ES2319831T3

ES2319831T3 - Metodos de tratamiento de mieloma multiple y resorcion osea inducida por mieloma usando antagonistas de la union receptor/integrina.

Info

Publication number: ES2319831T3
Application number: ES99949656T
Authority: ES
Inventors: Gregory R. Mundy; Toshiyuki Yoneda
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2009-05-12
Anticipated expiration: 2019-09-13
Also published as: DE69940206D1; NO20011244L; EP2065050A1; HK1038313A1; CZ302997B6; WO2000015247A8; ATE418999T1; SI1113810T1; DK1113810T3; NO20011244D0; AU757873B2; EA200100362A1; KR100628818B1; NO20011283D0; SK6052001A3; BR9913705A; IL197686A0; JP2002524529A; PL347128A1; EE05558B1

Abstract

Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado de: (a) un anticuerpo anti-VLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) un anticuerpo anti-integrina alfa 4/beta 7 o fragmento de unión a antígeno del mismo; y (c) un anticuerpo anti-VCAM-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del mieloma múltiple, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Description

Métodos de tratamiento de mieloma múltiple y resorción ósea inducida por mieloma usando antagonistas de la unión receptor/integrina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o de un polipéptido VLA-4 o VCAM-1 soluble para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de mieloma múltiple, y la liberación de factores de resorción ósea por células de mieloma, dando como resultado una pérdida ósea grave, que es el principal efecto secundario del mieloma en el ser humano. Más particularmente, esta invención se refiere al uso de un anticuerpo anti-VLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo, de un anticuerpo anti-integrina alfa 4/beta 7 o fragmento de unión a antígeno del mismo o de un anticuerpo anti-VCAM-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, o de polipéptidos VLA-4 o VCAM-1 solubles que antagonizan la interacción VLA-4/VCAM-1 para la preparación de composiciones farmacéuticas para un tratamiento de este tipo.

Antecedentes de la invención

El mieloma múltiple es la segunda neoplasia hematológica más común, diagnosticándose 15.000 nuevos casos cada año y con de 30.000 a 40.000 pacientes con mieloma en los EE.UU. por año (Mundy y Bertolini 1986). El ochenta por ciento de los pacientes padecen destrucción ósea osteolítica devastadora provocada por un aumento de la formación y la actividad de los osteoclastos (OCL) (Mundy y Bertolini 1986). Esta destrucción ósea puede provocar un dolor óseo muy agudo, fracturas patológicas, compresión de la médula espinal e hipercalcemia potencialmente mortal. Dado que el mieloma múltiple no puede curarse mediante quimioterapia convencional ni trasplante de células madre (Attal et al, 1996), y debido a la grave morbididad y la posible mortalidad asociadas con la osteopatía del mieloma, las estrategias de tratamiento que controlan el propio crecimiento del mieloma, y en particular la destrucción ósea osteolítica que se produce en estos pacientes, son de vital importancia.

Sin embargo, se desconocen los mecanismos patológicos responsables del aumento de la actividad de los osteoclastos en pacientes con mieloma múltiple (Mundy, 1998). Las lesiones óseas se producen en diversos patrones. Ocasionalmente, los pacientes desarrollan lesiones osteolíticas diferenciadas que están asociadas con plasmocitomas solitarios. Algunos pacientes tienen osteopenia difusa, que imita la aparición de la osteoporosis, y se debe a que las células de mieloma se extienden de manera difusa a través del esqueleto axial. En la mayoría de los pacientes hay múltiples lesiones líticas diferenciadas que se producen adyacentes a nidos de células de mieloma. Se produce hipercalcemia como consecuencia de la destrucción ósea en aproximadamente un tercio de los pacientes con enfermedad avanzada. En ocasiones poco frecuentes, los pacientes con mieloma no tienen lesiones líticas ni pérdida ósea, sino que en vez de eso tienen un aumento de la formación de hueso nuevo alrededor de células de mieloma. Esta situación poco frecuente se conoce como mieloma osteoesclerótico.

Las lesiones óseas osteolíticas son con diferencia las manifestaciones en el esqueleto más comunes en pacientes con mieloma (Mundy, 1998). Aunque siguen sin estar claros los mecanismos moleculares precisos, observaciones a lo largo de 15 años han mostrado que: 1) el mecanismo mediante el cual se destruye el hueso en el mieloma es mediante los osteoclastos, la célula de resorción ósea normal; 2) los osteoclastos se acumulan sobre superficies de resorción ósea en el mieloma adyacente a grupos de células de mieloma y parece que el mecanismo mediante el cual se estimulan los osteoclastos en el mieloma es local; 3) Durante años se ha sabido que los cultivos de células de mieloma humanas in vitro producen varios factores de activación de osteoclastos, incluyendo linfotoxina alfa (LT-a), interleucina 1 (IL-1), proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) e interleucina 6 (IL-6); 4) la hipercalcemia se produce en aproximadamente un tercio de los pacientes con mieloma en algún momento durante el transcurso de la enfermedad. La hipercalcemia siempre está asociada con un aumento marcado de la resorción ósea y frecuentemente con un empeoramiento de la filtración glomerular; 5) el aumento de la resorción ósea osteoclástica en el mieloma está normalmente asociado con un empeoramiento marcado de la función de los osteoblastos. La actividad fosfatasa alcalina en el suero está reducida o en el intervalo normal, al contrario que pacientes con otros tipos de osteopatía osteolítica, y las exploraciones con radionúclidos no muestran evidencias de un aumento de la captación, lo que indica respuestas de osteoblastos afectadas al aumento de la resorción ósea.

Aunque diversos mediadores indicados anteriormente se han implicado en la estimulación de la actividad de los osteoclastos en pacientes con mieloma múltiple, los informes de factores producidos por células de mieloma no han sido coherentes, y algunos estudios no han sido concluyentes debido a la presencia de otros tipos de células contaminantes incluyendo células del estroma y macrófagos, en la población de células de mieloma múltiple. IL-6 es un factor de crecimiento de mieloma principal que potencia el crecimiento de varia líneas de célula de mieloma y células de mieloma recién aisladas de pacientes (Bataille et al., 1989). La producción de IL-6 puede detectarse en aproximadamente el 40% de las células de mieloma recién aisladas mediante PCR, pero sólo 1 de cada 150 pacientes estudiados muestran una producción de IL-6 detectable mediante inmunocitoquímica o ensayos ELISA (Epstein 1992). Los receptores de IL-6 sólo se detectaron en 6 de 13 muestras de pacientes con mieloma múltiple (Bataille et al, 1992). Además, se ha notificado que las células de mieloma maduras tienen una respuesta proliferativa mínima a IL-6. La interleucina 11 (IL-11) tiene una actividad similar a IL-6 sobre plasmocitomas, pero hasta la fecha nadie ha demostrado que las células de mieloma produzcan IL-11. Bataille y colaboradores (1995) han mostrado que la perfusión a 5 pacientes con mieloma que no responde al tratamiento con un anticuerpo frente a IL-6 sólo reduce el tamaño de la carga de células de mieloma en 2 de estos pacientes. IL-1 es un agente de resorción ósea extremadamente potente que induce hipercalcemia en modelos de animales en ausencia de insuficiencia renal (Boyce et al, 1989). En cambio, se produce hipercalcemia en ocasiones poco frecuentes en pacientes con mieloma sin insuficiencia renal. Lo que es más importante, en células de mieloma sumamente purificadas, no puede detectarse producción de IL-1 y sólo una producción poco frecuente de TNF-a, lo que sugiere que otros tipos de células contaminantes tales como macrófagos pueden ser la fuente de IL-1 y TNF-a (Epstein 1992). De manera similar, LT-a se produce por la mayor parte de las líneas de célula de mieloma humanas (Bataille et al, 1995) pero no parece producirse por células de mieloma in vivo (Alsina et al, 1996). Además de IL-1, TNF-a, LT-a y IL-6, las células de mieloma producen una forma truncada de M-CSF que es biológicamente activa, pero M-CSF no provoca hipercalcemia ni induce formación de osteoclastos por sí mismo en cultivos de médula ósea humana (MacDonald et al, 1986).

Por tanto, no se ha demostrado claramente in vivo el papel de ninguno de estos factores en la osteopatía osteolítica en pacientes con mieloma, de manera que claramente las citocinas conocidas no explican totalmente la resorción ósea observada en estos pacientes.

Papel de las interacciones moleculares adherentes en la osteopatía de mieloma

Anderson y colaboradores fueron el primer grupo en demostrar la importancia de las interacciones adherentes entre células de mieloma y células en el microentorno de la médula tanto en el crecimiento de células de mieloma como en el desarrollo de osteopatía osteolítica. Las células de mieloma múltiple expresan moléculas de adherencia de superficie celular, CD29 (VLA-4), LFA-1 y CD44 (Chauhan et al, 1995). Estos trabajadores sugirieron que las células de mieloma se localizaban en la médula mediante interacciones de adherencia específicas entre proteínas de matriz extracelular y células del estroma de la médula ósea. Mostraron adicionalmente que la adherencia de células de mieloma múltiple a células del estroma activaba la secreción de IL-6 por células del estroma tanto normales como derivadas de médula ósea de mieloma múltiple y aumentaba el crecimiento de células tumorales mediado por IL-6. Sin embargo, anticuerpos frente a CD29, LFA-1 o CD44 no redujeron la producción de IL-6 por células del estroma de la médula en respuesta a células de mieloma, lo que sugiere que otra interacción ligando-receptor activaba la secreción de IL-6 por células del estroma de la médula ósea que se unían a células de mieloma. La simple identificación de una posible ruta de adherencia no significa necesariamente que la ruta sea importante. En este caso, ninguna de las rutas implicadas desempeña un papel en la producción de IL-6.

Vanderkerken et al (1997) también examinaron el perfil de adherencia fenotípico de células 5T2 murinas y células de mieloma 5T33 en un modelo de mieloma murino. Estos investigadores mostraron que estas líneas celulares expresaban VLA-4, VLA-5, LFA-1 y CD44, y sugirieron que estas interacciones adherentes podían ser importantes para que células de mieloma se unieran a células del estroma de la médula.

No obstante, a pesar de muchos avances de laboratorio, los mecanismos fundamentales que subyacen al aumento de la destrucción ósea osteoclástica en el mieloma in vivo siguen sin entenderse bien. Esto se refleja en la incapacidad para traducir fácilmente los datos sobre interacciones adherentes in vitro al entorno in vivo. Por ejemplo, muchos estudios in vitro implican tanto a la integrina VLA-4 como a la integrina LFA-1 en la adherencia de células madre hematopoyéticas al estroma de la médula ósea (revisado en Papayannopoulou y Nakamoto, 1993). Estos datos in vitro predecirían que cualquiera de las rutas, si se bloquea in vivo, daría como resultado la periferialización de células madre hematopoyéticas desde la médula hacia sangre periférica. Sin embargo, en un estudio en primates, aunque un anticuerpo monoclonal (AcM) frente a VLA-4 periferializó eficazmente células madre, un anticuerpo monoclonal frente a la cadena de integrina beta2 de LFA-1 no tuvo efecto, a pesar de aumentar el recuento de neutrófilos, demostrando así la eficacia del AcM (Papayannopoulou y Nakamoto, 1993). Estos datos muestran que los resultados in vitro no pudieron de hecho predecir con precisión la importancia in vivo.

Debe observarse que el papel de la integrina VLA-4 se ha estudiado en la metástasis de múltiples tumores, incluyendo leucemias tales como linfoma, con resultados contradictorios. Así, la transfección de la cadena alfa 4 humana en células de ovario de hámster chino (CHO) dio como resultado expresión de VLA-4, e hizo que estas células pudieran migrar a la médula ósea in vivo, un fenómeno inhibido por AcM frente a VLA-4 (Matsuura et al, 1996). En cambio, la transfección de células de linfoma con VLA-4 inhibió fuertemente la metástasis al hígado, pulmón y riñón, y no tuvo efecto sobre el direccionamiento hacia, y la proliferación en, la médula (Gosslar et al., 1996). Además, la expresión de VLA-4 en células de melanoma murino sumamente metastásico inhibió fuertemente la formación de metástasis pulmonares in vivo (Qian et al., 1994), y no predispuso al melanoma a la metástasis a la médula ósea.

En resumen, no queda claro, basándose en los estudios in vitro, cómo predecir de manera fiable la importancia in vivo de las rutas de adherencia. Además, aunque se han realizado estudios in vivo, los datos resultantes no son coherentes. Un motivo principal para las desconcertantes faltas de coherencia en el campo del mieloma múltiple es que los modelos de animales actualmente disponibles no son buenos factores de predicción de la enfermedad humana. En el caso del mieloma múltiple, las líneas de células de mieloma humana y murina que pueden hacerse crecer in vitro están asociadas en casos poco frecuentes con la destrucción ósea in vivo (Mundy 1998).

Sería sumamente deseable identificar compuestos o antagonistas que inhiban la producción de estos factores de resorción ósea, deteniendo así la destrucción ósea progresiva y mejorando la calidad de vida de pacientes con mieloma.

Sumario de la invención

Se ha utilizado un modelo murino recientemente desarrollado de mieloma múltiple en el que el ratón desarrolla osteólisis grave con todas las características distintivas de la enfermedad humana (Garrett 1997). Usando esta línea celular y modelo de animal se ha establecido que la inhibición de la ruta de integrina alfa 4/ligando de integrina alfa 4 in vivo conduce a una reducción de la capacidad de proliferar y/o sobrevivir de células de mieloma múltiple. Se muestra que se requiere la unión célula-célula entre células de mieloma y células del estroma de la médula mediante la interacción VLA-4/VCAM-1 para un aumento de la producción de una actividad que estimula la resorción ósea osteoclástica en el microentorno óseo in vitro.

Se propone que esta interacción es crítica para el direccionamiento de células de mieloma al compartimiento de la médula, para su posterior supervivencia y crecimiento, finalmente para la evolución de la osteólisis inducida por el mieloma. Se sometió esto a prueba en el modelo de animal y se encontró que, in vivo, un antagonista de la integrina VLA-4 que contiene la subunidad alfa 4 inhibe fuertemente la producción de anticuerpo del subtipo IgG2b. Este isotipo es el mismo que el producido por la línea celular 5TGM1, y es un sustituto preciso del número de células de mieloma en el compartimiento de la médula en cualquier momento. Por tanto, el bloqueo de la ruta de VLA-4 inhibe fuertemente la producción de IgG2b, y por implicación, el nivel de carga de mieloma.

Un aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo anti-VLA-4, un anticuerpo anti-integrina alfa 4/beta 7 o un anticuerpo anti-VCAM-1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del mieloma múltiple.

Agentes preferidos son anticuerpo anti-VLA4 o anti-alfa 4/beta 7 humano, quimérico, humanizado, anticuerpo de unión a antígeno y fragmentos de los mismos; homólogos de anticuerpo anti-VCAM-1 (un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y fragmentos de los mismos). La composición puede administrarse a una dosificación de manera que se proporciona desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. En particular, los agentes preferidos pueden antagonizar una interacción: a) tanto de VLA-4 como de alfa 4/beta 7 colectivamente con sus ligandos alfa 4 respectivos; o b) sólo de VLA-4 con su ligando alfa 4; o c) sólo de alfa 4/beta 7 con su ligando alfa 4.

Otro aspecto de la invención es el uso de polipéptido VLA-4 o VCAM-1 soluble que antagoniza la interacción VLA-4/VCAM-1 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del mieloma múltiple.

Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo anti-VLA-4, un anticuerpo anti-integrina alfa 4/beta 7 o un anticuerpo anti-VCAM-1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la resorción ósea asociada con tumores de médula ósea.

Agentes preferidos son anticuerpo anti-VLA4 o anti-alfa 4/beta 7 (anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y fragmentos de unión a antígeno de los mismos); anticuerpo anti-VCAM-1 (un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y fragmentos de los mismos). El agente puede administrarse a una dosificación de manera que se proporciona desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal.

Otro aspecto de la invención es el uso de polipéptido VLA-4 o VCAM-1 soluble que antagoniza la interacción VLA-4/VCAM-1 para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la resorción ósea asociada con un tumor de médula ósea. La composición puede administrarse a una dosificación de manera que se proporciona desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Efecto de anticuerpos neutralizantes sobre la formación de células de tipo OC multinucleadas positivas para TRAP en los cocultivos de células 5TGM1 y células de médula ósea.

Se sembró una mezcla de células 5TGM1 (1 e3) y células de médula (1 e6) en suspensión en placas de cultivo de 48 pocillos y se cultivó con o sin 10 \mug/ml de anticuerpo anti-VCAM-1 (Ac frente a VCAM-1), anticuerpo anti-alfa 4/beta 1 (Ac frente a \alpha4\beta11), anticuerpo anti-ICAM-1 (Ac frente a ICAM-1) o IgG de rata como control. Tras 6 días de cultivo, se fijaron los cultivos y se determinó el número de células de tipo OC multinucleadas positivas para TRAP (TRAP(+) MNC). Tanto el Ac frente a VCAM-1 como el Ac frente a alfa 4/beta l inhibieron la formación de TRAP(+) MNC, mientras que el Ac ICAM-1 no tuvo ningún efecto. Los datos se expresan como media \pm E.E. (n = 3). * = Significativamente diferente del control de IgG.

Figura 2. Efecto de medios condicionados de 5TGM1 y ST2 sobre la resorción ósea en cultivos de órganos de huesos largos de rata fetal.

Se sometieron a ensayo medios condicionados (48 horas) obtenidos de ST2 solo, 5TGM1 solo y cocultivos de ST2 y 5TGM1 para determinar la actividad de resorción en cultivos de órganos de huesos largos de rata fetal marcados con ^{45}calcio. Se cultivaron huesos largos de rata fetal marcados en presencia de medios condicionados (40% v/v) o medio de control durante 120 horas. Los datos se expresan como aumento en porcentaje de la liberación de calcio con respecto a la del medio de control. La liberación a partir de medio condicionado de células del estroma ST2 se muestra como barra abierta. La liberación a partir de 5TGM1 es la barra sombreada. La liberación a partir de medio condicionado recogido del cocultivo de 5TGM1 y ST2 es la barra cerrada. Los datos se expresan como media \pm E.E. (n = 4). * = significativamente diferente de ST2 solo. *** = significativamente diferente de 5TGM1 solo.

Figura 3. Efecto de VCAM-1 soluble recombinante (sVCAM-1) sobre la producción de actividad osteoclastogénica por células 5TGM1.

Se recogió medio condicionado de células 5TGM1 cultivadas en presencia o ausencia de sVCAM-1 (de 1 x 10^{-8} a 1 x 10^{-7} molar) durante 24 horas. Se sometió a ensayo la actividad osteoclastogénica de estos medios condicionados en los cultivos de médula de ratón. Se sembraron células de médula ósea (1 e6/pocillo) en placas de 48 pocillos, y se cocultivaron en presencia de medios condicionados (barras sombreadas) o medio de control (IMDM) que contenía las mismas concentraciones de sVCAM-1 (barras abiertas). Tras 6 días, se fijaron los cultivos y se determinó el número de células de tipo OC multinucleadas positivas para TRAP (TRAP+ MNC). El medio condicionado de células 5TGM1 tratadas con sVCAM-1 1 x 10^{-7} M aumentó la formación de TRAP(+) MNC. Los datos se expresan como media \pm E.E. (n = 3). * = significativamente diferente de los controles.

Figura 4. Efecto de AcM PS2 frente a VLA-4 sobre el aumento de IgG2b en suero en ratones portadores de 5TGM1.

Se inyectaron a ratones 1 e5 células 5TGM1, que se dejó que colonizaran la médula ósea. Se dividieron los ratones en dos grupos de tres, sirviendo uno como grupo control, y tratándose el segundo en los días 8, 11, 14, 17 y 20 con 80 \mug de AcM PS/2 (\sim4 mg/kg). Se midieron semanalmente los niveles de IgG2b, el isotipo de anticuerpo producido por las células de mieloma 5TGM1, desde la semana 1 hasta la 6. El tratamiento con AcM inhibió fuertemente la producción de IgG2b, lo que es indicativo de la inhibición de la supervivencia y el crecimiento de células de mieloma in vivo.

Figura 5. Efecto de AcM M/K-2.7 frente a VCAM-1 sobre el aumento de IgG2b en suero en ratones portadores de 5TGM1.

Se inyectaron a ratones células 5TGM1 tal como se describió en la figura 4, que se dejó que colonizaran la médula ósea. Se dividieron los ratones en grupos de cuatro o cinco, sirviendo un grupo como grupo control (cuadrado abierto), tratándose los grupos segundo/tercero de manera profiláctica a 80 \mug (rombos abiertos) y 160 \mug de AcM (círculos abiertos) (de \sim4 a 8 mg/kg), tratándose el cuarto grupo terapéuticamente a 160 \mug de AcM (triángulos). Se midieron los niveles de IgG2b, el isotipo de anticuerpo producido por células de mieloma 5TGM1. El tratamiento con AcM inhibió fuertemente la producción de IgG2b, lo que es indicativo de la inhibición de la supervivencia y el crecimiento de células de mieloma in vivo.

Figura 6. Efecto de anticuerpo anti-integrina alfa 4 sobre la supervivencia de ratones portadores de mieloma múltiple.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a tratamientos para, entre otras cosas, prevenir el mieloma múltiple. Más particularmente, los métodos de la invención se refieren al uso de antagonistas de polipéptido o anticuerpo de una interacción entre una integrina que contiene una subunidad alfa 4 y un ligando para esta integrina en el tratamiento del mieloma múltiple. Se pretende que la expresión "mieloma múltiple" signifique un estado médico en un individuo que tiene una enfermedad neoplásica de células plasmáticas, representando el clon neoplásico células en diferentes fases en el linaje de células plasmáticas entre pacientes (Mundy, 1998).

La integrina alfa 4/beta 1 es un receptor de superficie celular para VCAM-1, fibronectina y posiblemente otras moléculas que se unen a, o interaccionan de otro modo con, la integrina alfa 4/beta 1. Con respecto a esto, tales moléculas que se unen a, o interaccionan de otro modo con, la integrina que contiene la subunidad alfa 4 se denominan individual y colectivamente como "ligando(s) alfa 4". Por tanto la expresión integrina a4b1 ("VLA-4" o "a4b1" o "integrina a4b1", utilizadas de manera intercambiable) en el presente documento se refiere a polipéptidos que pueden unirse a VCAM-1 y miembros de las proteínas de matriz extracelular, lo más particularmente fibronectina, u homólogos o fragmentos de la misma, aunque se apreciará por los expertos habituales en la técnica que pueden existir otros ligandos para VLA-4 y pueden analizarse usando métodos convencionales.

No obstante, se sabe que la subunidad alfa 4 se asociará con otras subunidades beta además de beta 1 de manera que puede la expresión "integrina alfa 4" como que son aquellas integrinas cuya subunidad alfa 4 se asocia con una u otra de las subunidades beta. Un ejemplo adicional de una integrina "alfa 4" es alfa 4/beta 7 (R. Lobb y M Hemler, 1994). Tal como se usa en el presente documento, la expresión "integrina(s) alfa 4" significa VLA-4, así como integrinas que contienen beta 1, beta 7 o cualquier otra subunidad beta.

Dentro de la invención se incluyen usos médicos que usan un agente que antagoniza la acción de más de una integrina alfa 4, tales como un anticuerpo que antagoniza varias integrinas alfa 4 tales como VLA-4 y alfa 4/beta 7, u otras combinaciones de integrinas alfa 4. Dentro del alcance de la invención también se incluyen métodos que usan una combinación de diferentes moléculas de tal manera que la actividad combinada antagoniza la acción de más de una integrina alfa 4, tales como métodos que usan varios anticuerpos que en combinación antagonizan las integrinas alfa 4 VLA-4 y alfa 4/beta 7.

Por ejemplo, son útiles anticuerpos (tratados a continuación) así como formas solubles de las proteínas de unión naturales para VLA-4 y VCAM-1.

En otro ejemplo, VCAM-1, o un fragmento del mismo que puede unirse a VLA-4 sobre la superficie de células de mieloma portadoras de VLA-4, por ejemplo, un fragmento que contiene los dos dominios N-terminales de VCAM-1, puede usarse fusionado a un segundo péptido, por ejemplo, un péptido que aumenta la solubilidad o el tiempo de vida in vivo del resto VCAM-1. El segundo péptido puede ser un fragmento de un péptido soluble, preferiblemente un péptido humano, más preferiblemente una proteína plasmática, o un miembro de la superfamilia de inmunoglo-
bulinas.

En otras realizaciones preferidas, el agente que se usa en los usos médicos de la invención para unirse a, incluyendo bloquear o recubrir, integrina alfa 4 de superficie celular y/o ligando de integrina alfa 4 es un anticuerpo monoclonal anti-VLA-4 y/o anti-alfa 4/beta 7. Anticuerpos preferidos para el tratamiento, en particular para el tratamiento de seres humanos, incluyen anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, fragmentos de anticuerpo Fab, Fab', F (ab')2 y F(v), y monómeros o dímeros de cadenas pesada y ligera de anticuerpo o mezclas de los mismos. Los anticuerpos monoclonales frente a VLA-4 son un agente de unión preferido en el método de la invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos que consisten en cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina unidas mediante enlaces disulfuro. También se pretende que el término "anticuerpo" abarque una proteína que comprende uno o más polipéptidos seleccionados de cadenas ligeras de inmunoglobulina, cadenas pesadas de inmunoglobulina y fragmentos de unión a antígeno de las mismas que pueden unirse a uno o más antígenos. Los polipéptidos componentes de un homólogo de anticuerpo compuesto por más de un polipéptido pueden estar opcionalmente unidos por enlaces disulfuro o reticulados covalentemente de otra
manera.

Por tanto, en consecuencia, "anticuerpo" incluye inmunoglobulinas intactas de tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de las mismas), en las que las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda.

"Anticuerpo" también incluye porciones de anticuerpos intactos que conservan especificidad de unión a antígeno, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten en una cadena pesada y una ligera, y similares. Por tanto, los fragmentos de unión a antígeno, así como polipéptidos diméricos o triméricos de longitud completa derivados de los anticuerpos descritos anteriormente, son útiles en sí mismos.

Tal como se usa en el presente documento, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo, producido mediante tecnología de ADN recombinante, en el que algunos o todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana que no se requieren para la unión a antígeno se han sustituido por los aminoácidos correspondientes de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina de mamífero no humano.

Tal como se usa en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo, producido mediante tecnología de ADN recombinante, en el que la totalidad o parte de las regiones de bisagra y constante de una cadena ligera, cadena pesada o ambas de inmunoglobulina se han sustituido por las regiones correspondientes de otra cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina. En otro aspecto la invención presenta una variante de una molécula quimérica que incluye: (1) un resto de selección como diana de VLA-4, por ejemplo, un resto de VCAM-1 que puede unirse a antígeno (es decir, VLA-4) sobre la superficie de células de mieloma portadoras de VLA-4; (2) opcionalmente, un segundo péptido, por ejemplo, uno que aumenta la solubilidad o el tiempo de vida in vivo del resto de selección como diana de VLA-4, por ejemplo, un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas o fragmento o porción del mismo, por ejemplo, una porción o un fragmento de IgG, por ejemplo, la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana, por ejemplo, regiones de bisagra CH2 y CH3; y un resto de toxina. El resto de selección como diana de VLA-4 puede ser cualquier ligando de VLA-4 que se produce en la naturaleza o fragmento del mismo, por ejemplo, un péptido VCAM-1 o una secuencia de aminoácidos con sustituciones conservadoras similar. Un resto de selección como diana preferido es un fragmento de VCAM-1 soluble, por ejemplo, los dominios N-terminales 1 y 2 de la molécula VCAM-1. La molécula quimérica puede usarse para tratar a un sujeto, por ejemplo, un ser humano, que tiene riesgo de trastorno, por ejemplo, mieloma múltiple, caracterizado por la presencia de células de mieloma portadoras de VLA-4, y preferiblemente VLA-4 activado.

Tal como se usa en el presente documento, un "anticuerpo humano" es un anticuerpo producido mediante tecnología de ADN recombinante, en el que todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina se derivan de una fuente humana.

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Métodos de preparación de anticuerpo anti-VLA-4

La tecnología para producir homólogos de anticuerpo monoclonal se conoce bien. En resumen, se fusiona una línea celular inmortal (normalmente células de mieloma) con linfocitos (normalmente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con células completas que expresan un antígeno dado, por ejemplo, VLA-4, y se examinan los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes para detectar anticuerpos frente al antígeno. Véase, de manera general, Kohler et al., 1975, Nature, 265: 295-297.

La inmunización puede lograrse usando procedimientos convencionales. La dosis unitaria y el régimen de inmunización dependen de la especie de mamífero inmunizado, su estado inmunitario, el peso corporal del mamífero, etc. Normalmente, se extrae sangre de los mamíferos inmunizados y se somete a ensayo el suero de cada muestra de sangre para detectar anticuerpos particulares usando ensayos de selección apropiados. Por ejemplo, pueden identificarse anticuerpos anti-VLA-4 mediante inmunoprecipitación de lisados celulares marcados con 125I de células que expresan VLA-4. (Véanse, Sánchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 y Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). También pueden identificarse anticuerpos anti-VLA-4 mediante citometría de flujo, por ejemplo, midiendo la tinción fluorescente de células Ramos incubadas con un anticuerpo que se cree que reconoce VLA-4 (véase, Elices et al., 1990 Cell, 60: 577-584). Los linfocitos usados en la producción de células de hibridoma se aíslan normalmente de mamíferos inmunizados cuyos sueros ya se han determinado como positivos para la presencia de anticuerpos anti-VLA-4 usando tales ensayos de selección.

Normalmente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea de células de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Líneas celulares inmortales preferidas son líneas de células de mieloma de ratón que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Normalmente, se fusionan células de mieloma de ratón sensibles a HAT con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol de 1500 de peso molecular ("PEG 1500"). Después se seleccionan células de hibridoma resultantes de la fusión usando medio HAT, que destruye las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren tras varios días porque no están transformados). Se detectan hibridomas que producen un anticuerpo deseado examinando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma. Por ejemplo, pueden examinarse hibridomas preparados para producir anticuerpos anti-VLA-4 sometiendo a prueba el sobrenadante de cultivo de hibridoma para detectar anticuerpos secretados que tienen la capacidad de unirse a una línea celular que expresa la subunidad alfa 4 recombinante (véase, Elices et al., citado anteriormente).

Para producir homólogos de anticuerpo anti-VLA-4 que son inmunoglobulinas intactas, se cultivaron células de hibridoma que se determinaron como positivas en tales ensayos de selección en un medio de nutrientes en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que las células de hibridoma secreten los anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo. Técnicas de cultivo tisular y medios de cultivo adecuados para células de hibridoma se conocen bien. Puede recogerse el sobrenadante de cultivo de hibridoma condicionado y purificarse adicionalmente los anticuerpos anti-VLA4 mediante métodos bien conocidos.

Alternativamente, puede producirse el anticuerpo deseado inyectando las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón no inmunizado. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, secretando el anticuerpo que se acumula en el líquido ascítico. El anticuerpo puede recogerse extrayendo el líquido ascítico de la cavidad peritoneal con una jeringuilla.

Anteriormente se han descrito varios anticuerpos monoclonales anti-VLA-4 de ratón. Véanse, por ejemplo, Sánchez-Madrid et al., 1986, citado anteriormente; Hemler et al., 1987, citado anteriormente; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245). Estos anticuerpos monoclonales anti-VLA-4 tales como HP 1/2 y otros anticuerpos anti-VLA-4 (por ejemplo, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9) que pueden reconocer la cadena P de VLA-4 serán útiles en los métodos de tratamiento según la presente invención. Se prefieren los anticuerpos anti-VLA-4 que reconocerán los epítopos de cadena alfa 4 de VLA-4 que participan en la unión a ligandos de fibronectina y VCAM-1 (es decir, anticuerpos que pueden unirse a VLA-4 en un sitio que participa en el reconocimiento de ligandos y bloquear la unión a VCAM-1 y fibronectina). Tales anticuerpos se han definido como anticuerpos específicos del epítopo B (B1 o B2) (Pulido et al., 1991, citado anteriormente) y también son anticuerpos anti-VLA-4 según la presente invención.

Homólogos de anticuerpo monoclonal completamente humanos frente a VLA-4 son otro agente de unión preferido que puede bloquear o recubrir antígenos VLA-4 en el método de la invención. En su forma intacta pueden prepararse usando esplenocitos humanos sensibilizados in vitro, tal como se describe por Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Alternativamente, pueden prepararse mediante clonación de repertorio tal como se describe por Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 o por Huang y Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. La patente estadounidense 5.798.230 (25 de agosto de 1998, "Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use") que describe la preparación de anticuerpos monoclonales humanos de células B humanas. Según este procedimiento, se inmortalizan células B que producen anticuerpos humanos mediante infección con un virus Epstein-Barr, o un derivado del mismo, que expresa antígeno 2 nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA2). Posteriormente se desactiva la función de EBNA2, que se requiere para la inmortalización, lo que da como resultado un aumento en la producción de anticuerpos.

Aún en otro método para producir anticuerpos completamente humanos, la patente estadounidense 5.789.650 (4 de agosto de 1998, "Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies") describe animales no humanos transgénicos que pueden producir anticuerpos heterólogos y animales no humanos transgénicos que tienen genes de inmunoglobulina endógenos inactivados. Se suprimen genes de inmunoglobulina endógenos mediante polinucleótidos antisentido y/o mediante antisuero dirigido contra inmunoglobulinas endógenas. Se codifican anticuerpos heterólogos por genes de inmunoglobulina que no se encuentran normalmente en el genoma de esa especie de animal no humano. Se introducen uno o más transgenes que contienen secuencias de cadenas pesadas de inmunoglobulina humana heterólogas no reordenadas en un animal no humano formando así un animal transgénico que puede reordenar funcionalmente secuencias de inmunoglobulina transgénicas y producir un repertorio de anticuerpos de diversos isotipos codificados por genes de inmunoglobulina humanos. Tales anticuerpos humanos heterólogos se producen en células B que posteriormente se inmortalizan, por ejemplo, fusionándolas con una línea celular de inmortalización tal como un mieloma o manipulando tales células B mediante otras técnicas para perpetuar una línea celular que puede producir un homólogo de anticuerpo completamente humano, heterólogo, monoclonal.

También pueden usarse grandes bibliotecas de presentación de fagos humanos no inmunizados para aislar anticuerpos de alta afinidad que pueden desarrollarse como productos terapéuticos para seres humanos usando tecnología de fagos convencional (Vaughan et al, 1996). Aún otro agente de unión preferido que puede bloquear o recubrir antígenos de VLA-4 en el método de la invención es un homólogo de anticuerpo recombinante humanizado que tiene especificidad anti-VLA-4. Siguiendo a los primeros métodos para la preparación de anticuerpos quiméricos, se describió un nuevo enfoque en el documento EP 0239400 (Winter et al.) mediante el cual se alteran anticuerpos mediante sustitución de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) para una especie con las de otra. Este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para sustituir las CDR de dominios de región variable de Ig de cadena pesada y ligera humana con CDR alternativas de dominios de región variable murina. Estas regiones variables de Ig alteradas pueden combinarse posteriormente con regiones constantes de Ig humana para crear anticuerpos que tienen una composición totalmente humana excepto por las CDR murinas sustituidas. Se prevé que sería menos probable que tales anticuerpos con CDR sustituidas provoquen una respuesta inmunitaria en seres humanos en comparación con anticuerpos quiméricos debido a que los anticuerpos con CDR sustituidas contienen considerablemente menos componentes no humanos. El procedimiento para humanizar anticuerpos monoclonales mediante "injerto" de CDR se ha denominado "remodelado". (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536).

Normalmente, se trasplantan regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo murino en las regiones correspondientes en un anticuerpo humano, ya que las CDR (tres en cadenas pesadas de anticuerpo, tres en cadenas ligeras) son las regiones del anticuerpo de ratón que se unen a un antígeno específico. El trasplante de CDR se logra mediante ingeniería genética mediante lo cual se determinan secuencias de ADN de CDR mediante clonación de segmentos de genes de región variable (V) de cadena pesada y ligera murinas, y después se transfieren a regiones V humanas correspondientes mediante mutagénesis dirigida al sitio. En la fase final del procedimiento, se añaden segmentos de genes de región constante humana del isotipo deseado (normalmente gamma I para CH y kappa para CL) y se coexpresan los genes de cadena pesada y ligera humanizados en células de mamífero para producir anticuerpo humanizado soluble.

La transferencia de estas CDR a un anticuerpo humano confiere a este anticuerpo las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo murino original. Las seis CDR en el anticuerpo murino están montadas estructuralmente en una región marco ("framework") de región V. El motivo por el que el injerto de CDR es satisfactorio es porque las regiones marco entre anticuerpos de ratón y humanos pueden tener estructuras 3-D muy similares con puntos de unión similares para CDR, de tal manera que pueden intercambiarse CDR. Tales homólogos de anticuerpo humanizados pueden prepararse, tal como se muestra como ejemplo en Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; y Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

No obstante, se piensa que ciertos aminoácidos dentro de las regiones marco interaccionan con CDR e influyen en la afinidad de unión a antígeno global. La transferencia directa de CDR a partir de un anticuerpo murino para producir un anticuerpo humanizado recombinante sin ninguna modificación de los marcos de región V humana a menudo da como resultado una pérdida parcial o completa de afinidad de unión. En varios casos, parece ser crítico alterar residuos en las regiones marco del anticuerpo aceptor con el fin de obtener actividad de unión.

Queen et al., 1989 (citado anteriormente) y el documento WO 90/07861 (Protein Design Labs) han descrito la preparación de un anticuerpo humanizado que contiene residuos modificados en las regiones marco del anticuerpo aceptor combinando las CDR de un AcM murino (anti-Tac) con regiones constante y marco de inmunoglobulina humana. Han demostrado una solución al problema de la pérdida de afinidad de unión que a menudo resulta de la transferencia de CDR directa sin ninguna modificación de los residuos marco de la región V humana; su solución implica dos etapas clave. En primer lugar, se seleccionan las regiones marco V humanas por analistas informáticos para una homología de secuencia de proteína óptima con el marco de la región V del anticuerpo murino original, en este caso, el AcM anti-Tac. En la segunda etapa, se modela mediante ordenador la estructura terciaria de la región V murina con el fin de visualizar residuos de aminoácido marco que es probable que interaccionen con las CDR murinas y después se superponen estos residuos de aminoácido murinos sobre el marco humano homólogo. Véase también Protein Design Labs - patente estadounidense 5.693.762.

También puede usarse un enfoque diferente (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271) y utilizar, como patrón, los marcos de región V derivados de cadenas pesada y ligera NEWM y REI, respectivamente, para el injerto de CDR sin introducción de radicales de residuos de ratón. Una ventaja de usar el enfoque de Tempest et al. para construir anticuerpos humanizados basados en NEWM y REI es que las estructuras tridimensionales de las regiones variables de NEWM y REI se conocen a partir de cristalografía de rayos X y por tanto pueden modelarse las interacciones específicas entre CDR y residuos marco de región V.

Independientemente del enfoque tomado, los ejemplos de los homólogos de anticuerpo humanizado iniciales preparados hasta la fecha han mostrado que no es un procedimiento sencillo. Sin embargo, incluso reconociendo que tales cambios de marco pueden ser necesarios, no es posible predecir, basándose en la técnica anterior disponible, qué residuos marco, si los hay, serán necesarios alterar para obtener anticuerpos recombinantes humanizados funcionales de la especificidad deseada. Los resultados hasta ahora indican que los cambios necesarios para conservar la especificidad y/o la afinidad son en su mayor parte únicos para un anticuerpo dado y no pueden predecirse basándose en la humanización de un anticuerpo diferente.

Antagonistas preferidos útiles en la presente invención incluyen homólogos de anticuerpo recombinantes humanizados y recombinantes quiméricos (es decir, inmunoglobulinas intactas y porciones de las mismas) con especificidad por el epítopo B que se han preparado y descrito en la solicitud de patente estadounidense en tramitación junto con la presente con número de serie 08/004.798, presentada el 12 de enero de 1993, la publicación PCT US94/00266, presentada el 7 de enero de 1994. El material de partida para la preparación de homólogos de anticuerpo anti-VLA-4 quiméricos (V de ratón - C humana) y humanizados pueden ser un anticuerpo monoclonal murino anti-VLA-4 tal como se describió anteriormente, un anticuerpo monoclonal anti-VLA-4 comercialmente disponible (por ejemplo, HP2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine) o un anticuerpo monoclonal anti-VLA-4 preparado según las enseñanzas en el presente documento. Por ejemplo, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo HP 1/2 anti-VLA-4 se han clonado, secuenciado y expresado en combinación con regiones constantes de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina humana. Tal anticuerpo HP 1/2 tiene una especificidad y potencia similares al anticuerpo HP 1/2 murino, y puede ser útil en métodos de tratamiento según la presente invención.

Otros homólogos de anticuerpo anti-VLA4 humanizados preferidos se describen por Athena Neurosciences, Inc. en el documento PCT/US95/01219 (27 de julio de 1995). Estos anticuerpos anti-VLA-4 humanizados comprenden una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. La cadena ligera humanizada comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad correspondientes de una cadena ligera de inmunoglobulina 21.6 de ratón, y un marco de región variable de una secuencia marco de región variable de cadena ligera kappa humana excepto porque en al menos una posición la posición de aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del marco de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina 21.6 de ratón. La cadena pesada humanizada comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad correspondientes de una cadena pesada de inmunoglobulina 21.6 de ratón, y un marco de región variable de una secuencia marco de región variable de cadena pesada humana excepto porque en al menos una posición la posición de aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del marco de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina 21.6 de ratón.

Aplicaciones terapéuticas

En este método según el primer aspecto de la invención, se administran preferiblemente por vía parenteral agentes de unión a VLA-4, en particular, fusiones de VCAM y homólogos de anticuerpo anti-VLA-4. El término "parenteral" tal como se usa en el presente documento incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal.

Los agentes de unión a VLA-4 se administran preferiblemente como una composición farmacéutica estéril que contiene un excipiente farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquiera de los numerosos excipientes bien conocidos, tales como agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, o combinaciones de los mismos. Los compuestos de la presente invención pueden usarse en forma de sales farmacéuticamente aceptable derivadas de ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Entre tales sales de ácidos se incluyen las siguientes: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenil-propionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Las sales de bases incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino, tales como sales de sodio y de potasio, sales de metal alcalinotérreo, tales como sales de calcio y de magnesio, sales con bases orgánicas, tales como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina, tris(hidroximetil)metilamina y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, etcétera. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tales como cloruro, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo, tales como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo, haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquilo, tales como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. Así se obtienen productos dispersables o solubles en agua o aceite.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden cualquiera de los compuestos de la presente invención, o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, junto con cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable. El término "excipiente" tal como se usa en el presente documento incluye vehículos y adyuvantes aceptables. Excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicérido parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa
de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Según esta invención, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo una suspensión oleaginosa o acuosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse según técnicas conocidas en la técnica usando agentes de suspensión y agentes de dispersión o humectación adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites estériles, fijados, como medio disolvente o de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijado suave incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicérido son útiles en la preparación del producto inyectable, como lo son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas disoluciones o suspensiones en aceite también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como Ph. Helv o alcohol similar.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por vía parenteral o por vía oral. Si se administran por vía oral, pueden administrarse en cualquier forma farmacéutica aceptable por vía oral incluyendo, pero sin limitarse a, cápsulas, comprimidos, suspensiones o disoluciones acuosas. En el caso de comprimidos para su uso oral, excipientes que se usan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden normalmente agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para su uso oral, se combina el principio activo con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes. También pueden usarse parches transdérmicos por vía tópica. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden administrarse mediante aerosol nasal o inhalación mediante el uso de un nebulizador, un inhalador de polvo seco o un inhalador de dosis medida. Tales composiciones se preparan según técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como disoluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes de dispersión o solubilización convencionales.

Según otra realización, las composiciones que contienen un compuesto de esta invención también pueden comprender un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en corticosteroides, agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores, agentes antimetabolitos y agentes inmunomoduladores. Pueden seleccionarse compuestos específicos dentro de cada una de estas clases de cualquiera de los indicados en los encabezados de grupo apropiados en "Comprehensive Medical Chemistry", Pergamon Press, Oxford, Inglaterra, págs. 970-986 (1990). También se incluyen en este grupo compuestos tales como teofilina, sulfasalazina y aminosalicilatos (agentes antiinflamatorios); ciclosporina, FK-506 y rapamicina (agentes inmunosupresores); ciclofosfamida y metotrexato (agentes antimetabolitos); esteroides (inhalados, orales o tópicos) e interferonas (agentes inmunomoduladores).

La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales de excipiente para producir una forma farmacéutica única variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Sin embargo, debe entenderse que un régimen de tratamiento y una dosificación específicos para cualquier paciente particular dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos y el criterio del médico que le trate y la gravedad de la enfermedad particular que esté tratándose. La cantidad de principio activo también dependerá del agente terapéutico o profiláctico, si lo hay, con el que se administra conjuntamente el principio.

La dosificación y tasa de dosis de los compuestos de esta invención eficaces para prevenir, suprimir o inhibir la adherencia celular dependerá de una variedad de factores, tales como la naturaleza del inhibidor, el tamaño del paciente, el objetivo del tratamiento, la naturaleza de la patología que esté tratándose, la composición farmacéutica específica usada y el criterio del médico que le trate. Son útiles niveles de dosificación de entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día, preferiblemente de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal al día del principio activo. Lo más preferiblemente, el agente de unión a VLA-4, si es un anticuerpo o derivado de anticuerpo, se administrará a una dosis que oscila entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente que oscila entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día y a intervalos cada 1-14 días. Para los agentes de unión de moléculas pequeñas o distintos de anticuerpos, el intervalo de dosis debe estar preferiblemente entre cantidades equivalentes molares a esas cantidades de anticuerpo. Preferiblemente, una composición de anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para proporcionar un nivel en plasma de anticuerpo de al menos 1 mg/ml. Puede determinarse la optimización de dosificaciones mediante la administración de los agentes de unión, seguido por la evaluación del recubrimiento de células positivas para VLA-4 por el agente a lo largo del tiempo tras administrarse a una dosis dada in vivo.

Deben examinarse con sondas las células de mieloma contenidas en una muestra de la sangre periférica del individuo (o células de médula ósea) para determinar la presencia del agente in vitro (o ex vivo) usando un segundo reactivo para detectar el agente administrado. Por ejemplo, éste puede ser un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para el agente administrado que después se mide mediante análisis de FACS convencional (separador de células activado por fluorescencia). Alternativamente, puede detectarse la presencia del agente administrado in vitro (o ex vivo) mediante la incapacidad o la reducción de la capacidad de las células del individuo para unirse al mismo agente que se ha marcado en sí mismo (por ejemplo, mediante un fluorocromo). La dosificación preferida debe producir el recubrimiento detectable de la gran mayoría de las células positivas para VLA-4. Preferiblemente, se mantiene el recubrimiento en el caso de un homólogo de anticuerpo durante un periodo de 1-14 días.

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Modelos de animales

El modelo de animal se ha descrito en detalle (Garrett 1997). En resumen, Radl et al (1988) han descrito un modelo murino de mieloma que surgió espontáneamente en ratones envejecidos C57BL/KaLwRij. Este estado se produjo en aproximadamente 1 de cada 200 animales a medida que envejecían, y condujo a una gammapatía monoclonal con algunas características de la enfermedad humana (Radl 1988). Para desarrollar un modelo de animal mejor y más reproducible se ha establecido y subclonado una línea celular a partir de este mieloma murino denominada 5TGM1, y se ha encontrado que provoca lesiones en ratones características del mieloma humano, tales como osteólisis grave y la implicación de órganos no óseos incluyendo el hígado y el riñón (Garrett 1997). Los ratones a los que se inoculan células cultivadas desarrollan enfermedad de una manera sumamente predecible y reproducible, lo que incluye formación de una gammapatía monoclonal y lesiones óseas radiológicas. Además, algunos de los ratones se volvieron hipercalcémicos, y las lesiones óseas se caracterizan por un aumento de actividad de los osteoclastos. Por tanto, basándose en la exploración histológica de los órganos afectados en ratones portadores de 5TGM1 y en el aumento de los niveles en suero de IgG2b, se define 5TGM1 como un mieloma murino que recapitula con precisión las características distintivas de la enfermedad humana.

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren adicionalmente ciertas realizaciones preferidas de la invención y no se pretende que sean de naturaleza limitativa. En los siguientes ejemplos, las enzimas de restricción, plásmidos y otros reactivos y materiales necesarios pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales y la clonación, el ligamiento y otra metodología de ADN recombinante pueden realizarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

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Ejemplo 1 Materiales y métodos Células de mieloma 5TGM1

Inicialmente se derivaron células de mieloma 5TGM1 de un mieloma que surgió espontáneamente en ratones envejecidos C57BL/KaLwRij (Garrett 1997, Vanderkerken 1997). Se hicieron crecer las células en medio de Dulbecco modificado por Isocove (IMDM, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Summit, Fort Collins, CO) y disolución de penicilina-estreptomicina al 1% (GIBCO, Grand Island, NY) a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5%. Para la experimentación in vitro descrita a continuación, se usaron células 5TGM1 entre el pase 25 y el 30.

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Anticuerpos, VCAM-1 soluble

Los anticuerpos neutralizantes frente a VCAM-1 murina (M/K-2.7), integrina VLA-4 (PS/2) y molécula de adherencia intercelular 1 (ICAM-1, YN1/1.7) fueron una generosa donación del Dr. Kensuke Miyake (Saga Medical University, Saga, Japón). La VCAM-1 soluble recombinante (Lobb et al, 1991), que contenía los 7 dominios extracelulares de VCAM-1 humana, fue una donación del Dr. Roy Lobb, Biogen Inc., Cambridge, MA.

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Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)

Usando RT-PCR, se confirmó la expresión de VCAM-1 e integrina alfa 4 en células del estroma de la médula ósea y 5TGM1, respectivamente. Se preparó ARN total a partir de 5TGM1, un cultivo primario de células del estroma de la médula ósea y una línea celular del estroma de la médula ST2 (RIKEN Cell Bank, Tsukuba, Japón) mediante el método de aislamiento de ARN en una única etapa usando el reactivo TRIzol (GIBCO). Se incubaron tres \mug de ARN con 50 ng de hexámero al azar a 70ºC durante 10 min. y se enfriaron sobre hielo, después se convirtieron en ADNc de primera cadena usando transcriptasa inversa (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores usados para la PCR fueron los siguientes: cebador en 5' de VCAM-1 murina; 5'-OH-GCTGCGCGTCACCATTGTTCTC-3'-OH [SEQ ID NO: 1]; cebador en 3' de VCAM-1 murina; 5'-OH-ACCACCCTCTTGAAGCCTTGTG-3'-OH [SEQ ID NO: 2]; cebador en 5' de integrina alfa 4 murina; 5'-OH-CCCCTCAACACGAACAGATAGG-3'-OH [SEQ ID NO: 3]; cebador en 3' de integrina alfa 4 murina; 5'-OH-GCCTTGTCCTTAGCAACACTGC-3'-OH [SEQ ID NO: 4].

Se realizó la PCR durante 30 ciclos que consistieron en 1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC y 2 min. a 72ºC. La mezcla de reacción de PCR (50 \mul totales) contenía 10 microlitros. ADNc de primera cadena, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 2 mM, mezcla de desoxi-NTP (0,2 mM cada uno), el par de cebadores (0,15 micromolar cada uno) y 2 U de ADN polimerasa de Taq (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Se separaron los productos de PCR sobre geles de agarosa al 2,5% que contenían bromuro de etidio y se visualizaron con luz ultravioleta. Se confirmó el tamaño de los fragmentos mediante referencia a marcadores de peso molecular.

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Unión de células 5TGM1 sobre células del estroma de la médula ósea

Para los ensayos de adherencia célula-célula heterotípicos, se sembraron células ST2 (5 e4/pocillo) en placas de cultivo de 48 pocillos (Costar, Cambridge, MA) y se cultivaron durante 48 h en alfaMEM complementado con FBS al 10% hasta la confluencia. Se marcaron células 5TGM1 (5 e6) mediante incubación con [metil-3H]timidina 10 microCi (New England Nuclear) durante 24 h a 37ºC en el medio de cultivo. Tras formarse la monocapa de ST2, se incubó con albúmina sérica bovina al 1% (BSA, Sigma, St Louis, MO) en alfaMEM libre de suero durante 1 hora y se sembraron las células 5TGM1 marcadas con tritio sobre la monocapa. Se incubó el sistema en ausencia o en presencia de anticuerpos frente a VCAM-1 o integrina alfa 4/beta 1 a 37ºC durante 1 h. Se eliminaron las células no adherentes mediante lavado con ácido tricloroacético al 5% dos veces y PBS dos veces, y se solubilizaron las células adherentes en 300 microlitros de NaOH 0,25 mM, se neutralizaron con el mismo volumen de HCl 0,25 mM y se determinó la radiactividad en un contador de centelleo líquido.

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Ensayo de formación de osteoclastos en el cocultivo de 5TGM1 y células de médula ósea de ratón

Se obtuvieron células de médula ósea de ratón a partir de ratones C57BL macho de 5 semanas de edad tal como se describió anteriormente (Yoneda 1993). Se disecaron de manera aséptica fémures y tibias y se cortaron ambos extremos. Se extrajeron mediante lavado las células de médula ósea, se recogieron y se incubaron en alfaMEM complementado con FBS al 10% (Hyclone, Logan, UT) y penicilina-estreptomicina al 1% en placas de cultivo de 100 mm (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) a 37ºC durante 2 h. Se recogieron las células no adherentes que contenían precursores de osteoclastos hematopoyéticos y células del estroma. Se sembraron células de médula ósea (1 e6) y células 5TGM1 (1 e3) en 300 microlitros del medio de cultivo sobre placas de cultivo de 48 pocillos (día 0). El día 2, se añadieron suavemente 300 microlitros de medio de cultivo reciente a cada pocillo, y el día 4, se sustituyeron 300 microlitros de medio gastado con el mismo volumen de medio reciente. El día 6, se fijaron los cultivos y se tiñeron para detectar fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) usando kits comerciales (Sigma). Se definieron células multinucleadas positivas para TRAP con más de 3 núcleos como células de tipo osteoclasto (de tipo OC), y se contaron manualmente al microscopio. Para confirmar que estas células de tipo OC tienen la capacidad de resorber hueso, se cocultivaron células 5TGM1 y células de médula sobre cortes de diente de ballena de 5 x 5 mm en las mismas condiciones, y se examinaron las fosas de resorción formadas sobre estos cortes de dientes mediante microscopía electrónica de barrido tal como se describe (Yoneda 1992).

En algunos experimentos, se realizaron cocultivos de células de mieloma 5TGM1 y células de médula usando insertos Transwell (Becton Dickinson Labware) para evitar el contacto directo entre estos dos tipos de células (2 e6, placas de 24 pocillos, Costar). Se sembraron células de médula en las cámaras inferiores y entonces se sembraron células de mieloma 5TGM1 (2 e3) en cámaras o bien inferiores (contacto directo) o bien superiores (sin contacto).

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Cultivos de órganos de huesos largos de rata fetal marcados con 45Ca

Se sometieron a ensayo medios condicionados recogidos de cultivos de 5TGM1 para determinar la actividad de resorción ósea mediante cultivos de órganos de huesos largos de rata fetal marcados con 45Ca tal como se describió anteriormente (Mbalaviele 1995). Se inyectaron a ratas durante el periodo de gestación 250 uCi de 45Ca (New England Nuclear) en día 18 de gestación. Se obtuvieron diáfisis de radio y de cúbito a partir de fetos de 19 días mediante microdissección, y se cultivaron previamente durante 24 h en medio BGJ (Sigma) complementado con BSA al 0,1% entre aire y fase líquida sobre rejillas de malla inoxidable. Después se cultivaron los huesos en presencia de medios condicionados (50% v/v) o en medio de control durante 120 horas. Se cambiaron los medios una vez a las 48 horas. Al final del cultivo, se incubaron los huesos en ácido tricloroacético al 5% helado durante 2 h, y se determinó la radiactividad de 45Ca en huesos y medios en un contador de centelleo líquido. Se cuantificó la resorción ósea como el porcentaje de 45Ca liberado en el medio a partir de los huesos según se calcula mediante:

(recuento de 45Ca en el medio)/(recuento de 45Ca en el medio y el hueso) x 100.

Cocultivo de células de mieloma 5TGM1 con células ST2 de línea de células del estroma de ratón

Se sembraron células ST2 (0,5 e6) y 5TGM1 (4 e6) juntas sobre placas de cultivo de 60 mm (Beckton Dickinson) en IMDM complementado con FBS al 10% y se cultivaron durante la noche, se lavaron con IMDM libre de suero dos veces y se incubaron en 5 ml de IMDM libre de suero. Tras 48 h, se recogieron los medios condicionados y se almacenaron a -70ºC hasta su uso.

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Efecto de AcM PS2 frente a VLA-4 sobre el aumento de IgG2b en suero en ratones portadores de 5TGM1

Se inyectaron a ratones 1 e5 células 5TGM1, que se dejó que colonizaran la médula ósea. Se dividieron los ratones en dos grupos de tres, sirviendo uno como grupo control y tratándose el segundo bisemanalmente comenzando el día 8 con 80 \mug de AcM PS/2 (4 mg/kg). Se midió semanalmente desde la semana 1 hasta la 6 los niveles de IgG2b, el isotipo de anticuerpo producido por células de mieloma 5TGM1.

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Resultados Expresión de VCAM-1, VLA-4 y efecto de anticuerpos frente a VCAM-1 y VLA-4 sobre la unión de 5TGM1 a monocapas de ST2

Usando RT-PCR, se confirmó la expresión de VCAM-1 e integrina VLA-4 en células del estroma de la médula ósea y células de mieloma, respectivamente. Tal como se esperaba, tanto la línea de células del estroma ST2 como las células del estroma de la médula ósea primarias expresaron VCAM-1, mientras que las células 5TGM1 no lo hicieron. En cambio, las células de mieloma 5TGM1 expresaron integrina VLA-4, mientras que las células del estroma no lo hicieron (datos no mostrados). Además, tanto el anticuerpo anti-VCAM-1 (10 \mug/ml) como el anticuerpo frente a VLA-4 (10 \mug/ml) inhibieron parcialmente (50-80%) la unión de células 5TGM1 a monocapas de ST2, mostrando que la VCAM-1 y la integrina VLA-4 expresadas sobre estas células son biológicamente funcionales y que estos anticuerpos tienen una actividad neutralizante (datos no mostrados).

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Formación de células de tipo OC en el cocultivo de células de mieloma 5TGM1 con células de médula ósea de ratón

El día 6 del cocultivo de células 5TGM1 y células de médula de ratón, se formaron numerosas células de tipo osteoclasto (de tipo OC) multinucleadas positivas para TRAP. Estas células de tipo OC mostraron formación de una fosa de resorción sobre cortes de dientes, demostrando que estas células podían resorber hueso, y que presentan un fenotipo osteoclástico. En experimentos usando insertos Transwell, se observó formación de células de tipo OC cuando se cultivaron células 5TGM1 en contacto directo con células de médula ósea. En cambio, sólo hubo un número mínimo de células de tipo OC formadas cuando se separaron las células 5TGM1 de las células de médula mediante la membrana Transwell. Por tanto, las células 5TGM1 inducen formación de osteoclastos en cultivos de médula mixtos, y esta inducción requiere el contacto directo célula-célula.

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Efecto de anticuerpos frente a VCAM-1 e integrina VLA-4 sobre la formación de células de tipo OC en el cocultivo de células 5TGM1 y de médula

Tanto el anticuerpo anti-VCAM-1 (Ac frente a VCAM-1, 10 \mug/ml) como el anticuerpo anti-integrina VLA-4 (Ac frente a alfa 4/beta 1, 10 \mug/ml) inhibieron drásticamente la formación de células de tipo OC. En cambio, el AcM frente a ICAM-1, otra molécula de adherencia sobre células del estroma de la médula que participan en interacciones estroma/mieloma, no tuvo ningún efecto sobre la formación de células de tipo OC (figura 1).

Para determinar si esta inhibición por AcM frente a VCAM-1 y VLA-4 era específica para la formación de células de tipo OC inducida por 5TGM1 y no se debía a citotoxicidad, se examinaron los efectos de estos anticuerpos sobre la formación de células de tipo OC inducida por 1,25 (OH)_{2}D_{3}, un estimulante de la osteoclastogénesis ampliamente usado en cultivos de células de médula ósea de ratón (Takahashi 1988). Ni el Ac frente a VCAM-1 ni el AcM frente a VLA-4 inhibieron la formación de células de tipo OC inducida por la vitamina D3, que en sí misma no tenía ningún efecto sobre la expresión de VCAM-1 en células del estroma (datos no mostrados).

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Efecto del medio condicionado recogido del cocultivo de 5TGM1 y ST2 sobre la resorción ósea

El medio condicionado del cocultivo de células 5TGM1 y células ST2 mostró un marcado aumento en la resorción ósea en el ensayo de huesos largos de rata fetal (figura 2), mientras que el medio condicionado de 5TGM1 sólo provocó un aumento mínimo, en comparación con el medio de control. El medio condicionado a partir de células ST2 no mostró aumento en la resorción ósea. Por tanto, el contacto directo célula-célula mediante VCAM-1 y VLA-4 inducen ambos células de tipo osteoclasto y producción de factores de resorción ósea in vitro.

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Efecto de VCAM-1 soluble recombinante (sVCAM-1) sobre la producción de resorción ósea y la actividad osteoclastogénica por células 5TGM1

El medio condicionado de 5TGM1 tratadas con una forma recombinante soluble de VCAM-1 (sVCAM-1) aumentó la resorción ósea en huesos largos de rata fetal de una manera dependiente de la dosis, mientras que el medio condicionado obtenido a partir de 5TGM1 sin tratar sólo aumentó mínimamente la resorción ósea. El propio VCAM-1 soluble no tuvo efectos sobre la resorción ósea (datos no mostrados). En el sistema de cultivo de médula de ratón, el medio condicionado recogido de células 5TGM1 tratadas con sVCAM-1 mostró un aumento en la actividad de formación de células de tipo OC, mientras que el medio condicionado de 5TGM1 sin tratar sólo mostró una actividad mínima de formación de células de tipo OC (figura 3).

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Expresión de ARNm de ligando Rank en células del estroma de la médula (ST2) cultivadas en presencia y ausencia de células de mieloma murinas

Dado que el ligando Rank parece ser un mediador importante en la formación de OCL y puede ser la ruta común final para los efectos de citocinas osteoclastogénicas en la formación de OCL, se ha examinado la expresión del ligando Rank en células 5TGM1 y ST2 tanto individualmente como cocultivadas. Se encontró que el cocultivo de células 5TGM1 y ST2 induce ARNm de ligando Rank en las células ST2. Además, aunque las células 5TGM1 no expresan ligando Rank, lo hacen cuando se tratan con sVCAM-1 (no mostrado). Finalmente, el medio condicionado a partir de células 5TGM1 tratadas con sVCAM-1 indujo ARNm de ligando Rank en células ST2, sugiriendo que la ruta VCAM-1/VLA-4 produce una citocina en células de mieloma que potencia la expresión de ligando Rank por células del estroma de la médula (datos no mostrados).

En resumen, se muestra que las células 5TGM1 solas producen una cantidad mínima de actividad que estimula la formación de células de tipo OC y la resorción ósea. Sin embargo, cuando se cocultivan células de mieloma 5TGM1 con células de médula ósea que contienen precursores de osteoclastos hematopoyéticos y células del estroma, se adhieren fuertemente a las células del estroma y aumentan la formación de células de tipo OC. No se formaron células de tipo OC en los cocultivos en los que se evitó que las células 5TGM1 entrasen en contacto con las células del estroma. Además, en cultivos de órganos de huesos largos de rata fetal, el medio condicionado recogido de los cocultivos de células de mieloma 5TGM1 y células del estroma de la médula ósea ST2 tuvo un aumento de la actividad de resorción ósea en comparación con el medio condicionado o bien de ST2 o bien de 5TGM1 solas. Estos datos son coherentes con la noción de que se requiere el contacto directo célula-célula de células 5TGM1 con células del estroma de la médula ósea para la producción de actividad estimulante de osteoclastos y de resorción ósea. Después se determinó qué moléculas de adherencia celular participaban en la interacción directa célula-célula entre células 5TGM1 y células del estroma de la médula que es necesaria para la producción de actividad osteoclastogénica. Los datos indican que VCAM-1 y la integrina VLA-4 desempeñan un papel en esta interacción célula-célula, ya que anticuerpos neutralizantes frente a estas dos moléculas de adherencia redujeron profundamente la formación de células de tipo OC en los cocultivos. La interacción VCAM-1/integrina VLA-4 es responsable de la comunicación célula-célula entre células del estroma de la médula y células de mieloma 5TGM1 que conduce a un aumento de la producción de una actividad osteoclastogénica y de resorción ósea. Finalmente, esta actividad de resorción ósea se debe en parte a la inducción de ligando Rank.

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Ejemplo 2 Experimentos in vivo

Los estudios in vitro sugieren que la interacción entre VLA-4 sobre células de mieloma y VCAM-1 sobre células del estroma de la médula puede desempeñar un papel clave en la inducción de actividad de resorción ósea por el mieloma. Se ha tomado la etapa clave de someter a prueba esta hipótesis in vivo en un modelo de animal que refleja con precisión la enfermedad humana.

A. En este experimento, se inyectaron a ratones 1 e5 células de mieloma 5TGM1, que después se dejó que colonizaran la médula ósea. Se dividieron los ratones en dos grupos de tres, sirviendo uno como grupo control y tratándose el segundo bisemanalmente comenzando el día 8 con AcM PS/2. Se midieron semanalmente desde la semana 1 hasta la 6 los niveles de IgG2b, el isotipo de anticuerpo producido por células de mieloma 5TGM1. El tratamiento con AcM a una dosis de 80 \mug por inyección (\sim4 mg/kg) bisemanalmente inhibió fuertemente la producción de IgG2b, lo que es indicativo de una inhibición significativa de la supervivencia y el crecimiento de células de mieloma in vivo (figura 4). Además, los ratones tratados mostraron una reducción de la incidencia de paraplejía (los 3 animales no tratados mostraron paraplejía el día 42, mientras que sólo uno de los animales tratados mostró paraplejía). Los dos animales tratados sin paraplejía también mostraron una reducción en el peso del bazo y del hígado, lo que también se correlaciona con la carga de tumor. Finalmente, los animales tratados mostraron una reducción en el área del tumor mediante histología (desde 6,71 +/- 1,74 hasta 0,05 +/- 0,08 milímetros cuadrados) en la tibia y los fémures. No hubo ningún efecto de tratamiento sobre los niveles de calcio en el suero (datos no mostrados).

B. En un experimento paralelo, el tratamiento con 40 \mug de PS/2 bisemalamente no tuvo ningún efecto sobre los niveles de IgG2b (no mostrado). Estos datos muestran que el AcM PS/2 frente a VLA-4 inhibe fuertemente el crecimiento de células de mieloma establecidas de una manera dependiente de la dosis.

C. En otro experimento in vivo, se inyectaron a 18 ratones SCID células de mieloma 5TGM1 en el día 0. Se trataron cuatro ratones con PBS; se trataron 4 ratones en un protocolo profiláctico con AcM M/K-2.7 reactivo frente a VCAM-1 de ratón a una dosificación de 80 \mug (-4 mg/kg) cada 3 días comenzando el día -1 (es decir, los días -1, 2, 5, 8 y 11). En un experimento paralelo usando el mismo protocolo, se trataron cinco ratones con 160 \mug de AcM M/K-2.7. Además, se trataron cinco ratones con 160 \mug de AcM M/K-2.7 comenzando el día 8 (es decir, los días 8, 11, 14, 17 y 20) en un protocolo terapéutico. Se extrajo suero de todos los ratones en los días 21, 28 y 35, y se sometieron los animales a rayos X y después se sacrificaron para la histología en el día 35. Los tres grupos de tratamiento mostraron una reducción en los niveles de IgG2b en suero, lo que es indicativo de una reducción en la carga de células de mieloma (figura 5). También se observó un efecto significativo sobre los pesos del bazo en el protocolo profiláctico a dosis baja con respecto al control (0,23 +/- 0,14 g para el control frente a 0,08 +/- 0,04 para los tratados). En el grupo de dosis alta profiláctica, 4 de 5 animales mostraron una clara reducción en el peso del bazo, pero el valor global no fue significativo debido a un animal con un gran peso del bazo (datos no presentados).

D. Puede investigarse si una dosis en bolo alta inicial de antagonista de integrina alfa 4, seguida por una dosis de mantenimiento, mejora la eficacia. Las células de mieloma ya están establecidas en el compartimiento de la médula y es necesario inhibir su estrecha interacción dependiente de VLA-4 con VCAM-1. Además, presumiblemente cuanto mayor es el número de células de mieloma establecidas, mayor es la dosis inicial requerida para extraer las células mediante lavado hacia la circulación periférica.

Por tanto, se realizó un estudio más grande con el anticuerpo PS/2 anti-VLA-4. Se inyectaron a veintiocho ratones SCID células de mieloma 5TGM1 en el día 0. Nueve ratones no recibieron tratamiento; 9 ratones recibieron un AcM frente a IgG de control de isotipo correspondiente; 10 ratones se trataron con AcM PS/2 frente a integrina alfa 4. Se administró un régimen terapéutico diferente, en el que se administró a los ratones una dosis alta de AcM (200 \mug) en los días 4, 5 y 6, después una dosis de mantenimiento de 80 \mug (\sim 4 mg/kg) cada 3 días comenzando el día 8.

Hubo una reducción estadísticamente significativa en la IgG2b en suero cuando se comparó el grupo tratado o bien con el grupo sin tratar o bien con el grupo tratado con IgG control en las semanas 3 y 4 (datos no presentados). De manera importante, cuando se comparó el grupo tratado o bien con el grupo sin tratar o bien con el grupo tratado con IgG control hubo un claro efecto sobre la supervivencia (figura 6).

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Ejemplo 3 Otros experimentos in vivo

Basándose en la información presentada en el presente documento por primera vez, los expertos habituales en la técnica pueden confirmar y ampliar fácilmente la importancia de las integrinas alfa 4 y sus ligandos en el mieloma múltiple usando el modelo de animal murino descrito.

La siguiente serie de experimentos están bien dentro del nivel de experiencia en la técnica basándose en la presente descripción pero sirven meramente para mostrar a modo de ejemplo, y no para limitar, los tipos de trabajo.

1) Respuesta a la dosis para AcM PS/2 para determinar la dosis de mantenimiento bisemanal óptima. 80 \mug muestran buena eficacia, pero 40 \mug no tuvieron efecto. Se examinan dosis superiores hasta 20 mg/kg dos o tres veces por semana para determinar la administración óptima.

2) Pacientes presentes con enfermedad en diferentes fases de gravedad, relacionadas con aumento de la carga del tumor. Se examina la eficacia de AcM PS/2 administrado en diferentes momentos tras el establecimiento de la enfermedad, es decir se compara el inicio del tratamiento a los 8 días (véase por ejemplo la figura 4) con el inicio tras dos, tres, cuatro y cinco semanas tras la inoculación para ver cómo de tarde puede administrarse AcM para proporcionar cierto alivio de los síntomas.

3) Se examinan los efectos de AcM MK-2 frente a VCAM-1 murina, siguiendo los mismos parámetros expuestos anteriormente (administración, momento de administración) para AcM frente a VLA-4. Se anticipa que se requerirán niveles de administración similares para observar eficacia.

4) Se examinan marcadores adicionales de la evolución del mieloma, incluyendo carga del tumor tanto en médula como en sitios extramedulares, cuantificación de lesiones óseas mediante análisis radiográfico del esqueleto mediante histomorfometría; medición de tasas de resorción ósea mediante evaluación de reticulaciones de colágeno en el plasma; medición de la producción de proteína monoclonal en el plasma; hipercalcemia cuando está presente; y mortalidad.

5) Se trata actualmente de manera ineficaz el mieloma múltiple con regímenes quimioterápicos convencionales. Se examinan los efectos aditivos o sinérgicos de AcM a dosificación óptima junto con, o bien antes o bien después, administración con regímenes quimioterápicos apropiados.

6) Se examina la capacidad de un inhibidor de integrina alfa 4 de molécula pequeña que es selectivo para una integrina alfa 4 particular o es selectivo para varias integrinas alfa 4 a la vez o la capacidad de combinaciones de tales inhibidores, para imitar los efectos de AcM y bloquear la evolución del mieloma usando los protocolos y desenlaces descritos anteriormente. Los inhibidores de molécula pequeña se administran por vía parenteral o por vía oral, en el intervalo de dosificación de 0,1 a 30 mg/kg, una o dos veces al día, o dos o tres veces por semana.

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Claims

1. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado de:

(a): un anticuerpo anti-VLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo;

(b): un anticuerpo anti-integrina alfa 4/beta 7 o fragmento de unión a antígeno del mismo; y

(c): un anticuerpo anti-VCAM-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo,

para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del mieloma múltiple, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

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2. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado de:

(a): un anticuerpo anti-VLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo;

(c): un anticuerpo anti-VCAM-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo,

para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la resorción ósea asociada con tumores de médula ósea, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

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3. Uso de un polipéptido VLA-4 o VCAM-1 soluble que antagoniza la interacción VLA-4/VCAM-1 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del mieloma múltiple.

4. Uso de un polipéptido VLA-4 o VCAM-1 soluble que antagoniza la interacción VLA-4/VCAM-1 para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la resorción ósea asociada con un tumor de médula ósea.

5. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo anti-VLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado del grupo que consiste en: un anticuerpo HP1/2 o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo HP2/1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo HP2/4 o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo L25 o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo P4C2 o fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo P4G9 o fragmento de unión a antígeno del mismo.

6. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo anti-VLA-4 humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada, comprendiendo cada una de la cadena ligera y la cadena pesada regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de anticuerpo anti-VLA-4 de ratón 21.6.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que

(a): la cadena ligera humanizada comprende un marco de región variable de una secuencia marco de región variable de cadena ligera kappa humana, en la que al menos una posición de aminoácido de la región marco está ocupada por el aminoácido presente en la posición equivalente del marco de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón 21.6; y

(b): la cadena pesada humanizada comprende un marco de región variable de una secuencia marco de región variable de cadena pesada humana, en la que al menos una posición de aminoácido de la región marco está ocupada por el aminoácido presente en la posición equivalente del marco de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón 21.6.

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8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido está configurado para su administración parenteral.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o polipéptido es adecuado para su uso en combinación con uno o más de: un corticosteroide, un antiinflamatorio, un inmunosupresor, un antimetabolito y un inmunomodulador.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 5 a 9, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 5 a 10, en el que el anticuerpo anti-VLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la cadena alfa de VLA-4.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 5 a 11, en el que el anticuerpo anti-VLA-4 o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo anti-VLA-4 específico del epítopo B o fragmento de unión a antígeno del mismo.