Boyle WJ. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 93: 165 až 176, 1998.

Lobb R, Chi-Rosso H, Leone D, Rosa M, Newman B, Luhowskyj S, Osbom L, Schiťfer S, Benjamin C, Dougas I, Hession C, Chow P. Expression and functional characterisation of a soluble form of vascular cell adhesion molecule 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178: 1498 až 1504, 1991.

Lobb, R. and Hemler M. The Pathophysiologic Role of alpha4 Integrins In Vivo. J. Clin. Invest., 94: 1722 až 1728(1994).

Mac Donald BR, Mundy GR, Clark S, Wang EA, Kuehl TJ, Stanley ER, Roodman GD. Effects of human recombinant CSF-GM and highly purifíed CSF-1 on the formatíon of multinucíeated cells with osteoclast characteristics in long-term bone marrow cultures. J Bone Min Res 1: 227 až 233, 1986.

Mbalaviele G, Chen H, Boyce BF, Mundy GR, Yoneda T: The role of cadherin in the generation of multinucíeated osteoclasts from mononuclear precursors in murine marrow. J Clin Invest 95: 2757 až 2765, 1995.

Matsuura N, Puzon-McLaughlin W, Irie A, Morikawa Y, Kakudo K, Takada Y. Induction of experimental bone metastasis in mice by transfection of integrin alpha 4 beta 1 into tumor cells. Am J Pathol 148: 55 až 61, 1996.

Matsuzaki K, Udagawa N, Takahashi N, Yamaguchi K, Yasuda H, Shima N, Morinaga T, Toyama Y, Yabe Y, Higashio K, Suda T. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral bíood mononuclear cell cultures. Biochem Biophys Res Commun 246: 199 až 204, 1998.

Mundy GR, Bertolini DR. Bone destruction and hypercalcemia in plasma cell myeloma. Seminář Oncol3:291, 1986.

Mundy GR. Myeloma bone disease. Eur. J. Cancer 34: 246 až 251, 1998.

Papayannopoulou T, Nakamoto B. Peripheralization of homepoietic progenitors in primates treated with anti-VLA4 integrin. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 9374 až 9378, 1993.

Qian F, Vaux DL, Weissman IL. Expression of the integrin a4bl on melanoma cells can inhibit the invasive stage of metastasis formation. Cell, 77: 335 až 347, 1994.

Radí J, Croese JW, Zurcher C, van den Enden-Vieveen MM, de Leuuw AM. Animal model of human disease. Am. J. Pathol. 132: 593 až 597, 1988,

Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR, Kelley M, Chang MS, Luthy R, Nguyen HQ, Wooden S, Bennett L, Boone T, Shimamoto G, DeRose M, Elliott R, Colombero A, Tan HL, Trail G, Sullivan J, Davy E, Bucay N, Renshaw-Gegg L, Hughes TM, Hill D, Pattison W, Campbell P, Boyle WJ, et al. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 309 až 319, 1997.

Takahashi N, Yamana H, Yoshiki S, Roodman GD, Mundy GR, Jones SH, Boyde A, Suda T: Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouše bone marrow cultures. Endocrinology 122: 1373 až 1382, 1988.

Vanderkerken K, De Raeve H, Goes E, Van Meirvenne S, Radí J, Van Riet I, Thielemans K, Van Camp B. Organ involvement and phenotypic adhesion profile of 5T2 and 5T33 myeloma cells in the C57BL7KaLwRij mouše. Brit J Cancer 76: 451 až 460, 1997,

Takahashi N, Suda T. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RankL. Proč. Natí. Acad. Sci. USA 95: 3597 až 3602, 1998.

-23CZ 302997 Β6

Yoneda T, Alsina MM, Garcia JL, Mundy GR: Diťferentiation of HL-60 Cells into eells with the osteoclast phenotype. Endocrinology 129: 683 až 689, 1992.

Yoneda T, Lowe C, Lee CH, Gutierrez G, Niewolna M, Williams P, Izbicka E, Uehara Y, Mundy GR: Herbimycin A, app6O^c tyrosine kinase inhibitor, ínhibits osteoclastic bone resorption in vitro and hypercalcemia in vivo. J Clin Invest 91: 2791 až 2795, 1993.

Vaughan T, Williams AJ, Pritchard K, Osboum JK, Pope AR, Earnshaw JC, et al. Human atibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nátuře Biotechnology 14: 309 až 314, 1996.

Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Mochizuki S, Tomoyasu A, Yano K, Goto M, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashio K, Udagawa N,

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení mnohočetného myelomu, přičemž protilátka nebo její fragment vázající antigen jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: a) anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen, b) anti-alfa4beta7 integrin protilátka nebo její fragment vázající antigen, a c) antiVCAM-1 protilátka nebo její fragment vázající antigen.

2. Použití podle nároku 1, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen.

3. Použití podle nároku 1, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je anti-alfa4beta7 protilátka nebo její fragment vázající antigen.

4. Použití podle nároku 1, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je anti-VCAM-l protilátka nebo její fragment vázající antigen.

5. Použití podle nároku 1, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří lidská protilátka, chimérická protilátka, humanizovaná protilátka ajejich fragmenty vázající antigen.

6. Použití podle nároku 1, kdy farmaceutický přípravek je podáván v takové dávce, která poskytuje dávku protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti.

7. Použití protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen pro výrobu farmaceutického přípravku k inhibici resorpce kosti spojené s nádory kostní dřeně, přičemž protilátka nebo její fragment vázající antigen jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: a) anti-VLA^f protilátka nebo její fragment vázající antigen, b) anti-alfa4beta7 integrin protilátka nebo její fragment vázající antigen, a c) anti-VCAM-l protilátka nebo její fragment vázající antigen.

8. Použití podle nároku 7, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen.

9. Použití podle nároku 7, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je anti-VCAM-l protilátka nebo její fragment vázající antigen.

10. Použití podle nároku 7, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je anti-alfa4beta7 protilátka nebo její fragment vázající antigen.

-24CZ 302997 B6

11. Použití podle nároku 7, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří lidská protilátka, chimérická protilátka, humanizovaná protilátka a jejich fragmenty vázající antigen.

12. Použití podle nároku 7, kdy farmaceutický přípravek je podáván v takové dávce, která poskytuje dávku protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti.

13. Použití podle nároku 7, kdy farmaceutický přípravek jc podáván v takové dávce, která poskytuje dávku protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen 0,1 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti.

14. Použití podle nároku 1, kdy farmaceutický přípravek je podáván v takové dávce, která poskytuje dávku protilátky nebo jejího fragmentu vázajícího antigen 0,1 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti.

15. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen jc VLA^f protilátka nebo její fragment vázající antigen vybrané ze skupiny, kterou tvoří: protilátka HP 1/2 nebo její fragment vázající antigen, protilátka HP2/1 nebo její fragment vázající antigen, protilátka HP2/4 nebo její fragment vázající antigen, protilátka L25 nebo její fragment vázající antigen, protilátka P4C2 nebo její fragment vázající antigen a protilátka P4G9 nebo její fragment vázající antigen.

16. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je humanizovaná VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen obsahující humanizovaný lehký řetězec a humanizovaný těžký řetězec, kde jak lehký, tak těžký řetězec obsahuje komplementaritu určující úseky CDRl, CDR2 a CDR3 z myší anti-VLA-4 protilátky 21.6.

17. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je humanizovaná VLA^i protilátka nebo její fragment vázající antigen a kdy

a) humanizovaný lehký řetězec obsahuje rámec variabilního úseku ze sekvence rámce variabilního úseku lidského lehkého řetězce kappa, kde alespoň jedna pozice rámce je obsazena stejnou aminokyselinou jaká je přítomna v ekvivalentní pozici rámce variabilního úseku lehkého řetězce myšího imunoglobulinu 21.6., a

b) humanizovaný těžký řetězec obsahuje rámec variabilního úseku ze sekvence rámce variabilního úseku lidského těžkého řetězce, kde alespoň jedna aminokyselinová pozice rámce je obsazena stejnou aminokyselinou, jaká je přítomna v ekvivalentní pozici rámce variabilního úseku těžkého řetězce myšího imunoglobulinu 21.6.

18. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy farmaceutický přípravek je určen pro parenterální podávání.

19. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy je farmaceutický přípravek určen pro podávání v kombinaci s jedním nebo více z následujících činidel: kortikosteroid, protizánětové činidlo, imunosupresivum, antimetabolit a imunomodulátor a/nebo v kombinaci s chemoterapeutickým režimem.

20. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy protilátka nebo její fragment vázající antigen je monoklonální protilátka nebo její fragment vázající antigen.

21. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy anti-VLA—4 protilátka nebo její fragment vázající antigen se váže na alfa4 řetězec VLA-4.

-25CZ 302997 B6

22. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající anti gen jsou anti-VLA-4 protilátka nebo její fragment vázající antigen specifické pro B epitop.

5 23. Použití podle nároku 1 nebo 7, kdy pacientem je člověk.