CN1236815C - 整联蛋白拮抗剂在制备治疗多发性骨髓瘤和骨髓瘤诱发的骨吸收的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明描述了α4整联蛋白/α4整联蛋白配体粘着的拮抗剂，该拮抗剂可抑制这种粘着的生物学效应，本发明还详细描述了所述拮抗剂的使用方法。该拮抗剂对于抑制多发性骨髓瘤相关的骨破坏是有用的。导致多发性骨髓瘤患者骨破坏的多发性骨髓瘤细胞返回骨髓及其α4整联蛋白依赖性骨吸收因子释放均受到抑制。

Description

整联蛋白拮抗剂在制备治疗多发性骨髓瘤和骨髓 瘤诱发的骨吸收的药物中的应用

                    本发明的领域

本发明涉及治疗多发性骨髓瘤和骨髓瘤细胞的骨吸收因子释放，其中骨吸收因子释放将导致严重骨损失，后者是人骨髓瘤的主要副效应。更具体地，本发明涉及整联蛋白拮抗剂，例如包含α4的整联蛋白的拮抗剂，其可抑制与多发性骨髓瘤细胞返回骨髓相关的粘着的生物学效应；多发性骨髓瘤细胞随后的整联蛋白依赖性存活；以及导致多发性骨髓瘤患者骨破坏的整联蛋白依赖性骨吸收因子释放。

                     本发明的背景

多发性骨髓瘤是第二大常见血液恶性肿瘤，每年诊断出15,000个新病例，在美国每年有30,000-40,000个骨髓瘤患者(Mundy和Bertolini 1986)。80％患者患有因破骨细胞(OCL)形成和活性的增加引起的破坏性骨溶解骨破坏(Mundy和Bertolini 1986)。这种骨破坏会引起极为痛苦的骨痛、病理性骨折、脊髓受压和危及生命的高血钙。因为多发性骨髓瘤不能通过标准的化疗或干细胞移植治愈(Attal等，1996)，而且由于骨髓瘤骨疾病的严重发病率和潜在的死亡率，所以控制骨髓瘤本身的生长尤其是这些患者中发生的骨溶解性骨破坏的治疗策略是至关重要的。

然而，导致多发性骨髓瘤患者破骨细胞活性增加的病理机制是未知的(Mundy，1998)。骨损伤发生的形式有几种。有时，患者会出现孤立性浆细胞瘤相关的不连续骨溶解损伤。一些患者患有弥散性骨质减少(osteopenia)，该病表面上类似于骨质疏松，是由弥散分布在整个中轴骨骼的骨髓瘤细胞导致的。大多数患者在骨髓瘤细胞巢附近有多个不连续溶解损伤。在大约三分之一的晚期疾病患者中骨破坏的结果是高血钙的发生。在很少情况下，骨髓瘤患者没有溶解性损伤或骨损失，而是在骨髓瘤细胞周围出现新骨形成的增加。这种罕见的情况被称作骨质硬化骨髓瘤。

至今为止，骨溶解性骨损伤是骨髓瘤患者中最常见的骨骼临床表现(Mundy，1998)。尽管确切的分子机制仍不清楚，但超过15年的观察显示：1)骨髓瘤中骨破坏的机制是通过破骨细胞，一种正常的骨吸收细胞来实现的；2)骨髓瘤中破骨细胞在骨髓瘤细胞集中区域附近的骨吸收表面上集聚，而且骨髓瘤中破骨细胞激活的机制似乎是一种局部机制；3)多年来已经知道人骨髓瘤细胞的体外培养物可产生几种破骨细胞激活因子，包括淋巴毒素α(LT-α)、白介素-1(IL-1)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)和白介素-6(IL-6)；4)大约三分之一的骨髓瘤患者在病程的某个时期将发生高血钙。高血钙总是与骨吸收的明显增加相关，并经常与肾小球滤过损伤相关；5)骨髓瘤中破骨细胞的骨吸收增加通常与成骨细胞功能的明显削弱有关。与患有其它类型骨溶解性骨疾病的患者不同，该疾病患者的血清碱性磷酸酶活性降低或处于正常范围，而且辐射性核素扫描没有显示出摄取增加的迹象，说明成骨细胞的损伤与骨吸收的增加相对应。

尽管以上列出的各种介质均参与多发性骨髓瘤患者的破骨细胞活性刺激，但骨髓瘤细胞产生的因子的报道并不一致，而且由于在多发性骨髓瘤细胞群体中存在其它污染细胞类型，包括基质细胞和巨噬细胞，一些研究一直是不确定的。IL-6是增强几种骨髓瘤细胞系和从患者中新鲜分离的骨髓瘤细胞生长的主要骨髓瘤生长因子(Bataille等，1989)。通过PCR可在大约40％新鲜分离的骨髓瘤细胞中检测到IL-6的产生，但研究的150个病人中仅有1人通过免疫细胞化学或ELISA分析可检测到IL-6产生(Epstein 1992)。在来自多发性骨髓瘤患者的13个样品中仅有6个检测到IL-6受体(Bataille等，1992)。而且，已报道成熟的骨髓瘤细胞对IL-6的增殖应答很小。白介素11(IL-11)在浆细胞瘤中具有IL-6样活性，但至今为止没有人证明骨髓瘤细胞产生IL-11。Bataille及其同事(1995)显示，用IL-6的抗体灌注5个顽固性骨髓瘤患者仅减小了其中2名患者的骨髓瘤细胞负荷的大小。IL-1是一种极为有效的骨吸收试剂，在无肾衰竭的动物模型中可诱导高血钙(Boyce等，1989)。相反，在无肾衰竭的骨髓瘤患者中高血钙很少发生。更为重要的是，在高度纯化的骨髓瘤细胞中，不能检测到IL-1的产生并仅能检测到很少的TNFα产生，这暗示了其他污染细胞类型如巨噬细胞可能是IL-1和TNFα的来源(Epstein 1992)。同样，大多数人骨髓瘤细胞系可产生LT-α(Bataille等，1995)，但体内骨髓瘤细胞并没有表现出可产生LT-α(Alsina等，1996)。除IL-1、TNFα、LT-α和IL-6之外，骨髓瘤细胞还产生具有生物学活性的截短形式M-CSF，但在人骨髓培养物中M-CSF本身并不引起高血钙或诱发破骨细胞形成(MacDonald等，1986)。

因此，这些因子在骨髓瘤患者的骨溶解性骨疾病中的作用均没有在体内阐述清楚，很明显，已知的细胞因子不能完全解释这些患者中所观察到的骨吸收。

        粘着分子相互作用在骨髓瘤骨疾病中的作用

Anderson和其同事的研究小组首次阐述了骨髓瘤细胞与骨髓微环境中的细胞之间的粘着相互作用在骨髓瘤细胞生长和骨溶解性骨疾病发生中的重要性。多发性骨髓瘤细胞表达细胞表面粘着分子CD29(VLA-4)、LFA-1和CD44(Chauhan等，1995)。这些工作者提示，骨髓瘤细胞通过细胞外基质蛋白和骨髓基质细胞间的特异粘着相互作用定位于骨髓。而且他们显示，多发性骨髓瘤细胞与基质细胞的粘着触发来自正常骨髓和多发性骨髓瘤骨髓的基质细胞分泌IL-6，以及IL-6介导的肿瘤细胞生长增加。然而，抗CD29、LFA-1或CD44的抗体并不降低骨髓瘤细胞相应的骨髓基质细胞产生IL-6，提示另一种配体-受体相互作用触发了与骨髓瘤细胞结合的骨髓基质细胞分泌IL-6。可能的粘着途径的单纯鉴定并不必然意味着该途径是重要的。这里，所有相关的途径均不在IL-6的产生中起作用。

Vanderkerken等(1997)还在鼠骨髓瘤模型中研究过鼠5T2细胞和5T33骨髓瘤细胞的表型粘着概貌。这些研究者显示，这些细胞系表达VLA-4、VLA-5、LFA-1和CD44，并提示这些粘着相互作用可能对于骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞的结合是重要的。

然而，尽管许多实验室获得了进展，但对体内骨髓瘤中破骨细胞骨破坏增加的基本机制仍了解很少。这反映在体外获得的粘着相互作用数据并不能被容易地移植到体内研究中。例如，许多体外研究显示整联蛋白VLA-4和整联蛋白LFA-1参与了造血干细胞与骨髓基质的粘着(Papayannopoulou和Nakamoto的综述，1993)。这些体外数据似乎可预测任一途径如果被体内阻断将导致造血干细胞从骨髓向周围血液的外周化。然而，在灵长类动物的研究中，尽管抗VLA-4的单克隆抗体(mAb)有效地使干细胞外周化，但抗LFA-1β2整联蛋白链的单克隆抗体却没有作用，尽管其增加了嗜中性粒细胞数，由此阐明了该mAb的效力(Papayannopoulou和Nakamoto，1993)。这些数据显示，体外结果实际上并不能准确地预测体内的相关性。

应该注意的是，整联蛋白VLA-4在多种肿瘤包括白血病如淋巴瘤转移中的作用的研究结果相互矛盾。例如，将人的α4链转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞导致了VLA-4表达，并使这些细胞能在体内迁移至骨髓，该现象被抗VLA-4的mAb抑制(Matsuura等，1996)。相反，用VLA-4转染淋巴瘤细胞会强烈地抑制瘤细胞向肝、肺和肾转移，而且对其返回骨髓和在骨髓中增殖均没有影响(Gosslar等，1996)。此外，VLA-4在高转移性鼠骨髓瘤细胞上的表达强烈地抑制体内肺转移的形成(Qian等，1994)，并不促使黑素瘤向骨髓转移。

总之，根据体外研究并不清楚如何可靠地预测粘着途径的体内相关性。而且，即使已进行过体内研究，所获数据也不一致。多发性骨髓瘤领域中这种令人困惑的不一致性的一个主要原因是目前可获得的动物模型并不是人类疾病的良好预测者。对于多发性骨髓瘤，可在体外生长的人和鼠骨髓瘤细胞系很少与体内的骨破坏相关(Mundy1998)。

鉴定抑制这些骨吸收因子产生的化合物或拮抗剂可能是极为需要的，因为这可终止进行性骨破坏并改善骨髓瘤患者的生活质量。

                      本发明概要

我们使用了新开发的多发性骨髓瘤小鼠模型，该模型中小鼠出现具有所有人疾病特征的严重骨溶解(Garrett 1997)。采用该细胞系和动物模型，我们证明体内α4整联蛋白/α4整联蛋白配体途径的抑制将导致多发性骨髓瘤细胞的增殖和/或存活能力降低。我们显示，骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞通过VLA-4/VCAM-1相互作用发生的细胞-细胞粘着是体外骨微环境中刺激破骨细胞骨吸收的活性生产增高所必需的。

我们认为该相互作用对骨髓瘤细胞返回骨髓区室、对该细胞随后的存活和生长、以及最终对骨髓瘤诱发的骨溶解发展是十分关键的。我们在动物模型中检验了该假说，并发现在体内含有α4亚基的整联蛋白VLA-4的拮抗剂强烈地抑制IgG2b亚型抗体的产生。该同种型与5TGM1细胞系产生的同种型相同，并且在任何时候均准确反映了骨髓区室中骨髓瘤细胞的数目。因此，VLA-4途径的阻断强烈地抑制IgG2b的产生，并且意味着抑制骨髓瘤负荷的水平。

本发明的一个方面是用于治疗多发性骨髓瘤的方法，其包括给个体施用治疗学上有效量的组合物，所述组合物包含拮抗具有α4亚基的整联蛋白(例如VLA-4)和该整联蛋白之配体(例如VCAM-1)间相互作用的拮抗剂。该拮抗剂可以是α4整联蛋白结合试剂或α4整联蛋白配体的结合试剂。优选的试剂是抗VLA4或抗α4β7的抗体同系物(人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的片段)；抗VCAM-1的抗体同系物(人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的片段)；和包含α4亚基的整联蛋白与其配体相互作用的小分子抑制剂。该组合物可按提供约0.1至20mg/kg体重的剂量来施用。具体地，优选试剂可：a)同时拮抗VLA-4和α4β7与其各自的α4配体的相互作用；或b)仅拮抗VLA-4与其α4配体的相互作用；或c)仅拮抗α4β7与其α4配体的相互作用。

本发明的另一方面是用于抑制骨髓肿瘤相关的骨吸收的方法，该方法包括给患有所述肿瘤的哺乳动物施用含α4亚基的整联蛋白如VLA-4和该整联蛋白的配体如VCAM-1间相互作用的拮抗剂，施用剂量为有效抑制骨吸收的量。该拮抗剂可以是α4整联蛋白结合试剂如VLA-4结合试剂或α4整联蛋白配体结合试剂如VCAM-1结合试剂。优选的试剂是抗VLA4或抗α4B7的抗体同系物(人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的片段)；抗VCAM-1的抗体同系物(人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的片段)；和包含α4亚基的整联蛋白与其各自的α4整联蛋白配体间相互作用(如VCAM-1/VLA-4相互作用)的小分子抑制剂。该拮抗剂可按提供约0.1-20mg/kg体重的剂量施用。

本发明的另一个方面是治疗以存在破骨细胞生成为特征的疾病的患者的方法，该方法包括给患者施用具有α4亚基的整联蛋白和其配体间相互作用的拮抗剂，施用量应足以抑制破骨细胞生成。同样，该拮抗剂可以是α4结合试剂或α4配体结合试剂。优选的试剂是抗VLA4或抗α4β7的抗体同系物(人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的片段)；抗VCAM-1的抗体同系物(人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的片段)；和包含α4亚基的整联蛋白与其各自的α4整联蛋白配体间相互作用(如VCAM-1/VLA-4相互作用)的小分子抑制剂。该组合物可按提供约0.1-20mg/kg体重的剂量施用。除非特别指明，所有文献均以参考文献方式并入本文。

                     附图简要说明

图1.

在5TGM1细胞和骨髓细胞的共培养物中中和抗体对TRAP阳性多核OC样细胞形成的影响。

将5TGM1细胞(1e3)和骨髓细胞(1e6)的悬浮混合物接种在48孔培养板中，并在有或没有10ug/ml抗VCAM-1抗体(VCAM-1 Ab)、抗α4β1抗体(α4β11Ab)、抗ICAM-1抗体(ICAM-1 Ab)、或对照大鼠IgG时进行培养。培养6天后，固定培养物并测定TRAP阳性多核OC样细胞(TRAP(+)MNC)的数量。VCAM-1 Ab和α4β1Ab均抑制TRAP(+)MNC的形成，而ICAM-1 Ab没有作用。数据表示为平均值±S.E.(n＝3)。*＝显著不同于对照IgG。

图2

在胚胎大鼠长骨的器官培养物中5TGM1和ST2条件培养基对骨吸收的影响。

在⁴⁵Ca标记的胚胎大鼠长骨的器官培养物中，分析从单独的ST2、单独的5TGM1、和ST2与5TGM1的共培养物获得的条件培养基(48小时)的骨吸收活性。标记的胚胎大鼠长骨在存在条件培养基(40％v/v)或对照培养基的情况下培养120小时。数据表示为与对照培养基中的钙释放相比(条件培养基中)钙释放的增加百分数。ST2基质细胞条件培养基的钙释放显示为空心柱。5TGM1的释放为阴影柱。从5TGM1和ST2的共培养物收获的条件培养基的释放为实心柱。数据表示为平均值±S.E.(n＝4)。*＝显著不同于单独的ST2。***＝显著不同于单独的5TGM1。

图3

重组可溶性VCAM-1(sVCAM-1)对5TGM1细胞产生破骨细胞生成活性的影响。

从有或无sVCAM-1(1×10^-8至1×10^-7摩尔)时培养了24小时的5TGM1细胞收获条件培养基。在小鼠骨髓培养物中分析这些条件培养基的破骨细胞生成活性。将骨髓细胞(1e6/孔)接种在48孔板中，然后在条件培养基(阴影柱)或含有同样浓度的sVCAM-1的对照培养基(IMDM)(空心柱)中进行培养。6天后，固定培养物，并测定TRAP阳性多核OC样细胞(TRAP+MNC)的数量。用1×10^-7M sVCAM-1处理的5TGM1细胞的条件培养基增加了TRAP(+)MNC的形成。数据表示为平均±S.E.(n＝3)。*＝显著不同于对照。

图4

在含有5TGM1的小鼠中抗VLA-4的mAb PS2对血清IgG2b升高的影响。

给小鼠注射1e5 5TGM1细胞，让这些细胞定植于骨髓。将小鼠分成两组，每组3只，一组用作对照组，第二组用80ug mAb PS/2(约4mg/kg)在第8、11、14、17、和20天进行处理。从第1周至第6周每周测量5TGM1骨髓瘤细胞产生的抗体同种型IgG2b的水平。单克隆抗体的处理强烈地抑制IgG2b的产生，这指示骨髓瘤细胞体内存活和生长被抑制。

图5

在含有5TGM1的小鼠中抗VCAM-1的mAb M/K-2.7对血清IgG2b升高的影响

按图4中所述，给小鼠注射5TGM1细胞让其定植于骨髓。将小鼠分组，每组4或5只，一组用作对照(空心方块)，第二组/第三组以80ug(空心菱形)和160ug mAb(空心圆)(约4-8mg/kg)进行预防性处理，第四组用160ug mAb(三角形)进行治疗性处理。测定5TGM1骨髓瘤细胞产生的抗体同种型IgG2b的水平。单克隆抗体的处理强烈地抑制IgG2b的产生，指示骨髓瘤细胞体内存活和生长被抑制。

图6抗α4整联蛋白抗体对多发性骨髓瘤小鼠存活的影响。

                   本发明的详细描述

本发明涉及多发性骨髓瘤的治疗，特别是多发性骨髓瘤的预防。更具体地，本发明方法涉及在多发性骨髓瘤的治疗中使用可拮抗含α4亚基的整联蛋白与该整联蛋白之配体间相互作用的拮抗剂。术语“多发性骨髓瘤”是指患有浆细胞瘤性疾病的个体的医学病症，不同患者的瘤性克隆代表浆细胞系不同阶段的细胞(Mundy，1998)。

α4β1整联蛋白是VCAM-1、纤连蛋白以及可能的其它与α4β1整联蛋白结合或以其它方式相互作用的分子的细胞表面受体。在这一点上，与含α4亚基的整联蛋白结合或以其它方式相互作用的这些分子单独和共同地称作“α4配体”。因此术语α4β1整联蛋白(可互换使用的“VLA-4”或“α4β1”或“α4β1整联蛋白”)在本文中指能与VCAM-1和细胞外基质蛋白成员，尤其是纤连蛋白，或它们的同系物或片段结合的多肽，但本领域技术人员将理解可能存在其它VLA-4的配体并可采用传统方法对其进行分析。

然而，已知α4亚基除了与β1外还与其它β亚基相连，因此我们可将术语“α4整联蛋白”定义为其α4亚基与任意一个β亚基相连的那些整联蛋白。“α4”整联蛋白的又一例子是α4β7(R.Lobb和MHemler，1994)。本文中，术语“α4整联蛋白”是指VLA-4以及含有β1、β7、或任何其它β亚基的整联蛋白。

正如本文所讨论的，本发明方法中使用的拮抗剂并不限于特定类型或结构的分子，因此对于本发明如下任何试剂均被认为是本文实施例中所用之拮抗剂的等价物：能与任何含α4亚基的整联蛋白(如携带VLA-4的细胞表面的VLA-4和/或携带α4β7的细胞表面的α4β7整联蛋白)[见Lobb和Hemler，J.Clin.Invest.，94：1722-1728(1994)]，和/或它们相应的α4配体(如分别位于携带VCAM-1和MadCAM的细胞表面的VCAM-1和MadCAM)结合，并可有效阻断或覆盖VLA-4(或α4β7)或VCAM-1(或MadCAM)的任何试剂(即分别是“α4整联蛋白结合试剂”和“α4整联蛋白配体结合试剂”)。

整联蛋白“拮抗剂”包括任何可抑制α4整联蛋白与α4整联蛋白配体和/或受体结合的化合物。含有抗整联蛋白抗体或抗体同系物的蛋白(讨论如下)及其它分子如可溶形式的整联蛋白配体蛋白均是有用的。可溶形式的α4整联蛋白配体蛋白包括可溶性VCAM-1或胶原肽、VCAM-1融合蛋白、或双功能VCAM-1/Ig融合蛋白。例如，可使用可溶形式的α4整联蛋白配体或其片段以结合整联蛋白，并优选竞争细胞上的整联蛋白结合位点，从而引起类似于施用拮抗剂如抗α4整联蛋白的抗体(例如α4β7抗体和/或VLA-4抗体)的效应。特别地，结合α4整联蛋白但不引起整联蛋白依赖性信号传导的可溶性α4整联蛋白突变体也包括在本发明的范畴中。这些突变体可充当野生型整联蛋白的竞争性抑制剂，因此被认为是“拮抗剂”。本发明方法中使用的其它拮抗剂是“小分子”，定义如下。

本发明包括使用拮抗一种以上α4整联蛋白作用的试剂的方法，这些试剂例如拮抗几种α4整联蛋白如VLA-4和α4β7、或其它α4整联蛋白组合的单个小分子或抗体同系物。使用不同分子的组合以使组合活性可拮抗一种以上α4整联蛋白的方法也包括在本发明的范畴中，例如使用几种小分子或抗体同系物联合拮抗α4整联蛋白VLA-4和α4β7、或其它整联蛋白组合的方法。

正如本文讨论的，某些整联蛋白拮抗剂可融合或以其它方式连接例如抗体同系物如免疫球蛋白或其片段，并且不限于特定类型或结构的整联蛋白或配体或其它分子。因此，对于本发明，能形成融合蛋白(定义如下)、结合α4整联蛋白配体并有效阻断或覆盖α4β7和/或VLA-4整联蛋白的任何试剂均被认为是本发明实施例中所用之拮抗剂的等价物。

对于本发明，“α4整联蛋白配体/α4整联蛋白间相互作用的拮抗剂”是指具有如下功能的试剂：能抑制或阻断α4配体(如VCAM-1)和/或α4整联蛋白(如α4β7或VLA-4)介导的结合，或能通过例如抑制或阻断α4配体介导的α4整联蛋白信号传导或α4配体介导的α4配体信号传导，调节α4配体和/或α4整联蛋白功能，并能有效治疗多发性骨髓瘤，优选以抗α4整联蛋白抗体的相同方式进行，这些试剂例如为多肽或其它分子。

特别地，VCAM-1/VLA-4相互作用的拮抗剂是具有如下一种或多种性质的试剂：(1)其以足够的特异性覆盖或结合携带VLA-4的细胞(如骨髓瘤细胞)表面的VLA-4以抑制VLA-4配体/VLA-4相互作用，如骨基质细胞和骨髓瘤细胞间的VCAM-1/VLA-4相互作用；(2)其以足够的特异性覆盖或结合携带VLA-4的细胞(如骨髓瘤细胞)表面的VLA-4以修饰，优选抑制，VLA-4介导的信号传导如VLA-4/VCAM-1介导的信号传导；(3)其以足够的特异性覆盖或结合骨基质细胞上的VLA-4配体(如VCAM-1)以抑制VLA-4/VCAM相互作用；(4)其以足够的特异性覆盖或结合骨基质细胞上的VLA-4配体(如VCAM-1)以修饰，优选抑制，VLA-4配体介导的VLA-4信号传导，如VCAM-1介导的VLA-4信号传导。在优选实施方案中，该拮抗剂具有性质1和2中的一或两项。在其它优选实施方案中，该拮抗剂具有性质3和4中的一或两项。而且，可以给患者施用一种以上拮抗剂，例如结合VLA-4的试剂可联合结合VCAM-1的试剂一起施用。

例如，VLA-4和VCAM-1的抗体或抗体同系物(讨论如下)以及可溶形式的天然结合蛋白均是有用的。VLA-4的可溶性天然结合蛋白包括可溶性VCAM-1肽、VCAM-1融合蛋白、双功能VCAM-1/Ig融合蛋白、纤连蛋白、具有由另一种拼接方式形成的非III类连接片段的纤连蛋白、和含有EILDV氨基酸序列或类似的保守替换氨基酸序列的纤连蛋白肽。VCAM-1的可溶性天然结合蛋白包括可溶性VLA-4肽、VLA-4融合蛋白、双功能VLA-4/Ig融合蛋白等。在本文中，“可溶性VLA-4肽”或“可溶性VCAM-1肽”是一种不能将其自身锚定在细胞膜中的VLA-4或VCAM-1多肽。这些可溶性多肽包括，例如缺少锚定该多肽所需的足够跨膜区部分，或经修饰以至跨膜区功能丧失的VLA-4和VCAM多肽。这些结合试剂可通过与VLA-4的细胞表面结合蛋白竞争或通过改变VLA-4的功能起作用。例如，可施用可溶形式的VCAM-1(见例如Osborn等，1989，细胞(Cell)，59：1203-1211)或其片段以结合VLA-4，优选竞争骨髓瘤细胞上的VLA-4结合位点，从而导致类似施用拮抗剂如小分子或抗VLA-4抗体的效果。

在另一个例子中，VCAM-1或其能结合携带VLA-4的骨髓瘤细胞表面的VLA-4的片段，例如含有VCAM-1的两个N端结构域的片段，可与第二种肽例如增加VCAM-1部分的可溶性或体内存在时间的肽融合。该第二种肽可是可溶性肽，优选人的肽，更优选胞浆蛋白或免疫球蛋白超家族的成员。在特别优选的实施方案中，该第二种肽是IgG或其部分或片段，例如人IgG1重链恒定区并至少包括铰链区、CH2和CH3结构域。

本发明方法中有用的其它拮抗剂包括，但不限于模拟能中断α4整联蛋白/α4整联蛋白配体相互作用的肽作用的试剂(称作“小分子”的有机分子)，其作用途径是例如通过结合细胞表面的VLA-4受体阻断VLA-4，或通过结合细胞表面VCAM-1受体阻断VCAM-1。这些“小分子”本身可以是小肽，或较大的含肽有机化合物或非肽有机化合物。正如本文所定义的，“小分子”并不包含抗体或抗体同系物。尽管该“小分子”的分子量一般小于2000，但我们并无意用该数值作为分子量的绝对上限。

例如，可使用模拟VLA-4配体的结合域并匹配VLA-4受体域的小分子如寡糖。(见J.J.Devlin等，1990，科学(Science)，249：400-406(1990)，J.K.Scott和G.P.Smith，1990，科学249：386-390，和美国专利4,833,092(Geysen)，所有文献均以参考文献方式并入本文)。相反地，也可使用模拟VCAM-1配体的结合域并匹配VCAM-1受体域的小分子。

本发明中有用的其它小分子的例子可参见Komoriya等(“在纤连蛋白另一种拼接形式的III型连接片段结构域中，主要细胞类型特异性的粘着位点(CS1)的最小必需序列是亮氨酸-天门冬氨酸-缬氨酸”(″The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-SpecificAdhesion Site(CS1)Within the Alternatively Spliced Type IIIConnecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-AsparticAcid-Valine″)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，266(23)，第15075-79页(1991))。他们鉴定了结合VLA-4所必需的最小活性氨基酸序列，并基于特定类型纤连蛋白的CS-1区(VLA-4结合域)的氨基酸序列合成了各种重叠肽。他们鉴定了一个8氨基酸肽，Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr，以及两个较小的重叠五肽，Glu-Ile-Leu-Asp-Val和Leu-Asp-Val-Pro-Ser，这些肽均对纤连蛋白依赖性细胞粘着有抑制活性。以后文献显示含有LDV序列的某些较大肽在体内有活性(T.A.Ferguson等，“两个整联蛋白结合肽破坏体内T细胞介导的免疫应答” (″Two Integrin Binding PeptidesAbrogate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo″)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88，第8072-76页(1991)；和S.M.Wahl等，“合成纤连蛋白肽通过阻断白细胞的粘着和募集抑制大鼠的关节炎”(″Synthetic Fibronectin Peptides SuppressArthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion andRecruitment″)，J.Clin.Invest.，94，第655-62页(1994))。还有文献描述过一种可抑制VLA-4和VLA-5与纤连蛋白粘着的环状五肽，Arg-Cys-Asp-TPro-Cys(其中TPro表示4-硫代脯氨酸)(见例如D.M.Nowlin等“一种新的环状五肽抑制α4β1纤连蛋白介导的细胞粘着”，生物化学杂志，268(27)，第20352-59页(1993)；和PCT出版物PCT/US91/04862)。该五肽的基础是FN的三肽序列Arg-Gly-Asp，该序列已知是几种细胞外基质蛋白识别位点中的共同基序。

其它小分子VLA-4抑制剂的例子报道于例如Adams等，“细胞粘着抑制剂”，PCT US97/13013中，其中描述了具有细胞粘着抑制活性的含β氨基酸的线性肽基化合物。国际专利申请WO 94/15958和WO92/00995描述了具有细胞粘着抑制活性的环肽和拟肽化合物。国际专利申请WO 93/08823和WO 92/08464描述了含胍基、脲和硫脲的细胞粘着抑制化合物。美国专利5,260,277描述了胍基细胞粘着调节化合物。

这些小分子模拟试剂可通过合成许多肽、半肽化合物或非肽有机化合物，然后根据其抑制α4整联蛋白/α4整联蛋白配体相互作用的能力筛选这些化合物来产生。一般见美国专利4,833,092，Scott和Smith，“用表位文库寻找肽配体”(“Searching for Peptide Ligands with anEpitope Library”)，科学，249，第386-90页，(1990)，以及Devlin等，“随机肽文库：特异蛋白结合分子的来源”(“Random PeptideLibraries：A Source of Specific Protein Binding Molecules”)，科学，249，第40407页(1990)。

在其它优选实施方案中，本发明方法中用于结合，包括阻断或覆盖，细胞表面α4整联蛋白/α4整联蛋白配体的试剂是抗VLA-4和/或抗α4β7单克隆抗体或抗体同系物。用于治疗，尤其是用于人的治疗的优选抗体和同系物包括人抗体同系物、人源化抗体同系物、嵌合抗体同系物、Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)抗体片段、以及抗体重链或轻链的单体或二聚体或它们的混合物。在本发明方法中抗VLA-4的单克隆抗体是优选的结合试剂。

在本文中，术语“抗体同系物”包括通过二硫键连接的免疫球蛋白轻链和重链组成的完整抗体。术语“抗体同系物”还旨在包括含有选自免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链和其抗原结合片段(其能够结合一种或多种抗原)的一或多个多肽的蛋白。由一个以上多肽构成的抗体同系物的组成多肽可任选性地通过二硫键或其它共价形式交联。

因此“抗体同系物”包括完整的IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可是κ型或λ型。

“抗体同系物”还包括保留了抗原结合特异性的完整抗体的一些部分，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体、含有一个重链和一个轻链的二聚体等。因此，抗原结合片段以及来源于以上所述抗体的全长二聚体或三聚体多肽本身均是有用的。

在本文中，“人源化抗体同系物”是一种通过重组DNA技术产生的抗体同系物，其中已用人免疫球蛋白轻链或重链中对抗原结合非必需的一些或所有氨基酸替换了非人哺乳动物免疫球蛋白轻链或重链中的相应氨基酸。

在本文中，“嵌合抗体同系物”是一种通过重组DNA技术产生的抗体同系物，其中免疫球蛋白轻链、重链或两者的恒定区和铰链区的全部或部分被替换成另一个免疫球蛋白轻链或重链的相应区域。在另一方面中，本发明特别涉及一种嵌合分子的变体，其包括：(1)VLA-4导向部分，例如能结合带有VLA-4的骨髓瘤细胞表面的抗原(即VLA-4)的VCAM-1部分；(2)可选择地包括第二肽，例如可增加VLA-4导向部分的可溶性或体内存在时间的肽，如免疫球蛋白超家族成员或其片段或部分，如IgG的片段或部分，如人IgG1的重链恒定区，如CH2和CH3铰链区；以及毒素部分。VLA-4导向部分可是任何天然存在的VLA-4配体或其片段，如VCAM-1肽或类似的保守替换氨基酸序列。优选的导向部分是可溶性VCAM-1片段，如VCAM-1分子的N端结构域1和2。该嵌合分子可用于治疗对象如有患如下疾病危险的人，该疾病以存在携带VLA-4优选活性VLA-4的骨髓瘤细胞为特征，例如多发性骨髓瘤。

在本文中，“人抗体同系物”是通过重组DNA技术产生的抗体同系物，其中免疫球蛋白轻链或重链的所有氨基酸均来自人。

制备抗VLA-4抗体同系物的方法

产生单克隆抗体的技术是熟知的。简单地说，将永生细胞系(典型地是骨髓瘤细胞)与来自免疫了表达指定抗原例如VLA-4的全细胞的哺乳动物的淋巴细胞(典型地是脾细胞)融合，然后对所获杂交瘤细胞的培养上清液筛选抗该抗原的抗体。一般描述见Kohler等，1975，自然(Nature)，265：295-297。

可采用标准程序进行免疫。单位剂量和免疫方式取决于待免疫哺乳动物的种类、其免疫状态、该哺乳动物的体重等。典型地，采取被免疫哺乳动物的血液，并采用合适的筛选方法对每个血液样本的血清分析特定抗体。例如，可通过表达VLA-4的细胞的¹²⁵I标记的细胞裂解物进行免疫沉淀来鉴定抗VLA-4抗体。(见，Sanchez-Madrid等，1986，Eur.J.Immunol.，16：1343-1349和Hemler等，1987，生物化学杂志，262，11478-11485)。还可通过流式细胞计数来鉴定抗VLA-4抗体，例如通过测量与认为可识别VLA-4的抗体孵育过的Ramos细胞的荧光染色(见Elices等，1990，细胞，60：577-584)来进行。在杂交瘤细胞生产中使用的淋巴细胞典型地分离自免疫的哺乳动物，其中该动物的血清经所述筛选方法已被证实为抗VLA-4抗体阳性。

典型地，永生化细胞系(例如骨髓瘤细胞系)来源于与淋巴细胞相同的哺乳动物种。优选的永生化细胞系是对含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基(“HAT”培养基)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。典型地，使用1500分子量的聚乙二醇(“PEG1500”)将HAT敏感小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后，使用HAT培养基筛选融合获得的杂交瘤细胞，该培养基将杀死未融合和未有效融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞由于没有转化在几天后死亡)。通过筛选杂交瘤培养物上清液鉴定产生所需抗体的杂交瘤。例如，制备用于产生抗VLA-4抗体的杂交瘤可通过检测杂交瘤培养物上清液的分泌抗体结合表达α4亚基的重组细胞系的能力来进行筛选(见Elices等，见上)。

为生产抗VLA-4的完整免疫球蛋白抗体同系物，在营养培养基上培养在所述筛选实验中检测为阳性的杂交瘤细胞，培养的条件和时间足以允许杂交瘤细胞向培养基分泌单克隆抗体。适合杂交瘤细胞的组织培养技术和培养基是熟知的。可收集条件杂交瘤培养上清液，并可选择通过熟知方法进一步纯化抗VLA-4抗体。

作为替代方法，可通过向未免疫小鼠的腹腔注射该杂交瘤细胞来生产所需抗体。该杂交瘤细胞在腹腔中增殖并分泌抗体，该抗体将集聚成腹水。可通过用注射器从腹腔抽取腹水来收获抗体。

几种小鼠抗VLA-4单克隆抗体以前已有过描述。见例如Sanchez-Madrid等，1986，见上；Hemler等，1987，见上；Pulido等，1991，生物化学杂志，266(16)，10241-10245)。这些抗VLA-4单克隆抗体如HP1/2和其它能识别VLA-4 P链的抗VLA-4抗体(例如HP2/1、HP2/4、L25、P4C2、P4G9)在本发明的治疗方法中将是有用的。优选可识别参与结合VCAM-1和纤连蛋白配体的VLA-4α4链表位的抗VLA-4抗体(即可在参与配体识别的位点结合VLA-4并阻断与VCAM-1和纤连蛋白结合的抗体)。这些抗体已定义为B表位特异抗体(B1或B2)(Pulido等，1991，见上)，同时也是本发明的抗VLA-4抗体。

抗VLA-4的完全人单克隆抗体同系物是另一种可在本发明方法中阻断或覆盖VLA-4抗原的优选结合试剂。可使用体外接触过抗原的人脾细胞，按Boerner等，1991，免疫学杂志(J.Immunol.)，147，86-95中所述，制备完整形式的这些抗体。作为替代方法，可按Persson等(1991，美国科学院院刊，88：2432-2436)或Huang和Stollar(1991，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)141，227-236)中所述方法，通过库克隆(repertoire cloning)制备这些抗体。美国专利5,798,230(1998年8月25日，“制备人单克隆抗体和使用这些抗体的方法”)描述了从人B细胞制备人单克隆抗体。根据该方法，通过用Epstein-Barr病毒或表达Epstein-Barr病毒核抗原2(EBNA2)的该病毒衍生物感染，可使产生人抗体的B细胞永生化。之后将永生化必需的EBNA2功能关闭，以增加抗体的产生。

在制备完全人抗体的另一方法中，美国专利5,789,650(1998年8月4日，“用于生产异源抗体的转基因非人动物”)描述了能生产异源抗体的转基因非人动物和具有失活的内源免疫球蛋白基因的转基因非人动物。通过反义多核苷酸和/或通过抗内源免疫球蛋白的抗血清可抑制内源免疫球蛋白基因。异源抗体由该非人动物种的基因组中正常情况下不存在的免疫球蛋白基因编码。可将含有未重排异源人免疫球蛋白重链序列的一或多个转基因导入非人动物，从而形成能功能性重排转基因免疫球蛋白序列并生产由人免疫球蛋白基因编码的各种独特型的抗体库的转基因动物。这些异源人抗体在B细胞中产生，这些B细胞之后可通过例如与永生化细胞系如骨髓瘤融合，或用其它永生化能产生单克隆异源完全人抗体同系物的细胞系的方法操作该B细胞，来进行永生化。

还可使用未免疫过的人的大噬菌体展示文库，按标准噬菌体技术(Vaughan等，1996)分离可开发用以治疗人的高亲合性抗体。可在本发明方法中阻断或覆盖VLA-4抗原的另一个优选结合试剂是具有抗VLA-4特异性的人源化重组抗体同系物。在嵌合抗体制备的早期方法之后，EP 0239400(Winter等)中描述了一种新的方法，其中通过将一个物种的抗体互补决定区(CDR)替换为另一个种的抗体互补决定区来改变抗体。该方法可用于例如将人重链和轻链Ig可变区结构域的CDR替换成来自鼠可变区结构域的另一种CDR。之后这些改变的Ig可变区可与人的Ig恒定区结合，产生组成上除了替换的鼠CDR外完全是人来源的抗体。由于该CDR替换抗体含有很少的非人成分，因此预测该CDR替换抗体在人体中引起免疫应答的可能性将比嵌合抗体小。通过CDR“移植”人源化单克隆抗体的方法被称作“重塑(reshaping)”。(Riechmann等，1988，自然332，323-327；Verhoeyen等，1988，科学239，1534-1536)。

典型地，将鼠抗体的互补决定区(CDR)移植至人抗体的相应区域，因为CDR(抗体重链中有3个，轻链中有3个)是鼠抗体中与特异抗原结合的区域。CDR的移植可通过遗传工程获得，其中通过鼠重链和轻链可变(V)区基因片段的克隆确定CDR DNA序列，然后将该序列通过定点诱变转移至相应的人V区。在该程序的最后阶段，加入所需独特型的人恒定区基因片段(通常对于CH是γI，对于CL是κ)，并在哺乳动物细胞中共表达人源化重链和轻链基因以产生可溶性人源化抗体。

将这些CDR转移至人抗体给该抗体赋予了初始鼠抗体的抗原结合特性。鼠抗体的6个CDR在结构上安装于V区的“构架”区。CDR移植成功的原因是鼠抗体和人抗体的构架区可能具有非常相似的3-D结构，而且具有相似的CDR附着点，以至CDR可互相交换。该人源化抗体同系物的制备可参照：Jones等，1986，自然，321：522-525；Riechmann，1988，自然，332，323-327；Queen等，1989，美国科学院院刊，86：10029；和Orlandi等，1989，美国科学院院刊，86：3833。

然而，构建区中的某些氨基酸被认为与CDR相互作用并影响整个抗原结合亲和力。将鼠抗体的CDR不经人V区构架的修饰而直接转移以产生重组人源化抗体通常导致结合亲和力的部分或全部丧失。在许多情况中，为获得结合活性，改变受者抗体的构架区中的残基显得至关重要。

Queen等，1989(见上)和WO 90/07861(蛋白设计实验室(ProteinDesign Labs))描述了通过鼠MAb(抗-Tac)的CDR与人免疫球蛋白构架区和恒定区的结合来制备在受者抗体的构架区含有修饰残基的人源化抗体。他们阐述了一种解决不经人V区构架残基任何修饰直接进行CDR转移常常会产生的结合亲和力丧失问题的方法；该解决方法包括两个关键步骤。首先，通过计算机分析选择与初始鼠抗体V区构架具有最佳蛋白序列同源性的人V构架区，在此为抗Tac MAb。第二步中，通过计算机模拟鼠V区的三级结构以便观察可能与鼠CDR相互作用的构架氨基酸残基，然后将这些鼠氨基酸残基添加在同源的人构架上。也见蛋白设计实验室--美国专利5,693,762。

可以使用不同的方法(Tempest等，1991，生物技术(Biotechnology)9，266-271)，并作为标准分别使用NEWM和REI的重链和轻链的V区构架进行CDR移植，而不过度引入鼠的残基。使用Tempest等的方法以构建基于NEWM和REI的人源化抗体的优点是，从X射线晶体学已知NEWM和REI可变区的3维结构，因此即可模拟CDR和V区构架残基间的特异相互作用。

无论采用何种方法，至今制备的初始人源化抗体同系物的例子显示，它们均不是简洁的方法。然而，即便承认这种构架改变可能是必需的，根据可获得的现有技术，即使需要改变，也不可能预测应改变哪些构架残基来获得具有期望特异性的功能性人源化重组抗体。迄今的结果显示，维持特异性和/或亲和力必需的改变在极大程度上对于给定的抗体是独特的，而且不能根据不同抗体的人源化来预测。

在本发明中有用的优选拮抗剂包括具有B表位特异性的嵌合重组和人源化重组抗体同系物(即完整的免疫球蛋白和其部分)，这些同系物的制备和描述见共同未决的1993年1月12日提交的美国专利申请No.08/004,798和1994年1月7日提交的PCT出版物US94/00266。用于制备嵌合(鼠V-人C)和人源化抗VLA-4抗体同系物的起始材料可以是以前描述的鼠单克隆抗VLA-4抗体、可从商业途径获得的单克隆抗VLA-4抗体(例如HP2/1，Amae International，Inc.，Westbrook，Maine)、或是根据本文所授方法制备的单克隆抗VLA-4抗体。例如，抗VLA-4抗体HP1/2的重链和轻链可变区已被克隆、测序并联合人免疫球蛋白重链和轻链一起表达。该HP1/2抗体的特异性和效价类似于鼠的HP1/2抗体，而且在根据本发明的治疗方法中是有用的。

其它优选的人源化抗VLA-4抗体同系物描述于AthenaNeurosciences，Inc.的PCT/US95/01219(1995年7月27日)。这些人源化抗VLA-4抗体含有一条人源化的轻链和一条人源化的重链。人源化轻链含有3个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，其氨基酸序列来自鼠21-6免疫球蛋白轻链的相应互补决定区，和来自人κ轻链可变区构架序列的可变区构架，只是至少一个氨基酸位置被鼠21.6免疫球蛋白轻链可变区构架相应位置中的氨基酸替代。人源化重链包含3个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，其氨基酸序列来自鼠21-6免疫球蛋白重链的相应互补决定区，和来自人κ轻链可变区构架序列的可变区构架，只是至少一个位置的氨基酸被鼠21.6免疫球蛋白重链可变区构架相应位置中的氨基酸替代。

治疗应用

在根据本发明第一方面的方法中，VLA-4结合试剂，尤其是VCAM融合物和抗VLA-4抗体同系物优选通过非肠胃途径施用。在本文中术语“非肠胃途径”包括皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、损伤内和颅骨内注射或输注技术。

VLA-4结合试剂优选作为含药学可接受载体的无菌药物组合物来施用，其中所述载体可以是任何许多熟知的载体，例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡聚糖、甘油、乙醇等，或它们的组合。本发明的化合物可采用来源于无机或有机酸和碱的药学可接受盐形式使用。这种酸盐包括：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸酯、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。碱盐包括铵盐、碱金属盐如钠盐和钾盐、碱土金属盐如钙盐和镁盐、与有机碱形成的盐如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡萄糖胺、三(羟甲基)甲胺、以及与氨基酸如精氨酸、赖氨酸等形成的盐。而且，碱性含氮基团可用下列物质季铵化：例如低烷基卤如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；硫酸二烷基酯如硫酸二甲基、二乙基、二丁基和二戊基酯；长链卤化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基、硬脂基氯、溴和碘；芳烷基卤化物如苄基溴、苯乙基溴；以及其它物质。由此获得可溶于或可分散于水或油的产物。

本发明的药物组合物含有本发明的任意化合物，或其药学可接受衍生物，以及任何药学可接受载体。本文所用术语“载体”包括可接受的佐剂和赋形剂。可在本发明的药物组合物中使用的药学可接受的载体包括，但不限于离子交换试剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

根据本发明，所述药物组合物可采用无菌可注射制剂形式，例如无菌可注射水或油质悬浮物。该悬浮物可根据本领域已知技术采用适合的分散或湿润剂和悬浮剂来制备。该无菌可注射制剂还可以是溶解于无毒非肠胃途径可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮物，例如溶于1，3-丁二醇的溶液。可使用的可接受赋形剂和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，按常规可使用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何温和的不挥发油包括合成的单或二甘油酯。脂肪酸如油酸和其甘油酯衍生物在注射剂的制备中是有用的，同样，药学上可接受的天然油如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式也是有用的。这些油溶液或悬浮物还可含有长链醇稀释剂或分散剂，如Ph.Helv或类似醇。

本发明的药物组合物，尤其是VLA-4/VCAM-1相互作用的小分子拮抗剂，可通过非肠胃途径或口服给药。如果口服给药，这些组合物的施用可采用任何口服可接受制剂形式，包括但不限于胶囊、片剂、水悬浮物或溶液。对于口服施用的片剂，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。典型地还可加入润滑剂如硬脂酸镁。对于以胶囊形式进行的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当口服要求使用水悬浮液时，活性成分可联合乳化剂和悬浮剂。如果需要，还可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。还可使用局部透皮贴片。本发明药物组合物还可通过使用喷雾器、干粉吸入器或计量型剂量吸入器以鼻烟雾或吸入来施用。这些组合物的制备可根据药物制剂领域的熟知技术进行，也可使用苯甲醇或其它适合的防腐剂、提高生物利用率的吸收促进剂、碳氟化合物、和/或其它常规增溶剂或分散剂制备成盐水溶液。

根据另一实施方案，含有本发明化合物的组合物还可含有其它选自如下的药物：皮质类固醇、抗炎剂、免疫抑制剂、抗代谢物和免疫调节剂。每一类的特定化合物可选自“综合药物化学”(″Comprehensive Medicinal Chemistry″，Pergamon Press，Oxford，England，第970-986页(1990))合适分组标题下所列举的任何化合物，该文献的公开内容以参考文献形式并入本文。这类物质也包括如下化合物如茶碱、柳氮磺吡啶和氨基水杨酸(抗炎剂)；环孢菌素、FK-506、和雷帕霉素(免疫抑制剂)；环磷酰胺和氨甲喋呤(抗代谢物)；类固醇(吸入、口服或局部给药)和干扰素(免疫调节剂)。

可与载体物质联合产生单个剂量形式的活性成分的量将根据治疗宿主和给药的特定形式而不同。然而，应该理解对于某个特定病人的具体剂量和疗法将取决于各种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康情况、性别、饮食、给药时间、排出速率、药物结合、以及治疗医师的判断和治疗中具体病情的严重程度。如果有的话，活性成分的量还取决于与该成分共同施用的治疗或预防药物。

对于防止、抑制或阻断细胞粘着有效的本发明化合物的剂量和给药量将取决于多种因素，例如抑制剂的性质、病人的体积、治疗的目的、待治疗的病理性质、所用的特定药物组合物、和治疗医师的判断。活性成分化合物的有用剂量范围在每天约0.001-约100mg/kg体重，优选每天约0.1-约50mg/kg体重。最优选地，VLA-4结合试剂，如果是抗体或抗体衍生物，将按约0.1-约20mg/kg体重/天的剂量给药，优选按约0.1-约10mg/kg体重/天的剂量，每1-14天一次。对于非抗体或小分子结合试剂，剂量范围应优选处于这些抗体量的等摩尔量之间。优选地，抗体组合物以能有效提供至少1mg/ml的抗体胞浆水平的量给药。可通过施用结合试剂，随后评价按给定剂量施用一段时间后试剂对VLA-4阳性细胞的覆盖，确定最优剂量。

为检测所施用试剂，应采用第二种试剂体外(或离体)探测个体外周血样品中的骨髓瘤细胞(或骨髓细胞)是否存在所述试剂。例如，第二种试剂可以是荧光染料标记的所施用试剂特异的抗体，然后该抗体可通过标准FACS(荧光活化细胞分拣器)分析进行测量。另外，可通过个体细胞结合自身已被标记(如通过免疫荧光染料)的同一试剂的能力丧失或降低，体外(或离体)检测所施用试剂的存在。优选的剂量应产生绝大多数VLA-4阳性细胞的可检测覆盖。优选地，对于抗体同系物，覆盖持续1-14天的时间。

动物模型：

该动物模型已有详细描述(Garrett 1997)。简单地说，Radl等(1998)描述了在老年C57BL/KaLRij小鼠中自发产生的骨髓瘤小鼠模型。在200只动物中约有1只在衰老时会发生该疾病，该疾病将引起具有某些人类疾病特征的单克隆丙种球蛋白病(Radl 1988)。为开发一种更好和更具有重复性的动物模型，我们从该称为5TGM1的小鼠骨髓瘤建立和亚克隆了一个细胞系，并发现该细胞系会在小鼠中引起具有人类骨髓瘤特征的损伤，例如严重的骨质溶解和对非骨器官包括肝和肾的累及(Garrett 1997)。接种了培养细胞的小鼠出现疾病的方式具有高的可预测性和可重复性，包括形成单克隆丙种球蛋白病和放射骨损伤。而且，一些小鼠会出现血钙过高，并且骨损伤的特征在于破骨细胞活性增加。因此，基于含5TGM1小鼠的感染器官组织学检查和IgG2b血清水平的增加，5TGM1被确定为能准确重演人类疾病特点的鼠骨髓瘤。

以下实施例旨在进一步阐明本发明的某些优选实施方案，而并非进行限制。在如下实施例中，所需的限制性酶、质粒和其它试剂和材料可从商业途径获得，克隆、连接和其它重组DNA方法学可按本领域熟知程序进行。

实施例1：材料和方法

5TGM1骨髓瘤细胞

5TGM1骨髓瘤细胞最初来源于在老年C57BL/KaLwRij小鼠中自然出现的骨髓瘤(Garrett 1997，Vanderkerken 1997)。在添加了10％胎牛血清(FBS，Summit，Fort Collins，CO)和1％青霉素-链霉素溶液(GIBCO，Grand Island，NY)的Isocove氏改良Dulbecco培养基(IMDM，Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)中，于含5％CO2的空气中37℃进行细胞培养。对于下述体外实验，使用第25-30代5TGM1细胞。

抗体，可溶性VCAM-1

抗鼠VCAM-I(M/K-2.7)、整联蛋白VLA-4(PS/2)和细胞间粘着分子1(ICAM-I，YNI/1.7)的中和抗体由Kensuke Miyake博士(SagaMedical University，Saga，日本)惠赠。含有人VCAM-1的7个细胞外结构域的重组可溶性VCAM-1(Lobb等，1991)由Roy Lobb博士(BiogenInc.，Cambridge，MA)惠赠。

逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

我们采用RT-PCR证实了骨髓基质细胞和5TGM1分别表达VCAM-1和整联蛋白α4。采用TRIzol试剂(GB8CO)通过一步RNA分离法，从5TGM1、骨髓基质细胞的原代培养物和ST2骨髓基质细胞系(RIKEN CellBank，Tsukuba，日本)制备总RNA。将3ug RNA与50ng随机六聚体在70℃孵育10分钟，冰上冷却，然后使用逆转录酶(Perkin-Elmer，Branchburg，NJ)按厂商说明书合成cDNA第一链。PCR所用引物如下：鼠VCAM-15’引物：5’-OH-GCTGCGCGTCACCATTGTTCTC-3’-OH[SEQ ID NO：1]；鼠VCAM-13’引物：5’-OH-ACCACCCTCTTGAAGCCTTGTG-3’-OH[SEQID NO：2]；鼠α4整联蛋白5’引物：5’-OH-CCCCTCAACACGAACAGATAGG-3’-OH[SEQ ID NO：3]；鼠α4整联蛋白3’引物：5’-OH-GCCTTGTCCTTAGCAACACTGC-3’-OH[SEQ IDNO：4]。

PCR进行30个循环，其中每个循环包括94℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟。PCR反应混合物(总共50ul)含有10ul第一链cDNA，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，2mM MgCl₂，脱氧NTP混合物(每种0.2mM)，引物对(每个0.15微摩尔)和2U Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Branchburg，NJ)。PCR产物在含有溴化乙锭的2.5％琼脂糖凝胶上分离，紫外光下观察。通过参照分子量标准确定片段的大小。

5TGM1细胞在骨髓基质细胞上的附着

为进行异型细胞-细胞粘着分析，将ST2细胞(5e4/孔)接种在48孔培养板上(Costar，Cambridge，MA)，并在添加了10％FBS的αMEM中培养48小时至细胞汇合。通过与10uCi[甲基-³H]胸苷(NewEngland Nuclear)在培养基中37℃孵育24小时，标记5TGM1细胞(5e6)。在ST2单层细胞形成后，在无血清αMEM中与1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St Louis，MO)孵育1小时，并将氚标记的5TGM1细胞铺在该单层细胞上。在有或无抗VCAM-1或α4β1整联蛋白的抗体的情况下于37℃孵育该系统1小时。通过5％三氯乙酸和PBS各洗涤两次除去非粘着细胞，然后在300ul 0.25mM NaOH中溶解粘着细胞，用等体积的0.25mM HCl中和，并在液体闪烁计数仪中测量放射活性。

在5TGM1和鼠骨髓细胞的共培养物中分析破骨细胞的形成

按前人所述(Yoneda 1993)从5周龄雄性C57BL小鼠获得小鼠骨髓细胞。在无菌条件下解剖股骨和胫骨，并将两端切除。将骨髓细胞冲出，收集并在100mm培养皿(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)中37℃孵育2小时，培养基是添加了10％FBS(Hyclone，Logan，UT)和1％青霉素-链霉素的αMEM。收集含有造血破骨细胞前体的非粘着细胞和基质细胞。将300ul培养基中的骨髓细胞(1e6)和5TGM1细胞(1e3)铺在48孔培养板上(第0天)。在第2天，向每孔温和加入300ul新鲜培养基，然后在第4天，将300ul用过的培养基更换为等体积新鲜培养基。第6天，固定该培养物并用商业试剂盒(Sigma)对抗酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)染色。将具有3个以上细胞核的TRAP阳性多核细胞定义为破骨细胞样(OC样)细胞，并在显微镜下人工计数。为证实这些OC样细胞具有吸收骨的能力，在相同条件下将5TGM1细胞和骨髓细胞共培养于5×5mm的鲸牙质薄片上，并通过扫描电子显微镜按前人所述(Yoneda 1992)检测这些牙质薄片上形成的吸收凹痕。

在一些实验中，使用孔间插入物(transwell inserts)(BectonDickinson Labware)进行5TGM1骨髓瘤细胞和骨髓细胞的共培养以防止这两种细胞(2e6，24孔板，Costar)的直接接触。将骨髓细胞接种在下面的室中，然后将5TGM1骨髓瘤细胞接种在下面(直接接触)或上面(不接触)的室中。

⁴⁵Ca标记胚胎大鼠长骨的器官培养物

按前人所述(Mbalaviele 1995)，通过⁴⁵Ca标记胚胎大鼠长骨的器官培养物，分析从5TGM1培养物收集的条件培养基的骨吸收活性。给妊娠大鼠在妊娠第18天注射250 uCi ⁴⁵Ca(New England Nuclear)。通过显微解剖第19天的胚胎获得桡骨体和尺骨体，并在添加了0.1％BSA的BGJ培养基(Sigma)中在不锈钢网格上气相和液相之间预培养24小时。然后在有条件培养基(50％v/v)或对照培养基时培养骨120小时。每48小时更换一次培养基。培养结束时，将骨在冰冷的5％三氯乙酸中孵育2小时，在液体闪烁计数仪中测量骨和培养基中的⁴⁵Ca放射活性。骨吸收表示为按如下公式计算的从骨中释放至培养基中的⁴⁵Ca百分数：(培养基中的⁴⁵Ca计数)/(培养基和骨中的⁴⁵Ca计数)×100。

5TGM1骨髓瘤细胞和鼠基质细胞系ST2细胞的共培养

将ST2细胞(0.5e6)和5TGM1(4e6)一起铺在含有添加了10％FBS的IMDM的60mm培养皿(Beckton Dickinson)中，并培养过夜，用无血清IMDM洗涤两次，然后在5ml无血清IMDM中孵育。48小时后，收集条件培养基并将其储存在-70℃待用。

抗VLA-4的mAb PS2对含5TGM1的小鼠体内血清IgG2b增加的影响

给小鼠注射可转移至骨髓的1e5 5TGM1细胞。将小鼠分成两组，每组3只，一组用作对照组，第二组从第8天开始用80ug mAb PS/2(4mg/kg)处理，每两周一次。从第1至6周每周测量5TGM1骨髓瘤细胞产生的抗体同种型IgG2b的水平。

结果

VCAM-1、VLA-4的表达和抗VCAM-1和VLA-4的抗体对5TGM1附着ST2单层细胞的影响

使用RT-PCR我们证实了骨髓基质细胞和骨髓瘤细胞分别表达VCAM-1和整联蛋白VLA-4。正如所预期的，ST2基质细胞系和原代骨髓基质细胞均表达VCAM-1，而5TGM1不表达。相反，5TGM1骨髓瘤细胞表达整联蛋白VLA-4，而基质细胞不表达(数据未给出)。此外，抗VCAM-1抗体(10ug/ml)和抗VLA-4抗体(10ug/ml)均部分(50-80％)抑制5TGM1细胞附着于ST2单层细胞，说明在这些细胞上表达的VCAM-1和VLA-4整联蛋白具有生物学功能，而且这些抗体具有中和活性(数据未给出)。

在5TGM1骨髓瘤细胞和鼠骨髓细胞的共培养物中OC样细胞的形成

在5TGM1细胞和鼠骨髓细胞共培养的第6天，形成大量TRAP阳性多核破骨细胞样(OC样)细胞。在牙质薄片上这些OC样细胞表现出形成吸收凹痕，说明这些细胞能吸收骨，并具有破骨细胞表型。在使用孔间插入物的实验中，当5TGM1细胞与骨髓细胞直接接触培养时，观察到OC样细胞形成。相反，当用孔间膜分隔5TGM1细胞和骨髓细胞时，仅有少量OC样细胞形成。因此，5TGM1细胞在混合的骨髓培养物中诱导了破骨细胞形成，并且该诱导需要细胞-细胞的直接接触。

在5TGM1和骨髓细胞的共培养中抗VCAM-1和整联蛋白VLA-4的抗体对OC样细胞形成的影响

抗VCAM-1抗体(VCAM-1Ab，10ug/ml)和抗VLA-4整联蛋白抗体(α4β1Ab，10ug/ml)均极大地抑制OC样细胞的形成。相反，抗ICAM-1的mAb，即骨髓基质细胞上的另一种与基质/骨髓瘤相互作用有关的粘着分子，对OC样细胞的形成并没有影响(图1)。

为测定VCAM-1和VLA-4mAb的该抑制作用对5TGM1诱导的OC样细胞形成是否特异，而且不是由细胞毒性引起的，在鼠骨髓细胞培养物中检测这些抗体对1,25(OH)₂D₃(一种广泛使用的破骨细胞发生刺激剂)诱导的OC样细胞形成的影响(Takahashi 1988)。VCAM-1Ab和VLA-4mAb均不抑制维生素D3诱导的OC样细胞形成，维生素D3本身对基质细胞中VCAM-1的表达没有影响(数据未给出)。

收获自5TGM1和ST2共培养物的条件培养基对骨吸收的影响

在胚胎大鼠长骨分析中，与对照培养基相比，获自5TGM1和ST2共培养物的条件培养基表现出骨吸收的显著增加(图2)，而5TGM1的条件培养基仅引起少量增加。获自ST2细胞的条件培养基没有表现出骨吸收的增加。因此，通过VCAM-1和VLA-4两者的细胞-细胞直接接触，可体外诱导破骨细胞样细胞和骨吸收因子的产生。

重组可溶性VCAM-1(sVCAM-1)对5TGM1细胞产生骨吸收和破骨细胞生成活性的影响

用可溶性重组形式的VCAM-1(sVCAM-1)处理5TGM1的条件培养基可以以剂量依赖方式增加胚胎大鼠长骨的骨吸收，而获自未处理的5TGM1的条件培养基仅少量增加骨吸收。可溶性VCAM-1本身对骨吸收没有作用(数据未给出)。在小鼠骨髓培养系统中，收获自sVCAM-1处理过的5TGM1细胞的条件培养基表现出OC样细胞形成活性的增加，而未处理的5TGM1的条件培养基仅表现出少量OC样细胞形成活性(图3)。

在有或无鼠骨髓瘤细胞情况下培养的骨髓基质细胞(ST2)中Rank配体mRNA的表达

因为Rank配体似乎是OCL形成的一种重要介导物，并且可能是破骨细胞生成性细胞因子影响OCL形成的最终共同途径，我们检测了单独和共培养时的5TGM1和ST2细胞中Rank配体的表达。我们发现5TGM1和ST2细胞的共培养可诱导ST2细胞中的Rank配体mRNA。而且，尽管5TGM1细胞不表达Rank配体，但在用sVCAM-1处理后这些细胞可表达该配体(未显示)。最后，获自sVCAM-1处理过的5TGM1细胞的条件培养基可诱导ST2细胞中的Rank配体mRNA，暗示了VCAM-1/VLA-4途径可使骨髓瘤细胞中产生细胞因子，该细胞因子通过骨髓基质细胞增加Rank配体的表达(数据未给出)。

总之，我们证明5TGM1细胞单独可产生刺激OC样细胞形成和骨吸收的少量活性。然而，当5TGM1骨髓瘤细胞与含有造血破骨细胞前体和基质细胞的骨髓细胞共培养时，5TGM1骨髓瘤细胞强烈粘着基质细胞并增加OC样细胞的形成。在5TGM1细胞被阻止与基质细胞接触的共培养物中没有OC样细胞的形成。而且，在胚胎大鼠长骨的器官培养物中，与单独的ST2或5TGM1的条件培养基相比，收获自5TGM1骨髓瘤细胞和ST2骨髓基质细胞共培养物的条件培养基增加了骨吸收活性。这些数据符合如下观点，即5TGM1细胞与骨髓基质细胞的直接细胞-细胞接触对于破骨细胞刺激和骨吸收活性的产生是必需的。然后我们确定了何种细胞粘着分子参与破骨细胞生成活性产生所必需的5TGM1细胞与骨髓基质细胞的直接细胞-细胞相互作用。我们的数据显示，VCAM-1和VLA-4整联蛋白在该细胞-细胞相互作用中起作用，因为这两种粘着分子的中和抗体极大地降低了共培养物中OC样细胞的形成。该VCAM-1/VLA-4整联蛋白的相互作用负责骨髓基质细胞和5TGM1骨髓瘤细胞间的细胞-细胞通讯，此通讯导致破骨细胞生成和骨吸收活性产生的增加。最后，该骨吸收活性的部分原因是Rank配体的诱导。

实施例2：体内实验

我们的体外研究暗示，骨髓瘤细胞上的VLA-4与骨髓基质细胞上的VCAM-1的相互作用可能在骨髓瘤的骨吸收活性诱导中起着关键作用。我们采取了如下关键步骤，在准确反映人类疾病的动物模型中体内检验该假说。

A.在该实验中，给的小鼠注射可转移至骨髓的1e5 5TGM1骨髓瘤细胞。将小鼠分为两组，每组3只，一组作为对照组，第二组从第8天起每两周用mAb PS/2进行处理。从第1-6周每周测量5TGM1骨髓瘤细胞产生的抗体同种型IgG2b的水平。每两周一次注射80ug剂量(约4mg/kg)mAb的处理强烈抑制IgG2b的产生，指示体内骨髓瘤细胞的存活和生长被显著抑制(图4)。而且，处理小鼠表现出截瘫发生率的降低(所有3只未处理动物在第42天表现出截瘫，而仅有一只处理动物出现截瘫)。未患截瘫的两只处理动物还表现出与肿瘤负荷相关的脾和肝重量的降低。最后，处理动物表现出胫骨和股骨中组织学肿瘤面积的减小(从6.71+/-1.74到0.05+/-0.08平方毫米)。处理对血清钙水平没有影响(数据未给出)。

B.在平行实验中，每两周用40ug PS/2进行的处理对IgG2b水平没有影响(数据未给出)。这些数据显示，抗VLA-4的mAb PS/2以剂量依赖方式强烈抑制建立的骨髓瘤细胞的生长。

C.在另一个体内实验中，在第0天给18只SCID小鼠注射5TGM1骨髓瘤细胞。4只小鼠用PBS进行处理；4只小鼠用抗鼠VCAM-1的mAbM/K-2.7按80ug(约4mg/kg)剂量从第-1天起每3天(即第-1、2、5、8和11天)以预防方式进行处理。在使用同样处理程序的平行实验中，用160ug mAb M/K-2.7处理5只小鼠。此外，从第8天起(即第8、11、14、17天)用160ug mAb M/K-2.7按治疗程序处理5只小鼠。在第21、28和35天采取所有小鼠的血清，动物经X射线照射后在第35天处死进行组织学检查。所有三个处理组均表现出血清IgG2b水平的降低，表明骨髓瘤细胞负荷的降低(图5)。还观察到，与对照组相比低剂量预防程序处理组对脾重量有显著影响(对照组0.23+/-0.14g，处理组0.08+/-0.04)。在高剂量预防组中5只动物中4只表现出脾重量的明显降低，但由于一只动物的脾重量大，整体值并不显著(数据未给出)。

D.可研究在起始高剂量α4整联蛋白拮抗剂药团注射之后施用维持剂量是否可提高效力。骨髓瘤细胞已在骨髓区室中建立，并需要抑制其与VCAM-1的VLA-4依赖性紧密相互作用。而且，推测建立的骨髓瘤细胞的数量越大，使细胞流出进入外周循环需要的起始剂量就越高。

因此，用抗VLA-4的抗体PS/2进行了更大规模的研究。在第0天给28只SCID小鼠注射5TGM1骨髓瘤细胞。9只小鼠未接受处理；9只小鼠接受同种型匹配的对照IgG mAb；10只小鼠接受抗α4整联蛋白的mAb PS/2的处理。给予不同的治疗方法，其中在第4、5和6天给予小鼠高剂量的mAb(200ug)，然后自第8天开始每3天给予80ug(约4mg/kg)的维持剂量。

在第3周和第4周，处理组与未处理组或对照IgG处理组相比，血清IgG2b均有统计学上显著的降低(数据未给出)。重要的是，处理组与未处理组或对照IgG处理组相比，对动物的存活有明显影响(图6)。

实施例3：其它体内实验

基于首次由本文给出的信息，本领域的普通技术人员能容易地使用所述鼠动物模型证实并扩大α4整联蛋白和其配体在多发性骨髓瘤中的重要性。

根据本公开，如下系列实验是本领域技术人员所熟知的，但只用作举例说明而不限制这些工作的种类。

1)对mAb PS/2的剂量反应以确定最佳每两周维持剂量。80ug显示很有效，而40ug则无效。可检查每周两到三次给予高达20mg/kg的剂量来确定最佳剂量。

2)患者的疾病严重性阶段，与肿瘤负荷增加相关。可检查疾病确立以后不同时间给出的mAb PS/2的效力，即比较接种后第8天开始治疗(见例如图4)与第2、3、4和5周开始治疗，以观察可以多晚给予mAb仍可获得症状的某种减轻。

3)按以上针对抗VLA-4mAb列出的相同参数(给药、给药时间安排)检测抗鼠VCAM-1的mAb MK-2的作用。预期见效将需要相似的给药水平。

4)检测骨髓瘤进程的其它标记，包括骨髓和髓外部位的肿瘤负荷；通过使用组织形态测定法进行骨骼的X光照相术分析来鉴定骨损伤；通过评价胞浆中胶原的交联，测量骨吸收的速率；测量胞浆中单克隆蛋白的产生；存在的血钙过多；以及死亡率。

5)目前用标准的化疗方法无法有效地治疗多发性骨髓瘤。检测在适当化疗之前或之后或同时使用的最佳剂量mAb的加和性或协同性作用。

6)采用上述程序和结果，检测选择性抑制一个特定α4整联蛋白或同时抑制几种α4整联蛋白的小分子α4整联蛋白抑制剂或这些抑制剂的组合，模拟mAb的效应并阻断骨髓瘤进程的能力。小分子抑制剂通过口服或非肠胃途径递送，剂量范围是0.1-30mg/kg，每天一或两次，或每周两或三次。

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Claims (21)

1.抗VLA-4抗体同系物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

2.权利要求1的应用，其中所述抗VLA-4抗体同系物结合VLA-4的α4亚基。

3.权利要求1的应用，其中所述抗VLA-4抗体同系物选自：人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的抗原结合片段。

4.抗VCAM-1抗体同系物在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

5.权利要求4的应用，其中所述抗VCAM-1抗体同系物选自：人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的抗原结合片段。

6.权利要求1的应用，其中所述药物按能提供0.1-20mg抗体同系物/kg体重的剂量施用。

7.抗VLA-4抗体同系物在制备抑制骨髓肿瘤相关的骨吸收的药物中的应用。

8.权利要求7的应用，其中所述抗VLA-4抗体同系物结合VLA-4的α4亚基。

9.权利要求7的应用，其中所述抗VLA-4抗体同系物选自：人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的抗原结合片段。

10.抗VCAM-1抗体同系物在制备抑制骨髓肿瘤相关的骨吸收的药物中的应用。

11.权利要求10的应用，其中所述抗VCAM-1抗体同系物选自：人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的抗原结合片段。

12.权利要求7的应用，其中所述药物按能提供0.1-20mg抗体同系物/kg体重的剂量施用。

13.拮抗VLA-4/VCAM-1相互间作用的可溶性VLA-4或VCAM-1多肽在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

14.权利要求13的应用，其中所述多肽是可溶性VLA-4多肽。

15.权利要求13的应用，其中所述多肽是可溶性VCAM-1多肽。

16.权利要求1的应用，其中所述抗VLA-4抗体同系物选自HP1/2抗体同系物、HP2/1抗体同系物、HP2/4抗体同系物、L25抗体同系物、P4C2抗体同系物和P4G9抗体同系物。

17.权利要求1的应用，其中所述抗VLA-4抗体同系物是含有人源化轻链和人源化重链的人源化抗VLA-4抗体，并且所述轻链和重链各自含有来自鼠21-6抗VLA-4抗体的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

18.权利要求17的应用，其中：(a)所述人源化轻链含有来自人κ轻链可变区构架序列的可变区构架，其中该构架区中的至少一个氨基酸位置被鼠21.6免疫球蛋白轻链可变区构架相应位置中的氨基酸所占据；以及(b)所述人源化重链含有来自人重链可变区构架序列的可变区构架，其中该构架区中的至少一个氨基酸位置被小鼠21-6免疫球蛋白重链可变区构架相应位置中的氨基酸所占据。

19.权利要求1-18中任一项的应用，其中配制所述抗体同系物或多肽以进行肠胃外施用。

20.权利要求1-18中任一项的应用，其中所述抗体同系物或多肽与下面的一种或多种组合应用：皮质类固醇、抗炎剂、免疫抑制剂、抗代谢物和免疫调节剂。

21.权利要求19的应用，其中所述抗体同系物或多肽与下面的一种或多种组合应用：皮质类固醇、抗炎剂、免疫抑制剂、抗代谢物和免疫调节剂。

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