JP2000355600A - ヒトｐｄｇｆベータ・レセプタに対する阻害性免疫グロブリン・ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ヒト型ベータ血小板由来成長因子（PDGF）レセ
プタの細胞外ドメインに特異的に結合する免疫グロブリ
ン・ポリペプチドを提供する。 【解決手段】レセプタのリン酸化及びダイマー化の阻
害、並びにその細胞表面上のヒトPDGEベータ型レセプタ
表示細胞のPDGE-仲介有糸分裂誘発、化学走性及び転移
の阻害により、PDGF-誘導（又は刺激）レセプタ活性化
を阻害する免疫グロブリン・ポリペプチドをエンコード
する核酸及び該ポリペプチドの製造。更に該ポリペプチ
ドを診断、治療の用途に用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、ヒト型ベ
ータ血小板由来成長因子レセプタ提示細胞のPDGF- 仲介
増殖を阻害する免疫グロブリン・ポリペプチドの製造及
び使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】血小板由来成長因子(platelet derived
growth factor(PDGF))は、間充織(mesenchymal) 起源の
細胞における有効な増殖剤である(Antoniades, H.N. et
al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1809-18
13; Bowen-Pope, D.F. and Ross. R. (1982) J. Biol.
Chem. 257:5167-5171; Heldin, C-H. et al. (1983) J.
Biol. Chem. 258: 10054-10059(これを、引用により本
明細書中に取り込む。)) 。PDGF( 分子量30kDa)は、A
又はB という2 つの相同鎖から成るジスルフィド結合ダ
イマーである(Johnsson, A. et al. (1982) Biochim. B
iophys. Res. Com mun. 104:66-74( これを、引用により
本明細書中に取り込む。) ) 。この鎖は、同一又は異な
る型の鎖と組み合わされ、相同形態(isoforms) AA 、BB
又はABをもたらす(Heldin,C-H. et al. (1986) Nature
319:511-514 ( これを、引用により本明細書中に取り込
む。) ) 。この有糸分裂促進物質(mitogen)PDGF は、最
初に同定され(Antoniades, H.N. et al. (1979) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76: 1809-1813; Raines, E.W. a
nd Ross, (1982) J. Biol. Chem. 257:5154-5160 (こ
れらの両方を、引用により本明細書中に取り込む。) 、
そしてヒト血小板から精製された(Raines,前掲書中) 、
但し、その後の研究は、血管内皮細胞、血管平滑筋細
胞、マクロファージ及び繊維芽細胞さえも含む幾つかの
細胞がPDGFを合成することを、示した(Ross, R. et al.
(1986) Cell 46:155-169 ( これを、引用により本明細
書中に取り込む。) ) 。

【０００３】PDGFの相同形態のすべてにより誘導される
細胞増殖は、PDGFレセプタへのリガンド結合により仲介
される(Heldin, C-H. (1983)前掲書中., EK, B. et al.
(1982) Nature 295:419-420; Glenn, K. et al. (198
2) J. Biol. Chem. 257:5172-5176; Frackelton, A.R.
et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:7909-7915; Willia
ms, L.T. et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:5287-529
4( これを、引用により本明細書中に取り込む。) ) 。P
DGFレセプタ( 分子量180kDa) は、チロシン・キナーゼ
・ファミリーに属し、そしてA 型( 又はα型)(Matsui,
T. et al. (1989)Science 243: 800-804,及びClaesson-
Welsh, L. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:491
7-4921 ( これらの両方を、引用により本明細書中に取
り込む。))及びB 型( 又はベータ型)(Yarden, Y. et a
l. (1986) Nature 323:226-232,及びEscobedo, J.A. et
al. (1988) Science 240:1532-1534( これを、引用に
より本明細書中に取り込む。) ) という2 つのレセプタ
・サブタイプから成る。

【０００４】PDGFのレセプタへの高いアフィニティー結
合が、レセプタ・ダイマー化(Bishayee, S. et al. (19
89) J. Biol. Chem. 264:11699-11705, 及びHeldin, C-
H. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 8905-8912) 及
び自動リン酸化(Frackelton,et al. 前掲書中) の後に
起こり、そしてDNA 合成における最高点に達する一連の
複雑な細胞間シグナル事件(signalling events) をもた
らす。マウス及びヒトPDGFベータ・レセプタ並びにPDGF
アルファ・レセプタ遺伝子が、クローン化されている(M
atsui et al.前掲書中, Claesson-Welsh et al. 前掲書
中, Yarden etal. 前掲書中, 及びEscobedo et al. 前
掲書中) 。本明細書中でPDGFレセプタについていうと
き、A 型とアルファ型とを、同様に、B 型とベータ型と
を、交換できるものとして使用する。

【０００５】2 つのタイプの相同形態は、それらの顕著
に異なるリガンド結合の特性により、区別されることが
できる。PDGFベータ・レセプタは、B-鎖( 相同形態BB及
びAB) のみに結合し、一方、PDGFアルファ・レセプタ
は、PDGFのすべての形態(A及び/ 又はB 鎖を含む形態(M
atsui et al.前掲書中, Claesson-Welsh et al. 前掲書
中, 及びSeifert, R.A. et al. (1989) J. Biol. Chem.
264:8771-8778))に結合することができる。PDGFレセプ
タは、マクロファージ- コロニー刺激因子レセプタ(Cou
ssens, L. et al. (1986) Nature 320:277-280) 及びc-
kit プロトオンコジーン(protooncogene) 生成物(Yarde
n, et al.,前掲書中) に対する高い程度の構造相同性を
示す。

【０００６】PDGFレセプタは、それらのβ- シート豊富
構造に基づく5 つのIg- 様ドメイン( ドメイン1-5)中に
はっきり分けられることができる細胞外ドメインを特徴
とする。約100 アミノ酸のこれらのIg反復は、( 第4 反
復を除き) それぞれ、規則的に間隔をあけて配置された
システイン残基をもつ。このレセプタは、単一のトラン
スメンブラン・ドメイン及び細胞質チロシン・キナーゼ
・ドメインをもつ(Williams, L. T. (1989) Science 24
3: 1564-1570( これを、引用により本明細書中に取り込
む。) ) 。

【０００７】PDGFは、正常な生理学的過程、例えば、組
織修復及び胚形成(embryogenesis)において重要な役割
を演じている(Ross, R. et al.前掲書中) 。しかしなが
ら、目下、研究は、病因学的増殖失調における及び特定
の肉腫の発達におけるこの有効な有糸分裂促進物質(mit
ogen) に係わっている(Ross, R. et al.前掲書中) 。PD
GF A鎖及びPDGFベータ・レセプタの発現は、その場のハ
イブリダイゼーションによるヒト・アテローム性動脈硬
化症プラークにおいて検出された(Wilcox, J.N. et al.
(1988) J. Clin. Invest. 82:1134-1143)。最近、Fern
s et al.((1991) Science 253:1129-1132)は、PDGFに対
するポリクローナル抗体が無胸腺の(athymic) ヌード・
ラットにおける脱内皮化頸動脈(deendothelialised car
otid arteries)における脈管内膜の(intimal) 病変の形
成を有意に減少させることを、報告した。PDGFは、間充
織起源の細胞における増殖疾患の病因論において掛かり
合っている(Nister, M. et al. (1984) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 81:926-930,及びNister, M. et al. (198
7) Cancer Res. 47:4953-4961 ( これらの両方を、引用
により本明細書中に取り込む。))。Golden et al. は、
PDGF A鎖メッセージが、血管移植のためのヒヒ・モデル
における脈管内膜の過形成(hyperplasia) の領域内にお
いて増加されたことを報告した((1990) J. Vasc. Surg.
11: 580-585) 。また、PDGFは、平滑筋のために化学走
性(chemotactic) であり(Westermark,B. et al. (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:128-132)、及び血小
板PDGFは、ヒヒ化ラット頸動脈における平滑筋細胞の転
移及び増殖であって重症な狭窄症(stenosis)をもたらす
もの、のための原因となる剤となることができる。

【０００８】他の増殖因子及びそれらのレセプタの研究
は、レセプタに対する抗体の発明により、援助された。
例えば、表皮成長因子レセプタを認識する抗体は、レセ
プタ活性化の機構の評価における強力な道具であること
が証明されている(Spaargaren, M. et al. (1991) J. B
iol. Chem. 266:1733-1739, ( これを、引用により本明
細書中に取り込む。) ) 。インターロイキン-2(IL-2)の
ためのレセプタに対する抗体は、IL-2の内面化(interna
lisation) を阻害し、そしてこれ故、応答性細胞の増殖
のその後の導入を阻害する(Duprez, V. et al. (1991)
J. Biol. Chem.1497-1501( これを、引用により本明細
書中に取り込む。) ) 。同様に、表皮成長因子(EGF) レ
セプタに対するモノクローナル抗体は、ヒト哺乳動物腺
癌(adenocarcinoma)細胞系MCF-7 のエストロゲン- 刺激
成長を阻害する(Eppstein, D.A.(1989) J. Cell. Physi
ol. 141: 420-430 ( これを、引用により本明細書中に
取り込む。) ) 。このような抗体は、成長因子- 仲介疾
患の治療において非常に治療的な価値を有することがで
きる。

【０００９】幾つかのグループは、PDGFレセプタに対す
る抗体を単離したが、これらの抗体は、用途を限定され
ていた( 例えば、Kawahara, R.S. et al. (1987) Bioch
em.Biophys. Res. Commun. 147:839-845 ( これを、引
用により本明細書中に取り込む。) を参照のこと。) 。
追加のモノクローナル抗体が、ブタの子宮(porcine ute
rus)からのPDGFの細胞外PDGF- 結合ドメインに対して作
られたが(Ronnestrand, L. and terracio, L. (1988)
J. Biol. Chem. 263:10429-10435 (これを、引用により
本明細書中に取り込む。) ) 、これらの抗体は、¹²⁵ I-
標識PDGFの、ヒト繊維芽細胞への結合を阻害しなかっ
た。また、PDGF活性を阻害しないPDGFレセプタに対する
多数の抗体が、Kanakaraj, P.S. et al. (1991) Bioche
mistry 30:1761-1767; Claesson-Welsh, L. et al. (19
89) J. Biol. Chem. 264:1742-1747; Seifert, R. A. e
t al. (1989) J. Biol. Chem. 264:8771-8778; Kumjia
n,D. A. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
6: 8232-8236; Bishayee,S. et al. (1988) Mol. Cell.
Biol. 8: 3696-3702; Hart, C. E. et al. (1987) J.
Biol. Chem. 262:10780-10785; Escobedo, J. A. et a
l. (1988) J. Biol.Chem. 263:1482-2487; Daniel, T.
O. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 9778-9784; Ke
ating, M. T. and L. T. Williams (1987) J. Biol. Ch
em. 262:7932-7937; Kazlauskas, A. and J. A. Copper
(1990) EMBO J. 9:3279-3286; ( これらの全てを、引
用により本明細書中に取り込む。) により、報告されて
いる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】このように、ヒト・レ
セプタの活性化を特異的に阻害、及び/ 又はヒト・ベー
タ型PDGFレセプタを提示する細胞の増殖を、可能にする
免疫グロブリン及び他の剤の必要性が在る。このような
剤は、そのレセプタの異なる機能的ドメインのマッピン
グにおいて、そして正常及び疾患状態におけるPDGF及び
そのレセプタの役割を吟味することにおいて、有用であ
ろう。さらに、このような剤は、PDGF- 仲介増殖性疾
患、そしてまた、PDGF- 仲介化学走性及び転移の治療に
おける治療的価値をもつであろう。このような疾患は: a)再狭窄(restenosis)であって、血管形成(angioplast
y) 、atherectomy 、又はプラーク(plaque)除去の他の
侵入方法後の冠状動脈再狭窄(coronary restenosis) 、
並びに同一手順の後の腎臓(renal) 又は末梢(periphera
l)の動脈再狭窄を含むもの; b)血管増殖現象及び繊維症(fibrosis)であって急性損傷
の他の形態と関連のあるもの、例えば: 成人呼吸困難症
候群関連肺繊維症、腎炎(nephritis) 関連腎臓繊維症、
カワサキ病関連冠状狭窄、及び他の動脈炎(arteritis)
、例えば、タカヤス病関連血管狭窄(vascular narrowi
ng); c)静脈移植における狭窄の防止; d)移植臓器における加速された平滑筋細胞の転移及び増
殖を原因とする狭窄の防止; e)他の繊維症の(fibrotic)過程、例えば、他の硬皮症(a
cleroderma) 、筋繊維症(myofibrosis);及び、 f)PDGFにより仲介される腫瘍細胞増殖の阻害、を含む。

【００１１】本発明は、これらの及び他の必要性を実現
する。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒト型ベータ
血小板由来成長因子レセプタ( βPDGF-R) に特異的に結
合する免疫グロブリン・ポリペプチドであって、その免
疫グロブリン・ポリペプチドの、ヒトβPDGF-Rの第5 Ig
- 様ドメインへの結合が、以下の効果の1 以上をもつも
のを提供する: i)レセプタへのPDGF BB 結合の阻害;ii)
PDGF- 誘導βPDGF-Rリン酸化の阻害;iii)PDGF-誘導βPD
GF-Rダイマー化の阻害;iv)ヒトβPDGF-R提示細胞のPDGF
- 誘導有糸分裂誘発の阻害; 及びv)βPDGF-R提示細胞の
PDGF- 誘導化学走性及び転移。本発明の好ましい態様
は、モノクローナル抗体、例えば、モノクローナル抗体
2A1E2 であってIgG ₁ イソタイプを有するものである。

【００１３】上記の性質をもつ免疫グロブリン・ポリペ
プチドの全部又は部分をコードしているものに実質的に
同じ配列をもつ単離核酸も、本発明に包含される。これ
らの核酸によりトランスフェクト、形質転換、又は感染
された細胞系は、請求の核酸を含む細胞系を培養しそし
てその免疫グロブリン・ポリペプチド又は断片を収穫す
ることによりその免疫グロブリン・ポリペプチド又はそ
れらの断片を製造する方法と同様に、本発明の他の態様
である。

【００１４】本発明の免疫グロブリン・ポリペプチド
は、診断及び治療の用途をもつ。例えば、本発明のさら
なる態様は、平滑筋細胞の増殖に関連するPDGF- 仲介疾
患をもつヒトを治療する方法であって、患者に、本発明
の免疫グロブリン・ポリペプチドの治療的有効投与量を
投与することを含んで成る方法を含む。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明は、ヒト型ベータPDGFレセ
プタに特異的に結合する免疫グロブリン・ポリペプチド
を提供する。この抗体は、その細胞表面上にヒト・ベー
タ型PDGFレセプタを提示する細胞のPDGF- 誘導有糸分裂
誘発を阻害することができる。本発明は、診断用途にお
いて、並びに、ヒト・ベータ型PDGFレセプタを提示する
細胞の、PDGF- 仲介増殖、転移及び化学走性に関連する
疾患の治療のためにも、有用であろう。定義 a)蛋白 用語" ペプチド" 、" ポリペプチド" 又は" 蛋白" は、
本明細書中で互換可能に使用される。用語" 実質的同一
性" は、ポリプチドについていうとき、問題のポリペプ
チド又は蛋白が天然蛋白の全体又はそれらの部分に少な
くとも約30% 同じであり、普通には少なくとも約70% 同
じであり、そして好ましくは少なくとも約95% 同じであ
ることを示している。

【００１６】本明細書中で使用するとき、用語" 単離さ
れた" 、" 実質的に純粋な" 及び"実質的に均一な"
は、互換可能に使用され、そして蛋白に天然に同伴する
成分から分離された蛋白について記載している。典型的
には、モノマー蛋白が、サンプルの少なくとも約60〜75
% が1 本鎖ポリペプチド骨格を示すとき、実質的に純粋
である。僅かな変異体又は化学修飾は、典型的には、同
じポリペプチド配列を占めている。実質的に純粋な蛋白
は、典型的には、蛋白サンプルの約85〜90% 超えるも
の、より普通には約95% を含んで成るであろうし、そし
て好ましくは約99%を超えるものであろう。蛋白の純度
又は同質性(homogeneity) は、本分野においてよく知ら
れた多数の手段、例えば、蛋白サンプルのポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動、その後の、染色の間のポリアク
リルアミド・ゲル上の単一ポリペプチド・バンドの可視
化により、示されることができる。特定の目的のために
は、高分解能が必要であろうし、そしてHPLC又は精製用
途のための類似の手段が必要であろう。

【００１７】ポリペプチドは、それがその天然の状態に
おいてそれを同伴する生来の汚染物から分離されると
き、天然関連成分を実質的に含まない。したがって、化
学的に合成される又はそれが天然に生じる細胞と異なる
細胞系内で合成されるポリペプチドは、その天然関連成
分を実質的に含まないであろう。蛋白は、硫酸アンモニ
ウムのような物質による選択的沈降、カラム・クロマト
グラフィー、免疫精製法、及びその他を含む本分野にお
いてよく知られた標準的な技術により、実質的な同質性
まで精製されることができる。例えば、R. Scopes, Pro
tein Purification: Principles and Practice, Spring
er-Verlag: New York (1982)( これを、引用により本明
細書中に取り込む。) を参照のこと。 b)核酸 本明細書中で使用するとき、核酸は、DNA 又はRNA であ
ることができる。核酸についていいうとき、用語" 実質
的同一性" は、2 つの核酸配列、又はそれらの設計され
た部分が、場合により並べられそして比較されたとき、
適当なヌクレオチドの挿入又は欠失を伴って、そのヌク
レオオチドの少なくとも約80% において、そのヌクレオ
チドの、普通には少なくとも約90% 〜95% 、そしてより
好ましくは少なくとも約98〜99.5% において、同一であ
ることを、示している。

【００１８】あるいは、実質的な核酸配列の同一性は、
核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件
下、他の核酸ストランドとハイブリダイズするであろう
ときに、存在する。" 実質的に相補的な" は、同様に、
ある核酸が他の核酸と同一であり、又はそれに選択的に
ハイブリダイズするということを、意味している。典型
的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも
14-25 ヌクレオチドのストレッチにわたり少なくとも約
55% の同一性が、好ましくは少なくとも約65% の同一性
が、より好ましくは少なくとも約75% の、そして最も好
ましくは少なくとも約90% の同一性が、在るときに、起
こる。M. Kanehisa Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)
( これを、引用により本明細書中に取り込む。) を参照
のこと。

【００１９】ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件は、典型的には、約1M未満の、より普通には約50
0mM 未満の、そして好ましくは約200mM 未満の塩濃度を
含むであろう。温度条件は、典型的には、22℃よりも高
く、より典型的には約30℃よりも高く、そして好ましく
は約37℃を超えるであろう。その相補的ストランドの塩
基組成及びサイズ、有機溶媒の存在及び塩基非適合の程
度を含む他の要素が、劇的にハイブリダイゼーションの
ストリンジェンシーに影響を与えることができるので、
パラメーターの組み合わせが、いずれか1 つの単独の絶
対的な測定よりも、より重要である。

【００２０】" 単離された" 又は" 実質的に純粋な"
は、核酸についていうとき、アルカリ/SDS処理、CsCl結
合、カラム・クロマトグラフィー。そして本分野におい
てよく知られているその他を含む標準的な技術により、
他の細胞成分又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又
は蛋白から精製されているものをいう。F. Ausubel, et
al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, G
reene Publishing andWiley-Interscience, New York
(1987) ( これを、引用により本明細書中に取り込む。)
を参照のこと。

【００２１】核酸は、それが他の核酸配列との機能的関
係に中に置かれてるとき、" 作用可能な状態で結合され
て(operably linked)"いる。例えば、プロモーター又は
エンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合
に、コーディング配列に作用可能な状態で結合されてい
る。一般的には、作用可能な結合は、結合されている核
酸配列が連続しており、2 つの蛋白コーディング領域を
連結させる必要がある場合には、連続しており、そして
読み取り枠内にある。

【００２２】核酸操作のための技術、例えば、ポリペプ
チドをエンコードしている核酸配列の、発現ベクターへ
のサブクローニング、プローブの標識付け、DNA ハイブ
リダイゼーション、等は、一般的に、例えば、Sambrook
et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboretory Man
ual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Labor
atory, 又はAusbel et al., ed. (1987) 前掲書中, (
これらの両方を、引用により本明細書中に取り込む。)
の中に記載されている。

【００２３】" 発現ベクター" 、" クローニング・ベク
ター" 又は" ベクター" は、しばしば、プラスミド又は
他の核酸分子であって選ばれた宿主内で複製することが
できるものである。発現ベクターは、自己複製可能であ
り、又はそれらは、本分野においてよく知られた方法に
より、宿主細胞のゲノム内に挿入されることにより、複
製することができる。自己複製したベクターは、選ばれ
た宿主細胞内において機能的な複製起点又は自律複製配
列(autonomous replicating sequence(ARS))をもつであ
ろう。しばしば、ベクターが、1 以上の宿主細胞内にお
いて、例えば、クローニング及び構築のための大腸菌
(E.coli)内において、並びに発現のための哺乳類細胞内
において、使用可能であることが必要である。

【００２４】哺乳類細胞系は、しばしば、真核生物から
得られるポリペプチドの発現のための宿主細胞として使
用される。培養における哺乳類細胞の増殖(Propagatio
n) は、それ自体よく知られている。Tissue Culture, A
cademic Press, Kruse and Patterson, ed. (1973) (
これを、引用により本明細書中に取り込む。) を参照の
こと。また、宿主細胞系は、数ある中で、バクテリア(
例えば、大腸菌(E.coli)又はバチルス・サブチリス(B.
subtilis) ) 、酵母、糸状菌、植物細胞、又は昆虫細
胞、のような生物を含む。

【００２５】" 形質転換" は、よく知られた方法によ
り、問題の核酸を含むベクターを直接に宿主に導入する
ことをいう。宿主のタイプに依存する形質転換の方法
は、エレクトロポレーション; 塩化カルシウム、塩化ル
ビジウム、リン酸カルシウム、DEAE- デキストラン、又
は他の物質を使用するトランスフェクション; マイクロ
プロジェクタイル・ボンバードメント(microprojectile
bombardment);リポフェクション; 感染( ベクターが感
染性剤の場合）; 及び他の方法を含む。一般的には、Sa
mbrook et al., (1989) 前掲書中. 及びAusbel et al.
(ed.), (1987) 前掲書中. を参照のこと。また、先に記
載した核酸が導入されている細胞への言及は、そのよう
な細胞の子孫を含むことを意味している。 c)抗体 本明細書中で使用するとき、" 免疫グロブリン・ポリペ
プチド" は、特異的な免疫反応活性をもつ分子をいう。
抗体は、典型的には、免疫グロブリン・ポリペプチドの
テトラマーである。本明細書中で使用するとき、用語"
抗体" は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコード
されている1 以上のポリペプチドから成る蛋白をいう。
免疫グロブリン遺伝子は、カッパ又はラムダ型を有する
ことができる軽鎖をコードしているもの、及び重鎖をコ
ードしているものを含み、重鎖の型は、アルファ、ガン
マ、デルタ、エプシロン及びミューである。免疫グロブ
リン重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端部分は、定常領域で
あり、一方、そのアミノ末端部分は、無数の免疫グロブ
リン可変領域遺伝子によりコードされている。免疫グロ
ブリンの可変領域は、抗原認識特異性を提供する部分で
ある。特に、その特異性は、その免疫グロブリンの、相
補性決定領域(complementerity determing regions(CDR
s)) であって超可変領域としても知られているものの内
に在る。免疫グロブリンは、例えば、Fv、Fab 、及びF
(ab) ₂ 、を含む様々な形態において、並びに1 本鎖に
おいて、存在することができる( 例えば、Huston, et a
l., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883(198
8)及びBird, et al., Science 242:423-426 (1988)( こ
れを、引用により本明細書中に取り込む。) ) 。( 一般
的には、Hood, et al., "Immunology", Benjamin, N.
Y., 2nd ed. (1984), ( これを、引用により本明細書中
に取り込む。) を参照のこと。) 。重鎖及び軽鎖のため
の遺伝子が1 本鎖コーディング配列内で組み合わされて
いるところの1 本鎖抗体を、使用することもできる。

【００２６】" モノクローナル抗体" は、当業者に馴染
みのある様々な技術により得られることができる。簡単
に言えば、所望の抗原により免疫化された動物からの脾
臓細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合により、不死
化する(Kohner and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511
-519(1976)) 。不死化の他の方法は、Epstein Barrウイ
ルス、オンコジーン、又はレトロウイルスによる形質転
換、あるいは、本分野においてよく知られた他の方法を
含む。単一の不死化細胞から生じたコロニーは、所望の
特異性及び抗原についてのアフィニティーを有する抗体
を作り出すためにスクリーニングされ、そしてこのよう
な細胞により作られたモノクローナル抗体の収率は、脊
椎動物宿主の腹膜腔(pertoneal cavity)中への注射を含
む様々な技術により、増強されることができる。

【００２７】また、モノ特異的免疫グロブリンが、原核
生物又は真核生物宿主細胞における組換え技術により、
作られることができる。" キメラ" 抗体は、その軽鎖及
び重鎖の遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝
子セグメントから成るように遺伝子操作された免疫グロ
ブリン遺伝子によりコードされている。例えば、マウス
・モノクローナル抗体からの遺伝子の可変(V) セグメン
トを、ヒト定常(C) セグメントに結合することができ
る。このようなキメラ抗体は、マウス定常領域並びにマ
ウス可変領域をもつ抗体よりもヒトに対してより少ない
抗原性をもつようである。

【００２８】本明細書中で使用するとき、また、用語キ
メラ抗体は、ヒト- 様の枠組み(framework) をもち、そ
してその中で、存在するいずれかの定常領域がヒト免疫
グロブリン定常領域に少なくとも約85-90%、そして好ま
しくは約95% 同じポリペプチド配列をもつような免疫グ
ロブリン、所謂" ヒト化" 免疫グロブリンをいう( 例え
ば、PCT 国際公開WO 90/07861 、( これを、引用により
本明細書中に取り込む。) を参照のこと。) 。これ故
に、このような" ヒト化" 免疫グロブリンの全ての部分
は、ひょっとしたら相補性決定領域(CDR's) を除いて、
1 以上の生来のヒト免疫グロブリン配列の対応部分に実
質的に同一である。

【００２９】用語" フレームワーク領域" は、本明細書
中で使用するとき、Kabat, et al.,(1987): Sequences
of Proteins of Immunologic Interest, 4th Ed., US D
ept. Health and Human Services,( これを、引用によ
り本明細書中に取り込む。)により定められるような、
免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域の部分であっ
て単一種内の異なる免疫グロブリンの中の比較的保存さ
れているような( すなわち、CDR's 以外の) ものをい
う。本明細書中で使用されるとき、" ヒト- 様フレーム
ワーク領域" は、それぞれの現存鎖内に、ヒト免疫グロ
ブリン内のものと同じ、少なくとも約70% 以上のアミノ
酸残基、典型的には75〜85以上の残基を含んで成るフレ
ームワーク領域である。

【００３０】ヒト定常領域DNA 配列は、よく知られた手
順に従って、様々なヒト細胞から単離されることができ
るが、好ましくは、不死化B-細胞から単離されることが
できる。本発明のキメラ免疫グロブリンを作るための可
変領域又はCDRsは、ヒト・ベータ型PDGFレセプタに結合
することができるモノクローナル抗体から、同様に得ら
れるであろうし、そしてマウス、ラット、ウサギ、又は
よく知られた方法により抗体を作ることができる他の脊
椎動物を含むいずれかの慣用の哺乳類源内で作られるで
あろう。

【００３１】好適な、DNA 配列のための源細胞及び免疫
グロブリン発現及び分泌のための宿主細胞は、多数の
源、例えば、American Type Culture Collection("Cata
logueof Cell Lines and Hybridomas," Fifth edition
(1985) Rockville, Maryland,U.S.A.,( これを、引用に
より本明細書中に取り込む。) から得られることができ
る。

【００３２】本明細書中に特に記載するキメラ及び" ヒ
ト化" 免疫グロブリンに加えて、他の実質的に同一な修
飾された免疫グロブリンを、当業者によく知られた様々
な組換えDNA 技術を使用して容易に設計及び製造するこ
とができる。一般的に、遺伝子の修飾は、様々なよく知
られた技術、例えば、部位特異的突然変異誘発により容
易に行われることができる(Gillman and Smith, Gene
8:81-97 (1979) 及びRoberts et al., Nature 328:731-
734 (1987),( これらの両方を、引用により本明細書中
に取り込む。) を参照のこと。) 。

【００３３】あるいは、一次免疫グロブリン構造の一部
のみを含んで成るポリペプチド断片を作ることができ
る。例えば、抗原認識に加えて、又はそれ以外の、1 以
上の免疫グロブリン活性( 例えば、補体固定) を有する
免疫グロブリン・ポリペプチド断片を作ることが要求さ
れることができる。また、免疫グロブリン遺伝子は、全
体として又は部分において、他の遺伝子からの機能的領
域( 例えば、酵素) と、又は他の分子、例えば、新たな
性質をもつ融合蛋白( 例えば、" 免疫毒(immunotoxin
s)")を作るための毒素又は標識と、組み合わされること
ができる。遺伝子融合のこれらの場合においては、2 つ
の成分が、同一ポリペプチド鎖内に存在する。あるい
は、免疫グロブリン又はそれらの断片が、様々なよく知
られた化学的手順のいずれかにより、毒素又は標識に化
学的に結合されることができる。例えば、標識又は細胞
毒性剤が蛋白であり、そして第2 成分が無傷の免疫グロ
ブリンであるとき、その結合は、ヘテロ2 官能価の架橋
剤、例えば、SPDP、カルボジイミド、グルタルアルデヒ
ド、等の方法によるものであることができる。

【００３４】好適な標識は、例えば、放射性核種、酵
素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学発光剤、磁気
粒子を含む。このような標識の使用を教示している特許
の例は、以下のものである: 米国特許第3,817,837 号;
第3,850,752 号; 第3,939,350号; 第3,996,345 号; 第
4,277,437 号; 第4,275,149 号; 及び第4,366,241 号,
( これらの全てを、引用により本明細書中に取り込
む。) 。

【００３５】また、1 本鎖分子を含む免疫毒は、組換え
手段により、製造されることができる。様々な免疫毒の
製造は、本分野によく知られており、そして方法は、例
えば、"Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine,
Academic Press, pp. 168-190 (1982); E. Vitetta, S
cience (1987) 238: 1098-1104; 及びG. Winter andC.
Milstein, Nature (1991) 349:293-299; ( すべてを、
引用により本明細書中に取り込む。) 中に見られること
ができる。

【００３６】様々な細胞毒剤(cytotoxic agent) が、免
疫毒における使用に好適である。細胞毒剤は、放射性核
種、例えば、インジウム-131、イットリウム-90 、レン
ニウム-188、及びビスマス-212; 多数の化学療法医薬、
例えば、ビンデジン(vindesine) 、メトトレキサート、
アドリアマイシン、及びシスプラチナム(cisplatinum);
及び細胞毒性蛋白、例えば、リボソーム阻害蛋白様ヤマ
ゴボウ(pokeweed)抗ウイルス蛋白、シュードモナス外毒
素A(Pseudomonas exotoxin A) 、リシン(ricin) 、ジフ
テリア毒素、リシンA 鎖、等、又は細胞表面において活
性な剤、例えば、ホスホリパーゼ酵素( 例えば、ホスホ
リパーゼC)を、含むことができる( 一般的に、"Chimeri
c Toxins," Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 15:355
-381 (1981) 、及び"Monoclonal Antibodies for Cance
r Detection and Therapy," eds.Baldwin and Byers, p
p. 159-179, 224-266, Academic Press (1985),( これ
らの両方を、引用により本明細書中に取り込む。) を参
照のこと。) 。

【００３７】発明の説明 本発明の免疫グロブリン・ポリペプチドは、治療におけ
る並びに診断及び他の用途における使用を見つけられる
であろう。これらの分野において有用な様々な技術は、
例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor, New York (1988) ( すべ
ての目的のために、引用により本明細書中に取り込
む。) 中に記載されており: 免疫グロブリンを作るため
の動物の免疫化; モノクローナル抗体の生産; プローブ
としての使用のための免疫グロブリンの標識付け; 免疫
アフィニティー精製; 及び免疫検定を含む。

【００３８】本発明の免疫グロブリン・ポリペプチドの
例は、以下に記載するようなモノクローナル抗体2A1E2
であって、ベータ型ヒトPDGFレセプタに特異的に結合す
るものである。モノクローナル抗体2A1E2 であってIgG
₁ イソタイプを有するものは、American Type Culture
Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Mary
land 20231(ATCC no. HB10938)に、この出願の出願日に
先立って、寄託されている。

【００３９】本発明の抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン
・ポリペプチドを、ヒト・ベータ型PDGFレセプタの精製
された又は部分的に精製された細胞外ドメインにより動
物を免疫化することにより、調製することができる。免
疫化された動物は、ヒト・ベータ型PDGFレセプタ細胞外
ドメインに特徴的なエピトープを免疫学的に認識するこ
とができる様々な種、例えば、ネズミ、ウサギ(lagomor
ph) 、ウマ(equine)等の中のいずれか1 つである。

【００４０】本発明のモノクローナル抗体は、ヒト・ベ
ータ型PDGFレセプタ細胞外ドメインに特徴的な抗原決定
基に特異的に結合する免疫グロブリン・ポリペプチド又
はそれらの部分をエンコードしている核酸配列を免疫化
することにより、調製されることができる。不死化過程
を、ハイブリドーマ融合技術により、抗体- 産生リンパ
球のウイルス形質転換、組換えDNA 技術により、又は細
胞融合、ウイルス形質転換及び/ 又は組換えDNA 方法論
を組み合わせることにより、行うことができる。

【００４１】本発明の1 つの態様に従って、ヒト抗-PDG
F レセプタ・モノクローナル抗体産生細胞を、例えば、
Epstein-Barrウイルス(EBV) 形質転換技術を使用して、
不死化する。例えば、患者の、末梢血液、骨髄、リンパ
節、扁桃(tonsils) 等、好ましくは、PDGFレセプタ又は
それらの部分により免疫化されたものを、米国特許第4,
464,465 号及びChan et al., J. Immunol. 136:106 (19
86) ( これを、引用により本明細書中に取り込む。) に
従ってEBV を使用して、不死化する。

【００４２】また、ヒト抗-PDGF レセプタ・モノクロー
ナル抗体を、様々な他の方法により、例えば、EBV 又は
他のウイルス形質転換とハイブリドーマ融合技術との組
み合わせを使用して、調製することができる。例えば、
ハイブリドーマを、PDGFレセプタ又はそれらの部分によ
り免疫化された個体から得られた刺激されたB 細胞を、
マウス/ ヒト・ヘテロハイブリッド融合パートナーと、
融合することにより、創出することができ、これらの様
々なものが、記載されている。例えば、米国特許第4,62
4,921 号及びJames and Bell, J. Immunol. Meths. 10
0:5-40 (1987)(これを、引用により本明細書中に取り込
む。) を、参照のこと。マウス/ ヒト融合パートナー
は、EBV により刺激され又は形質転換されたヒト・リン
パ球を、容易に入手可能なマウス骨髄腫系、例えば、NS
-1又はP3NS-1と、例えば、ポリエチレン・グリコールの
存在中で、融合することにより、構築されることができ
る。このハイブリッドは、好適に医薬- マークされるべ
きであり、これは、そのハイブリッドを、所望の医薬、
例えば、6-チオグアニン、オウバイン(oubain)、又はネ
オマイシン(neomycin)の増加濃度において培養すること
により、達成されることができる。

【００４３】問題の抗体を分泌するマイブリドーマ又は
リンパ芽球様細胞(lymphoblastoidcells)は、ベータ型P
DGFレセプタに結合する抗体について培養上澄液をスク
リーニングすることにより同定されることができる。よ
り好ましくは、スクリーニング検定は、例えば、PDGF-
仲介有糸分裂誘発を阻害する抗体を検出するために使用
されることができる。所望の活性を有する細胞を、慣用
の技術に従ってクローン化及びサブクローン化し、そし
て問題の抗-PDGF レセプタ・モノクローナル抗体を産生
する安定な、不死化された系が同定されるまで、監視す
る。モノクローナル抗体は、異なる抗原結合特異性をも
つ抗体を産生する細胞から分離されたクローンの、不死
化された細胞系により作られた抗体を、意味する。した
がって、このような抗体は、他のモノクローナル抗体か
ら単離されて作られ、そして、従って、( 他の抗体と比
べて) 実質的に純粋な形態であり、そしてB 細胞源とし
て役立つ動物種からの血清中に正常に生じるよりも一般
的に高い濃度にある。

【００４４】あるいは、ある者は、Huse et al., Scien
ce 246:1275-1281(1989)( これを、引用により本明細書
中に取り込む。) により概説されるような一般的な手順
に従ってヒトB 細胞からDNA ライブラリーをスクリーニ
ングし、そして次に所望の特異性を有する抗-PDGF レセ
プタ抗体( 又は結合断片) をコードしている配列をクロ
ーニング及び増幅することにより、PDGFレセプタの細胞
外ドメインに特異的に結合するヒト抗-PDGF レセプタ免
疫・ポリペプチド又はそれらの部分をコードしているDN
A 配列を単離することができる。

【００４５】免疫グロブリンを、次に、適当な免疫グロ
ブリン遺伝子、又はそれらの部分を含む発現ベクター
を、適当な宿主細胞に導入することにいより、作ること
ができる。この宿主細胞を、次に、免疫グロブリン・ヌ
クレオチド配列の高レベル発現に好適な条件下で、維持
し、そして必要なときに、軽鎖、重鎖、軽/ 重鎖ダイマ
ー又は無傷抗体、結合断片、又は他の免疫グロブリン形
態の回収及び精製が、続くことができる。

【００４６】好適な宿主細胞は、微生物を含むが、哺乳
類又は昆虫の組織細胞培養物が、本発明のモノクローナ
ル抗体の生産に好まれることができる(E. Winnacker, "
FromGenes to Clones," VCH Publishers, N. Y., N.Y.
(1987) ( これを、引用により本明細書中に取り込む。)
を参照のこと。) 。無傷の免疫グロブリンを分泌する
ことができる多数の好適な宿主細胞系が、本分野におい
て開発されており、そしてこれは、チャイニーズ・ハム
スター卵巣(CHO) 細胞系を含むが、好ましくは、形質転
換されたB-細胞又はハイブリドーマが使用されるであろ
う。

【００４７】一旦発現されれば、本発明の、抗体全体、
それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫
グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈降、アフィニテ
ィー・カラム、カラム・クロマトグラフィー、ゲル電気
泳動、等を含む、本分野の標準的技術に従って精製する
ことができる( 一般的には、R. Scopes, Protein Purif
ication, Springer-Verlag, N.Y. (1982) ( 引用により
本明細書中に取り込む。) を参照のこと。) 。少なくと
も約90〜98% 同質性(homogeneity) を有する実質的に純
粋な免疫グロブリンが好ましく、そして医薬用途のため
には、98〜99%以上の同質性を有するものが最も好まし
い。一旦、部分的に又は同質性まで精製されれば、その
ポリペプチドを、次に、( 体外を含み) 治療的に、又は
検定手順、免疫蛍光染色、等の開発及び実施において、
使用することができる。( 一般的に、Immunological Me
thods, Vols. I and II, Lefkovits and Pernis, eds.,
Academic Press, New York, N.Y. (1979 and 1981) (
これを、引用により本明細書中に取り込む。) を参照の
こと。) 。

【００４８】本発明に従って作られた免疫グロブリン・
ポリペプチドは、IgG 、IgM 、IgA又はIgD イソタイプ
を有することができ、そしてさらに、それらの適当なサ
ブクラス、例えば、IgG ₁ 、IgG ₂ 、IgG ₃ 、又はIgG
₄ の中のいずれかであることができる。組換えDNA 技術
を使用して、単離された免疫グロブリン・ポリペプチド
の" クラス- スイッチング(class-switching)"を、容易
に行うことができる。この方法においては、問題の免疫
グロブリン分子のイソタイプを決定する定常領域をコー
ドしている遺伝子が、欧州特許出願第EP1 314,161 号(
引用により本明細書中に取り込む。) 中に一般的に記載
されるように、所望のイソタイプ又はサブクラスをコー
ドしている遺伝子により、置き換えられる。また、クラ
ス- スイッチされた免疫グロブリンは、本分野において
知られた選択方法を使用して自発的スイッチングを経験
した細胞を選択することにより、単離されることもでき
る。

【００４９】実質的に非- ヒトである免疫グロブリン・
ポリペプチドのヒトへの投与は、抗- 抗体応答を顕現さ
せることができる。したがって、実質的にヒトである本
発明の抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン・ポリペプチド
を調製することが必要であることができる。" 実質的に
ヒト" とは、特に、確立されたPDGF- 仲介細胞増殖失調
を治療するために必要であることができる長い期間にわ
たる反復投与のための、起源において少なくとも約50%
、より好ましくは約70〜80% 以上、そして最も好まし
くは約95〜99% 以上であるアミノ酸配列から成る抗体又
はそれらの結合断片を、意味する。本明細書中で使用す
るとき、ヒト抗体は、その文脈が特にことわらない限
り、完全にヒト起源の抗体並びに実質的にヒトであるも
のを含むことを、意味する。

【００５０】ヒト抗-PDGF レセプタ・モノクローナル抗
体の生産が慣用の不死化技術によっては困難であること
ができるので、まず、非- ヒト抗体を作り、そして次に
組換えDNA 技術を介して、非- ヒト抗体の抗原結合領
域、例えば、Fab 、相補性決定領域(CDRs)又は超可変領
域を、実質的なヒト分子を作るために適用なヒト定常領
域(Fc)又はフレームワーク領域に、移すことが、必要で
あることができる。このような方法は、本分野において
一般的に知られており、そして、例えば、米国特許第4,
816,397 号、PCT 国際公開WO 90/07861 、及び欧州特許
出願第 173494 号及び239400号( これらのそれぞれを、
引用により本明細書中に取り込む。) 中に記載されてい
る。

【００５１】ヒト・ベータ型PDGFレセプタに特異的に結
合し、そしてこれ故、そのレセプタへのPDGFの結合を阻
害する、得られたキメラ抗体及びキメラ免疫グロブリン
・ポリペプチドも、本発明の範囲内にある。典型的な治
療的キメラ抗体は、ヒトPDGFベータ型レセプタ抗原決定
基に特異的なマウス免疫グロブリンからの可変(V) 又は
抗原結合ドメイン、及びヒト免疫グロブリンからの定常
(C) 又はエフェクター・ドメインから成るハイブリッド
蛋白であるであろう。但し、他の哺乳類種からのドメイ
ンを、可変及び定常ドメインの両方のために使用するこ
とができる。本明細書中で使用するとき、また、用語"
キメラ抗体" は、相補性決定領域(CDR's) だけがその抗
原決定基を特異的に認識する免疫グロブリンから移され
ており、その免疫グロブリン遺伝子の残りがヒト( 又は
所望により他の哺乳類) の免疫グロブリン遺伝子から得
られているような、免疫グロブリン遺伝子により、コー
ドされている抗体をいう。このタイプのキメラ抗体
は、" ヒト化(humanized)"( ヒト免疫グロブリン遺伝子
が使用される場合) 抗体といわれる。

【００５２】抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン・ポリペ
プチドの可変ドメインの超可変領域は、本発明の関連態
様を含んで成る。この超可変領域又はCDRsは、フレーム
ワーク領域( 単一種内の異なる免疫グロブリンの中で比
較的保存されている免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可
変領域の部分) と共に、抗-PDGF レセプタ免疫グロブリ
ン・ポリペプチドがヒト・ベータ型PDGFレセプタを認識
し且つそれ故それに結合することを、可能にする。この
超可変領域を、クローン化し、そして配列決定すること
ができる。一旦、同定されれば、PDGFレセプタの特異的
認識を与えるこれらの領域は、次に、他の免疫グロブリ
ン分子の一部として又は融合蛋白、例えば、そのクロー
ン化イディオタイプの免疫原性を強化する働きをもつ担
体分子として、宿主内での発現のために、ベクター内に
クローン化されることができる。

【００５３】本発明の抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン
・ポリペプチドは、一般的に無傷で、又は免疫原性断
片、例えば、F _v 、Fab 、又はF(ab')₂ 断片として、使
用されるであろう。この断片を、慣用の技術により、例
えば、ペプシン又はパパインのようなものを使用した抗
体の蛋白分解消化により、又は所望の断片をコードして
いる遺伝子又はそれらの部分がクローン化又は合成さ
れ、そして様々な宿主内で発現されてるような組換えDN
A 技術により、抗体から得ることができる。

【００５４】当業者は、" 抗- イディオタイプ" 抗体を
標準的な技術に従って免疫原として特異的免疫グロブリ
ンを使用することにより作ることができることを認める
であろう。例えば、PDGFレセプタ・ポリペプチド、又は
それらの断片による感染又は免疫化は、そのFab 可変領
域結合部位の上に、その特定の免疫グロブリン、例え
ば、イディオタイプに対しユニークなPDGFレセプタ・ポ
リペプチドのイメージをもつ中和免疫グロブリンを、誘
導する。このような抗-PDGF-R 免疫グロブリンによる免
疫化は、抗- イディオタイプ抗体であって元のPDGF-R抗
原の構造を真似たその結合部位において立体配置をもつ
ものを、誘導する。これらの抗- イディオタイプ抗体
は、それ故に、PDGF- 仲介疾患を治療するためにPDGF-R
抗原の代わりに、使用されることができる( 例えば、Ni
sonoff (1991) J. Immunol. 147:2429-2438 ( これを、
引用により本明細書中に取り込む。) を参照のこと。)
。

【００５５】本発明の抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン
・ポリペプチドは、治療及び診断方法並びに組成物にお
ける用途を見いだしている。治療用途のためには、抗-P
DGFレセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドを、ヒト・
ベータ型PDGFレセプタのための可溶性リガンドとして使
用され、そのレセプタをマスキングし又はその他にその
レセプタへの結合からPDGF分子を阻害し、そしてそれに
より不所望の細胞の転移及び増殖を阻害する。

【００５６】医薬組成物のためには、本明細書中に記載
するような本発明の抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン・
ポリペプチドを、PDGF- 仲介細胞増殖失調をもつ個体に
投与する。治療用途においては、組成物を、細胞レセプ
タを有効にブロックするのに充分な量で患者に投与し、
そしてそれによりその細胞増殖及びその徴候及び/ 又は
合併症を少なくとも部分的に休止させる。これを達成す
るのに適当な量は、"治療的有効投与量" として定めら
れる。この使用のために有効な量は、例えば、抗-PDGF
レセプタ免疫グロブリン・ポリペプチド組成物の性質、
投与のやり方、治療される疾患の段階及び重度、患者の
体重及び健康の総合状態、及び処方内科医の判断に依存
するであろうが、一般的には、1 日当たり約0.01mg/kg
から約100.0mg/kg体重までの範囲にあるであろうし、1
日当たり約0.1mg/kgから約10.0mg/kg 体重までの投与量
が、より一般的に使用される。抗-PDGF レセプタ免疫グ
ロブリン・ポリペプチド及びそれから得られたペプチド
組成物が、重症な疾患状態、すなわち、致死的又は潜在
的に致死的な状態において使用されることができるとい
うことに留意しなければならない。このような場合に
は、実質的に過剰のこれらの組成物を投与することが、
可能であり、そしてそその処方内科医により必要と思わ
れることができる。したがって、本発明の、ヒト抗-PDG
F レセプタ・モノクローナル抗体又は実質的ヒト抗-PDG
F レセプタ・モノクローナル抗体が、これらの情況の下
では最も好ましい。

【００５７】本組成物の単一又は複数の投与を、その処
方内科医により選ばれた投与レベル及びパターンによ
り、行うことができる。いずれの事件においても、医薬
配合物は、患者を有効に治療するのに充分な本発明の抗
-PDGF レセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドの量を提
供すべきである。投与は、不所望の細胞増殖の第一指標
において又は診断直後に開始され、そして徴候が実質的
に軽減され、そしてその後の期間にわたり、続けられる
べきである。よく確立された病気の場合においては、負
荷投与量その後の維持投与量が、必要であろう。

【００５８】治療処置のための医薬組成物は、非経口
的、局所的、経口的又は居所投与について意図されてい
る。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、例えば、
静脈中に、皮下内に、皮膚内に、又は筋肉内に、投与さ
れる。したがって、本発明は、許容される担体、好まし
くは水性担体中に溶解され又は懸濁される抗-PDGF レセ
プタ免疫グロブリン・ポリペプチドの溶液を含んで成る
非経口投与のための組成物を提供する。様々な水性担
体、例えば、水、バッファー水、0.4%生理食塩水、0.3%
グリシン、ヒアルロン酸、等を、使用することができ
る。これらの組成物は、慣用の、よく知られた滅菌技術
により、滅菌され、又は滅菌濾過されることができる。
得られた水溶液を、それ自体としての使用のために包装
し、又は凍結乾燥することができる。投与に先立ちその
凍結乾燥調製物が無菌溶液と組み合わされる。この組成
物は、生理学的条件に近づけるために必要な、医薬とし
て許容される補助物質、例えば、pH調整及び緩衝化剤、
浸透圧調整剤、水和剤、等、例えば、酢酸ナトリウム、
乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、ソルビタン・モノラウレート、トリエタノ
ールアミン・オレエート、等を含むことができる。

【００５９】医薬配合品中の本発明の抗-PDGF レセプタ
免疫グロブリン・ポリペプチドの濃度は、広く、すなわ
ち、約1%未満、普通には約10-15%において又は少なくと
も約10-15%においてから、50重量% 以上と同じ程度ま
で、変動することができ、そして選ばれた投与の特定の
態様に従って、主に、液体の容量、粘度等により、選ば
れることができるであろう。

【００６０】したがって、静脈中の注入のための典型的
な医薬組成物は、250ml の滅菌Ringer's溶液、及び100m
g の抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン・ポリペプチドを
含むように調製されることができる。非経口的に投与す
ることができる化合物を製造するための実際の方法は、
当業者に知られ又は明らかになるであろうし、そして例
えば、Remington's Pharmaceutical Science, 17th e
d., Merk Publishing Company, Easton, PA (1985)( こ
れを、引用により本明細書中に取り込む。) 中により詳
細に記載されている。

【００６１】また、抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン・
ポリペプチド及びそれらの断片は、リポソームを介して
投与されることもできる。この抗-PDGF レセプタ免疫グ
ロブリン・ポリペプチドは、そのリポソームを、ヒト・
ベータ型PDGFレセプタを表示する特定の組織又は細胞
に、標的化することに役立つことができる。リポソーム
は、エマルジョン、泡、ミセル、不溶性単層、脂質結
晶、リン脂質分散体、ラメラ層、等を含む。これらの調
製物においては、配達されるべき免疫グロブリン・ポリ
ペプチド又は断片は、リポソームの一部として、単独で
又は例えば、その標的細胞に対して毒性である分子と共
に、取り込まれる。免疫グロブリン・ポリペプチドを含
むリポソーム懸濁液は、静脈内に、局部的に、局所的
に、等に、とりわけ、投与のやり方、配達されるペプチ
ド、及び治療される疾患の段階に従って変動する投与量
において、投与されることができる。

【００６２】本発明の抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン
・ポリペプチドの固体組成物のために、慣用の非毒性固
体担体であって、例えば、医薬グレードのマンニトー
ル、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サ
ッカリン・ナトリウム、タルク、セルロース、グルコー
ス、シュクロース、炭酸マグネシウム等を含むものを、
使用することができる。経口投与のためには、医薬とし
て許容される非毒性組成物を、正常に使用される賦形
剤、例えば、先に列記したような担体、一般的に10-95%
の活性成分、すなわち、1 以上の抗-PDGF レセプタ免疫
グロブリン・ポリペプチドのいずれかを、そしてより好
ましくは25%-75% の濃度において、取り込むことにより
配合する。

【００６３】診断目的のためには、抗-PDGF レセプタ免
疫グロブリン・ポリペプチドを、標識又は非標識のいず
れかを行うことができる。標識は、本分野においてよく
知られ且つ報告されている様々な技術の中のいずれかに
より検出することができるシグナルを提供する物質であ
る。あるいは、本発明内に含まれる非標識抗体を、標識
され、そして本発明の抗-PDGF レセプタ免疫グロブリン
・ポリペプチドを認識する他の抗体( 第二抗体) と共
に、使用することができる。例えば、抗-PDGF レセプタ
免疫グロブリン・ポリペプチドの定常領域に特異的な標
識抗体を、サンプルに結合した免疫グロブリン・ポリペ
プチドを検出するために使用することができる。

【００６４】多種多様の標識、例えば、放射性核種、ホ
タル石(fluors)、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻
害剤、リガンド( 特にハプテン) 、等を、使用すること
ができる。多くのタイプの免疫検定が利用でき、そして
当業者によく知られている。本発明の、抗-PDGF レセプ
タ免疫グロブリン・ポリペプチド、及びそれらの断片
は、生理学的試料中のPDGFレセプタの検出のための様々
な免疫検定において使用されることができる。このよう
な免疫検定は、液相イムノアッセイ及びウェスタン・ブ
ロット検定、競合的及び非競合的蛋白結合検定、酵素-
結合イムノソルベント検定(ELISA) 、一般的に使用さ
れ、そして科学的及び特許の刊行物において広く記載さ
れている他のもの、並びに商業的に使用される多くのも
のを、含むことができる。

【００６５】このような免疫グロブリン及びペプチド
は、同様に、本分野においてよく知られた方法により、
免疫組織化学的染色技術において、使用されることがで
きる。以下の例を、限定ではなく、例示により、提供す
る。 実施例材料 PDGF BB をAmgen から購入した。抗- ホスホチロシン・
モノクローナル抗体(MAb) PY20を、ICI から購入した。
DMEM、RPMI 1640 、F12 、ウシ血清、ペニシリン- スト
レプトマイシン溶液、G418- ネオマイシン、200mM グル
タミン、1M HEPES、ピルビン酸ナトリウム(11mg/ml) 、
及びリン酸塩バッファー生理食塩水(PBS) を、GIBCO か
ら入手した。ウシ胎児血清(FCS) 及びモノクローナル抗
体サブタイピング・キットは、Hyclone からのものであ
った。Tris、リン酸ナトリウム、硼酸ナトリウム、酢
酸、ピロリン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ジチオ
トレオトール(DDT) 、エチレン・ジアミン・テトラ酢酸
(EDTA)、EGTA、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) 、ナトリ
ウム・オルトバナデート、塩化ナトリウム(NaCl)、クエ
ン酸、フェニル・メチル・スルホニル・フルオリド(PMS
F)、ウシ血清アルブミン(BSA) 、Triton X100 、Tween
20、2,2'アジノ-bis(3- エチルベンズチアゾリン)-6-ス
ルホン酸(ABTS)、及び過酸化水素は、Sigma からのもの
であった。ヤギ抗- マウス・ペルオキシダーゼ及びヒポ
キサンチン- チアミン(HT)は、Boehringer Mannheim か
らのものであった。ゼラチン、非染色蛋白分子量マーカ
ー及びニトロセルロースは、BioRadからのものであっ
た。前染色高分子量蛋白マーカーは、BRL からのもので
あった。プロテインA セファロースCL4B、プロテインG
セファロースCL4B、Immunopure^TM結合バッファー、F(a
b')₂ 及びFab 調製キットは、Pierceからのものであっ
た。前包装PD10カラムは、Pharmacia からのものであっ
た。¹²⁵ I-プロテインA 及び¹⁴C-分子量マーカーは、Am
ershamからのものであった。¹²⁵ I-ジヨード-Bolton-Hu
nter試薬は、New England Nuclear からのものであっ
た。メタノールは、Burdick-Jackson からのものであっ
た。組織培養供給物は、Costarからのものであった。AG
01523B細胞は、ATCCから得た。HR5 細胞は、J.A. Escob
edo(UCSF) により好意的に提供された。初期のヒヒ腕動
脈平滑筋細胞は、J. Anderson 及びS. Hanson (Emory U
niv.) により、親切に提供された。方法 細胞培養。 NIH 3T3細胞を、10% ウシ胎児血清、1Xペニ
シリン- ストレプトマイシン、2mM グルタミン、及びピ
ルビン酸ナトリウム(0.11mg/ml) を含むDMEM中で、定例
的に維持した。細胞外ドメイン(PΔ1-5)又は完全長PDGF
ベータ・レセプタ(HR5) を表示するCHO 細胞を、10% FC
S 、1Xペニシリン- ストレプトマイシン、2mM グルタミ
ン、ピルビン酸ナトリウム(0.11mg/ml) 及びG418(200μ
g/ml) を含むRPMI中で培養した。ヒト包皮繊維芽細胞(A
G01523B)を、10% FCS 、1Xペニシリン- ストレプトマイ
シン、2mM グルタミン、及びピルビン酸ナトリウム(0.1
1mg/ml) を含むDMEM中で培養した。モノクローナル・ハ
イブリドーマ細胞を、20%FCS 、1Xペニシリン- ストレ
プトマイシン、2mM グルタミン、ピルビン酸ナトリウム
(0.1mg/ml)、1X HT 、及び10% マクロファージ- ならし
培地を含む50:50 DME:RPMI中で維持した。

【００６６】切り詰められたヒトPDGFベータ・レセプタ
- 発現細胞系の構築。ヒトPDGFベータ・レセプタcDNAの
切り詰めを、オリゴヌクレオチド- 特異的欠失突然変異
誘発(oligonucleotide-directed deletion mutagenesi
s) により、行った。オリゴヌクレオチド- 特異的イン
ビトロ突然変異誘発は、Kunkel et al. (1987) Meth. E
nzymol. 154: 367-382( これを、引用により本明細書中
に取り込む。) の修飾された方法に従って行われた。最
初に、ヒトPDGFベータ・レセプタのコーディング領域全
体の3.9kb EcoRI-HindIII cDNA断片( 残基-32 〜499)
を、ml3mpl8 産生ベクターmpl8PRのEcoRI とHindIII と
の中にサブクローン化した(Maniatis, T. etal. (1982)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,( こ
れを、引用により本明細書中に取り込む。) ) 。

【００６７】オリゴヌクレオチドを、アミノ酸499-1074
(PR Δ1; GTG TGA GGA ACG GGA AATTCA TCG AAG GAC AT
C CCC CGAC)、又はアミノ酸384-1074(PR Δ2; GGA AGG
TCGATG TCT AGT TAA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC)をコー
ドしているヒトPDGFベータ・レセプタcDNAの部分を欠失
させるために設計した (図1)。終止コドンを、残基499
(PRΔ1)又は残基384(PRΔ2)の後に導入した。サブクロ
ーニングの正当化を、制限酵素消化分析及びジデオキシ
連鎖終止配列決定により行った(Sanger, F. etal. (197
7) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467, ( こ
れを、引用により本明細書中に取り込む。) ) 。

【００６８】修飾されたPDGFベータ・レセプタ・ポリペ
プチドを、発現ベクターPBJ1 (Lin,A. et al. (1990)
Science 249: 677-679,( これを、引用により本明細書
中に取り込む。) ) のEcoRI とHindIII との中にサブク
ローン化し、ベクターpSV2Neo(Southern, P.J. and Ber
g, P. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327-341 ( これ
を、引用により本明細書中に取り込む。) ) と共に、1:
10の比において、CHO-K1細胞中に、リポフェクチン試薬
取り込み(lipofectin reagent uptake) の方法(Felgne
r, P. L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84: 7413-7417( これを、引用により本明細書中に取り
込む。) ) により、共同トランスフェクトした。トラン
スフェクトされた細胞を、G418- ネオマイシン耐性につ
いて選択し、そして個々のクローンを、単離し、そして
無血清培地中の細胞外PDGFベータ・レセプタの高レベル
発現のための等しい細胞密度において、スクリーニング
した。修飾された細胞外PDGFベータ・レセプタ蛋白の発
現を、ヒトPDGFレセプタ残基51-68 に基づく合成ペプチ
ド(SVLTLTNLTGLDTGEYFC 配列番号3)に対して作られたウ
サギ・ポリクローナル血清(Ab 1-3-5 、図1 を参照のこ
と。) を使用して、ウェスタン・ブロット検定により、
測定した。組換えクローンp Δ1-5(完全長細胞外PDGFレ
セプタを発現するもの) 及びp Δ2-7(細胞外PDGFレセプ
タのドメイン1-4を発現するもの) を、その後の蛋白製
造のために使用した。

【００６９】ヒトPDGFベータ・レセプタに対するMAbsの
調製。抗体を、Harlow and Lane (1988), In Antibodie
s: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat
ory,Cold Spring Harbor, NY,( これを、引用により本
明細書中に取り込む。) により記載されているように、
開発した。マウスを、PDGFベータ・レセプタ(pΔ1-5)の
部分的に精製された細胞外ドメインにより、50-100μg/
免疫注射を使用して、免疫化した。免疫化マウス中の抗
体の力価を、以下のように、酵素- 結合イムノソルベン
ト検定(ELISA) を使用して測定した。96-welll Immunol
on II マイクロタイター・プレートを、PDGFベータ・レ
セプタの部分精製(10-15%)細胞外ドメイン(200-300ng/w
ell)により、4 度において一夜被覆した。残りの操作
を、室温において行った。このwellを、100mM NaCl及び
0.5%ゼラチンを含む0.05M Tris, pH7により、1 時間ブ
ロッックした。プレートを、各種希釈のマウス血清によ
り2時間インキュベートし、洗浄バッファー(0.05M Tri
s, pH 7 、100mM NaCl及び0.3%ゼラチン) により5 回洗
浄し、ヤギ抗- マウス・ペルオキシダーゼ( 洗浄バッフ
ァー中1:1000) と共に1 時間インキュベートした。プレ
ートを、先に記載したように洗浄し、そして過酸化水素
( 最終濃度0.003%) を含む、0.1Mクエン酸、0.1 M リン
酸ナトリウム2 塩基、pH 4中の2,2'- アジノ-bis(3エチ
ルベンズチアゾリン)6- スルホン酸(ABTS 、1mg/ml) に
より、顕色させた。650nm における吸光度を測定し、そ
してその値を、pBJ ベクター単独によりトランスフェク
トされたCHO 細胞からのならし培地から類似の程度まで
精製された蛋白により得られた値と比較した。

【００７０】高い反応性を示すマウスを、殺し、そして
その脾臓を単離した。脾臓細胞を取り出し、そして先に
記載したような骨髄腫細胞と融合した(harlow and Lan
e, 前掲書中) 。ハイブリドーマを、同一ELISA を使用
してスクリーニングし、そして陽性ハイブリドーマを、
クローン化し、そして再スクリーニングした。陽性モノ
クローナル抗体細胞を、培養し、そして腹水(ascites)
を、記載されたBalb/cマウス中で調製した(Harlow and
Lane, 前掲書中) 。組織培養基を、製造者による指示に
従ってHyClone からのサブタイピング・キットを使用し
てそのMAbsをサブ- タイプ(sub-type)するために使用し
た。

【００７１】抗体の精製。抗体を、以下のようにプロテ
インA CL4B上で精製した。腹水液を、Immunopure^TM結合
バッファー(Pierce)中で1:5 希釈し、そして同一バッフ
ァー中で平衡にしたプロテインA CL4Bカラム上でクロマ
トグラフィーにかけた。通過物を、回収し、そしてその
カラムを、Immunopure結合バッファー(10 カラム容量)
により洗浄した。この結合IgGsを、0.1 M グリシン、pH
2.8により溶出させ、そして中和剤として2 M Tris, pH
11(40μg/ml) を入れたチューブ内に回収した。ピーク
蛋白画分を、280nm における吸光度を測定することによ
り検出し、プールし、そしてPBS 中で透析した( それぞ
れ4 L の2 回交換) 。

【００７２】MAb 2A1E2 F(ab')₂ 及びFab 蛋白分解断片
の調製。MAb 2A1E2 のF(ab')₂ 断片を、製造者の指示に
従ってImmunopure F(ab') ₂ 調製キット(Pierce)を使用
して無傷MAb から調製した。モノクローナル抗体2A1E2
を、pH 4.2において37℃において4 時間、固定化ペプシ
ンと共にインキュベートし、そして非解裂IgG 及びFc断
片を、プロテインA セファロースCL4Bを使用してF(ab')
₂ 断片から分離した。Fab 断片を、同様に、Pierce I
mmunopure Fab 調製キットを使用して調製した。このIg
G を、37℃においてpH 7で5 時間、固定化パパインと共
にインキュベートし、そして未消化IgG 及びFc断片を、
プロテインA を使用して除去した。サンプルを、酵素消
化後SDS-PAGEにより分析し、そしてPDGFベータ・レセプ
タELISAを、たとえあるにしても、抗原認識の損失につ
いて測定するために使用した。

【００７３】免疫沈降検定。免疫沈降検定を、Kessler,
S.W. (1981), Meth. Enzymol. 73:442-471 ( これを、
引用により本明細書中に取り込む。) の手順の修正によ
り行った。精製p Δ1-5 又はp Δ2-7 を使用するとき、
蛋白を、室温において2 時間か又は4 ℃において12時間
かのいずれかで、免疫沈降(IP)バッファー(40mM Tris,
pH 8, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 1mM EGTA 及び1% Trito
n X100) 中で、MAb とインキュベートした。完全長レセ
プタを免疫沈降させる場合、その時、PDGFベータ・レセ
プタ表現細胞は、1 μM ナトリウム・オルトバナデート
及び1mM PMSFを含むIPバッファー中で可溶化され、そし
て4 ℃において8-12時間、MAb とインキュベートされ
た。次に、サンプルを、プロテインA-セファロース CL4
B とプロテインG-セファロース CL4B との1:1 混合物の
50% スラリー(50-100 μl / サンプル) と共にインキュ
ベートした。4 ℃において1-2 時間後、樹脂を、3 サイ
クルの遠心分離により洗浄し、そしいてIPバッファー中
に再懸濁させ、そして最終的に、その樹脂を、Laemmli
サンプル可溶化バッー中で煮沸した(50-100 μl / サン
プル)(1970, Nature 227:680-685( これを、引用により
本明細書中に取り込む。) 。サンプルを、7%又は10% La
emmli ゲル上でSDS-PAGEに供し、そして次に、ニトロセ
ルロースに移した。ウェスタン・ブロットを、ブロッキ
ング・バッファー(0.5% NaCl及び4% BSAを含む0.05 M T
ris, pH 8)中でブロックし、そして4 ℃において12時
間、一次抗体と共にインキュベートした。このニトロセ
ルロースを、ブロッキング・バッファーにより洗浄し、
そして¹²⁵ I-プロテインA(0.4mCi/ml)と、室温において
1-2 時間インキュベートし、そしてX-線に露出させた。

【００７４】PDGF BB の放射ヨウ素化。PDGF BB を、Du
an et al. (1991, J. Biol. Chem.266: 413-418( これ
を、引用により本明細書中に取り込む。) ) により記載
されているようなBolton-Hunter 手順の修正によりヨウ
素化した。簡単に言えば、^{12 5} I-ジヨードBolton-Hunte
r 試薬(1 mCi) を、窒素下で乾燥させた。次に、PDGFBB
(2.5 μg)を、10μl の0.1 M ホウ酸ナトリウム(pH 8.
5)中4 ℃において15分間、¹²⁵ I-ジヨードBolton-Hunte
r 試薬に添加した。この試薬混合物を、500 μl の0.1
M ホウ酸ナトリウム、0.2 M グリシン、pH 8.5により、
4 ℃において10分間、クエンチした。この材料を、1mg/
ml BSAを含む0.3 M 酢酸により前もって平衡としたPD10
カラム上のゲル濾過クロマトグラフィーに供した。ピー
ク放射標識蛋白画分を、ガンマ・カウンターを使用して
検出した。典型的には、ヨウ素化PDGF BB の比活性は、
50000 カウント/ng であった。

【００７５】無傷HR5 細胞への¹²⁵ I-PDGF BB の結合。
HR5 細胞を、2mM EDTAを含むPBS により、37℃において
20分間、収穫した。洗浄HR5 細胞(1 x 10 ⁶ 細胞/100μ
l )を、0.5% BSAを含むPBS 中のMAb(又はF(ab')₂ 又はF
ab 断片) の各種濃度をもつ懸濁液中で、3 連で、30分
間室温においてインキュベートした。HR5 細胞を、100
倍過剰の非標識PDGF BB 及び担体蛋白( 血小板貧弱血
漿、50μl ) の非存在中( 全結合) 又は存在中( 非特異
的結合) において¹²⁵ I-PDGF BB ( 約1ng/チューブ)
と、室温において45分間、インキュベートした。インキ
ュベーションの最終容量は、500 μl であった。このイ
ンキュベーション混合物(400μl ) を、Ficoll-paque(7
00μl ) 上に層化し、そして遠心分離した。その上澄液
を、除去し、そして細胞ペレット中の放射能を測定し
た。

【００７６】リン酸化検定。HR5 細胞を、6-well皿内で
集密まで増殖させ、そして一次細胞を、100mm 皿内で培
養した。細胞を、冷無血清DMEMにより2 回洗浄し、そし
て10分間氷上でインキュベートした。細胞を、回転振と
う機上で氷上で30-45 分間、MAb 2A1E2 と2 連で、前イ
ンキュベートし、そして次に、リガンドPDGF BB を、そ
のwellに添加し、そしてインキュベーションを、1.5-2
時間続けた。細胞を冷PBS により2 回洗浄し、そして溶
菌バッファー(100mM Tris, pH 8 、 30mM ピロリン酸ナ
トリウム、50mM フッ化ナトリウム、5mM EDTA、5mM EG
TA、1% SDS、100mM DTT)、又はIPバッファーであって両
者が1mM PMSF及び1 μM オルトバナデートを含むものの
いずれかにおいて、可溶化した。次に、サンプルを、電
気泳動に先立ってさらに加工した。

【００７７】ヒト包皮繊維芽AG01523B細胞及びヒヒ平滑
筋細胞における有糸分裂誘発。ヒト包皮繊維芽AG01523B
細胞及びヒヒ平滑筋細胞を、96-well 皿内で集密まで増
殖させた。ヒヒ平滑筋細胞を、0.5%ウシ血清を含むDMEM
と一夜インキュベートすることにより、静止させた。次
に、細胞を、PDGF BB の存在中37℃において18時間、そ
の後37℃において5 時間、2 μCi/well の³ H-チミジン
と共に、様々な濃度のMAb 2A1E2 と共に3 連でインキュ
ベートした。対照ヒヒ初期平滑筋細胞を、非特異的MAb
と共に並行してインキュベートし、そして対照AG01523B
細胞を、非阻害性抗-PDGF ベータ・レセプタMAb(4C5C8)
と共にインキュベートした。次に、Wellを、氷冷5% TCA
(2 x 250μl ) により洗浄し、そして0.25 N NaOH (2 x
100μl）により可溶化した。この可溶化サンプルを、
シンチレーション・バイアルに移し、そして放射能を測
定した。

【００７８】ダイマー化検定。集密HR5 細胞を、100mm
皿内で先に記載したように培養した。細胞を、冷PBS 中
で2 回洗浄し、そしてBSA(1.5mg/ml) 及び25mM Hepesを
含むPBS 中の各種濃度のMAb 2A1E2 と共に4 ℃において
1 時間、インキュベートした。PDGF BB を、細胞に添加
し、そしてインキュベーションを、4 ℃において2 時間
続けた。細胞を、冷PBS 中で2 回洗浄し、25mM Hepesを
含むPBS 中の架橋剤BS ³ (0.75mg/プレート) と共に4 ℃
において30分間、インキュベートした。この反応を、ク
エンチ・バッファー(150mM NaCl を含む0.025 M Tris,
pH 7.4; 10ml/プレート) 中の希釈により終了させた。
細胞を、1mM PMSF及び100 μM ナトリウム・オルトバナ
デートを含むIPバッファー(0.5ml/ プレート) 中で4 ℃
において20分間、抽出した。細胞溶解物を、ポリクロー
ナル抗ヒト・ベータ・レセプタAb(AB88 、1:500 希釈)
を使用して4 ℃において一夜免疫沈降させた。次に、プ
ロテインA CL4B(60 μl の50% スラリー) を、それぞれ
のサンプルに添加した。4℃において1 時間後、ビーズ
を、逐次、0.5% NP400を含むPBS 、0.5% NP40 を含む0.
5M塩化リチウム、0.5 M 塩化リチウム、そして最後に、
水により、洗浄した。サンプルを、Laemmli サンプル可
溶化バッファーにより可溶化し、そして3%-8% グラジエ
ント・ゲル上のSDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動、その後の、ニトロセルロースへのウェスタン転移に
供した。ウェスタン・ブロットを、抗ホスホチロシンMA
b(1:1000) 又はAb88(1:500希釈) のいずれかと、4 ℃に
おいて一夜、その後、¹²⁵ I-プロテインA(0.15μCi/ml)
と、室温において2 時間、インキュベートした。次に、
ウェスタン・ブロットをX-線フィルムに露出させた。結果 MAb 2A1E2 の性質。MAb 2A1E2 は、IgG ₁ モノクローナ
ル抗体である。ウェスタン分析は、MAb 2A1E2 が、非-
還元ヒトPDGFベータ・レセプタ( 図2 、パネルA 、レー
ン4)を認識するが、還元蛋白( 図2 、パネルA 、レーン
1)を認識しないことを示している。MAb 2A1E2 は、溶液
から完全長の細胞外レセプタ(pΔ1-5;残基1-499)を免疫
沈降させる( 図2 、パネルC 、レーン3)。しかしなが
ら、精製Δ2-7(ドメイン5 を除く; 残基1-384)が抗原で
あるとき、反応性は全くない( 図2、パネルB 、レーン
2)。このデータは、MAb 2A1E2 により認識されるエピト
ープが第5 Ig- 様ドメイン内に、すなわち、ヒトPDGFベ
ータ・レセプタの残基385-499 間にあることを示してい
る。

【００７９】MAb 2A1E2 によるHR5 細胞への¹²⁵ I-PDGF
BB 結合の投与量- 依存性阻害。HR5 細胞( 完全長ヒト
PDGFベータ・レセプタを発現するCHO-K 細胞) が最初に
MAb2A1E2 と、その後¹²⁵ I-PDGF BB とインキュベート
されるとき、有意(48.1%) な阻害が、MAb 2A1E2 により
処理されていない細胞と比べて、0.1nM MAb と同程度に
低い濃度にあることが観察される。1nM 以上の濃度のMA
b 2A1E2 を使用するとき、その細胞上の完全長PDGFベー
タ・レセプタへのリガンド結合の100%阻害が在る( 図3
、パネルA)。PDGFベータ・レセプタに対する200nM の
異なる、非阻害性MAb(4C5C8)を前インキュベーションに
おいて使用するとき、阻害の量は、ほんの36.1% であ
る。これは、200nM の非関連MAb(抗-IIb/IIIa)の効果に
匹敵する(19.18% 阻害) 。1nM MAb 2A1E2 の存在中の
¹²⁵ I-PDGF BB 結合の量は、非標識PDGFBB の1500倍過
剰の存在中に見られるリガンド結合の量に( 図3 、パネ
ルA)、又はヒトPDGFレセプタを発現しない非トランスフ
ェクトCHO 細胞へのリガンドの結合量に( データを示さ
ず。) 、等しい。

【００８０】MAb 2A1E2 により見られる阻害が立体障害
によるものであるかどうかを決定するために、我々は、
MAb のF(ab')₂ 及びFab 断片を調製した。この抗体のこ
れらの蛋白分解断片は、ELISA におけるPDGFベータ・レ
セプタを未だに認識する( データを示さず。) 。但し、
それらの活性は、僅かに減少されていた。これを、放射
標識リガンド結合検定において使用するとき、我々は、
その抗体断片が、濃度に依存してHR5 細胞上の完全長PD
GFベータ・レセプタへの¹²⁵ I-PDGF BB の結合を未だ阻
害することを見つけた( 図3 、パネルB)。しかしなが
ら、完全な阻害が、10nM MAb 2A1E2の F(ab') ₂ 又はFa
b 断片により見られ、一方、1nM 無傷抗体は、完全に、
結合を阻害した。1nM F(ab') ₂ 断片の存在中のリガン
ドの結合は、64.5% 程阻害され、1nM Fab 断片の存在中
の結合は、50% 程阻害された。

【００８１】MAb 2A1E2 によるリン酸化の阻害。図4 中
に示すように、MAb 2A1E2 は、濃度に依存して、HR5 細
胞におけるPDGF誘導リン酸化を特異的に阻害し、約50%
の阻害が1.3nM の濃度において生じ( レーン4)、そして
100%の阻害が13.3 nM MAb 2A1E2 において生じている(
レーン5)。対照の非関連MAb(抗-IIb/IIIa)は、効果な無
く( レーン3)、そしてMAb 4C5C8 であってこれもヒトPD
GFベータ・レセプタに対して開発されたが異なるエピト
ープを認識するものは、リガンド- 誘導リン酸化に対す
る効果を全くもっていなかった( レーン8)。

【００８２】ヒトPDGFベータ・レセプタのPDGF BB 誘導
ダイマー化に対するMAb 2A1E2 の効果。PDGF BB による
HR5 細胞の処理は、PDGFベータ・レセプタの、リガンド
- 仲介リン酸化( 図5 、レーン1-6 中の180KDa) 及びダ
イマー化( 図5 、レーン2 及び6 中の390KDa) をもたら
した。HR5 細胞を、MAb 2A1E2 と最初の前インキュベー
トし、そして次に、PDGF BB とインキュベートすると
き、ダイマー化は、テスト濃度のすべてにおいて阻害さ
れた( 図5 、レーン3 、4 及び5)。このデータは、レセ
プタ上のMAb 2A1E2 の結合がリガンド結合及びレセプタ
・ダイマー化を排除することを示している。

【００８３】MAb 2A1E2 による有糸分裂誘発の阻害。図
6 中に示すように、MAb 2A1E2 は、濃度に依存して、ヒ
ト包皮繊維芽AG01523B細胞におけるPDGF BB-誘導有糸分
裂誘発を阻害し、最大阻害(69.55%)は、1.3 μM の濃度
において生じる。非- 阻害性MAb 、4C5C8 を使用したと
き、我々は、有糸分裂誘発の有意な阻害を検出しなかっ
た。MAb 2A1E2 の濃度の増加は、阻害の程度を改善しな
かった。主な理由は、これらの細胞が、2A1E2 により結
合又は阻害されないPDGFアルファ・レセプタ(データを
示さず。) をも発現するからである。

【００８４】また、我々は、ヒヒ動脈からの初期平滑筋
細胞に対する様々な濃度のMAb 2A1E2 の効果について測
定した。ヒヒ平滑筋細胞におけるPDGF BB-仲介PDGFレセ
プタ・リン酸化は、200nM 及び20nM MAb 2A1E2により阻
害された( それぞれ、図7 中、レーン4 及び5)。図8 中
に見られるように、1nM MAb 2A1E2 は、1-2ng/mlのPDGF
の存在中の³ H-チミジンの取り込みを、90% 程、阻害
し、そして25nM MAbは、1-10ng/ml からのリガンドの濃
度範囲において、80% 程、有糸分裂誘発を阻害する。25
0nM を超える濃度のMAb 2A1E2 は、リガンドのすべての
テスト濃度において90% 程、有糸分裂誘発を阻害する。
非関連MAbsを使用するとき、ヒヒ平滑筋細胞における有
糸分裂誘発の有意な効果は全くなかった。

【００８５】要約すると、我々は、ヒトPDGFベータ・レ
セプタに高く特異的であるモノクローナル抗体、MAb 2A
1E2 を開示した。MAb 2A1E2 は、ナノモル濃度において
ヒト・ベータ型PDGFレセプタへのPDGFの結合を阻害し、
そしてそれ故、リガンド- 仲介リン酸化及びダイマー化
の阻害により示されるようなレセプタの活性化を阻害す
る。この抗体は、マイクロモルの濃度においてインビト
ロにおける有糸分裂誘発を阻害する。本MAb の蛋白分解
断片は、¹²⁵ I-PDGF BB 結合の阻害により測定されるよ
うに、阻害作用を保持している( 図3A) 。MAb 2A1E2
は、PDGFベータ・レセプタの第5 Ig- 様ドメイン内のエ
ピトープを認識するようであり( 図2)、そしてこのドメ
インへの結合は、このレセプタのダイマー化を防ぐよう
である( 図5)。1.3nM MAb 2A1E2 と同程度に低い濃度に
おいて、PDGFベータ・レセプタのリガンド- 誘導自動リ
ン酸化の特異的且つ有意な阻害が在る( 図4)。結果とし
て、我々は、0.1 μM MAb 2A1E2 においてHR5 細胞にお
けるPDGF誘導有糸分裂誘発の完全な阻害を見つけ( デー
タを示さず。) 、そしてヒト包皮繊維芽細胞(AG01523B)
において、70% 阻害が、1 μM MAb 2A1E2 濃度において
達成される。

【００８６】また、MAb 2A1E2 を、ヒヒ腕動脈からの平
滑筋細胞との交差反応についてテストした。PDGF BB-誘
導リン酸化( 図7)及び有糸分裂誘発( 図8)は、20-25nM
MAb2A1E2 により80% まで阻害された。モノクローナル
抗体2A1E2 は、イヌ、ウサギ、マウス、又はブタからあ
のPDGFレセプタと交差反応せず、そしてまた、ヒト・ア
ルファ型PDGFレセプタと交差反応しない( データを示さ
ず。) 。

【００８７】特に興味のあるのは、我々が、MAb 2A1E2
がPDGFベータ型レセプタの第5 Ig-様ドメインに結合
し、そしてそれ故、PDGF- 仲介活性を阻害するというこ
とを証明したと同時に、PDGFが第3 Ig- 様ドメインに結
合するということである。これまでの記載は、例示的な
ものであって、限定的なものではないことを理解すべき
である。先の記載をレビューする間、多くの態様が当業
者にとって明らかとなるであろう。それ故、本発明の範
囲は、先の記載を参照により決定されるべきではなく、
代わりに、添付の請求の範囲を参照して、このような請
求の範囲が権利をもつ等価な範囲の全体を伴って、決定
されるべきである。

【００８８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> COR Therapentics, Inc. <120> Inhibitory Immunoglobulin Polypeptides to Human PDGF Bata Receptor <150> US 07/801,795 <151> 02-DEC-1991 <160> 3 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <400> 1 gtgtgaggaa cgggaaattc atcgaaggac atcccccgac 40 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <400> 2 ggaaggtcga tgtctagtta atcgaaggac atcccc 36 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <400> 3 Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly Glu Tyr 1 5 10 15 Phe Cys

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えヒト・ベータ・レセプタ細胞外ドメイン
構築物。完全長のPDGFベータ・レセプタの欠失突然変異
誘発を、方法中に記載するように行った。P Δ1 は、第
5 ドメイン細胞外PDGFベータ・レセプタ( アミノ酸1-49
9)であって、PDGFベータ型レセプタcDNAからアミノ酸残
基500-1074のコドンをオリゴヌクレオチドGTG TGA GGA
ACG GGA AAT TCA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC( 配列番号
1 ）を使用して欠失させることにより作られたものをい
う。P Δ2 は、第4 ドメイン細胞外PDGFレセプタ(aa1-3
84) であって、上記cDNAからアミノ酸残基385-1074のコ
ドンをオリゴヌクレオチドGGA AGG TCG ATG TCT AGT TA
A TCG AAG GAC ATC CCC CGAC( 配列番号2 ）を使用して
欠失させることにより作られたものをいう。仮定のIgド
メインを、以下のように示す:D1(aa 1-91)、D2(aa 92-1
81) 、D3(aa182-282) 、D4(aa283-384) 及びD5(aa385-4
99) 。ポリクローナル抗血清1-3-5 のペプチド決定基
は、先に示したD1である。

【図２】A. 分泌された第5 ドメイン細胞外PDGFベータ
・レセプタp Δ1-5 のウェスタン・ブロット。還元され
た( レーン1-3)及び非還元( レーン4-6)のPDGFベータ・
レセプタの分泌細胞外ドメイン(pΔ1-5 、5 μg/レー
ン) を、7% Laemmliゲル上で電気泳動にかけ、その後、
方法中に記載するようにウェスタン転移をおこなった。
ニトロセルロースを、2%ミルクを含むリン酸塩- バッフ
ァー生理食塩水(PBS) 中でブロックし、ストリップに切
断し、そしてMAb 2A1E2(レーン1 及び4)、他のPDGFベー
タ・レセプタ・モノクローナル抗体(1C7D5)(レーン2 及
び5)、又は非特異的モノクローナル抗体( レーン3 及び
6)のいずれかの60μg/mlと共に、4 ℃において一夜イン
キュベートした。このニトロセルロース・ストリップ
を、0.5%ミルク及び0.1% Tween 20 を含むPBS により洗
浄し、室温において2 時間¹²⁵ I-標識プロテインA と共
にインキュベートし、そしてX-線フィルムに露出させ
た。矢印は、p Δ1-5 の位置を示している。 B. 分泌された第4 ドメイン細胞外PDGFベータ・レセプ
タp Δ2-7 の免疫沈降。分泌された第4 ドメイン細胞外
PDGFベータ・レセプタp Δ2-7(2.6 μg)を、MAb 2A1E2
(レーン2 、5 μg)、1C7D5(レーン3 、5 μg)又は非特
異的MAb(レーン4、5 μg)のいずれかと共にI.P.バッフ
ァー中の最終容量500 μl 中で4 ℃において3 時間イン
キュベートした。プロテインA セファロースCL4B: プロ
テインG セファロースCL4B(1:1) を、それぞれのチュー
ブに添加し(60 μl の50% スラリー) 、そしてインキュ
ベーションを、4 ℃において2 時間続けた。ビーズを、
分離し、I.P.バッファー中で5 回洗浄し、そして10% La
emmli ゲル上で電気泳動にかけた。このゲルを、ニトロ
セルロースに移し、そして5%ミルクを含むPBS 中でブロ
ックした。このブロットを、0.5%ミルクを含むPBS 中の
ウサギ・ポリクローナル抗-PDGF ベータ・レセプタAb(1
-3-5) の1:100 希釈物と共にインキュベートした。一夜
のインキュベーション後、このブロットを、洗浄し、
¹²⁵ I-プロテインA と共にインキュベートし、洗浄し、
そしてX-線フィルムに露出させた。レーン1 は、免疫沈
降をもたないp Δ2-7 の標準を示している。矢印は、p
Δ2-7 の位置を示している。 C. MAb 2A1E2 による分泌細胞外PDGFベータ・レセプタ
の免疫沈降。細胞外ヒトPDGFベータ・レセプタ(pΔ1-5
、5 μg)を、非特異的MAb(レーン2)、MAb 2A1E2(レー
ン3)、又は1C7D5(レーン4)のいずれかの5 μg と共に、
パネルA について記載したように、免疫沈降させた。こ
のサンプルを、加工し、そしてそのブロットを、ウサギ
・ポリクローナル抗-PDGF ベータ・レセプタ1-3-5(1:10
0 希釈物)及び¹²⁵ I-プロテインA と共に、パネルB に
ついての凡例中に記載したように、インキュベートし
た。

【図３】HR5 細胞への¹²⁵ I-PDGF BB 結合の阻害。A) H
R5細胞を、方法中に記載したように、様々な濃度のMAb
2A1E2 又は対照MAbs(200nM抗-IIb/IIIa 又は200nM 4C5C
8)と共にインキュベートした。次に、この細胞を、¹²⁵
I-PDGF BB とインキュベートし、そして結合された放射
能を先に記載したように測定した。非特異的結合は、10
0 倍過剰の非標識PDGF BB の存在中で結合した¹²⁵ I-PD
GF BB の量といして決定する。B) HR5細胞を、様々な濃
度の完全長MAb 2A1E2 、MAb 2A1E2-F(ab')2 、又はMAb
2A1E2-Fab 、及び方法中に記載するような100nM 完全長
抗-IIb/IIIa と共にインキュベートした。MAbs及びそれ
らの誘導体の存在及び非存在中の細胞への¹²⁵ I-PDGF B
B の全結合を測定した。100 倍過剰の非標識PDGF BB の
存在中で結合した¹²⁵ I-PDGF BB の量は、非特異的結合
を表している。

【図４】MAb 2A1E2 によるHR5 細胞のリン酸化の阻害。
6-well皿中のHR5 細胞の集密単層を、様々なMAbsと2 で
前インキュベートし、その後、方法中に記載するように
リガンドPDGF BB とインキュベートした。細胞を、可溶
化し、そして1 つの6-well皿の当量を、7% Laemmliゲル
上で電気泳動し、そしてニトロセルロースに移した。ウ
ェスタン・ブロットをブロックし、そして次に¹²⁵ I-プ
ロテインA と共にインキュベートし、そしてオートラジ
オグラフを行った。レーン3-7 は、0.13 nM MAb 2A1E2
(レーン3)、1.3nM MAb 2A1E2(レーン4)、13.3nM MAb 2A
1E2( レーン5)、0.13μM Mab 2A1E2(レーン6)又は0.53
μM 2A1E2(レーン7)のいずれかと前インキュベートさ
れ、その後100ng/ml PDGF BBとインキュベートされたwe
lls を表している。レーン2 は、その細胞が0.53μM の
非特異的MAb と第一前インキュベートされたときの100n
g/ml PDGF BBの存在中のリン酸化の程度を示しており、
そしてレーン8 は、その細胞が0.53μM のPDGFベータ・
レセプタMAb 4C5C8 と前インキュベートされたときのPD
GF BB-誘導体リン酸化を示している。矢印は、完全長の
ヒトPDGFベータ・レセプタの位置を示している。

【図５】MAb 2A1E2 によるPDGFレセプタのPDGF BB-仲介
ダイマー化の阻害。 HR5細胞を、0.13 nM MAb 2A1E2(レ
ーン3)、0.13μM MAb 2A1E2(レーン4)、又は1.3 μM MA
b 2A1E2(レーン5)のいずれかと、その後、100ng/ml PDG
F BBとインキュベートし、そして架橋を、方法中に記載
するように行った。レーン6 は、ダイマー化に対する0.
1 μM の抗-IIb/IIIa MAb の効果を表している。レーン
1 は、添加された架橋剤の非存在中のダイマーの相対量
を示しており、そしてレーン2 は、抗体の非存在中のダ
イマー化PDGFレセプタの量を示している。

【図６】MAb 2A1E2 によるAG01523B細胞における有糸分
裂誘発の阻害。細胞を、集密まで増殖させ、そして方法
中に記載したように、様々な濃度の、MAb 2A1E2(白丸)
又は非阻害的対照PDGFベータ・レセプタMAb 4C5C8(黒四
角) のいずれかと共に、50ng/ml のPDGF BB の存在中で
インキュベートした。³ H-チミジンの取り込みを、記載
するように測定した。

【図７】ヒヒ平滑筋細胞におけるMAb 2A1E2 によるリン
酸化の阻害。ヒヒ平滑筋細胞を、PDGF BB 無し( レーン
1)、又は100ng/ml PDGF BBと共に、MAb の非存在中( レ
ーン2)、又は2nM MAb 2A1E2 ( レーン3)、200 nM MAb 2
A1E2( レーン4)又は20nMMAb 2A1E2( レーン5)の存在
中、インキュベートした。リガンド誘導リン酸化を、方
法中に記載したようにウェスタン分析により測定した。

【図８】MAb 2A1E2 によるヒヒ平滑筋細胞における有糸
分裂誘発の阻害。集密ヒヒ平滑筋細胞を、様々な濃度の
PDGF BB の存在で、1nM 、5nM 、25nM、250 nM、又は1
μM MAb 2A1E2 とインキュベートした。³ H-チミジン取
り込みを、方法中に記載したように測定した。データ
は、MAb の非存在中の飽和リガンド濃度(10ng/ml)にお
ける最大³ H-チミジン取り込み( 約30-50000 cpm) のパ
ーセントとして、表されている。PDGF BB の非存在中の
³ H-チミジン取り込みは、5-8000 cpmである。このグラ
フは、4 つの別々の実験の平均を表している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 9/08 9/08 35/00 35/00 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 エスコベド，マリア エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サンフランシスコ，＃３，アッパー テラ ス 455 (72)発明者 フレット，ラリー ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94002, ベルモント，エスコンディド ウェイ 1553

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第５細胞外Ig様ドメイン内ではないβ−
   PDGFレセプタに特異的に結合する抗体であって、前記抗
   体はβ−PDGFを発現する細胞のPDGF BB 誘導増殖を阻害
   し、その阻害は10μｇ／mlの抗体濃度で80％より高く達
   成される、前記抗体。
2. 【請求項２】 前記抗体がβ−PDGFレセプタを発現する
   細胞へのPDGF BB の結合を阻害する請求項１に記載の抗
   体。
3. 【請求項３】 前記抗体がβ−PDGFレセプタの細胞外Ig
   様ドメインに結合する請求項１に記載の抗体。
4. 【請求項４】 前記抗体がヒト化されている請求項１に
   記載の抗体。
5. 【請求項５】 第５細胞外Ig様ドメイン内ではないβ−
   PDGFレセプタに特異的に結合するヒト化された抗体であ
   って、前記抗体はβ−PDGFレセプタを発現する細胞のPD
   GF BB 誘導増殖を阻害し、その阻害は10μｇ／mlの抗体
   濃度で80％より高く達成される、前記抗体。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項の少なくと
   も１つの抗体を含む組成物。
7. 【請求項７】 さらに医薬として許容し得る補形剤を含
   有する請求項６の組成物。
8. 【請求項８】 前記組成物が固体組成物である請求項７
   の組成物。
9. 【請求項９】 β−PDGFレセプタに特異的に結合し、約
   10μｇ／mlの抗体濃度を有し、80％より高いβ−PDGFレ
   セプタを発現する細胞のPDGF BB 誘導増殖を阻害する抗
   体。
10. 【請求項１０】 β−PDGFレセプタに特異的に結合し、
    約 250nMの抗体濃度を有し、約90％のβ−PDGFレセプタ
    を発現する細胞のPDGF BB 誘導増殖を阻害する抗体。
11. 【請求項１１】 β−PDGFレセプタに特異的に結合し、
    約3.75μｇ／mlの抗体濃度を有し、80％より高いβ−PD
    GFレセプタを発現する細胞のPDGF BB 誘導増殖を阻害す
    る抗体。
12. 【請求項１２】 前記抗体がPDGF BB のβ−PDGFレセプ
    タを発現する細胞への結合を阻害する、請求項９〜１１
    のいずれか１項に記載の抗体。
13. 【請求項１３】 前記抗体がβ−PDGFレセプタの細胞外
    Ig様ドメインに結合する、請求項９〜１１のいずれか１
    項に記載の抗体。
14. 【請求項１４】 前記抗体がヒト化されている請求項９
    〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
15. 【請求項１５】 請求項９〜１１のいずれかの少なくと
    も１種の抗体を含む組成物。
16. 【請求項１６】 さらに医薬として許容し得る補形剤を
    含有する請求項１５の組成物。
17. 【請求項１７】 前記組成物が固体組成物である請求項
    １６の組成物。
18. 【請求項１８】 前記細胞外Ig様ドメインが第２細胞外
    Ig様ドメインである請求項１３の抗体。